FI106928B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen konjugaatin valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen konjugaatin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI106928B
FI106928B FI923085A FI923085A FI106928B FI 106928 B FI106928 B FI 106928B FI 923085 A FI923085 A FI 923085A FI 923085 A FI923085 A FI 923085A FI 106928 B FI106928 B FI 106928B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
moiety
target cell
antibody
cell binding
ricin
Prior art date
Application number
FI923085A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI923085A (fi
FI923085A0 (fi
Inventor
John Edward Fitton
Jan Holmgren
Andrew Firman Wright
David Charles Blakey
Peter Lind
Leif Lindholm
Original Assignee
Zeneca Ltd
Kabi Pharmacia Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeneca Ltd, Kabi Pharmacia Ab filed Critical Zeneca Ltd
Publication of FI923085A0 publication Critical patent/FI923085A0/fi
Publication of FI923085A publication Critical patent/FI923085A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI106928B publication Critical patent/FI106928B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Semiconductor Lasers (AREA)
  • Bipolar Transistors (AREA)
  • Metal-Oxide And Bipolar Metal-Oxide Semiconductor Integrated Circuits (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

106928
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen konjugaatin valmistamiseksi Tämä keksintö liittyy menetelmään kasvaimia vastaan 5 suunnatussa hoidossa käytettävien konjugaattien, kuten im-munotoksiinien tarkemmin keksintö liittyy menetelmään terapeuttisesti käyttökelpoisen konjugaatin valmistamiseksi, joka konjugaatti käsittää toksiiniosan ja kohdesoluun sitoutuvan osan, on valikoiva gastrointestinaalisia kasvai-10 mia kohtaan, ja jossa kohdesoluun sitoutuva osa käsittää C242-vasta-aineen tai kohdesoluun sitoutuvan osan, jolla on olennaisesti samat soluunsitoutumisominaisuudet.
Risiini ja risiinintyyppiset molekyylit, kuten abriini, modesiini ja viskumiini, ovat kasvisolujen tuot-15 tamia tunnettuja yhdisteitä, joilla on sytotoksisia ominaisuuksia. Tämäntyyppiset toksiinit koostuvat kahdesta polypeptidiketjusta, jotka ovat kytkeytyneet toisiinsa disulfidisillan välityksellä. Toinen polypeptidiketjuista ("A"-ketju) vastaa pääasiassa toksiinimolekyylin sytotok-20 sisista ominaisuuksista, kun taas toinen polypeptidiketju ("B"-ketju) mahdollistaa toksiinimolekyylin sitoutumisen solujen pintaan.
Risiinityyppisten molekyylien toksisuus on kolmivaiheinen ilmiö: ' 25 (a) toksiini sitoutuu solun pintaan B-ketjun galak- toosia sitovien kohtien ja solun pinnalla esillä olevien glykoproteiinien tai glykolipidien kesken tapahtuvien vuorovaikutusten välityksellä; (b) ainakin A-ketju tunkeutuu solun sytosoliin, ja 30 (c) proteiinisynteesi inhiboituu A-ketjun tuhotessa ribosomien 60S-alayksiköiden aktiivisuuden.
Sen lisäksi, että B-ketjun primaarisena tehtävänä on toksiinimolekyylin sitominen solun pintaan, arvellaan sen tärkeäksi sekundaariseksi tehtäväksi helpottaa toksii-35 nin kerääntymistä soluun. Niinpä A- ja B-ketjut ovat toi- 2 106928 sistaan erossa ollessaan olennaisesti ei-toksisia, koska A-ketju ei B-ketjun puuttuessa pysty sitoutumaan solujen pintaan ja tunkeutumaan solun sytosoliin eikä B-ketjulla taas ole sytotoksisia ominaisuuksia.
5 Kuten aiemmin mainittiin, risiini ja risiinin tyyp piset toksiinimolekyylit ovat kasvien tuottamia. Varsinaisen risiinin ollessa kyseessä tuotanto tapahtuu Ricinus communis -kasvissa, josta käytetään myös nimitystä risii-niöljykasvi. Arvellaan, että ensimmäisessä vaiheessa muo-10 dostuu johtojakson, A-ketjun, yhdistävän jakson ja B-ket -jun käsittävä prekursoripolypeptidi (josta käytetään nimitystä preprorisiini). Johtojakson uskotaan eliminoituvan tämän prekursorin (preprorisiinin) kuljetuksen aikana kasvisolun sisällä,, jolloin muodostuu prorisiiniä. Maturoitu-15 nut risiini muodostuu sitten prorisiinistä siten, että A-ja B-ketjujen välille muodostuu disulfidisilta ja yhdistävä jakso eliminoituu.
Aiemmin on jo ehdotettu, että toksiinien, kuten risiinin, A-ketjun toksisuus saattaisi olla käyttökelpoi-20 nen kasvaimia vastaan suunnatussa hoidossa, mikäli erottelematta sitoutuva B-ketju voitaisiin korvata erilaisella kantaja-aineella, jolla olisi kyky sitoutua kasvainsolui-hin normaaleihin soluihin tapahtuvan sitoutumisen kustannuksella. On tehty ehdotuksia useista erilaisista konju-·. 25 gaateista, jotka sisältäisivät maturoituneen risiinin tai risiinin A-ketjun ja kasvaimia vastaan spesifisen vasta-aineen, ja näitä konjugaatteja on myös valmistettu. Tällaisilla konjugaateilla, immunokonjugaateilla tai immuno-toksiineilla on kuitenkin monia haittapuolia.
30 Yhden tunnettuihin konjugaatteihin liittyvän ongel man aiheuttaa luonnosta peräisin olevan risiinin A-ketjun eräs rakenteellinen ominaisuus. Arvellaan, että risiinin synteesin aikana kasvisoluissa tapahtuu N-glykosylaatiota ja tuloksena olevat sokeriryhmät kykenevät ei-spesifiseen 35 vuorovaikutukseen solujen pinnan kanssa.
• 3 106928
Kasvirisiini-immunokonjugaatteja koskevan valikoivuuden menetyksen arvellaan syntyvän joko (a) B-ketjun galaktoosia sitovien kohtien epäspesifisistä vuorovaikutuksista solujen pinnan kanssa koko- - 5 naista risiiniä sisältävien immunokonjugaattien kyseessä ollessa, tai (b) että kasvin risiinin A-ketjun sisältävien immunokonjugaattien kyseessä ollessa kasvin risiinin A-ketjus-sa ilmentyvät glykaanisivuketjut sitoutuvat solun pinnoil- 10 la oleviin galaktoosi- ja mannoosireseptoreihin.
Ongelmana on lisäksi se, että B-ketjun arvellaan helpottavan toksiinimolekyylin kertymistä soluun, kuten aiemmin jo mainittiin. Niinpä vaikka ne konjugaatit, joista B-ketju puuttuu, eli ne, jotka koostuvat A-ketjusta ja 15 vasta-aineesta, ovatkin spesifisempiä kuin natiivit toksiinit, niin niiltä on raportoitu puuttuvan natiivin toksiinin tehokkuus (Moolten, F. L. , et ai., Immun. Rev. 62 (1982) 47 - 72) . Tämän tehokkuuden menetyksen arvellaan johtuvan siitä, että toksiinin tehokas kerääntyminen so-20 luun on vähentynyt. Niinpä raportoiduista vasta-aineista suhteellisen harvat helpottavat toksiinin tehokasta kulkeutumista solun sisään, mikä johtaa tehokkuudeltaan vaillinaisten immunotoksiinien muodostumiseen.
Tähän mennessä on valmistettu konjugaatteja, joilla : 25 on käyttöpotentiaalia monien erilaisissa kudoksissa esiin tyvien kasvainten hoitoon. Esimerkiksi PCT-patenttihake-musjulkaisussa nro W085/003 508 on kuvattu sellaisten kon-jugaattien valmistus, jotka käsittävät loitontaja (spacer) -molekyylin välityksellä rintasyövälle spesifisiin vasta-30 aineisiin kytketyn risiinin A-ketjun tai difteriatoksiinin A-ketjun.
On myös julkaistu kolorektaalisyöpäsoluja tunnistavia vasta-aineita koskevia raportteja, mutta näitä vasta-aineita sisältävien konjugaattien heikkouksiin kuuluvat 3¾ taipumus sitoutua siinä määrin normaaliin kudokseen, ettei 4 106928 tällaista voida hyväksyä, ja/tai vähäinen tehokkuus. Niinpä kolorektaalisyöpäkasvainsoluja tunnistaville tunnetuille vasta-aineille ei ole löytynyt käyttöä valmistettaessa todellista terapeuttista mielenkiintoa omaavia konjugaat-5 teja. Niinpä on olemassa tarve saada käyttöön konjugaatti, jolla on terapeuttista arvoa kolorektaalisyövän vaatimassa hoidossa.
Vaikka onkin tehty ehdotuksia useiden erilaisten konjugaattien valmistamiseksi ja tällaisia on valmistettu, 10 on tarvetta saada käyttöön parannettuja konjugaatteja. Tällaisilla parannetuilla konjugaateilla voidaan poistaa yksi tai useampia tunnettuihin konjugaatteihin liittyvistä haitoista. On olemassa myös tarve saada käyttöön konjugaatteja, jotka ovat selektiivisiä gastrointestinaali-15 alueen kasvaimia vastaan.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle terapeuttisesti käyttökelpoisen konjugaatin valmistamiseksi, joka konjugaatti käsittää toksiinosan ja kohdesoluun sitoutuvan osan, on valikoiva gastrointestinaalisia kasvaimia koh-20 taan, ja jossa kohdesoluun sitoutuva osa käsittää C242-vasta-aineen tai kohdesoluun sitoutuvan osan, jolla on olennaisesti samat soluunsitoutumisominaisuudet , on tunnusomaista se, että menetelmässä: (a) niiden konjugaattien osalta, joissa kohdesoluun • 25 sitoutuva osa kytketään suoraan toksiiniosaan, annetaan toksiiniosan reagoida kohdesoluun sitoutuvan osan kanssa; tai (b) niiden konjugaattien osalta, joissa kohdesoluun sitoutuva osa kytketään toksiiniosaan liitososan välityk- 30 sellä, annetaan liitososan kanssa derivatisoidun kohdesoluun sitoutuvan osan reagoida toksiiniosan kanssa tai antamalla liitososan kanssa derivatisoidun toksiiniosan reagoida kohdesoluun sitoutuvan osan kanssa.
35 s 106928 Tämän keksinnön mukaisesti saadaan käyttöön konju-gaatti, joka käsittää toksiiniosan ja kohdesoluun sitoutuvan osan, joka on selektiivinen gastrointestinaalialueen kasvainsoluja vastaan.
5 Tarkemmin sanottuna kohdesoluun sitoutuva osa (ja siis myös konjugaatti) on selektiivinen kolorektaalisia kasvainsoluja ja haimasyöpäkasvainsoluja kohtaan, vielä tarkemmin sanottuna kolorektaalisyöpäkasvainsoluja kohtaan .
10 Kohdesoluun sitoutuva osa käsittää esimerkiksi yleensä vasta-aineen, vasta-ainefragmentin tai vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin johdannaisen.
Kohdesoluun sitoutuva osa on sillä tavoin selektiivinen gastrointestinaalialueen syöpäkasvainsoluja kohtaan 15 (erityisesti kolorektaalikasvainsoluja kohtaan), että tämä osa sitoutuu ensisijaisesti tällaisiin soluihin normaaleihin soluihin tapahtuvan sitoutumisen kustannuksella. Niinpä kohdesoluun sitoutuva osa sitoutuu gastrointestinaalialueen kasvainsoluihin mutta ei sitoudu tai sitoutuu ai-20 noastaan minimaalisesti normaaleihin soluihin. Tarkemmin sanottuna kohdesoluun sitoutuva osan selektiivisyys gastrointestinaalialueen syöpäkasvaimia kohtaan on olennaisesti yhtä suurta kuin C242-vasta-aineen selektiivisyys. Kuvaavia esimerkkejä C242-vasta-aineen gastrointestinaali-: 25 alueen syöpäkasvaimia, kuten kolorektaalikasvaimia, koh taan osoittamasta selektiivisyydestä ovat jäljempänä esitetyt immunohistokemialliset koetulokset. Tarkemmin sanottuna kohdesoluun sitoutuva osa, kuten C242-vasta-aine, sitoutuukin antigeeniin, joka esiintyy gastrointestinaali-30 alueen kasvainten yhteydessä mutta joka ei esiinny tai ilmentyy vain heikosti normaaleissa soluissa. Erityinen esimerkki tällaisesta kohdesoluun sitoutuvasta osasta on C242-vasta-aine tai kohdesoluun sitoutuva osa, jolla on olennaisesti samanlaiset sitoutumisominaisuudet soluihin.
6 · 106928
Kuten jo on mainittu, tämä konjugaatti kykenee tappamaan gastrointestinaalialueen kasvainsoluja. Niinpä tämä konjugaatti (tai "immunotoksiini") kykenee toimittamaan toksiiniosan kasvainsoluun siten, että toksiiniosan syto-5 toksiset ominaisuudet voivat päästä vaikuttamaan. Konju-gaatilla on siten yleensä kyky sitoutua kasvainsoluihin (kasvainsoluihin sitoutuvan kohdesoluun sitoutuvan osan avulla) ja mahdollistaa toksiiniosan pääsyn solun sisälle, eli mahdollistaa toksiiniosan "internalisoitumisen". Eri-10 tyisen tehokkailla konjugaateilla tulisi yleisesti olla seuraavat ominaisuudet: 1. Kohdesoluun sitoutuvan osan tulisi kyetä sitoutumaan kasvainsolun pinta-antigeeniin.
2. Solun pinnan antigeeniä tulisi esiintyä suurina 15 kappalemäärinä kasvainsolujen pinnoilla, esimerkiksi ainakin kymmenentuhatta solua kohti.
3. Antigeeniä ei tulisi esiintyä suurina kappalemäärinä normaalien solujen pinnalla.
4. Vasta-aineen ja antigeenin muodostaman komplek-20 sin tulisi internalisoitua tehokkaasti siten, että toksii- nimolekyylin sytotoksiset ominaisuudet pääsevät vaikuttamaan solunsisäisesti.
5. Konjugaatti tulisi edullisesti konstruoida siten, että se on riittävän stabiili pysyäkseen muuttumat- • 25 tomana veressä niin kauan, että se saisi toimitettua tok siiniosan kasvainsoluihin sekä sen olisi kyettävä tulemaan pilkotuksi riittävässä määrin, jotta toksiiniosan vapautuminen olisi mahdollista toksiiniosan päästyä solun sisään.
Vasta-aine C242 on IgG-luokkaan kuuluva hiiren vas-30 ta-aine, jota saadaan tuotettua viljelemällä tarkoituksenmukaisella kasvatusalustalla hybridoomasolulinjaa, joka on saatu aikaan fuusioimalla ihmisen paksunsuolen adenokarsi-noomasolulinjalla immunisoidun hiiren pernan soluja hiiren myeloomasolulinjaan Sp 2/0. C242:II-vasta-ainetta (josta 35 tässä keksinnössä käytetään yksinkertaisesti nimitystä 7 106928 C242-vasta-aine) tuottava hybridöomasolulinja (242.11) talletettiin 26.1.1990 Budapestin sopimuksen mukaisesti talletusnumerolla 90012601 talletuslaitokseen European Collection of Animal Cell Cultures (ECÄCC), PHLS Centre 5 for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, Yhdistynyt kuningaskunta.
Termi "kohdesoluun sitoutuva osa, jolla on olennaisesti samat soluunsitoutumisominaisuudet" käsittää kohde-soluun sitoutuvat osat, joilla on olennaisesti sama immu-10 nologinen spesifisyys kuin talletetun ECACC-soluiinjän 90012601 tuottamalla osalla, eli ne sitoutuvat samaan an-tigeenideterminanttiin tai epitooppiin ja kilpailevat C242-vasta-aineen kanssa tähän kohtaan sitoutumisesta.
Ilmaisuun "kohdesoluun sitoutuva osa" sisältyvät 15 myös vasta-ainefragmentit ja erityisesti vasta-aineen C242 fragmentit sekä koskemattomana pysynyt vasta-aine. Vasta-ainef ragmenteilla säilyy fragmentoimattoman immunoglobu-liinin sitoutumismiskyky ja spesifisyys ja näihin kuuluvat esimerkiksi vasta-ainetta proteolyyttisellä entsyymillä 20 hajottamalla aikaansaadut fragmentit. Erityisiä esimerkkejä fragmenteista ovat F(ab')- ja F (ab') 2-fragmentit.
On painotettava sitä, että kohdesoluun sitoutuva fragmentti voidaan valmistaa geenitekniikan avulla ja sen mukaisesti termi kohdesoluun sitoutuva fragmentti käsittää • · · 25 tällaisilla menetelmillä derivatisoidut vasta-aineet ja vasta-ainefragmentit. Erityisesti termi kohdesoluun sitoutuva osa käsittää C242-vasta-aineen tai sen fragmentin, joka on geenitekniikkaa käyttäen saatu tuote.
Vasta-ainefragmenttien ja erityisesti humanisoitu-30 jen vasta-ainefragmenttien valmistusta on kuvattu esimer-. kiksi teoksessa Carter et ai., Biotechnology, osa 10, hel mikuu 1992.
Kohdesoluun sitoutuva osa käsittää vasta-aineiden ja vasta-ainefragmenttien johdannaismuodot, ja erityisesti 35 ei-humaani-lähteistä johdettujen vasta-aineiden ja vasta- m . m m m 8 106928 ainefragmenttien humanisoidut muodot, esimerkiksi hiiren vasta-aineiden humanisoidut muodot.
Vasta-aine C242 on suunnattu kasvaimeen liittyvää antigeeniä vastaan, josta tässä keksinnössä käytetään ni-5 mitystä CA-242. Niinpä kohdesoluun sitoutuva osa käsittää erityisesti vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin, joka kykenee sitoutumaan antigeeniin CA-242. Spesifinen esimerkki tällaisesta vasta-aineesta on varsinainen vasta-aine C242. Kasvaimeen liittyvä antigeeni CA-242 ilmentyy 10 suurimmassa osassa kolorektaalisista kasvaimista, ja normaalissa paksusuolen kudoksessa se ilmentyy ainoastaan heikosti tai ei lainkaan.
Aiemmin mainittua geenitekniikkaa käyttäen kloonattiin jäljempänä kuvattavalla tavalla monoklonaalisen 15 C242:II-vasta-aineen kevyiden ja raskaiden ketjujen vaih- televien alueiden cDNA-jaksot. Ennen yksityiskohtaista tarkastelua lienee paikallaan kuvailla immunoglobuliinin perusrakenneyksikkö lyhyttä ja yleistä kuvausta käyttäen, johon soveltuu mukaan liitettyjen piirrosten kuvio 17, 20 joka esittää G-luokkaan kuuluvan vasta-aineen eli immunoglobuliinin yleisrakennetta.
Kuvion 17 perusteella immunoglobuliini koostuu kahdesta identtisestä kevyestä polypeptidiketjusta (L) ja kahdesta identtisestä raskaasta polypeptidiketjusta (H), '' 25 ja nämä neljä ketjua liittyvät toisiinsa disulfidisidosten ja useiden erilaisten ei-kovalenttisten voimien välityksellä muodostaen symmetrisen "Y"-kirjaimen muotoisen kuvion. Kussakin raskaassa ketjussa on molemmissa päissä sijaitseva vaihteleva alue (VH) ja niiden jälkeen useita 30 muuttumattomia alueita (CH), ja kummassakin kevyessä ket-; jussa on toisessa päässä sijaitseva vaihteleva alue (VL) ja toisessa päässä sijaitseva muuttumaton alue (CL) . On olemassa kahden tyyppisiä kevyitä ketjuja, joita kumpaakin erikseen nimitetään kappa- ja lambdaketjuiksi. Kevyen ket-35 jun vaihteleva alue on kohdakkain raskaan ketjun vaihte- .. .. · 9 106928 levän alueen kanssa ja kevyen ketjun muuttumaton alue on kohdakkain raskaan ketjun ensimmäisen muuttumattoman alueen kanssa, kevyiden ja raskaiden ketjujen vaihtelevien alueiden muodostaessa antigeenin sitoutumiskohdan.
5 Kevyiden ja raskaiden ketjujen vaihtelevat alueet ~ ovat yleisrakenteeltaan samanlaiset ja kumpikin näistä käsittää kolme runsasta vaihtelua sisältävää alueetta, joita kutsutaan komplementaarisuuden määrääviksi alueiksi, eli CDR-alueiksi, ja jotka sijaitsevat neljän kehysalueen, 10 eli FR-alueen, välissä. Kunkin vaihtelevan alueen CDR-alueet pysyvät lähellä kehysalueita, ja nämä kaksi CDR-aluesarjaa ovat yhdessä vastuussa vasta-aineen spesifisyydestä .
Vasta-aineen C242:II kevyiden ja raskaiden ketjujen 15 vaihtelevien osien cDNA-jaksojen kloonaamiseksi valmistettiin C242:II-hybridoomasta ensin cDNA-faagikirjasto sinänsä tunnettujen menetelmien avulla. Tämän jälkeen valmistettiin hiiren genomin DNA:sta polymeraasiketjureaktiota (PCR) ja sopivia alukkeita käyttäen hybridisaatiokoetti-20 mia, jotka kukin erikseen kattoivat raskaan ketjun ja kevyen ketjun (kappa) muuttumattomat osat. cDNA-kirjasto seulottiin tulokseksi saaduilla koettimilla C242:II-vasta-aineen raskaita ketjuja ja kappaketjuja koodaavia DNA-jak-soja sisältävien cDNA-kloonien suhteen. Positiivisesti 25 hybridisoituvat faagikloonit jatkoviljeltiin ja cDNA irrotettiin plasmidien muodossa. Viimeksimainitut luonnehdittiin restriktioentsyymikartoituksen avulla ja odotetun kokoisia liitosjaksoja (insert) sisältävät plasmidit sek-venssoitiin. CDR-alueiden määrittämisen mahdollistamiseksi 30 verrattiin liitososien koodaamia aminohappojaksoja aiemmin tunnettuihin hiiren kappaketjuihin ja raskaisiin ketjuihin huomioiden CDR-alueiden perussijaintipaikat, jotka on esitetty esimerkiksi teoksessa Kabat, E. A., et ai., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 4. painos, (1987), 35 U.S. Department of Health and Human Services, National * 10 106928
Institute of Health. Havaittiin, että kunkin ketjun omat CDR-alueet sisälsivät seuraavat aminohappojaksot (nämä on esitetty myös mukaan liitettyjen piirrosten kuvioissa 18 ja 19, katso myös jaksotunnisteet nro 21 ja 22): 5
Kevyt ketju CDR1 (jaksotunniste nro 1):
ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr CDR2 (jaksotunniste nro 2): ArgMetSerAsnLeuValSer 10 CDR3 (jaksotunniste nro 3): LeuGlnHisLeuGlyTyrProPheThr Raskas ketju CDR1 (jaksotunniste nro 4): TyrThrGlyMetAsn CDR2 (jaksotunniste nro 5):
TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly 15 CDR3 (jaksotunniste nro 6) : ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal Näitä CDR-alueiden aminohappo- ja/tai DNA-jaksoja koskevan tiedon perusteella alan ammattimies pystyy liittämään C242:II-vasta-aineen CDR-alueet toisen vasta-aineen 20 tai vasta-ainefragmentin kloonattuihin vaihteleviin osiin kohdemutageneesin avulla tällä alalla tunnetulla tavalla. Tähän menetelmään, joka yleisesti tunnetaan "CDR-alueiden siirtona" (tämä on kuvattu esimerkiksi EP-patenttihakemus-julkaisussa 239 400), kuuluu C242:II-vasta-aineen CDR-alu-25 eitä koodaavien jaksojen korvaaminen vastaanottavan vasta-aineen tai fragmentin CDR-alueita korvaavilla jaksoilla, ja sen tuloksena saadaan vasta-aine tai vasta-ainefrag-mentti, jonka spesifisyys vastaa monoklonaalisen C242:II-vasta-aineen spesifisyyttä. Kohdesoluun sitoutuvaa osaa 30 koskevaan suojapiiriin katsotaan luonnollisesti kuuluvan minkä tahansa sellaisen osan, joka käsittää ainakin yhden edellä kuvatuista CDR-alueista (tai edellä kuvattua CDR-aluetta olennaisesti muistuttavan alueen) omaavan vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin, vasta-aineessa tai vastasi ainefragmentissa olevien CDR-alueiden määrän ja niiden m 11 106928 järjestyksen ollessa sellaisen, että kohdesoluun sitoutuvalla osalla on olennaisesti samanlaiset sitoutumisominai-suudet soluun kuin mitä C242-vasta-aineella on. On tavallisesti edullista, että kohdesoluun sitoutuva osa sisältää 5 kaikki edellä kuvatut (tai olennaisesti edellä kuvattuja alueita muistuttavat) CDR-alueet (eli kevyen ketjun alueet CDR1, CDR2 ja CDR3 ja raskaan ketjun alueet CDR1, -2 ja -3) . Olennaisesti edellä kuvattuja alueita muistuttavat alueet käsittivät pidennettyjä jaksoja, kuten 10
Kevyt ketju CDR1 (jaksotunniste nro 7):
ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTrpPhe CDR2 (jaksotunniste nro 8): 15 IleTyrArgMetSerAsnLeuValSerGlyVal CDR3 (jaksotunniste nro 9):
LeuGlnHi sLeuGluTyrProPheThrPheGly Raskas ketju CDR1 (jaksotunniste nro 10): PheThrTyrThrGlyMetAsn 2 0 CDR2 (jaksotunniste nro 11) :
MetGlyTrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly-
Arglle CDR3 (jaksotunniste nro 12) : AIaArgArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVaITrpG1y 25 CDR-alueiden siirrolla valmistetut vasta-aineet tai vasta-ainefragmentit valmistetaan edullisesti siirtämällä C242:n CDR-alueet kehykseen, joka valitaan siten, että se muistuttaa suuresti C242:ta niin homologiansa kuin CRD-aluei-30 den kokonsa puolesta.
Tämän keksinnön mukaisesti saadaan myös käyttöön konjugaatti, joka käsittää toksiiniosan ja kohdesoluun sitoutuvan osan, joka käsittää C242-vasta-aineen, tai kohdesoluun sitoutuvan osan, jolla on olennaisesti samat si-35 toutumisominaisuudet soluun.
12 106928
On pantava merkille se seikka, että tämän keksinnön mukaisesti valmistettava konjugaatti ei välttämättä koostu yhdestä toksiinimolekyylistä ja yhdestä vasta-ainemolekyy-listä. Konjugaatti voi esimerkiksi käsittää useamman kuin 5 yhden toksiinimolekyylin vasta-ainemolekyyliä kohti.
Toksiiniosa käsittää yleensä komponentin, joka omaa sytotoksisia ominaisuuksia ja kykenee siis solujen sisään päästyään tuhoamaan soluja.
Kohdesoluun sitoutuva osa käsittää yleensä kohde-10 soluun sitoutuvan osan, joka kykenee tunnistamaan spesifisen antigeenideterminantin tai kohdesolun.
Toksiiniosa ja kohdesoluun sitoutuva osa voivat olla kytketyt toisiinsa suoraan tai ne on voitu kytkeä epäsuoralla tavalla. Toksiiniosa ja kohdesoluun sitoutuva 15 osa on yleensä kytketty siten, että konjugaatin geometrinen rakenne mahdollistaa kohdesoluun sitoutuvan osan sitoutumisen kohdesoluunsa. Toksiiniosa ja kohdesoluun sitoutuva osa on kytketty edullisesti toisiinsa siten, että konjugaatti on solujen ulkopuolella ollessaan pysyvä ja 20 solujen sisällä pysymätön, jotta toksiiniosa ja kohdesoluun sitoutuva gsa pysyisivät kytkettyinä toisiinsa kohdesolun ulkopuolella, mutta toksiiniosa vapautuisi konjugaatin päästyä solujen sisään. Konjugaatissa on siten edullisesti solujen sisällä pilkkoutuva/solujen ulkopuo-• ' · 25 lella pysyvä kohta.
Esimerkkejä sellaisista konjugaateista, joissa toksiiniosa on suoraan kytketty kohdesoluun sitoutuvaan osaan, ovat ne konjugaatit, joissa toksiiniosa ja kohde-soluun sitoutuva osa ovat kytkeytyneenä toisiinsa tok-30 siiniosan tioliryhmän ja kohdesoluun sitoutuvan osan tio-liryhmän välisellä disulfidisillalla.
Kohdesoluun sitoutuva osa voi sisältää osa-alueen, joka tunnistaa toksiiniosan ja siten kytkee toksiiniosan ja kohdesoluun sitoutuvan osan toisiinsa. Esimerkki jäl-35 kimmäisestä tapauksesta on sellainen, jossa kohdesoluun 13 106928 sitoutuva osa sisältää toksiiniosaan sitoutuvan vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin.
Kohdesoluun sitoutuva osa ja toksiiniosa voivat käsittää yhden polypeptidin, joka edullisesti sisältää 5 solujen sisällä pilkkoutuvan kohdan,. jotta toksiiniosa vapautuisi solun sisällä. Tällaisessa polypeptidissä toksiiniosa ja kohdesoluun sitoutuva osa voivat olla kytkettyjä toisiinsa polypeptidiliitososan välityksellä.
Esimerkkeihin sellaisista konjugaateista, joissa 10 toksiiniosa on kytketty epäsuorasti kohdesoluun sitoutuvaan osaan, kuuluvat konjugaatit, joissa toksiiniosa ja kohdesoluun sitoutuva osa ovat kytkeytyneenä toisiinsa bifunktionaalisen liitososan, erityisesti heterobifunktio-naalisen liitososan välityksellä.
15 ' Sopivia liitososia ovat esimerkiksi polypeptidin käsittävät liitososat, kuten PCT-patenttihakemusjulkaisussa W085/003 508 kuvatut liitososat, ja liitososat, jotka käsittävät kemiallisia ryhmiä, kuten julkaistussa EP-pa-tenttihakemusjulkaisussa nro 169 111 kuvatut liitososat. 20 On tarkoituksenmukaista kytkeä toksiiniosa ja koh desoluun sitoutuva osa toisiinsa disulfidisillan tai tio-eetterisidoksen välityksellä. On yleensä edullista, että toksiiniosa ja kohdesoluun sitoutuva osa kytketään toisiinsa sellaisen liitososan avulla, joka kytkee mainitut , 25 osat toisiinsa intrasellulaarisesti pilkkoutumaan kykenevän disulfidi- tai tioeetterisillan avulla. Esimerkkejä tällaisista liitososista ja niiden käytöstä immunotoksii-nien valmistuksessa on kuvattu EP-patenttihakemusjulkai-sussa nro 169 111, julkaisussa Methods in Enzymology 112 30 (1985), 207 - 222 (Cumber, A. J., Forrester, J. A., Fox- : weel, B. M. J. , Ross, W. C. J. ja Thorpe, P. E., Prep aration of antibody-toxin conjugates) ja teoksessa Vogel, Immunoconjugates: Antibody conjugates in radioimaging and therapy of cancer, s. 28 - 55, (Wawrzyncak, E. J. ja * 14 106928
Thorpe, P. E., Methods for preparing immunotoxins: effects of the linkage on activity and stability).
Erityisiin liitososiin kuuluvat ne osat, jotka kykenevät muodostamaan disulfidisillan toisessa toksiini-5 osassa ja kohdesoluun sitoutuvassa osassa olevan tioliryh-män kanssa ja amidisidoksen toisessa toksiiniosassa ja kohdesoluun sitoutuvassa osassa olevan aminoryhmän kanssa.
Esimerkkejä tietyistä liitososista ovat sellaiset osat, joilla on kaava: 10 -S-X-CO-, jossa X on loitonninryhmä.
X voi käsittää suoraketjuisen alkyyliryhmän, joka 15 on vaihtoehtoisesti substituoitu yhdellä tai kahdella substituentilla jo(t)ka on(ovat) (1-6C)alkyyli, fenyyli tai (1-4C)alkyylifenyyli; tai (1-4C)alkyylifenyyliryhmän, jossa alkyyliryhmä on vaihtoehtoisesti korvattu yhdellä tai kahdella substituentilla, jotka ovat (1-6C)alkyyli, 20 fenyyli tai (1-4C)alkyylifenyyli, ja jossa fenyylirengas voi olla substituoitu esimerkiksi halogeenilla, (1-4C)-alkyylillä tai (1-4C)alkoksilla.
On yleensä edullista, että esimerkiksi alkyyliryh-mässä oleva X sisältää substituentin, joka on jokin kah-• : 25 teen edelliseen ryhmään kuuluva substituentti.
X voi esimerkiksi käsittää (1-6C)alkyyliketjun, joka on vaihtoehtoisesti substituoitu yhdellä tai kahdella substituentilla, jotka ovat (1-4C)alkyyli tai fenyyli. Erityisiin X:n arvoihin kuuluvat esimerkiksi toisistaan 30 riippumatta yhdellä tai kahdella metyyli-, etyyli-, pro-pyyli- tai butyyliryhmällä substituoidut metyleeni-, ety-leeni-, propyleeni- tai butyleeniryhmä (erityisesti käytettäessä substituenttina metyyliä, etyyliä, propyyliä tai butyyliä).
15 106928
Kyseeseen tulevat X:n erityiset arvot ovat ne, joissa X käsittää vaihtoehtoisesti yhdellä tai kahdella edellä esitetyllä ryhmällä substituoidun metyleeni- tai etyleeniryhmän.
5 X käsittää edullisesti substituoimattoman tai yh dellä tai kahdella metyyliryhmällä substituoidun etyleeniryhmän, erityisesti yhdellä metyyliryhmällä substituoidun etyleeniryhmän.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja edullisia 10 konjugaatteja ovat konjugaatit, joilla on kaava:
H
A-Si-S2-X-C0N-B
15 jossa A käsittää yhden toksiiniosista ja kohdesoluun sitoutuvan osan ja B käsittää toisen toksiiniosista ja kohdesoluun sitoutuvan osan; kohdesoluun sitoutuvaan osaan voi olla kiinnittyneenä yksi tai useampia toksiiniosia; 20 Si on A:ssa esiintyvä rikkiatomi, NH on B:ssä, ja S2-X-CO oh liitososa, jossa S2 on rikkiatomi ja X on edellä esitetyn kuvauksen mukainen.
On merkillepantavaa, että S, on peräsin A:ssa ole-r_. 25 vasta tioliryhmästä.
On merkillepantavaa, että silloin kun liitososa sisältää kiraalisen keskuksen, niin se voi olla optisesti aktiivisena tai raseemisena muotona ja se voidaan eristää tällaisena. Tässä kuvataan liitososan minkä tahansa opti-30 sesti aktiivisen tai raseemisen muodon käyttöä. Optisesti • ’ aktiiviset muodot voidaan syntetisoida tällä alalla tun nettujen tavallisten orgaanisen kemian menetelmien avulla.
A käsittää edullisesti toksiiniosan ja B käsittää kohdesoluun sitoutuvan osan.
16 106928
Kuten aiemmin mainittiin, voi toksiiniosa käsittää minkä tahansa sytotoksisia ominaisuuksia omaavan komponentin. Esimerkkejä tällaisista komponenteista ovat polypep-tidit, jotka kykenevät inaktivoimaan ribosomeja ja siten 5 inhiboimaan proteiinisynteesiä. Erityisiä esimerkkejä ovat luonnossa esiintyvät polypeptidit ja näiden polypeptidien komponentit. Silloin kun tämä polypeptidi käsittää toksisen komponentin ja olennaisesti ei-toksisen komponentin, niin on tarkoituksenmukaista, että toksiiniosa käsittää 10 toksisen komponentin. Toksiiniosa voi käsittää esimerkiksi risiinin, mutta on tarkoituksenmukaista, että toksiiniosa käsittää risiinin A-ketjun. Toksiiniosa voi myös käsittää sytotoksisia ominaisuuksia omaavien luonnossa esiintyvien polypeptidien osia tai niiden analogeja. Toksiiniosaksi 15 sopivia polypeptidejä ja niiden valmistusta on kuvattu julkaisussa "Ribosome inactivating proteins up to date", Stripe, F. ja Barbieri, L., FEBS 3269 ja siinä esiintyvissä kirjallisuusviitteissä. Toksiiniosaksi erityisen sopivia polypeptidejä ovat risiinin A-ketju (risiini-A), 20 restriktosiini ja shigatoksiini. Muita toksiiniosaksi sopivia polypeptidejä ovat abriini, viskumiini, modesiini, volkensiini, geloniini, kermesmarjan antiviraalinen proteiini, saporiini, luffiini, trikosantiini, ohran riboso-mia inaktivoiva proteiini, diantiinit, byodiini, momor- . 25 diini, tritiini, dodekandriini, α-sarkiini, mitogelliini, • · difteriatoksiini, pseudomonaseksotoksiini-A ja "shiga-tok-siinia muistuttavat" toksiinit, VT1 ja VT2.
Luonnossa esiintyvien polypeptidien analogit ovat niitä polypeptidejä, joiden primaarirakenne muistuttaa 30 luonnossa esiintyvän polypeptidin primaarirakennetta sillä tavoin, että tämä eroaa alkuperäisestä yhden tai useamman sellaisen aminohappomuutoksen (deleetion, addition, substituution) verran, joka ei aiheuta sytotoksisen aktiivisuuden menetystä. Erityisiä esimerkkejä tällaisista ana- * 17 106928 logeista ovat ne, joissa muutos tai muutokset helpottavat liittymistä kohdesoluun sitoutuvaan osaan.
Silloin kun toksiiniosa käsittää luonnossa esiintyvän polypeptidin tai sen osan, niin toksiiniosa voidaan 5 valmistaa eristämällä polypeptidi luonnossa esiintyvästä lähteestä, ja kun tarvitaan osa polypeptidistä, niin eristetty polypeptidi muokataan kemiallisin keinoin, esimerkiksi entsymaattisesti. Polypeptidi tai sen osa voidaan valmistaa myös geenitekniikan menetelmin. Tällaisia mene-10 telmiä ovat yhdistelmä-DNA-tekniikat, joissa haluttua po-lypeptidiä koodaava DNA-jakso tavallisesti liitetään sopivaan vektoriin tai plasmidiin. Vektorilla tai plasmidilla transformoituja isäntäsoluja voidaan viljellä tarkoituksenmukaisissa olosuhteissa DNA-jakson ilmentymisen ja po-15 lypeptidin tuotannon aikaansaamiseksi.
On edullista, että toksiiniosa käsittää risii-ni-A:n, sen osan tai näiden analogin. Silloin kun toksiiniosa käsittää risiini-A:n, voidaan risiini-A saada Ricinus communiksen eli "risiiniölykasvin" siemenistä. On 20 kuitenkin edullista, että A-ketju tai risiini valmistetaan geeniteknisin menetelmin. Niinpä yhdistelmä-risiini-A tai -risiini on edullinen.
DNA-tekniikan avulla saatu risiini-A on yleensä edullinen luonnosta saatuun risiiniin verrattuna, koska 25 yhdistelmä-DNA-tekniikka mahdollistaa sellaisen risiini- A.-n valmistuksen, jossa kontaminanttina ei ole risiinin B-ketjua, ja koska tällä tavoin valmistettu risiini-A ei ole glykosyloitua. Niinpä käyttämällä yhdistelmä-risiini-A:ta saadaan aikaan selektiivisempi konjugaatti, mikä johtuu 30 erottelematta sitoutuvan B-ketjun puuttumisesta ja solun .. pintojen kanssa ei-spesifiseen vuorovaikutukseen kykene- vien sokeriryhmien puuttumisesta.
Yhdessä edullisessa sovellusmuodossa tämän keksinnön mukainen konjugaatti käsittää kohdesoluun sitoutuvan 18 106928 osan, joka on selektiivinen kolorektaalisia syöpäkasvain-soluja kohtaan.
Kohdesoluun sitoutuva osa käsittää edullisesti C242-vasta-aineen tai sen fragmentin, erityisesti C242-5 vasta-aineen.
Toksiiniosa ja kohdesoluun sitoutuva osa liitetään edullisesti toisiinsa 3-merkaptovoihapporadikaalin, -COP *CH2 *CH (CH3) -S-, välityksellä. Tämän radikaalin liittämiseen kohdesoluun sitoutuvaan osaan soveltuu sen ja koh-10 desoluun sitoutuvassa osassa olevan NH-ryhmän, esimerkiksi lysyyliryhmän NH-ryhmän, välinen kovalenttinen sidos ja kiinnittyminen toksiiniosaan tapahtuu toksiiniosassa olevan tioliryhmän, esimerkiksi risiini-A:n kysteiiniryhmän tioliryhmän, kanssa muodostuvan disulfidisillan välityk-15 sellä.
Tämän keksinnön mukaisesti saadaan siten käyttöön nimenomaan sellainen immunotoksiini, joka käsittää C242-vasta-aineen ja yhdistelmä-risiini-A:n, jotka on liitetty toisiinsa C242:ssa olevasta aminoryhmästä risiini-A:ssa 20 olevan kysteiiniryhmän tioliin 3-merkaptovoihapporadikaa lin, -COCH2CH(CH3)-S-, välityksellä.
Edullinen immunotoksiini on sellainen immunotoksiini, joka käsittää C242-vasta-aineen ja yhdistelmä-ri-siini-A:n, jotka on liitetty toisiinsa C242:ssa olevan . 25 lysyyliryhmän terminaalisesta aminoryhmästä risiini-A:ssa olevan kysteiiniryhmän terminaaliseen tioliryhmään 3-mer-kaptovoihappodiradikaalin välityksellä.
Kussakin vasta-aineyksikössä on yleensä ainakin yksi risiini-A-yksikkö. On pantava merkille se, että vas-30 ta-aineyksikköön voi olla kytkeytyneenä useampia kuin yksi .. yhdistelmä-risiini-A-ryhmä, jotka kukin kiinnittyvät omien i liitososiensa välityksellä. Vasta-aineeseen on katsottava voivan olla kiinnittyneenä yksi tai useampia liitososia risiini-A:han kiinnittyneiden ryhmien lisäksi. Näissä 35 muissa liitososissa voi olla ei-toksinen molekyyli, esi- 106928 merkiksi kysteiini. Ei-toksinen molekyyli voi siis toimia tällaisten liitososien pääteryhmänä.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistetuilla im-munotoksiineilla on potentiaalista käyttöä gastrointes-5 tinaalialueen syöpäkasvainten hoidossa ja erityisesti ko-lorektaalialueen tai haiman kasvainten hoidossa. Niinpä tämän keksinnön mukaisesti saadaan käyttöön menetelmä ga-strointestinaalialueen kasvainten hoitamiseen, joka menetelmä käsittää sen, että annetaan tasalämpöiselle eläimel-10 le, kuten ihmiselle, tehokas annos konjugaattia (tämän ollessa esitetyn määritelmän mukainen).
On pantava merkille se, että annos ja annostelualue riippuvat käytetystä nimenomaisesta toksiiniosasta, koh-desolupopulaatiosta ja potilaan sairaskertomuksesta. An-15 nosteltava konjugaattiannos on tyypillisesti välillä 0,1 -1 mg/kg potilaan painoa.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja konjugaat-teja annostellaan normaalisti farmaseuttisen koostumuksen muodossa. Niinpä tässä kuvataan farmaseuttinen koostumus, 20 joka käsittää konjugaatin (tämä on tämän keksinnön mukaisesti määritelty konjugaatti) sekä farmaseuttisesti hyväksyttävän laimentimen tai kantaja-aineen.
Kuvattavat koostumukset voidaan formuloida useisiin erilaisiin annostusmuotoihin. Yleensä tämän keksinnön mu-25 kaisesti valmistettuja konjugaatteja annostellaan parente-raalisesti, edullisesti suonensisäisesti. Nimenomainen parenteraalinen farmaseuttinen koostumus on sellainen koostumus, joka on formuloitu sopivaan yksikköannostusmuo-toon injektiona annosteltavaksi. Niinpä erityisen sopivat 30 koostumukset käsittävät immunotoksiinista valmistetun liuoksen, emulsion tai suspension yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyttävään parenteraaliseen kantaja-aineeseen tai laimentimeen. Sopivia kantaja-aineita tai laimentimia ovat vesipitoiset kantaja-aineet, esimerkiksi vesi tai 35 fysiologinen suolaliuos, ja vedettömät kantaja-aineet, 106928 esimerkiksi kiinteät öljyt tai liposomit. Koostumukset voivat sisältää aineita, jotka tehostavat konjugaatin pysyvyyttä koostumuksessa. Koostumus voi esimerkiksi sisältää puskuriliuosta, esimerkiksi Tween-puskuriliuosta. Kon-5 jugaatin konsentraatio vaihtelee, mutta yleensä konjugaat-ti formuloidaan konsentraatioihin, jotka ovat alueella noin 1-10 mg/annos.
Vasta-aine C242 on selektiivinen kolorektaalisia kasvainsoluja kohtaan ja tätä vasta-ainetta sisältävien 10 konjugaattien on havaittu olevan voimakkaita, kolorektaalisia kasvainsoluja kohtaan selektiivisiä immunotoksiine-ja.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistetun edullisen konjugaatin on nimenomaisesti havaittu olevan yllättävän 15 tehokas immunotoksiini siinä mielessä, että se on sekä selektiivinen kolorektaalisia syöpäkasvainsoluja kohtaan että vaikutukseltaan voimakas. Tämän konjugaatin on havaittu poistuvan verenkiertoelimistöstä suhteellisen pienellä nopeudella ja pilkkoutuvan ja hajoavan solunulkoi-20 sessa tilassa vähäisessä määrin, mikä merkitsee sitä, että tämän pysyvyys plasmassa on melko hyvä. Tästä saadaan se potentiaalinen etu, että immunotoksiinille jää riittävästi aikaa vuorovaikutukseen kohdesolujensa kanssa ennen sen kehosta poistumista tai tuhoutumista.
• 25 Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetelmiä edel lä kuvatun konjugaatin valmistamiseksi: (a) Niiden konjugaattien osalta, joissa kohdesoluun sitoutuva osa kytketään suoraan toksiiniosaan, annetaan toksiiniosan reagoida kohdesoluun sitoutuvan osan kanssa. 30 Esimerkiksi siinä tapauksessa, että kohdesoluun sitoutuva osa kytketään suoraan toksiiniosaan disulfidi-sillan välityksellä, voidaan toinen kohdesoluun sitoutuvista osista ja toksiiniosa pelkistää käyttäen esimerkiksi ditiotreitolia ennen kuin sen annetaan reagoida toisen 35 kohteeseen sitoutuvan osan ja toksiiniosan kanssa.
il 106928
Niiden konjugaattien osalta, joissa kohdesoluun sitoutuva osa kytketään toksiiniosaan liitososan välityksellä, annetaan liitososasta muodostuvan johdannaisen sisältävän kohdesoluun sitoutuvan osan reagoida toksiiniosan 5 kanssa tai annetaan toksiiniosan liitosryhmäjohdannaisen reagoida kohdesoluun sitoutuvan osan kanssa.
Asiaankuuluva osa derivatisoidaan antamalla sen reagoida liittämisessä käytettävän yhdisteen kanssa siten, että liitososan sitoutuu kyseiseen osaan. On tarkoituksen-10 mukaista antaa johdannaisen sisältävän kohdesoluun sitoutuvan osan reagoida toksiiniosan kanssa.
Johdannaisen sisältävä kohdesoluun sitoutuva osa tai johdannaisen sisältävä toksiiniosa voidaan valmistaa esimerkiksi liuottamalla kyseinen osa sopivaan puskuri-15 liuokseen (kuten asetaatti-, fosfaatti- tai boraattipus-kuriliuokseen) ja säätämällä pH-arvo sellaiseksi, että se on yhteensopiva liitoksen aikaansaavan yhdisteen kanssa. Liitoksen aikaansaava yhdiste voidaan lisätä tämän jälkeen reaktioseokseen. Niissä tapauksissa, joissa liittämiseen 20 käytettävä yhdiste ei liukene reaktioseokseen, voidaan kulloisestakin tapauksesta riippuen joko kohdesoluun sitoutuvasta osasta tai toksiiniosasta valmistettu liuos, sen mukaan, kummasta tapauksesta kulloinkin on kyse, lisätä liuokseen, joka sisältää pieneen määrään orgaanista . 25 liuotinta, kuten dimetyylisulfoksidia tai dimetyyliform- • · » amidia. Liittämiseen käytettävän yhdisteen kanssa tapahtuneen reaktion jälkeen derivatisoitu tuote voidaan erottaa tavallisilla menetelmillä, kuten geelisuodatuksella, dialyysillä tai pyiväskromatografiällä. Tämän jälkeen johdan-30 naisen sisältävän tuotteen (johdannaisen sisältävän kohde-.. soluun sitoutuvan osan tai johdannaisen sisältävän toksii- niosan) voidaan antaa reagoida toisen osan kanssa lopullisen konjugaatin muodostamiseksi.
Liittämiseen käytetyn yhdisteen tarkan luonteen 35 voidaan katsoa riippuvan kytkeytymiseen käytettävissä ole- « · < 22 106928 vien kohdesoluun sitoutuvan osan ja toksiiniosan ryhmien (esimerkiksi tioli-, karboksi- tai aminoryhmien) luonteesta .
Toksiiniosa voidaan valmistaa luonnollisista läh-5 teistä. On edullista, että toksiiniosa valmistetaan yhdis-telmä-DNA-tekniikan avulla. Tässä tekniikassa käytetään ammattimiesten hyvin tuntemia menetelmiä mRNA:n uuttamiseksi, cDNA-kirjastojen valmistamiseksi, vektorien konstruoimiseksi, solujen transformoimiseksi ja transformoitulo jen isäntäsolujen viljelemiseksi toksiinipolypeptidin ilmentymisen aikaansaamiseksi. Haluttujen toksiiniosien ilmentämiseen sopivia isäntäsoluja ovat prokaryootit, esimerkiksi E. coli, ja eukaryootit, esimerkiksi hiiva. Näitä menetelmiä on valaistu myöhemmin kuvatun konjugaatin val-15 mistuksen yhteydessä.
Kohdesoluun sitoutuva osa käsittää yleensä vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin tai -johdannaisen. Vasta-aine käsittää edullisesti monoklonaalisen vasta-aineen. Vasta-aineita voidaan valmistaa tällä alalla tunnettujen 20 menetelmien avulla. Niitä voidaan eristää seerumista, pernasta ja vasta-ainetta erittävistä hybridoomasoluista.
Vasta-aineiden valmistusta on kuvattu esimerkiksi teoksessa Methods in Enzymology, osa 178: Antibodies,
Antigens and Molecular Mimicry, toim. J. Langone, Academic 25 Press Inc (aihetta on käsitelty erityisesti kohdassa
Section II: Engineered Antibodies), ja teoksessa Methods in Enzymology, osa 73: Immunochemical Techniques Part B, toimittaneet J. Langone ja H. Van Vunakis, Academic Press Inc (aihetta on käsitelty erityisesti kohdassa Section I: 30 Production of Antibodies).
.. Siinä tapauksessa, että liitososa käsittää ryhmän -S-X-CO-, voidaan vasta-aineesta (tai toksiiniosasta) muodostaa johdannainen antamalla sen reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava L1-S-X-C0-L2, jossa La ja L2 ovat syrjäy-35 tyviä ryhmiä. Esimerkiksi CO-L2 voi käsittää karboksyyli- 106928 happoryhmän tai edullisesti aktivoidun karboksyylihappo-ryhmän. Ryhmä CO-L2 voi esimerkiksi käsittää esteri- tai anhydridiryhmän. Nimenomaisia esimerkkejä L2-ryhmästä ovat imidatsolyyliryhmä tai sukkinimidyyliesteriryhmä. Ιι2 voi 5 käsittää ryhmän, joka syrjäytyy tioryhmän hapettuessa, se voi esimerkiksi käsittää pyridiiniryhmän. Liitososan annetaan yleensä reagoida vasta-aineessa tai toksiiniosassa (edullisesti toksiiniosassa) olevan pelkistetyn tioliryh-män kanssa.
10 Silloin, kun käytetään muita liitososia, niin nii den annetaan reagoida vasta-aineen ja toksiiniosan kanssa alalla tunnettujen menetelmien avulla. Yleensä liitososan annetaan reagoida vastaavien käytössä olevien kohdesoluun sitoutuvassa osassa ja toksiiniosassa olevien funktionaa-15 listen ryhmien kanssa. Kohdesoluun sitoutuva osa ja tok-siiniosa voidaan kuitenkin kytkeä toisiinsa suoraan muodostamalla niiden välille kovalenttinen sidos, esimerkiksi disulfidisidos.
Siinä tapauksessa, että toksiiniosassa on sulfhyd-20 ryyliryhmä, kuten tällainen kysteiiniryhmään kuuluva ryhmä, niin sitä voidaan käyttää konjugoinnissa. Sitä voidaan käyttää esimerkiksi muodostamaan disulfidisidos kohdesoluun sitoutuvassa osassa tai liitososassa olevan sulfhyd-ryyliryhmän kanssa. Silloin, kun toksiiniosassa ei ole 25 sulfhydryyliryhmää, siitä voidaan muodostaa johdannainen • · tällaisen ryhmän aikaansaamiseksi, jonka ansiosta konjugointi helpottuu. Tämä johdannaisen muodostaminen voidaan suorittaa käyttämällä esimerkiksi iminotiolaania.
Siinä tapauksessa, että käytetään polypeptidilii-30 tososia, voidaan liitososan antaa reagoida toksiiniosassa ja kohdesoluun sitoutuvassa osassa olevien vapaiden kar-boksi- tai aminoryhmien kanssa.
Siinä tapauksessa, että toksiiniosa käsittää risiinin A-ketjun ja liitososa käsittää diradikaalin 35 -COCH2CH (CH3)-S-, sopiva kytkentäreagenssi on N-sukkini- 24 106928 tnidyyli-3- (2-pyridyylid.itio) butyraatti . Edullinen menetelmä tällaisen immunotoksiinin valmistamiseksi käsittää sen, että annetaan derivatisoidun kohdesoluun sitoutuvan osan reagoida pelkistetyn risiini-A:n kanssa.
5 Kohdesoluun sitoutuva osa derivatisoidaan antamalla sen reagoida kytkentäreagenssin, kuten N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyliditio)butyraatin, ja risiinin A-ketjun kanssa, joka ketju on pelkistetty käsittelemällä sitä sopivalla pelkistimellä vapaassa kysteiiniryhmässä olevan tioliryh-10 män pelkistämiseksi esimerkiksi ditiotreitolia käyttäen.
Haluttuihin tarkoituksiin on sopivaa käyttää ylimäärin kytkentäreagenssia siten, että derivatisoituun kohdesoluun sitoutuvaan osaan on sitoutunut useampi kuin yksi liitososa. Risiini-A:n kanssa tapahtuneen reaktion jälkeen 15 kaikkien risiini-A:hän liittymättä jääneiden liitosryhmien päihin liitetään tarkoitukseen sopivalla tavalla suojaryh-mä antamalla niiden reagoida ryhmien reaktiokyvyn hävittävän ryhmän, kuten kysteiinin, kanssa.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut konjugaatit 20 ovat potentiaalisesti käyttökelpoisia syöpäkasvainten hoidossa. Tämän osoittaa konjugaatin kyky inhiboida proteiinisynteesiä syöpäkasvainsoluissa in vitro -olosuhteissa, ja/tai konjugaatin kyky pienentää syöpäkasvaimen kokoa tai kasvua in vivo -olosuhteissa. Yksityiskohdat tarkoituksen-25 mukaisista tutkimusmenetelmistä on esitetty jäljempänä. Piirrosten lyhyt kuvaus: kuvio 1 esittää pICI 0020:n konstruointia, kuvio 2 esittää pTB344:n konstruointia, kuvio 3 esittää pICI 0042:n konstruointia, 30 kuvio 4 esittää pICI 1079:n konstruointia, kuvio 5 esittää pICI 1187:n konstruointia, kuvio 6 esittää E. coli -lysaattien Coomassie-si-nellä värjättyä SDS-geeliä, jossa kanava A on pICI 1102, B on pICI 0020 ja C on molekyylipainomarkkerikanava, 25 106928 kuvio 7 esittää pICI 1102:n geeliprofiilia, jossa huippu R esittää risiini-A:ta, kuvio 8 on pICI 1102:n tuottamasta risiini-A:sta tehty Western blot -analyysi, jossa kanava 1 on molekyyli-5 painomarkkerikanava, 2 ja 3 ovat risiiniä tuottamattomia klooneja, 4 on pICI 1102 ja 5 on pICI 0020 (kontrolli-plasmidi-ei-risiini-A -jakso), kuvio 9 on pICI 1102:n osittainen jakso, kuvio 10 esittää pICI 1102:n konstruointia, 10 kuvio 11 kuvaa plasmidien valmistuksessa käytettyä fragmenttia, kuvio 12 on pICI 0042:n plasmidikartta, kuvio 13 esittää transkription terminaattorijaksoa, kuvio 14 on pICI 1079:n plasmidikartta, 15 kuvio 15 esittää COLO 205 -soluissa tapahtuvaa 125I-C242:n endosytoosia, kuvio 16 esittää C242/risiini-A-immunotoksiinin sytotoksisuutta in vitro -olosuhteissa COLO 205 -soluja vastaan, 20 kuvio 17 esittää vasta-ainetta, kuvio 18 esittää C242:n kappaketjun vaihtelevan alueen cDNA-jaksoa (plasmidissa pKGE761 oleva cDNA), ja kuvio 19 esittää C242:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen cDNA-jaksoa (plasmidissa pKGE762 oleva cDNA).
25 Tätä keksintöä valaistaan nyt seuraavien tätä kek sintöä rajoittamattomien esimerkkien avulla, joissa esimerkeissä, ellei toisin mainita: (i) haihdutukset suoritettiin pyöröhaihdutuksella tyhjiössä, 30 (ii) toimenpiteet suoritettiin huoneen lämpötilas sa, eli välillä 18 - 26 °C, (iii) saannot on esitetty ainoastaan esimerkin vuoksi eivätkä ne välttämättä edusta suurimpia huolellisella menetelmien kehittelyllä saatavissa olevia määriä, 26 106928 (v) protoni-NMR-spektrit määritettiin normaalisti 200 MHztn taajuudella liuottimena käytetyssä deuteroidussa dimetyylisulfoksidissa käyttäen sisäisenä standardina tet-rametyylisilaania (TMS), ja arvot on esitetty kemiallisina 5 siirtyminä (delta-arvoina) miljoonasosina suhteessa TMS:ään, käyttäen tavanomaisia lyhenteitä suurimpien huippujen merkitsemiseen: s, singletti, m, multipletti, t, tripletti, br, leveä, d, dupletti, ja (vi) käytetään seuraavia lyhenteitä: 10 BSA = naudan seerumin albumiini PBS = fosfaatilla puskuroitu fysiologinen suolaliuos IPTG = isopopyylitio-P-galaktosidi
EtOH = etanoli 15 SDS-PAGE = natriumdodekyylisulfaatti(SDS)-polyak- ryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE) R±sixn±-A/C2 42-immune) boksi in in valmistus
Liuos, joka sisälsi 4,4 mg/ml (200 mg) fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (natriumfosfaat-20 ti/150 mM natriumkloridi, pH 7,2) valmistettua monoklonaa- lista vasta-ainetta C242, konsentroitiin 12 mg/ml:ksi membraanisuodatuksella (Amicon YM10 -membraani) 4 °C:ssa. Konsentraatti laimennettiin 0,5 tilavuudella boraattipus-kuriliuosta (100 mM natriumboraattia, pH 9,1). Proteiini-25 konsentraatio määritettiin seuraamalla absorbanssia 280 nm:n aallonpituudella ja sekoitetun liuoksen pH-arvon todettiin olevan 8,8 ± 0,1.
N-sukkinimidyyli- 3 - (2-pyridyylidit io)butyraatti ("liitososa") liuotettiin kuivaan uudelleentislattuun di-30 metyyliformamidiin tai asetonitriiliin konsentraatioon : 10 mg/ml. Tästä liuoksesta otettu erä (0,352 ml), joka sisälsi 3,52 mg N-sukkinimidyyli-3 -(2-pyridyyliditio)-butyraattia, lisättiin välittömästi konsentroituun vasta-aineliuokseen. Saatu liuos sekoitettiin ja sen annettiin 35 seistä 20 °C:ssa yhden tunnin ajan. Tämän jälkeen liuos 27 106928 käsiteltiin suolanpoistopylväässä (G25 Sephadex Pharmacia, 2,6 x 58 cm, virtausnopeus 2 ml/min, tasapainotus suoritettu 50 mM natriumfosfaatti/150 mM natriumkloridi/1 mM EDTA-seoksella, pH 8,0), ylimääräisten 5 reagenssien poistamiseksi ja derivatisoidun vasta-aineen puskuriliuoksen vaihtamiseksi. Reaktiotuotteet voidaan vaihtoehtoisesti poistaa poikittaisvirtaussuodatuksella. Suolanpoistokäsitellyn derivatisoidun vasta-aineen fraktiot yhdistettiin ja proteiinikonsentraatio määritettiin 10 seuraamalla absorbanssia 280 nm:n aallonpituudella. Liitososalla derivatisoitumisen aste määritettiin lisäämällä ylimäärin ditiotreitolia ja seuraamalla vapaiden tiopyri-dyyliryhmien vapautumista 343 nm:n aallonpituudella. Deri-vatisoitumisasteen havaittiin olevan 4-6 liitososaa vas-15 ta-ainemoolia kohti.
Yhdistelmä-risiini-A pelkistettiin käsittelemällä fosfaattipuskuriliuokseen, jonka pH oli 8, valmistettua risiini-A:ta ylimäärällä ditiotreitolia, ja se konsentroitiin poikittaisvirtaussuodatuksella. Ylimääräiset reagens-20 sit poistettiin pyiväskromatografiällä (G25 Sephadex -Pharmacia, 2,6 x 58 cm, virtausnopeus 2 ml/min, 50 mM natriumfosfaatti/150 mM natriumkloridi/l mM EDTA-seoksessa, pH 8,0).
Yhdistelmä-risiini-A konjugoitiin derivatisoituun 25 vasta-aineeseen sekoittamalla valmistettua yhdistelmä-ri siini -A: ta (190 mg) ja derivatisoitua vasta-ainetta (190 mg) sisältäviä liuoksia keskenään käyttäen risii-ni-A:n ja derivatisoidun vasta-aineen painosuhdetta 1:1. Glyserolia lisättiin 20 tilavuus-%:n pitoisuuteen ja as-30 tian vapaan tilan läpi johdettiin argonia. Tuloksena ole- . van liuoksen annettiin olla 15 °C:ssa 40 - 65 tunnin ajan.
Tämän jälkeen lisättiin kysteiiniä siten, että lopulliseksi konsentraatioksi saatiin 0,2 mM (ja ainakin 10-kertainen mooliylimäärä vasta-aineen pinnalla oleviin lii-35 tososiin nähden), jotta vasta-aineessa oleviin ylimääräi- « 28 106928 siin liitososiin oltaisiin saatu liitettyä pääteryhmät. Liuosta sekoitettiin ja sen annettiin olla 20 °C:ssa 2 -3 tunnin ajan. Sen jälkeen kun immunotoksiiniin oli liitetty kysteiinipääteryhmä, tutkittiin tuloksena olleesta 5 immunotoksiinista otettu näyte käsittelemällä sitä ditio-treitoliylimäärällä ja sitä seurattiin 343 nm:n aallonpituudella sen kvantitoimiseksi, että reaktio oli mennyt loppuun.
Tämän jälkeen konjugaattia sisältävä liuos kon-10 sentroitiin membraanisuodatuksen avulla (Amicon YM10 -membraani) ja se lisättiin kromatografiapylvääseen (HR300 Sephacryl - Pharmacia, 2,6 x 50 cm, virtausnopeus 3 ml/min, puskuriliuoksena käytettiin oli 50 mM natrium-fosfaatti/25 mM natriumkloridi/l mM EDTA-seosta), jonka 15 tuloksena immunotoksiini ja konjugoitumaton vasta-aine erottuivat konjugoitumattomasta risiini-A:sta. Immuno-toksiinin ja vasta-aineen seoksen sisältävää piikkiä vastaavat fraktiot yhdistettiin ja proteiinin konsentraatio määritettiin seuraamalla absorbanssia 280 nm:n aallonpi-20 tuudella.
Tuloksena olevan sekä konjugoimatonta vasta-ainetta että immunotoksiinia sisältävän liuoksen pH säädettiin arvoon 6,3 lisäämällä 1 M HCl:ää, ja liuos lisättiin tri-atsiiniväriainematriisia sisältävään pylvääseen (Mimetic • 25 A6XL, ACL pic, Cambridge, UK, 8 x 26 cm pylväs, virtaus nopeus 1,5 ml/min) . Pylväs pestiin 100 ml :11a lähtöpusku-riliuosta, joka sai aikaan konjugoimattoman vasta-aineen eluoitumisen, ja immunotoksiini eluoitiin lähtöpuskuri-liuoksella, joka sisälsi 0,5 M natriumkloridia. Immunotok-30 siiniliuos dialysoitiin fosfaatilla puskuroitua fysiolo- . gista suolaliuosta vastaan, suodatettiin 0,22 μτα-.η suodat- timella, ja säilytettiin 4 °C:n lämpötilassa.
Immunotoksiinin puhtaus määritettiin SDS-poly-akryyliamidielektroforeesin avulla ja se sisälsi kaikkiaan 3'5 45 mg immunotoksiinia, jonka koostumus oli: 50 - 60 % mo- 29 1 0 6 9 2 8 no-risiini-A-johdannaista, 10 - 30 % di-risiini-A-johdannaista, 5 - 15 % tri-risiini-A-johdannaista ja < 10 % de-rivatisoitumatonta vasta-ainetta.
Geelisuodatusvaiheen (jäljelle jääneen r-risii-5 ni-A:n poistaminen) ja väriaineaffiniteettikromatografia-vaiheen (jäljelle jääneen C-242-vasta-aineen poistaminen) paikkaa puhdistusvaiheissa voidaan vaihtoehtoisesti vaihtaa keskenään. Tässä tämän menetelmän muunnelmassa konju-gaatioseos laimennetaan tislattuun veteen välittömästi sen 10 jälkeen, kun reagoimattomien liitosryhmien toiminta on estetty kysteiinillä (aiemmin kuvatulla tavalla), siten, että konduktiivisuudeksi saadaan alle 5 mS. Tämän jälkeen pH säädetään 1 M etikkahapolla arvoon 6,0 ja liuos selkeytetään membraanisuodatuksella. Tämän jälkeen liuos lisä-15 tään väriaineligandipylvääseen (2,5 ml geeliä/mg konjugaa-tioseoksessa käytettyä r-risiini-A:ta). Tämän jälkeen pylvästä pestään 0,68-%:isella natriumasetaatilla, pH 6,0, kunnes konjugoitumaton C242-vasta-aine on huuhtoutunut pylvään läpi. Tämän jälkeen immunotoksiini ja jäljelle 20 jäänyt r-risiini-A voidaan eluoida pylväästä 20 mM nat-riumfosfaattipuskuriliuoksella, jonka pH on 7,0 ja joka on natriumkloridikonsentraation suhteen 0,5-molaarinen. Tämän jälkeen tämä eluaatti konsentroidaan poikittaisvirtaussuo-datuksella käyttäen spiraalikasetilla varustettua ultra-: ’ 25 suodatusjärjestelmää ja se lisätään Sephacryl S300HR:ää sisältävään pylvääseen (2,5 ml geeliä kutakin alkuperäisessä konjugaatioreaktiossa käytettyä vasta-ainemilligram-maa kohti ja < 5 % pylvään kokonaistilavuudesta olevassa tilavuudessa). Pylväs voidaan tasapainottaa millä tahansa 30 sopivasti formuloidulla puskuriliuoksella, kuten fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, jonka pH on 7,2.
106928 30
Liitososan valmistus
Edellä käytetty N-sukkinimidyvli- (R) - 3- (2-pvridw-liditio)butvraatti valmistettiin käyttäen seuraavaa menet-5 telyä, jossa, ellei toisin mainita: (i) haihdutukset suoritettiin pyöröhaihdutuksella tyhj iössä, (ii) toimenpiteet suoritettiin huoneenlämmössä, eli alueella 18 - 26 °C, 10 (iii) saannot on esitetty ainoastaan esimerkin vuoksi eivätkä ne välttämättä edusta suurimpia huolellisella menetelmien kehittelyllä saatavissa olevia määriä, (v) protoni-NMR-spektrit määritettiin normaalisti 200 MHz:n taajuudella liuottimena käytetyssä deuteroidussa 15 dimetyylisulfoksidissa käyttäen sisäisenä standardina tet-rametyylisilaania (TMS), ja arvot on esitetty kemiallisina siirtyminä (delta-arvoina) miljoonasosina suhteessa TMS:ään, käyttäen tavanomaisia lyhenteitä suurimpien huippujen merkitsemiseen: s, singletti, m, multipletti, t, 20 tripletti, br, leveä, d, dupletti.
N-sukkinimidwli- (R) -3- (2-pvridwliditio) butvraatti (R) - 3 - (2-pyridyyliditio)voihappoa (90,0 g, 0,393 mol) liuotettiin dikloorimetaaniin (630 ml) sekoittamalla huoneenlämmössä. Siihen lisättiin N-hydroksisukki-; 25 nimidiä (45,2 g, 0,393 mol, 1,0 mooliekvivalenttia) ja se huuhdeltiin seokseen dikloorimetaanilla (90 ml) . Seosta sekoitettiin 30 minuutin ajan samalla kun liuos jäähdytettiin -2 °C:n lämpötilaan. Siihen lisättiin 35 minuutin jakson aikana liuosta, joka sisälsi dikloorimetaaniin val-30 mistettua disykloheksyylikarbodi-imidiä (81,08 g, 0,393 mol, 1,0 mooliekvivalenttia) samalla kun reaktio-lämpötila pidettiin lämpötilassa 0+2 °C, ja se huuhdeltiin seokseen dikloorimetaanilla (90 ml). Liuosta sekoitettiin 0-10 °C:Ssa 3 tunnin 15 minuutin ajan, jonka 35 jälkeen sen annettiin lämmetä huoneenlämpöön. Liuos suodatettiin siten, että saatiin poistettua kiinteä disyklohek-• syyliurea, joka pestiin dikloorimetaanilla (180 ml x 2).
31 106928
Suodos haihdutettiin alipaineessa 20 - 22 °C:ssa ja tästä oli tuloksena ruskeaa öljyä (150 g) . Tämä öljy puhdistettiin suorittamalla kromatografia pylväässä, joka sisälsi tolueenin ja etyyliasetaatin suhteessa 80 : 20 (v/v) val-5 mistettuun seokseen valmistettua Kieselgel 60 -silikagee-liä (1 180 g), jonka seulakoko oli 0,06 - 0,11 mm. Tolueenin ja etyyliasetaatin seoksella (tilavuussuhde 80 : 20) suoritetun eluoinnin tuloksena saatiin N-sukkinimidyyli-(R)-3-(2-pyridyyliditio) butyraattia (52 g) vaalean keltai-10 sena kumina tyhjiössä (25 Pa) 28 °C:ssa suoritetun haihdutuksen jälkeen.
NMR: 1,5 (d, 3H), 2,85 (m, 4H) , 2,8 (dd, 1H), 3,2 (dd, 1H) , 3,5 (m, 1H) , 7,1 (m, 1H) , 7,7 (m, 2H), 8,5 (d, 1H) .
15 Elektronitörmäytysmassaspektroskopia osoitti yhdis teen molekyylipainon olevan 326, fragmentoitumisen ollessa yhdenmukainen sen suhteen, että yhdisteen rakenne on N-sukkinimidyyli-(R)-3-(2-pyridyyliditio)butyraatti.
Lähtömateriaali valmistettiin seuraavalla tavalla: 20 a. (R)-3-hvdroksivoihappo
Metyyli-(R)-3-hydroksibutyraattia (1,670 kg, 14,152 mol) jäähdytettiin jää/etanolihauteessa. Siihen lisättiin vettä (4 698 ml) ja sen jälkeen 47-paino-%:ista natriumhydroksidia (965 ml, 16,98 mol, 1,2 mooliekviva-25 lenttia) sellaisella nopeudella, että lämpötila pysyi vä- ' Iillä 0 ± 2 °C. Reaktioseosta sekoitettiin 0 °C:ssa vielä 1 tunnin 30 minuutin ajan. Reaktioseokseen lisättiin 35 minuutin jakson aikana väkevää suolahappoa (1 490 ml 17,28 mol, 1,22 mooliekvivalenttia) siten, että lopulli-30 seksi pH-arvoksi saatiin 1,5, samalla kun lämpötila pidettiin 5 °C:ssa tai sen alapuolella. Tämän jälkeen seokseen lisättiin natriumkloridia (1 061 g) ja vesipitoinen seos uutettiin metyyli-tert-butyylieetterillä (10 x 3,5 1). Uutteet yhdistettiin ja liuotin poistettiin tislaamalla 35 tyhjiössä huoneenlämmössä siten, että saatiin aikaan jään- „ 106928 32 nos. Jäännökseen sekoitettiin tolueenia (7,5 1) ja haihtuva materiaali poistettiin tislaamalla tyhjiössä, ja tästä saatiin (R)-3-hydroksivoihappoa (1 189 g, 81 %) öljynä. Tämä öljy jäähdytettiin 4 °C:seen ja valmiita kiteitä li-5 sättiin kiteytymiskeskuksiksi kiinteän aineen aikaansaamiseksi .
b. (S)-β-butvrolaktoni (R) -3-hydroksivoihappoa (530 g, 5,096 mol) sekoitettiin trietyyliortoasetaattiin (1 322,8 g, 1 488 ml, 10 8,154 mol, 1,6 mooliekvivalenttia) 25 - 30 °C:ssa, josta oli tuloksena samea liuos (sameuden arveltiin johtuvan edellisestä vaiheesta jäljelle jääneestä natriumkloridis-ta) .
Liuos haihdutettiin suuressa tyhjiössä (133,3 Pa) 15 30 °C:n lämpötilassa haihtuvan materiaalin poistamiseksi.
Jäljelle jäänyt neste (1 001 g), joka sisälsi (2S,6R)-2-etoksi-2,6-dimetyyli-1,3-dioksan-4-onia, kuumennettiin 80 °C:seen 2 tunniksi, jonka jälkeen se jäähdytettiin 40 °C:seen. Raakatuote tislattiin lasisilla Raschig-ren-20 käillä täytetyn lasipylvään läpi (50 cm x 3,5 cm läpimitta) siten, että saatiin (S)-β-butyrolaktonia (57,3 g), kiehumispiste 1,0 - 1,2 kPa:n paineessa 59 - 62 °C.
c. (R)-3-merkaptovoihappo (S) -β-butyrolaktonia (91,12 g, 1,058 mol) jäähdy- ; - 25 tettiin 5 °C:n lämpötilaan typpiatmosfäärissä sekoittaen.
Siihen lisättiin tiolietikkahappoa (80,57 g, 75,65 ml, 1,058 mol, 1,0 mooliekvivalenttia) samalla kun lämpötila pidettiin 5 °C:ssa. Tämän jälkeen siihen lisättiin tri-etyyliamiinia (146,7 ml, 1,058 mol, 1,0 mooliekvivalent-30 tia) 45 minuutin jakson aikana samalla kun reaktiolämpöti-la pidettiin välillä -5 - +5 °C. Jäähdytyshaude poistet-tiin ja lämpötila nousi 65 °C:n lämpötilaan saaden aikaan keltaisen/oranssin liuoksen. Reaktioseos jäähdytettiin 10 °C:seen ja sitä sekoitettiin huoneenlämmössä yön yli. 35 Liuos jäähdytettiin 0 °C:seen ja siihen lisättiin vettä 106928 konfluenssia, normaalisti 2-3 päivän kuluttua jatkoviljelystä, ja ne pestiin 3 kertaa fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS) immunisaatiota varten.
5 4-6 viikon ikäiset BALB/c-hiiret immunisoitiin intraperitoneaalisesti esikäsittelyannoksella, joka sisälsi 3 x 107 COLO 205 solua suspendoituna 0,1 ml:aan fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta. Tämän jälkeen eläimille annettiin vielä tehosterokote, joka sisälsi viero lä 0,1 ml suspensiota, jossa oli 3 x 107 COLO 205 -solua, ja hiiret lopetettiin neljän päivän kuluttua ja pernat poistettiin. Tämän jälkeen pernat hajotettiin yksisolusus-pensioksi.
Hvbridooman valmistus 15 1,2 x 108 pernasolua, jotka oli saatu edellä kuva tusta solususpensiosta, jaettiin kahteen koeputkeen. Kumpaankin koeputkeen lisättiin lisäksi 108 myeloomasolua, jotka olivat peräisin hiiren myeloomasolulinjasta Sp2/0 (saatavilla talletuslaitoksen American Type Culture 20 Collection (ATCC), Rockville, Maryland, U.S.A., kokoelmista hakunumerolla CRL 1581). Nämä kaksi koeputkea sentri-fugoitiin ja kaikki neste dekantoitiin. Kumpaankin koeputkeen lisättiin hitaasti 2 ml 37 °C:n lämpötilassa olevaa PEG-liuosta (10 g PEG Mr 4000, 1 ml DMSO:ta ja 10 ml mono-: · 25 klonaalista fysiologista suolaliuosta) 1 minuutin aikana koko ajan sekoittaen. Koeputket siirrettiin 37 °C:n lämpötilassa olevaan vesihauteeseen 90 sekunnin ajaksi samalla varovasti sekoittaen. Fuusio keskeytettiin lisäämällä kumpaankin koeputkeen fysiologista puskuriliuosta seuraavan 30 kaavion mukaisesti: 2 ml ensimmäisten 30 sekunnin aikana, 6 ml seuraavien 30 sekunnin aikana ja vielä 32 ml 1 minuutin aikana. Sen jälkeen kun solususpensio oli pesty vilje-lyliuoksella, se suspendoitiin kaikkiaan 100 ml:aan vilje-lyliuosta, jota oli täydennetty hypoksantiini/aminopterii-35 ni/tymidiini (HAT) -seoksella. Viljelyalustana oli Iscoven 36 106928 MEM, jota oli täydennetty 10-%:isella FCS:lla, L-aspara-giinilla (36 mg/1), L-arginiini-HCl:11a (116 mg/1), fooli-hapolla (10 rag/1), L-glutamiinilla (292,3 mg/1), natrium-pyruvaatilla (110,1 mg/1) ja merkaptoetanolilla (3,49 5 μΐ/ΐ). 50 μ1:η erät annosteltiin 96-kuoppaisen kudosvilje-lymaljan kuoppiin. Kuopat oli esipäällystetty 250 μΐ-.lla makrofagisuspensiota (2 x 104 solua/ml), joka oli valmistettu BALB/c-hiirten makrofageista HAT-seoksella täydennettyyn viljelyliuokseen. Liuos vaihdettiin 6 päivän kulo luttua fuusioitumisesta.
Vasta-ainehvbridoomien seulominen
Edellä mainitusta päivänä 6 poistetusta kasvatus-liuoksesta tutkittiin COLO 205 -positiiviset vasta-aineet teoksessa Kenneth, R. H., "Enzyme-linked antibody assay 15 with cells attached to polyvinyl chloride plates", Monoclonal Antibodies, Hybridomas, A new dimension in biological analyses, toim. H. R. Kenneth, T. J. McKelvin, K.B. Bechtol, Plenum Press, New York 1980, kuvatun menetelmän mukaisesti. Suoritus tapahtui tiivistäen esitettynä 20 siten, että tyypin IIF Nunc-immunolevyjen kuopat päällys tettiin COLO 205 -soluja käyttäen (1 mg/100 ml PBS) solu-tiheydellä 2 x 105 solua/kuoppa, päällystystilavuus 50 μΐ. Tämän jälkeen edellä mainittu päivänä 6 poistettu viljely-liuos lisättiin päällystettyihin kuoppiin 50 μΐ/kuoppa. 25 Yli yön huoneenlämmössä tapahtuneen inkuboinnin jälkeen kuoppiin lisättiin 100 μg/kuoppa peroksidaasiin konjugoi-tua, l-%:isella BSA-PBS -liuoksella (suhteessa 1/500) laimennettua anti-hiiri-immunoglobuliinia (Dakopatts P260, Dakopatts A/S, Kööpenhamina, Tanska), ja niitä inkuboitiin 30 yön yli huoneenlämmössä. Tämän jälkeen lisättiin subs traattia, joka sisälsi 4 OPD-tablettia Dako S2000 liuotettuna 12 ml:aan sitruunahappopuskuriliuosta, pH 5,0, plus 5 μΐ 30-%:ista vetyperoksidia, 100 μΐ/kuoppa ja inkuboinnin jälkeen absorbanssi mitattiin 450 nmm aallonpituudel-35 la.
• 33 1 0 6 9 2 8 (93 ml) . Seos jäähdytettiin edelleen -10 °C :seen ja sen jälkeen sitä käsiteltiin natriumhydroksidiliuoksella (185 ml 47 paino-%:ista natriumhydroksidia ja 92 ml vettä) lisäysnopeuden ollessa sellainen, että lämpötila pysyi 5 välillä -10 - +10 °C. Tämän jälkeen seosta sekoitettiin 1,5 tuntia -5 °C:ssa ja sen jälkeen seoksen annettiin lämmetä huoneenlämpöön. Seos pestiin metyyli-tert-butyylieet-terillä (265 ml). Vesipitoinen kerros laimennettiin vedellä (185 ml), jäähdytettiin 0 °C:seen ja käsiteltiin väke-10 väliä suolahapolla (270 ml) 0-10 °C:ssa, kunnes pH-arvo oli 1-2. Tämän jälkeen vesipitoinen seos uutettiin metyyli- tert-butyylieetterillä (2 x 265 ml) . Orgaaniset uutteet yhdistettiin, pestiin vedellä (265 ml) , kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin alipai-15 neessa 30 °C:n lämpötilassa siten, että saatiin oranssia öljyä (132,8 g) . Tämä öljy puhdistettiin tyhjiötislauksel-la siten, että saatiin (R)-3-merkaptovoihappoa (86,6 g), kiehumispiste 100 Pa:n paineessa 96 - 100 °C.
d. Pvridiini-2-sulfenwlikloridi 20 2,2'-dipyridyylidisulfidia (110,0 g, 0,5 mol) liuotettiin dikloorimetaaniin (800 ml) huoneenlämmössä siten, että saatiin vaaleankeltainen liuos, joka jäähdytettiin 0 °C:seen. 0-5 °C:ssa pidettyyn liuokseen kupli-tettiin kloorikaasua. 3 tunnin 25 minuutin kuluttua liuos 25 kyllästettiin kloorilla ja se oli väriltään kullanruskea.
Liuos konsentroitiin alipaineessa 0 - 5 °C:n lämpötilassa siten, että klooriylimäärä saatiin poistettua ja pyridii-ni-2-sulfenyylikloridi saostettua keltaisena kiinteänä aineena. Tämä kiinteä aine (11,8 g) koottiin talteen suo-30 dattamalla ja pestiin dikloorimetaanilla. Dikloorimetaani-suodos (1 624 g) sisälsi vielä 133 g pyridiini-2-sulfe-nyylikloridia.
e. (R)-3-(2-nvridvvliditio)voihappo
Pyridiini-2-sulfenyylikloridi (11,8 g keltaista 35 kiinteää ainetta ja 1 035 g edellä valmistettua dikloori- 34 106928 metaanissa olevaa liuosta, kaikkiaan 0,667 mol, 1,0 mooli-ekvivalenttia) laimennettiin dikloorimetaanilla (50 ml). Seosta sekoitettiin huoneenlämmössä 5-10 minuutin ajan, jonka jälkeen se jäähdytettiin -5 °C:n lämpötilaan. Siihen 5 lisättiin liuosta, joka sisälsi dikloorimetaanissa (400 ml) olevaa (R)-3-merkaptovoihappoa (80,0 g 0,667 mol) samalla kun lämpötila pidettiin välillä -5-0 °C. Seosta sekoitettiin yön yli huoneenlämmössä siten, että saatiin ruskeaa öljyä ja keltainen ylempi kerros. Vettä (485 ml) 10 lisättiin seokseen, joka tämän jälkeen jäähdytettiin 5 °C:n lämpötilaan ja käsiteltiin 2 N natriumhydroksidi-liuoksella (385 ml) kunnes pH-arvo oli 4,55. Dikloori-metaanikerros erotettiin ja jäljelle jäänyt vesipitoinen faasi uutettiin, dikloorimetaanilla (200 ml·) . Dikloorime-15 taaniuutteet yhdistettiin, kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin alipaineessa siten, että saatiin vaaleanruskeaa öljyä. Öljyä sekoitettiin voimakkaasti heksaanissa (325 ml) ja seosta jäähdytettiin jää-hauteella kunnes muodostui kiinteää ainetta. Seosta sekoi-20 tettiin 3 tunnin ajan, jonka jälkeen ruskea kiteinen kiinteä aine kerättiin suodattamalla, pestiin heksaanilla (2 x 162 ml) ja kuivattiin yön yli huoneenlämmössä tyhjiössä ja tästä saatiin (R)-3-(2-pyridyyliditio)voihappoa (140 g).
NMR: 1,45 (d, 3H), 2,6 (dd, 1H), 2,8 (dd, 1H), 3,4 25 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 7,7 (m, 2H), 8,5 (m, 1H).
C242-vasta-aineen (C242:II) valmistus
Hybridoomasolulinjan perustaminen ja C242:II:n tuotanto
Olemassaolevien pernasolujen valmistus 30 Ihmisen kolorektaalista karsinoomasolulinjaa COLO
; 205, joka on kaupallisesti saatavilla talletuslaitoksesta
American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., USA, hakunumerolla CCL 222, viljeltiin rutiininomaisesti Iscoven MEM-alustalla, jota oli täydennetty 10-%:isella 35 naudan sikiön seerumilla (FCS). Solut kerättiin ennen « 37 106928
Tutkittiin suunnilleen 600 hybridoomakloonia. Aluksi näistä 190 reagoi COLO 205 -solujen kanssa. Näistä 177 reagoi myös Nyegaard A/S -yhtiöstä saadulle Lymphopre-pille valmistettujen normaalien ihmisen lymfosyyttien 5 kanssa ja ne hylättiin. Yhdestä jäljelle jääneestä kloonista aikaansaatu klooni nimettiin hybridoomaksi C242 ja sen isotyypin määritettiin kuuluvan luokkaan IgGl. Tämän jälkeen C242-hybridoomalle suoritettiin muutama jatko-kloonausvaihe siten, että saatiin tuotettua lopullinen, 10 stabiili vasta-ainetta tuottava, C242:II:ksi nimetty klooni .
Niinpä C242-hybridooma kloonattiin ensin siten, että tuloksena oli klooni nimeltä C242:5. Tämä klooni kloonattiin vuorostaan siten, että muodostui klooni 15 C242:5:2. Kummassakin näissä kloonauksissa hybridoomasus- pensio laimennettiin hypoksantiini/tymidiini (HT) -seoksella täydennettyyn viljelyalustaan solutiheyteen 4 so-lua/ml. Kuhunkin 96-kuoppaisen viljelymaljan kuoppaan, jotka oli esipäällystetty 250 μΐ-.lla. BALB/c-hiirten makro-20 fageista HAT-seoksella täydennettyyn viljelyliuokseen valmistettua makrofagisuspensiota (2 x 104 solua/ml), annosteltiin 50 μΐ hybridoomasuspensiota (0,2 solua). 2-5 päivän kuluttua yksisolukloonit havaittiin visuaalisesti mikroskoopilla. Päivänä 6 kasvatusalusta vaihdettiin ja : 25 poistetuista kasvatusalustoista otetuista eristä analysoi tiin COLO 205 -soluihin sitoutuvien, mutta ei normaaleihin ihmisen soluihin sitoutuvien vasta-aineiden määrä edellä kuvatulla ELISA-määrityksellä. Valittiin parhaat kloonit, jotka reagoivat positiivisesti COLO 205 ELISA:ssa ja säi-30 lyttivät negatiivisen reaktion normaalisolu-ELISA:ssa, ja ne pakastettiin pulloissa nestetyppeen myöhempää kehittelyä varten.
Kolmannen kloonauksen suorittamista varten solut sulatettiin ja niitä viljeltiin DMEM-alustalla (Dulbeccon 35 modifioima Eaglen kasvatusalusta) (5 % FCS) . Tämän jälkeen 106928 3 o solut ympättiin 96-kuoppaisen kudosviljelylevyn kuoppiin keskimääräisen solutiheyden ollessa kolme solua kuoppaa kohti. Kloonaus suoritettiin DMEM-alustalla, joka sisälsi 5 % FCS:a, ja syöttösoluina käytettiin hiiren makrofageja.
5 Tällä maljalla esiintyi 30 kloonia, joista 16:sta tutkittiin IgG:n tuotanto nefelometrialla ja vasta-aineiden spesifisyys ELISA-määrityksellä edellä kuvatulla tavalla. Näistä klooneista kahdentoista havaittiin tuottavan IgG:tä. Tämän jälkeen 10 kloonia kasvatettiin 24-kuoppai-10 sella kudosviljelylevyllä, josta poistetusta kasvatus-liuoksesta tutkittiin IgG:n tuotanto ja sen spesifisyys. Tämän valikoinnin tuloksena saatiin talteen 4 suhteellisen suuren tuotantokyvyn omaavaa kloonia. Näiden neljän kloonin lopullinen tuotantokyky tutkittiin kaksoiskudosvilje-15 lypulloissa. Valittiin suurimman tuotantokyvyn omaava klooni ja sille annettiin nimi C242/CL 510 AI. Se pakastettiin nestetyppeen myöhempää käyttöä varten.
Ensimmäinen kloonaus kloonista C242/CL 510 AI
osoitti, että yksi kolmasosa soluista ei tuottanut IgGrtä 20 sillä perusteella, että absorbanssi oli alle 0,1 suhteessa 1 : 1000 laimennetussa hiiren yleis-IgG-ELISA-määritykses-sä. Viisi positiivista jatkokloonia yhdistettiin siten, että saatiin luotua klooni nimeltä C242:I. Tästä kloonista saatavan tuotantokyvyn kvantitointi antoi yleisellä ; 25 HPLCrhen perustuvalla määrityksellä tulokseksi 150 μg hii ren IgG·.tä ml:aa kohti.
Tämän jälkeen klooni C242:I kloonattiin 96-kuoppai-selle levylle saannon ollessa 33 kloonia, jotka kaikki olivat positiivisia hiiren IgG:n tuotannon suhteen. Näistä 30 viisi kloonia, joiden kaikkien saanto oli yli 150 ^g/ml, yhdistettiin siten, että luotiin lopullinen pysyvästi IgGrtä tuottava klooni, jolle annettiin nimitys C242-.II. HPLC-määritys osoitti C242:II:n tuotantokyvyn olevan 196 /xg hiiren IgGrtä yhtä ml:aa kohti. Solut pakastettiin 35 ja varastoitiin pulloissa nestetyppeen. Tuotetusta 106928 39 C242:II:sta otettu näyte on säilytettynä talletus-laitoksessa ECACC hakunumerolla 90012601, kuten edellä mainittiin.
Monoklonaalisen C242-vasta-aineen tuotanto 5 Yllä valmistetusta hybridoomasta valmistettu lähtö- solususpensio saatiin pakastetusta pullosta. Solut ympättiin Nunc A/S -yhtiöstä saataviin kudosviljelykammioihin, joiden kokonaispinta-ala oli 6000 cm2 solutiheyteen 2 x 104 solua/ml (C242:II-hybridooma). Tämän jälkeen soluja 10 viljeltiin Iscoven mukaan (Iscove N. N. ja Melchers F., J. Exp. Med., osa 147 (1978), s. 923) muunnetulla DMEM-alustalla, jota oli täydennetty 1 %:lla gentamysiiniä, 1 %:lla aminohappotäydennystä ja 5 %:lla naudan sikiön seerumia. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 4 tai . 5 päivän ajan 15 37 °C:n lämpötilassa kosteutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 8 % C02:ta. Inkuboinnin päätyttyä solut laskettiin ja viljelyliuoksesta otettiin näytteitä monoklonaalisen vasta-aineen konsentraation määrittämiseksi. Soluviljelmän supernatantti dekantoitiin ja suodatettiin selluloosasuo-20 dattimella suspendoituneiden solujen poistamiseksi. Tämän jälkeen supernatantti konsentroitiin 20 - 30-kertaisesti ultrasuodatuksella Millipore Pellican Ultrafiltration -kammiossa käyttäen membraania, jonka päästöraja oli mole-kyylipainon 30000 kohdalla. Konsentraatista otetusta näyt- : 25 teestä tutkittiin monoklonaalisen C242:II-vasta-aineen « · konsentraatio ja antigeenin reaktiokyky, jonka jälkeen vasta-ainekonsentraatti varastoitiin -70 °C lämpötilassa puhdistukseen saakka.
Monoklonaalisen C242-vasta-aineen puhdistus 30 Proteiini-A-Sepharose 4B (Pharmacia AB:n, Uppsala,
Ruotsi, tavaramerkki) valmistettiin valmistajan geelin turpoamista ja pesemistä koskevien ohjeiden mukaisesti, jonka jälkeen edellä tuotettu C242:II-konsentraatti (josta tässä keksinnössä käytetään myös yksinkertaisesti nimitys-35 tä C242-vasta-aine) kytkettiin siihen käyttäen kytkemis- 40 1 0 6 9 2 8 puskuriliuoksena 1,5 glysiini-NaOH-seosta, 3 M NaCl:a, pH 8,9. Samaa puskuriliuosta käyttäen suoritetun ensimmäisen pesun jälkeen affiniteettipylväs eluoitiin 0,1 M sitruuna-happo-NaOH -seoksella, jonka pH oli 5,0, ja monoklonaali-5 nen C242-vasta-aine kerättiin koeputkiin, jotka sisälsivät 1 mooli/1 Tris-HCl-seosta, jonka pH oli 8,0. Saatu vasta-ainetta dialysoitiin tämän jälkeen sellaista liuosta vastaan, jonka koostumus oli 0,02 M fosfaattipuskuri, 0,15 M NaCl, pH 7,2, 0,2 g/1 NaN3. Tämän jälkeen dialysoitu C242-10 vasta-aine konsentroitiin ultrasuodatuksella käyttäen membraania, jonka päästöraja oli molekyylipainon 30 000 kohdalla. Konsentraation määrittämiseen ja laadunvalvon-tatutkimuksiin tarkoitettujen näytteiden ottamisen jälkeen monoklonaalinen C242 -vasta-aine varastoitiin -20 °C:n 15 lämpötilaan.
Risiini-A:n valmistus
Risiini-A voidaan valmistaa yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla käyttäen risiini-A:ta koodaavia DNA-jaksoja. Tällaisia jaksoja on kuvattu EP-julkaisuissa 145 111, 20 0'Hare, et ai, FEBS Letts 216 (1987), s. 73 - 78, ja Lord, et ai., Eur. J. Biochem. 148 (1985), s. 265 - 270. Ri- siini-A:ta koodaava DNA-jakso asetetaan tarkoituksenmukaisten säätelyjaksojen, kuten promoottorijakson (esimerkiksi trp-promoottorin), ribosomin sitoutumiskohdan ja : 25 transkription terminaatiojakson, säätelyn alaisuuteen.
Yhdistelmä-risiini-A:n valmistus ja puhdistaminen on kuvattu PCT-patenttihakemusjulkaisussa W0 85/03 508 ja EP-patenttihakemusjulkaisussa nro 237 676.
Seuraavassa kuvataan sellaisen yhdistelmäplasmidin 30 konstruointi, jossa risiini-A:ta koodaava jakso asetettu prokaryoottisen promoottorielementin transkriptionaalisen ja translationaalisen säätelyn alaiseksi. Transkriptio lakkaa sillä, että lähettimolekyylin 31-päähän on liitetty luonnollinen terminaatioelementti. Translaation aloitusta 35 säätelee lähettimolekyylin 5'-päässä oleva DNA-jakso, ri- „ 106928 bosomin sitoutumiskohta (RBS). Konstruointimenetelmä tekee välttämättömäksi korvata luonnosta peräisin olevan matu-roituneen risiini-A-proteiinin kaksi N-terminaalisen pään aminohapporyhmää muilla ryhmillä.
5 Kuvataan muutamia yhdistelmä-risiini-A:n valmistuk sessa käytetyn vektorin muodostamisessa käytettyjä välivaiheita .
Kokeelliset menetelmät 1. Synteettiset oligonukleotidit 10 Spesifisten DNA-jakson muutosten tekoon risiini- geeniin käytettiin synteettisiä oligonukleotidejä. Kaikki tämän jälkeen kuvatut oligonukleotidit valmistettiin Applied Biosystem -yhtiön 380A DNA-syntetisointilaitteessa 5'-dimetoksitrityyliemäksellä suojatuista · nukleosidi-2-15 syaanietyyli-N,N-di-isopropyylifosforamidiiteista ja huokoskooltaan säädeltyyn lasitukimateriaaliin kytketyistä suojatuista nukleosideistä Ό, 2 mikromoolin suuruusluokassa Applied Biosystems Inc -yhtiön toimittamien valmistusohjeiden mukaisesti.
20 Sen jälkeen kun kukin oligonukleotidi oli pilkottu irti kiinteästä tukimateriaalista ja kaikki suojaavat ryhmät oli poistettu, kukin oligonukleotidi liuotettiin veteen (1 ml) ja konsentraation määritys suoritettiin mittaamalla absorbanssi 260 nm:n aallonpituudella.
; 25 2. Entsyymit ja isäntäsolukannat
Alla kuvatuissa manipulaatioissa käytettiin useita erilaisia restriktioendonukleaaseja ja DNA:ta modifioivia entsyymejä. Ne hankittiin joiltakin useista toimittajista (Amersham International, Beteshda Research Laboratories, 30 Boehringer Mannheim tai New England Biolabs) ja niitä käytettiin reaktio-olosuhteiden osalta valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Tässä keksinnössä käytettyjä isäntäsolukantoja on kaupallisesti saatavilla useista lähteistä. Esimerkiksi E. 35 coli C600 on vapaasti saatavilla useista lähteistä, mu- 106928 kaanlukien monet viljelmäkokoelmat, kuten E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA, hakunumerolla GCSC 3004. E. coli C600:n genotyyppi on K12 thr-1 leuB6 Thi-1 IacYl tonA21 λ~ supE44, E. coli HB 101 ja DH5a ovat saata-5 villa Beteshda Research Laboratories -yhtiöstä, E. coli TG1 ja K19 ovat saatavilla Anglia Biotechnology -yhtiöstä.
3. Geneclean (TM)
Koepakkaus sisältää 1) 6-molaarisen natriumjodidin, 2) natriumkloridin, Tris:in ja EDTA:n konsentroidun liuok-10 sen natriumkloridi/etanoli/vesi-pesulioksen valmistamiseksi, 3) Glassmilk (TM) - 1,5 ml:n pullo, joka sisältää 1,25 ml silikamatriisia veteen suspendoituna.
Tämä on Volgensteinin ja Gillespien julkaisussa Proceedings of the National Academy of Sciences USA 15 (1979), osa 76, s. 615 kuvaamaan menetelmään perustuva DNA:n puhdistustekniikka.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää, joka on kuvattu teoksessa "Molecular Cloning - a laboratory manual", toinen painos, Sambrook, Fritsch ja 20 Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 (tästä lähtien tästä teoksesta käytetään nimitystä "Maniatis").
4. Sequenase (TM)
Kemiallisesti modifioitu T7-DNA-polymeraasi
Perustuu Taborin ja Richardsonin julkaisussa • 25 Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1987), 84, s. 4767 - 4771, kuvattuun menetelmään.
5. pICI-ilmentämisvektorien konstruointi 5.a) pICI0020
Plasmidivektori pICI0020 on plasmidiin pAT153 pe-30 rustuva plasmidi, jossa 651 ep:n EcoRI - Accl -alue on . korvattu 167 ep:n suuruisella EcoRI - Clal -fragmentilla, jonka koostumus on: (1) synteettinen E. coli trp -promoottori ja trp-johtojakson ribosomin sitoumiskohta, 35 (2) translaation aloituskodoni, 43 106928 (3) monille restriktioentsyymeille tunnistuskohdat sisältävä jakso, joka on peräisin M13mpl8:sta ja joka sisältää Kpnl-, BamHI-, Xbal-, Sali-, PstI-, Sphl- ja HindiII-kohdat, 5 (4) synteettinen transkription lopetusjakso.
Tämän alueen DNA-jakso on esitetty kuviossa 11.
Synteettisen trp-promoottorijakson sisältävän plasmidivektorin konstruointi on julkaistu (Windass et ai., Nuc. Acids Res. 10 (1982), s. 6639 - 6657). Promootio torifragmentti eristettiin tällaisesta vektorista sen jälkeen, kun se oli pilkottu entsyymeillä EcoRI ja Hpal ja puhdistettu sopivasta agaroosigeelivyöhykkeestä eluoi-malla sähkövirralla (julkaisussa "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Maniatis, Fritsch ja Sambrook, julkai-15 sija CSH-laboratory, toinen painos, 1989).
Valmistettiin pari komplementaarisia synteettisiä oligonukleotidejä, jotka ligatoituvat promoottorifragmentin Hpal-päähän siten, että saadaan käyttöön luonnollinen trp-johtojakson ribosomin sitoutumiskohta, translaation 20 aloituskodoni ja 3'-pään Kpnl-kloonauskohta. Näitä oligonukleotidejä sekoitettiin toisiinsa samanmolaarisina konsentraatioina ja niiden annettiin liittyä toisiinsa kuumentamalla ne 100 °C:n lämpötilaan ja jäähdyttämällä sen jälkeen hitaasti huoneenlämpötilaan.
· 25 Tämän jälkeen promoottorifragmentti ja toisiinsa liitetyt oligonukleotidit liitettiin ligaasilla ja sopiva vyöhyke eristettiin polyakryyliamidigeelistä eluoimalla sähkövirralla. Tämän jälkeen tämä fragmentti liitettiin ligaasilla M13mpl8-vektorista johdettuun vektoriin, joka 30 sisälsi HinduI-kohtaan kloonatun (synteettisistä oligo-• nukleotideistä muodostetun) trp-attenuaattorijakson, jonka jälkeen attenuaattorin 3'-päähän liitettiin vielä yksi Clal-restriktiokohta. Ligatoitu DNA transfektoitiin E. coli -kantaan JM109 (Yanish-Perron, et ai., Gene 33 35 (1985), s. 103), joka oli tehty kompetentiksi CaCl2-mene- a 106928 44 telmällä (Maniatis, kappale 1, s. 82). Maljauksen ja maljojen inkuboinnin jälkeen plakit seulottiin Bentonin ja Daviesin menetelmällä (Maniatis, kappale 4, s. 41) käyttäen 32P-leimalla varustettua koetinta, joka oli muodostet-5 tu suorittamalla aiemmin eristetylle EcoRI - Hpal -pro-moottorifragmentille katkostranslaatio (nick-translation) . Positiivisesti hybridisoituvista plakeista valmistettiin vakiomenetelmällä yksinauhainen DNA (Maniatis, kappale 4, s. 29) ja se sekvenssoitiin käyttäen yleistä M13-aluketta 10 ja Sangerin ketjun dideoksiterminaatiomenetelmää useilta toimittajilta saatavilla olevassa koepakkausmuodossa, esimerkiksi Sequenase (United States Bioscience).
RF-DNA valmistettiin yhdestä eristetystä jaksosta, jonka promoottori/ribosomin sitoutumiskohta/vaimenninjakso 15 oli varmistettu. Tätä DNA:ta pilkottiin EcoRI:llä ja Clal:llä ja tarkoituksenmukainen fragmentti eristettiin polyakryyliamidigeeliltä edellä kuvatulla tavalla. Plas-midi pAT153 pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja Accl ja ne liitettiin ligaasilla eristettyyn promoottorifragmenttiin. 20 Ligatoitu DNA transformoitiin kompetenttiin E. coli HB101 -kantaan (Boyer, H.W. ja Roulland-Dussoix, D.J., Mol. Biol. 44 (1969), s. 459) (Beteshda Research Laboratories) ja selektoitiin ampisilliinille resistenttejä klooneja.
Plasmidi-DNA valmistettiin useista klooneista ja ·· ·. 25 EcoRI- ja Clal-kohtien välisen alueen DNA-jakso otettiin selville. Yhden kloonin varmistettiin sisältävän oikean promoottori/vaimenninjakson, ja sille annettiin nimi pICI0020.
Tämä konstruktio on esitetty pääpiirteittäin ku- 30 viossa 1.
3.b) pICI0042 pICI0042 (kuvio 12) on plasmidi, jossa plasmidin pAT153 antibioottiresistenssimarkkerit on korvattu yhdellä, plasmidista RP4 saadulla indusoitavalla tetrasykliini- 35 resistenssigeenillä (geenin tetA koodaama ja tetR-geeni- 106928 45 tuotteen säätelemä). Nämä geenit on karakterisoinut tutkijaryhmä Klock, et ai. (J. Bacteriol. 161 (1985), s. 326 -332) . Koska uusi resistenssimarkkeri ilmentyy ainoastaan antibiootin läsnäollessa, ei tetA-geenituote ole poten-5 tiaalinen yhdistelmä-risiini-A:ta kontaminoiva aine niissä viljelmissä, joissa plasmidi säilyttää pysyvyytensä tetra-sykliinin puuttuessa. Konstruktioon on myös lisätty plas-midin stabiilisuustoiminto (cer).
Tämä vektorin muodostamisen lähtövaiheena oli tuotit) taa johdannainen plasmidista pAT153, josta tetrasykliini-resistenssiä koodaava geeni oli kokonaan poistettu. Suunniteltiin komplementaarinen pari synteettisiä oligonukleo-tidejä korvaamaan pAT153:sta peräisin oleva EcoRI - Aval -fragmentti lyhyellä jaksolla, joka sisältää useita myö-15 hempään kloonaukseen tarvittavia ainutkertaisesta esiintyviä restriktioendonukleaasikohtia.
Plasmidin pAT153 DNA pilkottiin EcoRI- ja Aval-entsyymeillä ja 2175 ke:n kokoinen plasmidi-DNA-fragmentti eristettiin 0,7-%.-isesta agaroosigeelistä käyttäen 20 Genecleania (Bio 101, Kaliformia) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Näin poistettiin tetrasykliiniresistenssigee-nin sisältävä 1,425 kep:n kokoinen fragmentti.
Oligonukleotidit (jaksotunnisteet nro 13 ja 14) fosforyloitiin käyttäen T4-polynukleotidikinaasia ja nii-.25 den annettiin kiinnittyä vastinosiinsa yhtä suurina mooli-määrinä. Tämän jälkeen liitettiin toisiinsa liittyneistä oligonukleotideistä otettu näyte plasmidista pAT153 saatuun plasmidifragmenttiin ligaasia käyttäen. Ligatoitu DNA transformoitiin E. coli HB101 -kantaan (BRL) ja selektoi-30 tiin ampisilliinille resistenttejä klooneja.
' Pienessä mittakaavassa tapahtuvaa plasmidi-DNA:n valmistusta varten poimittiin useita pesäkkeitä (Birn-boimin ja Dolyn menetelmä, joka on kuvattu teoksessa Maniatis, kappale 1, s. 25) ja haluttu konstruktio tunnis-35 tettiin suorittamalla restriktioanalyysi sopivilla entsyy- 106928 46 meillä, esimerkiksi EcoRI:llä, Aval:llä ja BamHI:llä. Kolmen oikeat restriktiotulokset antavaksi tunnistetun eristetyn jakson rakenne varmistettiin määrittämällä niiden DNA-jakso käyttäen pBR322:n EcoRI-kohdasta myötäsuuntaan 5 lähtevää aluketta (New England Biolabs). Yhdelle eristetylle plasmidille annettiin nimitys pICI0019.
RP4-plasmidin DNA eristettiin vielä olemassa olevista varastokannoista Holmesin ja Quigleyn menetelmällä (Maniatis, kappale 1, s. 29). Tämä DNA pilkottiin täydel-10 lisesti BglII:lla ja sen jälkeen osittain Xmalrllä (25 °C:n lämpötilassa korkeintaan 35 minuutin ajan) ottaen näytteitä eri aikoina, kunnes tetR:n ja tetA:n sisältävä 2,45 kep:n fragmentti oli selvästi tunnistettavissa. Plas-midin pUC8 DNA:sta otettu näyte pilkottiin täydellisesti 15 BamHI:llä ja Xmal:llä. Ligaatiot suoritettiin siten, että tetrasykliiniresistenssigeenit saatiin liitettyä pUC8:aan. Ligatoitu DNA transformoitiin CaCl2-menetelmällä (Maniatis, kappale l, s. 82) kompetentiksi tehtyyn E. coli C600 -kantaan (Appleyard, R.K., Genetics 39 (1954), s. 440) ja suo-20 ritettiin tetrasykliinille resistenttien kloonien selektio. Plasmidi-DNA valmistettiin 8 kloonista (Holmes ja Quigley) ja RP4:n tetR- ja -A-geenien läsnäolo varmistettiin restriktioanalyysin avulla. Yhdelle näistä eristetyistä plasmideista annettiin nimitys pTB344.
25 Tämän jälkeen tetrasykliiniresistenssigeenit lii- » tettiin plasmidiin pICI0019 (kuvattu edellä) korvaamalla plasmidista pICI0019 saatu EcoRI/PstI-fragmentti vastaavalla plasmidista pTB344 saadulla fragmentilla. Tämän tuloksena suurin osa plasmidissa pICI0019 olevasta ampisil-30 liiniresistenssigeenistä korvautuu tetrasykliiniresistens-
• sigeeneillä. Plasmidi-DNA:n pilkkomisen ja ligaation jälkeen ja sitä seuranneen E. coli C600 -kantaan tapahtuneen transformaation jälkeen suoritettiin selektio pesäkkeiden fenotyypin eli TcR:n ja Aps:n perusteella. Plasmidi-DNA
3-5 valmistettiin 4 tällaisesta kloonista ja se pilkottiin • 106928 entsyymien yhdistelmällä, esimerkiksi yhdistelmällä BamHl/Pstl/Sstl, EcoRI/Sall, Smal, Styl/Sall tai Aval/Pstl. Kaikista 4 kloonista saatiin haluttun konstruktion suhteen yhdenmukaiset restriktiotulokset. Yhdelle 5 näistä annettiin nimitys pTB351.
Summers ja Sherrat (Cell 36 (1984), s. 1097 - 1103) ovat osoittaneet, että ColEIrstä johdettujen plasmidien (esim. pAT153) pysymättömyys johtuu isäntäplasmidissa esiintyvän 283 ep:n suuruisen jakson, cer-jakson, puut-10 tumisesta. Tämä jakso edesauttaa plasmidin oligomeerien muodostumisen estymistä, viimeksimainittujen vaikuttaessa häiritsevän plasmidin jakaantumista jollakin toistaiseksi selvittämättömällä tavalla. Tämä cer-jakso (Summers, D., et ai., Mol. and Gen. Genetics 201 (1985), s. 334 - 338, 15 ja Cell 36 (1984) , 1097 - 1103) eristettiin plasmidiin pUC18 kloonatusta fragmentista (pKS492). Plasmidin pKS492 DNA:ta pilkottiin BamHI:llä ja Taqlrllä siten, että vapautui 289 ep:n cer-jakson sisältävä fragmentti. Plasmidin pTB351 DNA (eristetty Dam' -isäntäsolusta E. coli GM48 -20 Arraj , J.A. ja Marinus, M.G., J. Bact. 153 (1983), s.
562 - 565) pilkottiin täydellisesti BamHI:llä ja Clal:llä ja liitettiin pKS492-plasmidin pilkottuun DNA:han ligaasia käyttäen. Kun ligatoitu DNA oli transformoitu kompetent-teihin E. coli C600-soluihin, suoritettiin selektio tet-. 25 rasykliinille resistenttien kloonien suhteen, cer-fragmen- tin läsnäolo varmistettiin ehdokkaiksi valituista kloo neista saadun plasmidi-DNA:n restriktioanalyysillä Aval-, MluI- ja PvuI-entsyymeillä. Yhdelle oikean rakenteen käsittävälle eristetylle plasmidille annettiin nimitys 30 pICI0042.
Näiden plasmidien konstruointi on kuvattu pääpiir-‘ ‘ teittäin kuvioissa 2 ja 3.
5.c) pICI1079
Plasmidivektori pICI1079 on ampisilliinille resis-35 tentti, plasmidista pAT153 peräisin oleva plasmidi, joka 106928 48 sisältää EcoRI- ja StyI-restriktiokohtien välissä sijaitsevat seuraavat elementit: (i) fagi A:sta saatu CI857-geeni, (ii) lPL-promoottori, 5 (iii) synteettinen ribosomin sitoutumiskohta, (iv) synteettinen interferonin a2-geenijakso, (v) synteettinen transkription terminaatiojakso, joka on johdettu T4-fagista, jotka sijaitsevat Sali- ja StyI-restriktiokohtien välissä. Tämän transkription lope- 10 tusjakson DNA-jakso on esitetty kuviossa 13.
pICI1079 on esitetty kuvassa 14.
pICI1079 talletettiin Budapestin sopimuksen mukaisesti 19.2.1991 talletuslaitokseen NCIMB, 23 St. Machaer Drive, Aberdeen, Skotlanti, ja sille annettiin NCIMB:n 15 hakunumero 40370.
Plasmidia pICI1079 käytettiin siitä käyttöön saatavan T4-transkriptioterminaattorin lähteenä risiini-A:ta ilmentävän kloonin pICI1185 muodostamiseksi (katso jäljempänä oleva kohta 7.d). Plasmidin pICI1079 muodostamisen 20 lähtökohta oli pICI1043. Plasmidi pICI1043 perustuu plas-midiin pICI0020 (katso edellä oleva kohta 3.a), jossa APl-promoottorin ja interferonin-a2-geenin sisältävä ilmenty-miskasetti (Edge, et ai., Nuc. Acids Res. 11 (1983), s.
6419 - 6435) esiintyy EcoRI- ja Sali-kohtien välissä.
25 Syntetisoitiin komplementaarinen pari oligonukleo- tidejä siten, että saatiin muodostettua bakteriofagin T4 geenistä 32 peräisin oleva transkription lopetusjakso, jolla on kohesiiviset 5'-pään Sali- ja 31-pään SphI-päät. Tämä fragmentti liitettiin ligaasilla pICI1043:sta eris-30 tettyyn plasmidifragmenttiin, joka oli pilkottu täydellisesti Sällillä ja Sphl:llä. Tällä tavoin tuotettu välivaiheen plasmidi (pICI1078) sisälsi kahtena peräkkäisenä kappaleena sekä T4-lopetusjakson että trp-attenuaattorijak-son.
106928 49 Tämän jälkeen trp-attenuaattorijakson (ja tetrasyk-liiniresistenssigeenin jäljellä olevan osan) korvaamiseen käytettiin toinen pari komplementaarisia oligonukleotidejä lisäämällä ne plasmidin pICI1078 Sphl- ja Styl-kohtien 5 väliin. Tämän synteettisen fragmentin sisään liitettiin ainutkertaisena esiintyvä BamHI-kohta.
Nämä manipulaatiot on esitetty pääpiirteittäin kuviossa 4.
6. Risiini-A:ta ilmentävän kloonin muodostaminen 10 6.a) pUC8RA-plasmidi-DNA:n valmistus
Muodostettiin klooni (pUC8RA), joka sisälsi risiini -A: ta koodaavan cDNA:n. Tämä klooni sisältää plasmidissa pUC8 (Vieira, J. ja Messing, J., Gene 19 (1982), s. 259) olevan A-ketjun cDNA:n alkaen johtojakson emäksestä numero 15 -74 ja päättyen B-ketjussa olevaan BamHI-kohtaan (emäs numero 857) julkaistun cDNA-jakson mukaisesti (Lamb, I.F., Roberts, L.M., Lord, J.M., Eur. J. Biochem. 148 (1985), s. 265 - 270). Kohdemutageeneesiä on lisäksi käytetty translaation lopetuskodonin muodostamiseksi välittömästi risii-20 ni-A:n maturoituneen muodon viimeisen kodonin 3'-pään puolelle (julkaisussa 0'Hare, M., et ai., FEBS Letts 216 (1987), s. 73 - 78, raportoidulla tavalla). Tästä kloonista saatu BamHI-fragmentti sisältää koko A-ketjua koodaavan alueen.
- 25 Yllä kuvatulla tavalla saatiin aikaan pieni määrä ' plasmidin pUC8RA DNA:ta. Tulevia kantaviljelmiä varten transformoitiin tästä DNA:sta valmistettu laimennos kom-petentteihin E. coli DH5a-soluihin (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166 (1983), s. 557) (Beteshda Research Laboratories) 30 ja niistä selektoitiin ampisilliinille resistentti trans-formantti. Tästä kloonista saatu plasmidi-DNA valmistettiin Birnboimin ja Dolyn menetelmän (Maniatis, kappale 1, s. 25) muunnoksella. Tästä DNA:sta otetut näytteet pilkottiin erikseen BamHI:llä ja Banl:llä ja niitä verrattiin 35 agaroosigeelissä suoritetun elektroforeesin jälkeen alku- so 106928 peräisen Lord, et al.:n raportoiman DNA:n vastaaviin pilkkoutumistuotteisiin. Restriktiotuloksissa ei havaittu mitään eroavuuksia ja tältä pohjalta näiden kahden DNA-näytteen oletettiin olevan identtiset.
5 6.b) Jatkokloonaus M13:een
BamHI:llä pilkotut plasmidin pUC8RA DNA ja faagi M13:n kannan K19 (Anglian Biotechnology) RF (replikoituva muoto) -DNA liitettiin sattumanvaraisesti ("shotgun") li-gaasilla yleisesti käytetyissä olosuhteissa (Maniatis, 10 kappale 1, s. 68). Suoritettiin myös kontrolliligaatioita. Ligaasilla liitetyt DNA-molekyylit transformoitiin CaCl2-menetelmällä (Maniatis, kappale 1, s. 82) kompetentiksi tehtyyn E. coli -kantaan TG1 (Gibson, 1984/Anglian).
Transformaatiofrekvenssit osoittivat tehokkaan li-15 gaation tapahtuneen ja tulokseksi odotettiin saatavan yh-distelmä-fageja. Yhdistelmä-fagien ennustettiin tuottavan kirkkaita plakkeja IPTG + X-gal (BRL) -seosta sisältävillä maljoilla IacZ (β-galaktosidaasi) -geenin rakenteen hajoamisen johdosta. Villityypin fagit tuottivat sinisiä 20 plakkeja X-galin β-galaktosidaasilla tapahtuvan hydrolysoi tumisen johdosta.
Yksinauhaisen DNA:n valmistamiseksi poimittiin useita kirkkaita plakkeja. Hajotetuista faagisuspensioista suoritettu suora geelielektroforeesi osoitti, että yksi • - 25 fagiklooni sisälsi melko suuren liitosjakson, jonka var mistettiin sekvenssoinnin avulla olevan risiinin A-ketjua koodaava jakso. Ainoastaan 182 maturoitunutta risiini-A:ta koodaavan jakson emästä saatin varmistettua, mutta tätä pidettiin riittävänä todistuksena koko risiini-A:n geenin 30 läsnäolosta. Tälle kloonille annettiin nimitys M13K19RA.
. 6.c) M13K19RA:n mutageneesi
Jotta maturoituneen risiini-A:n alkuun saataisiin muodostettua pICI-ilmentämisvektoreiden kanssa yhteensopiva Kpnl-kohta, ovat seuraavat muutokset (alleviivattuna) 35 välttämättömiä: S1 106928
Jaksotunniste 15 5 '____GATAACAACATATTCCCCAAA...... 3 ' 5 ....Risiinin johtojakso...|---Maturoitunut risiini-A--> muutettu jaksoksi:
Jaksotunniste 16 10 5 '____GATAACAACATGGTACCCAAA.......3 ' I Kpnl
Translaation aloitus 15 · ja tuloksena on Kpnl-kohdan kanssa limittäin menevä ATG-kodoni. Mutantista voidaan irrottaa risiini-A:n sisältävä Kpnl-fragmentti ja liittää se ICI-ilmentämisvektorisar-jaan. Tapahtuu kaksi N-terminaalisen pään aminohappomodi-20 fikaatiota (ile-phe-jakso muuttuu met-vai-jaksoksi).
Kussakin mutaatiostrategiassa mutageneesivaiheen templaattina käytettiin M13K19RA:sta valmistettua yksinau-haista DNA:ta. Syntetisoitiin yksi oligonukleotidi, DTR16, joka sisältää kaikki tässä strategiassa käytettävät mutaa-:r - 25 tion aiheuttamat muutokset.
t DTR16 (Jaksotunniste 17) 5' AACAACATGGTACCCAAACAA 3'
On olemassa useita menettelytapoja lisätä spesifi-30 siä DNA-jakson muutoksia kohdemutageneesin avulla. Jäljempänä pääpiirteittäin kuvatut menettelyt suoritettiin käyttäen Ecksteinin, et ai. , menetelmää (Nuc. Acids Res. 13 (1985), s. 8749 - 8764, ja 14 (1986), s. 9679 - 9698) koe-pakkauksen muodossa (Amersham International) ja sitä käy-35 tettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.
52 106928 Tämän menetelmän periaatteena on tehdä yksinauhai-seen DNA-templaattiin aluke mutageenisellä oligonukleoti-dillä ja syntetisoida komplementaarinen nauha käyttäen dATP:n tilalla DATPaS:ää. Tätä nukleotidiä käyttäen saa-5 daan aikaan fosforotioaattisidoksia, joita tietyt restrik-tioentsyymit (esim. Neil) eivät pilko. Toisen nauhan synteesin jälkeen parentaalinauhaan tehdään katkoksia Neil:llä ja lisätään eksonukleaasi-III:a, jotta pilkkoutuminen saadaan tapahtumaan taaksepäin mutaatiokohdan ohi. 10 Tämän jälkeen DNA-polymeraasi I mahdollistaa parentaali-nauhan uudelleensyntetisoimisen. Tämän seurauksena muta-geeninen oligonukleotidi toimii templaattina uudelleensyn-tetisoinnissa ja mutaatio liittyy kumpaankin nauhaan ennen transformaatiota. Mutaatiotaajuuden esitetään olevan jopa 15 96 % kokonaistuloksesta ja seulonta suoritetaan yksinker taisesti poimimalla satunnaisesti plakkeja sekvenssin määrittämistä varten.
Suorittamissamme kokeissa oli 4 poimitusta plakista 4 oikein mutatoituneita.
20 Sen jälkeen kun yksi mutantti (MRA16) oli valittu, valmistettiin RF-DNA ja varmistettiin, että siihen oli ilmaantunut uusi restriktiofragmentti, toisin sanoen Knpl-fragmentti.
6.d) Kloonaus, ilmentäminen ja alkukarakterisointi , 25 Ilmentämisvektoreiden pICI-sarjaan (katso osa 3) on mahdollista liittää DNA-fragmentteja, jotka kloonataan Trp-promoottorin vieressä sijaitsevaan ainutkertaisena esiintyvään Kpnl-restriktiokohtaan. Kpnl-kohta sijaitsee limittäin translaation aloituskohdan (ATG) suhteen, joka 30 sijaitsee 8 ep:a myötäsuuntaan promoottorin Shine-• Dalgarnon kohdasta (AGGA).
MRA16:n jakson varmistuksen jälkeen suoritettiin pilkkominen Kpnlrllä suuressa mittakaavassa (~5 μg RF-DNA: ta) ja asiaankuuluva risiini-A:ta koodaava DNA-frag-35 mentti eristettiin agaroosigeelistä (Nu-Sieve GTG -agaroo- 53 106928 si, FMC Bio-products) uuttamalla irtileikattu geeliviipale fenolilla valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Plasmidi pICI0020 (katso 3.a) pilkottiin Kpnl:llä ja sen jälkeen se defosforyloitiin käyttäen naudan suolen 5 alkalista fosfataasia (CIP - Boehringer Mannheim). Viimeksimainittu käsittely estää vektorin muodostumisen ligaa-tion aikana uudelleen renkaaksi, mikä voisi johtaa suureen määrään parentaalijaksoja transformaatiosta saatavissa jälkeläissoluissa.
10 Ligaatiot järjestettiin plasmidivektorin ja eris tetyn fragmentin suhteiden ollessa välillä 8:1-1:3 (w/w) eri strategioissa. Mukaan liitettiin fosfataasikä-sittelyn tehokkuuden, ligaasin aktiivisuuden jne. tutkimiseen tarkoitettuja kontrolliligaatioita. Ligaatio-olosuh-15 teet olivat käytetylle T4-DNA-ligaasin lähteelle (New England Biolabs tai Amersham) sopivat. Reaktioseoksia inkuboitiin yleensä 15 °C:ssa yön yli.
50 % kustakin ligaatioreaktiosta (5 μΐ) laimennettiin 100 ^l:ksi 1 x TNE-liuoksella (50 mM Tris, 50 mM 20 NaCl, 1 mM EDTA) ja niihin lisättiin 200 μΐ kompetentteja E. coli DS410 -soluja. Transformaation käytettävän vakio-menetelmän (Maniatis, kappale 1, s. 74) jälkeen solut mal-jattiin L-agarille, joka sisälsi lisäksi streptomysiiniä (25 μg/ml) ja ampisilliiniä (100 μg/ml), ja niitä inkuboi-: 25 tiin 37 °C:ssa yön yli.
Transformaatiomaljat tutkittiin inkuboinnin jälkeen. Ligaasilla käsiteltyjä plasmideja sisältävillä maljoilla havaittiin tavallisesti 5-10 kertaa enemmän pesäkkeitä kuin niillä maljoilla, joilla oli ligaasilla kä-30 sittelemättömiä kontrollinäytteitä. Joissain tapauksissa * havaittiin joko ligaasin läsnä ollessa tai sen puuttuessa, muodostuneiden pesäkkeiden määrissä pieniä eroja, mikä osoitti vektorin pilkkoutuneen epätäydellisestä tai ligaasin aktiivisuuden olleen heikko.
54 106928
Transformantteja sekä asiaankuuluvia kontrollinäyt-teitä poimittiin L-agarmaljoille asetetuille nitrosellu-loosasuodattimille hybridisaatioseulontaa varten (perustuu teoksessa Maniatis, kappale 1, s. 98 kuvattuun Grunsteinin 5 ja Hognessin menetelmään). Inkubaation jälkeen pesäkkeet hajotettiin in situ -olosuhteissa käyttäen 10-%:ista SDS-liuosta ja 1 M NaOH:ta, neutraloitiin käyttäen 1 M Tris:iä (pH 7,5) ja kuivattiin tyhjiössä 80 °C:ssa 2 tunnin ajan.
Hybridisaatiokoettimet muodostettiin varustamalla 10 mutatoituneet oligonukleotidit 32P-leimalla T4-polynukleo-tidikinaasia käyttäen. Suodattimet käsiteltiin koettimilla huoneenlämmössä ja sen jälkeen ne pestiin vaiheittain 55 -65 °C:n lämpötilaan saakka ei-spesifisesti sitoutuneiden iskujen poistamiseksi ennen autoradiografiaa. Spesifinen 15 hybridisaatio oli osoituksena mahdollisista risiini-A:n DNA:ta sisältävistä klooneista.
Positiivisesti hybridisoituvista klooneista valmistettiin (käyttäen Maniatisissa, kappaleessa 1, s. 25 kuvattua Holmesin ja Quigleyn tai Birnboimin ja Dolyn mene-20 telmää) DNA-valmisteet pienessä mittakaavassa. DNA-mole- kyylit pilkottiin asianmukaisilla restriktioentsyymeillä, esim. Kpnlrllä ja EcoRI/Bglll:11a, ja ne tutkittiin aga-roosigeeleissä suoritetun elektroforeesin avulla. Vektoreiden DNA-molekyylit ja RF-DNA-molekyylit pilkottiin sa-·· ·. 25 moilla entsyymeillä, jotta niiden olisi voitu osoittaa syntyvän sen kokoisia fragmentteja, jollaisia oikeilla klooneilla odotetaan olevan.
Kustakin kloonista valmistettuja suurehkossa mittakaavassa tehtyjä plasmidi-DNA-valmisteita (Birnboim ja 30 Doly) käytettiin yksityiskohtaisempaan restriktioanalyy- siin esimerkiksi Clal-, Hindlll-, BamHI-, EcoRI/Bglll-, Kpnl- ja Seal-entsyymeillä. Näistä pilkkoutumistuotteista saatiin agaroosigeeleissä selville liitetyn fragmentin koko, viitteitä sen orientaatiosta sekä se, kuinka hyvin 55 106928 risiinin A-ketjuun oli saatu muodostumaan ainutkertaisena esiintyviä restriktioentsyymikohtia.
6.e) Ilmentämistutkimukset
Hybridisaatio- ja restriktioseulonnalla positiivi-5 siksi tunnistetuista klooneista tutkittiin risiini-A:n ilmentyminen kokosolulysaateille suoritetun SDS-PAGE-ana-lyysin avulla. Ilmentämiskokeiden vakio-olosuhteet olivat: 1) Ympätään yksi pesäke 10 ml:aan kasvatusliuosta, jossa on L-lihalientä + antibioottia(eja), ja kasvatetaan 10 sitä 37 °C:ssa yön yli varovasti ravistellen.
2) Otetaan 750 μΐ L-lihalientä ja tehdään soluista nappi mikrofugissa (1 min 6 500 kierrosta/min).
3) Suspendoidaan nappi uudelleen 300 ^l:aan M9-kas-vatusliuosta (Maniatis, liite A.3) + 0,02 % kaseiinihydro- 15 lysaattia + 0,2 % glukoosia + 50 μg'/ml tiamiinia ja ympätään se 10 ml:aan samaa liuosta.
4) Inkuboidaan 7 tunnin ajan tai yön yli 37°C:ssa varovasti ravistellen.
5) Inkuboinnin jälkeen mitataan OD540-arvo, tehdään 20 soluista nappi, ja suspendoidaan se uudelleen sellaiseen tilavuuteen Laemmlin näytepuskuriliuosta, joka vastaa tilavuutta, jolla saataisiin OD540-arvo 10 veteen suspendoitu-na (Maniatis, kappale 18, s. 53). Keitetään 15 minuutin ajan.
.25 6) Pipetoidaan 20 μΐ kokosolulysaattia SDS-poly- akryyliamidigeeliiin, suoritetaan elektroforeesi, värjätään Coomassie-sinellä, poistetaan väri ja suoritetaan silmämääräinen tarkastelu.
SDS-PAGE:lla tutkituista klooneista voitiin ainoas-30 taan yhdessä osoittaa lisävyöhyke, jonka ekvivalenttimole-kyylipaino oli suunnilleen ~29 kD (ekvivalenttinen glyko-syloimattoman, maturoituneen risiini-A:n molekyylipainon suhteen). Geelien skannaus osoitti kertymistason olevan välillä 5 - 10 % kaikesta solun sisältämästä proteiinista.
106928 Tässä kloonissa olevalle plasmidille annettiin nimi pICI1102.
pICI1102:n konstruointi on esitetty pääpiirteittäin kuviossa 5 . Ilmentämiskokeiden tulokset on esitetty ku-5 vioissa 6 ja 7.
6. f) Western-siirrot ja yhdistelmä-risiinin havaitseminen immunologisesti SDS-polyakryyliamidigeeleille suoritetun Coomassie-sinivärjäyksen avulla ensiksi havaitun yhdistelmä-risiinin 10 A-ketjun proteiinin autenttisuus varmistettiin suoritta malla Western-blottaus. Proteiinivyöhykkeet siirrettiin nitroselluloosasuodattimille ja havaitseminen suoritettiin käyttäen risiini-A:lie spesifistä vasta-ainetta ja sen jälkeen peroksidaasilla leimattuja antiglobuliineja.
15 15-%:isiä SDS-PAGE-geelejä ajettiin yön yli 8 mA:n virralla, jonka jälkeen niitä tasapainotettiin vähintään 30 minuutin ajan siirtopuskuriliuoksessa.
Tämän jälkeen geeleissä olevat proteiinivyöhykkeet siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Hybond-C, 20 Amersham) elektroforeesin avulla Bio-Rad -yhtiön Trans
Blot -laitteessa 70 V jännitteellä 3 tunnin aikana. Suodattimet voitiin varastoida kuivauksen jälkeen suljetuissa muovipusseissa -20 °C:ssa.
Risiini-A.l oli kaniineissa risiini-A:n synteettis-.25 tä peptidifragmenttia vastaan muodostettu polyklonaalinen vasta-aine. Alustavat tutkimukset osoittivat, että affiniteetti risiini-A:ta kohtaan oli hyvä, mutta että tapahtui merkittävää ristiinreagointia monien E. colin proteiinien kanssa. Tämän ristiinreaktion aiheuttaman voimakkaan taus-30 tareagoinnin poistamiseksi vasta-ainetta esi-inkuboitiin * E. coli -lysaatin kanssa.
Näinollen 10 ml yön yli viljeltyä E. colin kantaa DS410 sisältävää L-lihalientä sentrifugoitiin nopeudella 4 000 kierrosta/min 10 minuutin ajan siten, että soluista 35 saatiin muodostettua nappi. Nappi suspendoitiin uudelleen 57 106928 5 ml:aan bakteeripuskuriliuosta ja sille suoritettiin ult-raäänikäsittely 4 - 6 /xm:n aallonpituudella 6 x 10 sekunnin purkauksina 30 sekunnin jäähdytysvälein jäähauteella.
Tämän jälkeen 0,5 ml ultraäänikäsiteltyä liuosta 5 sekoitettiin 0,5 ml:aan risiini-A.1-antiseerumia ja seosta inkuboitiin huoneenlämmössä 90 minuutin ajan. Solujäte sentrifugoitiin pohjaan nopeudella 13 000 kierrosta/min 5 minuutin ajan ja supernatantti varastoitiin -20°C:ssa.
Western-siirroista saatujen nitroselluloosasuodat-10 timien "blokkaus" suoritettiin inkuboimalla niitä yön yli huoneenlämmössä 5-%:isessa BSA-PBS/Tween -seoksessa. {PBS Tween = 5 ml Tween 20:tä 1 litraa PBS:ää kohti).
Pestiin 3x3 minuuttia PBS/Tween-seoksessa.
Inkuboitiin 2 tunnin ajan (tai yön yli) huoneenläm-15 mössä yhdessä 0,5-%:iseen BSA-PBS/Tween -seokseen "bloka-tun" risiini-A.1-vasta-aineen suhteessa 1/4000 tehdyn laimennoksen kanssa.
Pestiin 3x3 minuuttia PBS/Tween-seoksessa.
Inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä yhdessä 20 0,5-%:iseen BSA-PBS/Tween-seokseen vuohen kaniinia vastaan valmistetun antiseerumin suhteessa 1/1 000 tehdyn laimennoksen kanssa.
Pestiin 3x3 minuuttia PBS/Tween-seoksessa.
Inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä yhdessä ,25 0,5-%:iseen BSA/PBS/Tween-seokseen kaniinin peroksidaasi- anti-peroksidaasi-antiseerumin suhteessa 1/5 000 tehdyn laimennoksen kanssa.
Pestiin 3x3 minuuttia PBS/Tween-seoksessa.
Kehitettiin upottamalla liuokseen, joka sisälsi 30 20 ml:aan metanolia valmistettua 4-kloorinaftolia (60 mg), joka oli täytetty 120 ml:n tilavuuteen PBS-liuoksella ja ‘ ' joka sisälsi 12 μΐ vetyperoksidia. Membraani poistettiin liuoksesta heti kun vyöhykkeet tulivat näkyviin, se kuivattiin ja valokuvattiin.
58 106928
Tyypillinen Western blot -analyysi on esitetty kuviossa 8 .
6. g) Yhdistelmä-risiini-A-proteiinin biologinen määritys 5 Tavoitteena oli saada aikaan kokeellinen järjestel mä r-risiini-A:n biologisen aktiivisuuden tutkimiseen so-luttomassa, in vitro -olosuhteissa suoritetussa proteiini-synteesimäärityksessä.
Kaniinin retikulosyyttilysaatteja valmistettiin 10 Alienin ja Schweetin menetelmän mukaisesti {J. Biol. Chem.
237 (1962) , 760 - 767) . Määrityksellä voidaan osoittaa proteiinisynteesin inhiboituminen soluttomassa systeemissä sen perusteella, että 14C-leimalla varustettua leusiinia ei liity syntetisoituvaan proteiiniin.
15 6.g.i) Määrityksen suoritusvaiheet:
Kantaliuos: 1-millimolaarinen aminohapposeos, josta leusiini on jätetty pois..
Liuos, joka leusiinia lukuunottamatta sisältää kaikki L-aminohapot 1-millimolaarisessa pitoisuudessa (pH 20 on säädetty arvoon 7,4 NaOH:lla ja liuosta pidetään säilytettynä -70 °C:ssa).
Liuos A: 40 mM magnesiumasetaattia, 2 M ammonium- asetaattia, 0,2 M Tris, (pH 7,4 HClrlla, säilytys 4 °C:ssa) ·· . 25 Liuos B: ATP (Sigma A5394) 246 mg/ml, GTP (Sigma G8752) 24,4 mg/ml.
Määritysseos: 1 ml aminohapposeosta, 1 ml liuosta A, 0,1 ml liuosta B, 103 mg kreatiinifosfaattia, 1 mg kreatiinikinaasia, 510 μΐ H20, 600 μΐ (60 μΟί) L-14C-leusii-30 nia (New England Nuclear, NEC-279E).
Reaktioseos: Tutkittavaa näytettä 25 μΐ, määritys-seosta 12,5 μΐ, kaniinin retikulosyyttilysaattia 25 μΐ.
Nollanäyteliuos oli PBS:ään valmistettu BSA, jonka konsentraatio oli 2 mg/ml.
106928 59
Kaikki määritykset tehtiin kahtena rinnakkaismääri-tyksenä.
12,5 μΐ määritysseosta pipetoitiin steriileihin lasiputkiin.
5 25 μΐ PBS:ään valmistettua BSArta lisättiin kuhun kin neljään ensimmäiseen putkeen nollanäytteeksi.
25 μΐ tutkittavaa näytettä lisättiin jäljelläole-viin putkiin.
1 ml 0,1 M KOH lisättiin kahteen ensimmäiseen put-10 keen (nollanäytteen tausta).
Koeputket tasapainotettiin 28 °C:n lämpötilaan vesihauteessa .
25 μΐ kaniinin retikulosyyttilysaattia (annettiin sulaa nestetypen lämpötilasta) lisättiin kuhunkin koeput-15 keen 20 sekunnin välein. Kun ensimmäistä putkea oli inku-boitu 12 minuutin ajan, lisättiin kuhunkin koeputkeen jälleen 20 sekunnin välein 1 ml 0,1 M KOH:a siten, että kaikki putkien inkubointi kesti 12 minuuttia. Kuhunkin koeputkeen lisättiin kaksi pisaraa 20-%:ista vetyperoksidia 20 ja sen jälkeen 1 ml 20-%:ista TCA:ta.
Koeputkia sekoitettiin ja niiden annettiin seistä vähintään yhden tunnin ajan tai yön yli 4 °C:ssa. Saostumat suodatettiin 2,5 cm:n GFC-levyille, pestiin 3 x 4 ml :11a 5-%:ista TCA:ta, siirrettiin tuikepulloihin ja , 25 niihin lisättiin 10 ml tuikeainetta (Ready-Solv. MP, Beckman). Yhden tunnin kuluttua pulloja ravistettiin ja laskenta suoritettiin.
6.g.ii) E. coli -lysaatteihin sovellettavan menetelmän luominen 30 10 ml:n L-lihaliemiviljelmiä kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa. 400 μ1:η eristä tehtiin solunappi nopeudella 13 000 kierrosta/min 30 sekunnin ajan ja suurin osa super-natantista dekantoitiin.
Solunapeille tehtiin kaksi kertaa käsittely, jossa 35 ne ensin pakastettiin kuivajää/EtOH-seoksessa ja tämän 106928 60 jälkeen sulatettiin 37 °C:ssa. Lisättiin 12 μΐ 50 mM:seen Tris-HCl:ään, jonka pH oli 8,0, valmistettua 25-%:sta sakkaroosia, jonka jälkeen lisättiin 4 μΐ lysotsyymiä, jonka pitoisuus oli 10 mg/ml.
5 Sen jälkeen kun liuosta oli inkuboitu 15 minuutin ajan jäissä, lisättiin 8 μΐ 0,25 M EDTA:ta ja inkubointia jatkettiin 15 minuutin ajan. Hajoaminen saatiin aikaan osmoottisesti laimentamalla näytteet 400 ^l:ksi vedellä. Tässä menetelmässä saatava elinkykyisten solujen lukumäärä 10 oli 80 - 100/ml.
Kun tästä lysaatista otettu 25 μ1:η erä lisättiin määritysreaktioseokseen, oli syntetisoituneeseen proteiiniin liittyneen 14C-leusiinin taso ~10 % nollanäytteestä, joka ei sisältänyt lysaattia. Tämä inhiboitumistaso oli 15 sama kuin se, mikä on aikaansaatavissa käyttäen 8 ng/ml risiini-A:ta. Tämän jälkeen E. coli -lysaatista valmistettiin laimennoksia ja määritys toistettiin. Tulos osoitti selvästi, että lysaatin vaikutuksen pienentämiseksi nolla-näytteen tasolle tarvittiin vähintään 16-kertainen laimen-20 nus.
Jotta voitaisiin olla mahdollisimman varmoja siitä, etteivät E. colin hajoaminen ja E. coli -lysaatit vähennä risiini-A:n toksisuutta, suoritettiin kaksi kontrollimää-ritystä. Näistä ensimmäisessä lisättiin 16 x laimennettuun ;25 E. coli -solunappiin kasvin risiini-A:ta siten, että solujen hajoamisen jälkeen määritysseoksen lopulliseksi kon-sentraatioksi tuli 8 ng/ml. Kumpikaan kontrollimääritys ei osoittanut lysaattien tai hajottamismenetelmän vaikuttavan haitallisesti risiini-A:n inhiboivaan vaikutukseen.
30 Näitä menetelmiä käytettiin varmistamaan biologi- * sesti aktiivisen yhdistelmä-risiini-A:n syntetisoituminen pICI1102:sta ja jäljempänä kuvatuista klooneista.
6.h) DNA-jaksojen analysointi pICI1102:n analysointiin käytettiin plasmidi-DNA:n 35 sekvenssointia. Valittu menetelmä oli muunnelma Zagurskyn, ei 106928 et ai. kuvaamasta menetelmästä (Gene Analysis Techniques osa 2, nro 5) ja siihen kuuluu kaksinauhaisen plasmidi-DNA:n alkalinen denaturointi ennen alukkeen kiinnittämistä vastinosaansa sekä sekvenssointi standardimenetelmällä, 5 kuten koepakkauksen muodossa useilta valmistajilta saatavissa olevalla menetelmällä, esim. Sequenasella (United States Bioscience). Promoottorin ja risiini-A:n kummankin nauhan sekvenssointi oli mahdollista, kun oligonukleotidiä käytettiin toimivien alukkeiden muodostamiseen β-lak- 10 tamaasin 31-päässä ja useiden A-ketjun sisäisten alukkeiden kohdalla.
Alustavista sekvenssointituloksista ilmeni odottamatta, että promoottorin ja risiini-A:ta koodaavan jakson välissä oli ylimääräinen Kpnl-fragmentti, toisin sanoen 15 (jaksotunniste nro 20):
Kpnl
5' AAAAAGGGTATCGACATGGTACCCGGGGATCCACCTCAGGGTGG
20
Kpnl TCTTT CACATTAGAGGATAACAACATGGTAC C CAAACAATAC 3’ 25 Ylimääräinen Kpnl-fragmentti oli tullut M13K19RA:sta ja se sisältää pUC8RA:sta kloonatut restrik-tioentsyymikohdat sekä osan risiinin johtojaksosta. Risiinin A-ketjun 5'-pään alue sisältää mutageneesin aikana indusoituneet emäsmuutokset.
30 Tämän jakson tarkastelusta käy ilmi, että ensimmäi- . nen translaation aloituskodoni (ATG) on risiini-A:ta koo daavan alueen lukukehyksen ulkopuolella. Risiini-A:n aloi-tuskodonia ennen on myös lukukehyksessä oleva lopetus-kodoni (TAG) ja mahdollinen Shine-Dalgarnon jakso (AGGA), 62 106928 joka saattaisi pystyä aloittamaan translaation uudelleen toisesta ATG-kodonista.
Myöhemmät tutkimukset paljastivat, että tällä ylimääräisellä DNA-fragmentilla oli yllättävä ja edullinen 5 vaikutus risiinin A-ketjun kertymistasoon E. coli -soluihin verrattuna sellaisiin klooneihin, joista tämä jakso oli poistettu.
Täydellinen pICI1102:n sisältämä risiini-A-geenin DNA-jakso on esitetty kuvassa 9 (jaksotunniste nro 18) .
10 7. Seuraavien risiini-A:ta ilmentävien kloonien muodostaminen 7.a) Risiini-A-kloonin pICI1102 mutatoiminen jatkokloonauksen mahdollistamiseksi
Olisi tullut vaikeaksi jatkokloonata nämä kaksi 15 Kpnl- fragmenttia onnekkaan sattuman johdosta muodostunees ta pICI1120:stä siten, että niiden orientaatio olisi pysynyt oikeana, risiini-A:n ilmentämistä varten. Tämän johdosta teimme suunnitelman sisäisen Kpnl-tunnistuskohdan muuttamiseksi yhden emäksen korvauksen avulla (A:n muuttaminen 20 T:ksi). Tämä estäisi Kpnl:llä tapahtuvan pilkkoutumisen tästä kohdasta ja mahdollistaisi yhden Kpnl-fragmentin j atkokloonauksen useisiin pICI-ilmentämisvektoreihin . Korvaamalla Kpnl-tunnistuskohdan adeniini (GGTACC) tymiinillä (eli GGTTCC), pysyy risiini-A:n ensimmäinen ryhmä muuttu-. 25 mattomana (GTA/GTT = Vai).
Toisin sanoen jakso:
Kpnl 53 ep:n fragmentti Kpnl Risiini-A:n jakso Kpnl
I I I
30 ------------------------------
GGTACC ATGGTACC | GGTACC
TGA
muutetaan jaksoksi: 63 106928 ΚρηΙ 53 ep:n fragmentti Kpnl Risiini-A:n jakso Kpnl
I I I
5 GGTACC ATGGTTCC | GGTACC
| TGA
Kpnl ei tunnista tätä Tämän muutoksen aikaansaamiseksi syntetisoidun oli-10 gonukleotidin jakso on (jaksotunniste nro 19): 5' ATAACAACATGGTTCCCAAACAATAC 3' jossa alleviivattu emäs esittää mutaation kautta tullutta 15 muutosta.
Vertailevaa ilmentämistutkimusta varten laadimme suunnitelman mutatoituneen risiini-A-fragmentin kloonaamiseksi useisiin trp-ilmentämisvektoreihin. Kloonaus pICI0020 .-een tarjoaa lähtökohdan plasmidiin pICI 1102 teh-20 tävään vertaamiseen yhden emäksen korvaamisesta mahdollisten ilmentymisen tasolla esiintyvien vaikutusten määrittämiseksi .
7.b) Mutageneesi
Mutageneesissä oli templaattina MRA16, joka on pICI 25 1102:ssa esiintyvät kaksi Kpnl-fragmenttia sisältävä M13- klooni. Mutageneesin jälkeen halutut mutaatiot sisältävät eristetyt kloonit tunnistettiin satunnaisotannalla ja määrittämällä DNA-jakso alueelta, johon mutageeninen oligo-nukleotidi sitoutuu spesifisesti.
30 Yhdelle mutatoituneelle templaatille annettiin ni mitys MRA22. Tämä tutkittiin edelleen määrittämällä koko risiini-A:ta koodaavan jakson DNA-jakso siten, että saa-; tiin varmistuttua siitä, ettei ei-spesifisiä mutaatioita esiintynyt.
35 7.c) Jatkokloonaus
Mutatoituneet yksinauhaiset DNA:t transformoitiin kompetentteihin E. coli TG1 -soluihin yksittäisten plakkien tuottamiseksi. Tämän jälkeen poimittiin erillisiä . ... plakkeja ja replikatiivisen muodon (RF, kaksinauhainen) 106928 64 DNA puhdistettiin muodostamalla niistä vyöhyke keesiumklo-ridi/etidiumbromidikelluntatiheysgradienteissa. Puhdistettu RF-DNA pilkottiin täydellisesti Kpnl:llä. Kloonaus suoritettiin liittämällä pilkottu RF-DNA satunnaisesti 5 ("shotgun") ligaasilla tarkoituksenmukaiseen Kpnl:llä pilkottuun ja fosfataasilla käsiteltyyn ilmentämisvektoriin tai ligatoimalla risiini-A-fragmentti spesifisesti agaroo-sigeelistä puhdistamisen jälkeen. Ligatoitu DNA transformoitiin E. coli TGl:een tai HB101:een.
10 Risiini-A:ta sisältävät kloonit tunnistettiin hybridisaatioseulonnan avulla käyttäen 32P-leimalla varustettua risiini-A -koetinta, joka oli saatu aikaan muodostamalla toisesta risiini-A:n sisältävästä kloonista (pICI 1121) eristettyyn Kpnl-fragmenttiin aluke satunnaisella 15 heksanukleotidillä. Pesäkkeet, joissa esiintyi positiivista hybridisaatiota, seulottiin edelleen plasmidi-DNA:n restriktioanalyysin avulla käyttäen yksinkertaista pilkkomista Kpnlcllä ja kaksinkertaista pilkkomista EcoRI/Bgllll:a. Kpnl tunnistaa liittyneen fragmentin koon 20 ja EcoRI/Bglll määrittää fragmentin orientaation.
Ne kloonit, joiden varmistettiin sisältävän risii-ni-A-fragmentin oikeassa orientaatiossa ilmentymistä varten, analysoitiin SDS-PAGE:lla ja sen jälkeen suorittamalla rinnakkaisista geeleistä Coomassie-värjäys ja Western-. 25 blottaus. Risiini-A:n kerääntymisen taso näihin klooneihin vastasi pICI1102:sta havaittua tasoa.
Valittiin yksi eristetty klooni ja sille annettiin nimitys pICI1131.
7.d) Vaihtoehtoisen transkription lopetusjakson 30 käyttäminen . Transkription lopetusjakso saa aikaan sellaisen ' ‘ sekundaarisen rakenteen mRNA:n 3'-päähän, joka liittyy RNA-polymeraasin toiminnan pysäyttämiseen. Tämän sekundaarisen rakenteen stabiilisuus voi parantaa proteiinin ke-3¾ rääntymistä suojaamalla mRNA:ta 31-päähän kohdistuvalta 106928 6 3 eksonukleaasin toiminnalta. T4-transkriptioterminaatiojakson sekundaarirakennetta pidetään vahvempana kuin kaikissa aiemmissa risiini-A -konstruktioissa ollutta trp-attenu-aattorij aksoa.
5 Näissä kokeissa pICI 1131:sta peräisin oleva trp- promoottori ja risiini-A -fragmentti leikattiin pois pilkkomalla EcoRI- ja Sali-entsyymeillä. Viimeksimainittu entsyymi pilkkoo risiini-A:ta koodaavan jakson ja trpA-transkription lopetusjakson välistä. Tuloksena oleva fragmentti 10 leikattiin irti agaroosigeelistä (2 % NuSieve GTG Agarose, FMC Bioproducts) ja se puhdistettiin uuttamalla fenolilla ja kloroformilla ja saostamalla sen jälkeen etanolilla. Puhdistettu fragmentti liitettiin ligaasilla EcoRI:llä ja Sall:llä pilkottuun pICI 1079:ään. Tämä viimeksimainittu 15 plasmidi sisältää T4-lopetusjakson ainutkertaisten Sali- ja Sphl-kohtien välissä (katso 5.c).
Ligatoitu DNA transformoitiin kompetentteihin E. coli HB101 (BRL) -soluihin ja risiini-A:n DNA:n esiintyminen havaittiin hybridisaatioseulonnalla, kuten aiemmissa-20 kin kokeissa oli asian laita. Plasmidi-DNA:n valmistusta varten valittiin positiivisesti hybridisoituvia klooneja, ja sen jälkeen sopivan kokoisen fragmentin läsnäolon osoittamiseksi suoritettiin restriktioanalyysi käyttäen samanaikaisesti entsyymejä EcoRI ja Sali.
25 Tunnistettiin yksi oikean konstruktion omaava eri stetty klooni ja sille annettiin nimitys pICI1185.
7.e) Vaihtoehtoisen plasmiditaustan käyttäminen Plasmidia pICI1185 käytettiin vielä yhden konstruktion tuottamiseen jatkokloonaamalla ilmentämiskasetti 30 plasmidiin pICI 0042. pICI1185:stä valmistettiin plasmidi-.. DNA ja se pilkottiin samanaikaisesti entsyymeillä EcoRI ja
Sphl trp-promoottori/RBSl/risiini-A (MRA22) fragmentti/T4-lopetusjakso-konstruktion sisältävän ilmentämiskasetin irrottamiseksi. Tämä fragmentti eristettiin kohdassa 4.d • « 66 106928 pääpiirteittäin esitetyn menetelmän avulla ja liitettiin ligaasilla EcoRIrllä ja Sphl:llä pilkottuun pICI 0042 teen.
Ligatoitu DNA transformoitiin E. coli HBlOl-solui-hin ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa yön yli. Transformoitu-5 neet HBlOl-solut maljattiin maljalle, joka sisälsi L-aga-ria + tetrasykliiniä ja pesäkkeet seulottiin suorittamalla hybridisointi 32P-leimalla varustetulla risiini-A DNA-koet-timella.
Positiivisiksi tunnistetut pesäkkeet varmistettiin 10 kummassakin tapauksessa suorittamalla plasmidi-DNA:sta restriktioanalyysi pilkkomalla EcoRI/Sphl:llä ja EcoRI/Bglll:11a. Tunnistettiin kolme eristettyä kloonia, eli pICI1187.1-3.
Kuvassa 10 on esitetty pääpiirteittäin pICI1185:n 15 ja pICI187:n konstruointi.
7.f) Kloonien selektio
Eristetyt plasmidit transformoitiin E. coli 71.18 -soluihin (Gronenborn, B., Mol. Gen. Genet. 148 (1976), 243 - 250) ja yksittäisiä pesäkkeitä poimittiin kloonien 20 selektiotutkimuksiin. Tuloksena oleville kokosolulysaa- teille suoritettiin elektroforeesi rinnakkaisilla SDS-PAGE-geeleillä, joista toinen värjättiin Coomassie-sinellä ja toisesta suoritettiin Western blot -analyysi. Värjätystä geelistä saatavat risiini-A:n ilmentymistä koskevat o 25 tulokset olivat minimaalisia E. coli 71.18:sta peräisin olevasta vyöhykkeen kanssa rinnakkain liikkuvasta proteiinista johtuen. Western-blottaus osoitti selvästi risii-ni-A:n ilmentymisen positiivisiin ja negatiivisiin kont-rollinäytteisiin verrattuna. Yksi eristetty klooni annet-30 tiin fermentaatiotutkimusryhmälle menetelmän toteuttami seksi suuremmassa mittakaavassa.
r-risiini-A:n fermentaatio (a) Plasmidi pICI 1187 transformoitiin E. coli -kantaan DS410 (josta tässä hakemuksessa käytetään myös 35 nimitystä MSD68) ja tuloksena oleva yhdistelmä-(MSD1051) 67 106928 puhdistettiin ja sitä säilytettiin glyseroliin valmistettuina kantaviljelminä -80 °C:ssa.
Kantaviljelmästä otettiin erä viljelmää ja se siveltiin L-tetrasykliiniä sisältäville agarmaljoille yksit-5 täisten pesäkkeiden erottamiseksi yön yli 37 °C:ssa tapahtuneen kasvatuksen jälkeen. Maljalta otettiin yksi MSD 1051 -pesäke ja se suspendoitiin uudelleen 10 mlraan L-tetrasykliiniä sisältävää lihalientä ja tästä ympättiin välittömästi 100 μΐ jokaiseen 10:stä 250 ml:n erlenmeyer-10 pullosta, jotka sisälsivät 75 ml L-tetrasykliiniä sisältävää lihalientä. Sen jälkeen kun kasvatus oli jatkunut 16 tunnin ajan 37 °C:ssa edestakaisin toimivalla ravisti-mella, pullojen sisällöt yhdistettiin ja ne ympättiin fer-mentoriin, joka sisälsi 20 1 modifioitua LCM50-kasvatus-15 liuosta, jonka koostumus oli seuraava:
Tehty tislattuun veteen gZi KH2P04 3,0 2 0 Na2HP04 6,0
NaCl 0,5
Kaseiinihydrolysaatti (Oxoid L41) 2,0 (NH4)2S04 10,00
Hiivauute (Difco) 20,00 : 25 Glyseroli 35,00 «
MgS04 . 7 H20 0,5 • CaCl2 . 2 H20 0,03
Tiamiini 0,008
FeS04/sitruunahappo 0,04/0,02 30 Hivenaineliuos (TES) 0,5 ml e"1 • Tämän jälkeen fermentoinnit suoritettiin 37 °C:ssa ja pH-arvossa 6,7, pH:n säädön tapahtuessa automaattisesti suoritetulla 6 M natriumhydroksidiliuoksen lisäyksellä. 35 Liuenneen hapen paineen (dOT) asetuspiste oli 50-%:inen 106928 68 kylläisyys ilmaan verrattuna ja sitä säädeltiin säätämällä automaattisesti fermentorin sekoittimen nopeutta. Fermen-toriin virtaavan ilman määrää, joka aluksi oli 20 1/min, mikä vastaa 1 tilavuutta ilmaa nesteen tilavuutta kohti 5 minuutissa, lisättiin virtausnopeuteen 45 1/min kun fermentorin sekoittimen nopeus lähestyi 80 - 90 %:iin maksimistaan .
Koko fermentaation ajan otettiin näytteitä optisen tiheyden (ODSSo) , solujen kuivapainon ja soluhin kertyneen 10 risiini A:n määrän määrittämiseksi. Risiini-A:n kertyminen mitattiin näytebakteerien kokosolulysaateista tehdyistä Coomassie-sinellä värjätyistä SDS-PAGE-geeleistä tällä alalla tunnetulla tavalla.
4,5 tuntia ymppäyksen jälkeen fermentoreihin pum-15 pattiin hiivauute (Difco) -liuosta (225 g/1) nopeudella 1,7 g/l/h.
12 tunnin kuluttua,. kun OD550-arvo saavutti suunnilleen arvon 50 ja ennen kuin hapenpuute alkoi rajoittaa fermentaatiota, bakteerit kerättiin Sorval RC3B -sentri-20 fugissa (7000 G, 30 min, 4 °C) ja kertynyt proteiini kerättiin bakteereista talteen.
(b) Plasmidi pICI 1187 transformoitiin E. coli -kantaan DS410 (josta tässä hakemuksessa käytetään myös nimitystä MSD68) ja tuloksena oleva yhdistelmä-(MSD 1051) 25 puhdistettiin ja sitä säilytettiin glyseroliin valmistettuna kantaviljelmänä -80 °C:ssa.
Kantaviljelmästä otettiin erä, joka ympättiin välittömästi 2 litran erlenmeyerpulloon, joka sisälsi 600 ml L-tetrasykliinilihalientä. Pullon sisältö ympättiin edes-30 takaisin liikkuvassa ravistelijassa 37 °C:ssa 16 tuntia . kestäneen kasvatuksen jälkeen fermentoriin, joka sisälsi kasvatusliuosta, jonka koostumus oli seuraava: 106928 69
Komponentti Tehty tislattuun veteen (g/l) KH2P04 3,0
Na2HP04 6,0
NaCl 0,5 5 Kaseiinihydrolysaatti (Oxoid L41) 2,0 (NH4)2S04 10,0
Hiivauute (Difco) 20,0
Glyseroli 35,0
MgS04 . 7 H20 0,5 10 CaCl2 . 2 H20 0,03
Tiamiini 0,008
FeS04/sitruunahappo 0,04/0,02
Hivenaineliuos (TES) (0,5 ml l'1)
Tetrasykliini (10 mg l'1) 15
Fermentointi suoritettiin 37 °C:ssa. pH-arvoa säädeltiin lisäämällä automaattisesti 2 M rikkihappoa ja 6 M natriumhydroksidiliuosta siten, että pH-arvo pysyi arvossa 6,7 10 tuntia ymppäyksen jälkeen ja sen jälkeen arvossa 20 6,0.
Liuenneen hapen paineen (dOT) asetuspiste oli 50 %:inen kylläisyys ilmaan verrattuna ja sitä säädeltiin aluksi säätämällä automaattisesti fermentorin sekoittimen nopeutta. Fermentoriin virtaavan ilman määrä oli aluksi ; 25 20 1/min, mikä vastaa 1 tilavuutta ilmaa nesteen tilavuut- ta kohti minuutissa, ja se kasvatettiin virtausnopeuteen 45 1/min, kun fermentorin sekoittimen nopeus saavutti maksimin (1 000 kierrosta minuutissa). Fermentoriin tulevan ilman määrä vähennettiin käsin takaisin virtausnopeuteen 30 20 1/minuutti kun fermentaation loppuvaiheessa sekoittimen ·* nopeus oli automaattisesti laskenut suunnilleen 500 kier rokseen minuutissa. Fermentointi kesti 23 tuntia ja sinä aikana otettiin näytteitä optisen tiheyden (QD550) , solujen kuivapainon ja soluhin kertyneen ja jaottuneen risiini-A:n 35 määrän määrittämiseksi. Risiini-A:n kertyminen mitattiin 106928 70 näytebakteerien kokosolulysaateista tehdyistä Coomassie-sinellä värjätyistä SDS-PAGE-geeleistä tällä alalla tunnetulla tavalla. Risiini-A:n jakaantuminen soluissa syto-plasmiseen (liukoiseen) fraktioon ja inkluusio-osa (liuke-5 nematon) -fraktioon määritettiin suorittamalla näytebak-teereille ultraäänihajotus tällä alalla tunnetulla tavalla. Fermentoriin pumpattiin hiivauuteliuosta (225 gl'1) 4,5 tuntia ymppäyksen jälkeen nopeudella 1,7 gl^h'1.
Kun fermentaation hiilen lähde loppui (johtaen dOT-10 arvon nopeaan nousuun arvosta 50-%:inen kylläisyys ilmaan verrattuna) , pumpattiin fermentoriin glyserolia (714 gl'1) ja ammoniumsulfaattia (143 gl'1) sisältävää ravintoliuosta tarpeeksi suurella nopeudella bakteerien hiilen maksimi-tarpeen tyydyttämiseksi. Tämän jälkeen hiilen lähteen ja 15 ammoniumsulfaatin syöttönopeuden annettiin olla muuttumat tomana fermentaation loppuajan.
23 tunnin kuluttua fermentaation saannoksi saatiin noin 1 500 mg liukoista risiini-A:ta litrassa fermentaa-tiolihalientä.
20 Huomautuksia: 1. E. coli DS410 (josta tässä hakemuksessa käyte tään myös nimitystä MSD68) on tunnettu (Dougan ja Sherrat, Molecular and General Genetics 151 (1977) s. 151 - 160).
Tämä kanta on saatavilla rajoituksetta yleiseen käyttöön ; - 25 ja lisäksi tämän patentin hakijat tallettivat sen 7.7.1985
Budapestin sopimuksen mukaisesti talletuslaitokseen National Collections of Industrial & Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, Skotlanti, hakunumerolla 12100.
2. Hivenaineliuos (TES) 30 TES-liuoksen koostumus on seuraava: • · « mg/10 ml (deioisoitua vettä)
AlClj . 6 H20 2,0
CoCl2 . 6 H20 0,8 35 KCr (S04) 2 . 12 H20 0,2 71 106928
CuCl2 . 2 H20 0,2 h3bo3 0,1 KI 2,0
MnS04 . H20 2,0 5 NiS04 . 6 H20 0,09
Na2Mo04 . 2 H20 0,4
ZnS04 . 7 H20 0,4 r-risiini-A:n puhdistaminen E. coli -soluista 10 Optimaalisissa fermentaatio-olosuhteissa r-risii- ni-A kertyy liukoiseksi soluliman proteiiniksi. Tämä proteiini kerättiin talteen hajottamalla solut (homogenointi) puskuriliuoksessa, joka on suotuisa r-risiini-A:n pysyvyydelle. Tämä yksikkötoimenpide suoritettiin eläville so-15 luille solujen keräämisen yhteydessä, jotta saatiin varmistuttua tuotteen pysvyydestä liuoksessa. r-risiini-A kerättiin .talteen homogenoidusta liuoksesta poistamalla siitä sentrifugoimalla kiinteät aineet (solujäte). Tämän menetelmän tehostamiseksi jäte saostettiin höytäleinä sel-20 laisen aineen (polyteeni-imiini) kanssa, joka saostaa myös suurimman osan uutteessa olevista nukleiinihapoista. Sentrifugisupernatantille suoritettiin steriilisuodatus, väkevöitiin poikittaisvirtaussuodatuksen avulla ja proteiini saostettiin ammoniumsulfaatilla. Ammoniumsulfaatilla • 25 saatua saostumaa säilytettiin pakastettuna -70 °C:ssa.
r-Risiini-A:n isoelektrisen pisteen arvo on 7,3, joka on selvästi korkeampi kuin monien muiden E. colin proteiinien isoelektrinen piste. Tämän ansiosta tuote voidaan puhdistaa kätevästi ioninvaihtokromatografiän avulla. 30 Kaikki talteenotto- ja kromatografiavaiheet suoritettiin olosuhteissa, jotka edistävät r-risiini-A:n pysyvyyttä: lämpötila < 15 °C, seoksessa käytetään ditiotreitolia pitämään vapaa tioli pelkistyneenä ja EDTA:ta vähentämään ilman aiheuttamaa hapettumista ja proteolyysiä.
106928 72 r-risxini-A:n talteenotto
Solut kerättiin fermentaatiolihaliemestä käyttäen ajoittaisella poistohuuhtelumahdollisuudella varustettua 5 jatkuvatoimista levypakkaseparaattoria. Lihaliemi (50 l:n erä 2 x 25 l:n fermentaatiosta) siirrettiin ensin fermen-toreista 50 1 pyörivään tankkiin ja kuljetettiin suljettuun systeemiin, joka koostui useista separaattoriin ja korkeapainehomogenisaattoriin liitetyistä säiliötankeista. 10 Pyörivä tankki oli kytketty tähän systeemiin ja lihalientä pumpattiin sentrifugiseparaattoriin virtausnopeudella 40 1/h. Poistohuuhtelutahti säädettiin siten, että sentrifugista saatava supernatantti oli supernatantin poistokanavassa olevan okulaarin kautta silmämääräisesti 15 tarkasteltuna kirkasta. Separaattorista tuleva poistettava kiinteä aine (solut) kerättiin sopivaan astiaan ja ne sus-pendoitiin.uudelleen 40 l:aan kiinteiden aineiden vastaan-ottoastiassa olevaa puskuriliuosta A (50 mM natriumdivety-ortofosfaattia, 25 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa, 20 5 mM bentsamidiinia, 2 mM ditiotreitolia, pH 6,3 5 N nat- riumhydroksidia käyttäen), joka oli esijäähdytetty 8 °C:n lämpötilaan. Tämän jälkeen suspendoidut solut siirrettiin takaisin pyörivään tankkiin 60 MPa:n paineessa toimimaan säädetyn homogenisaattorin kautta. Tuloksena oleva homo-" 25 genoitu liuos (60 1) jäähdytettiin < 20 °C:n lämpötilaan ja polyteeni-imiinin pitoisuus säädettiin 0,5 %:iin lisäämällä 2,5 1 10-tilavuus-%:sta liuosta. Suspension annettiin höytälöityä 10 minuutin ajan ennen kuin se siirrettiin säilytystankkiin sentrifugiseparaattorin kautta. Tä-30 män jälkeen kirkas supernatantti kerättiin ja steriloitiin puhdistamalla syvyyssuodattimen ja positiivisen varauksen omaavan 0,2 μτη·.η membraanisuodattimen läpi.
Axnmoniuxnsul£aa t ti s ao s tus
Steriili selkeytetty supernatantti väkevöitiin 35 12 l:n tilavuuteen käyttäen spiraalikasetilla varustettua poikittaisvirtaussuodatuslaitetta ja liuoksen kylläisyys säädettiin 40-%:iseksi lisäämällä 2,9 kg kiinteitä 106928 73 ammoniumsulfaattikiteitä. Liuoksen annettiin höytälöityä varovasti sekoittaen yön yli 15 °C:ssa, jonka jälkeen se sentrifugoitiin. Pois huuhdeltu liete koottiin talteen ja sitä säilytettiin -70 °C:ssa siihen asti kunnes sitä tar-5 vittiin jatkokäsittelyyn.
Uudelleensolubilisointi ja suolanpoisto
Ammoniumsulfaatilla aikaansaatu saostuma sulatettiin 14 l:ssa puskuriliuosta B (50 mM natriumdivetyorto-fosfaattia, 25 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa, 2 mM 10 ditiotreitolia, pH 6,3 5 N natriumhydroksidia käyttäen).
Suspensio selkeytettiin 30 minuutin kuluttua sentrifugoi-malla ja suola poistettiin diafiltraatiolla puskuriliuosta B, jonka määrä oli 70 1, vastaan, jonka jälkeen tarkistettiin, että konduktiivisuuslukema oli laskenut alle 15 3 mS/cm. Liuos, josta suola oli poistettu, selkeytettiin edelleen sentrifugoimalla ja se käsiteltiin välittömästi.
Anioninvaihtokromatografia
Suolanpoistosta saatu liuos lisättiin hitaasti yhdeksi tuotantoeräksi kerrallaan täytettävään kromatogra-20 fiatankkiin, joka sisälsi 2 kg 60 1:11a puskuriliuosta B tasapainotettua DEAE-selluloosaa. 6,5 h:n sekoituksen jälkeen sitoutumaton r-risiini-A-liuos pumpattiin tankin pohjalta virtausnopeudella 80 ml/min läpimitaltaan 11,3 cm x 10 cm pylvääseen, joka sisälsi pakattua ja tasapainotettua .·· 25 DEAE-selluloosaa. Suurin osa r-risiini-A:sta ei sitoutunut 9 ja se kerättiin ruostumattomasta teräksestä valmistettuun astiaan.
Kationinvaihtokromatografia r-risiini-A -liuoksen pH säädettiin 1 M orto-30 fosforihapolla arvoon 5,5 ja se lisättiin läpimitaltaan • 10 cm x 10 cm pylvääseen, joka sisälsi 10 1:11a puskuri-
liuosta C (25 mM natriumdivetyortofosfaattia, 5 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa, 2 mM ditiotreitolia, pH
5,5 5 N natriumhydroksidia käyttäen) tasapainotettua kar-35 boksimetyyliagaroosia. r-risiini-A sitoutui tähän pylvää- 106928 74
seen ja sen jälkeen kun pylvästä oli pesty 10 1:11a puskuriliuosta C, se eluoitiin puskuriliuoksella D (25 mM nat-riumdivetyortofosfaattia, 5 mM etyleenidiamiinitetraetik-kahappoa, 2 mM ditiotreitolia, 100 mM natriumkloridia, pH 5 5,5 5 N natriumhydroksidia käyttäen) Puhdas r-risiini-A
eluoitui yhtenä piikkinä, joka kerättiin ja säilytettiin -70 °C:n lämpötilaan pakastettuna steriilinä liuoksena kunnes sitä tarvittiin jatkokäsittelyyn. r-risiini-A on stabiili näissä olosuhteissa jopa vuoden ajan.
10 Käytettiin seuraavia laitteistoja:
Anioninvaihtaja: DE-52, DEAE-selluloosa (Whatman Bio chemical s)
Kationinvaihtaja: CM/Sepharose (Pharmacia)
Sentrifugi: Westphalia CSA-1 -levypakkasentrifugi (West-15 phalia)
Homogenisaattori: APV-Schroeder Lab 60/60 -homogenisaat- tori (APV)
Suodattimet: AMI 0057P syvyyssuodatin, ABI NFZP-Posidyne-membraanisuodatin (Pali) 20 Kertatankki: Pharmacian 70 l:n kertakromatografiatankki (Pharmacia) DE-pylväs: Bioprocess 113 (Pharmacia) DM-pylväs: K100/50 (Pharmacia) C242-vasta-aineen ja immunotoksiinxn biologiset 25 ominaisuudet C242:n (C242.II) immunohistokemiallinen määritys kolorektaalisessa syövässä ja normaaleissa kudoksissa
Hankittiin näytteitä primaarisesta kolorektaalises-ta karsinoomasta ja useista erilaisista normaaleista ku-30 doksista, jotka olivat peräisin kirurgisessa uusintaleik kauksessa olevista potilaista. Kudoksia pidettiin jäissä ja ne pakastettiin 1 tunnin sisällä poistosta nestetypellä esijäähdytettyyn isopentaaniin. Kudokset säilytettiin -70 °C:ssa siihen asti kunnes niistä tehtiin leikkeitä. 35 Pakastetut koepalat leikattiin 5 μπΐ:η leikkeiksi ja ne 75 106928 kiinnitettiin 50-%:isessa asetonissa 30 sekunnin ajan +4 °C:ssa. Leikkeet kuivattiin ilmassa ja ne huuhdeltiin PBS-liuoksessa 10 minuutin ajan. Tämän jälkeen kaikkia leikkeitä inkuboitiin PBS-liuoksessa olevassa 0,3-%:isessa 5 vetyperoksidissa 5 minuutin ajan endogeenisen peroksidaa-sin toiminnan estämiseksi, jonka jälkeen ne huuhdeltiin kaksi kertaa PBSrssä. Tämän jälkeen leikkeet käsiteltiin normaalilla sian seerumilla ja laimennettiin suhteessa 1 : 10 PBS/4-%:isessa BSA-seoksessa 5 minuutin ajan +4 °C:ssa 10 vasta-aineiden ei-spesifisen sitoutumisen estämiseksi.
Kaikki vasta-aineiden kanssa suoritetut inkuboinnit suoritettiin kosteassa atmosfäärissä 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Leikkeet inkuboitiin ensin edellä kuvatussa esimerkissä 1 saadun, PBS/4-%:isessa BSA-seoksessa olevan 15 monoklonaalisen vasta-aineen C242 (C242.II) kanssa ja sen jälkeen suhteessa 1 : 400 PBS/4-%:iseen BSA-seokseen laimennetun biotinyloidun hevosen hiirtä vastaan valmistetun IgG:n (Vectastain - kauppanimi, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) kanssa, 2-%risen hiiren kaniinia vas-20 taan valmistetun immunoglobuliinin kanssa ja lopuksi Avidiini DH/biotinyloitu piparjuuriperoksidaasi H -kompleksin (Dakopatts A/S, Kööpenhamina, Tanska) kanssa. Kunkin inkuboinnin jälkeen leikkeet huuhdeltiin PBSrssä 15 minuutin ajan. Tämän jälkeen leikkeet käsiteltiin subs- i . 25 traatilla 15 minuutin ajan, huuhdeltiin PBSrssä, vastavär- jättiin hematoksyliinillä ja kiinnitettiin aluslasille glyseroligelatiinin avulla (Merck, Darmstadt, Saksa). Käytetty substraatti koostui 10 mgrsta 6 mlraan dimetyylisul-foksidia liuotettua 3-amino-9-etyylikarbatsolia (Sigma, 30 St. Louis, Mo. USA), joka oli laimennettu 50 mlrlla 4 μΐ • 3 0-%:ista H202:ta sisältävää 0,02 M natriumasetaattia, jon ka pH oli 5,5. Substraattiliuos suodatettiin ennen käyttöä. Tämän jälkeen leikkeet tutkittiin ja tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa l.
35 106928
Taulukko 1
Kolorektaalisten syöpäkasvainten ja useiden erilaisten normaalien kudosten värjääminen C242:IX:lla 5 Kudos Värjäytyneitä/Kokonaismäärä
Kolorektaalikarsinooma 26/41
Normaali paksusuoli 8/16
Maitorauhanen 2/3 10 Sylkirauhanen 2/2
Iho 0/1 hikirauhaset värjäytyivät hieman
Maksa 0/2 sappitiehyet värj äytyivät 15 heikosti
Munuainen 0/1
Haima .2/2 tiehyet
Maha 0/1
Ohutsuoli 0/1 20
Kuten taulukosta 1 ilmenee, 63 % tutkituista kolorektaalisista syöpäkasvaimista otetuista koepaloista värjäytyi positiivisesti monoklonaalisella C242:II:lla. Antigeenin CA242 ilmentymisen normaalissa paksusuolen ku-25 doksessa havaittiin olevan yleisesti ottaen heikompaa kuin syöpäkasvainkudoksessa, värjäytymisen paikallistuessa kokonaan lieriöepiteeliin ja maljasoluihin. Normaali, muualta kuin paksusuolesta peräisin oleva kudos ei reagoinut miltei ollenkaan monoklonaalisen C242:II:n kanssa, kun 30 taas positiivinen reaktio havaittiin normaaleissa rinta-tiehyissä, haimatiehyissä, sappitiehyissä ja hikirauhasissa, mutta värjäytymisen voimakkuus oli vähäinen.
106928 77 C242:n (C242:XX) immunohis tokemiallinen määritys ruumiinavauksen yhteydessä otetuissa normaaleissa ihmisen kudoksissa
Kaikkiaan 21 yksilöltä kerättiin ruumiinavauksen 5 yhteydessä kattava määrä normaaleja ihmisen kudoksia. Kudosnäytteistä valittiin 5 parasta sarjaa C242:II:n immunoreaktiivisuuden arvioimiseksi.
Kudokset poistettiin ruumiinavauksen yhteydessä ja asetettiin välittömästi emäksistä liuosta sisältäviin esi-10 jäähdytettyihin koeputkiin, joihin oli lisätty antibioottia. Tämän jälkeen kudosta sisältävät koeputket kuljetettiin laboratorioon (jäissä), viljelyneste poistettiin ja kudos leikattiin 0,5 cm3:n kuutioiksi. Kudoskuutiot asetettiin suodatinpaperisuikaleille ja pakastettiin nopeasti 15 nestemäisessä N2:ssa. Pakastettuja kudoksia säilytettiin -80 °C:ssa siihen saakka kunnes niistä tehtiin leikkeitä. Leikkeiden teon yhteydessä pakastetut näytteet leikattiin 6 μτη:η paksuisiksi leikkeiksi, jotka kiinnitettiin mikroskoopin objektilaseille. Leikkeet kiinnitettiin upottamal-20 la objektilasit 100-%:iseen asetoniin huoneenlämmössä kahden minuutin ajaksi. Tämän jälkeen objektilasit poistettiin asetonista, niiden annettiin kuivua ilmassa ja ne säilytettiin -20 °C:n lämpötilassa ennen käyttöä.
Kaikki inkubaatiot suoritettiin kosteassa atmosfää-. 25 rissa 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Leikkeet inkuboi- ' tiin ensin Tris-puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (TBS) olevan monoklonaalisen vasta-aineen C242 (C242.II) kanssa, sen jälkeen 20 % ihmisen seerumia (Sigman Chemical Company Ltd., Poole, Dorset, UK) sisältävään 30 TBS-liuokseen suhteessa 1 : 50 laimennetun piparjuuripe- • roksidaasilla konjugoidun kaniinin hiirtä vastaan valmis tetun IgG:n (Dako Ltd., High Wykombe, Bucks, UK) kanssa ja lopuksi piparjuuriperoksidaasiin konjugoidun sian kaniinia vastaan valmistetun IgG:n (Dako Ltd.) kanssa. Kunkin inku-35 baation jälkeen leikkeet huuhdeltiin 2 x TBS:llä. Tämän 78 106928 jälkeen leikkeet käsiteltiin substrastilla 3-5 minuutin ajan, huuhdeltiin TBS:llä, vastavärjättiin Mayersin hema-toksyliinillä ja kiinnitettiin aluslasille synteettisen kiinitysliuoksen (Shandon Scientific Ltd, Runcom, 5 Cheshire, UK) avulla. Käytetty substraatti oli 10 mg di-aminobentsidiiniä (Sigma), joka oli liuotettu 17 ml:aan TBS-liuosta, joka sisälsi 17 μΐ 30-%:ista H202:ta. Subs-traattiliuos suodatettiin ennen käyttöä. Tämän jälkeen leikkeet tutkittiin ja tulokset on esitetty seuraavassa 10 taulukossa 2.
« 106928 79
Taulukko 2
Ruumiinavauksen yhteydessä otettujen kudosten värjäys C242:II:11a 5 Kudos Värjäytyneitä/kokonaismäärä
Pikkuaivot 0/3
Isoaivot 0/3
Keskiaivot 0/3
Sydän 1/5 heikko, hajanainen värjäytyminen 10 Keuhko 0/5 Ääreishermo 0/3
Munuainen 1/5 reagoi proksimaalisiin/ distaalisiin tubuluksiin
Maksa 1/5 reagoi heikosti tiehyisiin 15 Haima 2/2 duktaalinen ja asinaarinen
Paksusuoli 2/3 reagoi heikosti epiteeliin
Ohutsuoli 3/3 reagoi heikosti epiteeliin
Lisämunuainen 2/5 reagoi heikosti kapseliin
Virtsarakko l/5 hajanainen 20 Kilpirauhanen 1/5 hajanainen
Lisäkilpirauhanen 0/2
Iho 2/4 levyepiteeliin ja hikirauhasiin
Poikkijuovainen lihasl/5 hajanainen Perna 0/5 25 Imusolmuke 0/5
Maha 3/3 reagoi heikosti epiteeliin
Kives 0/3
Sylkirauhanen l/l reagoi heikosti tiehyisiin
Kitarisa 4/4 reagoi levyepiteeliin 30
Kuten taulukosta 2 ilmenee, 72 % normaaleista ruumiinavauksen yhteydessä otetuista kudoksista ei reagoinut C242:II:n kanssa. Positiivisesti reagoineissa 28 %:ssa suurin osa värjäytymisestä oli joko hajanaista, määritte-35 lemätöntä tai tiettyyn kohtaan rajoittunutta, pääasiassa 106928 kudoksissa oleviin tiehytrakenteisiin rajoittunutta. Heterogeeniserapää, mutta silti minimaalista sitoutumista havaittiin tapahtuvan gastrointestinaaliseen epiteeliin. 2/4 ihonäytteestä värjäytyi positiivisesti reaktiivisuuden 5 kohdistuessa levyepiteeliin ja hikirauhasiin. Levyepiteeli värjäytyi positiivisesti myös 4:ssä C242:II:lla seulotussa kitarisanäytteessä.
Ihmisen COLO 205 -paksusuolikarsinoomaan sitoutuvan C242:II:n endosytoosi 10 Endosytoosimääritys suoritettiin seuraavalla taval la:
Yksisolukerrosviljelmänä kasvatetuista COLO 205 -soluista valmistettiin yksisolususpensioita (katso edellä kuvattu C242-vasta-aineen valmistus). Solut käsiteltiin 15 trypsiinillä, pestiin perusteellisesti ja suspendoitiin uudelleen viljelyliuokseen. Edellä mainittua jodileimalla varustettua C242:II-vasta-ainetta (200 000 cpm, joka vastaa 50 mg:aa monokloonaalista vasta-ainetta) lisättiin 5 ml:n koeputkissa oleviin COLO 205 -soluista (106 solua) 20 valmistettuihin yksisolususpensioihin. Lopullinen tilavuus oli 200 μΐ/koeputki.
Soluja inkuboitiin 125I-C242:n kanssa 1 tunnin ajan jäillä (0 °C). Tämän jälkeen suspensio sentrifugoitiin ja solut pestiin niiden puhdistamiseksi sitoutumattomista . 25 monoklonaalisistä vasta-aineista. Esi-inkuboituja soluja inkuboitiin edelleen 37 °C:ssa 10 minuutin aikavälein 1 tunnin ajan siten, että jokaisella kerralla solut jäähdytetään uudelleen ja ne sentrifugoidaan solunapiksi. Viljelyliuokseen vapautuneen radioaktiivisen merkkiaineen 30 määrä mitattiin supernatantista (LKB-gammalaskin, Pharma-• cia AB, Uppsala, Ruotsi). Supernatantille suoritettiin myös saostus TCA:lla ja saostuman radioaktiivisuus mitattiin. Solun pintaan kiinnittynyt 125I-C242 poistettiin suorittamalla pesu happamassa 0,2 M glysiini-HCl -puskuri-35 liuoksessa, jonka pH oli 1,5 ja joka sisälsi 2,5 mg/ml 81 106928 papaiinia, ja solun sisään kulkeutunutta 125I-C242:ta edustava radioaktiivisuus mitattiin. Kullakin kerralla solun pintaan 37 °C:ssa tapahtuneen inkuboinnin aikana kiinnittyneen vasta-aineen määrä laskettiin vähentämällä vapautu-5 neen ja solun sisään menneen monoklonaalisen vasta-aineen määrä solun pintaan sitoutuneen monoklonaalisen vasta-aineen kokonaismäärästä. Vapautuneen vasta-aineen pilkkoutuminen mitattiin liuoksen supernatantin TCA-saostumasta.
Tulokset on esitetty mukaan liitettyjen piirrosten 10 kuvoiossa 15, joka esittää COLO 205 -soluissa tapahtuneen 124I-C242: II :n endosytoosin, solun pinnan radioaktiivisuuden ("Sur"), solun sisään joutuneen radioaktiivisuuden ("Int"), vapautuneen radioaktiivisuuden ("Res") ja pilkkoutuneen vapautuneen radioaktiivisuuden ("Deg.Re") il-15 maistuna prosenttiyksikköinä solun pinnalla aluksi olleesta kokonaisradioaktiivisuudesta. Kuvoissa 15 voidaan havaita, että yli 20 % C242:II:n internalisaatiosta tapahtui 1 tunnin sisällä, kun esi-inkuboituja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa. Voitiin havaita pieniä määriä happoon liukene-20 vaa radioaktiivisuutta, kun liuoksen supernatantille suoritettiin saostus TCA:11a, mikä osoittaa vapautuneen aktiivisuuden vähäistä fragmentaatiota 1 tunnin inkubaation jälkeen.
Risiini-A/C242~vasta-aine-inimunotoksiinin sytotok- . 25 sisuus
Sytotoksisuus in vitro -olosuhteissa Tämä koe osoittaa immunotoksiinin sytotoksisuuden in vitro -olosuhteissa ihmisen kolorektaalista syöpä-kasvainsolulinjaa (Colo 205 - ATCC nro CCL 222) vastaan. 30 Colo 205 -soluja kasvatettiin suspensiona RPM1640- • liuoksessa, joka sisälsi 2,0 g/1 natriumvetykarbonaattia mutta ei glutamiinia ja jossa oli 5 % kuumentamalla inak-tivoitua naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia ja 50 μg/ml gentamisiinia. Solut laskettiin hemosytometriruu-35 dukkoa käyttäen. Proteiinisynteesin inhibitiomäärityksissä 106928 82 solut maljättiin solutiheydellä 2 x 104 solua/kuoppa 96-kuoppaisille levyille 100 μ1:η tilavuuksia käyttäen. Immu-notoksiininäytteet lisättiin 3 rinnakkaiseen kuoppaan. Immunotoksiinia lisättiin käyttäen 12 kaksinkertaista lai-5 mennosta pitoisuuksiin 2 000 - 0,98 ng/ml. Joihinkin kuoppiin lisättiin kontrolliksi 100 μΐ viljelyliuosta. Kutakin levyä inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 °C:ssa, jonka jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 2 μϋί 3H-L-leusiinia. Levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa vielä 24 tunnin ajan. Kuhunkin kuop-10 paan lisättiin 50 μΐ trypsiiniä ja levyjä inkuboitiin vielä 15 - 20 minuutin ajan. Solut kerättiin kultakin kuopal-ta/levyltä lasikuitumatoille ja radioaktiivisuus määritettiin käyttäen LKB:n betaplate-tuikelaskinta. Tehtiin proteiinisynteesin inhibitiokäyrät ja muodostettiin ICS0-ar-15 vot. Edullista immunotoksiinia (valmistus kuvattu edellä) käyttäen aikaansaadut tulokset on esitetty kuvassa 16. Sytotoksisuus in vivo -olosuhteissa Tämä koe osoittaa tämän immunotoksiinin sytotoksi-suuden in vivo -olosuhteissa kateenkorvattomissa hiirissä 20 ihonalaisina ksenografteinä kasvatettua ihmisen syöpäkas-vainsolulinjaa COLO 205 vastaan. Testattiin myös kontrolliryhmiä, joissa käytettiin ainoastaan vasta-ainetta tai fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta.
Kateenkorvattomien hiirten kylkeen injektoitiin . 25 yhteen ihonalaiseen kohtaan 5 x 106 COLO 205 -solua. Syöpä kasvainten annettiin kasvaa ja ne mitattiin joka 3-4 päivä kahdesta suunnasta liukumittoja käyttäen. Tutkittavan materiaalin injektointia ei aloitettu ennen kuin syöpäkasvainten koko oli saavuttanut 0,7 - 1,0 neliösent-30 timetrin koon. Tämä vaihe on päivä 0 ja tutkittavia raate-• riaaleja injektoitiin suonensisäisesti häntälaskimoihin päivinä 0, 1 ja 2. Kasvainten koon mittausta kahdessa suunnassa jatkettiin ja se esitettiin suhteellisena syöpäkasvaimen tilavuutena. Mittauksia suoritettiin joka 3-4 35 päivä siihen saakka, kunnes koe lopetettiin.
83 106928 Tässä tutkimuksessa verrataan fosfaatilla puskuroidun fysiologisen suolaliuoksen, pelkän C242-vasta-aineen (1,2 mg/kg) ja edullisen immunotoksiinin (valmistus kuvattu edellä) (2,0 mg/kg) vaikutusta syöpäkasvaimen kasvuun 5 ja tulokset on esitetty seuraavissa taulukoissa.
Ryhmä 1: Fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta 0,1 ml/10 g/i.v./3 x päivittäin
Hiiri 10 Päivi 1 2 3 45678 9 10 0 111 111111 1 4 2,02 1,15 2,28 1,02 0,51 0,80 2,05 1,58 0,79 1,23 8 5,04 3,27 5,08 2,18 1,09 1,83 4,54 4,75 1,59 3,63 15 10 Ml 4,32 5,24 3.94 1,96 2,44 5,58 5,91 1,85 4,43 15 7.72 5,24 4,13 2,94 7,25 9,45 2,71 7,02 1» 11.01 6,78 3,53 8,02 14,39 3,30 11,48 20 Ryhmä 2: C242-vasta-ainetta 1,2 mg/kg/i.v./3 x päivittäin
Nfirl
Mivi 1 2 * * S 6 7 8 9 10 : 25 0 111 1111 1 1 , * 1.64 2,19 1,85 1.08 1,48 2.07 1,65 1,36 2,14 2,47 8 3.31 4.30 3,28 4.07 3,38 4.78 6,08 2,96 3.34 7,31 10 4,46 4.65 4.88 4.85 3.44 5,11 8.82 4.19 4,12 7,43 30 15 5.29 10.80 2,57 18 15,03 9 9 84 106928
Ryhmä 3: Immunotoksiinia 2,0 mg/kg/i.v./3 x päivittäin
Hiiri
Hiivi 123 4567 8 9 0 1111111 11 * 0/63 0,86 1,40 0,64 0,48 0,43 0,73 0,91 0,77 8 0,44 0,87 1,08 0,48 0,58 0,41 0,67 0,93 1,07 10 0,48 0.71 1,39 0,29 0,55 0,51 0,56 1.13 1,21 10 Kuten edellä olevissa taulukoissa on esitetty, im- munotoksiini saa aikaan syöpäkasvaimen koon pienenemisen (taulukoissa on esitetty syöpäkasvainten suhteelliset tilavuudet) verrattuna kontrollina olevaan fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (PBS) ja pelkkään 15 vasta-aineeseen.
C242.Il:n reaktiivisuus ihmisen haimasyöpäkasvain-kudokseen Tämä koe osoittaa C242.II:n reaktiivisuuden ihmisen haimasyöpäkasvainkudosta kohtaan.
20 C242.II:n reaktiivisuus ihmisen haimasyöpäkasvain kudosta kohtaan määritettiin käyttäen samoja immunohisto-kemiallisia menetelmiä kuin mitä kuvattiin ihmisen normaalin kudoksen reaktiivisuuden määrityksen yhteydessä. Tuoretta pakastettua haimasyöpäkasvainkudosta saatiin ohuella ; ; 25 neulalla otetusta koepalasta ja formaliinilla kiinnitet- tyä/parafiiniin upotettua kudosta saatiin poisleikatuista syöpäkasvaimista. 13/16 haimasyöpäkasvaimista värjäytyi positiivisesti. Yleisesti ottaen sitoutumisen laajuus ja sen ominaispiirteet olivat paremmat tai yhtäsuuret kuin 30 kolorektaalisista syöpäkasvainkudosnäytteistä havaitut piirteet.
Immunotoksiinin tehokkuus in vitro -olosuhteissa haimasyöpäkasvainsolulinjoissa Tämä koe osoittaa immunotoksiinin sytotoksisuuden 35 in vitro -olosuhteissa ihmisen haimasyöpäkasvainsolulinjo- 106928 ja kohtaan. Immunotoksiinin sytotoksisen tehokkuuden määrittämiseksi in vitro -olosuhteissa käytettiin haiman ade-nokarsinoomasta peräisin olevaa solulinjaa Pan 1, jonka FACS-analyysin avulla osoitettiin ilmentävän kohdeantigee-5 niä. Tehokkuuden määrittämiseksi viljelmässä oleviin Pan 1 -soluihin lisättiin vaihtelevia konsentraatioita immuno-toksiinia IC50-arvon saamiseksi. Negatiivisina kontrolleina käytettiin MOPC:risiini-A-konjugaattia ja risiini-A:ta yksinään. Biologinen määritys suoritettiin kolme kertaa ja 10 tehokkuuden keskiarvoksi saatiin 40 ± 18 ng/ml. Negatiiviset kontrollit eivät olleet sytotoksisia edes 1 000 ng/ml konsentraatioina. Nämä koetulokset osoittavat, että kohdeantigeeniä esiintyy haimasyöpäkasvainsoluissa ja että immunotoksiini pystyy tappamaan antigeenin suhteen 15 positiiviset kasvainsolut.
Monoklonaalisen vasta-aineen C242:II kevyiden ja raskaiden ketjujen osia koodaavien cDNA-molekyylien mole-kulaarinen kloonaus A. Kokonais-RNA:n valmistus 20 108:sta solusta saatu kökonais-RNA valmistettiin olennaisesti P. Chomenzynskin ja N. Sacchin (Anal. Bio-chem. 162 (1987) 156 - 159) muunnoksen mukaisesti J. M.
Cirgwinin, el ai. (Biochemistry 18 (1979) , 5294 - 5299) menetelmästä. Lyhyesti esitettynä solunappi liuotettiin , 25 15 ml:aan kylmää denaturointiliuosta, jonka koostumus oli 4 M guanidiumisotiosyanaattia, 25 mM natriumsitraattia, pH 7, 0,5 % N-lauroyylisarkosiinia, 0,1 M 2-merkaptoetano-lia. Sen jälkeen kun solumateriaali oli hajonnut, lisättiin 1,2 ml 2 M natriumasetataattia (pH 4,0) ja seos 30 uutettiin fenolin, kloroformin ja isoamyylialkoholin suhteessa 250 : 49 : 1 valmistetulla seoksella. Sentrifugoin-nin jälkeen RNA saostettiin vesipitoisesta faasista lisäämällä siihen yhtä suuri tilavuus isopropanolia ja inkuboi-malla sitä yön yli -20 °C:ssa kokonais-RNA:n saostamisek-3¾ si. RNA:n sentrifugoinnin ja uudelleensuspendoinnin jäi- • 106928 keen saostus toistettiin, ja vielä yhden sentrifugoinnin ja saostuksen jälkeen RNA:n kokonaissaannon laskettiin absorbanssiraittausten perusteella olevan 960 μg.
B. mRNA:n eristäminen 5 Promega Corporationin, Madison, Wisconsin, USA,
PolyATract™-mRNA:n eristämisjärjestelmää käytettiin valmistajan ohjeiden (vrt. Promega Technical Bulletin, No. 090: 1990) mukaisesti polyadenyloituneen mRNA:n eristämiseksi edellä valmistetusta kokonais-RNA:sta. Lyhyesti esi-10 tettynä 960 μg kokonais-RNA:ta liuotettiin veteen ja sen annettiin kiinnittyä vastinosistaan 0,4 x SCC-liuokseen (1 x SCC = 8,77 g NaCl, 4,41 g natriumsitraattia litrassa vettä seoksen pH-arvon ollessa 7,0) valmistettuun bioti-nyloituun oligo(dT)-koettimeen (50 pmol). Siihen lisättiin 15 streptavidiinilla päällystettyjä paramagneettisia partikkeleita (Streptavidin Magnesphere™) ja 10 minuutin inku-boinnin jälkeen magneettiset partikkelit poistettiin ja ne pestiin useita kertoja 0,1 x SCC-liuoksella. Polyadenyloi-tunut mRNA eluoitiin pallosista inkuboimalla vedessä, 20 saannon ollessa 5 μg mRNA:ta.
C. cDNA-fagikirjaston valmistaminen E. colissa cDNA valmistettiin edellisessä vaiheessa saadusta polyadenyloidusta mRNA:sta kaksinauhaisen cDNA:n suuntau-tumattoman kloonauksen mahdollistavaa Uni-ZAP™-vektoria 25 (Stratagene Inc., La Jolla, Kalifornia) varten muunnetun U. Gublerin ja B.J. Hoffmanin (Gene 25 (1983), 263 - 269) menetelmän mukaisesti. Lyhyesti esitettynä 5 μg polyadeny-loitua mRNA:ta muunnettiin yksinauhaiseksi cDNA:ksi liittämällä siihen alukkeeksi Uni-ZAP™-kytkijäaluke 30 (56 ng/ml), lisäämällä siihen dATP:tä, dGTP:tä, dTTP:tä ja 5-metyyli-dCTP:tä 6 mM pitoisuutena ja 45 U Moloney Murine leukemiaviruksen käänteiskopiointientsyymiä. Seosta inku-boitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Toisen nauhan cDNA-syn-teesi suoritettiin lisäämällä dATP:tä, dGTP:tä, dTTPrtä ja 35 dCTPrtä siten, että lopulliseksi konsentraatioksi saatiin 87 106928 0,15 mM, 3,2 U RNaasi H:ta ja 6,5 U DNA-polymeraasi l:tä, ja inkuboimalla seosta 2,5 tunnin ajan 16 °C:ssa. Seos uutettiin fenolin ja kloroformin seoksella (valmistettu suhteessa 1 : 1) ja saostettiin etanolilla. cDNA:n päät 5 muutettiin tarttumattomiksi inkuboimalla 37 °C:ssa 30 minuutin ajan 0,16 mM dNTP:n ja 10 U:n T4-DNA-polymeraasin kanssa. Fenoli/kloroformi-seoksella suoritetun uuttamisen ja etanolilla tapahtuneen saostuksen jälkeen tuloksena oleva tarttumattomat päät omaava cDNA liitettiin ligaasil-10 la kiinni EcoRI-adaptorijaksoihin lisäämällä 3 Weissin yksikköä T4-DNA-ligaasia, 1 mM ATP:tä ja inkuboimalla yön yli 8 °C:ssa. Ligaation jälkeen EcoRI-kohesiiviset päät käsiteltiin kinaasilla lisäämällä 10 U T4-polynukleotidi-kinaasia 1 mM ATP:n läsnäollessa, ja inkuboimalla seosta 15 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. Tuloksena oleva fosforyloidut
EcoRI-kohesiiviset päät omaava cDNA pilkottiin 90 U:lla Xhol:tä siten, että Uni-ZAP™-kytkijäalukkeen koodaamasta jaksosta saatiin muodostettua kohesiivinen Xhol-pää. Tämän jälkeen tuloksena oleva cDNA liitettiin ligaasilla 20 1 μg:aan UniZAP™ XR EcoRI:llä ja Xhol:llä käsiteltyihin käsivarsiin seoksen sisältäessä 2 Weissin yksikköä T4-DNA-ligaasia ja 1 mM ATP:ta, ja inkuboimalla seosta 12 °C:ssa yön yli. Ligaatioseos pakattiin in vitro -olosuhteissa λ-fagipartikkeleihin käyttäen Gigapack II GoldR -pakkaamis-. 25 uutetta valmistajan ohjeiden mukaisesti, ja tuloksena olevia faageja käytettiin E. coli PLK-F' -solujen infektoitui -seen. Tuloksena oleva 8,5 x 104 erillistä kloonia käsittävä cDNA-kirjasto amplifioitiin kerran siten, että fagitiitte-riksi saatiin 7,5 x 108 pfu/ml. Tulokseksi saatu cDNA-kir-30 jasto seulottiin käyttäen isäntäsolukantana E. coli XL1-Blue -soluja (vrt. Bullock, W., Biotechniques 5 (1978) 4) jäljempänä kuvatulla tavalla.
D. Hybridisaatiokoettimien valmistus Hiiren genomin DNA:sta valmistettin R. H. Saikin, 35 et ai. (Science 239 (1988), 487 - 491) mukaisen polymeraa- • 88 106928 siketjureaktion avulla hybridisaatiokoettimia, jotka kattoivat raskaan ketjun ensimmäisen muuttumattoman alueen, CH1, ja kappaketjun muuttumattoman alueen, CK, jotta pystyttiin havaitsemaan C242:II-vasta-aineen IgGl:n raskasta 5 ketjua ja kappaketjua koodavat cDNA-kloonit. Lyhyesti esitettynä hiiren genomin DNA:n amplifiointiin käytettiin edellä mainittuja immunoglobuliinialueita koodaavien ekso-nien 5'- ja 3'-päihin hybridisoituvia oligonukleotidialu-kepareja. Agaroosigeelielektroforeesin avulla suoritetun 10 puhdistuksen jälkeen tuloksena olevat DNA-koetinfragmentit varustettiin 32P-leimalla satunnaisella alukkeen pidennys-menetelmällä A. P. Fienbergin ja B. Vogelsteinin (Anal. Biochem., 132 (1983) 6) mukaan.
E. IgGl:n raskaita ketjuja ja kappaketjuja koodaa-15 vien jaksojen seulonta ja liittäminen plasmideihin
Kappaleessa C aikaansaatu cDNA-kirjasto seulottiin kahdessa erillisessä vaiheessa käyttäen kappaleessa C aikaansaatuja immunoglobuliini IgGl- ja kappakoettimia kummassakin vaiheessa erikseen J. Sambrookin, et ai., 20 (Molecular Cloning, 2. painos (1989) Cold Spring Harbor
Laboratory Press) kuvaamien menetelmien mukaisesti. Näistä kahdesta erillisestä hybridisaatiosta saatuja positiivisesti hybridisoituvia fagiklooneja puhdistettiin edelleen seulomalla uudelleen samoilla koettimilla, jotka olivat : ' 25 samoja koettimia, joita oli käytetty ensimmäisessä seulon- nassa. Positiivisesti hybridisoituvat fagikloonit kasvatettiin E. coli CLl-Blue -viljelmissä ja tuloksena olevista fagikannoista valmistettiin pBluescript SK(-) -plasmi-deja sisältävä cDNA käyttämällä fagemidin irrottamista ja 30 kasvatusta olennaisesti J.M. Shortin, et ai. (Nucleic
Acids Res. 16 (1988), 7583 - 7600) menetelmän mukaisesti.
*' F. Hybridisoituvista pesäkkeistä saadun plasmidi- DNA:n luonnehtiminen
Tuloksena oleva plasmideja sisältävä cDNA karakte-35 risoitiin restriktioentsyymikartoituksen avulla ja odote- 106928 89 tun kokoisia liitososia sisältäville plasmideille suoritettiin dideoksi-DNA-sekvenssointi F. Sangerin, et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463 - 5467) kuvaaman menetelmän mukaisesti. IgG-kappakoettimen kanssa hyb-5 ridisoituva plasmidi, joka oli nimetty pKGE761;ksi, sisälsi cDNA-liitosjakson, jonka jakso koodaa avointa lukukehystä, joka muistuttaa suuresti aikaisemmin tunnettuja hiiren kevyen kappaketjun jaksoja (vrt. Kabat, E.A., et ai. , Sequences of Protein of Immunological Interest, 4.
10 painos, U.S. Department of Health and Human Services, National Institute of Health). Kevyen kappaketjun vaihte-leva alue, VK, ja sen translaatiosta saatava proteiinijakso on esitetty kuvassa 18. Kolme CDR-aluetta, jotka on merkitty nimityksillä CDR1 - CDR3, on esitetty alleviivat-15 tuina. VK-segmentin aminoterminaalista päätä edeltävä sig-naalipeptidi on merkitty S-kirjaimella. CK merkitsee VK-jakson karboksiterminaalisen pään jälkeen tulevaa muuttumatonta aluetta.
IgG-koettimen kanssa hybridisoituva plasmidi, jolle 20 on annettu nimitys pKGE761, sisälsi cDNA-liitososan, jonka jakso koodaa avointa lukukehystä, joka muistuttaa suuresti aikaisemmin tunnettuja hiiren IgGl:n raskaan ketjun jaksoja (vrt. Kabat, E.A., et ai., edellä). IgGlm raskaan ketjun vaihteleva alue, VH, ja sen translaatiosta saatava t : 25 proteiinijakso on esitetty kuvassa 19. Kolme CDR-aluetta, jotka on merkitty nimityksillä CDR1 - CDR3, on esitetty alleviivattuina. VH-segmentin aminotermiminaalista päätä edeltävä signaalipeptidi on merkitty S-kirjaimella. CH1 merkitsee VH-jakson karboksiterminaalisen pään jälkeen 30 tulevaa muuttumatonta aluetta.
Koostumukset
Seuraavassa kuvataan edustavaa farmaseuttista annostusmuotoa, joka sisältää tämän keksinnön mukaista immunotoksiinia, jota voidaan käyttää terapeuttisiin tar-35 koituksiin ihmisillä.
90 106928
Injektoitava liuos
Steriili, vesipitoinen injektoitavaksi tarkoitettu liuos sisältää:
Risiini-A/C242-vastaaine-immunotoksiini 1,0 mg 5 Natriumasetaattitrihydraatti 6,8 mg
Natriumkloridi 7,2 mg
Tween 20 0,05 mg mlrssa liuosta « 106928 91
Jaksoluettelo (1) Yleiset tiedot
(1) Patentin hakijat:Imperial Chemical Industries PLC ja Kabi Pharmacia AB
5 (ii) Keksinnön otsikko: Konjugaatteja (iii) Jaksojen lukumäärä: 22 (iv) Kirjeenvaihto-osoite: (A) Vastaanottaja: Legal Department:
Patents 10 (B) Katu: Bessemer Road (C) Kaupunki: Welwyn Garden City (D) Lääni: Hertfordshire (E) Maa: Yhdistynyt kuningaskunta
(F) Postinumero: GB-AL7 1HD
15 (v) Tietokoneella luettava muoto: (A) Välinetyyppi: Levyke, 3,50 tuumaa, 1,2 Mb kapasiteetti (B) Tietokone: 18 M PS/2 (C) Käyttöjärjestelmä: PC-DOS 3.20 20 (D) Ohjelmisto: ACSII WPS-PLUS -ohjelmasta (vi) Tämän hakemuksen tiedot: (A) Hakemuksen numero: (B) Jättöpäivä: (C) Luokitus: * 25 (vii) Aikaisemman hakemuksen tiedot: (A) Hakemuksen nro: 9114399.0 (B) : Jättöpäivä: 3.7.1991 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 1: 30 (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 16 aminohappoa (B) Tyyppi: Aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen 92 106928 (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr 16 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 2: 5 (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 7 aminohappoa (B) Tyyppi: Aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen 10 (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 2:
Arg Met Ser Asn Leu Vai Ser 7 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 3: (1) Jakson ominaispiirteet: 15 (A) Pituus: 9 aminohappoa (B) Tyyppi: Aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 3: 20 Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr 9 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 4: (1) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 5 aminohappoa : 25 (B) Tyyppi: Aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 4:
Tyr Thr Gly Met Asn 5 30 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 5: (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 17 aminohappoa (B) Tyyppi: Aminohappo 35 (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 5: 106928 93
TrpI1eAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLys 16
Gly 17 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 6: 5 (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 10 aminohappoa (B) Tyyppi: Aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen 10 (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 6:
Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Vai 10 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 7: (1) Jakson ominaispiirteet: 15 (A) Pituus: 18 aminohappoa (B) Tyyppi: Aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 7: 20 ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr 16
Trp Phe 18 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 8: (1) Jakson ominaispiirteet: ...... 25 (A) Pituus: 11 aminohappoa (B) Tyyppi: Aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 8: 30 Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Vai Ser Gly Vai 11 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 9: (i) Jakson ominaispiirteet: 94 106928 (A) Pituus: 11 aminohappoa (B) Tyyppi: Aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen 5 (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 9: ' Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly 11 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 10: (1) Jakson ominaispiirteet: 10 (A) Pituus: 7 aminohappoa (B) Tyyppi: Aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 10: 15 Phe Thr Tyr Thr Gly Met Asn 7 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 11: (1) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 21 aminohappoa 20 (B) Tyyppi: Aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 11: MetGlyTrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAsp 16 .1 - 25 Phe Lys Gly Arg Ile 21 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 12: (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 14 aminohappoa 30 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 12: AlaArgArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspValTrpGly 14 35 « S5 106928 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 13: (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 25 (B) Tyyppi: nukleiinihappo 5 (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 13: AATTCGCAT GCGGATCCAT CGATC 25 10 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 14: (1) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 25 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen 15 (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 14: GCGTACGCC TAGGTAGCTA GAGCC· 25 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 15: 20 (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 21 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen • 25 (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 15: GATAACAACA TATTCCCCAA A 21 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 16: (i) Jakson ominaispiirteet: 30 (A) Pituus: 23 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 16: 35 GATAACAAC ATGGTACCC AAA 23 1 96 106928 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 17: (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 23 (B) Tyyppi: nukleiinihappo 5 (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 17: AACAACATG GTACCCAAA CAA 23 10 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 18: (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 1140 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen 15 (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 18: TTCTGGCAAA TATTCTGAAA TGAGCTGTTG ACAATTAATC ATCGAACTAG TTAACTAGTA 60 20 CGCAAGTTCA CGTAAAAAGG GTATCGACAA TGGTACCCGG GGATCCACCT CAGGGTGGTC 120 TTTCACATTA GAGGATAACA ACATGGTACC CAAACAATAC CCAATTATAA ACTTTACCAC 180 AGCGGGTGCC ACTGTGCAAA GCTACACAAA CTTTATCAGA GCTGTTCGCG GTCGTTTAAC 240 . 25 AACTGGAGCT GATGTGAGAC ATGAAATACC AGTGTTGCCA AACAGAGTTG GTTTGCCTAT 300 AAACCAACGG TTTATTTTAG TTGAACTCTC AAATCATGCA GAGCTTTCTG TTACATTAGC 360 30 CCTGGATGTC ACCAATGCAT ATGTGGTCGG CTACCGTGCT GGAAATAGCG CATATTTCTT 420 · TCATCCTGAC AATCAGGAAG ATGCAGAAGC AATCACTCAT CTTTTCACTG ATGTTCAAAA 480 TCGATATACA TTCGCCTTTG GTGGTAATTA TGATAGACTT GAACAACTTG CTGGTAATCT 540 35 GAGAGAAAAT ATCGAGTTGG GAAATGGTCC ACTAGAGGAG GCTATCTCAG CGCTTTATTA 600 • · 106928 97 TTACAGTACT GGTGGCACTC AGCTTCCAAC TCTGGCTCGT TCCTTTATAA TTTGCATCCA 660 AATGATTTCA GAAGCAGCAA GATTCCAATA TATTGAGGGA GAAATGCGCA CGAGAATTAG 720 5 GTACAACCGG AGATCTGCAC CAGATCCTAG CGTAATTACA CTTGAGAATA GTTGGGGGAG 780 ACTTTCCACT GCAATTCAAG AGTCTAACCA AGGAGCCTTT GCTAGTCCAA TTCAACTGCA 840 AAGACGTAAT GGTTCCAAAT TCAGTGTGTA CGATGTGAGT ATATTAATCC CTATCATAGC 900 10 TCTCATGGTG TATAGATGCG CACCTCCACC ATCGTCACAG TTTTGATTGC TTATAAGGCC 960 AGTGGTACCC GGGGATCCTC TAGAGTCGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTTAG CCCGCCTAAT 1020 15 GAGCGGGCTT TTTTTTATCG ACCGATGCCC TTGAGAGCCT TCAACCCAGT CAGCTCCTTC 1080 CGGTGGGCGC GGGGCATGAC TATCGTCGCC GCACTTATGA CTGTCTTCTT TATCATGCAA 1140 20 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 19: (1) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 26 (B) Tyyppi: nukleiinihappo 25 (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 19: ATAACAACAT GGTTCCCAAA CAATAC 26 30 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 20: (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 86 (B) Tyyppi: nukleiinihappo 35 (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen 106928 98 (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 20: AAAAAGGGTA TCGACATGGT ACCCGGGGAT CCACCTCAGG GTGGTCTTTC ACATTAGAGG 60 5 ATAACAACAT GGTACCCAAA CAATAC 86 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 21: 10 (i) Jakson ominaispiirteet: (A) Pituus: 463 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen 15 (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 21: GGAATTCGGC ACGAGGAGTT TTTTTGTATC AAGTTCTCAGA ATG AGG TGC CTA GCT 55
Het Arg Cys Leu Ala 2 0 GAG TTC CTG GGG CTG CTT GTG CTC TGG ATC CCT GGA GCC ATT GGG GAT 103
Glu Fhe Leu Gly Leu Leu Vai Leu Trp Ile Pro Gly Ala Ile Gly Asp ATT GTG ATG ACT CAG G CT GCA CCC TCT GTA CCT GTC ACT CCT GGA GAG 151
Ile Vai Met Thr Gin Ala Ala Pro Ser Vai Pro Vai Thr Pro Gly Glu ' · 25 TCA GTA TCC ATC TCC TGC AGG TCT AGT AAG AGT CTC CTG CAT AGT AAT 199
Ser Vai Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Hls Ser Asn GGC AAC ACT TAC TTG TAT TGG TTC CTG CAG AGG CCA GGC CAG TCT CCT 247 30 Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro CAG CTC CTG ATA TAT CGG ATG TCC AAC CTT GTC TCA GGA GTC CCA GAC 295
Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Het Ser Asn Leu Vai Ser Gly Vai Pro Asp 35 AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCA GGA ACT GCT TTC ACA CTG AGA ATC AGT 343
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser 106928 99 AGA GTG GAG GCT GAG GAT GTG GGT GTT TAT TAC TGT CTG CAA CAT CIA 391
Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Leu Gin His Leu GAG TAT CCG TTC ACG TTC GGT CCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG 439 5 Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA ACG 463
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Vai Thr 10 (2) Tiedot jaksotunnisteesta nro 22: (i) Jakson ominaispiirteet : (A) Pituus: 483 (B) Tyyppi: nukleiinihappo 15 (C) Nauhamuoto: Yksinauhainen (D) Topologia: Lineaarinen (xi) Jakson kuvaus: Jaksotunniste nro 22: 20 GAATTCGGCA CGAGATTGAG CCCAAGTCTT AGACATC ATG GAT TGG CTG CGG 52
Het Asp Trp Leu Arg AAC TTG CTA TTC CTG ATG GCA GCT G CC CAA AGT ATC CAA GCA CAG GTC 100
Asn Leu Leu Phe Leu Het Ala Ala Ala Gin Ser Ile Gin Ala Gin Vai : - :: 25 CAG TTG GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG ACA GTC 148
Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Vai AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GAT TAT ACC TTC ACA TAC TAT GGA ATG 196 3 0 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr Gly Het AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCG GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG 244
Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Het Gly Trp 106928 100 ΑΤΑ GAC ACC ACC ACT GGA GAG CCA ACA TAT GCT GAA GAT TTT AAG GGA 292 lie Asp Thr Tbr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly 5 CGG ATT GCC TTC TCT TTG GAG ACC TCT GCC AGC ACT GCC TAT TTG CAG 340
Arg lie Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gin ATC AAA AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT GCA AGA 388
Ile Lys Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg CGG GGG CCT TAC AAC TGG TAC TTT GAT GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG 436
Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr 15 GTC ACC GTC TCC TCA GCC AAA ACG ACN CCC CCA TCT GTC TAT CC 483
Val Thr Val Set Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

Claims (14)

106928
1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kon- jugaatin valmistamiseksi, joka konjugaatti käsittää tok- 5 siiniosan ja kohdesoluun sitoutuvan osan, on valikoiva gastrointestinaalisia kasvaimia kohtaan, ja jossa kohdesoluun sitoutuva osa käsittää C242-vasta-aineen tai kohdesoluun sitoutuvan osan, jolla on olennaisesti samat so-luunsitoutumisominaisuudet, tunnettu siitä, että 10 menetelmässä: (a) niiden konjugaattien osalta, joissa kohdesoluun sitoutuva osa kytketään suoraan toksiiniosaan, annetaan toksiiniosan reagoida kohdesoluun sitoutuvan osan kanssa; tai 15 (b) niiden konjugaattien osalta, joissa kohdesoluun sitoutuva osa kytketään toksiiniosaan liitososan välityksellä, annetaan liitososan kanssa derivatisoidun kohdesoluun sitoutuvan osan reagoida toksiiniosan kanssa tai antamalla liitososan kanssa derivatisoidun toksiiniosan rea-20 goida kohdesoluun sitoutuvan osan kanssa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdesoluun sitoutuva osa käsittää C242-vasta-aineen tai sen fragmentin.
3. CDR1: TyrThrGlyMetAsn CDR2: TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly « « * CDR3: ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal CDR-alueiden ollessa järjestäytyneenä siten, että kohde-soluun sitoutuvalla osalla on olennaisesti samat sitoutu- 3*5 misominaisuudet kuin C242-vasta-aineella. • 106928
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että toksiiniosa käsittää yhdis telmä-risiini -A: n.
4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että kohdesoluun sitoutuva osa ja toksiiniosa kytketään toisiinsa bifunktionaalisen 30 liitososan avulla. ’ 5. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, t unnet t u siitä, että kohde-soluun sitoutuva osa ja toksiiniosa kytketään toisiinsa disulfidi- tai tioeetterisidoksen avulla. 4 106928
5 A-Si-Sj-X-CON-B jossa A käsittää yhdistelmä-risiini-A:n ja B käsittää kohdesoluun sitoutuvan osan, joka käsittää C242-vasta-ai- 10 neen, 51 on yhdistelmä-risiini-A:ssa oleva rikkiatomi, NH on C242-vasta-aineen pinnalla, 52 on rikkiatomiryhmä ja X on suoraketjuinen (1-6C)alkyyliryhmä, joka on valinnaisesti substituoitu yh- 15 dellä tai kahdella substituentilla, joka on(jotka ovat) (1-6C)alkyyli, fenyyli tai (1-4C)alkyylifenyyli; tai (1-4C)alkyylifenyyliryhmä, jossa alkyyliosa on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai kahdella substituentilla, jotka ovat (1-6C)alkyyli, fenyyli tai (1-4)alkyylifenyyli; 20 ja jossa fenyylirengas voi olla substituoitu esimerkiksi halogeenilla, (1-4C)alkyylilla tai (1-4C)alkoksilla.
6. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohde-soluun sitoutuva osa ja toksiiniosa kytketään toisiinsa liitososalla, jolla on kaava -S-X-CO-, jossa X on suora- 5 ketjuinen (1-6C)alkyyliryhmä, joka on valinnaisesti sub-stituoitu yhdellä tai kahdella substituentilla, joka on(jotka ovat) (1-6C)alkyyli, fenyyli tai (1-4C)alkyyli-fenyyli; tai (1-4C)alkyylifenyyliryhmä, jossa alkyyliosa on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai kahdella substi- 10 tuentilla, jotka ovat (1-6C)alkyyli, fenyyli tai (1-4C) alkyylifenyyli; ja jossa fenyylirenkaassa voi olla substi-tuenttina halogeeni, (1-4C)alkyyli tai (1-4C)alkoksi.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X käsittää metyleeni-, ety- 15 leeni-, propyleeni- tai butyleeniryhmän, joka on substituoitu yhdellä tai kahdella ryhmällä, jotka ovat metyyli, etyyli, propyyli tai butyyli.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liitososa käsittää radikaalin
20 -S-CH(CH3) CH2CO- .
9. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohde-soluun sitoutuvan osan CDR-alueiden jaksot ovat olennaisesti seuraavat: - - 25 Kevyt ketju CDR1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr Raskas ketju
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugaatilla on kaava: H
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugaatin, joka käsittää C242-vasta-aineen ja yhdistelmä-risiini-A:n, osat kytke- 25 tään toisiinsa C242:ssa olevasta aminoryhmästä risiini-A:ssa olevan kysteiiniryhmän tioliin 3-merkaptovoihappora-dikaalin (-CO.CH2.CH(CH3)-S-) välityksellä.
12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugaatissa, joka käsittää 30 yhdistelmä-risiini-A:n ja kohdesoluun sitoutuvan osan, on vähintään yksi CDR-alue, jonka jakso on olennaisesti seu-* raava: Kevyt ketju CDR1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
35 CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer 106928 CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr Raskas ketju CDR1: TyrThrGlyMetAsn CDR2: TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly 5 CDR3: ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal CDR-alueiden määrän ja järjestyksen ollessa sellainen, että kohdesoluun sitoutuvalla osalla on olennaisesti samat sitoutumisominaisuudet kuin C242-vasta-aineella.
13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että konjugaatti, joka käsittää toksiiniosan ja kohdesoluun sitoutuvan osan, on spesifinen gastrointestinaalisen syöpäkasvaimen epitooppia kohtaan.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu, siitä, että kohdesoluun sitoutuva osa on 15 spesifinen sille epitoopille, johon C242-vasta-aine sitou tuu . 11 106928
FI923085A 1991-07-03 1992-07-03 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen konjugaatin valmistamiseksi FI106928B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB919114399A GB9114399D0 (en) 1991-07-03 1991-07-03 Conjugates
GB9114399 1991-07-03

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI923085A0 FI923085A0 (fi) 1992-07-03
FI923085A FI923085A (fi) 1993-01-04
FI106928B true FI106928B (fi) 2001-05-15

Family

ID=10697775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI923085A FI106928B (fi) 1991-07-03 1992-07-03 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen konjugaatin valmistamiseksi

Country Status (24)

Country Link
EP (1) EP0528527B1 (fi)
JP (1) JP3735379B2 (fi)
KR (1) KR100252147B1 (fi)
AT (1) ATE164768T1 (fi)
AU (1) AU665546B2 (fi)
CA (1) CA2073113C (fi)
CZ (1) CZ209792A3 (fi)
DE (1) DE69225035T2 (fi)
DK (1) DK0528527T3 (fi)
ES (1) ES2113923T3 (fi)
FI (1) FI106928B (fi)
GB (2) GB9114399D0 (fi)
GR (1) GR3026575T3 (fi)
HU (1) HU215243B (fi)
IE (1) IE922190A1 (fi)
IL (1) IL102399A (fi)
MY (1) MY110513A (fi)
NO (1) NO308539B1 (fi)
NZ (1) NZ243437A (fi)
PT (1) PT100660B (fi)
SK (1) SK209792A3 (fi)
TW (1) TW329425B (fi)
ZA (1) ZA924973B (fi)
ZW (1) ZW10192A1 (fi)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5686121A (en) * 1979-12-14 1981-07-13 Teijin Ltd Antitumor proten complex and its preparation
EP0335476A3 (en) 1984-02-08 1989-12-13 Cetus Corporation Recombinant methods for the production of ricin a, ricin b, ricin or diphtheria toxin (dt)a or ab' fragment, suitable hosts and vectors therefor, and conjugates comprising ricin toxin a chain or diphtheria toxin
US5165923A (en) * 1989-11-20 1992-11-24 Imperial Cancer Research Technology Methods and compositions for the treatment of hodgkin's disease
CA2087164C (en) * 1990-07-20 2002-11-26 Terje Kalland Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation

Also Published As

Publication number Publication date
CA2073113A1 (en) 1993-01-04
AU1943092A (en) 1993-01-07
ZA924973B (en) 1993-04-28
DK0528527T3 (da) 1999-01-18
KR930001928A (ko) 1993-02-22
JP3735379B2 (ja) 2006-01-18
NO922383D0 (no) 1992-06-17
IL102399A0 (en) 1993-01-14
GB9114399D0 (en) 1991-08-21
IE922190A1 (en) 1993-01-13
SK209792A3 (en) 1994-06-08
MY110513A (en) 1998-07-31
DE69225035T2 (de) 1998-08-13
AU665546B2 (en) 1996-01-11
FI923085A (fi) 1993-01-04
EP0528527A2 (en) 1993-02-24
GB9212880D0 (en) 1992-07-29
HU215243B (hu) 1998-11-30
NO922383L (no) 1993-01-04
FI923085A0 (fi) 1992-07-03
ATE164768T1 (de) 1998-04-15
KR100252147B1 (ko) 2000-09-01
EP0528527B1 (en) 1998-04-08
NZ243437A (en) 1994-10-26
GR3026575T3 (en) 1998-07-31
EP0528527A3 (en) 1993-03-17
IL102399A (en) 2003-05-29
HU9202219D0 (en) 1992-10-28
HUT67048A (en) 1995-01-30
TW329425B (en) 1998-04-11
ES2113923T3 (es) 1998-05-16
CA2073113C (en) 2004-09-14
NO308539B1 (no) 2000-09-25
CZ209792A3 (en) 1993-01-13
PT100660B (pt) 1999-06-30
JPH05320065A (ja) 1993-12-03
PT100660A (pt) 1993-10-29
ZW10192A1 (en) 1993-03-31
DE69225035D1 (de) 1998-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6728264B2 (ja) 抗ｈｅｒ２抗体及びその結合体
EP1805222B1 (en) Antibodies directed to the mammalian eag1 ion channel protein
US5840840A (en) Selective RNase cytotoxic reagents
US5608039A (en) Single chain B3 antibody fusion proteins and their uses
Onda et al. In vitro and in vivo cytotoxic activities of recombinant immunotoxin 8H9 (Fv)-PE38 against breast cancer, osteosarcoma, and neuroblastoma
US5889157A (en) Humanized B3 antibody fragments, fusion proteins, and uses thereof
EP0521842B1 (en) Tumor antigen specific antibody
AU634314B2 (en) Chimeric mouse-human a10 antibody with specificity to a human tumor cell antigen
CN110382535A (zh) 抗-gpr20抗体以及抗-gpr20抗体-药物缀合物
WO2022001864A1 (zh) 一种抗体-药物偶联物，其制备方法及应用
MX2012003996A (es) Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2.
WO1992015327A1 (en) Recombinant double chain immunotoxins
CN116472064A (zh) 抗体-药物偶联物及其应用
FI106928B (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen konjugaatin valmistamiseksi
EP4273169A1 (en) Development and use of function-enhanced antibody blocking agent
Kokunai et al. Antigen related to cell proliferation in malignant gliomas recognized by a human monoclonal antibody
US11020490B2 (en) Antibody-drug conjugate with a tubulysin analog warhead having a stabilized acetate group in the TUV subunit
KR20230135653A (ko) 항-클라우딘 18.2 항체 및 이의 항체-약물 접합체
BR112016002752B1 (pt) Anticorpo ou seus fragmentos funcionais que pode especificamente se ligar ao her2, conjugados, composição farmacêutica, e, uso do anticorpo ou seus fragmentos funcionais, do conjugado ou da composição farmacêutica

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: ZENECA LIMITED

MA Patent expired