CN101460849B - 胰腺癌的诊断药和治疗药 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用血液标记物诊断和治疗胰腺癌的新方法。一种含有抗AMIGO2抗体的胰腺癌诊断药和治疗药。
Description
技术领域
本发明涉及利用抗AMIGO2抗体的胰腺癌诊断药和治疗药。
背景技术
胰腺癌患者有每年增加的倾向,2001年度,日本国内的死亡人数是约2万人。另外,分别占男性因癌死亡的第5位、女性因癌死亡的第6位。胰腺癌预后差,切除例的5年生存率是5~20%。胰腺癌预后差的原因在于,当癌病灶为2cm左右时,多数病例已经在胰腺外发生浸润,并向肝脏转移。因此,胰腺癌的早期诊断非常重要,但是,现在还没有在胰腺癌浸润周围脏器前进行诊断的方法。
在日本国内的全国调查中,作为最初表达胰腺癌的方法,CT最多,为44%,超声波是41%。因此,现在这2种检查方法在胰腺癌的诊断中是重要的。但是,现在一般所使用的CT的情况下,癌组织和非癌组织的区别困难,在诊断中需要熟练的技术。胰腺癌的肿瘤标记物有CA19-9、DUPAN-2、Span-1、CEA等。这些标记都是在晚期癌中变为阳性,而早期的诊断率低,不是在早期诊断中有用的标记。还已知,CA19-9的血中浓度在肝炎、肝硬化、胰炎这种非恶性肿瘤中也升高,所以,不适合使用于胰腺癌诊断。
虽然,由FDG-PET进行的胰腺癌诊断也得到实施,但存在检查费用高和图象分辨限度差等问题。因此,考虑PET检查的费用对效果和效率时,希望开发特异性识别胰腺癌组织的探针,开发高精度的诊断方法。
另一方面,胰腺癌的治疗通过手术、化学疗法、放射线疗法进行。全部病例中,能够切除的为40%以下。术后5年生存率极低,为5~20%。由手术引起的并发症也多发,而成为问题。因局部侵犯和远端转移而被表达的胰腺癌多数不适合手术,而适合化学疗法和放射线疗法。由于放射线疗法对消化道的负担少,也能够在门诊实施,所以近 年来有病例增加的倾向。
因此,在胰腺癌诊断中,谋求能够简便且确实地进行检查的新的胰腺癌诊断标记物。另外,在胰腺癌的治疗中,希望开发非侵入性且有效的治疗方法,即,对胰腺癌细胞给予特异性损伤的治疗药。
近年来,盛行以癌细胞中特异性表达的蛋白质作为标的的癌诊断和治疗方法的开发。即,是以在癌细胞中高表达,但在正常组织中表达少或不表达的细胞表面蛋白质作为目标,使用血液和组织等进行诊断和治疗的方法。赫赛汀(Herceptin)等诊断和治疗药已经提供给临床,对许多患者的治疗作出贡献,对于其它癌,也希望开发特异的治疗药。
AMIGO2和相同家族的AMIGO1与AMIGO3在氨基酸数、结构域以及基因序列的同源性极其类似。它们全都是一次跨膜蛋白质,具有信号肽。这就暗示AMIGO2蛋白质为膜蛋白质,同时,也有向血液中分泌的可能性。AMIGO家族的蛋白质的结构全部类似,在细胞外具有6个富亮氨酸重复(leucine rich repeats,LRRs),并存在夹持这些结构域的LRR氨基末端结构域和LRR羧基末端结构域。另外,在细胞外的跨膜结构域的附近,存在免疫球蛋白(immunoglobulin)结构域。AMIGO家族在神经组织中表达,暗示作为细胞粘着分子发挥作用(非专利文献1)。
在专利文献1和专利文献2中,虽然关于胃癌、甲状腺癌、乳腺癌、子宫癌、肾癌、肺癌、大肠癌和脑肿瘤,有AMIGO2基因表达亢进的记载,但是显示,在胰腺癌中AMIGO2基因表达和正常组织没有差别。而且,这些文献中,在使用抗体的实施例中,只不过通过免疫染色、免疫沉降、蛋白质印迹确认了在大鼠胎儿脑中随着的分化进展的AMIGO蛋白质表达,还没有抗AMIGO2抗体能够用于癌的诊断和治疗的具体记载。
非专利文献1:J Cell Biol.2003Mar17;160(69):963—73,
专利文献1:国际公开WO2004/003165小册子
专利文献2:国际公开WO2004/055055小册子
发明内容
和其它癌同样,胰腺癌的早期治疗决定预后,因此,必须诊断早期的癌。但是,在现有技术中不存在早期诊断胰腺癌的技术。另一方面,胰腺癌的手术治疗不仅难以治疗转移灶,而且大多伴随侵袭和并发症。另外,关于放射线治疗,对健康正常组织的暴露是问题。
本发明的目的在于提供一种高精度的诊断早期胰腺癌的方法和有效的治疗方法。
虽然在以往的研究中报告,在胰腺癌组织中未确认AMIGO2基因的表达,但是,本发明的发明人等意外地表达,根据采用DNA芯片进行的基因表达分析的结果,在胰腺癌组织中,AMIGO2基因的表达量比正常胰腺组织中多。进而,制作针对AMIGO2蛋白质的抗体,选择了符合以下目的的抗体。
1)采用为了用于ELISA测定系统而选择得到的抗AMIGO2单克隆抗体PPZ3122和PPZ3133,在胰腺癌细胞株提取液和培养液中成功检出释放的AMIGO2蛋白质。
2)另外,采用为了用于免疫染色而选择得到的抗AMIGO2单克隆抗体PPZ2913、PPZ2952和PPZ3130,在胰腺癌患者摘出组织中,能够确认约83%患者为阳性。
3)进而,作为对细胞增殖带来良好影响的抗体,选择了抗AMIGO2单克隆抗体PPZ2919、PPZ2952、PPZ3122、PPZ3124、PPZ3135和PPZ3148。
4)这些抗体在体外(in vitro)试验中,对AMIGO2全长表达CHO克隆或者作为胰腺癌细胞株的PK-45P投与抗AMIGO2抗体,表现出作为细胞损伤活性指标的CDC和/或ADCC活性。
5)在使用scid小鼠的体内(in vivo)试验中,抗AMIGO2抗体抑制了胰腺癌细胞株PK-45P和AMIGO2过表达胰腺癌细胞株MIAPaCa2在小鼠体的植入和增殖。
6)另外,对移植有胰腺癌细胞株PK-45P的scid小鼠投与以荧光物质标记的抗AMIGO2抗体,通过in vivo荧光成像,能够确认抗AMIGO2抗体向肿瘤块聚集。
7)在与细胞表面上存在的AMIGO2结合的抗AMIGO2抗体的介导下,具有细胞损伤性的物质由胞吞作用摄入细胞内,从而能够确认 细胞增殖抑制效果。
根据以上的1)~7),使本发明完成。
即,本发明提供一种含有AMIGO2抗体的胰腺癌诊断药和治疗药。
另外,本发明提供AMIGO2抗体在胰腺癌诊断药制造中的使用。
另外,本发明提供AMIGO2抗体在胰腺癌治疗药制造中的使用明。
另外,本发明提供一种胰腺癌诊断方法,其特征在于,使抗AMIGO2抗体与从被检验者采取的试样反应,或者向在被检验者投与AMIGO2抗体,检测AMIGO2蛋白质。
本发明还提供一种胰腺癌的治疗方法,其特征在于,投与AMIGO2抗体。
发明的效果
作为现有的代表性的癌图象诊断,以使用葡萄糖类似物质的正电子释放核素标记的物质作为探针的正电子发射断层摄影术(PositronEmission Tomography,FDG-PET),在胰腺癌的初期诊断中多为假阳性或假阴性。
如果根据本发明,则采用能够特异性检测的分子成像(PET)进行的方法和血液诊断以及使用通过活组织检查采取的组织的诊断(活检)成为可能,从而能够迅速制定新的治疗计划。另外,不做手术而实施不对患者造成负担的胰腺癌非侵入性治疗成为可能。
附图说明
图1-a表示使用GeneChipU133进行的AMIGO2基因表达分析的结果。:在正常组织、非癌部分中的AMIGO2基因表达分析
图1-b表示使用GeneChipU133进行的AMIGO2的基因表达分析的结果。:在临床检测体中的AMIGO2基因表达分析
图1-c表示使用GeneChipU133进行的AMIGO2的基因表达分析的结果。:在癌细胞株中的AMIGO2基因表达分析
图2表示在使用GeneChipU133plus2进行的胰腺癌临床检测体中的AMIGO2基因表达分析的结果。
图3表示通过非还原下的SDS-PAGE对纯化sAMIGO2分析的结果。
图4表示使用市售的抗AMIGO2单克隆抗体对AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)细胞裂解物和胰腺癌细胞株细胞裂解物进行的蛋白质印迹的分析结果。
图5表示采用流式细胞术对AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)的分析结果。
图6表示采用流式细胞术对胰腺癌细胞株PK-45P的分析结果。
图7表示以AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)为标的细胞的CDC活性的定量分析结果。
图8表示以胰腺癌细胞株PK-45为标的细胞的CDC活性的定量分析结果。
图9表示采用AMIGO2抗体进行胰腺癌组织的免疫组织染色的结果。
图10表示将胰腺癌细胞株移植到scid小鼠中而形成的肿瘤块的免疫染色的结果。
图11表示在移植了胰腺癌细胞株的scid小鼠中,抗AMIGO2单克隆抗体(亚类是IgG1的抗体群)的肿瘤植入-增殖抑制试验的评价结果。
图12表示在移植了胰腺癌细胞株移植的scid小鼠中,抗AMIGO2单克隆抗体(亚类是IgG2a的抗体群)的肿瘤植入-增殖抑制试验的评价结果。
图13表示在AMIGO2过表达胰腺癌细胞株MIA PaCa2和野生株MIA PaCa2中的AMIGO2的免疫染色结果。
图14表示在移植了AMIGO2过表达胰腺癌细胞株的scid小鼠中,抗AMIGO2单克隆抗体的肿瘤植入抑制相关的评价结果。
图15表示在移植了AMIGO2过表达胰腺癌细胞株的scid小鼠中,抗AMIGO2单克隆抗体PPZ3124的肿瘤增殖抑制相关的评价结果。
图16表示在移植了AMIGO2过表达胰腺癌细胞株的scid小鼠中,抗AMIGO2单克隆抗体PPZ3148的肿瘤增殖抑制相关的评价结果。
图17表示通过in vivo荧光成像,确认抗AMIGO2单克隆抗体向scid小鼠中移植胰腺癌细胞株而形成的肿瘤聚集的结果。
图18表示确认抗AMIGO2单克隆抗体与细胞膜表面上的 AMIGO2结合而被胞吞的结果。
图19表示由具有细胞损伤活性的物质的结合抗体引起的AMIGO2表达细胞的增殖抑制效果的调查结果。
具体实施方式
由本发明诊断和治疗的疾病是胰腺癌。成为诊断和治疗的动物优选是人,但也可以是狗、猫、兔、小鼠、大鼠、豚鼠等哺乳类动物。
在本发明中,进行胰腺癌诊断时,当在被检验者的血液中和脏器组织中检出AMIGO2蛋白质时,判定被检验者是胰腺癌患者的可能性高。另外,通过测定诊断为胰腺癌的患者血液或组织中AMIGO2蛋白质浓度,能够判定该患者是否为治疗对象患者(治疗对象患者的选择)。进而,在胰腺癌的治疗后,在AMIGO2蛋白质测定中,当AMIGO2蛋白质的量比术前减少时,能够判定治疗过程良好。另一方面,当治疗后AMIGO2蛋白质的量不下降或增加时,能够判定发生复发或转移。胰腺癌诊断能够通过图象诊断、活检和血液诊断进行。
在图象诊断中,通过在投与标记的抗AMIGO2抗体后,由图象诊断检出AMIGO2蛋白质而进行。更具体而言,向被检验者投与以作为标记物质的放射性同位素标记抗AMIGO2抗体而得到的探针,通过PET或SPECT能够检出癌组织。使用的放射性同位素,能够使用本领域技术人员所公知的物质,但优选为正电子释放放射性同位素,进一步优选为11C、13N、18F、15O、94mTc、124I。以放射性同位素标记抗AMIGO2抗体能够采用本领域技术人员公知的方法进行。
作为通过活检进行胰腺癌诊断的方法,能够以从被检验者得到的脏器组织作为试样,进行免疫学性测定法。例如,可以列举放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、免疫沉降法、免疫比浊法、蛋白质印迹、免疫染色、免疫扩散法等,但优选免疫染色。免疫染色等上述免疫学性方法能够采用本领域技术人员公知的方法进行。
作为通过活检进行胰腺癌诊断的其它方式,能够进行以抗AMIGO2抗体作为一次抗体使用的免疫组织学染色法。具体而言,采用公知方法将从被检验者得到的检测体用石蜡或冷冻等固定,并制作 切片。接着,分别使用作为一次抗体的抗AMIGO2抗体和作为二次抗体的识别IgG的生物素标记抗体处理切片。二次抗体能够使用识别IgG的公知抗体,例如,能够使用兔抗IgG抗体等。使标记物质与二次抗体结合,通过分别适合各种标记物质的公知方法,检出切片中有无AMIGO2蛋白质。另外,也可以不使用二次抗体,而使标记物质与抗AMIGO2抗体结合,进行免疫组织学染色法。标记物质能够使用本领域技术人员公知的物质,例如,可以列举过氧化物酶、FITC等。抗体和标记物质的结合能够采用本领域技术人员公知的方法进行,具体而言,可以列举利用抗生蛋白链菌素和生物素的结合方法。
作为进行胰腺癌诊断的其它方式,能够将从被检验者得到的血液、血清或血浆作为试样,进行免疫学测定法。例如,可以列举放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、免疫沉降法、免疫比浊法、蛋白质印迹、免疫扩散法等,但优选酶免疫测定法,特别优选酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay:ELISA)(例如sandwich ELISA)。ELISA等上述免疫学方法能够采用本领域技术人员公知的方法进行。
作为以血液、血清或血浆作为检测体的胰腺癌诊断方法,例如,可以列举下述方法:在支持体上固定抗AMIGO2抗体,向其中加入被检试样,进行孵育,使抗AMIGO2抗体和蛋白质结合后,洗净,检出通过抗AMIGO2抗体结合在支持体上的AMIGO2蛋白质。
在本发明中,作为用于固定抗AMIGO2抗体所使用的支持体,例如,可以列举琼脂糖、纤维素等不溶性多糖类、硅树脂、聚苯乙烯树脂、聚丙烯酰胺树脂、锦纶树脂、聚碳酸酯树脂等合成树脂、玻璃、铁氧体等不溶性支持体。这些支持体能够以珠或板等的形状使用。当形状为珠时,能够使用填充有该珠的柱等。当形状为板时,能够使用多孔板(96孔多孔板等)和生物传感器芯片等。抗AMIGO2抗体和支持体的结合,能够通过化学结合或物理吸附等通常使用的方法结合。这些支持体都能够使用市售品。
抗AMIGO2抗体和试样中AMIGO2蛋白质的结合,通常在缓冲液中进行。作为缓冲液,例如,可以使用磷酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等,只要是通常使用的pH范 围即可。另外,作为孵育条件,采用已经经常使用的条件,例如在4~37℃进行1~24小时的孵育。孵育后的洗净,只要不妨碍抗AMIGO2抗体和AMIGO2蛋白质结合即可,例如,使用包含Tween-20等表面活性剂的缓冲液等。
在根据本发明进行的AMIGO2蛋白质的检出方法中,除了想检出AMIGO2蛋白质的被检试样以外,也可以设置对照试样。作为对照试样,有不含AMIGO2蛋白质的阴性对照试样和包含AMIGO2蛋白质的阳性对照试样。此时,通过比较以不含AMIGO2蛋白质的阴性对照试样得到的结果和以包含AMIGO2蛋白质的阳性对照试样得到的结果,能够检出被检试样中的AMIGO2蛋白质。另外,配制使浓度呈梯度变化的一系列对照试样,得到相对各对照试样的检出结果的数值,制成标准曲线,根据标准曲线,由被检试样的数值也能够定量检出被检试样中所含的AMIGO2蛋白质。
作为检出通过抗AMIGO2抗体结合在支持体上的AMIGO2蛋白质的优选方式,可以列举使用以标记物质标记的抗AMIGO2抗体的方法。例如,使被检试样接触固定在支持体上的抗AMIGO2抗体,洗净后,使用特异性识别AMIGO2蛋白质的标记抗体来检出。
抗AMIGO2抗体的标记能够采用通常已知的方法进行。作为标记物质,能够使用荧光色素、酶、辅酶、化学发光物质、放射性物质等本领域技术人员公知的标记物质,作为具体的例子,可以列举放射性同位素(32P、14C、125I、3H、131I等)、荧光素、罗丹明、丹磺酰氯、伞形酮、虫荧光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、微过氧化物酶、生物素、钌等。当使用生物素作为标记物质时,优选在添加生物素标记抗体后,再添加结合有过氧化物酶等酶的抗生蛋白链菌素。标记物质和抗AMIGO2抗体的结合可以使用戊二醛法、马来酸酰亚胺法、吡啶基二硫化物法、高碘酸法等公知的方法。
具体而言,在板或珠等支持体中加入包含抗AMIGO2抗体的溶液,将抗AMIGO2抗体固定在支持体上,洗净板或珠后,为了防止蛋白质的非特异性结合,以例如BSA、明胶、白蛋白等进行封闭。再次洗净,在板或珠中加入被检试样。孵育后洗净,加入标记抗AMIGO2抗体。 适度孵育后,洗净板或珠,检出在支持体上残留的标记抗AMIGO2抗体。检出能够通过本领域技术人员公知的方法进行,例如,在采用放射性物质标记的情况下,能够通过液体闪烁或RIA法检出。在采用酶标记的情况下,加入底物,酶导致的底物变化、例如显色,能够通过吸光度计检出。作为底物的具体例子,可以列举2,2-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,2-苯二胺(邻苯二胺)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)等。在荧光物质或化学发光物质的情况下,能够通过光度计检出。
作为本发明的AMIGO2蛋白质检出方法的特别优选的方式,可以列举使用以生物素标记的抗AMIGO2抗体和抗生蛋白链菌素的方法。
具体而言,在板等支持体中加入包含抗AMIGO2抗体的溶液,固定抗AMIGO2抗体。洗净板后,为了防止蛋白质的非特异性结合,以例如BSA等封闭。再次洗净,在板中加入被检试样。孵育后洗净,加入以生物素标记的抗AMIGO2抗体。适度孵育后,洗净板,加入结合有碱性磷酸酶、过氧化物酶等酶的抗生物素蛋白。孵育后洗净板,加入与结合在抗生物素蛋白的酶相对应的底物,以酶导致的底物变化等为指标,检出AMIGO2蛋白质。
作为本发明的AMIGO2蛋白质检出方法的其它方式,可以列举使用一种以上特异性识别AMIGO2蛋白质的一次抗体和一种以上特异性识别该一次抗体的二次抗体的方法。
例如,使被检试样接触固定在支持体上的一种以上的抗AMIGO2抗体,孵育后洗净,用一次抗AMIGO2抗体和一种以上特异性识别该一次抗体的二次抗体检测出在洗净后结合的AMIGO2蛋白质。此时,二次抗体优选由标记物质标记。
作为本发明的AMIGO2蛋白质的检出方法的其它方式,可以列举利用凝集反应的检出方法。该方法能够使用经抗AMIGO2抗体致敏的载体检出AMIGO2蛋白质。作为经抗体致敏的载体,只要是不溶性、不引起非特异性反应、而且是稳定的,则可以使用任何载体。例如,可以使用胶乳颗粒、膨润土、胶棉、高岭土、固定羊红细胞等,但优选使用胶乳颗粒。作为胶乳颗粒,例如,可以使用聚苯乙烯胶乳颗粒、苯乙烯—丁二烯共聚物胶乳颗粒、聚乙烯基甲苯胶乳颗粒等,但优选 使用聚苯乙烯胶乳颗粒。将经致敏的颗粒和试样混合,搅拌一定时间。在试样中,由于AMIGO2蛋白质的浓度越高,颗粒的凝集度就越大,所以,能够通过肉眼观察凝集而检出AMIGO2蛋白质。另外,也能够由分光光度计等测定由凝集引起的浊度来检出。
作为本发明的蛋白质检出方法的其它方式,例如,可以列举使用利用了表面细胞质基因组共振现象的生物传感器的方法。利用表面细胞质基因组共振现象的生物传感器,能够使用微量蛋白质,且不用标记,作为表面细胞质基因组共振信号而实时观察蛋白质—蛋白质之间的相互作用。例如,通过使用BIAcore(Biacore International AB公司生产)等生物传感器,能够分别检出抗AMIGO2抗体和AMIGO2蛋白质的结合。具体而言,使被检试样接触固定有抗AMIGO2抗体的传感器芯片,与抗AMIGO2抗体结合的AMIGO2蛋白质能够作为共振信号的变化而分别检出。
本发明的检出方法也能够使用各种自动检查装置而自动化,由此能够一次对大量试样进行检查。
本发明的胰腺癌诊断药,也可以采用药盒的方式。本发明的胰腺癌诊断药至少包括抗AMIGO2抗体。当该诊断药基于ELISA法等EIA法时,既可以包含将抗体固相化的载体,也可以将抗体预先结合在载体上。当基于使用胶乳等载体的凝集法时,该诊断药也可以包括吸附有抗体的载体。另外,该诊断药也可以适当包含封闭溶液、反应溶液、反应终止液、用于处理试样的试剂等。
本发明的使用活检组织和血液等试样的诊断用抗AMIGO2抗体,只要分别与AMIGO2蛋白质特异地结合即可,而不考虑其来源、种类(单克隆、多克隆)和形状。具体而言,可以使用小鼠抗体、大鼠抗体、鸡抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体等公知的抗体。抗体也可以是多克隆抗体,但优选是单克隆抗体,若能够以高灵敏度特异地测定,则也可以使用市售的抗体。
另外,固定在支持体上的抗AMIGO2抗体和以标记物质标记的抗AMIGO2抗体可以识别AMIGO2蛋白质的相同抗原决定簇,但优选识别不同的抗原决定簇,部位没有特别限制。
在本发明中,进行胰腺癌治疗时,能够通过使抗AMIGO2抗体与 胰腺癌细胞中表达的AMIGO2蛋白质特异地结合,从而带给胰腺癌细胞损伤而进行。细胞损伤能够利用抗AMIGO2抗体的细胞损伤活性,例如ADCC活性或CDC活性。
在本发明的胰腺癌治疗和图象诊断中所使用的抗体,只要与AMIGO2蛋白质特异地结合,且为单克隆抗体,则可以是嵌合抗体、人源化(CDR移植)抗体、人抗体的任意一种。另外,这些抗体只要对胰腺癌具有治疗效果,则也可以使用市售的抗体。优选具有细胞损伤活性的抗体。此外,在本发明中所使用的抗体,还可以是改变了糖链的抗体。通过改变抗体的糖链,能够增强抗体的细胞损伤活性。另外,在胰腺癌治疗中所使用的抗体,可以是具有抗癌作用的抗体,也可以是使具有抗肿瘤效果的物质结合得到的抗体。采用在单克隆抗体上使具有抗肿瘤效果的药物和放射性同位素结合而得到的单克隆抗体,能够治疗癌。
本发明中的所谓细胞损伤活性,例如,可以列举抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC)活性、补体依赖性细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity:CDC)活性。在本发明中,所谓CDC活性,意指由补体系统带来的细胞损伤活性,所谓ADCC活性,意指在标的细胞的细胞表面抗原上附着特异性抗体时,其Fc部分和具有Fcγ受体的细胞(免疫细胞等)通过Fcγ受体而结合,从而对标的细胞带来损伤的活性。
抗AMIGO2抗体是否具有ADCC活性或者是否具有CDC活性,能够通过公知的方法测定。例如,报告有下述方法:以预先摄入标的细胞的放射性物质51Cr的释放作为指标的方法[Martin R.et al.(1990)Fine specificity and HLArestriction of myelin basic protein-specificcytotoxic T cell lines from multiple sclerosis patients and healthyindividuals.J.Immuno.145,540.等]、以预先摄入标的细胞的荧光物质Calcein的释放作为指标的方法[Lichtenfels R.et al.(1994)CARE-LASS(calcein-release-assay),an improved fluorescence-basedtest system tomeasure cytotoxic T lymphocyte activity.J.Immunol.Methodes172,227.等]、以标的细胞中内在的乳酸脱氢酶(LDH)的释放作为指标的方法[Korzeniewski C.and Callewaert DM.(1983)An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.J.Immunol.Methods64,313.等]。
具体而言,首先进行效应细胞、补体溶液、标的细胞的调制。
(1)效应细胞的调制
从BALB/c小鼠等摘出脾脏,在RPMI1640培养基(Invitrogen公司生产)中分离脾脏细胞。以含有5~10%胎牛血清(FBS)的相同培养基洗净后,将细胞浓度调制为5×106/mL,调制效应细胞。
(2)补体溶液的调制
用含有5~10%FBS的RPMI1640(Invitrogen公司生产)适当稀释Baby Rabbit Complement(CEDARLANE公司生产),调制补体溶液。
(3)标的细胞的调制
准备表达AMIGO2的细胞(用编码AMIGO2的基因转染得到的细胞、胰腺癌细胞)。当采用以预先摄入标的细胞的放射性物质51Cr的释放作为指标的方法测定细胞损伤活性时,在0.2mCi的51Cr—铬酸钠(GEHealthcare Bioscience公司生产)的存在下,将细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中37℃培养1小时,由此进行放射体标记。放射体标记后,用含有10%FBS的DMEM培养基将细胞洗净3次,将细胞浓度调制为2×105/mL,调制标的细胞。
当采用以预先摄入标的细胞的荧光物质的释放作为指标的方法测定细胞损伤性时,在25μM的Calcein-AM(3’,6’-二(邻乙酰基)-4’,5’-双[N,N-双(羧甲基)氨基甲基]荧光素,四乙酰氧基甲酯)的存在下,将细胞在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中37℃培养30分钟,由此进行荧光标记。荧光标记后,用含有5%FBS的DMEM培养基(不含酚红)将细胞洗净2次,将细胞浓度调制为2×105/mL,调制标的细胞。当采用以标的细胞中内在的乳酸脱氢酶(LDH)的释放作为指标的方法测定细胞损伤活性时,将细胞调制为2×105/mL浓度直接使用。
接着进行ADCC活性或CDC活性剂的测定。测定ADCC活性时,在96孔U底板(Becton Dickinson公司生产)中,各加入50μL标的细胞和抗AMIGO2抗体,使其在冰上反应15分钟。此后,加入100μL效应细胞,在二氧化碳孵箱内培养4小时。培养后,回收100μL上清,当以51Cr的释放作为指标时,以γ计数器(COBRAIIAUTO-GMMA,MODELD5005,Packard Instrument Company公司生产)测定放射活性。 细胞损伤活性(%)能够通过(A-C)/(B-C)×100求出。A表示在各试样中的放射活性(cpm),B表示加入1%Triton-X100等表面活性剂将细胞全部溶解得到的试样中的放射活性(cpm),C表示只含标的细胞的试样的放射活性(cpm)。当以荧光物质Calcein的释放作为指标时,用荧光分析仪(fluorescence plate reader)(激发波长485nm/荧光波长520nm)测定荧光强度。当以标的细胞内在的LDH放出作为指标时,用酶标仪(波长490nm)测定由LDH和Diaphorase的共轭反应从四唑盐生成的红色甲臜。
另一方面,在测定CDC活性时,在96孔U底板(Becton Dickinson公司生产)中,加入50μL标的细胞和20μL抗AMIGO2抗体,使其在冰上反应30分钟。此后,加入10μL补体溶液,在二氧化碳孵箱内培养4小时。培养后,回收50μL的上清,测定放射活性等。细胞损伤活性可以和ADCC活性的测定同样求出。
抗AMIGO2抗体还能够作为胰腺癌治疗药,在特异性靶向癌组织的癌细胞定向破坏疗法中使用。即,其为通过投与结合有对癌细胞带来损伤的药物的抗体,特异地移动至癌部位,从而实现治疗效果和减轻副作用的治疗方法。
药物和抗体的结合能够采用本领域技术人员公知的方法进行(ClinCancer Res.2004Jul1;10(13):4538—49.)。与抗体结合的药物能够使用对癌细胞带来损伤的公知物质,但优选抗癌剂和毒素,进一步优选Calicheamicin、DM1、DM4、蓖麻毒素、Pseudomonas外毒素A。
在胰腺癌治疗中所使用的抗体,可以是在与AMIGO2蛋白质特异性结合的抗体上结合对癌细胞带来损伤的放射性同位素、由此附加或增强细胞损伤活性的抗体。抗体和放射性同位素的结合能够采用本领域技术人员公知的方法进行(Bioconjug Chem.1994Mar-Apr;5(2):101—4.)。利用的放射性同位素能够使用本领域技术人员公知的物质,但优选放出β射线或γ射线的核素,进一步优选131I、99mTc、111In、90Y。
使用结合有包含放射性同位素的化合物的抗体进行胰腺癌治疗,能够采用本领域技术人员公知的方法进行(Bioconjug Chem.1998Nov-Dec;9(6):773—82.)。具体而言,最初,向患者投与结合有包含少量放射性同位素的化合物的抗体,进行全身的闪烁扫描。在确认 正常组织细胞与抗体的结合少、癌细胞与抗体的结合多的基础上,大量投与结合有包含放射性同位素的化合物的抗体。
本发明中所使用的抗AMIGO2抗体,能够使用公知方法,作为多克隆或单克隆抗体得到。作为本发明中所使用的抗AMIGO2抗体,优选来自哺乳动物或来自鸡的单克隆抗体。特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体包括由杂交瘤产生的单克隆抗体、和通过基因工程方法以含有抗体基因的表达载体转染而得到的宿主所产生的单克隆抗体。
产生单克隆抗体的杂交瘤,基本上能够采用公知技术如下制作。即,能够通过下述方法制作:使用AMIGO2蛋白质作为致敏抗原,按照通常的免疫方法将其免疫,采用通常的细胞融合法使得到的免疫细胞与公知的亲本细胞融合,通过通常的筛选法筛选单克隆抗体产生细胞。
具体而言,制作单克隆抗体中可以如下进行。
首先,作为取得抗体的致敏抗原所使用的AMIGO2蛋白质,通过表达GenBank号(NM181847)公开的基因/氨基酸序列(序列号1和2)而得到。即,将编码AMIGO2蛋白质的各基因序列插入公知的表达载体系统中,转染适当的宿主细胞后,用公知方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化目的人AMIGO2蛋白质。另外,也可以纯化天然的AMIGO2蛋白质使用。
接着,将该纯化AMIGO2蛋白质作为致敏抗原使用。或者也可以将AMIGO2蛋白质的部分肽作为致敏抗原使用。此时,部分肽既能够根据人AMIGO2蛋白质的氨基酸序列通过化学合成得到,也能够将人AMIGO2基因的一部分组装入表达载体中而得到,还能够通过蛋白质分解酶分解天然的人AMIGO2蛋白质而得到。作为部分肽使用的人AMIGO2蛋白质的部分和大小没有限制。
作为以致敏抗原免疫的哺乳动物,没有特别限定,但优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适合性来选择,一般使用啮齿类动物,例如大鼠、小鼠、仓鼠,或者鸡、兔、猴等。
以致敏抗原免疫动物能够按照公知的方法进行。例如,作为一般的方法,通过在哺乳动物的腹腔内或皮下注射致敏抗原而进行。具体 而言,根据希望,将致敏抗原以PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理食盐水等稀释悬浮,将通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂适量混合、乳化后,向哺乳动物中每日数次投与4~21日。另外,在致敏抗原免疫时,也可以使用载体。特别是使用分子量小的部分肽作为致敏抗原时,希望使其和白蛋白、钥孔戚血蓝素等载体蛋白质结合来免疫。
这样将哺乳动物免疫,确认在血清中所希望的抗体水平上升后,从哺乳动物采取免疫细胞以进行细胞融合,作为优选的免疫细胞,可以特别列举脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的另一方面的亲本细胞,使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。该骨髓瘤细胞可以适合使用公知的各种细胞株,例如P3(P3×63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123,1548-1550)、P3×63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein,C.Eur.J.Immunol.(1976)6,511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.,Cell(1976)8,405-415)、SP2/0(Shulman,M.et al.,Nature(1978)276,269-270)、FO(de St.Groth,S.F.et al.,J.Immunol.Methods(1980)35,1-21)、S194(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313-323)、R210(Galfre,G.et al.,Nature(1979)277,131-133)等。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合基本上能够基于公知的方法,例如Kohler和Milstein等的方法(Kohler.G.and Milstein.C.,MethodsEnzymol.(1981)73,3-46)等进行。
更具体而言,上述细胞融合,例如,在细胞融合促进剂的存在下,在通常的营养培养液中实施。作为融合促进剂,例如,使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等,而且,根据所希望,为了提高融合效率,也可以添加使用二甲基亚砜等辅助剂。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如,优选使免疫细胞相对骨髓瘤细胞为1~10倍。作为在上述细胞融合中使用的培养液,例如,能够使用适合上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、其它该种细胞培养中所使用的通常的培养液,还可以并用胎牛血清(FCS)等血清补充液。
细胞融合是在上述培养液中充分混合规定量的上述免疫细胞和骨 髓瘤细胞,以通常30~60%(w/v)的浓度添加混合预先加热到37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000~6000左右),形成目的融合细胞(杂交瘤)。接着,逐渐添加适当的培养液,反复进行离心、除去上清的操作,由此除去对杂交瘤的生长发育不良的细胞融合剂。
这样得到的细胞瘤通过在通常的选择培养液,例如由HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)中培养而选择。为了使目的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡消失,在上述HAT培养液中的培养需要继续充分的时间(通常是数日~数周)。接着,实施通常的有限稀释法,筛选产生目的抗体的杂交瘤和单克隆化。
目的抗体的筛选和单克隆化可以采用基于公知的抗原抗体反应的筛选方法进行。例如,使抗原结合在用聚苯乙烯等制成的珠子或市售的96孔微孔板等载体上,使其和杂交瘤的培养上清反应,洗净载体后,与酶标记二次抗体等反应,由此能够决定在培养上清中是否包含与致敏抗原反应的目的抗体。通过有限稀释法等能够将产生目的抗体的杂交瘤克隆化。此时,作为抗原,可以使用在免疫中使用过的抗原。
另外,除了将抗原免疫人以外的动物而得到上述杂交瘤以外,还可以在体外用AMIGO2蛋白质致敏人淋巴细胞,使致敏的淋巴细胞和人源的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞融合,得到具有AMIGO2蛋白质结合活性的所希望的人抗体(参照日本特公平1—59878号公报)。此外,还可以向具有全部人抗体基因文库的转基因动物投与作为抗原的AMIGO2蛋白质,从而获得抗AMIGO2抗体产生细胞,并使其永生化,从该细胞分别取得针对AMIGO2蛋白质的人抗体(参照WO94/25585号小册子、WO93/12227号小册子、WO92/03918号小册子、WO94/02602号小册子)。
这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤能够在通常的培养液中继代培养,另外,能够在液氮中长期保存。
从该杂交瘤获得单克隆抗体可以采用按照通常方法培养该杂交瘤,作为其培养上清得到的方法,或者将杂交瘤投与和该杂交瘤具有相容性的哺乳动物并使之增殖,作为其腹水得到的方法等。前者方法适合于得到高纯度的抗体,而后者方法适合于抗体的大量生产。
在本发明中,作为单克隆抗体,能够使用从杂交瘤克隆抗体基因、 组装入适当的载体、并将该载体导入宿主、采用基因重组技术产生的重组型抗体(例如,参照Vandamme,A.M.et al.,Eur.J.Biochem.(1990)192,767-775,1990)。
具体而言,从产生抗AMIGO2抗体的杂交瘤中分离编码抗AMIGO2抗体的可变(V)区的mRNA。mRNA的分离采用公知的方法、例如胍超离心法(Chirgwin,J.M.et al.,Biochemistry(1979)18,5294-5299)、APGC法(Chomczynski,P.et al.,Anal.Biochem.(1987)162,156-159)等进行,调制总RNA,使用mRNA Purification Kit(Pharmacia生产)等调制目的mRNA。另外,也可以使用QuickPrepmRNA Purification Kit(Pharmacia生产)直接调制mRNA。
使用逆转印酶从得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工业社生产)等进行。另外,在进行cDNA的合成和扩增中,能够采用使用了5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech生产)和PCR的的5’-RACE法(Frohman,M.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,8998-9002、Belyavsky,A.et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919-2932)等。
从得到的PCR产物纯化目的DNA片段,与载体DNA连接。进而,由此制作重组载体,导入大肠杆菌等,选择菌落,调制所希望的重组载体。然后,采用公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等确认目的DNA的碱基序列。
在分别得到编码目的抗AMIGO2抗体的V区的DNA后,将其组装入含有将所希望的抗体恒定区(C区)编码的DNA表达载体中。
在制造本发明中所使用的抗AMIGO2抗体时,将抗体基因组装入载体,使其在表达控制区域,例如增强子、启动子的控制下表达。接着,用该表达载体转染宿主细胞,使抗体表达。
抗体基因的表达,既可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别组装入表达载体,同时转染宿主细胞,或者也可以将编码H链和L链的DNA组装入单一的表达载体转染宿主细胞(参照WO94/11523号公报)。
另外,在产生重组型抗体时,不仅可以使用上述宿主细胞,而且 可以使用转基因动物。例如,将抗体基因插入编码在乳汁中固有产生的蛋白质(山羊β酪蛋白)的基因中,作为融合基因调制。将包含插入有抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊胚,将该胚导入雌山羊。从接受胚的山羊生出的转基因山羊或其后代产生的乳汁能够得到所希望的抗体。另外,为了使从转基因山羊产生的含有所希望的抗体的乳汁量增加,也可以对转基因山羊使用适宜的激素(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702)。
本发明中所使用的抗体,不限于抗体的整个分子,只要与AMIGO2蛋白质结合,也可以是抗体片段或其修饰物,既包括二价抗体,也包括一价抗体。例如,作为抗体的片段,可以列举具Fab、F(ab’)2、Fv、具有1个Fab和完整Fc的Fab/c、或以适当的接头连接H链或L链的Fv得到的单链Fv(scFv)。具体而言,用酶、例如以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体,生成抗体片段,或者构建编码这些片段的基因,将其导入表达载体后,使其在适当的宿主细胞中表达(例如,参照Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968-2976、Better,M.& Horwitz,A.H.Methods in Enzymology(1989)178,476-496,Academic Press,Inc.、Plueckthun,A.& Skerra,A.Methods in Enzymology(1989)178,476-496,Academic Press,Inc.、Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989)121,652-663、Rousseaux,J.et al.,Methods in Enzymology(1989)121,663-669,Bird,R.E.et al.,TIBTECH(1991)9,132-137)。
ScFv通过连接H链V区和L链V区而得到。在该scFv中,H链V区和L链V区通过接头、优选通过肽接头而被连接(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区,可以源自本说明书中作为抗体记载的任意抗体。作为连接V区的肽接头,例如,可以使用由12~19个氨基酸残基组成的任意一条肽链。
编码scFv的DNA能够通过下述方法得到:在编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、和编码L链或L链V区的DNA中,以这些序列中的全部或编码所希望的氨基酸序列的DNA部分作为模板,使用规定其两端的引物对,以PCR法进行扩增,接着,再组合编码肽接头部分的DNA以及规定其两端分别与H链、L链连接的引物对进行扩增。
另外,一旦制作了编码scFv的DNA,就能够通过通常方法得到含有该DNA的表达载体和用该表达载体转染得到的宿主,另外,通过使用该宿主,能够通过通常方法得到scFv。
这些抗体的片段,能够和上述同样,获得其基因并使其表达,并通过宿主产生。本发明中的“抗体”也包含这些抗体的片段。
作为抗体的修饰物,可以使用与标记物质等各种分子结合的抗AMIGO2抗体。本发明中的“抗体”也包含这些抗体修饰物。这样的抗体修饰物能够通过在得到的抗体上施加化学修饰而得到。另外,抗体的修饰方法在该领域已经确立。
本发明中所使用的抗体也可以是双重特异性抗体(bispecificantibody)。双重特异性抗体既可以是具有识别分子上不同抗原决定簇的抗原结合部位的双重特异性抗体,也可以是一个抗原结合部位识别AMIGO2蛋白质,另一个抗原结合部位识别标记物质等。双重特异性抗体既可以使两种抗体的HL对结合而制作得到,也可以使产生不同单克隆抗体的杂交瘤融合、制作双重特异性抗体产生融合细胞而得到。还能够通过基因工程的方法制作双重特异性抗体。
如上述那样构建的抗体基因能够通过公知的方法表达获得。在哺乳类细胞的情况下,能够使常用的有用启动子、使之表达的抗体基因、其3’侧下流的多聚腺苷酸信号功能性结合而表达。例如,作为启动子/增强子,可以列举人巨细胞病毒早期启动子/增强子(humancytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
另外,作为其它的本发明中所使用的抗体表达中能够使用的启动子/增强子,可以列举逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猴肾病毒病毒40(SV40)等病毒的启动子/增强子,或人延伸因子1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子。
当使用SV40启动子/增强子时,通过Mulligan等的方法(Nature(1979)277,108),另外,当使用HEF1α启动子/增强子时,通过Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18.5322),能够容易进行基因表达。
在采用大肠杆菌的情况下,能够使常用的有用启动子、用于抗体分泌的信号序列和使之表达的抗体基因功能性结合而使该基因表达。 作为启动子,例如,可以列举lacZ启动子、araB启动子。当使用lacZ启动子时,通过Ward等的方法(Nature(1098)341,544-546;FASEBJ.(1992)6,2422-2427),或者,当使用araB启动子时,通过Better等的方法(Science(1988)240,1041-1043)能够进行表达。
作为用于抗体分泌的信号序列,当使其在大肠杆菌的周质产生时,可以使用pelB信号序列(Lei,S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169,4379)。然后,将在周质产生的抗体分离后,将抗体结构适当重组(refold)后使用。
作为复制起点,可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等的复制起点,而且,为了以宿主细胞系统扩增基因拷贝数,表达载体可以包含作为选择标记物的氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
为了制造本发明中所使用的抗体,可以使用任意的表达系统,例如,可以使用真核细胞或原核细胞系统。作为真核细胞,例如,可以列举已建立的哺乳类细胞系统、昆虫细胞系统、丝状真菌细胞和酵母细胞等动物细胞等,作为原核细胞,例如,可以列举大肠杆菌细胞等细菌细胞。
本发明中所使用的抗体优选在哺乳类细胞,例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero、HeLa细胞中表达。
接着,in vitro或in vivo培养经转染的宿主细胞,使目的抗体产生。宿主细胞的培养按照公知的方法进行。例如,作为培养液,可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM,也可以并用胎牛血清(FCS)等血清补充液。
如上述那样表达、产生的抗体,能够从细胞、宿主动物中分离,并纯化至均匀。本发明中所使用的抗体的分离、纯化,可以使用亲合柱进行。例如,作为使用蛋白A柱的柱,可以列举HyperD、POROS、Sepharose FF(Pharmacia生产)等。此外,可以使用在通常的蛋白质中使用的分离、纯化方法,没有任何限制。例如,通过适当选择并组合上述亲合柱以外的色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析等,能够对抗体进行分离、纯化(Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane.Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。
本发明的胰腺癌治疗药,通过将抗AMIGO2抗体和在该技术领域熟知的药学上可接受的载体一起混合、溶解、颗粒化、片剂化、乳化、封入胶囊、冷冻干燥等而能够制剂化。
在用于口服给药时,可以将抗AMIGO2抗体和药学上可接受的溶剂、赋形剂、粘合剂、稳定剂、分散剂等一起,制成片剂、药丸、糖衣剂、软胶囊、硬胶囊、溶液、悬浊液、乳剂、凝胶剂、糖浆剂、悬浮液等剂型。
在用于非口服给药时,可以将抗AMIGO2抗体和药学上可接受的溶剂、赋形剂、粘合剂、稳定剂、分散剂等一起,制成注射用溶液、悬浊液、乳剂、乳膏剂、软膏剂、吸入剂、栓剂等剂型。在注射用的处方中,可以将抗AMIGO2抗体溶解在水性溶液、优选在Hanks’溶液、林格溶液或生理食盐缓冲液等具有生理学适应性的缓冲液中。还可以在油性或水性介质中,将组合物制成悬浊液、溶液或乳浊液等形态。或者也可以将治疗剂制成粉体形态,在使用前用灭菌水等调制为水溶液或悬浊液。在用于吸入给药时,可以将抗AMIGO2抗体粉末化,和乳糖或淀粉等适当的基剂一起制成粉末混合物。栓剂处方能够通过将抗AMIGO2抗体和可可脂等惯用的栓剂基剂混合而制造。而且,本发明的治疗剂的配方还可以是封入聚合物基质等,作为持续释放用制剂。
给药量和给药次数,根据剂型和给药途径以及患者的症状、年龄、体重而异,一般而言,每日每1kg体重,抗AMIGO2抗体可以为约0.001mg至1000mg的范围,优选为约0.01mg至10mg的范围,1日1次至数次投与。
本发明的胰腺癌治疗药优选以通常的非口服途径,例如注射剂(皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射等)、经皮、经粘膜、经鼻、经肺等给药。
实施例
以下,根据实施例更详细地说明本发明,但本发明不受这些实施例的定。
实施例1采用DNA微阵列对各种癌细胞中的AMIGO2基因的表达分析
为了探索在胰腺癌中表达亢进的基因,使用ISOGEN(Nippon Gene 社),根据常规方法从表1所示的各种人体组织和癌细胞株中、和通过激光捕获显微分离法(Laser Capture Microdissection)从分别由分化程度不同的24例胰腺癌、癌前病变1例、胰管癌2例、胰管内乳头粘液瘤1例摘出的组织、以及作为对照的正常组织(被摘出的胰腺癌组织的非癌部分)4例中回收的样品调制总RNA。
使用上述总RNA各10ng,供给GeneChipU-133(Affimetrix公司生产),根据Expression Analysis Technical Manual(Affimetrix公司生产),进行基因表达分析。将全基因表达评分的平均值设为100,探索在癌细胞中表达亢进的基因时,与正常胰腺(52.9)比较,可知AMIGO2mRNA(探针ID:222108at HG-U133A)在胰腺癌4例内的3例中,表达评分(304.0、148.7、448.9)分别表达亢进5.7倍、2.8倍、8.5倍(图1a、b)。
在胰腺癌细胞株的分析中显示,AMIGO2的表达在Capanl、Pancl、PK-45H、PK-45P、PK-59和QGP-1中,表达评分为100以上(图1c)。
分别使用从摘出的胰腺癌组织中的高分化型4例、中分化型17例、低分化型3例和正常胰腺4例、癌前病变1例、胰管癌2例、胰管内乳头粘液瘤1例调制的总RNA各10ng,采用GeneChipU133Plus2.0(Affimetrix公司生产)进行基因表达分析。表示将GeneChipU133Plus2.0的全基因表达评分的平均值作为100时的各组织的表达评分。结果可知,AMIGO2mRNA(探针ID:222108at HG-U133plus2)在正常胰腺、癌前病变、胰管内乳头粘液瘤、高分化型胰腺癌中的表达评分低,与此相对,在中分化型胰腺癌和低分化型胰腺癌中表达亢进(图2)。
[表1]
在AMIGO2基因表达分析中使用的组织和细胞株
实施例2 AMIGO2 cDNA的克隆
AMIGO2的cDNA以来自胰腺癌细胞株PK-59细胞的cDNA作为 模板,通过PCR法扩增。此时,使用引物对AMIGO2FW(序列号3)和AMIGO2RV(序列号4),该引物对以GenBank号(NM181847)的序列信息为根据设计,扩增包含ORF领域(open reading flame)的片段。在该PCR反应中,使用KOD-plus(东洋纺社),以94℃—15秒、60℃—15秒、68℃—120秒、40个循环的条件进行。
此后,通过琼脂糖凝胶电泳,切出接近目的大小的含有约1.6kbp的条带的凝胶,使用QIAquick gel extraction kit(Qiagen公司)由该凝胶片段进行纯化,得到目的AMIGO2的全长cDNA(以下称为AMIGO2full cDNA)。
实施例3AMIGO2抗原的调制
(1)AMIGO2的全长cDNA在哺乳类动物细胞中的表达载体的制作
为了将上述AMIGO2 full cDNA插入哺乳类表达用载体pEF4/Myc-HisB(Invitrogen公司生产),将其用2种限制酶KpnI(TaKaRa公司生产)和EcoRV(TaKaRa公司生产)处理后,采用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics公司生产),与用相同的KpnI/EcoRV处理过的pEF4/Myc-HisB进行连接,由此而插入。通过常规方法进行碱序列分析,得到目的表达载体pEF4/AMIGO2full。
(2)相当于AMIGO2的细胞外区域部分长度的cDNA在哺乳类动物细胞中的表达载体的制作
以AMIGO2的全长cDNA(AMIGO2full cDNA)作为模板,使用以GenBank号(NM181847)的序列信息为根据设计的引物对AMIGO2FW(序列号3)和AMIGO2-Rv-KY(序列号5)进行PCR反应,扩增相当于AMIGO2的细胞外区域部分的cDNA片段(sAMIGO2cDNA)。在该PCR反应中,使用KOD-plus(东洋纺社),以94℃—15秒、60℃—15秒、68℃—90秒、40个循环的条件进行。
通过琼脂糖凝胶电泳,切出含有接近目的尺寸的约900bp的条带的凝胶,使用QIAquick gel extraction kit(Qiagen公司)由该凝胶片段进行纯化,得到目的sAMIGO2cDNA。
为了将该sAMIGO2cDNA插入哺乳类表达用载体pEF4/Myc-HisB(Invitrogen公司生产),用2种限制酶KpnI(TaKaRa公司生产)和XbaI(TaKaRa公司生产)处理后,采用DNA快速连接试剂盒(Roche Diagnostics公司生产),与用相同的KpnI/XbaI处理过的Myc-HisB进行连接,由此而插入。通过常规方法进行碱序列分析,得到目的表达载体pEF4/sAMIGO2。
(3)AMIGO2全长蛋白质和sAMIGO2蛋白质的表达
根据FuGENE6转染试剂(Roche Diagnostics公司生产)的实验设计,在转染的前一天,在直径10cm的培养皿中接种8×105细胞的CHO细胞,培养一晚,次日,在400μL的无血清Opti-MEM培养基(Invitrogen公司生产)中混合8μg表达载体pEF4/AMIGO2full或pEF4/sAMIGO2和16μL的FuGENE6试剂,进行15~45分钟的室温孵育后,在细胞培养液中加入,进行转染。在转染次日,使用有限稀释法和作为选择试剂的Zeocin(Invitrogen公司生产),开始克隆化。
AMIGO2全长表达CHO,通过使用抗AMIGO2单克隆抗体(R&D Systems公司生产)的蛋白质印迹和流式细胞术(使用BectonDickinson公司生产的FACScalibur),选择信号强且增殖良好的克隆。结果得到AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005),在单克隆抗体制作时的筛选中使用EXZ1005。
sAMIGO2表达CHO细胞的筛选,通过使用抗AMIGO2单克隆抗体(R & D Systems公司生产,MAB2080)的蛋白质印迹,分析在培养上清中所分泌的sAMIGO2的浓度而进行。选择向培养上清中的分泌量多且增殖良好的克隆,结果得到sAMIGO2表达CHO克隆(EXZ0902)。使用3个培养面积1500cm2的转瓶(roller bottle),以每1个转瓶333mL无血清培养基CHO-S-SFM-II(Invitrogen公司)对该选择的sAMIGO2表达CHO克隆(EXZ0902)进行72小时培养,回收培养上清。使用HisTrapHP柱(GE Healthcare Bioscience公司生产)由得到的培养上清进行sAMIGO2Myc-His tag融合蛋白质(以下以sAMIGO2蛋白质表示)的纯化。通过非还原下的SDS-PAGE分析后,确认为95%以上的纯度(图3)。将该被纯化的融合蛋白质相对PBS进行透析,作为免疫用抗原和抗原决定簇鉴定等分析用蛋白质使用。sAMIGO2蛋白质的浓度采用将已知浓度的纯品牛血清白蛋白作为标准曲线的BCA法(使用PIRCE公司生产的试剂盒)算出。
(4)表达AMIGO2的免疫球蛋白(immunoglobulin)结构域的重组杆 状病毒的制作
以在实施例2中调制的AMIGO2 full cDNA作为模板,使用根据GenBank号(NM181847)的序列信息设计的引物对BS/AMIGO2/Ig-FW(序列号6)和BS/AMIGO2/Ig-RV(序列号7)进行PCR反应,扩增相当于AMIGO2的免疫球蛋白结构域部分的cDNA片段(AMIGO2/IgcDNA)。在该反应中,使用KOD-plus(东洋纺社),以94℃—15秒、60℃—15秒、68℃—50秒、40个循环的条件进行反应。通过进行琼脂糖凝胶电泳,切出包含目的尺寸的cDNA,使用QIAquickgel extraction kit(Qiagen公司)从凝胶片段得到目的AMIGO2Ig cDNA。用限制酶KpnI(TaKaRa公司生产)在37℃处理该AMIGO2Ig cDNA1小时后,通过酚/氯仿提取、乙醇沉淀回收。将这样调制的AMIGO2IgcDNA插入使用KpnI(TaKaRa公司生产)切断的pBacSurf1(Novagen公司生产),构建转移载体pBS/AMIGO2/Ig。接着,将4μg的pBS/AMIGO2/Ig用限制酶BpII(Fermentas公司)切断成直链后,根据Invitrogen公司的说明书,和Bac-N-Blue DNA共同导入Sf9细胞,调制AMIGO2的免疫球蛋白结构域和gp64的融合蛋白质表达重组杆状病毒。
向Sf9细胞(2×10-6个细胞/mL)中加入上述调制的重组杆状病毒,使MOI成为5,使其感染后,在27℃培养3日。从培养3日后的培养上清中回收表达AMIGO2的免疫球蛋白结构域和gp64的融合蛋白质的芽生杆状病毒(budding baculovirus)(BV)。即,将培养液以800×g离心15分钟,除去细胞和细胞破碎物后,以45000g将回收的培养上清离心30分钟。将以PBS悬浮沉淀物得到的标准品作为AMIGO2-Ig-BV部分,在后述的抗AMIGO2单克隆抗体的抗原决定簇鉴定中使用。
实施例4通过蛋白质印迹进行胰腺癌细胞株的AMIGO2的检出
使用市售的抗AMIGO2单克隆抗体(R & D Systems公司生产,MAB2080),通过蛋白质印迹检出12种胰腺癌细胞株(Capanl、KLM1、MIA PaCa2、NOR-P1、Pancl、PK-1、PK-8、PK-9、PK-45H、PK-45P、PK-59、QGP-1)和作为阳性对照的AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)的细胞裂解物中的AMIGO2。即,将各细胞在RIPA缓冲 液(150mM氯化钠、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸、0.1%SDS、2μg/mL胰蛋白酶抑制剂(aprotinin)、2μg/mL胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)、2μg/mL亮肽酶素(leupeptin)、0.87mg/mL PMSF、10mM三羟基氨基甲烷盐酸盐(pH7.4))中溶解而调制细胞裂解物,在非还原条件下SDS-PAGE的各泳道中,将该细胞裂解物在胰腺癌细胞的情况下上样10μL,在阳性对照的AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)的情况下上样0.5μL。
将蛋白质从电泳结束后的凝胶转印到硝酸纤维素膜(GEHealthcare Bioscience公司生产)上,使作为一次抗体的抗AMIGO2单克隆抗体(R&D Systems公司生产)反应,接着使作为二次抗体的过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体(GE Healthcare Bioscience公司生产)反应,检出AMIGO2。
其结果,在分子量约75~65kDa的位置,PK-45H、PK-45P、PK-59和QGP-1的细胞裂解物检出强的条带,Capanl、Pancl、PK-1的细胞裂解物检出弱的条带。其它的细胞裂解物均未检出条带。该结果和GeneChipU133的分析结果相关,只在mRNA的表达评分高的细胞株中检出AMIGO2蛋白质(图4)。在阳性对照的AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)的裂解物中检出的AMIGO2分子量为约85kDa,与胰腺癌细胞的分子量比较,分子量略高,推测这是基于在阳性对照的AMIGO2蛋白质的C末端侧附加的Myc-His tag(分子量约3kDa)和糖链结构的不同。
实施例5采用抗AMIGO2单克隆抗体的AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)和胰腺癌细胞株的流式细胞术
使用上述的细胞裂解物用蛋白质印迹检出AMIGO2的AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)和胰腺癌细胞株PK-45P,以使用FACScalibur(Becton Dickinson公司生产)的流式细胞术分析在细胞表面是否表达AMIGO2。即,以2mM EDTA-PBS处理AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)和胰腺癌细胞株PK-45P,从培养板剥离后,在FACS溶液(含有1%牛血清白蛋白、0.1mM EDTA、0.1%NaN3的PBS)中悬浮,使其为1×106个/mL。将该细胞悬浮液以50μL/孔接种在96孔板(BD Falcon公司生产)中,加入市售的抗AMIGO2单克隆 抗体(0.6μg/孔,R & D Systems公司生产),使其在4℃反应60分钟,以FACS溶液(200μL/孔)洗净2次后,加入FITC标记抗小鼠IgG抗体(Jackson公司生产),使其在4℃反应30分钟。
然后,以FACS溶液洗净2次后,根据使用说明书,使用FACScalibur(Becton Dickinson公司生产)实施流式细胞术。在抗AMIGO2单克隆抗体的阴性对照中使用正常小鼠IgG。另外,在使抗AMIGO2单克隆抗体与细胞反应前,使sAMIGO2蛋白质(5.1μg/孔)和抗AMIGO2单克隆抗体反应,由此调查流式细胞术中的峰值漂移是否消失。
图5表示AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)的结果。使抗AMIGO2单克隆抗体反应时观察到峰值漂移,该峰值漂移在事先使抗AMIGO2单克隆抗体与sAMIGO2蛋白质反应时消失。图6表示胰腺癌细胞株PK-45P的结果。与AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)的结果同样,使抗AMIGO2单克隆抗体反应时观察到峰值漂移,该峰值漂移在事先使抗AMIGO2单克隆抗体与sAMIGO2蛋白质反应时几乎消失。
根据这些结果可知,在AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)和胰腺癌细胞株PK-45P的细胞膜表面上表达AMIGO2蛋白质,在抗AMIGO2抗体制作中作为筛选用细胞使用。
实施例6抗AMIGO2单克隆抗体的制作
等量混合溶解在PBS中的50μg sAMIGO2蛋白质和Titer-MAX(TiterMAX USA,Inc.),对MRL/Ipr小鼠(Sankyo Labo Service)腹腔内注射,由此进行初次免疫。第2次以后的免疫通过混合同样调制的相当于25μg蛋白质量的sAMIGO2蛋白质和Titer-MAX并腹腔内注射而实施。从最后一次免疫3日后,从小鼠中无菌调制脾脏细胞,通过聚乙二醇法与小鼠骨髓瘤细胞NS1进行细胞融合。
使用的免疫前小鼠抗血清(使用0.3μL/孔)。
[表2]使用AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)的杂交瘤培养上清的筛选结果
接着,对这些28种阳性杂交瘤的培养上清,按照实施例5的方法调查使用胰腺癌细胞株PK-45P的流式细胞术中的反应性。另外,在该实验中,出于确认培养上清中所含的抗AMIGO2抗体与胰腺癌细胞株PK-45P的细胞膜上表达的AMIGO2特异性反应的目的,在使各杂交瘤的培养上清与细胞反应前,在培养上清中添加sAMIGO2蛋白质(5.1μg/孔),调查培养上清中所含的抗体被中和时,流式细胞术中的峰值漂移是否减弱。其结果,除了1种(PPZ2927)以外,27种杂交瘤培养上清因sAMIGO2蛋白质的添加而峰值漂移减弱,确认该27种杂交瘤培养上清中所含的抗体与胰腺癌细胞株PK-45P的细胞膜上表达的AMIGO2特异地结合。
[表3]使用胰腺癌细胞株PK-45的杂交瘤培养上清的筛选结果
接着,在表3中表示的杂交瘤中,通过有限稀释法对除PPZ2927以外的27种杂交瘤进行克隆化,最终确立20种克隆。接着,将克隆后的杂交瘤腹腔内移植(1×107个/只)给降植烷处理过的BALB/cAjcl-nu/nu小鼠(CLEA Japan),制作腹水。
实施例7各种抗AMIGO2单克隆抗体的纯化和亚型的鉴定
通过以硫酸铵进行盐析和以HiTrap ProteinG柱(GE HealthcareBioscience公司生产)进行亲和层析,由实施例6中制作的腹水纯化抗体。各纯化抗体的亚型使用小鼠-单克隆抗体分型试剂盒(GE HealthcareBioscience公司生产)调查(表4)。
[表4]纯化的抗AMIGO2抗体的亚型
实施例8通过蛋白质印迹鉴定抗AMIGO2单克隆抗体的抗原决定簇
以还原和非还原条件的样品缓冲液处理作为抗原的sAMIGO2蛋白质或AMIGO2-Ig-BV部分,每一泳道上样150ng(sAMIGO2蛋白质)或590ng(AMIGO2-Ig-BV部分),进行SDS-PAGE。电泳结束后,将凝胶内的蛋白质向Hybond-P膜(GE Healthcare Bioscience)以38V转印16小时。使用40%Block Ace(雪印)/TBS(50mM Tris-HCl(pH7.5),150mM NaCl),将转印膜在室温下封闭1小时。接着,使以40%BlockAce(雪印)/TBS液稀释为3μg/mL的抗AMIGO2单克隆抗体在室温下反应1小时后,将膜用TBST(50mM Tris-HCl(pH7.5),150mM NaCl,0.05%Tween20)5分钟×3次洗净。
此后,使以10%Block Ace(雪印)/TBS液稀释5000倍的HRP标记抗小鼠IgG抗体(GE Healthcare Bioscience)在室温下反应1小时后,用TBST进行5分钟×3次洗净。最后,使ECL检出试剂(GEHealthcare Bioscience)作用,使化学发光信号在X线胶片上感光5分钟。各抗体对抗原的反应性根据条带的浓淡来判断,其结果汇总在表5中。
[表5]抗AMIGO2单克隆抗体在蛋白质印迹中的反应性
表中,sAMIGO2表示纯化sAMIGO2蛋白质,AMIGO2-Ig表示AMIGO2-Ig-BV部分。另外,+表示有反应性、-表示没有反应性。
从该结果可知,PPZ2904、PPZ2912、PPZ2913、PPZ2936、PPZ2952、PPZ3016、PPZ3122等7种抗AMIGO2单克隆抗体识别AMIGO2的免疫球蛋白结构域中存在的抗原决定簇。另外,这7种单克隆抗体与还原下的抗原也反应,所以也可知其识别不依赖于由二硫键形成的AMIGO2立体结构的抗原决定簇。
PPZ3130和sAMIGO2反应,但不和AMIGO2-Ig反应,由此可知其识别从LRR氨基末端区域到LRR羧基末端区域构成的区域中存在的抗原决定簇。因为PPZ3130也与还原下的抗原反应,所以可知其识别不依赖于由二硫键形成的AMIGO2立体结构的抗原决定簇。
其它12种抗AMIGO2单克隆抗体(PPZ2919、PPZ2920、PPZ2937、PPZ2956、PPZ3003、PPZ3124、PPZ3125、PPZ3133、PPZ3135、PPZ3145、PPZ3148、PPZ3160)均不与任一抗原反应。这12种单克隆抗体都与AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)强烈反应(参照表2),但在蛋白质印迹中不反应。作为其理由,认为这些单克隆抗体识别的抗原决定簇由AMIGO2的高级结构形成,抗原决定簇的结构因暴露于SDS而消失。
实施例9抗AMIGO2单克隆抗体的解离常数的测定
使用BIAcore3000系统(BIAcore公司)测定单克隆抗体的解离常数。首先,在传感器芯片CM5上,使用氨基偶联法将抗小鼠IgG抗体(BIAcore公司)固相化。其次,使用在HBS-EP(10mM HEPES,pH7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.005%surfactant P20)中加入0.1%Tween20得到的缓冲液(buffer)调制各种抗AMIGO2抗体后注射,将抗AMIGO2抗体固定化,使其为数百RU程度的固相化量。接着,注射将sAMIGO2蛋白质在上述缓冲液中以25nM至50nM、100nM、200nM的各浓度调制的调制物,测定结合-解离后,使用分析程序(BIAevaluation)求出解离常数。在表6中表示其测定结果。
[表6]抗AMIGO2单克隆抗体的解离常数
表中,ND表示解离常数在检出限以下。另外,例如,解离常数3.0E-08表示3.0×10-8。
根据表6,解离常数表示10-9级的低数值的PPZ3133、PPZ3122、PPZ3016、PPZ2956、PPZ2920等5种单克隆抗体捕捉sAMIGO2蛋白质的能力高,所以能够在采用ELISA法进行的血液或组织中AMIGO2测定系统的构建中应用。
实施例10抗AMIGO2抗体对AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)和胰腺癌细胞株的细胞损伤活性(CDC活性)
CDC活性的测定采用以标的细胞内部存在的乳酸脱氢酶(LDH)的释放作为指标的方法进行。具体而言,使用CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit(Promega公司生产),按照试剂盒中附加的实验设计如下实施。
作为标的细胞,使用AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)和胰腺癌细胞株PK-45P。将这些细胞从培养皿剥离后,悬浮在含有10%FBS的DMEM培养基中,使其成为2×105个/mL,以100μL/孔分别注入96孔U底板(Becton Dickinson公司生产)中,在二氧化碳孵箱中培养一夜。次日,用含有5%FBS的DMEM培养基(不含酚红)洗净在板的底面贴壁的细胞2次后,在各孔分别注入30μL含有5%FBS的DMEM培养基(不含酚红),再分别注入30μL/孔(抗体浓度:10.7μg/mL,反应时的抗体终浓度为4μg/mL)实施例7的表4中所示的20种纯化抗AMIGO2单克隆抗体后,在冰上孵育30分钟。
接着,以20μL/孔分别注入用含有5%FBS的DMEM培养基(不含酚红)将Baby Rabbit Complement(CEDARLANE公司生产)稀释16倍的补体标准品(标的细胞是AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)时)、或者用相同培养基稀释8倍的补体标准品(标的细胞是胰腺癌细胞株PK-45P时),在二氧化碳孵箱中培养4小时。培养后,回收50μL上清,移入平底的酶测定用板。向其中添加50μL/孔试剂盒附属的底物混合液,遮光下室温孵育30分钟。孵育后,添加50μL/孔反应停止液。反应停止后,使用酶标仪测定在波长490nm的吸光度。另外,作为阳性对照(IMS),使用sAMIGO2蛋白质免疫过的小鼠抗血清(稀释100倍),作为阴性对照(NMS),使用免疫前的小鼠抗血清(稀释100倍)。
细胞损伤活性能够如下求出。
细胞损伤活性(%)=(A-B-C)/(D-C)×100
A:[各试样的吸光度]-[培养液的背景吸光度]
B:[由源于补体的LDH产生的吸光度]-[培养液的背景吸光度]
C:[由源于标的细胞自然释放的LDH产生的吸光度]-[培养液的背景吸光度]
D:[由因0.9%Triton-X100添加而从标的细胞100%释放的LDH产生的吸光度]-[培养液的背景吸光度]
结果表示在表7中。在使用AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)得到的CDC活性测定值中,显示高CDC活性(70%以上)的为13个克隆,显示低CDC活性(70%以下)的为7个克隆。在使用胰腺癌细胞株PK-45P得到的CDC活性测定值中,显示高CDC活性(10%以上)的为7个克隆,显示低CDC活性(小于10%)的为13个克隆。
使用AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)时和使用胰腺癌细胞株PK-45P时,各克隆的CDC活性值未必相关,这推测是由于在AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)和胰腺癌细胞株PK-45P的细胞膜上表达的AMIGO2蛋白质的量存在差别等。实际上,从图5和图6的结果可明确地知道两者的AMIGO2蛋白质表达量不同。
[表7]
抗AMIGO2单克隆抗体的CDC活性
在表7中,对于在使用AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005) 时和使用胰腺癌细胞株PK-45P时均表现出高CDC活性的7种抗体(PPZ2919、PPZ2937、PPZ3003、PPZ3124、PPZ3125、PPZ3135、PPZ3148),为了定量求出CDC活性,将反应时抗体浓度调制为200~0ng/mL[标的细胞使用AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)时]、200~0μg/mL[标的细胞使用胰腺癌细胞株PK-45P时],以上述方法测定CDC活性。
图7表示使用AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)作为标的细胞时的结果。另外,图8表示使用胰腺癌细胞株PK-45P作为标的细胞时的结果。根据图7和图8,求出显示50%的CDC活性时的抗体浓度(EC50,使用AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)作为标的细胞时)、或者显示25%的CDC活性时的抗体浓度(EC25,使用胰腺癌细胞株PK-45P作为标的细胞时)后,如表8所示,上位的4种抗体为PPZ2919、PPZ3124、PPZ3135、PPZ3148。
[表8]以AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)和胰腺癌细胞株PK-45P作为标的细胞得到的CDC活性定量分析结果
显示出这种高CDC活性的抗AMIGO2单克隆抗体,基于细胞损伤活性,可以认为作为胰腺癌的治疗药有用。产生这4种单克隆抗体的杂交瘤细胞,作为PPZ2919(识别序号:PPMX0501,受理序号:FERMAP-21017)、PPZ3124(识别序号:PPMX0502,受理序号:FERMAP-21018)、PPZ3135(识别序号:PPMX0503,受理序号:FERMAP-21019)、PPZ3148(识别序号:PPMX0504,受理序号:FERMAP-21020)保藏在(独)产业技术综合研究所专利生物保藏中心(住所:茨城县筑波市东1-1-1中央第6)(受理日:平成18(2006)年9月8日)。
另外,即使是不显示CDC活性的单克隆抗体,如果通过流式细胞 术确认与胰腺癌细胞膜表面上表达的AMIGO2结合,则可以认为使抗体标记同位素或者结合具有细胞损伤活性的化合物,作为胰腺癌的治疗药有用。
实施例11采用ELISA的AMIGO2检出试剂的构建
在实施例9的抗AMIGO2单克隆抗体的解离常数测定中,表现出解离常数为10-9级的低数值,即AMIGO2的捕捉能力高的PPZ3133、PPZ3122、PPZ3016、PPZ2956、PPZ2920的5种单克隆抗体组合,进行采用ELISA的AMIGO2检出试剂的构建。
5种单克隆抗体的过氧化物酶(POD)标记使用Peroxidase LabellingKit-SH(同仁化学),按照试剂盒附属手册的用法容量实施。
在Maxi sorp 96孔板(Nunc公司生产)中,以100μL/孔分别注入纯化抗AMIGO2单克隆抗体(5μg/mL),4℃放置一夜进行固相化。以包含0.05%Tween-20的PBS(后文记做Tween-PBS)洗净孔,以200μL/孔分别注入包含40%Block Ace(雪印乳业生产)的20mM Tris-HCl、150mM NaCl pH8.0(40%BA-TBS),室温放置1小时,由此封闭未吸附在板上的部分,以Tween-PBS洗净孔后,以100μL/孔分别注入用40%BA-TBS稀释为0.7ng/mL的sAMIGO2蛋白质,在室温下反应1小时。
以Tween-PBS洗净孔后,以100μL/孔分别注入包含10%Block Ace(雪印乳业生产)的20mM Tris-HCl、以150mM NaCl pH8.0(10%BA-TBS)稀释为0.1μg/mL的过氧化物酶标记的抗AMIGO2单克隆抗体,室温反应1小时。以Tween-PBS洗净后,在暗处、室温下以TMB试剂(SCYTEK公司)反应30分钟后,以STOP液(SCYTEK公司)使反应停止,通过酶标仪测定在波长450nm的吸光度。吸光度1.1以上的评价为○,吸光度小于1.1、0.6以上的评价为△,吸光度小于0.6的评价为×(表9)。
[表9]采用ELISA的抗AMIGO2单克隆抗体组合的研究
对于在表9中表示为“○”的组合,在后述实施例12中记载的对胰腺癌细胞株的培养上清中存在的可溶型AMIGO2的反应性的研究结果,可知PPZ3122和PPZ3133的组合表现出最好的反应性。
因此,产生在ELISA组合的研究中最有用的2种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞PPZ3122和PPZ3133分别作为识别序号:PPMX0507、受理序号:FERM AP-21023,和识别序号:PPMX0508、受理序号:FERMAP-21024保藏在(独)产业技术综合研究所专利生物保藏中心(住所:茨城县筑波市东1-1-1中央第6)(受理日:平成18(2006)年9月8日)。
实施例12采用ELISA进行的胰腺癌细胞裂解物和培养上清中的AMIGO2检出
根据实施例11的结果,尝试使用以PPZ3133作为固相抗体、以PPZ3122作为过氧化物酶标记抗体的组合进行胰腺癌细胞裂解物和培养上清中的AMIGO2检出。
使用细胞增殖至基本融合后第4日的细胞,如下调制细胞裂解物和培养上清。
胰腺癌细胞裂解物通过用提取用缓冲液(150mM氯化钠、1%TritonX-100、2μg/mL胰蛋白酶抑制剂、2μg/mL胃蛋白酶抑制剂、2μg/mL亮肽酶素、0.87mg/mL苯甲基磺酰氟化物(phenylmethane sulfonylfluoride,PMSF)、10mM三羟基氨基甲烷盐酸盐(pH7.4))溶解细胞而调制,将用40%BA-TBS稀释为10倍的标准品作为样品。胰腺癌细胞培养上清将采用离心分离(3000转,10分钟)除去细胞得到的上清用40%BA-TBS稀释为3倍的标准品作为样品。
以100μL/孔在Maxi sorp96孔板(Nunc公司生产)中分别注入 PPZ3133(5μg/mL),4℃放置一夜固相化。以包含0.05%Tween-20的PBS(后文记做Tween-PBS)洗净孔,以200μL/孔分别注入40%BA-TBS,室温放置1小时,封闭板上的未吸附部分,以Tween-PBS洗净孔后,以100μL/孔分别注入如上述那样调制得稀释后的胰腺癌细胞裂解物和细胞培养上清,在室温下反应1小时。以Tween-PBS洗净孔后,以100μL/孔分别注入以10%BA-TBS稀释成为0.1μg/mL的过氧化物酶标记PPZ3122,在室温下反应1小时。以Tween-PBS洗净后,在暗处、室温下,以TMB试剂反应30分钟后,用STOP液使反应停止,在酶标仪中测定在波长450nm的吸光度。
胰腺癌细胞裂解物和细胞培养上清中的AMIGO2浓度,将已知浓度的sAMIGO2蛋白质作为标准曲线而算出。胰腺癌细胞裂解物中的AMIGO2,作为基于用Bradford法(Bio-Rad公司生产,使用ProteinAssay试剂盒)求得的总蛋白质浓度的AMIGO2浓度而算出。
其结果如表10所示,细胞裂解物中的AMIGO2,在MIA PaCa2中为检出限以下,但在PK-1、PK-45P和PK-59中,以1.9ng/mg protein、4.4ng/mg protein、6.7ng/mg protein的浓度被检出。该浓度与采用GeneChiPU133得到的mRNA表达评分得程度大致成比例。另外,在PK-1、PK-45P和PK-59中,也分别以1.9ng/mL、2.9ng/mL、2.4ng/mL的浓度在细胞培养液中检出AMIGO2,但在MIA PaCa2中为检出限以下。该事实表示,在细胞膜上表达的AMIGO2因某种原因而被切断,作为可溶型AMIGO2游离在细胞培养液中。进而暗示了将被检验者的血液或体液作为检测体检出该可溶型AMIGO2,由此来诊断胰腺癌的可能性。
[表10]
由ELISA检出的胰腺癌细胞裂解物和培养上清中的AMIGO2浓度
胰腺癌细胞 | 细胞裂解物中得浓度(ng/mg蛋白质) | 培养上清中得度(ng/mL) |
MIA PaCa2 | 检出限以下 | 检出限以下 |
PK-1 | 1.9 | 1.9 |
PK-45P | 4.4 | 2.9 |
PK-59 | 6.7 | 2.4 |
实施例13胰腺癌的免疫组织染色
作为预备实验,尝试对胰腺癌细胞株PK-45P和Capan-1的免疫染 色,使用已确认对两种细胞株或任意一种细胞株具有反应性的抗AMIGO2单克隆抗体,对胰腺癌的临床检测体实施免疫组织染色。
作为胰腺癌组织和正常胰腺组织的检测体,使用Folio Biosciences公司生产的Pancreatic Carcinoma & Normal TMA(将福尔马林固定后石蜡包埋标本制成5μm的组织切片)。具体而言,如下述那样实施。
将组织切片浸渍在100%二甲苯中3次,每次5分钟,由此脱石蜡,接着,浸渍在100%乙醇中2次,每次1分钟,浸渍在90%乙醇中1次,1分钟,再在70%乙醇中浸渍1次,1分钟,由此进行亲水化。此后,以PBS(20mM磷酸,150mM NaCl,pH7.0)洗净3次,每次5分钟,然后,浸渍在10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)中进行高压处理(121℃,20分钟),由此将抗原活化。抗原活化后,用PBS洗净3次,每次5分钟,然后,为了使内源性的过氧化物酶失活,在加入0.3%过氧化氢的甲醇中室温反应15分钟。
接着,以蒸馏水洗净1次后,以PBS洗净3次,每次5分钟,用含有40%BlockAce(雪印乳业)的TBS(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH8.0)封闭(室温30分钟)。以PBS每次5分钟洗净3次后,将用含有10%Block Ace的TBS稀释为20μg/mL的抗AMIGO2单克隆抗体在4℃反应一夜。以PBS每次5分钟洗净3次后,将用PBS稀释200倍的过氧化物酶标记抗小鼠IgG(GE Healthcare Bioscience公司生产)作为二次抗体,室温下反应1小时。以PBS每次5分钟洗净3次后,使用DAB(3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐)显色。另外,使用苏木精对细胞核进行对比染色。
如图9所示可知,采用PPZ2913、PPZ2952、PPZ3130等3种抗体,能够将胰腺癌组织中表达亢进的AMIGO2特异地免疫染色。另外,对于点在组织芯片上的66例胰腺癌组织检测体,AMIGO2表达的区分以Histofine HER2试剂盒的染色程度为基准进行。4阶段的判断评分如下。
判断评分0,在检测体组织中的肿瘤细胞中,没有呈现AMIGO2阳性的细胞,或AMIGO2阳性细胞数不足10%。判断评分1+,在检测体组织中的肿瘤细胞中,呈现AMIGO2阳性的细胞有10%以上,但局限在一部分肿瘤细胞膜中,染色强度弱。判断评分2+,在检测体组 织中的肿瘤细胞中,呈现AMIGO2阳性的细胞有10%以上,局限在肿瘤细胞膜中,染色强度中等程度。判断评分3+,在检测体组织中的肿瘤细胞中,呈现AMIGO2阳性的细胞有10%以上,局限在肿瘤细胞膜中,染色强度强。
根据该评分原则将66例胰腺癌组织检测体分类时,评分0的有24例检测体(36%),评分1+的有28例检测体(42%),评分2+的有9例检测体(14%),评分3+的有5例检测体(8%)。
如果将评分1+以上的作为染色阳性,则有合计42例检测体,阳性率为64%。再严格些,如果将被分类为评分2+~评分3+的检测体判断为AMIGO2过量表达,则有合计14例检测体,阳性率为21%。
将PPZ2913、PPZ2952和PPZ3130分别以识别序号:PPMX0509、受理序号:FERMAP-21037,识别序号:PPMX0510、受理序号:FERMAP-21038和识别序号:PPMX0511、受理序号:FERM AP-21039保藏在(独)产业技术综合研究所专利生物保藏中心(住所:茨城县筑波市东1—1—1中央第6)(受理日:平成18(2006)年9月27日)。实施例14抗AMIGO2抗体对AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)的细胞损伤活性(ADCC活性)
ADCC活性的测定采用以在标的细胞内部存在的乳酸脱氢酶(LDH)的释放作为指标的方法进行。具体而言,使用CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit(Promega公司生产),按照试剂盒附加的实验设计如下实施。
效应细胞的调制
从C3H小鼠(8周龄,雄性,埼玉实验动物)中出脾脏,在含有10%FBS的RPM11640培养基中分离脾细胞。用相同培养基洗净后,将细胞浓度调制为5×106个/mL,在500U/mL人IL-2(PEPROTECHEC公司生产)、10ng/mL小鼠GM-CSF(PEPROTECHEC公司生产)的存在下培养5日。测定当日,回收脾细胞,以含有5%FBS的DMEM培养基(不含酚红)洗净后,用相同培养基调制为1.25×107个/mL,作为效应细胞。
标的细胞的调制
作为标的细胞,使用AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)。 从培养皿剥离细胞后,悬浮在含有5%FBS的DMEM培养基(不含酚红)中,在96孔U底板(Becton Dickinson公司生产)中分别注入30μL/孔,使其为2×104个/孔。
ADCC活性的测定
将2.4μg/mL的抗体液分别以10μL/孔向标的细胞注入后,孵育30分钟。接着,分别注入40μL/孔的效应细胞,在二氧化碳孵箱中培养4小时。培养后,回收50μL上清,移入平底的酶分析用板。向其中添加50μL/孔的试剂盒附属的底物混合液,遮光下室温孵育30分钟。孵育后,添加50μL/孔的反应停止液。使用酶标仪测定在波长490nm的吸光度。
细胞损伤活性能够如下求出。
细胞损伤活性(%)=(A—B—C)/(D—C)×100
A:[各试样的吸光度]—[培养液的背景吸光度]
B:[由来自效应细胞的LDH产生的吸光度]—[培养液的背景吸光度]
C:[由来自标的细胞自然释放的LDH产生的吸光度]—[培养液的背景吸光度]
D:[由因0.9%Triton-X100添加而从标的细胞100%释放的LDH产生的吸光度]—[培养液的背景吸光度]
结果表示在表11中。表中,所谓阴性对照,是事先已经判明不表现与AMIGO2的反应性的抗体。相对于该阴性对照抗体表现出的ADCC活性值3.6%,得到表现出20%以上的高ADCC活性的4种抗体(PPZ2952、PPZ3122、PPZ3133和PPZ3145)。
产生这4种抗体的杂交瘤细胞,作为PPZ2952(识别序号:PPMX0510,FERM AP-21038)、PPZ3122(识别序号:PPMX0507,FERMAP-21023)、PPZ3133(识别序号:PPMX0508,FERM AP-21024)、PPZ3145(识别序号:PPMX0519,FERM AP-21042)保藏在(独)产业技术综合研究所专利生物保藏中心(住所:茨城县筑波市东1—1—1中央第6)(PPZ2952和PPZ3145的受理日:平成18(2006)年9月27日;PPZ3122和PPZ3133的受理日:平成18(2006)年9月8日)。
[表11]
制作能够对应各种使用目的的抗AMIGO2单克隆抗体。在哺乳类细胞的CHO细胞和出芽型杆状病毒中,不仅表达AMIGO2蛋白质的全长,而且表达各种部分肽,作为免疫用以及筛选用抗原使用。其结果,如表12中所示,选择了能够适应使用目的的抗体。如该结果所示那样,明确了符合全部使用目的的抗体是难以获得的,为了取得能够对应使用目的的抗体,必须采取适应目的的筛选方法。
实施例15将胰腺癌细胞株移植scid小鼠所形成的肿瘤块的免疫染色
将胰腺癌细胞株PK-45P移植在CB17-scid小鼠(雄性,7周龄)的右侧腹部皮下(1×107个细胞/小鼠),移植34日后摘出肿瘤块后,OTC复合物包埋,制作冷冻切片。将这样制作的冷冻切片用PBS(20mM磷酸,150mM NaCl,pH7.0)洗净3次,每次5分钟,然后浸渍在10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)中,高压处理(121℃,20分钟)使抗原活化。
使抗原活化后,用PBS每次5分钟洗净3次后,为了使内源性的过氧化物酶失活,在加入0.3%过氧化氢的甲醇中室温反应15分钟。接着,以蒸馏水洗净1次后,以PBS每次5分钟洗净3次,以含有40%BlockAce(雪印乳业)的TBS(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH8.0)封闭(室温30分钟)。以PBS每次5分钟洗净3次后,将用含有10%Block Ace的TBS稀释为20μg/mL的抗AMIGO2单克隆抗体在4℃反应一夜。以PBS每次5分钟洗净3次后,将用PBS稀释200倍的过氧化物酶标记抗小鼠IgG(GE Healthcare Bioscience公司生产)作为二次抗体室温反应1小时。以PBS每次5分钟洗净3次后,使用DAB(3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐)显色。另外,使用苏木精对细胞核进行对比染色。
结果表示在图10中。可知移植在scid小鼠中的胰腺癌细胞株PK-45P在小鼠皮下形成肿瘤块后,也维持AMIGO2的表达。另外,如果根据实施例13中记载的判断基准判断该免疫染色的程度,则判断为评分1+。
实施例16对胰腺癌细胞株向scid小鼠植入-增殖的抑制试验
将实施例15中所示判断在scid小鼠皮下移植后也维持(判断:评分1+)AMIGO2表达的胰腺癌细胞株PK-45P,以2×106个细胞/小鼠移植在新的scid小鼠(雄性,7周龄)的右侧腹部皮下,以移植日为day0,到包含day0的day15为止,以3日间隔从小鼠尾静脉投与抗体(合计投与6次);到day38为止,以2~3日间隔实施胰腺癌细胞株的植入性确认(由触诊进行)及植入后肿瘤块的体积测定(隔着皮肤,以游标卡尺测定肿瘤块的长径L和短径W,以计算式V=LW2/2算出肿瘤体积V。单位mm3)。
作为投与抗体,选择显示CDC活性或/和ADCC活性的3种抗 AMIGO2单克隆抗体(PPZ2952、PPZ3122、PPZ3148)。
此时,因为PPZ2952是亚型IgG1,PPZ3122和PPZ3148是亚型IgG2a,所以,作为不与移植的PK-45P反应的阴性对照抗体,也投与对应于各自亚型的3423(亚型IgGl)和K7124(亚型IgG2a)。以10只为1组,1次的抗体给药量根据小鼠体重换算,为25mg/kg。
在图11中表示亚型IgGl抗体组相关的结果,在图12中表示亚型IgG2a抗体组相关的结果。抗体投与期间,即从day0到day15的期间,各试验组均确认肿瘤植入。但是,如果观察抗体投与结束后的肿瘤体积增加,则相比较于阴性对照的3423或K7124,PPZ2952、PPZ3122、PPZ3148的任意一种抗体都能够确认肿瘤增殖抑制效果。如在实施例13和实施例15中所记载的那样,移植在scid小鼠中而形成的PK-45P肿瘤块的免疫染色评分是1+,与之相对,临床检测体胰腺癌组织的免疫染色评分显示1+以上的为64%以上。据此,在高表达AMIGO2的癌患者中,能够期待由PPZ2952、PPZ3122、PPZ3148产生的胰腺癌治疗效果。
实施例17AMIGO2过表达胰腺癌细胞株向scid小鼠的植入-增殖抑制试验
(1)AMIGO2过表达胰腺癌细胞株的制作
根据FuGENE HD转染试剂(Roche Diagnostics公司生产)的实验设计,将在实施例3(1)中调制的AMIGO2全长表达载体pEF4/AMIGO2full转染胰腺癌细胞株MIAPaCa2。即,在转染前一日,在直径35mm培养皿中接种8×105细胞的MIAPaCa2,培养一晚,次日,在150μL的无血清Opti-MEM培养基(Invitrogen公司生产)中混合3μg表达载体pEF4/AMIGO2full和6μL的FuGENE HD试剂,进行15~45分钟的室温孵育后,加入细胞培养液中进行转染。在转染次日,使用有限稀释法和作为选择试剂的Zeocin(Invitrogen公司生产)开始克隆化。
通过使用了AMIGO2全长表达MIA PaCa2、抗AMIGO2单克隆抗体(R & D systems公司生产)的蛋白质印迹、流式细胞术(使用BectonDickinson公司生产的FACScalibur)和使用抗AMIGO2抗体进行的免疫染色,选择信号强且增殖良好的克隆,得到AMIGO2全长表达MIA PaCa2克隆EXZ3901。如果采用免疫染色调查AMIGO2蛋白质的表达量,如图13所示的那样,能够确认相比于MIAPaCa2野生株,EXZ3901中的AMIGO2蛋白质表达十分高。
(2)AMIGO2过表达胰腺癌细胞株向scid小鼠的移植
将上述制作的AMIGO2全长表达MIA PaCa2克隆(EXZ3901)或野生株MIAPaCa2细胞株以1×107个细胞/小鼠移植在scid小鼠(雄性,7周龄)的右侧腹部皮下。
(3)肿瘤块尺寸和scid小鼠血清中AMIGO2蛋白质的测定
为了了解胰腺癌细胞株移植后的肿瘤块和scid小鼠血清中AMIGO2蛋白质浓度,对移植了AMIGO2全长表达MIA PaCa2克隆(EXZ3901)或野生株MIA PaCa2细胞株的各2只scid小鼠,在day10进行肿瘤块摘出和小鼠血清采取。用尺测定摘出的肿瘤块长径,将长径小于3mm的记做小,将长径3mm以上、小于6mm的记做中,将长径6mm以上的记做大,进行尺寸分类。小鼠血清中AMIGO2蛋白质的检出采用实施例11中表示的ELISA实施。结果汇总在表13中。在移植了AMIGO2全长表达MIA PaCa2克隆(EXZ3901)的小鼠个体中,能够检出血清中AMIGO2蛋白质浓度,其浓度与肿瘤尺寸成比例。在移植了MIA PaCa2野生株的小鼠个体中,肿瘤块尺寸虽然十分大,但血清中AMIGO2蛋白质浓度完全不能检出,所以,EXZ3901移植小鼠的血清中能够检出的AMIGO2蛋白质,可以认为是以某种原因从EXZ3901肿瘤块游离到血液中的AMIGO2蛋白质。
[表13]荷瘤小鼠的摘出肿瘤块尺寸和血清中AMIGO2浓度
小鼠个体序号 | 移植细胞种类 | 摘出肿瘤块的大小 | 小鼠血清中AMIGO2浓度(ng/mL) |
1 | EXZ3901 | 大 | 9.0 |
2 | EXZ3901 | 中 | 1.8 |
3 | MIA PaCa2野生株 | 大 | 0.0 |
4 | MIA PaCa2野生株 | 中 | 0.0 |
(4)scid小鼠中的AMIGO2过表达胰腺癌细胞株的植入-增殖抑制试验对于与上述实施例17(2)同样制作的荷瘤小鼠模型,以移植日为 day0,至包含该day0的day27为止,以3日间隔从小鼠尾静脉投与抗体(合计投与10次);至day42为止,以3~4日间隔实施胰腺癌细胞株的植入性确认(由触诊进行)及植入后肿瘤块的体积测定(隔着皮肤,以游标卡尺测定肿瘤块长径L和短径W,以计算式V=LW2/2算出肿瘤体积V。单位mm3)。
作为投与抗体,选择显示CDC活性或/和ADCC活性的2种抗AMIGO2单克隆抗体(PPZ3124和PPZ3148)。
由于PPZ3124和PPZ3148是亚型IgG2a,所以,作为不与移植的AMIGO2全长表达MIAPaCa2克隆(EXZ3901)反应的阴性对照抗体,也投与K7124(亚型IgG2a)。以10只为1组,1次的抗体给药量根据小鼠体重换算,为75mg/kg。
各抗体投与组的肿瘤植入率表示在图14中。在任意1个抗体投与组中,至移植后12日,AMIGO2全长表达MIA PaCa2克隆(EXZ3901)均显示80~90%的植入率。但是,在PPZ3124和PPZ3148投与组中,此后的植入率暂时下降,到抗体投与结束的31日以后,也仅停止在20~30%的植入率。另一方面,在阴性对照K7124投与组中,在抗体投与期间的21日,显示100%的植入率。
另外,关于植入后的肿瘤体积的平均值±SD的推移,在图15中表示PPZ3124相关的结果,在图16中表示PPZ3148相关的结果。在被检验抗体(PPZ3124或PPZ3148)投与组和阴性对照抗体(K7124)投与组之间,如果以Wilcoxon秩和检验来检定在各测定日的肿瘤体积平均值之差,则能够得出PPZ3124投与组在12日以后,PPZ3148投与组在15日以后,p值<0.01的结论。
实施例18通过近红外区域的in vivo荧光成像确认抗体向荷瘤小鼠的肿瘤聚集
(1)采用荧光物质进行抗体标记
在以含有0.5M NaCl的50mM碳酸氢钠缓冲液(pH8.5)调制为浓度5mg/mL的抗AMIGO2单克隆抗体(PPZ3124)1mL中,搅拌下添加2.5μL溶解在N,N-二甲基甲酰胺中的25mM DY-676-NHS-Ester(Dyomics公司生产),在暗处室温反应1小时(PPZ3124和DY-676的摩尔比=1∶2)。将全部量的反应液加入预先用含有150mM NaCl的 20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)平衡的PD-10柱(GE Healthcare Bioscience公司生产),将抗体溶出部分混合后,通过超滤浓缩,使抗体浓度成为5mg/mL。根据在波长280nm的抗体的摩尔吸光系数(220000M-1cm-1)和在波长674nm的DY-676的摩尔吸光系数(145000M-1cm-1)算出的荧光物质DY-676在每1分子PPZ3124抗体的结合数是0.8分子。
以同样方法用DY-676标记阴性对照抗体K7124。DY-676在每1分子K7124抗体的结合数是0.9分子。
(2)in vivo成像
准备将胰腺癌细胞株PK-45P以2×106个细胞/小鼠移植在scid小鼠(雄性,7周龄)的右侧腹部皮下制作的荷瘤小鼠,从小鼠尾静脉投与0.1mL上述调制的DY-676标记PPZ3124或DY-676标记K7124(浓度均为5mg/mL)。在荧光标记抗体投与48小时后,在小鼠腹腔内注射戊巴比妥,在麻醉下通过搭载近红外激发荧光检出单元的LAS-3000(Fuji Film),取得荧光成像数据。
DY-676标记PPZ3124投与小鼠的结果表示在图17(a)中,DY-676标记K7124投与小鼠的结果表示在图17(b)中。图中,以白色虚线的圆表示肿瘤的存在部位。可观察到DY-676标记PPZ3124聚集在荷瘤小鼠的肿瘤中。另外,在阴性对照的DY-676标记K7124投与小鼠的肿瘤中检不出荧光,所以可知DY-676标记PPZ3124的聚集是基于PPZ3124与肿瘤细胞上表达的AMIGO2蛋白质结合而产生的特异性反应。即,可知通过在荷瘤小鼠的静脉内投与荧光标记的抗AMIGO2抗体PPZ3124,能够使表达AMIGO2的肿瘤特异地成像。
实施例19由抗体结合产生的AMIGO2蛋白质向细胞内移行
(1)用荧光物质进行抗体标记
在用含有0.5M NaCl的50mM碳酸氢钠缓冲液(pH8.5)调制成为浓度5mg/mL的365μL抗AMIGO2单克隆抗体(PPZ3124)中,搅拌下添加1.7μL的5mg/mL Alexa Fluor488 Succinimidyl Ester(MolecularProbes公司),在暗处室温反应1小时(PPZ3124和Alexa Fluor 488的摩尔比=1∶2)。将全部量的反应液加入预先用含有150mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)平衡的PD-10柱(GE Healthcare Bioscience公司生产),将抗体溶出部分混合后,通过超滤浓缩,使抗体浓度成为 1mg/mL。根据在波长280nm的抗体的摩尔吸光系数(220000M-1cm-1)和在波长495nm的Alexa Fluor488的摩尔吸光系数(71000M-1cm-1)算出的荧光物质Alexa Fluor488在每1分子PPZ3124的结合数是0.8分子。
(2)使用激光共聚焦显微镜确认抗体结合AMIGO2蛋白质向细胞内的移行
将实施例3(3)制作的AMIGO2全长表达CHO克隆(EXZ1005)以5×105个细胞接种在直径35mm的玻璃底培养皿(IWAKI生产)中,培养2日后,弃去培养基,在细胞中加入含有上述调制的Alexa Fluor488标记PPZ312420μg/mL的含有10%FBS的F-12HAM培养基200μL,室温孵育5分钟。接着,以含有10%FBS的F-12HAM培养基洗净细胞,添加200μL相同培养基后,用激光共聚焦显微镜(倒立型I×81,Olympus生产)经时地(0、0.5、1、2小时)取得数据(激发波长488nm/荧光波长519nm)。观察到在刚反应后,在细胞膜表面局部存在荧光信号随着时间推移而移动到细胞内的情况(图18)。即,可知一旦抗体(PPZ3124)与在细胞膜表面上存在的AMIGO2结合,则AMIGO2—抗体复合体通过胞饮作用进入细胞内。
实施例20结合了具有细胞损伤活性的物质的抗体对AMIGO2表达细胞的增殖抑制
将实施例3(3)制作的AMIGO2全长表达CHO细胞悬浮在含有10%FBS的F-12HAM培养基中,接种在平底96孔板中,使每1孔为5×103个细胞,培养1夜(70μL/孔)。接着,以30μL/孔添加含有各种浓度的作为一次抗体的抗AMIGO2抗体PPZ3124或者阴性对照抗体K7124的含10%FBS的F-12HAM培养基(Sigma公司)(PPZ3124或者K7124的孔内最终浓度:0.1、1、10、100ng/mL,各浓度测定3次),在5%CO2孵箱内(37℃)静置1小时。以F-12HAM培养基(不含FBS)洗净细胞2次,将用CHO-S-SFM-II培养基(Invitrogen公司)稀释成为0.21μg/mL的来自植物的毒素Saporin结合抗小鼠IgG的山羊IgG(商品名:Mab-ZAP,Funakoshi)作为二次抗体,以150μL/孔添加,在5%CO2孵箱内(37℃)静置48小时。接着,以75μL/孔向各孔中添加XTT试剂(Roche Diagnostics公司生产,细胞增殖试剂盒II),在5% CO2孵箱内(37℃)静置6小时。使用酶标仪测定在波长450nm的吸光度(与各孔的活细胞数成比例),将仅使二次抗体反应的孔的吸光度平均值作为100%,求出使一次抗体以各种浓度反应的孔的吸光度的相对百分比。在图19中表示了将该相对百分比作为活细胞数(%)、相对一次抗体浓度绘图的结果。
在使PPZ3124作为一次抗体反应时,活细胞数(%)对抗体浓度的依赖大大下降。该结果表示,PPZ3124与细胞膜上存在的AMIGO2蛋白质浓度依赖性结合,据此表示,来自植物的毒素Saporin结合抗小鼠IgG的山羊IgG结合后,来自植物的毒素Saporin通过实施例19中所示的胞饮作用进入细胞内,从而表现出细胞毒性。即,间接或直接用来自植物的毒素Saporin标记抗AMIGO2单克隆抗体PPZ3124,使其作用于AMIGO2表达细胞,由此能够具有细胞增殖抑制作用。
序列表
<110>株式会社英仙蛋白质科学;国立大学法人东京大学
<120>胰腺癌的诊断药和治疗药
<130>PER0011
<150>JP-2006-114134
<151>2006-04-18
<150>JP-2006-291091
<151>2006-10-26
<150>JP-2006-347544
<151>2006-12-25
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3769
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(469)..(2037)
<223>
<400>1
ggggtcctgc agcctcccga gtgcggagag gcggggccgc ccgctgccgc ccggctgcct 60
gcgccccctc ccgcggcccc ggctctggga gcggggcgcc ccgcgcgcgg gcacacggcg 120
gccagagcgc cgaggcggta ccttcagcct gcaatgagag gaacccggga gagcccccgg 180
gagccagcga agagcttggc tgctgcgtcc agggctgctg ctgccgccgc ggctgcttga 240
aactcctcaa agttgagagc cggctagagg gtgccgcccg ccgggagccg gagggaaagg 300
aagtcgggag gtgcaagagt gacagacacg gacagacgga cgcgcagacc ttcggaaggc 360
actgcgtagg cagcctcccc ggagcccacg aggctcccca gcaccgttca ctggtgggag 420
gctgagccgg tggaaaagac accgggaaga gactcagagg cgaccata atg tcg tta 477
Met Ser Leu
1
cgt gta cac act ctg ccc acc ctg ctt gga gcc gtc gtc aga ccg ggc 525
Arg Val His Thr Leu Pro Thr Leu Leu Gly Ala Val Val Arg Pro Gly
5 10 15
tgc agg gag ctg ctg tgt ttg ctg atg atc aca gtg act gtg ggc cct 573
Cys Arg Glu Leu Leu Cys Leu Leu Met Ile Thr Val Thr Val Gly Pro
20 25 30 35
ggt gcc tct ggg gtg tgc ccc acc gct tgc atc tgt gcc act gac atc 621
Gly Ala Ser Gly Val Cys Pro Thr Ala Cys Ile Cys Ala Thr Asp Ile
40 45 50
gtc agc tgc acc aac aaa aac ctg tcc aag gtg cct ggg aac ctt ttc 669
Val Ser Cys Thr Asn Lys Asn Leu Ser Lys Val Pro Gly Asn Leu Phe
55 60 65
aga ctg att aag aga ctg gac ctg agt tat aac aga att ggg ctt ctg 717
Arg Leu Ile Lys Arg Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Arg Ile Gly Leu Leu
70 75 80
gat tct gag tgg att cca gta tcg ttt gca aag ctg aac acc cta att 765
Asp Ser Glu Trp Ile Pro Val Ser Phe Ala Lys Leu Asn Thr Leu Ile
85 90 95
ctt cgt cat aac aac atc acc agc att tcc acg ggc agt ttt tcc aca 813
Leu Arg His Asn Asn Ile Thr Ser Ile Ser Thr Gly Ser Phe Ser Thr
100 105 110 115
act cca aat ttg aag tgt ctt gac tta tcg tcc aat aag ctg aag acg 861
Thr Pro Asn Leu Lys Cys Leu Asp Leu Ser Ser Asn Lys Leu Lys Thr
120 125 130
gtg aaa aat gct gta ttc caa gag ttg aag gtt ctg gaa gtg ctt ctg 909
Val Lys Asn Ala Val Phe Gln Glu Leu Lys Val Leu Glu Val Leu Leu
135 140 145
ctt tac aac aat cac ata tcc tat ctc gat cct tca gcg ttt gga ggg 957
Leu Tyr Asn Asn His Ile Ser Tyr Leu Asp Pro Ser Ala Phe Gly Gly
150 155 160
ctc tcc cag ttg cag aaa ctc tac tta agt gga aat ttt ctc aca cag 1005
Leu Ser Gln Leu Gln Lys Leu Tyr Leu Ser Gly Asn Phe Leu Thr Gln
165 170 175
ttt ccg atg gat ttg tat gtt gga agg ttc aag ctg gca gaa ctg atg 1053
Phe Pro Met Asp Leu Tyr Val Gly Arg Phe Lys Leu Ala Glu Leu Met
180 185 190 195
ttt tta gat gtt tct tat aac cga att cct tcc atg cca atg cac cac 1101
Phe Leu Asp Val Ser Tyr Asn Arg Ile Pro Ser Met Pro Met His His
200 205 210
ata aat tta gtg cca gga aaa cag ctg aga ggc atc tac ctt cat gga 1149
Ile Asn Leu Val Pro Gly Lys Gln Leu Arg Gly Ile Tyr Leu Hi s Gly
215 220 225
aac cca ttt gtc tgt gac tgt tcc ctg tac tcc ttg ctg gtc ttt tgg 1197
Asn Pro Phe Val Cys Asp Cys Ser Leu Tyr Ser Leu Leu Val Phe Trp
230 235 240
tat cgt agg cac ttt agc tca gtg atg gat ttt aag aac gat tac acc 1245
Tyr Arg Arg His Phe Ser Ser Val Met Asp Phe Lys Asn Asp Tyr Thr
245 250 255
tgt cgc ctg tgg tct gac tcc agg cac tcg cgt cag gta ctt ctg ctc 1293
Cys Arg Leu Trp Ser Asp Ser Arg His Ser Arg Gln Val Leu Leu Leu
260 265 270 275
cag gat agc ttt atg aat tgc tct gac agc atc atc aat ggt tcc ttt 1341
Gln Asp Ser Phe Met Asn Cys Ser Asp Ser Ile Ile Asn Gly Ser Phe
280 285 290
cgt gcg ctt ggc ttt att cat gag gct cag gtc ggg gaa aga ctg atg 1389
Arg Ala Leu Gly Phe Ile His Glu Ala Gln Val Gly Glu Arg Leu Met
295 300 305
gtc cac tgt gac agc aag aca ggt aat gca aat acg gat ttc atc tgg 1437
Val His Cys Asp Ser Lys Thr Gly Asn Ala Asn Thr Asp Phe Ile Trp
310 315 320
gtg ggt cca gat aac aga ctg cta gag ccg gat aaa gag atg gaa aac 1485
Val Gly Pro Asp Asn Arg Leu Leu Glu Pro Asp Lys Glu Met Glu Asn
325 330 335
ttt tac gtg ttt cac aat gga agt ctg gtt ata gaa agc cct cgt ttt 1533
Phe Tyr Val Phe His Asn Gly Ser Leu Val Ile Glu Ser Pro Arg Phe
340 345 350 355
gag gat gct gga gtg tat tct tgt atc gca atg aat aag caa cgc ctg 1581
Glu Asp Ala Gly Val Tyr Ser Cys Ile Ala Met Asn Lys Gln Arg Leu
360 365 370
tta aat gaa act gtg gac gtc aca ata aat gtg agc aat ttc act gta 1629
Leu Asn Glu Thr Val Asp Val Thr Ile Asn Val Ser Asn Phe Thr Val
375 380 385
agc aga tcc cat gct cat gag gca ttt aac aca gct ttt acc act ctt 1677
Ser Arg Ser His Ala His Glu Ala Phe Asn Thr Ala Phe Thr Thr Leu
390 395 400
gct gct tgc gtg gcc agt atc gtt ttg gta ctt ttg tac ctc tat ctg 1725
Ala Ala Cys Val Ala Ser Ile Val Leu Val Leu Leu Tyr Leu Tyr Leu
405 410 415
act cca tgc ccc tgc aag tgt aaa acc aag aga cag aaa aat atg cta 1773
Thr Pro Cys Pro Cys Lys Cys Lys Thr Lys Arg Gln Lys Asn Met Leu
420 425 430 435
cac caa agc aat gcc cat tca tcg att ctc agt cct ggc ccc gct agt 1821
His Gln Ser Asn Ala His Ser Ser Ile Leu Ser Pro Gly Pro Ala Ser
440 445 450
gat gcc tcc gct gat gaa cgg aag gca ggt gca ggt aaa aga gtg gtg 1869
Asp Ala Ser Ala Asp Glu Arg Lys Ala Gly Ala Gly Lys Arg Val Val
455 460 465
ttt ttg gaa ccc ctg aag gat act gca gca ggg cag aac ggg aaa gtc 1917
Phe Leu Glu Pro Leu Lys Asp Thr Ala Ala Gly Gln Asn Gly Lys Val
470 475 480
agg ctc ttt ccc agc gag gca gtg ata gct gag ggc atc cta aag tcc 1965
Arg Leu Phe Pro Ser Glu Ala Val Ile Ala Glu Gly Ile Leu Lys Ser
485 490 495
acg agg ggg aaa tct gac tca gat tca gtc aat tca gtg ttt tct gac 2013
Thr Arg Gly Lys Ser Asp Ser Asp Ser Val Asn Ser Val Phe Ser Asp
500 505 510 515
aca cct ttt gtg gcg tcc act taa tttgtgccta tatttgtatg atgtcataat 2067
Thr Pro Phe Val Ala Ser Thr
520
ttaatctgtt catatttaac tttgtgtgtg gtctgcaaaa taaacagcag gacagaaatt 2127
gtgttgtttt gttctttgaa atacaaccaa attctcttaa aatgattggt aggaaatgag 2187
gtaaagtact tcagttcctc aatgtgccag agaaagatgg ggttgttttc caaagtttaa 2247
gttctagatc acaatatctt agcttttagc actattggta atttcagagt aggcccaaag 2307
gtgatatgac tcccattgtc cctttattta ggatattgaa agaaaaaata aactttatgt 2367
attagtgtcc tttaaaaata gactttgcta acttactagt accagagtta ttttaaagaa 2427
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accagaatga atagactaca ctgataaaat gtactggata atgccacatc ctatatggtg 2607
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tcccattctg tattcttgta caaaagatct cattgaaaat ttaaagtcat cataatttgt 2727
tgccataaat atgtaagtgt caataccaaa atgtctgagt aacttcttaa atccctgttc 2787
tagcaaacta atattggttc atgtgcttgt gtatatgtaa atcttaaatt atgtgaacta 2847
ttaaatagac cctactgtac tgtgctttgg acatttgaat taatgtaaat atatgtaatc 2907
tgtgacttga tattttgttt tatttggcta tttaaaaaca taaatctaaa atgtcttatg 2967
ttatcagatt atgctatttt gtataaagca ccactgatag caaatctctc tccaaaattc 3027
ttatagtaaa gttgattttt ttaaaggggg aggggaaggc tttaatgtgt tctagatcaa 3087
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aaacactcaa atttattttg caacaagtga gagcccagga gacctcctta ttatcctgtc 3207
tctgctttga ggcaatcaag taccctctct gaacctaggt tccctcatct gtaaaacaaa 3267
ggtttcagac cagatggtgt ttaaggtttc tccccatact ggaatgaatg atttcttggt 3327
ggtattagca tcatcacaga cctatacttg ctttctgaaa ctctaccaca tactgaagga 3387
atacaggaat gggattaaga tgactagcat agcagtgtac agcttgaaga gatgttccac 3447
atcatcactc cagctccttc tcttttctca gggacaaatg aggcccagag agaatacgac 3507
ctgtgtaagg tcaaacagtg gcagggaaag aaggagagct ggggtttagc attctccctg 3567
gtgaagattg gaggtccaaa gaaatgactc ctttttaagg gatgggcata aaaaagtgat 3627
caaaacattg caaaggagaa tcaaagattg attgtcctgg ggctaagaaa gaagataatt 3687
tttaaagaat gggagtgggc aacagtgaaa aatattgcag ataagtagat aaggatagaa 3747
gatcaaccac tgactggtag ta 3769
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<211>522
<212>PRT
<213>智人
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Met Ser Leu Arg Val His Thr Leu Pro Thr Leu Leu Gly Ala Val Val
1 5 10 15
Arg Pro Gly Cys Arg Glu Leu Leu Cys Leu Leu Met Ile Thr Val Thr
20 25 30
Val Gly Pro Gly Ala Ser Gly Val Cys Pro Thr Ala Cys Ile Cys Ala
35 40 45
Thr Asp Ile Val Ser Cys Thr Asn Lys Asn Leu Ser Lys Val Pro Gly
50 55 60
Asn Leu Phe Arg Leu Ile Lys Arg Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Arg Ile
65 70 75 80
Gly Leu Leu Asp Ser Glu Trp Ile Pro Val Ser Phe Ala Lys Leu Asn
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115 120 125
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145 150 155 160
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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305 310 315 320
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325 330 335
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<223>根据AMIG02基因设计的DNA
<400>7
atggtacctg atgagcatgg gatctgct 28
Claims (17)
1.一种胰腺癌诊断药,其特征在于:
含有抗AMIGO2抗体,其中,该抗AMIGO2抗体由选自保藏号为FERM BP-10809的杂交瘤PPMX0502、保藏号为FERM BP-10810的杂交瘤PPMX0504、保藏号为FERM BP-10811的杂交瘤PPMX0507、保藏号为FERM BP-10812的杂交瘤PPMX0508、和保藏号为FERMBP-10813的杂交瘤PPMX0519中的至少一种杂交瘤产生。
2.如权利要求1所述的胰腺癌诊断药,其特征在于:
抗AMIGO2抗体是和AMIGO2蛋白质细胞外区域结合的抗体。
3.如权利要求1或2所述的胰腺癌诊断药,其特征在于:
其为使抗AMIGO2抗体在血液中、血清中、血浆中或脏器组织中反应而检测AMIGO2蛋白质所使用的诊断药。
4.如权利要求1或2所述的胰腺癌诊断药,其特征在于:
其为在投与标记的抗AMIGO2抗体后,通过图象诊断检测AMIGO2蛋白质所使用的诊断药。
5.如权利要求1或2所述的胰腺癌诊断药,其特征在于:
其为用于在胰腺癌患者中选择治疗对象患者的诊断药。
6.抗AMIGO2抗体在胰腺癌诊断药制造中的使用,其中,该抗AMIGO2抗体由选自保藏号为FERM BP-10809的杂交瘤PPMX0502、保藏号为FERM BP-10810的杂交瘤PPMX0504、保藏号为FERMBP-10811的杂交瘤PPMX0507、保藏号为FERM BP-10812的杂交瘤PPMX0508、和保藏号为FERM BP-10813的杂交瘤PPMX0519中的至少一种杂交瘤产生。
7.如权利要求6所述的使用,其特征在于:
抗AMIGO2抗体是和AMIGO2蛋白质细胞外区域结合的抗体。
8.如权利要求6或7所述的使用,其特征在于:
使抗AMIGO2抗体在血液中、血清中、血浆中或脏器组织中反应而检测AMIGO2蛋白质,由此进行诊断。
9.如权利要求6或7所述的使用,其特征在于:
在投与标记的抗AMIGO2抗体后,通过图象诊断检测AMIGO2蛋白质,由此进行诊断。
10.一种胰腺癌治疗药,其特征在于:
以抗AMIGO2抗体为有效成分,其中,该抗AMIGO2抗体由选自保藏号为FERM BP-10809的杂交瘤PPMX0502、保藏号为FERMBP-10810的杂交瘤PPMX0504、保藏号为FERM BP-10811的杂交瘤PPMX0507、保藏号为FERM BP-10812的杂交瘤PPMX0508、和保藏号为FERM BP-10813的杂交瘤PPMX0519中的至少一种杂交瘤产生。
11.如权利要求10所述的胰腺癌治疗药,其特征在于:
抗AMIGO2抗体是和AMIGO2蛋白质细胞外区域结合的抗体。
12.如权利要求10所述的胰腺癌治疗药,其特征在于:
抗AMIGO2抗体是具有细胞损伤活性的抗体。
13.如权利要求10所述的胰腺癌治疗药,其特征在于:
抗AMIGO2抗体是结合有同位素标记或具有细胞损伤活性的化合物的抗体。
14.抗AMIGO2抗体在胰腺癌治疗药制造中的使用,其中,该抗AMIGO2抗体由选自保藏号为FERM BP-10809的杂交瘤PPMX0502、保藏号为FERM BP-10810的杂交瘤PPMX0504、保藏号为FERMBP-10811的杂交瘤PPMX0507、保藏号为FERM BP-10812的杂交瘤PPMX0508、和保藏号为FERM BP-10813的杂交瘤PPMX0519中的至 少一种杂交瘤产生。
15.如权利要求14所述的抗AMIGO2抗体在胰腺癌治疗药制造中的使用,其特征在于:
抗AMIGO2抗体是和AMIGO2蛋白质细胞外区域结合的抗体。
16.如权利要求14所述的使用,其特征在于:
抗AMIGO2抗体是具有细胞损伤活性的抗体。
17.如权利要求14所述的使用,其特征在于:
抗AMIGO2抗体是结合有同位素标记或具有细胞损伤活性的化合物的抗体。
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