CN101646781B - 自身免疫病的诊断和治疗靶标及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了在I型自身免疫性糖尿病(T1D)、其他自身免疫病及其他糖尿病相关疾病和病症中鉴定ZnT8作为自身抗原靶标。本发明还描述了基于该发现的各种治疗、诊断和预后工具及方法。本发明公开了鉴定出ZnT8的遗传变异在疾病过程的起始和自身免疫性向临床糖尿病的进展中起着重要作用。

Description

自身免疫病的诊断和治疗靶标及其用途

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请引入2006年12月29日提交的美国临时申请60/882,815的全文作为参考。 发明领域

[0003] 本发明大致涉及自身抗原靶标的鉴定,具体来说是I型自身免疫性糖尿病(T1D)的 自身抗原靶标,更具体的说,蛋白ZnT8作为新的自身抗原,本文描述了基于所述自身抗原的 治疗、诊断及预后工具和方法。

[0004] 发明背景

[0005] 自身免疫病是由抗机体自身组织的免疫应答引起的疾病。自身免疫病导致一种或 多种机体组织的破坏、器官的异常生长或器官功能的变化。所述疾病可能只影响一种器官 或组织类型,或可能影响多种器官和组织。

[0006] 人和N0D小鼠模型中的1型自身免疫性糖尿病(T1D)是一种多基因 Τ细胞依赖性自 身免疫病,其特征为胰岛β细胞的选择性破坏(1-3),源于易感个体中对β细胞抗原耐受性的 障碍,所述易感个体在关键的免疫调节机制方面具有先天缺陷(5)(例如,对自身显示致病 性而不是保护性免疫应答的个体)。与β细胞具有相同发育谱系(developmental lineage) 并且经常直接接触细胞的胰腺外分泌和内分泌细胞基本上不受影响,并且一旦细胞损失 则胰岛炎消退,这表明自身免疫性靶标主要是辟田胞特异性的。许多已知的糖尿病自身抗原 (诸如胰岛素和IGRP)反映了这种细胞特异性,但是,已知免疫靶标的列表是无论如何也不 全面的。这尤其涉及被免疫系统的细胞武器识别的抗原,但是尽管进行了十多年的研究,但 主要CD4+致糖尿病Τ细胞的靶标仍然是不清楚的。近年来利用免疫筛选步骤只出现少数几 个新靶标,所述免疫筛选步骤最初鉴定出这类分子为GAD65、ΙΑ-2和ICA 69。

[0007] 许多具有强T1D遗传倾向性的个体从不患有明显的疾病(单卵双生儿有一个糖尿 病成员时,50%的这种双生儿保持不一致),而非种系编码的因素显著影响T1D进展的速度 (7) 。这种低的外显率和易变的自然史表明环境因素以及免疫应答自身随机性质的重要性。 将这种平衡向更易致耐受(toleragenic)环境迀移的治疗策略具有防止或减缓自身免疫向 破坏性胰岛炎进展的潜能。

[0008] 在N0D小鼠的早期胰腺浸润中出现有限数量的胰岛细胞反应性T细胞克隆(16 ; 17),疾病进展看起来涉及表位传播(18)和早期T细胞应答的亲和力成熟(19)以及新的自身 抗原的募集(20)。已经从前期糖尿病或新近糖尿病N0D小鼠的脾、淋巴结或胰岛浸润中分离 出许多胰岛特异性CD4+和CD8+T细胞克隆(21-25),所述小鼠的同源抗原很难确定,看起来不 对应于任何人类糖尿病自身免疫的任一已知血清学标记物,诸如GAD65,胰岛素颗粒膜蛋白 ICA512(IA-2)和phogrin(ΙΑ-2β) (20),羧肽酶E(26),ICA69(27)和硫酸糖脂(28)。自体反应 性Τ细胞的分子靶标可以包括辟田胞未经确认的组分,或本质上不会引发体液免疫的已知β 细胞蛋白。因此,确定它们的同源抗原仍然是一个重要目标,随着基因组和蛋白质组技术的 最新发展,现在其是一个现实的目标。因此,利用对从ΝΙΤ1胰岛素瘤细胞的H-2Kd分子洗脱 的蛋白质组肽进行的敏感生物测定和分析的组合(29),最近证明被彻底研究的NY8.3CD8+ 克隆的靶标(23)是源自辟田胞蛋白IGRP(胰岛葡糖6-磷酸酶相关蛋白)的肽。

[0009] 尽管体液免疫自身对疾病发病机理可能不起什么作用(30),但B-淋巴细胞分子靶 标的鉴定仍是一个重要目标,因为B细胞在T1D的抗原呈递中起作用(31)。此外,循环的自身 抗体为糖尿病自身免疫提供有效的临床前标记物。高亲和力抗体的产生是T依赖性过程,因 此有理由预期被自身抗体识别的分子还将是自体反应性致糖尿病T细胞的靶标。该假设至 少对于胰岛素、phogrin和GAD65来说是正确的(32-34)。已知靶标的列表尽管很长,但还是 远远不够全面的。这被以下事实突出显示:通过人胰腺的免疫组化确定的前-T1D的血清学 诊断仍然是最灵敏的指标,仅仅因为它定义了不属于分子术语中确定的自身抗原的其他靶 标。

[0010] 关于在T1D及其他自身免疫病中是否存在初始或起始自身抗原还存在持续的争 论。对于TID来说,目前N0D小鼠中最佳候选物是胰岛素(33;35-38),但基于胰岛浸润中识别 该抗原的T细胞的前体频率还表明IGRP可能也起着重要作用(29; 39;40)。另一种看法是该 疾病由正常致耐受机制的破坏导致的多克隆活化引起,所述机制将另外产生针对相同分子 的调控细胞(41)。考虑到后一情况,本发明人假设作为T1D中自身免疫重要靶标的任意分子 是基于抗原疗法的候选物。基于用胰岛素(42;43)、64065(44-48)、批? 65(49)和161^(50) 的天然表位免疫的N0D小鼠中的有效免疫耐受策略看起来证明了这点。此外,本发明人对 IA-2和phogrin的初步研究表明,当给初生N0D小鼠施用时,已知的小鼠和人肽表位(肽7 (51))同样延缓疾病的出现。在这方面,其他已知的T细胞靶标,包括IAPP(52)、頂0GEN 38 (53-57)看起来还未被表征。

[0011]自身抗原和病毒蛋白间推定的分子模拟性质的实例是基于科学文献中大量的序 列同源性(58)。例如,就T1D来说,已经提出过GAD65与柯萨奇B3P2-C蛋白(59)或人巨细胞病 毒主要DNA结合蛋白(60)的交叉反应性,及IA-2与轮状病毒VP7(61)或柯萨奇Μ VP1(62)的 交叉反应性。类似地,还假定了胰岛素原与GAD65的模拟(63)。能够想象得到,通过建立并加 强免疫网络,与分子模拟物的接触可以引发自身免疫或者预防该分子模拟物。对由传染原 引发的人自身免疫的流行病学研究还不是特别有益的,这可能是因为疾病的长期前驱症状 及无法鉴定涉及的特定生物(或常见病原体的罕见血清型)(14)。本质上对"卫生假说"非常 重要的保护性应答是更难建立的。

[0012] 非肥胖糖尿病(N0D)小鼠是目前人T1D最好的模型(8),其中疾病进展的三个阶段 是明显的,即,自体反应性T细胞的扩增("检查点0"),它们向胰岛的归巢("检查点Γ ),及从 良性的胰岛周围炎向导致辟田胞损伤的侵袭性胰岛炎转变("检查点2")(9)。已经假定通过 "检查点0"与小岛细胞凋亡的波动一致,所述小岛细胞凋亡导致胰淋巴结中细胞抗原呈递 的增强。相关假设表明此时(当存在断奶时)接触肠中的新抗原导致Thl极化T细胞的活化, 所述T细胞随后迀移至胰腺并干扰引流区淋巴结,这样的话引起针对小岛细胞抗原的免疫 原性应答。在人T1D中还表明存在生后小岛细胞凋亡(10)、先天性β细胞异常(11)及饮食 (12;13)或肠病毒(14)引发的类似参与,尽管目前,它们的相对作用(如果有的话)及作为偶 然因素的普遍性仍存在争论。尽管如此,很明显小岛细胞抗原对疾病过程非常重要(15),对 其分子特征的详细了解对于免疫治疗的合理设计及监测并鉴定高危个体非常重要。

[0013] 仅在美国就有超过2百万1型糖尿病患者,他们都需要终身多次每日给药胰岛素以 维持生命。这些个体中的大多数将在其一生中患有糖尿病并发症,据估计在任何年龄,他们 的寿命可以减少直至三分之一。因此预防或甚至减缓疾病的进展将具有巨大的社会和经济 效益。存在大量针对糖尿病预防和逆转的实验性方法,它们在T1D的啮齿类动物模型中被证 明非常有效,目前正处于临床试验阶段。例如,利用抗CD3单克隆抗体的初步发现是尤其有 希望的。为了能够有效,任何基于免疫的疗法都需要诊断性试验来确定介入是否是合适的 以及什么时候相对于疾病的分期实施治疗。一旦治疗开始,必须评价其短期和长期效果。基 于针对自身抗原的体液或细胞自身反应性的诊断测试(用于监测疾病进展)对于做出治疗 患者的任何决定及治疗结果的后续监测非常重要。

[0014]因此,在本领域一直需要改进的针对T1D的诊断分析,以及新的基于疾病靶标的免 疫治疗。此外,在一种自身免疫病诸如T1D中鉴定的许多靶标还是其他自身免疫病的靶标, 从而扩展了各种自身免疫病的可用诊断和治疗方法。

[0015] 发明概述

[0016] 本发明的一个实施方案涉及ZnT8的各种片段。一方面,所述片段包括ZnT8的至少 10个C端氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少10个C端氨基酸组成,或由ΖηΤ8的至少10个C端氨基酸 组成。一方面,所述片段包括ΖηΤ8的至少25个C端氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少25个C端氨基 酸组成,或由ΖηΤ8的至少25个C端氨基酸组成。另一方面,所述片段包括ΖηΤ8的至少50个C端 氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少50个C端氨基酸组成,或由ΖηΤ8的至少50个C端氨基酸组成。另 一方面,所述片段包括ΖηΤ8的至少75个C端氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少75个C端氨基酸组 成,或由ΖηΤ8的至少75个C端氨基酸组成。仍在另一方面,所述片段包括ΖηΤ8的至少100个C 端氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少100个C端氨基酸组成,或由ΖηΤ8的至少100个C端氨基酸组 成。一方面,所述片段包括ΖηΤ8的至少101个C端氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少101个C端氨基 酸组成,或由ΖηΤ8的至少101个C端氨基酸组成。一方面,所述片段包括ΖηΤ8的至少102个C端 氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少102个C端氨基酸组成,或由ΖηΤ8的至少102个C端氨基酸组成。 仍在另一方面,所述片段包括ΖηΤ8的至少104个C端氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少104个C端 氨基酸组成,或由ΖηΤ8的至少104个C端氨基酸组成。一方面,所述片段包括ΖηΤ8的至少350 个C端氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少350个C端氨基酸组成,或由ΖηΤ8的至少350个C端氨基酸 组成。另一方面,所述片段包括至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQ ID Ν0:2的346-353位),基本 上由至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQ ID Ν0: 2的346-353位)组成,或由至少氨基酸序列 SLTIQMES(SEQ ID N0:2的346-353位)组成。一方面,所述片段包括ZnT8的至少10个N端氨基 酸,基本上由ΖηΤ8的至少10个Ν端氨基酸组成,或由ΖηΤ8的至少10个Ν端氨基酸组成。一方 面,所述片段包括ΖηΤ8的至少25个Ν端氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少25个Ν端氨基酸组成,或 由ΖηΤ8的至少25个Ν端氨基酸组成。另一方面,所述片段包括ΖηΤ8的至少50个Ν端氨基酸,基 本上由ΖηΤ8的至少50个Ν端氨基酸组成,或由ΖηΤ8的至少50个Ν端氨基酸组成。一方面,所述 片段包括ΖηΤ8的至少74个Ν端氨基酸,基本上由ΖηΤ8的至少74个Ν端氨基酸组成,或由ΖηΤ8 的至少74个Ν端氨基酸组成。

[0017] 在本发明上述方面中的任意一项,所述片段可以包括选自Ε352和S353的氨基酸位 置(相对于SEQ ID Ν0:2)。

[0018] 在本发明上述方面中的任意一项,ZnT8可以是人ZnT8(SEQ ID N0:2)。一方面,所 述片段包括SEQ ID N0:2的位置325。另一方面,ZnT8是SEQ IDN0:2的多态性变体。另一方 面,所述片段包括SEQ ID N0:2的位置325,在本发明该方面的一个实施方案中,325位的氨 基酸是色氨酸、谷氨酰胺或精氨酸。

[0019] 本发明的另一个实施方案涉及ZnT8的片段,包括SEQ ID N0s:8-24或40-65中任一 所示片段,基本上由SEQ ID NOs:8-24或40-65中任一所示片段组成,或由SEQ ID NOs:8-24 或40-65中任一所示片段组成。

[0020] 本发明的一个实施方案涉及嵌合蛋白,包括本文所述的任意两个或更多个片段, 基本上由本文所述的任意两个或更多个片段组成,或由本文所述的任意两个或更多个片段 组成。一方面,嵌合蛋白包括ZnT8的N端片段和ZnT8的C端片段。另一方面,嵌合蛋白包括 ΖηΤ8的两个C端片段,其中每一片段包括氨基酸325位,并且其中每一片段在325位包括不同 的氨基酸。一方面,一个片段包括325位的精氨酸,其中第二片段包括325位的色氨酸。

[0021 ]本发明的另一个实施方案涉及ΖηΤ8的片段或同系物,包括被抗ΖηΤ8抗体选择性结 合的至少一个ΖηΤ8表位。一方面,抗ΖηΤ8抗体是获自特定个体的抗体。一方面,所述个体患 有或被怀疑患有I型糖尿病。

[0022]本发明的另一个实施方案涉及ΖηΤ8的片段或同系物,包括被ΖηΤ8特异性Τ细胞受 体特异性识别的至少一个ΖηΤ8表位。一方面,权利要求30的ΖηΤ8的片段或同系物,其中所述 个体患有或被怀疑患有I型糖尿病。

[0023] 在上述实施方案的任意一项中,一方面,所述片段或嵌合蛋白与至少一个祀向基 团复合以将该片段或嵌合蛋白靶向到组织或机体的细胞或部位。一方面,所述靶向基团靶 向于Τ细胞。另一方面,靶向基团靶向于ΖηΤ8特异性自体反应Τ细胞。

[0024] 在上述实施方案中的任意一项中,一方面,所述片段或嵌合蛋白与毒素复合,以在 Τ细胞或Β细胞中诱导凋亡,或另外对Τ细胞或Β细胞是有毒性的。

[0025] 在上述实施方案的任意一项中,一方面,所述片段或嵌合蛋白与可检测的标记物 连接。

[0026]本发明的另一个实施方案涉及ΖηΤ8的同系物,包括与天然存在的ΖηΤ8蛋白具有低 于99%同一性并且与SEQ ID Ν0:2具有至少90%同一性的蛋白。一方面,所述蛋白与SEQ ID N0:2具有至少95%同一性。另一方面,所述蛋白包括SEQ ID N0:2的位置325,其中325位的 氨基酸是精氨酸、色氨酸或谷氨酰胺。

[0027] 本发明的另一个实施方案涉及包括ZnT8或其变体或片段的疫苗,其中所述疫苗引 发抑制或消除个体中ΖηΤ8特异性自体反应Τ细胞的免疫应答。

[0028] 本发明的另一个实施方案涉及抗体或其抗原结合片段,它们选择性结合ΖηΤ8或其 片段或变体,并抑制或降低个体中ΖηΤ8特异性自身免疫应答。一方面,所述抗体是单克隆抗 体。

[0029 ]本发明的另一个实施方案涉及一种诊断易患或正患有自身免疫病的个体的方法, 包括检测个体试样中选择性结合ΖηΤ8的抗体,其中与阴性对照相比,如果检测到个体中抗 体的增加表明个体易患或正患有自身免疫病。一方面,所述方法包括检测选择性结合人 ΖηΤ8的抗体,其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。

[0030]本发明的另一个实施方案涉及一种诊断易患或正患有自身免疫病的个体的方法, 包括检测个体试样中ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答,其中与阴性对照相比,如果检测到个体中 ΖηΤ8特异性Τ细胞应答的增加表明个体易患或正患有自身免疫病。一方面,所述方法包括检 测对包含325位精氨酸的人ΖηΤ8特异的Τ细胞应答。一方面,所述方法包括检测对人ΖηΤ8特 异的T细胞应答,其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。

[0031] 在上述方法的任意一项中,当个体易患或正患有自身免疫病时,所述方法可以进 一步包括给该个体施用靶向于个体的ZnT8表位的治疗剂,所述ZnT8表位包括325位的氨基 酸。一方面,所述治疗剂个体中ΖηΤ8的是蛋白、肽或激动剂,它们使个体的免疫应答耐受 ΖηΤ8蛋白。一方面,所述治疗剂刺激抗ΖηΤ8蛋白的免疫应答。

[0032] 在上述方法的任意一项中,一方面,自身免疫病是I型糖尿病。

[0033] 本发明的另一个实施方案涉及一种监测个体的I型糖尿病自身免疫从最初的良性 自身反应性到破坏性胰岛炎的进展的方法,包括检测个体试样中选择性结合ΖηΤ8的抗体, 其中与相同个体中抗体的先前测量值相比,检测到个体中抗体的增加表明该个体正向破坏 性胰岛炎发展。一方面,所述方法包括检测选择性结合人ΖηΤ8的抗体,其中325位的氨基酸 是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。

[0034] 本发明的另一个实施方案涉及一种监测个体的I型糖尿病自身免疫从最初的良性 自身反应性到破坏性胰岛炎的进展的方法,包括检测个体试样中ΖηΤ8特异性Τ细胞应答,其 中与相同个体中ΖηΤ8特异性Τ细胞应答的先前测量值相比,检测到个体中ΖηΤ8特异性Τ细胞 应答的增加表明该个体正向破坏性胰岛炎发展。一方面,所述方法包括检测对包含325位精 氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺的人ΖηΤ8特异的Τ细胞应答。

[0035] 本发明的另一个实施方案涉及一种监测用于预防I型糖尿病、延缓I型糖尿病发病 或改善前驱糖尿病个体的自身免疫的治疗效果的方法,包括检测个体试样中选择性结合 ΖηΤ8的抗体,其中与相同个体中抗体的先前测量值相比,检测到个体中抗体水平降低或基 本上相同表明所述治疗是有效的,其中与同个体中抗体的先前测量值相比,检测到个体中 抗体增加表明所述治疗是无效的。一方面,所述方法包括检测选择性结合人ΖηΤ8的抗体,其 中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。

[0036]本发明的另一个实施方案涉及一种监测用于预防I型糖尿病、延缓I型糖尿病发病 或改善前驱糖尿病个体的自身免疫的治疗效果的方法,包括检测个体试样中ΖηΤ8特异性的 Τ细胞应答,其中与相同个体中ΖηΤ8特异性Τ细胞应答的先前测量值相比,检测到个体中 ΖηΤ8特异性Τ细胞应答水平降低或基本上相同表明所述治疗是有效的,其中与同个体中 ΖηΤ8特异性Τ细胞应答的先前测量值相比,检测到个体中ΖηΤ8特异性Τ细胞应答增加表明所 述治疗是无效的。一方面,所述方法包括检测对包含325位精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺的 人ΖηΤ8特异的Τ细胞应答。

[0037] 在上述检测抗体方法的任意一项中的一方面,所述方法可以包括使用以下分析 法,其选自但不限于:放射免疫沉淀分析,ELISA,时间分辨焚光分析和发光分析。一方面,所 述方法包括使用竞争性铕分析。

[0038] 在上述检测T细胞应答方法的任意一项中的一方面,所述方法可以包括使用以下 分析法,其选自但不限于:T细胞增殖分析,利用可溶性MHC四聚体的结合分析,利用可溶性T 细胞受体的结合分析,和ELISP0T分析。

[0039]在上述确定方法的任意一项中,在一个实施方案中,所述方法包括使用ZnT8或其 片段或变体,包括但不限于,本文描述的任一 ΖηΤ8片段。

[0040]本发明的另一个实施方案涉及用于进行本文所述任意方法的分析试剂盒。所述试 剂盒包括:(a)ZnT8蛋白或其变体或片段;(b)用于检测选择性结合ΖηΤ8的抗体的试剂;和/ 或用于检测ZnT8特异性T细胞应答的试剂。

[0041 ]本发明的另一个实施方案涉及一种预防自身免疫病、延缓自身免疫病发病或改善 患有自身免疫病的个体的自身免疫(包括改善该疾病的任意一种或多种症状)的方法,包括 给需要其的个体施用引发ΖηΤ8特异性免疫应答的药剂,所述ΖηΤ8特异性免疫应答保护患者 被自身免疫病靶向的细胞或组织。一方面,所述自身免疫病是I型糖尿病,并且其中所述药 剂保护胰岛的辟田胞。

[0042] 本发明的另一个实施方案涉及一种预防自身免疫病、延缓自身免疫病发病或改善 患有自身免疫病的个体的自身免疫(包括改善该疾病的任意一种或多种症状)的方法,包括 给需要其的个体施用药剂,所述药剂靶向于个体的ΖηΤ8特异性Τ细胞,并诱导ΖηΤ8特异性Τ 细胞的坏死或凋亡。一方面,所述自身免疫病是I型糖尿病,并且其中所述药剂诱导ΖηΤ8特 异性Τ细胞的坏死或凋亡。

[0043] 本发明的另一个实施方案涉及一种预防自身免疫病、延缓自身免疫病发病或改善 患有自身免疫病的个体的自身免疫(包括改善该疾病的任意一种或多种症状)的方法,包括 给需要其的个体施用诱导个体中ΖηΤ8特异性Τ细胞耐受性的药剂。一方面,所述自身免疫病 是I型糖尿病,并且其中所述药剂诱导个体中ΖηΤ8特异性Τ细胞的耐受性。

[0044] 在上述治疗方法的任意一项中,一方面,所述药剂是ΖηΤ8、其同系物、其片段或其 合成模拟物。一方面,所述药剂是如本文任意地方所述的片段或嵌合蛋白,同系物,或其片 段。一方面,所述药剂是与个体的天然自身抗体竞争结合个体的ΖηΤ8的抗体。一方面,所述 药剂对包含325位精氨酸的人ΖηΤ8的多态性变体具有特异性。一方面,所述药剂对包含325 位色氨酸的人ΖηΤ8的多态性变体具有特异性。一方面,所述药剂对包含325位谷氨酰胺的人 ΖηΤ8的多态性变体具有特异性。

[0045]本发明的另一个实施方案涉及ΖηΤ8、其变体、其片段、其合成模拟物或结合所述 ΖηΤ8的抗体、其同系物或其片段在基本上如本文所述的诊断、预后或治疗方法中的用途。 [0046]本发明的另一个实施方案涉及基本上如本文所述的任意方法、药剂、ΖηΤ8片段、同 系物、变体、嵌合蛋白、融合蛋白或编码上述物质的核酸,或选择性结合上述物质的抗体。 [0047]本发明的附图简述

[0048]图1是显示针对Slc30A8的糖尿病特异性自身抗体的图示。

[0049]图2A和2B显示果蝇S2细胞中膜结合的糖尿病自身抗原的表达和纯化。图2A是数字 化图象,显示mIGRPV5His构建体的表达在S2细胞中被诱导,以及用抗V5抗体印迹的细胞膜 组分(CMF)。图2B是显示对IGRP-CMFT细胞杂交瘤(克隆1 -76-54)进行应答分析的图示。 [0050]图3显示基于EST序列变异修正的ZnT8的基因结构及预测的选择性翻译产物。对于 显示的选择性翻译产物,MYHCH的"起始"序列对应于SEQID Ν0: 2的50-54位,MEFLER的"起 始"序列对应于SEQ ID N0:2的1-6位。

[0051 ]图4A显示人ZnT8的氨基酸序列(SEQ ID N0:2),其中用暗灰色突出显示预测的跨 膜结构域。

[0052]图4B显示预测的ZnT8的膜拓扑结构,并显示环的氨基酸位置。

[0053] 图5显示针对ZnT8 C端探针的标准分析。

[0054]图6是显示利用不同ΖηΤ8构建体的盲DASP研究结果的图示。

[0055]图7证明ΖηΤ8检测患者的自身抗体,所述患者对ICA和金标准生化抗体是阴性的。

[0056]图8A-8C是一系列图表,显示在新发病群体中就胰岛素(图8A)、GAD(图8B)和IA2 (图8C)而言自身抗体与ZnT8的关系。

[0057]图9A-9D是一系列图表,显示相对于年龄来说,疾病发病时自身抗体的表达(图9Α = ΖηΤ8;图9B=GAD;图9C =胰岛素;图9D = IA2)。

[0058] 图10A和10B是显示在两个不同患者中使用ZnT8自身抗体作为T1D预测标记物,表 明在图10Α和10Β中显示。

[0059] 图11是显示疾病发病时T1D患者的糖尿病自身抗体状况的表格。

[0060] 图1 2 Α和1 2 Β是显示Ζ η Τ 8抗体分析的受试者工作特性(r e c e i ν e r operatorcharacteristics)的图示(图12A显示免测沉淀指数,图12B显示灵敏度)。

[0061] 图13是显示与ZnT80RF、C端和N端反应性的关系的图示。

[0062]图14A和14B显示研究ZnT8的N端和C端是否能够相互作用产生新的表位的实验的 结果;该实验利用作为免测沉淀分析中标准品的2个糖尿病血清库进行,第一个基于针对C 端探针的强应答来选择(图14Α),第二个基于Ν端的反应性(图14Β)。

[0063]图 15Α显示小鼠 Slc30A8(顶部;显示的是SEQ ID Ν0:4的267-367位)、人Slc30A8 (中间;显示的是SEQ ID N0:2的268-369位)和小鼠 Slc30A3(底部;序列是SEQ ID N0:25)比 对的序列。

[0064]图15B显示对于自身抗体反应来说,对C端探针修饰的作用(引用序列显示限制性 酶切位点是SEQ ID N0:2的336-369位)。

[0065]图15C显示对于自身抗体反应来说,在带电残基处(K340,H345和E352)具有点突变 的C端探针的影响。

[0066]图16显示对于自身反应性非常重要的ZnT8C端的残基。

[0067]图17显示利用缺失突变体和小鼠/人嵌合体的表位绘图。显示的小鼠 ZnT8序列是 SEQIDN0:4的267-367位;显示的人ZnT8序列是SEQIDN0:2的268-369位。

[0068]图18显示用于直接诱变研究的分子模型。

[0069]图19显示被T1D自身抗体靶向的区域中ΖηΤ8残基的保守性(Mse Ν端序列是SEQ ID N0:4的 1-74位;Hum N端序列是SEQ ID N0:2的 1-75位;Xen N端序列是SEQ ID N0:38;Mse C 端序列是SEQ ID N0:4的267-367;Hum C端序列是SEQ ID N0:2的268-369位;Xen C端序列 是SEQ IDN0:39)。

[0070] 图20显示人Slc30A家族成员之间的序列同源性。

[0071] 图21A-21C显示根据CR限制性自身抗体应答(图21A)、CW限制性自身抗体应答(图 21B)和CQ自身抗体应答(图21C),小鼠 ZnT8的定点诱变鉴定结构中的主要表位。

[0072]图22A-22D显示小鼠 ΖηΤ8的多位点突变概括了与hCArg反应性血清的人ΖηΤ8反应 (图22Α =与hCArg反应性血清的mCArg探针;图22B = mCArg(Arg Glu Lys Lys);图22C =与 hCTrp反应性血清的mCTrp探针;图220 =与11(71印反应性血清的mCArg(Arg Glu Lys Lys)探 针)。

[0073] 图23A-23D显示用人多态性探针检测的抗体水平与小鼠定点突变体之间的关系 (图23六显示11〇八坪-6111指数对111〇八坪指数;图2313显示11^找,11〇4找和11〇4找-6111指数;图 23C显示mC Trp指数对hC Trp-Gln指数;图 23D显示mCTrp,hCTrp和hC Trp-Gln指数)。

[0074] 图24A-24D显示Slc30A8 aa325多态性与ZnT8A的关系。图24D显示基于针对单个探 针或探针组合的应答进行区分的应答的水平和频率。图24C显示对普通Arg和Trp变体应答 之间的关系,基于只对Trp(垂直的)和Arg(水平的)应答的95%截断将其分为5个区,对角线 代表针对分析中两种探针假定15%CV的等同应答±3SD的边界。图24A和24B在检查针对Gin 探针及Arg和Trp探针的应答之间的关系时使用相同分层。

[0075] 图25显示相对于编码aa325的基因型ZnT8A的发生率。

[0076] 图26显示基因型与对hCR和hCW探针的反应性之间的相关性。

[0077]图27显示与糖尿病发病年龄有关的Slc30A8基因型。

[0078] 图28A-B显示Slc30A8基因型与抗体水平比较(图28A显示相对于基因型的Slc30A8 自身抗体反应水平;图28B显示相对于基因型的其他自身抗体反应水平)。

[0079] 图29显示现有ZnT8分析的概述。

[0080] 图30显示针对组合Ν端、C端、腔环(luminal loops)、细胞溶质环和多态性残基的 不同ZnT8构建体的自身反应性。

[0081] 图31A-31F显示发病后0-2年的抗体与C-肽比较(图31A-C与C-肽比较;图31D-F与 GADA 和ΙΑ-2Α比较)。

[0082] 图32Α显示发病后5-10年的ΖηΤ8Α和C-肽水平。

[0083]图33Α显示检出率变化的原则(黑色为检出ΖηΤ8;白色未检出)。

[0084]图33Β显示增加 ΖηΤ8抗体测量的不同效果。

[0085]图34显示,人胎儿胰腺的实时PCR显示高胰岛特异性。

[0086]图35显示,新确诊的T1D患者显示针对ΖηΤ8合成肽的外周Τ细胞应答。

[0087]图36显示自身抗体预吸附实验确认了利用重组蛋白来区别不同的ΖηΤ8表位。

[0088] 发明详述

[0089] 本发明广泛涉及自身抗原靶标的鉴定,具体的是I型自身免疫性糖尿病(T1D)的自 身抗原靶标,更具体的是蛋白ΖηΤ8作为新的自身抗原,本文描述了基于所述自身抗原的治 疗、诊断及预后工具和方法。本发明还涉及ΖηΤ8中遗传变异的鉴定,本文描述了所述遗传变 异在疾病过程的起始和自身免疫性向临床糖尿病的进展中起着重要作用。这些发现允许本 发明人提供新的诊断工具,所述诊断工具可用于提高对病程的预后评价及监测在疾病的临 床前期治疗介入的有效性。所述分子本身、衍生的肽、肽类似物和第二免疫药剂还作为预防 发病或自身免疫性向临床疾病进展的治疗介入的基础。当个体一出生就能确定其基因型的 能力为实施治疗性检测提供独特的优势,因为预防自身免疫性过程的出现比一旦其确立再 让其逆转要容易。

[0090] 过去,正如以上讨论的,胰岛素被定义为基于其组织结合的候选基因,GAD65和ΙΑ-2来自于患者血清免疫沉淀来自放射性标记的胰岛的蛋白的能力(64-66),和IGRP作为结合 MHC H-2Kd(刺激源自自发性糖尿病小鼠的Τ细胞克隆)的肽。本发明人已经回答了以下问 题:基于现在关于自身抗原的细胞和分子生物学的理解,以及可用的通过微阵列分析在不 同组织中研究和分析基因组范围表达的工具,是否能够开发出更加系统化的方法来鉴定靶 向自身抗原。目标是产生一系列将包括至关重要的糖尿病自身抗原的候选基因,其可能从 在辟田胞中表达的15,000个或类似基因转录物中具有超过50个蛋白。然后可以使用有效的 分析检测针对这种分子的细胞和体液免疫应答。本研究的结果在下文描述,尤其着重于新 的靶向自身抗原(即ZnT8)的发现。

[0091] 更具体地,抗原呈递和T细胞识别的结构生物学为新的T1D自身抗原的鉴定提供相 对较少的线索,因为MHC和T细胞受体分子均具有较宽的肽结合特异性范围和相对较低的亲 和力。已经证明很难鉴定天然表位,即使已经详细了解模拟位肽的结合特性,这只是因为接 触残基的数量较少并且保守的氨基酸取代可以轻易被接受。本发明人在本文中描述了在基 因组范围基础上鉴定候选自身抗原的基于知识的算法的开发。最初基于实验信息假设"理 想"自身抗原的大量主要和次要属性,然后据此评估。然后评估抗原与每一理想属性的一致 性以获得"自身抗原分数",从而得到最佳候选物的有序表。然后在开始鉴定候选物的短列 表之前(基于N0D小鼠中自发性和激发的细胞介导的自身免疫性应答及N0D小鼠和人血清中 测定的体液自身反应性),考虑基于基因本体论功能和信息诸如基因位置的中间分析。支持 该方法的微阵列数据已经被大量获得。因此,首先通过人类受试者的血清学分析筛选候选 抗原,然后利用转基因小鼠的HLA-DR3、-DR4、DQ2-和-DQ8 HLAA2及其他I型HLA糖尿病易感 性等位基因筛选针对候选抗原的细胞介导的免疫应答。

[0092] 利用该方法,本发明人已经鉴定锌转运蛋白蛋白(ZnT8,亦称为Slc30A8)作为用于 与T1D有关的预后、诊断和治疗方法的新的自身抗原靶标。ΖηΤ8是一种看起来是被限定于人 和小鼠胰岛的胰岛素生成辟田胞中的蛋白。本发明人已经证明,ΖηΤ8是患有T1D的人类受试 者中自身抗体的靶标,并且已经鉴定出ΖηΤ8的多态性变体作为1型糖尿病易感性、自身免疫 性状况、自身抗体特异性和疾病进展及严重性的遗传标志物。ΖηΤ8的自身抗体在临床疾病 发展前出现,被认为是初期糖尿病的新标记物。

[0093]此外,本发明人发现ΖηΤ8自身抗体靶向于分子的两个不同区域,这些区域中的一 个包括3个不同氨基酸(在确定免疫应答的特异性和程度方面均起重要作用)之一。在自身 免疫性和糖尿病发展之前的任何时间利用单核苷酸多态性分析确定个体的基因型提供关 于编码的变体氨基酸的信息,因此可用于做出关于治疗和护理的临床决定。此外,本发明允 许准确分析针对ΖηΤ8的自身抗体的特异性,并进一步根据免疫系统靶向的ΖηΤ8的变体形式 对抗体进行分类。目前,取决于分子的325位变体氨基酸的同一性(Arg、Trp或Gin)的3种主 要形式(在本文中被称为"异表位(isoepitopes )")及包括保守氨基酸(aa325不依赖的)的 第四表位已被识别。个体的应答可以被分为8种不同的应答之一:(1)无;(2)Arg325-限制性 的;(3)Trp325-限制性的;(4)Gln325-限制性的;(5)Arg325-和Trp325-限制性的;(6) Arg325-和Gln325-限制性的;(7)Trp325-和Gln325-限制性的;和(8)氨基酸325-不依赖的。 在本文中提出自身抗体应答的这种层化以提供有关疾病进展的信息,对于决定如何利用抗 原特异性治疗剂来治疗T1D自身免疫性非常重要。

[0094]更具体地,本发明人表明:

[0095] #60%的新发病TID患者对于针对ZnT8的自身抗体是阳性的;

[0096] #20-30%的T1D患者对于针对ΖηΤ8的自身抗体是阳性的,而通过生化(GAD、Ins和 IA2自身抗体)或组织学手段(胰岛细胞质自身抗体)测量,所述患者对其他自身抗体是阴性 的;

[0097] •针对ZnT8的自身抗体的鉴定使患者从低风险(高于1)变为高风险类型(高于2); [0098] •在利用GAD的单一分析形式中,抗ΖηΤ8分析检测到90%的新发病T1D患者;

[0099] •本发明能够大规模筛选患者;

[0100] ·ΖηΤ8自身抗体靶向于分子的两个不同区域(Ν端和C端),其后者包括3个不同氨 基酸(在确定免疫应答的特性和程度方面均起重要作用)之一。

[0101] •针对上面鉴定位点的自身抗体复合基因编码的序列,因此确实是自身反应性 的,等位基因以高(75%)、中(25%)和低(1%)频率存在,在人种间显示显著变异;

[0102] •在3岁前患有糖尿病的幼儿具有比预期更高ZnT8的CC(对于Arg325基因型是纯 合的)频率(75%vs 55%)和更低的ZnT8的CT基因型(对于Arg325和Trp 325基因型是杂合 的)频率(35%vs 40%)。年龄更大的儿童显示与正态群体中报道的类似的基因型频率。因 此,CC基因型可以被认为是糖尿病的危险因素。

[0103] 在本发明之前,在为了鉴定与胰腺辟田胞特异性相关的分子的出版物中鉴定和报 道了编码ZnT8-部分的部分核苷酸序列,作为mRNA其在胰腺β细胞中比在α细胞、肝或肾中 的表达更高(Neophytou et al.,1996,Diabetes 45:127-133)。两个克隆的部分核苷酸序 列保存于GENBANK®,登录号为Z47772(克隆23)和Z47779(克隆41)。但是,该出版物没 有鉴定出ZnT8的全长核苷酸或氨基酸序列,该出版物也没有鉴定或证明所述部分序列编码 潜在的自身抗原。

[0104] 完整的ΖηΤ8分子最初在2004年由瑞士的一个小组克隆,该小组主要研究重金属离 子转运蛋白(参见Chimienti et al.,Biometals 2005 Aug;18(4):313_7;Chimienti et al.,Diabetes 2004 Sep;53(9):2330_7;和Seve et al.,BMCGenomics 2004 May 23;5 (1):32,每篇均在此完整引入作为参考)。利用生物信息学方法和免疫组织化学,Chimienti 等观察到分子在胰岛中表达,他们还报道了其与胰岛素分泌颗粒的结合。此外,Chimienti 等人教导了当在HeLa细胞中过表达时,ZnT8导致胞内囊泡中的锌积聚,表明ZnT8是参与细 胞质锌向胞内囊泡转运的ΖηΤ。但是,在这些报告中未提及ΖηΤ8是潜在的自身抗原,因此,也 未提及其在如本文描述的那些诊断或治疗方法中的用途。

[0105] 本发明人对ΖηΤ8作为1型糖尿病中自身抗原的重要作用的发现基于在本发明人实 验室进行的一系列新近实验,其具体解决了以下问题:在新发病的1型糖尿病患者中ΖηΤ8是 否是体液自身反应性的革G标。本发明人进行的初步研究提示,大约10 %患者对Ζ η Τ 8显示中 等自身反应性(参见实施例)。所述分析法的进一步发展(利用分子的C00H末端(C端)片段取 代全长ΖηΤ8的)(如下所述)显著增加该分析法的灵敏性,这样的话在疾病发病时直至70% 的T1D受试者被检测是阳性的(相对低于1%的配对对照)。与目前在T1D受试者中使用的基 于公知分子:胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD65)和IA-2(PTrN)的体液自身反应性分析法相比, 这种灵敏性与其相当或更好。本发明人还证明ZnT8是独立的疾病标记物,因此,完善并扩展 了基于抗体的分析法的灵敏性。通过检查10年间收集的一系列样品,显示在前驱糖尿病的 发展过程中ΖηΤ8抗体出现得比其他抗体更晚,因此它可以指示胰岛炎的最终破坏期,所以 它是早期临床疾病的标记物。

[0106] 此外,本发明人发现ΖηΤ8自身抗体靶向于分子的两个不同区域,这些区域中的一 个包括3个不同氨基酸(在确定免疫应答的特性和程度方面均起重要作用)之一。因为可以 通过基因组的核苷酸序列确定变体氨基酸序列,因此有可能确定编码的变体氨基酸。本发 明人第一次证明,针对该位点的自身抗体匹配基因编码的序列,因此确实是自身反应性的。 所述基因显示3个已知的等位基因,其以高(75%)、中(25%)和低(1 % )频率存在,并在人种 间显示显著的变异。这对如何诊断自身免疫性及如何指导治疗性检测有启示作用,因为根 据所需结果,针对正确(自身)或错误(非自身)编码的序列是有益或有害的。例如,免疫治疗 的目的可以是诱导免疫耐受性,或相反,分别通过使用或去除免疫元件来编排免疫系统,诸 如破坏性效应T细胞或保护性调控T细胞。

[0107] 在本发明之前,没有理由怀疑ZnT8可能是被免疫系统的抗体或细胞武器识别的自 身抗原。实际上,就本发明人所知,ΖηΤ8还没有在自身免疫性糖尿病背景下被研究,在免疫 学范围内也没有关于该分子的其他公开数据。如上所述,在其他自身免疫病和糖尿病范围 内存在关于使用自身抗原作为诊断剂和治疗剂的文献报告。但是,这些指向分子诸如胰岛 素、谷氨酸脱羧酶(GAD65)、IA2、phogrin和热休克蛋白60,它们从结构、细胞生物学和免疫 观点看均与ZnT8无关。

[0108] 此外,尽管通过例如磷酸化或瓜氨酸化(citrullination)鉴定蛋白的单氨基酸差 异或单氨基酸的翻译后改造是以前就有的,但没有理由怀疑这种变化将是如本发明人显示 的自身抗体特异性的具体决定因素。实际上,单核苷酸多态性(SNP)编号rsl3266634和 rs 16889462,其编码人ZnT8编码序列的非同义变化,已公开于国家生物技术信息中心 (NCBI)的单核苷酸多态性数据库。该SNP编码ΖηΤ8中氨基酸325位的选择性Arg或Trp(SEQ ID N0:2),其与本发明人研究中鉴定的多态性变体一致。但是,就本发明人所知,之前还没 有鉴定出该SNP与1型糖尿病(T1D)的关系。基因组范围的关联研究鉴定出ZnT8包含大量与2 型糖尿病相关的SNPs,包括上面引用的rsl3266634(Sladek et al.,2007,Nature.2007 Feb 22;445(7130):881-5.电子出版2007 Feb 11),最近还发表了ZnT8多态性与β细胞功能 之间关系的在线报告(Staiger et al.,2007,PLoS 0ΝΕ.2007 Sep 5;2(9):e832)。但是,2 型糖尿病不是自身免疫病,就本发明人所知,之前还没有鉴定出该SNP与1型糖尿病的关系。 此外,没有证明2型糖尿病患者显示ZnT8自身抗体。

[0109] 已经鉴定出其他T1D自身抗原(即GAD65和ΙΑ2)序列中的多态性变体;但是,在1型 糖尿病中这些都不涉及这些自身抗原的自身反应性的变化。在ΙΑ2中,似乎有mRNA的选择性 剪接,其以组织特异性方式存在,可以想象得到导致逃脱免疫监视。但是,这不等同于本发 明人在本文中报道的遗传变异类型,即,与自身抗体对分子的特异性识别有关的单氨基酸 改变。因此,本发明人的所述发现是没有前例的。本文描述了以下发现,由普通多态性编码 的ZnT8的两种形式定性诱导不同的免疫应答,从而将自身抗体测定提高到新的水平。它还 提示,分子的不同形式可用于靶向于免疫系统的不同组分,以引起不同的免疫结果。

[0110] 因此,本发明人在本文中描述了编码ΖηΤ8的基因、其衍生的核酸分子、所述基因和 核酸分子编码的ΖηΤ8蛋白或其片段以及所述基因和蛋白的同系物及相关药剂(例如,抗体, 激动剂,拮抗剂),和ΖηΤ8的多态性变体在开发各种诊断和治疗工具及分析法中的用途,和 所述基因、核酸、蛋白、同系物、和/或相关药剂和/或包括上述物质的组合物或制剂在开发 各种诊断和治疗工具及分析法中的用途或靶向作用。所述工具及分析法包括,但不限于:

[0111] 1.在人和实验动物中用于检测糖尿病相关自身免疫性的分析法,基于针对ΖηΤ8的 抗体应答,分子的特定结构域及衍生自该蛋白的肽。这种分析法以放射免疫沉淀分析法、 ELISAs、时间分辨荧光和化学发光(luminescence)分析法的形式提供,尽管本发明还包括 其他形式。这种分析法可用于:

[0112] a.预测个体或受试者组中对1型糖尿病患病的易感性;

[0113] b.监测自身免疫性从初始的良性自身反应性向破坏性胰岛炎的进展;和/或

[0114] c.监测目的在于预防或改善前驱糖尿病状况下自身免疫性的治疗的效果。这种治 疗可以基于广泛的潜在免疫抑制性药剂,包括那些根据ZnT8分子本身设计的药剂。

[0115] 2.在人和实验动物中用于检测糖尿病相关自身免疫性的表位特异性自身抗体分 析法,基于针对ΖηΤ83种变体形式的探针,并使用编码所述3种形式的重组蛋白作为竞争剂 或阻断剂。这种分析法可以采用放射免疫沉淀分析法、ELISAs、时间分辨荧光和化学发光分 析法的形式,尽管本发明还包括其他形式。这种分析法可用于:

[0116] a.如上文(1),通常根据抗体的发生率、应答水平、抗体滴度或应答的亲合力、亲和 性或克隆形成能力预测个体和受试者组中对1型糖尿病患病的易感性;

[0117] b.在特定个体中确定3个表位中哪个作为靶标,及在疾病和治疗过程中确定应答 特异性的变化以便测量进展和针对治疗的应答;

[0118] c.通过基因型的组合确定免疫应答的可能靶向表位特异性,从而预先确定最佳治 疗形式;和/或

[0119] d.监测目的在于预防或改善前驱糖尿病状况下自身免疫性的治疗的效果。这种治 疗可以基于广泛的潜在免疫抑制性药剂,包括那些根据ZnT8分子本身设计的药剂。

[0120] 3.在人和实验动物中用于检测糖尿病相关自身免疫性的分析法,基于针对所述蛋 白和衍生肽的Τ淋巴细胞反应性,利用淋巴细胞增殖性应答、MHCI型和II型四聚体试剂和 ELI SPOT分析。

[0121 ] 4.针对抗原的标记抗体,基于自身抗体与标记抗体的竞争的测定作为分析工具。

[0122] 5.抗自发性抗体作为配体的模拟物。

[0123] 6.基于抗原、结合抗原的抗体和/或结合细胞的抗原或抗体的治疗剂。

[0124] 7.基于ZnT8的试剂用于进一步的诊断目的。这些包括针对所述分子、肽、肽模拟物 和变异肽的多克隆及单克隆抗体,当它们在体内施用时,能够影响病程,或可以在体外使用 以刺激来自自身免疫受试者的Τ细胞采取不同表型,从而变得更具有耐受性。

[0125] 8.抗原特异性免疫治疗剂(基于同源肽表位或结合其MHC分子的变异肽)及对Τ细 胞有毒性的试剂(它们将与肽/MHC复合物结合),或识别抗原肽的单克隆抗体,或模拟物诸 如分离的分子或与另一分子组分复合的分子(诸如肽/MHC复合物或肽/Τ细胞受体复合物, 它们将作为正常肽相互作用和信号转导的激动剂或拮抗剂)。根据个体的基因型和当时优 势抗体的表位特异性,治疗剂可以符合抗体的特异性,或不符合以刺激可选的免疫应答。

[0126] 9.使用ΖηΤ8分子作为重组蛋白,以保护性而不是破坏性的方式改变免疫系统的应 答。这包括使用重组蛋白,该蛋白的化学或物理改造形式,衍生自该蛋白的肽序列,化学或 物理改造的肽及肽同系物,可以用作疫苗。

[0127] 10.制备含ΖηΤ8表位特异性肽或试剂(诸如小分子或抗体)的效应分子的偶联物或 组合,以高度特异性的靶向于维持自身免疫反应的免疫过程。这基于以下原理,抗体是特异 性Β细胞的产物,Β细胞还充当针对自身反应性Τ细胞的抗原递呈细胞,而Τ细胞反过来提供 信号以活化Β细胞并造成其分化。

[0128] 11.基于人和小鼠 ZnT8mRNA的cDNA构建体,包括缺失,嵌合构建体,单个或多个位 点的点突变以改变编码序列,及使用这种构建体作为诊断剂或研究免疫应答的特异性;

[0129] 12.表位标记的融合蛋白,包括GFP、GST、NUS和聚组氨酸序列,在用于哺乳动物细 胞、酵母和大肠杆菌中表达ZnT8的载体中,及使用这种构建体作为诊断剂或研究免疫应答 的特异性。

[0130] 13.用于在哺乳动物细胞中转导和表达ZnT8的腺病毒构建体,包括多态性变体及 表位标记的报告蛋白构建体,及使用这种构建体作为诊断剂或研究免疫应答的特异性。

[0131] 图20显示在人类中识别的Slc30A基因的10种变体的比较,尽管这些中的1种 (Slc30A9)可能不是真正的同系物,考虑到其低的氨基酸序列同一性和相似性(在上文括号 中显示hZnTS的最接近亲缘物是Slc30A2(溶酶体蛋白)、Slc30A3(与突触小泡有关的蛋白) 和Slc30A4。用Slc30A8激发的兔抗体显示与Slc30A3的交叉反应性,这表明反应性或交叉反 应性还可能存在于其他人类自身免疫病中,像多发性硬化。相反,针对Slc30A8反应性T细胞 的糖尿病Slc30A8自身抗体还可能以其他组织作为靶标,从而导致糖尿病的并发症。因此, 本发明的工具和方法被认为适用于T1D以外的自身免疫病,诸如但不限于,全身性红斑狼 疮,重症肌无力,风湿性关节炎,多发性硬化,乳糜泻,自身免疫性甲状腺炎,艾迪生氏病,格 雷夫斯氏病和风湿性心脏炎。本发明的方法适用于任意自身免疫病,其中Slc30A8(ZnT8)或 同系物是靶标或自身抗原(自身抗体或T细胞自身抗原)。

[0132] 此外,本发明人已经证明,在一些情况下含有ZnT8自身抗体的个体显示对Slc30A 基因家族(编码其他ΖηΤ转运蛋白)的其他成员的反应性。例如,本发明人证明对ZnT3的一些 反应性,ΖηΤ3通常被认为是神经元特异的亚型。该发现的重要启示在于,这种反应性在胰腺 外的组织中可能造成病理性结果。众所周知糖尿病尤其是1型糖尿病与周围神经病有关,而 抗原的交叉反应性可能体现这些疾病之间的联系。因此,本发明的工具和方法被认为适用 于通过抗原交叉反应性联系的其他疾病,包括但不限于,周围神经病。

[0133] 本文显示的本发明方面包括下列临床观察:

[0134] •前驱糖尿病(prediabetes):

[0135] -ZnT8自身抗体通常出现较早,在GADA和IAA及IA2A之后

[0136] -其出现不存在严格的先后(hierarchy),ΖηΤ8可以比糖尿病早1-12年

[0137] •新发病(new onset)

[0138] -发病2-3年后ZnT8的流行增加,60-80 %在16-18年达到最大

[0139] •发病后(post onset)

[0140] -通过C肽测量,ZnT8在发病后下降,半衰期为1年,可能与细胞群的损失平行。

[0141] -ΖηΤ8的持续性低于GAD或ΙΑ2。

[0142] -在没有可测量的C肽情况下ZnT8可以持续,反之亦然。

[0143] ΖηΤ8核酸,蛋白,多态性变体,同系物,片段,抗体,和组合物

[0144] ΖηΤ8基因,结构信息,核酸和氨基酸序列

[0145] 在一个实施方案中,本发明包括使用编码ΖηΤ8的基因,以及源自或包括该基因的 编码区和/或调控区一部分的核酸分子,和包括该基因的任意多态性变体的核酸分子。本发 明还包括使用任意ΖηΤ8蛋白,其同系物或片段,包括其任意多态性变体,或其激动剂或拮抗 剂,包括由上述引用的基因或核酸分子编码的那些。新的ΖηΤ8核酸分子和蛋白(包括各种新 的ΖηΤ8的同系物,变体,片段,融合蛋白,和嵌合蛋白)及其激动剂和拮抗剂,均被本发明包 括为物质的组成。本发明进一步包括可用于本发明各种方法的ΖηΤ8抗体,其抗原结合片段 和抗原结合肽。

[0146] 锌转运蛋白蛋白8(ΖηΤ8,亦称为Slc30A8)是由ΖηΤ8基因编码的369个氨基酸的蛋 白。与其他ΖηΤ蛋白一样,ΖηΤ8包含6个跨膜结构域,在跨膜结构域IV和V之间包含组氨酸富 集环(参见Chimienti et &1.,2004,0丨3匕6七68,上文,和本文所示图4)。该蛋白只在胰腺中 转录,更具体的,只在胰岛的β细胞中表达。如Chimienti等所述,同上,ZnT8基因位于染色体 8q24.ll上,包含8个外显子,跨越37kb。人ΖηΤ-8蛋白的cDNA和推定氨基酸序列提供于 Chimienti等,同上,该出版物显示人ZnT8的基因结构、染色体定位和推定的剪接(参见 Chimienti等的图1Α,同上)。编码人ΖηΤ8的cDNA序列和推定的氨基酸序列显示于Chimienti 等(同上)的图1B,其中还显示了预测的ZnT8跨膜结构域。Chimienti等(同上)的图1C显示了 hsZnT-8、mmZnT-8和rnZnT-8氨基酸序列的比较,用黑色框标明相同的残基。在本文中编码 人ZnT8的核酸序列用SEQ ID N0:1表示。SEQ ID N0:1编码人ZnT8蛋白,其氨基酸序列在本 文中用SEQ ID Ν0:2表示。小鼠 ΖηΤ8也是本领域公知的。编码小鼠 ΖηΤ8的核酸序列用SEQ ID N0:3表示。SEQ ID N0:3编码小鼠 ZnT8蛋白,其氨基酸序列在本文中用SEQ ID N0:4表示。编 码人ZnT8的核苷酸序列还描述于国家生物技术信息中心(NCBI)数据库,登录号NM_173851 ( 81:64762488)。人21^8的氨基酸序列也可参见%81数据库,登录号即_776250(81: 64762489)。编码大鼠 ZnT8的核苷酸序列也是已知的。本文引用的数据库登录号和出版物中 包含的所有信息也在此引入作为参考。这些序列的各种多态性变体、片段、嵌合蛋白和融合 蛋白在本文其他地方描述,也包括在本发明中。

[0147] Chimienti等,同上,图3A-D,提供ΖηΤ8结构分析的进一步描述,包括预测的ΖηΤ8跨 膜结构域和组氨酸富集域的位置,所述组氨酸富集域是ΖηΤ家族的其他成员共有的(参见 Chimienti等)。这些结构模体在大鼠和小鼠 ΖηΤ-8中是保守的。在人ΖηΤ8蛋白中,相对于SEQ ID Ν0:2,保守的组氨酸出现在197、203和205位。在小鼠中,SEQ ID Ν0:4196位的组氨酸对 应人Hisl97,SEQ ID Ν0:4204位的组氨酸对应人His205。因此,在本发明之前可以获得大量 有关ZnT8核酸和氨基酸序列的结构和功能信息。

[0148] 本发明包括的ΖηΤ8的同系物、变体、片段和嵌位

[0149] 本发明还包括许多天然存在和合成得到的ΖηΤ8变体(同系物),包括基因中的核苷 酸和氨基酸多态性,通过选择性起始位点编码的蛋白,和各种片段,融合蛋白及嵌合蛋白, 和编码所述片段、融合蛋白及嵌合蛋白的核酸分子。这些多核苷酸和蛋白或肽可用于本发 明的各种诊断、治疗和研究应用,如下文所述。

[0150] 在本发明的一个实施方案中,可用于本文所述任意方法的ΖηΤ8的同系物或变体包 括下列氨基酸序列,基本上由下列氨基酸序列组成,由下列氨基酸序列组成,所述氨基酸序 列与野生型ΖηΤ8蛋白的氨基酸序列、尤其是本文描述的人ΖηΤ8蛋白(参加上文的讨论)至少 约45 %,或至少约50%,或至少约55%,或至少约60%,或至少约65%,或至少约70%,或至 少约75%,或至少约80%,或至少约85%,或至少约90%,或至少约95%相同,或至少约95% 相同,或至少约96%相同,或至少约97%相同,或至少约98%相同,或至少约99%相同(或 45%到99%之间的任意百分比同一性,全整数增加)。在一个实施方案中,同系物包括下列 氨基酸序列,基本上由下列氨基酸序列组成,或由下列氨基酸序列组成,所述氨基酸序列与 ΖηΤ8蛋白天然存在的氨基酸序列低于100%相同,低于约99%相同,低于约98%相同,低于 约97%相同,低于约96%相同,低于约95%相同,等等,按1 %增加,到低于约70%相同。

[0151] 本发明还包括各种天然存在和合成得到的ΖηΤ8变体,它们是通过选择性起始位点 编码的蛋白,以及其片段(肽),融合蛋白,或其嵌合蛋白,可用于本文描述的任意诊断、治疗 或研究方法。例如,具有选择性起始位点的人ΖηΤ8的天然变体在本文中用SEQ ID Ν0:5表 示。该蛋白跨越SEQ ID N0:2的氨基酸50到367位。参照图3,显示的基因结构是本发明人通 过比对公开的EST序列和基因推断的。但是它不同于被认为是"正常的"8外显子基因结构。 具体来说,评价大约210个EST序列,并鉴定显著的剪接位点变化,其可能导致组织表达的潜 在变化,因为5 ' UTR被改变。在外显子4被剪接的情况下,序列越过阅读框和截短的转录物, 通常是MEFLERAYLVNDKAAKMYAFTLERRSCK*(SEQ ID NO:6),尽管另一种截短形式是用SEQ ID NO: 7 (MEFLERTYLVNDKAAKMYAFTLERRSRK*)表示,其中第7位是苏氨酸取代丙氨酸,第27位是 精氨酸取代半胱氨酸。看起来下游Met可以用作选择性起始位点,产生该序列NH2末端的截 短型。如果这以组织特异性方式(例如在胸腺而不在胰腺中)存在,然后出现可以被免疫系 统靶向的隐蔽表位。本发明人的实验室有证据证明,这种出现有助于针对其他糖尿病相关 自身抗原(IA-2和IGRP)的自身反应性。选择性翻译产物也可以作为"外来"肽表位被呈现给 免疫系统。此外,已经鉴定了全长ZnT8蛋白的天然多态性变体,其包括但不限于,用组氨酸 取代SEQ ID NO:218位的酪氨酸,用缬氨酸取代SEQ ID NO:2261位的丙氨酸,和用色氨酸或 谷氨酰胺取代SEQ ID NO:2325位的精氨酸。本发明特别对ZnT8的多态性变体(尤其是在325 位)感兴趣,将在下文详细描述。包括所述多态性的蛋白、变体、片段、嵌合蛋白和融合蛋白, 及编码它们的核苷酸均被本发明包括。

[0152] 参照图4Α和4Β,预测ΝΗ2和C00H末端位于膜的相同一侧。就参考序列而言,Ν末端是 74aa,就具有选择性起始位点的亚型而言,Ν末端是25 &&。94&&的C00H末端包括1型糖尿病中 的主要体液免疫决定簇。该表位隐含于全长分子,位于aa268和358之间,这是通过去除最后 15aa造成的对抗原性的最小影响来证明的。令人惊讶的是,这是一个在不同物种的ΖηΤ转运 蛋白间高度保守的区域。因此,有可能产生抗ΖηΤ8蛋白的自身反应性(只针对胰腺辟田胞), 其还可以通过传染性生物的同源蛋白产生。对于另一糖尿病自身抗原ΙΑ2已经观察到类似 的联系(未公开的工作)。这是一个通则,然后就可以假设T1D中的自身免疫性可能由含类似 Ζη转运蛋白的微生物的轻度感染引发。同样,有可能用传染原的指定表位进行免疫。第二更 弱的表位位于不保守的Ν末端。

[0153] 鉴定出的表位看起来位于细胞内部,就像自身抗原ΙΑ2和GAD65-样。参照图4Β,位 于附图顶端的短环(包括用97-105; 164-168和239-252位表示的位置)将可能朝向分泌途径 的细胞元件的内腔。这有可能包括内质网,高尔基体,胰岛素分泌颗粒和最终包括细胞间 隙。有可能它们暴露于细胞表面,在胰岛素颗粒的正常胞吐作用期间、正常分泌期间或如果 细胞以某些方式被损伤。因此本文包括针对呈现这些环的肽的抗体用于检测ΖηΤ8,它从而 可以用作体内成像辟田胞群的生物标记物,以测定细胞活性(分泌更多等于更暴露)和在正 常发育期间监测从其他来源诸如干细胞的细胞生成。本发明的一种抗体被提议激发抗小 鼠 ΖηΤ8的腔结构域2序列(SEQ ID Ν0:4的163-183位,或ERLLYPDYQIQAGHOTVSGC)用于细胞 生物学应用。此外,已经制备出针对人C末端(作为与谷胱甘肽S转移酶的融合蛋白)的抗体 (参见下文)。利用本文提供的教导,可以产生针对N端和C端区域序列的其他抗肽抗体。还可 以制备抗磷酸肽抗体。

[0154] 在第二胞内结构域和C端环中存在分子磷酸化的潜在位点。这些位点的磷酸化可 以决定分子在细胞中的定位及其作为Ζη转运蛋白的活性。新一代治疗剂以蛋白激酶作为靶 标,因此有可能通过药物施用调节体内的蛋白活性。

[0155] 第三胞内环(描述为图4Β中SEQ ID Ν0:2的残基196-215)富含组氨酸残基(SEQ ID NO: 2的197、203和205位),其在结合Zn和其他重金属中可能是重要的。这可能属于分子将锌 从细胞质转移到包膜小室内腔(构成分泌途径)的机制。

[0156] 在本发明的一个实施方案中,包括ZnT8的片段用于诊断和治疗方法,或用于抗体 的产生。根据本发明,ΖηΤ8蛋白、蛋白部分(片段,部分,结构域,等等)或蛋白区域或表位的 大小底限是足以作为产生抗体的表位或保守结合表面或作为体外分析的靶标的大小。在一 个实施方案中,本发明的蛋白长度为至少约4,5,6,7或8个氨基酸(例如,适合作为抗体表位 或作为分析法中的可检测肽),或长度为至少约25个氨基酸,或长度为至少约50个氨基酸, 或长度为至少约100个氨基酸,或长度为至少约150个氨基酸,等等,在4个氨基酸和直到 ΖηΤ8蛋白全长或其部分或更长之间的任意长度,为全整数(例如,8,9,10, . . .25,26, ...300,301,..就任意物种的ΖηΤ8蛋白而言,本发明包括任意长度的任意Ν端片段、C端 片段、其嵌合体或缺失片段,其中人ΖηΤ8是优选的,包括其任意多态形式。表1和图15-19、21 和25,例如,描述了有关ΖηΤ8的表位和异表位定位的其他信息,包括对于自身反应性非常重 要的C末端残基的鉴定。所述信息允许在本文描述的任意诊断、预后和治疗方法中设计、产 生和使用ΖηΤ8的各种片段和同系物。

[0157] 正如以上的讨论,图4Α和4Β显示预测的ΖηΤ8蛋白的跨膜结构域。这些结构域给分 析法的设计提出一个问题,因为它们通常被脂质围绕并且非常有粘性,所以该蛋白或者沉 淀或者不折叠。这类区域可能是Τ细胞的靶标,因此被包括用于本发明的片段,但它们不太 可能是抗体的靶标。全长序列显示对循环抗体的反应性,并且所述反应性在糖尿病中比在 对照中更高。但是该分析法只检测了新近发病个体中的10-20%。因此,本发明人提供选择 性探针,即下文阐述的Ν端、C端和Zn结合环探针。

[0158] 用于本发明的尤其优选的ZnT8蛋白片段是ZnT8的任意N端或C端片段,其中C端片 段是特别优选的。另一种优选的ΖηΤ8片段是ΖηΤ8Ν端和C端片段的混合物或杂交物(嵌合 体)。尤其优选的ΖηΤ8片段包括来自人ΖηΤ8的约C端110残基到约C端8残基的任意C端片段, 基本上由来自人ΖηΤ8的约C端110残基到约C端8残基的任意C端片段组成,或由来自人ΖηΤ8 的约C端110残基到约C端8残基的任意C端片段组成。尤其优选的C端片段包括人ΖηΤ8的101 和102C端残基。

[0159] 可用于本发明各种实施方案的各种蛋白、变体、嵌合蛋白和片段显示下文的表1。 任何蛋白、变体、嵌合蛋白或片段可添加一个、两个或更多个氨基酸残基(例如,在片段Ν端 的甲硫氨酸,如对于下文的C端片段所示)。此外,根据提供的这些构建体和实施例提供的信 息,本领域技术人员能够轻易地产生其他构建体,其中添加的氨基酸被缺失,嵌合体结构域 的顺序被逆转,或本文描述的两个或更多个片段或其部分被组合产生其他嵌合蛋白。

[0160] 藍

[0161] Ν3探针(Ν端片段)SEQ ID Ν0:2的aal-74 Mr = 8576 pl = 6.72

[0162] MEFLERTYLVNDKAAKMYAFTLESVELQQKPVNKDQCPRERPEELESGGMYHCHSGSKPTEKGANEYAY AKWKL(SEQ ID NO:8)

[0163] C4Probe(C端片段)SEQ ID N0:2的aa268-369 Mrll235 PI = 4.95

[0164] MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIA KALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQ ID N0:9)

[0165] 截短的C端探针1(在本文描述的分析法中是有活性的)

[0166] MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIA KALSKSFTMHSLTIQMES(SEQ ID NO:10)

[0167] 截短的C端探针2(在本文描述的分析法中是无活性的)

[0168] MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIA KALSKSFTM(SEQ ID NO:11)

[0169] 突变的C端探针(在本文描述的分析法中是具有降低的活性)

[0170] MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIA KALSASFTMASLTIQMAAPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQ ID N0:12)

[0171] 锌结合环

[0172] VLTVVLHQRCLGHNHKEVQANASVRA(SEQ ID NO:13)

[0173] M275探针SEQ ID N0:2的aa275-369 Mrl0414 ΡΙ = 5·21

[0174] MEGVPKSLNY SGVKELILAV DGVLSVHSLH IffSLTMNQVI LSAHVATAAS RDSQVVRREI AKALSKSFTM HSLTIQMESP VDQDPDCLFC EDPCD(SEQ IDN0:14)

[0175] M282探针SEQ ID N0:2的aa283-369 Mr9703 PI = 5.15

[0176] MNYSGVKELI LAVDGVLSVH SLHIWSLTMN QVILSAHVAT AASRDSQVVRR EIAKALSKS FTMHSLTIQM ESPVDQDPDC LFCEDPCD(SEQ ID N0:15)

[0177] M282探针SEQIDN0:2的aa290-369 Mr8699 PI = 5·08

[0178] MILAVDGVLS VHSLHIWSLT MNQVILSAHV ATAASRDSQV VRREIAKALS KSFTMHSLTI QMESPVDQDP DCLFCEDPCD(SEQ ID N0:16)

[0179] M300探针SEQIDN0:2的aa300-369 Mr7845 PI = 5·50

[0180] MHSLHIWSLT MNQVILSAHV ATAASRDSQV VRREIAKALS KSFTMHSLTI QMESPVDQDP DCLFCEDPCD(SEQ ID N0:17)

[0181] M305探针SEQIDN0:2的aa300-369 Mr7257 PI = 4·74

[0182] MffSLTMNQVI LSAHVATAAS RDSQVVRREI AKALSKSFTM HSLTIQMESP VDQDPDCLFC EDPCD(SEQ ID N0:18)

[0183] C4探针SEQ ID N0:2的 Aaa293-369 Mr2827 PI = 4.68(Sall切割)

[0184] MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILA(SEQ ID NO:19)

[0185] C4探针SEQ ID N0:2的 Aaa325-369Mr6109 PI = 6.13(Hpall切割)

[0186] MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSA HVATAAS(SEQ ID NO :20)

[0187] C4探针SEQ ID N0:2的 Aaa344-369 Mr8282 PI = 8.87(Hphl切割)

[0188] MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSA HVATAASRDS QVVRREIAKA LSKSFT(SEQ ID NO:21)

[0189] C4探针SEQ ID N0:2的 Aaa351-369 Mr9093 PI = 8.87(BstXI切割)

[0190] MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSA HVATAASRDS QVVRREIAKA LSKSFTMHSL TIQMESPVDQ DPDCLFCEDPCD(SEQ ID N0:22)

[0191] C4探针SEQ ID N0:2的 Aaa357-369Mr 9752PI = 6.86(BstNI切割)

[0192] MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSA HVATAASRDS QVVRREIAKA LSKSFTMHSL TIQMESPVD(SEQ ID N0:23)

[0193] C4野生型SEQ ID N0:2的aa268-369 Mrll235 ΡΙ = 4·95(突变用下划线表示)

[0194] MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSA HVATAASRDS QWRREIAKA LSKSFTMHSL TIQMESPVDQ DPDCLFCEDPCD(SEQ ID N0:24)

[0195] 其他C4突变探针(SEQ ID N0:9,含有相对于SEQ ID N0:2位置的突变):

[0196] K340A;Mr = 11177 pl = 4.74

[0197] H345A;Mr = 11168 pl = 4.74

[0198] E352A;Mr = 11176 pl = 5.17

[0199] S353A;Mr = 11218 pl = 4.95

[0200] S353D;Mr = 11262 pl = 4.77

[0201] 三元组K340A,H345A,E345A;Mr = 11053 pl = 4.67

[0202] 小鼠 ZnT8氨基酸序列变体

[0203] mSLC30a8C端Met266,Gln324

[0204] MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIff SLTVNQVILS VHVATAASQD SQSVRTGIAQ ALSSFDLHSL TIQIESAADQ DPSCLLCEDP QD(SEQID N0:40)

[0205] mSLC30a8C端Met266,Arg324

[0206] MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIff SLTVNQVILS VHVATAASRD SQSVRTGIAQ ALSSFDLHSL TIQIESAADQ DPSCLLCEDP QD(SEQ ID NO:41)

[0207] mSLC30a8C端Met266,Trp324

[0208] MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIff SLTVNQVILS VHVATAASWD SQSVRTGIAQ ALSSFDLHSL TIQIESAADQ DPSCLLCEDP QD(SEQ ID N0:42)

[0209] mSLC30a8C 端 Met266,Lys339(插入)

[0210] MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIff SLTVNQVILS VHVATAASQD SQSVRTGIAQ ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID N0:43)

[0211 ] mSLC30a8C 端 Met266,Arg324,Lys339(插入)

[0212] MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIff SLTVNQVILS VHVATAASRD SQSVRTGIAQ ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID NO:44)

[0213] mSLC30a8C 端 Met266,Trp324,Lys339 (插入)

[0214] MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIff SLTVNQVILS VHVATAASWD SQSVRTGIAQ ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID N0:45)

[0215] Met266REKK 突变体 TGIAQALS331-338>REIAKALSK332-340

[0216] MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIff SLTVNQVILS VHVATAASQD SQSVRREIAK ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID N0:46)

[0217] Met266RREKK 突变体(R325;TGIAQALS331-338>REIAKALSK332-340

[0218] MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIff SLTVNQVILS VHVATAASRD SQSVRREIAK ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID N0:47)

[0219] Met266WREKK 突变体(R325;TGIAQALS331-338>REIAKALSK332-340

[0220] MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIff SLTVNQVILS VHVATAASWD SQSVRREIAK ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID N0:48)

[0221] 人ZnT8氨基酸序列变体

[0222] hSLC30a8C端267Met,325Arg

[0223] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASRD SQWRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCD(SEQ ID N0:49)

[0224] hSLC30a8C端267Met,325Gln

[0225] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASQD SQWRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCD(SEQ ID N0:50)

[0226] hSLC30a8C端267Met,325Trp

[0227] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASWD SQWRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCD(SEQ ID NO:51)

[0228] hSLC30A8连接子序列

[0229] PSTPPGSSGG G(SEQ ID NO:52)

[0230] hSLC30a8C端二聚体lMet,59Arg,连接子,172Arg(59和172位对应于野生型中的 aa325)

[0231] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASRD SQWRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSL HIWSLTMNQV ILSAHVATAA SRDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMES PVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID N0:53)

[0232] hSLC30a8C 端二聚体 IMet,59Arg,连接子,172Gln

[0233] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASRD SQWRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSL HIWSLTMNQV ILSAHVATAA SQDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMES PVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO :54)

[0234] hSLC30a8C 端二聚体 IMet,59Arg,连接子,172Trp

[0235] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASRD SQWRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSL HIWSLTMNQV ILSAHVATAA SffDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMES PVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO :55)

[0236] hSLC30a8C 端二聚体 IMet,59Gln,连接子,172Gln

[0237] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASQD SQWRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSL HIWSLTMNQV ILSAHVATAA SQDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMES PVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO :56)

[0238] hSLC30a8C 端二聚体 IMet,59Gln,连接子,172Arg

[0239] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASQD SQWRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSL HIWSLTMNQV ILSAHVATAA SRDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMES PVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID N0:57)

[0240] hSLC30a8C端二聚体lMet,59Gln,连接子,172Trp(59和172位对应于野生型中的 aa325)

[0241 ] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASQD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSL HIWSLTMNQV ILSAHVATAA SQDSWVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMES PVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO :58)

[0242] hSLC30a8C 端二聚体 IMet,59Trp,连接子,172Trp

[0243] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASWD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSL HIWSLTMNQV ILSAHVATAA SffDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMES PVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO :59)

[0244] hSLC30a8C 端二聚体 IMet,59Trp,连接子,172Arg

[0245] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASWD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSL HIWSLTMNQV ILSAHVATAA SRDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMES PVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO :60)

[0246] hSLC30a8C 端二聚体 IMet,59Trp,连接子,172Gln

[0247] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASWD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSL HIWSLTMNQV ILSAHVATAA SQDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMES PVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO:61)

[0248] hSLC30a8N端/C端融合野生型Trp325变体

[0249] MEFLERTYLV NDKAAKMYAF TLESVELQQK PVNKDQCPRE RPEELESGGM YHCHSGSKPT EKGANEYAYA KffKLCSGGGK DFSILLMEGV PKSLNYSGVK ELILAVDGVL SVHSLHIWSL TMNQVILSAH VATAASWDSQ VVRREIAKAL SKSFTMHSLT IQMESPVDQD PDCLFCEDPC D(SEQ ID N0:62)

[0250] hSLC30a8N端/C端融合野生型Arg325变体

[0251] MEFLERTYLV NDKAAKMYAF TLESVELQQK PVNKDQCPRE RPEELESGGM YHCHSGSKPT EKGANEYAYA KffKLCSGGGK DFSILLMEGV PKSLNYSGVK ELILAVDGVL SVHSLHIWSL TMNQVILSAH VATAASRDSQ VVRREIAKAL SKSFTMHSLT IQMESPVDQD PDCLFCEDPC D(SEQ ID N0:63)

[0252] hSLC30a8N端/C端融合野生型Trp325变体-选择性起始密码子

[0253] MYHCHSGSKP TEKGANEYAY AKWKLCSGGG KDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSA HVATAASWDS QVVRREIAKA LSKSFTMHSL TIQMESPVDQ DPDCLFCEDP CD(SEQ ID N0:64)

[0254] hSLC30a8N端/C端融合野生型Arg325变体-选择性起始密码子

[0255] MYHCHSGSKP TEKGANEYAY AKWKLCSGGG KDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSA HVATAASRDS QVVRREIAKA LSKSFTMHSL TIQMESPVDQ DPDCLFCEDP CD(SEQ ID N0:65)

[0256] hSLC30a8C端/N端融合野生型Arg325变体

[0257] MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIff SLTMNQVILS AHVATAASRD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCDGGGMEFL ERTYLVNDKA AKMYAFTLES VELQQKPVNK DQCPRERPEE LESGGMYHCH SGSKPTEKGA NEYAYAKWKL CS(SEQ ID NO:66)

[0258] 序列 hSLC30a8 无 TM 节段 Trp325变体

[0259] MEFLERTYLV NDKAAKMYAF TLESVELQQK PVNKDQCPRE RPEELESGGM YHCHSGSKPT EKGANEYAYA KffKLCSASDA AHLLIDSSKP PSKRLTFGWH RAECERLLYP DYQIQATLHQ RCLGHNHKEV QANASVRKPE YKKDFSILLM EGVPKSLNYS GVKELILAVD GVLSVHSLHI WSLTMNQVIL SAHVATAASff DSQWRREIA KALSKSFTMH SLTIQMESPV DQDPDCLFCE DPCD(SEQ ID N0:67)

[0260] 表1列出的序列由本发明人设计,以检测患者自身反应性的各种特征,并设计分析 法,其能够更好的在患者之间进行鉴别,或相反地,是泛反应性的。下面列表显示本发明人 如何根据患者自身反应性(患者血清样品)将如上所述的序列分类。不在括号内的序列表示 鉴定出针对包含该序列的构建体的患者反应性;括号内显示的序列表示降低的活性或者改 变的活性,这可能是还有待确定的其他特异性造成的。对于一个特定样品类型来说,序列号 识别的缺失表示缺乏反应性。就Gln325限制性反应性来说,信息是有限的,因为在已经检验 的超过500位患者中迄今为止只鉴定出1位患者血清。

[0261] 籲N端反应性样品:SEQ ID N0s:8,63,64,65

[0262] 籲Arg325-限制性反应性:SEQ ID NOs:9,10,(11),( 12),14,15,(16到21),(22), 23,(24to 30),(40),41,(42),(43),44,47,49,(52),53,54,55,57,60,63,65

[0263] 籲Trp325-限制性反应性:SEQ ID NOs: (40),(41),42,(43),45,48,51,(52),55, 58,59,60,61,62,64

[0264] 籲Gln325-限制性反应性:SEQ ID NOs :40,(41 ),(42),50

[0265] ♦氨基酸325非依赖的:SEQ ID NOs : 9 to 16,( 17到21),22,23,24,(25到30), (40,41),42,(43),47到51,(52),53到65

[0266]本发明还包括ZnT8蛋白,其包括抗原肽或T细胞表位(也称为主要组织相容性复合 体(MHC)结合肽),基本上由抗原肽或Τ细胞表位(也称为主要组织相容性复合体(MHC)结合 肽)组成,或由抗原肽或Τ细胞表位(也称为主要组织相容性复合体(MHC)结合肽)组成。这类 肽包括能够以下列方式结合MHC蛋白的任意肽,所述方式使得MHC-肽复合物能够结合Τ细胞 受体(TcR),在优选的实施方案中,从而诱导Τ细胞应答(例如,刺激性或致耐受应答,如下所 述)。腿0结合肽(结合MHC分子,并且与MHC分子一起被T细胞受体识别)被认为是抗原肽。实 际上,在抗原结合MHC蛋白前,通过抗原水解产生的肽先经历水解。I型MHC蛋白通常呈递来 自细胞的细胞质中主动合成蛋白的抗原肽。与此相反,II型MHC蛋白通常呈递来自外源蛋白 (进入细胞内吞途径)或者内质网(ER)中合成蛋白的抗原肽。胞内运输使得抗原肽与MHC蛋 白结合。所获MHC肽复合物然后转移到细胞表面,在那里它被提供与TcR相互作用。

[0267]肽与MHC肽结合沟的结合可以控制被TcR识别的MHC和/或肽氨基酸残基的空间排 列。这种空间控制部分是由肽和MHC蛋白之间形成的氢键造成的。优选的,T细胞表位的长度 为约5到约40个氨基酸残基,更优选的为约6到约30个氨基酸残基,和甚至更优选的为约8到 约20个氨基酸残基,和甚至更优选的在约9到11个氨基酸残基之间,包括长度为5到40个氨 基酸之间的任意大小肽,全整数增加(即,5,6,7,8,9...40)。尽管天然MHCII型结合肽在约 9-40个氨基酸之间变化,在几乎所有的情况下,所述肽可以截短到约9-11个氨基酸核心,而 不损失MHC结合活性或T细胞识别。

[0268] 与多核苷酸和蛋白或肽有关的一般定义和实施方案

[0269]除非另外指出,本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术),微生物学,细胞 生物学,生物化学,核酸化学和免疫学的常规技术,这是本领域技术人员公知的。这类技术 在下列文献中有详尽解释,诸如,Methods ofEnzymology(酶学方法),Vol. 194,Guthrie et al·,eds·,Cold Spring HarborLaboratory Press(1990);Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验手册),第二版(Sambrook et al·,1989)和Molecular Cloning:A LaboratoryManual(分子克隆:实验手册),第三版(Sambrook and Russel, 2001),(本文中统称为 "Sambrook");Current Protocols in Molecular Biology(分子生 物学实验方法)(F.M.Ausubel et 31.,6(18.,1987,包括直到2001的补充);?〇1?: ThePolymerase Chain Reaction(PCR:聚合酶链式反应),(Mullis et al.,eds.,1994); Harlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual(抗体,实验手册),Cold Spring Harbor Publications,New York;Harlow and Lane(1999)UsingAntibodies:A Laboratory Manual(使用抗体:实验手册)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(本文中统称为 "Harlow and Lane"),Beaucage et al · eds ·,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(核酸化学实验方法)John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)。

[0270]根据本发明,分离的多核苷酸(还称为分离的核酸分子)是已经从其天然环境转移 (例如,已经过人工处理)的核酸分子,其天然环境是自然界中发现所述核酸分子的基因组 或染色体。因此,"分离的"不是必需反映核酸分子纯化的程度,但表示该分子不包括完整的 基因组或完整的染色体(其中发现自然界中的该核酸分子)。用于本发明的多核苷酸通常是 本发明基因(正义或非正义链)的一部分,它们适合用作鉴定指定样品中全长基因(或其部 分)的杂交探针或PCR引物,或适用于编码ZnT8蛋白或其片段,或适合作为治疗剂(例如,反 义或适体)。分离的核酸分子可以包括基因或基因的一部分(例如,调控区或启动子),例如, 以产生报告构建体或重组蛋白。包括基因的分离的核酸分子不是包括该基因的染色体的片 段,而是包括该基因相关的编码区和调控区,但没有相同染色体上天然存在的其他基因。分 离的核酸分子还可以包括侧翼(即,序列的5'和/或3'端)有额外核酸的指定核酸序列,所述 额外的核酸在自然界中通常不在指定核酸序列的侧翼(即,异源序列)。分离的核酸分子可 以包括DNA,RNA(例如,mRNA),或DNA或RNA的衍生物(例如,cDNA)。尽管短语"核酸分子"主要 是指物理上的核酸分子,短语"核酸序列"主要是指核酸分子中核苷酸的序列,但这两个短 语可以互换使用,尤其是当其涉及能够编码蛋白的核酸分子或核酸序列时。优选的,利用 DNA重组技术(例如,聚合酶链式反应(PCR)扩增,克隆)或化学合成来产生本发明的分离的 核酸分子。

[0271] 本发明核酸分子或多核苷酸的大小底限如下:足以编码具有所需生物活性的蛋 白,足以形成探针或寡核苷酸引物,所述探针或寡核苷酸引物能够与编码天然蛋白的核酸 分子的互补序列形成稳定的杂交物(例如,在中等、高或非常高的严谨性条件下),或另外在 本文所述的分析法或任意治疗方法中用作靶标或药剂。如果多核苷酸是寡核苷酸探针或引 物,该多核苷酸的大小取决于核酸组成,核酸分子与互补序列之间的百分比同源性或同一 性,以及杂交条件本身(例如,温度,盐浓度,和甲酰胺浓度)。用作寡核苷酸探针或引物的多 核苷酸的大小底限是长度为至少约5个核苷酸,优选的范围为约5到约50或约500个核苷酸 或更多(1000,2000,等等),包括其中的任意长度,整数增加(8卩,5,6,7,8,9,10,...33, 34,. . .256,257,. . .500. . .1000...),和优选的为约10到约40个核苷酸,和最优选的长度为 约15到约40个核苷酸。一方面,如果核酸分子是富含GC的,则寡核苷酸引物或探针的长度为 至少约12到约15个核苷酸,如果它们是富含AT的,则长度为至少约15到约18个碱基。除了实 际极限外,对本发明核酸分子的最大值没有限制,因为所述核酸分子可以包括蛋白编码序 列的一部分或编码全长蛋白的核酸序列。

[0272] 根据本发明,寡核苷酸探针(或简单地,探针)是大小范围最常见从长约8个核苷酸 到数百个核苷酸的核酸分子。这种分子通常被用于鉴定样品中的靶核酸序列,通过在严谨 杂交条件下与所述靶核酸序列杂交。如本文使用的,严谨杂交条件是指标准杂交条件,在该 条件下核酸分子用于鉴定类似的核酸分子。这类标准条件公开于,例如,Sambrook et al., Molecular Cloning:ALaboratory Manual(分子克隆:实验手册),Cold Spring Harbor Labs Press,1989.Sambrook et al.,同上,在此完整引入作为参考(具体参见,第9.31-9.62页)。此外,计算合适杂交和洗涤条件(以实现允许不同错配程度的核苷酸杂交)的公式 公开于,例如Meinkoth et al.,1984,Anal.Biochem.l38,267_284;Meinkoth et al·,同 上,在此完整引入作为参考。

[0273] 更具体的,本文涉及的中等严谨杂交和洗涤条件,是指在杂交反应中允许与核酸 分子具有至少约70%核酸序列同一性的核酸分子分离的条件(即,该条件允许核苷酸的约 30%或更低错配)。本文涉及的高严谨杂交和洗涤条件,是指在杂交反应中允许与核酸分子 具有至少约80%核酸序列同一性的核酸分子分离的条件(即,该条件允许核苷酸的约20% 或更低错配)。本文涉及的非常高严谨杂交和洗涤条件,是指在杂交反应中允许与核酸分子 具有至少约90%核酸序列同一性的核酸分子分离的条件(即,该条件允许核苷酸的约10% 或更低错配)。正如以上的讨论,本领域技术人员可以使用Meinkoth等(同上)的公式计算合 适的杂交和洗涤条件以实现所述特定水平的核苷酸错配。这类条件将取决于形成的是DNA: RNA或DNA:DNA杂交物而不同。计算出的DNA:DNA杂交物的解链温度比DNA:RNA杂交物低10 °C。在具体实施方案中,DNA: DNA杂交物的严谨杂交条件包括在以下条件杂交:离子强度为 6X SSC(0.9M Na+),温度为约20°C到约35°C(低严谨),更优选的,约28°C到约40°C(更严 谨),甚至更优选的,约35°C到约45°C(甚至更严谨),并利用合适的洗涤条件。在具体实施方 案中,DNA:DNA杂交物的严谨杂交条件包括在以下条件杂交:离子强度为6X SSC(0.9M Na + ),温度为约30°C到约45°C,更优选的,约38°C到约50°C,甚至更优选的,约45°C到约55°C, 并利用类似的严谨洗涤条件。这些值基于对大于约100个核苷酸的分子、〇%甲酰胺和约 40%的G+C含量的解链温度的计算。或者,可以按Sambrook等所述(上文,第9.31到9.62页) 通过经验计算Tm。通常,洗涤条件应当尽可能严谨,并与选择的杂交条件相适应。例如,杂交 条件可以包括盐和温度条件(低于计算的具体杂交物的Tm约20-25°C)的组合,洗涤条件通 常包括盐和温度条件(低于计算的具体杂交物的Tm约12-20°C)的组合。适用于DNA:DNA杂交 物的杂交条件的实例包括,在约42°C6X SSC(50%甲酰胺)中杂交2-24小时,然后是洗涤步 骤(包括室温下用约2X SSC-次或多次洗涤),继之以在更高温度和更低离子强度下另外洗 涤(例如,在约37°C约0.1X-0.5X SSC中至少一次洗涤,然后在约68°C约0.1X-0.5X SSC中至 少一次洗涤)。

[0274] PCR引物也是核酸序列,尽管PCR引物通常是用于聚合酶链式反应的长度相当短的 寡核苷酸。本领域技术人员利用来自靶序列的序列信息,能够轻易地开发和制备PCR引物和 杂交探针。(参见,例如,Sambrook et al·,上文或〃Molecular Biotechnology(分子生物技 术),〃第二版,Glick和Pasternak,ASM Press,Washington D. C.,1998,第555-590页)。

[0275] 了解本发明某些核酸分子的核酸序列允许本领域技术人员,例如,(a)制备所述核 酸分子的拷贝和/或(b)获得包括所述核酸分子至少一部分的核酸分子(例如,包括全长基 因、全长编码区、调节性调控序列、截短编码区的核酸分子)。这种核酸分子可以通过各种方 式获得,包括传统的克隆技术,利用寡核苷酸探针筛选相应文库或DNA,及利用寡核苷酸引 物PCR扩增相应文库或DNA。待筛选或从其扩增核酸分子的优选文库包括哺乳动物基因组 DNA文库。克隆和扩增基因的技术公开于,例如,Sambrook等,如上。

[0276] 如本文使用的,反义核酸分子被定义为通过高严谨条件下与编码蛋白的基因杂 交,降低该蛋白表达的分离的核酸分子。这种核酸分子与编码蛋白的基因足够类似,使得该 分子能够在高严谨条件下与编码天然蛋白的基因或RNA的编码或互补链杂交。

[0277] RNA干扰(RNA i )是一种方法,其中双链RNA和在哺乳动物系统中,短干扰RNA (siRNA),用于抑制或沉默互补基因的表达。在靶细胞中,siRNA展开并与RNA诱导的沉默复 合物(RISC)结合,其然后被引导到与siRNA互补的mRNA序列,由此RISC切割mRNA。

[0278]核酶是一种RNA片段,其通过结合靶标RNA基团并使其灭活(通过在特定切割位点 切割磷酸二酯主链)发挥作用。核酶可以作为核酸分子的靶向运输载体,或可选择的,核酶 可以例如靶向和结合编码生物标记物的RNA,从而有效抑制所述生物标记物的翻译。

[0279]适体是合成核酸(通常是RNA,也可以是DNA)的短链,根据它们以高亲和力和特异 性结合预定具体靶分子的能力,选自随机组合核酸文库。适体呈现指定的三维结构,能够区 别结构上有细微差别的化合物。

[0280]重组核酸分子是包括编码ZnT8蛋白或本文描述的其他蛋白的任意核酸序列中至 少之一的分子。在一个实施方案中,重组核酸分子被可操作的连接到至少一个表达调控序 列,其在宿主细胞中能够有效调节核酸分子的表达。优选的,利用DNA重组技术(例如,聚合 酶链式反应(PCR)扩增,克隆)产生重组核酸分子。重组核酸分子包括重组载体,其是任意核 酸序列,通常是异源序列,被可操作的连接到编码蛋白(例如,ΖηΤ8)的分离的核酸分子,其 能够启动蛋白的重组生成,或能够在体外(in vitro)、离体(ex vivo)或体内(in vivo)将 核酸分子输送入本发明的宿主细胞。这类载体可以包含不是在插入载体的分离核酸分子附 近天然存在的核酸序列。载体可以是RNA或DNA,原核或真核的,在本发明中优选的是病毒或 者质粒。重组载体可用于核酸分子的克隆、测序和/或在其他方面控制。优选的重组载体被 用于核酸分子的表达,其还可以被称作表达载体。优选的重组载体能够在转染的宿主细胞 中表达,具体来说,在转染的哺乳动物宿主细胞体内表达。

[0281]在本发明的重组分子中,核酸分子被可操作的连接到包含调控序列的表达载体, 所述调控序列诸如转录控制序列,翻译控制序列,复制起点及其他调控序列,它们与宿主细 胞相容并控制本发明核酸分子的表达。短语"可操作的连结"是指采用以下方式将核酸分子 连结到表达控制序列,该方式使得当所述分子被转染(即,转化、转导或转染)入宿主细胞时 可以表达。

[0282]转录控制序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。尤其重要的转录控制序列 是那些控制转录起始的序列,诸如启动子、增强子、操纵子和抑制序列。合适的转录控制序 列包括可以在本发明的宿主细胞中起作用的任意转录控制序列。各种合适的转录控制序列 是本领域技术人员已知的。尤其优选的转录控制序列包括诱导型启动子,细胞特异性启动 子,组织特异性启动子(例如,胰岛素启动子)和增强子。本发明的转录控制序列还可以包括 天然存在的转录控制序列,其在分离前与待表达蛋白天然结合。在一个实施方案中,转录控 制序列包括诱导型启动子。

[0283] -类可用于本发明重组核酸分子的重组载体是重组病毒载体。这种载体包括编码 本发明ZnT8蛋白的重组核酸序列,其被包装在病毒包膜中,在施用后所述重组核酸序列可 以在动物的宿主细胞或体外表达。可以使用各种重组病毒载体,包括但不限于,那些基于甲 病毒,痘病毒,腺病毒,疱疹病毒,慢病毒,腺相关病毒和逆转录病毒的重组病毒载体。尤其 优选的病毒载体是基于腺病毒和腺相关病毒的病毒载体。适于基因输送的病毒载体是本领 域公知的,可由技术人员选择用于本发明。现有病毒载体的详细讨论提供于"Molecular Biotechnology (分子生物技术),〃第二版,G1 ick和Pasternak,ASMPress,Washington D.C.,1998,第555-590页,其内容在此完整引入作为参考。

[0284] 用于转染本发明重组核酸分子的合适宿主细胞包括可以被转染的任意微生物,昆 虫,或动物细胞。宿主细胞可以是未转染的细胞或已经转染至少一种核酸分子的细胞。

[0285] 根据本发明,术语"转染"用于表示能够将外源核酸分子(即,重组核酸分子)插入 细胞的任意方法。术语"转化"可以与术语"转染"互换使用,其条件是当该术语用于表示将 核酸分子导入微生物细胞(诸如细菌和酵母)时。在微生物系统中,术语"转化"用于描述由 于微生物获得外源核酸造成的遗传性改变,并与术语"转染"是基本上同义的。但是,在动物 细胞中,转化具有第二种含义,例如,它可以表示细胞变为癌性后培养物中细胞生长特性的 变化。因此,为避免混淆,术语"转染"优选的是指将外源核酸导入动物细胞,术语"转染"在 本文中使用时通常包括动物细胞的转染及微生物细胞的转化,从而使得该术语涉及外源核 酸向细胞的导入。因此,转染技术包括,但不限于,转化,电穿孔,显微注射,脂质体转染,吸 附,感染和原生质体融合。

[0286]如本文使用的,就包括ZnT8蛋白的本发明分离的蛋白或多肽来说,它是一种已从 其天然环境转移的蛋白(即,已经过人工处理),包括全长蛋白,融合或嵌合蛋白,或该蛋白 的任意片段或同系物。这类蛋白可以包括,但不限于,纯化的蛋白,部分纯化的蛋白,重组产 生的蛋白,合成产生的蛋白,膜结合蛋白,与脂质复合的蛋白,可溶性蛋白及与其他蛋白结 合的分离的蛋白。这样的话,"分离的"不表示蛋白被纯化的程度。优选的,本发明分离的蛋 白是重组产生的。此外,再次举例来说,"人ZnT8蛋白"或"源自"人ZnT8蛋白的蛋白是指来自 人(智人)的ΖηΤ8蛋白(通常包括天然存在的ΖηΤ8蛋白的同系物),或根据已知的天然存在的 智人ΖηΤ8蛋白的结构(例如,序列)以及也可能是功能另外产生的ΖηΤ8蛋白。换言之,人ΖηΤ8 蛋白包括任意ΖηΤ8蛋白,如本文详细所述,其与天然存在的智人ΖηΤ8蛋白具有基本上类似 的结构及功能,或是天然存在的智人ΖηΤ8蛋白的活性(即,具有生物活性)同系物。这样的 话,人ΖηΤ8蛋白可以包括纯化的,部分纯化的,重组的,突变/改变的及合成的蛋白。根据本 发明,术语"改变"和"突变"可以可以互换使用,尤其当涉及本文描述的蛋白的氨基酸序列 (或核酸序列)的改变/突变时。可用作本发明拮抗剂或激动剂的分离的蛋白可以从其天然 来源分离,重组产生或合成产生。

[0287] 本发明还包括融合蛋白和嵌合蛋白。融合蛋白是通过将本发明的蛋白或肽(例如, ΖηΤ8或其变体或片段)与融合伴侣(融合部分)结合(通常是重组的,尽管本发明包括化学及 其他类型的结合)产生的蛋白。用于本发明的合适融合伴侣包括,但不限于,具有以下功能 的融合伴侣:增强蛋白的稳定性;增强或允许蛋白从宿主细胞分泌;提供其他生物活性;和/ 或协助从宿主细胞纯化蛋白(例如,通过亲和层析)。合适的融合伴侣可以是具有所需功能 (例如,赋予增加的稳定性、溶解性、作用或活性;提供其他活性;和/或简化蛋白的纯化)的 蛋白或其任意大小的结构域或片段。融合伴侣可以连接到感兴趣蛋白(例如,ΖηΤ8)的氨基 和/或羧基端,并且容易被切割,以便能够直接回收表达的外源蛋白。嵌合蛋白类似于融合 蛋白,上述术语可以互换使用,除了在嵌合蛋白的情况下,融合伴侣最常见的是感兴趣的第 二蛋白(或其片段),诸如具有所需生物活性的第二蛋白。因此,嵌合蛋白可能具有所述蛋 白/肽组分中每种/两种的活性,或由蛋白结构域组合产生的新活性。

[0288] 在一个优选的实施方案中,利用体外翻译系统(诸如基于网织红细胞裂解物、小麦 胚芽、酵母和细菌的系统)产生蛋白(包括肽和同系物)。该系统优选的正确翻译后加工蛋 白,例如,通过蛋白水解和/或糖基化。体外翻译系统的产物是本发明方法最常使用的,尽管 本发明不限于这类产物。

[0289] 如本文使用的,术语"同系物"或"变体"用于表示通过对天然存在的蛋白或肽的较 小改变而不同于天然存在的蛋白或肽(即,"原型"或"野生型"蛋白)的蛋白或肽,其保持天 然存在形式的基本蛋白和侧链结构。这种改变包括,除了不限于:在1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 或更多几条氨基酸侧链中的改变;改变1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多几个氨基酸,包括缺 失(例如,蛋白或肽的截短形式)、插入和/或取代;1个或几个原子立体化学的改变;和/或次 要衍生,包括但不限于:甲基化,糖基化,磷酸化,乙酰化,豆蔻酰化,异戊烯化,棕榈酸化 (palmitation),酰胺化和/或糖基化磷脂酰肌醇的添加。与天然存在的蛋白或肽相比,同系 物可以具有增强、降低或基本上类似的特性。同系物可以包括蛋白的激动剂或蛋白的拮抗 剂。

[0290]同系物可以是天然等位基因变异或遗传多态性,或任意自然突变的结果。编码蛋 白的核酸的天然存在的等位基因变体或遗传多态性是与编码该蛋白的基因存在于在基因 组中基本上相同基因座的基因,但由于天然变异,其具有类似但不相同的序列。等位基因变 体通常编码与被比较的基因编码的蛋白具有类似活性的蛋白。单核苷酸多态性(SNP)是当 基因组中的单核苷酸在物种成员之间或个体的配对染色体之间不同时存在的DNA序列变 异。由于人群间的变异,在一个地理或种族中常见的SNP等位基因可能在另一种族中更罕 见。此外,人DNA序列的变异可能影响人如何患有疾病及如何对病原体、化学制剂、药物、疫 苗和其他试剂产生应答,这已经被本文中针对ZnT8基因中存在的多态性的自身抗体应答所 作证。

[0291] -类等位基因变体可以编码相同的蛋白,但由于遗传密码的简并性所以具有不同 的核酸序列。等位基因变体还可以包括基因的5'或3'未翻译区(例如,在调控性控制区)。等 位基因变体是本领域技术人员公知的。

[0292] 同系物可以利用本领域已知的用于蛋白制备的技术产生,包括但不限于,对分离 的天然存在蛋白的直接改变,直接蛋白合成,或利用例如经典或重组DNA技术来影响随机或 靶向诱变,对编码蛋白的核酸序列进行改变。

[0293] 根据本发明,分离的蛋白(包括其生物活性的同系物或片段),具有活性野生型或 天然存在的对照蛋白的至少一种生物活性特征(其可以不同,取决于所述同系物或片段是 否是蛋白的激动剂或拮抗剂,或是否描述了蛋白的激动剂或拮抗剂模拟物)。通常,蛋白的 生物活性或生物作用是指由蛋白显示或行使的任意功能,其归因于蛋白的天然存在形式, 通过体内(即,在蛋白的天然生理环境中)或体外(即,在实验室条件下)测量或观察得到。 [0294]本发明ΖηΤ8蛋白的生物活性包括将锌输送出细胞,或将锌固定在胞内小室。更具 体的,本发明的ΖηΤ8生物活性包括将细胞质锌转移到胰岛辟田胞的胞内囊泡。用于本发明的 ΖηΤ8的其他生物学活性包括诱导抗ΖηΤ8的免疫应答,包括细胞及体液免疫应答,以及在分 析法中被结合剂识别的能力(例如,形成可以被ΖηΤ8特异结合剂识别的初级或三级结构或 构象表位)。

[0295] 导致蛋白表达降低或蛋白活性降低的修饰、活性或相互作用被称作灭活(完全或 部分的),下调,作用减弱,或蛋白的作用或活性降低。类似地,导致蛋白表达增加或蛋白活 性增加的修饰、活性或相互作用被称作蛋白的扩增、过量产生、活化、增强、上调或作用增 加。本发明蛋白尤其是ΖηΤ8蛋白的生物活性可以利用本领域已知的用于蛋白生物活性的任 意分析法进行测量或评价。这类分析可以包括,但不限于,结合分析(包括各种免疫分析), 确定蛋白和/或相关蛋白的内化或定位的分析,锌运输分析(例如,zinquin分析,描述于 Chimienti et al.,2004,Diabetes,上文)和/或用于测定下游细胞事件(由蛋白的活性造 成)的分析。

[0296] 如本文使用的,除非另作说明,百分比(% )同一性是指利用以下方法进行同源性 鉴定:(1)BLAST 2.0 Basic BLAST同源性搜索,利用标准缺省参数的用于氨基酸搜索的 blastp和用于核酸搜索的blastn,其中利用默认值对询问序列进行低复杂性区域过滤(描 述于Altschul,S·F·,Madden,T· L·,Sch組ffer:,A· A·,Zhang,J·,hang,Z.,Miller,W.& Lipman ,D . J. (1997)7/Gapped BLAST andPSI-BLAST : a new generation of protein database search programs(缺口BLAST和PSI-BLAST:新一代蛋白数据库搜索程序)·" Nucleic Acids Res.25:3389-3402,在此完整引入作为参考);(2)BLAST 2比对(利用如下 所述的参数);(3)和/或PSI-BLAST,利用标准缺省参数(位置特异性迭代81^31'(?〇8^1〇11-Specific Iterated BLAST))。应注意到由于BLAST 2.0 Basic BLAST和BLAST 2之间标准 参数的一些差异,利用BLAST 2程序有两条特定序列被识别为具有显著的同源性,而在 BLAST 2.0 Basic BLAST中利用其中一条序列作为询问序列进行的搜索未能在最佳配对 (top matches)中鉴定出第二序列。此外,PSI-BLAST提供自动化、易于使用形式的"模式"搜 索,这是一种寻找序列同系物的灵敏方法。该程序首先进行缺口BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序利用返回的来自任意显著比对的信息构建位置特异性分数矩阵,其取代询问序 列用于下一轮数据库搜索。因此,应了解可以利用这些程序中的任意一项确定百分比同一 性。

[0297] 如Tatusova和Madden所述,(1999 ),〃 Biast 2 sequences-a new too 1 forcomparing protein and nucleotide sequences(Blast 2 sequences-一种用于比车交 蛋白和核苷酸序列的新工具)〃,FEMS Microbiol Lett. 174:247-250,在此完整引入作为参 考,可以利用BLAST 2 Sequence对两条特定序列进行彼此比对。BLAST 2序列比对是在 blastp或blastn中利用BLAST 2.0算法进行,在两条序列之间进行缺口BLAST搜索(BLAST 2.0)以便在所获比对中导入缺口(缺失和插入)。为了阐明本文,BLAST 2序列比对利用下列 标准缺省参数进行。

[0298] 对于blastn,利用0 BL0SUM62矩阵:

[0299] 配对奖励=1 [0300] 错配罚分=-2

[03011 开放缺口(5)和延伸缺口(2)罚分

[0302] 缺口 x_降低(50)预期(10)字大小(11)过滤(开)

[0303]对于blastp,利用0 BL0SUM62矩阵:

[0304] 开放缺口(11)和延伸缺口(1)罚分

[0305] 缺口 xj#低(50)预期(10)字大小(3)过滤(开)。

[0306]如本文使用的,指定蛋白的"激动剂"是指特征为具有激动(例如,刺激,诱导,增 加,增强,或模拟)天然存在蛋白的生物活性的能力的任意化合物,包括任意同系物、结合蛋 白(例如,抗体)、试剂(它们与蛋白或被蛋白结合的受体相互作用),或药物/化合物/肽设计 或筛选的任意合适产物,它们的特征在于具有以类似于天然激动剂(其是对照蛋白)的方式 激动(例如,刺激,诱导,增加,增强)天然存在蛋白的生物活性的能力。

[0307]类似地,"诘抗剂"是指抑制(例如,诘抗,降低,减少,阻断,逆转,或改变)上述蛋白 的指定激动剂(包括该蛋白自身)作用的任意化合物。更具体的,拮抗剂能够以与蛋白活性 有关的方式发挥作用,这样的话天然激动剂或对照蛋白的生物活性以对该蛋白的天然作用 拮抗(例如,抗、逆转或相反)的方式被降低。这种拮抗剂可以包括,但不限于,蛋白,肽,或核 酸(包括核酶,RNAi,适体,和反义),抗体及其抗原结合片段,或提供拮抗效应的药物/化合 物/肽设计或筛选的产物。

[0308]指定蛋白诸如ZnT8的同系物,包括肽和非肽激动剂和拮抗剂(类似物),可以是药 物设计或筛选的产物,也可以利用本领域已知的各种方法产生。这种同系物可以被称作模 拟物。可用于本发明设计或挑选模拟物或其他治疗化合物的药物设计的各种方法公开于 Maulik et al.,1997, MolecularBiotechno logy:Therapeutic Applications and Strategies(分子生物技术:治疗应用和策略),Wiley-LiSS,Inc.,其在此完整引入作为参 考。

[0309]如本文使用的,模拟物是指能够模拟天然存在肽的生物作用的任意肽或非肽化合 物,通常是因为模拟物具有模拟天然存在肽的基本结构的基本结构,和/或具有天然存在肽 的显著生物学特性。模拟物可以包括,但不限于:与原型具有实质改变的肽,诸如与天然存 在的肽没有侧链相似性(这种改变,例如,可能降低其对降解的敏感性);抗个体基因型和/ 或催化抗体,或其片段;分离的蛋白的非蛋白部分(例如,碳水化合物结构);或合成或天然 的有机分子,包括例如通过组合化学鉴定的核酸和药物。可以利用本领域已知的各种方法 设计、选择和/或另外鉴定这类模拟物。

[0310] 可以获得模拟物,例如,利用分子多样性策略(允许快速构建大的、化学多样性分 子文库的相关策略的组合),天然或合成化合物的文库,尤其是利用化学或组合文库(即,序 列或大小不同但具有类似结构单元的化合物的文库),或通过推理性、定向或随机药物设 计。参见例如,Maulik et al·,上文。

[0311] 在分子多样性策略中,利用生物学、酶学和/或化学方法,例如从肽、寡核苷酸、碳 水化合物和/或合成有机分子合成大的化合物文库。开发分子多样性策略中的临界参数包 括亚基多样性、分子大小和文库多样性。筛选这种文库的一般目标是利用组合筛选的连续 应用以获得所需靶标的高亲和力配体,然后通过随机或者定向设计策略优化先导分子。分 子多样性的方法详细描述于Maulik,et al.,如上。

[0312] 在推理性药物设计步骤中,可以通过例如,核磁共振(NMR)或X-射线晶体衍射法分 析调节化合物的三维结构。然后可以使用该三维结构预测潜在化合物的结构,诸如通过例 如计算机模拟预测潜在的调节剂。预测的化合物结构可用于优化衍生的前导化合物,例如, 通过分子多样性方法。此外,预测的化合物结构可以通过以下方法产生,例如,化学合成, DNA重组技术,或通过从天然来源(例如,植株,动物,细菌和真菌)分离模拟位。

[0313] Maulik等还公开了,例如,定向设计的方法,其中用户指导从相应挑选片段的片段 文库产生新分子的步骤;随机设计,其中用户使用遗传或其他方法随机突变片段及它们的 组合并同时应用选择标准来评价候选配体的适合性;和基于网格的方法,其中用户计算三 维受体结构和小片段探针之间的相互作用能,然后将良好探针位点结合到一起。

[0314]本发明的抗体和抗原结合伴侣

[0315]本发明还包括抗体及其抗原结合片段(它们选择性结合ZnT8),以及这种抗体及其 抗原结合片段在本文描述的任意一项方法中的用途。可以利用从蛋白获得的结构信息(例 如,蛋白至少一部分的氨基酸序列)产生选择性结合蛋白的抗体。如本文使用的,术语"选择 性结合"是指一种蛋白与另一种(例如,抗体,其片段,或抗原的结合伴侣)的特异性结合,其 中通过任意标准分析(例如,免疫分析)测定,结合水平统计上显著高于该分析的背景对照。 例如,当进行免疫分析时,对照通常包括只包含抗体或抗原结合片段(即,没有抗原)的反应 孔/管,其中无抗原时抗体或其抗原结合片段的反应性量(例如,与孔的非特异性结合)被认 为是背景。可以利用本领域的各种方法标准检测结合,包括但不限于:Western印迹,免疫印 迹,酶联免疫吸附分析(ELISA),放射免疫分析(RIA),免测沉淀,表面等离子体共振,化学发 光,荧光极化,磷光,免疫组织化学分析,基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-T0F)质 谱法,微细胞计数法,微阵列,显微镜检查,荧光活化细胞分选(FACS),和流式细胞术。

[0316]根据本发明,指定蛋白或肽或其他分子的"表位"通常被定义为(对抗体来说)更大 分子的部分或位点,抗体或其抗原结合片段将与该分子结合,并且将产生的抗体抗该分子。 术语表位可以与术语指定蛋白或抗原的"抗原决定簇"、"抗体结合位点"或"保守结合表面" 互换使用。更具体地,表位可以用参与抗体结合的氨基酸残基以及它们在三维空间的构象 (例如,构象表位或保守结合表面)来定义。表位可以小至约4-6个氨基酸残基包括在肽中, 或包括在蛋白的更大部分,当涉及表位的三维结构(尤其是涉及抗体结合表位)时,无需由 邻接氨基酸残基组成。抗体结合表位通常是构象表位而不是连续表位(即,线性表位),或换 言之,由氨基酸残基限定的表位在蛋白或多肽(抗体与其结合)的表面三维空间内排列。如 上所述,构象表位不是由氨基酸残基的邻接序列组成,相反,残基可能广泛分布于初级蛋白 序列,经由蛋白在三维空间折叠成其天然构象而聚集形成结合表面。因此,本发明包括任意 蛋白或肽,它们包括或由下列物质组成:任意ZnT8表位,以及抗体,抗原结合片段,或结合 ΖηΤ8蛋白任意表位的其他结合伴侣(结合肽)。

[0317]本发明的"异表位"是以变体形式或亚型(天然或通过合成设计)存在的表位,诸如 包含多态性变体氨基酸位置的表位。异表位的实例在本文中描述为包含325位的ΖηΤ8表位, 其中一种异表位包含325位的精氨酸,两种其他变体天然存在于该位置(Trp325和Gln325)。 这三种变体是异表位。

[0318]本领域技术人员可以利用已知技术鉴定和/或组装构象表位和/或连续表位,包括 突变分析(例如,定点诱变);防止蛋白水解降解(蛋白足迹法);模拟位分析,利用例如,合成 肽和肽扫描,BIAC0RE或ELISA;抗体竞争作图;组合肽库筛选;基质辅助激光解吸/电离飞行 时间(MALDI-T0F)质谱法;或三维模拟(例如,利用任意合适的软件程序,包括但不限于, M0LSCRIPT 2.0(AvatarSoftware AB,Heleneborgsgatan 21C,SE 11731 Stockholm, Sweden),图形显不程序0(Jones et.al ·,Acta Crystallography,vol ·Α47,ρ· 110,1991), 图形显示程序GRASP,图形显示程序INSIGHT。例如,技术人员可以使用分子取代或其他技术 及相关蛋白的已知三维结构来模拟ZnT8的三维结构,并预测与该结构结合的抗体的构象表 位。实际上,技术人员可以使用这类技术中的一种或任意组合来确定抗体结合表位。

[0319] 可用于本发明的抗体包括多克隆和单克隆抗体,二价和单价抗体,双或多特异性 抗体,包含该抗体的血清,已经被不同程度纯化的抗体,和完整抗体的任意功能同等物。本 发明分离的抗体包括包含该抗体的血清,或已经被不同程度纯化的抗体。可选择地,完整抗 体的功能同等物,诸如抗原结合片段,其中一个或多个抗体结构域被截短或缺失(例如,Fv, FabJal/,或F(ab)2片段),以及遗传改造的抗体或其抗原结合片段,包括单链抗体或可以 结合超过一个表位的抗体(例如,双特异性抗体),或可以结合一个或多个不同抗原的抗体 (例如,双或多特异性抗体),也可在本发明中使用。

[0320] 遗传改造的抗体包括那些通过标准重组DNA技术产生的抗体,涉及编码抗体可变 区和/或恒定区的DNA的操作和再表达。具体实例包括,嵌合抗体,其中抗体的VH和/或VL结 构域来自于对于抗体剩余部分来说不同的来源,和CDR移植抗体(及其抗原结合片段),其中 至少一个CDR序列和任选的至少一个可变区骨架氨基酸来来源于一个来源,可变区和恒定 区的剩余部分(视情况而定)来源于不同的来源。嵌合及CDR移植抗体的构建描述于,例如, 欧洲专利申请:EP-A 0194276,EP-A 0239400,EP-A 0451216和EP-A0460617。

[0321] 通常,在抗体的制备中,合适的实验动物,诸如,例如,但不限于,兔,绵羊,仓鼠,豚 鼠,小鼠,大鼠,或鸡,被暴露于抗原(要求该抗原是抗体所针对的)。通常,动物用有效量的 抗原(被注射入该动物)免疫。抗原的有效量是指诱导动物产生抗体所需要的量。然后允许 动物的免疫系统在预定时间段内产生应答。免疫步骤可以重复,指导发现免疫系统产生针 对所述抗原的抗体。为了获得对抗原特异的多克隆抗体,从包含所需抗体的动物收集血清 (或就鸡而言,可以从鸡卵收集抗体)。这类血清可用作试剂。通过例如用硫酸铵处理血清, 可以从血清(或鸡卵)进一步纯化多克隆抗体。

[0322] 可以根据Kohler和Milstein的方法(Nature 256:495-497,1975)产生单克隆抗 体。例如,从免疫动物的脾(或任意合适的组织)回收B淋巴细胞,然后与骨髓瘤细胞融合得 到能够在合适培养基中连续生长的杂交瘤细胞群。通过检测杂交瘤产生的抗体结合所需抗 原的能力来挑选产生所需抗体的杂交瘤。

[0323] 本发明还扩展到非抗体多肽,有时被称为抗原结合伴侣或抗原结合肽,它们被设 计成能选择性结合感兴趣的蛋白。设计这种多肽(具有指定的配体特异性)的实例可参见 Beste等(Proc.Natl .Acad. Sci.96:1898-1903,1999),在此完整引入作为参考。

[0324] 根据本发明,本文术语"抗原"常规使用涉及:蛋白的任意部分(肽,部分蛋白,全长 蛋白),其中蛋白是天然存在的或合成衍生自,细胞组成(全细胞,细胞裂解物或破坏的细 胞),生物(完整生物,裂解物或破坏的细胞)或碳水化合物或其他分子,或其部分,其中抗原 引发抗原特异性免疫应答(体液和/或细胞免疫应答),或可选的作为耐受原,抗相同或类似 的抗原(在施用该抗原的动物的细胞和组织内遭遇)。

[0325] 在本发明的一个实施方案中,当需要刺激免疫应答时,术语"抗原"可以与术语"免 疫原"互换使用,在本文中用于描述引发体液和/或细胞免疫应答(即,是免疫原性的)的抗 原,这样的话给动物施用免疫原(例如,通过本发明的疫苗)引发抗相同或类似抗原(在动物 组织内遭遇)的抗原特异性免疫应答。在另一个实施方案中,当需要抑制抗指定抗原的免疫 应答时,抗原可以包括耐受原。根据本发明,"耐受原"用于描述采用以下形式、量或施用途 径提供的抗原,这样的话存在减弱或改变的对抗原的免疫应答,优选的免疫系统细胞对接 触耐受原或表达或呈递这种耐受原的细胞的应答的无应答性、无反应性、其他失活或缺失。

[0326] "接种抗原"可以是免疫原或耐受原,但是用于疫苗的抗原,其中生物反应(免疫应 答、耐受性的引发)由抗接种抗原引发。

[0327] 指定抗原的免疫原性结构域(部分,片段,表位)可以是抗原的任意部分(例如,肽 片段或亚基或抗体表位或其他构象表位),包含当给动物施用时作为免疫原(或耐受原,对 于致耐受结构域来说)的至少一个表位。例如,单个蛋白可以包含多种不同的免疫原性结构 域。就体液免疫来说,免疫原性结构域不必是蛋白内的线性序列。

[0328] 作为通称,表位在本文中被定义为指定抗原内的单个免疫原性位点(足以引发免 疫应答),或指定抗原内的单个致耐受位点(足以抑制、去除免疫应答或使免疫应答失活)。 正如以上的讨论,本领域技术人员认可T细胞表位与B细胞表位在大小和组成方面不同,并 且通过I型MHC途径呈递的表位不同于通过II型MHC途径呈递的表位,表位可以是线性序列 或构象表位(保守的结合区域)。这取决于免疫应答的类型。抗原可以小至单个表位,或更 大,可以包括多个表位。这样的话,抗原大小可以小至约5-12个氨基酸(例如,肽)和大至:全 长蛋白,包括多聚体和融合蛋白,嵌合蛋白,全细胞,全微生物,或其部分(例如,全细胞的裂 解物或微生物的提取物)。

[0329] 本发明的组合物和制齐lj (f ormu lat i on)

[0330] ZnT8蛋白,同系物(包括突变的肽),片段,肽,肽和非肽模拟物,及抗体和其抗原结 合片段可以被包含在用于本发明的组合物、制剂,尤其是疫苗中。这种组合物、制剂或疫苗, 可以包括药学上可接受的载体,其包括药学上可接受的赋形剂和/或载体。如本文使用的, 药学上可接受的载体是指适合将可用于本发明方法的组合物、制剂或疫苗输送到合适的体 内或体外位点的任意物质。优选的药学上可接受的载体能够采用以下形式维持待输送的药 剂(例如,ZnT8蛋白,同系物(包括突变的肽),片段,肽,肽和非肽模拟物,及抗体和其抗原结 合片段其),这种形式使得药剂到达靶细胞或靶位点时,该药剂能够作用于所述细胞或位点 (例如能够诱导免疫应答)。本发明的合适赋形剂包括输送或辅助输送的赋形剂或配方,但 不是特异性的将药剂靶向于表位(本文中还称为非靶向载体)。药学上可接受的赋形剂的实 例包括,但不限于水,磷酸盐缓冲液,Ringed s液,葡萄糖溶液,包含血清的溶液,HanV s液, 其他水性生理平衡液,油类,酯和乙二醇。水性载体可以包含要求近似受体生理条件的合适 辅助剂物质,例如,通过增强化学稳定性和等渗性。合适的辅助剂物质包括,例如,醋酸钠, 氯化钠,乳酸钠,氯化钾,氯化钙,及其他用于产生磷酸盐缓冲液的物质,Tris缓冲液,和碳 酸氢盐缓冲液。辅助剂物质还可以包括防腐剂,诸如硫柳汞,m-或〇-甲酚,福尔马林和安息 油醇。本发明的组合物可以通过常规方法灭菌和/或冻干。

[0331] -类药学上可接受的载体包括能够将本发明的组合物缓慢释放入动物的控释剂。 如本文使用的,控释剂包括可用于本发明控释赋形剂的试剂。合适的控释赋形剂包括,但不 限于,生物相容性聚合物,其他聚合基质,胶囊,微胶囊,微粒,丸剂制品,渗透栗,扩散装置, 脂质体,脂质微球(lipospheres),和透皮输送系统。合适的载体还包括,但不限于脂质体, 病毒载体或其他载体,包括核酶。天然的包含脂质的载体包括细胞和细胞膜。人工的的包含 脂质的载体包括脂质体和微胶粒。本发明的载体可被改造靶向于患者的特定位点,从而使 试剂靶向该位点并在该处使用。合适的改造包括控制载体脂质部分的化学式,和/或向赋形 剂中导入能够使载体特异性靶向优选位点(例如,优选的细胞类型)的靶向剂。

[0332] 疫苗是用于免疫或耐受动物抗特定抗原的特定类型的组合物。因此,疫苗包括引 发针对抗原或其免疫原性或致耐受部分(作为疫苗施用的结果)的至少一种化合物或试剂。 疫苗的施用优选导致预防或治疗效果,其中后来的暴露于抗原(或抗原的来源)引发抗抗原 (或来源)的免疫应答,所述免疫应答在动物中减轻或预防疾病。这种免疫应答通常增强或 抑制针对抗原的免疫应答,就ZnT8来说,优选的疫苗抑制抗ZnT8和/或胰岛β细胞的疫苗。接 种的概念是本领域公知的。通过施用本发明的治疗组合物引发的免疫应答可以是与未施用 疫苗时相比,免疫应答任意方面(例如,细胞应答,体液免疫,细胞因子生成)的任意可检测 变化。

[0333] 本发明的方法

[0334]本发明还包括利用鉴定ΖηΤ8作为涉及I型糖尿病(T1D)的新自身抗原的各种方法。 这种方法包括用于监测疾病进展或治疗效果的诊断分析,以及预防和治疗方法,包括免疫 治疗方法和疫苗策略。ΖηΤ8还可以被用作鉴定可用于T1D的诊断、预防和/或治疗的化合物 的新靶标。本发明的方法利用如上所述的ΖηΤ8蛋白,肽,模拟物,同系物,抗体,或甚至核酸 分子中的任意一种。在一些实施方案中,这种试剂与其他诊断或治疗部分组合以增加方法 的有效性。例如,除ΖηΤ8之外其他自身抗原(例如,胰岛素,胰岛素瘤抗原,和/或谷氨酸脱羧 酶)的检测可以与ΖηΤ8的检测组合以增强诊断分析法的有效性、灵敏性和特异性,并且各种 治疗部分(例如,毒素,消炎剂,抗原)可以与ΖηΤ8试剂组合或连接以增强对患者的治疗效 果。

[0335]因此,本发明的实施方案涉及检测糖尿病相关自身免疫性(即,I型糖尿病或T1D) 的方法和分析。这种分析可以被用作诊断分析(例如,为了鉴定正患有T1D的患者或一组受 试者或预测对T1D的易感性)或用作预后/监测分析。后一分析可用于监测患者或一组受试 者中自身免疫性的进展(从自身免疫反应的初始良性(非破坏性的)症状到指示明显T1D的 破坏性胰岛炎)。后一分析还可以用于监测治疗效果,其针对前驱糖尿病受试者中自身免疫 性的预防和/或治疗或改善。例如,可以给受试者施用一种或多种免疫抑制性或预防性试 剂,包括但不限于基于ZnT8分子自身的试剂,然后可以利用本发明的分析监测T1D的进展或 非进展。所述分析可以基于检测受试者中针对ΖηΤ8的自身抗体应答,或检测受试者中针对 ΖηΤ8抗原表位的Τ淋巴细胞反应性。所述分析可以单独使用或彼此结合使用。

[0336]在一个实施方案中,本发明包括抗体分析,其检测受试者中特异性结合ΖηΤ8的抗 体的存在或缺失。本发明的方法基于患者血清中抗ΖηΤ8抗体的水平,可用于有效鉴定或选 择最可能将患有或正患有的I型糖尿病的患者,包括预测因素诸如发病时间,或监测疾病的 进展或阶段。所述方法还可用于有效鉴定或选择对具体治疗方法有应答或没有应答的患者 (即,该方法用于指示对特定患者的治疗方法或显示对特定患者的治疗方法不可取)。

[0337]在本发明自身抗体分析的一个方面,检测由ΖηΤ8基因和蛋白多态性确定的特异性 异表位。异表位特异性的诊断可以用简单的诊断试验实现,所述诊断试验可以基于结合特 异性配体(可以是完整的蛋白或源自它的肽)的抗体。特异性的进一步分析可以通过以下方 法实现:测定过量的所述蛋白的特异性变体或衍生肽与抗体竞争和配体相互作用的能力。 用于这种分析的分析平台可以是放射免疫沉淀,ELISA,发光时间分辨荧光或大量其他一般 分析形式。

[0338]方法通常包括利用任意合适的技术检测患者或受试者样品(试样)中选择性结合 ΖηΤ8的自身抗体。患者抗体结合的水平可以针对阳性对照(例如,阳性血清对照)标准化,并 与实验测定的或预定的抗原(ΖηΤ8)的截止值(阴性对照水平)进行比较和分析,以便确定试 样是否包含临床上或相反相关的抗ΖηΤ8抗体的水平。所述分析可以包括筛选除了 ΖηΤ8之外 的其他自身抗原(包括但不限于,胰岛素,胰岛素瘤抗原和谷氨酸脱羧酶)的能力。

[0339]本发明的该方法或分析更具体的包括提供一种ΖηΤ8抗原,可以检测抗该ΖηΤ8抗原 的患者抗体。ΖηΤ8抗原可以是任意合适的ΖηΤ8衍生的抗原,包括全长ΖηΤ8蛋白,或其同系 物、片段、融合蛋白、突变的肽或肽模拟物,它们可以检测患者中抗ΖηΤ8的血清抗体。ΖηΤ8抗 原包含至少一个抗体表位。尤其优选的ΖηΤ8抗原是ΖηΤ8蛋白的C端肽,其在上文被详细描 述。

[0340] 依照本发明,是在根据本文所述信息的预期用途能够有效筛选抗体的条件下进行 分析。有效条件包括,但不限于,允许细胞生长的合适培养基、温度、pH和氧条件。通常,在竞 争或非竞争性条件下将患者的试样与ZnT8抗原接触,检测、定量试样中自身抗体与ZnT8抗 原的结合并与阴性和/或阳性对照进行比较。用于检测样品中抗ΖηΤ8的自身抗体的技术可 以包括任意合适的分析,包括但不限于,ELISA(直接或间接的),放射免疫沉淀分析,时间分 辨荧光和化学发光分析。这种分析形式是本领域公知的。

[0341] 用于本发明该实施方案的优选分析是竞争性铕分析。这种分析已经详细描述于美 国临时申请号60/822,786,其在此完整引入作为参考。该方法通常包括进行竞争性抗体分 析,其中检测方法使用铕荧光。该方法更具体的包括以下步骤:将抗原(受试者抗体与其选 择性结合)固定到基质上,诸如分析板的孔或其他合适的基质;封闭基质上的非特异性结合 位点;向板中加入试样(例如,来自进行抗体评价的受试者的血清样品),其中在存在或不存 在抗原的液体形式的条件下预孵育试样(即,竞争步骤);和最终,利用基于铕的检测系统检 测结合固定抗原的抗体,诸如与试剂(例如,生物素)偶联的二抗,然后是结合第一试剂(例 如,链霉亲和素)的第二试剂(用铕标记)。然后利用标准的检测方法检测铕发射的荧光水 平。因为所述分析是竞争性分析,从与抗原预孵育的样品计数的荧光中减去未与抗原预孵 育的样品计数的荧光,获得结果水平。该水平可以针对阳性对照(例如,阳性血清对照)标准 化,并与实验测定的或预定的抗原(ZnT8)的截止值(阴性对照水平)进行比较和分析,以便 确定试样是否包含临床上或相反相关的抗ΖηΤ8抗体的水平。

[0342]根据本发明,术语"试样"一般可用于表示任一类型的样品,其被认为包含或可能 包含将通过本发明检测的抗体。试样包括准备好的样品,诸如源自天然样品或合成产生的 样品,及更优选的获自待测受试者(个体,患者,动物)的任意生物样品。因此样品包括细胞 上清液,体液,组织或其他培养基,它们可能包含待检测的抗体。适于取样的体液包括,但不 限于,血液,粘液和母乳,和最优选的是血液或血清样品,其中血清是尤其优选的。

[0343]正如以上的讨论,本发明的分析可被安排用于检测一种抗体特异性(即,ΖηΤ8),超 过一种(例如,2,3,4,5,6,7,8,9,或10)抗体特异性(8卩,检测结合不同抗原或相同抗原的不 同表位或其组合的抗体),或多种(>1〇)抗体特异性。换言之,所述方法被安排用于在单次 分析或实验中检测一种、超过一种或多种不同的抗体(例如,通过将不同的抗原和/或抗原 表位(一组抗原和/或表位)加入单个板或分析基质的不同孔中,以便所述分析利用尽可能 多的不同抗体(只要有效)筛选单个样品)。此外,所述分析可被安排以高通量方式筛选多个 受试者,以便获得关于受试者群体的信息。

[0344]本发明的方法具有数种不同的用途。本发明的方法可用于为了任意目的检测样品 中的抗体,包括临床(例如,诊断、预后和治疗)和研究目的。本发明的方法可以利用人或非 人动物样品进行。首先,所述方法可用于诊断T1D,或更重要的诊断受试者患T1D的可能性或 T1D发病的时间。所述受试者可以是被怀疑患有T1D的个体,已知易患T1D的个体,或被推测 是健康的但经历常规或诊断筛选的个体。所述受试者还可以是先前被诊断患有T1D的个体, 或已经开始治疗的个体,和正监视T1D进展的个体。术语"诊断(diagnose,diagnosis, diagnosing)"及其变形是指疾病或病症的鉴定(基于其体征和症状)。本文中,"阳性诊断" 表明鉴定出疾病或病症,或患疾病或病症的可能性。与此相反,"阴性诊断"表明未鉴定出疾 病或病症,或患疾病或病症的可能性。

[0345]在本发明的另一个实施方案中,所述方法可用于选择被预测将从T1D的治疗步骤 受益或不受益的患者。类似地,所述方法可用于指示对特定患者的具体治疗步骤或显示对 特定患者的具体治疗步骤不可取。在该实施方案中,所述方法通常包括以下步骤:(a)进行 本发明的方法用于检测本文详细描述的抗体;(b)将患者样品中的抗体水平与选自以下组 的抗体的对照水平进行比较:(1)与对治疗步骤的反应性有关的抗体的对照水平;和(2)与 对治疗步骤的非反应性有关的抗体的对照水平;和(c)挑选被预测将受益于治疗步骤的患 者,如果相对于与对治疗步骤的非反应性相关的抗体的对照水平,患者样品中的抗体水平 统计上更类似于与对治疗步骤的反应性有关的抗体的对照水平;或(d)挑选被预测将不会 受益于治疗步骤的患者,如果相对于与对治疗步骤的反应性相关的抗体的对照水平,患者 样品中的抗体水平统计上更类似于或低于与对治疗步骤的非反应性有关的抗体的对照水 平。例如,这种方法可用于指示给患者施用消炎剂或施用选择性靶向ZnT8或另一种自身抗 原或其表达的试剂,或显示给患者施用消炎剂或施用选择性靶向ΖηΤ8或另一种自身抗原或 其表达的试剂不可取。该实施方案的其他方面对本领域技术人员来说是显而易见的。

[0346]利用本发明的方法根据抗体检测的阳性诊断或预后指示,样品中存在的抗体水平 统计上显著高于同类样品中实验确定的或预定的阴性或"正常"抗体水平(即,"正常"水平 是在未患T1D的受试者中发现的抗体检测水平或其平均值)。为了确定阳性诊断或预后,试 样中检测出的抗体水平比设定或确定的基线增加的量是统计上有显著意义的(即,至少 95%置信水平,或ρ<0.05)。标准化或产生样品中抗体水平"指数"的方法是本领域已知的。 利用本发明的方法根据抗体检测的阴性诊断或预后指示,未在样品检测出抗体,或样品中 存在的抗体水平统计上没有显著高于(和可以低于)一种水平(该水平统计上显著高于实验 确定的或预定的阴性或"正常"抗体水平)。

[0347]本发明的另一个实施方案包括Τ淋巴细胞分析,其检测受试者中特异性结合ΖηΤ8 的Τ细胞的存在或缺失。如同上面讨论的抗体分析一样,本发明的所述方法可以基于患者血 清中抗ΖηΤ8的Τ细胞应答性水平有效鉴定或选择最有可能将患有或正患有I型糖尿病的患 者,包括预测以下因素,诸如发病时间,或监测疾病的进展或阶段。所述方法还可用于有效 鉴定或选择对具体治疗方法有应答或没有应答的患者(即,该方法用于指示对特定患者的 治疗方法或显示对特定患者的治疗方法不可取)。

[0348]在该实施方案的一个方面,所述方法包括根据ΖηΤ8多态性检测本文描述的异表 位。分析可以区别小肽,通常是8到20个氨基酸长度,其编码蛋白序列,包括分子的可变区或 恒定区。这种Τ细胞应答通常在外周血中监测,但也可用于获自身体其他部分的淋巴细胞 群。用于这种分析的分析平台可以基于增殖、细胞因子产生或活化的其他标记物,它们是表 面或胞内蛋白标记物或脂质或碳水化合物。这些分析的判断通常还涉及对个体的HLA1型和 2型基因型的了解。

[0349]在本发明的这些实施方案中,在检测患者试样的ΖηΤ8特异性Τ淋巴细胞(Τ细胞)应 答的分析法中提供包含至少一个ΖηΤ8Τ细胞表位的ΖηΤ8抗原。包括Τ细胞表位的ΖηΤ8蛋白和 抗原已在上文详细描述。例如,在一个实施方案中,体外翻译系统的产物可用于本分析。分 析形式可以是用于抗原的任意合适的Τ淋巴细胞分析,包括但不限于,Τ淋巴细胞增殖分析, 利用MHCI型和II型四聚体试剂的分析,流式细胞分析和ELISP0T分析。因此,合适的分析可 以包括基于细胞的分析和不基于细胞的分析。就后者来说,可以使用可溶性Τ细胞受体,例 如,在检测结合可溶性MHC分子(例如,四聚体试剂)的ΖηΤ8抗原的结合或免疫分析中。在前 一种情况下,检测抗原与细胞表面Τ细胞受体的结合,通常通过检测细胞的增殖或细胞的细 胞因子产生。在抗体分析中,本发明的Τ细胞分析可用于检测患者样品中超过一种或多种自 身抗原,和/或检测多个受试者中的Τ细胞应答。

[0350]如同所述抗体分析一样,根据ΖηΤ8Τ细胞应答的检测的阳性诊断或预后指示,患者 样品中存在的ΖηΤ8特异性Τ细胞(自体反应性Τ细胞)的水平统计上显著高于同类样品中实 验确定的或预定的这种Τ细胞应答的阴性或"正常"水平(即,"正常"水平是在未患T1D的受 试者中发现的Τ细胞应答水平或其平均值)。为了确定阳性诊断或预后,试样中检测出的 ΖηΤ8-特异性Τ细胞应答水平比设定或确定的基线增加的量是统计上有显著意义的(即,至 少95 %置信水平,或ρ<0.05)。标准化或产生样品中ΖηΤ8-特异性Τ细胞应答水平"指数"的 方法是本领域已知的。利用本发明的方法根据ZnT8特异性T细胞应答检测的阴性诊断或预 后指示,未在样品检测出ΖηΤ8特异性Τ细胞应答,或样品中存在的这种应答的水平统计上没 有显著高于(和可以低于)一种水平(该水平统计上显著高于实验确定的或预定的这种应答 的阴性或"正常"水平)。

[0351] 本发明还包括用于进行如上所述的任意一项诊断方法的试剂盒。所述试剂盒包括 (a)ZnT8抗原(包括如上所述的任意一种蛋白、肽或模拟物),用于液相中的分析或固定在基 质上(可以提供已经固定的抗原或以适于固定的形式提供抗原);和(b)用于检测抗体与抗 原的结合的试剂,和/或用于检测T细胞受体与抗原的结合的试剂(在基于细胞或不基于细 胞的分析中)。用于进行所述分析的其他试剂还可以包括,诸如,但不限于,缓冲液,二抗,用 于读取所述分析的可检测标记和试剂,可溶性结合蛋白(例如,可溶性MHC,可溶性T细胞受 体),和其他有用的试剂。

[0352] 本发明的另一个实施方案涉及在治疗和预防性策略中基于鉴定ZnT8作为重要的 自身抗原开发和使用各种试剂给受试者接种以在个体中预防、延缓或改善I型糖尿病的发 病,抑制或破坏抗胰岛β细胞的自体反应性Τ细胞应答,和/或将抗胰岛β细胞的免疫应答从 破坏性应答变为破坏性更低或保护性更高的应答。

[0353]在一个实施方案中,ΖηΤ8蛋白、肽、同系物、模拟物、ΖηΤ8抗体或其抗原结合片段, 及其他ΖηΤ8衍生的或基于ΖηΤ8的试剂(包括肽或抗体的化学或物理改造形式)在体外或体 内给受试者施用,以便改变T1D发展或发病的过程,和/或在受试者中诱导ΖηΤ8特异性的Τ淋 巴细胞应答,其是致耐受或保护性的,而不是破坏性的。在一个实施方案中,这种试剂作为 疫苗施用。这种ΖηΤ8相关的试剂已经在上文描述。

[0354]在另一个实施方案中,将基于ΖηΤ8的抗原特异性试剂(被设计成靶向于ΖηΤ8特异 性自体反应性Τ细胞)以及在Τ细胞中诱导凋亡或对Τ细胞有毒性的药剂给受试者施用。该方 法可以在体内或体外进行。例如,形成肽-结合沟的可溶性MHC分子(参见,例如,美国专利号 5,820,866)与21^8抗原或致耐受肽(根据该实施方案包括21^8的突变肽和同系物,它们结 合MHC并引发Τ细胞应答)结合。这种复合物可以与毒素或其他试剂进一步复合(通过任意共 价或非共价技术),当Τ细胞通过它们的Τ细胞受体结合MHC-肽复合物时,所述毒素或其他试 剂将诱导Τ细胞的坏死或凋亡。

[0355] 适用于本发明作为与ΖηΤ8肽和同系物复合(结合,偶联)的试剂的毒素包括对细胞 有毒性的(坏死或凋亡)任意毒素或蛋白、试剂或分子,包括可用于本文所述治疗环境的任 意毒素。这种毒素包括,但不限于,Fas配体,美洲商陆抗病毒蛋白,肉毒毒素,蓖麻毒,等等。

[0356] 此外,从本文描述的遗传、自身抗体和T细胞分析获得的知识可用于决定使用具体 的治疗方式。这种方式可基于与ZnT8或Slc30A8无关的试剂,或抗原特异性试剂,诸如单独 的或与另一试剂(例如毒素)连接的重组ΖηΤ8蛋白、ΖηΤ8衍生肽,细胞诸如淋巴细胞,蛋白诸 如HLA分子或免疫球蛋白,或单独的或与另一试剂连接的Slc30A8DNA。治疗可基于抗原或编 码它的核酸或抑制其表达,可以根据所需结果进行调整与异表位匹配或者不匹配。与具有 自身反应性的患者的异表位匹配可能是保护性的,通过诱导耐受性体质。另一方面,与其不 匹配是一种免疫形式,其也可以被控制用于有益效果。起初就知道个体的异表位状况将是 重要的,因为这将决定按照哪条途径和使用哪种亚型的药剂。

[0357] 这种治疗方法将与目标在于检测治疗剂效果的诊断分析结合。一些情况下这种诊 断将是上文提及的自身抗体和T细胞分析的重复;但是产生的一些试剂可应用于疾病特异 性目标。例如,包含或编码治疗剂的异表位可应用于Β淋巴细胞,以扩增、活化或除去特定细 胞类型。治疗效果可以按照靶细胞类型的群来评价,例如,使用与荧光分子的酶偶联的异表 位肽标记Β细胞群,然后可以通过流式细胞术进行计数和表型表征。这种步骤还可以用于这 种细胞群的分离,通过筛选步骤或荧光活化的细胞分选。

[0358] 上述用于本发明预防和治疗方法的试剂可以单独施用,在组合物、制剂或疫苗中 施用,和/或与用于T1D的预防或治疗的其他试剂联合施用(一起或连续地)。正如以上的讨 论,将本发明的组合物或药剂以有效输送该药剂到靶细胞或靶位点的方式给患者施用,这 样的话所述药剂可以作用于该位点和/或对所述细胞起作用。合适的施用方案包括任意体 内或体外施用方案。有效施用方案(即,以有效方式施用本发明的组合物或药剂)包括合适 的剂量参数和施用模式(在受试者或细胞中产生组合物或药剂的所需活性),诸如对自身抗 原ΖηΤ8的自体反应性Τ细胞的耐受性,胰岛炎的预防或减少和/或胰岛β细胞的破坏,及发病 的预防、延缓,或T1D严重性的改善。优选的患者获得来自所述施用的一些可测量的、可见的 或感觉得到的受益。可以通过实验,例如,利用体外细胞培养,体内动物模型,和最终,临床 试验(如果患者是人),确定有效的剂量参数。可以利用本领域标准的针对具体疾病或病症 (患者患有或具有患病的风险)的方法测定有效的剂量参数。这种方法包括,例如,存活率、 副作用(即,毒性)和发病、疾病的进展或消退的测定。

[0359] 给药途经包括体内、体外和离体途径。体内途径包括,但不限于,静脉内施用,腹腔 内施用,肌内施用,节点内施用,冠状动脉内施用,动脉内施用(例如,进入颈动脉),皮下施 用,透皮输送,气管内施用,皮下施用,关节内施用,心室内施用,吸入(例如,气雾剂),颅内, 脊柱内,眼内,耳,鼻内,口服,肺部施用,导管的注入,和直接注射入组织。在本发明的一个 优选实施方案中,通过肠胃外途径(例如,皮下,皮内,静脉内,肌内和腹腔途径)施用组合 物。可以利用本领域标准的方法进行静脉内、腹腔内、皮内、皮下和肌内施用。耳输送可以包 括滴耳剂,鼻内输送可以包括滴鼻剂或鼻内注射,和眼内输送可以包括滴眼剂。气雾剂(吸 入)输送还可以利用本领域标准的方法进行(参见,例如,Stribling et al., Proc .Natl .Acad. Sci.USA189:11277-11281,1992,其在此完整引入作为参考)。可以将本发 明的药剂或组合物与载体(能够抵抗动物肠内消化酶的降解)络合,进行口服输送。这种载 体的实例,包括塑料胶囊或片剂,诸如本领域已知的那些。

[0360] 体外是指在患者体外进行调控步骤的一部分,诸如通过输送药剂或组合物到细胞 群(或将细胞与药剂或组合物接触),其中细胞已从患者取出,并将处理后的细胞返回到患 者。这种细胞可以包括,例如,T细胞,其中T细胞被诱导改变它们在体内接触ZnT8时产生的 免疫应答类型。给宿主细胞的培养物施用组合物的体外和离体途径通过以下方法实现,包 括但不限于,转染,转化,电穿孔,显微注射,脂质体转染,吸附,原生质体融合,蛋白载体的 使用,离子载体的使用,用于细胞透化的去污剂的使用,和在培养物中将化合物与靶细胞 和/或靶蛋白简单混合(例如,结合)。

[0361] 对于蛋白、小分子(即,药物设计的产物)或抗体来说,优选的这类药剂的单次剂量 通常包括约0.01微克X千克-1到约10毫克X千克-1动物体重。更优选的药剂的单次剂量包 括约1微克X千克-1到约10毫克X千克-1动物体重。更优选的药剂的单次剂量包括约5微克 X千克-1到约7毫克X千克-1动物体重。甚至更优选的药剂的单次剂量包括约10微克X千 克-1到约5毫克X千克-1动物体重。如果药剂是肠胃外输送,另一种尤其优选的药剂的单次 剂量包括约〇. 1微克X千克-1到约10微克X千克-1动物体重。

[0362] 由本文所述方法产生的预防或治疗效果不必是治愈具体的疾病或病症(例如,I型 糖尿病),而是还可以包括以下结果:大部分情况下包括前驱糖尿病或明显T1D的发病的延 缓,或疾病破坏性方面的改善,这样的话与没有所述治疗情况下的预期相比,完全的胰岛损 伤将被推迟更长时间,从而给予患者更长的时间来完成对胰岛素疗法的依赖,其他治疗介 入,和疾病的下游有害健康影响。如本文使用的,短语"预防疾病"是指减轻疾病的症状;减 少疾病的出现或发病,和/或减轻疾病的严重性。保护患者是指给患者施用本发明的药剂或 组合物时,其预防疾病出现和/或治愈或减轻疾病症状、体征或病因的能力。像这样,保护患 者免患疾病包括预防或延缓疾病发生(预防性治疗)和治疗患有疾病或处于疾病早期的患 者(治疗性治疗)。术语,"疾病"泛指与哺乳动物正常健康状态的任何偏离,包括存在疾病症 状时的状态,以及其中存在偏离(胰岛辟田胞的破坏)但症状还未显示的病症。

[0363] 本发明的另一个实施方案涉及一种鉴定可用于本文描述的诊断分析,或本文描述 的本发明预防或治疗方法的化合物的方法。这种方法包括以下步骤:将基于ZnT8的药剂(例 如,ΖηΤ8核酸分子,蛋白或肽,同系物,模拟物,或抗体或其片段,或ΖηΤ8特异性Τ细胞受体) 与推定的调控化合物接触,并检测相互作用和/或由推定的调控化合物与基于ΖηΤ8的药剂 相互作用产生的作用。这种分析可以是基于细胞或不基于细胞的。例如,可以利用如上所述 的ΖηΤ8蛋白(包括片段及其同系物)鉴定选择性结合ΖηΤ8的抗体及其抗原结合片段。可以使 用ΖηΤ8抗体或ΖηΤ8特异性Τ细胞受体鉴定ΖηΤ8同系物,肽模拟物,突变肽和片段,它们可用 于诊断或治疗分析。基于ΖηΤ8的试剂可用于设计新的合成试剂,包括模拟物,用于本文描述 的诊断或治疗方法。还可以使用ΖηΤ8核酸分子,蛋白,肽,模拟物或抗体来鉴定在个体中可 以抑制或改变针对ΖηΤ8的免疫应答的各种调控化合物。

[0364] 这种方法的步骤通常包括将基于ΖηΤ8的试剂与推定的调控化合物接触,利用各种 分析测量对基于ΖηΤ8的试剂的作用,诸如检测ZnTSmRNA转录(例如,通过聚合酶链式反应 (PCR),逆转录酶-PCR(RT-PCR),原位杂交,Northern印迹,报告基因的序列分析或检测);检 测ZnT8翻译(例如,通过免疫印迹,酶联免疫吸附分析(ELISA),放射免疫分析(RIA),免测沉 淀,免疫组织化学和免疫荧光);和/或检测ZnT8生物活性(例如,通过检测本文描述的任意 一项ΖηΤ8活性,或通过检测这种活性的抑制或遏制)。该方法中检测到的化合物可用于本文 描述的诊断、预防或治疗方法。

[0365] 根据本发明,本文描述的方法和分析适用于作为脊椎动物类哺乳纲成员的患者, 包括但不限于,灵长类动物,家畜和家养宠物(例如,伴侣动物)。最常见,患者是人类患者。

[0366] 提供下列实施例是用于说明目的,而不是用于限制本发明的范围。下文和本文其 他处公开的每篇出版物或其他参考文献均在此完整引入作为参考。 实施例

[0367] 实施例1

[0368]下列实施例描述将ΖηΤ8(亦称Slc30a8)首次鉴定为新的糖尿病自身抗原。

[0369] 本发明人利用人U133和小鼠 M0E430 Affymetrics芯片(实际上覆盖了完整基因 组)以及Panchip 5.0(报告小鼠胰腺中的基因转录物)进行寡核苷酸微阵列实验。从正常小 鼠、糖尿病模型(NOD和ob/ob)及IAPP基因和Ngn 3缺陷小鼠的分离的胰岛,以及小鼠胰腺肿 瘤细胞系(aTCl-6胰高血糖素瘤,i3TC3和Min6胰岛素瘤和mPAC导管瘤系)获得数据。分析所 述数据,高亮显示具有小岛细胞型特异性表达的转录物,以及它们在胰腺和细胞之间 的分布。使用基于基因本体论(GO)注释的进一步分析来产生人和小鼠候选自身抗原的基因 列表。在10个得分最高的候选物中,5个是已知的糖尿病自身抗原,促使本发明人对高得分 转录物(对应于ZnT8)中的一种作为新发病的T1D人类受试者中体液自身免疫性的靶标进行 验证原则化1'〇(^-(^11';[11(^口16)实验。开发的针对该候选物的血清学分析在20%的糖尿病 受试者中检测到免疫反应性,而在对照中没有检测到(<2.5%)。现在的计划利用体液和细 胞介导的自身免疫性的分析寻求检查所述列表中的这种和其他基因候选物。

[0370] 具体来说,覆盖几乎所有编码的小鼠 mRNAs范围(转录组)的基因微阵列的出现使 得能够鉴定在胰岛中表达的基因亚组。大量公开的研究已经记载了在胰岛组织、特异性小 岛细胞类型和胰岛来源的细胞系中表达的基因(67)(51^1以,2002)(68)。此外,研究报告了 胰岛对生理和病理生理处理(诸如在体外用葡萄糖或炎性细胞因子刺激)的应答,及载有突 变基因(影响胰功能或发育)的小鼠的胰岛的应答。令人遗憾地,目前该数据的大部分不能 从中央库公共数据库获得,或在各种微阵列平台上,使得数据标准化非常困难。本发明人利 用人U133和小鼠 M0E430寡核苷酸芯片(实质上报告了每个物种的全部转录物)进行了超过 50次微阵列实验。这包括来自正常小鼠、糖尿病模型(N0D和ob/ob)及IAPP基因和Ngn 3缺陷 小鼠的数据。后者完全缺失胰腺内分泌腺细胞,因此在不同妊娠时间点的分析允许鉴定在 整个发育期间相对于外分泌和导管组织在内分泌腺细胞中高表达的转录物(69)。已经将这 些数据与来自45个组织类型(Novartis数据集和Unigene表达模式)的较大非胰腺组织库的 阵列数据和dbEST序列数据进行比较。小鼠胰腺肿瘤细胞系(aTCl-6胰高血糖素瘤,i3TC3和 Min6胰岛素瘤和mPAC导管瘤系)的分析进一步允许产生预示分数,以选择有可能显示小岛 细胞型特异性表达的转录物,以及它们在a_和β_细胞之间的分布。这些细胞系表达与肿瘤 细胞表型有关的基因,因此还对来自表达自身抗原Phogrin(与EGFP相连,受大鼠胰岛素2启 动子的控制)的转基因小鼠的分离胰腺辟田胞进行分析。表2列出一些基因,对于这些基因通 过AN0VA分析确定转录物,首先是在任意胚胎学年龄的Ngn3野生型和敲除小鼠(胰腺内分泌 腺和前体)中差别表达,其次是存在于成年小鼠胰岛。然后基于在aTC和i3TC细胞系中的相对 表达将所述列表进行划分。所述方法成功地预测了参与胰岛发育的大多数已知转录调控组 分的小岛细胞特异性,诸如Ipf 1,Arx,Pax4,Pax6,Brn4,NeuroD及数个a和β细胞基因的已知 细胞类型特异性。已知的神经内分泌转录物诸如PTPRN( ΙΑ-2)、激素原转化酶(Pcskl, Pcsk2,Cpe)和granins(Chga,Chgb Scg2,Sgne 1)属于常见的aTC和PTC转录物的库。根据预 测,与other胰岛内分泌腺细胞有关的基因不表达(Ppy,Pyy和ghrelin)。在已知基因中存在 一些意外,例如WilliamsBeuren综合征染色体区域14基因作为显示β细胞特异性的转录物 出现。该转录因子是糖酵解和葡萄糖异生作用酶的重要调节因子,与肝起源的2型糖尿病形 式有关(70)。它通常被认为分布广泛。利用原位杂交分析追踪(数据未显示)显示,实际上转 录物被发现于发育胰腺的区域(此处出现内分泌腺细胞),在成年胰腺中,转录物限于胰岛, 其分布符合细胞的特异性。

[0371] 表2.检查基因转录物(在Ngn3 ko胰腺中el2.5、el5.5或el8.5被去除)在内分泌腺 细胞系aTC和PTC和成年胰岛中的表达。胰岛内分泌腺细胞的组分用下划线表示;已知的自 身抗原用黑体字突出显示。

[0372]

Figure CN101646781BD00431

[0373] 表2还显示已知T1D自身抗原的分布,用黑体字突出显示。这种相对简单的生物信 息学分析显示,胰岛素1和2,161^(66?^8),14??和14-2(?了?1^)位于它们的预期细胞位 置,但GAD65不是这种情况。但是大部分研究者包括本发明人未在小鼠胰岛中检测到后者, 尽管它在人胰岛中是高丰度的(71)。上述分析强调了以下事实,许多自身抗原显示细胞类 型特异性。但是其自身不足以确定候选物,因此改进所述生物信息学方法以考虑大量被认 为是自身抗原候选物属性的特征,同时根据存在/缺席呼叫(present/absentcal 1)不排除 候选物。模型基本上考虑了下列特征:

[0374] 1.自身抗原显示对祀细胞的特异性,尽管这不必是绝对的。

[0375] 2.大多数自身抗原在靶细胞中以中等到高水平表达。

[0376] 3. T1D自身抗原看起来与调节分泌途径的元件物理相关。

[0377] 4.细胞介导的自身免疫的许多靶标看起来是膜结合型的。

[0378] 5.大部分还在胸腺的外周抗原表达细胞中表达。

[0379] 6.数个显示选择性剪接的组织特异性模式。

[0380] 特征1-4可以是基于微阵列数据集的交集和组成基因的注释进行评价。人们认为 有可能基于这类数据推算出"自身抗原指数",尽管重点放于对抗原性有贡献的具体结构、 分子生物学和细胞生物学特征正在确定,就像与细胞介导的应答相比对体液介导的应答的 相对贡献一样。为解决这个问题,本发明人编译了2组基因,一组针对小鼠,一组针对人,基 于对内分泌胰腺表达的丰度和特异性(表3);小鼠数据源自表2中的数据,关于表达数据的 人类数据源自79个人类组织的Novartis GeneAtlas(72)。在GeneSpring和GeneSpeed中进 行分析,后者是由Jan Jensen及其同事在科罗拉多丹佛的Barbara Davis Center开发的蛋 白结构域数据库。

[0381] 表3

[0382] A:小鼠 β细胞转录物选择308个转录物,依据是它们不存在于缺失Ngn3的小鼠胰 腺,存在于成年胰岛,及它们存在于β-TC细胞系。在UnigeneEST表达数据库中查询这些基因 中的每一种,以确定每种基因在38个不同小鼠组织包括胰腺(但不包括胰岛)中转录的频 率。列表显示每百万EST克隆频率,以及与所有组织中的总数相比在胰腺中注明的转录物百 分比(特异性)。丰度和特异性的结果用于分选数据。编码已知糖尿病自身抗原的转录物被 突出显示。

[0383] B:人转录物最初查询代表71个不同人组织的Novartis定制寡核苷酸阵列,以确定 胰岛数据集中的哪种基因显示与所有其他组织的中值显著不同的信号(AN0VA截断< 0.0002)。筛选出这些转录物的子集(显示比所有组织的中值高5倍的信号),以去除显示低 信号强度(<200)的转录物,并且相对于胰岛所述子集在胰腺中的表达水平更高。然后将符 合这些标准的140个基因用于查询Unigene EST表达数据库,以确定每种基因在52个不同人 组织包括胰腺中的转录频率。列表显示胰腺的每百万EST克隆频率(丰度),以及相对于所有 组织来说,胰腺中转录物的百分比(特异性)。数据按Abu*Spe C指数分类。编码已知糖尿病自 身抗原的转录物被突出显示。

[0384]

Figure CN101646781BD00451

[0385] 在所述两种情况下,已知的糖尿病自身抗原在所述列表中出现靠前,甚至次要的 体液自身免疫靶标诸如ICA69和GAD67也属于最前面的100个候选物。两种列表上的转录物 显著重叠,它们的相对丰度和组织特异性相似,除了GAD65外,与人相比时,它在小鼠中表达 很少。位于最前面100个中的许多蛋白是分泌颗粒蛋白或与分泌途径有关的膜蛋白,这通过 检查SWISSPROT,Prosite和EPCONdb数据库的基因本体论(G0)功能得到确定。

[0386] 为了解决这些基因列表是否能够真正预测自身抗原靶标的问题,本发明人开发了 针对Slc30a8(现被称为ZnT8)的免测沉淀分析,Slc30a8是一种跨膜阳离子转运蛋白,其在 小鼠和人类基因列表中表现靠前,是具有中等丰度但高组织特异性的转录物。利用克隆序 列的体外翻译及人类血清(来自接受胰岛素疗法之前44例新发病受试者及40岁和HLA配对 对照),开发出一种放射免疫沉淀分析法(图1)。具体来说,从人胰岛cDNA扩增Slc30A8,并将 其克隆入PCDNA3定向拓扑载体,验证序列,在利用5yCi 35S甲硫氨酸的网织红细胞裂解物 体外翻译反应中用作模板(〇. 5yg)。将人血清样品(5μ1)与20,000dpm翻译产物在50μ1包含 0.1%ΝΡ40的Tris缓冲盐溶液中4°C温育过夜。将固定的Protein Α添加到每种温育液中,利 用过滤分离免疫球蛋白结合的放射性并通过闪烁计数测定。

[0387] T1D血清样品中的9个显示显著高于对照血清观察到的结合水平(MannWhitney非 参数双尾检验),高达所述分析中存在的放射性配体的50%。自身抗体在早期发病(<8岁) 和年龄更大的患者(>8岁)中都存在。在9例阳性患者中,6例经检测还对胰岛素自身抗体显 示阳性,5例对GAD显示阳性,6例对IA-2显示阳性。Slc30a8看起来是独立的疾病标记物。

[0388] 诊断血清学分析及用于细胞介导的自身免疫性的分析的进一步发展需要产生至 少功能上纯的、折叠成天然构象并不含促有丝分裂杂质的抗原。这不是一个小问题,尤其是 对于跨膜蛋白像Slc30a8和IGRP来说,它们在过表达时对细菌和真核细胞是倾向于有毒性 的。

[0389] 就IGRP来说,本发明人先前就能够表达天然形式的高水平抗原,通过利用受调控 的金属硫蛋白启动子驱动的构建体稳定转染果蝇S2细胞。已经利用IGRP反应性的T细胞杂 交瘤克隆检测了这种细胞的粗制膜组分(CMF),所述杂交瘤克隆通过将IGRP免疫N0D小鼠的 引流淋巴结细胞与BWZ36淋巴瘤系(在IL-2启动子的控制下稳定表达LacZ)融合产生(73)。

[0390] 例如,在图2A显示的数字化图象中,S2细胞用mIGRP V5 His构建体稳定转染,并用 0.5mM Cu诱导表达,细胞膜组分(CMF)用抗V5抗体进行印迹。用TX-100有效提取蛋白,将其 与金属螯合物亲和层析柱结合,并在非变性条件下用咪唑洗脱。图2B是显示对IGRP-CMF T 细胞杂交瘤(克隆1-76-54)进行应答分析的图示。将T细胞杂交瘤(2X105细胞/孔)与作为 APCs的辐射N0D脾细胞(1 X 106细胞/孔)和抗原(IGRP-CMF或S2-CMF,1 Oyg蛋白/孔)温育过 夜。对β半乳糖苷酶活性进行分光光度法分析。图2A-3B显示,IGRP生成受金属硫蛋白启动子 的紧密调节(图2Α),粗制膜组分可以被哺乳动物APCs加工以诱导来自IGRP反应性Τ细胞杂 交瘤克隆的IGRP特异性应答(图2B),利用氯-酚红-β-半乳糖苷作为底物测定。推定抗原的 昆虫细胞表达与Τ细胞增殖或杂交瘤活化分析的组合提供了一种通用但有效的标准操作方 案集合,它们应当适应各种蛋白,包括可溶性和膜组分及需要糖基化和其他翻译后修饰的 蛋白。

[0391] 实施例2

[0392] 下列实施例描述了鉴定体液和细胞介导的自身免疫的其他靶标的分析,通过进一 步评价表3中潜在候选物的候选名单(参见实施例1)。

[0393] 最初,对于不熟悉的候选物和只用ESTs表示的分子,获得全长克隆,对人和小鼠胰 腺组织进行原位杂交分析以验证它们在辟田胞中的表达。 _4] 在人类受试者中通过血清学分析筛选候选抗原。

[0395]这些分析最好在人类受试者中进行,由于免疫应答基因的遗传多样性和复杂性, 它们很可能显示更宽的自身免疫应答谱。还可以利用半自动化方法采用96孔模式以每个样 品低成本每天筛选大量样品。Barbara Davis Center已经保存了数以万计的样品,根据HLA 单倍型、对与T1D有关的分子(胰岛素,GAD65,IA2,phogrin)的自身反应性、与乳糜泻有关的 分子(转谷氨酰胺酶IgA)的自身反应性及与多内分泌腺疾病有关的分子包括影响肾上腺皮 质(21β-羟化酶Addisons (74))和甲状腺(TSH受体(75))的自身反应性进行充分注释和分 析。可以获得来自新发病患者的超过20,000份血清,以及数量较少的来自未患有T1D的同卵 双生的样品和获自糖尿病患者一级亲属的系列样品,跨越的疾病阶段从抗体阴性,到单个 和多个抗体阳性,和疾病发病。

[0396]首先开发出两种分别基于放射免疫沉淀和时间分辨荧光检测(TRF)方法的分析 法。这两种分析法均需要克隆和表达候选抗原,本发明人采用一种通用方法,其起始于逆转 录的mRNA或经验证的MGC质粒(其作为PCR模板,利用被设计成能将序列插入Invitrogen GATEWAY进入载体的引物)。基于进入载体,所述序列通过单步重组就可被指向体外翻译,细 菌重组蛋白的产生,腺病毒或杆状病毒生成。

[0397]对于放射性沉淀分析,在利用网织红细胞裂解物和5yCi 35S甲硫氨酸的偶联转 录/翻译反应(TNT试剂盒;Promega)中,将克隆的受CMV启动子控制的cDNA用作模板(0.5μ g)。将96孔板中的血清样品(5μ1)与20,OOOdpm翻译产物在50μ1包含0.1 %ΝΡ40的Tris缓冲 盐溶液中4°C温育过夜。然后将固定的Protein A添加到每种温育液中以捕获免疫球蛋白结 合的放射性,然后利用过滤回收并通过闪烁计数测定放射性。在每次分析中运行阳性和阴 性标准血清以实现标准化和归一化。

[0398]为了进行TRF分析,根据情况cDNA在大肠杆菌或昆虫细胞中被表达为组氨酸标记 的构建体,并通过金属螯合物层析纯化。96孔板用纯化的蛋白(l-lOμg/ml)包被,封闭,然后 与血清在50μ1包含0.1%NP40的Tris缓冲盐溶液中4°C温育过夜。利用与铕偶联的小鼠抗人 IgG(DELFIA)和酸性pH下的时间分辨荧光测量法(Victor 2多通道计数器)确定与板结合的 免疫球蛋白。在这两种类型的分析中,利用抗体与重组抗原的预吸附作为对照以检测特异 性并排除异嗜性抗体假象。就膜结合的抗原而言,可能证明必需利用结构域特异性构建体 而不是全长分子进行,但这可以通过设计扩增特异性结构域的引物及按如上所述的相同方 法克隆来实现。

[0399]最初目标是筛选190份新发病T1D血清和190份配对对照的库,确定每种分析的特 异性和灵敏性,利用受试者工作曲线分析来确定可接受的截断和Mann Whitney非参数检验 来确定统计显著性(Prism软件;Graphpad Inc.)。通过进一步优化分析步骤以最小化背景 并最大化信号/噪音来追踪糖尿病血清的阳性结果。真正的阴性结果(低背景和信号/噪音 为1)之后可进一步改进所述分析,例如在体外翻译分析中引入胰腺微粒体。利用无疏水性 结构域的构建体,不同的阻断剂,不同的免疫球蛋白捕获方法及将试验血清与重组抗原预 吸附的样品对比,通过降低分析中噪音的共同努力,具有低疾病特异性的分析有时可以被 改进。指向故障排除的努力的程度将明显取决于问题的本质和疾病特异性的自身反应性是 否是可疑的这一指示。对有希望的分析法进行追踪,通过将其应用于其他可用的临床样品 以回答以下问题:在自然病史中自身反应性何时存在,自身反应性与其他自身抗原的重叠, 以及是否存在与患者的年龄或HLA状况的关联。本发明人实验室和Barbara Davis Center 的大量出版物用做所述研究的模板(76;77)。

[0400] 在HLA-DR3、-DR4和-DQ8转基因小鼠中筛选针对候选抗原的细胞介导的免疫应答。

[0401 ] 本发明人先前的数据显示,B10 . Μ背景下HLA-DQ8 +1-Αβ°/°小鼠可以引发针对 phogrin表位肽2和7的CD4+T细胞回忆应答,并且相同的肽被人类新发病患者(其中许多具 有DR4/DQ8单倍型)中的外周T细胞作为靶标(78)。这些先前的研究支持以下预测,人HLA-DQ8对小鼠 I-Ag7具有类似的结合特异性,而且所述-DQ8分子在小鼠或人共刺激和辅助分子 的环境下可以呈递抗原。它们确认了小鼠转基因模型作为鉴定与人类疾病有关的表位的方 法的应用,即使当HLA转基因不是在严格地糖尿病易感的背景下携带。为了评价任何候选抗 原(在1A型糖尿病人中可以被MHC易感基因座呈递)的T细胞表位的完整谱,利用转基因!11^-DQ8、-DR3 (DRB1 *0 301)和-DR4 (DRB1 *0401)小鼠作为代表已知的糖尿病易感基因座和HLA-DR2(DRB1*1502)作为与糖尿病无关的"保护性" II型分子的对照,对用人重组蛋白免疫后的 T细胞回忆应答进行分析。

[0402]动物:产生HLA-DR和-DQ转基因小鼠的数个品系来评价这些分子在塑造疾病(诸如 T1D、实验性自身免疫性脑炎和全身性红斑狼疮)中免疫应答的作用(79;80)。本发明人从 Dr. Che 11a David (Department of Immunology, Mayo Clinic,Rochester,MN)处获得!11^\-DQ8+I-Af3〇/o,-DR2,-DR3和-DR4转基因小鼠,并在我们的中心建立这些小鼠的群落。最近从 01'.6代七&3〇11(16181:1'卯,3七&11;1^〇1(11]11;[¥618;^7获得具有人004的第二!11^\-01?4系,其数量目 前正在扩增。利用Ι-Αβο/ο I-Eao/o背景的基因组构建体制备HLA-DQ8(DQA1*0301/DQB1* 0302)小鼠,因此产生HLA-DQ8作为唯一的II型分子。基因组-DR2(DRB1*1502)及-DR4(DRB1* 0401)和-DR3(DRB1*0301)的cDNA构建体与小鼠 I-Ea或人DRa转基因配对。通过对取自尾部 的DNA进行PCR,将所有的转基因动物根据MHC表达进行基因分型,对PBMCs和脾细胞进行 FACS分析以确定人转基因的表达水平并监测小鼠 MHC基因产物的表达。

[0403] 抗原呈递细胞(APCs):辐射过的(20_35Gy)同基因小鼠脾细胞或源自骨髓的DCs被 用于CD4+细胞的体外刺激,通过在蛋白抗原(l-100μg/ml)或肽(0. l-10μg/ml)存在的条件 下共温育。使用时,在用25号注射器针头灌洗后,从8-12周龄雄性小鼠的胫骨和股骨的骨髓 制备DCs。碎片和大的细胞聚集物通过过滤(70μπι网目)去除,红细胞用NH4C1裂解,将细胞重 悬于RPMI1640(包含10%热灭活的无内毒素 FBS),并添加抗生素、丙酮酸盐(1πιΜ)、β-巯基乙 醇(50μΜ)和10ng/ml GM-CSF。在第2天和第4天通过用新鲜培养基替换去除未粘附的细胞, 第6天回收粘附不牢的细胞(主要是含有一些污染的单核细胞和粒细胞的未成熟DCs)。在这 个时候细胞将与重组抗原以及〇. lμg/ml细菌脂多糖(LPS)接触24-48小时,以诱导II型MHC 分子的"成熟"和上调。

[0404] T细胞系和杂交瘤:利用我们先前已经使用过的策略(78)从转基因小鼠产生T细胞 系和克隆,所述策略依赖于免疫(在尾巴基部皮下注射溶于50ylCFA的5-100yg重组抗原)以 诱导抗原特异性应答。在免疫后8-10天从腹股沟和主动脉周淋巴结收集T细胞,检测针对抗 原的CD4+回忆应答,其优选的在选择性载体系统(即用S2细胞的His标记抗原免疫;用细菌 GST杂合物回忆)中产生。随后使用抗原特异性细胞产生T细胞杂交瘤。T细胞将要经受单轮 体外刺激,然后聚乙二醇介导其与BWZ36胸腺瘤(其在IL-2启动子的NFAT元件控制下稳定表 达LacZ)融合(73)。撤1'抗性系将在1^1/^3中繁殖,利用有限稀释克隆,并通过将1\105个 杂交瘤细胞与1 X 106个同基因脾细胞在RPMI/FBS和抗原中共培养进行分析。在16-24小时 后,诱导的β半乳糖苷酶利用可溶性比色底物氯-酚红-β-半乳糖苷进行测量(参见图1),或 在单独的固定杂交瘤细胞中利用X-Ga 1。为了证明MHC限制性,还利用选择性AP C s分析杂交 瘤,所述APCs包括具有相同遗传背景的非转基因小鼠的脾细胞,和一组EBV转化的B淋巴样 干细胞系(该细胞系是我们从T1D和对照器官供体建立的);参见(78)。为了确认克隆形成能 力和评价克隆多样性,通过反向PCR测序从总RNA制备的克隆cDNA,确定TCR使用(81)。

[0405] 本发明人现有的经验(研究HLA-DQ8+和DR4+转基因动物中对phogrin细胞质结构 域的T细胞应答)表明,推论的针对其他抗原的免疫原性、应答应当在这些动物中获得,并且 它们可能是提供消息的。按照呈递相关肽的能力,I_Ag7和-DQ8是功能高度相似的,尽管载 有这些分子的APCs不会越界呈递给限于同源分子的T细胞。因为高亲和力类型转换抗体的 产生是T依赖性的步骤,可以预料从用抗原(先前在如上所述的实验中显示引发自身抗体) 免疫的动物中将检测到回忆应答。但是,转换不必是真实的;不显示体液免疫的抗原仍然可 以是细胞介导免疫的靶标。在本研究中HLA-DR2转基因被归入II型分子,其与糖尿病易感性 无关,可以连接到与疾病无关的不同表位。本发明人先前的经验表明,利用杂交瘤而不是T 细胞克隆更可能获得更高的TCRs多样性,因此我们开始的焦点是制备这种试剂。

[0406]与N0D小鼠不同,人类糖尿病受试者表达多种MHC II型分子,未来研究的一个可能 领域就是在二倍转基因动物中研究各种糖尿病易感性或保护性等位基因。例如,HLA-DR3/-DQ8动物,患有更严重的胰岛炎(但不是糖尿病),并且与亲本动物相比,显示对GAD65增强的 自发应答(82;83)。不受理论约束,本发明人相信它们还可能显示对候选自身抗原增加的应 答性。类似地,可以检查共表达HLA-DR3和-DR4或HLA-DR2和-DQ8的效果。

[0407] 实施例3

[0408]下列实施例描述了另外的与鉴定ZnT8作为糖尿病自身免疫性的新标记物和靶标 有关的实验。

[0409] 编码ZnT8的cDNA可以作为糖尿病自身免疫标记物的观点来源于基因敲除小鼠 (Ngn3缺失)的微阵列数据集的生物信息学分析及与其他组织中组织表达模式的比较(实施 例l)。最初,所述标记物被注释为对应于RikenESTC820002P14的UnigeneMm.208831,然后 认识到其对应于ZnT8。

[0410] 本发明人制备了全长ΖηΤ8,并进行了一系列实验,在放射免疫沉淀分析中利用新 发病的糖尿病血清检测了该蛋白。原始数据表明10%的患者显示反应性,指示ΖηΤ8可以作 为用于I型糖尿病诊断分析的新自身抗原。

[0411] 然后本发明人设计并制备了 ΖηΤ8的C端片段,其最终对应于全长分子的大约102个 氨基酸。在分析法中对该片段的检测概述如下。

[0412] 利用ΖηΤ8片段检测来自144例新发病T1D患者(年龄1到55岁;平均年龄11.9岁)的 血清,在放射免疫沉淀分析中45 %是血清阳性的,与此相对,在年龄和HLA配对对照组中血 清阳性<1%。按照年龄分层显示,在年龄更大的个体中抗体显示倾向于更高,在12-15岁的 糖尿病发病组中达到70 %的顶点。该年龄模式类似于其他糖尿病自身抗原(GAD65和ΙΑ2)的 模式,但比胰岛素抗体出现更晚。对所述新抗原的自身反应性显示与IAA、GAD和ΙΑ2的自身 反应性水平无关,因此其被认为是一种独立的标记物。

[0413] 分析来自9例个体的样品,所述个体从< 1岁追踪到临床糖尿病的发病。这些来自 于Barbara Davis Center进行的同胞队列的DAISY研究。在前驱糖尿病的过程中这些个体 中的8例是血清阳性的。在前驱糖尿病的过程中自身反应性倾向于出现更晚,通常接着出现 GAD和胰岛素自身抗体。一些情况下发病时间出现在IA2自身反应性之前或之后。在1个所述 受试者中,抗ZnT8是发病前检测到的唯一抗体,强调了发现这种新自身抗原的重要性。

[0414] 检测了8例新发病的个体,所述个体对胰岛素 GAD或ΙΑ2抗体是阴性的。在该组中, 经检测2例对新抗原阳性,这再一次增强了以下观点:其具有不依赖现有标记物的预测价 值。

[0415] 更具体地,参照图5,该图显示ZnT8C端探针的标准分析。曲线描述了在7个分离实 验中一式两份分析的稀释系列的平均值±SD。实验在3个月内进行,并使用不同的体外翻译 反应。将体外翻译的35S标记探针(20000cpm)与溶于50μ1 PBS ρΗ7·4(包含0.15%Tween 20、1 %BSA和0.01 %叠氮钠)的5μ1血清温育过夜,然后添加20μ1 50 % (按体积计算) Protein A琼脂糖珠子悬液。45分钟后,通过过滤回收珠子,清洗4次,然后干燥,添加30μ1闪 烁剂,进行液体闪烁计数。对ZnTSORF和Ν端探针进行比较分析。阳性样品:9例新发病糖尿病 血清的库在合并的对照血清中二倍稀释;对照样品:来自糖尿病同胞的9例年龄、性别和HLA 匹配的样品的库;非特异性结合:无血清添加。

[0416] 图6显示利的不同ZnT8构建体的盲DASP研究的结果。将体外翻译的35S标记构建体 (20000cpm)与溶于50μ1 PBS ρΗ7·4(包含0.15%Tween 20、1%BSA和0.01%叠氮钠)的5μ1 血清温育过夜,然后添加20μ1 50% (按体积计算)Protein Α琼脂糖珠子悬液。45分钟后,通 过过滤回收珠子,清洗4次,然后干燥,添加30μ1闪烁剂,进行液体闪烁计数。免疫沉淀放射 性可以表示为相对于从合并血清制备的标准品和16例个体对照血清组的分数,如下所示: 抗原性指数=(cpm试验品-平均cpm对照)/(cpm标准品-平均对照)。所有分析都重复3次。 DASP提供100个参考样品作为对照和50个匹配的新发病糖尿病样品。分析截断被定义为对 应于平均对照+4SD的指数,对于0RF、N端和C端分析分别是0.1543、0.1555和0.0129。在译码 时,这对应于98%、998%和99%。据此8%、4%和60%的糖尿病样品检测为阳性。

[0417]如图6所述,大量对照血清在ORF和N端分析中始终检测为阳性。该分析灵敏性更 低,相对于C端分析显示降低的信号:噪音比。尽管糖尿病和对照样品之间的差异在所有分 析中都是显著的(P<〇.〇〇〇IMann Whitney秩和检验),但最有效的分析是利用C端构建体 (C4探针SEQ ID:24)<X端分析更好的性能可能与探针(不存在跨膜结构域)更好的溶解性 和/或其他隐含表位的暴露有关。

[0418]图7所示实验证明ZnT8检测患者的自身抗体,所述患者对ICA和金标准生化抗体是 阴性的。用于检测糖尿病自身抗体的初始金标准品是ICA(胰岛细胞质抗体),一种复杂、耗 时和相对主观的分析,需要将血型0人类受试者的组织学胰腺切片与血清接触,然后与荧光 标记的二抗温育,由经过训练的观察者进行显微镜鉴定。它还没有完全被3种生化抗体分析 (胰岛素 GAD和ΙΑ2)取代,因为存在ICA+ve但生化抗体阴性的个体。因此对于包括超过60000 例受试者的大规模糖尿病预防试验1,ICA被用作确定T1D患者高风险一级亲属群体中自身 免疫性的方法。

[0419] 对30例新发病患者(他们是ICA阳性,但胰岛素、GAD和IA2阴性)血清的分析显示, 24 %对ZnT8C端探针有反应,表明ZnT8可能是ICA分析中检测到的抗体的组分。更值得注意 的是发现对ICA以及胰岛素、insulin,GAD和ΙΑ2阴性的个体样品中30例(20.3% )对ΖηΤ8抗 体检测为阳性。这表明C端探针检测到的表位可能隐含于0RF分子,该结论得到后续研究的 证实。存在以下可能性,对ΖηΤ8的反应性可能不是泛泛的与自身免疫性有关,而是特异性的 与糖尿病有关。一系列24份个体(对抗DNA抗体检测为阳性)样品在ΖηΤ8自身抗体分析中是 阴性的。

[0420] 图8A-C显示在新发病群体中就Ins(图8A)、GAD(图8Β)和ΙΑ2(图8C)中的每一种而 言自身抗体与ΖηΤ8的关系。在该实验中,自身抗体与ZnT8C端探针之间的关系与3种金标准 品进行比较。数据来源于BDC采集的175例新发病的患者。结果显示为采用对数尺度的抗原 指数,以显示数据的全部范围及其重叠。

[0421 ]图9A-9D显示相对于年龄来说,疾病发病时自身抗体的表达(图9A = ZnT8;图9B = GAD;图9C =胰岛素;图9D= IA2)。具体来说,该实验显示发病时ZnT8血清阳性在年长受试者 中更高,而胰岛素自身反应性降低。数据来源于237例受试者,他们糖尿病发病的年龄在9个 月到18岁之间。数据按1年间隔分类,得到与年龄有关的频率模式。ZnT8C端反应性随着发病 年龄增加,而胰岛素反应性显示预期的降低,如公开的研究中所述。GAD反应性也倾向于增 加,尽管不是那么显著。检测年长受试者中自身反应性的标记物弥补了年长个体中胰岛素 作为标记物的低效应用。发病后不能使用胰岛素,因为将产生针对外源胰岛素(用于治疗疾 病)的抗体。该实验证明ZnT8抗体能够提供良好指标以检测老年糖尿病(LADA或1.5型糖尿 病)的潜在自身免疫性,所述糖尿病在年长受试者中经常被误诊为2型糖尿病并被不当治 疗。在美国可能存在与1型患者同样多的LADA患者。

[0422]图10A和10B显示研究ZnT8自身抗体作为T1D预测标记物的实验的结果。在一组43 例个体(他们从9个月大追踪到糖尿病)的样品中回顾分析针对ΖηΤ8的自身抗体及针对胰岛 素、GAD65和ΙΑ2的3种金标准抗体。来自9例个体的一系列结果在此显示作为实例。抗体反应 性表示为cpm,用先证者(proband)减去对照除以对照应答的标准偏差。分析中截断由灰色 区域定义,其等于3SD或大约1%概率(阳性分析将偶然产生)。图10A组显示的患者不产生针 对胰岛素的自身抗体,但在1.5岁对IA2和GAD检测为阳性。IA2抗体被短暂表达,但在4岁时 恢复。期间发展出高并且持续的对ZnT8的反应性。此后IA2抗体恢复,5年后个体患有临床糖 尿病。图10Β显示的患者不产生针对胰岛素、ΙΑ2或GAD65的自身抗体,但在2岁时(临床疾病 前18个月)显示ZnT8Abs。

[0423] 图11是显示发病时糖尿病自身抗体状况的图表。ZnT8自身抗体的测量为3种金标 准自身抗原ΙΑ2、胰岛素和GAD65提供额外的预测功效。已公开的研究显示检测到的抗体数 量而不是抗体滴度是疾病的最有效预测因素。尽管如此,一些人患有T1D而从不显示针对3 种金标准抗体IA2、GAD65和胰岛素的抗体。这表明可能存在遗漏的反应性,该结论还得到自 身抗原免疫组化分析(其比INS、GAD和IA2Abs的组合测量检测更多的患者)的证实。但是ICA 分析是耗时和主观的。对于只显示金标准抗体之一的个体来说,5年内的患病相对风险较 低,但2种或更多种抗体表明预后不良,将提示治疗介入(如果可用的话)。图11的上部显示 对患糖尿病个体进行临床诊断时的抗体状况。结果来自于对50例新发病糖尿病受试者及 1 0 0例年龄配对对照(由糖尿病自身抗原标准计划(D i a b e t e s A u t 〇 a n t i g e η Standardization Program)提供)和先前部分所示数据的盲研究。在添加了ZnT8自身反应 性的分析后,抗体阴性的个体数量从14%显著降低到8%,另外12%被指定为更高的风险。 另一方面,在被列为抗体阴性的7例个体中,43%实际上具有针对ZnT8的抗体。在"低风险" lAb组的7例个体中,再一次,3例(43%)对ΖηΤ8抗体检测为阳性,使他们处于更高的风险类 型。

[0424] 对于金标准3,胰岛素自身抗体很难检测,并且在实验室之间分析的重现性很差。 如果放弃胰岛素分析并用ΖηΤ8分析取代将有以下优点:0Ab患者的数目仍将从14减少到 8%,将会有类似数量的双阳性和三阳性患者。将需要进行纵向系列实验以证明存在额外的 诊断效力,但可以合理推断ZnT8/GAD/IA2将是优于INS/GAD/IA2的组合。此外,有可能避免 使用1251标记的配体,并进行抗胰岛素分析所需的抗原预吸附。

[0425] 图11的部分记载了抗体如何在不同类型的患者之间分布。在该组中ZnT8C端抗体 经常作为唯一的抗体出现,再次与GAD类似,证明其预测的价值。在挑选的个体种群(ICA阳 性,但对3种金标准品是阴性的)中,25%是ZnT8C端阳性的。

[0426] 图12A和12B显示ZnT8抗体分析的受试者工作特性。数据来源于Barbara Davis Center (Denver,Colorado)的新发病患者的组合,样品集由DASP提供。该组合覆盖发病时年 龄从1.5岁到59岁的个体。从对应的16例对照血清组的3SD限制性确定截断。通过在每种情 况下比较对照和糖尿病组产生R0C曲线。图12A显示免测沉淀指数,图12B显示每种分析的灵 敏性和特异性之间的关系。

[0427] 图13显示与ΖηT80RF、C端和N端探针的抗体反应性之间的关系。数据来源于 Barbara Davis Center的新发病患者的组合,样品集由DASP提供,共227例个体。最前面的 50例C端阳性患者包括了大多数对ZnT80RF和ZnT8N端探针的反应性检测为阳性的个体。在 对Ν端探针和0RF的反应性之间存在显著的相关性,但在0RF和C端探针之间不存在。这表明 参与Ν端反应性的表位是被0RF探针检测到的那些表位的亚群,但C端检测到其他患者,是比 0RF翻译产物更好的自身反应指示物。这可能是因为跨膜区错误折叠并扭曲了正常C端的折 叠,导致0RF探针未能正确折叠。C端可以包括其他表位,其中一些可以是隐含的,除非其从 完整的分子释放。

[0428] 图14A和14B的实验研究了 ZnT8的N端和C端是否会相互作用产生新的表位(这取决 于所述两种结构域)或N端序列是否可以掩盖C端表位。

[0429] 该实验利用糖尿病血清的2个库进行,所述糖尿病血清对C端探针具有强应答,但N 端反应性是较低(图14A)或较高的(图14B)。利用所述两种混合物,很明显对N端和C端的反 应性是独立的,并且探针混合时免疫沉淀的放射性等于单独探针的总和。该实验的其他变 化包括Zn离子的添加或内源Zn的螯合,它们作为可能的因素参与这些结构域的相互作用。 来自上文这些的结果是没有差别的,表明N端和C端相互作用不影响免疫反应性。

[0430] 参照图15A-15C,这些图显示目的在于定位ZnT8C端自身抗体表位的实验的结果。 图15A显示小鼠 Slc30A8(顶部;显示的是SEQ ID N0:4的267-367位)、人Slc30A8(中间;显示 的是SEQ ID N0:2的268-369位)和小鼠 Slc30A3(底部;序列是SEQ ID N0:25)比对的序列。 因为小鼠 Slc30A8和Slc30A3不被大多数T1D血清识别,该数据表明变异残基很可能对预测 人Slc30A8序列中的表位非常关键。本发明人假设最后的11个氨基酸(PDCLFCEDPCD;SEQ ID NO: 2的359-369位)因此可能是抗原表位;但是缺失该区域的探针(BstNl消化,图15B;参照 显示限制性酶切位点的序列是SEQ ID N0:2的336-369位)与野生型C端一样有效的被9例糖 尿病血清的库免疫沉淀(图15B)。削减另6个氨基酸减弱了自身抗体结合,削减12个氨基酸 消除了抗体结合,表明该区域是特别重要的。这些探针的序列提供于本文的表1。

[0431 ] 如图15C所示,在带电残基(K340、H345和E352)处对C端探针进行点突变,所述带电 残基可能有助于抗原性,并对丝氨酸353进行点突变,丝氨酸353是推定的酪蛋白激酶及可 能的翻译后修饰的磷酸化位点。当用相同的糖尿病血清库检测时,很明显这些残基中的每 一种都有助于免疫反应性,在3个带电残基都被改变的突变体中(AAA)被被证明是累加的。 这些探针的序列提供于本文的表1。

[0432] 利用覆盖该区域的重叠20mer合成肽作为潜在的阻断剂进行进一步的实验(数据 未显示)。它们阻断结合的能力最多是中等的(降低<33%),表明自身抗体表位实际上可能 是构象型的,而不是简单的线性序列。进一步的方法是产生Slc30A8和Slc30A3的嵌合分子, 其保留C端区域的一般构象但允许关键序列被替换以干扰二级结构。这些嵌合分子还将用 于绘制针对蛋白的T细胞应答。

[0433] 图16显示对于自身反应性非常重要的ZnT8C端的残基,并显示动物物种间指定表 位的保守性。截短型和突变型突变体(如上文表1)表明,核心序列SLTIQMES(SEQIDN0 :2的 346-353位)是针对人Slc30A8的自身抗体反应性的关键,并且单个残基E352和S353对抗体 结合做出重要的贡献。全部序列在不同脊椎动物物种的Slc30A8高度保守,但在最接近的哺 乳动物同系物Slc30A2和Slc30A3保守性要低一些。糖尿病自身抗体检测不到表达为C端片 段的后一蛋白。

[0434] 有趣地是,从关系更远的细菌物种的阳离子外排(cation efflux)蛋白(其他 CzcD)和两种无关蛋白(大肠杆菌的偶联转移蛋白和人REEP3)中观察到同源序列。这提出了 以下可能性,分子模拟可能在对人类锌转运蛋白的自身反应性发展中起作用,或可能有助 于抗原表位扩展及免疫应答的旁观活化。

[0435]总之,ZnT8是1型糖尿病前独立的自身免疫性血清学标记物,其被预期尤其可用于 预测从进行性自身反应性向早期糖尿病的转变。

[0436]本文描述的分析形式允许每天筛选直至500份样品,并且能够轻易地自动化以增 加其能力。人类受试者具有针对ZnT8的自身抗体的事实表明,自体反应性T细胞应答是可能 性非常高的。这反过来表明,可以按照上文的详细描述开发其他的诊断分析,以及治疗和预 防I型糖尿病的新的治疗方法,亦如上文详细所述。

[0437] 实施例4

[0438]下列实施例描述了另外的利用缺失突变体和小鼠/人嵌合体对ΖηΤ8的自身抗体表 位作图。

[0439]在该实验中,结果在图17中显示,对包括C端自身抗体结合位点的区域的边界作 图,利用一系列ΖηΤ8肽(其中ΝΗ2或⑶0Η端被截短),或通过制备人和小鼠 ΖηΤ8序列的嵌合 体,后者在标准分析中是没有免疫反应的。按比例显示重叠程度,缺失程度显示为缺失氨基 酸的数目(缺失图)或氨基酸位置号,其中融合蛋白是接合在一起的,前面有单字母代码的 氨基酸(嵌合体图)。

[0440]通过MODELLER,利用大肠杆菌Yi ip阳离子外排转运蛋白的晶体结构产生人ZnT8C 端的3维模型(图18)。用亮灰色突出显示的残基在人和小鼠序列之间变化,用中灰色突出显 示的残基被指定为较弱的抗原候选物,基于NH2和C00H缺失构建体的免疫分析。人ZnT8325 位的多态性残基在空填模型(spacefill model)中显示为暗灰色残基(该图中所有位置都 是根据SEQ IDN0:2)。

[0441 ]白种人种群中ZnT8的主要人多态性变体(Trp325和Arg325)远离所述结构的细胞 质极处的膜,很大程度上被人和小鼠之间保守的残基包围。Arg侧链伸展到溶剂中,而Trp吲 哚环折回到分子,所以有可能产生非常不同的表面而不扭曲总的折叠。Gln325变体,尽管在 几何位置上接近Arg侧链,被预测导致结构沿着Ser353转动。第二α螺旋部分( aa328-341)的 变异残基簇(其拓扑结构基本上不受多态性的影响)被假定为表位(同等的被载有多态性变 体的探针识别)的良好候选物。在这点上Arg332、Glu333、Arg336和Arg340的相邻和溶剂显 露都是值得关注的。

[0442] 至于图19,显示T1D自身抗体靶向区域中ZnT8残基的保守性。在大约5 %的患者中N 端是抗体的祀标,而达到80 %的T1D受试者显示针对C端的抗体。制备含C端起始和结尾的构 建体,以绘制C端表位的边界。灰色阴影区域是大部分自身反应性集中的区域。比较小鼠、人 和蟾蜍的Znt8序列,显示大部分表位区域是保守的,除了氨基酸322-341之外(参照SEQ IDN0:2)。该区域包括人的主要多态性变体(325R或325W),这在其他物种中没有发现。

[0443] 实施例5

[0444] 下列实施例描述了与涉及ZnT8基因和蛋白的多态性的本发明实施方案有关的实 验。

[0445] 小鼠 ZnT8C端与人ΖηΤ8的不同之处在于104个氨基酸中的18个,其不与新发病的糖 尿病血清反应。产生基于小鼠序列的构建体,其中变异氨基酸被单独或多次替换为它们的 人类对应物。该实验的结果显示于图21A-21C。每个数据点是利用人血清测定的2-7次应答 的平均值,所述血清已被实现分类为限于人Arg325(CR)或Trp325(CW)多态性变体,或与 Arg325、Trp325或Gln325(CQ)变体以相同程度反应。氨基酸编号参照人类序列位置(SEQ ID N0:2)〇

[0446] 结果显示,氨基酸325向其人类对应物的改变恢复了与CR-和CW-限制性血清的结 合,但只与相应的氨基酸结合。没有单氨基酸改变能恢复CQ应答血清的反应性。但是,氨基 酸332、333、336的组合取代以及在小鼠序列的aa340包括氨基酸缺失恢复了反应性。这被 325位包括Arg进一步增强。

[0447] 图22A-22D显示小鼠 ZnT8的多位点突变概括了人ZnT8反应性。在该实验中,图22A 显示小鼠序列的单个点突变,尽管仍能够检测大量人Arg反应性的抗体应答,但对大多数血 清没有反应。但是,基于人和小鼠结构差异的4残基的进一步突变(REKK突变体)立刻使小鼠 序列几乎与人Arg325天然结构的反应性一样(图22B)。大多数hTrp反应性血清观察不到相 同的探针(图22D)。相同血清只与mTrp探针微弱反应(图22C)。

[0448] 在进一步的实验中,如图23A-23D所示,利用 11^>1?325、11^>1325、111?325、111325和 hQ325探针分析来自171例新发病T1D受试者的ZnT8,相对于兔抗C端抗体(BUN-E)计算数据。 32例个体显示hArg325限制性抗体结合,其中19例显示对mArg325探针的应答。13例显示 hTrp325限制性抗体结合,其中10例显示对mArg325探针的应答。在没有人类对应物的情况 下没有观察到与mArg325或mTrp325的结合。Arg325限制人和小鼠之间相关的应答,在对 hQ325探针表示的结合校正后具有类似的大小。当对hTrp325限制性应答作图时,甚至在对 hQ325结合校正后,mTrp325探针的结合具有较低的强度。这些数据表明,325位的氨基酸是 自身抗体表位特异性的决定簇,就Arg变体来说,小鼠点突变体类似于天然的人构象。

[0449]在另一个实验中,利用氨基酸325的变体测定出新发病T1D患者中的ZnT8自身抗体 应答。基于Arg、Trp和Gin变体ΖηΤ8325的突变C端探针被用于测定300例新发病患者中的体 液免疫应答。图24D显示基于针对单个探针或探针组合的应答区分的应答的水平和频率。图 24C显示对普通Arg和Trp变体应答之间的关系,基于只对Trp (垂直的)和Arg(水平的)应答 的95%截断将其分为5个区,对角线代表针对分析中两种探针假定15%CV的等同应答±3SD 的边界。图24A和24B在检查针对Gin探针及Arg和Trp探针的应答之间的关系时使用相同分 层。

[0450]图25显示ZnT8自身抗体特异性与氨基酸325处密码子的患者基因型(SNP rsl3266634)之间的关系。新诊断的T1D受试者用TaqMan探针进行基因分型,并利用氨基酸 325处掺入Gln(Q)、Arg(R)或Trp(W)的人ZnT8C端构建体进行血清分析。将分析截断设定成 指数为〇. 〇2。在R或W之间的信号超过Q探针信号的情况下,假定相应测量值的CV是15 %,被 指定为具有双反应阳性,如果指数相差>3SD。

[0451] 从该数据可以得出大量重要的结论:

[0452] 1)对Gin探针(hCQ)的反应性相对不受基因型影响,而在具有C等位基因(Arg编码) 的个体中Arg反应性(hCR)更显著,在具有T等位基因(Trp编码)的个体中Trp活性更显著。

[0453] 2)300例个体中只有一个显示与hCQ探针反应,但不与hCW或hCR反应。该个体在氨 基酸325处可能编码Gin残基(核苷酸测序分析)。对Arg(仅仅Arg)显示限制性应答的个体都 具有编码C等位基因。对Trp(仅仅Trp)显示限制性应答的个体都具有编码T等位基因。对于 显示超过hCQ反应性的hCR和hCW反应性的个体来说相同情况是基本上成立的。

[0454] 3)显示与hCR和hCW反应但不与hCQ反应的个体主要是杂合的。

[0455] 这些数据概述于图26,其显示基因型与对hCR和hCW探针的反应性之间的相关性。 更具体的,图26概述了以下主要发现,限于Arg325表位的反应性与C等位基因尤其是CC基因 型密切相关,相反,限于Trp325表位的抗体反应性与T等位基因尤其是TT基因型相关。

[0456] 图27显示与糖尿病发病年龄有关的Slc30A8基因型。在基因型与T1D被诊断的年龄 之间不存在明显的相关性。但是,需要总结更多的样品,例如,具有TT基因型的个体在6岁前 很少患病,尽管趋势仍然存在,对于介入来说结论是重要的。

[0457] 与对照受试者文献中报道的相比,本发明人的糖尿病群体中的基因型存在一些改 变。本发明人观察到56.8 % CC,35.1 % CT和8.1 % TT (η = 285)。欧洲群体中报道的基因型频 率是 52.3%〇:、44.1%(:1'和3.6%1'1'(11=168)? = 0.05卩丨81^^精确检验。但74.4%(:和25.6% Τ的等位基因频率在两个群体中是相同的。基因型的分布与Hardy Wienberg分布(55.33% 0:、38.11%(:1'和6.56%1'1')不是显著不同。如果观察杂合子对纯合1'1',差异将更加显著(?= 0.026),可能表明存在更多的TT基因型和更少的杂合子。

[0458] 种群研究没有报告染色体8(Slc30A8所在区域)上T1D相关基因的存在。尽管如此 基因组范围的SNP分析显示Slc30A8T等位基因与2型糖尿病的关联,这种关联需要分析大约 8000例受试者以检测到显示大约1.2的比值比和P<0.05。

[0459] 组合的免疫和基因数据的有趣特征是观察到,Arg限制性抗体在CC纯合组中的发 生率高于杂合子,同样,Trp限制性抗体在TT纯合组中高于杂合子。这可能部分由于基因剂 量作用,更多的抗原表达伴随更高的自身反应性。

[0460] 在图28A-B中,相对于使用的探针和Slc30A8基因型显示自身抗体反应性的水平。 CC基因型由169个样品代表,CT由108个样品代表,TT由23个样品代表。ZnT8hC Gin探针据预 测只反映与REKK表位结合的抗体,而hC Arg探针与该表位及以Arg 325残基为中心的表位 都结合。hC Trp探针报告REKK结合及以Arg 325为中心的表位。hCArg反应性的平均水平和 发生率按预期方向受基因型的影响,即增加的反应性与C等位基因频率(Arg 325编码)有关 (图28A)。同样地,hCTrp反应性的平均水平和发生率随T等位基因频率(Trp325编码)增加 (图28Α)。!^ Gin反应性倾向于随C等位基因增加,尽管对于发生率或水平来说不是显著的 (图28A)。与其他生化自身抗体IAA、GADA和IA2A的反应性不受Slc30A8基因型的影响(图 28B)。

[0461] 图2 9显示概括Ζη T 8 A分析当前发展状况的实验。对一系列盲样品(b 1 i n d e d samples)进行分析,所述样品由疾病控制中心(CDC)的糖尿病自身抗原计划(DASP)提供,由 50例新发病的糖尿病患者和99例对照组成。利用体外翻译的35S甲硫氨酸放射标记的探针 (基于小鼠(m)或人(h)ZnT8序列),采用基本的放射免疫沉淀形式进行分析。所有探针都包 括ZnT8的C端 104aa(C),其在人氨基酸325位具有Gln(Q)(SEQ ID N0:50)、Arg(R)(SEQ IDN0:49)或Trp(W)(SEQ ID N0:51)。此外,通过以下方式产生抗体:利用3个甘氨酸残基的 接头序列将ZnT8的N端74aa(N)与C端融合,例如hNCW,或产生C端二聚体,其具有通过柔性接 头臂(SEQ ID N0:52)与hCR构建体连接的hCW构建体,以产生hCWR构建体(SEQ ID N0:60)。 接头臂源自免疫球蛋白重链序列,其已知在其序列的恒定区和可变区之间提供柔性连接。 接头(序列PSTPPGSSGGG;SEQ ID N0:52)能够允许单个抗体分子以更高的亲和力结合,因为 它可以在2个位点与探针连接。可选择地,探针可以同时结合2个抗体分子,包括不同表位特 异性的免疫球蛋白。

[0462] 从完全相同的样品获得的结果显示本领域的众多当前状况和糖尿病自身反应性 的特征,即:

[0463] 1)与人类对应物(hCQ)(SEQ ID N0:50)相比,人T1D自身抗体对天然小鼠序列(SEQ 10从):40)的反应性较低{11^相对于1^}。

[0464] 2)在氨基酸324处(SEQ ID N0:41)(相当于人aa325)用Arg残基取代Gin残基(SEQ ID N0:49)的单个点突变增加抗体与小鼠 ZnT8的结合{mCQ相对于mCR的数据}。

[0465] 3)对载有325位单氨基酸改变的人探针的差别反应性{发病时自身抗体的发生率 一贯遵循hCR>hCW>hCQ的顺序)。这是因为hCR(SEQ ID N0:49)和hCW(SEQ ID N0:51)探针 具有以氨基酸325位为中心的其他表位,并且因为在本发明人的群体(主要是白种人)中针 对Arg变体的抗体的出现频率高于针对Trp变体的抗体。

[0466] 4)N端与C端W(SEQ ID N0:62)或R(SEQ ID N0:63)变体的融合引入以下可能性:在 反应性更高的C端表位中掺入被5_8%T1D群体识别的N端表位。但是因为背景的原因,采用 这种方式测量到的抗体总发生率实际上低于单独的C端探针,因此分析中的截断更高。对分 子的进一步改造将纠正这点。

[0467] 5)将CW和CR结构域融合入一个分子(SEQ ID N0:60)产生一种探针,其检测与CR、 CW和CQ探针有反应的个体的自身反应性。此外,信号在糖尿病受试者中更高,没有背景的任 何损失,产生一种性能比3种不同分析法的组合更优越的分析法。可以想像探针的进一步多 聚化甚至可以进一步提高检测水平。78%的检出率与任意其他糖尿病生化自身抗体标记物 相比同样高或更高。

[0468] 图30显示针对组合N端、C端、腔环、细胞溶质环和多态性残基的不同ZnT8构建体的 自身反应性。hCTrp minus TM(SEQ ID Ν0:67)是包括3个胞外(腔)和2个细胞溶质环(连接6 个跨膜结构域)的构建体,其被设计成能捕获存在于这些环中的任意表位。它检测额外4% 的新发病患者。hCArgN包括Ν和C端,但按照相反的顺序(SEQ ID Ν0:66)。利用该探针测量到 的抗体水平与单独利用hCArg测量到的抗体水平有关,但也捕捉到一些额外的患者,尤其是 那些显示低水平反应性的患者。该数据还显示,除了对包括氨基酸325的表位反应相同或对 其不依赖的患者以外,325位交换Arg为Trp的多态性鉴定了众多限于只对hCArg或hCTrp的 抗体应答的患者。

[0469] 实施例6

[0470] 下列实施例提供涉及ZnT8作为新靶标和I型糖尿病标记物的其他数据。

[0471] 图31A-F显示研究结果,其中在23个新发病T1D受试者的组中随时间将针对ΖηΤ8的 自身抗体与C肽(正餐后2小时)和其他自身抗体进行比较。该分析的主要结果是,针对ΖηΤ8 的自身抗体在发病后降低,其动力学类似于β细胞群的损失,反映为C肽应答的减弱。该数据 导致本发明人最初怀疑在图31A-31C的分子中存在遗传变异,可以观察到对C端构建体的应 答有时与N-C融合构建体相同(图31Α)或完全不同(图31B-C)。当重新测序这些探针时,显示 C端是Arg325形式(SEQ ID N0:49),N-C是分子的Trp325形式(SEQ ID Ν0:64)。通过利用用 于克隆的2个不同胰岛来源或从杂合个体克隆产物来引入多态性变体。反应性的年平均减 退对于C端是26±13%,N/C是28±9%,C-pep是32±14%,ΙΑ2是22±11( 土SD η=15)。相反 GADA增加42 ± 191 %,可能因为存在该抗原的另一组织来源。

[0472] 图32显示发病后5-10年的ΖηΤ8Α和C-肽水平。对先前研究(描述于上文的实施例) 直至10年的追踪显示,在个体中抗体一直减退,而那些最初高水平的抗体更持久。到5+年的 时候大约60%的样品中存在血清转化,在所有情况下水平平均降低90%。具有低Ab水平(< 0.4)的样品倾向于更快的血清转化。具有高水平抗体的一些样品具有残余的细胞群,由阳 性随机C肽指示。

[0473] 在本文先前实施例中已经描述了对胰岛素、GAD和IA2之外的ZnT8自身抗体的测 量。在这些实施例中,本发明人只测量了hCR反应性,其已经排除Trp325反应性。图33Α进一 步显示检出率变化的原则(黑色为检出ZnT8;白色未检出)。图33B显示增加 ZnT8抗体测量的 不同效果。

[0474] 实施例7

[0475] 下列实施例描述自身抗体预吸附实验,显示利用重组蛋白来区别不同的ΖηΤ8表 位。

[0476]利用载体诸如PGEX(产生谷胱甘肽S转移酶融合蛋白,可以在谷胱甘肽琼脂糖上纯 化)或PQE系列(产生蛋白的N或C端具有多聚组氨酸标记的蛋白,可以通过金属螯合物层析 纯化)已产生大量重组ZnT8分子。但是,这些被证明产生不溶性的包涵体,其很难被纯化,而 且不能正确折叠重新产生自身抗原表位。本发明人发现了一种解决方案,利用整合His标签 (用于金属螯合物亲和纯化)和蛋白融合伴侣(一种细菌伴侣蛋白,确保正确折叠)的载体 (ρΕΤ43 · 1 载体,Novagen,EMD Biosciences)。蛋白在BL-21 (DE3)细菌(Novagen)中表达。

[0477] 产生基于SEQ ID N0:49(Arg325变体)、SEQ ID N0:50(Gln325变体)和SEQ ID N0: 51(Trp325变体)的NUS hZnT8C端蛋白,并在Ni chalate柱上纯化,将20微克样品与T1D血清 在室温下温育2小时,然后添加35S Met标记的hCArg、hCTrp和hCGln探针并进行常规放射免 疫沉淀分析。

[0478] 在图2C所示的实验中,选择3种血清,它们已知限于Arg 325(血清#541827命名为 hCArg),Trp325(血清#533855命名为hCTrp),及与所有hC端构建体共有的表位(不依赖325 位的氨基酸)反应(血清#BT命名为hCGln)。

[0479] 结果显示血清的显著特异性,它们限于由325位多态性确定的表位。结果还显示, 325无限制性的血清不能区别Trp和Arg构建体。实际上,这提供了一种确定血清对Arg325、 Trp325和非限制性表位(当这些存在于相同样品中时)的相对反应性的更好方式。目前,利 用单一的外部泛反应性C端标准品(BUN-E)的3种放射性分析用于标定应答,然后将数字彼 此相减。利用本文描述的可用重组蛋白,使用相关的探针并测定信号被不同重组蛋白压制 的程度,可以确定反应性的水平。

[0480]因此,基于ZnT8的融合蛋白(诸如本文描述的hCNUS融合蛋白)的可用性(显示预期 的表位特异性),是产生基于非同位素方法的固相自身抗体分析中的重要步骤。

[0481 ] 实施例8

[0482] 下列实施例描述编码hZnT8的腺病毒载体的产生,及其在宿主细胞中的表达。

[0483] 本发明人还制备了用于表达全长hZnT8的腺病毒载体。在Μ0Ι为100时用对照腺病 毒(AdLacZ)或Ad-hZnT8-V5-His()转导Cos7细胞。48小时后,收集细胞,通过SDS-PAGE和利 用多克隆兔抗hZnT8的免疫印迹检测表达(数据未显示)。按照制造商的说明书在体外(RTS 100小麦胚CECF试剂盒,Roche)翻译β-葡糖醛酸酶(⑶S)或hZnT8-V5_His。通过western印迹 分析1μ1(2%)混合物。检测到hZnT8蛋白的表达(数据未显示)。

[0484] 实施例9

[0485] 下列实施例显示ZnT8在各种细胞中的免疫组织化学定位。

[0486] INS-1细胞是源自胰腺细胞的细胞系,提供细胞的良好细胞培养模型。用于上 述分析的抗体由称为BUN-E的重组融合蛋白激发,用于鉴定Slc30A8基因编码的ΖηΤ8的胞内 定位。抗体突出显示大小约为0.2-0.5微米的胞内点状细胞器(数据未显示)。这些以与胰岛 素类似的模式分布于细胞,从而标记胰岛素颗粒,先前的研究已将ZnT8定位于此处。本发明 人在该实施例中描述的免疫组织化学研究(数据未显示)表明,ΖηΤ8不是完全位于颗粒中, 但与transGolgi网络标记物TGN38显示部分重叠。它不与早期内体标记物ΕΕΑ1或循环内体 (由转铁蛋白受体标记)定位,但与成熟溶酶体的标记物LAMP1基本重叠。总的说来,这些数 据与先前的报道(ZnT8仅仅是分泌颗粒蛋白)(Chimienti et al.,上文)不同。

[0487] 实施例1〇

[0488]下列实施例显示人胎儿胰腺的实时PCR,表明ZnT8具有高的胰岛特异性,不同于该 基因家族的相关成员(ΖηΤ1-7和ΖηΤ9)。

[0489] 按照指定年龄获得人胎儿的胰腺,提取mRNA,然后将其用于测定发育期间(9和23 周妊娠)和成年胰岛中的表达水平。在第9周,胰腺主要由未分化的间充组织组成。到第23 周,大体解剖(gross anatomy)类似于成年的,显示ZnTl (Slc30Al)尤其是ZnT8(Slc30A8)的 表达实质上增加,参见图34。分离的胰岛具有更少的ZnTl,因为其主要限于外分泌组织。

[0490] 实施例11

[0491]下列实例证明,新确诊的T1D患者显示针对ΖηΤ8合成肽的外周Τ细胞应答。

[0492] 该实验显示来自新近的糖尿病受试者的PBMCs产生hZnT8依赖性IFN- γ。从4例新 近的糖尿病受试者分离PBMCs,并用2个连续hZnT8肽(10μg/ml)的库培养48小时,所述2个连 续hZnT8肽跨越完整的人ZnT8序列,具有20mer肽,重叠7个氨基酸。洗涤后,将细胞转移到包 被抗IFN-γ单克隆的ELISP0T板,再培养17小时。在洗涤去除细胞和培养基后,利用第二位 点生物素化的抗IFN-g单克隆,GABA,和沉淀银溶液检测分泌的细胞因子。利用Bioreader 4000Pro X(BIOSYS)计数斑点。对照受试者不对任何肽产生显著的信号(SI 2 3),但对于破 伤风类毒素/白喉毒素阳性对照显示SI = 22。所有被测的患者,但不是对照,对至少3种肽产 生显著的IFN-γ应答(SI 2 3),而受试者N03对肽库中的12种产生应答。在个体之间几乎没 有观察到相关性,只有库17 (E5+F5)被所有受试者识别。

[0493] 参考文献

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[0584] 本文引用的每篇出版物均完整引入作为参考。

[0585] 尽管已详细描述了本发明的各种实施方案,上述实施方案的修改或改变对本领域 技术人员是显而易见的。但是,应明确了解,这种修改和改变属于如下列权利要求阐述的本 发明范围。

Claims (26)

1. 作为I型自身免疫性糖尿病(T1D)的自身抗原靶标的ZnT8片段,其选自SEQ ID NOs: 9,10,14-18,22-23,49-51 和67,且所述片段包括氨基酸序列SLTIQMES(SEQ ID NO: 2的346-353位)和SEQ ID NO :2的位置325。
2. 权利要求1的片段,其中325位的氨基酸是色氨酸。
3. 权利要求1的片段,其中325位的氨基酸是谷氨酰胺。
4. 一种嵌合蛋白,由权利要求1所述的ZnT8片段中的任意两个或更多个片段组成。
5. 权利要求4的嵌合蛋白,其选自SEQ ID N0s:53-61。
6. 权利要求4的嵌合蛋白,其中所述嵌合蛋白包括ZnT8的N端片段和ZnT8的C端片段。
7. 权利要求4的嵌合蛋白,其中所述嵌合蛋白包括ZnT8的两个C末端片段,其中每一片 段在325位包括不同的氨基酸。
8. 权利要求7的嵌合蛋白,其中一个片段包括在325位的精氨酸,第二片段包括在325位 的色氨酸。
9. ΖηΤ8片段制备诊断易患或正患有1型自身免疫性糖尿病的个体的试剂盒的用途,所 述诊断包括检测个体试样中选择性结合ΖηΤ8的抗体,其中与阴性对照相比,如果检测到个 体中抗体的增加表明个体易患或正患有该自身免疫病,所述ΖηΤ8片段由权利要求1所述的 片段组成。
10. 权利要求9的用途,其中所述选择性结合ΖηΤ8的抗体是选择性结合人ΖηΤ8的抗体, 所述人ΖηΤ8的325位的氨基酸是精氨酸。
11. 权利要求9的用途,其中所述选择性结合ΖηΤ8的抗体是选择性结合人ΖηΤ8的抗体, 所述人ΖηΤ8的325位的氨基酸是色氨酸。
12. 权利要求9的用途,其中所述选择性结合ΖηΤ8的抗体是选择性结合人ΖηΤ8的抗体, 所述人ΖηΤ8的325位的氨基酸是谷氨酰胺。
13. 权利要求9的用途,其中所述选择性结合ΖηΤ8的抗体是选择性结合人ΖηΤ8的抗体, 所述人ΖηΤ8的325位的氨基酸是精氨酸或色氨酸。
14. ΖηΤ8片段制备诊断易患或正患有I型自身免疫性糖尿病的个体的试剂盒的用途,所 述诊断包括检测个体试样中ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答,其中与阴性对照相比,如果检测到个 体中ΖηΤ8特异性Τ细胞应答的增加表明个体易患或正患有该自身免疫病,所述ΖηΤ8片段由 权利要求1所述的片段组成。
15. 权利要求14的用途,其中所述ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答是对包含325位精氨酸的人 ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答。
16. 权利要求14的用途,其中所述ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答是对包含325位色氨酸的人 ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答。
17. 权利要求14的用途,其中所述ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答是对包含325位谷氨酰胺的 人ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答。
18. ΖηΤ8片段制备监测个体的I型糖尿病自身免疫从最初的良性自身反应性到破坏性 胰岛炎的进展的试剂盒的用途,所述监测包括检测个体试样中选择性结合ΖηΤ8的抗体,其 中与相同个体中抗体的先前测量值相比,检测到个体中抗体的增加表明该个体正向破坏性 胰岛炎发展,所述ΖηΤ8片段由权利要求1所述的片段组成。
19. 权利要求18的用途,其中所述选择性结合ΖηΤ8的抗体是选择性结合人ΖηΤ8的抗体, 所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸。
20. 权利要求18的用途,其中所述选择性结合ΖηΤ8的抗体是选择性结合人ΖηΤ8的抗体, 所述人ΖηΤ8的325位的氨基酸是色氨酸。
21. 权利要求18的用途,其中所述选择性结合ΖηΤ8的抗体是选择性结合人ΖηΤ8的抗体, 所述人ΖηΤ8的325位的氨基酸是谷氨酰胺。
22. 权利要求18的用途,其中所述选择性结合ΖηΤ8的抗体是选择性结合人ΖηΤ8的抗体, 所述人ΖηΤ8的325位的氨基酸是精氨酸或色氨酸。 23 .ΖηΤ8片段制备监测个体的I型糖尿病自身免疫从最初的良性自身反应性到破坏性 胰岛炎的进展的试剂盒的用途,所述监测包括检测个体试样中ΖηΤ8特异性Τ细胞应答,其中 与相同个体中ΖηΤ8特异性Τ细胞应答的先前测量值相比,检测到个体中ΖηΤ8特异性Τ细胞应 答的增加表明该个体正向破坏性胰岛炎发展,所述ΖηΤ8片段由权利要求1所述的片段组成。
24. 权利要求23的用途,其中所述ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答是对包含325位精氨酸的人 ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答。
25. 权利要求23的用途,其中所述ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答是对包含325位色氨酸的人 ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答。
26. 权利要求23的用途,其中所述ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答是对包含325位谷氨酰胺的 人ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答。
27. 权利要求23的用途,其中所述ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答是对包含325位精氨酸或色 氨酸的人ΖηΤ8特异性的Τ细胞应答。
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