MX2012012736A

MX2012012736A - Metodo de diagnostico para la deteccion de celulas ex vivo.

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Publication number: MX2012012736A
Application number: MX2012012736A
Authority: MX
Inventors: Dobosz Michael; Scheuer Werner
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2010-05-07
Filing date: 2011-05-09
Publication date: 2013-02-26
Also published as: JP6145404B2; EP2567234A1; KR20130036012A; BR112012028006A2; CN102939538A; EP2567234B1; RU2012148816A; JP2013525805A; WO2011138462A1; US20130236906A1; CA2797741A1

Abstract

La presente invención es concerniente en esencia con un método para detectar u subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células, el método comprende detectar ex vivo dicho subconjunto de células, en donde dicho dominio de enlace va a ser administrado a un sujeto que comprende o se supone que comprende dicho subconjunto de células, antes de la remoción del subconjunto de células. La presente invención también es concerniente con el uso de un dominio de enlace como se define en la presente con un método definido en la presente. También se contempla el uso de un dominio de enlace como se define en la presente para la preparación de una composición de diagnóstico a ser usada en un método definido en la presente. En otro aspecto, la presente invención es concerniente con un dominio de enlace como se define en la presente a ser usado en un método definido en la presente. También se revelan kits que comprenden un dominio de enlace como se define en la presente y medios para administrar dichos dominios de enlace a un sujeto y opcionalmente medios para detectar el dominio de enlace con un método definido en la presente. En otro aspecto, la presente invención es concerniente con el uso de un dominio de enlace, preferiblemente un anticuerpo terapéuticamente efectivo, por ejemplo alemtuzumab, apolizumab, cetuximab, epratuzumab, galiximab, gemtuzumab, ipilimumab, labetuzumab, panitumumab, rituximab, trastuzumab, nimotuzumab, mapatumumab, matuzumab, rhMab 1CR62, rhMab B-Ly1 y pertuzumab etc., incluyendo combinaciones de los mismos, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de pacientes dispuestos a responder favorablemente al dominio de enlace como se identifica por un método definido en la presente.

Description

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO PARA LA DETECCIÓN DE CÉLULAS EX VIVO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en esencia con un método para detectar un subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células, tal método comprende detectar, ex vivo, dicho subconjunto de células, en donde el dominio de enlace va a ser administrado a un sujeto que comprende o se supone que comprende dicho subconjunto de células, antes de la remoción de dicho subconjunto de células. La presente invención también es concerniente con el uso de un dominio de enlace como se define en la presente en un método definido en la presente. El uso de un dominio de enlace como se define en la presente para la preparación de una composición de diagnostico a ser usada en un método definido en la presente es también contemplado. En otro aspecto, la presente invención es concerniente con el dominio de enlace como se define en la presente, a ser usado en un método definido en la presente. También se revelan kits que comprenden un dominio de enlace como se define en la presente y medios para administrar dicho dominio de enlace a un sujeto y opcionalmente, medios para detectar dicho dominio de enlace con un método definido en la presente. En otro aspecto, la presente invención es concerniente con el uso de un dominio de enlace, preferiblemente un anticuerpo terapéuticamente efectivo como por ejemplo al alemtuzumab, apolizumab, cetuximab, epratuzumab, galiximab, gemtuzumab, ipilimumab, labetuzumab, panitumumab, rituximab, trastuzumab, nimotuzumab, mapatumumab, matuzumab, rhMab ICR62, rh ab B-Lyl y pertuzumab, etc., incluyendo combinaciones de los mismos, para la preparación de un composición farmacéutica para el tratamiento de pacientes dispuestos a responder favorablemente a dicho dominio de enlace como se identifica por un método definido en la presente.

El apuntamiento de un antigeno de superficie tumor-asociado mediante un anticuerpo monoclonal es un procedimiento exitoso para el tratamiento de diferentes malignidades. Sin embargo, antes de la intervención terapéutica con un anticuerpo dado sea iniciada, la expresión del antígeno relevante tiene que ser confirmada. Esto se lleva a cabo frecuentemente mediante inmunohistoquimica (IHC) convencional o análisis de hibridización in situ después de fijación en formalina y procedimientos de embebido en parafina del tejido de tumor explantado. El tratamiento con un anticuerpo terapéutico es solamente justificado si la expresión del antigeno objetivo tumor-asociado relevante ha sido confirmada. Métodos de biodistribución basados' en anticuerpos radio marcados han sido discutidos también (Decker et al., Nucí. Med. And Biol., 35 (2008), pp. 599-604). Sin embargo, estos métodos dan solo algún discernimiento a la biodistribución de anticuerpos dentro del cuerpo viviente y/u órganos explantados.

La inmunohistoquimica (IHC) es la localización de antigenos en secciones de tejido mediante el uso de anticuerpo marcado como reactivos específicos por medio de interacciones antígeno-anticuerpos que son visualizadas por un marcador, tal como un tinte fluorescente, enzima, elemento radioactivo u oro coloidal. La inmunohistoquimica consiste en general de las siguientes etapas: (a) un anticuerpo primario se enlaza a un antígeno especifico; (b) el complejo de anticuerpo-antígeno es enlazado por un anticuerpo secundario, marcado; (c) el marcador y mediante esto el antigeno (si está presente) es detectado en los sitios de enlace de anticuerpo-antígeno. El segundo anticuerpo es en general empleado con el fin de mejorar la señal de detección que podría de otra manera ser baja para una detección suficiente.

Albert H. Coons y sus colegas (Coons et al. 1941, 1955; Coons y Kaplan 1950) fueron los primeros para marcar anticuerpos con un tinte fluorescente y usarlo para identificar antígenos en secciones de tejido. Con la expansión y desarrollo de las técnicas de inmunohistoquimica, marcadores enzimáticos han sido introducidos tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, también como oro coloidal por nombrar algunos. El inmunohistoquímico es usado ampliamente en la diagnosis de células anormales tales como aquellas encontradas en tumores cancerosos. Otros marcadores moleculares específicos son característicos de eventos celulares particulares tales como proliferación o muerte celular. IHC es también usada ampliamente en la investigación básica para comprender la distribución y localización de biomarcadores y proteínas expresadas diferencialmente en diferentes partes de un tejido biológico. Puesto que la inmunohistoquímica involucra una región de antígeno-anticuerpo especifica, tiene ventaja evidente con respecto a técnicas de teñido enzimáticas especiales usadas tradicionalmente que identifican solo un número limitado de proteínas, enzimas y estructuras de tejido. Por consiguiente, la inmunohistoquímica se ha convertido en una técnica crucial' y es ampliamente usada en muchos laboratorios de investigación médica también como diagnósticos clínicos.

WO 2008/033495 reporta en cuanto al hallazgo sorprendente de que un cierto clon de anticuerpo que es especifico para el receptor de EGF puede ser útil para detección y terapia de enfermedades de la piel, en particular para psoriasis. Dicho anticuerpo es también sugerido para los métodos de representación de imagen in vivo y para un método a base de IHC "clásico". Mientras que el método de representación de imagen in vivo requiere la administración del anticuerpo antes de la detección (véanse, reivindicaciones 26 y 33 también como párrafo

[0041] de dicho documento) , es claro que los métodos de IHC revelados en WO 2008/033495 (dichos métodos de IHC son usados alternativamente al método de representación de imagen in vivo) , poner en contacto el anticuerpo marcado con las células objetivo solo después de la remoción del tejido en cuestión (véase en particular párrafos

[0044],

[0102] y [103] también como el ejemplo 1) . WO 2208/0033495 no revela ni sugiere administrar el anticuerpo antes de la remoción de tejido respectiva y detectar el anticuerpo enlazado por medio de un método de IHC.

La preparación de tejido es la piedra fundamental de la inmunohistoquímica . Para asegurar la conservación de la arquitectura del tejido y morfología celular, · una fijación pronta y apropiada es esencial. Sin embargo, la fijación inapropiada o prolongada puede disminuir significativamente la capacidad de enlace de anticuerpo ya que los objetivos antigénicos son alterados o aun destruidos en el curso del procedimiento de fijación. Esto podría conducir a intensidad de señal disminuida, a una ausencia completa de la señal o aun peor, alteraciones del objetivo que podrían dar como resultado señales positivas falsas y/o negativas falsas. La conflabilidad de los resultados de IHC, por consiguiente, depende de las alteraciones posibles del objetivo durante la fijación de IHC. También otros factores podrían influenciar la conflabilidad de los resultados de IHC. Es por ejemplo estándar embeber el tejido fijo en parafina que, sin embargo, presupone que el dominio de enlace (por ejemplo, un anticuerpo) que es empleado para la medición de IHC es "parafina-permeable" , esto es, debe ser apto de encontrar su objetivo en un ajuste de parafina. Un anticuerpo aplicable par a un estudio de IHC ha sido optimizado para satisfacer tales criterios específicos (por ejemplo, permeabilidad de parafinas) y por consiguiente, puede tener características de enlace diferentes del anticuerpo terapéutico. Los anticuerpos terapéuticos son, generalmente hablando, no parafina-reactivos y por consiguiente es necesario desarrollar anticuerpos, además de los anticuerpos terapéuticamente efectivos que pueden ser usados para la detección del objetivo en IHC. Esta diferencia entre los anticuerpos de "diagnostico" y "terapéuticos", sin embargo tiende a dar como resultado problemas. Por ejemplo, a pesar del beneficio clínico impresionante de trastuzumab en pacientes con carcinoma de pecho HER2-positivo prematuro y avanzado, no todos los pacientes tratados son probables de beneficiarse a una extensión similar. Siendo una terapia apuntada molecularmente, la eficacia clínica de trastuzumab depende de la determinación precisa del estatus de HER2 en especímenes de tumor de pacientes candidatos para tratamiento. Actualmente, los dos procedimientos más estandarizados para evaluación del estatus de HER2 en la instalación clínica son inmunohistoquimica (IHC) y FISH. A pesar de la selección confiable de pacientes con tumores HER2-positivos que utilizan los métodos mencionados anteriormente, la proporción de respuesta (RR) con trastuzumab de un solo agente en pacientes con cáncer de pecho avanzado solo varia de 19% a 34%. Esto es asi debido a que los métodos de IHC usados más ampliamente para detectar la sobre expresión de HER2 no pueden documentar realmente la presencia del sitio objetivo especifico de trastuzumab.

Asi, hay necesidad en el arte por un método mejorado que permita una detección más exacta y/o más sensible de un objetivo deseado (preferiblemente un objetivo celular) y/o un subconjunto de células caracterizadas por tal objetivo.

Asi, el problema técnico fundamental de la presente invención es proveer métodos de diagnostico para la detección de células ex vivo.

La presente invención trata esta necesidad y asi provee, como solución al problema técnico, un método para detectar un subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células, tal método comprende detectar ex vivo dicho subconjunto de células en una muestra de tejido de un sujeto, en donde el sujeto es uno que ha recibido dicho dominio de enlace antes de la remoción de la muestra de tejido.

Hasta ahora, la verificación de la expresión objetivo en general no es efectuada con el anticuerpo terapéutico, sino con un anticuerpo apropiado para IHC. Sin embargo, este procedimiento tiene limitaciones que pueden conducir a malas interpretaciones de la configuración del objetivo. Además, la fijación con formalina convencional tiene desventajas (Chu W-S et al. odern Pathol- 2005; 18: 850-863) . La fijación puede, modificar el antigeno de superficie de tal manera que el enlace del anticuerpo de IHC es disminuido (o mejorado) lo que no refleja la situación clínica. Además, los portaobjetos' de tejido embebidos con parafina fijados con formalina tienen que ser procesados de maneras especiales para obtener el fluido óptimo con un anticuerpo de IHC (por ejemplo, recuperación de antígeno mediante calentamiento o incubación con enzimas especiales) . Finalmente, los antígenos de superficie tumor-asociados pueden ser modulados (sobre expresados, internalizados o derramados) durante el crecimiento del tumor y esparcimiento metastático que ilustra la necesidad de evaluar la efectividad real de una terapia dada tan frecuentemente como sea posible con el fin de ser aptos ya sea de alterar la terapia (uso de un dominio de enlace diferente) o decidir si una terapia dada es todavía apropiada o no. Así, una técnica que permita la verificación de la expresión objetivo y demostración de enlace del anticuerpo terapéutico simultáneamente in vivo en el punto del tiempo cuando la terapia es iniciada sería deseable y optimizaría el proceso de estratificación.

Se ha desarrollado un método que trata ambas cuestiones. Los anticuerpos terapéuticos son marcados con un fluoróforo orgánico e inyectado i.v. en xenoinjertos humanos. En este reporte, se demuestra la utilidad de fluorescencia del infrarrojo cercano (NIRF) para verificar la expresión objetivo y enlace al tejido de tumor. Después de una sola inyección i.v. de 50 microgramos de Herceptin Cy5 marcado con Omnitarg en ratones (que portan un tumor Her2 positivo) una señal de fluorescencia fuerte es detectable en el área del tumor después de 24 a 48 horas. El análisis subsecuente de tejido de tumor explantado revela que los anticuerpos Her2 específicos se enlazan solamente a células de tumor, pero no ha tejido murino. En contraste, ninguna señal de fluorescencia es generada con un anticuerpo testigo Xolair que es dirigido a IgE humana (Figuras 1-3) . Este procedimiento es superior a la detección convencional de antígenos objetivo mediante IHC clásica debido a que (i) el objetivo relevante está entre "medio ambiente natural" mientras que esta enlazado por el dominio de enlace; (ii) la modulación de la expresión objetivo durante el crecimiento de tumor primario y esparcimiento metastático pueden ser detectada; (iii) la explantación del tejido de tumor y fijación va a ser efectuada después que el dominio de enlace (anticuerpos) sea enlazado al objetivo relevante; (iv) la diferencias en las características de enlace del anticuerpo terapéutico y anticuerpo de IHC se vuelven obsoletas.

Modalidades adicionales de la presente invención son caracterizadas y descritas en la presente y también reflejadas en las reivindicaciones.

Se debe notar que como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el", incluyen referencias plurales, a no ser que el contexto lo indique claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "un" incluyen uno o más de tales diferentes reactivos y la referencia "al método" incluye referencia a etapas equivalentes y métodos conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en el arte que podrían ser modificados o sustituidos por los métodos descritos en la presente. ? no ser que se indique de otra manera, el término "por lo menos" precedente a una serie de elementos se entenderá que se refiere a cada elemento en la serie. Aquellos experimentados en el arte reconocerán o serán aptos de determinar, utilizando no mas que experimentación de rutina, muchos de diferentes a las modalidades especificas de la invención descritas en la presente. Se pretende que tales equivalentes sean abarcados por la presente invención. En toda esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a no ser que el contexto lo requiera de otra manera "comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se comprenderá que implican la inclusión de un numero entero afirmado o etapa o grupo de números enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro numero entero o etapa o grupo de enteros o etapas.

Varios documentos son citados en todo el texto de esta especificación. Cada uno de los documentos citados en la presente (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patentes, publicaciones científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, etc.), ya sea supra o infra, son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Nada en la presente será interpretado como una misión de que la invención no tiene derecho a anticiparse a tal revelación en virtud de invención previa.

En un primer aspecto, la presente invención es concerniente con un método para detectar un subconjunto de células con un dominio de' enlace que es especifico para un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células, tal método comprende detectar ex vivo tal subconjunto de células con dicho dominio de enlace, en donde dicho dominio de enlace va a ser administrado a un sujeto que comprende o se supone que comprende dicho subconjunto de células, antes de la remoción del subconjunto de células. Los métodos de la invención son preferiblemente basados en métodos de IHC. La presente invención también es concerniente con un método para detectar un subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células, tal comprende detectar ex vivo dicho subconjunto de células con el dominio de enlace, en donde dicho subconjunto de células se origina de un sujeto, tal sujeto (a) comprende o se supone que comprende dicho subconjunto de células; (b) ha .sido pre tratado con dicho dominio de enlace.

Los métodos de la presente invención son preferiblemente métodos in vitro (o ex vivo) .

En un aspecto adicional, la presente invención es concerniente con un método para detectar un objetivo que caracteriza un subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para dicho objetivo, tal método comprende detectar ex vivo dicho objetivo, en donde el dominio de enlace va a ser administrado a un sujeto que comprende o se supone que comprende dicho subconjunto de células y/u objetivo, antes de la remoción de dicho subconjunto de células.

La presente invención también es concerniente con un método para detectar un objetivo que caracteriza un subconjunto de células, con un dominio de enlace que es especifico para dicho objetivo, tal método comprende detectar ex vivo dicho objetivo, en donde dicho subconjunto de células se origina de un sujeto, tal sujeto (a) comprende o se supone que comprende dicho subconjunto de células y (b) ha sido pre tratado con dicho dominio de enlace.

En una modalidad preferida de los métodos de la presente invención, dicho subconjunto de células está comprendido dentro de una muestra de tejido.

Se comprenderá que el dominio de enlace va a ser administrado al sujeto en una cantidad de por un periodo de tiempo que es/son suficientes para permitir su enlace al objetivo.

La presente invención es concerniente asi con métodos de IHC que son caracterizados en que el dominio de enlace que es especifico para un objetivo se enlaza al objetivo en su medio ambiente natural y en particular antes de que el subconjunto de células caracterizado por aquel objetivo haya sido removido del sujeto y fue sometido a un procedimiento de fijación en IHC. El "medio ambiente natural" del objetivo es mediante este por ejemplo, el objetivo in vivo (dentro de un sujeto) o una linea celular en su medio ambiente de cultivo celular. El término "procedimientos de fijación de IHC" incluye todas las etapas y métodos bien conocidos que se pueden llevar a cabo con el fin de asegurar la conservación de la arquitectura del tejido y morfología celular. Tales procedimientos de fijación de IHC son también ejemplificados en la presente.

Un "método de IHC" significa la localización de objetivos (por ejemplo, antígenos) en secciones de tejido mediante el uso de dominios de enlace marcados como reactivos específicos por medio de interacciones de objetivo-dominio de enlace que son visualizados por dicho marcador. Se contempla que dichas secciones de tejido son ya sea rebanadas delgadas (de alrededor de 2-40 mieras) que son tomadas de una muestra del tejido o si la muestra del tejido no es muy gruesa y es penetrable es usada entera. Dicha muestra de tejido es preferiblemente embebida, por ejemplo en parafina.

La presente invención es concerniente así con una modalidad adicional con el método, preferiblemente un método de IHC, que comprende la etapa de detectar un subconjunto de células que están caracterizadas por un objetivo que es específico para aquel subconjunto de células, tal objetivo es caracterizado en que dicho objetivo es enlazado por un dominio de enlace que es específico para aquel objetivo, tal dominio de enlace se ha enlazado al objetivo antes de la remoción de aquel subconjunto de células (o muestra de tejido que comprende dicho subconjunto de células) de un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención es concerniente con un método, preferiblemente un método de IHC, que comprende la etapa de detectar un objetivo que es específico para un subconjunto de células, tal objetivo esta caracterizado porque dicho objetivo es enlazado por un dominio de enlace que es específico para aquel objetivo, tal dominio de enlace ha sido enlazado a dicho objetivo antes de la remoción de aquel subconjunto de células (o muestra de tejido que comprende dicho subconjunto de células) de un sujeto.

La "detección" que toma lugar ex vivo se lleva a cabo mediante técnicas de detección estándar que son bien conocidas para la persona experimentada e incluyen pero n o están limitadas a cualquier clase de técnicas de detección de IHC apropiadas, tales como microscopía a base de fluorescencia, preferiblemente microscopía basada en infrarrojo cercano, incluyendo opcionalmente barrido de portaobjetos. El barrido de portaobjetos puede ser usado para la reconstrucción en 3D subsecuente.

El término "dominio de enlace" caracteriza en relación con la presente invención un dominio de un polipéptido que se enlaza específicamente a/interactúa con un objetivo dado. Preferiblemente, dicho dominio de enlace es apto de enlazarse/interactuar específicamente con un antígeno especifico o antígeno objetivo de tumor o un grupo especifico de antígenos, por ejemplo, el antígeno idéntico o antígeno objetivo de tumor en especies diferentes. Dicho enlace/interacción también se entiende que define un "reconocimiento especifico de un objetivo". El término "dominio de enlace" incluye específicamente todas las clases de andamios (algunos de ellos son caracterizados adicionalmente en la presente) , tales andamios son caracterizados por al menos un antígeno o sitio de interacción de epitopes. Un sitio de interacción de antigeno o epitope es caracterizado por una entidad de enlace especifica de antigeno/epitope que reconoce específicamente un antigeno o epitopes (esto es, un objetivo de la invención) . Tal sitio de enlace de antigeno o epitope es preferiblemente a base de anticuerpo/dominio de inmunoglobulina.

El término "reconoce específicamente un objetivo" o "especifico por un objetivo", significa, de acuerdo con la presente invención, que el dominio de enlace, por ejemplo un anticuerpo es apto de interactuar específicamente con y/o enlazarse a un objetivo como se define en la presente. Como se usa en la presente, los términos, "enlace" en relación con la interacción de un objetivo y un dominio de enlace indica que el dominio de enlace se asocia con (por ejemplo, interactúa con o se completa con) el objetivo a un grado estadísticamente significativo en comparación con la asociación con proteínas en general (esto es, enlace no especifico) . Así, el término "dominio de enlace" también se entiende que se refiere a un dominio que tiene una asociación o enlace estadísticamente significativa con un objetivo.

La interacción específica del sitio de interacción de antígeno con su antígeno específico puede resultar también en un enlace simple de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción especifica del sitio de interacción de dominio de enlace/antigeno es antigeno es antigeno especifica puede dar como resultado alternativamente el inicio de una señal, por ejemplo debido a la inducción de un cambio de la conformación del antigeno, una oligomerización del antigeno, etc. "Dominio de enlace" de la presente invención incluyen pero no están limitados a anticuerpos, un anticuerpo de dominio (dAb) , lipocalinas, anticuerpos, avimeros, aptámeros de péptido, micro cuerpos, etc.

Un ejemplo preferido de un dominio de enlace en linea con la presente invención es un fragmento de enlace de anticuerpo o antigeno del mismo, mas preferiblemente un anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace antigeno del mismo o aun mas preferido un anticuerpo terapéutico o fragmentos de enlace de antigeno del mismo. Dicho anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo es en una modalidad preferida marcado fluorescentemente. Formatos de anticuerpo bis específicos o multiméricos son también contemplados .

El dominio de enlace (por ejemplo, un anticuerpo) va a ser administrado al sujeto antes de que el subconjunto de células y/o dicha muestra de tejido que comprende dicho subconjunto de células sea removido y también antes de que la detección se lleve a cabo, esto es, antes de la detección (incluyendo la fijación) y consecuentemente también antes de la remoción de dicho subconjunto de células y/o dicha muestra de tejido que comprende dicho subconjunto de células. "Antes de" significa además que el marco de tiempo entre la administración real del dominio de enlace y la remoción real del subconjunto de células y/o la muestra de tejido es de tal manera que, de acuerdo con las circunstancias en el dominio de tiempo suficiente para enlazarse a su objetivo. Dicho periodo de tiempo depende del objetivo, del dominio de enlace, las características de enlace del dominio de enlace (afinidad por el objetivo o avidez del dominio de enlace), la vida media del dominio de enlace en el sujeto, el despeje de la sangre del dominio de enlace (a condición de que sea administrado intravenosamente) , etc. La persona experimentada es sin embargo apta de juzgar cual periodo de tiempo es suficiente con el fin de permitir un enlace específico del dominio de enlace al objetivo. Lo mismo es cierto para la cantidad del dominio de enlace, ruta de administración, etc.

A condición de que un dominio de enlace secundario sea usado con el fin de detectar el primer dominio de enlace (el dominio de enlace primario) también se contempla que ya sea solo el primer dominio de enlace sea administrado antes de la detección o ambos, esto es, el dominio de enlace primario o secundario sean administrados antes de la detección (ya sea simultanea o secuencialmente) y consecuentemente también antes de la remoción de dicho subconjunto de células y/o dicha muestra de tejido que comprende dicho subconjunto de células como se explica anteriormente. Los dominios de enlace primarios y secundarios son explicados en más detalle posteriormente en la presente; Es preferido que el dominio de enlace primario sea administrado al sujeto antes de la detección de y consecuentemente también antes de la remoción del subconjunto de células y/o dicha muestra de tejido que comprende dicho subconjunto de células y que el dominio de enlace secundario (si es empleado) sea usado después de la remoción del subconjunto de células y/o dicha muestra de tejido que comprende dicho subconjunto de células.

Es más preferido que solo un dominio de enlace primario pero no un dominio de enlace secundario sea empleado con el fin de detectar el primer dominio de enlace.

El sujeto de la presente invención es un sujeto a quien el dominio de enlace va . a ser administrado antes de la remoción del subconjunto de células/muestra de tejido. Alternativamente, el sujeto de la presente invención es un sujéto que ha recibido el dominio de enlace de la invención antes de la remoción de la muestra del tej ido/subconj unto de células. Se contempla que el sujeto de la invención ya comprende los dominios de enlace definidos en la presente antes de la remoción de las muestras de tej ido/subconjunto de células. El sujeto de la invención comprende o se supone que comprende dicho subconjunto de células y/u objetivo. "Se supone que comprende" significa que se pretende diagnosticas si un subconjunto de células y/u objetivo está presente, ausente, sobre expresado o sub-expresado . Por consiguiente, no es necesario que sea conocido de antemano (esto es, antes de que la detección real tome lugar) si un subconjunto de células y/o un objetivo de interés está presente, ausente, sobre expresado o sub expresado. Se contempla además que el sujeto de la presente invención es un sujeto que comprendé el dominio de enlace de la presente invención. Se comprenderá que la muestra de tejido y/o subconjunto de células de la invención es obtenido del sujeto de la invención.

La presente invención es concerniente asi con un método de inmunohistoquímica (IHC) para detectar un subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células, tal método comprende detectar ex vivo el subconjunto de células, en donde dicho subconjunto de células (o una muestra de tejido como se describe en la presente) es obtenido de un sujeto que ha recibido el dominio de enlace de la invención antes de la remoción de la muestra de tejido/ subconjunto de células .

La ruta de administración depende de la circunstancias e incluye administración oral, pero la administración es preferiblemente parenteral, por ejemplo intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratumoralmente, etc. La administración intravenosa es más preferida. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, acetites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios de pH regulado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactada o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de fluido y nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como aquellos a base de dextrosa de Ringer) y los semejantes. Conservadores y otros aditivos pueden también estar presentes tales como, por ejemplo antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y los semejantes.

Se contempla que el dominio de enlace es específico para un objetivo que caracteriza un subconjunto de células. El término "subconjunto de células" denota (a) célula (s) de interés que son caracterizadas y/o identificables para al menos uno, esto es, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o aún más objetivo (s) tal (es) objetivo (s) ayuda (n) a distinguir este subconjunto de células de otras células.

Dicho objetivo ya sea es ó se supone que es especifico para el subconjunto de células.

El objetivo puede estar especificamente presente sobre o en el subconjunto de células (expresado) , puede ser regulado específicamente de manera ascendente sobre/en dicho subconjunto de células (sobre expresado) , puede ser regulado descendentemente de manera específica sobre/en el subconjunto de células (sub expresado) o puede estar específicamente ausente del subconjunto contemplado de células. Así, se comprenderá que no solo la presencia o ausencia de un objetivo puede caracterizar el subconjunto de células, sino también alteraciones en el nivel de expresión del objetivo (por ejemplo, sobre el tiempo; sensible a un estímulo o inhibidor; en comparación con el estado normal/natural de una célula testigo comparable, en donde "estado normal/natural de una célula objetivo comparable" significa una célula testigo que es preferiblemente de la misma clase como la (s) célula (s) que forma (n) el subconjunto de células, por ejemplo ambas son células epiteliales) pero que es/fue derivada de una fuente diferente, "una fuente diferente" incluye por ejemplo una célula/muestra de tejido obtenida de un sujeto saludable o una célula/muestra de tejido obtenida de una parte distinta pero obviamente saludable del mismo sujeto en donde dicha parte diferente parece estar libre de síntomas asociados de una enfermedad que es caracterizada por dicho subconjunto de células.

También se contempla definir un subconjunto de células por una mezcla de las condiciones mencionadas anteriormente, por ejemplo por lo menos un objetivo que está presente específicamente mientras que otro no, etc.

"Células de interés" significa que depende de la intención del análisis y por consiguiente del (los) objetivo (s) seleccionado (s), determinar cuáles son de interés y cuáles no. Es por ejemplo bien conocido que ciertos tumores sobre expresan marcador de tumor como ß-HCG, CA 15-3, CA 19-9, CA 72-4, CFA, MUC-1, AGE, p53, ETA, CA-125, CEA, AFP, PSA, PSMA, la familia de receptores ErbB que es una subfamilia de cuatro cinasas de tirosina de receptor estrechamente relacionadas: EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) y Her 4 (ErbB-4), etc., esto es el "subconjunto de células" que pueden comprender células (supuestamente células de tumor) que expresan/sobre expresan uno o más de estos marcadores de tumor. Es así mismo posible identificar un subconjunto de células que no expresa uno o todos los marcadores de tumor mencionados-dependiendo de la intención del análisis.

Las células que forman un subconjunto de células pueden ser células de animal, células de parásitos tales como gusanos, células fúngales, bacterias, virus o protozoarios .

El término "células de animal" incluye por ejemplo células de un "sujeto" que es definido en la presente más tarde. Las células de tumor son preferidas. Asi, en una modalidad preferida, dicho subconjunto de células consiste de o comprende (a) célula (s) de tumor.

El término "tumor" o "células de tumor", como se usa en la presente, se refiere a o describa la condición fisiológica en mamíferos que está caracterizada comúnmente por crecimiento celular sin regular. Ejemplos de tumores incluyen pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma (incluyendo meduloblastoma y retinoblastoma) , sarcoma (incluyendo liposarcoma y sarcoma de células sinovial) , tumores neuroendocrinos (incluyendo tumores carcinoides, gastrinoma y cáncer de célula de isleta) , mesotelioma, schwanoma (incluyendo neuroma acústico), meningioma, adenoma carcinoma y melanoma. "Células de tumor" que incluye además un "tumor solido" que se refiere a tumores seleccionados del grupo de cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, bioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma, penil, cáncer testicular, cáncer de esófago, tumores del sistema biliar, también cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pecho siendo el preferido.

Lineas celulares son también contempladas. Estas lineas celulares pueden ser usadas en forma "aislada". Las lineas celulares tales como pero no limitadas, esto es, cada célula considerable que exprese un objetivo dentro del significado de la presente invención es contemplada. Las líneas celulares pueden ser homogéneas o heterogéneas. Preferiblemente, dichas líneas celulares son derivadas de células de tumor.

El término "protozoario" o parásitos protozoarios incluye por ejemplo Entamoeba histolítica o especies pertenecientes a los Apicomplej os (particularmente la subórdenes transportadas por la sangre incluyendo Adeleorina, Hemosporida y Eimeriorina, especies de genoplasmodia siendo preferidos) y/o endoparásitos .

El termino hongos incluye especies de Aspergillus, Candida, Cryptococcus , Histoplasma, Blastomyces, Paracoccoides, Mucor, Curvularia, Fusarium etc., incluyendo las esporas fúngales.

El término "bacteria" incluye especies que crecen inter de manera semejante por ejemplo especies de Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Vibrio, Pasteurella, Borrelia, Leptospira, Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Yersinia, Treponema, ' Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma, Coxiella, Neisseria, Listeria, Haemophilus, Helicobacter, Legionella, Pseudomonas, Bordetella, Brucella, Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus, Bacillus, Mycobacterium, Nocardia, etc.

El término "virus" incluye por ejemplo virus del genero Picornaviridae, . Caliciviridae, Reoviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Coronaviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Rteroviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, HAV, HBV, HCV, HIV, HTLV, virus de influenza, virus de herpes, virus de viruela, incluyendo todos los subtipos y variaciones conocidos, HBV, HCV y HIV siendo preferidos.

No hay necesidad que el subconjunto asi definido de células sea homogéneo como tal, esto es, es concebible que diferentes tipos de células (células heterogéneas) sean agrupadas conjuntamente, por ejemplo debido a que todas estas células diferentes expresan un objetivo deseado que caracteriza o se supone que caracteriza estas células-por ejemplo células que expresan un marcador o células que expresan un receptor, por ejemplo receptores de citoquina u hormonas. Sin embargo, también se contempla que el subconjunto de células sea homogéneo, esto es, que consiste principalmente de uno y el mismo tipo de célula (por ejemplo, células epiteliales, fibroblastos, etc.). Los tumores son normalmente clasificados por el tipo de célula que se asemeja al tumor y por consiguiente las células de tumor son frecuentemente homogéneas. Ejemplos de categorías generales de tumores homogéneos incluyen: carcinoma (tumores malignos derivados de células epiteliales incluyendo formas comunes de cáncer de pecho, próstata, pulmón y colon) ; sarcoma (tumores malignos derivados del tejido conectivo o células mesenquimales) ; linfoma y leucemia (malignidades derivadas de células hematopoyéticas (formadores de sangre)); tumor de célula germinal (tumores derivados de células totipotentes -en adultos más frecuentemente encontrados en los testículos y ovarios; en fetos, bebes y niños jóvenes más frecuentemente encontrados en la línea media corporal, particularmente en la punta del hueso de la cola) ; tumor blástico o blastoma (un tumor (usualmente maligno) que se asemeja un tejido inmaduro o embriónico. Muchos de estos tumores son más comunes en niños) . Todos estos tumores mencionados pueden formar un subconjunto de células, respectivamente. Así mismo es posible definir un subconjunto más limitado de células de tumor dentro de los tumores mencionados, por ejemplo aquellas células de tumor que expresan, sobre expresan y/o sub expresan por lo menos un objetivo, un tumor de la familia de ErbB de receptores. El subconjunto de células es por ejemplo una célula de tumor que sobre expresa un receptor de la familia de receptores de ErbB, por ejemplo el receptor de HER2 /neu .

Dicho subconjunto de células esta ya sea comprendida en una muestra de tejido o es la muestra de tejido como tal (por ejemplo, células de tumor derivadas de un tumor, lineas celulares que son cultivadas en cultivo celular, células primarias que han sido aisladas y preferiblemente también purificadas con el fin de enriquecer el tipo de células deseado) . Por ejemplo, células de tumor y/o una (micro) metástasis que están frecuentemente rodeados por tejido saludable-, esto es, no tumorigénico, esto es, las células de tumor podrían luego formar un subconjunto de células dentro del tejido saludable. Una muestra de tejido podría mediante esto comprender un subconjunto de células saludables y un subconjunto de células tumorigénicas . Dentro de dicho subconjunto de células de tumor, podrían ser posible definir un subconjunto adicional de células de tumor, por ejemplo, tales células de tumor que expresan/sobre expresan Her2/neu. También se contempla que por ejemplo virus u otras especies patógenas (bacterias, protozoarios, etc.) estén comprendidos por una muestra de tejido. Tales bacterias podrían luego formar un subconjunto de células dentro de este tejido o las células que comprenden por ejemplo bacterias intracelulares , podrían formar un subconjunto de células dentro de la muestra del tejido. Como se menciona anteriormente, también se contempla que la muestra de tejido este compuesta completamente de un subconjunto de células. Se comprenderá que los términos "tejido", "muestra de tejido", "sección de tejido", etc., sean usados intercambiablemente. Además, también se contempla que los métodos de la presente invención se pueden llevar con subconjunto de células (que pueden estar comprendidos en una muestra de tejido) .

La muestra de tejido puede ser obtenida vía biopsia tal como biopsia de aguja, biopsia quirúrgica, biopsia de medula ósea, etc.

El término "objetivo" o "objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células" incluye todas las estructuras/antigenos/epitopes a los cuales un dominio de enlace se enlaza y que son específicos o que se supone que son específicos para un subconjunto deseado de células, "especifico" significa que este objetivo caracteriza dicho subconjunto de células, esto es, esta principalmente presente en (o en) estas células o principalmente ausente o principalmente sobre- o sub-expresado sobre o en estas células. "Principalmente" reflejara mediante esto el hecho de que en sistemas biológicos es casi imposible obtener una situación en donde un subconjunto deseado de células permanece sin cambio con el paso del tiempo. El objetivo puede estar asociado con un estado biológico, tal como una enfermedad o alteración, como también como en la presencia de un patógeno. Cuando un objetivo esta "asociado con" un cierto estado biológico, la presencia o ausencia del objetivo o la presencia o ausencia de una cierta cantidad de objetivos puede identificar el estado biológico.

El "objetivo" en el contexto de la presente invención incluye específicamente una proteína, un péptido, una enzima, un ácido nucleico, un polisacárido, un lípido, un receptor, un objetivo celular y/o un antígeno de tumor o cualquier otra clase de estructura/antígeno/epítope, cuya presencia (cualitativamente) y/o cuya cantidad (cuantitativamente) es de interés y caracteriza un subconjunto de células. Preferiblemente, dicho objetivo (su presencia, ausencia o cantidad) tiene un valor de prognóstico para una enfermedad específica, preferiblemente para cáncer.

Un "objetivo celular" incluye todas las clases de epítopes/antígeno/estructura, preferiblemente sobre la superficie celular, que caracteriza un subconjunto de células, tales como CA s semejantes NCAM, ICA -1, VCAM-1, PECAM-1, Ll, CHL1, MAG, integrinas tales como a?ß3 y a?ß5 integrina, selectinas, antígenos de CD tales como CDld, que pueden ser usados para el apuntamiento de, por ejemplo células dendríticas, células epiteliales intestinales, subconjunto de célula B, subconjunto de célula T K, CD 11 a, b, c; C14 y CD 16/18, que pueden ser usados para el apuntamiento de, por ejemplo macrófagos; CD23, que pueden ser usados para el apuntamiento de, por ejemplo, células B maduras activadas que expresan IgM o IgD (particularmente células de manto) , monocitos/macrófagos activados, subconjunto de célula T, plaquetas, eosinofilos, células de Langerhans, células dendríticas foliculares o epitelio intestinal; CD54 (también conocido como ICAM-1) , que puede ser usado para el apuntamiento de, por ejemplo células B y células T y precursores de células B, monocitos, osteoclastos , celulares endoteliales y varias celulares epiteliales; CD57, que pueden ser usados para el apuntamiento de, por ejemplo, células del subconjunto de NK, subconjunto de células T, tejido neuroectodermico, retina, cerebro, próstata, túbulos próximos renales; CD64 (también llamado Fe gama RI), que pueden ser usados para el apuntamiento donde células que presentan antigeno incluyendo macrófagos/monocitos, granulocitos activados, células dendríticas o células mieloides prematuras; CD91 (también conocido como proteína 1 receptor de lipoproteína-relacionada de baja densidad (LRP1); también llamado receptor de alfa-2-macroglobulina) que pueden ser usados para el apuntamiento de fibroblasto, células dendríticas, macrófagos, hígado, tejido de cerebro o pulmón también como CD-20, CD-45. Además, el termino se relación con anticuerpos anti-CD a antígenos expresados por células de tallo de cáncer de diferente origen (pecho, colon, pulmón, próstata, ovarios, hígado y pancreático) , a señales de peligro molecular, TLR, toxinas bacterianas, por ejemplo "trapo" a las células del nervio como se describe en WO 2006/114308 o DEC-205, que esta comúnmente presente en células dendriticas. Además, el término es concerniente con un péptido de albergamiento vascular, que puede ser especifico para ciertos órganos o tejidos como por ejemplo cerebro, riñon, pulmón, piel o corazón. Mas preferiblemente, el termino se relaciona con tales péptidos como se menciona en Arap, . et al. Proc . Nati Acad Sci. U.S. A., 99:1527-1531 (2002); Rajotte, D. et al., J. Clin Invest., 102:430-437 (1998); Pasqualini, R. , and Ruoslahti, E. (2002) Nat . Rev. Cáncer 2 : 83; · Rajotte, D. and Ruoshlati, E., J. Biol. Chem. 274:11593-11598 (1999); Essler, M . , and Ruoshlati, E . , Proc. Nati Acad. Sci. U.S. A., 99:2252-2257 (2002) .

El término "moléculas de receptor" o "receptor" es concerniente con proteínas sobre la membrana celular o dentro del citoplasma o núcleo celular que se enlaza a un ligando y comúnmente transmite una señal, tales como receptores metabotrópicos, receptores proteína G-acoplados, receptores de acetil colina muscarinicos , receptores de adenosina, adrenoreceptores, receptores de GABA, receptores de antiotensina, receptores de canabionides, receptores de colecistoquinina, receptores de dopamina, receptores de glucagón, receptores de glutamato metabotrópicos, receptores de histamina, receptores olfativos, receptores de opioides, los receptores de quimioquinas , receptor de detección de calcio, receptores de somatostatina, receptores de serotonina, receptores de secretina, receptores de Fe o receptores de cinasa de tirosina (RTK) . La familia de cinasa de tirosina de receptor consisten de receptores de superficie celular de alta afinidad para muchos factores de crecimiento de polipéptido, citoquinas y hormonas que comprende ínter alia los receptores de efrina (familia de receptores de Eph) , la familia del receptor de RET; la familia de receptor de VEGF que comprende ínter alia VEGFR1 (Flt-1), VEGFR2 (Flk-1/KDR) and VEGFR4 (Flt-4) y la familia del receptor del factor de crecimiento de fibroblasto ejemplificado por FGFRl, FGFR2, FGFR3, FGFR4 y FGFR6. La familia de receptores de ErbB que es una subfamilia de cuatro cinazas de tirosina de receptor estrechamente relacionadas: EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) y Her 4 (ErbB-4) está también incluido y específicamente preferido.

El término "ácido nucleico" se refiere a cualquier ácido nucleico conocido para la persona experimentada en el arte, por ejemplo un poli nucleótido como ADN, ARN, ADN de una sola hebra, cADN, PNA o derivados de los mismos.

El término "proteína" incluye cualquier polipéptido de interés, incluyendo proteínas terapéuticamente activas, enzimas, proteínas marcadoras, etc.

El término "péptido" denota una molécula formada por el enlace de por lo menos dos aminoácidos (preferiblemente alfa-aminoácido), esto es, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince y aun mas, hace 30 amino ácidos por enlaces de amida.

El término "enzimas" pretende incluir proteínas catalíticamente activas que son o que se supone que son específicas para un subconjunto de células, por ejemplo metaloproteasas que son frecuentemente sobre expresadas en células de tumor, etc.

El término "lípido" pretende incluir todas las clases de lípidos que son aptos de caracterizar un subconjunto de células e incluye mensajeros de lípido que se enlazan a una proteína, tal como un receptor, cinasa o fosfatasa que a su vez moderan los efectos de estos lipidos sobre respuestas celulares específicas.

El término "polisacárido" significa estructuras de carbohidrato poliméricas formadas de unidades repetitivas (ya sea mono-o bi-sacáridos) unidos conjuntamente mediante enlaces glicosidicos e incluyen polisacáridos que son presentados sobre la superficie de células (por ejemplo, MUC-1) , polisacáridos que forman o son parte de capsulas o envolventes bacterianas o virales, lipopolisacáridos (LPS) de bacterias gram negativas, etc.

El término "antígeno de tumor" que es intercambiable con "marcador de tumor" incluye antígenos específicos de tumor antígenos asociados, preferiblemente antígenos tumor-asociados que son responsables por el crecimiento de tumor primario y metástasis, "antigeno de tumor" son ejemplificados por (pero no limitados a), ß-HCG, CA 15-3, CA 19-9, CA 72-4, CFA, MUC-1, MAGE, ras, p53, ETA, CA-125, CEA, AFP, PSA, PSMA, Ep-CAM, CD33, CD44v6, MCSP, CD30, la familia de receptores de ErbB es una subfamilia de cuatro cinazas de tirosina de receptor estrechamente relacionadas: EGFR (ErbB-1) , HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) and Her 4 (ErbB-4), angiopoietinas y sus receptores, VEGF y sus receptores, CD9; CDCP1; CSF1R; CYR61; HER3; HPN (= Hepsin) ; TDGF1; TROP2; CD44; IGF1R; T EAK; EGFR y PLGF y/o c-met, para nombrar algunos.

También, bacterias, virus u otros organismos patógenos mencionados en la presente pueden formar un objetivo, preferiblemente cuando estos organismos patógenos están comprendidos por una célula (célula huésped) . Las células huésped son luego caracterizadas por el objetivo (bacteria, virus ) .

Los objetivos que son presentados sobre la superficie del subconjunto de células son particularmente preferidos (ya sea como un solo objetivo o combinaciones de los mismos) .

Objetivos que son de valor de diagnóstico son aun mas preferidos. "Valor de diagnóstico" significa que ya es conocido o será conocido en el futuro si la presencia o ausencia o regulación ascendente o regulación descendente de un objetivo tiene valor de prognóstico para una cierta enfermedad (como HER2/neu para cáncer de pecho) .

El término "ex vivo", que es intercambiable con "in vitro" se refiere a actividades conducidas en células en un medio ambiente controlado. Como se usa en la presente y en el arte, este término es frecuentemente usado intercambiablemente con "en cultivo", que se puede referir a células en un. cultivo celular o células en un cultivo de órgano.

Asi, en otro aspecto, la presente invención es concerniente con un método para detectar un subconjunto de células y/o para detectar un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células, tal método comprende detectar in vitro, dicho subconjunto de células, en donde dicho dominio de enlace se ha enlazada a su objetivo antes de la detección de dicho subconjunto de células y/o antes de la detección del ob etivo .

En una modalidad preferida, dicho subconjunto de células está comprendido dentro de una muestra de tejido.

El dominio de enlace de la presente invención es preferiblemente marcado.

Un marcador se refiere en el contexto de la invención un compuesto o composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquimicos, bioquímicos, inumoquímicos o químicos .

El marcador puede ser directa o indirectamente detectable .

"Directamente" significa que el marcador como tal genera la señal tal como una señal radioactiva, cromogénica o fluorescente. Los marcadores directos incluyen radio marcadores; marcador fluorescente, reactivos densos de electrones; etc. el marcador directo tiene o genera una señal mensurable que puede ser usada para cuantificar y/o detectar (cualitativamente) el dominio de enlace enlazado. Un marcador fluorescente es el marcador directo preferido.

En algunas modalidades de la presente invención, dicha detención es mediante inmunohistoquímica directa y comprende detectar la presencia de dicho dominio de enlace marcado (de preferencia fluorescentemente) . Dicho dominio de enlace es más preferiblemente un anticuerpo.

Se comprenderá que el dominio de enlace primario es directamente marcado si no se emplea ningún dominio de enlace secundario .

"Indirectamente" significa que el marcador esta por ejemplo enlazado por otra entidad que como tal es luego detectable (entidad de detección) . La detección indirecta o marcador indirecto involucra el enlace de un segundo dominio de enlace detectable directa o indirectamente al marcador indirecto. Por ejemplo, el marcador indirecto de enlace del dominio de la invención puede ser el ligando de un' socio de enlace, tal como biotina, que es un socio de enlace para estreptavidina o una secuencia de nucleótidos que es el socio de enlace para una secuencia complementaria a la cual se puede hibridizar específicamente, etc. "marcación indirecta" esta por consiguiente caracterizada porque el dominio de enlace primario es manipulado de tal manera que puede ser detectado por un segundo dominio de enlace (algunas veces también denotado entidad de detección) que es específico para aquella manipulación (por ejemplo un marcador de biotina) .

En una modalidad preferida, dicho dominio de enlace es un anticuerpo (anticuerpo primario) y dicha entidad de detección es un anticuerpo secundario que reacciona específicamente con (marcador de) anticuerpo primario.

También se contempla que la marcación indirecta y directa sea mezclada. Por ejemplo, ya el marcador directo es apto de generar una señal (por ejemplo, un marcador fluorescente como FITC) , pero el dominio de enlace secundario, que está también marcado, por ejemplo con un marcador directo se enlaza específicamente a aquel marcador (anticuerpo anti FITC) se enlaza al marcador de la señal primaria y mediante esto, puede incrementar la señal detectable. Tales medios y métodos son bien conocidos para la persona experimentada, en particular para los practicantes en el campo de inmunohistoquímica .

Es preferido que por lo menos el 10% de la población de los dominios de enlace que son/van a ser administrados al sujeto (o que están comprendidos por el sujeto) , sean marcados ya sea con un marcador directo o con un marcador indirecto. Preferiblemente, más de 50, 60, 70, 80 o 90% o un 100% de la población de dominio de enlace que son/van a ser administrados al sujeto son marcados ya sea con un marcador directo o con un marcador indirecto.

En otra modalidad, el dominio de enlace primario (por ejemplo, un anticuerpo) no es marcado como tal pero es detectado/detectable por medio de un dominio de enlace secundario (entidad de detección) que se enlaza al dominio de enlace primario (por ejemplo, un anticuerpo no marcado primario criado en ratones detectado por un sequndo anticuerpo marcado, que fue criado en otra especie y se enlaza específicamente a anticuerpos de ratón (por ejemplo, anti-ratón de cabra) ) . El dominio de enlace secundario es luego marcado directa o indirectamente. Tales emparedados de detección de anticuerpo están bien establecidos si la persona experimentada no -tendría problema de generar/establecer o crear tales sistemas.

El fijador más común usado para inmunohistoquímica es para formaldehído, que es usado frecuentemente en diversas soluciones reguladores que contienen alrededor de 1 a 5% de paraformaldehído. Soluciones reguladoras específicas que están basadas en paraformaldehído están ejemplificadas en lo siguiente: a) paraformaldehído al 4% de solución reguladora de fosfato de 0.1 M. b) paraformaldehído al 2% con ácido pícrico al 0.2% en solución reguladora de fosfato 0.1 . c) fijador de PLP (paraformaldehído, lisina, paraformaldehído) ; por ejemplo, paraformaldehído al 4%, periodato al 0.2%, lisina al 1.2% en solución reguladora de fosfato 0.1 M; d) paraformaldehído al 4% con glutaraldehído al 0.05%. Estas soluciones reguladoras no pretenden limitar la invención sino que simplemente ilustran condiciones específicas que son aplicadas normalmente para obtener una fijación suficiente en tejido. El tiempo de fijación estándar es de alrededor de 5, 10, 15, 20, 30 minutos a toda la noche. El tejido así tratado es frecuentemente sometido a un protocolo de embebido en parafina subsecuente. Seguido por la incubación en solventes orgánicos como por ejemplo tratamiento de xileno y etanol . La muestra es luego normalmente hidratada al colocarla en alcohol al 95%, 70%, 50%, 30% (por ejemplo, etanol) por varios minutos cada una. Sin embargo, no hay ningún protocolo estándar para IHC, esto es, el protocolo variara dependiendo del objetivo, el tejido, los anticuerpos usados, etc. todo es conocido por la persona experimentada y manipulada sistemáticamente sin adición adicional. Protocolos específicos son revelados por ejemplo en internet (que se puede mostrar con la hilera de los protocolos de IHC en una máquina de búsqueda como Google, etc.) . Algunos antígenos aún no se sobrevivirán a cantidades moderadas de fijación con aldehido. Bajo esta condición, los tejidos son frecuentemente congelados frescos en nitrógenos líquidos y cortados con un criostato. Las secciones son mantenidos congeladas a -20 °C a una temperatura menor hasta fijación con acetona o alcohol helado.

Se contempla así que el marcador que es empleado en el contexto de la presente invención soporta el procedimiento de IHC, por ejemplo, la fijación, incorporación en parafina de la hibridización, etc. Un marcador "soporta el procedimiento de IHC" si es todavía detectable después que ha sido sometido a un protocolo de IHC. Por ejemplo: algunos marcadores podrían ser desactivados mediante calor (imbibición en parafina o mediante solventes orgánicos o mediante las soluciones reguladores de fijación, etc., y ya no son aptos de generar una señal detectable, ya se debido a que la señal es muy baja o debido a que la señal ya no está presente) . La resistencia de un marcador dependerá así del protocolo de IHC específico que es usado. Así, podría ser que un marcador sea desactivado en el curso de un protocolo de IHC específico pero todavía sea utilizable después del empleo de otro protocolo de IHC.

Preferiblemente, el marcador de la invención soporta* la fijación, mas preferiblemente soporta la fijación en aldehido con formalina. "Soporta" a este respecto significa que es todavía detectable después de dicho procedimiento, esto es, de preferencia no pierde más del 50% de su capacidad de detección .

Se contempla que también el dominio de enlace primario y si es empleado antes de la detección, también el dominio de enlace secundario, soporta el procedimiento de IHC.

Un "marcador fluorescente" como es usado en la presente caracteriza una molécula que comprende un fluoróforo. Un fluoróforo que es algunas veces también denominado fluorocromo, es un grupo funcional en una molécula que absorberá energía de una longitud de onda específica y re-emitirá energía a una longitud de onda diferente. Dicha longitud de onda diferente, cuando es comparada con la longitud de onda especifica (predeterminada) , es re-emitida con una longitud de onda que es distinguible de la longitud de onda especifica (predeterminada) , por ejemplo es re-emitida con una longitud de onda más larga o con una longitud de onda más corta, sin embargo, en un último caso con intensidad disminuida. La cantidad y longitud de onda de la energía emitida depende tanto del fluoróforo como del medio ambiente químico del fluoróforo.

Métodos para acoplamiento de marcadores fluorescentes incluyendo marcadores de fluorescencia de NIR son bien conocidos en el arte. Las técnicas de conjugación de estos marcadores a un anticuerpo han madurado significativamente durante los años pasados y una vista general excelente es dada en Aslam, M. , and Dent, A., Bioconj ugation (1998) 216-363, London, and in the chapter "Macromolecule conjugation" in. Tijssen, P., "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990), Elsevier, Amsterdam.

Técnicas de acoplamiento apropiadas son conocidas de la literatura citada anteriormente (Aslam, supra) . El marcador fluorescente dependiendo de cuál porción de acoplamiento está presente, se puede hacer reaccionar directamente con el anticuerpo ya sea en un acuoso o en un medio orgánico. La porción de acoplamiento es un grupo reactivo o un grupo activado que es usado para acoplamiento químicamente del marcador de fluorocromo al anticuerpo. El marcador de fluorocromo puede ya sea ser anexado · directamente al anticuerpo o unido al anticuerpo vía un separador para formar un conjugado de marcador de fluorescencia de NIR que comprende el anticuerpo y un marcador de fluorescencia de NIR. El separador usado puede ser escogido o diseñado para tener una persistencia in vivo apropiadamente larga (vida media) inherentemente.

El marcador fluorescente es preferiblemente seleccionado del grupo que consiste de agentes de punto cuántico, tintes fluorescentes, tintes fluorescentes pH-sensibles, tintes fluorescentes sensibles al voltaje y Microesferas marcadas fluorescentes, los tintes fluorescentes son preferidos.

"Agente de punto cuántico" o "puntos cuánticos", también conocidos como nanocristales , son la clase de materiales espaciales conocidos como semiconductores que son cristales compuestos de materiales de los grupos periódicos IV-VI, III-v, IV-VI.

"Proteína fluorescente" incluye por ejemplo proteínas fluorescentes verdes (GFP) , CFP, YFP, BFP, ya sea mejorada o no. Proteínas fluorescentes adicionales son descritas en Zhang, Nat Rev Mol Cell Biol. 2002, 12, paginas 906-18 o en Giepmans, Science. 2006, 312, paginas 217-24.

"Tintes fluorescentes" incluyen toda clase de marcadores fluorescentes incluyendo pero no limitado a fluorescencia incluyendo todos sus derivados, por ejemplo FITC; Rodamina incluyendo todos sus derivados, tales como tetrametilrodamina (TAMRA) y su derivado de isotiosianato (TRITC) sulforodamina 101 (y su forma de cloruro de sulfonilo Texas Red) , Rodamina Red, y otros derivados de rodamina que incluyen nuevos fluoróforos mas nuevos tales como, Alexa 546, Alexa 555, Alexa 633, 549 y DyLight DyLight 633); Alexa Fluors (la familia de Alexa Fluor de tintes fluorescentes es producida por Molecular Probes) ; DyLight Fluor que es una familia de tintes fluorescentes son producidos por Dyomics, ATTO Dyes, que representan una serie de marcadores fluorescentes y tintes manufacturados por ATTO-TEC GmbH en Siegen, WO/2007/067978 Japón ); LaJolla Blue (Diatron, Miami, Fia.) ; verde de indocianina (ICG) y sus análogos (Licha et al, 1996, SPIE 2927:192-198;... Ito et al, Patente de estadounidense 5,968,479); indotricarbocianina (ITC, WO 98/47538), y compuestos de lantánidos quelados. Metales de lantánido fluorescentes incluyen europio y terbio. El marcador de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIR) es también contemplado. Marcadores de fluorescencia de NIR con longitudes de onda de excitación y emisión en el espectro de infrarrojo cercano son usados, esto es, 640-1300 nanómetros, preferiblemente 640-1200 nanómetros y más preferiblemente 640-900 nanómetros. El uso de esta porción del espectro electromagnético maximiza la penetración del tejido y mínima la absorción por absorbedores fisiológicamente abundantes tales como hemoglobina <650 nm) y agua (>1200 nm) . Los fluorocromos infrarrojos cercanos ideales para uso in vivo exhiben: (1) características espectrales estrechas, (2) alta sensibilidad (rendimiento cuántico), (3) biocompatiblidad, (4) espectro de absorción y excitación desacoplados y (5) fotoestabilidad.

Varios marcadores de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIR) están disponibles comercialmente y pueden ser usados para preparar una entidad fluorescente de acuerdo con esta invención, marcadores de NIRF ejemplares incluyen los siguientes: Cy5.5, Cy5 and Cy7 (Amersham, Arlington Hts., IL; IRD41 e IRD700 (LI-COR, Lincoln, NE) ; NIR-I, (Dejindo, umamoto, Japón) ; LaJoIIa Blue (Diatron, Miami, FL) ; verde indocianina (ICG) y sus análogos (Licha, K., et al., SPIE-The International Society for Optical Engineering 1996; Vol. 2927: 192-198; US 5,968,479); indotricarbocianina (ITC; WO 98/47538); y compuestos de lantánido quelados SF64, 5-29, 5-36 y 5-41 (de WO 2006/072580) . Metales de lantánidos fluorescentes incluyen europio y serbio. Las propiedades de fluorescencia de lantánido son descritas en Lackowicz, J. R., Principies of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed., Kluwer Academic, New York, (1999). " icroesferas fluorescentes" son descritas en mayor detalle en WO/2007/067978 que es incorporada en la presente por referencia.

Es conocido que la cantidad y longitud de onda de la energía emitida por un tinte fluorescente depende tanto del fluoroforo como del medio ambiente químico del fluoróforo. Se sigue que los tintes presentes pueden reaccionar pH-sensibles o sensibles al voltaje, esto es son activados mediante tales cambios en el medio ambiente químico. Marcadores fluorescentes activables adicionales son descritos por ejemplo en mayor detalle en US 2006/0147378 Al, US 6592847, US 6,083,486, O/2002/056670 o US 2003/0044353 Al, todas la cuales son incorporadas en la presente por referencia.

Los tintes fluorescentes son preferidos en el contexto de la presente invención. Particularmente preferidos son tintes presentes en la familia de Cy, Alexa y Dylight.

El sujeto que está dentro del contexto de la presente invención es un animal. Preferiblemente, dicho sujeto es un vertebrado, mas preferiblemente un mamífero. Es más preferido que dicho sujeto mamífero sea un humano, un mono tal como un mono cinomolgus, un ratón, una rata, un conejillo de indias, un conejo, un caballo, un camello, un perro, un gato, un cuerpo, una vaca, una cabra o un ave. Un sujeto humano es más preferido. Un sujeto no humano puede representar un modelo de enfermedad o alteración particular. También se contempla que el sujeto de la presente invención comprende un xenoinjerto, preferiblemente células de tumor humanas.

El dominio de enlace de la presente invención preferiblemente es o comprende un dominio de enlace de epítope .

Preferiblemente, dicho dominio de enlace de epítopes es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

El término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal (véase, Harlow y Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, USA, 1988) que se enlaza a un objetivo o un derivado de dicho anticuerpo que retiene o retiene esencialmente su especificidad de enlace. Derivados preferidos de tales anticuerpos, son anticuerpos quiméricos que comprenden, por ejemplo una región variable de ratón o rata y una región constante humana. El término "anticuerpo" también comprende anticuerpos bifuncionales (bis especifico) y construcciones de anticuerpo, como Fv de una sola cadena (scFv) o proteínas de anticuerpo-fusión. El término "Fragmentos de scFv" (fragmento de Fv de una sola cadena) es bien entendido en el arte y preferido debido a su tamaño pequeño y la posibilidad de producir tales fragmentos recombinantemente . Dicho anticuerpo o porción de enlace de anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. El término "anticuerpo humanizado" significa, de acuerdo con la presente invención, un anticuerpo de origen no humano, en donde por lo menos una región gue determina la complementareidad (CDR) en las regiones variables tales como las CDR3 y preferiblemente todas las 6 CDR han sido reemplazadas por CDR de un anticuerpo de origen humano que tiene una especificidad deseada. Opcionalmente, la (s) región (es) constante (s) no humana (s) del anticuerpo ha sido reemplazada por una (s) región (es) constante (s)de un anticuerpo humano. Métodos para la producción de anticuerpos humanizados son descritos en , por ejemplo EP-A1 0 239 400 and WO90/07861. El termino anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo también incluye anticuerpos de cadena pesada y los dominios variables de los mismos, que son mencionados WO 94/04678, WO 96/34103 y WO 97/49805, WO 04/062551, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041862 y WO 04/041867, también como anticuerpos de dominio o "dAb", que están basados en o derivados de dominio variable de cadena pesada (VH) o el dominio variable de cadena ligera (VL) de 4 moléculas de anticuerpo de cadena tradicionales (véase, por ejemplo Ward et al. 1989 Nature 341, 544-546).

El término "fragmento de enlace de antigeno", como se usa en la presente, se refiere a fragmentos de los anticuerpos como se especifica en la presente que retienen o retienen esencialmente la especificidad de enlace de los anticuerpos como cadenas ligeras y pesadas separadas, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2. Un fragmento de enlace antigeno puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VR) de un anticuerpo; sin embargo, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos de Fd, por ejemplo, tienen dos regiones de VH y frecuentemente retienen función de enlace de antigeno del fragmento de enlace de antigeno intacto.

El término "dominio de enlace de epitope" incluye, además de anticuerpos o fragmentos de enlace antigeno de los mismos, otras entidades de enlace que se enlazan a (se enlazan específicamente a) un objetivo. El término "dominio de enlace de epítope" incluye, por ejemplo un dominio que se enlaza (específicamente) a un antígeno o epítope independientemente de una región V o dominio diferente, este puede ser un anticuerpo de dominio (dAb) , por ejemplo un dominio variable de una sola inmunoglobulina de humano, camélido o tiburón o puede ser un dominio que es un derivado de un andamio seleccionado del grupo que consiste de CTL1-4 (Evibody) ; lipocalina; moléculas derivadas de proteína A, tales como dominio Z de la Proteína A (Affibody, SpA) , un dominio A (Avimer / Maxibody) ; proteínas de choque térmico, tales como GroEI y GroES; transferrina ( trans-cuerpo) ; proteína de repetición de anquirina (DARPin) ; aptámero de péptido ; dominio lectina tipo C (tetranectina) ; ubiquitina ?-cristalina humana y humana (affilina) ; dominios PDZ; dominios de tipo Kunitz de toxinas escorpión de inhibidores de proteasa humanos y fibronectina (adnectin) , que ha sido sometida a diseño de proteína con el fin de obtener el enlace a un ligando diferente del ligando natural. CTLA-4 (antígeno 4 linfocitos T citotóxico-asociado) es un receptor de la familia de CD28 expresado sobre principalmente células T CD4 positivas. El dominio extracelular tiene un pliegue de Ig semejante a dominio variable. Los bucles correspondientes a CDR de anticuerpos pueden ser sustituidos con secuencia heteróloga para conferir diferentes propiedades de enlace. Moléculas de CTLA-4 diseñadas para tener diferente especificidad de enlace son también conocidas como evicuerpos. Para detalles adicionales véase, Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001).

Las lipocalinas son una familia de proteínas extracelulares que . transportan moléculas hidrofóbicas pequeñas tales como esferoides, bilinas, retinoides y lipidos. Tienen una estructura secundaria de hoja ß rigida con un número de bucles en el extremo abierto de la estructura cónica que pueden ser diseñados para enlazarse a diferente antigeno objetivo. Las anticalinas son de entre 160-180 aminoácidos de tamaño y son derivadas de lipocalinas. Para detalles adicionales véase Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 y US20070224633.

Un afficuerpo es un andamio derivado de proteina A de Staphylococcus aureus que pueden ser diseñado para enlazarse al antigeno. El dominio consiste de unas de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado bibliotecas mediante aleatorización de residuos de superficie. Para detalles adicionales véase Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) y EP1641818A1.

Los avimeros son proteínas de multidominio derivadas de la familia de andamio del dominio A. los dominios naturales de aproximadamente 35 amino ácidos afectan una estructura enlazada de disulfuro definida. La diversidad es generada mediante entre mezcla de la variación natural exhibida por la familia de dominio de A. para detalles adicionales véase Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) and Expert Opinión on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007) .

Una transferrina es una glicoproteina de transporte de suero monomérica. Las transíerrinas pueden ser diseñadas para enlazarse a diferentes antigenos objetivos mediante inserción de secuencias de péptido en un bucle de superficie permisivo. Ejemplos de andamios de transferrina diseñados incluyen el trans-cuerpo . Para detalles adicionales véase, J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999) .

Las proteínas de repetición de Anquirina diseñadas (DARPin) son derivadas de Anquirina que es una familia de proteínas que moderan la anexión de proteínas de membrana integrales al citoesqueleto . Una repetición de anquirina individual es una porción de 33 residuos que consiste de dos a-hélices y una vuelta ß. Pueden ser diseñadas para enlazarse a diferentes antígenos objetivo mediante aleatorización de residuos en la primera a-hélice y una vuelta ß de cada repetición. Su interface de enlace puede ser incrementada al incrementar el número de moléculas (un método de maduración por afinidad) . Para detalles adicionales, véase J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) y J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) y US20040132028A1.

La fibronectina es un andamio que puede ser diseñado para enlazarse a un antígeno. Las adnectinas consisten de una cadena fundamental de las secuencia de amino acido natural del décimo dominio de las 15 unidades de repetición de fibronectina humana tipo III (FN3) . Tres bucles en un extremo del emparedado ß pueden ser diseñados para permitir que una adnectina reconozca específicamente un objetivo terapéutico de interés. Para detalles adicionales, véase Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005), US20080139791, WO2005056764 and US6818418B1.

Los aptámeros de péptido son moléculas de reconocimiento combinatorial que consisten de una proteína de andamio constante, típicamente tioredoxina (TrxA) que contiene un bucle de péptido variable restringido insertado en el sitio activo. Para detalles adicionales, véase Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005) .

Los microcuerpos son derivados de micro proteínas que se presentan naturalmente de 25-50 aminoácidos de longitud que contienen 3-4 puentes de cisteína-ej emplos de microproteínas incluyen KalataBl y cono toxina y knottina. Las microproteínas tienen un bucle que puede ser diseñado para incluir hasta 25 aminoácidos sin afectar el plegado global de la micro proteína. Para detalles adicionales de dominios de knottina diseñados, véase WO2008098796.

Otros dominios de enlace de epítope incluyen proteínas que han sido usados como andamio para diseñar diferentes propiedades de enlace antigeno objetivo que incluyen ?-cristalina y ubiquitina humana (affilina) , dominios tipo kunitz de inhibidores de proteasa humana, dominios PDZ de proteina de enlace de ras AF-5, toxinas de escorpión (caribdotoxina) , dominio de lectina Tipo C (tetranéctinas) son revisados en el Capitulo 7- Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, editado por Stefan Dubel) y Protein Science 15:14-27 (2006). Los dominios de enlace de epitopes de la presente invención podrían ser derivados de cualquiera de estos dominios de proteína alternativos. Ejemplos de "dominios de enlace de epitopes adicionales" son receptores (que se enlazan específicamente a su ligando) , lectinas (que se enlazan específicamente a polisacáridos ) , dedos de zinc y cremalleras de leucina (enlace a ácidos nucleicos) , enzimas (que se enlazan específicamente a su sustrato) , virus y bacterias (por ejemplo que se enlazan específicamente a sus células objetivo) , ácidos nucleicos (que se hibridizan específicamente entre sí), etc.

Se contempla que en algunas modalidades de la presente invención, dicho dominio de enlace es terapéuticamente activo .

"Terapéuticamente activo" significa que el dominio de enlace como tal es apto de o se considera apto de ejercer un efecto terapéutico en el sujeto, por ejemplo un anticuerpo terapéuticamente efectivo que alivia los síntomas o la causa de una enfermedad, que trata una enfermedad, es apto de impedir el inicio de una enfermedad, etc.

En algunas modalidades, dicho dominio de enlace terapéuticamente activo es seleccionado del grupo que consiste . de alemtuzumab, apolizumab, cetuximab, epratuzumab, galiximab, gemtuzumab, ipilimumab, labetuzumab, panitumumab, rituximab, trastuzumab, nimotuzumab, mapatumumab, matuzumab, rh ab ICR62, rhMab B-Lyl y pertuzumab.

En algunas modalidades, también se contempla que dicho sujeto ha recibido dicho dominio de enlace en una dosis terapéuticamente efectiva antes de la remoción de la muestra de tejido y/o subconjunto de células, esto es, dicho sujeto de la invención ya comprende una comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de dicho dominio de enlace antes de la remoción de la muestra de tej ido/subconj unto de células. El sujeto de la presente invención es alternativamente un sujeto que ha recibido el dominio de enlace de la invención en una dosis terapéuticamente efectiva antes de la remoción de las muestras de te ido/subconj unto de células.

Por medio de la presente invención, es ahora posible combinar dos capacidades diferentes de un dominio de enlace, es decir (a) su capacidad para marcar detectablemente un objetivo vía técnicas de detección de IHC y (b) su capacidad para actuar de una manera terapéuticamente efectiva, al mismo tiempo. Así, el marcador marcado detectablemente que puede ser usado en IHC y el agente terapéuticamente activo podrían ser uno y la misma entidad. En particular, es ahora posible emplear cada anticuerpo terapéutico en un ajuste de IHC, incrementando mediante esto la conflabilidad de los resultados de IHC. Es por ejemplo estándar "gradual" ciertos tumores, por ejemplo dependiendo del nivel de expresión de un marcador de tumor tal como HER2/neu-la relevancia de prognóstico de tal medición puede ser mejora por medio de las modalidades de la presente invención debido a que la medición se lleva a cabo ahora con el anticuerpo terapéutico que será aplicado subsecuentemente (o que ya ha sido aplicado de antemano). La medición de IHC resultante refleja mediante esto más exactamente si un cierto objetivo de tumor (que es también "usado" por el anticuerpo terapéutico) está todavía o no y consecuentemente, se puede suponer que una terapia subsecuente con el mismo anticuerpo estará en toda probabilidad de ser exitoso o no (por ejemplo, si el objetivo que es usado por el anticuerpo terapéutico esta todavía ahí entonces se puede especular que la terapia con el mismo anticuerpo debe tener una mejor esperanza de éxito) . Es así una ventaja significativa usar el mismo anticuerpo para dos propósitos diferentes. Tampoco hay necesidad de desarrollar anticuerpos específicos que trabajan en una estación de IHC debido a que el anticuerpo ya ha sido enlazado a su objetivo antes de que el subconjunto de células/muestra de tejido sea sometido a fijación, etc. la reacción de enlace de anticuerpo-objetivo por consiguiente refleja más estrechamente la situación real.

Además, los portaobjetos de tejido embebidos con parafina fijos en formalina tienen que ser procesados de maneras especiales para obtener el teñido óptimo con un anticuerpo de IHC (por ejemplo, es necesario recuperar/desenmascarar el antigeno I mediante calentamiento y/o incubación con enzimas especiales). Tal tratamiento especializado no es necesario en la aplicación de las enseñanzas de la presente invención ya que los epitopes antigénicos son presentados y enlazados dentro del sujeto o dentro de un equipo de cultivo celular, impidiendo o disminuyendo mediante esto el riesgo de que el antigeno sea enmascarado (y por consiguiente ya sea no detectado o detectado erróneamente por el dominio de enlace) durante el procedimiento de fijación, destruyendo o alterando mediante esto potencialmente el epitope que indica la presencia, ausencia o grado de expresión de aquel objetivo.

La presente invención también es concerniente con el uso de un dominio de enlace como se define en la presente en un método definido en la presente.

La presente invención también es concerniente con el uso de un dominio de enlace como se define en la presente para la preparación de una composición a ser usada en un método definido en la presente. Tal composición es preferiblemente una composición de diagnóstico, sin embargo, composiciones farmacéuticas son también contempladas.

La presente invención también es concerniente con un dominio de enlace como se define en la presente a ser usado en un método definido en la presente. Asi, en un aspecto adicional la presente invención es concerniente con un dominio de enlace que es especifico para aun objetivo, tal objetivo caracteriza un subconjunto de células para uso en un método de inmunohistoquimica (IHC) de la invención, tal método de IHC comprende detectar ex vivo dicho subconjunto de células, en donde dicho dominio de enlace va a ser administrado a un sujeto que comprende o se supone que comprende dicho subconjunto de células, antes de la remoción del subconjunto de células. La presente invención también es concerniente con un dominio de enlace que es especifico para un objetivo, tal objetivo caracteriza un subconjunto de células, para uso en un método de inmunohistoquimica (IHC) para detectar un subconjunto de células, tal método comprende detectar ex vivo dicho subconjunto de células, en donde dicho subconjunto de células (o una muestra de tejido como se describe en la presente) es obtenido de un sujeto que ha recibido el dominio de enlace de la invención antes de la remoción de la muestra de tejido/subconjunto de células.

En algunas modalidades de la presente invención dicho subconjunto de células es detectado mediante ¦inmunohistoquímica, preferiblemente mediante inmunohistoquímica directa.

Inmunohistoquímica (IHC) es la localización de objetivos (por ejemplo, antígenos) y/o subconjunto de células- que presentan un objetivo en secciones de tejido mediante el uso de dominios de enlace que son ya sea marcados directamente (IHC directa) o marcados .indirectamente (IHC indirecta) tales dominios de enlace reaccionan con su objetivo por medio de interacciones de objetivo-dominio de enlace especificas. Estas interacciones son luego visualizadas por el marcador mencionado .

Hay principalmente dos estrategias usadas para la detección inmunohistoquímica (IHC) de antígenos en tejido, el método directo y el método indirecto. El método directo de teñido inmunohistoquímico usa un dominio de enlace marcado directamente, que se enlaza directamente al objetivo por quien es teñido. El método directo es así un método de teñido de una etapa e involucra por ejemplo un anticuerpo marcado (por ejemplo, antisuero FITC conjugado) que reacciona directamente con el antígeno es secciones de tejido. Estas técnica utiliza solamente un anticuerpo y el procedimiento es por consiguiente simple y rápido. Es conocido que este método de IHC directo, cuando se lleva a cabo en el "formato convencional" como fue usado antes de la presente invención, tiene problemas con la sensibilidad debido a poca amplificación de señal. Esto es supuestamente debido al hecho de que el objetivo como tal ya está alterado en el curso de la etapa de fijación, lo que disminuye espectacularmente la cantidad de objetivo "detectable" y consecuentemente, también disminuye la cantidad de dominio de enlace que se podría enlazar a y mediante esto detectar el objetivo. Sin embargo, sorprendentemente, se podría demostrar que mediante la aplicación de las enseñanzas de la presente invención, esto es, al hacer reaccionar el dominio de enlace marcado directamente con el objetivo antes de la detección y mediante esto antes de la remoción del tejido y también antes de la fijación del tejido, es por supuesto posible detectar el objetivo a un con un dominio de enlace primario marcado directamente (esto es, sin la necesidad de "amplificar" la señal por medio de un segundo dominio de enlace que se enlaza específicamente al dominio de enlace primario) .

En otras modalidades de la presente invención, dicho subconjunto de células es detectado mediante inmunohistoquímica indirecta. El método indirecto de teñido inmunohistoquímico usa un dominio de enlace contra el objetivo que es sondeado y un segundo dominio de enlace marcado contra el primero. Se contemplan métodos en donde el dominio de enlace es un anticuerpo (anticuerpo primario) y dicha entidad de detección es un anticuerpo secundario que reacciona específicamente con (marcador . del) anticuerpo primario .

El método indirecto involucra un anticuerpo primario (primera capa-normalmente sin marcar) que reacciona con el objetivo y un dominio de enlace secundario marcado (segunda capa) que reacciona con un dominio de enlace primario. El dominio de enlace secundario es por ejemplo criado contra la IgG de la especie de animal en la cual el anticuerpo primario ha sido criado.

Se contempla que en algunas modalidades de los métodos de la presente invención, dicha inmunohistoquímica está caracterizada por las siguientes etapas: (a) proveer un medio (por ejemplo un portaobjeto) que comprende dicha muestra de tejido que comprende el subconjunto de células y/o dicho subconjunto de células a las cuales el dominio de enlace se ha enlazado; (b) opcionalmente fijar la muestra de tejido; (c) opcionalmente deshidratar la muestra de tejido; (d) opcionalmente permitir que la muestra de tejido sea parafinizada; (e) detectar directa o indirectamente el dominio de enlace y mediante esto el subconjunto de células.

"Fijar" o "fijación" significa un procedimiento de fijación que es apropiado para preparar el objetivo/subconjunto de células/muestra de tejido que comprende dicho subconjunto de células para un procedimiento de IHC subsecuente. Una "fijación" se lleva a cabo particularmente con el fin de asegurar la conservación de la arquitectura de tejido y la morfología de las células. Condiciones de fijación apropiadas son bien conocidas y también reveladas en la presente. Alternativamente, también se contempla que el tej ido/subconj unto es conservado por medio de congelación intensa (por ejemplo, en nitrógeno líquido) .

Todas las etapas /medidas de pre tratamiento anteriores están dentro del alcance del término "fijación", esto es, fijación incluye específicamente fijación con agentes de fijación como formaldehído, paraformaldehído y/o congelación intensa de la muestra de tej ido/subconjunto de células y/u opcionalmente también la imbibición del tej ido/subconj unto de células en parafina o agentes similares. Se debe entender que el objeto de la presente invención radica en el hallazgo sorprendente de que es ventajoso que el dominio de enlace (por ejemplo, el anticuerpo primario que es especifico par a un objetivo) se permite que se enlace a su objetivo antes de que el tej ido/subcon unto, etc., presente dicho objetivo sea sometido a un procedimiento de fijación, ya que el procedimiento de fijación podría afectar la cantidad y/o calidad del objetivo, alterando mediante esto el resultado de manera indeseable.

El tej ido/subconjunto puede también ser parafinizado (usualmente después de la fijación) .

Medios y métodos para poner en práctica los diferentes protocolos de IHC son bien conocidos para las personas experimentadas y. han sido y serán/pueden ser adaptados al tej ido/subconjunto de células/objetivo especifico que es de interés, sin acciones adicionales. Tres protocolos ejemplares son enlistados a continuación, tales protocolos son sin embargo ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

A. Lineas celulares Cultivos de células sobre portaobjetos de vidrio estériles o portaobjetos de la noche a la mañana.

Lavado brevemente con PBS.

Fijación como se desee. Los procedimientos posibles incluyen: 10 minutos con formalina al 10% en PBS (mantenido húmedo) 5 minutos con metanol helado, se permite que se seque al aire 5 minutos con acetano helada, se permite que se seque al aire Lavado en PBS B. Secciones congeladas Se toman tejidos recientes congelados en nitrógeno líquido o isopentano pre-enfriado en nitrógeno líquido, embebidos en compuesto de O.C.T. Se almacenan los bloques congelados a -80°C.

Se cortan secciones de criostat de alrededor de 4-8 mieras de espesor y se montan sobre superfrost mas portaobjetos o portaobjetos recubiertos de gelatina. Se almacenan los portaobjetos a -80°C hasta que se necesiten.

Antes del teñido, los portaobjetos calientes a temperatura ambiente por 30 minutos y se fija en acetona helada por 5 minutos. Se deja al aire por 30 minutos.

Lavado en PBS .

C. Secciones de parafina Se desparafinizan secciones en xileno, 2 x 5 minutos. Se hidrata con etanol al 100%, 2 x 3 minutos.

Se hidrata con etanol al 95%, 1 minuto.

Es preferido que el procedimiento se lleve a cabo como sigue : Se desparafinizan secciones en xileno, alrededor de 3 x alrededor de 1 minútese hidrata con etanol al 100%, alrededor de 2 x alrededor de 1 minuto; Se hidrata con etanol al 90%, alrededor de 1 minuto; Se hidrata con etanol al 80%, alrededor de 1 minuto; Se hidrata con etanol al 70%, alrededor de 1 minuto; Agua alrededor de 1 minuto.

Teñido con Hematoxilina de Mayer por alrededor de 1 minuto Se lava con agua fluida por alrededor de 0.5 minutos a 2 minutos Agua alrededor de 10 segundos Eosina al 0.01% por alrededor de 1 minuto.

Se hidrata con etanol al 70%, alrededor de 5 segundos; Se hidrata con etanol al 80%, alrededor de 10 segundos; Se hidrata con etanol al 90%, alrededor de 10 segundos; Se hidrata con etanol al 100%, alrededor de 10 segundos (se verifican las secciones en el microscopio) ; Xileno alrededor de 1 minuto.

El término "alrededor" en el protocolo anterior incluye desviaciones de hasta 100% (con respecto a los intervalos de tiempo) . También se contempla que una etapa que se dice que se lleva a cabo por ejemplo 2 veces, es llevada a cabo 3 veces o solo 1 vez, etc. -la persona experimentada estará consciente de que es posible enmendar el protocolo anterior a la misma extensión. Se comprenderá que el protocolo anterior sirve solamente como directriz para llevar a cabo un procedimiento de fijación exitoso.

Se contempla que las secciones respectivas pueden ser examinadas mediante microscopía de fluorescencia.

Se inyectan 50 microgramos de Herceptin Cy5 marcado, Omnitarg y Xolair en ratones portadores de Calu3 (tumor Her2 positivo) . El Herceptin y Omnitarg son anticuerpos terapéuticos contra Her2 (grupos testigo positivos) y Xolair es un anticuerpo que se enlaza a IgE humana (grupo testigo negativo) . 48 horas después de la inyección una señal de fluorescencia fuerte es detectable en el área de tumor de ratones tratados con Herceptin-Cy5 y Omnitarg Cy5, mientras que el grupo tratado con Xolair-Cy5 mostró ahora señal de fluorescencia en el tumor (Figuras la-c) . Después de la representación de imagen in vivo, los tumores fueron explantados, fijados en formalina y después de esto deshidratados embebidos en parafina. Tejidos parafina-embebidos fueron cortados a rebanadas de 2 mieras, montados sobre portaobjetos de microscopio e incubados de la noche a la mañana a 39 °C. El análisis subsecuente del tejido de tumor explantado revela que los anticuerpos Her2 específicos se enlazan solamente a células de tumor, pero al tejido murino. En contraste, ninguna señal dé fluorescencia es generada con el anticuerpo testigo Xolair que es dirigido a IgE humana (Figuras 3a-c) .

Para verificar el enlace especifico del anticuerpo marcado a las células de tumor, se usó un nuevo procedimiento de teñido desarrollado que hace posible obtener campo brillante e información de fluorescencia de un portaobjeto de tejido. Con el procedimiento de teñido normal se necesitan dos portaobjetos de tejido seriales. Un portaobjetos para el teñido de Hematoxilina (estructuras basofilicas ) /Eosina (estructuras eosinofilicas ) , que provee una vista general morfológica muy detallada y fina estructurada. El segundo portaobjetos es usado para visualizar las señales de fluorescencia del anticuerpo Cy5 marcado. Las desventajas de este método normal son las diferencias morfológicas de los dos portaobjetos de tejido y el tiempo de preparación adicional para el teñido de fluorescencia del núcleo de las células y el tejido celular. Con el nuevo procedimiento se puede obtener esta información de un portaobjetos de tejido. Para esto, se cambiaron la concentración y tiempos de incubación del protocolo de teñido de Hematoxilina/Eosina de Roche existente. Hematoxilina y Eosina muestran una activación bajo condiciones de fluorescencia de tal manera que se pueden visualizar más o menos los mismos detalles morfológicos como en una medición de campo brillante. Con el sistema de cámara de fluorescencia especial (Nuance; CRi) es posible separar los espectros de fluorescencia de diferentes fluoróforos. Este sistema de representación de imagen multiespectral permite a los usuarios cuantificar marcadores moleculares aun cuando están localizados en una sola sección de tejido, produciendo imágenes claras y agudas de cada marcador individual sobre una sección de tejido de multi-marcador. Estos sistemas también ofrecen la capacidad poderosa de des mezclar y remover la auto florescencia en las imágenes de fluorescencia de Nuance incrementado mediante esto espectacularmente la señal a ruido y mejorando la exactitud de los resultados. En el nuevo procedimiento, se mide primero el teñido de Hematoxilina/Eosina optimizado del portaobjetos de tejido en el campo brillante (Figuras 2a-2c) . Luego se cambia la misma área de portaobjetos a fluorescencia y se miden las señales de Hematoxilina y Eosina más la señal de anticuerpo Cy5 marcado. El sistema de Nuance separa estas tres señales de fluorescencia del resto de la información del portaobjetos indeseable (por ejemplo, auto fluorescencia) y los pega en una imagen con untamente (Figuras 3a-c) .

Se contempla por consiguiente que los métodos de la presente invención son llevados a cabo preferiblemente como se especifica anteriormente. En particular, se contempla que el subconjunto de células (que esta preferiblemente comprendido en una muestra de tejido) es teñido con Hematoxilina/Eosina y subsecuentemente analizado con un dispositivo de detección de fluorescencia (por ejemplo, un sistema de cámara de fluorescencia (Nuance; CRi)) o sistemas comparables de Olympus, que es/son aptos de separar los espectros de fluorescencia de diferentes fluoróforos. Los elementos de programación, etc., que podrían ser usados o diseñados para aquel propósito, son bien conocidos para la persona experimentada en el arte.

Una vez que se obtiene una "señal" a condición de que dicha señal refleje fielmente la distribución del objetivo es todavía una materia de alguna dificultad. El testigo negativo más simple es la ausencia de expresión en tejidos en los cuales la ARN para el objetivo es conocido no a ser expresado por la protección de ARNasa y restricción de expresión a regiones de un tejido objetivo que tienen ARN expresado como se observa mediante hibridización in situ. Un testigo negativo alternativo es la eliminación de la señal mediante pre incubación de dominio de enlace con un exceso del péptido o proteína con el cual fue criado. Un Western Blot puede sugerir especificad de la interacción si solamente se observa una banda; no obstante, la dificultad de optimizar condiciones para un Western Blot deben demostrar la posibilidad de que las condiciones en la región de inmunohistoquímica sean menos que óptimas.

Se contempla que en los métodos de la presente invención, dicha detección comprende además técnicas de hibridización in situ, preferiblemente hibridización in situ fluorescente (FISH) .

La presente invención también es concerniente con un kit que comprende un dominio de enlace como se define en la presente y opcionalmente medios para administrar dicho dominio de enlace a un sujeto y/o medios para detectar dicho dominio de enlace con un método definido en la presente. Tal kit puede comprender además folletos que comprenden instrucciones en cuanto a cómo emplear el dominio de enlace y en particular para emplear para emplear el dominio de enlace en los métodos de la presente invención. Los kits de la presente invención comprenden, en una modalidad preferida, un dominio de enlace como se describe en la presente, tal dominio de enlace es marcado, preferiblemente con tinte fluorescente y adicionalmen e , medios de administración como por ejemplo una jeringa, un portador aceptable farmacéuticamente para diluir dicho dominio de enlace, etc., y preferiblemente, también instrucciones técnicas que ayudan a la persona experimentada en la administración de dominio d.e enlace al sujeto respectivo (es en particular importante que el dominio de enlace sea administrado antes de que el tejido/subconjunto de células sean removidos) . Los kits pueden comprender además medios para remover una muestra de tejido del sujeto una vez que el dominio de enlace ha sido administrado al mismo sujeto y/o medios para fijar la muestra de tejido removida tales como soluciones reguladoras del pH, que permiten la fijación de la muestra de tejido removió y/o portaobjetos de vidrio para la microscopía de fluorescencia subsecuente y/o parafina para parafinizar la muestra de tejido removida y/o solventes orgánicos para remover la parafina, etc.

La presente invención también es concerniente con un método para detectar un subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células, tal método comprende detectar in vitro dicho subconjunto de células, en donde dicho dominio de enlace ha sido enlazado a su objetivo antes de la fijación del subconjunto de células y/o antes de la detección del obj etivo .

La presente invención también es concerniente para detectar un objetivo que caracteriza el subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para dicho objetivo, tal método comprende detectar in vitro el objetivo, en donde dicho dominio de enlace se ha enlazado a su objetivo antes de la fijación del subconjunto de células y/o antes de la detección del objetivo.

Los métodos "para detectar un subconjunto de células" como se define en la presente puede adicional o alternativamente pueden ser usados para: (i) identificar un sujeto dispuesto a responder favorablemente a un dominio de enlace (tal sujeto es preferiblemente un sujeto que sufre de un tumor) o (ii) monitorear una terapia, preferiblemente una terapia anti-cáncer/tumor que está basada en un dominio de enlace (esto es, el dominio de enlace es terapéuticamente activo) o (iii) identificar un dominio de enlace apto de enlazarse in vivo a un objetivo, (iv) seleccionar un dominio de enlace dispuesto a actuar terapéuticamente efectivo sobre un tumor caracterizado por un objetivo, (v) tipificar un tumor.

Se comprenderá que el término "detectar un subconjunto de células" como se usa en la presente incluye situaciones en donde no todas las células individuales (cuantitativamente) del subconjunto de células mencionado están enlazadas por el dominio de enlace (aunque estas células son caracterizadas por el objetivo también) . Debido a las limitaciones naturales de la acumulación de dominio de enlace en una masa celular como un tumor, es posible y por consiguiente contemplado que no todas las células objetivos que definen el subconjunto de células están enlazadas por el dominio de enlace.

Ventajosamente, los métodos de la presente invención permiten la verificación de expresión objetivo y demostración del enlace del anticuerpo terapéutico simultáneamente in vivo en el punto en el tiempo cuando la terapia es iniciada. Los métodos de la presente invención pueden ser asi aplicados para la estratificación de pacientes. En el equipo adyuvante, los pacientes serán tratados primero con una pequeña cantidad del anticuerpo terapéutico marcado. Subsecuentemente, el tejido del tumor será removido quirúrgicamente alrededor de 24 a 48 horas más tarde, fijando formalina y embebido en parafina, la expresión del antigeno tumor-asociado y enlace especifico del anticuerpo a las células de tumor pueden ser confirmada mediante microscopía a base de infrarrojo cercano. La identificación de un sujeto dispuesto a responder favorablemente a un dominio de enlace puede alternativamente ser denotada como "medicina estratificada". La medicina estratifica es el manejo de un grupo de pacientes con características biológicas compartidas (por ejemplo, un objetivo o subconjunto de células como se define en la presente) al usar pruebas de diagnóstico molecular para seleccionar la terapia más óptima con el fin de obtener el resultado medicinal mejor posible para aquel grupo. Es por ejemplo contemplado que con el fin de tratar un cierto tumor en un paciente, se caracteriza cual dominio de enlace (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que es o que se supone que es terapéuticamente activo) tiene las mejores características de enlace para un grupo de pacientes o para un paciente específico. Así, por medio del empleo de las modalidades de la presente invención, es posible encontrar el mejor dominio de enlace para un paciente (medicina personalizada) . La mayor ventaja de la presente invención es mediante esto que los dominios de enlace activos terapéuticos (por ejemplo, anticuerpos) pueden también ser usados para la detección a base de IHC que conduce a resultados que reflejan la situación in vivo real. Situación in vivo significa que podría ser que algunos pacientes respondan mas favorablemente con el anticuerpo A, mientras que otros reaccionan mas favorablemente al anticuerpo B (ambos anticuerpos son mediantes esto específicos para el mismo objetivo, por ejemplo, para Her2/neu) . Las diferencias en las características de enlace pueden así guiar a la persona experimentada a emplear el mejor dominio de enlace posible para una situación terapéutica dada (por ejemplo, un tumor) . El dominio de enlace puede así ser escogido específicamente para un paciente específico. Se contempla por ejemplo proveer un conjunto de anticuerpos todos los cuales se enlazan al mismo objetivo y para probar cuál de estos anticuerpos muestran las características de enlace más promisorias para el paciente respectivo (medicina personalizada) .

"Monitoreo de una terapia" incluye que es ahora posible monitorear la presencia, ausencia, sobre expresión, sub-expresión de un objetivo dado o subconjunto de células caracterizadas por aquel objetivo con el anticuerpo terapéuticamente activo que ya es o que puede ser usado para el tratamiento de una enfermedad, tal enfermedad es caracterizada por aquel objetivo y/o subconjunto. Así, es ahora por ejemplo posibl3e tratar un tumor con un anticuerpo especifico en un paciente y monitorear el "éxito" de la terapia con uno y el mismo anticuerpo. A este respecto, se contempla que el anticuerpo terapéutico es marcado o por lo menos marcado parcialmente (por ejemplo, 10% de la población de anticuerpo total es marcado, mientras que el total esta sin marcar) y que la respuesta in vivo es monitoreada de vez en cuando. También se contempla que el anticuerpo terapéuticamente efectivo, pero sin marcar, es reemplazado de vez en cuando por el mismo anticuerpo en forma marcada con el fin de monitorear la respuesta in vivo.

"Identificación de un dominio de enlace apto de enlazarse in vivo a un objetivo" significa que es ahora posible proveer un conjunto de dominio de enlace, (a) tal conjunto es o se supone que es terapéuticamente efectivo o (b) tal conjunto comprende o se supone que comprende dominios de enlace que son terapéuticamente efectivos y probar si estos dominios de enlace son aptos de enlazarse al objetivo respectivo, indicando mediante esto que dicho dominio de enlace es terapéuticamente efectivo, ya sea en qeneral o en un subqrupo de pacientes o en aun en solamente un paciente (identificación personalizada) . Es asi posible seleccionar un dominio de enlace dispuesto a actuar terapéuticamente efectivo sobre un tumor (tal tumor es caracterizado por dicho objetivo) .

"Tipificar un tumor" siqnifica evaluar el estatus de un tumor, por ejemplo el estatus de Her2/neu.

La presente invención también es concerniente con el uso de un dominio de enlace, preferiblemente un anticuerpo terapéuticamente efectivo por ejemplo alemtuzumab, apolizumab, cetuximab, epratuzumab, galiximab, gemtuzumab, ipilimumab, labetuzumab, panitumumab, rituximab, trastuzumab, nimotuzumab, mapatumumab, matuzumab, rhMab ICR62, rh ab B-Lyl y pertuzumab etc., incluyendo combinaciones de los mismos, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de pacientes dispuestos a responder favorablemente a dicho dominio de enlace al como se identifica por un método descrito en la presente.

La presente invención también es concerniente con un dominio de enlace terapéuticamente efectivo, preferiblemente un anticuerpo terapéuticamente activo como por ejemplo alemtuzumab, apolizumab, cetuximab, epratuzumab, galiximab, gemtuzumab, ipilimumab, labetuzumab, panitumumab, rituximab, trastuzumab, nimotuzumab, mapatumumab, matuzumab, rhMab ICR62, rhMab B-Lyl y pertuzumab etc., incluyendo combinaciones de los mismos, para uso en el tratamiento de pacientes dispuestos a responder favorablemente a dicho dominio de enlace como se identifica por un método descrito en la presente.

Las figuras muestran: Figuras 1-3: correlación de intensidades de señales de NIRF in vivo (Figuras la, b, c) con portaobjetos de tejido de HE fijados con formalina/embebidos en parafina (Figuras 2a, b, c) representación de imagen multiespectral de tejido de tumor explantado (Figura 3a, b, c) utilizando Herceptina marcada (a), Omnitarg (b) y Xolair (c) .

Figuras 4-6: Correlación de intensidades de señal de NIRF in vivo y ex vivo. Una señalización de fluorescencia in vivo fuerte podría ser visualizada en el tumor Her2 positivo con Herceptina Cy5 marcada y Omnitarg (Figuras 4a, b) . Ninguna señal de fluorescencia especifica podría ser detectada con el Erbituxe Cy5 marcado, anti-IGF-IR y anti-Her3 (Figuras 4c, 4e) .El análisis ex vivo de tumores explantados, fijados con formalina y embebidos en parafina confirman estos resultados. El enlace especifica del anticuerpo marcado podría ser visualizado solamente con Herceptin-Cy5 y Omnitarg Cy5, mientras que Erbituxe Cy5 marcado, anti-IGF-IR y anti-Her3 Cy5 no muestran ninguna señal de fluorescencia en las células de tumor (Figura 6a., 6e) .

Figura 7. Que comprende las Figuras 7? y 7B demuestran la expresión genética de Her2 indica por color verde. Las células sin expresión genética de Her2 han sido identificadas como células de estroma murinas. Las Figuras 7C y 7D demuestran enlace especifico del Herceptin Cy5 marcado (anticuerpo monoclonal anti-Her2) a las células de tumor que expresan el gen de Her2.

La presente revelación puede ser entendida en conjunción con las figuras adjuntas incorporadas en la presente por referencia. Además, un mejor entendimiento de la presente invención y de sus muchas ventajas se tendrá de los siguientes ejemplos, dados a manera de ilustración y que no pretenden ser limitantes.

E emplos : Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Estos ejemplos no deben ser interpretados para limitar el alcance de esta invención. Los ejemplos son incluidos por propósitos de ilustración y la presente invención no está limitada solamente por las reivindicaciones.

E emplo 1 : Para la validación de este nuevo procedimiento, se inyectaron 50 microgramos de Herceptina Cy5 marcada, Omnitarg y Xolair en ratones portadores de Calu3 (tumor Her2 positivo) Herceptina y Omnitarg son anticuerpos terapéuticos contra Her2 (grupos testigo positivo) y Xolair es un anticuerpo que se enlaza a IgE humana (grupos testigo negativo) . 48 horas después de la inyección una fuerte señal de fluorescencia es detectable en el área de el tumor de ratones tratados con Herceptin-Cy5 y 0mnitarg-Cy5 , mientras que el grupo tratado con Xolair Cy5 mostró ahora señal de fluorescencia en el tumor (Figuras la-c) . Después de la representación de imagen in vivo, los tumores fueron explantados, fijados en formalina y después de esto deshidratados y embebidos en parafina. Los tejidos en parafina-embebidos fueron cortados en rebanadas de 2 mieras, montados sobre portaobjetos del microscopio e incubados de la noche a la mañana a 39°C. El análisis subsecuente del tejido de tumor explantado revela que los anticuerpos Her2 específicos se enlazan solamente a células de tumor, pero no al tejido raurino. En contraste, ninguna señal de fluorescencia es generada con el anticuerpo testigo Xolair que es dirigida a IgE humana (Figura 3a-3c) .

Para verificar el enlace especifico del anticuerpo marcado a las células de tumor, se usa un nuevo procedimiento de teñido desarrollado que hace posible obtener campo brillante e información de fluorescencia de un portaobjeto de tejido. Con el procedimiento de teñido normal se necesitan dos portaobjetos de tejido seriales. Un portaobjeto para el deslizamiento de Hematoxilina (estructuras basofílicas) /Eosina (estructuras eosinofílicas ) , que proveen una vista general morfológica muy detallada y fina estructurada. El segundo portaobjetos es usado para visualizar las señales de fluorescencia del anticuerpo Cy5 marcado. Las desventajas de este método normal son las diferencias morfológicas de los dos portaobjetos de tejido y al tiempo de preparación adicional para el teñido de fluorescencia del núcleo de la célula y el tejido celular. Con el nuevo procedimiento se puede obtener esta información de un portaobjeto de tejido. Para esto, se cambio la concentración y tiempos de incubación del protocolo de teñido de Hematoxilina de Roche existente. Hematoxilina y Eosina muestran una activación bajo condiciones de fluorescencia de tal manera que se pueden visualizar más o menos los mismos detalles morfológicos como en una medición de campo brillante. Con el sistema de cámara de fluorescencia especieil (Nuance; CRi) es posible separar los espectros de fluorescencia de diferentes fluoróforos. Este sistema de representación de imagen multiespectral permite a los usuarios cuantificar marcadores moleculares aun cuando están colocalizados en una sola sección de tejido, permitiendo imágenes claras y exactas de cada marcador individual sobre una sección de tejido multi-marcador . Estos sistemas también ofrecen la capacidad poderosa de desmezclar y remover el auto fluorescencia en imágenes de fluorescencia de Nuance, incrementando mediante esto espectacularmente la señal a ruido y mejorando la exactitud de los resultados. En el nuevo procedimiento se mide primero el teñido de Hematoxilina/Eosina optimizado del portaobjetos de tejido en el campo brillante (Figuras 2a-2c) . Luego se cambia la misma área del portaobjetos a fluorescencia y se miden las señales de Hematoxilina y Eosina más la señal de anticuerpo Cy5 marcado. El sistema de Nuance separa estas tres señales de fluorescencia del resto de la información del portaobjetos indeseable (por ejemplo, auto fluorescencia) y los pega en una imagen conjuntamente (Figuras 3a-3c) .

Ejemplo 2 Se confirmaron los resultados del primer ejemplo en un segundo experimento. Para esto, el mismo montaje experimental fue usado pero con algunos anticuerpos Cy5 marcados adicionales (Erbitux, anti-IGF-lR, anti-Her3) . Las señales in vivo fuertes de Herceptin-Cy5 y Omnitar-Cy5 se correlacionan con la señalización ex vivo fuerte en los portaobjetos de tejido (Figura 4a, 4b, 6a, 6b) por otra parte, Erbitux-Cy5, anti-IGF-lR-Cy5 y anti-Her3-Cy5 no mostraron ninguna fluorescencia in vivo y ex vivo significativa. Los resultados de la representación de imagen in vivo y ex vivo coinciden perfectamente con los datos mostrados previos del ejemplo 1.

Ejemplo 3 Estudios subsecuentes tienen como objetivo probar si el anticuerpo marcado se enlaza específicamente a las células de tumor. Los portaobjetos de la Figura la han sido usados para hibridización in situ de fluorescencia. Con este análisis, el gen de Her2 puede ser detectado en portaobjetos de tejido fijados con formalina. La Figura 7b demuestra que el anticuerpo anti-Her2 Cy5 marcado (Herceptina) se enlaza solamente a células que expresan el gen de Her2.

Sera claro que la invención se puede llevar a la práctica de otra manera que como se describe particularmente en la descripción anterior y ejemplos. Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores y por consiguiente, están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Toda la relevación y cada documento citado (incluyendo patentes, solicitudes de patente, artículos de revista, extractos, manuales de laboratorio, libros u otras revelaciones) en los antecedentes de la invención, descripción detallada y ejemplos son incorporados en la presente por referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de histoquímica (IHC) para detectar un subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células, el método está caracterizado porque comprende detectar ex vivo dicho subconjunto de células, en donde el dominio de enlace va a ser administrado a un sujeto que comprende o se supone que comprende dicho subconjunto de células, antes de la remoción del subconjunto de células.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho subconjunto de células está compuesto de células de tumor.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el dominio de enlace es marcado preferiblemente con un marcador fluorescente.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el objetivo es una proteina, un péptido, una enzima, un ácido nucleico, un polisacárido, un lipido, un receptor, un objetivo celular y/o un antigeno de tumor.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el dominio de enlace es un anticuerpo .

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el subconjunto de células es detectado mediante inmunohistoquimica directa.

7. El método de la cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el subconjunto de células es detectado mediante inmunohistoquimica indirecta.

8. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque dicha detección mediante inmunohistoquimica directa comprende detectar la presencia del dominio de enlace marcado (fluorescentemente) .

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sujeto es recibido en dominio de enlace en una dosis terapéuticamente efectiva antes de la muestra de remoción de tejido

10. El uso de un dominio de enlace como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se usa en un método definida en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

11. El uso de un dominio de enlace como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la preparación de una composición de diagnóstico a ser usada en un método definida en cualquiera de las reivindicaciones precedentes .

12. Un dominio de enlace caracterizado porque es como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes a ser usado en un método definido en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

13. Un kit que comprende un dominio de enlace como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes y medios para administrar dicho dominio de enlace a un sujeto y opcionalmente medios para detectar dicho dominio de enlace con un método definido en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

14. El método como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es para: (i) identificar un sujeto dispuesto a responder favorablemente a un dominio de enlace (tal sujeto es preferiblemente un sujeto que sufre de un tumor) o (ii) monitorear una terapia, preferiblemente una terapia anti-cáncer/tumor que está basada en un dominio de enlace (esto es, el dominio de enlace es terapéuticamente activo) o (iü) identificar un dominio de enlace apto de enlazarse in vivo a un objetivo, (iv) seleccionar un dominio de enlace dispuesto a actuar terapéuticamente efectivo sobre un tumor caracterizado por un objetivo, (v) tipificar un tumor.

15. Un dominio de enlace terapéuticamente activo como por ejemplo alemtuzumab, apolizumab, cetuximab, epratuzumab, galiximab, gemtuzumab, ipilimumab, labetuzumab, panitumumab, rituximab, trastuzumab, nimotuzumab, mapatumumab, matuzumab, rhMab ICR62, rhMab B-Lyl y pertuzumab etc., caracterizado porque incluye combinaciones de los mismos para el uso en el tratamiento de pacientes dispuestos a responder favorablemente a dicho dominio de enlace como se identifica por un método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en esencia con un método para detectar u subconjunto de células con un dominio de enlace que es especifico para un objetivo que caracteriza dicho subconjunto de células, el método comprende detectar ex vivo dicho subconjunto de células, en donde dicho dominio de enlace va a ser administrado a un sujeto que comprende o se supone que comprende dicho subconjunto de células, antes de la remoción del subconjunto de células. La presente invención también es concerniente con el uso de un dominio de enlace como se define en la presente con un método definido en la presente. También se contempla el uso de un dominio de enlace como se define en la presente para la preparación de una composición de diagnóstico a ser usada en un método definido en la presente. En otro aspecto, la presente invención es concerniente con un dominio de enlace como se define en la presente a ser usado en un método definido en la presente. También se revelan kits que comprenden un dominio de enlace como se define en la presente y medios para administrar dichos dominios de enlace a un sujeto y opcionalmente medios para detectar el dominio de enlace con un método definido en la presente. En otro aspecto, la presente invención es concerniente con el uso de un dominio de enlace, preferiblemente un anticuerpo terapéuticamente efectivo, por ejemplo alemtuzumab, apolizumab, cetuximab, epratuzumab, galiximab, gemtuzuma , ipilimumab, labetuzumab, panitumumab, rituximab, trastuzumab, nimotuzumab, mapatumumab, matuzumab, rhMab ICR62, rhMab B-Lyl y pertuzumab etc., incluyendo combinaciones de los mismos, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de pacientes dispuestos a responder favorablemente al dominio de enlace como se identifica por un método definido en la presente.