KR100252147B1 - 항-종양 치료에 사용되는 접합물 및 그 제조방법 - Google Patents

항-종양 치료에 사용되는 접합물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 C242항체와 같은 항체 및 리신 A와 같은 독소를 포함하는 결장직장 종양과 같은 위장의 종양을 치료하는데 유용한 접합물에 관한 것이다. 상기 접합물을 포함하는 약학적 조성물과 그것의 제조방법 및 위장의 종양을 치료하는 방법도 본 발명에 포함된다.

Description

항-종양 치료에 사용되는 접합물 및 그 제조 방법
제1도는 pICI0020의 구조를 나타낸다.
제2도는 pTB344의 구조를 나타낸다.
제3도는 pICI0042의 구조를 나타낸다.
제4도는 pICI1079의 구조를 나타낸다.
제5도는 pICI1187의 구조를 나타낸다.
제6도는 쿠마시 블루로 염색한 E.Coli 용해질의 SDS겔로서 A는 pICI1102를, B는 pICI0020을, 그리고 C는 분자량 마커를 나타낸다.
제7도는 pICI1102의 겔패턴을 나타내는 것으로서, 피이크 R은 리신 A를 나타낸다.
제8도는 pICI1102에 의해 생성된 리신 A의 웨스턴 블로트로서, 1번은 분자량 마커이고, 2번 및 3번은 비-리신 생성 클론이며, 4번은 pICI1102이고 5번은 pICI0020(대조용 플라스미드-비 리신 A서열)을 나타낸다.
제9도는 pICI1102의 서열의 일부를 나타낸다.
제10도는 pICI1102의 구조를 나타낸다.
제11도는 플라스미드 제조시 사용된 단편을 나타낸다.
제12도는 pICI0042의 플라스미드 지도이다.
제13도는 전사 종결인자의 서열을 나타낸다.
제14도는 pICI1079의 플라스미드 지도이다.
제15도는 COLO205세포에 의한125I-C242의 세포내 취입을 나타낸다.
제16도는 COLO205세포에 대한 C242/리신 A 면역독소의 시험관내 세포 독성을 나타낸다.
제17도는 항체를 나타낸다.
제18도는 C242카파 사슬, 가변영역의 cDNA 서열(플라스미드 pKGE 761에서의 cDNA)을 나타낸다.
제19도는 C242 H쇄 가변영역의 cDNA 서열(플라스미드 pKGE762에서의 cDNA)을 나타낸다.
본 발명은 항-종양 치료에 사용되는 면역독소와 같은 접합물, 그러한 접합물의 제조 방법 및 그러한 접합물을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
아브린, 모데신 및 비스쿠민과 같은 리신-유형의 분자 및 리신은 공지된 화합물로서 세포독성을 갖고 있으며, 식물 세포에 의해 생성된다. 이러한 유형의 독소는 이황화결합을 통해 연결되어 있는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있다. 이러한 폴리펩티드 사슬 중의 하나(“A사슬”)은 독소분자의 세포독성을 주로 담당하며 다른 폴리펩티드 사슬(“B사슬”)은 세포 표면에 독소분자가 결합될 수 있도록 한다.
리신 유형의 분자의 독성은 다음과 같은 세가지 단계로 적용한다: (a) B 사슬상의 갈락토즈 결합 부위와 세포 표면에서 노출된 당단백질 또는 당지질과의 상호작용을 통하여 독소를 세포표면에 결합시키는 단계; (b) 세포의 세포질내로 최소한 A사슬이 침투하는 단계; (c) A사슬이 리보좀 60S 서브유니트의 활성을 파괴시키는 것을 통하여 단백질 합성을 억제시키는 단계.
B사슬은 독소 분자를 세포표면에 결합시키는 첫 번째 기능외에 독소가 세포내로 흡수되는 것을 용이하게 하는 중요한 두 번째 기능도 갖고 있는 것으로 사료된다. B사슬의 부재시, A사슬은 세포표면에 결합될 수 없으며 세포질내로 침투할 수 없고, B사슬은 세포독성을 갖고 있지 않으므로 분리된 A 및 B사슬은 실질적으로 비-독성이다.
상기 언급한 바와 같이, 리신 및 리신-유형의 분자는 식물에 의해 생성된다. 리신은, 피마자유로 알려져 있는 리시누스 코무니스에서 생성된다. 이때 리더서열, A사슬, 연결서열 및 B사슬을 포함하는 폴리펩티드 전구체(프리프로 리신으로 공지됨)가 가장 먼저 생성된다. 식물세포내에서 상기 전구체(프리프로리신)가 전달될 때 리더서열이 제거되어 프로리신이 산출될 것으로 사료된다. 이어서, A 및 B사슬 사이에 이황화 결합이 형성되고 연결서열이 제거됨으로써 프로리신으로부터 완전한 리신이 생성된다.
리신과 같은 독소의 A사슬양 독성은, 구분없이 결합하는 B사슬이, 정상세포보다 종양세포에 더 잘 결합하는 다른 담체로 대체된다면 항-종양 치료에 유용하게 이용될 수 있으리라는 것이 제안된 바 있다. 따라서 다양한 접합물이 제시되었으며, 완전한 리신 또는 리신의 A사슬 및 종양-특이항체를 포함하는 접합물이 제조되었다. 그러나 그러한 접합물, 면역접합물 또는 면역 독소는 많은 결점도 갖고 있다.
공지된 접합물들에서 야기되고 있는 하나의 문제점으로는 천연 리신의 A사슬의 구조적 특징이다. 식물 세포내에서 리신이 합성되는 동안 N-글리코실화가 유발되며 이로써 생성된 당 부분은 세포표면과 비-특이성 상호작용을 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
식물성 리신-면역 접합물과의 선택성이 결여되면, 그 결과, a) 리신-면역 접합물의 경우, B사슬상의 갈락토즈 결합 부위가 세포표면과 비-특이성 방식으로 상호작용하거나; b) 식물성 리신 A-면역접합물의 경우, 식물성 리신 A상에서 형질발현된 글리칸 측쇄가 세포 표면상의 갈락토즈 및 만노즈 수용체와 결합하는 것으로 사료된다.
또다른 문제점은, 상기 언급한 바와 같이, B사슬은 독소분자가 세포내로 흡수되는 것을 용이하게 한다는 것이다. 따라서, B사슬이 결여된 접합물, 다시 말하면, A사슬과 항체만으로 구성된 접합물은 고유한 독소에 비해 좀 더 특이성을 갖고 있다 하더라도 고유한 독소의 효능은 결여된 것으로 보고되고 있다(Moolten F.L. 등, Immun Rev, 62, 47-72, 1982). 이와 같은 효능의 결여는 독소가 세포내로 효과적으로 흡수되는 것이 감소한 것에 기인하는 것으로 생각된다. 따라서, 독소의 효과적인 유입을 용이하게 하여 효능이 결여된 면역독소를 야기시키는 항체는 비교적 희박한 것으로 보고되고 있다.
따라서 현재까지는, 다양한 조직내에서 종양을 치료할 수 있는 접합물이 제조되었다. 예를 들면, PCT 특허 출원 제 WO85/003508에서는 리신 A, 또는 스페이서(spacer)분자를 통해 유방종양에 특이성을 갖는 항체에 연결된 디프테리아 독소 A사슬을 포함하는 접합물의 제조 방법을 제시하고 있다.
결장직장 종양 세포를 인지하는 항체도 보고된 바 있으나 이러한 항체를 포함하는 접합물은 정상조직에 결합할 수 없고 및/또는 결합능력이 매우 낮은 경향이 있다. 따라서, 결장직장 종양세포를 인지하는 것으로 공지된 항체는 치료에 실제적으로 사용될 수 있는 접합물의 제조에 유용하지 않은 것으로 나타났다. 그러므로, 결장직장 종양을 치료할 수 있는 접합물이 필요하게 되었다.
여러 가지 접합물이 제안되고 제조되었으나, 개선된 접합물이 필요하게 되었다. 그러한 개선된 접합물은 공지된 접합물들이 갖고 있는 단점중 하나 또는 그 이상을 개선시킬 수 있다. 위장 종양에 선택적인 접합물도 필요하게 되었다.
본 발명은 독소부와 표적 세포 결합부를 포함하며 위장 종양 세포에 선택적인 접합물을 제공하는 것이다.
특히, 상기 표적 세포 결합부(따라서 접합물)은 결장직장 종양세포 및 췌장 종양 세포에 대해 선택적이며 이러한 선택성은 결장직장 종양 세포에서 더욱 우세하다.
예를 들면, 상기 표전 세포 결합부는, 일반적으로 항체, 항체단편 또는 이들의 유도체를 포함한다.
상기 표적 세포 결합부는 위장 종양 세포(특히, 결장직장 종양 세포)에 선택적인 것으로서, 정상 세포보다 상기 세포에 더 잘 결합한다. 따라서, 표적 세포 결합부는 위장 종양 세포에는 결합하지만, 정상세포에 대해서는 결합 친화력이 희박하거나 없다. 특히, 상기 표적 세포 결합부는 C242항체에 의해 표현되는 것과 거의 동일한 정도로 위장 종양에 대한 선택성을 나타낸다. 결장직장 종양과 같은 위장종양에 대한 C242항체의 선택성은 하기 제시한 면역조직화학적 자료에 의해 예시된다. 특히, C242항체와 같은 표적세포 결합부는 위장종양과 연관되어 있는 항원에 결합하나, 정상 세포에서는 없거나 약하게 형질발현된다. 그러한 표적 세포 결합부의 특별한 예로는 C242항체 또는 그와 거의 동일한 세포 결합특성을 갖는 표적 세포 결합부를 들 수 있다.
본원에서 언급한 바와 같이, 상기 접합물은 위장 종양 세포를 죽일 수 있다. 따라서, 상기 접합물(또는 면역독소)은 독소부를 종양 세포에 전달하여 독소부가 그 세포독성을 야기시킬 수 있도록 할 수 있다. 그러므로 상기 접합물은, 통상적으로 종양 세포에 결합할 수 있으며(종양 세포에 결합하는 표적 세포 결합부를 통해), 독소부가 세포내로 통과할 수 있도록하는데, 다시말하면 독소부를 “내면화(internalise)”시킨다. 통상적으로 특히 효과적인 접합물은 다음과 같은 특성을 갖고 있다:-
1. 표적 세포 결합부는 종양 세포 표면 항원에 대한 결합능력을 갖고 있다.
2. 상기 세포 표면 항원은 종양 세포상에 그 복사체수가 많아야 하는 것으로서 적어도 세포당 10000개가 존재한다.
3. 상기 항원은 정상 세포상에서는 복사체수가 많도록 형질발현되어서는 안된다.
4. 상기 항체:항원 복합체는 세포내로 효과적으로 도입되어 세포내에서 세포독성을 야기시킨다.
5. 상기 접합물은, 독소부를 종양 세포에 전달하기에 충분한 시간동안 혈액내에서 완전하게 유지되기에 충분히 안정하며 독소부가 세포내에 들어갔을 때 독소부를 유리시킬 수 있도록 절단하기에 충분해야 한다.
C242항체는 IgG계열의 쥐의 항체로서, 사람의 결장 선암 세포주로 면역화된 쥐의 비장세포를 쥐의 미엘로마 세포주 Sp 2/0와 융합시킴으로써 산출된 하이브리도마 세포주를 적합한 배지내에서 배양시킴으로써 수득된다. C242:II 항체(본원에서는 C242항체로 간략하게 지칭하기도 함)를 생성하는 하이브리도마 세포주(242.II)는 영국, 월트셔, 샐리스버리, 포톤다운에 소재하는 응용 미생물학 및 연구를 위한 PHLS 센터내의 유럽 동물세포 배양체 수집소(European Collection of Animal Cell Cultures : ECACC)에 기탁번호 제90012601로 1990년 1월 26일, 부다페스트 조약하에 기탁되었다.
“거의 동일한 세포결합 특성을 갖는 표적 세포 결합부”라는 용어는, 동일한 항원 결정기 또는 에피토프에 결합하되 그 결합부위에서 C242항체와 경쟁적으로 결합하며 기탁된 세포주 ECACC 90012601에 의해 생성된 것과 거의 동일한 면역학적 특이성을 갖는 세포 결합부를 의미한다.
또, “표적 세포 결합부”라는 용어에는 항체 단편, 특히 C242항체의 단편 뿐만 아니라 완전한 항체의 단편을 포함된다. 항체단편은 비단편화된 면역글로불린의 결합력과 특이성을 유지하고, 예를 들면, 펩신과 같은 단백질분해 효소로 항체 분해함으로써 수득될 수 있다. 이들 단편의 예로는 F(ab′) 및 F(ab′)2단편을 들 수 있다.
표적 세포 결합부는 유전공학적 방법으로 생성될 수 있으며, 따라서 표적 세포 결합 단편이라는 용어에는 그와 같은 기술에 의해 생성된 항체 및 항체 단편이 포함된다. 특히, 표적세포 결합부라는 용어에는 유전공학 생성물인 C242항체 또는 이들의 단편이 포함된다.
항체 단편, 특히 인체사용 가능한 항체 단편의 제조 방법은, 예를 들어, Carter 등에 의한 Biotechnology 10권(1992년 2월)에 기재되어 있다.
표적 세포 결합부에는 항체 또는 항체 단편의 유도체, 특히 사람이외의 동물에서 유래한 항체 또는 항체 단편의 인체 사용가능한 형태, 예를 들면 쥐의 항체의 인체 사용 가능한 형태가 포함된다.
C242항체는 본 원에서 CA-242로 규정되는 종양 관련 항원에 직접 작용한다.
따라서, 표적 세포 결합부에는 CA-242항원에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편이 포함된다. 그러한 항체의 선택적 예로는 바로 C242항체를 들 수 있다. 종양과 관련된 항원 CA-242는 대다수의 결장-직장 종양내에서 형질발현되며, 정상적인 결장 조직내에는 약하게 형질발현되거나 존재하지 않는다.
상기 언급한 유전 공학에 입각하여, C242:II 모노클론 항체의 L쇄 및 H쇄의 가변영역을 하기 기술된 바와 같이 클로닝시켰다. 이를 상세히 거론하기에 앞서, 면역글로불린 또는 G계열의 항체의 일반구조를 제시하는, 첨부한 도면 제17도를 참고로하여 기본 면역 글로불린 구조 유니트를 간략히 보편적으로 제시하는 것이 필요하다.
제17도를 참고해 보면, 면역글로불린은 2개의 동일한 L(light) 폴리펩티드 쇄 및 2개의 동일한 H(heavy)쇄로 구성되어 있으며, 이러한 4개의 쇄는 이황화 결합 및 다양한 비-공유 결합력에 의해 결합되어 “Y”자형의 입체구조를 생성한다. 각각의 H쇄는 말단에 가변 도메인(VH) 및 여러개의 불변 도메인(CH)을 갖고 있으며 각각의 L쇄는 한 쪽 말단에 가변 도메인(VL) 및 다른쪽 말단에 불변 도메인(CL)을 갖고 있다. L쇄에는 각각 카파 및 람다로 명명되는 2가지 유형이 있다. L쇄의 가변 도메인은 H쇄의 가변 도메인과 나란하게 배열되고, L쇄의 불변 도메인은 H쇄의 불변 도메인과 나란하게 배열되며, L쇄 및 H쇄의 가변 도메인은 항원 결합 부위를 형성한다.
L쇄 및 H쇄의 가변 도메인은 동일한 일반 구조를 갖고 있으며, 각 도메인은 4개의 구조영역(FR)사이사이에 상보성 결정 영역 또는 CDR로 명명되는 3개의 초가변영역을 포함하고 있다. 각 가변 도메인의 CDR은 구조 영역에 근접해 있으며 CDR의 2세트가 함께 항체의 특이성을 제공한다.
C242:II항체의 L쇄 및 H쇄의 가변 부분의 cDNA를 클로닝하기 위해서는 공지된 방법에 의해 C242:II 하이브리도마로부터 cDNA 파지 라이브러리를 제조하는 것이 우선적이다. 이어서, H쇄 및 L쇄(카파)의 하이브리드화 프로브를 커버 하는 불변 부분은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 적합한 프라이머를 이용하여 마우스의 DNA 게놈으로부터 제조했다. 생성된 프로브는 C242:II 항체의 H쇄 및 카파쇄를 암호하는 DNA 서열을 함유하는 cDNA클론에 대한 cDNA 라이브러리를 선별하는데 사용했다. 양성적으로 하이브리드화된 파지 클론을 확장하여 cDNA를 플라스미드 형태로 절단했다. 상기 플라스미드형의 cDNA를 제한효소 지도화로 규명한 후 예상크기의 삽입체를 함유하는 플라스미드를 서열 분석했다. CDR 영역을 결정하기 위해 삽입된 서열에 의해 암호된 아미노산 서열을 종래의 공지된 마우스의 카파 및 H쇄의 서열과 비교했다. 이 때에는 Kabat E.A. 등에 의해 정의된 CDR 영역의 기본 위치를 고려토록 했다(“면역학적 관심의 대상이 되는 단백질의 서열”, 1987, 국제 건강 기구, 건강 및 휴먼 서어비스 부서). 각 사슬의 CDR은 하기와 같은 아미노산 서열을 갖고 있는 것으로 나타났다(첨부한 도면의 제18도 및 제19도에 나타난 것과 동일함. 서열 번호 21 및 22번 참고).
숙련된 기술자들은 CDR 아미노산 및/또는 DNA 서열에 대한 지식을 바탕으로, 당 분야에 공지된 부위-지시성 돌연변이를 이용함으로써 C242:II 항체의 CDR 영역을 다른 항체 또는 항체 단편의 클론된 가변부내로 도입할 수 있다. “CDR 이식화”라고 알려져 있는 이러한 방법(예를 들면, 유럽 특허 출원 239,400호에 제시되어 있음)은 C242로, 수용 항체 또는 단편의 서열을 암호하는 CDR을 DNA수준에서 대체함으로써 C242:II 모노클론 항체에 상응하는 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편을 생성한다. 그러므로 상기 규정된 CDR들(또는 상기 규정한 것과 거의 동일한 CDR) 중 적어도 하나를 갖고 있는 항체 또는 항체단편을 포함하는 임의의 부는 표적세포 결합부의 범위내에 포함된다는 관점에서 볼 때, 표적 세포 결합부가 C242항체와 거의 동일한 세포 결합 특성을 갖도록 CDR의 수 및 항체 또는 항체단편상에서의 이들의 배열이 이루어져야 한다. 이러한 표적 세포 결합부는 상기 규정된(또는 상기 규정된 것과 거의 동일함) 모든 CDR(즉, L쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 H쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고 있는 것이 일반적으로 바람직하다. 상기 규정된 것과 거의 동일한 CDR에는 다음과 같은, 확장된 서열들이 포함된다:
CDR 이식화에 의해 제조되는 항체 또는 항체 단편은, 동질성이나 CDR크기면에서 볼 때, C242에 근접한 것으로서 선택된 구조상에 C242 CDR을 이식시킴으로써 제조되는 것이 바람직하다.
C242항체를 포함하는 표적 세포 결합부 또는 거의 동일한 세포 결합 특성을 갖는 표적 세포 결합부 및 독소부를 포함하는 접합체도 본 발명에 의해 제공되고 있다.
본 발명의 접합물은 반드시 독소 분자 하나와 항체 분자하나로 구성되어 있을 필요는 없음을 숙지해야 한다. 예를 들어 상기 접합물은 항체 분자당 하나 이상의 독소분자를 포함할 수 있다.
독소부는 일반적으로 세포독성을 갖는 성분을 포함하며, 따라서 세포내로 도입된 후 세포를 치사시킬 수 있다.
표적 세포 결합부는 일반적으로 특히 항원 결정기 또는 표적 세포를 인식할 수 있는 표적 세포 결합부를 포함하고 있다.
독소부 및 표적세포 결합부는 서로 직접 결합되거나 또는 간접적으로 결합된다. 통상적으로, 독소부 및 표적세포 결합부는 표적 세포 결합부가 그 표적 세포 에 결합될 수 있도록 접합되어야 한다. 독소부 및 표적 세포 결합부의 접합물은 세포밖에서는 안정하지만 세포내에서는 불안정하며, 세포밖에서는 독소부 및 표적세포 결합부가 서로 결합해 있지만 세포내로 도입된 이후에는 독소부가 유리되는 것이 바람직하다. 따라서, 접합물은 세포내에서는 절단되지만 세포밖에서는 안정한 부위를 갖고 있어야 한다.
독소부가 표적세포 결합부에 직접 결합된 접합물의 예로는 독소부상의 티올기 및 표적세포 결합부상의 티올기사이에 형성되는 이황화결합에 의해 연결되는 독소부 및 표적 세포 결합부를 갖는 접합물을 들 수 있다.
상기 표적 세포 결합부는 독소부를 인식하는 부분을 포함할 수 있으며, 따라서 이러한 부분에 의해 독소부 및 표적 세포 결합부가 연결된다. 이러한 것의 예로는 표적 세포 결합부가, 독소부에 결합하는 항체 또는 항체단편을 포함하는 것을 들 수 있다.
상기 표적 세포 결합부 및 독소부는 단일 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 세포내에서 독소부가 절단될 수 있도록 세포내의 절단부위를 갖고 있는 것이 바람직하다. 그러한 폴리펩티드에서 독소 및 표적 세포 결합부는 폴리펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다.
독소부가 표적 세포 결합부에 간접적으로 연결되는 접합물의 예로는 2작용성 링커, 특히 이형의 2-작용성 링커를 통해 독소부가 표적세포 결합부에 연결된 것을 들 수 있다.
적합한 링커의 예로는, PCT 특허 출원 WO85/003508에 제시된 폴리펩티드를 포함하는 링커 및 공고된 유럽 특허 출원 제169,111호에 제시된 것과 같은 화학적 부위를 포함하는 링커를 들 수 있다.
독소부 및 표적세포 결합부는 이황화 결합 또는 티오에테르 결합에 의해 연결되는 것이 편리하다. 일반적으로, 독소부 및 표적 세포 결합부는 세포내에서 절단될 수 있는 이황화결합 또는 티오에테르 결합에 의해 이들 부들을 연결시키는 링커에 의해 연결되는 것이 바람직하다. 그러한 링커의 예 및 면역독소를 제고하는데 이들 링커를 사용한 예를 공고된 유럽 특허 출원 169,111호; Methods in Enzymology 112, 207-225, 1985(Cumber A. J., Forrester J.A., Foxweel B.M.J., Ross W.C.J., Thorpe P.E.-항체-독소 접합물의 제조); 및 Vogel, Immunoconjugates: 암의 방사선영상화 및 치료에 있어서의 항체 접합물, pp 28-55(Wawrzynczak E.J. 및 Thorpe P.E.- 면역독소를 제조하는 방법: 링커에 의한 결합이 활성 및 안정성에 미치는 효과)에 제시되어 있다.
링커의 구체적인 예로는 독소부 및 표적 세포 결합부상의 티올기에 의해 이황화결합을 형성할 수 있는 것 및 독소부 및 표적 세포 결합부 상의 아미노기에 의해 아미드 결합을 형성할 수 있는 것을 들 수 있다.
링커의 상세한 예로는 다음과 같은 일반식으로 표시되는 것을 들 수 있다: -S-X-CO-
상기식에서 X는 스페이서 기이다.
X는 (1-6C)알킬, 페닐 및 (1-4C)알킬페닐기로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기에 의해 임의로 치환된 직쇄의 알킬기; (1-6C)알킬, 페닐 및 (1-4c)알킬 페닐로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기에 의해 임의로 치환된 의해 임의로 치환된 알킬부를 갖는 (1-4C)알킬페닐기 이때, 페닐고리는 할로겐, (1-4C)알킬 및 (1-4C)알콕시로부터 선택된 치환기를 함유할 수도 있다.
일반적으로, X는 상기 언급한 것들로부터 선택된 치환기를 포함하는 알킬기인 것이 바람직하다.
예를 들면, X는 (1-6C)알킬 사슬을 포함할 수 있으며, 이것은 (1-4C)알킬 및 페닐로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기에 의해 임의로 치환된(특히 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸에 의해 치환된 경우) 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 및 부틸렌기를 들 수 있다.
X의 특별한 예로는, X가, 상기 정의한 것 중 1 또는 2개의 기에 의해 임의로 치환된 메틸렌 또는 에틸렌기인 경우를 들 수 있다.
1 또는 2개의 메틸기에 의해 치환된 또는 비치환된 에틸렌기, 특히 하나의 메틸기 치환된 에틸렌기인 X가 바람직하다.
본 발명의 바람직한 접합물은 하기와 같은 일반식으로 표시되는 접합물을 포함한다:
상기식에서, A는 한 독소부 및 표적 세포 결합부이며, B는 다른 독소부 및 표적 세포 결합부를 포함하는 데 이때 표적 세포 결합부는 하나 또는 그 이상의 독소부를 전달할 수 있으며; S1은 A상에 존재하는 황이고; NH는 B상에 존재하며; S2-X-CO는 링커로서, S2는 황 원자이며; X는 앞서 정의한 바와 같다.
S는 A상의 티올기로부터 유래된 것임을 숙지해야 한다.
링커가 비대칭 중심을 함유하고 있을 때 이는 광학적 활성형 또는 라세믹 형태 중에 존재하고 분리될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 본 발명은 링커의 광학적 활성 형태 또는 라세믹 형태의 용도를 포함한다. 광학적 활성형태의 합성은 당 분야에 공지된 유기 화학의 표준 방법을 이용하여 실시할 수 있다.
A는 독소부이며 B는 표적 세포 결합부를 포함하는 것이 바람직하다.
앞서 언급한 바와 같이, 독소부는 세포 독성을 소유하고 있는 임의의 성분을 포함할 수 있다. 그러한 성분의 예로는 리보좀을 불활성화시켜서 단백질 합성을 억제할 수 있는 폴리펩티드를 들 수 있다. 좀 더 상세한 예를 들면 천연적인 폴리펩티드 및 그러한 폴리펩티드의 성분들을 들 수 있다. 이러한 폴리펩티드가 독소 성분 및 본질적으로 비-독성인 성분을 포함할 때 독소부가 독소 성분을 포함하는 것이 편리하다. 예를 들어, 독소부가 리신을 포함할 수도 있으나 독소부가 리신의 A-사슬을 포함하는 것이 편리하다. 독소부는 세포 독성을 갖고 있는, 천연적으로 발견되는 폴리펩티드의 부분 또는 유사체를 포함할 수도 있다. 독소부에 사용될 수 있는 적합한 폴리펩티드 및 그 제조 방법은 “새로운, 리보좀 불활성화 단백질” - Stripe F 및 Barbieri. L. FEBS 3269 및 상기 문헌에 수록된 참고 문헌에 제시되어 있다. 독소부에 사용될 수 있는 특히 적합한 폴리펩티드에는 리신의 A-사슬(리신 A), 레스트릭독소 및 쉬가(shiga) 독소가 포함된다. 독소부에 사용될 수 있는 다른 적합한 폴리펩티드로는 아브린, 비스쿠민, 모데신, 볼켄신, 겔로닌, 포크위드 항바이러서 단백질, 사포린, 루핀, 트리코산틴, 발리 리보좀 불활성화 단백질, 디안틴스, 비오딘, 모모르딘, 트리틴, 도데칸드린, α-사르신, 미토겔린, 디프테리아 독소, 슈도모나스 엑소독소 A 및 “쉬가형”독소, VT1 및 VT2를 들 수 있다.
천연적으로 발견되는 폴리펩티드의 유사체로는, 세포 독성의 활성이 손실되지 않을 정도의, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 변화(결실, 첨가, 치환)된, 천연 폴리펩티드와 연관이 있는 1차 구조를 가진 폴리펩티드를 들수 있다. 그러한 유사체의 상세한 예로는 표적 세포 결합부에 대해 변화된 것이나 또는 변화를 용이하게 하는 결합을 이룬 것을 들 수 있다.
독소부가 천연 폴리펩티드 또는 그 한 부분을 포함할 때, 그러한 독소부는 천연원으로부터 폴리펩티드를 분리함으로써 제조될 수 있으며, 일부분은 필요로하는 경우에는 분리된 폴리펩티드를 화학적 수단, 예를 들면 효소를 이용함으로써 변형시킬 수 있다. 이러한 폴리펩티드 또는 그 일부는 유전 공학적 기술에 의해 제조될 수도 있다. 상기 기술은 목적하는 폴리펩티드를 암호화는 DNA 서열을 적합한 벡터 또는 플라스미드에 통상적으로 삽입시키는 재조합 DNA 기술이다. 벡터 또는 플라스미드에 의해 형질 전환된 숙주 세포는 DNA 서열을 형질 발현시키며 폴리펩티드를 생성하기에 적합한 조건에서 배양할 수 있다.
독소부는 리신 A, 그 일부 또는 그 유사체를 포함하는 것이 바람직하다. 독소부가 리신 A를 포함할 때, 이러한 리신 A는 리시니스 코무니스 또는 “카스터콕” 식물의 종자로부터 수득할 수 있다. 그러나 A 사슬 또는 리신은 유전 공학적 기술에 의해 제조하는 것이 바람직하다. 따라서 재조합 리신 A 또는 리신이 바람직하다.
재조합 DNA 기술에 의해 수득된 리신 A에는 리신의 B-사슬이 혼탁되어 있지 않고, 이러한 방식으로 제조된 리신 A는 글리코실화되어 있지 않으므로 천연원으로부터 수득하는 것이 바람직하다. 따라서, 재조합 리신 A의 사용은 구분없이 결합하는 B-사슬이 결여되어 있고, 세포 표면과 비-특이성 상호 작용을 나타낼 수 있는 당 부분이 결여되어 있으므로 좀 더 선택적인 접합물을 유도하게 되었다.
바람직한 구체예를 살펴보면, 본 발명의 접합물은 결장 직장 종양 세포에 선택적인 표적 세포 결합부를 포함한다.
상기 표적 세포 결합부는 C242 항체 또는 그 단편, 특히 C242 항체를 포함하는 것이 바람직하다.
독소부 및 표적 세포 결합부는 3-메르캅토부티르 라디칼, C-CO·CH2·CH(CH3)-S-를 통해 결합되는 것이 바람직하다. 상기 라디칼은 표적 세포 결합부 상의 NH 기(예, 리실 잔기의 NH) 사이의 공유 결합 및 독소부상의 티올기(예, 리신 A의 시스테인 잔기상의 티올기) 사이의 이황화 결합에 의해 표적 세포 결합부에 결합되는 것이 용이하다.
따라서, 특히, 본 발명은 C242 항체 및 재조합 리신 A를 포함하는 면역 독소를 제공하는 것으로서, 이 때 C242 상의 아미노 잔기는 3-메르캅토 부티르 라디칼-COCH2CH(CH3)-S- 에 의해 리신 A의 시스테인 잔기의 티올에 연결된다.
바람직한 면역 독소는 C242의 리실 잔기의 말단 아미노기가 3-메르캅토부티르산 디라디칼에 의해 리신의 시스테인 잔기의 말단 티올기에 연결된 C242 항체 및 재조합 리신 A를 포함한다.
일반적으로, 각각의 항체 유니트는 적어도 하나의 리신 A 유니트를 부를 전달할 수 있음을 숙지해야 한다. 이들 부가적인 링커부는 비-독성분자, 예를 들면 시스테인을 포함할 수 있다. 그러므로 그러한 링커들은 비-독성 분자에 의해 “캡화(capped)”될 수 있다.
본 발명의 면역 독소는 위장 종양, 특히 결장 직장 또는 췌장 종양을 치료하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 앞서 정의된 접합물의 효과적인 양을 사람과 같은 온혈 동물에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법도 제공한다.
투여량 및 투여 요법은 사용된 독소부의 특성, 표적 세포 분포도 및 환자의 조직에 따라 달라질 수 있다. 투여되는 접합물의 투여량은 환자 체중 1kg당 0.1 내지 1mg인 것이 통상적이다.
본 발명의 접합물은 약학적 형태로 투여되는 것이 통상적이다. 따라서 본 발명은 약학적-허용 부형제 또는 담체와 혼합된 형태의 접합물(상기 정의된 것)을 포함하는 약학적 조성물도 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 일반적으로 본 발명의 접합물은 비경구적, 바람직하게는 정맥내로 투여될 수 있다. 비경구적 약학 조성물은 주사로 투여하기에 적합한 단위 투여 형태로 제형화 할 수 있다. 따라서, 특히 적합한 조성물에는 약학적 허용 비경구 담체 또는 부형제와 혼합된 독소의 용액, 유화액 또는 현탁액이 포함된다. 적합한 담체 또는 부형제로는 수용성 담체(예, 물 또는 식염수) 또는 비-수용성 담체(예, 고정된 오일 또는 리포좀)를 들 수 있다. 상기 조성물은 조성물내에서 접합물의 안정성을 향상시킬 수 있는 제제도 포함될 수도 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 트윈(Tween)과 같은 완충액을 포함할 수도 있다. 접합물의 농도는 달라질 수 있으나, 일반적으로 접합물은 약 1 내지 10mg/투여용량의 농도로 제형화된다.
결장직장 종양 세포에 선택적인 C242 항체 및 상기 항체가 삽입된 접합물은 결장직장 종양 세포에 선택적인 강력한 면역독소임이 밝혀졌다.
특히, 본 발명의 바람직한 접합물은 결장직장 종양 세포 및 효능에 모두 선택적인 매우 효과적인 면역독소임이 밝혀졌다. 또한, 상기 접합물은 혈액제거 속도 및 세포의 절단 및 파괴 속도가 비교적 낮으므로 높은 혈장 존속을 초래한다. 이는 제거 및 파괴가 일어나기 전에 면역독소를 그 표적세포와 충분한 시간 동안 접촉시킬 수 있는 강력한 장점을 갖고 있다.
또한, 본 발명은 앞서 정의된 것과 같은 접합물의 제조 방법을 제공한다 : - (a) 표적 세포 결합부가 독소부에 직접 접합물에 있어서는 독소부를 표적 세포 결합부와 반응시킨다.
예를 들어, 표적 세포 결합부가 이황화 결합을 통해 독소부에 결합된 경우에는 한표적 세포 결합부 및 독소부를 다른 표적 세포 결합부 및 독소부와 반응하기 이전에 디티오트레이톨 등을 이용하여 환원시킬 수 있다.
표적 세포 결합부가 링커에 의해 독소부에 결합된 접합물의 경우에는, 링커에 의해 유도된 표적 세포 결합부를 독소부와 반응시키거나, 또는 링커에 의해 유도체화된 독소부를 표적 세포 결합부와 반응시킨다.
적합한 부는 링커와 상기 부에 결합될 수 있도록 링커제제와 반응시킴으로써 유도체화 된다. 유도체화된 표적 세포 결합부는 독소부와 반응하는 것이 용이하다.
유도체화된 표적 세포 결합부 또는 유도체화된 독소부는, 예를 들어, 적합한 완충액(예, 아세테이트완충액, 포스페이트완충액 또는 보레이트 완충액)내에 상기 독소부를 용해하고 pH를 링커제제에 적합하도록 조절함으로써 제조될 수 있다. 이어서 상기 링커제제를 상기 반응 혼합물에 첨가한다. 링커제제가 반응 혼합물내에서 불용성인 경우에는, 적합한 표적 세포 결합부 또는 독소부의 용액을 소량의 유기 용매(예, 디메틸설폭시드 또는 디메틸포름아미드) 중의 링커제제의 용액에 첨가할 수 있다. 링커 제제와의 반응 후 겔 여과, 투석 또는 컬럼 크로마토그래피와 같은 표준 방법에 의해 유도체화된 생성물을 분리할 수 있다. 그후, 상기 유도체화된 생성물(유도된 표적 세포 결합부 또는 유도된 독소부)을 다른 부와 반응시켜 최종 접합물을 생성한다.
사용된 링커제제와 정확한 특성은 접합에 사용될 수 있는 표적 세포 결합부 및 독소부상의(예, 티올, 카르복시 또는 아미노)의 특성에 달려 있다.
상기 독소부는 천연원으로부터 제조될 수 있다. 독소부는 재조합 DNA 방법에 의해 재조하는 것이 바람직하다. 상기 방법은 당 분야의 숙련자들에게 잘 알려진 기술을 사용하며, mRAN를 추출하고, cDNA 라이브러리를 제조하며, 벡터를 제조하고, 세포를 형질전환시키며, 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여 독소 폴리 펩티를 형질발현시키는 과정을 포함한다. 목적하는 독소부를 형질발현 시키기에 적합한 숙주에는 원핵세포(예, E.coli) 및 진핵세포(예, 효소)가 포함된다. 이러한 과정하기 제시되는 접합물의 제조방법에 나타나 있다.
일반적으로, 표적 세포 결합부는 항체 또는 항체단편 또는 유도체를 포함한다. 항체는 단일클론 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 항체는 당 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들은 혈청, 비장 및 항체를 분비하는 하이브리도마로부터 분리할 수 있다.
항체의 제조방법은, 예를 들어, Methods in Enzymology, 178권, “항체, 및 분자의태”, J. Langone에 의해 편집, 아카데미 출판사(특히, 섹션 II : 유전 공적 항체 참고); 및 Methods in Enzymology 73권, “면역화학적 방법 파트 B” Langone 및 H Van Vunakis에 의해 편집됨, 아카데미 출판사(특히, 섹션 I: 항생성참고).
링커가 -S-X-CO-의 기를 포함하는 경우에 있어서, 항체(또는 독소부)는 일반식 L1-S-X-CO-L2(이때, L1및 L2는 치환가능기)의 화합물과의 반응에 의해 유도체화될 수 있다. 예를 들어, CO-L2는 카르복실산 기 또는 바람직하게는 활성화된 카르복실산기를 포함한다. 예를 들어, CO-L2기는 에스테르 또는 무수물기를 포함할 수 있다. L2의 구체적인 예로는 이미다졸릴기를 또는 숙신이미딜 에스테르기를 포함한다. L1은 티오기의 산화시 치환되는 기로서 피리딘기 일 수 있다. 일반적으로 링커는 항체 또는 독소부(바람직하게는 독소부)상에서 환원된 티올기와 반응한다.
다른 링커들이 사용되는 경우, 이들은 당 분야에 공지된 방법에 의해 항체 및 독소부와 반응한다. 일반적으로, 링커는 표적 세포 결합부 및 독소부는 공유 링커(예, 이황화결합)를 형성함으로써 직접 결합될 수 있다.
독소부가 시스테인 잔기와 같은 설프히드릴기를 갖고 있을 때, 이는 접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이는 표적세포 결합부 또는 링커상의 설프히드릴기와 이황화 결합을 형성하는데 사용될 수 있다. 설프히드릴기가 독소부에 존재하지 않는 경우에는, 그러한 기를 제공하여 접합을 용이하게 할 수 있도록 유도체화될 수 있다. 이러한 유도체화는 아미노티올란과 같은 것을 이용함으로써 실시할 수 있다.
폴리펩티드 링커가 사용된 경우에는, 링커를 독소부 및 표적 세포 결합부상 의 자유 카르복실기 또는 아미노기와 반응시킬 수 있다.
독소부가 리신 A-사슬을 포함하고 있으며 링커 디라디칼 -COCH2CH(CH3)-S-를 포함할 때의 적합한 링커제제는 N-숙신이미딜-3-(20피리딜디티오)부티레이트이다. 이와 같은 면역독소를 제조하기 위한 바람직한 방법에는 유도체화된 표적 세포 결합부를 환원된 리신 A와 반응시키는 단계가 포함된다.
표적 세포 결합부는 커플링제(예, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티오)-부티레이트)와 반응시켜 유도체화한 후, 디티오트레이톨과 같은 적합한 환원제로 리신의 A-사슬을 처리하여 자유 시스테인 기상의 티올기를 환원시킨다.
유도체화된 표적 세포 결합부에 하나 이상의 링커가 결합되도록 과량의 링커 제제를 사용하는 것이 용이하다. 리신 A와의 반응 후 리신 A에 결합되지 않은 임의의 링커기는 시스테인과 같은 차단기와의 반응에 의해 캡화시키는 것이 통상적이다.
본 발명의 접합물은 종양을 치료하는데 있어서 매우 유용하다. 이는 상기 접합물이 시험관내에서 종양세포 중의 단백질의 합성을 억제할 수 있으며 및/또는 생체내에서 종양의 크기 또는 성장을 감소시킬 수 있다는 것에 의해 입증된다. 적합한 시험 프로토콜은 하기에 상세히 제시되어 있다.
본 발명은 특별한 언급이 없는한 후술하는 비-제한적 실시예에 의해 예시된다 : (i) 증발과정은 진공내에서의 회전 증발에 의해 실시했다 : (ii) 본 발명은 실온, 즉 18 내지 26℃의 범위에서 실시되었다; (iii) 수거율은 단지 예시하기 위하여 제시한 것이며, 과정을 전개시킴으로써 얻을 수 있는 최고치일 필요는 없다.
(v) 양성자 NMR 스펙트럼은 테트라메틸실란(TMS)을 내부 표준물로 이용하여 이중수소화된 디메틸 설폭시드 용매내에서 200MHz에서 통상적으로 측정되었으며 다음과 같은 약어를 이용하여 TMS에 대한 상대치(ppm: parts per million)로 화학적 전이값(δ값)으로써 표현되었다: s, 단일; m, 다중; t, 삼중; br, 광범위; d, 이중.
(vi) 하기 약어가 사용되었다 : BAS-소 혈청 알부민
PBS-인산염 완충 식염수
IPTG-이소프로필티오-β-갈락토시드
EtOH-에탄올
SDS-PAGE-소듐 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔
전기영동(PAGE)
[리실 A/C242 면역독소의 제조 방법]
단일 클론항체 C242(200mg)를 4.4 mg/ml로 인산염 완충 식염수(인산나트륨/150mM 염화나트륨 pH 7.2) 중에 용해시킨 용액을 4℃에서 멥브레인 여과법(Amicon YM10 멤브레인)을 사용하여 12mg/ml로 농축시켰다. 이 농축물을 0.5부피의 붕산염 완충액(100mM 붕산나트륨 pH 9,1)으로 희석했다. 280nm에서 흡광도를 모니터하여 단백질 농도를 정량하였으며, 이 혼합 용액의 pH는 8.8 +/- 0.1인 것으로 나타났다.
N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트(“링커”)를 무수 상태의 재증류된 디메틸포름아미드 또는 아세토니트릴 중에 10mg/ml 농도로 용해시켰다. 3.52mg의 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트를 함유하는 상기 용액의 표본액(0.352ml)을 상기 항체의 농축 용액에 직접 첨가했다. 얻어진 용액을 혼합한 후 15℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 그후 이 용액을 탈염용 컬럼(G25 세파덱스-Pharmacia, 2.6 x 58cm, 유속 2ml/분 50mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨/1mM EDTA pH 8.0으로 평형시킨 것)에 가하여, 과량의 시약을 제거하고 유도체화된 항체를 완충 교환했다. 선택적으로, 본 반응 생성물을 교차 흐름 여과법(crossflow filtration)으로 제거할 수 있다. 탈염된 항체 유도체는 혼주시켜, 280nm에서 흡광도를 조사함으로써 그 단백질 농도를 정량했다. 링커를 갖는 유도체화정도는 과량의 디티오트레이톨을 첨가하고, 343nm에서 유리 티오피리딜기가 방출되는 것을 모니터함으로써 측정되었다. 유도체화 정도는 항체 각 몰당 4내지 6개의 링커기를 갖는 것으로 밝혀졌다.
재조합 리신 A는 pH 8의 인산염 완충액 중의 리신 A 용액을 과량의 디티오트레이톨로 처리시키고, 교차 흐름 여과법으로 농축시켜 환원시켰다. 과량의 시약은 컬러크로마토그래피(G25 세파덱스-Pharmacia, 2.6 x 58cm, 유속 2ml/분, 50mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨/1mM EDTA pH 8.0 중에서)에 의해 제거된다.
유도체화된 항체(190mg) 용액과 제조된 재조합 리신 A(190mg) 용액을 리신 A/유도체화된 항체비가 1:1(w/w)이 되도록 혼합함으로써 유도체화된 항체에 재조합 리신 A를 접합시켰다. 글리세롤을 20% v/v로 가하고, 용기를 아르곤으로 퍼어지시켰다. 얻어진 용액을 40 내지 65시간 동안 15℃에서 유지시켰다.
항체상에 존재하는 과량의 링커기를 캡핑하기 위해, 시스테인을 0.2mM의 최종농도(및 항체상에 존재하는 링커기에 대해 적어도 10배몰 과량으로)로 첨가했다. 이 용액을 혼합하고 20℃에서 2-3시간 동안 유지시켰다. 시스테인으로 캡핑한 후, 얻어진 면역독소 시료를 과량의 디티오트레이톨로 처리하고 반응 완결 시점을 정하기 위해 343nm에서 모니터함으로써 분석했다.
그후 접합체를 함유한 용액을 멤브레인 여과법(Amicon Ym10 멤브레인)으로 농축하고, 크로마토그래피 컬럼(HR300 세파크릴-Pharmacia, 2.6 x 50cm, 유속 3ml/분 인산나트륨 50mM 완충액/25mM 염화나트륨/1mM EDTA)에 가해 접합되지 않은 리신 A로부터 면역독소와 비접합항체를 분리했다. 면역독소와 항체로 구성된 혼합물을 함유한 피크를 혼주시키고, 단백질 농도를 280nm에서의 흡광도 측정법으로 정량했다.
얻어진 용액은 비접합 항체와 면역 독소를 모두 함유하며, 이 용액에 1M HCl을 첨가해 pH 6.3으로 조정한 후 트리아진 염료 매트릭스(Minetic A6 XL, 영국, 캠브리지, ACL plc, 8 x 26cm 컬럼, 유속 1.5ml/분)를 함유하는 컬럼에 적용했다. 이 컬럼을 100ml의 출발 완충액으로 세척하고, 0.5M 염화나트륨을 함유하는 출발 완충액으로 비접합 항체와 면역독소를 용출시켰다. 상기 면역 독소용액을 인산염 완충 식염수에 대해 투석시키고, 0.22 미크론 필터를 통해 여과시킨 후 4℃에서 보관했다.
면역 독소의 순도는 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동법으로 측정되었고, 하기 조성을 갖는 총 45mg의 면역독소가 함유되어 있었다 : 50 내지 60% 모노리신 A유도체, 10 내지 30%의 디 리신 A유도체, 5 내지 15% 트리 리신 A유도체와 <10% 비유도체화된 항체.
선택적으로 겔여과 단계(잔류 γ-리신 A의 제거)와 염료 친화 크로마토그래피 단계(잔류 C-242 항체의 제거)를 정제 단계에 사용할 수도 있다. 이 방법의 변형에서 미반응 링커부를 시스테인으로 차단한 직후(전술함). 접합 혼합물을 전도도가 5mS 이하가 되도록 증류수로 희석했다. 그후 pH를 1M 아세트산으로 6.0이 되도록 조정하고, 이 용액을 멤브레인 여과법으로 청징시켰다. 이 용액을 염료 리간드 컬럼(상기 접합 혼합물 중에 사용된 γ-리신 A 1mg당 2.5ml 겔)에 적용하였다. 이 컬럼을 0.68% 아세트산 나트륨 pH 6.0으로 세척하되, 비접합된 C242 항체가 컬럼으로부터 세정되어 제거될 때까지 세척한다. 그후 면역독소와 잔류 γ-리신 A를 이 컬럼으로부터 염화나트륨 농도와 관련하여 0.5M, pH 7.0에서 인산나트륨 완충액 20mM 중에서 용출시켰다. 이 용출액을 나선형 카트리지 한외여과 시스템을 사용해 교차 흐름 여과법으로 농축시키고, 이를 세파크릴 S300HR 컬럼(최초 접합 반응에 사용된 항체 각 mg당 2.5ml 겔 및 상기 컬럼의 총부피의 5%미만 부피로)에 적용시켰다. 이 컬럼을 인산염 완충 식염수 pH 7.2 같은 적절한 조성의 완충액으로 평형화 시킬수도 있다.
[링커부의 제조 방법]
상기 사용된 N-숙신이미딜(R)-3-(2-피리딜 디티오)부티레이트는 하기 과정에서 제조되며, 이 과정에서 특별한 언급이 없는한 이하 기술하는 바가 적용된다: (i) 증발은 진공하에서 회전 증발로 실시되었다 ; (ii) 작업은 실온, 즉 18-26℃에서 실시되었다 ; (iii) 수율은 설명할 목적으로 제시한 것일뿐, 본 방법을 실시함으로써 얻을 수 있는 최대치는 아니다 ; (v) 양성자 NMR 스펙트럼은 용매로서 중수소화시킨 클로로포름 중에서, 내부 표준 물질로 테트라메틸 실란(TMS)을 사용해 270MHz에서 측정되었고, TMS에 대해 ppm 단위로 화학적 전이(델타 값)를 표시하되 주요피크를 표시하는 데는 통상의 약어를 사용했다 ; s, 단일 ; m, 다중 ; t, 삼중 ; br 브로드 ; d, 이중.
[N-숙신이미딜(R)-3-(2-피리딜디티오)부티레이트]
(R)-3-(2-피리딜디티오)부티르산(90.0g, 0.393몰)을 실온에서 교반하에 디클로로메탄(630ml) 중에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(45.2g, 0.393몰, 1.OAHF 당량)를 첨가하고, 이 혼합물을 디클로로메탄(90ml)으로 세척했다. 이 혼합물을 -2℃로 냉각하면서 30분간 교반했다. 디클로로메탄(540ml) 중의 디시클로 헥실카르보디이미드 용액(81.08g, 0.393몰, 1.0몰 당량)용액을 0℃±2℃의 반응 온도를 유지하면서 35분을 한주기로 하여 가하고, 이 혼합물을 디클로로메탄(90ml)으로 세척했다. 이 용액을 3시간 15분 동안 0-10℃의 온도에서 교반한 뒤 실온에서 가온했다. 이 용액을 여과해 디시클로헥실 우레아 고체를 제거하여, 이 고체를 디클로로메탄(180ml x 2)으로 세척했다. 여액을 20-22℃, 감압하에 증발시켜 갈색 오일(150g)을 수득했다. 이 오일을 톨루엔/에틸 아세테이트 80:20(v/v) 중에서 제조된 Kieselgel 60 실리카겔 230-400메쉬 컬럼(1180g)상에서 크로마토그래피로 정제했다. 톨루엔/에틸 아세테이트(80:20 v/v)로 용출하고, 28℃, 진공(0.25mbar)하에 증발시킨 후 엷은황색 검상태의 N-숙실이미딜(R)-3-(2-피리딜디티오)부티레이트(52g)를 수득했다.
NMR : 1.5(d,3H), 2.85(m,4H), 2.8(dd,1H), 32.(dd,1H), 3.5(m,1H), 7.1(m,1H), 7.7(m,2H), 8.5(d,1H)
전자 충격 질량 스펙트로 스코피에 의하면 상기 화합물이 분자량 326이며, 단편화한 결과 N-숙신이미딜-(R)-3-(2-피리딜디티오)부티레이트의 구조와 일치했다.
출발물질은 다음과 같이 제조되었다 : -
a. (R)-3-히드록시 부티르산
메틸(R)-3-히드록시부티레이트(1.670Kg, 14.152몰)를 얼음/에탄올 배스중에서 냉각시켰다. 몰(4698ml)을 가한후, 47% w/w 수산화나트륨 (965ml, 16.98몰, 1.2몰 당량)을 온도가 0℃±2℃로 유지되도록 하는 속도로 첨가했다. 이 반응 혼합물은 0℃에서 추가로 1시간 30분 동안 교반했다.
진한 염산(1490ml, 17.28몰, 1.22몰 당량)을 35분 동안 상기 반응 혼합물에 첨가하여 최종 pH를 1.5로 만들되, 온도는 5℃ 또는 그 이하를 유지시킨다. 그후 이 반응 혼합물에 염화나트류(1061g)을 부가하고, 이 수성 혼합물을 메틸 3급-부틸 에테르(10 x 3.5l)로 추출했다. 이 추출물들을 합한 뒤, 용매는 실온 진공하에 증류 제거하고 잔사를 수득했다. 이 잔사를 톨루엔(7.5l)과 혼합하고, 휘발성 물질은 진공하에 증류제거하여 유분상태의 (R)-3-히드록시 부티르산(1189g, 81%)를 얻었다. 이 오일을 4℃로 냉각하고 시이드(seed)시켜 고체를 수득했다.
b. (S)-β-부티로 락톤
(R)-3-히드록시 부티르산(530g, 5.096몰)을 트리에틸 오르토 아세테이트(1322.8g, 1488ml, 8.154몰, 1.6몰당량)와 25-30℃에서 혼합하여 혼탁한 용액을 수득했다(이 혼탁도는 전단계에서 잔류한 염화나트륨 때문인 것으로 사료된다).
이 용액을 고압 진공(1.0mm)하에 30℃에서 증발시켜 휘발성 물질을 제거했다. (2S,6R)-2-에톡시-2,6-디메틸-1,3-디옥산-4-온을 함유하는 잔류 액체(1001g)를 80℃에서 2시간 동안 가열한 후, 40℃로 냉각했다. 조생성물을 유리 라스치크 링(Raschig rings)이 팩킹된 유리 컬럼(50cm x 3.5cm 직경)을 통해 정제시켜 10-12mbar에서 비등점이 59-62℃인 (S)-β-부티로락톤(57.3g)을 수득했다.
c. (R)-3-메트캅토 부티르산
(S)-β-부티로락톤(91.12g, 1.058몰)을 질소하에 교반하면서 5℃로 냉각시켰다. 온도를 5℃로 유지하면서, 티올 아세트산(80.57g, 75.65ml, 1.058몰, 1.0몰 당량)을 가했다. 그후 트리에틸아민(146.7ml, 1.058몰, 1.0몰 당량)을 45분 동안 첨가하고, 이때 반응 온도는 -5℃ 내지 5℃를 유지시켰다. 냉각 배스를 제거하고 온도를 65℃로 올리면 황색/오렌지색 용액이 얻어진다. 이 반응 혼합물을 10℃로 냉각하고 밤새 실온에서 교반했다. 이 용액을 0℃로 냉각하고 물(93ml)을 첨가했다. 이 혼합물을 다시 -10℃로 냉각한 후, 수산화나트륨 용액(수산화나트륨 47% w/w 185ml와 물 92ml)으로 처리하되, 이때 온도를 -10 내지 +10℃로 유지하는 속도로 상기 수산화나트륨을 첨가했다. 이 혼합물을 -5℃에서 1시간 반동안 교반한 후 실온에서 가온했다. 이 혼합물을 메틸 3차-부틸에테르(265ml)로 세척했다. 수성층을 물(185ml)로 세척한 뒤 0℃로 냉각하고, pH가 1-2가 될 때까지 0-10℃에서 진한 염산(270ml)으로 처리했다. 이 수성 혼합물을 메틸 3차-부틸 에테르(2 x 265ml)로 추출했다. 유기 추출물을 합하고, 물(265ml)로 세척한 뒤, 과량의 무수 황산 마그네슘으로 탈수시킨 후 감압하 30℃에서 증발시켜 오렌지색 오일(132.8g)을 수득했다. 이 오일을 진공 증류시켜 정제함으로써 (R)-3-메르캅토 부티르산(86.6g)을 수득했다(2mbar에서 비등점 96-100℃).
d. 피리딘-2-설페닐 클로라이드
2,2′-디피리딜 디설파이드(110.0g, 0.5몰)를 실온에서 디클로로메탄(800ml) 중에 용해시켜, 엷은 황색 용액을 수득하고, 이를 0℃로 냉각시켰다.
이 용액내로 염소기체를 버블링시키고, 0-5℃로 유지시켰다. 3시간 25분 후, 이 용액을 염소로 포화시키면 황갈색이 나타났다. 이 용액을 감압하 0-5℃에서 농축시켜 과량의 염소를 제거하면, 황색 고체 상태의 피리딘-2-설페닐 클로라이드가 침전된다. 이 고체(11.8g)를 여과 수거하고, 디클로로메탄으로 세척했다. 이 디클로로메탄 여과액(1624g)은 또한 133g의 피리딘-2-설페닐 클로라이드를 함유하고 있다.
e. (R)-3-(2-피리딜디티오)부티르산
피리딘-2-설페닐 클로라이드(상기에서 제조된 디클로로메탄 중의 용액 1035g과 황색 고체 11.8g, 총 0.667몰, 1.0몰 당량)를 디클로로 메탄(50ml)으로 희석했다. 이 혼합물을 5-10분동안 실온에서 교반한 후 -5℃로 냉각시켰다. 디클로로메탄(400ml) 중의 (R)-3-메르캅토 부티르산 용액(80.0g, 0.667몰)을 부가하고, 이때 온도는 -5℃ 내지 0℃를 유지시켰다. 이 혼합물을 실온에서 밤새 교반하여 갈색 오일과 황색 상부층을 얻었다. 이 혼합물에 물(485ml)을 부가한 후 5℃로 냉각하고, pH가 4.55가 될 때까지 2N 수산화나트륨 용액(385ml)으로 처리했다. 디클로로메탄층을 분리하고, 남은 수성층을 디클로로메탄(200ml)으로 추출했다. 디클로로메탄 추출물을 합하고, 과량의 무수 황산 마그네슘으로 탈수한 후, 감압하에 증발시켜 밝은 갈색 오일을 수득했다. 이 오일을 헥산(325ml)과 함께 격렬하게 교반시킨 후 고체가 형성될 때까지 얼음 배스 중에서 냉각시켰다. 이 혼합물을 3시간 동안 교반한 후 갈색 결정고체를 여과 수거하고, 헥산(2 x 162ml)으로 세척한 후 밤새 실온에서 진공 건조시켜 (R)-3-(2-피리딜디티오)부티르산(140g)을 수득했다.
NMR : 1.45(d,3H), 2.6(dd,1H), 2.8(dd,1H), 3.4(m,1H), 7.1(m,1H), 7.7(m,2H), 8.5(m,1H).
[C242 항체(C242:II)의 제조 방법]
[하이브로도마 셀라인의 제조 및 C242:II의 제조]
[주화된 비장 세포의 제조]
사람의 결장 직장암 셀라인 COLO 205(미합중국, 메릴랜드주, 록크빌에 소재하는 미합중국 모식균 배양 수집소로부터 기탁번호 CCL 222호로 시판되고 있음)을 10% 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 아이스코프의 MEM 배지 중에서 통상적인 방법으로 배양했다. 융합단계전에 세포들을 수거하는데 통상 계대 배양 2 내지 3일후에 수거하여, 면역화시키기 위해 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척했다.
4 내지 6주령의 BALB/C 마우스는 인산염 완충 식염수 용액 O.1ml 중에 현탁시킨 3 x 107COLO 205 세포의 초기용량을 복강내 주사하여 면역화시켰다. 이 동물은 3 x 107COLO 205 세포의 0.1ml 현탁액을 추가 주사하여 추가 항원 자극시켰고, 4일후 치사시켜 비장을 수거했다. 그후 비장을 단일 세포 현탁액으로 분리시켰다.
[하이브리도마의 제조]
상술한 세포 현탁액으로부터 1.2 x 108비장 세포를 2개의 튜브로 나누었다. 각 튜브에 추가로 마우스 골수 셀라인 Sp 2/0(미합중국 모식균 배양 수집소(ATCC)에서 기탁번호 CRL 1581 하에 시판)으로부터 얻은 108골수세포를 부가했다. 이 두 개의 튜브를 원심분리하고, 모든 액체를 따라 버렸다. 그후 각 튜브에 일정하게 교반하면서 1분간 느린 속도로 2ml의 37℃ PEG 용액(PEG Mw 4000 10g, 1ml의 DMSO와 10ml의 모노클론 식염수)을 부가했다. 이 튜브들을 37℃ 수조로 옮겨 90초간 서서히 교반했다. 융합단계는 각 테스트 튜브에 하기 순서로 생리적 완충 용액을 부가함으로써 중단시켰다 : 처음 30초간 2ml, 다음 30초간 6ml, 다시 1분간 32ml. 상기 세포 배양 배지 중의 세포 현탁액을 세척한 후, 히포크산틴/아미노프테린/티미딘(HAT)이 보충된 배양 배지 총 100ml 중에 현탁시켰다. 이 배양 배지는 10% FCS, L-아스파라긴(36 mg/l), L-아르기닌-HCl(116mg/l), 엽산(10mg/l), L-글루타민(292.3mg/l), 소듐 피루베이트(110.1mg/l)와 케르캅토 에탄올(3.49㎕/l)이 보충된 아이스코프 MEM이다. 50㎕식의 표본 샘플들을 96-웰 조직 배양 접시의 웰에 가했다. 이 웰을 HAT 보충 배양 배지 중의 BALB/C 마우스(2 x 104세포/ml)로부터 얻은 마크로파아지 현탁액 250㎕로 사전 피복시켰다. 배지는 융합 6일후 교환했다.
[항체 하이브리도마의 선별]
상기 6일 경과후에 폐배지를 Kennett R.H에 의해 “폴리비닐 클로라이드 플레이트에 결합된 세포로 효소-결합된 항체를 분석하는 방법”이란 제하에 기술된 방법에 따라 COLO 205 양성 항체에 대해 시험했다(Monoclonal Antibodies, Hybridomas, A new dimension in biological analyses, Eds. H.R. Kennett, T.T. Mckelvin, K.B. Bechtol, Plenum Press, New York 1980). 간단히, Nunc 면역 플레이트 IIF 유형의 웰을 2 x 105세포/웰의 COLO 205 세포(1mg/100ml PBS)로 피복했다 ; 피복 부피 50㎕. 상술한 6일 경과 경과 경과된 폐배양 배지를 상기 피복된 웰에 50㎕/웰 정도 부가했다. 실온에서 밤새 배양한 후, 1% BSA-PBS 중에 희석한 퍼옥시다제가 접합된 항-마우스 Ig(Dakopatts p260, Dakopatts A.S, 덴마크, 코펜하겐)100㎍/웰을 가하고 실온에서 밤새 배양했다. pH 5.0의 시트르산 완충액 12ml과 5㎕의 30% 과산화수소 중에 용해시킨 4개의 OPD-정제 Dako S 2000 형태의 기질을 100㎕/웰로 부가하고, 항온한 후 450nm에서 흡광도를 측정했다.
약 600개의 하이브리도마 클론을 시험했다. 처음에는 이들중 190개가 COLO 205 세포와 반응했다. 이들중 177개가 또한 노르웨이의 Nyegaard A/S로부터의 Lymphoprep 상에서 제조된 사람의 정상 임파구와 반응했으며, 이들은 버렸다. 남은 클론들중 하나에서 주화된 클론을 하이브리도마 C242로 명명하였으며, 이는 IgG1류와 같은 유형인 것으로 분류되었다. 그후 이 C242 하이브리도마를 수회의 서브클로닝 단계를 실시해 최종적으로 안정한 모노클론 항체를 생산하는 클론인 C242:II를 제조했다.
상기 C242 하이브리도마는 먼저 클로닝되어 C242:5로 명명되는 클론을 제공하였다. 이 클론은 차례로 클로닝되어 클론 C242:5:2를 형성했다. 상기 두 개의 클로닝에서, 하이브리도마 현탁액을 히포크산틴/티미딘(HT)이 보충된 배양 배지 중에 4세포/ml의 밀도로 희석시켰다. 50㎕(0.2 세포)를 HT 보충 배지 중의 Balb/c 마우스 마크로파아지 현탁액(5 x 103마크로파아지/웰)현탁액 250㎕로 사전 피복한 96-웰 베양 접시내의 각 웰에 분배했다. 2-5일후, 현미경으로 육안 조사한 결과 단일 세포클론이 검출되었다. 6일째, 배지를 교환하고, 폐 배지의 표본 샘플을 사용해 상술한 바와 같이 ELISA에 의해 사람의 정상 세포에는 결합하지 않으나 COLO 205 세포에는 결합하는 항체의 양을 분석했다. 정상세포 ELISA에서의 잔류한 음성 반응 결과 및 COLO 205 ELISA에서의 양성 반응결과 가장 우수한 클론을 선별하고 추후 실험을 위해 이를 액체 질소 중에서 바이알로 냉동시켰다.
3차 클로닝을 실시하기 위해, 세포를 해동시키고, DMEM(둘베코의 변형된 이글 배지)(5% FCS) 중에서 배양했다. 그후 세포를 웰당 3개 세포의 평균 밀도로 96-웰 조직 배양 플레이트 웰내에 접종시켰다. 5% FCS와 모세포로 사용된 마우스 대식세포를 지닌 DMEM 중에서 클로닝을 실시했다. 이 플레이트상에서 30개의 클론이 발생하였으며 그중 16개에 대해 비탁법 및 상술한 바와 같은 ELISA에 의한 항체 특이성 시험법으로 IgG 생산 여부를 시험했다. 이들 클론중 12개가 IgG를 생산함이 밝혀졌다. 그후 10개의 클론을 24-웰 조직 배양 플레이트상에 전개시키고, 그로부터 얻어진 폐 배지를 사용하여 IgG 생산 및 특이성을 시험했다. 이 선별과정으로 비교적 높은 생산성을 지닌 4개의 클론을 얻었다.
이들 4개의 클론의 최종 생산성 시험은 2중 조직 배양 플라스크내에서 실시되었다. 가장 높은 생산성을 나타내는 클론을 선택하여 C242/CL 510A1으로 명명하였다. 추후 사용을 위해 이것을 액화 질소로 동결 보관하였다.
C242/CL 510A1 클론을 1차 클로닝한 결과 마우스 IgG ELISA 시험법에 의한 흡광도가 1:1000의 희석도에서 0.1이하인 것으로 판명됨에 따라 상기 세포의 1/3은 IgG를 생산하지 않는 것으로 나타났다. 이 클론으로부터의 생산성은 일반적인 HPLC-기초 분석법에 의하면 ml당 마우스 IgG 150㎍으로 정량되었다.
클론 C242:I는 이후 96-웰 디쉬에 클로닝되어 33개의 클론을 제공하였다. 이들 모두가 IgG를 생산하였다. 이들중 5개는 모두 상술한 바와 같이 150㎍/ml 이상의 생산성을 나타내며, 이들을 혼주시켜 C242:II로 명명되는 최종 클론을 생산하였다. 이 클론은 IgG를 안정하게 생산한다. HPLC 분석 결과 C242:II의 생산성은 ml당 마우스 IgG 196㎍인 것으로 나타났다. 이 세포들을 동결 건조시키고 액화 질소 중에서 바이알내에 저장했다. 제조된 C242:II 하이브리도마 샘플은 상술한 바와 같이 ECACC에 기탁번호 90012601 하에 기탁되었다.
[C242 모노클론 항체의 제조]
상기 동결바이알로부터 상기한 바와 같이 제조된 하이브리도마의 초기 세포 현탁액을 얻었다. 세포들을 조직 배양실 내에서 2 x 104세포/ml(C242:II 하이브리도마)의 밀도로 Nunc A/S로부터 6000㎠의 총면적으로 접종시켰다. 그후 이 세포들을 아이스코프(iscove N.N.,과 Melchers F., J. Exp. Med. Vol. 147, p(923, 1978)에 의해 변형되고, 1% 겐타마이신, 1% 아미노산 보충제 및 5% 태아송아지 혈청이 보충된 DMEM 중에서 배양했다. 그후 이 세포를 8% CO2를 함유한 습윤 대기 중에서 4 내지 5일간 37℃하에 배양시켰다. 배양 말기에 세포를 계수하고, 시료를 취해 모노클론 항체의 농도를 정량했다. 세포 배양 상청액을 따라내어, 셀룰로오즈 필터를 통해 여과하여 현탁 세포들을 제거했다. 그후 상청액을 분자량 한계치가 30,000인 멤브레인을 사용하여 Millipore Pellican Ultrafiltration Cell 중에서 한외 여과시켜, 20-30배로 농축시켰다. 이 농축물로부터 시료를 취해 C242:II 모노클론 항체 농도와 항원 반응성을 분석하고, 이 모노클론 항체 농축물을 정제단계까지 -70℃로 저장했다.
[C242 단일클론 항체의 정제]
단백질 A-세파로즈 4B(스웨덴 왕국, 웁살라, Pharmacia AB의 상표명)를 이 겔의 팽창방법 및 세척 방법에 관한 제조자의 지시에 준거하여 제조하였다. 여기에 상기에서 제조된 C242:II 농축물(본원 명세서에서 간단히 C242 항체로 언급함)을 결합시키되, 결합 완충액으로 1.5 글리신-NaOH, 3M NaCl, pH 8.9를 사용하였다. 동일한 완충액을 사용하여 초기 세척한 후, 상기 친화도 컬럼을 0.1M 시트르산-NaOH, pH 5.0으로 용출시키고, C242 단일클론 항체를 pH 8.0의 Tris-HCl 1몰/l를 함유하는 튜브에 수거했다. 얻어진 항체는 그후 0.02M 인산염 완충액, 0.15M NaCl, pH 7.2, 0.2g/l의 NaN3에 대해 투석했다. 투석된 C242 항체를 분자량 한계치가 30,000인 멤브레인을 사용해 한외 여과시켜 농축했다. 샘플을 농축하고 정성 조절 분석한후 C242 단일클론을 -20℃에 저장했다.
[리신 A의 제조]
리신 A는 리신 A를 암호하는 DNA 서열을 사용하여 DNA 재조합 기법으로 제조할 수 있다. 이 서열들은 EP145, 111; O′Hare 등, FEBS Letts, 216, p73-78, 1987 ; 및 Lord 등, Eur. J. Biochem. 148, p265-270, 1985에 개시되어 있다. 리신 A를 암호하는 DNA 서열은 프로모터(예를 들어 trp 프로모터), 리보조옴 결합부위와 전사 터미네이터같은 적절한 조절 서열의 조절하에 위치 시킬 수 있다. 재조합 리신 A의 제조 방법 및 정제방법은 공고된 PCT 특허출원 WO 85/03508과 공고된 유럽출원 제237,676호에 제시되어 있다.
이하에서 재조합 플라스미드의 작제 방법을 상술하였으며, 상기 플라스미드내에는 리신-A의 암호서열이 원핵 프로모터 요소의 전사 및 번역 조절하에 위치하고 있다. 전사는 상기 메시지의 3′말단에 천연 종료 요소를 병합시킴으로써 종료되었다. 번역개시는 상기 메시지의 5′말단에 있는 DNA 서열인 리보조옴 결함 부위(RBS)에 의해 조절되었다.
작제 방법에서 천연의 리신 A 성숙 단백질의 N-말단 아미노산 잔기 2개를 치환할 필요가 있다.
재조합 리신 A를 제조하기 위해 사용된 벡터를 유도하는 방법에 관한 여러 중간 단계를 개시한다.
[실험 과정]
1. 합성 올리고 뉴클레오티드
특정 DNA 서열 변형체를 리신 유전자내로 도입하기 위해 합성 올리고 뉴클레오티드들을 사용했다. 이후 기술되는 모든 올리고 뉴클레오티드들은 0.2 마이크로몰 규모의 조절된 다공-유리 지지체에 결합된 5′-디메톡시트리틸 염기-보호된 뉴클레오시드-2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포아미다이트와 보호된 뉴클레오시드로부터 Applied Biosytsems 380A DNA 합성기상에서 Applied Biosystems Inc.에서 제공된 프로토콜에 따라 제조되었다. 각각의 올리고 뉴클레오티드들은 상기 고체 지지체로부터 절단되어 모든 보호기를 제거한후 몰(1ml) 중에 용해되고 260nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정했다.
2. 효소 및 숙주 균주
각종 제한 엔도뉴클레아제 및 DNA 변형 효소가 후술되는 조작 과정에서 사용되었다. 이들은 여러 공급자들(Amersham International, Bethesda Research Laboratories, Boehrmger Mannheim 또는 New England Biolabs)로부터 구입하여, 반응 조건등에 관한 제조자의 지시에 따라 사용했다.
본원 명세서에서 언급된 숙주 균주들은 일반적으로 여러 구입처들로부터 입수할 수 있는 것들이다. 예를 들면, E.Coli C600은 다수의 모식균 배양소, 즉 미합중국, 예일유니버시티에 소재하는 E.Coli Genetic Stock Center에서 수탁번호 GCSC3004로 자유롭게 입수할 수 있는 것이다. E.Coli C600의 게노타입은 K12 thr-1 leuB6 thi-1 lacY1 tonA21 λ- supE44이고 ; E.Coli HB101과 DH 5α는 Bethescla Research Laboratories(BRL)에서 입수할 수 있으며 ; E.Coli TG1과 K19는 Anglia Biotechnology에서 입수할 수 있다.
3. Geneclean(TM)
이 키트는 1) 6M 요오드화 나트륨 ; 2) 염화나트륨/에탄올/물 세척액을 만들기 위한 염화나트륨, Tris와 EDTA의 농축용액 ; 3) Glassmilk(TM) - 물중의 실리카 매트릭스 현탁액 1.25ml를 함유한 1.5ml 바이알.
이것은 Proceedings of the National Academy of Sciences USA(1979) vol 76, p615에 개시된 Vogelstein과 Gillespie의 방법에 기초한 DNA 정제방법이다.
선택적으로 “Molecular Cloning - a laboratory manual”(2판, 1989. Sambrook, Fritsch와 Maniatis의 Cold Spring Harbor Laboratory ; 이후 “Maniatis로 언급”)에 개시된 방법을 사용할 수 있다.
4. Sequenase(TM)
(화학적으로 변형시킨 T7 DNA 폴리머라제)
“Proceedings of the Natiional Academy of Sciences USA(1987) vol 84 pp 4767-4771”에 개시된 Tabor와 Richardson의 방법에 기초함.
5. pICI 형질발현 벡터의 구조
5. a) pICI 0020
플라스미드 벡터 pICI 0020은 651 bp EcoRI-AccI 영역이 167 bp EcoRI-ClaI 단편에 의해 대체된 pAT 153 기본의 플라스미드로서, 하기(1) 내지 (4)로 구성된다 :(1) 합성의 이.콜리(E.Coli)trp 프로모터 및 trp 리더 리보좀 결합 부위 (2) 번역 개시 코돈 (3) Kpn I, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI 및 HindIII에 대한 부위를 포함하는, M 13mp18으로부터 유도된 여러 가지 제한 효소 인지 서열, (4) 합성의 전사 종결 서열, 이 영역의 DNA 서열은 제11도에 제시되어 있다.
합성의 trp 프로모터 서열을 포함하는 플라스미드의 구조는 공지되어 있다(윈다스 외, Nuc. Acids Res. 10, p6639-6657, 1982). EcoRI 및 HpaI 효소로 소화하고 전기-용출법에 의해 아가로즈 겔에서 적당한 밴드를 정제한 후 상기 벡터로부터 프로모터 단편을 분리했다(“Moleculer Cloning-A Laboratory Manual”, Maniatis, Fritsch and Sambrook, CSH 실험실 편찬, 2판, 1989).
합성 올리고뉴클레오티드의 상보성 쌍은 천연 trp 리더 리보좀 결합부위, 번역 개시코돈 및 3′Kpn I 클로닝 부위를 제공하는 프로모터 단편의 Hpa I 말단에 결찰시켜서 제조했다. 상기 올리고뉴클레오티드를 동물 농도로 혼합하고 100℃로 가열한 후 실온으로 서서히 냉각하여 어닐링 시켰다.
상기 프로모터 단편과 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 그후 결찰시키고 전기용출법으로 폴리아크릴아미드 겔로부터 적당한 밴드를 분리했다. 그후 이 단편을 Hind III 부위에 클론된 trp 감쇠인자(attenuator) 서열(합성 올리고뉴클레오티드로부터 생성됨)을 포함하며 이 감쇠인자에 추가의 ClaI 제한 부위 3′을 도입시킨 M13mp18 벡터와 결찰시켰다. 상기 결찰된 DNA를 CaCl2법에 의해 적당하게 제조된 이.콜리 균주 JM109(야니시-페논 외, Gene, 33, p103, 1985)에 트랜스펙트시킨다(메니아티스, 제1장, p82). 플레이트시킨후, 이 플레이트를 배양하고32P-라벨된 프로브를 사용하여 벤톤과 데이비스 방법(메니아티스, 제4장, p41)으로 스크린 했으며, 상기 프로브는 미리 분리한 EcoRI-HpaI 프로모터 단편의 니크 번역에 의해 산출되었다. 단일 스트랜드 DNA는 표준 방법에 의해(메니아티스, 제4장, p29) 양성적으로 하이브리드화시킨 플라크로부터 제조하고, M13 일반 프라이머와 생거(Sanger) 디데옥시 사슬 종결법(많은 제조자에 의해 키트가 제공됨 ; 예, Sequenase(United states Bioscience))을 사용하여 서열분석을 했다.
RF DNA는 프로모터/리보좀 결합부위/ 감쇄인자 서열이 확인된 한 분리물로부터 제조했다. 이 DNA를 EcoRI과 ClaI로 절단하고 적당한 단편을 전술한 바와 같이 폴리아크릴아미드 겔로부터 분리했다. 플라스미드 pAT 153을 EcoRI과 ACCI로 절단하고 상기 분리된 프로모터 단편과 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 적당한 이.콜리 HB101(보이어, H.W. 및 로울랜드-두소익스, D ; 1969, J. Mol. Biol., 44, p459 ; Bethesda Research Laboratories)로 형질전환하고 암피실린 내성의 콜로니를 선별했다.
몇 개의 클론으로부터 플라스미드 DNA를 제조하고 EcoRI과 ClaI 부위 사이의 영역으로부터 DNA 서열을 유도했다. 올바른 프로모터/감쇠인자 영역을 포함하는 것으로 확인된 한 클론을 pICI 0020으로 명명했다.
이 구조는 제1도에 요약되어 있다.
3. b) pICI 0042
pICI 0042(제12도)는 pAT 153의 항생제 내성 마커가 플라스미드 RP4로부터 수득된 단일의 유동성 테트라시클린 내성 유전자(tet A 유전자에 의해 코딩되며 tet R 유전자의 생성물에 의해 조절됨)로 대체된 플라스미드이다. 이 유전자들은 클록크등에 의해 특성 규명이 되었다(Klock 외, J. Bacteriol, 161, p326-332, 1985). 상기 신규한 내성 마커는 항생제의 존재하에만 형질발현 되기때문에, tet A 유전자 생성물은 상기 플라스미드가 테트라시클린 부재하에 안정하게 유지되는 배양물 내에서 재조합 라신 A의 강력한 혼탁물이 되지는 않을 것이다. 플라스미드 안정화 작용(cer)도 병합시킬 수 있다.
상기 벡터 생성의 개시 단계는 테트라시클린 내성인자를 코딩하는 유전자를 완전히 제거한 pAT 153 유도체를 생성하는 것이다. 합성 뉴클레오티드의 상보성 쌍은 pAT 153의 EcoRI-AvaI 단편을 클로닝을 위한 특정한 몇 개의 제한 효소 부위를 포함하는 짧은 서열로 대체할 수 있도록 고안되었다.
pAT 153 플라스미드 DNA를 EcoRI과 AvaI으로 절단하고 제조자 지시에 의거하여 제네클린(Geneclean : Bio 101, Californai)를 사용하여 0.7% 아가로즈 겔로부터 2.175Kbp 플라스미드 DNA 단편을 분리했다. 따라서 테트라시클린 내성 유전자를 포함하는 1.425Kpb 단편이 제거되었다.
올리고뉴클레오티드(서열 번호 13과 14)를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 인산화하고 등몰량을 함께 어닐링시켰다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 샘플을 pAT153 플라스미드 단편과 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 이.콜리 HB101(BRL)로 형질전환 시키고 암피실린 내성 콜로니를 선별했다.
몇 개의 콜로니를 소량 플라스미드 DNA 제법(메니아티스, 제1장, p25에서 구체화된 바와 같은 Birnboim 및 Doly법)으로 골라내고 적당한 효소(예, EcoRI, Avai 및 Bam HI)로 제한 분석을 하여 원하는 구조를 확인했다. 올바른 제한 패턴을 갖는 것으로 확인된 3개 분리물의 구조는 pBR 322 EcoRI 부위 시계방향 프라이머(New England Biolabs)를 사용한 DNA 서열 분석법으로 확인했다. 한 분리물을 pICI0019로 명명했다.
RP4 플라스미드 DNA는 홀메스와 퀴글리법(Holmes and Quigley; 매나어티스, 제1장, p29)에 의해 잔존하는 원료 용액으로부터 분리했다. 이 DNA를 Bgl II로 완전히 절단한 후 XmaI으로 부분적으로 절단하여(25℃에서 35분이하 동안) tet R 및 tet A를 함유하는 2.45KbP 단편이 명확히 확인될 때까지 여러 시간대별로 샘플을 채취했다. pUC8 DNA(Amersham International)의 샘플을 BamHI과 XmaI으로 완전히 절단했다. 상기 테트라시클린 내성 유전자를 pUC8 내로 삽입하기 위해 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 CaCl2법(메니아티스, 제1장, p82)으로 적당하게 제조한 이.콜리 C600(Appleyard, P.K. Genetics 39 p440, 1954)로 형질전환시키고 테트라시클린 내성 콜로니를 선별했다. 플라스미드 DNA를 8개 콜로니로부터 제조하고(Holmes 및 Quigley법) 제한 분석법으로 RP4 tet R과 tet A 유전자의 존재를 확인했다. 이러한 분리물중 하나를 pTB344로 명명했다.
pICI 0019의 EcoRI/PstI 단편을 pTB 344의 대응하는 단편으로 대체시킴으로써 테트라시클린 내성 유전자를 pICI0019내로 삽입시켰다(전술함). 그 결과 pICI 0019내에 있는 대부분의 임피실린 내성 유전자는 테트라시클린 내성 유전자로 대체되었다. 플라스미드 DNA를 절단 및 결찰한후, 이.콜리 C600으로 형질 전환시키고, 표현형(예, TcR및 ApS)을 근거로 콜로니를 선별했다. 플라스미드 DNA는 4개의 상기 콜로니로부터 제조되며 제한 효소의 배합물(예, BamHI/PstI/ Sst I, EcoRI/SalI, Smal Sty I/ Sal I 및 AaI/Pst I)로 절단했다. 모든 4개의 클론들은 원하는 구조에 일치하는 제한 패턴을 산출했다. 이들중 하나를 pTB351로 명명했다.
서머스와 셔레트(Summers and Sherratt; Cell 36 p1097-1103, 1984)는 ColEI으로부터 유도된 플라스미드(예, pAT153)의 불안정성이 모 플라스미드에 존재하는 283bp 서열(cer)이 손실된 까닭이라고 밝혔다. 이 서열은 플라스미드 올리고머의 형성을 억제하는데 도움을 주며, 상기 플라스미드 올리고머는 아직 밝혀지지 않은 방법으로 플라스미드를 분할하는 것으로 나타났다. 상기 cer 서열(Summers, D 외 ; Mol. and Gen. Genetics 201, p334-338, 1985 ; 및 Cell, 36, 1097-1103, 1984)를 pUC 18 내로 클론시킨 단편(pKS 492)으로부터 분리했다. pKS 492 플라스미드 DNA를 Bam HI과 Taq I으로 절단하여 289bp의 cer-함유 단편을 산출했다. 플라스미드 pTB 351 DNA(Dam host 이.콜리 GM 48로부터 분리됨 - Arraj, J. A. 및 Marinus, M.G.J. Bact 153 p562-565, 1983)을 BamHI과 Cla I으로 완전히 절단하고 절단된 pKS 492 DNA와 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 적당한 이.콜리 C600으로 형질전환시킨 후, 테트라시클린 내성 콜로니를 선별했다. 예상 클론의 플라스미드 DNA를 효소 AvaI, MluI 및 PvuI으로 제한 분석하여 cer 존재를 확인했다. 정확한 구조를 갖는 한 분리물을 pICI 0042로 명명했다.
이 플라스미드의 구조는 제2도와 제3도에 요약되어 있다.
5. c) pICI 1079
플라스미드 벡터 pICI 1079는 암피실린 내성이 있으며, EcoRI와 StyI 제한 부위 사이에 하기(i) 내지 (v)의 원소를 갖는 pAT153-유래의 플라스미드이다 : (i) 파지 λ의 CI 857 유전자 ; (ii) λPL프로모터 ; (iii) 합성 리보좀 결합부위 ; (iv) 합성 인터페론 α2 유전자 서열 ; (v) 합성 전사 종결 서열(이 서열은 파지 T4로부터 유도됨, SalI과 Sty I 제한 부위 사이에 존재한다. 이 전사 종결인자의 DNA 서열은 제13도에 제시되어 있다.) pICI 1079는 제14도에 나타나 있다.
pICI 1079는 부다페스트 조약하에 NCIMB에 1991. 2. 19일자로 기탁되었으며(스코틀랜드, 아베르딘, 세인트 마셔 드라이브 23 소재) NCIMB 수탁번호 제40370호로 접수되었다.
플라스미드 pICI 1079는 리신 A 형질발현 클론 pICI 1185의 생성을 위한 T4 전사 종결 인자 원을 제공하기 위해 사용했다(참고 이하 7.d). 플라스미드 pICI 1079를 산출하는 출발점은 pICI 1043이다. pICI 1043은 λPL프로모터와 인테페론 α2 유전자(에지 외. Nuc. Acids Res. 11 p6419-6435, 1983)을 함유하는 형질발현 카세트가 EcoRI과 SalI 부위사이에 존재하는 pICI 0020(참고. 상기 3.a)에 근거한 플라스미드이다.
올리고뉴클레오티드의 상보성 쌍은 합성하여 5′SalI과 3′SphI 부착 말단을 갖는 박테리오파지 T4의 유전자 32로부터 전사 종결인자를 산출했다. 이 단편을 pICI 1043으로부터 분리한 플라스미드 단편(SalI과 SphI으로 완전히 절단함)과 결찰시켰다. 그로써 산출된 플라스미드 중간물(pICI 1078)은 T4 종결인자와 Trp 감쇠인자 서열이 나란히 포함되어 있었다.
pICI 1078의 SphI와 StyI 부위 사이에 삽입함으로써 trp 감쇠인자( 및 테트라시클린 내성 유전자의 나머지 부분)을 대체하는 데 올리고뉴클레오티드의 제2 상보성 쌍을 사용했다. 특정한 BamHI 부위를 이 합성 단편내에 삽입했다.
이 구조는 제4도에 요약되어 있다.
6. 리신 A 형질발현 클론의 생성
6. a) pUC 8RA 플라스미드 DNA의 제조
리신 A에 대한 cDNA를 포함하는 클론(pUC 8RA)를 생성했다. 이 클론은 플라스미드 pCU8(비에이라, J 및 메싱, J. Gene, 19, p259, 1982)에서의 공지된 cDNA 서열(램브, I.F., 로버츠, L.M., 로드, J.M., Eur, J. Biochem, 1985, 148, p265-270)에 의거하여 리더 서열의-74 염기로부터 B쇄내의 BamHI 부위까지의 A-쇄 cDNA를 포함한다. 추가로, 부위-지정의 변이를 사용하여 성숙한 리신 A의 최종 코돈의 3′에 번역 종결 코돈을 생성시켰다(오 ‘헤어, M 외, FEBS Letts, 1987, 216, p73-78에 보고됨). 완전한 A-쇄 코딩부위는 이 클론으로부터의 BamHI 단편중에 포함된다.
pUC8RA 플라스미드 DNA의 소량을 전술한 바대로 수득했다. 원료용액을 보관하기 위해서는, 이 DNA 희석액을 이.콜리 DH5α 적응 세포(하나안, D. ; 1983, J. Mol. Biol., 166, p557 ; Bethesda Research Laboratories)로 형질전환 시키고 암피실린 내성의 형질전환체를 선별했다. 이 클론의 플라스미드 DNA는 변형된 Birnboim-Doly법(메니아티스, 제1장, p25)에 의해 제조했다. 이 DNA 샘플은 각각 BamHI와 BanI으로 절단하고 아가로즈 겔로 전기 영동한 후 원 DNA의 대응하는 절단물(로드, 등에 의해 보고됨)과 비교했다. 제한 패턴에 있어서 차이점은 발견되지 않았으며, 이를 근거로, 2개의 DNA 샘플이 동일함이 확인되었다.
6. b) M13으로의 서브-클로닝
파지 M13 군주 K19(Anglian Biotechnology)의 pUC8RA 플라스미드 DNA와 RF(복제형) DNA의 BamHI 절단물을 표준 조건을 이용하여(메니아티스, 제1장, p68)“쇼트건(shotgun)” 결찰시켰다. 대조군 결찰반응도 실시했다. 상기 결찰된 DNA를 이.콜리 규준 TG1(Gibson, 1984/Anglian)으로 형질전환시키며, 상기 이.콜리 균주 TG1은 CaCl2법에 의해 적당하게 제조되었다(메니아티스, 제1장, p82).
상기 형질전환 빈도수는 효과적인 결찰반응을 나타냈으며 재조합 파지는 자손대에서 기대되었다. 이 재조합 파지는 lacZ(β-갈락토시다제) 유전자의 분해로 인해 IPTG + X-gal(BRL) 함유의 프레이트상에서 투명한 플라크(plaque)를 형성하는 것이 예측되었다. 야생형 파지는 β-갈락토시다제에 의한 X-gal의 가수분해로 푸른색 플라크를 형성한다.
몇 개의 투명한 플라크를 채취하여 단일 스트랜드 DNA를 제조했다. 분해된 v파지 현탁액의 직접 겔 전기영동 결과, 한 파지 클론이 시퀀싱에 의해 리신 A-쇄 코딩 서열로 확인된 크기분류가 가능한 삽입물을 포함하는 것으로 나타났다. 성숙한 A 코팅 서열의 182 염기만이 완전한 리신 A 유전자의 존재에 대한 충분한 증거로서 확인되었다. 이 클론은 M13K 19RA로 명명했다.
6. c) M13K 19RA의 돌연변이
성숙한 리신 A의 개시부에서 pICI 형질발현 벡터에 적합한 Kpn I 부위를 산출하기 위해서, 이하의 서열 번호 15를 서열 번호 16으로 변형(밑줄친 것)시키는 것이 필요하다 :
그 결과 KpnI 부위와 겹치는 ATG 코돈이 형성된다. 리신 A을 포함하는 KpnI 단편은 상기 돌연변이물로부터 절단되어 ICI 형질발현 벡터 시리즈내로 삽입될 수 있다. 2개의 N-말단 아미노산 변형물을 제조했다(ile-phe을 met-val으로 변형시킴).
M13K 19RA로부터 제조한 단일 스트랜드 DNA는 각 돌연변이 단계의 변형을 위한 주형이었다. 이 단계에 대해 모든 돌연변이 변형을 도입하는 단일 올리고뉴클레오티드, DTR 16을 합성했다.
DTR16(서열 번호 17) 5′AACAACATGGTACCCAAACAA 3′
부위 지정의 돌연변이에 의해 특정한 DNA 서열을 변형하기 위한 몇가지 프로토콜이 존재한다. 이하에서 요약한 방법은 키트형(Amersham International)으로 제공되는 엑크스타인 등의 방법(Nuc. Acid Res., 1985. 13. p8749-8764, 및 1986년 14, p9679-9698)을 제조자의 지시에 의거하여 사용했다.
상기 방법의 원리는 변이유발 올리고뉴클레오티드로 단일-스트랜드 DNA 주형을 프라임(prime)하고 dATP 대신 dATPαS를 결합시킨 상보성 스트랜드를 합성하는 것이다. 이 뉴클레오티드를 사용한 결과 특정한 제한요소(예, NciI)로 절단되지 않는 포스포로티오에이트 결합을 형성하게 된다. 제2의 스트랜드를 합성한 후, NciI를 사용하여 모(parent) 스트랜드 틈(nick)을 내고 엑소뉴클레아제 III를 첨가하여 돌연변이 점을 지나서 거꾸로 절단하게 한다. 그후 DNA 폴리머라제 I으로 모 스트랜드를 재합성한다. 결과적으로, 변이유발 올리고뉴클레오티드는 재합성을 위한 주형으로서 작용하여 형질전환 되기 이전에 돌연변이 체가 두 스트랜드에 도입된다. 총 자손의 96%까지의 돌연변이 율이 요구되며, 서열 분석을 위해 무작위로 플라크를 채취함으로써 간단하게 스크리닝을 할 수 있다.
채취한 4개의 플라크로 실시한 본 실험 4는 정확하게 돌연변이 되었다.
한 돌연변이체(MRA 16)을 선택하여, RF DNA를 제조하고 새롭게 생성된 제한단편(즉, KpnI)의 존재에 대하여 체크했다.
6. d) 클로닝, 형질발현 및 개시특성
형질발현 벡터의 pICI 시리즈(참고. 3)은 T게 프로모터에 인접한 특정한 KpnI 제한 부위로 클론되는 DNA 단편을 수용할 수 있다. KpnI 부위는 프로모터의 샤인-달가노(Shine-Dalganno) 부위(AGCA)로부터 8bp 아래쪽에 위치한 해독 개시 코돈(ATG)와 겹친다.
MRA 16의 서열을 확인하기 위하여, 다량(~5㎍ RF DNA)을 KpnI로 절단하고 적절한 리신 A 코딩 DNA 단편을 아가로즈겔(Nu-Sieve GTG 아가로즈, FMC Bio-Products)로부터 분리하며, 상기 분리는 제조자의 프로토콜에 의거하여 절취된 겔 슬라이스를 페놀로 추출함으로써 실시된다.
pICI 0020(참고 3a)를 KpnI으로 절단한후 송아지 장내 알칼린 포스파타제(CIP-Boehringer Mannheim)을 사용하여 탈이산화 하였다. 이것은 형질전환 자손에 있어서 모체(parentals)를 고비율로 유도할 수 있는 결찰반으시 벡터의 재고리화를 억제한다.
결찰 반응은 플라스미드 벡터와 분리된 단편의 비율을 여러 단계에서 8:1(w/w) 내지 1:3으로 실시했다. 포스파타제 처치의 효율성, 리가제 활성 등을 시험하기 위한 대조군 결찰 반응도 실시한다. 결찰반응 조건은 사용된 T4 DNA 리가제 원(New England Biolabs 도는 Amerscham)에 적당했다. 일반적으로 이 반응은 15℃에서 하룻밤 동안 항온처리됐다.
각 결찰(5㎕) 반응의 50%를 1x TNE(50mM Tris, 50mM NaCl, 1mM EDTA)로 100㎕까지 희석하고 적당한 이.콜리 DS 410을 CARK했다. 표준의 형질전환 프로토콜(Maniatis, 1장, p74)를 실시한 후, 세포를 L 아가 + 스트렙토마이신(25㎍/ml)와 암피실린(100㎍/ml) 위에 플레이트하고 37℃에서 하룻밤동안 항온처리했다.
형질전환 플레이트는 상기 항온처리 이후에 조사했다. 일반적으로, 리가제가 없는 대조군에 비해, 결찰 반응에서 5 내지 10배 이상의 콜로니가 나타났다. 일부 경우에 있어서, 리가제 존재 또는 부재의 경우 생성된 콜로니 수가 거의 차이가 없는 것은 벡터의 불완전한 절단이나 미약한 리가제 활성을 갖는 것을 나타내는 것이다.
형질전환체와 그에 적절한 대조군은 하이브리드화 스크리닝(Maniatis, 1장 p48에 기재된 Grunstein과 Hogness의 방법에 기초함)용 L 아가 플레이트상에 놓은 니트로 셀룰로오즈 필터위에서 채취했다. 항원처리 이후, 10% SDS와 1M NaOH를 사용하여 동일계상에서 결찰시키고, 1M Tris(pH 7.5)를 사용하여 중화시키고, 80℃에서 2시간 동안 진공하에 건조시켰다.
하이브리드화 프로브는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 돌연변이 올리고뉴클레오티드를32P 라벨링 시킴으로써 산출했다. 필터를 실온에서 프로브한 후 55-65℃ 이하에서 세척하여 비-특이적으로 결합된 것을 제거한후 자동방사능 사진을 촬영했다. 특이적인 하이브리드화는 리신 A DNA를 함유하는 추정 클론을 나타냈다.
소량의 DNA 제제(Maniatis 1장, p25에 구체화된 Holmes와 Quigley법 또는 Birnboim-Doly법에 의함)는 양성적으로 하이브리드된 한 클론으로부터 제조했다. 이 DNA를 적절한 제한효소(예, KpnI 및 EcoRI/Bal II)로 절단하고, 아가로즈겔에서 전기 영동하여 분석했다. 벡터 DNA와 돌연변이된 RF DNA를 동일한 효소로 절단하여 정확한 클론으로 예상되는 단편 사이즈를 입증했다.
각 클론의 다량의 플라스미드 DNA 제제(Birnboim-Doluy)를 사용하여 더 상세한 제한 분석(예, Cla I, Hind III, Bam HI, EcoRI/Bgl II, Kpn I 및 Sca I)을 하였다. 아가로즈 겔 상에서 상기 절단물은 삽입된 단편의 사이즈, 리신 A 사슬 유전자에 특징적인 제한 효소 부위의 획득 및 그것의 배향성을 나타냈다.
6. e) 형질발현 연구
하이브리드화 및 제한 스크리닝에 의한 양성적으로 확인된 클론은 전체 세포 분해물의 SDS-PAGE 분석에 의해 리신 A의 형질발현을 시험했다. 이 형질발현 연구에 대한 표준 조건은 다음과 같다 :
1) L-브로쓰 + 항생제(들)의 10ml를 단일 콜로니에 접종하고 서서히 교반하면서 37℃에서 하룻밤동안 증식시킨다.
2) L-브로쓰 750㎕를 취하여 미량 원심분리기(microfuge ; 6500rpm, 1분) 세포를 펠릿화 한다.
3) 300㎕의 M9 배지(Maniatis, 부록 A.3) + 0.02% 카제인 가수분해물(hydrolysate) + 0.2% 글루코드 + 50㎍/ml 티아민 내에 상기 펠릿을 재현탁시키고 다시 10ml의 동일물을 접종한다.
4) 서서히 교반하면서 37℃에서 7시간 동안 또는 하룻밤 동안 항온처리 한다.
5) 상기 항온처리 이후, OD540′을 측정하고 세포를 펠릿화하며 물에 현탁시키는 경우 OD540= 10을 제공하는 것과 동일한 부피의 램리(Laemmli) 샘플 완충액 중에 재현탁시킨다. (Maniatis, 18장, p53). 15분 동안 가열한다.
6) SDS 폴리아크릴아미드겔에 전체 세포 분해물 20㎕를 적재하여, 전기 영동하며, 코마씨 블루로 염색하고 탈색한 후 눈으로 관찰한다.
SDS-PAGE로 연구한 클론중, 단 하나만이 ~29KD 과거의 같은 분자량(비클리코실화된, 성숙한 리신 A의 예상 분자량과 동일함)을 갖는 추가의 밴드를 나타냈다. 겔 스캔은 전체 세포 단백질의 5-10% 범위에서 축적 농도를 나타냈다. 이 클론의 플라스미드를 pICI 1102로 명명했다.
pICI1102의 구조는 제5도에 요약하고 있다. 형질발현 연구의 결과는 제6도와 제7도에 나타나 있다.
6. f) 웨스턴 이동(transfer) 및 재조합 리신 A의 면역 검출
SDS-폴리아크릴아미드 겔의 쿠마씨 블루에 의해 초기에 관찰된, 재조합 A-사슬 단백질의 존재는 웨스턴 블로트에 의해 확인했다. 단백질 밴드를 니트로셀룰로즈 필터에 옮기고 리신 A 특이 항체에 이어 퍼옥시다제 라벨은 항 글로블린을 사용하여 검출했다.
15% SDS-PAGE 겔은 8mA에서 하룻밤동안 러닝시키고, 이동 완충액에서 30분 이상동안 평형화시켰다.
상기 겔상의 단백질 밴드를 니트로 셀룰로즈 막(Hybond-C, Amersham)에 옮기고 Bio-Rad Trans Blot기에서 3시간 동안 70V로 전기영동시킨다. 이 필터를 건조한 후 -20℃ 밀봉 플라스틱 백에서 보관할 수 있다.
리신 A.1은 리신 A의 합성 펩티드 단편에 대한 토끼의 폴리클로날 항체였다. 예비 연구에서는 리신 A에 대한 우수한 친화성을 갖지만 많은 이.콜리 단백질과의 높은 교차-반응성을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 교차 반응성에 의한 높은 기준치(background)를 극복하기 위하여 상기 항체를 이.콜리 분해물과 함께 예비 배양했다.
따라서, 이.콜리 균주 DS410을 10ml L- 브로쓰에서 하룻밤 배양하고 10분간 4000rpm에서 원심분리하여 세포를 펠릿화 했다. 상기 펠릿을 5ml의 박테리아 완충액에 재 현탁하고 얼음상에서 30초의 냉각 간격으로 6 x 10초 동안 4-6μ로 초음파 처리(sonicate) 했다.
초음파 처리물 0.5ml를 0.5ml의 리신 A.1 항혈청과 혼합하고 90분 동안 실온에서 항온처리했다. 세포 찌꺼기는 13000rpm에서 5동안 회전시켜서 침전시키고 상청액은 -20℃에서 보관했다.
웨스턴 이동시킨 니트로셀룰로즈 필터는 실온의 5% BSA-PBS/Tween(PBS Tween=5ml Tween 20/PBS 1ℓ)중에서 하룻밤동안 항온처리함으로써 보호했다.
PBS/Tween으로 3분간 3회 세척했다.
0.5% BSA-PBS/Tween 중에 “보호된” 리신 A.1 항체의 1/4000 희석액으로 실온에서 2시간(또는 하룻밤)동안 항온처리했다.
PBS/Tween으로 3분간 3회 세척했다.
0.5% BSA-PBS/Tween 중의 염소항 토끼항 혈청의 1/1000 희석액으로 실온에서 1시간동안 항온처리했다.
PBS/Tween으로 3분간 3회 세척했다.
0.5% BSA-PBS/Tween 중의 토끼 퍼옥시다제 항-퍼옥시다제 항 혈청의 1/5000 희석액으로 1시간동안 항온처리했다.
PBS/Tween으로 3분간 3회 세척했다. 12㎕ 과산화수소를 함유하며 PBS로 120ml를 맞춘 20ml 메탄올 중의 4- 클로로나프톨(60mg) 용액 중에 침지시킴으로써 전개했다. 밴드가 나타나자 마자, 상기 막을 상기 용액으로부터 꺼내어 건조하고 촬영했다. 전형적인 웨스턴 블로트 분석치는 제8도에 나타나 있다.
6. g) 재조합 리신 A 단백질에 대한 생물학적 검정
이것은 실험관내에서 무세포 단백질 합성 검증시 생물학적 활성에 대하여 r- 리신 A를 시험하기 위한 실험 시스템을 설정하는 것을 목적으로 한다.
토끼의 망상 적혈구 분해물을 알렌과 쉬비트 방법(Allen and Schweet ; J Biol Chem(1962), 237 760-767)에 의거하여 제조했다. 이 검증법은14C- 라벨된 루이신이 새로 합성된 단백질에 결합되는 것을 경감시킴으로써 무세포 시스템에서 단백질 합성의 억제도를 입증한다.
6. g. I) 효력검정 프로토콜
원료용액 : 루이신이 없는 1mM 아미노산 혼합물.
루이신을 제외한 모든 L- 아미노산 1mM을 함유하는 용액(NaOH로 pH 7.4를 맞추고 -70℃에서 보관함)
용액 A : 40mM 마그네슘 아세테이트 ; 2M 암모늄 아세테이트 ; 0.2M Tris ; (HCl로 pH 7.4를 맞춤. 4℃에서 보관함)
용액 B : ATP(Sigma A5394) 245mg/ml ; GTP(Sigma G 8752)24.4mg/ml
효력검정 혼합물 : 1ml 아미노산 혼합물 ; 1ml 용액 A ; 0.1ml 용액 B ; 103mg 크레아틴 포스페이트 ; 1mg 크레아틴 키나제 ; 510㎕ H2O ; 600㎕(60μCi) L- 14C- 루이신(New England Nuclear, NEC-279E)
반응 혼합물 : 시험샘플 25㎕ ; 효력검정 혼합물 12.5㎕ ; 토끼 망상 적혈구 분해물 25㎕.
블랭크 용액은 PBS 중의 2mg/ml BSA였다.
모든 효력 검정은 2회 실시했다.
12.5㎕의 효력 검정 혼합물을 멸균된 유리 튜브에 넣는다.
PBS 중의 BSA 25㎕을 첫 번째 4개의 블랭크용 튜브 각각에 첨가했다.
시험 샘플 25㎕를 나머지 튜브에 첨가한다.
0.1M KOH 1ml을 첫 번째 2개의 튜브(기준 블랭크)에 첨가한다.
상기 튜브를 수조(water bath) 내에서 28℃로 평형화한다.
토끼의 망상 적혈구 분해물 25㎕(액체 질소 온도로부터 해동시킴)을 20초 간격으로 각 튜브에 첨가했다.
12분동안 첫 번째 튜브를 항온처리했을 때, 1ml의 0.1M KOH를 다시 20초 간격으로 각 튜브에 첨가하여 모든 튜브가 12분간 항원 처리하도록 한다. 20% 과산화수소를 각 튜브에 2방울씩 첨가한 후 20% TCA 1ml를 첨가했다. 튜브를 혼합하고 1시간 이상, 또는 하룻밤동안 4℃에서 세워둔다. 상기 침전물을 2.5cm GFC 디스크 상에서 여과하고 5% TCA 4ml로 3회 세척한후 신틸레이숀 바이엘로 옮겨담고 10ml 신틸란트(scintillant) ; Ready-Solv. MP, Beckman)을 첨가했다. 1시간 이후 바이엘을 교반하고 카운팅한다.
6. g. ii) 이.콜리 분해물을 사용하기 위한 기술의 설정
10ml L-브로쓰 배양물을 37℃에서 하룻밤동안 증식시켰다. 40㎕ 분획을 30초 동안 13000rpm에서 펠릿화 하고 대부분의 상청액을 따라 버렸다.
상기 펠릿을 무수 얼음/EtoH 중에서 2회 급속 냉동시킨 후 37℃에서 해동시켰다. 50mM Tris HCl(pH 8.0) 중의 25% 슈크로즈 12㎕를 첨가한 후 4㎕의 10mg/ml 라이소자임 용액을 첨가했다.
15분간 얼음상에서 배양한후, 8㎕의 0.25M EDTA를 첨가하고 15분간 항원처리를 지속했다. 물로 샘플을 400㎕까지 희석하고 삼투적으로 분해한다. 이 방법은 가시성 세포수 80-100/ml을 산출했다.
이 분해물을 25㎕ 분획을 효력 검정 반응 혼합물에 첨가하였을 때, 새로 합성된 단백질로 결합된14C-루이신의 농도는 분해물이 없는 블랭크의 약 10%였다. 이것은 8ng/ml 리신 A에 의해 생성되는 억제도와 유사했다. 그후 이.콜리 분해물의 희석액을 제조하여, 효력검정을 반복했다. 그 결과 블랭크의 영향과 동일하게 상기 분해물의 영향을 경감시키는 데는 최소한 16배의 희석액이 필요하다는 것이 명백하게 나타났다.
이.콜리를 분해하고, 이.콜리 분해물이 리신 A 독성을 포함하지 않을 가능성을 확신하기 위하여, 2개의 대조군의 효력검정을 실시했다. 첫 번째는 식물에서 유도된 리신 A를 세포 분해 이후에 효력검정시 최종농도가 8ng/ml가 될 수 있도록 16배 희석된 이.콜리 세포 펠릿에 첨가했다. 이러한 2개의 대조군은 리신 A의 억제 작용에 대하여 분해물이나 분해 방법에 유해한 영향을 나타내지 않았다.
이 기법은 pICI1102 및 후술한 클론으로부터 생물학적 활성의 재조합 리신 A의 합성을 입증하는데 사용했다.
6. h) DNA 서열 분석
플라스미드 DNA 서열 분석은 pICI1102를 분석하는데 사용했다. 선택한 프로토콜은 자거스키등에 의해 변형되며(Gene Analysis Techniques Vol 2, N°5), 이는 이중 스트랜드 플라스미드 DNA를 알칼리로 변성한 후 프라이머 어닐링하고 몇 개의 공급처(예, Seguenase : United States Bioscience)에서 제공하는 키트 형태를 사용한 표준 방법으로 시퀀싱한다. β-락타마제의 3′말단에 프라임하기 위한 올리고뉴클레오티드와 몇 개의 A-사슬 내부 프라이머를 사용하여, 프로모터와 리신 A의 두 스트랜드의 서열 분석이 가능하였다.
초기 서열분석 자료는 추가의 KpnI 단편이 상기 프로모터와 리신 A 코딩서열(즉, 서열 번호 20) 사이에 존재한다는 예상밖의 결과를 나타냈다 :
부가의 KpnI 단편은 M13K 19RA로부터 기인되며 pUC 8RA로부터 클론된 리신 리더 서열의 일부 + 제한효소 부위를 포함한다. 상기 리신 A 사슬 5′ 영역은 돌연변이 중에 나타내는 염기 변형을 포함한다.
상기 서열을 분석하면 최초의 해독개시 코돈(ATG)이 리신 A 코딩 영역을 갖는 프레임에서 유도되는 것으로 나타났다. 또한, 리신 A 개시코돈 앞에 인-프레임 종결 코돈(TAG)가 있으며 추정의 샤인-달가노 서열(AGGA)는 두 번째 ATG로부터 해독을 재개시할 수 있다.
그 이후의 연구에서는 절단된 클론과 비교했을 때 이.콜리 중의 리신-A 사슬의 축적 농도에 비해 이러한 부가의 DNA 단편이 장점을 제공하는 것으로 나타났다.
pICI 1102에 포함되어 있는 리신 A 유전자의 DNA 서열을 제9도에 제공하고 있다(서열 번호 18).
7. 연속 리신 A 형질 발현 클론의 생성
7. (a) 서브클로닝을 하는 리신-A 클론 pICI 1102의 돌연변이
리신-A 형질 발현에 대해서 바르게 배향된 우발적으로 생성된 pICI 1120의 2가지 KpnI 단편을 서브클론시키는 것은 어렵다. 결과적으로 단일 염기 치환(A에서 T로)에 의해 내부의 KpnI 인지 부위를 바꾸고자 한다. 이는 KpnI가 상기 부위에서 분열되는 것을 방지하며, pICI 형질 발현 벡터의 범위내로 단일 KpnI 단편을 서브 클론시킨다. 티민(즉, GGTTCC) 대신에 KpnI인지 부위의 아데니(GGTACC)을 대체함으로써, 리신-A의 첫 번째 잔기를 바꾸지 않았다(GTA/GTT=Val) 즉,
상기와 같은 변화로 합성된 올리고뉴클레오티드는 하기의 서열을 갖는다.
(서열 번호 19) : 5′ ATTAACAACATGGTTCCCAAACAATAC 3′이때, 밑줄이 그어진 염기는 돌연변이 변화를 나타낸다.
형질 발현 연구를 비교하기 위해서, 돌연변이 리신-A 단편을 trp 형질 발현 벡터의 범위로 클론시키고자 한다. pICI 0020으로 클론시키는 것은 pICI 1102와 비교하여 단일 염기 치환의 형질 발현에 대한 효과를 결정한다.
7. (b) 돌연변이 유발
돌연변이 유발의 주형은 pICI 1102에 존재하는 2가지의 KpnI 단편을 함유한 M13 클론인 MRA16이다. 돌연변이 유발 후, 목적하는 돌연변이를 실시하는 분리물은 무작위로 샘플을 취하여, 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드가 특별하게 결합되어 있는 부위에 걸쳐서 DNA 서열을 결정하므로써 식별된다.
돌연변이된 주형은 MRA 22로 불리운다. 이를 전체 리신-A 코딩 서열의 DNA 결정에 의해 분석하여 비특이성 돌연변이의 부재를 증명한다.
7. (c) 서브-클로닝
돌연변이, 단일-스트랜드 DNA를 적응 E.Coli TGl 세포로 형질 전환시켜 단일 플라크를 만든다. 그후, 각각의 플라크를 가려내어, 복제 형태(RF, 이중 스트랜드) DNA를 세슘 클로라이드/에티듐 브라마이드 부양성 밀도 성분에 밴드를 형성시켜 정제한다. 정제된 RF DNA를 KpnI를 사용하여 완전히 절단시킨다. 절단된 RF DNA를 적당한 KpnI 컷트와 인산화 형질 발현 벡터를 사용하는 “산탄총” 결찰에 의해 또는 아가로스 겔로부터 이를 정제한 후 리신-A 단편을 특이 결찰시켜 클로닝을 했다. 결찰시킨 DNA는 E.Coli TGl 또는 HB101로 형질 변화시켰다.
클론을 함유한 다른 리신 A에서 분리한 KpnI의 초회항원 자극을 받은 무작위 헥사뉴클레오티드로 제조된32P 표시된 리신-A 탐침을 사용하여 하이브리드 형성 선별법으로 클론을 함유한 리신-A를 식별하였다(pICI 1121). KpnI 단일절단 및 EcoRI/BglII 이중 절단을 사용하여 플라스미드 DNA의 제한 분석으로 양성 하이브리드 형성을 나타내는 콜로니를 선별하였다. KpnI는 삽입된 단편의 크기를 식별했으며, EcoRI/BglII는 단편의 배향을 결정했다.
형질 발현에 대해서 바르게 배향된 리신-A 단편을 갖는 것으로 확인된 클론을 SDS-PAGE로 분석한 후, 증복 겔을 쿠마지(Coomassie) 염색시키고, 이를 웨스턴 블롯팅시켰다. 상기 클론에서 리신 A 축적의 함량은 pICI 1102에서 검출된 것과 같다.
분리물을 선택하고, 그 플라스미드를 pICI 1131이라고 했다.
7. (d) 임의의 전사 종결부 성분의 사용
전사 종결부 성분은 RNA 폴리머라제 활성을 중지시키는데 포함되는 mRNA의 3′말단부에서 2차 구조를 만든다. 3′말단 부위에서의 엑소뉴클레아제 공격으로부터 mRAN를 보호하여, 상기 2차 구조의 안정성은 단백질의 축적을 증가시킨다. T4전사 종결부는 상기의 모든 리신-A 구성으로 존재하는 trp 감쇠제보다 더 강한 2차 구조를 갖는 것으로 간주된다.
상기의 실험에서, 효소 EcoRI 및 SaII를 사용하여 절단시킴으로써 pICI 1131로부터의 trp 프로모터와 리신-A 단편을 절제한다. 후자의 효소는 리신-A 암호화 서열의 3′말단과 trpA 전자 종결부 사이를 분열시킨다. 생성된 단편을 아가로스 겔(2% 뉴시이브 GTG 아가로스, FMC 바이오프로덕츠)로부터 제거하여, 페놀과 클로로포름 추출로 정제하고 에탄올로 침강시킨다. 정제된 단편을 EcoRI와 SalI로 절단된 pICI 1079로 결찰시켰다. 상기 후자의 플라스미드는 비반복 SalI 및 SphI 부위 사이에 T4종결부를 함유한다(5.c를 보라).
결찰된 DNA를 성분 E.Coli HB101(BRL)로 형질 변환시키고, 하입2MFLEM 형성 선별법을 사용하여 상기 실험에서와 같은 리신-A DNA의 존재를 검출했다. 플라스미드 DNA 제조를 위해 양성 하이브리드 클론을 선택한 후, EcoRI와 SalI을 함께 사용하여 제반 분석하여 적당한 크기의 단편의 존재를 보인다.
바른 성분을 지닌 분리물을 식별하여 이를 pICI 1185로 명명하였다.
7. (e) 임의의 플라스미드 배경의 사용
플라스미드는 pICI 1185를 사용하여 형질 발현 카세트를 pICI 0042에 서브 클로닝시켜 부가적인 구조를 얻었다. pICI 1185로 플라스미드 DNA를 제조하고, EcoRI 및 SphI로 절단시켜서 trp 프로모터/RBS1/리신-A (MRA-22) 단편/T4종결부를 함유한 형질 발현 카세트를 절제했다. 4.d에서 대략 설명된 방법으로 상기의 단편을 분리하고 EcoRI 및 SphI로 절단된 pICI 0042를 사용하여 결찰시켰다.
결합된 DNA를 E.Coli HB101로 형질 변환시켜, 37℃에서 밤새 배양했다. HB101 형질 변환은 L 한천 + 테트라시클린상에서 플레이트화 했고,32P 표지된 리신-A DNA 탐침으로 하이브리드를 형성시켜 콜로니를 선별했다.
상기 2가지 경우, EcoRI/SphI 및 EcoRI/BglII 절단을 사용하여 플라스미드 DNA를 제한 분석하여 양성으로 선별된 콜로니를 확인했다. 3가지 분리물은 pICI 1187 1-3으로 식별했다.
제10도는 pICI 1185 및 pICI 1187의 구조를 간단하게 설명한다.
7. (f) 클론 선택
분리된 플라스미드를 E.Coli 71.18(크로넨보른, B.; 1976. MoL. Gen. Genet, 148, 243-250)으로 형질 변환시켜 클론 선별 연구를 위해 단일 콜로니를 가려낸다. 생성된 전체의 세포 용해질을 중복 SDS-PAGE 겔에서 전기 영동시키고, 이중 하나를 쿠마지 블루로 염색하고 다른 하나를 웨스턴 블롯 분석에 사용했다.
염색된 겔은 E.Coli 71.18의 동시 이동성 단백질의 존재에 기인한 리신-A 형질 발현에서 최소의 데이터를 제공한다. 웨스턴 블롯은 양성과 음성 대조용 샘플과 비교한 리신-A를 나타낸다. 프로세스 스케일 업을 위해 발효 리서치 그룹(Fermentation Research Group)에 하나의 분리물을 제공했다.
[γ-리신 A 발효]
(a) 플라스미드 pICI1187을 E.Coli 균주 DS410(또한 여기서는 MSD68로 언급됨)으로 형질 변환시켰고, -80℃에서 글리세롤 저장물에서 유지시켰다.
배양액의 일부를 저장물로부터 꺼내어 L-테트라시클린의 한천 평판에 줄무늬를 37℃에서 밤새 성장시켜 단일 콜로니를 분리했다. MSD1051의 단일 콜로니를 꺼내어 10ml L-테트라시클린 육즙 배지에서 재현탁시키고, 75ml L-테트라시클린 육즙 배지를 함유한 10개의 250ml 삼각 플라스크 각각에 상기 재현탁시킨 것 100㎕를 즉가 배양했다. 왕복 진탕기에서 16시간 동안 37℃에서 성장시킨 후, 플라스크의 내용물을 수거하여, 하기의 조성을 갖는 20ℓ의 개질 LCM 50 성장 매체를 함유한 발효조를 배양하는데 사용했다 :
증류수 중의 조성(g/l)
KH2PO43.0
Na2HPO46.0
NaCl 0.5
카제인 가수분해물(Oxoid L41) 2.0
(NH4)2SO410.00
이스트 추출물(Difco) 20.00
글리세롤 35.00
MgSO4·7H2O 0.5
CaCl2·2H2O 0.03
티아민 0.008
FeSO4/시트르산 0.04/0.02
미량원소 용액(TES) 0.5ml e-1
37℃의 온도에서, pH 6.7인 6M 수산화나트륨 용액을 자동 첨가하여 조절된 pH에서 발효를 실시했다. 용해된 산소 장력(dOT) 세트 포인트는 50% 공기-포화이며, 발효 교반기 속도를 자동으로 조절하면서 상기 포인트를 조절했다. 초기에 1분당 1부피당의 1부피(VVM)에 상응하는 20L/분의 발효기로의 공기 흐름을 발효기의 속도가 최대치의 80-90%가 되었을 때 45L/분으로 증가시켰다.
발효 샘플을 취하여 광학 밀도(OD550), 세포의 건조 중량 및 세포내의 리신 A의 축적을 측정했다. 당 분야에서 공지된 바와 같이 샘플링된 박테리아의 전체 세포 용해질의 쿠마지 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔을 스캐닝시켜 리신 A 축적물을 측정했다.
접종후 4½시간에서 이스트 추출물(Difco) 용액(225g/L)을 1.7g/L/시의 속도로 발효조로 펌핑시켰다.
OD550이 대략 50이 된지 12시간 후, 그리고 발효로 산소가 부족되기 전에 소르발 RC3B 원심 분리기(7000g, 30분, 4°)에서 박테리아를 수거하고 박테리아로부터 축적된 단백질을 회수했다.
(b) 플라스미드 pICI 1187을 E.Coli 균주 DS 410(또한 여기서는 MSD 68로 언급됨)으로 형질 전환시켰고, 생성된 재조합물(MSD 1051)을 정제하고, -80℃의 글리세롤 저장물에 유지시켰다.
배양액의 일부(100㎕)를 꺼내어, 600ml의 L-테트라시클린 육즙 배지를 함유한 2L 삼각 플라스크에 즉시 접종시켰다. 왕복 진탕기에서 16시간동안 37℃에서 성장시킨 후, 하기 조성을 갖는 성장 배지를 함유한 발효조에 접종시킬 때 그 플라스크의 내용물을 사용했다 :
증류수 중의 조성(g/l)
KH2PO43.0
Na2HPO46.0
NaCl 0.5
카제인 수해물(Oxoid L41) 2.0
(NH4)2SO410.00
이스트 추출물(Difco) 20.00
글리세롤 35.0
MgSO4·7H2O 0.5
CaCl2·2H2O 0.03
티아민 0.008
FeSO4/시트르산 0.04/0.02
미량원소 용액 (0.5ml e-1)
테트라시클린 (10mg 1-1)
37℃의 온도에서 발효를 실시했다. 2M 황산과 6M 과산화나트륨을 자동 첨가하여 pH를 조절하여, 후 접종의 10시간 미만의 시간 동안에는 6.7로 그리고 그 이후는 pH 6.0으로 pH를 조절했다.
용해된 산소 장력(dOT) 세트 포인트는 50% 공기-포화이며, 발효 교반기 속도를 자동으로 조절하면서 상기 포인트를 조절했다. 초기에 1분당 1부피당의 1부피(VVM)에 상응하는 20L/분의 발효기로의 공기 흐름을 발효기의 속도가 최대치가 되었을 때(1분당 100회전) 45L/분으로 증가시켰다. 발효의 마지막 단계에서 발효조로의 공기 흐름을 수동으로 20ℓ/분으로 감소시키고, 교반 속도를 1분당 대략 500 회전으로 자동 감소시켰다. 23시간 동안 발효를 실시하고, 이 시간 동안 발효 샘플을 취하고 광학 밀도(OD550), 세포의 건조 중량 및 박테리아 세포내의 리신 A의 축적을 측정했다. 당 분야에서 고안된 바와 같이 샘플링된 박테리아의 전체 세포 용해질의 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔을 스캐닝시켜 리신 A 축적물을 측정했다. 당 분야에서 공지된 바와 같이, 샘플링된 박테리아를 초음파 분해하여 세포질 부분(가용성)과 봉입체(불용성)로 분배된 리신 A를 측정했다. 접종후 4.5시간에서 이스트 추출물 용액(225g/L)을 1.7g/L/시의 속도로 발효조로 펌핑시켰다.
발효에서 탄소 원이 거의 사용되었을 때 (50% 공기 포화에서의 dOT가 급격히 증가됨), 글리세롤(714 gl-1)과 암모니아 설페이트(143 gl-1)를 함유한 공급물을 충분한 속도로 발효조에 펌핑하여 박테리아의 최대 탄소 요구량을 충족시킨다. 그후, 탄소원과 암모늄 설페이트의 공급 속도는 나머지 발효하는 동안 변화시키지 않았다.
23시간 후, 발효는 발효육즙 배지의 1L당 대략 1500mg의 가용성 리신 A를 산출시켰다.
주 :
1. E.Coli DS410 (또는 여기서는 MSD68로 언급됨)은 공지되어 있다(Dougan and Sherratt, Molcular and General Genetics, Vol. p151-160, 1977). 상기 균주는 손쉽게 구할 수 있으며, 부타페스트 조약하에 기탁번호 12100으로 스코틀랜드 아버딘 내쇼날 콜렉션즈 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아 리미티드로 1985년 6월 7일 본 출원인에 의해 기탁되어 있다.
2. 미량원소 용액(TES)
TES는 하기의 조성을 갖는다 : -
mg/10ml (탈이온수)
Alcl3·6H2O 2.0
CoCl2·6H2O 0.8
KCr(SO4)2·12H20 0.2
CuCl2·2H2O 0.2
H3BO30.1
KI 2.0
MnSO4·H2O 2.0
NiSO4·6H2O 0.09
Na2MoO4·2H2O 0.4
ZnSO4·7H2O 0.4
E.Coli로부터 γ-리신 A의 정제
최적의 발효 조건하에서, γ-리신 A는 가용성 시토솔 단백질로서 축적된다. γ-리신 A의 안정성을 촉진시키는 완충용액내에서 세포(균질화)의 파괴로 상기 단백질을 회수했다. 수거시에 살아 있는 세포로 상기 유니트 조작을 실시하여 생성물의 용액 안정성을 유지시켰다. 원심분리기 고체(세포 데브리스)를 제거하여 균등질로부터 γ-리신 A를 회수했다. 상기의 절차를 스캐일-업시키기 위해서, 추출물내에 존재하는 헥산의 덩어리를 침강시키는 제제(폴리텐 이민)으로 데브리스를 응집시켰다. 그후, 원심분리의 상층액을 무균여과시키고, 교차 흐름 여과로 농축시키고 단백질을 암모늄 설페이트로 침강시킨다. 암모늄 설페이트 침강물을 -70℃에서 냉각시켜 보관했다.
γ-리신 A는 다른 많은 E.Coli 단백질의 등전점 이상인 7.3의 등전점을 갖는다. 그래서 생성물은 이온 교환 크로마토그래피로 통상적으로 정제될 수 있다. 모든 회수와 크로마토그래피 단계를 γ-리신 A의 안정성을 촉진시키는 조건, 즉, 온도 <15℃, 디티오트레이톨의 존재하에서 실시하여 환원상태의 자유 티올과 EDTA를 유지시켜 공기 산화와 단백질 분해를 감소시켰다.
[γ-리신 A의 회수]
연속 디스크 스택 간헐적 방출 분리기를 사용하여 발효 육즙배지에서 상기 세포를 수집했다. 초기에 육즙배지(2×25ℓ 발효로부터 얻은 50ℓ)를 발효조에서 50ℓ 다리바퀴가 달린 탱크로 옮기고, 분리기에 연결된 수많은 수용탱크와 고압 균질기로 구성된 함유 시스템으로 운반했다.
바퀴가 달린 탱크를 상기 시스템에 연결시키고, 40ℓ/시의 흐름 속도로 원심분리기로 육즙 배지를 펌핑시켰다. 상기 배출 속도를 조절하여 상층액 배출 라인에서 안경을 이용하여 눈을 관찰하여 원심분리 상층액이 맑도록 한다. 분리기로부터의 고체 배출물(세포)을 적당한 용기에서 수집하고, 40ℓ의 완충용액 A(50mM 나트륨 디하이드로겐 오르토포스페이트; 20mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산; 5mM 벤즈아미딘; 2mM 디티오트레이톨; pH 6.3인 5N 수산화나트륨)에서 재현탁시키고, 고체 수집 용기에서 8℃로 예비 냉각시켰다. 그후 현탁된 세포를 600 bar의 작업 압력으로 조정된 균질기를 통해 바퀴가 달린 탱크로 다시 옮겼다. 생성된 균등질(60ℓ)을 <20℃로 냉각시키고 2.5ℓ의 10% (v/v)용액을 첨가하여 폴리테네민 0.5%를 만든다. 원심분리기를 통해서 수용탱크로 옮기기전에 10분 동안 현탁액을 응집시킨다. 맑은 상층액을 수집하고, 뎁스 여과기와 양으로 충전된 0.2μ 멤브레인 여과기로 정제하여 무균화했다.
[암모늄 설페이트 침강]
나선형 카트리지 교차 흐름 여과 장치를 사용하여 무균 청징화 상청액을 12ℓ의 부피로 농축했고, 2.9kg의 고체 암모늄 설페이트 결정을 첨가하여 용액을 40%로 표화시켰다. 15℃에서 밤새 약하게 교반시켜 용액을 응집시키고, 원심분리했다. 배출된 슬러리를 수집하고 -70℃에서 보관하며, 필요할 때에는 부가로 가공하여 사용한다.
[재가용화 및 탈염]
14ℓ의 완충용액 B(50mM 나트륨 디하이드로겐 오르토포스페이트; 25mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산; 2mM 디티오트레이톨; pH 6.3인 5N 수산화나트륨)의 존재하에 상기 암모늄 설페이트 침강물을 녹였다. 30분후, 현탁액을 원심분리하여 청징화하고, 70ℓ의 완충용액 B에서 대해서 다이아필트레이션을 실시하여 탈염시키고, 3mS/cm 이하로 감소된 것을 확인했다. 탈염 용액을 원심분리하고 즉시 가공하여 청징화했다.
[음이온 교환 크로마토그래피]
60ℓ의 완충용액 B로 평형화된 2kg의 DEAE-셀룰로스를 함유한 배치 크로마토그래피 탱크에 탈염 용액을 천천히 첨가했다. 6.5시간 동안 교반시킨 후, 충전된 11.3cm 직경 × 10cm의 칼럼으로 탱크의 바닥에서 용액을 펌핑시키고, 80ml/분의 흐름 속도로 DEAE-셀룰로스를 평형화시켰다. γ-리신 A의 덩어리는 결합을 하지 않았으며, 스테인레스 스틸 용기에 수집했다.
[양이온 교환 크로마토그래피]
1M 오르토포스포르산으로 γ-리신 A 용액을 pH 5.5로 조절하고, 10ℓ의 완충용액 C(25mM 나트륨 디하이드로겐 오르토포스페이트; 5mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산; 2mM 디티오트레이톨; pH 5.5인 5N 수산화나트륨)으로 평형화된 10cm 직경 × 10cm의 칼럼의 카르복시메틸 아가로스에 넣었다.
γ-리신 A를 상기 칼럼에서 결합시키고, 10ℓ의 완충용액 C로 세척한 후, 완충용액 D(25mM 나트륨 디하이드로겐 오르토포스페이트; 5mM 에틸디아민 테트라아세트산; 2mM 디티오트레이톨; 100mM 염화나트륨; pH 5.5인 5N 수산화나트륨)로 희석시켰다. 순수한 γ-리신 A를 단일 피이크로 희석시키고, 이를 수집하여 냉각 무균 용액으로서 -70℃에서 보관했으며, 필요할 경우 부가의 가공을 한다. γ-리신 A는 1년 이하의 기간 동안 상기 조건하에서 안정하다.
하기의 장비를 사용했다:
음이온 교환기 : DE-52, DEAE 셀룰로스 (왓트맨 바이오케미칼스)
양이온 교환기 : CM/세파로스(파마시아)
원심분리기 : 웨스트팔리아 CSA-1 디스크 스택 원심분리기(웨스트팔리아)
균질기 : APV-슈로이더 랩 60/60 균질기(APV)
여과기 : AMI 0057P 뎁스 여과기, ABI NFZP-포시딘 멤브레인 여과기(팔)
배치 탱크 : 701 파마시아 배치 크로마토그래피 탱크(파마시아)
DE-컬럼 : 바이오프로세스 113 (파마시아)
DM-컬럼 : K100/50 (파마시아)
[C242 항체와 면역독소의 생물학적 특성]
[콜로렉탈 암 조직과 정상 조직에서 C242(C242.II)의 면역 조직 화학평가.]
일차 콜로렉탈 암조직과 다양한 정상 조직의 시험체를 수술로 절제된 부위를 갖는 환자에게서 얻었다. 조직을 얼음위에 놓고, 액체 질소와 함께 예비 냉각된 이소펜탈에서 절제한 후 1시간 이내에 냉각시켰다. 절편으로 절단될때까지 -70℃에서 조직을 보관했다. 냉각되 생검을 5㎛절편으로 절단하고 +4℃에서 30초동안 50% 아세톤으로 고정시키고, +4℃에서 5분 동안 100% 아세톤으로 고정시켰다. 절편을 공기 중에서 건조시키고, 10분 동안 PBS에서 헹군다. 그후 5분 동안 PBS에 용해된 0.3% 과산화수소에서 모든 단편을 배향시켜 내인성 퍼옥시다제 형성을 방해하고, PBS로 2회 헹구었다. 그후, 정상적인 돼지 혈청으로 절편을 처리하고 +4℃에서 5분 동안 1:10의 PBS-4% BSA로 희석하여, 항체의 비특이 결합 형성을 방해했다.
실온에서 30분 동안 습한 대기하에서 항체를 사용한 모든 배양을 실시했다. 우선 상기 실시예 1에서 얻은 모노클로날 항체 C242 (C2412:II)로 상기 절편을 배양한 후, 2% 돼지 항-토끼 면역 글로불린을 갖는 1:400의 PBS-4% BSA로 희석된 비오틴화 말 항-마우스 IgG(벡타스테인-상표명, 벡터 래보러토리스, 벌링게임, 캘리포니아, 미합중국)을 배양하고, 최종적으로 아비딘 DH/비오틴화 호스래디시 포옥시다제 H 복합체(다코파츠 A/S, 코펜하겐, 덴마크)로 배양했다. 각각의 배양후, 슬라이드를 15분 동안 PBS에서 헹군다. 그후, 15분 동안 지지체로 절편을 처리하고, PBS로 헹구고, 해마토크실린으로 대비염색시키고, 글리세로젤라틴(멕, 다름스타트, 독일)으로 마운팅시킨다. 사용된 지지체는 6ml의 디메틸설폭시드에 용해된 10mg의 3-아미노-9-에틸카르바졸(시그마, 세인트 루이스, 미조리, SA)이었고, 4㎕의 30% H2O2를 함유한 pH 5.5의 50ml인 0.02M 나트륨 아세테이트로 희석시켰다. 사용하기 전에 지지체 용액을 여과했다. 그후, 절편을 검사하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타낸다.
[표 1]
표 1에 나타낸 바와 같이, 콜로-렉탈 종양의 63% 검사된 생검은 모노클로날 C242:II으로 양성 염색되었다는 것을 나타냈다. 정상 콜론 조직에서 항원 CA242의 형질발현이 종양 조직내에서 보다 더 약한 것으로 나타났으며, 염색은 원주 상피와 고브렛 세포에 거의 편재되어 있다. 비-콜론 정상 조직은 모노클로날 C242:II과 함께 반응성이 거의 결여되어 있으며, 반면, 정상의 가슴관, 췌장관, 담즙관 및 땀샘관에서 양성인 것으로 밝혀졌으나 염색의 강도는 약하다.
[시체에서 얻은 정상인 사람 조직에서 C242 (C242:II)의 면역조직 화학 평가]
시체에서 총 21개의 광범위한 정상인 사람 조직을 얻었다. 조직 시험체중 우수한 5가지 세트를 선별하여 C242:II 면역 반응성을 평가했다.
시체에서 조직을 떼내어, 항생물질이 첨가된 염기성 매질을 함유한 예비 냉각된 튜브로 즉시 넣었다. 튜브에 함유된 조직을 실험실(얼음)로 운반하고 배양액을 제거하고, 조직을 0.5㎤ 정육면체로 잘라냈다. 조직 정육면체을 여과지 스트립에 넣고, 스냅을 액체 N2에서 냉각시킨다. 절단하기 전까지 냉각된 조직을 -80℃에서 보관한다. 절단할 때, 냉각된 샘플을 6㎛ 절편으로 절단하고, 유리 현미경 슬라이드에 놓는다. 실온에서 2분 동안 100% 아세톤으로 슬라이드를 제거하고, 공기 중에서 건조하고, 사용할 때까지 -20℃에서 보관한다.
실온에서 30분 동안 습한 대기하에서 모든 배양을 실시했다. 트리스 완충 염수(TBS)에서 모노클로날 항체 C242:II으로 절편을 배양한 후, 20% 사람의 혈청(시그맨 케미칼 컴패니 리미티드, 푸울, 도르세트, 영국)을 함유한 TBS에 1:50으로 희석된 호스라디시 포옥시다제 접합 토끼 항-마우스 IgG (다코리미티드, 하이위콤브, 벅스, 영국)으로 배양한 후, 20% 사람의 혈청을 함유한 TBS에 1:50으로 희석된 호스라디시 퍼옥시다제 접합 돼지 항-토끼 IgG(다코리미티드)로 배양했다. 각각의 배양후, 슬라이드를 TBS에서 2회 헹구었다. 그후, 3-5분 동안 절편을 지지체로 처리하고, TBS로 헹구고, 메이어 해마토크실린으로 대비염색하고, 신세틱 마운팅 미디움(Synthetic Mounting Medium)(샨돈 사이언티픽 리미티드, 런콘, 체셔, 영국)으로 마운팅시킨다.
사용된 지지체는 17㎕의 30% H2O2를 함유한 17ml의 TBS에 용해된 10mg의 디아미노벤지딘(시그마)였다. 사용할 때 지지체 용액을 여과시켰다. 절편을 검사하여 결과를 하기의 표 2에 나타낸다.
[표 2]
표 2에 나타난 바와 같이, 72%의 정상인 PM 조직 스크린은 C242:II 반응성을 갖지 않는다. 28%로 양성인 경우, 대부분의 염색은 선명도나 초점이 집중되지 않고 흐트러져 있으며, 주로 조직내의 관 구조에 흐트러져 있다. 보다 불균질하지만, 여전히 위장의 상피에 대해서는 최소의 결합이 관찰된다. 2/4 피부 시험체가 인상 상피와 땀선에 대해서 양성의 반응성을 갖도록 염색되어 있다. 또한 인상 상피는 C242:II로 스크린된 4편도 시험체에서 양성으로 염색되어 있다.
[COLO 205 인체 콜론 암에 결합된 C242:II의 엔도사이토시스]
하기와 같이 엔도사이토시스 분석을 실시했다:
단층 배양액으로 성장한 COLO 205세포(상기 설명된 C242 항체의 제조 참조보라)조 제조한 단일 세포 현탁액을 제조했다. 세포를 트립신으로 처리하고, 세척하고, 배양액 매질에 제현탁시켰다. 상기(50ng의 모노클로날 항체에 상응하는 200000cpm)의 요오드 표지된 C242:II 항체를 5ml 시험관내의 COLO 205 세포(106세포)의 단일 세포 현탁액에 첨가했다. 최종 부피는 200㎕/시험관이었다.
1시간 동안 얼음(0℃)에서125I-C-242의 존재하에 세포를 배양했다. 그후 현탁액을 원심분리하고, 세포를 세척하여 결합되지 않은 모노클로날 항체를 제거한다. 예비 배양된 세포를 1시간 동안 10분 간격으로 37℃에서 배양하고, 세포를 재냉각시키고 매시간 펠렛화한다. 배양 매질에 방출된 방사능 표지를 상청액(LKB 감마 계수기, 파마시아 AB, 웁살라 스웨덴)에서 측정했다. 또한 상청액을 TCA 침강시키고, 침강물의 방사능을 측정했다. 2.5mg/mL 파파인을 함유한 pH1.5의 0.2M 글리신-HCl 완충용액의 산 세척으로125I-C242에 결합된 표면을 제거하고, 내면화된125I-C242를 나타내는 방사능을 계수하였다. 37℃에서 배양된 매 시간후 결합된 표면의 양은 모노클로날 항체에 결합된 전체 표면에서 방출되고 내면화된 모노클로날 항체를 빼서 계산했다. 방출된 항체의 감소를 매질 상청액의 TCA 침강으로 측정했다.
결과를 첨부된 제15도에서 나타냈으며, 이는 COLO 250 세포에 의해125I-C242:II의 엔도시토시스를 나타내며, 세포 표면(“Sur”), 내면화 방사능(“Int”), 방출된 방사능(“Res”) 및 감소 방출된 방사능(“Deg.Re”)에 대한 방사능은 세포 표면에서의 모든 초기 방사능의 %로 나타냈다. 제15도에서, 37℃에서 예비 배양된 세포를 배양시킬 때 20% 이상의 내면화 C242:II를 1시간내에 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 매질 상청액이 TCA 침강되었을 때 소량의 산 가용성 방사능이 있으며, 이는 1시간의 배양후 방출된 활성이 절단이 거의 없다는 것을 나타낸다.
[리신 A/C242 항체 면역 독소의 세포 독성; 생체외에서의 세포 독성]
본 테스트는 사람의 콜로-렉탈 세포라인(COLO 205ATCC No.CCL 222)에 대한 면역 독소의 생체외에서의 세포 독성을 나타낸다.
2.Og/l의 중탄산 나트륨을 사용하고, 글루타민을 사용하지 않으며, 5% 열불활성화 송아지 혈청, 2mM L-글루타민 및 50㎕/ml 젠타마이신을 사용하여 RPM 1540 매질내의 현탁액에서 COLO 205 세포를 성장시켰다. 단백질 합성 저해 분석에 있어서, 100㎕ 부피의 96 웰 플레이트내의 2 × 104세포/웰에 세포를 플레이팅시켰다. 면역 독소 샘플을 3가지 복제 웰에 첨가했다. 2,000 내지 0.98ng/ml의 12더불링 희석으로 면역 독소를 첨가했다. 2μCi의3H-L-루신이 각각의 웰에 첨가되기 전에 37℃, 24시간 동안 각각의 플레이트를 배양했다. 37℃에서 24시간 동안 플레이트를 배양했다. 각각의 웰/플레이트에서 유리 파이버 매트상에 세포를 거두고 들이고, LKB 베타플레이트 신틸레이션 계수기를 사용하여 방사능을 측정했다. 단백질 합성 저해 곡선을 만들고, IC50값을 구했다. 바람직한 면역 독소(상기 설명된 제조)로 얻은 결과를 제16도에서 예시했다.
[생체내 세포 독성]
상기 테스트는 의식을 잃은 쥐에서의 피하 이종조직 이식으로 성장한 사람의 종양 세포 라인, COLO 205에 대한 면역 독소의 생체내 세포 독성을 나타낸다. 항체만을 사용하거나 또는 인산염 완충 염수를 사용하여 대조군을 테스트했다.
의식을 상실한 쥐의 옆구리의 단일 피하 부위에 5 × 106COLO 205 세포를 주입했다. 종양을 성장시켜 3-4일마다 칼리퍼를 사용하여 종양의 면적을 측정한다. 종양이 0.7-1.0㎠이 될 때까지 테스트 물질을 투여하지 않았다. 상기 단계가 0일째이며, 0, 1 및 2일째 되는날 꼬리 정맥에 테스트 물질을 정맥내에 투여했다. 종양의 크기를 계속해서 측정했고, 상대적인 종양 부피를 구했다. 실험이 종료될 때까지 3-4일마다 측정을 실시했다.
상기의 테스트를 종양의 성장에 대해서 인산염 완충 염수, C242 항체 단독(1.2mg/kg), 바람직한 면역 독소(상기 설명된 제법)(2.0mg/kg)의 상대적인 종양 부피의 효과와 비교했으며, 그 결과를 하기 표에 예시했다.
그룹 1 인산염 완충 염수 0.1ml/10g/정맥내/일일 3회
그룹 2 C242 항체 1.2ml/kg/정맥내/일일 3회
그룹 3 면역 독소 2.0mg/kg/정맥내/일일 3회
상기 표에서 예시한 바와 같이, 인산염 완충 염수(PBSA) 대조용과 항체 단독의 경우와는 반대로 면역 독소는 종양 크기(표는 상대적인 종양 부피를 나타냄)의 감소를 야기한다.
[사람의 췌장 종양 조직과 C242:II의 반응성]
상기 테스트는 사람의 췌장 종양 조직과 C242:II의 반응성을 나타낸다.
사람의 정상 조직의 반응성에 대해 설명한 것과 동일한 면역 조직학적 기술을 이용하여 사람의 췌장 종양 조직에 대한 C242:II 반응성을 측정했다. 신선한 냉동 췌장 종양 조직을 미세한 침으로 채취한 생검 물질에서 얻었으며, 포르말린으로 고정되고/파라핀 포매 조직을 종양 절제로 얻었다. 13/16의 췌장 종양이 양성으로 염색되었다. 일반적으로 결합의 정도와 형식은 콜로-렉탈 종양 조직의 시험체에서 관찰된 것보다 낫거나 동일했다.
[췌장 종양 세포 라인에서 면역 독소의 생체외 역가]
본 테스트는 사람의 췌장 종양 세포라인에 대한 면역 독소의 생체외 세포 독성을 나타낸다. 췌장 선암에서 세포라인 팬 1을 사용하여 면역 독소의 세포의 세포 독성 역가를 정량했으며, FACS 분석으로 목표하는 항원을 형질 발현시켰다. 역가를 정량하기 위해서 배양역내의 팬 1세포에 첨가하는 면역 독소의 농도를 변화시켜 IC50을 얻었다. MOPC 21:리신 A 접합물과 리신 A를 단독으로 사용하여 음성 대조군으로 했다. 생체 분석을 3회 실시하고, 40+/- 18ng/ml의 평균 역가를 얻었다. 음성 대조군은 1,000ng/ml 이하의 농도에서는 세포 독성이 아니었다. 상기 데이터는 목표하는 항원이 췌장 종양 세포에 존재하며, 항원 양성 종양 세포는 면역 독소에 의해 죽을 수 있다.
[모노클로날 항체 C242:II의 cDNA의 암호화 부위의 경쇄 및 중쇄의 분자 클로닝]
A. 총 RNA의 제조
쵸메진크시, P. 및 사키, N, (1987, Anal. Biochem, 162, 156-159)에 의해 개질된 바와 같은 서귄, J.M. 이동(1979; Biochemistry 18, 5294-5299)의 방법에 따라 108세포의 총 RNA를 제조했다. 간략하게, 4M 구아니디늄 티오시아네이트 ; 25mM 나트륨 시트레이트 ; pH7 ; 0.5% N-라우로일 사르코신 ; 0.1M 2 메르캅토에탄올로 구성된 15ml의 저온 변성 용액에 세포 펠렛을 용해시켰다. 세포 물질을 용해시킨 후, 1.2ml의 2M 나트륨 아세테이트(pH 4.0)를 첨가하고, 페놀-클로로로포름-페놀-클로로포름-이소아밀 알콜(250:49;1)을 사용하여 상기 혼합물을 추출시켰다. 원심 분리 후, 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하여 수성 상에서 RNA를 침강시키고, -20℃에서 밤새 배양시켜 총 RNA를 침강시켰다. RNA를 원심 분리시키고 재현탁한 후, 침강을 반복하고, 원심분리하고, 총 RNA를 침강시킨 후, 흡광도 측정을 기준으로 960㎍에 대해 수득율을 계산했다.
B. mRNA의 분리
상기에서 제조된 총 RNA에서 폴리아데닐화 mRNA를 분리시키기 위해서, 미합중국 위스콘신 매디슨 프로메가 코오포레이션의 폴리어트랙트TMmRNA 분리시스템을 제조업자의 지시사항에 따라 사용했다(참고 : 프로메가 테크니칼 불러틴, No. 090:1990). 간략하게 960㎍의 총 RNA를 물에 용해시키고, 0.4 X SSC(1 X SSC=8.77g NaCl, pH 7.0에서 물 1ℓ당 4.41g 나트륨 시트레이트)에서 비오틴화 올리고(dT) 탐침(50P몰)을 사용하여 어닐링시켰다. 스트렙타비닌 피복된 상자성 비이드(스트렙타비딘 마그네스피어TM)를 첨가하고 10분 배양후, 자기성 입자를 제거하여 0.1 X SSC로 여러번 세척했다. 물에 배양시켜 스피어로 폴리아데닐화 mRAN를 유출시켜 5ℓ의 mRNA를 얻었다.
C. E.Coli의 cDNA 파지 라이브러리의 제조
구블러, 유우. 및 호프만, 비이.제이(1983; Gene 25, 263-269)의 방법으로 상기 단계의 폴리아데닐화 mRNA에서 cDNA를 제조하고, 2중 스트랜드 cDNA의 클로닝을 가능케하는 벡터 유니-잽TM(스트라타뉴 인코오포레이티드, 라졸라, 캘래포니아)에 대해 개질시켰다. 간략하게, 유니-잽TM링커 프라이머(56ng/ml)를 사용하여 프라이밍시키고, 0.6mM의 dATP, dGTP, dTTP, 및 5-메틸-dCTP 및 45U의 몰론시 뮤린 류케미아 비루스 역전사효소를 첨가하여 5㎍의 폴리아데닐화 mRNA를 단일 스트랜드 cDNA로 전환시켰다. 혼합물을 1시간 동안 37℃에서 배양했다. dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP를 0.15mM, 3.2U RNase H, 및 6.5U DNA 폴리머라제 1에 첨가하고, 16℃에서 2.5시간 동안 배양시켰다. 페놀-클로로포름(1:1)으로 혼합물을 추출하고, 에탄올을 침강시켰다. 0.16mM dNTP 및 10U T4 DNA 폴리머라제를 37℃에서 30분간 동안 배양시켜 cDNA의 말단을 평체화했다. 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침강후, 3 비스 U T4 DNA 리가아제, 1mM ATP를 첨가하고, 8℃에서 밤새 배양함으로써 생성된 평체 cDNA를 EcoRI 수용체에 결찰시킨다. 결찰후 1mM ATP의 존재하에 10U T4 폴리뉴크레오티드 키나제를 첨가하고, 37℃에서 30분동안 배양시킴으로써 EcoRI 응집성 말단을 키나아제화했다. 포스포릴화 EcoRI 응집성 말단을 갖는 상기의 cDNA를 90U X홀로 소화시키고, 유니-잽TM링커 프라이머로 암호화된 서열에서 X홀 응집성 말단을 생성시켰다. 그후 생성된 cDNA를 2비스 U T4 DNA 리가아제, 1mM ATP의 존재하에 된 1㎍의 유니=잽TMXR EcoRI 및 X홀에 결찰시키고, 120℃에서 밤새 배양했다. 제조업자의 지시에 따른 지가팩 II 골드R 팩키징 추출물을 사용하여 결찰 혼합물을 λ-파아지 입자에 생체외에 포장하고 파아지를 사용하여 E.Coli PLK-F′를 감염시켰다. 생성된 cDNA 라이브러리의 8.5 ×104독립클론을 증폭시켜 7.5 × 108pfu/ml의 파아지 역가를 얻었다. 하기에 설명된 바와 같이 숙주(참고:불록, 더블우. (1978)바이오테크닉스 5,4)로서 E.Coli XL1-블루를 사용하여 상기의 cDNA 라이브러리를 스크리닝시켰다.
D. 하이브리드형성 탐침의 제조
C424:II 항체의 IgG1 중쇄 및 카파 쇄를 암호화하는 cDNA 클론을 검출하기 위해서 중쇄, CH1의 첫 번째 불변수와 카파 쇄, CK의 불변부를 포함하는 하이브리드 형성 탐침을 사이키 아아르. 에이치., 일동에 따른 폴리머라제 연쇄 반응으로 쥐의 게놈 DNA로 제조했다)(1988; 사이언스 239, 487-491). 간략하게, 상기 면역 글로블린 부위를 암호화하는 엑손의 5′와 3′ 부위에 하이드리드를 형성하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 주의 게놈 DNA의 증폭에 사용된다. 아가로스 겔 전기 영동으로 정제한 후, 화인버그, 에이.페이., 및 보겔 스타인, 비이.에 따른 무작위 프라이머 확장 방법으로 상기의 DNA 탐침 절편을32P로 표지했다(1983;Anal. Biochem. 132, 6).
E. IgG1 중쇄 및 카파쇄 암호화 서열을 위한 스크리닝 및 플라스미드로의 삽입
샘브룩 제이. 일동(1989; 분자 블로닝, 2판, 콜드 스프링 하버 래보러토리프레스)에 의해 설명된 방법에 따라 각각 D로부터의 면역 글로블린 IgGl 및 카파 탐침을 사용하는 2개의 분리된 라운드에서 상기 C로부터의 cDNA 라이브러리를 스크리닝시켰다. 초기의 스크리닝과 같은 동일한 탐침을 사용하여 제스크리닝시킴으로써 2가지의 분리된 하이드리드 형성으로부터 양성 하이드리드화 파아지 클론을 정제했다. 쇼트, 제이.엠. 일동(1988; Nucleic Acids Res. 16, 7583-7600)에 따라서, 양성 하이드리드화 파아지 클론을 E.Coli CL1-블루의 배양액에서 확장시키고, 생성된 파아지 저장물을 사용하여 파아지미드를 제거시키고 전개시킴으로써 P블루스크립트 SK(-) 플라스미드를 함유하는 cDNA를 제조했다.
F. 하이브리드화 콜로니로부터 플라스미드 cDNA의 특성 결정
생거, 에프. 일동(1988; Proc, Natl, Acad, Sci, USA 74, 5463-5467)에 따라서, 제한 효소 지도로 플라스미드를 함유한 상기의 cDNA를 특성결정하고, 목적하는 크기의 삽입물을 함유하는 플라스미드를 DNA 서열에 디데옥시화했다. pKGE761로 표시된 Ig 카파 탐침으로 하이브리드화된 플라스미드는 이미 공지된 주위 카파 경쇄 서열과 거의 유사한 개구 리딩 프레임을 암호화하는 서열의 cDNA 삽입물을 함유한다(참고, 카바트, 이이. 에이. 일동(1987), 면역학적 관점에서의 단백질의 서열화, 4판, 미합중국, 보건 의료 후생성, 국립 의료원) 카파 경쇄, VK, 및 이의 해독 단백질 서열의 가변부를 암호화하는 cDNA 서열의 일부를 제18도에 도시한다. cDR1에서 CDR3로 표시된 3가지의 CDR 서열을 밑줄을 그어서 나타냈다. 에스. CK로 나타낸 VK 절편의 아미노 말단 단부에 선행하는 단일 펩티드는 VK 서열의 the 카르복시말단 단부가 있는 불변부를 나타낸다.
pKGE762로 표시된 IgG1 탐침으로 하이브리드화된 플라스미드는 이미공지된 주의 IgG1 중쇄 서열과 거의 유사한 개구 리딩 프레임을 암호화하는 서열의 cDAN 삽입물을 함유한다(참고, 카바트, 이이. 에이., 일동 등). IgG1 중쇄 가변부를 암호화하는 cDNA 서열의 일부, VH 및 이의 해독된 단백질 서열을 제19도에 나타낸다. CDR1 CDR3로 표시된 3가지의 CDR 서열은 밑줄을 그어서 나타냈다. 에스 CH1으로 나타낸 VH 절편의 아미노말단 단부에 선행하는 신호 펩티드는 VH 서열의 카르복시말단 단부가 있는 불변부를 나타낸다.
[조성]
하기는 사람에게 치료학적인 목적으로 사용할 수 있는 본 발명의 면역 독소를 함유하는 대표적인 약학적 투약량을 예시한다.
[주사용 용액]
무균수용액, 투여용, 하기를 함유한다(용액 1ml 당) :
리신 A/C242 항체 면역 독소 … 1.0mg
나트륨 아세테이트 삼수화물 … 6.8mg
염화 나트륨 … 7.2mg
트윈 20 … 0.05mg/용액 1ml
[서열목록]
(1) 일반정보
(i) 출원인 : 임페리얼 케미칼 인더스트리즈 피엘시 및 캐비 파마시아 에이비
(ii) 발명의 명칭 : 접합물
(iii) 서열번호 : 22
(iv) 주소 :
(A) 주소 : 리갈 디파트먼트 : 특허부
(B) 스트리트 : 베세머 로드
(C) 시 : 웰윈 가든 시티
(D) 주 : 헤드트포드셔
(E) 국명 : 영국
(F) 우편번호 : GB-ALU 1HD
(V)컴퓨터 판독형 :
(A) 메디움 형 : 디스켓, 3.50 인치, 1.2Mb 저장용량
(B) 컴퓨터 : 18 M PS/2
(C) 작동 시스템 : PC-DOS 3.20
(D) 소프트웨어 : WPS-PLUS의 ASCII
(vi) 현재출원데이터 :
(A) 출원번호
(B) 출원일
(C) 분류번호
(vii) 종래 출원데이터 :
(A) 출원번호. 9114399.0
(B) 출원인 : 1991. 7. 3
(2) 서열 번호 1의 정보 :
(i) 서열특징 :
(A) 길이 : 16 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드 종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 1
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
(2) 서열 번호 2의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 7 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 2 :
Arg Met Ser Asn Leu Val Ser
(3) 서열 번호 3의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 9 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 3 :
Leu Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
(2) 서열 번호 4의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 5 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 4 :
Tyr Thr Gly Met Asn
(2) 서열 번호 5의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 17 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 5 :
Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Phe Lys Gly
(2) 서열 번호 6의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 5 :
Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Asp Val
(2) 서열 번호 7의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 7 :
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 16
Trp Phe 18
(2) 서열 번호 8의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 11 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 8 :
Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val
(2) 서열 번호 9의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 11 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 9 :
Leu Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly
(2) 서열 번호 10의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 7 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 10 :
Phe Thr Tyr Thr Gly Met Asn
(2) 서열 번호 11의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 21 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 11 :
Met Gly Trp Ile Asp Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp 16
Phe Lys Gly Arg Ile 21
(2) 서열 번호 12의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 12 :
Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 14
(2) 서열 번호 13의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 25
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 14 :
AATTCGCAT GCGGATCCAT CGATC 25
(2) 서열 번호 14의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 25
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 14 :
GCGTACGCC TAGGTACGTA GAGCC 25
(2) 서열 번호 15의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 21
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 15 :
GATAACAACA TATTCCCCAA A 21
(2) 서열 번호 16의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 16 :
GATAACAAC ATGGTACCC AAA 23
(2) 서열 번호 17의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 17 :
AACAACATG GTACCCAAA CAA 23
(2) 서열 번호 18의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 1140
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 18 :
(2) 서열 번호 19의 정보:
(i) 서열특징 :
(A) 길이 : 26
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드 종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 19 :
(2) 서열 번호 20의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 86
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 20 :
(2) 서열 번호 21의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 463
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 21
(2) 서열 번호 19의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 26
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 19 :
ATAACAACAT GGTTCCCAAA CAATAC
(2) 서열 번호 20의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 86
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 20 :
AAAAAGGGTA TCGACATGGT ACCCGGGGAT CCACCTCAGG GTCCTCTTTC ACATTAGAGG
ATAACAACAT GGTACCCAAA CAATAC
(2) 서열 번호 21의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 463
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 21 :
(2) 서열 번호 22의 정보
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 483
(B) 종류 : 핵산
(C) 스트랜드종류 : 단일
(D) 형태 : 선형
(xi) 서열표시 : 서열 번호 22 :

Claims (13)

  1. 위장의 종양에 선택적인 표적 세포 결합부와 독소부를 포함하며, 이 표적 세포 결합부는 C242 항체 또는 이 C242 항체와 동일한 항원 결정 인자 또는 에피토프에 결합하는 C242 항체의 단편을 포함하는 접합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 독소부가 재조합 리신 A를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합물.
  3. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 표적 세포 결합부와 독소부가 이작용성 링커에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 접합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 세포 결합부와 독소부가 이황화결합 또는 티오에테르 결합에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 접합물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 표적 세포 결합부와 독소부가 식 -S-X-CO-의 링커에 의해 결합되며, 이 때 X는 (1-6C)알킬, 페닐 및 (1-4C)알킬페닐 중에서 선택된 1개 또는 2개의 치환기에 의해 임의로 치환된 직쇄 (1-6C)알킬기이거나; 또는 알킬부가 (1-6C)알킬, 페닐 및 (1-4C)알킬페닐 중에서 선택된 1개 또는 2개의 치환기에 의해 임의로 치환된 (1-4C)알킬페닐기이며; 상기 페닐고리는 할로겐, (1-4C)알킬 및 (1-4C)알콕시 중에서 선택되는 치환기를 포함할 수 있는 것임을 특징으로 하는 접합물.
  6. 제5항에 있어서, X가 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 중에서 선택되는 1개 또는 2개의 기에 의해 치환된 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 부틸렌 기를 포함하는 것임을 특징으로 하는 접합물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 링커가 라디칼 -S-CH(CH3)CH2CO-를 포함하는 것임을 특징으로 하는 접합물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 세포 결합부가 실질적으로 하기의 서열을 갖는 CDR 영역을 지니며, 이 CDR 영역은 상기 표적 세포 결합부가 C242 항체와 거의 동일한 세포 결합 특성을 갖도록 배열하는 것을 특징으로 하는 접합물 :
    L쇄(경쇄)
    CDR1 : ArgSerserLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
    CDR2 : ArgMetSerAsnLeuValSer
    CDR3 : LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr
    H쇄(중쇄)
    CDR1 : TyrThrGlyMetAsn
    CDR2 : TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysgly
    CDR3 : ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal
  9. 하기 식에서 표시되는 접합물.
    상기식에서, A는 재조합 리신 A를 포함하고, B는 C242 항체인 표적 세포 결합부를 포함하며; S1은 재조합 리신 A상에 존재하는 황 원자이고; NH는 C242 항체 상에 있으며; S2는 황 원자 기이고; X는 (1-6C)알킬, 페닐 및 (1-4C)알킬페닐 중에서 선택된 1개 또는 2개의 치환기에 의해 임의로 치환된 직쇄(1-6C)알킬기이거나; 또는 알킬부가 (1-6C)알킬, 페닐 및 (1-4C)알킬페닐 중에서 선택된 1개 또는 2개의 치환기에 의해 임의로 치환된 (1-4C)알킬페닐기이며; 상기 페닐고리는 할로겐, (1-4C)알킬 및 (1-4C)알콕시 중에서 선택되는 치환기를 포함할 수 있다.
  10. 제1항에 있어서, C242 항체와 재조합 리신 A를 포함하며, 상기 C242 상의 아미노기와 리신 A내의 시스테인 잔기의 티올기가 3-메르캅토 부티르산 디라디칼(-C0·CH2CH(CH3)-S-)에 의해 결합된 접합물.
  11. 제1항에 있어서, 재조합 리신 A와 표적 세포 결합부를 포함하며, 이 표적 결합부는 거의 하기 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR 영역을 가지며, 이 CDR의 수와 그것의 배열은 상기 표적 세포 결합부가 C242 항체와 실질적으로 동일한 세포 결합 특성을 지닐 수 있도록 되어 있는 접합물.
    L쇄(경쇄)
    CDR1 : ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
    CDR2 : ArgMetSerAsnLeuValSer
    CDR3 : LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr
    H쇄(중쇄)
    CDR1 : TyrThrGlyMetAsn
    CDR2 : TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysgly
    CDR3 : ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal
  12. 제1항의 접합물을 제조하는 방법으로서, (a) 표적 세포 결합부가 독소부에 직접 결합된 접합물인 경우, 이 독소부와 표적 세포 결합부를 반응시키고; (b) 표적 세포 결합부가 링커에 의해 독소부에 결합된 접합물인 경우, 링커에 의해 유도체화된 표적 세포 결합부를 독소부와 반응시키거나, 링커에 의해 유도체화된 독소부를 표적 세포 결합부와 반응시키는 것을 포함하는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 기재된 접합물을 약학적 허용 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 위장 종양의 치료에 유용한 약학적 조성물.
KR1019920011913A 1991-07-03 1992-07-03 항-종양 치료에 사용되는 접합물 및 그 제조방법 KR100252147B1 (ko)

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GB919114399A GB9114399D0 (en) 1991-07-03 1991-07-03 Conjugates
GB9114399.0 1991-07-03

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