JP2019528079A - 組織因子標的化抗体薬物接合体 - Google Patents

Abstract

組織因子(TF)標的化抗体薬物接合体(ADC)及びADCを調製する方法。ADCは、高い特異性でTF抗原に結合し、高い親和性、低い免疫原性、高い細胞傷害性、及び顕著な抗腫瘍活性を有する。【選択図】なし

Description

本発明は、医薬分野に関し、特に組織因子を標的とする抗体、及びその抗体−薬物接合体、並びにその調製方法及び使用に関する。

組織因子（ＴＦ）は、４７ｋＤａのトランスメンブラン糖タンパク質である。通常の生理学的条件下で、ＴＦ発現は主に、主に内皮下細胞の層に隔離されており；血管が生体内で損傷されると、ＴＦが血流に暴露され、そして第VII因子に結合し、そして活性化することにより、外因性凝固反応を開始する。

ＴＦが異常に活性化され、そして多くの腫瘍組織において発現され、そして腫瘍の発生及び進行において重要な役割を演じることが研究において見出された。特に癌の進行期において、ほとんどの患者は、自発的血栓症、例えば深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）及び肺塞栓症（ＰＥ）を伴い（Thrombosis research, 2013, 131: S59-S62; Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2011, 9(s1): 306-315）；腫瘍細胞におけるＴＦの異常発現は、それらの症状の主なる原因である。多くの腫瘍の臨床サンプルについての分析は、ＴＦの発現レベルが悪化指標、例えば患者における腫瘍の転移及び血栓症の発生に直接的に影響を及ぼし、例えば異常ＴＦ発現の割合が、乳癌で８５．８％、膵臓癌で８８．５％、肺癌で８３．６％及び食道癌において９１．３％、等であったことを示している（Blood, 2012, 119: 924-932）。

最初に、ＴＦ及びＦＶIIにより形成されるＴＦ−ＦＶIIａはトランスメンブランＧタンパク質共役受容体、すなわちプロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）に直接的に接合し、そしてその活性化を誘発できることが研究において示される。ＰＡＲ２は、炎症応答を調節する重要なシグナル経路である。腫瘍の分野におけるＰＡＲ２についての研究はほとんどないが、ＴＦがＰＡＲ２により細胞における一連の腫瘍機能シグナルに影響を及ぼすことができると考えられる。例えば、ＴＦ−ＦＶIIａ−ＰＡＲ２は、血管新生を促進し、そしてＭＡＰＫ／ＥＲＫリン酸化、及び主要成長因子、免疫調節剤及びケモカイン（例えば、ＶＥＧＦ、ＣＳＦ１／２、ＩＬ８、ＣＸＣＬ１、等）の遺伝子発現の誘発により、腫瘍増殖のための適切な栄養素、エネルギー及び適切な微小管強を提供する。次に、ＴＦはまた、Ｒａｃ１及びβ１ファミリー関連インテグリンとの相互作用により腫瘍細胞の遊走及び付着を増強することができ、それにより、一般的に腫瘍細胞の血行性転移能力を増強することができる。さらに、ＴＦ開始の凝固はまた、腫瘍血栓症の重要な原因であり、そして複数の腫瘍の悪化をもたらす。一方、ＴＦ誘発性凝固亢進状態はまた、腫瘍細胞が生体における免疫系を回避するのを直接的に助け、そして腫瘍細胞と内皮細胞との間の相互作用を増強し、血行性転移能力の上昇をもたらす。これはまた、癌を治療することが難しい理由でもあります。

モノクローナル抗体が腫瘍細胞の表面上の特定抗原を特異的に認識する特性を利用することにより、抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）は、抗腫瘍薬（例えば、小分子化学療法薬）を腫瘍標的細胞に正確に送達し、そしてそこで薬物を放出し、腫瘍を正確に殺す目的を達成することができる。ＡＤＣはまた、それらの適切な分子量、高い安定性、強い標的化特性、及び低い毒性副作用のために、最も潜在的な抗腫瘍薬として見なされている。しかしながら、ＡＤＣの開発の成功に関しては、考慮し、そして解決されなければならない多くの以下の問題が存在する：例えば、抗体は病変部位を特異的認識しなければならず、免疫感作性が低く、そして細胞により急速且つ効率的に内在化され得；抗体−薬物リンカーは、血液におて非常に安定しなければならず、そして標的細胞において特異的に活性化され、そして小分子薬物を効率的に放出することができ；接合された小分子薬物は細胞を殺す強い能力を有すべきであり、そして同様のことを有すべきである。

ＴＦは腫瘍の発生及び進行において重要な役割を果たし、そして抗体−薬物接合体はそれらの独自の特徴及び利点を有するが、しかしながら、ヒトＴＦに対して非常に特異的な抗体−薬物接合体はまだ存在しないことが結論づけられている。

本発明の目的は、ヒトＴＦを特異的に標的とし、腫瘍増殖及び転移を阻害する活性、等を有する抗体−薬物接合体を提供することである。

第１の側面によれば、本発明は、以下を含み：
（ａ）抗体部分：及び
（ｂ）前記抗体部分に接合される接合部分、ここで前記接合部分は検出可能マーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、及びそれらの組合せから成る群から選択され；
前記抗体のＨ鎖可能領域が、以下の３種の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含み：
（Ｈ１）配列番号１に記載の配列を有するＣＤＲ１、
（Ｈ２）配列番号２に記載の配列を有するＣＤＲ２、及び
（Ｈ３）配列番号３に記載の配列を有するＣＤＲ３；
ここで前記Ｈ鎖可能領域のアミノ酸配列のアミノ酸配列がさらに、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から任意に生じ、そしてＴＦ−結合親和性を保持する誘導体配列を含み；そして／又は
前記抗体のＬ鎖可変領域が、以下の３種の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含み：
（Ｌ１）配列番号４に記載の配列を有するＣＤＲ１′
（Ｌ２）配列番号５に記載の配列を有するＣＤＲ２′及び
（Ｌ３）配列番号６に記載の配列を有するＣＤＲ３′
ここで、前記アミノ酸配列中の任意のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有する誘導体配列を含むことを特徴とする、抗体−薬物接合体を提供する。

別のこの好ましい例によれば、前記抗体は、無償の抗体又はその活性フラグメントを含む。

別の好ましい例によれば、前記活性フラグメントは、組織因子に対するその結合活性を保持する。

別の好ましい例によれば、抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）は、以下のような式：
[式中、ＬＵはリンカーであり：
Ｄは薬物であり；そして
下付文字ｐは、１〜１０、好ましくは１〜８から選択された値である］を有する。

別の好ましい例によれば、ＬＵは、６−マレイミドカプロイル − バリン− シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ−ｖａｌ −ｃｉｔ−ＰＡＢ）、６−マレイミドカプロイル−アラニン−フェニルアラニン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ − ａｌａ − ｐｈｅ − ＰＡＢ）、マレイミドプロピオニル− バリン−シトルリン−p−アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＰ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ）、マレイミドプロピオニル−アラニン−フェニルアラニン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＰ−ａｌａ−ｐｈｅ−ＰＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、４−（２−ピリジルジチオ）ブタン酸Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル（ＳＰＤＢ）又はＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）から成る群から選択される。

別の好ましい例によれば、ＬＵは、ＳＭＣＣ、ＳＰＰ、ＳＰＤＢ又は６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ）である。

別の好ましい例によれば、Ｄは、メイタンミン誘導体（ＤＭ１、ＤＭ４）、アウリスタチン及びドラスタチンから成る群から選択される。

別の好ましい例によれば、Ｄは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルドラスタチン１０（ＭＭＡＤ）誘導体、又はそれらの組み合わせから成る群から選択される。

別の好ましい例によれば、Ｄに連結されるアミノ酸残基は、本来、抗体（親抗体）に存在するか、又は外因的に導入される。

別の好ましい例によれば、Ｄに連結されるアミノ酸残基は、システインである。

別の好ましい例によれば、システインとは、Ｋａｂａｔ番号付け規則に従ってＬ鎖の１又は２以上の位置で及び／又はＫａｂａｔ番号付け規則に従ってＨ鎖の１又は２以上の位置で、及びＥＵ番号付け規則に従ってＨ鎖の１又は２以上の位置で親抗体中に導入される１又は２以上の遊離システインを言及する。

別の好ましい例によれば、Ｄに連結されるアミノ酸残基は、リシンである。

別の好ましい例によれば、前記フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖフラグメントから選択される。

別の好ましい例によれば、抗体は、モノクローナル抗体である。

別の好ましい例によれば、抗体は、二本鎖の抗体、単鎖抗体を含む。

別の好ましい例によれば、抗体は組換え型である。

別の好ましい例によれば、抗体は、最近（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ））において生成される。

別の好ましい例によれば、抗体は、真核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において生成される。

別の好ましい例によれば、抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はそれらの組合せから選択され；より特定には、抗体はヒト化抗体である。

別の好ましい例によれば、抗体は、ヒトＴＦタンパク質に対する親和性について、０．００５~０．１０ｎＭ又は０．０１~０．０２ｎＭのＥＣ_５０を有する。

別の好ましい例によれば、抗体は、野生型ネズミＴＦタンパク質に結合しない。

別の好ましい例によれば、抗体は、
（ａ）腫瘍細胞の移動又は転移の阻害；及び
（ｂ）腫瘍増殖の阻害、
から成る群から選択される１又は２以上の特性を有する。

別の好ましい例によれば、抗体のＨ鎖可変領域の配列は、配列番号７、９、１０、１１、１２又は１３から選択され、そして／又は抗体のＬ鎖可変領域の配列は、配列番号８、１４、１５、１６又は１７から選択される。

別の好ましい例によれば、抗体は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈ、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ２９、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３０、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３１、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３２、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３３、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３４、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３５、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３６、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３７、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３８、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４０、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４１、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４２、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４３、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４５、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４６、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４７、及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４８から成る群から選択される。

別の好ましい例によれば、本発明は、（i）診断剤の製造；及び／又は（ii）ＴＦ−関連疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造のためへの、本発明の第１の側面の抗体−薬物接合体の使用を提供する。

別の好ましい例によれば、ＴＦ関連疾患は、腫瘍形成、腫瘍増殖及び/又は転移、血栓症関連疾患、炎症、代謝関連疾患、又はそれらの組み合わせから選択される。

別の好ましい例によれば、腫瘍は、高ＴＦ発現を有する腫瘍である。

別の好ましい例によれば、「高ＴＦ発現（high TF expression）」という表現は、腫瘍中のＴＦ転写体及び／又はタンパク質レベルＬ１が、正常組織中の転写体及び／又はタンパク質レベルＬＯに比較して、Ｌ１／Ｌ０≧２、好ましくは≦３であることを意味する。

別の好ましい例によれば、腫瘍は、トリプルネガティブ乳癌、膵臓癌、肺癌及び悪性神経膠腫から成る群から選択される。

第３の側面によれば、本発明は、
（ｉ）第１の側面の抗体−薬物接合体、又はその組合せである活性成分；及び
（ii）医薬的に許容できる担体、
を含む医薬組成物を提供する。

別の好ましい例によれば、医薬組成物は、ヒト用の単位剤形である。

別の好ましい例によれば、医薬組成物は、液体製剤である。

別の好ましい例によれば、医薬組成物においては、抗体−薬剤接合体は、０．００５〜５０重量％、好ましくは０．０５〜１０重量％の量で存在する。

別の好ましい例によれば、医薬組成物はさらに、（iii）追加の治療剤を含む。

別の好ましい例によれば、追加の治療剤は、化学療法剤である。

第４の側面によれば、本発明は、腫瘍細胞と、第１の側面の抗体−薬物接合体とを接触する工程を含む、インビトロで腫瘍細胞を非治療に阻害する方法を提供する。

第５の側面によれば、本発明は、第１の側面の抗体−薬物接合体を、その必要な対象に投与する工程を含む、腫瘍の治療方法を提供する。

別の好ましい例によれば、対象は、ヒトを含む哺乳類である。

別の好ましい例によれば、接触は、インビトロ培養システムにおいて実施される。

第６の側面によれば、本発明は、放射線療法、化学療法、生物学的療法、又はそれらの組合せから選択された１又は２以上の療法と組合して、有効量の第１の側面の抗体−薬物接合体を用いる工程を含む、対象における腫瘍増殖を遅らせる方法を提供する。

第７の側面によれば、本発明は、放射線療法、化学療法、生物学的療法、又はそれらの組合せから選択された１又は２以上の療法と組合して、有効量の第１の側面の抗体−薬物接合体を用いる工程を含む、対象における細胞移動を阻害するための方法を提供する。

第８の側面によれば、本発明は、放射線療法、化学療法、生物学的療法、又はそれらの組合せから選択された１又は２以上の療法と組合して、有効量の第１の側面の抗体−薬物接合体を用いる工程を含む、対象における細胞付着を阻害するための方法を提供する。

第９の側面によれば、本発明は、
本発明のネズミ抗体可変領域のヌクレオチド配列を、ヒト抗体不変領域を含む発現ベクター中にクローニングした後、動物細胞をトランスフェクトすることによりヒト−マウスキメラ抗体を発現し；
本発明のヒトＦＲ領域を含む抗体可変領域のヌクレオチド配列を、ヒト抗体不変領域を含む発現ベクター中にクローニングした後、動物細胞をトランスフェクトすることによりヒト化抗体を発現する、工程を含む、ヒト化抗体又はキメラ抗体を調製するための方法を提供する。

別の好ましい例によれば、抗体は、部分的に又は完全にヒト化されたモノクローナル抗体である。

本発明の範囲内で、上述の本発明の技術的特徴と以下に（例えば実施例において）記載される技術的特徴とを互いに組み合わせて、新規又は好ましい技術的解決策を構成することができることが理解されるべきである。スペースを節約するために、これらの組み合わせはここではこれ以上説明しない。

図１は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１が高いＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を有意に阻害し得、そしてその阻害は細胞表面上のＴＦ分子に比例することを示し、ここで左図は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１が高ＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を良く阻害できたことを示す曲線であり、そして右の表は、異なる細胞系についてのＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１のＩＤ_５０値を示した。

図２は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが高いＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を有意に阻害し得、そしてその阻害は細胞表面上のＴＦ分子に比例することを示し、ここで左図は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが高ＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を良く阻害できたことを示す曲線であり、そして右の表は、異なる細胞系についてのＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥのＩＤ_５０値を示した。

図３Ａ及び３Ｂは、細胞表面上のＴＦ分子に比例した異なる腫瘍細胞の増殖に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１（図３Ａ）及びＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥ（図３Ｂ）の阻害効果を示す。ＣＣＬＥデータベース（Arrays_2013-03-18.tar.gz, Broad-Novartis Cancer Cell line Encyclopedia）を用いて、異なる腫瘍細胞の細胞表面上の相対ＴＦ分子数を分析することにより、結果は、異なる細胞の増殖に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１の阻害効果が細胞表面上の分子数に比例したことを示す。 図３Ａ及び３Ｂは、細胞表面上のＴＦ分子に比例した異なる腫瘍細胞の増殖に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１（図３Ａ）及びＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥ（図３Ｂ）の阻害効果を示す。ＣＣＬＥデータベース（Arrays_2013-03-18.tar.gz, Broad-Novartis Cancer Cell line Encyclopedia）を用いて、異なる腫瘍細胞の細胞表面上の相対ＴＦ分子数を分析することにより、結果は、異なる細胞の増殖に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１の阻害効果が細胞表面上の分子数に比例したことを示す。

図４Ａは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１が、容量依存性態様でＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害できたことを示す。ドセタキセルグループと比較して、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１グループにおけるマウスは、ほとんど体重減少を示さず、このことは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１が低い毒性副作用を有することを示唆する。図４Ｂはヌードマウス体の体重曲線を示す。 図４Ａは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１が、容量依存性態様でＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害できたことを示す。ドセタキセルグループと比較して、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１グループにおけるマウスは、ほとんど体重減少を示さず、このことは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１が低い毒性副作用を有することを示唆する。図４Ｂはヌードマウス体の体重曲線を示す。

図５は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが、容量依存性態様でＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害できたことを示す。特に、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥは、３．７５ｍｇ／ｋｇの容量でＨＣＣ１８０６同所性移植腫瘍の増殖を、ほぼ完全に阻害できた。ドセタキセルグループと比較して、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥグループにおけるマウスは、ほとんど体重減少を示さず、このことは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが低い毒性副作用を有したことを示唆する。図５Ｂは、ヌードマウスの体重曲線を示す。 図５は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが、容量依存性態様でＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害できたことを示す。特に、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥは、３．７５ｍｇ／ｋｇの容量でＨＣＣ１８０６同所性移植腫瘍の増殖を、ほぼ完全に阻害できた。ドセタキセルグループと比較して、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥグループにおけるマウスは、ほとんど体重減少を示さず、このことは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが低い毒性副作用を有したことを示唆する。図５Ｂは、ヌードマウスの体重曲線を示す。

図６は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥがまた、低容量で効果的に、ＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍の増殖を阻害できることを示し、そして実験は、最小効果用量が０．７ｍｇ／ｋｇであったことを示す。

図７Ａは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが、容量依存性態様でＢｘＰＣ−３皮下移植腫瘍の増殖を効果的に阻害できたことを示す。ドセタキセルグループと比較して、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥグループにおけるマウスは、ほとんど体重減少を示さず、このことは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが低い毒性副作用を有することを示唆する。図７Ｂはヌードマウス体の体重曲線を示す。 図７Ａは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが、容量依存性態様でＢｘＰＣ−３皮下移植腫瘍の増殖を効果的に阻害できたことを示す。ドセタキセルグループと比較して、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥグループにおけるマウスは、ほとんど体重減少を示さず、このことは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが低い毒性副作用を有することを示唆する。図７Ｂはヌードマウス体の体重曲線を示す。

図８は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥの分子篩ＨＰＬＣ結果を示す。

図９は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥの疎水性クロマトグラフィーの結果を示す。

図１０は、質量分析により特徴づけられたＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥの結果を示す。

図１１は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥの分子篩ＨＰＬＣ結果を示す。

図１２は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥの疎水性クロマトグラフィーの結果を示す。

図１３は、質量分析により特徴づけられたＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥの結果を示す。

図１４は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥが、高ＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を有意に阻害し、そしてその阻害効果は、細胞表面上のＴＦの分子数に比例することを示し、ここで右パネルの表は、その対応するＩＣ_５０値を示す。

図１５は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥが、高ＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を有意に阻害し、そしてその阻害効果は、細胞表面上のＴＦの分子数に比例することを示し、ここで右パネルの表は、その対応するＩＣ_５０値を示す。

図１６Ａ及び１６Ｂは、ＣＣＬＥデータベース（Arrays_2013-03-18.tar.gz, Broad-Novartis Cancer Cell line Encyclopedia）による異なる細胞の細胞表面上のＴＦ相対分子数の分析を示し、そしてその結果は、異なる細胞に対するＴＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥ（図１６Ａ）及びＴＴＦ−ｍＡＢ−Ｈ４４−ＭＭＡＥ（図１６Ｂ）の殺害効果が細胞表面上ＴＦの分子数に比例したことを示す。 図１６Ａ及び１６Ｂは、ＣＣＬＥデータベース（Arrays_2013-03-18.tar.gz, Broad-Novartis Cancer Cell line Encyclopedia）による異なる細胞の細胞表面上のＴＦ相対分子数の分析を示し、そしてその結果は、異なる細胞に対するＴＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥ（図１６Ａ）及びＴＴＦ−ｍＡＢ−Ｈ４４−ＭＭＡＥ（図１６Ｂ）の殺害効果が細胞表面上ＴＦの分子数に比例したことを示す。

図１７は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥがＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、そして３ｍｇ／ｋｇの用量でＨＣＣ１８０６腫瘍の増殖を完全に阻害できたことを示す。

図１８は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥがＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、そしてその最小有効用量は１ｍｇ／ｋｇであったことを示す。

図１９は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥがＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、そして１ｍｇ／ｋｇの用量で、ＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増加を完全に阻害できたことを示す。

図２０は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥがＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、そしてその最小有効用量が０．３ｍｇ／ｋｇであったことを示す。

本発明者は、広範且つ詳細な研究及び多数のスクリーニングを実施することにより、意外にも抗−ＴＦモノクローナル抗体（ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１）を得、そしてその実験結果は、ＴＦタンパク質に対するモノクローナル抗体がＩｇＧ２ｂ抗体であることを示す。抗体は、高い特異性及び高い親和性でＴＦ抗原に結合することができ（ＥＣ_５０は、ＥＬＩＳＡにより決定される場合、約０．０１９ｎＭである）、そして抗体は有意な抗腫瘍活性を有し、そして哺乳動物自体に対して明らかな毒性副作用を有さない。さらに、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１に基いて得られる、キメラ抗体、ヒト化抗体及びその対応するＡＤＣもまた、卓越した特性を有する。本発明は、それらに基いて達成された。

用語
本明細書において、「抗体薬物接合体」、「抗体接合体」、「抗体-薬物-接合体」、「抗体-薬物接合体」及び「免疫接合体」は相互置換可能に用いられ得、（ａ）抗体又は活性断片及び（ｂ）薬物によって形成される接合体を意味する。

「本発明の抗体薬物接合体」、「本発明の抗体-薬物接合体」及び「本発明のＡＤＣ」は、相互置換可能に用いられ得、本発明の薬物及び組織因子に対する抗体又はその活性断片によって形成される接合体を意味する。

他に規定の無い限り、本明細書中で用いられる技術及び科学用語は、当業者が共通して理解するのと同じ意味を有する。本明細書中、特定の数値が示されているときに使用される「約」は、その値が、明示された数値から最大１％変動し得ることを意味する。例えば、「約１００」は、９９〜１０１の間の全ての数値を含む（例えば９９．１、９９．２．９９．３、９９．４等）

抗体
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」又は「免疫グロブリン（immunoglobulin）」とは、２つの同一の軽鎖（Ｌ）及び２つの同一の重鎖（Ｈ）から成る、同じ構造特性を有する約１５０，０００Ｄａのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は、共有ジスルフィド結合を介して重鎖に結合され、そして異なる免疫グロブリンイソタイプは、重鎖間に異なる数のジスルフィド結合を有する。各重鎖及び各軽鎖に規則的等間隔の鎖内ジスルフィド結合も存在する。各重鎖は、一端で可変領域（ＶＨ）、続いて多くの不変領域を有する。各軽鎖は、一端で可変領域（ＶＬ）及び他端で不変領域；重鎖の第１不変領域に対応する軽鎖の不変領域、及び重鎖の不変領域に対応する軽鎖の可変領域を有する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域との間に界面を形成する。

本明細書において使用される場合、用語「可変（variable）」とは、可変領域の特定部分における配列に関して、抗体がお互いに異なり、それが種々の特定の抗体のそれらの特定の抗原への結合及び特異性を担当していることを意味する。しかしながら、可変性は、抗体の可変領域全体に均一に分布されない。それは、軽鎖及び重鎖可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中されている。可変領域の保存部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然に存在する重鎖及び軽鎖の各可変領域は、一般的に、結合ループを形成する３つのＣＤＲにより連結されるβ−シート構造で存在し、そして場合によっては、部分的β−シート構造を形成できる、４つのＦＲ領域を含む。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域を介して互いに密接に結合され、そして他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位を形成する（Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pp. 647-669 (1991)を参照のこと）。不変領域は、抗原への抗体の結合に直接関与していないが、しかしながら、それらは異なる効果及び機能を示し、例えば抗体の抗体依存性細胞毒性に関与している。

脊椎動物抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖（light chain）」は、その不変領域のアミノ酸配列に依存して、２つの明白に異なるクラス（κ及びλと呼ばれる）のうちの１つに分類され得る。免疫グリブリンは、それらの重鎖不変領域のアミノ酸配列に依存して、異なるクラスに分類され得る。免疫グロブリンには主に以下の５つのクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、それらのいくつかはさらに、以下のサブクラス（アイソタイプ）に分類され得る：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖不変領域はそれぞれ、α、δ、 ε、 γ、 及び μと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット機構及び三次元配置は、当業者に良く知られている。

一般的に、抗体の抗原結合特性は、可変領域を４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分割する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、重鎖及び軽鎖可変領域に位置する３つの特定領域により説明され得；４つのＦＲのアミノ酸配列は比較的保存的であり、そして結合反応には直接的に関与していない。それらのＣＤＲは環構造を形成し、そしてそれらの環のＦＲにより形成されるβ−シートを介して立体構造内で互いに接近し、そして重鎖上のＣＤＲ及び対応する軽鎖上のＣＤＲは抗体の抗原結合部位を構成する。同じタイプの抗体のアミノ酸配列を比較することにより、どのアミノ酸がＦＲ又はＣＤＲを形成するかが決定され得る。

本発明は、損なわれていない抗体のみならず、また免疫学的活性を有する抗体のフラグメント、又は抗体及び別の配列により形成される融合タンパク質も含む。従って、本発明はまた、抗体のフラグメント、誘導体及び類似体を含む。

本発明においては、抗体は、当業者に周知の技法により調製される、マウス、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体を含む。ヒト及び非ヒト部分を含む、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は、標準的なＤＮＡ組換え技法により得られ、それらのすべては有用な抗体である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばマウス由来のモノクローナル抗体からの可変領域、及びヒト免疫グロブリンからの不変領域を有するキメラ抗体である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及び第４，８１６，３９７号を参照のこと；それらはそれらの全体が参照により本明細書に組込まれる）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１又は２以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子を言及する（米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと；それはその全体が参照により本明細書に組込まれる）。それらのキメラ及びヒト化抗体は、当業界において良く知られている組換えＤＮＡ技法により調製され得る。

本発明においては、抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は多重特異性であり得る。

本発明においては、本発明の抗体はさらに、その保存的変異体を含み、それは本発明の抗体のアミノ酸配列に比較して最大１０、好ましくは最大８、より好ましくは最大５及び最も好ましくは最大３個のアミノ酸の類似アミノ酸による置換により形成されるポリペプチドを言及する。それらの保存的変異体ポリペプチドは好ましくは、表Ａによるアミノ酸置換により調製される。

抗−ＴＦ抗体
本発明は、重鎖及び軽鎖を含む、ＴＦに対して高い特異性及び高い親和性を有する抗体を提供し、ここで重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を含み、そして軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む。

好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に対するＣＤＲは、下記から選択される：
ａ１) 配列番号１;
ａ２) 配列番号２;
ａ３) 配列番号３;
ａ４) 配列番号４;
ａ５) 配列番号５;
ａ６) 配列番号６;
ａ７) 前記アミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、ＴＦ−結合親和性を有する配列。

別の好ましい例によれば、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じる配列は好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列である。

好ましくは、抗体は、ＴＦ−関連シグナル経路を阻害する活性を有し；抗凝固活性を有し；ＦＸａ産生を阻害する活性を有し；又はそれらの組合を有する。

典型的には、本発明は：本発明の重鎖可変領域；及び／又は本発明の軽鎖可変領域；を有する抗−ＴＦ抗体を提供し、ここで、当該抗体の重鎖可変領域は、以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
配列番号１に記載の配列を有するＣＤＲ１、
配列番号２に記載の配列を有するＣＤＲ２、
配列番号３に記載の配列を有するＣＤＲ３；
を有し、ここで、これらのアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列は、更に任意で少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換による誘導的配列を含みつつ、ＴＦ−結合活性を保持し；
ここで、当該抗体の軽鎖可変領域は、以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
配列番号４に記載の配列を有するＣＤＲ１´、
配列番号５に記載の配列を有するＣＤＲ２´、
配列番号６に記載の配列を有するＣＤＲ３´；
を有し、ここで、これらのアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列は、更に任意で少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換による誘導的配列を含みつつ、ＴＦ−結合活性を保持している。

好ましくは、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７、９、１０、１１、１２又は１３から選択され；及び／又は前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８、１４、１５、１６又は１７から選択される。

本発明において、前記抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はそれらの組合せからなる群から選択される。他の好ましい例において、付加、欠失、修飾及び／又は置換されるアミノ酸の数は、当初のアミノ酸配列の全アミノ酸数の４０％を超えない。

他の好ましい例において、付加、欠失、修飾及び／又は置換されるアミノ酸の数は、１〜７個である。

他の好ましい例において、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換によって得られた配列は、元の配列に対し８０％以上の同一性を有する。

他の好ましい例において、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換によって得られた配列は、ＴＦ−関連シグナル経路の阻害活性、抗凝集活性、及びＦＸａ生産の阻害活性の１つ以上を有する。

本発明の抗体は、二本鎖又は単鎖抗体であり得、そして動物由来の抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体から成る群から選択され得；より好ましくは、ヒト化抗体及びヒト−動物キメラ抗体から成る群から選択され得；そして完全ヒト抗体であり得る。

本発明の抗体は、単鎖抗体、及び／又は抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ′、（Ｆａｂ′）_２、又は当業界において知られている他の抗体誘導体であり得、そしてＩｇＡ，ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体又はサブタイプの抗体のいずれか１又２以上であり得る。

本発明においては、動物は好ましくは、哺乳類、例えばマウスである。

本発明の抗体は、ヒトＴＦを標的とするキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植及び／又は修飾抗体であり得る。

本発明の好ましい例によれば、配列番号１〜３のいずれか１又は２以上の配列、又は少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有するそれらの配列は、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲに位置する。

本発明の好ましい例によれば、配列番号４〜６のいずれか１又は２以上の配列、又は少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有するそれらの配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲに位置する。

本発明のより好ましい例によれば、ＶＨ ＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３は、配列番号１〜３のいずれか１又は２以上の配列、又は少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有するそれらの配列から独立して選択され；ＶＬ ＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３は、配列番号４〜６のいずれか１又は２以上の配列、又は少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有するそれらの配列から独立して選択される。

本発明においては、付加され、欠失され、修飾され、そして／又は置換されるアミノ酸の数は、初期アミノ酸配列のアミノ酸の合計数の、好ましくは、４０％を越えず、より好ましくは３５％を越えず、より好ましくは１〜３３％であり、より好ましくは５〜３０％であり、より好ましくは１０〜２５％であり、そしてより好ましくは１５〜２０％である。

本発明においては、より好ましくは、付加され、欠失され、修飾され及び／又は置換されるアミノ酸の数は、１〜７、より好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２である。

別の好ましい例によれば、ＴＦを標的とする抗体は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１（オリジナル名称はＴＦ−ｍＡｂである）である。

別の好ましい例によれば、抗体ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号７に示されるようなアミノ酸配列である。

別の好ましい例によれば、抗体ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の軽鎖可変領域（Ｖ−κ）のアミノ酸配列は、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列である。

抗体の調製
本発明の抗体又はそのフラグメントに対するＤＮＡ分子の配列は、従来の技法、例えばＰＣＲ増幅又はゲノムライブラリースクリーニングのような方法により得られる。さらに、軽鎖及び重鎖をコードする配列は、一緒に融合され、単鎖抗体が形成される。

関連配列が得られると、組換え方法を用いて、関連配列を多量に得ることができる。これは通常、配列をベクター中にクローニングし、そのベクターにより細胞を形質転換し、そして次に、増殖された宿主細胞から関連配列を、従来の方法により分離することにより実施される。

さらに、関連配列は、特に、フラグメントの長さが短い場合、人工的に合成される。通常、いくつかの小フラグメントが、まず合成され、そして次に、一緒に連結され、長い配列を有するフラグメントが得られる。

本発明の抗体（又はそのフラグメント、又はその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を、化学合成により得ることは、現在可能である。次に、そのＤＮＡ配列は、当業界において知られている種々の既存のＤＮＡ分子（又は、例えばベクター）及び細胞中に導入され得る。さらに、突然変異がまた、化学合成により、本発明のタンパク質配列中に導入され得る。

本発明はさらに、前記適切なＤＮＡ配列、及び適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターに関する。それらのベクターは、それらがタンパク質を発現することを可能にするために適切な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。

宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞；又は下等真核細胞、例えば酵母細胞；又は高等真核細胞、例えば哺乳類細胞であり得る。好ましい動物細胞は、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３細胞を含むが、但しそれらだけには限定されない。

一般的に、本発明の抗体の発現のために適切な条件下で、得られる宿主細胞は培養される。次に、本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製工程、例えば当業者に良く知られている従来の分離及び精製手段、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー又は親和性クロマトグラフィーを用いることにより精製される。

得られるモノクローナル抗体は、従来の手段により同定され得る。例えば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））により決定され得る。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばScatchard分析（Anal. Biochem., 107: 220 (1980)）により決定され得る。

本発明の抗体は、細胞において又は細胞膜上に発現され、又は細胞外に分泌される。必要に応じて、組換えタンパク質は、その物理的、化学的又は他の特性に従って種々の分離方法により分離され、そして精製され得る。それらの方法は、当業者に良く知られている。それらの方法の例は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透性細菌の破砕、超音波処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、他の様々な液体クロマトグラフィー技法及びそれらの方法の組合せ。

細胞毒性薬物
本発明のＡＤＣを形成するのに用いられ得る薬物は、限定されないが：細胞毒性薬物を含む。

「細胞毒性薬物」は、細胞発現活性、細胞機能を阻害又はブロックし、及び／又は細胞の破壊をもたらす物質を意味する。この用語は、放射性同位体、化学治療剤及び毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物由来の、小分子毒素又は酵素活性毒素（その断片及び／又は変異体を含む）を含む。細胞毒性薬物の例は、限定されないが、以下のものを含む：アウリスタチン（auristatin）（例えばアウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）、クロルテトラサイクリン、マイタンシノール（maytansinol）、リシン（ricin）、リシンＡ鎖、コブスタチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テントポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシ炭疽菌ジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素(ＰＥ)Ａ、ＰＥ４０、アカシア毒素（Acacia toxin）、アカシア毒素Ａ鎖、モデクシン（modeccin）Ａ鎖、α−サルシナ、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリア・オフィシナリス（Sapaonaria officinalis）阻害剤、グルココルチコイド及び他の化学治療剤、並びに放射性同位体、例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212又は213、P32、及びLu177を含むLuの放射性同位体。抗体は、プロドラッグをその活性フォームに変換し得る、抗癌プロドラッグ活性化とも接合され得る。

好ましい小分子薬物は、高い細胞毒性を有する化合物であり、好ましくは、モノメチルアウリスタチン、カリケアミシン(calicheamicin)、マイタンシン（maytansine）、又はその組合せ；より好ましくは：モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチン−Ｄ（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチン−Ｆ（ＭＭＡＦ）、又はそれらの組合せから選択される。

抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）
本発明はまた、本発明の抗体に基く抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）も提供する。

典型的には、抗体−薬物接合体は、抗体及びエフェクター分子を含み、ここで抗体はエフェクター分子に接合され、そして化学的接合が好ましい。好ましくは、エフェクター分子は、治療的活性薬物である。さらに、エフェクター分子は、１又は２以上の毒性タンパク質、化学療法薬物又は放射性核種であり得る。

本発明の抗体及びエフェクター分子は、カップリング剤によりカップリングされ得る。カップリング剤の例としては、非選択的カップリング剤、カルボキシル基を利用するカップリング剤、ペプチド鎖、及びジスルフィド結合を利用するカップリング剤のいずれか１つ又は２以上のものであり得る。非選択的カップリング剤は、共有結合、例えばグルタルアルデヒドなどを介してエフェクター分子と抗体との間の連結をもたらす化合物を言及する。カルボキシル基を利用するカップリング剤は、シス−アコニット酸無水物カップリング剤（例えば、シス−アコニット酸無水物）及びアシルヒドラゾンカップリング剤（カップリング部位はアシルヒドラゾンである）のいずれか１つ又は２以上のものであり得る。

抗体上の特定の残基（例えば、Ｃｙｓ又はＬｙｓ、等）は、造影剤（例えば、発色団及び蛍光体）、診断剤（例えば、ＭＲＩ造影剤及び放射性同位体）、安定化剤（例えば、ポリ（エチレングリコール））及び治療剤を含む種々の官能基を連結するために使用される。抗体は、抗体−機能剤の接合体を形成するために機能剤に接合され得る。機能剤（例えば、薬物、検出試薬、安定化剤）は、抗体に接合される（共有結合による）。機能剤は、リンカーを介して直接的に又は間接的に抗体に連結される。

本発明に適した典型的な接合様式は、Ｋ−Ｌｏｃｋ及びＣ−Ｌｏｃｋ接合様式の両方を含む。Ｋ−Ｌｏｃｋ接合様式において、薬物分子は、抗体配列中のリシン（Ｋ）残基と接合し；Ｃ−Ｌｏｃｋ接合様式において、薬物分子は、抗体配列中のシステイン（Ｃ）残基と接合する。

抗体は、抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）を形成するために、薬物に接合され得る。典型的には、ＡＤＣは、薬物と抗体との間にリンカーを含む。リンカーは、分解性又は非分解性リンカーであり得る。典型的には、分解性リンカーは、細胞内環境下で容易に分解され、例えば、リンカーは標的部位で分解され、それにより、抗体から薬物を放出する。適切な分解性リンカーは、細胞内でプロテアーゼ（例えば、リソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼ）により分解され得るペプチジル含有リンカーを含む酵素分解リンカー、糖リンカー、例えばグルクロニダーゼにより分解され得るグルクロニド含有リンカーを含む。ペプチジルリンカーは例えば、ジペプチド、例えばバリン−シトルリン、フェニルアラニン−リシン又はバリン−アラニンを含むことができる。他の適切な分解性リンカーは、例えばｐＨ感受性リンカー（例えば、５．５以下のｐＨで水分解されるリンカー、例えばヒドラゾンリンカー）及び還元条件下で分解されるリンカー（例えば、ジスルフィド結合リンカー）を含む。非分解性リンカーは、典型的には、抗体がプロテアーゼにより加水分解される条件下で薬物を放出する。

抗体への連結の前、リンカーは特定のアミノ酸残基と反応できる反応基を有し、そして連結がその反応基により達成される。チオール特異的反応基が好ましく、これは例えば、マレイミド化合物、ハロゲン化（例えば、ヨード、ブロモ、又はクロロ置換された）アミド；ハロゲン化（例えば、ヨード、ブロモ、又はクロロ置換された）エステル；ハロゲン化（例えば、ヨード、ブロモ、又はクロロ置換された）ハロゲン化ベンジル；ビニルスルホン；ピリジルジスルフィド；水銀誘導体、例えば３、６−ジ−（水銀メチル）ジオキサン（対イオンがＣＨ_３ＣＯＯ⁻、Ｃｌ⁻又はＮＯ_３ ⁻である）；及びポリメチレンジメチルスルフィドチオスルホネートを含む。リンカーは例えば、チオスクシンイミドを介して抗体に連結されるマレイミドを含む。

薬物は、任意の細胞毒性、細胞増殖抑制又は免疫抑制薬物であり得る。１つの実施形態によれば、抗体はリンカーを介して薬物に連結され、そして薬物は、リンカーと共に結合を形成できる官能基を有する。例えば、薬物は、リンカーと共に結合を形成できる、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、又はケトン基を有することができる。薬物がリンカーに直接連結される場合、薬物は、抗体に連結される前、反応基を有する。

有用な薬物は以下を含む：抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、葉酸拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなど。特に有用な細胞毒性薬物の例は、以下を含み：DNA副溝結合剤、ＤＮＡアルキル化剤、及びチューブリン阻害剤；典型的な細胞毒性薬物は、例えば以下を含む：アウリスタチン、カンプトテシン、ドカマイシン／デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシン及びメイタンシノイド（例えば、ＤＭ１及びＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン又はベンゾジアゼピン含有薬物（例えば、ピロロ[１，４]ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、並びにビンカアルカロイド。

本発明においては、薬物−リンカーは、簡単な工程プロセスでＡＤＣを形成するために使用され得る。他の実施形態によれば、二官能性リンカー化合物が、二段階又は多段階プロセスでＡＤＣを形成するために使用され得る。例えば、システイン残基は、第１段階においてリンカーの反応性部分と反応され、そして次に、リンカー上の官能基が、ＡＤＣを形成するために続く段階において薬物と反応される。

一般的に、リンカー上の官能基は、薬物部分上の適切な反応性基と特別に反応できるよう選択される。非限定的な例として、アジトベースの部分が、薬物部分上の反応性アルキニル基と特別に反応するために使用され得る。薬物は、アジト基とアルキニル基との間の１，３−双極子環状付加によりリンカーに共有結合される。他の有用な官能基は例えば、以下を含む：ケトン及びアルデヒド（ヒドラジド及びアルコキシアミンとの反応のために適切な）、ホスフィン（アジドとの反応のために適切な）；イソシアネート及びイソチオシアネート（アミン及びアルコールとの反応のために適切な）；及び活性化エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（アミン及びアルコールとの反応のために適切な）。それらの及び他の連結法、例えばBioconjugation Technology (2^nd Edition (Elsevier))は、当業者に良く知られている。当業者は、相補的対の反応性官能基が薬物部分とリンカーとの間の選択的反応のために選択される場合、相補的対の各メンバーがリンカーのために使用され、そしてまた、薬物のために使用され得ることを理解できる。

本発明はさらに、抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）を形成するために十分な条件下で、薬物−リンカー化合物に抗体を結合されることをさらに含む、ＡＤＣの調製方法を提供する。

特定の実施形態によれば、本発明の方法は、抗体−リンカー接合体を形成するのに十分な条件下で、二官能性リンカー化合物に抗体を結合されることを含む。それらの実施形態によれば、本発明の方法は、リンカーを介して薬物部分を抗体に共存結合するのに十分な条件下で、抗体−リンカー接合体を薬物部分に結合されることを含む。

いくつかの実施形態によれば、抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）は、以下のような式：
［式中、Ａｂは抗体であり；
ＬＵはリンカーであり、
Ｄは薬物であり；そして
下付文字ｐは、１〜８から選択された値である］を有する。

用途
本発明はさらに、診断剤の製造、又はＴＦ関連疾患を予防し、そして／又は治療するための医薬の製造のための本発明の抗体の使用を提供する。ＴＦ関連疾患は、腫瘍形成、腫瘍増殖及び/又は転移、血栓症関連疾患、炎症、代謝関連疾患などを包含する。

本発明の抗体、ＡＤＣ又はＣＡＲ−Ｔの使用は、以下のためを包含する（但し、それらだけには限定されない）：
（ｉ）腫瘍形成、腫瘍増殖及び／又は転移、特に高ＴＦ発現を有する腫瘍の診断、予防及び／又は治療、ここで腫瘍は以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：乳癌（例、トリプルネガティブ乳がん）、膵臓癌、肺癌、悪性神経膠腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、白血病、骨髄癌、血管肉腫など；特に、トリプルネガティブ乳癌、膵臓癌、悪性神経膠腫及び肺癌；より好ましくは、トリプルネガティブ乳癌及び/又は膵臓癌；
（ii）血栓症関連疾患の診断、予防及び／又は治療、ここで血栓症関連疾患は、以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：アテローム性動脈硬化症、急性冠症候群、急性心筋梗塞、脳卒中、高血圧、深部静脈血栓症、肺塞栓症、腎塞栓症及び動脈手術、冠状動脈バイパス術による血栓症など；
（iii）炎症の診断、予防及び／又は治療、ここで炎症は、以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：リウマチ性関節炎、変形性関節症、強直性脊椎炎、痛風、リトル症候群、乾癬性関節炎、感染性関節炎、結核性関節炎、ウイルス性関節炎、真菌性関節炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、及び特発性肺線維症；
（iv）代謝関連疾患の診断、予防及び／又は治療、ここで代謝関連疾患は、以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：糖尿病、食事性肥満、脂肪炎症など。

医薬組成物
本発明はさらに、組成物を提供する。好ましい例によれば、組成物は、抗体、又はその活性フラグメント、融合タンパク質又はＡＤＣ、又は対応するＣＡＲ−Ｔ細胞、及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物である。一般的に、それらの物質は、非毒性、不活性及び医薬的に許容できる水性担体媒体において配合され得、ここでｐＨは一般的に約５〜８であり、好ましくは、ｐＨは約６〜８であり、但しそのｐＨ値は、配合される物質の性質及び治療される状態に依存して変えられ得る。配合される医薬組成物は、従来の経路、例えば腫瘍内、腹腔内、静脈内、又は局所投与（但し、それらだけには限定されない）により投与され得る。

本発明の医薬組成物は、ＴＦタンパク質分子に結合するように直接使用され、それにより、腫瘍等の疾患を予防及び治療するために使用され得る。加えて、他の治療剤、例えば様々なサイトカイン、例えばＴＮＦ、ＩＦＮ、ＩＬ−２等；様々な腫瘍用の化学治療剤、例えば核酸の生合成に影響する薬物、例えば５−ＦＵ及びメトトレキサート等；アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード及びシクロホスファミド等；転写に干渉してＲＮＡ合成をブロックする薬物、例えばドキソルビシン及びアクチノマイシンＤ；ビンクリスチン及びカンプトテシン等が、同時に使用され得る。

本発明の医薬組成物は、安全且つ有効な量（例えば、０．００１〜９９重量％、好ましくは０．０１〜９０重量％、好ましくは０．１〜８０重量％）の本発明のモノクローナル抗体（又はその接合体）及び医薬的に許容できる担体又は賦形剤を含む。そのような担体は、以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組合せ。医薬製剤は、投与法に対応すべきである。本発明の医薬組成物は、生理食塩水、又はグルコース及び他のアジュバントを含む水溶液を用いて従来の方法により、注射剤の形で調製され得る。医薬組成物、例えば注射剤及び溶液は、無菌条件で調製されるべきである。活性成分の投与量は、治療的有効量、例えば約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。さらに、本発明のポリペプチドはまた、追加の治療剤と組合しても使用され得る。

医薬組成物が使用される場合、安全且つ有効な量の免疫接合体が哺乳類に投与され、ここで前記安全且つ有効な量は、一般的に、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、及びほとんどの場合、約５０ｍｇ以下／ｋｇ体重である。好ましくは、用量は、約１０μｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、特定の用量は、投与経路及び患者の体調など、熟練した医師の技量の範囲内である要因に依存するはずである。

本発明の主な利点は、以下を含む：
ａ）本発明の抗体は、卓越した生物活性及び特性を有し、そして高い親和性を有し（ＥＣ_５０は、ＥＬＩＳＡにより決定される場合、０．０１〜００３ｎＭである）；さらに、細胞表面ＴＦに対して良好な結合親和性を有し、そしてＴＦ−標的抗体として使用され得；
（ｂ）本発明のヒト化抗体は、免疫抗体の活性に匹敵する活性を有するのみならず、また、低い免疫原性も有し；
（ｃ）本発明の抗体及びＡＤＣの両者は、有意な抗腫瘍活性を有し、そし的哺乳類動物自体に対して明らかな毒性副作用を有さず、そして
（ｄ）本発明の抗体及びＡＤＣは、腫瘍モデルにおいて有意な治療効果を有するのみならず、また、他の高ＴＦ発現関連疾患、例えば血栓性疾患及び代謝性疾患にも適用できる。

本発明はさらに、続く特定の実施例を参照して説明される。続く実施例は、本発明を説明するために単に使用されるが、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。続く実施例における実験方法は、その特定の条件は示されていないが、通常、従来の条件、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載される条件、又は製造業者により推薦される条件に従って、実施される。特にことわらない限り、百分率及び部は、重量百分率及び重量部を意味する。細胞系は、市販されているか又はＡＴＣＣから購入される従来の製品であり、そしてすべてのプラスミドは、市販されている製品である。

実施例１：ヒトＴＦを標的とするモノクローナル抗体の発現及び調製
工程１：ハイブリドーマ細胞の調製：
最初に、生後８週の雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、ヒトＴＦタンパク質の細胞外ドメイン（UniProtKB/Swiss-Prot: P13726.1、位置３４〜２５１からのアミノ酸）により免疫化し、ここでＴＦの細胞外ドメインは、免疫化された脾細胞を調製するために１００μｇ／マウスの量で使用され；マウス骨髄腫細胞（ＳＰ２／０）及びフィーダー細胞を、融合の目的で適時に調製した。

前記３種の細胞を調製した後、脾細胞及びＳＰ２／０の細胞の融合を、ＰＥＧにより媒介し、ＰＥＧを除去し、そして得られる細胞を、フィーダー細胞を含むＨＡＴ完全培地に再懸濁し、そして９６ウェルプレートにおいて培養した。陽性ウェルを、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。最終的に、陽性ウェル中の細胞を、限界希釈法によりクローン培養にゆだね、そして高力価及び良好な形態を有し、そしてモノクローナル様式で増殖した細胞を、ＥＬＩＳＡ又は免疫蛍光技法によりスクリーニングした。モノクローナル様式で増殖された細胞をさらに、３回の連続したスクリーニングについて陽性クローニング率が１００％になるまで、サブクローニングスクリーニングにゆだねた。

工程２：ヒトＴＦを標的とするネズミモノクローナル抗体の腹水の調製：
工程１でスクリーニングされたハイブリドーマ細胞を、増幅培養にゆだねた。適応性の上昇の後、プリスタン（０．５ｍｌ／マウス）を、マウスの腹腔内に注射し、ハイブリドーマ細胞の増殖のために好ましい環境を提供した。７〜１０日後、１０×１０^６個のハイブリドーマ細胞を、各マウスの腹腔内に注射した。マウスを、７日目以降、腹水及び精神状態の産生を毎日観察し、そして腹水を採取し、遠心分離し、細胞を除去し、そして後での精製のために−８０℃で凍結保存した。

工程３：ヒトＴＦを標的とするネズミモノクローナル抗体の精製：
工程２で凍結保存された腹水を、氷上で融解し、そして０．４５μｍのフィルターを通して濾過した後、４℃で一晩、ＰＢＳにより透析した。最終的に、抗体を、ＦＰＬＣ技法により精製し、限外濾過し、所望する濃度に濃縮し、再包装し、そしてさらなる使用のために−８０℃で凍結保存した。

工程４：ヒトＴＦを標的とするネズミモノクローナル抗体の生物活性及び標的特異性の決定：
予備スクリーニングの後、約３０個のハイブリドーマを、二次限界希釈クローニングのために選択し、そして次に６個の抗体を、大規模発現及び精製のために選択した。各抗体を、フローサイトメトリーにより、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト膵臓癌細胞ＢｘＰＣ−３及びネズミ黒色腫細胞Ｂ１６−Ｆ１０に対するその親和性について１０μｇ／ｍｌの濃度で決定した。

図１に示される結果は、試験された抗体がネズミＴＦ（Ｂ１６−Ｆ１０細胞）への特異的結合を伴わないで、ヒトＴＦ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢｘＰＣ−３細胞）に対して特異的に結合し、ここで、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、他の５個の抗体よりもヒトＴＦに対して高い親和性を有したことを示した。

その後、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＥＬＩＳＡプレートを、０．０５μｇ／ウェルでのＴＦの細胞外ドメインタンパク質により被覆した。結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１がＴＦの細胞外ドメインタンパク質への強い結合親和性を有したことを示し；細胞結合親和性アッセイは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１がトリプルネガティブ乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、及び高ＴＦ発現を有する膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ−３）に対して非常に高い親和性を有したことを示し；そしてＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、ある程度の用量依存性で、ＴＦ−ＰＡＲ２下流ＭＡＰＫ／ＥＲＫのリン酸化レベルを有意に阻害できた。

ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は非常に高い特異性、非常に高い親和性、及びＭＡＰＫ／ＥＲＫのリン酸化レベルに対する有意な阻害効果を示したので、それを配列決定及び続く研究のために選択した。

Ｋａｂａｔのデータベースに従っての従来の配列決定及び分析により、以下の配列情報を得た：
Ｈ鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の通りであった：
配列番号１: ＳＹＷＭＮ;
配列番号２: ＭＩＹＰＡＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤ;
配列番号３: ＥＤＹＧＳＳＤＹ。

完全ＶＨアミノ酸配列は、配列番号７に示される通りであった：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＩＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＹＰＡＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＤＹＧＳＳＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ (配列番号７)。

Ｌ鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の通りであった：
配列番号４: ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮ;
配列番号５: ＧＩＳＮＬＡＳ;
配列番号６: ＱＱＫＳＳＦＰＷＴ。

完全ＶＬアミノ酸配列は、配列番号８に示される通りであった：
ＥＩＬＬＴＱＳＰＡＩＩＡＡＳＰＧＥＫＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＬＱＫＰＧＳＳＰＫＩＷＩＹＧＩＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＳＦＴＩＮＳＭＥＴＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＫＳＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ(配列番号８)。

実施例２：ヒト−マウスキメラ抗体の調製
ヒト−マウス抗体を、得られた高い活性の及び特異的ネズミＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１に基いて構成した。

プライマーを、Ｈ鎖可変領域にＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩを導入し、そしてＬ鎖可変領域にＡｇｅＩ及びＢｓｉＷＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するよう設計し、そして次に、上記で得られた抗体のＨ鎖及びＬ鎖可変領域の配列を、Ｈ鎖不変領域及びヒトＩｇＧ１のκ鎖不変領域を含むベクター中に別々にクローン化した。同定による確認の後、構成されたキメラ抗体を、トランスフィクション技法及び哺乳類発現システム（ＣＨＯ−Ｓ又はＨＥＫ−２９３細胞）を用いることにより、発現し、そして精製し、そして得られたヒト−マウスキメラ抗体を、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈと命名した。

実施例３：ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１のヒト化及び活性の決定
抗体ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１のＨ鎖可変領域（配列番号７）及びＬ鎖可変領域（配列番号８）の配列を参照することにより、非ＣＤＲ領域と最も良く一致したヒト化鋳型を、Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースで選択した。次に、ネズミ抗体ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１のＣＤＲ領域を、選択されたヒト化鋳型に移植し、ヒト化鋳型のＣＤＲ領域を置換し、続いてＩｇＧ１／κ不変領域と組換えた。一方、ネズミ抗体の三次元構造に基いて、ＣＤＲ領域と直接的に相互作用された残基、及びＶＬ及びＶＨの立体配座に対する重要な効果を有した残基に対して復帰突然変異を行い、それにより、５つのヒト化Ｈ鎖可変領域（配列番号９、１０、１１、１２及び１３）及び４つのヒト化Ｌ鎖可変領域（配列番号１４、１５、１６及び１７）を得た。

操作されたＶＨ及びＶＬに基いて、それらのヒト化Ｈ鎖及びＬ鎖を別々に組合して発現し、最終的に合計２０のヒト化抗体、すなわちＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ２９〜ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４８を得た。各抗体についてのＨ鎖及びＬ鎖の対応する組合せは、以下の表に示された：

最初に、２０のヒト化抗体を、ＥＬＩＳＡ結合アッセイによりＴＦの細胞外ドメインタンパク質に対するそれらの親和性について決定した（実験方法については、実施例１の段階４を参照）。結果は、表１に示される。

１０μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌでの２０のヒト化抗体を、それぞれ、フローサイトメトリーにより１×１０^５個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するそれらの結合親和性について試験した。結果は、表２に示された。

実施例４：抗体−薬物接合体ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥの調製
ＴＦ―ｍＡｂ―ＳＣ１のストック溶液に、その濃度が２０ｍｇ／ｍｌに達するまで、ＰＢＳ／Ｄ（ｐＨ＝７．４）緩衝液を添加し、そして次に、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１を、２５℃で２時間、ＴＣＥＰ（２．６当量）により還元した。得られる混合物を氷上で冷却し、そしてＭＩＭＡＥ（６当量）を、精製しないで、直接添加した。０℃での１時間の反応の後、Ｃｙｓｔを添加し、反応を停止した。過剰の小分子を、Ｇ２５脱塩カラムにより除去し、そして得られる画分を、１０ｍＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に配置し、さらなる使用のために−８０℃で貯蔵した。得られる抗体−薬物接合体を、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥと命名した。

実施例５：抗体−薬物接合体ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１の調製
１：一段階調製
最初に、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１のストック溶液を、７．８ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるよう、Ｇ２５脱塩カラムにより、反応緩衝液（５０ ｍＭのリン酸カリウム/５０ ｍＭ のＮａＣｌ/２ ｍＭ のＥＤＴＡ、ｐＨ ７．５）に交換し；そして次に、９当量の１１ｍｇ／ｍｌのＭＣＣ−ＤＭ１（ＤＭＡに溶解された；ここで反応システム中のＤＭＡ含有率は５％未満であった）を添加した。反応を、室温で６時間、実施した。遠心分離の後、上清液を、Ｑカラム及びカチオンカラム精製により精製し、過剰の小分子を除去し、そして最終的に、Ｇ２５脱塩化ラム又は限外濾過により、１０ｍＭのＰＢＳ溶液に交換し、そしてさらなる使用のために−８０℃で貯蔵した。得られた抗体−薬物接合体を、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１と命名した。

２：二段階調製
ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１のストック溶液を、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるよう、Ｇ２５脱塩カラムにより、反応緩衝液（５０ ｍＭのリン酸カリウム/５０ ｍＭ のＮａＣｌ/２ ｍＭ のＥＤＴＡ、ｐＨ ７．５）に交換し；そして次に、８当量のＭＣＣ−ＤＭ（ＤＭＡＯに溶解された）を添加した。反応を、１０−１２℃で３時間、実施した、そして過剰ＳＭＣＣを、Ｇ２５脱塩カラムにより除去した。ＤＭ１（１２当量）を、Ｐ−ＭＣＣに添加し、そして反応を２５℃で１８時間、行い、そして最終的に、Ｇ２５脱塩化ラムにより、１０ｍＭのＰＢＳ溶液に交換し、そしてさらなる使用のために−８０℃で貯蔵した。得られた抗体−薬物接合体を、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１と命名した。

実施例６：高ＴＦ発現を有するトリプルネガティブ乳癌細胞及び膵臓癌細胞に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＡＤＣのインビトロ抗腫瘍活性
この実施例に使用される以下の細胞系を、American Type Culture Collection (ATCC) 又は Cell Bank of Chinese Academy of Sciencesから購入し、そしてその対応する説明書に従って培養した：ＭＣＦ７、ＭＤＡ−４５３、Ｔ４７Ｄ、Ａ５４９、Ｕ８７ＭＧ、Ｈ１９７５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢｘＰＣ−３、ＨＣＣ１８０６及び Ｈｓ５７８Ｔ。

対数増殖期にある細胞を、ウェル当たり１，０００〜３，０００個の密度で（異なる細胞の増殖速度に依存する）、９６ウェル培養部プレートに播種した。５％ＣＯ_２下で３７℃で約１６時間インキュベートした後、異なる濃度でのＴＦ−ｍＡｂ−ＡＤＣ（すなわち、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１及びＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥ）を添加し、各薬物濃度を３つのウェルにおいて反復し、そして対応する培地対照及びブランク対照ウェルを使用した。４日間のインキュベーションの後、培養溶液を廃棄し、そしてＭＴＳ反応溶液（Ｐｒｏｍｅｇａから購入された、カタログ番号Ｇ３５８１）を、１００μｌ／ウェルで添加した。反応を、所望の色深度が得られるまで、３７℃で行い、各グループの細胞生存率（ＯＤ４９０ｎｍ）を決定し、そして細胞生存率を、以下の式に従って計算した：
細胞生存率＝ＯＤ_{administration} ⁻ＯＤ_blank)/(ＯＤ_control-ＯＤ_blank)×１００%

上記データを、Graphpad Prism ５ソフトウェアにより分析し、そして異なる細胞系についてのＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１及びＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥのＩＣ_５０値を、それぞれ計算した。

実験結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１及びＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥの両者が、インビトロで高ＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を良好に阻害でき、そして阻害効果が細胞表面上のＴＦ分子の数に比例したことを示した。図１に示されるように、左図は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１が高ＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を十分に阻害できることを示す曲線であり、そして右図は、異なる細胞系に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１のＩＣ_５０値を示した。図２に示されるように、左図は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが高ＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を十分に阻害できたことを示す曲線であり、そして右側の表は、異なる細胞に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥのＩＣ_５０値を示した。

異なる細胞表意面上のＴＦの相対的分子数を、ＣＣＬＥデータベース（Broad-Novartis Cancer Cell line Encyclopedia）により分析し、そしてその結果は、異なる細胞の増殖に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１及びＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥの阻害効果が細胞表面上のＴＦの分子数に比例することを示し、それらは、それぞれ図３Ａ及び図３Ｂに示している。

実施例７：高ＴＦ発現を有するトリプルネガティブ乳癌及び膵臓癌モデルに対するＴＦ−ｍＡｂ−ＡＤＣのインビボ抗腫瘍活性
対数増殖期におけるＨＣＣ１８０６及びＢｘＰＣ−３細胞を、生後６週のＢａｌｂ／ｃ雌ヌードマウスの背の皮下又は乳房脂肪パッドに、それぞれ２００μｌの無血清培地当たり３×１０^６及び１０×１０^６個の密度で接種するために使用した（Ｂａｌｂ／ｃヌードは、Shanghai Xipuer-Beikai Experimental Animal Co., Ltd.から購入された）。腫瘍が１００〜２００ｍｍ^３まで増殖した後、動物をランダムにグループ分けし、各グループについて８個の腫瘍を有した。マウスに、３．７５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの用量でＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１を投与するか、０．７ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３．７５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの用量でＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥを、尾の静脈に週当たり１度、投与した。正常マウスＩｇＧ（ＩｇＧ）及びドセタキセルを、それぞれ、負及び正の対照薬物として使用した。ヌードマウスの腫瘍体積及び重量を、週当たり２〜３度、測定し、そして記録し、腫瘍増殖曲線をプロットした。腫瘍体積（Ｖ）を、以下の式に従って計算した：
Ｖ＝１／２×ａ×ｂ^２
式中、ａ及びｂは、それぞれ、腫瘍の長さ及び幅を表している。

図４に示されるように、図４Ａは、ＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍増殖が、特定用量依存性態様でＴＦ−ｍＡｂ−ＤＭ１により阻害された曲線を示す。図４Ｂは、ヌードマウスの体重変化曲線を示した。

図５Ａ及び図６は、ＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍増殖が異なる用量でＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥにより阻害された曲線を示し、そして図５Ｂは、ヌードマウスの体重変化曲線を示した。ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥが０．７ｍｇ／ｋｇの用量でＨＣＣ１８０６腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、そして３．７５ｍｇ／ｋｇの用量でＨＣＣ１８０６の増殖をほとんど完全に阻害できたことが、結果から見られた。

図７Ａに示されるように、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥは、用量依存性態様でＢｘＰｃ−３異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害できた。ドセタキセルグループ中のマウスと比較して、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥグループ中のマウスは、体重減少を示さず、このことは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥがより低い毒性副作用を有したことを示唆する。図７Ｂは、ヌードマウスの体重変化の曲線を示した。

実施例８：ヒト化抗体のＡＤＣ
実施例４−７を反復し、但しＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１を、以下により置換した：ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ２９、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３０、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３１、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３２、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３３、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３４、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３５、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３６、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３７、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３８、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４０、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４１、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４２、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４３、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４５、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４６、 ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４７、及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４８。

次に、それらのヒト化抗体とＭＭＡＥとの接合体を、それぞれ調製し、ここでＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥ及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥの特徴づける結果を、下記に示した。

図８は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥの分子篩ＨＰＬＣを示し；図９は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥの疎水性クロマトグラフィーを示し；図１０は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥの質量スペクトルを示し；図１１は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥの分子篩ＨＰＬＣを示し；図１２は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥの疎水性クロマトグラフィーを示し；そして図１３は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥの質量スペクトルを示した。

上記実験結果に従って計算される場合、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥ及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥは主に、２及び４の薬物−抗体比（ＤＡＲ）を有し、そして平均ＤＡＲは約４であった。

試験結果は、それらのヒト化抗体に基いてのＡＤＣもまた、高い親和性（ＴＦ−ｍＡｂ−ＭＭＡＥと比較して、好ましいヒト化抗体のＡＣＤは、６０％〜１４０％の範囲の相対的親和性を有した）、高い細胞毒性、及び低い毒性副作用を有し、そして有意な抗腫瘍効果を示したことを示した。

２種の好ましいヒト化抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥ及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥのインビトロ及びインビボ抗腫瘍活性が、それぞれ図１４〜図２０に示された。

図１４に示されるように、実験結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥが高ＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を有意に阻害でき、そして細胞表面上のＴＦの分子数に比例したことを示し、ここで右側の表は、異なる細胞系についてのＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥのＩＣ_５０値を示した。

図１５に示されるように、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥは、高ＴＦ発現を有する腫瘍細胞の増殖を有意に阻害し、そして阻害効果は、細胞表面上のＴＦの分子数に比例し、ここで右側の表は、異なる細胞系についてのＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥのＩＣ_５０値を示した。

異なる細胞表面上のＴＦの相対的分子数を、ＣＣＬＥデータベースにより分析し、そしてその結果は、異なる細胞に対するＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥ及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥの阻害効果が、細胞表面上のＴＦ分子数に比例することを示し、それらは、それぞれ、図１６Ａ及び図１６Ｂに示された。

図１７に示されるように、ＴF−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥは、用量依存性態様でＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、そして３ｍｇ／ｋｇの用量でＨＣＣ１８０６腫瘍増殖を完全に阻害でき、そして最小効果用量（ＭＥＤ）は１ｍｇ／ｋｇであった。

図１８に示されるように、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥは、ＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍の増殖を効果的に阻害し、そして最小効果用量（ＭＥＤ）は１ｍｇ／ｋｇであった。

図１９に示されるように、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４−ＭＭＡＥは、用量依存性態様で、ＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を有意に阻害し、そして１ｍｇ／ｋｇの用量でＢｘＰＣ−３腫瘍の増殖を完全に阻害できた。

図２０に示されるように、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９−ＭＭＡＥは、ＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を有意に阻害でき、そして最小効果用量（ＭＥＤ）は、０．３ｍｇ／ｋｇであった。

本発明において言及される全ての文書は、あたかも各個々の文書が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に参照により本出願に組み込まれる。 さらに、本発明で教示された内容を読んだ後、当業者によって本発明に対して様々な修正及び変更がなされてもよく、これらの同等物もまた特許請求の範囲によって定義される範囲に含まれることを理解すべきである。

Claims (10)

1. 抗体薬物接合体であって、以下：
   (a)抗体部分；及び
   (b)当該抗体部分と接合した接合部分、ここで当該接合部分は、検出マーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素及びそれらの組合せからなる群から選択される；
   を含み、当該抗体の重鎖可変領域が、以下の3つの相補性決定領域(CDR)：
   (H1)配列番号1に記載の配列を有するCDR1；
   (H2)配列番号2に記載の配列を有するCDR2；及び
   (H3)配列番号3に記載の配列を有するCDR3；
   を含み、ここで、当該重鎖可変領域のアミノ酸配列のいずれかが、更に、任意で1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、変更及び／又は置換による派生配列を含み、そしてTF結合活性を保持し；及び／又は
   当該抗体の軽鎖可変領域が、以下の3つの相補性決定領域(CDR)：
   (L1)配列番号4に記載の配列を有するCDR1'；
   (L2)配列番号5に記載の配列を有するCDR2'；及び
   (L3)配列番号6に記載の配列を有するCDR3'；
   を含み、ここで、当該軽鎖可変領域のアミノ酸配列のいずれかが、更に、任意で1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、変更及び／又は置換による派生配列を含み、そしてTF結合活性を保持する、抗体薬物接合体。
2. 前記抗体薬物接合体(ADC)が、以下の式：
   （式中、
   Abは抗TF抗体であり、
   LUはリンカーであり、
   Dは薬物であり、
   Pは1〜10、好ましくは1〜8から選択される数値である）
   で表される、請求項１に記載の抗体薬物接合体。
3. LUが：6-マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p−アミノベンジルオキシカルボニル(MC-val-cit-PAB)、6-マレイミドカプロイル-アラニン-フェニルアラニン-p−アミノベンジルオキシカルボニル(MC-ala-phe-PAB)、マレイミドプロピオニル-バリン-シトルリン-p−アミノベンジルオキシカルボニル(MP-val-cit-PAB)、マレイミドプロピオニル-アラニン-フェニルアラニン-p−アミノベンジルオキシカルボニル(MP-ala-phe-PAB)、N-スクシニミジル4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)、N-スクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)、4-(2-ピリジルジチオ)ブタン酸N-ヒドロスクシニミドエステル(SPDB)又はN-スクシニミジル(4-ヨード-アセチル)アミノベンゾエート(SIAB)からなる群から選択される、請求項２に記載の抗体薬物接合体。
4. Dが：
   (i)マイタジン(Maytansine)誘導体(DM1、DM4)、アウリスタチン(auristatin)及び(dolastatin)；並びに
   (ii)モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、モノメチルドラスタチン10(MMAD)誘導体又はそれらの組合せ；
   からなる群から選択される、請求項２に記載の抗体薬物接合体。
5. 前記抗体が、以下：動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の抗体薬物接合体。
6. 前記抗体の重鎖可変領域の配列が、以下：配列番号7、9、10、11、12、又は13からなる群から選択され；及び／又は
   前記抗体の軽鎖可変領域の配列が、以下：配列番号8、14、15、16、又は17からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体薬物接合体。
7. 前記抗体が、以下：TF-mAb-SC1、TF-mAb-Ch、TF-mAb-H29、TF-mAb-H30、TF-mAb-H31、TF-mAb-H32、TF-mAb-H33、TF-mAb-H34、TF-mAb-H35、TF-mAb-H36、TF-mAb-H37、TF-mAb-H38、TF-mAb-H39、TF-mAb-H40、TF-mAb-H41、TF-mAb-H42、TF-mAb-H43、TF-mAb-H44、TF-mAb-H45、TF-mAb-H46、TF-mAb-H47、及びTF-mAb-H48の群から選択される、請求項１に記載の抗体薬物接合体。
8. 前記抗体が、(i)診断剤の製造；及び／又は(ii)TF関連疾患の予防及び／又は治療用医薬の製造に使用される、請求項１に記載の抗体薬物接合体の使用。
9. 前記TF関連疾患が：腫瘍形成、腫瘍成長及び／又は転移からなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
10. 以下：
    (i)請求項１に記載の抗体薬物接合体又はその組合せである有効成分；及び
    (ii)医薬として許容される担体；
    を含有する、医薬組成物。