KR20220070440A - 치료학적 항체와 인터루킨-2 (il2)를 수반한 치료 - Google Patents

치료학적 항체와 인터루킨-2 (il2)를 수반한 치료 Download PDF

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Abstract

종양 세포는 종종 예를 들어, MHC 발현 및/또는 IFN-신호전달의 감소 또는 소거를 통해 면역 반응을 회피하며, 그래서 통제되지 않은 증식이 가능할 수 있다. 본 발명에서는, 항체-기반한 면역요법이 IL2의 투여와 조합하여 이러한 내성 종양에 대해 효과적인 요법임을 입증한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 개체에 a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 b. 항체-기반의 면역요법을 투여하는 것을 포함하는, MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 가진 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

치료학적 항체와 인터루킨-2 (IL2)를 수반한 치료
본 발명은 MHC-의존적인 T 세포에 기반한 치료에 적절하게 반응하지 못하는, 예를 들어, 암의 MHC-I 결함 또는 암의 IFN-신호전달의 결함으로 인해 치료에 적절하게 반응하지 못하는 암을 가진 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 특히 발병한 세포가 세포 표면 상에 항원을 발현하는 것을 특징으로 하는 암 질환을 치료하는데 유용하다. 구체적으로, 본 발명은 개체에게 하기를 투여하는 것을 포함하는 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 가진 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다: a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 (이하 일반적으로 "IL2"로 지칭함) 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 b. 항체-기반의 암 면역요법. 또한, 본 발명의 내용은 개체에게 하기를 투여하는 것을 포함하는 암을 가진 개체에서 암이 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 내성을 발현하지 않도록 방지하는 방법에 관한 것이다: a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 b. 항체-기반의 암 면역요법. 본원의 방법은 화학요법 또는 방사선요법, 특히 화학요법과 같은 추가의 암 요법을 개체에 수행하는 것을 더 포함할 수 있다.
면역 시스템은 암 발생, 진행 및 치료에서 중요한 역할을 담당한다. CD8+ T 세포 및 NK 세포는 직접 종양 세포를 파괴할 수 있으며, 이들 세포의 상당한 종양-침윤은 일반적으로 다양한 종양 질환들의 결과에 우호적인 것으로 간주한다. CD4+ T 세포는 IFNγ의 분비 또는 항원-제시 수지상 세포 (DC)의 허가를 통해 항-종양성 면역 반응에 기여하고, 이로써 CD8+ T 세포를 감작화하고 활성화한다 (Kreiter et al. Nature 520, 692-6 (2015)). CD8+ T 세포에 의한 종양 세포의 인지 및 제거는 주 조직접합성 복합체 (MHC) 클래스 I을 통한 항원 제시에 의존하여 이루어진다. MHC 클래스 I 분자는 세포 표면 상에 위치하며, α-쇄와 β2-마이크로글로불린 (B2M)으로 구성된다. 모든 인간 개체는 α-쇄를 암호화하는 유전자들에 대해 서로 다른 대립유전자 6종과 B2M을 암호화하는 유전자들이 풍부한 대립유전자 2종을 가지고 있다. B2M은 복합체의 안정성에 필요한 반면, α-쇄는 기본적으로 임의의 내인성 단백질에 의해 유래할 수 있는 펩타이드 항원을 수용하는 그루브를 형성한다. 만일 항원이 (예를 들어, 돌연변이된 또는 바이러스 유전자 산물로부터 유래하여) 면역원성이면, 이러한 특정한 펩타이드-MHC 클래스 I 복합체와 매칭되는 T 세포 수용체 (TCR)를 가진 CD8+ T 세포는 종양 세포를 외부의 것으로 인지할 수 있다. CD8+ T 세포가 감작되어 활성화되면, 종양 세포를 파괴해 IFNγ를 분비하게 될 것이다. 주변 종양 세포들이 IFNγ를 감지할 수 있으며, 그래서 MHC 클래스 I의 상향 조절을 통해 증식 저해와 항원 제시 강화로 이어지게 되며, 따라서 종양 세포가 CD8+ T 세포 인지에 더 민감해진다. 아울러, 종양 미세환경 (TME) 하에 놓인 CD4+ T 세포와 NK 세포도 IFNγ의 공급원일 수 있으며, DC와 대식세포도 I형 IFN을 방출해 종양 세포의 증식 및 항원 제시에 대해 비슷한 효과를 발휘할 수 있다.
입양 T 세포 전달, 재조합 사이토카인 또는 면역 체크포인트 차단 (ICB)과 같은 몇가지 면역요법들이 암 환자 치료용으로 승인되어 있다. 특히, ICB는 암 치료 분야를 혁신시켜, 환자 군에서 지속적인 반응을 야기한다 (Larkin et al. N Engl J Med 373, 23-34 (2015)). ICB는 종양 세포에 대한 기존 CD8+ T 세포 반응의 재-활성화에 의존한다. 부가적인 T 세포 기반의 면역요법 방식은 ICB 성공으로 인해 상당히 기대되고 있으며, 현재 여러가지가 임상 실험으로 평가 중에 있다. 그러나, CD8+ T 세포에 기반한 요법은 종양 세포에 의한 기능적인 항원 제시에 의존하는 본질적인 문제를 가지고 있어, 내성 기전이 발생할 기회는 열려 있다.
종양 세포는 흔히 유전자 측면에서 불안정하다 (Burrell et al. Nature 501, 338-45 (2013)). 이러한 이유로, 종양 세포에는 돌연변이가 축적되고, 돌연변이는 (예를 들어, 미스센스- 또는 넌센스-돌연변이를 통해) 비-기능적인 유전자 산물 또는 전체 유전자의 결손을 야기한다. 암 치료에 반응하는데 필요한 유전자의 기능적인 상실은 일차적인, 적응성 또는 후천성 내성에 관여할 수 있다 (Sharma et al. Cell 168, 707-23 (2017)). 후천성 내성의 발현은 요법-내성 종양 세포 클론의 선별 및 과증식을 유발하며, 종종 질병에 걸린 환자의 사망으로 이어진다. 특히, 항원 제시를 손상시키는 돌연변이는 입양 T 세포 전달, ICB 및 백신접종 등의 면역요법들에서 내성 기전으로서 관찰된 바 있다 (Restifo et al. J Natl Cancer Inst 88, 100-8 (1996), Zaretsky et al. N Engl J Med 375, 819-29 (2016), Sahin et al. Nature 547, 222-6 (2017)). 예를 들어, MHC 클래스 I의, 특히 B2M의 돌연변이를 통한 상실은 항원 제시의 완전한 폐쇄로 이어진다. 그 결과, 종양 세포는 CD8+ T 세포에 의한 인지 및 제거로부터 벗어나게 된다. 종양 실체에 따라 MHC 클래스 I 대립유전자의 일부 또는 전체 상실은 종양의 최대 95%에서 관찰되며 (Garrido et. al. Cancer Immunol Immunother 66, 259-271 (2017)), 특히 B2M 상실은 ICB에 반응하지 않는 환자들의 거의 30%에서 관찰된다 (Sade-Feldman et al. Nat Commun 8, 1136 (2017)). 아울러, IFN-신호전달 경로에 참여하는 수종의 유전자의 돌연변이도 ICB에 대한 내성과 연관되어 있다 (Zaretsky et al. N Engl J Med 375, 819-29 (2016), Gao et al. Cell 167, 397-404 (2016)). 예를 들어, 중추적인 IFN 신호전달 분자인 Janus 키나제 1 (JAK1)의 기능적인 상실은 I형 IFN 및 IFNγ 둘다에 대한 반응을 저해한다. 최근 보고에서 고전적인 암 요법이 종양 세포에 대한 세포성 면역 반응의 활성화에 의존하는 것으로 발표되어 있어, 면역요법과 더불어 고전적인 암 요법 (화학요법 및 방사선요법)에 대해서도 항원 제시의 손상이 잠재적인 내성 기전이다 (Galluzzi et. al. Cancer Cell 28, 690-714 (2015), Weichselbaum et. al. Nat Rev Clin Oncol 14, 365-379 (2017)).
본 발명은, MHC 클래스 I의 상실을 통한 항원 제시 손상이 뮤라인 종양 모델에서 면역요법에 대한 포괄적인 내성 기전임을, 검증한다. 이와 더불어, MHC 클래스 I의 상실이 고전적인 암 요법에 대한 내성을 매개함을 보여주는 데이터를 제시한다. 지금까지, 기능적인 MHC 클래스 I의 완전 또는 일부 상실 또는 기능적인 IFN 신호전달의 상실을 통한 항원 제시의 손상으로 면역 인지를 회피하는 내성 종양에 대해 효과적인 것으로 기술된 요법은 없다. 이러한 이유로, 내성 종양 세포의 면역 인지 및 제거를 회복시키기 위한 새로운 전략이 의학적으로 상당히 요구되고 있다.
본 발명은 MHC 클래스 I의 상실 또는 IFN 신호전달 경로의 손상을 통해 항원 제시를 손상시키는 변형에 의해 내성을 획득한 종양에 대한 면역치료학적 개입 전략을 개시한다. 이러한 요법은 종양 항원에 결합하는 항체를 사이토카인 IL2와 조합하여 포함한다. 본원에 기술된 조합 요법은 다양한 면역 세포에 의한 종양의 침윤과, 뮤라인 모델에서 내성 종양에 대해 완전한 거부를 유발한다. 아울러, 본 발명은 화학요법과 같은 고전적인 암 요법이 항체와 IL2 조합 면역요법에 의한 내성 종양의 제어를 추가로 개선함을 입증한다.
본 발명은 일반적으로 MHC 클래스 I의 상실 IFN 신호전달 경로의 손상을 통해 항원 제시를 손상시키는 변형을 통해 내성을 획득한 종양을 치료하거나 또는 이러한 변형에 의해 내성을 획득하지 못하도록 종양을 처리하기 위해, IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 항체-기반의 암 면역요법의 투여를 포함하는, 개체에 대한 면역치료학적 치료를 망라한다.
본원에 기술된 방법 및 물질은, IL2에 약동학 변형 기 (이하, "약동학 (PK)-연장된 IL2 (extended-pharmacokinetic (PK) IL2)"로 지칭됨)가 부착된 경우, 특히 효과적이다. 본원에 기술된 방법 및 물질은, PK-연장된 IL2와 같은 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA일 경우, 특히 효과적이다. 일 구현예에서, 이러한 RNA는 전신 이용성을 위해 간으로 표적화된다. 간 세포는 효과적으로 형질감염되어, 단백질을 다량 생산할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 개체에 하기를 투여하는 것을 포함하는 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 가진 개체를 치료하는 방법을 기술한다:
a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
b. 항체-기반의 암 면역요법.
일 구현예에서, 상기한 암은 MHC-의존적인 T 세포, 특히 CD8+ T 세포와 같은 T 세포에 기반한, 즉 T 세포를 수반하는 치료에 적절하게 반응하지 않는 것이다. 일 구현예에서, 상기한 암은 백신 접종, 면역 체크포인트 저해 및 T 세포 전달 중 하나 이상에 적절하게 반응하지 않는 것이다. 일 구현예에서, 상기한 암은 항원 가공 처리 및/또는 제시에 결함을 가진다. 일 구현예에서, 상기한 암은 MHC-I 결함성이다. 일 구현예에서, MHC-I 결함은 MHC-I 대립유전자 또는 β2-마이크로글로불린 (B2M)의 돌연변이 또는 일부 상실 또는 전체 상실이 원인이다. 일 구현예에서, 상기한 암은 T 세포의 자극에 대해 결함성을 가진다. 일 구현예에서, 상기한 암은 I형 IFN 또는 IFNγ 신호전달과 같은 IFN-신호전달에 대해 결함이 존재한다. 이러한 IFN-신호전달에 대한 결함은 IFN-신호전달 경로에 참여하는 하나 이상의 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이가 원인일 수 있다. 일 구현예에서, 유전자는 Janus 키나제 1 (JAK1)이다.
일 측면에서, 본 발명은 개체에게 하기를 투여하는 것을 포함하는 암을 가진 개체에서 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 암의 내성 발생을 예방하는 방법을 제공한다:
a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
b. 항체-기반의 암 면역요법.
일 구현예에서, 내성은 암이 MHC-의존적인 T 세포, 특히 CD8+ T 세포와 같은 T 세포에 기반한, 즉 T 세포를 수반한 치료에 적절하게 반응하지 않는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 내성은 암이 백신 접종, 면역 체크포인트 저해 및 T 세포 전달 중 하나 이상에 대해 적절하게 반응하지 않는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 내성은 암이 항원 가공 처리 및/또는 제시에 결함 (deficiency)을 가지는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 내성은 암이 MHC-I 결함성인 것을 포함한다. 일 구현예에서, MHC-I 결함은 MHC-I 대립유전자 또는 β2-마이크로글로불린 (B2M)의 돌연변이 또는 일부 상실 또는 전체 상실로 인한 것이다. 일 구현예에서, 내성은 암이 T 세포 자극에 대해 결함을 가지는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 내성은 암이 I형 IFN 또는 IFNγ 신호전달과 같은 IFN-신호전달에 대해 결함을 가지는 것을 포함한다. 이러한 IFN-신호전달에 대한 결함은 IFN-신호전달에 참여하는 하나 이상의 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이가 원인일 수 있다. 일 구현예에서, 그 유전자는 Janus 키나제 1 (JAK1)이다.
일 구현예에서, IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
일 구현예에서, 항체-기반의 암 면역요법은 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 암에 대한 치료학적 항체는 암 세포에 의해 발현된 종양 항원을 겨냥한다. 일 구현예에서, 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
일 구현예에서, 이러한 방법은 개체에게 하기를 투여하는 것을 포함한다:
a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA; 및
b. 암에 대한 치료학적 항체.
일 구현예에서, 암은 항원의 발현 또는 항원의 발현 증가와 관련 있는 것이다. 일 구현예에서, 항원은 종양 항원이다. 일 구현예에서, 항체-기반의 암 면역요법은 상기한 항원을 겨냥한다.
일 구현예에서, IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드는 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2이다. 일 구현예에서, PK-연장된 IL2는 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 IL2의 모이어티 또는 이의 기능성 변이체와, 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 혈청 알부민은 마우스 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일 구현예에서, 면역글로불린 단편은 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 의학적 제제 (medical preparation)를 제공한다:
a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
b. 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
c. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 치료 또는 예방하기 위한 의학적 제제의 사용 설명서.
일 측면에서, 본 발명은 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 치료 또는 예방하기 위한 하기를 포함하는 의학적 제제를 제공한다:
a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
b. 암에 대한 치료학적 항체, 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 의학적 제제를 제공한다:
a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
b. 암에 대한 치료학적 항체, 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
c. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 암의 내성 발생을 예방하기 위한 의학적 제제의 사용 설명서.
일 측면에서, 본 발명은 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 암의 내성 발생을 예방하기 위한, 하기를 포함하는 의학적 제제를 제공한다:
a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
b. 암에 대한 치료학적 항체, 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일 구현예에서, 의학적 제제는 키트이다.
일 구현예에서, 의학적 제제는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 암에 대한 치료학적 항체, 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 별개의 용기 안에 포함한다.
일 구현예에서, 의학적 제제는 약학적 조성물이다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 치료 또는 예방하기 위한, IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 투여하기 위한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 치료 또는 예방하기 위한 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 투여하기 위한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 암의 내성 발생을 예방하기 위한 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 투여하기 위한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 암의 내성 발생을 예방하기 위한 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 투여하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 의학적 제제, IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같이 본 발명의 방법에서 이용하기 위한 것이다.
의학적 제제, IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 바람직한 구현예들은 전술한 본 발명의 방법에 대해서와 동일하다.
도 1: 여러가지 뮤라인 종양 모델에서 CD8 + T 세포 및 CD45 + 면역 세포에 의한 종양 침윤.
Balb/c 마우스에 5x105 CT26 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. C57Bl/6 마우스에 5x105 MC38 세포, 3x105 B16F10 세포 또는 1x105 TC1 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종 후 20일에 유세포 측정에 의해 측정한 종양내 CD8+ T 세포 (A) 및 전체 면역 세포 (B)의 비율. 점은 개개 마우스를 표시하고, 선은 군의 평균을 표시한다.
도 2: B2m 의 유전자 넉아웃 후 CT26 뮤라인 결장 암종 및 MC38 뮤라인 결장 선암종 종양 세포주에 의한 MHC 클래스 I의 표면 발현의 상실.
대조군 및 B2m -/- CT26 (A) 및 MC38 세포 (B)의 MHC 클래스 I 표면 발현. Cas9 mRNA 및 B2m 표적화 sgRNA의 일시적인 형질감염을 통해 구축한 B2m -/- 클론. 유세포 측정으로 측정한 세포 표면 상의 MHC 클래스 I의 발현.
도 3: B2m 의 유전자 넉아웃 후 B16F10 뮤라인 흑색종 및 TC1 뮤라인 폐 상피 암 종양 세포주에 의한 MHC 클래스 I의 표면 발현의 상실.
대조군 및 B2m -/- B16F10 (A) 및 TC1 세포 (B)의 MHC 클래스 I 표면 발현. 도 2에 기술된 바와 같이 구축한 B2m -/- 클론. 유세포 측정에 의해 측정한 세포 표면에서의 MHC 클래스 I의 발현. 유세포 측정을 분석하기 전 24시간 동안 25 ng/mL IFNγ를 B16F10 세포에 처리하였다.
도 4: B16F10 뮤라인 흑색종 세포의 IFN 반응은 PD-L1 및 MHC 클래스 I의 상향 조절을 유도한다.
1000 U/mL IFN-α로 24시간 자극한 후 유세포 측정에 의해 측정한, B16F10 세포에 의한 PD-L1 (A) 및 MHC 클래스 I (B)의 발현. 대조군은 자극 처리하지 않았다.
도 5: Jak1 의 유전자 넉아웃 후 B16F10 뮤라인 흑색종 세포에서의 손상된 IFN 반응.
도 4에 기술된 바와 같이 IFN 자극 후 유세포 측정에 의해 측정한 B16F10-Jak1 -/- 세포에 의한 PD-L1 (A) 및 MHC 클래스 I (B)의 발현. 대조군은 자극 처리하지 않았다. B16F10-Jak1 -/- 세포는 Jak1을 표적화하는 sgRNA를 사용해 도 2에 기술된 바와 같이 구축하였다.
도 6: 모 CT26 뮤라인 결장 암종과 B2m -/- 변이체를 가진 MC38 뮤라인 결장 선암종 종양의 증식 비교.
5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포가 피하 (s.c.) 접종된 Balb/c 마우스 (n=5/군)(A) 및 5x105 MC38 또는 MC38-B2m -/- 세포가 피하 (s.c.) 접종된 C57Bl/6 마우스 (n=5)(B)의 종양 증식. 나타낸 데이터는 군의 평균 ± SEM이다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 이후의 시다크의 다중 비교 검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 7: 모 B16F10 뮤라인 흑색종과 B2m -/- 변이체를 가진 TC1 뮤라인 폐 상피 종양의 증식 비교.
3x105 B16F10 또는 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종한 C57Bl/6 마우스 (n=10/군)(A) 및 1x105 TC1 또는 TC1-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종한 C57Bl/6 마우스 (n=10)(B)의 종양 증식. 나타낸 데이터는 군의 평균 ± SEM이다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 이후의 시다크의 다중 비교 검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 8: CT26 및 CT26- B2m -/- 뮤라인 결장 암종 종양의 면역 세포의 침윤 비교.
Balb/c 마우스에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정하고 종양 무게에 대해 표준화한, 종양내 림프구 (A), 골수성 (B) 및 수지상 세포 (DC) 서브세트 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 군의 평균 ± SEM이다. 이상점 (outlier)은 그럽 (Grubb) 검정으로 제거하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 9: CT26 또는 CT26- B2m -/- 뮤라인 결장 암종 종양을 가진 마우스로부터 채취한 종양-배액성 림프절의 면역 세포의 조성 비교.
Balb/c 마우스에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정한, 종양-배액 (tumor-draining) 림프절내 림프구 (A), 골수성 (B) 및 수지상 세포 (DC) 서브세트 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 이상점은 그럽 검정으로 제거하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 10: MC38 및 MC38- B2m -/- 뮤라인 결장 선암종 종양의 면역 세포의 침윤 비교.
C57Bl/6 마우스에 5x105 MC38 또는 MC38-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정하고 종양 무게에 대해 표준화한, 종양내 림프구 (A), 골수성 (B) 및 수지상 세포 (DC) 서브세트 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 이상점은 그럽 검정으로 제거하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 11: MC38 또는 MC38- B2m -/- 뮤라인 결장 선암종 종양 보유 마우스로부터 채취한 종양-배액성 림프절의 면역 세포 조성 비교.
C57Bl/6 마우스에 5x105 MC38 또는 MC38-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정한, 종양-배액성 림프절내 림프구 (A), 골수성 (B) 및 수지상 세포 (DC) 서브세트 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 이상점은 그럽 검정으로 제거하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 12: B16F10 및 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 종양의 면역 세포 침윤 비교.
C57Bl/6 마우스에 3x105 B16F10 또는 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정하고 종양 무게에 대해 표준화한, 종양내 림프구 (A), 골수성 (B) 및 수지상 세포 (DC) 서브세트 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 이상점은 그럽 검정으로 제거하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 13: B16F10 및 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 종양 보유 마우스로부터 채취한 종양-배액성 림프절의 면역 세포 조성 비교.
C57Bl/6 마우스에 3x105 B16F10 또는 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정한, 종양-배액성 림프절내 림프구 (A), 골수성 (B) 및 수지상 세포 (DC) 서브세트 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 이상점은 그럽 검정으로 제거하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 14: TC1 및 TC1- B2m -/- 뮤라인 폐 상피 종양의 면역 세포의 침윤 비교.
C57Bl/6 마우스에 1x105 TC1 또는 TC1-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정하고 종양 무게에 대해 표준화한, 종양내 림프구 (A), 골수성 (B) 및 수지상 세포 (DC) 서브세트 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 이상점은 그럽 검정으로 제거하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 15: TC1 및 TC1- B2m -/- 뮤라인 폐 상피 종양을 가진 마우스로부터 채취한 종양-배액성 림프절의 면역 세포의 조성 비교.
C57Bl/6 마우스에 1x105 TC1 또는 TC1-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정한, 종양-배액성 림프절내 림프구 (A), 골수성 (B) 및 수지상 세포 (DC) 서브세트 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 이상점은 그럽 검정으로 제거하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 16: 여러 시점에 T 세포 및 NK 세포에 의한 CT26 및 CT26- B2m -/- 뮤라인 결장 암종 종양의 차별적인 침윤.
Balb/c 마우스 (n=5/군/시점)에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종 후 8일, 12일 (NK 세포 단독), 20일 및 26일에 유세포 측정으로 측정하고 종양 부피에 대해 표준화한, 종양내 CD3+ T 세포 (A) 및 NK 세포 (B)의 수. 나타낸 데이터는 군의 평균 ± SEM이다. 통계적 유의성은 혼합-효과 분석 (Mixed-effects analysis)과 이후 시다크의 다중 비교 검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 17: 종양내 CT26 및 CT26- B2m -/- 뮤라인 결장 암종 종양 또는 TC1 및 TC1- B2m -/- 뮤라인 폐 상피 종양에서 CD8 + T 세포의 여러가지 표현형.
Balb/c 마우스에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. C57Bl/6에 1x105 TC1 또는 TC1-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정한, CT26 및 CT26-B2m -/- 종양으로부터 유래한 종양내 gp70-특이적인 (A) 및 PD-1+ CD8+ T 세포 (B)의 빈도, 및 TC1 및 TC1-B2m -/- 종양으로부터 유래한 종양내 PD-1+ CD8+ T 세포 (C)의 빈도. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 18: 종양내 대식세포 (TAM)와 CT26 및 CT26- B2m -/- 뮤라인 결장 암종 종양 유래의 종양 세포의 여러가지 표현형.
Balb/c 마우스 (n=8/군)에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정한, 종양내 TAM에 의한 MHC 클래스 II (A) 및 PD-L1 발현 (B), 및 종양 세포에 의한 PD-L1 발현 (C). 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 19: 종양내 대식세포 (TAM)와 TC1 및 TC1- B2m -/- 뮤라인 폐 상피 종양 유래 종양 세포의 여러가지 표현형.
C57Bl/6 (n=8/군)에 1x105 TC1 또는 TC1-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 도 18에 기술된 바와 같이 측정한, 종양내 TAM에 의한 MHC 클래스 II (A) 및 PD-L1 발현 (B), 및 종양 세포에 의한 PD-L1 발현 (C). 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 20: CT26 및 CT26- B2m -/- 뮤라인 결장 암종 종양의 TME에서 Ifng 및 케모카인의 여러가지 발현 수준.
Balb/c 마우스에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종 후 19일 경과시 qRT-PCR에 의해 측정한, Ifng (A), Cxcl9 (B), Cxcl10 (C), Cxcl11 (D), Ccl5 (E) 및 Xcl1 (F)의 종양내 상대적인 유전자 발현 수준. 데이터는 n=3 마우스/군의 평균 + SEM이다.
도 21: MC38 및 MC38- B2m -/- 뮤라인 결장 선암종 종양의 TME에서 Ifng 와 케모카인의 여러가지 발현 수준.
C57Bl/6 마우스에 5x105 MC38 또는 MC38-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 도 20에 언급된 바와 같이 측정한, Ifng (A), Cxcl9 (B), Cxcl10 (C), Cxcl11 (D), Ccl5 (E) 및 Xcl1 (F)의 종양내 상대적인 유전자 발현 수준. 데이터는 n=5 마우스/군의 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 만-휘트니 U-검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 22: B2m 결핍은 CT26 뮤라인 결장 암종 모델에서 anti-PD-1, anti- CTLA4 및 anti-4-1BB 항체 요법에 대해 내성을 유도한다.
Balb/c 마우스 (n=10/군)에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 평균 부피 32-36 ㎣에 도달한 후 0일, 3일, 7일 및 10일 경과시, PD-1, CTLA4 또는 4-1BB를 표적화하는 항체를 200 ㎍으로 마우스에 복막내 (i.p.) 주사하였다. 대조군에는 비-관련 항원에 결합하는 항체를 주사하였다. CT26 (A) 또는 CT26-B2m -/- (B) 종양 보유 마우스의 종양 증식. 나타낸 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하고, 마지막 도시된 시점에 대해 나타낸다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 23: anti-PD-1, anti- CTLA4 및 anti-4- 1BB 항체 요법으로 처리한 후, CT26 및 CT26- B2m -/- 뮤라인 결장 암종 종양에서 CD8 + T 세포의 차별적인 침윤.
Balb/c 마우스에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 22에 기술된 바와 같이 처리하였다. 유세포 측정에 의해 측정하고 종양 부피 또는 종양 무게에 대해 표준화한, anti-PD-1 또는 anti-CTLA4 (A) 또는 anti-4-1BB (B)가 처리된 CT26 종양, 및 anti-PD-1 또는 anti-CTLA4 (C) 또는 anti-4-1BB (D)가 처리된 CT26-B2m -/- 종양에서의 종양내 CD8+ T 세포의 수. 1차 처리 후 7일차에 분석한 anti-4-1BB 항체 처리 종양, 및 1차 처리 후 10일에 분석한 anti-PD-1 또는 anti-CTLA4 항체 처리 종양. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 일원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정 (A 및 C) 또는 스튜던트의 비-대응 t-검정 (B 및 D)으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 24: B2m 결핍은 MC38 뮤라인 결장 선암종 모델에서 anti-PD-1, anti-CTLA4 및 anti-4- 1BB 항체 요법에 대해 내성을 유발한다.
C57Bl/6 마우스 (n=10/군)에 5x105 MC38 또는 MC38-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 마우스에 도 22에 기술된 바와 같이 0, 4일, 7일 및 10일에 항체를 처리하였다. 14일 및 17일에 MC38-보유 마우스에 추가로 주사하였다. MC38 (A) 또는 MC38-B2m -/- (B) 종양 보유 마우스의 종양 증식. 나타낸 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하고, 마지막 도시된 시점에 대해 나타낸다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 25: B2m 결핍은 CT26 뮤라인 결장 암종 모델에서 치료학적 RNA 백신 접종에 대해 내성을 유발한다.
Balb/c 마우스 (n=10/군)에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종 후 5일, 8일, 12일 및 19일에, 40 ㎍ gp70AH5 RNA-LPX 또는 임의의 항원을 암호화하지 않는 RNA-LPX (비-관련 RNA)를 마우스에 정맥내 (i.v.) 주사하였다. 대조군에는 처리하지 않았다. CT26 (A) 또는 CT26-B2m -/- (B) 종양 보유 마우스에서의 종양 증식. 나타낸 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하고, 마지막 도시된 시점에 대해 나타낸다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 26: 치료학적 RNA 백신 접종 후 CT26 및 CT26- B2m -/- 뮤라인 결장 암종 종양에서 CD8 + T 세포의 차별적인 침윤 및 항원 특이성.
Balb/c 마우스에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 25에 기술된 바와 같이 처리하였다. 1차 처리 후 17일차에 유세포 측정에 의해 측정하고 종양 무게에 대해 표준화한, CT26 (A) 및 CT26-B2m -/- (B) 종양으로부터 유래한 종양내 CD8+ T 세포의 수. CT26 (C) 및 CT26-B2m -/- (D) 종양으로부터 유래한 gp70-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 일원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 27: B2m 결핍은 TC1 뮤라인 폐 상피 종양 모델에서 치료학적 RNA 백신 접종에 대해 내성을 유발한다.
C57Bl/6 마우스 (n=10/군)에 1x105 TC1 또는 TC1-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양이 평균 부피 대략 20 ㎣에 도달한 후 0일 및 7일에, 20 ㎍ E7 RNA-LPX 또는 임의의 항원을 암호화하지 않는 RNA-LPX (비-관련 RNA)를 마우스에 정맥내 (i.v.) 주사하였다. 대조군에는 처리하지 않았다. TC1 (A) 또는 TC1-B2m -/- (B) 종양 보유 마우스에서의 종양 증식. 나타낸 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하고, 마지막 도시된 시점에 대해 나타낸다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 28: 치료학적 RNA 백신 접종 후 TC1 및 TC1- B2m -/- 뮤라인 폐 상피 종양에서 CD8 + T 세포의 차별적인 침윤 및 항원 특이성.
C57Bl/6 마우스 (n=10/군)에 1x105 TC1 또는 TC1-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 27에 기술된 바와 같이 처리하였다. 1차 처리 후 9일차에 유세포 측정에 의해 측정하고 종양 무게에 대해 표준화한, TC1 (A) 및 TC1-B2m -/- (B)로부터 유래한 종양내 CD8+ T 세포의 빈도. TC1 (C) 및 TC1-B2m -/- (D) 종양으로부터 유래한 E7-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 일원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 29: B2m 결핍이 CT26 뮤라인 결장 암종 모델에서 화학요법 처리 후 종양 거부를 막는다.
Balb/c 마우스 (n=9-10/군)에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양이 평균 부피 대략 6 ㎣에 도달한 후 0, 7일 및 14일에, 마우스에 5 mg/kg 옥살리플라틴 (OX)을 복막내 (i.p.), 그리고 60 mg/kg 5-플루오로우라실 (5-FU)을 정맥내 (i.v.)로 주사하였다. 대조군에는 비히클을 투여하였다. 종양 증식은 종양 보유 마우스의 평균 + SEM (A) 및 생존성 (B)으로 나타낸다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 이후의 시다크의 다중 비교 검정을 이용해 구하고, 마지막 도시된 시점에 대해 나타낸다. 생존성에 대한 통계학적 유의성은 로그-순위 (만텔-콕스) 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 30: CT26 및 CT26- B2m -/- 뮤라인 결장 암종 종양에서 화학요법 처리 후 CD8 + T 세포의 차별적인 침윤 및 항원 특이성.
Balb/c 마우스에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 29에 기술된 바와 같이 처리하였다. 1차 처리 후 13일차에 유세포 측정에 의해 측정한, CT26 (A) 및 CT26-B2m -/- (B)에서의 종양내 CD8+ T 세포의 수. CT26 (C) 및 CT26-B2m -/- (D) 종양으로부터 유래한 gp70-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 31: B2m 결핍이 CT26 뮤라인 결장 암종 모델에서 방사선요법 처리 후 종양 거부를 막는다.
Balb/c 마우스 (n=10/군)에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양이 평균 부피 대략 30 ㎣에 도달한 후 국소적으로 12 Gy로 방사선 조사하였다. 대조군에는 처리하지 않았다. 종양 증식 곡선을 종양 보유 마우스의 평균 + SEM (A) 및 생존성 (B)으로 도시한다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 이후의 시다크의 다중 비교 검정을 이용해 구하고, 마지막 도시된 시점에 대해 나타낸다. 생존성에 대한 통계학적 유의성은 로그-순위 (만텔-콕스) 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 32: CT26 및 CT26- B2m -/- 뮤라인 결장 암종 종양에서 방사선요법 처리 후 CD8 + T 세포의 차별적인 침윤 및 항원 특이성.
Balb/c 마우스에 5x105 CT26 또는 CT26-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 31에 기술된 바와 같이 처리하였다. 처리 후 8일차에 유세포 측정에 의해 측정한, CT26 (A) 및 CT26-B2m -/- (B) 종양으로부터 유래한 종양내 CD8+ T 세포의 수. CT26 (C) 및 CT26-B2m -/- (D) 종양으로부터 gp70-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도. 점은 개별 마우스를 나타내고, 선은 평균 ± SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 스튜던트 비-대응 t-검정을 이용해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 33: anti- Trp1 항체와 mAlb - mIL2 RNA의 조합 요법은 B16F10 및 B16F10 -B2m -/- 뮤라인 흑색종 종양의 증식을 감소시킨다.
C57Bl/6 마우스 (n=9-10/군)에 3x105 B16F10 또는 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종 후 5일, 8일, 12일, 15일, 19일, 22일 및 26일차에, 200 ㎍ anti-Trp1 항체 (TA99) 또는 이소형 대조군을 마우스에 복막내 (i.p.) 주사하였으며, 종양 접종 후 5일, 12일, 19일 및 26일차에 1 ㎍ mAlb-mIL2 암호화 RNA 또는 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)의 TransIT® 제형을 정맥내 (i.v.) 주사하였다. 대조군에는 이소형 및 mAlb RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 처리하지 않았다. B16F10 (A) 또는 B16F10-B2m -/- (B) 종양 보유 마우스의 종양 증식. 나타낸 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 34: anti- Trp1 항체와 mAlb - mIL2 RNA의 조합 요법은 B16F10 및 B16F10 -B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 장기 생존을 유도한다.
C57Bl/6 마우스 (n=9-10/군)에 3x105 B16F10 또는 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 33에 기술된 바와 같이 처리하였다. B16F10 (A) 또는 B16F10-B2m -/- (B) 종양 보유 마우스의 생존성. 생존성에 대한 통계학적 유의성은 로그-순위 (만텔-콕스) 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 35: mAlb - mIL2 RNA 단독 또는 anti- Trp1 항체와의 조합은 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 CD4 + T 세포 및 CD8 + T 세포의 침윤을 증가시킨다.
C57Bl/6 마우스에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 종양 접종 후 9일차에 도 33에 기술된 바와 같은 처리를 개시하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정하고 종양 무게에 대해 표준화한, 종양내 CD4+ Th 세포 (A), Treg 세포 (B) 및 CD8+ T 세포 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 표시하고, 선은 군의 평균을 표시한다. 통계학적 유의성은 크루스칼-왈리스 검정과 후속적인 듄의 다중 비교 검정을 통해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 36: mAlb - mIL2 RNA 단독 또는 anti- Trp1 항체와의 조합은 B16F10 -B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 γδ T 세포, NK 세포 및 NKT 세포의 침윤을 강화한다.
C57Bl/6 마우스에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 종양 접종 후 9일에 도 33에 기술된 바와 같은 처리를 개시하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정하고 종양 무게에 대해 표준화한, 종양내 δγ T 세포 (A), NK 세포 (B) 및 NKT 세포 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 표시하고, 선은 군의 평균을 표시한다. 통계학적 유의성은 크루스칼-왈리스 검정과 후속적인 듄의 다중 비교 검정을 통해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 37: mAlb - mIL2 RNA 단독 또는 anti- Trp1 항체와의 조합은 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 대식세포의 침윤을 강화한다.
C57Bl/6 마우스에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 33에 기술된 바와 같은 처리를 종양 접종 후 9일에 개시하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정하고 종양 무게에 대해 표준화한, 종양내 대식세포 (A), 단핵구 (B) 및 호중구 (C)의 수. 점은 개별 마우스를 표시하고, 선은 군의 평균을 표시한다. 통계학적 유의성은 크루스칼-왈리스 검정과 후속적인 듄의 다중 비교 검정을 통해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 38: mAlb - mIL2 RNA 단독 또는 anti- Trp1 항체와의 조합은 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 호산구 및 DC의 침윤을 강화한다.
C57Bl/6 마우스에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 33에 기술된 바와 같은 처리를 종양 접종 후 9일에 개시하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정하고 종양 무게에 대해 표준화한, 종양내 호산구 (A), cDC1 (B) 및 CD11b+ DCs (C)의 수. 점은 개별 마우스를 표시하고, 선은 군의 평균을 표시한다. 통계학적 유의성은 크루스칼-왈리스 검정과 후속적인 듄의 다중 비교 검정을 통해 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 39: mAlb - mIL2 RNA는 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 종양내 대식세포에 의한 FcγR의 상향 조절을 유도한다.
C57Bl/6 (n=7-8/군) 마우스에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 33에 기술된 바와 같은 처리를 종양 접종 후 9일에 개시하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정한, 종양내 대식세포에 의한 FcγRI (A), Fc FcγRII/III (B) 및 FcγRIV (C)의 발현. 나타낸 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 일원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 40: mAlb - mIL2 RNA는 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 종양내 단핵구에 의한 FcγR의 상향 조절을 유도한다.
C57Bl/6 (n=7-8/군) 마우스에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 33에 기술된 바와 같은 처리를 종양 접종 후 9일차에 개시하였다. 종양 접종한 후 20일 경과시, 유세포 측정을 통해 측정한, 종양내 대식세포에 의한 FcγRI (A), Fc FcγRII/III (B) 및 FcγRIV (C)의 발현. 나타낸 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 일원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 41: NK 세포 또는 호중구가 아닌 대식세포의 고갈은 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 anti- Trp1 항체와 조합하여 mAlb - mIL2 RNA 처리 마우스의 생존을 손상시키는 것으로 보인다.
C57Bl/6 마우스 (대조군: n=10, 기타 군들: n=8-15)에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 종양 접종 후 5일, 8일, 12일, 15일, 19일, 22일차에 anti-Trp1 (TA99) 항체를, 5일, 12일 및 19일차에 mAlb-mIL2 암호화 RNA를 도 33에 기술된 바와 같이 처리하였다. 대조군에는 이소형 대조군 항체 및 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 투여하였다. NK1.1, CSF1R 또는 Ly6G에 대한 고갈성 항체 또는 비-관련 대조군 항체 (비-고갈성)를, 종양 접종 후 4일차에 부하 용량 400 ㎍으로 복막내 (i.p.) 주사한 다음 7일, 11일, 14일, 18일 및 20일차에 후속 용량 200 ㎍ (비관련 항체, NK1.1 또는 Ly6G) 또는 300 ㎍ (CSF1R)을 주사하였다.
도 42: 면역 세포 고갈을 검증하기 위한 혈액 샘플에 대한 유세포 측정 분석.
고갈성 항체를 주사한 후 1일차에, 도 41에 기술된 바와 같이 처리한 마우스 유래 혈액에서 NK1.1 (NK 세포)(A) 또는 Ly6G (호중구)(B) 고갈에 대한 유세포 측정 분석. 상단 패널은 대조군 항체를 주사한 대표적인 마우스로부터 유래한 혈액이고, 하단 패널은 고갈성 항체를 주사한 대표적인 마우스를 나타낸다.
도 43: mAlb - mIL2 RNA의 anti- Trp1 항체와 조합한 종양 증식의 저하는 B16F10 -B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 화학요법에 의해 강화된다.
C57Bl/6 마우스 (n=12-13/군)에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 종양 접종 후 6일차에 200 mg/kg 사이클로포스파미드 (CTX) 또는 대조군으로서 비히클을 복막내 (i.p.) 주사하였다. 종양 접종 후 7일, 10일, 14일, 17일 및 21일차에 anti-Trp1 (TA99) 항체를 처리하거나 처리하지 않고, 그리고 7일, 14일 및 21일에 mAlb-mIL2 암호화 RNA를 도 33에 기술된 바와 같이 마우스에 처리하였다. 대조군에는 이소형 대조군 항체 또는 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 처리하였다. 나타낸 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 44: anti- Trp1 항체와 mAlb - mIL2 RNA의 조합 요법은 B16F10 - Jak1 -/ 뮤라인 흑색종 종양의 증식을 감소시킨다.
C57Bl/6 마우스 (n=10/군)에 3x105 B16F10-Jak1 -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 종양 접종 후 5일, 8일, 12일, 15일 및 19일차에 anti-Trp1 (TA99) 항체를, 5일, 12일 및 19일차에 mAlb 암호화 RNA-mIL2를 도 33에 기술된 바와 같이 처리하였다. 대조군에는 이소형 대조군 항체 또는 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 처리하였다. 종양 보유 마우스의 종양 증식 (A) 및 생존성 (B). 나타낸 데이터는 평균 + SEM이다. 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하였다. 생존성에 대한 통계학적 유의성은 로그-순위 (만텔-콕스) 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 45: TC1 및 TC1- B2m -/- 뮤라인 폐 상피 종양의 면역 세포의 침윤 비교.
C57Bl/6 마우스에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. Anti-CSF1R 항체를 종양 접종한 후 10일에 600 ㎍의 투여량으로, 12일에 350 ㎍의 투여량으로 복막내 (i.p.) 주사하였다. 종양 접종 후 13일에, 유세포 측정으로 GR-1- CD11b+ F4/80+ 대식세포 집단의 존재를 분석하였다. 상단 패널은 비처리 대조군을 나타내고, 하단 패널은 항체 주사한 개별 마우스를 나타낸다.
도 46: CD4 + T 세포 및 전체 림프구 고갈을 검증하기 위한 혈액 샘플에 대한 유세포 측정 분석.
C57Bl/6 마우스 (대조군: n=10, 기타 군: n=15)에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 종양 접종 후 5일, 8일, 12일, 15일 및 19일차에 anti-Trp1 (TA99) 항체를, 5일, 12일 및 19일차에 mAlb 암호화 RNA-mIL2를 도 33에 기술된 바와 같이 처리하였다. CD4 또는 CD90.2에 대한 고갈성 항체 또는 비관련 대조군 항체 (비-고갈성)를, 종양 접종 후 3일에 400 ㎍의 투여량으로 투여한 다음, 7일, 10일, 14일 및 20일 (대조군 및 anti-CD4는 20일에만)차에는 200 ㎍의 투여량으로 복막내 (i.p.) 주사하였다. CSF1R에 대한 고갈성 항체를, 종양 접종 후 2일차에 투여량 600 ㎍으로, 그리고 5일, 7일, 10일, 12일 및 14일차에 350 ㎍의 투여량으로 복막내 (i.p.) 주사하였다. 고갈성 항체를 주사한 후 2일차에, 마우스로부터 수득한 혈액에서 CD4 (CD4+ T 세포) (A) 또는 CD90.2 (전체 림프구)(B) 고갈에 대한 유세포 측정 분석. 상단 패널은 대조군 항체를 주사한 대표적인 마우스의 혈액을 나타낸 것이고, 하단 패널은 고갈성 항체를 주사한 대표적인 마우스를 나타낸 것이다.
도 47: 대식세포 또는 전체 림프구의 고갈은 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 mAlb - mIL2 RNA를 anti- Trp1 항체와 조합하여 처리한 마우스의 생존성을 손상시킨다.
C57Bl/6 마우스에 도 46에 기술된 바와 같이 접종 및 처리하였다. 생존성에 대한 통계학적 유의성은 로그-순위 (만텔-콕스) 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 48: CD8 + T 세포 고갈을 검증하기 위한 혈액 샘플에 대한 유세포 측정 분석.
C57Bl/6 마우스 (대조군: n=8, 비관련 대조군 항체 투여 군: n=14, anti-IFNγ 투여 군: n=15, anti-CD8 투여 군: n=13)에 도 46에 기술된 바와 같이 접종하고, anti-Trp1 (TA99) 및 mAlb 암호화 RNA-mIL2를 처리하였다. CD8에 대한 고갈성 항체 또는 IFNγ에 대한 중화 항체 또는 비관련 대조군 항체 (비-고갈성)를, 종양 접종 후 3일치에 투여량 400 ㎍으로, 이후 7일 및 10일차에 anti-CD8을 투여량 200 ㎍으로, 5일, 7일 및 10일차에 대조군 항체 또는 anti-IFNγ를 250 ㎍으로 복막내 (i.p.) 주사하였다. anti-CD8 항체를 주사한 후 2일차에 마우스 혈액에서 CD8 (CD8+ T 세포) 고갈에 대한 유세포 측정 분석. 상단 패널은 대조군 항체를 주사한 대표적인 마우스 혈액을 나타낸 것이고, 하단 패널은 고갈성 항체를 주사한 대표적인 마우스를 나타낸 것이다.
도 49: CD8 + T 세포의 고갈 또는 IFNγ 중화는 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 mAlb - mIL2 RNA를 anti- Trp1 항체와 조합하여 처리한 마우스의 생존을 손상시킨다.
도 47에 기술된 바와 같이 C57Bl/6 마우스에 접종하고, 처리하였다. 생존성에 대한 통계학적 유의성은 로그-순위 (만텔-콕스) 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 50: CD8 + T 세포 및 IFNγ는 B16F10 - B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 mAlb -mIL2 단독 또는 anti- Trp1 항체와의 조합에 대한 반응에서 대식세포의 전염증성 분극화에 필요하다.
C57Bl/6 마우스에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 33에 기술된 바와 같은 처리를 종양 접종 후 9일차에 개시하였다. (B)에서, 마우스에, anti-IFNγ, anti-CD8 또는 비관련 대조군 항체를 종양 접종 후 7일차에 투여량 400 ㎍으로, 이후 11일 및 14일차에 anti-CD8을 투여량 200 ㎍으로 또는 9일, 11일 및 14일차에 대조군 항체 또는 anti-IFNγ를 250 ㎍으로 추가로 주사하였다. 종양 접종 후 (A) 및 종양 접종 후 18일차에 mAlb-mIL2 및 anti-Trp1 (TA99) 조합 요법의 처리 및 anti-CD8 또는 anti-IFNγ 항체 주사 후 (B), mAlb-mIL2 및 anti-Trp1 (TA99) 조합 요법, 각각의 단일요법 또는 종양 접종 후 20일에 대조군 처리 후 종양내 대식세포의 분극화,
도 51: 항체와 mAlb - mIL2의 조합 요법은 B16F10 및 B16F10 - B2m -/- 세포로 이루어진 이질적인 종양에 대한 anti-PD-1 및 anti- CTLA4 요법의 항종양 활성을 개선한다.
C57Bl/6 마우스 (n=15/군)에 75% B16F10 및 25% B16F10-B2m -/- 세포를 함유한 혼합물을 세포수 3x105로 피하 (s.c.) 접종하였다. 마우스에, 도 33에 기술된 바와 같이, anti-Trp1 (TA99) 항체를 종양 접종 후 3일, 7일, 10일, 14일 및 17일차에, 3일, 10일 및 17일차에 mAlb 암호화 RNA-mIL2를 처리하였다. 부가적으로, 마우스에, 200 ㎍ anti-PD-1을 3일, 7일, 10일, 14일 및 17일차에, anti-CTLA4 200 ㎍을 3일차에, 그리고 7일, 10일, 14일 및 17일차에 후속 투여량 100 ㎍으로 복막내 (i.p.) 주사하였다. 이소형 및 mAlb RNA를 대조군으로서 제공하였다. 종양 보유 마우스의 단일 종양 증식 곡선 (A) 및 생존성 (B). 생존성에 대한 통계학적 유의성은 로그-순위 (만텔-콕스) 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 52: 항체와 mAlb - mIL2의 조합 요법은 B16F10 뮤라인 흑색종 모델에서 PD-1 및 anti-CTLA4에 대한 후천적인 내성을 방지한다.
도 51에 기술된 바와 같이, C57Bl/6 마우스에 접종 및 처리하였다. 마우스가 엔드포인트 기준에 도달하면 종양을 채취하고, 25 ng/mL IFNγ로 24시간 자극한 후 유세포 측정을 통해 종양 세포 현탁물에서 MHC 클래스 I+ 종양 세포의 비율을 구하였다. 통계적 유의성은 일원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 53: MC38- Her2 - B2m -/- 세포의 Her2 표면 발현.
MC38-Her2-B2m -/- 세포를 20 ㎍/mL anti-Her2 항체와 4℃에서 20분간 인큐베이션한 다음 항체의 결합성을 anti-마우스 2차 항체로 검출하여 유세포 측정으로 분석하였다.
도 54: anti- Her2 항체와 mAlb - mIL2 RNA의 조합 요법은 MC38- Her2 - B2m -/- 뮤라인 결장 선암종 모델에서 종양 증식을 낮추고, 장기 생존을 유도한다.
C57Bl/6 마우스 (n=10/군)에 5x105 MC38-Her2-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 마우스에, 200 ㎍ anti-Her2 항체 (7.16.4) 또는 이소형 대조군을 종양 접종 후 3일, 6일, 10일, 13일, 17일 및 24일차에, mAlb 암호화 RNA-mIL2 또는 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 3일, 10일, 17일 및 24일차에 도 33에 기술된 바와 같이 복막내 (i.p.) 주사하였다. 대조군에는 이소형 및 mAlb RNA를 처리하였다. 평균 + SEM으로 나타낸 종양 증식 (A) 및 종양 보유 마우스의 생존성 (B). 통계적 유의성은 이원식 ANOVA와 후속적인 듀넷의 다중 비교 검정으로 구하여 마지막 도시된 시점에 대해 나타내거나 (A) 또는 로그-순위 (만텔-콕스) 검정 (B)으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 55: B2m 결핍이 MC38 뮤라인 결장 선암종 모델에서 화학요법 처리 후 종양 거부를 막는다.
C57Bl/6 마우스에 5x105 MC38 (n=15/군) 또는 MC38-B2m -/- (n=10/군) 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 마우스에 5 mg/kg 옥살리플라틴을 종양 접종 후 4일, 11일 및 18일에 복막내 (i.p.) 주사하였다. 대조군에는 비히클을 투여하였다. 종양 보유 마우스의 생존성. 생존성에 대한 통계학적 유의성은 로그-순위 (만텔-콕스) 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 56: anti- Trp1 항체와 mAlb - mIL2 RNA의 조합 요법은 MC38- Her2 - B2m -/- 뮤라인 결장 선암종 모델에서 화학요법과 상승작용한다.
C57Bl/6 마우스 (n=15/군)에 5x105 MC38-Her2-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 옥살리플라틴 (OX)을 도 55에 기술된 바와 같이 처리하였다. 추가적으로, 마우스에 anti-Her2 (7.16.4) 항체를 5일, 8일, 12일, 15일 및 19일차에, mAlb 암호화 RNA-mIL2를 7일, 14일 및 21일차에 도 54에 기술된 바와 같이 처리하였다. 대조군에는 비히클, 이소형 대조군 항체 또는 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 처리하였다. 종양 보유 마우스의 생존성. 생존성에 대한 통계학적 유의성은 로그-순위 (만텔-콕스) 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 57: mAlb - mIL2 RNA와 anti- Trp1 항체의 조합에 의한 종양 증식 감소는 B16F10 -B2m -/- 뮤라인 흑색종 모델에서 화학요법에 의해 강화된다.
C57Bl/6 마우스 (대조군만 투여한 군: n=14, 기타 군: n=15)에 5x105 B16F10-Jak1 -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 150 mg/kg 사이클로포스파미드 (CTX) 또는 대조군으로서 비히클을 종양 접종 후 7일차에 복막내 (i.p.) 주사하였다. 마우스에, 도 33에 기술된 바와 같이, anti-Trp1 (TA99) 항체를 종양 접종 후 8일, 11일, 15일, 18일 및 22일차에, mAlb 암호화 RNA-mIL2를 8일, 15일 및 22일차에 처리하였다. 대조군에는 비히클, 이소형 대조군 항체 또는 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 처리하였다. 종양 보유 마우스의 생존성. 생존성에 대한 통계학적 유의성은 로그-순위 (만텔-콕스) 검정으로 구하였다. 모든 분석은 양측이었으며, GraphPad Prism 8을 사용해 수행하였다. ns P>0.05, *P≤0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
본 발명은 아래에서 상세히 설명되지만, 본 발명의 내용은 변경될 수 있으므로, 본 발명에 기술된 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약으로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어들은 구체적인 구현예를 기술하기 위한 목적일 뿐, 첨부된 청구항에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않은 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 당해 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다.
바람직하게는, 본원에서 사용되는 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 기술된 바와 같이 정의된다.
본 발명의 실시는, 달리 언급되지 않은 한, 본 기술 분야의 문헌에 설명된 통상적인 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술 방법이 채택될 것이다 (예, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
이하, 본 발명의 요소들이 설명될 것이다. 이들 요소는 구체적인 구현예를 들어 열거되지만, 임의의 방식 및 임의의 수로 조합하여 부가적인 구현예들을 만들 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 구현예들은 본 발명을 명시적으로 기술한 구현예들로만 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 설명은 명시적으로 기술된 구현예들이 임의의 복수의 기술된 요소들과 조합하는 구현예들을 기술하고 포괄하는 것으로 이해하여야 한다. 아울러, 언급된 모든 요소들에 대한 임의 순열 및 조합도 문맥상 달리 의미하지 않은 한 이러한 설명에 의해 개시된 것으로 간주하여야 한다.
용어 "약"은 대략적으로 또는 거의를 의미하며, 본 발명에 기술된 수치 값 또는 범위의 맥락에서, 일 구현예에서, 언급되거나 또는 청구된 수치 값 또는 범위에 대한 ±20%, ±10%, ±5% 또는 ±3%를 의미한다.
개시 내용을 설명하는 문맥에 (특히 청구항의 맥락에서) 사용되는 용어 정관사 및 부정관사 ("a" 및 "an" 및 "the") 및 비슷한 표현은, 본원에서 달리 명시되지 않거나 또는 문맥상 명확하게 상충되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명에서 수치 값들에 대한 범위 언급은 주로 범위에 속하는 각각의 개별 값들을 각각 기술하는 약칭 방식으로 사용하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 언급되지 않은 한, 각각의 개별 값은 본원에 각각 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본 발명에 기술된 모든 방법들은, 본원에서 달리 언급되지 않거나 또는 문맥상 명확하게 상충되지 않는 한, 임의의 적절한 순서로 수행할 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 모든 예, 또는 예시적인 표현 (예, "와 같은")의 사용은 주로 개시 내용을 잘 설명하기 위한 것일 뿐, 청구항의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 명세서에서 어떤 표현도 개시 내용을 실시하는데 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소들을 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.
명확하게 달리 명시되지 않은 한, 용어 "포함하는"은 본 발명의 맥락에서 "포함하는"에 의해 나열되는 목록의 구성 요소와 더불어 추가적인 구성원들이 선택적으로 존재할 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 그러나, 본 발명의 구체적인 구현예로서, 용어 "포함하는"은 추가적인 구성 요소들이 존재하지 않을 가능성도 포괄하는 것으로 고려되며, 즉 이러한 구현예의 경우 "포함하는"은 "로 이루어진"의 의미인 것으로 이해되어야 한다.
몇몇 문헌들이 본 명세서의 전체 내용에서 인용된다. 본원에 인용된 전술한 또는 후술한 각각의 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 명세서, 설명서 등)은, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 이러한 기술 내용을 선행할 자격이 없다는 인정으로서 해석되어서는 안된다.
이하, 본 발명의 모든 측면들에 적용되는 정의들을 제시한다. 아래 용어들은 달리 언급되지 않은 한 후술한 의미를 가진다. 정의되지 않은 임의의 용어는 당해 기술 분야에서 인지되는 의미를 가진다.
정의
"MHC-의존적인 T 세포 반응에 적어도 부분적으로 내성"인 암은, 암에 대한 MHC-의존적인 T 세포 반응이, 특히 암이 본원에 기술된 바와 같이 내성 기전의 발현으로 인해, 정상 상태와 비교해, 예를 들어 암이 MHC-의존적인 T 세포 반응에 내성이지 않은 상태, 예를 들어 암에 대한 생산적인 MHC-의존적인 T 세포 반응이 발생해 궁극적으로 종양을 공격 및 사멸시킬 수 있거나, 및/또는 암이 T 세포에 기반한, 즉 T 세포가 참여하는 치료에 반응하는 상황과 비교해, 감소되는 것을 의미한다. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성이지 않은 암은, 바람직하게는, 정상적인 항원의 가공 처리 및/또는 제시뿐 아니라 정상적인 IFN-신호전달을 나타낸다. 이에, "MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성"인 암은 암에 대한 생산적인 MHC-의존적인 T 세포 반응 및/또는 MHC-의존적인 T 세포에 의한 종양 세포의 사멸을 일부 또는 완전히 회피할 수 있다. MHC-의존적인 T 세포 반응은 암에 대한 내인성 반응일 수 있으며, 및/또는 MHC-의존적인 T 세포의 유도로 인한, 예를 들어 T 세포가 참여하는 면역요법으로 인한 반응일 수 있다.
용어 "적절하게 반응하지 않는다"는 것은, 반응이, 정상적인 상황, 예를 들어, 암이 MHC-의존적인 T 세포 반응에 적어도 부분적으로 내성이 아니며 T 세포에 기반한, 즉, T 세포가 참여하는 치료에 반응하는 상황과 비교해, 감소되는 것을 의미한다. MHC-의존적인 T 세포 반응에 적어도 부분적으로 내성이 아닌 암은, 바람직하게는, 정상적인 항원 가공 처리 및/또는 제시뿐 아니라 정상적인 IFN-신호전달을 발휘한다. 용어 "결함"은, 대상이 결함이 있는 특성 또는 활성이 그러한 결함이 없는 정상적인 상황과 비교해 저하되는 것을 의미한다.
바람직하게는, MHC-의존적인 T 세포 반응에 적어도 부분적으로 내성이거나 및/또는 T 세포에 기반한 치료에 적절하게 반응하지 않는 암은, 1) 항원의 가공 처리 및/또는 제시를 야기하는 기전에 결함이 존재할 수 있거나, 예를 들어, 암이, MHC-I 대립유전자 또는 β2-마이크로글로불린 (B2M)의 돌연변이 또는 부분 상실 또는 전체 상실이 원인일 수 있는 MHC-I 결함이 존재할 수 있거나; 2) 예를 들어, I형 IFN 또는 IFNγ 신호전달과 같은 IFN-신호전달에 대한 결함으로 인해, T 세포 자극에 대해 결함이 존재할 수 있거나; 또는 3) 예를 들어, CD8+ T 세포에 의한 인지를 위해 MHC를 통해 제시되는 항원을 놓칠 수 있거나, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본원에서, "감소한다", "낮춘다", "저해한다" 또는 "손상시킨다"는, 수준 측면에서, 예를 들어 결합 수준 측면에서, 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더 바람직하게는 50% 이상, 더 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 전체적인 감소 또는 전체적인 감소를 유발하는 능력을 의미한다.
"증가시킨다", "강화한다" 또는 "초과한다"와 같은 용어들은 바람직하게는 약 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더 바람직하게는 40% 이상, 더 바람직하게는 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상, 200% 이상, 500% 이상 또는 그 이상으로의 증가 또는 강화를 의미한다.
본원에 따라, 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합으로 서로 연결된 연속적인 아미노산을 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 6개 이상, 약 8개 이상, 약 10개 이상, 약 13개 이상, 약 16개 이상, 약 20개 이상에서 최대 약 50개, 약 100개 또는 약 150개 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 큰 펩타이드, 특히 아미노산 약 150개 이상의 펩타이드를 지칭하지만, 용어 "펩타이드", "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 본원에서 통상적으로 동의어로 사용된다.
"치료학적 단백질"은 개체에 치료학적 유효량으로 제공되었을 때 개체의 병태 또는 질환 상태에 긍정적인 또는 유익한 효과를 가진다. 일 구현예에서, 치료학적 단백질은 치유적 (curative) 또는 고식적 (palliative) 특성을 가지며, 투여하여 질환 또는 장애의 한가지 이상의 증상의 개선, 완화, 경감, 역전, 발병 지연 또는 중증도 약화를 달성할 수 있다. 치료학적 단백질은 예방학적 특성을 가지며, 질환의 개시를 지연시키거나 또는 이러한 질환 또는 병리학적 병태의 중증도를 약화하기 위해 이용할 수 있다. 용어 "치료학적 단백질"은 전체 (entire) 단백질 또는 펩타이드를 망라하며, 또한 이의 치료학적 활성 단편을 지칭할 수도 있다. 또한, 단백질의 치료학적 활성 변이체도 포괄할 수 있다. 치료학적 활성 단백질의 예로는 사이토카인이 있지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)과 관련하여, "단편"은 아미노산 서열의 일부를 의미하며, 즉, N-말단 및/또는 C-말단에서 짧아진 아미노산 서열을 의미한다. C-말단에서 짧아진 단편 (N-말단 단편)은, 예를 들어, 오픈 리딩 프래임의 3'-말단이 결핍된 말단 절단된 (truncated) 오픈 리딩 프래임을 번역함으로써, 수득가능하다. N-말단에서 짧아진 단편 (C-말단 단편)은, 절단된 오픈 리딩 프래임이 번역 개시에 이용되는 개시 코돈을 포함하는 한, 예를 들어, 오픈 리딩 프래임의 5'-말단이 결핍된 말단 절단된 오픈 리딩 프래임을 번역함으로써, 수득가능하다. 아미노산 서열의 단편은, 예를 들어, 아미노산 서열의 아미노산 잔기들 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%를 포함한다. 아미노산 서열의 단편은, 바람직하게는, 아미노산 서열로부터 유래하는 연속적인 아미노산을 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개 포함한다.
본원에서, "변이체" 또는 "변이체 단백질" 또는 "변이체 폴리펩타이드"는 하나 이상의 아미노산 변형 측면에서 야생형 단백질과는 다른 단백질을 의미한다. 모 (parent) 폴리펩타이드는 자연 생성 또는 야생형 (WT) 폴리펩타이드일 수 있거나, 또는 야생형 폴리펩타이드의 변형된 버전일 수 있다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드와 비교해 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어 모 폴리펩타이드와 비교해 1개 내지 약 20개, 바람직하게는 1개 내지 약 10개 또는 1개 내지 약 5개의 아미노산 변형을 가진다.
본원에서, "모 폴리펩타이드", "모 단백질", "전구체 폴리펩타이드" 또는 "전구체 단백질"은, 향후 변형되어 변이체를 만들게 되는, 비-변형된 폴리펩타이드를 의미한다. 모 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드, 또는 야생형 폴리펩타이드의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다.
본원에서 "야생형" 또는 "WT" 또는 "천연 (native)"은 대립유전자 변형을 비롯해 자연계에서 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 단백질 또는 폴리펩타이드는 의도적으로 변형하지 않은 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 목적에서, 아미노산 서열 (펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결손 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 스플라이스 변이체, 번역 후 수정된 버전, 입체구조 (conformation), 이소형 및 종 상동체 (species homolog), 특히 세포에 의해 자연적으로 발현되는 것을 모두 포괄한다. 용어 "변이체"는 특히 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에 하나 또는 2 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입이 존재하는 아미노산 서열의 경우, 수득되는 산물에 대한 적절한 스크리닝을 이용한 무작위 삽입도 가능하지만, 아미노산 서열에서 특정 부위에 하나 이상의 아미노산 잔기를 삽입한다. 아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그보다 많은 수로 된 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합체를 포함한다. 아미노산 결손 변이체는 서열에서 하나 이상의 아미노산의 제거, 예를 들어 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 제거를 특징으로 한다. 결손은 단백질의 임의 위치에 존재할 수 있다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 결손을 포함하는 아미노산 결손 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절단형 변이체 (truncation variant)로도 지칭된다. 아미노산 치환 변이체는 서열에서 하나 이상의 잔기를 제거하고 그 위치에 다른 잔기를 삽입하는 것을 특징으로 한다. 상동적인 단백질들 또는 펩타이드들 간에 비-보존된 아미노산 서열 위치에 변형이 존재하거나, 및/또는 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 펩타이드 및 단백질 변이체에서 아미노산 변화는 보존적인 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전 또는 비-하전된 아미노산으로의 치환이다. 보존적인 아미노산 변화는 측쇄가 비슷한 아미노산들로 구성된 계열에 속하는 하나로의 치환을 수반한다. 자연 생성 아미노산은 일반적으로 4가지 계열로 나뉜다: 산성 아미노산 (아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성 아미노산 (라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비-극성 아미노산 (알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비-하전된 극성 아미노산 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 함께 분류된다. 일 구현예에서, 보존적인 아미노산 치환은 다음과 같은 그룹 내에서의 치환을 포함한다:
글리신, 알라닌;
발린, 이소루신, 루신;
아스파르트산, 글루탐산;
아스파라긴, 글루타민;
세린, 트레오닌;
라이신, 아르기닌; 및
페닐알라닌, 티로신.
바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 간의 유사성, 바람직하게는 동일성 정도는 적어도 약 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%의 아미노산 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열이 아미노산 200개로 구성된다면, 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 아미노산, 바람직하게는 연속적인 아미노산 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 60개, 적어도 약 80개, 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개 또는 약 200개에 대해 제공된다. 바람직한 구현예에서, 유사성 또는 동일성 정도는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 제공된다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 기술 분야에 공지된 도구를 사용해, 바람직하게는 최상의 서열 정렬, 예를 들어, Align을 사용해, 표준 설정 조건으로, 바람직하게는 EMBOSS::needle, 매트릭스: Blosum62, 갭 오픈 (Gap Open) 10.0, 갭 연장 (Gap Extend) 0.5 하에 수행할 수 있다.
"서열 유사성"은 보존적인 아미노산 치환이거나 또는 동일한 아미노산의 %를 나타낸다. 아미노산 서열 2종 간의 "서열 동일성"은 서열들 간에 동일한 아미노산의 %를 나타낸다.
용어 "동일성 %"는 최상으로 정렬하여 수득되는, 비교 서열 2종 간에 동일한 아미노산 잔기의 %를 나타내는 것으로 의도되며, 이 %는 순수하게 통계이며, 서열 2종 간의 차이는 전장에 걸쳐 무작위로 분포한다. 아미노산 서열 2종 간의 서열 비교는 통상적으로 이들 서열을 최적으로 정렬한 후 비교함으로써 수행하며, 국소 서열 유사성 영역을 식별 및 비교하기 위해서는 이러한 비교는 세그먼트 또는 "비교 창"에 의해 이루어진다. 서열을 비교하기 위한 최적 정렬은 수동 외에도 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 국소 상동성 알고리즘을 이용하거나, Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 국소 상동성 알고리즘을 이용하거나, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 검색 방법을 이용하거나, 또는 이들 알고리즘을 이용하는 컴퓨터 프로그램 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 이용하여, 생성할 수 있다.
동일성 %는 서열 2종 간의 동일성 %를 구하기 위해 비교 중인 서열 2종 간에 동일한 위치의 수를 측정한 다음 이를 비교하는 위치의 수로 나눈 후 그 결과에 100을 곱하여 계산한다.
상동적인 아미노산 서열은 본원에 따르면 아미노산 잔기들에 대해 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 가진다.
본 발명에 기술된 아미노산 서열 변이체는 당해 기술 분야의 당업자에 의해, 예를 들어, 재조합 DNA 조작을 통해 쉽게 제조할 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결손을 가진 펩타이드 또는 단백질을 제조하기 위한 DNA 서열의 조작 방법은, 예를 들어, Sambrook et al. (1989)에 상세히 기술되어 있다. 또한, 본원에 기술된 펩타이드 및 아미노산 변이체는, 예를 들어 고상 합성 및 유사 방법과 같이 공지된 펩타이드 합성 기법을 보조적으로 이용해 쉽게 제조할 수 있다.
일 구현예에서, 아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)의 단편 또는 변이체는 바람직하게는 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"이다. 아미노산 서열의 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"라는 용어는 이의 유래가 되는 아미노산 서열과 동일한 또는 비슷한 한가지 이상의 기능적 특성을 발휘하는 임의의 단편 또는 변이체를 의미하며, 즉 기능적 균등물이다. IL2와 같은 사이토카인과 관련한 구체적인 한가지 기능은 단편 또는 변이체의 기원이 되는 아미노산 서열에 의해 발휘되는 한가지 이상의 면역조절 활성, 및/또는 단편 또는 변이체의 기원이 되는 아미노산 서열이 결합하는 수용체(들)에의 결합이다. 본원에서, 용어 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"는, 특히, 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열과 비교해 하나 이상의 아미노산이 변형된 아미노산 서열을 포함하지만, 모 분자 또는 서열의 한가지 이상의 기능성을 여전히 충족할 수 있는, 예를 들어 표적 분자에의 결합성 또는 표적 분자에의 결합에 기여하는 기능성을 여전히 발휘하는, 변이체 분자 또는 서열을 의미한다. 일 구현예에서, 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열내 변형은 분자 또는 서열의 결합 특징을 현저하게 변형시키지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다. 다른 구현예에서, 기능성 단편 또는 기능성 변이체의 결합성이 저하될 순 있지만, 여전히 현저한 수준으로 존재하며, 예를 들어, 기능성 변이체의 결합성은 모 분자 또는 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%일 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서는, 기능성 단편 또는 기능성 변이체의 결합성이 모 분자 또는 서열과 비교해 강화될 수도 있다.
지정된 아미노산 서열 (펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)"로부터 유래한" 아미노산 서열 (펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)은 제1 아미노산 서열의 기원을 참조한다. 바람직하게는, 특정 아미노산 서열로부터 유래한 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편과 동일한, 본질적으로 동일한 또는 상동적인 아미노산 서열을 가진다. 특정 아미노산 서열로부터 유래한 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에서 이용하기 적합한 IL2 화합물이, 이의 기원이 되는 자연 생성 또는 본래의 서열과 서열상 차이는 있지만 본래의 서열의 바람직한 활성을 유지하도록 변형될 수 있는 것임을, 이해할 것이다.
본원에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 공지하기 위해 이용할 수 있는 "설명 자료" 또는 "설명서"는 출판물, 기록, 도표 또는 임의의 다른 표현 매체를 포괄한다. 본 발명의 키트의 설명 자료는, 예를 들어, 본 발명의 조성물이 수용된 용기에 고정되거나 또는 조성물이 수용된 용기와 함께 전달될 수 있다. 대안적으로, 설명 자료는 용기와는 별도로, 설명 자료와 조성물을 사용자가 함께 이용하고자 하는 의도로 전달할 수 있다.
"단리된"은 자연적인 상태로부터 변경되거나 또는 취해지는 것을 의미한다.예를 들어, 살아있는 동물에 본래 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이 아니며, 자연적인 상태에서 함께 존재하는 물질로부터 일부 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 비-천연 환경, 예를 들어 숙주 세포에 존재할 수 있거나, 또는 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있다.
용어 "재조합"은 본 발명의 맥락에서 "유전자 조작을 통해 제조되는" 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서, 재조합 세포와 같은 "재조합 대상체"는 자연적으로 생성되지 않는다.
본원에서, 용어 "자연 생성"은 대상체를 자연에서 발견할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, (바이러스 등의) 유기체에 존재하며 본래의 원료로부터 분리할 수 있되 실험실에서 인간에 의한 의도적인 조작을 거치지 않은 펩타이드 또는 핵산은 자연 생성된 것이다.
용어 "유전자 변형"은 세포의 핵산 형질감염을 포함한다. 용어 "형질감염"은 핵산, 특히 RNA를 세포에 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적에서, 용어 "형질감염"은 또한 세포에 핵산의 도입 또는 세포에 의한 핵산의 흡수를 포함하며, 이때 세포는 개체, 예를 들어 환자에 존재하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 본원에 기술된 핵산을 형질감염시키기 위한 세포는 시험관내 또는 생체내에 존재할 수 있으며, 예를 들어 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 유기체의 일부를 구성할 수 있다. 본 발명에 따라, 형질감염은 일시적이거나 또는 안정적일 수 있다. 형질감염의 일부 적용의 경우, 형질감염된 유전 물질이 일시적인 발현되는 것만으로도 충분하다. 형질감염 과정 중에 도입된 핵산은 통상적으로 핵 게놈에 삽입되지 않으므로, 외래 핵산은 유사분열을 통해 희석되거나 또는 분해될 것이다. 핵산의 에피좀 증폭을 허용하는 세포는 희석 속도를 상당히 늦춘다. 형질감염된 핵산이 실제 그 세포와 이의 딸 세포의 게놈에 잔류하는 것이 바람직하다면, 안정적인 형질감염이 이루어져야 한다. 이러한 안정적인 형질감염은 바이러스-매개 시스템 또는 트랜스포존-매개 시스템을 형질감염에 이용함으로써 달성할 수 있다. 일반적으로, IL2와 같은 사이토카인을 코딩하는 핵산은 세포에 일시적으로 형질감염된다. RNA는 세포에 형질감염되어, 이를 암호화하는 단백질이 일시적으로 발현될 수 있다.
용어 "면역 작동자 세포" 또는 "작동자 세포"는 본 발명의 맥락에서 면역 반응 중에 작동자 기능을 발휘하는 세포를 지칭한다. 예를 들어. 면역 작동자 세포는 T 세포 (세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤성 T 세포), B 세포, 자연 살상 세포, 호중구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다. 용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포) 및 세포용해성 T 세포를 포함하는 세포독성 T 세포 (CTL, CD8+ T 세포)를 포괄한다. 용어 "MHC-의존적인 T 세포" 또는 유사 용어는 MHC를 통해 제시되었을 때 항원을 인지하여, 바람직하게는 T 세포의 작동자 기능, 예를 들어 항원을 발현하는 표적 세포의 사멸을 야기하는 T 세포를 지칭한다.
T 세포는 림프구로 알려진 백혈구 세포 군에 속하며, 세포-매개 면역에 중추적인 역할을 담당한다. T 세포는 T 세포 수용체 (TCR)로 지칭되는 세포 표면 상의 특수한 수용체의 존재에 의해 B 세포 및 자연 살상 세포와 같은 다른 림프구 유형과 구분할 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙을 담당하는 기본 장기이다. 각각 구분되는 기능을 가진 T 세포의 몇가지 다양한 아종들이 발견되어 있다.
T 헬퍼 세포는, 다른 기능들 중에서도, B 세포에서 형질세포로의 성숙화 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 비롯해, 면역학적 과정에서 다른 백혈구 세포를 보조한다. 이들 세포는 또한 표면에 CD4 당단백질을 발현하므로, CD4+ T 세포로도 공지되어 있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포 (APC)의 표면에 발현된 MHC 클래스 II 분자를 통해 펩타이드 항원을 제시하였을 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 빠르게 분열하여, 능동 면역 반응에서 조절 또는 보조하는 사이토카인으로 지칭되는 소형 단백질을 분비하게 된다.
세포독성 T 세포는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하며, 이식 거부 반응에도 관여한다. 이들 세포는 표면에 CD8 당단백질을 발현하므로, CD8+ T 세포로도 알려져 있다. 이들 세포는 신체 거의 모든 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 I에 조합된 항원에 결합함으로써 그 표적을 인지한다.
모든 T 세포는 여러가지 단백질들로 된 복합체로서 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)를 가지고 있다. T 세포의 TCR은 주 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합되어 표적 세포의 표면 상에 제시된 면역원성 펩타이드 (에피토프)와 상호작용할 수 있다. 특이적인 TCR 결합은 T 세포 내부에서 신호 캐스케이드를 촉발하여, 성숙한 작동자 T 세포로의 증폭과 분화를 유발한다. 대부분의 T 세포에서, 실제 T 세포 수용체는 독립적인 T 세포 수용체 α 및 β (TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 만들어지는 구분되는 펩타이드 쇄 2개로 구성되는데, 이는 α-TCR 쇄 및 β-TCR 쇄로 지칭한다. γδ T 세포 (감마 델타 T 세포)는 T 세포에서 훨씬 적은 비중을 차지하는 군 (총 T 세포의 2%)으로서, 그 표면에 구분되는 T 세포 수용체 (TCR)를 가지고 있으며, 그 수용체는 γ-쇄 하나와 δ-쇄 하나로 구성된다.
모든 T 세포는 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 기원한다. 조혈 줄기 세포로부터 유래하는 조혈 전구 세포는 흉선에 머무르며, 세포 분열을 통해 증폭함으로써 미성숙 흉선세포 집단을 대량으로 만들다. 최초기 흉선세포는 CD4도 CD8도 발현하지 않으며, 그래서 이중-음성 (CD4-CD8-) 세포로 분류한다. 이것은 발달을 통해 진행되어, 이중-양성 흉선세포 (CD4+CD8+)를 거쳐, 최종적으로는 단일-양성 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+) 흉선세포로 성숙된 다음 흉선에서 말초 조직으로 방출된다.
본원에서, 용어 "NK 세포" 또는 "자연 살상 세포"는 T 세포 수용체가 없고 CD56 또는 CD16을 발현하는 것으로 정의되는 말초혈 림프구의 하위군을 지칭한다.
인간에서 MHC 분자는 보통 HLA (인간 백혈구 항원) 분자를 지칭한다. 기본적으로 2가지 유형의 MHC 분자가 존재한다: 클래스 I 및 클래스 II. MHC 클래스 I 항원은 신체의 거의 모든 유핵 세포에서 발견된다. 이 유형에 속하는 MHC 분자의 일차적인 기능은 세포내 단백질의 펩타이드 단편을 CTL에 나열 (또는 제시)하는 것이다. 이러한 나열에 기반하여, CTL은 암 항원과 같은 질환-관련 펩타이드 (항원)를 비롯한 MHC-결합된 펩타이드를 나열한 것을 공격하게 된다. CD8-양성 T 세포는 통상적으로 세포독성이며 (그래서, 세포독성 T 세포 = CTL로 지칭됨), 임의의 세포내 위치된 단백질로부터 세포내에서 가공 처리되어 MHC 클래스 I 분자에 의해 세포 표면 상에 제시된, 아미노산 9-10개로 이루어진 펩타이드를 인지한다. 따라서, MHC 클래스 I 분자의 표면 발현은 CTL에 대한 표적 세포의 감수성을 결정하는데 중요한 역할을 담당한다.
암 면역요법에서 종종 직면하는 문제는, 예를 들어, 암의 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 내성을 유발하는, 암 조직의 면역원성 손상이다. 이러한 소위 "면역 탈출"은 신생물 세포에서 직면하는 표현형 차이를 토대로 이해할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포는 항원을 가공 처리 및 제시하는 능력 저하를 나타내거나, T 세포, 예를 들어, 자가 T 세포를 자극하는 능력이, 예를 들어, IFN-신호전달의 결함으로 인해 감소되거나, 형질전환된 세포와 관련있는 면역원성 단백질이 완전한 하향-조절되거나 및/또는 백혈구 응착 분자 또는 기타 보조 분자가 발현되지 않거나 또는 적게 발현되고, 일부 MHC 클래스 I 및 클래스 II 대립유전자 또는 B2M에 대해 선택적인 하향-조절을 보인다. MHC의 기능 또는 발현 상실은 단일 MHC 대립유전자의 상실, MHC 하플로타입 상실 또는 이중-대립유전자 B2M 유전자 상실로 인한 전체 MHC 클래스 I의 상실로 인해 생길 수 있다. 따라서, MHC 발현이 상실된 종양은 MHC-의존적인 T 세포에 기반한 임의의 치료에 내성을 가지게 된다. 실제, MHC 기능 손상은 종양의 "면역 탈출" 기전들 중 하나이므로, T 세포 매개의 면역 요법의 이용을 제한하게 된다. 본 발명에 따르면, MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암은 하나 이상의 면역 탈출 기전을 획득할 수 있다.
게놈 불안정성은 암의 특징이다. 그래서 종양은 치료에 대한 내성을 진화, 적응 및 전개할 수 있다. 숙주 면역 시스템과의 상호작용이 주어진 종양 세포 클론에 대한 생존과 전파력을 좌우한다. 따라서, 특히 예를 들어, MHC-I 결함성 종양 변이체에 대한 T-세포 면역 압력으로 인한 "선택" 과정이 자연적인 과정일 수도 있다. 백신 접종과 같은 다수의 요법들에서 내성을 선택되므로, 이러한 장벽을 효과적으로 다루지 못하게 된다. 본 발명은 암 세포의 표적화를 전환함으로써 생기는 대안적인 선택 압력을 암 세포에 적용하는 치료법을 개시한다. 이러한 대안적인 선택 압력은 또한 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 내성의 발생을 방지할 수 있다.
인터페론
인터페론 (IFN)은 바이러스, 세균, 기생충 및 또한 종양 세포와 같은 여러가지 병원체의 존재에 반응하여 숙주 세포에 의해 생성 및 분비되는 일군의 신호전달 단백질이다. 전형적인 시나리오로, 바이러스-감염된 세포는 인터페론을 방출해, 인접 세포의 항-바이러스 방어를 강화하게 된다.
인터페론은 신호전달에 관여하는 수용체 유형에 따라 전형적으로 3가지 계열로 나뉜다: I형 인터페론, II형 인터페론 및 III형 인터페론.
I형 인터페론들은 모두 IFNAR1 쇄와 IFNAR2 쇄로 구성된 IFN-α/β 수용체 (IFNAR)로 알려진 특이적인 세포 표면 수용체 복합체에 결합한다.
인간에 존재하는 I형 인터페론은 IFNα, IFNβ, IFNε, IFNκ 및 IFNω이다. 일반적으로, I형 인터페론은 신체가 침입한 바이러스를 인지하였을 때 만들어진다. 이는 섬유모세포 및 단핵구에 의해 생산된다. I형 인터페론은, 일단 방출되면, 표적 세포 상의 특이적인 수용체에 결합하게 되며, 그래서 바이러스가 RNA 및 DNA를 생성 및 복제하지 못하게 막는 단백질이 발현된다.
IFNα 단백질은 주로 형질세포양 수지상 세포 (plasmacytoid dendritic cell, pDC)에 의해 생산된다. 이는 주로 바이러스 감염에 대한 선천 면역에 관여한다. 이의 합성을 담당하는 유전자는 IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21로 지칭되는 13종의 하위종들로 제공된다. 이들 유전자는 9번 염색체에서 클러스터로 군집하여 발견된다.
IFNβ 단백질은 섬유모세포에 의해 다량으로 생산된다. 이는 주로 선천 면역 반응에 참여하는 항바이러스 활성을 가진다. IFNβ에 대한 2가지 유형, 즉 IFNβ1 및 IFNβ3가 알려져 있다. IFNβ1의 천연 형태와 재조합 형태 모두 항-바이러스, 항-세균 및 항-암 특성을 가지고 있다.
II형 인터페론 (인간의 경우 IFNγ)은 또한 면역 인터페론으로도 알려져 있으며, IL12에 의해 활성화된다. 또한, II형 인터페론은 세포독성 T 세포 및 T 헬퍼 세포에 의해 방출된다.
III형 인터페론은 IL10R2 (CRF2-4로도 지칭됨) 및 IFNLR1 (CRF2-12로도 지칭됨)으로 구성된 수용체 복합체를 통해 신호 전달한다. III형 IFN은 I형 IFN 및 II형 IFN보다 최근에 발견되었지만, 최근 정보는 일부 바이러스 또는 진균 감염 유형들에서 III형 IFN의 중요성을 보여준다.
일반적으로, I형 인터페론 및 II형 인터페론은 면역 반응을 제어 및 활성화하는 역할을 담당한다.
용어 "자가"는 어떤 것이 동일한 개체로부터 유래한다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, "자가 이식"은 동일한 개체로부터 유래한 조직 또는 장기의 이식을 의미한다. 이러한 시술은, 그렇지 않을 경우 거부 반응을 야기하는 면역학적 장벽을 극복할 수 있으므로, 유리하다.
용어 "동종이계"는 어떤 것이 동일 종의 다른 개체로부터 유래함을 나타내기 위해 사용된다. 2 이상의 개체는, 하나 이상의 유전자 좌에 위치한 유전자들이 동일하지 않을 경우, 서로에 대해 동종이계이라 한다.
용어 "동계"는 어떤 것이 동일한 유전자형을 가진 개체 또는 조직, 즉 동일한 일란성 쌍둥이 또는 근친계 (inbred strain)의 동물 또는 이들의 조직으로부터 유래한다는 것을 나타내기 위해 사용된다.
용어 "이종"은 어떤 것이 복수의 서로 다른 인자들로 구성된다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, 한 개체의 골수를 다른 개체로 이식하는 것은 이종 이식이다. 이종의 유전자는 개체와는 다른 기원으로부터 유래한 유전자이다.
핵산
본원에서, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합에 의해 만들어진 분자 및 화학 합성된 분자와 같은 DNA 및 RNA를 포괄하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일 가닥이거나 또는 이중 가닥일 수 있다. RNA는 시험관내 전사된 RNA (IVT RNA) 또는 합성 RNA를 포괄한다.
핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 본원에서, 용어 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지와 같은 파지 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 베큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC) 또는 P1 인공 염색체 (PAC)와 같은 인공 염색체 벡터를 비롯하여, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의 벡터를 포괄한다. 이러한 벡터는 발현 벡터뿐 아니라 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드뿐 아니라 바이러스 벡터를 포함하며, 일반적으로 바람직한 암호화 서열과, 특정 숙주 유기체 (예, 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류)에서 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현시키는데 필요한 적절한 DNA 서열을 가진다. 클로닝 벡터는 일반적으로 원하는 특정 DNA 단편을 조작 및 증폭시키기 위해 이용되며, 원하는 DNA 단편을 발현시키기 위해 필요한 기능적인 서열들은 결핍되어 있을 수도 있다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, IL2를 암호화하는 핵산 또는 항체를 암호화하는 핵산과 같은 핵산은 IL2 또는 항체를 제공하기 위해 처치된 개체의 세포에서 발현된다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 핵산은 개체의 세포에서 일시적으로 발현된다. 따라서, 일 구현예에서, 핵산은 세포의 게놈에 통합되지 않는다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 핵산은 RNA이며, 바람직하게는 시험관내에서 전사된 RNA이다.
본원에 기술된 핵산은 재조합 분자이거나 및/또는 단리된 분자일 수 있다.
본원에서, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 함유한 핵산 분자를 의미한다. 바람직한 구현예에서, RNA는 그 전체가 또는 대부분이 리보뉴클레오티드 잔기로 구성된다. 본원에서, "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 기의 2' 위치에 하이드록시 기를 가진 뉴클레오티드이다. RNA는, 비-제한적으로, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예를 들어 일부 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합에 의해 제조된 RNA 뿐 아니라 자연 생성 RNA와 비교해 뉴클레오티드 하나 이상의 부가, 결손, 치환 및/또는 변형 차이를 가진 변형된 RNA를 포괄한다. 이러한 변형은 내부 RNA 뉴클레오티드 또는 RNA의 말단(들)에 비-뉴클레오티드 물질이 부가된 것을 의미할 수도 있다. 이는 또한, 본원에서, RNA의 뉴클레오티드가 화학 합성 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비-표준 뉴클레오티드일 수 있는 것 역시 고려한다. 본원에서, 이들 변형된 RNA는 자연 생성 RNA의 유사체로 간주한다.
본 발명의 특정 구현예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 RNA 전사체를 의미하는 메신저 RNA (mRNA)이다. 당해 기술 분야에서 확립된 바와 같이, mRNA는 일반적으로 5' 비-번역 영역 (5'-UTR), 펩타이드 암호화 영역 및 3' 비-번역 영역 (3'-UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 제조한다. 일 구현예에서, mRNA는 DNA 주형을 이용한 시험관내 전사를 통해 제조하며, 여기서 DNA는 데옥시리보뉴클레오티드를 함유한 핵산을 지칭한다.
일 구현예에서, RNA는 시험관내에서 전사된 RNA (IVT-RNA)이며, 적절한 DNA 주형으로부터 시험관내 전사를 통해 수득할 수 있다. 전사 조절 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고, 이를 시험관내 전사를 위해 적절한 벡터에 도입하여 수득할 수 있다. cDNA는 RNA를 역전사하여 수득할 수도 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 RNA는 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수도 있다. 일부 구현예에서, RNA는 하나 이상의 (예를 들어, 모든) 우리딘을 대신하여 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서, 용어 "우라실"은 RNA의 핵산에서 생길 수 있는 뉴클레오베이스들 중 하나를 지칭한다. 우라실의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00001
본원에서, 용어 "우리딘"은 RNA에서 생길 수 있는 뉴클레오시드들 중 하나를 지칭한다. 우리딘의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00002
UTP (우리딘 5'-트리포스페이트)는 하기 구조를 가진다:
Figure pct00003
슈도-UTP (슈도우리딘 5'-트리포스페이트)는 하기 구조를 가진다:
Figure pct00004
"슈도우리딘"은 우라실이 질소-탄소 글리코시드 결합 대신 탄소-탄소 결합을 통해 펜토스 고리에 결합된, 변형된 뉴클레오시드, 즉 우리딘 이성질체의 일 예이다.
변형된 뉴클레오시드에 대한 다른 예는 하기 구조를 가진 N1-메틸-슈도우리딘 (m1ψ)이다:
Figure pct00005
N1-메틸-슈도-UTP는 하기 구조를 가진다:
Figure pct00006
변형된 뉴클레오시드에 대한 또다른 예는 하기 구조를 가지는 5-메틸-우리딘 (m5U)이다:
Figure pct00007
일부 구현예에서, 본원에 언급된 RNA에서 하나 이상의 우리딘이 변형된 뉴클레오시드로 치환된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 변형된 우리딘이다.
일부 구현예에서, RNA는 하나 이상의 우리딘 대신 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 각각의 우리딘 대신 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 독립적으로 슈도우리딘 (ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1ψ) 및 5-메틸-우리딘 (m5U)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (ψ)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘 (m1ψ)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 변형된 뉴클레오시드를 2가지 타입 이상 포함할 수 있으며, 변형된 뉴클레오시드는 독립적으로 슈도우리딘 (ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1ψ) 및 5-메틸-우리딘 (m5U)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (ψ)과 N1-메틸-슈도우리딘 (m1ψ)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (ψ)과 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘 (m1ψ)과 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1ψ) 및 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA에서 하나 이상의 우리딘을 치환하는 변형된 뉴클레오시드는 다음 중 어느 하나 이상일 수 있다: 3-메틸-우리딘 (m3U), 5-메톡시-우리딘 (mo5U), 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘 (s2U), 4-티오-우리딘 (s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘 (ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘 (예를 들어, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산 (cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르 (mcmo5U), 5-카르복시메틸-우리딘 (cm5U), 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 (chm5U), 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르 (mchm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-우리딘 (mcm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-우리딘 (mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘 (nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘 (mnm5U), 1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘 (mnm5se2U), 5-카바모일메틸-우리딘 (ncm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-우리딘 (cmnm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (cmnm5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘 (τm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘(τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘), 5-메틸-2-티오-우리딘 (m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 다이하이드로우리딘 (D), 다이하이드로슈도우리딘, 5,6-다이하이드로우리딘, 5-메틸-다이하이드로우리딘 (m5D), 2-티오-다이하이드로우리딘, 2-티오-다이하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘 (acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘 (acp3 ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘 (inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘 (inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘 (Um), 5,2'-O-다이메틸-우리딘 (m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘 (ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘 (s2Um), 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm5Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm5Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm5Um), 3,2'-O-다이메틸-우리딘 (m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm5Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-ara-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-ara-우리딘, 5-(2-카르보메톡시비닐) 우리딘, 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)우리딘, 또는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기타 변형된 우리딘.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA는 5'-캡 (cap)을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 RNA는 캡이 달리지 않은 5'-트리포스페이트를 포함하지 않는다. 일 구현예에서, RNA는 5'-캡 유사체에 의해 변형될 수 있다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 구조를 지칭하는데, 이는 일반적으로 5' -> 5' 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 일 구현예에서, 이 구아노신은 7번 위치에서 메틸화된다. RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 부가는, 5'-캡이 RNA 가닥으로 공동-전사를 통해 발현되는 시험관내 전사에 의해 형성되거나, 또는 캡핑 효소를 이용하여 전사 후 RNA에 부착할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA에 대한 빌딩 블록 캡은 하기 구조를 가진 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG (때때로 m2 7,3`OG(5')ppp(5')m2'-OApG로 지칭됨)이다:
Figure pct00008
RNA 및 m2 7, 3`OG(5')ppp(5')m2 '- OApG를 포함하는 Cap1 RNA에 대한 예는 다음과 같다:
Figure pct00009
(캡 유사체가 아닌) Cap1 RNA에 대한 다른 예는 다음과 같다:
Figure pct00010
일부 구현예에서, RNA는, 일 구현예에서, 하기 구조를 가진 캡 유사체 안티-리버스 캡 (ARCA Cap (m2 7,3`OG(5')ppp(5')G))을 이용해 "Cap0" 구조로 변형된다:
Figure pct00011
RNA 및 m2 7, 3`OG(5')ppp(5')G를 포함하는 Cap0 RNA에 대한 예는 다음과 같다:
Figure pct00012
일부 구현예에서, "Cap0" 구조는 하기 구조를 가진 캡 유사체 β-S-ARCA (m2 7,2`OG(5')ppSp(5')G)를 이용해 만들다:
Figure pct00013
β-S-ARCA (m2 7, 2`OG(5')ppSp(5')G) 및 RNA를 포함하는 Cap0 RNA에 대한 예는 다음과 같다:
Figure pct00014
일부 구현예에서, 본원에 따른 RNA는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 용어 "비-번역 영역" 또는 "UTR"은 DNA 분자에서 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 영역, 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자에서의 대응되는 영역을 의미한다. 비-번역 영역 (UTR)은 오픈 리딩 프래임의 5' (상류)(5'-UTR) 및/또는 오픈 리딩 프래임의 3' (하류)(3'-UTR)에 존재할 수 있다. 5'-UTR은, 존재한다면, 단백질-암호화 영역의 개시 코돈의 상류, 5'-말단에 위치한다. 5'UTR은, (존재한다면) 5'-캡의 하류이며, 예를 들어 5'-캡에 바로 인접한다. 3'-UTR은, 존재한다면, 단백질-암호화 영역의 종결 코돈의 하류, 3' 말단에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리 (A) 서열을 포함하지 않는다. 따라서, 3'-UTR은 (존재한다면) 폴리 (A) 서열의 상류이며, 예를 들어 폴리 (A) 서열에 바로 인접하게 위치한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA는 3'-폴리(A) 서열을 포함한다. 본원에서, 용어 "폴리(A) 서열" 또는 "폴리-A 꼬리"는 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치한 아데닐레이트 잔기들로 구성된 불연속적인 또는 연속적인 서열을 지칭한다. 폴리(A) 서열은 당해 기술 분야의 당업자들에게 알려져 있으며, 본원에 기술된 RNA에서 3' UTR 다음에 올 수 있다. 폴리 (A) 서열은 임의 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리 (A) 서열은 A 뉴클레오티드를 적어도 약 20개, 적어도 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 80개 또는 적어도 약 100개, 그리고 최대 약 500개, 최대 약 400개, 최대 약 300개, 최대 약 200개 또는 최대 약 150개 포함하며, 특히 A 뉴클레오티드를 약 110개 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 A 뉴클레오티드로만 구성된다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 본질적으로 A 뉴클레오티드로 구성되지만, WO 2016/005324 A1에 기술된 바와 같이 뉴클레오티드 4종 (A, C, G 및 U)이 무작위로 중간에 삽입되며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이러한 무작위 서열은 뉴클레오티드 5-50개, 10-30개 또는 10-20개 길이일 수 있다. 본질적으로 dA 뉴클레오티로 구성되지만 뉴클레오티드 4종 (dA, dC, dG, dT)이 균등하게 분포하며 예를 들어 뉴클레오티드 5-50개 길이의 무작위 서열이 중간에 삽입된, DNA의 암호화 가닥에 존재하는 폴리(A) 카세트는, DNA 수준에서, E. coli에서 플라스미드 DNA의 일정한 증폭성을 보이며, RNA 수준에서도, RNA 안정성 및 번역 효율을 뒷받침하는 측면에서 유익한 특성과 여전히 연관되어 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 3' 말단에서 A 뉴클레오티드 이외의 다른 뉴클레오티드가 측면에 위치하지 않으며, 즉, 폴리(A) 서열이 3' 말단에서 A 이외의 다른 뉴클레오티드에 의해 가려지거나 또는 후속되지 않는다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "전사"는 DNA 서열에서 유전자 코드가 RNA로 전사되는 과정을 지칭한다. 이후, RNA는 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있다.
"암호화"는 정의된 뉴클레오티드 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열과 이로부터 기인한 생물학적 특성을 가진, 생물학적 과정에서 다른 폴리머 및 거대분자를 합성하기 위한 주형으로서 역할하기 위한, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드에서 특정한 뉴클레오티드 서열의 고유한 특성을 의미한다. 따라서, 세포 또는 다른 생물 시스템에서 유전자에 대응되는 mRNA의 전사 및 번역으로 단백질이 만들어진다면, 그 유전자가 단백질을 암호화하는 것이다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에 제공된 암호화 가닥과, 유전자 또는 cDNA를 전사하기 위한 주형으로서 사용되는 비-암호화 가닥 둘다, 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 산물을 암호화하는 것으로서 언급할 수 있다.
본원에서 "내인성"은 임의 물질이 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 내부로부터 파생되거나 또는 내부에서 생성되는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "외인성"은 임의 물질이 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로 도입되거나 또는 그 외부에서 생성되는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "발현"은 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
본원에서, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 2가지 이상의 요소 또는 구성성분 또는 도메인이 서로 연결되는 것을 의미한다.
사이토카인
사이토카인은 세포 신호전달에 중요한 소형 단백질 (~5-20 kDa) 범주에 속한다. 사이토카인의 분비는 주변 세포의 거동에 영향을 미친다. 사이토카인은 면역조절제로서 자가분비 신호전달, 주변분비 신호전달 및 내분비 신호전달에 관여한다. 사이토카인으로는 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자를 포함하지만, 일반적으로 (용어 측면에서 일부 중복되지만) 호르몬 또는 성장인자는 포함되지 않는다. 사이토카인은 대식세포, B 림프구, T 림프구 및 비만 세포와 같은 면역 세포뿐 아니라 내피 세포, 섬유모세포 및 다양한 기질 세포 등의, 광범위한 세포들에 의해 생산된다. 소정의 사이토카인은 세포 타입 2종 이상들에서 만들어질 수도 있다. 사이토카인은 수용체를 통해 작용하며, 특히 면역 시스템에 중요하며; 사이토카인은 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응 간의 균형을 조절하고, 특정 세포 집단의 성숙, 증식 및 반응성을 조절한다. 일부 사이토카인은 복잡한 방식으로 다른 사이토카인의 작용을 강화하거나 또는 저해한다.
IL2
인터루킨-2 (IL2)는 항원-활성화된 T 세포의 증식을 유도하고 자연 살상 (NK) 세포를 자극하는, 사이토카인이다. IL2의 생물학적 활성은 세포 막에 걸쳐있는 폴리펩타이드 서브유닛 3개로 된 다중-서브유닛 IL2 수용체 복합체 (IL2R)를 통해 매개한다: p55 (IL2Rα, α 서브유닛, 인간에서는 CD25로 공지됨), p75 (IL2Rβ, β 서브유닛, 인간에서는 CD122로 공지됨) 및 p64 (IL2Rγ, γ 서브유닛, 인간에서는 CD132로 공지됨). IL2에 대한 T 세포의 반응은, (1) IL2의 농도; (2) 세포 표면 상의 IL2R 분자의 개수; 및 (3) IL2에 의해 점유된 IL2R의 개수 (즉, IL2와 IL2R 간의 결합 상호작용의 친화성 (Smith, "Cell Growth Signal Transduction is Quantal" In Receptor Activation by Antigens, Cytokines, Hormones, and Growth Factors 766:263-271, 1995)) 등의, 다양한 인자들 따라 결정된다. IL2:IL2R 복합체는 리간드 결합시 내재화되고, 여러가지 구성성분들이 차별적인 분류를 거치게 된다. IL2는 정맥내 (i.v.) 볼루스 투여시 전신에서 빠르게 소거된다 (반감기 12.9분의 초기 소거 단계를 거친 후 반감기 85분의 느린 소거 단계로 이행됨)(Konrad et al., Cancer Res. 50:2009-2017, 1990).
진핵생물 세포에서, 인간 IL2는 아미노산 153개로 된 폴리펩타이드 전구체로 합성된 후 아미노산 20개가 제거되어 성숙한 분비형 IL2가 된다. 재조합 인간 IL2는 E. coli, 곤충 세포 및 포유류 COS 세포에서 생산된 바 있다.
본원에 따르면, IL2 (선택적으로 PK-연장된 IL2의 일부로서)는 자연 생성 IL2 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. IL2는 인간 IL2일 수 있으며, 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유류로부터 유래할 수 있다. 본원에서, "인간 IL2" 또는 "야생형 인간 IL2"는, 천연성 또는 재조합이든, 천연적인 인간 IL의 자연 생성 아미노산 133개로 된 서열 (부가적인 N-말단 아미노산 20개로 구성된, 신호 펩타이드 제외)을 가지며, 이의 아미노산 서열은 Fujita, et. al, PNAS USA, 80, 7437-7441 (1983)에 기술되어 있으며, 단백질이 E. coli에서 세포내 분획으로서 발현되는 경우 필수적으로 포함되는 부가적인 N-말단 메티오닌을 가지거나 또는 가지지 않는다.
일 구현예에서, IL2는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, IL2의 기능성 변이체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, IL2의 기능성 변이체는 IL2 수용체, 특히 IL2 수용체의 α 서브유닛 및/또는 β/γ 서브유닛과 같은 IL2 수용체의 서브유닛에 결합한다. 일반적으로, 본 발명의 목적에서, 용어 "IL2"는 본 발명에서 문맥상 상충하지 않은 한 자연 생성 IL2 모이어티 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 모든 폴리펩타이드를 망라한다.
본원에서, 특정 구현예들에서, IL2에 약동학적 변형 기 (pharmacokinetic modifying group)가 부착된다. 수득되는 분자는 이하 "약동학 (PK)-연장된 IL2"로 지칭되며, 이것은 유리형 IL2에 비해 연장된 순환 반감기를 가진다. PK-연장된 IL2의 연장된 순환 반감기는 생체내 혈청 IL2 농도를 치료학적 범위에서 유지시킬 수 있어, 잠재적으로 T 세포 등의 다수 유형의 면역 세포들의 활성화를 강화한다. PK-연장된 IL2는, 이의 우호적인 약동학적 프로파일로 인해, 비-변형된 IL2와 비교해, 적은 빈도로, 더 오래 투여할 수 있다.
이에, 본원에 기술된 특정 구현예들에서, IL2 모이어티에 이종의 폴리펩타이드 (즉, IL2가 아닌, 바람직하게는 IL2의 변이체가 아닌 폴리펩타이드)가 융합되며, 즉 PK-연장된 IL2이다. 특정 구현예에서, PK-연장된 IL2에서 IL2 모이어티는 인간 IL2이다. 다른 구현예들에서, PK-연장된 IL2에서 IL2 모이어티는 인간 IL2의 단편 또는 변이체이다. 이종의 폴리펩타이드는 IL2의 순환 반감기를 늘릴 수 있다. 아래에서 상세히 기술된 바와 같이, 순환 반감기를 연장하는 폴리펩타이드는 인간 또는 마우스 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민일 수 있다.
IL15
IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 이용을 수반하는 본원에 기술된 구현예에서, IL15 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL15 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 더불어 또는 그 대신, 이용할 수 있다.
인터루킨-15 (IL15)는 인터루킨-2 (IL-2)와 구조적으로 비슷한 사이토카인이다. IL15는, IL2와 마찬가지로, IL-2/IL-15 수용체 β 쇄 (CD122)와 공통 γ 쇄 (γ-C, CD132)로 구성된 복합체에 결합하고 이를 통해 신호를 전달한다. IL15는 자연 살상 세포의 세포 증식을 유도한다.
PK-연장 기
본 발명에 기술된 IL2 폴리펩타이드는 IL2 부분과 이종의 폴리펩타이드 (즉, IL2 또는 이의 변이체가 아닌 폴리펩타이드)를 포함하는 키메라 또는 융합 폴리펩타이드로서 제조될 수 있다. IL2에 순환성 반감기를 연장하는 PK-연장 기를 융합할 수 있다. PK-연장 기에 대한 비-제한적인 예들은 아래에서 기술된다. 사이토카인 또는 이의 변이체의 순환성 반감기를 연장하는 다른 PK 기 역시 본 발명에 이용가능한 것으로 이해하여야 한다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 혈청 알부민 도메인 (예를 들어, 마우스 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민)이다.
본원에서, 용어 "PK"는 "약동학"의 두 문자어로서, 예를 들어 개체에 의한 흡수, 분배, 대사 및 소거 등의 화합물의 특성을 포괄한다. 본원에서, "PK-연장 기"는, 생물학적 활성 분자와 함께 투여되거나 또는 이와 융합되었을 경우, 생물학적 활성 분자의 순환 반감기를 연장하는 단백질, 펩타이드 또는 모이어티를 지칭한다. PK-연장 기에 대한 예로는 혈청 알부민 (예를 들어, HSA), 면역글로불린 Fc 또는 이의 Fc 단편 및 변이체, 트랜스페린 및 이의 변이체, 및 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합제 (미국 특허 공개공보 2005/0287153 및 2007/0003549에 개시된 것) 등이 있다. 다른 예시적인 PK-연장 기들은 Kontermann, Expert Opin Biol Ther. 2016; Jul;16(7):903-15에 기술되어 있으며, 이 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에서, "PK-연장된 사이토카인"은 사이토카인 모이어티가 PK-연장 기와 조합된 것을 지칭한다. 일 구현예에서, PK-연장된 사이토카인은 사이토카인 모이어티가 PK-연장 기와 연결되거나 또는 이와 융합된 융합 단백질이다. 본원에서, "PK-연장된 IL"은 인터루킨 (IL) 모이어티 (IL 변이체 모이어트 등)가 pK-연장 기와 조합된 것을 의미한다. 일 구현예에서, PK-연장된 IL은 IL 모이어티가 PK-연장 기와 연결 또는 융합된 융합 단백질이다. 예시적인 융합 단백질은 IL2 모이어티가 HSA와 융합된 HSA/IL2 융합체이다.
특정 구현예에서, PK-연장된 IL의 혈청 반감기는 IL 단독 (즉, PK-연장 기가 융합되지 않은 IL)에 비해 연장된다. 특정 구현예에서, PK-연장된 IL의 혈청 반감기는 IL 단독의 혈청 반감기에 비해 적어도 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 400, 600, 800 또는 1000% 더 길다. 특정 구현예에서, PK-연장된 IL의 혈청 반감기는 IL 단독의 혈청 반감기보다 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 10배, 12배, 13배, 15배, 17배, 20배, 22배, 25배, 27배, 30배, 35배, 40배 또는 50배 더 길다. 특정 구현예에서, PK-연장된 IL의 혈청 반감기는 적어도 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 50시간, 60시간, 70시간, 80시간, 90시간, 100시간, 110시간, 120시간, 130시간, 135시간, 140시간, 150시간, 160시간 또는 200시간이다.
본원에서, "반감기"는, 예를 들어, 자연 기전에 의한 분해 및/또는 소거 또는 격리로 인해, 펩타이드 또는 단백질과 같은 화합물의 혈청 또는 혈장내 농도가 생체내에서 50% 줄어드는데 걸리는 시간을 의미한다. 본원에서 사용하기 적합한 PK-연장된 인터루킨 (IL)과 같은 PK-연장된 사이토카인은 생체내에서 안정적이며, 그 반감기는, 예를 들어, 분해 및/또는 소거 또는 격리를 견디는 혈청 알부민 (예, HSA 또는 MSA)과의 융합에 의해 연장된다. 반감기는 약동학 분석과 같이 자체 공지된 임의의 수단으로 측정할 수 있다. 적합한 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이며, 이는 예를 들어 아미노산 서열 또는 화합물을 적정 용량으로 개체에 적절하게 투여하는 단계; 일정한 간격으로 개체에서 혈액 샘플 또는 기타 샘플을 수집하는 단계; 혈액 샘플에서 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도를 확인하는 단계; 및 수득한 데이터로부터, 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도가 투여시 최초 수준과 비교해 50%로 감소할 때까지 걸리는 시간을 계산하는 단계를 일반적으로 수반할 수 있다. 추가적인 상세 내용은, 예를 들어, Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists 및 Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996) 등의 표준 문헌에 제공되어 있다. 또한, Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)를 참조한다.
특정 구현예에서, PK-연장 기는 혈청 알부민 또는 이의 단편 또는 혈청 알부민의 변이체 또는 이의 단편 (이들 모두 본 발명의 목적에서 용어 "알부민"에 포함됨)을 포괄한다. 본 발명에 기술된 폴리펩타이드에 알부민 (또는 이의 단편 또는 변이체)을 융합하여 알부민 융합 단백질을 제조할 수 있다. 이러한 알부민 융합 단백질은 미국 특허 공개번호 20070048282에 기술되어 있다.
본원에서, "알부민 융합 단백질"은 하나 이상의 알부민 분자 (또는 이의 단편 또는 변이체)를 치료 단백질, 특히 IL2 (또는 이의 변이체)와 같은 하나 이상의 단백질 분자에 융합함으로써 만들어지는 단백질을 지칭한다. 알부민 융합 단백질은 치료 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 알부민을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 인-프래임으로 연결된 핵산의 번역을 통해 제조할 수 있다. 치료 단백질 및 알부민은, 알부민 융합 단백질의 일부일 경우, 알부민 융합 단백질의 "부분", "영역" 또는 "모이어티" (예, "치료 단백질 부분" 또는 "알부민 단백질 부분")로서 각각 언급될 수 있다. 매우 바람직한 구현예에서, 알부민 융합 단백질은 하나 이상의 치료 단백질 분자 (예를 들어, 비-제한적으로, 치료 단백질의 성숙한 형태) 및 하나 이상의 알부민 분자 (예, 비-제한적으로, 알부민의 성숙한 형태)를 포함한다. 일 구현예에서, 알부민 융합 단백질은 투여된 RNA의 표적 기관의 세포 등의 숙주 세포, 예를 들어, 간 세포에 의해 처리되어, 순환계로 분비된다. RNA 발현에 이용되는 숙주 세포의 분비 경로에서 이루어지는 생성 초기 알부민 융합 단백질의 처리는 신호 펩타이드 절단; 이황화 결합 형성; 적절한 접힘; 탄수화물의 부가 및 가공 처리 (예, N- 및 O-연결된 당화); 특이적인 단백질분해성 절단; 및/또는 다량체 단백질로의 조립을 포함할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 알부민 융합 단백질은, 바람직하게는, 특히 N-말단에 신호 펩타이드를 가진 비-가공된 형태로 RNA에 의해 암호화되며, 이후 세포에 의해 분비되어 바람직하게는 특히 신호 펩타이드가 절단 제거된 가공된 형태로 존재한다. 가장 바람직한 구현예에서, "알부민 융합 단백질의 가공된 형태"는 본원에서 "성숙한 알부민 융합 단백질"로도 지칭되는 N-말단 신호 펩타이드가 절단된 알부민 융합 단백질 생성물을 지칭한다.
바람직한 구현예에서, 치료 단백질을 포함하는 알부민 융합 단백질은 알부민이 융합되지 않은 동일한 치료 단백질의 혈장 안정성과 비교해 더 높은 혈장 안정성을 가진다. 혈장 안정성은 전형적으로 치료 단백질이 생체내 투여되어 혈류로 운반된 시점부터 치료 단백질이 분해되어 혈류로부터 신장 또는 간과 같은 장기로 흡수되고, 궁극적으로 치료 단백질이 신체에서 소거되기까지의 시간을 의미한다. 혈장 안정성은 혈류에서의 치료 단백질의 반감기 관점에서 계산한다. 혈류에서 치료 단백질의 반감기는 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 분석으로 쉽게 측정할 수 있다.
본원에서, "알부민"은, 종합적으로, 알부민의 한가지 이상의 기능적인 활성 (예를 들어, 생물학적 활성)을 가진, 알부민 단백질 또는 아미노산 서열 또는 알부민 단편 또는 변이체를 의미한다. 구체적으로, "알부민"은 인간 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체, 특히 인간 알부민의 성숙한 형태, 또는 기타 척추 동물로부터 유래한 알부민 또는 이의 단편, 또는 이들 분자의 변이체를 지칭한다. 알부민은 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유류, 예를 들어, 인간, 소, 양 또는 돼지로부터 유래할 수 있다. 포유류로부터 유래하지 않은 알부민으로는, 비-제한적으로, 닭 및 연어를 포함한다. 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 치료 단백질 부분과는 다른 동물로부터 유래할 수 있다.
특정 구현예에서, 알부민은 US 5,876,969, WO 2011/124718, WO 2013/075066 및 WO 2011/0514789에 기술된 바와 같이, 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 이의 단편 또는 이의 변이체이다.
용어, 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 인간 알부민 (HA)은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 용어 "알부민 및 "혈청 알부민"은 보다 광의적인 의미이며, 인간 혈청 알부민 (및 이의 단편 및 변이체)뿐 아니라 다른 종으로부터 유래한 알부민 (및 이의 단편 및 변이체)를 포괄한다.
본원에서, 치료 단백질의 치료 활성 또는 혈장 안정성을 늘리는데 충분한 알부민의 단편은, 알부민 융합 단백질에서 치료 단백질 부분의 혈장 안정성이, 융합되지 않은 상태에서의 혈장 안정성과 비교해, 연장 또는 길어지도록, 단백질의 치료 활성 또는 혈장 안정성을 안정화 또는 연장하는데 길이 또는 구조 측면에서 충분한 알부민의 단편을 의미한다.
알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 알부민 서열의 전장을 포함할 수 있거나, 또는 혈장 안정성 또는 치료 활성을 안정화 또는 연장할 수 있는 이의 하나 이상의 단편을 함유할 수 있다. 이러한 단편은 아미노산 10개 이상의 길이일 수 있거나, 또는 알부민 서열로부터 유래하는 연속적인 아미노산을 약 15개, 20개, 25개, 30개, 50개 또는 그보다 많은 수로 포함할 수 있거나, 또는 알부민의 특정 도메인들 전체 또는 그 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 처음 2개의 면역글로불린-유사 도메인에 걸쳐있는 HSA의 하나 이상의 단편을 이용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, HSA 단편은 HSA의 성숙한 형태이다.
일반적으로 말해, 알부민 단편 또는 변이체는 아미노산 100개 이상의 길이, 바람직하게는 아미노산 150개 이상의 길이일 것이다.
본원에 따라, 알부민은 자연 생성 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 알부민은 인간 알부민일 수 있으며, 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유류로부터 유래할 수 있다. 일 구현예에서, 알부민은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 3 또는 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 알부민 융합 단백질은 N-말단 부분으로서 알부민을, 그리고 C-말단 부분으로서 치료 단백질을 포함한다. 대안적으로, C-말단 부분으로서 알부민을, 그리고 N-말단 부분으로서 치료 단백질을 포함하는, 알부민 융합 단백질 역시 이용할 수 있다. 다른 구현예들에서, 알부민 융합 단백질은 알부민의 N-말단 및 C-말단 둘다에 융합된 치료 단백질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, N-말단에 융합된 치료 단백질과 C-말단에 융합된 치료 단백질은 동일한 치료 단백질이다. 다른 바람직한 구현예에서, N-말단에 융합된 치료 단백질과 C-말단에 융합된 치료 단백질은 서로 다른 치료 단백질이다. 일 구현예에서, 서로 다른 치료 단백질은 둘다 사이토카인이다.
일 구현예에서, 치료 단백질(들)은 (하나의) 펩타이드 링커(들)를 통해 알부민과 연결된다. 융합되는 부분들 사이에 존재하는 링커 펩타이드는 모이어티들 간에 더 확실한 물리적인 분리를 제공하여, 치료 단백질 부분의, 예를 들어 이의 동족 수용체에의 결합에 대한, 접근성을 최대화할 수 있다. 링커 펩타이드는, 유연하거나 또는 더 뻣뻣한 아미노산으로 구성될 수 있다. 링커 서열은 프로테아제에 의해 절단가능하거나 또는 화학적으로 절단가능할 수 있다.
본원에서, 용어 "Fc 영역"은 중쇄 2개로 된 각각의 Fc 도메인 (또는 Fc 모이어티)들에 의해 형성된 천연 면역글로불린의 영역을 지칭한다. 본원에서, 용어 "Fc 도메인"은 단일 면역글로불린 (Ig) 중쇄의 부분 또는 단편을 의미하며, Fc 도메인은 Fv 도메인을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 파파인 절단부의 바로 상류에 위치한 힌지부에서 시작하여 항체의 C-말단에서 종결된다. 즉, 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 힌지 (예를 들어, 상류, 중간 및/또는 하류 힌지부) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인 또는 이의 변이체, 부분 또는 단편. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 완전한 Fc 도메인 (즉, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH3 도메인 (또는 이의 일부)이 융합된 힌지 도메인 (또는 이의 일부)을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH3 도메인 (또는 이의 일부)과 융합된 CH2 도메인 (또는 이의 일부)을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH3 도메인 또는 이의 일부로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 힌지 도메인 (또는 이의 일부) 및 CH3 도메인 (또는 이의 일부)으로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH2 도메인 (또는 이의 일부)과 CH3 도메인으로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 힌지 도메인 (또는 이의 일부)과 CH2 도메인 (또는 이의 일부)으로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인에는 적어도 CH2 도메인의 부분 (예를 들어, CH2 도메인 전체 또는 일부)가 존재하지 않는다. 본원에서 Fc 도메인은 일반적으로 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 것으로는 전체 CH1, 힌지, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 뿐 아니라 오직, 예를 들어 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 이러한 폴리펩타이드의 단편 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. Fc 도메인은, 비-제한적으로, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM 항체를 비롯하여, 임의 종의 및/또는 임의 서브타입의 면역글로불린으로부터 유래할 수 있다. Fc 도메인은 천연 Fc 및 Fc 변이체 분자를 포괄한다. 본 발명에 기술된 바와 같이, 당해 기술 분야의 당업자라면, 임의의 Fc 도메인이 자연 생성 면역글로불린 분자의 천연 Fc 도메인과 아미노산 서열상 다르게 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 작동자 기능 (예를 들어, FcγR 결합성)이 저하된 것이다.
본원에 기술된 폴리펩타이드의 Fc 도메인은 여러가지 면역글로불린 분자들로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 Fc 도메인은 IgG1 분자로부터 유래하는 CH2 및/또는 CH3 도메인과, IgG3 분자로부터 유래하는 힌지부를 포함할 수 있다. 다른 예로, Fc 도메인은 부분적으로 IgG1 분자로부터 유래하고 일부는 IgG3 분자로부터 유래한 키메라 힌지부를 포함할 수 있다. 다른 예로, Fc 도메인은 일부는 IgG1 분자로부터, 일부는 IgG4 분자로부터 유래하는 키메라 힌지부를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, PK-연장 기는 Fc 도메인 또는 이의 단편 또는 Fc 도메인의 변이체 또는 이의 단편 (이들 모두 본 발명의 목적에서 용어 "Fc 도메인"에 포함됨)을 포함한다. Fc 도메인은 항원에 결합하는 가변 영역을 포함하지 않는다. 본 발명에서 사용하기 적합한 Fc 도메인은 다수의 여러가지 공급원으로부터 입수할 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 인간 면역글로불린으로부터 유래한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 불변부로부터 유래한다. 그러나, Fc 도메인이, 예를 들어 설치류 (예, 마우스, 랫, 토끼, 기니아 피그) 또는 인간이 아닌 영장류 (예, 침팬지, 마카크) 종 등의, 다른 포유류 종의 면역글로불린으로부터 유래할 수도 있는 것으로, 이해된다.
아울러, Fc 도메인 (또는 이의 단편 또는 변이체)은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 임의의 면역글로불린 계열로부터, 그리고 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 임의의 면역글로불린 이소형으로부터 유래할 수 있다.
다양한 Fc 도메인 유전자 서열들 (예, 마우스 및 인간 불변 영역 유전자 서열)이 공개적으로 접근가능한 수탁 형태로 이용가능하다. Fc 도메인을 포함하는 불변 영역 도메인은 특정 작동자 기능이 결여된 것으로 및/또는 면역원성을 줄이도록 특정 변형을 가진 것으로 선택할 수 있다. 다수의 항체 서열 및 항체-암호화 유전자들이 공개되어 있으며, 당해 기술 분야에서 인정되는 기법을 이용해 이들 서열로부터 적절한 Fc 도메인 서열 (예, 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체)을 유래할 수 있다.
특정 구현예에서, PK-연장 기는 US2005/0287153, US2007/0003549, US2007/0178082, US2007/0269422, US2010/0113339, WO2009/083804 및 WO2009/133208에 기술된 것과 같은 혈청 알부민 결합 단백질이며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 US 7,176,278 및 US 8,158,579에 기술된 바와 같이 트랜스페린이며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 US2007/0178082, US2014/0220017 및 US2017/0145062에 기술된 바와 같은 혈청 면역글로불린 결합성 단백질이며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 US2012/0094909에 기술된 바와 같이 혈청 알부민에 결합하는 파이브로넥틴 (Fn)-기반의 스캐폴드 도메인 단백질이며, 이 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 파이브로넥틴-기반의 스캐폴드 도메인 단백질의 제조 방법은 또한 US2012/0094909에 기술되어 있다. Fn3-기반의 PK-연장 기에 대한 비-제한적인 예는 Fn3(HSA), 즉, 인간 혈청 알부민에 결합하는 Fn3 단백질이다.
특정 측면에서, 본 발명에 따라 이용하기 적합한 PK-연장된 IL은 하나 이상의 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 본원에서, 용어 "펩타이드 링커"는 폴리펩타이드 체인의 선형 아미노산 서열에서 2 이상의 도메인 (예, PK-연장 모이어티 및 IL2와 같은 IL 모이어티)을 연결하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 펩타이드 링커를 사용해 IL2 모이어티를 HSA 도메인과 연결할 수 있다.
예를 들어, IL2에 PK-연장 기를 융합하는데 적합한 링커는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예시적인 링커로는 글리신-세린-폴리펩타이드 링커, 글리신-프롤린-폴리펩타이드 링커 및 프롤린-알라닌 폴리펩타이드 링커 등이 있다. 특정 구현예에서, 링커는 글리신-세린-폴리펩타이드 링커, 즉 글리신 잔기와 세린 잔기로 구성된 펩타이드이다.
전술한 이종의 폴리펩타이드와 더불어 또는 그 대신, 본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩타이드는 "마커" 또는 "리포터"를 암호화하는 서열을 함유할 수 있다. 마커 또는 리포터 유전자에 대한 예로는 β-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 아데노신 데아미나제 (ADA), 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 히그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제 (HPH), 티미딘 키나제 (TK), β-갈락토시다제 및 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (XGPRT) 등이 있다.
항원
용어 "항원"은 면역 반응 또는 항체와 같은 면역 작동자 분자가 겨냥하거나 및/또는 겨냥하여야 하는 에피토프를 포함하는 물질을 의미한다. 용어 "항원"은, 특히 단백질 및 펩타이드를 포괄한다. 일 구현예에서, 항원은 종양 항원과 같은 질환-관련 항원이다.
용어 "질환-관련 항원"은, 광의적인 의미에서, 바람직하게는 숙주의 면역 시스템이 질환에 대해 항원-특이적인 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 항체 반응을 구축하게 자극하게 될 에피토프를 함유한, 질환과 관련있는 임의의 항원을 지칭하기 위해 사용된다. 질환-관련 항원, 이의 에피토프 또는 질환-관련 항원 또는 에피토프를 표적화하는 물질은 따라서 치료학적 목적으로 이용할 수 있다. 질환-관련 항원은 미생물, 전형적으로 미생물 항원에 의한 감염과 관련 있을 수 있거나, 또는 암, 전형적으로 종양과 관련 있을 수 있다.
용어 "종양 항원"은 세포질, 세포 표면 및 세포 핵으로부터 유래할 수 있는 암 세포의 구성요소를 지칭한다. 구체적으로, 이 용어는 세포 안에서 또는 종양 세포 상의 표면 항원으로서 만들어지는 항원을 지칭한다. 종양 항원은 전형적으로 암 세포에 의해 선호적으로 발현되며 (예, 암 세포가 아닌 세포에 비해 암 세포에서 높은 수준으로 발현됨), 일부 경우에 암 세포에서만 발현된다. 종양 항원에 대한 예로는, 비-제한적으로, p53, ART-4, BAGE, β-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1 , CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, claudin 계열의 세포 표면 단백질, 예를 들어 CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 및 CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE-A4, MAGE- A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 minor BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT 및 WT-1 등이 있다.
용어 "세포 표면 상에 발현된" 또는 "세포 표면에 부속된 (associated with the cell surface)"은, 수용체 또는 항원과 같은 분자가 세포의 원형질막에 결합하여 위치하고, 분자의 적어도 일부가 세포의 세포외 공간에 접해 있으며 세포의 외부로부터, 예를 들어 세포의 외부에 존재하는 항체가 접근가능한 것을 의미한다. 이러한 맥락에서, 상기한 일부는 바람직하게는 아미노산 4개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 12개 이상, 더 바람직하게는 20개 이상으로 구성된다. 결합은 직접적이거나 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, 결합은 하나 이상의 막관통 도메인, 하나 이상의 지질 앵커, 또는 임의의 다른 단백질, 지질, 사카라이드 또는 세포의 원형질막의 외부 소편 (leaflet) 상에서 발견할 수 있는 기타 구조체와의 상호작용에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 세포의 표면에 부속된 분자는 세포외 영역을 가진 막관통 단백질일 수 있거나, 또는 다른 막관통 단백질과의 상호작용을 통해 세포의 표면에 결합한 단백질일 수 있다.
"세포 표면" 또는 "세포의 표면"은 당해 기술 분야에서 일반적인 의미로 사용되며, 따라서 단백질 및 기타 분자가 결합에 의해 접근할 수 있는 세포의 외측을 포함한다.
용어 "세포외 영역" 또는 "엑소도메인"은, 본 발명의 맥락에서, 세포의 세포외 공간으로 향하며, 바람직하게는 예를 들어, 세포의 외부에 위치한 항체 등의 분자에 결합함으로써, 세포의 외부로부터 접근가능한, 단백질과 같은 분자의 일부분을 의미한다. 바람직하게는, 이 용어는 하나 이상의 세포외 루프 또는 도메인 또는 이의 단편을 지칭한다.
용어 "에피토프"는 분자에서 항원 결정부, 즉, 면역 시스템에 의해 인지되는 항원과 같은 분자의 일부분 또는 단편을 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 T 세포, B 세포 또는 항체에 의해 인지될 수 있다. 항원의 에피토프는 항원의 연속적인 부분 또는 비-연속적인 부분을 포함할 수 있으며, 아미노산 약 5개 내지 약 100개, 예를 들어 약 5개 내지 약 50개, 더 바람직하게 약 8개 내지 약 30개, 가장 바람직하게는 약 10개 내지 약 25개 길이일 수 있으며, 예를 들어, 에피토프는 바람직하게는 아미노산 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 에피토프는 아미노산 약 10개 내지 약 25개 길이이다. 용어 "에피토프"는 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프를 포함한다.
용어 "T 세포 에피토프"는 MHC 분자를 통해 제시되었을 때 T 세포에 의해 인지되는 단백질의 일부분 또는 단편을 지칭한다. 용어 "주 조직적합성 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며, 이는 모든 척추동물에 존재하는 유전자 복합체를 지칭한다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질병에 걸린 세포 간의 신호전달에 중요하며, MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드 에피토프와 결합하여 T 세포 상의 T 세포 수용체에 의해 인지되도록 이를 제시한다. MHC에 의해 암호화되는 단백질은 세포 표면 상에 발현되며, T 세포에 대한 자기-항원 (세포 자체로부터 유래한 펩타이드 단편) 및 비-자기-항원 (예, 침입 미생물의 단편) 둘다를 제시한다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합하는 펩타이드는 전형적으로 아미노산 약 8개 내지 약 10개 길이이지만, 더 길거나 또는 짧은 펩타이드도 유효할 수 있다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합하는 펩타이드는 전형적으로 아미노산 약 10개 내지 약 25개 길이이며, 구체적으로 아미노산 약 13개 내지 약 18개 길이이나, 더 긴 펩타이드 및 더 짧은 펩타이드도 유효할 수 있다.
치료학적 항체
"치료학적 항체"는 항원, 특히 표적 세포, 예를 들어 암 세포 상의 세포-표면 항원에 결합하여, 치료학적 효과를 유발할 수 있는 항체이다. 치료학적 단일클론 항체는 종양 선택적인 항원 또는 에피토프를 표적화함으로써 종양 선택적인 치료를 허용하는 약제학적 활성 물질의 계열로서 인식되고 있다. 바람직한 구현예에서, 치료학적 항체는 종양 또는 암 항원을 표적화한다.
용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 중(H)쇄 2개와 경(L)쇄 2개를 포함하는 당단백질을 의미하며, 이는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 임의의 분자를 포괄한다. 용어 "항체"는 단일클론 항체 및 항체의 단편 또는 유도체, 즉, 항체로부터 파생된 구조체, 예를 들어, 비-제한적으로, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 예를 들어, scFv의 및 항원-결합성 항체 단편, 예컨대 Fab 및 Fab' 단편을 포함하며, 항체의 모든 재조합 형태, 예를 들어, 항체, 비-당화된 항체 및 임의의 항원-결합성 항체 단편 및 본원에 기술된 바와 같은 유도체를 또한 망라한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부 (본원에서 VH로 약칭됨)와 중쇄 불변부로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변부 (본원에서 VL로 약칭됨)와 경쇄 불변부로 구성된다. VH 영역과 VL 영역은 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 더욱 보존적인 영역이 사이에 배치된 상보성 결정부 (CDR)로 지칭되는 과변이 영역들로 추가적으로 세분할 수 있다. 각각의 VH와 VL은 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 보체 (Clq) 등의 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린이 결합하는 것을 매개할 수 있다.
본원에 기술된 항체는 인간 항체일 수 있다. 본원에서, 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 영역과 불변 영역을 가진 항체를 포괄하는 것으로 의도된다. 본원에 기술된 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 함유할 수 있다.
용어 "인간화 항체 (humanized antibody)"는 비-인간 종의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래한 항원 결합성 부위를 가진 분자로서, 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열을 토대로 하는, 분자를 지칭한다. 항원 결합성 부위는 불변 도메인으로 융합된 전체 가변성 도메인을 포함하거나, 또는 가변성 도메인내 적절한 프래임워크 영역으로 이식된 상보성 결정 영역 (CDR)만 포함할 수 있다. 항원 결합성 부위는 야생형일 수 있거나, 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있으며, 예를 들어, 인간 면역글로불린과 더 비슷하도록 변형될 수 있다. 인간화된 항체의 일부 형태들은 CDR 서열들을 모두 보존한다 (예를 들어, 마우스 항체로부터 유래한 CDR 6종을 모두 함유한 인간화된 마우스 항체). 다른 형태는 오리지널 항체와 비교해 변형된 하나 이상의 CDR을 가진다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 각각의 일부분이 특정 종으로부터 유래하거나 또는 특정 계열에 속하는 항체의 대응되는 서열에 대해 상동적이고, 체인의 나머지 부분은 다른 항체의 대응되는 서열에 대해 상동적인, 항체를 의미한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘다의 가변부는 포유류 한종으로부터 유래한 항체의 가변 영역을 모방하고, 불변 영역은 다른 종으로부터 유래한 항체의 서열에 대해 상동적이다. 이러한 키메라 형태가 가지는 명확한 한가지 이점은, 예를 들어, 가변 영역이, 인간 세포 제제로부터 유래한 불변 영역과 조합하여, 인간 이외의 숙주 유기체로부터 유래한 쉽게 이용가능한 B 세포 또는 하이브리도마를 이용함으로써 현재 공지된 소스로부터 편리하게 수득할 수 있다는 것이다. 가변 영역은 제조가 용이한 이점이 있으며, 특이성이 소스에 의해 영향을 받지 않지만 불변 영역은 인간 유래이므로, 항체를 주사할 경우 불변 영역이 인간 이외의 소스로부터 유래할 경우와 비교해, 인간 개체에서 면역 반응을 유발할 가능성이 낮다. 그러나, 이 정의가 이러한 특정한 예로만 한정되는 것은 아니다.
항체의 "항원-결합부" (또는 간단하게, "결합부") 또는 항체의 "항원 결합 단편" (또는 간단하게 "결합 단편")이라는 용어 또는 유사 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 알려져 있다. 항체의 "항원-결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인들로 구성되는 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 연결된 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편, 즉 F(ab')2 단편; (iii) VH 도메인과 CH 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 한쪽 팔의 VL 도메인과 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR들로 구성된 조합을 포함한다. 아울러, Fv 단편의 도메인 2개 VL 및 VH는 개별 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 형성하여 일가 분자 (단쇄 Fv (scFv)로 공지됨)를 형성하는 단백질 단쇄로서 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용해 서로 연결할 수 있다; 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883을 참조한다. 이러한 단쇄 항체는 또한 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 추가적인 예는, (i) 면역글로불린 힌지부 폴리펩타이드가 융합된 결합성 도메인 폴리펩타이드, (ii) 힌지부가 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변부, 및 (iii) CH2 불변부와 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변부를 포함하는, 결합성-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 결합성 도메인 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 결합성-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가적으로 기술되어 있다. 이들 항체 단편은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 통상적인 기법을 사용해 수득하며, 이들 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 스크리닝한다.
용어 "이중 특이성 분자"는, 2종의 서로 다른 결합 특이성을 가진, 임의의 물질, 예를 들어, 단백질, 펩타이드 또는 단백질 또는 펩타이드 복합체를 포괄하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 이 분자는 (a) 세포 표면 항원, 및 (b) 작동자 세포의 표면 상의 Fc 수용체에 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있다. 용어 "다중 특이성 분자" 또는 "이종 특이성 분자 (heterospecific molecule)"는, 결합 특이성이 3가지 이상인, 임의의 물질, 예를 들어, 단백질, 펩타이드 또는 단백질 또는 펩타이드 복합체를 포괄하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 이 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 작동자 세포의 표면 상의 Fc 수용체, 및 (c) 하나 이상의 기타 성분에 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있다. 이에, 본 발명은, 비-제한적으로, 종양 항원과, 작동자 세포 상의 Fc 수용체와 같은 기타 표적으로 향하는, 이중 특이성, 삼중 특이성, 사중 특이성 및 기타 다중 특이성 분자를 포괄한다. 용어 "이중 특이성 항체"는 또한 서로 다른 2가지 결합 특이성을 가진 3가 항체, 서로 다른 2 또는 3가지 결합 특이성을 가진 4가 항체 등과 같은 다가 항체를 포괄한다. 용어 "이중 특이성 항체"는 또한 다이아바디를 포함한다. 다이아바디는, VH 도메인과 VL 도메인이 단일한 폴리펩타이드 쇄 상에 발현되지만 2개의 도메인 간에 쌍을 형성시키기에는 매우 짧은 링커가 사용되어, 도메인들이 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성해 항원 결합 부위 2개를 형성하게 되는, 2가, 이중 특이성 항체이다 (예를 들어, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123을 참조함).
항체는 세포독소 (cytotoxin), 약물 (예를 들어, 면역억제제) 또는 방사성 동위원소와 같은 치료학적 모이어티 또는 물질과 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성 물질은 세포에 유해하며, 특히 세포를 죽이는 모든 물질을 망라한다. 그 예로는 메이탄신 (maytansin)(예, 메르탄신 (mertansine), 라브탄신 (ravtansine) 또는 엠탄시드 (emtanside)), 아우리스타틴 (auristatin)(모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)), 돌라스타틴 (dolastatin), 칼리케아미신 (calicheamicin)(예, 오조가미신 (ozogamicin)), 피롤로벤지다이아제핀 다이머 (pyrrolobenzidiazepine dimer)(예, 테시린 (tesirine), 타이린 (tairine)), 두오카르마이신 (duocarmycin)(예, 두오카르마이신 SA, CC-1065, 두오카르마진 (duocarmazine)) 및 α-아마니틴 (α-amanitin), 이리노테칸 (irinotecan) 또는 이의 유도체 SN-38, 탁솔 (taxol), 사이토칼라신 B (cytochalasin B), 그라미시딘 D (gramicidin D), 에티듐 브로마이드, 에메틴 (emetine), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 테노포시드 (tenoposide), 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 콜히친 (colchicin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 다이하이드록시 안트라신 다이온 (dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론 (mitoxantrone), 미트라마이신 (mithramycin), 액티노마이신 D (actinomycin D), 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인 (procaine), 테트라카인 (tetracaine), 리도카인 (lidocaine), 프로프라놀롤 (propranolol), 및 푸로마이신 (puromycin) 및 이의 유사체 또는 상동체, 항-대사산물제 (예를 들어, 메토트렉세이트 (methotrexate), 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈 (cytarabine), 플루다라빈 (fludarabin), 5-플루오로우라실 데카르바진 (5-fluorouracil decarbazine), 알킬화제 (예를 들어, 메클로르에타민 (mechlorethamine), 티오에파 클로람부실 (thioepa chlorambucil), 멜팔란 (melphalan), 카르무스틴 (carmustine) (BSNU) 및 로무스틴 (lomustine)(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판 (busulfan), 다이브로모만니톨 (dibromomannitol), 스트렙토조톡신 (streptozotocin), 미토마이신 C (mitomycin C), 및 cis-다이클로로다이아민 플라티늄 (II)(DDP) 시스플라틴 (cisplatin)), 안트라사이클린 (anthracycline)(예를 들어, 다우노루비신 (daunorubicin) (종래에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (dactinomycin)(종래에 액티노마이신), 블레오마이신 (bleomycin), 미트라마이신 (mithramycin) 및 안트라마이신 (AMC), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 (vincristine) 및 빈블라스틴 (vinblastine)) 등이 있다. 바람직한 구현예에서, 치료학적 물질은 세포독성 물질 또는 방사성 독성 물질이다. 다른 구현예에서, 치료학적 물질은 면역억제제이다. 또 다른 구현예에서, 치료학적 물질은 GM-CSF이다. 바람직한 구현예에서, 치료학적 물질은 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 설페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드 또는 리신 A이다.
또한, 항체는 방사성 동위원소, 예를 들어, I-131, 이트륨-90 또는 인듐-111과 접합되어, 세포독성 방사성 의약제 (cytotoxic radiopharmaceutical)를 구현할 수 있다.
본 발명의 항체 접합체는 소정의 생물학적 반응을 변경하기 위해 이용할 수 있으며, 약물 모이어티는 고전적인 화학적 치료 물질로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 가진 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 효소적으로 활성인 독소 (enzymatically active toxin) 또는 이의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어, 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어, 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF") 또는 기타 성장인자를 포함할 수 있다.
이러한 치료학적 모이어티를 항체에 접합하는 기법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds. ), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds. ), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)을 참조한다.
본원에서, 항체가 동물의 면역화를 통해 또는 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써 시스템으로부터 수득한 것이라면, 그 항체는 특정 생식계열 서열"로부터 유래하"는 것이며, 이때 선택 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 전형적으로, 특정 생식계열 서열로부터 유래한 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 비교해 아미노산 차이가 10개 이하, 더 바람직하게는 5개 이상, 보다 더 바람직하게는 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하일 것이다.
본원에서, 용어 "이종항체 (heteroantibody)"는 서로 다른 특이성을 가진 2종 이상의 항체, 이의 유도체 또는 항원 결합 영역이 서로 연결된 것을 의미한다. 이러한 서로 다른 특이성은 작동자 세포 상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이성과, 표적 세포, 예를 들어 종양 세포 상의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 포함한다.
본원에 기술된 항체는 단일클론 항체일 수 있다. 본원에서, 용어 "단일클론 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자 제제를 지칭한다. 단일클론 항체는 하나의 결합 특이성과 친화성을 나타낸다. 일 구현예에서, 단일클론 항체는, 불멸화 세포와 융합된, 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스로부터 수득되는 B 세포를 함유한 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 기술된 항체는 재조합 항체일 수 있다. 본원에서, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 구현 또는 단리된 모든 항체, 예를 들어 (a) 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉이거나 또는 염색체이식 (transchromosomal) 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마 (transfectoma)로부터 단래된 항체, (c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 기타 수단을 통해 제조, 발현, 구현 또는 단리된 항체를 포괄한다.
본원에 기술된 항체는, 비-제한적으로, 마우스, 랫, 토끼, 기니아 피그 및 인간 등의 여러가지 종으로부터 유래할 수 있다.
본원에 기술된 항체는 다클론 항체 및 단일클론 항체를 포함하며, IgA, 예를 들어 IgA1 또는 IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM 및 IgD 항체를 망라한다. 다양한 구현예들에서, 항체는 IgG1 항체, 특히 IgG1, κ 또는 IgG1, λ 이소형 (즉 IgG1, κ, λ), IgG2a 항체 (예, IgG2a, κ, λ), IgG2b 항체 (예, IgG2b, κ, λ), IgG3 항체 (예, IgG3, κ, λ) 또는 IgG4 항체 (예, IgG4, κ, λ)이다.
본원에서, 용어 "트랜스펙토마"는 항체를 발현하는 재조합 진핵생물 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, 식물 세포 또는 효모 세포 등의 진균 세포를 포함한다.
본원에서, "이종 항체 (heterologous antibody)"는 이러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 유기체와 관련하여 정의된다. 이 용어는 트랜스제닉 유기체로 구성되지않은 유기체에서 발견되는 것에 해당하며, 통상적으로 트랜스제닉 유기체 이외의 다른 종으로부터 유래하는, 아미노산 서열을 가진 항체 또는 암호화 핵산 서열을 지칭한다.
본원에서, "이종하이브리드 (heterohybrid) 항체"는 여러가지 유기체 기원의 경쇄 및 중쇄를 가진 항체를 지칭하며, 예를 들어, 인간 중쇄가 뮤라인 경쇄와 조합된 항체가 이종하이브리드 항체이다.
본 발명은, 본 발명의 목적에서, 용어 "항체"에 포괄되는, 본원에 기술된 항체 및 항체의 유도체를 모두 포함한다. 용어 "항체 유도체"는 항체의 임의의 변형된 형태, 예를 들어, 항체, 및 다른 물질 또는 항체 또는 항체 단편의 접합체를 지칭한다.
본원에 기술된 항체는 바람직하게는 단리된다. 본원에서, "단리된 항체"는 여러가지 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 포함하는 것으로 의도된다 (예를 들어, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 종양 항원 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, 인간 종양 항원의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 예를 들어 다른 종으로부터 유래한 다른 관련 항원 (예, 종양 항원의 종 상동체)에 대해 교차-반응성을 가진다.
본 발명에 따라 용어 "결합하는"은 바람직하게는 특이적인 결합을 의미한다.
본 발명에서, 항체는, 이것이 미리 정해진 표적에 대해 유의한 친화성을 가지며 표준 분석에서 미리 정해진 표적에 결합한다면, 미리 정해진 표적에 결합할 수 있는 것이다. "친화성" 또는 "결합 친화성"은 종종 평형 해리 상수 (KD)에 의해 측정한다. 바람직하게는, 용어 "유의한 친화성"은 미리 정해진 표적에 해리 상수 (KD) 10-5 M 이하, 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하 또는 0-12 M 이하로 결합하는 것을 의미한다.
항체가 표적에 대해 유의한 친화성이 없으며 유의하게 결합하지 않는다면, 특히 표준 분석에서 표적에 검출가능하게 결합하지 않는다면, 항체는 그 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없는 것이다. 바람직하게는, 항체가 만일 최대 2, 바람직하게는 10, 더 바람직하게는 20, 특히 50 또는 100 ㎍/ml, 또는 그보다 높은 농도로 존재한다면, 항체는 그 표적에 검출가능하게 결합하지 않는 것이다. 바람직하게는, 항체가 만일 결합할 수 있는 미리 정해진 표적에의 결합성에 대한 KD와 비교해 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배 또는 106배 높은 KD로 표적에 결합한다면, 항체는 그 표적에 대해 유의한 결합성을 가지지 않는 것이다. 예를 들어, 만일 항체가 결합할 수 있는 표적에 항체가 결합하는 KD가 10-7 M이면, 항체가 유의한 친화성을 가지지 않는 표적에 결합하는 경우의 KD는 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M 또는 10-1 M이다.
만일 항체가 미리 정해진 표적에 결합할 수 있지만 다른 표적에는 결합할 수 없다면, 즉 다른 표적에 대해 유의한 친화성을 가지지 않으며 표준 분석에서 다른 표적에 특이적으로 결합하지 않는다면, 이 항체는 미리 정해진 표적에 특이적인 것이다. 본 발명에서, 항체가 종양 항원에 결합할 수 있지만 다른 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없다면, 이 항체는 종양 항원에 특이적인 것이다. 바람직하게는, 다른 표적에 대한 친화성 및 결합성이 종양 항원-비관련 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민 (BSA), 카세인, 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 비-종양 항원 막관통 단백질, 예를 들어 MHC 분자 또는 트랜스페린 수용체 또는 임의의 기타 특정 폴리펩타이드에 대한 친화성 또는 결합성을 현저하게 초과하지 않는다면, 이 항체는 종양 항원에 특이적인 것이다. 바람직하게는, 항체가 특이적이지 않은 표적에 결합하는 KD보다 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배 또는 106배 낮은 KD로 표적에 결합한다면, 이 항체는 미리 정해진 표적에 특이적인 것이다. 예를 들어, 항체가 특이적인 표적에 결합하는 KD가 10-7 M이면, 비-특이성 표적에 결합하는 KD는 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M 또는 10-1 M일 것이다.
항체의 표적에 대한 결합성은 임의의 적절한 방법을 이용해 실험으로 결정할 수 있으며; 예를 들어, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), 및 본원에 기술된 방법들은 참조한다. 친화성은, 평형 투석을 통해; BIAcore 2000 장치를 사용해 제조사에서 설명한 일반적인 공정을 이용함으로써; 방사성 표지된 표적 항원을 이용한 방사성면역분석을 통해; 또는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기타 방법을 통해 쉽게 결정할 수 있다. 친화성 데이터는, 예를 들어, Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)의 방법을 통해 분석할 수 있다. 특정한 항체-항원 상호작용에 대한 친화성 측정값은 여러가지 조건, 예를 들어, 염 농도, pH 하에 측정할 경우 달라질 수 있다. 따라서, 친화성 및 기타 항원-결합 파라미터, 예를 들어, KD, IC50에 대한 측정은, 바람직하게는 표준 항체 용액 및 표준 항원 용액 및 표준 완충제를 사용해 수행한다.
본원에서, "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화된 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
본원에서, "이소형 스위칭"은 항체의 클래스 또는 이소형이 Ig 클래스에서 다른 IG 클래스들 중 하나로 바뀌는 현상을 지칭한다.
본원에서, 용어 "재정렬된"은, 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 각각 암호화하는 형태로 V 세그먼트가 D-J 또는 J 세그먼트에 바로 인접하게 위치하는, 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린의 배열을 의미한다. 재정렬된 면역글로불린 (항체) 유전자 좌는 생식계열 DNA와 비교함으로써 동정할 수 있으며; 재정렬된 유전자 좌는 하나 이상의 재조합된 헵타머/노나머 상동성 인자를 가질 것이다.
본원에서, V 세그먼트와 관련하여 용어 "비-재정렬된" 또는 "생식계열 배열 (germline configuration)"은 V 세그먼트가 D 또는 J 세그먼트에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 배열을 지칭한다.
본 발명에 따라, 항-종양 항원 항체 (anti-tumor antigen antibody)는 종양 항원에 존재하는 에피토프, 바람직하게는 종양 항원의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합할 수 있는 항체이다. 본 발명에 따라, 항-종양 항원 항체는 바람직하게는 종양 항원에 특이적인 항체이다. 바람직하게는, 항-종양 항원 항체는 세포 표면에 발현된 종양 항원에 결합하는 항체이다. 특히 바람직한 구현예에서, 항-종양 항원 항체는 살아있는 세포의 표면에 존재하는 종양 항원의 천연적인 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 항체는 암 세포에 결합하며, 비-암성 세포에는 실질적으로 결합하지 않는다. 바람직하게는, 종양 항원을 발현하는 세포에 대한 항-종양 항원 항체의 결합은 종양 항원을 발현하는 세포의 사멸을 유도 또는 매개한다. 종양 항원을 발현하는 세포는 바람직하게는 암 세포이다. 바람직하게는, 항체는 항체 의존적인 세포성 세포독성 (ADCC) 매개 세포용해, 항체 의존적인 세포성 식세포작용 (ADCP) 매개 세포용해, 보체 의존적인 세포독성 (CDC) 매개 세포용해, 세포자살 및 종양 항원을 발현하는 세포의 증식 저해 중 하나 이상을 유도함으로써, 세포의 사멸을 유도 또는 매개한다.
바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 하기 특성들 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다:
a) 종양 항원에 대한 특이성;
b) 약 100 nM 이하, 바람직하게는, 약 5-10 nM 이하, 더 바람직하게는, 약 1-3 nM 이하의, 종양 항원에 대한 결합 친화성,
c) 종양 항원 양성 세포에 대해 ADCC를 유도 또는 매개하는 능력;
d) 종양 항원 양성 세포에 대해 ADCP를 유도 또는 매개하는 능력;
e) 종양 항원 양성 세포에 대해 CDC를 유도 또는 매개하는 능력;
f) 종양 항원 양성 세포의 증식을 저해하는 능력;
g) 종양 항원 양성 세포의 세포자살을 유도하는 능력.
본원에 기술된 항체는, 바람직하게는, 면역 시스템의 구성성분과, 바람직하게는 ADCC, ADCP 또는 CDC를 통해 상호작용한다. 또한, 본원에 기술된 항체는 표적 페이로드 (payload)(예를 들어, 방사성 동위원소, 약물 또는 독소)가 종양 세포를 직접 죽이도록 이용할 수 있거나, 또는 T 림프구에 대한 화학치료제의 세포독성 부작용으로 인해 손상될 수 있는 항-종양 면역 반응을 포괄할 수 있는 보체 작용 기전을 통해 종양을 공격하는, 전통적인 화학치료제와 함께 이용할 수 있다. 그러나, 본원에 기술된 항체는 또한 단순히 세포 표면 상의 종양 항원에 결합함으로써 효과를 발휘할 수 있으며, 따라서 예를 들어 세포의 증식을 차단할 수 있다.
항체-의존적인 세포-매개 세포독성 ( ADCC )
항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC)은, 세포독성 과립체의 내용물 방출 또는 세포 사멸-유도 분자의 발현을 특징으로 하는, 세포독성 작동자 세포에 의해 항체-코팅된 표적 세포를 비-식세포 작용으로 사멸하는 것이다. ADCC는 표적을 또한 세포용해하는 면역 보체 시스템과는 독립적이지만, 임의의 다른 세포가 필요한 것은 아니다. ADCC는 표적-결합된 항체 (IgG 또는 IgA 또는 IgE 클래스에 속하는)와, 면역글로불린 (Ig)의 Fc 영역에 결합하는 작동자 세포 표면에 위치한 당단백질인 작동자 특정 Fc 수용체 (FcR)의 상호작용을 통해 촉발된다. ADCC를 매개하는 작동자 세포는 자연 살상 (NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구 및 수지상 세포를 포함한다. ADCC는 그 효과가 다수의 파라미터 (표적 세포의 표면에서의 항원의 밀도 및 안정성; 항체 친화성 및 FcR-결합 친화성)에 의존하는, 신속한 작동자 기전이다. 치료 항체에서 가장 많이 사용되는 IgG 서브클래스인 인간 IgG1을 수반하는 ADCC는 항체의 Fc 영역의 당화 프로파일과 Fcγ 수용체의 다형성에 크게 좌우된다.
항체-의존적인 세포성 식세포 작용 ( ADCP )
ADCP는 다수의 항체 요법들에서 중요한 한가지 작용 기전이다. 이는 항체가 식세포 상의 특이적인 수용체에 Fc 도메인을 연결하여 식세포 작용을 발휘함으로써 결합된 표적을 제거하는 고도로 제어된 공정으로서 정의된다. ADCP는, ADCC와는 달리, FcγRIIa, FcγRI 및 FcγRIIIa를 통해 단핵구, 대식세포, 호중구, 및 수지상 세포에 의해 매개될 수 있으며, 대식세포 상의 FcγRIIa (CD32a)가 가장 지배적인 경로이다.
보체 -의존적인 세포독성 ( CDC )
CDC는 항체에 의해 지시될 수 있는 또 다른 세포-사멸 방법이다. IgM은 보체 활성화에서 가장 효과적인 이소형이다. 또한, IgG1 및 IgG3는 둘다 고전적인 보체-활성화 경로를 통해 CDC를 지시하는데 매우 효과적이다. 바람직하게는, 이러한 캐스케이드에서, 항원-항체 복합체의 형성은, IgG 분자와 같이 참여하는 항체 분자의 CH2 도메인 상에 복수의 C1q (C1q는 보체 C1의 하위 구성성분 3종 중 하나임) 결합 부위를 매우 근접하게 노출 (uncloaking)하게 만든다. 바람직하게는, 이렇게 노출된 C1q 결합 부위는 기존에 저-친화성 C1q-IgG 상호작용을 높은 항원-항체 결합력 (avidity)을 가진 것으로 전환되어, 일련의 다른 보체 단백질이 참여하는 캐스케이드 현상이 촉발되고, 단백질 분해를 통해 작동자-세포 주화성/활성화 물질 C3a 및 C5a가 방출된다. 바람직하게는, 보체 캐스케이드는 막 공격 복합체의 형성으로 끝나며, 복합체가 막에 세포 내외부로 물과 용질이 자유롭게 통과하게 하는 구멍을 만든다.
본원에 기술된 항체는 통상적인 단일클론 항체 방법, 예를 들어 Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)의 표준 체세포 혼성화 기법 등의 다양한 기법을 통해 생산할 수 있다. 체세포 혼성화 공정이 바람직하지만, 실제 단일클론 항체를 생산하는 다른 기법, 예를 들어 B-림프구의 바이러스 또는 종양유발성 형질전환 또는 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 기법을 채택할 수도 있다.
단일클론 항체를 분비하는 바람직한 하이브리도마 생산 동물 시스템은 뮤라인 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마의 제조는 매우 잘 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜 및 면역화된 비장세포를 융합하기 위해 단리하는 기법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 또한, 융합 파트너 (예를 들어, 뮤라인 골수종 세포) 및 융합 공정 역시 공지되어 있다.
단일클론 항체를 분비하는 다른 바람직한 하이브리도마 생산 동물 시스템은 랫 및 토끼 시스템이다 (예, Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995)에 기술되어 있으며, 또한 Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)를 참조함).
또 다른 바람직한 구현예에서, 인간 단일클론 항체는 마우스 시스템보다는 다른 인간 면역 시스템의 일부를 운반하는 트랜스제닉 또는 염색체이식 (transchromosomal) 마우스를 이용하여 구축할 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 염색체이식 마우스는 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 공지된 마우스를 포함하며, 본원에서는 총괄적으로 "형질전환 마우스"로 지칭한다. 이러한 형질전환 마우스에서 인간 항체의 생산은 WO2004 035607에서 CD20에 대해 상세히 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
단일클론 항체를 구축하는 또 다른 전략은 지정된 특이성을 가진 항체를 생산하는 림프구로부터 유전자 암호화 항체를 직접 분리하는 것이다. 예를 들어, Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities을 참조한다. 재조합 항체 조작에 대한 상세한 설명은 또한 Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 및 Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1을 참조한다.
항체를 구축하기 위해, 본원에 기술된 바와 같이, 항원 서열, 즉 항체가 겨냥하고자 하는 서열로부터 유래한 담체-접합된 펩타이드, 재조합에 의해 발현된 항원 또는 이의 단편 및/또는 항원을 발현하는 세포가 농화된 제제를 사용해 마우스를 면역화할 수 있다. 대안적으로, 마우스는 항원 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA로 면역화할 수 있다. 정제된 또는 농화된 항원 제제를 이용한 면역화를 통해 항체를 만들지 못할 경우, 면역 반응을 촉진하기 위해, 항원 발현 세포, 예를 들어 세포주로 마우스를 면역화할 수도 있다.
면역 반응은 꼬리 정맥 또는 후안와 채혈을 통해 수득한 혈장 및 혈청 샘플을 이용하여 면역화 프로토콜 과정 중에 모니터링할 수 있다. 면역글로불린 역가가 충분한 마우스를 융합시 사용할 수 있다. 마우스는 희생 및 비장 수득하기 3일 전 항원 발현 세포를 복막내 또는 정맥내 부스팅 접종함으로써, 특이 항체를 분비하는 하이브리도마의 비율을 높일 수 있다.
단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 구축하기 위해, 면역화된 마우스로부터 비장세포 및 림프절 세포를 단리하고, 이를 마우스 골수종 세포주와 같이 적절한 불멸화 세포주와 융합할 수 있다. 제조되는 하이브리도마는 이후 항원-특이 항체 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 개별 웰에서 항체 분비 하이브리도마를 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 항원 발현 세포를 이용한 면역형광 및 FACS 분석을 통해, 항원에 대해 특이성을 가진 항체를 식별할 수 있다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 다시 접종, 스크리닝할 수 있으며, 단일클론 항체에 대해 여전히 양성인 경우 제한 희석에 의해 서브 클로닝할 수 있다. 이후, 안정한 서브클론은 특정화를 위해 시험관내에서 배양해 조직 배양 배지에서 항체를 생산할 수 있다.
또한, 항체는, 당해 기술 분야에서 잘 알려진 바와 같이 (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202), 예를 들어 재조합 DNA 기법 및 유전자 형질감염 방법들의 조합을 이용해, 숙주 세포 트랜스펙토마 (transfectoma)에서 생산할 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에서, 대상 유전자(들), 예를 들어, 항체 유전자를 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 발현 시스템 또는 당해 기술 분야에 잘 알려진 다른 발현 시스템에서 사용된 바와 같은 진핵생물 발현 플라스미드 등의 발현 벡터에 연결할 수 있다. 클로닝한 항체 유전자를 가진 정제된 플라스미드를 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293T 세포 또는 HEK293 세포와 같은 진핵생물 숙주 세포 또는 대안적으로 식물 유래 세포, 진균 또는 효모 세포와 같은 다른 진핵생물 세포에 도입할 수 있다. 이들 유전자를 도입하기 위해 이용하는 방법은 전기천공, 리포펙션, 리포펙타민 등과 같은 당해 기술 분야에서 언급된 방법들일 수 있다. 이들 항체 유전자를 숙주 세포에 도입한 후, 그 항체를 발현하는 세포를 식별 및 선별할 수 있다. 이들 세포는 트랜스펙토마이며, 이후 발현 수준에 대해 증폭시키고 규모를 확장하여 항체를 생산할 수 있다. 재조합 항체는 이들 배양 상층물 및/또는 세포로부터 단리 및 정제할 수 있다.
대안적으로, 클로닝한 항체 유전자는 미생물, 예를 들어 E. coli와 같은 원핵생물 세포를 비롯한 다른 발현 시스템에서 발현시킬 수 있다. 아울러, 항체는 양 및 토끼의 모유 또는 닭의 알 또는 트랜스제닉 식물 등의 인간이 아닌 트랜스제닉 동물에서 생산할 수도 있으며; 예를 들어 Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; 및 Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839를 참조한다.
키메라화
뮤라인 단일클론 항체는, 독소 또는 방사성 동위원소로 표지할 경우, 인간에서 치료 항체로 이용할 수 있다. 비-표지된 뮤라인 항체는 반복 적용시 사람에서 상당히 면역원성이므로, 치료학적 효과의 저하를 유도한다. 주요 면역원성은 중쇄 불변 영역에 의해 매개된다. 인간에서 뮤라인 항체의 면역원성은, 각 항체가 인간화되거나 또는 키메라화된다면, 감소되거나 또는 완전히 피할 수 있다. 키메라 항체는, 항체의 서로 다른 부분들이 서로 다른 동물 종으로부터 유래하는, 예를 들어 뮤라인 항체로부터 유래한 가변 영역과 인간 면역글로불린 불변 영역을 가진, 항체이다. 항체의 키메라화는 (예, Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8에서 기술된 바와 같이) 뮤라인 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인간 중쇄 및 경쇄의 불변 영역과 연결함으로써 달성된다. 바람직한 구현예에서, 키메라 항체는 인간 κ-경쇄 불변 영역을 뮤라인 경쇄 가변 영역과 연결함으로써 제조한다. 또한 바람직한 구현예에서, 키메라 항체는 인간 λ-경쇄 불변 영역을 뮤라인 경쇄 가변 영역과 연결함으로써 제조할 수 있다. 키메라 항체를 제조하는데 바람직한 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG3 및 IgG4이다. 키메라 항체를 제조하는데 바람직한 중쇄 불변 영역은 IgG2, IgA, IgD 및 IgM이다.
인간화
항체는 주로 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 6개에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호 작용한다. 이런 이유로, CDR내 아미노산 서열은 CDR 외부에 위치한 서열과 비교해 개별 항체들 간에 다양성이 더 크다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하므로, 다른 특성을 가진 다른 항체로부터 유래한 프래임워크 서열에 이식된 특이적인 자연 생성 항체로부터 유래한 CDR 서열을 함유한 발현 벡터를 구축함으로써 특이적인 자연 생성 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; 및 Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033을 참조함). 이러한 프래임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 보유한 공개 DNA 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 이들 생식계열 서열은 성숙한 항체 유전자 서열과 다른데, 그 이유는 이들이 B 세포 성숙화 동안에 V (D) J 연결을 통해 형성되는 완전히 조립된 가변성 유전자들을 함유할 것이기 때문이다. 생식계열 유전자 서열은 가변 영역에 걸쳐 개별적으로 균일하다는 점에서 고 친화성 2차 레퍼토리 항체의 서열과도 다를 것이다.
항체가 항원에 결합하는 결합력은 표준 결합 분석 (예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광 및 유세포 측정 분석)을 이용해 확인할 수 있다.
항체를 정제하기 위해, 선별한 하이브리도마를 2L 스피너-플라스크에서 단일클론 항체 정제를 위해 배양할 수 있다. 대안적으로, 항체는 투석에 기반한 생물조에서 생산할 수 있다. 상층물을 여과하고, 필요에 따라 농축한 후 단백질 G-세파로스 또는 단백질 A-세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피를 실시할 수 있다. 용출된 IgG는 순도를 확인하기 위해 겔 전기영동 및 고 성능 액체 크로마토그래피를 통해 체크할 수 있다. 완충제 용액을 PBS로 교체하고, OD280에 의해 1.43 흡광 계수를 적용함으로써 농도를 확인할 수 있다. 단일클론 항체는 나누어, -80℃에서 보관할 수 있다.
선별한 단일클론 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지를 확인하기 위해, 부위-특이적인 또는 다중-부위 특이적인 돌연변이 유발을 이용할 수 있다.
항체의 이소형을 확인하기 위해, 다양한 시판 키트 (예, Zymed, Roche Diagnostics)를 이용해 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 마이크로타이터 플레이트의 웰을 항-마우스 Ig로 코팅할 수 있다. 플레이트를 차단 처리한 후, 단일클론 항체 또는 정제한 이소형 대조군을 첨가하여 주위 온도에서 2시간 동안 반응시킨다. 그런 후, 웰을 다른 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3, IgA 또는 마우스 IgM-특이적인 퍼옥시다제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 세척한 다음, ABTS 기질 (1 mg/ml)을 사용해 현상하고, OD 405-650에서 분석할 수 있다. 대안적으로, IsoStrip 마우스 단일클론 항체 이소타이핑 키트 (Roche, 카탈로그 번호 1493027)를 제조사의 설명에 따라 활용할 수도 있다.
면역화된 마우스의 혈청에서 항체의 존재 또는 항원을 발현하는 살아있는 세포에 대한 단일클론 항체의 결합성을 확인하기 위해, 유세포 측정을 이용할 수 있다. 천연적으로 또는 형질감염 후 항원을 발현하는 세포주와 (표준 배양 조건에서 배양한) 항원 발현이 결여된 대조군을, 하이브리도마 상층물 또는 1% FBS 함유 PBS 중의 다양한 농도의 단일클론 항체와 혼합하고, 4℃에서 30분간 인큐베이션할 수 있다. 이를 헹군 후, APC-표지된 또는 Alexa647-표지된 항-IgG 항체를 1차 항체 염색과 동일한 조건에서 항원-결합된 단일클론 항체에 결합시킬 수 있다. 샘플은 하나의 살아있는 세포에 대해 게이팅하기 위해 FACS 장치에서 빛 및 측면 산란 특성을 이용한 유세포 측정에 의해 분석할 수 있다. 한번의 측정으로 항원-특이적인 단일클론 항체를 비-특이적인 결합 물질과 구분하기 위해, 공동-형질감염 방법을 채택할 수 있다. 항원 및 형광 마커를 암호화하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염한 세포를 전술한 바와 같이 염색할 수 있다. 형질감염된 세포는 항체-염색된 세포와는 다른 형광 채널에서 검출할 수 있다. 대부분의 형질감염 세포가 전이유전자 2종을 둘다 발현하므로, 항원-특이적인 단일클론 항체는 형광 마커를 발현하는 세포에 우선적으로 결합하는 반면, 비-특이 항체는 형질감염되지 않은 세포에 비슷한 비율로 결합한다. 유세포 측정 분석과 더불어 또는 그 대신, 형광 현미경을 이용한 대안적인 분석도 이용할 수 있다. 세포는 정확하게 전술한 바와 같이 염색하고, 형광 현미경으로 조사할 수 있다.
면역화된 마우스의 혈청에서 항체의 존재 또는 항원을 발현하는 살아있는 세포에 대한 단일클론 항체의 결합을 입증하기 위해, 면역형광 현미경 분석을 이용할 수 있다. 예를 들어, 자발적으로 항원을 발현하거나 또는 형질감염 후 항원을 발현하는 세포주와 항원 발현이 결여된 음성 대조군을 10% 소 태아 혈청 (FCS), 2 mM L-글루타민, 100 IU/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM/F12 배지에서 표준 배양 조건 하에 챔버 슬라이드에서 배양한다. 그런 후, 세포를 메탄올 또는 파라포름알데하이드로 고정하거나 또는 처리하지 않고 둔다. 이후, 세포를 항원에 대한 단일클론 항체와 30분간 25℃에서 반응시킬 수 있다. 세포를 헹군 다음, Alexa555-표지된 항-마우스 IgG 2차 항체 (Molecular Probes)와 동일한 조건에서 반응시킬 수 있다. 이후, 세포를 형광 현미경으로 조사할 수 있다.
항원을 발현하는 세포 및 적절한 음성 대조군으로부터 유래한 세포 추출물을 준비하여, 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 차단 처리 후 검사할 단일클론 항체로 탐침한다. IgG 결합을 항-마우스 IgG 퍼옥시다제를 이용해 검출하고, ECL 기질로 현상할 수 있다.
항체는 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려진 방식으로, 예를 들어, 일상적인 외과적 시술 중에 환자로부터 수득한 비-암 조직 또는 암 조직 샘플 또는 항원을 자발적으로 발현하거나 또는 형질감염 후 발현하는 세포주를 접종한 이종이식 종양을 보유한 마우스로부터 유래한, 파라포름알데하이드 또는 아세톤 고정된 냉동단편 또는 파라포름알데하이드로 고정 및 파라핀 포매한 조직 단편을 이용해, 면역조직화학법에 의해 항원과의 반응성에 대해 추가로 검사할 수 있다. 면역염색을 위해, 항원 반응성 항체와 인큐베이션한 다음 호스래디시-퍼옥시다제 접합된 염소 항-마우스 또는 염소 항-토끼 항체 (DAKO)와 공급사의 설명서에 따라 인큐베이션할 수 있다.
항체는 종양 항원을 발현하는 세포의 식세포 작용과 사멸을 매개하는 능력에 대해 검사할 수 있다. 시험관내 단일클론 항체 활성에 대한 검사는 생체내 모델에서 검사하기 전 초기 스크리닝을 제공해줄 것이다.
항체-의존적인 세포-매개 세포독성 ( ADCC ):
간략하게는, 건강한 공여자로부터 유래한 다형핵 세포 (PMN), NK 세포, 단핵구, 단핵 세포 또는 기타 작동자 세포는 피콜 파이팩 (Ficoll Hypaque) 밀도 원심분리한 다음 오염 물질인 적혈구를 세포용해하여 정제할 수 있다. 세척한 작동자 세포를 10% 열-불활화된 소 태아 혈청 또는 대안적으로 5% 열-불활화된 인간 혈청이 첨가된 RPMI에 현탁하고, 종양 항원을 발현하는 51Cr 표지된 표적 세포와 다양한 비율의 작동자 세포:표적 세포로 혼합할 수 있다. 대안적으로, 표적 세포는 형광 강화 리간드 (BATDA)로 표지할 수 있다. 사멸 세포로부터 방출된 강화 리간드를 가진 유로퓸의 고 형광성 킬레이트를 형광측정기로 측정할 수 있다. 다른 대안적인 기법은 표적 세포를 루시퍼라제로 형질감염하는 것을 이용할 수 있다. 첨가된 루시퍼 옐로우는 이후 살아있는 세포에 의해서만 산화될 수 있다. 그 후, 정제한 항-종양 항원 IgG를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 비관련 인간 IgG는 음성 대조군으로 이용할 수 있다. 분석은 사용되는 작동자 세포 유형에 따라 37℃에서 4-20시간 동안 수행할 수 있다. 샘플은 51Cr 방출을 측정하거나 또는 배양 상층물내 EuTDA 킬레이트의 존재를 측정함으로써, 세포용해 (cytolysis)를 분석할 수 있다. 대안적으로 루시퍼 옐로우의 산화로부터 발생되는 발광이 살아있는 세포의 척도일 수 있다.
항-종양 항원 단일클론 항체는 또한, 세포용해가 복수의 단일클론 항체에 의해 강화되는지를 확인하기 위해 다양한 조합으로 검사할 수 있다.
항체-의존적인 세포성 식세포 작용 ( ADCP ):
간략하게는, 고전적인 ADCP 분석 형식은 작동자 세포로서 말초혈 단핵 세포 (PBMC)-유래 대식세포의 이용을 기반으로 한다. 신선한 인간 PBMC를 추출한 후, 단핵구를 분리하고, 대식세포로 배양하여 분화할 수 있다. 식세포 현상은 FACS 스크리닝을 이용해 분석할 수 있으며, 용량-의존적인 곡선을 구하여 ADCP 효력을 구체적으로 평가할 수 있다. 서로 다른 공여자로부터 유래한 작동자 세포는 MHC 제한으로 인해 합칠 수 없다. 그래서, 공여자-특이적인 가변성을 줄이기 위해 일련의 수용자로부터 유래한 샘플을 이용하여야 한다.
보체 의존적인 세포독성 ( CDC ):
단일클론 항-종양 항원 항체는 다양한 공지된 기법들을 이용해 CDC를 매개하는 능력에 대해 검사할 수 있다. 예를 들어, 보체용 혈청을 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 방식으로 혈액으로부터 수득할 수 있다. mAb의 CDC 활성을 확인하기 위해, 여러가지 방법들을 이용할 수 있다. 51Cr 방출을 예를 들어 측정할 수 있거나, 또는 증가된 막 투과성을 프로피듐 아이오다이드 (PI) 배제 분석을 이용해 분석할 수 있다. 간략하게는, 표적 세포를 헹군 다음 5 x 105/ml을 다양한 농도의 mAb와 10-30분간, 실온에서 또는 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 그런 후, 혈청 또는 혈장을 최종 농도 20% (v/v)로 첨가하여, 세포를 37℃에서 20-30분간 인큐베이션할 수 있다. 각 샘플에서 유래한 세포 모두 FACS 시험관내 PI 용액에 투입할 수 있다. 그런 후, 혼합물을 바로 FACS 어레이를 이용한 유세포 측정 분석으로 분석할 수 있다.
대안적인 분석으로, CDC의 유도는 부착 세포에서 확인할 수 있다. 이러한 분석에 대한 일 구현예에서, 분석하기 24시간 전 바닥이 평평한 조직-배양 마이크로타이터 플레이트에 세포를 3 x 104/웰의 밀도로 접종한다. 다음날 배양 배지를 제거하고, 세포를 항체와 트리플리케이트로 배양한다. 백그라운드 세포용해 및 최대 세포용해를 각각 확인하기 위해, 대조군 세포를 배양 배지와 인큐베이션하거나, 또는 0.2% 사포닌이 함유된 배양 배지와 인큐베이션한다. 20분간 실온에서 인큐베이션한 다음, 상층액은 제거하고, (37℃로 미리 데운) DMEM 중의 20% (v/v) 인간 혈장 또는 혈청을 세포에 첨가하여, 다시 20분간 37℃에서 인큐베이션한다. 각 샘플에서 유래한 모든 세포는 프로피듐 아이오다이드 용액 (10 ㎍/ml)에 투입한다. 그런 후, 상층액을 2.5 ㎍/ml 에티듐 브로마이드가 첨가된 PBS로 교체하고, 520 nm에서 여기시 형광 방출을 Tecan Safire를 사용해 60 nm에서 측정한다. 특이적인 세포용해 %를 다음과 같이 계산한다: 특이적인 세포용해 % = (형광 샘플 - 형광 백그라운드)/(형광성 최대 세포용해 - 형광 백그라운드) x 100.
단일클론 항체에 의한 세포자살의 유도 및 세포 증식의 저해:
세포자살을 개시하는 능력에 대해 조사하기 위해, 단일클론 항-종양 항원 항체를, 예를 들어, 종양 항원 양성 종양 세포, 또는 종양 항원으로 형질감염된 종양 세포와 37℃에서 약 20시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 세포를 회수하여, 아넥신-V 결합 완충제 (BD biosciences)에서 헹군 다음, FITC 또는 APC (BD biosciences)가 접합된 아넥신 V와 15분간 암 조건 하에 인큐베이션할 수 있다. 각 샘플에서 유래한 모든 세포를 FACS 시험관내 PI 용액 (PBS 중의 10 ㎍/ml)에 투입하여, (전술한 바와 같이) 유세포 측정을 통해 바로 평가할 수 있다. 대안적으로, 단일클론 항체에 의한 세포-증식의 전체적인 저해를 상업적으로 이용가능한 키트를 이용해 검출할 수 있다. DELFIA 세포 증식 키트 (Perkin-Elmer, 카탈로그 번호 AD0200)는 마이크로플레이트에서 증식성 세포의 DNA가 합성되는 동안에 병합되는 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU)의 측정값을 토대로 하는 비-동위원소 면역분석이다. 병합된 BrdU는 유로퓸 표지된 단일클론 항체를 사용해 검출한다. 항체 검출을 위해, 세포를 고정하고, Fix 용액으로 DNA를 변성시킨다. 결합되지 않은 항체는 세척 제거하고, DELFIA 유도제를 첨가해 표지된 항체로부터 용액으로 유로퓸을 해리시키며, 이것은 DELFIA 유도제 성분과 현저한 형광성의 킬레이트를 형성하게 된다. 검출시 시간-분해 형광측정을 이용해 측정한 형광성은 각 웰 세포의 DNA 합성에 비례한다.
전임상 실험
종양 항원에 결합하는 단일클론 항체는 또한 생체내 모델 (예, 종양 항원을 발현하는 세포가 접종된 이종이식된 종양을 보유한 면역 결핍성 마우스에서, 또는 형질감염 후, 예를 들어 HEK293)에서 검사하여, 종양 항원-발현성 종양 세포의 증식을 제어하는 효과를 확인할 수 있다.
종양 항원을 발현하는 종양 세포를 면역약화 마우스 또는 기타 동물에 이종이식한 후 본원에 기술된 항체를 이용해 생체내 실험을 수행할 수 있다. 항체를 종양이 없는 마우스에 투여한 다음 종양 세포를 주사해, 종양의 형성 또는 종양-관련 증상을 방지하는 항체의 효과를 측정할 수 있다. 항체를 종양-보유 마우스에 투여하여, 해당 항체가 종양 증식, 전이 또는 종양 관련 증상을 완화하는 치료학적 효능이 있는 지를 확인할 수 있다. 항체 이용은 면역 체크포인트 저해제, 세포분열 억제 약물, 성장인자 저해제, 세포주기 차단제, 혈관신생 저해제 또는 조합물의 효능 및 잠재적인 독성을 확인하기 위한 기타 항체로서 다른 물질의 이용과 조합할 수 있다. 항체에 의해 매개되는 독성 부작용을 분석하기 위해, 동물에 항체 또는 대조군 시약을 접종하고, 가능하게는 종양 항원-항체 요법과 관련있는 증상을 전부 조사할 수 있다. 종양 항원 항체의 생체내 적용시 가능한 부작용은 특히 위 등의 종양 항원 발현 조직에서의 독성을 포함한다. 인간 및 기타 종, 예를 들어, 마우스에서 종양 항원을 인지하는 항체는 특히 인간에서 단일클론 종양 항원-항체의 이용에 의해 매개되는 잠재적인 부작용을 예측하는데 유용하다.
항체에 의해 인지되는 에피토프에 대한 맵핑은 "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 및 "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay에 상세히 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
본원에서, "종양 항원" 또는 "암 항원"은 (i) 종양-특이 항원, (ii) 종양-관련 항원, (iii) 종양 상의 배아 항원, (iv) 종양-특이 막 항원, (v) 종양-관련 막 항원, (vi) 성장인자 수용체, 및 (xi) 암과 관련있는 임의 다른 유형의 항원 또는 물질을 포괄한다.
본 발명에 따라 이용할 수 있는 치료학적 항체로는, 비-제한적으로, 임상 실험 또는 임상 사용을 위한 개발에서 사용이 허가된 당업계에서 인정된 임의의 항암 항체를 포괄한다. 특정 구현예에서, 항암 항체 2종 이상이 본 발명의 조합 요법에 포함될 수 있다.
예를 들어, 다음과 같은 종양 항원이 본원에 기술된 치료학적 항체의 표적이 될 수 있다.
종양 항원은 상피 암 항원, (예를 들어, 유방, 위장, 폐), 전립선 특이 암 항원 (PSA) 또는 전립선 특이 막 항원 (PSMA), 방광암 항원, 폐 (예를 들어, 소 세포 폐) 암 항원, 대장암 항원, 난소암 항원, 뇌암 항원, 위암 항원, 신장 세포 암종 항원, 췌장암 항원, 간암 항원, 식도암 항원, 두경부암 항원 또는 결장직장암 항원일 수 있다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 림프종 항원 (예를 들어, 비-호지킨 림프종 또는 호지킨 림프종), B 세포 림프종 암 항원, 백혈병 항원, 골수종 (예를 들어, 다발성 골수종 또는 형질세포 골수종) 항원, 급성 림프모구성 백혈병 항원, 만성 골수성 백혈병 항원 또는 급성 골수성 백혈병 항원이다. 언급된 종양 항원들은 단순 예일 뿐이며, 임의의 종양 항원이 본 발명에서 표적이 될 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
종양 항원은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 것을 포함한다. 종양 항원은, 예를 들어, 신경교종-관련 항원, 암태아성 항원 (CEA), β-인간 융모성 고나도트로핀, 알파페토프로테인 (AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린 (thyroglobulm), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2 (AS), 장 카르복시 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이 항원 (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 티로시나제, 프로스테인, PSMA, ras, Her2/neu, TRP-1, TRP-2, TAG-72, KSA, CA-125, PSA, BRCI, BRC-II, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-l, 서비빈 (survivin) 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1 (PCTA-1), MAGE, GAGE, GP-100, MUC-1, MUC-2, ELF2M, 호중구 엘라스타제, ephrinB2, CD22, 인슐린 성장인자 (IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체, VEGF, Claudin 분자, 예를 들어 Claudin 18 이소형 2와 Claudin 6, 및 메소텔린 (mesothelin)일 수 있다.
종양 항원은 (통상적으로 돌연변이에 의해 유발되는) 고유한 항원 (예를 들어, p53, ras, β-카테닌, CDK4, CDC27, α 액티닌-4), 분화 항원 (예를 들어, 티로시나제, TRP1/gp75, TRP2, gp100, Melan-A/MART1, 강글리오시드, PSMA), 과발현된 항원 (예를 들어, HER2, WT1, EphA3, EGFR, CD20), 암-고환 항원 (예를 들어, MAGE, BAGE, GAGE, NY-ESO-1) 또는 유니버셜 항원 (예를 들어, 텔로머라제, 서비빈)일 수 있다.
또한, 종양 항원은 종양-특이 항원 (TSA) 또는 종양-관련 항원 (TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 고유하며, 체내에서 다른 세포 상에서는 발생되지 않는다. TAA는 종양 세포에 고유하지 않으며, 대신 항원에 면역학적 관용 상태를 유도하는데 실패한 환경에서는 정상 세포 상에서도 발현된다. 종양 상의 항원의 발현은 면역 시스템이 항원에 반응할 수 있는 환경에서 발생할 수도 있다. TAA는, 면역 시스템이 미성숙하고 반응하지 못할 수 있는 경우에 태아 발달 중에 정상 세포 상에 발현되는 항원일 수 있거나, 또는 이는 정상적으로는 정상 세포 상에서 매우 낮은 수준으로 존재하지만 종양 세포 상에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
항암 항체에 대한 비-제한적인 예는, 비-제한적으로, 하기를 포함한다:
HER-2/neu 양성 유방암 또는 전이성 유방암을 치료하기 위해 사용되는, 트라스투주맵 (trastuzumab)(HERCEPTIN™; 표적: HER2/neu);
결장직장암, 전이성 결장직장암, 유방암, 전이성 유방암, 비-소 세포성 폐암 또는 신장 세포 암종을 치료하기 위해 사용되는, 베박시주맵 (bevacizumab)(AVASTIN™; 표적: VEGF-A);
비-호지킨 림프종 또는 만성 림프성 백혈병을 치료하기 위해 사용되는, 리툭시맵 (rituximab)(RITUXAN™; 표적: CD20);
유방암, 전립선암, 비-소 세포성 폐암 또는 난소암을 치료하기 위해 사용되는, 퍼투주맵 (pertuzumab)(OMNITARG™; 표적: HER2/neu);
결장직장암, 전이성 결장직장암, 폐암, 두경부암, 대장암, 유방암, 전립선암, 위암, 난소암, 뇌암, 췌장암, 식도암, 신장 세포 암, 전립선암, 자궁경부암 또는 방광암을 치료하기 위해 사용할 수 있는, 세투시맵 (cetuximab)(ERBITUX™; 표적: EGFR);
비-호지킨 림프종 및 낭포성 비-호지킨 림프종을 치료하기 위해 사용되는, 토시투모맵 (tositumomab)(BEXXAR™; 표적: CD20);
만성 림프성 백혈병에 대한 오파투무맵 (ofatumumab)(ARZERRA™; 표적: CD20);
결장직장암에 대한 파니투무맵 (panitumumab)(VECTIBIX™; 표적: EGFR);
만성 림프성 백혈병에 대한 알렘투주맵 (alemtuzumab)(CAMPATH™; 표적: CD52);
만성 림프성 백혈병에 대한 오비누투주맵 (obinutuzumab)(Gazyva ™; 표적: CD20).
화학요법
IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 항체-기반의 암 면역요법과 더불어, 추가적인 치료를 환자에게 수행할 수 있다. 이러한 추가적인 치료로는 고전적인 암 요법, 예를 들어, 방사선 요법, 수술, 온열요법 (hyperthermia therapy) 및/또는 화학요법을 포함한다.
화학요법은 한가지 이상의 항암 약물 (화학치료제)을 통상적으로 표준화된 화학치료 용법의 일부로 이용하는 일종의 암 치료이다. 용어 화학요법은 유사 분열을 저해하기 위해 세포내 독성 물질을 비-특이적으로 사용하는 것을 포함하게 되었다. 여기에는 세포외 신호 (신호 변환)을 차단하는 보다 선택적인 물질들은 포함되지 않는다. 고전적인 내분비 호르몬 (주로 유방암의 경우 에스트로겐, 전립선암의 경우 안드로겐)을 저해하는 특이적인 분자 또는 유전자 표적을 이용한 요법의 개발을 현재 호르몬 요법이라고 한다. 이와는 대조적으로, 수용체 티로신 키나제와 관련있는 것과 같은 성장-신호에 대한 또 다른 저해는 표적 요법이라고 한다.
중요하게는, 약물의 이용 (화학요법, 호르몬 요법 또는 표적 요법)은, 약물이 혈류로 들어가, 따라서 기본적으로 체내 임의의 해부학적 위치에서 암을 해결한다는 점에서, 전신 암 요법을 구성한다. 전신 요법은 종종 방사선 요법, 수술 또는 온열요법과 같은 암에 대한 국소 요법 (즉, 치료 효과가 적용된 해부학적 영역으로만 한정됨)을 구성하는 다른 용법과 조합하여 사용된다.
전통적인 화학치료제는 세포 분열 (유사분열)을 간섭함으로써 세포독성이지만, 암 세포는 이들 물질에 대해 다양한 감수성을 가진다. 화학요법은, 넓은 의미에서, 세포자살이 개시된다면 세포 사멸로 이어질 수 있는, 세포를 손상시키거나 또는 스트레스를 가하기 위한 방식으로 볼 수 있다.
화학치료제로는 알킬화제, 항-대사산물제, 항-미세소관제 (anti-microtubule agent), 토포이소머라제 저해제 및 세포독성 항생제 (cytotoxic antibiotic) 등이 있다.
알킬화제는 단백질, RNA 및 DNA 등의 다수의 분자를 알킬화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 알킬화제의 하위 유형은 질소 머스타드 (nitrogen mustard), 니트로소우레아, 테트라진 (tetrazine), 아지리딘 (aziridine), 시스플라틴 (cisplatin) 및 유도체, 그리고 비-고전적인 알킬화제이다. 질소 머스타드로는 메클로르에타민 (mechlorethamine), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 클로람부실 (chlorambucil), 이포스파미드 (ifosfamide) 및 부설판 (busulfan) 등이 있다. 니트로소우레아로는 N-니트로소-N-메틸우레아 (MNU), 카르무스틴 (carmustine)(BCNU), 로무스틴 (lomustine)(CCNU) 및 세무스틴 (semustine)(MeCCNU), 포테무스틴 (fotemustine) 및 스트렙토조톡신 (streptozotocin) 등이 있다. 테트라진으로는 다카르바진 (dacarbazine), 미토졸로미드 (mitozolomide) 및 테모졸로미드 (temozolomide) 등이 있다. 아지리딘으로는 티오테파 (thiotepa), 미토마이신 (mytomycin) 및 다이아지쿠온 (diaziquone)(AZQ) 등이 있다. 시스플라틴 및 유도체로는 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin) 및 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 등이 있다. 이들 물질은 생물학적으로 중요한 분자의 아미노, 카르복시, 설프하이드릴 및 포스페이트 기와 공유 결합을 형성함으로써 세포 기능을 손상시킨다. 비-고전적인 알킬화제로는 프로카바진 (procarbazine) 및 헥사메틸멜라민 (hexamethylmelamine) 등이 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 알킬화제는 사이클로포스파미드이다.
항-대사산물제는 DNA 및 RNA의 합성을 방해하는 분자 군이다. 이 물질 다수가 DNA 및 RNA 빌딩 블록과 비슷한 구조를 가진다. 항-대사산물제는 뉴클레오베이스 또는 뉴클레오시드와 비슷하지만, 변형된 화학적 기를 가진다. 이들 약물은 DNA 합성에 필요한 효소를 차단하거나 또는 DNA 또는 RNA로 병합됨으로써 그 효과를 발휘한다. 항-대사산물제에 대한 하위 유형은 항-폴레이트, 플루오로피리미딘, 데옥시뉴클레오시드 유사체 및 티오퓨린이다. 항-폴레이트로는 메토트렉세이트 (methotrexate) 및 페메트렉세드 (pemetrexed) 등이 있다. 플루오로피리미딘으로는 플루오로우라실 및 카페시타빈 (capecitabine) 등이 있다. 데옥시뉴클레오시드 유사체로는 시타라빈 (cytarabine), 겜시타빈 (gemcitabine), 데시타빈 (decitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 플루다라빈 (fludarabine), 넬아라빈 (nelarabine), 클라드리빈 (cladribine), 클로파라빈 (clofarabine) 및 펜토스타틴 (pentostatin) 등이 있다. 티오퓨린으로는 티오구아닌 및 머캅토퓨린 등이 있다.
항-미세소관제는 미세소관의 기능을 막으므로써 세포 분열을 차단한다. 빈카 알칼로이드는 미세소관의 형성을 방지하고, 탁산은 미세소관의 분해를 방지한다. 빈카 알카로이드로는 비노렐빈 (vinorelbine), 빈데신 (vindesine) 및 빈플루닌 (vinflunine) 등이 있다. 탁산으로는 도세탁셀 (docetaxel)(Taxotere) 및 파클리탁셀 (Taxol) 등이 있다.
토포이소머라제 저해제는 효소 2종, 즉 토포이소머라제 I 및 토포이소머라제 II의 활성에 영향을 주는 약물이며, 이러한 것으로는 이리노테칸 (irinotecan), 토포테칸 (topotecan), 캄프토테신 (camptothecin), 에토포시드 (etoposide), 독소루비신 (doxorubicin), 미톡산트론 (mitoxantrone), 테니포시드 (teniposide), 노보비오신 (novobiocin), 메르바론 (merbarone) 및 아클라루비신 (aclarubicin) 등이 있다.
세포독성 항생제는 작용 기전이 여러가지인 다양한 약물 군이다. 이들이 화학요법 적응증에서 공유하는 공통적인 부분은 이들이 세포 분열을 방해한다는 것이다. 가장 중요한 하위군은 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신, 다우노루비신 (daunorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 이다루비신 (idarubicin) 피라루비신 (pirarubicin) 및 아클라루비신) 및 블레오마이신 (bleomycin)이며; 그외 주요 예로는 미토마이신 C, 미톡산트론 (mitoxantrone) 및 액티노마이신 (actinomycin) 등이 있다.
면역 체크포인트 저해제
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 본원에 기술된 다른 치료학적 물질과 조합하여 이용된다.
본 발명의 내용에서, "면역 체크포인트"는 NK 세포 활성과 같은 면역 세포 활성의 규모와 특성을 제어하는 공동-자극성 신호 및 저해성 신호를 지칭한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트는 저해성 신호이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 CD28 결합성을 대체하기 위한 CTLA-4와 CD80 또는 CD86 간의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 LAG3와 MHC 클래스 II 분자 간의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 TIM3와 갈렉틴 9 간의 상호작용이다.
본 발명의 내용에서, "면역 체크포인트 저해제"는 하나 이상의 체크포인트 단백질을 부분적으로 또는 완전히 감소, 저해, 간섭 또는 조절하는 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 면역 체크포인트와 관련한 저해성 신호를 방지한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 면역 체크포인트와 관련한 저해성 신호전달을 교란하는 항체 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 저해성 신호전달을 교란하는 소분자이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 체크포인트 차단제 단백질들 간의 상호작용을 방지하는 항체, 이의 단편 또는 항체 모방체, 예를 들어 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 방지하는 항체 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 CTLA-4와 CD80 또는 CD86 간의 상호작용을 방지하는, 항체 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 LAG3와 이의 리간드, 또는 TIM-3와 이의 리간드 간의 상호작용을 방지하는 항체 또는 이의 단편이다. 체크포인트 저해제는 또한 분자 (또는 이의 변이체) 자체의 용해성 형태, 예를 들어 용해성 PD-L1 또는 PD-L1 융합체 형태일 수 있다.
"프로그램화된 사멸-1 (PD-1)" 수용체는 CD28 패밀리에 속하는 면역-저해성 수용체를 지칭한다. PD-1은 이전에 활성화된 T 세포 상에서 주로 생체내 발현되며, 이는 리간드 2종, PD-L1 및 PD-L2와 결합한다. 본원에서, 용어 "PD-1"은 인간 PD-1 (hPD-1), 변이체, 이소형 및 hPD-1의 종 호몰로그, 및 hPD-1과 공통적인 에피토프를 하나 이상 가진 유사체를 포괄한다.
"프로그램화된 사멸 리간드-1 (PD-L1)"은 PD-1에 결합하였을 때 T 세포 활성화와 사이토카인 분비를 하향 조절하는 PD-1에 대한 세포 표면 당단백질 리간드 2종 중 하나 (나머지는 PD-L2임)이다. 본원에서, 용어 "PD-L1"은 인간 PD-L1 (hPD-L1), 변이체, 이소형 및 hPD-L1의 종 호몰로그, 및 hPD-L1과 공통적인 에피토프를 하나 이상 가진 유사체를 포괄한다.
"세포독성 T 림프구 관련 항원-4 (CTLA-4)"는 면역 세포 표면 분자로서, 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 구성원이다. 이 단백질은 CD80 및 CD86에 결합함으로써 면역 시스템을 하향 조절한다. 본원에서, 용어 "CTLA-4"는 인간 CTLA-4 (hCTLA-4), 변이체, 이소형 및 hCTLA-4의 종 호몰로그, 및 hCTLA-4와 공통적인 에피토프를 하나 이상 가진 유사체를 포괄한다.
"림프구 활성화 유전자-3 (LAG3)"는 MHC 클래스 II 분자에 결합함으로써 면역 세포의 활성을 저해하는 것과 관련있는 저해성 수용체이다. 이 수용체는 Treg 세포의 기능을 강화하고, CD8+ 작동자 T 세포 기능을 저해한다. 본원에서, 용어 "LAG3"는 인간 LAG3 (hLAG3), 변이체, 이소형 및 hLAG3의 종 호몰로그, 및 하나 이상의 공통적인 에피토프를 가진 유사체를 포괄한다.
"T 세포막 단백질-3 (TIM3)"는 TH1 세포 반응을 저해함으로써 면역 세포 활성의 저해에 참여하는 저해성 수용체이다. 이의 리간드는 갈렉틴 9로서, 이것은 다양한 타입의 암들에서 상향 조절된다. 본원에서, 용어 "TIM3"는 인간 TIM3 (hTIM3), 변이체, 이소형 및 hTIM3의 종 호몰로그, 및 하나 이상의 공통적인 에피토프를 가진 유사체를 포괄한다.
"B7 패밀리"는 수용체가 정의되지 않은 저해성 리간드이다. B7 패밀리는 종양 세포 및 종양 침윤성 세포 상에서 둘다 상향 조절되는 B7-H3 및 B7-H4를 포괄한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에서 이용하기 적합한 면역 체크포인트 저해제는 저해성 신호의 길항제, 예를 들어 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, B7-H3, B7-H4 또는 TIM3를 표적화하는 항체이다. 이들 리간드들과 수용체는 Pardoll, D., Nature. 12: 252-264, 2012에서 검토되어 있다.
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는, 저해성 면역조절제로부터 신호전달을 교란 또는 저해하는, 항체 및 이의 항원-결합 부분이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 저해성 면역조절제로부터의 신호전달을 교란 또는 저해하는 소분자이다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 PD-1/PD-L1 신호전달 경로의 구성요소이다. 이에, 본 발명의 특정 구현예는 PD-1 수용체와 이의 리간드 PD-L1 간의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에 투여하는 것을 제공한다. PD-1에 결합하여 PD-1과 이의 리간드 PD-L1 간의 상호작용을 교란하는 항체들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 PD-1에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 PD-L1에 특이적으로 결합하여, 이와 PD-1의 상호작용을 저해하고 면역 활성을 강화한다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 CTLA4 신호전달 경로의 구성요소이다. 이에, 본 발명의 특정 구현예는 CTLA4를 표적화하여 CD80 및 CD86과의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에 투여하는 것을 제공한다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 LAG3 (림프구 활성화 유전자 3) 신호전달 경로의 구성요소이다. 이에, 본 발명의 특정 구현예는 LAG3를 표적화하여 이와 MHC 클래스 II 분자와의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에 투여하는 것을 제공한다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 B7 패밀리 신호전달 경로의 구성요소이다. 특정 구현예에서, B7 패밀리 구성원은 B7-H3 및 B7-H4이다. 이에, 본 발명의 특정 구현예는 B7-H3 또는 H4를 표적화하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에 투여하는 것을 제공한다. B7 패밀리는 임의의 정의된 수용체를 가지진 않지만, 이들 리간드는 종양 세포 또는 종양-침윤성 세포 상에서 상향 조절된다. 전임상 마우스 모델에서, 이들 리간드를 차단하면 항-종양 면역을 강화할 수 있는 것으로, 입증되어 있다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 TIM3 (T 세포막 단백질 3) 신호전달 경로의 구성요소이다. 이에, 본 발명의 특정 구현예는 TIM3를 표적화하여 이와 갈렉틴 9의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에 투여하는 것을 제공한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 표적화에 의해, 예를 들어, 면역 세포 증식 증가, 면역 세포 활성화 강화 및/또는 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ, IL2) 생산 증가에서 반영되는 바와 같이, 항-종양 면역 반응과 같은 면역 반응의 자극이 발생되는 한, 다른 면역 체크포인트들 역시 길항제 또는 항체에 의해 표적화 가능함을 이해할 것이다.
RNA 표적화
본 발명에서, 본원에 기술된 펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드, 특히 IL2 폴리펩타이드 및/또는 항체는 본원에 기술된 펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 형태로 투여되는 것이 특히 바람직하다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 여러가지 펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드는 여러가지 RNA 분자들에 의해 암호화된다.
일 구현예에서, RNA는 전달 비히클 내에 제형화된다. 일 구현예에서, 전달 비히클은 입자를 포함한다. 일 구현예에서, 전달 비히클은 하나 이상의 지질을 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 지질은 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일 구현예에서, 지질은 RNA와 복합체를 형성하거나 및/또는 RNA를 둘러싼다. 일 구현예에서, 지질은 RNA를 둘러싼 소낭 안에 포함된다. 일 구현예에서, RNA는 리포좀 안에 제형화된다.
본 발명의 내용에서, 본원에 기술된 RNA는 투여 후, RNA의 적어도 일부가 표적 세포로 전달된다. 일 구현예에서, RNA의 적어도 일부는 표적 세포의 세포질로 전달된다. 일 구현예에서, RNA는 표적 세포에 의해 번역되어, 암호화된 펩타이드 또는 단백질이 만들어진다.
본원의 내용에 대한 일부 측면들은 본원에 기술된 RNA (예를 들어, IL2 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA, 항체를 암호화하는 RNA)의 표적 전달을 수반한다.
RNA는, RNA가 양이온성 지질 및 선택적으로 부가적인 또는 보조 지질을 포함하는 리포좀에 결합하여 주사가능한 나노입자 제형을 형성하는, 소위 리포플렉스 제형에 의해 전달할 수 있다. 리포좀은 에탄올 중의 지질 용액을 물 또는 적절한 수상에 주입함으로써 수득할 수 있다. RNA 리포플렉스 입자는 리포좀을 RNA와 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "RNA 리포플렉스 입자"는 지질, 특히 양이온성 지질과 RNA를 함유한 입자를 지칭한다. 양으로 하전된 리포좀과 음으로 하전된 RNA 간의 정전기적 상호작용으로 복합체가 형성되고, RNA 리포플렉스 입자가 자발적으로 만들어진다. 양으로 하전된 리포좀은 일반적으로 DOTMA와 같은 양이온성 지질 및 DOPE와 같은 부가적인 지질을 사용해 합성할 수 있다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 나노입자이다.
본원에서, "양이온성 지질"은 양의 순 전하를 가진 지질을 지칭한다. 양이온성 지질은 지질 매트릭스에의 정전기적 상호작용을 통해 음으로 하전된 RNA에 결합한다. 일반적으로, 양이온성 지질은 스테롤, 아실 또는 다이아실 쇄와 같은 친지성 모이어티를 가지고 있으며, 전형적으로 지질 헤드 기는 양 전하를 띤다. 양이온성 지질의 예로는, 비-제한적으로 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 다이메틸다이옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-다이올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP); 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-다이아실옥시-3-다이메틸암모늄 프로판; 1,2-다이알킬옥시-3-다이메틸암모늄 프로판; 다이옥타데실다이메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 2,3-다이(테트라데콕시)프로필-(2-하이드록시에틸)-다이메틸아자늄 (DMRIE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DMEPC), 1,2-다이미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE) 및 2,3-다이올레오일옥시-N-[2(스페르민 카르복사미드)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA) 등이 있다. DOTMA, DOTAP, DODAC 및 DOSPA가 바람직하다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 DOTMA 및/또는 DOTAP이다.
부가적인 지질을 병합함으로써, 총 양 전하 : 음 전하의 비율과 RNA 리포플렉스 입자의 물리적 안정성을 조정할 수 있다. 특정 구현예에서, 부가적인 지질은 중성 지질이다. 본원에서, "중성 지질"은 순 전하가 0인 지질을 지칭한다. 중성 지질의 예로는, 비-제한적으로, 1,2-다이-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 다이아실포스파티딜 콜린, 다이아실포스파티딜 에탄올 아민, 세라마이드, 스핑고마이엘린, 세팔린, 콜레스테롤 및 세레브로사이드 등이 있다. 특정 구현예에서, 부가적인 지질은 DOPE, 콜레스테롤 및/또는 DOPC이다.
특정 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 양이온성 지질과 부가적인 지질 둘다 포함한다. 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 DOTMA이고, 부가적인 지질은 DOPE이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질 : 하나 이상의 부가적인 지질의 몰 비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 또는 약 3:1 내지 약 1:1이다. 특정 구현예에서, 상기한 몰 비는 약 3:1, 약 2.75:1, 약 2.5:1, 약 2.25:1, 약 2:1, 약 1.75:1, 약 1.5:1, 약 1.25:1 또는 약 1:1일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질 : 하나 이상의 부가적인 지질의 몰 비는 약 2:1이다.
본 발명에서 언급되는 RNA 리포플렉스 입자는, 일 구현예에서, 약 200 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위의 평균 직경을 가진다. 특정 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 200 nm, 약 225 nm, 약 250 nm, 약 275 nm, 약 300 nm, 약 325 nm, 약 350 nm, 약 375 nm, 약 400 nm, 약 425 nm, 약 450 nm, 약 475 nm, 약 500 nm, 약 525 nm, 약 550 nm, 약 575 nm, 약 600 nm, 약 625 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 725 nm, 약 750 nm, 약 775 nm, 약 800 nm, 약 825 nm, 약 850 nm, 약 875 nm, 약 900 nm, 약 925 nm, 약 950 nm, 약 975 nm 또는 약 1000 nm이다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 250 nm 내지 약 700 nm 범위이다. 다른 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 300 nm 내지 약 500 nm 범위이다. 예시적인 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 400 nm이다.
본 발명의 RNA 리포플렉스 입자의 전하는 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 전하와 RNA에 존재하는 전하의 총 합이다. 전하 비율은 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 양 전하 : RNA에 존재하는 음 전하의 비율이다. 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 양 전하 : RNA에 존재하는 음 전하의 전하 비율은 다음과 같은 식으로 계산한다: 전하 비율 = [(양이온성 지질 농도 (mol)) * (양이온성 지질에 존재하는 양 전하의 총 수)] / [(RNA 농도 (mol)) * (RNA에 존재하는 음 전하의 총 수)].
사이토카인, 예를 들어 PK-연장된 사이토카인, 특히 본원에 기술된 것과 같은 PK-연장된 인터루킨은 RNA를 간 또는 간 조직으로 선호적으로 전달하기 위한 제형 형태로 사이토카인을 코딩하는 RNA를 개체에 투여함으로써 개체에 제공될 수 있다. 이러한 표적 장기 또는 조직으로 RNA를 전달하는 것이 바람직하며, 특히 사이토카인을 다량 발현하는 것이 요망되거나 및/또는 사이토카인이 특히 유의한 양으로 전신에 존재하는 것이 요망되거나 또는 필요할 경우, 바람직하다.
RNA 전달 시스템은 고유한 간 선호성을 가진다. 이는 지질-기반의 입자, 양이온성 나노입자 및 중성 나노입자, 특히 지질 나노입자, 예를 들어 리포좀, 나노마이셀 및 친지성 리간드와 바이오접합체 형태로서 적용된다. 간 축적은 간 혈관 구조 또는 지질 대사 (리포좀 및 지질 또는 콜레스테롤 접합체)의 불연속적인 특성으로 인해 유발된다.
RNA를 간으로 생체내 전달하는 경우, 분해를 방지함으로써 RNA를 간으로 수송하기 위해 약물 전달 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)-코팅된 표면과 mRNA-함유성 코어로 구성되는 폴리플렉스 나노마이셀은, 나노마이셀이 생리학적 조건에서 우수한 생체내 RNA 안정성을 제공하므로, 유용한 시스템이다. 아울러, 조밀한 PEG 울타리로 구성된, 폴리플렉스 나노마이셀 표면에 의해 제공되는 잠행성도 숙주 면역 방어를 효과적으로 회피한다.
약학적 조성물
본원에 기술된 물질은 약학적 조성물 또는 의약제로 투여할 수 있으며, 임의의 적절한 약학적 조성물의 형태로 투여할 수 있다.
본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, 사이토카인 (IL2) 또는 항체를 암호화하는 핵산과 같은 본원에 기술된 구성성분들은 함께 또는 서로 분리하여, 약제학적으로 허용가능한 담체와 선택적으로 하나 이상의 보강제, 안정화제 등을 포함할 수 있는 약학적 조성물로 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 치료학적 또는 예방학적 치료, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 암 질환 등의 항원이 참여하는 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다.
용어 "약학적 조성물"은 치료학적으로 유효한 물질을, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함하는 제형을 지칭한다. 이러한 약학적 조성물은, 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써 질환 또는 장애의 중증도를 낮추거나, 방지하거나 또는 치료하기 위해 사용가능하다. 약학적 조성물은 또한 약학적 제형으로서 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 보강제를 포함할 수 있거나, 또는 하나 이상의 보강제와 함께 투여할 수 있다. 용어 "보강제"는 면역 반응을 연장, 강화 또는 가속화하는 화합물을 지칭한다. 보강제는 오일 에멀젼 (예, 프로인트 보강제), 미네랄 화합물 (예, 알럼), 박테리아 생산물 (예, 백일해균 독소) 또는 면역-자극 복합체와 같은 이질적인 화합물 군을 포함한다. 보강제의 예로는, 비-제한적으로, LPS, GP96, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 성장인자 및 사이토카인, 예를 들어 모노카인, 림포카인, 인터루킨, 케모카인 등이 있다. 사이토카인은 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL12, IL18, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-a일 수 있다. 추가적으로 알려진 보강제는 알루미늄 하이드록사이드, 프로인트 보강제 또는 오일, 예를 들어 Montanide® ISA51이다. 본 발명에서 사용하기 적합한 다른 보강제로는 Pam3Cys과 같은 리포펩타이드 등이 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 일반적으로 "약제학적 유효량"으로, "약제학적으로 허용가능한 제제"로 적용된다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 물질이 약학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 무독성을 의미한다.
용어 "약제학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 단독으로 또는 추가적인 투여와 더불어 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양을 의미한다. 특정 질환을 치료하는 경우에, 원하는 반응은 바람직하게는 질환의 진행 저해를 의미하다. 이는 질환의 진척 속도를 늦추는 것을 포함하며, 구체적으로 질환의 진척을 중단시키거나 또는 역전시키는 것을 포함한다. 질환의 치료에서 원하는 반응은 또한 이러한 질환 또는 병태의 개시 지연 또는 개시 예방일 수 있다. 본 발명에 기술된 조성물의 유효량은 치료할 병태, 질환의 중등도, 나이, 신체 상태, 키 및 체중 등의 환자의 개별 매개변수, 치료 기간, (존재하는 경우) 동반되는 요법의 유형, 구체적인 투여 경로 및 유사 인자 등에 따라 결정될 것이다. 따라서, 본 발명에 기술된 조성물의 투여 용량은 이러한 다양한 매개변수에 따라 결정할 수 있다. 환자에서 반응이 1차 투여로 충분하지 않을 경우, 이보다 고 용량 (또는 효과적으로는 다른, 보다 국지적인 투여 경로에 의해 달성되는 더 높은 용량)을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 염, 완충제, 보존제, 그리고 선택적으로 다른 치료학적 물질을 포함할 수도 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용하기 적합한 보존제로는, 비-제한적으로, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살 등이 있다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 약학적 조성물에 존재할 수 있지만 활성 성분은 아닌 물질을 지칭한다. 부형제에 대한 예로는, 비-제한적으로, 담체, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 계면활성제, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제, 착향제 또는 착색제 등이 있다.
용어 "희석제"는 희석하는 물질 및/또는 묽게 하는 물질을 의미한다. 또한, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁물 및/또는 혼합 매질 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물 등이 있다.
용어 "담체"는 약학적 조성물의 투여를 용이하게 하거나, 강화하거나 또는 투여를 수행할 수 있게 하기 위해 활성 성분과 조합되는 천연, 합성, 유기, 무기성일 수 있는 성분을 지칭한다. 본원에서, 담체는, 개체에 투여하기 적합한, 하나 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 적합한 담체로는, 비-제한적으로, 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 등장성 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌, 특히, 생체적합한 락티드 폴리머, 락티드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 코폴리머 등이 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 등장성 식염수를 포함한다.
치료학적 용도를 위한 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제들은 약학 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다.
약제학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도한 투여 경로 및 표준 약제학 실무에 따라 선택할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 기술된 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 진피내 또는 근육내로 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 국소 또는 전신 투여용으로 제형화한다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수를 수반하는 장 투여, 또는 비경구 투여를 포함할 수 있다. 본원에서, "비경구 투여"는 정맥내 주사 등의 위장관을 통해 이루어지는 것 이외의 다른 임의의 방식으로 투여하는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 전신 투여용으로 제형화한다. 다른 바람직한 구현예에서, 전신 투여는 정맥내 투여에 의한 것이다.
본원에서, 용어 "공동-투여"는 여러가지 화합물 또는 조성물 (예를 들어 IL2 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 및 항체)를 동일한 환자에게 투여하는 처리를 의미한다. 여러가지 화합물 또는 조성물은 동시에, 기본적으로 동일한 시간에 또는 연속적으로 투여할 수 있다. 일 구현예에서, IL2 폴리펩타이드 또는 IL2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 먼저 투여한 다음 항체를 투여한다.
치료
본원에 기술된 물질, 조성물 및 방법을 이용해, 질환, 예를 들어 항원을 발현하는 질환에 걸린 세포의 존재를 특징으로 하는 질환을 가진 개체를 치료할 수 있다. 특히 바람직한 질환은 암 질환, 특히, 암 세포가 종양 항원을 발현하는 암 질환이다.
용어 "질환"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 병태를 의미한다. 질환은 종종 특정 증상 및 징후와 관련있는 의학적인 상태로서 해석된다. 질환은 감염성 질환과 같은 외부 원인으로부터 기원한 인자에 의해 유발되거나, 또는 자가면역 질환과 같은 내부 기능부전에 의해 유발될 수 있다. 인간에서, "질환"은 더 넒은 의미에서 개체와 접촉시 병에 걸린 개체에서 통증, 기능부전, 괴로움, 사회적 문제 또는 사망, 또는 비슷한 문제를 야기하는 임의의 병태를 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 광의의 의미에서, 이는 때때로 상해, 불능, 장애, 증후군, 감염, 독립된 증상, 일탈 행위 및 구조적 및 기능적인 비정형성 변형을 포괄하며, 다른 맥락 및 다른 목적에서, 이는 구분할 수 있는 범주로 간주할 수도 있다. 질환은, 다수 질환으로 인한 위축 및 생활이 개체의 삶에 대한 관점과 성격을 바꿀 수 있으므로, 일반적으로 개체에게 신체적으로뿐 아니라 정서적으로도 영향을 미친다.
본 맥락에서, 용어 "치료", "치료하는" 또는 "치료학적 개입"은 질환 또는 장애와 같은 병태를 퇴치할 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것을 의미한다. 이 용어는 증상 또는 합병증을 완화하거나, 질환, 장애 또는 병태의 진행을 지연시키거나, 증상 및 합병증을 완화 또는 경감하거나, 및/또는 질환, 장애 또는 병태를 치유 또는 제거하거나, 아울러 병태를 예방하기 위해, 치료학적으로 효과적인 화합물의 투여 등의, 개체가 앓고 있는 소정의 병태에 대한 전 범위 치료를 포괄하는 것으로 의도되며, 여기서 예방은 질환, 병태 또는 장애를 퇴치하기 위한 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것으로서 이해하여야 하며, 증상 또는 합병증의 개시를 방지하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.
용어 "치료학적 치료"는 개체의 건강 상태를 개선하거나 및/또는 개체의 수명을 연장(증가)하는 모든 치료를 의미한다. 이러한 치료는 개체에서 질환의 소거, 개체에서 질환 진행의 정지 또는 서행, 개체에서 질환 진행의 저해 또는 서행, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도 감소, 및/또는 질환을 현재 앓고 있거나 예전에 걸린 적 있는 개체에서 재발의 감소일 수 있다.
용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 개체에서 질환 발생을 방지하기 위해 의도한 모든 치료를 의미한다. 용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "개인" 및 "개체"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는, 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)에 걸릴 수 있거나 또는 취약할 수 있는 인간 또는 기타 포유류 (예, 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭하지만, 질환 또는 장애에 걸렸을 수 있거나 또는 걸리지 않았을 수 있다. 다수 구현예들에서, 개체는 인간이다. 달리 명시되지 않은 한, 용어 "개인" 및 "개체"는 특정 연령을 지칭하는 것은 아니며, 따라서 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 망라한다. 본 발명의 구현예들에서, "개체" 또는 "개인"은 "환자"이다.
용어 "환자"는 치료 대상 개인 또는 개체, 구체적으로 질환에 걸린 개인 또는 개체를 의미한다.
본원에서, "면역 반응"은 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대한 일체화된 신체 반응을 의미하며, 이는 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응을 지칭한다.
"세포-매개 면역", "세포성 면역", "세포성 면역 반응" 또는 유사 용어들은 항원 발현을 특징으로 하는, 특히 클래스 I 또는 클래스 II를 이용한 항원 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포성 반응을 포함하는 것을 의미한다. 세포성 반응은 "헬퍼" 또는 "살상 세포"로 작용하는 T 세포 또는 T 림프구로 지칭되는 세포와 관련 있다. 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포로도 지칭됨)는 면역 반응을 조절함으로써 중추적인 역할을 수행하고, 살상 세포 (세포독성 T 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL로 지칭됨)는 암 세포와 같이 질병에 걸린 세포를 살상하여, 질병에 걸린 세포가 더 많이 생기지 않도록 방지한다.
용어 "면역요법"은 면역 반응의 유도 또는 강화에 의한 질환 또는 병태의 치료를 의미한다. 용어 "면역요법"은 항원 면역화 또는 항원 백신 접종을 포함한다.
용어 "면역화" 또는 "백신 접종"은 면역 반응을 유도할 목적으로, 예를 들어 치료학적 또는 예방학적인 이유로 개체에게 항원을 투여하는 처리를 의미한다.
용어 "대식세포"는 단핵구의 분화를 통해 만들어지는 식세포의 하위군을 지칭한다. 염증, 면역 사이토카인 또는 미생물 산물에 의해 활성화된 대식세포는 비-특이적으로 탐식 작용을 수행하고, 가수분해성 및 산화성 공격을 통해 대식세포 내 외인성 병원체를 살상하여 병원체를 분해한다. 분해된 단백질로부터 유래한 펩타이드는 대식세포의 세포 표면 상에 나열되어, 여기서 T 세포에 의해 인지될 수 있으며, B 세포 표면 상에서 항체와 직접 상호작용하여, T 세포 및 B 세포를 활성화하고 면역 반응을 추가적으로 자극할 수 있다. 대식세포는 항원-제시 세포 계열에 속한다. 일 구현예에서, 대식세포는 비장 대식세포이다
용어 "수지상 세포" (DC)는 항원 제시 세포 계열에 속하는 식세포의 또 다른 하위종을 지칭한다. 일 구현예에서, 수지상 세포는 조혈 골수 전구 세포로부터 유래한다. 전구 세포는 먼저 미성숙 수지상 세포로 변환된다. 이들 미성숙 세포는 높은 탐식 활성과 낮은 T 세포 활성화 잠재성을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 주변 환경으로부터 계속적으로 바이러스 및 박테리아 등의 병원체에 대해 샘플을 탐색한다. 미성숙 수지상 세포가 제시가능한 항원과 접촉하게 되면, 그 세포는 성숙한 수지상 세포로 활성화되어, 비장 또는 림프절로 이동하기 시작한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하여 이의 단백질을 작은 조각으로 분해하고, 성숙되면 이들 조각을 MHC 분자를 이용해 세포 표면에 제시한다. 동시에, 이들 세포는 CH80, CH86 및 CH40과 같은 T 세포 활성화에서 공동-수용체로서 작용하는 세포-표면 수용체를 상향 조절하여, 이의 T 세포 활성화 능력을 크게 강화한다. 이들 세포는 또한 수지상 세포가 혈류를 통해 비장으로 이동하거나 또는 림프 시스템을 통해 림프절로 이동하게 유도하는 주화성 수용체인 CCR7을 상향 조절한다. 여기서, 이들 세포는 항원-제시 세포로 작용하며, 비-항원 특이적인 공동-자극 신호와 동시에, 헬퍼 T 세포 및 살상 T 세포뿐 아니라 항원 제시에 의해 B 세포를 활성화한다. 따라서, 수지상 세포는 T 세포-관련 면역 반응 또는 B 세포-관련 면역 반응을 적극적으로 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 수지상 세포는 비장의 수지상 세포이다.
용어 "항원 제시 세포" (APC)는 세포의 표면 상에 (또는 표면에) 하나 이상의 항원 또는 항원 단편을 나열, 획득 및/또는 제시할 수 있는 다양한 세포이다. 항원-제시 세포는 전문 항원 제시 세포 및 비-전문 항원 제시 세포로 구분할 수 있다.
용어 "전문 항원 제시 세포"는 나이브 T 세포와의 상호작용에 필요한 주 조직적합성 복합체 클래스 II (MHC 클래스 II) 분자를 구성적으로 발현하는 항원 제시 세포이다. T 세포가 항원 제시 세포의 막 상에 MHC 클래스 II 분자 복합체와 상호작용하면, 항원 제시 세포는 T 세포의 활성화를 유도하는 공동-자극성 분자를 생산하게 된다. 전문 항원 제시 세포는 수지상 세포 및 대식세포를 포함한다
용어 "비-전문 항원 제시 세포"는 인터페론-γ와 같은 특정 사이토카인에 의한 자극시 MHC 클래스 II 분자를 구성적으로 발현하지 않는 항원 제시 세포를 지칭한다. 예를 들어, 비-전문 항원 제시 세포는 섬유모세포, 흉선 상피 세포, 갑상선 상피 세포, 신경교 세포, 췌장 베타 세포 또는 혈관 내피 세포를 포함한다.
"항원 가공 처리"는 항원을 가공 처리 산물로 분해하는 것을 의미하며, 처리 산물은 항원의 단편 (예, 단백질의 펩타이드로의 분해) 및 특정 T 세포에 대한 항원 제시 세포와 같이 세포에 의해 제시하기 위한 MHC 분자와 이들 하나 이상의 단편의 (예, 결합을 통한) 조합물이다.
용어 "항원을 수반하는 질환"은 항원이 연루된 임의 질환, 예를 들어 항원의 존재를 특징으로 하는 질환을 의미한다. 이러한 항원을 수반하는 질환은 암 질환 또는 간단히 암일 수 있다. 전술한 바와 같이, 항원은 종양-관련 항원과 같은 질환-관련 항원일 수 있다. 일 구현예에서, 항원을 수반하는 질환은 항원을, 바람직하게는 세포 표면 상에 발현하는 세포를 수반하는 질환이다.
용어 "암 질환" 또는 "암"은 개체에서 전형적으로 통제를 벗어난 세포 증식을 특징으로 하는 병리학적 병태를 지칭하거나 또는 이를 의미한다. 암의 예로는, 비-제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 등이 있다. 보다 상세하게는, 이러한 암의 예로는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성 및 생식 기관의 암종, 호지킨 질환, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 신경외배엽 암, 척추 종양, 신경교종, 수막종 및 뇌하수체 선종을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 용어 "암"은 암 전이를 또한 포함한다.
본원에 참조된 문헌 및 실험에 대한 인용은 임의의 전술한 내용이 선행 기술 분야와 관련 있음을 인정하는 것으로서 의도하는 것은 아니다. 이들 문헌의 내용에 대한 모든 언급은 출원시 이용가능한 정보를 기반으로 하며, 이들 문헌의 내용에 대한 정확성에 관한 어떠한 인정으로 간주되는 것은 아니다.
후술한 내용은 당해 기술 분야의 당업자가 다양한 구현예들을 구성 및 이용할 수 있도록 제공된다. 구체적인 장치, 기법 및 이용에 관한 설명은 단지 예로서 제공된다. 본 발명에 기술된 예에 대한 다양한 변형들이 당해 기술 분야의 당업자들에게 용이하게 자명할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 다양한 구현예들의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 다른 예 및 활용에 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 구현예들은 본 발명에 기술된 예들로 한정하고자 하는 것은 아니며, 청구항과 일치하는 범위에 부합하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1: MHC 클래스 I 결함성 또는 IFN 신호전달 결함성 뮤라인 종양 모델의 선별 및 구축
1차 목표는, MHC 클래스 I 상실이 종양 세포와 면역 시스템 간의 상호작용에 어떻게 영향을 미치는 지를 분석하는 것이었다. 본 발명자들은, 종양 세포의 인지가 MHC 클래스 I에 엄격하게 의존하므로 CD8+ T 세포가 이와 관련하여 중요한 역할을 담당할 수 있을 것으로 추정하였으며, 여러가지 뮤라인 종양 모델들에서 CD8+ T 세포 침윤을 비교하였다. Balb/c 마우스 (Balb/c JRj, Janvier Labs)(n=8)에 5x105 CT26 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, C57Bl/6 마우스 (C57Bl/6 JOlaHsd, Jackson Laboratory)(n=8/세포주)에 5x105 MC38 세포, 3x105 B16F10 세포 또는 1x105 TC1 세포를 s.c. 접종하였다. 종양 접종 후 20일차에, 경추 파열에 의해 마우스를 희생시키고, 종양을 적출하였다. 종양을 조각으로 자르고, 종양 분해 키트 마우스 (Miltenyi Biotec, 카탈로그 번호 130-096-730)를 제조사의 설명서에 따라 사용해 효소적으로 처리하였다. 샘플을 단일 세포 현탁물로 가공 처리하고, Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 염색하였다. 죽은 세포는 eF780 (ebioscience, 카탈로그 번호 65-0865-14)로 염색하였다. CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279) 및 CD8 항체 (BD, 카탈로그 번호 563046 또는 카탈로그 번호 553031)를 사용하였다. 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
본 발명자들은 여러가지 종양 모델에서 전체 살아있는 세포들에서 CD8+ T 세포의 비율 차이를 관찰하였으며, CT26 및 MC38은 높은 (CD8high), B16F10은 중간 (CD8int), TC1은 낮음 (CD8low)로 분류하였다 (도 1A). 전체적으로 면역 세포에 의한 침윤성이 CT26 및 MC38은 강하고, B16F10은 중간이고, TC1은 낮으므로, CD8+ T 세포 비율은 살아있는 세포들에서 전체 CD45+ 면역 세포 비율과 상관관계가 성립한다 (도 1B).
종양 세포주에서 MHC 클래스 I에 대한 유전자 넉아웃을 수행하기 위해, 본 발명자들은 공개적으로 이용가능한 도구를 사용해 B2m을 표적화하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 구축하였다 (CT26, B16F10, TC1: CATGGCTCGCTCGGTGACCC; MC38: GACAAGCACCAGAAAGACCA). 종양 세포에 sgRNA 및 Cas9 암호화 mRNA뿐 아니라 (dsRNA에 대한 세포성 반응을 저해하기 위해) E3 및 B18에 대한 암호화 mRNA를 RNAiMAX (Invitrogen, 카탈로그 번호 13778030)를 이용한 리포펙션에 의해 또는 4 mm 큐벳 (VWR, 카탈로그 번호 732-1137)에서의 전기천공에 의해 일시적으로 형질감염시켰다. 제한 희석을 통해 단일 클론을 수득하고, 이를 증폭시킨 다음, 유세포 측정으로 분석한 세포 표면 상의 MHC 클래스 I의 부재에 의해 B2m 넉아웃의 성공을 확인하였다 (도 2 및 3). B16F10 세포는 시험관내에서 MHC 클래스 I을 미량으로만 발현하므로, 6웰 플레이트에서 MHC 클래스 I 상향 조절을 유도하기 위해 25 ng/mL IFNγ (Peprotech, 카탈로그 번호 315-05)의 존재 하에 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 세포를 배양하였다.
IFN 신호전달 경로에서의 결함이 암 면역요법과 임상적으로 관련있는 또 다른 내성 기전임을 감안하여, 본 발명자들은 IFN 반응이 결여된 B16F10 유래 종양 세포주를 구축하였다. 이를 달성하기 위해, 중추적인 IFN 신호전달 분자 Jak1을 전술한 CRISPR/Cas9 시스템과 Jak1 표적화 sgRNA (TGGCGTTCTGTGCTAAAATG)를 사용해 넉아웃하였다. 모 B16F10 세포를 6웰 플레이트에 접종하고, 1000 U/mL IFNα (PBL, 카탈로그 번호 12100-1)의 존재 하에 또는 IFN 없이 (대조군) 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포에 대해 유세포 측정 분석을 수행하여, PD-L1과 MHC 클래스 I의 발현 수준을 확인하였다. B16F10 세포는 IFN 유도성 마커 2종 둘다에 대해 강한 상향 조절을 나타내었다 (도 4). B16F10-Jak1 -/- 에 비슷하게 처리한 경우, 양쪽 마커에 대한 검출가능한 상향 조절은 관찰되지 않았으며, 이는 IFN 반응 경로의 결함을 입증해준다 (도 5).
실시예 2: MHC 클래스 I 상실은 종양 진행과 종양 미세환경의 조성에 영향을 미친다
MHC 클래스 I 결함이 종양 진행에 영향을 미치는 지를 조사하기 위해, 마우스에 야생형 또는 B2m 결핍 (B2m -/- ) 종양 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 접종하였다 (CT26, MC38: n=5/군; B16F10, TC1: n=10/군).
B2m -/- 종양의 증식을 대응되는 대조군 종양의 증식과 비교하였다. CT26-B2m -/- 및 MC38-B2m -/- 종양 둘다 종양 증식이 현저하게 강화된 (도 6) 반면, B16F10-B2m -/- 및 TC1-B2m -/- 종양에서는 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (도 7).
본 발명자들은, 자발적인 CD8+ T 세포 반응이 비처리 CD8high 종양 모델의 증식을 제어하여, 파생된 MHC 클래스 I 결함성 종양의 증식을 강화할 가능성이 있는 것으로, 결론 내렸다. 본 발명자들은, 또한, 파생된 MHC 클래스 I 결함성 종양 모델에서 자발적인 항원 인지의 부재가 종양 미세환경 (TME)의 면역 세포 조성에 영향을 미칠 수 있는 것으로, 추정하였다. 이를 조사하기 위해, 마우스에 정상 또는 B2m -/- 종양 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 접종하였다 (n=마우스 8마리/군). 종양 접종 후 20일차에, 종양을 적출하여, 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소 분해하였다. 샘플을 Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 단일 세포 현탁물로 처리하여 염색하였다. 죽은 세포는 eF780 (ebioscience, 카탈로그 번호 65-0865-14) 또는 고정가능한 노란색 사멸 세포 염료 (Life technologies, 카탈로그 번호 L34967)로 염색하였다. CD3 항체 (BD, 카탈로그 번호 100227), CD4 항체 (BD, 카탈로그 번호 564298), CD8 항체 (BD, 카탈로그 번호 563046 또는 카탈로그 번호 553031), CD11b 항체 (BD, 카탈로그 번호 553310), CD11c 항체 (Miltenyi Biotec, 카탈로그 번호 130-102-493), CD25 항체 (BD, 카탈로그 번호 564023), CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279), CD49b 항체 (BD, 카탈로그 번호 740133), CD103 항체 (ebioscience, 카탈로그 번호 12-1031-83), F4/80 항체 (BD, 카탈로그 번호 123146), GR-1 항체 (BD, 카탈로그 번호 108423), NK1.1 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 108738), XCR1 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 148220) 및 FoxP3 항체 (ebioscience, 카탈로그 번호 12-5773-82)를 사용하였다. 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
본 발명자들은 B2m -/- 종양의 면역 세포 침윤을 대응되는 대조군 종양과 비교하였다. CT26-B2m -/- 및 MC38-B2m -/- 종양 둘다 CD8+ T 세포, NK 세포 및 교차-제시 수지상 세포 (cross-presenting dendritic cell, cDC1)에 의한 침윤이 현저하게 감소하였다 (도 8 및 10). 아울러, MC38-B2m -/- 종양은 대식세포 및 단핵구에 의한 침윤이 현저하게 감소하였다. CT26 및 CT26-B2m -/- 종양 보유 마우스로부터 유래한 종양-배액성 림프절 (TDLN)의 세포 조성에는 차이가 관찰되지 않았다 (도 9). MC38-B2m -/- 모델에서, CD8+ T 세포 및 Treg의 양은 약간 증가하고, TDLN에서 cDC1 및 CD11b+ DC의 수는 감소하였다. B16F10-B2m -/- 종양에서는 CD8+ T 세포, NK 세포 및 cDC1에 의한 침윤에 차이가 관찰되지 않았지만, CD4 Th 세포의 수적 증가와 대식세포, 단핵구 및 CD11b+ DC의 수적 감소를 관찰할 수 있었다 (도 12). B16F10-B2m -/- 종양 보유 마우스의 TDLN에서 cDC1이 수적으로 증가하였다 (도 13). TC1-B2m -/- 종양의 경우, 종양과 TDLN 둘다에서 면역 세포 조성에 검출가능한 차이는 관찰되지 않았다 (도 14 및 15). 여러가지 종양 모델들에서 관찰되는 면역 세포의 침윤 변화는 CD8+ T 세포 침윤의 유형과 밀접하게 관련 있었으며, 가장 큰 차이는 CD8high 종양 모델에서 관찰되었다. 이는, 종양 세포의 자발적인 CD8+ T 세포 인지가 면역 세포를 TME로 상당히 유인한다는 것을, 보여준다. TDLN에서 관찰된 변화는 TME와 연관성이 없고 매우 소폭이므로, MHC 클래스 I 상실 영향은 주로 TME에 국한된 것으로 보인다. 중요하게도, CT26-B2m -/- 및 MC38-B2m -/- 종양에서 감소된 면역 세포 서브세트는 항-종양 면역에 필수적인 것으로 보이며, 면역억제로서 간주되는 서브세트의 겨우에는 MC38 모델에서의 대식세포를 제외하고는 영향이 없었다. 이는, 활발한 염증성 (inflamed) TME가 MHC 클래스 I 상실시 면역억제 TME로 전환된다는 것을 암시해준다.
다음 목표는 면역 세포가 B2m -/- 의 TME로 능동적으로 계속 이동하는데 있어 대응되는 대조군 종양과 비교해 차이가 있는지를 분석하는 것이었다. 본 발명자들은, CD8+ T 세포 침윤성이 가장 높은 CT26 모델을 선택해, 이의 특징을 규명하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이, 마우스에 정상 또는 파생된 B2m -/- 종양 세포를 접종하였다 (시점 당, n=5 마우스/군). 여러 시점 (접종 후 8일, 12일, 20일 및 26일)에 종양을 적출하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소적으로 분해 처리하였다. Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 세포를 단일 세포 현탁물로 가공 처리한 다음 염색하였다. 사멸 세포는 eF780 (ebioscience, 카탈로그 번호 65-0865-14)으로 염색하였다. CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279), CD3 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 100233) 및 CD49b 항체 (BD, 카탈로그 번호 553875)를 이용하였다. 세포를 절대 계수 시험관으로 옮긴 후 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
종양 접종한 후 8일까지 종양-침윤성 CD3+ T 세포와 NK 세포 간에는 수적인 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, CT26 종양에서는 시간 경과에 따라 이들 2가지 세포 유형의 침윤이 증가하였다 (도 16). CT26-B2m -/- 종양에서는 이러한 증가를 관찰할 수 없었는데, 이는 CD3+ T 세포 및 NK 세포가 CD26쪽으로 능동적으로 향하지만, CT26-B2m -/- TME쪽으로는 가지 않는다는 것을 입증해준다. 이들 데이터는, 종양 세포가 MHC 클래스 I 발현을 상실하게 되면, 활발한 염증 발병 중인 TME이 면역 세포 침윤으로 진행되는 것이 손상됨을 입증해준다.
기술한 관찰 결과들은 MHC 클래스 I 발현 종양의 TME를 형성하는데 있어 CD8+ T 세포의 역할을 명확하게 입증해주는 바, 본 발명자들은 CD8+ T 세포에 의해 발현된 항원 엔카운터 (encounter)의 마커를 분석하였다. 본 실험에서, 본 발명자들은 CD8+ T 세포 침윤이 가장 낮은 모델로서 비교하기 위해 TC1 모델을 포함시켰다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 마우스에 정상 또는 파생된 B2m -/- 종양 세포를 접종하였다 (n=8 마우스/군). 종양 접종 후 20일차에, 종양을 적출하여, 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소적으로 분해 처리하였다. Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 세포를 단일 세포 현탁물로 가공 처리한 다음 염색하였다. 사멸 세포는 eF780 (ebioscience, 카탈로그 번호 65-0865-14) 또는 고정가능한 노란색 사멸 세포 염료 (Life technologies, 카탈로그 번호 L34967)로 염색하였다. CD8 항체 (BD, 카탈로그 번호 563046), CD11b 항체 (BD, 카탈로그 번호 553310), CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279), F4/80 항체 (BD, 카탈로그 번호 123146), MHC 클래스 II에 대한 항체 (BD, 카탈로그 번호 742894), PD-1에 대한 항체 (ebioscience, 카탈로그 번호 46-9981-82) 및 PD-L1에 대한 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 124333) 및 gp70 테트라머에 대한 항체 (MBl, 카탈로그 번호 MBL-TB-M521-7)를 이용하였다. 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
본 발명자들은 B2m -/- 종양의 CD8+ T 세포 표현형을 대응되는 대조군 종양과 비교하였다. gp70은 바이러스 CD8+ T 세포 항원으로, CT26 세포에 의해 발현된다. CD8+ T 세포는 gp70 항원-특이적인 세포의 비율이 유의하게 감소된 것으로 나타났다 (도 17A). 아울러, CT26-B2m - -/- 종양에서 PD-1+ CD8+ T 세포의 %도 유의하게 감소하였다 (도 17B). TC1-B2m -/- 종양에서, PD-1+ CD8+ T 세포의 %도 감소한 것으로 관찰되었다 (도 17C). 항원 특이성의 척도로서 gp70과 CD8+ T 세포 활성화 및 항원 엔카운터에 대한 마커인 PD-1을 이용할 경우, CD8+ T 세포 표현형의 차이는 CT26-B2m -/- TME에서 항원의 인지 감소를 의미한다. TC1 모델에서 차이 정도는 CT26 모델과 비교해 소폭이었으며, 이는 TC1 종양 세포의 자발적인 CD8+ T 세포 인지가 더 낮다는 것을 의미한다. 본 발명자들은 MHC 클래스 I 결함성 종양에서 CD8+ T 세포에 의한 항원 인지가 TME에 위치한 다른 면역 세포에 직접 영향을 미친다는 증거를 입수하고자 하였다. CT26- B2m -/- 및 CT26 종양에서 종양-관련 대식세포 (TAM) 및 종양 세포에 의해 발현된 IFNγ (항원 접촉시 방출되는 CD8+ T 세포의 시그니처 사이토카인) 유도성 마커들을 분석한 결과, TAM에 의한 PD-L1 및 MHC 클래스 II의 발현, 그리고 종양 세포에 의한 PD-L1의 발현이 상당히 감소한 것으로 드러났다 (도 18). TC1 모델에서 동일한 마커들을 분석한 결과, TAM에 의한 MHC 클래스 II 발현에는 차이가 나타나지 않았다 (도 19A). TAM 및 종양 세포에 의한 PD-L1 발현은 현저하게 감소했지만, 그 정도는 CD8+ T 세포에 의한 PD-1+ 발현에서의 차이 정도와 일치하게 CT26 모델과 비교해 역시 소폭이었다 (도 19C 및 D). 이들 데이터는, 자발적인 CD8+ T 세포 인지가 CD8high CT26 TME에서 강한 IFNγ 시그니처로 이어지며, 이러한 현상이 CT26-B2m -/- TME에서 감소됨을, 보여준다. 한편, CD8low TC1 모델의 경우, 종양 세포에 대한 자발적인 면역 반응, 즉 IFNγ 시그니처는 염증성 TME를 유도하기 위한 필요 역치에 도달하지 못한 것으로 보인다. 이런 이유로, TME는 CD8high 모델에서의 경우와 같이 MHC 클래스 I 상실에 영향을 받지 않는다.
마지막 목표는, 항-종양 면역 세포 (CD8+ T 세포, NK 세포 및 cDC1)가 MHC 클래스 I 발현을 상실한 후 CT26 및 MC38 종양의 TME로 적게 유인되는 이유가 항원을 인지하는 CD8+ T 세포에 의해 방출되는 IFNγ의 부재라는 것을 검증하는 것이었다. 마우스에 정상 또는 유래한 B2m -/- 종양 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 접종하였다 (CT26: n=3 마우스/군, MC38: n=5 마우스/군). 종양 접종한 후 19일차에, 종양을 적출해 액체 질소에서 급속 냉동하였다. 종양으로부터 전체 RNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen, 카탈로그 번호 74106)를 제조사의 설명서에 따라 사용해 추출하고, RNA 농도 및 완전성을 NanoDrop 200c (Thermo Fisher) 및 Fragment Analyzer 모세관 겔 전기영동 장치 (Agilent Advanced Analytical)를 이용해 확인하였다. 샘플 당 RNA 1 ㎍을 PrimeScript RT 시약 키트와 gDNA Eraser (Takara, 카탈로그 번호 RR047A)를 이용한 역전사의 주형으로 사용하였다. 수득한 cDNA는, SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Biorad, 카탈로그 번호 1725271)를 제조사의 설명에 따라 CFX384 Touch 실시간 PCR 검출 시스템 (BioRad)에서 실시하는 정량적인 실시간 PCR (qRT-PCR)에 사용하였으며, 이때 반응물 당 1.25 ㎕ cDNA와 프라이머 각각 최종 농도 333 nM씩 함유한 반응 부피 15 ㎕로, 어닐링 온도가 60℃인 2단계 PCR 사이클을 40회 수행하였다. CFX Manager 3.1 소프트웨어 (Biorad)를 이용해 Ct-값을 구하고, 상대적인 유전자 발현 값을 구하기 위해 Hprt 기준 유전자에 대해 표준화하여 ΔΔCt 값을 계산하였다. 신뢰성을 위해, 컷-오프를 적용해 Ct-값 > 35는 제외시켰다. 프라이머 서열: Hprt 정방향 프라이머 (CCCTGGTTAAGCAGTACAGC), Hprt 역방향 프라이머 (CTCATTATAGTCAAGGGCATATCC); Ifng 정방향 프라이머 (CT26) (TTCTTCAGCAACAGCAAGGCG); Ifng 역방향 프라이머 (CT26) (TGGACCACTCGGATGAGCT); Ifng 정방향 프라이머 (MC38) (GAGGAACTGGCAAAAGGATGG), Ifng 역방향 프라이머 (MC38) (GCCTTGCTGTTGCTGAAGAAG); Cxcl9 정방향 프라이머 (GCAACAAAACTGAAATCATTGCTAC), Cxcl9 역방향 프라이머 (GTTTTTCATGTTCTTTTGATGTTTTTTCC); Cxcl10 정방향 프라이머 (GAGTGGGACTCAAGGGATC), Cxcl10 역방향 프라이머 (TTCTTTTTCATCGTGGCAATGATCTC); Cxcl11 정방향 프라이머 (GCGACAAAGTTGAAGTGATTGTTAC), Cxcl11 역방향 프라이머 (AGTCAGACGTTCCCAGGATG); Ccl5 정방향 프라이머 (GGAGTATTTCTACACCAGCAGC), Ccl5 역방향 프라이머 (CAGAATCAAGAAACCCTCTATCC); Xcl1 정방향 프라이머 (ATGGGTTGTGGAAGGTGTGG), Xcl1 역방향 프라이머 (CCATTTGGCTTCTGGATCAGC).
본 발명자들은 B2m -/- 종양으로부터 유래한 Ifng 유전자 발현 수준뿐 아니라 IFN-유도성 케모카인 Cxcl9 , Cxcl10 및 Cxcl11 (CXCR3 리간드)의 유전자 발현 수준을 대응되는 대조군 종양과 비교하였다. 2가지 종양 모델에서 Ifng 발현이 감소하였다 (도 20A 및 21A). T 세포와 NK 세포를 TME로 동원하는데 필요한 CXCR3 리간드의 발현 역시 이들 2가지 종양 모델에서 마찬가지로 감소하였다 (도 20B, C, D 및 21B, C, D)(Nagarsheth et al. Nat Rev Immunol 17, 559-72 (2017)). 이들 관찰 결과는 본래 CD8high인 MHC 클래스 I 결함성 종양에서 IFNγ 시그니처의 감소를 입증해준다. CD8+ T 세포 유래 IFNγ에 의한 CXCR3 리간드 유도는 부가적인 CD3+ T 세포 및 NK 세포가 CD8high 종양의 TME로 계속 유인되는 이유를 설명해주는데, 이는 MHC 클래스 I 결함성 카운터파트에 의해 상실된다. 아울러, cDC1 유인성 케모카인 Ccl5 및 Xcl1의 발현 수준이 감소하였다 (도 20 E, F 및 도 21 E, F). NK 세포는 이들 케모카인의 주 생산자인 것으로 알려져 있으며, 이의 침윤 감소가 케모카인의 발현 감소, 즉 cDC1 침윤 감소의 이유일 수 있다 (Bottcher et al. Cell 172, 1022-37 (2018)).
본 발명의 결과는, 종양 항원의 자발적인 CD8+ T 세포 인지가 MHC 클래스 I 발현 종양의 증식을 어느 정도 제어하고, 염증성 TME를 유지하여 연쇄적인 케모카인 유도 반응을 촉발함으로써 추가의 항종양 면역 세포를 유인할 수 있음을, 보여준다. 요컨대, 본래 염증성 종양은 MHC 클래스 I 상실시 상당히 면역억제성으로 되어, TME에 대해 예기치 못한 효과를 유발한다는 것이, 밝혀졌다.
실시예 3: MHC 클래스 I 상실은 면역요법 및 고전적인 암 요법에 대한 포괄적인 내성 기전이다
비처리 MHC 클래스 I 결함성 종양의 특징을 규명한 후, 암 요법에 대한 내성을 분석하고자 착수하였다. 본 발명자들은 PD-1 및 CTLA4를 차단하는 ICB 항체와 4-1BB에 대한 작용제성 항체에 대한 CT26-B2m -/- 및 MC38-B2m -/- 종양의 내성을 검사함으로써 착수하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 마우스에 정상 또는 B2m -/- 종양 세포를 접종하고 (종양 증식의 경우 n=10/군, 유세포 측정의 경우 n=5-7/군), 종양이 평균 부피 32-36 ㎣에 도달한 후 0, 3일, 7일 및 10일에 200 ㎍ anti-PD-1 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0146), anti-CTLA (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0164) 또는 anti-4-1BB (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0239) 항체를 복막내 (i.p.) 주사하였다 (MC38: 14일 및 17일에 2번 추가로 처리). 대조군에는 비관련 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 0089)를 주사하였다. 항-종양 효과를 대조군 대비 검사군에서의 종양 증식의 저해로서 결정하였다. 1차 처리 후 7일차 (anti-4-1BB) 또는 10일차 (anti-PD1 및 anti-CTLA4)에 종양을 적출하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소적으로 분해 처리하였다. Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 세포를 단일 세포 현탁물로 가공 처리한 다음 염색하였다. 사멸 세포는 eF780 (ebioscience, 카탈로그 번호 65-0865-14)으로 염색하였다. CD8 항체 (BD, 카탈로그 번호 563046) 및 CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279)를 이용하였다. 세포를 절대 계수 시험관으로 옮긴 후 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
시험 처리 결과, 대조군과 비교해 CT26 및 MC38 종양의 증식이 유의하게 억제되었다 (도 22A 및 도 24A). 검사한 CT26-B2m -/- 및 MC38-B2m -/- 종양은 대조군과 비슷한 속도로 증식하였으며, 유의한 증식 저해는 검출되지 않았다 (도 22B 및 도 24B). 여러가지 처리 후 CD8+ T 세포 침윤을 분석한 결과, 대조군과 비교해 처리된 CT26 종양에서 CD8+ T 세포의 수적 증가가 관찰되었으며 (도 23A 및 B), 이는 anti-CTLA4 또는 anti-4-1BB 처리 후 통계학적으로 유의한 수준에 도달하였다. 이와 비교해, 임의의 시험 처리 후, CT26-B2m -/- 에서 CD8+ T 세포 수는 증가하지 않았다. 이러한 결과는, MHC 클래스 I 상실이 항체에 기반한 면역요법에 대해 완전한 내성을 부여하고, 종양내 면역 반응이 기능성 MHC 클래스 I을 발현하는 반응성 종양 모델에만 국한된다는 것을, 검증해준다.
본 발명자들은, 다음으로, CT26-B2m -/- 및 TC1-B2m -/- 종양이 치료학적 RNA 백신 접종에 대해 내성으로 바뀌는 지를 조사하였다. 마우스에 정상 또는 B2m -/- 종양 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 접종하였다 (종양 증식의 경우 n=10/군, 유세포 측정의 경우 n=5/군). CT26 및 CT26-B2m -/- 을 가진 마우스에 종양 접종한 후 5일, 8일, 12일 및 19일차에 gp70 (SPSAYAHQF)을 암호화하는 RNA-LPX 40 ㎍을 Kranz et al. (Kranz, L. M. et al. Nature 534, 396-401 (2016))에 기술된 바와 같이 정맥내 (i.v.) 백신 접종하고, TC1 또는 TC1-B2m -/- 을 가진 마우스에는 종양이 평균 부피 대략 20 ㎣에 도달한 후 0일 및 7일차에 E7 (RAHYNIVTF)을 암호화하는 RNA-LPX 40 ㎍을 정맥내 (i.v.) 백신 접종하였다. E7은 바이러스 CD8+ T 세포 항원으로서, TC1 세포에 의해 발현된다. 추가의 군에 (임의의 항원을 암호화하지 않는) 비-관련 RNA-LPX를 백신 접종하고, 대조군에는 처리하지 않았다. 대조군 대비 실험군에서의 종양 증식의 저해로서 항-종양 효과를 측정하였다. 1차 처리 후 CT26 및 CT26-B2m - -/- 종양을 17일차에 적출하고, TC1 및 TC1-B2m -/- 종양은 9일차에 적출하였으며, 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소적으로 분해 처리하였다. Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 세포를 단일 세포 현탁물로 가공 처리한 다음 염색하였다. 사멸 세포는 eF780 (ebioscience, 카탈로그 번호 65-0865-14)으로 염색하였다. CD8 항체 (BD, 카탈로그 번호 563046 또는 Invitrogen, 카탈로그 번호 1825015) 및 CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279), 및 gp70 테트라머에 대한 항체 (MBl, 카탈로그 번호 MBL-TB-M521-7) 또는 E7 덱스트라머에 대한 항체 (Immudex, 카탈로그 번호 JA2195-PE)를 이용하였다. 세포를 절대 계수 시험관으로 옮긴 후 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
항원-암호화 RNA-LPX를 백신 접종한 결과 CT26 및 TC1 종양의 증식이 현저하게 저해되었지만, 비-관련 RNA-LPX를 처리한 경우에는 대조군 대비 종양 증식에 유의한 효과는 없었다 (도 25A 및 27A). 항원-암호화 또는 비-관련 RNA-LPX를 백신 접종한 경우에는 파생된 B2m -/- 종양의 종양 증식은 억제되지 않았다 (도 25B 및 27B). CD8+ T 세포 침윤 및 항원 특이성을 분석한 결과, 임의의 종양 모델에서 비-관련 RNA-LPX는 유의한 효과가 없는 것으로 드러났다 (도 26 및 28). 항원-암호화 RNA-LPX를 백신 접종하면, B2m -/- 및 대조군 종양으로의 CD8+ T 세포의 침윤이 현저하게 강화되었다. 침윤 강화와 관련하여, 항원-암호화 RNA-LPX는 B2m -/- 및 대조군 종양 둘다에서 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시켰다. 이는, 심지어 MHC 클래스 I 음성이더라도 여러가지 종양 모델에 침윤하는 CD8+ T 세포를 백신 접종이 감작시켜 증폭시킨다는 것을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 항원-특이적인 CD8+ T 세포에 의한 침윤은 MHC 클래스 I 결함성 종양의 증식에는 영향을 미치지 않았으므로, 이는 치료학적 백신 접종에 대한 내성을 검증해준다.
최근, 면역 시스템이 화학요법 또는 방사선요법 (고전적인 암 요법)에 대해 반응하는 동안 중요한 역할을 수행한다는 내용이 발표되었다 (Galluzzi et. al. Cancer Cell 28, 690-714 (2015), Weichselbaum et. al. Nat Rev Clin Oncol 14, 365-379 (2017)). 본 발명자들은, 염증성 종양의 MHC 클래스 I 상실을 통한 침묵화가 고전적인 암 요법의 효능에도 영향을 미칠 수 있는 것으로 추정하였다. 이러한 추정을 조사하기 위해, 마우스에 CT26 또는 CT26-B2m -/- 종양 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 접종하였다 (종양 증식의 경우 n=9-10/군, 유세포 측정의 경우 n=5/군). 화학요법을 위해, 종양이 평균 부피 대략 6 ㎣에 도달한 후 0, 7일 및 14일차에, 5 mg/kg 옥살리플라틴 (OX)(Medac, Medoxa)을 복막내 (i.p.)로, 60 mg/kg 5-플루오로우라실 (5-FU)(Medac, 5-FU medac)을 정맥내 (i.v.)로 마우스에 주사하였다. 대조군에는 비히클을 투여하였다. 방사선 요법의 경우, 종양이 평균 부피 대략 30 ㎣에 도달한 후, X-RAD 320 (Precision X-Ray Instruments)을 사용해 종양에 12 Gy로 방사선을 국소 조사하였다. 대조군에는 처리하지 않았다. 항-종양 효과를 대조군 대비 실험군에서의 종양 증식의 저해로서, 그리고 100일 동안의 관찰 기간 동안의 생존성으로 결정하였다. 1차 처리 후 13일 (화학요법) 또는 8일 (방사선요법)에 종양을 적출하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소적으로 분해 처리하였다. Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 세포를 단일 세포 현탁물로 가공 처리한 다음 염색하였다. 사멸 세포는 eF780 (ebioscience, 카탈로그 번호 65-0865-14)으로 염색하였다. CD8 항체 (BD, 카탈로그 번호 553031) 및 CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279) 및 gp70 테트라머에 대한 항체 (MBl, 카탈로그 번호 MBL-TB-M521-7)를 이용하였다. 세포를 절대 계수 시험관으로 옮긴 후 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
화학요법 또는 방사선요법으로 처리시, CT26 뿐만 아니라 CT26-B2m -/- 종양의 증식이 현저하게 억제되었으며, 그래서 모든 처리군들의 생존성이 대조군과 비교해 현저하게 개선되었다 (도 29 및 도 31). 화학요법 및 방사선요법 후, CT26 종양 보유 마우스 10마리 중 3마리 (30%)가 완전한 반응을 보였으며, 종양 거부와 종양 접종 후 100일까지 장기 생존이 달성된 반면, 대조군 동물들은 모두 진행성 종양으로 인해 희생시켜야 했다. 이와는 대조적으로, CT26-B2m -/- 종양 보유 마우스는 임의의 처리 후 완전한 반응성을 나타내지 못하였으며, 마우스들 모두 100일 전에 희생시켜야 했다. CT26 종양에서 CD8+ T 세포 침윤 및 항원 특이성을 분석한 결과, 화학요법 및 방사선요법 후 대조군과 비교해 CD8+ T 세포의 수가 증가하고 아울러 화학요법 후 더 높은 gp70 항원-특이성이 나타나는 경향이 드러났다 (도 30A 및 C, 및 도 32A 및 C). CT26-B2m -/- 종양에서 침윤성 CD8+ T 세포의 수에서도 동일한 경향성이 관찰되었으며, 2가지 요법 적용 후 침윤성 CD8+ T 세포의 항원 특이성이 유의하게 증가한 것으로 검출되었다 (도 30B 및 D, 및 도 32B 및 D). 이들 데이터는, 고전적인 암 요법이 CD8+ T 세포 반응의 감작을 유발할 수 있으며, 이는 완전한 반응을 매개해 MHC 클래스 I을 발현하는 종양의 거부를 야기할 수 있음을, 보여준다. 이런 이유로, MHC 클래스 I 결함성 종양은 고전적인 암 요법에 대한 면역-매개 완전 반응을 회피할 수 있다.
실시예 4: 항체와 IL2의 조합 면역요법은 TME에서 염증을 유발하고, MHC 클래스 I 결함성 종양에 대해 치료학적 면역 반응을 야기한다.
본 발명자들은, 다음으로, MHC 클래스 I 결합성 종양에 대해 치료학적 면역 반응을 유발할 수 있는 치료 용법을 동정하고자 하였다. 적응 면역 시스템은 MHC 클래스 I 상에 제시된 항원을 통해 종양 세포를 우선적으로 인지한다. 이는 MHC 클래스 I 결함성 종양에 대해서는 더이상 가능하지 않으므로, 대안적인 방식을 통한 항원-특이적인 종양 인지가 필요하다. 이를 해결하기 위해, 종양 세포를 외부 물질로 인지하도록 종양-관련 항원 (TAA)에 결합하는 항체 기반 용법을 근간으로 하였다. 선천적인 면역 세포 (예를 들어, NK 세포 또는 대식세포)는 Fcγ 수용체 (FcγR)를 통해 항체-옵소닌화 (opsonized) 종양 세포를 인지하며, 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 식세포 작용 (ADCP)을 통해 항원-특이적인 방식으로 세포를 제거한다. 본 발명자들은, 보강제로서 제공되는 제2 화합물이 FcγR을 이용해 면역 세포를 활성화하고 종양 세포를 제거하도록 허가하는 것이 필요할 것으로 추정하였다. 이러한 목적으로, 본 발명자들은 선천 면역 및 적응 면역에서 강력한 활성인자인 사이토카인 IL2를 선택하였다. IL2는 NK 세포를 활성화하고, IFNγ 생산을 강화한다 (Weigent et al. Infect Immun 41, 992-7 (1983)). 2차 효과로서, TME에서 NK 세포에 의해 방출된 IFNγ는 수종의 케모카인의 발현을 유도하여, 면역 세포 유입 (influx)을 야기하고, 또한 강력한 ADCP 작동자 세포로서 대식세포를 활성화할 수 있다 (Shi et al. J Immunol 194, 4379-86 (2015)). 마우스에 B16F10 및 파생된 B2m -/- 종양 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 접종하였다 (n=9-10/군). 마우스에 200 ㎍ anti-Trp1 항체 (TA99) 또는 이소형 대조군을 종양 접종 후 5일, 8일, 12일, 15일, 19일, 22일 및 26일에 복막내 (i.p.)로, 그리고 1 ㎍ mAlb 암호화 RNA-mIL2 또는 대조군으로서 mAlb (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)의 TransIT® (Mirus, 카탈로그 번호 MIR2255) 제형을 종양 접종 후 5일, 12일, 19일 및 26일에 정맥내 (i.v.) 주사하였다. mAlb-mIL2는, IL2의 혈청 반감기를 연장하고 종양내 단백질을 보강된 투과성 및 체류 (EPR) 효과를 통해 높이기 위해, 알부민이 IL2의 N-말단에 연결된 융합 단백질이다. 이 단백질은 N1-메틸-슈도우리딘-변형된 mRNA에서 암호화되며, 수일간 간내 다량의 단백질 발현을 야기한다. 대조군에는 이소형 및 mAlb RNA를 처리하였다. 항-종양 효과는 대조군 대비 실험군에서의 종양 증식 저해 및 100일간의 관찰 기간 동안의 생존성으로 확인하였다. 추가의 마우스에 B16F10-B2m -/- 을 실시예 1에 기술된 바와 같이 접종하고 (n=7-8/군), 상기한 처리를 종양 접종 후 9일에 개시하였다. 1차 처리 후 11일에 종양을 적출하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소적으로 분해 처리하였다. Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 세포를 단일 세포 현탁물로 가공 처리한 다음 염색하였다. 사멸 세포는 eF780 (ebioscience, 카탈로그 번호 65-0865-14), 고정성 노란색 사멸 세포 염료 (Life technologies, 카탈로그 번호 L34967) 또는 고정성 적색 사멸 세포 염료 (Life technologies, 카탈로그 번호 L34971)로 염색하였다. CD3 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 100227), CD4 항체 (BD, 카탈로그 번호 564298) CD8 항체 (BD, 카탈로그 번호 553031), CD11b 항체 (BD, 카탈로그 번호 553310) CD11c 항체 (Miltenyi, 카탈로그 번호 130-102-493), CD25 항체 (BD, 카탈로그 번호 564023), CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279), CD103 항체 (ebioscience, 카탈로그 번호 12-1031-83), F4/80 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 123132 및 123146), FoxP3 항체 (ebioscience, 카탈로그 번호 12-5773-82), FcγRI에 대한 항체 (BD, 카탈로그 번호 740622), FcγRII/III에 대한 항체 (BD, 카탈로그 번호 558636), FcγRIV에 대한 항체 (BD, 카탈로그 번호 742564), TCR γδ에 대한 항체 (BD, 카탈로그 번호 563993), Ly6C 항체 (BD, 카탈로그 번호 553104), Ly6G 항체 (BD, 카탈로그 번호 551461), NK1.1 항체 (BD, 카탈로그 번호 108738), SiglecF 항체 (BD, 카탈로그 번호 565183) 및 XCR1 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 148220)를 이용하였다. 세포를 절대 계수 시험관으로 옮긴 후 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
TA99 또는 mAlb-mIL2 RNA 단일요법은 B16F10 종양의 종양 증식에 유의한 효과를 발휘하지 못하였다 (도 33A). mAlb-mIL2 단일요법은 B16F10-B2m -/- 종양의 증식을 유의하게 억제하였다 (도 33B). TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법은 B16F10 및 B16F10-B2m -/- 종양 둘다의 증식을 유의하게 억제하였다. 종양 증식 억제는 2가지 종양 모델에서 대조군 대비 TA99 및 mAlb-mIL2 요법으로 처리된 마우스의 통계학적 생존성 개선으로 나타났다 (도 34). 대조군 및 mAlb-mIL2 단일요법 처리 군의 경우, B16F10 및 B16F10-B2m -/- 종양을 가진 마우스들 모두 종양 진행으로 인해 희생시켜야 했다. TA99 단일요법은 B16F10 모델의 경우 마우스 10마리 중 1마리 (10%)에서, B16F10-B2m -/- 모델의 경우에는 마우스 10마리 중 2마리 (20%)에서, 완전한 종양 거부와 100일까지의 생존이 달성되었다. TA99와 mAlb-mIL2의 조합 처리는 양쪽 모델에서 단일요법보다 우수하였으며, B16F10 모델의 경우 마우스 10마리 중 3마리 (30%)에서, B16F10-B2m -/- 모델의 경우 마우스 10마리 중 6마리 (60%)에서 완전한 종양 거부가 달성되었다.
본 발명자들은 단일 요법 및 TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법 후, B16F10-B2m -/- 종양에서 여러가지 면역 세포 아종의 침윤을 분석하였으며, 이를 대조군과 비교하였다. mAlb-mIL2 단일요법은 CD4+ Th 세포, Treg 세포, CD8+ T 세포, γδ T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, 호산구 및 CD11b+ DC의 침윤을 현저하게 강화하였다 (도 35, 36, 37 및 38). 약간 강화되었지만 통계학적으로 유의하지 않은 종은 cDC1, 단핵구 및 호중구였다. TA99 단일요법은 면역 침윤에 대해 임의의 검출가능한 효과를 나타내지 않았지만, TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법 수행 후 종양 침윤은 모든 경우에서 mAlb-mIL2 단일요법과 유사하였다. 아울러, 본 발명자들은 단일요법 및 TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법 후 대식세포 및 단핵구에 의한 FcγR 발현을 분석하고, 이를 대조군과 비교하였다. mAlb-mIL2 단일요법은 종양내 대식세포 및 단핵구에 의한 FcγRI, FcγRII/III 및 FcγRVI의 발현을 강화하였지만, TA99 단일요법은 그렇지 않았다 (도 39 및 도 40). FcγR의 발현은 mAlb-mIL2 단일요법을 처리한 군과 비교해 TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법을 처리한 군에서 더 낮았으며, 이는 TA99-유발성 FcγR의 내재화가 이유일 수 있다.
MHC 클래스 I 결함성 종양 세포에 대한 항-종양 효과에서 중요한 세포 유형을 동정하기 위해, 마우스 (n=8-15/군)에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, anti-Trp1 (TA99) 항체를 종양 접종 후 5일, 8일, 12일, 15일, 19일, 22일에, mAlb 암호화 RNA-mIL2를 5일, 12일 및 19일에 도 33에 기술된 바와 같이 처리하였다. 대조군에는 이소형 대조군 항체 및 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 투여하였다. NK1.1에 대한 고갈성 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0036), CSF1R에 대한 고갈성 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0213) 또는 Ly6G에 대한 고갈성 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0075-1), 또는 비관련 대조군 항체 (비-고갈성)(Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0089)를 부하 용량 400 ㎍으로 종양 접종 후 4일에, 후속 용량 200 ㎍ (비관련 항체, NK1.1 또는 Ly6G) 또는 300 ㎍ (CSF1R)으로 종양 접종 후 7일, 11일, 14일, 18일 및 20일에 복막내 (i.p.) 주사하였다. 고갈성 항체를 주사한 군의 생존성을 비관련 항체를 투여한 군의 생존성과 비교해, 면역 세포 고갈시 치료학적 효과 차이를 확인하였다. NK 세포 및 호중구의 성공적인 고갈은, CD3 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 100227), CD11b 항체 (BD, 카탈로그 번호 550993), CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279), Ly6C 항체 (BD, 카탈로그 번호 553104), Ly6G 항체 (BD, 카탈로그 번호 551461) 및 NK1.1 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 108720)로 염색한 (Kranz et al. (Kranz, L. M. et al. Nature 534, 396-401 (2016)에 기술된 바와 같이 염색) 혈액 샘플에 대한 유세포 측정 분석으로 검증하였다. 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
본 발명자들은 TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법으로 처리한 마우스의 생존성에 대한 NK 세포 (NK1.1), 대식세포 (CSF1R) 또는 호중구 (Ly6G)의 고갈이 미치는 유의한 효과는 관찰할 수 없었다 (도 41). 그러나, 본 발명자들은, 몇몇 마우스를 조기 희생시켜야 했으며 8/15 (53.3%)와 비교해 단 4/13 (30.8%)만 100일까지 생존하였으므로, 대식세포 고갈 후 약한 항-종양 효과 경향을 관찰할 수 있었다. NK 세포 및 호중구의 고갈은 염색한 혈액 샘플에 대한 유세포 측정 분석에서 검증되었음에 유념한다 (도 42). 이 실험에서 대식세포의 성공적인 고갈은 검증되지 않았는데, 오히려 생존에서의 소폭 차이는 불완전한 대식세포 고갈이 원인일 수 있다. 이런 이유로, 본 실험을 반복 실시할 예정이며, 향후 완전한 대식세포 고갈을 검증한 후 다룰 예정이다.
요컨대, 본 발명자들은 MHC 클래스 I 결함성 뮤라인 종양 모델에 대한 효과적인 치료로서 anti-TAA 항체와 IL2의 조합 요법을 동정하였다. 항체는 종양 세포의 항원-특이적인 면역 인지를 매개하고, IL2는 TME에서 염증을 유발하여, 광범위한 면역 세포의 유입을 야기한다. 아울러, ADCP를 통해 옵소닌화된 표적 세포를 제거할 수 있는 대식세포 및 단핵구는, IL2에 반응하여 FcγR을 강하게 상향 조절하였으며, 이는 IL2가 선천적인 면역 세포에 항체 작동자 기전을 허가함을 시사해준다. 이러한 조합 요법은 MHC 클래스 I 결함성 종양의 완전한 거부를 달성하였다. 뮤라인 종양 모델에서 종양-표적화 항체, 특히 항체와 IL2의 조합의 항-종양 효과에서 CD8+ T 세포 면역의 상당한 역할이 추정되는 바, 이는 특히 놀라운 발견이다 (Park et al. Cancer Cell 18, 160-70 (2010), Yang et al. Mol Ther 21, 91-100 (2013), Zhu et al. Cancer Cell 27, 489-501 (2015), Kwan et al. J Exp Med 214, 1679-90 (2017)). 그럼에도 불구하고, 본 발명의 데이터는, 항체와 IL2의 조합 요법이, TME에서 염증 유도 및 선천적인 면역 세포에 의한 항원-특이적인 종양 세포 인지의 재확립을 통해, MHC 클래스 I 결함성 종양에 대해 예상치 못하게도 적합하다는 사실을 명확하게 입증해준다.
실시예 5: 고전적인 암 요법은 항체 및 IL2 조합 면역요법에 의한 MHC 클래스 I 결함성 종양의 제어를 강화한다
마지막 목표는 MHC 클래스 I 결함성 종양의 제어를 고전적인 암 요법을 통해 추가로 강화할 수 있는지를 조사하는 것이었다. 마우스 (n=12-13/군)에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 종양 접종 후 6일차에 200 mg/kg 사이클로포스파미드 (CTX)(Baxter, Endoxan) 또는 대조군으로서 비히클을 복막내 (i.p.) 주사한 다음 anti-Trp1 (TA99) 항체를 7일, 10일, 14일,17일 및 21일에 처리하거나 처리하지 않고, 또한 mAlb 암호화 RNA-mIL2를 7일, 14일 21일에 실시예 4에 기술된 바와 같이 처리하였다. 대조군에는 이소형 대조군 항체 또는 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 처리하였다. CTX 및 TA99 및 mAlb-mIL2 조합 요법 처리한 군에서, CTX 단일요법, TA99와 mAlb-mIL2 조합 요법 또는 대조군을 처리한 군과 비교해, 종양 증식 저해로서 항-종양 효과를 확인하였다.
종양 증식을 비교한 결과, 종양 진행이 CTX 처리 후 후속적인 TA99 mAlb-mIL2의 조합 요법에 의해 거의 완전히 억제되었다 (도 43). 증식 억제가 CTX 단일요법 또는 TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법과 비교해 유의하게 개선되었다. 결론적으로, 고전적인 암 요법은 항체 및 IL2 조합 요법과 양호하게 조합되어, MHC 클래스 I 결함성 종양의 상승적인 항-종양 제어가 달성된다.
실시예 6: 항체와 IL2의 조합 면역요법은 IFN 신호전달 결함성 종양에 대해 치료학적 면역 반응을 유발한다.
MHC 클래스 I 상실 외에도, IFN 신호전달의 결함 역시 종양이 T 세포에 의한 제거로부터 벗어나는 또 다른 기전으로, 환자들에서 빈번하게 관찰된다 (Gao et al. Cell 167, 397-404 (2016)). 본 발명의 목표는 특정 내성 기전과는 독립적으로, T 세포 내성 종양에 적용가능한 치료법을 동정하는 것이었다. 이런 이유로, 본 발명자들은 Jak1 돌연변이로 인해 결함성 IFN 신호전달 경로를 가진 종양에 대해 치료가 효과적인지를 조사하였다. 마우스 (n=10/군)에 3x105 B16F10-Jak1 -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 33에 기술된 바와 같이 anti-Trp1 (TA99) 항체를 종양 접종 후 5일, 8일, 12일, 15일, 19일에, 그리고 mAlb 암호화 RNA-mIL2를 5일, 12일 및 19일에 처리하였다. 대조군에는 이소형 대조군 항체 및 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 투여하였다.
TA99는 mAlb-mIL2 RNA 단일요법과는 달리 B16F10-Jak1 -/- 종양의 종양 증식을 유의하게 지연시켰으며, TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법은 종양 증식을 완전히 억제하였다 (도 44A). 종양 증식의 억제는 TA99 단일요법 또는 TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법을 처리한 마우스에서의 대조군 대비 통계학적인 생존성 개선으로 나타났다 (도 44B). 대조군의 경우, B16F10-Jak1 -/- 종양들 중 2/10 (20%)이 자발적으로 퇴행되었고, mAlb-mIL2 단일요법의 경우 종양의 5/10 (50%)이 퇴행되었다. TA99 단일요법의 경우 마우스 10마리중 8마리 (80%)에서 완전한 종양 거부 및 100일까지의 생존이 달성되었고, TA99와 mAlb-mIL2의 조합 치료의 경우 마우스 10마리 모두 (100%)에서 완전한 종양 거부가 달성되었다. 요컨대, 항체와 IL2의 조합 요법은 IFN 신호전달 결함성 종양에 대해 치료학적 면역 반응을 나타낸다. 결론적으로, 이러한 치료 용법은 MHC 클래스 I 상실 또는 IFN 신호전달 손상으로 인해 CD8+ T 세포에 의한 제거에 대해 내성을 획득하는 종양 요법에 다재다능한 접근 방식이다.
실시예 7: 항체와 IL2의 조합 면역요법에는 대식세포, CD8 + T 세포 및 IFNγ 가 요구된다
대식세포의 고갈이 실시예 4에서 기술된 바와 같이 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법의 항-종양 효과를 약화시키는 경향을 있다는 점에 감안하여, 이러한 결과를 검토하기 위해 항체를 더 고용량으로 사용해 대식세포의 고갈에 대한 개선된 프로토콜을 확립하였다. C57Bl/6 마우스 (n=6)에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 피하 (s.c.) 접종하였다. CSF1R에 대한 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0213)를 마우스 5마리에 종양 접종 후 10일에 투여량 600 ㎍으로, 12일에 투여량 350 ㎍으로 복막내 (i.p.) 주사하고, 마우스 1마리는 대조군으로 처리하지 않고 두었다. 종양 접종 후 13일차에 종양을 적출하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소적으로 분해 처리하였다. Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 세포를 단일 세포 현탁물로 가공 처리한 다음 염색하였다. 사멸 세포는 고정성 노란색 사멸 세포 염료 (Life technologies, 카탈로그 번호 L34967)로 염색하였다. CD11b 항체 (BD, 카탈로그 번호 553310), CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279), F4/80에 대한 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 123132) 및 GR-1에 대한 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 123132 및 123146)를 이용하였다. 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
비처리 대조군 종양에서는 뚜렷한 CD11b+ F4/80+ 대식세포 집단을 관찰할 수 있었으나, anti-CSF1R 주사시 대식세포 집단이 마우스 5마리 중 4마리에서 감소하였다 (도 45). 즉, anti-CSF1R을 고 용량으로 주사해, 3일내에 대식세포를 고갈시킬 수 있다.
개선된 대식세포 고갈 프로토콜을 활용해 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법에서 대식세포의 중요성에 대한 유효한 데이터를 확보하고 림프구의 역할을 조사하기 위해, C57Bl/6 마우스 (n=10-15/군)에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 33에 기술된 바와 같이, anti-Trp1 (TA99) 항체를 종양 접종 후 5일, 8일, 12일, 15일 및 19일에, mAlb 암호화 RNA-mIL2를 5일, 12일 및 19일에 처리하였다. 대조군에는 처리하지 않았다. CD4에 대한 고갈성 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0119) 및 CD90.2에 대한 고갈성 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0066) 또는 비관련 대조군 항체 (비-고갈성)(Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0089)를, 종양 접종 후 3일차에 부하 용량 400 ㎍으로, 7일, 10일, 14일 및 20일에 후속 용량 200 ㎍으로 복막내 (i.p.) 주사하였다 (20일에는 대조군과 anti-CD4만). CSF1R에 대한 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0213)를 종양 접종 후 2일에 부하 용량 600 ㎍으로, 5일, 7일, 10일, 12일 및 14일에 후속 용량 350 ㎍으로 복막내 (i.p.) 주사하였다. 고갈성 항체를 주사한 군의 생존성을 비관련 항체를 투여한 군의 생존성과 비교하여, 면역 세포 고갈시 치료학적 효과 차이를 확인하였다. CD4+ T 세포 및 전체 CD90.2+ 림프구의 성공적인 고갈은, CD4 항체 (BD, 카탈로그 번호 564298), CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279) 및 CD90.2 항체 (BD, 카탈로그 번호 553003)로 염색한 (Kranz et al. (Kranz, L. M. et al. Nature 534, 396-401 (2016)에 기술된 바와 같이 염색) 혈액 샘플에 대한 유세포 측정 분석을 통해 검증하였다. 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
anti-CD4 주사시 CD4+ T 세포와 anti-CD90.2 주사시 전체 림프구의 성공적인 고갈을, 항체와 mAlb-mIL2 처리 개시 시점에 마우스의 혈액에서 검증하였다 (도 46). CD4+ T 세포의 고갈은 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법의 항-종양 활성에는 영향을 미치지 않았지만, 전체 림프구의 고갈시 유의한 생존성 저하가 관찰되었으며, 이는 림프구 집단이 항-종양 효과에 필요하다는 것을 의미한다 (도 47). 대식세포의 고갈시 항-종양 활성이 거의 완전히 억제되었으며, 대식세포가 치료학적 활성에 중요한 것으로 검증되었다.
NK 세포 또는 CD4+ T 세포의 고갈은 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법의 항-종양 활성에 영향을 미치지 않는다는 점을 감안하여, CD8+ T 세포가 필요한 림프 세포 집단인지를 조사하였다. 아울러, CD8+ T 세포에 의해 분비된 IFNγ가 대식세포를 전염증성 항-종양 표현형으로 분극화하고 (Gubin et al. Cell 175(4), 1014-30 (2018)), 대식세포의 IFNγ 활성화가 ADCP를 통해 항체-옵소닌화된 종양 세포의 제거를 강화한다 (Shi et al. J Immunol 194, 4379-86 (2015))는 점을 고려하여, IFNγ가 MHC 클래스 I 결함성 종양에 대한 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법의 항-종양 활성에 필요한지 의문을 가지게 되었다. C57Bl/6 마우스 (n=8-15/군)에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 33에 기술된 바와 같이, anti-Trp1 (TA99) 항체를 종양 접종 후 5일, 8일, 12일, 15일 및 19일에, mAlb 암호화 RNA-mIL2를 5일, 12일 및 19일에 처리하였다. 대조군에는 처리하지 않았다. CD8에 대한 고갈성 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0117) 또는 IFNγ에 대한 중화 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0055) 또는 비관련 대조군 항체 (비-고갈성)(Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0088)를 부하 용량 400 ㎍으로 종양 접종 후 3일에, 그리고 후속 용량 200 ㎍의 anti-CD8을 7일 및 10일에, 또는 250 ㎍ 대조군 항체 또는 anti-IFNγ를 5일, 7일 10일에 복막내 (i.p.) 주사하였다. 고갈성 항체를 주사한 군의 생존성을 비관련 항체 투여 군의 생존성과 비교해, 면역 세포의 고갈에 따른 치료학적 효과 차이를 확인하였다. CD8+ T 세포의 성공적인 고갈은 CD8 항체 (BD, 카탈로그 번호 553032) 및 CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279)로 염색한 (Kranz et al. (Kranz, L. M. et al. Nature 534, 396-401 (2016)에 기술된 바와 같이 염색) 혈액 샘플에 대한 유세포 측정 분석으로 검증하였다. 유세포 측정 분석은 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
anti-CD8 주사시 CD8+ T 세포의 성공적인 고갈은 항체와 mAlb-mIL2 처리를 개시한 시점에 마우스의 혈액에서 검증되었다 (도 48). CD8+ T 세포의 고갈 또는 IFNγ의 중화는 항체와 mAlb-mIL2의 요법의 항-종양 활성을 비슷하게 저해하였는데, 이는 CD8+ T 세포가 필요한 림프구 집단임을 의미하는 것이며, 이들 세포가 IFNγ의 분비를 통해 기여함을 시사해준다 (도 49).
다음 목표는 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법으로 처리시 대식세포의 전염증성 분극화가 발생하는지를 분석하고, 대식세포, CD8+ T 세포 및 IFNγ 간의 직접적인 상관성을 검증하는 것이었다. C57Bl/6 마우스 (n=7-8/군)에 3x105 B16F10-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 도 33에 기술된 바와 같이, anti-Trp1 (TA99) 항체를 종양 접종 후 9일, 12일 및 16일에, mAlb 암호화 RNA-mIL2를 9일 및 10일에 처리하였다. 대조군에는 이소형 대조군 항체 및 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 투여하였다. 1차 처리 후 11일차에 종양을 적출하였다. 2차 실험으로, C57Bl/6 마우스 (n=15/군)에 동일한 방식으로 접종 및 처리하고, 부가적으로 CD8에 대한 고갈성 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0117) 또는 IFNγ에 대한 중화 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0055) 또는 비관련 대조군 항체 (비-고갈성) (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0088)를 부하 용량 400 ㎍으로 종양 접종 후 7일에, 그리고 후속 용량 200 ㎍으로 anti-CD8을 11일 및 14일에, 또는 250 ㎍으로 대조군 항체 또는 anti-IFNγ를 9일, 11일 및 14일에 복막내 (i.p.) 주사하였다. 1차 처리 후 9일차에 종양을 적출하였다. 종양들 모두 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소적으로 분해 처리하였다. Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 세포를 단일 세포 현탁물로 가공 처리한 다음 염색하였다. 사멸 세포는 고정성 노란색 사멸 세포 염료 (Life technologies, 카탈로그 번호 L34967)로 염색하였다. CD11b 항체 (BD, 카탈로그 번호 562127), CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279), CD206 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 141720), GR-1에 대한 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 108423), F4/80에 대한 항체 (Biolegend, 카탈로그 번호 123132) 및 MHC II에 대한 항체 (BD, 카탈로그 번호 551799)를 이용하였다. 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다.
종양-침윤성 대식세포의 전염증성 상태를 확인하기 위해, 전염증성 M1-유사 대식세포 (MHC IIhigh, CD206low) 및 항-염증성 M2-유사 대식세포 (MHC IIlow, CD206high)의 비율을 유세포 측정으로 정량하고, M1/M2 비율을 계산하였다. 항체 요법 단독시 M1/M2 비율이 유의하게 달라지지 않았지만, mAlb-mIL2를 단일요법으로 또는 TA99와의 조합 요법으로 처리한 경우에는 M1/M2 비율이 유의하게 증가하였는데, 이는 대식세포 비율의 전염증성 재조정을 의미한다 (도 50A). 대식세포의 전염증성 분극화는 CD8+ T-세포 고갈 또는 IFNγ 중화시 마찬가지로 무력화되었으며, 이는 CD8+ T 세포와 IFNγ가 mAlb-mIL2에 반응하여 대식세포 표현형을 구성하는데 작용한다는 것을 보여주며, CD8+ T 세포의 중요성이 IFNγ의 생산에 있으며 직접적인 종양 세포의 제거에 있지 않을 가능성이 높음을 부각시켜준다 (도 50B).
결론적으로, 이들 결과는 MHC 클래스 I의 부재를 통해 직접적인 T 세포 인지를 회피하는 종양을 제어하는데 있어 CD8+ T 세포의 기존에 인지하지 못했던 역할을 드러내준다. 대식세포가 항체와 mAlb-mIL2의 요법의 치료학적 활성에 필연적인 것으로 파악된 유일한 FcγR-발현성 세포 유형이라는 사실을 감안해, 대식세포는 항체-옵소닌화된 종양 세포를 제거하는 역할을 담당할 가능성이 매우 높다. CD8+ T 세포는 IFNγ를 통해 대식세포를 활성화하여, 이를 종양 세포를 효과적으로 제거할 수 있게 한다.
실시예 8: 항체와 mAlb - mIL2의 요법은 ICB 중에 내성 획득을 방지한다
ICB로 치료받은 종양 환자들의 상당 비율이, T 세포 인지를 회피하는 MHC 클래스 I 결함성 종양 세포 클론이 처음에는 적은 수로 과증식으로부터 발생하며 (Zaretsky et al. N Engl J Med 375, 819-29 (2016)), 최초 질환 제어 후 획득 내성의 발현으로 인해 재발을 경험한다 (Schoenfeld et al. Cancer Cell 37(4), 443-55 (2020)). 획득 내성을 묘사하기 위해, C57Bl/6 마우스 (n=15/군)에 75% B16F10 및 25% B16F10-B2m -/- 세포로 구성된 혼합물을 세포 3x105개로 피하 (s.c.) 접종하였다. 마우스에, 도 33에 기술된 바와 같이, anti-Trp1 (TA99) 항체를 종양 접종 후 3일, 7일, 10일, 14일 및 17일에, mAlb 암호화 RNA-mIL2를 3일, 10일 및 17일에 처리하였다. 이소형 항체 및 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 대조군으로 이용하였다. 마우스에는, 부가적으로, 200 ㎍ anti-PD-1 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0146)을 3일, 7일, 10일, 14일 및 17일에, anti-CTLA4 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0131)와 조합하여, 3일에 부하 용량 200 ㎍으로, 7일, 10일, 14일 및 17일에 후속 용량 100 ㎍으로 복막내 (i.p.) 주사하였다. 이소형 항체 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0089 및 BE0087)를 대조군으로 사용하였다. anti-PD-1 및 anti-CTLA4 투여 군의 생존성을 anti-PD-1, anti-CTLA4, TA99 및 mAlb-mIL2 투여 군과 비교해, 종양-결합성 항체와 mAlb-mIL2의 첨가가 ICB의 항-종양 활성을 강화하는지를 확인하였다. 마우스가 엔드포인트 기준에 도달하면 종양을 적출하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소적으로 분해 처리하였다. Grunwitz et al. (Grunwitz, C. et al. Oncoimmunology 8, 온라인 공개 (2019))에 기술된 바와 같이 세포를 단일 세포 현탁물로 가공 처리하고, 단일 세포 현탁물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 IFNγ로 자극한 후 염색하였다. 사멸 세포는 고정성 노란색 사멸 세포 염료 (Life technologies, 카탈로그 번호 L34967)로 염색하였다. CD45 항체 (BD, 카탈로그 번호 564279), H2-Kb 항체 (BD, 카탈로그 번호 553570) 및 H2-Db 항체 (BD, 카탈로그 번호 553574)를 이용하였다. 유세포 측정 분석을 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하고, 획득한 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10 (TreeStar)으로 분석하였다. MHC 클래스 I 양성 종양 세포의 비율을 여러 군들에서 비교해, ICB가 내성 MHC 클래스 I 결함성 세포에 대한 양성 선별을 유발하는지, 그리고 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법이 이러한 양성 선별을 방지할 수 있는 지를, 확인하였다.
Anti-PD-1 및 anti-CTLA4 ICB는 종양 증식을 지연시켰으며, 마우스의 80% (12/15)에서 종양 과증식이 뒤를 이었으며, 20% (3/15)에서는 종양 거부가 달성되었는데, 이는 아마도 MHC 클래스 I 결함성 세포의 방관자 제거 (bystander elimination)가 원인로 보인다 (Spiotto et al. Nat Med 10(3), 294-8 (2004))(도 51). ICB 없이 TA99 및 mAlb-mIL2 요법을 실시한 경우 종양 거부는 33.3% (5/15)였으며, TA99 및 mAlb-mIL2와 ICB의 조합을 실시한 경우에는 보다 우수한 종양 거부가 달성되었고, 관찰 기간 종료시 마우스의 60% (9/15)에서 종양이 관찰되지 않았다. 이는 ICB 단독 처리한 군과 비교해 유의하게 개선된 생존성으로 나타났다.
종양에서 MHC 클래스 I 양성 종양 세포의 비율을 분석한 결과, 대조군만 처리한 군에서는 종양 세포의 비율이 안정적으로 유지되는 것으로 나타났으며, 반면 ICB는 MHC 클래스 I 결함성 종양 세포를 매우 현저하게 증가시켰다. 이는 T 세포 감수성 종양 세포의 선택적인 고갈과, 획득 내성 및 종양 재발로 이어지는 후속적인 ICB-내성 종양 세포의 과증식을 의미한다. TA99 및 mAlb-mIL2의 추가는 MHC 클래스 I 결함성 세포의 선택적인 증가를 완전히 방지하였다.
결론적으로, ICB에 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법을 추가하면, MHC 클래스 I-의존적인 T 세포 반응을 유도하는 면역요법 과정 중에 T 세포 내성 종양 세포가 선택되는 이점을 약화시킴으로써 획득 내성의 발현을 방지할 수 있다.
실시예 9: 항체와 mAlb - mIL2의 조합 면역요법은 MC38- Her2 - B2m -/- 종양에 대해 효과적이며, 고전적인 암 요법에 대한 MHC 클래스 I 결함성 종양의 완전한 반응을 복구한다
제2 MHC 클래스 I 결함성 종양 모델에 대한 항체 및 mAlb-mIL2 요법의 효능을 조사하기 위해, 랫 Her2/neu (제조사 GeneArt, Thermo Fisher Scientific) 암호화 유전자를 Ef1a 프로모터의 통제 하에 함유한 렌티바이러스 벡터를 이용해, Beissert et al. (Beissert et al. Mol Ther 28(1), 119-28 (2019))에 기술된 바와 같이, MC38-B2m -/- 을 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 4 ㎍/mL 블라스티시딘 함유 배지에서 1주일간 37℃ 및 5% CO2 하에 배양한 다음 실시예 1에 기술된 바와 같이 단일 클론을 수득해 유세포 측정을 통해 Her2 발현에 대해 스크리닝하였다. Her2 양성 클론을 6웰 플레이트에서 4주간 37℃ 및 5% CO2 하에 블라스티시딘을 첨가하지 않고 배양하였으며, Her2 발현에 대해 스크리닝하였다. 전이유전자가 안정적으로 삽입된 클론 하나를 MC38-Her2-B2m -/- 로 명명하고, 향후 실험에 이용하였다 (도 53).
MC38-Her2-B2m -/- 이 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법에 반응하는 지를 조사하기 위해, C57Bl/6 마우스 (n=10/군)에 5x105 MC38-Her2-B2m -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하였다. 종양 접종한 후 3일, 6일, 10일, 13일, 17일 및 24일에 200 ㎍으로 anti-Her2 항체 (7.16.4)(Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0277) 또는 이소형 대조군 (Bioxcell, 카탈로그 번호 BE0085)을, 그리고 3일, 10일, 17일 및 24일에 mAlb 암호화 RNA-mIL2를 도 33에 기술된 바와 같이, 마우스에 복막내 (i.p.) 주사하였다. 항-종양 효과는 대조군 대비 실험군에서의 종양 증식의 저해 및 관찰 기간 100일 동안의 생존성으로 확인하였다.
7.16.4 또는 mAlb-mIL2를 단일요법으로, 조합 요법으로 처리할 경우, 종양 증식이 현저하게 억제되었다 (도 54A). 7.16.4 처리는 종양 거부를 유도하였지만, mAlb-mIL2를 단일요법으로 처리한 마우스의 경우 10% (1/10)만 종양 거부가 관찰되었다. 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법으로 처리한 마우스에서는 종양 거부가 50% (5/10)였으며, 실험 종료시까지 종양 없이 생존하여, mAlb-mIL2 단일요법 투여 군과 비교해 생존성이 유의하게 개선되었다 (도 54B).
항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법을 이용해 MC38-Her2-B2m -/- 종양을 효과적으로 표적화할 수 있다는 점을 감안해, 이러한 종양 모델에서 이러한 치료가 화학요법에 대한 완전한 반응을 복구할 수 있는지 의문을 가지게 되었다. 먼저, 화학요법에 대한 MC38-B2m -/- 의 내성을 확인하기 위해, 마우스에 MC38 (n=15/군) 또는 MC38-B2m -/- (n=10/군)을 실시예 1에 기술된 바와 같이 접종하고, 종양 접종 후 4일, 11일 및 18일에 도 29에 기술한 바와 같이 OX를 주사하였다. 대조군에는 비히클을 투여하였다. 항-종양 효과를 관찰 기간 100일 동안 대조군과 비교해 실험군의 생존성으로 확인하였다.
화학요법이 MC38 또는 MC38-B2m -/- 종양 보유 마우스의 생존성을 현저하게 개선하였다 (도 55). MC38-B2m -/- 종양들 모두 궁극적으로 진행되었지만, 화학요법으로 MC38 종양 거부율이 13.3% (2/15)에서 대조군의 경우 26.7% (4/15)로 2배로 증가하였으며, 이는 화학요법에 대해 MC38 종양이 완전한 반응성을 나타내는데 기능성 MHC 클래스 I의 발현이 필요하다는 것을 보여준다.
항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법의 추가가 화학요법에 대한 완전 반응을 다시 구현할 수 있는지를 분석하기 위해, 마우스 (n=15/군)에 MC38-Her2-B2m -/- 세포를 접종하고, 종양 접종 후 4일, 11일 및 18일에 OX를 도 29에 기술된 바와 같이 주사하였으며, anti-Her2 (7.16.4) 항체를 5일, 8일, 12일, 15일 19일에, 그리고 mAlb 암호화 RNA-mIL2를 7일, 14일 및 21일에, 도 54에 기술된 바와 같이 처리하였다. 대조군에는 비히클, 이소형 대조군 항체 또는 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 처리하였다. 항-종양 효과를, OX 단일요법 또는 7.16.4와 mAlb-mIL2의 조합 요법을 처리한 군과 비교해, OX 및 7.16.4와 mAlb-mIL2의 조합 요법을 처리한 군의 생존성으로 확인하였다.
OX를 단일요법으로 처리한 종양 또는 7.16.4와 mAlb-mIL2의 조합 요법을 처리한 종양은 치료 기간 중에 100% (15/15)가 진행되었다 (도 56). OX에 7.16.4 및 mAlb-mIL2를 추가하면, 종양의 53.3% (8/15)가 거부 반응을 보였으며, 그 결과 다른 처리군과 비교해 생존성이 현저하게 개선되었다.
요컨대, MHC 클래스 I 결함성 종양에 대한 다른 항체 표적을 이용한 효과적인 표적화가 제2 종양 모델에서 검증되었다. 제2 모델에서, MHC 클래스 I 결함이 고전적인 암 요법에 의한 완전한 반응에 대해 종양 내성을 유발한다는 사실도 추가로 검증되었다. 고전적인 암 요법에 항체 및 mAlb-mIL2를 추가하면, 완전한 반응을 다시 복구할 수 있으며, 상승적인 종양 제어가 달성되어, 이러한 방식의 활용성을 보여준다.
실시예 10: 고전적인 암 요법은 항체와 IL2 조합 면역요법에 의해 IFN 신호전달 결함성 종양에 대한 제어를 강화한다
또한, IFN 신호전달에 결함이 있는 종양에서도 고전적인 암 요법 및 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법의 상승적인 활성을 조사하였다. 마우스 (n=14-15/군)에 5x105 B16F10-Jak1 -/- 세포를 피하 (s.c.) 접종하고, 종양 접종 후 7일에 150 mg/kg CTX를, 실시예 5에 기술된 바와 같이, 그리고 8일, 11일, 15일, 18일 및 22일에 anti-Trp1 (TA99) 항체와, 8일, 15일 및 22일에 mAlb 암호화 RNA-mIL2를, 실시예 4에 기술된 바와 같이 처리하였다. 대조군에는 비히클, 이소형 대조군 항체 또는 mAlb 암호화 RNA (임의의 사이토카인을 암호화하지 않음)를 처리하였다. 항-종양 효과는, CTX 단일요법 처리군 또는 TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법을 처리한 군과 비교해, CTX 및 TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법을 모두 처리한 군의 생존성으로 확인하였다.
CTX는 종양 증식의 지연을 유도하여, 종양의 6.7% (1/15)에서 거부 반응이 달성되었고, TA99와 mAlb-mIL2의 조합 요법은 종양의 69.2% (9/15)에서 거부 반응을 유도하였다 (도 57). CTX는, TA99 및 mAlb-mIL2의 처리시, 종양이 상당한 거부 반응을 나타내도록 민감하게 만들어 주며, 따라서 종양 거부율이 86.7% (13/15)까지 증가하였다. 결론적으로, 고전적인 암 요법이 항체와 mAlb-mIL2의 조합 요법 처리를 통한 IFN 신호전달 결함성 종양의 제어를 개선한다.
<110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH et al. <120> Treatment involving therapeutic antibody and interleukin-2 (IL2) <130> 674-299 PCT2 <150> PCT/EP2019/075712 <151> 2019-09-24 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 149 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln 1 5 10 15 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu 20 25 30 Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu 35 40 45 Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu Pro Lys Gln Ala 50 55 60 Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu 65 70 75 80 Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp 85 90 95 Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys 100 105 110 Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr 115 120 125 Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser Ile Ile 130 135 140 Ser Thr Ser Pro Gln 145 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> 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Claims (39)

  1. 개체에 하기 a 및 b를 투여하는 것을 포함하는, MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 가진 개체를 치료하는 방법:
    a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    b. 항체-기반의 암 면역요법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암이 MHC-의존적인 T 세포와 같은 T 세포, 특히 CD8+ T 세포에 기반한 치료에 적절하게 반응하지 않는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 암이 항원의 가공 처리 및/또는 제시에 결함을 가진, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 MHC-I 결함을 가진, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    MHC-I 결함이 β2-마이크로글로불린 (B2M)과 같은 MHC-I 대립유전자의 돌연변이 또는 이의 일부 상실 또는 전체 상실로 인한 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 T 세포 자극에 대해 결함을 가진. 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 I형 IFN 또는 IFNγ 신호전달과 같은 IFN-신호전달에 대해 결함을 가진, 방법.
  8. 개체에 하기 a 및 b를 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸린 개체에서 MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 암의 내성 발생을 예방하는 방법:
    a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    b. 항체-기반의 암 면역요법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 내성은 암이 MHC-의존적인 T 세포와 같은 T 세포, 특히 CD8+ T 세포에 기반한 치료에 적절하게 반응하지 않는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 내성은 암이 항원 가공 처리 및/또는 제시에 결함을 가지는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내성은 암이 MHC-I 결함을 가지는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    MHC-I 결함은 β2-마이크로글로불린 (B2M)와 같은 MHC-I 대립유전자의 돌연변이 또는 일부 상실 또는 전체 상실이 원인인, 방법.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내성은 암이 T 세포 자극에 대해 결함을 가지는 것을 포함하는, 방법.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내성은 암이 I형 IFN 또는 IFNγ 신호전달과 같은 IFN-신호전달에 대해 결함을 가지는 것을 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체-기반의 암 면역요법이 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 암에 대한 치료학적 항체가 암 세포에 의해 발현되는 종양 항원에 대한 것인, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체에게 하기 a 및 b를 투여하는 것을 포함하는, 방법:
    a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA; 및
    b. 암에 대한 치료학적 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 항원의 발현 또는 항원의 발현 증가와 관련있는, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 항원이 종양 항원인, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 항체-기반의 암 면역요법이 상기 항원에 대한 것인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드가 약동학 (PK)-연장된 IL2인, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 PK-연장된 IL2가 융합 단백질을 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 IL2 또는 이의 기능성 변이체의 모이어티와, 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 혈청 알부민이 마우스 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함하는, 방법.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 면역글로불린 단편이 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는, 방법.
  28. 하기를 포함하는 의학적 제제:
    a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    b. 암에 대한 치료학적 항체, 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    c. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 치료 또는 예방하기 위한 의학적 제제의 사용 설명서.
  29. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 치료 또는 예방하기 위한, 하기를 포함하는 의학적 제제:
    a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    b. 암에 대한 치료학적 항체, 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  30. 하기를 포함하는 의학적 제제:
    a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    b. 암에 대한 치료학적 항체, 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    c. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 암의 내성 발생을 예방하기 위한 의학적 제제의 사용 설명서.
  31. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 암의 내성 발생을 예방하기 위한, 하기를 포함하는 의학적 제제:
    a. IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    b. 암에 대한 치료학적 항체, 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    키트인, 의학적 제제.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 별개의 용기 안에 포함하는, 의학적 제제.
  34. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학적 조성물인, 의학적 제제.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 약학적 조성물이 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함하는, 의학적 제제.
  36. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 치료 또는 예방하기 위한 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 투여하기 위한 것인, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드.
  37. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대해 적어도 부분적으로 내성인 암을 치료 또는 예방하기 위한 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 투여하기 위한 것인, 치료학적 항체 또는 폴리뉴클레오티드.
  38. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 암의 내성 발생을 예방하기 위한 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 투여하기 위한 것인, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드.
  39. MHC-의존적인 T 세포 반응에 대한 암의 내성 발생을 예방하기 위한 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 암에 대한 치료학적 항체 또는 암에 대한 치료학적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 투여하기 위한 것인, 치료학적 항체 또는 폴리뉴클레오티드.
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GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7176278B2 (en) 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
KR20090088973A (ko) 2002-10-17 2009-08-20 젠맵 에이/에스 Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
ES2551682T3 (es) 2002-11-08 2015-11-23 Ablynx N.V. Anticuerpos de dominio simple dirigidos contra factor de necrosis tumoral-alfa y usos para los mismos
PL1729795T3 (pl) 2004-02-09 2016-08-31 Human Genome Sciences Inc Białka fuzyjne albuminy
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
CN101511868B (zh) 2006-07-24 2013-03-06 比奥雷克西斯制药公司 毒蜥外泌肽融合蛋白
AU2007293614A1 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
EA201000979A1 (ru) 2007-12-27 2011-02-28 Новартис Аг Улучшенные связывающие молекулы на основе фибронектина и их применение
PT2269371T (pt) 2008-03-20 2018-05-08 Inst Rundfunktechnik Gmbh Um método de adaptar imagens de vídeo a tamanhos pequenos de ecrã, em particular a tamanhos pequenos de ecrã de terminais portáteis
US9296810B2 (en) 2008-05-02 2016-03-29 Novartis Ag Fibronectin-based binding molecules and uses thereof
WO2011124718A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Novozymes A/S Albumin derivatives and variants
EP3424949A1 (en) 2010-04-13 2019-01-09 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domain proteins that bind pcsk9
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CN111741764A (zh) * 2018-02-12 2020-10-02 生物技术Rna制药有限公司 使用细胞因子编码rna的治疗

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