ES2543350T3 - Composiciones de anticuerpos de Ovr110 y métodos de uso - Google Patents

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Shu-Hui Liu
Agnes Nowakowski
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Abstract

Un anticuerpo anti Ovr110 o fragmento de unión a antígeno que comprende: (a) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7; (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 12 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº; 17; (c) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 22 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº; 27; o (d) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 42 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 47.

Description

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E07868854
22-07-2015
factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento transformante β, factor de crecimiento de tipo insulina, factor de crecimiento de hepatocitos y factor de crecimiento endotelial vascular pueden desempeñar diversos papeles en el cáncer pancreático, aunque dichos papeles no se han dilucidado. Misma referencia en 18-22.
5 El desarrollo de técnicas de exploración para detectar la presencia de cáncer pancreático es particularmente esencial para este cáncer letal, ya que la mayoría de los pacientes no presentan hasta que sus tumores pancreáticos obstruyen el conducto biliar o inducen dolor, momento en el cual los tumores han invadido los vasos capilares y linfáticos que rodean al páncreas, Howe, mencionado anteriormente en 29; desafortunadamente, los pacientes con la forma metastásica de la enfermedad típicamente sobreviven menos de un año después del diagnóstico, Jean et al., mencionado anteriormente en 15. Aunque la tomografía computarizada (CT) y colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (ERCP) pueden ayudar en el diagnóstico de pacientes sintomáticos, no hay en la actualidad ninguna herramienta para explorar con respecto a tumores pancreáticos que permitirían su descubrimiento temprano, momento en el cual podrían ser curables. Howe, mencionado anteriormente
15 en 29. Marcadores tales como el antígeno carcinoembrionario, y anticuerpos generados contra líneas celulares de cáncer colónico humano (CA 19-9 y CA 195), cáncer ovárico humano (CA 125) y cáncer pancreático humano (SPAN-1 y DUPAN-2) pueden estar elevados en el suero de pacientes con cáncer pancreático, pero estos marcadores no son suficientemente fiables para actuar como herramientas de exploración debido a su falta de especificidad y aparición tardía en la enfermedad. Walter J. Burdette, Cancer: Etiology. Diagnosis, and Treatment 99 (1998); Hasholzner, U. et al, Anticancer Res. 19(4A): 2477-80(1999).
Debido a la presente falta de métodos de exploración adecuados, los médicos están centrándose crecientemente en técnicas que emplean métodos de biología molecular como el medio más prometedor para diagnóstico temprano de la enfermedad. Howe, mencionado anteriormente en 30. En la actualidad, no hay ningún marcador de alta
25 sensibilidad, alta especificidad, que permita la detección de cáncer pancreático en individuos asintomáticos, pero se están investigando varios marcadores biológicos. Misma referencia. Se están centrando en la actualidad esfuerzos considerables en K-ras, ideando los investigadores técnicas para explorar muestras de jugo pancreático, bilis, jugo duodenal o cepillados de ERCP para detectar mutaciones de K-ras. Misma referencia. Debido a que la recogida de estas muestras es invasiva y no es particularmente útil en la exploración de las personas que son asintomáticas, los investigadores también se han centrado en análisis de suero y heces con respecto a mutaciones de K-ras, siendo el primero el más prometedor, ya que el último está obstaculizado por la complejidad del material fuente. Misma referencia en 35-38, 42. Además, debido a que los niveles en suero de la proteína de factor de transcripción p53 pueden asemejarse a la progresión de cáncer, p53 se está estudiando de forma similar como un posible marcador tumoral. Misma referencia en 37; Jean et al., mencionado anteriormente en 17.
35 Una vez que se ha diagnosticado el cáncer pancreático, se realizan escisiones de tratamiento en referencia al estadio de progresión del cáncer. Se emplean varias técnicas de captura de imágenes para estadificar el cáncer pancreático, siendo la tomografía computarizada (CT) el presente método preferente, Harmeet Kaur et al., Pancreatic Cancer: Radiologic Staging, en Pancreatic Cancer 86 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002); Ishiguchi, T. et al, Hepatogastroenterology 48(40): 923-27 (2001), a pesar del hecho de que frecuentemente infravalora el alcance del cáncer, ya que las metástasis de volumen pequeño están con frecuencia más allá de la resolución de CT, H J. Kim y K. C. Conlon, Laparascopic Staging, en Pancreatic Cancer 15 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002). La MRI puede en algún momento reemplazar a la CT a la vista de, entre otros, su capacidad para (1) contrastar entre diversos tejidos, (2) modificar las secuencias de pulso para mejorar la visualización de lesiones y minimizar los
45 artefactos, (3) realizar captura de imágenes limitando al mismo tiempo la exposición de un paciente a radiación ionizante y (4) visualizar vasos sin usar reactivos de contraste yodados IV. Kaur et al, mencionado anteriormente en
87. En la actualidad, sin embargo, la MRI no ha demostrado una clara ventaja sobre la CT. Kim y Conlon, mencionado anteriormente en 116.
También se emplean en la actualidad una diversidad de técnicas ultrasónicas en la estadificación, incluyendo ultrasonido transabdominal (TUS), ultrasonido endoscópico (EUS) y ultrasonido intraoperatorio (IUS), siendo el EUS uno de los más prometedores. Kaur et al., mencionado anteriormente en 86; Richard A. Erickson, Endoscopic Diagnosis and Staging: Endoscopic Ultrasound, Endoscopio Retrograde Cholangiopancreatography, en Pancreatic Cancer 97-106 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002). Estas técnicas, sin embargo, se limitan cada una por una
55 diversidad de factores: el TUS está obstaculizado por gas en el tracto gastrointestinal y grasa en el peritoneo, EUS requiere una experiencia considerable en ecografía y endoscopia y puede no estar ampliamente disponible, y el IUS solamente puede usarse de forma intraoperatoria. Kaur et al, mencionado anteriormente en 86.
Aunque está en sus estadios iniciales, la búsqueda de marcadores que ayuden a la estadificación de cáncer pancreático ha encontrado algunos posibles candidatos. Por ejemplo, la investigación ha revelado que dos genes supresores de metástasis nm23-H1 y KAI1, se expresan diferencialmente dependiendo del estadio del cáncer pancreático, estando su expresión regulada positivamente en estadios tempranos y regulada negativamente en estadios posteriores de la enfermedad. Friess, H. et al, J. Clin. Oncol 19(9): 2422-32(2001). Los investigadores se han centrado también en la estadificación de ganglios linfáticos genéticos, particularmente buscando mutaciones en
65 el protooncogén K-ras. Yamada, T. et al, Int’l J. Oncol 16(6): 1165-71 (2000). De forma similar, la investigación ha
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identificado que la presencia de secuencias de K-ras mutadas en plasma/suero está asociada con cáncer pancreático de estadio tardío, aunque la presencia de cáncer pancreático de estadio temprano puede detectarse también de esta manera. Sorenson, G. D., Clin. Cancer Res. 6(6): 2129-37 (2000). Una técnica de estadificación prometedora usando un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa multimarcador ha
5 distinguido con éxito estadios de cáncer pancreático ensayando muestras sanguíneas y tisulares con respecto a expresión de ARNm de los siguientes marcadores tumorales: el gen de la gonadotropina coriónica humana β, el gen del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos c-met, y el gen de la β-1,4-N-acetil-galactosaminil-transferasa. Bilchik, A. et al, Cancer 88(5): 1037-44(2000).
Un sistema de clasificación usado habitualmente para estadificar el cáncer pancreático es el sistema TNM ideado por la Union Internationale Contre le Cancer. AJCC Cancer Staging Handbook 3 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5ª ed. 1998). Este sistema se divide en varios estadios, cada uno de los cuales evalúa el grado de crecimiento del cáncer con respecto a tumor primario (T), ganglios linfáticos regionales (N) y metástasis distante (M). Misma referencia.
15 El estadio 0 se caracteriza por carcinoma in situ (Tis), sin metástasis de ganglios linfáticos regionales (N0) y sin metástasis distante (M0). Misma referencia en 113. Los estadios I y II difieren del estadio 0 solamente con respecto a la categoría tumoral: el estadio I implica un tumor limitado solamente al páncreas que es (1) de 2 cm o menos en su dimensión mayor (T1) o (2) de más de 2 cm en su dimensión mayor (T2), mientras que el estadio II implica un tumor que se extiende directamente al duodeno, conducto biliar o tejidos peripancreáticos (T3). Misma referencia. El estadio III implica la categoría tumoral T1, T2 o T3; metástasis de ganglios linfáticos regionales (N1), que implica un único ganglio linfático (pN1a) o múltiples ganglios linfáticos (pN1b); y ninguna metástasis distante (M0). El estadio IVA se caracteriza por extensión tumoral directamente al estómago, bazo, colon o vasos grandes adyacentes (T4); cualquier categoría N; y ninguna metástasis distante (M0). Finalmente, el estadio IVB se caracteriza por cualquier categoría T, cualquier categoría N y metástasis distante (M1). Misma referencia.
25 Una vez que se ha estadificado el cáncer, el único tratamiento uniformemente eficaz para la enfermedad es la cirugía, y siendo solamente del diez al quince por ciento de los pacientes capaces de someterse a resección potencialmente curativa. Jean et al, mencionado anteriormente en 15; Fleming et al. eds., mencionado anteriormente en 111; William F. Regine, Postoperative Adjuvant Therapy: Past, Present, and Future Triol Development, en Pancreatic Cancer 235 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002). Además, la supervivencia a cinco años de los pacientes que se someten a resección está por debajo del veinte por ciento. Regine, mencionado anteriormente en 235. Aunque agentes quimioterapéuticos tales como gemcitabina y 5-fluorouracilo han mostrado algo de eficacia contra carcinomas pancreáticos, la realidad es que la quimioterapia ha mostrado poca influencia en la supervivencia de cáncer pancreático. Burdette, mencionado anteriormente en 101. La radioterapia ha proporcionado resultados
35 conflictivos con respecto a su eficacia, misma referencia, aunque la radiación en combinación con 5-fluorouracilo ha mostrado algo de promesa, Regine, mencionado anteriormente en 235.
A la vista del fracaso de las técnicas convencionales en el tratamiento del cáncer pancreático, se han investigado varios enfoques nuevos que emplean las técnicas de biología molecular. Se ha realizado investigación considerable en el área de la terapia génica, incluyendo tecnología antisentido, estrategias de activación de profármacos dirigidas por genes, estrategias de genes promotores y terapias virales oncolíticas. Eugene A. Choi y Francis R. Spitz, Strategies for Gene Therapy, en Pancreatic Cancer 331 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002); Kasuya, H. et al, Hepatogastroenterology 48(40): 957-61 (2001). Otros enfoques recientes se han centrado en la inhibición de las metaloproteinasas de matriz, enzimas que facilitan la metástasis e invasión de células tumorales a través de su
45 degradación de membranas basales, y su papel en la degradación del estroma peritumoral y angiogénesis. Alexander S. Rosemurgy, II y Mahmudul Haq, Role of Matrix Metalloproteinase Inhibition in the Treatment of Pancreatic Cancer, en Pancreatic Cancer 369 (Douglas B. Evans et al eds., 2002).
Angiogénesis en cáncer
El crecimiento y la metástasis de tumores sólidos también dependen de la angiogénesis. Folkman, J., 1986, Cancer Research, 46, 467-473; Folkman, J., 1989, Journal of the National Cancer Institute, 82, 4-6. Se ha mostrado, por ejemplo, que los tumores que se agrandan hasta más de 2 mm deben obtener su propio aporte sanguíneo y lo hacen induciendo el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos capilares. Una vez que estos nuevos vasos
55 sanguíneos se incluyen en el tumor, estos proporcionan un medio para que las células tumorales entren en la circulación y se metastaticen a sitios distantes tales como hígado, pulmón o hueso. Weidner, N., et al, 1991, The New England Journal of Medicine, 324(1), 1-8.
La angiogénesis, definida como el crecimiento o brote de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos existentes, es un proceso complejo que sucede principalmente durante el desarrollo embrionario. El proceso es distinto de la vasculogénesis, por que las nuevas células endoteliales que revisten el vaso surgen de proliferación de células existentes, en lugar de diferenciarse de células madre. El proceso es invasivo y depende de la proteólisis de la matriz extracelular (ECM), migración de nuevas células endoteliales y síntesis de nuevos componentes de matriz. La angiogénesis se produce durante el desarrollo embrionario del sistema circulatorio; sin embargo, en humanos 65 adultos, la angiogénesis se produce solamente como respuesta a una condición patológica (excepto durante el ciclo
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reproductivo en mujeres).
En condiciones fisiológicas normales en adultos, la angiogénesis tiene lugar solamente en situaciones muy restringidas tales como crecimiento del pelo y curación de heridas. Auerbach, W. y Auerbach, R., 1994, Pharmacol 5 Ther. 63(3):265-3 11; Ribatti et al., 1991, Haematologica 76(4): 3 11-20; Risau, 1997, Nature 386(6626): 67 1-4. La angiogénesis progresa por un estímulo que da como resultado la formación de una columna de migración de células endoteliales. La actividad proteolítica se centra en la punta de avance de este “brote vascular”, que degrada la ECM lo suficiente para permitir que la columna de células se infiltre y migre. Detrás del frente de avance, las células endoteliales se diferencian y comienzan a adherirse entre sí, formando de este modo una nueva membrana basal.
10 Las células cesan después la proliferación y finalmente definen un lumen para la nueva arteriola o capilar.
Se ha reconocido gradualmente que la angiogénesis desregulada es responsable de una amplia serie de trastornos, incluyendo, pero sin limitación, cáncer, enfermedad cardiovascular, artritis reumatoide, psoriasis y retinopatía diabética. Folkman, 1995, Nat Med 1(1): 27-31; Isner, 1999, Circulation 99(13): 1653-5; Koch, 1998, Arthritis Rheum
15 41(6): 951-62; Walsh, 1999, Rheumatology (Oxford) 38(2): 103-12; Ware y Simons, 1997, Nat Med 3(2): 158-64.
Es de particular interés la observación de que se requiere angiogénesis por tumores sólidos para su crecimiento y metástasis. Folkman, 1986 mencionado anteriormente; Folkman 1990, J Natl. Cancer Inst, 82(1) 4-6; Folkman, 1992, Semin Cancer Biol 3(2): 65-71; Zetter, 1998, Annu Rey Med 49: 407-24. Un tumor comienza habitualmente como 20 una única célula aberrante que puede proliferar solamente hasta un tamaño de algunos milímetros cúbicos debido a la distancia de los lechos capilares disponibles, y puede permanecer “durmiente” sin crecimiento adicional ni diseminación durante un periodo largo de tiempo. Algunas células tumorales cambian después al fenotipo angiogénico para activar células endoteliales, que proliferan y maduran en nuevos vasos sanguíneos capilares. Estos vasos sanguíneos de nueva formación no solamente permiten el crecimiento continuado del tumor primario,
25 sino también la diseminación y recolonización de células tumorales metastásicas. Los mecanismos precisos que controlan el cambio angiogénico no se entienden bien, pero se cree que la neovascularización de la masa tumoral resulta del equilibrio neto de una multitud de estimuladores e inhibidores de angiogénesis Folkman, 1995, mencionado anteriormente.
30 Uno de los inhibidores de la angiogénesis más potentes es la endostatina identificada por O’Reilly y Folkman. O'Reilly et al., 1997, Cell 88(2): 277-85; O'Reilly et al., 1994, Cell 79(2): 3 15-28. Su descubrimiento se basó en el fenómeno de que ciertos tumores primarios pueden inhibir el crecimiento de metástasis distantes. O’Reilly y Folkman plantearon la hipótesis de que un tumor primario inicia la angiogénesis generando estimulantes angiogénicos en exceso de inhibidores. Sin embargo, los inhibidores angiogénicos, en virtud de su semivida más larga en circulación,
35 alcanzan el sitio de un tumor secundario en exceso de los estimuladores. El resultado neto es el crecimiento de tumor primario e inhibición de tumor secundario. La endostatina es uno de una lista creciente de dichos inhibidores de angiogénesis producidos por tumores primarios. Es un fragmento proteolítico de una proteína mayor: la endostatina es un fragmento de 20 kDa del colágeno XVIII (aminoácido H1132-K1315 en el colágeno XVIII murino). Se ha mostrado que la endostatina inhibe específicamente la proliferación de células endoteliales in vitro y bloquea
40 la angiogénesis in vivo. Lo que es más importante, la administración de endostatina a ratones portadores de tumor conduce a regresión tumoral significativa, y no se ha observado toxicidad o resistencia a fármacos incluso después de múltiples ciclos de tratamiento. Boehm et al., 1997, Nature 390(6658): 404-407. El hecho de que la endostatina se dirige a células endoteliales genéticamente estables e inhibe una diversidad de tumores sólidos la hace un candidato muy atractivo para terapia antineoplásica. Fidler y Ellis, 1994, Cell 79(2): 185-8; Gastl et al., 1997,
45 Oncology 54(3): 177-84; Hinsbergh et al., 1999, Ann Oncol 10 Supl 4: 60-3. Además, se ha mostrado que los inhibidores de angiogénesis son más eficaces cuando se combinan con radiación y agentes quimioterapéuticos. Klement, 2000, J. Clin Invest, 105(8) R15-24. Browder, 2000, Cancer Res. 6-(7) 1878-86, Arap et al., 1998, Science 279(5349): 377-80; Mauceri et al., 1998, Nature 394(6690): 287-91.
50 Como se ha analizado anteriormente, cada uno de los métodos para diagnóstico y estadificación de cáncer ovárico, pancreático, pulmonar o de mama está limitado por la tecnología empleada. En consecuencia, existe la necesidad de marcadores moleculares y celulares sensibles para la detección de cáncer ovárico, pancreático, pulmonar o de mama. Existe la necesidad de marcadores moleculares para la estadificación precisa, incluyendo estadificación clínica y patológica, de cánceres ováricos, pancreáticos, de pulmón o de mama para optimizar métodos de
55 tratamiento. Además, existe la necesidad de marcadores moleculares y celulares sensibles para controlar el progreso de tratamientos de cáncer, incluyendo marcadores que pueden detectar la reaparición de cánceres ováricos, pancreáticos, de pulmón o de mama después de remisión.
La presente invención proporciona métodos alternativos para tratar cáncer ovárico, pancreático, de pulmón o de
60 mama que superan las limitaciones de métodos terapéuticos convencionales así como ofrecen ventajas adicionales que resultarán evidentes a partir de la descripción detallada posterior.
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Descripción detallada de la invención
Definiciones y técnicas generales
5 “Ovr110” humano como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína de 282 aminoácidos que se expresa en la superficie celular como una glucoproteína, cuyas secuencias de nucleótidos y aminoácidos son como se desvela, por ejemplo, en el documento WO 00/12758, el gen específico de cáncer (CSG) Ovr110; documento WO 99/63088, la proteína unida a Membrana PRO1291; documento WO00/36107, antígeno de carcinoma ovárico Humano; documento WO 02/02624-A2, proteína de tipo B7 humana (B7-L). Ya que la proteína Ovr110 contiene un
10 péptido señal de secreción, los aminoácidos 30-282 se localizan en la superficie celular de la proteína madura nativa. Ovr110 como se usa en el presente documento incluye variantes alélicas y mutantes de sustitución conservativa de la proteína que tienen actividad biológica de Ovr110.
Ovr110 se conoce en la bibliografía como B7x, B7H4, B7S1, B7-H4 o B7h.5. La base de datos RefSeq en el NCBI
15 indica la referencia NM_024626 como “dominio de conjunto V de Homo sapiens que contiene inhibidor de la activación de linfocitos T 1 (VTCN1), ARNm”. Se proporciona el siguiente sumario para este nucleótido y la proteína codificada NP_078902.1:
B7H4 pertenece a la familia B7 (véase CD80; MIM 112203) de proteínas coestimuladoras. Estas proteínas se
20 expresan en la superficie de células presentadoras de antígeno e interaccionan con ligandos (por ejemplo, CD28; MIM 186760) en linfocitos T [proporcionado por OMIM].
Se enumera a continuación una lista de referencias que analizan Ovr110
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Un grupo de tres publicaciones independientes identificaron Ovr110 en ratón y ser humano como un nuevo miembro de la familia B7 de linfocitos T de moléculas coestimuladoras, una clase importante de moléculas que regulan muy estrechamente la activación/inhibición de la función de linfocitos T. Prasad et al, B7S1, a novel B7 family member 5 that negatively regulates T cell activation, Immunity 18: 863-73 (2003); Sica et al., B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulates T cell immunity, Immunity 18: 849-61 (2003); y Zang et al, B7x: a widely expressed B7 family member that inhibits T cell activation, Proc. Nati Acad. Sci USA 100: 10388-92 (2003). La secuencia de aminoácidos predicha del gen de ratón para B7S1 (Prasad 2003) fue altamente homóloga con la molécula Ovr110 previamente identificada por los inventores, y la secuencia predicha de las moléculas de B7-H4/B7x humanas (Sica 10 2003; Zang 2003) fueron idénticas a Ovr110. Publicaciones adicionales han demostrado la sobreexpresión de B7-H4 en diversos cánceres incluyendo cáncer de mama (Tringer 2005; Salceda 2005), cáncer ovárico (Salceda 2005; Tringer 2006, Simon 2006, Kryczek J Exp Med 2006; Bignotti 2006), cáncer de pulmón (Sun 2006) y carcinoma de células renales (Krambeck 2006; Chen 2006). Estudios funcionales han dilucidado adicionalmente la asociación de B7-H4 con poblaciones de macrófagos supresores (Kryczek J Exp Med 2006), vascularización tumoral (Krambeck
15 2006) e inmunorregulación incluyendo producción del factor de interleucina y la activación de linfocitos T, proliferación e infiltración tumoral (Mao 2006; Kryczek J Immunol 2006).
Se han generado previamente y se han caracterizado anticuerpos anti Ovr110 que se describen en los documentos WO 2004/101756, WO 2006/053110 y WO2006/074418. El análisis inmunofluorescente directo por citometría de
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contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan con restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseadas. En
5 algunos casos, los restos de región marco conservada (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596(1992).
15 Como se usa en el presente documento, un anticuerpo anti Ovr110 que “se internaliza” es uno que se capta por (es decir, entra en) la célula tras la unión con Ovr110 en una célula de mamífero (es decir Ovr110 de superficie celular). El anticuerpo internalizante incluirá por supuesto fragmentos de anticuerpo, anticuerpo humano o humanizado y conjugado de anticuerpo. Para aplicaciones terapéuticas, se contempla la internalización in vivo. El número de moléculas de anticuerpo internalizadas será suficiente o adecuado para destruir una célula que expresa Ovr110, especialmente una célula cancerosa que expresa Ovr110. Dependiendo de la potencia del anticuerpo o conjugado de anticuerpo, en algunos casos, la captación de una única molécula de anticuerpo en la célula es suficiente para destruir la célula diana con la que se une el anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas son altamente potentes en la destrucción de modo que la internalización de una molécula de la toxina conjugada con el anticuerpo sea suficiente
25 para destruir la célula tumoral.
Si un anticuerpo anti Ovr110 se internaliza tras la unión de Ovr110 en una célula de mamífero, puede determinarse por diversos ensayos incluyendo los descritos en los ejemplos experimentales posteriores. Por ejemplo, para ensayar la internalización in vivo, el anticuerpo de ensayo se marca e introduce en un animal que se sabe que tiene Ovr110 expresado en la superficie de ciertas células. El anticuerpo puede radiomarcarse o marcarse con partículas fluorescentes o de oro, por ejemplo. Los animales adecuados para este ensayo incluyen un mamífero tal como un ratón desnudo o un ratón SCID que contiene un trasplante o xenoinjerto de tumor que expresa Ovr110 humano, o un ratón en el que se han introducido células transfectadas con Ovr110 humano, o un ratón transgénico que expresa el transgén de Ovr110 humano. Los controles apropiados incluyen animales que no recibieron el anticuerpo de ensayo 35 o que recibieron un anticuerpo no relacionado, y los animales que recibieron un anticuerpo para otro antígeno en las células de interés, conociéndose que dicho anticuerpo se internaliza tras su unión con el antígeno. El anticuerpo puede administrarse al animal, por ejemplo, mediante inyección intravenosa o inyección intraperitoneal. A intervalos temporales adecuados, pueden prepararse secciones del tumor o tejido del animal usando métodos conocidos o como se describen en los ejemplos experimentales posteriores, y analizarse por microscopía óptica o microscopía electrónica, con respecto a unión o internalización así como la localización del anticuerpo internalizado en la célula. También pueden usarse métodos de captura de imágenes de animales vivos tales como PET para demostrar la localización de los anticuerpos en el tumor. Para internalización in vitro, las células pueden incubarse en placas de cultivo tisular en presencia o ausencia de los anticuerpos relevantes añadidos al medio de cultivo y procesarse para análisis microscópico en puntos temporales deseados. La presencia de un anticuerpo internalizado, marcado en las 45 células puede visualizarse directamente por microscopía o por autorradiografía si se usa un anticuerpo radiomarcado. Como alternativa, en un ensayo bioquímico cuantitativo, una población de células que comprenden células que expresan Ovr110 se ponen en contacto in vitro o in vivo con un anticuerpo de ensayo radiomarcado y las células (si se pone en contacto in vivo, las células se aíslan después tras una cantidad de tiempo adecuada) se tratan con una proteasa o se someten a un lavado ácido para retirar el anticuerpo no internalizado en la superficie celular. Las células se muelen y se mide la cantidad de recuentos radiactivos, resistentes a proteasa, por minuto (cpm) asociados con cada lote de células pasando el homogeneizado a través de un contador de centelleo. Basándose en la actividad específica conocida del anticuerpo radiomarcado, el número de moléculas de anticuerpo internalizadas por célula puede deducirse a partir de los recuentos de centelleo de las células molidas. Las células se “ponen en contacto” con un anticuerpo in vitro preferentemente en forma de solución tal como añadiendo las
55 células al medio de cultivo celular en la placa de cultivo o matraz y mezclando el anticuerpo bien con el medio para asegurar una exposición uniforme de las células al anticuerpo. En lugar de añadir al medio de cultivo, las células pueden ponerse en contacto con el anticuerpo de ensayo en una solución isotónica tal como PBS en un tubo de ensayo durante el periodo de tiempo deseado. In vivo, las células se ponen en contacto con anticuerpo por cualquier método adecuado para administrar el anticuerpo de ensayo tal como los métodos de administración descritos posteriormente cuando se administran a un paciente.
Cuanto más rápida sea la velocidad de internalización del anticuerpo tras la unión con la célula que expresa Ovr110 in vivo, más rápido podrá conseguirse el efecto inhibidor de crecimiento o de destrucción deseado en la célula que expresa Ovr110 diana, por ejemplo, por un inmunoconjugado citotóxico. Preferentemente, la cinética de 65 internalización de los anticuerpos anti Ovr110 es tal que favorece la destrucción rápida de la célula diana que
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expresa Ovr110. Por lo tanto, es deseable que el anticuerpo anti Ovr110 muestre una velocidad de internalización rápida preferentemente, en un periodo de 24 horas desde la administración del anticuerpo in vivo, más preferentemente en un periodo de aproximadamente 12 horas, incluso más preferentemente en un periodo de aproximadamente 30 minutos a 1 hora y, más preferentemente, en un periodo de aproximadamente 30 minutos. La
5 presente invención proporciona anticuerpos que se internalizan tan rápido como aproximadamente 15 minutos desde el momento de introducir el anticuerpo anti Ovr110 in vivo o in vitro. El anticuerpo se internalizará preferentemente en la célula en un periodo de algunas horas tras la unión con Ovr110 en la superficie celular, preferentemente en un periodo de 1 hora, aún más preferentemente en un periodo de 15-30 minutos.
Para determinar si un anticuerpo de ensayo puede competir con respecto a la unión con el mismo epítopo que el epítopo con el que se unen los anticuerpos anti Ovr110 de la presente invención incluyendo los anticuerpos producidos por los hibridomas depositados en la ATCC, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado, por ejemplo, un ensayo de ELISA competitivo. En un ensayo de ELISA competitivo ejemplar, los pocillos recubiertos con Ovr110 de una placa de microtitulación, o perlas de sepharose recubiertas con Ovr110, se preincuban con o sin
15 anticuerpo competidor candidato y después se añade un anticuerpo anti Ovr110 marcado con biotina de la invención. La cantidad de anticuerpo anti Ovr110 marcado unido con el antígeno Ovr110 en los pocillos o en las perlas se mide usando conjugado de avidina-peroxidasa y sustrato apropiado.
Como alternativa, el anticuerpo anti Ovr110 puede marcarse, por ejemplo, con un marcador radiactivo o fluorescente
o algún otro marcador detectable y medible. La cantidad de anticuerpo anti Ovr110 marcado que se une con el antígeno tendrá una correlación inversa con la capacidad del anticuerpo competidor candidato (anticuerpo de ensayo) para competir con respecto a la unión con el mismo epítopo en el antígeno, es decir, cuanto mayor sea la afinidad del anticuerpo de ensayo por el mismo epítopo, menos anticuerpo anti Ovr110 marcado se unirá con los pocillos recubiertos con antígeno. Un anticuerpo competidor candidato se considera un anticuerpo que se une
25 sustancialmente con el mismo epítopo o que compite por la unión con el mismo epítopo que un anticuerpo anti Ovr110 de la invención si el anticuerpo competidor candidato puede bloquear la unión del anticuerpo anti Ovr110 en al menos 20 %, preferentemente en al menos 20-50 %, aún más preferentemente, en al menos 50 % en comparación con un control realizado en paralelo en ausencia del anticuerpo competidor candidato (pero puede estar en presencia de un anticuerpo no competidor conocido). Se entenderá que pueden realizarse variaciones de este ensayo para llegar al mismo valor cuantitativo.
Un anticuerpo que tiene una “característica biológica” de un anticuerpo designado, tal como cualquiera de los anticuerpos monoclonales Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (previamente identificado como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A 99.1, 35 Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1, Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1,Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2, Ovr110.J3, Ovr110.Q1, Ovr110.Q3, Ovr110.Q4, Ovr110.Q5, Ovr110.Q6, Ovr110.Q7, Ovr110.Q8, Ovr110.Q9, Ovr110.Q10, Ovr110.Q11, Ovr110.Q12, Ovr110.Q13, Ovr110.Q14, Ovr110.Q15, Ovr110.Q16, Ovr110.Q17, Ovr110.Q18, Ovr110.Q19, Ovr110.Q20, Ovr110.Q21, Ovr110.Q23, Ovr110.Q24, Ovr110.Q25, Ovr110.Q26 y Ovr110.Q27 es uno que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que lo distingue de otros anticuerpos que se unen con el mismo antígeno, Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, 45 Ovr110.A72.1 (previamente identificado como Ovr110 A22.1), Ovr110-A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A 99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11,1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovir110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2, Ovr110.J3, Ovr110.Q1, Ovr110.Q3, Ovr110.Q4, Ovr110.Q5, Ovr110.Q6, Ovr110.Q7, Ovr110.Q8, Ovr110.Q9, Ovr110.Q10, Ovr110.Q11, Ovr110.Q12, Ovr110.Q13, Ovr110.Q14, Ovr110.Q15, Ovr110.Q16, Ovr110.Q17, Ovr110.Q18, Ovr110.Q19, Ovr110.Q20, Ovr110.Q21, Ovr110.Q23, Ovr110.Q24, Ovr110.Q25, Ovr110.Q26 y Ovr110.Q27 se unirá con el mismo epítopo que con el que se une Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, 55 Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (previamente identificado como Ovr110 A22.1), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1, Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2, Ovr110.J3, Ovr110.Q1, Ovr110.Q3, Ovr110.Q4, Ovr110.Q5, Ovr110.Q6, Ovr110.Q7, Ovr110.Q8, Ovr110.Q9, Ovr110.Q10, Ovr110.Q11, Ovr110.Q12, Ovr110.Q13, Ovr110.Q14, Ovr110.Q15, Ovr110.Q16, Ovr110.Q17, Ovr110.Q18, Ovr110.Q19, Ovr110.Q20, Ovr110.Q21, Ovr110.Q23, Ovr110.Q24, Ovr110.Q25, Ovr110.Q26 y Ovr110.Q27 (por ejemplo que compite por la unión o bloquea la unión del anticuerpo monoclonal 65 Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (previamente identificado
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fagocitosis; regulación negativa de receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.
“Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en
5 la que Ig secretado unido en receptores de Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo linfocitos Citolíticos Naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente con una célula diana portadora de antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos “arman” las células citotóxicas y se requieren de forma absoluta para dicha destrucción. Las células primarias para mediar en ADCC, linfocitos NK, expresan solamente FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resumen en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos Citolíticos Naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad
15 de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).
“Receptor de Fc” o “FcR” describe un receptor que se une con la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une con un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un “receptor activador”) y FcγRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activador FcγRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de
25 inhibición basado en tirosina inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático (véase revisión M. en Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Se revisan FcR en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126.330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifican en el futuro, están abarcados por el término “FcR” en el presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia, de IgG maternos al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).
Las “células efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FcγRIII y realizan función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos
35 citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; prefiriéndose las PBMC y los linfocitos NK. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo de sangre.
“Citotoxicidad dependiente de complemento” o “CDC” se refiere a la lisis de una célula diana en presencia de complemento. La activación de la ruta del complemento clásica se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) con anticuerpos (de la subclase apropiada) que se unen con su antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se
45 caracterizan típicamente por crecimiento celular desregulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Más ejemplos particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer del cuello uterino, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peneano, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de linfocitos B, cáncer cerebral, así como de
55 cabeza y cuello, y metástasis asociadas.
Una “célula que expresa Ovr110” es una célula que expresa Ovr110 endógeno o transfectado en la superficie celular. Un “cáncer que expresa Ovr110” es un cáncer que comprende células que tienen proteína Ovr110 presente en la superficie celular. Un “cáncer que expresa Ovr110” produce suficientes niveles de Ovr110 en la superficie de células del mismo, de modo que un anticuerpo anti Ovr110 puede unirse con las mismas y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Un cáncer que “sobreexpresa” Ovr110 es uno que tiene niveles significativamente mayores de Ovr110 en la superficie celular del mismo, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo tisular. Dicha sobreexpresión puede estar provocada por amplificación génica o por transcripción o traducción aumentada. La sobreexpresión de Ovr110 puede determinarse en un ensayo de 65 diagnóstico o pronóstico evaluando niveles aumentados de la proteína Ovr110 presente en la superficie de una
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célula (por ejemplo mediante un ensayo inmunohistoquímico; análisis de FACS). Como alternativa, o adicionalmente, se pueden medir los niveles de ácido nucleico o ARNm que codifica Ovr110 en la célula, por ejemplo mediante técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH; véase documento WO98/45479 publicado en octubre de 1998), transferencia de Southern, transferencia de Northern o reacción en cadena de la polimerasa 5 (PCR), tal como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR). Se puede estudiar también la sobreexpresión de Ovr110 midiendo el antígeno en un fluido biológico tal como suero, por ejemplo, usando ensayos basados en anticuerpos (véase también, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.933.294 expedida el 12 de junio de 1990; documento WO91/05264 publicado el 18 de abril de 1991; Patente de Estados Unidos 5.401.638 expedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Aparte de los ensayos anteriores, están disponibles diversos ensayos in vivo para el experto en la materia. Por ejemplo, se pueden exponer células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que está opcionalmente marcado con un marcador detectable, por ejemplo un isótopo radiactivo, y puede evaluarse la unión de anticuerpo con células en el paciente, por ejemplo mediante exploración externa con respecto a radiactividad o analizando una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo. Un cáncer que expresa Ovr110 incluye cáncer ovárico, pancreático, endometrial, de cabeza y cuello, de
15 riñón, de pulmón o de mama. Los fluidos corporales incluyen todos los fluidos internos, secretados, expulsados y derivados del cuerpo tales como sangre, plasma, suero, orina, saliva, esputo, lágrimas, líquido ascítico, fluido de lavado peritoneal, fluido linfático, bilis, semen, pus, líquido Amniótico, humor Acuoso, Cerumen, Quilo, Quimo, fluido Intersticial, Menstruación, Leche, Moco, Fluido pleural, sudor, Lubricación vaginal, vómito, líquido cefalorraquídeo y líquido sinovial.
Un “mamífero” para fines de tratar un cáncer o aliviar los síntomas del cáncer, se refiere a cualquier mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.
25 “Tratar” o “tratamiento” o “alivio” se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en los que el objeto es prevenir o ralentizar (reducir) la afección o el trastorno patológico diana. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como los propensos a tener el trastorno o en los que el trastorno se debe prevenir. Un sujeto o mamífero se “trata” con éxito para un cáncer que expresa Ovr110 si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo anti Ovr110 de acuerdo con los métodos de la presente invención, el paciente muestra una reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más de los siguientes: reducción del número de células cancerosas o ausencia de las células cancerosas; reducción del tamaño tumoral; inhibición (es decir, ralentización en algún grado y preferentemente detención) de la infiltración de células cancerosas a órganos periféricos incluyendo la propagación del cáncer a tejido blando y hueso; inhibición (es decir,
35 ralentización en algún grado y preferentemente detención) de metástasis tumoral o angiogénesis; inhibición, en algún grado, del crecimiento tumoral; y/o alivio en algún grado, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; morbilidad y mortalidad reducidas, y mejora en asuntos de calidad de vida. En la medida en que el anticuerpo anti Ovr110 puede prevenir el crecimiento de y/o destruir células cancerosas existentes, este puede ser citostático y/o citotóxico. El paciente también puede notar la reducción de estas señales o síntomas.
Los parámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora en la enfermedad son fácilmente medibles por procedimientos rutinarios con los que está familiarizado un médico. Para terapia de cáncer, puede medirse la eficacia, por ejemplo, evaluando el tiempo de progresión a enfermedad (TTP) y/o determinando la velocidad de respuesta (RR).
45 La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un anticuerpo o un fármaco eficaz para “tratar” una enfermedad o trastorno de un sujeto o mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño tumoral; inhibir (es decir, ralentizar en algún grado y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en algún grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en algún grado, el crecimiento tumoral y/o aliviar el algún grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Véase la definición precedente de “tratar”. En la medida en que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, este puede ser citostático y/o citotóxico.
55 La administración “crónica” se refiere a la administración del agente o los agentes en un modo continuo a diferencia de un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un periodo de tiempo prolongado.
La administración “intermitente” es un tratamiento que no se realiza de forma consecutiva sin interrupción, sino que es de naturaleza cíclica.
La administración “en combinación con” uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
Los “vehículos” como se usa en el presente documento incluyen vehículos, excipientes o estabilizadores 65 farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o mamífero que se expone a los mismos a las
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por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascíticos en un animal, por ejemplo, mediante inyección i.p. de las células en ratones.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan convenientemente del medio de cultivo,
5 líquido ascítico, o suero por procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando proteína A o proteína G-sepharose) o cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc.
Se aísla fácilmente ADN que codifica los anticuerpos monoclonales y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente con genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma actúan como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transforman o transfectan en células hospedadoras procariotas o eucariotas tales como, por ejemplo, células de E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) o células de mieloma, que no
15 producen de otro modo proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Los artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5: 256-262 (1993) y Phuckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).
Además, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por redistribución de cadenas (Marks et al.,
25 Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales.
El ADN que codifica el anticuerpo puede modificarse para producir polipéptidos de anticuerpo quiméricos o de fusión, por ejemplo, sustituyendo con secuencias de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera humanas (CH y CL) las secuencias murinas homólogas (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; y Morrison, et al, Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos, 81: 6851 (1984)), o fusionando la secuencia codificante de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no de inmunoglobulina (polipéptido heterólogo). Las secuencias
35 polipeptídicas no de inmunoglobulina pueden sustituir los dominios constantes de un anticuerpo, o pueden sustituir los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación con antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.
Anticuerpos humanizados
Se han descrito en la técnica métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en el de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se denominan con frecuencia restos “de importación”, que se toman típicamente
45 de un dominio variable “de importación”. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo con secuencias de región hipervariable las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567) en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos restos de región hipervariable y posiblemente algunos restos de FR se sustituyen por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
55 La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la respuesta HAMA (de anticuerpo humano anti ratón) cuando se pretende que el anticuerpo sea para uso terapéutico humano. De acuerdo con el denominado método de “mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se explora frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia de dominio V humana que es más cercana a la del roedor se identifica y la región marco conservada humana (FR) dentro de ella se acepta para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol.,
196: 901 (1987)). Otro método usa una región marco conservada particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco conservado puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
65 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
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Es importante además que los anticuerpos se humanicen con conservación de la afinidad de alta unión por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parental y humanizada.
5 Están disponibles habitualmente modelos de inmunoglobulina tridimensionales y los expertos en la materia están familiarizados con ellos.
Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidata seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse con su antígeno. De esta manera, pueden seleccionarse restos FR y combinarse a partir de las secuencias receptoras y de importación de modo que se consiga la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad aumentada por el antígeno o los antígenos diana. En general, los restos de región hipervariable están indicados
15 directamente y más sustancialmente en la influencia sobre la unión a antígeno.
Se contemplan diversas formas de un anticuerpo anti Ovr110 humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos para generar un inmunoconjugado. Como alternativa, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.
Anticuerpos humanos
Como alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, es posible ahora
25 producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras su inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de región de unión a cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes de línea germinal y quimérica da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); Patente de Estados Unidos Nº 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; y, como alternativa, puede usarse tecnología de presentación en fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y
35 fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominios V de anticuerpo se clonan en fase en un gen de proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenaria del genoma de fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita algunas de las propiedades del linfocito B. Puede realizarse presentación en fagos en una diversidad de formatos, revisados en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de segmentos génicos V para presentación en fagos. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) aislaron una serie
45 diversa de anticuerpos anti oxazolona a partir de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos para una serie diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas en Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Véase, también, Patente de Estados Unidos Nº 5.565.332 y 5.573.905. Como se ha analizado anteriormente, también pueden generarse anticuerpos humanos mediante linfocitos B activados in vitro (véase Patentes de Estados Unidos Nº 5.567.610 y 5.229.275).
Fragmentos de anticuerpo
55 En ciertas circunstancias el uso de fragmentos de anticuerpo, en lugar de anticuerpos completos, tiene ventajas. El menor tamaño de los fragmentos permite una eliminación rápida, y puede conducir a un acceso mejorado a tumores sólidos. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente por células hospedadoras recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv pueden expresarse todos en y secretarse de E. coli, permitiendo de este modo la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpo analizadas anteriormente. Como alternativa, pueden recuperarse fragmentos Fab’-SH directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos
65 F(ab)2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, pueden aislarse fragmentos
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Original
Sustituciones Ejemplares Sustituciones Preferidas
Cys (C)
ser; ala ser
Gln (Q)
asn; glu asn
Glu (E)
asp; gln asp
Gly (G)
ala ala
His (H)
asn; gln; lys; arg arg
Ile (I)
leu; val; met; ala; phe; leu
Leu (L)
norleucina; ile; val; met; ala; ile
Lys (K)
arg; gin; asn arg
Met (M)
leu; phe; ile leu
Phe (F)
leu; val; ile; ala; tyr tyr
Pro (P)
ala ala
Ser (S)
thr thr
Thr (T)
ser ser
Trp (W)
tyr; phe tyr
Tyr (Y)
trp; phe; thr; ser Phe
Val (V)
ile; leu; met; phe; ala; leu
Se consiguen modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la
5 carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) restos que influyen en la orientación de cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
10 Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo anti Ovr110 también puede sustituirse, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar el entrecruzamiento aberrante. Por el contrario, pueden añadirse un enlace o enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento
15 Fv).
Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o las variantes resultantes seleccionadas para desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación con el 20 anticuerpo parental del que se generan. Un modo conveniente para generar dichas variantes de sustitución implica maduración de afinidad usando presentación en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de región hipervariable (por ejemplo 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de este modo se presentan de una manera monovalente de partículas de fago filamentoso como fusiones con el producto del gen III de MI3 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes presentadas 25 en fagos se exploran después con respecto a su actividad biológica (por ejemplo afinidad de unión) como se desvela en el presente documento. Para identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, puede realizarse mutagénesis de exploración de alanina para identificar restos de región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Como alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y
30 Ovr110 humano. Dichos restos de contacto y restos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas desarrolladas en el presente documento. Una vez que se han generado dichas variantes, el panel de variantes se somete a exploración como se ha descrito en el presente documento y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo adicional.
35 Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Por alterar se entiende suprimir uno o más restos de carbohidratos hallados en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de anticuerpos es típicamente ligada a N
o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto de carbohidrato con la cadena lateral de un resto de
asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier 40 aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática del resto de carbohidrato
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Otros agentes citotóxicos
Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos anti Ovr110 de la invención incluyen BCNU, estreptozocina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL
5 E33288 descrita en las patentes de Estados Unidos 5.053.394, 5.770.710, así como esperamicinas (patente de Estados Unidos 5.877.296). Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, 15 fragmentos activos no de unión de la toxina diftérica, cadena A de exotoxinas (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa, DNasa).
15 Para destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Una diversidad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de anticuerpos anti Ovr110 radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, In111, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para diagnóstico, puede comprender un átomo radiactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo Tc99M o I123, o un marcador de espín para captura de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como captura de imágenes por resonancia magnética, irm), tal como yodo-123, yodo-131, indio111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los radiomarcadores u otros marcadores pueden incorporarse en el conjugado de maneras conocidas. Por ejemplo,
25 el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por síntesis de aminoácidos química usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Pueden unirse marcadores tales como Tc99M, I123, In111, Re186, Re188, mediante un resto de cisteína en el péptido. Puede unirse Itrio-90 mediante un resto de lisina. El método de IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) puede usarse para incorporar yodo. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
Pueden prepararse conjugados del anticuerpo y agente citotóxico usando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil (Nmaleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como
35 dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolieno 2,6 diisocianato), y compuestos de flúor bisactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil metildietilen triaminopentaacético marcado con carbono (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación de radinucleótido con el anticuerpo. Véase documento WO 94/11026. El enlazador puede ser un “enlazador escindible” que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil por ácido, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992); Patente de Estados Unidos Nº 5.208.020).
45 Como alternativa, puede prepararse una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti Ovr110 y agente citotóxico, por ejemplo mediante técnicas recombinantes o síntesis peptídica. El tramo de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos partes del conjugado bien adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
Además, el anticuerpo puede conjugarse con un “receptor” (tal como estreptavidina) para utilización en pre dirección tumoral en el que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de retirada de conjugado no unido de la circulación usando un agente de aclaramiento y después administración de un “ligando” (por ejemplo avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido).
55 Terapia profarmacológica mediada por enzima dependiente de anticuerpo (ADEPT)
Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en ADEPT conjugando el anticuerpo con una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase documento WO 81/01145) en un fármaco antineoplásico activo. Véase, por ejemplo, documento WO 88/07378 y Patente de Estados Unidos Nº 4.975.278.
El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco de tal manera que lo convierta en su forma más activa, citotóxica. Las enzimas que son útiles en el
65 método de la presente invención incluyen, pero sin limitación, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que
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Se transforman células hospedadoras con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para producción de anticuerpo anti Ovr110 y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
5 Cultivo de células hospedadoras
Las células hospedadoras usadas para producir el anticuerpo anti Ovr110 de la presente invención pueden cultivarse en una diversidad de medios. Medios disponibles en el mercado tales como FIO de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Además, puede usarse cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patente de Estados Unidos Nº 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o Patentes de Estados Unidos Re. 30.985 como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina,
15 transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que se conocerán por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las previamente usadas con la célula hospedadora seleccionada para expresión, y resultará evidente para el experto habitual en la materia.
Purificación de anticuerpo anti Ovr110
25 Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse de forma intracelular, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio. Si el anticuerpo se produce de forma intracelular, como una primera etapa, los residuos en partículas, bien células hospedadoras o bien fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, se descongela la pasta celular en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los residuos celulares pueden retirarse por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión generalmente se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de
35 las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.
La composición de anticuerpos preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La conveniencia de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté preste en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas γ1, γ2 o γ4 humanas (Lindmark et al.,
J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para γ3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz con la que se une el ligando de afinidad es más
45 frecuentemente agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirendivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden conseguirse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N J) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparín SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SIDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo para recuperar.
Después de cualquier etapa o etapas de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés
55 y contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrófoba a pH bajo usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferentemente realizada a concentraciones salinas bajas (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25 M de sal).
Formulaciones farmacéuticas
Se preparan formulaciones farmacéuticas de los anticuerpos de acuerdo con la presente invención para almacenamiento mezclando un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol,
A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o 65 estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e
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También se describen kits que son útiles para diversos fines, por ejemplo, para ensayos de destrucción de células de Ovr110, para purificación o inmunoprecipitación de Ovr110 de células o para detectar la presencia de Ovr110 en una muestra de suero o detectar la presencia de células que expresan Ovr110 en una muestra de células. Para aislamiento y purificación de Ovr110, el kit puede contener un anticuerpo anti Ovr110 acoplado con un soporte 5 sólido, por ejemplo, una placa de cultivo tisular o perlas (por ejemplo, perlas de sepharose). Pueden proporcionarse kits que contienen los anticuerpos para detección y cuantificación de Ovr110 in vitro, por ejemplo en un ELISA o una transferencia de Western. Como con el artículo de fabricación, el kit comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo que comprende un anticuerpo de la presente invención. El kit puede comprender además una etiqueta o un prospecto en o asociado con el recipiente. Los kits pueden comprender componentes adicionales, 10 diluyentes y tampones, sustancias que se unen con los anticuerpos de la presente invención, por ejemplo, un segundo anticuerpo que puede comprender un marcador tal como los desvelados en el presente documento, por ejemplo, un radiomarcador, marcador fluorescente, o enzima, o el kit puede comprender también anticuerpos de control. Los componentes adicionales pueden estar dentro de recipientes separados dentro del kit. La etiqueta o el prospecto pueden proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el uso pretendido in
15 vitro o de diagnóstico.
Ejemplos
Ejemplo 1: producción y aislamiento de hibridomas productores de anticuerpo monoclonal
20 Los siguientes MAb/hibridomas de la presente invención se describen posteriormente: Ovr110.Q1, Ovr110.Q3, Ovr110.Q4, Ovr110.Q5, Ovr110.Q6, Ovr110.Q7, Ovr110.Q8, Ovr110.Q9, Ovr110.Q10, Ovr110.Q11, Ovr110.Q12, Ovr110.Q13, Ovr110.Q14, Ovr110.Q15, Ovr110.Q16, Ovr110.Q17, Ovr110.Q18, Ovr110.Q19, Ovr110.Q20, Ovr110.Q21, Ovr110.Q23, Ovr110.Q24, Ovr110.Q25, Ovil 10.Q26, Ovr110.Q27. Si el MAb se ha clonado, obtendrá
25 la nomenclatura “X.1”, por ejemplo, el primer clon de Ovr110.Q3 se denominará Q3.1, el segundo clon de Q3 se denominará Q3.2, etc. Para los fines de la presente invención, una referencia a Ovr110.Q3 o Q3 incluirá todos los clones, por ejemplo, Q3.1, Q3.2, etc.
Inmunógenos y antígenos
30 Para producción, exploración y caracterización de anticuerpos se prepararon diversas proteínas recombinantes, preparaciones de membrana y células transfectadas como se describe posteriormente.
Para las construcciones de Ovr110 descritas posteriormente, se insertaron moléculas de ácido nucleico que
35 codificaban regiones de Ovr110 en diversos vectores de expresión para producir proteínas recombinantes. Estas secuencias de ácido nucleico se aislaron usando cebadores, cuyo diseño es rutinario por un experto en la materia. En algunos casos, los cebadores usados se incluyen en las descripciones debajo de cada construcción.
Para fines de ilustración, la secuencia de aminoácidos predicha codificada por cada construcción también se incluye.
40 Sin embargo, las construcciones pueden incluir variantes de origen natural (por ejemplo variantes alélicas, SNP) dentro de la región Ovr110 como se aísla por los cebadores. Estas secuencias variantes, y anticuerpos que se unen con ellas se consideran parte de la invención como se describe en el presente documento.
Construcción 1 de Ovr110 (marcada con His)
45 Se insertó una molécula de ácido nucleico que codificaba la proteína Ovr110 de longitud completa, aminoácidos Met1 a Lys282, en un vector modificado que comprende una secuencia en el extremo 3’ de sitio de clonación que codifica dos aminoácidos transicionales, Ala y Ser, y un marcador de 6 His. El vector resultante con el fragmento de ácido nucleico de Ovr110 insertado codifica una proteína de fusión de Ovr110 recombinante con el marcador de 6
50 His fusionado con el extremo C terminal de la proteína Ovr110. Este plásmido recombinante que codifica la proteína marcada con His Ovr110 de longitud completa se denomina en el presente documento “Construcción 1 de Ovr110”. Una secuencia de aminoácidos representativa codificada por la Construcción 1 de Ovr110 se presenta en la SEC ID Nº: 51.
55 Secuencia de Aminoácidos de Construcción 1 de Ovr110 (SEC ID Nº: 51)
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La proteína Ovr110 expresada por la Construcción 1 se purificó en columna usando técnicas convencionales de 60 cultivo celular de células 293F transfectadas con Construcción 1. Se sometieron muestras de fracciones recogidas a
49
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añadieron a cada pocillo 133 l de tampón FACS y 67 l de paraformaldehído/DPBS al 1 %, para fijación, después el volumen se aumentó a 250 l con DPBS. Se analizaron células teñidas en un separador celular activado por fluorescencia Elite (FACS) (Beckman-Coulter).
5 La mayoría de los sobrenadantes de hibridoma reaccionaron fuertemente con células 293F transfectadas con Ovr110 y células tumorales positivas para Ovr110, y no mostraron unión o la mostraron débil con células negativas para Ovr110. Los anticuerpos para ricina que no se localizan en la superficie celular y CD71 que se localiza en la superficie celular actuaron como controles negativo y positivo, respectivamente. Se muestran los resultados de la tinción de superficie celular en las tablas 1 y 2.
Tabla 1. Tinción de superficie celular de células que expresan Ovr110 con sobrenadantes de hibridoma
Células 293F transfectadas con Ovr110
Células 293F no transfectadas
Muestra
% de Células Positivas Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) % de Células Positivas Intensidad de Fluorescencia Media (IFM)
Anti Ricina
1,6 0,297 0,9 0,278
Anti-CD71
97,9 9,15 95 4,21
Ovr110.Q1
96,2 23,3 1,1 0,29
Ovr110.Q3
95,3 13,6 1 0,287
Ovr110.Q4
89,8 8,32 1,7 0,311
Ovr110.Q5
84,6 4,89 0,8 0,273
Ovr110.Q6
97,4 7,12 71,1 1,27
Ovr110.Q7
27 1,02
Ovr110.Q8
2,5 0,331
Ovr110.Q9
84,3 1,96 83,5 1,72
Ovr110.Q10
1,8 0,317
Ovr110.Q11
95,7 26 0,7 0,282
Ovr110.Q12
96,6 31,8 0,8 0,29
Ovr110.Q13
2,1 0,316
Ovr110.Q14
97 28,2 1,6 0,326
Ovr110.Q15
97,3 32,9 0,8 0,277
Ovr110.Q16
22,2 0,49
Ovr110.Q17
97,5 30,5 0,8 0,296
Ovr110.Q18
3,9 0,341
Ovr110.Q19
95,7 24,5 1,2 0,309
Ovr110.Q20
99,8 12,9 1,2 0,293
Ovr110.Q21
18,7 0,45
Ovr110.Q23
94,7 17,9 0,6 0,296
Ovr110.Q24
3,2 0,36
Ovr110.Q25
96,8 25,3 4 0,371
Ovr110.Q26
89,2 8,08 0,9 0,286
Ovr110.Q27
91,8 6,09 0,8 0,278
Tabla 2. Tinción de superficie celular de líneas celulares tumorales con sobrenadantes de hibridoma.
SKBR3
HeLa
Muestra
% de Células Positivas Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) % de Células Positivas Intensidad de Fluorescencia Media (IFM)
Anti Ricina
0,9 0,255 1,1 0,261
Anti-CD71
97,5 15,1 99,2 11,1
Ovr110.Q1
95,3 3,76 1 0,27
Ovr110.Q3
54,9 1,01 0,7 0,266
Ovr110.Q4
23,7 0,678 8,5 0,32
Ovr110.Q5
1,3 0,259
Ovr110.Q6
84,1 1,06 98,5 3,67
Ovr110.Q7
63,5 1,6 16,3 0,367
Ovr110.Q8
12,4 0,346 15 0,367
Ovr110.Q9
56,6 0,919 87,7 1,68
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SKBR3
HeLa
Muestra
% de Células Positivas Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) % de Células Positivas Intensidad de Fluorescencia Media (IFM)
Ovr110.Q10
4 0,289
Ovr110.Q11
98,7 9,71 0,6 0,25
Ovr110.Q12
98,8 12 4,2 0,295
Ovr110.Q13
42,8 0,945 76,8 1,44
Ovr110.Q14
97,3 5,82 12,9 0,348
Ovr110.Q15
98,6 10,5 0,8 0,253
Ovr110.Q16
4,5 0,288
Ovr110.Q17
97,4 6,67 0,6 0,253
Ovr110.Q18
18,6 0,649
Ovr110.Q19
98,9 10,4 8,1 0,328
Ovr110.Q20
79,6 1,18 97,9 4,49
Ovr110.Q21
7,9 0,325
Ovr110.Q23
97,1 4,35 3,4 0,303
Ovr110.Q24
44 0,916 82,3 1,82
Ovr110.Q25
97,4 4,95 24,5 0,815
Ovr110.Q26
8,3 0,314
Ovr110.Q27
87,7 1,48 1 0,265
Basándose en los datos de ELISA y experimentos de citometría de flujo, se seleccionaron los siguientes hibridomas para clonación de una única célula en placas de cultivo de 96 pocillos por clasificación celular (Coulter Elite): Q1, Q3, Q11, Q12, Q15, Q19, Q23 y Q27. Después de 2 semanas de cultivo, los sobrenadantes de hasta 3 clones de 5 hibridoma de cada hibridoma parental se ensayaron con respecto a tinción de células 293F transfectadas con Ovr110 por citometría de flujo. Los anticuerpos se purificaron a partir de sobrenadantes de clones seleccionados y se volvieron a analizar por tinción de células 293F transfectadas con Ovr110 y células tumorales. Se incluyeron como controles MAb anti Ovr110 C3.2 y C6.3 que se obtuvieron de ratones inmunizados con Ovr110 recombinante. La generación y caracterización de anticuerpos de Ovr110.C3.2 y Ovr110.C6.3 se ha descrito previamente en los
10 documentos PCT/US2004/014490 y PCT/US2005/040707. Los resultados se muestran en las tablas 3 y 4. Todos los MAb Q seleccionados reconocen proteína Ovr110 nativa en la membrana plasmática de células 293F transfectadas y en células tumorales. La intensidad de tinción de los MAb de serie Q, particularmente Q1.2, Q11.12.3, Q12.2, Q15.2, Q19.6, Q23.6 y Q27.4, demostró la unión con células vivas de células que expresaban Ovr110 (transfectadas y células tumorales positivas para Ovr110) que era igual o mayor que los MAb de control positivo C3.2 y C6.3.
15 Tabla 3. Tinción de superficie celular de células 293F transfectadas con Ovr110 con MAb purificados.
Células 293F transfectadas con Ovr110
Células 293F transfectadas con simulación
% de Células Positivas
IFM % de Células Positivas IFM
Anti-Ricina
1,1 0,27 0,9 0,292
Anti-CD71
98,4 10 91,6 5,1
C3.2
91,1 3,5 3,9 0,343
Q1.2
92,8 4,53 12,2 0,433
Q3.1
93,6 4,12 4,9 0,379
Q11.12.3
93,8 5,47 40,4 0,959
Q12.2
94,3 5,25 34,1 0,81
Q15.2
94,2 5,49 33,3 0,765
Q19.6
91,9 5,25 42 1
Q23.6
92,6 4,98 33,7 0,773
Q27.4
95,2 5,48 34 0,799
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    imagen2
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