JP2023528417A - Ａｂｃｇ２排出ポンプ－がん抗原多重特異性抗体並びにそれらに関連する組成物、試薬、キット、及び方法 - Google Patents

Ａｂｃｇ２排出ポンプ－がん抗原多重特異性抗体並びにそれらに関連する組成物、試薬、キット、及び方法 Download PDF

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Abstract

細胞排出ポンプＡＢＣＧ２及びがん関連抗原の両方を標的とする多重特異性抗体、並びにかかる多重特異性抗体を含むか又はコードする医薬組成物、核酸、組換え発現ベクター、細胞、及びキットが提供される。対象に、細胞排出ポンプ及びがん関連抗原の両方を標的とする多重特異性抗体を投与することを含む、対象をがんについて治療する方法も提供される。本方法に有用な遺伝子改変細胞株及びかかる遺伝子改変細胞株を作製する方法を含め、記載の多重特異性抗体及びそれらに関連する試薬を生成する方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月４日に出願された米国仮特許出願第６３／０３４，８２２号の優先権の利益を主張し、その出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０２１年５月２７日に作成され、８７ＫＢのサイズを有するテキストファイル「ＫＮＪＹ－００５ＷＯ ＳＥＱ ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本明細書に提供される。テキストファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
薬剤耐性は、疾患が医薬品治療に耐性になるときに生じるよく知られた現象であり、腫瘍学を含む様々な医学の分野における大きなますます増大している課題である。多くのタイプのがんは、当初、化学療法に感受性であるが、時間の経過とともに、それらは、これら並びにＤＮＡ変異及び薬物の阻害、分解、及び増強された排出を促進する代謝的変化を含む他のメカニズムを通じて、耐性を発達させることができる。
排出ポンプ（ＥＰ）は、生細胞によって発現されるタンパク質であり、様々な化合物を細胞から自然に排出するように進化してきている。ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリータンパク質のメンバーは、薬物排出を可能にするＥＰの例である。トランスポーターの構造はタンパク質毎に異なるが（例えば、ヒトには４９種の既知のＡＢＣファミリーメンバーがある）、それらは全て２つの異なるドメイン―高度に保存されたヌクレオチド結合ドメイン及びより可変的な膜貫通ドメインの存在によって分類される。ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１（ＡＢＣＢ１）遺伝子によってコードされる多剤耐性タンパク質１（ＡＢＣＧ２）は、これらのうち最初に特定されたものであり、広範囲にわたって研究されてきている。ＡＢＣＧ２発現は、特定の化学療法剤による治療に応答して増加する。
ＥＰは、腫瘍が化学療法剤に対する耐性を発達させることを可能にする。かかる耐性は、薬剤耐性細胞からの化学療法剤の増強された排出としばしば関連する。この化学療法耐性は、２つ以上の化学療法剤に適用される場合、多剤耐性（ＭＤＲ）と呼ばれる。
がん患者のなかでも、化学療法の使用によって転移性がん細胞集団が大部分殺傷され患者から排除されている場合に、薬剤耐性がん性細胞集団が出現して広がり以前の療法による再治療に対して応答を伴わなくなることは珍しくない。ほとんどの場合、異なる作用機序を有する異なる薬物が、別の出現する薬物耐性細胞の集団及び／又は腫瘍が発達するまで適用される。
したがって、ＥＰを阻害するために使用され得る試薬を開発する必要性がある。
ＡＢＣＧ２及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ：tumor-associated antigen）の両方を標的とする多重特異性抗体として使用され得る抗ＡＢＣＧ２抗体、並びにかかる多重特異性抗体を含むか又はコードする医薬組成物、核酸、組換え発現ベクター、細胞、及びキットが提供される。多重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含む共通の可変軽（ＶＬ）鎖と、ＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含む第１の可変重（ＶＨ）鎖と、ＴＡＡに対する抗原結合部位を含む第２のＶＨ鎖と、を含むか、又はＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含む第１のＶＨ鎖及び第１のＶＬ鎖と、ＴＡＡに対する抗原結合部位を含む第２のＶＨ鎖及び第２のＶＬ鎖と、を含む。対象にＡＢＣＧ２及びＴＡＡの両方を標的とする多重特異性抗体を投与することを含む、対象をがんについて治療する方法も提供される。治療することは、多重特異性抗体を単独で投与すること、又は多重特異性抗体及び化学療法剤を投与することを伴い得る。その上、記載の多重特異性抗体及びそれらに関連する試薬を生成する方法が、対象方法に有用な遺伝子改変細胞株及びかかる遺伝子改変細胞株を作製する方法を含めて、提供される。
本明細書に提供される二重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡの両方を発現するがん細胞に結合するが、ＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡを発現する非がん細胞に対しては低下した結合を示す。換言すれば、本明細書に提供される二重特異性抗体は、（１）ＴＡＡを発現するが、ＡＢＣＧ２発現が低いか又は存在しない細胞、及び（２）ＡＢＣＧ２を発現するが、ＴＡＡ発現が低いか又は存在しない細胞には、低い親和性で結合し、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡの少なくとも１つ又は両方を比較的高いレベル、すなわち、正常細胞よりも高いレベルで発現するがん細胞には高い親和性で結合する。
ＡＢＣＧ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞が、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３、並びにＡＢＣＧ２及びＣＤ４７に結合する二重特異性抗体の存在下で、トポテカンに対する増加した感受性を有することを示す化学感受性分析を提供する。二重特異性抗体５Ｄ３ＤＤＫＴ１４ＫＫ５Ｄ３は、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３からの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）、並びに抗ＣＤ４７抗体である５Ｆ９からのＨＣを含む。二重特異性抗体５Ｄ３ｈＶＨｖ１ＤＤＫＴ１４ＫＫ５Ｄ３ｈＶＬｖ１は、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３からのＨＣ及びＬＣ、並びに抗ＣＤ４７抗体である５Ｆ９からのＨＣを含む。二重特異性抗体５Ｄ３ｈＶＨｖ２ＤＤＫＴ１４ＫＫ５Ｄ３ｈＶＬｖ１は、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３からのＨＣ及びＬＣ、並びに抗ＣＤ４７抗体である５Ｆ９からのＨＣを含む。ｈＶＨｖ１及びｈＶＨｖ２は、それぞれ、５Ｄ３ ＨＣのヒト化可変重鎖１型及び２型を指す。ｈＶＬｖ１は、５Ｄ３ ＬＣのヒト化可変軽鎖１型を指す。ＫＴ１４は、ＣＤ４７を指す。ＤＤ及びＫＫは、５Ｄ３ ＨＣと５Ｆ９ ＨＣとの間の対形成を増強する電荷対置換を指す。ＩＣ５０値は、ｎＭ単位である。 ２９３Ｔ－Ｇ２ＯＸ細胞に対する５Ｄ３及びヒト化５Ｄ３抗体の結合を、対応するＥＣ５０結合親和性とともに示す。ＥＣ５０値は、ｎＭ単位である。 ＡＢＣＧ２を発現するように安定的にトランスフェクトされた３Ｔ３細胞（３Ｔ３－Ｇ２）、ヒトＡＢＣＧ２を発現するように安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ＿ＡＢＣＧ２＿ＯＸ）、及びヒトＫＴ９を発現するように安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ－ＫＴ９ＯＸ）に対するヒト化ＡＢＣＧ２／ＫＴ９二重特異性抗体の結合を示す。ＫＴ９は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブであり、５Ｄ３は、抗ＡＢＣＧ２抗体である。ヒト化二重特異性抗体５Ｄ３ｈＶＨ－ｖ１ＤＤ ＫＴ９ＫＫ ５Ｄ３ｈＶＬ－ｖ１及び５Ｄ３ｈＶＨ－ｖ２ＤＤ ＫＴ９ＫＫ ５Ｄ３ｈＶＬ－ｖ１は、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３からのＨＣ及びＬＣ、並びに抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるＫＴ９からのＨＣを含む。 ＡＢＣＧ２（２９３Ｔ－Ｇ２ＯＸ）、ＫＴ９（２９３Ｔ－ＫＴ９ＯＸ）、並びにＡＢＣＧ２及びＫＴ９（２９３Ｔ－Ｇ２ＫＴ９ＯＸ）の両方で安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に対するヒト化５Ｄ３／ＫＴ９／５Ｄ３二重特異性抗体の結合を、対応するＥＣ５０結合親和性値とともに示す。 ＡＢＣＧ２／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（５Ｄ３／ＫＴ９）の細胞傷害性活性を、単独又はトポテカンと組み合わせて、ＨＴ１３７６（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１４７２）ヒト膀胱上皮がん細胞株で試験した、異種移植片試験の結果を示す。
定義
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体又は免疫グロブリン、抗原との特異的結合を保持する抗体の断片で、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ断片を含むがこれらに限定されない断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、重鎖のみを含む抗体（例えば、ＶＨＨラクダ科抗体）を含む単鎖抗体、二重特異性抗体、及び抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を生じる酵素、蛍光タンパク質などで検出可能なように標識され得る。抗体は、特定の結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分に更にコンジュゲートされ得る。抗体はまた、ポリスチレンプレート又はビーズなどを含むが、これらに限定されない固体支持体に結合され得る。また用語によって、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、及び／又は抗原との特異的結合を保持する他の抗体断片、並びにモノクローナル抗体も包含される。抗体は、一価又は二価であり得る。本明細書に使用される抗体は、例えば、患者からの細胞試料又は組織試料における、細胞表面上の標的抗原の発現をアッセイするために使用され得る。
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、例えば、インタクト抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）： １０５７－１０６２（１９９５））、重鎖のみを含む抗体（例えば、ＶＨＨラクダ抗体）を含む単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び容易に結晶化する（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅ）能力を反映する命名である残りの「Ｆｃ」断片を生じる。ペプシン処置は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合性会合で１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この立体構造では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を定義する。まとめると、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ抗原を認識して結合する能力を有して抗原結合部位を形成することができるが、各可変ドメインの３つのＣＤＲを含む全結合部位よりも低い親和性である。
「Ｆａｂ」断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端におけるいくつかの残基の付加によって、Ｆａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する、本明細書における命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片はもともと、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に分けられ得る。
「単鎖Ｆｖ」、「ｓＦｖ」、又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの概説について、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）におけるＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、この断片は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）に含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、該ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成され、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）に、より完全に記載されている。
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの薬剤の可逆的結合における平衡定数を指し、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、関連のないアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも、少なくとも１倍大きい、少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、又は少なくとも１０００倍大きい、又はそれ以上であることができる。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約１ピコモル（ｐＭ）、又は約１００ｎＭ～約１フェムトモル（ｆＭ）以上であることができる。本明細書に使用される場合、「アビディティ」という用語は、希釈後の解離に対する２つ以上の薬剤の複合体の耐性を指す。「免疫反応性の」及び「優先的に結合する」という用語は、抗体及び／又は抗原結合断片に関して本明細書において互換的に使用される。
「結合」という用語は、共有結合相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、並びに例えば、塩架橋及び水架橋などの相互作用を含むイオン及び／又は水素結合相互作用による、２つの分子間の直接的会合を指す。ＡＢＣＧ２特異的抗体は、ＡＢＣＧ２ポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する。非特異的結合は、約１０－７Ｍ未満の親和性による結合、例えば、１０－６Ｍ、１０－５Ｍ、１０－４Ｍなどの親和性による結合を指す。
本明細書に使用される場合、「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」という用語は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に認められる非連続的な抗原結合部位を意味することが意図される。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６（１９７７）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）によって記載されており、それらの定義には、互いに対して比較されたときに、重複するアミノ酸残基又はそれらのサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体のＣＤＲ又はそれらのグラフト抗体若しくはバリアントを指すいずれかの定義の適用は、本明細書に定義及び使用される用語の範囲内であることが意図される。上記に引用した文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基が、比較として以下の表１に示される。
Figure 2023528417000002
本明細書に使用される場合、「フレームワーク」という用語は、抗体可変領域に関して使用されるとき、抗体の可変領域におけるＣＤＲ領域外の全てのアミノ酸残基を意味することが意図される。可変領域フレームワークは、概して、長さが約１００～１２０個のアミノ酸の不連続なアミノ酸配列であるが、ＣＤＲの外側のこれらのアミノ酸のみを言及することが意図される。本明細書に使用される場合、「フレームワーク領域」という用語は、ＣＤＲによって分離されているフレームワークの各ドメインを意味することが意図される。ＶＨ鎖は、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、でＮ末端からＣ末端に配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含むことができる。同様に、ＶＬ鎖は、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、でＮ末端からＣ末端に配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含むことができる。
本明細書で使用される場合、抗体という用語は、２つの重鎖及び２つの軽鎖の四量体を包含し、重鎖及び軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続される。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の様々な細胞及び補体系の第１の成分を含む、ホストの組織及び因子との抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、免疫グロブリンのタイプであるＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、及びそれらのサブタイプを含む。いくつかの実施形態において、対象抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１である。
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質を指す。認められたヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、並びに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン軽鎖（約２５ｋＤ又は２１４個のアミノ酸）は、Ｎ末端の可変領域遺伝子（約１１０個のアミノ酸）及びＣ末端のカッパ又はラムダ定常領域によってコードされる。全長免疫グロブリン重鎖（約５０ｋＤ又は４４６個のアミノ酸）は、Ｎ末端の可変領域遺伝子（約１１６個のアミノ酸）及びＣ末端の他の上述の定常領域遺伝子のうちの１つ、例えば、ガンマ（約３３０個のアミノ酸をコードする）によってコードされる。いくつかの実施形態において、対象抗体は、全長免疫グロブリン重鎖及び全長免疫グロブリン軽鎖を含む、免疫グロブリン全体を含む。
「抗原結合断片」という用語は、抗原に特異的に結合することができる全長抗体の１つ以上の断片を指す。結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを含む、例えば、それらからなる、一価の断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片）、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む、例えば、それらからなる）、（ｉｖ）Ｆｖ断片（例えば、抗体の単一アームのＶＨ及びＶＬドメインを含む、例えば、それらからなる）、（ｖ）ｄＡｂ断片（ＶＨドメインを含む、例えば、それからなる）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、ＶＨ及びＶＬドメイン対が一価分子を形成するように組換え手段を使用して合成リンカーによって結合された抗体の単一アームのＶＨ及びＶＬドメインを含む、例えば、それらからなる）、（ｖｉｉｉ）ダイアボディ（ＶＨ及びＶＬドメインが、それらが一価分子を形成しないように対形成しない２つのｓｃＦｖを含む、例えば、それらからなり、ｓｃＦｖのうちの各１つのＶＨが、他のｓｃＦｖのＶＬドメインと対形成して二価分子を形成する）。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源若しくは種に由来し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残分が、異なる供給源若しくは種に由来する抗体を指す。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する、抗体に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリン可変軽鎖（ＶＬ）又は可変重鎖（ＶＨ）フレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワーク（ＦＲ）である。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３におけるようなサブグループである。一実施形態において、ＶＬについて、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上記におけるようなカッパＩである。一実施形態において、ＶＨについて、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上記におけるようなサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲからのアミノ酸残基及びヒトフレームワーク（ＦＲ）からのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ヒト化抗体定常領域の少なくとも一部は、ヒト抗体に由来した。本明細書に開示される抗体分子の好ましい実施形態において、定常領域は、ヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧ抗体からのものである。好ましい実施形態において、本明細書に開示される抗体分子は、本明細書に提供される可変重鎖領域、及びＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１８５７－１、ｖｅｒｓｉｏｎ １に示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１定常領域を含む重鎖を含む。好ましい実施形態において、本明細書に開示される抗体分子は、本明細書に提供される可変軽鎖領域、及びヒト軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。好ましい実施形態において、ヒト軽鎖定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域である。特定の態様において、対象抗体に存在するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、変異、例えば、Ｆｃ機能を調節する置換を含み得る。例えば、ＬＡＬＡＰＧエフェクター機能変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ）又はＮ２９７Ａ変異を導入して、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を低下し得る。置換の番号付けは、ＥＵ番号付けシステムに基づく。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を言及するときに一般的に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に報告されているＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ １ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けている抗体を指す。
「エピトープ」という用語は、免疫系によって、例えば、抗体、Ｂ細胞、又はＴ細胞によって認識される抗原の領域を指す。例えば、エピトープは、抗体が結合する抗原の特異的領域である。
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定、分離、及び／又は回収されている抗体である。その天然環境のコンタミネーション成分は、抗体における診断的又は治療的使用を妨げ得る物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態において、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定されるときに抗体の重量で９０％超、９５％超、又は９８％超、例えば、重量で９９％超まで、（２）スピニングカップシーケネータの使用によって、Ｎ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クマシーブルー若しくは銀染色を使用して、還元若しくは非還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による均質性まで、精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれ、これは、該抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。いくつかの事例において、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
本明細書で使用される場合、「細胞傷害性剤」という用語は、細胞機能を阻害若しくは防止し、かつ／又は細胞死若しくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。「抗腫瘍剤」とも称される「化学療法剤」は、がん又は他の疾患若しくは障害を治療するために使用される細胞傷害性剤であることができる。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」などという用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患又はその症状を完全若しくは部分的に防止するという点で予防的であり得、かつ／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する副作用における部分的若しくは完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書で使用される場合、「治療」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患の任意の治療を網羅し、（ａ）疾患にかかりやすいが、それを有すると診断されていない対象において、疾患が発生することを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、及び（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすこと、を含む。
本明細書で互換的に使用される「個体」、「対象」、「ホスト」、及び「患者」という用語は、ネズミ（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄類（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。
「治療有効量」又は「有効量」は、疾患を治療するために哺乳類又は他の対象に投与されたとき、疾患におけるかかる治療に影響を及ぼすのに十分である、標的特異的抗体の量を指す。「治療有効量」は、抗体、疾患及びその重症度、並び治療される対象の年齢、体重などに応じて変化する。
本明細書で使用される「難治性」という用語は、治療に応答しない疾患又は状態を指す。がんに関して、「難治性がん」は、本明細書で使用される場合、治療に応答しないがんを指す。難治性がんは、治療の開始時に耐性であり得るか、又は治療中に耐性になり得る。難治性がんは、耐性がんとも呼ばれ得る。
「生体試料」は、個体から得られる様々な試料タイプを包含し、診断又はモニタリングアッセイに使用することができる。定義は、生体由来の血液及び他の液体試料、生検標本などの固体組織試料、又は組織培養物若しくはそれに由来する細胞及びそれらの子孫を包含する。定義はまた、それらの取得後に任意の方法、例えば、試薬による処置、可溶化、又はポリヌクレオチドなどの特定の成分の豊富化によって、操作されている試料を含む。「生体試料」という用語は、臨床試料を包含し、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、及び組織試料も含む。
配列の対の間の同一性パーセントは、対における一致数に１００を乗じ、ギャップを含む整列した領域の長さで除することによって計算され得る。同一性スコアリングは、完全な一致のみを計数し、アミノ酸の互いの類似性の程度は考慮しない。内部のギャップのみが長さに含まれ、配列端のギャップは含まれない。同一性パーセント＝（一致数×１００）／整列した領域の長さ（ギャップを伴う）
「保存的アミノ酸置換」という語句は、以下の基内のアミノ酸残基の置換を指す。１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、２）Ｒ、Ｋ、３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ、４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ、５）Ｑ、Ｎ、及び６）Ｄ、Ｅ。保存的アミノ酸置換は、タンパク質中のアミノ酸を、側鎖の類似の酸性度、塩基性度、電荷、極性、又はサイズの側鎖を有するアミノ酸で置き換えることによって、タンパク質の活性を保存し得る。
「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移すために使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、又はウイルス）を意味する。
「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、宿主細胞の形質転換に好適であり、それに動作可能に連結された１つ以上の異種コード領域の発現を（宿主細胞と併せて）指示及び／又は制御する核酸配列を含む、ベクターを指す。発現構築物は、限定されないが、転写、翻訳に影響を及ぼすか、又はそれを制御し、イントロンが存在する場合、それに動作可能に（operably）連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含み得る。
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体又はＣＡＲ）とその同族リガンド（又はＣＡＲの場合に腫瘍抗原）との結合によって誘導される一次応答を指し、それによって、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達、又は適切なＮＫ受容体若しくはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介する。刺激は、特定の分子の変化した発現を媒介することができる。
「刺激分子」という用語は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様について刺激的な方法で免疫細胞の活性化を調節する細胞質シグナル配列を提供する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）によって発現される分子を指す。一態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドがロードされたＭＨＣ分子との結合によって開始される一次シグナルであり、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞応答の媒介をもたらす。刺激的な手段で作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。本発明において特に有用なＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例には、ＣＤ３ゼータ、コモンＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれるが、これらに限定されない。
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、Ｔ細胞による共刺激応答、例えば、限定されないが、増殖を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する抗原受容体又はそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体、並びにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれるが、これらに限定されない。
「自己」という用語は、後に再導入される個体と同じ個体に由来する任意の材料を指す。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、本明細書で使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生じる。例えばＣＡＲ－Ｔ細胞における、免疫エフェクター機能の例には、細胞溶解活性及びサイトカインの分泌を含むヘルパー活性が含まれる。
本明細書に使用される場合、「免疫エフェクター細胞」は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例には、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞及びガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、並びに骨髄由来食細胞が含まれる。
置換、挿入、又は欠失のための手引きは、異なる種からのタンパク質のアミノ酸配列の整列に基づき得るか、又は同じか若しくは類似の機能を有する複数のタンパク質に基づいたコンセンサス配列からのものであり得る。
ＡＢＣＧ２及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の両方を標的とする多重特異性抗体として使用され得る抗ＡＢＣＧ２抗体、並びにかかる多重特異性抗体を含むか又はコードする医薬組成物、核酸、組換え発現ベクター、細胞、及びキットが提供される。多重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含む共通の可変軽（ＶＬ）鎖と、ＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含む第１の可変重（ＶＨ）鎖と、ＴＡＡに対する抗原結合部位を含む第２のＶＨ鎖と、を含むか、又はＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含む第１のＶＨ鎖及び第１のＶＬ鎖と、ＴＡＡに対する抗原結合部位を含む第２のＶＨ鎖及び第２のＶＬ鎖と、を含み、第１及び第２のＶＬ鎖は、異なる。対象にＡＢＣＧ２及びＴＡＡの両方を標的とする多重特異性抗体を投与することを含む、対象をがんについて治療する方法も提供される。治療することは、多重特異性抗体を単独で投与すること、又は多重特異性抗体及び化学療法剤を投与することを伴い得る。その上、記載の多重特異性抗体及びそれらに関連する試薬を生成する方法が、対象方法に有用な遺伝子改変細胞株及びかかる遺伝子改変細胞株を作製する方法を含めて、提供される。
本明細書に提供される二重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡの両方を発現するがん細胞に結合するが、ＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡを発現する非がん細胞に対しては低下した結合を示す。換言すれば、本明細書に提供される二重特異性抗体は、（１）ＴＡＡを発現するが、ＡＢＣＧ２発現が低いか又は存在しない細胞、及び（２）ＡＢＣＧ２を発現するが、ＴＡＡ発現が低いか又は存在しない細胞には低い親和性で結合し、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡの少なくとも１つ又は両方を比較的高いレベル、すなわち、正常細胞よりも高いレベルで発現するがん細胞には高い親和性で結合する。
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、そのため、もちろん変化し得ることを理解されたい。本明細書に使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することが意図されておらず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値と、記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより狭い範囲の上限及び下限は、独立して、より狭い範囲に含まれ得、また、記載された範囲内の任意の特定の除外された制限に従うことを条件として、本発明内に包含される。記載された範囲が制限の一方又は両方を含む場合、それらの制限のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
特定の範囲は、本明細書において、「約」という用語によって先行される数値で示される。「約」という用語は、本明細書において、それが先行する正確な数字、並びにその用語が先行する数字に近いか又はおおよそ付近である数字について文言的サポートを提供するために使用される。ある数が、具体的に列挙された数字に近いか又はおおよそ付近であるかを決定する際、近いか又はおおよそ付近であるが列挙されていない数字とは、それが提示される文脈において、具体的に列挙された数字の実質的に等価値を提供する数字であり得る。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、本発明の実施又は試験において使用することができるが、代表的な例示的な方法及び材料がここに記述される。
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、各個別の刊行物又は特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が関連して引用されるところの方法及び／又は材料を開示して説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物の引用は、本出願日の前のその開示についてのものであり、本発明がかかる刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なり得、独立して確認する必要があり得る。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数の指示物を含むことに留意されたい。更に、特許請求の範囲は、任意選択的な要素を除外するように起草され得ることに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」等の排他的な用語の使用、又は「除く」による限定の使用のための記載根拠としての役割を果たすことが意図される。
本開示を読むと当業者に明らかになるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、又はそれらと組み合わされ得る個別の構成要素及び特性を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
方法及び組成物は、文法的流動性のために機能的説明を伴って説明されてきたか又はこれから説明されるが、特許請求の範囲は、明示的に３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ｆ）の下で定式化されていない限り、「手段」又は「ステップ」の限定の構築によって必ずしも限定されると解釈されるべきではなく、均等論の下で特許請求の範囲によって提供される定義の意味及び等価物の完全な範囲を与えられ、特許請求の範囲が明示的に３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ｆ）の下で定式化されている場合には、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ｆ）の下での完全な法定等価物を与えられることを明確に理解されたい。
抗体
二重特異性抗体
本開示は、多剤耐性タンパク質１（ＡＢＣＧ２）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する二重特異性抗体分子を提供し、抗体分子は、２つの同一の可変軽（ＶＬ）鎖、第１の可変重（ＶＨ）鎖、及び第２のＶＨ鎖を含み、ＶＬ鎖は各々、ＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含み、第１のＶＨ鎖は、ＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含み、第２のＶＨ鎖は、ＴＡＡに対する抗原結合部位を含み、第２のＶＨ鎖は、軽鎖のうちの１つと対形成したときにＴＡＡに結合するか、又はＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含む第１のＶＨ鎖及び第１のＶＬ鎖と、ＴＡＡに対する抗原結合部位を含む第２のＶＨ鎖及び第２のＶＬ鎖と、を含み、第１及び第２のＶＬ鎖は異なる配列を有する。二重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡの両方を発現するがん細胞に結合するが、ＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡを発現する非がん細胞に対しては低下した結合を示す。換言すれば、本明細書に提供される二重特異性抗体は、（１）ＴＡＡを発現するが、ＡＢＣＧ２発現が低いか又は存在しない細胞、及び（２）ＡＢＣＧ２を発現するが、ＴＡＡ発現が低いか又は存在しない細胞には低い親和性で結合し、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡのうちの少なくとも１つ又は両方を比較的高いレベル、すなわち、正常細胞よりも高いレベルで発現するがん細胞には高い親和性で結合する。
比較的高いレベルは、当該がん細胞と同じタイプの正常細胞における発現レベルの少なくとも１．５倍（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、又はそれ以上）である発現を指す。低下した親和性は、当該がん細胞と同じタイプの正常細胞に対する抗体分子の結合と比較して、少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、又はそれ以上）低下される結合親和性を指す。低下した親和性はまた、検出可能な結合の欠如を包含する。
「抗体分子」という用語は、本明細書に定義される抗体を包含し、その抗原結合断片を含む。特定の態様において、抗体分子は、２つの可変軽鎖（ＶＬ）及び２つの可変重鎖（ＶＨ）を含む。特定の態様において、抗体分子はその上、重鎖及び軽鎖定常領域を含む。重鎖及び軽鎖定常領域は、ヒト抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体からのものであり得る。ヒトＩｇＧ１重鎖（ＨＣ）定常領域は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を低下させる変異を含むように改変され得る。加えて、又は代替的に、２つのＶＨ鎖は各々、異なるヒトＩｇＧ１ ＨＣ定常領域にコンジュゲートされ得、個々のヒトＩｇＧ１ ＨＣ定常領域は、異なるヒトＩｇＧ１ ＨＣ定常領域間の二量体の形成に都合がよい置換を有する。かかるＨＣ領域は、本明細書で更に詳細に記載される。特定の態様において、抗体分子が二重特異性抗体分子である場合、ヒトＩｇＧ１ ＨＣ定常領域のうちの１つは、正荷電側鎖を有する１つ以上のアミノ酸を導入する置換を含み得、他のヒトＩｇＧ１ ＨＣ定常領域は、２つの異なるＨＣ間の二量体の形成に都合がよい負荷電側鎖を有する１つ以上のアミノ酸を導入する置換を含み得る。
特定の態様において、２つのＶＬ鎖の抗原結合部位は、配列：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＦＳＶＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＫＡＳＧＹＩＬＮＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧＮＡＰＲＬＬＩＳＧＡＴＳＬＥＴＧＦＰＳＲＦＳＧＴＧＳＧＫＤＹＴＬＳＩＳＳＬＱＴＥＤＶＧＴＹＹＣＱＱＹＷＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＲ（配列番号１）を有するＶＬ鎖の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１～３）を含む。
配列番号１に示されるＶＬ鎖アミノ酸配列は、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３のＶＬ鎖の配列である。
特定の態様において、ＶＬ及びＶＨ軽鎖のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ命名法に基づいて定義され得る。
特定の態様において、ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列：ＫＡＳＧＹＩＬＮＲＬＡ（配列番号２）を含み、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列：ＧＡＴＳＬＥＴ（配列番号３）を含み、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列：ＱＱＹＷＳＴＰＷＴ（配列番号４）を含む。これらのＬＣＤＲは、Ｋａｂａｔ命名法に基づいている。
特定の態様において、２つのＶＬ鎖は、ヒト化されている。特定の態様において、２つのＶＬ鎖は、ヒト抗体からのフレームワーク領域を含むようにヒト化されている。
特定の態様において、２つのＶＬ鎖は、配列：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＦＳＶＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＫＡＳＧＹＩＬＮＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧＮＡＰＲＬＬＩＳＧＡＴＳＬＥＴＧＦＰＳＲＦＳＧＴＧＳＧＫＤＹＴＬＳＩＳＳＬＱＴＥＤＶＧＴＹＹＣＱＱＹＷＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＲ（配列番号１）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の同一性である配列を含む。
特定の態様において、二重特異性抗体は、本明細書に記載のＶＬ鎖及び軽鎖定常領域を含む軽鎖を含む。軽鎖定常領域は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４．２に示されるアミノ酸配列を有するヒト免疫グロブリンカッパ鎖定常領域であり得る。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、第１のＶＨ鎖を含み、ＶＨ鎖は、配列：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＫＬＥＷＭＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＲＳＶＴＰＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号５）を有するＶＨ鎖の重鎖ＣＤＲ１～３（ＨＣＤＲ１～３）を含む。
配列番号５に示されるＶＨ鎖アミノ酸配列は、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３のＶＨ鎖の配列である。
特定の態様において、ＶＨ鎖のＨＣＤＲ１～３は、Ｋａｂａｔ命名法に基づいて定義される。
特定の態様において、第１のＶＨ鎖は、（ｉ）配列：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号６３）を含むＨＣＤＲ１、（ｉｉ）配列：ＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧ（配列番号６４）を含むＨＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列：ＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ３を含む。これらのＨＣＤＲは、Ｋａｂａｔ命名法に基づいている。
特定の態様において、第１及び／又は第２のＶＨ鎖は、ヒト化されている。特定の態様において、ＶＨ鎖は、ヒト抗体からのフレームワーク領域を含むようにヒト化されている。
特定の態様において、第１のＶＨ鎖は、配列：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＫＬＥＷＭＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＲＳＶＴＰＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号５）、
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＭＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）、又は
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含む。
特定の態様において、第１のＶＨ鎖は、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性である配列を含む。
特定の態様において、二重特異性抗体は、本明細書に記載の第１のＶＨ鎖及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む第１の重鎖を含む。
特定の態様において、二重特異性抗体の第２のＶＨ鎖は、ＴＡＡに結合する単一特異性抗体分子に由来し、ＴＡＡに対する二重特異性抗体分子の親和性は、そのＶＨ鎖が由来するＴＡＡに対する単一特異性抗体分子の親和性より少なくとも２倍低い（例えば、少なくとも３倍低い、少なくとも４倍低い、少なくとも５倍低い）。二重特異性抗体及び単一特異性抗体の親和性は、同じアッセイを使用して測定される。抗体親和性を測定するための任意の好適な方法が利用され得る。特定の態様において、親和性は、抗原との抗体の可逆的結合における平衡定数を計算することによって測定され得、解離定数（Ｋｄ）として表される。特定の態様において、Ｋｄは、ＥＬＩＳＡによって測定され得る。
特定の態様において、二重特異性抗体の第２のＶＨ鎖は、ＴＡＡに結合する単一特異性抗体分子に由来し、ＴＡＡに対する二重特異性抗体分子の最大有効濃度の半分（ＥＣ５０）は、そのＶＨ鎖が由来するＴＡＡに対する単一特異性抗体分子のＥＣ５０よりも、少なくとも２倍高い（例えば、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い）。二重特異性抗体及び単一特異性抗体のＥＣ５０は、同じアッセイを使用して測定される。抗体のＥＣ５０を測定するための任意の好適な方法が利用され得る。最大応答の半分（例えば、最大蛍光強度の半分）を提供する濃度は、ＥＣ５０として測定される。
試験抗体のＥＣ５０は、フローサイトメトリー又はＥＬＩＳＡによって決定され得る。例えば、フローサイトメトリーは、抗原（例えば、ヒト野生型ＡＢＣＧ２又は変異体ＡＢＣＧ２）を発現する細胞をフローサイトメトリー緩衝液中の抗体（抗体は連続的に希釈されている）と接触させることと、室温又は４℃で抗体が細胞に結合するのに十分な時間（例えば、１０分～１時間）インキュベートすることと、を伴い得る。インキュベートした後、任意で細胞を洗浄して、非特異的に結合した抗体を除去し得、かつ／又は細胞を、試験抗体に特異的に結合する蛍光標識二次抗体と接触させ得る。インキュベーション後、蛍光標識二次抗体を除去し、細胞を洗浄し得る。洗浄した細胞は、フローサイトメトリーによって選別され、蛍光標識二次抗体に結合した細胞数がカウントされ得る。最大応答の半分（例えば、最大蛍光強度の半分）を提供する濃度は、ＥＣ５０として測定される。フローサイトメトリーアッセイの変化では、細胞は、ＡＢＣＧ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞であり得る。
ＴＡＡは、がん細胞において過剰発現されることが知られている任意の抗原であり得る。例えば、ＴＡＡは、正常細胞では検出可能なレベルで発現されず、がん細胞内で発現される抗原であり、正常細胞及びがん細胞は、同じ細胞タイプ、例えば、上皮細胞である。例えば、ＴＡＡは、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を、未変異タンパク質のアミノ酸配列と比較して変化させる腫瘍特異的変異から生じる腫瘍抗原のクラスであるネオ抗原であり得る。他の態様において、ＴＡＡは、正常細胞で発現されるが、がん細胞でより高いレベルで発現される抗原である。特定の態様において、ＴＡＡは、ＣＤ４７、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、又はＰＤ－Ｌ１であり得る。
抗ＡＢＣＧ２及び抗ＣＤ４７二重特異性抗体
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ４７に結合し、第２のＶＨ鎖は、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）を含むＶＨ鎖のＨＣＤＲを含む。
配列番号８に示されるＶＨ鎖アミノ酸配列は、抗ＣＤ４７抗体５Ｆ９のＶＨ鎖の配列である。
特定の態様において、第２のＶＨ鎖は、配列：ＮＹＮＭＨ（配列番号９）を含むＨＣＤＲ１、配列：ＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号１０）を含むＨＣＤＲ２、及び配列：ＧＧＹＲＡＭＤＹ（配列番号１１）を含むＨＣＤＲ３を含む。ＨＣＤＲ１～３は、Ｋａｂａｔ命名法に基づいて定義される。
特定の態様において、第２のＶＨ鎖は、配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は１００％の同一性）である配列を含む。
特定の態様において、二重特異性抗体は、第１のＶＨ鎖及び第１のＶＬ鎖と、第２のＶＨ及び第２のＶＬ鎖と、を含み、第１のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＡＢＣＧ２に結合し、第２のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＣＤ４７に結合する。第１のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、前述のセクションに記載の通りであり得、共通の軽鎖は、第１のＶＬ鎖であり、第２のＶＨ鎖は、上記の通りであり、第２のＶＬ鎖は、抗ＣＤ４７抗体のＶＬ鎖のＬＣＤＲ１～３を含むＶＬ鎖であり得る。特定の態様において、二重特異性抗体は、それぞれ配列番号６３～６５に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～３を含む第１のＶＨ鎖と、それぞれ配列番号２～４に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～３を含む第１のＶＬ鎖と、それぞれ配列番号９～１１に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～３を含む第２のＶＨと、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖のＬＣＤＲ１～３を含む第２のＶＬ鎖と、を含む。
二重特異性抗体の追加の態様は、本出願に他の箇所に記載されており、本明細書に開示される配列のヒト化型、及び／又は第１のＶＨ鎖と第２のＶＨ鎖との間のヘテロ二量体の形成を促進するＦｃ領域における置換を含む。
抗ＡＢＣＧ２及び抗ＥｒｂＢ２二重特異性抗体
特定の態様において、ＴＡＡは、ＥｒｂＢ２であり得る。ＥｒｂＢ２は、受容体チロシンキナーゼ２又はＨＥＲ２としても知られている。特定の態様において、ＡＢＣＧ２及びＥｒｂＢ２に結合する二重特異性抗体分子は、前述のセクションに記載される共通の軽鎖及び第１のＶＨ鎖を含み、第２のＶＨ鎖は、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）を含むｍＡｂペルツズマブのＶＨ鎖のＨＣＤＲ１～３を含む。
Ｋａｂａｔ命名法に従って定義されるＨＣＤＲ１～３は、以下である。
ＨＣＤＲ１： ＤＹＴＭＤ（配列番号１３）
ＨＣＤＲ２： ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号１４）
ＨＣＤＲ３： ＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号１５）
ＡＢＣＧ２及びＥｒｂＢ２に結合する二重特異性抗体の第２のＶＨ鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の同一性であるアミノ酸配列を有し得る。
ＡＢＣＧ２及びＥｒｂＢ２に結合する二重特異性抗体の第２のＶＨ鎖は、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１６）に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する重鎖に存在し得る。
本明細書の他の箇所に記載されるように、ＶＬ鎖、第１のＶＨ鎖、及び第２のＶＨのうちの少なくとも１つ、２つ、又は全ては、ヒト化され得る。加えて、ＶＨ鎖のＦｃ領域は、第１のＶＨ鎖と第２のＶＨ鎖との間のヘテロ二量体化を増加させる置換を含み得る。特定の態様において、第１の重鎖は、ヒト化され得、電荷対置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ並びに第２の重鎖を含み、電荷対置換Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む。
特定の態様において、二重特異性抗体は、第１のＶＨ鎖及び第１のＶＬ鎖と、第２のＶＨ及び第２のＶＬ鎖と、を含み、第１のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＡＢＣＧ２に結合し、第２のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＨＥＲ２に結合する。第１のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、前述のセクションに記載の通りであり得、共通の軽鎖は、第１のＶＬ鎖であり、第２のＶＨ鎖は、上記の通りであり、第２のＶＬ鎖は、抗ＨＥＲ２抗体のＶＬ鎖のＬＣＤＲ１～３を含むＶＬ鎖であり得る。
抗ＡＢＣＧ２及び抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体
特定の態様において、ＴＡＡは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）であり得る。ＥＧＦＲはまた、受容体チロシン－タンパク質キナーゼＥｒｂＢ１及びＨＥＲ１としても知られている。ＥＧＦＲに対する抗原結合部位を含む第２のＶＨ鎖におけるＨＣＤＲ１～３は、抗ＥＧＦＲ抗体ネシツムマブ又はセツキシマブのＶＨ鎖に由来し得る。ネシツムマブの重鎖は、以下の配列を有する。
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＧＤＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＤＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＶＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＳＩＦＧＶＧＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＬＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１７）
セツキシマブの重鎖は、以下の配列を有する。
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１８）
第１の態様において、抗ＡＢＣＧ２抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体は、前述のセクションに記載されるＶＬ及び第１のＶＨ鎖を含み、第２のＶＨ鎖は、ネシツムマブのＶＨ領域からのＨＣＤＲを含み得る。Ｋａｂａｔ命名法に従って定義されるＨＣＤＲは、以下の配列を有し得る。
ＨＣＤＲ１： ＳＧＤＹＹＷＳ（配列番号１９）
ＨＣＤＲ２： ＹＩＹＹＳＧＳＴＤＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２０）
ＨＣＤＲ３： ＶＳＩＦＧＶＧＴＦＤＹ（配列番号２１）
特定の態様において、第２のＶＨ鎖は、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＧＤＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＤＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＶＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＳＩＦＧＶＧＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２２）に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の同一性であるアミノ酸配列を有し得る。
ＡＢＣＧ２及びＥＧＦＲに結合する二重特異性抗体の第２のＶＨ鎖は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する重鎖に存在し得る。
第２の態様において、抗ＡＢＣＧ２抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体は、前述のセクションに記載されるＶＬ及び第１のＶＨ鎖を含み、第２のＶＨ鎖は、セツキシマブのＶＨ領域からのＨＣＤＲを含み得る。Ｋａｂａｔ命名法に従って定義されるＨＣＤＲは、以下の配列を有し得る。
ＨＣＤＲ１： ＮＹＧＶＨ（配列番号２３）
ＨＣＤＲ２： ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号２４）
ＨＣＤＲ３： ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号２５）
特定の態様において、第２のＶＨ鎖は、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２６）に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の同一性であるアミノ酸配列を有し得る。
ＡＢＣＧ２及びＥＧＦＲに結合する二重特異性抗体の第２のＶＨ鎖は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する重鎖に存在し得る。
特定の態様において、二重特異性抗体は、第１のＶＨ鎖及び第１のＶＬ鎖と、第２のＶＨ及び第２のＶＬ鎖と、を含み、第１のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＡＢＣＧ２に結合し、第２のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＥＧＦＲに結合する。第１のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、前述のセクションに記載の通りであり得、共通の軽鎖は、第１のＶＬ鎖であり、第２のＶＨ鎖は、上記の通りであり、第２のＶＬ鎖は、抗ＥＧＦＲ抗体のＶＬ鎖のＬＣＤＲ１～３を含むＶＬ鎖であり得る。
抗ＡＢＣＧ２及び抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体
特定の態様において、ＴＡＡは、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）であり得る。ＰＤ－Ｌ１はまた、分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ１（Ｂ７－Ｈ１）としても知られている。特定の態様において、ＡＢＣＧ２及びＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体分子は、前述のセクションに記載される共通の軽鎖及び第１のＶＨ鎖を含み、第２のＶＨ鎖は、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２７）を含むＶＨ鎖のＨＣＤＲ１～３を含む。
Ｋａｂａｔ命名法に従って定義されるＨＣＤＲ１～３は、以下である。
ＨＣＤＲ１： ＤＳＷＩＨ（配列番号２８）
ＨＣＤＲ２： ＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）
ＨＣＤＲ３： ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３０）
ＡＢＣＧ２及びＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体の第２のＶＨ鎖は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の同一性であるアミノ酸配列を有し得る。
ＡＢＣＧ２及びＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体の第２のＶＨ鎖は、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３１）に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の同一性であるアミノ酸配列を有する重鎖に存在し得る。
特定の態様において、二重特異性抗体は、第１のＶＨ鎖及び第１のＶＬ鎖と、第２のＶＨ及び第２のＶＬ鎖と、を含み、第１のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＡＢＣＧ２に結合し、第２のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＰＤ－Ｌ１に結合する。第１のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、前述のセクションに記載の通りであり得、共通の軽鎖は、第１のＶＬ鎖であり、第２のＶＨ鎖は、上記の通りであり、第２のＶＬ鎖は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶＬ鎖のＬＣＤＲ１～３を含むＶＬ鎖であり得る。
本明細書の他の箇所に記載されるように、ＶＬ鎖（又は第１及び第２のＶＬ鎖）、第１のＶＨ鎖、及び第２のＶＨのうちの少なくとも１つ、２つ、又は全ては、ヒト化され得る。加えて、ＶＨ鎖のＦｃ領域は、第１のＶＨ鎖と第２のＶＨ鎖との間のヘテロ二量体化を増加させる置換を含み得る。特定の態様において、第１の重鎖は、ヒト化され得る。
第１のＨＣは、電荷対置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み得、第２の重鎖は、電荷対置換Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含み得、又はその逆である。
特定の態様において、二重特異性抗体は、本明細書に記載される第２のＶＨ鎖及び重鎖定常領域を含む第２の重鎖を含む。重鎖は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域配列を含み得る。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡの両方を発現する細胞に特異的に結合し、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡの両方を発現する細胞に対する親和性は、ＡＢＣＧ２又はＴＡＡのいずれかを発現する細胞と比較して２倍を上回る親和性を有する。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、ＡＢＣＧ２を発現する細胞に結合した場合、ＡＢＣＧ２による排出を阻害する。阻害は、二重特異性抗体の非存在下におけるＡＢＣＧ２による排出と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、又はそれ以上の排出の減少であり得る。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、１つ以上のＦｃγ受容体との抗体の結合を低下又は抑止するように改変されているＦｃドメインを含む。特定の態様において、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、及びＮ２９７Ａ／Ｑ／Ｇのうちの１つ以上を有し得る。
上記に要約されるように、本開示は、細胞排出ポンプを標的とするドメインと、がん関連抗原を標的とするドメインと、を有する多重特異性抗体を提供する。多剤耐性タンパク質１（ＡＢＣＧ２）－結合ドメイン及び白血球表面抗原ＣＤ４７－結合ドメインを含む多重特異性抗体が含まれる。本開示のかかる多重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２及びＣＤ４７の両方を発現する細胞に特異的に結合する。
一態様において、本開示の多重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２及びＣＤ４７の両方を標的とする。ＣＤ３８８及びＢＣＲＰとしても知られるＡＢＣＧ２は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）遺伝子から発現される、多剤耐性細胞における減少した薬物蓄積を担うエネルギー依存性排出ポンプである。ＣＤ４７は、インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）としても知られており、膜インテグリンに結合し、リガンドトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）及びシグナル制御タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）の受容体としても機能する、免疫グロブリンスーパーファミリー膜貫通タンパク質であり、ＣＤ４７遺伝子によってコードされる。ＣＤ４７リガンド結合は、食作用の阻害をもたらすことができ、したがって、免疫療法における標的として、ＣＤ４７細胞外ドメインのマスキングは、ＣＤ４７発現がん細胞の免疫媒介性殺傷の阻害を防止する。
本開示の多重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２結合ドメイン及びＣＤ４７結合ドメイン、並びに任意選択的に、Ｆｃドメインの全て又は一部を含む。ＡＢＣＧ２を発現するが、ＣＤ４７発現が低いか又は存在しない細胞の存在下では、多重特異性抗体は、該細胞に対して低い親和性を有する。それに対応して、ＣＤ４７を発現するが、ＡＢＣＧ２発現が低いか又は存在しない細胞の存在下では、多重特異性抗体は、該細胞に対して低い親和性を有する。しかしながら、ＡＢＣＧ２及びＣＤ４７の両方を発現する細胞の存在下では、多重特異性抗体は、該細胞に対して高い親和性を有する。
したがって、本開示の多重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２及びＣＤ４７の両方を発現する細胞に、ＡＢＣＧ２又はＣＤ４７のみを発現する細胞よりも高い親和性で結合する。対応して、本開示の多重特異性抗体は、対応する第２の標的が低レベルで存在する場合、例えば第１の標的及び第２の標的の両方が低レベルを上回って（例えば、平均、正常、及び／又は高レベルで）存在する場合と比較して、非常に低下した親和性で結合する。いくつかの実施形態において、対象多重特異性抗体がＡＢＣＧ２及びＣＤ４７の両方を発現する細胞に結合する親和性は、対象多重特異性抗体がＡＢＣＧ２若しくはＣＤ４７のいずれか（又はＡＢＣＧ２若しくはＣＤ４７のいずれかの低レベル）を発現する細胞に結合する親和性と比較して２倍超であり、例えば、２．５倍超、３倍超、４倍超、５倍超、６倍超、７倍超、８倍超、９倍超、１０倍超、又はそれ以上を含む。
いくつかの実施形態において、対象多重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２を発現する細胞に結合したとき、細胞性ＡＢＣＧ２タンパク質の機能を妨げ得る。したがって、本開示の多重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２タンパク質による排出を阻害し得、例えば、対象多重特異性抗体の非存在下におけるＡＢＣＧ２による排出と比較して、排出は、５％以上、例えば、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上を含めて、低下される。
いくつかの実施形態において、対象多重特異性抗体は、ＣＤ４７を発現する細胞に結合したとき、細胞性ＣＤ４７タンパク質の機能を妨げ得る。したがって、本開示の多重特異性抗体は、ＣＤ４７に対するＣＤ４７リガンド又はＣＤ４７結合パートナーの結合を阻害し得、例えば、対象多重特異性抗体の非存在下におけるＣＤ４７による結合と比較して、リガンド／結合パートナー結合は、５％以上、例えば、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上を含めて、低下される。
本開示の多重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２及びＣＤ４７に対して少なくとも二重特異的であり、抗体の立体構造は変化し得る。「抗体」という用語は、１つ以上（例えば、１つ又は２つ）の重鎖可変領域（ＶＨ）及び／若しくは１つ以上（例えば、１つ又は２つ）の軽鎖可変領域（ＶＬ）、又はエピトープに結合することができるそれらの細断片を含むタンパク質を指す。本明細書に記載の多重特異性抗体に関して、かかる抗体は、２つの異なる標的タンパク質に存在する少なくとも２つの異なるエピトープに結合することができる。対象多重特異性抗体によって結合される異なる標的タンパク質の数、したがって異なるエピトープの数は、変化し得、２つ（すなわち、二重特異性）、３つ（三重特異性）、４つ、又はそれ以上であり得る。
いくつかの実施形態において、本開示の多重特異性抗体は、共通の軽鎖を含み得る。本明細書で使用される場合、「共通の軽鎖」という用語は、一般に、同一の軽鎖の２つのコピーの多重特異性抗体への使用及び組み込みを指す。言い換えれば、組み立てられた多重特異性抗体における軽鎖は、ＡＢＣＧ２特異的重鎖と結合し、同じ軽鎖の第２のコピーは、ＣＤ４７特異的重鎖と結合する。
ＶＨ及びＶＬ領域は、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と称される超可変性の領域に更に細分化することができ、「フレームワーク領域（ＦＲ）」と称される、より保存された領域とともに散在される。ＦＲ及びＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６： ９０１～９１７を参照されたい）。ＶＨ鎖は、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、でＮ末端からＣ末端に配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含むことができる。同様に、ＶＬ鎖は、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、でＮ末端からＣ末端に配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含むことができる。
抗体のＶＨ又はＶＬ鎖は、重鎖又は軽鎖の定常領域の全て又は一部を更に含んで、それによって、それぞれ重又は軽免疫グロブリン鎖を形成することができる。一実施形態において、抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖の四量体であり、重鎖及び軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続される。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の様々な細胞及び補体系の第１の成分を含む、ホストの組織及び因子との抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、免疫グロブリンのタイプであるＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、及びそれらのサブタイプを含む。いくつかの実施形態において、対象抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質を指す。認められたヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、並びに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン軽鎖（約２５ｋＤ又は２１４個のアミノ酸）は、Ｎ末端の可変領域遺伝子（約１１０個のアミノ酸）及びＣ末端のカッパ又はラムダ定常領域によってコードされる。全長免疫グロブリン重鎖（約５０ｋＤ又は４４６個のアミノ酸）は、Ｎ末端の可変領域遺伝子（約１１６個のアミノ酸）及びＣ末端の他の上述の定常領域遺伝子のうちの１つ、例えば、ガンマ（約３３０個のアミノ酸をコードする）によってコードされる。いくつかの実施形態において、対象抗体は、全長免疫グロブリン重鎖及び全長免疫グロブリン軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、全長免疫グロブリン重鎖及び全長免疫グロブリン軽鎖を含まず、代わりに、１つ以上の全長免疫グロブリン重鎖の抗原結合断片、及び／又は全長免疫グロブリン軽鎖の１つ以上の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、別個のポリペプチド鎖に含まれ、他の実施形態において、抗原結合断片は、単一のポリペプチド鎖内に含まれる。
「抗原結合断片」という用語は、上記のようにＡＢＣＧ２又はＣＤ４７に特異的に結合することができる全長抗体の１つ以上の断片を指す。結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを含む、例えば、それらからなる、一価の断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片）、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む、例えば、それらからなる）、（ｉｖ）Ｆｖ断片（例えば、抗体の単一アームのＶＨ及びＶＬドメインを含む、例えば、それらからなる）、（ｖ）ｄＡｂ断片（ＶＨドメインを含む、例えば、それからなる）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、ＶＨ及びＶＬドメイン対が一価分子を形成するように組換え手段を使用して合成リンカーによって結合された抗体の単一アームのＶＨ及びＶＬドメインを含む、例えば、それらからなる）、（ｖｉｉｉ）ダイアボディ（ＶＨ及びＶＬドメインが、それらが一価分子を形成しないように対形成しない２つのｓｃＦｖを含む、例えば、それらからなり、ｓｃＦｖのうちの各１つのＶＨが、他のｓｃＦｖのＶＬドメインと対形成して二価分子を形成する）。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、組換え又は改変された抗体、例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫化、又はインビトロ生成された抗体である。本明細書で使用される場合、「組換え」又は「改変された」抗体という用語は、（ｉ）宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、（ｉｉ）組換えの組み合わせた抗体ライブラリーから単離された抗体、（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリン遺伝子で遺伝子導入された動物（例えば、マウス）から単離された抗体、又は（ｉｖ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、生成、若しくは単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、生成、又は単離される全ての抗体を含むことが意図される。かかる組換え抗体には、ヒト化、ＣＤＲ移植、キメラ、脱免疫化、及びインビボ生成された抗体が含まれ、任意選択的に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含むことができる。
改変された抗体は、任意の抗体ドメインが天然に存在する形態から改変され得る場合を含む、改変されたドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、改変された抗体は、改変されたＣＨ２及び／又は改変されたＣＨ３ドメインを含む、改変されたＦｃドメインを含む、改変された重鎖を含み得る。いくつかの事例において、改変されたＦｃドメインは、例えば、限定されないが、開示が本明細書に参照によりその全体で組み込まれているＧｕｎａｓｅｋｅｒａｎ ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５，１９６３７－１９６４６に記載されている手順の使用を通して、静電的ステアリング効果を用い得る。いくつかの事例において、二重特異性抗体は、ＣＨ３ドメインにおける電荷対置換によって組み立てられ、例えば、一方の重鎖が、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ置換を含むように改変され、他方の重鎖が、Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ置換を含むように改変される場合を含むが、これらに限定されない。電荷対置換された鎖は、互いにヘテロ二量体を優先的に形成し得る。アミノ酸置換の番号付けは、ＨＣのＥＵ番号付けシステムに従う。
いくつかの事例において、本開示の抗体は、電荷対置換を含む。いくつかの事例において、本開示の抗体は、電荷対置換を含まない。いくつかの事例において、所望の鎖の優先的なヘテロ二量体形成を促進する代替手段が用いられ得る。
いくつかの事例において、改変された重鎖は、ノブイントゥーホール（Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）改変を含み得る。「ノブイントゥーホール」アミノ酸改変は、抗体工学における合理的な設計戦略であり、二重特異性ＩｇＧ抗体を含む、多重特異性抗体の産生において、重鎖のヘテロ二量体化のために使用される。例えば、ノブイントゥーホール戦略を異なる特異性の２つのモノクローナル抗体から作製される二重特異性抗体に組み込む際、アミノ酸変化を操作して、モノクローナル抗体１（ｍＡｂ１）の重鎖のＣＨ３に「ノブ」、及びモノクローナル抗体２（ｍＡｂ２）の重鎖のＣＨ３に「ホール」を作製する。ノブは、例えば、チロシン（Ｙ）などの大きなアミノ酸によって代表され得るが、一方、ホールは、スレオニン（Ｔ）などの小さなアミノ酸によって代表され得る。例えば、ノブイントゥーホール改変は、第１のＣＨ３ドメインにＴ２２Ｙ置換及びパートナーであるＣＨ３ドメインにＹ８６Ｔ置換を作製し得る。ノブイントゥーホール改変の例は、Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８（１－２）：７－１５（２００１）、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（７）：６１７－２（１９９６）、及びＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（７）：６７７－８１（１９９８）に記載されており、それらの開示は、本明細書にそれらの全体が組み込まれる。対形成したノブイントゥーホール改変ドメインから生成された抗体では、二重特異性ヘテロ二量体が、一般に、主な割合を示す。
上記に要約されるように、本開示の多重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２結合ドメイン及びＣＤ４７結合ドメインを含む。かかるドメインは、ドメインによって結合されたエピトープ、可変領域配置、及び配列などを含め、変化し得る。
対象ＡＢＣＧ２結合ドメインは、ＡＢＣＧ２の１つ以上のエピトープに特異的に結合する。したがって、エピトープは、ＡＢＣＧ２エピトープである。抗ＡＢＣＧ２結合ドメインによって結合されるＡＢＣＧ２エピトープのサイズは変化し得、ＡＢＣＧ２エピトープが、例えば、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、４ａａ～１０ａａ、５ａａ～１０ａａ、６ａａ～１０ａａ、４ａａ～８ａａ、５ａａ～８ａａ、６ａａ～８ａａなどを含むがこれらに限定されない、４ａａ以下～１２ａａ以上の範囲にあり得るＡＢＣＧ２配列の連続的ストレッチを有するポリペプチドによって形成される場合を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＢＣＧ２エピトープは、例えば、ヒトＡＢＣＧ２配列：
ＭＳＳＳＮＶＥＶＦＩＰＶＳＱＧＮＴＮＧＦＰＡＴＡＳＮＤＬＫＡＦＴＥＧＡＶＬＳＦＨＮＩＣＹＲＶＫＬＫＳＧＦＬＰＣＲＫＰＶＥＫＥＩＬＳＮＩＮＧＩＭＫＰＧＬＮＡＩＬＧＰＴＧＧＧＫＳＳＬＬＤＶＬＡＡＲＫＤＰＳＧＬＳＧＤＶＬＩＮＧＡＰＲＰＡＮＦＫＣＮＳＧＹＶＶＱＤＤＶＶＭＧＴＬＴＶＲＥＮＬＱＦＳＡＡＬＲＬＡＴＴＭＴＮＨＥＫＮＥＲＩＮＲＶＩＱＥＬＧＬＤＫＶＡＤＳＫＶＧＴＱＦＩＲＧＶＳＧＧＥＲＫＲＴＳＩＧＭＥＬＩＴＤＰＳＩＬＦＬＤＥＰＴＴＧＬＤＳＳＴＡＮＡＶＬＬＬＬＫＲＭＳＫＱＧＲＴＩＩＦＳＩＨＱＰＲＹＳＩＦＫＬＦＤＳＬＴＬＬＡＳＧＲＬＭＦＨＧＰＡＱＥＡＬＧＹＦＥＳＡＧＹＨＣＥＡＹＮＮＰＡＤＦＦＬＤＩＩＮＧＤＳＴＡＶＡＬＮＲＥＥＤＦＫＡＴＥＩＩＥＰＳＫＱＤＫＰＬＩＥＫＬＡＥＩＹＶＮＳＳＦＹＫＥＴＫＡＥＬＨＱＬＳＧＧＥＫＫＫＫＩＴＶＦＫＥＩＳＹＴＴＳＦＣＨＱＬＲＷＶＳＫＲＳＦＫＮＬＬＧＮＰＱＡＳＩＡＱＩＩＶＴＶＶＬＧＬＶＩＧＡＩＹＦＧＬＫＮＤＳＴＧＩＱＮＲＡＧＶＬＦＦＬＴＴＮＱＣＦＳＳＶＳＡＶＥＬＦＶＶＥＫＫＬＦＩＨＥＹＩＳＧＹＹＲＶＳＳＹＦＬＧＫＬＬＳＤＬＬＰＭＲＭＬＰＳＩＩＦＴＣＩＶＹＦＭＬＧＬＫＰＫＡＤＡＦＦＶＭＭＦＴＬＭＭＶＡＹＳＡＳＳＭＡＬＡＩＡＡＧＱＳＶＶＳＶＡＴＬＬＭＴＩＣＦＶＦＭＭＩＦＳＧＬＬＶＮＬＴＴＩＡＳＷＬＳＷＬＱＹＦＳＩＰＲＹＧＦＴＡＬＱＨＮＥＦＬＧＱＮＦＣＰＧＬＮＡＴＧＮＮＰＣＮＹＡＴＣＴＧＥＥＹＬＶＫＱＧＩＤＬＳＰＷＧＬＷＫＮＨＶＡＬＡＣＭＩＶＩＦＬＴＩＡＹＬＫＬＬＦＬＫＫＹＳ（配列番号３２）、若しくはそのＥＣＤ１（４１７～４２８）：ＫＮＤＳＴＧＩＱＮＲＡＧ（配列番号３３）、そのＥＣＤ２（４９９～５０６）：ＬＫＰＫＡＤＡＦ（配列番号３４）、そのＥＣＤ３（５５７～６３０）： ＮＬＴＴＩＡＳＷＬＳＷＬＱＹＦＳＩＰＲＹＧＦＴＡＬＱＨＮＥＦＬＧＱＮＦＣＰＧＬＮＡＴＧＮＮＰＣＮＹＡＴＣＴＧＥＥＹＬＶＫＱＧＩＤＬＳＰＷＧＬＷＫＮＨ（配列番号３５）、又はＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＡＢＣＧ２配列： ＭＳＳＳＮＤＨＶＬＶＰＭＳＱＲＮＮＮＧＬＰＲＴＮＳＲＡＶＲＴＬＡＥＧＤＶＬＳＦＨＨＩＴＹＲＶＫＶＫＳＧＦＬＶＲＫＴＶＥＫ
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ＭＴＩＣＦＶＦＭＭＩＦＳＧＬＬＶＮＬＴＴＩＡＳＷＬＳＷＬＱＹＦＳＩＰＲＹＧＦＴＡＬＱＨＮＥＦＬＧＱＮＦＣＰＧＬＮＡＴＶＮ
ＮＴＣＮＹＡＴＣＴＧＥＥＹＬＴＫＱＧＩＤＬＳＰＷＧＬＷＫＮＨＶＡＬＡＣＭＩＶＩＦＬＴＩＡＹＬＫＬＬＦＬＫＫＹＳ（配列番号４０）、若しくはそのＥＣＤ１（４１７～４２８）：ＮＮＤＳＴＧＩＱＮＲＡＧ（配列番号４１）、そのＥＣＤ２（４９９～５０６）： ＬＫＰＴＡＤＡＦ（配列番号４２）、そのＥＣＤ３（５５７～６３０）：ＮＬＴＴＩＡＳＷＬＳＷＬＱＹＦＳＩＰＲＹＧＦＴＡＬＱＨＮＥＦＬＧＱＮＦＣＰＧＬＮＡＴＶＮＮＴＣＮＹＡＴＣＴＧＥＥＹＬＴＫＱＧＩＤＬＳＰＷＧＬＷＫＮＨ（配列番号４３）、又はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ ＡＢＣＧ２配列：ＭＳＳＳＮＶＥＶＦＩＰＭＳＱＧＮＴＮＧＦＰＡＴＴＳＮＤＬＫＡＦＴＥＧＡＶＬＳＦＨＮＩＣＹＲＶＫＬＫＳＧＦＬＰＣＲＫＰＶＥＫＥＩＬＳＮＩＮＧＩＭＫＰＧＬＮＡＩＬＧＰＴＧＧＧＫＳＳＬＬＤＶＬＡＡＲＫＤＰＳＧＬＳＧＤＶＬＩＮＧＡＰＲＰＡＮＦＫＣＮＳＧＹＶＶＱＤＤＶＶＭＧＴＬＴＶＲＥＮＬＱＦＳＡＡＬＲＬＰＴＴＭＴＮＨＥＫＮＥＲＩＮＲＶＩＱＥＬＧＬＤＫＶＡＤＳＫＶＧＴＱＦＩＲＧＶＳＧＧＥＲＫＲＴＳＩＧＭＥＬＩＴＤＰＳＩＬＦＬＤＥＰＴＴＧＬＤＳＳＴＡＮＡＶＬＬＬＬＫＲＭＳＫＱＧＲＴＩＩＦＳＩＨＱＰＲＹＳＩＦＫＬＦＤＳＬＴＬＬＡＳＧＲＬＭＦＨＧＰＡＱＥＡＬＧＹＦＥＳＡＧＹＨＣＥＡＹＮＮＰＡＤＦＦＬＤＩＩＮＧＤＳＴＡＶＡＬＮＲＥＥＤＦＫＡＴＥＩＩＥＰＳＫＱＤＫＰＬＩＥＫＬＡＥＩＹＶＮＳＳＦＹＫＥＴＫＡＥＬＨＱＬＳＧＧＥＫＫＫＫＩＴＶＦＫＥＩＳＹＴＴＳＦＣＨＱＬＲＷＶＳＫＲＳＦＫＮＬＬＧＮＰＱＡＳＩＡＱＩＩＶＴＶＩＬＧＬＶＩＧＡＩＹＦＧＬＫＮＤＳＴＧＩＱＮＲＡＧＶＬＦＦＬＴＴＮＱＣＦＳＳＶＳＡＶＥＬＦＶＶＥＫＫＬＦＩＨＥＹＩＳＧＹＹＲＶＳＳＹＦＬＧＫＬＬＳＤＬＬＰＭＲＭＬＰＳＩＩＦＴＣＩＶＹＦＭＬＧＬＫＰＫＡＤＡＦＦＶＭＭＦＴＬＭＭＶＡＹＳＡＳＳＭＡＬＡＩＡＡＧＱＳＶＶＳＶＡＴＬＬＭＴＩＣＦＶＦＭＭＩＦＳＧＬＬＶＮＬＴＴＩＡＳＷＬＳＷＬＱＹＦＳＩＰＲＹＧＦＴＡＬＱＨＮＥＦＬＧＱＮＦＣＰＧＬＮＡＴＧＮＮＰＣＮＹＡＴＣＴＧＥＥＹＬＶＫＱＧＩＤＬＳＰＷＧＬＷＫＮＨＶＡＬＡＣＭＩＶＩＦＬＴＩＡＹＬＫＬＬＦＬＫＫＹＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）などが含まれるが、これらに限定されないＡＢＣＧ２配列の連続的ストレッチに対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドによって形成することができる。
いくつかの実施形態において、ＡＢＣＧ２エピトープは、変異したＡＢＣＧ２ポリペプチドによって形成され得る。変異したＡＢＣＧ２ポリペプチドは、ヒトＡＢＣＧ２ポリペプチドに由来し得る。ヒトＡＢＣＧ２ポリペプチドは、開いた立体構造を有するＡＢＣＧ２ポリペプチドをもたらす変異を含み得る。開いた立体構造を有する変異体ヒトＡＢＣＧ２ポリペプチドは、本明細書に提供されるヒトＡＢＣＧ２ポリペプチドの配列を参照して番号付けされた、置換：Ｅ２１１Ｑを含み得る。特定の態様において、開いた立体構造を有する変異体ヒトＡＢＣＧ２ポリペプチドは、アミノ酸配列：ＭＳＳＳＮＶＥＶＦＩＰＶＳＱＧＮＴＮＧＦＰＡＴＡＳＮＤＬＫＡＦＴＥＧＡＶＬＳＦＨＮＩＣＹＲＶＫＬＫＳＧＦＬＰＣＲＫＰＶＥＫＥＩＬＳＮＩＮＧＩＭＫＰＧＬＮＡＩＬＧＰＴＧＧＧＫＳＳＬＬＤＶＬＡＡＲＫＤＰＳＧＬＳＧＤＶＬＩＮＧＡＰＲＰＡＮＦＫＣＮＳＧＹＶＶＱＤＤＶＶＭＧＴＬＴＶＲＥＮＬＱＦＳＡＡＬＲＬＡＴＴＭＴＮＨＥＫＮＥＲＩＮＲＶＩＱＥＬＧＬＤＫＶＡＤＳＫＶＧＴＱＦＩＲＧＶＳＧＧＥＲＫＲＴＳＩＧＭＥＬＩＴＤＰＳＩＬＦＬＤＱＰＴＴＧＬＤＳＳＴＡＮＡＶＬＬＬＬＫＲＭＳＫＱＧＲＴＩＩＦＳＩＨＱＰＲＹＳＩＦＫＬＦＤＳＬＴＬＬＡＳＧＲＬＭＦＨＧＰＡＱＥＡＬＧＹＦＥＳＡＧＹＨＣＥＡＹＮＮＰＡＤＦＦＬＤＩＩＮＧＤＳＴＡＶＡＬＮＲＥＥＤＦＫＡＴＥＩＩＥＰＳＫＱＤＫＰＬＩＥＫＬＡＥＩＹＶＮＳＳＦＹＫＥＴＫＡＥＬＨＱＬＳＧＧＥＫＫＫＫＩＴＶＦＫＥＩＳＹＴＴＳＦＣＨＱＬＲＷＶＳＫＲＳＦＫＮＬＬＧＮＰＱＡＳＩＡＱＩＩＶＴＶＶＬＧＬＶＩＧＡＩＹＦＧＬＫＮＤＳＴＧＩＱＮＲＡＧＶＬＦＦＬＴＴＮＱＣＦＳＳＶＳＡＶＥＬＦＶＶＥＫＫＬＦＩＨＥＹＩＳＧＹＹＲＶＳＳＹＦＬＧＫＬＬＳＤＬＬＰＭＲＭＬＰＳＩＩＦＴＣＩＶＹＦＭＬＧＬＫＰＫＡＤＡＦＦＶＭＭＦＴＬＭＭＶＡＹＳＡＳＳＭＡＬＡＩＡＡＧＱＳＶＶＳＶＡＴＬＬＭＴＩＣＦＶＦＭＭＩＦＳＧＬＬＶＮＬＴＴＩＡＳＷＬＳＷＬＱＹＦＳＩＰＲＹＧＦＴＡＬＱＨＮＥＦＬＧＱＮＦＣＰＧＬＮＡＴＧＮＮＰＣＮＹＡＴＣＴＧＥＥＹＬＶＫＱＧＩＤＬＳＰＷＧＬＷＫＮＨＶＡＬＡＣＭＩＶＩＦＬＴＩＡＹＬＫＬＬＦＬＫＫＹＳ（配列番号４５）等に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％）の同一性であるアミノ酸配列を含み得る。
対象ＡＢＣＧ２結合ドメインは、ＡＢＣＧ２に対する高親和性結合を示す。例えば、対象ＡＢＣＧ２結合ドメインは、ＡＢＣＧ２に、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、若しくは少なくとも約１０－１２Ｍ、又は１０－１２Ｍを超える親和性で結合する。対象ＡＢＣＧ２結合ドメインは、ＡＢＣＧ２に存在するエピトープに、約１０－７Ｍ～約１０－８Ｍ、約１０－８Ｍ～約１０－９Ｍ、約１０－９Ｍ～約１０－１０Ｍ、約１０－１０Ｍ～約１０－１１Ｍ、若しくは約１０－１１Ｍ～約１０－１２Ｍ、又は１０－１２Ｍを超える親和性で結合する。
対象ＡＢＣＧ２結合ドメインは、関連するが配列が異なるＥＰなどの、関連するが配列が異なる他のタンパク質内のアミノ酸によって形成されるエピトープには実質的に結合を示さない。関連するが配列が異なるタンパク質内のアミノ酸によって形成されるエピトープに対する対象ＡＢＣＧ２結合ドメインの結合は、一般に、ＡＢＣＧ２におけるエピトープに対するＡＢＣＧ２結合ドメインの特異的結合よりも実質的に低い親和性の非特異的結合である。実質的に低い親和性は、一般に、少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍低い親和性である。
対象ＡＢＣＧ２結合ドメインは、ＡＢＣＧ２トランスポーターを介した分子の輸送を低下させることができる。例えば、対象ＡＢＣＧ２結合ドメインは、輸送を、ＡＢＣＧ２結合ドメインの非存在下での輸送の程度と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はそれ以低下させることができる。
対象ＣＤ４７結合ドメインは、ＣＤ４７の１つ以上のエピトープに特異的に結合する。したがって、エピトープは、ＣＤ４７エピトープである。抗ＣＤ４７結合ドメインによって結合されるＣＤ４７エピトープのサイズは変化し得、ＣＤ４７エピトープが、例えば、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、４ａａ～１０ａａ、５ａａ～１０ａａ、６ａａ～１０ａａ、４ａａ～８ａａ、５ａａ～８ａａ、６ａａ～８ａａなどを含むがこれらに限定されない、４ａａ以下～１２ａａ以上の範囲にあり得るＣＤ４７配列の連続的ストレッチを有するポリペプチドによって形成される場合を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ４７エピトープは、例えば、ヒトＣＤ４７配列：
ＭＷＰＬＶＡＡＬＬＬＧＳＡＣＣＧＳＡＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶＳＷＦＳＰＮＥＮＩＬＩＶＩＦＰＩＦＡＩＬＬＦＷＧＱＦＧＩＫＴＬＫＹＲＳＧＧＭＤＥＫＴＩＡＬＬＶＡＧＬＶＩＴＶＩＶＩＶＧＡＩＬＦＶＰＧＥＹＳＬＫＮＡＴＧＬＧＬＩＶＴＳＴＧＩＬＩＬＬＨＹＹＶＦＳＴＡＩＧＬＴＳＦＶＩＡＩＬＶＩＱＶＩＡＹＩＬＡＶＶＧＬＳＬＣＩＡＡＣＩＰＭＨＧＰＬＬＩＳＧＬＳＩＬＡＬＡＱＬＬＧＬＶＹＭＫＦＶＡＳＮＱＫＴＩＱＰＰＲＫＡＶＥＥＰＬＮＡＦＫＥＳＫＧＭＭＮＤＥ（配列番号４６）、又はげっ歯類ＣＤ４７配列、例えば、マウスＣＤ４７配列番号：
ＭＷＰＬＡＡＡＬＬＬＧＳＣＣＣＧＳＡＱＬＬＦＳＮＶＮＳＩＥＦＴＳＣＮＥＴＶＶＩＰＣＩＶＲＮＶＥＡＱＳＴＥＥＭＦＶＫＷＫＬＮＫＳＹＩＦＩＹＤＧＮＫＮＳＴＴＴＤＱＮＦＴＳＡＫＩＳＶＳＤＬＩＮＧＩＡＳＬＫＭＤＫＲＤＡＭＶＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＳＲＥＧＫＴＶＩＥＬＫＮＲＴＶＳＷＦＳＰＮＥＫＩＬＩＶＩＦＰＩＬＡＩＬＬＦＷＧＫＦＧＩＬＴＬＫＹＫＳＳＨＴＮＫＲＩＩＬＬＬＶＡＧＬＶＬＴＶＩＶＶＶＧＡＩＬＬＩＰＧＥＫＰＶＫＮＡＳＧＬＧＬＩＶＩＳＴＧＩＬＩＬＬＱＹＮＶＦＭＴＡＦＧＭＴＳＦＴＩＡＩＬＩＴＱＶＬＧＹＶＬＡＬＶＧＬＣＬＣＩＭＡＣＥＰＶＨＧＰＬＬＩＳＧＬＧＩＩＡＬＡＥＬＬＧＬＶＹＭＫＦＶＡＳＮＱＲＴＩＱＰＰＲＮＲ（配列番号４７）など、又は非ヒト霊長類配列、例えば、Ｐｏｎｇｏ ａｂｅｌｉｉ（スマトラオランウータン）配列：
ＭＷＰＬＶＡＡＬＬＬＧＳＡＣＣＧＳＡＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶＳＷＦＳＰＮＥＮＩＬＩＶＩＦＰＩＦＡＩＬＬＦＷＧＱＦＧＩＫＴＬＫＹＲＳＧＧＭＤＥＫＴＩＡＬＬＶＡＧＬＩＩＴＶＩＶＩＶＧＡＩＬＦＶＰＧＥＹＳＬＫＮＡＴＧＬＧＬＩＶＴＳＴＧＩＬＩＬＬＨＹＹＶＦＳＴＡＩＧＬＮＳＦＶＩＡＩＬＶＩＱＶＩＡＹＩＬＡＶＶＧＬＳＬＣＩＡＡＣＩＰＭＨＧＰＬＬＩＳＧＬＳＩＬＡＬＡＱＬＬＧＬＶＹＭＫＦＶＡＳＮＱＫＴＩＱＰＰＲＫＡＶＥＥＰＬＮＡＦＫＥＳＫＧＭＭＮＤＥ（配列番号４８）など、又はＭａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）配列：
ＭＷＰＬＶＡＡＬＬＬＧＳＡＣＣＧＳＡＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＡＰＡＮＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶＳＷＦＳＰＮＥＮＩＬＩＶＩＦＰＩＦＡＩＬＬＦＷＧＱＦＧＩＫＴＬＫＹＲＳＧＧＭＤＥＫＴＩＡＬＬＶＡＧＬＭＩＴＶＩＶＩＶＧＡＩＬＦＶＰＧＥＹＳＬＫＮＡＴＧＬＧＬＩＶＴＳＴＧＩＬＩＬＬＨＹＹＶＦＳＴＡＩＧＬＴＳＦＶＩＡＩＬＶＩＱＶＩＡＹＩＬＡＶＶＧＬＳＬＣＩＡＡＣＩＰＭＨＧＰＬＬＩＳＧＬＳＩＬＡＬＡＱＬＬＧＬＶＹＭＫＦＶＡＳＮＱＫＴＩＱＰＰＲＫＡＶＥＥＰＬＮＡＦＫＥＳＫＧＭＭＮＤＥ（配列番号４９）などが含まれるが、これらに限定されないＣＤ４７配列の連続的ストレッチに対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドによって形成することができる。
対象抗ＣＤ４７結合ドメインは、ＣＤ４７に対する高親和性結合を示す。例えば、対象ＣＤ４７結合ドメインは、ＣＤ４７に、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、若しくは少なくとも約１０－１２Ｍ、又は１０－１２Ｍを超える親和性で結合する。対象ＣＤ４７結合ドメインは、ＣＤ４７に存在するエピトープに、約１０－７Ｍ～約１０－８Ｍ、約１０－８Ｍ～約１０－９Ｍ、約１０－９Ｍ～約１０－１０Ｍ、約１０－１０Ｍ～約１０－１１Ｍ、若しくは約１０－１１Ｍ～約１０－１２Ｍ、又は１０－１２Ｍを超える親和性で結合する。
対象ＣＤ４７結合ドメインは、関連するが配列が異なる免疫チェックポイントマーカーなどの、関連するが配列が異なる他のタンパク質内のアミノ酸によって形成されるエピトープには実質的に結合を示さない。関連するが配列が異なるタンパク質内のアミノ酸によって形成されるエピトープに対する対象ＣＤ４７結合ドメインの結合は、一般に、ＣＤ４７におけるエピトープに対するＣＤ４７結合ドメインの特異的結合よりも実質的に低い親和性の非特異的結合である。実質的に低い親和性は、一般に、少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍低い親和性である。
対象ＣＤ４７結合ドメインは、例えば、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、シグナル制御タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）、及びインテグリン（例えば、インテグリンａｖｂ３）を含む、ＣＤ４７に対するＣＤ４７結合パートナーの結合を低下させることができる。例えば、対象ＣＤ４７結合ドメインは、ＣＤ４７結合パートナーの結合を、ＣＤ４７結合ドメインの非存在下での結合の程度と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はそれ以低下させることができる。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、重鎖ＦＲ１領域、ＨＣＤＲ１、重鎖ＦＲ２領域、ＨＣＤＲ２、重鎖ＦＲ３領域、ＨＣＤＲ３、及び重鎖ＦＲ４領域を含む。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、ＦＲ領域の各々は、例えば、ヒトＦＲ領域を含む、哺乳類ＦＲ領域である。いくつかの実施形態において、対象抗体は、軽鎖ＦＲ１領域、ＬＣＤＲ１、軽鎖ＦＲ２領域、ＬＣＤＲ２、軽鎖ＦＲ３領域、ＬＣＤＲ３、及び重鎖ＦＲ４領域を含む。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、ＦＲ領域の各々は、例えば、ヒトＦＲ領域を含む、哺乳類ＦＲ領域である。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、Ｆｃ領域に対する電荷対電荷スワップ（ＫＫ）改変を含む抗ＡＢＣＧ２重鎖配列と、電荷対電荷スワップ（ＤＤ）改変を含む抗ＣＤ４７、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥＧＦＲ、抗ＰＤ－Ｌ１重鎖配列、特に電荷対電荷スワップ（ＤＤ）改変を有する抗ＣＤ４７重鎖配列と、を含み、配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＫＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＫＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号５０）を有する。いくつかの事例において、対象抗体は、電荷対置換以外の代替のヘテロ二量体Ｆｃ対形成戦略を含み得る。
電荷対電荷スワップ改変は、一方の重鎖がＫ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ置換を含むように改変され、他方の重鎖がＥ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ置換を含むように改変される置換を指す。電荷対置換された鎖は、互いとのヘテロ二量体の形成に好都合である。アミノ酸置換の番号付けは、Ｉｇ ＨＣのＥＵ番号付けシステムに従う。
対象抗体の領域及び／又は鎖は、１つ以上のリンカー領域によって連結されてもよいしされなくてもよい。存在する場合、リンカー領域は、長さが約５個のアミノ酸～約５０個のアミノ酸、例えば、長さが約５ａａ～約１０ａａ、約１０ａａ～約１５ａａ、約１５ａａ～約２０ａａ、約２０ａａ～約２５ａａ、約２５ａａ～約３０ａａ、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、又は約４５ａａ～約５０ａａであることができる。
対象抗体における使用に好適なリンカーには、「フレキシブルリンカー」が含まれる。存在する場合、リンカー分子は、一般に、連結した領域間のある程度のフレキシブルな動きを可能にするのに十分な長さである。リンカー分子は一般に、約６～５０個の原子長である。リンカー分子は、例えば、アリールアセチレン、２～１０個のモノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、又はそれらの組み合わせであり得る。ポリペプチドに結合することができる他のリンカー分子が、本開示の観点から使用され得る。
好適なリンカーは、容易に選択することができ、１個のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０個のアミノ酸、２個のアミノ酸～１５個のアミノ酸、３個のアミノ酸～１２個のアミノ酸、例えば、４個のアミノ酸～１０個のアミノ酸、５個のアミノ酸～９個のアミノ酸、６個のアミノ酸～８個のアミノ酸、又は７個のアミノ酸～８個のアミノ酸などの異なる長さの好適ないずれかのものであることができ、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸であり得る。
例示的なフレキシブルリンカーには、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号５１）、及びＧＧＧＳｎ（配列番号５２）を含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当該技術分野において既知の他のフレキシブルリンカーが含まれる。グリシン及びグリシン－セリンポリマーは、これらのアミノ酸の両方が比較的非構造的であり、したがって、成分間の中性テザーとして機能し得るため、関心対象のものである。グリシンポリマーは、グリシンがパイ－プサイ空間にアラニンさえよりも著しく多くアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限されないため、特に関心対象のものである（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２）を参照されたい）。例示的なフレキシブルリンカーには、ＧＧＳＧ（配列番号５３）、ＧＧＳＧＧ（配列番号５４）、ＧＳＧＳＧ（配列番号５５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号５６）、ＧＧＧＳＧ（配列番号５７）、ＧＳＳＳＧ（配列番号５８）などが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、上記の任意の要素にコンジュゲートされるペプチドの設計が、全て又は部分的にフレキシブルであるリンカーを含むことができ、それによって、リンカーがフレキシブルリンカー並びにより低いフレキシブル構造を付与する１つ以上の部分を含むことができることを認識するであろう。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、「ヒト化」されている。「ヒト化抗体」という用語は、実質的にヒト抗体鎖（アクセプター免疫グロブリン又は抗体と称される）からの可変領域フレームワーク残基、及び実質的に非ヒト抗体（例えば、げっ歯類（例えば、マウス抗体）、非ヒト霊長類など）（ドナー免疫グロブリン又は抗体と称される）からの少なくとも１つのＣＤＲを含む、抗体を指す。Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９ １００３３（１９８９）、米国特許第５，５３０，１０１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、ＷＯ９０／０７８６１、及び米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。定常領域は、存在する場合、実質的に又は完全にヒト免疫グロブリンからのものであることができる。いくつかの実施形態において、対象抗体は、１つ以上のＡＢＣＧ２ ＣＤＲ及び１つ以上のＣＤ４７ ＣＤＲ、並びにヒト抗体からの１つ以上のＦＲ領域を含む。ヒト化抗体を作製する方法は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第７，２５６，２７３号を参照されたい。
マウスＣＤＲのヒト可変ドメインフレームワークへの置換は、それらの正しい空間配向の保持をもたらすことができ、例えば、ヒト可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲを生じたマウス可変ドメインフレームワークと同じか又は類似の立体構造を取り入れる。これは、フレームワーク配列が、ＣＤＲの由来したマウス可変フレームワークドメインと高い配列同一性を示すヒト抗体から、ヒト可変ドメインを得ることによって達成することができる。重鎖及び軽鎖可変フレームワーク領域は、同じか又は異なるヒト抗体配列に由来することができる。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であることができるか、又はいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であることができる。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３（１９９１）、Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：９７１（１９９３）を参照されたい。
マウスドナー免疫グロブリン及び適切なヒトアクセプター免疫グロブリンの相補性決定領域が特定されており、次のステップは、これらの成分からの残基が、もしある場合は、どの残基を置換すべきか決定して、得られるヒト化抗体の特質を最適化することである。一般に、ネズミ残基の導入は、ヒトにおけるヒト－抗ネズミ－抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発する抗体のリスクを増加させるため、マウスによるヒトアミノ酸残基の置換は最小限にされるべきである。免疫応答を決定する当該技術分野で認められた方法を行って、特定の患者におけるか、又は臨床試験中のＨＡＭＡ応答を監視することができる。ヒト化抗体を投与された患者には、当該療法の投与の開始時及び全体を通じて免疫原性評価を行うことができる。ＨＡＭＡ応答は、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）及び／又は固相ＥＬＩＳＡ分析を含む、当業者に既知の方法を使用して、患者からの血清試料中で、ヒト化治療試薬に対する抗体を検出することによって測定される。多くの実施形態において、対象ヒト化抗体は、ヒト対象におけるＨＡＭＡ応答を実質的に誘発しない。
ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸は、ＣＤＲ立体構造及び／又は抗原との結合に対するそれらの起こりうる影響に基づいた置換について選択される。マウスＣＤＲ領域とヒト可変フレームワーク領域との非天然並置は、非天然立体構造抑制をもたらし得、特定のアミノ酸残基の置換によって補正されない限り、結合親和性の減少をもたらす。
置換のためのアミノ酸残基の選択は、部分的に、コンピュータモデリングによって決定することができる。免疫グロブリン分子の三次元画像を生成するためのコンピュータハードウェア及びソフトウェアは、当該技術分野において既知である。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖又はそのドメインについて解明された構造から開始して生成される。モデル化される鎖は、解明された三次元構造の鎖又はドメインとのアミノ酸配列類似性について比較され、最大の配列類似性を示す鎖又はドメインが、分子モデルの構築の出発点として選択される。少なくとも５０％の配列同一性を共有する鎖又はドメインが、モデリングのために選択され、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性又はそれ以上を共有するものが、モデリングのために選択される。解明された出発構造は、モデル化される免疫グロブリン鎖又はドメイン内の実際のアミノ酸と、出発構造内のアミノ酸との間の違いを可能にするように改変される。次いで、改変された構造は、複合免疫グロブリンに組み立てられる。最後に、モデルは、エネルギー最小限化によって、並びに全ての原子が互いに適切な距離内にあり、結合の長さ及び角度が化学的に許容可能な限界内にあることを検証することによって、洗練される。
ＣＤＲ領域及びフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１）によって定義される通りである。代替的な構造的定義がＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８（１９８９）、及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８９）（まとめて「Ｃｈｏｔｈｉａ」と呼ばれる）によって提唱されている。上記のＫａｂａｔによって定義されるフレームワーク残基が上記のＣｈｏｔｈｉａによって定義される構造的ループ残基を構成する場合、マウス抗体に存在するアミノ酸は、ヒト化抗体への置換のために選択され得る。「ＣＤＲ領域に隣接する」残基は、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列におけるＣＤＲのうちの１つ以上に直接隣接する位置、例えば、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲ、又はＣｈｏｔｈｉａによって定義されるＣＤＲに直接隣接する位置にアミノ酸残基を含む（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ ＪＭＢ １９６：９０１（１９８７）を参照されたい）。これらのアミノ酸は、特に、ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用し、アクセプターから選択される場合、ドナーＣＤＲを歪め、親和性を低下させる可能性がある。その上、隣接するアミノ酸は、抗原と直接相互作用し得（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７（１９８６）、これらのアミノ酸をドナーから選択することは、元の抗体における親和性を提供する全ての抗原接触を維持するために望ましいものであり得る。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、ｓｃＦｖ多量体を含む。例えば、いくつかの実施形態において、対象抗体は、ｓｃＦｖ二量体（例えば、２つのタンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ２）を含む）、ｓｃＦｖ三量体（例えば、３つのタンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ３）を含む）、ｓｃＦｖ四量体（例えば、４つのタンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ４）を含む）であるか、又は４つを超えるｓｃＦｖの多量体である（例えば、タンデムで）。ｓｃＦｖモノマーは、長さが約２個のアミノ酸～約１０個のアミノ酸のリンカー、例えば、長さが２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、又は１０ａａのリンカーを介して直列で連結することができる。好適なリンカーには、例えば、（Ｇｌｙ）ｘ（配列番号６９）が含まれ、ｘは２～１０の整数である。他の好適なリンカーは、上で考察されたものである。いくつかの実施形態において、対象ｓｃＦＶ多量体におけるｓｃＦｖモノマーの各々は、上述のように、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、免疫グロブリンの定常領域（例えば、Ｆｃ領域）を含む。Ｆｃ領域は、存在する場合、ヒトＦｃ領域であることができる。定常領域が存在する場合、抗体は、軽鎖及び重鎖定常領域の両方を含むことができる。好適な重鎖定常領域には、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４領域が含まれる。本明細書に記載の抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む全てのタイプの定常領域、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプを有する抗体を含む。好適な重鎖Ｆｃ領域の例は、ヒトアイソタイプＩｇＧ１ Ｆｃである。軽鎖定常領域は、ラムダ又はカッパであることができる。本発明の抗体（例えば、本発明のヒト化抗体）は、２つ以上のクラス又はアイソタイプからの配列を含むことができる。抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む四量体として、別個の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖとして、又は重鎖及び軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して連結されている単鎖抗体として、発現させることができる。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、カルボキシル末端に遊離チオール（－ＳＨ）基を含み、遊離チオール基を使用して、抗体を第２のポリペプチド（例えば、対象抗体を含む、別の抗体）、足場、担体などに結合させることができる。
対象抗体は、例えば、グルタルアルデヒド、ホモ二官能性架橋剤、又はヘテロ二官能性架橋剤を使用して、第２の部分（例えば、脂質、対象抗体以外のポリペプチド、合成ポリマー、炭水化物など）に共有結合することができる。グルタルアルデヒドは、ポリペプチドをそれらのアミノ部分を介して架橋結合する。ホモ二官能性架橋剤（例えば、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル、又はホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤）は、２つ以上の同一の反応性部分を含み、架橋剤が連結されるポリペプチドの混合物を含有する溶液に添加されるワンステップ反応手順で使用することができる。ホモ二官能性ＮＨＳエステル及びイミドエステルは、アミン含有ポリペプチドを架橋結合する。穏やかなアルカリ性ｐＨでは、イミドエステルは一級アミンとのみ反応してイミドアミドを形成し、架橋結合したポリペプチドの全電荷は影響を受けない。ホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤には、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、及び１，４－ジ－（３’，２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）が含まれる。
組成物及び製剤
本開示は、対象抗体を含む組成物を提供する。対象抗体組成物は、対象抗体に加えて、塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性界面活性剤；プロテアーゼ阻害剤；グリセロールなどのうちの１つ以上を含むことができる。
本開示の組成物にはまた、本明細書に記載の多重特異性抗体を含む医薬組成物が含まれる。一般に、製剤は、有効量の対象抗体を含む。「有効量」は、所望の結果、例えば、対象におけるがんの低下、対象におけるがんの成長率の低下、がんの症状の改善などを生じるのに十分な投与量を意味する。一般に、所望の結果は、対照と比較して、少なくとも、がんの症状における低下、がんの成長における低下、がんのサイズにおける低下である。対象抗体は、血液脳関門を回避するような手段で送達するか、又は製剤化することができる。いくつかの事例において、抗体は、送達増強剤を含み得、かかる増強剤が血液脳関門の横断を促進し得る場合、例えば、効率的な経皮送達を可能にする増加した透過性などを含む。有用な送達エンハンサーには、例えば、セレポート、レガデノソン、ボルネオール、プエラリン、プロピレングリコール、オレイン酸、アゾン、Ｎ－メチルピロリドン、Ｔｗｅｅｎ８０、リモネン、脂質ベースのナノ粒子（ＮＰ）、リポソーム、ニオソーム、トランスファーソーム、エトソーム、デンドリマー、ミセルＮＰ、ポリマーナノ構造、金属ナノ構造、磁性ナノ構造、組換えヒトヒアルロニダーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。
対象方法では、対象抗体は、所望の治療効果又は診断効果をもたらすことができる任意の好都合な手段を使用して、ホストに投与することができる。したがって、薬剤は、治療的投与のための様々な製剤に組み込むことができる。より具体的には、対象抗体は、適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤との組み合わせによって医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、及びエアロゾルなどの固体、半固体、液体、又は気体形態で調製物に製剤化され得る。
製剤投与形態では、対象抗体は、薬学的に許容される賦形剤と併せて投与することができ、又はそれらは、単独で、若しくは他の薬学的に活性な化合物との適切な関連、並びに組み合わせで使用され得る。以下の方法及び賦形剤は、単なる例示であり、決して限定されない。
経口調製物では、対象抗体は、単独又は適切な添加剤と組み合わせて使用して、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、若しくはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤とともに、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプン、若しくはゼラチンなどの結合剤とともに、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤とともに、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤とともに、必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、及び香味剤とともに、錠剤、粉末、顆粒、又はカプセルを作製することができる。いくつかの事例において、抗体の経口送達は、適切なヒドロゲルとの抗体の複合体化によって増強され得る。
対象抗体は、植物若しくは他の同様の油、合成脂肪族酸グリセリド、高脂肪族酸若しくはプロピレングリコールのエステルなどの水性又は非水性溶媒中に、必要に応じて、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、及び保存剤などの従来の添加剤とともに、それらを溶解、懸濁化、又は乳化することによって注射用の調製物に製剤化することができる。
対象抗体を含む医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を、任意選択的に、生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤、及び／又は等張化剤と混合することによって調製される。許容される担体、賦形剤、及び／又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度において受容者に無毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、及びクエン酸を含む酸化防止剤；保存剤（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロル－ｍ－クレゾール、メチル若しくはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、又はそれらの組み合わせ）；アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、及びそれらの組み合わせなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；ゼラチン若しくは血清アルブミンなどのタンパク質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン、ガラクトサミン、及びノイラミン酸などの糖類；並びに／又はＴｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、又は凍結乾燥形態から再構成された液体形態であり得、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液で再構成される。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、純水の体積（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積に等しい）を加えて戻すことであるが、抗微生物剤を含む溶液が、非経口投与のための医薬組成物の生成のために使用され得、Ｃｈｅｎ（１９９２）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ １８，１３１１－５４も参照されたい。
対象医薬組成物中の例示的な抗体濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍｌ、又は約５０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、又は約１５０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
抗体の水性製剤は、ｐＨ緩衝溶液中に、例えば、約４．０～約７．０、又は約５．０～約６．０、又は代替的に約５．５の範囲にあるｐＨで調製され得る。この範囲内のｐＨに好適な緩衝剤の例には、リン酸－、ヒスチジン－、クエン酸－、コハク酸－、酢酸－緩衝剤、及び他の有機酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤濃度は、例えば、緩衝剤及び製剤の所望の張度に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、又は約５ｍＭ～約５０ｍＭであることができる。
等張剤が抗体製剤に含まれ、製剤の張力を調節し得る。例示的な等張剤には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、及びアミノ酸、糖の群からの任意の成分、並びにそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、水性製剤は、等張性であるが、高張性又は低張性溶液が好適であり得る。「等張性」という用語は、それが比較される、生理学的塩溶液又は血清などの他のいくつかの溶液と同じ張度を有する溶液を示す。等張剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量、例えば、１００ｍＭ～３５０ｎＭの量で使用され得る。
また、界面活性剤を抗体製剤に添加して、製剤化した抗体の凝集を低下、及び／又は製剤中の微粒子の形成を最小限化、及び／又は吸着を低下し得る。例示的な界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ，Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。好適なポリオキシエチレンソルビタン－脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０（商標Ｔｗｅｅｎ２０（商標）で販売されている）及びポリソルベート８０（商標Ｔｗｅｅｎ８０（商標）で販売されている）である。好適なポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８又はＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８（商標）の名称で販売されているものである。好適なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、商標Ｂｒｉｊ（商標）で販売されているものである。界面活性剤の例示的な濃度は、約０．００１％～約１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
また、凍結保護剤を添加して、不安定な活性成分（例えば、タンパク質）を、凍結乾燥プロセス中の不安定化条件から保護し得る。例えば、既知の凍結保護剤には、糖（グルコース及びスクロースを含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む）、及びアミノ酸（アラニン、グリシン、及びグルタミン酸を含む）が含まれる。凍結保護剤は、約１０ｍＭ～５００ｎＭの量で含むことができる。
いくつかの実施形態において、対象製剤は、対象抗体、及び上記で特定された薬剤のうちの１つ以上（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張剤）を含み、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチル又はプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及びそれらの組み合わせなどの１つ以上の保存剤を本質的に含まない。他の実施形態において、保存剤は、例えば、約０．００１～約２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で製剤に含まれる。
例えば、対象製剤は、非経口投与に好適な液体又は凍結乾燥製剤であることができ、約１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの対象抗体、約０．００１％～約１％の少なくとも１つの界面活性剤、約１ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝剤、任意選択的に、約１０ｍＭ～約５００ｍＭの安定剤、及び約５ｍＭ～約３０５ｍＭの等張剤を含むことができ、約４．０～約７．０のｐＨを有する。
別の例として、対象非経口製剤は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ｍＭのスクロースを含む液体又は凍結乾燥製剤であり、５．５のｐＨを有する。
別の例として、対象非経口製剤は、１）１５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ｍＭのスクロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は２）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ｍＭのスクロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は３）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ｍＭのスクロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は４）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ｍＭのトレハロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は６）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ｍＭのトレハロースを含み、５．５のｐＨを有する、凍結乾燥製剤を含む。
別の例として、対象非経口製剤は、１）７．５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、１２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ １２５ｍＭのスクロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は２）３７．５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び１２５ｍＭのスクロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は３）３７．５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０１％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び１２５ｍＭのスクロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は４）３７．５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び１２５ｍＭのトレハロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は５）３７．５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０１％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び１２５ｍＭのトレハロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は６）５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ｍＭのトレハロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は７）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ｍＭのマンニトールを含み、５．５のｐＨを有するか、又は８）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、５．５のｐＨを有するか、又は９）１５０ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ｍＭのトレハロースを含み、５．５のｐＨを有するか、又は１０）１５０ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び２５０ｍＭのマンニトールを含み、５．５のｐＨを有するか、又は１１）１５０ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、５．５のｐＨを有するか、又は１２）１０ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０１％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び４０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、５．５のｐＨを有する、液体製剤である。
対象抗体は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤に利用することができる。対象抗体は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される推進剤に製剤化することができる。
更に、対象抗体は、乳化基剤又は水溶性基剤などの様々な基剤と混合することによって、座薬にすることができる。対象抗体は、座薬を介して直腸によって投与することができる。座薬は、体温で融解するが、室温で固化するカカオバター、カルボワックス、及びポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことができる。
シロップ、エリキシル剤、及び懸濁液などの経口又は直腸投与のための単位投与形態が提供され得、各投与単位、例えば、小さじ１杯、大さじ１杯、錠剤、又は座薬は、１つ以上の阻害剤を含有する所定量の組成物を含有する。同様に、注射又は静脈内投与のための単位投与形態は、対象抗体を滅菌水、生理食塩水、又は別の薬学的に許容される担体中の溶液として組成物中に含み得る。
本明細書で使用される場合、「単位投与形態」という用語は、ヒト及び動物の対象のための単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルと関連して、所望の効果を生じるのに十分な量で計算された所定量の本発明の化合物を含有する。対象抗体の仕様は、用いられる特定の抗体及び達成されるべき効果、並びにホストにおける各抗体に関連する薬力学に依存し得る。
他の投与形式もまた、対象発明による使用を見出すであろう。例えば、対象抗体は、座薬に、いくつかの事例において、エアロゾル及び鼻腔内組成物に、製剤化することができる。座薬では、ビヒクル組成物は、ポリアルキレングリコール、又はトリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体を含む。かかる座薬は、活性成分を約０．５％～約１０％（ｗ／ｗ）、例えば約１％～約２％の範囲で含有する混合物から形成され得る。
鼻腔内製剤は、通常、鼻粘膜に刺激を生ぜず、線毛機能を著しく妨害しないビヒクルを含む。水、水性生理食塩水、又は他の既知の物質などの希釈剤を、対象発明とともに用いることができる。鼻腔製剤はまた、例えばクロロブタノール及び塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を含有し得るがこれらに限定されない。界面活性剤は、鼻腔粘膜による対象タンパク質の吸収を増強するために存在し得る。
対象抗体は、注射可能な製剤として投与することができる。典型的には、注射可能な組成物は、液体溶液又は懸濁液として調製され、注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に好適な固体形態も調製され得る。調製物はまた、乳化され得るか、又は抗体がリポソームビヒクルに封入され得る。
好適な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせである。加えて、必要に応じて、ビヒクルは、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有し得る。かかる投与形態を調製する実際の方法は、当業者に既知であるか、又は明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５を参照されたい。投与される組成物又は製剤は、いずれにせよ、治療される対象において所望の状態を達成するのに適切な量の対象抗体を含有する。
ビヒクル、アジュバント、担体、又は希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。更に、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張度調整剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質は、一般に容易に入手可能である。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、制御放出製剤に製剤化される。徐放性調製物は、当技術分野で周知の方法を使用して調製され得る。徐放性調製物の好適な例には、マトリックスが成形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態にある、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、Ｌ－グルタミン酸とエチル－Ｌ－グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ヒドロゲル、ポリラクチド、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が含まれる。徐放性調製物に含まれる抗体の生物学的活性の起こりうる喪失及び免疫原性の起こりうる変化は、適切な添加剤を使用することによって、水分含量を制御することによって、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって防止され得る。
本発明の範囲内の制御された放出は、多くの延長した放出剤形のうちのいずれか１つを意味すると解釈することができる。以下の用語：連続放出、制御放出、遅延放出、デポー、漸進的放出、長期放出、プログラム化放出、遅延放出、比例放出、延長放出、リポジトリ、抑制遅延放出、間隔化放出、持続放出、タイムコート、時限放出、遅滞作用、延長作用、階層化時間作用、長期作用、長期化作用、反復作用、遅延作用、持続作用、持続作用薬、及び延長放出は、本発明の目的のために、制御された放出と実質的に同等であるとみなされ得る。これらの用語の更なる考察は、Ｌｅｓｃｚｅｋ Ｋｒｏｗｃｚｙｎｓｋｉ，Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１９８７（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に見出され得る。
投与量
好適な投薬量は、様々な臨床的要因に基づいて、主治医又は他の有資格医療従事者によって決定することができる。医学分野において周知であるように、任意の一患者のための投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、患者の性別、期間、及び投与経路、全般的な健康、並びに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。対象抗体は、用量当たり１ｎｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．５ｍｇ／ｋｇ体重～５ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与され得るが、特に前述の要因を考慮して、この例示的な範囲を下回るか又は上回る用量が想定される。レジメンが連続注入である場合、１分当たり体重１キログラム当たり１μｇ～１０ｍｇの範囲であることもできる。
当業者は、用量レベルが、特定の抗体、症状の重症度、及び副作用に対する対象の感受性の関数として変化し得ることを容易に理解するであろう。所与の化合物における好ましい投与量は、様々な手段によって当業者は容易に決定可能である。
投与の経路
対象抗体は、インビボ及びエクスビボ法、並びに全身的及び局所的投与経路を含む、薬物送達に好適な任意の利用可能な方法及び経路を使用して個体に投与される。
従来の薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、動脈内、直腸、鼻腔、経口、並びに他の経腸及び非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、抗体及び／又は所望の効果に応じて組み合わされ得るか、又は必要に応じて調整され得る。対象抗体組成物は、単回用量又は複数回用量で投与することができる。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、経口投与される。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、吸入経路を介して投与される。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、鼻腔内投与される。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、局所的に投与される。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、頭蓋内投与される。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、静脈内に投与される。
薬剤は、全身的又は局所的な経路を含む、従来の薬物の送達に好適な任意の利用可能な従来の方法及び経路を使用して、ホストに投与することができる。一般に、本発明によって企図される投与経路には、経腸、非経口、又は吸入経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
吸入投与以外の非経口投与経路には、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、脊髄内、胸骨内、及び静脈内経路、すなわち、消化管を通る以外の任意の投与経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。非経口投与は、対象抗体の全身又は局所送達をもたらすために行うことができる。全身送達が所望される場合、投与は、典型的には、医薬調製物の侵襲的又は全身的に吸収される局所若しくは粘膜投与を伴う。
対象抗体はまた、経腸投与によって対象に送達することができる。経腸投与経路には、経口及び直腸（例えば、坐剤を使用する）送達が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
治療とは、少なくともホストに罹患する病理学的状態に関連する症状の改善を意味し、改善は、広い意味で使用されて、がん及び／又はがんの成長、並びにそれに関連する疼痛などの治療される病理学的状態に関連するパラメータ、例えば、症状、の大きさの少なくとも低下を指す。したがって、治療はまた、病理学的状態、又は少なくともそれに関連する症状が完全に阻害され、例えば、生じることが防止されるか、停止され、例えば、終結され、それによってホストはもはや病理学的状態、又は少なくとも病理学的状態を特徴とする症状に苦しまない状況を含む。
様々なホスト（「ホスト」という用語は、本明細書において「対象」「個体」、及び「患者」という用語と互換的に使用される）が、対象方法に従って治療可能である。一般に、かかるホストは、「哺乳動物」又は「哺乳類」であり、これらの用語は、食肉目（例えば、イヌ及びネコ）、げっ歯類（例えば、マウス、モルモット、及びラット）、及び霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、及びサル）を含む、哺乳綱内である生物を説明するために広く使用される。いくつかの実施形態において、ホストは、ヒトである。
対象抗体の単位用量を有するキットが、例えば、経口用量又は注射可能用量で、提供される。いくつかの実施形態において、単位用量を含有する容器に加えて、目的の病理学的状態の治療における抗体の使用及びそれに伴う利点を説明する情報添付文書がある。
核酸
本開示は、対象抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。対象抗体をコードするヌクレオチド配列は、意図された標的細胞（例えば、コードされた抗体を合成及び／又は分泌するように遺伝子改変されている細胞）におけるヌクレオチド配列の発現を可能にするプロモーター及びエンハンサーなどの１つ以上の調節エレメントに動作可能に連結することができる。
好適なプロモーター及びエンハンサーエレメントは、当該技術分野において既知である。細菌細胞における発現のため、好適なプロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ｌａｍｂｄａ Ｐ及びｔｒｃが含まれるが、これらに限定されない。真核生物細胞における発現のため、好適なプロモーターには、軽鎖及び／又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスからの長期末端反復に存在するプロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、並びに様々な技術的に知られている組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
対象抗体をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクター及び／又はクローニングベクターに存在することができる。対象抗体が２つ以上の別個のポリペプチドを含む場合、２つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じか又は別個のベクターにクローニングすることができる。別個のポリペプチドは、別個のプロモーター、１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、１つ以上の自己切断配列（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａなどの２Ａ切断配列）、それらの組み合わせなどの様々な戦略を使用して、単一核酸又は単一ベクターから発現され得る。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製起点、並びにベクターの複製及び／又は維持を提供する他の特性を含むことができる。
多数の好適なベクター及びプロモーターは当業者に既知であり、多くは、対象組換え構築物を生成するために市販されている。以下のベクターが、例として提供される。細菌：ｐＢｓ、ファージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
発現ベクターは、一般に、プロモーター配列の近くに位置する都合のよい制限部位を有して、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供する。発現宿主で作動する選択可能なマーカーが存在し得る。好適な発現ベクターには、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、及びＷＯ９５／００６５５を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９；Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、ＷＯ９３／０９２３９におけるＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５、及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照されたい）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、並びにラウス肉腫ウイルス、ハービー肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスなどに由来するベクター）などに基づくウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
上記のように、対象核酸は、対象多重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。対象核酸は、重－及び軽－鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、対象核酸は、重－及び／又は軽－鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含み、ＣＤＲコード配列は、ＦＲコードヌクレオチド配列とともに散在される。いくつかの実施形態において、対象核酸は、重－及び／又は軽－鎖ＣＤ４７ ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含み、ＣＤＲコード配列は、ＦＲコードヌクレオチド配列とともに散在される。いくつかの実施形態において、ＦＲコードヌクレオチド配列は、ヒトＦＲコードヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態において、対象核酸は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、アミノ酸配列は、本明細書に提供されるアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
例えば本明細書に記載のような核酸は、いくつかの事例において、例えば、細胞を核酸と接触させることによって、細胞内に導入され得る。導入された核酸を有する細胞は、一般に、本明細書において遺伝子改変細胞と呼ばれる。様々な核酸送達方法が用いられ得、例えば、ネイキッド核酸送達、ウイルス送達、化学的トランスフェクション、遺伝子銃などを含むが、これらに限定されない。
細胞
本開示は、対象核酸で遺伝子改変されている単離された遺伝子改変細胞（例えば、インビトロ細胞、エクスビボ細胞、培養細胞など）を提供する。いくつかの実施形態において、単離された対象遺伝子改変細胞は、対象抗体を産生することができる。いくつかの事例において、遺伝子改変細胞は、抗体を、例えば、それを必要とする対象に送達することができる。いくつかの事例において、遺伝子改変細胞は、多重特異性抗体の産生、スクリーニング、及び／又は発見に使用され得る。遺伝子改変細胞はまた、いくつかの事例において、内因性遺伝子発現が、低下、例えば、阻害、ノックダウンなど、又は抑止、例えば、ノックアウト、されている細胞を含み得る。遺伝子改変細胞はまた、いくつかの事例において、遺伝子の発現が増強されている、例えば、内因性遺伝子の発現が増加されるか、又は異種遺伝子の発現が増加される細胞を含み得る。
好適な細胞には、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞などの真核生物細胞、及び細菌細胞などの原核生物細胞が含まれる。対象核酸の宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、又は他の既知の方法によってもたらされ得る。
好適な哺乳類細胞には、初代細胞及び不死化細胞株が含まれる。好適な哺乳類細胞株には、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが含まれる。好適な哺乳類細胞株には、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの事例において、有用な哺乳類細胞は、哺乳類組織又は器官に由来する細胞を含み得る。いくつかの事例において、使用される細胞は、腎細胞であり、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの確立された腎細胞株の腎細胞を含む。
好適な酵母細胞又は真菌若しくは藻類細胞には、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ菌種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ菌種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ菌種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ菌種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなどが含まれるが、これらに限定されない。
好適な原核生物細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ菌種などの様々な実験室株のうちのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１７６－１１８１、米国特許第６，４４７，７８４号、及びＳｉｚｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：２９９－３０２を参照されたい。本発明に用いることができるサルモネラ株の例には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ及びＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが含まれるが、これらに限定されない。好適なシゲラ株には、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ ｄｉｓｅｎｔｅｒｉａｅが含まれるが、これらに限定されない。典型的には、実験室株は非病原性のものである。他の好適な細菌の非限定的な例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌種などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。
いくつかの事例において、本開示の細胞は、免疫細胞であり得る。本明細書に使用される場合、「免疫細胞」という用語は、一般に、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球細胞（白血球）を含む。「免疫細胞」には、例えば、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）及び骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。「Ｔ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）、及びガンマ－デルタＴ細胞を含むＣＤ３を発現する全てのタイプの免疫細胞が含まれる。「細胞傷害性細胞」には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び好中球が含まれ、これらの細胞は、細胞傷害性応答を媒介することができる。
いくつかの事例において、本開示の多重特異性抗体を発現する有用な細胞には、プロデューサーＴ細胞が含まれ得る。プロデューサーＴ細胞の非限定的な例には、Ｔｓａｉ ＆ Ｄａｖｉｌａ Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１６）５（５）：ｅ１１２２１５８に記載されるものが含まれ、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示の多重特異性抗体をコードする核酸配列を含むように操作されたプロデューサーＴ細胞は、いくつかの事例において、抗体を、それを必要とする対象に送達するために用いられ得る。
本開示の細胞にはまた、細胞内のＡＢＣＧ２及びＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）のうちの１つ以上の発現を変更及び／又は修正するように遺伝子改変された細胞が含まれる。かかる改変細胞は、多重特異性抗体の結合をアッセイすることを含む、様々な目的のために有用であり、本明細書に提供される説明及び方法に従って産生されるものを含むが、これらに限定されない。いくつかの事例において、ＡＢＣＧ２は、対象細胞株においてノックアウト又はノックダウンされ得る。いくつかの事例において、ＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）は、対象細胞株においてノックアウト又はノックダウンされ得る。いくつかの事例において、ＡＢＣＧ２は、対象細胞株において、構成的に又は誘導的に過剰発現され得る。いくつかの事例において、ＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）は、対象細胞株において構成的に又は誘導的に過剰発現され得る。いくつかの事例において、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）の両方が、対象細胞株においてノックダウンされるか、ノックアウトされるか、又は構成的に若しくは誘導的に過剰発現され得る。ノックダウン、ノックアウト、及び／又は過剰発現のための任意の都合のよい適切な方法が使用され得る。導入された核酸は、安定的に組み込まれ得るか、又は一過性に存在し得る。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、ＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）を発現する遺伝子改変ヒト細胞株を含み、ＡＢＣＧ２の過剰発現のためにＡＢＣＧ２をコードする配列を含む外因性核酸を含む。かかる細胞において、ＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）発現は、内因的に又は外因的に由来し得（すなわち、導入される）、ＡＢＣＧ２発現は、安定的か又は一過性であり得る。いくつかの事例において、ＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）を発現する本開示の細胞株は、ＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）を発現し、ＡＢＣＧ２を安定的に過剰発現する遺伝子改変ヒト細胞を生成するように構成され得る。
本開示の細胞及び細胞株は、例えば、本明細書に記載の培養方法の使用を介して、培養され得る。いくつかの事例において、細胞を遺伝子改変するために核酸が導入されている細胞は、培養されて細胞株を産生し得る。有用な細胞株には、例えば、ＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）を発現し、ＡＢＣＧ２を安定的に過剰発現する、ヒト細胞株を含む遺伝子改変細胞株が含まれるが、これらに限定されない。
本開示の細胞及びその細胞株は、本開示の様々な方法に、例えば、試験試料、対照などとして使用され得る。例えば、いくつかの事例において、ＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）がノックアウト及び／又はノックダウンされている細胞は、参照細胞として使用され得、例えば、本開示の多重特異性抗体の結合が比較され得る。他の有用な参照細胞には、例えば、非がん性細胞、並びに正常細胞及び正常レベルのＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）を含む、正常レベルの様々なタンパク質を発現する細胞が含まれるが、これらに限定されない。
方法
上に要約されるように、本開示の方法は、細胞を本開示の抗体と接触させる方法、本開示の抗体を対象に投与することを伴う方法に従って対象を治療する方法、本出願に記載の要素、例えば、多重特異性抗体、組成物及び製剤、核酸、発現ベクター、細胞などを作製する方法を含む。
上記に要約されるように、本開示の方法は、がん細胞を本開示の多重特異性抗体と接触させて、例えば、がん細胞の殺傷を促進及び／又は増強することを含む。いくつかの事例において、がん細胞の殺傷は、２つの標的ががん細胞で共発現されるときに、二重特異的標的化によるがん細胞のオプソニン化の結果として、がん細胞に作用する免疫応答又は免疫細胞によって媒介される。いくつかの事例において、がん細胞の殺傷は、例えば、多重特異性抗体によってがん細胞の表面に存在するＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７）エピトープをマスキング又はアンタゴナイズする結果として、がん細胞に作用する免疫応答又は免疫細胞によって媒介される。いくつかの事例において、がん細胞の殺傷は、例えば、多重特異性抗体によるがん細胞でのＡＢＣＧ２アンタゴニズムの結果として、がん細胞の細胞排出の阻害によって媒介される。いくつかの事例において、多重特異性抗体と接触させる細胞は、多剤耐性がん細胞であり得る。がん細胞を本開示の多重特異性抗体と接触させることを伴う方法は、がん細胞を、例えば、化学療法剤、免疫療法、放射線療法などを含む追加の療法又は活性剤と接触させることを含み得、又は含み得ない。
がん細胞を本開示の多重特異性抗体と接触させることは、概して、例えば、多重特異性抗体の非存在下でのがん細胞の殺傷レベルと比較して、がん細胞の殺傷を増強する。いくつかの事例において、追加の活性剤が用いられる場合、がん細胞の増強された殺傷は、追加の活性剤を単独で使用して観察される殺傷レベルと比較して示され得る。多重特異性抗体に起因するがん細胞殺傷の増強量は変化し、がん細胞殺傷の少なくとも５％の増加から少なくとも９０％以上の範囲であり得、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％などを含むが、これらに限定されない。かかる増加は、１つ以上の追加の活性剤を単独で接触させることと比較され得る。
がん細胞の増強された殺傷は、様々な手段によって評価され得、例えば、観察試験、インビトロでの細胞に基づいた細胞傷害性アッセイ、フローサイトメトリー、細胞生存率標識（例えば、１つ以上の細胞生存染色を使用する）などを含むが、これらに限定されない。
治療方法
本開示は、がんを治療する方法を提供し、方法は、一般に、それを必要とする個体（例えば、がんを有する個体）に、有効量の対象多重特異性抗体を、単独で（例えば、単独療法で）、又は１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて（例えば、併用療法で）投与することを伴う。本開示の多重特異性抗体の投与は、任意の都合のよい適切な送達経路によって行われ得る。
本開示の態様は、対象におけるがんを治療する方法で使用するための本明細書の前述のセクションによる二重特異性抗体分子を含み、方法は、抗体を対象に投与することを含む。方法は、抗体を、少なくとも１つの追加の活性剤と組み合わせて投与することを含み、少なくとも１つの追加の活性剤は、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、又はそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、少なくとも１つの追加の活性剤は、化学療法剤であり、任意選択的に、化学療法剤は、タキソール、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、タキソール、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エトポシド、ミトキサントロン、又はメトトレキサートである。ＡＢＣＧ２における基質には、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ミトキサントロン、アントラサイクリン：ドキソルビシン、エピルビシンなど）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン類似体：トポテカン、ジャイマテカンなど）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ）などが含まれる。
また、対象におけるがんを治療する方法で使用するための化学療法剤が開示され、方法は、化学療法剤を、本明細書に記載される抗体と組み合わせて対象に投与することを含み、任意選択的に、化学療法剤は、タキソール、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エトポシド、ミトキサントロン、又はメトトレキサートである。
したがって、投与には、例えば、注射による抗体の送達、注入による抗体の送達、多重特異性抗体をコードする核酸又は発現ベクターの送達、対象に多重特異性抗体を発現及び分泌する細胞を投与することによる抗体の送達などが含まれるが、これらに限定されない。薬剤、薬剤をコードする核酸、薬剤を発現する細胞などの投与は、薬剤と接触させること、核酸と接触させること、細胞と接触させることなどを含み得る。
いくつかの実施形態において、有効量の対象多重特異性抗体は、単独（例えば、単独療法で）又は１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて（例えば、併用療法で）、１回以上の用量で投与される場合、がんの有害症状を、抗体による治療の不存在下での有害症状の重症度と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はそれ以上低下させるのに有効な量である。
いくつかの実施形態において、有効量の対象多重特異性抗体は、単独（例えば、単独療法で）又は１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて（例えば、併用療法で）、１回以上の用量で投与される場合、治療されている個体におけるがんを改善する（すなわち、がんの成長を遅延させ、がんの成長を停止させ、がんの成長を逆転させ、がん細胞（腫瘍細胞などを含む）を殺傷する）のに有効な量である。例えば、有効量の対象抗体は、多重特異性抗体による治療の不存在と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又はそれ以上、個体におけるがん成長率を低下させるか、又は個体におけるがんサイズを低下させることができる。
いくつかの事例において、対象は、全身的に治療され得、対象多重特異性抗体を、１つ以上の追加の試薬とともに、又は伴わずに用いることを含む。「全身治療」とは、本明細書で使用される場合、特定の腫瘍（例えば、原発腫瘍又は定義された二次腫瘍）又は特定のがんを含有する組織（例えば、肝臓がんの症例では肝臓、血液がんの症例では血液など）を標的とするだけではない治療を意味する。全身治療は、一般に、対象の体に全体として向けられ、例えば、全身放射線療法、全身化学療法、全身免疫療法、それらの組み合わせなどを含み得るが、これらに限定されない。
いくつかの事例において、対象は、局所的に治療され得、対象多重特異性抗体を、１つ以上の追加の試薬とともに、又は伴わずに用いることを含む。「局所治療」とは、本明細書で使用される場合、腫瘍の位置（例えば、原発腫瘍又は定義された二次腫瘍）に特異的に向けられているか、又はがんを含有する組織（例えば、肝臓がんの症例では肝臓、血液がんの症例では血液など）に特異的に向けられている治療を意味する。いくつかの事例において、局所治療はまた、腫瘍に直接隣接する組織など、腫瘍を取り囲む組織などの腫瘍を取り囲む環境に影響を及ぼすような方法で投与され得る。局所治療は、一般に、原発腫瘍などの腫瘍部位を含む、がん部位から遠い組織に影響を及ぼさないか、又は標的化されない。対象多重特異性抗体に加えて、又は対象多重特異性抗体と組み合わせて、投与され得る有用な局所治療には、例えば、手術、局所放射線療法、局所凍結療法、局所レーザー療法、局所外用療法、それらの組み合わせなどが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、対象治療方法は、対象多重特異性抗体及び１つ以上の追加の治療剤を投与することを伴う。好適な追加の治療剤には、化学療法剤、放射線治療試薬、免疫療法試薬、他の抗体又は多重特異性抗体剤などが含まれるが、これらに限定されない。本開示の多重特異性抗体の対象投与の前、間、又は後に対象に投与され得る追加の療法は、例えば、がんのタイプ、対象の治療歴、全般的な健康状態、及び／又は任意の併存疾患などを含む、多くの要因に応じて変化するであろう。有用ながん療法には、例えば、放射線療法、化学療法、免疫療法などが含まれるが、これらに限定されない。
放射線療法には、ビームなどの外部から加えられる線源からの、又は小さな放射線源の植え込みによって送達される、Ｘ線又はガンマ線が含まれるが、これらに限定されない。
がん治療における使用に好適な抗体には、ネイキッド抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標））、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、アレムツズマブ（Ｌｅｍｔｒａｄａ（商標））、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（商標））、オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ（商標））、ランブロリズマブ（ＭＫ－３４７５）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標））など、及びコンジュゲート化抗体、例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｒｔａｒｇ（商標）、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標））、９０Ｙ標識イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（商標））、１３１Ｉ－標識トシツモマ（Ｂｅｘｘａｒ（商標））などが含まれるが、これらに限定されない。がん治療における使用に好適な抗体には、腫瘍関連抗原に対して作製された抗体も含まれるが、これらに限定されない。かかる抗原には、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、ＣＡＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２など）、Ｌｅｙ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリンアルファ－Ｖ－ベータ－３、インテグリンアルファ－５－ベータ－１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＰＤ－Ｌ１、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシンなどが含まれるが、これらに限定されない。
従来のがん療法にはまた、がんに対する標的化療法が含まれ、例えば、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２／ｎｅｕ）を標的とするＡｄｏ－トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ）（乳がんでの使用が承認されている）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１／ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２／ｎｅｕ）を標的とするアファチニブ（Ｇｉｌｏｔｒｉｆ）（非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、標的とするアルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（腎細胞がん、黒色腫での使用が承認されている）、ＡＬＫを標的とするアレクチニブ（Ａｌｅｃｅｎｓａ）（非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、ＣＤ５２を標的とするアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）（Ｂ細胞慢性リンパ性白血病での使用が承認されている）、ＰＤ－Ｌ１を標的とするアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）（尿路上皮がん、非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、ＰＤ－Ｌ１を標的とするアベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）（メルケル細胞がんでの使用が承認されている）、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲβ、ＶＥＧＦＲ１／２／３を標的とするアキシチニブ（Ｉｎｌｙｔａ）（腎細胞がんでの使用が承認されている）、ＢＡＦＦを標的とするベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ）（エリテマトーデスでの使用が承認されている）、ＨＤＡＣを標的とするベリノスタット（Ｂｅｌｅｏｄａｑ）（末梢Ｔ細胞リンパ腫での使用が承認されている）、ＶＥＧＦリガンドを標的とするベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）（子宮頸がん、結腸直腸がん、卵管がん、膠芽腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、腹膜がん、腎細胞がんでの使用が承認されている）、ＣＤ１９／ＣＤ３を標的とするブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）（急性リンパ芽球性白血病（前駆体Ｂ細胞）での使用が承認されている）、プロテアソームを標的とするボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）（多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫での使用が承認されている）、ＡＢＬを標的とするボスチニブ（Ｂｏｓｕｌｉｆ）（慢性骨髄性白血病での使用が承認されている）、ＣＤ３０を標的とするブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫での使用が承認されている）、ＡＬＫを標的とするブリガチニブ（Ａｌｕｎｂｒｉｇ）（非小細胞肺がん（ＡＬＫ＋）での使用が承認されている）、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＶＥＧＦＲ２を標的とするカボザンチニブ（Ｃａｂｏｍｅｔｙｘ、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ）（髄性甲状腺がん、腎細胞がんでの使用が承認されている）、プロテアソームを標的とするカルフィルゾミブ（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ）（多発性骨髄腫での使用が承認されている）、ＡＬＫを標的とするセリチニブ（Ｚｙｋａｄｉａ）（非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１／ＥＲＢＢ１）を標的とするセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（結腸直腸がん、頭頸部の扁平上皮がんでの使用が承認されている）、ＭＥＫを標的とするコビメチニブ（Ｃｏｔｅｌｌｉｃ）（黒色腫での使用が承認されている）、ＡＬＫ、ＭＥＴ、ＲＯＳ１を標的とするクリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ）（非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、ＢＲＡＦを標的とするダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ）（黒色腫、非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、ＣＤ３８を標的とするダラツムマブ（Ｄａｒｚａｌｅｘ）（多発性骨髄腫での使用が承認されている）、ＡＢＬを標的とするダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）（慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病での使用が承認されている）、ＲＡＮＫＬを標的とするデノスマブ（Ｘｇｅｖａ）（骨の巨細胞腫瘍での使用が承認されている）、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１（ＧＤ２）を標的とするジヌツキシマブ（Ｕｎｉｔｕｘｉｎ）（小児神経芽細胞腫での使用が承認されている）、ＰＤ－Ｌ１を標的とするデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）（尿路上皮がんでの使用が承認されている）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１／ＣＤ３１９／ＣＲＡＣＣ）を標的とするエロツズマブ（Ｅｍｐｌｉｃｉｔｉ）（多発性骨髄腫での使用が承認されている）、ＩＤＨ２を標的とするエナシデニブ（Ｉｄｈｉｆａ）（急性骨髄性白血病での使用が承認されている）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１／ＥＲＢＢ１）を標的とするエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）（非小細胞肺がん、膵臓がんでの使用が承認されている）、ｍＴＯＲを標的とするエベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）（膵臓、胃腸、又は肺起源の神経内分泌腫瘍、腎細胞がん、切除不能な上衣下巨細胞性星状細胞腫、乳がんでの使用が承認されている）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１／ＥＲＢＢ１）を標的とするゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）（非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、ＣＤ２０を標的とするイブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（非ホジキンリンパ腫での使用が承認されている）、ＢＴＫを標的とするイブルチニブ（Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ）（マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症での使用が承認されている）、ＰＩ３Ｋδを標的とするイデラリシブ（Ｚｙｄｅｌｉｇ）（慢性リンパ性白血病、濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫での使用が承認されている）、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲ、ＡＢＬを標的とするイマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（ＧＩ間質腫瘍（Ｋｉｔ＋）、隆起性皮膚線維肉腫、多発性悪性血液疾患での使用が承認されている）、ＣＴＬＡ－４を標的とするイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）（黒色腫での使用が承認されている）、プロテアソームを標的とするイキサゾミブ（Ｎｉｎｌａｒｏ）（多発性骨髄腫での使用が承認されている）、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２／ｎｅｕ）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１／ＥＲＢＢ１）を標的とするラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（乳がん（ＨＥＲ２＋））での使用が承認されている）、ＶＥＧＦＲ２を標的とするレンバチニブ（Ｌｅｎｖｉｍａ）（腎細胞がん、甲状腺がんでの使用が承認されている）、ＦＬＴ３を標的とするミドスタウリン（Ｒｙｄａｐｔ）（急性骨髄性白血症（ＦＬＴ３＋）での使用が承認されている）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１／ＥＲＢＢ１）を標的とするネシツムマブ（Ｐｏｒｔｒａｚｚａ）（扁平上皮非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２／ｎｅｕ）を標的とするネラチニブ（Ｎｅｒｌｙｎｘ）（乳がんでの使用が承認されている）、ＡＢＬを標的とするニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ）（慢性骨髄性白血病での使用が承認されている）、ＰＡＲＰを標的とするニラパリブ（Ｚｅｊｕｌａ）（卵巣がん、卵管がん、腹膜がんでの使用が承認されている）、ＰＤ－１を標的とするニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）（結腸直腸がん、頭頸部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、尿路上皮がんでの使用が承認されている）、ＣＤ２０を標的とするオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）（慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫での使用が承認されている）、ＣＤ２０を標的とするオファツムマブ（（Ａｒｚｅｒｒａ、ＨｕＭａｘ－ＣＤ２０）（慢性リンパ性白血病での使用が承認されている）、ＰＡＲＰを標的とするオラパリブ（Ｌｙｎｐａｒｚａ）（卵巣がんでの使用が承認されている）、ＰＤＧＦＲαを標的とするオララツマブ（Ｌａｒｔｒｕｖｏ）（軟部組織肉腫での使用が承認されている）、ＥＧＦＲを標的とするオシメルチニブ（Ｔａｇｒｉｓｓｏ）（非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６を標的とするパルボシクリブ（Ｉｂｒａｎｃｅ）（乳がんでの使用が承認されている）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１／ＥＲＢＢ１）を標的とするパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（結腸直腸がんでの使用が承認されている）、ＨＤＡＣを標的とするパノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｋ）（多発性骨髄腫での使用が承認されている）、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＫＩＴを標的とするパゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）（腎細胞がん腫での使用が承認されている）、ＰＤ－１を標的とするペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）（古典的ホジキンリンパ腫、黒色腫、非小細胞肺がん（ＰＤ－Ｌ１＋）、頭頸部扁平上皮がん、固形腫瘍（ＭＳＩ－Ｈ）での使用が承認されている）、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２／ｎｅｕ）を標的とするペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ）（乳がん（ＨＥＲ２＋）での使用が承認されている）、ＡＢＬ、ＦＧＦＲ１－３、ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ２を標的とするポナチニブ（Ｉｃｌｕｓｉｇ）（慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病での使用が承認されている）、ＶＥＧＦＲ２を標的とするラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ）（結腸直腸がん、胃がん又は食道胃接合部（ＧＥＪ）腺がん、非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲβ、ＲＡＦ、ＲＥＴ、ＶＥＧＦＲ１／２／３を標的とするレゴラフェニブ（Ｓｔｉｖａｒｇａ）（結腸直腸がん、胃腸間質腫瘍、肝細胞がんでの使用が承認されている）、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６を標的とするリボシクリブ（Ｋｉｓｑａｌｉ）（乳がん（ＨＲ＋、ＨＥＲ２－）での使用が承認されている）、ＣＤ２０を標的とするリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ、Ｍａｂｔｈｅｒａ）（非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、関節リウマチ、多発性血管炎性肉芽腫症での使用が承認されている）、ＣＤ２０を標的とするリツキシマブ／ヒアルロニダーゼヒト（Ｒｉｔｕｘａｎ Ｈｙｃｅｌａ）（慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫での使用が承認されている）、ＨＤＡＣを標的とするロミデプシン（Ｉｓｔｏｄａｘ）（皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫での使用が承認されている）、ＰＡＲＰを標的とするルカパリブ（Ｒｕｂｒａｃａ）（卵巣がんでの使用が承認されている）、ＪＡＫ１／２を標的とするルキソリチニブ（Ｊａｋａｆｉ）（骨髄線維症での使用が承認されている）、ＩＬ－６を標的とするシルツキシマブ（Ｓｙｌｖａｎｔ）（多中心性キャッスルマン病での使用が承認されている）、標的とするシプリューセル－Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）（前立腺がんでの使用が承認されている）、平滑化を標的とするソニデギブ（Ｏｄｏｍｚｏ）（基底細胞がんでの使用が承認されている）、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＫＩＴ、ＲＡＦを標的とするソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）（肝細胞がん、腎細胞がん、甲状腺がんでの使用が承認されている）、ｍＴＯＲを標的とするテムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）（腎細胞がんでの使用が承認されている）、ＣＤ２０を標的とするトシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）（非ホジキンリンパ腫での使用が承認されている）、ＭＥＫを標的とするトラメチニブ（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ）（黒色腫、非小細胞肺がんでの使用が承認されている）、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２／ｎｅｕ）を標的とするトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（乳がん（ＨＥＲ２＋）、胃がん（ＨＥＲ２＋）での使用が承認されている）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１／ＥＲＢＢ１）、ＲＥＴ、ＶＥＧＦＲ２を標的とするバンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ）（髄性甲状腺がんでの使用が承認されている）、ＢＲＡＦを標的とするベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）（黒色腫での使用が承認されている）、ＢＣＬ２を標的とするベネトクラクス（Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ）（慢性リンパ性白血病での使用が承認されている）、ＰＴＣＨ、平滑化を標的とするビスモデギブ（Ｅｒｉｖｅｄｇｅ）（基底細胞がんでの使用が承認されている）、ＨＤＡＣを標的とするボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ）（皮膚Ｔ細胞リンパ腫での使用が承認されている）、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦＡ／Ｂを標的とするＺｉｖ－アフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ）（結腸直腸がんでの使用が承認されている）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の方法に関連した使用に好適な生物学的応答改良剤には、（１）チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性の阻害剤、（２）セリン／スレオニンキナーゼ活性の阻害剤、（３）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体などの腫瘍関連抗原アンタゴニスト、（４）アポトーシス受容体アゴニスト、（５）インターロイキン－２、（６）インターフェロン－α、（７）インターフェロン－γ、（８）コロニー刺激因子、（９）血管新生の阻害剤、及び（１０）腫瘍壊死因子のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
化学療法剤は、がん細胞の増殖を低下させる非ペプチド性（すなわち、非タンパク質性）化合物であり、細胞傷害性剤及び細胞増殖抑制剤を包含する。化学療法剤の非限定的な例には、アルキル化剤、ニトロウレア、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイド、及びステロイドホルモンが含まれる。
細胞増殖を低下させるように作用する薬剤は、当該技術分野で既知であり、広く使用されている。かかる薬剤には、窒素マスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、及びトリアゼンなどのアルキル化剤が含まれ、限定されないが、メクロレタミン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））、メルファラン（Ｌ－サルコリシン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル－ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、ダカルバジン、及びテモゾロミドが挙げられる。
抗代謝剤には、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤が含まれ、限定されないが、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ－Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦｕｄＲ）、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、ペントスタチン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、メトトレキサート、１０－プロパギル－５，８－ジデアザ葉酸（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８－ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、及びゲムシタビンが挙げられる。
好適な天然生成物及びそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、及びエピポドフィロトキシン）には、限定されないが、Ａｒａ－Ｃ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン－Ｃ、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナール；アルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンなど；ポドフィロトキシン、例えば、エトポシド、テニポシドなど；抗生物質、例えば、アントラサイクリン、ダウノルビシン塩酸塩（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、及びモルホリノ誘導体など；フェノキシゾンビスシクロペプチド、例えば、ダクチノマイシン；塩基性糖ペプチド、例えば、ブレオマイシン；アントラキノングリコシド、例えば、プリカマイシン（ミトラマイシン）；アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン；アジリノピロロインドレジオン、例えば、マイトマイシン；大環状免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、ＦＫ－５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシンなどが含まれる。
他の抗増殖性細胞傷害性剤は、ナベルベン、ＣＰＴ－１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イホサミド、及びドロロキサフィンである。
抗増殖活性を有する微小管影響剤もまた、使用に好適であり、限定されないが、アロコルヒチン（ＮＳＣ ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ ７５７）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＳＣ ３３４１０）、ドルスタチン１０（ＮＳＣ ３７６１２８）、メイタンシン（ＮＳＣ １５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ ３３２５９８）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、Ｔａｘｏｌ（登録商標）誘導体、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、チオコルヒチン（ＮＳＣ ３６１７９２）、トリチルシステリン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、天然及び合成のエポチロン（エトピロンＡ、エポチロンＢ、ディスコデルモリドを含むが、これらに限定されない）、エストラムスチン、ノコダゾールが含まれる。
使用に好適なホルモン調節剤及びステロイド（合成アナログを含む）には、アドレノコルチコステロイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾンなど、エストロゲン及びプレゲスチン、例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェンなど、副腎皮質抑制剤、例えば、アミノグルテチミド、１７α－エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトロン、メチルプレドニゾロン、メチル－テストロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド（ドロゲニル）、トレミフェン（フェアストン）、及びゾラデックスが含まれるが、これらに限定されない。エストロゲンは増殖及び分化を刺激し、したがって、エストロゲン受容体に結合する化合物が、この活性を遮断するために使用される。コルチコステロイドは、Ｔ細胞増殖を阻害し得る。
他の化学療法剤には、金属錯体、例えば、シスプラチン（ｃｉｓ－ＤＤＰ）、カルボプラチンなど；尿素、例えば、ヒドロキシウレア；及びヒドラジン、例えば、Ｎ－メチルヒドラジン；エピドフィロトキシン；トポイソメラーゼ阻害剤；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガフールなどが含まれる。関心対象の他の抗増殖剤には、免疫抑制剤、例えば、ミコフェノール酸、サリドマイド、デソキシスペルグアリン、アザスポリン、レフルノマイド、ミゾリビン、アザスピラン（ＳＫＦ１０５６８５）；Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ＺＤ１８３９、４－（３－クロロ－４－フルオロフェニルアミノ）－７－メトキシ－６－（３－（４－モルホリニル）プロポキシ）キナゾリンなどが含まれる。
「タキサン」には、パクリタキセル、並びに任意の活性タキサン誘導体又はプロドラッグが含まれる。「パクリタキセル」（例えば、ドセタキセル、ＴＡＸＯＬ（商標）、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）（ドセタキセルの製剤）、パクリタキセルの１０－デスアセチル類似体、及びパクリタキセルの３’Ｎ－デスベンゾイル－３’Ｎ－ｔ－ブトキシカルボニル類似体などの類似体、製剤、及び誘導体を含むように本明細書で理解されるべきである）は、当業者に既知の技術（ＷＯ９４／０７８８２、ＷＯ９４／０７８８１、ＷＯ９４／０７８８０、ＷＯ９４／０７８７６、ＷＯ９３／２３５５５、ＷＯ９３／１００７６、米国特許第５，２９４，６３７号、同第５，２８３，２５３号、同第５，２７９，９４９号、同第５，２７４，１３７号、同第５，２０２，４４８号、同第５，２００，５３４号、同第５，２２９，５２９、及びＥＰ５９０，２６７を参照されたい）を利用して容易に調製され得るか、又は例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａからのＴ７４０２、又はＴａｘｕｓ ｙａｎｎａｎｅｎｓｉｓからのＴ－１９１２）を含む様々な市販の供給源から入手され得る。
パクリタキセルは、一般的な化学的に利用可能な形態のパクリタキセルだけでなく、類似体及び誘導体（例えば、上述のＴａｘｏｔｅｒｅ（商標）ドセタキセル）及びパクリタキセルコンジュゲート（例えば、パクリタキセル－ＰＥＧ、パクリタキセル－デキストラン、パクリタキセル－キシロース、又はパクリタキセル－アルブミン）を指すと理解されるべきである。
「タキサン」という用語には、親水性誘導体及び疎水性誘導体の両方を含む、様々な既知の誘導体も含まれる。タキサンの誘導体には、国際特許出願第ＷＯ９９／１８１１３号に記載のガラクトース及びマンノースの誘導体、同第ＷＯ９９／１４２０９号に記載のピペラジノ及び他の誘導体、同第ＷＯ９９／０９０２１号、同第ＷＯ９８／２２４５１号、及び米国特許第５，８６９，６８０号に記載のタキサンの誘導体、ＷＯ９８／２８２８８に記載の６－チオ誘導体、米国特許第５，８２１，２６３号に記載のスルフェンアミドの誘導体、並びに米国特許第５，４１５，８６９号に記載のタキソール誘導体が含まれるが、これらに限定されない。パクリタキセルのプロドラッグが更に含まれ、ＷＯ９８／５８９２７、ＷＯ９８／１３０５９、及び米国特許第５，８２４，７０１号に記載されるものを含むがこれらに限定されない。
有用な免疫療法には、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法、及び／又は治療方法において標的化され得る、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、及びＴＩＭ－３などの免疫チェックポイントマーカーなどを標的とする他の免疫療法が含まれる。抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法は、例えば、対象に、有効量の１つ以上の抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療アンタゴニストを投与することを含むが、これらに限定されず、かかるアンタゴニストとしては、例えば、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペンブロリズマブ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標）（アテゾリズマブ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５）、ＣＡ－１７０、ＢＭＳ－２０２、ＢＭＳ－８、ＢＭＳ－３７、ＢＭＳ－２４２などが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ－４は、ＣＤ８０及びＣＤ８６に結合する。ＣＴＬＡ－４に対する抗体が、いくつかのがんタイプを治療するために承認されてきている。ＣＴＬＡ－４と他の免疫療法との共阻害効果は、ＣＴＬＡ－４を、特定のがんを治療する他の免疫療法と組み合わせて使用するための優れた候補にする。ＴＩＭ－３はまた、いくつかのがんタイプにおける免疫療法のために標的化され得る。
ＬＡＧ－３は、がんを治療するための臨床試験中である。抗ＬＡＧ－３免疫療法には、Ｔエフェクター細胞を活性化し（ＬＡＧ－３阻害シグナルを前活性化ＬＡＧ－３＋細胞に下方調節することによって）、誘導された（すなわち、抗原特異的な）Ｔｒｅｇ抑制活性を阻害する両方ができるアンタゴニストＬＡＧ－３抗体を用いるものが含まれる。有用なＬＡＧ－３アンタゴニスト抗体には、レラトリマブ（ＢＭＳ－９８６０１６、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによって開発された）、ＩＭＰ７０１（Ｉｍｍｕｔｅｐによって開発された）、ＴＳＲ－０３３（抗ＬＡＧ－３ｍＡｂ、ＴＥＳＡＲＯ，Ｉｎｃ．によって開発された）などが含まれる。
免疫療法にはまた、例えば、養子細胞療法（ＡＣＴ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法などのＴ細胞に基づく免疫療法が含まれる。例えば、対象は、対象のがんによって発現される抗原を標的にするように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞の集団が投与され得る。Ｔ細胞ベースの療法は、いくつかの事例において、対象から血液試料又は腫瘍生検などの細胞試料を得ることと、試料から免疫細胞をエクスビボで、培養される免疫細胞の遺伝子改変の有無にかかわらず培養することと、を伴い得る。例として、免疫細胞は、対象から得られ、エクスビボで培養され、がんによって発現された抗原に特異的なＣＡＲで改変されて、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を産生し得る。次いで、ＣＡＲ Ｔ細胞は、対象に再導入されてがんを標的にし得る。Ｔ細胞をベースの免疫療法は、治療される特定のがんに応じて、例えば、様々な抗原を標的にすることによって、様々な細胞タイプを収集／培養することによってなど、様々な方法で構成され得る。加えて、Ｔ細胞ベースの免疫療法は、例えば、静脈内注射によって、又は局所的に、例えば、注入（例えば、腹腔内注入、胸膜カテーテル注入など）、直接注入などによって全身的に投与され得る。
いくつかの事例において、本明細書に記載される治療方法は、対象に、多剤耐性トランスポーター、例えば、ＡＢＣＧ２以外の多剤耐性トランスポーターを含むが、これらに限定されない、１つ以上の阻害剤を投与することを含み得る。多剤耐性トランスポーターの有用な阻害剤には、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、天然生成物、マイクロＲＮＡ、及び小分子阻害剤が含まれる。多剤耐性トランスポーターの阻害剤には、ＡＢＣトランスポーター阻害剤が含まれる。
本開示の方法を使用する治療に好適な個体には、がんを有する個体、がんを有すると診断された個体、化学療法、放射線療法、抗体療法、手術などでがんを治療されている個体、がんを（例えば、化学療法、放射線療法、抗体療法、手術などのうちの１つ以上で）治療されてきているが、治療に応答していない個体、がんを（例えば、化学療法、放射線療法、抗体療法、手術などのうちの１つ以上で）治療されてきているが、治療に最初に応答したが、その後に再燃した、すなわち、がんが再発した個体、が含まれる。
本開示の方法は、例えば、原発性がん、二次性がん、再増殖性がん、再発性がん、難治性がんなどを含む様々ながんを標的にして治療するために用いられ得る。例えば、いくつかの事例において、本開示の方法は、対象において特定された原発性がんの初期治療として用いられ得る。いくつかの事例において、本開示の方法は、一次以外（例えば、二次又はそれ以降）の治療として、例えば、前治療に難治性であるがんを有する対象において、前治療後に再成長しているがんを有する対象において、前治療に対する混合応答（例えば、対象における少なくとも１つの腫瘍に対する陽性応答及び対象における少なくとも１つの第２の腫瘍に対する陰性又は中性応答）を有する対象において、などで用いられ得る。
いくつかの事例において、本開示の方法は、多剤耐性がんなどの薬剤耐性がんを有する対象を治療するために用いられ得る。多剤耐性（ＭＤＲ）は、多くのがんが化学療法剤に対する耐性を発達させる機序であり、最小限の細胞死及び薬剤耐性腫瘍の拡大をもたらす。ＭＤＲがんは、１つ以上の耐性メカニズムを伴い得、例えば、排出ポンプの増加した発現、薬物の減少した吸収、細胞死又はアポトーシスの阻害、薬物代謝の調節などを含むが、これらに限定されない。いくつかの事例において、本開示の方法は、ＭＤＲを防止、逆転、又は回避し得る。
いくつかの事例において、本開示の方法は、第１の薬剤に対して耐性であるがんを有する対象を、第１の薬剤とは異なる第２の薬剤と組み合わせた有効量の本明細書に記載の対象多重特異性抗体によって治療することを含み得る。例えば、いくつかの事例において、対象のがんは、第１の化学療法剤に対して耐性であり得、対象は、第１の化学療法剤とは異なる第２の化学療法剤と組み合わせて本明細書に記載の有効量の対象多重特異性抗体を投与することによって治療され得る。第１及び第２の化学療法剤の様々な組み合わせは、例えば、治療されるがんのタイプ、耐性を発達させる可能性などに応じて用いられ得る。
多数のがんが薬剤耐性を発達させることが知られている。この理由及び他の理由によって、本開示の方法は、様々ながんにおける使用が認められ得、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん（例えば、カポジ肉腫、リンパ腫など）、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型催奇形／ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、胆管がん（肝外）、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、及び悪性線維組織細胞腫など）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、中枢神経系胚性腫瘍、中枢神経系生殖細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上皮腫など））、乳がん（例えば、女性乳がん、男性乳がん、小児乳がんなど）、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（例えば、小児、胃腸など）、未知の原発腫瘍、心（心臓）腫瘍、中枢神経系（例えば、非定型催奇形腫瘍／ラブドイド腫瘍、胚腫瘍、生殖細胞腫瘍、リンパ腫など）、子宮頸がん、小児がん、脊髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、導管（例えば、胆管、肝外など）、非浸潤性乳管（ＤＣＩＳ）、胚芽腫瘍、子宮内膜がん、上皮腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外生殖細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫など）、骨の線維性組織球腫（例えば、悪性、骨肉腫など）、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、卵巣、精巣など）、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、臓がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球症（例えば、ランゲルハンス細胞など）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞腫瘍（例えば、膵神経内分泌腫瘍など）、カポジ肉腫、腎臓がん（例えば、腎細胞、ウィルムス腫瘍、小児腎臓腫瘍泌腫瘍など）、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病（例えば、急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ＡＭＬ）、慢性リンパ性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、有毛細胞など）、口唇及び口腔がん、肝臓がん（原発性）、非浸潤性小葉がん（ＬＣＩＳ）、肺がん（例えば、非小細胞、小細胞など）、リンパ腫（例えば、エイズ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）など）、マクログロブリン血症（例えば、ワルデンストレームなど）、男性乳がん、骨及び骨肉腫の悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、ナット遺伝子を伴う正中線管がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病（例えば、慢性（ＣＭＬ）など）、骨髄性白血病（例えば、急性（ＡＭＬ）など）、骨髄増殖性腫瘍（例えば、慢性腫瘍など）、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔がん（例えば、唇など）、口腔咽頭がん、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん（例えば、上皮性、生殖細胞腫瘍、低悪性度腫瘍など）、膵臓がん、膵神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫瘍、副鼻腔腫瘍、副鼻腔洞及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、腎盂及び尿道移行性細胞がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、腫（例えば、ユーイング、カポジ、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟組織、子宮など）、セザリー症候群、皮膚がん（例えば、小児、黒色腫、メルケル細胞がん、非黒色腫など）、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、扁平頸部がん（例えば、原発不明、転移性などを伴う）、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行細胞がん、尿管及び腎盂がん、尿道がん、子宮がん（例えば、子宮内膜がんなど）、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、ウィルムス腫瘍などが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の治療方法は、いくつかの事例において、以前に１つ以上の従来の治療を受けている対象において行われ得る。例えば、腫瘍学の場合、本明細書に記載の方法は、いくつかの事例において、例えば、従来の化学療法、従来の放射線療法、従来の免疫療法、手術などを含むが、これらに限定されない従来のがん療法に続いて行われ得る。いくつかの事例において、本明細書に記載の方法は、対象が従来の療法に応答していないか、又は難治性である場合に使用され得る。いくつかの事例において、本明細書に記載の方法は、対象が従来の療法に応答している場合に使用され得る。
いくつかの事例において、本開示の方法は、前がん治療後に残っている最小残存疾患（ＭＲＤ）について対象を標的にするか、処置するか、又は排除するために用いられ得る。ＭＲＤの標的化、処置、及び／又は排除は、ＭＲＤが前治療に対して難治性であるか否かにかかわらず、本方法を使用して追求され得る。いくつかの事例において、本開示の方法を用いて、ＭＲＤが、前治療、又は本明細書に記載の多重特異性抗体を用いる治療以外の１つ以上の利用可能な治療選択肢に対して難治性であるという決定後に、ＭＲＤの対象を標的化、処置、及び／又は排除し得る。
いくつかの事例において、本方法は、サーベイランスのために予防的に用いられ得る。例えば、それを必要とする対象は、対象が検出可能な疾患を有さないが、例えば、薬剤耐性がんを含む再発性がんを発症するリスクにある場合に、本明細書に記載の多重特異性抗体のうちの１つ以上を伴う治療を投与され得る。いくつかの事例において、予防的アプローチは、対象が、薬剤耐性であることが予測されるか、又は薬剤耐性になることが予想される原発性がんを発症する特に高いリスクにある場合に用いられ得る。いくつかの事例において、予防的アプローチは、対象が以前にがんのために治療されており、再発又は薬剤耐性の発達のリスクにある場合に用いられ得る。
いくつかの事例において、本開示の方法は、１つ以上のマーカー又は治療標的の発現についてがんを分析することを伴い得る。例えば、いくつかの事例において、方法は、対象からのがんの試料を分析して、がんが、所定の（predetermined）閾値を超えるＡＢＣＧ２、所定の閾値を超えるＴＡＡ（例えば、ＣＤ４７、ｅｒｂＢ２、又はＥＧＦＲ）、又は両方を発現するか、決定することを伴い得る。
いくつかの事例において、対象が本開示の多重特異性抗体によって治療されるかは、ＴＡＡ及び／又はＡＢＣＧ２試験の結果に依存し得る。例えば、いくつかの事例において、がんがＴＡＡを所定の閾値以上で発現する場合、対象は本開示の多重特異性抗体で治療され得、がんがＴＡＡを所定の閾値未満で発現する場合、対象は多重特異性抗体で治療され得ず、例えば、対象は、対象多重特異性抗体を伴わずに関連するがんのための従来療法で治療され得る。例えば、いくつかの事例において、がんがＡＢＣＧ２を所定の閾値以上で発現する場合、対象は、本開示の多重特異性抗体で治療され得、がんがＡＢＣＧ２を所定の閾値未満で発現する場合、対象は、多重特異性抗体で治療され得ず、例えば、対象は、対象多重特異性抗体を伴わずに関連するがんのための従来療法で治療され得る。いくつかの事例において、がんがＴＡＡ及びＡＢＣＧ２の両方を所定の閾値以上で発現する場合、対象は本開示の多重特異性抗体で治療され得、がんがＴＡＡ及びＡＢＣＧ２を所定の閾値未満で発現する場合、対象は多重特異性抗体で治療され得ず、例えば、対象は、対象多重特異性抗体を伴わずに関連するがんのための従来療法で治療され得る。
任意の都合のよいアッセイがＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡレベルを分析するために用いられ得、例えば、フローサイトメトリー、核酸ベースのアッセイ（例えば、増幅、配列決定など）、細胞サイトメトリー、免疫組織化学などを含むが、これらに限定されない。任意の都合のよい生体試料が用いられ得、例えば、がん生検試料が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上のマーカー及び／又は標的の発現を評価するための有用な所定の閾値は、任意の都合がよく適切な方法によって決定され得、測定された発現レベルと対応する対照との比較を含む。例えば、いくつかの事例において、試料でアッセイされたＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡのレベルにおける有用な所定の閾値は、健常／正常細胞などの参照細胞で測定されたＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡのレベルに対応し得る。ＴＡＡは、ＣＤ４７、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、又はＰＤ－Ｌ１であり得る。
作製の方法
上記に要約したように、本開示の方法はまた、本明細書に記載の多重特異性抗体を作製及び／又は特定する方法を含む。対象抗体は、任意の既知の方法、例えば、タンパク質合成のための従来の合成方法、組換えＤＮＡ方法などによって産生することができる。
対象抗体が単鎖ポリペプチドである場合、それは、標準的な化学的ペプチド合成技術を使用して合成することができる。ポリペプチドが化学的に合成される場合、合成は、液相又は固相を介して進行され得る。配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、続いて配列に残りのアミノ酸が順次付加される固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、対象抗体の化学合成に好適な方法の例である。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃなどの様々な形態のＳＰＰＳが、対象抗体を合成するために利用可能である。固相合成のための技術は、Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ｐｐ．３－２８４ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２： Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５： ２１４９－２１５６（１９６３）、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）、Ｇａｎｅｓａｎ Ａ．２００６ Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０、及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８によって記載されている。簡単に説明すると、小さい不溶性の多孔質ビーズは、ペプチド鎖が構築される官能単位で処理される。カップリング／脱保護のサイクルを繰り返した後、結合した固相の遊離Ｎ末端アミンが、単一のＮ保護アミノ酸単位に結合される。次いで、この単位は脱保護され、更なるアミノ酸が結合され得る新たなＮ末端アミンを露出させる。ペプチドは、固相上に固定されたままであり、切断される前にフィルトレーションプロセスを受ける。
標準的な組換え方法を、対象抗体の産生に使用することができる。例えば、任意で定常領域に連結された、軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸が、発現ベクターに挿入される。軽鎖及び重鎖は、同じか又は異なる発現ベクターにクローニングすることができる。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクターにおいて制御配列に動作可能に連結される。発現制御配列には、プロモーター（例えば、天然関連又は異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサー要素、及び転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。発現制御配列は、真核生物宿主細胞（例えば、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞）を形質転換又はトランスフェクトすることができるベクターにおける真核生物プロモーターシステムであることができる。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現、並びに抗体の収集及び精製に好適な条件下で維持される。
コードの縮重により、様々な核酸配列が、各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードすることができる。所望の核酸配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成によって、又は所望のポリヌクレオチドよりも早く調製されたバリアントのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発によって生成することができる。オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発は、標的ポリペプチドＤＮＡの置換、欠失、及び挿入バリアントを調製するための好適な方法の例である。Ａｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ２：１８３（１９８３）を参照されたい。簡単に説明すると、標的ポリペプチドＤＮＡは、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせることによって改変される。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込む鋳型の第２の相補鎖全体を合成し、選択された改変を標的ポリペプチドＤＮＡ内にコードさせる。
好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物内で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にする選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、又はネオマイシン耐性）を含有する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、対象抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングするために使用することができる原核生物宿主細胞の例である。使用に好適な他の微生物宿主には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの桿菌、及びサルモネラ、セラチア、及び種々のシュードモナス種などの他の腸内細菌科が含まれる。これらの原核生物宿主では、典型的には、宿主細胞と適合性のある発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターを作製することもできる。加えて、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、ベータ－ラクタマーゼプロモーターシステム、又はファージラムダからのプロモーターシステムなどの多くの様々な周知のプロモーターが存在する。プロモーターは、典型的には、発現を任意でオペレーター配列とともに制御し、転写及び翻訳を開始及び完了するために、リボソーム結合部位配列などを有する。
酵母などの他の微生物もまた、発現に有用である。サッカロマイセス（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキアは、好適な酵母宿主細胞の例であり、所望に応じて、発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製起点、終結配列などを有する好適なベクターを伴う。典型的なプロモーターには、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の解糖酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが含まれる。
微生物に加えて、哺乳類細胞（例えば、インビトロ細胞培養で増殖される哺乳類細胞）を使用して、本発明（例えば、免疫グロブリン又はそれらの断片をコードするポリヌクレオチド）のポリペプチドを発現及び産生することもできる。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）を参照されたい。好適な哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞株、種々のＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、及び形質転換Ｂ細胞又はハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。好適な発現制御配列の例は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。
一度合成されると（化学的又は組換え的のいずれか）、全抗体、その二量体、個々の軽鎖及び重鎖、又は対象抗体の他の形態（例えば、ｓｃＦｖなど）は、当該技術分野の標準的な手順に従って精製することができ、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などが含まれる（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照されたい）。対象抗体は、実質的に純粋、例えば、少なくとも約８０％～８５％純粋、少なくとも約８５％～９０％純粋、少なくとも約９０％～９５％純粋、又は９８％～９９％以上純粋であることができ、例えば、細胞デブリ、対象抗体以外の巨大分子などの汚染物質を含まない。
いくつかの実施形態において、本開示の多重特異性抗体を生成する方法は、候補抗体を産生することと、活性についてスクリーニングすることと、を含み得る。かかる方法は、一連のステップの使用によって、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡの両方を発現する細胞に特異的に結合する多重特異性抗体を生成し得る。かかる方法のステップには、各々がＡＢＣＧ２結合ドメイン及びＴＡＡ結合ドメインを含むか、若しくは含むことが予期される多重特異性抗体又は複数の抗体を産生するステップと、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡを発現する第１の試験細胞を、多重特異性抗体又は複数の抗体と接触させるステップと、ＡＢＣＧ２又はＴＡＡのいずれかを発現する第２の細胞を、多重特異性抗体又は複数の抗体と接触させるステップと、第１の細胞に対する多重特異性抗体又は複数の抗体の結合を、第２の細胞に対する多重特異性抗体の結合と比較して、結合特異性比率を決定するステップと、比率が所定の閾値を超えるときに、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡの両方を発現する細胞に特異的であるとして、多重特異性抗体、又は複数の抗体のうちの１つ以上を特定するステップと、を含み得る。かかる比較結合のための閾値が用いられる場合、閾値は、変化し得、１．５：１以上の範囲であり得、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、５０：１、１００：１などを含むが、これらに限定されない。
様々な細胞が、かかる方法で使用され得、例えば、本明細書に記載の細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの事例において、ＡＢＣＧ２のみを発現する細胞及びＴＡＡのみを発現する細胞の両方との抗体の結合が行われ得る。例えば、いくつかの事例において、方法は、上記のステップに関連して、第２の細胞は、ＡＢＣＧ２を発現してＴＡＡを発現しないが、方法は、ＴＡＡを発現するが、ＡＢＣＧ２は発現しない第３の細胞を、多重特異性抗体と接触させることを更に含み得る。
いくつかの事例において、かかる方法は、１つ以上の対照を用い得、例えば、対照細胞、対照試薬などが含まれるが、これらに限定されない。有用な対照細胞には、１つ以上の関連遺伝子又はタンパク質の既知の発現又は既知の発現の欠如を有するものが含まれる。有用な対照試薬には、例えば、既知の標的に対する単一特異性抗体などの対照抗体が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、いくつかの事例において、本開示のかかる方法は、第１の細胞、第２の細胞、及び／又は第３の細胞を、単一特異性抗ＡＢＣＧ２抗体及び単一特異性ＴＡＡ抗体から選択される対照抗体と接触させることを更に含み得る。使用される特定の方法に応じて、必要に応じて、様々な他又は追加の対照が、適切なように、用いられ得る。
キット
本開示の態様はまた、キットを含む。キットは、例えば、本明細書に記載の多重特異性抗体、試薬、組成物、製剤、細胞、核酸、発現ベクターなどの任意の組み合わせを含み得る。対象キットは、対象多重特異性抗体、それをコードする核酸、又は対象多重特異性核酸を含む細胞のうちの１つ以上を含むことができる。キットは、様々な目的のために構成され得、例えば、治療キット（例えば、キットが多重特異性抗体、及び、例えば、化学療法剤などの１つ以上の追加の活性剤を含み得る）、抗体を産生するためのキット、抗体をスクリーニングするためのキットなどが含まれる。
キットの任意選択的な構成要素は変化し、例えば、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤などを含み得る。対象キットが対象核酸を含む場合、核酸はまた、制限部位、複数のクローニング部位、プライマー部位などを有し得る。キットの様々な構成要素は、別々の容器に存在し得るか、又は特定の互換性のある構成要素が、所望により、単一の容器に予め組み合わされ得る。
上記の構成要素に加えて、対象キットは、対象方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための説明書を含むことができる。対象方法を実施するための説明書は、一般に、好適な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙又はプラスチックなどの基材に印刷され得る。したがって、説明書は、パッケージインサートとして、キット又はその構成要素の容器の表示に存在し得る（すなわち、パッケージング若しくは下位パッケージングと関連付けられる）。他の実施形態において、説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、コンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。更に他の実施形態において、実際の説明書はキットには存在しないが、リモートソースから、例えば、インターネットを介して、説明書を得るための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書が表示できるウェブアドレス及び／又は説明書がダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るためのこの手段は、好適な基材に記録される。
本開示の例示的な非限定的態様
上記の本主題の態様は、実施形態を含め、単独で、又は１つ以上の他の態様若しくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。先の説明を限定することなく、本開示の特定の非限定的な態様が以下に提供される。本開示を読むと、当業者に明らかになるように、個々に番号が付けられた態様の各々が、使用されるか、又は先行か若しくは後続の個々に番号が付けられた態様のうちのいずれかと組み合わされ得る。これは、態様の全てのかかる組み合わせにおける支持を提供することが意図されており、以下で明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。当業者には、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことができることは明らかであろう。
以下の実施例は、例示として、限定としてではなく提供される。
以下の実施例は、本発明を作製及び使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示され、発明者がそれらの発明とみなすものの範囲を限定することは意図されず、以下の実験は、行われた全ての実験又は唯一の実験であることを表すことは意図されない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段に示されない限り、割合は重量による割合であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
分子生化学及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的なテキストブックに認められ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示に言及されるか、又は関連する方法のための試薬、クローニングベクター、細胞、及びキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．などの商業ベンダー、並びに、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などのリポジトリから入手可能である。
実施例１：トポテカンに対して細胞を感受性にする二重特異性ｍＡｂの生成
材料及び方法
安定したＡＢＣＧ２過剰発現（Ｏｘ）細胞株の生成
結合及びインビトロ有効性の両方を特徴付けるために、ＡＢＣＧ２を安定的に過剰発現した細胞株を開発した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られた接着２９３Ｔナイーブ細胞を利用した。市販のＡＢＣＧ２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、クローン５Ｄ３）を使用したフローサイトメトリーによって特徴付けたとき、この細胞株は、ＡＢＣＧ２を内因的に細胞表面に低～中度で発現する。２９３Ｔナイーブ細胞、３Ｔ３細胞、又はＣ６細胞（ＱＺ）を、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ＰＥＩｐｒｏ試薬を使用してＡＢＣＧ２でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ハイグロマイシンＢ溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して細胞を選択下に置いた。連続したハイグロマイシンＢ選択の１４日後、２９３Ｔ細胞をＡＢＣＧ２細胞表面発現について評価した。トランスフェクトされていない細胞が今後の培養で増殖しないことを確実にするために、ＡＢＣＧ２陽性２９３Ｔ細胞の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用したバルク選別を、ＦＡＣＳＡｒｉａＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。バルク選別した２９３Ｔ ＡＢＣＧ２過剰発現細胞を増殖させ、続いてＡＢＣＧ２過剰発現を再確認した。
細胞培養技術及び抗体産生
標準的な細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されるように使用される。
２９３細胞を二重特異性ｍＡｂの一過性産生に使用した。Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ａ１４５２７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のポリマーベースの共トランスフェクションを使用して、異なる抗体構築物を発現させた。細胞を、製造業者の推奨に従って、哺乳類発現ベクターとともに懸濁液中で増殖させた。
二重特異性抗体分子の調製では、細胞は対応する発現ベクターを１：１：４（重鎖ＫＫ：重鎖ＤＤ：軽鎖）の比で用いてトランスフェクトした。標準的な抗体発現では、１：２の比（重鎖：軽鎖）を使用した。
トランスフェクションの約６日後、細胞を遠心分離によって収集した。詳細には、１ｍｌのトランスフェクトした培養物当たり１μｇの総コードＤＮＡを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈し、同じ培地中でＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに２０分間インキュベートした。次いで、混合物を、Ｅｘｐｉ２９３（登録商標）発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の懸濁液中で増殖するＥｘｐｉ２９３（登録商標）細胞に、空気中の８％ＣＯ２でおおい３７℃で、細胞２５０万個／ｍＬで添加した。６日後、抗体構築物を含有する培地を遠心分離によって収集した。
試験した分子のヒト－マウス配列の構築（ヒトＦｃ、マウスＦｖ、又はヒト化Ｆｖ）
発現ベクター：抗体発現ベクターの生成のために、哺乳類細胞株における発現に最適化された一般的なレシピエント発現ベクターにそれぞれ予め挿入されたヒトＩｇＧ１定常重鎖又はヒトＩｇＧ１カッパ定常軽鎖のいずれかにインフレームになるように重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域をサブクローニングした。発現される遺伝子を、高レベル遺伝子発現のために全長ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期プロモーターを使用するｐＣＩ－ｎｅｏ哺乳類発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。異なる抗体鎖を、異なるベクターにクローニングした。
マウスＩｇＧ重鎖及びカッパ軽鎖からのＮ末端シグナル配列を、それぞれ重鎖及び軽鎖の分泌型発現のために使用した。シグナルペプチドは発現中に切断され、インタクトＮ末端を残した。Ｆａｂ構築物において、ＣＨ１ ＩｇＧ１定常領域のＣ末端を、精製を容易にする６×Ｈｉｓタグに融合させた。
二重特異性抗体ベクターの生成のために、ＩｇＧ１由来の二重特異性分子は、２つの異なる標的：ＴＡＡ及びＡＢＣＧ２に特異的に結合することができる少なくとも２つの抗原結合部分を含む。抗原結合部分は、各々可変領域及び定常領域を含む、重鎖及び軽鎖からなるＦａｂ断片である。対形成して、Ｆａｂ抗ＴＡＡ及びＦａｂ抗ＡＢＣＧ２（ａＡＢＣＧ２）の両方として許容される結合をもたらすことができる共通の軽鎖が特定され、その使用はＬＣの誤対形成を回避することを可能にした。二重特異性構築物を、静電的ステアリング効果に基づいて作製した（例えば、Ｇｕｎａｓｅｋｅｒａｎ ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５，１９６３７－１９６４６を参照されたい。その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に説明すると、標的に対するポリペプチド鎖又は抗体の半分は、ＣＨ３ドメインにおける電荷対置換を通して二重特異性抗体として組み立てられる：一方の重鎖は、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ置換（「ＤＤ」）を含有し、他方はＥ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ置換（「ＫＫ」）を含む。
マウスハイブリドーマ配列からの可変重鎖及び軽鎖断片が利用可能であり、リーダー配列及び定常領域の同じバックグラウンドにクローニングした。
細胞結合アッセイ。細胞との抗体結合をフローサイトメトリーによって評価した。ヒト又はカニクイザルＡＢＣＧ２（２９３Ｔ＿ＡＢＣＧ２＿ＯＸ）又はＫＴ９（２９３Ｔ－ＫＴ９ＯＸ）を発現するように安定的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をフローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウム）で１回洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液に細胞２×１０＾６／ｍＬで再懸濁させ、９６ウェルマイクロタイタープレートに０．１ｍＬ／ウェルで分注した。組換え抗体を、初期結合確認のために５ｕｇ／ｍＬで細胞に添加するか、又はフローサイトメトリー緩衝液で１００ｕｇ／ｍＬから連続希釈した。細胞を氷上で３０分間インキュベートした後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で２回洗浄した。結合した抗体をＰＥ標識Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって検出し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターで評価した。ＥＣ５０は、最大応答の半分をもたらす抗体の濃度であるように計算される。
細胞傷害性アッセイ。トポテカン細胞傷害性に対する抗体の効果を、ＡＢＣＧ２を発現するように安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞である２９３Ｔ＿ＡＢＣＧ２＿ＯＸ細胞で評価した。細胞を白色の平底９６ウェル組織培養プレートに、０．０５ｍＬのアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中に細胞５０００個／ウェルで播種した。トポテカンは、１００ｕｇ／ｍＬ（２×最終濃度）の試験抗体若しくは対照抗体、又は２０ｕＭ（２×最終濃度）の低分子ＡＢＣＧ２阻害剤であるフミトレモルジンＣ（ＦＴＣ）を含有するアッセイ培地に、２００ｕＭからの連続希釈によって２×最終アッセイ濃度で調製した。トポテカン／抗体混合物の等体積（０．０５ｍＬ）を、９６ウェルプレートで２９３Ｔ＿ＡＢＣＧ２＿ＯＸ細胞に添加した。次いでプレートを、５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。約７２～９６時間後、プレートを室温に平衡化し、Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイを製造業者の推奨プロトコルに従って使用して細胞生存率を評価した。発光は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）３マルチモードマイクロプレートリーダーで測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを使用して分析した。半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、応答（細胞増殖）が５０％低下する薬物（トポテカン又は他の化学療法細胞傷害性剤）の濃度である。
異種移植片試験
材料：
細胞： ＨＴ１３７６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４７２）ヒト膀胱がん細胞株。
マウス：６５匹の５～６週齢雌ＳＣＩＤ－Ｂｉｅｇｅマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）。
試薬：上述のように産生したＧ２ＫＴ９抗ＡＢＣＧ２×抗ＣＤ４ ＢｓＡｂ、ヒトアイソタイプＩｇＧ１（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）、トポテカン。
方法：
細胞培養：ＨＴ１３７６細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン及び１％ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。使用した細胞株は真正であり、マイコプラズマ陰性であることが確認された。
接種―ＰＢＳ：マトリゲル（１：１）で希釈した細胞２×１０６個を、５０匹の麻酔した５～６週齢雌ＳＣＩＤ－Ｂｉｅｇｅマウスに、２７Ｇインスリン注射器を用いて無菌条件下で皮下注射した。
配列
抗ＡＢＣＧ２ ５Ｄ３抗体可変重（ＶＨ）鎖配列は、以下の通りである。
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＫＬＥＷＭＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＲＳＶＴＰＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号５）
５Ｄ３ ＶＨ鎖のヒト化型（ｖ１及びｖ２）を作製した。
ヒト化５Ｄ３ ＶＨｖ１配列は、以下の通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＭＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）
ヒト化５Ｄ３ ＶＨｖ２配列は、以下の通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）
抗ＡＢＣＧ２ ５Ｄ３抗体可変軽鎖配列は、以下の通りである。
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＦＳＶＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＫＡＳＧＹＩＬＮＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧＮＡＰＲＬＬＩＳＧＡＴＳＬＥＴＧＦＰＳＲＦＳＧＴＧＳＧＫＤＹＴＬＳＩＳＳＬＱＴＥＤＶＧＴＹＹＣＱＱＹＷＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＲ（配列番号１）
５Ｄ３ ＶＬ鎖のヒト化型（ｖ１）を作製した。
ヒト化５Ｄ３ ＶＬｖ１配列は、以下の通りである。
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＧＹＩＬＮＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＳＧＡＴＳＬＥＴＧＦＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＫＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５９）
ＣＤ４７をコードする配列：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＣＤ４７分子（ＣＤ４７）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１７７７．３が、利用可能である。
抗ＣＤ４７ ５Ｆ９抗体可変重鎖配列は、以下の通りである。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）
抗ＣＤ４７ ５Ｆ９抗体可変軽鎖配列は、以下の通りである。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＹＳＮＧＮＴＹＬＧＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６０）
抗ｅｒｂＢ２抗体、ペルツズマブ、重鎖及び軽鎖配列は、以下の通りである。
ペルツズマブ重鎖配列：
Figure 2023528417000003

ＶＨ鎖は太字で示され、下線が引かれている。
ペルツズマブ軽鎖配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号６１）
抗ｅｒｂＢ１抗体、ネシツムマブ、重鎖及び軽鎖配列は、以下の通りである。
ネシツムマブ重鎖配列：
Figure 2023528417000004

ＶＨ鎖は太字で示され、下線が引かれている。
ネシツムマブ軽鎖配列：
Figure 2023528417000005

ＶＬ鎖は太字で示され、下線が引かれている。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アテゾリズマブ、可変重鎖配列は、以下の通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２７）
結果
図１は、ＡＢＣＧ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞が、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３、並びにＡＢＣＧ２及びＣＤ４７に結合する二重特異性抗体の存在下で、トポテカンに対する増加した感受性を有することを示す。二重特異性抗体５Ｄ３ＤＤＫＴ１４ＫＫ５Ｄ３は、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３由来の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）、並びに抗ＣＤ４７抗体である５Ｆ９からのＨＣを含む。二重特異性抗体５Ｄ３ｈＶＨｖ１ＤＤＫＴ１４ＫＫ５Ｄ３ｈＶＬｖ１は、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３からのＨＣ及びＬＣ、並びに抗ＣＤ４７抗体である５Ｆ９からのＨＣを含む。二重特異性抗体５Ｄ３ｈＶＨｖ２ＤＤＫＴ１４ＫＫ５Ｄ３ｈＶＬｖ１は、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３からのＨＣ及びＬＣ、並びに抗ＣＤ４７抗体である５Ｆ９からのＨＣを含む。ｈＶＨｖ１及びｈＶＨｖ２は、それぞれ、５Ｄ３ ＨＣのヒト化可変重鎖１型及び２型を指す。ｈＶＬｖ１は、５Ｄ３ ＬＣのヒト化可変軽鎖１型を指す。ＫＴ１４は、ＣＤ４７を指す。ＤＤ及びＫＫは、５Ｄ３ ＨＣと５Ｆ９ ＨＣとの間の対形成を増強する電荷対置換を指す。ＩＣ５０値は、ｎＭである。
図２は、ヒトＡＢＣＧ２を発現するように安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ－Ｇ２ＯＸ）に対する５Ｄ３及びヒト化５Ｄ３抗体の結合を、対応するＥＣ５０値とともに示す。結果は、ヒト化が５Ｄ３抗体の効力を有意に妨げないことを示す。
図３は、ＡＢＣＧ２を発現するように安定的にトランスフェクトされた３Ｔ３細胞（３Ｔ３－Ｇ２）、ヒトＡＢＣＧ２を発現するように安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ＿ＡＢＣＧ２＿ＯＸ）、及びヒトＫＴ９を発現するように安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ－ＫＴ９ＯＸ）に対するヒト化ＡＢＣＧ２／ＫＴ９二重特異性抗体の結合を示す。ＫＴ９は抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブであり、５Ｄ３は抗ＡＢＣＧ２抗体である。ヒト化二重特異性抗体５Ｄ３ｈＶＨ－ｖ１ＤＤ ＫＴ９ＫＫ ５Ｄ３ｈＶＬ－ｖ１及び５Ｄ３ｈＶＨ－ｖ２ＤＤ ＫＴ９ＫＫ ５Ｄ３ｈＶＬ－ｖ１は、抗ＡＢＣＧ２抗体５Ｄ３からのＨＣ及びＬＣ、並びに抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるＫＴ９からのＨＣを含む。結果は、ヒト化二重特異性抗体が、それぞれ標的ＡＢＣＧ２及びＰＤ－Ｌ１に結合する能力を保持することを示す。
図４は、ＡＢＣＧ２（２９３Ｔ－Ｇ２ＯＸ）、ＫＴ９（２９３Ｔ－ＫＴ９ＯＸ）、並びにＡＢＣＧ２及びＫＴ９（２９３Ｔ－Ｇ２ＫＴ９ＯＸ）の両方で、安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に対するヒト化５Ｄ３／ＫＴ９／５Ｄ３二重特異性抗体の結合を、対応するＥＣ５０結合親和性とともに示す。結果は、試験したヒト化抗体が、それらの標的に結合する能力を保持することを示す。
図５は、ＡＢＣＧ２／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（５Ｄ３／ＫＴ９）単独又はトポテカンとの組み合わせの細胞障害性活性が、ＨＴ１３７６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４７２）ヒト膀胱上皮がん細胞株において試験された異種移植片試験の結果を示す。二重特異性抗体は、単剤及びトポテカンとの組み合わせとしての両方で有効であることが示される。
前述の発明は、理解の明確さのために例示及び実施例としてある程度詳細に説明されてきているが、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変更及び修正が行われ得ることが、本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかである。
したがって、上記は、本発明の原理を単に例示している。当業者は、本明細書に明示的に記載又は示されていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々な構成を考案することができることを理解されたい。更に、本明細書に列挙される全ての例及び条件付き言語は、主に、本発明の原理及び本技術の促進に発明者によって寄与される概念を理解する上で読者を支援することを意図しており、かかる具体的に列挙される例及び条件に限定されないものとして解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態を列挙する本明細書の全ての記述、並びにその具体例は、その構造的及び機能的等価物の両方を包含することが意図される。加えて、かかる等価物は、現在知られている等価物及び将来開発される等価物の両方、すなわち、構造に関係なく同じ機能を実行する任意の開発された要素を含むことが意図される。更に、本明細書に開示されるいかなるものも、かかる開示が特許請求の範囲内で明示的に列挙されているかどうかにかかわらず、公衆に捧げることを意図していない。
したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され記載される例示的な実施形態に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。特許請求の範囲において、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ｆ）又は３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（６）は、特許請求の範囲のかかる限定の最初に正確なフレーズ「のための手段」又は正確なフレーズ「のためのステップ」が記載されている場合にのみ、特許請求の範囲の限定のために援用されるものとして明示的に定義され、かかる正確なフレーズが特許請求の範囲の限定で使用されない場合には、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ｆ）又は３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（６）は援用されない。

Claims (73)

  1. ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する二重特異性抗体分子であって、前記抗体分子が、２つの同一の可変軽（ＶＬ）鎖、第１の可変重（ＶＨ）鎖、及び第２のＶＨ鎖を含み、
    前記ＶＬ鎖が各々、ＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含み、前記第１のＶＨ鎖が、ＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含み、前記第２のＶＨ鎖が、前記ＴＡＡに対する抗原結合部位を含み、前記第２のＶＨ鎖が、前記ＶＬ鎖のうちの１つと対形成したときに前記ＴＡＡに結合し、
    前記二重特異性抗体が、ＡＢＣＧ２及び前記ＴＡＡの両方を発現するがん細胞に結合するが、ＡＢＣＧ２及び／又は前記ＴＡＡを発現する非がん細胞に対しては低下した結合を示す、二重特異性抗体分子。
  2. 前記２つのＶＬ鎖の前記抗原結合部位が、配列：
    ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＦＳＶＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＫＡＳＧＹＩＬＮＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧＮＡＰＲＬＬＩＳＧＡＴＳＬＥＴＧＦＰＳＲＦＳＧＴＧＳＧＫＤＹＴＬＳＩＳＳＬＱＴＥＤＶＧＴＹＹＣＱＱＹＷＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＲ（配列番号１）を有するＶＬ鎖の軽鎖ＣＤＲ１～３（ＬＣＤＲ１～３）を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体分子。
  3. 前記２つのＶＬ鎖が、ＬＣＤＲ１～３を含み、ＬＣＤＲ１が、配列ＫＡＳＧＹＩＬＮＲＬＡ（配列番号２）を含み、ＬＣＤＲ２が、配列ＧＡＴＳＬＥＴ（配列番号３）を含み、ＬＣＤＲ３が、配列ＱＱＹＷＳＴＰＷＴ（配列番号４）を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体分子。
  4. 前記２つのＶＬ鎖が、配列：
    ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＦＳＶＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＫＡＳＧＹＩＬＮＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧＮＡＰＲＬＬＩＳＧＡＴＳＬＥＴＧＦＰＳＲＦＳＧＴＧＳＧＫＤＹＴＬＳＩＳＳＬＱＴＥＤＶＧＴＹＹＣＱＱＹＷＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＲ（配列番号１）、又は
    ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＧＹＩＬＮＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＳＧＡＴＳＬＥＴＧＦＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＫＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５９）、あるいは前記配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  5. 前記第１のＶＨ鎖の前記抗原結合部位が、配列：
    ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＫＬＥＷＭＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＲＳＶＴＰＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号５）を有するＶＨ鎖の重鎖ＣＤＲ１～３（ＨＣＤＲ１～３）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  6. 前記第１のＶＨ鎖の抗原結合部位が、重鎖ＣＤＲ１～３（ＨＣＤＲ１～３）を含み、
    （ｉ）前記ＨＣＤＲ１が、配列：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号６３）を含み、
    （ｉｉ）前記ＨＣＤＲ２が、配列：ＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧ（配列番号６４）を含み、
    （ｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ３が、配列：ＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹ（配列番号６５）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  7. 前記第１のＶＨ鎖が、前記アミノ酸配列：
    ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＫＫＬＥＷＭＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＲＳＶＴＰＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号５）、
    ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＭＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）、又は
    ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＦＤＧＧＴＴＹＮＰＳＬＲＧＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＦＹＧＡＫＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）、あるいは前記アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  8. 前記第１及び／若しくは第２のＶＨ鎖が、ヒト化されており、かつ／又は前記ＶＬ鎖が、ヒト化されている、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  9. 前記第２のＶＨ鎖が、前記ＴＡＡに結合する単一特異性抗体分子に由来するものであり、前記軽鎖のうちの１つと対形成したときの前記ＴＡＡに対する前記二重特異性抗体分子の親和性が、前記ＶＨ鎖が由来する前記ＴＡＡに対する前記単一特異性抗体分子の親和性よりも少なくとも２倍低い、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  10. 前記ＴＡＡが、ＣＤ４７である、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  11. 前記第２のＶＨ鎖の前記抗原結合部位が、アミノ酸配列：
    ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）を含むＶＨ鎖のＨＣＤＲ１～３を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗体分子。
  12. 前記第２のＶＨ鎖が、配列：ＮＹＮＭＨ（配列番号９）を含むＨＣＤＲ１、配列：ＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号１０）を含むＨＣＤＲ２、配列：ＧＧＹＲＡＭＤＹ（配列番号１１）を含むＨＣＤＲ３を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  13. 前記第２のＶＨ鎖が、アミノ酸配列：
    ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）、
    ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６６）、
    ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＮＹＮＭＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＧＹＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号６７）、又は
    ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号６８）、あるいは前記アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  14. 前記ＴＡＡが、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂＢ－１である、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  15. 前記第２のＶＨ鎖の前記抗原結合部位が、アミノ酸配列：
    ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＧＤＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＤＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＶＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＳＩＦＧＶＧＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２２）を含むＶＨ鎖のＨＣＤＲ１～３を含む、請求項１４に記載の二重特異性抗体分子。
  16. 前記第２のＶＨ鎖の前記抗原結合部位が、配列：ＳＧＤＹＹＷＳ（配列番号１９）を含むＨＣＤＲ１、配列：ＹＩＹＹＳＧＳＴＤＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２０）を含むＨＣＤＲ２、及び配列：ＶＳＩＦＧＶＧＴＦＤＹ（配列番号２１）を含むＨＣＤＲ３を含む、請求項１４に記載の二重特異性抗体分子。
  17. 前記第２のＶＨ鎖が、アミノ酸配列：
    ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＧＤＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＤＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＶＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＳＩＦＧＶＧＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２２）、又は前記アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  18. 前記ＴＡＡが、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂＢ－２である、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  19. 前記第２のＶＨ鎖の前記抗原結合部位が、アミノ酸配列：
    ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）を含むＶＨ鎖のＨＣＤＲ１～３を含む、請求項１８に記載の二重特異性抗体分子。
  20. 前記第２のＶＨ鎖の前記抗原結合部位が、配列：ＤＹＴＭＤ（配列番号１３）を含むＨＣＤＲ１、配列：ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号１４）を含むＨＣＤＲ２、及び配列：ＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号１５）を含むＨＣＤＲ３を含む、請求項１８に記載の二重特異性抗体分子。
  21. 前記第２のＶＨ鎖が、アミノ酸配列：
    ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）、又は前記アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  22. 前記ＴＡＡが、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  23. 前記第２のＶＨ鎖の前記抗原結合部位が、アミノ酸配列：
    ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２７）を含むＶＨ鎖のＨＣＤＲ１～３を含む、請求項２２に記載の二重特異性抗体分子。
  24. 前記第２のＶＨ鎖の前記抗原結合部位が、配列：ＤＳＷＩＨ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ１、配列：ＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ２、及び配列：ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３０）を含むＨＣＤＲ３を含む、請求項２２に記載の二重特異性抗体分子。
  25. 前記第２のＶＨ鎖が、アミノ酸配列：
    ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２７）、又は前記アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  26. 前記抗体が、１つ以上のＦｃγ受容体に対する前記抗体の結合を低下又は抑止するように改変されているＦｃドメインを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  27. 対象におけるがんを治療する方法に使用するための先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子であって、前記方法が、前記抗体を前記対象に投与することを含む、使用のための二重特異性抗体分子。
  28. 前記方法が、前記抗体を、少なくとも１つの追加の活性剤と組み合わせて投与することを含み、前記少なくとも１つの追加の活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２６に記載の使用のための二重特異性抗体分子。
  29. 前記少なくとも１つの追加の活性剤が、化学療法剤であり、任意選択的に、前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エトポシド、ミトキサントロン、又はメトトレキサートである、請求項２７に記載の使用のための二重特異性抗体分子。
  30. 対象におけるがんを治療する方法に使用するための化学療法剤であって、前記方法が、前記化学療法剤を請求項１～２６のいずれか一項に記載の抗体と組み合わせて前記対象に投与することを含み、任意選択的に、前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、又はアントラサイクリンである、化学療法剤。
  31. 治療される前記対象が、前記化学療法剤に耐性であると決定されているがんを有する、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体分子。
  32. 対象をがんについて治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～２６のいずれかに記載の二重特異性抗体分子を投与することを含む、方法。
  33. 前記方法が、前記二重特異性抗体を、少なくとも１つの追加の活性剤と組み合わせて投与することを含み、前記少なくとも１つの追加の活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記少なくとも１つの追加の活性剤が、化学療法剤であり、任意選択的に、前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エトポシド、ミトキサントロン、又はメトトレキサートである、請求項３３に記載の方法。
  35. 治療される前記対象が、前記化学療法剤による治療に耐性であると決定されているがんを有する、請求項３３に記載の方法。
  36. 医薬組成物であって、
    請求項１～２６のいずれか一項に記載の抗体と、
    薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  37. 少なくとも１つの追加の活性剤を更に含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
  38. 前記少なくとも１つの追加の活性剤が、免疫療法剤を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
  39. 前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エトポシド、ミトキサントロン、又はメトトレキサートである、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. 前記少なくとも１つの追加の活性剤が、多剤耐性トランスポーターの阻害剤を含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  41. 前記少なくとも１つの追加の活性剤が、免疫療法剤を含む、請求項４０に記載の医薬組成物。
  42. 先行請求項のいずれかに記載の抗体をコードする１つ以上の配列を含む、１つ以上の核酸。
  43. 前記１つ以上の配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、請求項４２に記載の１つ以上の核酸。
  44. 請求項４２又は４３に記載の１つ以上の核酸を含む、１つ以上の組換え発現ベクター。
  45. 請求項４４に記載の１つ以上の組換え発現ベクターで遺伝子改変された、哺乳類細胞。
  46. 前記細胞が、免疫細胞である、請求項４５に記載の細胞。
  47. 請求項１～２６のいずれかに記載の、前記抗体又は前記抗体をコードする核酸と、
    少なくとも１つの追加の活性剤と、を含む、キット。
  48. 前記少なくとも１つの追加の活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、又はそれらの組み合わせを含む、請求項４７に記載のキット。
  49. がん細胞を殺傷する方法であって、前記がん細胞を請求項１～２６のいずれかに記載の抗体と接触させることを含む、方法。
  50. 少なくとも１つの追加の活性剤を投与することを含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記少なくとも１つの追加の活性剤が、化学療法剤を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記方法が、前記がん細胞の前記殺傷を、前記少なくとも１つの追加の活性剤単独で接触させることと比較して、少なくとも５％増加させる、請求項５０又は５１に記載の方法。
  53. 前記がん細胞が、多剤耐性がん細胞である、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 対象をがんについて治療する方法であって、前記対象に、請求項１～２６のいずれかに記載の抗体又は請求項３５～４１のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  55. 前記対象が、前記がんについて以前に治療されている、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記がんが、薬剤耐性又は多剤耐性である、請求項５４又は５５に記載の方法。
  57. 前記がんが、化学療法剤に耐性である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記がんが、免疫療法剤に耐性である、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記がんが、多剤耐性トランスポーターの阻害剤に耐性である、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
  60. 少なくとも１つの追加の活性剤を前記対象に投与することを更に含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記少なくとも１つの追加の活性剤が、化学療法剤を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エトポシド、ミトキサントロン、又はメトトレキサートである、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記少なくとも１つの追加の活性剤が、多剤耐性トランスポーターの阻害剤を含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記少なくとも１つの追加の活性剤が、免疫療法剤を含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記方法が、前記少なくとも１つの追加の活性剤の有効性を、前記少なくとも１つの追加の活性剤単独による治療と比較して増加させる、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
  66. 増加した前記有効性が、がん細胞殺傷における少なくとも５％の増加を含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記がんの試料を分析して、前記がんが、所定の閾値を上回るＡＢＣＧ２、所定の閾値を上回る腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、又は両方を発現するか決定することを更に含み、任意選択的に、前記ＴＡＡが、ＣＤ４７、ｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ２、又はＰＤ－Ｌ１を含む、請求項５４～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記所定の閾値が、参照細胞によって発現されたＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡのレベルに対応する、請求項６７に記載の方法。
  69. ＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡが、前記参照細胞においてノックアウト又はノックダウンされている、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記参照細胞が、非がん性細胞である、請求項６８又は６９に記載の方法。
  71. 前記非がん性細胞が、正常レベルのＡＢＣＧ２及び／又はＴＡＡを発現する、請求項６８に記載の方法。
  72. 前記がんが、ＡＢＣＧ２及びＴＡＡを前記所定の閾値以上で発現する場合、前記対象は多重特異性抗体を投与され、前記がんが、ＡＢＣＧ２又はＴＡＡを前記所定の閾値未満で発現する場合、前記対象は、前記多重特異性抗体を投与することを伴わずに従来の療法によって治療される、請求項５４～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する二重特異性抗体分子であって、
    各々がＡＢＣＧ２に対する抗原結合部位を含む第１のＶＨ鎖及び第１のＶＬ鎖であって、前記第１のＶＨ鎖が、配列番号５に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～３を含み、前記第１のＶＬ鎖が、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～３を含む、第１のＶＨ鎖及び第１のＶＬ鎖を含み、
    前記ＴＡＡが、ＰＤ－Ｌ１であり、前記抗体分子が、第２のＶＨ鎖及び第２のＶＬ鎖を更に含み、前記第２のＶＨ鎖が、配列番号２７に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～３を含み、前記第２のＶＬ鎖が、アテゾリズムマブなどの抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶＬ鎖のＬＣＤＲ１～３を含むか、又は
    前記ＴＡＡが、ＣＤ４７であり、前記抗体分子が、第２のＶＨ鎖及び第２のＶＬ鎖を更に含み、前記第２のＶＨ鎖が、配列番号８に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～３を含み、前記第２のＶＬ鎖が、５Ｆ９などの抗ＣＤ４７抗体のＶＬ鎖のＬＣＤＲ１～３を含むか、又は
    前記ＴＡＡが、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）であり、前記抗体分子が、第２のＶＨ鎖及び第２のＶＬ鎖を更に含み、前記第２のＶＨ鎖が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～３を含み、前記第２のＶＬ鎖が、ペルツズマブ若しくはトラスツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体のＶＬ鎖のＬＣＤＲ１～３を含むか、又は
    前記ＴＡＡが、ＨＥＲ１（ＥｒｂＢ１）であり、前記抗体分子が、第２のＶＨ鎖及び第２のＶＬ鎖を更に含み、前記第２のＶＨ鎖が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～３を含み、第２のＶＬ鎖が、ネシツマブなどの抗ＨＥＲ１抗体のＶＬ鎖のＬＣＤＲ１～３を含み、
    前記二重特異性抗体は、ＡＢＣＧ２及び前記ＴＡＡの両方を発現するがん細胞に結合するが、ＡＢＣＧ２及び／又は前記ＴＡＡを発現する非がん細胞に対しては低下した結合を示す、二重特異性抗体分子。
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