CN116529267A - Abcg2外排泵-癌症抗原多特异性抗体及其相关组合物、试剂、试剂盒和方法 - Google Patents

Abcg2外排泵-癌症抗原多特异性抗体及其相关组合物、试剂、试剂盒和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116529267A
CN116529267A CN202180057500.7A CN202180057500A CN116529267A CN 116529267 A CN116529267 A CN 116529267A CN 202180057500 A CN202180057500 A CN 202180057500A CN 116529267 A CN116529267 A CN 116529267A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chain
seq
ser
cancer
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180057500.7A
Other languages
English (en)
Inventor
W·R·阿拉松
R·布莱恩特
S·莫汉蒂
P·D·波那斯
翟倩婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kenjotti Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Kenjotti Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kenjotti Biotechnology Co ltd filed Critical Kenjotti Biotechnology Co ltd
Publication of CN116529267A publication Critical patent/CN116529267A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了可同时靶向细胞外排泵ABCG2和癌症相关抗原的多特异性抗体，还提供了包含或编码所述多特异性抗体的药物组合物、核酸、重组表达载体、细胞和试剂盒。本发明还提供了治疗癌症受试者的方法，所述方法包括向受试者施用同时靶向细胞外排泵和癌症相关抗的多特异性抗体。本发明还提供了产生所述多特异性抗体以及与其相关的试剂的方法，包括在主题方法中有用的经基因修饰的细胞系以及制备此类经基因修饰的细胞系的方法。

Description

ABCG2外排泵-癌症抗原多特异性抗体及其相关组合物、试剂、 试剂盒和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月4日提交的第63/034,822号美国临时专利申请的优先权权益，通过本发明的整体引用，所述临时专利申请构成本发明的一部分。
以文本文件形式提供的序列表的引用并入
序列表以文本文件“KNJY-005WO SEQ LIST_ST25.txt”的形式提供，创建于2021年5月27日，且文件大小为87KB。通过本发明的整体引用，所述文本文件的内容构成本发明的一部分。
背景技术
耐药性为一种众所周知的疾病对药物治疗耐受的现象，也是包括肿瘤学在内的各医学领域所面临的一项日益严峻的重大挑战。虽然许多类型的癌症期初对化疗敏感，但随着时间的推移，某些机制(包括通过DNA突变、促进药物抑制、降解和增强外排的代谢变化)都可能产生耐药性。
外排泵(EP)是由各种活细胞表达的蛋白质，并且已经完成进化，可以细胞自然外排各种化合物。ATP结合盒(ABC)转运蛋白家族蛋白质的成员为药物外排的EP实例。尽管转运蛋白结构因蛋白质而异(例如，人类ABC家族有49个已知成员)，其均依照按两个不同结构域(即高度保守的核苷酸结合结构域和更可变的跨膜结构域)的存在进行分类。由ATP结合盒亚家族B成员1(ABCB1)基因编码的多药耐药蛋白1(ABCG2)为其中首个被鉴定出的转运蛋白，该转运蛋白已得到了广泛的研究。ABCG2表达在进行某些化疗后呈上升趋势。
EP导致肿瘤对化学治疗剂产生耐药性。这种耐药性通常与化学治疗剂从耐药性细胞的外排增强相关。如果这种化疗耐药性适用于一种以上化学治疗剂，则被称为多药耐药性(MDR)。
在癌症患者中，通过化疗，转移性癌细胞群已基本被杀死并从患者体内清除，耐药性癌细胞群出现和扩散而对早期疗法的重新治疗没有反应，这种情况并不少见。在大多数情况下，在再次出现新的耐药细胞和/或肿瘤之前，会使用具有不同作用机制的不同药物。
因此，有必要研发用于测定抑制EP的试剂。
发明内容
本发明提供了可作为多特异性抗体的抗ABCG2抗体，所述多特异性抗体可同时靶向ABCG2和肿瘤相关抗原(TAA)，还提供了包含或编码所述多特异性抗体的药物组合物、核酸、重组表达载体、细胞和试剂盒。所述多特异性抗体包括包含ABCG2抗原结合位点的共同可变轻(VL)链、包含ABCG2抗原结合位点的第一可变重(VH)链、以及包含TAA抗原结合位点的第二VH链或包含ABCG2抗原结合位点的第一VH链和第一VL链，以及包含TAA抗原结合位点的第二VH链和第二VL链。本发明还提供了治疗癌症受试者的方法，所述方法包括向受试者施用靶向ABCG2和TAA的多特异性抗体。治疗可能涉及单独施用多特异性抗体，或多特异性抗体和化学治疗剂联合施用。本发明还提供了产生所述多特异性抗体以及与其相关的试剂的方法，包括在主题方法中有用的经基因修饰的细胞系以及制备此类经基因修饰的细胞系的方法。
本文提供的双特异性抗体与表达ABCG2和TAA的癌细胞结合，同时显示与表达ABCG2和/或TAA的非癌细胞的结合减少。换言之，本文提供的双特异性抗体以低亲和力与(1)低表达或不表达ABCG2的表达TAA的细胞结合；以及(2)低表达或不表达TAA的表达ABCG2的细胞结合，并且以高低亲和力与以较高水平(即高于正常细胞的水平)表达至少一种或两种ABCG2和TAA的癌细胞结合。
附图说明
图1提供了化学敏感性分析，显示在存在抗ABCG2抗体5D3以及与ABCG2和CD47结合的双特异性抗体的情况下，过度表达ABCG2的293T细胞对托泊替康的敏感性增加。双特异性抗体5D3DDKT14KK5D3包括源自抗ABCG2抗体5D3的重链(HC)和轻链(LC)以及源自抗CD47抗体5F9的HC。双特异性抗体5D3hVHv1DDKT14KK5D3hVLv1包括源自抗ABCG2抗体5D3的HC和LC以及源自抗CD47抗体5F9的HC。双特异性抗体5D3hVHv2DDKT14KK5D3hVLv1包括源自抗ABCG2抗体5D3的HC和LC，以及源自抗CD47抗体5F9的HC。hVHv1和hVHv2分别指5D3 HC的人源化可变重链形式1和形式2，hVLv1指5D3 LC的人源化可变轻链形式1。KT14指CD47。DD和KK指增强5D3和5F9 HC之间配对的带电对取代。IC50值以nM为单位。
图2显示了5D3和人源化5D3抗体与293T-G2OX细胞的结合，以及相应的EC50结合亲和力。EC50值以nM为单位。
图3显示了人源化ABCG2/KT9双特异性抗体与稳定转染以表达ABCG2的3T3细胞(3T3-G2)、稳定转染以表达人ABCG2的293T细胞(293T_ABCG2_OX)、以及稳定转染以表达人KT9的293T细胞(293T-KT9OX)的结合情况。KT9为阿替利珠单抗，一种抗PD-L1抗体，而5D3为一种抗ABCG2抗体。人源化双特异性抗体5D3hVH-v1DD KT9KK 5D3hVL-v1和5D3hVH-v2DDKT9KK 5D3hVL-v1包括源自抗ABCG2抗体5D3的HC和LC，以及源自抗PD-L1抗体KT9的HC。
图4显示人源化5D3/KT9/5D3双特异性抗体与稳定转染ABCG2(293T-G2OX)、KT9(293T-KT9OX)以及ABCG2和KT9(293T-G2KT9OX)的293T细胞的结合，以及相应的EC50结合亲和力值。
图5显示了使用HT1376(ATCC CRL-1472)人膀胱上皮癌细胞系，测试ABCG2/PD-L1双特异性抗体的单独施用以及与拓扑替康联合施用的细胞毒活性的异种移植研究结果。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型抗体或免疫球蛋白、保留与抗原特异性结合的抗体片段(包括但不限于Fab、Fv、scFv以及Fd片段)、嵌合抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单链抗体(包括仅由重链组成的抗体(例如，VHH骆驼抗体))、双特异性抗体、以及由抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白组成的融合蛋白。抗体可经(例如放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等)被可检测地标记。抗体可以进一步偶联至其他部分，例如，特异性结合对的成员(例如，生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等。抗体也可以与固体支持物(包括但不限于聚苯乙烯板或聚苯乙烯微球，以及类似物)结合。所述术语还包括Fab'、Fv、F(ab')2，和/或保留与抗原特异性结合的其他抗体片段，以及单克隆抗体。抗体可以是单价抗体，也可以是二价抗体。本文使用的抗体可用于测定靶抗原在细胞表面(例如，源自患者的细胞样品或组织样品中)的表达，
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段示例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双价抗体；线性抗体(Zapata等人，《蛋白质工程》8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子(包括仅由重链组成的抗体(例如，VHH骆驼抗体))；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化会产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)，每个片段上都有一个抗原结合位点，以及一个残留的“Fc”片段，这一名称体现了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段，其上有两个抗原结合位点并且仍能与抗原交叉结合。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。所述区域由紧密、非共价结合的一条重链可变结构域和一条轻链可变结构域的二聚体组成。各可变结构域的三个互补决定区(CDR)正是在这种构型中相互作用，进而在VH-VL二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于由各可变结构域的三个CDR组成的完整结合位点。
“Fab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不尽相同。本文中Fab'-SH为对恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初作为成对Fab'片段生成，在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联同样已知。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，根据其恒定结构域的氨基酸序列，可归入两种截然不同类型(被称为κ和λ)中的一种。免疫球蛋白可根据其重链恒定结构域的氨基酸序列被归入不同的类别。免疫球蛋白主要包含五种类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
“单链Fv”、“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽连接子，据此sFv形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，请参见《Pluckthun在单克隆抗体的药理学中的应用》，第113卷，Rosenburg和Moore著，施普林格出版社，纽约，第269-315页(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，所述片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。通过使用过短且不允许同一条链上的两个结构域配对的连接子，强制性使结构域与另一条链的互补结构域配对，并生成两个抗原结合位点。有关双抗体的更完整的描述，参见例如，EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等人，《美国国家科学院院刊》，90：6444-6448(1993)。
如本文所用，术语“亲和力”指两种药剂可逆结合的平衡常数，并且以解离常数(Kd)表示。与抗体对不相关的氨基酸序列的亲和力相比，所述亲和力可以高至少1倍、高至少2倍、高至少3倍、高至少4倍、高至少5倍、高至少6倍、高至少7倍、高至少8倍、高至少9倍、高至少10、高至少20倍、高至少30倍、高至少40倍、高至少50倍、高至少60倍、高至少70倍、高至少80倍、高至少90倍、高至少100倍、高至少1000倍甚至更高。抗体对靶蛋白的亲和力可以为例如，约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更高。如本文所用，术语“亲合力”指在稀释之后，两种或更多种药剂的复合物对解离的抗性。就抗体和/或抗原结合片段而言，术语“免疫反应性”和“优先结合”在本文中可互换使用。
术语“结合”指在，例如，共价、静电、疏水性和离子和/或氢键等的相互作用(包括盐桥和水桥等相互作用)下，两个分子之间的直接缔合。ABCG2特异性抗体与ABCG2多肽内的表位特异性结合。非特异性结合指亲和力低于约10-7M的结合，例如，亲和力为10-6M、10-5M、10-4M等的结合。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”指在重链多肽和轻链多肽二者的可变区内发现的非连续抗原结合位点。CDR已通过多个文献进行描述，例如，Kabat等人，《生物化学杂志》252：6609-6616(1977)；Kabat等人，美国卫生与公众服务部，《具有免疫学意义的蛋白质的序列》(1991)；Chothia等人著，《分子生物学杂志》196：901-917(1987)；和MacCallum等人,杂志》262：732-745(1996)，当彼此比较时，其中定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体的CDR旨在将其纳入如本文所定义和使用的术语范围内。下表1中列出了涵盖前述各参考文献所定义的CDR的氨基酸残基，以作为比较。
表1：CDR定义
1残基编号遵循Kabat等人的命名法，见上文的命名法
2残基编号遵循Chothia等人的命名法，见上文的命名法
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法，见上文的命名法
如本文所用，术语“框架”在提及抗体可变区时，指抗体可变区内CDR区外的所有氨基酸残基。可变区框架通常是长度为约100-120个氨基酸之间的不连续氨基酸序列，但旨在仅指CDR之外的氨基酸。如本文所用，术语“框架区”旨在表示由CDR分隔的框架的每个域。VH链可包括三个CDR和四个FR，从N-端到C-端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。同样地，VL链可包括三个CDR和四个FR，从N-端到C-端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所用，术语“抗体”包括两条重链和两条轻链的四聚体，其中重链和轻链通过例如，二硫键，相互连接。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。重链可变区和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合区。抗体的恒定区通常介导抗体对宿主组织和因子(包括免疫系统的各种细胞和补体系统的第一组分)的结合。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM类型的免疫球蛋白及其亚型。在一些实施方案中，主题抗体为IgG同种型抗体，例如，IgG1。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”指包括实质上由免疫球蛋白基因编码的一条或多条多肽组成的蛋白质。公认的人类免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及许多免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链(约25kD或214个氨基酸)由N端的可变区基因(约110个氨基酸)以及C端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白重链(约50kD或446个氨基酸)由N端的可变区基因(约116个氨基酸)和C端其他前述恒定区基因之一编码，例如，γ(编码约330个氨基酸)。在一些实施方案中，主题抗体包括全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链。
术语“抗原结合片段”指能够特异性结合抗原的全长抗体的一个或多个片段。结合片段的实例包括：(i)Fab片段(单价片段，例如，包括由VL、VH、CL和CH1结构域组成)；(ii)F(ab')2片段(包含两个由二硫键在铰链区连接的Fab片段的组成的二价片段)；(iii)Fd片段(例如，包括由VH结构域和CH1结构域组成)；(iv)Fv片段(例如，包括由抗体单臂的VH结构域和VL结构域组成)；(v)dAb片段(例如，包括由VH结构域组成)；(vi)孤立的CDR；(vii)单链Fv(scFv)(例如，包括由使用重组方法通过合成连接子连接的抗体单臂的VH结构域和VL结构域组成，以使VH结构域和VL结构域配对形成单价分子)；(viii)双抗体(例如，包括由两个scFv组成，其中VH结构域和VL结构域被连接在一起，不允许其配对形成单价分子；每个scFv的VH与另一个scFv的VL结构域配对，形成一个二价分子)。
术语“嵌合抗体”指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，同时重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种的抗体。
“人抗体”指与人或人细胞产生的抗体或源自利用人抗体组库或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表人免疫球蛋白可变轻链(VL)或可变重链(VH)框架序列选集中最常出现的氨基酸残基的框架(FR)。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变结构域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质的序列》，第五版，美国国立卫生研究院出版物91-3242,马里兰州贝塞斯达(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL而言，其亚组为亚组κI，如Kabat等人所述，见上文。在一个实施方案中，对于VH而言，其亚组为亚组III，如Kabat等人所述，见上文。
“人源化”抗体指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人框架(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。人源化抗体恒定区的至少一部分源自人抗体。在本文公开的抗体分子的优选实施方案中，恒定区源自人IgG抗体，例如，人IgGl抗体。在优选实施方案中，本文公开的抗体分子包括包含本文所提供的可变重链区的重链和具有UniProt：P01857-1(第1版)中所示氨基酸序列的人IgGl恒定区。在优选实施方案中，本文公开的抗体分子包括包含本文所提供的可变轻链区的轻链和人轻链恒定区。在优选实施方案中，人轻链恒定区为人κ轻链恒定区。在某些方面，主题抗体中存在的人IgG1重链恒定区可包括突变，例如，用于调节Fc功能的取代。例如，可以引入LALAPG效应子功能突变(L234A、L235A和P329G)或N297A突变以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。基于EU编号系统确定取代的编号。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质的序列》，第5版(1991)中报道的EU索引)。公共卫生服务，国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991)中报道的索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号。
抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
术语“表位”指被免疫系统(例如，抗体、B细胞或T细胞)识别的抗原区域。例如，表位是抗体结合的特定抗原区域。
“分离的”抗体是已经从其自然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体，其自然环境的污染物组分是会干扰抗体诊断或治疗用途的物质，且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，抗体将被纯化(1)至大于90％、大于95％或大于98％的抗体，如通过Lowry方法测定，例如，大于99％重量；(2)达到足以通过使用旋转杯测序仪获得至少15个N端或内部氨基酸序列残基的程度；或(3)至在还原或非还原条件下使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得的同质性。因为抗体自然环境的至少一种组分将不存在，分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。在一些情况下，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
如本文所用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。“化学治疗剂”(又称“抗肿瘤剂”)可以是用于治疗癌症或其他疾病或障碍的细胞毒性剂。
如本文所用，术语“治疗”(“treatment”、“treating”)等指获得所需的药理和/或生理作用。所述作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可能是预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不利影响而言可能是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物(包括人类)疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未诊断为患有所述疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即遏止其发展；以及(c)缓解疾病，即引起疾病消退。
在本文中可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类动物、人类、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
“治疗有效量”或“有效量”指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以影响对疾病的这种治疗的靶标特异性抗体的量。“治疗有效量”因抗体、疾病及其严重性以及待治疗受试者的年龄、体重等而异。
本文使用的术语“难治性”指对治疗无反应的疾病或病症。就癌症而言，如本文所用的“难治性癌症”指对治疗无反应的癌症。难治性癌症可能在治疗开始时产生耐药性，也可能在治疗过程中变得具有耐药性。难治性癌症又可称为耐药性癌症。
“生物样品”包括从个体获得的可以用于诊断或监测测定的多种类型样品。所述定义包括生物来源的血液和其他液体样品、固体组织样品(例如，活检标本)或组织培养物或由组织培养物得到的细胞及其后代。所述定义还包括在获取后以任何方式进行操作的样品，如通过试剂处理、增溶或富集某些组分(例如，多核苷酸)进行操作。术语“生物样品”包括临床样品，并且还包括培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物体液和组织样品。
一对序列之间的同一性百分比可以通过下述方法计算：所述序列对中的匹配数量乘以100并除以比对区域(包括空位)的长度。同一性评分仅计数完美匹配，而不考虑氨基酸之间的相似性程度。在长度中仅包括内部空位，而不包括所述序列末端的空位。同一性百分比＝(匹配×100)/比对区域(具有空位)的长度。
短语“保守氨基酸取代”指在以下组内的氨基酸残基的取代：1)L、I、M、V、F；2)R、K；3)F、Y、H、W、R；4)G、A、T、S；5)Q、N；和6)D、E。保守氨基酸取代可以通过将蛋白质中的一个或多个氨基酸用具有相似的酸度、碱度、电荷、极性或侧链大小的侧链氨基酸替代来保持蛋白质的活性。
术语“载体”指用于将蛋白质编码信息转移至宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
术语“表达载体”或“表达构建体”指适合于宿主细胞转化并且含有如下核酸序列的载体，所述核酸序列指导和/或控制(连同宿主细胞)与其操作性地连接的一个或多个异源编码区的表达。表达构建体可以包含但不限于如下序列，所述序列影响或控制转录、翻译以及(如果存在内含子)影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接。
术语“刺激”指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或在CAR的情况下，为肿瘤抗原)的结合从而介导信号转导事件(例如，但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导或经由适当的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导)而诱导的初级应答。刺激可以介导某些分子表达的改变。
术语“刺激分子”指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，所述分子提供一个或多个胞质信号传导序列，其针对免疫细胞信号传导途径的至少某个方面以刺激方式调节免疫细胞的激活。在一个方面，所述信号为初级信号，其通过例如，TCR/CD3复合物与装载肽的MHC分子的结合而启动，并且其导致介导T细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。以刺激方式发挥作用的初级胞质信号传导序列(又称“初级信号传导结构域”)可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导基序。在本发明中具有特定用途的含有ITAM的胞质传导信号序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。
术语“共刺激分子”指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，例如，但不限于增殖。共刺激分子是有助于高效免疫应答的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。
术语“自体的”指源自同一个体稍后将所述材料重新引入所述个体体内的任何材料。
如本文所用的术语，“细胞内信号传导结构域”指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生促进含CAR的细胞(例如，CAR-T细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的实例，例如，在CAR-T细胞中，包括溶细胞活性和辅助活性(包括细胞因子的分泌)。
如本文所用，术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如，参与促进免疫效应子应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞(例如，α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和髓源性吞噬细胞。
对于取代、插入或缺失的指导可以基于来自不同物种的蛋白质的氨基酸序列的比对，或来自基于具有相同或相似功能的多种蛋白质的共有序列实现。
具体实施方式
本发明提供了可作为多特异性抗体的抗ABCG2抗体，所述多特异性抗体可同时靶向ABCG2和肿瘤相关抗原(TAA)，还提供了包含或编码所述多特异性抗体的药物组合物、核酸、重组表达载体、细胞和试剂盒。所述多特异性抗体包括包含ABCG2抗原结合位点的共同可变轻(VL)链、包含ABCG2抗原结合位点的第一可变重(VH)链、以及包含TAA抗原结合位点的第二VH链或包含ABCG2抗原结合位点的第一VH链和第一VL链，以及包含TAA抗原结合位点的第二VH链和第二VL链，其中所述第一和第二VL链不同。本发明还提供了治疗癌症受试者的方法，所述方法包括向受试者施用靶向ABCG2和TAA的多特异性抗体。治疗可能涉及单独施用多特异性抗体，或多特异性抗体和化学治疗剂联合施用。本发明还提供了产生所述多特异性抗体以及与其相关的试剂的方法，包括在主题方法中有用的经基因修饰的细胞系以及制备此类经基因修饰的细胞系的方法。
本文提供的双特异性抗体与表达ABCG2和TAA的癌细胞结合，同时显示与表达ABCG2和/或TAA的非癌细胞的结合减少。换言之，本文提供的双特异性抗体以低亲和力与(1)低表达或不表达ABCG2的表达TAA的细胞结合；以及(2)低表达或不表达TAA的表达ABCG2的细胞结合，并且以高低亲和力与以较高水平(即高于正常细胞的水平)表达至少一种或两种ABCG2和TAA的癌细胞结合。
因为此类实施方案可能会发生变化，在更详细地描述本发明之前，应当理解本发明并不限于所描述的特定实施方案。还应当理解本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
如果提供数值范围，则应当理解除非上下文另有明确规定近似到下限值单位的十分之一，否则在所述范围的上限值与下限值之间的每个中间值以及所陈述范围内的任何其他所陈述的或中间值均包括在本发明内。在受所陈述的范围内任何确切排除的限值的约束下，这些较小范围的上限和下限均可以独立地包括在较小的范围内，并且同样包含在本发明内。如果所陈述的范围包括一个或两个限值，则排除其所包括的限值中的任一个或两个限值的范围也包括在本发明中。
某些范围在本文中通过前面带有术语“约”的数值呈现。术语“约”在本文中用于为了对其后的精确数值以及接近或近似于所述术语后的数值提供字面支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举数字可能是在其出现的上下文中提供具体列举的数字的基本等效形式的数字。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中同样可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但其目前用于描述代表性的说明性方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用而并入本文，每个单独的出版物或专利均被视作具体和单独地通过引用并入本文，并且通过引用并入本文以公开和描述出版物所引用的相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前公开的内容，并且不应被解释为承认本申请的权利要求不具有通过在先的发明而早于该出版物的权利。此外，在此提供的出版日期可能与实际出版日期不同，实际出版日期可能需要独立确认。
应注意，除非上下文另有明确规定，否则如在本文以及在所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数形式。还应当注意，可以起草权利要求以排除任何任选要素。因此，本声明旨在作为结合权利要求要素的叙述使用的诸如“唯一地”、“仅”等排他性术语或使用“否定型”限制的先行基础。
本公开内容对于本领域技术人员而言将显而易见，本文描述和图示的每个单独实施方案具有单独的组件和特征，所述组件和特征可以在不偏离本发明范围或精神的情况下与任何其他实施方案的特征分离或组合。任何列举的方法均可以依照所列举的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序执行。
虽然出于语法流畅和功能性解释目的，已经或即将对所述方法和组合物进行描述，然而应当明确理解，除非依照《美国法典》第35卷第112(f)条明确制定，否则其不应被解释为通过构建“手段”或“步骤”限制以任何方式进行必然限制，而应被赋予权利要求所提供定义的含义和在等同物的司法原则下的等同物的全部范围，并且如果根据《美国法典》第35卷第112(f)条明确地制定权利要求，权利要求应被赋予根据《美国法典》第35卷第112(f)条的全部法定等同物。
抗体
双特异性抗体
本公开提供了一种结合多药耐药蛋白1(ABCG2)和肿瘤相关抗原(TAA)的双特异性抗体分子，所述抗体分子包括两条相同的可变轻链(VL)、一条第一可变重链(VH)和一条第二VH链，其中所述VL链各自包括ABCG2的抗原结合位点，所述第一VH链包括ABCG2的抗原结合位点，并且所述第二VH链包括TAA的抗原结合位点，并且其中所述第二VH链与其中一条轻链或包括ABCG2抗原结合位点的第一VH链和第一VL链配对，以及与包括TAA抗原结合位点的第二VH链和第二VL链配对时结合TAA，其中所述第一和第二VL链具有不同序列。本文提供的双特异性抗体分子与表达ABCG2和TAA的癌细胞结合，同时显示与表达ABCG2和/或TAA的非癌细胞的结合减少。换言之，本文提供的双特异性抗体以低亲和力与(1)低表达或不表达ABCG2的表达TAA的细胞结合；以及(2)低表达或不表达TAA的表达ABCG2的细胞结合，并且以高低亲和力与以较高水平(即高于正常细胞的水平)表达至少一种或两种ABCG2和TAA的癌细胞结合。
较高水平指在与癌细胞相同类型的正常细胞中的表达水平的至少1.5倍(例如，至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或更高)。亲和力降低指与抗体分子与癌细胞相同类型的正常细胞的结合相比，亲和力降低至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更多)。亲和力降低也包括缺乏可检测的结合。
术语“抗体分子”涵盖本文定义的抗体并且包括其抗原结合片段。在某些方面，抗体分子包括两条可变轻链(VL)以及两条可变重链(VH)。在某些方面，抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区和轻链恒定区可以来自人抗体，例如，人IgGl抗体。抗体分子可以修饰人IgGl抗体重链(HC)恒定区，以包含能够降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的突变。此外，或可替代性地，可以将两条VH链分别偶联至不同的人IgGl HC恒定区，其中单个IgGl HC恒定区具有有利于在不同的人IgGl HC恒定区之间形成二聚体的取代。本文将对HC区进行进一步详细描述。在某些方面，当抗体分子是双特异性抗体分子时，其中一个人IgGlHC恒定区可包括引入一个或多个具有带正电荷侧链的氨基酸的取代，并且另一个人IgGlHC恒定区可以包括引入一个或多个具有负电荷侧链的氨基酸的取代，以促进两个不同HC之间二聚体的形成。
在某些方面，两条VL链的所述抗原结合位点由具有如下序列的一条VL链的轻链CDR(LCDR 1-3)组成：
DIVLTQSPSSFSVSLGDRVTISCKASGYILNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGFPSRFSGTGSGKDYTLSISSLQTEDVGTYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIR(SEQ ID NO:1)。
SEQ ID NO：1所示的VL链氨基酸序列为抗ABCG2抗体5D3的VL链序列。
在某些方面，可以按照Kabat命名法定义CDR的VL和VH轻链。
在某些方面，i)所述LCDR1包括序列：KASGYILNRLA(SEQ ID NO:2)；(ii)所述LCDR2包括序列：GATSLET(SEQ ID NO:3)；以及(iii)LCDR3包括序列：QQYWSTPWT(SEQ ID NO:4)。此类LCDR基于Kabat命名法。
在某些方面，所述两条VL链是为人源化链。在某些方面，所述两条VL链被人源化以包括源自人抗体的构架区。
在某些方面，所述两条VL链包含与以下序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的序列：
DIVLTQSPSSFSVSLGDRVTISCKASGYILNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGFPSRFSGTGSGKDYTLSISSLQTEDVGTYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIR(SEQ ID NO:1)。
在某些方面，双特异性抗体包括包含本文所述的VL链和轻链恒定区的轻链。轻链恒定区可以为具有UniProtKB/Swiss-Prot：P01834.2中所示氨基酸序列的人免疫球蛋白κ链恒定区。
在某些方面，双特异性抗体分子包括第一VH链，其中所述VH链包含具有如下序列的VH链的重链CDR 1-3(HCDR 1-3)：
QVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYINFDGGTTYNPSLRGRISITRDTSKNQFFLQLRSVTPEDTATYYCATFYGAKGTLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:5)。
SEQ ID NO：5所示的VH链氨基酸序列为抗ABCG2抗体5D3的VH链序列。
在某些方面，可以按照Kabat命名法定义VH链的HCDR 1-3。
在某些方面，所述第一VH链包括：(i)所述HCDR1包括序列：SDYAWN(SEQ ID NO:63)；(ii)所述HCDR2包括序列：YINFDGGTTYNPSLRG(SEQ ID NO:64)；以及(iii)所述HCDR3包括序列：FYGAKGTLDY(SEQ ID NO:65)。此类HCDR基于Kabat命名法。
在某些方面，所述第一和/或第二VH链是人源化链。在某些方面，所述两条VH链被人源化以包括源自人抗体的构架区。
在某些方面，所述第一VH链包括序列：
QVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYINFD GGTTYNPSLRGRISITRDTSKNQFFLQLRSVTPEDTATYYCATFYGAKGTLDYWGQGT SVTVSS(SEQ ID NO:5)；
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYINFD GGTTYNPSLRGRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATFYGAKGTLDYWGQGT LVTVSS(SEQ ID NO:6)，或
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINFDG GTTYNPSLRGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATFYGAKGTLDYWGQGT LVTVSS(SEQ ID NO:7)。
在某些方面，第一VH链包括具有与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO：7中任何一项所述的序列的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的序列。
在某些方面，双特异性抗体包括包含本文所述的第一VH链和人IgG1重链恒定区的第一重链。
在某些方面，双特异性抗体的第二VH链源自结合TAA的单特异性抗体分子，并且与源自VH链的TAA的单特异性抗体分子的亲和力相比，其中双特异性抗体分子对TAA的亲和力至少低2倍(例如，至少低3倍、至少低4倍、至少低5倍)。采用相同的测定法测量双特异性抗体和单特异性抗体的亲和力。可使用任何合适的方法来测量抗体亲和力。在某些方面，亲和力可以通过计算抗体与抗原可逆结合的平衡常数，并且以解离常数(Kd)表示。在某些方面，可通过ELISA测量Kd。
在某些方面，双特异性抗体的第二VH链源自结合TAA的单特异性抗体分子，并且与源自VH链的TAA的单特异性抗体分子的半数最大效应浓度(EC50)相比，其中双特异性抗体分子对TAA的EC50至少高2倍(例如，至少高3倍、至少高4倍、至少高5倍)。采用相同的测定法测量双特异性抗体和单特异性抗体的EC50。可使用任何合适的方法来测量抗体的EC50。提供半数最大反应(例如，最大荧光强度的一半)的浓度被测量为EC50。
测试抗体的EC50可通过流式细胞术或ELISA确定。例如，流式细胞术可能涉及将表达抗原的细胞(例如，人类野生型ABCG2或突变型ABCG2)与流式细胞术缓冲液中的抗体接触，其中所述抗体被连续稀释，并在室温或4℃下孵育一段时间(例如，10分钟至1小时)，使抗体与细胞充分结合。孵育后，可以选择性地洗涤细胞以去除非特异性结合的抗体，和/或可以将细胞与特异性结合测试抗体的荧光标记的二抗接触。孵育后，可以去除荧光标记的二抗并洗涤细胞。可通过流式细胞术对洗涤后的细胞进行分选，并且计算与荧光标记的二抗结合的细胞数量。提供半数最大反应(例如，最大荧光强度的一半)的浓度被测量为EC50。在流式细胞术测定的变体中，细胞可以为过度表达ABCG2的293T细胞。
TAA可以为已知在癌症细胞中过度表达的任何抗原。例如，TAA可能为一种在正常细胞中未以可检测水平表达而在癌细胞中表达的抗原，其中正常细胞和癌细胞为相同的细胞类型(例如，上皮细胞)。新抗原是一类由肿瘤特异性突变产生的肿瘤抗原，与未突变蛋白质的氨基酸序列相比，肿瘤特异性突变改变了编码蛋白质的氨基酸序列。在其他方面，TAA是在正常细胞中表达但在癌细胞中以更高水平表达的抗原。在某些方面，TAA可能为CD47、ErbB1、ErbB2或PD-L1。
抗ABCG2或抗CD47双特异性抗体
在某些方面，双特异性抗体分子与CD47结合，并且第二VH链包括包含如下氨基酸序列的VH链的HCDR：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIY PGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)。
SEQ ID NO：8所示的VH链氨基酸序列为抗CD47抗体5F9的VH链序列。
在某些方面，所述第二VH链包括包含如下序列的HCDR1：NYNMH(SEQ ID NO:9)，所述HCDR2包括序列：TIYPGNDDTSYNQKFKD(SEQ ID NO:10)，并且所述HCDR3包括序列：GGYRAMDY(SEQ ID NO:11)。按照Kabat命名法定义HCDR 1-3。
在某些方面，所述第二VH链包括具有与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同或100％相同)的氨基酸序列。
在某些方面，双特异性抗体包括第一VH链和第一VL链，以及第二VH和第二VL链，其中所述第一VH和VL链与ABCG2结合，并且所述第二VH和VL链与CD47结合。第一VH链和VL链可以如上节所述，其中所述共同轻链为如前文所述的第一VL链和所述第二VH链，并且所述第二VL链可以为由抗CD47抗体的VL链的LCDR 1-3构成的VL链。在某些方面，双特异性抗体包括包含分别具有SEQ ID No:63-65所示氨基酸序列的HCDR 1-3的第一VH链，并且包括包含分别具有SEQ ID No:2-4所示氨基酸序列的LCDR 1-3的第一VL链，并且包括包含分别具有SEQ ID No:9-11所示氨基酸序列的HCDR 1-3的第二VH链，并且包括具有SEQ ID No:60所示氨基酸序列的VL链的LCDR1-3的第二VL链。
双特异性抗体的其他方面在本申请其他部分的描述，并且包括本文公开的序列的人源化形式和/或Fc区对第一和第二VH链之间的异二聚体的启动子形成的取代。
抗ABCG2或抗ErbB2双特异性抗体
在某些方面，TAA可能为ErbB2。ErbB2又称为受体酪氨酸激酶2或HER2。在某些方面，与ABCG2和ErbB2结合的双特异性抗体分子包括前面章节所述的共同轻链和第一VH链，并且第二VH链包括包含如下氨基酸序列的mAb帕妥珠单抗的VH链的HCDR 1-3：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNP NSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)。
按照Kabat命名法定义的HCDR 1-3如下：
HCDR1:DYTMD(SEQ ID NO:13)
HCDR2:DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO:14)
HCDR3:NLGPSFYFDY(SEQ ID NO:15)。
与ABCG2和ErbB2结合的双特异性抗体的第二VH链可包括与具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％相同的氨基酸序列。
与ABCG2和ErbB2结合的双特异性抗体的第二VH链可以存在于具有与如下氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列的重链中：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:16)。
如本文其他部分所述，所述VL链、所述第一VH链和所述第二VH链中的至少一条、两条或所有均可人源化。此外，VH链的Fc区可以包括取代，以增强第一和第二VH链之间的异二聚体化。在某些方面，第一重链可人源化并且包括带电对取代K392D和K409D，并且所述第二重链可以包括带电对取代E356K和D399K。
在某些方面，双特异性抗体包括第一VH链和第一VL链，以及第二VH和第二VL链，其中所述第一VH和VL链与ABCG2结合，并且所述第二VH和VL链与HER2结合。第一VH链和VL链可以如上节所述，其中所述共同轻链为如前文所述的第一VL链和所述第二VH链，并且所述第二VL链可以为由抗HER2抗体的VL链的LCDR 1-3构成的VL链。
抗ABCG2或抗EGFR双特异性抗体
在某些方面，TAA可以为表皮生长因子受体(EGFR)。EGFR又称为受体酪氨酸-蛋白激酶ErbB1和HER1。包括EGFR抗原结合位点的第二VH链的HCDR 1-3可能源自抗EGFR抗体耐昔妥珠单抗或西妥昔单抗。耐昔妥珠单抗的重链具有如下序列：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:17)。
西妥昔单抗的重链具有如下序列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:18)。
在第一个方面，抗ABCG2抗EGFR双特异性抗体包括前面章节所述的VL链和第一VH链，并且第二VH链可以包括源自耐昔妥珠单抗的VH区的HCDR。按照Kabat命名法定义的HCDR可具有如下序列：
HCDR1:SGDYYWS(SEQ ID NO:19)
HCDR2:YIYYSGSTDYNPSLKS(SEQ ID NO:20)
HCDR3:VSIFGVGTFDY(SEQ ID NO:21)。
在某些方面，第二VH链可具有与下述氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:22)。
与ABCG2和EGFR结合的双特异性抗体的第二VH链可以存在于具有与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列的重链中。
在第二个方面，抗ABCG2抗EGFR双特异性抗体包括前面章节所述的VL链和第一VH链，并且第二VH链可以包括源自西妥昔单抗的VH区的HCDR。按照Kabat命名法定义的HCDR可具有如下序列：
HCDR1:NYGVH(SEQ ID NO:23)
HCDR2:VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO:24)
HCDR3:ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:25)
在某些方面，第二VH链可具有与下述氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:26)
与ABCG2和EGFR结合的双特异性抗体的第二VH链可以存在于具有与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列的重链中。
在某些方面，双特异性抗体包括第一VH链和第一VL链，以及第二VH和第二VL链，其中所述第一VH和VL链与ABCG2结合，并且所述第二VH和VL链与EGFR结合。第一VH链和VL链可以如上节所述，其中所述共同轻链为如前文所述的第一VL链和所述第二VH链，并且所述第二VL链可以为由抗EGFR抗体的VL链的LCDR 1-3构成的VL链。
抗ABCG2或抗PD-L1双特异性抗体
在某些方面，TAA可能为程序性死亡-配体1(PD-L1)。PD-L1又称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)。在某些方面，与ABCG2和PD-L1结合的双特异性抗体分子包括前面章节所述的共同轻链和第一VH链，并且第二VH链包括包含如下氨基酸序列的VH链的HCDR 1-3：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)
按照Kabat命名法定义的HCDR 1-3如下：
HCDR1:DSWIH(SEQ ID NO:28)
HCDR2:WISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:29)
HCDR3:RHWPGGFDY(SEQ ID NO:30)
与ABCG2和PD-L1结合的双特异性抗体的第二VH链可包括与具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％相同的氨基酸序列。
与ABCG2和PD-L1结合的双特异性抗体的第二VH链可以存在于具有与如下氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列的重链中：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:31)。
在某些方面，双特异性抗体包括第一VH链和第一VL链，以及第二VH和第二VL链，其中所述第一VH和VL链与ABCG2结合，并且所述第二VH和VL链与PD-L1结合。第一VH链和VL链可以如上节所述，其中所述共同轻链为如前文所述的第一VL链和所述第二VH链，并且所述第二VL链可以为由抗PD-L1抗体的VL链的LCDR 1-3构成的VL链。
如本文其他部分所述，所述VL链(或所述第一和第二VL链)、所述第一VH链和所述第二VH链中的至少一条、两条或所有均可人源化。此外，VH链的Fc区可以包括取代，以增强第一和第二VH链之间的异二聚体化。在某些方面，所述第一重链可人源化。
所述第一HC可包括带电对取代K392D和K409D，并且所述第二重链可以包括带电对取代E356K和D399K，反之亦然。
在某些方面，双特异性抗体包括包含本文所述的第二VH链和重链恒定区的第二重链。重链可包含人IgG1重链恒定区序列。
在某些方面，双特异性抗体分子特异性地结合表达ABCG2和TAA的细胞，并且与表达ABCG2或TAA的细胞相比，双特异性抗体分子对表达ABCG2和TAA的细胞的亲和力大于两倍。
在某些方面，如果与表达ABCG2的细胞结合，双特异性抗体分子能抑制ABCG2的外排。与不存在双特异性抗体时ABCG2的外排相比，抑制可将外排减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％，或更多。。
在某些方面，双特异性抗体分子包括已被修饰以减少或消除抗体与一种或多种Fcγ受体结合的Fc结构域。在某些方面，IgGl Fc结构域可以具有一个或多个取代L234A、L235A、P329G和N297A/Q/G。
如前文所述，本公开提供了具有靶向细胞外排泵的结构域和靶向癌症相关抗原的结构域的多特异性抗体。本公开包括多特异性抗体，所述抗体包括多药耐药蛋白1(ABCG2)结合域和白细胞表面抗原CD47结合域。本公开的此类多特异性抗体特异性地结合表达ABCG2和CD47的细胞。
在一个方面，本公开的多特异性抗体靶向ABCG2和CD47。ABCG2(又称CD388和BCRP)是一种能量依赖性外排泵，其负责减少多药性细胞中的药物积累，并且由ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)基因表达。CD47(又称整联素关联蛋白(IAP))是一种免疫球蛋白超家族跨膜蛋白，可结合膜整合素，也可作为配体血栓反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα)的受体，并且由CD47基因编码。CD47配体结合可以抑制吞噬作用，因此，作为免疫治疗的靶点，掩蔽CD47细胞外结构域可以抑制CD47表达癌细胞的免疫介导杀伤。
本公开的多特异性抗体包括ABCG2结合结构域和CD47结合结构域，且可选地，包括全部或部分Fc结构域。如果存在表达ABCG2的细胞，但是CD47表达低或不表达，则多特异性抗体对细胞具有低亲和力。相应地，如果存在表达CD47的细胞，但是ABCG2表达低或不表达，多特异性抗体对细胞具有低亲和力。然而，如果存在表达ABCG2和CD47的细胞，则多特异性抗体对细胞具有高亲和力。
因此，与仅表达ABCG2或CD47的细胞相比，本公开的多特异性抗体结合同时表达ABCG2和CD47的细胞具有更高的亲和力。相应地，如果存在低水平的相应第二靶点时，例如与存在低水平以上的第一和第二靶点(例如，平均、正常、和/或高水平)相比，本公开的多特异性抗体结合的亲和力大大降低。在一些实施方案中，与主题多特异性抗体结合表达ABCG2或CD47的细胞(或低水平的ABCG2或CD47)的亲和力相比。主题多特异性抗体同时结合表达ABCG2和CD47细胞的亲和力高两倍，包括例如，高2.5倍、高3倍、高4倍、高5倍、高6倍、高7倍、高8倍、高9倍、高10倍或更高。
在一些实施方案中，如果与表达ABCG2的细胞结合，所述主题多特异性抗体可阻止细胞ABCG2蛋白的功能。因此，本公开的多特异性抗体可以抑制ABCG2蛋白外排，包括例如，其中外排减少5％或更多，包括例如，与不存在所述主题多特异性抗体时ABCG2蛋白外排相比，减少10％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多。
在一些实施方案中，如果与表达CD47的细胞结合，所述主题多特异性抗体可阻止细胞CD47蛋白的功能。本公开的多特异性抗体可以抑制CD47-配体或CD47结合配偶体与CD47的结合，包括例如配体/结合配偶体结合减少5％或更多，包括例如，与不存在所述主题多特异性抗体时CD47的集合相比，减少10％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多。
本公开的多特异性抗体至少对ABCG2和CD47是双特异性的，其中所述抗体的构型可以不同。术语“抗体”指包含一个或多个(例如，一个或两个)重链可变区(VH)和/或一个或多个(例如，一个或两个)轻链可变区(VL)，或其能够结合表位的亚片段。
就本文所述的多特异性抗体而言，此类抗体能够结合存在于两种不同靶蛋白上的至少两种不同表位。由主题多特异性抗体结合的不同靶蛋白的数量可能不尽相同，不同表位的数量也因此而不同，并且可以是两个(即双特异性)、三个(三特异性)、四个或更多。
在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体可以包括一条共同轻链。如本文所用，术语“共同轻链”一般指将相同轻链的两份拷贝使用和并入多特异性抗体中。换言之，在组装的多特异性抗体中，一条轻链将与ABCG2特异性重链结合，而同一条轻链的第二份拷贝将与CD-47特异性重链结合。
VH和VL区可以进一步细分为被称为“互补决定区(CDR)”的超变区，其散布在被称为“框架区”(FR)的更保守区域中。FR和CDR的范围已被精确地界定(参加Kabat等人,(1991)《具有免疫学意义的蛋白质的序列》，第五版，美国国立卫生研究院出版物91-3242；Chothia等人，(1987)《分子生物学杂志》196:901-917)。VH可包括三个CDR和四个FR，从N-端到C-端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。同样地，VL可包括三个CDR和四个FR，从N-端到C-端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体的VH或VL链可进一步包括全部或部分重链或轻链恒定区，从而分别形成重链或轻链免疫球蛋白。在一个实施方案中，抗体为两条重链和两条轻链的四聚体，其中所述重链和轻链通过例如，二硫键，相互连接。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。轻链恒定区由一个结构域(CL)构成。重链可变区和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合区。抗体的恒定区通常介导抗体对宿主组织和因子(包括免疫系统的各种细胞和补体系统的第一组分)的结合。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM类型的免疫球蛋白及其亚型。在一些实施方案中，主题抗体为IgG同种型抗体。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”指包括实质上由免疫球蛋白基因编码的一条或多条多肽组成的蛋白质。公认的人类免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及许多免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链(约25kD或214个氨基酸)由N端的可变区基因(约110个氨基酸)以及C端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白重链(约50kD或446个氨基酸)由N端的可变区基因(约116个氨基酸)和C端其他前述恒定区基因之一编码，例如，γ(编码约330个氨基酸)。在一些实施方案中，主题抗体包括全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链。
在一些实施方案中，主题抗体不包括全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链，而是包含一条或多条全长免疫球蛋白重链的结合片段和/或一条全长免疫球蛋白轻链的一个或多个抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段包含在单独的多肽链上；在其他实施方案中，抗原结合片段包含在单个多肽链中。
术语“抗原结合片段”指能够特异性结合前文所述的ABCG2或CD47的全长抗体的一个或多个片段。结合片段的实例包括：(i)Fab片段(单价片段，例如，包括由VL、VH、CL和CH1结构域组成)；(ii)F(ab')2片段(包含两个由二硫键在铰链区连接的Fab片段的组成的二价片段)；(iii)Fd片段(例如，包括由VH结构域和CH1结构域组成)；(iv)Fv片段(例如，包括由抗体单臂的VH结构域和VL结构域组成)；(v)dAb片段(例如，包括由VH结构域组成)；(vi)孤立的CDR；(vii)单链Fv(scFv)(例如，包括由使用重组方法通过合成连接子连接的抗体单臂的VH结构域和VL结构域组成，以使VH结构域和VL结构域配对形成单价分子)；(viii)双抗体(例如，包括由两个scFv组成，其中VH结构域和VL结构域被连接在一起，不允许其配对形成单价分子；每个scFv的VH与另一个scFv的VL结构域配对，形成一个二价分子)。
在一些方面，主题抗体是重组型抗体或修饰型抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体、去免疫化抗体或体外生成的抗体。本文所使用的术语“重组型”或“修饰型”抗体旨在包括通过重组方式制备、表达、创建或分离的所有抗体，例如，(i)使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；(ii)从重组、组合抗体库中分离的抗体；(iii)从人类免疫球蛋白基因转基因动物(例如，小鼠)身上分离的抗体；或(iv)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列剪接的任何其他方式制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组型抗体包括人源化抗体、CDR移植抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体和体外生成的抗体，并且此类重组型抗体可以选择性地包括源自人种系免疫球蛋白序列的恒定区。
修饰型抗体可包括修饰型的结构域，包括任何抗体结构域可以从自然发生的形式中修饰的结构域。在一些实施方案中，修饰型抗体可包括修饰型重链，包括修饰型Fc结构域、包括修饰型CH2和/或修饰型CH3结构域。在一些情况下，修饰型Fc结构域可以利用静电转向效应，包括但不限于例如，通过使用Gunasekeran等人，(2010)《生物化学杂志》285，19637-19646中描述的程序；所述公开内容通过本发明的整体引用，构成本发明的一部分。在一些情况下，双特异性抗体是通过CH3结构域的电荷对取代组装的，包括但不限于例如，其中一条重链被修饰以包含K392D和K409D取代，并且另一条重链被修饰以包含E356K和D399K取代。电荷对取代的链可以优先彼此形成异二聚体。氨基酸替换的编号按欧盟HC编号系统确定。
在一些情况下，本公开的抗体包括电荷对取代。在一些情况下，本公开的抗体不包括电荷对取代。在一些情况下，可以采用促进所需链的优先异二聚体形成的替代方法。
在一些情况下，修饰型重链可包括杵臼结构(Knob-into-hole)修饰。“杵臼结构”的氨基酸修饰是抗体工程中的一种合理设计技术，用于在生产多特异性抗体(包括双特异性IgG抗体)时重链的异源二聚体化。例如，在将“杵臼结构”技术纳入由两种不同特异性的单克隆抗体制成的双特异性抗体时，氨基酸的变化被设计成在单克隆抗体1(mAb1)的重链CH3上创建一个“杵”，而在单克隆抗体2(mAb2)重链CH3上创建一个“臼”。杵可以用大氨基酸(例如，酪氨酸(Y)表示，而臼则可以用小氨基酸(例如，苏氨酸(T)表示。例如，可以在第一个CH3结构域中创建一个T22Y取代，并且在伙伴CH3结构域中创建一个Y86T取代，从而创建一个杵臼结构对修饰。杵臼结构修饰的实例在Carter，《免疫法杂志》，248(1-2):7-15(2001)；Ridgway,J.B.等人《蛋白质工程》9(7):617-2(1996)；以及Merchant，A.M.等人《自然生物科技》16(7):677-81(1998)中均有描述；所述实例的公开内容整体并入本文。在由成对的杵臼结构修饰型结构域生成的抗体中，双特异性异二聚体通常代表主要部分。
如前文所述，本公开的多特异性抗体将包括ABCG2结合结构域和CD47结合结构域。此类结构域可能不尽相同，包括结构域结合的表位、可变区域排列和序列等。
主题ABCG2结合结构域特异性地结合ABCG2的一个或多个表位。因此，所述表位为ABCG2表位。ABCG2结合结构域结合的ABCG2表位的大小可能会不尽相同，包括由具有连续延伸的ABCG2序列的多肽形成的所述ABCG2表位，所述大小范围可以从4aa或更小至12aa或更大，包括但不限于例如，4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、4aa至10aa、5aa至10aa、6aa至10aa、4aa至8aa、5aa至8aa、6aa至8aa等等。
在一些实施方案中，所述ABCG2表位可由一个多肽形成，而所述多肽具有与连续延伸的ABCG2序列(包括但不限于，例如，人ABCG2序列)的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列：
MSSSNVEVFIPVSQGNTNGFPATASNDLKAFTEGAVLSFHNICYRVKLKSGFLPCRKPVEKEILSNINGIMKPGLNAILGPTGGGKSSLLDVLAARKDPSGLSGDVLINGAPRPANFKCNSGYVVQDDVVMGTLTVRENLQFSAALRLATTMTNHEKNERINRVIQELGLDKVADSKVGTQFIRGVSGGERKRTSIGMELITDPSILFLDEPTTGLDSSTANAVLLLLKRMSKQGRTIIFSIHQPRYSIFKLFDSLTLLASGRLMFHGPAQEALGYFESAGYHCEAYNNPADFFLDIINGDSTAVALNREEDFKATEIIEPSKQDKPLIEKLAEIYVNSSFYKETKAELHQLSGGEKKKKITVFKEISYTTSFCHQLRWVSKRSFKNLLGNPQASIAQIIVTVVLGLVIGAIYFGLKNDSTGIQNRAGVLFFLTTNQCFSSVSAVELFVVEKKLFIHEYISGYYRVSSYFLGKLLSDLLPMRMLPSIIFTCIVYFMLGLKPKADAFFVMMFTLMMVAYSASSMALAIAAGQSVVSVATLLMTICFVFMMIFSGLLVNLTTIASWLSWLQYFSIPRYGFTALQHNEFLGQNFCPGLNATGNNPCNYATCTGEEYLVKQGIDLSPWGLWKNHVALACMIVIFLTIAYLKLLFLKKYS(SEQ ID NO:32)，或其ECD1(417–428):KNDSTGIQNRAG(SEQ ID NO:33)；其ECD2(499–506)：LKPKADAF(SEQ ID NO:34)；其ECD3(557–630)：
NLTTIASWLSWLQYFSIPRYGFTALQHNEFLGQNFCPGLNATGNNPCNYATCTGEEYLVKQGIDLSPWGLWKNH(SEQ ID NO:35)，或小鼠ABCG2序列：
MSSSNDHVLVPMSQRNNNGLPRTNSRAVRTLAEGDVLSFHHITYRVKVKSGFLVRKTVEKEILSDINGIMKPGLNAILGPTGGGKSSLLDVLAARKDPKGLSGDVLINGAPQPAHFKCCSGYVVQDDVVMGTLTVRENLQFSAALRLPTTMKNHEKNERINTIIKELGLEKVADSKVGTQFIRGISGGERKRTSIGMELITDPSILFLDEPTTGLDSSTANAVLLLLKRMSKQGRTIIFSIHQPRYSIFKLFDSLTLLASGKLVFHGPAQKALEYFASAGYHCEPYNNPADFFLDVINGDSSAVMLNREEQDNEANKTEEPSKGEKPVIENLSEFYINSAIYGETKAELDQLPGAQEKKGTSAFKEPVYVTSFCHQLRWIARRSFKNLLGNPQASVAQLIVTVILGLIIGAIYFDLKYDAAGMQNRAGVLFFLTTNQCFSSVSAVELFVVEKKLFIHEYISGYYRVSSYFFGKVMSDLLPMRFLPSVIFTCVLYFMLGLKKTVDAFFIMMFTLIMVAYTASSMALAIATGQSVVSVATLLMTIAFVFMMLFSGLLVNLRTIGPWLSWLQYFSIPRYGFTALQYNEFLGQEFCPGFNVTDNSTCVNSYAICTGNEYLINQGIELSPWGLWKNHVALACMIIIFLTIAYLKLLFLKKYS(SEQ ID NO:36)，或其ECD1(415–428)：DLKYDAAGMQNRAG(SEQ ID NO:37)；其ECD2(499–506)：LKKTVDAF(SEQ IDNO:38)；其ECD2(557–632)：NLRTIGPWLSWLQYFSIPRYGFTALQYNEFLGQEFCPGFNVTDNSTCVNSYAICTGNEY LINQGIELSPWGLWKNH(SEQ ID NO:39)；非人灵长类动物，例如，食蟹猴(Macacafascicularis)序列；
MSSSNVEVFIPMSQENTNGFPTTTSNDRKAFTEGAVLSFHNICYRVKVKSGFLPGRKPV
EKEILSNINGIMKPGLNAILGPTGGGKSSLLDVLAARKDPSGLSGDVLINGALRPTNFK
CNSGYVVQDDVVMGTLTVRENLQFSAALRLPTTMTNHEKNERINRVIQELGLDKVAD
SKVGTQFIRGVSGGERKRTSIGMELITDPSILFLDEPTTGLDSSTANAVLLLLKRMSKQG
RTIIFSIHQPRYSIFKLFDSLTLLASGRLMFHGPAQEALGYFESAGYHCEAYNNPADFFL
DIINGDSTAVALNREEDFKATEIIEPSKRDKPLVEKLAEIYVDSSFYKETKAELHQLSGG
EKKKKITVFKEISYTTSFCHQLRWVSKRSFKNLLGNPQASIAQIIVTVILGLVIGAIYFGL
NNDSTGIQNRAGVLFFLTTNQCFSSVSAVELFVVEKKLFIHEYISGYYRVSSYFFGKLLS
DLLPMRMLPSIIFTCIVYFMLGLKPTADAFFIMMFTLMMVAYSASSMALAIAAGQSVV
SVATLLMTICFVFMMIFSGLLVNLTTIASWLSWLQYFSIPRYGFTALQHNEFLGQNFCP
GLNATVNNTCNYATCTGEEYLTKQGIDLSPWGLWKNHVALACMIVIFLTIAYLKLLFLKKYS(SEQ IDNO:40)，或其ECD1(417–428)：NNDSTGIQNRAG(SEQ ID NO:41)；其ECD2(499–506)：LKPTADAF(SEQ ID NO:42)；其ECD3(557–630)：NLTTIASWLSWLQYFSIPRYGFTALQHNEFLGQNFCPGLNATVNNTCNYATCTGEEYL TKQGIDLSPWGLWKNH(SEQ ID NO:43)，或黑猩猩ABCG2序列：MSSSNVEVFIPMSQGNTNGFPATTSNDLKAFTEGAVLSFHNICYRVKLKSGFLPCRKPVEKEILSNINGIMKPGLNAILGPTGGGKSSLLDVLAARKDPSGLSGDVLINGAPRPANFKCNSGYVVQDDVVMGTLTVRENLQFSAALRLPTTMTNHEKNERINRVIQELGLDKVADSKVGTQFIRGVSGGERKRTSIGMELITDPSILFLDEPTTGLDSSTANAVLLLLKRMSKQGRTIIFSIHQPRYSIFKLFDSLTLLASGRLMFHGPAQEALGYFESAGYHCEAYNNPADFFLDIINGDSTAVALNREEDFKATEIIEPSKQDKPLIEKLAEIYVNSSFYKETKAELHQLSGGEKKKKITVFKEISYTTSFCHQLRWVSKRSFKNLLGNPQASIAQIIVTVILGLVIGAIYFGLKNDSTGIQNRAGVLFFLTTNQCFSSVSAVELFVVEKKLFIHEYISGYYRVSSYFLGKLLSDLLPMRMLPSIIFTCIVYFMLGLKPKADAFFVMMFTLMMVAYSASSMALAIAAGQSVVSVATLLMTICFVFMMIFSGLLVNLTTIASWLSWLQYFSIPRYGFTALQHNEFLGQNFCPGLNATGNNPCNYATCTGEEYLVKQGIDLSPWGLWKNHVALACMIVIFLTIAYLKLLFLKKYS(SEQ ID NO:44)，或等等。
在一些实施方案中，ABCG2表位可以由突变的ABCG2多肽形成。突变的ABCG2多肽可能源自人ABCG2多肽。人ABCG2多肽可包括导致ABCG2多肽具有开放构型的突变。具有开放构型的突变的人ABCG2多肽可包括取代：E211Q，参考本文提供的人ABCG2多肽的序列编号。在某些方面，具有开放构型的突变的人ABCG2多肽可包括至少80％(例如，至少85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％)与氨基酸序列相同的氨基酸序列：MSSSNVEVFIPVSQGNTNGFPATASNDLKAFTEGAVLSFHNICYRVKLKSGFLPCRKPVEKEILSNINGIMKPGLNAILGPTGGGKSSLLDVLAARKDPSGLSGDVLINGAPRPANFKCNSGYVVQDDVVMGTLTVRENLQFSAALRLATTMTNHEKNERINRVIQELGLDKVADSKVGTQFIRGVSGGERKRTSIGMELITDPSILFLDQPTTGLDSSTANAVLLLLKRMSKQGRTIIFSIHQPRYSIFKLFDSLTLLASGRLMFHGPAQEALGYFESAGYHCEAYNNPADFFLDIINGDSTAVALNREEDFKATEIIEPSKQDKPLIEKLAEIYVNSSFYKETKAELHQLSGGEKKKKITVFKEISYTTSFCHQLRWVSKRSFKNLLGNPQASIAQIIVTVVLGLVIGAIYFGLKNDSTGIQNRAGVLFFLTTNQCFSSVSAVELFVVEKKLFIHEYISGYYRVSSYFLGKLLSDLLPMRMLPSIIFTCIVYFMLGLKPKADAFFVMMFTLMMVAYSASSMALAIAAGQSVVSVATLLMTICFVFMMIFSGLLVNLTTIASWLSWLQYFSIPRYGFTALQHNEFLGQNFCPGLNATGNNPCNYATCTGEEYLVKQGIDLSPWGLWKNHVALACMIVIFLTIAYLKLLFLKKYS(SEQ ID NO:45)，或者等等。
主题ABCG2结合结构域表现出对ABCG2的高亲和力结合。例如，主题ABCG2结合结构域与ABCG2结合的亲和力至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、至少约10-10M、至少约10- 11M、至少约10-12M或高于10-12M。主题ABCG2结合结构域与ABCG2上存在的表位结合的亲和力为从约10-7M至约10-8M、从约10-8M至约10-9M、从约10-9M至约10-10M、从约10-10M至约10-11M、从约10-11M至约10-12M，或高于10-12M。
主题ABCG2结合结构域基本上不会与其他相关但序列不同的蛋白质(例如，相关但序列不同的EP)内的氨基酸形成的任何表位结合。主题ABCG2结合结构域与相关但序列不同的蛋白质内的氨基酸形成的表位的任何结合通常是非特异性结合，其亲和力显著低于ABCG2结合结构域与ABCG2上的表位的特异性结合的亲和力。显著更低的亲和力通常指至少低两倍、三倍、五倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍的亲和力。
主题ABCG2结合结构域可以减少通过ABCG2转运体的分子转运。例如，与不存在ABCG2结合结构域时的转运程度相比，主题ABCG2结合结构域可以减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％，或更多的转运。
主题CD-47结合结构域特异性地结合CD47的一个或多个表位。因此，所述表位是CD47表位。CD47结合结构域结合的CD47表位的大小可能会不尽相同，包括由具有连续延伸的CD47序列的多肽形成的所述CD47表位，所述大小范围可以从4aa或更小至12aa或更大，包括但不限于例如，4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、4aa至10aa、5aa至10aa、6aa至10aa、4aa至8aa、5aa至8aa、6aa至8aa等等。
在一些实施方案中，所述CD47表位可由一个多肽形成，而所述多肽具有与连续延伸的CD47序列(包括但不限于，例如，人CD47序列)的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列：
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE(SEQ ID NO:46)；或啮齿动物CD47序列，例如，小鼠CD47序列：
MWPLAAALLLGSCCCGSAQLLFSNVNSIEFTSCNETVVIPCIVRNVEAQSTEEMFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDAMVGNYTCEVTELSREGKTVIELKNRTVSWFSPNEKILIVIFPILAILLFWGKFGILTLKYKSSHTNKRIILLLVAGLVLTVIVVVGAILLIPGEKPVKNASGLGLIVISTGILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYVLALVGLCLCIMACEPVHGPLLISGLGIIALAELLGLVYMKFVASNQRTIQPPRNR(SEQ ID NO:47),或非人灵长类动物，例如，苏门答腊猩猩(Pongo abelii)序列；MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLIITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLNSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE(SEQ ID NO:48)，或普通猕猴(Macaca mulatta)序列：MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTAPANFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLMITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE(SEQ ID NO:49)，或者等等。
主题CD47结合结构域表现出对CD47的高亲和力结合。例如，主题CD47结合结构域与CD47结合的亲和力至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或高于10-12M。主题CD47结合结构域与CD47上存在的表位结合的亲和力为从约10-7M至约10-8M、从约10-8M至约10-9M、从约10-9M至约10-10M、从约10-10M至约10-11M、从约10- 11M至约10-12M，或高于10-12M。
主题CD47结合结构域基本上不会与其他相关但序列不同的蛋白质(例如，相关但序列不同的免疫检查点标记)内的氨基酸形成的任何表位结合。主题CD47结合结构域与相关但序列不同的蛋白质内的氨基酸形成的表位的任何结合通常是非特异性结合，其亲和力显著低于CD47结合结构域与CD47上的表位的特异性结合的亲和力。显著更低的亲和力通常指至少低两倍、三倍、五倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍的亲和力。
主题CD47结合结构域可以减少CD47结合配偶体结合CD47(包括例如，血栓反应蛋白-1(TSP-1)、信号调节蛋白α(SIRPα)和整合素(例如，整合素avb3))的结合。例如，与不存在CD47结合结构域时的结合程度相比，主题CD47结合结构域可以减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％，或更多的CD47结合配偶体结合。
在一些实施方案中，主题抗体包括：一个重链FR1区；一个HCDR1；一个重链FR2区；一个HCDR2；一个重链FR3区；一个HCDR3；和一个重链FR4区。在其中一些实施方案中，每个FR区域均为哺乳动物FR区域，包括例如，人FR区域。在一些实施方案中，主题抗体包括：一个轻链FR1区；一个HCDR1；一个轻链FR2区；一个LCDR2；一个轻链FR3区；一个LCDR3；和一个轻链FR4区。在其中一些实施方案中，每个FR区域均为哺乳动物FR区域，包括例如，人FR区域。
在一些实施方案中，主题抗体包括抗ABCG2重链序列，该序列包括对Fc区的电荷-电荷交换(KK)修饰，以及抗CD47、抗ErbB2、抗EGFR、抗PD-L1重链序列，该重链序列包括电荷-电荷交换(DD)修饰，尤其是具有如下序列的电荷交换(DD)修饰的抗CD47重链序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGN
DDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGT
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC
PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR
EPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:50)。在一些情况下，主题抗体可以包括替代的异二聚体Fc配对策略，而非带电对取代。
电荷-电荷交换修饰是指其中一条重链被修饰为包含K392D和K409D取代，而另一条重链被修饰为包含E356K和D399K取代的取代。电荷对取代的链可以优先彼此形成异二聚体。氨基酸替换的编号按欧盟Ig HC编号系统确定。
所述主题抗体的区和/或链可以或可以不由一个或多个连接子区连接。如果存在连接子区，则所述连接子区的长度可以从约5个氨基酸至约50个氨基酸，例如，长度从约5aa至约10aa、从约10aa至约15aa、从约15aa至约20aa、从约20aa至约25aa、从约25aa至约30aa、从约30aa至约35aa、从约35aa至约40aa、从约40aa至约45aa、或从约45aa至约50aa。
适用于主题抗体的连接子包括“柔性连接子”。如果存在连接子分子，则连接子分子通常具有足够的长度，以允许在链接区之间进行灵活的移动。所述连接子分子通常为约6-50个原子长。连接子分子也可以是，例如，芳基乙炔、含有2-10个单体单位的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。根据本公开内容，还可以使用可与多肽结合的其他连接子分子。
适合的连接子很容易选择，并且适合的连接子可以具有任何适合的不同长度，例如，从1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、从2个氨基酸至15个氨基酸、从3个氨基酸至12个氨基酸，包括从4个氨基酸至10个氨基酸、从5个氨基酸至9个氨基酸、从6个氨基酸至8个氨基酸、或从7个氨基酸至8个氨基酸，并且可能是1、2、3、4、5、6，或7个氨基酸。
示例性柔性连接子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n,GSGGSn(SEQ ID NO:51))和GGGSn(SEQ ID NO:52)其中，n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性连接子。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是有意义的，因为这两种氨基酸都是相对非结构化的，因此可以作为组分之间的中性栓系。甘氨酸聚合物也颇具意义，因为甘氨酸甚至比丙氨酸更容易进入phi-psi空间，并且比侧链较长的残基受到的限制要少得多(参见Scheraga，《计算化学综述》，11173-142(1992))。示例性柔性连接子包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:53)、GGSGG(SEQ ID NO:54)、GSGSG(SEQ ID NO:55)、GSGGG(SEQ ID NO:56)、GGGSG(SEQ ID NO:57)、GSSSG(SEQ IDNO:58)，以及等等。普通技术人员将认识到，偶联至前述任何元素的多肽设计可以包括全部或部分柔性连接子，以使连接子可以包括柔性连接子以及具有较低柔性结构的一个或多个部分。
在一些实施方案中，主题抗体可“人源化”。术语“人源化抗体”指包括至少一条包括基本上源自人抗体链的可变区构架残基的链(称为受体免疫球蛋白或抗体)和至少一个基本上源自非人抗体(例如，啮齿动物(例如，小鼠抗体)、非人灵长类动物等)(称为供体免疫球蛋白或抗体)的CDR的抗体。参见Queen等人，《美国国家科学院科学院刊》86:1002910033(1989)，第5,530,101号美国专利，第5,585,089号美国专利，第5,693,761号美国专利，WO 90/07861，以及第5,225,539号美国专利。如果存在恒定区，则恒定区也可基本上或完全来自人免疫球蛋白。在一些实施方案中，主题抗体包含一个或多个ABCG2 CDR和一个或多个CD47 CDR以及一个或多个来自人抗体的FR区。制备人源化抗体的方法在本领域中已知。参见，例如，第7,256,273号美国专利。
将小鼠CDR替换到人可变结构域框架中可以导致保留其正确的空间方向，在所述空间方向上，例如，人可变结构域框架采用与CDR起源的小鼠可变结构域框架相同或相似的构象。这可以通过从人抗体中获得人可变结构域来实现，而人抗体的框架序列与CDR起源的小鼠可变框架结构域具有高度的序列同一性。重链可变框架区和轻链可变框架区可源自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是自然产生的人抗体序列，也可以是多种人抗体的共有序列。参见Kettleborough等人，《蛋白质工程》4:773(1991)；Kolbinger等人，《蛋白质工程》6:971(1993)。
确定了鼠类供体免疫球蛋白和适当的人受体免疫球蛋白的互补性决定区域后，下一步是确定所述成分中应该被替换的残基(如果有)，以优化所产生的人源化抗体的特性。一般来说，应该尽量减少用鼠类氨基酸残基取代人氨基酸残基，因为鼠类残基的引入会增加抗体在人类中引发人抗小鼠抗体(HAMA)反应的风险。可以采用本领域公认的确定免疫应答的方法，以监测特定患者或临床试验期间的HAMA反应。可以对给予人源化抗体的患者可以在所述治疗开始时和整个治疗过程中进行免疫原性评估。例如，使用本领域已知的方法(包括表面等离子共振技术(BIACORE)和/或固相ELISA分析)对患者血清样品中的人源化治疗试剂的抗体进行检测，以评估HAMA反应。在许多实施方案中，受试者人源化抗体基本上不在人受试者中引发HAMA反应。
基于人可变区框架残基对CDR构象和/或与抗原结合的可能影响，从人可变区框架残基中选择某些氨基酸用于取代。鼠类CDR区与人可变框架区的非自然并置会导致构象限制，除非通过某些氨基酸残基的取代对所述限制予以纠正，否则会导致结合亲和力的丧失。
用于取代的氨基酸残基的选择在某种程度上可以通过计算机建模来确定。用于产生免疫球蛋白分子的三维图像的计算机硬件和软件是本领域已知的。一般来说，分子模型是基于免疫球蛋白链或其结构域的解析结构而产生的。对拟建模链与已解析的三维结构链或结构域的氨基酸序列相似性进行比较，并且选择序列相似性最大的链或结构域作为构建分子模型的起点。选择共享至少50％序列同一性的链或结构域进行建模，并且优选地选择共享至少60％、70％、80％、90％序列同一性或更多的链或结构域进行建模。对已解析的起始结构进行修饰，以允许被建模的免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸与起始结构中的氨基酸之间存在差异。然后将已修饰的结构组装成复合免疫球蛋白。最后，通过能量最小化和验证所有原子之彼此之间的距离是否均在适当范围内以及键长和键角是否均在化学可接受的范围内来，对模型进行改进。
按照Kabat定义CDR和框架区，《具有免疫学意义的蛋白质的序列》(美国国立卫生研究院出版物91-3242,马里兰州贝塞斯达，1987和1991)。Chothia等人通过以下文献提出了另一种结构定义：《分子生物学杂志》196：901-917(1987)；《自然》(1989)；以及《分子生物学杂志》186:651(1989)(以下统称为“Chothia”)。如果前文所述Kabat定义的框架残基构成前文所述Chothia所定义的结构环残基，可选择将小鼠抗体中存在的氨基酸用于取代到人源化抗体中。“邻近CDR区”的残基包括在人源化免疫球蛋白链主序列中紧邻一个或多个CDR的位置上的氨基酸残基，例如，紧邻Kabat所定义的CDR的位置，或紧邻Chothia所定义的CDR的位置(参见例如，Chothia和Lesk JMB 196:901(1987))。此类氨基酸特别有可能与CDR中的氨基酸相互作用，且如果从受体中选择，则会扭曲供体CDR并降低亲和力。此外，相邻的氨基酸可直接与抗原相互作用(Amit等人，《科学》，233：747(1986))，并且从供体中选择此类氨基酸可能是可取的，以保持原始抗体中提供亲和力的所有抗原接触。
在一些实施方案中，主题抗体包括scFv多聚体。例如，在一些实施方案中，主题抗体是scFv二聚体二聚体(例如，包括含两个串联的(scFv2))、scFv三聚体(例如，包括三个串联scFv(scFv3))、scFv四聚体(例如，包括四个scFv(scFv4))，或四个以上(例如，串联)的scFv多聚体。scFv单体可以通过长度为约2个氨基酸至约10个氨基酸(例如，长度为2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa或10aa)的连接子串联连接。适合的连接子包括，(Gly)x(SEQ ID NO:69)，其中x是2至10之间的整数。其他适合的连接子为前文讨论的连接子。在一些实施方案中，如前文所述，受试者scFv多聚体中的每个scFv单体是人源化的。
在一些实施方案中，主题抗体包括免疫球蛋白的恒定区(例如，Fc区)。如果存在所述Fc区，则可以是人Fc区。如果存在恒定区，则抗体可包含轻链恒定区和重链恒定区。适合的重链恒定区包括CH1区、铰链区、CH2区、CH3区和CH4区。本文所述的抗体包括具有所有类型恒定区的抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。适合的重链Fc区的一个实例是人同种型IgG1Fc。轻链恒定区可以是λ恒定区或κ恒定区。主题抗体(例如，受试者人源化抗体)可以包括源自多类或同种型的序列。抗体可以表达为包含两条轻链和两条重链的四聚体，可以表达为单独的重链、轻链，可以表达为Fab、Fab'F(ab')2和Fv，也可以表达为重链可变结构域和轻链可变结构域通过间隔基链接的单链抗体。
在一些实施方案中，主题抗体包括羧基端的游离硫醇(-SH)基团，其中所述游离硫醇基团可用于将抗体附着至第二多肽(例如，另一种抗体，包括主题抗体)、支架、载体等。
可以使用例如，戊二醛、同双功能交联剂或异双功能交联剂，以将主题抗体共价链接至第二部分(例如，脂质、除主题抗体以外的多肽、合成聚合物、碳水化合物、毒素等)。戊二醛通过其氨基部分交联多肽。同双功能交联剂(例如，同双功能亚胺酯、同双功能N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或同双功能巯基反应性交联剂)包含两个或多个相同的反应性部分，并且可用于一步反应程序，其中将交联剂被添加到含有待连接多肽混合物的溶液中。同双功能NHS酯和酰亚胺酯交联含胺多肽。在温和的碱性pH值下，酰亚胺酯仅与伯胺反应形成亚氨基酰胺，交联多肽的总电荷不受影响。同双功能巯基反应性交联剂包括双马来酰亚胺己烷(BMH)、1,5-二氟-2,4-二硝基苯(DFDNB)和1,4-双(3',2'-吡啶二硫代)丙酰氨基)丁烷(DPDPB)。
组合物和制剂
本公开提供了包含主题抗体的组合物。除主题抗体外，主题抗体组合物还可包括如下一种或多种成分：盐(例如，NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等)；缓冲剂(例如，三羟甲基氨基甲烷缓冲液、组氨酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等)；增溶剂；洗涤剂(例如，Tween-20等非离子洗涤剂)；蛋白酶抑制剂；以及甘油等等。
本公开的组合物还包括包含本文所述的多特异性抗体的药物组合物。一般来说，制剂包括有效量的主题抗体。“有效量”指足以产生所期望的结果(例如，受试者癌症减退、受试者体内肿瘤生长速度放缓、癌症症状改善等)的剂量。一般来说，与对照例相比，所期望的结果至少是癌症症状的减少、肿瘤生长速度放缓、肿瘤体积变小等。可以通过避开血脑屏障的方式递送或配制主题抗体。在一些情况下，抗体可包括递送增强剂，包括所述增强剂有助于越过血脑屏障、增加渗透性，例如，允许有效的透皮递送等。有用的递送增强剂包括但不限于，例如，Cereport、Regadenoson、冰片、葛根素、丙二醇、油酸、氮酮、N-甲基吡咯烷酮、Tween 80、柠檬烯、脂质纳米颗粒(NP)、脂质体、Niosomes、传递体、乙醇体、树枝状聚合物、胶束NP、聚合物纳米结构、金属纳米结构、磁性纳米结构、重组人透明质酸酶，以及类似物。
在主题方法中，可以使用能够产生所期望治疗效果或诊断效果的任何便利方式，将主题抗体施用于宿主。因此，可以在多种制剂中加入所述药剂用于治疗性给药。更具体地，可以通过与药学上可接受的合适载体或稀释剂组合，将主题抗体配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如，片剂、-胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。
在药物剂型中，主题抗体可以与药学上可接受的赋形剂联合给药，或也可以单独使用或与其他药学活性化合物适当联合使用。以下方法和赋形剂仅为示例性，绝非限制性方法和赋形剂。
对于口服制剂，主题抗体可以单独使用或与合适的添加剂联合使用以制成片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，与常规添加剂(例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉)联合使用；与粘合剂(例如，结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶联合使用；与崩解剂(例如，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠)联合使用；与润滑剂(例如，滑石粉或硬脂酸镁)联合使用；如果需要，还可以添加稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂。在一些情况下，口服抗体可通过抗体与适当的水凝胶络合而增强。
通过在水或非水溶剂(例如，植物油或其他类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇)中溶解、悬浮或乳化，可以将主题抗体配制成注射制剂；如果需要，还可以加入常规添加剂，例如，增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
通过将具有所期望纯度的抗体与可选的生理学上可接受的载体、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张度剂混合来制备包含主题抗体的药物组合物。在已使用的剂量和浓度下，可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂对受体无毒。可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂包括磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸等缓冲剂；包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸和柠檬酸等在内的抗氧化剂；防腐剂(例如，乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸(例如，精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合)；单糖、双糖以及其他碳水化合物；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质(例如，明胶或血清白蛋白)；EDTA等螯合剂；海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、半乳糖胺、神经氨酸等糖类；和/或Tween、Brij Pluronics、Triton-X或聚乙二醇(PEG)等非离子表面活性剂。
所述药物组合物可以是液体形式、冻干形式或以冻干形式重构的液体形式，其中所述冻干制剂在给药前用无菌溶液进行重构。重构冻干组合物的标准程序是加回一定体积的纯水(通常相当于冻干过程中除去的体积)；然而，含有抗菌剂的溶液可用于生产用于肠胃外给药的药物组合物，也可参见Chen(1992)《药物开发与工业制药学》，18,1311-54。
受试者药物组合物中的示例性抗体浓度可为从约1mg/mL至约200mg/mL，或从约50mg/mL至约200mg/mL，或从约150mg/mL至约200mg/mL的范围内。
抗体的水剂型可以在pH(例如，pH值范围为从约4.0至约7.0，或从约5.0至约6.0，或约5.5)缓冲溶液中制备。适用于pH值在此范围内的缓冲液示例包括磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、乙酸盐缓冲液和其他有机酸缓冲液。缓冲液浓度可为从约1mM至约100mM，或从约5mM至约50mM，具体取决于例如，缓冲液和制剂的所需张力。
张度剂可包含在抗体制剂中以调节制剂的张度。示例性张度剂包括氯化钠、氯化钾、甘油和选自氨基酸、糖类及其组合的任何组分。在一些实施方案中，尽管高渗溶液或低渗溶液可能都适用，但是水剂型具有等渗性。术语“等渗”指与其它溶液(例如，生理盐溶液或血清)具有相同张力的溶液。张度剂的用量可为约5mM至约350mM，例如，用量为100mM至350mM。
还可以将表面活性剂添加到抗体制剂中，以减少所配制抗体的聚集和/或最小化制剂中微粒的形成和/或减少吸附。示例性表面活性剂包括聚氧乙烯山梨醇糖醇脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆、Pluronic)和十二烷基硫酸钠(SDS)。合适的聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯的实例是聚山梨醇酯20(以商标Tween 20TM出售)和聚山梨醇酯80(以商标Tween 80TM出售)。合适的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的实例指以商品名F68或Poloxamer 188TM出售的此类共聚物。合适的聚氧乙烯烷基醚的实例指以商标BrijTM出售的类似物。表面活性剂的示例性浓度可在约0.001％至约1％w/v的范围内。
还可以添加冻干保护剂，以保护不稳定的活性成分(例如，蛋白质)在冻干过程中免受不稳定条件的影响。例如，已知的冻干保护剂包括糖类(包括葡萄糖和蔗糖)；多元醇(包括甘露醇、山梨糖醇和甘油)；以及氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。可以包括约10mM至500nM冻干保护剂。
在一些实施方案中，主题制剂包括主题抗体和前述已确定的一种或多种试剂(例如，表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、张力剂)，并且基本上不含一种或多种防腐剂，例如，乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或其组合。在其他实施方案中，制剂中包括防腐剂，例如，浓度范围为约0.001至约2％(w/v)。
例如，主题制剂可以是适合肠胃外给药的液体或冻干制剂，并且可以包含：约1mg/mL至约200mg/mL的主题抗体；约0.001％至约1％的至少一种表面活性剂；约1mM至约100mM的缓冲液；任选约10mM至约500mM的稳定剂；以及约5mM至约305mM的张度剂；并且pH值为约4.0至约7.0。
作为另一个实例，主题肠胃外制剂为液体或冻干制剂，其包含：约1mg/mL至约200mg/mL的主题抗体；0.04％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；以及250mM的蔗糖；且pH值为5.5。
作为另一个实例，主题肠胃外制剂包括冻干制剂，其包含：1)15mg/mL的主题抗体；0.04％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；以及250mM的蔗糖；且pH值为5.5；或2)75mg/mL的主题抗体；0.04％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；以及250mM的蔗糖；且pH值为5.5；或3)75mg/mL的主题抗体；0.02％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；以及250mM的蔗糖；且pH值为5.5；或4)75mg/mL的主题抗体；0.04％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；以及250mM的海藻糖；且pH值为5.5；或6)75mg/mL的主题抗体；0.02％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；；以及250mM的海藻糖；且pH值为5.5。
作为另一个实例，主题肠胃外制剂为液体制剂，其包含：1)7.5mg/mL的主题抗体；0.022％的Tween 20w/v；120mM的L-组氨酸；以及250 125mM的蔗糖；且pH值为5.5；或2)37.5mg/mL的主题抗体；0.02％的Tween 20w/v；10mM的L-组氨酸；以及125mM的蔗糖；且pH值为5.5；或3)37.5mg/mL的主题抗体；0.01％的Tween 20w/v；10mM的L-组氨酸；以及125mM的蔗糖；且pH值为5.5；或4)37.5mg/mL的主题抗体；0.02％的Tween 20w/v；10mM的L-组氨酸；以及125mM的蔗糖；且pH值为5.5；或5)37.5mg/mL的主题抗体；0.01％的Tween 20w/v；10mM的L-组氨酸；以及125mM的海藻糖；且pH值为5.5；或6)5mg/mL的主题抗体；0.02％的Tween20w/v；20mM的L-组氨酸；以及250mM的海藻糖；且pH值为5.5；或7)75mg/mL的主题抗体；0.02％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；以及250mM的甘露醇；且pH值为5.5；或8)75mg/mL的主题抗体；0.02％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；以及140mM的氯化钠；且pH值为5.5；或9)150mg/mL的主题抗体；0.02％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；以及250mM的海藻糖；且pH值为5.5；或10)150mg/mL的主题抗体；0.02％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；以及250mM的甘露醇；且pH值为5.5；或11)150mg/mL的主题抗体；0.02％的Tween 20w/v；20mM的L-组氨酸；以及140mM的氯化钠；且pH值为5.5；或12)10mg/mL的主题抗体；0.01％的Tween20w/v；20mM的L-组氨酸；以及40mM的氯化钠；且pH值为5.5。
主题抗体可用于经吸入给药的气雾剂制剂。可以将主题抗体配制成加压可接受的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
此外，主题抗体可以通过与-多种基质(例如，乳化基质或水溶性基质)混合制成栓剂。主题抗体可以通过栓剂直肠给药。所述栓剂可包括在体温下融化，但在室温下凝固的可可脂、聚乙二醇和聚氧乙烯等载体。
可提供用于口服或直肠给药的单位剂型，例如糖浆剂、酏剂和混悬剂，其中每个剂量单位(例如，茶匙、汤匙、片剂或栓剂)含有包含一种或多种抑制剂的组合物的预定量。同样地，用于注射或静脉给药的单位剂型可包括作为无菌水、正常生理盐水或其他药学上可接受的载体中的溶液的组合物中的主题抗体。
如本文所用，术语“单位剂型”指物理上离散的单位，适合作为人和动物受试者的单位剂量，每个单位含有预定量的本发明化合物，而预定量的计算量足以与药学上可接受的稀释剂、载体或载体相结合产生所期望的效果。主题抗体的规格可能取决于所使用的特定抗体和需到达的效果，以及与宿主中每种抗体相关的药效学。
其他给药方式也可用于本发明。例如，可将主题抗体配制成栓剂，并且在一些情况下配制成气雾剂和鼻内组合物。对于栓剂，载药组合物将包括传统的粘合剂和载体，例如，聚乙二醇或甘油三酸酯。此类栓剂可由含有约0.5％至约10％(w/w)，例如，约1％至约2％范围内，的活性成分的混合物形成。
鼻内制剂通常包括既不会刺激鼻粘膜也不会显著干扰纤毛功能的载体。本主题发明可使用稀释剂，例如水、盐水或其他已知物质。鼻用制剂还可含有防腐剂，例如，但不限于氯丁醇和苯扎氯铵。可存在表面活性剂以增强鼻粘膜对主题蛋白质的吸收。
主题抗体可作为注射剂型给药。通常，可注射组合物制备成液体溶液或混悬剂；也可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。还可以将所述制剂乳化或将所述抗体包封在脂质体媒介物中。
合适的赋形媒介物包括，例如，水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物及其组合。此外，如果需要，所述媒介物可以包含少量的辅助性物质，例如，润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。制备此类剂型的实际方法对本领域技术人员而言是已知或显而易见的。参见，例如，《雷明顿制药科学》，马克出版社，宾夕法尼亚州伊斯顿，第17版。1985。在任何情况下，待施用的组合物或制剂将含有足以在接受治疗的受试者中达到所需状态的数量的主题抗体.
公众可轻松获取药学上可接受的赋形剂，例如，媒介物、佐剂、载体或稀释剂。此外，药学上可接受的辅助物质(例如，pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等)也很容易为公众所用。
在一些实施方案中，主题抗体以控释制剂配制。可以使用本领域众所周知的方法制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，其中基质为成形制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、水凝胶、聚交酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。通过使用适当的添加剂、通过控制水分含量和通过开发特定的聚合物基质组合物，可以防止缓释制剂中所含抗体的生物活性的可能丧失和免疫原性的可能变化。
本发明范围内的控释可指多种缓释剂型中的任何一种。就本发明而言，以下术语可被认为基本上等同于控释：连续释放、控释、延迟释放、储库、逐渐释放、长期释放、程控释放、延长释放、按比例释放、持续释放、储存库、延迟缓慢释放、间隔释放、持续释放、时间涂层、定时释放、延迟作用、延长作用、分层时间作用、长效作用、延迟作用、重复作用、缓慢作用、持续作用，持续-行动药物和延长释放。可通过Lesczek Krowczynski,《缓释剂型》，1987(CRC出版公司)中查阅此类术语的进一步讨论。
剂量
可由主治医师或其他合格的医务人员根据各种临床因素确定合适的剂量。在医疗领域内众所周知，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待给药的特定组合物、患者的性别、给药时间和给药途径、一般健康状况，以及同时服用的其他药物。主题抗体的给药量可以在每剂量1mg/kg体重和20mg/kg体重之间，例如，在0.1mg/kg体重至10mg/kg体重之间，例如，在0.5mg/kg体重至5mg/kg体重之间；然而，特别考虑到上述因素,可以设想低于或高于该示例性范围的剂量。如果给药方案是连续输注，给药量也可以在每分钟每公斤体重1μg至10mg的范围内。
本领域技术人员将容易理解，剂量水平可以随特异性抗体、症状的严重程度和受试者对副作用的易感性而异。本领域技术人员通过多种方式很容易确定给定组合物的优选剂量。
给药途径
使用适合给药的任何可用方法和途径，包括体内和离体方法，以及全身和局部给药途径，将主题抗体施用于个体。
常规给药途径和药学上可接受的给药途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、局部敷用、静脉内、动脉内、直肠、鼻、口和其他肠内和肠胃外给药途径。如果需要，可以采用组合式给药途径，或根据抗体和/或所需效果进行调整。主题抗体组合物可以单剂量或多剂量给药。在一些实施方案中，口服施用主题抗体组合物。在一些实施方案中，经由吸入途径施用主题抗体组合物。在一些实施方案中，鼻内施用主题抗体组合物。在一些实施方案中，局部施用主题抗体组合物。在一些实施方案中，颅内施用主题抗体组合物。在一些实施方案中，静脉内施用主题抗体组合物。
可以使用任何可用的常规方法和适合常规药物递送的途径(包括全身或局部途径)，将药剂施用于宿主。一般来说，本发明所考虑的给药途径包括但不一定限于肠内、肠胃外或吸入途径。
除吸入给药外的肠胃外给药途径包括但不一定限于局部、透皮、皮下、肌肉内、眼眶内、囊内、椎管内、胸骨内和静脉给药途径，即除通过消化道外的任何给药途径。可以通过肠胃外给药以实现主题抗体的全身或局部递送。如果需要全身递送，施用通常涉及药物制剂的侵入性或全身吸收的局部或粘膜施用。
也可通过肠内施用向受试者递送主题抗体。肠内施用途径包括但不一定限于口服和直肠(例如，使用栓剂)递送。
治疗指至少与折磨宿主的病理状况相关的症状的改善，其中改善在广义上用于指至少降低与所治疗的病理状况相关的参数的量级，例如，症状，例如，癌症和/或癌症的生长以及与之相关的疼痛。因此，治疗还包括病理条件或至少与病理条件相关的症状被完全抑制(例如，阻止发生)或停止(例如，终止)，从而使宿主不再遭受病理状况，或至少不再有表征该病状的症状。
多种宿主(其中术语“宿主”在本文中可与术语“主题”、“个体”和“患者”互换使用)可根据所述主题方法进行治疗。一般来说，此类宿主是“哺乳动物”或“哺乳动物的”，其中这些术语广泛用于描述属哺乳纲生物体，包括食肉动物目(例如，狗和猫)、啮齿目(例如，小鼠、豚鼠、和大鼠)和灵长目(例如，人、黑猩猩和猴子)。在一些实施方案中，宿主为人。
提供带有单位剂量主题抗体的试剂盒，例如，口服或注射剂量。在一些实施方案中，除容纳单位剂量的容器以外，还将提供用于描述在治疗所关注的病理状况中所述抗体的用途和附带益处的信息包装插页。
核酸
本公开提供了包含编码主题抗体的核苷酸序列的核酸。编码主题抗体的核苷酸序列可与一个或多个调节元件(例如启动子和增强子)，可操作地连接，调控元件允许所述核苷酸序列在预期靶细胞(例如，经基因修饰以合成所编码的抗体的细胞)中表达。
合适的启动子和增强子元件在本领域中已知。为了在细菌细胞中表达，合适的启动子包括但不限于lacl、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。为了在真核细胞中表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒极早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于来自逆转录病毒的长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；以及本领域已知的各种组织特异性启动子。
编码主题抗体的核苷酸序列可存在于表达载体和/或克隆载体中。主题抗体包含两个或多个单独多肽时，编码这两个多肽的核苷酸序列可以克隆到相同或单独的载体中。可以使用各种策略(例如，单独启动子，一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)、一个或多个自切割序列(例如，2A切割序列，例如，P2A、T2A、E2A和F2A)及其组合等)通过单个核酸或单个载体表达单独多肽。表达载体可包括选择标记、复制起点和提供载体复制和/或维持的其他特征。
本领域的技术人员已知大量合适的载体和启动子；许多可商购获得用于产生主题重组载体。以举例的方式提供以下载体。细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescriptSK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene公司,美国加州拉霍亚市)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540，以及pRIT5(Pharmacia公司，瑞典乌普萨拉)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG以及pSVL(Pharmacia)。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的合宜限制位点以提供编码异源蛋白的核酸序列的插入。可能存在在表达宿主中有效的选择标记。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如，基于痘苗病毒的病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒)(参见，例如，Li等人，《眼科研究与视力学》，35:2543 2549,1994；Borras等人，《基因疗法》，6:515524,1999；Li和Davidson，《美国国家科学院院刊》92:7700 7704，1995；Sakamoto等人，WO 94/12649，WO93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO95/00655)；腺相关病毒(参见，例如，Ali等人，《人基因疗法》9:81 86，1998；Flannery等人，《美国国家科学院院刊》94:69166921，1997；Bennett等人，《眼科研究与视力学》，38:2857 2863，1997；Jomary等人，《基因疗法》，4:683 690，1997；Rolling等人，《人基因疗法》10:641 648，1999；Ali等人，《人类分子遗传学》，5:591 594，1996；Srivastava在WO 93/09239；Samulski等人，《血管和介入放射学杂志》，(1989)63:3822-3828；Mendelson等人，《病毒学杂志》(1988)166:154-165；以及Flotte等人，《美国国家科学院院刊》(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(参见，例如，Miyoshi等人，《美国国家科学院院刊》94:10319 23，1997；Takahashi等人,《血管和介入放射学杂志》73:7812 7816，1999)；逆转录病毒载体(鼠白血病病毒、脾坏死病毒、以及源自逆转录病毒的载体，例如，劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等。
如前文所述，主题核酸包含编码主题多特异性抗体的核苷酸序列。主题核酸可包括编码重链CDR和轻链CDR的核苷酸序列。在一些实施方案中，主题核酸包含编码重链CDR和/或轻链CDR的核苷酸序列，其中所述CDR编码序列与编码FR的核苷酸序列穿插。在一些实施方案中，主题核酸包含编码重链CD47 CDR和/或轻链CD47 CDR的核苷酸序列，其中所述CDR编码序列与编码FR的核苷酸序列穿插。在一些实施方案中，FR编码核苷酸序列为人FR编码核苷酸序列。
在一些实施方案中，主题核酸包括编码氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列与本文提供的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的序列同一性。
如本文所述的核酸，例如，在以下情况下，可通过使细胞与核酸接触而引入细胞。引入了核酸的细胞在本文中通常称为基因修饰的细胞。采用多种核酸递送方法，包括但不限于例如，裸核酸递送、病毒递送、化学转染、基因枪等。
细胞
本公开提供了分离的经基因修饰的细胞(例如，体外细胞、离体细胞、培养细胞等)，其用主题核酸进行基因修饰。在一些实施方案中，主题分离的经基因修饰的细胞可产生主题抗体。在一些情况下，经基因修饰的细胞可将抗体递送给(例如)需要抗体的受试者。在一些情况下，经基因修饰的细胞可用于生产、筛选和/或发现多特异性抗体。在一些情况下，经基因修饰的细胞还可以包括内源性基因表达已被降低(例如，被抑制、敲低等)或已消除(例如，敲除)的细胞。在一些情况下，经基因修饰的细胞还可以包括基因表达已增强的细胞，例如，内源性基因的表达增加或异源基因的表达增加。
合适的细胞包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；以及原核细胞，如细菌细胞。可以通过，例如，磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、电穿孔或其它已知方法，将主题核酸引入细胞。
合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类细胞系、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于：HeLa细胞(例如，美国标准生物品收藏中心(ATCC)第CCL-2号细胞)、CHO细胞(例如，ATCC第CRL9618、CCL61、CRL9096号细胞)、293细胞(例如，ATCC第CRL-1573号细胞)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC第CRL-1658号细胞)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC第CCL10号细胞)、PC12细胞(ATCC第CRL1721号细胞)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC第CRL1651号细胞)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC第CCLI.3号细胞)、人胚肾(HEK)细胞(ATCC第CRL1573号细胞)、HLHepG2细胞以及类似细胞。
在一些情况下，有用的哺乳动物细胞可包括源自哺乳动物组织或器官的细胞。在一些情况下，所使用的细胞为肾细胞，包括例如，已建立的肾细胞系的肾细胞，如HEK 293T细胞。
合适的酵母细胞或真菌或藻类细胞包括但不限于：Pichia pastoris,Pichiafinlandica,Pichia trehalophila,Pichia koclamae,Pichia membranaefaciens,Pichiaopuntiae,Pichia thermotolerans,Pichia salictaria,Pichia guercuum,Pichiapijperi,Pichia stiptis,Pichia methanolica,Pichia sp.、酿酒酵母、酵母菌、汉逊酵母、克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、白色念珠菌、小巢状麹菌、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、勒氏黄孢霉、镰刀菌、禾本科镰刀菌、维纳镰刀菌、粗糙脉孢菌、莱茵衣藻，以及类似物。
合适的原核细胞包括但不限于大肠杆菌、乳酸杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属等的多种实验室菌株中的任何一种。参见，例如，Carrier等人，(1992)《分子生物学杂志》。148:1176-1181；美国第6,447,784号专利；以及Sizemore等人，(1995)《科学》270:299-302。可用于本发明的沙门氏菌菌株的实例包括但不限于，肠道沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。合适的志贺氏菌菌株包括但不限于，福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌。通常，实验室菌株是非致病性菌株。其他合适的细菌的非限制性实例包括但不限于枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌绿脓杆菌、梅伐罗尼假单胞菌、球形红细菌、荚膜红细菌、红螺旋菌菌、红球菌属，以及类似物。在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在一些情况下，本公开的细胞可以是免疫细胞。如本文所用，术语“免疫细胞”通常包括从骨髓中产生的造血干细胞(HSC)衍生而来的白血球(白细胞)。“免疫细胞”包括，例如，淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)和髓源细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞)。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括辅助性T细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、调节性T细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，此类细胞能够介导细胞毒性反应。
在一些情况下，表达多特异性抗体的有用细胞可以包括生产性T细胞。生产性T细胞的非限制性实例包括《Tsai&Davila Oncoimmunology》(2016)5(5):e1122158，所描述的实例，公开内容通过本发明的整体引用，构成本发明的一部分。在一些情况下，可以使用经设计成以包括编码本公开的多特异性抗体的核酸序列的生产性T细胞，将抗体递送给需要所述抗体的受试者。
本公开的细胞还包括经基因修饰的细胞，以改变和/或修正细胞中ABCG2和TAA(例如，CD47)中的一种或多种的表达的细胞。此类经修饰的细胞可用于各种目的，包括测定多特异性抗体(包括但不限于根据本文提供的说明书和方法生产的多特异性抗体)的结合。在一些情况下，ABCG2可在受试者细胞系中被敲除或敲低。在一些情况下，TAA(例如，CD47)可在受试者细胞系中被敲除或敲低。在一些情况下，ABCG2可在受试者细胞系中构成型或诱导型地过度表达。在一些情况下，TAA(例如，CD47)可以在受试者细胞系中组成性和诱导性地过度表达。在一些情况下，ABCG2和TAA(例如，CD47)均可在受试者细胞系中被敲低、敲除或组成性和诱导性地过度表达。可以采用任何方便和事方的方法进行敲低、敲除和/或过度表达。引入的核酸可以稳定整合，也可以瞬时存在。
在一些实施方案中，本公开的细胞包括表达TAA(例如，CD47)的经基因修饰的细胞人细胞系，并且包括包含编码用于ABCG2过度表达的ABCG2的序列的外源性核酸。在此类细胞中，TAA(例如，CD47)表达可以是内源性或外源性衍生的(即引入的)，并且ABCG2表达也可以是稳定表达或瞬时表达。在一些情况下，表达TAA(例如，CD47)的本公开的细胞系可被构型为产生表达TAA(例如，CD47)和稳定过度表达ABCG2的经基因修饰的人细胞。
可以培养(包括例如，通过使用本文所描述的培养方法)本公开的细胞和细胞系。在一些情况下，可对已引入核酸以对其进行基因修饰的细胞进行培养以产生细胞系。有用的细胞系可包括但不限于，例如，经基因修饰的细胞系，包括人细胞系、表达TAA(例如，CD47)并稳定过度表达ABCG2。
本公开的细胞及其细胞系可用于本公开的各种方法，例如，作为测试样品、对照等。例如，在某些情况下，其中ABCG2和/或TAA(例如，CD47)被敲除和/或敲除的细胞可被用作参考细胞，例如，可以与本发明的多特异性抗体的结合进行比较。其他有用的参考细胞包括但不限于，例如，非癌细胞，以及正常细胞和表达正常水平的各种蛋白质(包括正常水平的ABCG2和/或TAA(例如，CD47))的细胞。
方法
如前文所述，本公开的方法包括将细胞与本公开的抗体接触的方法，根据涉及向受试者施用本公开的抗体的方法治疗受试者的方法，制备本申请所述要素(包括例如，多特异性抗体、组合物和制剂、核酸、表达载体、细胞以及类似物)的方法。
如前文所述，本公开的方法包括将癌细胞与本公开的多特异性抗体接触，例如，以促进和/或增强对癌细胞的杀伤力。在一些情况下，当两个靶点在癌细胞上共表达时，免疫反应或免疫细胞作用于癌细胞，从而介导癌细胞的死亡。在一些情况下，癌细胞的杀伤是由免疫反应或免疫细胞作用于癌细胞介导的，例如，通过多特异性抗体掩蔽或拮抗存在于癌细胞表面上的TAA(例如，CD47)。在一些情况下，对癌细胞的杀伤力是通过抑制癌细胞的细胞外排，例如，由于多特异性抗体对癌细胞的ABCG2拮抗作用。在一些情况下，与多特异性抗体接触的细胞可能为多药耐药癌细胞。涉及使癌细胞与本公开的多特异性抗体接触的方法可以包括也可以不包括使用附加疗法或活性剂(包括例如，化学疗法、免疫疗法、放射疗法等等)接触癌细胞。
使癌细胞与本公开的多特异性抗体接触通常会(例如，与不存在多特异性抗体时癌细胞的杀伤水平相比)增强对癌细胞的杀伤力。在一些情况下，与单独使用附加活性剂观察到的杀伤水平相比，可以发现使用附加活性剂时，增强了对癌细胞杀伤力。因多特异性抗体引起的对癌细胞杀伤的增强量会不尽相同，范围可从癌细胞杀伤增强至少5％到至少90％或更多，包括但不限于例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％等。此类增强可与接触一种或多种附加活性剂时单独进行比较。
可通过多种方式(包括但不限于，例如，观察研究、基于体外细胞的细胞毒性测定、流式细胞术、细胞活力标记(例如，使用一种或多种细胞活力染色剂)等等)评估对癌细胞杀伤力的增强情况。
治疗方法
本公开提供了治疗癌症的方法，所述方法通常涉及向有需要的个体(例如，患有癌症的个体)单独(例如，在单一疗法中)或与一种或多种附加治疗剂联合(例如，在联合治疗中)施用本文所提供的有效量的主题多特异性抗体。可以通过任何方便和适当的给药途径，适用本公开的抗体。
本公开的方面包括根据说明书的前面章节所述的双特异性抗体分子，在治疗受试者癌症的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用抗体。所述方法包括将抗体与至少一种附加活性剂联合使用，其中所述至少一种附加活性剂包括化学治疗剂、多药耐药转运体的抑制剂、免疫治疗剂或其组合。在某些方面，所述至少一种附加活性剂是化学治疗剂，任选地，其中所述化学治疗剂是紫杉烷、长春花生物碱、蒽环类抗生素、紫杉烷、长春花生物碱、蒽环类抗生素、依托泊苷、米托蒽醌，或甲氨蝶呤。ABCG2的底物包括拓扑异构酶II抑制剂(例如，米托蒽醌、蒽环类抗生素：阿霉素、表阿霉素等)；拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱类似物：拓扑替康、吉马替康等)；酪氨酸激酶抑制剂(例如，吉非替尼)以及类似物。
本文还公开了用于治疗受试者癌症的方法的化学治疗剂，所述方法包括将化学治疗剂与本文所述的抗体联合施用于受试者，任选地，其中所述化学治疗剂是紫杉烷、长春花生物碱、蒽环类抗生素、依托泊苷、米托蒽醌，或甲氨蝶呤。
因此，给药包括但不限于例如，通过注射递送抗体、通过输注递送抗体、通过递送编码多特异性抗体的核酸或表达载体、通过向受试者施用表达和分泌所述多特异性抗体的细胞来递送抗体，等等。药剂、编码药剂的核酸、表达药剂的细胞等的施用，可包括与所述药剂接触、与核酸接触、与细胞接触等。
在一些实施方案中，主题多特异性抗体的有效量为如下所述的量，当以一个或多个剂量单独(例如，在单一疗法中)或与一种或多种附加治疗剂联合(例如，在联合治疗中)施用时，与未使用抗体治疗时不良症状的严重程度相比，癌症的不良症状有效减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。
在一些实施方案中，主题抗体的有效量为如下所述的量，当以一个或多个剂量单独(例如，在单一疗法中)或与一种或多种附加治疗剂联合(例如，在联合治疗中)施用时，有效改善被治疗个体中的癌症(即，减缓癌症的生长、阻止癌症的生长、逆转癌症的生长、杀死癌细胞(包括肿瘤细胞或类似物))。例如，与未使用抗体治疗相比，主题抗体的有效量可使个体的癌症生长速度降低或将肿瘤体积缩小至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或更多。
在一些情况下，可以对受试者进行全身治疗，包括采用主题多特异性抗体，使用或不使用一种或多种附加试剂。如本文所用，“全身治疗”指不仅仅针对特定肿瘤(例如，原发性肿瘤或确定的继发性肿瘤)或特定的含癌组织(例如，肝癌的情况下是肝脏，血癌的情况下是血液等)进行的治疗。全身治疗通常针对受试者的整个身体，并且可以包括但不限于例如，全身放疗、全身化疗、全身免疫治疗及其组合等。
在一些情况下，可以对受试者进行局部治疗，包括采用受试者抗体，使用或不使用一种或多种附加试剂。如本文所用，“局部治疗”指专门针对特定肿瘤(例如，原发性肿瘤或确定的继发性肿瘤)的位置或门针对含癌组织(例如，肝癌的情况下是肝脏，血癌的情况下是血液等)进行的治疗。在一些情况下，还可以以影响肿瘤周围环境的方式(例如肿瘤周围的组织，例如紧邻肿瘤的组织)施用局部治疗。局部治疗通常不会影响或不会靶向远离癌症部位的组织，包括肿瘤部位，例如原发性肿瘤。可以与主题多特异性抗体一起施用或与主题多特异性抗体联合施用的有效局部治疗，例如包括但不限于手术、局部放射疗法、局部冷冻疗法、局部激光疗法、局部外用疗法及其组合等。
在一些实施方案中，受试者治疗方法涉及施用主题多特异性抗体和一种或多种附加治疗剂。合适的其他治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗试剂、免疫治疗试剂、其他抗体或多特异性抗体制剂，以及类似物。在对受试者施用本公开的多特异性抗体之前、期间或之后可施用于受试者的附加疗法将随许多因素(例如，癌症类型、受试者的病史、一般健康状态和/或任何共病症等)而异，有效的癌症疗法包括但不限于例如，放射疗法、化学疗法、免疫疗法等。
放射疗法包括但不限于从外部应用源(例如，射束)或通过植入小型放射源发出的x射线或γ射线。
用于癌症治疗的合适抗体包括但不限于裸抗体，例如，曲妥珠单抗(赫赛汀)、贝伐珠单抗(安维汀TM)、西妥昔单抗(爱必妥TM)、帕尼单抗(维克替比TM)、伊匹木单抗(逸沃TM)、利妥昔单抗(美罗华)、阿仑单抗(任力达TM)、奥法木单抗(亚舍拉TM)、奥戈伏单抗(奥瓦瑞TM)、帕博利珠单抗(MK-3475)、帕妥珠单抗(帕捷特TM)、兰尼单抗(乐舒晴TM)、阿替利珠单抗(泰圣奇TM)等，以及偶联抗体，例如，吉妥单抗(米罗他TM)、维布妥昔单抗(安适利TM)、90Y标记的替伊莫单抗(泽瓦林TM)、131I标记的托西莫单抗(百克沙TM)等。用于癌症治疗的合适抗体还包括但不限于针对肿瘤相关抗原产生的抗体。此类抗原包括但不限于CD20、CD30、CD33、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如GD2、GD3、GM2等)、Ley、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、ERBB2、ERBB3、PD-L1、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、生腱蛋白等。
常规癌症疗法还包括针对癌症的靶向疗法，包括但不限于，例如，靶向HER2(ERBB2/neu)的曲妥珠单抗抗体-药物偶联物(Kadcyla)(批准用于治疗乳腺癌)；靶向EGFR(HER1/ERBB1)、HER2(ERBB2/neu)的阿法替尼(Gilotrif)(批准用于治疗非小细胞肺癌)；靶向阿地白介素(Proleukin)(批准用于治疗肾细胞癌、黑色素瘤)；靶向ALK的阿来替尼(Alecensa)(批准用于治疗非小细胞肺癌)；靶向CD52的阿仑单抗(Campath)(批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病)；靶向PD-L1的阿替利珠单抗(Tecentriq)(批准用于治疗尿路上皮癌、非小细胞肺癌)；靶向PD-L1的阿维鲁单抗(Bavencio)(批准用于治疗Merkel细胞癌)；靶向KIT、PDGFRβ、VEGFR1/2/3的阿西替尼(Inlyta)(批准用于治疗肾细胞癌)；靶向BAFF的贝利单抗(Benlysta)(批准用于治疗红斑狼疮)；靶向HDAC的贝利司他(Beleodaq)(批准用于治疗外周T细胞淋巴瘤)；靶向VEGF配体的贝伐单抗(Avastin)(批准用于治疗宫颈癌、结直肠癌、输卵管癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、腹膜癌、肾细胞癌)；靶向CD19/CD3的博纳吐单抗(Blincyto)(批准用于治疗急性淋巴细胞白血病(前体B细胞))；靶向蛋白酶体的硼替佐米(Velcade)(批准用于治疗多发性骨髓瘤、曼特尔细胞淋巴瘤)；靶向ABL的博苏替尼(Bosulif)(批准用于治疗慢性粒细胞白血病)；靶向CD30的布仑妥昔单抗韦多汀(Adcetris)(批准用于治疗霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤)；靶向ALK的布加替尼(Alunbig)(批准用于治疗非小细胞肺癌(ALK+))；靶向FLT3、KIT、MET、RET、VEGFR2的卡博扎替尼(Cabometyx，Cometriq)(批准用于治疗甲状腺髓样癌、肾细胞癌)；靶向蛋白酶体的卡非佐米(Kyprolis)(批准用于治疗多发性骨髓瘤)；靶向ALK的色瑞替尼(Zykadia)(批准用于治疗非小细胞肺癌)；靶向EGFR(HER1/ERBB1)的西妥昔单抗(Erbitux)(批准用于治疗结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌)；靶向MEK的考比替尼(Cotellic)(批准用于治疗黑色素瘤)；靶向ALK、MET、ROS1的克唑替尼(Xalkori)(批准用于治疗非小细胞肺癌)；靶向BRAF的达拉菲尼(Tafinlar)(批准用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌)；靶向CD38的达雷木单抗(Darzalex)(批准用于治疗多发性骨髓瘤)；靶向ABL的达沙替尼(Sprycel)(批准用于治疗慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病)；靶向RANKL的地诺单抗(Xgeva)(批准用于治疗骨巨细胞瘤)；靶向B4GALNT1(GD2)的丁努西单抗(Unituxin)(批准用于治疗儿童神经母细胞瘤)；靶向PD-L1的德瓦鲁单抗(Imfinzi)(批准用于治疗尿路上皮癌)；靶向SLAMF7(CS1/CD319/CRACC)的埃洛妥珠单抗(Empliciti)(批准用于治疗多发性骨髓瘤)；靶向IDH2的依那西尼(Idhifa)(批准用于治疗急性髓系白血病)；靶向EGFR(HER1/ERBB1)的埃洛替尼(Tarceva)(批准用于治疗非小细胞肺癌、胰腺癌)；靶向mTOR的依维莫司(Afinitor)(批准用于治疗胰腺、胃肠道或肺源性神经内分泌肿瘤、肾细胞癌、不可切除的室管膜下巨细胞星形细胞瘤、乳腺癌)；靶向EGFR(HER1/ERBB1)的吉非替尼(Iressa)(批准用于治疗非小细胞肺癌)；靶向CD20的伊布替莫单抗(Zevalin)(批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤)；靶向BTK的伊布替尼(Imbruvica)(批准用于治疗曼特尔细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、沃尔登斯特罗姆巨球蛋白血症)；靶向PI3Kδ的伊德拉利西卜(Zydelig)(批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病、滤泡B细胞非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤)；靶向KIT、PDGFR、ABL的伊马替尼(Gleevec)(批准用于治疗胃肠道间质瘤(KIT+)、隆突性皮肤纤维肉瘤、多种血液系统恶性肿瘤)；靶向CTLA-4的易普利姆玛(Yervoy)(批准用于治疗黑色素瘤)；靶向蛋白酶体的伊沙佐米(Ninlaro)(批准用于治疗多发性骨髓瘤)；靶向HER2(ERBB2/neu)、EGFR(HER1/ERBB1)的拉帕替尼(Tykerb)(批准用于治疗乳腺癌(HER2+))；靶向VEGFR2的乐伐替尼(Lenvima)(批准用于治疗肾细胞癌、甲状腺癌)；靶向FLT3的米哚妥林(Rydapt)(批准用于治疗急性髓系白血病(FLT3+))；靶向EGFR(HER1/ERBB1)的耐昔妥珠单抗(Portrazza)(批准用于治疗鳞状非小细胞肺癌)；靶向HER2(ERBB2/neu)的耐拉替尼(Nerlinx)(批准用于治疗乳腺癌)；靶向ABL的尼洛替尼(Tassina)(批准用于治疗慢性粒细胞白血病)；靶向PARP的尼拉帕利(Zejula)(批准用于治疗卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌)；靶向PD-1的纳武利尤单抗(Opdivo)(批准用于治疗结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、尿路上皮癌)；靶向CD20的奥布妥珠单抗(Gazyva)(批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤)；靶向CD20的奥法木单抗(Arzerra，HuMax-CD20)(批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病)；靶向PARP的奥拉帕尼(Lynparza)(批准用于治疗卵巢癌)；靶向PDGFRα的奥拉拉单抗(Lartruvo)(批准用于治疗软组织肉瘤)；靶向EGFR的奥希替尼(Tagrisso)(批准用于治疗非小细胞肺癌)；靶向CDK4、CDK6的帕博西尼(Ibrance)(批准用于治疗乳腺癌)；靶向EGFR(HER1/ERBB1)的帕尼单抗(Vectibix)(批准用于治疗结直肠癌)；靶向HDAC的帕比司他(Farydak)(批准用于治疗多发性骨髓瘤)；靶向VEGFR、PDGFR、KIT的帕唑帕尼(Votrient)(批准用于治疗肾细胞癌)；靶向PD-1的帕博利珠单抗(Keytruda)(批准用于治疗经典霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌(PD-L1+)、头颈部鳞状细胞癌、实体瘤(MSI-H))；靶向HER2(ERBB2/neu)的帕妥珠单抗(Perjeta)(批准用于治疗乳腺癌(HER2+))；靶向ABL、FGFR1-3、FLT3、VEGFR2的泊那替尼(Iclusig)(批准用于治疗慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病)；靶向VEGFR2的雷莫芦单抗(Cyramza)(批准用于治疗结直肠癌、胃癌或胃食管交界处(GEJ)腺癌、非小细胞肺癌)；靶向KIT、PDGFRβ、RAF、RET、VEGFR1/2/3的雷戈非尼(Stivarga)(批准用于治疗结直肠癌、胃肠道间质瘤、肝细胞癌)；靶向CDK4、CDK6的利博昔单抗(Kisqali)(批准用于治疗乳腺癌(HR+、HER2-))；靶向CD20的利妥昔单抗(Rituxan，Mabthera)(批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎、肉芽肿伴多血管炎)；靶向CD20的人利妥昔单抗/透明质酸酶(Rituxan Hycela)(批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)；靶向HDAC的罗米地辛(Istoax)(批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)；靶向PARP的卢卡帕尼(Rubraca)(批准用于治疗卵巢癌)；靶向JAK1/2的鲁索替尼(Jakafi)(批准用于治疗骨髓纤维化)；靶向IL-6的西妥昔单抗(Sylvant)(批准用于治疗多中心卡斯尔门病)；靶向Sipuleucel-T(Provenge)(批准用于治疗前列腺癌)；靶向SMO的索尼德吉(Odomzo)(批准用于治疗基底细胞癌)；靶向VEGFR、PDGFR、KIT、RAF的索拉非尼(Nexavar)(批准用于治疗肝细胞癌、肾细胞癌、甲状腺癌)；靶向mTOR的特姆西莫司(Torisel)(批准用于治疗肾细胞癌)；靶向CD20的托西莫单抗(Bexxar)(批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤)；靶向MEK的曲美替尼(Mekinist)(批准用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌)；靶向HER2(ERBB2/neu)的曲妥珠单抗(Herceptin)(批准用于治疗乳腺癌(HER2+)、胃癌(HER2+))；靶向EGFR(HER1/ERBB1)、RET、VEGFR2的凡德他尼(Caprelsa)(批准用于治疗甲状腺髓样癌)；靶向BRAF的维罗非尼(Zelbraf)(批准用于治疗黑色素瘤)；靶向BCL2的维奈托克(Venclexta)(批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病)；靶向PTCH SMO的维莫德吉(Erivedge)(批准用于治疗基底细胞癌)；靶向HDAC的伏立诺他(Zolinza)(批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤)；靶向PIGF、VEGFA/B的阿柏西普(Zaltrap)(批准用于治疗结直肠癌)等。
适合用于与本公开的方法相关的生物反应调节剂包括但不限于：(1)酪氨酸激酶(RTK)活性抑制剂；(2)丝氨酸/苏氨酸激酶活性抑制剂；(3)肿瘤相关抗原拮抗剂，例如，与肿瘤抗原特异性结合的抗体；(4)凋亡受体激动剂；(5)白细胞介素-2；(6)干扰素-α；(7)干扰素-γ；(8)集落刺激因子；(9)血管生成抑制剂；(10)肿瘤坏死因子拮抗剂。
化学治疗剂为减少癌细胞增殖的非肽类(即非蛋白质)组合物，并且包括细胞毒性剂和细胞生长抑制剂。化学治疗剂的非限制性实例包括烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类)、植物生物碱和类固醇激素。
用于减少细胞增殖的药剂在本领域中是已知的并且已被广泛使用。此类药剂包括括烷化剂，例如氮芥、亚硝基脲、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯，包括但不限于二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(CytoxanTM)、美法仑(L-肌溶素)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链脲佐菌素、氯脲菌素、尿嘧啶氮芥、氮芥、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙烯三聚氰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢物药物包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(FudR)、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤(6-MP)、喷司他汀、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、10-丙炔-5,8-二氮唑酸(PDDF,CB3717)、5,8-二去氮四氢叶酸(DDATHF)、亚叶酸、磷酸氟达拉滨、喷司他汀和吉西他滨。
合适的天然产物及其衍生物(例如，长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和依托泊苷)，包括但不限于，阿糖胞苷、紫杉醇多西他赛/>脱氧科福霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤；布雷奎纳；生物碱，如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛等；鬼臼毒素，如依托泊苷、替尼泊苷等；抗生素，如蒽环类、盐酸柔红霉素(柔红霉素、柔红霉素、西柔比定)、伊达柔比星、阿霉素、表阿霉素和吗啉衍生物等；苯氧腙双环肽，如大卡霉素；碱性糖肽，如博莱霉素；蒽醌苷类，如褶皱霉素(密特拉霉素)；蒽二酮，如米托蒽醌；叠氮吡咯吲哚二酮，如丝裂霉素；大环免疫抑制剂，如环孢霉素、FK-506(他克莫司，普乐可复)、雷帕霉素等，以及类似物。
其他抗增殖细胞毒性剂有维诺拜、CPT-11、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨、雷洛昔芬、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛沙芬。
具有抗增殖活性的微管影响剂也适合使用，包括但不限于异秋水仙碱(NSC406042)、软海绵素B(NSC 609395)、秋水仙碱(NSC 757)、秋水仙素衍生物(例如，NSC33410)、杜洛他汀10(NSC 376128)、美坦素(NSC 153858)、根癌毒素(NSC 332598)、紫杉醇衍生物、多西他赛/>硫代秋水仙素(NSC361792)、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春花碱、硫酸长春新碱、天然和合成的埃博霉素，包括但不限于，脱甲硅烷A、埃博霉烯B、盘皮内酯；雌莫司汀、诺考达唑，以及类似物。
适合使用的激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)包括但不限于肾上腺皮质激素，例如，强的松、地塞米松等；雌激素和孕激素，例如，己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、雌二醇、克罗米芬、他莫昔芬等和肾上腺皮质抑制剂，例如，氨基谷氨酸钠；17α-炔雌醇；己烯雌酚、睾酮、氟氧甲甾酮、丙酸屈莫司他龙、睾酮、甲基强的松龙、甲基睾酮、泼尼松、曲安奈德、氯三氮烯、羟基孕酮、氨基谷丙酰胺、雌甾烷胺、醋酸甲羟孕酮、亮丙脯胺、氟他胺(Drogenil)、托雷米芬(Fareston)和诺雷德。雌激素刺激增殖和分化，因此与雌激素受体结合的组合物被用于阻止这种活动。皮质类固醇可能会抑制T细胞的增殖。
其他化学治疗剂包括金属络合物，例如，顺铂(cis-DDP)、卡铂等；尿素，例如，羟基脲；和肼，例如，N-甲基肼；叶绿毒素；拓扑异构酶抑制剂；普鲁卡因；米托蒽醌；无色伏林；特加富尔；其他相关的抗增殖剂包括免疫抑制剂，例如，霉酚酸、沙利度胺、去甲氧基哌瓜林、氮孢霉素、来氟米特、咪唑立滨、氮螺旋体(SKF 105685)； (ZD 1839，4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)等。
“紫杉烷”包括紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物或前体药物。可以使用本领域技术人员已知的技术轻松制备“紫杉醇”(在本文中应理解为包括类似物、制剂和衍生物，例如，多昔紫杉醇、TAXOLTM、TAXOTERETM(多西紫杉醇的一种制剂)、10-去乙酰基的紫杉醇类似物和3'N-去苯甲酰-3'N-叔丁氧基羰基的紫杉醇类似物)(也参见WO 94/07882、WO 94/07881、WO 94/07880、WO 94/07876、WO 93/23555、WO 93/10076；第5,294,637、5,283,253、5,279,949、5,274,137、5,202,448、5,200,534、5,229,529以及EP 590,267号美国专利)，或从各种商业来源获得，包括例如，西格玛化学公司，密苏里州圣路易斯。(源自太平洋紫杉的T7402；或源自云南红豆杉的T-1912)。
紫杉醇应该理解为不仅指紫杉醇的常见化学可用形式，而且指类似物和衍生物(例如，TaxotereTM多西紫杉醇，如前文所述)和紫杉醇偶联物(例如，紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖、紫杉醇-木糖、或蛋白结合的紫杉醇)。
术语“紫杉烷”还包括多种已知衍生物，包括亲水衍生物和疏水衍生物。紫杉烷衍生物包括但不限于国际专利申请号WO 99/18113中所描述的半乳糖和甘露糖衍生物；WO99/14209中所描述的哌嗪和其他衍生物；WO 99/09021、WO 98/22451和第5,869,680号美国专利中所描述的紫杉烷衍生物；WO 98/28288中所描述的6-硫代衍生物；第5,821,263号美国专利中所描述的亚磺酰胺衍生物；以及第5,415,869号美国专利中所描述的紫杉烷衍生物。进一步包括紫杉醇前体药物，包括但不限于WO 98/58927、WO 98/13059以及第5,824,701号美国专利中所描述的紫杉醇前体药物。
有效的免疫疗法包括抗PD-1/PD-L1免疫疗法和/或其他免疫疗法靶点，例如，可在治疗方法中靶向的免疫检查点标志物，例如，CTLA-4、LAG-3和TIM-3。抗PD-1/PD-L1免疫疗法包括但不限于，例如，包括向受试者施用有效量的一种或多种抗PD-1/PD-L1治疗性拮抗剂的疗法，其中所述拮抗剂包括但不限于，例如，(纳武利尤单抗)、(帕博利珠单抗)、TecentriqTM(阿替利珠单抗)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)、阿维鲁单抗(MSB0010718C)、BMS-936559(MDX-1105)、CA-170、BMS-202、BMS-8、BMS-37、BMS-242等。
CTLA-4(又称CD152)与CD80和CD86结合。针对CTLA-4的抗体已被批准用于治疗某些类型的癌症。CTLA-4与其他免疫疗法的共同抑制作用使CTLA-4成为与其他免疫疗法联合使用治疗某些癌症的良好预选方案。TIM-3也可以靶向用于多种类型癌症的免疫治疗。
LAG-3目前正处于治疗癌症的临床试验阶段。抗LAG-3免疫疗法包括使用拮抗性LAG-3抗体的疗法，而所述抗体既可以激活效应型T细胞(通过下调LAG-3抑制信号进入预激活的LAG-3+细胞)又可以抑制诱导的(即抗原特异性)Treg抑制活动。有效的LAG-3拮抗性抗体包括瑞拉利单抗(BMS-986016；由百时美施贵宝公司研发)、IMP701(由Immutep公司研发)、TSR-033(抗LAG-3mAb；由TESARO公司研发)，以及类似物。
免疫疗法还包括基于T细胞的免疫疗法，例如过，过继性细胞疗法(ACT)和嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。例如，可以向受试者施用经改造以靶向由受试者癌症表达的抗原的CAR-T细胞群。在一些情况下，基于T细胞的疗法可能涉及通过受试者获得细胞样品(例如，血液样品或肿瘤活检组织)，以及从样品中离体培养免疫细胞，对培养的免疫细胞进行或不进行基因修饰。例如，可通过受试者获得免疫细胞，离体培养并用对癌症表达的抗原特异的CAR修饰以产生CAR-T细胞群。然后，可以将CAR-T细胞重新引入受试者体内以靶向癌症。可采用多种方式(例如，通过靶向各种抗原，通过收集/培养各种细胞类型等)对基于T细胞的免疫疗法进行构型，具体取决于待治疗的特定癌症。此外，基于T细胞的免疫疗法可以全身施用，例如，通过静脉内注射，或局部施用(例如，通过输注(例如，腹膜内输注、胸膜导管输注等)、直接注射等。
在一些情况下，本文所述的治疗方法可包括向受试者施用一种或多种多药耐药转运蛋白抑制剂，包括但不限于，例如，除ABCG2之外的多药耐药转运蛋白。多药耐药性转运蛋白的有效抑制剂包括，例如，酪氨酸激酶抑制剂、天然产物、微小RNA和小分子抑制剂。多药耐药转运蛋白抑制剂包括ABC转运蛋白抑制剂。
适用于使用本公开的方法治疗的个体包括患有癌症的个体；被确诊患有癌症的个体；正在接受化疗、放疗、抗体治疗、手术等癌症治疗的个体)；曾接受癌症治疗(例如，化疗、放疗、抗体治疗、手术等其中的一种或多种)但治疗无效的个体；曾接受癌症治疗(例如，化疗、放疗、抗体治疗、手术等其中的一种或多种)并且最初对治疗有反应但随后复发(即，癌症复发)的个体。
本公开的方法可用于靶向和治疗多种癌症，包括例如，原发性癌症、继发性癌症、再生长癌症、复发性癌症、难治性癌症等。例如，在一些情况下，本公开的方法可用作对受试者确定的原发性癌症的初始治疗。在一些情况下，本公开的方法可用作非初级(例如，二级或后期)治疗，例如，在患有对先前治疗无反应的癌症受试者中，在患有先前治疗后重新生长的癌症的受试者中，在对先前治疗有混合反应(例如，对受试者中至少一个肿瘤有阳性反应，对受试者中至少第二个肿瘤有阴性或中性反应)的受试者中等。
在一些情况下，本公开的方法可用于治疗患有耐药性癌症(例如，多药耐药性癌症)的受试者。多药耐药性(MDR)是许多癌症对化疗药物产生耐药性的机制，导致最低限度的细胞死亡和耐药肿瘤的扩张。MDR癌症可能涉及一种或多种耐药机制，包括但不限于，例如，外排泵表达增加、药物吸收减少、细胞死亡或细胞凋亡抑制、药物代谢调节等。在一些情况下，本公开的方法可以预防、逆转或绕过MDR。
在一些情况下，本公开的方法可以包括使用本文所述的有销量的主题抗体与不同于第一药剂的第二药剂结合，治疗患有对第一药剂耐药的癌症的受试者。例如，在一些情况下，受试者的癌症可能对第一种化学疗法具有耐药性，并且可以通过施用本文所述的有销量的主题抗体与不同于第一种化学疗法的第二种化学疗法组合来治疗所述受试者。可根据，例如，待治疗的癌症的类型、产生耐药性的可能性等，可以采用第一种和第二种化学疗法的各种组合。
已知有许多癌症会产生耐药性。由于这个原因和其他原因，本公开的方法可用于治疗各种癌症，包括但不限于，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性细胞白血病(AML)、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症(例如，卡波西肉瘤、淋巴瘤等)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌瘤、基底细胞癌、胆管癌(肝外)、膀胱癌、骨癌(例如，尤因肉瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤等)、脑干胶质瘤、脑肿瘤(例如，星形细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤等)、乳腺癌(例如，女性乳腺癌、男性乳腺癌、儿童乳腺癌等)、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌(例如，儿童、胃肠道等)、不明转移癌、心脏肿瘤、中枢神经系统肿瘤(例如，非典型畸胎瘤/横纹肌瘤、胚胎肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤等)、宫颈癌、儿童癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、长期骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、管癌(例如，胆管、肝外等)、原位导管癌(DCIS)、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(例如，眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤等)、骨纤维组织细胞瘤(例如，恶性、骨肉瘤等)，胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(例如，颅外、性腺外、卵巢、睾丸等)、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增生症(例如，朗格汉斯细胞等)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤(例如，胰腺神经内分泌肿瘤等)、卡波西肉瘤、肾癌(例如，肾细胞、肾母细胞瘤、儿童肾肿瘤等)、朗格汉斯细胞组织细胞病、喉癌、白血病(例如，急性淋巴细胞(ALL)、急性髓细胞(AML)、慢性淋巴细胞(CLL)、慢性粒细胞(CML)、毛细胞等)、唇癌和口腔癌、肝癌(原发性)、小叶原位癌(LCIS)、肺癌(例如，非小细胞、小细胞等)、淋巴瘤(例如，艾滋病相关、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、非霍奇金、原发性中枢神经系统(CNS)等)、巨球蛋白血症(例如，瓦尔登斯特伦病等)、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、转移性伴隐性原发性鳞状颈癌、NUT中线癌、口腔癌、多发内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生/骨髓增生性肿瘤、髓性白血病(例如，慢性(CML)等)、髓细胞白血病(例如，急性(AML)等)，骨髓增生性肿瘤(例如，慢性等)、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口腔癌(例如，唇癌等)、口咽癌、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌(例如，上皮性、生殖细胞肿瘤、低恶性潜能肿瘤等)、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞瘤)、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状腺癌、阴茎癌、喉癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、肉瘤(例如，尤文、卡波西、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织、子宫等)、赛塞里综合征、皮肤癌(例如，儿童、黑色素瘤、Merkel细胞癌、非黑色素瘤等)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈部癌(例如，隐性原发性、转移性等)、胃癌、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、输尿管和肾盂癌、尿道癌、子宫癌(例如，子宫内膜癌等)、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、肾母细胞瘤等。
在一些情况下，本文所描述的治疗方法可以在先前接受过一种或多种常规治疗的受试者中进行。例如，在肿瘤学的情况下，在一些情况下，本文所述的方法可在常规癌症疗法(包括但不限于，例如，常规化疗、常规放疗、常规免疫疗法、手术等)之后进行。在一些情况下，当受试者对常规疗法没有反应或难以治疗时，可以使用本文所描述的治疗方法。在一些情况下，当受试者对常规疗法有反应时，可以使用本文所描述的治疗方法。
在一些情况下，本公开的方法可用于靶向、治疗或清除受试者在先前癌症治疗后残留的微小残留病变(MRD)。无论是否确定或已确定MDR对先前的治疗无效，都可以使用本发明的方法对MRD进行靶向、治疗和/或清除。在一些情况下，在确定受试者的MRD先前治疗或一种或多种可用治疗方案(使用本文所述的多特异性抗体的治疗方案除外)无反应后，本公开的方法可用于靶向、治疗和/或清除受试者所述MRD。
在一些情况下，本公开的可用于预防性监测。例如，当受试者为患有可检测到的疾病但出现复发性癌症(包括，例如，耐药性癌症)的风险时，可以对需要的受试者施用涉及本文所述的一种或多种多特异性抗体进行治疗。在一些情况下，当受试者罹患预计具有耐药性或预期会产生耐药性的原发性癌症的风险特别高时，可以采用预防性方法。在一些情况下，当受试者先前曾接受过癌症治疗并且出现复发或耐药性风险时，可以采用预防性方法。
在一些情况下，本公开的方法可能涉及分析癌症中一种或多种标记物或治疗靶标的表达。例如，在一些情况下，本公开的方法可涉及分析来自受试者的癌症样品，以确定癌症对ABCG2的表达是否高于预定阈值，TAA(例如，CD47、erbB2或EGFR)是否高于预定阈值，或两者。
在一些情况下，是否施用本公开的多特异性抗体对受试者进行治疗，可能取决于ABCG2表达评估和/或ABCG2测试的结果。例如，在一些情况下，如果癌症以预定阈值或高于预定阈值表达TAA，则可以用本公开的多特异性抗体对受试者进行治疗，并且如果癌症以低于预定阈值表达TAA，则可以不使用本公开的多特异性抗体对受试者进行治疗，例如，可以在不适用主题多特异性抗体的情况下，用相关癌症的常规疗法治疗对受试者进行治疗。例如，在一些情况下，如果癌症以预定阈值或高于预定阈值表达ABCG2，则可以用本公开的多特异性抗体对受试者进行治疗，并且如果癌症以低于预定阈值表达ABCG2，则可以不使用本公开的多特异性抗体对受试者进行治疗，例如，可以在不适用主题多特异性抗体的情况下，用相关癌症的常规疗法治疗对受试者进行治疗。例如，在一些情况下，如果癌症以预定阈值或高于预定阈值表达TAA和ABCG2，则可以用本公开的多特异性抗体对受试者进行治疗，并且如果癌症以低于预定阈值表达TAA和ABCG2，则可以不使用本公开的多特异性抗体对受试者进行治疗，例如，可以在不适用主题多特异性抗体的情况下，用相关癌症的常规疗法治疗对受试者进行治疗。
可以采用任何方便的检测方法(例如，流式细胞术、核酸检测(例如，扩增、测序等)、细胞血细胞计数法、免疫组织化学，以及类似方法)来分析ABCG2和/或TAA水平。可采用任何方便的生物样品，包括但不限于，例如，癌症活检样品。可以通过任何方便和适当的方法(包括将测量的表达水平与相应的对照物进行比较)来确定用于评估一种或多种标记物和/或靶标的表达的有用预定阈值。例如，在一些情况下，样品中测定的ABCG2和/或TAA水平的有用预定阈值可能对应于参比池(例如，作为健康/正常细胞)中测定的ABCG2和/或TAA水平。TAA可能是CD47、erbB2、EGFR或PD-L1。
制备方法
如前文所述，本公开的方法还包括制备和/或鉴定本文所描述的多特异性抗体的方法。可通过任何已知方法(例如，用于蛋白质合成的常规合成方法；重组DNA方法等)生产主题抗体。
如果主题抗体为单链多肽形式，则可以使用化学肽标准合成技术合成。如果化学合成多肽，则可通过液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)是用于主题抗体化学合成的合适方法的一个实例，其中所述序列的C端氨基酸连接到不溶性支持物上，然后依次添加序列中剩余的氨基酸。各种形式的SPPS(例如，Fmoc和Boc)均可用于合成主题抗体。有关固相合成的技术可参见：Barany和Merrifield，载于《肽：分析、合成、生物学》(第2卷：肽合成的特殊方法，第A部分)第3-284页，《固相多肽合成》，Merrifield等人，《美国化学会志》，85:2149-2156(1963)；Stewart等人，《固相肽的合成》第2版，Pierce化学出版社，Rockford,III(1984)；以及Ganesan A.2006《药物化学短评》，6:3-10和Camarero JA等人2005，《蛋白质与肽通讯》12:723-8。简而言之，通过用于构建肽链的功能单元对不溶性多孔小球进行处理。经重复偶联/脱保护循环后，固相附着的游离N端胺被偶联至单个N保护氨基酸单元。然后将该单元脱保护，显示可以附着更多氨基酸的新N端胺，。肽在固相上保持固定，并在被切割之前经历过滤过程。
标准重组方法可用于生产主题抗体。例如，编码可变区轻链和重链可变区(可任选链接至恒定区)的核酸被插入到表达载体中。轻链和重链可以克隆至相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作性地连接至确保免疫球蛋白多肽表达的表达载体中的控制序列。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然相关启动子或异源启动子)、信号序列、增强子元件以及转录终止序列。表达控制序列可以是能够转化或转染真核宿主细胞(例如，COS或CHO细胞)的载体中的真核启动子系统。一旦载体被整合到合适的宿主中，宿主始终保持在适合核苷酸序列的高水平表达以及抗体收集和纯化的条件下。
由于遗传密码的简并性，多种核酸序列可以编码每个免疫球蛋白氨基酸序列。可以通过从头固相DNA合成或通过聚合酶链式反应(PCR)对所需多核苷酸的较早制备的变体进行诱变来产生所需的核酸序列。寡核苷酸介导的诱变是制备目标多肽DNA的取代、缺失和插入变体的合适方法的一个实例。参见Adelman等人，DNA 2:183(1983)。简而言之，通过将编码所需突变的寡核苷酸与单链DNA模板杂交，来改变目标多肽DNA。杂交后，使用DNA聚合酶合成包含寡核苷酸引物的模板的完整第二互补链，并且并编码目标多肽DNA中的选定改变。
通常可以将合适的表达载体作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物体中复制。通常，表达载体包含选择标记(例如，氨苄青霉素耐药、潮霉素耐药、四环素耐药、卡那霉素耐药或新霉素耐药)，以允许检测用所需DNA序列转化的细胞。
大肠杆菌是可用于克隆主题抗体编码多核苷酸的原核宿主细胞的实例。适用的其他微生物宿主包括杆菌，例如，枯草芽孢杆菌和其他肠杆菌科(例如，沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌)。在此类原核宿主中，也可以制造表达载体，其通常包含与宿主细胞兼容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，将出现任何数量的各种众所周知的启动子，例如，乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或源自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达，任选地与操纵子序列一起，并且具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。
其他微生物(例如，酵母)也可用于表达。酵母菌属(例如，酿酒酵母)和毕赤酵母属是合适的酵母宿主细胞的实例，其具有表达控制序列的所需的合适载体(例如，启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括源自乙醇脱氢酶、异细胞色素C以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶等。
除微生物外，哺乳动物细胞(例如，在体外细胞培养物中生长的哺乳动物细胞)也可用于表达和产生本发明的多肽(例如，编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。参见Winnacke，《从基因到克隆》，VCH出版社，纽约州纽约市(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系和转化的B细胞或杂交瘤。此类细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(Queen等人，《免疫学评述》，89:49(1986))，以及必要的加工信息位点，例如，核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。合适的表达控制序列的实例是源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见Co等人，《免疫法杂志》148:1149(1992)。
一旦合成(化学方法或重组方法)，整个抗体及其二聚体、单个轻链和重链，或其他形式的主题抗体(例如，scFv等)可以根据本斜体的标准程序(包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、高效液相色谱(HPLC)纯化、凝胶电泳等)进行纯化，(一般参见Scopes,《蛋白质纯化》(施普林格出版社，纽约(1982))。主题抗体可以是高纯抗体，例如，纯度至少约80％至85％、纯度至少约85％至90％、纯度至少约90％至95％、或纯度为98％至99％或更高，例如不含污染物，例如，细胞碎片、除主题抗体以外的大分子等。
在一些实施方案中，产生本公开的多特异性抗体的方法可以包括产生候选抗体和筛选活性。通过使用一系列步骤，此类方法可产生特异性地结合表达ABCG2和TAA的细胞的多特异性抗体。此类方法的步骤可包括：产生一种或若干多特异性抗体，其中每种抗体包括或可能包括ABCG2结合结构域和TAA结合结构域；将表达ABCG2和TAA的第一细胞与所述多特异性抗体或所述若干多特异性抗体接触；将表达ABCG2和TAA的第二细胞与所述多特异性抗体或所述若干多特异性抗体接触；将所述多特异性抗体或所述若干多特异性抗体与所述第一细胞的结合与所述第二细胞的结合进行比较，以确定特异性结合比率；以及当比率高于预定阈值时，将所述多特异性抗体或所述若干多特异性抗体中的一种或多种鉴定为对表达ABCG2和TAA的细胞具有特异性。如果采用这种比较结合的阈值，则该阈值可能不尽相同，并且范围可能为1.5:1或以上，包括但不限于，例如，2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、50:1、100:1等。
在这种方法中可以使用各种细胞，包括但不限于，例如，本文所述的细胞。在一些情况下，可将抗体与仅表达ABCG2的细胞和仅表达癌症相关抗原的细胞相结合。例如，在一些情况下，相对于前述步骤，所述方法可包括，其中所述第二细胞表达ABCG2而不表达TAA，并且所述方法进一步包括将表达TAA但不表达ABCG2的第三细胞与多特异性抗体接触。
在一些情况下，此类方法可采用一种或多种对照物，包括但不限于，例如，对照细胞、对照试剂等。有用的对照细胞包括具有一种或多种相关基因或蛋白质的已知表达或已知缺乏表达的细胞。有用的对照试剂可能包括但不限于，例如，对照抗体，例如，但不限于例如，针对已知靶标的单特异性抗体。例如，在一些情况下，本公开的此类方法可以进一步包括与从单特异性抗ABCG2抗体和单特异性抗TAA抗体中选择的对照抗体接触的第一细胞、第二细胞和/或第三细胞。根据所使用的特定方法，可酌情采用各种其他对照物或额外对照物。
试剂盒
本公开的方面还包括试剂盒。试剂盒可能包括，例如，本文所述的多特异性抗体、试剂、组合物、制剂、细胞、核酸、表达载体或类似物的任何组合。主题试剂盒可包括主题多特异性抗体、编码所述主题抗体的核酸或包含主题多特异性核酸的细胞中的一种或多种。试剂盒可以为各种目的而配置，包括例如，治疗试剂盒(例如，试剂盒可以包括多特异性抗体，以及例如，一种或多种附加活性剂，例如化疗剂)，用于抗体生产的试剂盒，用于筛选抗体的试剂盒以及类似目的。
试剂盒的可选组分不尽相同，例如可能包括：缓冲液；蛋白酶抑制剂等。如果主题试剂盒包括主题核酸，则核酸也可以具有限制性位点、多个克隆位点、引物位点等。试剂盒的各种组分可存放于单独的容器中，或某些相容的组分也可按需要预先组合在单个容器中。
除上述组分外，主题试剂盒还可以包括使用试剂盒组分来实践主题方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在承印物(例如，纸或塑料等)上。因此，说明书可以作为包装插入件存放于试剂盒中，存在于试剂盒或其组件的容器的标签中(即与包装或子包装相关联)等。在其他实施方案中，说明书作为合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件(例如，只读光盘存储器(CD-ROM)、数位多功能光碟(DVD)、软盘等)存在。在其他实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，而是提供从远程源(例如，通过互联网)获得说明书的方法。这一实施方案的实例是包含网址的试剂盒，其中说明书可以在所述网址上查看和/或通过所述网址下载。与说明书一样，用于获取说明书的方法记录在合适的介质上。
本公开的示例性非限制性方面
前文所描述的本主题的各个方面，包括实施方案，可以单独或与一个或多个其他方面或实施方案相结合而受益。在不限制前述说明的情况下，下文将提供本公开的某些非限制性方面。本领域的普通技术人员在阅读本公开内容后，将发现每个单独编号的方面可以与任何前述或以下单独编号的方面一起使用或组合，旨在为所有此类方面的组合提供支下划线持，并且不限于下文明确提供的方面的组合。对于本领域的普通技术人员而言，可以在不偏离本发明的精神或范围的情况下进行各种改变和修改。
下述实施例以说明而非限制的方式提供。
实施例
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并不是为了限制发明者视为其发明的范围，也不是为了表示下述实验是全部或唯一进行的实验。已努力确保所用数字(例如，数量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。
分子和细胞生物化学的一般方法可以在如下标准教科书中找到：《分子克隆：实验室手册》(第3版)(Sambrook等人，美国冷泉港实验室出版社，2001)；《分子生物学精编》，第4版。(Ausubel等人著，约翰威立出版社，1999)；《蛋白质方法》(Bollag等人,约翰威立出版社，1996)；《用于基因治疗的非病毒性载体》(Wagner等人著，学术出版社，1999)；《病毒载体》(Kaplift和Loewy著，学术出版社，1995)；《免疫学方法手册》(I.Lefkovits著，学术出版社，1997)；以及《细胞和组织培养：生物技术实验室程序》(Doyle和Griffiths，约翰威立出版社，1998)，所述教科书中的公开内容通过引用纳入本文。与本公开提及的方法，或与本公开相关的试剂、克隆载体、细胞和试剂盒可通过商业供应商(例如，伯乐生命医学产品公司、安捷伦科技有限公司、赛默飞世尔科技公司、西格玛奥德里奇公司、NEB公司、宝日医生物技术公司，以及其他公司)以及资料库(例如，阿德基因公司、美国标准生物品收藏中心(ATCC)等)获得。
实施例1：对拓扑替康敏感的双特异性抗体的生成
材料和方法
过度表达(Ox)细胞系的稳定ABCG2的生成
为了表征结合和体外效力，开发了稳定过度表达ABCG2的细胞系。使用从美国标准生物品收藏中心(ATCC)获得的贴壁293T初始细胞。使用市售ABCG2抗体(R&DSystems公司生产，克隆5D3)，通过流式细胞术表征，所述细胞系在细胞表面以低至中等程度内源性表达ABCG2。使用Polyplus PEIpro试剂对293T初始细胞、3T3细胞和C6细胞(QZ)进行ABCG2转染。转染后三天，使用潮霉素B溶液(密理博西格玛公司生产)对细胞进行筛选。连续使用潮霉素B筛选293T细胞十四天后，对293T细胞的ABCG2细胞表面表达进行评估。为了确保未转染的细胞在未来的培养物中扩增，使用FACSAriaI(BD生物科学公司生产)对已通过荧光激活细胞分选技术(FACS)分选的ABCG2阳性的293T细胞进行批量分选。对批量分选的293T ABCG2过度表达的细胞进行扩增，随后重新确认ABCG2的过度表达
细胞培养技术和抗体生产
可使用《生物细胞学实验操作规则》((2000)，Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.著，约翰威立出版社)中所述使用标准细胞培养技术。
293细胞用于双特异性抗体的瞬时生产。使用基于聚合物的共转染Expi293细胞(A14527，赛默飞世尔科技公司生产)来表达抗体构建体。按照生产商的建议，细胞与哺乳动物表达载体一起悬浮生长。
为了制备双特异性抗体分子，用相应的表达载体以1:1:4的比例(重链KK：重链DD：轻链)转染细胞。对于标准抗体的表达，采用1:2的比例(重链：轻链)。
转染后约六天，通过离心法收获细胞。具体而言，将每1ml转染培养物中的1ug总编码DNA稀释到培养基(生命科技公司生产)中，并与Expifectamine转染试剂(生命科技公司生产)在同一培养基中孵育20分钟。然后将所得混合物添加到在37℃和8％ CO2的空气中，以250万个细胞/ml的速度在/>表达培养基(生命科技公司生产)中悬浮生长的/>细胞中。6天后，通过离心法收获含有抗体构建体的培养基。6天后，通过离心法收获含有抗体构建体的培养基。
测试分子人鼠序列的构建(人Fc、小鼠Fvs或人Fc，或人源化Fvs)
表达载体：为了生成抗体表达载体，通过将人IgG1恒定轻链或人IgG1κ恒定轻链预插入至优化后用于哺乳动物细胞系中表达的各自的通用受体表达载体中，将重链DNA序列和轻链DNA序列的可变区亚克隆到框架内。将待表达的基因克隆到pCI-neo哺乳动物表达载体(Promega)中，所述载体使用全长人巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子进行高水平基因表达。不同的抗体链被克隆到两个不同的载体中。
源自小鼠的IgG重链和κ轻链的N端信号序列分别用于重链和轻链的分泌表达。在表达过程中，信号肽被切割，留下完整的N端。在Fab构建体中，CH1 IgG1恒定区的C端与6×His标签融合以进行纯化。
为了生成双特异性抗体载体，IgG1衍生的双特异性分子包括至少两个能够特异性地与两个不同的靶标结合的抗原结合部分：TAA和ABCG2。抗原结合部分是由一条重链和一条轻链组成的Fab片段，每个部分均包括可变区和恒定区。确定了一条共同轻链，能够对Fab抗TAA和和Fab抗ABCG2(aABCG2)配对并产生可接受的结合；共同轻链的使用可以避免LC错配。双特异性构建体是基于静电转向效应制备的(参见，例如Gunasekeran等人，(2010)《生物化学杂志》285，19637-19646；其公开内容通过整体引用，构成本发明的一部分)。简而言之，针对靶标的多肽链或半抗体通过CH3结构域的电荷对取代组装成双特异性抗体：一条重链包含K392D和K409D取代(“DD”)，另一条重链包含E356K和D399K取代(“KK”)的。
从小鼠杂交瘤序列中获得可变重链和轻链片段，并将其克隆到相同背景的前导序列和恒定区。
细胞结合试验。通过流式细胞术评估抗体与细胞的结合情况。通过流式细胞术评估抗体与细胞的结合情况。在流式细胞术缓冲液(PBS+2％ FBS+0.02％叠氮化钠)中，将稳定转染以表达人ABCG2或食蟹猴ABCG2(293T_ABCG2_OX)或KT9(293T-KT9OX)的293T细胞洗涤一次，以2×10^6细胞/mL重新悬浮于流式细胞术缓冲液中，并分配以0.1mL/孔加入96孔微量滴定板。将重组抗体以5ug/mL的剂量添加到细胞中以进行初始结合确认，或在流式细胞术缓冲液中从100ug/mL开始连续稀释。将细胞在冰上孵化30分钟后，用流式细胞术缓冲液洗涤细胞两次。用PE标记的F(ab′)2山羊抗人IgG(杰克逊免疫研究实验室公司生产)检测结合抗体，并在Attune NxT流式细胞仪上进行评估。EC50被计算为给出半数最大反应的抗体浓度。
细胞毒性试验。在293T_ABCG2_OX细胞和稳定转染以表达ABCG2的293T细胞上评估抗体对拓扑替康细胞毒性的影响。将细胞以5000个细胞/孔接种在0.05mL测定培养基(DMEM+10％ FBS)中，置于白色平底96孔组织培养板中。在含有100ug/mL(2倍最终浓度)的测试抗体或对照抗体，或20uM(2倍最终浓度)的小分子ABCG2抑制剂烟曲霉毒素C(FTC)的测定培养基中，从200uM开始连续稀释，制备2倍最终测定浓度的拓扑替康。在96孔板中的293T_ABCG2_OX细胞中加入等效容积(0.05mL)的拓扑替康/抗体混合物。然后在37℃、5％ CO2中对孔板进行孵育。72-96小时后，将孔板平衡至室温，并根据生产商推荐的方案使用普洛麦格公司生产发光法细胞活力检测试剂盒评估细胞活力。在Molecular3多模式酶标仪上测量发光，并使用GraphPad Prism 8.0软件分析数据。半数最大抑制浓度(IC50)是反应(细胞生长)降低50％时，药物(托泊替康或其他化疗细胞毒性剂)的浓度。
异种移植研究
材料
细胞：HT1376(ATCC CRL-1472)人膀胱癌细胞系。
小鼠：六十五只5-6周龄的雌性SCID-Biege小鼠(查尔斯河实验室培育)。
试剂：按前述方式产生的G2KT9抗ABCG2×抗CD4 BsAb，人同种型IgG1(Bioxcell公司成产)，拓扑替康。
方法:
细胞培养：在补充有10％的FBS和1％青霉素和1％链霉素的RPMI培养基中，将HT1376细胞在37℃、5％ CO2的条件下培养。所使用的细胞系是正确细胞系，并确认为支原体阴性。
在无菌条件下，将在PBS:Matrigel(1:1)中稀释的-2×106细胞用27G胰岛素注射器皮下注射到50只麻醉的5-6周龄雌性SCID-Biege小鼠体内。
序列
抗ABCG2 5D3抗体可变重(VH)链序列如下：
QVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYINFDGGTTYNPSLRGRISITRDTSKNQFFLQLRSVTPEDTATYYCATFYGAKGTLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:5).
创建了5D3 VH链的人性化形式(v1和v2)。
人源化5D3 VHv1序列如下：
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYINFDGGTTYNPSLRGRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATFYGAKGTLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)。
人源化5D3 VHv2序列如下：
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINFDGGTTYNPSLRGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATFYGAKGTLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)
抗ABCG2 5D3抗体可变轻链序列如下：
DIVLTQSPSSFSVSLGDRVTISCKASGYILNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGFPSRFSGTGSGKDYTLSISSLQTEDVGTYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIR(SEQ ID NO:1)。
创建了5D3 VL链的人性化形式(v1)。
人源化5D3 VLv1序列如下：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASGYILNRLAWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGFPSRFSGSGSGKDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:59)
编码CD47的序列可用：智人CD47分子(CD47)，转录变体1，mRNA NCBI参考序列：NM_001777.3
抗CD47 5F9抗体可变重链序列如下：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)。
抗CD47 5F9抗体可变重链序列如下：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:60)。
抗erbB2抗体、帕妥珠单抗、重链和轻链序列如下：
帕妥珠单抗重链序列：
VH链以粗体加下划线表示。
帕妥珠单抗轻链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:61)
抗erbB1抗体、耐昔妥珠单抗、重链和轻链序列如下：
耐昔妥珠单抗帕重链序列：
/>
VH链以粗体加下划线表示。
耐昔妥珠单抗帕轻链序列：
VL链以粗体加下划线表示。
抗PD-L1抗体、阿替利珠单抗、可变重链和轻链序列如下：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPY GGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQ GTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。
结果
图1显示了在存在抗ABCG2抗体5D3以及与ABCG2和CD47结合的双特异性抗体的情况下，过度表达ABCG2的293T细胞对托泊替康的敏感性增加。双特异性抗体5D3DDKT14KK5D3包括源自抗ABCG2抗体5D3的重链(HC)和轻链(LC)以及源自抗CD47抗体5F9的HC。双特异性抗体5D3hVHv1DDKT14KK5D3hVLv1包括源自抗ABCG2抗体5D3的HC和LC以及源自抗CD47抗体5F9的HC。双特异性抗体5D3hVHv2DDKT14KK5D3hVLv1包括源自抗ABCG2抗体5D3的HC和LC，以及源自抗CD47抗体5F9的HC。hVHv1和hVHv2分别指5D3 HC的人源化可变重链形式1和形式2，hVLv1指5D3 LC的人源化可变轻链形式1。KT14指CD47。DD和KK指增强5D3和5F9 HC之间配对的带电对取代。IC50值以nM为单位。
图2显示了5D3和人源化5D3抗体与稳定转染以表达人ABCG2(293T-G2 OX)的293T细胞的结合以及相应的EC50值。结果表明人源化不会显著干扰5D3抗体的效力。
图3显示了各种人源化ABCG2/KT9双特异性抗体与稳定转染以表达ABCG2的3T3细胞(3T3-G2)、稳定转染以表达人ABCG2的293T细胞(293T_ABCG2_OX)、以及稳定转染以表达人KT9的293T细胞(293T-KT9OX)的结合情况。KT9为阿替利珠单抗，一种抗PD-L1抗体，而5D3为一种抗ABCG2抗体。人源化双特异性抗体5D3hVH-v1DD KT9KK 5D3hVl-v1和5D3hVH-v2DDKT9KK 5D3hVL-v1包括源自抗ABCG2抗体5D3的HC和LC，以及源自抗PD-L1抗体KT9的HC。结果表明人源化双特异性抗体保留了分别与其靶点ABCG2和PD-L1结合的能力。
图4显示人源化5D3/KT9/5D3双特异性抗体与稳定转染ABCG2(293T-G2OX)、KT9(293T-KT9OX)以及ABCG2和KT9(293T-G2KT9OX)的293T细胞的结合，以及相应的EC50结合亲和力。结果表明所测试的人源化双特异性抗体保留了与其各自的靶点结合的能力。
图5显示了使用HT1376(ATCC CRL-1472)人膀胱上皮癌细胞系，测试ABCG2/PD-L1双特异性抗体(5D3/KT9)的单独施用以及与拓扑替康联合施用的细胞毒活性的异种移植研究结果。所述的双特异性抗体，无论是作为单独药剂还是与拓扑替康联合使用，均有效。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过举例说明和实施例相当详细地描述了前述发明，但是在本发明的教导下对本领域普通技术人员将显而易见的是，在不背离附加权利要求的精神和范围的情况下可对本发明进行某些改变和修饰。
因此，上文仅仅说明了本发明的原理。应当理解，尽管在本文中没有明确地描述或显示，但是本领域技术人员将能够设计出各种体现本发明原理并被包括在本发明的精神和范围内的各种配置。此外，本文叙述的所有实施例和条件语句主要是用来帮助读者理解本发明的原理和本发明人作出贡献以推动本领域的理念，并且应当被解释为并不限制于此类具体列举的实施例和条件。此外，本文中叙述本发明原理、方面和实施方案及其具体实施例的所有陈述旨在涵盖其结构等价物和功能等价物两者。此外，此类等同物旨在包括当前已知的等价物和将来开发的等同物，即包括所开发的实现相同功能的任何要素，而不管结构如何。此外，本文中所公开的任何内容都并非旨在贡献给公众，无论权利要求是否明确地叙述此类公开。
因此，并不旨在将本发明的范围限制于本文中显示和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由附加权利要求体现。在权力要求书中，《美国法典》第35卷第112(f)条或《美国法典》第35卷第112(6)条被明确定义为仅当在权利要求中的某项限制的开始部分使用“用于......的方式”或“用于......的步骤”的确切措辞时，才会在权利要求书中援引该限制；如果权利要求书的限制中未使用前述确切措辞，则《美国法典》第35卷第112(f)条或《美国法典》第35卷第112(6)条不会被援引。
序列表
<110> 肯乔克蒂生物技术股份有限公司
W·R·阿拉松
R·布莱恩特
S·莫汉蒂
P·D·波那斯
翟倩婷
<120> ABCG2外排泵-癌症抗原多特异性抗体及其相关组合物、试剂、试剂盒和方法
<130> KNJY-005WO
<150> US 63/034,822
<151> 2020年6月4日
<160> 69
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Phe Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Thr Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Asn Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 4
Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Phe Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Phe Asp Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Arg Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Phe Tyr Gly Ala Lys Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 6
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Phe Asp Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Phe Tyr Gly Ala Lys Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Asn Phe Asp Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Phe Tyr Gly Ala Lys Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 9
Asn Tyr Asn Met His
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 10
Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 11
Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 13
Asp Tyr Thr Met Asp
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 14
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 15
Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 17
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Leu Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 18
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 21
Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 23
Asn Tyr Gly Val His
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 24
Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 25
Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 26
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 28
Asp Ser Trp Ile His
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 29
Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 30
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 31
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 32
<211> 655
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Met Ser Ser Ser Asn Val Glu Val Phe Ile Pro Val Ser Gln Gly Asn
1 5 10 15
Thr Asn Gly Phe Pro Ala Thr Ala Ser Asn Asp Leu Lys Ala Phe Thr
20 25 30
Glu Gly Ala Val Leu Ser Phe His Asn Ile Cys Tyr Arg Val Lys Leu
35 40 45
Lys Ser Gly Phe Leu Pro Cys Arg Lys Pro Val Glu Lys Glu Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Ile Asn Gly Ile Met Lys Pro Gly Leu Asn Ala Ile Leu Gly
65 70 75 80
Pro Thr Gly Gly Gly Lys Ser Ser Leu Leu Asp Val Leu Ala Ala Arg
85 90 95
Lys Asp Pro Ser Gly Leu Ser Gly Asp Val Leu Ile Asn Gly Ala Pro
100 105 110
Arg Pro Ala Asn Phe Lys Cys Asn Ser Gly Tyr Val Val Gln Asp Asp
115 120 125
Val Val Met Gly Thr Leu Thr Val Arg Glu Asn Leu Gln Phe Ser Ala
130 135 140
Ala Leu Arg Leu Ala Thr Thr Met Thr Asn His Glu Lys Asn Glu Arg
145 150 155 160
Ile Asn Arg Val Ile Gln Glu Leu Gly Leu Asp Lys Val Ala Asp Ser
165 170 175
Lys Val Gly Thr Gln Phe Ile Arg Gly Val Ser Gly Gly Glu Arg Lys
180 185 190
Arg Thr Ser Ile Gly Met Glu Leu Ile Thr Asp Pro Ser Ile Leu Phe
195 200 205
Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Ala Asn Ala Val
210 215 220
Leu Leu Leu Leu Lys Arg Met Ser Lys Gln Gly Arg Thr Ile Ile Phe
225 230 235 240
Ser Ile His Gln Pro Arg Tyr Ser Ile Phe Lys Leu Phe Asp Ser Leu
245 250 255
Thr Leu Leu Ala Ser Gly Arg Leu Met Phe His Gly Pro Ala Gln Glu
260 265 270
Ala Leu Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Gly Tyr His Cys Glu Ala Tyr Asn
275 280 285
Asn Pro Ala Asp Phe Phe Leu Asp Ile Ile Asn Gly Asp Ser Thr Ala
290 295 300
Val Ala Leu Asn Arg Glu Glu Asp Phe Lys Ala Thr Glu Ile Ile Glu
305 310 315 320
Pro Ser Lys Gln Asp Lys Pro Leu Ile Glu Lys Leu Ala Glu Ile Tyr
325 330 335
Val Asn Ser Ser Phe Tyr Lys Glu Thr Lys Ala Glu Leu His Gln Leu
340 345 350
Ser Gly Gly Glu Lys Lys Lys Lys Ile Thr Val Phe Lys Glu Ile Ser
355 360 365
Tyr Thr Thr Ser Phe Cys His Gln Leu Arg Trp Val Ser Lys Arg Ser
370 375 380
Phe Lys Asn Leu Leu Gly Asn Pro Gln Ala Ser Ile Ala Gln Ile Ile
385 390 395 400
Val Thr Val Val Leu Gly Leu Val Ile Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Leu
405 410 415
Lys Asn Asp Ser Thr Gly Ile Gln Asn Arg Ala Gly Val Leu Phe Phe
420 425 430
Leu Thr Thr Asn Gln Cys Phe Ser Ser Val Ser Ala Val Glu Leu Phe
435 440 445
Val Val Glu Lys Lys Leu Phe Ile His Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Tyr
450 455 460
Arg Val Ser Ser Tyr Phe Leu Gly Lys Leu Leu Ser Asp Leu Leu Pro
465 470 475 480
Met Arg Met Leu Pro Ser Ile Ile Phe Thr Cys Ile Val Tyr Phe Met
485 490 495
Leu Gly Leu Lys Pro Lys Ala Asp Ala Phe Phe Val Met Met Phe Thr
500 505 510
Leu Met Met Val Ala Tyr Ser Ala Ser Ser Met Ala Leu Ala Ile Ala
515 520 525
Ala Gly Gln Ser Val Val Ser Val Ala Thr Leu Leu Met Thr Ile Cys
530 535 540
Phe Val Phe Met Met Ile Phe Ser Gly Leu Leu Val Asn Leu Thr Thr
545 550 555 560
Ile Ala Ser Trp Leu Ser Trp Leu Gln Tyr Phe Ser Ile Pro Arg Tyr
565 570 575
Gly Phe Thr Ala Leu Gln His Asn Glu Phe Leu Gly Gln Asn Phe Cys
580 585 590
Pro Gly Leu Asn Ala Thr Gly Asn Asn Pro Cys Asn Tyr Ala Thr Cys
595 600 605
Thr Gly Glu Glu Tyr Leu Val Lys Gln Gly Ile Asp Leu Ser Pro Trp
610 615 620
Gly Leu Trp Lys Asn His Val Ala Leu Ala Cys Met Ile Val Ile Phe
625 630 635 640
Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Lys Leu Leu Phe Leu Lys Lys Tyr Ser
645 650 655
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Lys Asn Asp Ser Thr Gly Ile Gln Asn Arg Ala Gly
1 5 10
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Leu Lys Pro Lys Ala Asp Ala Phe
1 5
<210> 35
<211> 74
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Asn Leu Thr Thr Ile Ala Ser Trp Leu Ser Trp Leu Gln Tyr Phe Ser
1 5 10 15
Ile Pro Arg Tyr Gly Phe Thr Ala Leu Gln His Asn Glu Phe Leu Gly
20 25 30
Gln Asn Phe Cys Pro Gly Leu Asn Ala Thr Gly Asn Asn Pro Cys Asn
35 40 45
Tyr Ala Thr Cys Thr Gly Glu Glu Tyr Leu Val Lys Gln Gly Ile Asp
50 55 60
Leu Ser Pro Trp Gly Leu Trp Lys Asn His
65 70
<210> 36
<211> 657
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 36
Met Ser Ser Ser Asn Asp His Val Leu Val Pro Met Ser Gln Arg Asn
1 5 10 15
Asn Asn Gly Leu Pro Arg Thr Asn Ser Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala
20 25 30
Glu Gly Asp Val Leu Ser Phe His His Ile Thr Tyr Arg Val Lys Val
35 40 45
Lys Ser Gly Phe Leu Val Arg Lys Thr Val Glu Lys Glu Ile Leu Ser
50 55 60
Asp Ile Asn Gly Ile Met Lys Pro Gly Leu Asn Ala Ile Leu Gly Pro
65 70 75 80
Thr Gly Gly Gly Lys Ser Ser Leu Leu Asp Val Leu Ala Ala Arg Lys
85 90 95
Asp Pro Lys Gly Leu Ser Gly Asp Val Leu Ile Asn Gly Ala Pro Gln
100 105 110
Pro Ala His Phe Lys Cys Cys Ser Gly Tyr Val Val Gln Asp Asp Val
115 120 125
Val Met Gly Thr Leu Thr Val Arg Glu Asn Leu Gln Phe Ser Ala Ala
130 135 140
Leu Arg Leu Pro Thr Thr Met Lys Asn His Glu Lys Asn Glu Arg Ile
145 150 155 160
Asn Thr Ile Ile Lys Glu Leu Gly Leu Glu Lys Val Ala Asp Ser Lys
165 170 175
Val Gly Thr Gln Phe Ile Arg Gly Ile Ser Gly Gly Glu Arg Lys Arg
180 185 190
Thr Ser Ile Gly Met Glu Leu Ile Thr Asp Pro Ser Ile Leu Phe Leu
195 200 205
Asp Glu Pro Thr Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Ala Asn Ala Val Leu
210 215 220
Leu Leu Leu Lys Arg Met Ser Lys Gln Gly Arg Thr Ile Ile Phe Ser
225 230 235 240
Ile His Gln Pro Arg Tyr Ser Ile Phe Lys Leu Phe Asp Ser Leu Thr
245 250 255
Leu Leu Ala Ser Gly Lys Leu Val Phe His Gly Pro Ala Gln Lys Ala
260 265 270
Leu Glu Tyr Phe Ala Ser Ala Gly Tyr His Cys Glu Pro Tyr Asn Asn
275 280 285
Pro Ala Asp Phe Phe Leu Asp Val Ile Asn Gly Asp Ser Ser Ala Val
290 295 300
Met Leu Asn Arg Glu Glu Gln Asp Asn Glu Ala Asn Lys Thr Glu Glu
305 310 315 320
Pro Ser Lys Gly Glu Lys Pro Val Ile Glu Asn Leu Ser Glu Phe Tyr
325 330 335
Ile Asn Ser Ala Ile Tyr Gly Glu Thr Lys Ala Glu Leu Asp Gln Leu
340 345 350
Pro Gly Ala Gln Glu Lys Lys Gly Thr Ser Ala Phe Lys Glu Pro Val
355 360 365
Tyr Val Thr Ser Phe Cys His Gln Leu Arg Trp Ile Ala Arg Arg Ser
370 375 380
Phe Lys Asn Leu Leu Gly Asn Pro Gln Ala Ser Val Ala Gln Leu Ile
385 390 395 400
Val Thr Val Ile Leu Gly Leu Ile Ile Gly Ala Ile Tyr Phe Asp Leu
405 410 415
Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Met Gln Asn Arg Ala Gly Val Leu Phe Phe
420 425 430
Leu Thr Thr Asn Gln Cys Phe Ser Ser Val Ser Ala Val Glu Leu Phe
435 440 445
Val Val Glu Lys Lys Leu Phe Ile His Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Tyr
450 455 460
Arg Val Ser Ser Tyr Phe Phe Gly Lys Val Met Ser Asp Leu Leu Pro
465 470 475 480
Met Arg Phe Leu Pro Ser Val Ile Phe Thr Cys Val Leu Tyr Phe Met
485 490 495
Leu Gly Leu Lys Lys Thr Val Asp Ala Phe Phe Ile Met Met Phe Thr
500 505 510
Leu Ile Met Val Ala Tyr Thr Ala Ser Ser Met Ala Leu Ala Ile Ala
515 520 525
Thr Gly Gln Ser Val Val Ser Val Ala Thr Leu Leu Met Thr Ile Ala
530 535 540
Phe Val Phe Met Met Leu Phe Ser Gly Leu Leu Val Asn Leu Arg Thr
545 550 555 560
Ile Gly Pro Trp Leu Ser Trp Leu Gln Tyr Phe Ser Ile Pro Arg Tyr
565 570 575
Gly Phe Thr Ala Leu Gln Tyr Asn Glu Phe Leu Gly Gln Glu Phe Cys
580 585 590
Pro Gly Phe Asn Val Thr Asp Asn Ser Thr Cys Val Asn Ser Tyr Ala
595 600 605
Ile Cys Thr Gly Asn Glu Tyr Leu Ile Asn Gln Gly Ile Glu Leu Ser
610 615 620
Pro Trp Gly Leu Trp Lys Asn His Val Ala Leu Ala Cys Met Ile Ile
625 630 635 640
Ile Phe Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Lys Leu Leu Phe Leu Lys Lys Tyr
645 650 655
Ser
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 37
Asp Leu Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Met Gln Asn Arg Ala Gly
1 5 10
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 38
Leu Lys Lys Thr Val Asp Ala Phe
1 5
<210> 39
<211> 76
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 39
Asn Leu Arg Thr Ile Gly Pro Trp Leu Ser Trp Leu Gln Tyr Phe Ser
1 5 10 15
Ile Pro Arg Tyr Gly Phe Thr Ala Leu Gln Tyr Asn Glu Phe Leu Gly
20 25 30
Gln Glu Phe Cys Pro Gly Phe Asn Val Thr Asp Asn Ser Thr Cys Val
35 40 45
Asn Ser Tyr Ala Ile Cys Thr Gly Asn Glu Tyr Leu Ile Asn Gln Gly
50 55 60
Ile Glu Leu Ser Pro Trp Gly Leu Trp Lys Asn His
65 70 75
<210> 40
<211> 655
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 40
Met Ser Ser Ser Asn Val Glu Val Phe Ile Pro Met Ser Gln Glu Asn
1 5 10 15
Thr Asn Gly Phe Pro Thr Thr Thr Ser Asn Asp Arg Lys Ala Phe Thr
20 25 30
Glu Gly Ala Val Leu Ser Phe His Asn Ile Cys Tyr Arg Val Lys Val
35 40 45
Lys Ser Gly Phe Leu Pro Gly Arg Lys Pro Val Glu Lys Glu Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Ile Asn Gly Ile Met Lys Pro Gly Leu Asn Ala Ile Leu Gly
65 70 75 80
Pro Thr Gly Gly Gly Lys Ser Ser Leu Leu Asp Val Leu Ala Ala Arg
85 90 95
Lys Asp Pro Ser Gly Leu Ser Gly Asp Val Leu Ile Asn Gly Ala Leu
100 105 110
Arg Pro Thr Asn Phe Lys Cys Asn Ser Gly Tyr Val Val Gln Asp Asp
115 120 125
Val Val Met Gly Thr Leu Thr Val Arg Glu Asn Leu Gln Phe Ser Ala
130 135 140
Ala Leu Arg Leu Pro Thr Thr Met Thr Asn His Glu Lys Asn Glu Arg
145 150 155 160
Ile Asn Arg Val Ile Gln Glu Leu Gly Leu Asp Lys Val Ala Asp Ser
165 170 175
Lys Val Gly Thr Gln Phe Ile Arg Gly Val Ser Gly Gly Glu Arg Lys
180 185 190
Arg Thr Ser Ile Gly Met Glu Leu Ile Thr Asp Pro Ser Ile Leu Phe
195 200 205
Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Ala Asn Ala Val
210 215 220
Leu Leu Leu Leu Lys Arg Met Ser Lys Gln Gly Arg Thr Ile Ile Phe
225 230 235 240
Ser Ile His Gln Pro Arg Tyr Ser Ile Phe Lys Leu Phe Asp Ser Leu
245 250 255
Thr Leu Leu Ala Ser Gly Arg Leu Met Phe His Gly Pro Ala Gln Glu
260 265 270
Ala Leu Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Gly Tyr His Cys Glu Ala Tyr Asn
275 280 285
Asn Pro Ala Asp Phe Phe Leu Asp Ile Ile Asn Gly Asp Ser Thr Ala
290 295 300
Val Ala Leu Asn Arg Glu Glu Asp Phe Lys Ala Thr Glu Ile Ile Glu
305 310 315 320
Pro Ser Lys Arg Asp Lys Pro Leu Val Glu Lys Leu Ala Glu Ile Tyr
325 330 335
Val Asp Ser Ser Phe Tyr Lys Glu Thr Lys Ala Glu Leu His Gln Leu
340 345 350
Ser Gly Gly Glu Lys Lys Lys Lys Ile Thr Val Phe Lys Glu Ile Ser
355 360 365
Tyr Thr Thr Ser Phe Cys His Gln Leu Arg Trp Val Ser Lys Arg Ser
370 375 380
Phe Lys Asn Leu Leu Gly Asn Pro Gln Ala Ser Ile Ala Gln Ile Ile
385 390 395 400
Val Thr Val Ile Leu Gly Leu Val Ile Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Leu
405 410 415
Asn Asn Asp Ser Thr Gly Ile Gln Asn Arg Ala Gly Val Leu Phe Phe
420 425 430
Leu Thr Thr Asn Gln Cys Phe Ser Ser Val Ser Ala Val Glu Leu Phe
435 440 445
Val Val Glu Lys Lys Leu Phe Ile His Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Tyr
450 455 460
Arg Val Ser Ser Tyr Phe Phe Gly Lys Leu Leu Ser Asp Leu Leu Pro
465 470 475 480
Met Arg Met Leu Pro Ser Ile Ile Phe Thr Cys Ile Val Tyr Phe Met
485 490 495
Leu Gly Leu Lys Pro Thr Ala Asp Ala Phe Phe Ile Met Met Phe Thr
500 505 510
Leu Met Met Val Ala Tyr Ser Ala Ser Ser Met Ala Leu Ala Ile Ala
515 520 525
Ala Gly Gln Ser Val Val Ser Val Ala Thr Leu Leu Met Thr Ile Cys
530 535 540
Phe Val Phe Met Met Ile Phe Ser Gly Leu Leu Val Asn Leu Thr Thr
545 550 555 560
Ile Ala Ser Trp Leu Ser Trp Leu Gln Tyr Phe Ser Ile Pro Arg Tyr
565 570 575
Gly Phe Thr Ala Leu Gln His Asn Glu Phe Leu Gly Gln Asn Phe Cys
580 585 590
Pro Gly Leu Asn Ala Thr Val Asn Asn Thr Cys Asn Tyr Ala Thr Cys
595 600 605
Thr Gly Glu Glu Tyr Leu Thr Lys Gln Gly Ile Asp Leu Ser Pro Trp
610 615 620
Gly Leu Trp Lys Asn His Val Ala Leu Ala Cys Met Ile Val Ile Phe
625 630 635 640
Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Lys Leu Leu Phe Leu Lys Lys Tyr Ser
645 650 655
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 41
Asn Asn Asp Ser Thr Gly Ile Gln Asn Arg Ala Gly
1 5 10
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 42
Leu Lys Pro Thr Ala Asp Ala Phe
1 5
<210> 43
<211> 74
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 43
Asn Leu Thr Thr Ile Ala Ser Trp Leu Ser Trp Leu Gln Tyr Phe Ser
1 5 10 15
Ile Pro Arg Tyr Gly Phe Thr Ala Leu Gln His Asn Glu Phe Leu Gly
20 25 30
Gln Asn Phe Cys Pro Gly Leu Asn Ala Thr Val Asn Asn Thr Cys Asn
35 40 45
Tyr Ala Thr Cys Thr Gly Glu Glu Tyr Leu Thr Lys Gln Gly Ile Asp
50 55 60
Leu Ser Pro Trp Gly Leu Trp Lys Asn His
65 70
<210> 44
<211> 655
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<400> 44
Met Ser Ser Ser Asn Val Glu Val Phe Ile Pro Met Ser Gln Gly Asn
1 5 10 15
Thr Asn Gly Phe Pro Ala Thr Thr Ser Asn Asp Leu Lys Ala Phe Thr
20 25 30
Glu Gly Ala Val Leu Ser Phe His Asn Ile Cys Tyr Arg Val Lys Leu
35 40 45
Lys Ser Gly Phe Leu Pro Cys Arg Lys Pro Val Glu Lys Glu Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Ile Asn Gly Ile Met Lys Pro Gly Leu Asn Ala Ile Leu Gly
65 70 75 80
Pro Thr Gly Gly Gly Lys Ser Ser Leu Leu Asp Val Leu Ala Ala Arg
85 90 95
Lys Asp Pro Ser Gly Leu Ser Gly Asp Val Leu Ile Asn Gly Ala Pro
100 105 110
Arg Pro Ala Asn Phe Lys Cys Asn Ser Gly Tyr Val Val Gln Asp Asp
115 120 125
Val Val Met Gly Thr Leu Thr Val Arg Glu Asn Leu Gln Phe Ser Ala
130 135 140
Ala Leu Arg Leu Pro Thr Thr Met Thr Asn His Glu Lys Asn Glu Arg
145 150 155 160
Ile Asn Arg Val Ile Gln Glu Leu Gly Leu Asp Lys Val Ala Asp Ser
165 170 175
Lys Val Gly Thr Gln Phe Ile Arg Gly Val Ser Gly Gly Glu Arg Lys
180 185 190
Arg Thr Ser Ile Gly Met Glu Leu Ile Thr Asp Pro Ser Ile Leu Phe
195 200 205
Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Ala Asn Ala Val
210 215 220
Leu Leu Leu Leu Lys Arg Met Ser Lys Gln Gly Arg Thr Ile Ile Phe
225 230 235 240
Ser Ile His Gln Pro Arg Tyr Ser Ile Phe Lys Leu Phe Asp Ser Leu
245 250 255
Thr Leu Leu Ala Ser Gly Arg Leu Met Phe His Gly Pro Ala Gln Glu
260 265 270
Ala Leu Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Gly Tyr His Cys Glu Ala Tyr Asn
275 280 285
Asn Pro Ala Asp Phe Phe Leu Asp Ile Ile Asn Gly Asp Ser Thr Ala
290 295 300
Val Ala Leu Asn Arg Glu Glu Asp Phe Lys Ala Thr Glu Ile Ile Glu
305 310 315 320
Pro Ser Lys Gln Asp Lys Pro Leu Ile Glu Lys Leu Ala Glu Ile Tyr
325 330 335
Val Asn Ser Ser Phe Tyr Lys Glu Thr Lys Ala Glu Leu His Gln Leu
340 345 350
Ser Gly Gly Glu Lys Lys Lys Lys Ile Thr Val Phe Lys Glu Ile Ser
355 360 365
Tyr Thr Thr Ser Phe Cys His Gln Leu Arg Trp Val Ser Lys Arg Ser
370 375 380
Phe Lys Asn Leu Leu Gly Asn Pro Gln Ala Ser Ile Ala Gln Ile Ile
385 390 395 400
Val Thr Val Ile Leu Gly Leu Val Ile Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Leu
405 410 415
Lys Asn Asp Ser Thr Gly Ile Gln Asn Arg Ala Gly Val Leu Phe Phe
420 425 430
Leu Thr Thr Asn Gln Cys Phe Ser Ser Val Ser Ala Val Glu Leu Phe
435 440 445
Val Val Glu Lys Lys Leu Phe Ile His Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Tyr
450 455 460
Arg Val Ser Ser Tyr Phe Leu Gly Lys Leu Leu Ser Asp Leu Leu Pro
465 470 475 480
Met Arg Met Leu Pro Ser Ile Ile Phe Thr Cys Ile Val Tyr Phe Met
485 490 495
Leu Gly Leu Lys Pro Lys Ala Asp Ala Phe Phe Val Met Met Phe Thr
500 505 510
Leu Met Met Val Ala Tyr Ser Ala Ser Ser Met Ala Leu Ala Ile Ala
515 520 525
Ala Gly Gln Ser Val Val Ser Val Ala Thr Leu Leu Met Thr Ile Cys
530 535 540
Phe Val Phe Met Met Ile Phe Ser Gly Leu Leu Val Asn Leu Thr Thr
545 550 555 560
Ile Ala Ser Trp Leu Ser Trp Leu Gln Tyr Phe Ser Ile Pro Arg Tyr
565 570 575
Gly Phe Thr Ala Leu Gln His Asn Glu Phe Leu Gly Gln Asn Phe Cys
580 585 590
Pro Gly Leu Asn Ala Thr Gly Asn Asn Pro Cys Asn Tyr Ala Thr Cys
595 600 605
Thr Gly Glu Glu Tyr Leu Val Lys Gln Gly Ile Asp Leu Ser Pro Trp
610 615 620
Gly Leu Trp Lys Asn His Val Ala Leu Ala Cys Met Ile Val Ile Phe
625 630 635 640
Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Lys Leu Leu Phe Leu Lys Lys Tyr Ser
645 650 655
<210> 45
<211> 655
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Ser Ser Ser Asn Val Glu Val Phe Ile Pro Val Ser Gln Gly Asn
1 5 10 15
Thr Asn Gly Phe Pro Ala Thr Ala Ser Asn Asp Leu Lys Ala Phe Thr
20 25 30
Glu Gly Ala Val Leu Ser Phe His Asn Ile Cys Tyr Arg Val Lys Leu
35 40 45
Lys Ser Gly Phe Leu Pro Cys Arg Lys Pro Val Glu Lys Glu Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Ile Asn Gly Ile Met Lys Pro Gly Leu Asn Ala Ile Leu Gly
65 70 75 80
Pro Thr Gly Gly Gly Lys Ser Ser Leu Leu Asp Val Leu Ala Ala Arg
85 90 95
Lys Asp Pro Ser Gly Leu Ser Gly Asp Val Leu Ile Asn Gly Ala Pro
100 105 110
Arg Pro Ala Asn Phe Lys Cys Asn Ser Gly Tyr Val Val Gln Asp Asp
115 120 125
Val Val Met Gly Thr Leu Thr Val Arg Glu Asn Leu Gln Phe Ser Ala
130 135 140
Ala Leu Arg Leu Ala Thr Thr Met Thr Asn His Glu Lys Asn Glu Arg
145 150 155 160
Ile Asn Arg Val Ile Gln Glu Leu Gly Leu Asp Lys Val Ala Asp Ser
165 170 175
Lys Val Gly Thr Gln Phe Ile Arg Gly Val Ser Gly Gly Glu Arg Lys
180 185 190
Arg Thr Ser Ile Gly Met Glu Leu Ile Thr Asp Pro Ser Ile Leu Phe
195 200 205
Leu Asp Gln Pro Thr Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Ala Asn Ala Val
210 215 220
Leu Leu Leu Leu Lys Arg Met Ser Lys Gln Gly Arg Thr Ile Ile Phe
225 230 235 240
Ser Ile His Gln Pro Arg Tyr Ser Ile Phe Lys Leu Phe Asp Ser Leu
245 250 255
Thr Leu Leu Ala Ser Gly Arg Leu Met Phe His Gly Pro Ala Gln Glu
260 265 270
Ala Leu Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Gly Tyr His Cys Glu Ala Tyr Asn
275 280 285
Asn Pro Ala Asp Phe Phe Leu Asp Ile Ile Asn Gly Asp Ser Thr Ala
290 295 300
Val Ala Leu Asn Arg Glu Glu Asp Phe Lys Ala Thr Glu Ile Ile Glu
305 310 315 320
Pro Ser Lys Gln Asp Lys Pro Leu Ile Glu Lys Leu Ala Glu Ile Tyr
325 330 335
Val Asn Ser Ser Phe Tyr Lys Glu Thr Lys Ala Glu Leu His Gln Leu
340 345 350
Ser Gly Gly Glu Lys Lys Lys Lys Ile Thr Val Phe Lys Glu Ile Ser
355 360 365
Tyr Thr Thr Ser Phe Cys His Gln Leu Arg Trp Val Ser Lys Arg Ser
370 375 380
Phe Lys Asn Leu Leu Gly Asn Pro Gln Ala Ser Ile Ala Gln Ile Ile
385 390 395 400
Val Thr Val Val Leu Gly Leu Val Ile Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Leu
405 410 415
Lys Asn Asp Ser Thr Gly Ile Gln Asn Arg Ala Gly Val Leu Phe Phe
420 425 430
Leu Thr Thr Asn Gln Cys Phe Ser Ser Val Ser Ala Val Glu Leu Phe
435 440 445
Val Val Glu Lys Lys Leu Phe Ile His Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Tyr
450 455 460
Arg Val Ser Ser Tyr Phe Leu Gly Lys Leu Leu Ser Asp Leu Leu Pro
465 470 475 480
Met Arg Met Leu Pro Ser Ile Ile Phe Thr Cys Ile Val Tyr Phe Met
485 490 495
Leu Gly Leu Lys Pro Lys Ala Asp Ala Phe Phe Val Met Met Phe Thr
500 505 510
Leu Met Met Val Ala Tyr Ser Ala Ser Ser Met Ala Leu Ala Ile Ala
515 520 525
Ala Gly Gln Ser Val Val Ser Val Ala Thr Leu Leu Met Thr Ile Cys
530 535 540
Phe Val Phe Met Met Ile Phe Ser Gly Leu Leu Val Asn Leu Thr Thr
545 550 555 560
Ile Ala Ser Trp Leu Ser Trp Leu Gln Tyr Phe Ser Ile Pro Arg Tyr
565 570 575
Gly Phe Thr Ala Leu Gln His Asn Glu Phe Leu Gly Gln Asn Phe Cys
580 585 590
Pro Gly Leu Asn Ala Thr Gly Asn Asn Pro Cys Asn Tyr Ala Thr Cys
595 600 605
Thr Gly Glu Glu Tyr Leu Val Lys Gln Gly Ile Asp Leu Ser Pro Trp
610 615 620
Gly Leu Trp Lys Asn His Val Ala Leu Ala Cys Met Ile Val Ile Phe
625 630 635 640
Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Lys Leu Leu Phe Leu Lys Lys Tyr Ser
645 650 655
<210> 46
<211> 323
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 47
<211> 303
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 47
Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser
20 25 30
Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr
50 55 60
Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn
65 70 75 80
Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys
100 105 110
Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys
115 120 125
Asn Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Lys Ile Leu Ile Val
130 135 140
Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile
145 150 155 160
Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn Lys Arg Ile Ile Leu
165 170 175
Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile Val Val Val Gly Ala
180 185 190
Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys Asn Ala Ser Gly Leu
195 200 205
Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Asn
210 215 220
Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe Thr Ile Ala Ile Leu
225 230 235 240
Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu
245 250 255
Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly
260 265 270
Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys
275 280 285
Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn Arg
290 295 300
<210> 48
<211> 323
<212> PRT
<213> 苏门答腊猩猩
<400> 48
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Ile Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Asn Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 49
<211> 323
<212> PRT
<213> 猕猴
<400> 49
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Ala Pro Ala Asn
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Met Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 50
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Lys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 所述序列可重复n次，其中n是一个至少为1的整数。
<400> 51
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 52
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(4)
<223> 所述序列可重复n次，其中n是一个至少为1的整数。
<400> 52
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 53
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 53
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 54
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 55
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 56
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 57
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 58
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 59
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Phe Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser
85 90 95
His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 62
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 62
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Ala Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 63
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 64
Tyr Ile Asn Phe Asp Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Gly
1 5 10 15
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 65
Phe Tyr Gly Ala Lys Gly Thr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 68
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> SITE
<222> (3)..(10)
<223> 第3至10位的氨基酸可以独立存在或不存在
<400> 69
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10

Claims (73)

1.一种结合ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)和肿瘤相关抗原(TAA)的双特异性抗体分子，所述抗体分子包括两条相同的可变轻链(VL)、一条第一可变重链(VH)和一条第二VH链，
其中所述VL链各自包括ABCG2的抗原结合位点，所述第一VH链包括ABCG2的抗原结合位点，所述第二VH链包括TAA的抗原结合位点，并且其中所述第二VH链与其中一条VL配对时结合所述TAA，
其中所述双特异性抗体分子与表达ABCG2和TAA的癌细胞结合，同时显示与表达ABCG2和/或TAA的非癌细胞的结合减少。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体分子，其中所述两条VL链的所述抗原结合位点包括具有如下序列的VL链的轻链CDR 1-3(LCDR 1-3)：
DIVLTQSPSSFSVSLGDRVTISCKASGYILNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETG FPSRFSGTGSGKDYTLSISSLQTEDVGTYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIR(SEQ IDNO:1)。
3.根据权利要求2所述的双特异性抗体分子，其中所述两条VL链包含LCDR 1-3，其中LCDR1包含序列KASGYILNRLA(SEQ ID NO：2)；LCDR2包含序列GATSLET(SEQ ID NO:3)，并且LCDR3包含序列QQYWSTPWT(SEQ ID NO：4)。
4.根据权利要求1至3中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中所述两条VL链包含与下述序列至少90％、至少95％或至少99％相同的序列或氨基酸序列：
DIVLTQSPSSFSVSLGDRVTISCKASGYILNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETG FPSRFSGTGSGKDYTLSISSLQTEDVGTYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIR(SEQ IDNO:1)；或
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASGYILNRLAWYQQKPGKAPKLLISGATSLET GFPSRFSGSGSGKDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO:59)。
5.根据前述任何一项权利要求所述的双特异性抗体分子，其中所述第一VH链的所述抗原结合位点包括具有如下序列的VH链的重链CDR 1-3(HCDR 1-3)：
QVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYINFD GGTTYNPSLRGRISITRDTSKNQFFLQLRSVTPEDTATYYCATFYGAKGTLDYWGQGT SVTVSS(SEQ ID NO:5)。
6.根据权利要求1-4中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中第一VH链的所述抗原结合位点包括重链CDR 1-3(HCDR 1-3)，其中：
(i)所述HCDR1包括序列：SDYAWN(SEQ ID NO:63)；
(ii)所述第二HCDR2包括序列：YINFDGGTTYNPSLRG(SEQ ID NO:64)；以及
(iii)所述HCDR3包括序列：FYGAKGTLDY(SEQ ID NO:65)。
7.根据权利要求1至6中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中所述第一VH链包括所述氨基酸序列或与所述至少90％、至少95％或至少99％的所述氨基酸序列相同的氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYINFD GGTTYNPSLRGRISITRDTSKNQFFLQLRSVTPEDTATYYCATFYGAKGTLDYWGQGT SVTVSS(SEQ ID NO:5)，
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYINFD GGTTYNPSLRGRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATFYGAKGTLDYWGQGT LVTVSS(SEQ ID NO:6)，或
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINFDG GTTYNPSLRGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATFYGAKGTLDYWGQGT LVTVSS(SEQ ID NO:7)。
8.根据前述任何一项权利要求所述的双特异性抗体分子，其中所述第一和/或第二VH链被人源化和/或VL链被人源化。
9.根据前述任何一项权利要求所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链源自与TAA结合的单特异性抗体分子，并且双特异性抗体分子对TAA的亲和力比VH链与其中一条轻链配对时，亲和力比源自VH链条的单特异性抗体分子对TAA的亲和力至少低2倍。
10.根据前述任何一项权利要求所述的双特异性抗体分子，其中所述TAA为CD47。
11.根据权利要求10所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链的所述抗原结合位点包括包含如下氨基酸序列的VH链的HCDR 1-3：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTI YPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)。
12.根据权利要求1至11中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链包括包含如下序列的HCDR1：NYNMH(SEQ ID NO:9)，所述HCDR2包括序列：
TIYPGNDDTSYNQKFKD(SEQ ID NO:10)，并且所述HCDR3包括序列：GGYRAMDY(SEQ ID NO:11)。
13.根据权利要求1至12中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链包括所述氨基酸序列或与至少90％、至少95％或至少99％的所述氨基酸序列相同的氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIY PGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)，
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYP GNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:66)，
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYP GNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWG QGTTVTVSS(SEQ ID NO:67)，或
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYP GNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQ GTTVTVSS(SEQ ID NO:68)。
14.根据权利要求1-9中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中所述TAA为受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-1。
15.根据权利要求14所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链的所述抗原结合位点包括包含如下氨基酸序列的VH链的HCDR 1-3：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYS GSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQ GTLVTVSS(SEQ ID NO:22)。
16.根据权利要求14所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链的所述抗原结合位点包括包含如下序列的HCDR1：SGDYYWS(SEQ ID NO:19)；所述HCDR2包括序列：YIYYSGSTDYNPSLKS(SEQ ID NO:20)，并且所述HCDR3包括序列：
VSIFGVGTFDY(SEQ ID NO:21)。
17.根据权利要求14至16中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链包括所述氨基酸序列或与至少90％、至少95％或至少99％的所述氨基酸序列相同的氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYS GSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQ GTLVTVSS(SEQ ID NO:22)。
18.根据权利要求1-9中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中所述TAA为受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2。
19.根据权利要求18所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链的所述抗原结合位点包括包含所述氨基酸序列的VH链的HCDR 1-3：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNP NSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)。
20.根据权利要求18所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链的所述抗原结合位点包括包含如下序列的HCDR1：DYTMD(SEQ ID NO:13)；所述HCDR2包括序列：DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO:14)；并且所述HCDR3包括序列：
NLGPSFYFDY(SEQ ID NO:15)。
21.根据权利要求18至20中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链包括所述氨基酸序列或与至少90％、至少95％或至少99％的所述氨基酸序列相同的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNP NSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)。
22.根据权利要求1-9中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中所述TAA为程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。
23.根据权利要求22所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链的所述抗原结合位点包括包含所述氨基酸序列的VH链的HCDR 1-3：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPY GGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQ GTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。
24.根据权利要求22所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链的所述抗原结合位点包括包含如下序列的HCDR1：DSWIH(SEQ ID NO:28)；所述HCDR2包括序列：WISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:29)；并且所述HCDR3包括序列：RHWPGGFDY(SEQ ID NO:30)。
25.根据权利要求22-24中任何一项所述的双特异性抗体分子，其中所述第二VH链包括所述氨基酸序列或与至少90％、至少95％或至少99％的所述氨基酸序列相同的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPY GGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQ GTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。
26.根据前述任何一项权利要求所述的双特异性抗体分子，其中所述双特异性抗体分子包括已被修饰以减少或消除抗体与一种或多种Fcγ受体结合的Fc结构域。
27.根据前述任何一项权利要求所述的双特异性抗体分子，在治疗受试者癌症的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用抗体。
28.根据权利要求26所述的双特异性抗体分子的用途，其中所述方法包括将抗体与至少一种附加活性剂联合使用，其中所述至少一种附加活性剂包括化学治疗剂、多药耐药转运体的抑制剂、免疫治疗剂或其组合。
29.根据权利要求27所述的双特异性抗体分子的用途，其中所述至少一种附加活性剂是化学治疗剂，可选地，其中所述化学治疗剂是紫杉烷、长春花生物碱、蒽环类抗生素、依托泊苷、米托蒽醌，或甲氨蝶呤。
30.一种用于治疗癌症的方法中使用的化学治疗剂，所述方法包括将化学治疗剂与权利要求1至26中任何一项所述的抗体联合施用于受试者，任选地，其中所述化学治疗剂是紫杉烷、长春花生物碱，或蒽环类抗生素。
31.根据权利要求27-29所述的双特异性抗体分子的用途，其中接受治疗的受试者患有已确定患有化学治疗剂具有耐药性的癌症。
32.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1至26中任何一项所述的治疗有效量的双特异性抗体分子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法包括将双特异性抗体分子与至少一种附加活性剂联合使用，其中所述至少一种附加活性剂包括化学治疗剂、多药耐药转运体的抑制剂、免疫治疗剂或其组合。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述至少一种附加活性剂是化学治疗剂，可选地，其中所述化学治疗剂是紫杉烷、长春花生物碱、蒽环类抗生素、依托泊苷、米托蒽醌，或甲氨蝶呤。
35.根据权利要求33所述的方法，其中接受治疗的受试者患有已确定对化学治疗剂具有耐药性的癌症。
36.一种药物组合物，包括:
权利要求1-26中任何一项所述的抗体；以及
药学上可接受的赋形剂。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，进一步包括至少一种附加活性剂。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述至少一种附加活性剂包括化学治疗剂。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂为紫杉烷、长春花生物碱、蒽环类抗生素、依托泊苷、米托蒽醌，或甲氨蝶呤。
40.根据权利要求37至39中任何一项所述的药物组合物，其中所述至少一种附加活性剂包括多药耐药转运体的抑制剂。
41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述至少一种附加活性剂包括免疫治疗剂。
42.一种或多种核酸，其包含编码根据前述任何一项权利要求所述抗体的一个或多个序列。
43.根据权利要求42所述的一种或多种核酸，其中所述一种或多种序列可操作地连接一个启动子。
44.根据权利要求42或43所述的包含一种或多种核酸的一种或多种重组表达载体。
45.权利要求44所述的一种或多种重组表达载体进行基因修饰的一种哺乳动物细胞。
46.根据权利要求45所述的细胞，其中所述细胞为免疫细胞。
47.一种试剂盒，包括：
对权利要求1至26中任何一项所述的抗体编码的抗体或核酸；以及
至少一种附加活性剂。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中所述至少一种附加活性剂包括化学治疗剂、多药耐药转运体的抑制剂、免疫治疗剂或其组合。
49.一种杀死癌细胞的方法，其中所述方法包括使癌细胞与权利要求1至26中任何一项抗体接触。
50.根据权利要求49所述的方法，包括施用至少一种附加活性剂。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种附加活性剂包括化学治疗剂。
52.根据权利要求50或51所述的方法，与单独接触所述至少一种附加活性剂相比，其中所述方法使癌细胞的杀伤增加至少5％。
53.根据权利要求49至52中任何一项所述的方法，其中所述癌细胞为耐药性癌细胞。
54.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1至26中任何一项所述的抗体或权力要求35-41中任何一项所述的药物组合物。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述受试者先前已接受过癌症治疗。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述癌症为耐药癌症或多药耐药癌症。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述癌症对化学治疗剂具有耐药性。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述癌症对免疫治疗剂具有耐药性。
59.根据权利要求54至56中任何一项所述的方法，其中癌症对多药耐药转运体的抑制剂具有耐药性。
60.根据权利要求54至59中任何一项所述的方法，进一步包括向受试者施用至少一种附加活性剂。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述至少一种附加活性剂包括化学治疗剂。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述化学治疗剂为紫杉烷、长春花生物碱、蒽环类抗生素、依托泊苷、米托蒽醌，或甲氨蝶呤。
63.根据权利要求60至62中任何一项所述的方法，其中所述至少一种附加活性剂包括多药耐药转运体的抑制剂。
64.根据权利要求60至62中任何一项所述的方法，其中所述至少一种附加活性剂包括免疫治疗剂。
65.根据权利要求60至62中任何一项所述的方法，与单独使用所述至少一种附加活性剂进行治疗相比，其中所述方法增加了所述至少一种附加活性的有效性。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述增加的有效性包括对癌细胞的杀伤至少增加了5％。
67.根据权利要求54至66中任何一项所述的方法，进一步包括分析癌症样品，以确定癌症对ABCG2的表达是否高于预定阈值、对癌症相关抗原(TAA)表达是否高于预定阈值，或两者，其中可选地，TAA包括CD47、erbB1、erbB2或PD-L1。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述预定阈值对应于由参考细胞表达的ABCG2和/或TAA水平。
69.根据权利要求68所述的方法，其中ABCG2和/或TAA在参考细胞中已被敲除或敲低。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述参考细胞为非癌细胞。
71.根据权利要求68所述的方法，其中所述非癌细胞表达ABCG2和/或TAA的正常水平。
72.根据权力要求54至71中任何一项所述的方法，其中如果癌症以预定阈值或高于预定阈值表达ABCG2和TAA，则可以向受试者施用所述多特异性抗体；并且如果癌症以低于预定阈值表达TAA和ABCG2或TAA，则可以不施用所述多特异性抗体对受试者进行治疗。
73.一种结合ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)和肿瘤相关抗原(TAA)的双特异性抗体分子，其中所述抗体分子包括：
第一VH链和第一VL链各自包含ABCG2的抗原结合位点，其中所述第一VH链包括包含SEQID NO:5所示氨基酸序列的HCDR 1-3，并且所述第一VL链包括包含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的LCDR 1-3；以及
其中所述TAA为PD-L1，并且所述抗体分子进一步包括第二VH链和第二VL链，其中所述第二VH链包括包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的HCDR 1-3，并且所述第二VL链包括包含抗PD-L1抗体(例如，阿替利珠单抗)的VL链的LCDR 1-3；或
其中所述TAA为CD47，并且所述抗体分子进一步包括第二VH链和第二VL链，其中所述第二VH链包括包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的HCDR 1-3，并且所述第二VL链包括包含抗CD47抗体(例如，5F9)的VL链的LCDR 1-3；或
其中所述HER2(ErbB2)，并且所述抗体分子进一步包括第二VH链和第二VL链，其中所述第二VH链包括包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的HCDR 1-3，并且所述第二VL链包括包含抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗)的VL链的LCDR 1-3；或
其中所述TAA为HER1(ErbB1)，并且所述抗体分子进一步包括第二VH链和第二VL链，其中所述第二VH链包括包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的HCDR 1-3，并且所述第二VL链包括包含抗HER1抗体(例如，耐昔妥珠单抗)的VL链的LCDR 1-3；以及
其中所述双特异性抗体分子与表达ABCG2和TAA的癌细胞结合，同时显示与表达ABCG2和/或TAA的非癌细胞的结合减少。
CN202180057500.7A 2020-06-04 2021-05-28 Abcg2外排泵-癌症抗原多特异性抗体及其相关组合物、试剂、试剂盒和方法 Pending CN116529267A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063034822P 2020-06-04 2020-06-04
US63/034,822 2020-06-04
PCT/US2021/034913 WO2021247423A1 (en) 2020-06-04 2021-05-28 Abcg2 efflux pump-cancer antigen multi-specific antibodies and compositions, reagents, kits and methods related thereto

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116529267A true CN116529267A (zh) 2023-08-01

Family

ID=76624185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180057500.7A Pending CN116529267A (zh) 2020-06-04 2021-05-28 Abcg2外排泵-癌症抗原多特异性抗体及其相关组合物、试剂、试剂盒和方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230192902A1 (zh)
EP (1) EP4161564A1 (zh)
JP (1) JP2023528417A (zh)
CN (1) CN116529267A (zh)
AU (1) AU2021283080A1 (zh)
CA (1) CA3182969A1 (zh)
WO (1) WO2021247423A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023159220A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Kenjockety Biotechnology, Inc. Anti-cd47 antibodies

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
TW197439B (zh) 1991-04-04 1993-01-01 Ueno Pharmaceutics Applic Res Co Ltd
DK0648271T3 (da) 1991-08-20 2003-07-21 Us Gov Health & Human Serv Adenovirusmedieret overførsel af gener til mave-/tarmkanal
US5283253A (en) 1991-09-23 1994-02-01 Florida State University Furyl or thienyl carbonyl substituted taxanes and pharmaceutical compositions containing them
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
AU3140093A (en) 1991-11-22 1993-06-15 University Of Mississippi, The Synthesis and optical resolution of the taxol side chain and related compounds
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
US5200534A (en) 1992-03-13 1993-04-06 University Of Florida Process for the preparation of taxol and 10-deacetyltaxol
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
WO1993023555A1 (en) 1992-05-21 1993-11-25 The Penn State Research Foundation Cultured taxus tissues as a source of taxol, related taxanes and other novel anti-tumor/anti-viral compounds
US5274137A (en) 1992-06-23 1993-12-28 Nicolaou K C Intermediates for preparation of taxols
US5294637A (en) 1992-07-01 1994-03-15 Bristol-Myers Squibb Company Fluoro taxols
US5202448A (en) 1992-08-14 1993-04-13 Napro Biotherapeutics, Inc. Processes of converting taxanes into baccatin III
CA2100808A1 (en) 1992-10-01 1994-04-02 Vittorio Farina Deoxy paclitaxels
FR2696463B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé d'obtention de la désacétyl-10 baccatine III.
FR2696461B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux dérivés d'analogues du taxol, leur préparation et les compositions qui les contiennent.
FR2696458B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé de préparation de dérivés du taxane.
FR2696462B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé d'obtention de la désacétyl-10 baccatine III.
FR2696464B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveau procédé d'estérification de la baccatine III et de la désacétyl-10 baccatine III.
US6063621A (en) * 1992-10-27 2000-05-16 Queen's University At Kingston Antibodies to a multidrug resistance protein
CA2145641C (en) 1992-12-03 2008-05-27 Richard J. Gregory Pseudo-adenovirus vectors
US5279949A (en) 1992-12-07 1994-01-18 Board Of Trustees Operating Michigan State University Process for the isolation and purification of taxol and taxanes from Taxus spp
DE69434486T2 (de) 1993-06-24 2006-07-06 Advec Inc. Adenovirus vektoren für gentherapie
US5824701A (en) 1993-10-20 1998-10-20 Enzon, Inc. Taxane-based prodrugs
ATE437232T1 (de) 1993-10-25 2009-08-15 Canji Inc Rekombinanter adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
US5415869A (en) 1993-11-12 1995-05-16 The Research Foundation Of State University Of New York Taxol formulation
US5821263A (en) 1996-08-26 1998-10-13 Bristol-Myers Squibb Company Sulfenamide taxane derivatives
WO1998013059A1 (en) 1996-09-27 1998-04-02 Bristol-Myers Squibb Company Hydrolyzable prodrugs for delivery of anticancer drugs to metastatic cells
WO1998022451A1 (fr) 1996-11-19 1998-05-28 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Derives taxol
US5977386A (en) 1996-12-24 1999-11-02 Bristol-Myers Squibb Company 6-thio-substituted paclitaxels
SK182599A3 (en) 1997-06-20 2000-07-11 Baker Norton Pharma Soluble prodrugs of paclitaxel
US7288665B1 (en) 1997-08-18 2007-10-30 Florida State University Process for selective derivatization of taxanes
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
JPH1192468A (ja) 1997-09-17 1999-04-06 Yakult Honsha Co Ltd 新規なタキサン誘導体
AU741433B2 (en) 1997-10-08 2001-11-29 Bio Research Corporation Of Yokohama Taxoid derivatives and process for producing the same
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
CN106432490B (zh) * 2016-09-14 2020-01-07 北京大学 一种abcg2单克隆抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
US20230192902A1 (en) 2023-06-22
CA3182969A1 (en) 2021-12-09
AU2021283080A1 (en) 2022-12-15
JP2023528417A (ja) 2023-07-04
WO2021247423A1 (en) 2021-12-09
EP4161564A1 (en) 2023-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020082209A1 (zh) 抗cldn18.2抗体及其用途
JP2019505564A (ja) 抗ｂｃｍａポリペプチド及びタンパク質
US20220204627A1 (en) Efflux Pump-Cancer Antigen Multi-Specific Antibodies and Compositions, Reagents, Kits and Methods Related Thereto
US20230203156A1 (en) Anti-mdr1 antibodies and uses thereof
JP2022547850A (ja) 抗ｔｉｇｉｔ免疫阻害剤及び応用
CN116529267A (zh) Abcg2外排泵-癌症抗原多特异性抗体及其相关组合物、试剂、试剂盒和方法
CN116323662A (zh) 抗abcg2抗体及其用途
CN116490522A (zh) 抗abcc1抗体及其应用
EP4244257A1 (en) Anti-mrp4 (encoded by abcc4 gene) antibodies and uses thereof
WO2023114658A1 (en) Anti-abcb1 antibodies
WO2023159220A1 (en) Anti-cd47 antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination