JP6961625B2 - 抗ｔｎｆｒｓｆ２５抗体 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は２０１６年６月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３４８００９号の優先権の利益を主張するものである。

技術分野
本文書は、抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体、ならびに研究、療法および診断目的でのその使用に関する。

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２５（ＴＮＦＲＳＦ２５）は、活性化および抗原経験Ｔリンパ球により優先的に発現されるＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである。ＴＮＦＲＳＦ２５は、そのリガンドであるＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５とも呼ばれる）により活性化され、これはトール様受容体またはＦｃ受容体の活性化後、抗原提示細胞およびいくつかの内皮細胞で迅速に上方制御される。ＴＮＦＲＳＦ２５は、ＮＦ−κＢ活性を刺激し得、またカスパーゼの活性化を刺激して、細胞のアポトーシスを制御し得る（Ｂｏｄｍｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６（１）：７９〜８８、１９９７、およびＫｉｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３８４（６６０７）：３７２〜３７５、１９９６）。３９３アミノ酸長のヒトＴＮＦＲＳＦ２５タンパク質の構造組織は、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）に最も相同である。ＴＮＦＲＳＦ２５の細胞外ドメインは、４つのシステインリッチドメインを含み、細胞質領域は、アポトーシスをシグナル伝達することが知られているデスドメインを含有する。選択的スプライシングにより、ＴＮＦＲＳＦ２５の複数の異なるアイソフォームが産生され、その多くは、分泌される可能性のある分子である。ＢおよびＴ細胞におけるＴＮＦＲＳＦ２５遺伝子の選択的スプライシングは、Ｔ細胞が活性化されると、プログラム変化に遭遇し、これは、全長の膜結合アイソフォームを主に産生し、Ｔ細胞の活性化により誘導されるリンパ球増殖の制御に関与すると考えられる。

ＴＮＦＲＳＦ２５の活性化は、Ｔ細胞受容体の事前の関与に依存する。ＴＮＡＲＳＦ２５のＴＬ１Ａへの結合後、ＴＮＦＲＳＦ２５シグナル伝達により、Ｔ細胞の内因性ＩＬ−２に対する感受性が高まり、Ｔ細胞の増殖が増加する。ＴＮＦＲＳＦ２５の活性化はＴ細胞受容体依存性であるため、インビボにおけるＴＮＦＲＳＦ２５の活性は、同種抗原に遭遇したＴ細胞に特異的である。静止時、および潜在的な自己免疫が存在しない場合、同種抗原に定期的に遭遇するＴ細胞の大多数は、ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞である。任意の他の外因性シグナルの不在下でのＴＮＦＲＳＦ２５の刺激により、５日以内に全ＣＤ４＋Ｔ細胞の８〜１０％のベースラインから全ＣＤ４＋Ｔ細胞の３５〜４０％までＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の高度に特異的な増殖が刺激される（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１２０（１０）：３６２９〜３６４０、２０１０）。ＴＮＦＲＳＦ２５の治療アゴニストを使用して、Ｔｒｅｇの増殖を刺激することができ、これにより、喘息、同種固形臓器移植、および眼角膜炎の実験モデルにおける炎症が低減され得る（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒらの上記論文；Ｒｅｄｄｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ８６（１９）：１０６０６〜１０６２０、２０１２；およびＷｏｌｆら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ９４（６）：５６９〜５７４、２０１２）。同様に、ＴＮＦＲＳＦ２５の活性化は、抗原依存性であるため、自己抗原またはワクチン抗原と共にＴＮＦＲＳＦ２５の共刺激は、免疫病理の増悪またはワクチン刺激免疫の強化各々に至り得る（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８９（７）３３１１〜３３１８、２０１０）。

本文書は、少なくとも部分的にはＴＮＦＳＦ２５中の特定のエピトープを標的とする抗体の発現に基づくものである。いくつかの実施形態において、抗体は、種間で交差反応し得る。例えば、いくつかの実施形態において、本文書は、互いに１００倍以内（例えば、１０倍以内）のＫ_ｄ値でげっ歯類およびヒトＴＮＦＲＳＦ２５ポリペプチドに結合できる、抗体を提供する。場合によっては、本明細書に記載の抗体は、ＴＮＦＲＳＦ２５に結合するＴＬ１Ａ（例えば、げっ歯類またはヒトＴＬ１Ａ）のシグナル伝達活性と一致するシグナル伝達事象を誘導できる。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５のアミノ酸Ｃ４８〜Ｌ７１の領域のエピトープに結合できる。例えば、抗体は、アミノ酸Ｐ６４〜Ｔ６９の領域のエピトープに特異的に結合できる。

本文書はまた、少なくとも部分的にはＴＮＦＲＳＦ２５を標的とする親和性成熟抗体の発現に基づく。親和性成熟抗体は、親抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体と比較してＴＮＦＲＳＦＳ２５に対して増加した親和性を有し得るか、もしくは親和性成熟抗体は、親抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体と比較して増加した活性を有し得るか、または親和性成熟抗体は、親抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体と比較して増加したＴＮＦＲＳＦ２５親和性および増加した活性の両方を有し得る。

したがって、第１の態様において、本文書は、抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体またはその抗原結合フラグメントを特徴とする。抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含有し、重鎖ＣＤＲ１配列がＧＦＴＦＳＮＨＤＬＮ（配列番号１２）であり、重鎖ＣＤＲ２配列がＹＩＳＳＡＳＧＬＩＳＹＡＤＡＶＲＧ（配列番号１４）であり、重鎖ＣＤＲ３配列がＤＰＡＹＴＧＬＹＡＬＤＦ（配列番号２６）である、重鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含有し、軽鎖ＣＤＲ１配列がＴＬＳＳＥＬＳＷＹＴＩＶ（配列番号２５）であり、軽鎖ＣＤＲ２配列がＬＫＳＤＧＳＨＳＫＧＤ（配列番号２１）であり、軽鎖ＣＤＲ３配列がＣＧＡＧＹＴＬＡＧＱＹＧＷＶ（配列番号２３）である、軽鎖可変領域を含み得る。

抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含有し、重鎖ＣＤＲ１配列がＧＦＴＦＳＮＨＤＬＮ（配列番号１２）であり、重鎖ＣＤＲ２配列がＹＩＳＳＡＳＧＬＩＳＹＡＤＡＶＲＧ（配列番号１４）であり、重鎖ＣＤＲ３配列がＤＰＰＹＳＧＬＹＡＬＤＦ（配列番号１６）である、重鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含有し、軽鎖ＣＤＲ１配列がＴＬＳＳＥＬＳＷＹＴＩＶ（配列番号２５）であり、軽鎖ＣＤＲ２配列がＬＫＳＤＧＳＨＳＫＧＤ（配列番号２１）であり、軽鎖ＣＤＲ３配列がＣＧＡＧＹＴＬＡＧＱＹＧＷＶ（配列番号２３）である、軽鎖可変領域を含み得る。

抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、重鎖ＣＤＲ１配列がＧＦＴＦＳＮＨＤＬＮ（配列番号１２）であり、重鎖ＣＤＲ２配列がＹＩＳＳＡＳＧＬＩＳＹＡＤＡＶＲＧ（配列番号１４）であり、重鎖ＣＤＲ３配列がＤＰＡＹＴＧＬＹＡＬＤＦ（配列番号２６）である、重鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、軽鎖ＣＤＲ１配列がＴＬＳＳＥＬＳＧＦＴＩＶ（配列番号２７）であり、軽鎖ＣＤＲ２配列がＬＫＳＤＧＳＨＳＫＧＤ（配列番号２１）であり、軽鎖ＣＤＲ３配列がＣＧＡＧＹＴＬＡＮＱＹＧＷＶ（配列番号２８）である、軽鎖可変領域を含み得る。

抗体または抗原結合フラグメントは、式（ＦＷ１）−（ＣＤＲ１）−（ＦＷ２）−（ＣＤＲ２）−（ＦＷ３）−（ＣＤＲ３）−（ＦＷ４）の、ＣＤＲ間に並置された可変領域フレームワーク（ＦＷ）配列であって、重鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列が重鎖可変領域ＦＷ配列であり、軽鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列が軽鎖可変領域ＦＷ配列である、可変領域フレームワーク（ＦＷ）配列を更に含み得る。可変領域ＦＷ配列はヒトであり得る。抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト重鎖および軽鎖定常領域を更に含有し得る。定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択され得る。定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量での抗体または抗原結合フラグメントの対象への投与後、対象の腫瘍細胞のアポトーシスが増加し得る。

別の態様において、本文書は、薬学的に許容される担体、および本明細書に開示の抗体または抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物を特徴とする。

別の態様において、本文書は、癌を治療するための上記医薬組成物および少なくとも１つの追加の薬剤を含有する製造品を特徴とする。少なくとも１つの追加の薬剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３またはＣＤ２７８を標的とする薬剤であり得るか、またはＡ２Ａ受容体アンタゴニストもしくはＴＧＦ−βアンタゴニストであり得る。少なくとも１つの追加の薬剤は、Ｂ７ファミリー共刺激分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー共刺激分子、ワクチン組成物または化学療法剤の１つ以上であり得る。少なくとも１つの追加の薬剤には、インビトロまたは対象における養子Ｔ細胞療法での使用のためのキメラ抗原受容体トランスフェクトＴ細胞または増殖腫瘍浸潤リンパ球が含まれ得る。少なくとも１つの追加の薬剤は、自己Ｔ細胞療法のインビトロ製造方法において用いられ得る。

更に別の態様において、本文書は、腫瘍においてＴＮＦＲＳＦ２５発現腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するのに有効な量の本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象の腫瘍を治療する方法を特徴とする。

本文書はまた、本明細書に記載の治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激する方法を特徴とする。ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析により測定されるように、投与前の増殖のベースラインレベルと比較して少なくとも約２０％増加し得る。

更に、本文書は、治療有効量の本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象の免疫応答を誘導する方法を特徴とする。

本文書はまた、治療有効量の本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の増殖を刺激する方法を特徴とする。

別の態様において、本文書は、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントであって、抗体またはそのＦａｂフラグメントが、ＴＮＦＲＳＦ２５に結合すると、ＴＮＦＲＳＦ２５に結合するＴＬ１Ａにより誘導されるシグナル伝達事象と一致するシグナル伝達事象を誘導し、抗体が、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５のアミノ酸Ｃ４８〜Ｌ７１の領域のエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントを特徴とする。抗体またはフラグメントは、ＴＮＦＲＳＦ２５の以下の残基：配列番号１のＣ４８、Ｒ４９、Ｇ５０、Ｃ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｇ５４、Ｈ５５、Ｙ５６、Ｌ５７、Ｋ５８、Ａ５９、Ｐ６０、Ｃ６１、Ｔ６２、Ｅ６３、Ｐ６４、Ｃ６５、Ｇ６６、Ｎ６７、Ｓ６８、Ｔ６９、Ｃ７０またはＬ７１の少なくとも１つを含有するエピトープに結合できる。抗体またはフラグメントのＴＮＦＲＳＦ２５への結合は、ＴＬ１ＡのＴＮＦＲＳＦ２５への結合を阻害し得る。抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。抗体は、いずれかのサブタイプのＩｇＧ抗体であり得る。抗体またはフラグメントは、他の１００倍以内のＫ_ｄ値でマウスＴＮＦＲＳＦ２５、非ヒト霊長類ＴＮＦＲＳＦ２５、およびヒトＴＮＦＲＳＦ２５に結合することが可能であり得る。

別の態様において、本文書は、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントであって、抗体またはそのＦａｂフラグメントが、ＴＮＦＲＳＦ２５に結合すると、ＴＮＦＲＳＦ２５に結合するＴＬ１Ａにより誘導されるシグナル伝達事象に特有であるシグナル伝達事象を誘導し、抗体が、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５のアミノ酸Ｐ６４〜Ｔ６９の領域のエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントを特徴とする。抗体またはフラグメントは、ＴＮＦＲＳＦ２５の以下の残基：配列番号１のＰ６４、Ｃ６５、Ｇ６６、Ｎ６７、Ｓ６８またはＴ６９の少なくとも１つを含有するエピトープに結合できる。抗体またはフラグメントのＴＮＦＲＳＦ２５への結合は、ＴＬ１ＡのＴＮＦＲＳＦ２５への結合を阻害し得る。抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。抗体は、いずれかのサブタイプのＩｇＧ抗体であり得る。抗体またはフラグメントは、他の１００倍以内のＫ_ｄ値でマウスＴＮＦＲＳＦ２５、非ヒト霊長類ＴＮＦＲＳＦ２５、およびヒトＴＮＦＲＳＦ２５に結合することが可能であり得る。

別の態様において、本文書は、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントであって、抗体が、配列番号１のＣ４８〜Ｌ７１に記載の配列と少なくとも８０％同一である配列を有するエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントを特徴とする。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１のＣ４８〜Ｌ７１に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有するエピトープ、または配列番号１のＣ４８〜Ｌ７１に記載の配列と少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を有するエピトープに結合できる。

更に別の態様において、本文書は、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントであって、抗体が、配列番号１のＰ６４〜Ｔ６９に記載の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を有するエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントを特徴とする。

本文書はまた、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントであって、抗体が、４個以下のアミノ酸置換を有する配列番号１のＣ４８〜Ｌ７１に記載の配列を有するエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントを特徴とする。いくつかの実施形態において、抗体は、３個以下のアミノ酸置換、２個以下のアミノ酸置換または１個のアミノ酸置換を有する配列番号１のＣ４８〜Ｌ７１に記載の配列を有するエピトープに結合できる。

別の態様において、本文書は、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントであって、抗体が、１個のアミノ酸置換を有する配列番号１のＰ６４〜Ｔ６９に記載の配列を有するエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはそのＦａｂフラグメントを特徴とする。

更に別の態様において、本文書は、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する方法を特徴とする。本方法は、薬学的に許容される担体、およびヒトＴＮＦＲＳＦ２５に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはそのＦａｂフラグメントを含有する組成物を哺乳動物に投与することを含み得、抗体またはそのＦａｂフラグメントは、ＴＮＦＲＳＦ２５に結合するＴＬ１Ａにより刺激されるシグナル伝達事象を模倣でき、抗体は、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５のアミノ酸Ｃ４８〜Ｌ７１の領域のエピトープに結合する。抗体またはフラグメントは、ＴＮＦＲＳＦ２５の以下の残基：配列番号１のＣ４８、Ｒ４９、Ｇ５０、Ｃ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｇ５４、Ｈ５５、Ｙ５６、Ｌ５７、Ｋ５８、Ａ５９、Ｐ６０、Ｃ６１、Ｔ６２、Ｅ６３、Ｐ６４、Ｃ６５、Ｇ６６、Ｎ６７、Ｓ６８、Ｔ６９、Ｃ７０またはＬ７１の少なくとも１つを含有するエピトープに結合できる。抗体またはフラグメントは、ＴＮＦＲＳＦ２５の以下の残基：配列番号１のＰ６４、Ｃ６５、Ｇ６６、Ｎ６７、Ｓ６８またはＴ６９の少なくとも１つを含有するエピトープに結合できる。抗体またはフラグメントのＴＮＦＲＳＦ２５への結合は、ＴＬ１ＡのＴＮＦＲＳＦ２５への結合を阻害し得る。抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。抗体はいずれかのサブタイプのＩｇＧ抗体であり得る。抗体またはフラグメントは、他の１００倍以内のＫ_ｄ値でマウスＴＮＦＲＳＦ２５、非ヒト霊長類ＴＮＦＲＳＦ２５およびヒトＴＮＦＲＳＦ２５に結合することが可能であり得る。

別の態様において、本文書は、薬学的に許容される担体、および本明細書に記載の単離されたモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントを含有する医薬組成物を特徴とする。更に、本文書は、患者の癌、感染性疾患または組織移植片の治療のための医薬組成物の使用を特徴とする。

別段の規定がない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施のために使用できるが、以下には好適な方法および材料が記載されている。本明細書に言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。更に、材料、方法および実施例は単に例示であり、限定を意図するものではない。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。

ＴＮＦＲＳＦ２５が何らかの相同性を共有するヒトＴＮＦＲ１（配列番号３）およびヒトＦａｓ（配列番号４）との、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５（配列番号２）のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。配列ナンバリングは、予測成熟タンパク質のＮ末端から始まる。システインリッチ領域Ｉ〜ＩＶ、膜貫通ドメイン（ＴＭ）およびデスドメイン（ＤＤ）の位置が示されている。配列の少なくとも２つの間で同一である残基は太字で下線が引かれている。 ヒト（配列番号１および７）由来の２つの代表的なＴＮＦＲＳＦ２５アミノ酸配列、ならびにマウス（配列番号８）、アカゲザル（配列番号９）およびカニクイザル（配列番号１０）由来の代表的なＴＮＦＲＳＦ２５アミノ酸配列を示す図である。 様々な組み換えＴＮＦＲＳＦ２５ポリペプチドの発現を評価する方法のステップを示す図である。 ６つの組み換えＴＮＦＲＳＦ２５ポリペプチドの発現レベルを示すグラフである。 キメラ抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体の組み換えＴＮＦＲＳＦ２５ポリペプチドへの結合を評価する方法のステップを示す図である。 増加量の組み換えＴＮＦＲＳＦ２５ポリペプチドのキメラ抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体への結合を示すグラフである。 様々なＴＮＦＲＳＦ２５アラニン変異体の抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体への結合における倍数変化を示すグラフである。 抗体結合に関与しているか、または関与している可能性があると同定された残基の位置を示す、ＴＮＦＲＳＦ２５の構造を示す図である。 抗体結合に関与していると同定されたアミノ酸の位置を示す、両側から見たＴＮＦＲＳＦ２５の構造の空間充填図である。「ホットスポット」残基は、アミノ酸４８〜７１のドメインにあると同定された。 ＴＬ１Ａ−Ｉｇ融合タンパク質の存在下もしくは不在下での抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体のＴＮＦＲＳＦ２５への結合の阻害、または抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体の存在下もしくは不在下でのＴＬ１Ａ−ＩｇのＴＮＦＲＳＦ２５への結合の阻害を示すグラフである。左欄：抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体（「ハムスター親」）の組み換えヒトＴＮＦＲＳＦ２５への結合は、ＴＬ１Ａ−Ｉｇの存在下で完全に阻害された。中央欄：ＴＬ１Ａ−Ｉｇ融合タンパク質の組み換えヒトＴＮＦＲＳＦ２５への結合は、親抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体の存在下で完全に阻害された。右欄：ヒト化抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体の組み換えヒトＴＮＦＲＳＦ２５への結合はＴＬ１Ａ−Ｉｇの存在下で完全に阻害された。 親ヒト化抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体および親和性成熟クローンのＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃ融合タンパク質への結合を示すグラフである。 親抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体、ＴＬ１Ａおよび記載の親和性成熟クローンのカスパーゼ活性を示すグラフである。親和性成熟クローンは、ＩｇＧ１型であった。 親抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体、ＴＬ１Ａおよび記載の親和性成熟クローンのカスパーゼ活性を示すグラフである。親和性成熟クローンは、記載されているようにＩｇＧ１またはＩｇＧ４型であった。 競合アッセイにおける蛍光レベルを示すグラフであり、そこでＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７−標識ＴＬ１Ａおよび様々な抗体競合物（４Ｃ１２親ならびにＭ３、Ｍ４およびＭ５親和性成熟クローン）を、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３）を発現するｐ８１５細胞と共にインキュベートした。 競合アッセイにおける蛍光レベルを示すグラフであり、そこでＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７−標識４Ｃ１２および様々な抗体競合物（４Ｃ１２親、ｈＩｇＧ１ならびにＭ３、Ｍ４およびＭ５親和性成熟クローン）を、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３）を発現するｐ８１５細胞と共にインキュベートした。

本文書は、少なくとも部分的にはＴＮＦＳＦ２５中の特定のエピトープを標的とする抗体の発現に基づくものである。例えば、本文書は、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５のアミノ酸Ｃ４８〜Ｌ７１の領域のエピトープに結合できる抗体を提供する。いくつかの実施形態において、抗体は互いに１００倍以内（例えば、１０倍以内）のＫ_ｄ値でげっ歯類およびヒトＴＮＦＲＳＦ２５ポリペプチドに結合でき、ＴＮＦＲＳＦ２５に結合するげっ歯類またはヒトＴＬ１Ａのシグナル伝達活性を模倣することが可能であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、有胎盤哺乳動物におけるポリペプチドの保存領域であるアミノ酸Ｐ６４〜Ｔ６９の領域のエピトープに結合できる。本明細書で提供される抗体の１つ以上、または１つ以上の抗体を含有する組成物を使用して、Ｔ細胞（例えば、ヒトＴ細胞、マウスＴ細胞またはサルＴ細胞）の増殖を刺激する方法、ならびに１つ以上の抗体または組成物を使用して、ヒト癌患者を治療する（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するのに有効な量の抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体を投与する）方法も本明細書で提供される。

本文書はまた、親和性成熟ヒト化ＴＮＦＲＳＦ２５特異的モノクローナル抗体、および親和性成熟抗体の抗原結合フラグメントを提供する。親和性成熟抗体を使用して、とりわけＴ細胞（例えば、自然発生腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を含む、ヒトＴ細胞、ならびにマウスＴ細胞またはサルＴ細胞）の増殖を刺激する方法、ならびにＴ細胞の増殖が有益な効果を有し得る癌および他の疾患状態（例えば、感染性疾患、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患）の治療において親和性成熟抗体を使用する方法も本明細書で提供される。本方法は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞または適当な制御性Ｔ細胞集団の増殖を刺激するのに有効な量の親和性成熟抗体を投与することを含み得る。

ヒトＴＮＦＲ１およびＦａｓのアミノ酸配列とアラインメントした、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５の部分アミノ酸配列を図１に示す。ヒトＴＮＦＲＳＦ２５の代表的な全長アミノ酸配列は、

である。

本明細書で使用する、用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する任意の免疫グロブリンまたは抗体（例えば、ヒト、ハムスター、ネコ、マウス、軟骨魚類またはラクダ抗体）、ならびにそれらの任意の誘導体またはコンジュゲートを指す。広範な抗体が当業者に公知である。抗体の非限定的な例として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異的抗体）、一本鎖抗体（例えば、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体および軟骨魚類抗体）、キメラ抗体、ネコ抗体およびネコ化抗体が挙げられる。モノクローナル抗体は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の同種集団である。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血清中に含有される抗体分子の異種集団である。用語「抗体」は、抗体誘導体およびコンジュゲート（例えば、安定化タンパク質、検出可能な部分または治療剤にコンジュゲートした抗体）も含む。

ポリペプチド（例えば、抗体またはそのフラグメント）に関して「単離された」または「精製された」は、ポリペプチドが、通常自然に見出される細胞成分（例えば、他のポリペプチド、脂質、炭水化物および核酸）からある程度分離されることを意味する。いくつかの実施形態において、「単離された」ポリペプチドは、ポリペプチドが自然に発現および産生される環境以外の環境で発現および産生されるポリペプチドである。例えば、植物ポリペプチドは、細菌または真菌中で発現および産生されて、単離される。同様に、植物ポリペプチドは、その遺伝子コード配列をキメラ調節エレメントに機能し得る形で結合させ、ポリペプチドが自然には発現しない組織中で発現されて、単離される。

単離されたポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主バンドを生成し得る。単離されたポリペプチドは、少なくとも約７５％純粋（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％純粋）であり得る。単離されたポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出により、化学合成により、または宿主細胞またはトランスジェニック植物における組み換え産生により入手され得、例えば、親和性クロマトグラフィー、免疫沈降、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製され得る。精製の程度は、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、または高性能液体クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない任意の適当な方法を用いて測定され得る。

「抗原結合フラグメント」は、抗原に特異的に結合できる、少なくとも１つの可変ドメイン（例えば、哺乳動物（例えば、ネコ、ヒト、ハムスターまたはマウス）重鎖もしくは軽鎖免疫グロブリンの可変ドメイン、ラクダ可変抗原結合ドメイン（ＶＨＨ）、または軟骨魚類免疫グロブリン新規抗原受容体（Ｉｇ−ＮＡＲ）ドメイン）を含有する全長抗体のいずれかの部分である。抗体フラグメントの非限定的な例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。少なくとも１つのラクダＶＨＨドメインまたは少なくとも１つの軟骨魚類Ｉｇ−ＮＡＲドメインを含有する追加の抗体フラグメントには、ミニボディ、マイクロ抗体、サブナノ抗体およびナノ抗体、ならびに例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９２４７０号に記載の他の形態の抗体のいずれかが含まれる。

「Ｆｖフラグメント」は、完全抗原認識および結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。この領域は、堅固な非共有結合的に会合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのは、この立体配置においてである。用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原結合部位の部分を形成する免疫グロブリン（重鎖または軽鎖免疫グロブリン）内の領域を指す。当技術分野で知られているように、重鎖および軽鎖免疫グロブリンは各々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを含有する。任意の抗体または抗原結合フラグメントにおいて、重鎖免疫グロブリンからの３つのＣＤＲおよび軽鎖免疫グロブリンからの３つのＣＤＲは、一緒になって抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原結合部位を形成する。Ｋａｂａｔデータベースは、軽鎖免疫グロブリンまたは重鎖免疫グロブリン中に存在するＣＤＲ配列をナンバリングするために当技術分野で用いられる１つのシステムである。

全体として、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、通常、結合部位全体よりも親和性は低いが、抗原を認識および結合する能力を有する。「Ｆａｂフラグメント」はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）を含有する。「Ｆａｂフラグメント」は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖Ｃ_Ｈ１ドメインのカルボキシ末端で少数の残基を追加することにより「Ｆａｂ′フラグメント」と異なる。「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、元々、その間にヒンジシステインを有する「Ｆａｂ’フラグメント」の対として産生される。パパインまたはペプシン消化などの、このような抗体フラグメントを調製する方法は、当業者に公知である。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化により産生され得、Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより産生され得る。場合によっては、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得る。例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１７２５、１９８９を参照されたい。抗体またはそのフラグメントは、産生されたら、標準的なイムノアッセイ法、例えば、ＥＬＩＳＡ技術、ラジオイムノアッセイ、およびウエスタンブロット法を用いてＴＮＦＲＳＦ２５ポリペプチドの認識について試験され得る。Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１１章、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ編、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２を参照されたい。

抗体は、ＩｇＧまたはＩｇＭ型、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２型を含むが、これらに限定されない、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ型の抗体であり得る。例えば、場合によっては、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４型の抗体である。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、完全ヒトまたはヒト化抗体であり得る。「ヒト抗体」は、ヒトゲノムに存在する核酸（例えば、再配列ヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子座）によりコードされる抗体を意味する。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、ヒト細胞培養（例えば、ネコハイブリドーマ細胞）で産生され得る。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、非ヒト細胞（例えば、マウスまたはハムスター細胞株）で産生され得る。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、細菌または酵母細胞で産生され得る。

ヒト抗体は、異種抗体、例えば、マウスまたはラット可変および／または定常領域を保有する抗体に関連したある種の問題を回避できる。例えば、エフェクター部分がヒトであるため、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用して、例えば、補体依存性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害によって標的細胞をより効率的に破壊することができる。更に、ヒト免疫系は、抗体を異物として認識しないであろう。更に、ヒトの循環における半減期は、自然発生ヒト抗体と類似しており、より少ない投与用量およびより少ない投与頻度を可能にする。ヒト抗体を調製する方法は、当技術分野で公知である。

本明細書で用いられる用語「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えば、マウス、ハムスター、ラット、ウサギまたはヤギ）免疫グロブリン由来の最小配列を含有するヒト抗体を指す。ヒト化抗体は、一般に、ヒト定常および／もしくは可変領域ドメインまたは特異的変化を有する、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたは他の種からのキメラまたは変異モノクローナル抗体である。非限定的な例において、ヒト化抗体は、ヒト抗体（レシピエント抗体）であり、そこで、レシピエント抗体の超可変領域（ＨＶＲ）残基は、所望の特異性、親和性および能力を有する、非ヒト種（ドナー）抗体、例えば、マウス、ラット、ウサギまたはヤギ抗体からのＨＶＲ残基で置き換えられている。いくつかの実施形態において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられていてもよい。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含有し得る。このような改変は、例えば、抗体の性能を向上させるために行われ得る。

いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つのおよび典型的には２つの実質的にすべての可変ドメインを含有し得、そこで、超可変ループ（ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応しており、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常（Ｆｃ）領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常（Ｆｃ）領域の少なくとも一部を含有し得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるヒト化抗体または抗原結合フラグメントは、対応する非ヒト化抗体が刺激するのと同じ程度でエフェクター細胞の作用を刺激しないように、（例えば、対応する非ヒト化抗体と比較して）低下したまたは最小限のエフェクター機能を有し得る。

ヒト化抗体を産生する技術は、当業者者に周知である。いくつかの実施形態において、新しい人工タンパク質分子または「キメラ」抗体を形成するために、タンパク質ジスルフィド結合を介して結合される、抗体ドメインの制御再配列が利用され得る（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ（Ｂｕｄａｐ．）１４：９５、１９８１）。組み換えＤＮＡ技術は、マウス抗体可変軽鎖および重鎖ドメイン、ならびにヒト抗体軽鎖および重鎖定常ドメインをコードするＤＮＡ配列間の遺伝子融合を構築するために用いられ得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：６８５１、１９８４）。例えば、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部分またはＣＤＲをコードするＤＮＡ配列は、ヒト抗体重鎖および軽鎖のフレームワークをコードするＤＮＡ配列中に分子手段によって接合され得る（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２、１９８６；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３、１９８８）。発現された組み換え産物は、「再形成された」抗体またはヒト化抗体と呼ばれ、ヒト抗体の軽鎖または重鎖のフレームワーク、およびマウスモノクローナル抗体の抗原認識部分であるＣＤＲを含有する。

重鎖および軽鎖を設計するためのおよびヒト化抗体を産生するための他の方法は、例えば米国特許第５５３０１０１号、第５５６５３３２号、第５５８５０８９号、第５６３９６４１号、第５６９３７６１号、第５６９３７６２号および第５７３３７４３号に記載されている。ヒト化抗体についての更に追加の方法は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、第４９３５４９６号、第５５０２１６７号、第５５５８８６４号、第５６９３４９３号、第５６９８４１７号、第５７０５１５４号、第５７５００７８号および第５７７０４０３号に記載されている。

用語「一本鎖抗体」は、抗原に特異的に結合できる少なくとも１つの可変結合ドメイン（例えば、哺乳動物重鎖もしくは軽鎖免疫グロブリンの可変ドメイン、ラクダＶＨＨまたは軟骨魚類（例えば、サメ）Ｉｇ−ＮＡＲドメイン）を含有する単一ポリペプチドを指す。一本鎖抗体の非限定的な例として、単一ドメイン抗体が挙げられる。

本明細書で使用する用語「単一ドメイン抗体」は、抗原に特異的に結合できる１つのラクダＶＨＨまたは少なくとも１つの軟骨魚類Ｉｇ−ＮＡＲドメインを含有するポリペプチドを指す。単一ドメイン抗体の非限定的な例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９２４７０号に記載されている。

抗体またはその抗原結合フラグメントは、試料中の特定の抗原に結合し、試料中の他の分子を認識および結合しないか、または比較的低い程度でそれを認識および結合する場合、特定の抗原、例えば、ＴＮＦＲＦＳ２５に「特異的に結合」する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、リン酸緩衝生理食塩水中で、例えば、約１×１０^−６Ｍ以下（例えば、約１×１０^−９Ｍ以下、約１×１０^−１０Ｍ以下、約１×１０^−１１Ｍ以下、または約１×１０^−１２Ｍ以下）の親和性（Ｋ_ｄ）を有するエピトープに選択的に結合できる。タンパク質エピトープを特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントの能力は、当技術分野で公知の方法のいずれかまたは本明細書に記載の方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ／表面プラズモン共鳴）を用いて決定され得る。これには、例えば、形質転換された生細胞におけるカスパーゼの活性化を刺激する方法としての生細胞上のＴＮＦＲＳＦ２５への結合、ＥＬＩＳＡ法を用いて検出されるようにヒトＴＮＦＲＳＦ２５融合タンパク質を含む固定化標的基質への結合、フローサイトメトリーにより検出されるように生細胞上のＴＮＦＲＳＦ２５への結合、または表面プラズモン共鳴（ＰｒｏｔｅＯｎを含む）による固定化基質への結合が含まれ得る。

ＴＮＦＲＳＦ２５に対して特異的結合親和性を有する抗体は、標準的な方法を用いて産生され得る。例えば、ＴＮＦＲＳＦ２５ポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号２に記載の配列セット、または全長少なくとも６〜１０個のアミノ酸である、配列番号１もしくは配列番号２のフラグメントを有する）は、組み換え技術により産生され得るか、生体試料（異種発現系）から精製され得るか、または化学的に合成されて、ウサギ、ニワトリ、マウス、モルモットまたはラットを含む、宿主動物に免疫を与えるために用いられ得る。免疫応答を増大するために用いられ得る様々なアジュバントは宿主種に依存し、これらには、フロインドアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールが含まれる。モノクローナル抗体は、ＴＮＦＲＳＦ２５ポリペプチドおよび標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製され得る。特に、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、１９７５）により記載されたような、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術、Ｋｏｓｂｏｒら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２、１９８３）またはＣｏｔｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２０２６、１９８３）のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＣｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁、１９８３）により記載されたＥＢＶ−ハイブリドーマ技術により得られる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの任意のサブクラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスの抗体であり得る。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロおよびインビボで培養され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のモノクローナル抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体は、アミノ酸配列が、配列番号５と８０％〜９９．５％同一であるように、１〜２４個の改変体（例えば、置換、付加または欠失）を有する配列番号５に記載のアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のモノクローナル抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体は、アミノ酸配列が、配列番号６と８０％〜９９．９％同一であるように、１〜２３個の改変体（例えば、置換、付加または欠失）を有する配列番号６に記載のアミノ酸配列を含有する軽鎖可変領域を有する。配列番号５および配列番号６の配列は以下の通りである：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＳＱＰＧＮＳＬＱＬＳＣＥＡＳＧＦＴＦＳＮＨＤＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＹＩＳＳＡＳＧＬＩＳＹＡＤＡＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＦＬＱＭＮＮＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＤＰＰＹＳＧＬＹＡＬＤＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号５）、
ＱＰＶＬＴＱＳＰＳＡＳＡＳＬＳＧＳＶＫＬＴＣＴＬＳＳＥＬＳＳＹＴＩＶＷＹＱＱＲＰＤＫＡＰＫＹＶＭＹＬＫＳＤＧＳＨＳＫＧＤＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＡＨＲＹＬＳＩＳＮＶＱＳＥＤＤＡＴＹＦＣＧＡＧＹＴＬＡＧＱＹＧＷＶＦＧＳＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号６）。

したがって、本文書は、１〜２４個の配列改変体を有する、配列番号５に記載のアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントを含有する重鎖可変領域ポリペプチド、ならびに配列番号５またはその抗原結合フラグメントに対して少なくとも約８０％（例えば、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％）のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号５またはその抗原結合フラグメントと比較して２４個以下（例えば、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個）のアミノ酸置換を含有し得る。

本文書はまた、１〜２３個の配列改変体を有する、配列番号６に記載のアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントを含有する軽鎖可変領域ポリペプチド、ならびに配列番号６またはその抗原結合フラグメントに対して少なくとも約８０％（例えば、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％）のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号６またはその抗原結合フラグメントと比較して２３個以下（例えば、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個）のアミノ酸置換を含有し得る。

本文書はまた、本明細書に開示の重鎖可変領域ポリペプチドと軽鎖可変領域ポリペプチドの両方を含有する抗体および抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、１〜２４個のアミノ酸置換（例えば、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０または２０〜２４個の全アミノ酸置換）を有する配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、１〜２３個のアミノ酸置換（例えば、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０または２０〜２３個の全アミノ酸置換）を有する配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列の両方を含有し得る。アミノ酸置換は、ペプチド配列において１個のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを指す。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＣ４８〜Ｌ７１に記載の配列に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性）を有するアミノ酸配列を有するＴＮＦＲＳＦ２５のエピトープに結合できる。例えば、場合によっては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、４個以下（例えば、３個以下または２個以下）のアミノ酸置換を有するか、または１個のアミノ酸置換を有する、配列番号１のＣ４８〜Ｌ７１に記載の配列を有するＴＮＦＲＳＦ２５のエピトープに結合できる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のＰ６４〜Ｔ６９に記載の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＴＮＦＲＳＦ２５のエピトープに結合できる。例えば、場合によっては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、１個のアミノ酸置換を有する、配列番号１のＰ６４〜Ｔ６９に記載の配列を有するＴＮＦＲＳＦ２５のエピトープに結合できる。

本明細書に記載されるように、他（例えば、国際公開第２０１６／０８１４５５号）に記載のように産生されたＴＮＦＲＳＦ２５に対するヒト化モノクローナル抗体を、親和性成熟試験で使用したところ、親和性および／または活性の増加に関連すると思われるいくつかの重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲ改変体が同定された。しかし、興味深いことに、本明細書の実施例３で考察されるように、ＴＮＦＲＳＦ２５に対して最高の結合親和性を示すクローンは、必ずしも親抗体に対して最高の活性を有するクローンとは限らなかった。例えば、「Ｍ５」として本明細書で同定されるクローンは、カスパーゼ−３放出アッセイにより測定されたように、改善されたアゴニスト活性を示したが、驚くべきことにＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃ融合タンパク質へのその結合は、コンビナトリアルライブラリースクリーニングにより同定された他のクローンの多くよりもはるかに弱かった。この知見の例外は、「Ｍ４」として同定されたクローンであり、これは、親抗体と比較して、ＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃへの改善された結合と改善されたアゴニスト活性の両方を示した。

したがって、場合によっては、本明細書に記載の抗体は、親ヒト化４Ｃ１２抗体と比較して、ＴＮＦＲＳＦ２５に対する増加した結合親和性、増加したアゴニスト活性（例えば、カスパーゼ−３アッセイにより測定されたように）、または増加した親和性と活性の両方を有し得る。「増加した」親和性または活性は、ヒト化４Ｃ１２の親和性またはアゴニスト活性と比較して、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％または１００％超）の増加を意味する。４Ｃ１２重鎖および軽鎖の可変領域の配列は、本明細書において各々配列番号５および６に記載されている。抗体のアゴニスト活性は、例えば、本明細書に記載のカスパーゼ３アッセイ、または他（例えば、Ｂｕら、Ｂｏｎｅ３３（５）：７６０−７７０、２００３）に記載のＴＮＦＲＳＦ２５受容体シグナル伝達アッセイを用いて評価され得る。

したがって、いくつかの実施形態において、本文書は、配列番号１２に記載のＣＤＲ１配列、配列番号１４に記載のＣＤＲ２配列、および配列番号１６、２６および３２のいずれかに記載のＣＤＲ３配列を含有する重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。ポリペプチドはまた、例えば、式（ＦＷ１）−（ＣＤＲ１）−（ＦＷ２）−（ＣＤＲ２）−（ＦＷ３）−（ＣＤＲ３）−（ＦＷ４）の、ＣＤＲ間に並置された可変領域重鎖フレームワーク（ＦＷ）配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＦＷ配列はヒト配列であり得る。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号１１に記載のＦＷ１配列、配列番号１３に記載のＦＷ２配列、配列番号１５に記載のＦＷ３配列および配列番号１７に記載のＦＷ４配列を含み得る。

本文書はまた、配列番号２５、２７および２９のいずれかに記載のＣＤＲ１配列、配列番号２１に記載のＣＤＲ２配列、ならびに配列番号２３、２８および３０のいずれかに記載のＣＤＲ３配列を含有する軽鎖可変領域ポリペプチドを提供する。ポリペプチドはまた、式（ＦＷ１）−（ＣＤＲ１）−（ＦＷ２）−（ＣＤＲ２）−（ＦＷ３）−（ＣＤＲ３）−（ＦＷ４）の、ＣＤＲ間に並置された可変領域軽鎖ＦＷを含み得る。場合によっては、ＦＷ配列はヒト配列であり得る。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号１８に記載のＦＷ１配列、配列番号２０に記載のＦＷ２配列、配列番号２２に記載のＦＷ３配列および配列番号２４に記載のＦＷ４配列を含み得る。

本文書はまた、本明細書に開示の重鎖可変領域ポリペプチドと軽鎖可変領域ポリペプチドの両方を含有する抗体および抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書に開示の重鎖ＣＤＲ配列を有する重鎖可変領域配列と、本明細書に開示の軽鎖ＣＤＲ配列を有する軽鎖可変領域配列の両方を含有し得る。場合によっては、抗体は、配列番号１２、１４および１６に記載の重鎖可変領域ＣＤＲを含有せず、配列番号１９、２１および２３に記載の軽鎖可変領域ＣＤＲを含有しないように、４Ｃ１２抗体ではない。

いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持するその効果の点で有意に異ならない保存的置換を選択することにより行われ得る。例えば、自然発生残基は、側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：（１）疎水性アミノ酸（ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）、（２）中性親水性アミノ酸（システイン、セリンおよびトレオニン）、（３）酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、（４）塩基性アミノ酸（アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシンおよびアルギニン）、（５）鎖の配向に影響を与えるアミノ酸（グリシンおよびプロリン）、および（６）芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン）。これらのグループ内で行われる置換は、保存的置換と考えることができる。保存的置換の非限定的な例として、アラニンに代わるバリン、アルギニンに代わるリシン、アスパラギンに代わるグルタミン、アスパラギン酸に代わるグルタミン酸、システイン代わるセリン、グルタミンに代わるアスパラギン、グルタミン酸に代わるアスパラギン酸、グリシンに代わるプロリン、ヒスチジンに代わるアルギニン、イソロイシンに代わるロイシン、ロイシンに代わるイソロイシン、リシンに代わるアルギニン、メチオニンに代わるロイシン、フェニルアラニンに代わるロイシン、プロリンに代わるグリシン、セリンに代わるトレオニン、トレオニンに代わるセリン、トリプトファンに代わるチロシン、チロシンに代わるフェニルアラニン、および／またはバリンに代わるロイシンでの置換が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、上記のアミノ酸クラスの内の１つのメンバーを別のクラスのメンバーに交換するような非保存的置換であり得る。

特定の核酸またはアミノ酸配列と特定の配列識別番号により参照される配列との間のパーセント配列同一性を、以下のように測定する。最初に、核酸またはアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４およびＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含有するＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンからのＢＬＡＳＴ２シーケンス（Ｂ１２ｓｅｑ）プログラムを用いて特定の配列識別番号に記載の配列と比較する。このＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンは、ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔまたはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでオンラインで得ることができる。Ｂ１２ｓｅｑプログラムの使用方法を説明する指示書は、ＢＬＡＴＺに付属のリードミーファイル中に見出すことができる。Ｂ１２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを用いて２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために用いられ、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いられる。２つの核酸配列を比較するために、オプションを以下のように設定する：−ｉは、比較される第１の核酸配列を含有するファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較される第２の核酸配列を含有するファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐはｂｌａｓｔｎに設定し；−ｏは、任意の所望のファイル名に設定し（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；−ｑは−１に設定し；−ｒは２に設定し；および全ての他のオプションは、それらのデフォルト設定のままにする。例えば、以下のコマンドを使用して、２つの配列間の比較を含有する出力ファイルを出力することができる：Ｃ：＼Ｂ１２ｓｅｑ−ｉｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ−ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ−ｐ ｂｌａｓｔｎ−ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ−ｑ−１−ｒ ２。２個のアミノ酸配列を比較するために、Ｂ１２ｓｅｑのオプションを以下のように設定する：−ｉは、比較される第１のアミノ酸配列を含有するファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較される第２のアミノ酸配列を含有するファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐはｂｌａｓｔｐに設定し；−ｏは任意の所望のファイル名に設定し（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；および全ての他のオプションは、それらのデフォルト設定のままにする。例えば、以下のコマンドを使用して、２個のアミノ酸配列間の比較を含有する出力ファイルを出力することができる：Ｃ：＼Ｂ１２ｓｅｑ−ｉｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ−ｊｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ−ｐｂｌａｓｔｐ−ｏｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。２つの比較された配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、アラインメントした配列として相同性の領域を示す。２つの比較された配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは、アラインメントした配列を示さない。

いったんアラインメントしたら、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列において示される位置数を計数することにより、マッチ数を決定する。同定された配列（例えば、配列番号１）に記載の配列の長さ、または区切られた長さ（例えば、同定された配列に記載の配列からの１００の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のいずれかでマッチ数を割り、次いで得られた値に１００をかけることにより、パーセント配列同一性を決定する。例えば、１１０マッチを有するアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列とアラインメントした場合、配列番号１に記載の配列と９０．９％同一である（すなわち、１１０÷１２１×１００＝９０．９）。パーセント配列同一性の値は、少数第２位で四捨五入されることに留意されたい。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３および７５．１４は、７５．１に切り捨てられ、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８および７５．１９は、７５．２に切り上げられる。長さの値は常に整数となることも留意されたい。

更に、本文書はまた、薬学的に許容される担体と併用して、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物を提供する。「薬学的に許容される担体」（「賦形剤」または「担体」とも称される）は、１つ以上の治療用化合物を対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラットまたはウサギ）に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤、安定化剤または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルであり、これは、使用する投与量および濃度でそれに曝露される細胞または対象に無毒である。薬学的に許容される担体は、液体または固体であり得、治療用化合物の１つ以上および所与の医薬組成物の任意の他の成分と併用される場合、所望のバルク、コンシステンシーおよび他の適切な輸送および化学特性を与えるように、計画された投与形式を念頭において選択され得る。アミノ酸と有害な反応をしない典型的な薬学的に許容される担体には、例として、水、食塩水、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチンまたは硫酸カルシウム）、潤滑剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）、崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体としてまた、水性ｐＨ緩衝溶液またはリポソーム（哺乳動物への薬物の送達に有用な様々な種類の脂質、リン脂質および／または界面活性剤からなる小さい小胞）が挙げられる。薬学的に許容される担体のさらなる例として、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルジニンもしくはリシン、グルコース、マンノースもしくはデキストリン等の単糖類、二糖類および他の炭水化物、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール、塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）が挙げられる。

医薬組成物は、１つ以上の活性剤と、１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤および／またはアジュバント、ならびに改善された移動、送達、耐容性などを提供するために製剤に通常組み込まれる任意選択の他の薬剤とを混合することにより製剤化され得る。医薬組成物は、例えば、凍結乾燥製剤、水溶液、分散剤または固形製剤、例えば、錠剤、糖衣錠またはカプセルに製剤化され得る。多数の適当な製剤は、全ての薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９０）），特に８７章に見出すことができる。これらの製剤として、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）を含有する小胞（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲルおよびカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。製剤中の活性剤が、製剤により不活化されず、製剤が、投与経路について生理学的に適合性および耐容性であるとの条件で、前述の混合物のいずれかは本発明に記載の治療および療法において適切であり得る。薬剤師に周知の製剤、賦形剤および担体に関する追加情報については、Ｂａｌｄｒｉｃｋ， Ｒｅｇｕｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３２：２１０〜２１８、２０００；Ｗａｎｇ、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２０３：１〜６０、２０００；Ｃｈａｒｍａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８９：９６７〜９７８、２０００；およびＰｏｗｅｌｌら、ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８〜３１１、１９９８）、ならびにそこに記載される引用文献も参照されたい。

医薬組成物として、溶液、エマルジョン、水性懸濁液およびリポソーム含有製剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組成物は、例えば、予め形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含む、様々な成分から生成され得る。エマルジョンは、互いに密接に混合および分散された２つの不混和性液相からなる２相系である場合が多い。一般に、エマルジョンは油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型のいずれかである。エマルジョン製剤は、製剤化が容易であること、ならびに可溶化、吸収およびバイオアベイラビリティの有効性により、治療剤の経口送達のために広範に用いられている。

組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤および他の好適な添加剤（例えば、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体）も含有し得る滅菌水溶液を含有し得る。組成物は、医薬組成物中に従来見出される他の補助成分を更に含有し得る。したがって、組成物には、適合性のある薬学的に活性な材料、例えば、かゆみ止め薬、収斂剤、局所麻酔剤もしくは抗炎症剤、または本明細書に記載の様々な剤形の組成物を物理的に製剤化するのに有用な追加の材料、例えば、色素、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤も含まれ得る。更に、組成物は、助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、香料および芳香物質と混合されてもよい。しかし、このような材料が添加される場合、本明細書に記載の組成物中のポリペプチド成分の生物活性を過度に妨害してはならない。製剤は、所望される場合、滅菌されてもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含有する組成物は、注射可能な懸濁液を製造するために希釈剤を含むまたは含まない溶液または粉末の形態であってよい。組成物は、例えば、薬学的に許容されるビヒクル、例えば、食塩水、水、乳酸、マンニトールまたはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない追加の成分を含有し得る。

任意の適当な方法を使用して、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを哺乳動物に投与することができる。投与は、例えば、非経口（例えば、皮下、髄腔内、心室内、筋肉内もしくは腹腔内注射、または点滴静注）であり得る。投与は、（例えば、注射により）迅速であり得るか、または（例えば、徐注入または徐放製剤の投与により）一定期間にわたって行われ得る。いくつかの実施形態において、投与は、局所（例えば、経皮、舌下、点眼または経鼻）、肺（例えば、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送）または経口であり得る。更に、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含有する組成物は、腫瘍の外科的切除前、その後またはその代わりに投与され得る。

抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントを含有する組成物は、所望の結果を得るのに有効な任意の適当な量で、任意の適当な頻度でおよび任意の適当な継続期間、哺乳動物に投与され得る。例えば、抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントは、インビトロまたはインビボでのＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を含む、ヒト、マウス、ハムスターまたはサルＴ細胞）の増殖を刺激するか、ＴＮＦＲＳＦ２５を発現する腫瘍細胞のアポトーシスを刺激するか、腫瘍のサイズを縮小するか、または癌患者の無憎悪生存期間を延長するのに有効な量で対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ）の投与量で投与され得、１週間〜３週間に１回（例えば、１週間、１０日、２週間または３週間に１回）投与され得る。

本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントの対象への投与により、哺乳動物中に存在する癌細胞に対して抗癌作用を発揮し得るＴ細胞（例えば、自然発生腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞）の数が増加し得る。したがって、本文書はまた、本明細書に開示の抗体、抗原結合フラグメントまたは組成物を対象に投与することにより、対象のＴ細胞の増殖を刺激する方法を提供する。場合によっては、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントを含有する組成物は、組成物の投与前の対象のＴ細胞の増殖の「ベースライン」レベルと比較して、または組成物が投与されなかった対照対象もしくは対象の集団のＴ細胞の増殖レベルと比較して、Ｔ細胞の増殖を（例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％または１００％超）増加させるのに有効な量で対象に投与され得る。Ｔ細胞は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞であり得る。任意の好適な方法を使用して、Ｔ細胞の増殖レベルが対象において増加しているかどうかを決定することができる。このような方法には、抗原特異的Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞プール全体のごく一部としての抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合のフローサイトメトリー分析）、ＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞増殖マーカー（例えば、Ｋｉ６７の発現）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加数、または特定のＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの個々のＴＣＲ配列の増加比率の分析が含まれ得るが、これらに限定されない。

本文書はまた、本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたは組成物で対象を治療することによる、対象のＴＮＦＲＳＦ２５発現腫瘍細胞のアポトーシスを促進する方法を提供する。場合によっては、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含有する組成物は、組成物の投与前の対象の腫瘍細胞のアポトーシスの「ベースライン」レベルと比較して、または組成物が投与されなかった対照対象もしくは対象の集団の腫瘍細胞のアポトーシスレベルと比較して、ＴＮＦＲＳＦ２５発現腫瘍細胞のアポトーシスを（例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％または１００％超）増加させるのに有効な量で対象（例えば、癌患者）に投与され得る。任意の好適な方法を使用して、腫瘍細胞のアポトーシスレベルが対象において増加しているかどうかを決定することができる。これには、例えば、壊死もしくはアポトーシスを起こした腫瘍の存在を示す造影剤ありもしくはなしでの放射線技術、例えば、ＣＴもしくはＭＲＩ、腫瘍細胞死の増加を示す腫瘍試料の生検、腫瘍細胞内におけるカスパーゼ誘導、放射線による検出可能な腫瘍病変の除去、または外科検査もしくは身体診察が含まれ得る。

固形腫瘍および白血病／リンパ腫を含む癌を有する対象（例えば、ヒト患者）を治療する方法も本明細書で提供される。場合によっては、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含有する組成物は、組成物の投与前の対象の癌の進行速度と比較して、または組成物が投与されなかった対照対象もしくは対象の集団の癌の進行速度と比較して、癌の進行速度を（例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％または９０％超）低下させるのに有効な量で、癌を有する対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、さらなる癌の進行が検出されないように、進行速度が低下され得る。任意の適当な方法を使用して、癌の進行速度が低下されるかどうかを決定することができる。皮膚癌（例えば、メラノーマ）については、例えば、進行速度は、異なる時点で組織を撮像し、存在する癌細胞の量を測定することによって評価され得る。本明細書に記載の治療後、進行速度は、別の時間間隔にわたって再び測定され得る。場合によっては、治療後の癌の病期を決定し、治療前の病期と比較して、進行速度が低下されたかどうかが決定され得る。

本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含有する組成物はまた、未治療の癌を有する対応する対象の平均無増悪生存期間、または癌を有し、他の療法（例えば、化学療法剤のみ）で治療した対応する対象の平均無増悪生存期間と比較して、無憎悪生存期間が（例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％または１００％超）増加している条件下で癌を有する対象に投与され得る。無憎悪生存期間は、任意の期間（例えば、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月またはそれ以上）にわたって測定され得る。

本明細書に記載の分子を含有する組成物の有効量は、所望の効果を有する任意の量であり得る（例えば、顕著な毒性を引き起こすことなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するか、ＴＮＦＲＳＦ２５発現腫瘍細胞のアポトーシスを刺激するか、対象の免疫応答を刺激または誘導するか、腫瘍のサイズを縮小するか、癌の進行速度を低下させるか、癌患者の無憎悪生存期間を延長するか、または進行までの時間の中央値を増加させる）。最適な投与量は、個々のポリペプチド（例えば、抗体および抗原結合フラグメント）の相対的な有効性に応じて変更され得、一般にインビトロおよびインビボ動物モデルで有効であることが判明したＥＣ_５０に基づき推定され得る。典型的には、投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇである。例えば、抗体または抗原結合フラグメントの有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇまたは約５０ｍｇ／ｋｇ）、または例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇのいずれかの範囲であってよい。特定の対象が、特定の量に応答しない場合、抗体または抗原結合フラグメントの量は、例えば、２倍に増加され得る。対象は、この高濃度が投与された後、治療に対する応答性と毒性症状の両方について監視され得、それにしたがって調整がなされる。有効量は、治療に対する対象の応答に応じて、一定のままであり得るか、またはスライディングスケールもしくは変動用量として調整され得る。様々な因子が、特定の用途のために用いられる実際の有効量に影響を与え得る。例えば、投与頻度、治療期間、複数の治療剤の使用、投与経路、および癌の重症度により、投与される実際の有効量の増加または減少が必要となり得る。

投与頻度は、例えば、顕著な毒性を引き起こすことなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するか、ＴＮＦＲＳＦ２５発現腫瘍細胞のアポトーシスを刺激するか、腫瘍のサイズを縮小するか、癌の進行速度を低下させるか、癌患者の無憎悪生存期間を延長するか、または進行までの時間の中央値を増加させる任意の頻度であり得る。例えば、投与頻度は、１日１回以上、２週間に１回以上、週１回以上、月１回以上、またはそれ以下であり得る。投与頻度は一定のままであり得るか、または治療期間中に変化し得る。治療過程は、休薬期間を含み得る。例えば、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含有する組成物は、２週間にわたって投与され得、その後２週間の休薬期間が続き、このようなレジメンが複数回繰り返され得る。有効量と同様に、様々な因子が、特定の用途に用いられる実際の投与頻度に影響を与え得る。例えば、有効量、治療の継続期間、複数の治療剤の使用、投与経路、および癌の重症度により、投与頻度の増加または減少が必要となり得る。

本明細書に記載の組成物の投与に有効な継続期間は、顕著な毒性を引き起こすことなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するか、ＴＮＦＲＳＦ２５発現腫瘍細胞のアポトーシスを刺激するか、腫瘍のサイズを縮小するか、癌の進行速度を低下させるか、癌患者の無憎悪生存期間を延長するか、または進行までの時間の中央値を増加させる任意の継続期間であり得る。したがって、有効な継続期間は、数日から数週間、数か月または数年まで様々であり得る。一般に、癌の治療に有効な継続期間は、数週間から数か月の継続期間におよび得る。場合によっては、有効期間は、個々の対象が生存する限り有効期間であり得る。複数の因子が、特定の治療に用いられる実際の有効な継続期間に影響を与え得る。例えば、有効な継続期間は、投与頻度、有効量、複数の治療剤の使用、投与経路、および癌の重症度により異なり得る。

本明細書に記載の組成物の癌患者への投与後、患者を監視して、癌が治療されたかどうかが決定され得る。例えば、治療後に対象を評価して、癌の進行速度が低下した（例えば、停止した）かどうかが決定され得る。当技術分野で標準的な方法を含む任意の方法が、進行速度および生存率を評価するために用いられ得る。

本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを使用する方法は、例えば、併用されるもしくは追加の治療ステップとして、または治療用製剤の追加の成分としてのいずれで公知の癌治療方法と併用されてもよい。例えば、宿主の免疫機能の向上は、腫瘍に対抗するのに有用であり得る。方法には、例えば、外来ＭＨＣ抗原（腫瘍抗原、変異由来の抗原または他の抗原を含む）をコードするＤＮＡの腫瘍中への注入によるＡＰＣ増強、または腫瘍の免疫抗原認識（例えば、免疫刺激性サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦまたは共刺激分子Ｂ７．１、Ｂ７．２）の確率を増加させる遺伝子での生検腫瘍細胞のトランスフェクションが含まれ得るが、これらに限定されない。他の方法には、例えば、特定の腫瘍抗原のデポーまたは持続放出製剤中への可溶化、同種異系腫瘍細胞の補助タンパク質または抗原担体タンパク質でのトランスフェクション、同種異系腫瘍細胞の免疫刺激タンパク質、例えば、α−ガラクトシルセラミドでのトランスフェクション、特異的腫瘍抗原のウイルス由来のワクチンレジメンへの組み込み、特異的腫瘍抗原のリステリア由来のワクチンレジメンへの組み込み、養子細胞免疫療法（キメラ抗原受容体トランスフェクトＴ細胞を含む）、または活性化した腫瘍特異的Ｔ細胞（エクスビボ増殖腫瘍浸潤リンパ球を含む）での治療が含まれ得る。養子細胞免疫療法は、腫瘍浸潤宿主Ｔリンパ球を単離し、インビトロ集団を（例えば、ＩＬ−２での刺激により）増殖させることが含まれ得る。次いで、Ｔ細胞は宿主に再投与され得る。本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントと併用され得る他の治療には、例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法および血管形成阻害剤の使用が含まれる。有用であり得るさらなる併用パートナーには、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１／Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＬＡＧ３、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＴＩＭ３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＣＤ４７、抗ＴＭＩＧＤ２、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＥＡＣＡＭまたは抗ＧＡＲＰ）、他の共刺激抗体（例えば、抗ＯＸ４０、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１３７、抗ＧＩＴＲまたは抗ＣＤ４０）、癌ワクチン（例えば、ウイルスベースのワクチン、ペプチドワクチン、全細胞ワクチンまたはＲＮＡベースのワクチン）、および標的化剤［例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブ）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）またはＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標）（イブルチニブ）が含まれる。

したがって、いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害するか、ＣＴＬＡ−４のＣＤ８０もしくはＣＤ８６への結合を阻害するか、またはＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ９もしくはＴＮＦＲＳＦ１８経路を介してシグナル伝達を活性化する１つ以上の追加のモノクローナル抗体と併用され得る。これはまた、腫瘍細胞の特定の標的を結合する別の抗体、融合タンパク質または小分子と共に投与することを含み得る（例えば、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＶＥＧＦ、ＣＤ３９およびＣＤ７３などの標的を結合するモノクローナル抗体との併用）。抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントはまた、癌患者における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化を高める癌ワクチンアプローチと併用され得る。更に、抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントは、特異的腫瘍抗原を認識するキメラＴ細胞受容体を発現するように操作された自己または同種異系ＴまたはＮＫ細胞の投与後に用いられ得る。更に、抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントは、腫瘍特異的Ｔ細胞を増殖させ、癌患者における単剤療法としてのいずれかのアプローチの活性を高める方法として特定の化学療法または放射線療法戦略と併用され得る。

例えば、１つ以上の従来の療法が、癌を治療するための、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントを使用する治療と併用される場合、従来の療法（複数可）は、抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントの投与前、投与後またはそれと同時に投与され得る。例えば、ＰＤ−１阻害抗体は、ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体の投与前に患者に投与され得る。例えば、このようなレジメンは、数週間、数か月または数年間にわたって繰り返され得る。あるいは、ＰＤ−１阻害抗体は、ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体の投与と同時にまたはその後投与され得る。このようなレジメンはまた、数週間、数か月または数年間にわたって繰り返され得る。いくつかの実施形態において、一定期間にわたって繰り返し投与される併用療法は、上記投与戦略の２つ以上を含み得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体または抗原結合フラグメントは、癌患者から単離された腫瘍浸潤リンパ球の増殖を刺激するか、またはインビトロで増殖させ、癌患者の治療のためのその後の注入が意図されるキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞の増殖を刺激するための方法としてインビトロアッセイまたは製造方法において用いられ得る。

本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、または抗体もしくは抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物を含有する製造品も本明細書で提供される。抗体または医薬組成物は、容器（例えば、ボトル、バイアルまたは注射器）内にあり得る。製造品はまた、抗体、抗原結合フラグメントまたは組成物の再構成および／または使用についての指示を有するラベルを含み得る。いくつかの実施形態において、製造品は、１つ以上の追加の品目（例えば、１つ以上の緩衝液、希釈剤、充填剤、注射針、注射器および／または使用のためのさらなる指示書を含む添付文書）を含み得る。製造品はまた、癌を治療するための少なくとも１つの追加の薬剤を含み得る。例えば、本明細書に記載の製造品は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３またはＣＤ２７８を標的とする薬剤を含有し得る。いくつかの実施形態において、製造品は、Ａ２Ａ受容体アンタゴニストまたはＴＧＦ−βアンタゴニストを含有し得る。いくつかの実施形態において、製造品は、Ｂ７ファミリー共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＣＤ２７８）、もしくはＴＮＦ受容体スーパーファミリー共刺激分子（例えば、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ９またはＴＮＦＲＳＦ１８）、化学療法剤、または抗腫瘍ワクチン組成物を含み得る。

本発明は以下の実施例において更に記載されるが、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。

実施例
実施例１−エピトープマッピング
いくつかのＴＮＦＲＳＦ２５発現構築物を調製した。これらは、位置２５（Ｑ２５）のＧｌｎから位置２０１（Ｆ２０１）のＰｈｅに及ぶ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）全体、またはＱ２５から位置１８１（Ｔ１８１）のＴｈｒに及ぶ可溶性スプライスバリアントのいずれかを含んでいた。構築物はまた、６Ｈｉｓ、ｈＦｃ−６ＨｉｓおよびｍＦｃ−Ｈｉｓを含む、様々なタグを含んでいた。６つの構築物（表１）を２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、その発現レベルを図２に示すように測定した。

試験した構築物の中で、Ｗ３８１−ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ−Ｍ．ｍＦｃＨｉｓは最大の発現を示した（図３）。したがって、この型のＴＮＦＲＳＦ２５を、アラニンスキャニングに基づくエピトープマッピングの骨格として選択した。

７３個のアラニン変異体を産生し、その発現を上記のように測定した。変異体を、その発現レベル（表２Ａおよび２Ｂ）に基づき５つのグループに分け、結合活性分析に使用した。

次いで、抗体により認識されるＴＮＦＲＳＦ２５のエピトープを同定するために、抗体のＴＮＦＲＳＦ２５変異タンパク質への結合を図４に示すステップを用いて評価した。具体的には、キメラ抗体であるＷ３３０−ｃＡｂ１．ｈＩｇＧ１（３５７８３）（ヒトＩｇＦｃとのキメラにした親ハムスター抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体）の、１５００ｎｇ／ｍｌ超で発現したＷＢＰ３３０−ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃＨｉｓのアラニン変異体への結合を評価するための試験を行った。各変異タンパク質への結合親和性を、非変異ＷＢＰ３３０−ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃＨｉｓの結合親和性と比較した（図５）。２５％超のシグナル変化（倍数変化＜０．７５；表３および図６）を示す変異タンパク質を構造モデリングに使用した（図７および８）。

更に、抗体が、ＴＬ１ＡのＴＮＦＲＳＦ２５への結合を阻害できたかおよび逆の場合も同様に決定するための試験を行った。図９に示すように、抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体（「ハムスター親」）の組み換えヒトＴＮＦＲＳＦ２５への結合は、ＴＬ１Ａ−Ｉｇ（対の棒グラフの左）により阻害された。反対に、ＴＬ１Ａ−Ｉｇ融合タンパク質の組み換えヒトＴＮＦＲＳＦ２５への結合は、親抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体（対の棒グラフの中央）により阻害された。更に、ヒト化抗ＴＮＦＲＳＦ２５抗体（「ハムスター親」抗体由来）の組み換えヒトＴＮＦＲＳＦ２５への結合は、ＴＬ１Ａ−Ｉｇ（対の棒グラフの右）により阻害された。

実施例２−親和性成熟および特性評価方法
Ｗ３１５３−Ｐ８Ｒ３２−Ｈ６抗体の親和性最適化：ハイブリダイゼーション変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２（２）：４８８−４９２、１９８５）を使用して、親クローンの３つのＣＤＲの各アミノ酸を、全２０個のアミノ酸に個々に変異した。２０個のアミノ酸をコードするＮＮＳコドンを含有するＤＮＡプライマーを使用して、各標的化されたＣＤＲ位置に変異を導入した。個々の縮重プライマーを、ハイブリダイゼーション変異誘発反応に使用した。簡単に言えば、各縮重プライマーをリン酸化し、次いでウリジニル化したｓｓＤＮＡと１０：１の比で使用した。混合物を８５℃に５分間加熱し、次いで５５℃まで１時間かけて冷却した。その後、Ｔ４リガーゼおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼを添加し、混合物を３７℃で１．５時間インキュベートした。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲの合成生成物を各々プールした。典型的には、ＢＬ２１細菌叢上でのプラーク形成のため、またはｓｃＦｖフラグメントの生成のために、プールしたライブラリーＤＮＡ ２００ｎｇをＢＬ２１に電気穿孔した。

親重鎖および軽鎖、ならびにそのＣＤＲおよびＦＷ領域の配列は以下の通りであった。
重鎖可変領域：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＳＱＰＧＮＳＬＱＬＳＣＥＡＳＧＦＴＦＳＮＨＤＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＹＩＳＳＡＳＧＬＩＳＹＡＤＡＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＦＬＱＭＮＮＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＤＰＰＹＳＧＬＹＡＬＤＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号５）
ＦＷ１：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＳＱＰＧＮＳＬＱＬＳＣＥＡＳ（配列番号１１）
ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＮＨＤＬＮ（配列番号１２）
ＦＷ２：ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＹＩＳＳＡＳＧＬＩＳＹＡＤＡＶＲＧ（配列番号１４）
ＦＷ３：ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＦＬＱＭＮＮＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲ（配列番号１５）
ＣＤＲ３：ＤＰＰＹＳＧＬＹＡＬＤＦ（配列番号１６）
ＦＷ４：ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１７）
軽鎖可変領域：ＱＰＶＬＴＱＳＰＳＡＳＡＳＬＳＧＳＶＫＬＴＣＴＬＳＳＥＬＳＳＹＴＩＶＷＹＱＱＲＰＤＫＡＰＫＹＶＭＹＬＫＳＤＧＳＨＳＫＧＤＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＡＨＲＹＬＳＩＳＮＶＱＳＥＤＤＡＴＹＦＣＧＡＧＹＴＬＡＧＱＹＧＷＶＦＧＳＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号６）
ＦＷ１：ＱＰＶＬＴＱＳＰＳＡＳＡＳＬＳＧＳＶＫＬＴＣ（配列番号１８）
ＣＤＲ１：ＴＬＳＳＥＬＳＳＹＴＩＶ（配列番号１９）
ＦＷ２：ＷＹＱＱＲＰＤＫＡＰＫＹＶＭＹ（配列番号２０）
ＣＤＲ２：ＬＫＳＤＧＳＨＳＫＧＤ（配列番号２１）
ＦＷ３：ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＡＨＲＹＬＳＩＳＮＶＱＳＥＤＤＡＴＹＦ（配列番号２２）
ＣＤＲ３：ＣＧＡＧＹＴＬＡＧＱＹＧＷＶ（配列番号２３）
ＦＷ４：ＦＧＳＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号２４）

ｓｃＦｖライブラリーの一次スクリーニング：一次スクリーニングはシングルポイントＥＬＩＳＡ（ＳＰＥ）アッセイからなり、これは、９６ウェル（ディープウェル）プレートにおいて増殖した細菌のペリプラズム抽出物（ＰＥ）を使用して行われた。簡単に言えば、この捕獲ＥＬＩＳＡは、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートの個々のウェルを、コーティング緩衝液（２００ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３／ＮａＨＣＯ_３）中の抗ｃ−ｍｙｃ抗体でｐＨ９．２にて４℃で終夜コーティングすることに関与していた。翌日、プレートをカゼインで室温にて１時間遮断した。次いで、ｓｃＦｖ ＰＥをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化された抗原タンパク質をウェルに添加し、混合物を室温で１時間インキュベートした。この後に、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートと共に室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ活性をテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質で検出し、反応を２Ｍ ＨＣｌでクエンチした。プレートを４５０ｎＭで読み取った。親クローンのＯＤシグナルを超える４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）シグナルを示すクローンを採取し、ＥＬＩＳＡにより（上記のように）２つ組みで再アッセイして、陽性の結果を確認した。親抗体のシグナルを超えるシグナルを繰り返し示したクローンを配列決定した。次いで、ＣＤＲ変化を有する各クローンのｓｃＦｖタンパク質濃度を、定量的ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡにより測定し、そこで既知の濃度のｓｃＦｖを参照として使用した。ＥＬＩＳＡシグナルと、参照ｓｃＦｖにより発生したシグナルとを比較することにより、ｓｃＦｖタンパク質濃度を測定した。変異体ｓｃＦｖおよび親抗体の相対結合親和性を決定するために、結合アッセイを、正規化されたｓｃＦｖ濃度下で全ての陽性バリアントについて再び繰り返した。改善された結合を示す厳選されたｓｃＦｖヒットを、ＩｇＧ１にリフォーマットし、以下に示すようにカスパーゼ−３アッセイで試験した。

ｓｃＦｖライブラリーのコンビナトリアルスクリーニング：抗原への結合に有益であると判断されたＶＨおよびＶＬ鎖の点変異を組み合わせて、さらなる結合相乗効果が得られたかどうかを決定した。コンビナトリアル変異体を、ｓｃＦｖとして発現させ、捕獲ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした。親クローンのＯＤシグナルを超える４５０ｎｍでＯＤシグナルを示すクローンを配列決定し、更に上記の結合ＥＬＩＳＡにより順位付けした。上位１１個のクローンがＩｇＧ４リフォーマットおよび上記のさらなる特性評価用に選択された。

改善された親和性を有する４Ｃ１２変異体のリフォーマット、一過性発現および精製：一次およびコンビナトリアルスクリーニングにより同定されたＶ遺伝子の上位のＳｃＦｖクローンをＰＣＲにより増幅し、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ専有の発現ベクターにクローン化し、２９３Ｆ細胞から発現した。抗体を含有する培養上清を採取し、タンパク質Ａクロマトグラフィーを用いて精製した。

カスパーゼ放出アッセイ：ＴＮＦＲＳＦ２５を発現するＰ８１５細胞を、様々な濃度の抗体（１μｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ）と共に３７℃にて９６ウェルプレートで５時間インキュベートした。ホモジニウスカスパーゼアッセイキット（ロシュ：００５３７２００１）を用いてカスパーゼの活性を測定した。分子素子ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ５ｅプレートリーダーを用いて蛍光を読み取った。

競合アッセイ：ヒトＴＮＦＲＳＦ２５を発現する親ｐ８１５細胞およびｐ８１５細胞（ｐ８１５−ｈＤＲ３とも称される）をＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳの懸濁液中で培養した。細胞を、採取時に計数し、ペレット化し、３０００００細胞／１００μＬの濃度で無血清培地に再懸濁した。細胞懸濁液の１００μＬアリコートをＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れた。

ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７（ＡＦ６４７）−コンジュゲート４Ｃ１２およびｈＴＬ１Ａ−Ｉｇ（ＡＫＴＡ精製、１ラウンド）を、製造業者の指示書に従って、分子プローブＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）標識キット（ＲＬ＃１７０５１２）を用いて産生した。４Ｃ１２−ＡＦ６４７の標識の程度は、抗体に対する色素５．９８モルであり、ｈＴＬ１Ａ−Ｉｇ−ＡＦ６４７の標識の程度は、タンパク質に対する色素４．５５モルであった（いずれも許容範囲内であると考えられる）。

ｈＴＬ１Ａ−Ｉｇ−ＡＦ６４７または４Ｃ１２−ＡＦ６４７を、０．５μｇ／ｍＬの濃度でＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに添加した。その直後に、非標識４Ｃ１２、親和性成熟４Ｃ１２（ｈＩｇＧ１サブタイプ）またはアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１を２μｇ／ｍＬ〜０．００７８μｇ／ｍＬの範囲の濃度で添加した。混合物を３７℃で５％ＣＯ_２加湿インキュベーターで１時間インキュベートした。細胞を、微量遠心分離機でペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で１ｘを洗浄した。ペレットを、ＦＡＣＳ緩衝液３００μＬ中に再懸濁し、Ｓｏｎｙ ＳＨ８００フローサイトメーターで分析した。生単細胞をゲートオンし、各試料についてＡＦ６４７のＭＦＩを測定した。

実施例３−親和性成熟および特性評価の結果
一次スクリーニングでは、野生型よりも少なくとも２倍高い捕獲ＥＬＩＳＡシグナルを示す、７つのＣＤＲ位置で１１個の変異体が産生された（表４）。軽鎖ＣＤＲ１の位置４２での複数の変異は、ＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃタンパク質への改善された結合を一貫して示した。この位置でのＳｅｒのＴｒｐへの置換の結果、ＥＬＩＳＡシグナルが１０倍超増加した。２つの他の変異、重鎖ＣＤＲ３の位置２７でのＡｌａのＴｈｒへの変異、および軽鎖ＣＤＲ１の位置４３でのＴｙｒのＰｈｅへの変異も顕著な結合の改善を示した。これらの変異体を、ＩｇＧ１に変換し、カスパーゼ−３アッセイを用いて活性について試験した（表５）。位置４２の変異体のみが、カスパーゼ−３放出アッセイにおいて改善された有効性を示した。軽鎖ＣＤＲ１でのＳｅｒからＴｒｐへの変異を含有する１つの特定のＩｇＧクローンであるＷ３０７２−ｚ４Ｃ１２−Ｒ１−４２Ｇ２−ｕＩｇＧ１Ｌは、カスパーゼ−３アゴニスト活性の最大の増加を示した。

一次スクリーニングで同定された全ての個々の親和性改善変異を使用して、コンビナトリアル変異体ライブラリーを設計および構築した。このライブラリーをスクリーニングして、結合の改善に対して相乗効果を有する変異の組み合わせを同定した。単一変異体のクローン４２Ｇ２をベンチマークとして使用した。ＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃタンパク質への結合が顕著に改善された複数の組み合わせ変異体クローンが同定された（図１０）。しかし、１つの組み合わせ変異体である９Ｇ２のみが、軽鎖ＣＤＲ１でのＳｅｒからＴｒｐへの変異を含んでいた。このクローン、ならびにＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃタンパク質への最も強い結合を示した３つの追加のクローン（９Ａ５、１Ｆ１０および５Ａ６）をＩｇＧ変換およびさらなる試験用に選択した（表６）。

ＩｇＧ変換後、ＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃタンパク質への結合が改善されたクローンは以下のように称された：
１Ｆ１０→Ｗ３０７２−ｚ４Ｃ１２−ｍ１（本明細書においてＭ１とも称される）
５Ａ６→Ｗ３０７２−ｚ４Ｃ１２−ｍ２（本明細書においてＭ２とも称される）
９Ａ５→Ｗ３０７２−ｚ４Ｃ１２−ｍ３（本明細書においてＭ３とも称される）
９Ｇ２→Ｗ３０７２−ｚ４Ｃ１２−ｍ４（本明細書においてＭ４とも称される）
４２Ｇ２→Ｗ３０７２−ｚ４Ｃ１２−ｍ５（本明細書においてＭ５とも称される）

カスパーゼ−３放出アッセイにより、Ｍ５およびＭ４（いずれも、軽鎖ＣＤＲ１におけるＳｅｒ→Ｔｒｐ置換を含有する）のみが、親ヒト化クローン（Ｗ３３０−ｈＡｂ３５８１６、ＣＤＲ接合により産生される）および天然リガンドＴＬ１Ａと比較して改善されたアゴニスト活性を示し、３つの他の変異体は、親抗体よりも低いアゴニスト活性（図１１Ａおよび１１Ｂ、表６）ではあるが、ＴＮＦＲＳＦ２５に対して高い結合親和性を示すことが判明した（図１０）。興味深いことに、Ｍ４高親和性クローンは、Ｍ５クローンよりも高い振幅応答を有していた（図１１Ｂ）。最高の親和性クローンであるＭ３は、親ヒト化抗体およびキメラクローンより劣るアゴニスト活性を有していた（図１１Ａ）。また、驚くべきことに、ヒト化親抗体は、キメラ親抗体と比較して著しく優れた振幅応答を有していた（図１１Ａ）。

Ｍ５およびＭ４をＩｇＧ４にリフォーマットし、ＩｇＧ１とＩｇＧ４型の両方をカスパーゼ−３放出アッセイで試験した。これらの試験により、ＩｇＧ１型抗体が、親ヒト化４Ｃ１２ ＩｇＧ１（Ｗ３３０−ｈＡｂ３５８１６；表７）と比較して改善されたアゴニスト活性を一貫して示すことが判明した。

競合試験を行って、親和性成熟抗体が、ＴＮＦＲＳＦ２５への結合について４Ｃ１２またはＴＬ１Ａと競合できたかどうかを決定した。第１の実験では、全ての試料にｈＴＬ１Ａ−Ｉｇ−ＡＦ６４７ ０．５μｇ／ｍＬを与え、これを、非標識４Ｃ１２−Ｍ３、４Ｃ１２−Ｍ４、４Ｃ１２−Ｍ５および４Ｃ１２で競合除去させた。図１３Ａに示すように、Ｍ４およびＭ５抗体は、４Ｃ１２親抗体よりもＴＬ１Ａに対して強い競合を示した。したがって、Ｍ４およびＭ５は、Ｍ３（９Ａ５：図１０）よりも弱いが、親抗体（ＷＴ；図１０）よりも強いＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃへの結合を示したが、これらは、細胞表面発現ＴＮＦＲＳＦ２５に結合するＴＬ１Ａの強力な競合物であると思われた。ｈＴＬ１Ａ−Ｉｇ−ＡＦ６４７を与えなかった試料は、約１０００のＭＦＩを有し、ｈＩｇＧ１アイソタイプを与えた試料は、約３３２０のＭＦＩを有していた。

さらなる競合アッセイを行い、そこでは全ての試料に４Ｃ１２−ＡＦ６４７ ０．５μｇ／ｍＬを与え、これを８μｇ／ｍＬまで増大させた非標識抗体濃度で非標識４Ｃ１２−Ｍ３、４Ｃ１２−Ｍ４および４Ｃ１２−Ｍ５で競合除去させ、結合曲線を完成させた。図１３Ｂに示すように、非標識４Ｃ１２親抗体は、標識４Ｃ１２を競合除去し、アイソタイプｈＩｇＧ１は、競合効果を有していなかった。４Ｃ１２−ＡＦ６４７を投与しなかった試料は、約１４００のＭＦＩを有していた。４Ｃ１２、Ｍ４およびＭ５親和性成熟抗体は、標識４Ｃ１２に対して同様の競合を示し、Ｍ３は、最も弱い競合阻害物であった。

したがって、ヒト化４Ｃ１２抗体が親和性成熟したとき、一次スクリーニング（抗体ＣＤＲの飽和変異誘発による）では、ＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃタンパク質への結合が改善された複数の変異体が同定された。特に、軽鎖ＣＤＲ１におけるＳｅｒ→Ｔｒｐ変異を含有するクローンＭ５は、カスパーゼ−３放出アッセイにより測定されたように改善されたアゴニスト活性を示した。コンビナトリアルライブラリースクリーニングでは、Ｍ５よりもＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃタンパク質への顕著に強い結合を有する複数の変異体が産生されたが、驚くべきことにこれらの多くは親抗体と比較して低いアゴニスト活性を示した。この例外は、Ｍ４であり、これは、Ｍ５と同じ軽鎖ＣＤＲ１におけるＳｅｒ→Ｔｒｐ変異を含有していた。Ｍ５およびＭ４のみが、カスパーゼ−３放出アッセイにおいて改善されたアゴニスト活性と、ＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃ融合タンパク質への改善された結合の両方を示した。更に、これらのクローンはまた、ＴＮＦＲＳＦ２５に結合する４Ｃ１２に対して同等の競合を維持しながら（図１３Ｂ）、４Ｃ１２親抗体と比較して、細胞発現ＴＮＦＲＳＦ２５に結合するＴＬ１Ａに対して強い競合（図１３Ａ）を示した。

他の実施形態
本発明を、その詳細な説明と共に記載してきたが、前述の説明は、例示を意図するものであり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことが理解される。他の態様、利点および変形は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (16)

1. （ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および配列番号５と９５％同一性を有するアミノ酸を含み、前記重鎖ＣＤＲ１配列がＧＦＴＦＳＮＨＤＬＮ（配列番号１２）であり、前記重鎖ＣＤＲ２配列がＹＩＳＳＡＳＧＬＩＳＹＡＤＡＶＲＧ（配列番号１４）であり、前記重鎖ＣＤＲ３配列がＤＰＡＹＴＧＬＹＡＬＤＦ（配列番号２６）またはＤＰＰＹＳＧＬＹＡＬＤＦ（配列番号１６）である、重鎖可変領域、ならびに
   （ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および配列番号６と９５％同一性を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１配列がＴＬＳＳＥＬＳＷＹＴＩＶ（配列番号２５）であり、前記軽鎖ＣＤＲ２配列がＬＫＳＤＧＳＨＳＫＧＤ（配列番号２１）であり、前記軽鎖ＣＤＲ３配列がＣＧＡＧＹＴＬＡＧＱＹＧＷＶ（配列番号２３）である、軽鎖可変領域
   を含む、抗腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２５抗体。
2. ヒト重鎖および軽鎖定常領域を更に含む、請求項１に記載の抗体。
3. 前記定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択される、請求項２に記載の抗体。
4. 前記定常領域がＩｇＧ１である、請求項３に記載の抗体。
5. 前記定常領域がＩｇＧ４である、請求項３に記載の抗体。
6. 薬学的に許容される担体、および請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
7. 癌を治療するための請求項６に記載の医薬組成物および少なくとも１つの追加の薬剤を含む製造品。
8. 前記少なくとも１つの追加の薬剤が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＣＤ２７、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３もしくはＣＤ２７８を標的とする薬剤であるか、またはＡ２Ａ受容体アンタゴニストもしくはＴＧＦ−βアンタゴニストである、請求項７に記載の製造品。
9. 前記少なくとも１つの追加の薬剤が、Ｂ７ファミリー共刺激分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー共刺激分子、ワクチン組成物または化学療法剤である、請求項７に記載の製造品。
10. 前記少なくとも１つの追加の薬剤が、インビトロまたは対象における養子Ｔ細胞療法での使用のためのキメラ抗原受容体トランスフェクトＴ細胞または増殖腫瘍浸潤リンパ球を含む、請求項７に記載の製造品。
11. 前記少なくとも１つの追加の薬剤が、自己Ｔ細胞療法のインビトロ製造方法において用いられる、請求項７に記載の製造品。
12. 対象の癌を治療する方法において使用するための組成物であって、前記方法は、前記対象の癌においてＴＮＦＲＳＦ２５発現腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するのに有効な量の前記組成物を前記対象に投与することを含む、請求項６に記載の組成物。
13. 対象の癌を治療する方法において使用するための組成物であって、前記組成物は、前記対象のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激し、前記方法は、治療有効量の前記組成物を前記対象に投与することを含む、請求項６に記載の組成物。
14. ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析により測定されるように、投与前の増殖のベースラインレベルと比較して少なくとも２０％増加する、請求項１３に記載の組成物。
15. 対象の癌を治療する方法において使用するための組成物であって、治療有効量の前記組成物を前記対象に投与することにより、前記対象の免疫応答を誘導する、請求項６に記載の組成物。
16. 対象の癌を治療する方法において使用するための組成物であって、治療有効量の前記組成物を前記対象に投与することにより、前記対象のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の増殖を刺激する、請求項６に記載の組成物。

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