JP6184695B2 - 多重特異性抗体、抗体アナログ、組成物、及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は2009年12月4日に出願された米国仮出願番号61/267006、及び2010年5月20日に出願された米国仮出願番号61/346566の優先権を主張し、これらの出願の両方が出典明記によってその全体が本明細書中に援用される。
本出願は、EFS−Web経由でASCII形式で送信された配列表を含み、その全体が本明細書に参考として援用される。2010年11月30日に作成された前記ASCII形式のコピーはP4377R1WO.txtと命名され、53,549バイトの大きさである。
少なくとも2つの異なるエピトープを結合する多重特異性抗体が提供される。天然型抗体(抗体アナログ)の構造変異体も与えられる。同様に与えられるのは様々な生物学的活性を持つ多重特異性抗体及び抗体アナログである。アゴニスト及びアンタゴニスト多特異性抗体、アゴニスト及びアンタゴニスト抗体の類似体が与えられる。治療および/または診断薬をコンジュゲートした多重特異性抗体及び抗体アナログもまた与えられるが、多重特異性抗体及び抗体アナログがそうした薬剤を欠いた多重特異性抗体及び抗体アナログと比較してインビボでの半減期を増加する薬剤とコンジュゲートしているためである。治療、研究、および診断における多重特異性抗体および抗体アナログの用途も与えられる。
本発明の所定の実施態様に対して参照が詳細に行われ、その例を添付の構造及び式で説明する。本発明を列挙する実施態様と併せて説明するが、それらは本発明をその実施態様に限定することを意図するものではないことは理解されよう。逆に、本発明は特許請求の範囲によって定まる本発明の範囲に含まれうるあらゆる代替例、変形例、及び均等物を包含することが意図される。
本明細書を理解するために、以下の定義を適用し、適切な場合にはいつでも、単数で使用した用語には複数形も含まれ、その逆もそうである。以下に示すいずれかの定義が出典明記によって本明細書中に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合、以下の定義が支配する。
抗体ヒンジ領域由来の1つ以上のシステインを含むCH1ドメインのカルボキシ末端に追加されたいくつかの残基を有することでFab断片とは異なる。Fab’−SHは本明細書では定常ドメインのシステイン残基(複数)が遊離のチオール基を有するFab’の呼称である。
典型的には、ワンアームド抗体の可変ドメインは抗原結合領域を形成する。ある場合にはワンアームド抗体の可変ドメインは単一可変ドメインであり、各単一可変ドメインは抗原結合領域である。
多重特異性抗体および抗体アナログ
本明細書において既述される二重特異性抗体を含む多重特異性抗体、及び抗体アナログを構築するため、少なくとも一つの遊離のスルフヒドリル基を有する抗体断片が得られた。抗体断片は上述の通り、システイン改変抗体を含む親抗体から得ることができる。親抗体は酵素的に切断されて抗体断片を生成し得る。例示的な酵素消化法は、限定されないが、ペプシン、パパインおよびLys-Cを含む。例示的な抗体断片は、限定されないが、
Fab、Fab’、F(ab')2、Fv、ダイアボディ(Db);タンデムダイアボディ(taDb)、直鎖状抗体(米国特許第5641870号、実施例2;Zapata ら、Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995));ワンアームド抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ(Olafsenら、(2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323)、単鎖抗体分子、Fab発現ライブラリーにより生成した断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、CDR(相補性決定領域)、及びエピトープ結合断片を含む。抗体断片はまた、前記抗体断片をコードするDNA断片として、プラスミド発現ベクター又はファージミドベクターへクローン化され、直接大腸菌で発現され得る。抗体の酵素的消化法、DNAのクローニング及び組換えタンパク質発現法は、当業者に良く知られ、例示的方法は本明細書にて与えられている。
システイン改変抗体は以前に既述されている。米国特許出願公開第2007/0092940号及びJunutula, J. R. ら、J Immunol Methods 332(1-2):41-52 (2008)。システイン改変抗体は親抗体となり得る。これらは、特定の場所に、典型的には定常領域(例えばCL又はCH1)に遊離のシステインを有する抗体断片を産生するために有用である。システインを含有するために改変された親抗体は、本明細書では「チオMab」と称され、及びそうしたシステイン改変抗体から生成されたFab断片は、生産方法によらず、本明細書では「チオMab」と称される。以前に既述されたように(米国特許出願公開第2007/0092940号、及びJunutula, J. R.ら、J Immunol Methods 332(1-2):41-52 [2008])、置換された(「改変された」)システイン(Cys)残基を持つ変異体は、新たに導入された改変システインチオール基の反応性について評価される。チオール反応性値は0から1.0の範囲の相対的な数値用語であり、任意のシステイン改変抗体について測定することができる。反応性チオール基を有することに加えて、チオMabはそれらが抗原結合能を保持するように選択されるべきである。システイン改変抗体の設計、選択、及び調製は以前に詳述されている。米国特許出願公開第2007/0092940号、及びJunutula, J. R.ら、J Immunol Methods 332(1-2):41-52 (2008)。
多重特異性抗体及び抗体アナログは、付加的な機能性部分が、多重特異性抗体及び抗体アナログに結合しうるように、修飾された架橋剤で合成することができる。修飾された架橋剤は任意のスルフヒドリル反応性部分の結合を可能とする。一実施態様において、N-サクシニミジル-S-アセチルチオアセテート(SATA)をビスマレイミドへ付着させ、ビスマレイミドアセチルチオアセテート(BMata)を形成する。マスクされたチオール基の脱保護の後に、スルフヒドリル反応性(又はチオール反応性)部分を有する任意の官能基が付着されうる。
出発ポリペプチドのアミノ酸配列改変体をコードするDNAは、当該分野で公知の様々な方法により調製される。これらの方法としては、ポリペプチドをコードする予め調製したDNAの、部位特異的(またはオリゴヌクレオチド媒介)変異誘発、PCR変異誘発およびカセット変異誘発による調製が挙げられるがこれらに限定されない。組換え抗体の改変体は、制限フラグメントの操作によって、または、合成オリゴヌクレオチドを用いた重複伸張PCRによっても構築され得る。変異誘発プライマーは、システインコドン置換をコードする。標準的な変異誘発技術は、このような変異体システイン操作抗体をコードするDNAを生成するために使用され得る。一般的なガイダンスは、Sambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;およびAusubelら,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley−Interscience,New York,N.Y.,1993に見出され得る。
システイン操作抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖をコードする遺伝子および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)容易に分離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの供給源として役立つ。一旦単離されると、このDNAは、発現ベクター内に配置され得、次いで、この発現ベクターは、トランスフェクションしなければ抗体タンパク質を生成しない宿主細胞(例えば、E.coli細胞、サルのCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または他の哺乳動物宿主細胞(例えば、骨髄腫細胞)(米国特許第5807715号;米国特許出願公開第2005/0048572号;米国特許出願公開第2004/0229310号))へとトランスフェクションされて、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が得られる。hu4D5Fabv8システイン改変抗体の収率は、野生型hu4D5Fabv8と類似していた。抗体をコードするDNAの細菌中での組換え発現に関する総説としては、Skerraら(1993)Curr.Opinion in Immunol.5:256−262およびPlueckthun(1992)Immunol.Rev.130:151−188が挙げられる。
カラムはグリセロールなどの試薬でコーティングさる。
本発明の多重特異性抗体及び抗体アナログは、遊離スルフヒドリル基を有する修飾架橋剤で特に合成されたものであり、反応性システインチオール基によって抗体に共有結合可能な任意の標識部分とコンジュゲートされ得る(Singhら(2002)Anal.Biochem.304:147−15;Harlow E.およびLane,D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification,第2版,CRC Press,Boca Raton,FL)。結合した標識は、以下のために機能し得る:(i)検出可能なシグナルを提供する;(ii)第2の標識と相互作用して、第1の標識または第2の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変して、例えば、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)を与える;(iii)抗原またはリガンドとの相互作用を安定化するかまたは結合親和性を増加させる;(iv)電荷、疎水性、形状または他の物理的パラメータによる移動性(例えば、電気泳動易動度または細胞浸透性)に影響を及ぼす;または(v)捕捉部分を提供して、リガンド親和性、抗体/抗原結合またはイオン性錯体形成を改変する。
(i)基質として水素ペルオキシダーゼを持つ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ここで、水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)または3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB))を酸化する;
(ii)発色基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェートを持つアルカリホスファターゼ(AP);および
(iii)発色基質(例えば、p−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシダーゼ)または蛍光発生性基質4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトシダーゼを持つβ−D−ガラクトシダーゼ(β−D−Gal)。
血漿タンパク質結合は、短命の分子の薬剤動態特性を改善する有効な手段であり得る。アルブミンは、血漿において最も豊富なタンパク質である。血清アルブミン結合性ペプチド(ABP)は、組織取り込み、浸透および拡散の変更を含め、融合した活性ドメインタンパク質の薬力学を変更し得る。これらの薬力学的パラメータは、適切な血清アルブミン結合性ペプチド配列の特異的選択により調節され得る(米国特許出願公開第20040001827号)。一連のアルブミン結合性ペプチドは、ファージディスプレイスクリーニングにより確認された(Dennisら(2002)「Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins」,J Biol Chem.277:35035−35043;国際公開第01/45746号)。本発明の化合物は、以下によって教示されるABP配列を含む:(i)Dennisら(2002)J Biol Chem.277:35035−35043,Tables IIIおよびIV,35038頁;(ii)米国特許出願公開第20040001827号,[0076],配列番号9〜22;および(iii)国際公開第01/45746号,12−13頁,配列番号z1〜z14。
本発明の多重特異性抗体及び抗体アナログ、特に遊離のスルフヒドリル基を有する修飾された架橋剤で合成されたものは、任意の治療的薬剤、すなわち反応性スルフヒドリル基を介して抗体に共有結合できる薬剤部分とコンジュゲートされ得る。
ここで、pは、1、2、3、または4である。チオール反応性リンカー部分を介して多重特異性抗体及び抗体アナログへと結合し得る薬剤部分の数は、本明細書に記載される方法によって導入される反応性チオールの数により制限される。
ここで、pは、1、2、3、または4である
抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)の薬剤部分(D)は、細胞傷害効果または細胞増殖抑制果を有する、任意の化合物、部分または基を含む。薬剤部分としては、以下が挙げられる:(i)化学療法剤(これは、マイクロチューブリンインヒビター、有糸分裂インヒビター、トポイソメラーゼインヒビターまたはDNAインターカレーターとして機能し得る)、(ii)タンパク質毒素(これは、酵素的に機能し得る)、および(iii)ラジオアイソトープ。
0000
式Iの抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)の薬剤部分(D)は、以下の構造を有するメイタンシノイドを含み、
ここで、破線はDの硫黄原子の抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)のリンカー(L)への共有結合を意味する。Rは独立にH、又は、メチル、エチル、1−プロピル、2−プロピル、1−ブチル、2−メチル−1−プロピル、2−ブチル、2−メチル−2−プロピル、1−ペンチル、2−ペンチル、3−ペンチル、2−メチル−2−ブチル、3−メチル−2−ブチル、3−メチル−1−ブチル、2−メチル−1−ブチル、1−ヘキシル、2−ヘキシル、3−ヘキシル、2−メチル−2−ペンチル、3−メチル−2−ペンチル、4−メチル−2−ペンチル、3−メチル−3−ペンチル、2−メチル−3−ペンチル、2,3−ジメチル−2−ブチル、及び3,3−ジメチル−2−ブチルから選択されるC1−C6アルキルでありうる。アミド基を硫黄原子へ結合するアルキレン鎖は、メタニル、エタニル、又はプロピルであり得、すなわちmは1、2、又は3である。
マイタンシノイド薬剤部分の例示的実施態様としては、以下の構造を有する、以下が挙げられる:DM1、(CR2)m=CH2CH2;DM3、(CR2)m=CH2CH2CH(CH3);およびDM4、(CR2)m=CH2CH2C(CH3)2:
「リンカー」(L)は、一又は複数の薬剤部分(D)と抗体ユニット(Ab)を連結させて、式Iの多重特異性抗体−薬剤コンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)を形成させるために用いられうる、二官能性部分又は多機能性部分である。ADCは、薬剤及び抗体への結合について反応性機能を有するリンカーを用いて簡便に調製されうる。抗体ユニット(Ab)は、リンカー試薬、薬剤部分又は薬剤-リンカー中間体の官能基と結合を形成することができる。
このとき、
−A−は、抗体(Ab)のシステインチオールに共有結合したストレッチャーユニットであり、
aは0又は1であり、
各々の−W−は、独立したアミノ酸ユニットであり、
wはそれぞれ、0から12の範囲の整数であり、
−Y−は、薬剤部分に共有結合したスペーサーユニットであり、そして、yは0、1又は2である
ストレッチャユニット(−A−)は、存在する場合には、抗体ユニットをアミノ酸ユニット(−W−)に連結することができる。この点に関しては、抗体(Ab)は、ストレッチャーの求電子性官能基と結合を形成することができる遊離のシステインチオール基又は他の遊離のチオール基を有する。この実施態様の代表的なストレッチャーユニットが式IIIaおよびIIIbの括弧内に示されており、このときAb、−W−、−Y−、−D、w及びyは前記に定義した通りであり、R17は、(CH2)r、C3−C8 カルボシクリル、O−(CH2)r、アリーレン、(CH2)r−アリーレン、−アリーレン−(CH2)r−、(CH2)r−(C3−C8 カルボシクリル)、(C3−C8 カルボシクリル)−(CH2)r、C3−C8 ヘテロシクリル、(CH2)r−(C3−C8 ヘテロシクリル)、−(C3−C8 ヘテロシクリル)−(CH2)r−、−(CH2)rC(O)NRb(CH2)r−、−(CH2CH2O)r−、−(CH2CH2O)r−CH2−、−(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r−、−(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r−CH2−、−(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r−、−(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r−CH2−、及び−(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r−から選択される二価のラジカルであり、RbはH、C1−C6アルキル、フェニル又はベンジルであり、そして、rは独立に、1から10の範囲の整数である。
図示する式IIIaのストレッチャーユニットは、R17が−(CH2)5−である、マレイミド−カプロイル(MC)から得られる。
図示する式IIIaのストレッチャーユニットは、R17が−(CH2)2−である、マレイミド−プロパノイル(MP)から得られる。
他の図示する式IIIaのストレッチャーユニットは、R17が−(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r−CH2−であり、RbがHであり、各々のrが2である。
他の図示する式IIIbのストレッチャーユニットは、R17が−(CH2)5−である。
リンカーはアミノ酸残基を含んでいてもよい。アミノ酸ユニット(−Ww−)は、存在する場合には、抗体(Ab)を本発明の抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)の薬剤部分(D)に連結する。
である。
スペーサユニット(−Yy−)は、存在する場合(y=1又は2)には、アミノ酸ユニットが存在する(w=1〜12)場合に、アミノ酸ユニット(−Ww−)を薬剤部分(D)に連結する。あるいは、アミノ酸ユニットがない場合には、スペーサーユニットはストレッチャーユニットを薬剤部分に連結する。アミノ酸ユニット及びストレッチャーユニットがともにない(w、y=0)場合には、スペーサーユニットも薬剤部分を抗体ユニットに連結する。スペーサーユニットは、2つの一般的な型のものである:自己犠牲型および非自己犠牲型。非自己犠牲型スペーサーユニットは、抗体−薬剤コンジュゲート又は薬剤部分−リンカーからアミノ酸ユニットが切断、特に酵素的に切断された後に、スペーサーユニットの一部ないしはすべてが薬剤部分に結合したままとなるものである。グリシン−グリシンスペーサーユニット又はグリシンスペーサーユニットを含むADCが腫瘍細胞関連プロテアーゼ、癌細胞関連プロテアーゼ又はリンパ球関連プロテアーゼによって酵素的に切断される場合、グリシン−グリシン−薬剤部分又はグリシン−薬剤部分がAb−Aa−Ww−から切断される。一実施態様では、独立した加水分解反応が標的細胞の中で起こり、グリシン−薬剤部分の結合が切断され、薬剤が遊離される。
このとき、Qは、−C1−C8アルキル、−O−(C1−C8アルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、mは0〜4の範囲の整数であり、そして、pは1から4の範囲である。
を有し、2-(4-アミノベンジリデン)プロパン1,3-ジオールデンドリマーユニットを含み(国際公開2004/043493号;de Groot等 (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42: 4490-4494)、Qは、−C1−C8アルキル、−O−(C1−C8アルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、mは0〜4の範囲の整数であり、nは0又は1であり、そして、pは1から4の範囲である。
他の実施態様では、リンカーLは、分岐状の、多機能リンカー部分により一又は複数の薬剤部分を抗体へと共有結合させるための樹状型のリンカーであり得る(Sun等 (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215;Sun等 (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹状リンカーは抗体に対する薬剤のモル比、すなわち負荷を増し、これはADCの力価に関連がある。したがって、抗体は1つの反応性チオール基のみを有する場合、多くの薬剤部分が樹状リンカーを介して結合され得る。
ここで、Qは、−C1−C8アルキル、−O−(C1−C8アルキル)、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり;そしてmは、0〜4の範囲の整数である;
が挙げられる。
が挙げられ、ここでXは:
であり、
Yは:
であり、
Rは、独立して、HまたはC1−C6アルキルであり;そして、nは、1〜12である。
が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、Xは、脱離基(例えば、O−メシル、O−トシル、−Cl、−Br、−I);またはマレイミドである。
ここで、nは1〜100の範囲の整数であり、Tは−H又は−SO3Naであり;
ここで、nは0〜3の範囲の整数であり;
を、アミノ酸単位のN末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得る。
を、アミノ酸単位のN末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得、上記式において、XはBrまたはIである。この式のストレッチャー単位はまた、以下の二官能性試薬:
を、アミノ酸単位のN末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得る。
を、アミノ酸単位のN末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得る。
のイソチオシアネートストレッチャーは、Angew.Chem.,(1975)87(14),517に記載されるようにして、イソチオシアナトカルボン酸クロリドから調製され得、上記式において、−R17−は、本明細書中に記載されるとおりである。
を有し、上記構造において、Qは、−C1−C8アルキル、−O−(C1−C8アルキル)、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり;そして、mは、0〜4の範囲の整数である。
を有し、上記構造において、Mtrは、モノ−4−メトキシトリチルであり、Qは、−C1−C8アルキル、−O−(C1−C8アルキル)、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり;そして、mは、0〜4の範囲の整数である。
が挙げられ、ここで、Valはバリンであり;Citはシトルリンであり;pは、1、2、3または4であり;そして、Abは、多重特異性抗体又は抗体アナログである。メイタンシノイド薬剤部分DM1が、BMPEOリンカーを介して、トラスツズマブのチオール基に連結された他の例示的な抗体薬剤コンジュゲートは、以下の構造:
を有し、上記構造において、Abは抗体であり;nは、0、1または2であり;そして、pは、1、2、3または4である。
式IのADCは、当業者に公知の有機化学反応、条件および試薬を用いて、いくつかの経路によって調製され得る:(1)共有結合を介して、抗体−リンカー中間体Ab−Lを形成するための、システイン改変された抗体のシステイン基のリンカー試薬との反応、その後の、活性化された薬剤部分Dとの反応;および(2)共有結合を介して、薬剤−リンカー中間体D−Lを形成するための、薬剤部分の求核性基のリンカー試薬との反応、その後の、システイン改変された抗体のシステイン基との反応。コンジュゲーションの方法(1)および(2)は、種々のシステイン改変された抗体、薬剤部分およびリンカーを用いて行われ、式Iの抗体−薬剤コンジュゲートを調製し得る。
一般に、抗体、例えば本発明の多重特異性抗体又は抗体アナログ、又は本発明の抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)の細胞毒性または細胞増殖抑制活性は、レセプタータンパク質(例えば、HER2)を有する哺乳動物細胞を、細胞培養培地中のADCの抗体に暴露し;約6時間〜約5日間のある期間にわたって細胞を培養し;そして、細胞の生存度を測定することによって測定される。細胞ベースのインビトロアッセイを用いて、本発明の多重特異性抗体、抗体アナログ又はADCの生存度(増殖)、細胞傷害性、およびアポトーシスの誘導(カスパーゼの活性化)を測定した。
本発明の多重特異性抗体、抗体アナログ又は抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)は処置されるべき状態に適した任意の経路で投与され得る。そのような抗体は、典型的には、非経口的に、すなわち、注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下腔および硬膜外に投与される。
本発明の治療用の多重特異性抗体、抗体アナログ又は抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)の薬学的処方物は、代表的に、非経口投与(すなわちボーラス注射、静脈内注射、腫瘍内注射)のために、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと共に、単位投薬注射可能形態で調製される。所望の程度の純度を有する多重特異性抗体、抗体アナログ、抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)は、必要に応じて、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤もしくは安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980)第16版,Osol,A.編)と、凍結乾燥処方物形態もしくは水溶液形態で混合される。
本明細書に記載された多重特異性抗体、抗体アナログ及びADCは治療的適用に用いられ得る。例えば、そのような抗体及び抗体断片及び抗体−薬剤コンジュゲートは、腫瘍(前癌性、非転移性、転移性、悪性腫瘍(例えば、早期癌)を含む)の処置、アレルギー性疾患または炎症性疾患の処置、又は自己免疫疾患の処置、又は癌(例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、腎細胞癌、神経膠腫、卵巣癌)、アレルギー性疾患又は炎症性疾患、又は自己免疫疾患を発症するリスクにある被検体の処置のために用いられ得る。
球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
本発明の多重特異性抗体、抗体アナログ、又は抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)は、例えば抗癌特性を有する第2化合物との、薬学的な併用処方物または併用療法としての投薬レジメンにおいて組み合わされ得る。その薬学的な併用処方物または投薬レジメンの第2化合物は、好ましくは、組み合わせのADCに対して補完的な活性を有するものであり、それらが互いに悪影響を及ぼさないものである。
本発明の多重特異性抗体及び抗体アナログにより標的にされ得る分子の例は、水溶性の血清タンパク質およびそれらのレセプター及び他の膜結合タンパク質(例えば、アドヘシン)を含むが、これらに限定されない。
April));TNFSF13B;TNFSF14(HVEM−L);TNFSF15(VEGI);TNFSF18;TNFSF4(OX40リガンド);TNFSF5(CD40リガンド);TNFSF6(FasL);TNFSF7(CD27リガンド);TNFSF8(CD30リガンド);TNFSF9(4−1BBリガンド);TOLLIP;Toll様レセプター;TOP2A(トポイソメラーゼ(topoisomerase)Ea);TP53;TPMl;TPM2;TRADD;TRAFl;TRAF2;TRAF3;TRAF4;TRAF5;TRAF6;TREMl;TREM2;TRPC6;TSLP;TWEAK;VEGF;VEGFB;VEGFC;バーシカン(versican);VHLC5;VLA−4;XCLl(リンホタクチン(lymphotactin));XCL2(SCM−Ib);XCRl(GPR5/CCXCRl);YYl;及びZFPM2。
代謝産物が先行技術に対して新規性及び非自明性を有する限りにおいて、本明細書中に記載のADC化合物のインビボ代謝産物も、本発明の権利内である。このような生成物は、投与された化合物の、例えば酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化、酵素切断などから生じうる。したがって、本発明は、代謝産物が生じるために十分な時間、本発明の化合物を哺乳動物と接触させることを含む方法によって生成される新規の自明でない化合物を包含する。
他の実施態様において、多重特異性抗体又は抗体は、放射性核種、蛍光色素、バイオルミネセンスを誘発する基質部分、化学発光を誘発する基質部分、酵素、及び診断用、薬剤動態用、治療用の用途によるイメージング実験のための他の検出標識を有する反応性チオールによって標識されてもよい。一般に、標識された多重特異性抗体又は標識された抗体アナログ、すなわち「バイオマーカー」又は「プローブ」は、注入、灌流又は経口摂取によって生きている生物体、例えばヒト、げっ歯動物、又は他の小動物、灌流される臓器、又は組織試料に投与される。プローブの分布は経時的に検出され、画像に表される。
他の実施態様では、上記の疾患の治療に有用な物質を具備する製造品又は「キット」が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ブリスター包装などが含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療するために有効な多重特異性抗体、抗体、抗体アナログ又はADC組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性薬剤は多重特異性抗体、抗体、抗体アナログ又はADCである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌などの選択された症状の治療に使用されることを示す。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
実施例1 チオFab及びヒンジ-cys-Fabの調製、タンパク質産生、及び二重特異性ビスFabの合成
チオFab及びヒンジ-cys-Fabの調製
続く反応で用いるために、幾つかのアプローチが、遊離スルフヒドリル基を持つ抗体断片を作製するために用いられた。一つのアプローチにおいて、以前にJunutulaら、J Immunol Methods 332(1-2): 41-52 (2008)に記載されたように、部位特異的変異によりチオMabを作製するために、軽鎖又は重鎖の定常ドメインの様々な位置にて、抗体コンストラクトに導入された。チオFabは25mMのTris中でチオMabを1mg/mLに希釈し、Lys−C(Wako Chemicals USA,Inc.,Richmond,VA)を用いて酵素の抗体に対する比率が1:1000において37℃で1時間酵素的に消化することで酵素的に産生された。Lyc−Cによる消化は5μMのプロテアーゼインヒビターのトシル−L−リジンクロロメチルケトン(TLCK)(Bachem,Torrence,CA)で停止し、5mL Hi−Trap SP FFカラム(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上の陽イオン交換クロマトグラフィーにより、50mM酢酸ナトリウム緩衝液および0から300mMのNaCl 10 CV勾配を用いて精製した。この方法で産生されたチオFabは本明細書にて「酵素によるチオFab」と称される。その他のアプローチにおいて、改変されたcys残基を有するFabをコードするDNAコンストラクト、又はヒンジ領域に一つの天然型のcys残基を含む重鎖断片をコードするDNAコンストラクトは、プラスミド発現ベクターへサブクローニングされ大腸菌で直接発現された。この方法で産生されたチオFabは時には「組換えによるチオFab」と称される。第三のアプローチは、改変されたcys残基を欠いた抗体に使用され、IgGのヒンジ領域に存在する天然のcys残基に依存した。この方法は「ヒンジ-cys-Fab」を産生するために用いられ、下記の更なる詳細に記載される。
大腸菌によるタンパク質発現は、前述したように震とうフラスコ中で一晩培養するか又は10リッターのファーメンターで一晩培養するかの何れかで行った。例えば、Carterら、Biotechnology (N Y) 10(2): 163-7 (1992); Simmonsら、J Immunol Methods 263(1-2): 133-47 (2002)を参照。反応性システイン残基を含むように改変されたトラスツズマブ(完全長ハーセプチン(登録商標))(hu4D5-thio-Mab)の場合、抗体はJunutulaら、J Immunol Methods 332(1-2): 41-52 (2008)に既述されたように発現し精製した。組換えチオFab又は組換えヒンジ-cys-Fabを発現する大腸菌細胞ペレットは、25mMのTris、pH7.5、125mMのNaCl、5mMのEDTA(TEB)を含むバッファーに再懸濁し、マイクロフルイダイザーを用いて溶解した。抽出物は綿状ポリエチレンイミン(0.4%)と処置され、1時間撹拌しながらpH9.0へ調整した後、15000×gで45分間遠心分離した。チオFab又はヒンジ-cys-Fabは、プロテインG及び陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて当業者に公知の標準的手順で精製した。具体的には、上清を0.22ミクロンフィルターを通して濾過した後、直接プロテインG樹脂、典型的にはHi−TrapプロテインG(GE Healthcare,Piscataway,NJ)へ適用した。溶出は0.2Mの酢酸で行い、続いてSP−HP陽イオン交換樹脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)で捕獲した。チオFab又はヒンジ-cys-Fabは、0−1MのNaClの10CVの勾配で溶出した。精製されたチオFabはSDS−PAGE及び質量分析で特性を評価にした。これらの特性評価は、多くの場合、275Da及び306Daの質量の増加を示した。これらの質量の増加は、ビスマレイミドとの架橋のためのチオFabを調製するために、還元及び酸化により除去した、不対システインのジスルフィド付加物であることが判明した。チオFabの還元及び酸化は以下のように行った。最初に、チオFabは、25mMのMES、pHが5.8、300mLのNaCl、および5mMのEDTAを含むバッファー中で、2mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸(TCEP−HCl;TCEPとも称される) (Pierce[Thermo Fisher Scientific],Rockford,IL)の添加により24時間還元した。還元後、タンパク質は5mMのデヒドロアスコルビン酸(DHAA)(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)の添加により酸化した。単離されたチオFabはSDS−PAGEおよび質量分析によって分析され、タンパク質が適切に還元され酸化されたことを確かにした。
図1はビスFabの合成のスキームを示す。ビスFab合成の第一段階において、不対システインを持つチオFab又はヒンジ-cys-Fabが用いられた。一般に、チオFab又はヒンジ-cys-Fabは、還元及び酸化が行われる同一バッファー中にタンパク質濃度1mg/mLにて存在した(MES、pH5.8、2mMのEDTA、及び300mMのNaCl)(図1、パネル1)。この段階で、ジスルフィド2量体及び架橋された2量体という2つの望ましくない反応産物が存在する可能性がある。この合成段階にてタンパク質濃度1mg/mLのタンパク質濃度が、2量体化がそのタンパク質濃度で最小であったため反応の重要な特徴であることを見いだした。更に、EDTAを含む低いpHのバッファーを用いることで反応を調節することが2量体化を最小に抑えた。ビスマレイミド架橋剤(Quanta BioDesign,Powell,OH)の5倍過剰が反応混合物へ添加された(図1、パネル2)。この5倍過剰の架橋剤は望ましくない2量体化を最小にするのにも役だった。反応は室温(RT)で又は37℃で4時間、完結するまでインキュベートされた。次いで、混合物はゲル濾過に適した体積に濃縮した(図1、パネル3)。我々は通常22mLのS−200 Tricornカラム(GE Healthcare,Piscataway,NJ)をμgからmgの量の合成のために用いた。この最初のゲル濾過工程は未使用の架橋剤の除去を可能とし、架橋剤へコンジュゲートした精製されたチオFab又はヒンジ-cys-Fabを生じた。上記の条件は典型的には少なくとも90%か又はそれ以上の所望の産物をもたらした。遊離のチオ−ルのままであるチオFab又はヒンジ-cys-Fabは存在せず、全てが不対システインを介して架橋剤へコンジュゲートしたか又は別のチオFab又はヒンジ-cys-Fabへジスルフィドにより結合していた。
上記のマトリックス組換えの手法を使用して、我々はトラスツズマブから派生した一連のビスFab構造変異体を合成した。我々は、ビスFabを合成するために、4つの異なるチオ付着点を選んだ;その位置の2か所は重鎖にあり位置の2か所は軽鎖にあった。チオ付着点を含むFabは3つの異なる源に由来した;1)抗体由来のチオFabを遊離するためにリジン-Cで消化されたシステインによる置換を伴うチオMab、2)大腸菌で直接発現され精製されたシステインの置換を伴うチオFab、3)単一の架橋剤をペプシンによる消化後の非改変抗体のヒンジ領域へ連結するため上述の酵素的方法で産生したヒンジ-cys-Fab。この方法で別のチオFabとの組換えのためにチオFabにおいて4つの異なる置換点を作り出し、構造変異体のパネルを得た(図3A)。4つの異なる置換点は軽鎖の位置110(LC110Cys)、軽鎖の位置205(LC205Cys)、重鎖の位置118(HC118Cys)、及び重鎖のヒンジ領域(HCHg−Cys)にある。合成はマトリックス形式で行われ、四つのチオFabの組が最初に架橋剤とコンジュゲートされ、次いでお互いに再度組み合わされて16分子を生成し、そのうち10は質量と構造において固有であった。チオFabは、合成されたビスFabの固有の識別子及び各ビスFabに対する各チオFabの起源とともに図3Aに模式的に素描される。合成反応に由来する最終の精製産物は質量分析により特性評価され、試験物質の純度を確実にした。更に、我々はビスFabの分子量を非還元SDS-PAGEによる分析した(図3B)。図3Bに示すように、全てのビスFab構造変異体は大きく異なる見かけの分子量を有しており、個々の起源のチオFabは同じ分子量であり、同じ架橋剤が各ビスFabの合成に用いられたことを考慮すると興味深い結果であった。異なる見かけの分子量についての最も可能性のある説明は、結合位置(チオ付着点)が変性条件で起きる直線状に伸長したポリペプチドで観測される構造的変異体を作るとするものである。
ビスFab合成の方法を他の分子標的への一般的適用を試験するため、我々は、FcγRIIbを標的とする一抗体(5A6)に由来したチオFab又はヒンジ-cys-Fab、及びFcεRIα(22E7)を標的とする一抗体に由来したチオFab又はヒンジ-cys-Fabを用いて、2重特異的ビスFabマトリックスを設計した。5A6及び22E7抗体は米国特許出願公開第20060073142号およびJackmanら、J. Biol. Chem. 285:20850-20859 (2010)に記載されている。FcγRIIb細胞表面タンパク質は、近隣のチロシンキナーゼレセプター(例えばFcεRIα)を脱リン酸化することができるタンパク質チロシンフォスファターゼでり、それらの活性を阻害する。我々は以前に、肥満細胞の表面上のこれらの2つのレセプターを標的とする2重特異的IgGを記述した(同文献)。更に、我々は、2重特異的抗体がFcεRIα及びFcγRIIbに結合して架橋し、ヘテロ2量体レセプター複合体を形成して、IgEのFcεRIαへの結合によって始まる細胞のシグナル伝達とヒスタミン放出を強く阻害することを示した。同文献。2重特異的IgGの作用機構にもとずいて、我々は、肥満細胞上でFcγRIIb及びFcεRIαを標的にするビスFabは作用の類似した機構を有するのであろうと仮定する。従って、理論に拘束されることなく、我々は、FcγRIIb及びFcεRIαを標的にするビスFabによる処置は、FcγRIIbの活性化レセプター複合体への補充へと導き、ヒスタミン放出の阻害をもたらすのであろうという仮説を立てる。
上記ビスFabの一つの特徴は、少なくとも一部は分子のFc領域の欠損が原因である、予測されたインビボでの短い半減期である。所定のインビボでの適用において、ビスFabが天然型抗体に類似した薬物動態学的特性を有することが望ましい。従って、我々は、ビスFabの合成に使うための修飾された架橋剤を作る方法を考案した。以下に詳述されるように、そうした修飾架橋剤の使用は、インビボ半減期を改変するのに有用な試薬、例えば(限定されないが)ポリエチレングリコール(PEG)の添加を可能とする。更に、本明細書に記述されるように、修飾された架橋剤はイメージング又は検出剤として有用な試薬、例えば(限定されないが)蛍光標識、あるいは細胞傷害性薬物、例えば(限定されないが)モノメチルオーリスタチンE(MMAE)、又は別の望ましい特性又は機能を持つ試薬、例えば(限定されないが)siRNAの添加を可能とする。
我々は、任意のスルフヒドリル反応性部分の付着を可能にする修飾された架橋剤を合成する方法を考案した。以下に、我々はN-サクシニミジル-S-アセチルチオアセテート(SATA)をビスマレイミドへ付着させ、所望の官能基を付着させる更なる反応に使用可能な保護されたSH基を有するビスマレイミドアセチルチオアセテート(BMata)を形成するための方法を記述する。我々は、Quanta BioDesign Limited,Powell,OHから入手したビスマレイミドアミン(分子量546.62)から開始した。六十マイクロモル(32mg)が100μLのジメチルアミン(DMA)に溶解され1mlのアセトニトリルで希釈した。百三十マイクロモル(31mg)SATA(N-サクシニミジル-S-アセチルチオアセテート、分子量231.23、Thermo Fisher Scientific)を1mlのアセトニトリルに溶解し、ビスマレミド溶液へ添加した。Hepesバッファー(カリウム塩、pH7.1、0.5M)が最終濃度0.15Mに添加され、反応混合物は4℃で暗所で一晩インキュベートした。混合物は0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)で4倍希釈され、その後10x250mmのC4カラム上(Vydac) で、0.1%のTFA中で15−50%のアセトニトリル勾配により分離した。ビスマレイミドアセチルチオアセテート(分子量662.29)(エレクトロスプレー質量分析法(Agilent 6210 TOF)による評価)を含む分画がプールされ、真空遠心分離で乾燥させ、−20℃で保存された。この修飾された架橋剤、BMataを合成する反応を図7Aに示す。
2つの別個の実験が、C3−101V110C/HercV110C ビスFabsのインビトロでの血清半減期に関して、上述したBMata-PEG又はBMata-ABP修飾の作用を評価するために実施された。単一の5mg/kgのIVボーラス投与がマウス又はヌードラットに投与され、血清に存在するビスFabが最大14日間分析された。個別のマウスが各データ点において用いられたが、ラットにおいては血清サンプルは実験期間中同一の動物から採取された。
PBS中で1μg/mlに希釈されたEGFR-Fc(ジェネンテック試薬)が384穴のMaxisorbポリスチレンプレート(Nalgate Nunc International カタログ番号464718)にコーティングされた。16から72時間後、被膜は取り除かれ、プレートはブロックバッファー(PBS/0.5%BSA/Proclin 300)で0.5から3時間ブロックされた。ビスFabの標準物質の希釈(0.156から20ng/ml)がアッセイバッファー(PBS/0.5%BSA/0.05%Tween20/0.25%CHAPS/5mMEDTA/0.2%BGG/0.35MのNaCl/15ppmのProclin300)で調製された。サンプル(ラット又はマウスの血清を含むビスFab)はアッセイバッファー中へ最小希釈の1/100まで希釈され、その後アッセイの範囲に8倍連続希釈された。ブロックされたプレートは洗浄バッファー(PBS/0.05%Tween 20)で3回洗浄し、標準物質とサンプルが適切なアッセイウエルに添加された。1時間のインキュベーション後、プレートは洗浄バッファーで6回洗浄された。結合したビスFabはビオチン標識化HER2 ECD(ジェネンテック試薬のロット39575−15−ビオチン化がNHS-スクシンイミド(Succimide)化学(Biotin-X-NHS research organics 10554B−2)を用いて実施された。1時間のインキュベーション後、プレートは洗浄バッファーで6回洗浄され、コンジュゲートバッファー(PBS/0.5%BSA/0.05%Tween20/15ppmのroclin300)中で1/40,000に希釈されたストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ(GE Healthcare RPN1231)が全てのアッセイウエルに添加された。30分のインキュベーション後、プレートは6回洗浄され、基質のTMB(KPLカタログ番号50−65−02)が全てのアッセイウエルに添加された。基質反応は15−20分後に1Mのリン酸で停止させた。プレートは参照波長620nmを用いて450nmにて読み取られた。サンプル濃度は4つのパラメーターカーブフィッティングアルゴリズムを用い、結果を標準物質と比較することで決定した。
Alpha_HL=アルファ相の半減期;Beta_HL=ベータ相の半減期;AUC=最後の観測点に至る血清濃度−時間曲線の下の面積;CL=クリアランス;Cmax=投薬期間中に観察された最大濃度;Vss=定常状態における分布容量;N/A=該当しない。
インビボでのマウス異種移植モデルでの研究のため、我々は以下のようにペグ化ビスFabを構築した。我々はまず最初に、Her2標的化チオFabの2C4V110C、及びEGFR(Her1)標的化チオFabのD1−5V110Cを含有するBMata架橋ビスFabを生成した。このMata架橋ビスFabは次にヒドロキシルアミンと20Kのmal-PEGの1:1分子等量で反応させてペグ化ビスFabを生成した。そのペグ化ビスFabを精製しSDS−PAGEで分析した(図10A)。ペグ化ビスFabはインビトロでのCalu3細胞の増殖を阻害する能力について試験された。Calu3細胞はHer2及びEGFRの両方を発現することが知られている(データ非表示)。アッセイのために、ウエルあたり8500細胞が播種され、2nMのヘレグリンと5nMのTGFαで処置された。我々は次いでビスFab及び親抗体の濃度(図10Bの横軸に示された濃度)を可変させてリガンド刺激による細胞増殖をブロックする能力について試験した。アラマーブルー(25μL)が各ウエルに添加され37℃で3−4時間インキュベートした。プレートは蛍光プレートリーダーで545/590nmで読み取られた。細胞増殖の量は相対蛍光単位(RFU)で直接的に、あるいはコントロールに対しる規格化によるかの何れかで報告された。図10Bはこの実験においてペグ化ビスFabがCalu3増殖の強力な阻害剤であったことを示している。実際にそれは親抗体の2C4及びD1−5の何れよりも強力であった。
*2時間の時点はデータ解析から除かれた。
HL-ラムダ_zは、排出相に関連した半減期を参照し、CLobsは観察されたクリアランスを参照し、AUCinf−obsは無限大に外挿する血清濃度−時間曲線下の観察面積を参照する。
Her2は心臓、乳房、および神経組織の正常な発達および細胞増殖に関与しており、他の臓器系の発達に関連している。Falls, D. L.ら、Exp Cell Res 284(1):14-30 (2003);Casalini, P.ら、J Cell Physiol 200(3):343-50 (2004); Negro, A.ら、Recent Prog Horm Res 59:1-12 (2004); Britsch, S. Adv Anat Embryol Cell Biol 190:1-65 (2007)。最も特記すべきは乳癌細胞増殖におけるHer2の過剰発現の関与、及びハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)の恩恵を受けるであろう乳癌患者を同定するための診断マーカーとしてのHer2の過剰発現の用途である。Lee, K. F.ら、Nature 378(6555):394-8 (1995); Erickson, S. L.ら、Development 124(24):4999-5011 (1997); Britsch, S.ら、Genes Dev 12(12):1825-36 (1998); Morris, J. K.ら、Neuron 23(2): 273-83 (1999); Woldeyesus, M. T.ら、Genes Dev 13(19):2538-48 (1999); Lin, W.ら、Proc Natl Acad Sci U S A 97(3):1299-304 (2000); Park, S. K.ら、J Cell Biol 154(6):1245-58 (2001); Leu, M.ら、Development 130(11):2291-301 (2003); Brufsky, A. Am J Clin Oncol. Aug. 11, 2009 (EPub PMID: 19675448)。ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)は、レセプターの膜貫通領域近傍の細胞外部分の第4番目のドメインに結合するモノクローナル抗体である。(Cho, H. S.ら、Nature 421(6924):756-60 [2003])。Her2は細胞増殖と分化に寄与する4つのレセプターのファミリーの一員であり、病気の治療の標的でもある(Casalini, P.ら、J Cell Physiol 200(3):343-50 [2004])。複数のレセプターの協調的な作業がしばしば腫瘍細胞の増殖を牽引を担っている(Yarden, Y.ら、Nat Rev Mol Cell Biol 2(2):127-37 (2001); Lee-Hoeflich, S. T.ら、Cancer Res 68(14): 878-87 [2008])。この点において、複数の受容体の活性の中和が、ある種の癌の特に効果的な治療法を与えるために望まれ得る。そのような分子の構築と設計への一つの方法は、2重特異的抗体技術を使用することであり、それによって単一の抗体分子が2つの固有のモノクローナル活性を有する。(Drakeman, D. L.ら、Expert Opin Investig Drugs 6(9):1169-78 (1997); Kontermann, R. E. Acta Pharmacol Sin 26(1):1-9 (2005); Chames, P.ら、Curr Opin Drug Discov Devel 12(2):276-83 [2009])。我々は、そうした分子をスクリーニングし、かつ単一抗体又は抗体の組合わせ以上に増加した有効性を与え得るものを探索するための手段として少なくとも一部が本明細書に記されるビスFab技術を開発した。我々は、ビスFabの合成プロセスは、二重特異性分子を生成するために、堅牢かつシンプルな方法であることを本明細書で実証してきた。我々は、一般に、ビスFab分子が両方の親抗体の組み合わされた生物学的活性を有することを特定した。我々は、分子の一価構造による可能性がある、いくつかのビスFabに対する細胞表面親和性のわずかな低下を観察した。しかし、これは多くの方法で相殺することができる。例えば、一つの細胞の表面で2つのレセプターを標的にするビスFabを合成することができ、同じレセプターの2つのドメインが標的となり得、あるいは一価のFab親和性を増加させることができる。本明細書に記載されたマトリックスアプローチを用いて、Her2及びEGFRを標的とする一組のビスFabの合成により、様々なアッセイに十分な量で高純度な分子を得た。細胞ベースのアッセイでビスFabを用いて、我々は幾つか固有の活性を観察した。例えば、ビスFab1191は、特徴的でない急な阻害カーブを持つ細胞増殖の強力な阻害を示した(図2C)。この分子の興味深い態様は、Her2の2つの異なるドメインを同時に結合することである。ビスFabの2C4アームはECDのドメインIIを標的とし、ビスFabのHercアームはドメインIVを標的とする(Franklin, M. C.ら、Cancer Cell 5(4):317-28 (2004); Schmitz, K. R.ら、Exp Cell Res 315(4):659-70 [2009])。そのカーブは協同的に見え、同一標的の2つのドメインを結合する分子に特有である作用機構を指している可能性がある。そのような分子は、所定の治療用設定において、単一抗体又は2つの別個のモノクローナル抗体の組合わせ以上に有効性における有利さを与え得る。しかし、その他より目立った知見は、お互い結合しビスFab1188を形成するトラスツズマブ チオFabについてであった。この場合、ビスFabは、Fc部分を欠き、Fabが天然のヒンジのジスルフィド結合とは異なる部位で共有結合していることを除いて、単一親抗体に構造的に似ている。ビスFab1188、Herc LC110Cys−Herc LC110Cysは、細胞増殖に予期せぬ上昇を示し、強いアンタゴニストの代わりにアゴニストとして作用した(図2F)。これは驚くべきことであって、その理由は、その活性が構造的に似た親抗体とは逆であっただけでなく、Her2を過剰発現するBT474細胞の細胞増殖がリガンド依存的ではなく、基底状態で最大限に刺激されると考えられるからである。更に。2つの2C4Fabを一緒に結合する別のビスFabは親抗体に似た活性を有していた(図2E)。理論に拘束されることなく、異なる抗体由来のFabの異なる作用機構は、ビスFabで観察された異なる結果を説明する可能性ある。2C4はドメインIIに結合し、Her2のそれ自身及び他のHerファミリーメンバーとの2量体化を阻害するが、トラスツズマブは、ドメインIVが2量体化ドメインではないため、異なった複合体形成に影響を与えるように見える。トラスツズマブエピトープは、抗体が、2つのキナーゼドメインの配向を生じさせる膜貫通領域の配向に著しい影響を及ぼし得る場所である、膜貫通領域に極めて近接している(Cho, H. S.ら、Nature 421(6924):756-60 [2003])。キナーゼの活性部位とのアロステリックな相互作用又は別の直接的な相互作用は、抗体もしくはビスFabが、非常に接近した2つのレセプター分子へ結合することにより影響され得る(Bocharov, E. V.ら、J Biol Chem 283(11):6950-6 (2008); Schmitz, K. R.ら、Exp Cell Res 315(4):659-70 [2009])。
Claims (30)
- 多重特異性抗体のパネルを合成する方法であって、第一の単一特異性及び遊離スルフヒドリル基を有する第一の親抗体から得られた第一の抗体断片を、チオ-反応性架橋剤と反応させて、抗体断片−架橋剤部分を生成し、抗体断片−架橋剤部分を、各々が遊離スルフヒドリル基を有する、第一の抗体断片とは異なる単一特異性の、一又は複数の第二の親抗体から得られた三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々と対で反応させ、多重特異性抗体のパネルを生成し、付加的抗体断片の各々の遊離スルフヒドリル基が少なくとも三つの異なる位置にあり、
親抗体の各々が、細胞表面レセプターに結合する、方法。 - 第一の親抗体が抗Her1、抗Her2、抗FcεRIα及び抗FcγRIIbから選択される、請求項1に記載の方法。
- 第一の親抗体が抗Her2であり、第二の親抗体が抗Her1であり、又は第一の親抗体が抗Her1であり、第二の親抗体が抗Her2であり、又は第一の親抗体が抗FcγRIIbであり、第二の親抗体が抗FcεRIαであり、又は第一の親抗体が抗FcεRIαであり、第二の親抗体が抗FcγRIIbである、請求項1又は2に記載の方法。
- 第一の抗体断片が抗Her2から得られ、三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々が抗Her1から得られ、又は第一の抗体断片が抗Her1から得られ、三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々が抗Her2から得られ、又は第一の抗体断片が抗FcεRIαから得られ、三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々が抗FcγRIIbから得られ、又は第一の抗体断片が抗FcγRIIbから得られ、三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々が抗FcεRIαから得られる、請求項1又は2に記載の方法。
- 抗体アナログのパネルを合成する方法であって、遊離のスルフヒドリル基を有する第一の抗体断片をチオ反応性架橋剤と反応させて、抗体断片−架橋剤部分を生成し、抗体断片−架橋剤部分を遊離のスルフヒドリル基を各々が有する二又はそれ以上の付加的抗体断片の各々と対で反応させて、単離された抗体アナログのパネルを生成し、抗体断片の各々が単一の親抗体から得られ、付加的抗体断片の各々の遊離スルフヒドリル基が少なくともふたつの異なる位置にあり、
親抗体が、細胞表面レセプターに結合する、方法。 - 親抗体が抗Her1、抗Her2、抗FcεRIα及び抗FcγRIIbから選択される、請求項5に記載の方法。
- 抗Her2がトラスツズマブ及びペルツズマブから選択される、請求項2、3、4、及び6の何れか一項に記載の方法。
- 第一の親抗体が抗Her2であり、及び第一の抗体断片が配列番号1、2、3、6及び7から選択される軽鎖配列、及び配列番号4、5及び8から選択される重鎖配列を含む、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 親抗体が抗Her2であり、第一の抗体断片及び付加的抗体断片が同じ軽鎖配列及び同じ重鎖配列を含み、軽鎖配列が配列番号1、2、3、6及び7から選択され、重鎖配列が配列番号4、5及び8から選択される、請求項5に記載の方法。
- 抗Her1がD1-5及びC3-101から選択される、請求項2、3、4、及び6の何れか一項に記載の方法。
- 第一の親抗体が抗Her1であり、及び第一の抗体断片が配列番号18、19、21、及び22から選択される軽鎖配列、及び配列番号17及び20から選択される重鎖配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 親抗体が抗Her1であり、第一の抗体断片及び付加的抗体断片が同じ軽鎖配列及び同じ重鎖配列を含み、軽鎖配列が配列番号18、19、21、及び22から選択され、重鎖配列が配列番号17及び20から選択される、請求項6に記載の方法。
- 抗FcγRIIbが5A6である、請求項2、3、4、及び6の何れか一項に記載の方法。
- 第一の親抗体が抗FcγRIIbであり、及び第一の抗体断片が配列番号11及び12から選択される軽鎖配列、及び配列番号9及び10から選択される重鎖配列を含む、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 親抗体が抗FcγRIIbであり、第一の抗体断片及び付加的抗体断片が同じ軽鎖配列及び同じ重鎖配列を含み、軽鎖配列が配列番号11及び12から選択され、重鎖配列が配列番号9及び10から選択される、請求項6に記載の方法。
- 抗FcεRIαが22E7である、請求項2、3、4、及び6に記載の方法。
- 第一の親抗体が抗FcεRIαであり、及び第一の抗体断片が配列番号15及び16から選択される軽鎖配列、及び配列番号13及び14から選択される重鎖配列を含む、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 親抗体が抗FcεRIαであり、第一の抗体断片及び付加的抗体断片が同じ軽鎖配列及び同じ重鎖配列を含み、軽鎖配列が配列番号15及び16から選択され、重鎖配列が配列番号13及び14から選択される、請求項6に記載の方法。
- チオ反応性架橋剤がビスマレイミド、ビス-アルキルハロゲン化物、ピリジルジスルフィド、ビス-水銀塩、5-チオ-2-ニトロ安息香酸媒介架橋剤、及びビス-チオスルホン酸塩から選択される、請求項1から18の何れか一項に記載の方法。
- チオ反応性架橋剤がビスマレイミドである、請求項1から19の何れか一項に記載の方法。
- 第一の抗体断片、及び/又は付加的抗体断片の各々がシステイン改変抗体から得られる、請求項1から20の何れか一項に記載の方法。
- システイン改変抗体が軽鎖の位置110又は位置205に置換を含み、残基の番号付けはEU番号付けシステムに従い、該置換がシステインである、請求項21に記載の方法。
- システイン改変抗体が重鎖の位置118又は位置121に置換を含み、残基の番号付けはEU番号付けシステムに従い、該置換がシステインである、請求項21又は22に記載の方法。
- 第一の抗体断片、及び/又は付加的抗体断片の各々が天然型抗体から得られ、天然型抗体がペプシンで消化されてF(ab')2断片を生成し、F(ab')2断片が精製され、還元剤で処置された後、Fabの重鎖及び軽鎖の間にジスルフィドが再形成され、ヒンジ領域のシステイン残基は非酸化のままである条件下で酸化剤により処理される、請求項1から23の何れか一項に記載の方法。
- 架橋剤が保護されたSH基を含む修飾された架橋剤である、請求項1から24の何れか一項に記載の方法。
- 修飾された架橋剤がビスマレイミドアセチルアセテート(BMata)である、請求項25に記載の方法。
- 修飾された架橋剤を含む抗体が官能基を含む薬剤と更に反応する、請求項25又は26に記載の方法。
- 薬剤がポリエチレングリコール(PEG)、アルブミン結合ペプチド(ABP)、蛍光タグ、放射性イメージング剤、細胞傷害性薬剤、及びsiRNAから選択される、請求項27に記載の方法。
- 薬剤がPEGであり、該PEGが2000mw(2K)PEG、12,000mw(12K)PEG、及び20,000mw(20K)PEGから選択される、請求項27又は28に記載の方法。
- 付加的抗体断片の各々の遊離スルフヒドリル基が、軽鎖の位置110、軽鎖の位置205、重鎖の位置118、重鎖の位置121、及びヒンジ領域の位置からなる群から選択される位置にある、請求項1又は5に記載の方法。
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