CN116490522A - 抗abcc1抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了靶向细胞外排泵ABCC1的抗体。本发明还提供了包含或编码此类抗体的药物合成物、核酸、重组表达载体、细胞和试剂盒。本发明还公开了使用抗体检测细胞(例如，肿瘤细胞)中是否存在ABCC1表达、ABCC1表达水平和/或抑制ABCC1功能的方法。本发明还提供了治疗癌症受试者的方法，包括向受试者给予本发明所述的抗ABCC1抗体。所述目标抗体可以是双特异性抗体。所述双特异性抗体可与ABCC1和肿瘤相关抗原(TAA)结合。

Description

抗ABCC1抗体及其应用
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2020年9月2日提交的第63/073826号美国临时专利申请的权益，所述美国临时专利申请通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
引用文本文件提供的序列表
通过文本文件“KNJY-006WO SEQ LIST_ST25.txt”提供序列表，该文本文件创建于2021年8月24日，大小为151KB。文本文件的内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
背景技术
耐药性是一种众所周知的现象，即疾病对药物治疗产生耐受性，是包括肿瘤领域在内的各种医学领域面临的重大且日益严峻的挑战。虽然许多类型的癌症最初对化疗敏感，但随着时间的推移，它们可以通过这些化疗和其他机制产生耐药性，包括促进药物抑制、降解和增强外排的DNA突变和代谢变化。
外排泵(EP)是由活细胞表达的蛋白质，并且已经进化到能够从细胞中自然排出各种化合物。ATP结合盒(ABC)转运蛋白家族蛋白质的成员是允许药物外排的EP示例。虽然转运蛋白的结构因蛋白质而异(例如，人类中有49个已知的ABC家族成员)，但它们根据是否存在两个不同的结构域(一个高度保守的核苷酸结合结构域和一个更加多变的跨膜结构域)进行分类。由ATP结合盒亚家族B成员1(ABCB1)基因编码的多药耐药蛋白质1(MDR1)是第一个被确定并得到广泛研究的蛋白。在某些化疗药物的治疗中增加ATP结合盒亚家族C成员1(ABCC1)表达。
EP使肿瘤对化疗剂产生耐药性。这种耐药性通常与耐药细胞对化疗剂的外排增强有关。当作用于一种以上的化疗剂时，这种化疗耐药性称为多药耐药性(MDR)。
因此，需要开发可用于测定EP表达和/或抑制EP的试剂。
发明内容
本发明提供了靶向细胞外排泵ATP结合盒亚家族C成员1(ABCC1)的抗体。本发明还提供了包含或编码此类抗体的药物合成物、核酸、重组表达载体、细胞和试剂盒。本发明还公开了使用抗体检测细胞(例如，肿瘤细胞)中是否存在ABCC1表达、ABCC1表达水平和/或抑制ABCC1功能的方法。本发明还提供了治疗癌症受试者的方法，包括向受试者给予本发明所述的抗ABCC1抗体。
附图说明
图1描述了所示抗ABCC1单克隆抗体与内源性表达ABCC1的多柔比星耐药肺癌细胞系H69AR(CRL-11351)的滴定结合的结果。从NCI-H69细胞中建立H69AR(ATCC CRL-11351)，这些细胞在浓度不断增加的阿霉素(多柔比星)存在下生长了总共14个月
图2A-2B描述了所示抗ABCC1单克隆抗体与人和食蟹猴ABCC1过表达大鼠C6神经胶质瘤细胞系的滴定结合的结果。
图3A-3C、4、5A-5B和6A-6B显示了其他抗ABCC1单克隆抗体与人和食蟹猴ABCC1过表达大鼠C6神经胶质瘤细胞系的滴定结合的结果。“仅二抗”是指在与二抗(即第二抗体)结合以提供阴性对照之前不添加一抗。
图7A-7B显示了使用表达人ABCC1的HEK293T细胞进行ABCC1外排测定的结果。
图8A-8C显示了人源化抗ABCC1单克隆抗体的滴定结合和外排测定表征。
图9A-9C显示了人源化抗ABCC1单克隆抗体与人和食蟹猴ABCC1过表达大鼠C6胶质瘤细胞系的结合。
图10A-10B显示了各种人源化C1.851抗ABCC1抗体与人和食蟹猴ABCC1过表达大鼠C6胶质瘤细胞系的结合。
图11A-11C显示了四种人源化C1/KT9双特异性抗体分别与过表达ABCC1和KT9的人和食蟹猴C6细胞系的结合。还显示了双特异性抗体的结构示意图。KT9代表阿特珠单抗(一种抗PD-L1单克隆抗体)。双特异性抗体包含所示ABCC1抗体的重链和轻链以及KT9抗体形成的scFv区。
图12A-12C显示了四种人源化C1/KT1双特异性抗体分别与表达人ABCC1的293T细胞和表达人或食蟹猴KT1的293T细胞的结合。KT1代表曲妥珠单抗(一种抗ErbB2(抗HER2)单克隆抗体)。双特异性抗体包含所示抗ABCC1抗体的重链和轻链以及KT1抗体形成的scFv区。
图13A-13B、14A-14B和15显示了在293T细胞毒性测定中测试的抗ABCC1单克隆抗体对长春新碱细胞毒性的影响。
图16显示了在H69AR细胞毒性测定中测试的三种抗ABCC1单克隆抗体抑制体内肿瘤生长。该测定评价了测试抗体对H69AR细胞系的阿霉素细胞毒性的影响，该细胞系是人小细胞肺癌细胞系NCI-H69的阿霉素选择的C1阳性变体。由H69AR细胞系形成的肿瘤对阿霉素(多柔比星)具有耐药性。测试的所有三种抗ABCC1单克隆抗体均使肿瘤对阿霉素敏感。
图17显示了抗ABCC1单克隆抗体C1-831和C1-737A抑制CT26同基因小鼠肿瘤模型中的体内肿瘤生长。多柔比星增强了这些抗体对肿瘤生长的抑制。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，与抗原保持特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、Fd、Fab'、Fv、F(ab')2、嵌合抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单链抗体，包括仅包含重链(例如VHH骆驼抗体)的抗体、双特异性抗体以及包含抗体抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。所述抗体可以使用(例如)放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等进行可检测标记。所述抗体可进一步与其他部分偶联，例如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等。所述抗体也可与固相载体结合，包括但不限于聚苯乙烯板或微球等。抗体可以是单价抗体或二价抗体。抗体可与毒性部分偶联，例如化疗剂。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段示例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体(Zapata等人，《蛋白工程》，8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子，包括仅包含重链的抗体(例如VHH骆驼抗体)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段有一个抗原结合位点和一个残留“Fc”片段，这一名称反映了容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点，并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体通过紧密的非共价缔合组成。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面上定义抗原结合位点。总的来说，这六个CDR赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于包含每个可变结构域的三个CDR的整个结合位点。
“Fab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于，在重链CH1结构域的羧基末端增加了少许残基，包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本发明中Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离的硫醇基团。F(ab')2抗体片段最初的产生形式为Fab'片段对，这些片段对之间有铰链半胱氨酸。还已知抗体片段的其他化学偶联。
任何脊椎动物种类的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以根据其恒定结构域的氨基酸序列分为两种明显不同的类型，即κ和λ。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别。免疫球蛋白主要有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
“单链Fv”、“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施例中，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽连接子，从而使sFv形成所需的抗原结合结构。有关sFv的综述，请参阅单克隆抗体药理学中的固定式多价型分子，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，纽约，第269页-第315页(1994)。
术语“双体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不能在同一链上的两个结构域之间进行配对的连接子，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，并创建两个抗原结合位点。有关双体更全面的描述，参见(例如)EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人，《美国国家科学院院刊》，90:6444-6448(1993)。
在本发明中，术语“亲和力”是指两种试剂可逆结合的平衡常数，并表示为解离常数(Kd)。亲和力可以比抗体对不相关氨基酸序列的亲和力至少大1倍、至少大2倍、至少大3倍、至少大4倍、至少大5倍、至少大6倍、至少大7倍、至少大8倍、至少大9倍、至少大10倍、至少大20倍、至少大30倍、至少大40倍、至少大50倍、至少大60倍、至少大70倍、至少大80倍、至少大90倍、至少大100倍，或至少大1000倍或更多。抗体对靶蛋白的亲和力范围是(例如)约100纳摩尔(nM)-约0.1nM、约100nM-约1皮摩尔(pM)、约100nM-约1飞摩尔(fM)或更多。在本发明中，术语“亲合力”是指稀释后两种或多种试剂的复合物对解离的抗性。就抗体和/或抗原结合片段而言，术语“免疫反应性”和“优先结合”在本发明中可交替使用。
术语“结合”是指两个分子之间的直接缔合，例如，由于共价、静电、疏水以及离子和/或氢键相互作用，包括盐桥和水桥等相互作用。ABCC1特异性抗体与ABCC1多肽内的表位特异性结合。表位可以是由相邻氨基酸小片段形成的线性表位，也可以是由相邻氨基酸小片段形成的非线性或构象表位。非特异性结合是指亲和力小于约10-7M的结合，例如，亲和力为10-6M、10-5M、10-4M等的结合。
在本发明中，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽可变区域内发现的非连续抗原结合位点。CDR是高变区域，穿插着更保守的区域，称为“框架区域(FR)”。在Kabat等人《生物化学杂志》252:6609-6616(1977)；Kabat等人(美国卫生与人类服务部)“具有免疫学意义的蛋白质序列”(1991)；Chothia等人《生物化学杂志》196:901-917(1987)；以及MacCallum等人《分子生物学杂志》262:732-745(1996)中描述了CDR，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植抗体或其变体的CDR均在本发明定义和使用的术语范围内。下表1列出了包含上述各参考文献所定义的CDR的氨基酸残基作为比较。
表1：CDR定义
Kabat1 Chothia2 MacCallum3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 89-97 91-96 89-96
1残基编号遵循Kabat等人的命名法，同上。
2残基编号遵循Chothia等人的命名法，同上。
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法，同上。
在本发明中，术语“框架”在提及抗体可变区时是指抗体可变区内CDR区之外的所有氨基酸残基。可变区框架通常是长度大约为100-120个氨基酸的不连续氨基酸序列，但仅用于引用CDR之外的氨基酸。在本发明中，术语“框架”是指由CDR分离的框架的每个结构域。VH链可包含三个CDR和四个FR，从N端到C端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。同样，VL轻链可包含三个CDR和四个FR，从N端到C端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语VH链和VH区在本发明中可交替使用。术语VL链和VL区在本发明中可交替使用。
在本发明中，术语抗体包含两个重链和两个轻链的四聚体，其中，所述重链和轻链通过二硫键互连。所述重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。所述轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。所述重链和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合区。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织和因子(包括免疫系统的各种细胞和补体系统的第一组分)的结合。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM类型及其亚型的免疫球蛋白。在一些实施例中，目标抗体为IgG同种型，例如IgG1。
在本发明中，术语“免疫球蛋白”是指包含基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽的蛋白质。识别的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因；以及许多免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链(约25kD或214个氨基酸)由N端的可变区基因(约110个氨基酸)和C端的κ或λ恒定区编码。全长免疫球蛋白重链(约50kD或446个氨基酸)由N端的可变区基因(约116个氨基酸)和C端的一种其他上述恒定区基因(例如γ(编码约330个氨基酸))编码。在某些实施例中，目标抗体包含全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链。
术语“抗原结合片段”是指能够与抗原特异性结合的全长抗体的一个或多个片段。结合片段的示例包括(i)Fab片段(单价片段，包括(例如)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的片段)；(ii)F(ab')2片段(二价片段，包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段)；(iii)Fd片段(包括(例如)由VH和CH1结构域组成的片段)；(iv)Fv片段(包括(例如)由抗体单臂的VH和VL结构域组成的片段)；(v)dAb片段(包括(例如)由VH结构域组成的片段)；(vi)分离的CDR；(vii)单链Fv(scFv)(包括(例如)由抗体单臂的VH和VL结构域组成的scFv，其中VH和VL结构域使用重组方法由合成连接子连接，使VH和VL结构域配对以形成单价分子)；(viii)双体(包括(例如)由两个scFv组成的双体，其中VH和VL结构域连接在一起，因此它们不配对形成单价分子；每个scFv的VH与另一个scFv的VL结构域配对以形成二价分子)。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。
“人源抗体”是指具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或源自利用人源抗体库或其他人源抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列。人源抗体的这一定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共识框架”是代表了一系列人免疫球蛋白轻链可变(VL)或重链可变(VH)框架序列中最常见氨基酸残基的一种框架(FR)。通常，该系列人免疫球蛋白VL或VH序列来自一个亚组的可变结构域序列。通常，序列的亚组是Kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质序列》第5版(NIH出版物91-3242，马里兰州贝塞斯达(1991)，第1-3卷)中所述的亚组。在一个实施例中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人所述的κI亚组。在一个实施例中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人所述的III亚组。
术语“人源化”抗体是指一种包含非人CDR氨基酸残基和人类构架(FR)氨基酸残基的嵌合抗体。人源化抗体恒定区的至少一部分源自人源抗体，例如人IgG1抗体。在优选实施例中，本发明公开的抗体分子包括一个包含本发明提供的重链可变区的重链和一个具有UniProt:P01857-1第1版中规定的氨基酸序列的人IgG1恒定区。在优选实施例中，本发明公开的抗体分子包括一个包含本发明提供的轻链可变区的轻链和一个人轻链恒定区。在优选实施例中，所述人轻链恒定区为一个具有UniProtKB/Swiss-Prot:P01834.2中规定的氨基酸的人κ轻链恒定区。在某些实施例中，目标抗体中存在的人IgG1重链恒定区可包括突变，例如用于调节Fc功能的替换物。例如，可以引入LALAPG效应子功能突变(L234A、L235A和P329G)或N297A突变来降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。替换物的编号基于EU编号系统。在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时通常采用“EU编号系统”或“EU指数”(例如，Kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质序列》第5版(公共卫生署，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991))中报告的EU指数)。“如Kabat所述的EU指数”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指进行人源化的抗体。
术语“表位”是指由免疫系统(例如抗体、B细胞或T细胞)识别的抗原区域。例如，表位是与抗体结合的抗原的特定区域。
“分离”抗体是指已从其自然环境的某个组分中鉴定并分离和/或回收的抗体。其自然环境中的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，将抗体纯化(1)至大于90％、大于95％或大于98％，按劳里法测定的抗体重量，例如，大于99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯测序仪获得至少15个N端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)使用考马斯蓝或银染剂在还原或非还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使其均匀的程度。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的自然环境中至少有一种组分不存在。在某些情况下，分离抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
在本发明中，术语“细胞毒素剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。“化疗剂”也称为“抗肿瘤剂”，可以是用于治疗癌症或其他疾病或病症的细胞毒素剂。
在本发明中，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指达到预期的药理学和/或生理学效果。效果可以具有预防性，即完全或部分预防疾病或症状，和/或具有治疗性，即部分或完全治愈疾病和/或疾病产生的副作用。在本发明中，“治疗”涵盖对哺乳动物(包括人类)疾病的任何治疗，包括：(a)防止疾病发生在可能易患疾病但尚未确诊患有该疾病的受试者中；(b)抑制疾病，即阻止其发展；以及(c)缓解疾病，即疾病消退。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本发明中可交替使用，是指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类动物、人类、犬、猫、有蹄类动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
“治疗有效量”或“有效量”是指给哺乳动物或其他受试者治疗疾病时，足以影响这种疾病治疗的靶标特异性抗体的量。“治疗有效量”将取决于抗体、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重。
在本发明中，术语“难治性”是指对治疗无反应的疾病或病症。关于癌症，在本发明中，“难治性癌症”是指对治疗无反应的癌症。难治性癌症可能在治疗开始时产生耐药性，也可能在治疗期间产生耐药性。难治性癌症也可以称为耐药性癌症。
“生物样品”包括从个体获得的各种类型的样品，并且可用于诊断或监测测定。该定义包括血液和其他生物来源的液体样品、固体组织样品，例如活检标本或组织培养物或其衍生的细胞及其后代。该定义还包括在获得后以任何方式操作的样品，例如通过试剂处理、增溶或富集某些组分，例如多核苷酸。术语“生物样品”包括临床样品，还包括培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。
可以通过将一对序列中的匹配数乘以100并除以比对区域的长度(包括间隙)来计算一对序列之间的一致性百分比。一致性评分只计算完美匹配，不考虑氨基酸之间的相似程度。长度中仅包括内部间隙，不包括序列末端的间隙。一致性百分比＝(匹配×100)/比对区域的长度(包括间隙)
“保守氨基酸替换”一词是指以下组中氨基酸的替换：1)L、I、M、V、F；2)R、K；3)F、Y、H、W、R；4)G、A、T、S；5)Q、N；以及6)D、E。保守氨基酸替换可通过用具有相似酸性、碱性、电荷、极性或侧链大小的侧链的氨基酸替换蛋白质中的氨基酸来保持蛋白质的活性。
替换、插入或删除的指导可基于不同物种蛋白质的氨基酸序列的比对，或来源于基于具有相同或相似功能的多个蛋白质的共有序列。
术语“载体”是指用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
术语“表达载体”或“表达构建体”是指适用于宿主细胞转化的载体，并且包含指示和/或控制(与宿主细胞一起)一个或多个与其可操作连接的异源编码区表达的核酸序列。表达构建体可包括但不限于影响或控制转录、翻译的序列，如果存在内含子，则影响与其可操作连接的编码区的RNA剪接。
术语“刺激”是指刺激分子(例如TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或CAR中的肿瘤抗原)结合从而介导信号转导事件而诱导的主要反应，例如但不限于通过TCR/CD3复合物的信号转导或通过CAR的适当NK受体或信号传导结构域进行信号转导。刺激可以介导某些分子的表达改变。
术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供的细胞质信号传导序列至少在免疫细胞信号传导通路的某些方面以刺激方式调节免疫细胞的激活。在一个实施例中，信号是主要信号，例如，由TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合引发，并导致T细胞反应的介导，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式作用的初级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可能包含信号传导基序，它也被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。在本发明中特定使用的含有细胞质信号传导序列的ITAM示例包括但不限于源自CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的ITAM。
术语“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体特异性结合的同源结合配偶体，从而可以介导T细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，有助于有效的免疫反应。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。
术语“自体”是指源自同一个体的任何物质，这些物质后来又被重新引入该个体。
在本发明中，“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生促进含CAR细胞(例如CAR-T细胞)的免疫效应细胞功能的信号。在CAR-T细胞中免疫效应细胞功能的示例包括溶细胞活性和辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。
在本发明中，“免疫效应细胞”是指参与免疫反应的细胞，例如，促进免疫效应反应的细胞。免疫效应细胞的示例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和髓源性吞噬细胞。
具体实施方式
本发明提供了与细胞外排泵ABCC1结合的抗体。本发明还提供了包含或编码此类抗体的药物合成物、核酸、重组表达载体、细胞和试剂盒。本发明还公开了使用抗体检测细胞(例如，肿瘤细胞)中是否存在ABCC1表达、ABCC1表达水平和/或抑制ABCC1功能的方法。本发明还提供了治疗癌症受试者的方法，包括向受试者给予本发明所述的抗ABCC1抗体。
在进一步描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于所描述的特定实施例，因为这些实施例可能会有所不同。还应理解的是，本发明使用的术语仅用于描述特定实施例，而非加以限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求进行限制。
在提供数值范围的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则本发明包括此范围上限和下限之间的每个居中值(近似到下限的十分之一)以及此规定范围内的任何其他规定或居中值。这些较小范围的上限和下限可独立包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，但受规定范围内任何具体排除限值的限制。如果规定范围包括一个或两个限值，本发明还包括排除这些任一或两个限值的范围。
本发明所述的某些范围，数值之前带有术语“约”。在本发明中，术语“约”用于为其前面的确切数字以及接近或近似于该术语前面的数字提供字面上的支持。在确定一个数字是否接近或近似于一个特定列举数字时，接近或近似的未列举数字可能是一个数字，在该数字的上下文中，它提供了与特定列举数字基本等同的数字。
除非另有说明，否则本发明所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域普通技术人员公知的相同含义。虽然在本发明的实践或测试中也可使用与本发明所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但代表性说明方法和材料描述如下。
本说明书中引用的所有出版物和专利通过本发明的引用，成为本发明的一部分，就像各个出版物或专利均具体、单独表明通过本发明的引用，成为本发明的一部分，旨在公开并描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。引用任何出版物的目的是在提交日期前公开，不应视为承认本发明无权先于此类出版物出版。此外，提供的出版日期可能与需要单独确认的实际出版日期不同。
值得注意的是，在本发明和所附权利要求中，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”也包括复数指称对象。还应注意，在起草权利要求时可以排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为使用如“仅”、“唯一”等与权利要求要素的叙述有关的排他性术语或使用“否定”限制的前提依据。
在阅读本发明后，本领域的技术人员可明显看出，本发明所述的各个实施例具有离散组成部分和特征，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可与任何其他几个实施例的特征随意分离或组合。可按所列举事件的顺序或按逻辑上可行的任何其他顺序执行所列举的任何方法。
虽然为了语法上的流畅性和功能上的解释，已经或将要对方法和合成物进行描述，但应明确理解的是，除非《美国专利法》第35篇第112(f)条明确规定，否则权利要求不应解释为必须在任何方面都受限于“方式”或“步骤”的限制，而是根据等同司法原则赋予权利要求提供的定义的含义和等同物的全部范围，并且在《美国专利法》第35篇第112(f)条明确规定权利要求的情况下，应根据《美国专利法》第35篇第112(f)条给予完全法定等同物。
抗体
如上所述，本发明提供了与哺乳动物细胞(例如人细胞)表面上表达的细胞外排泵ABCC1结合的抗体。ABCC1，也称为谷胱甘肽-S-偶联物-易位性ATP酶ABCC1或多药耐药相关蛋白1(MRP1)，是一种能量依赖性泵，可将药物和有机阴离子穿过质膜排出体外。它包括17个由细胞外和细胞质环连接的跨膜螺旋。ABCC1介导对多柔比星、依托泊苷和长春新碱等的耐药性。
在一些实施例中，本发明公开的抗体与ABCC1胞外区的一个或多个位点结合。在某些实施例中，本发明的抗ABCC1抗体与人ABCC1结合。在某些实施例中，本发明的抗ABCC1抗体与在人类细胞(例如癌细胞)的细胞表面表达的人ABCC1结合。
本发明的抗体可具有以下一种或多种性质：
i)抑制ABCC1外排；
ii)增加癌细胞对化疗剂治疗的敏感性，从而使化疗剂的IC50降低至少2倍；
iii)与细胞表面的人和食蟹猴ABCC1结合；
iv)在体外细胞杀伤测定中有效；
v)即使没有化疗也能有效抑制肿瘤生长；以及
vi)对ABCC1的亲和力较低，因此与表达ABCC1水平较高的癌细胞相比，与非癌细胞的结合明显较少。
在本发明中，EC50是指提供一半最大反应的抗体浓度(例如，最大荧光强度的一半)。本发明所述抗体的EC50可以是100nM或更低，例如，100nM-4nM、80nM-4nM、60nM-4nM、40nM-4nM、30nM-4nM、20nM-4nM、15nM-4nM或10nM-4nM。测试抗体的EC50可以用流式细胞术或ELISA测定。例如，流式细胞术可能涉及将表达ABCC1的细胞(例如人ABCC1)与流式细胞术缓冲液中的抗体接触，其中所述抗体被连续稀释；在室温或4℃下培养足够的时间，使抗体与细胞结合(例如10分钟-1小时)。培养后，可选地洗涤细胞以去除非特异性结合的抗体，和/或细胞可与特异性结合测试抗体的荧光标记的二抗接触。培养后，可以去除荧光标记的二抗并洗涤细胞。通过流式细胞术对洗涤的细胞进行分类，并计数与荧光标记的二抗结合的细胞数量。提供一半最大反应的浓度(例如，最大荧光强度的一半)以EC50测量。在流式细胞术测定的变体中，细胞可能是过表达ABCC1的293T细胞。
可以通过测量细胞生长的抑制来确定测试抗体的IC50。可以通过单独使用测试抗体来测量IC50，以确定产生一半最大反应的抗体浓度。可以在有和没有测试抗体的情况下测量化疗剂的IC50，以确定抗体对IC50化疗剂的影响。化疗剂可以是多柔比星、柔红霉素、依托泊苷、长春新碱等。细胞可以是癌细胞系。癌细胞系可能是H69AR，一种肺癌细胞系H69的多柔比星选择的C1阳性变体。如果确定抗体的IC50，则细胞可以单独与抗体接触，其中抗体在连续稀释下测试。细胞可以与抗体和化疗剂接触，以确定抗体对药剂IC50的影响，其中药剂在连续稀释下测试。细胞可以在37℃下培养一段时间(例如24小时-84小时)，并使用标准试剂和方法评估细胞活力。本发明公开的抗体可以提高癌细胞对化疗剂治疗的敏感性，从而使化疗剂的IC50降低至少5倍。在某些实施例中，本发明的抗体可以将化疗剂的IC50降低5倍或以上，例如，6倍或以上、7倍或以上、8倍或以上、9倍或以上或10倍或以上，例如，5倍-10倍。
在某些实施例中，本发明公开的一种或多种抗ABCC1抗体与人和食蟹猴ABCC1结合。该性质可用于确定动物模型中抗体的安全性。
在某些实施例中，本发明公开的抗ABCC1抗体对ABCC1具有特异性，并且没有显示出与其他抗原的显著结合。
在一些实施例中，一种或多种目标抗体在与表达ABCC1的细胞结合时，可阻止细胞ABCC1蛋白发挥功能。因此，本公开的一种或多种抗体可以通过ABCC1蛋白抑制外排，包括(例如)与没有目标抗体情况下的ABCC1的外排相比，外排减少5％或以上，包括(例如)10％或以上、15％或以上、20％或以上、25％或以上、30％或以上、40％或以上、50％或以上、60％或以上、70％或以上、80％或以上或90％或以上。在一些实施例中，目标抗体在与表达ABCC1的细胞结合时，可能以其他机制阻碍ABCC1发挥作用，例如，使ABCC1渗漏，这反过来可以增强化疗剂的吸收和/或降低细胞的活力。
在某些实施例中，提供了一种抗ABCC1抗体，该抗体与分别包含表2所列抗体的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区对的重链互补决定区(HCDR)和轻链CDR(LCDR)竞争与ABCC1结合。例如，在一个实施例中，本发明的抗ABCC1抗体与表2所列的C1.309抗体竞争与ABCC1结合。在某些实施例中，根据Kabat命名法定义HCDR 1-3和LCDR 1-3。
在某些实施例中，抗ABCC1抗体包含表2所列抗体的VH区的HCDR1、HCDR2和HCDR3。在某些实施例中，根据Kabat命名法定义HCDR1、HCDR2和HCDR3。例如，在一个实施例中，本发明的抗ABCC1抗体与表2所列的C1.309抗体竞争与ABCC1结合，包含C1.309抗体的VH区的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
可以采用任何适当的方法来确定一抗是否与二抗竞争与ABCC1结合。使用本领域已知的竞争结合测定可以轻松测定一抗是否与二抗“竞争”与抗原结合。例如，可以通过抗体竞争测定识别竞争抗体。例如，一抗样品可与固相载体结合。然后，加入疑似能够与此类一抗竞争的二抗样品。对两个抗体中的一个进行标记。如果标记的抗体和未标记的抗体与抗原上独立和分散的位点结合，则无论是否存在可疑的竞争抗体，标记的抗体都将结合相同的水平。然而，如果相互作用位点相同或重叠，未标记的抗体将竞争，与抗原结合的标记抗体量将降低。如果存在过多的未标记抗体，则将结合的标记抗体(如有)很少。
就本发明而言，竞争抗体是将抗体与抗原的结合降低约30％或以上、约40％或以上、约50％或以上、约60％或以上、约70％或以上、约80％或以上、约85％或以上、约90％或以上、约95％或以上或约99％或以上的抗体。进行此类竞争测定的详细程序在本领域是众所周知的，详情见(例如)Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，1988，567-569，1988，ISBN 0-87969-314-2。此类测定可以使用纯化抗体进行定量。可通过滴定一种抗体来建立标准曲线，即相同的抗体用于标记和竞争抗体。可以对未标记的竞争抗体抑制标记抗体与抗原结合的能力进行滴定。可以对结果进行绘制，并比较达到理想结合抑制程度的必要浓度。
在某些实施例中，与ABCC1特异性结合的抗体包含(i)表2所列抗体的一对重链(VH)可变区和轻链(VL)可变区的HCDR 1-3和轻链CDR(LCDR 1-3)；(ii)表2所列抗体的VH区的HCDR 1-3；(iii)表2所列抗体的VH区的LCDR 1-3；或(iv)表2所列一抗的VH区的HCDR 1-3和表2所列二抗的VL区的LCDR 1-3。可以根据Kabat命名法定义HCDR和LCDR。
在某些实施例中，本发明中与人ABCC1特异性结合的抗体包含表2所列抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。除了与人ABCC1结合外，本发明提供的一种或多种抗体还可以与其他哺乳动物物种的ABCC1结合，例如小鼠、猴、黑猩猩等。抗体可以在小鼠或大鼠中产生。表2列出了产生抗体的动物。
表2：从左到右，第1列：抗ABCC1抗体名称，第2列：VH区，第3列：HCDR1，第4列：HCDR2，第5列：HCDR3，第6列：VL区，第7列：LCDR1，第8列：LCDR2，第9列：LCDR3。
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表2所列抗ABCC1抗体也称为抗KPC1抗体或抗C1抗体，可以用表2所列的抗体编号来表示。
在一些实施例中，抗体包含存在于分离多肽中的一个VL区和一个VH区；在其他实施例中，VL区和VH区包含在单个多肽中。
本发明的抗体可选自Ig单体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、scFv、scAb、dAb和Fv。
在一些实施例中，目标抗体是重组或修饰的抗体，例如嵌合、人源化、去免疫化或体外生成的抗体。在本发明中，术语“重组”或“修饰”抗体旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(i)使用转染到宿主细胞的重组表达载体表达的抗体；(ii)从重组组合抗体库中分离的抗体；(iii)从动物(例如小鼠)中分离出的人免疫球蛋白基因转基因的抗体；或(iv)通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的方式制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组抗体包括人源化、CDR移植、嵌合、去免疫化和体外生成的抗体；并且可选地包括源自人种系免疫球蛋白序列的恒定区。
如上所述，目标抗ABCC1抗体与ABCC1的一个或多个表位特异性结合。因此，所述表位为ABCC1表位。与抗ABCC1抗体结合的ABCC1表位的大小可能有所不同，包括ABCC1表位由具有ABCC1序列相邻小片段的多肽形成的情况，其范围可以为3个aa或小于12个aa或更多，包括但不限于(例如)4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、4个aa-10个aa、5个aa-10个aa、6个aa-10个aa、4个aa-8个aa、5个aa-8个aa、6个aa-8个aa等。
在一些实施例中，ABCC1表位可以由与ABCC1序列相邻小片段具有氨基酸序列一致性至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的多肽形成，包括但不限于(例如)人ABCC1序列：MALRGFCSADGSDPLWDWNVTWNTSNPDFTKCFQNTVLVWVPCFYLWACFPFYFLYLSRHDRGYIQMTPLNKTKTALGFLLWIVCWADLFYSFWERSRGIFLAPVFLVSPTLLGITMLLATFLIQLERRKGVQSSGIMLTFWLVALVCALAILRSKIMTALKEDAQVDLFRDITFYVYFSLLLIQLVLSCFSDRSPLFSETIHDPNPCPESSASFLSRITFWWITGLIVRGYRQPLEGSDLWSLNKEDTSEQVVPVLVKNWKKECAKTRKQPVKVVYSSKDPAQPKESSKVDANEEVEALIVKSPQKEWNPSLFKVLYKTFGPYFLMSFFFKAIHDLMMFSGPQILKLLIKFVNDTKAPDWQGYFYTVLLFVTACLQTLVLHQYFHICFVSGMRIKTAVIGAVYRKALVITNSARKSSTVGEIVNLMSVDAQRFMDLATYINMIWSAPLQVILALYLLWLNLGPSVLAGVAVMVLMVPVNAVMAMKTKTYQVAHMKSKDNRIKLMNEILNGIKVLKLYAWELAFKDKVLAIRQEELKVLKKSAYLSAVGTFTWVCTPFLVALCTFAVYVTIDENNILDAQTAFVSLALFNILRFPLNILPMVISSIVQASVSLKRLRIFLSHEELEPDSIERRPVKDGGGTNSITVRNATFTWARSDPPTLNGITFSIPEGALVAVVGQVGCGKSSLLSALLAEMDKVEGHVAIKGSVAYVPQQAWIQNDSLRENILFGCQLEEPYYRSVIQACALLPDLEILPSGDRTEIGEKGVNLSGGQKQRVSLARAVYSNADIYLFDDPLSAVDAHVGKHIFENVIGPKGMLKNKTRILVTHSMSYLPQVDVIIVMSGGKISEMGSYQELLARDGAFAEFLRTYASTEQEQDAEENGVTGVSGPGKEAKQMENGMLVTDSAGKQLQRQLSSSSSYSGDISRHHNSTAELQKAEAKKEETWKLMEADKAQTGQVKLSVYWDYMKAIGLFISFLSIFLFMCNHVSALASNYWLSLWTDDPIVNGTQEHTKVRLSVYGALGISQGIAVFGYSMAVSIGGILASRCLHVDLLHSILRSPMSFFERTPSGNLVNRFSKELDTVDSMIPEVIKMFMGSLFNVIGACIVILLATPIAAIIIPPLGLIYFFVQRFYVASSRQLKRLESVSRSPVYSHFNETLLGVSVIRAFEEQERFIHQSDLKVDENQKAYYPSIVANRWLAVRLECVGNCIVLFAALFAVISRHSLSAGLVGLSVSYSLQVTTYLNWLVRMSSEMETNIVAVERLKEYSETEKEAPWQIQETAPPSSWPQVGRVEFRNYCLRYREDLDFVLRHINVTINGGEKVGIVGRTGAGKSSLTLGLFRINESAEGEIIIDGINIAKIGLHDLRFKITIIPQDPVLFSGSLRMNLDPFSQYSDEEVWTSLELAHLKDFVSALPDKLDHECAEGGENLSVGQRQLVCLARALLRKTKILVLDEATAAVDLETDDLIQSTIRTQFEDCTVLTIAHRLNTIMDYTRVIVLDKGEIQEYGAPSDLLQQRGLFYSMAKDAGLV(SEQ ID NO:150)，或其胞外区，例如，环1(氨基酸1–33)：MALRGFCSADGSDPLWDWNVTWNTSNPDFTKCF(SEQ IDNO:151)；环2(氨基酸96-100)：RSRGI(SEQ ID NO:152)；环3(氨基酸155-172)：SKIMTALKEDAQVDLFRD(SEQ ID NO:153)；环4(氨基酸338-363)：MMFSGPQILKLLIKFVNDTKAPDWQG(SEQ ID NO:154)；环5(氨基酸462-464)：LGP；环6(氨基酸569-690)：VTIDENNILDAQTAFVSLALFN(SEQ ID NO:155)；环7(氨基酸989-1025)：ALASNYWLSLWTDDPIVNGTQEHTKVRLSVYGALGIS(SEQ ID NO:156)；环8(氨基酸1111)：A；环9(氨基酸1225-1226)：LS；或人ABCC1的片段，例如，包含氨基酸残基204-1531的片段：MDPNPCPESSASFLSRITFWWITGLIVRGYRQPLEGSDLWSLNKEDTSEQVVPVLVKNWKKECAKTRKQPVKVVYSSKDPAQPKESSKVDANEEVEALIVKSPQKEWNPSLFKVLYKTFGPYFLMSFFFKAIHDLMMFSGPQILKLLIKFVNDTKAPDWQGYFYTVLLFVTACLQTLVLHQYFHICFVSGMRIKTAVIGAVYRKALVITNSARKSSTVGEIVNLMSVDAQRFMDLATYINMIWSAPLQVILALYLLWLNLGPSVLAGVAVMVLMVPVNAVMAMKTKTYQVAHMKSKDNRIKLMNEILNGIKVLKLYAWELAFKDKVLAIRQEELKVLKKSAYLSAVGTFTWVCTPFLVALCTFAVYVTIDENNILDAQTAFVSLALFNILRFPLNILPMVISSIVQASVSLKRLRIFLSHEELEPDSIERRPVKDGGGTNSITVRNATFTWARSDPPTLNGITFSIPEGALVAVVGQVGCGKSSLLSALLAEMDKVEGHVAIKGSVAYVPQQAWIQNDSLRENILFGCQLEEPYYRSVIQACALLPDLEILPSGDRTEIGEKGVNLSGGQKQRVSLARAVYSNADIYLFDDPLSAVDAHVGKHIFENVIGPKGMLKNKTRILVTHSMSYLPQVDVIIVMSGGKISEMGSYQELLARDGAFAEFLRTYASTEQEQDAEENGVTGVSGPGKEAKQMENGMLVTDSAGKQLQRQLSSSSSYSGDISRHHNSTAELQKAEAKKEETWKLMEADKAQTGQVKLSVYWDYMKAIGLFISFLSIFLFMCNHVSALASNYWLSLWTDDPIVNGTQEHTKVRLSVYGALGISQGIAVFGYSMAVSIGGILASRCLHVDLLHSILRSPMSFFERTPSGNLVNRFSKELDTVDSMIPEVIKMFMGSLFNVIGACIVILLATPIAAIIIPPLGLIYFFVQRFYVASSRQLKRLESVSRSPVYSHFNETLLGVSVIRAFEEQERFIHQSDLKVDENQKAYYPSIVANRWLAVRLECVGNCIVLFAALFAVISRHSLSAGLVGLSVSYSLQVTTYLNWLVRMSSEMETNIVAVERLKEYSETEKEAPWQIQETAPPSSWPQVGRVEFRNYCLRYREDLDFVLRHINVTINGGEKVGIVGRTGAGKSSLTLGLFRINESAEGEIIIDGINIAKIGLHDLRFKITIIPQDPVLFSGSLRMNLDPFSQYSDEEVWTSLELAHLKDFVSALPDKLDHECAEGGENLSVGQRQLVCLARALLRKTKILVLDEATAAVDLETDDLIQSTIRTQFEDCTVLTIAHRLNTIMDYTRVIVLDKGEIQEYGAPSDLLQQRGLFYSMAKDAGLV(SEQ ID NO:157)；或食蟹猴ABCC1序列：MALRGFCSADGSDPLWDWNVTWYTSNPDFTKCFQNTVLVWVPCFYLWACFPFYFLYLSRHDRGYIQMTLLNKTKTALGFLLWIVCWADLFYSFWERSRGIFLAPVFLVSPTLLGITMLLATFLIQLERRKGVQSSGIMLTFWLVALLCALAILRSKIMTALKEDVQVDLFRDMTFYVYFSLVLIQLVLSCFSDRSPLFSETIHDPNPCPESSASFLSRITFWWITGLIVRGYRQPLEGSDLWSLNKEDTSEQVVPVLVKNWKKECAKTRKQPVKVVYSSKDPAQPKDSSKVDANEEVEALIVKSPQKEWNPSLFKVLYKTFGPYFLMSFFFKAIHDLMMFSGPEILKLLINFVNDTKAPDWQGYFYTALLFVAACLQTLVLHQYFHICFVSGMRIKTAVIGAVYRKALVITNAARKSSTVGEIVNLMSVDAQRFMDLATYINMIWSAPLQVILALYLLWRNLGPPILAGVAVMVLMVPVNAVMAMKTKTYQVAHMKSKDNRIKLMNEILNGIKVLKLYAWELAFKDKVLAIRQEELKVLKKSAYLAAVGTFTWVCTPFLVALCTFAVYVTIDKNNVLDAQKAFVSLALFNILRFPLNILPMVISSIVQASVSLKRLRIFLSHEELEPDSIERRPVKDGGDTNSITVRNATFTWARSDPPTLNGITFSIPEGALVAVVGQVGCGKSSLLSALLAEMDKVEGHVALKGSVAYVPQQAWIQNDSLQENILFGCQLEEPYYRSVIQACALLPDLEILPSGDRTEIGEKGVNLSGGQKQRVSLARAVYCNADIYLFDDPLSAVDAHVGKHIFENVIGPKGMLKNKTRILVTHSMSYLPQVDVIIVMSGGKISEMGSYQELLARDGAFAEFLRTYASAEQEQDPEDNGVTGVSGPGKEAKQMENGMLVTDSAGKQLQRQLSSSSSYSGDVSRQHNSTAELQKDGAKKEETWKLMEADKAQTGQVKLSVYWDYMKAIGLFISFLSIFLFICNHVAALASNYWLSLWTDDPIVNGTQEHTKVRLSVYGALGISQGIAVFGYSMAVSIGGILASRCLHVDLLHSILRSPMSFFERTPSGNLVNRFSKELDTVDSMIPEVIKMFMGSLFNVIGACIVILLATPIAAIIIPPLGLIYFFVQRFYVASSRQLKRLESVSRSPVYSHFNETLLGVSVIRAFEEQERFIHQSDLKVDENQKAYYPSIVANRWLAVRLECVGNCIVLFAALFAVISRHSLSAGLVGLSVSYSLQVTTYLNWLVRMSSEMETNIVAVERLKEYSETEKEAPWQIQETAPPSNWPQVGRVEFRNYCLRYREDLDFVLRHINVTINGGEKVGIVGRTGAGKSSLTLGLFRINESAEGEIIIDGINIARIGLHDLRFKITIIPQDPVLFSGSLRMNLDPFSQYSDEEVWTSLELAHLKGFVSALPDKLDHECAEGGENLSVGQRQLVCLARALLRKTKILVLDEATAAVDLETDDLIQSTIRTQFEDCTVLTIAHRLNTIMDYTRVIVLDKGEIQEYGAPSDLLQQRGLFYNMARDAGLV(SEQ ID NO:158)；其胞外区；或食蟹猴ABCC1的片段，例如包含氨基酸残基204-1531的片段：
MDPNPCPESSASFLSRITFWWITGLIVRGYRQPLEGSDLWSLNKEDTSEQVVPVLVKNWKKECAKTRKQPVKVVYSSKDPAQPKDSSKVDANEEVEALIVKSPQKEWNPSLFKVLYKTFGPYFLMSFFFKAIHDLMMFSGPEILKLLINFVNDTKAPDWQGYFYTALLFVAACLQTLVLHQYFHICFVSGMRIKTAVIGAVYRKALVITNAARKSSTVGEIVNLMSVDAQRFMDLATYINMIWSAPLQVILALYLLWRNLGPPILAGVAVMVLMVPVNAVMAMKTKTYQVAHMKSKDNRIKLMNEILNGIKVLKLYAWELAFKDKVLAIRQEELKVLKKSAYLAAVGTFTWVCTPFLVALCTFAVYVTIDKNNVLDAQKAFVSLALFNILRFPLNILPMVISSIVQASVSLKRLRIFLSHEELEPDSIERRPVKDGGDTNSITVRNATFTWARSDPPTLNGITFSIPEGALVAVVGQVGCGKSSLLSALLAEMDKVEGHVALKGSVAYVPQQAWIQNDSLQENILFGCQLEEPYYRSVIQACALLPDLEILPSGDRTEIGEKGVNLSGGQKQRVSLARAVYCNADIYLFDDPLSAVDAHVGKHIFENVIGPKGMLKNKTRILVTHSMSYLPQVDVIIVMSGGKISEMGSYQELLARDGAFAEFLRTYASAEQEQDPEDNGVTGVSGPGKEAKQMENGMLVTDSAGKQLQRQLSSSSSYSGDVSRQHNSTAELQKDGAKKEETWKLMEADKAQTGQVKLSVYWDYMKAIGLFISFLSIFLFICNHVAALASNYWLSLWTDDPIVNGTQEHTKVRLSVYGALGISQGIAVFGYSMAVSIGGILASRCLHVDLLHSILRSPMSFFERTPSGNLVNRFSKELDTVDSMIPEVIKMFMGSLFNVIGACIVILLATPIAAIIIPPLGLIYFFVQRFYVASSRQLKRLESVSRSPVYSHFNETLLGVSVIRAFEEQERFIHQSDLKVDENQKAYYPSIVANRWLAVRLECVGNCIVLFAALFAVISRHSLSAGLVGLSVSYSLQVTTYLNWLVRMSSEMETNIVAVERLKEYSETEKEAPWQIQETAPPSNWPQVGRVEFRNYCLRYREDLDFVLRHINVTINGGEKVGIVGRTGAGKSSLTLGLFRINESAEGEIIIDGINIARIGLHDLRFKITIIPQDPVLFSGSLRMNLDPFSQYSDEEVWTSLELAHLKGFVSALPDKLDHECAEGGENLSVGQRQLVCLARALLRKTKILVLDEATAAVDLETDDLIQSTIRTQFEDCTVLTIAHRLNTIMDYTRVIVLDKGEIQEYGAPSDLLQQRGLFYNMARDAGLV(SEQ ID NO:159)。
目标抗ABCC1抗体表现出与ABCC1结合的高亲和力。例如，目标抗ABCC1抗体与人ABCC1结合的亲和力至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或大于10-12M。目标抗ABCC1抗体与ABCC1上表位结合的亲和力至少约10-7M-约10-8M、约10-8M-约10-9M、约10-9M-约10-10M、约10-10M-约10-11M,、约10-11M-约10-12M或大于10-12M。
目标抗ABCC1抗体基本上不与其他相关但序列不同的蛋白质(例如相关但序列不同的EP)中的氨基酸形成的任何表位结合。目标抗ABCC1抗体与由相关但序列不同的蛋白质内氨基酸形成的表位的任何结合通常是非特异性结合，其亲和力明显低于抗ABCC1抗体与ABCC1上表位的特异性结合。明显较低的亲和力通常比亲和力低至少2倍、3倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。
目标抗ABCC1抗体可以减少分子通过ABCC1(例如人ABCC1)转运蛋白的转运。例如，与没有抗ABCC1抗体情况下的转运程度相比，目标抗ABCC1抗体可以减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或以上的转运。
在一些实施例中，目标抗体包含哺乳动物序列的FR区，包括(例如)啮齿动物、非人灵长类动物和人类序列(例如，由各自的重链FR编码序列编码)。
目标抗体可包含重链可变(VH)区，该区域包含与表2中抗体的VH-VL对的VH区序列85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上(包括100％)相同的氨基酸序列。目标抗体可包含轻链可变(VL)区，该区域包含与表2中抗体的VH-VL区域对的VL序列85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上(包括100％)相同的氨基酸序列。
在一个方面，抗体分子包含表2所列C1.844抗体、C1.851抗体、C1.831抗体或C1.861抗体其中一种的HCDR 1-3和/或LCDR 1-3。
在一个方面，抗体分子包含表2所列C1.773抗体、C1.773a抗体、C1.777a抗体、C1.784a抗体、C1.786a抗体、C1.787a抗体、C1.827抗体、C1.830B抗体、C1.831抗体、C1.835抗体、C1.841抗体、C1.844抗体、C1.845抗体、C1.847抗体、C1.851抗体、C1.855抗体、C1.861抗体、C1.863抗体、C1.876抗体、C1.877抗体或C1.879A抗体其中一种的HCDR 1-3和/或LCDR1-3。
在某些实施例中，本发明的抗体可以将化疗剂(例如长春新碱)的IC50降低5倍或以上，例如，6倍或以上、7倍或以上、8倍或以上、9倍或以上、10倍或以上，或者20倍或以上，例如，5倍-50倍。在一个方面，抗体分子可以将化疗剂(例如长春新碱)的IC50降低5倍或以上，并且可包含表2所列C1.851抗体、C1.841抗体、C1.861抗体、C1.831抗体、C1.786a抗体、C1.787a抗体或C1.777抗体的HCDR 1-3和/或LCDR 1-3。
目标抗体的区域和/或链可能由一个或多个连接区连接，也可能不由一个或多个连接区连接。在存在的情况下，所述连接区的长度可以是约5个氨基酸-约50个氨基酸，例如，约5个aa-约10个aa、约10个aa-约15个aa、约15个aa-约20个aa、约20个aa-约25个aa、约25个aa-约30个aa、约30个aa-约35个aa、约35个aa-约40个aa、约40个aa-约45个aa或约45个aa-约50个aa的长度。
适合目标抗体使用的连接子包括“柔性连接子”。如果存在，所述连接分子通常具有足够的长度，以便在连接区之间进行一些柔性移动。所述连接分子的长度通常约6-50个原子。所述连接分子还可以是(例如)芳基乙炔、含2-10个单体单元的乙二醇低聚物、二元胺、二元酸、氨基酸或其组合。根据本发明内容，可以使用与多肽结合的其他连接分子。
可轻松选择合适的连接子，并且可以是任何合适的不同长度，例如，1个氨基酸(例如甘氨酸)-20个氨基酸、2个氨基酸-15个氨基酸、3个氨基酸-12个氨基酸，包括4个氨基酸-10个氨基酸、5个氨基酸-9个氨基酸、6个氨基酸-8个氨基酸或7个氨基酸-8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
示例性柔性连接子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸丝氨酸聚合物(包括(GS)n、GSGGSn(SEQ ID NO:160)和GGGSn(SEQ ID NO:161)，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性连接子。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物很受关注，因为这两种氨基酸相对非结构化，因此可以作为组分之间的中性拴系。甘氨酸聚合物特别受关注，因为甘氨酸比丙氨酸进入更多的空间，并且比侧链较长的残基受到的限制要少得多(参见Scheraga，《计算化学综述》，11173-142(1992))。示例性柔性接头包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:162)、GGSGG(SEQ ID NO:163)、GSGSG(SEQ ID NO:164)、GSGGG(SEQ ID NO:165)、GGGSG(SEQ ID NO:166)、GSSSG(SEQ ID NO:167)等。本领域的普通技术人员将认识到，与上述任何元素偶联的肽的设计可包括全部或部分柔性的连接子，这样所述连接子可以包括柔性连接子以及赋予较低柔性结构的一个或多个部分。
在其他情况下，可以通过以下方法降低本发明的抗体铰链区的灵活性：将氨基酸C220突变为丝氨酸或任何其他天然氨基酸，去除C220，去除整个铰链，或者用IgG3铰链替换IgG1铰链，形成一种抗体，其轻链通过其C端半胱氨酸连接，类似于人同种型IgA2m的情况。这导致Fab相对于Fc的灵活性降低，从而降低交联能力。另一种降低IgG1分子灵活性的策略是用IgG2铰链或类似IgG2的铰链替换IgG1铰链。或者，可以引入类似于IgG2铰链的IgG1铰链变体。该突变体(TH7Δ6-9)包含突变T223C和两个缺失(K222和T225)，以创建具有额外半胱氨酸的较短铰链。
将小鼠CDR替换为人可变结构域框架可以保持其正确的空间方向，例如，人可变域框架采用与CDR来源的小鼠可变框架相同或相似的构象。这可以通过从人抗体中获得人可变结构域来实现，人抗体的框架序列与CDR来源的鼠可变框架结构域表现出高度的序列一致性。重链和轻链可变框架区可以来自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体序列，也可以是几种人抗体的共有序列。参见Kettleborough等人，《蛋白质工程》，4:773(1991)；Kolbinger等人，《蛋白质工程》，6:971(1993)。
在确定了鼠供体免疫球蛋白和适当的人受体免疫球蛋白的互补决定区域之后，下一步是确定应替换这些组分中的哪些残基(如有)，以优化所得人源化抗体的性质。一般来说，应尽量减少用鼠氨基酸残基替换人氨基酸残基，因为引入鼠残基会增加抗体在人类中引发人抗小鼠抗体(HAMA)反应的风险。可以实施本领域认可的确定免疫反应的方法，以监测特定患者或临床试验期间的HAMA反应。给予人源化抗体的患者可以在所述治疗的开始和整个给药过程中进行免疫原性评估。例如，通过使用本领域已知的方法，包括表面等离子共振技术(BIACORE)和/或固相ELISA分析，在患者的血清样品中检测人源化治疗剂的抗体来测量HAMA反应。在许多实施例中，人源化抗体基本上不会在人受试者中引起HAMA反应。
根据对CDR构象和/或与抗原结合的可能影响，从人可变区框架残基中选择某些氨基酸进行替换。鼠CDR区域与人可变框架区域的不自然并置可导致构象限制，除非通过替换某些氨基酸残基进行纠正，否则会导致丧失结合亲和力。
可以部分通过计算机建模来确定用于替换的氨基酸残基的选择。本领域已知用于产生免疫球蛋白分子三维图像的计算机硬件和软件。通常，从免疫球蛋白链或其结构域的解析结构开始产生分子模型。将要建模的链与解析的三维结构的链或结构域进行氨基酸序列相似性比较，并选择具有最大序列相似性的链或结构域作为构建分子模型的起点。选择共享至少50％序列一致性的链或结构域进行建模，优选共享至少60％、70％、80％、90％序列一致性或更多的链或结构域进行建模。对解析的起始结构进行修饰，以允许正在建模的免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸与起始结构中的实际氨基酸之间的差异。然后将修饰的结构组装成复合免疫球蛋白。最后，通过能量最小化和验证所有原子彼此之间的适当距离以及键长度和角度在化学可接受的范围内来完善模型。
在一些实施例中，目标抗体包括scFv多聚体。例如，在一些实施例中，目标抗体为scFv二聚体(例如，包括两个串联scFv(scFv2))、scFv三聚体(例如，包括三个串联scFv(scFv3))、scFv四聚体(例如，包括四个串联scFv(scFv4))，或者是超过四个scFv的多聚体(例如，串联)。scFv单体可以通过长度为约2个氨基酸-约15个氨基酸的连接子串联连接，例如长度为2个aa、3个aa、4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa或15个aa。合适的连接子包括(例如)(Gly)x(SEQ ID NO:168)，其中x是2-15的整数。其他适当的连接子已在上文进行了讨论。在一些实施例中，如上所述，目标scFV多聚体中的每个scFv单体都是人源化scFv单体。在某些实施例中，双特异性抗体可以是文献中已知的任何分子形式。例如，本发明的双特异性抗体可以具有Spiess C.等人《分子免疫学》(2015年10月；67(2Pt A):95-106)所述的分子形式。
在一些实施例中，目标抗体包含免疫球蛋白的恒定区(例如，Fc区)。Fc区(如存在)可以是人Fc区。如果存在恒定区，则抗体可以同时包含轻链和重链恒定区。合适的重链恒定区包含CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。本发明所述的抗体包括具有所有恒定区类型的抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。合适的重链Fc区的示例为人同种型IgG1 Fc。轻链恒定区可以是λ或κ。目标抗体(例如，目标人源化抗体)可以包含多个类别或同种型的序列。抗体可以表达为包含两条轻链和两条重链的四聚体，如分离的重链、轻链，如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv，或如单链抗体，其中重链和轻链可变结构域通过间隔子连接。
在一些实施例中，目标抗体包括羧基末端的游离硫醇(-SH)基团，其中游离硫醇基团可用于将抗体连接到第二多肽(例如，另一个抗体，包括目标抗体)、支架、载体等。
目标抗体可以使用(例如)戊二醛、同型双功能交联剂或异型双功能交联剂与第二部分(例如，脂质、目标抗体以外的多肽、合成聚合物、碳水化合物、毒素等)共价连接。戊二醛通过其氨基部分与多肽交联。同型双功能交联剂(例如，同型双功能亚氨酸酯、同型双功能N羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或同型双功能巯基反应交联剂)包含两个或多个相同的反应部分，可用于一步反应过程，其中将交联剂添加到含有待连接多肽混合物的溶液中。同型双功能NHS酯和酰亚胺酯与含有多肽的胺交联。在弱碱性pH值下，酰亚胺酯仅与伯胺反应生成酰亚胺，交联多肽的总电荷不受影响。同型双功能巯基反应交联剂包括双马来酰亚胺己烷(BMH)、1,5-二氟-2,4-二硝基苯(DFDNB)和1,4-双[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]丁烷(DPDPB)。
双特异性抗体
在某些方面，本发明提供的抗体可以是包含前一节所述的抗ABCC1抗体的VH区和VL区的双特异性抗体，并进一步包含一个第二VH区，其中包含与肿瘤相关抗原(TAA)结合的抗体的HCDR 1-3。
所述抗体可包含一个第二VL区，其中所述第二VH区和所述第二VL区与所述TAA结合。在某些实施例中，所述第二VH区和所述第二VL区可存在于单个多肽中。在某些实施例中，所述第二VH区和所述第二VL区存在于scFv中。
在某些实施例中，所述双特异性抗体包含一个通用轻链，其中通用轻链包含前一节所述的抗ABCC1抗体的VL区。
所述TAA可以是已知在癌细胞中过度表达的任何抗原。例如，所述TAA可能是在正常细胞中无法以可检测水平表达但在癌细胞中表达的抗原，其中正常细胞和癌细胞是相同的细胞类型，例如上皮细胞。例如，TAA可能是新抗原，是一类由肿瘤特异性突变产生的肿瘤抗原，与未突变蛋白质的氨基酸序列相比，该突变改变了编码蛋白质的氨基酸序列。在其他方面，TAA是一种在正常细胞中表达但在癌细胞中表达水平较高的抗原。
在某些实施例中，所述TAA可以是PD-L1。PD-L1也称为分化抗原274(CD274)或B7同系物1(B7-H1)。在某些实施例中，与PD-L1结合的所述抗体可能是阿特珠单抗。
在某些实施例中，所述双特异性抗体可能包含一个VH区和一个VL区，分别包含表2所列C1.844抗体或C1.851抗体的VH和VL区的HCDR 1-3和LCDR 1-3；以及一个第二VH区和一个第二VL区，分别包含阿特珠单抗的HCDR 1-3和LCDR 1-3。在某些实施例中，根据Kabat命名法定义HCDR 1-3和LCDR 1-3。
在某些实施例中，所述双特异性抗体包含：表2所列C1.844抗体或C1.851抗体的一个VH区和一个VL区；以及一个scFv，包含阿特珠单抗的HCDR 1-3和LCDR 1-3，其中根据Kabat命名法定义HCDR 1-3和LCDR 1-3。
在某些实施例中，所述双特异性抗体可能包含：一个VH区和一个VL区，分别包含表2所列C1.844hu21抗体或C1.851hu12抗体的VH和VL区的HCDR 1-3和LCDR 1-3；以及一个第二VH区和一个第二VL区，分别包含阿特珠单抗的HCDR 1-3和LCDR 1-3。在某些实施例中，根据Kabat命名法定义HCDR 1-3和LCDR 1-3。
在某些实施例中，所述双特异性抗体包含：表2所列C1.844hu21抗体或C1.851hu12抗体的一个VH区和一个VL区；以及一个scFv，包括阿特珠单抗的HCDR 1-3和LCDR 1-3，其中根据Kabat命名法定义HCDR 1-3和LCDR 1-3。
在某些实施例中，存在于双特异性抗体的第二VH区或scFv区中的HCDR 1-3是阿特珠单抗的HCDR 1-3，其中HCDR 1包含序列DSWIH(SEQ ID NO:25)，HCDR 2包含序列WISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:169)，HCDR 3包含序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:170)。在某些实施例中，与ABCC1和PD-L1结合的所述双特异性抗体可能进一步包含一个第二VL区，其中包含阿特珠单抗的LCDR 1-3，其中LCDR 1包含序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:171)，LCDR2包含序列SASFLYS(SEQ ID NO:172)，LCDR 3包含序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:173)。在某些实施例中，scFv区中存在的LCDR 1-3包含阿特珠单抗的LCDR 1-3，并根据Kabat命名法定义。
在某些实施例中，与ABCC1和PD-L1结合的所述双特异性抗体包含一个第二VH区，其氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或100％与阿特珠单抗VH区的氨基酸序列相同，如下所述：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPY GGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQ GTLVTVSS(SEQ ID NO:174)。
在某些实施例中，与ABCC1和PD-L1结合的所述双特异性抗体包含一个第二VL区，其氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或100％与阿特珠单抗VL区的氨基酸序列相同，如下所述：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:175)。
在某些实施例中，与ABCC1和PD-L1结合的所述双特异性抗体包含一个与PD-L1结合的scFv区，并且包含至少80％、至少90％、至少95％或100％与氨基酸序列相同的氨基酸序列，如下所述：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:176)。
斜体序列是VH和VL区之间的连接子序列。任何其他连接子序列都可用于连接VH和VL区。
在某些实施例中，所述TAA为ErbB2(HER2)。ErbB2也被称为受体酪氨酸激酶2或HER2。在某些实施例中，与ErbB2结合的抗体是曲妥珠单抗。
在某些实施例中，所述双特异性抗体可能包含：一个VH区和一个VL区，分别包含表2所列C1.844抗体或C1.831抗体的VH和VL区的HCDR 1-3和LCDR 1-3；以及一个第二VH区和一个第二VL区，分别包含曲妥珠单抗的HCDR 1-3和LCDR 1-3。在某些实施例中，根据Kabat命名法定义HCDR 1-3和LCDR 1-3。
在某些实施例中，所述双特异性抗体包含：一个VH区和一个VL区，分别包含表2所列C1.844抗体、C1.831抗体或C1.851抗体的VH和VL区的HCDR 1-3和LCDR 1-3；以及一个scFv，包含曲妥珠单抗的HCDR 1-3和LCDR 1-3。
在某些实施例中，所述双特异性抗体包含：C1.844hu21抗体、C1.831hu11抗体或C1.851hu12抗体的一个VH区和一个VL区；以及一个scFv，包含曲妥珠单抗的HCDR 1-3和LCDR 1-3，其中根据Kabat命名法定义HCDR 1-3和LCDR 1-3。
在某些实施例中，所述双特异性抗体的第二VH区和scFv区存在的HCDR 1-3为曲妥珠单抗的HCDR 1-3，其中HCDR1包含序列DTYIH(SEQ ID NO:177)，HCDR2包含序列RIYPTNGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:178)，HCDR3包含序列WGGDGFYAMDY(SEQ ID NO:179)。在某些实施例中，与ABCC1和HER2结合的所述双特异性抗体可能进一步包含一个第二VL区，其中包含曲妥珠单抗的LCDR 1-3，其中LCDR1包含序列RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:180)，LCDR2包含序列SASFLYS(SEQ ID NO:172)，LCDR3包含序列QQHYTTPPT(SEQ ID NO:181)。在某些实施例中，scFv区中存在的LCDR 1-3包含曲妥珠单抗的LCDR 1-3，并根据Kabat命名法定义。
在某些实施例中，与ABCC1和HER2结合的所述双特异性抗体包含一个第二VH区，其氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或100％与阿特珠单抗VH区的氨基酸序列相同，如下所述：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTN GYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:182)。
在某些实施例中，与ABCC1和HER2结合的所述双特异性抗体包含一个第二VL区，其氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或100％与曲妥珠单抗VL区的氨基酸序列相同，如下所述：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYS GVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:183)。
在某些实施例中，与ABCC1和HER2结合的所述双特异性抗体包含一个与HER2结合的scFv区，并且包含至少80％、至少90％、至少95％或100％与氨基酸序列相同的氨基酸序列，如下所述：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKCPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:184)
斜体序列是VH和VL区之间的连接子序列。任何其他连接子序列都可用于连接VH和VL区。
在某些实施例中，所述双特异性抗体的重链可包含本发明所述的一个VH区和一个重链恒定区。在某些实施例中，所述双特异性抗体的轻链可包含本发明所述的一个VL区和一个轻链恒定区。在某些实施例中，scFv可能共轭到重链恒定区。
重链恒定区和轻链恒定区可能是人IgG抗体，例如人IgG1抗体。恒定区可能具有野生型序列或修饰序列。在一些实施例中，所述双特异性抗体可包含修饰的重链，包含修饰的Fc结构域，包括修饰的CH2和/或修饰的CH3结构域。在某些情况下，修饰的Fc结构域可以采用静电转向效应，包括但不限于(例如)通过使用Gunasekeran等人，(2010)，《生物化学杂志》285，19637-19646中描述的程序；其公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。在某些情况下，双特异性抗体通过在CH3结构域的电荷对替换进行组装，包括但不限于(例如)一个重链被修饰为包含K392D和K409D替换物，另一个重链被修饰为包含E356K和D399K替换物。电荷对替换链可以优先形成异源二聚体。氨基酸替代物的编号根据HC的EU编号系统。
在某些情况下，本发明的抗体包括电荷对替换。在某些情况下，本发明的抗体不包括电荷对替换。在某些情况下，可以采用促进所需链的优选异二聚体形成的替代方法。
在某些情况下，修饰的重链可能包括杵臼结构修饰。“杵臼结构”氨基酸修饰是抗体工程中的一种合理设计策略，用于重链的异二聚化，产生多特异性抗体，包括双特异性IgG抗体。例如，在将杵臼结构策略结合到由两种不同特异性的单克隆抗体制成的双特异性抗体中时，对氨基酸变化进行工程化改造，以便在单克隆抗体1(mAb1)的重链CH3上形成一个“杵结构”，在单克隆抗体2(mAb2)的重链CH3上形成一个“臼结构”。杵结构可以用大的氨基酸表示，例如酪氨酸(Y)，而臼结构可以用小氨基酸表示，例如苏氨酸(T)。例如，杵臼结构对修饰可以在第一CH3结构域中创建T22Y替换，在配偶体CH3结构域中创建Y86T替换。杵臼结构修饰的示例在Carter,J《免疫学杂志》，248(1-2):7-15(2001)；Ridgway,J.B.等人，《蛋白质工程》9(7):617-2(1996)；Merchant,A.M.等人《自然生物技术》，16(7):677-81(1998)中进行了描述；其公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。在由成对杵臼结构修饰结构域产生的抗体中，双特异性异二聚体通常代表主要部分。
在某些实施例中，本发明提供的双特异性抗体与表达ABCC1和TAA的癌细胞结合，同时表现出与表达ABCC1和/或TAA的非癌细胞的结合减少。换句话说，本发明提供的双特异性抗体与(1)表达TAA的细胞(其中ABCC1表达低或不存在)和(2)表达ABCC1的细胞(其中TAA表达低或不存在)结合的亲和力较低，与以相对高水平(即高于正常细胞的水平)表达至少一种或两种ABCC1和TAA的癌细胞结合的亲和力较高。
合成物和制剂
本发明提供了一种合成物，包含一种目标抗体。除目标抗体之外，目标抗体合成物可包含以下一种或多种：盐类，例如，NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等；缓冲剂，例如，Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)等；增溶剂；洗涤剂，例如，非离子型洗涤剂，如吐温20等；蛋白酶抑制剂；甘油等。
本发明所述合成物还包括药物合成物，所述药物合成物包括本发明所述的抗体。一般而言，制剂包含有效量的目标抗体。“有效量”是指足以产生预期结果的剂量，例如，减轻受试者癌症、降低受试者癌症生长速率、改善癌症症状等。一般而言，预期结果为与对照组相比至少减轻一种癌症症状、减缓癌症生长、减少癌症大小等。以一种可避开血脑屏障的方式递送或配制目标抗体。
在一些情况下，抗体可包含递送促进剂，包含此类促进剂可促进穿透血脑屏障，增加渗透性，例如，实现高效经皮递送等。
在一些情况下，可以不使用含递送促进剂的制剂给予本发明所述抗体。在某些情况下，本发明所述抗体本身即可提高穿透血脑屏障的渗透性。在某些情况下，本发明所述抗体可用作递送促进剂，促进抗肿瘤剂(例如，免疫治疗剂或化疗剂)穿透血脑屏障。在某些情况下，本发明所述抗体可用作递送促进剂，促进活性剂(如另一种抗体或化疗剂)穿透血脑屏障、血脑脊液(CSF)屏障、血睾屏障或血胎屏障。
在目标方法中，可使用能够产生预期治疗效果或诊断效果的任何便利方式向宿主给予目标抗体。因此，可将所述药剂掺入各种制剂中进行治疗给药。更具体地说，可通过与适当的可药用载体或稀释剂结合，可将目标抗体配制成药物合成物，也可将其配制成固态、半固态、液态或气态剂型，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、乳膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。
在药物剂型中，目标抗体可以与可药用赋形剂联合给药，也可以单独使用或以适当的联合方式以及与其他药物活性化合物联合使用。以下方法和赋形剂仅用作示例，不旨在以任何方式进行限制。
可在水性或非水溶剂中溶解、悬浮或乳化目标抗体，将目标抗体配制成注射用制剂，如植物油或其他类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇，如需要，使用增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂等常规添加剂。
将具有所需纯度的抗体与可选生理上可接受的载体、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张度剂混合，制备包含目标抗体的药物合成物。可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂在所用剂量和浓度下对受体无毒，包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸和柠檬酸；防腐剂(如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸，如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖、二糖和其他碳水化合物；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，如明胶或血清白蛋白；螯合剂，如EDTA；糖，如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡萄糖胺、N-甲基葡萄糖胺、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，如吐温、Brij Pluronics、Triton-X或聚乙二醇(PEG)。
所述药物合成物可为液态、冻干态或由冻干态重组的液态，其中，在给药前使用无菌溶液重组所述冻干制剂。
目标药物合成物中的示例性抗体浓度可为约1mg/mL-200mg/ml、约50mg/mL-200mg/mL或约150mg/mL-200mg/mL。
可在pH缓冲溶液中制备抗体水性制剂，例如，pH值范围为约4.0-7.5、约5.0-6.0或约5.5。适用于此范围内pH值的缓冲剂示例包括磷酸、组氨酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸缓冲液和其他有机酸缓冲液。缓冲液浓度可为约1mM-100mM或约5mM-50mM，具体取决于缓冲液以及制剂的预期张度。
在一些实施例中，虽然高渗或低渗溶液可能适用，但是水性制剂为等渗制剂。术语“等渗”表示张度与和其比较的其他溶液相同的溶液，如生理盐溶液或血清。张度剂的使用量可为约5mM-350mM，例如，100mM-350nM。
也可向抗体制剂中加入表面活性剂，以减少所配制抗体聚合和/或尽量减少制剂中颗粒的形成和/或减少吸附。示例性表面活性剂包括聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基酚聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊咯沙姆、普朗尼克)和十二烷基硫酸钠(SDS)。表面活性剂的示例性浓度可为约0.001％-1％(质量体积比)。
也可加入冻干保护剂，以在冻干工艺过程中保护不稳定活性成分(例如，蛋白)，使其免受不稳定条件影响。例如，已知冻干保护剂包括糖(包括葡萄糖和蔗糖)；多元醇(包括甘露糖醇、山梨糖醇和甘油等)；以及氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。冻干保护剂的含量可为约10mM-500nM。
在一些实施例中，目标制剂包含目标抗体以及上述一种或多种药剂(例如，表面活性剂、缓冲剂、稳定剂或张度剂)，基本不含一种或多种防腐剂，如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵及其组合。在其他实施例中，制剂包含防腐剂，例如，浓度约为0.001％-2％(质量体积比)。
例如，目标制剂可以是适合胃肠外给药的液体或冻干制剂，可包含：约1mg/mL-200mg/mL的目标抗体、约0.001％-1％的至少一种表面活性剂；约1mM-100mM的缓冲剂；可选约10mM-500mM的稳定剂；以及约5mM-约305mM的张度剂；pH值约为4.0-7.0。
可在通过吸入给药的气雾剂中使用目标抗体。可将目标抗体配制成可接受的加压抛射剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
在本发明中，术语“单位剂型”是指用作人类和动物受试者单位剂量的物理离散单位，每单位含有预定量的本发明所述化合物，经计算，与可药用稀释剂、载体或运载体结合时，用量足以产生预期效果。目标抗体的规格可取决于所用特定抗体、需达到的效果以及与宿主中每个抗体相关的药效学。
可采用注射制剂的形式给予目标抗体。通常，以液态溶液或悬浮液的形式制备注射合成物；也可以制备在注射前适合在液体运载体中溶解或悬浮的固态制剂。还可以在脂质体运载体中乳化制剂或将抗体封装在脂质体运载体中。
例如，适当的赋形剂运载体包括水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如需要，运载体可包含少量的辅助物质，如润湿剂、乳化剂或pH值缓冲剂。对于本领域的技术人员来说，制备此类剂型的实际方法众所周知或显而易见。
公众很容易获得运载体、赋形剂或稀释剂等可药用赋形剂。此外，公众也很容易获得pH值调节和缓冲剂、张度调节剂、稳定剂、润湿剂等可药用辅助物质。
在一些实施例中，以控释制剂的形式配制目标抗体。可使用本领域众所周知的方法制备持续释放制剂。
剂量
可由主治医生或其他合格医务人员根据各种临床因素确定适当剂量。在医学领域，众所周知，任何患者的剂量均取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、所给药的特定化合物、患者性别、给药时间和途径、总体健康状况以及同时给药的其他药物。可按1ng/kg体重-20mg/kg体重的单位剂量给予目标抗体，例如，0.1mg/kg体重-10mg/kg体重、0.5mg/kg体重-5mg/kg体重；但是，还设想使用低于或高于此示例性范围的剂量，尤其考虑到上述因素。如果方案为连续输注，则此范围也可为每分钟1μg-10mg/kg体重。
本领域的技术人员很容易理解，剂量水平可能因特异性抗体的功能、症状的严重程度以及受试者对副作用的易感性而有所不同。本领域的技术人员可通过各种方式轻松确定给定化合物的优选剂量。
给药途径
采用适用于药物递送的任何可用方法和途径向个体给予目标抗体，包括体内和离体方法以及全身和局部给药途径。
常规给药途径和可药用给药途径包括鼻内、肌肉内、气管内、皮下、皮内、局部涂抹、静脉内、动脉内、直肠、鼻腔、口腔以及其他肠内和胃肠外给药途径。根据抗体和/或期望效果，可组合或调整(如需要)给药途径。可以单剂量或多剂量给予目标抗体合成物。在一些实施例中，口服目标抗体合成物。在一些实施例中，通过吸入途径给予目标抗体合成物。在一些实施例中，鼻内给予目标抗体合成物。在一些实施例中，局部给予目标抗体合成物。在一些实施例中，颅内给予目标抗体合成物。在一些实施例中，静脉内给予目标抗体合成物。
可采用适用于递送常规药物的任何可用常规方法和途径向宿主给予药剂，包括全身或局部途径。一般而言，本发明所考虑的给药途径包括但不一定仅限于肠内、胃肠外或吸入途径。
除吸入给药之外的胃肠外给药途径包括但不一定仅限于局部、经皮、皮下、肌肉内、眶内、囊内、椎管内、胸骨内和静脉内途径，即，除通过消化道之外的任何给药途径。可通过胃肠外给药来影响目标抗体的全身或局部递送。如果需要全身递送，则给药通常包括药物制剂的侵入性或全身吸收局部或粘膜给药
也可通过肠内给药向受试者递送目标抗体。肠内给药途径包括但不一定仅限于口腔和直肠(例如，使用栓剂)递送。
治疗至少是指与折磨宿主的病理病症相关的症状得到改善，其中，改善从广义上至少是指降低参数的数量级，例如，与所治疗的病理病症相关的症状，如癌症和/或癌症生长以及与其相关的疼痛。因此，治疗还包括病理病症或至少与其相关的症状完全得到抑制的情况，例如，防止发生或停止，例如，终止，使宿主不再受所述病理病症或至少对所述病理病症进行表征的症状的折磨。
可根据本发明所公开的方法治疗各种受试者(其中，术语“受试者”在本发明中可与术语“个体”和“患者”互换使用)。一般而言，此类受试者为“哺乳动物”，其中，这些术语广泛用于描述哺乳纲生物，包括食肉目(例如，狗和猫)、啮齿目(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)以及灵长目(例如，人类、黑猩猩和猴子)。在一些实施例中，所述宿主为人类。
提供包含单位剂量目标抗体的试剂盒。在一些实施例中，除包含单位剂量的容器之外，还包括信息包装说明书，其中描述了抗体在治疗目标病理病症中的用途以及附带益处。
核酸
本发明提供了核酸，所述核酸包含对目标抗体进行编码的核苷酸序列。对目标抗体进行编码的核苷酸序列可操作连接至一个或多个调控元件，如启动子和增强子，使核苷酸序列在预定目标细胞(例如，经基因修饰以合成和/或分泌编码抗体的细胞)中表达。
适当的启动子和增强子元件在本领域中已知。对于细菌细胞中的表达，适当的启动子包括但不限于lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。对于真核細胞中的表达，适当的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疮疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；逆转录病毒长末端重复序列中存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；以及各种领域已知的组织特异性启动子。
表达载体和/或克隆载体中存在对目标抗体进行编码的核苷酸序列。如果目标抗体包含两个或多个单独多肽，则可在相同或单独载体中克隆对两个多肽进行编码的核苷酸序列。可使用各种策略从单一核酸或单一载体中表达单独多肽，如单独启动子、一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)、一个或多个自切割序列(例如，2A切割序列，如P2A、T2A、E2A和F2A)及其组合等。表达载体可包括可选标志物、复制起点以及提供载体复制和/或维持的其他特征。
本领域的技术人员了解大量适用的载体和启动子；许多均可通过商业获得，用于生成目标重组构建体。以下载体用作示例。细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescriptSK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，美国加利福尼亚州拉荷亚)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia，瑞典乌普萨拉)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表达载体一般包含位于启动子序列附近方便的限制性位点，以便插入对异源蛋白进行编码的核酸序列。可存在表达宿主中有效的可选标志物。适当的表达载体包括但不限于病毒载体(例如，基于牛痘病毒的病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒；腺相关病毒；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒以及源自逆转录病毒(如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)的载体)等。
在一些情况下，可将核酸(例如，本发明所述核酸)引入细胞中，例如，通过使细胞与核酸接触。引入核酸的细胞在本发明中通常被称为基因修饰细胞。可采用各种核酸递送方法，包括但不限于裸核酸递送、病毒递送、化学转染、基因枪等。
细胞
本发明提供了使用目标核酸进行基因修饰的分离基因修饰细胞(例如，体外细胞、离体细胞)。在一些实施例中，目标分离基因修饰细胞可产生目标抗体。在一些情况下，基因修饰细胞可向有需要的受试者递送抗体。
适当的细胞包括真核细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和原核细胞，如细菌细胞。例如，通过磷酸盐沉淀、DEAE-葡聚糖介导转染、脂质体介导转染、电穿孔或其他已知方法，可影响将目标核酸引入宿主细胞的过程。
适当的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。适当的哺乳动物细胞系包括人类细胞系、非人灵长类细胞系、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)细胞系等。适当的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞、CHO细胞、293细胞、3T3细胞、Vero细胞、Huh-7细胞、BHK细胞、PC12细胞、COS细胞、COS-7细胞、RAT1细胞、小鼠L细胞、人胚肾(HEK)细胞、HLHepG2细胞等。
在一些情况下，有用的哺乳动物细胞可包括源自哺乳动物组织或器官的细胞。在一些情况下，所用细胞为肾细胞，包括确立肾细胞系的肾细胞，如HEK 293T细胞。
在一些情况下，本发明所述细胞可为免疫细胞。在本发明中，术语“免疫细胞”通常包括源自骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白细胞。“免疫细胞”包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞)和髓系来源细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、调节性T细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、天然杀伤(NK)细胞和中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性应答。
在一些情况下，表达抗体(如本发明所述多重特异性抗体)的有用细胞可包括生产T细胞。在一些情况下，经工程化改造以包含对本发明所述抗体进行编码的核酸序列的生产T细胞可用于将所述抗体递送至有需要的受试者。
在一些情况下，本发明所述免疫细胞包括免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包含一个嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含一个ABCC1结合结构域、一个跨膜结构域和一个胞内信号传导结构域，其中，所述ABCC1结合结构域包含表2所列抗体的一对重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的重链互补决定区(HCDR)和轻链CDR(LCDR)。在一个实施例中，所述胞内信号传导结构域可包含一个或多个源自至少一个共刺激分子(例如，4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28)的功能信号传导结构域。所述胞内信号传导结构域可包含一个源自共刺激分子的功能信号传导结构域和一个源自刺激分子的功能信号传导结构域。
所述免疫效应细胞可为T细胞。所述免疫效应细胞可为自体细胞。
方法
如上所述，本发明所述方法包括使细胞与本发明所述抗体接触的方法、根据包括向受试者给予本发明所述抗体的方法治疗受试者的方法、制备即时应用中所述元件的方法，包括(例如)抗体、合成物和制剂、核酸、表达载体、细胞等。
如上所述，本发明所述方法包括使癌细胞与本发明所述抗体接触，例如，以检测癌细胞上是否表达ABCC1，测量癌细胞上ABCC1的表达水平或促进和/或增强杀死癌细胞。在一些实施例中，通过免疫应答或免疫细胞作用于抗体所结合的癌细胞来介导杀死癌细胞。在一些实施例中，通过抑制癌细胞的细胞外排来介导杀死癌细胞，例如，由于抗体抑制ABCC1。在一些实施例中，通过抑制癌细胞的细胞外排结合免疫介导应答(例如，通过抗体的Fc区)来介导杀死癌细胞。包括使癌细胞与本发明所述抗体接触的方法可包括或不包括使癌细胞与附加疗法或活性剂接触，包括化疗、免疫疗法、放疗等。
治疗方法
本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法通常包括向有需要的个体(例如，患癌个体)单独给药(例如，在单一疗法中)或与一种或多种附加治疗剂联合给药(例如，在联合疗法中)有效量的本发明所述抗体。可通过任何方便、适当的递送途径来给予本发明所述抗体。
因此，给药包括但不限于通过注射递送抗体、通过输注递送抗体、递送对抗体进行编码的核酸或表达载体、通过向受试者给予表达并分泌抗体的细胞来递送抗体、递送在细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，CAR-T细胞)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含一个ABCC1结合结构域、一个跨膜结构域和一个胞内信号传导结构域，其中，所述ABCC1结合结构域包含表2所列抗体的一对VH区和VL区的HCDR和LCDR等。给予一种药剂、对药剂进行编码的核酸、表达药剂的细胞等可包括与所述药剂接触、与所述核酸接触、与所述细胞接触等。
在一些实施例中，目标抗体的有效量为一次或多次单独给药(例如，在单一疗法中)或与一种或多种附加治疗剂联合给药(例如，在联合疗法中)时可有效将癌症的不良症状减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或以上(与未进行抗体治疗时不良症状的严重程度相比)的量。
在一些实施例中，目标抗体为在所治疗的个体中一次或多次单独给药(例如，在单一疗法中)或与一种或多种附加治疗剂联合给药(例如，在联合疗法中)时可有效改善癌症(即，减缓癌症生长，使癌症停止生长，逆转癌症生长，杀死癌细胞(包括肿瘤细胞等))的量。例如，与不使用抗体进行治疗相比，有效量的目标抗体可将个体的癌症生长速率或癌症大小降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或以上。
在一些情况下，受试者可接受全身治疗，包括使用目标抗体以及使用或不使用一种或多种附加试剂。在本发明中，“全身治疗”是指不仅仅直接靶向特异性肿瘤(例如，原发性肿瘤或所定义的继发性肿瘤)或包含组织(例如，肝癌情况下的肝脏、血癌情况下的血液等)的特异性肿瘤的治疗。全身治疗通常靶向受试者全身，可包括但不限于全身放疗、全身化疗、全身免疫疗法及其组合等。
在一些情况下，受试者可接受局部治疗，包括使用目标抗体以及使用或不使用一种或多种附加试剂。在本发明中，“局部治疗”是指特异性靶向肿瘤(例如，原发性肿瘤或所定义的继发性肿瘤)位置或特异性靶向包含组织(例如，肝癌情况下的肝脏、血癌情况下的血液等)的肿瘤的治疗。在某些情况下，也可以影响肿瘤周围环境的方式进行局部治疗，如肿瘤周围的组织、紧邻肿瘤的组织。局部治疗通常不会影响或不会靶向远离癌症部位的组织，包括肿瘤(如原发性肿瘤)部位。除目标抗体或与目标抗体联合之外，可进行的有用的局部治疗包括但不限于手术、局部放疗、局部冷冻疗法、局部激光疗法、局部外用治疗及其组合等。
在一些实施例中，目标治疗方法包括给予一种目标抗体以及一种或多种附加治疗剂。适当的附加治疗剂包括但不限于化疗剂、放疗试剂、免疫疗法试剂以及其他抗体药剂等。在本发明所述抗体给药之前、期间或之后可向受试者给药的附加疗法将因癌症类型、受试者病史、总体健康状况和/或任何共病等多种因素而有所不同。有用的癌症疗法包括但不限于放疗、化疗、免疫疗法等。
放疗包括但不限于源自射束等外用源或通过植入小放射源提供的x射线或伽马射线。
适用于癌症治疗的抗体包括但不限于裸抗体(例如，曲妥珠单抗(赫塞汀)、贝伐单抗(安维汀TM)、西妥昔单抗(爱必妥TM)、帕尼单抗(维克替比TM)、伊匹单抗(逸沃TM)、利妥昔单抗(美罗华)、阿仑单抗(LemtradaTM)、奥法木单抗(亚舍拉TM)、奥戈伏单抗(OvaRexTM)、兰洛利珠单抗(MK-3475)、帕妥珠单抗(帕罗嘉TM)、雷珠单抗(诺适得TM)等)以及偶联抗体(例如，吉妥单抗(MylortargTM)、本妥昔单抗(安适利TM)、90Y标记替伊莫单抗(泽娃灵TM)、131I-托西莫单抗(百克沙TM)等)。
适用于癌症治疗的抗体还包括但不限于对抗肿瘤相关抗原的抗体。此类抗原包括但不限于CD20、CD30、CD33、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、黏蛋白、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸盐结合蛋白、神经节苷脂(例如GD2、GD3、GM2等)、Ley、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、腱生蛋白、程序性死亡配体1(PD-L1)、雄激素受体(AR)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)、BCR-Abl、c-kit、PIK3CA、EML4-ALK、KRAS、ALK、ROS1、AKT1、BRAF、MEKJ、MEK2、NRAS、RAC1、ESR1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3等。可通过与本文所述抗ABCC1抗体的联合疗法给予这些抗体。
常规癌症疗法还包括癌症靶向疗法，包括但不限于(例如)靶向HER2(ERBB2/neu)的曲妥珠单抗-美坦新偶联物(赫赛莱)(批准用于乳腺癌)；靶向EGFR(HER1/ERBB1)、HER2(ERBB2/neu)的阿法替尼(吉泰瑞)(批准用于非小细胞肺癌)；靶向…的阿地白介素(普留净)(批准用于肾细胞癌、黑色素瘤)；靶向ALK的阿来替尼(安圣莎)(批准用于非小细胞肺癌)；靶向CD52的阿仑单抗(坎帕斯)(批准用于B细胞慢性淋巴细胞白血病)；靶向PD-L1的阿替利珠单抗(泰圣奇)(批准用于尿路上皮癌、非小细胞肺癌)；靶向PD-L1的阿维鲁单抗(巴文西亚)(批准用于默尔克细胞癌)；靶向KIT、PDGFRβ、VEGFR1/2/3的阿西替尼(英立达)(批准用于肾细胞癌)；靶向BAFF的贝利尤单抗(倍力腾)(批准用于红斑狼疮)；靶向HDAC的贝利司他(Beleodaq)(批准用于外周T细胞淋巴瘤)；靶向VEGF配体的贝伐单抗(安维汀)(批准用于宫颈癌、结直肠癌、输卵管癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、腹膜癌、肾细胞癌)；靶向CD19/CD3的博纳吐单抗(倍利妥)(批准用于急性成淋巴细胞性白血病(前体B细胞))；靶向蛋白酶体的硼替佐米(万珂)(批准用于多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤)；靶向ABL的博舒替尼(Bosulif)(批准用于慢性骨髓性白血病)；靶向CD30的本妥昔单抗(安适利)(批准用于霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤)；靶向ALK的布加替尼(Alunbrig)(批准用于非小细胞肺癌(ALK+))；靶向FLT3、KIT、MET、RET、VEGFR2的卡博替尼(Cabometyx、Cometriq)(批准用于甲状腺髓样癌、肾细胞癌)；靶向蛋白酶体的卡非佐米(Kyprolis)(批准用于多发性骨髓瘤)；靶向ALK的色瑞替尼(赞可达)(批准用于非小细胞肺癌)；靶向EGFR(HER1/ERBB1)的西妥昔单抗(爱必妥)(批准用于结直肠癌、头颈鳞状细胞癌)；靶向MEK的考比替尼(Cotellic)(批准用于黑色素瘤)；靶向ALK、MET、ROS1的克唑替尼(赛可瑞)(批准用于非小细胞肺癌)；靶向BRAF的达拉菲尼(泰菲乐)(批准用于黑色素瘤、非小细胞肺癌)；靶向CD38的达雷木单抗(兆珂)(批准用于多发性骨髓瘤)；靶向ABL的达沙替尼(施达赛)(批准用于慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病)；靶向RANKL的地诺单抗(安加维)(批准用于骨巨细胞瘤)；靶向B4GALNT1(GD2)的地努妥昔单抗(Unituxin)(批准用于儿童神经母细胞瘤)；靶向PD-L1的德瓦鲁单抗(英飞凡)(批准用于尿路上皮癌)；靶向SLAMF7(CS1/CD319/CRACC)的埃罗妥珠单抗(Empliciti)(批准用于多发性骨髓瘤)；靶向IDH2的恩西地平(伊迪法)(批准用于急性髓系白血病)；靶向EGFR(HER1/ERBB1)的埃罗替尼(特罗凯)(批准用于非小细胞肺癌、胰腺癌)；靶向mTOR的依维莫司(飞尼妥)(批准用于胰腺、胃肠道或肺源性神经内分泌肿瘤、肾细胞癌、不可切除的室管膜下巨细胞星形细胞瘤、乳腺癌)；靶向EGFR(HER1/ERBB1)的吉非替尼(易瑞沙)(批准用于非小细胞肺癌)；靶向CD20的替伊莫单抗(批准用于非霍奇金淋巴瘤)；靶向BTK的伊布替尼(亿珂)(批准用于套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、华氏巨球蛋白血症)；靶向PI3Kδ的艾代拉里斯(Zydelig)(批准用于慢性淋巴细胞白血病、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤)；靶向KIT、PDGFR、ABL的伊马替尼(格列卫)(批准用于胃肠道间质瘤(KIT+)、隆突性皮肤纤维肉瘤、多发性恶性血液病)；靶向CTLA-4的伊匹单抗(逸沃)(批准用于黑色素瘤)；靶向蛋白酶体的伊沙佐米(Ninlaro)(批准用于多发性骨髓瘤)；靶向HER2(ERBB2/neu)、EGFR(HER1/ERBB1)的拉帕替尼(泰立沙)(批准用于乳腺癌(HER2+))；靶向VEGFR2的乐伐替尼(乐卫玛)(批准用于肾细胞癌、甲状腺癌)；靶向FLT3的米哚妥林(雷德帕斯)(批准用于急性髓系白血病(FLT3+))；靶向EGFR(HER1/ERBB1)的耐昔妥珠单抗(Portrazza)(批准用于鳞状非小细胞肺癌)；靶向HER2(ERBB2/neu)的来那替尼(Nerlynx)(批准用于乳腺癌)；靶向ABL的尼罗替尼(达希纳)(批准用于慢性骨髓性白血病)；靶向PARP的尼拉帕利(则乐)(批准用于卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌)；靶向PD-1的纳武单抗(欧狄沃)(批准用于结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、尿路上皮癌)；靶向CD20的奥滨尤妥珠单抗(Gazyva)(批准用于慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤)；靶向CD20的奥法木单抗(亚舍拉、HuMax-CD20)(批准用于慢性淋巴细胞白血病)；靶向PARP的奥拉帕尼(利普卓)(批准用于卵巢癌)；靶向PDGFRα的奥拉妥单抗(拉特沃)(批准用于软组织肉瘤)；靶向EGFR的奥斯替尼(泰瑞沙)(批准用于非小细胞肺癌)；靶向CDK4、CDK6的帕博西尼(爱博斯)(批准用于乳腺癌)；靶向EGFR(HER1/ERBB1)的帕尼单抗(维克替比)(批准用于结直肠癌)；靶向HDAC的帕比司他(Farydak)(批准用于多发性骨髓瘤)；靶向VEGFR、PDGFR、KIT的帕唑帕尼(维全特)(批准用于肾细胞癌)；靶向PD-1的派姆单抗(可瑞达)(批准用于经典型霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌(PD-L1+)、头颈鳞状细胞癌实体瘤(MSI-H))；靶向HER2(ERBB2/neu)的帕妥珠单抗(帕罗嘉)(批准用于乳腺癌(HER2+))；靶向ABL、FGFR1-3、FLT3、VEGFR2的帕纳替尼(Iclusig)(批准用于慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病)；靶向VEGFR2的雷莫芦单抗(Cyramza)(批准用于结直肠癌、胃癌或胃食管连接部(GEJ)腺癌、非小细胞肺癌)；靶向KIT、PDGFRβ、RAF、RET、VEGFR1/2/3的雷莫芦单抗(拜万戈)(批准用于结直肠癌、胃肠道间质瘤、肝细胞癌)；靶向CDK4、CDK6的瑞博西尼(击癌利)(批准用于乳腺癌(HR+、HER2-))；靶向CD20的利妥昔单抗(美罗华)(批准用于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎、肉芽肿性多血管炎)；靶向CD20的利妥昔单抗/人透明质酸酶(Rituxan Hycela)(批准用于慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)；靶向HDAC的罗米地辛(Istodax)(批准用于皮肤T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤)；靶向PARP的卢卡帕尼(Rubraca)(批准用于卵巢癌)；靶向JAK1/2的鲁索替尼(Jakafi)(批准用于骨髓纤维化)；靶向IL-6的司妥昔单抗(萨温珂)(批准用于多中心型巨大淋巴结增生症)；靶向…的西普鲁塞-T(普列威)(批准用于前列腺癌)；靶向SMO的索尼德吉(奥昔朵)(批准用于基底细胞癌)；靶向VEGFR、PDGFR、KIT、RAF的索拉非尼(多吉美)(批准用于肝细胞癌、肾细胞癌、甲状腺癌)；靶向mTOR的西罗莫司脂化物(驮瑞塞尔)(批准用于肾细胞癌)；靶向CD20的托西莫单抗(百克沙)(批准用于非霍奇金淋巴瘤)；靶向MEK的曲美替尼(迈吉宁)(批准用于黑色素瘤、非小细胞肺癌)；靶向HER2(ERBB2/neu)的曲妥珠单抗(赫塞汀)(批准用于乳腺癌(HER2+)、胃癌(HER2+))；靶向EGFR(HER1/ERBB1)、RET、VEGFR2的凡德他尼(Caprelsa)(批准用于甲状腺髓样癌)；靶向BRAF的维莫非尼(佐博伏)(批准用于黑色素瘤)；靶向BCL2的维奈托克(唯可来)(批准用于慢性淋巴细胞白血病)；靶向PTCH、SMO的维莫德吉(Erivedge)(批准用于基底细胞癌)；靶向HDAC的伏立诺他(Zolinza)(批准用于皮肤T细胞淋巴瘤)；靶向PIGF、VEGFA/B的阿柏西普(Zaltrap)(批准用于结直肠癌)等。可通过与本文所述抗ABCC1抗体的联合疗法给予这些抗体。
适用于本发明所述方法的生物应答调节剂包括但不限于(1)酪氨酸激酶(RTK)活性抑制剂；(2)丝氨酸/苏氨酸激酶活性抑制剂；(3)肿瘤相关抗原拮抗剂，如与肿瘤抗原特异性结合的抗体；(4)凋亡受体激动剂；(5)白细胞介素-2；(6)α干扰素；(7)γ干扰素；(8)集落刺激因子；(9)血管生成抑制剂；以及(10)肿瘤坏死因子拮抗剂。
化疗剂或抗肿瘤剂为可减少癌细胞增殖的非肽(非蛋白)化合物，包括细胞毒性剂和细胞抑制剂。化疗剂的非限制性示例包括烷化剂(例如，亚硝基脲)、抗代谢药(例如，甲氨蝶呤)、抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类)、植物生物碱(例如，长春花生物碱、紫杉烷等)、拓扑异构酶抑制剂和类固醇激素。
减少细胞增殖的药剂在本领域众所周知并广泛使用。此类药剂包括烷化剂，如氮芥、亚硝基脲、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯，包括但不限于二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(环磷酰胺TM)、美法仑(左旋溶肉瘤素)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链脲佐菌素、氯脲霉素、尿嘧啶氮芥、氯甲烷、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢剂包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(FudR)、6-硫鸟嘌呤、6-巯嘌呤(6-MP)、喷司他丁、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、10-炔丙基-5,8-双去氮杂叶酸(PDDF、CB3717)、5,8-双去氮杂四氢叶酸(DDATHF)、亚叶酸、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和吉西他滨。
适当的天然产物及其衍生物(例如，长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、紫杉醇()、多西他赛(/> )、脱氧助间型霉素、丝裂霉素C、左旋天冬酰胺酶、咪唑硫嘌呤；布喹那；生物碱，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛等；鬼臼毒素，如依托泊苷、替尼泊苷等；抗生素，如蒽环类、盐酸柔红霉素(道诺霉素、红比霉素、柔红霉素)、伊达比星、多柔比星、表柔比星、吗啉基衍生物等；吩噁嗪酮双环肽，例如，更生霉素；碱性糖肽，例如，博莱霉素；蒽醌苷，例如，普利霉素(光神霉素)；蒽二酮类，例如，米托蒽醌；氮丙啶并吡咯并吲哚二酮，例如，丝裂霉素；大环免疫抑制剂，例如，环孢素、FK-506(他克莫司、普乐可复)、雷帕霉素等。
其他抗增殖细胞毒性剂包括诺维本、CPT-11、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨、雷洛昔芬、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛昔芬。
具有抗增殖活性的微管影响剂也适合使用，包括但不限于别水秋水仙碱(NSC406042)、软海绵素B(NSC 609395)、秋水仙碱(NSC 757)、秋水仙碱衍生物(例如，NSC33410)、海兔毒素10(NSC 376128)、美登素(NSC 153858)、根瘤菌素(NSC 332598)、紫杉醇()、/>衍生物、多西他赛(/>)、硫代秋水仙碱(NSC 361792)、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、天然和合成的埃博霉素，包括但不限于埃博霉素A、埃博霉素B、圆皮海绵内酯；雌莫司汀、诺考达唑等。
适用的激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)包括但不限于肾上腺皮质类固醇，例如，强的松、地塞米松等；雌激素和孕酮，例如，己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雌二醇、克罗米芬、三苯氧胺等；肾上腺皮质抑制剂，例如，氨鲁米特；17α-炔雌醇；乙炔雌酚、睾酮、氟甲睾酮、屈他雄酮丙酸酯、睾内酯、甲基强的松龙、甲基睾酮、强的松龙、曲安奈德、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他米特(佐吉能)、托瑞米芬(法乐通)和诺雷德。雌激素刺激增殖和分化，因此，与雌激素受体结合的化合物用于阻断此活性。皮质类固醇可能抑制T细胞增殖。
其他化疗剂包括金属络合物，例如，顺铂(顺-DDP)、卡铂等；脲，例如，羟基脲；肼，例如，N-甲基肼；表鬼臼毒素；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽醌；亚叶酸；喃氟啶等。其他目标抗增殖剂包括免疫抑制剂，例如，霉酚酸、沙利度胺、脱氧精胍菌素、氮杂孢菌素、来氟米特、咪唑立宾、氮杂螺烷(SKF 105685)、(ZD 1839，4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)等。
“紫杉烷”包括紫杉醇以及任何活性紫杉烷衍生物或前药。可采用本领域技术人员众所周知的技术轻松制备“紫杉醇”(在本发明中应理解为包括类似物、制剂和衍生物，例如，多西他赛、泰克索TM、泰索帝TM(多西他赛的一种制剂)、紫杉醇的10-脱乙酰基类似物和紫杉醇的3'N-去苯甲酰-3'N-叔丁氧羰基类似物)(另参见WO 94/07882、WO 94/07881、WO94/07880、WO 94/07876、WO 93/23555、WO 93/10076；第5,294,637号、第5,283,253号、第5,279,949号、第5,274,137号、第5,202,448号、第5,200,534号、第5,229,529号和第EP 590,267号美国专利)，或从各种商业来源购得，例如，Sigma Chemical Co.(密苏里州圣路易斯)(来自短叶红豆杉的T7402或来自云南红豆杉的T-1912)。
应理解，紫杉醇不仅指紫杉醇的常见化学可用形式，还指其类似物和衍生物(例如，上述泰索帝TM多西他赛)以及紫杉醇偶联物(例如，紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖、紫杉醇-木糖或蛋白结合紫杉醇，如)。
术语“紫杉烷”还包括各种已知衍生物，包括亲水性衍生物和疏水性衍生物。紫杉烷衍生物包括但不限于第WO 99/18113号国际专利申请中所述的半乳糖和甘露糖衍生物；WO 99/14209中所述的哌嗪和其他衍生物；WO 99/09021、WO 98/22451和第5,869,680号美国专利中所述的紫杉烷衍生物；WO 98/28288中所述的6-硫代衍生物；第5,821,263号美国专利中所述的次磺酰胺衍生物以及第5,415,869号美国专利中所述的紫杉醇衍生物。进一步包括紫杉醇的前药，包括但不限于WO 98/58927、WO 98/13059和第5,824,701号美国专利中所述的前药。
有用的免疫疗法包括抗PD-1/PD-L1免疫疗法和/或其他免疫疗法靶点，例如，在治疗方法中可能靶向的免疫检查点标志物，如CTLA-4、LAG-3和TIM-3。抗PD-1/PD-L1免疫疗法包括但不限于包括向受试者给予有效量的一种或多种抗PD-1/PD-L1治疗拮抗剂的免疫疗法，此类拮抗剂包括但不限于(纳武单抗)、/>(派姆单抗)、泰圣奇TM(阿替利珠单抗)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)、阿维鲁单抗(MSB0010718C)、BMS-936559(MDX-1105)、CA-170、BMS-202、BMS-8、BMS-37、BMS-242等。可通过与本文所述抗ABCC1抗体的联合疗法给予这些抗体。
CTLA-4(也称为CD152)与CD80和CD86结合。抗CTLA-4抗体获批用于治疗某些癌症类型。CTLA-4与其他免疫疗法的共抑制作用使CTLA-4成为适合与其他免疫疗法联合用于治疗某些癌症的良好候选者。对于一些癌症类型，免疫疗法也可靶向TIM-3。
LAG-3在临床试验中用于治疗癌症。抗LAG-3免疫疗法包括使用可活化效应T细胞(通过下调向预活化LAG-3+细胞发送的LAG-3抑制信号)并抑制诱导(即抗原特异性)Treg抑制活性的拮抗剂LAG-3抗体的免疫疗法。有用的LAG-3拮抗剂抗体包括瑞拉利单抗(BMS-986016，由Bristol-Myers Squibb研发)、IMP701(由Immutep研发)、TSR-033(抗LAG-3mAb；由TESARO,Inc.研发)等。
免疫疗法还包括T细胞免疫疗法，例如，过继性细胞疗法(ACT)和嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。例如，可向受试者给予经工程化改造以靶向受试者癌症所表达的抗原的大量CAR T细胞。在某些情况下，T细胞疗法可包括从受试者体内采集细胞样本，如血液样本或肿瘤活检，以及在对培养的免疫细胞进行或不进行基因修饰的情况下培养从离体样本中采集的免疫细胞。例如，可从受试者体内采集免疫细胞，进行离体培养，使用对癌症所表达的抗原具有特异性的CAR进行修饰，以产生大量的CAR T细胞。然后，可将CAR T细胞重新引入受试者体内，以靶向癌症。T细胞免疫疗法可采用各种配置，例如，通过靶向各种抗原、通过采集/培养各种细胞类型等，具体取决于所治疗的特定癌症。此外，T细胞免疫疗法可全身给药(例如，通过静脉注射)或局部给药(例如，通过输注(例如，腹膜内输注、胸腔导管输注等)、直接注射等)。
在某些情况下，本发明所述的治疗方法可包括向受试者给予一种或多种多药耐药转运蛋白抑制剂，包括但不限于除ABCC1之外的多药耐药转运蛋白。有用的多药耐药转运蛋白抑制剂包括氨酸激酶抑制剂、天然产物、微小RNA和小分子抑制剂。多药耐药转运蛋白抑制剂包括ABC转运蛋白抑制剂。
适合采用本发明所述方法进行治疗的个体包括患癌个体；确诊患有癌症的个体；因癌症而接受化疗、放疗、抗体疗法、手术等治疗的个体；接受过癌症治疗(例如，通过化疗、放疗、抗体治疗、手术等的一种或多种疗法)且对治疗没有反应的个体；接受过癌症治疗(例如，通过化疗、放疗、抗体治疗、手术等的一种或多种疗法)且最初对治疗有反应但随后复发(即癌症复发)的个体。
本发明所述方法可用于靶向并治疗各种癌症，包括原发性癌症、继发性癌症、再生癌症、复发性癌症、难治性癌症等。例如，在某些情况下，本发明所述癌症可用作受试者原发性癌症的初始治疗方法。在某些情况下，本发明所述方法可用作非初级(二级或晚期)治疗，例如，在通过既往治疗难以治疗的癌症受试者中、在既往治疗后再生的癌症受试者中、在对既往治疗产生不同反应的受试者中(例如，对受试者体内至少一种肿瘤产生积极反应，对受试者体内至少第二种肿瘤产生消极或中性反应)等。
在一些情况下，本发明所述方法可用于治疗患有耐药癌症(如多药耐药癌症)的受试者。多药耐药(MDR)是一种机制，即，许多癌症对化疗药物产生耐药性，导致细胞死亡极少，耐药肿瘤扩大。MDR癌症可包括一种或多种耐药机制，包括但不限于外排泵表达增加、药物吸收减少、细胞死亡或凋亡抑制、药物代谢调节等。在某些情况下，本发明所述方法可防止、逆转或规避MDR。
在一些情况下，本发明所述方法可包括治疗患有在含有有效量本发明所述目标抗体的第一种药剂与不同于第一种药剂的第二种药剂联合给药时具有耐药性的癌症的患者。例如，在某些情况下，受试者的癌症可能对第一种化疗剂具有耐药性，可通过有效量的本发明所述目标抗体与不同于第一种化疗剂的第二种化疗剂联合给药，对受试者进行治疗。可使用所述第一种化疗剂和第二种化疗剂的各种组合，具体取决于所治疗的癌症类型、产生耐药性的可能性等。
已知大量癌症均可产生耐药性。由于这个原因以及其他原因，本发明所述方法可用于治疗各种癌症，包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症(例如，卡波西肉瘤、淋巴瘤等)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌瘤、基底细胞癌、胆管癌(肝外)、膀胱癌、骨癌(例如，尤文肉瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤等)、脑干胶质瘤、脑肿瘤(例如，星形细胞瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤等)、乳腺癌(例如，女性乳腺癌、男性乳腺癌、儿童乳腺癌等)、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(例如，儿童类癌瘤、胃肠道类癌瘤等)、原发不明癌、心脏(心脏)肿瘤、中枢神经系统肿瘤(例如，非典型畸胎瘤/横纹肌瘤、胚胎性肿瘤、生殖细胞瘤、淋巴瘤等)、宫颈癌、儿童癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增殖性肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、管癌(例如，胆管癌、肝外胆管癌等)、原位管癌(DCIS)、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌(例如，眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤等)、骨纤维组织细胞瘤(例如，骨恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤等)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤(例如，颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、卵巢殖细胞瘤、睾丸殖细胞瘤等)、妊娠滋养细胞病、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多症(例如，朗格汉斯细胞组织细胞增多症等)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤(例如，胰腺神经内分泌肿瘤等)、卡波西肉瘤、肾癌(例如，肾细胞癌、肾母细胞瘤、儿童肾肿瘤等)、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病(例如，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛细胞白血病等)、唇癌和口腔癌、肝癌(原发性肝癌)、小叶原位癌(LCIS)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌等)、淋巴瘤(例如，AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤等)、巨球蛋白血症(例如，华氏巨球蛋白血症等)、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤及骨肉瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、转移性颈鳞癌伴隐性原发、涉及NUT基因的中线道癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤、骨髓性白血病(例如，慢性骨髓性白血病(CML)等)、髓系白血病(例如，急性髓系白血病(AML)等)、骨髓增殖性肿瘤(例如，慢性骨髓增殖性肿瘤等)、鼻腔及鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌(例如，唇癌等)、口咽癌、骨肉瘤及骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌(例如，上皮细胞瘤、生殖细胞瘤、低度恶性潜在肿瘤等)、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞瘤)、乳头状瘤、副神经节瘤、鼻窦及鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂及输尿管癌移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(例如，尤文肉瘤、卡波西肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤等)、塞泽里综合征、皮肤癌(例如，儿童皮肤癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、非黑色素瘤等)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌(例如，原发性隐匿鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌等)、胃癌、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤及胸腺癌、甲状腺癌、肾盂及输尿管移行细胞癌、输尿管及肾盂癌、尿道癌、子宫癌(例如，子宫内膜癌等)、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、肾母细胞瘤等。
可对先前接受过一种或多种常规治疗的受试者使用本发明所述治疗方法。例如，在某些情况下，就肿瘤学而言，可在常规癌症疗法(包括但不限于常规化疗、常规放疗、常规免疫疗法、手术等)后实施本发明所述的方法。在某些情况下，当受试者对常规疗法没有反应或常规方法难以治疗时，可使用本发明所述的方法。在一些情况下，当受试者对常规疗法有反应时，可使用本发明所述的方法。
在一些情况下，本发明所述的方法可用于靶向、治疗或清除既往癌症疗法后剩余的微小残留病(MRD)。无论是否确定或已确定通过既往治疗难以治疗MRD，均可使用即时方法来靶向、治疗和/或清除MRD。在某些情况下，在确定通过既往治疗或一个或多个可用治疗选项(并非本发明所述的多重特异性抗体的选项)难以治疗MRD后，可使用本发明所述的方法来靶向、治疗和/或清除受试者的MRD。
在一些情况下，所述即时方法可用于预防性监测。例如，当受试者没有可检测到的疾病但存在癌症复发风险(包括耐药癌症)时，可对有需要的受试者给予涉及一种或多种本发明所述抗体的治疗。在某些情况下，当受试者存在预计具有耐药性或预计会产生耐药性的极高原发性癌症风险时，可使用预防性方法。在某些情况下，当受试者接受过既往癌症治疗并存在复发或产生耐药性的风险时，可使用预防性方法。
在一些情况下，本发明的方法可包括分析表达一种或多种标志物或治疗剂的癌症。例如，在一些情况下，所述方法可包括分析受试者的癌症样本，以确定所述癌症中ABCC1的表达是否高于预定阈值。
在一些情况下，受试者是否接受本发明所述抗体的治疗可取决于ABCC1表达评估结果。例如，在一些情况下，如果癌症中ABCC1的表达不低于预定阈值，则受试者可使用本发明所述抗ABCC1抗体进行治疗，如果癌症中ABCC1的表达低于预定阈值，则受试者可不使用本发明所述抗ABCC1抗体进行治疗。
任何方便的检测均可用于分析ABCC1水平，包括但不限于流式细胞术、核酸检测(例如，扩增、测序等)、细胞计数、免疫组织化学等。任何方便的生物样本均可使用，包括但不限于癌症活检样本。可通过任何方便、适当的方法来确定用于评估一种或多种标志物和/或靶点表达的有用预定阈值，包括将测得的表达水平与相应对照水平进行比较。例如，在某些情况下，样本中ABCC1水平的有用预定阈值可对应于在参考细胞(如健康/正常细胞)中测得的ABCC1水平。
制备方法
如上所述，本发明的方法还包括制备和/或确定本发明所述抗体的方法。可通过任何已知方法生产目标抗体，例如，用于合成蛋白的常规合成方法；重组DNA法等。
如果目标抗体为单链多肽，则可采用标准化学肽合成技术进行合成。如果多肽采用化学合成，则可通过液相或固相继续合成。固相多肽合成(SPPS)是目标抗体化学合成适当方法的一个示例，其中，序列的C端氨基酸附着在不溶性支撑物上，然后按顺序加入序列中的剩余氨基酸。各种形式的SPPS(如Fmoc和Boc)均可用于合成目标抗体。
可采用标准重组方法生产目标抗体。例如，将对轻链和重链可变区进行编码、可选连接恒定区的核酸插入表达载体中。可在相同或不同表达载体中克隆所述轻链和重链。对免疫球蛋白链进行编码的DNA片段可选连接表达载体中的控制序列，确保表达免疫球蛋白多肽。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，自然相关或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。所述表达控制序列可为载体中能够转化或转染真核宿主细胞(例如，COS或CHO细胞)的真核启动子。一旦所述载体进入适当的宿主中，宿主即可保持在适合核苷酸序列高水平表达以及抗体采集和纯化的条件下。
由于遗传密码具有简并性，各种核酸序列均可对每个免疫球蛋白核酸序列进行编码。可通过从头固相DNA合成或通过先前制备的所需多核苷酸变体的聚合酶链反应(PCR)诱变来产生所需核酸序列。寡核苷酸介导的诱变是靶多肽DNA取代、缺失和插入变体适当制备方法的一个示例。参见Adelman等人，《DNA》，2:183(1983)。简而言之，通过使对所需突变进行编码的寡核苷酸与单链DNA模板杂交，改变靶多肽DNA。杂交后，DNA聚合酶用于合成模板的整个第二互补链，所述模板包含寡核苷酸引物并对靶多肽DNA中的所选改变进行编码。
适当的表达载体在宿主生物中通常可作为附加体或宿主染色体DNA不可或缺的一部分进行复制。表达载体含有选择标志物(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性标志物)，可检测使用所需DNA序列进行转化的细胞。
大肠杆菌是可用于克隆目标抗体编码多肽的原核宿主细胞的一个示例。其他适用的微生物宿主包括杆菌(如枯草芽抱杆菌)以及其他肠杆菌科(如沙门氏菌、沙雷氏菌属以及各种假单胞菌属)。
也可采用酵母等其他微生物进行表达。酵母菌(例如，酿酒酵母)和毕赤酵母是适当酵母宿主细胞的示例，包含适当的载体，所述载体按需包含表达控制序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等。典型启动子包括3-磷酸甘油酸激酶以及其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括乙醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶中的启动子。
除微生物之外，还可采用哺乳动物细胞(例如，体外细胞培养时生长的哺乳动物细胞)表达和产生本发明的多肽(例如，对免疫球蛋白或其片段进行编码的多核苷酸)。参见Winnacker，《从基因到克隆》，VCH出版社，纽约州纽约市(1987)。适当的哺乳动物细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、HEK细胞、骨髓瘤细胞系和转化B细胞或杂交瘤。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(Queen等人，《免疫学评论》，89:49(1986))，还包括必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列。适当的表达控制序列示例为源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见Co等人，《免疫学杂志》，148:1149(1992)。
一旦合成(无论以化学方式还是以重组方式)，均可根据本领域的标准程序纯化整个抗体、其二聚体、单独的轻链和重链或其他形式的目标抗体(例如，scFv)，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱法、高效液相色谱法(HPLC)纯化、凝胶电泳等(通常参见《范围、蛋白质纯化》(施普林格出版社，纽约)(1982))。目标抗体可达到基本纯，例如，至少约80％-85％的纯度、至少约85％-90％的纯度、至少约90％-95％的纯度或98％-99％或更高的纯度，例如，无污染物，如细胞碎片、除目标抗体之外的大分子等。
试剂盒
本发明的某些方面还包括试剂盒。所述试剂盒可包含本发明所述的抗体、试剂、合成物、制剂、细胞、核酸、表达载体等的任何组合。目标试剂盒可包含以下一项或多项：目标抗体、对目标抗体进行编码的核酸或包含目标核酸的细胞。试剂盒经过配置可用于各种目的，包括治疗试剂盒(例如，试剂盒可包含抗ABCC1抗体和一种或多种附加活性剂，如化疗剂)、用于产生抗体的试剂盒、用于筛选抗体的试剂盒等。
所述试剂盒的可选组分各不相同，可包括缓冲剂、蛋白酶抑制剂等。如果目标试剂盒包含目标核酸，则所述核酸也可包含限制位点、多个克隆位点、引物位点等。所述试剂盒的各个组分可装在单独容器中，或某些相容性组分可按需在一个容器中预先组合。
除上述组分之外，目标试剂盒可包含使用试剂盒组分实施目标方法的说明。所述目标方法实施说明通常记录在适当的记录介质上。例如，可将所述说明打印在纸或塑料等基底上。因此，所述说明可以包装说明书的形式装在试剂盒中或在所述试剂盒或其组分容器的标签中(即，与包装或分包装相连)等。在其他实施例中，所述说明以电子存储数据文件的形式存储在适当的计算机可读存储介质上，例如，光盘只读存储器(CD-ROM)、数字通用光盘(DVD)、软盘等。在其他实施例中，所述实际说明不在试剂盒中，而是提供了通过互联网从远程来源获取所述说明的方法。本实施例的一个示例为包含可查看所述说明和/或从中下载所述说明的网址的试剂盒。与所述说明一样，获取所述说明的这种方法也记录在适当的基底上。
示例
为了向本领域的普通技术人员完整公开和说明如何制备并使用本发明，提出了以下示例，这些示例并不会限制发明人所认为的发明范围，也不表示以下实验是全部或唯一进行的实验。我们努力确保所用数字的准确性(例如，数量、温度等)，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏温度，压力为大气压或接近大气压。
可以在以下标准教科书中找到分子和细胞生物化学的一般方法：如《分子克隆：实验室手册》，第3版(Sambrook等人，HaRBor实验室出版社，2001)；《精编分子生物学》，第4版(Ausubel等人编辑，约翰·威利父子出版公司，1999)；《蛋白质方法》(Bollag等人，约翰·威利父子出版公司，1996)；《基因治疗的非病毒载体》(Wagner等人编辑，学术出版社，1999)；《病毒载体》(Kaplift和Loewy编辑，学术出版社，1995)；《免疫学方法手册》(I.Lefkovits编辑，学术出版社，1997)；以及《细胞和组织培养：生物技术实验室程序》(Doyle和Griffiths，约翰·威利父子出版公司，1998)，其公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。本发明提及或与之相关的试剂、克隆载体、细胞和试剂盒可从商业渠道购买，例如BioRad、Agilent Technologie、Thermo Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、New England Biolabs(NEB)、Takara Bio USA,Inc.等，以及存储库，例如Addgene,Inc.、American Type Culture Collection(ATCC)等。
示例1：制备与表达ABCC1的细胞特异性结合的抗体
材料和方法
抗体制备
采用野生型(WT)人和犬类ABCC1(全长和截断版本)来免疫小鼠或大鼠。接种疫苗动物的脾脏和淋巴结细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(杂交瘤技术)融合。通过流式细胞术筛选杂交瘤上清液是否存在抗ABCC1抗体。通过标准方案转染将选定鼠IgG的CDR克隆到哺乳动物IgG1骨架表达载体中，进行HEK 293宿主细胞中全长IgG1抗体表达和生产，如下所述。
表达载体
为了制备抗体表达载体，在框架中亚克隆重链和轻链DNA序列的可变区，将人IgG1恒定重链或人IgG1κ恒定轻链预先插入到针对哺乳动物细胞系表达优化的相应通用受体表达载体中。将待表达的基因克隆到pCI-neo哺乳动物表达载体(Promega)中，该载体使用全长人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子进行高水平的基因表达。将两条抗体链克隆到两种不同的载体中。
分别采用小鼠IgG重链和κ轻链的N端信号序列进行重链和轻链的分泌表达。在表达过程中切割信号肽，留下完整的N端。在Fab构建体中，CH1 IgG1恒定区的C端与6×His标签融合以进行纯化。
mAb的生产
按照制造商的建议，使用基于聚合物的Expi293细胞(A14527，ThermoFisher)与哺乳动物表达载体悬浮生长的共转染来表达抗体构建体。
转染后约六天，通过离心收获细胞。具体来说，将每1ml转染培养物中1μg的总编码DNA稀释到Opti-培养基(Life Technologies)中，并在同一培养基中与Expifectamine试剂(Life Technology)一起培养20分钟。然后将混合物加入到/>表达培养基(Life Technologies)中悬浮生长的/>细胞中，其中悬浮生长条件为37℃，250万个细胞/ml，空气中覆盖8％的CO2。6天后，通过离心收获含有抗体构建体的培养基。
mAb的纯化
为了纯化含有人Fc的抗体形式，在收获的培养基中加入每1ml上清液10μlMabSelectTMSuReTM(GE Healthcare)，并在4℃下搅拌过夜。第二天，使用真空歧管装置将蛋白质A树脂加入到24孔过滤板中(Pall Lifesciences，美国)。用PBS洗涤树脂，抗体在50mM磷酸盐(pH 3)中洗脱，并用10×PBS(pH 13)中和。
mAb的分析测试(GXII还原和非还原)
使用Protein Express LabChip试剂盒(Perkin-Elmer)在Caliper的LabChipGXII上通过高通量分析确定最终蛋白质制备的纯度和单体含量，如制造商所述。用含有0.2％ SDS和荧光染色染料的聚合物溶液自动将芯片涂在仪器上。用不含SDS和染料的聚合物溶液填充染色通道。简而言之，通过将少量(2-5μL)样品与含或不含DDT的Caliper样品缓冲液混合，制备还原和非还原状态下的蛋白质。样品在75℃下变性5分钟，以2000g离心3分钟，然后运行。电泳图由LabChip GXII Touch软件(Perkin Elmer)生成。
mAb的分析测试(HPLC)
通过HPLC上的高通量分析测定最终蛋白质制备的纯度和单体含量。在Infinity1260Agilent HPLC系统上使用Advancebio SEC 300A 4.6×300mm，2.7μm(件号：PL1580-5301)(Agilent Technologies)进行尺寸排阻色谱(SEC)。使用PBS、400mM氯化钠、pH 7.4的流动相在等度洗脱条件下进样，并用280nm吸光度检测。定量基于检测峰的相对面积。
目标抗体可以基本上纯化，例如，至少约80％-85％纯度、至少约85％-90％纯度、至少约90％-95％纯度或者98％-99％或以上，例如，无污染物，如细胞碎片、除目标抗体之外的大分子等。
单克隆抗体滴定与KPC1结合
通过连续稀释约666nM的抗体进行重组抗体与KPC1转染剂的结合滴定。将流式细胞术缓冲液中的稀释抗体与冰上的细胞培养30分钟。用流式细胞术缓冲液洗涤2次后，用PE标记的F(ab′)2片段山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)在流式细胞术缓冲液中以1:200稀释后与细胞在冰上培养20分钟，检测结合的抗体。用流式细胞术缓冲液洗涤2次后，在Attune NxT流式细胞仪上测量荧光。使用GraphPad Prism 8.0软件分析数据以确定EC50。
细胞结合测定
通过流式细胞术评价抗体与细胞的结合。稳定转染表达人或食蟹猴ABCC1的293T细胞在流式细胞术缓冲液(PBS+2％ FBS+0.02％叠氮化钠)中洗涤一次，在流式细胞术缓冲液中以2×10^6个细胞/mL重悬，并以0.1mL/孔分配到96孔微量滴定板中。将重组抗体以5μg/mL加入细胞中进行初始结合确认，或在流式细胞术缓冲液中从100μg/mL开始连续稀释。将细胞在冰上培养30分钟后，用流式细胞术缓冲液洗涤细胞两次。用PE标记的F(ab′)2片段山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)检测结合抗体，并在Attune NxT流式细胞仪上进行评价。EC50计算为产生一半最大反应的抗体浓度。
ABCC1外排测定
将表达人ABCC1的HEK 293T细洗涤数次，并以每毫升1×106个细胞的细胞密度在无酚红DMEM中以50μl等分试样/孔等分到96孔板中。将细胞与50μl抗体混合，并在37℃下培养1.5小时。然后将细胞洗涤两次，最后重悬于200ml PBS中。用流式细胞术测量钙黄绿素AM荧光。
细胞毒性测定
在稳定转染表达ABCC1的293T细胞上评价抗ABCC1抗体对长春新碱细胞毒性的影响。细胞在0.05mL的检测培养基(DMEM+10％ FBS)中，在白色平底96孔组织培养板中以5000个细胞/孔接种。在含有测试抗体或对照抗体的测定培养基中以100μg/mL(2倍最终浓度)从200μM开始连续稀释，以2倍最终测定浓度制备长春新碱。将等效体积(0.05mL)的长春新碱/抗体混合物加入96孔板中的293T_ABCC1细胞中。然后将板在37℃下在5％ CO2中培养。约72-96小时后，将板平衡至室温，并根据制造商建议的方案使用CellTiter-/>发光细胞活力测定评估细胞活力。在Molecular/>3多功能微孔读板机上测量发光，并使用GraphPad Prism 8.0软件分析数据。一半最大抑制浓度(IC50)是药物(长春新碱或其他化疗细胞毒素剂)的浓度，其中反应(细胞生长)降低50％。
CT26同源异种移植小鼠模型
同源模型是来自小鼠癌细胞系中永生化的同种异体移植物，然后将其移植回相同的近交免疫功能小鼠品系中。CT26是一种患有侵袭性结肠癌的BALB/c小鼠建立的N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸酯(NNMU)诱导的未分化成纤维细胞性结肠癌细胞系。C26细胞购自(CRL-2638TM)，并在37℃、5％ CO2下，保持在添加10％ FBS和1％青霉素、1％链霉素的RPMI-1640培养基中。使用的细胞系是真实的，经证实为支原体阴性。这些细胞贴壁呈成纤维细胞形态，在同系BALB/c小鼠或免疫功能低的小鼠中植入后会形成肿瘤和转移。
在无菌条件下，用27G胰岛素注射器将在PBS：基质胶(1：1)中稀释的1×106细胞经皮下植入麻醉的5-6周龄雌性Balb/c小鼠中。按照APLAC方案的批准实施所有动物饲养、处理、监测和动物程序。
一旦肿瘤达到100-150mm3，将小鼠随机分成6组，每组5只小鼠：
1.对照同种型3mg/kg，
2.对照同种型3mg/kg+多柔比星2mg/kg
3.KNJY C1-831 3mg/kg
4.KNJY C1-831 3mg/kg+多柔比星
5.KNJY C1-787A3mg/kg
6.KNJY C1-787A3mg/kg+多柔比星2mg/kg。
多柔比星可溶于水。所有供试品每周向腹膜内给药两次，连续两周。抗体在多柔比星之前4小时给药。
使用校准的游标卡尺每周测量肿瘤三次，并根据公式1/2*L*S*S计算肿瘤体积，其中L是肿瘤的长轴，S是肿瘤的短轴。在治疗开始前记录体重，并在整个研究过程中持续监测。根据上述预定义的标准(体重迅速减轻，行走能力丧失，呼吸困难或无法饮水或进食)，当动物濒临死亡时，对动物实施安乐死，以避免动物遭受痛苦。
结果
表3列出了抗ABCC1抗体的以下特征：通过FACS测量与稳定转染表达ABCC1的293T细胞的结合情况，以及通过FACS测量与稳定转染表达食蟹猴ABCC1的293T细胞的结合情况。
图1描述了十种抗ABCC1单克隆抗体与上述流式细胞术(FACS)测定中内源性表达ABCC1的多柔比星耐药肺癌细胞系H69AR(CRL-11351TM)的滴定结合的结果。所有测试的抗体均显示出与H69AR细胞的显著(>10倍背景荧光平均强度(FMI))结合。
图2A-2B描述了所示抗ABCC1单克隆抗体与上述FACS测定中人和食蟹猴ABCC1过表达大鼠C6神经胶质瘤细胞系的滴定结合的结果。所有测试的抗体均显示出与过表达人ABCC1的C6细胞和过表达食蟹猴ABCC1的C6细胞的显著结合。
图3A-3C、4、5A-5B和6A-6B显示了其他抗ABCC1单克隆抗体与FACS测定中人和食蟹猴ABCC1过表达大鼠C6神经胶质瘤细胞系的滴定结合的结果。“仅二抗”是指用作阴性对照的非一抗。所有测试的抗ABCC1抗体均显示出相对于阴性对照，与过表达人ABCC1的C6细胞和过表达食蟹猴ABCC1的C6细胞的显著结合。
图7A-7B显示了使用表达人ABCC1的HEK293T细胞进行ABCC1外排测定的结果。所有测试的抗ABCC1抗体均显著抑制ABCC1转运蛋白的外排功能。
图8A-8C显示了人源化抗ABCC1单克隆抗体的滴定结合和外排测定表征。人源化抗ABCC1抗体C1.831.hu11、C1.861.hu11、C1.861.hu21和C1.844.hu21在滴定结合测定中与人和食蟹ABCC1结合，并在外排测定中显著抑制ABCC1转运蛋白的外排功能。
图9A-9C显示了抗ABCC1单克隆抗体C1.831、C1.861和C1.844的人源化变体与人和食蟹猴ABCC1过表达大鼠C6胶质瘤细胞系的结合。所有人源化抗体均保留了与人和食蟹猴ABCC1结合的能力。
图10A-10B显示了人源化抗ABCC1抗体C1.851.12、C1.851.14和C1.851.15与人和食蟹猴ABCC1过表达大鼠C6胶质瘤细胞系的结合。所有三种抗体都保留了与人和食蟹猴ABCC1结合的能力。
图11A-11C显示了四种人源化ABCC1/KT9双特异性抗体分别与过表达ABCC1和KT9的人和食蟹猴C6细胞系的结合。还显示了双特异性抗体的结构示意图。KT9代表阿特珠单抗(一种抗PD-L1单克隆抗体)。双特异性抗体包含所示ABCC1抗体的重链和轻链以及KT9抗体形成的scFv区。所有测试的双特异性抗体均与过表达ABCC1的C6细胞和过表达KT9的C6细胞结合。
图12A-12C显示了四种人源化C1/KT1双特异性抗体分别与表达人ABCC1的293T细胞和表达人或食蟹猴KT1的293T细胞的结合。KT1代表曲妥珠单抗(一种抗ErbB2(抗HER2)单克隆抗体)。双特异性抗体包含所示抗ABCC1抗体的重链和轻链以及KT1抗体形成的scFv区。测试的双特异性抗体与表达人KT1的293T细胞和表达食蟹猴KT1的293T细胞结合，并保留与表达人ABCC1的293T细胞结合的能力。
图13A-13B、14A-14B和15显示了在293T细胞毒性测定中测试的抗ABCC1单克隆抗体对长春新碱细胞毒性的影响。在该测定中，测试的抗ABCC1抗体增加了长春新碱的细胞毒性。MK571是一种市售的ABCC1介导转运的小分子抑制剂。
图16显示了在H69AR细胞毒性测定中测试的三种抗ABCC1单克隆抗体抑制体内肿瘤生长。该测定评价了测试抗体对H69AR细胞系的长春新碱细胞毒性的影响，该细胞系是人小细胞肺癌细胞系NCI-H69的阿霉素选择的C1阳性变体。
图17显示了抗ABCC1单克隆抗体C1-831和C1-737A抑制CT26同基因小鼠肿瘤模型中的体内肿瘤生长。
尽管为了理解清楚起见，已经通过说明和示例对上述发明进行了一些详细的描述，但对于本领域的普通技术人员来说，根据本发明的指导，显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些更改和修改。
因此，上述内容仅说明了本发明的原则。可以理解的是，本领域技术人员将能够设计出各种布置，尽管本发明没有明确描述或表示，但体现了本发明的原则，并包含在其精神和范围内。而且，本发明列举的所有示例和条件语言主要目的是帮助读者理解本发明的原则以及发明人为促进本领域的发展所提出的概念，并应视为不限于此类具体列举的示例和条件。另外，本发明中列举本发明的原则、方面和实施例的所有陈述及其具体示例，旨在包括其结构和功能等同物。此外，这些等同物既包括当前已知的等同物，也包括未来开发的等同物，即任何开发的执行相同功能的要素，无论其结构如何。另外，本发明公开的任何内容均无意专门向公众开放，无论此类公开是否在权利要求中明确列举。
因此，本发明的范围并不限于本发明所示和描述的示例性实施例。相反，所附权利要求体现了本发明的范围和精神。在权利要求中，《美国专利法》第35篇第112(f)条或《美国专利法》第35篇第112(6)条被明确定义为只有在权利要求中此类限制以确切短语“方式”或确切短语“步骤”开始时，才作为权利要求中的限制而援引；如果权利要求中没有使用此类确切短语，则《美国专利法》第35篇第112(f)条或《美国专利法》第35篇第112(6)条没有援引。
序列表
<110> 肯乔克蒂生物技术股份有限公司
W·R·阿拉松
R·布莱恩特
P·D·波那斯
C·谭
R·西奥利斯
翟倩婷
张萍萍
<120> 抗ABCC1抗体及其应用
<130> KNJY-006WO
<150> US 63/073,826
<151> 2020-09-02
<160> 184
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 1
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<213> 小鼠
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<213> 大鼠
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<211> 5
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 25
Asp Ser Trp Ile His
1 5
<210> 26
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 26
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<210> 27
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 27
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1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Arg Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 28
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Arg Gly Tyr Tyr Trp Ser Asn Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 29
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Glu Arg Gly Trp Asn Tyr Pro Phe Ile Thr Asn Gly Tyr Tyr Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 30
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 30
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Gln
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Glu Arg Gly Trp Asn Tyr Pro Phe Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 31
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Gly Val Ile Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Gly Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Thr Thr Thr Ala Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Gly Val Ile Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Gly Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Thr Thr Thr Ala Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 33
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Val Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Thr Thr Thr Ala Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn
20 25 30
Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Val Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Thr Thr Thr Ala Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 35
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Ser
20 25 30
Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Val Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Thr Thr Thr Ala Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Ser
20 25 30
Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Val Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Thr Thr Thr Ala Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 37
Ser Tyr Asp Ile Thr
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 38
Ser Asn Gly Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 39
Gly Tyr Phe Met Asn
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 40
Asn Asn Gly Val Ser
1 5
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 41
Ser Tyr Asn Val His
1 5
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 42
Ser Asn Gly Val Ile
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 43
Asn Tyr Asn Val His
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 44
Ser Asn Gly Val Thr
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 45
Ser Gln Gly Val Ser
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 46
Ser Ser Gly Val Thr
1 5
<210> 47
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 47
Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser
1 5 10 15
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 48
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser
1 5 10 15
<210> 49
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 49
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 50
Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 51
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser
1 5 10 15
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 52
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Asn Leu Ala Phe Lys Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 53
Ala Met Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 54
Val Ile Trp Thr Gly Gly Tyr Thr Asp Ser Asn Ser Pro Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 55
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser
1 5 10 15
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 56
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Gly Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 57
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 57
Ala Ile Ser Asn Gly Gly Asn Ile Tyr His Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 58
Ile Ile Trp Thr Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Ser Asp Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 59
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 60
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr His Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 61
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 61
Ala Ile Ser Asn Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser
1 5 10 15
<210> 62
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 62
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Val Lys Ser
1 5 10 15
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 63
Ala Met Ser Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser
1 5 10 15
<210> 64
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 64
Asp Leu Arg Tyr Gly Tyr Asp Gly Phe Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 65
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 65
His Arg Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 66
Glu Arg Gly Trp Asn Tyr Pro Gly Ile Thr Asn Gly Tyr Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 67
Ser Gly Trp Gly Tyr Asp Val Tyr Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 68
<211> 14
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 68
His Arg Gly Tyr Tyr Gly Phe Asn Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 69
<211> 14
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 69
His Arg Gly Tyr Tyr Trp Tyr Asn Trp Gly Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 70
Glu Arg His Thr Met Gly Ile Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 71
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 71
His Arg Gly Tyr Tyr Trp Ser Asn Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 72
Ala Arg Gly Thr Thr Thr Ala Tyr Phe Met Asp Ala
1 5 10
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 73
Glu Arg Gly Trp Asn Tyr Pro Phe Ile Thr Asn Gly Tyr Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 74
Ala Arg Gly Thr Thr Thr Ala Tyr Val Met Asp Ala
1 5 10
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 75
Glu Arg Gly Trp Asn Tyr Pro Phe Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 76
<211> 112
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 小鼠 或 人源化序列
<400> 76
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 小鼠 或 人源化序列
<400> 77
Asp Val Val Met Thr Gln Ala Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ile Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 78
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gly Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Trp Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 79
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 79
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Leu Ser Cys Lys Ala Gly Gln Lys Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 81
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 82
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asp Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 83
<211> 110
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 83
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asp Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
<210> 84
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 84
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 85
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Phe Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Asn Thr Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Lys Phe Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 86
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 86
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Gln Tyr Asn Asp Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 87
<211> 114
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 87
Glu Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Leu Met Lys Met Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 88
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 88
Asn Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 89
<211> 107
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 89
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Phe Ser Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Asn Ser Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Lys Phe Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 90
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 90
Glu Ile Met Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Gly Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 91
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 92
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 92
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Arg Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asn Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
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Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<211> 114
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 93
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Val Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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50 55 60
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Tyr Tyr Asp Thr Leu Met Lys Met Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Leu Lys
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<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 94
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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85 90 95
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100 105
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<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 95
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 96
<211> 107
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 96
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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85 90 95
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100 105
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<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 97
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
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<211> 114
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 98
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Val Leu Met Asn Met Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 99
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 99
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Ser Ser Leu Gln Ala Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Asp Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 100
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 100
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Arg Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
100 105
<210> 101
<211> 106
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 101
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asp Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 102
<211> 114
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 102
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Val Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val
<210> 103
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Phe Ser Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Asn Ser Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Lys Phe Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 104
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 104
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 105
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 105
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 106
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 106
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 107
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 107
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Gln Tyr Asn Asp Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 108
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 108
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 109
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 109
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Leu Met Lys Met Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Leu Lys
<210> 110
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 110
Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Tyr Asp Val Leu Met Asn Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 111
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 111
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 112
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ser Leu Asn
1 5 10
<210> 113
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 113
Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 114
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 114
Lys Ala Gly Gln Lys Ile Asn Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 115
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 116
Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 117
Leu Ala Ser Glu Gly Ile Phe Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 118
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 119
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 119
Lys Gly Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 120
Leu Ala Ser Glu Gly Ile Phe Ser Tyr Leu Gly
1 5 10
<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 121
Lys Ala Gly Gln Asn Ile Asn Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 122
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Val Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 123
Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr Leu Gly
1 5 10
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 124
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 125
Gly Thr Ser Ser Leu Asp Ser
1 5
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 126
Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr
1 5
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 127
Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr
1 5
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 128
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 129
Gly Ala Asn Thr Leu Gln Ala
1 5
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 130
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser
1 5
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 131
Gly Ala Asn Ser Leu Gln Ala
1 5
<210> 132
<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 132
Lys Thr Asn Asn Leu Gln Thr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 133
Lys Thr Ser Ser Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 134
Glu Thr Asn Ser Leu Gln Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 135
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 136
Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 137
Tyr Gln Tyr Asn Asn Trp Tyr Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 138
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1 5
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<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 139
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 140
Ser Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 141
Tyr Gln Tyr Asn Asp Gly Tyr Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 142
Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 143
Cys Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 144
Gln Gln Ser Tyr Lys Phe Pro Val Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 145
Cys Gln Tyr Asn Asp Gly Tyr Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 146
Gln Gln Tyr Tyr Asp Thr Leu Met Lys Met
1 5 10
<210> 147
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大鼠 或 人源化序列
<400> 147
Gln Gln Tyr Tyr Asp Val Leu Met Asn Met
1 5 10
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 148
Tyr Gln Tyr Asn Gln Gly Tyr Thr
1 5
<210> 149
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化序列
<400> 149
Tyr Gln Tyr Asn Ser Gly Tyr Thr
1 5
<210> 150
<211> 1531
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
Met Ala Leu Arg Gly Phe Cys Ser Ala Asp Gly Ser Asp Pro Leu Trp
1 5 10 15
Asp Trp Asn Val Thr Trp Asn Thr Ser Asn Pro Asp Phe Thr Lys Cys
20 25 30
Phe Gln Asn Thr Val Leu Val Trp Val Pro Cys Phe Tyr Leu Trp Ala
35 40 45
Cys Phe Pro Phe Tyr Phe Leu Tyr Leu Ser Arg His Asp Arg Gly Tyr
50 55 60
Ile Gln Met Thr Pro Leu Asn Lys Thr Lys Thr Ala Leu Gly Phe Leu
65 70 75 80
Leu Trp Ile Val Cys Trp Ala Asp Leu Phe Tyr Ser Phe Trp Glu Arg
85 90 95
Ser Arg Gly Ile Phe Leu Ala Pro Val Phe Leu Val Ser Pro Thr Leu
100 105 110
Leu Gly Ile Thr Met Leu Leu Ala Thr Phe Leu Ile Gln Leu Glu Arg
115 120 125
Arg Lys Gly Val Gln Ser Ser Gly Ile Met Leu Thr Phe Trp Leu Val
130 135 140
Ala Leu Val Cys Ala Leu Ala Ile Leu Arg Ser Lys Ile Met Thr Ala
145 150 155 160
Leu Lys Glu Asp Ala Gln Val Asp Leu Phe Arg Asp Ile Thr Phe Tyr
165 170 175
Val Tyr Phe Ser Leu Leu Leu Ile Gln Leu Val Leu Ser Cys Phe Ser
180 185 190
Asp Arg Ser Pro Leu Phe Ser Glu Thr Ile His Asp Pro Asn Pro Cys
195 200 205
Pro Glu Ser Ser Ala Ser Phe Leu Ser Arg Ile Thr Phe Trp Trp Ile
210 215 220
Thr Gly Leu Ile Val Arg Gly Tyr Arg Gln Pro Leu Glu Gly Ser Asp
225 230 235 240
Leu Trp Ser Leu Asn Lys Glu Asp Thr Ser Glu Gln Val Val Pro Val
245 250 255
Leu Val Lys Asn Trp Lys Lys Glu Cys Ala Lys Thr Arg Lys Gln Pro
260 265 270
Val Lys Val Val Tyr Ser Ser Lys Asp Pro Ala Gln Pro Lys Glu Ser
275 280 285
Ser Lys Val Asp Ala Asn Glu Glu Val Glu Ala Leu Ile Val Lys Ser
290 295 300
Pro Gln Lys Glu Trp Asn Pro Ser Leu Phe Lys Val Leu Tyr Lys Thr
305 310 315 320
Phe Gly Pro Tyr Phe Leu Met Ser Phe Phe Phe Lys Ala Ile His Asp
325 330 335
Leu Met Met Phe Ser Gly Pro Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ile Lys Phe
340 345 350
Val Asn Asp Thr Lys Ala Pro Asp Trp Gln Gly Tyr Phe Tyr Thr Val
355 360 365
Leu Leu Phe Val Thr Ala Cys Leu Gln Thr Leu Val Leu His Gln Tyr
370 375 380
Phe His Ile Cys Phe Val Ser Gly Met Arg Ile Lys Thr Ala Val Ile
385 390 395 400
Gly Ala Val Tyr Arg Lys Ala Leu Val Ile Thr Asn Ser Ala Arg Lys
405 410 415
Ser Ser Thr Val Gly Glu Ile Val Asn Leu Met Ser Val Asp Ala Gln
420 425 430
Arg Phe Met Asp Leu Ala Thr Tyr Ile Asn Met Ile Trp Ser Ala Pro
435 440 445
Leu Gln Val Ile Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Trp Leu Asn Leu Gly Pro
450 455 460
Ser Val Leu Ala Gly Val Ala Val Met Val Leu Met Val Pro Val Asn
465 470 475 480
Ala Val Met Ala Met Lys Thr Lys Thr Tyr Gln Val Ala His Met Lys
485 490 495
Ser Lys Asp Asn Arg Ile Lys Leu Met Asn Glu Ile Leu Asn Gly Ile
500 505 510
Lys Val Leu Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Leu Ala Phe Lys Asp Lys Val
515 520 525
Leu Ala Ile Arg Gln Glu Glu Leu Lys Val Leu Lys Lys Ser Ala Tyr
530 535 540
Leu Ser Ala Val Gly Thr Phe Thr Trp Val Cys Thr Pro Phe Leu Val
545 550 555 560
Ala Leu Cys Thr Phe Ala Val Tyr Val Thr Ile Asp Glu Asn Asn Ile
565 570 575
Leu Asp Ala Gln Thr Ala Phe Val Ser Leu Ala Leu Phe Asn Ile Leu
580 585 590
Arg Phe Pro Leu Asn Ile Leu Pro Met Val Ile Ser Ser Ile Val Gln
595 600 605
Ala Ser Val Ser Leu Lys Arg Leu Arg Ile Phe Leu Ser His Glu Glu
610 615 620
Leu Glu Pro Asp Ser Ile Glu Arg Arg Pro Val Lys Asp Gly Gly Gly
625 630 635 640
Thr Asn Ser Ile Thr Val Arg Asn Ala Thr Phe Thr Trp Ala Arg Ser
645 650 655
Asp Pro Pro Thr Leu Asn Gly Ile Thr Phe Ser Ile Pro Glu Gly Ala
660 665 670
Leu Val Ala Val Val Gly Gln Val Gly Cys Gly Lys Ser Ser Leu Leu
675 680 685
Ser Ala Leu Leu Ala Glu Met Asp Lys Val Glu Gly His Val Ala Ile
690 695 700
Lys Gly Ser Val Ala Tyr Val Pro Gln Gln Ala Trp Ile Gln Asn Asp
705 710 715 720
Ser Leu Arg Glu Asn Ile Leu Phe Gly Cys Gln Leu Glu Glu Pro Tyr
725 730 735
Tyr Arg Ser Val Ile Gln Ala Cys Ala Leu Leu Pro Asp Leu Glu Ile
740 745 750
Leu Pro Ser Gly Asp Arg Thr Glu Ile Gly Glu Lys Gly Val Asn Leu
755 760 765
Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val Ser Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ser
770 775 780
Asn Ala Asp Ile Tyr Leu Phe Asp Asp Pro Leu Ser Ala Val Asp Ala
785 790 795 800
His Val Gly Lys His Ile Phe Glu Asn Val Ile Gly Pro Lys Gly Met
805 810 815
Leu Lys Asn Lys Thr Arg Ile Leu Val Thr His Ser Met Ser Tyr Leu
820 825 830
Pro Gln Val Asp Val Ile Ile Val Met Ser Gly Gly Lys Ile Ser Glu
835 840 845
Met Gly Ser Tyr Gln Glu Leu Leu Ala Arg Asp Gly Ala Phe Ala Glu
850 855 860
Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Ser Thr Glu Gln Glu Gln Asp Ala Glu Glu
865 870 875 880
Asn Gly Val Thr Gly Val Ser Gly Pro Gly Lys Glu Ala Lys Gln Met
885 890 895
Glu Asn Gly Met Leu Val Thr Asp Ser Ala Gly Lys Gln Leu Gln Arg
900 905 910
Gln Leu Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Gly Asp Ile Ser Arg His His
915 920 925
Asn Ser Thr Ala Glu Leu Gln Lys Ala Glu Ala Lys Lys Glu Glu Thr
930 935 940
Trp Lys Leu Met Glu Ala Asp Lys Ala Gln Thr Gly Gln Val Lys Leu
945 950 955 960
Ser Val Tyr Trp Asp Tyr Met Lys Ala Ile Gly Leu Phe Ile Ser Phe
965 970 975
Leu Ser Ile Phe Leu Phe Met Cys Asn His Val Ser Ala Leu Ala Ser
980 985 990
Asn Tyr Trp Leu Ser Leu Trp Thr Asp Asp Pro Ile Val Asn Gly Thr
995 1000 1005
Gln Glu His Thr Lys Val Arg Leu Ser Val Tyr Gly Ala Leu Gly
1010 1015 1020
Ile Ser Gln Gly Ile Ala Val Phe Gly Tyr Ser Met Ala Val Ser
1025 1030 1035
Ile Gly Gly Ile Leu Ala Ser Arg Cys Leu His Val Asp Leu Leu
1040 1045 1050
His Ser Ile Leu Arg Ser Pro Met Ser Phe Phe Glu Arg Thr Pro
1055 1060 1065
Ser Gly Asn Leu Val Asn Arg Phe Ser Lys Glu Leu Asp Thr Val
1070 1075 1080
Asp Ser Met Ile Pro Glu Val Ile Lys Met Phe Met Gly Ser Leu
1085 1090 1095
Phe Asn Val Ile Gly Ala Cys Ile Val Ile Leu Leu Ala Thr Pro
1100 1105 1110
Ile Ala Ala Ile Ile Ile Pro Pro Leu Gly Leu Ile Tyr Phe Phe
1115 1120 1125
Val Gln Arg Phe Tyr Val Ala Ser Ser Arg Gln Leu Lys Arg Leu
1130 1135 1140
Glu Ser Val Ser Arg Ser Pro Val Tyr Ser His Phe Asn Glu Thr
1145 1150 1155
Leu Leu Gly Val Ser Val Ile Arg Ala Phe Glu Glu Gln Glu Arg
1160 1165 1170
Phe Ile His Gln Ser Asp Leu Lys Val Asp Glu Asn Gln Lys Ala
1175 1180 1185
Tyr Tyr Pro Ser Ile Val Ala Asn Arg Trp Leu Ala Val Arg Leu
1190 1195 1200
Glu Cys Val Gly Asn Cys Ile Val Leu Phe Ala Ala Leu Phe Ala
1205 1210 1215
Val Ile Ser Arg His Ser Leu Ser Ala Gly Leu Val Gly Leu Ser
1220 1225 1230
Val Ser Tyr Ser Leu Gln Val Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Val
1235 1240 1245
Arg Met Ser Ser Glu Met Glu Thr Asn Ile Val Ala Val Glu Arg
1250 1255 1260
Leu Lys Glu Tyr Ser Glu Thr Glu Lys Glu Ala Pro Trp Gln Ile
1265 1270 1275
Gln Glu Thr Ala Pro Pro Ser Ser Trp Pro Gln Val Gly Arg Val
1280 1285 1290
Glu Phe Arg Asn Tyr Cys Leu Arg Tyr Arg Glu Asp Leu Asp Phe
1295 1300 1305
Val Leu Arg His Ile Asn Val Thr Ile Asn Gly Gly Glu Lys Val
1310 1315 1320
Gly Ile Val Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Ser Leu Thr Leu
1325 1330 1335
Gly Leu Phe Arg Ile Asn Glu Ser Ala Glu Gly Glu Ile Ile Ile
1340 1345 1350
Asp Gly Ile Asn Ile Ala Lys Ile Gly Leu His Asp Leu Arg Phe
1355 1360 1365
Lys Ile Thr Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Ser Gly Ser
1370 1375 1380
Leu Arg Met Asn Leu Asp Pro Phe Ser Gln Tyr Ser Asp Glu Glu
1385 1390 1395
Val Trp Thr Ser Leu Glu Leu Ala His Leu Lys Asp Phe Val Ser
1400 1405 1410
Ala Leu Pro Asp Lys Leu Asp His Glu Cys Ala Glu Gly Gly Glu
1415 1420 1425
Asn Leu Ser Val Gly Gln Arg Gln Leu Val Cys Leu Ala Arg Ala
1430 1435 1440
Leu Leu Arg Lys Thr Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala
1445 1450 1455
Ala Val Asp Leu Glu Thr Asp Asp Leu Ile Gln Ser Thr Ile Arg
1460 1465 1470
Thr Gln Phe Glu Asp Cys Thr Val Leu Thr Ile Ala His Arg Leu
1475 1480 1485
Asn Thr Ile Met Asp Tyr Thr Arg Val Ile Val Leu Asp Lys Gly
1490 1495 1500
Glu Ile Gln Glu Tyr Gly Ala Pro Ser Asp Leu Leu Gln Gln Arg
1505 1510 1515
Gly Leu Phe Tyr Ser Met Ala Lys Asp Ala Gly Leu Val
1520 1525 1530
<210> 151
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
Met Ala Leu Arg Gly Phe Cys Ser Ala Asp Gly Ser Asp Pro Leu Trp
1 5 10 15
Asp Trp Asn Val Thr Trp Asn Thr Ser Asn Pro Asp Phe Thr Lys Cys
20 25 30
Phe
<210> 152
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Arg Ser Arg Gly Ile
1 5
<210> 153
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Ser Lys Ile Met Thr Ala Leu Lys Glu Asp Ala Gln Val Asp Leu Phe
1 5 10 15
Arg Asp
<210> 154
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Met Met Phe Ser Gly Pro Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ile Lys Phe Val
1 5 10 15
Asn Asp Thr Lys Ala Pro Asp Trp Gln Gly
20 25
<210> 155
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
Val Thr Ile Asp Glu Asn Asn Ile Leu Asp Ala Gln Thr Ala Phe Val
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Phe Asn
20
<210> 156
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
Ala Leu Ala Ser Asn Tyr Trp Leu Ser Leu Trp Thr Asp Asp Pro Ile
1 5 10 15
Val Asn Gly Thr Gln Glu His Thr Lys Val Arg Leu Ser Val Tyr Gly
20 25 30
Ala Leu Gly Ile Ser
35
<210> 157
<211> 1329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
Met Asp Pro Asn Pro Cys Pro Glu Ser Ser Ala Ser Phe Leu Ser Arg
1 5 10 15
Ile Thr Phe Trp Trp Ile Thr Gly Leu Ile Val Arg Gly Tyr Arg Gln
20 25 30
Pro Leu Glu Gly Ser Asp Leu Trp Ser Leu Asn Lys Glu Asp Thr Ser
35 40 45
Glu Gln Val Val Pro Val Leu Val Lys Asn Trp Lys Lys Glu Cys Ala
50 55 60
Lys Thr Arg Lys Gln Pro Val Lys Val Val Tyr Ser Ser Lys Asp Pro
65 70 75 80
Ala Gln Pro Lys Glu Ser Ser Lys Val Asp Ala Asn Glu Glu Val Glu
85 90 95
Ala Leu Ile Val Lys Ser Pro Gln Lys Glu Trp Asn Pro Ser Leu Phe
100 105 110
Lys Val Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Pro Tyr Phe Leu Met Ser Phe Phe
115 120 125
Phe Lys Ala Ile His Asp Leu Met Met Phe Ser Gly Pro Gln Ile Leu
130 135 140
Lys Leu Leu Ile Lys Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Pro Asp Trp Gln
145 150 155 160
Gly Tyr Phe Tyr Thr Val Leu Leu Phe Val Thr Ala Cys Leu Gln Thr
165 170 175
Leu Val Leu His Gln Tyr Phe His Ile Cys Phe Val Ser Gly Met Arg
180 185 190
Ile Lys Thr Ala Val Ile Gly Ala Val Tyr Arg Lys Ala Leu Val Ile
195 200 205
Thr Asn Ser Ala Arg Lys Ser Ser Thr Val Gly Glu Ile Val Asn Leu
210 215 220
Met Ser Val Asp Ala Gln Arg Phe Met Asp Leu Ala Thr Tyr Ile Asn
225 230 235 240
Met Ile Trp Ser Ala Pro Leu Gln Val Ile Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
245 250 255
Trp Leu Asn Leu Gly Pro Ser Val Leu Ala Gly Val Ala Val Met Val
260 265 270
Leu Met Val Pro Val Asn Ala Val Met Ala Met Lys Thr Lys Thr Tyr
275 280 285
Gln Val Ala His Met Lys Ser Lys Asp Asn Arg Ile Lys Leu Met Asn
290 295 300
Glu Ile Leu Asn Gly Ile Lys Val Leu Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Leu
305 310 315 320
Ala Phe Lys Asp Lys Val Leu Ala Ile Arg Gln Glu Glu Leu Lys Val
325 330 335
Leu Lys Lys Ser Ala Tyr Leu Ser Ala Val Gly Thr Phe Thr Trp Val
340 345 350
Cys Thr Pro Phe Leu Val Ala Leu Cys Thr Phe Ala Val Tyr Val Thr
355 360 365
Ile Asp Glu Asn Asn Ile Leu Asp Ala Gln Thr Ala Phe Val Ser Leu
370 375 380
Ala Leu Phe Asn Ile Leu Arg Phe Pro Leu Asn Ile Leu Pro Met Val
385 390 395 400
Ile Ser Ser Ile Val Gln Ala Ser Val Ser Leu Lys Arg Leu Arg Ile
405 410 415
Phe Leu Ser His Glu Glu Leu Glu Pro Asp Ser Ile Glu Arg Arg Pro
420 425 430
Val Lys Asp Gly Gly Gly Thr Asn Ser Ile Thr Val Arg Asn Ala Thr
435 440 445
Phe Thr Trp Ala Arg Ser Asp Pro Pro Thr Leu Asn Gly Ile Thr Phe
450 455 460
Ser Ile Pro Glu Gly Ala Leu Val Ala Val Val Gly Gln Val Gly Cys
465 470 475 480
Gly Lys Ser Ser Leu Leu Ser Ala Leu Leu Ala Glu Met Asp Lys Val
485 490 495
Glu Gly His Val Ala Ile Lys Gly Ser Val Ala Tyr Val Pro Gln Gln
500 505 510
Ala Trp Ile Gln Asn Asp Ser Leu Arg Glu Asn Ile Leu Phe Gly Cys
515 520 525
Gln Leu Glu Glu Pro Tyr Tyr Arg Ser Val Ile Gln Ala Cys Ala Leu
530 535 540
Leu Pro Asp Leu Glu Ile Leu Pro Ser Gly Asp Arg Thr Glu Ile Gly
545 550 555 560
Glu Lys Gly Val Asn Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val Ser Leu
565 570 575
Ala Arg Ala Val Tyr Ser Asn Ala Asp Ile Tyr Leu Phe Asp Asp Pro
580 585 590
Leu Ser Ala Val Asp Ala His Val Gly Lys His Ile Phe Glu Asn Val
595 600 605
Ile Gly Pro Lys Gly Met Leu Lys Asn Lys Thr Arg Ile Leu Val Thr
610 615 620
His Ser Met Ser Tyr Leu Pro Gln Val Asp Val Ile Ile Val Met Ser
625 630 635 640
Gly Gly Lys Ile Ser Glu Met Gly Ser Tyr Gln Glu Leu Leu Ala Arg
645 650 655
Asp Gly Ala Phe Ala Glu Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Ser Thr Glu Gln
660 665 670
Glu Gln Asp Ala Glu Glu Asn Gly Val Thr Gly Val Ser Gly Pro Gly
675 680 685
Lys Glu Ala Lys Gln Met Glu Asn Gly Met Leu Val Thr Asp Ser Ala
690 695 700
Gly Lys Gln Leu Gln Arg Gln Leu Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Gly
705 710 715 720
Asp Ile Ser Arg His His Asn Ser Thr Ala Glu Leu Gln Lys Ala Glu
725 730 735
Ala Lys Lys Glu Glu Thr Trp Lys Leu Met Glu Ala Asp Lys Ala Gln
740 745 750
Thr Gly Gln Val Lys Leu Ser Val Tyr Trp Asp Tyr Met Lys Ala Ile
755 760 765
Gly Leu Phe Ile Ser Phe Leu Ser Ile Phe Leu Phe Met Cys Asn His
770 775 780
Val Ser Ala Leu Ala Ser Asn Tyr Trp Leu Ser Leu Trp Thr Asp Asp
785 790 795 800
Pro Ile Val Asn Gly Thr Gln Glu His Thr Lys Val Arg Leu Ser Val
805 810 815
Tyr Gly Ala Leu Gly Ile Ser Gln Gly Ile Ala Val Phe Gly Tyr Ser
820 825 830
Met Ala Val Ser Ile Gly Gly Ile Leu Ala Ser Arg Cys Leu His Val
835 840 845
Asp Leu Leu His Ser Ile Leu Arg Ser Pro Met Ser Phe Phe Glu Arg
850 855 860
Thr Pro Ser Gly Asn Leu Val Asn Arg Phe Ser Lys Glu Leu Asp Thr
865 870 875 880
Val Asp Ser Met Ile Pro Glu Val Ile Lys Met Phe Met Gly Ser Leu
885 890 895
Phe Asn Val Ile Gly Ala Cys Ile Val Ile Leu Leu Ala Thr Pro Ile
900 905 910
Ala Ala Ile Ile Ile Pro Pro Leu Gly Leu Ile Tyr Phe Phe Val Gln
915 920 925
Arg Phe Tyr Val Ala Ser Ser Arg Gln Leu Lys Arg Leu Glu Ser Val
930 935 940
Ser Arg Ser Pro Val Tyr Ser His Phe Asn Glu Thr Leu Leu Gly Val
945 950 955 960
Ser Val Ile Arg Ala Phe Glu Glu Gln Glu Arg Phe Ile His Gln Ser
965 970 975
Asp Leu Lys Val Asp Glu Asn Gln Lys Ala Tyr Tyr Pro Ser Ile Val
980 985 990
Ala Asn Arg Trp Leu Ala Val Arg Leu Glu Cys Val Gly Asn Cys Ile
995 1000 1005
Val Leu Phe Ala Ala Leu Phe Ala Val Ile Ser Arg His Ser Leu
1010 1015 1020
Ser Ala Gly Leu Val Gly Leu Ser Val Ser Tyr Ser Leu Gln Val
1025 1030 1035
Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Val Arg Met Ser Ser Glu Met Glu
1040 1045 1050
Thr Asn Ile Val Ala Val Glu Arg Leu Lys Glu Tyr Ser Glu Thr
1055 1060 1065
Glu Lys Glu Ala Pro Trp Gln Ile Gln Glu Thr Ala Pro Pro Ser
1070 1075 1080
Ser Trp Pro Gln Val Gly Arg Val Glu Phe Arg Asn Tyr Cys Leu
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Arg Tyr Arg Glu Asp Leu Asp Phe Val Leu Arg His Ile Asn Val
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Thr Ile Asn Gly Gly Glu Lys Val Gly Ile Val Gly Arg Thr Gly
1115 1120 1125
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1190 1195 1200
Ala His Leu Lys Asp Phe Val Ser Ala Leu Pro Asp Lys Leu Asp
1205 1210 1215
His Glu Cys Ala Glu Gly Gly Glu Asn Leu Ser Val Gly Gln Arg
1220 1225 1230
Gln Leu Val Cys Leu Ala Arg Ala Leu Leu Arg Lys Thr Lys Ile
1235 1240 1245
Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ala Val Asp Leu Glu Thr Asp
1250 1255 1260
Asp Leu Ile Gln Ser Thr Ile Arg Thr Gln Phe Glu Asp Cys Thr
1265 1270 1275
Val Leu Thr Ile Ala His Arg Leu Asn Thr Ile Met Asp Tyr Thr
1280 1285 1290
Arg Val Ile Val Leu Asp Lys Gly Glu Ile Gln Glu Tyr Gly Ala
1295 1300 1305
Pro Ser Asp Leu Leu Gln Gln Arg Gly Leu Phe Tyr Ser Met Ala
1310 1315 1320
Lys Asp Ala Gly Leu Val
1325
<210> 158
<211> 1531
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 158
Met Ala Leu Arg Gly Phe Cys Ser Ala Asp Gly Ser Asp Pro Leu Trp
1 5 10 15
Asp Trp Asn Val Thr Trp Tyr Thr Ser Asn Pro Asp Phe Thr Lys Cys
20 25 30
Phe Gln Asn Thr Val Leu Val Trp Val Pro Cys Phe Tyr Leu Trp Ala
35 40 45
Cys Phe Pro Phe Tyr Phe Leu Tyr Leu Ser Arg His Asp Arg Gly Tyr
50 55 60
Ile Gln Met Thr Leu Leu Asn Lys Thr Lys Thr Ala Leu Gly Phe Leu
65 70 75 80
Leu Trp Ile Val Cys Trp Ala Asp Leu Phe Tyr Ser Phe Trp Glu Arg
85 90 95
Ser Arg Gly Ile Phe Leu Ala Pro Val Phe Leu Val Ser Pro Thr Leu
100 105 110
Leu Gly Ile Thr Met Leu Leu Ala Thr Phe Leu Ile Gln Leu Glu Arg
115 120 125
Arg Lys Gly Val Gln Ser Ser Gly Ile Met Leu Thr Phe Trp Leu Val
130 135 140
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ala Ile Leu Arg Ser Lys Ile Met Thr Ala
145 150 155 160
Leu Lys Glu Asp Val Gln Val Asp Leu Phe Arg Asp Met Thr Phe Tyr
165 170 175
Val Tyr Phe Ser Leu Val Leu Ile Gln Leu Val Leu Ser Cys Phe Ser
180 185 190
Asp Arg Ser Pro Leu Phe Ser Glu Thr Ile His Asp Pro Asn Pro Cys
195 200 205
Pro Glu Ser Ser Ala Ser Phe Leu Ser Arg Ile Thr Phe Trp Trp Ile
210 215 220
Thr Gly Leu Ile Val Arg Gly Tyr Arg Gln Pro Leu Glu Gly Ser Asp
225 230 235 240
Leu Trp Ser Leu Asn Lys Glu Asp Thr Ser Glu Gln Val Val Pro Val
245 250 255
Leu Val Lys Asn Trp Lys Lys Glu Cys Ala Lys Thr Arg Lys Gln Pro
260 265 270
Val Lys Val Val Tyr Ser Ser Lys Asp Pro Ala Gln Pro Lys Asp Ser
275 280 285
Ser Lys Val Asp Ala Asn Glu Glu Val Glu Ala Leu Ile Val Lys Ser
290 295 300
Pro Gln Lys Glu Trp Asn Pro Ser Leu Phe Lys Val Leu Tyr Lys Thr
305 310 315 320
Phe Gly Pro Tyr Phe Leu Met Ser Phe Phe Phe Lys Ala Ile His Asp
325 330 335
Leu Met Met Phe Ser Gly Pro Glu Ile Leu Lys Leu Leu Ile Asn Phe
340 345 350
Val Asn Asp Thr Lys Ala Pro Asp Trp Gln Gly Tyr Phe Tyr Thr Ala
355 360 365
Leu Leu Phe Val Ala Ala Cys Leu Gln Thr Leu Val Leu His Gln Tyr
370 375 380
Phe His Ile Cys Phe Val Ser Gly Met Arg Ile Lys Thr Ala Val Ile
385 390 395 400
Gly Ala Val Tyr Arg Lys Ala Leu Val Ile Thr Asn Ala Ala Arg Lys
405 410 415
Ser Ser Thr Val Gly Glu Ile Val Asn Leu Met Ser Val Asp Ala Gln
420 425 430
Arg Phe Met Asp Leu Ala Thr Tyr Ile Asn Met Ile Trp Ser Ala Pro
435 440 445
Leu Gln Val Ile Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Trp Arg Asn Leu Gly Pro
450 455 460
Pro Ile Leu Ala Gly Val Ala Val Met Val Leu Met Val Pro Val Asn
465 470 475 480
Ala Val Met Ala Met Lys Thr Lys Thr Tyr Gln Val Ala His Met Lys
485 490 495
Ser Lys Asp Asn Arg Ile Lys Leu Met Asn Glu Ile Leu Asn Gly Ile
500 505 510
Lys Val Leu Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Leu Ala Phe Lys Asp Lys Val
515 520 525
Leu Ala Ile Arg Gln Glu Glu Leu Lys Val Leu Lys Lys Ser Ala Tyr
530 535 540
Leu Ala Ala Val Gly Thr Phe Thr Trp Val Cys Thr Pro Phe Leu Val
545 550 555 560
Ala Leu Cys Thr Phe Ala Val Tyr Val Thr Ile Asp Lys Asn Asn Val
565 570 575
Leu Asp Ala Gln Lys Ala Phe Val Ser Leu Ala Leu Phe Asn Ile Leu
580 585 590
Arg Phe Pro Leu Asn Ile Leu Pro Met Val Ile Ser Ser Ile Val Gln
595 600 605
Ala Ser Val Ser Leu Lys Arg Leu Arg Ile Phe Leu Ser His Glu Glu
610 615 620
Leu Glu Pro Asp Ser Ile Glu Arg Arg Pro Val Lys Asp Gly Gly Asp
625 630 635 640
Thr Asn Ser Ile Thr Val Arg Asn Ala Thr Phe Thr Trp Ala Arg Ser
645 650 655
Asp Pro Pro Thr Leu Asn Gly Ile Thr Phe Ser Ile Pro Glu Gly Ala
660 665 670
Leu Val Ala Val Val Gly Gln Val Gly Cys Gly Lys Ser Ser Leu Leu
675 680 685
Ser Ala Leu Leu Ala Glu Met Asp Lys Val Glu Gly His Val Ala Leu
690 695 700
Lys Gly Ser Val Ala Tyr Val Pro Gln Gln Ala Trp Ile Gln Asn Asp
705 710 715 720
Ser Leu Gln Glu Asn Ile Leu Phe Gly Cys Gln Leu Glu Glu Pro Tyr
725 730 735
Tyr Arg Ser Val Ile Gln Ala Cys Ala Leu Leu Pro Asp Leu Glu Ile
740 745 750
Leu Pro Ser Gly Asp Arg Thr Glu Ile Gly Glu Lys Gly Val Asn Leu
755 760 765
Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val Ser Leu Ala Arg Ala Val Tyr Cys
770 775 780
Asn Ala Asp Ile Tyr Leu Phe Asp Asp Pro Leu Ser Ala Val Asp Ala
785 790 795 800
His Val Gly Lys His Ile Phe Glu Asn Val Ile Gly Pro Lys Gly Met
805 810 815
Leu Lys Asn Lys Thr Arg Ile Leu Val Thr His Ser Met Ser Tyr Leu
820 825 830
Pro Gln Val Asp Val Ile Ile Val Met Ser Gly Gly Lys Ile Ser Glu
835 840 845
Met Gly Ser Tyr Gln Glu Leu Leu Ala Arg Asp Gly Ala Phe Ala Glu
850 855 860
Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Ser Ala Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu Asp
865 870 875 880
Asn Gly Val Thr Gly Val Ser Gly Pro Gly Lys Glu Ala Lys Gln Met
885 890 895
Glu Asn Gly Met Leu Val Thr Asp Ser Ala Gly Lys Gln Leu Gln Arg
900 905 910
Gln Leu Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Gly Asp Val Ser Arg Gln His
915 920 925
Asn Ser Thr Ala Glu Leu Gln Lys Asp Gly Ala Lys Lys Glu Glu Thr
930 935 940
Trp Lys Leu Met Glu Ala Asp Lys Ala Gln Thr Gly Gln Val Lys Leu
945 950 955 960
Ser Val Tyr Trp Asp Tyr Met Lys Ala Ile Gly Leu Phe Ile Ser Phe
965 970 975
Leu Ser Ile Phe Leu Phe Ile Cys Asn His Val Ala Ala Leu Ala Ser
980 985 990
Asn Tyr Trp Leu Ser Leu Trp Thr Asp Asp Pro Ile Val Asn Gly Thr
995 1000 1005
Gln Glu His Thr Lys Val Arg Leu Ser Val Tyr Gly Ala Leu Gly
1010 1015 1020
Ile Ser Gln Gly Ile Ala Val Phe Gly Tyr Ser Met Ala Val Ser
1025 1030 1035
Ile Gly Gly Ile Leu Ala Ser Arg Cys Leu His Val Asp Leu Leu
1040 1045 1050
His Ser Ile Leu Arg Ser Pro Met Ser Phe Phe Glu Arg Thr Pro
1055 1060 1065
Ser Gly Asn Leu Val Asn Arg Phe Ser Lys Glu Leu Asp Thr Val
1070 1075 1080
Asp Ser Met Ile Pro Glu Val Ile Lys Met Phe Met Gly Ser Leu
1085 1090 1095
Phe Asn Val Ile Gly Ala Cys Ile Val Ile Leu Leu Ala Thr Pro
1100 1105 1110
Ile Ala Ala Ile Ile Ile Pro Pro Leu Gly Leu Ile Tyr Phe Phe
1115 1120 1125
Val Gln Arg Phe Tyr Val Ala Ser Ser Arg Gln Leu Lys Arg Leu
1130 1135 1140
Glu Ser Val Ser Arg Ser Pro Val Tyr Ser His Phe Asn Glu Thr
1145 1150 1155
Leu Leu Gly Val Ser Val Ile Arg Ala Phe Glu Glu Gln Glu Arg
1160 1165 1170
Phe Ile His Gln Ser Asp Leu Lys Val Asp Glu Asn Gln Lys Ala
1175 1180 1185
Tyr Tyr Pro Ser Ile Val Ala Asn Arg Trp Leu Ala Val Arg Leu
1190 1195 1200
Glu Cys Val Gly Asn Cys Ile Val Leu Phe Ala Ala Leu Phe Ala
1205 1210 1215
Val Ile Ser Arg His Ser Leu Ser Ala Gly Leu Val Gly Leu Ser
1220 1225 1230
Val Ser Tyr Ser Leu Gln Val Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Val
1235 1240 1245
Arg Met Ser Ser Glu Met Glu Thr Asn Ile Val Ala Val Glu Arg
1250 1255 1260
Leu Lys Glu Tyr Ser Glu Thr Glu Lys Glu Ala Pro Trp Gln Ile
1265 1270 1275
Gln Glu Thr Ala Pro Pro Ser Asn Trp Pro Gln Val Gly Arg Val
1280 1285 1290
Glu Phe Arg Asn Tyr Cys Leu Arg Tyr Arg Glu Asp Leu Asp Phe
1295 1300 1305
Val Leu Arg His Ile Asn Val Thr Ile Asn Gly Gly Glu Lys Val
1310 1315 1320
Gly Ile Val Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Ser Leu Thr Leu
1325 1330 1335
Gly Leu Phe Arg Ile Asn Glu Ser Ala Glu Gly Glu Ile Ile Ile
1340 1345 1350
Asp Gly Ile Asn Ile Ala Arg Ile Gly Leu His Asp Leu Arg Phe
1355 1360 1365
Lys Ile Thr Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Ser Gly Ser
1370 1375 1380
Leu Arg Met Asn Leu Asp Pro Phe Ser Gln Tyr Ser Asp Glu Glu
1385 1390 1395
Val Trp Thr Ser Leu Glu Leu Ala His Leu Lys Gly Phe Val Ser
1400 1405 1410
Ala Leu Pro Asp Lys Leu Asp His Glu Cys Ala Glu Gly Gly Glu
1415 1420 1425
Asn Leu Ser Val Gly Gln Arg Gln Leu Val Cys Leu Ala Arg Ala
1430 1435 1440
Leu Leu Arg Lys Thr Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala
1445 1450 1455
Ala Val Asp Leu Glu Thr Asp Asp Leu Ile Gln Ser Thr Ile Arg
1460 1465 1470
Thr Gln Phe Glu Asp Cys Thr Val Leu Thr Ile Ala His Arg Leu
1475 1480 1485
Asn Thr Ile Met Asp Tyr Thr Arg Val Ile Val Leu Asp Lys Gly
1490 1495 1500
Glu Ile Gln Glu Tyr Gly Ala Pro Ser Asp Leu Leu Gln Gln Arg
1505 1510 1515
Gly Leu Phe Tyr Asn Met Ala Arg Asp Ala Gly Leu Val
1520 1525 1530
<210> 159
<211> 1329
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 159
Met Asp Pro Asn Pro Cys Pro Glu Ser Ser Ala Ser Phe Leu Ser Arg
1 5 10 15
Ile Thr Phe Trp Trp Ile Thr Gly Leu Ile Val Arg Gly Tyr Arg Gln
20 25 30
Pro Leu Glu Gly Ser Asp Leu Trp Ser Leu Asn Lys Glu Asp Thr Ser
35 40 45
Glu Gln Val Val Pro Val Leu Val Lys Asn Trp Lys Lys Glu Cys Ala
50 55 60
Lys Thr Arg Lys Gln Pro Val Lys Val Val Tyr Ser Ser Lys Asp Pro
65 70 75 80
Ala Gln Pro Lys Asp Ser Ser Lys Val Asp Ala Asn Glu Glu Val Glu
85 90 95
Ala Leu Ile Val Lys Ser Pro Gln Lys Glu Trp Asn Pro Ser Leu Phe
100 105 110
Lys Val Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Pro Tyr Phe Leu Met Ser Phe Phe
115 120 125
Phe Lys Ala Ile His Asp Leu Met Met Phe Ser Gly Pro Glu Ile Leu
130 135 140
Lys Leu Leu Ile Asn Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Pro Asp Trp Gln
145 150 155 160
Gly Tyr Phe Tyr Thr Ala Leu Leu Phe Val Ala Ala Cys Leu Gln Thr
165 170 175
Leu Val Leu His Gln Tyr Phe His Ile Cys Phe Val Ser Gly Met Arg
180 185 190
Ile Lys Thr Ala Val Ile Gly Ala Val Tyr Arg Lys Ala Leu Val Ile
195 200 205
Thr Asn Ala Ala Arg Lys Ser Ser Thr Val Gly Glu Ile Val Asn Leu
210 215 220
Met Ser Val Asp Ala Gln Arg Phe Met Asp Leu Ala Thr Tyr Ile Asn
225 230 235 240
Met Ile Trp Ser Ala Pro Leu Gln Val Ile Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
245 250 255
Trp Arg Asn Leu Gly Pro Pro Ile Leu Ala Gly Val Ala Val Met Val
260 265 270
Leu Met Val Pro Val Asn Ala Val Met Ala Met Lys Thr Lys Thr Tyr
275 280 285
Gln Val Ala His Met Lys Ser Lys Asp Asn Arg Ile Lys Leu Met Asn
290 295 300
Glu Ile Leu Asn Gly Ile Lys Val Leu Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Leu
305 310 315 320
Ala Phe Lys Asp Lys Val Leu Ala Ile Arg Gln Glu Glu Leu Lys Val
325 330 335
Leu Lys Lys Ser Ala Tyr Leu Ala Ala Val Gly Thr Phe Thr Trp Val
340 345 350
Cys Thr Pro Phe Leu Val Ala Leu Cys Thr Phe Ala Val Tyr Val Thr
355 360 365
Ile Asp Lys Asn Asn Val Leu Asp Ala Gln Lys Ala Phe Val Ser Leu
370 375 380
Ala Leu Phe Asn Ile Leu Arg Phe Pro Leu Asn Ile Leu Pro Met Val
385 390 395 400
Ile Ser Ser Ile Val Gln Ala Ser Val Ser Leu Lys Arg Leu Arg Ile
405 410 415
Phe Leu Ser His Glu Glu Leu Glu Pro Asp Ser Ile Glu Arg Arg Pro
420 425 430
Val Lys Asp Gly Gly Asp Thr Asn Ser Ile Thr Val Arg Asn Ala Thr
435 440 445
Phe Thr Trp Ala Arg Ser Asp Pro Pro Thr Leu Asn Gly Ile Thr Phe
450 455 460
Ser Ile Pro Glu Gly Ala Leu Val Ala Val Val Gly Gln Val Gly Cys
465 470 475 480
Gly Lys Ser Ser Leu Leu Ser Ala Leu Leu Ala Glu Met Asp Lys Val
485 490 495
Glu Gly His Val Ala Leu Lys Gly Ser Val Ala Tyr Val Pro Gln Gln
500 505 510
Ala Trp Ile Gln Asn Asp Ser Leu Gln Glu Asn Ile Leu Phe Gly Cys
515 520 525
Gln Leu Glu Glu Pro Tyr Tyr Arg Ser Val Ile Gln Ala Cys Ala Leu
530 535 540
Leu Pro Asp Leu Glu Ile Leu Pro Ser Gly Asp Arg Thr Glu Ile Gly
545 550 555 560
Glu Lys Gly Val Asn Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val Ser Leu
565 570 575
Ala Arg Ala Val Tyr Cys Asn Ala Asp Ile Tyr Leu Phe Asp Asp Pro
580 585 590
Leu Ser Ala Val Asp Ala His Val Gly Lys His Ile Phe Glu Asn Val
595 600 605
Ile Gly Pro Lys Gly Met Leu Lys Asn Lys Thr Arg Ile Leu Val Thr
610 615 620
His Ser Met Ser Tyr Leu Pro Gln Val Asp Val Ile Ile Val Met Ser
625 630 635 640
Gly Gly Lys Ile Ser Glu Met Gly Ser Tyr Gln Glu Leu Leu Ala Arg
645 650 655
Asp Gly Ala Phe Ala Glu Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Ser Ala Glu Gln
660 665 670
Glu Gln Asp Pro Glu Asp Asn Gly Val Thr Gly Val Ser Gly Pro Gly
675 680 685
Lys Glu Ala Lys Gln Met Glu Asn Gly Met Leu Val Thr Asp Ser Ala
690 695 700
Gly Lys Gln Leu Gln Arg Gln Leu Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Gly
705 710 715 720
Asp Val Ser Arg Gln His Asn Ser Thr Ala Glu Leu Gln Lys Asp Gly
725 730 735
Ala Lys Lys Glu Glu Thr Trp Lys Leu Met Glu Ala Asp Lys Ala Gln
740 745 750
Thr Gly Gln Val Lys Leu Ser Val Tyr Trp Asp Tyr Met Lys Ala Ile
755 760 765
Gly Leu Phe Ile Ser Phe Leu Ser Ile Phe Leu Phe Ile Cys Asn His
770 775 780
Val Ala Ala Leu Ala Ser Asn Tyr Trp Leu Ser Leu Trp Thr Asp Asp
785 790 795 800
Pro Ile Val Asn Gly Thr Gln Glu His Thr Lys Val Arg Leu Ser Val
805 810 815
Tyr Gly Ala Leu Gly Ile Ser Gln Gly Ile Ala Val Phe Gly Tyr Ser
820 825 830
Met Ala Val Ser Ile Gly Gly Ile Leu Ala Ser Arg Cys Leu His Val
835 840 845
Asp Leu Leu His Ser Ile Leu Arg Ser Pro Met Ser Phe Phe Glu Arg
850 855 860
Thr Pro Ser Gly Asn Leu Val Asn Arg Phe Ser Lys Glu Leu Asp Thr
865 870 875 880
Val Asp Ser Met Ile Pro Glu Val Ile Lys Met Phe Met Gly Ser Leu
885 890 895
Phe Asn Val Ile Gly Ala Cys Ile Val Ile Leu Leu Ala Thr Pro Ile
900 905 910
Ala Ala Ile Ile Ile Pro Pro Leu Gly Leu Ile Tyr Phe Phe Val Gln
915 920 925
Arg Phe Tyr Val Ala Ser Ser Arg Gln Leu Lys Arg Leu Glu Ser Val
930 935 940
Ser Arg Ser Pro Val Tyr Ser His Phe Asn Glu Thr Leu Leu Gly Val
945 950 955 960
Ser Val Ile Arg Ala Phe Glu Glu Gln Glu Arg Phe Ile His Gln Ser
965 970 975
Asp Leu Lys Val Asp Glu Asn Gln Lys Ala Tyr Tyr Pro Ser Ile Val
980 985 990
Ala Asn Arg Trp Leu Ala Val Arg Leu Glu Cys Val Gly Asn Cys Ile
995 1000 1005
Val Leu Phe Ala Ala Leu Phe Ala Val Ile Ser Arg His Ser Leu
1010 1015 1020
Ser Ala Gly Leu Val Gly Leu Ser Val Ser Tyr Ser Leu Gln Val
1025 1030 1035
Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Val Arg Met Ser Ser Glu Met Glu
1040 1045 1050
Thr Asn Ile Val Ala Val Glu Arg Leu Lys Glu Tyr Ser Glu Thr
1055 1060 1065
Glu Lys Glu Ala Pro Trp Gln Ile Gln Glu Thr Ala Pro Pro Ser
1070 1075 1080
Asn Trp Pro Gln Val Gly Arg Val Glu Phe Arg Asn Tyr Cys Leu
1085 1090 1095
Arg Tyr Arg Glu Asp Leu Asp Phe Val Leu Arg His Ile Asn Val
1100 1105 1110
Thr Ile Asn Gly Gly Glu Lys Val Gly Ile Val Gly Arg Thr Gly
1115 1120 1125
Ala Gly Lys Ser Ser Leu Thr Leu Gly Leu Phe Arg Ile Asn Glu
1130 1135 1140
Ser Ala Glu Gly Glu Ile Ile Ile Asp Gly Ile Asn Ile Ala Arg
1145 1150 1155
Ile Gly Leu His Asp Leu Arg Phe Lys Ile Thr Ile Ile Pro Gln
1160 1165 1170
Asp Pro Val Leu Phe Ser Gly Ser Leu Arg Met Asn Leu Asp Pro
1175 1180 1185
Phe Ser Gln Tyr Ser Asp Glu Glu Val Trp Thr Ser Leu Glu Leu
1190 1195 1200
Ala His Leu Lys Gly Phe Val Ser Ala Leu Pro Asp Lys Leu Asp
1205 1210 1215
His Glu Cys Ala Glu Gly Gly Glu Asn Leu Ser Val Gly Gln Arg
1220 1225 1230
Gln Leu Val Cys Leu Ala Arg Ala Leu Leu Arg Lys Thr Lys Ile
1235 1240 1245
Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ala Val Asp Leu Glu Thr Asp
1250 1255 1260
Asp Leu Ile Gln Ser Thr Ile Arg Thr Gln Phe Glu Asp Cys Thr
1265 1270 1275
Val Leu Thr Ile Ala His Arg Leu Asn Thr Ile Met Asp Tyr Thr
1280 1285 1290
Arg Val Ile Val Leu Asp Lys Gly Glu Ile Gln Glu Tyr Gly Ala
1295 1300 1305
Pro Ser Asp Leu Leu Gln Gln Arg Gly Leu Phe Tyr Asn Met Ala
1310 1315 1320
Arg Asp Ala Gly Leu Val
1325
<210> 160
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 160
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 161
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 161
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 162
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 162
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 163
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 164
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 164
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 165
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 165
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 166
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 166
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 167
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 167
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 168
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> SITE
<222> (3)..(15)
<223> Each amino acid at positions 3 to 15 is either present or absent
<400> 168
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 169
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 169
Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 170
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 171
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 172
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 172
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 173
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 174
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 174
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 175
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 175
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 176
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 176
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
165 170 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro
180 185 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
210 215 220
Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 177
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 177
Asp Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 178
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 178
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 179
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 179
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 180
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 180
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 181
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 182
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 182
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 183
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 183
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 184
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 184
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Cys
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Cys Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys

Claims (55)

1.一种与哺乳动物细胞表面的ATP结合盒亚家族C成员1(ABCC1)特异性结合的抗体，其中，所述抗体与包含以下区域的抗体竞争与ABCC1结合：
表2所列抗体的一对重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的重链互补决定区1-3(HCDR1-3)和轻链CDR 1-3(LCDR 1-3)。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体包含表2所列抗体VH区的HCDR1-3。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中，所述抗体包含表2所列抗体VL区的LCDR1-3。
4.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体包含：
表2所列抗体的一对重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的重链互补决定区(HCDR)和轻链CDR(LCDR)。
5.一种与哺乳动物细胞表面的ATP结合盒亚家族C成员1(ABCC1)特异性结合的抗体分子。
6.根据权利要求5所述的抗体分子，其中，所述抗体包含：
(a)一个重链可变(VH)区，包含表2所列抗体VH区的重链互补决定区1-3(HCDR 1-3)；
(b)一个轻链可变(VL)区，包含表2所列抗体VL区的轻链CDR 1-3(LCDR 1-3)；
(c)一个VH区，包含表2所列抗体VH区的HCDR 1-3，以及一个VL区，包含表2所列抗体VL区的LCDR 1-3；或
(d)一个VH区，包含表2所列抗体VH区的HCDR 1-3，以及一个VL区，包含所述抗体VL区的LCDR 1-3。
7.根据权利要求6所述的抗体分子，其中，所述抗体包含表2所列抗体的一对VH区和VL区的HCDR 1-3和LCDR 1-3。
8.根据权利要求6所述的抗体，其中，所述抗体包含表2所列一抗VH区的HCDR1-3。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中，所述抗体包含表2所列二抗VL区的LCDR1-3。
10.根据权利要求6所述的抗体分子，其中，所述抗体分子包含表2所列抗体的可变轻链(VL)和/或可变重链(VH)。
11.根据权利要求5所述的抗体分子，其中，所述抗体包含：
i.一个重链可变(VH)区，包含表2所列C1.831.hu41抗体、C1.831.hu11抗体、C1.844.hu21抗体、C1.851.hu15抗体、C1.851.hu12抗体或C1.861.hu11抗体的VH区的重链互补决定区1-3(HCDR 1-3)；
ii.一个轻链可变(VL)区，包含表2所列C1.831.hu41抗体、C1.831.hu11抗体、C1.844.hu21抗体、C1.851.hu15抗体、C1.851.hu12抗体或C1.861.hu11抗体的VL区的轻链CDR 1-3(LCDR 1-3)；
iii.一个VH区，包含表2所列C1.831.hu41抗体、C1.831.hu11抗体、C1.844.hu21抗体、C1.851.hu15抗体、C1.851.hu12抗体或C1.861.hu11抗体的VH区的HCDR 1-3；以及一个VL区，包含表2所列C1.831.hu41抗体、C1.831.hu11抗体、C1.844.hu21抗体、C1.851.hu15抗体、C1.851.hu12抗体或C1.861.hu11抗体的VL区的LCDR 1-3；
iv.一个VH区和一个VL区，分别包含表2所列C1.831.hu41抗体、C1.831.hu11抗体、C1.844.hu21抗体、C1.851.hu15抗体、C1.851.hu12抗体或C1.861.hu11抗体的VH区和VL区的HCDR 1-3和LCDR 1-3；或
v.表2所列C1.831.hu41抗体、C1.831.hu11抗体、C1.844.hu21抗体、C1.851.hu15抗体、C1.851.hu12抗体或C1.861.hu11抗体的VH区和VL区。
12.根据权利要求5所述的抗体分子，其中，所述抗体包含：
i.一个VH区，包含表2所列C1.830B.hu11抗体、C1.851.hu11抗体、C1.851.hu13抗体、C1.787a.hu11抗体、C1.844.hu11抗体、C1.861.hu21抗体、C1.861.hu41抗体、C1.861.hu61抗体或C1.851.hu14抗体的VH区的HCDR 1-3；
ii.一个VL区，包含表2所列C1.830B.hu11抗体、C1.851.hu11抗体、C1.851.hu13抗体、C1.787a.hu11抗体、C1.844.hu11抗体、C1.861.hu21抗体、C1.861.hu41抗体、C1.861.hu61抗体或C1.851.hu14抗体的VL区的LCDR 1-3；
iii.一个VH区，包含表2所列C1.830B.hu11抗体、C1.851.hu11抗体、C1.851.hu13抗体、C1.787a.hu11抗体、C1.844.hu11抗体、C1.861.hu21抗体、C1.861.hu41抗体、C1.861.hu61抗体或C1.851.hu14抗体的VH区的HCDR 1-3；以及一个VL区，包含表2所列C1.830B.hu11抗体、C1.851.hu11抗体、C1.851.hu13抗体、C1.787a.hu11抗体、C1.844.hu11抗体、C1.861.hu21抗体、C1.861.hu41抗体、C1.861.hu61抗体或C1.851.hu14抗体的VL区的LCDR1-3；
iv.一个VH区和一个VL区，分别包含表2所列C1.830B.hu11抗体、C1.851.hu11抗体、C1.851.hu13抗体、C1.787a.hu11抗体、C1.844.hu11抗体、C1.861.hu21抗体、C1.861.hu41抗体、C1.861.hu61抗体或C1.851.hu14抗体的VH区和VL区的HCDR 1-3和LCDR 1-3；或
v.表2所列C1.830B.hu11抗体、C1.851.hu11抗体、C1.851.hu13抗体、C1.787a.hu11抗体、C1.844.hu11抗体、C1.861.hu21抗体、C1.861.hu41抗体、C1.861.hu61抗体或C1.851.hu14抗体的VH区和VL区。
13.根据权利要求5所述的抗体分子，其中，所述抗体包含：
i.一个VH区，包含表2所列C1.773抗体、C1.773a抗体、C1.777a抗体、C1.784a抗体、C1.786a抗体、C1.787a抗体、C1.827抗体、C1.830B抗体、C1.831抗体、C1.835抗体、C1.841抗体、C1.844抗体、C1.845抗体、C1.847抗体、C1.851抗体、C1.855抗体、C1.861抗体、C1.863抗体、C1.876抗体、C1.877抗体或C1.879A抗体的VH区的HCDR 1-3；
ii.一个VL区，包含表2所列C1.773抗体、C1.773a抗体、C1.777a抗体、C1.784a抗体、C1.786a抗体、C1.787a抗体、C1.827抗体、C1.830B抗体、C1.831抗体、C1.835抗体、C1.841抗体、C1.844抗体、C1.845抗体、C1.847抗体、C1.851抗体、C1.855抗体、C1.861抗体、C1.863抗体、C1.876抗体、C1.877抗体或C1.879A抗体的VL区的LCDR 1-3；
iii.一个VH区，包含表2所列C1.773抗体、C1.773a抗体、C1.777a抗体、C1.784a抗体、C1.786a抗体、C1.787a抗体、C1.827抗体、C1.830B抗体、C1.831抗体、C1.835抗体、C1.841抗体、C1.844抗体、C1.845抗体、C1.847抗体、C1.851抗体、C1.855抗体、C1.861抗体、C1.863抗体、C1.876抗体、C1.877抗体或C1.879A抗体的VH区的HCDR 1-3；以及一个VL区，包含表2所列C1.773抗体、C1.773a抗体、C1.777a抗体、C1.784a抗体、C1.786a抗体、C1.787a抗体、C1.827抗体、C1.830B抗体、C1.831抗体、C1.835抗体、C1.841抗体、C1.844抗体、C1.845抗体、C1.847抗体、C1.851抗体、C1.855抗体、C1.861抗体、C1.863抗体、C1.876抗体、C1.877抗体或C1.879A抗体的VL区的LCDR 1-3；
iv.一个VH区和一个VL区，分别包含表2所列C1.773抗体、773a抗体、777a抗体、784a抗体、786a抗体、787a抗体、C1.827抗体、C1.830B抗体、C1.831抗体、C1.835抗体、C1.841抗体、C1.844抗体、C1.845抗体、C1.847抗体、C1.851抗体、C1.855抗体、C1.861抗体、C1.863抗体、C1.876抗体、C1.877抗体或C1.879A抗体的VH区和VL区的HCDR 1-3和LCDR 1-3；或
v.表2所列C1.773抗体、773a抗体、777a抗体、784a抗体、786a抗体、787a抗体、C1.827抗体、C1.830B抗体、C1.831抗体、C1.835抗体、C1.841抗体、C1.844抗体、C1.845抗体、C1.847抗体、C1.851抗体、C1.855抗体、C1.861抗体、C1.863抗体、C1.876抗体、C1.877抗体或C1.879A抗体的VH区和VL区。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体包含一个人IgG Fc区。
15.根据权利要求11-13中任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体包含一个人IgG1Fc区。
16.根据权利要求11-13中任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体包含人IgG1重链恒定区和轻链恒定区。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体在与表达ABCC1的细胞结合时，通过ABCC1抑制外排。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体包含一个人源化轻链。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体包含一个人源化重链。
20.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体选自双特异性抗体、Ig单体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、scFv、scAb、dAb和Fv。
21.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体为双特异性抗体，其中包含权利要求1-20中任一项所述的VH区和VL区，并进一步包含一个第二VH区，其中包含与肿瘤相关抗原(TAA)结合的抗体的HCDR 1-3。
22.根据权利要求21所述的抗体分子，其中，所述抗体包含一个第二VL区，其中，所述第二VH区和第二VL区与TAA结合。
23.根据权利要求22所述的抗体分子，其中，所述第二VH区和所述第二VL区存在于单一多肽中。
24.根据权利要求22所述的抗体分子，其中，所述第二VH区和所述第二VL区存在于scFv中。
25.根据权利要求21所述的抗体分子，其中，所述抗体包含一个通用轻链，其中，所述通用轻链包含权利要求1-20中任一项所述的VL区。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的抗体分子，其中，所述TAA为PD-L1。
27.根据权利要求26所述的抗体分子，其中，与PD-L1结合的所述抗体为阿特珠单抗。
28.根据权利要求27所述的抗体分子，其中，所述双特异性抗体包含：一个VH区和一个VL区，分别包含表2所列C1.844抗体或C1.851抗体的VH区和VL区的HCDR1-3和LCDR 1-3；以及一个scFv，包含阿特珠单抗的HCDR 1-3和LCDR 1-3。
29.根据权利要求27所述的抗体分子，其中，所述双特异性抗体包含：表2所列C1.844.hu21抗体或C1.851.hu12抗体的一个VH区和一个VL区；以及一个scFv，包含阿特珠单抗的HCDR 1-3和LCDR 1-3。
30.根据权利要求21-25中任一项所述的抗体分子，其中，所述TAA为ErbB2(HER2)。
31.根据权利要求30所述的抗体分子，其中，与ErbB2结合的所述抗体为曲妥珠单抗。
32.根据权利要求31所述的抗体分子，其中，所述双特异性抗体包含：一个VH区和一个VL区，分别包含表2所列C1.844抗体、C1.831抗体或C1.851抗体的VH区和VL区的HCDR 1-3和LCDR 1-3；以及一个scFv，包含曲妥珠单抗的HCDR 1-3和LCDR1-3。
33.根据权利要求31所述的抗体分子，其中，所述双特异性抗体包含：表2所列C1.844hu21抗体、C1.831hu11抗体或C1.851hu12抗体的一个VH区和一个VL区；以及一个scFv，包含曲妥珠单抗的HCDR 1-3和LCDR 1-3。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体包含存在于独立多肽中的一个VL区和一个VH区。
35.根据权利要求1-33中任一项所述的抗体分子，其中，所述抗体包含存在于单一多肽中的一个VH区和一个VL区。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的抗体分子用于治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者给予所述抗体。
37.根据权利要求36所述应用的抗体分子，其中，所述方法包括将所述抗体与至少一种附加活性剂组合给药，其中，所述至少一种附加活性剂包括化疗剂、多药耐药转运蛋白的抑制剂、免疫治疗剂或其组合。
38.根据权利要求37所述应用的抗体分子，其中，所述至少一种附加活性剂为化疗剂，可选地，其中，所述化疗剂为紫杉醇、长春花生物碱、蒽环类抗生素、依托泊苷、米托蒽醌或甲氨蝶呤。
39.根据权利要求36-38所述应用的抗体分子，其中，所述接受治疗的受试者患有癌症，已确定对化疗剂治疗具有耐药性。
40.一种药物合成物，包含：
根据前述权利要求中任一项所述的抗体；以及
一种可药用赋形剂。
41.根据权利要求40所述的药物合成物，进一步包含一种附加活性剂。
42.根据权利要求41所述的药物合成物，其中，所述附加活性剂为化疗剂。
43.根据权利要求41所述的药物合成物，其中，所述附加活性剂包括多药耐药转运蛋白的抑制剂。
44.根据权利要求41所述的药物合成物，其中，所述附加活性剂包括免疫治疗剂。
45.一种或多种核酸，包含对权利要求1-35中任一项所述的抗体分子进行编码的一个或多个序列。
46.一种或多种重组表达载体，包含权利要求45所述的一种或多种核酸。
47.一种用权利要求46所述的一种或多种重组表达载体进行基因修饰的宿主细胞。
48.一种免疫效应细胞，包含一个嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含一个ABCC1结合结构域、一个跨膜结构域和一个细胞内信号传导结构域，其中，所述ABCC1结合结构域包含表2所列抗体重链可变(VH)区的重链互补决定区1-3(HCDR1-3)和/或表2所列抗体轻链可变(VL)区的轻链CDR 1-3(LCDR 1-3)。
49.一种测定细胞表面ABCC1表达的方法，所述方法包括将细胞与权利要求1-35中任一项所述的抗体接触。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述抗体可检测标记。
51.一种抑制由活细胞表达的ABCC1的外排活性的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1-35中任一项所述的抗体接触。
52.根据权利要求51所述的方法，进一步包括使细胞与ABCC1介导外排的抑制剂接触。
53.根据权利要求51或52所述的方法，进一步包括使细胞与化疗剂接触。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的方法，其中，所述细胞为癌细胞。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，所述癌细胞为多药耐药癌细胞。
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