KR20220004653A - 유출 펌프-암 항원 다중특이적 항체 및 그것과 관련된 조성물, 시약, 키트 및 방법 - Google Patents

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에반 매튜 비숍
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알리사 로렌 브릭스
수치스미타 모한티
폴 데이비드 포나스
신디 탄
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Abstract

세포 유출 펌프 및 암-관련된 항원 둘 다를 표적화하는 다중특이적 항체, 뿐만 아니라 이러한 다중특이적 항체를 포함하거나 암호화하는 약학적 조성물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 세포, 및 키트가 제공된다. 세포 유출 펌프 및 암-관련된 항원 둘 다를 표적화하는 다중특이적 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암에 대해 대상체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 대상 방법에 유용한 유전적으로 변형된 세포주 및 이러한 유전적으로 변형된 세포주를 제조하는 방법을 포함하는, 기재된 다중특이적 항체 및 그것과 관련된 시약을 생성하는 방법이 또한 제공된다.

Description

유출 펌프-암 항원 다중특이적 항체 및 그것과 관련된 조성물, 시약, 키트 및 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 1월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/967,478 및 2019년 4월 2일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/828,044에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 그 출원들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
도입
질환이 약학적 치료에 대한 내성이 생길 때 일어나는 널리 공지된 현상인 약물 저항성은 종양학을 포함한 다양한 의학의 분야에서 주요하고 점점 증가하는 과제이다. 약물 저항성의 일부 방법은 질환-특이적이지만, 미생물 및 인간 약물-저항성 암에서 관찰되는 약물 유출과 같은 다른 것들은 진화론적으로 보존된다. 많은 유형의 암이 처음에는 화학요법에 민감하지만, 시간이 흐름에 따라 그것들은 약물 억제, 분해 및 유출 향상을 촉진하는 대사 변화 및 DNA 돌연변이와 같은 이러한 및 다른 메커니즘을 통해 저항성을 발달시킬 수 있다.
유출 펌프 (EP)는 거의 모든 살아있는 세포에 의해 발현되는 단백질이고 세포로부터 다양한 화합물을 자연적으로 배출하도록 진화되었다. ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체 패밀리 단백질의 구성원이 건강한 세포의 원형질막에서 약물 유출을 가능하게 하고 널리 연구된 중요한 조절자인 EP의 예이다. 수송체의 구조가 단백질마다 다르긴 하지만 (예를 들어, 인간에는 49개의 공지된 ABC 패밀리의 구성원이 존재한다), 그것들은 모두 2개의 별개의 도메인 - 고도로 보존된 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 더 가변적인 막관통 도메인 - 의 존재에 의해 분류된다. ATP 결합 카세트 서브패밀리 B 구성원 1 (ABCB1) 유전자에 의해 암호화되는 다중약물 저항성 단백질 1은 이것들 중 처음으로 확인되었고 광범위하게 연구되었다. MDR1의 정상적인 발현은 특정 조직 (예를 들어, 결장, 간, 및 신장)이 신생물이 될 때 이들 조직에서 증가하였고 특정 화학치료제로의 치료에 반응하여 증가한 발현은 MDR1 과발현의 내재적 및 외부적 메커니즘이 둘 다 작동하고 있다는 것을 입증한다.
EP는 세포와 종양이 화학치료제에 대한 저항성을 발달시킬 수 있게 한다. 이러한 저항성은 저항성 세포로부터의 치료 분자의 향상된 유출과 빈번하게 연관성이 있다. 이 화학요법 저항성은 하나 초과의 화학치료제에 적용될 때 다중 약물 저항성 (MDR)이라고 불린다. EP를 표적화하고 억제하는 다양한 소분자 억제자가 개발되었지만 인간 임상 설정에서는 아무 것도, 세포 또는 그것들의 유출 펌프의 기능과 관계없이, 자연 발생 세포 독소의 유출에 EP를 이용하는 건강한 세포를 포함한 체내의 모든 세포에 침투하여 그것에 영향을 미치는 성향, 등의 다양한 이유로 성공한 적이 없다.
암 환자들 중에서, 전이성 암 세포 집단이 화학요법의 사용에 의해 대부분 사멸되고 환자로부터 제거된 경우, 이전의 요법을 이용한 재개된 치료에 대한 반응 없이 세포의 약물-저항성 암성 집단이 나타나고 확산되는 것은 드문 일이 아니다. 대부분의 경우에, 다시 한 번 약물-저항성 세포 및/또는 종양의 또 다른 신생 집단이 발생할 때까지 상이한 작용 메커니즘을 가진 상이한 약물이 적용된다.
MDR1 및 종양-관련 항원 (TAA) 둘 다를 표적화하는 다중특이적 항체로서 사용될 수 있는 항-MDR1 항체, 뿐만 아니라 이러한 다중특이적 항체를 포함하거나 암호화하는 약학적 조성물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 세포, 및 키트가 제공된다. 다중특이적 항체는 MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 공통 가변 경쇄 (VL), MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 제1 가변 중쇄 (VH), 및 TAA에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 제2 VH 사슬을 포함한다. 암에 대해 대상체를 치료하는 방법이 또한 제공되며 MDR1 및 TAA 둘 다를 표적화하는 다중특이적 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 다중특이적 항체를 단독으로 투여하는 단계 또는 다중특이적 항체와 화학치료제를 투여하는 단계를 수반할 수 있다. 기재된 다중특이적 항체 및 그것과 관련된 시약을 생성하는 방법이 또한 제공되며, 대상 방법에 유용한 유전적으로 변형된 세포주 및 이러한 유전적으로 변형된 세포주를 제조하는 방법을 포함한다.
본원에서 제공된 이중특이적 항체는 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 암 세포에 결합하지만 MDR1 및/또는 TAA를 발현하는 비-암 세포에 대한 감소된 결합을 나타낸다. 다시 말해서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체는 (1) MDR1 발현이 낮거나 없는 경우 TAA를 발현하는 세포 및 (2) TAA 발현이 낮거나 없는 경우 MDR1을 발현하는 세포에 낮은 친화도로 결합하고, 상대적으로 높은 수준, 즉, 정상 세포보다 더 높은 수준으로 MDR1 및 CD47 중 적어도 하나 또는 둘 다를 발현하는 암 세포에 높은 친화도로 결합한다.
또한 항-MDR1 항체 15D3과 비교하여 MDR1에 대해 감소된 친화도를 가진 항-MDR1 항체 및 항-CD47 항체 5F9와 비교하여 CD47에 대해 감소된 친화도를 가진 항-CD47 항체가 본원에서 개시되어 있다. 이들 항체는 동시-투여될 때 대상체의 암 치료에 사용되고 화학요법에 대한 암 세포의 화학민감도을 증가시키는데 사용된다.
도 1A는 본원에서 기재된 본 발명의 다중특이적 항체의 구체예의 개략도를 제공한다.
도 1B는 다중특이적 항체가 표적화되는 표적 중 하나 또는 둘 다를 발현하는 세포로의 도 1A에서 도시된 다중특이적 항체의 구체예의 결합을 나타내는 개략도를 제공한다.
도 2는 본원에서 기재된 이중특이적 단클론성 항체의 개략도를 제공한다.
도 3A-3F는 나타난 바와 같이 표적을 발현하는 나이브(naive) 및 재조합 세포주를 포함한 다양한 세포주 상에서 Pgp 및 CD47 (어떤 경우에는 "KT14"라고도 불림)에 대한 라벨링된 단클론성 항체의 결합의 FACS 분석을 제공한다.도 4A-4B는 두 표적이 동시-발현될 때 특이적 결합을 나타내는 다양한 시약 세포주 (예를 들어, 293T 나이브 세포) 및 표적 중 단 하나만이 존재할 때 크게 감소된 결합을 나타내는 시약 세포주 (예를 들어, 293 KT14-KO 및 KPB1-KD (Pgp는 어떤 경우에는 본원에서 "KPB1"이라고도 불린다))에 결합하는 이중특이적 항체 (HC-15D3:HC-5F9:LC-MRK16)의 결합의 FACS 분석을 제공한다.
도 5는 본원에서 기재된 다양한 1가, Fab 및 이중특이적 항체 분자의 존재 하에 파클리탁셀에 대한 나이브 293T 및 N6ADR 세포주 민감성을 나타내는 화학민감도 분석을 제공한다. 세포 (나이브 293T 세포 (왼쪽 패널) 및 N6ADR 세포 (오른쪽 패널))는, 예를 들어, 화학요법 단독으로 치료 ("Chemo 단독") 또는 다른 항체와 조합된 화학요법 (15D3:MRK16 Fab; a15D3:MRK16 항체; aCD47:MRK16 항체; aCD47:MRK16 Fab; 및 15D3:9F11 Fab)과 비교하여 15D3.aCD47:MRK16 이중특이적 항체의 존재 하에 향상된 민감도를 나타냈다. 도 5는 개개의 표적에 대한 이중특이적 항체의 친화도 감소에도, 이중특이적 항체가 나이브 293T 세포 및 아드리아마이신 저항성 N6ADR 세포의 화학민감도를 향상시킨다는 것을 입증한다.
도 6A-6C는 도 5에서 제공된 데이터의 재표현을 제공하며, 나이브 293T 세포 및 N6ADR 세포 데이터의 나란한 맞춤 곡선 (도 6A) 및 나이브 293T 세포 (도 6B) 및 N6ADR 세포 (도 6C)에 대한 미가공 (왼쪽) 및 맞춤 (오른쪽) 데이터의 나란한 도면을 포함한다.
도 7은 15D3.aCD47:MRK16 항체가 빈크리스틴과 조합하여 사용될 때 15D3.aCD47:MRK16 항체의 약물 감작 효과를 입증한다.
도 8은 실시예 섹션에서 기재된 바와 같이, 테스트된 항체 경쇄 및 중쇄 조합의 결합 및 표적 세포 살해를 나타내는 표를 제공한다.
도 9는 화학요법 없이 MES-SA-DX5 (자궁 육종) 종양 부피에 대한 표시된 항체의 효과를 나타낸다.
도 10은 NALM6 세포의 종양 성장 억제에 대한 파클리탁셀의 효과를 나타낸다.
도 11은 파클리탁셀 저항성 NALM6ADR 세포의 종양 성장 억제에 대한 BisP1.1의 효과를 나타낸다.
도 12는 파클리탁셀 저항성 NALM6ADR 세포의 종양 성장 억제에 대한 발스포다르의 효과를 나타낸다.
도 13은 파클리탁셀 저항성 NALM6ADR 세포로 이식된 마우스의 체중에 대한 BisP1.1의 효과를 나타낸다.
도 14는 파클리탁셀 저항성 NALM6ADR 세포로 이식된 마우스의 체중에 대한 발스포다르의 효과를 나타낸다.
도 15는 파클리탁셀 저항성 NALM6ADR 세포로 이식된 마우스의 생존에 대한 KBisP1.1의 효과를 나타낸다.
도 16은 A2780ADR 세포의 표면 상에서 CD47 및 ABCB1의 발현을 나타낸다.
도 17은 HeyT30 세포의 표면 상에서 CD47 및 ABCB1의 발현을 나타낸다.
도 18은 파클리탁셀 유무에 관계없이 KBisP1.1을 투여한 후 생체 내에서(in vivo) A2780ADR 종양 부피 감소를 나타낸다.
도 19는 파클리탁셀 유무에 관계없이 KBisP1.1을 투여한 후 생체 내에서 HeyT30 종양 부피의 감소를 나타낸다.
도 20은 생체 내에서 N6ADR 세포 종양에 대하여 KbisP1.1이 15D3 항체보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다.
도 21은 파클리탁셀에 대한 다중약물 저항성 N6ADR 종양의 KbisP1.1 화학감작이 생체 내에서 용량-의존적이라는 것을 나타낸다.
도 22A-22B는 KBisP1.1 항체가 항-CD47 5F9 항체와 대조적으로 인간 적혈구 (RBC) (도 22A) 및 게먹이 원숭이(cynomolgus) RBC (도 22B)로의 유의한 결합을 나타내지 않고 5F9 HC 및 MRK16 LC를 포함하는 항-CD47 항체 ("KT14_MRK16")가 항-CD47 5F9 항체 ("KT14")와 대조적으로 RBC에 유의하게 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 23은 인간화된 15D3 VH 사슬 서열의 정렬을 나타낸다.
도 24는 인간화된 MRKK16 사슬 서열의 정렬을 나타낸다.
도 25는 인간화된 뮤트된(muted) Fc 이중특이적 항체가 다중약물 저항성 MES-SA-DX5 종양을 화학감작시킨다는 것을 나타낸다.
도 26은 인간화된 KBisP1.1 항체가 마우스에서 다중약물 저항성 A2780ADR 세포-생성된 종양을 화학감작시킨다는 것을 나타낸다.
도 27A는 N297A 치환된 KBisP1.1 이중특이적 항체가 마우스에서 다중약물 저항성 MES-SA/Dx5 세포 종양을 파클리탁셀에 대해 화학감작시킨다는 것을 나타낸다.
도 27B는 KBisP1.1 N297A 항체 ("N297A"로 라벨링됨)가 생체 내에서 다중약물 저항성 A2780ADR 세포를 파클리탁셀에 대해 감작시킨다는 것을 나타낸다.
도 28은 KBisP1.1 항체가 생체 내에서 다중약물 저항성 A2780ADR 세포를 파클리탁셀에 대해 감작시킨다는 것을 나타낸다.
도 29는 KBisP1.1 항체가 생체 내에서 다중약물 저항성 MES-SA/Dx5 세포를 파클리탁셀에 대해 감작시킨다는 것을 나타낸다.
도 30은 KBisP1.1 이중특이적 항체가 생체 내에서 파클리탁셀 저항성 CTG-2616 환자-유래된 유방 종양을 감작시켜 종양 성장을 억제했다는 것을 나타낸다.
도 31은 ELISA로 측정된 CD47, FACS로 측정된 MDR1, ELISA로 측정된 PD-L1, 및 ELISA 또는 FACS로 측정된 EGFR로의 표시된 항체의 결합의 개요를 제공한다.
도 32A는 MDR1을 과발현하는 293T 세포를 사용하여 측정된 나열된 항체에 대한 MFI를 나타낸다.
도 32B는 EGFR을 과발현하는 293T 세포를 사용하여 측정된 나열된 항체에 대한 MFI를 나타낸다.
도 32C는 도 32B에서 나타난 항체의 부분집합에 대해 EGFR을 과발현하는 293T 세포를 사용하여 측정된 나열된 항체에 대한 MFI를 나타낸다.
정의
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 임의의 아이소타입의 항체 또는 면역글로불린, 항원에 대한 특이적 결합을 유지하는 항체의 단편을 포함하며, 제한되는 것은 아니지만, Fab, Fv, scFv, 및 Fd 단편, 키메라 항체, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, 예컨대 중쇄만을 포함하는 항체 (예를 들어, VHH 카멜리드(camelid) 항체), 이중특이적 항체, 및 항체의 항원-결합 부분 및 비-항체 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 항체는, 예를 들어, 방사성 동위원소, 검출 가능한 생성물을 생성하는 효소, 형광 단백질, 등으로 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 항체는 다른 모이어티, 예컨대 특이적 결합 쌍의 구성원, 예를 들어, 비오틴 (비오틴-아비딘 특이적 결합 쌍의 구성원), 등에 더 컨쥬게이션될 수 있다. 항체는 또한, 제한되는 것은 아니지만, 폴리스티렌 플레이트 또는 비드, 등을 포함하는 고체 지지체에 결합될 수 있다. 또한 용어는 Fab', Fv, F(ab')2, 및 또는 항원에 대한 특이적 결합을 유지하는 다른 항체 단편, 및 단클론성 항체를 포함한다. 항체는 1가 또는 2가일 수 있다. 본원에서 사용된 항체는 세포 표면 상에서, 예를 들어, 환자의 세포 샘플 또는 조직 샘플에서 표적 항원(들)의 발현을 분석하는데 사용될 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 예를 들어, 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 단일 사슬 항체 분자, 예컨대 중쇄만을 포함하는 항체 (예를 들어, VHH 카멜리드 항체); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편이라고 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산하며, 각각 단일 항원-결합 부위, 및 쉽게 결정체화될 수 있는 능력을 반영하는 명칭인 잔류 "Fc" 단편을 갖는다. 펩신 처리는 2개의 항원 조합 부위를 갖고 항원을 교차-연결할 수 있는 F(ab')2 단편을 수득한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소한의 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비-공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 다이머로 이루어진다. 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 다이머의 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정하는 것은 이 구성형태에서 이루어진다. 전체적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 하지만, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR을 포함하는 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에서도 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인식하고 그것에 결합하는 능력을 갖고 항원 결합 부위를 형성할 수 있다.
"Fab" 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지(hinge) 영역의 하나 이상의 시스테인을 포함하는, 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에서 몇몇 잔기의 추가에 의해 Fab' 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 함유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하여 카파(kappa) 및 람다(lambda)라고 불리는 2개의 분명한 별개의 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 주요 클래스, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 다수는 하위 클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 더 세분화될 수 있다.
"단일 사슬 Fv", "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일부 구체예에서, Fv 폴리펩타이드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 더 포함하며, sFV가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 검토를 위해, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 참조.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 가진 작은 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) (VH-VL)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에는 너무 잘ㅂ은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강요된다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에서 더 충분히 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화도"는 2개의 작용제의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 나타내고 해리 상수 (Kd)로 표현된다. 친화도는 무관한 아미노산 서열에 대한 항체의 친화도보다 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 또는 적어도 1000배, 또는 그 이상 더 클 수 있다. 표적 단백질에 대한 항체의 친화도는, 예를 들어, 약 100 나노몰 (nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰 (pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펨토몰 (fM) 또는 그 이상일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합력"은 희석 후 해리에 대한 2개 이상의 작용제의 복합체의 저항성을 나타낸다. 용어 "면역반응성" 및 "우선적으로 결합하다"는 항체 및/또는 항원-결합 단편에 관하여 본원에서 교체 가능하게 사용된다.
용어 "결합"은, 예를 들어, 염 다리(salt bridge) 및 물 다리(water bridge)와 같은 상호작용을 포함하는, 공유 결합, 정전 결합, 소수 결합, 및 이온 결합 및/또는 수소 결합 상호작용으로 인한 2개의 분자 사이의 직접적인 회합을 나타낸다. MDR1-특이적 항체는 MDR1 폴리펩타이드 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 비-특이적 결합은 약 10-7 M 미만의 친화도, 예를 들어, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 등의 친화도로의 결합을 나타낼 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비-인접한 항원 조합 부위를 의미하도록 의도된다. CDR은 Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)에 의해 기재되어 있으며, 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도, 항체 또는 이식된 항체 또는 그것들의 변이체의 CDR을 나타내기 위한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용된 바와 같이 용어의 범위 내에 있도록 의도된다. 상기 인용된 참고문헌 각각에 의해 정의된 바와 같이 CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에서 제시된다.
CDR 정의
Kabat 1 Chothia 2 MacCallum 3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 89-97 91-96 89-96
1 잔기 넘버링은 Kabat et al., supra의 명명법을 따른다
2 잔기 넘버링은 Chothia et al., supra의 명명법을 따른다
3 잔기 넘버링은 MacCallum et al., supra의 명명법을 따른다
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크"는 항체 가변 영역에 관하여 사용될 때 항체의 가변 영역 내의 CDR 영역 외부의 모든 아미노산 잔기를 의미하도록 의도된다. 가변 영역 프레임워크는 일반적으로 길이가 약 100-120 아미노산의 불연속적인 아미노산 서열이지만 CDR 외부의 상기 아미노산만을 언급하도록 의도된다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "프레임워크 영역"은 CDR에 의해 분리되는 프레임워크의 각각의 도메인을 의미하도록 의도된다. VH 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함할 수 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 유사하게, VL 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함할 수 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 테트라머를 포함하며, 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어, 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 영역을 포함한다. 항체의 불변 영역은 전형적으로 면역 시스템의 다양한 세포 및 보체 시스템의 제1 구성요소를 포함하는 숙주 조직 또는 인자로의 항체의 결합을 매개한다. 용어 "항체"는 유형 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM 및 이것들의 하위 유형의 면역글로불린을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상 항체는 IgG 아이소타입, 예를 들어, IgG1이다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 암호화되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 나타낸다. 인식되는 인간 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파(alpha) (IgA1 및 IgA2), 감마(gamma) (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타(delta), 엡실론(epsilon) 및 뮤(mu) 불변 영역 유전자; 및 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 전장 면역글로불린 경쇄 (약 25 kD 또는 214개의 아미노산)는 N-말단 (약 110개의 아미노산)에서 가변 영역 유전자 및 C-말단에서 카파 또는 람다 불변 영역에 의해 암호화된다. 전장 면역글로불린 중쇄 (약 50 kD 또는 446개의 아미노산)는 N-말단 (약 116개의 아미노산)에서 가변 영역 유전자 및 C-말단에서 다른 상기 언급된 불변 영역 유전자 중 하나, 예를 들어, 감마 (약 330개의 아미노산을 암호화함)에 의해 암호화된다. 일부 구체예에서, 대상 항체는 전장 면역글로불린 중쇄 및 전장 면역글로불린 경쇄를 포함하는 전체 면역글로불린을 포함한다.
용어 "항원-결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 전장 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편 (VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 포함하는, 예를 들어, 이것들로 이루어진 1가 단편); (ii) F(ab')2 단편 (힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편); (iii) Fd 단편 (VH 및 CH1 도메인을 포함함, 예를 들어, 이것들로 이루어짐); (iv) Fv 단편 (항체의 단일 아암(arm)의 VH 및 VL 도메인을 포함함, 예를 들어, 이것들로 이루어짐); (v) dAb 단편 (VH 도메인을 포함함, 예를 들어, 이것으로 이루어짐); (vi) 단리된 CDR; (vii) 단일 사슬 Fv (scFv) (VH 및 VL 도메인이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하도록 재조합 수단을 사용하여 합성 링커에 의해 결합된 항체의 단일 아암의 VH 및 VL 도메인을 포함함, 예를 들어, 이것들로 이루어짐); (viii) 디아바디 (VH 및 VL 도메인이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하지 않도록 그것들이 결합되는 2개의 scFv를 포함함, 예를 들어, 이것들로 이루어짐; scFv 중 각각의 하나의 VH는 다른 scFv의 VL 도메인과 쌍을 형성하여 2가 분자를 형성함)를 포함한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 나타낸다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리(repertoire) 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체와 상응하는 아미노산 서열을 가지고 있는 것이다. 인간 항체의 이 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특이적으로 배제한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 가변 경쇄 (VL) 또는 가변 중쇄 (VH) 프레임워크 서열의 선택시 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크 (FR)이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 부분군으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 부분군은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3에서와 같은 부분군이다. 한 구체예에서, VL에 대해, 부분군은 Kabat et al., 상기에서와 같은 부분군 카파 I이다. 한 구체예에서, VH에 대해, 부분군은 Kabat et al., 상기에서와 같은 부분군 III이다.
"인간화된" 항체는 비-인간 CDR의 의 아미노산 잔기 및 인간 프레임워크 (FR)의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 나타낸다. 인간화된 항체 불변 영역의 적어도 일부는 인간 항체로부터 유래된다. 본원에서 개시된 항체 분자의 바람직한 구체예에서, 불변 영역은 인간 IgG 항체, 예컨대 인간 IgG1로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 본원에서 개시된 항체 분자는 본원에서 제공된 가변 중쇄 영역 및 UniProt: P01857-1, 버전 1에서 제시된 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본원에서 개시된 항체 분자는 본원에서 제공된 가변 경쇄 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 인간 경쇄 불변 영역은 인간 카파 경쇄 불변 영역이다. 특정 양태에서, 대상 항체에 존재하는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역은 Fc 기능을 조절하기 위한 돌연변이, 예를 들어, 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, LALAPG 효과기 기능 돌연변이 (L234A, L235A, 및 P329G) 또는 N297A 돌연변이가 항체 의존적 세포독성 (ADCC)을 감소시키기 위해 도입될 수 있다. 치환의 넘버링은 EU 넘버링 시스템을 기반으로 한다. "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서 잔기를 나타낼 때 사용된다 (예를 들어, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)에서 보고된 EU 지수). "Kabat에서의 EU 지수"는 인간 IgG 1 EU 항체의 잔기 넘버링을 나타낸다.
항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 거친 항체를 나타낸다.
용어 "에피토프"는 면역 시스템, 예를 들어, 항체, B 세포, 또는 T 세포에 의해 인식되는 항원의 영역을 나타낸다. 예를 들어, 에피토프는 항체가 결합하는 항원의 특이적 영역이다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 구성요소로부터 확인 및 분리되고 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염 구성요소는 항체에 대한 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이고 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체 중량 기준 90% 초과, 95% 초과, 또는 98% 초과, 예를 들어, 중량 기준 99% 초과로, (2) 회전식 컵 배열 결정장치의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 환원 또는 비환원 조건 하에서 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 사용하는 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 구성요소가 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내 제자리(in situ)의 항체를 포함한다. 어떤 경우에, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
용어 "세포독성제"는 본원에서 사용된 바와 같이 세포 기능을 억제하거나 방지하고 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 나타낸다. "항신생물제"라고도 불리는 "화학치료제"는 암 또는 다른 질환 또는 장애를 치료하는데 사용되는 세포독성제일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는 것", 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 나타낸다. 효과는 질환 또는 그 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 것에 관하여 예방적일 수도 있고 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인하는 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유에 관하여 치료적일 수도 있다. "치료"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 인간을 포함한 포유동물에서 질환의 임의의 치료를 포함하고, (a) 질환에 취약할 수 있지만 아직 질환에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환 발생의 방지; (b) 질환의 억제, 즉, 그 발달의 정지; 및 (c) 질환의 완화, 즉, 질환의 퇴행 유발을 포함한다.
본원에서 교체 가능하게 사용된 용어 "개체", "대상체", "숙주", 및 "환자"는, 제한되는 것은 아니지만, 쥐 (래트, 마우스), 비-인간 영장류, 인간, 개, 고양이, 유제류 (예를 들어, 말, 소, 양, 돼지, 염소), 등을 포함하는 포유동물을 나타낸다.
"치료적 유효량" 또는 "유효량"은, 질환을 치료하기 위해 포유동물 및 다른 대상체에게 투여될 때, 질환에 대해 이러한 치료가 영향을 미치기에 충분한 양을 나타낸다. "치료적 유효량"은 항체, 질환 및 그 심각도 및 치료되는 대상체의 나이, 체중, 등에 따라 달라질 것이다.
본원에서 사용된 용어 "난치성"은 치료에 반응하지 않는 질환 또는 병태를 나타낸다. 암에 관하여, "난치성 암"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 치료에 반응하지 않는 암을 나타낸다. 난치성 암은 치료 시작시 저항성일 수 있거나 치료 동안에 저항성이 될 수도 있다. 난치성 암은 또한 저항성 암이라고도 불릴 수 있다.
"생물학적 샘플"은 개체로부터 얻어진 다양한 샘플 유형을 포함하고 진단 또는 모니터링 분석에서 사용될 수 있다. 정의는 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플, 고체 조직 샘플, 예컨대 생검 표본 또는 조직 배양물 또는 그것들로부터 유래된 세포 및 그 자손을 포함한다. 정의는 또한 그것들의 조달 이후 임의의 방법으로, 예컨대 시약의 처리, 가용화, 또는 특정 구성요소, 예컨대 폴리뉴클레오타이드에 대한 풍부화에 의해 조작된 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포함하고, 또한 배양 중인 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플을 포함한다.
서열 쌍 사이의 퍼센트 동일성은 쌍에서 일치하는 수에 100을 곱하고 갭(gap)을 포함한 정렬된 영역의 길이로 나눔으로써 계산될 수 있다. 동일성 점수는 완벽한 일치만을 계수하고 아미노산의 서로에 대한 유사성의 정도를 고려하지 않는다. 내부의 갭만이 길이에 포함되며, 서열 단부의 갭은 포함되지 않는다. 퍼센트 동일성 = (일치 x 100)/정렬된 영역의 길이 (갭 포함).
구절 "보존적 아미노산 치환"은 다음 군 내에서의 아미노산 잔기의 치환을 나타낸다: 1) L, I, M, V, F; 2) R, K; 3) F, Y, H, W, R; 4) G, A, T, S; 5) Q, N; 및 6) D, E. 보존적 아미노산 치환은 단백질의 아미노산(들)을 유사한 산성, 염기성, 전하, 극성, 또는 크기의 측쇄를 가진 아미노산으로 대체함으로써 단백질의 활성을 보존할 수 있다.
용어 "벡터"는 숙주 세포로 단백질 암호화 정보를 전달하는데 사용되는 임의의 분자 또는 실체물 (예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)을 의미한다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 작제물"은 숙주 세포의 형질전환에 적합한 벡터를 나타내고 (숙주 세포와 함께) 그것에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 암호화 영역의 발현을 지시하고 및/또는 제어하는 핵산 서열을 함유한다. 발현 작제물은 전사, 번역에 영향을 미치거나 이것들을 제어하고, 인트론이 존재하는 경우, 그것에 작동 가능하게 연결된 암호화 영역의 RNA 스플라이싱(splicing)에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "자극"은 동족 리간드 (또는 CAR의 경우에는 종양 항원)와의 자극 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체 또는 CAR)의 결합에 의해 유도되어, 제한되는 것은 아니지만, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 변환 또는 CAR의 적절한 NK 수용체 또는 신호전달 도메인을 통한 신호 변환과 같은 신호 변환 이벤트를 매개하는 1차 반응을 나타낸다. 자극은 특정 분자의 변화된 발현을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 양태에 대해 자극 방법으로 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현되는 분자를 나타낸다. 한 양태에서, 신호는, 예를 들어, 펩타이드와 함께 로딩된 MHC 분자와의 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 시작되고, 제한되는 것은 아니지만, 증식, 활성화, 분화, 등을 포함하는 T 세포 반응의 매개로 이어지는 1차 신호이다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열 ("1차 신호전달 도메인"이라고도 불림)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM로 알려져 있는 신호전달 모티프(motif)를 함유할 수 있다. 본 발명에서 특별하게 사용되는 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는, 제한되는 것은 아니지만, CD3 제타(zeta), 공통 FcR 감마 (FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타(beta) (Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것들을 포함한다.
용어 "동시자극 분자"는 동시자극 리간드에 특이적으로 결합하여, T 세포에 의한 동시자극 반응, 예컨대, 제한되는 것은 아니지만 증식을 매개하는, T 세포 상의 동족 결합 파트너를 나타낸다. 동시자극 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 또는 그것의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 동시자극 분자는, 제한되는 것은 아니지만, MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, 뿐만 아니라 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 및 4-1BB (CD137)를 포함한다.
용어 "자가"는 그것이 이후에 개체로 재도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 나타낸다.
"세포 내 신호전달 도메인"은, 용어가 본원에서 사용된 바와 같이, 분자의 세포 내 부분을 나타낸다. 세포 내 신호전달 도메인은 CAR 함유 세포, 예를 들어, CAR-T 세포의 면역 효과기 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들어, CAR-T 세포에서, 면역 효과기 기능의 예는 세포용해 활성 및 헬퍼(helper) 활성을 포함하며, 사이토카인의 분비를 포함한다.
"면역 효과기 세포"는, 용어가 본원에서 사용된 바와 같이, 면역 반응, 예를 들어, 면역 효과기 반응의 촉진에 수반되는 세포를 나타낸다. 면역 효과기 세포의 예는 T 세포, 예를 들어, 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 비만 세포, 및 골수-유래된 포식세포를 포함한다.
치환, 삽입, 또는 결실에 대한 지침은 상이한 종 또는 동일하거나 유사한 기능을 가진 복수의 단백질을 기반으로 하는 공통 서열로부터의 단백질의 아미노산 서열의 정렬을 기반으로 할 수 있다.
상세한 설명
MDR1 및 종양-관련 항원 (TAA) 둘 다를 표적화하는 다중특이적 항체, 뿐만 아니라 이러한 다중특이적 항체를 포함하거나 암호화하는 약학적 조성물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 세포, 및 키트로서 사용될 수 있는 항-MDR1 항체가 제공된다. 다중특이적 항체는 MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 공통 가변 경쇄 (VL), MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 제1 가변 중쇄 (VH), 및 TAA에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 제2 VH 사슬을 포함한다. 대상체에게 MDR1 및 TAA 둘 다를 표적화하는 다중특이적 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 암에 대해 대상체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 치료 단계는 다중특이적 항체를 단독으로 투여하거나 다중특이적 항체 및 화학치료제를 투여하는 단계를 수반할 수 있다. 대상 방법에서 유용한 유전적으로 변형된 세포주 및 이러한 유전적으로 변형된 세포주를 제조하는 방법을 포함하여, 기재된 다중특이적 항체를 생성하는 방법 및 그것과 관련된 시약이 또한 제공된다.
본원에서 제공된 이중특이적 항체는 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 암 세포에 결합하는 한편 MDR1 및/또는 TAA를 발현하는 비-암 세포로의 결합의 감소를 나타낸다. 다시 말해서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체는 (1) MDR1 발현이 낮거나 없는 경우 TAA를 발현하는 세포 및 (2) TAA 발현이 낮거나 없는 경우 MDR1을 발현하는 세포에 낮은 친화도로 결합하고, 상대적으로 높은 수준, 즉, 정상 세포보다 더 높은 수준으로 MDR1 및 CD47 중 적어도 하나 또는 둘 다를 발현하는 암 세포에 높은 친화도로 결합한다.
항-MDR1 항체 15D3과 비교하여 MDR1에 대해 감소된 친화도를 나타내는 항-MDR1 항체 및 항-CD47 항체 5F9와 비교하여 CD47에 대해 감소된 친화도를 나타내는 항-CD47 항체가 또한 본원에서 개시된다. 이들 항체는 동시 투여될 때 및 화학요법에 대한 암 세포의 화학민감도를 증가시키기 위해 대상체에서 암의 치료에 사용된다.
본 발명을 더 상세하게 기재하기 전에, 본 발명이 기재된 특정 구체에에 제한되지 않으며, 물론, 이와 같이 달라질 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기재할 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한되기 때문에, 제한하려는 의도가 없다는 것을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한과 하한 및 임의의 다른 언급된 값 또는 상기 언급된 범위 내의 사이값 사이에서 각각의 사이값은, 문맥상 달리 분명하게 나타나지 않는 한 하한의 단위의 10분의 1까지, 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 똑립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 언급된 범위에서 임의의 특이적으로 배제된 한계를 조건으로 본 발명 내에 또한 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
용어 "약"이 선행하는 수치를 가진 특정 범위가 제공된다. 용어 "약"은 본원에서 용어가 선행하는 정확한 숫자, 뿐만 아니라 용어가 선행하는 숫자에 대한 근처의 또는 대략적인 숫자에 대한 문자적 지원을 제공하는데 사용된다. 숫자가 구체적으로 나열된 숫자의 근처의 또는 대략적인 숫자인지를 결정하는데 있어서, 근처의 또는 대략적인 나열되지 않은 숫자는 그것이 제공된 문맥상 구체적으로 나열된 숫자의 실질적 동등물을 제공하는 숫자일 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 대표적인 예시의 방법 및 물질이 이제 기재된다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물 및 특허는 개개의 간행물 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타난 것처럼 본원에 참조로 포함되고 간행물이 인용되는 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 개시내용에 대한 것이며 본 발명이 이러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 공개일은 실제 공개일과 상이할 수 있으며 독립적으로 확인될 필요가 있다.
본원에서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형 "하나(a)", "하나(an)" 및 "그(the)는 문맥상 달리 분명하게 나타나지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 또한 청구항은 임의의 선택적인 요소들을 배제하도록 작성될 수 있다. 이와 같이, 이러한 진술은 청구 요소의 나열에 관하여 "오로지", "단지", 등과 같은 배타적인 용어의 사용, 또는 "부정적인" 제한의 사용에 대한 선행 근거의 역할을 하도록 의도된다.
본 발명을 읽을 때 당업자에게 분명한 바와 같이, 본원에서 기재되고 예시된 개개의 구체예는 쉽게 구별될 수 있거나 또는 본 발명의 범위 또는 사상으로부터 벗어나지 않으면서 다른 여러 구체예의 특징과 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 나열된 방법은 나열된 이벤트의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
방법 및 조성물은 기능적인 설명과 함께 문법적인 유동성을 위해 기재되었거나 기재될 것이지만, 청구항은, 35 U.S.C. §112(f) 하에서 명확하게 규정되지 않는 한, "수단" 또는 "단계" 제한의 구성에 의해 임의의 방식으로 반드시 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 동등물의 사법적 원칙 하에서 청구항에 의해 제공되는 정의의 의미 및 동등물의 전체 범위에 따라야 하고, 35 U.S.C. §112(f) 하에서 명확하게 규정되는 경우에는 35 U.S.C. §112(f) 하에서 완전한 법정 동등물에 따라야 한다는 것을 명확하게 이해되어야 한다.
항체
이중특이적 항체
본 발명은 다중약물 저항성 단백질 1 (MDR1) 및 종양 관련된 항원 (TAA)에 결합하는 이중특이적 항체 분자를 제공하는데, 항체 분자는 2개의 동일한 가변 경쇄 (VL), 제1 가변 중쇄 (VH), 및 제2 VH 사슬을 포함하며, VL 사슬은 각각 MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하고, 제1 VH 사슬은 MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하고, 제2 VH 사슬은 TAA에 대한 항원-결합 부위를 포함하고, 제2 VH 사슬은 경쇄 중 하나와 쌍을 형성할 때 TAA에 결합한다. 이중특이적 항체 분자는 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 암 세포에 결합하지만 MDR1 및/또는 TAA를 발현하는 비-암 세포에 대해 감소된 결합을 나타낸다. 다시 말해서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체는 (1) MDR1 발현이 낮거나 없는 경우 TAA를 발현하는 세포 및 (2) TAA 발현이 낮거나 없는 경우 MDR1을 발현하는 세포에 낮은 친화도로 결합하고, 상대적으로 높은 수준, 즉, 정상 세포보다 높은 수준으로 MDR1 및 CD47 중 적어도 하나 또는 둘 다를 발현하는 암 세포에 높은 친화도로 결합한다.
상대적으로 높은 수준은 암 세포와 동일한 유형의 정상 세포에서의 발현 수준의 적어도 1.5배 (예를 들어, 적어도 2X, 적어도 3X, 적어도 4X, 적어도 5X 또는 그 이상)인 발현을 나타낸다. 감소된 친화도는 암 세포와 동일한 유형의 정상 세포로의 항체 분자의 결합과 비교하여 적어도 10% (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 그 이상) 만큼 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 감소된 친화도는 또한 검출 가능한 결합의 결핍을 포함한다.
용어 "항체 분자"는 본원에서 정의된 항체를 포함하고 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 양태에서, 항체 분자는 2개의 가변 경쇄 (VL) 및 2개의 가변 중쇄 (VH)를 포함한다. 특정 양태에서, 항체 분자는 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 또한 포함한다. 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 인간 항체, 예를 들어, 인간 IgG1 항체로부터 유래될 수 있다. 인간 IgG1 중쇄 (HC) 불변 영역은 항체 의존적 세포독성 (ADCC)을 감소시키는 돌연변이를 포함하도록 변형될 수 있다. 이에 더하여, 또는 대안으로, 2개의 VH 사슬은 개개의 인간 IgG1 HC 불변 영역이 상이한 인간 IgG1 HC 불변 영역 사이에서 다이머의 형성을 선호하는 치환을 갖는 상이한 인간 IgG1 HC 불변 영역에 각각 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 HC 영역은 본원에서 더 상세히 기재된다. 특정 양태에서, 항체 분자가 이중특이적 항체 분자인 경우, 인간 IgG1 HC 불변 영역 중 하나는 양으로 대전된 측쇄를 가진 하나 이상의 아미노산을 도입하기 위한 치환을 포함할 수 있고 다른 인간 IgG1 HC 불변 영역은 2개의 상이한 HC 사이에서 다이머의 형성을 선호하는 음으로 대전된 측쇄를 가진 하나 이상의 아미노산을 도입하기 위한 치환을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 2개의 VL 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR (LCDR)을 포함한다:
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다).
특정 양태에서, 2개의 VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함한다:
(i) DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK;
(ii) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK; 또는
(iii) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK.
일부 양태에서, 본원에서 기재된 항체는 (i) 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR을 포함하는 2개의 VL 사슬: DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK; 및 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR을 포함하는 제1 VH 사슬: EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS를 포함하지 않는다.
특정 양태에서, VL 및 VH 경쇄의 CDR은 Kabat 명명법을 기반으로 정의될 수 있다.
특정 양태에서, i) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGX1TYLE를 포함하고; (ii) LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고; (iii) LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하며; 여기서 X1은 N, Q 또는 S이다. 이들 LCDR은 Kabat 명명법을 기반으로 한다.
특정 양태에서, 2개의 VL 사슬은 인간화된다. 특정 양태에서, 2개의 VL 사슬은 인간 항체로부터의 프레임워크 영역을 포함하도록 인간화된다.
특정 양태에서, 2개의 VL 사슬은 다음 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 a 100% 동일한 서열을 포함한다:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK;
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK; 또는
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK.
특정 양태에서, 이중특이적 항체 분자는 각각 다음 서열을 포함하는 2개의 VL 사슬을 포함한다:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK.
특정 양태에서, 이중특이적 항체는 본원에서 기재된 VL 사슬 및 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 경쇄 불변 영역은 UniProtKB/Swiss-Prot: P01834.2에서 제시된 아미노산 서열을 가진 인간 면역글로불린 카파 사슬 불변 영역일 수 있다.
특정 양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 VH 사슬을 포함하며 VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR 1-3)을 포함한다: EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (X2는 N, Q 또는 S이다).
특정 양태에서, 제1 VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
(i) EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS, 또는
(ii) EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS, 또는
(iii) EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
특정 양태에서, VH 사슬의 HCDR 1-3는 Kabat 명명법을 기반으로 정의된다.
특정 양태에서, 제1 VH 사슬은 (i) 다음 서열을 포함하는 HCDR1: RYTMS; (ii) 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TISSGGGX2TYYPDSVKG; 및 (iii) 다음 서열을 포함하는 HCDR3: YGAGDAWFAY를 포함하며; 여기서 X2는 N, Q 또는 S이다. 이들 HCDR은 Kabat 명명법을 기반으로 한다.
특정 양태에서, 제1 및/또는 제2 VH 사슬은 인간화된다. 특정 양태에서, VH 사슬은 인간 항체로부터의 프레임워크 영역을 포함하도록 인간화된다.
특정 양태에서, 제1 VH 사슬은 다음 서열을 포함한다:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS;
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS; 또는
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
특정 양태에서, 제1 VH 사슬은 다음 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS;
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS; 또는
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
특정 양태에서, 이중특이적 항체는 본원에서 기재된 제1 VH 사슬 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다.
특정 양태에서, 이중특이적 항체의 제2 VH 사슬은 TAA에 결합하는 단일특이적 항체 분자로부터 유래되고, TAA에 대한 이중특이적 항체 분자의 친화도는 VH 사슬이 유래되는 TAA에 대한 단일특이적 항체 분자의 친화도보다 적어도 2배 (예를 들어, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배) 더 낮다. 이중특이적 항체 및 단일특이적 항체의 친화도는 동일한 분석을 사용하여 측정된다. 항체 친화도를 측정하기에 적합한 임의의 방법이 이용될 수 있다. 특정 양태에서, 친화도는 항원에 대한 항체의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 계산함으로써 측정될 수 있고 해리 상수 (Kd)로 표현된다. 특정 양태에서, Kd는 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
특정 양태에서, 이중특이적 항체의 제2 VH 사슬은 TAA에 결합하는 단일특이적 항체 분자로부터 유래되고, TAA에 대한 이중특이적 항체 분자의 절반-최대 유효 농도 (EC50)는 VH 사슬이 유래되는 TAA에 대한 단일특이적 항체 분자의 EC50보다 적어도 2배 (예를 들어, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배) 더 높다. 이중특이적 항체 및 단일특이적 항체의 EC50은 동일한 분석을 사용하여 측정된다. 항체의 EC50을 측정하기에 적합한 임의의 방법이 이용될 수 있다. 절반 최대 반응 (예를 들어, 최대 형광 강도의 절반)을 제공하는 농도는 EC50으로서 측정된다.
테스트 항체의 EC50은 유동세포분석법 또는 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 유동세포분석법은 항원 (예를 들어, 인간 야생형 MDR1 또는 돌연변이 MDR1)을 발현하는 세포를, 단계 희석된, 유동세포분석법 완충액 중의 항체와 접촉시키는 것과 항체가 세포에 결합하기에 충분한 기간 (예를 들어, 10 min-1 hr) 동안 실온 또는 4℃에서 인큐베이션하는 것을 수반할 수 있다. 인큐베이션 후, 세포는 선택적으로 세척되어 비-특이적으로 결합된 항체를 제거할 수 있고 및/또는 세포는 테스트 항체에 특이적으로 결합하는 형광 라벨링된 2차 항체와 접촉될 수 있다. 인큐베이션 후, 형광 라벨링된 2차 항체가 제거되고 세포가 세척될 수 있다. 세척된 세포는 유동세포분석법에 의해 분류되고 형광 라벨링된 2차 항체에 결합된 세포의 수가 계수될 수 있다. 절반 최대 반응 (예를 들어, 최대 형광 강도의 절반)을 제공하는 농도는 EC50으로서 측정된다. 유동세포분석법 분석의 변형으로, 세포는 MDR1을 과발현하는 293T 세포일 수 있다.
TAA는 암 세포에서 과발현되는 것으로 알려져 있는 임의의 항원일 수 있다. 예를 들어, TAA는 정상 세포에서 검출 가능한 수준으로 발현되지 않고 암 세포에서 발현되는 항원일 수 있으며, 정상 세포 및 암 세포는 동일한 세포 유형, 예를 들어, 상피 세포이다. 예를 들어, TAA는 돌연변이되지 않은 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키는 종양-특이적 돌연변이(들)로부터 발생한 종양 항원의 클래스인 신항원(neoantigen)일 수 있다. 다른 양태에서, TAA는 정상 세포에서 발현되되지만 암 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 항원이다. 특정 양태에서, TAA는 CD47일 수 있다.
항-MDR1 및 항-CD47 이중특이적 항체
특정 양태에서, 이중특이적 항체 분자는 CD47에 결합하고 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR을 포함한다:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS.
특정 양태에서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH, 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD, 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY를 포함한다. HCDR1-3는 Kabat 명명법을 기반으로 정의된다.
특정 양태에서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열과 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%) 동일한 서열을 포함한다:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS.
특정 양태에서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함한다:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS.
특정 양태에서, MDR1 및 CD47에 결합하는 이중특이적 항체는 다음 서열을 가진 CD47에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 인간화된 VH 사슬을 포함할 수 있다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS;
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS; 또는
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS.
이중특이적 항체의 추가적인 양태는 본 출원의 다른 곳에서도 기재되어 있고 제1 VH 사슬과 제2 VH 사슬 사이에서 헤테로다이머의 형성을 촉진하기 위해 본원에서 개시된 서열의 변화 인간화된 버전 및/또는 Fc 영역에서의 치환을 포함한다.
항-MDR1 및 항-PD-L1 이중특이적 항체
특정 양태에서, TAA는 예정된 사멸-리간드 1 (PD-L1)일 수 있다. PD-L1은 또한 분화 274의 클러스터 (CD274) 또는 B7 상동체 1 (B7-H1)로도 알려져 있다. 특정 양태에서, MDR1 및 PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체 분자는 이전의 섹션에서 기재된 바와 같이 공통 경쇄 및 제1 VH 사슬을 포함하고 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS.
Kabat 명명법에 따라 정의된 HCDR 1-3는 다음과 같다:
HCDR1: DSWIH
HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG
HCDR3: RHWPGGFDY.
MDR1 및 PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체의 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS.
MDR1 및 PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체의 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 중쇄에 존재할 수 있다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, VL 사슬, 제1 VH 사슬, 및 제2 VH 중 적어도 하나, 둘, 또는 전부가 인간화될 수 있다. 이에 더하여, VH 사슬의 Fc 영역은 제1 VH 사슬과 제2 VH 사슬 사이에서 헤테로다이머화를 증가시키기 위한 치환을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 제1 중쇄는 인간화되고 대전된 쌍 치환 K392D 및 K409D를 포함하고 제2 중쇄는 대전된 쌍 치환 E356K 및 D399K를 포함할 수 있다.
항-MDR1 및 항-EGFR 이중특이적 항체
특정 양태에서, TAA는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)일 수 있다. EGFR에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 제2 VH 사슬에 대한 HCDR1-3는 항-EGFR 항체 네시투무맙 또는 세툭시맙의 VH 사슬로부터 유래될 수 있다. 네시투무맙의 중쇄는 다음 서열을 갖는다:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
세툭시맙의 중쇄는 다음 서열을 갖는다:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
제1 양태에서, 항-MDR1 항-EGFR 이중특이적 항체는 이전 섹션에서 기재된 바와 같이 VL 및 제1 VH 사슬을 포함하고 제2 VH 사슬은 네시투무맙의 VH 영역으로부터의 HCDR을 포함할 수 있다. Kabat 명명법에 따라 정의된 HCDR은 다음 서열을 가질 수 있다:
HCDR1: SGDYYWS
HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS
HCDR3: VSIFGVGTFDY.
특정 양태에서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS.
MDR1 및 EGFR에 결합하는 이중특이적 항체의 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 중쇄에 존재할 수 있다:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
제2 양태에서, 항-MDR1 항-EGFR 이중특이적 항체는 이전 섹션에서 기재된 바와 같이 VL 및 제1 VH 사슬을 포함하고 제2 VH 사슬은 세툭시맙의 VH 영역으로부터의 HCDR을 포함할 수 있다. Kabat 명명법에 따라 정의된 HCDR은 다음 서열을 가질 수 있다:
HCDR1: NYGVH
HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS
HCDR3: ALTYYDYEFAY
특정 양태에서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA.
MDR1 및 EGFR에 결합하는 이중특이적 항체의 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 중쇄에 존재할 수 있다:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
상기 기재된 항-MDR1 항-EGFR 이중특이적 항체는 항-MDR1 항-CD47 이중특이적 항체와 동일한 VH 및 VL 사슬의 조합을 포함하고 상기 기재된 항-MDR1 항-PD-L1 이중특이적 항체는 15D3 HC :: MRK16 LC :: 네시투무맙 HC 및 15D3 HC :: MRK16 LC :: 세툭시맙 HC 항체라고 불릴 수 있다.
또한 MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 공통 VL 사슬 및 MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 제1 VH 사슬의 상이한 조합을 포함하는 이중특이적 항체 분자가 본원에서 제공되지만 상기 기재된 바와 같이 MRK16 LC 및/또는 15D3 HC를 기반으로 하는 것은 아니다.
특정 양태에서, 항-MDR1 항-EGFR 이중특이적 항체는 중쇄 및 경쇄의 다음 조합을 가질 수 있다: (i) 15D3 HC :: 세툭시맙 HC :: 15D3 LC; (ii) MRK16 HC :: 세툭시맙 HC :: 15D3 LC; 또는 (iii) MRK16 HC :: 세툭시맙 HC :: MRK16 LC.
HCDR 및 LCDR, VL 및 VH 영역, 중쇄 및 경쇄는 본원에서 제공된 바와 동일한 서열을 가질 수 있다.
제1 HC는 대전된 쌍 치환 K392D 및 K409D를 포함할 수 있고 제2 중쇄는 대전된 쌍 치환 E356K 및 D399K를 포함할 수 있거나 그 반대도 가능하다.
특정 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 이중특이적 항체, UIC2 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: MRK16 LC를 포함하지 않는다. 이 이중특이적 항체는 항-MDR1 항체, UIC2의 HCDR1-3을 포함하는 VH 사슬을 포함한다. 하지만, 이 항체는 MDR1을 과발현하는 293T 세포를 사용하는 FACS에 의해 측정된 바와 같이 MDR1에 대한 결합을 유지하지 않는다. 도 31을 참조하면 된다. UIC2 HC의 VH 사슬은 본원의 다른 곳에서 제공된 바와 같다.
특정 양태에서, 이중특이적 항체는 본원에서 기재된 제2 VH 사슬 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 제2 중쇄를 포함한다. 중쇄는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 서열을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 이중특이적 항체 분자는 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 세포에 특이적으로 결합하고 MDR1 또는 TAA를 발현하는 세포와 비교하여 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 세포에 대해 2배 더 높은 친화도를 갖는다.
특정 양태에서, 이중특이적 항체 분자는 화학치료제로의 치료에 대한 암 세포의 민감도를 증가시킬 수 있으며, 화학치료제의 절반 최대 억제 농도 (IC50)는 다음 서열을 가진 VH 사슬: EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA; 및 다음 서열을 가진 VL 사슬: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK을 포함하는 항-MDR1 항체와 동시투여될 때의 화학치료제의 IC50보다 항체와 동시투여될 때 적어도 2배 (예를 들어, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 적어도 30배) 더 낮다. 특정 양태에서, 항-MDR1 항체는 미국 특허 번호 5,959,084에서 기재된 15D3 항체일 수 있다.
특정 양태에서, 이중특이적 항체 분자는 다음 서열을 가진 VH 사슬: EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA; 및 다음 서열을 가진 VL 사슬: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK을 포함하는 항-MDR1 항체보다 적어도 2배 더 낮은 친화도 (예를 들어, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 적어도 30배 더 낮은 친화도)로 MDR1에 결합한다. 특정 양태에서, 항-MDR1 항체는 미국 특허 번호 5,959,084에서 기재된 15D3 항체일 수 있다.
특정 양태에서, 이중특이적 항체 분자는, MDR1을 발현하는 세포에 결합될 때, MDR1에 의한 유출을 억제한다. 억제는 이중특이적 항체의 부재시 MDR1에 의한 유출과 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 50%, 또는 그 이상만큼 유출을 감소시킬 수 있다.
특정 양태에서, 이중특이적 항체 분자는 하나 이상의 Fcγ 수용체로의 항체의 결합을 감소시키거나 폐지하도록 변형된 Fc 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, IgG1 Fc 도메인은 치환 L234A, L235A, P329G 및 N297A/Q/G 중 하나 이상을 가질 수 있다.
상기 요약된 바와 같이, 본 발명은 세포 유출 펌프를 표적화하는 도메인 및 암-관련된 항원을 표적화하는 도메인을 가진 다중특이적 항체를 제공한다. 다중약물 저항성 단백질 1 (MDR1)-결합 도메인 및 백혈구 표면 항원 CD47-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체가 포함된다. 본 발명의 다중특이적 항체는 MDR1 및 CD47 둘 다를 발현하는 세포에 특이적으로 결합한다.
따라서, 본 발명의 다중특이적 항체는 MDR1 및 CD47 둘 다를 표적화한다. P-당단백질 1 (Pgp)로도 알려져 있는 MDR1은 ATP 결합 카세트 서브패밀리 B 구성원 1 (ABCB1)로부터 발현되는 다중약물-저항성 세포에서 약물 축적 감소의 원인이 되는 에너지-의존적 유출 펌프이다. 인테그린 관련된 단백질 (IAP)로도 알려져 있는 CD47은 막 인테그린에 결합하고 또한 리간드 트롬보스폰딘-1 (TSP-1) 및 신호 조절 단백질 알파 (SIRPα)에 대한 수용체의 역할을 하고 CD47 유전자에 의해 암호화되는 면역글로불린 슈퍼패밀리 막관통 단백질이다. CD47 리간드 결합은 식균작용(phagocytosis)을 억제시킬 수 있으며 따라서, 면역 요법에서의 표적으로서, CD47 세포 외 도메인의 마스킹(masking)은 CD47-발현 암 세포의 면역-매개된 살해의 억제를 방지한다.
본 발명의 다중특이적 항체의 구체예의 개략도는 도 1A에서 제공된다. 도시된 바와 같이, 다중특이적 항체 (100)는 MDR1-결합 도메인 (101) 및 CD47-결합 도메인 (102)을 포함하고, 선택적으로, Fc 도메인 (103)의 전부 또는 일부를 포함한다. 도 1B에서 예시된 바와 같이, MDR1 (107)을 발현하지만 CD47 발현이 낮거나 없는 세포 (104)의 존재시, 다중특이적 항체 (100)는 세포에 대해 낮은 친화도를 갖는다. 이에 상응하여, CD47 (108)을 발현하지만, MDR1 발현이 낮거나 없는 세포 (105)의 존재시, 다중특이적 항체 (100)는 세포에 대해 낮은 친화도를 갖는다. 하지만, MDR1 (107) 및 CD47 (108) 둘 다를 발현하는 세포 (106)의 존재시, 다중특이적 항체 (100)는 세포에 대해 높은 친화도를 갖는다.
따라서, 본 발명의 다중특이적 항체는 MDR1 또는 CD47만을 발현하는 세포보다 더 높은 친화도로 MDR1 및 CD47 둘 다를 발현하는 세포에 결합한다. 이에 상응하여, 본 발명의 다중특이적 항체는, 예를 들어, 제1 표적 및 제2 표적 둘 다가 낮은 수준보다 높게 (예를 들어, 평균, 정상, 및/또는 높은 수준으로) 존재할 때와 비교하여 각각의 제2 표적의 낮은 수준이 존재할 때 훨씬 감소된 친화도로 결합한다. 일부 구체예에서, 대상 다중특이적 항체가 MDR1 및 CD47 둘 다를 발현하는 세포에 결합하는 친화도는 대상 다중특이적 항체가 MDR1 또는 CD47을 발현하는 세포에 결합하는 친화도 (또는 MDR1 또는 CD47의 낮은 수준)와 비교하여 2배, 예를 들어, 2.5배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 그 이상 더 높다.
일부 구체예에서, 대상 다중특이적 항체는, MDR1을 발현하는 세포에 결합될 때, 세포 MDR1 단백질의 기능을 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다중특이적 항체는 MDR1 단백질에 의한 유출을 억제할 수 있으며, 예를 들어, 유출은 대상 다중특이적 항체의 부재시 MDR1에 의한 유출과 비교하여 5% 이상, 예를 들어, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상만큼 감소된다.
일부 구체예에서, 대상 다중특이적 항체는, CD47을 발현하는 세포에 결합될 때, 세포 CD47 단백질의 기능을 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다중특이적 항체는 CD47로의 CD47-리간드 또는 CD47 결합 파트너의 결합을 억제할 수 있으며, 예를 들어, 리간드/결합 파트너 결합은 대상 다중특이적 항체의 부재시의 CD47에 의한 결합과 비교하여 5% 이상, 예를 들어, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 만큼 감소된다.
본 발명의 다중특이적 항체는 적어도 MDR1 및 CD47에 대해 이중특이적이며, 항체의 구성형태는 다를 수도 있다. 용어 "항체"는 에피토프에 결합할 수 있는 하나 이상의 (예를 들어, 하나 또는 둘) 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 하나 이상의 (예를 들어, 하나 또는 둘) 경쇄 가변 영역 (VL), 또는 그것들의 부분 단편을 포함하는 단백질을 나타낸다. 본원에서 기재된 다중특이적 항체에 관하여, 이러한 항체는 2개의 상이한 표적 단백질 상에 존재하는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대상 다중특이적 항체에 의해 결합되는 상이한 표적 단백질, 및 따라서 상이한 에피토프의 수는 달라질 수 있고 2 (즉, 이중특이적), 3 (삼중특이적), 4, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 다중특이적 항체는 공통 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "공통 경쇄"는 일반적으로 동일한 경쇄의 2개의 카피의 사용, 및 다중특이적 항체로의 그것들의 통합을 나타낸다. 바꿔 말하면, 조립된 다중특이적 항체에서 경쇄는 MDR1-특이적 중쇄와 회합하고 동일한 경쇄의 제2 카피는 CD47-특이적 중쇄와 회합할 것이다.
VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역 (FR)"이라고 불리는 더 보존되는 영역과 함께 산재된, "상보성 결정 영역 (CDR)"이라고 불리는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. FR 및 CDR의 정도는 정확하게 정의되어 있다 (Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 참조). VH는 다음 순서로 N-말단에서 C-말단 방향으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함할 수 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 유사하게, VL은 다음 순서로 N-말단에서 C-말단 방향으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함할 수 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
항체의 VH 또는 VL 사슬은 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 더 포함하여, 각각 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린을 형성할 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 테트라머이며, 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어, 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 영역을 포함한다. 항체의 불변 영역은 전형적으로 숙주 조직 및 면역 시스템의 다양한 세포 및 보체 시스템의 제1 보체를 포함하는 인자들로의 항체의 결합을 매개한다. 용어 "항체"는 유형 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM 및 그것들의 하위 유형의 면역글로불린을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상 항체는 IgG 아이소타입이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 암호화되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 나타낸다. 인식된 인간 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파 (IgA1 및 IgA2), 감마 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자; 및 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 전장 면역글로불린 경쇄 (약 25 kD 또는 214개의 아미노산)는 N-말단 (약 110개의 아미노산)에서는 가변 영역 유전자에 의해 암호화되고 C-말단에서는 카파 또는 람다 불변 영역에 의해 암호화된다. 전장 면역글로불린 중쇄 (약 50 kD 또는 446개의 아미노산)는 N-말단 (약 116개의 아미노산)에서는 가변 영역 유전자에 의해 암호화되고 C-말단에서는 상기 언급된 불변 영역 유전자 중 하나, 예를 들어, 감마 (약 330개의 아미노산을 암호화함)에 의해 암호화된다. 일부 구체예에서, 대상 항체는 전장 면역글로불린 중쇄 및 전장 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 전장 면역글로불린 중쇄 및 전장 면역글로불린 경쇄를 포함하지 않지만, 대신에 하나 이상의 전장 면역글로불린 중쇄의 항원-결합 단편 및/또는 전장 면역글로불린 경쇄의 하나 이상의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단편은 별개의 폴리펩타이드 사슬 상에서 함유되고; 다른 구체예에서, 항원-결합 단편은 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 함유된다.
용어 "항원-결합 단편"은 상기 기재된 바와 같이 MDR1 또는 CD47에 특이적으로 결합할 수 있는 전장 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편 (VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 포함하는, 예를 들어, 이것들로 이루어진 1가 단편); (ii) F(ab')2 단편 (힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편); (iii) Fd 단편 (VH 및 CH1 도메인을 포함함, 예를 들어, 이것들로 이루어짐); (iv) Fv 단편 (항체의 단일 아암의 VH 및 VL 도메인을 포함함, 예를 들어, 이것들로 이루어짐); (v) dAb 단편 (VH 도메인을 포함함, 예를 들어, 이것들로 이루어짐); (vi) 단리된 CDR; (vii) 단일 사슬 Fv (scFv) (VH 및 VL 도메인이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하도록 재조합 수단을 사용하여 합성 링커에 의해 결합된 항체의 단일 아암의 VH 및 VL 도메인을 포함함, 예를 들어, 이것들로 이루어짐); (viii) 디아바디 (VH 및 VL 도메인이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하지 않도록 VH 및 VL 도메인이 결합된 2개의 scFv를 포함함, 예를 들어, 이것들로 이루어짐; scFv의 각각의 하나의 VH는 다른 scFv의 VL 도메인과 쌍을 형성하여 2가 분자를 형성함)를 포함한다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 재조합 또는 변형된 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화된, 탈면역화된 또는 시험관내에서(in vitro) 생성된 항체이다. 용어 "재조합" 또는 "변형된" 항체는 본원에서 사용된 바와 같이 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 모든 항체, 예컨대 (i) 숙주 세포로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체; (ii) 재조합 조합적 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; (iii) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자 이식된 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체; 또는 (iv) 다른 DNA 서열로의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱(splicing)을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 항체를 포함하도록 의도된다. 이러한 재조합 항체는 인간화된, CDR 이식된, 키메라, 탈면역화된, 및 시험관내에서 생성된 항체를 포함하고; 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 불변 영역을 선택적으로 포함할 수 있다.
변형된 항체는 변형된 도메인을 포함할 수 있으며, 예컨대 임의의 항체 도메인은 자연 발생한 형태로부터 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 항체는 변형된 중쇄를 포함할 수 있으며, 변형된 Fc 도메인을 포함하고, 변형된 CH2 및/또는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 어떤 경우에, 변형된 Fc 도메인은 정전기 스티어링(steering) 효과를 이용할 수 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, Gunasekeran et al, (2010) Journal of Biological Chemistry 285, 19637-19646 (그 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기재된 절차를 사용하는 것을 포함한다. 어떤 경우에, 이중특이적 항체는 CH3 도메인에서 전하 쌍 치환을 통해 조립되며, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 하나의 중쇄가 K392D 및 K409D 치환을 함유하도록 변형되고 다른 중쇄는 E356K 및 D399K 치환을 함유하도록 변형된다. 전하 쌍 치환된 사슬은 우선적으로 서로 헤테로다이머를 형성할 수 있다. 아미노산 치환의 넘버링은 HC에 대해 EU 넘버링 시스템을 따른다.
어떤 경우에, 본 발명의 항체는 전하 쌍 치환을 포함한다. 어떤 경우에, 본 발명의 항체는 전하 쌍 치환을 포함하지 않는다. 어떤 경우에, 원하는 사슬의 우선적인 헤테로다이머 형성을 촉진하는 대안의 수단이 이용될 수 있다.
어떤 경우에, 변형된 중쇄는 노브-인투-홀(knob-into-hole) 변형을 포함할 수 있다. "노브-인투-홀" 아미노산 변형은 이중특이적 IgG 항체를 포함한 다중특이적 항체의 생산시, 중쇄의 헤테로다이머화에 사용되는, 항체 조작에서 합리적인 디자인 전략이다. 예를 들어, 상이한 특이성의 2개의 단클론성 항체로부터 만들어진 이중특이적 항체로 노브-인투-홀 전략을 통합시키는데 있어서, 아미노산 변화는 단클론성 항체 1 (mAb1)의 중쇄의 CH3 상의 "노브" 및 단클론성 항체 2 (mAb2)의 중쇄의 CH3 상의 "홀"을 생성하기 위해 조작된다. 노브는 큰 아미노산, 예를 들어, 티로신 (Y)으로 나타날 수 있는 반면, 홀은 작은 아미노산, 예컨대 트레오닌 (T)으로 나타날 수 있다. 예를 들어, 놉-인투-홀 쌍 변형은 제1 CH3 도메인에서 T22Y 치환 및 파트너 CH3 도메인에서 Y86T 치환을 생성할 수 있다. 놉-인투-홀 변형의 예는 Carter, J. Immunol. Methods, 248(1-2):7-15 (2001); Ridgway, J. B. et al. Protein Eng. 9(7):617-2 (1996); 및 Merchant, A. M. et al. Nat. Biotechnol. 16(7):677-81 (1998) (그 개시내용은 전문이 본원에 포함됨)에 기재되어 있다. 쌍 형성된 노브-인투-홀 변형된 도메인으로부터 생성된 항체에서 이중특이적 헤테로다이머는 일반적으로 주요 분획을 나타낼 것이다.
상기 요약된 바와 같이, 본 발명의 다중특이적 항체는 MDR1-결합 도메인 및 CD47-결합 도메인을 포함할 것이다. 이러한 도메인은 달라질 수도 있으며, 도메인에 의해 결합된 에피토프, 가변 영역 배열 및 서열, 등을 포함한다.
대상 MDR1-결합 도메인은 MDR1의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 따라서, 에피토프는 MDR1 에피토프이다. MDR1-결합 도메인에 의해 결합된 MDR1 에피토프의 크기는 달라질 수 있으며, 예컨대 MDR1 에피토프는 4 aa 이하 내지 12 aa 이하의 범위에 있을 수 있는, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 4 aa 내지 10 aa, 5 aa 내지 10 aa, 6 aa 내지 10 aa, 4 aa 내지 8 aa, 5 aa 내지 8 aa, 6 aa 내지 8 aa, 등의 MDR1 서열의 인접한 신장부를 가진 폴리펩타이드에 의해 형성된다.
일부 구체예에서, MDR1 에피토프는 MDR1 서열의 인접한 신장부, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간 MDR1 서열:
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MDLEGDRNGGAKKKNFFKLNNKSEKDKKEKKPTVSVFSMFRYSNWLDKLYMVVGTLAAIIHGAGLPLMMLVFGEMTDIFANAGNLEDLMSNITNRSDINDTGFFMNLEEDMTRYAYYYSGIGAGVLVAAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRKQFFHAIMRQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQSMATFFTGFIVGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAAVWAKILSSFTDKELLAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNKNLEEAKRIGIKKAITANISIGAAFLLIYASYALAFWYGTTLVLSGEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPSIEAFANARGAAYEIFKIIDNKPSIDSYSKSGHKPDNIKGNLEFRNVHFSYPSRKQVKILKGLNLKVQSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPTEGMVSVDGQDIRTINVRFLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGRENVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPHKFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQVALDKARKGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDDGVIVEKGNHDELMKEKGIYFKLVTMQTAGNEVELENAADESKSEIDALEMSSNDSRSSLIRKRSTRRSVRGSQAQDRKLSTKEALDESIPPVSFWRIMKLNLTEWPYFVVGVFCAIINGGLQPAFAIIFSKIIGVFTRIDDPETKRQNSNLFSLLFLVLGIISFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFRSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGAIGSRLAVITQNIANLGTGIIISFIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGAGKIASEAIENFRTVVSLTQEQKFEHMYAQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAMMYFSYAGCFRFGAYLVAHKLMSFEDVLLVFSAVVFGAMAVGQVSSFAPDYAKAKISAAHIIMIIEKTPLIDSYSTEGLTPNTLEGNVTFGEVVFNYPTRPDIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPLAGKVLLDGKEIKRLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSIAENIAYGDNSRVVSQEEIVRAAKEANIHAFIESLPNKYSTRVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVFQNGRVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGTKRQ, 또는 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) (게먹이 원숭이) 서열:
MDLEGDRNGGAEKKNFFKLNNKSKKDKKERKPTVSVFSMFRYSNWLDKLYMVVGTLAAIIHGAGLPLMMLVFGDMTDTFANAGNLGDLGALLFNNTNSSNITDTVPVMNLEEDMTRYAYYYSGIGAGVLVAAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRKQFFHAIMRQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQSMATFFTGFIVGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAAVWAKILSSFTDKELLAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNKNLEEAKRIGIKKAITANISIGAAFLLIYASYALAFWYGTTLVLSKEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPSIEAFANARGAAFEIFKIIDNKPSIDSYSKSGHKPDNIKGNLEFRNVHFSYPSRKEVKILKGLNLKVQSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPTEGMVSVDGQDIRTINVRFLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGREDVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPQKFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQVALDKARKGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDDGVIVEKGNHDELMKEKGIYFKLVTMQTAGNEIELENAADESKSEIDTLEMSSHDSGSSLIRKRSTRRSVRGSQGQDRKLSTKEALDESIPPVSFWRIMKLNLTEWPYFVVGVFCAIINGGLQPAFAVIFSKIIGIFTRNDDAETKRQNSNLFSLLFLVLGIVSFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFRSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGAIGSRLAIITQNIANLGTGIIISLIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGAGKIATEAIENFRTVVSLTQEQKFEHMYDQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAMMYFSYAGCFRFGAYLVAHSLMSFEDVLLVFSAVVFGAMAVGQVSSFAPDYAKAKVSAAHIIMIIEKTPLIDSYSTEGLKPNTLEGNVTFNEVVFNYPTRLDIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPLAGKVLLDGKEIKQLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSISENIAYGDNSRVVSQEEIVRAAKEANIHAFIESLPNKYSTRVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVFQNGRVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGAKRQ, 등에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가진 폴리펩타이드에 의해 형성될 수 있다.
대상 MDR1-결합 도메인은 MDR1에 대해 높은 친화도 결합을 나타낸다. 예를 들어, 대상 MDR1-결합 도메인은 적어도 약 10-7 M, 적어도 약 10-8 M, 적어도 약 10-9 M, 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11 M, 또는 적어도 약 10-12 M, 또는 10-12 M 초과의 친화도로 MDR1에 결합한다. 대상 MDR1-결합 도메인은 약 10-7 M 내지 약 10-8 M, 약 10-8 M 내지 약 10-9 M, 약 10-9 M 내지 약 10-10 M, 약 10-10 M 내지 약 10-11 M, 또는 약 10-11 M 내지 약 10-12 M, 또는 10-12 M 초과의 친화도로 MDR1 상에 존재하는 에피토프에 결합한다.
대상 MDR1-결합 도메인은 다른 관련이 있지만 서열이 다른 단백질, 예컨대 관련이 있지만 서열이 다른 EP 내의 아미노산에 의해 형성된 임의의 에피토프로의 결합을 실질적으로 나타내지 않는다. 관련이 있지만 서열이 다른 단백질 내의 아미노산에 의해 형성된 에피토프로의 대상 MDR1-결합 도메인의 임의의 결합은 일반적으로 MDR1 상에서 에피토프로의 MDR1-결합 도메인의 특이적 결합보다 실질적으로 더 낮은 친화도의 비-특이적 결합이다. 실질적으로 더 낮은 친화도는 일반적으로 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 50배, 100배, 500배, 또는 1000배 더 낮은 친화도이다.
대상 MDR1-결합 도메인은 MDR1 수송체를 통한 분자의 수송을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 대상 MDR1-결합 도메인은 MDR1-결합 도메인의 부재시 수송의 정도와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 그 이상만큼 수송을 감소시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 a) i. RYTMS의 중쇄 CDR1 영역과 아미노산 서열이 동일하거나 RYTMS의 중쇄 CDR1 영역을 포함하는 CDR1 영역; ii. TISSGGGNTYYPDSVKG의 중쇄 CDR2 영역과 아미노산 서열이 동일하거나 TISSGGGNTYYPDSVKG의 중쇄 CDR2 영역을 포함하는 CDR2 영역; 및 iii. YGAGDAWFAY의 중쇄 CDR3 영역과 아미노산 서열이 동일하거나 YGAGDAWFAY의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 이들 CDR1-3 영역은 다음 서열을 가진 15D3 항체의 VH 사슬: EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA 또는 다음 서열을 가진 이 VH 사슬의 인간화된 버전: EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (여기서 X2는 N, Q 또는 S이다)에 존재하는 것이다. 이들 CDR은 Kabat 명명법을 기반으로 한다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 CDR1 (RYTMS), CDR2 (TISSGGG X2TYYPDSVKG (여기서 X2는 N, Q 또는 S이다)), 및 CDR3 (YGAGDAWFAY) 중 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 CDR 중 1, 2, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 예를 들어, 설치류, 비-인간 영장류를 포함하는 포유류 서열, 및 인간 서열 (예를 들어, 각각의 중쇄 FR-암호화 서열에 의해 암호화됨)인 FR 영역을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 방향의 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다: 인간 중쇄 FR1; 아미노산 서열 RYTMS를 포함하는 CDR1; 인간 중쇄 FR2; 아미노산 서열 TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하는 CDR2; 인간 중쇄 FR3; 아미노산 서열 YGAGDAWFAY를 포함하는 CDR3; 및 인간 중쇄 FR4.
대상 항체는 다음 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상, 예컨대 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS. 대상 항체는 CDR1 (RYTMS), CDR2 (TISSGGGNTYYPDSVKG), 및 CDR3 (YGAGDAWFAY) 중 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 중 1, 2, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, VH 사슬은 인간 프레임워크 영역을 포함하도록 인간화되고 인간화된 VH 사슬은 다음 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상, 예컨대 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다: EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (여기서 X2는 N, Q 또는 S이다).
대상 CD47-결합 도메인은 CD47의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 따라서, 에피토프는 CD47 에피토프이다. CD47-결합 도메인에 의해 결합된 CD47 에피토프의 크기는 달라질 수 있으며, 예컨대 CD47 에피토프는 4 aa 이하 내지 12 aa 이하의 범위에 있을 수 있는, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 4 aa 내지 10 aa, 5 aa 내지 10 aa, 6 aa 내지 10 aa, 4 aa 내지 8 aa, 5 aa 내지 8 aa, 6 aa 내지 8 aa, 등의 CD47 서열의 인접한 신장부를 가진 폴리펩타이드에 의해 형성된다.
일부 구체예에서, CD47 에피토프는 CD47 서열의 인접한 신장부, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간 CD47 서열:
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE; 또는 설치류 CD47 서열, 예를 들어, 마우스 CD47 서열:
MWPLAAALLLGSCCCGSAQLLFSNVNSIEFTSCNETVVIPCIVRNVEAQSTEEMFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDAMVGNYTCEVTELSREGKTVIELKNRTVSWFSPNEKILIVIFPILAILLFWGKFGILTLKYKSSHTNKRIILLLVAGLVLTVIVVVGAILLIPGEKPVKNASGLGLIVISTGILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYVLALVGLCLCIMACEPVHGPLLISGLGIIALAELLGLVYMKFVASNQRTIQPPRNR, 또는 비-인간 영장류 서열, 예컨대 예를 들어, 수마트라 오랑우탄(Pongo abelii) (수마트라 오랑우탄) 서열:
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLIITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLNSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE, 또는 벵골 원숭이(Macaca mulatta) (붉은 털 원숭이) 서열:
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTAPANFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLMITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE, 등에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드에 의해 형성될 수 있다.
대상 CD47-결합 도메인은 CD47에 대해 높은 친화도 결합을 나타낸다. 예를 들어, 대상 CD47-결합 도메인은 적어도 약 10-7 M, 적어도 약 10-8 M, 적어도 약 10-9 M, 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11 M, 또는 적어도 약 10-12 M, 또는 10-12 M 초과의 친화도로 CD47에 결합한다. 대상 CD47-결합 도메인은 약 10-7 M 내지 약 10-8 M, 약 10-8 M 내지 약 10-9 M, 약 10-9 M 내지 약 10-10 M, 약 10-10 M 내지 약 10-11 M, 또는 약 10-11 M 내지 약 10-12 M, 또는 10-12 M 초과의 친화도로 CD47 상에 존재하는 에피토프에 결합한다.
대상 CD47-결합 도메인은 다른 관련이 있지만 서열이 다른 단백질, 예컨대 관련이 있지만 서열이 다른 면역 체크포인트(checkpoint) 마커 내의 아미노산에 의해 형성된 임의의 에피토프로의 결합을 실질적으로 나타내지 않는다. 관련이 있지만 서열이 다른 단백질 내의 아미노산에 의해 형성된 에피토프로의 대상 CD47-결합 도메인의 임의의 결합은 일반적으로 CD47 상의 에피토프로의 CD47-결합 도메인의 특이적 결합보다 실질적으로 더 낮은 친화도의 비-특이적 결합이다. 실질적으로 더 낮은 친화도는 일반적으로 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 50배, 100배, 500배, 또는 1000배 더 낮은 친화도이다.
대상 CD47-결합 도메인은 CD47에 대한 CD47-결합-파트너, 예를 들어, 트롬보스폰딘-1 (TSP-1), 신호 조절 단백질 알파 (SIRPα) 및 인테그린 (예를 들어, 인테그린 avb3)의 결합을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 대상 CD47-결합 도메인은 CD47-결합-파트너 결합을 CD47-결합 도메인의 부재시 결합의 정도와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 그 이상만큼 감소시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 a) i. NYNMH의 CDR1 영역과 아미노산 서열이 동일하거나 NYNMH의 CDR1 영역을 포함하는 CDR1영역; ii. TIYPGNDDTSYNQKFKD의 중쇄 CDR2 영역과 아미노산 서열이 동일하거나 TIYPGNDDTSYNQKFKD의 중쇄 CDR2 영역을 포함하는 CDR2 영역; 및 iii. GGYRAMDY의 중쇄 CDR3 영역과 아미노산 서열이 동일하거나 GGYRAMDY의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 가변 도메인을 포함한다. 이들 CDR1-3 영역은 다음 서열을 가진 5F9 항체의 VH 사슬에 존재하는 것이다: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS. 이들 CDR은 Kabat 명명법을 기반으로 한다.
대상 항체는 다음 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상, 예컨대 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS. 대상 항체는 CDR1 (NYNMH), CDR2 (TIYPGNDDTSYNQKFKD), 및 CDR3 (GGYRAMDY) 중 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 중 1, 2, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 CDR1 (NYNMH), CDR2 (TIYPGNDDTSYNQKFKD), 및 CDR3 (GGYRAMDY) 중 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 CDR 중 1, 2, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 포유류, 예를 들어, 설치류, 비-인간 영장류, 또는 인간 서열 (예를 들어, 각각의 중쇄 FR-암호화 서열에 의해 암호화됨)인 FR 영역을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 방향의 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다: 인간 중쇄 FR1; 아미노산 서열 NYNMH를 포함하는 CDR1; 인간 중쇄 FR2; 아미노산 서열 TIYPGNDDTSYNQKFKD를 포함하는 CDR2 아미노산 서열; 인간 중쇄 FR3; GGYRAMDY를 포함하는 CDR3; 및 인간 중쇄 FR4.
대상 항체는 다음 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상, 예컨대 100% 동일한 아미노산 서열: DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK 또는 다음 서열을 가진 이 서열의 인간화된 버전: DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
대상 항체는 CDR1 (RSSQSIVHSTG X1TYLEW) (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다), CDR2 (KISNRFSG), 및 CDR3 (FQASHFPRTF) 또는 CDR1 (RSSQSLLHSDGFDYLNW), CDR2 (ALSNRASG) 및 CDR3 (MZALQAPITF)에서 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 이러한 경쇄 가변 영역은 대상 다중특이적 항체의 공통 경쇄에서 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 CDR1 (RSSQSIVHSTG X1TYLEW) (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다), CDR2 (KISNRFSG), 및 CDR3 (FQASHFPRTF) 또는 CDR1 (RSSQSLLHSDGFDYLNW), CDR2 (ALSNRASG) 및 CDR3 (MZALQAPITF)에서 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 포유동물, 예를 들어, 설치류, 비-인간 영장류, 또는 인간 서열인 FR 영역 (예를 들어, 각각의 경쇄 FR-암호화 서열에 의해 암호화됨)을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 방향의 순서로 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다: 인간 경쇄 FR1; 아미노산 서열 RSSQSIVHSTGX1TYLEW를 포함하는 CDR1 (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다); 인간 경쇄 FR2; 아미노산 서열 KISNRFSG를 포함하는 CDR2; 인간 경쇄 FR3; FQASHFPRTF에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및 인간 경쇄 FR4.
일부 구체예에서, 대상 항체는 선택적으로 중쇄 FR1 영역; 아미노산 서열 RYTMS를 포함하는 CDR1; 중쇄 FR2 영역; 아미노산 서열 TISSGGG(N/S/Q)TYYPDSVKG를 포함하는 CDR2; 중쇄 FR3 영역; 아미노산 서열 YGAGDAWFAY를 포함하는 CDR3; 및 중쇄 FR4 영역; 및 선택적으로 중쇄 FR1 영역; 아미노산 서열 NYNMH를 포함하는 CDR1; 중쇄 FR2 영역; 아미노산 서열 TIYPGNDDTSYNQKFKD를 포함하는 CDR2; 중쇄 FR3 영역; 아미노산 서열 GGYRAMDY를 포함하는 CDR3; 및 중쇄 FR4 영역을 포함한다. 이들 구체예 중 일부에서, 각각의 FR 영역은 포유동물 FR 영역, 예를 들어, 인간 FR 영역이다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 이전 단락에서 기재된 중쇄 서열 및 경쇄 FR1 영역; 아미노산 서열 RSSQSIVHSTGNTYLEW 또는 RSSQSLLHSDGFDYLNW를 포함하는 CDR1; 경쇄 FR2 영역; 아미노산 서열 KISNRFSG 또는 ALSNRASG를 포함하는 CDR2; 경쇄 FR3 영역; 아미노산 서열 FQASHFPRTF 또는 MZALQAPITF를 포함하는 CDR3; 선택적으로 경쇄 FR4 영역을 또한 포함한다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 다음 서열을 가진 전하 대 전하 교환 (charge-to-charge swap) (KK) 변형을 포함하는 항-MDR1 중쇄 서열: EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG, 다음 서열을 가진 전하 대 전하 교환 (DD) 변형을 포함하는 항-CD47 중쇄 서열: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG, 및 다음 서열을 가진 항-MDR1 경쇄 서열: DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC를 포함한다. 어떤 경우에, 대상 항체는 대안의 헤테로다이머 Fc 쌍 형성 전략을 포함할 수 있다.
전하 대 전하 교환 변형은 하나의 중쇄가 K392D 및 K409D 치환을 함유하도록 변형되고 다른 중쇄가 E356K 및 D399K 치환을 함유하도록 변형된 치환을 나타낸다. 전하 쌍 치환된 사슬은 서로 헤테로다이머 형성을 선호한다. 아미노산 치환의 넘버링은 Ig HC에 대해 EU 넘버링 시스템을 따른다.
단일특이적 2가 항체 및 이중특이적 항체
단일특이적 2가 항체 또는 그것으로부터 유래된 이중특이적 항체일 수 있는 항체가 또한 본원에서 제공된다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR (LCDR)을 포함하는 가변 경쇄 (VL): DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다); 및 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR (HCDR)을 포함하는 가변 중쇄 (VH): EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (여기서 X2는 N, Q 또는 S이다)를 포함한다.
특정 양태에서, VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR을 포함하고: DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK; VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR을 포함하거나: EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS, 또는 VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR을 포함하고: DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK; VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR을 포함하거나: EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS, 또는 VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR을 포함하고: DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK; VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 LCDR을 포함한다: EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
특정 양태에서, LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE, RSSQSIVHSTGQTYLE, 또는 RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고, LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고, LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함한다.
특정 양태에서, HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고, HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG, TISSGGGQTYYPDSVKG, 또는 TISSGGGSTYYPDSVKG를 포함하고, HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다.
특정 양태에서, LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고, LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고, LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고; HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고, HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고, HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다.
특정 양태에서, LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGQTYLE를 포함하고, LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고, LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고; HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고, HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고, HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다.
특정 양태에서, LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고, LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고, LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고; HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고, HCDR2는 다음 서열: TISSGGGSTYYPDSVKG를 포함하고, HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다.
특정 양태에서, LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고, LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고, LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고; HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고, HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고, HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는 LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고, LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고, LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고; HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고, HCDR2는 다음 서열: TISSGGGSTYYPDSVKG를 포함하고, HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다.
특정 양태에서, LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGQTYLE를 포함하고, LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고, LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고; HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고, HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고, HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다.
특정 양태에서, LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고, LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고, LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고; HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고, HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고, HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다.
특정 양태에서, LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고, LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고, LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고; HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고, HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고, HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다.
특정 양태에서, LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고, LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고, LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고; HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고, HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고, HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다.
특정 양태에서, 항체는 MDR-1에 특이적으로 결합하는 단일특이적 2가 항체이다. 특정 양태에서, MDR-1에 특이적으로 결합하는 단일특이적 2가 항체는 다음 아미노산 서열을 가진 VL 사슬에 대해 적어도 80% 동일한 (예를 들어, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 또는 100% 동일한 ) 아미노산 서열을 가진 인간화된 VL 사슬을 포함한다:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK;
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK; 또는
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK.
특정 양태에서, VL 사슬 서열 또는 VH 사슬 서열과 상이한 아미노산 잔기가 프레임워크 영역에 위치한다.
특정 양태에서, MDR-1에 특이적으로 결합하는 단일특이적 2가 항체는 다음 아미노산 서열을 가진 VH 사슬과 적어도 80% 동일한 (예를 들어, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 가진 인간화된 VH 사슬을 포함한다:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS;
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS; 또는
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
특정 양태에서, 항체는 공통 경쇄로서 VL 사슬을 포함하는 이중특이적 항체이다.
특정 양태에서, 이중특이적 항체는 MDR-1 결합 도메인 및 종양 관련 항원 (TAA) 결합 도메인을 포함하며 MDR-1 결합 도메인 및 TAA 결합 도메인은 각각 VL 사슬의 LCDR1-3을 포함한다.
특정 양태에서, TAA는 CD47이며 TAA 결합 도메인은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR을 포함한다: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS.
특정 양태에서, CD47 결합 도메인의 VH 사슬은 다음 서열를 포함하는 HCDR1: NYNMH, 다음 서열를 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD, 및 다음 서열를 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR (LCDR)을 포함하는 가변 경쇄 (VL): DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다); 및 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR (HCDR)을 포함하는 가변 중쇄 (VH): QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS를 포함한다
특정 양태에서, VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH, 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD, 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY를 포함한다.
특정 양태에서, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하는 단일특이적 2가 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 CD47 및 MRD-1에 결합하는 이중특이적 항체이다.
특정 양태에서, MDR-1에 특이적으로 결합하는 단일특이적 2가 항체 및 CD47에 특이적으로 결합하는 단일특이적 2가 항체는 본원에서 기재된 바와 같이 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법에 사용될 수 있고, 방법은 대상체에게 2개의 항체를 암을 치료하는데 유효한 양으로 동시-투여하는 단계를 수반할 수 있다. 특정 양태에서, 방법은 대상체에게 화학치료제를 투여하는 단계를 더 수반할 수 있다.
대상 항체의 영역 및/또는 사슬은 하나 이상의 링커 영역에 의해 결합되거나 결합되지 않을 수도 있다. 존재하는 경우, 링커 영역은 길이가 약 5개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 예를 들어, 길이가 약 5 aa 내지 약 10 aa, 약 10 aa 내지 약 15 aa, 약 15 aa 내지 약 20 aa, 약 20 aa 내지 약 25 aa, 약 25 aa 내지 약 30 aa, 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 또는 약 45 aa 내지 약 50 aa일 수 있다.
대상 항체에서 사용하기에 적합한 링커는 "유연한 링커"를 포함한다. 존재하면, 링커 분자는 일반적으로 연결된 영역 사이에서 약간의 유연한 이동을 허용하기에 충분한 길이이다. 링커 분자는 일반적으로 길이가 약 6-50개의 원자이다. 링커 분자는 또한, 예를 들어, 아릴 아세틸렌, 2-10개의 모노머 유닛을 함유하는 에틸렌 글리콜 올리고머, 디아민, 이염기산, 아미노산, 또는 이것들의 조합일 수 있다. 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 다른 링커 분자가 본 발명을 고려하여 사용될 수 있다.
적합한 링커는 쉽게 선택될 수 있고 적합한 상이한 길이, 예컨대 1개의 아미노산 (예를 들어, Gly) 내지 20개의 아미노산, 2개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 3개의 아미노산 내지 12개의 아미노산, 예컨대 4개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 5개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 6개의 아미노산 내지 8개의 아미노산, 또는 7개의 아미노산 또는 8개의 아미노산의 것일 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산일 수 있다.
예시의 유연한 링커는 글리신 폴리머 (G)n, 글리신-세린 폴리머 (예를 들어, (GS)n, GSGGSn (서열 번호: //) 및 GGGSn (서열 번호: //), 여기서 n은 적어도 1의 정수이다), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 해당 분야에 공지된 다른 유연한 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 폴리머가 관심이 있는데 이들 아미노산 둘 다가 상대적으로 구성되지 않았으며, 그러므로 구성요소들 사이에서 중립 테더(tether)의 역할을 할 수 있기 때문이다. 글리신 폴리머는 특히 관심이 있는데 글리신이 알라닌보다 훨씬 더 많은 phi-psi 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 가진 잔기보다 훨씬 덜 제한되기 때문이다 (Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992) 참조). 예시의 유연한 링커는 GGSG (서열 번호://), GGSGG (서열 번호://), GSGSG (서열 번호: //), GSGGG (서열 번호: //), GGGSG (서열 번호: //), GSSSG (서열 번호: //), 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 링커가 유연한 링커, 뿐만 아니라 덜 유연한 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록 상기 기재된 임의의 요소에 컨쥬게이션된 펩타이드의 디자인이 완전히 또는 부분적으로 유연한 링커를 포함할 수 있다는 것을 인정할 것이다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 "인간화된다". 용어 "인간화된 항체"는 실질적으로 인간 항체 사슬 (수령체 면역글로불린 또는 항체라고 불림)로부터의 가변 영역 프레임워크 잔기 및 실질적으로 비-인간 항체 (예를 들어, 설치류 (예를 들어, 마우스 항체), 비-인간 영장류, 등) (공여체 면역글로불린 또는 항체라고 불림)로부터 적어도 하나의 CDR을 포함하는 적어도 하나의 사슬을 포함하는 항체를 나타낸다. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029 10033 (1989), 미국 특허 번호 5,530,101, 미국 특허 번호 5,585,089, 미국 특허 번호 5,693,761, WO 90/07861, 및 미국 특허 번호 5,225,539를 참조하면 된다. 불변 영역(들)은 또한, 존재하면, 실질적으로 또는 전적으로 인간 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상 항체는 인간 항체로부터의 하나 이상의 MDR1 CDR 및 하나 이상의 CD47 CDR 및 하나 이상의 FR 영역을 포함한다. 인간화된 항체를 제조하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,256,273을 참조하면 된다.
인간 가변 도메인 프레임워크로의 마우스 CDR의 치환은, 예를 들어, 인간 가변 도메인 프레임워크가 CDR이 유래된 마우스 가변 프레임워크와 동일하거나 유사한 입체구조를 채택하는 경우 정확한 공간적인 배향을 유지할 수 있다. 이것은 프레임워크 서열이 CDR이 유래되는 쥐 가변 프레임워크 도메인과 높은 정도의 서열 동일성을 나타내는 인간 항체로부터 인간 가변 도메인을 얻음으로써 달성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 인간 항체 서열은 자연 발생 인간 항체의 서열일 수 있거나 여러 인간 항체의 공통 서열일 수 있다. Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993)을 참조하면 된다.
쥐 공여체 면역글로불린 및 적절한 인간 수령체 면역글로불린의 상보성 결정 영역을 확인하면, 다음 단계는, 존재하면, 이들 구성요소로부터의 잔기가 결과로 생성된 인간화된 항체의 성질을 최적화하기 위해 치환되어야 하는지를 결정하는 것이다. 일반적으로, 쥐 아미노산 잔기로의 인간 아미노산 잔기의 치환은 최소화되어야 하는데, 쥐 잔기의 도입이 인간에서 항체가 인간-항-마우스-항체 (HAMA) 반응을 유도하는 위험을 증가시키기 때문이다. 해당 분야에서 인정되는 면역 반응 결정 방법은 특정 환자에서 또는 임상 시험 동안에 HAMA 반응을 모니터링하기 위해 수행될 수 있다. 환자에게 투여된 인간화된 항체는 상기 요법의 투여 초기에 및 전반에 걸쳐 면역원성 평가가 제공될 수 있다. HAMA 반응은 표면 플라스몬 공명 기술 (BIACORE) 및/또는 고체상 ELISA 분석을 포함한, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 인간화된 치료 시약에 대한 항체를 검출함으로써 환자의 혈청 샘플에서 측정된다. 많은 구체예에서, 대상 인간화된 항체는 인간 대상체에서 실질적으로 HAMA 반응을 유도하지 않는다.
인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 특정 아미노산은 CDR 입체구조 및/또는 항원으로의 결합에 대한 가능한 영향력을 기반으로 치환에 대해 선택된다. 인간 가변 프레임워크 영역과 함께 쥐 CDR 영역의 비자연적인 배치는 비자연적인 입체구조적 제한을 발생시킬 수 있으며, 특정 아미노산 잔기의 치환에 의해 수정되지 않는 한, 결합 친화도의 손실로 이어진다.
치환을 위한 아미노산 잔기의 선택은 부분적으로 컴퓨터 모델링에 의해 결정될 수 있다. 면역글로불린 분자의 3차원 이미지를 생성하기 위한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어는 해당 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 분자 모델은 그것의 면역글로불린 사슬 또는 도메인에 대해 해독된 구조로부터 시작하여 생성된다. 모델링될 사슬은 아미노산 서열 유사성에 대해 해독된 3차원 구조의 사슬 또는 도메인과 비교되어 가장 높은 서열 유사성이 분자 모델의 구성을 위한 시작점으로서 선택된다는 것을 나타낸다. 적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 사슬 또는 도메인이 모델링을 위해 선택되고, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 서열 동일성 또는 그 이상의 서열 동일성을 공유하는 것들이 모델링을 위해 선택된다. 해독된 시작 구조는 모델링되는 면역글로불린 사슬 또는 도메인의 실제 아미노산과 시작 구조의 아미노산 사이의 차이를 허용하도록 변형된다. 변형된 구조는 합성 면역글로불린으로 조립된다. 마지막으로, 모델은 에너지 최소화에 의해 및 모든 원자가 서로 적절한 거리 내에 있고 결합 길이 및 각도나 화학적으로 허용 가능한 한계 내에 있다는 것을 검증함으로써 개선된다.
CDR 및 프레임워크 영역은 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)에 의해 정의된 바와 같다. 대안의 구조적 정의는 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); 및 J. Mol. Biol. 186:651 (1989) (일괄적으로 "Chothia"라고 불림)에 의해 제안되었다. 프레임워크 잔기가, Kabat, 상기에 의해 정의된 바와 같이, Chothia, 상기에 의해 정의된 구조적 루프 잔기를 구성할 때, 마우스 항체에 존재하는 아미노산이 인간화된 항체로의 치환에 대해 선택될 수 있다. "CDR 영역에 인접한" 잔기는 인간화된 면역글로불린 사슬의 주요 서열의 CDR 중 하나 이상에 바로 인접한 위치에서, 예를 들어, Kabat에 의해 정의된 CDR, 또는 Chothia에 의해 정의된 CDR (예를 들어, Chothia and Lesk JMB 196:901 (1987) 참조)에 바로 인접한 위치에서 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 아미노산은 특히 CDR에서 아미노산과 상호작용할 가능성이 크고, 수령체로부터 선택된 경우에는, 공여체 CDR을 비틀고 친화도를 감소시킬 가능성이 크다. 더욱이, 인접한 아미노산은 항원과 직접적으로 상호작용할 수 있도 (Amit et al., Science, 233:747 (1986)) 공여체로부터 이들 아미노산을 선택하는 것이 원래의 항체에서 친화도를 제공하는 모든 항원 접촉을 유지하는데 바람직할 수 있다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 scFv 멀티머를 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 대상 항체는 scFv 다이머 (예를 들어, 2개의 나란한(tandem) scFv (scFv2)를 포함함), scFv 트리머 (예를 들어, 3개의 나란한 scFv (scFv3)를 포함함), scFv 테트라머 (예를 들어, 4개의 나란한 scFv (scFv4)를 포함함)이거나, 또는 4개 초과의 scFv의 멀티머 (예를 들어, 나란히)이다. scFv 모노머는 길이가 약 2개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 예를 들어, 길이가 2 aa, 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 또는 10 aa의 링커를 통해 나란히 연결될 수 있다. 적합한 링커는, 예를 들어, (Gly)x를 포함하며, 여기서 x는 2 내지 10의 정수이다. 다른 적합한 링커는 상기 논의된 것들이다. 일부 구체예에서, 대상 scFV 멀티머에서 각각의 scFv 모노머는 상기 기재된 바와 같이 인간화된다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 면역글로불린의 불변 영역 (예를 들어, Fc 영역)을 포함한다. Fc 영역은, 존재하면, 인간 Fc 영역일 수 있다. 불변 영역이 존재하면, 항체는 경쇄 및 중쇄 불변 영역 둘 다를 함유할 수 있다. 적합한 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함한다. 본원에서 기재된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 임의의 아이소타입, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 모든 유형의 불변 영역을 가진 항체를 포함한다. 적합한 중쇄 Fc 영역의 예는 인간 아이소타입 IgG1 Fc이다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 대상 항체 (예를 들어, 대상 인간화된 항체)는 하나 초과의 클래스 또는 아이소타입으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 테트라머로서, 별개의 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab' F(ab')2, 및 Fv로서, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 스페이서(spacer)를 통해 연결된 단일 사슬 항체로서 발현될 수 있다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 카르복실 말단에서 유리 티올 (-SH) 기를 포함하며, 유리 티올 기는 제2 폴리펩타이드 (예를 들어, 대상 항체를 포함한 또 다른 항체), 스캐폴드(scaffold), 담체, 등에 항체를 부착시키는데 사용될 수 있다.
대상 항체는, 예를 들어, 글루타르알데하이드, 동형 이기능적(homobifunctional) 교차-링커, 또는 이형 이기능적(heterobifunctional) 교차-링커를 사용하여 제2 모이어티 (예를 들어, 지질, 대상 항체 이외의 폴리펩타이드, 합성 폴리머, 탄수화물, 등)에 공유 결합될 수 있다. 글루타르알데하이드는 아미노 모이어티를 통해 폴리펩타이드에 교차-결합한다. 동형 이기능적 교차-링커 (예를 들어, 동형 이기능적 이미도에스터, 동형 이기능적 N-하이드록시숙신이미딜 (NHS) 에스터, 또는 동형 이기능적 설피드릴 반응성 교차-링커)는 2개 이상의 동일한 반응성 모이어티를 함유하고 연결되는 폴리펩타이드의 혼합물을 함유하는 용액에 링커가 추가되는 1단계 반응 절차에서 사용될 수 있다. 동형 이기능적 NHS 에스터 및 이미도 에스터는 아민 함유 폴리펩타이드에 교차-결합한다. 약알칼리성 pH에서, 이미도 에스터는 1차 아민과만 반응하여 이미도아미드를 형성하고, 교차-결합된 폴리펩타이드의 전체 전하는 영향을 받지 않는다. 동형 이기능적 설피드릴 반응성 교차-링커는 비스말레이미드헥산 (BMH), 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 (DFDNB), 및 1,4-디-(3',2'-피리딜디티오) 프로피노아미도 부탄 (DPDPB)을 포함한다.
조성물 및 제제
본 발명은 대상 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 대상 항체 조성물은, 대상 항체에 더하여, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 염, 예를 들어, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, 등; 완충제, 예를 들어, Tris 완충제, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산) (HEPES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 나트륨 염 (MES), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산 (MOPS), N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로판설폰산 (TAPS), 등; 가용화제; 세제, 예를 들어, 비-이온성 세제, 예컨대 Tween-20, 등; 프로테아제 억제자; 글리세롤; 등.
본 발명의 조성물은 또한 본원에서 기재된 다중특이적 항체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 일반적으로, 제제는 대상 항체의 유효량을 포함한다. "유효량"은 원하는 결과, 예를 들어, 대상체의 암의 감소, 대상체서 암의 성장 속도의 감소, 암의 증상의 개선, 등을 생산하기에 충분한 투약량을 의미한다. 일반적으로, 원하는 결과는, 대조군과 비교하여, 적어도 암의 증상의 감소, 암의 성장의 감소, 암의 크기의 감소, 등이다. 대상 항체는 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 피하기 위한 방식으로 전달되거나, 또는 제제화될 수 있다. 어떤 경우에, 항체는 전달 인핸서를 포함할 수 있으며, 이러한 인핸서가 혈액-뇌 장벽의 교차를 촉진할 수 있는 경우, 예를 들어, 효율적인 경피 전달, 등을 허용하는 증가된 투과성을 포함한다. 유용한 전달 인핸서는, 예를 들어, 세레포트, 레가데노손, 보르네올, 푸에라린, 프로필렌 글리콜, 올레산, 아존, N-메틸 피롤리돈, Tween 80, 리모넨, 지질-기반 나노입자 (NP), 리포솜, 니오솜, 트랜스퍼솜, 에토솜, 덴드리머, 미셀 NP, 폴리머 나노구조, 금속성 나노구조, 자기성 나노구조, 재조합 인간 히알루로니다제, 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
대상 방법에서, 대상 항체는 원하는 치료 효과 또는 진단 효과를 발생시킬 수 있는 임의의 편리한 수단을 사용하여 숙주에게 투여될 수 있다. 따라서, 작용제는 치료적 투여를 위한 다양한 제제에 포함될 수 있다. 더 구체적으로, 대상 항체는 적절한 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와의 조합에 의해 약학적 조성물로 제제화될 수 있고, 타블렛, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 주사액, 흡입제 및 에어로졸과 같은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 조제물로 제제화될 수 있다.
약학적 투약 형태에서, 대상 항체는 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 투여될 수 있거나, 또는 단독으로 또는 다른 약학적으로 활성인 화합물과 적절한 연관성으로, 뿐만 아니라 그것과 조합으로 사용될 수도 있다. 다음 방법 및 부형제는 단지 예시이며 어떠한 방법으로도 제한하는 것은 아니다.
경구용 조제물에 대해, 대상 항체는 단독으로 또는 타블렛, 분말, 과립 또는 캡슐을 제조하기 위한 적절한 첨가제, 예를 들어, 통상적인 첨가제, 예컨대 락토스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분; 바인더(binder), 에컨대 결정질 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 분해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 또는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스; 윤활제, 예컨대 탈크(talc) 또는 마그네슘 스테아레이트; 및 원하는 경우, 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제 및 방향제와 조합으로 사용될 수 있다. 어떤 경우에, 항체의 경구 전달은 적절한 하이드로겔(hydrogel)과의 항체의 복합체 형성을 통해 향상될 수 있다.
대상 항체는 수성 또는 비수성 용제, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 방향족 산 글리세리드, 고등 방향족 산 또는 프로필렌 글리콜의 에스터; 및 원하는 경우, 통상적인 첨가제, 예컨대 가용화제, 등장화제, 현탁화제, 에멀젼화제, 안정화제 및 보존제에서 그것들을 용해, 현탁화 또는 에멀젼화함으로써 주사용 조제물로 제제화될 수 있다.
대상 항체를 포함하는 약학적 조성물은 원하는 정도의 순도를 가진 항체를 선택적인 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 안정화제, 계면활성제, 완충제 및/또는 등장화제와 혼합함으로써 제조된다. 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 안정화제는 이용된 투약량 및 농도에서 수령체에게 무독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 글루타티온, 시스테인, 메티오닌 및 시트르산; 보존제 (예컨대 에탄올, 벤질 알콜, 페놀, m-크레솔, p-클로르-m-크레솔, 메틸 또는 프로필 파라벤, 벤잘코늄 클로라이드, 또는 이것들의 조합); 아미노산, 예컨대 아르기닌, 글리신, 오르니틴, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 아이소류신, 류신, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린 및 이것들의 조합; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 젤라틴 또는 혈청 알부민; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 트레할로스, 수크로스, 락토스, 글루코스, 만노스, 말토스, 갈락토스, 프럭토스, 소르보스, 라피노스, 글루코사민, N-메틸글루코사민, 갈락토사민, 및 뉴라민산; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 Tween, Brij Pluronics, Triton-X, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
약학적 조성물은 액체 형태, 동결건조된 형태 또는 동결건조된 형태로부터 복원된 액체 형태로 되어있을 수 있으며, 동결건조된 조제물은 투여 전에 멸균 용액으로 복원되어야 한다. 동결건조된 조성물을 복원하기 위한 표준 절차는 순수한 물의 부피 (전형적으로 동결건조 중에 제거된 부피와 동등한)를 다시 추가하는 것이지만; 항세균제를 포함하는 용액은 비경구 투여용 약학적 조성물의 생산에 사용될 수 있으며; 또한 Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54를 참조하면 된다.
대상 약학적 조성물 중의 예시의 항체 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/ml 또는 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 또는 약 150 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 범위에 있을 수 있다.
항체의 수성 제제는 pH-완충된 용액에서, 예를 들어, 약 4.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.0 내지 약 6.0, 또는 대안으로 약 5.5의 범위의 pH에서 제조될 수 있다. 이 범위 내의 pH에 적합한 완충제의 예는 포스페이트-, 히스티딘-, 시트레이트-, 숙시네이트-, 아세테이트-완충제 및 다른 유기산 완충제를 포함한다. 완충제 농도는, 예를 들어, 완충제 및 제제의 원하는 장성에 따라 약 1 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 50 mM일 수 있다.
등장화제는 제제의 장성을 조절하기 위해 항체 제제에 포함될 수 있다. 예시의 등장화제는 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 글리세린 및 아미노산, 당의, 뿐만 아니라 이것들의 조합의 군으로부터의 임의의 구성요소를 포함한다. 일부 구체예에서, 수성 제제는 등장성이지만, 고장성 또는 저장성 용액이 적합할 수 있다. 용어 "등장성"은 비교되는 일부 다른 용액, 예컨대 생리학적 염 용액 또는 혈청과 동일한 장성을 가진 용액을 나타낸다. 등장화제는 약 5 mM 내지 약 350 mM의 양, 예를 들어, 100 mM 내지 350 nM의 양으로 사용될 수 있다.
제제화된 항체의 응집을 감소시키고 및/또는 제제에서 입자의 형성을 최소화하고 및/또는 흡착을 감소시키기 위해 계면활성제가 또한 항체 제제에 추가될 수 있다. 예시의 계면활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스터 (Tween), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (Brij), 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르 (Triton-X), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머 (Poloxamer, Pluronic), 및 나트륨 도데실 설페이트 (SDS)를 포함한다. 적합한 폴리옥시에틸렌소르비탄-지방산 에스터의 예는 폴리소르베이트 20 (상표명 Tween 20™으로 판매됨) 및 폴리소르베이트 80 (상표명 Tween 80™으로 판매됨)을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌-폴리프로필렌 코폴리머의 예는 상표명 Pluronic® F68 또는 Poloxamer 188™ 하에 판매되는 것들이다. 적합한 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르의 예는 상표명 Brij™ 하에 판매되는 것들이다. 계면활성제의 예시의 농도는 약 0.001% 내지 약 1% w/v의 범위에 있을 수 있다.
동결건조 과정 동안 불안정화 조건에 대해 불안정한 활성 성분 (예를 들어, 단백질)을 보호하기 위해 동결방지제가 또한 추가될 수 있다. 예를 들어, 공지된 동결방지제는 당 (예컨대 글루코스 및 수크로스 포함); 폴리올 (예컨대 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤); 및 아미노산 (예컨대 알라닌, 글리신 및 글루탐산)을 포함한다. 동결방지제는 약 10 mM 내지 500 nM의 양으로 포함될 수 있다.
일부 구체예에서, 대상 제제는 대상 항체, 및 상기 확인된 작용제 (예를 들어, 계면활성제, 완충제, 안정화제, 등장화제) 중 하나 이상을 포함하고 근본적으로 하나 이상의 보존제, 예컨대 에탄올, 벤질 알콜, 페놀, m-크레솔, p-클로르-m-크레솔, 메틸 또는 프로필 파라벤, 벤잘코늄 클로라이드, 및 이것들의 조합이 없다. 다른 구체예에서, 보존제는, 예를 들어, 약 0.001 내지 약 2% (w/v)의 범위의 농도로 제제에 포함된다.
예를 들어, 대상 제제는 비경구 투여에 적합한 액체 또는 동결건조된 제제일 수 있고, 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 대상 항체; 약 0.001 % 내지 약 1 %의 적어도 하나의 계면활성제; 약 1 mM 내지 약 100 mM의 완충제; 선택적으로 약 10 mM 내지 약 500 mM의 안정화제; 및 약 5 mM 내지 약 305 mM의 등장화제를 포함할 수 있고; 약 4.0 내지 약 7.0의 pH를 갖는다.
또 다른 예로서, 대상 비경구 제제는 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 대상 항체; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 수크로스를 포함하는 액체 또는 동결건조된 제제이고; 5.5의 pH를 갖는다.
또 다른 예로서, 대상 비경구 제제는 1) 15 mg/mL의 대상 항체; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 수크로스를 포함하는 동결건조된 제제를 포함하고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 2) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 수크로스를 포함하는 동결건조된 제제를 포함하고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 3) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 수크로스를 포함하는 동결건조된 제제를 포함하고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 4) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 트레할로스를 포함하는 동결건조된 제제를 포함하고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 6) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 트레할로스를 포함하는 동결건조된 제제를 포함하고; 5.5의 pH를 갖는다.
또 다른 예로서, 대상 비경구 제제는 1) 7.5 mg/mL의 대상 항체; 0.022% Tween 20 w/v; 120 mM L-히스티딘; 및 250 125 mM 수크로스를 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 2) 37.5 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 10 mM L-히스티딘; 및 125 mM 수크로스를 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 3) 37.5 mg/mL의 대상 항체; 0.01% Tween 20 w/v; 10 mM L-히스티딘; 및 125 mM 수크로스를 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 4) 37.5 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 10 mM L-히스티딘; 125 mM 트레할로스를 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 5) 37.5 mg/mL의 대상 항체; 0.01% Tween 20 w/v; 10 mM L-히스티딘; 및 125 mM 트레할로스를 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 6) 5 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 트레할로스를 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 7) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 만니톨을 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 8) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L 히스티딘; 및 140 mM 나트륨 클로라이드를 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 9) 150 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 트레할로스를 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 10) 150 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 만니톨을 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 11) 150 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 140 mM 나트륨 클로라이드를 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖거나; 또는 12) 10 mg/mL의 대상 항체; 0.01% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 40 mM 나트륨 클로라이드를 포함하는 액체 제제이고; 5.5의 pH를 갖는다.
대상 항체는 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 제제에서 이용될 수 있다. 대상 항체는 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같이, 허용 가능한 가압 추진제로 제제화될 수 있다.
게다가, 대상 항체는 에멀젼화 염기 또는 수용성 염기와 같은 다양한 염기와 혼합함으로써 좌제로 제조될 수 있다. 대상 항체는 좌제를 통해 직장으로 투여될 수 있다. 좌제는 코코아 버터, 카보왁스(carbowax) 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비히클(vehicle)을 포함할 수 있으며, 이것들은 체온에서 녹지만, 실온에서는 고체화된다.
시럽, 엘릭서, 및 현탁액과 같은 경구 또는 직장 투여용 단위 투약 형태가 제공될 수 있으며 각각의 투약 단위, 예를 들어, 티스푼(teaspoonful), 테이블스푼(tablespoonful), 타블렛 또는 좌제는 하나 이상의 억제자를 함유하는 조성물의 사전 결정된 양을 함유한다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여용 단위 투약 형태는 멸균수, 생리식염수 또는 또 다른 약학적으로 허용 가능한 담체 중의 용액으로서 조성물 중의 대상 항체를 포함할 수 있다.
용어 "단위 투약 형태"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 인간 및 동물 대상체에 대해 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며, 각각의 단위는 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 공동으로 원하는 효과를 생산하기에 충분한 양으로 계산된 본 발명의 화합물의 사전 결정된 양을 함유한다. 대상 항체에 대한 시방서는 이용되는 특정 항체 및 달성되는 효과, 및 숙주에서 각각의 항체와 관련된 약역학에 따라 다를 수 있다.
투여의 다른 방식은 또한 본 발명과 함께 사용될 것이다. 예를 들어, 대상 항체는 좌제, 및 어떤 경우에는, 에어로졸 및 비강내 조성물에서 제제화될 수 있다. 좌제에 대해, 비히클 조성물은 전통적인 바인더 및 담체, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜, 또는 트리글리세리드를 포함할 것이다. 이러한 좌제는 약 0.5% 내지 약 10% (w/w), 예를 들어, 약 1% 내지 약 2%의 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
비강내 제제는 비강 점막에 대한 자극을 유발하지 않고 모양체 기능을 크게 방해하지 않는 보통 비히클을 포함할 것이다. 희석제, 예컨대 물, 수성 식염수 또는 다른 공지된 물질이 본 발명과 함께 이용될 수 있다. 비강 제제는 또한, 제한되는 것은 아니지만, 클로로부탄올 및 벤잘코늄 클로라이드과 같은 보존제를 함유할 수 있다. 계면활성제는 비강 점막에 의한 대상 단백질의 흡수를 향상시키기 위해 존재할 수 있다.
대상 항체는 주사용 제제로서 투여될 수 있다. 전형적으로, 주사용 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조되고; 주사 전 액체 비히클 중의 용액, 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 조제물은 또한 에멀젼화될 수 있거나 또는 항체는 리포솜 비히클에 캡슐화될 수 있다.
적합한 부형제 비히클은, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 또는 등, 및 이것들의 조합이다. 이에 더하여, 원하는 경우, 비히클은 습윤제 또는 에멀젼화제 또는 pH 완충제와 같은 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다. 이러한 투약 형태의 실제 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 분명할 것이다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985를 참조하면 된다. 투여되는 조성물 또는 제제는, 어떤 경우에도, 치료되는 대상체에서 원하는 상태를 달성하기에 충분한 다량의 대상 항체를 함유할 것이다.
약학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 비히클, 보조제, 담체 또는 희석제는 대중이 쉽게 이용할 수 있다. 더욱이, 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 장성 조정제, 안정화제, 습윤제, 등은 대중이 쉽게 이용할 수 있다.
일부 구체예에서, 대상 항체는 제어된 방출 제제에서 제제화된다. 지효성 방출(Snustained-release) 조제물은 해당 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 지효성 방출 조제물의 적합한 예는 매트릭스가 성형체의 형태, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐로 되어 있는 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 지효성 방출 매트릭스의 예는 폴리에스터, L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해 가능한 에틸렌-비닐 아세테이트, 하이드로겔, 폴리락티드, 분해 가능한 락트산-글리콜산 코폴리머 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 생물학적 활성의 가능한 손실 및 지효성 방출 조제물에 포함된 항체의 면역원성의 가능한 변화는 적절한 첨가제를 사용함으로써, 수분 함유량을 제어함으로써 및 특이적 폴리머 매트릭스 조성물을 개발함으로써 방지될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 제어된 방출은 많은 연장된 방출 투약 형태 중 어느 하나를 의미하도록 취해질 수 있다. 다음 용어는 본 발명의 목적을 위해 제어된 방출과 실질적으로 동등한 것으로 간주될 수 있다: 연속 방출, 제어된 방출, 지연된 방출, 디포(depot), 점진적 방출, 장기간 방출, 프로그램된(programmed) 방출, 연장된 방출, 비례 방출, 연장된 방출, 저장소, 삽체(retard), 느린 방출, 간격을 둔 방출, 지효성 방출, 타임 코트(time coat), 정기 방출, 지연된 작용, 연장된 작용, 레이어드(layered)-시간 작용, 장시간 작용, 연장된 작용, 반복 작용, 느린 작용, 지효성 작용, 지효성 작용 약물, 및 연장된 방출. 이들 용어의 추가의 논의는 Lesczek Krowczynski, Extended-Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.)에서 발견될 수 있다.
투약량
적합한 투약량은 다양한 임상적 요인을 기반으로 주치의 또는 다른 자격이 있는 의료진에 의해 결정될 수 있다. 의학 분야에 널리 공지된 바와 같이, 임의의 하나의 환자에 대한 투약량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 환자의 성별, 시기, 및 투여 경로, 일반적인 건강 상태, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함한 많은 요인들에 따라 달라진다. 대상 항체는 용량 당 1 ng/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 예를 들어, 0.1 mg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중, 예를 들어, 0.5 mg/kg 체중 내지 5 mg/kg 체중의 양으로 투여될 수 있지만; 특히 상기 언급된 요인들을 고려하여 이 예시의 범위보다 낮거나 높은 용량이 구상된다. 양생법이 지속적인 주입인 경우, 그것은 또한 분 당 체중 킬로그램 당 1 μg 내지 10 mg의 범위에 있을 수 있다.
당업자는 특이적 항체의 기능, 증상의 심각도 및 부작용에 대한 대상체의 민감성에 따라 용량 수준이 달라질 수 있다는 것을 쉽게 인정할 것이다. 주어진 화합물에 대한 바람직한 투약량은 다양한 수단에 의해 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
투여 경로
대상 항체는, 생체 내 및 생체 외(ex vivo) 방법, 뿐만 아니라 전신 및 국소화된 투여 경로를 포함하는, 약물 전달에 적합한 임의의 이용 가능한 방법 및 경로를 사용하여 개체에게 투여된다.
통상적인 및 약학적으로 허용 가능한 투여 경로는 비강내, 근육내, 기관내, 피하, 피내, 국소 도포, 정맥내, 동맥내, 직장, 비강, 경구, 및 다른 장관 및 비경구 투여 경로를 포함한다. 투여 경로는 원하는 경우 조합될 수 있거나, 또는 항체 및/또는 원하는 효과에 따라 조정될 수 있다. 대상 항체 조성물은 단일 용량 또는 다회수 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상 항체 조성물은 경구로 투여된다. 일부 구체예에서, 대상 항체 조성물은 흡입 경로를 통해 투여된다. 일부 구체예에서, 대상 항체 조성물은 비강내로 투여된다. 일부 구체예에서, 대상 항체 조성물는 국소적으로 투여된다. 일부 구체예에서, 대상 항체 조성물은 두개내로 투여된다. 일부 구체예에서, 대상 항체 조성물은 정맥내로 투여된다.
작용제는 전신 또는 국소 경로를 포함하는, 통상적인 약물 전달에 적합한 임의의 이용 가능한 통상적인 방법 및 경로를 사용하여 숙주에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에서 고려되는 투여 경로는 장관, 비경구, 또는 흡입 경로를 포함하지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
흡입 투여 이외의 비경구 투여 경로는 국소, 경피, 피하, 근육내, 안와내, 낭내, 척수내, 흉골내, 및 정맥내 경로, 즉, 소화관(alimentary canal)을 통한 것 이외의 임의의 투여 경로를 포함하지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여는 대상 항체의 전신 또는 국소 전달에 영향을 미치도록 수행될 수 있다. 전신 전달을 원하는 경우, 투여는 전형적으로 약학적 조제물의 침습성 또는 전신으로 흡수되는 국소 또는 점막 투여를 수반한다.
대상 항체는 또한 장관 투여에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 장관 투여 경로는 경구 및 직장 (예를 들어, 좌제를 사용한) 전달을 포함하지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
치료는 적어도 숙주에게 피해를 주는 병리학적 병태와 관련된 증상의 개선을 의미하며, 개선은 적어도 치료되는 병리학적 병태, 예컨대 암 및/또는 암의 성장 및 이와 관련된 통증과 관련된 변수, 예를 들어, 증상의 규모의 감소를 나타내기 위해 광범위한 의미로 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 숙주가 병리학적 병태, 또는 병리학적 병태를 특징으로 하는 적어도 하나의 증상으로 더 이상 고통받지 않도록 병리학적 병태, 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전히 억제된, 예를 들어, 발생하는 것이 방지되거나, 또는 중단된, 예를 들어, 종결되는 상황을 포함한다.
다양한 숙주 (용어 "숙주"는 본원에서 용어 "대상체", "개체", 및 "환자"와 교체 가능하게 사용됨)는 대상 방법에 따라 치료 가능하다. 일반적으로, 이러한 숙주는 "포유동물" 또는 "포유류"이며, 이들 용어는 육식동물 목 (예를 들어, 개 및 고양이), 설치목 (예를 들어, 마우스, 기니피그, 및 래트), 및 영장목 (예를 들어, 인간, 침팬지, 및 원숭이)을 포함한 포유강 내에 있는 유기체를 기재하기 위해 광범위하게 사용된다. 일부 구체예에서, 숙주는 인간일 것이다.
예를 들어, 경구 또는 주사 가능 용량 내에 대상 항체의 단위 용량이 들어있는 키트가 제공된다. 일부 구체예에서, 단위 용량을 함유하는 용기에 더하여 관심있는 병리학적 병태를 치료하는데 있어서 항체의 사용 및 수반되는 이점을 기재한 정보 패키지 삽입물일 것이다.
핵산
본 발명은 대상 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 대상 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 의도된 표적 세포 (예를 들어, 암호화된 항체를 합성 및/또는 분비하도록 유전적으로 변형된 세포)에서 뉴클레오타이드 서열의 발현을 허용하는 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 인핸서에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
적합한 프로모터 및 인핸서 요소는 해당 분야에 공지되어 있다. 박테리아 세포에서의 발현에 대해, 적합한 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 진핵 세포에서의 발현에 대해, 적합한 프로모터는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소; 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 극초기 프로모터; 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus) 티미딘 키나제 프로모터; 초기 및 말기 SV40 프로모터; 레트로바이러스(retrovirus)의 긴 말단 반복부에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터; 및 해당 분야에 공지된 다양한 조직 특이적 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
대상 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 발현 벡터 및/또는 클로닝 벡터에 존재할 수 있다. 대상 항체가 2개 이상의 별개의 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 2개의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 동일한 또는 별개의 벡터에서 클로닝될 수 있다. 별개의 폴리펩타이드는 다양한 계획, 예컨대 별개의 프로모터, 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 하나 이상의 자가 분열 서열 (예를 들어, 2A 분열 서열, 예를 들어, P2A, T2A, E2A, 및 F2A), 이것들의 조합, 등을 사용하여 단일 핵산 또는 단일 벡터로부터 발현될 수 있다. 발현 벡터는 선택 가능 마커, 복제 기원, 및 벡터의 복제 및/또는 유지를 제공하는 다른 특징을 포함할 수 있다.
다수의 적합한 벡터 및 프로모터는 당업자에게 공지되어 있고; 다수는 대상 재조합 작제물을 생성하기 위해 상업적으로 이용 가능하다. 다음 벡터가 예로서 제공된다. 박테리아: pBs, 파지스크립트(phagescript), PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). 진핵 생물: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Strata유전자) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (Pharmacia).
발현 벡터는 일반적으로 이종성 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열 근처에 위치한 편리한 제한 부위를 갖는다. 발현 숙주에서 작동되는 선택 가능 마커가 존재할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 바이러스 벡터 (예를 들어, 우두 바이러스(vaccinia virus); 폴리오바이러스(poliovirus); 아데노바이러스(adenovirus) (예를 들어, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조); 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus) (예를 들어, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617 참조); SV40; 단순 헤르페스 바이러스; 인간 면역 결핍 바이러스 (예를 들어, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999 참조); 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 쥐 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus), 하비 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus), 인간 면역 결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus)를 기반으로 하는 바이러스 벡터), 및 유방 종양 바이러스(mammary tumor virus)와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터); 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 언급된 바와 같이, 대상 핵산은 대상 다중특이적 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 대상 핵산은 MDR1 CDR 및 CD47 CDR을 포함하느 중쇄 및 경쇄 CDR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 대상 핵산은 중쇄 및/또는 경쇄 MDR1 CDR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, CDR-암호화 서열은 FR-암호화 뉴클레오타이드 서열과 함께 산재된다. 일부 구체예에서, 대상 핵산은 중쇄 및/또는 경쇄 CD47 CDR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, CDR-암호화 서열은 FR-암호화 뉴클레오타이드 서열과 함께 산재된다. 일부 구체예에서, FR-암호화 뉴클레오타이드 서열은 인간 FR-암호화 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 구체예에서, 대상 핵산은 다음 아미노산 서열에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다: EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
일부 구체예에서, 대상 핵산은 다음 아미노산 서열에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS.
일부 구체예에서, 대상 핵산은 다음 아미노산 서열에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다: DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK.
핵산은, 예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같이, 어떤 경우에는, 예를 들어, 세포를 핵산과 접촉시킴으로써 세포로 도입될 수 있다. 도입된 핵산을 가진 세포는 일반적으로 본원에서 유전적으로 변형된 세포라고 불릴 것이다. 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 네이키드(naked) 핵산 전달, 바이러스 전달, 화학적 트랜스펙션, 유전자총법(biolistics), 등을 포함하는 다양한 핵산 전달 방법이 이용될 수 있다.
세포
본 발명은 대상 핵산으로 유전적으로 변형된, 단리된 유전적으로 변형된 세포 (예를 들어, 시험관내 세포, 생체 외 세포, 배양된 세포, 등)를 제공한다. 일부 구체예에서, 대상 단리된 유전적으로 변형된 세포는 대상 항체를 생산할 수 있다. 어떤 경우에, 유전적으로 변형된 세포는, 예를 들어, 필요로 하는 대상체에게 항체를 전달할 수 있다. 어떤 경우에, 유전적으로 변형된 세포는 다중특이적 항체의 생산, 스크리닝, 및/또는 발견에 사용될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 또한, 어떤 경우에는, 내인성 유전자 발현이 감소, 예를 들어, 억제, 넉다운(knock-down), 또는 폐지, 예를 들어, 넉아웃(knock-out)된 세포를 세포를 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 또한, 어떤 경우에, 유전자 발현이 향상된, 예를 들어, 내인성 유전자의 발현이 증가되거나 또는 이종성 유전자의 발현이 증가된 세포를 포함할 수 있다.
적합한 세포는 진핵 세포, 예컨대 포유류 세포, 곤충 세포, 효모 세포; 및 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포를 포함한다. 숙주 세포로의 대상 핵산의 도입은, 예를 들어, 칼슘 포스페이트 침전, DEAE 덱스트란 매개된 트랜스펙션, 리포솜-매개된 트랜스펙션, 전기천공법, 또는 다른 공지된 방법에 의해 영향을 받을 수 있다.
적합한 포유류 세포는 1차 세포 및 불멸화된 세포주를 포함한다. 적합한 포유류 세포주는 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트) 세포주, 등을 포함한다. 적합한 포유류 세포주는, 제한되는 것은 아니지만, HeLa 세포 (예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) 번호 CCL-2), CHO 세포 (예를 들어, ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (예를 들어, ATCC 번호 CRL-1573), Vero 세포, NIH 3T3 세포 (예를 들어, ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포 (예를 들어, ATCC 번호 CCL10), PC12 세포 (ATCC 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포 (ATCC 번호 CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포 (ATCC 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (ATCC 번호 CRL1573), HLHepG2 세포, 등을 포함한다.
어떤 경우에, 유용한 포유류 세포는 포유류 조직 또는 기관으로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 이용된 세포는 신장 세포이며, 예를 들어, 확립된 신장 세포주의 신장 세포, 예컨대 HEK 293T 세포를 포함한다.
적합한 효모 세포 또는 균류 또는 조류 세포는, 제한되는 것은 아니지만, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코클라매(Pichia koclamae), 피치아 멤브라내파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 오푼티애(Pichia opuntiae), 피치아 써모톨러란스(Pichia thermotolerans), 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피치아 구에르쿰(Pichia guercuum), 피치아 피즈페리(Pichia pijperi), 피치아 스티프티스(Pichia stiptis), 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피치아 종(Pichia sp.), 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 종(Saccharomyces sp.), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces sp.), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스페르질루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르질루스 오리재(Aspergillus oryzae), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리움 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종(Fusarium sp.), 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii), 등을 포함한다.
적합한 원핵 세포는, 제한되는 것은 아니지만, 대장균(Escherichia coli), 락토바실루스 종(Lactobacillus sp.), 살모넬라 종(Salmonella sp.), 시겔라 종(Shigella sp.), 등의 다양한 실험실 균주를 포함한다. 예를 들어, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181; 미국 특허 번호 6,447,784; 및 Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302를 참조하면 된다. 본 발명에서 이용될 수 있는 살모넬라 균주의 예는 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 및 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 시겔라 균주는 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 소네이(Shigella sonnei), 및 시겔라 디센테리애(Shigella disenteriae)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 전형적으로, 실험실 균주는 비-병원성인 것이다. 다른 적합한 박테리아의 비-제한적 예는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 푸디타(Pseudomonas pudita), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 메발로니(Pseudomonas mevalonii), 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 로도코쿠스 종(Rhodococcus sp.), 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 대장균이다.
어떤 경우에, 본 발명의 세포는 면역 세포일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 일반적으로 골수에서 생산되는 조혈 줄기 세포 (HSC)로부터 유래된 백혈구 세포 (백혈구)를 포함한다. "면역 세포"는, 예를 들어, 림프구 (T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포) 및 골수-유래된 세포 (호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상세포)를 포함한다. "T 세포"는 T-헬퍼 세포 (CD4+ 세포), 세포독성 T-세포 (CD8+ 세포), T-조절 세포 (Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함한, CD3을 발현하는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다. "세포독성 세포"는 CD8+ T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 및 호중구를 포함하며, 이 세포는 세포독성 반응을 매개할 수 있다.
어떤 경우에, 본 발명의 다중특이적 항체를 발현하는 유용한 세포는 생산자 T 세포를 포함할 수 있다. 생산자 T 세포의 비제한적 예는 Tsai & Davila Oncoimmunology. (2016) 5(5): e1122158 (그 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다. 본 발명의 다중특이적 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하도록 조작된 생산자 T 세포는, 어떤 경우에는, 필요로 하는 대상체에게 항체를 전달하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 세포는 또한 세포에서 MDR1 및 CD47 중 하나 이상의 발현을 변화시키고 및/또는 수정하도록 유전적으로 변형된 세포를 포함한다. 이러한 변형된 세포는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 설명 및 방법에 따라 생산된 것들을 포함하는 다중특이적 항체의 결합의 분석을 포함한 다양한 목적에 유용하다. 어떤 경우에, MDR1은 대상 세포주에서 넉아웃되거나 넉다운될 수 있다. 어떤 경우에, CD47은 대상 세포주에서 넉아웃되거나 넉다운될 수 있다. 어떤 경우에, MDR1은 대상 세포주에서 구성적으로 또는 유도성으로 과발현될 수 있다. 어떤 경우에, CD47은 대상 세포주에서 구성적으로 또는 유도성으로 과발현될 수 있다. 어떤 경우에, MDR1 및 CD47 둘 다는 대상 세포주에서 넉다운되거나, 넉아웃되거나, 또는 구성적으로 또는 유도성으로 과발현될 수 있다. 넉다운, 넉아웃 및/또는 과발현에 대해 임의의 편리하고 적절한 방법이 이용될 수 있다. 도입된 핵산은 안정하게 통합되거나 또는 일과성으로 존재할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포는 CD47을 발현하고 MDR1의 과발현을 위해 MDR1을 암호화하는 서열을 포함하는 외인성 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 인간 세포주를 포함한다. 이러한 세포에서 CD47 발현은 내인성으로 또는 외인성으로 유래 (즉, 도입)될 수 있고 MDR1 발현은 안정하거나 일과성일 수 있다. 어떤 경우에, CD47을 발현하는 본 발명의 세포주는 CD47을 발현하고 MDR1을 안정하게 과발현하는 유전적으로 변형된 인간 세포를 생산하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 세포 및 세포주는, 예를 들어, 본원에서 기재된 배양 방법의 사용을 통해 배양될 수 있다. 어떤 경우에, 핵산이 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 도입된 세포가 배양되어 세포주를 생산할 수 있다. 유용한 세포주는, 예를 들어, 인간 세포주를 포함한, CD47을 발현하고 MDR1을 안정하게 과발현하는 유전적으로 변형된 세포주를 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포, 및 그것의 세포주는 본 발명의 다양한 방법에서, 예를 들어, 테스트 샘플, 대조군, 등으로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에 MDR1 및/또는 CD47이 넉아웃 및/또는 넉다운된 세포는, 예를 들어, 본 발명의 다중특이적 항체의 결합이 비교될 수 있는 참조 세포로서 이용될 수 있다. 다른 유용한 참조 세포는, 예를 들어, 비-암성 세포, 뿐만 아니라 정상 세포 및 정상 수준의 다양한 단백질, 예컨대 정상 수준의 MDR1 및/또는 CD47을 발현하는 세포를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
방법
상기 요약된 바와 같이, 본 발명의 방법은 세포를 본 발명의 항체와 접촉시키는 방법, 본 발명의 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 수반하는 방법에 따라 대상체를 치료하는 방법, 본 출원에서 기재된 요소들, 예를 들어, 다중특이적 항체, 조성물 및 제제, 핵산, 발현 벡터, 세포, 등을 제조하는 방법을 포함한다.
상기 요약된 바와 같이, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 암 세포의 살해를 촉진하고 및/또는 향상시키기 위해 암 세포를 본 발명의 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 어떤 경우에, 암 세포의 살해는 2개의 표적이 암 세포 상에서 동시-발현될 때 이중특이적 표적화에 의한 암 세포의 옵소닌화의 결과로서 암 세포에 작용하는 면역 반응 또는 면역 세포에 의해 매개된다. 어떤 경우에, 암 세포의 살해는, 예를 들어, 다중특이적 항체에 의한 암 세포의 표면 상에 존재하는 CD47 에피토프의 마스킹 또는 길항 작용의 결과로서 암 세포에 작용하는 면역 반응 또는 면역 세포에 의해 매개된다. 어떤 경우에, 암 세포의 살해는, 예를 들어, 다중특이적 항체에 의한 암 세포 상의 MDR1 길항 작용의 결과로서 암 세포의 세포 유출의 억제에 의해 매개된다. 어떤 경우에, 다중특이적 항체와 접촉된 세포는 다중약물 저항성 암 세포일 수 있다. 암 세포를 본 발명의 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계를 수반하는 방법은 암 세포를, 예를 들어, 화학치료제, 면역요법, 방사선 요법, 등을 포함하는 추가적인 요법 또는 활성 작용제와 접촉시키는 단계를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.
암 세포를 본 발명의 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계는 일반적으로, 예를 들어, 다중특이적 항체의 부재시 암 세포의 살해의 수준과 비교하여 암 세포의 살해를 향상시킬 것이다. 어떤 경우에, 추가적인 활성제가 이용되는 경우, 추가적인 활성제를 단독으로 사용하여 관찰되는 살해의 수준과 비교하여 향상된 암 세포의 살해를 볼 수 있다. 다중특이적 항체에 기인하는 암 세포 살해의 향상의 양은 다를 것이고 암 세포 살해의 5% 증가에서 적어도 90% 이상, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 등까지의 범위에 있을 수 있다. 이러한 증가는 하나 이상의 추가적인 활성제와 단독으로 접촉하는 것과 비교될 수 있다.
암 세포의 향상된 살해는, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 관찰 연구, 시험관내 세포-기반 세포독성 분석, 유동세포분석법, 세포 생존력 라벨링 (예를 들어, 하나 이상의 세포 생존력 염색을 사용하여), 등을 포함한 다양한 수단에 의해 평가될 수 있다.
치료 방법
본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 일반적으로 대상 다중특이적 항체의 유효량을 필요로 하는 개체 (예를 들어, 암에 걸린 개체)에게 단독으로 (예를 들어, 단일 요법으로) 또는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합으로 (예를 들어, 조합 요법으로) 투여하는 단계를 수반한다. 본 발명의 다중특이적 항체의 투여는 임의의 편리하고 적절한 전달 경로에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 양태는 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위해 시방서의 이전 섹션에 따르는 이중특이적 항체 분자를 포함하며, 방법은 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 방법은 항체를 적어도 하나의 추가적인 활성제와 조합으로 투여하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학치료제, 다중약물 저항성 수송체의 억제자, 면역요법제, 또는 이것들의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학치료제이며, 선택적으로 화학치료제는 탁솔, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 또는 안트라사이클린이다. MDR1 펌프에 대한 기질인 일부 화학치료제는 파클리탁셀, 콜키신, 베라파밀, 빈블라스틴, 토포테칸, 독소루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 닐로티닙을 포함한다.
대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 화학요법제가 또한 본원에서 또한 개시되는데, 방법은 대상체에게 화학요법제를 본원에서 개지된 항체화 조합으로 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로 화학요법제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린이다.
따라서, 투여는, 예를 들어, 주사에 의한 항체 전달, 주입에 의한 항체 전달, 다중특이적 항체를 암호화하는 핵산 또는 발현 벡터의 전달, 대상체에게로의 다중특이적 항체를 발현하고 분비하는 세포의 투여에 의한 항체의 전달, 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 작용제, 작용제를 암호화하는 핵산, 작용제를 발현하는 세포, 등의 투여는 작용제와의 접촉, 핵산과의 접촉, 세포와의 접촉, 등을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 대상 다중특이적 항체의 유효량은, 단독으로 (예를 들어, 단일 요법으로) 또는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합으로 (예를 들어, 조합 요법으로) 투여될 때, 1회 이상의 용량에서, 항체로의 치료가 없을 때의 부정적인 증상의 심각도와 비교하여 암의 부정적인 증상을 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 그 이상만큼 감소시키기에 효과적인 양이다.
일부 구체예에서, 대상 다중특이적 항체의 유효량은, 단독으로 (예를 들어, 단일 요법으로) 또는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합으로 (예를 들어, 조합 요법으로) 투여될 때, 1회 이상의 용량에서, 치료되는 개체에서 암을 개선하기에 (즉, 암의 성장을 둔화시키고, 암의 성장을 중단시키고, 암의 성장을 반전시키고, 암 세포 (예컨대 종양 세포, 등)을 살해하기에) 효과적인 양이다. 예를 들어, 대상 항체의 유효량은 개체에서 다중특이적 항체로의 치료가 없을 때와 비교하여 암 성장 속도를 감소시키거나 암 크기를 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 또는 그 이상만큼 감소시킬 수 있다.
어떤 경우에, 대상체는, 하나 이상의 추가적인 시약의 유무에 관계없이, 예컨대 대상 다중특이적 항체로 전신으로 치료될 수 있다. "전신 치료"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 특이적 종양 (예를 들어, 1차 종양 또는 한정된 2차 종양) 또는 특이적 암 함유 조직 (예를 들어, 간암의 경우에는 간, 혈액암의 경우에는 혈액, 등)을 표적화하는 것만을 대상으로 하지 않는 치료를 의미한다. 전신 치료는 일반적으로 대상체의 신체 전체에 대한 것이고, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 전신 방사선 요법, 전신 화학요법, 전신 면역요법, 이것들의 조합, 등을 포함할 수 있다.
어떤 경우에, 대상체는, 하나 이상의 추가적인 시약의 유무에 관계없이 예컨대 대상 다중특이적 항체로 국소적으로 치료될 수 있다. "국소적 치료"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 종양 (예를 들어, 1차 종양 또는 한정된 2차 종양)의 위치와 특이적으로 관련이 있거나 또는 암 함유 조직 (예를 들어, 간암의 경우에는 간, 혈액암의 경우에는 혈액, 등)과 특이적으로 관련이 있는 치료를 의미한다. 어떤 경우에, 국소 치료는 또한 종양 주위의 환경, 예컨대 종양을 둘러싼 조직, 예컨대 종양에 바로 인접한 조직에 영향을 미치기 위한 방식으로 투여될 수 있다. 국소 치료는 일반적으로 종양, 예컨대 1차 종양의 부위를 포함한 암의 부위로부터 떨어진 조직에 영향을 미치지 않거나 그것으로 표적화되지 않을 것이다. 대상 다중특이적 항체에 더하여 또는 이것과 조합하여 투여될 수 있는 유용한 국소 치료는, 예를 들어, 수술, 국소 방사선 요법, 국소 냉동요법, 국소 레이저 요법, 국소 국부 요법, 이것들의 조합, 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 대상 치료 방법은 대상 다중특이적 항체 및 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여하는 단계를 수반한다. 적합한 추가적인 치료제는, 제한되는 것은 아니지만, 화학치료제, 방사선 요법 시약, 면역요법 시약, 다른 항체 또는 다중특이적 항체 작용제, 등을 포함한다. 본 발명의 다중특이적 항체를 투여하는 대상 단계 전에, 동안에 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있는 추가적인 요법은, 예를 들어, 암의 유형, 대상체의 병력, 일반적인 건강 상태 및/또는 임의의 동반 질병, 등을 포함한 많은 요인들에 따라 달라질 것이다. 유용한 암 요법은, 예를 들어, 방사선 요법, 화학요법, 면역요법, 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
방사선 요법은 빔(beam)과 같이 외부에서 적용되는 공급원으로부터, 또는 작은 방사성 공급원의 이식에 의해 전달되는 x선 또는 감마선을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
암 치료에서 사용하기에 적합한 항체는 네이키드 항체, 예를 들어, 트라스투주맙 (Herceptin), 베바시주맙 (Avastin™), 세툭시맙 (Erbitux™), 파니투무맙 (Vectibix™), 이필리무맙 (Yervoy™), 리툭시맙 (Rituxan), 알렘투주맙 (Lemtrada™), 오파투무맙 (Arzerra™), 오레고보맙 (OvaRex™), 람브롤리주맙 (MK-3475), 페르투주맙 (Perjeta™), 라니비주맙 (Lucentis™), 등, 및 컨쥬게이션된 항체, 예를 들어, 젬투주맙 오조가미신 (Mylortarg™), 브렌툭시맙 베도틴 (Adcetris™), 90Y-라벨링된 이브리투모맙 티욱세탄 (Zevalin™), 131I-라벨링된 토시투모마 (Bexxar™), 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 암 치료에 사용하기에 적합한 항체는 또한 종양-관련 항원에 대해 발생한 항체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 항원은 CD20, CD30, CD33, CD52, EpCAM, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, CAIX, PSMA, 폴레이트-결합 단백질, 갱글리오시드 (예를 들어, GD2, GD3, GM2, 등), Le y, VEGF, VEGFR, 인테그린 알파-V-베타-3, 인테그린 알파-5-베타-1, EGFR, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 테나신, 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
통상적인 암 요법은 또한, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 아도-트라스투주맙 엠탄신 (Kadcyla) 표적화 HER2 (ERBB2/neu) (유방암에서의 사용에 대해 승인됨); 아파티닙 (Gilotrif) 표적화 EGFR (HER1/ERBB1), HER2 (ERBB2/neu) (비-소세포 폐암에서의 사용에 대해 승인됨 ); 알데스류킨 (Proleukin) 표적화 (신장 세포 암종, 흑색종에서의 사용에 대해 승인됨); 알렉티닙 (Alecensa) 표적화 ALK (비-소세포 폐암); 알렘투주맙 (Campath) 표적화 CD52 (B-세포 만성 림프구성 백혈병에서의 사용에 대해 승인됨 ); 아테졸리주맙 (Tecentriq) 표적화 PD-L1 (요로 상피 암종, 비-소세포 폐암에서의 사용에 대해 승인됨); 아벨루맙 (Bavencio) 표적화 PD-L1 (Merkel 세포 암종); 악시티닙 (Inlyta) 표적화 키트, PDGFRβ, VEGFR1/2/3 ( 신장 세포 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 벨리무맙 (Benlysta) 표적화 BAFF (홍반성 낭창(Lupus erythematosus)에서의 사용에 대해 승인됨); 벨리노스타트 (Beleodaq) 표적화 HDAC (말초 T-세포 림프종(lymphoma)에서의 사용에 대해 승인됨); 베바시주맙 (Avastin) 표적화 VEGF 리간드 (자궁경부암, 결장직장암, 나팔관암(Fallopian tube cancer), 교아종(Glioblastoma), 비-소세포 폐암, 난소암, 복막암, 신장 세포 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 블리나투모맙 (Blincyto) 표적화 CD19/CD3 (급성 림프아구성 백혈병 (전구체 B-세포)에서의 사용에 대해 승인됨); 보르테조밉 (Velcade) 표적화 프로테아솜 (다발성 골수종(Multiple myeloma), 맨틀 세포(Mantle cell) 림프종에서의 사용에 대해 승인됨); 보수티닙 (Bosulif) 표적화 ABL (만성 골수형성성 백혈병에서의 사용에 대해 승인됨); 브렌툭시맙 베도틴 (Adcetris) 표적화 CD30 (호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 역형성 대세포 림프종에서의 사용에 대해 승인됨); 브리가티닙 (Alunbrig) 표적화 ALK (비-소세포 폐암 (ALK+)에서의 사용에 대해 승인됨); 카보잔티닙 (Cabometyx, Cometriq) 표적화 FLT3, 키트, MET, RET, VEGFR2 (갑상선 수질암, 신장 세포 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 카르필조밉 (Kyprolis) 표적화 프로테아솜 (다발성 골수종에서의 사용에 대해 승인됨); 세리티닙 (Zykadia) 표적화 ALK (비-소세포 폐암에서의 사용에 대해 승인됨); 세툭시맙 (Erbitux) 표적화 EGFR (HER1/ERBB1) (결장직장암, 두경부의 편평세포암에서의 사용에 대해 승인됨); 코비메티닙 (Cotellic) 표적화 MEK (흑색종에서의 사용에 대해 승인됨); 크리조티닙 (Xalkori) 표적화 ALK, MET, ROS1 (비-소세포 폐암에서의 사용에 대해 승인됨); 다브라페닙 (Tafinlar) 표적화 BRAF (흑색종, 비-소세포 폐암에서의 사용에 대해 승인됨); 다라투무맙 (Darzalex) 표적화 CD38 (다발성 골수종에서의 사용에 대해 승인됨); 다사티닙 (Sprycel) 표적화 ABL (만성 골수형성성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병에서의 사용에 대해 승인됨); 데노수맙 (Xgeva) 표적화 RANKL (뼈의 거대 세포 종양에서의 사용에 대해 승인됨); 디누툭시맙 (Unituxin) 표적화 B4GALNT1 (GD2) (소아 신경아세포종(Pediatric Neuroblastoma)에서의 사용에 대해 승인됨); 두르발루맙 (Imfinzi) 표적화 PD-L1 (요로 상피 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 엘로투주맙 (Empliciti) 표적화 SLAMF7 (CS1/CD319/CRACC) (다발성 골수종에서의 사용에 대해 승인됨); 에나시데닙 (Idhifa) 표적화 IDH2 (급성 골수성 백혈병에서의 사용에 대해 승인됨); 에를로티닙 (Tarceva) 표적화 EGFR (HER1/ERBB1) (비-소세포 폐암, 췌장암에서의 사용에 대해 승인됨); 에베롤리무스 (Afinitor) 표적화 mTOR (췌장, 위장, 또는 폐 기원 신경내분비 종양, 신장 세포 암종, 비절제 뇌실막하 거대 세포 성상세포종, 유방암에서의 사용에 대해 승인됨); 제피티닙 (Iressa) 표적화 EGFR (HER1/ERBB1) (비-소세포 폐암에서의 사용에 대해 승인됨); 이브리투모맙 티욱세탄 (Zevalin) 표적화 CD20 (비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)에서의 사용에 대해 승인됨); 이브루티닙 (Imbruvica) 표적화 BTK (맨틀 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia)에서의 사용에 대해 승인됨); 이델라리십 (Zydelig) 표적화 PI3Kδ (만성 림프구성 백혈병, 여포성 B-세포 비-호지킨 림프종, 소림프구성 림프종에서의 사용에 대해 승인됨); 이마티닙 (Gleevec) 표적화 키트, PDGFR, ABL (GI 간질 종양 (키트+), 융기성 피부섬유육종(Dermatofibrosarcoma protuberans), 다발성 혈액 악성 종양에서의 사용에 대해 승인됨); 이필리무맙 (Yervoy) 표적화 CTLA-4 (흑색종에서의 사용에 대해 승인됨); 익사조밉 (Ninlaro) 표적화 프로테아솜 (다발성 골수종에서의 사용에 대해 승인됨); 리파티닙 (Tykerb) 표적화 HER2 (ERBB2/neu), EGFR (HER1/ERBB1) (유방암 (HER2+)에서의 사용에 대해 승인됨); 렌바티닙 (Lenvima) 표적화 VEGFR2 (신장 세포 암종, 갑상선암에서의 사용에 대해 승인됨); 미도스타우린 (Rydapt) 표적화 FLT3 (급성 골수성 백혈병 (FLT3+)에서의 사용에 대해 승인됨); 네시투무맙 (Portrazza) 표적화 EGFR (HER1/ERBB1) (편평세포 비-소세포 폐암에서의 사용에 대해 승인됨); 네라티닙 (Nerlynx) 표적화 HER2 (ERBB2/neu) (유방암에서의 사용에 대해 승인됨); 닐로티닙 (Tasigna) 표적화 ABL (만성 골수형성성 백혈병에서의 사용에 대해 승인됨); 니라파립 (Zejula) 표적화 PARP (난소암, 나팔관암, 복막암에서의 사용에 대해 승인됨); 니볼루맙 (Opdivo) 표적화 PD-1 (결장직장암, 두경부 편평세포 암종, 호지킨 림프종, 흑색종, 비-소세포 폐암, 신장 세포 암종, 요로 상피 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 오비누투주맙 (Gazyva) 표적화 CD20 (만성 림프구성 백혈병, 여포성 림프종에서의 사용에 대해 승인됨); 오파투무맙 (Arzerra, HuMax-CD20) 표적화 CD20 (만성 림프구성 백혈병에서의 사용에 대해 승인됨); 올라파립 (Lynparza) 표적화 PARP (난소암에서의 사용에 대해 승인됨); 올라라투맙 (Lartruvo) 표적화 PDGFRα (연조직 육종에서의 사용에 대해 승인됨); 오시메르티닙 (Tagrisso) 표적화 EGFR (비-소세포 폐암에서의 사용에 대해 승인됨); 팔보시클립 (Ibrance) 표적화 CDK4, CDK6 (유방암에서의 사용에 대해 승인됨); 파니투무맙 (Vectibix) 표적화 EGFR (HER1/ERBB1) (결장직장암에서의 사용에 대해 승인됨); 파노비노스타트 (Farydak) 표적화 HDAC (다발성 골수종에서의 사용에 대해 승인됨); 파조파닙 (Votrient) 표적화 VEGFR, PDGFR, 키트 (신장 세포 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 펨브롤리주맙 (Keytruda) 표적화 PD-1 (고전적 호지킨 림프종, 흑색종, 비-소세포 폐암 (PD-L1+), 두경부 편평세포 암종, 고체 종양 (MSI-H)에서의 사용에 대해 승인됨); 페르투주맙 (Perjeta) 표적화 HER2 (ERBB2/neu) (유방암 (HER2+)에서의 사용에 대해 승인됨); 포나티닙 (Iclusig) 표적화 ABL, FGFR1-3, FLT3, VEGFR2 (만성 골수형성성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병에서의 사용에 대해 승인됨); 라무시루맙 (Cyramza) 표적화 VEGFR2 (결장직장암, 위암 또는 위식도 접합부 (GEJ) 선암종, 비-소세포 폐암에서의 사용에 대해 승인됨); 레고라페닙 (Stivarga) 표적화 키트, PDGFRβ, RAF, RET, VEGFR1/2/3 (결장직장암, 위장관 간질성 종양, 간세포 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 리보시클립 (Kisqali) 표적화 CDK4, CDK6 (유방암 (HR+, HER2-)에서의 사용에 대해 승인됨); 리툭시맙 (Rituxan, Mabthera) 표적화 CD20 (비-호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 류머티스성 관절염(Rheumatoid arthritis), 다발혈관염(polyangiitis)를 동반한 육아종증(Granulomatosis)에서의 사용에 대해 승인됨); 리툭시맙/히알루로니다제 인간 (Rituxan Hycela) 표적화 CD20 (만성 림프구성 백혈병, 확산성 큰 B-세포 림프종, 여포성 림프종에서의 사용에 대해 승인됨); 로미뎁신 (Istodax) 표적화 HDAC (피부 T-세포 림프종, 말초 T-세포 림프종에서의 사용에 대해 승인됨); 루카파립 (Rubraca) 표적화 PARP (난소암에서의 사용에 대해 승인됨); 룩소리티닙 (Jakafi) 표적화 JAK1/2 (골수섬유증(Myelofibrosis)에서의 사용에 대해 승인됨); 실툭시맙 (Sylvant) 표적화 IL-6 (다중심적 캐슬맨 병(Multicentric Castleman's disease)에서의 사용에 대해 승인됨); 시풀류셀-T (Provenge) 표적화 (전립선암에서의 사용에 대해 승인됨); 소니데집 (Odomzo) 표적화 스무스엔드(Smoothened) (기저 세포 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 소라페닙 (Nexavar) 표적화 VEGFR, PDGFR, 키트, RAF (간세포 암종, 신장 세포 암종, 갑상선 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 템시롤리무스 (Torisel) 표적화 mTOR (신장 세포 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 토시투모맙 (Bexxar) 표적화 CD20 (비-호지킨 림프종에서의 사용에 대해 승인됨); 트라메티닙 (Mekinist) 표적화 MEK (흑색종, 비-소세포 폐암에서의 사용에 대해 승인됨); 트라스투주맙 (Herceptin) 표적화 HER2 (ERBB2/neu) (유방암 (HER2+), 위암 (HER2+)에서의 사용에 대해 승인됨); 반데타닙 (Caprelsa) 표적화 EGFR (HER1/ERBB1), RET, VEGFR2 (갑상선 수질암에서의 사용에 대해 승인됨); 베무라페닙 (Zelboraf) 표적화 BRAF (흑색종에서의 사용에 대해 승인됨); 베네토클락스 (Venclexta) 표적화 BCL2 (만성 림프구성 백혈병에서의 사용에 대해 승인됨); 비스모데집 (Erivedge) 표적화 PTCH, 스무스엔드 (기저 세포 암종에서의 사용에 대해 승인됨); 보리노스타트 (Zolinza) 표적화 HDAC (피부 T-세포 림프종에서의 사용에 대해 승인됨); 지브-아플리버셉트 (Zaltrap) 표적화 PIGF, VEGFA/B (결장직장암에서의 사용에 대해 승인됨); 등을 포함하는, 암에 대해 표적화된 요법을 포함한다.
본 발명의 방법과 함께 사용하기에 적합한 생물학적 반응 개질제는 (1) 티로신 키나제 (RTK) 활성의 억제자; (2) 세린/트레오닌 키나제 활성의 억제자; (3) 종양-관련 항원 안타고니스트(antagonist), 예컨대 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체; (4) 아폽토시스(apoptosis) 수용체 아고니스트(agonist); (5) 인터류킨-2; (6) 인터페론-α; (7) 인터페론-γ; (8) 콜로니-자극 인자; (9) 혈관 형성 억제자; 및 (10) 종양 괴사 인자의 안타고니스트를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
화학치료제는 암 세포의 증식을 감소시키는 비-펩티드성 (즉, 비-단백질성) 화합물이고, 세포독성제 및 세포정지제를 포함한다. 화학치료제의 비-제한적 예는 알킬화제, 니트로소유레아, 대사 길항 물질, 항종양 항생제, 식물 (빈카) 알칼로이드, 및 스테로이드 호르몬을 포함한다.
세포 증식을 감소시키는 작용을 하는 작용제는 해당 분야에 공지되어 있고 널리 사용된된다. 이러한 작용제는 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드, 니트로소유레아, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 및 트리아젠을 포함하며, 제한되는 것은 아니지만, 메클로르에타민, 사이클로포스파미드 (Cytoxan™), 멜팔란 (L-사코리신), 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 세무스틴 (메틸-CCNU), 스트렙토조신, 클로로조토신, 유라실 머스타드, 클로르메틴, 이포스파미드, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포르아민, 부설판, 다카르바진, 및 테모졸로미드를 포함한다.
대사 길항 물질 작용제는 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 및 아데노신 데아미나제 억제자를 포함하며, 제한되는 것은 아니지만, 시타라빈 (CYTOSAR-U), 시토신 아라비노시드, 플루오로유라실 (5-FU), 플록슈리딘 (FudR), 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린 (6-MP), 펜토스타틴, 5-플루오로유라실 (5-FU), 메토트렉세이트, 10-프로파르길-5,8-디데아자폴레이트 (PDDF, CB3717), 5,8-디데아자테트라하이드로폴산 (DDATHF), 류코보린, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 및 젬시타빈을 포함한다.
적합한 천연 생성물 및 그 유도체 (예를 들어, 빈카 알칼로이드, 항종양 항생제, 효소, 림포카인, 및 에피포도필로톡신)는 Ara-C, 파클리탁셀 (Taxol®), 도세탁셀 (Taxotere®), 데옥시코포르마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 아자티오프린; 브레퀴나르; 알칼로이드, 예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 등; 포도필로톡신, 예를 들어, 에토포시드, 테니포시드, 등; 항생제, 예를 들어, 안트라사이클린, 다우노루비신 하이드로클로라이드 (다우노마이신, 루비도마이신, 세루비딘), 이다루비신, 독소루비신, 에피루비신 및 모르폴리노 유도체, 등; 페녹시존 비스사이클로펩타이드, 예를 들어, 닥티노마이신; 염기성 당펩타이드, 예를 들어, 블레오마이신; 안트라퀴논 글리코시드, 예를 들어, 플리카마이신 (미트라마이신); 안트라세네디온, 예를 들어, 미톡산트론; 아지리노피롤로 인돌디온, 예를 들어, 미토마이신; 대환식 면역억제제, 예를 들어, 사이클로스포린, FK-506 (타크롤리무스, 프로그래프), 라파마이신, 등; 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 항-증식성 세포독성제는 나벨벤, CPT-11, 아나스트라졸, 레트라졸, 카페시타빈, 레록사핀, 사이클로포스파미드, 이포스아미드, 및 드롤록사핀이다.
항증식성 활성을 가진, 미소관에 영향을 미치는 작용제가 또한 사용에 적합하며, 제한되는 것은 아니지만, 알로콜키신 (NSC 406042), 할리콘드린 B (NSC 609395), 콜키신 (NSC 757), 콜키신 유도체 (예를 들어, NSC 33410), 돌스타틴 10 (NSC 376128), 메이탄신 (NSC 153858), 리족신 (NSC 332598), 파클리탁셀 (Taxol®), Taxol® 유도체, 도세탁셀 (Taxotere®), 티오콜키신 (NSC 361792), 트리틸 시스테린, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 천연 및 합성 에포틸론, 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 에포틸론 A, 에포틸론 B, 디스코더몰리드; 에스트라무스틴, 노코다졸, 등을 포함한다.
사용하기에 적합한 호르몬 조절자 및 스테로이드 (예컨대 합성 유사체)는 아드레노코르티코스테로이드, 예를 들어, 프리드니손, 덱사메타손, 등; 에스트로겐 및 프로게스틴, 예를 들어, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 에스트라디올, 클로미펜, 타목시펜; 등; 및 부신피질 억제제, 예를 들어, 아미노글루테티미드; 17α-에티닐에스트라디올; 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스토락톤, 메틸프레드니솔론, 메틸-테스토스테론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 클로로트리아니센, 하이드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 류프롤리드, 플루타미드 (Drogenil), 트레미펜 (Fareston), 및 졸라덱스를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 에스트로겐은 증식 및 분화를 자극하며, 그러므로 에스트로겐 수용체에 결합하는 화합물은 이 활성을 차단하는데 사용된다. 코르티코스테로이드는 T 세포 증식을 억제할 수 있다.
다른 화학치료제는 금속 복합체, 예를 들어, 시스플라틴 (cis-DDP), 카르보플라틴, 등; 유레아, 예를 들어, 하이드록시유레아; 및 하이드라진, 예를 들어, N-메틸하이드라진; 에피도필로톡신; 토포이소머라제 억제자; 프로카르바진; 미톡산트론; 류코보린; 테가푸르; 등을 포함한다. 관심있는 다른 항-증식성 작용제는 면역억제제, 예를 들어, 마이코페놀산, 탈리도미드, 데스옥시스페르구아린, 아자스포린, 레플루노미드, 미조리빈, 아자스피란 (SKF 105685); Iressa® (ZD 1839, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-메톡시-6-(3-(4-모르폴리닐)프로폭시)퀴나졸린); 등을 포함한다.
"탁산"은 파클리탁셀, 뿐만 아니라 임의의 활성 탁산 유도체 또는 프로드러그(pro-drug)를 포함한다. "파클리탁셀" (본원에서 유사체, 제제, 및 유도체, 예를 들어, 도세탁셀, Taxol™, TAXOTERE™ (도세탁셀의 제제), 파클리탁셀의 10-데스아세틸 유사체 및 파클리탁셀의 3'N-데스벤조일-3'N-t-부톡시카르보닐 유사체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다)은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 쉽게 제조될 수 있거나 (또한 WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; 미국 특허 번호 5,294,637; 5,283,253; 5,279,949; 5,274,137; 5,202,448; 5,200,534; 5,229,529; 및 EP 590,267 참조), 또는 다양한 상업적 공급처, 예를 들어, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 T7402; 또는 탁수스 야나넨시스(Taxus yannanensis)의 T-1912)로부터 얻어질 수 있다.
파클리탁셀은 공통적인 화학적으로 이용 가능한 형태의 파클리탁셀, 뿐만 아니라 유사체 및 유도체 (예를 들어, Taxotere™, 도세탁셀, 상기 언급된 바와 같음) 및 파클리탁셀 컨쥬게이트(conjugate) (예를 들어, 파클리탁셀-PEG, 파클리탁셀-덱스트란, 파클리탁셀-자일로스, 또는 파클리탁셀-알부민)를 또한 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
친수성 유도체 및 소수성 유도체 둘 다를 포함한 다양한 공지된 유도체가 용어 "탁산" 내에 포함된다. 탁산 유도체는 국제 특허 출원 번호 WO 99/18113에서 기재된 갈락토스 및 만노스 유도체; WO 99/14209에서 기재된 피페라지노 및 다른 유도체; WO 99/09021, WO 98/22451, 및 미국 특허 번호 5,869,680에서 기재된 탁산 유도체; WO 98/28288에서 기재된 6-티오 유도체; 미국 특허 번호 5,821,263에서 기재된 설펜아미드 유도체; 및 미국 특허 번호 5,415,869에서 기재된 탁솔 유도체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 그것은, 제한되는 것은 아니지만, WO 98/58927; WO 98/13059; 및 미국 특허 번호 5,824,701에서 기재된 것들을 포함하는 파클리탁셀의 프로드러그를 더 포함한다.
유용한 면역요법은 다음을 포함한다: 항-PD-1/PD-L1 면역요법, 및/또는 치료 방법에서 표적화될 수 있는 다른 면역요법 표적, 예를 들어, 면역 체크포인트(check point) 마커, 예컨대 CTLA-4, LAG-3 및 TIM-3. 항-PD-1/PD-L1 면역요법은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 하나 이상의 항-PD-1/PD-L1 치료적 안타고니스트의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 요법을 포함하며 이러한 안타고니스트는, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, OPDIVO® (니볼루맙), KEYTRUDA® (펨브롤리주맙), Tecentriq™ (아테졸리주맙), 두르발루맙 (MEDI4736), 두르발루맙 (MSB0010718C), BMS-936559 (MDX-1105), CA-170, BMS-202, BMS-8, BMS-37, BMS-242 등을 포함한다.
CD152로도 알려져 있는 CTLA-4는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA-4에 대한 항체는 일부 암 유형을 치료하는 것에 대해 승인되었다. 다른 면역요법과 함께 CTLA-4의 동시 억제 효과는 CTLA-4를 특정 암을 치료하기 위해 다른 면역요법과 조합으로 사용하기 위한 양호한 후보물질로 만든다. TIM-3은 또한 여러 암 유형에 대한 면역요법을 위해 표적화될 수 있다.
LAG-3는 암 치료에 대해 임상 시험 중이다. 항-LAG-3 면역요법은 T 효과기 세포를 활성화시키고 (LAG-3 억제 신호를 사전 활성화된 LAG-3+ 세포로 하향조절함으로써) 유도된 (즉 항원-특이적) Treg 억제 활성을 억제할 수 있는 안타고니스트 LAG-3 항체를 이용하는 것들을 포함한다. 유용한 LAG-3 안타고니스트 항체는 렐라틀리맙 (BMS-986016; Bristol-Myers Squibb에 의해 개발됨), IMP701 (Immutep에 의해 개발됨), TSR-033 (항-LAG-3 mAb; TESARO, Inc.에 의해 개발됨), 등을 포함한다.
면역요법은 또한 T 세포-기반 면역요법, 예를 들어, 입양 세포 요법 (ACT) 및 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법을 포함한다. 예를 들어, 대상체는 대상체의 암에 의해 발현되는 항원을 표적화하도록 조작된 CAR T 세포의 집단이 투여될 수 있다. T 세포-기반 요법은, 어떤 경우에는, 배양된 면역 세포의 유전적 변형의 유무에 관계없이, 대상체로부터 세포 샘플, 예컨대 혈액 샘플 또는 종양 생검을 얻는 것, 및 생체 외에서 샘플로부터 면역 세포를 배양하는 것을 수반할 수 있다. 예로서, 면역 세포는 대상체로부터 얻어질 수 있고, 생체 외에서 배양될 수 있고 CAR T 세포의 집단을 생산하기 위해 암에 의해 발현되는 항원에 특이적인 CAR로 변형될 수 있다. 그 다음에, CAR T 세포는 암을 표적화하기 위해 대상체에 재도입될 수 있다. T 세포-기반 면역요법은 치료되는 특정 암에 따라 다양한 방식으로, 예를 들어, 다양한 항원을 표적화함으로써, 다양한 세포 유형, 등을 수집/배양함으로써 구성될 수 있다. 이에 더하여, T 세포-기반 면역요법은 전신으로, 예를 들어, 정맥내 주사에 의해, 또는 국소적으로, 예를 들어, 주입 (예를 들어, 복강내 주입, 늑막 카테터(catheter) 주입, 등), 직접 주사, 등에 의해 투여될 수 있다.
어떤 경우에, 본원에서 기재된 치료 방법은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, MDR1 이외의 다중약물 저항성 수송체를 포함하는 다중약물 저항성 수송체의 하나 이상의 억제자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 다중약물 저항성 수송체의 유용한 억제자는, 예를 들어, 티로신 키나제 억제자, 천연물, microRNA, 및 소분자 억제자를 포함할 수 있다. 다중약물 저항성 수송체의 억제자는 ABC 수송체 억제자를 포함한다. 이러한 MDR 조절자 또는 리버터(reverter)의 요약은 Choi (2005), Cancer Cell Int, 5:30 (개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 제공된다.
본 발명의 방법을 사용하는 치료에 적합한 개체는 암에 걸린 개체; 암에 걸린 것으로 진단된 개체; 화학요법, 방사선 요법, 항체 요법, 수술, 등으로 암에 대해 치료되고 있는 개체; 암에 대해 치료되었고 (예를 들어, 화학요법, 방사선 요법, 항체 요법, 수술, 등 중 하나 이상으로), 치료에 대해 반응하는데 실패한 개체; 암에 대해 치료되었고 (예를 들어, 화학요법, 방사선 요법, 항체 요법, 수술, 등 중 하나 이상으로), 처음에는 치료에 반응하였지만 나중에는 재발한, 즉, 암이 재발한 개체를 포함한다.
본 발명의 방법은, 예를 들어, 1차 암, 2차 암, 재성장 암, 재발암, 난치성 암, 등을 포함한 다양한 암을 표적화하고 치료하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에, 본 발명의 방법은 대상체에서 확인된 1차 암의 초기 치료로서 이용될 수 있다. 어떤 경우에, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 사전 치료에 대해 난치성인 암에 걸린 대상체, 사전 치료 후 재성장하는 암에 걸린 대상체, 사전 치료에 대해 혼합된 반응 (예를 들어, 대상체에서 적어도 하나의 종양에 대해 양성 반응 및 대상체에서 적어도 제2 종양에 대해 음성 또는 중성 반응)을 나타내는 대상체, 등에서 비-1차 (예를 들어, 2차 또는 그 이후) 치료로서 이용될 수 있다.
어떤 경우에, 본 발명의 방법은 약물 저항성 암, 예컨대 다중약물 저항성 암에 걸린 대상체를 치료하는데 이용될 수 있다. 다중약물 저항성 (MDR)은 많은 암들이 화학요법 약물에 대한 저항성을 발달시켜, 약물-저항성 종양의 최소한의 세포 사멸 및 확장을 일으키는 메커니즘이다. MDR 암은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 유출 펌프의 증가된 발현, 약물의 감소된 흡수, 세포 사멸 또는 아폽토시스의 억제, 약물 대사 조절, 등을 포함하는 하나 이상의 저항성 메커니즘을 수반할 수 있다. 어떤 경우에, 본 발명의 방법은 MDR을 방지하거나, 반전시키거나 또는 피할 수 있다.
어떤 경우에, 본 발명의 방법은 제1 작용제와 상이한 제2 작용제와 조합으로 본원에서 기재된 대상 다중특이적 항체의 유효량으로 제1 작용제에 대해 저항성인 암에 걸린 대상체를 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에, 대상체의 암은 제1 화학치료제에 대해 저항성일 수 있고 대상체는 제 화학치료제와 상이한 제2 화학치료제와 조합으로 본원에서 기재된 대상 다중특이적 항체의 유효량을 투여함으로써 치료될 수 있다. 제1 화학치료제와 제2 화학치료제의 다양한 조합은, 예를 들어, 치료되는 암의 유형, 저항성이 발달할 가능성, 등에 따라 이용될 수 있다.
많은 암이 약물 저항성을 발달시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 및 다른 이유에 대해 본 발명의 방법은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 부신피질 암종, AIDS-관련 암 (예를 들어, 카포시 육종(Kaposi Sarcoma), 림프종, 등), 항문암, 충수암, 성상세포종, 비정형 유기형/간상 종양(Atypical Teratoid / Rhabdoid Tumor), 기저 세포 암종, 담관암 (간장 외(Extrahepatic)), 방광암, 골암 (예를 들어, 유잉 육종(Ewing Sarcoma), 골육종(Osteosarcoma) 및 악성 섬유 조직구종(Malignant Fibrous Histiocytoma), 등), 뇌간교종(Brain Stem Glioma), 뇌 종양 (예를 들어, 성상세포종, 중추신경계 배아 종양 종양, 중추신경계 생식 세포 종양, 두개인두종(Craniopharyngioma), 뇌실막종(Ependymoma), 등), 유방암 (예를 들어, 여성 유방암, 남성 유방암, 소아 유방암, 등), 기관지 종양, 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 유암종 (예를 들어, 소아, 위장, 등), 원발 병소 불명 암종, 심장 (심장) 종양, 중추신경계 (예를 들어, 비정형 유기형/간상 종양, 배아 종양, 생식 세포 종양, 림프종, 등), 자궁경부암, 소아암, 척색종(Chordoma), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수형성성 백혈병 (CML), 만성 척수증식성 신생물, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T-세포 림프종, Duct (예를 들어, 담관, 간장 외, 등), 관상 제자리 암종 (DCIS), 배아 종양, 내막암, 뇌실막종, 식도암, 감각신경 모세포종, 유잉 육종, 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 간장 외 담관암, 안암 (예를 들어, 안내 흑색종, 망막아종, 등), 골 섬유 조직구종(Fibrous Histiocytoma of Bone) (예를 들어, 악성, 골육종, 등), 담낭암, 위장암 (위암), 위장관 유암종, 위장관 간질성 종양 (GIST), 생식 세포 종양 (예를 들어, 두개외, 고환외, 난소, 고환, 등), 임신성 영양막병(Gestational Trophoblastic Disease), 신경교종, 모양세포성 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포암 (간암), 조직구증(Histiocytosis) (예를 들어, 랑게르한스 세포(Langerhans Cell), 등), 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 도세포 종양 (예를 들어, 췌장 내분비 종양, 등), 카포시 육종, 신장암 (예를 들어, 신장 세포, 윌름스 종양(Wilms tumor), 소아 신장 종양, 등), 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병 (예를 들어, 급성 림프아구성 (ALL), 급성 골수성 (AML), 만성 림프구성 (CLL), 만성 골수형성성 (CML), 모양세포, 등), 구순암 및 구강암, 간암 (원발성), 소엽 제자리 암종 (LCIS), 폐암 (예를 들어, 비-소세포, 소세포, 등), 림프종 (예를 들어, AIDS-관련, 버킷, 피부 T-세포, 호지킨, 비-호지킨, 1차 중추신경계 (CNS), 등), 마크로글로불린혈증 (예를 들어, 발덴스트롬, 등), 남성 유방암, 골 악성 섬유 조직구종 및 골육종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종(Mesothelioma), 잠복 원발성을 가진 전이성 편평세포 경부암, NUT 유전자를 수반하는 중간선 암종, 구강암, 다발성 내분비선 신생물 증후군(Multiple Endocrine Neoplasia Syndrome), 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상 식육종(Mycosis Fungoides), 골수이형성 증후군(Myelodysplastic Syndrome), 골수이형성/척수증식성 신생물, 골수형성성 백혈병 (예를 들어, 만성 (CML), 등), 골수성 백혈병 (예를 들어, 급성 (AML), 등), 척수증식성 신생물 (예를 들어, 만성, 등), 비강암 및 부비동암, 비인두암, 신경아세포종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 구강암, 구강암 (예를 들어, Lip, 등), 구인두암, 골육종 및 골 악성 섬유 조직구종, 난소암 (예를 들어, 상피, 생식 세포 종양, 저악성 잠재적 종양, 등), 췌장암, 췌장 내분비 종양 (도세포 종양), 유두종증(Papillomatosis), 부신경절종(Paraganglioma), 부비동암 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬 친화성 세포종(Pheochromocytoma), 뇌하수체 종양, 흉막 폐 아세포종(Pleuropulmonary Blastoma), 원발성 중추신경계 (CNS) 림프종, 전립선암, 직장암, 신장세포암 (신장암), 신우뇨관, 이행세포암, 망막아종, 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma), 타액선암, 육종 (예를 들어, 유잉, 카포시, 골육종, 횡문근육종, 연조직, 자궁, 등), 세자리 증후군(Sezary Syndrome), 피부암 (예를 들어, 소아, 흑색종, 메르켈(Merkel) 세포 암종, 비흑색종, 등), 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평세포 암종, 편평세포 경부암 (예를 들어, 잠복 원발성, 전이성, 등), 위암 (위암), T-세포 림프종, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우뇨관 이행세포암, 신우뇨관암, 요도암, 자궁암 (예를 들어, 자궁내막, 등), 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 윌름스 종양, 등을 포함하는 다양한 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에서 기재된 치료 방법은, 어떤 경우에는, 이전에 하나 이상의 통상적인 치료를 거진 대상체에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 종양학의 경우에서, 본원에서 기재된 방법은, 어떤 경우에는, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 통상적인 화학요법, 통상적인 방사선 요법, 통상적인 면역요법, 수술, 등을 포함한 통상적인 암 요법 이후에 수행될 수 있다.
어떤 경우에, 본원에서 기재된 방법은 대상체가 통상적인 요법에 대해 반응하지 않거나 난치성일 때 사용될 수 있다. 어떤 경우에, 본원에서 기재된 방법은 대상체가 통상적인 요법에 반응했을 때 사용될 수 있다.
어떤 경우에, 본 발명의 방법은 사전 암 요법 이후에 남아있는 최소 잔존 질환 (MRD)에 대해 대상체를 표적화하거나, 치료하거나 또는 최소 잔존 질환을 제거하는데 이용될 수 있다. MRD의 표적화, 치료 및/또는 클리어런스(clearance)는 사전 치료에 대해 난치성이거나 난치성인 것으로 결정되었는지 여부에 관계없이 본 방법을 사용하여 추구될 수 있다. 어떤 경우에, 본 발명의 방법은 MRD가 사전 치료 또는 본원에서 기재된 다중특이적 항체를 이용하는 것 이외의 하나 이상의 이용 가능한 치료 옵션에 대해 난치성인지 결정한 후에 MRD의 대상체를 표적화하거나, 치료하거나 또는 MRD를 제거하는데 이용될 수 있다.
어떤 경우에, 본 방법은 감시를 위해 예방적으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 필요로 하는 대상체는 검출 가능한 질환이 없지만, 예를 들어, 약물 저항성 암을 포함한 재발성 암에 걸릴 위험이 있을 때 본원에서 기재된 다중특이적 항체 중 하나 이상을 수반하는 치료가 투여될 수 있다. 어떤 경우에, 예방적 접근법은 대상체가 약물 저항성인 것으로 예측되거나 약물 저항성이 될 것으로 예상되는 원발성 암에 걸릴 위험이 특히 높을 때 이용될 수 있다. 어떤 경우에, 예방적 접근법은 대상체가 이전에 암에 대해 치료되었고 약물 저항성의 재발 또는 발달의 위험이 있을 때 이용될 수 있다.
어떤 경우에, 본 발명의 방법은 하나 이상의 마커 또는 치료적 표적의 발현에 대해 암을 분석하는 단계를 수반할 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에, 방법은 암이 사전 결정된 임계치보다 높은 MDR1, 사전 결정된 임계치보다 높은 TAA (예를 들어, CD47, PD-L1, 또는 EGFR), 또는 둘 다를 발현하는지를 결정하기 위해 대상체의 암 샘플을 분석하는 단계를 수반할 수 있다.
어떤 경우에, 대상체가 본 발명의 다중특이적 항체로 치료되는지는 TAA 및/또는 MDR1 테스트 결과에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에, 암이 TAA를 사전 결정된 임계치 이상으로 발현하면 대상체는 본 발명의 다중특이적 항체로 치료될 수 있고, 암이 TAA를 사전 결정된 임계치 미만으로 발현하면, 대상체는 다중특이적 항체로 치료되지 않을 수도 있으며, 예를 들어, 대상체는 대상 다중특이적 항체 없이 적절한 암에 대한 통상적인 요법으로 치료될 수 있다. 어떤 경우에, 암이 MDR1을 사전 결정된 임계치 이상으로 발현하면 대상체는 본 발명의 다중특이적 항체로 치료될 수 있고, 암이 MDR1을 사전 결정된 임계치 미만으로 발현하면 대상체는 다중특이적 항체로 치료되지 않을 수도 있으며, 예를 들어, 대상체는 대상 다중특이적 항체 없이 적절한 암에 대한 통상적인 요법으로 치료될 수 있다. 어떤 경우에, 암이 TAA 및 MDR1 둘 다를 사전 결정된 임계치 이상으로 발현하면 대상체는 본 발명의 다중특이적 항체로 치료될 수 있고, 암이 TAA 및 MDR1을 사전 결정된 임계치 미만으로 발현하면 대상체는 다중특이적 항체로 치료되지 않을 수도 있으며, 예를 들어, 대상체는 대상 다중특이적 항체 없이 적절한 암에 대한 통상적인 요법으로 치료될 수 있다.
MDR1 및/또는 TAA 수준을 분석하기 위해, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 유동세포분석법, 핵산-기반 분석 (예를 들어, 증폭, 시퀀싱(sequencing), 등), 세포 계산법, 면역조직화학, 등을 포함한 임의의 편리한 분석이 이용될 수 있다. 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 암 생검 샘플을 포함한 임의의 편리한 생물학적 샘플이 이용될 수 있다. 하나 이상의 마커 및/또는 표적의 발현을 평가하기에 유용한 사전 결정된 임계치는 상응하는 대조군에 대한 측정된 발현 수준의 비교를 포함한 임의의 편리하고 적절한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에, 샘플에서 분석되는 MDR1 및/또는 TAA의 수준에 유용한 사전 결정된 임계치는 참조 세포, 예컨대 건강한/정상 세포에서 측정된 바와 같이 MDR1 및/또는 TAA의 수준에 상응할 수 있다. TAA는 CD47, PD-L1, 또는 EGFR일 수 있다.
제조 방법
상기 요약된 바와 같이, 본 발명의 방법은 또한 본원에서 기재된 바와 같이 다중특이적 항체를 제조 및/또는 확인하는 방법을 포함한다. 대상 항체는 임의의 공지된 방법, 예를 들어, 단백질 합성; 재조합 DNA 방법; 등에 대해 통상적인 합성 방법에 의해 생산될 수 있다.
대상 항체가 단일 사슬 폴리펩타이드인 경우, 그것은 표준 화학적 펩타이드 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 폴리펩타이드가 화학적으로 합성되는 경우, 합성은 액체상 또는 고체상을 통해 진행될 수 있다. 서열의 C-말단 아미노산이 불용성 지지체에 부착된 후 서열의 나머지 아미노산이 순차적으로 추가되는 고체상 폴리펩타이드 합성 (SPPS)은 대상 항체의 화학적 합성에 적합한 방법의 예이다. SPPS의 다양한 형태, 예컨대 Fmoc 및 Boc는 대상 항체를 합성하는데 이용 가능하다. 고체상 합성을 위한 기술은 Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984); 및 Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10 and Camarero JA et al. 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8에 의해 기재되어 있다. 간략히 말하면, 작은 불용성, 다공성 비드는 펩타이드 사슬이 구성되는 기능적 유닛으로 처리된다. 커플링/탈보호의 반복된 순환 이후, 부착된 고체상의 유리 N-말단 아민은 단일 N-보호된 아미노산 유닛에 커플링된다. 이 유닛은 탈보호되어, 추가의 아미노산이 부착될 수 있는 새로운 N-말단 아민을 나타낸다. 펩타이드는 고체상 위에 고정된 채로 유지되고 분열되기 전에 여과 과정을 거친다.
표준 재조합 방법은 대상 항체의 생산에 사용될 수 있다. 예를 들어, 선택적으로 불변 영역에 연결된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 발현 벡터로 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일한 또는 상이한 발현 벡터에서 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 암호화하는 DNA 절편은 면역글로불린 폴리펩타이드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들)의 대조군 서열에 작동 가능하게 연결된다. 발현 대조군 서열은 프로모터 (예를 들어, 자연적으로 회합된 또는 이종성 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 발현 대조군 서열은 진핵 생물 숙주 세포 (예를 들어, COS 또는 CHO 세포)를 형질전환하거나 트랜스펙션할 수 있는 벡터 내의 진핵 생물 프로모터 시스템일 수 있다. 벡터가 적절한 숙주로 통합되면, 숙주는 높은 수준의 뉴클레오타이드 서열의, 및 항체의 수거 및 정제발현에 적합한 조건 하에서 유지된다.
암호의 퇴화로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 면역글로불린 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 원하는 핵산 서열은 원하는 폴리뉴클레오타이드의 조기 제조된 변이체의 데 노보(de novo) 고체상 DNA 합성 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 돌연변이 유발에 의해 생산될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드-매개된 돌연변이 유발은 표적 폴리펩타이드 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하기에 적합한 방법의 예이다. Adelman et al., DNA 2:183 (1983) 참조. 간략히 말하면, 표적 폴리펩타이드 DNA는 단일 가닥 DNA 주형에 대한 원하는 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드를 혼성체화함으로써 변화된다. 혼성체화 이후, DNA 폴리머라제는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 통합하고, 표적 폴리펩타이드 DNA에서 선택된 변화를 암호화하는 주형의 전체 제2 상보적 가닥을 합성하는데 사용된다.
적합한 발현 벡터는 전형적으로 에피솜 또는 숙주 염색체 DNA의 구성요소로서 숙주 유기체에서 복제 가능하다. 공통적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 상기 세포의 검출을 허용하기 위해 선택 마커 (예를 들어, 앰피실린-저항성, 하이그로마이신-저항성, 테트라사이클린 저항성, 카나마이신 저항성 또는 네오마이신 저항성)를 함유한다.
대장균는 대상 항체-암호화 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는데 사용될 수 있는 원핵 숙주 세포의 예이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스(bacillus), 예컨대 바실루스 서브틸리스, 및 다른 장내 세균, 예컨대 살모넬라, 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 호환 가능한 발현 대조군 서열 (예를 들어, 복제 기원)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 이에 더하여, 임의의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로 발현을 전형적으로 선택적으로 작동자 서열로 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 시작하고 완료하기 위해 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 발현에 유용하다. 사카로미세스 (예를 들어, 사카로미세스 세레비시애) 및 피치아는 적합한 효모 숙주 세포의 예이며, 적합한 벡터는 원하는 경우 발현 대조군 서열 (예를 들어, 프로모터), 복제 기원, 종결 서열 등을 갖는다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당 분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 다른 것들 중에서도 알콜 데하이드로게나제, 아이소시토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 활용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
미생물에 더하여, 포유류 세포 (예를 들어, 시험관 내 세포 배양물에서 키워진 포유류 세포)는 또한 본 발명의 폴리펩타이드 (예를 들어, 면역글로불린 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)를 발현하고 생산하는데 사용될 수 있다. Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987) 참조. 적합한 포유류 숙주 세포는 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 및 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마(hybridoma)를 포함한다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 대조군 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터, 및 인핸서 (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필수적인 정보 처리 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 대조군 서열의 예는 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 시토메갈로바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992) 참조.
합성되면 (화학적으로 또는 재조합에 의해), 전체 항체, 그것들의 다이머, 개개의 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 형태의 대상 항체 (예를 들어, scFv, 등)은 암모늄 설페이트 침전, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 정제, 겔 전기영동, 등을 포함하는, 해당 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다 (일반적으로 Scopes, Protein 정제 (Springer-Verlag, N.Y., (1982) 참조). 대상 항체는 실질적으로, 예를 들어, 적어도 약 80% 내지 85%, 적어도 약 85% 내지 90%, 적어도 약 90% 내지 95%, 또는 98% 내지 99%, 또는 그 이상 순수할 수 있으며, 예를 들어, 대상 항체, 등 이외에 세포 데브리(debris), 거대분자와 같은 오염물질이 없다.
일부 구체예에서, 본 발명의 다중특이적 항체를 생성하는 방법은 후보 항체를 생산하고 활성에 대해 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 일련의 단계의 사용을 통해 MDR1 및 CD47 둘 다를 발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체를 생성할 수 있다. 이러한 방법의 단계는 다중특이적 항체 또는 MDR1-결합 도메인 및 CD47-결합 도메인을 각각 포함하거나 포함할 것으로 예상되는 복수의 항체를 생산하는 단계; MDR1 및 CD47을 발현하는 제1 테스트 세포를 다중특이적 항체 또는 복수의 항체와 접촉시키는 단계; MDR1 또는 CD47을 발현하는 제2 세포를 다중특이적 항체 또는 복수의 항체와 접촉시키는 단계; 결합 특이성 비율을 결정하기 위해, 제2 세포로의 다중특이적 항체의 결합과, 제1 세포로의 다중특이적 항체, 또는 복수의 항체의 결합을 비교하는 단계; 및 비율이 사전 결정된 임계치보다 높을 때 다중특이적 항체, 또는 하나 이상의 복수의 항체를 MDR1 및 CD47 둘 다를 발현하는 세포에 대해 특이적인 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 비교의 결합을 위해 이러한 임계치가 이용되는 경우, 임계치는 달라질 수 있고 1.5:1 또는 그 이상의 범위에 있을 수 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 50:1, 100:1, 등을 포함한다.
다양한 세포가 이러한 방법에서 사용될 수 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 본원에서 기재된 세포를 포함한다. 어떤 경우에, MDR1-단독 발현 세포 및 CD47-단독 발현 세포 둘 다로의 항체의 결합이 수행될 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에, 방법은 상기 기재된 단계와 관련하여 제2 세포가 CD47이 아니라 MDR1을 발현하는 경우를 포함할 수 있고 방법은 MDR1을 발현하지 않지만 CD47을 발현하는 제3 세포를 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
어떤 경우에, 이러한 방법은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 대조군 세포, 대조군 시약, 등을 포함한 하나 이상의 대조군을 이용할 수 있다. 유용한 대조군 세포는 하나 이상의 적절한 유전자 또는 단백질의 공지된 발현 또는 공지된 발현의 결핍을 나타내는 것들을 포함한다. 유용한 대조군 시약은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 대조군 항체, 제한되는 것이 아니라, 예를 들어, 공지된 표적에 대한 단일특이적 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에, 본 발명의 이러한 방법은 제1 세포, 제2 세포, 및/또는 제3 세포를 단일특이적 항-MDR1 항체 및 단일특이적 항-CD47 항체로부터 선택된 대조군 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 사용된 특정 방법에 따라, 적절한 경우, 다양한 다른 또는 추가적인 대조군이 이용될 수 있다.
키트
본 발명의 양태는 또한 키트를 포함한다. 키트는, 예를 들어, 본원에서 기재된 다중특이적 항체, 시약, 조성물, 제제, 세포, 핵산, 발현 벡터, 등의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대상 키트는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 대상 다중특이적 항체, 그것을 암호화하는 핵산, 또는 대상 다중특이적 핵산을 포함하는 세포. 키트는, 예를 들어, 치료 키트 (예를 들어, 키트는 다중특이적 항체 및 예를 들어, 하나 이상의 추가적인 활성제, 예컨대 화학치료제를 포함할 수 있음), 항체 생산용 키트, 항체 스크리닝용 키트, 등을 포함한 다양한 목적을 위해 구성될 수 있다.
키트의 선택적인 구성요소는 달라질 것이며, 예를 들어, 완충제; 프로테아제 억제자; 등을 포함할 수 있다. 대상 키트가 대상 핵산을 포함하는 경우, 핵산은 또한 제한 부위, 다수의 클로닝 부위, 프라이머 부위, 등을 가질 수 있다. 키트의 다양한 구성요소는 별개의 용기에 존재할 수 있거나 특정 호환 가능한 구성요소는 원하는 경우 단일 용기로 사전 조합될 수 있다.
상기 언급된 구성요소에 더하여, 대상 키트는 대상 방법을 실시하기 위해 키트의 구성요소를 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 대상 방법을 실시하기 위한 지침은 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 지침은 종이 또는 플라스틱, 등과 같은 기판에 인쇄될 수 있다. 이와 같이, 지침은 키트의 용기 또는 그 구성요소 (즉, 포장 또는 부분포장과 관련됨)의 라벨링에서 포장 삽입물로서 키트에 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 지침은 적합한 컴퓨터로 판독 가능한 저장 매체, 예를 들어, 컴팩트 디스크-판독 전용 메모리 (CD-ROM), 디지털 다목적 디스크 (DVD), 디스켓, 등에 존재하는 전자식 저장 데이터로서 존재한다. 다른 구체예에서, 실제 지침은 키트 내에 존재하지 않지만, 원격 소스로부터, 예를 들어, 인터넷을 통해 지침을 얻기 위한 수단이 제공된다. 이 구체예의 예는 지침을 볼 수 있고 및/또는 지침을 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 지침과 같이, 지침을 얻기 위한 이 수단은 적합한 기판 상에 기록되어 있다.
본 발명의 예시의 비-제한적 양태
구체예를 포함한, 상기 기재된 본 주제의 양태는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 양태 또는 구체예와 조합으로 유익할 수 있다. 상기 언급된 설명을 제한하지 않으면서, 본 발명의 특정 비-제한적 양태가 아래 제공된다. 본 발명을 읽을 때 당업자에게 분명한 바와 같이, 각각의 넘버링된 양태가 이용되거나 선행하거나 뒤따르는 개개의 넘버링된 양태와 조합될 수 있다. 이것은 이러한 모든 양태의 조합에 대한 지지를 제공하도록 의도되며 하기 명확하게 제공된 양태의 조합에 제한되지 않는다. 본 발명의 사상 또는 범위에서 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다.
1. 다중약물 저항성 단백질 1 (MDR1) 및 종양 관련된 항원 (TAA)에 결합하는 이중특이적 항체 분자로서, 항체 분자는 2개의 동일한 가변 경쇄 (VL), 제1 가변 중쇄 (VH), 및 제2 VH 사슬을 포함하며,
VL 사슬은 각각 MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하고, 제1 VH 사슬은 MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하고, 제2 VH 사슬은 TAA에 대한 항원-결합 부위를 포함하고, 제2 VH 사슬은 VL 사슬 중 하나와 쌍을 형성할 때 TAA에 결합하고,
이중특이적 항체는 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 암 세포에 결합하지만 MDR1 및/또는 TAA를 발현하는 비-암 세포로의 감소된 결합을 나타낸다.
2. 양태 1의 이중특이적 항체 분자로서, 2개의 VL 사슬의 항원-결합 부위는 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR 1-3 (LCDR 1-3)을 포함한다:
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (서열 번호:1) (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다).
3. 양태 2의 이중특이적 항체 분자로서, 2개의 VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함한다:
(i) DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (서열 번호:2);
(ii) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (서열 번호:3); 또는
(iii) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (서열 번호:4).
4. 양태 2 또는 3의 이중특이적 항체 분자로서,
(i) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGX1TYLE (서열 번호:5)를 포함하고;
(ii) LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고;
(iii) LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함한다
(여기서 X1은 N, Q 또는 S이다).
5. 양태 1 내지 4 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 2개의 VL 사슬은 인간화된다.
6. 양태 2 내지 5 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 2개의 VL 사슬은 다음 서열 또는 다음 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함한다:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (서열 번호:8);
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (서열 번호:3); 또는
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (서열 번호:4).
7. 양태 6의 이중특이적 항체 분자로서, 2개의 VL 사슬은 다음 서열 또는 다음 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (서열 번호:8).
8. 양태 1 내지 7 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제1 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR 1-3)을 포함한다:
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:9) (여기서 X2는 N, Q 또는 S이다).
9. 양태 1 내지 8 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제1 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
(i) EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:10), 또는
(ii) EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:11), 또는
(iii) EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:12).
10. 양태 8 또는 9의 이중특이적 항체 분자로서,
(i) HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고;
(ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGG X2TYYPDSVKG (서열 번호:14)를 포함하고;
(iii) HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함한다
(여기서 X2는 N, Q 또는 S이다).
11. 양태 1 내지 10 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제1 및/또는 제2 VH 사슬은 인간화된다.
12. 양태 8 내지 11 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제1 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함한다:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGnTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:16);
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:11); 또는
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:12).
13. 양태 2 내지 12 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서,
(i) LDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:26)를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG (서열 번호:29)를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
(ii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGQTYLE (서열 번호:27)를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG (서열 번호:30)를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
(iii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE (서열 번호:28)를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGSTYYPDSVKG (서열 번호:31)를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
(iv) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:26)를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG (서열 번호:30)를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
(v) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:26)를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGSTYYPDSVKG (서열 번호:31)를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
(vi) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGQTYLE (서열 번호:27)를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG (서열 번호:29)를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
(vii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE (서열 번호:28)를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG (서열 번호:29)를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
(viii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE (서열 번호:28)를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG (서열 번호:30)를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
(ix) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:26)를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG (서열 번호:30)를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함한다.
14. 양태 1 내지 7 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 TAA에 결합하는 단일특이적 항체 분자로부터 유래되고, 경쇄 중 하나와 쌍을 형성할 때 taa에 대한 이중특이적 항체 분자의 친화도는 VH 사슬이 유래되는 TAA에 대한 단일특이적 항체 분자의 친화도보다 적어도 2배 낮다.
15. 양태 1 내지 7 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, TAA는 CD47이다.
16. 양태 15의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열의 HCDR 1-3을 포함한다:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:17).
17. 양태 15 또는 16의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH (서열 번호:18), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD (서열 번호:19), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY (서열 번호:20)를 포함한다.
18. 양태 15 또는 16의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함한다:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:17),
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:21),
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (서열 번호:22), 또는
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (서열 번호:23).
19. 양태 1 내지 14 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, TAA는 PD-L1이다.
20. 양태 19의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32).
21. 양태 19 또는 20의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 서열을 포함하는 HCDR1: DSWIH (서열 번호:33), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:34), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: RHWPGGFDY (서열 번호:35)를 포함한다.
22. 양태 19 내지 21 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32).
23. 양태 1-14 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, TAA는 EGFR이다.
24. 양태 23의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36).
25. 양태 23 또는 24의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 서열을 포함하는 HCDR1: SGDYYWS (서열 번호:37), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS (서열 번호:38), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: VSIFGVGTFDY (서열 번호:39)를 포함한다.
26. 양태 24 또는 25의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36).
27. 양태 23의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40).
28. 양태 26 또는 27의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYGVH (서열 번호:41), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열 번호:42), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: ALTYYDYEFAY (서열 번호:43)를 포함한다.
29. 양태 26 내지 28 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40).
30. 양태 1의 이중특이적 항체 분자로서, 2개의 VL 사슬의 항원-결합 부위는 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR 1-3 (LCDR 1-3)을 포함한다:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25).
31. 양태 30의 이중특이적 항체 분자로서,
(i) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:44)를 포함하고;
(ii) LCDR2는 다음 서열: KISRLEA (서열 번호:45)를 포함하고;
(iii) LCDR3는 다음 서열: FQGSHFPRT (서열 번호:46)를 포함한다.
32. 양태 30 또는 31의 이중특이적 항체 분자로서, VL 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25).
33. 양태 30-32중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제1 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR 1-3)을 포함한다:
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
34. 양태 33의 이중특이적 항체 분자로서,
(i) HCDR1은 다음 서열: SYTMS를 포함하고;
(ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고;
(iii) HCDR3는 다음 서열: YYRYEAWFAS를 포함한다.
35. 양태 30-34 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제1 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함한다:
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
36. 양태 30-32 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제1 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR 1-3)을 포함한다:
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:9) (여기서 X2는 N, Q 또는 S이다).
37. 양태 36의 이중특이적 항체 분자로서,
(i) HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고;
(ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGG X2TYYPDSVKG (서열 번호:14)를 포함하고;
(iii) HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함한다
(여기서 X2는 N, Q 또는 S이다).
38. 양태 36-37의 이중특이적 항체 분자로서, 제1 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함한다:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:16);
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:11); 또는
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:12).
39. 양태 1-7 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제1 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR 1-3)을 포함한다:
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
40. 양태 39의 이중특이적 항체 분자로서,
(i) HCDR1은 다음 서열: SYTMS를 포함하고;
(ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고;
(iii) HCDR3는 다음 서열: YYRYEAWFAS를 포함한다.
41. 양태 39-40의 이중특이적 항체 분자로서, 제1 VH 사슬은 다음 서열 또는 다음 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함한다:
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
42. 양태 30-41 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 TAA에 결합하는 단일특이적 항체 분자로부터 유래되고, TAA에 대한 이중특이적 항체 분자의 친화도는 경쇄 중 하나와 쌍을 형성할 때 VH 사슬이 유래되는 TAA에 대한 단일특이적 항체 분자의 친화도보다 적어도 2배 더 낮다.
43. 양태 30-42 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, TAA는 CD47이다.
44. 양태 43의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:17).
45. 양태 44의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH (서열 번호:18), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD (서열 번호:19), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY (서열 번호:20)를 포함한다.
46. 양태 44 또는 45의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:17),
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:21),
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (서열 번호:22), 또는
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (서열 번호:23).
47. 양태 30-42 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, TAA는 PD-L1이다.
48. 양태 47의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32).
49. 양태 47 또는 48의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: DSWIH (서열 번호:33), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:34), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: RHWPGGFDY (서열 번호:35)를 포함한다.
50. 양태 48 또는 49의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32).
51. 양태 30-42 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, TAA는 EGFR이다.
52. 양태 51의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36).
53. 양태 52의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: SGDYYWS (서열 번호:37), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS (서열 번호:38), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: VSIFGVGTFDY (서열 번호:39)를 포함한다.
54. 양태 52 또는 53의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36).
55. 양태 51의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40).
56. 양태 52의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYGVH (서열 번호:41), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열 번호:42), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: ALTYYDYEFAY (서열 번호:43)를 포함한다.
57. 양태 52 또는 53의 이중특이적 항체 분자로서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40).
58. 양태 1 내지 57 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 항체는 MDR1 또는 TAA를 발현하는 세포와 비교하여 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 세포에 대하여 2배 더 큰 친화도를 갖는다.
59. 양태 1 내지 58 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 항체는 화학치료제로의 치료에 대한 암 세포의 민감도를 증가시킬 수 있으며, 화학치료제의 절반 최대 억제 농도 (IC50)는 항체와 동시-투여될 때 다음 서열을 가진 VH 사슬:
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:24); 및
다음 서열을 가진 VL 사슬:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25)
를 포함하는 항-MDR1 항체 15D3과 동시-투여될 때 화학치료제의 IC50보다 적어도 2배 더 낮으며, 선택적으로 IC50은 시험관 내에서 측정된다.
60. 양태 59의 이중특이적 항체 분자로서, 암 세포는 NALM6 ADR 세포이고 선택적으로 화학치료제는 파클리탁셀, 콜키신, 베라파밀, 빈블라스틴, 토포테칸, 독소루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 또는 닐로티닙을 포함한다.
61. 양태 1 내지 60 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 항체는, MDR1을 발현하는 세포에 결합될 때, MDR1에 의한 유출을 억제한다.
62. 양태 1 내지 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 항체는 다음 서열을 가진 VH 사슬:
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:24); 및
다음 서열을 가진 VL 사슬:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25)
을 포함하는 항-MDR1 항체 15D3보다 적어도 2배 더 낮은 친화도로 MDR1에 결합한다.
63. 양태 1 내지 62 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 항체는 하나 이상의 Fcγ 수용체로의 항체의 결합을 감소시키거나 폐지하도록 변형된 Fc 도메인을 포함한다.
64. 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 양태 1 내지 63 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자로서, 방법은 대상체에게 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
65. 양태 64에 따라 사용하기 위한 이중특이적 항체 분자로서, 방법은 적어도 하나의 추가적인 활성제와 조합으로 항체를 투여하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학치료제, 다중약물 저항성 수송체의 억제자, 면역요법제, 또는 이것들의 조합을 포함한다.
66. 양태 65에 따라 사용하기 위한 이중특이적 항체 분자로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학치료제이며, 선택적으로 화학치료제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린이다.
67. 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 화학요법제로서, 방법은 양태 1 내지 63 중 어느 하나의 항체와 조합으로 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로 화학요법제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린이다.
68. 양태 67에 따라 사용하기 위한 이중특이적 항체 분자로서, 치료되는 대상체는 화학치료제에 대해 저항성인 것으로 결정된 암에 걸려있다.
69. 암에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 대상체에게 양태 1 내지 63 중 어느 하나의 이중특이적 항체 분자의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
70. 양태 69의 방법으로서, 방법은 이중특이적 항체 분자를 적어도 하나의 추가적인 활성제와 조합으로 투여하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학치료제, 다중약물 저항성 수송체의 억제자, 면역요법제, 또는 이것들의 조합을 포함한다.
71. 양태 70의 방법으로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학치료제이며, 선택적으로 화학치료제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린이다.
72. 양태 71의 방법으로서, 치료되는 대상체는 화학치료제로의 치료에 대해 저항성인 것으로 결정된 암을 가지며, 선택적으로 화학치료제는 파클리탁셀, 콜키신, 베라파밀, 빈블라스틴, 토포테칸, 독소루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 또는 닐로티닙을 포함한다.
73. 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR (LCDR)을 포함하는 가변 경쇄 (VL):
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다); 및
다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR (HCDR)을 포함하는 가변 중쇄 (VH):
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (여기서 X2는 N, Q 또는 S이다)
를 포함하는 항체; 또는
다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR (LCDR)을 포함하는 가변 경쇄 (VL):
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25); 및
다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR (HCDR)을 포함하는 가변 중쇄 (VH):
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA
를 포함하는 항체.
74. 양태 73의 항체로서,
VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함하고:
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK;
VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하거나:
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS, 또는
VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함하고:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK;
VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하거나:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS, 또는
VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함하고:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK;
VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 LCDR 1-3을 포함한다:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
75. 양태 74의 항체로서,
LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE, RSSQSIVHSTGQTYLE, 또는 RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함한다.
76. 양태 75의 항체로서,
(i) HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고;
(ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGG X2TYYPDSVKG를 포함하고;
(iii) HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다
(여기서 X2는 N, Q 또는 S이다).
77. 양태 74-75의 항체로서,
(i) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
(ii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGQTYLE를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
(iii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGSTYYPDSVKG를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
(iv) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
(v) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGSTYYPDSVKG를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
(vi) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGQTYLE를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
(vii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
(viii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
(ix) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고,
LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고,
HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함한다.
78. 양태 73-77 중 어느 하나의 항체로서, 항체의 VL 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하거나 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK,
항체의 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하거나 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
79. 양태 73의 항체로서, 항체는
다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR 1-3 (LCDR)을 포함하는 가변 경쇄 (VL):
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25); 및
다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR)을 포함하는 가변 중쇄 (VH):
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA
를 포함한다.
80. 양태 79의 항체로서,
(i) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:44)를 포함하고;
(ii) LCDR2는 다음 서열: KISRLEA (서열 번호:45)를 포함하고;
(iii) LCDR3는 다음 서열: FQGSHFPRT (서열 번호:46)를 포함하고;
(i) HCDR1은 다음 서열: SYTMS를 포함하고;
(ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고;
(iii) HCDR3는 다음 서열: YYRYEAWFAS를 포함한다.
81. 양태 79 또는 80의 항체로서, 항체의 VL 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25); 항체의 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하거나 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다: EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
82. 양태 73-81 중 어느 하나의 항체로서, 항체는 MDR-1에 특이적으로 결합하는 단일특이적 2가 항체이다.
83. 양태 73-81 중 어느 하나의 항체로서, 항체는 공통 겨오새로서 VL 사슬을 포함하는 이중특이적 항체이다.
84. 양태 83의 항체로서, 이중특이적 항체는 MDR-1 결합 도메인 및 종양 관련된 항원 (TAA) 결합 도메인을 포함하며 MDR-1 결합 도메인 및 TAA 결합 도메인은 각각 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함한다.
85. 양태 84의 항체로서, TAA는 CD47이고 TAA 결합 도메인은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS.
86. 양태 85의 항체로서, CD47 결합 도메인의 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH, 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD, 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY를 포함한다.
87. 양태 84의 항체로서, TAA는 PD-L1이고 PD-L1 결합 도메인은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32).
88. 양태 87의 항체로서, PD-L1 결합 도메인의 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: DSWIH (서열 번호:33), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:34), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: RHWPGGFDY (서열 번호:35)를 포함한다.
89. 양태 84의 항체로서, TAA는 EGFR이고 EGFR 결합 도메인은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR을 포함한다:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36).
90. 양태 89의 항체로서, EGFR 결합 도메인의 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: SGDYYWS (서열 번호:37), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS (서열 번호:38), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: VSIFGVGTFDY (서열 번호:39)를 포함한다.
91. 양태 84의 항체로서, TAA는 EGFR이고 EGFR 결합 도메인은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR을 포함한다:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40).
92. 양태 91의 항체로서, EGFR 결합 도메인의 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYGVH (서열 번호:41), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열 번호:42), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: ALTYYDYEFAY (서열 번호:43)를 포함한다.
93. 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR (LCDR)을 포함하는 가변 경쇄 (VL):
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다); 또는
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25); 및
다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR (HCDR)을 포함하는 가변 중쇄 (VH):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS; 또는
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32); 또는
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36); 또는
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40)
를 포함하는 항체.
94. 양태 93의 항체로서, VL 사슬은 (i) 다음 서열: RSSQSIVHSTGX1TYLE (서열 번호:5)를 포함하는 LCDR1; (ii) 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하는 LCDR2; 및 (iii) 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하는 LCDR3 (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다)를 포함하고 VH 사슬은
(i) 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH, 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD, 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY; 또는
(ii) 다음 서열을 포함하는 HCDR1: DSWIH (서열 번호:33), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:34), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: RHWPGGFDY (서열 번호:35); 또는
(iii) 다음 서열을 포함하는 HCDR1: SGDYYWS (서열 번호:37), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS (서열 번호:38), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: VSIFGVGTFDY (서열 번호:39); 또는
(iv) 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYGVH (서열 번호:41), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열 번호:42), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: ALTYYDYEFAY (서열 번호:43)
를 포함한다.
95. 양태 93의 항체로서, VL 사슬은 (i) 다음 서열을 포함하는 LCDR1: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:44); (ii) 다음 서열을 포함하는 LCDR2: KISRLEA (서열 번호:45); 및 (iii) 다음 서열을 포함하는 LCDR3: FQGSHFPRT (서열 번호:46)를 포함하고 VH 사슬은
다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH, 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD, 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY; 또는
다음 서열을 포함하는 HCDR1: DSWIH (서열 번호:33), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:34), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: RHWPGGFDY (서열 번호:35); 또는
다음 서열을 포함하는 HCDR1: SGDYYWS (서열 번호:37), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS (서열 번호:38), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: VSIFGVGTFDY (서열 번호:39); 또는
다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYGVH (서열 번호:41), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열 번호:42), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: ALTYYDYEFAY (서열 번호:43)
를 포함한다.
96. 양태 93-95 중 어느 하나의 항체로서, 항체는 이중특이적 항체이다.
97. 양태 1-96 중 어느 하나의 항체로서, 항체는 인간화된 항체 또는 인간 Fc 도메인을 포함하는 키메라 항체이다.
98. 양태 97의 항체로서, 면역글로불린 G1 (IgG1) Fc 도메인을 포함한다.
99. 양태 1-98 중 어느 하나의 항체로서, 제1 VH 사슬은 제1 Fc 도메인에 융합되고 제2 VH 사슬은 제2 Fc 도메인에 융합된다.
100. 양태 99의 항체로서, Fc 도메인은 제1 VH 사슬 및 제2 VH 사슬을 포함하는 헤테로다이머를 우선적으로 형성하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
101. 양태 100의 항체로서, 제1 및 제2 Fc 도메인은 인간 면역글로불린 G1 (IgG1) Fc 도메인이다.
102. 양태 1 내지 양태 101 중 어느 하나의 항체; 및
약학적으로 허용 가능한 부형제
를 포함하는 약학적 조성물.
103. 양태 102의 약학적 조성물로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제를 더 포함한다.
104. 양태 103의 약학적 조성물로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학요법제를 포함한다.
105. 양태 104의 약학적 조성물로서, 화학요법제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린이다.
106. 양태 103 내지 105 중 어느 하나의 약학적 조성물로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 다중약물 저항성 수송체의 억제자를 포함한다.
107. 양태 103의 약학적 조성물로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 면역요법제를 포함한다.
108. 양태 1 내지 107 중 어느 하나의 항체를 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산.
109. 양태 108의 하나 이상의 핵산으로서, 하나 이상의 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
110. 양태 108 또는 109의 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터.
111. 양태 110의 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 유전적으로 변형된 포유류 세포.
112. 양태 111의 세포로서, 세포는 면역 세포이다.
113. 양태 1 내지 63 및 73-101 중 어느 하나의 항체 또는 그 항체를 암호화하는 핵산; 및
적어도 하나의 추가적인 활성제
를 포함하는 키트.
114. 양태 113의 키트로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학요법제, 다중약물 저항성 수송체의 억제자, 면역요법제, 또는 이것들의 조합을 포함한다.
115. 암 세포를 살해하는 방법으로서, 방법은 암 세포를 양태 1 내지 63 및 73-101 중 오느 하나의 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
116. 양태 115의 방법으로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제를 투여하는 단계를 더 포함한다.
117. 양태 116의 방법으로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학요법제를 포함한다.
118. 양태 116 또는 117의 방법으로서, 방법은 적어도 하나의 추가적인 활성제와 단독으로 접촉할 때와 비교하여 암 세포의 살해를 적어도 5%만큼 증가시킨다.
119. 양태 115 내지 118 중 어느 하나의 방법으로서, 암 세포는 약물 저항성 암 세포이다.
120. 암에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 양태 1 내지 63 및 73-101 중 어느 하나의 항체 또는 양태 102-107 중 어느 하나의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
121. 양태 120의 방법으로서, 대상체는 이전에 암에 대해 치료되었다.
122. 양태 120 또는 121의 방법으로서, 암은 약물 저항성 또는 다중약물 저항성이다.
123. 양태 122의 방법으로서, 암은 화학치료제에 대해 저항성이다.
124. 양태 122의 방법으로서, 암은 면역요법제에 대해 저항성이다.
125. 양태 120 내지 122 중 어느 하나의 방법으로서, 암은 다중약물 저항성 수송체의 억제자에 대해 저항성이다.
126. 양태 120 내지 125 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.
127. 양태 126의 방법으로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학요법제를 포함한다.
128. 양태 127의 방법으로서, 화학요법제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린이다.
129. 양태 126 내지 128 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 다중약물 저항성 수송체의 억제자를 포함한다.
130. 양태 126 내지 128 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 면역요법제를 포함한다.
131. 양태 126 내지 128 중 어느 하나의 방법으로서, 방법은 적어도 하나의 추가적인 활성제 단독으로의 치료와 비교하여 적어도 하나의 추가적인 활성제의 효과를 증가시킨다.
132. 양태 131의 방법으로서, 증가된 효과는 암 세포 살해의 적어도 5% 증가를 포함한다.
133. 양태 120 내지 132 중 어느 하나의 방법으로서, 암이 MDR1을 사전 결정된 임계치보다 더 많이 발현하는지, 종양 관련된 항원 (TAA)을 사전 결정된 임계치보다 더 많이 발현하는지, 또는 둘 다인지를 결정하기 위해 암의 샘플을 분석하는 단계를 더 포함하며, 선택적으로 TAA는 CD47을 포함한다.
134. 양태 133의 방법으로서, 사전 결정된 임계치는 참조 세포에 의해 발현된 MDR1 및/또는 TAA의 수준에 상응한다.
135. 양태 134의 방법으로서, MDR1 및/또는 TAA는 참조 세포에서 넉아웃되거나 넉다운되었다.
136. 양태 134 또는 135의 방법으로서, 참조 세포는 비-암성 세포이다.
137. 양태 134의 방법으로서, 비-암성 세포는 MDR1 및/또는 TAA를 정상 수준으로 발현한다.
138. 양태 120 내지 137 중 어느 하나의 방법으로서, 암이 MDR1 및 TAA를 사전 결정된 임계치 이상으로 발현하면 대상체는 다중특이적 항체가 투여되고, 암이 MDR1 또는 TAA를 사전 결정된 임계치 미만으로 발현하면 대상체는 다중특이적 항체를 투여하지 않는 통상적인 요법으로 치료된다.
139. 다중약물 저항성 단백질 1 (MDR1) 및 종양 관련된 항원 (TAA) 둘 다를 발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체를 생성하는 방법으로서, 선택적으로 TAA는 CD47, PD-L1, 또는 EGFR를 포함하고, 방법은
MDR1-결합 도메인 및 TAA-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체를 생산하는 단계;
MDR1 및 TAA를 발현하는 제1 세포를 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계;
MDR1 또는 TAA를 발현하는 제2 세포를 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계;
결합 특이성 비율을 결정하기 위해 제1 세포로의 다중특이적 항체의 결합을 제2 세포로의 다중특이적 항체로의 결합과 비교하는 단계
비율이 사전 결정된 임계치보다 높을 때 다중특이적 항체가 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 세포에 특이적인 것으로 확인하는 단계
를 포함한다.
140. 양태 139의 방법으로서, 사전 결정된 임계치는 2:1보다 크다.
141. 양태 139 또는 140의 방법으로서, 제2 세포는 MDR1을 발현하지만 TAA는 발현하지 않고 방법은 TAA를 발현하지만 MDR1을 발현하지 않는 제3 세포를 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
142. 양태 139 또는 140의 방법으로서, 방법은 제1 세포, the 제2 세포, 및/또는 제3 세포를 단일특이적 항-MDR1 항체 및 단일특이적 항-TAA 항체로부터 선택된 대조군 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
143. 유전적으로 변형된 인간 세포주로서, 세포주는 종양 관련된 항원 (TAA)을 발현하고 MDR1의 과발현을 위해 다중약물 저항성 단백질 1 (MDR1)을 암호화하는 서열을 포함하는 외인성 핵산을 포함하며, 선택적으로 TAA는 백혈구 표면 항원 CD47를 포함한다.
144. 양태 143의 세포주로서, 세포주는 신장 세포주이다.
145. 양태 144의 세포주로서, 세포주는 HEK 293T 세포주이다.
146. 양태 143 내지 145 중 어느 하나의 세포주를 제조하는 방법으로서, 방법은 외인성 핵산을 세포로 도입하기에 충분한 조건 하에 TAA를 발현하는 인간 세포를 외인성 핵산과 접촉시켜 TAA를 발현하고 MDR1을 안정하게 과발현하는 유전적으로 변형된 인간 세포를 생산하는 단계; 및
TAA를 발현하고 MDR1을 안정하게 과발현하는 유전적으로 변형된 인간 세포주를 생산하기에 충분한 조건 하에 유전적으로 변형된 인간 세포를 배양하는 단계
를 포함한다.
다음 실시예(들)는 제한하는 것이 아니라 예시의 방법으로 제공된다.
실시예
다음 실시예는 당업자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방법의 완벽한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되고 발명자가 본 발명으로 간주하는 것들의 범위를 제한하려는 의도가 아니며 그것들은 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내려는 의도이다. 사용된 수치 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하려는 노력이 이루어졌지만 일부 실험적 오차 및 편차를 고려해야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 근처이다.
분자 및 세포 생화학에서 일반적인 방법은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998) (이것들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)와 같은 표준 교과서에서 발견될 수 있다. 본 방법에서 언급되거나, 또는 그것에 관한 시약, 클로닝 벡터, 세포, 및 키트는 BioRad, Agilent Technologies, Thermo Fisher Scientific, Sigma-Aldrich, New England Biolabs (NEB), Takara Bio USA, Inc., 등과 같은 상업적 판매사, 뿐만 아니라, 예를 들어, Addgene, Inc., American Type Culture Collection (ATCC), 등과 같은 저장소로부터 이용 가능하다.
실시예 1: 단백질의 발현이 감소되거나 없는 세포가 아니라, Pgp (MDR1) 및 CD47을 동시에 발현하는 세포에 특이적으로 결합하고, 재감작하는 이중특이적 mAb의 생성
이 실시예는 암 세포에 의해 발현되는 항원을 특이적으로 표적화하면서 선택적인 방식으로 EP의 세포 외 도메인에 결합함으로써 유출을 효과적으로 차단할 수 있는 항체 포맷을 기반으로 하는 분자의 개발을 입증한다. EP 차단은 화학치료제에 대해 저항성이거나 저항성이 되는 세포의 재감작 및 살해를 초래한다. 이 실시예에서 EP의 세포 외 도메인 (ECD)에 결합하여, 암 면역 체크포인트 단백질을 표적화하면서 유출을 차단하는 이중특이적 항체 분자가 구성되었다. 하기 기재된 이중특이적 항체의 적용은 EP가 표적화된 면역 체크포인트 단백지로가 함께 동시-발현될 때 선택적인 방식으로 세포를 화학치료제에 재감작시킨다.
재료 및 방법
세포주 및 세포 생존력 실험
Pgp를 발현하는 HEK 293T, MCF-7, N6ADR 및 SKNF7 세포주를 American Type Culture Collection으로부터 얻었다. N6/ADR 세포는 또한 NALM6/ADR 세포라고도 불린다. 그것들로부터 유래된 모든 세포주들을 가습 인큐베이터 내에서 37 ℃ 및 5% CO2에서 최대 10% 소 태아 혈청 (Sigma), 비필수 아미노산, 및 2 mmol/L L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640 또는 DMEM에서 유지하였다 (달리 지시되지 않는 한). 세포를 공급된 대로 사용하거나 Pgp를 과발현하도록 변형시키거나 (Ox) Pgp 또는 렌티바이러스-매개된 짧은 헤어핀(hairpin) RNA로 넉다운된 (KD) Pgp 발현 또는 근본적으로 기재된 바와 같이 CRISPR/Cas-매개된 넉아웃 기술에 의한 기능적 CD47 유전자의 넉아웃 (KO)을 갖게 하였다 (Cong, L. et al. (2013) Science 339, 819-823). 빈크리스틴 및 파클리탁셀 IC50 결정을 위해, 세포를 정상 성장 배지에 평판배양하고 밤새도록 부착시켰다. 파클리탁셀 또는 빈크리스틴 (Sigma)을 단계 희석하여 추가하였고 임의의 조절자를 0 내지 500μM/L의 범위 내에서 추가하였다. Celltiter-Glo 발광 세포 생존력 분석 (Promega)을 사용하여 72 h 후에 세포 생존력을 측정하였다. 세포 생존력의 50% 억제를 초래하는 약물의 농도 (IC50)를 다중 변수 곡선 분석 (GraphPad Prism software GraphPad Software, Inc.)으로부터 계산하였고 최소 2회 반복으로부터 결정하였다. 실행된 대부분의 실험에서 약물 및/또는 조절자 처리에 반응하여 세포 생존력의 50% 감소를 나타내지 않은 세포주는 정의상 IC50에 도달하지 않은 것으로 간주되었고 파클리탁셀 또는 연구 중인 약물 / 조절자 조합에 대해 >1000 nmol/L의 IC50을 나타내는 것으로 나열되었다.
기재된 단클론성 항체 (mAb)를 안정하게 발현하는 재조합 세포주를 또한 생산하였다.
재조합 DNA 기술
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989에 기재된 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 제조사의 지시에 따라 시약을 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오타이드 서열에 관한 일반적인 정보는 Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242에서 제공된다. 항체 사슬의 아미노산을 Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1991)에 따라 넘버링하고 언급하였다.
DNA 서열 결정
DNA 서열을 이중 가닥 시퀀싱에 의해 결정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
벡터 NTI (ThermoFisher) 소프트웨어 패키지를 서열 맵핑(mapping), 분석, 주석 및 예시에 사용하였다.
세포 배양 기술 및 항체 생산
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S., Dasso, M., Harford, J. B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K. M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.에서 기재된 표준 세포 배양 기술을 사용한다.
293 & CHO 세포를 mAb, Fab'2, Fab 및 이중특이적 mAb의 일과성 생산에 사용하였다. 상이한 항체 작제물을 Expi293 세포 (A14527, ThermoFisher)의 폴리머-기반 동시-트랜스펙션을 사용하여 발현시켰다. 세포를 제조사의 권고에 따라 포유류 발현 벡터가 들어있는 현탁액에서 성장시켰다.
이중특이적 작제물의 제조를 위해서, 세포를 1:1:4 비 (중쇄 KK: 중쇄 DD: 경쇄)로 상응하는 발현 벡터로 트랜스펙션하였다. 표준 항체 발현을 위해 1:2 비 (중쇄: 경쇄)를 사용하였다.
트랜스펙션 후 6일에 세포를 원심분리에 의해 수확하였다. 상세히 말하면, 트랜스펙션된 배양물 1ml 당 총 암호화 DNA 1 μg을 Opti-MEM® 배지 (Life Technologies)에 희석하고, 동일한 배지에서 20분 동안 Expifectamine 시약 (Life Technologies)과 함께 인큐베이션하였다. 그 다음에 혼합물을 공지 중의 8%의 CO2의 오버레이(overlay)와 함께 37℃에서 250만 개의 세포/ml로 Expi293® 발현 배지 (Life Technologies) 중의 현탁액에서 성장하고 있는 Expi293® 세포에 추가하였다. 6일 후, 항체 작제물을 함유하는 배지를 원심분리에 의해 수확하였다.
테스트에 사용된 시약 세포주: 결합, 유출 차단, 화학치료제에 대한 세포 감작
인간 배아 신장 (HEK) 세포주 HEK 293FT (Life Technologies)를 37℃에서 5% CO2 인큐베이션으로 10% 소 태아 혈청 (HyClone), 2 mM GlutaMAX (Life Technologies), 100 U/mL 페니실린, 및 100 g/mL 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's Medium: DMEM)에서 유지하였다.
293T 세포를 최적화된 PEIPro™ 트랜스펙션 프로토콜 (Polyplus)을 사용하여 pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro 플라스미드 내 인간 P 당단백질 태그된(tagged) ORF 클론으로 일과성으로 트랜스펙션하였다. DNA 및 JetPEI®를 대략 10min 동안 부드럽게 혼합하기 전에 각각 배양 배지에서 희석하였다. 이 혼합은 트랜스펙션 복합체의 형성으로 이어지며, 이것을 세포 배양물이 직접적으로 추가하였다. 유출 차단을 제조사의 프로토콜에 따라 다중약물 저항성 직접 염료 유출 분석 (Chemicon)을 사용하여 측정하였다.
표적 서열, 항체 서열 및 특이적 항-표적 항체 서열의 공급처
pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro 내에서, 다중약물 저항성 단백질 1 (MDR1)로도 알려져 있는, P 당단백질 (Pgp), (유전자 ABCB1) (NM_000927) 인간 태그된 ORF 클론을 Origene, Biolegend의 항 CD47 항체 (CC2C6, Seiffert M, et al. (1999) Blood 94:3633), Millipore의 항-ABCB1 JSB-1 (MAB4120)로부터 얻었다.
안정한 ABCB1 과발현 (Ox) 세포주의 생성
결합 및 시험관내 효율 둘 다를 특성화하기 위해서, ABCB1을 안정하게 과발현하는 세포주를 개발하였다. American Type Culture Collection (ATCC)로부터 얻은 부착성 293T 나이브 세포를 이용하였다.
상업적으로 이용 가능한 ABCB1 항체 (Biolegend, clone 4E3.16)를 사용한 유동세포분석법에 의해 특성화된 바와 같이, 이 세포주는 세포 표면 상에서 ABCB1을 낮거나 중간 정도로 내인성으로 발현한다. 293T 나이브 세포를 Polyplus PEIpro 시약을 사용하여 ABCB1로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 3일에, 하이그로마이신 B 용액 (Millipore Sigma)을 사용하여 세포를 선택하였다. 지속적인 하이그로마이신 B 선택 후 14일에 293T 세포를 ABCB1 세포 표면 발현에 대해 평가하였다. 트랜스펙션되지 않은 세포가 미래의 배양에서 확장되지 않는다는 것을 보장하기 위해서, ABCB1 양성 293T 세포의 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 사용하는 일괄 분류를 FACSAriaI (BD Biosciences)를 사용하여 수행하였다. 일괄 분류된 293T ABCB1 과발현 세포를 확장시켰고 ABCB1 과발현을 이후에 재확인하였다. 유사한 방법을 사용하여 본원에서 기재된 바와 같이 생성된 293T-CD47 넉아웃 세포로부터 ABCB1 과발현 세포를 생성하였다.
안정한 ABCB1 KD 293T 세포주의 생성
결함 및 시험관내 효율 둘 다를 특성화하기 위해서, ABCB1 발현이 안정하게 넉다운된 세포주를 개발하였다. R8.74 헬퍼 플라스미드, VSVG 외피 플라스미드, 및 ABCB1에 대한 shRNA를 함유하는 GE Dharmacon GIPZ 렌티바이러스 벡터로 트랜스펙션하여 293T 나이브 세포에서 렌티바이러스를 생산하였다. 그 다음에 수확된 렌티바이러스를 사용하여 부착성 293T 나이브 세포에 형질도입하였다. 형질도입 후 3일에, 293T 형질도입된 세포를 유동세포분석법 (Biolegend, 클론 4E3.16)에 의해 ABCB1 세포 표면 발현에 대해 평가하였다. ABCB1을 내인성으로 낮은 수준으로 발현하는 293T 나이브 세포와 비교된 바와 같이, 형질도입된 293T 세포는 ABCB1을 발현하지 않았다. 이에 더하여, GIPZ 렌티바이러스 벡터는 GFP를 함유한다. 모든 형질도입된 293T 세포는 GFP+이며, 발현의 감소와 함께, 형질도입이 성공적이었음을 나타낸다. ABCB1 발현의 결핍을 이후의 계대배양에서 유동세포분석법에 의해 재확인하였다.
KO 세포주의 생성
ABCB1, 및 CD47 유전자 넉아웃 HEK293 세포주를 구성하기 위해서, HEK293 숙주 세포를 먼저 10% (v/v) FBS, 및 글루타민으로 보충된 DMEM (둘베코 변형 이글 배지, Gibco, Grand Island, N.Y., USA)에서 부착성 배양을 통해 배양하였다. 세포를 포화 습도에서 37℃에서 5% CO2로 배양하였다.
CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1 또는 TALEN-관련 돌연변이 유발을 위한 표적 부위를 선택하기 위해 gRNA의 디자인을 온라인 CHOPCHOP 웹 개발 도구를 사용하여 수행하였다. (Kornel Labun et al., (2016). Nucleic Acids Research; 및 Tessa G. Montague et at., (2014) Nucleic Acids Res. 42:W401-W407 참조). 모든 디자인된 gRNA를 화학적으로 합성하였다 (ThermoFisher).
293T 세포의 트랜스펙션을 제조사의 프로토콜에 따라 CRISPRMax 시약 (ThermoFisher)을 사용하여 지질-기반 트랜스펙션에 의해 수행하였다. 간략히 말하면, 트랜스펙션 하루 전에, 부착성 세포를 웰 당 0.2 x 105개의 세포로 96웰 플레이트에 평판배양하였다. 트랜스펙션 당일에, GeneArt Platinum Cas9 단백질, gRNA 및 트랜스펙션 시약의 용액을 세포에 추가하였다. 트랜스펙션 후 72 h에, 제한 희석 방법에 의한 단일 세포의 선택 이후 2주 동안 96웰 플레이트 포맷에서 세포 배양을 계속하였다. 이후에, 선별된 클론을 24웰 플레이트로 계대배양하고 제조사의 프로토콜에 따라 Guide-it 키트 (Takara)를 사용하여 유전자형 확인에 의해 테스트하였다. 각각의 유전자에 대한 CRISPR 표적 부위를 둘러싼 게놈 영역을 PCR 증폭하여 유전자 편집이 단일 단리된 클론에서 하나의 대립유전자 (단일대립유전자성) 또는 두 개의 대립 유전자 (이중대립유전자성)에 대한 삽입-결실(indel)을 초래하는지를 결정하였다. 대립유전자 둘 다에서 돌연변이를 가진 클론 상에서 관심있는 단백질의 발현을 FACS에 의해 테스트하였다.
테스트된 분자 (인간 Fc, 마우스 Fvs)의 인간-마우스 서열의 구성
발현 벡터: 항체 발현 벡터의 생성을 위해, 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 포유류 세포주에서의 발현에 대해 최적화된 각각의 포괄적인 수령체 발현 벡터로 사전 삽입된 인간 IgG1 불변 중쇄 또는 인간 IgG1 카파 불변 경쇄로 프레임 내에서(in frame) 서브클로닝하였다. 발현되어야 하는 유전자를 높은 수준의 유전자 발현을 위해 전장 인간 시토메갈로바이러스 (CMV) 급초기 프로모터를 사용하는 pCI-neo 포유류 발현 벡터 (Promega)에 클로닝하였다. 2개의 항체 사슬을 2개의 상이한 벡터에 클로닝하였다.
마우스 IgG 중쇄 및 카파 경쇄의 N-말단 신호 서열을 중쇄 및 경쇄 각각의 분비된 발현에 사용하였다. 신호 펩타이드를 발현 중에 분열시켜, 온전한 N-말단을 남겨두었다. Fab 작제물에서, CH1 IgG1 불변 영역의 C-말단을 정제를 용이하게 하기 위해 6Х His 태그와 융합시켰다.
이중특이적 항체 벡터의 생성을 위해, IgG1 유래된 이중특이적 분자는 2개의 별개의 표적, Pgp (ABCB1) 및 CD47에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 2개의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 항원 결합 모이어티는 중쇄 및 경쇄로 구성된 Fab 단편이며, 각각 가변 및 불변 영역을 포함한다. Fab 항-Pgp (aPgp) 및 Fab 항-CD47 (aCD47) 둘 다로서 쌍을 형성하고 허용 가능한 결합에 영향을 미칠 수 있는 공통 경쇄를 확인하였으며; 그것의 사용은 LC 쌍 형성 오류(mispairing)의 방지르 가능하게 하였다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,765,412 (그 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 정전기 스티어링 효과를 기반으로 이중특이적 작제물을 제조하였다. (예를 들어, Gunasekeran et al, (2010) Journal of Biological Chemistry 285, 19637-19646 (그 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 간략히 말하면, 표적에 대한 폴리펩타이드 사슬 또는 절반 항체는 CH3 도메인에서 전하 쌍 치환을 통해 이중특이적 항체로서 조립되며; 하나의 중쇄는 K392D 및 K409D 치환을 함유하고 다른 것은 E356K 및 D399K 치환을 함유하였다.
도 2는 MRK16으로부터 유래된 공통 경쇄 카파 서열인 C와 함께 둘 다 인간 IgG1Fc 상의 A, 15D3; B, 5F9의 서열을 함유하는 섹션을 포함하는 이중특이적 mAb의 도표를 제공한다.
Pgp에 대해 이전에 발생한 단클론성 항체 15D3 (예를 들어, 미국 특허 5,959,084 (그 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조) 및 MRK16 (Iwahashi et al., Cancer Research 53, 1993 (그 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨)) 단클론성 항체를 재조합 조작된 항체로서 인간 IgG1/카파 발현 벡터에 클로닝하였다.
마우스 하이브리도마 서열의 가변 중쇄 및 경쇄 단편이 이용 가능하고 선도 서열 및 불변 영역의 동일한 백그라운드에 클로닝하였다.
항 CD47 (5F9; 예를 들어, 미국 특허 번호 9,017,675 (그 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조) 항체 가변 중쇄 및 경쇄 단편을 2개의 별개의 벡터에서 선도 서열 및 불변 영역의 동일한 백그라운드에 클로닝하였다.
이들 및 다른 중쇄 및 경쇄 단편의 많은 조합을 생성하여 테스트하였다. 대부분의 테스트된 작제물은 허용 가능한 결합 또는 활성을 생성하지 않았다. 구성되어 테스트된 항체, 뿐만 아니라 그것들의 결합 및 세포 살해 성질의 예는 도 8에서 제공된다.
도 8은 상이한 이중특이적 항체에 의한 결합 및 향상된 세포 살해의 비교 (다양한 인간화된 또는 키메라화된 중쇄 또는 경쇄 조합과의 비교)를 제공한다. 특이적으로, 도 8의 컬럼 1 ("Ab")은, 예를 들어, 1열에서 테스트된 다양한 이중특이적 포맷을 제공한다: 15D3 IgG1 DD/5F9 IgG1 KK/MRK16은 i) 본원에서 기재된 DD CH3 돌연변이를 가진 15D3 중쇄 서열 (인간 IgG1 프레임워크에서 키메라화됨), ii) 본원에서 기재된 KK CH3 돌연변이를 가진 5F9 중쇄 서열, 및 iii) MRK16 경쇄 (인간 IgG 카파 프레임워크에서 키메라화됨)를 나타낸다. 나타나있는 모든 경쇄는 인간 카파 포맷으로 되어있다. 결합 (도 8, col. 2-3; "Kd (nM)" 및 "Bmax") 및 살해 (도 8, col. 3; "Killing")를 다음과 같이 결정하였다: "Kd (nM)", ELISA에 의한 결합 (플레이트 상의 캡쳐층으로서 Fc-태그된 CD47을 가진 고체상); "Bmax", "Kd (nM)"에 대해 기재된 플레이트로의 Bmax 결합; "Killing", 파클리탁셀 적정 (20μM - 10-8 μM 범위)의 존재시 향상된 293 나이브 세포-살해 (감작); "-" = 0, "±" = 0 내지 0.5 로그(Log) 이동 (50% 세포 살해 곡선에서), "+" = 1 내지 2 로그 이동, "++" ≥ 2 로그 이동. 컬럼 5-8 ("Binding (293)", "Binding (293 KO CD47)", Binding (293 KO CD47, OX ABCB1)", 및 "Binding (293 OX ABCB1)")은 비-결합 대조군 항체와 비교하여 지시된 세포주로의 항체 결합의 FACS 평균 형광 강도를 제공한다: "-" = ~zero, "±" = 0 내지 ~0.5 로그 이동, "+" = ~1 로그 이동, "++" = 1 - >2 로그 이동 (비-결합 대조군 및 결합 항체의 예로서 도 3A 참조).
구성되어 테스트된 상기 항체들이, 특히 주요 후보와 비교하여, MDR1 및 CD47 둘 다를 발현하는 표적 세포의 허용 불가능한 결합 특성 또는 비효율적인 살해를 나타낸다는 것이 중요하다.
예를 들어, 도 8에서 나타난 바와 같이, 15D3 및 5F9 중쇄 전하 대 전하 교환된 Fc 영역 및 공통 MRK16 유래된 경쇄를 함유하는 항체 ("15D3 IgG1 DD/5F9 IgG1 KK/MRK16")를 테스트하여 바람직한 결합 특성을 나타냈고 MDR1 및 CD47 둘 다를 발현하는 표적 세포의 향상된 살해 (++)를 생산하였다. 따라서 이 항체를 주요 후보로서 선택하였다. 비교해 보면, 주요 후보 (즉, "MRK16")의 공통 경쇄가 대안의 공통 경쇄, 예컨대 "UIC2" (예를 들어, "15D3 IgG1 DD/5F9 IgG1 KK/UIC2" 참조) 또는 "9F11" (예를 들어, "15D3 IgG1 KK/5F9 IgG1 DD/9F11" 참조) 경쇄로 치환될 때, 근본적으로 CD47 및 MDR1 둘 다를 발현하는 세포의 특이적 살해가 관찰되지 않았다. 이에 더하여, 대안의 항-MDR1 중쇄, 예컨대 "MM4.17 2" 또는 "UIC2" 중쇄를 "15D3" 중쇄에 대해 치환하는 것은 또한 CD47 및 MDR1 둘 다를 발현하는 세포의 크게 감소된 특이적 살해를 초래하였다 (예를 들어, 도 8, 예를 들어, "MM4.17 2 IgG1 DD/5F9 IgG1 KK/MRK16" 및 "UIC2 IgG1 KK/5F9 IgG1 DD/MRK16" 참조).
항원을 발현하는 항체 결합 세포 상에서 이용된 경쇄를 교환하는 것 (즉, "LC 셔플(shuffle)")의 효과를 ELISA 및 FACS 결합 분석으로 평가하였다. CD47-특이적 중쇄와의 LC 셔플링을 테스트하는데 있어서, 변형된 항-CD47 중쇄 (5F9)를 M89, 15D3, MRK16 또는 UIC2 경쇄와 조합하고 결합을 평가하였다. ELISA에 의해 CD47-Fc 코팅된 플레이트로의 다양한 항-MDR1 분자의 이중특이적 항체 결합에 대한 LC 셔플의 효과를 나타내는 결과는 표 2에서 제공된다:
5F9/5F9 5F9/M89 5F9/15D3 5F9/MRK16 5F9/UIC2
Bmax 2.782 4.22 2.957 2.939 3.076
Kd (nM) 0.001968 1510 0.2571 0.1695 6.297
상기 표에서 교환되지 않은 5F9 대조군과 비교하여 5F9/MRK16의 조합에서 친화도의 100배 감소가 나타났다는 것이 중요하다. 5F9/MRK16 조합과 유사한 CD47에 대한 Kd를 가진 항체가 바람직하며 그것들이 이중특이적 항체가 정상 세포로의 낮은 결합 및 정상 세포보다 더 높은 수준으로 CD47을 발현하는 암 세포에 대해 증가된 특이성을 나타내도록 이중특이적 포맷으로 사용될 때 특이성의 필수적인 정도를 제공하기 때문이다.
ELISA에 의해 측정된 바와 같이 CD47로의 결합에 대하여 15D3 중쇄와 UIC2, MRK16 또는 5F9 경쇄의 조합의 효과를 나타내는 LC 셔플 테스트의 결과는 표 3에서 제공된다:
15D3/15D3 15D3/UIC2 15D3/MRK16 15D3/5F9
Bmax 3.202 3.449 3.935 3.095
Kd (nM) 10.9 168.6 229.1 251.9
상기 표에서 교환되지 않은 15D3 대조군과 비교하여 15D3 HC와 MRK16 LC의 조합 이후 ~20배 감소된 CD47에 대한 15D3의 놀라운 친화도가 중요하다.
15D3 및 5F9 중쇄와 공통 MRK16 경쇄의 조합을 가진 후보 작제물은 허용 가능한 결합 및 표적 길항 특성을 나타낸다. 비교하면, 다른 테스트된 중쇄 및 경쇄 조합은 테스트될 때 허용 불가능한 결합 및/또는 표적 세포 살해 결과를 나타냈다. 도 8을 참조하면 된다.
mAb의 정제
Fc를 함유하는 항체 포맷을 정제하기 위해, 상층액 1 ml 당 MabSelect™ SuRe™ (GE Healthcare) 10 μl를 수확된 배지에 추가하였고 4℃에서 밤새도록 계속해서 교반하였다. 다음 날, 단백질 A 레진을 진공 매니폴드 유닛(vacuum manifold unit) (Pall Lifesciences, USA)을 사용하여 24웰 필터 플레이트에 도포하였다. 레진을 PBS로 세척하고 항체를 50 mM 포스페이트 pH 3에서 용출시키고 10x PBS pH 13으로 중화하였다.
Ni Sepharose 6 Fast Flow 히스티딘-태그된 단백질 정제 레진 (GE Healthcare)을 사용하여 동일한 절차에 따라 히스티딘-태그된 Fab를 정제하였다. 비드를 PBS로 세척한 후 이어서 20 mM 이미다졸이 보충된 25 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4, 150 mM NaCl로 세척하였다. 복합체를 500 mM 이미다졸이 보충된 2 부피의 25 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4, 150 mM NaCl로 용출시켰다. 마지막으로, 정제된 Fab를 PBS로 완충제 교환하였다.
서열
Pgp/MDR1은 다음 아미노산 서열을 갖는다:
MDLEGDRNGGAKKKNFFKLNNKSEKDKKEKKPTVSVFSMFRYSNWLDKLYMVVGTLAAIIHGAGLPLMMLVFGEMTDIFANAGNLEDLMSNITNRSDINDTGFFMNLEEDMTRYAYYYSGIGAGVLVAAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRKQFFHAIMRQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQSMATFFTGFIVGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAAVWAKILSSFTDKELLAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNKNLEEAKRIGIKKAITANISIGAAFLLIYASYALAFWYGTTLVLSGEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPSIEAFANARGAAYEIFKIIDNKPSIDSYSKSGHKPDNIKGNLEFRNVHFSYPSRKEVKILKGLNLKVQSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPTEGMVSVDGQDIRTINVRFLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGRENVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPHKFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQVALDKARKGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDDGVIVEKGNHDELMKEKGIYFKLVTMQTAGNEVELENAADESKSEIDALEMSSNDSRSSLIRKRSTRRSVRGSQAQDRKLSTKEALDESIPPVSFWRIMRLNLTEWPYFVVGVFCAIINGGLQPAFAIIFSKIIGVFTRIDDPETKRQNSNLFSLLFLALGIISFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFRSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGAIGSRLAVITQNIANLGTGIIISFIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGSGKIATEAIENFRTVVSLTQEQKFEHMYAQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAMMYFSYAGCFRFGAYLVAHKLMSFEDVLLVFSAVVFGAMAVGQVSSFAPDYAKAKISAAHIIMIIEKTPLIDSYSTEGLMPNTLEGNVTFGEVVFNYPTRPDIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPLAGKVLLDGKEIKRLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSIAENIAYGDNSRVVSQEEIVRAATEANIHAFIESLPNKYSTKVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVFQNGRVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGTKRQ.
Pgp/MDR1을 암호화하는 핵산 서열이 이용 가능하다: P 당단백질 (ABCB1) (NM_000927) 인간 게놈 DNA 호모 사피엔스(Homo sapiens) ATP 결합 카세트 서브패밀리 B 구성원 1 (ABCB1), 염색체 7 상의 Ref Seq Gene (NG_011513 gen).
CD47을 암호화하는 핵산 서열이 이용 가능하다: 호모 사피엔스 CD47 분자 (CD47), 전사물 변이체 1, mRNA NCBI Reference Sequence: NM_001777.3.
항 CD47 5F9 항체 가변 중쇄 서열은 다음과 같다:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS.
항-CD47 5F9 항체 가변 경쇄 서열은 다음과 같다:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIK.
항-MDR1 MRK16 항체 가변 중쇄 서열은 다음과 같다:
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
MRK16 항체 가변 경쇄의 서열은 다음과 같다:
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK.
항체 15D3 서열은 미국 특허 번호5849877로부터 이용 가능하며, 항체 15D3 중쇄 서열은 다음과 같고:
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA,
항체 15D3 경쇄 서열은 다음과 같다:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK.
본원에서 기재된 바와 같이 이용된 항-MDR1 UIC2 항체 경쇄의 서열은 다음과 같다:
DVVMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPPWTFGGGTKLDIK.
본원에서 기재된 바와 같이 이용된 항-MDR1 UIC2 항체 중쇄의 서열은 다음과 같다:
AVQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFSNYYIHWVKQSHGKSLEWIGFISCYNGATFYNQKFKGKATFTVDTSSSTAYMKFNSLTFEDSAVYYCARLPIQFGNFYPMDYWGQGTSVTVSS.
본원에서 기재된 바와 같이 이용된 항-MDR1 9F11 항체 경쇄의 서열은 다음과 같다:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK.
본원에서 기재된 바와 같이 이용된 항-MDR1 9F11 항체 중쇄의 서열은 다음과 같다:
EVKLVESGGGLVKFGGSLKLSCAASGFTLSSYYMSWVRQSPEKRLELVAVINSNGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCARPFYYSNSPFAYWGQGTLVTVSS.
본원에서 기재된 바와 같이 이용된 항-MDR1 MM4.17 항체 중쇄의 서열은 다음과 같다:
QVQLQESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGSYTYFPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQVSSLKSEDTAMYYCARPAEFRGYSWFAYWGQGTTVTVSS.
본원에서 기재된 바와 같이 이용된 항-MDR1 M89 항체 경쇄의 서열은 다음과 같다:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGGSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQTNTFPLTFGGGTKVEIK.
본원에서 기재된 바와 같이 이용된 항-MDR1 M89 항체 중쇄의 서열은 다음과 같다:
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQDPGKGLMWVSSISTDGSATKYADSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLRAEDTAVYYCVGGFLGWWGQGTLVTVSS.
결과
정제된 mAb에 대한 생물물리학적 분석 테스트 (GXII 기구, 환원 및 비-환원 단백질)
최종 단백질 조제물의 순도 및 모노머 함유량을 제조사에 의해 기재된 바와 같이 Protein Express LabChip Kit (Perkin -Elmer)를 사용하여 Caliper LabChip GXII 상에서 고처리량 분석에 의해 결정하였다. 칩을 0.2% SDS 및 형광 염색 염료를 함유하는 폴리머 용액으로 기구 상에서 자동으로 프라이밍하였다(primed). 탈색된 채널을 SDS 및 염료가 없는 폴리머 용액으로 채웠다. 간략히 말하면, 환원 및 비환원 조건의 단백질을 소량 (2-5 μL)의 샘플과 DDT가 있거나 없는 캘리퍼스(caliper) 샘플 완충제를 혼합하여 제조하였다. 샘플을 75℃에서 5분 동안 변성시키고, 2000g에서 3분 동안 원심분리시킨 다음, 실행하였다. LabChip GXII Touch 소프트웨어 (Perkin Elmer)에 의해 전기영동도를 생성하였다.
CD47 및 ABCB1 특이적 결합의 검출
mAb, Fab 및 이중특이적 IgG1 표적화 CD47의 결합 특이성을 인간 CD47-Fc 융합 단백질 (R&D systems)을 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 0.5 μg/ml에서 50 μl 정제된 인간 CD47-Fc 융합 단백질로 코팅한 다음, PBS 중의 0.4% BSA 100 μl로 블로킹하였다. 상이한 항체 포맷의 희석액을 각 웰에 1/3 순차 희석으로 추가하였고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 5F9 공지된 항-CD47 항체를 양성 대조군으로 사용하였고, 인간 IgG1을 아이소타입 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 이후에 PBS/Tween으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이션된 당나귀 항-인간 불변 특이적 2차 시약과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 HRP 기질로 현상하였다. 반응을 2M H2S04로 중단시키고, OD를 520 nM에서 측정하였다.
mAb, Fab 및 이중특이적 IgG1의 결합 특이성을 CD47을 자연적으로 발현하는 293T 세포주, 인간 ABCB1 표적을 과발현하는 293T 나이브 세포, 렌티바이러스 RNA 벡터를 사용하여 ABCB1이 넉다운된 293T 나이브 세포, CD47 넉아웃 293T 세포 및 인간 ABCB1을 과발현하는 CD47 넉아웃 293T 세포를 사용하여 FACS에 의해 테스트하였다. 간략히 말하면, 상이한 세포주를 다양한 양의 mAb 또는 이중특이적 mAb, 또는 인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체와 함께 얼음 위에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제 (0.5% BSA를 함유하는 PBS)로 3회 세척하였다. Alexa647 라벨링된 염소 항-인간 항체를 2차 항체로서 추가하였고, 샘플을 얼음 위에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 세척하고 BD FACS Canto (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
이 실시예는 이중특이적 헤테로-2가 항체 분자의 구성을 입증하며, 하나의 아암은 유출 펌프 MDR1/Pgp에 결합하고 다른 아암은 암 체크포인트 단백질 CD47에 결합한다. 두 표적이 세포의 표면 상에 동시에 존재할 때, 이중특이적 항체는 상대적으로 높은 친화도 / 결합력으로 세포에 결합한다. 비교하면, MDR1/Pgp 또는 CD47이 부재이거나, 또는 실질적으로 감소되면, 이중특이적 항체의 결합은 크게 감소하거나 검출 불가능하다. (도 4).
도 2에서 예시된 구성된 이중특이적 항체는 수송체 단백질 (유출 펌프 Pgp)에 결합하여 이에 길항작용하고, 세포를 화학치료제에 대해 더 민감성으로 만드는 하나의 아암 (아암 A)을 함유한다. 동시에 다른 아암 (아암 B)은 IgG1 Fc와 함께, 세포에 대해 더 강렬한 면역 반응을 허용하는 세포 표면 상에서 "면역-돈트 잇트 미(immuno-don't eat me)" 신호 (CD47)에 결합한다.
도 3A-3F는 후보 분자를 테스트하는데 사용된 다양한 시약 세포주의 FACS 결합의 예시를 제공한다. 이들 시약 세포주 중 일부는 방법 및 재료 섹션에서 기재된 바와 같이 수반된 표적; 세포의 존재 또는 부재 및 다양한 항신생물제에 대한 세포의 민감성의 정확하고 분명한 이해를 가능하게 하기 위해 표적 단백질의 넉다운, 넉아웃 또는 과발현으로 조작되었다. 구체적으로, 도 3A는 나이브 293T 세포로의 결합을 나타내고, 도 3B는 293T CD47-KO (넉아웃) 세포로의 결합을 나타내고, 도 3C는 293T Pgp-KD (넉다운) 세포로의 결합을 나타내고, 도 3D는 293T Pgp-ox ('과발현자')로의 결합을 나타내고, 도 3E는 N6ADR (NALM6 아드리아마이신 저항성) 세포로의 결합을 나타내고, 도 3F는 293T CD47-KO+Pgp-ox 세포로의 결합을 나타낸다.
도 4A-4B에서, 이중특이적 항체의 결합은 다양한 세포주에 대한 FACS 분석에 의해 나타난다. 제1 스캔 (도 4A 및 도 4B의 왼쪽 패널)은 두 표적 (Pgp 및 CD47)을 동시-발현하는 세포로의 항체의 결합을 예시한다. 다음 2개의 스캔 (도 4A 및 도 4B의 중간 및 오른쪽 패널)은 Pgp ("KBP1"로 불림, 오른쪽 패널) 또는 CD47 ("KT14"로 불림, 중간 패널)이 세포의 넉다운 (KD) 또는 넉아웃 (KO)일 때 결합의 부재 또는 크게 감소된 결합을 예시한다. 도 4A-4B는 600 nM, 200 nM, 66 nM, 7.4 nM 및 2 nM의 적정된 항체 농도로의 결합을 추가로 나타내며, 신호는 아이소타입으로부터 측정되고 항체 대조군은 제공되지 않는다. 각각의 항체 농도는 도 4A 및 4B의 왼쪽 패널에서 나타나고, 이들 상이한 농도로부터 측정된 신호는 일반적으로 도 4A 및 4B의 중간 및 오른쪽 패널에서 중첩된다. 도 4A 및 도 4B는 항체의 2개의 상이한 배치(batch)로부터 얻어진 결과를 나타낸다.
도 5 및 도 6A-6C는 세포가 15D3.aCD47:MRK16 이중특이적 항체에 의해 결합될 때 (화살표로 강조됨) 항신생물제 파클리탁셀에 의한 향상된 세포 살해를 예시한다. 도 5에서 제공된 데이터는 화학치료제로의 나이브 293T 세포 및 N6ADR 세포의 민감도가, 예를 들어, 화학요법 단독으로의 치료 ("Chemo only") 또는 다른 항체 (15D3:MRK16 Fab; a15D3:MRK16 항체; aCD47:MRK16 항체; aCD47:MRK16 Fab; 및 15D3:9F11 Fab)와 조합된 화학요법으로의 치료와 비교하여 15D3.aCD47:MRK16 이중특이적 항체에 의해 향상되었다는 것을 나타낸다.
도 6A는 GraphPad Prism 소프트웨어, GraphPad Software, Inc를 사용하여 생산된, 도 5에서 제공된 데이터의 형태-맞춤형 플롯을 제공한다. 도 6B는 도 5 및 도 6A에서 나타난 데이터의 재표현을 제공하며, 미가공 데이터 (왼쪽)과 나이브 293T 세포에 대한 맞춤형 데이터 (오른쪽)의 나란한 비교를 나타낸다. 도 6C는 도 5 및 도 6A에서 나타난 데이터의 재표현을 제공하며, 미가공 데이터 (왼쪽)와 N6ADR 세포에 대한 맞춤형 데이터 (오른쪽)의 나란한 비교를 나타낸다. 종합해보면, 이들 데이터는 15D3.aCD47:MRK16 이중특이적 항체의 존재시 화학치료제에 대한 표적 Pgp 및 CD47을 동시-발현하는 2개의 상이한 약물 저항성 세포주 (293T 및 N6ADR)의 향상된 민감성 및/또는 약물 감작 효과를 예시한다. 비교하면, 동일한 표적에 대한 다양한 다른 테스트된 항체는 유의한 감작 효과를 나타내지 않는다.
도 7은, 예를 들어, 빈크리스틴 단독으로 처리된 세포와 비교하여 15D3.aCD47:MRK16 이중특이적 항체 (25 nM) 및 화학치료제 빈크리스틴의 존재시 나이브 293T의 향상된 시험관내 살해를 나타낸다. 이들 데이터는 약물 감작 효과가 파클리탁셀로의 처리에 제한되지 않고 15D3.aCD47:MRK16 이중특이적 항체가 다수의 상이한 작용제와 조합하여 사용될 때 약물 민감도를 광범위하게 향상시킨다는 것을 입증한다.
이들 결과에서 나타난 특이적이고 수반되는 표적화의 이러한 조합은 이들 길항 효과로부터 정상 조직에 영향을 미치지 않는 한편, 화학저항성일 수 있는 것들을 포함하여, 암 세포에 대한 항신생물제로의 향상된 치료 효과를 입증한다. 동시에, 제2 단백질로의 결합 및 그것에에 잠재적으로 길항작용하거나 마스킹하는 것, 예를 들어, 이 실시예에서, "돈트 잇트 미" 신호는 수송체 단백질 (유출 펌프)와 함께 이 표적을 동시-발현하여, 이 제2 단백질의 동시의, 특이적이고 유익한 표적화를 가능하게 하는 암 세포에 국한된다.
따라서, 특이성은 표적의 조합이 세포 표면 상에 나타날 때 우선적인 결합에 의해 달성된다. 그 자체에 의한 이 결합은 세포에 대한 면역 반응에 초점을 맞추지만 (예를 들어, 이중특이적 분자로의 IgG1 Fc의 통합에 의해) 이중특이적 분자가 특이적 결합에 수반되는 표적 단백질의 쌍 중 하나 또는 둘 다의 활성에 대응하는 경우 이점이 추가될 수도 있다 - 이 실시예에서 입증된 경우와 같다. 바꿔 말하면, 이중특이적 항체가 제공하는 조직 (종양) 특이성의 바람직한 정도에 더하여, 본 발명의 항체는 또한 2개의 상이한 세포 메커니즘을 동시에 표적화하는 이점을 제공하며 결과는 부가적이거나, 상승적이거나 또는 그렇지 않으면 유익할 수 있다. 항체 분자에 의한 이 "직교 표적화"의 효과는 결합된 분자 또는 세포에 대한 수반되는 면역 반응을 향상시키거나 감소시키도록 항체의 Fc 영역을 조율하거나 조정함으로써 더 향상될 수 있다.
따라서, 이 접근법은 암 요법의 영역에서 많은 잠재적인 용처를 가지며 특히 수반된 단백질 중 하나가 수송체 단백질인 경우 약물 저항성, 다중약물 저항성, 면역-마스킹 또는 표적화 가능한 세포 표면 단백질 (예를 들어, TK 활성제, 신호전달 단백질, 비정상적으로 과발현된 단백질, 등을 포함함)의 다른 조합이 수반된다. 게다가, 2개 초과의 상이한 표적이 암 세포 상에서 동시에 동시-과발현될 수 있는 경우, 이 접근법은 이러한 세포의 특이적이고 활성인 표적화를 가능하게 하는 적절한 3가, 또는 다른 다원자가 분자의 사용과 함께 적용 가능하다.
많은 경우에, 정상 세포에 관하여, 특정 단백질의 동시-과발현이 암 세포, 특히 다중약물 저항성인 암 세포 상에서 나타난다. 본원에서 기재된 이중특이적 분자는 2개의 상이한 표적 단백질 (즉, 수송체 단백질 및 제2 단백질)이 존재할 때 세포에 강력하게 결합하지만, 예를 들어, 정상 세포 상에서 볼 수 있는 바와 같이 이 단백질 쌍 중 하나 또는 다른 하나의 농도가 없거나 감소될 때 덜 강력하다. 결합될 때, 이중특이적 항체는 표적화된 표면 단백질에 길항작용하거나, 이것을 활성화시키거나 마스킹함으로써 (또는 이들 효과의 조합에 의해) 결합된 세포의 생존력, 활성 또는 민감성을 조절한다.
유리한 포맷에서 각각 별개의 표적에 결합하는 2개의 별개의 중쇄는 표준 방법을 사용하여 함께 모아진다 (헤테로-2가 쌍을 형성하기 위해). 일부 구체예에서 이들 별개의 중쇄는 별개로 동족 표적으로의 HC의 결합을 허용하지만 결과로 생성된 이중특이적 항체 포맷으로 조합될 때 각각의 아암이 각각의 표적에 결합하는 것을 허용하는 적절한 단일 경쇄와 조합으로 이용될 수 있다. 두 표적이 세포 표면 상에 동시에 존재하면 (단지 하나 또는 나머지 하나보다는) 이중특이적 항체의 결합이 크게 향상되어 조직 특이성을 발생시킨다.
이 경우에, 이중특이적 항체는 표적의 기재된 조합을 나타내지만 세포를, 예를 들어, 추가의 화학치료제 및/또는 대상체의 면역 시스템에 대해 더 민감하거나 감작되게 만들기 위해 이들 표적 중 하나 또는 둘 다에 길항작용하고, 및/또는 그것들의 정상적인 기능을 억제하는 암 세포에 강력하고 특이적으로 결합할 수 있다.
실시예 2: 감소된 친화도 단일특이적 2가 항-MDR1 항체 및 항-CD47 항체 항-암 활성 및 이중특이적 항체에 대한 비교
이 실시예는 감소된 친화도 항-MDR1 항체 및 항-CD47 항체는 단독으로 투여될 때 암을 치료하는데 효과가 없지만, 동시-투여될 때 종양 부피를 감소시킨다는 것을 입증한다. 이중특이적 항체 (15D3 HC:MRK16 LC :: 5F9 HC:MRK16 LC)는 화학치료제의 부재시 항-MDR1 항체 및 항-CD47 항체의 동시-투여보다 더 효과적이었다. 15D3 HC:MRK16 LC :: 5F9 HC:MRK16 LC는 또한 본원에서 15D3 HC :: MRK16 LC :: 5F9 HC라고도 불린다.
항-MDR1 항체는 15D3 항체의 2개의 중쇄 및 MRK16 항체의 2개의 경쇄를 포함한다. 이 항체는 도 9에서 15D3/MRK16 단클론성이라고 불린다. 항-CD47 항체는 5F9 항체의 2개의 중쇄 및 MRK16 항체의 2개의 경쇄를 포함한다. 이 항체는 도 9에서 KT14/MRK16 단클론성이라고 불린다. 이중특이적 항체는 15D3 HC:MRK16 LC :: 5F9 HC:MRK16 LC를 포함하고 도 9에서 KbisP1.1이라고 불린다.
도 9는 다중약물 저항성 N6ADR 세포를 함유하는 종양의 부피에 대한 지시된 항체 투여의 효과를 나타낸다. N6ADR 세포를 지시된 항체의 투여 전에 테스트 군 당 6마리의 코호트(cohort)로 주사하였다. 감지할 수 있는 종양이 약 100-150mm3의 크기에 도달하면 항체를 투여하였다 (종양 세포 주사 후 약 7일). 항체를 제0 일, 제4 일, 제7 일, 및 제11 일에 투여하였다. 종양 부피를 측정하고 플롯팅한다. 패널 A: 15D3/MRK16 단클론성 항-MDR1 항체. 패널 B: KT14/MRK16 단클론성 항-CD47 항체. 패널 C: 15D3/MRK16 단클론성 항-MDR1 항체 및 KT14/MRK16 단클론성 항-CD47 항체의 동시-투여. 패널 D: KbisP1.1 항체.
지시된 항체를 화학치료제 파클리탁셀과 함께 또는 화학치료제 파클리탁셀 없이 투여하였다. 항체를 파클리탁셀 전 약 1 - 4 hr에 투여하였다.
15D3/MRK16 단클론성 항-MDR1 항체 및 KT14/MRK16 단클론성 항-CD47 항체 단독은 종양 부피에 대해 유의한 효과를 나타내지 않았다. 15D3/MRK16 단클론성 항-MDR1 항체는 화학저항성 N6ADR 세포를 파클리탁셀에 민감하게 만든다. 화학감작 효과는 15D3/MRK16 단클론성 항-MDR1 항체에 특이적이고 KT14/MRK16 단클론성 항-CD47 항체에 대해서는 관찰되지 않았다. 패널 A 및 B 참조.
15D3/MRK16 단클론성 항-MDR1 항체 및 KT14/MRK16 단클론성 항-CD47 항체의 동시-투여는 15D3/MRK16 단클론성 항-MDR1 항체 및 파클리탁셀이 동시-투여될 때 볼 수 있는 것과 유사한 정도로 종양 부피를 감소시켰다. 종양에 대한 15D3/MRK16 단클론성 항-MDR1 항체 및 KT14/MRK16 단클론성 항-CD47 항체의 동시-투여의 효능은 파클리탁셀이 또한 투여될 때 더 증가하였다. 이들 데이터는 15D3/MRK16 단클론성 항-MDR1 항체 및 KT14/MRK16 단클론성 항-CD47 항체의 동시-투여가 화학치료제의 존재시 또는 부재시 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 패널 C 참조.
패널 D는 이중특이적 항체가 15D3/MRK16 단클론성 항-MDR1 항체 및 KT14/MRK16 단클론성 항-CD47 항체의 동시-투여보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다.
이 실시예에 대한 재료 및 방법은 실시예 1에서 기재된 것들과 유사하다.
실시예 3: 이중특이적 항체는 N6ADR 세포-기반 이종이식(xenograft)에 대해 효과적이다
재료:
세포: B 세포 전구체 림프아구성 백혈병 세포주인 NALM6 (ATCC) 및 NALM6 ADR (ATCC)을 이 연구에 사용하였다. NALM6 ADR은 NALM6 세포로부터 유래된 다중약물 저항성 세포주이다.
마우스: 65마리의 5-6주령 암컷 SCID-Biege 마우스 (Charles River)를 이 연구에 사용하였다.
시약: BisP1.1 (15D3 중쇄/KT14 중쇄/MRK16 경쇄), 인간 아이소타입 IgG1 (Bioxcell), 파클리탁셀 (Sigma), 발스포다르 (Sigma).
방법:
세포 배양: NALM6 및 NALM6 ADR 세포 둘 다를 37℃, 5% CO2에서 10% FBS 및 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지에서 유지하였다. 사용된 세포주는 진짜이고 마이코플라스마(mycoplasma) 음성인 것으로 확인되었다.
접종-PBS:Matrigel (1:1)에 희석된 2 X 106 세포를 멸균 조건 하에서 27G 인슐린 주사기를 사용하여 50마리의 마취된 5-6주령 암컷 SCID-Biege 마우스에 피하로 주사하였다.
주입-
NALM6 피하 종양: 마우스를 각각 5마리 마우스의 3개의 군으로 무작위로 분류하였다-(i) 대조군 비히클, (ii) 5 mg/kg 및 (iii) 20 mg/kg의 파클리탁셀.
NALM6 ADR 피하 종양: 마우스를 각각 5마리 마우스의 9개의 군으로 무작위로 분류하였다-(i) 대조군 아이소타입 IgG1 15 mg/kg, (ii) 대조군 아이소타입 IgG1 15mg/kg 및 5 mg/kg의 파클리탁셀, (iii) 대조군 아이소타입 IgG1 15mg/kg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀, (iv) BisP1.1 15 mg/kg, (v) BisP1.1 15 mg/kg 및 5 mg/kg의 파클리탁셀, (vi) BisP1.1 15 mg/kg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀 (vii) 발스포다르 20 mg/kg (viii) 발스포다르 20 mg/kg 및 5 mg/kg의 파클리탁셀 및 (ix) 발스포다르 20 mg/kg 및 5 mg/kg의 파클리탁셀. 항체, 발스포다르 및 파클리탁셀을 4주 연속으로 주 2회 복강내로 투여하였다. 항체/발스포다르를 파클리탁셀 주사 전에 적어도 4시간에 주사하였다. 파클리탁셀 조제물: 파클리탁셀이 잘 녹지 않기 때문에, 무수 에탄올(absolute ethanol):Kolliphor (1:1) 중에서 50 mg/ml의 마스터 스톡(master stock)을 제조하였다. 주사 전에 스톡을 PBS로 20 mg/kg의 권장된 용량으로 희석하였으며 (1:16)의 비를 유지하였다.
측정: 종양 측정을 보정된 버니어 캘리퍼스(Vernier Caliper)를 사용하여 주 3회 실행하였고 종양 부피를 식 ½*L*S*S에 따라 계산하였으며 여기서 L은 종양의 장축이고 s는 단축이다. 치료를 시작하기 전에 체중을 기록하였고 연구 전반에 걸쳐 지속적으로 모니터링하였다. 동물 생존을 치료 제1 일부터 사망할 때까지 평가하였다. 고통을 피하기 위해, 상기 언급된 사전 정의된 기준에 따라 마우스가 빈사 상태에 빠지면 안락사시켰다: 급격한 체중 감소, 보행 능력 상실, 고된 호흡, 또는 마시거나 먹을 수 없는 상태.
통계학: 종양 부피 및 체중을 상이한 실험군 사이에서 정확한 일원 분산 분석 (one-way analysis of variance: ANOVA)을 사용하여 비교하였다. 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 상이한 처리군 사이에서 로그-순위 (만텔-콕스(Mantel-Cox)) 테스트를 사용하여 비교하였다. Graph Pad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA) 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 유의성의 수준은 모든 분석에 대해 p < 0.05로 설정하였다.
결과
NALM6 세포는 다중약물 저항성 NALM6ADR 세포와 비교하여 파클리탁셀에 대해 증가된 민감도를 입증하였다. NALM6 세포는 5 mg/kg 및 20 mg/kg의 용량에서 파클리탁셀에 대해 유의한 (p < 0.0001) 종양 성장 억제를 입증하였다. 대조적으로 NALM6ADR 세포는 5 mg/kg에서 유의하게 더 적은 종양 성장 억제를 나타냈으며 20 mg/kg에서 보통의 억제를 나타냈다 (도 11). 이것은 생체 내에서 NALM6ADR 세포의 파클리탁셀 저항성을 확인하였다 (도 10 및 도 11).
추가로 NALM6ADR 모델에서 15 mg/kg 용량으로 BisP1.1의 주사는 종양 성장의 강력한 억제를 나타냈다 (도 11). 유사하게, 5 mg/kg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀과 조합된 15 mg/kg의 BisP1.1은 종양 성장을 크게 감소시켰다 (도 11). 일관적으로 ABCB1의 소분자 억제자인 발스포다르는 NALM6ADR 종양을 화학감작시켰다 (도 12). 하지만, BisP1.1 플러스 파클리탁셀 조합 군과 대조적으로, 발스포다르 및 파클리탁셀 20 mg/kg의 조합으로 처리된 마우스는 유의한 체중 감소를 나타냈다 (도 13 및 도 14).
발스포다르 및 파클리탁셀 20 mg/kg으로 처리된 마우스는 대조군과 비교하여 가장 낮은 생존을 나타냈다. BisP1.1 또는 BisP1.1 플러스 파클리탁셀로 처리된 마우스는 대조군 또는 파클리탁셀 처리된 마우스와 비교하여 연장된 생존을 나타냈다 (도 15).
결론: BisP1.1은 단독으로 및 파클리탁셀과 조합으로 둘 다에서 NALM6ADR 세포의 종양 성장을 크게 억제하였다. BisP1.1은 임의의 마우스 체중 감소를 유도하지 않았다. BisP1.1 및 Bis1.1 플러스 파클리탁셀 조합으로 처리된 마우스는 대조군 및 파클리탁셀 처리된 코호트와 비교하여 마우스의 연장된 생존을 입증하였다.
실시예 4: 이중특이적 항체는 다수의 상이한 암 모델에 대해 효과적이다
BisP1.1 이중특이적 항체는 이종이식 연구에서 2개의 추가적인 다중약물 저항성 (MDR) 암 세포주에 대해 효과적이었다. A2780ADR MDR 암 세포주는 CD47 및 ABCB1 둘 다를 발현한다. HeyT30 MDR 암 세포주는 또한 CD47 및 ABCB1 둘 다를 발현하지만 A2780ADR 세포에 비해 낮은 수준으로 발현한다 (도 16 및 17). A2780ADR 및 HeyT30 세포주는 둘 다 난소 기원의 것이다. PE-컨쥬게이션된, 상업적으로 이용 가능한 항-MDR1 및 항-CD47 시약 항체를 사용하였다; MDR1에 대해, Biolegend Cat. No. 348606 및, CD47, Biolegend Cat. No. 323108.
A2780ADR MDR 암 세포주 및 HeyT30 MDR 암 세포주를 실시예 3에서 기재된 프로토콜에 따라 마우스에 주사하였다. 마우스를 파클리탁셀 유무에 관계없이 BisP1.1 이중특이적 항체로 처리하였다. 도 18에서 알 수 있는 바와 같이, BisP1.1 이중특이적 항체는 파클리탁셀 유무에 관계없이 A2780ADR MDR 암 세포 종양 부피를 감소시키는데 효과적이다. BisP1.1 이중특이적 항체는 또한 낮은 농도의 항체가 사용될 때 파클리탁셀로 HeyT30 MDR 암 세포 종양 부피를 감소시키는데 효과적이다. 더 높은 농도에서는 BisP1.1 이중특이적 항체가 파클리탁셀 유무에 관계없이 효과적이었다 (도 19).
실시예 5: KbisP1.1 이중특이적 항체는 MDR 세포에 대해 항-MDR1 15D3 항체보다 더 효과적이고 용량 의존적 방식으로 MDR 암 세포를 화학감작시킨다
마우스에서 다중약물 저항성 N6ADR 세포를 주사하여 형성된 종양은 파클리탁셀 유무에 관계없이 항-MDR1 항체 15D3을 투여함으로써, 또는 파클리탁셀 유무에 관계없이 KbisP1.1을 투여함으로써 치료되었다.
도 20에서 알 수 있는 바와 같이, KbisP1.1은 생체 내 N6ADR 세포 종양에 대해 15D3 항체보다 더 효과적이다.
도 21은 파클리탁셀에 대한 다중약물 저항성 N6ADR 종양의 KbisP1.1 화학감작은 생체 내에서 용량-의존적이라는 것을 나타낸다.
실시예 6 : 인간 및 게먹이 원숭이 적혈구로의 KbisP1.1 이중특이적 항체의 크게 감소된 결합
KBisP1.1 항체는 항-CD47 5F9 항체와 대조적으로 인간 및 게먹이 원숭이 적혈구로의 유의한 결합을 나타내지 않았으며 따라서 일반적인 세포독성을 유발하거나 적혈구 '항원 싱크(sink)'의 대상이 되지 않을 것으로 예상된다. 인간 및 게먹이 원숭이 RBC 결합 데이터는 각각 도 22A 및 22B에서 나타난다. 도 22A 및 22B는 또한 항-CD47 5F9 항체 ("KT14")와 대조적으로 5F9 HC 및 MRK16 LC를 포함하는 항-CD47 항체 ("KT14_MRK16")가 인간 및 게먹이 원숭이 적혈구 (RBC)에 유의하게 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
게먹이 원숭이에서 KBisP1.1 항체의 후속 테스트는 항체가 체중의 유의한 감소, 용혈성 빈혈을 초래하지 않고, 사망률의 증가는 이 항체와 관련이 없다는 것을 나타낸다. 게다가, KBisp1.1의 클리어런스는 관찰되는 분명한 '항원 싱크' 효과 없이 정상적인 것으로 보인다.
게먹이 원숭이에 KBisP1.1 항체를 10 mg/kg의 용량으로 투여하였다. 항체의 반감기는 114-148 hr이었다.
실시예 7 : KbisP1.1 이중특이적 항체 게먹이 원숭이 독성 연구
15마리의 게먹이 원숭이 (필리핀 원숭이)를 KbisP1.1 독성을 평가하기 위해 단일 용량 연구에 등록하였다. 원숭이를 5개의 코호트로 나누었다 (n=3 동물/코호트).
Figure pct00001
모든 동물은 전체 용량의 항체 및/또는 파클리탁셀을 받았다. 동물은 주입 반응의 어떠한 징후도 나타내지 않았다. 파클리탁셀 주입 후 주입 부위에서 최소량의 홍진(erythema)이 예상되었다. 항체 단독의 주입 부위에서는 홍진이 없었다.
KBisP1.1은 모든 코호트에서 잘 용인되었으며 활성 또는 식욕의 변화는 없었다. 체중은 안정하게 유지되었고 상세한 임상 검사는 정상이었다.
KbisP1.1 용량과 연관성이 없는 주입 후 또는 파클리탁셀을 받은 후 7일에 15마리의 동물 중 11마리에서 적혈구 용적률(hematocrit)의 약간의 감소가 관찰되었다. 모든 다른 임상화학 및 혈액학적 결과는 정상이었다.
실시예 8 : 면역원성을 감소시키거나 또는 ADCC를 변형시키도록 변형된 KbisP1.1 이중특이적 항체
재료 및 방법
세포: MES-SA/Dx5 세포주 (Sigma, 카탈로그 번호 95051031)는 자궁 육종이고, 모 MES-SA 세포주 (Sigma, 카탈로그 번호 95051030)로부터 유래되었으며, 이 연구에 사용되었다. MES-SA/Dx5 세포주는 그것의 모 세포와 비교하여 독소루비신에 대해 ~100배 더 높은 저항성을 입증한다.
마우스: 5-6주령 암컷 누드(nude) 마우스 (Charles River)를 이 연구에 사용하였다.
인간 아이소타입 IgG1 (Bioxcell)이 대조군의 역할을 한다.
세포 배양- MES-SA/Dx5 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% FBS 및 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지에서 유지하였다. 적어도 주 1회 10E-7 M 아드리아마이신의 처리. 사용된 세포주는 진짜이고 마이코플라스마 음성인 것으로 확인되었다.
접종-PBS:Matrigel (1:1)에서 희석된 0.5 X 106 세포를 멸균 조건 하에서 27G 인슐린 주사기을 사용하여 30마리의 마취된 5-6주령 암컷 누드 마우스에 피하 주사하였다. 모든 동물의 유지, 핸들링, 감시, 및 동물 수술을 APLAC 프로토콜에 따라 그 승인 하에 수행하였다.
주입-
MES-SA/Dx5 피하 종양: 종양이 100-150 mm3에 도달하면, 마우스를 각각 5마리 마우스의 6개의 군으로 무작위로 분류하였다-(i) 대조군 아이소타입 IgG1 3 mg/kg, (ii) 대조군 아이소타입 IgG1 3mg/kg 및 20mg/kg의 파클리탁셀, (iii) KNJYBisP1.1 3 mg/kg, (iv) KNJYBisP1.1 3 mg/kg 및 20mg/kg의 파클리탁셀, (v) KNJYBisP1.1 LALAPG 3 mg/kg 및 (vi) KNJYBisP1.1 LALAPG 3 mg/kg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀. 항체 및 파클리탁셀을 2주 연속으로 주 2회 복강내 투여하였다. 항체를 파클리탁셀 주사 전 적어도 4시간에 주사하였다.
파클리탁셀 조제물: 파클리탁셀은 잘 녹지 않기 때문에, 무수 에탄올:Kolliphor (1:1) 중에서 50 mg/ml의 마스터 스톡을 제조하였다. 주사 전에 스톡을 PBS로 20 mg/kg의 권장된 용량으로 희석하였으며 (1:16)의 비를 유지하였다.
측정-종양 측정을 보정된 버니어 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 실행하였고 종양 부피를 식 ½*L*S*S에 따라 계산하였으며 여기서 L은 종양의 장축이고 s는 단축이다. 치료를 시작하기 전에 체중을 기록하였고 연구 전반에 걸쳐 지속적으로 모니터링하였다. 동물 생존을 치료 제1 일부터 사망할 때까지 평가하였다. 고통을 피하기 위해, 상기 언급된 사전 정의된 기준, 급격한 체중 감소, 보행 능력 상실, 고된 호흡, 또는 마시거나 먹을 수 없는 상태에 따라 마우스가 빈사 상태에 빠지면 안락사시켰다.
KbisP1.1 항체는 또한 본워에서 KNJYBisP1.1이라고 불린다. KNJYBisP1.1 N297A 항체에 대해 동일한 프로토콜을 따랐다.
KbisP1.1 인간화된 항체
KbisP1.1 항체 (본원에서 KNJYBisP1.1이라고도 불림)을 KbisP1.1 항체의 키메라 및 인간화된 버전을 제조함으로써 면역원성을 감소시키도록 변형시켰다. KbisP1.1 키메라 항체는 대전된 쌍 치환 K392D 및 K409D를 가진 인간 IgG1 Fc 영역에 융합된 15D3 가변 중쇄 영역 및 대전된 쌍 치환 E356K 및 D399K를 가진 인간 IgG1 Fc 영역에 융합된 5F9 가변 중쇄 영역을 포함한다.
CDR-이식에 대한 주형으로 사용될 인간 항체 프레임워크 영역 (FR)를 선택하기 위해서, 마우스 15D3 VH 및 MRK16 VL 영역을 인간 생식계열 서열의 것과 비교하였다. 마우스 15D3 VH 영역의 FR이 인간 IGHV3 부분군과 가장 높은 상동성을 갖는다는 것을 발견하였다. 마우스 MRK16 VL 영역의 FR은 인간 IGKV2 부분군과 가장 높은 상동성을 나타냈다. 항체의 잠재적인 번역 후 변형을 감소시키고 안정성을 개선하기 위해, N56Q/N56S를 15D3 CDR H2에 도입하였고, N30Q/N30S를 MRK16 CDR L1에 도입하였다. 3가지 버전의 각각의 인간화된 VH (15D3 Hz0, 15D3 Hz1, 및 15D3 Hz2) 및 VL (MRK16 Hz0, MRK16 Hz1, 및 MRK16 Hz2)을 디자인하였다. 가변 영역 서열은 다음과 같다:
15D3 Hz0:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGnTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
15D3 Hz1:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
15D3 Hz2:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
MRK16 Hz0:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK
MRK16 Hz1:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSqsivhstgqtylewyqqrpgqpPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK
MRK16 Hz2:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK
각 버전의 서열 정렬은 도 23-24에서 제공된다.
도 25에서 나타난 바와 같이, 인간화된 항체는 마우스에서 다중약물 저항성 MES-SA-DX5 세포-생성된 종양을 화학감작시켰다. 도 26에서 나타난 바와 같이, 인간화된 항체는 마우스에서 다중약물 저항성 A2780ADR 세포-생성된 종양을 화학감작시켰다. 도 26에서, KBisP1.1 항체는 "KNJYBisP1.1"이라고 불리고 인간화된 KBisP1.1 항체는 "인간화된" 것으로 불린다.
인간화된 KBisP1.1 항체를 결합 적정 및 화학독성 분석에 의해 특성화하였다.
세포 결합 분석. 세포로의 항체 결합을 유동세포분석법에 의해 평가하였다. 인간 ABCB1을 발현하도록 안정하게 트랜스펙션된 293T 세포 (293T_ABCB1_OX)를 유동세포분석법 완충제 (PBS + 2% FBS + 0.02% 나트륨 아지드)에서 1회 세척하고, 유동세포분석법 완충제에서 2 x 10^6 세포/mL로 재현탁시키고, 0.1 mL/웰로 96웰 미세역가 플레이트에 분산시켰다. 재조합 항체를 초기 결합 확인을 위해 5 ug/mL로 세포에 추가하였거나, 또는 유동세포분석법 완충제에서 100 ug/mL로부터 단계 희석하였다. 세포를 얼음 위에서 30 min 동안 인큐베이션한 후, 세포를 유동세포분석법 완충제로 2회 세척하였다. 결합된 항체를 PE-라벨링된 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch)로 검출하였고 Attune NxT 유동세포분석기 상에서 평가하였다. EC50은 절반 최대 반응을 제공하는 항체의 농도가 되도록 계산된다.
세포독성 분석. 빈크리스틴 세포독성에 대한 항체의 효과를 인간 급성 림프아구성 백혈병 (ALL) 세포주의 N6/ADR, 독소루비신-선택된, B1-양성 변이체, NALM6 상에서 평가하였다. 세포를 흰색 평평한 바닥 96웰 조직 배양 플레이트에서 5000 세포/웰로 분석 배지 (RPMI-1640+10% FBS) 0.05 mL에 평판배양하였다. 빈크리스틴을 100 ug/mL (2X 최종 농도)의 테스트 항체 또는 대조군 항체, 또는 7 uM (2X 최종 농도)의 발스포다르, 소분자 B1 억제자를 함유하는 분석 배지에서 200 uM으로부터 단계 희석하여 2X 최종 분석 농도로 제조하였다. 동등한 부피 (0.05 mL)의 빈크리스틴/항체 혼합물을 96웰 플레이트의 N6/ADR 세포에 추가하였다. 그 다음에 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 72 hr 후 플레이트를 실온으로 평형화하고 세포 생존력을 제조사의 권장된 프로토콜에 따라 Promega® CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay를 사용하여 평가하였다. 발광을 Molecular Devices® FlexStation® 3 Multi-Mode Microplate Reader 상에서 측정하였고 데이터를 GraphPad Prism 8.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. IC50은 반응 (세포 성장)이 50%만큼 감소되는 약물 (빈크리스틴 또는 다른 화학요법 세포독성제)의 농도이다.
293T_ABCB1_OX 세포로의 이중특이적 항체의 세포 결합은 표 4에서 요약된다:
Figure pct00002
빈크리스틴 세포독성에 대한 항체의 효과는 표 5에서 요약된다:
Figure pct00003
KbisP1.1 LALAPG Fc-뮤트된 항체
키메라 항체의 IgG1 Fc 영역을 항체 의존적 세포독성 (ADCC)을 감소시키기 위해 LALAPG 효과기 기능 돌연변이 (L234A, L235A, 및 P329G) 또는 N297A 돌연변이를 포함하도록 변형시켰다. 이러한 항체를 본원에서 뮤트된 항체라고 부른다. 치환 위치는 인간 Ig G1의 아미노산 서열에 관한 것이다.
도 25에서 나타난 바와 같이 뮤트된 Fc LALAPG 이중특이적 항체는 마우스에서 다중약물 저항성 MES-SA-DX5 세포-생성된 종양을 화학감작시킨다. 뮤트된 Fc LALAPG 이중특이적 항체에 대한 데이터는 KNJYBisP1.1의 Fc 효과기 기능이 파클리탁셀에 대한 다중약물 저항성 종양의 화학감작에 불필요하다는 것을 시사한다. KNJYBisP1.1의 Fc 효과기 기능은 화학요법의 부재시 항체 단독의 항-종양 효과에 일부 원인이 있는 것으로 나타났다.
KbisP1.1 N297A Fc-뮤트된 항체
키메라 항체의 IgG1 Fc 영역을 항체 의존적 세포독성 (ADCC)을 감소시키기 위해 N297A 돌연변이를 포함하도록 변형시켰다. 이러한 항체를 본원에서 뮤트된 항체라고 부른다. 치환 위치는 인간 Ig G1의 아미노산 서열에 관한 것이다.
도 27A는 N297A 치환을 가진 KBisP1.1 이중특이적 항체 (도면에서 KNJY N297A로서 라벨링됨)가 생체 내에서 파클리탁셀에 대해 다중약물 저항성 MES-SA/Dx5 세포 종양을 화학감작시킨다는 것을 나타낸다. KBisP1.1의 Fc 효과기 기능은 파클리탁셀에 대한 다중약물 저항성 종양의 화학감작에 불필요한 것으로 나타났다. KBisP1.1의 Fc 효과기 기능은 화학요법의 부재시 항체 단독의 항-종양 효과에 일부 원인이 있는 것으로 나타났다.
KbisP1.1 N297A Fc-뮤트된 항체를 또한 상이한 암 세포주, A2780ADR 세포주에 대해 테스트하였다.
재료 및 방법
세포: A2780ADR 세포주 (Sigma, 카탈로그 번호 93112520)는 상피 난소 암종이고, 모 A2780 세포주 (Sigma, 카탈로그 번호 93112519)로부터 유래되며, 이 연구에 사용되었다.
마우스: 5-6주령 암컷 누드 마우스 (Charles River)를 이 연구에 사용하였다. 발명자들은 처리를 받지 않은 10% 추가 마우스에 대해 설명하였다.
인간 아이소타입 IgG1 (Bioxcell)이 대조군의 역할을 한다.
세포 배양- A2780ADR 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지에서 37℃, 5% CO2에서 유지하였다. 10E-7 M 아드리아마이신을 적어도 주 1회 처리하였다. 사용된 세포주는 진짜이고 마이코플라스마 음성인 것으로 확인되었다.
접종-PBS:Matrigel (1:1)에서 희석된 0.5 X 106 세포를 멸균 조건 하에서 27G 인슐린 주사기을 사용하여 30마리의 마취된 5-6주령 암컷 누드 마우스에 피하 주사하였다. 모든 동물의 유지, 핸들링, 감시, 및 동물 수술을 APLAC 프로토콜에 따라 그 승인 하에 수행하였다.
주입-
A2780ADR 피하 종양: 마우스를 각각 5마리 마우스의 6개의 군으로 무작위로 분류하였다-(i) 대조군 아이소타입 IgG1 3 mg/kg, (ii) 대조군 아이소타입 IgG1 3mg/kg 및 20mg/kg의 파클리탁셀, (iii) KNJYBisP1.1 3 mg/kg, (iv) KNJYBisP1.1 3 mg/kg 및 20mg/kg의 파클리탁셀, (v) KNJYBisP1.1 N297A 3 mg/kg 및 (vi) KNJYBisP1.1 N297A 3 mg/kg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀. 항체 및 파클리탁셀을 2주 연속으로 주 2회 복강내 투여하였다. 항체를 파클리탁셀 주사 전 적어도 4시간에 주사하였다. 파클리탁셀 조제물: 파클리탁셀은 잘 녹지 않기 때문에, 무수 에탄올:Kolliphor (1:1) 중에서 50 mg/ml의 마스터 스톡을 제조하였다. 주사 전에 스톡을 PBS로 20 mg/kg의 권장된 용량으로 희석하였으며 (1:16)의 비를 유지하였다.
측정-종양 측정을 보정된 버니어 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 실행하였고 종양 부피를 식 ½*L*S*S에 따라 계산하였으며 여기서 L은 종양의 장축이고 s는 단축이다. 치료를 시작하기 전에 체중을 기록하였고 연구 전반에 걸쳐 지속적으로 모니터링하였다. 동물 생존을 치료 제1 일부터 사망할 때까지 평가하였다. 고통을 피하기 위해, 상기 언급된 사전 정의된 기준, 급격한 체중 감소, 보행 능력 상실, 고된 호흡, 또는 마시거나 먹을 수 없는 상태에 따라 마우스가 빈사 상태에 빠지면 안락사시켰다.
도 27B는 KBisP1.1 N297A 항체 (도면에서 N297A로 라벨링됨)가 생체 내에서 파클리탁셀에 대해 다중약물 저항성 A2780ADR 세포를 화학감작시킨다는 것을 나타낸다. 이 모델에서 KBisP1.1의 Fc 효과기 기능은 파클리탁셀에 대한 다중약물 저항성 종양의 화학감작에 불필요하다. KBisP1.1의 Fc 효과기 기능은 화학요법의 부재시 항체 단독의 항-종양 효과에 일부 원인이 있는 것으로 나타났다.
실시예 9: 동일한 표적에 결합하는 단일특이적 항체와 비교된 KbisP1.1 이중특이적 항체
동일한 표적으로의 결합
항-MDR1 단클론성 항체, 15D3 및 항-CD47 KT14 단클론성 항체와 비교할 때 KNJYBisP1.1 항체의 항-종양 효과를 A2780ADR 및 MES-SA/Dx5 생체 내 다중약물 저항성 모델을 사용하여 평가하였다.
재료 및 방법
세포주 및 종양 모델은 실시예 7에서 기재된 바와 같다.
주입-
A2780ADR 피하 종양: 종양이 100-150 mm3에 도달하면, 마우스를 각각 5마리 마우스의 10개의 군으로 무작위로 분류하였다-(i) 대조군 아이소타입 IgG1 3 mg/kg, (ii) 대조군 아이소타입 IgG1 3mg/kg 및 20mg/kg의 파클리탁셀, (iii) KNJYBisP1.1 3 mg/kg, (iv) KNJYBisP1.1 3 mg/kg 및 20mg/kg의 파클리탁셀, (v) 15D3 하이브리도마 단클론성 Ab 3 mg/kg, (vi) 15D3 하이브리도마 3 mg/kg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀, (vii) KT14/KT14 단클론성 Ab 3 mg/kg, (viii) KT14/KT14 단클론성 Ab 3 mg/kg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀, (ix) 각각 15D3 하이브리도마 + KT14/KT14, 1.5 mg 및 (x) 각각 15D3 하이브리도마 + KT14/KT14, 1.5 mg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀. 항체 및 파클리탁셀을 2주 연속으로 주 2회 복강내 투여하였다. 항체를 파클리탁셀 주사 전 적어도 4시간에 주사하였다. 파클리탁셀 조제물: 파클리탁셀이 잘 녹지 않기 때문에, 무수 에탄올:Kolliphor (1:1) 중에서 50 mg/ml의 마스터 스톡을 제조하였다. 주사 전에 스톡을 PBS로 20 mg/kg의 권장된 용량으로 희석하였으며 (1:16)의 비를 유지하였다.
MES-SA/Dx5 피하 종양: 종양이 100-150 mm3에 도달하면, 마우스를 각각 5마리 마우스의 10개의 군으로 무작위로 분류하였다-(i) 대조군 아이소타입 IgG1 3 mg/kg, (ii) 대조군 아이소타입 IgG1 3mg/kg 및 20mg/kg의 파클리탁셀, (iii) KNJYBisP1.1 3 mg/kg, (iv) KNJYBisP1.1 3 mg/kg 및 20mg/kg의 파클리탁셀, (v) 15D3 하이브리도마 단클론성 Ab 3 mg/kg, (vi) 15D3 하이브리도마 3 mg/kg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀, (vii) KT14 단클론성 Ab 3 mg/kg, (viii) KT14 단클론성 Ab 3 mg/kg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀, (ix) 각각 15D3 하이브리도마 + KT14, 1.5 mg 및 (x) 각각 15D3 하이브리도마 + KT14, 1.5 mg 및 20 mg/kg의 파클리탁셀. 항체 및 파클리탁셀을 2주 연속으로 주 2회 복강내 투여하였다. 항체를 파클리탁셀 주사 전 적어도 4시간에 주사하였다. 파클리탁셀 조제물: 파클리탁셀이 잘 녹지 않기 때문에, 무수 에탄올:Kolliphor (1:1) 중에서 50 mg/ml의 마스터 스톡을 제조하였다. 주사 전에 스톡을 PBS로 20 mg/kg의 권장 용량으로 희석하였으며 (1:16)의 비를 유지하였다.
도 28은 KBisP1.1 항체가 생체 내에서 파클리탁셀에 대해 다중약물 저항성 A2780ADR 세포를 화학감작시킨다는 것을 나타낸다. KBisP1.1의 화학감작 효과는 항-MDR1 15D3 하이브리도마 항체 또는 항-CD47 KT14 단클론성 항체에 비해 더 강력했다. KNJYBisP1.1의 화학감작 효과는 15D3 하이브리도마 + KT14 단클론성 항체의 동시-주사와 비슷하였다. 15D3 하이브리도마 및 KT14 단클론성 항체 둘 다가 생체 외에서 각각의 표적에 대해 강력한 결합을 입증하지만 KNJYBisP1.1이 15D3 또는 KT14 단클론성 항체보다 더 효과적이다.
도 29에서 나타난 바와 같이, KBisP1.1 항체는 생체 내에서 파클리탁셀에 대해 다중약물 저항성 MES-SA/Dx5 세포를 화학감작시킨다. KBisP1.1의 화학감작 효과는 15D3 하이브리도마 또는 KT14 단클론성 항체보다 더 강력했다. 파클리탁셀과 조합되면 단일 KBisP1.1 이중특이적 항체의 화학감작 효과는 15D3 하이브리도마 + KT14 단클론성 항체의 동시-주사 조합과 비슷했다.
도 28-29에서, KBisP1.1 항체=KNJYBisP1.1; 15D3 하이브리도마=항-MDR1 단클론성 항체 15D3; KT14/KT14=항-CD47 단클론성 항체 5F9.
단일 이중특이적 항체 플러스 파클리탁셀로서 KBis P1.1 처리의 효과는 도 6B에서 나타난 시험관 내 결과와 일치하며 효과적인 파클리탁셀 페이로드(payload)가 2개의 표적을 높은 농도로 동시-발현하는 저항성 종양에서 축적된다는 것을 나타낸다. KBis P1.1 항체는 2개의 표적 항원을 발현하지 않는 세포로의 유의한 결합을 나타내지 않고 (도 4A 참조) 그러므로 개개의 단클론성 항체와 비교하여 2개의 표적 항원을 발현하는 암 세포를 표적화하는데 있어서 더 많은 특이성을 제공할 것이다.
실시예 10: 생체 내 환자-유래된 유방암 모델 CTG-2616에서 KBisP1.1의 항-종양 효과
재료 및 방법
세포: CTG-2616은 ER+/Her2+ 1차 유방암이고, 유방의 재발성 도관 선암종을 제공하는 환자로부터 유래된다.
마우스: 5-6주령 무흉선 Nude-Foxn1nu 암컷 누드 마우스 (Envigo)를 이 연구에 사용하였다.
접종- 환자-유래된 종양의 급속 냉동된(Snap-Frozen) 조각을 해동시키고, 5x5x5 mm으로 절단하고 멸균 조건 하에서 마취된 5-6주령 암컷 누드 마우스에 피하 주사하였다. 종양 이식 절차를 위해, 이식 부위에서 1-1.5 cm 절개가 이루어졌고 포셉을 사용하여 종양 단편을 이식하였다. 충분한 스톡 동물이 1000-1500 mm3에 도달하면, 사전 연구 동물로의 재이식을 위해 종양을 수확하였다. 사전 연구 동물을 스톡 동물로부터 수확된 종양 단편으로 왼쪽 측면에 일방적으로 이식하였다. 각각의 동물을 특이적 계대배양 로트(lot)로부터 이식하고 기록하였다. 사전 연구 종양 부피를 각각의 실험에 대해 이식 후 7 내지 10일에 시작하여 기록하였다. 종양이 150- 300mm3의 평균 종양 부피에 도달하면, 동물을 종양 부피에 따라 제0 일에 시작된 주입에 사용되는 처리군 또는 대조군으로 매치시켰다. 모든 수술 절차는 멸균 조건 하에서 실행하였다.
주입-
CTG-2616 피하 종양: 종양이 150-300 mm3의 범위에 있으면, 마우스를 각각 3마리 마우스의 3개의 군으로 무작위로 분류하였다-(i) 대조군 아이소타입 IgG1 (Bioxcell) 6 mg/kg + 비히클, (ii) 대조군 아이소타입 IgG1 6 mg/kg 및 5 mg/kg의 파클리탁셀 및 (iii) KNJYBisP1.1 6 mg/kg 및 5mg/kg의 파클리탁셀. 항체 및 파클리탁셀을 4주 연속으로 주 2회 복강내 투여하였다. 항체를 파클리탁셀 주사 전 적어도 4시간에 주사하였다. 파클리탁셀 조제물: 주사 전 스톡을 PBS로 5 mg/kg의 권장 용량으로 희석하였다.
종양 부피의 측정을 이전 실시예에서 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 30은 KBisP1.1 이중특이적 항체가 파클리탁셀 저항성 CTG-2616 환자-유래된 유방 종양을 화학감작시키고 생체 내에서 종양 성장 억제를 초래한다는 것을 나타낸다. KNJYBisP1.1은 CTG-2616 함유 동물에서 체중 변화를 유도하지 않았다. 따라서, KNJYBisP1.1 이중특이적 항체는, 파클리탁셀과 조합으로, 생체 내에서 파클리탁셀-저항성 Her2+ CTG-2616 환자-유래된 유방 종양을 화학감작시키는데 효과적이다.
실시예 11: PD-L1 및 MDR-1에 결합하는 이중특이적 mAb의 생성
실시예 1-8에서 기재된 KBis1.1 항체의 생성에 사용된 전략을 MDR-1 및 PD-L1에 동시에 결합하는 이중특이적 항체를 생성하는데 이용하였다. 이 항체는 본원에서 KBis2.1이라고 불린다. MDR1에 대한 항원-결합 부위를 가진 MRK16 항체의 공통 가변 경쇄 (VL), MDR1에 대한 항원-결합 부위를 가진 15D3 항체의 제1 가변 중쇄 (VH) 및 PD-L1에 대한 항원-결합 부위를 가진 제2 VH 사슬을 이용하여 이중특이적 항체를 제조하였다. MRK16 VL 사슬 및 15D3 VH 사슬은 KBis1.1 항체에 사용된 것들과 동일하다. 항-PD-L1 항체 아테졸리주맙의 VH 사슬은 PD-L1에 대한 항원-결합 부위를 가진 제2 VH 사슬의 역할을 한다. 이 항체는 다음과 같이 불린다: 15D3 HC :: PDL1 HC :: MRK16 LC. 15D3 HC 및 MRK16 LC의 인간화된 버전이 사용된 이 항체의 변이체를 또한 구성하였다. 이 항체는 다음과 같이 불릴 수 있다: 15D3 HC Hz :: PDL1 HC :: MRK16 LC Hz. 15D3 Hz0 VH 사슬 및 MRK16 Hz0 VL 사슬을 사용하였다. 아테졸리주맙 VH 사슬은 MRK16 VL 사슬과 쌍을 형성할 때 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 PD-L1으로의 결합을 유지한다 (데이터 미도시). 실시예 1에서 CD47에 대해 기재된 방식으로 ELISA를 수행하였다. 이에 더하여, KBisP1.1 항체의 데이터로부터 예상된 바와 같이, KBisP2.1 항체의 15D3 HC :: MRK16 LC 아암은 MDR1을 과발현하는 293 T 세포를 사용하여 FACS에 의해 측정된 바와 같이 MDR1로의 결합을 유지하였다 (데이터 미도시). MDR1 결합에 대한 FACS 측정을 실시예 1에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 이 데이터는 도 31에서 요약된다.
공통 경쇄의 사용은 올바르게 쌍 형성된 항체의 수율을 증가시킬 뿐만 아니라, 예를 들어, 15D3 단클론성 항체 및 항-PD-L1 항체 아테졸리주맙에서와 같이, 원래의 쌍 형성된 VH-VL 항체와 비교하여 표적에 대한 항체의 각각의 아암의 친화도를 감소시킨다. 이 감소된 친화도는 상대적으로 낮은 수준으로 표적 중 하나만을 발현하거나 낮은 수준으로 표적 둘 다를 발현하는 정상 세포와 비교하여 높은 수준으로 MDR1 및 PD-L1 중 적어도 하나를 발현하는 암 세포에 대한 KBis2.1 항체의 특이성을 증가시킨다.
KBis2.1 항체에서 15D3 VH 사슬 및 MRK16 VL 사슬에 대한 서열은 이전 실시예에 존재한다. 15D3 중쇄 및 MRK16 경쇄의 키메라 및 인간화된 버전 둘 다를 사용하였다. 아테졸리주맙의 중쇄는 다음 서열을 갖는다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
중쇄의 Fc 영역을 15D3 중쇄와의 쌍 형성을 촉진하기 위해 전하 쌍 치환 "KK"를 도입하도록 "DD" 치환으로 돌연변이시켰다. DD 치환은 K392D 및 K409D 치환을 나타내고, KK 치환은 E356K 및 D399K 치환을 나타낸다. 아미노산 치환의 넘버링은 HC에 대해 EU 넘버링 시스템을 따른다.
Kabat 명명법에 따라 정의된 항-PDL1 항체 아테졸리주맙의 HCDR 1-3은 다음과 같다:
HCDR1: DSWIH
HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG
HCDR3: RHWPGGFDY
항-PDL1 항체 아테졸리주맙의 경쇄는 이중특이적 항체에서 사용되지 않았지만, 완벽성의 목적을 위해 서열이 하기 제공된다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Kabat 명명법에 따라 정의된 LCDR1-3은 다음과 같다:
LCDR1: RASQDVSTAVA
LCDR2: SASFLYS
LCDR3: QQYLYHPAT
항-PDL1 항체 아테졸리주맙에 대한 EC50은 PDL1을 과발현하는 293T 세포를 사용하여 측정된 바와 같이 0.29 nM이다.
실시예 12 : EGFR 및 MDR-1에 결합하는 이중특이적 mAb의 생성
항-MDR1 항-EGFR 이중특이적 항체 버전 1
상기 제시된 실시예에서 기재된 KBis1.1 항체의 생성에 사용된 전략을 MDR-1 및 EGFR에 동시에 결합하는 이중특이적 항체를 생성하는데 이용하였다.
MDR1에 대한 항원-결합 부위를 가진 MRK16 항체의 공통 가변 경쇄 (VL), MDR1에 대한 항원-결합 부위를 가진 15D3 항체의 제1 가변 중쇄 (VH), 및 EGFR에 대한 항원-결합 부위를 가진 제2 VH 사슬을 이용하여 이중특이적 항체를 제조하였다. MRK16 VL 사슬 및 15D3 VH 사슬은 본 출원에서 기재된 것들과 동일하다. 항-EGFR 항체 세툭시맙 또는 네시투무맙의 VH 사슬은 EGFR에 대한 항원-결합 부위를 가진 제2 VH 사슬의 역할을 한다.
본원에서 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된 세툭시맙에 대한 Kd는 0.05 nM- 0.1nM의 범위에 있다. EGFR을 과발현하는 293T 세포를 사용하여 FACS에 의해 측정된 네시투무맙에 대한 EC50은 0.044nM이다.
이중특이적 항체는 중쇄 및 경쇄의 다음 조합을 포함한다:
i. 15D3 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: MRK16 LC
ii. 15D3 DD HC :: 네시투무맙 KK HC :: MRK16 LC
약어 "DD" 및 "KK"는 대전된 쌍 치환을 나타낸다.
15D3 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: MRK16 LC 항체는 MDR1 (MDR1을 과발현하는 293T 세포를 사용하여 FACS에 의해 측정됨) 및 EGFR (ELISA에 의해 측정됨)로의 결합을 유지하였다.
15D3 DD HC :: 네시투무맙 KK HC :: MRK16 LC 항체는 MDR1 (MDR1을 과발현하는 293T 세포를 사용하여 FACS에 의해 측정됨) 및 EGFR (EGFR을 과발현하는 293T 세포를 사용하여 FACS에 의해 측정됨)로의 결합을 유지하였다. 이 항체는 ELISA 분석에서 유의한 결합을 나타내지 않았다.
VH 및 VL 사슬의 추가적인 조합을 또한 테스트하였다. 항-MDR1 항체 UIC2의 VH 사슬을 15D3 대신에 사용하여 이중특이적 항체를 생성하였다:
UIC2 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: MRK16 LC. UIC2 VH 서열은 본 출원의 상세한 설명에서 제공된다. 하지만, 이 항체는 MDR1로의 유의한 결합을 나타내지 않았다.
이들 데이터는 도 31에서 요약된다.
항-MDR1 항-EGFR 이중특이적 항체 버전 2
항-MDR1 MRK16 항체의 VH 사슬 및 항-MDR1 항체 15D3의 VL 사슬을 항체를 생성하기 위해 항-EGFR 항체 세툭시맙의 VH 영역과의 조합으로 테스트하였다 - MRK16 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: 15D3 LC. 이 항체는 또한 MDR1 (MDR1을 과발현하는 293T 세포를 사용하여 FACS에 의해 측정됨) 및 EGFR (ELISA에 의해 측정됨)로의 결합을 유지하였다.
항-MDR1 항-EGFR 이중특이적 항체 버전 3
동일한 항-MDR1 항체의 VH 및 VL 영역을 유지하고 세툭시맙 VH 영역과 조합된 이중특이적 항체를 생성하였다:
i. MRK16 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: MRK16 LC
ii. 15D3 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: 15D3 LC
도 31에서 요약된 바와 같이, 15D3 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: 15D3 LC 항체는 MDR-1 및 EGFR 둘 다에 결합한다. MRK16 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: MRK16 LC는 또한 MDR-1 및 EGFR 둘 다에 결합하지만, EGFR로의 결합은 15D3 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: 15D3 LC 항체와 비교하여 더 낮은 친화도를 갖는다.
UIC2 HC DD :: EGFR HC KK :: 15D3 LC 항체를 또한 구성하였다. MRK16 LC가 UIC HC와 조합될 때의 관찰과 유사하게, 이 항체는 또한 MDR1로의 결합에 실패하였다. 도 31 참조.
이중특이적 항체에서 15D3 VH/VL 사슬 및 MRK16 VL/VH 사슬에 대한 서열은 본 출원의 상세한 설명에 있다. 세툭시맙 및 네시투무맙의 중쇄 및 경쇄 영역의 아미노산 서열이 하기 제공된다.
세툭시맙 중쇄
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HCDR1: NYGVH
HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS
HCDR3: ALTYYDYEFAY
세툭시맙 경쇄
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
LCDR1: RASQSIGTNIH
LCDR2: YASESIS
LCDR3: QQNNNWPTT
네시투무맙 중쇄
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HCDR1: SGDYYWS
HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS
HCDR3: VSIFGVGTFDY
네시투무맙 경쇄
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYGSTPLTFGGGTKAEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
LCDR1: RASQSVSSYLA
LCDR2: DASNRAT
LCDR3: HQYGSTPLT
도 31은 MDR1 (FACS에 의해 측정됨) 또는 TAA (ELISA 또는 FACS에 의해 측정됨)로의 지시된 항체의 결합을 요약하였다. aCD47=항-CD47; aEGFR=항-EGFR; aPDL1=항-PDL1.
도 31에서 "+"는 EC50이 5 nM-700 nM의 범위에 있다는 것을 나타낸다. 도 31에서 "±"는 EC50이 701 nM-900 nM의 범위에 있다는 것을 나타낸다. 도 31에서 "-"는 EC50이 1000 nM인 것을 나타낸다.
도 32A-32C는 나열된 항체에 대한 MFI 측정치를 나타낸다:
인간 IgG1 항체 ("hIgG"),
항-EGFR 항체 네시투무맙 ("KT3-2"),
항-EGFR 항-MDR1 이중특이적 항체:
15D3 KK HC :: 세툭시맙 DD HC :: 15D3 LC ("KT3QDD 15D3KK 15D3");
MRK16 KK HC :: 세툭시맙 DD HC :: MRK16 LC ("KT3QDD MRK16KK MRK16");
15D3 DD HC :: 세툭시맙 KK HC :: MRK16 LC ("KT3QKK 15D3DD MRK16");
15D3 DD HC :: 네시투무맙 KK HC :: MRK16 LC ("KT3-2KK 15D3DD 1MRK16").
도 32A는 각각의 이중특이적 항체가 MDR1을 과발현하는 293T 세포에 결합했다는 것을 나타낸다. 그래프에서 KT3-2로서 나타난 항-EGFR 항체 네시투무맙은 이들 세포로의 유의한 결합을 나타내지 않았으며, 음성 대조군 인간 IgG1 항체와 유사하다.
도 32B는 각각의 이중특이적 항체가 항-EGFR 항체 네시투무맙 "KT3-2"보다 훨씬 더 낮은 친화도로 EGFR을 과발현하는 293T 세포에 결합했다는 것을 나타낸다. 도 32C는 도 32B에서 나타난 이중특이적 항체에 대한 결합 데이터를 나타내며 Y축은 ≤400의 범위의 MFI를 나타낸다. 293T 세포는 EGFR을 발현하지 않는다 (도 32A 참조). EGFR을 과발현하는 293T 세포는 EGFR을 검출 가능한 수준으로 발현하지만, EGFR 발현은 상대적으로 낮으며 이것은 이들 세포에 대한 이중특이적 항체의 낮은 친화도를 설명한다. 대조적으로, MDR1을 과발현하는 293T 세포에서 MDR1의 발현 수준은 매우 높으며 이것은 EGFR의 발현의 부재시에도 이중특이적 항체의 결합을 설명한다.
이중특이적 항체에 대해 측정된 EC50의 요약이 하기 표 6-7에서 제공된다. 이들 293 세포-기반 FACS 분석에서 EC50은 최대 반응 (OD450)의 절반을 생성하는 항체의 농도이다:
293T-B1OX 세포에 결합하는 항-MDR1 항-EGFR 이중특이적 Ab
Ab EC50(nM)
15D3DD: 네시투무맙 KK:MRK16 33.1
15D3DD: 세툭시맙 KK:MRK16 53
15D3KK:세툭시맙 DD:15D3 76.8
MRK16KK: 세툭시맙 DD:MRK16 144.7
15D3 25.1
MRK16 58.8
hIgG1 NB
293T-EGFR OX 세포에 결합하는 항-MDR1 항-EGFR 이중특이적 Ab
Ab EC50(nM)
15D3DD: 네시투무맙 KK:MRK16 110.2
15D3DD: 세툭시맙 KK:MRK16 85.3
15D3KK: 세툭시맙 DD:15D3 ND
MRK16KK: 세툭시맙 DD:MRK16 112.1
네시투무맙 0.13
15D3 ND
MRK16 ND
hIgG1 NB
NB=결합하지 않음
ND=실행하지 않음
실시예 13: 인간화된 5F9 VH 영역을 가진 이중특이적 항-MDR1 항-CD47 항체의 생성
CDR-이식에 대한 주형으로 사용될 인간 항체 프레임워크 (FR)를 선택하기 위해서, 마우스 5F9 VH 영역을 인간 생식계열 서열의 것들과 비교하였다. 인간 VH5-51 및 VH7-4 및 VH3-23의 FR을 궁극적으로 인간화된 5F9 VH를 디자인하기 위한 시작점으로 선택하였다.
그 다음에, 인간화된 15D3 HC :: 5F9 HC :: MRK16 LC 이중특이적 작제물을 생산하여 293T 세포 및 293T-CD47 KO 세포로의 유동세포분석법 분석에 의해 검사하였다. 인간화된 MRK16 LC와 쌍 형성된 5F9.huVH5 및 5F9.huVH3 HC 둘 다는 CD47에 결합할 수 있다 (데이터 미도시).
상기 언급된 본 발명이 이해의 명확성의 목적을 위해 예시 및 예의 방식으로 어느 정도 상세히 설명되었지만, 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 본 발명의 교시내용에 비추어 당업자에게 쉽게 분명해질 것이다.
따라서, 전술된 것들은 단지 본 발명의 원리를 예시한다. 당업자들은 본원에서 명확하게 기재되거나 나타나지 않았지만 본 발명의 원리를 구현하고 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 창안할 수 있을 것이다. 게다가, 본원에서 나열된 모든 예 및 조건부 언어는 원칙적으로 본 발명의 원리 및 기술을 발전시키기 위해 발명자들이 기여한 개념을 이해하는데 있어서 독자들을 돕기 위한 의도이고 이러한 구체적으로 나열된 예 및 조건에 대해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 더욱이, 본 발명의 원리, 양태, 및 구체예, 뿐만 아니라 그것들의 특정 예를 나열하는 본원의 모든 진술은 그것들의 구조적 및 기능적 동등물 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 추가적으로, 이러한 동등물은 구조에 관계없이 현재 공지된 동등물 및 미래에 개발될 동등물, 즉, 동일한 기능을 수행하는 개발될 임의의 요소 둘 다를 포함하도록 의도된다. 더욱이, 본원에서 개시된 어떤 것도 그러한 개시내용이 청구범위에서 명확하게 나열되었는지 여부에 관계없이 대중에게 헌정되도록 의도된 것은 아니다.
그러므로, 본 발명의 범위는 본원에서 나타나고 기재된 예시의 구체예에 제한되도록 의도된 것이 아니다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상이 첨부된 청구범위에 의해 구현된다. 청구범위에서, 35 U.S.C. §112(f) 또는 35 U.S.C. §112(6)은 정확한 구절 "~를 위한 수단" 또는 정확한 구절 "~를 위한 단계"가 청구범위에서 이러한 제한의 시작시 나열될 때에만 청구범위에서 제한에 대해 적용된 바와 같이 명확하게 정의되고; 이러한 정확한 구절이 청구범위에서 제한에 사용되지 않으면, 35 U.S.C. §112 (f) 또는 35 U.S.C. §112(6)은 적용되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Kenjockety Biotechnology Arathoon, William R. Bishop, Evan M. Briante, Raffaella Briggs, Alissa L. Tan, Cindy Zhai, Qianting <120> EFFLUX PUMP-CANCER ANTIGEN MULTI-SPECIFIC ANTIBODIES AND COMPOSITIONS, REAGENTS, KITS AND METHODS RELATED THERETO <130> KNJY-002WO <140> PCT/US2020/026261 <141> 2020-04-01 <150> US 62/967,478 <151> 2020-01-29 <150> US 62/828,044 <151> 2019-04-02 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> The amino acid at position 35 is Asn, Gln or Ser <400> 1 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Xaa Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Gln Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Ser Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> The amino acid at position 12 is Asn, Gln or Ser <400> 5 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Thr Gly Xaa Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Phe Gln Ala Ser His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> The amino acid at position 57 is Asn, Gln or Ser <400> 9 Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Xaa Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Met Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Ala Gly Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 10 Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Met Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Ala Gly Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gln Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Ala Gly Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Ala Gly Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 13 Arg Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> The amino acid at position 8 is Asn, Gln or Ser <400> 14 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Xaa Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 15 Tyr Gly Ala Gly Asp Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Ala Gly Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 18 Asn Tyr Asn Met His 1 5 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 19 Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 20 Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 21 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 24 Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Met Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Ala Gly Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 25 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 25 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 26 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 27 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Thr Gly Gln Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 28 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Thr Gly Ser Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 29 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 30 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gln Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 31 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 33 Asp Ser Trp Ile His 1 5 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 34 Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 35 Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 36 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 36 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 37 Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 38 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 39 Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 40 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 40 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 41 Asn Tyr Gly Val His 1 5 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 42 Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 1 5 10 15 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 43 Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 44 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 45 Lys Ile Ser Arg Leu Glu Ala 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 46 Phe Gln Gly Ser His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 47 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 47 Glu Val Ile Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Glu Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 48 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 49 Tyr Tyr Arg Tyr Glu Ala Trp Phe Ala Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 50 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 51 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 51 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 52 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 53 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 54 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 55 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 56 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 57 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 58 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 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<222> (12)..(12) <223> The amino acid at position 12 is Asn, Gln or Ser <400> 71 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Thr Gly Xaa Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 Trp <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 72 Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly 1 5 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 73 Phe Gln Ala Ser His Phe Pro Arg Thr Phe 1 5 10 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 74 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Phe Asp Tyr Leu Asn 1 5 10 15 Trp <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 75 Ala Leu Ser Asn Arg Ala Ser Gly 1 5 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 76 Met Glx Ala Leu Gln Ala Pro Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 77 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Thr 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<210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 91 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 92 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 93 Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr 1 5 <210> 94 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 94 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 95 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 1 5 10 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 96 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 97 Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5 <210> 98 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 98 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Ala Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 99 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 100 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 101 His Gln Tyr Gly Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 102 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 102 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 103 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 103 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 104 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 104 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Gln Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 105 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 105 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Ser Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg

Claims (146)

  1. 다중약물 저항성 단백질 1 (MDR1) 및 종양 관련된 항원 (TAA)에 결합하는 이중특이적 항체 분자로서, 항체 분자는 2개의 가변 경쇄 (VL), 제1 가변 중쇄 (VH), 및 제2 VH 사슬을 포함하고,
    VL 사슬은 각각 MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하고, 제1 VH 사슬은 MDR1에 대한 항원-결합 부위를 포함하고, 제2 VH 사슬은 TAA에 대한 항원-결합 부위를 포함하고, 제2 VH 사슬은 VL 사슬 중 하나와 쌍을 형성할 때 TAA에 결합하고,
    이중특이적 항체는 MDR1 및/또는 TAA를 발현하는 비-암 세포로의 감소된 결합을 나타내면서 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 암 세포에 결합하는, 이중특이적 항체 분자.
  2. 제1 항에 있어서, 2개의 VL 사슬의 항원-결합 부위가 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR 1-3 (LCDR 1-3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (서열 번호:1) (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다).
  3. 제2 항에 있어서, 2개의 VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    (i) DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (서열 번호:2);
    (ii) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (서열 번호:3); 또는
    (iii) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (서열 번호:4).
  4. 제2 항 또는 제3 항에 있어서,
    (i) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGX1TYLE (서열 번호:5)를 포함하고;
    (ii) LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고;
    (iii) LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하며, 여기서 X1은 N, Q 또는 S인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 VL 사슬은 인간화된 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  6. 제2 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 VL 사슬은 다음 서열 또는 다음 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (서열 번호:8);
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (서열 번호:3); 또는
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (서열 번호:4).
  7. 제6 항에 있어서, 2개의 VL 사슬은 다음 서열 또는 다음 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (서열 번호:8).
  8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR 1-3)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:9) (여기서 X2는 N, Q 또는 S이다).
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    (i) EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:10), 또는
    (ii) EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:11), 또는
    (iii) EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:12).
  10. 제8 항 또는 제9 항에 있어서,
    (i) HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고;
    (ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGG X2TYYPDSVKG (서열 번호:14)를 포함하고;
    (iii) HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하며, 여기서 X2는 N, Q 또는 S인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 VH 사슬은 인간화된 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  12. 제8 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGnTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:16);
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:11); 또는
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:12).
  13. 제2 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:26)를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG (서열 번호:29)를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
    (ii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGQTYLE (서열 번호:27)를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG (서열 번호:30)를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
    (iii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE (서열 번호:28)를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGSTYYPDSVKG (서열 번호:31)를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
    (iv) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:26)를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG (서열 번호:30)를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
    (v) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:26)를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGSTYYPDSVKG (서열 번호:31)를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
    (vi) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGQTYLE (서열 번호:27)를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG (서열 번호:29)를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
    (vii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE (서열 번호:28)를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG (서열 번호:29)를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
    (viii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE (서열 번호:28)를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG (서열 번호:30)를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하거나, 또는
    (ix) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:26)를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG (서열 번호:30)를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  14. 제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 TAA에 결합하는 단일특이적 항체 분자로부터 유래되고, TAA에 대한 이중특이적 항체 분자의 친화도는 경쇄 중 하나와 쌍을 형성할 때 VH 사슬이 유래된 TAA에 대한 단일특이적 항체 분자의 친화도보다 적어도 2배 더 낮은 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  15. 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, TAA는 CD47인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  16. 제15 항에 있어서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:17).
  17. 제15 항 또는 제16 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH (서열 번호:18), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD (서열 번호:19), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY (서열 번호:20)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  18. 제15 항 또는 제16 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:17),
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:21),
    EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (서열 번호:22), 또는
    QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (서열 번호:23).
  19. 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, TAA는 PD-L1인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  20. 제19 항에 있어서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32).
  21. 제19 항 또는 제20 항에 있어서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 서열을 포함하는 HCDR1: DSWIH (서열 번호:33), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:34), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: RHWPGGFDY (서열 번호:35)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  22. 제19 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32).
  23. 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, TAA는 EGFR인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  24. 제23 항에 있어서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36).
  25. 제23 항 또는 제24 항에 있어서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 서열을 포함하는 HCDR1: SGDYYWS (서열 번호:37), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS (서열 번호:38), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: VSIFGVGTFDY (서열 번호:39)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  26. 제24 항 또는 제25 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36).
  27. 제23 항에 있어서, 제2 VH 사슬의 항원-결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40).
  28. 제26 항 또는 제27 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYGVH (서열 번호:41), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열 번호:42), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: ALTYYDYEFAY (서열 번호:43)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  29. 제26 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40).
  30. 제1 항에 있어서, 2개의 VL 사슬의 항원-결합 부위는 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR 1-3 (LCDR 1-3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25).
  31. 제30 항에 있어서,
    (i) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:44)를 포함하고;
    (ii) LCDR2는 다음 서열: KISRLEA (서열 번호:45)를 포함하고;
    (iii) LCDR3는 다음 서열: FQGSHFPRT (서열 번호:46)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  32. 제30 항 또는 제31 항에 있어서, VL 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25).
  33. 제30 항 내지 제32 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR 1-3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
  34. 제33 항에 있어서,
    (i) HCDR1은 다음 서열: SYTMS를 포함하고;
    (ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고;
    (iii) HCDR3는 다음 서열: YYRYEAWFAS를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  35. 제30 항 내지 제34 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
  36. 제30 항 내지 제32 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR 1-3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:9) (여기서 X2는 N, Q 또는 S이다).
  37. 제36 항에 있어서,
    (i) HCDR1은 다음 서열: RYTMS (서열 번호:13)를 포함하고;
    (ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGG X2TYYPDSVKG (서열 번호:14)를 포함하고;
    (iii) HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY (서열 번호:15)를 포함하며, 여기서 X2는 N, Q 또는 S인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  38. 제36 항 또는 제37 항에 있어서, 제1 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:16);
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:11); 또는
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (서열 번호:12).
  39. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR 1-3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
  40. 제39 항에 있어서,
    (i) HCDR1은 다음 서열: SYTMS를 포함하고;
    (ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고;
    (iii) HCDR3는 다음 서열: YYRYEAWFAS를 포함하는
    것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  41. 제39 항 또는 제40 항에 있어서, 제1 VH 사슬은 다음 서열 또는 다음 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
  42. 제30 항 내지 제41 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 TAA에 결합하는 단일특이적 항체 분자로부터 유래되고, TAA에 대한 이중특이적 항체 분자의 친화도는 경쇄 중 하나와 쌍을 형성할 때 VH 사슬이 유래된 TAA에 대한 단일특이적 항체 분자의 친화도보다 적어도 2배 더 낮은 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  43. 제30 항 내지 제42 항 중 어느 한 항에 있어서, TAA는 CD47인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  44. 제43 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:17).
  45. 제44 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH (서열 번호:18), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD (서열 번호:19), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY (서열 번호:20)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  46. 제44 항 또는 제45 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:17),
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:21),
    EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (서열 번호:22), 또는
    QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (서열 번호:23).
  47. 제30 항 내지 제42 항 중 어느 한 항에 있어서, TAA는 PD-L1인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
  48. 제47 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32).
  49. 제47 항 또는 제48 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: DSWIH (서열 번호:33), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:34), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: RHWPGGFDY (서열 번호:35)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  50. 제48 항 또는 제49 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32).
  51. 제30 항 내지 제42 항 중 어느 한 항에 있어서, TAA는 EGFR인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  52. 제51 항에 있어서, 제2 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36).
  53. 제52 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: SGDYYWS (서열 번호:37), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS (서열 번호:38), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: VSIFGVGTFDY (서열 번호:39)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  54. 제52 항 또는 제53 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36).
  55. 제51 항에 있어서, 제2 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40).
  56. 제52 항에 있어서, 제2 VH 사슬의 항원 결합 부위는 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYGVH (서열 번호:41), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열 번호:42), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: ALTYYDYEFAY (서열 번호:43)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  57. 제52 항 또는 제53 항에 있어서, 제2 VH 사슬은 다음 아미노산 서열 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자:
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40).
  58. 제1 항 내지 제57 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 MDR1 또는 TAA를 발현하는 세포와 비교하여 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 세포에 대해 2배 더 큰 친화도를 갖는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  59. 제1 항 내지 제58 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 화학치료제로의 처리에 대한 암 세포의 민감도를 증가시킬 수 있으며, 화학치료제의 절반 최대 억제 농도 (IC50)는 항체와 동시-투여될 때
    다음 서열을 가진 VH 사슬:
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:24); 및
    다음 서열을 가진 VL 사슬:
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25)
    을 포함하는 항-MDR1 항체 15D3와 동시-투여될 때 화학치료제의 IC50보다 적어도 2배 더 낮고, 선택적으로 IC50은 시험관 내에서 측정되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  60. 제59 항에 있어서, 암 세포는 NALM6 ADR 세포이고 선택적으로 화학치료제는 파클리탁셀, 콜키신, 베라파밀, 빈블라스틴, 토포테칸, 독소루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 또는 닐로티닙을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  61. 제1 항 내지 제60 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는, MDR1을 발현하는 세포에 결합될 때, MDR1에 의한 유출을 억제하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  62. 제1 항 내지 제61 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
    다음 서열을 가진 VH 사슬:
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:24); 및
    다음 서열을 가진 VL 사슬:
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25)
    을 포함하는 항-MDR1 항체 15D3보다 적어도 2배 더 낮은 친화도로 MDR1에 결합하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  63. 제1 항 내지 제62 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 하나 이상의 Fcγ 수용체로의 항체의 결합을 감소시키거나 폐지하도록 변형된 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  64. 제1 항 내지 제63 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것으로, 방법은 대상체에게 항체를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  65. 제64 항에 있어서, 방법은 항체를 적어도 하나의 추가적인 활성제와 조합하여 투여하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학치료제, 다중약물 저항성 수송체의 억제자, 면역요법제, 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  66. 제65 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학치료제이며, 선택적으로 화학치료제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  67. 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 화학요법제로서, 방법은 대상체에게 화학요법제를 제1 항 내지 제63 항 중 어느 한 항의 항체와 조합하여 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로 화학요법제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린인, 화학요법제.
  68. 제67 항에 있어서, 치료되는 대상체는 화학치료제에 대해 저항성인 것으로 결정된 암에 걸린 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 분자.
  69. 암에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 대상체에게 제1 항 내지 제63 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 분자의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  70. 제69 항에 있어서, 방법은 이중특이적 항체 분자를 적어도 하나의 추가적인 활성제와 조합으로 투여하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학치료제, 다중약물 저항성 수송체의 억제자, 면역요법제, 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제70 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학치료제이며, 선택적으로 화학치료제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제71 항에 있어서, 치료되는 대상체는 화학치료제로의 치료에 대해 저항성인 것으로 결정된 암에 걸려있으며, 선택적으로 화학치료제는 파클리탁셀, 콜키신, 베라파밀, 빈블라스틴, 토포테칸, 독소루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 또는 닐로티닙을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR (LCDR)을 포함하는 가변 경쇄 (VL)
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다); 및
    다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR (HCDR)을 포함하는 가변 중쇄 (VH):
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (여기서 X2는 N, Q 또는 S이다)
    를 포함하는 항체; 또는
    다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR (LCDR)을 포함하는 가변 경쇄 (VL)
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25); 및
    다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR (HCDR)을 포함하는 가변 중쇄 (VH):
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA
    를 포함하는 항체.
  74. 제73 항에 있어서,
    VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함하고:
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK;
    VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하거나:
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS, 또는
    VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함하고:
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK;
    VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하거나:
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS, 또는
    VL 사슬은 다음 서열을 가진 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함하고:
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK;
    VH 사슬은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 LCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
  75. 제74 항에 있어서,
    LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE, RSSQSIVHSTGQTYLE, 또는 RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  76. 제75 항에 있어서,
    (i) HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고;
    (ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGG X2TYYPDSVKG를 포함하고;
    (iii) HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하며, 여기서 X2는 N, Q 또는 S인 것을 특징으로 하는 항체.
  77. 제74 항 또는 제75 항에 있어서,
    (i) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
    (ii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGQTYLE를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
    (iii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGSTYYPDSVKG를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
    (iv) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
    (v) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGSTYYPDSVKG를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
    (vi) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGQTYLE를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
    (vii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
    (viii) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGSTYLE를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하거나, 또는
    (ix) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE를 포함하고,
    LCDR2는 다음 서열: KISNRFS를 포함하고,
    LCDR3는 다음 서열: FQASHFPRT를 포함하고;
    HCDR1은 다음 서열: RYTMS를 포함하고,
    HCDR2는 다음 서열: TISSGGGQTYYPDSVKG를 포함하고,
    HCDR3는 다음 서열: YGAGDAWFAY를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  78. 제73 항 내지 제77 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 VL 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하거나 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK,
    항체의 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하거나 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
  79. 제73 항에 있어서, 항체는
    다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR 1-3 (LCDR)을 포함하는 가변 경쇄 (VL):
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25); and
    다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR 1-3 (HCDR)을 포함하는 가변 중쇄 (VH)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
  80. 제79 항에 있어서,
    (i) LCDR1은 다음 서열: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:44)를 포함하고;
    (ii) LCDR2는 다음 서열: KISRLEA (서열 번호:45)를 포함하고;
    (iii) LCDR3는 다음 서열: FQGSHFPRT (서열 번호:46)를 포함하고;
    (i) HCDR1은 다음 서열: SYTMS를 포함하고;
    (ii) HCDR2는 다음 서열: TISSGGGNTYYPDSVKG를 포함하고;
    (iii) HCDR3는 다음 서열: YYRYEAWFAS를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  81. 제79 항 또는 제80 항에 있어서, 항체의 VL 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하거나 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고:
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25);
    항체의 VH 사슬은 다음 아미노산 서열을 포함하거나 또는 다음 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
  82. 제73 항 내지 제81 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 MDR-1에 특이적으로 결합하는 단일특이적 2가 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  83. 제73 항 내지 제81 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 공통 경쇄로서 VL 사슬을 포함하는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  84. 제83 항에 있어서, 이중특이적 항체는 MDR-1 결합 도메인 및 종양 관련된 항원 (TAA) 결합 도메인을 포함하며 MDR-1 결합 도메인 및 TAA 결합 도메인은 각각 VL 사슬의 LCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  85. 제84 항에 있어서, TAA는 CD47이고 TAA 결합 도메인은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS.
  86. 제85 항에 있어서, CD47 결합 도메인의 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH, 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD, 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  87. 제84 항에 있어서, TAA는 PD-L1이고 PD-L1 결합 도메인은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR 1-3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32).
  88. 제87 항에 있어서, PD-L1 결합 도메인의 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: DSWIH (서열 번호:33), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:34), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: RHWPGGFDY (서열 번호:35)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  89. 제84 항에 있어서, TAA는 EGFR이고 EGFR 결합 도메인은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36).
  90. 제89 항에 있어서, EGFR 결합 도메인의 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: SGDYYWS (서열 번호:37), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS (서열 번호:38), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: VSIFGVGTFDY (서열 번호:39)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  91. 제84 항에 있어서, TAA는 EGFR이고 EGFR 결합 도메인은 다음 서열을 가진 VH 사슬의 HCDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40).
  92. 제91 항에 있어서, EGFR 결합 도메인의 VH 사슬은 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYGVH (서열 번호:41), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열 번호:42), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: ALTYYDYEFAY (서열 번호:43)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  93. 다음 서열을 가진 VL 사슬의 경쇄 CDR (LCDR)을 포함하는 가변 경쇄 (VL)
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCHQASHFPRTFGGGTKLEIK (여기서 X1은 N, Q 또는 S이다); 또는
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (서열 번호:25); 및
    다음 서열을 가진 VH 사슬의 중쇄 CDR (HCDR)을 포함하는 가변 중쇄 (VH):
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS; 또는
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:32); 또는
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:36); 또는
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (서열 번호:40)
    를 포함하는 항체.
  94. 제93 항에 있어서, VL 사슬은 (i) 다음 서열: RSSQSIVHSTGX1TYLE (서열 번호:5)를 포함하는 LCDR1; (ii) 다음 서열: KISNRFS (서열 번호:6)를 포함하는 LCDR2; 및 (iii) 다음 서열: FQASHFPRT (서열 번호:7)를 포함하는 LCDR3를 포함하며, 여기서 X1은 N, Q 또는 S이고 VH 사슬은
    (i) 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH, 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD, 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY; 또는
    (ii) 다음 서열을 포함하는 HCDR1: DSWIH (서열 번호:33), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:34), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: RHWPGGFDY (서열 번호:35); 또는
    (iii) 다음 서열을 포함하는 HCDR1: SGDYYWS (서열 번호:37), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS (서열 번호:38), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: VSIFGVGTFDY (서열 번호:39); 또는
    (iv) 다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYGVH (서열 번호:41), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열 번호:42), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: ALTYYDYEFAY (서열 번호:43)
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  95. 제93 항에 있어서, VL 사슬은 (i) 다음 서열을 포함하는 LCDR1: RSSQSIVHSTGNTYLE (서열 번호:44); (ii) 다음 서열을 포함하는 LCDR2: KISRLEA (서열 번호:45); 및 (iii) 다음 서열을 포함하는 LCDR3: FQGSHFPRT (서열 번호:46)를 포함하고 VH 사슬은
    다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYNMH, 다음 서열을 포함하는 HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD, 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: GGYRAMDY; 또는
    다음 서열을 포함하는 HCDR1: DSWIH (서열 번호:33), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:34), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: RHWPGGFDY (서열 번호:35); 또는
    다음 서열을 포함하는 HCDR1: SGDYYWS (서열 번호:37), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS (서열 번호:38), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: VSIFGVGTFDY (서열 번호:39); 또는
    다음 서열을 포함하는 HCDR1: NYGVH (서열 번호:41), 다음 서열을 포함하는 HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열 번호:42), 및 다음 서열을 포함하는 HCDR3: ALTYYDYEFAY (서열 번호:43)
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  96. 제93 항 내지 제95 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  97. 제1 항 내지 제96 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간화된 항체 또는 인간 Fc 도메인을 포함하는 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  98. 제97 항에 있어서, 면역글로불린 G1 (IgG1) Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  99. 제1 항 내지 제98 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH 사슬은 제1 Fc 도메인에 융합되고 제2 VH 사슬은 제2 Fc 도메인에 융합되는 것을 특징으로 하는 항체.
  100. 제99 항에 있어서, Fc 도메인은 제1 및 제2 VH 사슬을 포함하는 헤테로다이머를 우선적으로 형성하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  101. 제100 항에 있어서, 제1 및 제2 Fc 도메인은 인간 면역글로불린 G1 (IgG1) Fc 도메인인 것을 특징으로 하는 항체.
  102. 제1 항 내지 제101 항 중 어느 한 항의 항체; 및
    약학적으로 허용 가능한 부형제
    를 포함하는 약학적 조성물.
  103. 제102 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  104. 제103 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학요법제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  105. 제104 항에 있어서, 화학요법제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  106. 제103 항 내지 제105 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 다중약물 저항성 수송체의 억제자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  107. 제103 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 면역요법제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  108. 제1 항 내지 제107 항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산.
  109. 제108 항에 있어서, 하나 이상의 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 하나 이상의 핵산.
  110. 제108 항 또는 제109 항의 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터.
  111. 제110 항의 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 유전적으로 변형된 포유류 세포.
  112. 제111 항에 있어서, 세포는 면역 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  113. 제1 항 내지 제63 항 및 제73 항 내지 제101 항 중 어느 한 항의 항체 또는 상기 항체를 암호화하는 핵산; 및
    적어도 하나의 추가적인 활성제
    를 포함하는 키트.
  114. 제113 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학요법제, 다중약물 저항성 수송체의 억제자, 면역요법제, 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  115. 암 세포를 살해하는 방법으로서, 방법은 암 세포와 제1 항 내지 제63 항 및 제73 항 내지 제101 항 중 어느 한 항의 항체를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  116. 제115 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  117. 제116 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학요법제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  118. 제116 항 또는 제117 항에 있어서, 방법은 적어도 하나의 추가적인 활성제와 단독으로 접촉할 때와 비교하여 암 세포의 살해를 적어도 5%만큼 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  119. 제115 항 내지 제118 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포는 약물 저항성 암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  120. 암에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 대상체에게 제1 항 내지 제63 항 및 제73 항 내지 제101 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제102 항 내지 제107 항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  121. 제120 항에 있어서, 대상체는 이전에 암에 대해 치료된 적이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 제120 항 또는 제121 항에 있어서, 암은 약물 저항성 또는 다중약물 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.
  123. 제122 항에 있어서, 암은 화학치료제에 대해 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.
  124. 제122 항에 있어서, 암은 면역요법제에 대해 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.
  125. 제120 항 내지 제122 항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 다중약물 저항성 수송체의 억제자에 대해 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.
  126. 제120 항 내지 제125 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 적어도 하나의 추가적인 활성제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  127. 제126 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 화학요법제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  128. 제127 항에 있어서, 화학요법제는 탁솔, 빈카 알칼로이드, 또는 안트라사이클린인 것을 특징으로 하는 방법.
  129. 제126 항 내지 제128 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 다중약물 저항성 수송체의 억제자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  130. 제126 항 내지 제128 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 활성제는 면역요법제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  131. 제126 항 내지 제128 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 적어도 하나의 추가적인 활성제 단독으로의 처리와 비교하여 적어도 하나의 추가적인 활성제의 효과를 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  132. 제131 항에 있어서, 증가된 효과는 암 세포 살해의 적어도 5% 증가를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  133. 제120 항 내지 제132 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 MDR1을 사전 결정된 임계치보다 높게 발현하거나, 종양 관련된 항원 (TAA)을 사전 결정된 임계치보다 높게 발현하거나, 또는 둘 다인지를 결정하기 위해 암의 샘플을 분석하는 단계를 더 포함하며, 선택적으로 TAA는 CD47을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  134. 제133 항에 있어서, 사전 결정된 임계치는 참조 세포에 의해 발현된 MDR1 및/또는 TAA의 수준에 상응하는 것을 특징으로 하는 방법.
  135. 제134 항에 있어서, MDR1 및/또는 TAA는 참조 세포에서 넉아웃 또는 넉다운된 것을 것을 특징으로 하는 방법.
  136. 제134 항 또는 제135 항에 있어서, 참조 세포는 비-암성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  137. 제134 항에 있어서, 비-암성 세포는 MDR1 및/또는 TAA를 정상 수준으로 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  138. 제120 항 내지 제137 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 MDR1 및 TAA를 사전 결정된 임계치 이상으로 발현하면 대상체는 다중특이적 항체가 투여되고, 암이 MDR1 또는 TAA를 사전 결정된 임계치 미만으로 발현하면 대상체는 다중특이적 항체를 투여하지 않는 통상적인 요법으로 치료되는 것을 특징으로 하는 방법.
  139. 다중약물 저항성 단백질 1 (MDR1) 및 종양 관련된 항원 (TAA) 둘 다를 발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체를 생성하는 방법으로서, 선택적으로 TAA는 CD47, PD-L1, 또는 EGFR을 포함하며, 방법은
    MDR1-결합 도메인 및 TAA-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체를 생산하는 단계;
    MDR1 및 TAA를 발현하는 제1 세포를 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계;
    MDR1 또는 TAA를 발현하는 제2 세포를 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계;
    결합 특이성 비율을 결정하기 위해 제1 세포로의 다중특이적 항체의 결합을 제2 세포로의 다중특이적 항체로의 결합과 비교하는 단계; 및
    비율이 사전 결정된 임계치보다 높을 때 다중특이적 항체가 MDR1 및 TAA 둘 다를 발현하는 세포에 특이적인 것으로 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  140. 제139 항에 있어서, 사전 결정된 임계치는 2:1보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  141. 제139 항 내지 제140 항에 있어서, 제2 세포는 MDR1을 발현하지만 TAA를 발현하지 않고 방법은 TAA를 발현하지만 MDR1을 발현하지 않는 제3 세포를 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  142. 제139 항 내지 제140 항에 있어서, 방법은 제1 세포, 제2 세포, 및/또는 제3 세포를 단일특이적 항-MDR1 항체 및 단일특이적 항-TAA 항체로부터 선택된 대조군 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  143. 유전적으로 변형된 인간 세포주로서, 세포주는 종양 관련 항원 (TAA)을 발현하고 다중약물 저항성 단백질 1 (MDR1)의 과발현을 위해 MDR1을 암호화하는 서열을 포함하는 외인성 핵산을 포함하며, 선택적으로 TAA는 백혈구 표면 항원 CD47을 포함하는, 세포주.
  144. 제143 항에 있어서, 세포주는 신장 세포주인 것을 특징으로 하는 세포주.
  145. 제144 항에 있어서, 세포주는 HEK 293T 세포주인 것을 특징으로 하는 세포주.
  146. 제143 항 내지 제145 항 중 어느 한 항의 세포주를 제조하는 방법으로서, 방법은
    TAA를 발현하고 MDR1을 안정하게 과발현하는 유전적으로 변형된 인간 세포를 생산하기 위해 외인성 핵산을 세포로 도입하기에 충분한 조건 하에서 TAA를 발현하는 인간 세포를 외인성 핵산과 접촉시키는 단계; 및
    TAA를 발현하고 MDR1을 안정하게 과발현하는 유전적으로 변형된 인간 세포를 생산하기에 충분한 조건 하에서 유전적으로 변형된 인간 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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