JP2022550328A - 治療用抗体およびインターロイキン2(il2)を含む治療 - Google Patents
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Abstract
腫瘍細胞は、例えば、制御されない増殖を可能にする、MHC発現および/またはIFNシグナル伝達を低減または排除することによって、しばしば免疫応答を回避する。本発明者らは、IL2投与と組み合わせた抗体に基づく免疫療法がそのような耐性腫瘍に対する有効な治療であることを本明細書で実証する。具体的には、本開示は、MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を有する対象を治療する方法であって、a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;およびb.抗体に基づく免疫療法を前記対象に投与することを含む方法に関する。
Description
本開示は、例えば、癌のMHC-I欠損または癌のIFNシグナル伝達欠損に起因して、MHC依存性T細胞に基づく治療に十分に応答しない癌を有する対象を治療する方法に関する。これらの方法は、特に、細胞表面に抗原を発現する疾患細胞を特徴とする癌疾患の治療に有用である。具体的には、本開示は、MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を有する対象を治療する方法であって、a.IL2もしくはその機能的バリアント(本明細書では一般に「IL2」と呼ばれる)を含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;およびb.癌に対する抗体に基づく免疫療法を対象に投与することを含む方法に関する。本開示はまた、癌を有する対象において癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防する方法であって、a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;およびb.癌に対する抗体に基づく免疫療法を対象に投与することを含む方法に関する。本開示の方法は、化学療法または放射線療法などのさらなる癌療法、特に化学療法を対象に投与することをさらに含み得る。
免疫系は、癌の発症、進行および治療の間、重要な役割を果たす。CD8+T細胞およびNK細胞は、腫瘍細胞を直接溶解することができ、これらの細胞の高い腫瘍浸潤は、一般に、様々な腫瘍疾患の転帰にとって好ましいと見なされている。CD4+T細胞は、IFNγの分泌または抗原提示樹状細胞(DC)のライセンシングによって抗腫瘍免疫応答に寄与し、これが次にCD8+T細胞をプライミングし、活性化する(Kreiter et al.Nature 520,692-6(2015))。CD8+T細胞による腫瘍細胞の認識および排除は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIを介した抗原提示に依存する。MHCクラスI分子は、細胞表面に位置し、α鎖およびβ2-ミクログロブリン(B2M)からなる。全てのヒト個体は、α鎖をコードする遺伝子の6つの異なる対立遺伝子と、B2Mをコードする遺伝子の2つの冗長対立遺伝子とを担持する。B2Mは複合体の安定性に必要であるが、α鎖はペプチド抗原を収容する溝を形成し、ペプチド抗原は原則として任意の内因性タンパク質に由来し得る。抗原が免疫原性である場合(例えば抗原が突然変異遺伝子産物またはウイルス遺伝子産物に由来するため)、この特定のペプチド-MHCクラスI複合体に適合するT細胞受容体(TCR)を担持するCD8+T細胞は、腫瘍細胞を外来細胞として認識することができる。CD8+T細胞がプライミングされ、活性化された場合、これは腫瘍細胞を溶解し、IFNγを分泌する。周囲の腫瘍細胞はIFNγを感知することができ、これが、MHCクラスIの上方制御を介して増殖阻害および抗原提示の増強をもたらし、腫瘍細胞をCD8+T細胞認識に対してより感受性にする。さらに、腫瘍微小環境(TME)に位置するCD4+T細胞およびNK細胞はIFNγの供給源であり得るが、DCおよびマクロファージは、腫瘍細胞の増殖および抗原提示に対して同様の効果を有するI型IFNを分泌することができる。
養子T細胞移入、組換えサイトカインまたは免疫チェックポイント遮断(ICB)などのいくつかの免疫療法が、癌患者の治療のために承認されている。特にICBは癌治療の分野に革命をもたらし、患者群における持続的な応答につながっている(Larkin et al.N Engl J Med 373,23-34(2015))。ICBは、腫瘍細胞に対する既存のCD8+T細胞応答の再活性化に依存する。ICBの成功により、さらなるT細胞ベースの免疫療法アプローチは非常に有望であり、多数が現在臨床試験で検討されている。しかしながら、CD8+T細胞に基づく療法は、腫瘍細胞による機能的抗原提示への依存性という固有の難点を有し、これは耐性機構の発生のための道を開く。
腫瘍細胞はしばしば遺伝的に不安定である(Burrell et al.Nature 501,338-45(2013))。このため、腫瘍細胞は突然変異を蓄積し、非機能性遺伝子産物(例えばミスセンス突然変異もしくはナンセンス突然変異を介して)または遺伝子全体の欠失をもたらし得る。癌治療に対する応答に不可欠な遺伝子の機能的喪失は、一次耐性、適応耐性または獲得耐性に関与し得る(Sharma et al.Cell 168,707-23(2017))。獲得耐性の発生は、治療耐性腫瘍細胞クローンの選択および増殖につながり、しばしば罹患患者の死をもたらす。特に、抗原提示を損なう突然変異は、養子T細胞移入、ICBおよびワクチン接種を含む免疫療法に対する耐性の機構として観察されている(Restifo et al.J Natl Cancer Inst 88,100-8(1996)、Zaretsky et al.N Engl J Med 375,819-29(2016)、Sahin et al.Nature 547,222-6(2017))。例えば、特にB2Mの突然変異によるMHCクラスIの喪失は、抗原提示の完全な停止をもたらす。その結果、腫瘍細胞は、CD8+T細胞による認識および排除を免れる。腫瘍実体に依存して、MHCクラスI対立遺伝子の部分的または完全な喪失が腫瘍の最大93%で観察されているが(Garrido et.al.Cancer Immunol Immunother 66,259-271(2017))、特にB2Mの喪失は、ICBに応答しない患者のほぼ30%に影響を及ぼすことが示されている(Sade-Feldman et al.Nat Commun 8,1136(2017))。さらに、IFNシグナル伝達経路に関与するいくつかの遺伝子の突然変異は、ICBに対する耐性に関連している(Zaretsky et al.N Engl J Med 375,819-29(2016)、Gao et al.Cell 167,397-404(2016))。例えば、中心的なIFNシグナル伝達分子であるヤヌスキナーゼ1(JAK1)の機能喪失は、I型IFNおよびIFNγの両方に対する応答を妨げる。最近の報告は、古典的な癌治療が腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答の活性化に依存することを示しているので(Galluzzi et.al.Cancer Cell 28,690-714(2015)、Weichselbaum et.al.Nat Rev Clin Oncol 14,365-379(2017))、免疫療法に加えて、抗原提示の障害も古典的な癌治療(化学療法および放射線療法)に対する耐性の潜在的な機構である。
Kreiter et al.Nature 520,692-6(2015)
Larkin et al.N Engl J Med 373,23-34(2015)
Burrell et al.Nature 501,338-45(2013)
Sharma et al.Cell 168,707-23(2017)
Restifo et al.J Natl Cancer Inst 88,100-8(1996)
Zaretsky et al.N Engl J Med 375,819-29(2016)
Sahin et al.Nature 547,222-6(2017)
Garrido et.al.Cancer Immunol Immunother 66,259-271(2017)
Sade-Feldman et al.Nat Commun 8,1136(2017)
Gao et al.Cell 167,397-404(2016)
Galluzzi et.al.Cancer Cell 28,690-714(2015)
Weichselbaum et.al.Nat Rev Clin Oncol 14,365-379(2017)
本開示は、MHCクラスIの喪失による抗原提示障害が、マウス腫瘍モデルにおける免疫療法に対する耐性の包括的な機構であることを確認する。それに加えて、MHCクラスIの喪失が古典的な癌治療に対する耐性を媒介することを示すデータを提供する。これまでのところ、機能的MHCクラスIの完全なもしくは部分的な喪失または機能的IFNシグナル伝達の喪失による抗原提示の障害を介して免疫認識を回避する耐性腫瘍に対して有効であると記載された治療法はない。このため、免疫認識および耐性腫瘍細胞の排除を回復させるための新規戦略への高い医学的必要性が存在する。
MHCクラスIの喪失またはIFNシグナル伝達経路の障害を介して抗原提示を損なう変化によって耐性を獲得した腫瘍に対する免疫療法介入のための戦略が本明細書に記載される。治療は、サイトカインIL2と組み合わせて腫瘍抗原に結合する抗体を含む。記載される併用療法は、マウスモデルにおいて、様々な免疫細胞による腫瘍浸潤および耐性腫瘍の完全拒絶をもたらす。さらに、本開示は、化学療法などの古典的な癌治療が、抗体およびIL2併用免疫療法による耐性腫瘍の制御をさらに改善することを実証する。
本発明は、一般に、MHCクラスIの喪失またはIFNシグナル伝達経路の障害を介して抗原提示を損なう変化によって耐性を獲得した腫瘍を治療するために、または腫瘍を治療して腫瘍が前記変化によって耐性を獲得するのを防ぐために、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および癌に対する抗体に基づく免疫療法を投与することを含む、対象の免疫療法治療を包含する。
本明細書に記載の方法および薬剤は、IL2が薬物動態修飾基に結合している場合(以下「延長薬物動態(PK)IL2」と呼ばれる)に特に有効である。本明細書に記載の方法および薬剤は、延長PK IL2などのIL2をコードするポリヌクレオチドがRNAである場合に特に有効である。一実施形態では、前記RNAは、全身アベイラビリティのために肝臓を標的とする。肝細胞は効率的にトランスフェクトすることができ、大量のタンパク質を産生できる。
一態様では、MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を有する対象を治療する方法であって、
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する抗体に基づく免疫療法
を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する抗体に基づく免疫療法
を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。
一実施形態では、癌は、MHC依存性T細胞、特にCD8+T細胞などのT細胞に基づく、すなわちT細胞を含む治療に十分に応答しない。一実施形態では、癌は、ワクチン接種、免疫チェックポイント阻害、およびT細胞移入の1つ以上に十分に応答しない。一実施形態では、癌は、抗原のプロセシングおよび/または提示が欠損している。一実施形態では、癌はMHC-I欠損である。一実施形態では、MHC-Iの欠損は、MHC-I対立遺伝子またはβ2-ミクログロブリン(B2M)の突然変異または部分的もしくは完全な喪失に起因する。一実施形態では、癌はT細胞刺激能が欠損している。一実施形態では、癌は、I型IFNまたはIFNγシグナル伝達などのIFNシグナル伝達が欠損している。そのようなIFNシグナル伝達の欠損は、IFNシグナル伝達経路に関与する1つ以上の遺伝子における1つ以上の突然変異に起因し得る。一実施形態では、遺伝子はヤヌスキナーゼ1(JAK1)である。
一態様では、癌を有する対象において癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防する方法であって、
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する抗体に基づく免疫療法
を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する抗体に基づく免疫療法
を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。
一実施形態では、耐性は、癌がMHC依存性T細胞、特にCD8+T細胞などのT細胞に基づく、すなわちT細胞を含む治療に十分に応答しないことを含む。一実施形態では、耐性は、癌がワクチン接種、免疫チェックポイント阻害、およびT細胞移入の1つ以上に適切に応答しないことを含む。一実施形態では、耐性は、癌が抗原のプロセシングおよび/または提示を欠損していることを含む。一実施形態では、耐性は、癌がMHC-I欠損であることを含む。一実施形態では、MHC-Iの欠損は、MHC-I対立遺伝子またはβ2-ミクログロブリン(B2M)の突然変異または部分的もしくは完全な喪失に起因する。一実施形態では、耐性は、癌がT細胞刺激能を欠損していることを含む。一実施形態では、耐性は、癌がI型IFNまたはIFNγシグナル伝達などのIFNシグナル伝達を欠損していることを含む。そのようなIFNシグナル伝達の欠損は、IFNシグナル伝達経路に関与する1つ以上の遺伝子における1つ以上の突然変異に起因し得る。一実施形態では、遺伝子はヤヌスキナーゼ1(JAK1)である。
一実施形態では、IL2またはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはRNAである。
一実施形態では、癌に対する抗体に基づく免疫療法は、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む。一実施形態では、癌に対する治療用抗体は、癌の細胞によって発現される腫瘍抗原に対するものである。一実施形態では、癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドはRNAである。
一実施形態では、本方法は、対象に、
a.IL2またはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするRNA;および
b.癌に対する治療用抗体
を投与することを含む。
a.IL2またはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするRNA;および
b.癌に対する治療用抗体
を投与することを含む。
一実施形態では、癌は、抗原の発現または発現上昇に関連する。一実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。一実施形態では、癌に対する抗体に基づく免疫療法は、前記抗原に対するものである。
一実施形態では、IL2またはその機能的バリアントを含むポリペプチドは、延長薬物動態(PK)IL2である。一実施形態では、延長PK IL2は融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、IL2の部分またはその機能的バリアントと、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、Fn3、およびそれらのバリアントからなる群より選択される部分とを含む。一実施形態では、血清アルブミンは、マウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、免疫グロブリン断片は、免疫グロブリンFcドメインを含む。
一態様では、
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド;および
c.MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を治療または予防するための医薬製剤の使用説明書
を含む医薬製剤が本明細書で提供される。
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド;および
c.MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を治療または予防するための医薬製剤の使用説明書
を含む医薬製剤が本明細書で提供される。
一態様では、MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を治療または予防するための、
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド
を含む医薬製剤が本明細書で提供される。
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド
を含む医薬製剤が本明細書で提供される。
一態様では、
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド;および
c.癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防するための医薬製剤の使用説明書
を含む医薬製剤が本明細書で提供される。
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド;および
c.癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防するための医薬製剤の使用説明書
を含む医薬製剤が本明細書で提供される。
一態様では、癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防するための、
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド
を含む医薬製剤が本明細書で提供される。
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド
を含む医薬製剤が本明細書で提供される。
一実施形態では、医薬製剤はキットである。
一実施形態では、医薬製剤は、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドとを別々の容器に含む。
一実施形態では、医薬製剤は医薬組成物である。一実施形態では、医薬組成物は、1つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤をさらに含む。
一態様では、MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を治療または予防するための、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供され、ここで、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドと共に投与されることになっている。
一態様では、MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を治療または予防するための、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供され、ここで、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドは、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと共に投与されることになっている。
一態様では、癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防するための、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供され、ここで、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドと共に投与されることになっている。
一態様では、癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防するための、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供され、ここで、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドは、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと共に投与されることになっている。
一実施形態では、医薬製剤、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または癌に対する治療用抗体もしくは癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドは、上記の本発明の方法で使用するためのものである。
医薬製剤、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または癌に対する治療用抗体もしくは癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドの好ましい実施形態は、本発明の方法について上述した通りである。
本開示を以下で詳細に説明するが、この開示は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、''A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)'',H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.Kolbl,Eds.,Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland,(1995)に記載されているように定義される。
本開示の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献(例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989を参照)で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えDNA技術の従来の方法を用いる。
以下において、本開示の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および実施形態は、本開示を明確に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、記述される全ての要素の任意の順列と組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されていると見なされるべきである。
「約」という用語は、およそまたはほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈において、一実施形態では、列挙または特許請求される数値または範囲の±20%、±10%、±5%、または±3%を意味する。
本開示を説明する文脈において(特に特許請求の範囲の文脈において)使用される「1つの」および「その」という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個々に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、個々の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語(例えば、「など」)の使用は、単に本開示をより良く説明することを意図しており、特許請求の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に必須の特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかしながら、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本開示の特定の実施形態として企図され、すなわち、この実施形態の目的のためには、「含む」は「からなる」の意味を有すると理解されるべきである。
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される各資料(全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書などを含む)は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有さなかったことの承認と解釈されるべきではない。
以下において、本開示の全ての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。定義されていない用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。
定義
「MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性」である癌は、特に、正常な状況、例えば癌がMHC依存性T細胞応答に対して耐性ではない状況、例えば癌に対する増殖性MHC依存性T細胞応答が最終的に腫瘍細胞の攻撃および死滅をもたらし得る状況、および/または癌がT細胞に基づく、すなわちT細胞を含む治療に応答する状況と比較して、癌が本明細書に記載される耐性機構を発現しているために、癌に対するMHC依存性T細胞応答が低下していることを意味する。MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性ではないそのような癌は、好ましくは、抗原の正常なプロセシングおよび/または提示ならびに正常なIFNシグナル伝達を示す。したがって、「MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性」である癌は、癌に対する増殖性MHC依存性T細胞応答および/またはMHC依存性T細胞による腫瘍細胞殺傷を部分的または完全に免れ得る。MHC依存性T細胞応答は、癌に対する内因性反応であり得、および/または例えばT細胞が関与する免疫療法による、MHC依存性T細胞応答の誘導から生じる反応であり得る。
「MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性」である癌は、特に、正常な状況、例えば癌がMHC依存性T細胞応答に対して耐性ではない状況、例えば癌に対する増殖性MHC依存性T細胞応答が最終的に腫瘍細胞の攻撃および死滅をもたらし得る状況、および/または癌がT細胞に基づく、すなわちT細胞を含む治療に応答する状況と比較して、癌が本明細書に記載される耐性機構を発現しているために、癌に対するMHC依存性T細胞応答が低下していることを意味する。MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性ではないそのような癌は、好ましくは、抗原の正常なプロセシングおよび/または提示ならびに正常なIFNシグナル伝達を示す。したがって、「MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性」である癌は、癌に対する増殖性MHC依存性T細胞応答および/またはMHC依存性T細胞による腫瘍細胞殺傷を部分的または完全に免れ得る。MHC依存性T細胞応答は、癌に対する内因性反応であり得、および/または例えばT細胞が関与する免疫療法による、MHC依存性T細胞応答の誘導から生じる反応であり得る。
「十分に応答しない」という用語は、正常な状況、例えば、癌がMHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性ではなく、T細胞に基づく、すなわちT細胞を含む治療に応答する状況と比較して、応答が低下していることを意味する。MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性ではないそのような癌は、好ましくは、抗原の正常なプロセシングおよび/または提示ならびに正常なIFNシグナル伝達を示す。「欠損」という用語は、対象物が欠損している特性または活性が、そのような欠損が存在しない正常な状況と比較して低下していることを意味する。
好ましくは、MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性であるおよび/またはT細胞に基づく治療に十分に応答しない癌は、1)抗原のプロセシングおよび/または提示をもたらす機構が欠損している可能性があり、例えば癌はMHC-I欠損であり得、MHC-Iの欠損は、MHC-I対立遺伝子またはβ2-ミクログロブリン(B2M)の突然変異または部分的もしくは完全な喪失に起因し得る;2)例えばI型IFNまたはIFNγシグナル伝達などのIFNシグナル伝達の欠損に起因して、T細胞刺激能が欠損している可能性がある;または3)例えばCD8+T細胞またはそれらの組合せによる認識のためにMHCに関連して提示される抗原を喪失している可能性がある。
本明細書で使用される「低減する」、「減少させる」「阻害する」または「損なう」などの用語は、レベル、例えば結合レベルの、好ましくは5%以上、10%以上、20%以上、より好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上、最も好ましくは100%の全体的な減少または全体的な減少を生じさせる能力に関する。
「増加させる」、「増強する」または「上回る」などの用語は、好ましくは、少なくとも約10%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも500%、またはさらにそれ以上の増加または増強に関する。
本開示によれば、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに連結された約2個以上、約3個以上、約4個以上、約6個以上、約8個以上、約10個以上、約13個以上、約16個以上、約20個以上、および最大約50個、約100個または約150個までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約150個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
「治療用タンパク質」は、治療有効量で対象に提供された場合、対象の状態または病態に対してプラスのまたは有利な効果を及ぼす。一実施形態では、治療用タンパク質は治癒的または緩和的特性を有し、疾患または障害の1つ以上の症状を改善する、緩和する、軽減する、逆転させる、発症を遅延させる、または重症度を軽減するために投与され得る。治療用タンパク質は予防的特性を有し得、疾患の発症を遅延させるため、またはそのような疾患もしくは病的状態の重症度を軽減するために使用され得る。「治療用タンパク質」という用語は、タンパク質またはペプチド全体を含み、それらの治療的に活性な断片も指すことができる。それはまた、タンパク質の治療的に活性なバリアントを含み得る。治療的に活性なタンパク質の例には、サイトカインが含まれるが、これに限定されない。
アミノ酸配列(ペプチドまたはタンパク質)に関して、「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちN末端および/またはC末端で短縮されたアミノ酸配列である配列に関する。C末端で短縮された断片(N末端断片)は、例えばオープンリーディングフレームの3'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。N末端で短縮された断片(C末端断片)は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの5'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えばアミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%を含む。アミノ酸配列の断片は、好ましくはアミノ酸配列からの少なくとも6個、特に少なくとも8個、少なくとも12個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも50個、または少なくとも100個の連続するアミノ酸を含む。
本明細書における「バリアント」または「バリアントタンパク質」または「バリアントポリペプチド」とは、少なくとも1つのアミノ酸修飾によって野生型タンパク質とは異なるタンパク質を意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するもしくは野生型(WT)ポリペプチドであり得るか、または野生型ポリペプチドの改変型であり得る。好ましくは、バリアントポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸修飾、例えば親と比較して1~約20のアミノ酸修飾、好ましくは1~約10または1~約5のアミノ酸修飾を有する。
本明細書で使用される「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」とは、その後修飾されてバリアントを生じる未修飾ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、野生型ポリペプチド、または野生型ポリペプチドのバリアントもしくは操作型であり得る。
本明細書における「野生型」または「WT」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列を意味する。野生型タンパク質またはポリペプチドは、意図的に修飾されていないアミノ酸配列を有する。
本開示の目的のために、アミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアントおよび/またはアミノ酸置換バリアントを含む。「バリアント」という用語は、全てのスプライスバリアント、翻訳後修飾バリアント、配座バリアント、アイソフォームバリアントおよび種ホモログ、特に細胞によって天然に発現されるものを含む。「バリアント」という用語は、特に、アミノ酸配列の断片を含む。
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列中に1個または2個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、1個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。アミノ酸付加バリアントは、1個以上のアミノ酸、例えば1、2、3、5、10、20、30、50個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および/またはカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失バリアントは、配列からの1個以上のアミノ酸の除去、例えば1、2、3、5、10、20、30、50個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、タンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のN末端および/またはC末端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、N末端および/またはC末端切断バリアントとも呼ばれる。アミノ酸置換バリアントは、配列内の少なくとも1個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にある修飾、および/またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの1つの置換が含まれる。天然に存在するアミノ酸は、一般に、酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、および非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン)アミノ酸の4つのファミリーに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。一実施形態では、保存的アミノ酸置換には、以下の群内の置換が含まれる:
グリシン、アラニン;
バリン、イソロイシン、ロイシン;
アスパラギン酸、グルタミン酸;
アスパラギン、グルタミン;
セリン、トレオニン;
リジン、アルギニン;および
フェニルアラニン、チロシン。
グリシン、アラニン;
バリン、イソロイシン、ロイシン;
アスパラギン酸、グルタミン酸;
アスパラギン、グルタミン;
セリン、トレオニン;
リジン、アルギニン;および
フェニルアラニン、チロシン。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または約100%であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が200個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約20、少なくとも約40、少なくとも約60、少なくとも約80、少なくとも約100、少なくとも約120、少なくとも約140、少なくとも約160、少なくとも約180、または約200個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸について与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最良の配列アラインメントを使用して、例えばAlignを使用して、標準的な設定、好ましくはEMBOSS::ニードル、マトリックス:Blosum62、ギャップオープン10.0、ギャップ伸長0.5を使用して行うことができる。
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。2つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
「同一性パーセント」という用語は、最良のアラインメント後に得られる、比較する2つの配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを示すことを意図しており、このパーセンテージは純粋に統計的であり、2つの配列間の相違は、ランダムにおよびそれらの全長にわたって分布する。2つのアミノ酸配列間の配列比較は、通常、これらの配列を最適に整列させた後に比較することによって行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウィンドウ」ごとに行われる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業に加えて、Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482の局所相同性アルゴリズムによって、Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443の局所相同性アルゴリズムによって、Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85,2444の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラム(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST NおよびTFASTA)によって作成され得る。
同一性パーセントは、比較する2つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除し、得られた結果に100を乗じて、これら2つの配列間の同一性パーセントを得ることによって計算される。
相同なアミノ酸配列は、本開示によれば、アミノ酸残基の少なくとも40%、特に少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98または少なくとも99%の同一性を示す。
本明細書に記載のアミノ酸配列バリアントは、例えば組換えDNA操作により、当業者によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのDNA配列の操作は、例えばSambrook et al.(1989)に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載のペプチドおよびアミノ酸バリアントは、例えば固相合成および類似の方法などによる公知のペプチド合成技術を用いて容易に調製され得る。
一実施形態では、アミノ酸配列(ペプチドまたはタンパク質)の断片またはバリアントは、好ましくは「機能的断片」または「機能的バリアント」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的バリアント」という用語は、それが由来するアミノ酸配列のものと同一または類似の1つ以上の機能特性を示す、すなわち機能的に等価である任意の断片またはバリアントに関する。IL2などのサイトカインに関して、1つの特定の機能は、断片もしくはバリアントが由来するアミノ酸配列によって示される1つ以上の免疫調節活性、および/または断片もしくはバリアントが由来するアミノ酸配列が結合する受容体(1つ以上)への結合である。本明細書で使用される「機能的断片」または「機能的バリアント」という用語は、特に、親の分子または配列のアミノ酸配列と比較して1つ以上のアミノ酸によって変化し、親の分子または配列の機能の1つ以上、例えば標的分子に結合する、または標的分子への結合に寄与する機能を依然として果たすことができるアミノ酸配列を含むバリアント分子または配列を指す。一実施形態では、親の分子または配列のアミノ酸配列の改変は、分子または配列の結合特性に有意に影響を及ぼさないかまたは変化させない。異なる実施形態では、機能的断片または機能的バリアントの結合は、低減され得るが、依然として有意に存在し得、例えば、機能的バリアントの結合は、親の分子または配列の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%であり得る。しかしながら、他の実施形態では、機能的断片または機能的バリアントの結合は、親の分子または配列と比較して増強され得る。
指定されたアミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)に「由来する」アミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列のバリアントまたはその断片であり得る。例えば、本明細書での使用に適したIL2化合物は、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在するまたは天然の配列とは配列が異なるように改変され得ることが当業者に理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「説明資料」または「説明書」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用することができる出版物、記録、図、または任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の組成物を含む容器に貼付され得るか、または組成物を含む容器と共に出荷され得る。あるいは、説明資料と組成物が受領者によって協働して使用されることを意図して、説明資料は容器とは別に出荷されてもよい。
「単離された」は、天然状態から改変されたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え細胞などの「組換え物」は、天然には存在しない。
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物(ウイルスを含む)中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人間によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。
「遺伝子改変」という用語は、核酸による細胞のトランスフェクションを含む。「トランスフェクション」という用語は、細胞への核酸、特にRNAの導入に関する。本発明の目的のために、「トランスフェクション」という用語はまた、細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みを含み、細胞は、対象、例えば患者に存在し得る。したがって、本発明によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロまたはインビボで存在することができ、例えば細胞は、患者の器官、組織および/または生物の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの用途では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現されれば十分である。トランスフェクションの過程で導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないので、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることを所望する場合は、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。そのような安定なトランスフェクションは、トランスフェクションのためにウイルスベースのシステムまたはトランスポゾンベースのシステムを使用することによって達成できる。一般に、IL2などのサイトカインをコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。RNAを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。
本発明の文脈における「免疫エフェクタ細胞」または「エフェクタ細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクタ機能を発揮する細胞に関する。例えば、免疫エフェクタ細胞は、T細胞(細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞、腫瘍浸潤T細胞)、B細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞を含む。「T細胞」および「Tリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Tヘルパー細胞(CD4+T細胞)および細胞溶解性T細胞を含む細胞傷害性T細胞(CTL、CD8+T細胞)を含む。「MHC依存性T細胞」という用語または同様の用語は、MHCに関連して提示された場合に抗原を認識し、好ましくはT細胞のエフェクタ機能、例えば抗原を発現する標的細胞の死滅を発揮するT細胞に関する。
T細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。これらは、T細胞受容体(TCR)と呼ばれるこれらの細胞表面上の特別な受容体の存在によって、B細胞およびナチュラルキラー細胞などの他の種類のリンパ球と区別することができる。胸腺は、T細胞の成熟に関与する主要な器官である。それぞれ別個の機能を有する、T細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されている。
Tヘルパー細胞は、数ある機能の中でも特に、B細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。これらの細胞は、その表面にCD4糖タンパク質を発現するため、CD4+T細胞としても公知である。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞(APC)の表面に発現されるMHCクラスII分子によってペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。ひとたび活性化されると、これらは速やかに分裂し、能動免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
細胞傷害性T細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、その表面にCD8糖タンパク質を発現するため、CD8+T細胞としても公知である。これらの細胞は、身体のほぼあらゆる細胞の表面上に存在する、MHCクラスIに関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。
全てのT細胞は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するT細胞受容体(TCR)を有する。T細胞のTCRは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子に結合し、標的細胞の表面に提示される免疫原性ペプチド(エピトープ)と相互作用することができる。TCRの特異的結合は、T細胞内のシグナルカスケードを引き起こし、増殖および成熟エフェクタT細胞への分化をもたらす。T細胞の大部分では、実際のT細胞受容体は独立したT細胞受容体アルファおよびベータ(TCRαおよびTCRβ)遺伝子から産生され、α-およびβ-TCR鎖と呼ばれる2つの別個のペプチド鎖で構成される。T細胞のはるかに一般的でない(全T細胞の2%)群であるγδ T細胞(ガンマデルタT細胞)は、1本のγ鎖と1本のδ鎖で構成される別個のT細胞受容体(TCR)をその表面に有する。
全てのT細胞は、骨髄の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞に由来する造血前駆細胞は胸腺に存在し、細胞分裂によって拡大して未成熟な胸腺細胞の大きな集団を生成する。最初期の胸腺細胞はCD4もCD8も発現せず、したがって二重陰性(CD4-CD8-)細胞として分類される。発達が進むにつれて、それらは二重陽性胸腺細胞(CD4+CD8+)になり、最終的に単一陽性(CD4+CD8-またはCD4-CD8+)胸腺細胞に成熟し、その後胸腺から末梢組織に放出される。
本明細書で使用される場合、「NK細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、CD56またはCD16の発現およびT細胞受容体の非存在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。
ヒトにおけるMHC分子は、通常、HLA(ヒト白血球抗原)分子と呼ばれる。MHC分子には、クラスIおよびクラスIIの2つの主要なクラスがある。MHCクラスI抗原は、身体のほぼ全ての有核細胞に見出される。このクラスのMHC分子の主な機能は、細胞内タンパク質のペプチド断片をCTLに表示する(または提示する)ことである。この表示に基づいて、CTLは、癌抗原などの疾患関連ペプチド(抗原)を含むMHC結合ペプチドを表示しているものを攻撃する。CD8陽性T細胞は通常、細胞傷害性であり(したがって細胞傷害性T細胞=CTLと命名される)、任意の細胞内局在のタンパク質から細胞内でプロセシングされ、MHCクラスI分子によって細胞表面に提示される9~10個のアミノ酸のペプチドを認識する。したがって、MHCクラスI分子の表面発現は、CTLに対する標的細胞の感受性を決定する上で重要な役割を果たす。
癌免疫療法においてしばしば遭遇する問題は、例えば癌のMHC依存性T細胞応答に対する耐性をもたらす、癌組織における免疫原性の低下である。このいわゆる「免疫回避」は、新生物細胞において遭遇する表現型の違いに基づいて理解することができる。例えば、腫瘍細胞は、抗原をプロセシングおよび提示する能力の低下を示し、T細胞、例えば自己T細胞を刺激する能力が低下しており、例えばIFNシグナル伝達の欠損に起因して、形質転換細胞に関連する免疫原性タンパク質の完全な下方制御、および/または白血球接着分子もしくは他の補助分子の発現の欠如もしくは低下、ならびに特定のMHCクラスIおよびクラスII対立遺伝子またはB2Mの選択的下方制御を示す。MHCの機能または発現の喪失は、単一MHC対立遺伝子の喪失、MHCハプロタイプの喪失または二対立遺伝子B2M遺伝子喪失による完全なMHCクラスI喪失によって引き起こされ得る。したがって、MHCの発現を喪失した腫瘍は、MHC依存性T細胞に基づく治療に対して耐性である。実際に、MHC機能の障害は、腫瘍細胞の重要な「免疫回避」機構の1つであり、したがってT細胞媒介免疫療法の適用を制限する。本発明によれば、MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌は、これらの免疫回避機構の1つ以上を獲得している可能性がある。
ゲノム不安定性は癌の顕著な特徴である。これは、腫瘍が進行し、適応し、治療に対する耐性を発現することを可能にする。宿主免疫系との相互作用は、所与の腫瘍細胞クローンが生存し、播種する能力を決定する。したがって、特に例えばMHC-I欠損腫瘍バリアントに対するT細胞免疫圧に起因する「選択」の過程は、自然なプロセスであり得る。ワクチン接種などの多くの治療法は耐性を選択し、したがって障害に有効に対処しない。癌細胞が、癌細胞標的化を切り替えることによって生じる代替選択圧を受ける治療が本明細書で開示される。この代替選択圧はまた、MHC依存性T細胞応答に対する耐性の発生を回避することを可能にする。
インターフェロン
インターフェロン(IFN)は、ウイルス、細菌、寄生虫などのいくつかの病原体、およびまた腫瘍細胞の存在に応答して、宿主細胞によって産生および放出されるシグナル伝達タンパク質の群である。典型的なシナリオでは、ウイルスに感染した細胞がインターフェロンを放出し、近くの細胞の抗ウイルス防御能を高める。
インターフェロン(IFN)は、ウイルス、細菌、寄生虫などのいくつかの病原体、およびまた腫瘍細胞の存在に応答して、宿主細胞によって産生および放出されるシグナル伝達タンパク質の群である。典型的なシナリオでは、ウイルスに感染した細胞がインターフェロンを放出し、近くの細胞の抗ウイルス防御能を高める。
インターフェロンがそれを介してシグナル伝達する受容体の種類に基づいて、インターフェロンは、典型的には3つのクラス:I型インターフェロン、II型インターフェロン、およびIII型インターフェロンに分けられる。
全てのI型インターフェロンは、IFNAR1鎖およびIFNAR2鎖からなるIFN-α/β受容体(IFNAR)として公知の特定の細胞表面受容体複合体に結合する。
ヒトに存在するI型インターフェロンは、IFNα、IFNβ、IFNε、IFNκおよびIFNωである。一般に、I型インターフェロンは、身体が、体内に侵入したウイルスを認識したときに産生される。それらは線維芽細胞および単球によって産生される。放出されると、I型インターフェロンは標的細胞上の特異的受容体に結合し、ウイルスがそのRNAおよびDNAを産生および複製するのを妨げるタンパク質の発現をもたらす。
IFNαタンパク質は、主に形質細胞様樹状細胞(pDC)によって産生される。それらは主にウイルス感染に対する自然免疫に関与する。それらの合成に関与する遺伝子は、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21と呼ばれる13のサブタイプに属する。これらの遺伝子は、9番染色体上のクラスタに一緒に見出される。
IFNβタンパク質は、線維芽細胞によって大量に産生される。それらは、主に自然免疫応答に関与する抗ウイルス活性を有する。2種類のIFNβ、すなわちIFNβ1とIFNβ3が記述されている。IFNβ1の天然型および組換え型は、抗ウイルス、抗菌、および抗癌特性を有する。
II型インターフェロン(ヒトにおけるIFNγ)は、免疫インターフェロンとしても公知であり、IL12によって活性化される。さらに、II型インターフェロンは、細胞傷害性T細胞およびTヘルパー細胞によって放出される。
III型インターフェロンは、IL10R2(CRF2-4とも呼ばれる)およびIFNLR1(CRF2-12とも呼ばれる)からなる受容体複合体を介してシグナル伝達する。I型およびII型IFNよりも最近発見されたが、最近の情報は、いくつかの種類のウイルスまたは真菌感染におけるIII型IFNの重要性を実証している。
一般に、I型およびII型インターフェロンは、免疫応答の調節および活性化を担う。
「自家」という用語は、同じ対象に由来するものを表すために使用される。例えば、「自家移植」は、同じ対象に由来する組織または器官の移植を指す。そのような手順は、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するので、有利である。
「同種異系」という用語は、同じ種の異なる個体に由来するものを表すために使用される。2つ以上の個体は、1つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。
「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体または組織、すなわち、一卵性双生児もしくは同じ近交系の動物、またはそれらの組織に由来するものを表すために使用される。
「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを表すために使用される。一例として、ある個体の骨髄を異なる個体に移入することは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
核酸
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、組換え生産された分子および化学合成された分子などのDNAおよびRNAを含むことを意図している。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。RNAは、インビトロ転写されたRNA(IVT RNA)または合成RNAを含む。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、組換え生産された分子および化学合成された分子などのDNAおよびRNAを含むことを意図している。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。RNAは、インビトロ転写されたRNA(IVT RNA)または合成RNAを含む。
核酸はベクターに含まれ得る。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、プラスミドベクター、コスミドベクター、λファージなどのファージベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)もしくはP1人工染色体(PAC)などの人工染色体ベクターを含む、当業者に公知の任意のベクターを含む。前記ベクターには、発現ベクターおよびクローニングベクターが含まれる。発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含み、一般に、所望のコード配列および特定の宿主生物(例えば細菌、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物)またはインビトロ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なDNA配列を含む。クローニングベクターは一般に、特定の所望のDNA断片を操作および増幅するために使用され、所望のDNA断片の発現に必要な機能的配列を欠いていてもよい。
本発明の全ての態様の一実施形態では、IL2をコードする核酸、または抗体をコードする核酸などの核酸は、処置された対象の細胞で発現されてIL2または抗体を提供する。本発明の全ての態様の一実施形態では、核酸は、対象の細胞において一過性に発現される。したがって、一実施形態では、核酸は細胞のゲノムに組み込まれない。本発明の全ての態様の一実施形態では、核酸はRNA、好ましくはインビトロ転写されたRNAである。
本明細書に記載の核酸は、組換えおよび/または単離された分子であり得る。
本開示では、「RNA」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、RNAは、リボヌクレオチド残基の全てまたは大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β-D-リボフラノシル基の2'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。RNAは、限定されることなく、二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分的に精製されたRNAなどの単離されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換え生産されたRNA、ならびに1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および/または改変によって天然に存在するRNAとは異なる修飾RNAを包含する。そのような改変は、内部RNAヌクレオチドまたはRNAの末端(1つ以上)への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書では、RNA中のヌクレオチドは、化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることも企図される。本開示では、これらの改変されたRNAは、天然に存在するRNAの類似体と見なされる。
本開示の特定の実施形態では、RNAは、ペプチドまたはタンパク質をコードするRNA転写物に関連するメッセンジャRNA(mRNA)である。当技術分野で確立されているように、mRNAは一般に、5'非翻訳領域(5'-UTR)、ペプチドコード領域および3'非翻訳領域(3'-UTR)を含む。いくつかの実施形態では、RNAは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。一実施形態では、mRNAは、DNA鋳型を使用するインビトロ転写によって生成され、ここで、DNAは、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸を指す。
一実施形態では、RNAはインビトロ転写されたRNA(IVT-RNA)であり、適切なDNA鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のRNAポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのDNA鋳型は、核酸、特にcDNAをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。cDNAは、RNAの逆転写によって得られ得る。
一実施形態では、本明細書に記載のRNAは修飾ヌクレオシドを有し得る。いくつかの実施形態では、RNAは、少なくとも1つの(例えば全ての)ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
「プソイドウリジン」は、ウリジンの異性体である修飾ヌクレオシドの一例であり、ウラシルは、窒素-炭素グリコシド結合の代わりに炭素-炭素結合を介してペントース環に結合している。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のRNA中の1つ以上のウリジンは、修飾ヌクレオシドで置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。
いくつかの実施形態では、RNAは、少なくとも1つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、RNAは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン(ψ)、N1-メチルプソイドウリジン(m1ψ)および5-メチルウリジン(m5U)から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはプソイドウリジン(ψ)を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはN1-メチルプソイドウリジン(m1ψ)を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは5-メチルウリジン(m5U)を含む。いくつかの実施形態では、RNAは、2種類以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよく、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン(ψ)、N1-メチルプソイドウリジン(m1ψ)および5-メチルウリジン(m5U)から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン(ψ)およびN1-メチルプソイドウリジン(m1ψ)を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン(ψ)および5-メチルウリジン(m5U)を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、N1-メチルプソイドウリジン(m1ψ)および5-メチルウリジン(m5U)を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン(ψ)、N1-メチルプソイドウリジン(m1ψ)および5-メチルウリジン(m5U)を含む。
いくつかの実施形態では、RNA中の1つ以上のウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、3-メチルウリジン(m3U)、5-メトキシウリジン(mo5U)、5-アザウリジン、6-アザウリジン、2-チオ-5-アザウリジン、2-チオウリジン(s2U)、4-チオウリジン(s4U)、4-チオプソイドウリジン、2-チオプソイドウリジン、5-ヒドロキシウリジン(ho5U)、5-アミノアリルウリジン、5-ハロウリジン(例えば5-ヨードウリジンまたは5-ブロモウリジン)、ウリジン5-オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5-カルボキシメチルウリジン(cm5U)、1-カルボキシメチルプソイドウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジン(chm5U)、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-ウリジン(mcm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン(mcm5s2U)、5-アミノメチル-2-チオウリジン(nm5s2U)、5-メチルアミノメチル-ウリジン(mnm5U)、1-エチルプソイドウリジン、5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン(mnm5s2U)、5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン(mnm5se2U)、5-カルバモイルメチル-ウリジン(ncm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-ウリジン(cmnm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン(cmnm5s2U)、5-プロピニルウリジン、1-プロピニルプソイドウリジン、5-タウリノメチルウリジン(τm5U)、1-タウリノメチルプソイドウリジン、5-タウリノメチル-2-チオウリジン(τm5s2U)、1-タウリノメチル-4-チオプソイドウリジン、5-メチル-2-チオウリジン(m5s2U)、1-メチル-4-チオプソイドウリジン(m1s4ψ)、4-チオ-1-メチルプソイドウリジン、3-メチルプソイドウリジン(m3ψ)、2-チオ-1-メチルプソイドウリジン、1-メチル-1-デアザプソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザプソイドウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロプソイドウリジン、5,6-ジヒドロウリジン、5-メチルジヒドロウリジン(m5D)、2-チオジヒドロウリジン、2-チオジヒドロプソイドウリジン、2-メトキシウリジン、2-メトキシ-4-チオウリジン、4-メトキシプソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオプソイドウリジン、N1-メチルプソイドウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイドウリジン(acp3ψ)、5-(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5-(イソペンテニルアミノメチル)-2-チオウリジン(inm5s2U)、α-チオウリジン、2'-O-メチルウリジン(Um)、5,2'-O-ジメチルウリジン(m5Um)、2'-O-メチルプソイドウリジン(Ψm)、2-チオ-2'-O-メチルウリジン(s2Um)、5-メトキシカルボニルメチル-2'-O-メチルウリジン(mcm5Um)、5-カルバモイルメチル-2'-O-メチルウリジン(ncm5Um)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2'-O-メチルウリジン(cmnm5Um)、3,2'-O-ジメチルウリジン(m3Um)、5-(イソペンテニルアミノメチル)-2'-O-メチルウリジン(inm5Um)、1-チオウリジン、デオキシチミジン、2'-F-アラウリジン、2'-F-ウリジン、2'-OH-アラウリジン、5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジン、5-[3-(1-E-プロペニルアミノ)ウリジン、または当技術分野で公知の任意の他の修飾ウリジンのいずれか1つ以上であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示によるRNAは5'キャップを含む。一実施形態では、本開示のRNAは、キャップされていない5'-三リン酸を有さない。一実施形態では、RNAは5'キャップ類似体によって修飾され得る。「5'キャップ」という用語は、mRNA分子の5'末端に見出される構造を指し、一般に、5'-5'三リン酸結合によってmRNAに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは7位でメチル化されている。RNAに5'キャップまたは5'キャップ類似体を提供することは、5'キャップがRNA鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写によって達成され得るか、またはキャッピング酵素を使用して転写後にRNAに付加され得る。
いくつかの実施形態では、RNAのためのビルディングブロックキャップは、m2
7,3'-OGppp(m1
2'-O)ApG(時にm2
7,3'OG(5')ppp(5')m2'-OApGとも呼ばれる)であり、これは、以下の構造:
を有する。
いくつかの実施形態では、RNAは、一実施形態では、構造:
を有するキャップ類似体の抗逆方向キャップ(ARCAキャップ(m2
7,3'OG(5')ppp(5')G))を使用して、「キャップ0」構造で修飾される。
いくつかの実施形態では、本開示によるRNAは、5'-UTRおよび/または3'-UTRを含む。「非翻訳領域」または「UTR」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないDNA分子内の領域、またはmRNA分子などのRNA分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域(UTR)は、オープンリーディングフレームの5'側(上流)(5'-UTR)および/またはオープンリーディングフレームの3'側(下流)(3'-UTR)に存在し得る。5'-UTRは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の5'末端に位置する。5'-UTRは5'キャップ(存在する場合)の下流にあり、例えば5'キャップに直接隣接している。3'-UTRは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の3'末端に位置するが、「3'-UTR」という用語は、好ましくはポリ(A)配列を含まない。したがって、3'-UTRはポリ(A)配列(存在する場合)の上流にあり、例えばポリ(A)配列に直接隣接している。
いくつかの実施形態では、本開示によるRNAは3'-ポリ(A)配列を含む。本発明で使用される場合、「ポリ(A)配列」または「ポリA尾部」という用語は、典型的にはRNA分子の3'末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。ポリ(A)配列は当業者に公知であり、本明細書に記載のRNAの3'UTRに後続し得る。ポリ(A)配列は、任意の長さであり得る。いくつかの態様では、ポリ(A)配列は、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも80個、または少なくとも100個、および最大500個、最大400個、最大300個、最大200個、または最大150個までのヌクレオチド、特に約110個のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様では、ポリ(A)配列はAヌクレオチドのみからなる。いくつかの実施形態では、ポリ(A)配列は、本質的にAヌクレオチドからなるが、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2016/005324A1号に開示されているように、4つのヌクレオチド(A、C、G、およびU)のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、5~50、10~30、または10~20ヌクレオチドの長さであり得る。本質的にdAヌクレオチドからなるが、4つのヌクレオチド(dA、dC、dG、dT)が均等に分布し、例えば5~50ヌクレオチドの長さを有するランダムな配列によって中断されているDNAのコード鎖に存在するポリ(A)カセットは、DNAレベルでは、大腸菌(E.coli)におけるプラスミドDNAの一定な増殖を示し、RNAレベルでは、RNAの安定性と翻訳効率の支持に関して有益な特性と依然として関連している。いくつかの実施形態では、Aヌクレオチド以外のヌクレオチドは、その3'末端でポリ(A)配列に隣接していない、すなわち、ポリ(A)配列は、その3'末端でマスクされていないか、またはA以外のヌクレオチドが後続していない。
本開示の文脈において、「転写」という用語は、DNA配列中の遺伝暗号がRNAに転写されるプロセスに関する。その後、RNAはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、ある遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると呼ばれ得る。
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生体、細胞、組織または系からの、またはそれらの内部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生体、細胞、組織または系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳として定義される。
本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、2つ以上の要素または成分またはドメインの結合を指す。
サイトカイン
サイトカインは、細胞シグナル伝達に重要である小さなタンパク質(約5~20kDa)のカテゴリである。サイトカインの放出は、それらの周りの細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインは、免疫調節剤として自己分泌シグナル伝達、パラ分泌シグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子が含まれるが、一般にホルモンまたは成長因子は含まれない(用語が一部重複しているにもかかわらず)。サイトカインは、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球および肥満細胞のような免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞および様々な間質細胞を含む、幅広い細胞によって産生される。所与のサイトカインは、複数の種類の細胞によって産生され得る。サイトカインは受容体を介して作用し、免疫系において特に重要である;サイトカインは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答のバランスを調整し、特定の細胞集団の成熟、成長、および応答性を調節する。一部のサイトカインは、他のサイトカインの作用を複雑な方法で増強または阻害する。
サイトカインは、細胞シグナル伝達に重要である小さなタンパク質(約5~20kDa)のカテゴリである。サイトカインの放出は、それらの周りの細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインは、免疫調節剤として自己分泌シグナル伝達、パラ分泌シグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子が含まれるが、一般にホルモンまたは成長因子は含まれない(用語が一部重複しているにもかかわらず)。サイトカインは、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球および肥満細胞のような免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞および様々な間質細胞を含む、幅広い細胞によって産生される。所与のサイトカインは、複数の種類の細胞によって産生され得る。サイトカインは受容体を介して作用し、免疫系において特に重要である;サイトカインは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答のバランスを調整し、特定の細胞集団の成熟、成長、および応答性を調節する。一部のサイトカインは、他のサイトカインの作用を複雑な方法で増強または阻害する。
IL2
インターロイキン2(IL2)は、抗原活性化T細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー(NK)細胞を刺激するサイトカインである。IL2の生物学的活性は、細胞膜にまたがる3つのポリペプチドサブユニット:p55(IL2Rα、アルファサブユニット、ヒトではCD25としても公知)、p75(IL2Rβ、ベータサブユニット、ヒトではCD122としても公知)およびp64(IL2Rγ、ガンマサブユニット、ヒトではCD132としても公知)のマルチサブユニットIL2受容体複合体(IL2R)を介して媒介される。IL2に対するT細胞応答は、(1)IL2の濃度;(2)細胞表面上のIL2R分子の数;および(3)IL2が占有するIL2Rの数(すなわち、IL2とIL2Rの間の結合相互作用の親和性)を含む様々な因子に依存する(Smith,''Cell Growth Signal Transduction is Quantal''In Receptor Activation by Antigens,Cytokines,Hormones,and Growth Factors 766:263-271,1995))。IL2:IL2R複合体はリガンド結合時に内在化され、様々な成分が異なる選別を受ける。静脈内(i.v.)ボーラスとして投与された場合、IL2は急速な全身クリアランス(半減期が12.9分の初期クリアランス期、続いて半減期が85分のより遅いクリアランス期)を有する(Konrad et al.,Cancer Res.50:2009-2017,1990)。
インターロイキン2(IL2)は、抗原活性化T細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー(NK)細胞を刺激するサイトカインである。IL2の生物学的活性は、細胞膜にまたがる3つのポリペプチドサブユニット:p55(IL2Rα、アルファサブユニット、ヒトではCD25としても公知)、p75(IL2Rβ、ベータサブユニット、ヒトではCD122としても公知)およびp64(IL2Rγ、ガンマサブユニット、ヒトではCD132としても公知)のマルチサブユニットIL2受容体複合体(IL2R)を介して媒介される。IL2に対するT細胞応答は、(1)IL2の濃度;(2)細胞表面上のIL2R分子の数;および(3)IL2が占有するIL2Rの数(すなわち、IL2とIL2Rの間の結合相互作用の親和性)を含む様々な因子に依存する(Smith,''Cell Growth Signal Transduction is Quantal''In Receptor Activation by Antigens,Cytokines,Hormones,and Growth Factors 766:263-271,1995))。IL2:IL2R複合体はリガンド結合時に内在化され、様々な成分が異なる選別を受ける。静脈内(i.v.)ボーラスとして投与された場合、IL2は急速な全身クリアランス(半減期が12.9分の初期クリアランス期、続いて半減期が85分のより遅いクリアランス期)を有する(Konrad et al.,Cancer Res.50:2009-2017,1990)。
真核細胞では、ヒトIL2は153アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから20アミノ酸が除去されて成熟した分泌型IL2が生成される。組換えヒトIL2は、大腸菌、昆虫細胞および哺乳動物COS細胞において産生されている。
本開示によれば、IL2(任意で延長PK IL2の一部として)は、天然に存在するIL2またはその断片もしくはバリアントであり得る。IL2はヒトIL2であり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。本明細書で使用される場合、「ヒトIL2」または「野生型ヒトIL2」は、天然または組換えにかかわらず、タンパク質が大腸菌において細胞内画分として発現される場合に必然的に含まれる追加のN末端メチオニンを伴うまたは伴わない、天然ヒトIL2の通常存在する133アミノ酸配列(追加の20個のN末端アミノ酸からなるシグナルペプチドを除く)を有し、そのアミノ酸配列は、Fujita,et.al,PNAS USA,80,7437-7441(1983)に記載されている。
一実施形態では、IL2は、配列番号1または2のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、IL2の機能的バリアントは、配列番号1または2と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、IL2の機能的バリアントは、IL2受容体またはIL2受容体のサブユニット、例えばαサブユニットおよび/またはβ/γサブユニットに結合する。一般に、本開示の目的のために、本明細書で使用される「IL2」という用語は、状況によって矛盾しない限り、天然に存在するIL2部分またはその機能的バリアントを含む任意のポリペプチドを含む。
本開示によれば、特定の実施形態では、IL2は薬物動態修飾基に結合されている。以下、「延長薬物動態(PK)IL2」と呼ばれる、得られた分子は、遊離IL2と比較して延長された循環半減期を有する。延長PK IL2の延長された循環半減期は、インビボで血清IL2濃度が治療範囲内に維持されることを可能にし、潜在的に、T細胞を含む多くの種類の免疫細胞の活性化の増強をもたらす。その有利な薬物動態プロフィールのために、非修飾IL2と比較した場合、延長PK IL2はより少ない頻度で、より長期間投与することができる。
したがって、本明細書に記載の特定の実施形態では、IL2部分は、異種ポリペプチド(すなわちIL2ではなく、好ましくはIL2のバリアントではないポリペプチド)に融合され、したがって、延長PK IL2である。特定の実施形態では、延長PK IL2のIL2部分は、ヒトIL2である。他の実施形態では、延長PK IL2のIL2部分は、ヒトIL2の断片またはバリアントである。異種ポリペプチドは、IL2の循環半減期を増加させることができる。以下でさらに詳細に論じるように、循環半減期を増加させるポリペプチドは、ヒトまたはマウス血清アルブミンなどの血清アルブミンであり得る。
IL15
IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を含む本明細書に開示される実施形態では、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに加えて、またはその代わりに、IL15もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL15もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用し得る。
IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を含む本明細書に開示される実施形態では、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに加えて、またはその代わりに、IL15もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL15もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用し得る。
インターロイキン15(IL15)は、インターロイキン2(IL2)と構造的類似性を有するサイトカインである。IL2と同様に、IL15は、IL-2/IL-15受容体ベータ鎖(CD122)および共通ガンマ鎖(ガンマ-C、CD132)から構成される複合体に結合し、それを介してシグナル伝達する。IL15は、ナチュラルキラー細胞の細胞増殖を誘導する。
延長PK基
本明細書に記載のIL2ポリペプチドは、IL2部分と異種ポリペプチド(すなわちIL2またはそのバリアントではないポリペプチド)を含む融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製することができる。IL2は延長PK基に融合され得、これは循環半減期を増加させる。延長PK基の非限定的な例を以下で説明する。サイトカインまたはそのバリアントの循環半減期を増加させる他のPK基もまた、本開示に適用可能であることが理解されるべきである。特定の実施形態では、延長PK基は、血清アルブミンドメイン(例えばマウス血清アルブミン、ヒト血清アルブミン)である。
本明細書に記載のIL2ポリペプチドは、IL2部分と異種ポリペプチド(すなわちIL2またはそのバリアントではないポリペプチド)を含む融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製することができる。IL2は延長PK基に融合され得、これは循環半減期を増加させる。延長PK基の非限定的な例を以下で説明する。サイトカインまたはそのバリアントの循環半減期を増加させる他のPK基もまた、本開示に適用可能であることが理解されるべきである。特定の実施形態では、延長PK基は、血清アルブミンドメイン(例えばマウス血清アルブミン、ヒト血清アルブミン)である。
本明細書で使用される場合、「PK」という用語は、「薬物動態」の頭字語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝、および排泄を含む化合物の特性を包含する。本明細書で使用される場合、「延長PK基」は、生物学的に活性な分子に融合されるかまたは生物学的に活性な分子と一緒に投与された場合、生物学的に活性な分子の循環半減期を増加させるタンパク質、ペプチド、または部分を指す。延長PK基の例には、血清アルブミン(例えばHSA)、免疫グロブリンFcまたはFc断片およびそのバリアント、トランスフェリンおよびそのバリアント、ならびにヒト血清アルブミン(HSA)バインダー(米国特許出願公開第2005/0287153号および同第2007/0003549号に開示されている)が含まれる。他の例示的な延長PK基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kontermann,Expert Opin Biol Ther,2016 Jul;16(7):903-15に開示されている。本明細書で使用される場合、「延長PKサイトカイン」は、延長PK基と組み合わせたサイトカイン部分を指す。一実施形態では、延長PKサイトカインは、サイトカイン部分が延長PK基に連結または融合されている融合タンパク質である。本明細書で使用される場合、「延長PK IL」は、延長PK基と組み合わせたインターロイキン(IL)部分(ILバリアント部分を含む)を指す。一実施形態では、延長PK ILは、IL部分が延長PK基に連結または融合されている融合タンパク質である。例示的な融合タンパク質は、IL2部分がHSAと融合されているHSA/IL2融合物である。
特定の実施形態では、延長PK ILの血清半減期は、IL単独(すなわち、延長PK基に融合されていないIL)と比較して増加している。特定の実施形態では、延長PK ILの血清半減期は、IL単独の血清半減期と比較して少なくとも20、40、60、80、100、120、150、180、200、400、600、800、または1000%長い。特定の実施形態では、延長PK ILの血清半減期は、IL単独の血清半減期より少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍、または50倍長い。特定の実施形態では、延長PK ILの血清半減期は、少なくとも10時間、15時間、20時間、25時間、30時間、35時間、40時間、50時間、60時間、70時間、80時間、90時間、100時間、110時間、120時間、130時間、135時間、140時間、150時間、160時間、または200時間である。
本明細書で使用される場合、「半減期」は、ペプチドまたはタンパク質などの化合物の血清または血漿濃度が、例えば分解および/または天然の機構によるクリアランスもしくは隔離のために、インビボで50%減少するのに要する時間を指す。本明細書での使用に適した延長PKインターロイキン(IL)などの延長PKサイトカインは、インビボで安定化されており、その半減期は、例えば、分解および/またはクリアランスもしくは隔離に抵抗する血清アルブミン(例えばHSAまたはMSA)への融合によって増加している。半減期は、薬物動態分析などによる、それ自体公知の任意の方法で決定することができる。適切な技術は当業者に明らかであり、例えば一般に、適切な用量のアミノ酸配列または化合物を対象に適切に投与する工程;前記対象から定期的な間隔で血液試料または他の試料を収集する工程;前記血液試料中のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程;およびこのようにして得られたデータ(のプロット)から、アミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投与時の初期レベルと比較して50%低下するまでの時間を計算する工程を含み得る。さらなる詳細は、例えば、Kenneth,A.et al.,Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacistsなどの標準的なハンドブックおよびPeters et al.,Pharmacokinetic Analysis:A Practical Approach(1996)に提供されている。Gibaldi,M.et al.,Pharmacokinetics,2nd Rev.Edition,Marcel Dekker(1982)も参照されたい。
特定の実施形態では、延長PK基は、血清アルブミンもしくはその断片、または血清アルブミンもしくはその断片のバリアント(本開示の目的のために、それらの全てが「アルブミン」という用語に含まれる)を含む。本明細書に記載されるポリペプチドは、アルブミン(またはその断片もしくはバリアント)に融合されてアルブミン融合タンパク質を形成し得る。そのようなアルブミン融合タンパク質は、米国特許出願公開第20070048282号に記載されている。
本明細書で使用される場合、「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも1分子のアルブミン(またはその断片もしくはバリアント)と、治療用タンパク質、特にIL2(またはそのバリアント)などの少なくとも1分子のタンパク質との融合によって形成されるタンパク質を指す。アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、アルブミンをコードするポリヌクレオチドとインフレームで結合している核酸の翻訳によって生成され得る。治療用タンパク質およびアルブミンは、ひとたびアルブミン融合タンパク質の一部になると、それぞれ、アルブミン融合タンパク質の「一部」、「領域」または「部分」(例えば、「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」)と呼ばれ得る。非常に好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、少なくとも1分子の治療用タンパク質(治療用タンパク質の成熟形態を含むがこれに限定されない)および少なくとも1分子のアルブミン(アルブミンの成熟形態を含むがこれに限定されない)を含む。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、投与されたRNAの標的器官の細胞、例えば肝細胞などの宿主細胞によってプロセシングされ、循環中に分泌される。RNAの発現に使用される宿主細胞の分泌経路で起こる新生アルブミン融合タンパク質のプロセシングには、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合の形成、適切な折り畳み、炭水化物の付加とプロセシング(例えばN-結合型およびO-結合型グリコシル化など)、特異的タンパク質分解切断、ならびに/または多量体タンパク質へのアセンブリが含まれ得るが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、特にそのN末端にシグナルペプチドを有するプロセシングされていない形態のRNAによってコードされ、細胞による分泌後、好ましくは、特にシグナルペプチドが切断された、プロセシングされた形態で存在する。最も好ましい実施形態では、「アルブミン融合タンパク質のプロセシングされた形態」は、本明細書では「成熟アルブミン融合タンパク質」とも呼ばれる、N末端シグナルペプチド切断を受けたアルブミン融合タンパク質産物を指す。
好ましい実施形態では、治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない場合の同じ治療用タンパク質の血漿安定性と比較して、より高い血漿安定性を有する。血漿安定性は、典型的には、治療用タンパク質がインビボで投与され、血流中に運ばれたときから、治療用タンパク質が分解され、血流から腎臓または肝臓などの臓器へと除去され、最終的に治療用タンパク質が体内から除去されるときまでの期間を指す。血漿安定性は、血流中の治療用タンパク質の半減期に関して計算される。血流中の治療用タンパク質の半減期は、当技術分野で公知の一般的なアッセイによって容易に決定することができる。
本明細書で使用される場合、「アルブミン」は、アルブミンの1つ以上の機能的活性(例えば生物学的活性)を有する、アルブミンタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくはバリアントを集合的に指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはその断片もしくはバリアント、特にヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子のバリアントを指す。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンには、雌鶏およびサケが含まれるが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療用タンパク質部分とは異なる動物に由来し得る。
特定の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン(HSA)、またはその断片もしくはバリアント、例えば米国特許第5,876,969号、国際公開第2011/124718号、国際公開第2013/075066号、および国際公開第2011/0514789号に開示されているものである。
ヒト血清アルブミン(HSA)およびヒトアルブミン(HA)という用語は、本明細書では互換的に使用される。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語はより広範であり、ヒト血清アルブミン(ならびにその断片およびバリアント)ならびに他の種由来のアルブミン(ならびにその断片およびバリアント)を包含する。
本明細書で使用される場合、治療用タンパク質の治療活性または血漿安定性を延長するのに十分なアルブミンの断片は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の血漿安定性が非融合状態での血漿安定性と比較して延長または拡大されるように、タンパク質の治療活性または血漿安定性を安定化または延長するのに十分な長さまたは構造のアルブミン断片を指す。
アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、アルブミン配列の全長を含み得るか、または治療活性もしくは血漿安定性を安定化もしくは延長することができるその1つ以上の断片を含み得る。そのような断片は、10個以上のアミノ酸長であり得るか、またはアルブミン配列からの約15、20、25、30、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を含み得るか、またはアルブミンの特定のドメインの一部もしくは全部を含み得る。例えば、最初の2つの免疫グロブリン様ドメインにまたがるHSAの1つ以上の断片を使用し得る。好ましい実施形態では、HSA断片は、HSAの成熟形態である。
一般的に言えば、アルブミン断片またはバリアントは、少なくとも100アミノ酸長、好ましくは少なくとも150アミノ酸長である。
本開示によれば、アルブミンは、天然に存在するアルブミンまたはその断片もしくはバリアントであり得る。アルブミンは、ヒトアルブミンであり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。一実施形態では、アルブミンは、配列番号3もしくは4のアミノ酸配列または配列番号3もしくは4と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、アルブミン融合タンパク質は、N末端部分としてアルブミンを含み、C末端部分として治療用タンパク質を含む。あるいは、C末端部分としてアルブミンを含み、N末端部分として治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質も使用し得る。他の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのN末端とC末端の両方に融合した治療用タンパク質を有する。好ましい実施形態では、N末端およびC末端で融合した治療用タンパク質は、同じ治療用タンパク質である。別の好ましい実施形態では、N末端およびC末端で融合した治療用タンパク質は、異なる治療用タンパク質である。一実施形態では、異なる治療用タンパク質は両方ともサイトカインである。
一実施形態では、治療用タンパク質(1つ以上)は、ペプチドリンカー(1つ以上)を介してアルブミンに結合されている。融合部分の間のリンカーペプチドは、部分間のより大きな物理的分離を提供し、したがって、例えばその同族受容体に結合するための治療用タンパク質部分のアクセス可能性を最大化し得る。リンカーペプチドは、それが柔軟であるかまたはより剛性であるようにアミノ酸で構成され得る。リンカー配列は、プロテアーゼによってまたは化学的に切断可能であり得る。
本明細書で使用される場合、「Fc領域」という用語は、天然免疫グロブリンの2本の重鎖のそれぞれのFcドメイン(またはFc部分)によって形成される天然免疫グロブリンの部分を指す。本明細書で使用される場合、「Fcドメイン」という用語は、FcドメインがFvドメインを含まない単一の免疫グロブリン(Ig)重鎖の一部または断片を指す。特定の実施形態では、Fcドメインは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のC末端で終わる。したがって、完全なFcドメインは、少なくともヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む。特定の実施形態では、Fcドメインは、ヒンジ(例えば上部、中間および/もしくは下部ヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、またはそのバリアント、部分もしくは断片の少なくとも1つを含む。特定の実施形態では、Fcドメインは、完全なFcドメイン(すなわち、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン)を含む。特定の実施形態では、Fcドメインは、CH3ドメイン(またはその一部)に融合したヒンジドメイン(またはその一部)を含む。特定の実施形態では、Fcドメインは、CH3ドメイン(またはその一部)に融合したCH2ドメイン(またはその一部)を含む。特定の実施形態では、Fcドメインは、CH3ドメインまたはその一部からなる。特定の実施形態では、Fcドメインは、ヒンジドメイン(またはその一部)およびCH3ドメイン(またはその一部)からなる。特定の実施形態では、Fcドメインは、CH2ドメイン(またはその一部)およびCH3ドメインからなる。特定の実施形態では、Fcドメインは、ヒンジドメイン(またはその一部)およびCH2ドメイン(またはその一部)からなる。特定の実施形態では、Fcドメインは、CH2ドメインの少なくとも一部(例えば、CH2ドメインの全部または一部)を欠く。本明細書におけるFcドメインは、一般に、免疫グロブリン重鎖のFcドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これには、CH1、ヒンジ、CH2、および/またはCH3ドメイン全体を含むポリペプチド、ならびに、例えばヒンジ、CH2、およびCH3ドメインのみを含むそのようなペプチドの断片が含まれるが、これらに限定されない。Fcドメインは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、またはIgM抗体を含むがこれらに限定されない、任意の種および/または任意のサブタイプの免疫グロブリンに由来し得る。Fcドメインは、天然のFcおよびFcバリアント分子を包含する。本明細書に記載されるように、任意のFcドメインを、アミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子の天然Fcドメインとは異なるように修飾し得ることは、当業者に理解されるであろう。特定の実施形態では、Fcドメインは、エフェクタ機能(例えばFcγR結合)が低下している。
本明細書に記載されるポリペプチドのFcドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのFcドメインは、IgG1分子に由来するCH2および/またはCH3ドメイン、ならびにIgG3分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、Fcドメインは、一部はIgG1分子に由来し、一部はIgG3分子に由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。別の例では、Fcドメインは、一部はIgG1分子に由来し、一部はIgG4分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。
特定の実施形態では、延長PK基は、Fcドメインもしくはその断片、またはFcドメインもしくはその断片のバリアント(本開示の目的のために、その全てが「Fcドメイン」という用語に含まれる)を含む。Fcドメインは、抗原に結合する可変領域を含まない。本開示での使用に適したFcドメインは、いくつかの異なる供給源から得られ得る。特定の実施形態では、Fcドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。特定の実施形態では、FcドメインはヒトIgG1定常領域に由来する。しかしながら、Fcドメインは、例えばげっ歯動物種(例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット)または非ヒト霊長動物(例えばチンパンジー、マカク)種を含む別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来してもよいことが理解される。
さらに、Fcドメイン(またはその断片もしくはバリアント)は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。
様々なFcドメイン遺伝子配列(例えば、マウスおよびヒト定常領域遺伝子配列)は、公的にアクセス可能な寄託物の形で入手可能である。特定のエフェクタ機能を欠く、および/または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するFcドメイン配列を含む定常領域ドメインを選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、適切なFcドメイン配列(例えばヒンジ、CH2、および/もしくはCH3配列、またはその断片もしくはバリアント)は、当技術分野で広く認められている技術を使用してこれらの配列から導くことができる。
特定の実施形態では、延長PK基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2005/0287153号、米国特許出願公開第2007/0003549号、米国特許出願公開第2007/0178082号、米国特許出願公開第2007/0269422号、米国特許出願公開第2010/0113339号、国際公開第2009/083804号、および国際公開第2009/133208号に記載されているものなどの血清アルブミン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長PK基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,176,278号および米国特許第8,158,579号に開示されているように、トランスフェリンである。特定の実施形態では、延長PK基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2007/0178082号、米国特許出願公開第2014/0220017号、および米国特許出願公開第2017/0145062号に開示されているものなどの血清免疫グロブリン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長PK基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2012/0094909号に開示されているものなどの、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン(Fn)ベースの足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質を作製する方法もまた、米国特許出願公開第2012/0094909号に開示されている。Fn3ベースの延長PK基の非限定的な例は、Fn3(HSA)、すなわち、ヒト血清アルブミンに結合するFn3タンパク質である。
特定の態様では、本開示による使用に適した延長PK ILは、1つ以上のペプチドリンカーを使用することができる。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列中の2つ以上のドメイン(例えば、延長PK部分およびIL2などのIL部分)を連結するペプチドまたはポリペプチド配列を指す。例えば、ペプチドリンカーを使用して、IL2部分をHSAドメインに連結し得る。
例えばIL2に延長PK基を融合するのに適したリンカーは、当技術分野で周知である。例示的なリンカーには、グリシン-セリンポリペプチドリンカー、グリシン-プロリンポリペプチドリンカー、およびプロリン-アラニンポリペプチドリンカーが含まれる。特定の実施形態では、リンカーは、グリシン-セリンポリペプチドリンカー、すなわち、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドである。
上記の異種ポリペプチドに加えて、またはその代わりに、本明細書に記載のIL2バリアントポリペプチドは、「マーカ」または「レポータ」をコードする配列を含むことができる。マーカまたはレポータ遺伝子の例には、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(HPH)、チミジンキナーゼ(TK)、β-ガラクトシダーゼ、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)が含まれる。
抗原
「抗原」という用語は、免疫応答または抗体などの免疫エフェクタ分子が向けられるおよび/または向けられるべきであるエピトープを含む作用物質に関する。「抗原」という用語には、特にタンパク質およびペプチドが含まれる。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原などの疾患関連抗原である。
「抗原」という用語は、免疫応答または抗体などの免疫エフェクタ分子が向けられるおよび/または向けられるべきであるエピトープを含む作用物質に関する。「抗原」という用語には、特にタンパク質およびペプチドが含まれる。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原などの疾患関連抗原である。
「疾患関連抗原」という用語は、好ましくは、宿主の免疫系を刺激して疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答および/または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含む、疾患に関連する任意の抗原を指すために、その最も広い意味で使用される。したがって、疾患関連抗原、そのエピトープ、または疾患関連抗原もしくはエピトープを標的とする薬剤は、治療目的に使用され得る。疾患関連抗原は、微生物、典型的には微生物抗原による感染に関連し得るか、または癌、典型的には腫瘍に関連し得る。
「腫瘍抗原」という用語は、細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得る癌細胞の成分を指す。特に、この用語は、細胞内でまたは腫瘍細胞上の表面抗原として産生される抗原を指す。腫瘍抗原は、典型的には癌細胞によって選択的に発現され(例えば、非癌細胞よりも癌細胞においてより高いレベルで発現される)、場合によっては、癌細胞によってのみ発現される。腫瘍抗原の例には、限定されることなく、p53、ART-4、BAGE、β-カテニン/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、クローディン6、クローディン18.2およびクローディン12などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap 100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(またはhTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A、好ましくはMAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、またはMAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/メランA、MC1R、ミオシン/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、pl90マイナーBCR-abL、Pml/RARa、PRAME、プロテイナーゼ3、PSA、PSM、RAGE、RU1またはRU2、SAGE、SART-1またはSART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、サバイビン、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE、WT、およびWT-1が含まれる。
「細胞表面に発現された」、「細胞表面と会合した」という用語または同様の用語は、抗原などの分子が細胞の形質膜と会合して位置し、分子の少なくとも一部が前記細胞の細胞外空間に面しており、例えば、細胞の外側に位置する抗体によって前記細胞の外側からアクセス可能であることを意味する。これに関連して、一部とは、好ましくは少なくとも4個、好ましくは少なくとも8個、好ましくは少なくとも12個、より好ましくは少なくとも20個のアミノ酸である。会合は、直接的または間接的であり得る。例えば、会合は、1つ以上の膜貫通ドメイン、1つ以上の脂質アンカーによるか、または他の任意のタンパク質、脂質、サッカリド、もしくは細胞の形質膜の外葉に見出され得る他の構造との相互作用によるものであり得る。例えば、細胞の表面と会合する分子は、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質であり得るか、または膜貫通タンパク質である別のタンパク質と相互作用することによって細胞の表面と会合するタンパク質であり得る。
「細胞表面」または「細胞の表面」は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、したがって、タンパク質および他の分子による結合にアクセス可能な細胞の外側を含む。
本発明の文脈における「細胞外部分」または「エキソドメイン」という用語は、細胞の細胞外空間に面しており、好ましくは、例えば細胞の外側に位置する抗体などの分子に結合することによって、前記細胞の外側からアクセス可能であるタンパク質などの分子の一部を指す。好ましくは、この用語は、1つ以上の細胞外ループもしくはドメインまたはその断片を指す。
「エピトープ」という用語は、分子中の抗原決定基、すなわち免疫系によって認識される抗原などの分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、T細胞、B細胞または抗体によって認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含み得、約5~約100、例えば約5~約50、より好ましくは約8~約30、最も好ましくは約10~約25アミノ酸長であり得、例えば、エピトープは、好ましくは9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25アミノ酸長であり得る。一実施形態では、エピトープは、約10~約25アミノ酸長である。「エピトープ」という用語は、B細胞エピトープおよびT細胞エピトープを含む。
「T細胞エピトープ」という用語は、MHC分子に関連して提示された場合にT細胞によって認識されるタンパク質の一部または断片を指す。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「MHC」という略語は、MHCクラスIおよびMHCクラスII分子を含み、全ての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。MHCタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、MHCタンパク質または分子はペプチドエピトープに結合し、T細胞上のT細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。MHCによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、自己抗原(細胞自体からのペプチド断片)および非自己抗原(例えば侵入微生物の断片)の両方をT細胞に表示する。クラスI MHC/ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約8~約10アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドも有効であり得る。クラスII MHC/ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約10~約25アミノ酸長であり、特に約13~約18アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドも有効であり得る。
治療用抗体
「治療用抗体」は、抗原、特に標的細胞、例えば癌細胞上の細胞表面抗原に結合して治療効果を生じさせることができる抗体である。治療用モノクローナル抗体は、腫瘍選択的抗原またはエピトープを標的とすることによって腫瘍選択的治療を可能にするはずである医薬活性剤のクラスと考えられている。好ましい実施形態では、治療用抗体は腫瘍または癌抗原を標的とする。
「治療用抗体」は、抗原、特に標的細胞、例えば癌細胞上の細胞表面抗原に結合して治療効果を生じさせることができる抗体である。治療用モノクローナル抗体は、腫瘍選択的抗原またはエピトープを標的とすることによって腫瘍選択的治療を可能にするはずである医薬活性剤のクラスと考えられている。好ましい実施形態では、治療用抗体は腫瘍または癌抗原を標的とする。
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも2本の重(H)鎖と2本の軽(L)鎖を含む糖タンパク質を指し、その抗原結合部分を含む任意の分子を含む。「抗体」という用語は、限定されることなく、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、例えばscFvならびにFabおよびFab'断片などの抗原結合抗体断片を含むモノクローナル抗体および抗体の断片または誘導体、すなわち抗体に由来する構築物を含み、また、抗体の全ての組換え形態、例えば原核生物で発現される抗体、非グリコシル化抗体、ならびに本明細書に記載される任意の抗原結合抗体断片および誘導体も含む。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)と重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)と軽鎖定常領域からなる。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各VHおよびVLは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された3つのCDRと4つのFRで構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えばエフェクタ細胞)および古典的補体系の第1成分(C1q)を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本明細書に記載の抗体はヒト抗体であり得る。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本明細書に記載されるヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えばインビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異)を含み得る。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を指し、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および/または配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメイン、または可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域(CDR)のみを含み得る。抗原結合部位は野生型であってもよく、または1つ以上のアミノ酸置換によって改変されていてもよく、例えばヒト免疫グロブリンにより類似するように改変されていてもよい。ヒト化抗体のいくつかの形態は、全てのCDR配列を保存する(例えばマウス抗体からの6つ全てのCDRを含むヒト化マウス抗体)。他の形態は、元の抗体に対して変化した1つ以上のCDRを有する。
「キメラ抗体」という用語は、重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列の一部が、特定の種に由来するまたは特定のクラスに属する抗体の対応する配列と相同であり、一方、鎖の残りのセグメントは別の種またはクラスの抗体の対応する配列と相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物の1つの種に由来する抗体の可変領域を模倣し、一方、定常部分は別の種に由来する抗体の配列と相同である。そのようなキメラ形態の1つの明らかな利点は、可変領域が、例えばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて、容易に入手可能な非ヒト宿主生物由来のB細胞またはハイブリドーマを使用して現在公知の供給源から好都合に誘導できることである。可変領域には調製が容易であるという利点があり、その特異性は供給源に影響されないが、ヒトである定常領域は、抗体を注入した場合に非ヒト供給源由来の定常領域よりもヒト対象から免疫応答を誘発する可能性が低い。しかし、定義はこの特定の例に限定されない。
抗体の「抗原結合部分」(もしくは単に「結合部分」)または抗体の「抗原結合断片」(もしくは単に「結合断片」)という用語または同様の用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、(i)VL、VH、CLおよびCHドメインからなる一価断片である、Fab断片;(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片である、F(ab')2断片;(iii)VHドメインとCHドメインからなるFd断片;(iv)抗体の1本の腕のVLドメインとVHドメインからなるFv断片;(v)VHドメインからなる、dAb断片(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546);(vi)単離された相補性決定領域(CDR)、ならびに(vii)任意で合成リンカーによって連結されていてもよい2つ以上の単離されたCDRの組合せが含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメイン、VLとVHは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、VL領域とVH領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖(一本鎖Fv(scFv)として公知;例えば、Bird et al.(1988)Science 242:423-426;およびHuston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883を参照)としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて連結することができる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合断片」という用語に包含されることが意図されている。さらなる例は、(i)免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、(ii)ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH2定常領域、および(iii)CH2定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH3定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であり得る。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、さらに米国特許出願公開第2003/0118592号および同第2003/0133939号に開示されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
「二重特異性分子」という用語は、2つの異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むことを意図している。例えば、分子は、(a)細胞表面抗原、および(b)エフェクタ細胞の表面上のFc受容体に結合し得るか、またはそれらと相互作用し得る。「多重特異性分子」または「異種特異性分子」という用語は、3つ以上の異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むことを意図している。例えば、分子は、(a)細胞表面抗原、(b)エフェクタ細胞の表面上のFc受容体、および(c)少なくとも1つの他の成分に結合し得るか、またはそれらと相互作用し得る。したがって、本発明は、腫瘍抗原、およびエフェクタ細胞上のFc受容体などの他の標的に対する二重特異性、三重特異性、四重特異性、および他の多重特異性分子を含むが、これらに限定されない。「二重特異性抗体」という用語はまた、2つの異なる結合特異性を有する三価抗体、2つまたは3つの異なる結合特異性を有する四価抗体などの多価抗体を含む。「二重特異性抗体」という用語は、ダイアボディも含む。ダイアボディは、VHおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによってドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、2つの抗原結合部位を作り出す二価二重特異性抗体である(例えば、Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123を参照)。
抗体は、細胞毒、薬物(例えば免疫抑制剤)または放射性同位体などの治療部分または治療薬にコンジュゲートされ得る。細胞毒または細胞傷害剤には、細胞に有害であり、特に細胞を死滅させる任意の薬剤が含まれる。例には、メイタンシン(例えばメルタンシン、ラブタンシンまたはエムタンシン)、アウリスタチン(モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE))、ドラスタチン、カリケアマイシン(例えばオゾガマイシン)、ピロロベンゾジアゼピン二量体(例えばテシリン、タイリン)、デュオカルマイシン(例えばデュオカルマイシンSA、CC-1065、デュオカルマジン)およびα-アマニチン、イリノテカンまたはその誘導体SN-38、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体またはホモログ、代謝拮抗剤(例えばメトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えばメクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCおよびシス-ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えばダウノルビシン(以前のダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えばダクチノマイシン(以前のアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、ならびに有糸分裂阻害剤(例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン)が含まれる。好ましい実施形態では、治療薬は、細胞傷害剤または放射性毒性剤である。別の実施形態では、治療薬は免疫抑制剤である。さらに別の実施形態では、治療薬はGM-CSFである。好ましい実施形態では、治療薬は、ドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドまたはリシンAである。
抗体を放射性同位体、例えばヨウ素131、イットリウム90またはインジウム111にコンジュゲートさせて、細胞傷害性放射性医薬品を生成することもできる。
本発明の抗体コンジュゲートは、所与の生物学的応答を改変するために使用することができ、薬物部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素、もしくはその活性断片;腫瘍壊死因子もしくはインターフェロンγなどのタンパク質;または、例えばリンホカイン、インターロイキン1(「IL-1」)、インターロイキン2(「IL-2」)、インターロイキン6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」)、もしくは他の成長因子などの生物学的応答調節物質が含まれ得る。
そのような治療部分を抗体にコンジュゲートさせるための技術は周知であり、例えば、Arnon et al.,''Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy'',in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom et al.,''Antibodies For Drug Delivery'',in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,''Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review'',in Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinical Applications,Pincheraet al.(eds.),pp.475-506(1985);''Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy'',in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985)、およびThorpe et al.,''The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates'',Immunol.Rev.,62:119-58(1982)を参照。
本明細書で使用される場合、抗体が動物を免疫することによって、または免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングすることによって得られ、選択された抗体が生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも96%、97%、98%、または99%同一である場合、抗体は特定の生殖系列配列に「由来」する。典型的には、特定の生殖系列配列に由来する抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と10個以下のアミノ酸相違、より好ましくは5個以下、またはさらにより好ましくは4、3、2、または1個以下のアミノ酸相違を示す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロ抗体」という用語は、少なくとも2つが異なる特異性を有する、互いに連結された2つ以上の抗体、その誘導体、または抗原結合領域を指す。これらの異なる特異性には、エフェクタ細胞上のFc受容体に対する結合特異性、および標的細胞、例えば腫瘍細胞上の抗原またはエピトープに対する結合特異性が含まれる。
本明細書に記載の抗体はモノクローナル抗体であり得る。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、単一の結合特異性および親和性を示す。一実施形態では、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合した非ヒト動物、例えばマウスから得られたB細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
本明細書に記載の抗体は組換え抗体であり得る。本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、(a)免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルである動物(例えばマウス)から単離された抗体またはそれから作製されたハイブリドーマ、(b)抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、(c)組換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、および(d)免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって作製、発現、創製または単離された抗体などの、組換え手段によって作製、発現、創製または単離された全ての抗体を含む。
抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを含むがこれらに限定されない様々な種に由来し得る。
本明細書に記載の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれ、IgA1またはIgA2などのIgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM、およびIgD抗体が含まれる。様々な実施形態では、抗体は、IgG1抗体、より具体的にはIgG1カッパもしくはIgG1ラムダアイソタイプ(すなわちIgG1κ、IgG1λ)、IgG2a抗体(例えばIgG2aκ、IgG2aλ)、IgG2b抗体(例えばIgG2bκ、IgG2bλ)、IgG3抗体(例えばIgG3κ、IgG3λ)またはIgG4抗体(例えばIgG4κ、IgG4λ)である。
本明細書で使用される「トランスフェクトーマ」という用語は、CHO細胞、NS/0細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、植物細胞、または酵母細胞を含む真菌などの、抗体を発現する組換え真核生物宿主細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック生物に関して定義される。この用語は、トランスジェニック生物で構成されない生物で認められるものに対応するアミノ酸配列またはコード化核酸配列を有し、一般にトランスジェニック生物以外の種に由来する抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物起源の軽鎖および重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス軽鎖と結合したヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。
本発明は、本発明の目的のために「抗体」という用語に包含される、本明細書に記載の全ての抗体および抗体の誘導体を含む。「抗体誘導体」という用語は、抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の作用物質もしくは別の抗体とのコンジュゲート、または抗体断片を指す。
本明細書に記載の抗体は、好ましくは単離されている。本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体(例えば、腫瘍抗原に特異的に結合する単離された抗体は、腫瘍抗原以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)も含むことが意図されている。しかしながら、ヒト腫瘍抗原のエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに特異的に結合する単離された抗体は、他の関連する抗原、例えば他の種由来の抗原(例えば腫瘍抗原の種ホモログ)に対する交差反応性を有し得る。
本発明による「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。
本発明によれば、抗体は、標準的なアッセイにおいて所定の標的に対して有意な親和性を有し、前記所定の標的に結合する場合、前記所定の標的に結合することができる。「親和性」または「結合親和性」は、しばしば平衡解離定数(KD)によって測定される。好ましくは、「有意な親和性」という用語は、10-5M以下、10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下、または10-12M以下の解離定数(KD)で所定の標的に結合することを指す。
抗体は、標準的なアッセイにおいて標的に対して有意な親和性を有さず、前記標的に有意に結合しない、特に検出可能に結合しない場合、前記標的に(実質的に)結合することができない。好ましくは、抗体は、最大2μg/ml、好ましくは10μg/ml、より好ましくは20μg/ml、特に50μg/mlまたは100μg/ml以上の濃度で存在する場合、前記標的に検出可能に結合しない。好ましくは、抗体は、その抗体が結合することができる所定の標的への結合に関するKDよりも少なくとも10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、または106倍高いKDで前記標的に結合する場合、前記標的に対して有意な親和性を有さない。例えば、抗体が結合することができる標的への抗体の結合に関するKDが10-7Mである場合、抗体が有意な親和性を有さない標的への結合に関するKDは、少なくとも10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、または10-1Mである。
抗体は、所定の標的に結合することができるが、他の標的には結合することができない、すなわち標準的なアッセイにおいて他の標的に対して有意な親和性を有さず、他の標的に有意に結合しない場合、所定の標的に特異的である。本発明によれば、抗体は、腫瘍抗原に結合することができるが、他の標的には(実質的に)結合することができない場合、腫瘍抗原に特異的である。好ましくは、そのような他の標的に対する親和性および結合が、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、ヒト血清アルブミン(HSA)などの腫瘍抗原に無関係なタンパク質、またはMHC分子もしくはトランスフェリン受容体などの非腫瘍抗原膜貫通タンパク質、または任意の他の特定のポリペプチドに対する親和性または結合を有意に上回らない場合、抗体は腫瘍抗原に特異的である。好ましくは、抗体は、その抗体が特異的でない標的への結合に関するKDよりも少なくとも10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、または106倍低いKDで所定の標的に結合する場合、前記所定の標的に特異的である。例えば、抗体が特異的である標的への結合に関するKDが10-7Mである場合、抗体が特異的ではない標的への結合に関するKDは、少なくとも10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、または10-1Mである。
抗体の標的への結合は、任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる;例えば、Berzofsky et al.,''Antibody-Antigen Interactions''In Fundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press New York,N Y(1984)、Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company New York,N Y(1992)、および本明細書に記載の方法を参照。親和性は、従来の技術を使用して、例えば平衡透析によって;製造者が概説する一般的手順を用いてBIAcore 2000装置を使用することによって;放射性標識した標的抗原を用いる放射免疫測定法によって;または当業者に公知の別の方法によって、容易に決定し得る。親和性データは、例えば、Scatchard et al.,Ann N.Y.Acad.ScL,51:660(1949)の方法によって分析し得る。特定の抗体-抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件下で、例えば異なる塩濃度、pHの下で測定された場合、異なり得る。したがって、親和性および他の抗原結合パラメータ、例えばKD、IC50の測定は、好ましくは抗体および抗原の標準溶液、ならびに標準緩衝液を用いて行われる。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例えばIgMまたはIgG1)を指す。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプスイッチング」は、抗体のクラスまたはアイソタイプが、あるIgクラスから他のIgクラスの1つに変化する現象を指す。
本明細書で使用される「再編成された」という用語は、Vセグメントが、本質的に完全なVHまたはVLドメインをそれぞれコードする立体配座でD-JまたはJセグメントに直接隣接して位置する、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を指す。再編成された免疫グロブリン(抗体)遺伝子座は、生殖系列DNAとの比較によって同定することができる;再編成された遺伝子座は、少なくとも1つの組換え七量体/九量体相同エレメントを有する。
Vセグメントに関して本明細書で使用される「再編成されていない」または「生殖系列立体配置」という用語は、VセグメントがDまたはJセグメントに直接隣接するように組換えられていない立体配置を指す。
本発明によれば、抗腫瘍抗原抗体は、腫瘍抗原中に存在するエピトープ、好ましくは腫瘍抗原の細胞外ドメイン内に位置するエピトープに結合することができる抗体である。本発明によれば、抗腫瘍抗原抗体は、好ましくは腫瘍抗原に特異的な抗体である。好ましくは、抗腫瘍抗原抗体は、細胞表面上に発現される腫瘍抗原に結合する抗体である。特定の好ましい実施形態では、抗腫瘍抗原抗体は、生細胞の表面上に存在する腫瘍抗原の天然エピトープに結合する。好ましくは、抗体は癌細胞に結合し、非癌細胞には実質的に結合しない。好ましくは、腫瘍抗原を発現する細胞への抗腫瘍抗原抗体の結合は、腫瘍抗原を発現する細胞の死滅を誘導または媒介する。腫瘍抗原を発現する細胞は、好ましくは癌細胞である。好ましくは、抗体は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)媒介性溶解、抗体依存性細胞食作用(ADCP)媒介性溶解、補体依存性細胞傷害(CDC)媒介性溶解、アポトーシス、および腫瘍抗原を発現する細胞の増殖の阻害の1つ以上を誘導することによって細胞の死滅を誘導または媒介する。
好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗体は、以下の特性の1つ以上によって特徴付けることができる:
a)腫瘍抗原に対する特異性;
b)約100nM以下、好ましくは約5~10nM以下、より好ましくは約1~3nM以下の腫瘍抗原に対する結合親和性;
c)腫瘍抗原陽性細胞に対するADCCを誘導または媒介する能力;
d)腫瘍抗原陽性細胞に対するADCPを誘導または媒介する能力;
e)腫瘍抗原陽性細胞に対するCDCを誘導または媒介する能力;
f)腫瘍抗原陽性細胞の増殖を阻害する能力;
g)腫瘍抗原陽性細胞のアポトーシスを誘導する能力。
a)腫瘍抗原に対する特異性;
b)約100nM以下、好ましくは約5~10nM以下、より好ましくは約1~3nM以下の腫瘍抗原に対する結合親和性;
c)腫瘍抗原陽性細胞に対するADCCを誘導または媒介する能力;
d)腫瘍抗原陽性細胞に対するADCPを誘導または媒介する能力;
e)腫瘍抗原陽性細胞に対するCDCを誘導または媒介する能力;
f)腫瘍抗原陽性細胞の増殖を阻害する能力;
g)腫瘍抗原陽性細胞のアポトーシスを誘導する能力。
本明細書に記載される抗体は、好ましくは、好ましくはADCC、ADCPまたはCDCを介して免疫系の成分と相互作用する。本明細書に記載される抗体はまた、ペイロード(例えば放射性同位体、薬物または毒素)を標的化して腫瘍細胞を直接死滅させるために使用することができ、または従来の化学療法剤と共に使用することができ、Tリンパ球に対する化学療法剤の細胞傷害性副作用のために損なわれた可能性がある抗腫瘍免疫応答を含み得る相補的な作用機序を介して腫瘍を攻撃する。しかしながら、本明細書に記載される抗体はまた、単に細胞表面上の腫瘍抗原に結合することによって、したがって、例えば細胞の増殖を阻止することによって効果を発揮し得る。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)は、細胞傷害性顆粒の内容物の放出または細胞死誘導分子の発現を特徴とする、非食作用プロセスを介した細胞傷害性エフェクタ細胞による抗体被覆標的細胞の死滅である。ADCCは、同じく標的を溶解するが他の細胞を必要としない免疫補体系とは無関係である。ADCCは、標的結合抗体(IgGまたはIgAまたはIgEクラスに属する)と、免疫グロブリン(Ig)のFc領域に結合するエフェクタ細胞表面上に存在する糖タンパク質である特定のFc受容体(FcR)との相互作用によって引き起こされる。ADCCを媒介するエフェクタ細胞には、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球および樹状細胞が含まれる。ADCCは、その有効性が多くのパラメータ(標的細胞の表面上の抗原の密度および安定性;抗体親和性およびFcR結合親和性)に依存する迅速なエフェクタ機構である。治療用抗体に最も使用されているIgGサブクラスであるヒトIgG1が関与するADCCは、そのFc部分のグリコシル化プロフィールおよびFcγ受容体の多型に高度に依存する。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)は、細胞傷害性顆粒の内容物の放出または細胞死誘導分子の発現を特徴とする、非食作用プロセスを介した細胞傷害性エフェクタ細胞による抗体被覆標的細胞の死滅である。ADCCは、同じく標的を溶解するが他の細胞を必要としない免疫補体系とは無関係である。ADCCは、標的結合抗体(IgGまたはIgAまたはIgEクラスに属する)と、免疫グロブリン(Ig)のFc領域に結合するエフェクタ細胞表面上に存在する糖タンパク質である特定のFc受容体(FcR)との相互作用によって引き起こされる。ADCCを媒介するエフェクタ細胞には、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球および樹状細胞が含まれる。ADCCは、その有効性が多くのパラメータ(標的細胞の表面上の抗原の密度および安定性;抗体親和性およびFcR結合親和性)に依存する迅速なエフェクタ機構である。治療用抗体に最も使用されているIgGサブクラスであるヒトIgG1が関与するADCCは、そのFc部分のグリコシル化プロフィールおよびFcγ受容体の多型に高度に依存する。
抗体依存性細胞食作用(ADCP)
ADCPは、多くの抗体療法の重要な作用機序の1つである。これは、抗体が、そのFcドメインを食細胞上の特異的受容体に結合し、食作用を誘発することによって、結合した標的を排除する高度に調節されたプロセスとして定義される。ADCCとは異なり、ADCPは、FcγRIIa、FcγRIおよびFcγRIIIaを介して、単球、マクロファージ、好中球および樹状細胞によって媒介され得、そのうちのマクロファージ上のFcγRIIa(CD32a)が主要な経路である。
ADCPは、多くの抗体療法の重要な作用機序の1つである。これは、抗体が、そのFcドメインを食細胞上の特異的受容体に結合し、食作用を誘発することによって、結合した標的を排除する高度に調節されたプロセスとして定義される。ADCCとは異なり、ADCPは、FcγRIIa、FcγRIおよびFcγRIIIaを介して、単球、マクロファージ、好中球および樹状細胞によって媒介され得、そのうちのマクロファージ上のFcγRIIa(CD32a)が主要な経路である。
補体依存性細胞傷害(CDC)
CDCは、抗体によって指令され得る別の細胞死滅方法である。IgMは、補体活性化のための最も有効なアイソタイプである。IgG1およびIgG3も、古典的補体活性化経路を介してCDCを指令するのに非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原抗体複合体の形成は、IgG分子などの関与する抗体分子のCH2ドメインにごく近接する複数のC1q結合部位の露出をもたらす(C1qは補体C1の3つのサブコンポーネントの1つである)。好ましくは、これらの露出されたC1q結合部位は、それまでの低親和性のC1q-IgG相互作用を高アビディティのものに変換し、一連の他の補体タンパク質が関与する事象のカスケードを開始させ、エフェクタ細胞走化性/活性化物質C3aおよびC5aのタンパク質分解性放出をもたらす。好ましくは、補体カスケードは、細胞内および細胞外への水と溶質の自由な通過を促進する細胞膜の孔を作り出す、膜侵襲複合体の形成で終了する。
CDCは、抗体によって指令され得る別の細胞死滅方法である。IgMは、補体活性化のための最も有効なアイソタイプである。IgG1およびIgG3も、古典的補体活性化経路を介してCDCを指令するのに非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原抗体複合体の形成は、IgG分子などの関与する抗体分子のCH2ドメインにごく近接する複数のC1q結合部位の露出をもたらす(C1qは補体C1の3つのサブコンポーネントの1つである)。好ましくは、これらの露出されたC1q結合部位は、それまでの低親和性のC1q-IgG相互作用を高アビディティのものに変換し、一連の他の補体タンパク質が関与する事象のカスケードを開始させ、エフェクタ細胞走化性/活性化物質C3aおよびC5aのタンパク質分解性放出をもたらす。好ましくは、補体カスケードは、細胞内および細胞外への水と溶質の自由な通過を促進する細胞膜の孔を作り出す、膜侵襲複合体の形成で終了する。
本明細書に記載される抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばKohler and Milstein,Nature 256:495(1975)の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が原則として好ましいが、モノクローナル抗体を作製するための他の技術、例えば、Bリンパ球のウイルスもしくは発癌性形質転換、または抗体遺伝子のライブラリを用いるファージディスプレイ技術を使用することができる。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は十分に確立された手順である。免疫化プロトコルおよび融合のために免疫化された脾細胞を単離するための技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー(例えばマウス骨髄腫細胞)および融合手順も公知である。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための他の好ましい動物系は、ラットおよびウサギの系である(例えばSpieker-Polet et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:9348(1995)に記載されており、またRossi et al.,Am.J.Clin.Pathol.124:295(2005)も参照のこと)。
さらに別の好ましい実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウスを使用して生成することができる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソーマルマウスには、それぞれHuMAbマウスおよびKMマウスとして公知のマウスが含まれ、本明細書では集合的に「トランスジェニックマウス」と呼ばれる。そのようなトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の生産は、国際公開第2004 035607号においてCD20に関して詳述されているように実施することができる。
モノクローナル抗体を作製するためのさらに別の戦略は、定義された特異性の抗体を産生するリンパ球から抗体をコードする遺伝子を直接単離することであり、例えばBabcock et al.,1996;A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single,isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificitiesを参照。組換え抗体工学の詳細については、Welschof and Kraus,Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8およびBenny K.C.Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1も参照のこと。
抗体を作製するために、記載されるように、抗原配列、すなわちそれに対して抗体が向けられるべき配列に由来する担体結合ペプチド、組換え発現された抗原もしくはその断片の濃縮調製物、および/または抗原を発現する細胞でマウスを免疫することができる。あるいは、抗原またはその断片をコードするDNAでマウスを免疫することができる。抗原の精製または濃縮調製物を使用した免疫が抗体をもたらさない場合、免疫応答を促進するために抗原を発現する細胞、例えば細胞株でマウスを免疫することもできる。
尾静脈または眼窩後採血によって得られる血漿および血清試料を用いて、免疫プロトコルの経過にわたって免疫応答を監視することができる。免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合に使用することができる。犠死および脾臓の切除の3日前に抗原発現細胞を用いてマウスを腹腔内または静脈内に追加免疫して、特異的抗体を分泌するハイブリドーマの割合を増加させることができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫マウスの脾細胞およびリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合することができる。次に、得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。次いで、個々のウェルを、抗体を分泌するハイブリドーマについてELISAによってスクリーニングすることができる。抗原発現細胞を使用した免疫蛍光法およびFACS分析により、抗原に対する特異性を有する抗体を同定することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再度スクリーニングすることができ、モノクローナル抗体が依然として陽性である場合は、限界希釈によってサブクローニングすることができる。その後、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特性決定のために組織培養培地中で抗体を生成することができる。
抗体はまた、例えば当技術分野で周知の組換えDNA技術と遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて生産することもできる(Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。
例えば、一実施形態では、関心対象の遺伝子(1つ以上)、例えば抗体遺伝子を、国際公開第87/04462号、国際公開第89/01036号および欧州特許第338 841号に開示されているGS遺伝子発現系または当技術分野で周知の他の発現系によって使用されるような真核生物発現プラスミドなどの発現ベクターに連結することができる。クローニングした抗体遺伝子を含む精製プラスミドは、CHO細胞、NS/0細胞、HEK293T細胞またはHEK293細胞などの真核宿主細胞、あるいは植物由来細胞、真菌または酵母細胞のような他の真核細胞に導入することができる。これらの遺伝子を導入するために使用される方法は、エレクトロポレーション、リポフェクチン、リポフェクタミンなどの当技術分野で記述されている方法であり得る。宿主細胞にこれらの抗体遺伝子を導入した後、抗体を発現する細胞を同定し、選択することができる。これらの細胞はトランスフェクトーマであり、その後発現レベルを増幅し、抗体を生産するためにスケールアップすることができる。これらの培養上清および/または細胞から組換え抗体を単離および精製することができる。
あるいは、クローニングした抗体遺伝子は、微生物、例えば大腸菌などの原核細胞を含む他の発現系で発現させることができる。さらに、抗体は、ヒツジおよびウサギの乳もしくはニワトリの卵などのトランスジェニック非ヒト動物において、またはトランスジェニック植物において生産することができる;例えば、Verma,R.,et al.(1998)J.Immunol.Meth.216:165-181;Pollock,et al.(1999)J.Immunol.Meth.231:147-157;およびFischer,R.,et al.(1999)Biol.Chem.380:825-839を参照。
キメラ化
マウスモノクローナル抗体は、毒素または放射性同位体で標識された場合、ヒトにおける治療用抗体として使用することができる。非標識マウス抗体は、反復適用された場合、ヒトにおいて高度に免疫原性であり、治療効果の低下をもたらす。主な免疫原性は、重鎖定常領域によって媒介される。ヒトにおけるマウス抗体の免疫原性は、それぞれの抗体がキメラ化またはヒト化されている場合、低減するかまたは完全に回避することができる。キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種に由来する抗体であり、例えばマウス抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。抗体のキメラ化は、マウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をヒト重鎖および軽鎖の定常領域と連結することによって達成される(例えばKraus et al.,Methods in Molecular Biology series,Recombinant antibody for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8に記載されるように)。好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトκ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。同じく好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトλ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製できる。キメラ抗体の作製のための好ましい重鎖定常領域は、IgG1、IgG3およびIgG4である。キメラ抗体の作製のための他の好ましい重鎖定常領域は、IgG2、IgA、IgDおよびIgMである。
マウスモノクローナル抗体は、毒素または放射性同位体で標識された場合、ヒトにおける治療用抗体として使用することができる。非標識マウス抗体は、反復適用された場合、ヒトにおいて高度に免疫原性であり、治療効果の低下をもたらす。主な免疫原性は、重鎖定常領域によって媒介される。ヒトにおけるマウス抗体の免疫原性は、それぞれの抗体がキメラ化またはヒト化されている場合、低減するかまたは完全に回避することができる。キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種に由来する抗体であり、例えばマウス抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。抗体のキメラ化は、マウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をヒト重鎖および軽鎖の定常領域と連結することによって達成される(例えばKraus et al.,Methods in Molecular Biology series,Recombinant antibody for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8に記載されるように)。好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトκ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。同じく好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトλ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製できる。キメラ抗体の作製のための好ましい重鎖定常領域は、IgG1、IgG3およびIgG4である。キメラ抗体の作製のための他の好ましい重鎖定常領域は、IgG2、IgA、IgDおよびIgMである。
ヒト化
抗体は、主に6つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(CDR)に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由から、CDR内のアミノ酸配列は、CDR外の配列よりも個々の抗体間でより多様である。CDR配列はほとんどの抗体-抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特定の天然抗体からのCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann,L.et al.(1998)Nature 332:323-327;Jones,P.et al.(1986)Nature 321:522-525;およびQueen,C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033を参照)。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的なDNAデータベースから得ることができる。これらの生殖系列配列は、B細胞成熟の間にV(D)J結合によって形成される完全に構築された可変遺伝子を含まないため、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖系列遺伝子配列はまた、可変領域全体にわたって個々に均一に、高親和性二次レパートリ抗体の配列と異なる。
抗体は、主に6つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(CDR)に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由から、CDR内のアミノ酸配列は、CDR外の配列よりも個々の抗体間でより多様である。CDR配列はほとんどの抗体-抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特定の天然抗体からのCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann,L.et al.(1998)Nature 332:323-327;Jones,P.et al.(1986)Nature 321:522-525;およびQueen,C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033を参照)。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的なDNAデータベースから得ることができる。これらの生殖系列配列は、B細胞成熟の間にV(D)J結合によって形成される完全に構築された可変遺伝子を含まないため、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖系列遺伝子配列はまた、可変領域全体にわたって個々に均一に、高親和性二次レパートリ抗体の配列と異なる。
抗原に結合する抗体の能力は、標準的な結合アッセイ(例えばELISA、ウェスタンブロット、免疫蛍光およびフローサイトメトリ分析)を使用して決定することができる。
抗体を精製するために、選択したハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために2リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができる。あるいは、透析ベースのバイオリアクタで抗体を生産することができる。上清を濾過し、必要に応じて、プロテインG-セファロースまたはプロテインA-セファロースを用いたアフィニティクロマトグラフィの前に濃縮することができる。溶出したIgGは、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィによって確認して、純度を確実にすることができる。緩衝液をPBSに交換し、1.43の吸光係数を用いてOD280によって濃度を決定することができる。モノクローナル抗体をアリコートに分け、-80℃で保存することができる。
選択したモノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを決定するために、部位特異的または多部位特異的突然変異誘発を使用することができる。
抗体のアイソタイプを決定するために、様々な市販のキット(例えばZymed、Roche Diagnostics)を用いたアイソタイプELISAを実施することができる。マイクロタイタプレートのウェルを抗マウスIgで被覆することができる。ブロッキング後、プレートをモノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と周囲温度で2時間反応させる。次いで、ウェルをマウスIgG1、IgG2a、IgG2bもしくはIgG3、IgAまたはマウスIgM特異的ペルオキシダーゼ結合プローブのいずれかと反応させることができる。洗浄後、プレートをABTS基質(1mg/ml)で展開し、405~650のODで分析することができる。あるいは、製造者によって記載されるように、IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche、カタログ番号1493027)を使用し得る。
免疫マウスの血清中の抗体の存在または抗原を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を実証するために、フローサイトメトリを使用することができる。天然にまたはトランスフェクション後に抗原を発現する細胞株および抗原発現を欠く陰性対照(標準的な増殖条件下で増殖)を、ハイブリドーマ上清または1%FBSを含有するPBS中で様々な濃度のモノクローナル抗体と混合し、4℃で30分間インキュベートすることができる。洗浄後、APCまたはAlexa647標識抗IgG抗体を、一次抗体染色と同じ条件下で抗原結合モノクローナル抗体に結合することができる。試料は、単一の生細胞をゲートするために光および側方散乱特性を使用するFACS装置を用いたフローサイトメトリによって分析することができる。1回の測定で抗原特異的モノクローナル抗体を非特異的結合抗体から区別するために、同時トランスフェクションの方法を使用することができる。抗原と蛍光マーカをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした細胞を、上記のように染色することができる。トランスフェクトされた細胞は、抗体染色細胞とは異なる蛍光チャネルで検出することができる。トランスフェクト細胞の大部分が両方の導入遺伝子を発現するので、抗原特異的モノクローナル抗体は蛍光マーカ発現細胞に選択的に結合するが、非特異的抗体は非トランスフェクト細胞に同等の割合で結合する。フローサイトメトリアッセイに加えて、またはその代わりに、蛍光顕微鏡法を用いる代替アッセイを使用してもよい。上記のように細胞を正確に染色し、蛍光顕微鏡法によって検査することができる。
免疫マウスの血清中の抗体の存在、または抗原を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を実証するために、免疫蛍光顕微鏡分析を使用することができる。例えば、自発的にまたはトランスフェクション後に抗原を発現する細胞株および抗原発現を欠く陰性対照を、10%ウシ胎仔血清(FCS)、2mM L-グルタミン、100IU/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したDMEM/F12培地で標準的な増殖条件下に、チャンバスライド中で増殖させる。その後、細胞をメタノールもしくはパラホルムアルデヒドで固定するか、または未処理のままにすることができる。次に、細胞を抗原に対するモノクローナル抗体と25℃で30分間反応させることができる。洗浄後、細胞を同じ条件下でAlexa555標識抗マウスIgG二次抗体(Molecular Probes)と反応させることができる。その後、細胞を蛍光顕微鏡法によって検査することができる。
抗原を発現する細胞および適切な陰性対照からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に転写し、ブロックし、試験するモノクローナル抗体でプローブする。IgG結合は、抗マウスIgGペルオキシダーゼを使用して検出し、ECL基質で展開することができる。
抗体は、当業者に周知の方法で、例えば、通常の外科処置中に患者から得られた、または自発的にもしくはトランスフェクション後に抗原を発現する細胞株を接種した異種移植腫瘍を担持するマウスから得られた非癌組織または癌組織試料からの、パラホルムアルデヒドもしくはアセトン固定した凍結切片またはパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋組織切片を使用して、免疫組織化学によって抗原との反応性についてさらに試験することができる。免疫染色のために、抗原に反応性の抗体をインキュベートし、続いて販売者の指示に従ってホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ抗体(DAKO)をインキュベートすることができる。
抗体は、腫瘍抗原を発現する細胞の食作用および死滅を媒介する能力について試験することができる。インビトロでのモノクローナル抗体活性の試験は、インビボモデルを試験する前に初期スクリーニングを提供する。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC):
簡潔には、健常ドナー由来の多形核細胞(PMN)、NK細胞、単球、単核細胞または他のエフェクタ細胞を、Ficoll Hypaque密度遠心分離、続いて混入赤血球の溶解によって精製することができる。洗浄したエフェクタ細胞を、10%熱不活性化ウシ胎仔血清または5%熱不活性化ヒト血清を添加したRPMIに懸濁し、エフェクタ細胞対標的細胞の様々な比率で、腫瘍抗原を発現する51Cr標識標的細胞と混合することができる。あるいは、標的細胞は、蛍光増強リガンド(BATDA)で標識し得る。死細胞から放出される増強リガンドを有するユウロピウムの高蛍光キレートを蛍光光度計によって測定することができる。別の代替技術は、ルシフェラーゼによる標的細胞のトランスフェクションを利用し得る。添加したルシファーイエローは、その後、生細胞のみによって酸化され得る。次いで、精製抗腫瘍抗原IgGを様々な濃度で添加することができる。無関係なヒトIgGを陰性対照として使用することができる。アッセイは、使用するエフェクタ細胞の種類に応じて、37℃で4~20時間行うことができる。試料は、51Cr放出または培養上清中のEuTDAキレートの存在を測定することによって、細胞溶解についてアッセイすることができる。あるいは、ルシファーイエローの酸化から生じる発光は、生細胞の尺度であり得る。
簡潔には、健常ドナー由来の多形核細胞(PMN)、NK細胞、単球、単核細胞または他のエフェクタ細胞を、Ficoll Hypaque密度遠心分離、続いて混入赤血球の溶解によって精製することができる。洗浄したエフェクタ細胞を、10%熱不活性化ウシ胎仔血清または5%熱不活性化ヒト血清を添加したRPMIに懸濁し、エフェクタ細胞対標的細胞の様々な比率で、腫瘍抗原を発現する51Cr標識標的細胞と混合することができる。あるいは、標的細胞は、蛍光増強リガンド(BATDA)で標識し得る。死細胞から放出される増強リガンドを有するユウロピウムの高蛍光キレートを蛍光光度計によって測定することができる。別の代替技術は、ルシフェラーゼによる標的細胞のトランスフェクションを利用し得る。添加したルシファーイエローは、その後、生細胞のみによって酸化され得る。次いで、精製抗腫瘍抗原IgGを様々な濃度で添加することができる。無関係なヒトIgGを陰性対照として使用することができる。アッセイは、使用するエフェクタ細胞の種類に応じて、37℃で4~20時間行うことができる。試料は、51Cr放出または培養上清中のEuTDAキレートの存在を測定することによって、細胞溶解についてアッセイすることができる。あるいは、ルシファーイエローの酸化から生じる発光は、生細胞の尺度であり得る。
抗腫瘍抗原モノクローナル抗体を様々な組合せで試験して、複数のモノクローナル抗体で細胞溶解が増強されるかどうかを決定することもできる。
抗体依存性細胞食作用(ADCP):
簡潔には、古典的なADCPアッセイ形式は、末梢血単核細胞(PBMC)由来のマクロファージをエフェクタ細胞として使用することに基づく。新鮮なヒトPBMCの抽出後、単球を単離し、培養中にマクロファージに分化させることができる。食作用事象は、FACSスクリーニングを使用して分析することができ、用量依存曲線を作成してADCP効力を詳細に評価することができる。異なるドナー由来のエフェクタ細胞は、MHC拘束性のためにプールすることができない。したがって、ドナー特異的変動性を低減するために、一連のドナーからの試料を適用しなければならない。
簡潔には、古典的なADCPアッセイ形式は、末梢血単核細胞(PBMC)由来のマクロファージをエフェクタ細胞として使用することに基づく。新鮮なヒトPBMCの抽出後、単球を単離し、培養中にマクロファージに分化させることができる。食作用事象は、FACSスクリーニングを使用して分析することができ、用量依存曲線を作成してADCP効力を詳細に評価することができる。異なるドナー由来のエフェクタ細胞は、MHC拘束性のためにプールすることができない。したがって、ドナー特異的変動性を低減するために、一連のドナーからの試料を適用しなければならない。
補体依存性細胞傷害(CDC):
モノクローナル抗腫瘍抗原抗体は、様々な公知の技術を使用してCDCを媒介する能力について試験することができる。例えば、補体のための血清は、当業者に公知の方法で血液から得ることができる。mAbのCDC活性を決定するために、様々な方法を使用することができる。例えば51Cr放出を測定することができ、またはヨウ化プロピジウム(PI)排除アッセイを使用して膜透過性の上昇を評価することができる。簡潔には、標的細胞を洗浄することができ、5×105個/mlを様々な濃度のmAbと共に室温または37℃で10~30分間インキュベートすることができる。次いで、血清または血漿を20%(v/v)の最終濃度まで添加し、細胞を37℃で20~30分間インキュベートすることができる。各試料からの全ての細胞をFACSチューブ内のPI溶液に添加することができる。次いで、混合物を、FACSArrayを使用したフローサイトメトリ分析によって直ちに分析することができる。
モノクローナル抗腫瘍抗原抗体は、様々な公知の技術を使用してCDCを媒介する能力について試験することができる。例えば、補体のための血清は、当業者に公知の方法で血液から得ることができる。mAbのCDC活性を決定するために、様々な方法を使用することができる。例えば51Cr放出を測定することができ、またはヨウ化プロピジウム(PI)排除アッセイを使用して膜透過性の上昇を評価することができる。簡潔には、標的細胞を洗浄することができ、5×105個/mlを様々な濃度のmAbと共に室温または37℃で10~30分間インキュベートすることができる。次いで、血清または血漿を20%(v/v)の最終濃度まで添加し、細胞を37℃で20~30分間インキュベートすることができる。各試料からの全ての細胞をFACSチューブ内のPI溶液に添加することができる。次いで、混合物を、FACSArrayを使用したフローサイトメトリ分析によって直ちに分析することができる。
別のアッセイでは、CDCの誘導を接着細胞上で決定することができる。このアッセイの一実施形態では、細胞を、アッセイの24時間前に組織培養平底マイクロタイタプレートに3×104個/ウェルの密度で播種する。翌日、増殖培地を除去し、細胞を抗体と共に三連でインキュベートする。バックグラウンド溶解および最大溶解をそれぞれ決定するために、対照細胞を、増殖培地または0.2%サポニンを含有する増殖培地と共にインキュベートする。室温で20分間インキュベートした後、上清を除去し、DMEM(37℃に予熱)中20%(v/v)のヒト血漿または血清を細胞に添加し、37℃でさらに20分間インキュベートする。各試料からの全ての細胞をヨウ化プロピジウム溶液(10μg/ml)に添加する。次いで、上清を、2.5μg/mlの臭化エチジウムを含有するPBSと交換し、Tecan Safireを使用して520nmで励起した際の蛍光発光を600nmで測定する。特異的溶解パーセンテージを以下のように計算する:特異的溶解%=(蛍光試料-蛍光バックグラウンド)/(蛍光最大溶解-蛍光バックグラウンド)×100。
モノクローナル抗体によるアポトーシスの誘導および細胞増殖の阻害:
アポトーシスを開始する能力を試験するために、モノクローナル抗腫瘍抗原抗体を、例えば、腫瘍抗原陽性腫瘍細胞または腫瘍抗原トランスフェクト腫瘍細胞と共に37℃で約20時間インキュベートすることができる。細胞を回収し、アネキシンV結合緩衝液(BD biosciences)で洗浄し、FITCまたはAPCとコンジュゲートしたアネキシンV(BD biosciences)と共に暗所で15分間インキュベートすることができる。各試料からの全ての細胞をFACSチューブ内のPI溶液(PBS中10μg/ml)に添加し、フローサイトメトリによって直ちに評価することができる(上記のように)。あるいは、モノクローナル抗体による細胞増殖の一般的な阻害は、市販のキットを用いて検出することができる。DELFIA Cell Proliferation Kit(Perkin-Elmer、カタログ番号AD0200)は、マイクロプレート中の増殖細胞のDNA合成中の5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)取り込みの測定に基づく非同位体イムノアッセイである。取り込まれたBrdUは、ユウロピウム標識モノクローナル抗体を使用して検出される。抗体検出を可能にするために、細胞を固定し、Fix溶液を使用してDNAを変性させる。結合していない抗体を洗い流し、DELFIA誘導剤を添加してユウロピウムイオンを標識抗体から溶液中に解離させ、溶液中でそれらはDELFIA誘導剤の成分と高度に蛍光性のキレートを形成する。検出において時間分解蛍光測定法を利用して測定される蛍光は、各ウェルの細胞におけるDNA合成に比例する。
アポトーシスを開始する能力を試験するために、モノクローナル抗腫瘍抗原抗体を、例えば、腫瘍抗原陽性腫瘍細胞または腫瘍抗原トランスフェクト腫瘍細胞と共に37℃で約20時間インキュベートすることができる。細胞を回収し、アネキシンV結合緩衝液(BD biosciences)で洗浄し、FITCまたはAPCとコンジュゲートしたアネキシンV(BD biosciences)と共に暗所で15分間インキュベートすることができる。各試料からの全ての細胞をFACSチューブ内のPI溶液(PBS中10μg/ml)に添加し、フローサイトメトリによって直ちに評価することができる(上記のように)。あるいは、モノクローナル抗体による細胞増殖の一般的な阻害は、市販のキットを用いて検出することができる。DELFIA Cell Proliferation Kit(Perkin-Elmer、カタログ番号AD0200)は、マイクロプレート中の増殖細胞のDNA合成中の5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)取り込みの測定に基づく非同位体イムノアッセイである。取り込まれたBrdUは、ユウロピウム標識モノクローナル抗体を使用して検出される。抗体検出を可能にするために、細胞を固定し、Fix溶液を使用してDNAを変性させる。結合していない抗体を洗い流し、DELFIA誘導剤を添加してユウロピウムイオンを標識抗体から溶液中に解離させ、溶液中でそれらはDELFIA誘導剤の成分と高度に蛍光性のキレートを形成する。検出において時間分解蛍光測定法を利用して測定される蛍光は、各ウェルの細胞におけるDNA合成に比例する。
前臨床試験
腫瘍抗原に結合するモノクローナル抗体はまた、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞の増殖の制御におけるそれらの有効性を決定するために、インビボモデル(例えば腫瘍抗原を発現する、またはトランスフェクション後に腫瘍抗原を発現する細胞株、例えばHEK293を接種した異種移植腫瘍を担持する免疫不全マウス)で試験することができる。
腫瘍抗原に結合するモノクローナル抗体はまた、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞の増殖の制御におけるそれらの有効性を決定するために、インビボモデル(例えば腫瘍抗原を発現する、またはトランスフェクション後に腫瘍抗原を発現する細胞株、例えばHEK293を接種した異種移植腫瘍を担持する免疫不全マウス)で試験することができる。
腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞を免疫不全マウスまたは他の動物に異種移植した後のインビボ試験は、本明細書に記載される抗体を使用して実施することができる。抗体を腫瘍のないマウスに投与し、続いて腫瘍細胞を注射して、腫瘍の形成または腫瘍関連症状を予防する抗体の効果を測定することができる。抗体を腫瘍担持マウスに投与して、腫瘍増殖、転移または腫瘍関連症状を低減するそれぞれの抗体の治療効果を決定することができる。抗体適用は、併用の有効性および潜在的な毒性を決定するために、免疫チェックポイント阻害剤、細胞増殖抑制薬、増殖因子阻害剤、細胞周期遮断薬、血管新生阻害剤または他の抗体としての他の物質の適用と組み合わせることができる。抗体によって媒介される毒性副作用を分析するために、動物に抗体または対照試薬を接種し、腫瘍抗原抗体療法に関連する可能性がある症状について十分に調査することができる。腫瘍抗原抗体のインビボ適用の起こり得る副作用には、特に、胃を含む腫瘍抗原発現組織における毒性が含まれる。ヒトおよび他の種、例えばマウスにおける腫瘍抗原を認識する抗体は、ヒトにおけるモノクローナル腫瘍抗原抗体の適用によって媒介される潜在的な副作用を予測するのに特に有用である。
抗体によって認識されるエピトープのマッピングは、Glenn E.Morris ISBN-089603-375-9による''Epitope Mapping Protocols(Methods in Molecular Biology)''およびOlwyn M.R.Westwood,Frank C.Hayによる''Epitope Mapping:A Practical Approach''Practical Approach Series 248に詳述されているように実施することができる。
本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」または「癌抗原」は、(i)腫瘍特異的抗原、(ii)腫瘍関連抗原、(iii)腫瘍上の胚性抗原、(iv)腫瘍特異的膜抗原、(v)腫瘍関連膜抗原、(vi)成長因子受容体、および(xi)癌に関連する任意の他の種類の抗原または物質を含む。
本発明に従って使用することができる治療用抗体は、使用が承認されている、臨床試験中である、または臨床使用のための開発中である、当技術分野で認められている抗癌抗体のいずれかを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、複数の抗癌抗体を本発明の併用療法に含めることができる。
例えば、以下の腫瘍抗原は、本明細書に開示される治療用抗体によって標的化され得る。
腫瘍抗原は、上皮癌抗原(例えば乳癌、消化器癌、肺癌)、前立腺特異的癌抗原(PSA)もしくは前立腺特異的膜抗原(PSMA)、膀胱癌抗原、肺癌(例えば小細胞肺癌)抗原、結腸癌抗原、卵巣癌抗原、脳癌抗原、胃癌抗原、腎細胞癌抗原、膵臓癌抗原、肝臓癌抗原、食道癌抗原、頭頸部癌抗原、または結腸直腸癌抗原であり得る。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、リンパ腫抗原(例えば非ホジキンリンパ腫もしくはホジキンリンパ腫)、B細胞リンパ腫癌抗原、白血病抗原、骨髄腫(例えば多発性骨髄腫もしくは形質細胞骨髄腫)抗原、急性リンパ芽球性白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原である。記載された腫瘍抗原は例示にすぎず、任意の腫瘍抗原が本発明に従って標的化され得ることが理解されるべきである。
腫瘍抗原は当技術分野で周知であり、本明細書に記載されるものを含む。腫瘍抗原は、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ、前立腺特異抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、チロシナーゼ、プロステイン、PSMA、ras、Her2/neu、TRP-1、TRP-2、TAG-72、KSA、CA-125、PSA、BRCI、BRC-II、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-l、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原1(PCTA-1)、MAGE、GAGE、GP-100、MUC-1、MUC-2、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン成長因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、VEGF、クローディン18アイソフォーム2およびクローディン6などのクローディン分子、ならびにメソテリンであり得る。
腫瘍抗原は、ユニーク抗原(通常は突然変異によって引き起こされる)(例えばp53、ras、β-カテニン、CDK4、CDC27、αアクチニン4)、分化抗原(例えばチロシナーゼ、TRP1/gp75、TRP2、gp100、Melan-A/MART1、ガングリオシド、PSMA)、過剰発現抗原(例えばHER2、WT1、EphA3、EGFR、CD20)、癌精巣抗原(例えばMAGE、BAGE、GAGE、NY-ESO-1)またはユニバーサル抗原(例えばテロメラーゼ、サバイビン)であり得る。
腫瘍抗原はまた、腫瘍特異的抗原(TSA)または腫瘍関連抗原(TAA)であり得る。TSAは腫瘍細胞に固有であり、体内の他の細胞には存在しない。TAAは腫瘍細胞に固有ではなく、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導できない条件下で正常細胞上にも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こり得る。TAAは、免疫系が未熟で応答することができない胎児発生中に正常細胞上に発現される抗原であり得るか、または正常細胞上では通常極めて低レベルで存在するが腫瘍細胞上でははるかに高レベルで発現される抗原であり得る。
抗癌抗体の非限定的な例には、限定されることなく、以下が含まれる:
HER-2/neu陽性乳癌または転移性乳癌を治療するために使用されるトラスツズマブ(HERCEPTIN(商標);標的:HER2/neu);
結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、乳癌、転移性乳癌、非小細胞肺癌、または腎細胞癌を治療するために使用されるベバシズマブ(AVASTIN(商標);標的:VEGF-A);
非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病を治療するために使用されるリツキシマブ(RITUXAN(商標);標的:CD20);
乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、または卵巣癌を治療するために使用されるペルツズマブ(OMNITARG(商標);標的:HER2/neu);
結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、脳癌、膵臓癌、食道癌、腎細胞癌、前立腺癌、子宮頸癌、または膀胱癌を治療するために使用することができるセツキシマブ(ERBITUX(商標);標的:EGFR);
非ホジキンリンパ腫および濾胞性非ホジキンリンパ腫を治療するために使用されるトシツモマブ(BEXXAR(商標);標的:CD20);
慢性リンパ性白血病のためのオファツムマブ(ARZERRA(商標);標的:CD20);
結腸直腸癌のためのパニツムマブ(VECTIBIX(商標);標的:EGFR);
慢性リンパ性白血病のためのアレムツズマブ(CAMPATH(商標);標的:CD52);
慢性リンパ性白血病のためのオビヌツズマブ(Gazyva(商標);標的:CD20)。
HER-2/neu陽性乳癌または転移性乳癌を治療するために使用されるトラスツズマブ(HERCEPTIN(商標);標的:HER2/neu);
結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、乳癌、転移性乳癌、非小細胞肺癌、または腎細胞癌を治療するために使用されるベバシズマブ(AVASTIN(商標);標的:VEGF-A);
非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病を治療するために使用されるリツキシマブ(RITUXAN(商標);標的:CD20);
乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、または卵巣癌を治療するために使用されるペルツズマブ(OMNITARG(商標);標的:HER2/neu);
結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、脳癌、膵臓癌、食道癌、腎細胞癌、前立腺癌、子宮頸癌、または膀胱癌を治療するために使用することができるセツキシマブ(ERBITUX(商標);標的:EGFR);
非ホジキンリンパ腫および濾胞性非ホジキンリンパ腫を治療するために使用されるトシツモマブ(BEXXAR(商標);標的:CD20);
慢性リンパ性白血病のためのオファツムマブ(ARZERRA(商標);標的:CD20);
結腸直腸癌のためのパニツムマブ(VECTIBIX(商標);標的:EGFR);
慢性リンパ性白血病のためのアレムツズマブ(CAMPATH(商標);標的:CD52);
慢性リンパ性白血病のためのオビヌツズマブ(Gazyva(商標);標的:CD20)。
化学療法
IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および癌に対する抗体に基づく免疫療法に加えて、さらなる治療を患者に投与し得る。そのようなさらなる治療には、古典的な癌治療、例えば、放射線療法、手術、温熱療法および/または化学療法が含まれる。
IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および癌に対する抗体に基づく免疫療法に加えて、さらなる治療を患者に投与し得る。そのようなさらなる治療には、古典的な癌治療、例えば、放射線療法、手術、温熱療法および/または化学療法が含まれる。
化学療法は、通常、標準化された化学療法レジメンの一部として、1つ以上の抗癌剤(化学療法剤)を使用する癌治療の一種である。化学療法という用語は、有糸分裂を阻害するための細胞内毒の非特異的使用を含意するようになった。この含意は、細胞外シグナル(シグナル伝達)を遮断するより選択的な薬剤を除外する。古典的な内分泌ホルモン(主に、乳癌のためのエストロゲンおよび前立腺癌のためのアンドロゲン)からの成長促進シグナルを阻害する特定の分子または遺伝子標的による治療法の開発は、現在ホルモン療法と呼ばれている。対照的に、受容体チロシンキナーゼに関連するもののような成長シグナルの他の阻害は、標的療法と呼ばれる。
重要なことに、薬物の使用(化学療法、ホルモン療法または標的療法にかかわらず)は、血流に導入され、したがって原則として体内の任意の解剖学的位置で癌に対処することができるという点で、癌の全身療法を構成する。全身療法は、放射線療法、手術または温熱療法などの癌の局所療法(すなわち、その有効性が適用される解剖学的領域に限定される治療)を構成する他のモダリティと組み合わせて使用されることが多い。
伝統的な化学療法剤は、細胞分裂(有糸分裂)を妨げることによって細胞傷害性であるが、癌細胞はこれらの薬剤に対する感受性が大きく異なる。大部分において、化学療法は、細胞を損傷するまたは細胞にストレスを加える方法と考えることができ、アポトーシスが開始された場合、細胞死をもたらし得る。
化学療法剤には、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および細胞傷害性抗生物質が含まれる。
アルキル化剤は、タンパク質、RNAおよびDNAを含む多くの分子をアルキル化する能力を有する。アルキル化剤のサブタイプは、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、テトラジン、アジリジン、シスプラチンおよび誘導体、ならびに非古典的アルキル化剤である。ナイトロジェンマスタードには、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドおよびブスルファンが含まれる。ニトロソ尿素には、N-ニトロソ-N-メチル尿素(MNU)、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)およびセムスチン(MeCCNU)、フォテムスチンおよびストレプトゾトシンが含まれる。テトラジンには、ダカルバジン、ミトゾロミドおよびテモゾロミドが含まれる。アジリジンには、チオテパ、マイトマイシンおよびジアジコン(AZQ)が含まれる。シスプラチンおよび誘導体には、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンが含まれる。これらは、生物学的に重要な分子中のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基およびリン酸基と共有結合を形成することによって細胞機能を損なう。非古典的なアルキル化剤には、プロカルバジンおよびヘキサメチルメラミンが含まれる。特に好ましい一実施形態では、アルキル化剤はシクロホスファミドである。
代謝拮抗物質は、DNAおよびRNAの合成を妨げる分子の群である。それらの多くは、DNAおよびRNAのビルディングブロックと類似の構造を有する。代謝拮抗物質は、核酸塩基またはヌクレオシドのいずれかに類似するが、変化した化学基を有する。これらの薬物は、DNA合成に必要な酵素を遮断するか、またはDNAもしくはRNAに組み込まれることによって効果を発揮する。代謝拮抗物質のサブタイプは、葉酸拮抗剤、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似体およびチオプリンである。葉酸拮抗剤には、メトトレキサートおよびペメトレキセドが含まれる。フルオロピリミジンには、フルオロウラシルおよびカペシタビンが含まれる。デオキシヌクレオシド類似体には、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、アザシチジン、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、およびペントスタチンが含まれる。チオプリンには、チオグアニンおよびメルカプトプリンが含まれる。
抗微小管剤は、微小管機能を妨げることによって細胞分裂を阻止する。ビンカアルカロイドは微小管の形成を妨げるが、タキサンは微小管の分解を防止する。ビンカアルカロイドには、ビノレルビン、ビンデシン、およびビンフルニンが含まれる。タキサンには、ドセタキセル(Taxotere)およびパクリタキセル(Taxol)が含まれる。
トポイソメラーゼ阻害剤は、2つの酵素:トポイソメラーゼIおよびトポイソメラーゼIIの活性に影響を及ぼす薬物であり、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロンおよびアクラルビシンが含まれる。
細胞傷害性抗生物質は、様々な作用機序を有する薬物の多様な群である。それらが化学療法の指標において共有する共通の主題は、細胞分裂を中断することである。最も重要なサブグループはアントラサイクリン(例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシンおよびアクラルビシン)ならびにブレオマイシンである;他の顕著な例には、マイトマイシンC、ミトキサントロンおよびアクチノマイシンが含まれる。
免疫チェックポイント阻害剤
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、本明細書に記載される他の治療薬と組み合わせて使用される。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、本明細書に記載される他の治療薬と組み合わせて使用される。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」は、NK細胞活性などの免疫細胞活性の大きさおよび質を調節する共刺激および阻害シグナルを指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイントは阻害シグナルである。特定の実施形態では、阻害シグナルは、PD-1とPD-L1との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、CD28結合を置き換えるCTLA-4とCD80またはCD86との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、LAG3とMHCクラスII分子との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、TIM3とガレクチン9との間の相互作用である。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害剤」は、1つ以上のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減する、阻害する、妨げるまたは調節する分子を指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナル伝達を妨害する抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナル伝達を妨害する小分子である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイント遮断タンパク質間の相互作用を妨げる抗体、その断片、または抗体模倣物、例えば、PD-1とPD-L1との間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、CTLA-4とCD80またはCD86との間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、LAG3とそのリガンド、またはTIM-3とそのリガンドとの間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。チェックポイント阻害剤はまた、分子(またはそのバリアント)自体の可溶性形態、例えば可溶性PD-L1またはPD-L1融合物の形態であり得る。
「プログラム死1(PD-1)」受容体は、CD28ファミリーに属する免疫抑制性受容体を指す。PD-1は、インビボで以前に活性化されたT細胞上で主に発現され、PD-L1とPD-L2の2つのリガンドに結合する。本明細書で使用される「PD-1」という用語は、ヒトPD-1(hPD-1)、hPD-1のバリアント、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにhPD-1と少なくとも1つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「プログラム死リガンド1(PD-L1)」は、PD-1に結合するとT細胞の活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する、PD-1の2つの細胞表面糖タンパク質リガンドの1つ(もう1つはPD-L2)である。本明細書で使用される「PD-L1」という用語は、ヒトPD-L1(hPD-L1)、hPD-L1のバリアント、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにhPD-L1と少なくとも1つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA-4)」は、免疫細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、CD80およびCD86に結合することによって免疫系を下方制御する。本明細書で使用される「CTLA-4」という用語は、ヒトCTLA-4(hCTLA-4)、hCTLA-4のバリアント、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにhCTLA-4と少なくとも1つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)」は、MHCクラスII分子に結合することによる免疫細胞活性の阻害に関連する阻害性受容体である。この受容体は、Treg細胞の機能を増強し、CD8+エフェクタT細胞の機能を阻害する。本明細書で使用される「LAG3」という用語は、ヒトLAG3(hLAG3)、hLAG3のバリアント、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも1つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「T細胞膜タンパク質3(TIM3)」は、TH1細胞応答の阻害による免疫細胞活性の阻害に関与する阻害性受容体である。そのリガンドは、様々な種類の癌で上方制御されるガレクチン9である。本明細書で使用される「TIM3」という用語は、ヒトTIM3(hTIM3)、hTIM3のバリアント、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも1つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「B7ファミリー」は、未定義の受容体との阻害性リガンドを指す。B7ファミリーはB7-H3およびB7-H4を包含し、どちらも腫瘍細胞および腫瘍浸潤細胞で上方制御される。
特定の実施形態では、本明細書に開示される方法での使用に適した免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナルのアンタゴニスト、例えば、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、B7-H3、B7-H4、またはTIM3を標的とする抗体である。これらのリガンドと受容体は、Pardoll,D.,Nature.12:252-264,2012に総説されている。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性免疫調節因子からのシグナル伝達を妨害または阻害する抗体またはその抗原結合部分である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性免疫調節因子からのシグナル伝達を妨害または阻害する小分子である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、PD-1/PD-L1シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、PD-1受容体とそのリガンドであるPD-L1との間の相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。PD-1に結合し、PD-1とそのリガンドであるPD-L1との間の相互作用を妨害する抗体は、当技術分野で公知である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、PD-1に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、PD-L1に特異的に結合し、PD-1とのその相互作用を阻害し、それによって免疫活性を増加させる。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、CTLA4シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、CTLA4を標的とし、CD80およびCD86とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、LAG3(リンパ球活性化遺伝子3)シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、LAG3を標的とし、MHCクラスII分子とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、B7ファミリーシグナル伝達経路の成分である。特定の実施形態では、B7ファミリーメンバーは、B7-H3およびB7-H4である。したがって、本開示の特定の実施形態は、B7-H3またはB7-H4を標的とする抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。B7ファミリーは定義された受容体を有さないが、これらのリガンドは腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞で上方制御される。前臨床マウスモデルは、これらのリガンドの遮断が抗腫瘍免疫を増強し得ることを示している。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、TIM3(T細胞膜タンパク質3)シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、TIM3を標的とし、ガレクチン9とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
標的化が、例えば免疫細胞増殖の増加、免疫細胞活性化の増強、および/またはサイトカイン産生の増加(例えばIFN-γ、IL2)に反映されるような抗腫瘍免疫応答などの免疫応答の刺激をもたらすことを条件として、他の免疫チェックポイント標的もまた、アンタゴニストまたは抗体によって標的化され得ることが当業者に理解されるであろう。
RNA標的化
本発明によれば、本明細書に記載のペプチド、タンパク質またはポリペプチド、特にIL2ポリペプチドおよび/または抗体は、本明細書に記載のペプチド、タンパク質またはポリペプチドをコードするRNAの形態で投与されることが特に好ましい。一実施形態では、本明細書に記載の異なるペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、異なるRNA分子によってコードされる。
本発明によれば、本明細書に記載のペプチド、タンパク質またはポリペプチド、特にIL2ポリペプチドおよび/または抗体は、本明細書に記載のペプチド、タンパク質またはポリペプチドをコードするRNAの形態で投与されることが特に好ましい。一実施形態では、本明細書に記載の異なるペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、異なるRNA分子によってコードされる。
一実施形態では、RNAは、送達ビヒクルに製剤化される。一実施形態では、送達ビヒクルは粒子を含む。一実施形態では、送達ビヒクルは少なくとも1つの脂質を含む。一実施形態では、少なくとも1つの脂質は、少なくとも1つのカチオン性脂質を含む。一実施形態では、脂質は、RNAと複合体を形成し、および/またはRNAを封入する。一実施形態では、脂質は、RNAを封入する小胞に含まれる。一実施形態では、RNAはリポソームに製剤化される。
本開示によれば、本明細書に記載のRNAの投与後、RNAの少なくとも一部が標的細胞に送達される。一実施形態では、RNAの少なくとも一部は、標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、RNAは標的細胞によって翻訳されて、コードされたペプチドまたはタンパク質を産生する。
本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示されるRNA(例えば、IL2ポリペプチドをコードするRNA、抗体をコードするRNA)の標的化送達を含む。
RNAは、いわゆるリポプレックス製剤によって送達され得、製剤中でRNAはカチオン性脂質および任意でさらなる脂質またはヘルパー脂質を含むリポソームに結合して、注射可能なナノ粒子製剤を形成する。リポソームは、エタノール中の脂質の溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得る。RNAリポプレックス粒子は、リポソームをRNAと混合することによって調製され得る。
本開示の文脈において、「RNAリポプレックス粒子」という用語は、脂質、特にカチオン性脂質、およびRNAを含む粒子に関する。正に帯電したリポソームと負に帯電したRNAとの間の静電相互作用は、RNAリポプレックス粒子の複合体化と自発的形成をもたらす。正に帯電したリポソームは、一般に、DOTMAなどのカチオン性脂質、およびDOPEなどのさらなる脂質を使用して合成され得る。一実施形態では、RNAリポプレックス粒子はナノ粒子である。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」は、正味の正電荷を有する脂質を指す。カチオン性脂質は、静電相互作用によって負に帯電したRNAを脂質マトリックスに結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシルまたはジアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭部基は、典型的には正電荷を有する。カチオン性脂質の例には、1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB);1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP);1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(DODAP);1,2-ジアシルオキシ-3-ジメチルアンモニウムプロパン;1,2-ジアルキルオキシ-3-ジメチルアンモニウムプロパン;ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、2,3-ジ(テトラデコキシ)プロピル-(2-ヒドロキシエチル)-ジメチルアザニウム(DMRIE)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMEPC)、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、1,2-ジオレイルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、および2,3-ジオレオイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミウムトリフルオロアセテート(DOSPA)が含まれるが、これらに限定されない。DOTMA、DOTAP、DODAC、およびDOSPAが好ましい。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、DOTMAおよび/またはDOTAPである。
RNAリポプレックス粒子の全体的な正電荷対負電荷の比率および物理的安定性を調整するためにさらなる脂質を組み込んでもよい。特定の実施形態では、さらなる脂質は中性脂質である。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、ゼロの正味電荷を有する脂質を指す。中性脂質の例には、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、およびセレブロシドが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、さらなる脂質は、DOPE、コレステロール、および/またはDOPCである。
特定の実施形態では、RNAリポプレックス粒子は、カチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はDOTMAであり、さらなる脂質はDOPEである。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つのカチオン性脂質対少なくとも1つのさらなる脂質のモル比は、約10:0~約1:9、約4:1~約1:2、または約3:1~約1:1である。特定の実施形態では、モル比は、約3:1、約2.75:1、約2.5:1、約2.25:1、約2:1、約1.75:1、約1.5:1、約1.25:1、または約1:1であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも1つのカチオン性脂質対少なくとも1つのさらなる脂質のモル比は、約2:1である。
本明細書に記載のRNAリポプレックス粒子は、一実施形態では、約200nm~約1000nm、約200nm~約800nm、約250nm~約700nm、約400nm~約600nm、約300nm~約500nm、または約350nm~約400nmの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、RNAリポプレックス粒子は、約200nm、約225nm、約250nm、約275nm、約300nm、約325nm、約350nm、約375nm、約400nm、約425nm、約450nm、約475nm、約500nm、約525nm、約550nm、約575nm、約600nm、約625nm、約650nm、約700nm、約725nm、約750nm、約775nm、約800nm、約825nm、約850nm、約875nm、約900nm、約925nm、約950nm、約975nm、または約1000nmの平均直径を有する。一実施形態では、RNAリポプレックス粒子は、約250nm~約700nmの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、RNAリポプレックス粒子は、約300nm~約500nmの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、RNAリポプレックス粒子は、約400nmの平均直径を有する。
本開示のRNAリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも1つのカチオン性脂質中に存在する電荷とRNA中に存在する電荷との合計である。電荷比は、少なくとも1つのカチオン性脂質中に存在する正電荷とRNA中に存在する負電荷の比である。少なくとも1つのカチオン性脂質に存在する正電荷とRNAに存在する負電荷の電荷比は、以下の式によって計算される:電荷比=[(カチオン性脂質濃度(mol))*(カチオン性脂質中の正電荷の総数)]/[(RNA濃度(mol))*(RNA中の負電荷の総数)]。
延長PKサイトカインなどのサイトカイン、特に本明細書に記載されるような延長PKインターロイキンは、RNAの肝臓または肝臓組織への選択的送達のための製剤中のサイトカインをコードするRNAを対象に投与することによって対象に提供され得る。そのような標的器官または組織へのRNAの送達は、特に、大量のサイトカインを発現することが望ましい場合、および/またはサイトカインの全身的な存在、特に有意な量での存在が望ましいかもしくは必要とされる場合に好ましい。
RNA送達システムは、肝臓への固有の選択性を有する。これは、脂質ベースの粒子、カチオン性および中性ナノ粒子、特にリポソーム、ナノミセルおよびバイオコンジュゲート中の親油性リガンドなどの脂質ナノ粒子に関連する。肝臓蓄積は、肝血管系の不連続な性質または脂質代謝(リポソームおよび脂質もしくはコレステロールコンジュゲート)によって引き起こされる。
肝臓へのRNAのインビボ送達のために、薬物送達システムを使用して、その分解を防止することによってRNAを肝臓に輸送し得る。例えば、ポリ(エチレングリコール)(PEG)被覆表面とmRNA含有コアからなるポリプレックスナノミセルは、ナノミセルが生理的条件下でRNAの卓越したインビボ安定性を提供するため、有用な系である。さらに、密なPEGパリセードで構成されるポリプレックスナノミセル表面によって提供されるステルス特性は、宿主の免疫防御を有効に回避する。
医薬組成物
本明細書に記載の薬剤は、医薬組成物または医薬品で投与され得るか、任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。
本明細書に記載の薬剤は、医薬組成物または医薬品で投与され得るか、任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。
本発明の全ての態様の一実施形態では、サイトカイン(IL2)または抗体を一緒にまたは互いに分離してコードする核酸などの本明細書に記載される成分は、薬学的に許容される担体を含み得、任意で1つ以上のアジュバント、安定剤などを含み得る医薬組成物で投与され得る。一実施形態では、医薬組成物は、治療的または予防的処置のためのもの、例えば、本明細書に記載されるような癌疾患などの抗原が関与する疾患の治療または予防における使用のためのものである。
「医薬組成物」という用語は、治療上有効な薬剤を、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤と共に含む製剤に関する。前記医薬組成物は、前記医薬組成物を対象に投与することによって疾患または障害を治療する、予防する、またはその重症度を軽減するのに有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても公知である。
本開示の医薬組成物は、1つ以上のアジュバントを含み得るか、または1つ以上のアジュバントと共に投与され得る。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン(例えばフロイントアジュバント)、無機化合物(ミョウバンなど)、細菌産物(百日咳菌毒素など)、または免疫刺激複合体などの不均一な化合物の群を含む。アジュバントの例には、限定されることなく、LPS、GP96、CpGオリゴデオキシヌクレオチド、成長因子、およびモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインなどのサイトカインが含まれる。サイトカインは、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、IL18、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-aであり得る。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、またはMontanide(登録商標)ISA51などの油である。本開示で使用するための他の適切なアジュバントには、Pam3Cysなどのリポペプチドが含まれる。
本開示による医薬組成物は、一般に、「薬学的に有効な量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。
「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
「薬学的に有効な量」または「治療上有効な量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、特に疾患の進行を中断するまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類(存在する場合)、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の組成物の投与量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量(または異なる、より局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量)を使用し得る。
本開示の医薬組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、および任意で他の治療薬を含み得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物は、1つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤を含む。
本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤には、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例には、限定されることなく、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤が含まれる。
「希釈剤」という用語は、希釈するおよび/または希薄にする薬剤に関する。さらに、「希釈剤」という用語は、流体、液体または固体の懸濁液および/または混合媒体のいずれか1つ以上を含む。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロールおよび水が含まれる。
「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した、1つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体には、限定されることなく、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンコポリマーが含まれる。一実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。
治療的使用のための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R Gennaro edit.1985)に記載されている。
医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準的な製薬慣行に関して選択することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与には、胃腸管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈内注射などによる、胃腸管を介する以外の任意の方法での投与を指す。好ましい実施形態では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。別の好ましい実施形態では、全身投与は静脈内投与によるものである。
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、異なる化合物または組成物(例えば、IL2ポリペプチドをコードするRNA、および抗体)を同じ患者に投与する工程を意味する。異なる化合物または組成物は、同時に、本質的に同時に、または連続的に投与され得る。一実施形態では、IL2ポリペプチドまたはIL2ポリペプチドをコードする核酸を最初に投与し、続いて抗体を投与する。
治療
本明細書に記載の薬剤、組成物および方法は、疾患、例えば抗原を発現する疾患細胞の存在を特徴とする疾患を有する対象を治療するために使用することができる。特に好ましい疾患は、癌疾患、特に癌細胞が腫瘍抗原を発現する癌疾患である。
本明細書に記載の薬剤、組成物および方法は、疾患、例えば抗原を発現する疾患細胞の存在を特徴とする疾患を有する対象を治療するために使用することができる。特に好ましい疾患は、癌疾患、特に癌細胞が腫瘍抗原を発現する癌疾患である。
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部からの要因によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能障害によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能障害、苦痛、社会的問題、もしくは死亡を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、単発症状、逸脱した挙動、および構造と機能の非定型の変化を含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリと見なされ得る。多くの疾患を患い、それらと共に生活することは、人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。
本文脈において、「治療」、「治療する」または「治療的介入」という用語は、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに/または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは排除するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の治療を含むことを意図しており、ここで、予防は、疾患、状態または障害と闘うことを目的とした個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。
「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および/または寿命を延長する(増加させる)任意の治療に関する。前記治療は、個体の疾患を排除し、個体の疾患の発症を停止もしくは遅延させ、個体の疾患の発症を阻害もしくは遅延させ、個体の症状の頻度もしくは重症度を低下させ、および/または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体の再発を減少させ得る。
「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患もしくは障害(例えば癌)に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患もしくは障害を有していても有していなくてもよいヒトまたは別の哺乳動物(例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長動物)を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって、成人、高齢者、小児、および新生児を包含する。本開示の実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。
「患者」という用語は、治療のための個体または対象、特に罹患した個体または対象を意味する。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗原または抗原を発現する細胞に対する統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答および/または体液性免疫応答を指す。
「細胞媒介性免疫」、「細胞性免疫」、「細胞性免疫応答」、または同様の用語は、抗原の発現を特徴とする、特にクラスIまたはクラスII MHCによる抗原の提示を特徴とする細胞に向けられる細胞応答を含むことを意図している。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働くT細胞またはTリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーT細胞(CD4+T細胞とも呼ばれる)は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞(細胞傷害性T細胞、細胞溶解性T細胞、CD8+T細胞またはCTLとも呼ばれる)は、癌細胞などの疾患細胞を死滅させ、さらなる疾患細胞の産生を防止する。
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導または増強することによる疾患または状態の治療に関する。「免疫療法」という用語は、抗原免疫化または抗原ワクチン接種を含む。
「免疫」または「ワクチン接種」という用語は、例えば治療上または予防上の理由により、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を投与する工程を表す。
「マクロファージ」という用語は、単球の分化によって産生される食細胞のサブグループを指す。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物によって活性化されるマクロファージは、マクロファージ内に外来病原体を非特異的に飲み込み、病原体の分解をもたらす加水分解および酸化攻撃によってそれらを死滅させる。分解されたタンパク質からのペプチドは、T細胞によって認識され得るマクロファージ細胞表面に表示され、B細胞表面の抗体と直接相互作用して、T細胞およびB細胞の活性化ならびに免疫応答のさらなる刺激をもたらすことができる。マクロファージは抗原提示細胞のクラスに属する。一実施形態では、マクロファージは脾臓マクロファージである。
「樹状細胞」(DC)という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する食細胞の別のサブタイプを指す。一実施形態では、樹状細胞は造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初に未成熟な樹状細胞に変化する。これらの未成熟細胞は、高い食作用と低いT細胞活性化能を特徴とする。未成熟な樹状細胞は、ウイルスおよび細菌などの病原体について周囲環境を絶えずサンプリングする。それらは、提示可能な抗原と接触すると、活性化されて成熟樹状細胞になり、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、それらのタンパク質を小さな断片に分解し、成熟すると、MHC分子を使用してそれらの断片を細胞表面に提示する。同時に、CD80、CD86およびCD40などのT細胞活性化における共受容体として働く細胞表面受容体を上方制御し、T細胞を活性化するそれらの能力を大幅に増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓に、またはリンパ系を通ってリンパ節に移動するように誘導する走化性受容体であるCCR7を上方制御する。ここで、それらは抗原提示細胞として働き、非抗原特異的共刺激シグナルと共に抗原を提示することによってヘルパーT細胞およびキラーT細胞ならびにB細胞を活性化する。したがって、樹状細胞は、T細胞またはB細胞に関連する免疫応答を能動的に誘導することができる。一実施形態では、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。
「抗原提示細胞」(APC)という用語は、その細胞表面上に(またはその細胞表面において)少なくとも1つの抗原または抗原断片を表示、獲得、および/または提示することができる様々な細胞の1つである。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞とに区別することができる。
「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブT細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスII(MHCクラスII)分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。T細胞が抗原提示細胞の膜上のMHCクラスII分子複合体と相互作用する場合、抗原提示細胞は、T細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、MHCクラスII分子を構成的に発現しないが、インターフェロンγなどの特定のサイトカインによる刺激を受けると発現する抗原提示細胞に関する。例示的な非プロフェッショナル抗原提示細胞には、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞が含まれる。
「抗原プロセシング」は、抗原の断片であるプロセシング産物への前記抗原の分解(例えば、タンパク質のペプチドへの分解)、および抗原提示細胞などの細胞による特定のT細胞への提示のためのMHC分子とこれらの断片の1つ以上との会合(例えば結合による)を指す。
「抗原が関与する疾患」という用語は、抗原に関係する任意の疾患、例えば抗原の存在を特徴とする疾患を指す。抗原が関与する疾患は、癌疾患または単に癌であり得る。上記のように、抗原は、腫瘍関連抗原などの疾患関連抗原であり得る。一実施形態では、抗原が関与する疾患は、好ましくは細胞表面に抗原を発現する細胞が関与する疾患である。
「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする個体の生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、そのような癌の例には、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が含まれる。本開示による「癌」という用語は、癌転移も含む。
本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認を意図するものではない。これらの文書の内容に関する全ての記述は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さに関する承認を構成するものではない。
以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。具体的な装置、技術、および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な変更は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書で説明され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。
実施例1:MHCクラスI欠損またはIFNシグナル伝達欠損マウス腫瘍モデルの選択および作製
本発明者らの第1の目的は、MHCクラスIの喪失が腫瘍細胞と免疫系との相互作用にどのように影響を及ぼすかを分析することであった。本発明者らは、腫瘍細胞のCD8+T細胞の認識がMHCクラスIに厳密に依存するので、CD8+T細胞がこの点で主要な役割を果たし得ると仮定し、異なるマウス腫瘍モデルにおけるCD8+T細胞浸潤を比較した。Balb/cマウス(Balb/c JRj、Janvier Labs)(n=8)に5×105個のCT26細胞を皮下(s.c.)接種し、C57Bl/6マウス(C57Bl/6 JOlaHsd、Jackson Laboratory)(細胞株あたりn=8)に5×105個のMC38細胞、3×105個のB16F10細胞または1×105個のTC1細胞をs.c.接種した。腫瘍接種の20日後、マウスを頸椎脱臼によって犠死させ、腫瘍を切除した。腫瘍を細断して小片にし、製造者の指示に従ってTumor Dissociation Kit、マウス(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-096-730)を使用して消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をeF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)で染色した。CD45(BD、カタログ番号564279)およびCD8(BD、カタログ番号563046またはカタログ番号553031)に対する抗体を使用した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
本発明者らの第1の目的は、MHCクラスIの喪失が腫瘍細胞と免疫系との相互作用にどのように影響を及ぼすかを分析することであった。本発明者らは、腫瘍細胞のCD8+T細胞の認識がMHCクラスIに厳密に依存するので、CD8+T細胞がこの点で主要な役割を果たし得ると仮定し、異なるマウス腫瘍モデルにおけるCD8+T細胞浸潤を比較した。Balb/cマウス(Balb/c JRj、Janvier Labs)(n=8)に5×105個のCT26細胞を皮下(s.c.)接種し、C57Bl/6マウス(C57Bl/6 JOlaHsd、Jackson Laboratory)(細胞株あたりn=8)に5×105個のMC38細胞、3×105個のB16F10細胞または1×105個のTC1細胞をs.c.接種した。腫瘍接種の20日後、マウスを頸椎脱臼によって犠死させ、腫瘍を切除した。腫瘍を細断して小片にし、製造者の指示に従ってTumor Dissociation Kit、マウス(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-096-730)を使用して消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をeF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)で染色した。CD45(BD、カタログ番号564279)およびCD8(BD、カタログ番号563046またはカタログ番号553031)に対する抗体を使用した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
本発明者らは、異なる腫瘍モデルにわたって全ての生細胞における様々な割合のCD8+T細胞を観察し、浸潤を、CT26およびMC38については高(CD8high)、B16F10については中間(CD8int)、TC1については低(CD8low)として分類した(図1A)。CD8+T細胞の割合は、概して、CT26およびMC38が免疫細胞による高い浸潤、B16F10が中間の浸潤、およびTC1が低い浸潤を示したので、全ての生細胞における全CD45+免疫細胞の割合と相関した(図1B)。
腫瘍細胞株においてMHCクラスIを遺伝的にノックアウトするために、本発明者らは、公的に利用可能なツールを使用してB2mを標的とする単一ガイドRNA(sgRNA)を生成した(CT26、B16F10、TC1:CATGGCTCGCTCGGTGACCC;MC38:GACAAGCACCAGAAAGACCA)。腫瘍細胞を、RNAiMAX(Invitrogen、カタログ番号13778030)によるリポフェクションによって、または4mmキュベット(VWR、カタログ番号732-1137)におけるエレクトロポレーションによって、(dsRNAに対する細胞応答を阻害するために)sgRNAおよびCas9をコードするmRNAならびにE3およびB18をコードするmRNAで一過性にトランスフェクトした。限界希釈によって単一クローンを得、増殖させ、フローサイトメトリによって分析した細胞表面上のMHCクラスIの非存在によってB2mのノックアウトの成功を確認した(図2および3)。B16F10細胞はインビトロでごく少量のMHCクラスIを発現するので、細胞を6ウェルプレート中で37℃および5%CO2、25ng/mLのIFNγ(Peprotech、カタログ番号315-05)の存在下で24時間培養して、MHCクラスIの上方制御を誘導した。
IFNシグナル伝達経路の欠陥が癌免疫療法に対する耐性の別の臨床的に関連する機構であることを考慮して、本発明者らはまた、IFN応答を欠くB16F10由来の腫瘍細胞株を作製した。これを達成するために、中心的なIFNシグナル伝達分子であるJak1を、上記のCRISPR/Cas9システムを使用してJak1標的化sgRNA(TGGCGTTCTGTGCTAAAATG)でノックアウトした。親B16F10細胞を6ウェルプレートに播種し、1000U/mLのIFNα(PBL、カタログ番号12100-1)の存在下に37℃および5%CO2で24時間培養するか、またはIFNなしで培養した(対照)。続いて、細胞をフローサイトメトリ分析に供して、PD-L1およびMHCクラスIの発現レベルを決定した。B16F10細胞は、両方のIFN誘導性マーカの強い上方制御を示した(図4)。B16F10-Jak1-/-の同様の処置は、いずれのマーカの検出可能な上方制御ももたらさず、IFN応答経路の欠陥を確認した(図5)。
実施例2:MHCクラスIの喪失は腫瘍進行および腫瘍微小環境の組成に影響を及ぼす
MHCクラスI欠損が腫瘍進行に影響を及ぼすかどうかを調べるために、実施例1に記載されるようにマウスに野生型またはB2m欠損(B2m-/-)腫瘍細胞を接種した(CT26、MC38:n=5/群;B16F10、TC1:n=10/群)。
MHCクラスI欠損が腫瘍進行に影響を及ぼすかどうかを調べるために、実施例1に記載されるようにマウスに野生型またはB2m欠損(B2m-/-)腫瘍細胞を接種した(CT26、MC38:n=5/群;B16F10、TC1:n=10/群)。
B2m-/-腫瘍の成長を、対応する対照腫瘍の成長と比較した。CT26-B2m-/-およびMC38-B2m-/-腫瘍の両方が有意に増強された腫瘍増殖を示したが(図6)、B16F10-B2m-/-およびTC1-B2m-/-腫瘍については有意差は観察されなかった(図7)。
本発明者らは、自発的なCD8+T細胞応答が未処置CD8high腫瘍モデルの成長を制御する可能性が高く、誘導されたMHCクラスI欠損腫瘍の成長増強をもたらすと結論付けた。本発明者らはさらに、誘導されたMHCクラスI欠損腫瘍モデルにおける自発的な抗原認識の欠如が腫瘍微小環境(TME)の免疫細胞組成にも影響を及ぼし得ると仮定した。これを調べるために、実施例1に記載されるようにマウスに正常またはB2m-/-腫瘍細胞を接種した(n=8匹のマウス/群)。腫瘍接種の20日後、実施例1に記載されるように腫瘍を切除し、消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をeF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)またはFixable Yellow Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34967)で染色した。CD3(BD、カタログ番号100227)、CD4(BD、カタログ番号564298)、CD8(BD、カタログ番号563046またはカタログ番号553031)、CD11b(BD、カタログ番号553310)、CD11c(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-102-493)、CD25(BD、カタログ番号564023)、CD45(BD、カタログ番号564279)、CD49b(BD、カタログ番号740133)、CD103(ebioscience、カタログ番号12-1031-83)、F4/80(BD、カタログ番号123146)、GR-1(BD、カタログ番号108423)、NK1.1(Biolegend、カタログ番号108738)、XCR1(Biolegend、カタログ番号148220)およびFoxP3(ebioscience、カタログ番号12-5773-82)に対する抗体を使用した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
B2m-/-腫瘍の免疫細胞浸潤を、対応する対照腫瘍と比較した。CT26-B2m-/-およびMC38-B2m-/-腫瘍の両方が、CD8+T細胞、NK細胞および交差提示樹状細胞(cDC1)による浸潤の有意な減少を示した(図8および10)。さらに、MC38-B2m-/-腫瘍は、マクロファージおよび単球による浸潤の有意な減少を示した。CT26およびCT26-B2m-/-腫瘍担持マウスの腫瘍排出リンパ節(TDLN)の細胞組成に差は観察されなかった(図9)。MC38-B2m-/-モデルでは、CD8+T細胞およびTregの量のわずかな増加、ならびにTDLN中のcDC1およびCD11b+DCの数の減少が観察された。B16F10-B2m-/-腫瘍は、CD8+T細胞、NK細胞およびcDC1による浸潤の差を示さなかったが、CD4 Th細胞の数の増加ならびにマクロファージ、単球およびCD11b+DCの数の減少が観察可能であった(図12)。B16F10-B2m-/-腫瘍担持マウスのTDLN中のcDC1の数が増加した(図13)。TC1-B2m-/-腫瘍は、腫瘍とTDLNの両方の免疫細胞組成において検出可能な差を示さなかった(図14および15)。異なる腫瘍モデルにわたって観察された免疫細胞浸潤の変化は、CD8+T細胞浸潤の分類とよく相関し、CD8high腫瘍モデルにおいて最大の差が観察された。これは、腫瘍細胞の自発的なCD8+T細胞認識が、TMEへの免疫細胞誘引を大きく決定することを示唆する。TDLNで観察された変化はTMEと相関せず、はるかに少ない程度であったので、MHCクラスI喪失の影響は主にTMEに限定されるようである。重要なことに、CT26-B2m-/-およびMC38-B2m-/-腫瘍で減少した免疫細胞サブセットは抗腫瘍免疫に必須であると見なされるが、免疫抑制性と考えられるサブセットは、MC38モデルのマクロファージを除いて影響を受けなかった。これは、活性な炎症TMEが、MHCクラスI喪失時に免疫抑制性TMEになり得ることを意味する。
本発明者らの次の目的は、対応する対照腫瘍と比較して、B2m-/-のTMEへの免疫細胞の活発に進行中の遊走に違いがあるかどうかを分析することであった。CT26モデルは最も高いCD8+T細胞浸潤を示すので、この特性評価のためにCT26モデルを選択した。実施例1に記載されるように、マウスに正常または誘導されたB2m-/-腫瘍細胞を接種した(n=5匹のマウス/群/時点)。腫瘍を異なる時点(接種の8、12、20および26日後)で切除し、実施例1に記載されるように消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をeF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)で染色した。CD45(BD、カタログ番号564279)、CD3(Biolegend、カタログ番号100233)およびCD49b(BD、カタログ番号553875)に対する抗体を使用した。細胞をAbsolute Counting Tubesに移し、BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
腫瘍浸潤CD3+T細胞およびNK細胞の数は、腫瘍接種後8日目までに差を示さなかった。しかしながら、CT26腫瘍は、時間の経過と共に両方の細胞型による浸潤の増加を示した(図16)。CT26-B2m-/-腫瘍では、そのような観察可能な増加はなく、CD3+T細胞およびNK細胞はCT26に活発に誘引されるが、CT26-B2m-/-TMEには誘引されないことが実証された。これらのデータは、腫瘍細胞がMHCクラスI発現を喪失すると、免疫細胞浸潤をもたらすTMEにおける活発に進行中の炎症が損なわれることをさらに裏付ける。
記載された観察結果は、MHCクラスI発現腫瘍のTMEの形成におけるCD8+T細胞の役割を強調するので、CD8+T細胞によって発現される抗原遭遇のマーカを分析した。この実験では、比較のためにCD8+T細胞浸潤が最も低いモデルとしてTC1モデルを含めた。実施例1に記載されるように、マウスに正常または誘導されたB2m-/-腫瘍細胞を接種した(n=8匹のマウス/群)。腫瘍接種の20日後、実施例1に記載されるように腫瘍を切除し、消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をeF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)またはFixable Yellow Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34967)で染色した。CD8(BD、カタログ番号563046)、CD11b(BD、カタログ番号553310)、CD45(BD、カタログ番号564279)、F4/80(BD、カタログ番号123146)、MHCクラスII(BD、カタログ番号742894)、PD-1(ebioscience、カタログ番号46-9981-82)およびPD-L1(Biolegend、カタログ番号124333)に対する抗体ならびにgp70四量体(MBl、カタログ番号MBL-TB-M521-7)を使用した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
B2m-/-腫瘍由来のCD8+T細胞の表現型を、対応する対照腫瘍と比較した。gp70は、CT26細胞によって発現されるウイルスCD8+T細胞抗原である。CD8+T細胞は、有意に低い割合のgp70抗原特異的細胞を示した(図17A)。さらに、PD-1+CD8+T細胞のパーセンテージは、CT26-B2m-/-腫瘍において有意に低かった(図17B)。TC1-B2m-/-腫瘍では、PD-1+CD8+T細胞の低いパーセンテージも観察された(図17C)。gp70は抗原特異性の尺度であり、PD-1はCD8+T細胞活性化および抗原遭遇のマーカであるので、CD8+T細胞表現型の違いは、CT26-B2m-/-TMEにおける抗原の認識の減少を示唆する。TC1モデルにおける差の大きさはCT26モデルと比較してわずかであり、TC1腫瘍細胞の自発的CD8+T細胞認識がより少ないことを示す。MHCクラスI機能正常腫瘍におけるCD8+T細胞による抗原認識が、TMEに位置する他の免疫細胞に直接影響を及ぼすことの証拠を探索した。CT26-B2m-/-およびCT26腫瘍における腫瘍関連マクロファージ(TAM)および腫瘍細胞によって発現されるIFNγ(抗原遭遇時に放出されるCD8+T細胞のシグネチャサイトカイン)誘導性マーカの分析は、TAMによるPD-L1およびMHCクラスIIの発現ならびに腫瘍細胞によるPD-L1の発現の大幅な減少を明らかにした(図18)。TC1モデルにおける同じマーカの分析は、TAMによるMHCクラスII発現の違いを明らかにしなかった(図19A)。TAMおよび腫瘍細胞によるPD-L1発現は有意に減少したが、その大きさは、CD8+T細胞によるPD-1+発現の差の大きさと一致して、CT26モデルと比較して再び低かった(図19CおよびD)。これらのデータは、自発的なCD8+T細胞認識がCD8high CT26 TMEにおける強いIFNγシグネチャをもたらし、これがCT26-B2m-/-TMEでは損なわれることを提案する。他方で、CD8low TC1モデルでは、腫瘍細胞に対する自発的免疫応答、したがってIFNγシグネチャは、炎症TMEを誘導するのに必要な閾値に達しないようである。この理由から、TMEは、CD8highモデルの場合のようにMHCクラスI喪失の影響を受けない。
本発明者らの最後の目的は、抗原を認識するCD8+T細胞によって放出されるIFNγの非存在が、MHCクラスI発現を喪失した後にCT26およびMC38腫瘍のTMEに誘引される抗腫瘍免疫細胞(CD8+T細胞、NK細胞およびcDC1)がより少ない理由であることを確認することであった。実施例1に記載されるように、マウスに正常または誘導されたB2m-/-腫瘍細胞を接種した(CT26:n=3匹のマウス/群、MC38:n=5匹のマウス/群)。腫瘍接種の19日後、腫瘍を切除し、液体窒素中で急速凍結した。全RNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen、カタログ番号74106)を製造者の説明書に従って使用して腫瘍から抽出し、RNA濃度および完全性を、NanoDrop 200c(Thermo Fisher)およびFragment Analyzerキャピラリーゲル電気泳動装置(Agilent Advanced Analytical)を使用して決定した。PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Takara、カタログ番号RR047A)を用いて、試料あたり1μgのRNAを逆転写のための鋳型として使用した。得られたcDNAを、CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System(BioRad)についての製造者の説明書に従ってSsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix(Biorad、カタログ番号1725271)を使用する定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)分析に使用し、アニーリング温度60℃、反応あたり1.25μLのcDNAを含む反応体積15μL、およびプライマーあたり333nMの最終プライマー濃度で40サイクルの2段階PCRを使用した。CFX Manager 3.1ソフトウェア(Biorad)を使用してCt値を決定し、相対遺伝子発現値を決定するためにHprt参照遺伝子に対する正規化によってΔΔCt値をコンピュータで計算した。信頼性の理由から、カットオフを使用してCt値>35を除外した。プライマー配列:Hprtフォワードプライマー(CCCTGGTTAAGCAGTACAGC)、Hprtリバースプライマー(CTCATTATAGTCAAGGGCATATCC);Ifngフォワードプライマー(CT26)(TTCTTCAGCAACAGCAAGGCG);Ifngリバースプライマー(CT26)(TGGACCACTCGGATGAGCT);Ifngフォワードプライマー(MC38)(GAGGAACTGGCAAAAGGATGG)、Ifngリバースプライマー(MC38)(GCCTTGCTGTTGCTGAAGAAG);Cxcl9フォワードプライマー(GCAACAAAACTGAAATCATTGCTAC)、Cxcl9リバースプライマー(GTTTTTCATGTTCTTTTGATGTTTTTTCC);Cxcl10フォワードプライマー(GAGTGGGACTCAAGGGATC)、Cxcl10リバースプライマー(TTCTTTTTCATCGTGGCAATGATCTC);Cxcl11フォワードプライマー(GCGACAAAGTTGAAGTGATTGTTAC)、Cxcl11リバースプライマー(AGTCAGACGTTCCCAGGATG);Ccl5フォワードプライマー(GGAGTATTTCTACACCAGCAGC)、Ccl5リバースプライマー(CAGAATCAAGAAACCCTCTATCC);Xcl1フォワードプライマー(ATGGGTTGTGGAAGGTGTGG)、Xcl1リバースプライマー(CCATTTGGCTTCTGGATCAGC)
B2m-/-腫瘍由来のIfngならびにIFN誘導性ケモカインCxcl9、Cxcl10およびCxcl11(CXCR3リガンド)の遺伝子発現レベルを対応する対照腫瘍と比較した。Ifngの発現は両方の腫瘍モデルで低下した(図20Aおよび21A)。TMEへのT細胞およびNK細胞の動員に不可欠なCXCR3リガンドの発現レベルは、同様に両方の腫瘍モデルで低下した(図20B、20C、20Dおよび21B、21C、21D)(Nagarsheth et al.Nat Rev Immunol 17,559-72(2017))。これらの観察結果は、元々CD8highであったMHCクラスI欠損腫瘍におけるIFNγシグネチャの減少を確認する。CD8+T細胞由来のIFNγによるCXCR3リガンドの誘導は、MHCクラスI欠損対応物によって失われる、CD8high腫瘍のTMEへのさらなるCD3+T細胞およびNK細胞の連続的な誘引を説明する。さらに、ケモカインCcl5およびXcl1を誘引するcDC1の発現レベルが低下した(図20E、20Fおよび21E、21F)。NK細胞は、これらのケモカインの主な産生細胞であることが公知であり、それらの浸潤障害は、ケモカイン発現の減少、したがってcDC1による浸潤の減少の理由であり得る(Bottcher et al.Cell 172,1022-37(2018))。
本発明者らの結果は、腫瘍抗原の自発的なCD8+T細胞認識が、MHCクラスI発現腫瘍の成長をある程度制御し、炎症TMEを維持し、ケモカイン誘導の連鎖反応を誘発し、これがさらなる抗腫瘍免疫細胞の誘引をもたらすことを意味する。要約すると、MHCクラスIが喪失すると、元々炎症性の腫瘍が高度に免疫抑制性になり、これがTMEに予期せぬ影響をもたらすことが示されている。
実施例3:MHCクラスIの喪失は、免疫療法および古典的な癌治療に対する耐性の包括的な機構である
未処置MHCクラスI欠損腫瘍モデルの特性評価後、癌治療に対するそれらの抵抗性を分析することに着手した。PD-1およびCTLA4を遮断するICB抗体ならびに4-1BBに対するアゴニスト抗体に対するCT26-B2m-/-およびMC38-B2m-/-腫瘍の耐性を試験することから始めた。実施例1に記載されるように、マウスに正常またはB2m-/-腫瘍細胞を接種し(腫瘍増殖についてはn=10/群、フローサイトメトリについてはn=5~7/群)、腫瘍が32~36mm3の平均体積に達した後0、3、7および10日目に、200μgの抗PD-1(Bioxcell、カタログ番号BE0146)、抗CTLA(Bioxcell、カタログ番号BE0164)または抗4-1BB(Bioxcell、カタログ番号BE0239)抗体を腹腔内(i.p.)注射した(MC38:14および17日目に2回のさらなる処置)。対照群には無関係な抗体(Bioxcell、カタログ番号0089)を注射した。抗腫瘍効果を、対照群と比較した試験群における腫瘍増殖阻害として決定した。CT26およびCT26-B2m-/-腫瘍を、実施例1に記載されるように、最初の処置の7日後(抗4-1BB)または10日後(抗PD1および抗CTLA4)に切除し、消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をeF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)で染色した。CD8(BD、カタログ番号563046)およびCD45(BD、カタログ番号564279)に対する抗体を使用した。細胞をAbsolute Counting Tubesに移し、BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
未処置MHCクラスI欠損腫瘍モデルの特性評価後、癌治療に対するそれらの抵抗性を分析することに着手した。PD-1およびCTLA4を遮断するICB抗体ならびに4-1BBに対するアゴニスト抗体に対するCT26-B2m-/-およびMC38-B2m-/-腫瘍の耐性を試験することから始めた。実施例1に記載されるように、マウスに正常またはB2m-/-腫瘍細胞を接種し(腫瘍増殖についてはn=10/群、フローサイトメトリについてはn=5~7/群)、腫瘍が32~36mm3の平均体積に達した後0、3、7および10日目に、200μgの抗PD-1(Bioxcell、カタログ番号BE0146)、抗CTLA(Bioxcell、カタログ番号BE0164)または抗4-1BB(Bioxcell、カタログ番号BE0239)抗体を腹腔内(i.p.)注射した(MC38:14および17日目に2回のさらなる処置)。対照群には無関係な抗体(Bioxcell、カタログ番号0089)を注射した。抗腫瘍効果を、対照群と比較した試験群における腫瘍増殖阻害として決定した。CT26およびCT26-B2m-/-腫瘍を、実施例1に記載されるように、最初の処置の7日後(抗4-1BB)または10日後(抗PD1および抗CTLA4)に切除し、消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をeF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)で染色した。CD8(BD、カタログ番号563046)およびCD45(BD、カタログ番号564279)に対する抗体を使用した。細胞をAbsolute Counting Tubesに移し、BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
試験した処置は、対照群と比較して、CT26およびMC38腫瘍の有意な増殖阻害をもたらした(図22Aおよび24A)。処置したCT26-B2m-/-およびMC38-B2m-/-腫瘍は、対照群と同様の動態で増殖し、有意な増殖阻害は検出されなかった(図22Bおよび24B)。異なる処置後のCD8+T細胞浸潤の分析は、対照群と比較して処置したCT26腫瘍におけるCD8+T細胞数の増加を示し(図23AおよびB)、抗CTLA4または抗4-1BB処置後に統計学的有意性に達した。それと比較して、試験したいずれの処置後もCT26-B2m-/-においてCD8+T細胞数は増加しなかった。これらの結果は、MHCクラスIの喪失が抗体に基づく免疫療法に対する完全な耐性を付与すること、および腫瘍内免疫応答が、機能的MHCクラスIを発現する応答性腫瘍モデルに限定されることを確認する。
その後、CT26-B2m-/-およびTC1-B2m-/-腫瘍が治療的RNAワクチン接種に対して耐性になるかどうかを試験した。実施例1に記載されるように、マウスに正常またはB2m-/-腫瘍細胞を接種した(腫瘍増殖についてはn=10/群、フローサイトメトリについてはn=5/群)。CT26およびCT26-B2m-/-担持マウスに、Kranz et al.(Kranz,L.M.et al.Nature 534,396-401(2016))に記載されるように、腫瘍接種後5、8、12および19日目にgp70(SPSAYAHQF)をコードする40μgのRNA-LPXを静脈内(i.v.)ワクチン接種し、TC1またはTC1-B2m-/-担持マウスに、腫瘍が約20mm3の平均体積に達した後0および7日目にE7(RAHYNIVTF)をコードする40μgのRNA-LPXを静脈内(i.v.)ワクチン接種した。E7は、TC1細胞によって発現されるウイルスCD8+T細胞抗原である。さらなる群に無関係なRNA-LPX(いかなる抗原もコードしない)をワクチン接種し、対照群は未処置とした。抗腫瘍効果を、対照群と比較した試験群における腫瘍増殖阻害として決定した。実施例1に記載されるように、CT26およびCT26-B2m-/-腫瘍を最初の処置の17日後に切除し、TC1およびTC1-B2m-/-腫瘍を最初の処置の9日後に切除し、消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をeF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)で染色した。CD8(BD、カタログ番号563046またはInvitrogen、カタログ番号1825015)およびCD45(BD、カタログ番号564279)に対する抗体ならびにgp70四量体(MBl、カタログ番号MBL-TB-M521-7)またはE7デキストラマー(Immudex、カタログ番号JA2195-PE)を使用した。細胞をAbsolute Counting Tubesに移し、BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
抗原をコードするRNA-LPXによるワクチン接種は、CT26およびTC1腫瘍の有意な増殖阻害をもたらしたが、無関係なRNA-LPXは、対照群と比較して腫瘍増殖に有意に影響しなかった(図25Aおよび27A)。抗原をコードするまたは無関係なRNA-LPXによるワクチン接種は、誘導されたB2m-/-腫瘍の増殖を阻害しなかった(図25Bおよび27B)。CD8+T細胞浸潤および抗原特異性の分析は、いずれの腫瘍モデルにおいても無関係なRNA-LPXの有意な効果を明らかにしなかった(図26および28)。抗原をコードするRNA-LPXによるワクチン接種は、B2m-/-および対照腫瘍へのCD8+T細胞の浸潤の有意な増強をもたらした。浸潤の増加に関連して、抗原をコードするRNA-LPXは、B2m-/-および対照腫瘍の両方において抗原特異的CD8+T細胞の頻度を高めた。これは、ワクチン接種が、MHCクラスI陰性であっても異なる腫瘍モデルに浸潤するCD8+T細胞をプライミングし、拡大させることを示す。それにもかかわらず、抗原特異的CD8+T細胞による浸潤はMHCクラスI欠損腫瘍の増殖に影響を及ぼさず、治療的ワクチン接種に対するそれらの耐性を確認する。
最近の報告は、化学療法または放射線療法(古典的な癌治療)に対する応答の間に免疫系が重要な役割を果たすことを示している(Galluzzi et.al.Cancer Cell 28,690-714(2015)、Weichselbaum et.al.Nat Rev Clin Oncol 14,365-379(2017))。本発明者らは、MHCクラスI喪失を介した炎症腫瘍のサイレンシングが古典的な癌治療の有効性にも影響を及ぼし得ると仮定した。この仮説を試験するために、実施例1に記載されるように、マウスにCT26またはCT26-B2m-/-腫瘍細胞を接種した(腫瘍増殖についてはn=9~10/群、フローサイトメトリについてはn=5/群)。化学療法のために、腫瘍が約6mm3の平均体積に達した後0、7および14日目に、マウスに5mg/kgのオキサリプラチン(OX)(Medac、Medoxa)を腹腔内(i.p.)注射し、60mg/kgの5-フルオロウラシル(5-FU)(Medac、5-FU medac)を静脈内(i.v.)注射した。対照群にはビヒクルを投与した。放射線療法では、腫瘍が約30mm3の平均体積に達した後、X-RAD 320(Precision X-Ray Instruments)を使用して12Gyで腫瘍に局所照射した。対照群は未処置であった。抗腫瘍効果を、対照群と比較した試験群における腫瘍増殖阻害、および100日間の観察期間中の生存率として決定した。実施例1に記載されるように、最初の処置の13日後(化学療法)または8日後(放射線療法)に腫瘍を切除し、消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をeF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)で染色した。CD8(BD、カタログ番号553031)およびCD45(BD、カタログ番号564279)に対する抗体ならびにgp70四量体(MBl、カタログ番号MBL-TB-M521-7)を使用した。細胞をAbsolute Counting Tubesに移し、BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
化学療法または放射線療法による処置は、CT26およびCT26-B2m-/-腫瘍の増殖を有意に阻害し、対照群に比べて全ての処置群の生存率を有意に改善した(図29および31)。化学療法または放射線療法の両方の後、3/10匹(30%)のCT26腫瘍担持マウスが完全奏効を示し、腫瘍接種後100日まで腫瘍拒絶および長期生存をもたらしたが、全ての対照動物は腫瘍の進行のために犠死させなければならなかった。対照的に、CT26-B2m-/-腫瘍担持マウスはいずれの処置後も完全奏効を示さず、全てのマウスを100日目までに犠死させなければならなかった。CT26腫瘍におけるCD8+T細胞浸潤および抗原特異性の分析は、対照群と比較した化学療法または放射線療法後のCD8+T細胞数の増加および化学療法後のより高いgp70抗原特異性への傾向を明らかにした(図30Aおよび30Cならびに32Aおよび32C)。浸潤CD8+T細胞の数における同じ傾向がCT26-B2m-/-腫瘍で観察可能であり、両方の治療後、浸潤CD8+T細胞の抗原特異性の有意な増加が検出された(図30Bおよび30Dならびに32Bおよび32D)。これらのデータは、古典的な癌治療が、MHCクラスI発現腫瘍の拒絶をもたらす完全奏効を媒介することができるCD8+T細胞応答のプライミングにつながり得ることを示唆する。このため、MHCクラスI欠損腫瘍は、古典的な癌治療に対する免疫媒介性完全奏効を回避することができる。
実施例4:抗体とIL2の併用免疫療法はTMEにおいて炎症を誘導し、MHCクラスI欠損腫瘍に対する治療的免疫応答をもたらす
次に、MHCクラスI欠損腫瘍に対する治療的免疫応答を可能にする治療レジメンを同定しようと試みた。適応免疫系は、MHCクラスI上に提示された抗原を介して腫瘍細胞を選択的に認識する。これはMHC I欠損腫瘍ではもはや不可能であるため、代替方法による腫瘍の抗原特異的認識を再確立する必要がある。これを達成するために、腫瘍細胞を外来細胞としてしるし付けるためにレジメンを腫瘍関連抗原(TAA)に結合する抗体に基づくものとした。自然免疫細胞(例えばNK細胞またはマクロファージ)は、Fcγ受容体(FcγR)を介して抗体オプソニン化腫瘍細胞を認識し、抗体依存性細胞傷害(ADCC)または食作用(ADCP)によって抗原特異的に細胞を排除することができる。さらに、アジュバントとして働く第2の化合物が、腫瘍細胞排除のために免疫細胞をFcγRで活性化し、ライセンスするのに必要であると仮定した。この目的のために、サイトカインIL2は自然免疫および適応免疫の強力な活性化因子であるので、これを選択した。IL2はNK細胞を活性化し、IFNγ産生を増強する(Weigent et al.Infect Immun 41,992-7(1983))。二次的効果として、TME中のNK細胞によって放出されたIFNγは、いくつかのケモカインの発現を誘導し、免疫細胞の流入をもたらし、強力なADCPエフェクタ細胞としてマクロファージを活性化することもできる(Shi et al.J Immunol 194,4379-86(2015))。実施例1に記載されるように、マウスにB16F10および誘導されたB2m-/-腫瘍細胞を接種した(n=9~10/群)。マウスに、腫瘍接種後5、8、12、15、19、22および26日目に200μgの抗Trp1抗体(TA99)またはアイソタイプ対照を腹腔内(i.p.)注射し、腫瘍接種後5、12、19および26日目にmAlb-mIL2またはTransIT(登録商標)(Mirus、カタログ番号MIR2255)で製剤化した対照としてのmAlb(いかなるサイトカインもコードしない)をコードする1μgのRNAを静脈内(i.v.)注射した。mAlb-mIL2は、IL2の血清半減期を延長し、透過性および保持(EPR)効果の増強によって腫瘍中のタンパク質を濃縮するために、アルブミンがIL2のN末端に連結された融合タンパク質である。このタンパク質は、数日間にわたって肝臓におけるタンパク質の高発現をもたらす、N1-メチルプソイドウリジン修飾mRNAにコードされている。対照群をアイソタイプおよびmAlb RNAで処置した。抗腫瘍効果を、対照群と比較した試験群における腫瘍増殖阻害、および100日間の観察期間中の生存率として決定した。さらなるマウスに、実施例1に記載されるようにB16F10-B2m-/-を接種し(n=7~8/群)、上記の処置を腫瘍接種の9日後に開始した。実施例1に記載されるように、最初の処置の11日後に腫瘍を切除し、消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞を、eF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)、Fixable Yellow Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34967)またはFixable Red Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34971)で染色した。CD3(Biolegend、カタログ番号100227)、CD4(BD、カタログ番号564298)CD8(BD、カタログ番号553031)、CD11b(BD、カタログ番号553310)、CD11c(Miltenyi、カタログ番号130-102-493)、CD25(BD、カタログ番号564023)、CD45(BD、カタログ番号564279)、CD103(ebioscience、カタログ番号12-1031-83)、F4/80(Biolegend、カタログ番号123132および123146)、FoxP3(ebioscience、カタログ番号12-5773-82)、FcγRI(BD、カタログ番号740622)、FcγRII/III(BD、カタログ番号558636)、FcγRIV(BD、カタログ番号742564)、TCR γδ(BD、カタログ番号563993)、Ly6C(BD、カタログ番号553104)、Ly6G(BD、カタログ番号551461)、NK1.1(BD、カタログ番号108738)、SiglecF(BD、カタログ番号565183)ならびにXCR1(Biolegend、カタログ番号148220)に対する抗体を使用した。細胞をAbsolute Counting Tubesに移し、BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
次に、MHCクラスI欠損腫瘍に対する治療的免疫応答を可能にする治療レジメンを同定しようと試みた。適応免疫系は、MHCクラスI上に提示された抗原を介して腫瘍細胞を選択的に認識する。これはMHC I欠損腫瘍ではもはや不可能であるため、代替方法による腫瘍の抗原特異的認識を再確立する必要がある。これを達成するために、腫瘍細胞を外来細胞としてしるし付けるためにレジメンを腫瘍関連抗原(TAA)に結合する抗体に基づくものとした。自然免疫細胞(例えばNK細胞またはマクロファージ)は、Fcγ受容体(FcγR)を介して抗体オプソニン化腫瘍細胞を認識し、抗体依存性細胞傷害(ADCC)または食作用(ADCP)によって抗原特異的に細胞を排除することができる。さらに、アジュバントとして働く第2の化合物が、腫瘍細胞排除のために免疫細胞をFcγRで活性化し、ライセンスするのに必要であると仮定した。この目的のために、サイトカインIL2は自然免疫および適応免疫の強力な活性化因子であるので、これを選択した。IL2はNK細胞を活性化し、IFNγ産生を増強する(Weigent et al.Infect Immun 41,992-7(1983))。二次的効果として、TME中のNK細胞によって放出されたIFNγは、いくつかのケモカインの発現を誘導し、免疫細胞の流入をもたらし、強力なADCPエフェクタ細胞としてマクロファージを活性化することもできる(Shi et al.J Immunol 194,4379-86(2015))。実施例1に記載されるように、マウスにB16F10および誘導されたB2m-/-腫瘍細胞を接種した(n=9~10/群)。マウスに、腫瘍接種後5、8、12、15、19、22および26日目に200μgの抗Trp1抗体(TA99)またはアイソタイプ対照を腹腔内(i.p.)注射し、腫瘍接種後5、12、19および26日目にmAlb-mIL2またはTransIT(登録商標)(Mirus、カタログ番号MIR2255)で製剤化した対照としてのmAlb(いかなるサイトカインもコードしない)をコードする1μgのRNAを静脈内(i.v.)注射した。mAlb-mIL2は、IL2の血清半減期を延長し、透過性および保持(EPR)効果の増強によって腫瘍中のタンパク質を濃縮するために、アルブミンがIL2のN末端に連結された融合タンパク質である。このタンパク質は、数日間にわたって肝臓におけるタンパク質の高発現をもたらす、N1-メチルプソイドウリジン修飾mRNAにコードされている。対照群をアイソタイプおよびmAlb RNAで処置した。抗腫瘍効果を、対照群と比較した試験群における腫瘍増殖阻害、および100日間の観察期間中の生存率として決定した。さらなるマウスに、実施例1に記載されるようにB16F10-B2m-/-を接種し(n=7~8/群)、上記の処置を腫瘍接種の9日後に開始した。実施例1に記載されるように、最初の処置の11日後に腫瘍を切除し、消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞を、eF780(ebioscience、カタログ番号65-0865-14)、Fixable Yellow Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34967)またはFixable Red Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34971)で染色した。CD3(Biolegend、カタログ番号100227)、CD4(BD、カタログ番号564298)CD8(BD、カタログ番号553031)、CD11b(BD、カタログ番号553310)、CD11c(Miltenyi、カタログ番号130-102-493)、CD25(BD、カタログ番号564023)、CD45(BD、カタログ番号564279)、CD103(ebioscience、カタログ番号12-1031-83)、F4/80(Biolegend、カタログ番号123132および123146)、FoxP3(ebioscience、カタログ番号12-5773-82)、FcγRI(BD、カタログ番号740622)、FcγRII/III(BD、カタログ番号558636)、FcγRIV(BD、カタログ番号742564)、TCR γδ(BD、カタログ番号563993)、Ly6C(BD、カタログ番号553104)、Ly6G(BD、カタログ番号551461)、NK1.1(BD、カタログ番号108738)、SiglecF(BD、カタログ番号565183)ならびにXCR1(Biolegend、カタログ番号148220)に対する抗体を使用した。細胞をAbsolute Counting Tubesに移し、BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
TA99またはmAlb-mIL2 RNA単剤療法は、B16F10腫瘍の成長に有意な効果を及ぼさなかった(図33A)。mAlb-mIL2単剤療法は、B16F10-B2m-/-腫瘍の成長を有意に阻害した。(図33B)。TA99とmAlb-mIL2の併用療法は、B16F10およびB16F10-B2m-/-腫瘍の両方の成長を有意に阻害した。腫瘍増殖阻害は、両方の腫瘍モデルにおいて、対照群と比較してTA99およびmAlb-mIL2療法で処置したマウスの統計的に改善された生存率に反映された(図34)。対照群またはmAlb-mIL2単剤療法処置群のB16F10およびB16F10-B2m-/-腫瘍を担持する全てのマウスは、腫瘍の進行のために犠死させなければならなかった。TA99単剤療法は、B16F10モデルでは1/10匹のマウス(10%)およびB16F10-B2m-/-モデルでは2/10匹のマウス(20%)による100日目までの完全な腫瘍拒絶および生存をもたらした。TA99とmAlb-mIL2の併用治療は、両方のモデルにおいて単剤療法よりも優れており、B16F10モデルでは3/10匹のマウス(30%)およびB16F10-B2m-/-モデルでは6/10匹のマウス(60%)による完全な腫瘍拒絶を誘導した。
単剤療法およびTA99とmAlb-mIL2の併用療法後のB16F10-B2m-/-腫瘍におけるいくつかの免疫細胞サブセットの浸潤を分析し、それらを対照群と比較した。mAlb-mIL2単剤療法は、CD4+Th細胞、Treg細胞、CD8+T細胞、γδ T細胞、NK細胞、NKT細胞、マクロファージ、好酸球およびCD11b+DCによる浸潤を有意に増強した(図35、36、37および38)。cDC1、単球および好中球は、わずかに増強されたが、統計学的に有意ではなかった。TA99単剤療法は免疫浸潤に検出可能な効果を及ぼさなかったが、TA99とmAlb-mIL2の併用療法後の腫瘍の浸潤は、全ての場合にmAlb-mIL2単剤療法と同様であった。さらに、単剤療法およびTA99とmAlb-mIL2の併用療法後のマクロファージおよび単球によるFcγRの発現を分析し、それらを対照群と比較した。mAlb-mIL2単剤療法は、腫瘍内マクロファージおよび単球によるFcγRI、FcγRII/IIIおよびFcγRVIの発現を増強したが、TA99単剤療法は増強しなかった(図39および40)。FcγRの発現は、mAlb-mIL2単剤療法で処置した群と比較して、TA99とmAlb-mIL2の併用療法で処置した群では低く、これは、TA99が誘導するFcγRの内在化に起因する可能性が高い。
MHCクラスI欠損腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果に重要な細胞型を同定するために、マウス(n=8~15/群)に3×105個のB16F10-B2m-/-細胞を皮下(s.c.)接種し、腫瘍接種後5、8、12、15、19、22日目に抗Trp1(TA99)抗体で、ならびに腫瘍接種後5、12および19日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで、図33に記載されるように処置した。対照群には、アイソタイプ対照抗体およびmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)を投与した。NK1.1(Bioxcell、カタログ番号BE0036)、CSF1R(Bioxcell、カタログ番号BE0213)もしくはLy6G(Bioxcell、カタログ番号BE0075-1)に対する枯渇抗体または無関係な対照抗体(非枯渇)(Bioxcell、カタログ番号BE0089)を、腫瘍接種後4日目に400μgの負荷用量で、ならびに腫瘍接種後7、11、14、18および20日目に200μg(無関係な抗体、NK1.1もしくはLy6G)または300μg(CSF1R)の後続用量で腹腔内(i.p.)注射した。枯渇抗体を注射した群の生存率を、無関係な抗体を注射した群の生存率と比較して、免疫細胞枯渇に対する治療効果の違いを決定した。NK細胞および好中球の枯渇の成功を、CD3(Biolegend、カタログ番号100227)、CD11b(BD、カタログ番号550993)、CD45(BD、カタログ番号564279)、Ly6C(BD、カタログ番号553104)、Ly6G(BD、カタログ番号551461)およびNK1.1(Biolegend、カタログ番号108720)に対する抗体で染色した(Kranz et al.(Kranz,L.M.et al.Nature 534,396-401(2016))に記載されるように染色)血液試料のフローサイトメトリ分析によって確認した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
TA99とmAlb-mIL2の併用療法で処置したマウスの生存に対するNK細胞(NK1.1)、マクロファージ(CSF1R)または好中球(Ly6G)の枯渇の有意な効果は観察されなかった(図41)。しかしながら、マクロファージ枯渇後には数匹のマウスをより早期に犠死させなければならず、100日目まで生存したのは8/15匹(53.3%)と比較してわずかに4/13匹(30.8%)であったので、マクロファージ枯渇後に抗腫瘍効果が弱まる傾向が観察された。染色した血液試料のフローサイトメトリ分析によって、NK細胞および好中球の枯渇が確認されたことに留意しなければならない(図42)。マクロファージの枯渇の成功はこの実験では確認されず、生存率のかなり小さな差は不完全なマクロファージ枯渇によるものであり得る。このため、完全なマクロファージ枯渇が確認できた後に実験を繰り返し、後ほど引き渡す予定である。
まとめると、抗TAA抗体とIL2の併用療法を、MHCクラスI欠損マウス腫瘍モデルの効率的な治療として同定した。抗体は腫瘍細胞の抗原特異的免疫認識を媒介し、一方IL2は、広範囲の免疫細胞の流入をもたらす、TMEにおける炎症を誘導した。さらに、ADCPを介してオプソニン化標的細胞を除去することができるマクロファージおよび単球は、IL2に応答してFcγRを強く上方制御し、IL2が自然免疫細胞を抗体エフェクタ機構に使用可能にすることを示唆する。併用療法は、MHCクラスI欠損腫瘍の完全な拒絶をもたらす。マウス腫瘍モデルにおける腫瘍標的化抗体、特に抗体とIL2との組合せの抗腫瘍効果におけるCD8+T細胞免疫の重要な役割が推測されるので、これは特に印象的な所見である(Park et al.Cancer Cell 18,160-70(2010)、Yang et al.Mol Ther 21,91-100(2013)、Zhu et al.Cancer Cell 27,489-501(2015)、Kwan et al.J Exp Med 214,1679-90(2017))。それにもかかわらず、本発明者らのデータは、自然免疫細胞による抗原特異的腫瘍細胞認識の再確立およびTMEにおける炎症の誘導を通じて、MHCクラスI欠損腫瘍に対する抗体とIL2の併用療法の予想外の適合性を明確に実証する。
実施例5:古典的癌治療は、抗体とIL2の併用免疫療法によるMHCクラスI欠損腫瘍の制御を増強する
本発明者らの最後の目的は、MHCクラスI欠損腫瘍の制御が古典的な癌治療によってさらに増強され得るかどうかを調べることであった。マウス(n=12~13/群)に3×105個のB16F10-B2m-/-細胞を皮下(s.c.)接種し、腫瘍接種後6日目に200mg/kgのシクロホスファミド(CTX)(Baxter、Endoxan)または対照としてのビヒクルを腹腔内(i.p.)注射し、次いで、実施例4に記載されるように、腫瘍接種後7、10、14、17および21日目に抗Trp1(TA99)抗体ならびに7、14および21日目にmAlb-mIL2をコードするRNAを用いて、または用いずに処置した。対照群を、アイソタイプ対照抗体またはmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)で処置した。抗腫瘍効果を、CTX単剤療法、TA99とmAlb-mIL2の併用療法または対照で処置した群と比較して、CTXおよびTA99およびmAlb-mIL2の併用療法で処置した群における腫瘍増殖阻害として決定した。
本発明者らの最後の目的は、MHCクラスI欠損腫瘍の制御が古典的な癌治療によってさらに増強され得るかどうかを調べることであった。マウス(n=12~13/群)に3×105個のB16F10-B2m-/-細胞を皮下(s.c.)接種し、腫瘍接種後6日目に200mg/kgのシクロホスファミド(CTX)(Baxter、Endoxan)または対照としてのビヒクルを腹腔内(i.p.)注射し、次いで、実施例4に記載されるように、腫瘍接種後7、10、14、17および21日目に抗Trp1(TA99)抗体ならびに7、14および21日目にmAlb-mIL2をコードするRNAを用いて、または用いずに処置した。対照群を、アイソタイプ対照抗体またはmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)で処置した。抗腫瘍効果を、CTX単剤療法、TA99とmAlb-mIL2の併用療法または対照で処置した群と比較して、CTXおよびTA99およびmAlb-mIL2の併用療法で処置した群における腫瘍増殖阻害として決定した。
腫瘍増殖の比較は、CTX、続いてTA99とmAlb-mIL2の併用療法による処置によって腫瘍進行がほぼ完全に阻害されたことを示した(図43)。増殖阻害は、CTX単剤療法またはTA99とmAlb-mIL2の併用療法と比較して有意に改善された。結論として、古典的な癌治療は、抗体とIL2の併用療法と良好に組み合わされ、MHCクラスI欠損腫瘍の相乗的な抗腫瘍制御をもたらす。
実施例6:抗体とIL2の併用免疫療法はIFNシグナル伝達欠損腫瘍に対する治療的免疫応答をもたらす
MHCクラスIの喪失に加えて、IFNシグナル伝達の欠損は、腫瘍がT細胞排除を免れるための別の方法であり、患者において頻繁に観察される(Gao et al.Cell 167,397-404(2016))。本発明者らの目標は、特定の耐性機構とは無関係にT細胞耐性腫瘍に適用可能な治療を同定することであった。このため、本発明者らはまた、Jak1の突然変異を介してIFNシグナル伝達経路が欠損している腫瘍に対して治療が有効であるかどうかを調べた。マウス(n=10/群)に3×105個のB16F10-Jak1-/-細胞を皮下(s.c.)接種し、腫瘍接種後5、8、12、15、19日目に抗Trp1(TA99)抗体で、ならびに腫瘍接種後5、12および19日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで、図33に記載されるように処置した。対照群には、アイソタイプ対照抗体およびmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)を投与した。
MHCクラスIの喪失に加えて、IFNシグナル伝達の欠損は、腫瘍がT細胞排除を免れるための別の方法であり、患者において頻繁に観察される(Gao et al.Cell 167,397-404(2016))。本発明者らの目標は、特定の耐性機構とは無関係にT細胞耐性腫瘍に適用可能な治療を同定することであった。このため、本発明者らはまた、Jak1の突然変異を介してIFNシグナル伝達経路が欠損している腫瘍に対して治療が有効であるかどうかを調べた。マウス(n=10/群)に3×105個のB16F10-Jak1-/-細胞を皮下(s.c.)接種し、腫瘍接種後5、8、12、15、19日目に抗Trp1(TA99)抗体で、ならびに腫瘍接種後5、12および19日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで、図33に記載されるように処置した。対照群には、アイソタイプ対照抗体およびmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)を投与した。
TA99単剤療法はB16F10-Jak1-/-腫瘍の成長を有意に遅延させたが、mAlb-mIL2 RNA単剤療法は遅延させず、TA99とmAlb-mIL2の併用療法は完全な腫瘍増殖阻害をもたらした(図44A)。腫瘍増殖阻害は、対照群と比較して、TA99単剤療法またはTA99とmAlb-mIL2の併用療法で処置したマウスの統計的に改善された生存率に反映された(図44B)。対照群の2/10(20%)のB16F10-Jak1-/-腫瘍は自然に退縮し、mAlb-mIL2単剤療法は5/10(50%)の腫瘍の退縮をもたらした。TA99単剤療法は、8/10匹(80%)のマウスによる100日目までの完全な腫瘍拒絶および生存をもたらし、TA99とmAlb-mIL2の併用治療は、10/10匹(100%)のマウスによる完全な腫瘍拒絶を誘導した。要約すると、抗体とIL2の併用療法は、IFNシグナル伝達欠損腫瘍に対する治療的免疫応答をもたらした。結論として、本治療レジメンは、MHCクラスIの喪失またはIFNシグナル伝達障害を介してCD8+T細胞による排除に対する耐性を獲得した腫瘍の治療のための汎用的なアプローチである。
実施例7:抗体とIL2の併用免疫療法は、マクロファージ、CD8+T細胞およびIFNγを必要とする
マクロファージ枯渇が、実施例4に記載されるように抗体とmAlb-mIL2の併用療法の抗腫瘍効果を弱める傾向をもたらしたことを考慮して、これらの結果を実証するために、より高い抗体用量を使用してマクロファージ枯渇のための改善されたプロトコルを確立した。C57Bl/6マウス(n=6)に、実施例1に記載されるように3×105個のB16F10-B2m-/-細胞を皮下(s.c.)接種した。CSF1Rに対する抗体(Bioxcell、カタログ番号BE0213)を、腫瘍接種後10日目に600μgの用量および12日目に350μgの用量で5匹のマウスに腹腔内(i.p.)注射し、1匹のマウスを対照として未処置のままにした。腫瘍接種の13日後に腫瘍を切除し、実施例1に記載されるように消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をFixable Yellow Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34967)で染色した。CD11b(BD、カタログ番号553310)、CD45(BD、カタログ番号564279)、F4/80(Biolegend、カタログ番号123132)ならびにGR-1(Biolegend、カタログ番号123132および123146)に対する抗体を使用した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
マクロファージ枯渇が、実施例4に記載されるように抗体とmAlb-mIL2の併用療法の抗腫瘍効果を弱める傾向をもたらしたことを考慮して、これらの結果を実証するために、より高い抗体用量を使用してマクロファージ枯渇のための改善されたプロトコルを確立した。C57Bl/6マウス(n=6)に、実施例1に記載されるように3×105個のB16F10-B2m-/-細胞を皮下(s.c.)接種した。CSF1Rに対する抗体(Bioxcell、カタログ番号BE0213)を、腫瘍接種後10日目に600μgの用量および12日目に350μgの用量で5匹のマウスに腹腔内(i.p.)注射し、1匹のマウスを対照として未処置のままにした。腫瘍接種の13日後に腫瘍を切除し、実施例1に記載されるように消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をFixable Yellow Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34967)で染色した。CD11b(BD、カタログ番号553310)、CD45(BD、カタログ番号564279)、F4/80(Biolegend、カタログ番号123132)ならびにGR-1(Biolegend、カタログ番号123132および123146)に対する抗体を使用した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
未処置対照腫瘍において明確なCD11b+F4/80+マクロファージ集団が観察可能であったのに対して、抗CSF1Rの注射は、4/5匹のマウスでマクロファージ集団の減少をもたらした(図45)。したがって、高用量の抗CSF1Rの注射は、3日以内にマクロファージを枯渇させることができる。
改善されたマクロファージ枯渇プロトコルを利用して、抗体とmAlb-mIL2の併用療法のためのマクロファージの重要性に関する有効なデータを得るため、およびリンパ球の役割を調べるために、C57Bl/6マウス(n=10~15/群)に3×105個のB16F10-B2m-/-細胞を皮下(s.c.)接種し、腫瘍接種後5、8、12、15および19日目に抗Trp1(TA99)抗体ならびに5、12および19日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで図33に記載されるように処置した。対照群は未処置であった。CD4(Bioxcell、カタログ番号BE0119)およびCD90.2(Bioxcell、カタログ番号BE0066)に対する枯渇抗体または無関係な対照抗体(非枯渇)(Bioxcell、カタログ番号BE0089)を、腫瘍接種後3日目に400μgの負荷用量で、ならびに7、10、14および20日目(20日目は対照および抗CD4のみ)に200μgの後続用量で腹腔内(i.p.)注射した。CSF1Rに対する抗体(Bioxcell、カタログ番号BE0213)を、腫瘍接種後2日目に600μgの負荷用量で、ならびに5、7、10、12および14日目に350μgの後続用量で腹腔内(i.p.)注射した。枯渇抗体を注射した群の生存率を、無関係な抗体を注射した群の生存率と比較して、免疫細胞枯渇に対する治療効果の違いを決定した。CD4+T細胞および全CD90.2+リンパ球の枯渇の成功を、CD4(BD、カタログ番号564298)、CD45(BD、カタログ番号564279)およびCD90.2(BD、カタログ番号553003)に対する抗体で染色した(Kranz et al.(Kranz,L.M.et al.Nature 534,396-401(2016))に記載されるように染色)血液試料のフローサイトメトリ分析によって確認した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
抗CD4の注射時のCD4+T細胞および抗CD90.2の注射時の全リンパ球の枯渇の成功は、抗体およびmAlb-mIL2処置開始の時点でマウスの血液で確認された(図46)。CD4+T細胞の枯渇は、抗体とmAlb-mIL2の併用療法の抗腫瘍活性に影響を及ぼさなかったが、全リンパ球枯渇時の生存率の有意な低下は、リンパ球集団が抗腫瘍効果のために必要であるに違いないことを示した(図47)。マクロファージの枯渇は、抗腫瘍活性をほぼ完全に阻害し、マクロファージが治療活性に必須であることを確認した。
NK細胞またはCD4+T細胞の枯渇が抗体とmAlb-mIL2の併用療法の抗腫瘍活性に影響を及ぼさなかったことを考慮して、CD8+T細胞が必要なリンパ球細胞集団であるかどうかを調べた。CD8+T細胞によって分泌されたIFNγがマクロファージを炎症誘発性の抗腫瘍表現型に分極し(Gubin et al.Cell 175(4),1014-30(2018))、マクロファージのIFNγ活性化がADCPを介して抗体オプソニン化腫瘍細胞の排除を増強する(Shi et al.J Immunol 194,4379-86(2015))ことを考慮して、MHCクラスI欠損腫瘍に対する抗体とmAlb-mIL2の併用療法の抗腫瘍活性にIFNγが必要であるかどうかをさらに調べた。C57Bl/6マウス(n=8~15/群)に3×105個のB16F10-B2m-/-細胞を皮下(s.c.)接種し、腫瘍接種後5、8、12、15および19日目に抗Trp1(TA99)抗体で、ならびに腫瘍接種後5、12および19日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで、図33に記載されるように処置した。対照群は未処置であった。CD8に対する枯渇抗体(Bioxcell、カタログ番号BE0117)またはIFNγに対する中和抗体(Bioxcell、カタログ番号BE0055)または無関係な対照抗体(非枯渇)(Bioxcell、カタログ番号BE0088)を、腫瘍接種後3日目に400μgの負荷用量で、7および10日目に200μgの抗CD8または5、7および10日目に250μgの対照抗体もしくは抗IFNγの後続用量で腹腔内(i.p.)注射した。枯渇抗体を注射した群の生存率を、無関係な抗体を注射した群の生存率と比較して、免疫細胞枯渇に対する治療効果の違いを決定した。CD8+T細胞の枯渇の成功を、CD8(BD、カタログ番号553032)およびCD45(BD、カタログ番号564279)に対する抗体で染色した(Kranz et al.(Kranz,L.M.et al.Nature 534,396-401(2016))に記載されるように染色)血液試料のフローサイトメトリ分析によって確認した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
抗CD8の注射時のCD8+T細胞の枯渇の成功は、抗体およびmAlb-mIL2処置開始の時点でマウスの血液で確認された(図48)。CD8+T細胞の枯渇またはIFNγの中和は、抗体およびmAlb-mIL2療法の抗腫瘍活性を同様に阻害し、CD8+T細胞が必要なリンパ球集団であることを示し、これらの細胞がIFNγの分泌を介して寄与することを示唆した(図49)。
次の目的は、抗体とmAlb-mIL2の併用療法による処置時にマクロファージの炎症誘発性分極が起こるかどうかを分析し、マクロファージ、CD8+T細胞およびIFNγの間の直接的な関係を確認することであった。C57Bl/6マウス(n=7~8/群)に3×105個のB16F10-B2m-/-細胞を皮下(s.c.)接種し、腫瘍接種後9、12および16日目に抗Trp1(TA99)抗体で、ならびに腫瘍接種後9および16日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで、図33に記載されるように処置した。対照群には、アイソタイプ対照抗体およびmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)を投与した。最初の処置の11日後に腫瘍を切除した。第2の実験では、C57Bl/6マウス(n=15/群)に接種し、同じ方法で処置し、さらにCD8に対する枯渇抗体(Bioxcell、カタログ番号BE0117)またはIFNγに対する中和抗体(Bioxcell、カタログ番号BE0055)または無関係な対照抗体(非枯渇)(Bioxcell、カタログ番号BE0088)を、腫瘍接種後7日目に400μgの負荷用量で、ならびに11および14日目に200μgの抗CD8または9、11および14日目に250μgの対照抗体もしくは抗IFNγの後続用量で腹腔内(i.p.)注射した。最初の処置の9日後に腫瘍を切除した。全ての腫瘍を実施例1に記載されるように消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をFixable Yellow Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34967)で染色した。CD11b(BD、カタログ番号562127)、CD45(BD、カタログ番号564279)、CD206(Biolegend、カタログ番号141720)、GR-1(Biolegend、カタログ番号108423)、F4/80(Biolegend、カタログ番号123132)およびMHC II(BD、カタログ番号551799)に対する抗体を使用した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。
腫瘍浸潤マクロファージの炎症誘発状態を決定するために、炎症誘発性M1様マクロファージ(MHC IIhigh、CD206low)および抗炎症性M2様マクロファージ(MHC IIlow、CD206high)の割合をフローサイトメトリによって定量化し、M1/M2比を計算した。抗体療法単独ではM1/M2比を有意に変化させなかったが、単剤療法でのmAlb-mIL2またはTA99と組み合わせたmAlb-mIL2はM1/M2比を有意に増加させ、マクロファージ区画の炎症誘発性リモデリングを示した(図50A)。マクロファージの炎症誘発性分極は、CD8+T細胞枯渇時またはIFNγ中和時に同様に抑止され、CD8+T細胞およびIFNγがmAlb-mIL2に応答してマクロファージ表現型を形作ることを示し、CD8+T細胞の重要性がIFNγの産生に依存する可能性が最も高いが、直接の腫瘍細胞排除には依存しないことを強調する(図50B)。
結論として、これらの結果は、MHCクラスIの非存在によって直接的なT細胞認識を回避する腫瘍の制御におけるCD8+T細胞のこれまで認識されていなかった役割を強調する。マクロファージが、抗体およびmAlb-mIL2療法の治療活性に必須であると同定された唯一のFcγR発現細胞型であるという事実を考慮すると、それらは抗体オプソニン化腫瘍細胞の排除に関与している可能性が最も高い。CD8+T細胞は、効率的な腫瘍細胞の排除を可能にするために、IFNγを介してマクロファージを活性化する。
実施例8:抗体およびmAlb-mIL2療法はICBの経過中の獲得耐性を防止する
ICBで治療された腫瘍患者のかなりの割合が、T細胞認識を回避する初期の少数のMHCクラスI欠損腫瘍細胞クローンの増殖から生じる獲得耐性の発現のために(Schoenfeld et al.Cancer Cell 37(4),443-55(2020))、初期の疾患制御後に再発を経験する(Zaretsky et al.N Engl J Med 375,819-29(2016))。獲得耐性をモデル化するために、C57Bl/6マウス(n=15/群)に、75%のB16F10および25%のB16F10-B2m-/-細胞を含む混合物の3×105個の細胞を皮下(s.c.)接種した。マウスを、腫瘍接種後3、7、10、14および17日目に抗Trp1(TA99)抗体で、ならびに3、10および17日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで、図33に記載されるように処置した。アイソタイプ抗体およびmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)を対照として使用した。さらに、マウスに、3、7、10、14および17日目に200μgの抗PD-1(Bioxcell、カタログ番号BE0146)を、3日目に200μgの負荷用量ならびに7、10、14および17日目に100μgの後続用量の抗CTLA4(Bioxcell、カタログ番号BE0131)と組み合わせて腹腔内(i.p.)注射した。アイソタイプ抗体(Bioxcell、カタログ番号BE0089およびBE0087)を対照とした。抗PD-1および抗CTLA4を投与された群の生存を、抗PD-1、抗CTLA4、TA99およびmAlb-mIL2を投与された群と比較して、腫瘍結合抗体およびmAlb-mIL2の添加がICBの抗腫瘍活性を増強するかどうかを決定した。マウスがエンドポイント基準に達したときに腫瘍を切除し、実施例1に記載されるように消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、単一細胞懸濁液を実施例1に記載されるようにIFNγで刺激した後、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をFixable Yellow Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34967)で染色した。CD45(BD、カタログ番号564279)、H2-Kb(BD、カタログ番号553570)およびH2-Db(BD、カタログ番号553574)に対する抗体を使用した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。MHCクラスI陽性腫瘍細胞の割合を異なる群にわたって比較して、ICBが耐性MHCクラスI欠損細胞の陽性選択をもたらし、抗体とmAlb-mIL2の併用療法が陽性選択を防止することができるかどうかを決定した。
ICBで治療された腫瘍患者のかなりの割合が、T細胞認識を回避する初期の少数のMHCクラスI欠損腫瘍細胞クローンの増殖から生じる獲得耐性の発現のために(Schoenfeld et al.Cancer Cell 37(4),443-55(2020))、初期の疾患制御後に再発を経験する(Zaretsky et al.N Engl J Med 375,819-29(2016))。獲得耐性をモデル化するために、C57Bl/6マウス(n=15/群)に、75%のB16F10および25%のB16F10-B2m-/-細胞を含む混合物の3×105個の細胞を皮下(s.c.)接種した。マウスを、腫瘍接種後3、7、10、14および17日目に抗Trp1(TA99)抗体で、ならびに3、10および17日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで、図33に記載されるように処置した。アイソタイプ抗体およびmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)を対照として使用した。さらに、マウスに、3、7、10、14および17日目に200μgの抗PD-1(Bioxcell、カタログ番号BE0146)を、3日目に200μgの負荷用量ならびに7、10、14および17日目に100μgの後続用量の抗CTLA4(Bioxcell、カタログ番号BE0131)と組み合わせて腹腔内(i.p.)注射した。アイソタイプ抗体(Bioxcell、カタログ番号BE0089およびBE0087)を対照とした。抗PD-1および抗CTLA4を投与された群の生存を、抗PD-1、抗CTLA4、TA99およびmAlb-mIL2を投与された群と比較して、腫瘍結合抗体およびmAlb-mIL2の添加がICBの抗腫瘍活性を増強するかどうかを決定した。マウスがエンドポイント基準に達したときに腫瘍を切除し、実施例1に記載されるように消化した。試料を単一細胞懸濁液に処理し、単一細胞懸濁液を実施例1に記載されるようにIFNγで刺激した後、Grunwitz et al.(Grunwitz,C.et al.Oncoimmunology 8,published online(2019))に記載されるように染色した。死細胞をFixable Yellow Dead Cell Stain(Life technologies、カタログ番号L34967)で染色した。CD45(BD、カタログ番号564279)、H2-Kb(BD、カタログ番号553570)およびH2-Db(BD、カタログ番号553574)に対する抗体を使用した。BD LSRFortessa(商標)フローサイトメータ(Becton Dickinson GmbH)でフローサイトメトリ分析を実施し、取得したデータをFlowJoソフトウェアバージョン10(TreeStar)を使用して分析した。MHCクラスI陽性腫瘍細胞の割合を異なる群にわたって比較して、ICBが耐性MHCクラスI欠損細胞の陽性選択をもたらし、抗体とmAlb-mIL2の併用療法が陽性選択を防止することができるかどうかを決定した。
抗PD-1および抗CTLA4 ICBは腫瘍増殖の遅延をもたらし、その後マウスの80%(12/15)で腫瘍が増殖したが、マウスの20%(3/15)は、おそらくMHCクラスI欠損細胞のバイスタンダー排除により、腫瘍を拒絶した(Spiotto et al.Nat Med 10(3),294-8(2004))(図51)。ICBを用いないTA99およびmAlb-mIL2療法は、腫瘍の33.3%(5/15)の拒絶をもたらし、TA99およびmAlb-mIL2とICBとの組合せは、マウスの60%(9/15)が観察期間の終了時に腫瘍を有していなかったことを考慮すると、優れた腫瘍拒絶をもたらした。これは、ICBのみで処置した群と比較して有意に改善された生存率に反映された。
腫瘍中のMHCクラスI陽性腫瘍細胞の割合の分析は、対照のみで処置した群では腫瘍細胞比が安定なままであったことを示したが、ICBはMHCクラスI欠損腫瘍細胞の非常に有意な濃縮をもたらした。これは、T細胞感受性腫瘍細胞の選択的枯渇、それに続くICB耐性腫瘍細胞の増殖を示し、獲得耐性および腫瘍再発をもたらした。TA99およびmAlb-mIL2の添加は、MHCクラスI欠損細胞の選択的濃縮を完全に防止した。
結論として、ICBへの抗体とmAlb-mIL2の併用療法の追加は、MHCクラスI依存性T細胞応答を誘導する免疫療法の過程で、T細胞耐性腫瘍細胞の選択利点を損なうことによって獲得耐性の出現を防ぐことができる。
実施例9:抗体とmAlb-mIL2の併用免疫療法はMC38-Her2-B2m-/-腫瘍に対して効率的であり、古典的癌治療に対するMHCクラスI欠損腫瘍の完全な応答を回復させる
第2のMHCクラスI欠損腫瘍モデルに対する抗体およびmAlb-mIL2療法の有効性を調べるために、MC38-B2m-/-を、Beissert et al.(Beissert et al.Mol Ther 28(1),119-28(2019))に記載されているように、Ef1aプロモータの制御下でラットHer2/neu(GeneArt,Thermo Fisher Scientificによって合成)をコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクターを使用して形質導入した。形質導入された細胞を、4μg/mLのブラスチシジンを含有する培地で、37℃および5%CO2で1週間培養し、その後、実施例1に記載されるように単一クローンを得、フローサイトメトリによってHer2発現についてスクリーニングした。Her2陽性クローンを6ウェルプレートで37℃および5%CO2で4週間、ブラスチシジンなしで培養し、Her2発現についてスクリーニングした。導入遺伝子の安定な組み込みを示す1つのクローンをMC38-Her2-B2m-/-と表し、さらなる試験に使用した(図53)。
第2のMHCクラスI欠損腫瘍モデルに対する抗体およびmAlb-mIL2療法の有効性を調べるために、MC38-B2m-/-を、Beissert et al.(Beissert et al.Mol Ther 28(1),119-28(2019))に記載されているように、Ef1aプロモータの制御下でラットHer2/neu(GeneArt,Thermo Fisher Scientificによって合成)をコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクターを使用して形質導入した。形質導入された細胞を、4μg/mLのブラスチシジンを含有する培地で、37℃および5%CO2で1週間培養し、その後、実施例1に記載されるように単一クローンを得、フローサイトメトリによってHer2発現についてスクリーニングした。Her2陽性クローンを6ウェルプレートで37℃および5%CO2で4週間、ブラスチシジンなしで培養し、Her2発現についてスクリーニングした。導入遺伝子の安定な組み込みを示す1つのクローンをMC38-Her2-B2m-/-と表し、さらなる試験に使用した(図53)。
MC38-Her2-B2m-/-が抗体とmAlb-mIL2の併用療法に応答するかどうかを試験するために、C57Bl/6マウス(n=10/群)に5×105個のMC38-Her2-B2m-/-細胞を皮下(s.c.)接種した。マウスに、腫瘍接種後3、6、10、13、17および24日目に200μgの抗Her2抗体(7.16.4)(Bioxcell、カタログ番号BE0277)またはアイソタイプ対照(Bioxcell、カタログ番号BE0085)、ならびに3、10、17および24日目に図33に記載されるmAlb-mIL2をコードするRNAを腹腔内(i.p.)注射した。抗腫瘍効果を、対照群と比較した試験群における腫瘍増殖阻害、および100日間の観察期間中の生存率として決定した。
単剤療法としての7.16.4またはmAlb-mIL2による処置および併用療法による処置は、腫瘍の成長を有意に阻害した(図54A)。7.16.4での処置は腫瘍拒絶を誘導しなかったが、単剤療法においてmAlb-mIL2で処置したマウスの10%(1/10)が腫瘍を拒絶した。抗体とmAlb-mIL2の併用療法で処置したマウスの50%(5/10)は腫瘍を拒絶し、実験終了まで腫瘍がないままであり、mAlb-mIL2単剤療法を受けた群と比較して有意に改善された生存をもたらした(図54B)。
MC38-Her2-B2m-/-腫瘍が抗体とmAlb-mIL2の併用療法を使用して効率的に標的化可能であったことを考慮して、治療がこの腫瘍モデルにおいて化学療法に対する完全応答を回復させることができるかどうかを調べた。最初に、化学療法に対するMC38-B2m-/-の耐性を決定するために、マウスに、実施例1に記載されるようにMC38(n=15/群)またはMC38-B2m-/-(n=10/群)を接種し、腫瘍接種後4、11および18日目に図29に記載されるようにOXを注射した。対照群にはビヒクルを投与した。抗腫瘍効果を、100日間の観察期間中の対照群と比較した試験群の生存率として決定した。
化学療法は、MC38またはMC38-B2m-/-腫瘍を担持するマウスの生存を有意に改善した(図55)。全てのMC38-B2m-/-腫瘍は最終的に進行したが、化学療法はMC38腫瘍の拒絶率を対照群の13.3%(2/15)から26.7%(4/15)に倍増させ、化学療法に対するMC38腫瘍の完全応答には機能的MHCクラスI発現が必要であることを示した。
抗体とmAlb-mIL2の併用療法の添加が化学療法に対する完全応答を再び可能にするかどうかを分析するために、マウス(n=15/群)にMC38-Her2-B2m-/-細胞を接種し、図29に記載されるように腫瘍接種後4、11および18日目にOXを注射し、図54に記載されるように5、8、12、15および19日目に抗Her2(7.16.4)抗体、ならびに7、14および21日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで処置した。対照群を、ビヒクル、アイソタイプ対照抗体またはmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)で処置した。抗腫瘍効果を、OX単剤療法または7.16.4とmAlb-mIL2の併用療法で処置した群と比較して、OXおよび7.16.4とmAlb-mIL2の併用療法で処置した群の生存率として決定した。
OX単剤療法または7.16.4とmAlb-mIL2の併用療法で処置した腫瘍の100%(15/15)が治療の経過中に進行した(図56)。OXへの7.16.4およびmAlb-mIL2の添加は、腫瘍の53.3%(8/15)の拒絶を可能にし、他の処置群と比較して有意に改善された生存率をもたらした。
要約すると、MHCクラスI欠損腫瘍の効率的な標的化は、異なる抗体標的を使用した第2の腫瘍モデルにおいて実証された。第2のモデルでは、MHCクラスI欠損が、古典的な癌治療によって誘導される完全応答に対する腫瘍の耐性をもたらすことがさらに確認された。古典的な癌治療への抗体およびmAlb-mIL2の添加は、完全応答を再び可能にし、相乗的な腫瘍制御をもたらし、このアプローチの適用性を強調する。
実施例10:古典的癌治療は、抗体とIL2の併用免疫療法によるIFNシグナル伝達欠損腫瘍の制御を増強する
古典的な癌治療および抗体とmAlb-mIL2の併用療法の相乗活性を、IFNシグナル伝達が欠損している腫瘍に対してさらに調べた。マウス(n=14~15/群)に5×105個のB16F10-Jak1-/-細胞を皮下(s.c.)接種し、腫瘍接種後7日目に実施例5に記載されるように150mg/kgのCTXで、実施例4に記載されるように腫瘍接種後8、11、15、18および22日目に抗Trp1(TA99)抗体で、ならびに8、15および22日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで処置した。対照群を、ビヒクル、アイソタイプ対照抗体またはmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)で処置した。抗腫瘍効果を、CTX単剤療法またはTA99とmAlb-mIL2の併用療法で処置した群と比較して、CTXおよびTA99とmAlb-mIL2の併用療法で処置した群の生存率として決定した。
古典的な癌治療および抗体とmAlb-mIL2の併用療法の相乗活性を、IFNシグナル伝達が欠損している腫瘍に対してさらに調べた。マウス(n=14~15/群)に5×105個のB16F10-Jak1-/-細胞を皮下(s.c.)接種し、腫瘍接種後7日目に実施例5に記載されるように150mg/kgのCTXで、実施例4に記載されるように腫瘍接種後8、11、15、18および22日目に抗Trp1(TA99)抗体で、ならびに8、15および22日目にmAlb-mIL2をコードするRNAで処置した。対照群を、ビヒクル、アイソタイプ対照抗体またはmAlbをコードするRNA(いかなるサイトカインもコードしない)で処置した。抗腫瘍効果を、CTX単剤療法またはTA99とmAlb-mIL2の併用療法で処置した群と比較して、CTXおよびTA99とmAlb-mIL2の併用療法で処置した群の生存率として決定した。
CTXは腫瘍増殖の遅延を誘導し、腫瘍の6.7%(1/15)の拒絶をもたらしたが、TA99とmAlb-mIL2の併用療法は腫瘍の69.2%(9/15)の拒絶を誘導した(図57)。CTXは、TA99およびmAlb-mIL2での処置時に優れた拒絶反応のために腫瘍を感作させ、これによって腫瘍拒絶率が86.7%(13/15)に増加した。結論として、古典的な癌治療は、抗体とmAlb-mIL2の併用療法で処置したIFNシグナル伝達欠損腫瘍の制御を改善する。
Claims (39)
- MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を有する対象を治療する方法であって、
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する抗体に基づく免疫療法
を前記対象に投与することを含む方法。 - 前記癌が、MHC依存性T細胞、特にCD8+T細胞などのT細胞に基づく治療に十分に応答しない、請求項1に記載の方法。
- 前記癌が抗原のプロセシングおよび/または提示を欠損している、請求項1または2に記載の方法。
- 前記癌がMHC-I欠損である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記MHC-Iの欠損が、β2-ミクログロブリン(B2M)などのMHC-I対立遺伝子の突然変異または部分的もしくは完全な喪失に起因する、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌がT細胞刺激能を欠損している、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、I型IFNまたはIFNγシグナル伝達などのIFNシグナル伝達を欠損している、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 癌を有する対象において癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防する方法であって、
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する抗体に基づく免疫療法
を前記対象に投与することを含む方法。 - 前記耐性が、前記癌がMHC依存性T細胞、特にCD8+T細胞などのT細胞に基づく治療に十分に応答しないことを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記耐性が、前記癌が抗原のプロセシングおよび/または提示を欠損していることを含む、請求項8または9に記載の方法。
- 前記耐性が、前記癌がMHC-I欠損であることを含む、請求項8~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記MHC-Iの欠損が、β2-ミクログロブリン(B2M)などのMHC-I対立遺伝子の突然変異または部分的もしくは完全な喪失に起因する、請求項8~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記耐性が、前記癌がT細胞刺激能を欠損していることを含む、請求項8~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記耐性が、前記癌がI型IFNまたはIFNγシグナル伝達などのIFNシグナル伝達を欠損していることを含む、請求項8~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL2またはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがRNAである、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌に対する抗体に基づく免疫療法が、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌に対する治療用抗体が、癌の細胞によって発現される腫瘍抗原に対するものである、請求項16に記載の方法。
- 前記癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドがRNAである、請求項16または17に記載の方法。
- a.IL2またはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするRNA;および
b.癌に対する治療用抗体
を前記対象に投与することを含む、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。 - 前記癌が抗原の発現または発現上昇に関連する、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項20に記載の方法。
- 前記癌に対する抗体に基づく免疫療法が前記抗原に対するものである、請求項20または21に記載の方法。
- 前記IL2またはその機能的バリアントを含むポリペプチドが、延長薬物動態(PK)IL2である、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記延長PK IL2が融合タンパク質を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、IL2またはその機能的バリアントの部分と、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、Fn3およびそれらのバリアントからなる群より選択される部分とを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記血清アルブミンがマウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記免疫グロブリン断片が免疫グロブリンFcドメインを含む、請求項25に記載の方法。
- a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド;および
c.MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を治療または予防するための医薬製剤の使用説明書
を含む医薬製剤。 - MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を治療または予防するための、
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド
を含む医薬製剤。 - a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド;および
c.癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防するための医薬製剤の使用説明書
を含む医薬製剤。 - 癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防するための、
a.IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
b.癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド
を含む医薬製剤。 - キットである、請求項28~31のいずれか一項に記載の医薬製剤。
- 前記IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、前記癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドとを別々の容器に含む、請求項28~32のいずれか一項に記載の医薬製剤。
- 医薬組成物である、請求項28~31のいずれか一項に記載の医薬製剤。
- 前記医薬組成物が、1つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤をさらに含む、請求項34に記載の医薬製剤。
- MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を治療または予防するための、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドと共に投与されることになっている、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- MHC依存性T細胞応答に対して少なくとも部分的に耐性である癌を治療または予防するための、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドであって、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと共に投与されることになっている、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防するための、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドと共に投与されることになっている、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 癌がMHC依存性T細胞応答に対する耐性を発現するのを予防するための、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチドであって、IL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドまたはIL2もしくはその機能的バリアントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと共に投与されることになっている、癌に対する治療用抗体または癌に対する治療用抗体をコードするポリヌクレオチド。
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