DE69225035T2 - Konjugate - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft Konjugate wie Immunotoxine zur Verwendung in der Antitumortherapie, Verfahren zur Herstellung derartiger Konjugate und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
- Ricin und Moleküle vom Ricin-Typ, beispielsweise Abrin, Modecin und Viscumin, sind bekannte Verbindungen, die von Pflanzenzellen gebildet werden und cytotoxische Eigenschaf ten besitzen. Toxine dieses Typs bestehen aus zwei Polypeptid-Ketten, die über eine Disulfid-Brücke verknüpft sind. Eine der Polypeptid-Ketten (die "A-Kette") ist hauptsächlich für die cytotoxischen Eigenschaften des Toxin- Moleküls verantwortlich, während die andere Polypeptidkette (die "B-Kette") die Bindung des Toxin-Moleküls an Zelloberflächen ermöglicht.
- Die toxische Wirkung von Molekülen des Ricin-Typs verläuft in drei Phasen:
- (A) Bindung des Toxins an die Zelloberfläche durch Wechselwirkung mit Galactose-Bindungsstellen an der B-Kette mit Glycoproteinen oder Glycolipiden, die an der Zelloberfläche exponiert sind,
- (B) Eindringen zumindest der A-Kette in das Cytosol der Zelle und
- (C) Inhibition der Protein-Synthese durch die A-Kette, welche die Aktivität der ribosomalen 605-Untereinheiten zerstört.
- Es wird ferner angenommen, daß die B-Kette eine wichtige sekundäre Funktion hat, abgesehen von ihrer Hauptfunktion der Bindung des Toxin-Moleküls an die Zelloberfläche, nämlich daß sie Aufnahme des Toxins in die Zelle erleichtert. Voneinander getrennte A- und B-Ketten sind im wesentlichen untoxisch, da die A-Kette nicht die Fähigkeit zur Bindung an Zelloberflächen besitzt und in Abwesenheit der B-Kette nicht in das Cytosol der Zelle penetrieren kann, während die B-Kette keine cytotoxischen Eigenschaften besitzt.
- Wie bereits oben erwähnt, werden Ricin- und Toxin-Moleküle vom Ricin-Typ von Pflanzen gebildet. Im Falle von Ricin selber erfolgt die Bildung in Ricinus communis, auch als Rizinusölpflanze bekannt. Es wird angenommen, daß ein Vorläufer-Polypeptid (als Präproricin bekannt), das eine Leader-Sequenz, die A-Kette, eine Verknüpfungssequenz und die B-Kette aufweist, zuerst gebildet wird. Es wird angenommen, daß während des Transports dieses Vorläufers (Präproricin) in der Pflanzenzelle die Leader-Sequenz unter Erhalt von Proricin eliminiert wird. Dann wird reifes Ricin durch die Bildung einer Disulfid-Brücke zwischen der A- und der B-Kette und durch Elimination der Verknüpfungssequenz gebildet.
- Es ist bereits vorgeschlagen worden, daß die Toxizität der A-Kette von Toxinen wie Ricin in der Antitumor-Therapie anwendbar sein könnte, wenn die B-Kette, die bei der Bindung nicht unterscheidet, durch einen unterschiedlichen Träger ersetzt werden könnte, der in der Lage ist, vorzugsweise statt an normale Zellen an Tumorzellen zu binden. Daher sind verschiedene Konjugate vorgeschlagen und hergestellt worden, die reifes Ricin oder die A-Kette von Ricin und einen Tumor-spezifischen Antikörper enthalten. Derartige Konjugate, Immunokonjugate oder Immunotoxine, haben jedoch eine Reihe von Nachteilen.
- Bei bekannten Konjugaten gibt es aufgrund eines Strukturmerkmals in der A-Kette von natürlichem Ricin ein Problem. Es wird angenommen, daß während der Synthese von Ricin in Pflanzenzellen eine N-Glycosylierung stattfindet und die sich ergebenden Zuckerreste zu unspezifischen Wechselwirkungen mit Zelloberflächen in der Lage sind.
- Ferner wird angenommen, daß es bei Pflanzenricin-Immunokonjugaten zu einem Verlust der Selektivität kommt, weil:
- (a) entweder die Galactose-Bindungsstellen an der B- Kette im Falle von vollständigen Ricin-Immunokonjugaten auf unspezifische Weise mit Zelloberflächen in Wechselwirkung treten, oder
- (b) im Falle von Pflanzenricin-A-Immunokonjugaten die am Pflanzenricin-A exprimierten Glycan-Seitenketten an Galactose- und Mannose-Rezeptoren an Zelloberflächen binden.
- Ein weiteres Problem besteht darin, daß wie oben erwähnt, die B-Kette die Aufnahme des Toxin-Moleküls in die Zelle erleichtern soll. Daher wurde berichtet, daß Konjugate, bei denen die B-Kette fehlt, d.h. solche, die aus der A-Kette und einem Antikörper bestehen, zwar spezifischer sind als die nativen Toxine, ihnen aber die Wirksamkeit des nativen Toxins fehlt (Moolten, F. L., et al., Immun Rev 62, 47-72, 1982). Es wird angenommen, daß dieser Verlust an Wirksamkeit auf einer Abnahme der effektiven Aufnahme des Toxins in die Zelle beruht. So erleichtern nur verhältnismäßig wenige Antikörper, über die berichtet wurde, die effektive Aufnahme des Toxins und ergeben somit Immunotoxine, denen die Wirksamkeit fehlt.
- Bisher sind Konjugate, die möglicherweise zur Behandlung von Tumoren in einer Anzahl von verschiedenen Geweben verwendbar sind, hergestellt worden. Beispielsweise wird in der PCT-Patentanmeldung W085/003508 die Herstellung von Konjugaten beschrieben, welche Ricin-A- oder Diphtherie- Toxin-A-Ketten aufweisen, die über ein Spacer-Molekül an für Brusttumoren spezifische Antikörper gebunden sind.
- Ferner wurde über Antikörper berichtet, die kolorektale Tumorzellen erkennen, wobei aber Konjugate, welche diese Antikörper aufweisen, zu einer unakzeptablen Bindung an normales Gewebe neigen und/oder eine geringe Wirksamkeit haben. Die bekannten Antikörper, welche kolorektale Tumorzellen erkennen, haben daher keine Anwendung in der Herstellung von Konjugaten gefunden, die wirklich von therapeutischem Interesse sind. Es besteht daher ein Bedarf für ein Konjugat, das zur Behandlung von kolorektalen Tumoren von therapeutischem Wert ist.
- Obwohl verschiedene Konjugate vorgeschlagen und hergestellt worden sind, besteht ein Bedarf für verbesserte Konjugate. Derartige verbesserte Konjugate können einen oder mehrere der mit bekannten Konjugaten verbundenen Nachteile aufheben. Ferner besteht ein Bedarf für Konjugate, die für gastromtestinale Tumoren selektiv sind.
- Erfindungsgemäß wird ein Konjugat bereitgestellt, das eine Toxin-Komponente und eine Zielzell-Bindungskomponente aufweist, die selektiv für gastromtestinalen Tumoren ist, wobei die Zielzell-Bindungskomponente den C242-Antikörper oder eine Zielzell-Bindungskomponente mit im wesentlichen den gleichen Zellbindungseigenschaftn umfaßt.
- Insbesondere ist die Zielzell-Bindungskomponente (und daher das Konjugat) für kolorektale und pankreatische Tumorzellen, insbesondere kolorektale Tumorzellen spezifisch.
- Die Zielzell-Bindungskomponente wird beispielsweise im allgemeinen einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Derivat eines Antikörpers oder Antikörperfragments aufweisen.
- Die Zielzell-Bindungskomponente ist für gastromtestinale Tumorzellen (insbesondere kolorektale Tumorzellen) selektiv, weil sie statt an normale Zellen vorzugsweise an derartige Zellen bindet. Daher bindet die Zielzell- Bindungskomponente zwar an gastromtestinale Tumorzellen, aber nicht an normale Zellen oder nur mit einer minimalen Bindungsaffinität. Die Zielzell-Bindungskomponente hat eine Selektivität für gastromtestinale Tumoren, die im wesentlichen die gleiche ist, wie sie der C242-Antikörper hat. Die Selektivität des C242-Antikörpers für gastrointestinale Tumoren, beispielsweise kolorektale Tumoren, wird durch die nachstehend angegebenen immunohistochemischen Daten beispielhaft erläutert. Somit wird eine Zielzell-Bindungskomponente, beispielsweise der C242- Antikörper, an ein Antigen binden, das mit gastrointestinalen Tumoren assoziiert ist, aber bei normalen Zellen fehlt oder nur schwach exprimiert wird.
- Wie bereits oben erwähnt, kann das Konjugat gastrointestinale Tumorzellen abtöten. Somit ist das Konjugat (oder "Immunotoxin") in der Lage die Toxin-Komponente den Tumorzellen zuzuführen, so daß die Toxin-Komponente ihre cytotoxischen Eigenschaften ausüben kann. Das Konjugat wird daher im allgemeinen zur Bindung an die Tumorzellen in der Lage sein (durch die an die Tumorzellen bindenden Zielzell- Bindungskomponente) und der Toxin-Komponente den Eintritt in die Zelle ermöglichen, d.h. die "Internalisierung" der Toxin-Komponente ermöglichen. Besonders wirksame Konjugate werden im allgemeinen die folgenden Eigenschaften haben:
- 1. Die Zielzell-Bindungskomponente sollte zur Bindung an ein Tumorzellen-Oberflächenantigen in der Lage sein.
- 2. Das Zelloberflächenantigen sollte auf den Tumorzellen in hoher Kopienzahl vorhanden sein, beispielsweise mindestens 10 000 pro Zelle.
- 3. Das Antigen sollte auf normalen Zellen nicht mit hoher Kopienzahl exprimiert werden.
- 4. Der Antikörper-Antigen-Komplex sollte wirksam aufgenommen werden, so daß die Toxin-Komponente ihre Cytotoxizität intrazellulär ausüben kann.
- 5. Das Konjugat sollte vorzugsweise so kontruiert sein, daß es ausreichend stabil ist, um im Blut lange genug intakt zu bleiben, so daß die Toxin-Komponente zu den Tumorzellen gelangt, sowie ausreichend spaltbar, damit die Toxin-Komponente freigesetzt wird, wenn die Toxin- Komponente sich im Inneren der Zelle befindet.
- Bei dem Antikörper C242 handelt sich um einen Antikörper der IgG-Klasse aus der Maus, der gebildet wird, wenn in einem geeigneten Medium eine Hybridom-Zellinie kultiviert wird, die durch Fusion von Milzzellen einer Maus, die mit einer menschlichen Kolonadeno-Carcinomzellinie immunisiert worden ist, mit der Maus-Myelom-Zellinie Sp 2/0 erhalten wird. Eine Hybridom-Zellinie (242.11), die den c242:II- Antikörper bildet (der hier auch einfach als C242-Antikörper bezeichnet wird), wurde am 26. Januar 1990 gemäß dem Budapester Vertrag bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Gentre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, United Kingdom, unter der Zugangs-Nr. 90012601 hinterlegt.
- Die Angabe "eine Zielzell-Bindungskomponente, welche im wesentlichen die gleichen Zellbindungseigenschaften hat" umfaßt Zielzell-Bindungskomponenten, die im wesentlichen die gleiche immunologische Spezifität haben wie sie von der hinterlegten ECACC-Zellinie 90012601 gebildet wird, d.h. sie bindet an die gleiche antigene Determinante oder Epitop und konkurriert mit dem C242-Antikörper um die Bindung an dieser Stelle.
- Die Angabe "Zielzell-Bindungskomponente" umfaßt ferner Antikörperfragmente, und zwar insbesondere Fragmente des Antikörpers C242 sowie intakte Antikörper. Die Antikörperfragmente behalten die Bindungsfähigkeit und Spezifität des unfragmentierten Immunoglobulins und umfassen beispielsweise diejenigen, die durch Abbau des Antikörpers mit einem proteolytischen Enzym, beispielsweise Pepsin, erhalten wurden. Besondere Beispiele für Fragmente umfassen F(ab')- und F(ab')&sub2;-Fragmente.
- Es ist klar, daß die Zielzell-Bindungskomponente gentechnologisch hergestellt werden kann, so daß demgemäß die Angabe Zielzell-Bindungsfragment Antikörper und Antikörperfragmente umfaßt, die mit einer derartigen Technik hergestellt worden sind. Insbesondere umfaßt die Angabe Zielzell-Bindungskomponente den C242-Antikörper oder ein Fragment davon, bei dem es sich um ein gentechnisches Produkt handelt.
- Die Herstellung von Antikörperfragmenten und insbesondere humanisierten Antikörperfragmenten wird beispielsweise von Carter et al., Biotechnology, Bd. 10, Februar 1992, beschrieben.
- Die Zielzell-Bindungskomponente umfaßt derivatisierte Formen von Antikörpern oder Antikörperfragmenten und insbesondere humanisierte Formen von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die von nicht-menschlichen Quellen stammen, beispielsweise humanisierte Formen von Maus- Antikörpern.
- Der Antikörper C242 ist gegen ein tumorassozuertes Antigen, das hier mit CA-242 bezeichnet wird, gerichtet. Somit umfaßt die Zielzell-Bindungskomponente insbesondere einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, das zur Bindung an das Antigen CA-242 in der Lage ist. Ein konkretes Beispiel für einen derartigen Antikörper ist der Antikörper C242 selber. Das tumorassoziierte Antigen CA-242 wird in den meisten kolorektalen Tumoren exprimiert und in normalem Kolongewebe nur schwach exprimiert oder fehlt dort.
- Hinsichtlich der oben erwähnten Gentechnik wurden die cDNA's der variablen Regionen der leichten und schweren Ketten des monoklonalen C242:II-Antikörpers wie nachstehend beschrieben kloniert. Bevor dies detaillierter diskutiert wird, erscheint es angebracht, eine kurze allgemeine Beschreibung der strukturellen Grundeinheit eines Immunglobulins zu geben, wobei auf Figur 17 der Zeichnungen Bezug genommen wird, in der die allgemeine Struktur eines Antikörpers, d.h. eines Immunglobulins der Klasse G beschrieben wird.
- Unter Bezugnahme auf Figur 17 besteht das Immunglobulin aus zwei identischen leichten (L) Polypeptid-Ketten und zwei identischen schweren Polypeptid-Ketten (H), wobei die vier Ketten durch Disulfid-Bindungen und verschiedene nichtkovalente Kräfte in Form einer symmetrischen "Y"-Konfiguration verbunden sind. Jede schwere Kette hat eine variable Domäne (VH) an jedem Ende der sich eine Anzahl konstanter Domänen (CH) anschließt, und jede leichte Kette hat eine variable Domäne (VL) an einem Ende und eine konstante Domäne (CL) am anderen Ende. Es gibt zwei Typen von leichten Ketten, die mit kappa bzw. lambda bezeichnet werden. Die variable Domäne der leichten Kette ist mit der variablen Domäne der schweren Kette ausgerichtet und die konstante Domäne der leichten Kette ist mit der ersten konstanten Domäne der schweren Kette ausgerichtet, wobei die variablen Domänen der leichten und der schweren Ketten die Antikörper-Bindungss teile bilden.
- Die variablen Domänen der leichten und der schweren Ketten haben die gleiche allgemeine Struktur, und zwar weist jede drei hypervariable Regionen, die komplementaritätsbestimmende Regionen oder CDR's genannt werden, auf, welche zwischen vier Gerüstregionen oder FR's liegen. Die CDR's jeder variablen Domäne befinden sich in enger Nachbarschaft zu den Gerüstregionen, und die zwei Sätze CDR's ergeben zusammen die Spezifität des Antikörpers.
- Zur Klonierung der cDNA's der variablen Teile der leichten und schweren Ketten des C242:II-Antikörpers wurde zunächst mit an sich bekannten Verfahren aus dem C242:II Hybridom eine cDNA-Phagenbibliothek hergestellt. Hybridisierungssonden, die konstante Teile der schweren Kette bzw. der leichten Kette (kappa) abdecken, wurden dann unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und geeigneter Primer aus genomischer DNA der Maus hergestellt. Die sich ergebenden Sonden wurden zur Durchmusterung der cDNA- Bibliothek auf cDNA-Klone, die DNA-Sequenzen enthalten, welche die schweren und die kappa-Ketten des C242:II- Antikörpers kodieren, verwendet. Positiv hybridisierende Phagenklone wurden vermehrt und die cDNA in Form von Plasmiden herausgeschnitten. Letztere wurde durch Restriktionsenzymkartierung charakterisiert, und Plasmide, welche Insertionen mit den erwarteten Größen enthielten, wurden sequenziert. Zur Bestimmung der CDR-Regionen wurden die Aminosäuresequenzen, welche durch die Sequenzen der Insertionen kodiert werden, mit denen von bereits bekannten kappa-Ketten und schweren Ketten der Maus verglichen, wobei die Grundlokalisierung von CDR-Regionen, wie sie beispielsweise Kabat E. A. et al. (1987), Sequence of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage, U.S. Department of Health and Human Services, National Institute of Health, definierten, berücksichtigt wurden. Es wurde gefunden, daß die CDR's der entsprechenden Ketten die folgenden Aminosäuresequenzen hatten (auch in den Figuren 18 und 19 der Zeichnungen dargestellt - vgl. SEQ.-ID.-Nrn. 21 und 22):
- CDR1 (SEQ.-ID.-Nr. 1): ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGly- AsnThrTyrLeuTyr
- CDR2 (SEQ. -ID. -Nr. 2): ArgMetSerAsnLeuValSer
- CDR3 (SEQ.-ID.-Nr. 3): LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr
- CDRL (SEQ. -ID. -Nr. 4): TyrThrGlyMetAsn
- CDR2 (SEQ.-ID.-Nr. 5): TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyr-AlaGluAspPheLysGly
- CDR3 (SEQ. -ID. -Nr. 6): ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal
- Mit Kenntnis dieser CDR-Aminosäure- und/oder DNA-Sequenzen kann der Fachmann die CDR-Regionen des C242:II-Antikörpers mit Hilfe der an sich im Stand der Technik bekannten Ortsgerichteten Mutagenese in die klonierten variablen Teile eines anderen Antikörpers oder Antikörperfragments einführen. Ein derartiges Verfahren, das allgemein als "CDR- Pfropfung" bekannt ist (beispielsweise in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP 239 400 beschrieben) ist damit verbunden, daß auf der DNA-Ebene die CDR- kodierenden Sequenzen des Empfängerantikörpers oder -fragments durch die CDR-kodierenden Sequenzen des C242:II- Antikörpers substituiert werden, was einen Antikörper oder ein Antikörperfragment ergibt, der/das eine entsprechende Spezifität wie der monoklonale C242:II-Antikörper hat. Die Zielzell-Bindungskomponente umfaßt daher natürlich eine beliebige Komponente, die einen Antikörper oder ein Antikörperfragment mit mindestens einer der oben definierten CDR's (oder CDR's, die in wesentlichen wie oben definiert sind) aufweist, wobei die Anzahl CDR's und ihre Anordnung im Antikörper oder Antikörperfragrnent derart sind, daß die Zielzell-Bindungskomponente im wesentlichen die gleichen Zellbindungseigenschaften wie der C242-Antikörper hat. Es ist allgemein bevorzugt, daß die Zielzell-Bindungskomponente alle CDR's (d.h. CDR1, CDR2 und CDR3 der leichten Ketten und CDR1, 2 und 3 der schweren Kette) umfaßt, wie sie oben definiert sind (oder im wesentlichen wie oben definiert sind). Im wesentlichen wie oben definierte CDR's umfassen beispielsweise verlängerte Sequenzen:
- CDRI (SEQ.-ID.-Nr. 7): ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGly-AsnThrTyrLeuTyrTrpPhe
- CDR2 (SEQ. -ID. -Nr. 8): IleTyrArgMetSerAsnLeuValSerGlyVal
- CDR3 (SEQ.-ID.-Nr. 9): LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThrPheGly
- CDRI (SEQ.-ID.-Nr. 10): PheThrTyrThrGlyMetAsn
- CDR2 (SEQ. -ID. -Nr. 11): MetGlyTrpIleAspThrThrThrGlyGluPro-ThrTyrAlaGluAspPheLysGlyArgLle
- CDR3 (SEQ. -ID. -Nr. 12): AlaArgArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAsp-ValTrpGly
- Durch CDR-Pfropfung hergestellte Antikörper oder Antikörperfragmente werden vorzugsweise hergestellt, indem die C242-CDR's auf ein Gerüst gepfropt werden, das so ausgewählt ist, daß es sowohl hinsichtlich der Homologie als auch der CDR-Größe dem von C242 ähnelt.
- Es ist klar, daß das Konjugat der vorliegenden Erfindung nicht notwendigerweise aus einem Toxin-Molekül und einem Antikörper-Molekül besteht. Beispielsweise kann das Konjugat mehr als ein Toxin-Molekül pro Antikörper-Molekül aufweisen.
- Die Toxin-Komponente weist im allgemeinen eine Komponente auf, die cytotoxische Eigenschaften besitzt, und ist daher nach der Aufnahme in das Innere zur Abtötung von Zellen in der Lage.
- Die Zielzell-Bindungskomponente weist im allgemeinen eine Zielzell-Bindungskomponente auf, die eine spezifische antigene Determinante oder Zielzelle erkennen kann.
- Die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente können direkt miteinander gekuppelt werden, oder sie können indirekt gekuppelt werden. Die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente werden im allgemeinen so gekuppelt, daß die Geometrie des Konjugats die Bindung der Zielzell-Bindungskomponente an ihre Zielzelle gestattet. Vorteilhafterweise sind die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente so gekuppelt, daß das Konjugat extrazellulär stabil und intrazellulär unstabil ist, so daß die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente außerhalb der Zielzelle gekuppelt bleiben, aber im Anschluß an die Aufnahme die Toxin-Komponente freigesetzt wird. Daher hat das Konjugat vorteilhafterweise eine intrazellulär spaltbare/extrazellulär stabile Stelle.
- Beispiele für Konjugate, bei denen die Toxin-Komponente direkt an die Zielzell-Bindungskomponente gekuppelt ist, sind solche, bei denen die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente durch eine Disulfid-Brücke gekuppelt sind, die zwischen einer Thiol-Gruppe an der Toxin-Komponente und einer Thiol-Gruppe an der Zielzell- Bindungskomponente gebildet wird.
- Die Zielzell-Bindungskomponente kann einen Teil aufweisen, der die Toxin-Komponente erkennt und daher die Toxin- Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente kuppelt. Ein Beispiel für den letzteren Fall ist eine einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der/das die Toxin-Komponente bindet, aufweisende Zielzell-Bindungskomponente.
- Die Zielzell-Bindungskomponente und die Toxin-Komponente können eine einzelne Polypeptid-Kette aufweisen, die vorzugsweise eine intrazellulär spaltbare Stelle besitzt, so daß die Toxin-Komponente in der Zelle freigesetzt wird. In einem derartigen Polypeptid können die Toxin- und die Zielzell-Bindungskomponente über einen Polypeptid-Linker verbunden sein.
- Beispiele für Konjugate, bei denen die Toxin-Komponente indirekt an die Zielzell-Bindungskomponente gekuppelt ist, sind solche, bei denen die Toxin-Komponente durch einen bifunktionellen Linker, insbesondere einen heterobifunktionellen Linker, an die Zielzell-Bindungskomponente gekuppelt ist.
- Geeignete Linker umfassen beispielsweise Linker, die ein Polypeptid aufweisen, beispielsweise die in der PCT- Patentanmeldung WO 85/003508 beschriebenen, und Linker, welche chemische Reste aufweisen, beispielsweise die in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 169 111 beschriebenen.
- Aus Bequemlichkeitsgründen sind die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente über eine Disulfid-Bindung oder eine Thioether-Bindung gekuppelt. Im allgemeinen ist bevorzugt, daß die Toxin-Komponente und die Zielzell- Bindungskomponente durch einen Linker gekuppelt sind, der die Komponenten durch eine intrazellulär spaltbare Disulfid- oder Thioether-Bindung kuppelt. Beispiele für derartige Linker und ihre Verwendung zur Herstellung von Immunotoxinen sind in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 169 111, in Methods in Enzymologv 112, 207-225, 1985 (Cumber, A. J., Forrester, J. A., Foxweel, B. M. J., Ross, W. C. J., Thorpe, P. E. - Preparation of antibody-toxin conjugates) und in Vogel, Immunoconjugates: Antibody conjugates in radioimaging and therapy of cancer, S. 28-55 (Wawrzynczak, E. J. und Thorpe, P. E. - Methods for preparing immunotoxins: effects of the linkage on activity and stability) beschrieben.
- Besondere Linker umfassen solche, die eine Disulfid-Bindung mit einer Thiol-Gruppe an einer der Komponenten, welche die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente bilden, und eine Amid-Bindung mit einer Amino-Gruppe an der anderen der Komponenten, welche die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente bilden, bildet.
- Beispiele für besondere Linker sind solche mit folgender Formel:
- -S-X-CO-
- in der X eine Spacer-Gruppe ist.
- X kann eine geradkettige Alkyl-Gruppe, die gegebenenfalls mit einem oder zwei unter (1-6C)Alkyl, Phenyl und (1-4C)Alkylphenyl ausgewählten Substituenten substituiert ist, oder eine (1-4C)Alkylphenyl-Gruppe, wobei der Alkyl- Rest gegebenenfalls mit einem oder zwei unter (1-6C)Alkyl, Phenyl und (1-4C)Alkylphenyl ausgewählten Substituenten
- substituiert ist und der Phenyl-Ring einen unter beispielsweise Halogen, (1-4C)Alkyl und (1-4C)Alkoxy ausgewählten Substituenten tragen kann, umfassen.
- Im allgemeinen ist bevorzugt, daß beispielsweise in X die Alkyl-Gruppe einen unter den oben erwähnten ausgewählten Substituenten trägt.
- Beispielsweise kann X eine (1-6C)Alkyl-Kette, die gegebenenfalls mit einem oder zwei unter (1-4C)Alkyl und Phenylen ausgewählten Substituenten substituiert ist, umfassen. Besondere Werte für X umfassen beispielsweise eine Methylen-, Ethylen-, Propylen-, Butylen-Gruppe, die gegebenenfalls mit einer oder zwei unabhängig unter Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl (insbesondere, sofern durch Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl substituiert) ausgewählten Gruppen substituiert ist.
- Wichtige konkrete Werte für X sind solche, bei denen X eine Methylen- oder Ethylen-Gruppe aufweist, die gegebenenfalls durch eine oder zwei oben definierte Gruppen definiert ist.
- Vorzugsweise weist X eine Ethylen-Gruppe auf, die unsubstituiert ist oder mit einer oder zwei Methyl-Gruppen substituiert ist, insbesondere eine Ethylen-Gruppe, die mit einer Methyl-Gruppe substituiert ist.
- Bevorzugte Konjugate der vorliegenden Erfindung umfassen die mit der folgenden Formel:
- A-S&sub1;-S&sub2;-X-CO -B
- in der:
- A eine der Komponenten umfaßt, welche die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente bilden, und B die andere der Komponenten umfaßt, welche die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente bilden, wobei die Zielzell-Bindungskomponente eine oder mehrere Toxin- Komponenten tragen kann, S&sub1; ein an A vorhandenes Schwefelatom ist, NH sich an B befindet und S&sub2;-X-CO der Linker ist, wobei S&sub2; ein Schwefelatom ist und X das oben definierte bedeutet.
- Es ist klar, daß S von einer Thiol-Gruppe an A stammt.
- Es ist klar, daß im Falle eines Linker, der ein chiräles Zentrum enthält, dieser in optischer aktiver oder racemischer Form vorliegen und isoliert werden kann. Die Erfindung umfaßt die Verwendung einer beliebigen optisch aktiven oder racemischen Form des Linkers. Die Synthese von optisch aktiven Formen kann durch Standardverfahren der organischen Chemie, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, durchgeführt werden.
- Vorzugsweise weist A die Toxin-Komponente und B die Zielzell-Bindungskomponente auf.
- Wie bereits oben angegeben, kann die Toxin-Komponente eine beliebige Komponente umfassen, die cytotoxische Eigenschaften besitzt. Beispiele für derartige Komponenten sind Polypeptide, die Ribosomen inaktivieren und somit die Protein-Synthese inhibieren können. Besondere Beispiele umfassen Polypeptide, die in der Natur vorgefunden werden, und Komponenten derartiger Polypeptide. Wenn ein derartiges Polypeptid eine toxische Komponente und eine im wesentlichen nicht-toxische Komponente umfaßt, weist die Toxin- Komponente zweckmäßigerweise die toxische Komponente auf. Beispielsweise kann die Toxin-Komponente Ricin umfassen, wobei aber aus Bequemlichkeitsgründen die Toxin-Komponente die A-Kette von Ricin umfaßt. Die Toxin-Komponente kann ferner Teile oder Analoge von in der Natur vorgefundenen Polypeptiden, die cytotoxische Eigenschaften besitzen, umfassen. Geeignete Polypeptide für die Toxin-Komponente und ihre Herstellung werden in "Ribosome inactivating proteins up to date" - Stripe F. and Barbieri L., FEBS 3269 und in den darin angegebenen Literaturstellen beschrieben. Besonders geeignete Polypeptide für die Toxin-Komponente umfassen die A-Kette von Ricin (Ricin A), Restrictocin und das Shiga-Toxin. Weitere geeignete Polypeptide für die Toxin-Komponente sind beispielsweise Abrin, Viscumin, Modeccin, Volkensin, Gelonin, das antivirale Protein aus der Kermesbeere, Saprom, Luffin, Trichosanthin, das Ribosomen inaktivierende Protein aus Gerste, Dianthine, Byodin, Momordin, Tritin, Dodecandrin, a-Sarcin, Mitgellin, das Diphtherie-Toxin, das Pseudomonas-Exotoxin A und die "Shiga-ähnlichen" Toxine, VT1 und VT2.
- Analoge von in der Natur vorgefundenen Polypeptiden umfassen solche Polypeptide, die eine Primärstruktur besitzen, die mit der des in der Natur vorgefundenen Polypeptids insofern in Beziehung steht, als sie sich nur durch eine Änderung einer oder mehrerer Aminosäuren (Deletionen, Additionen, Substitutionen) unterscheidet, welche nicht zu einem Verlust der cytotoxischen Wirkung führen. Besondere Beispiele für derartige Analogen sind solche, bei denen die Änderung oder Anderungen die Kupplung an die Zielzell-Bindungs komponente erleichtern.
- Wenn die Toxin-Komponente ein in der Natur vorgefundenes Polypeptid oder einen Teil davon aufweist, kann die Toxin Komponente hergestellt werden, indem das Polypeptid aus einer natürlichen Quelle isoliert wird, und wenn ein Teil erforderlich ist, das isolierte Polypeptid mit chemischen Mitteln, beispielsweise enzymatisch, modifiziert wird. Das Polypeptid oder Teile davon können ferner durch gentechnische Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren umfassen die Techniken zur Rekombination von DNA, bei denen eine DNA-Sequenz, die ein gewunschtes Polypeptid kodiert, gewöhnlich in einen geeigneten Vektor oder Plasmid eingeführt wird. Mit dem Vektor oder dem Plasmid transformierte Wirtszellen können unter geeigneten Bedingungen zur Expression der DNA-Sequenz und zur Bildung des Polypeptids kultiviert werden.
- Vorzugsweise umfaßt die Toxin-Komponente Ricin A, einen Teil davon oder ein Analoges davon auf. Wenn die Toxin- Komponente Ricin A umfaßt, ist das Ricin A aus den Samen von Ricinus communis oder der "Rizinusbohnen"-Pflanze erhältlich. Vorzugsweise jedoch wird die A-Kette oder das Ricin durch gentechnische Verfahren hergestellt. Somit ist rekombiniertes Ricin A oder Ricin bevorzugt.
- Das durch die Technik zur Rekombination von DNA erhaltene Ricin A ist gegenüber dem aus natürlichen Quellen erhaltenen allgemein bevorzugt, da die Technik zur Rekombination von DNA die Herstellung von Ricin A gestattet, das nicht mit der B-Kette von Ricin kontaminiert ist und weil das auf diese Weise hergestellte Ricin A nicht glykosyliert ist. Daher führt die Verwendung von rekombiniertem Ricin A zu einem selektiveren Konjugat, weil die ohne Unterscheidung bindende B-Kette fehlt und weil die Zuckerreste fehlen, die unspezifische Wechselwirkungen mit Zelloberflächen ergeben können.
- In einer bevorzugten Ausführungsform weist ein Konjugat der vorliegenden Erfindung eine Zielzell-Bindungskomponente auf, die für kolorektale Tumorzellen selektiv ist.
- Die Zielzell-Bindungskomponente weist vorzugsweise den C242-Antikörper oder ein Fragment davon, insbesondere den C242-Antikörper, auf.
- Die Toxin-Komponente und die Zielzell-Bindungskomponente sind vorzugsweise durch den 3-Mercaptobuttersäure-Rest, -CO.CH&sub2;.CH(CH&sub3;)-S-, gekuppelt. Dieser Rest wird leicht durch eine kovalente Bindung zwischen einer NH-Gruppe an der Zielzell-Bindungskomponente, beispielsweise das NH eines Lysyl-Restes, an die Zielzell-Bindungskomponente gebunden, und durch eine Disulfid-Brücke mit einer Thiol- Gruppe an der Toxin-Komponente, beispielsweise der Thiol- Gruppe am Cystein-Rest in Ricin A.
- Somit stellt die vorliegende Erfindung insbesondere ein Immunotoxin bereit, welches den C242-Antikörper und rekombiniertes Ricin A aufweist, die durch den 3-Mercaptobuttersäure-Rest, -COCH&sub2;CH(CH&sub3;)-S-, über einen Amino-Rest an C242 und über ein Thiol eines Cystein-Restes in Ricin A verknüpft sind.
- Ein bevorzugtes Immunotoxin ist ein solches, das den C242- Antikörper und rekombiniertes Ricin A aufweist, die durch die terminale Amino-Gruppe eines Lysyl-Restes in C242 mit dem terminalen Thiol eine Cystein-Restes in Ricin A durch einen 3-Mercaptobuttersäure-Direst verbunden sind.
- Jede Antikörper-Einheit wird im allgemeinen mindestens eine Ricin-A-Einheit tragen. Es ist klar, daß eine Antikörper- Einheit mehr als einen rekombinierten Ricin-A-Rest über entsprechende Linker-Reste tragen kann. Es ist klar, daß der Antikörper neben dem mit Ricin A verbundenen einen oder mehrere Linker-Reste tragen kann. Dieser zusätzlichen Linker-Reste können ein nicht-toxisches Molekül tragen, beispielsweise Cystein. Derartige Linker können daher durch das nicht-toxische Molekül "abgedeckt" werden.
- Die Immunotoxine der vorliegenden Erfindung sind zur Behandlung von gastromtestinalen Tumoren, und zwar insbesondere kolorektalen oder pankreatischen Tumoren, von potentiellem Nutzen. Somit wird nach der vorliegenden Erfindung ferner ein Verfahren zur Behandlung von gastromtestinalen Tumoren bereitgestellt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Konjugats (wie oben definiert) an einen Warmblüter wie dem Menschen umfaßt.
- Es ist klar, daß die Dosis und das Vorgehen bei der Dosierung von der konkreten Toxin-Komponente, die verwendet wird, der Population der Zielzelle und der Geschichte des Patienten abhängig sein wird. Das Konjugat wird typischerweise in einer Dosis im Bereich von 0,1 bis 1 mg/kg Patientengewicht verabreicht.
- Die Konjugate der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht. Somit wird nach der vorliegenden Erfindung ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Konjugat (wie oben definiert) in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.
- Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von Dosierungsformen formuliert werden. Im allgemeinen werden die Konjugate der vorliegenden Erfindung parenteral, vorzugsweise intravenös, verabreicht. Eine besondere parenterale pharmazeutische Zusammensetzung ist eine solche, bei der die Dosiereinheit so formuliert ist, daß sie sich zur Verabreichung durch Injektion eignet. Somit umfassen besonders geeignete Zusammensetzungen eine Lösung, Emulsion oder Suspension des Immunotoxins in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen parenteralen Trägermittel oder Verdünnungsmittel. Geeignete Trägermittel oder Verdünnungsmittel umfassen wäßrige Vehikel, beispielsweise Wasser oder Kochsalzlösung, und nicht-wäßrige Vehikel, beispielsweise fette Öle oder Liposomen. Die Zusammensetzungen können Mittel enthalten, welche die Stabilität des Konjugats in der Zusammensetzung erhöhen. Beispielsweise kann die Zusammensetzung einen Puffer, beispielsweise Tween, enthalten. Die Konzentration des Konjugats variiert, wobei aber im allgemeinen das Konjugat in Konzentrationen von etwa 1 bis 10 mg/Dosis formuliert wird.
- Der Antikörper C242 ist für kolorektale Tumorzellen selektiv, und es wurde gefunden, daß Konjugate, die diesen Antikörper enthalten, starke Immunotoxine sind, welche für kolorektale Tumorzellen selektiv sind.
- Insbesondere wurde gefunden, daß das bevorzugte Konjugat der vorliegenden Erfindung ein überraschend wirksames Immunotoxin ist, weil es sowohl selektiv für kolorektale Tumorzellen als auch wirksam ist. Ferner wurde gefunden, daß dieses Konjugat eine verhältnismäßig geringe Blut- Clearance besitzt und extrazellulär verhältnismäßig langsam gespalten und zerstört wird, wodurch die Persistenz im Plasma verbessert wird. Dadurch ergibt sich der potentielle Vorteil, daß das Immunotoxin ausreichend lange mit seinen Zielzellen in Wechselwirkung treten kann, bevor es zur Clearance oder zur Zerstörung kommt.
- Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Herstellung eines oben definierten Konjugats bereit:
- (a) Für solche Konjugate, bei denen die Zielzell- Bindungskomponente direkt an die Toxin-Komponente gekuppelt ist, wird die Toxin-Komponente mit der Zielzell-Bindungskomponente umgesetzt.
- Wenn beispielsweise die Zielzell-Bindungskomponente durch eine Disulfid-Brücke an die Toxin-Komponente gekuppelt ist, kann eine der Komponenten, welche die Zielzell-Bindungskomponente und die Toxin-Komponente bilden, beispielsweise unter Verwendung von Dithiothreitol reduziert werden, bevor die Umsetzung mit der anderen Komponente, welche die Zielzell-Bindungskomponente oder die Toxin-Komponente bilden, erfolgt.
- Für solche Konjugate, bei denen die Zielzell-Bindungskomponente durch einen Linker an die Toxin-Komponente gekuppelt ist, wird die mit dem Linker derivatisierte Zielzell-Bindungskomponente mit der Toxin-Komponente umgesetzt, oder die mit dem Linker derivatisierte Toxin- Komponente wird mit der Zielzell-Bindungskomponente umgesetzt.
- Die geeignete Komponente wird durch Umsetzung mit einem Linker-Agens derivatisiert, um den Linker an die Komponente zu binden. Bequemerweise wird die derivatisierte Zielzell- Bindungskomponente mit der Toxin-Komponente umgesetzt.
- Die derivatisierte Zielzell-Bindungskomponente oder die derivatisierte Toxin-Komponente kann beispielsweise hergestellt werden, indem die Komponente in einem geeigneten Puffer (beispielsweise einem Acetat-, Phosphat- oder Boratpuffer) gelöst und der pH-Wert auf einen Wert eingestellt wird, der mit dem Linker-Agens verträglich ist. Das Linker-Agens kann dann zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden. In Fällen, in denen das Linker-Agens in dem Reaktionsgemisch unlöslich ist, kann eine Lösung der Zielzell- Bindungskomponente oder der Toxin-Komponente, so wie es zweckmäßig ist, zu einer Lösung des Linker-Agens in einer geringen Menge eines organischen Lösungsmittels wie Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid gegeben werden. Nach der Umsetzung mit dem Linker-Agens kann das derivatisierte Produkt durch Standardtechniken wie Gelfutration, Dialyse oder Säulenchromatographie abgetrennt werden. Das denvatisierte Produkt (die derivatisierte Zielzell-Bindungskomponente oder die derivatisierte Toxin-Komponente) kann dann mit der anderen Komponente zur Herstellung des fertigen Konjugats umgesetzt werden.
- Es ist klar, daß die genaue Art des verwendeten Linker- Agens von der Art der Gruppen (beispielsweise Thiol, Carboxy oder Amino) an der Zielzell-Bindungskomponente und der Toxin-Komponente, die zur Konjugation verfügbar sind, abhängig ist.
- Die Toxin-Komponente kann aus natürlichen Quellen hergestellt werden. Vorzugsweise wird die Toxin-Komponente durch die Techniken zur Rekombination von DNA hergestellt. In dieser Technik werden Verfahren angewendet, die dem Fachmann gut bekannt sind und die beispielsweise Techniken zur Extraktion von mRNA, zur Herstellung von cDNA- Bibliotheken, zur Konstruktion von Vektoren, zur Transformation von Zellen und zur Kultivierung von transformierten Wirtszellen zur Expression des Toxin- Polypeptids umfassen. Geeignete Wirte zur Expression der gewünschten Toxin-Komponenten sind beispielsweise Prokaryoten, z.B. E. coli, und Eukaryoten, z.B. Hefe. Diese Verfahren werden in der nachstehend beschriebenen Herstellung des Konjugats veranschaulicht.
- Die Zielzell-Bindungskomponente weist im allgemeinen einen Antikörper oder ein Antikörperfragment oder eine Derivat davon auf. Der Antikörper umfaßt vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper. Antikörper können nach auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren hergestellt werden. Sie können aus Serum, Milz und aus Antikörper sezernierenden Hybridomen isoliert werden.
- Die Herstellung von Antikörpern ist beispielsweise beschrieben in Methods in Enzymology, Bd. 178, Antibodies, Antigens und Molecular Mimicry, herausgegeben von J. Langone, Academic Press Inc. (vgl. insbesondere Abschnitt II: Engineered Antibodies); und Methods in Enzymology, Bd. 73, Immunochemical Techniques Part B; heraugegeben von J. Langone und H. Van Vunakis; Academic Press Inc. (vgl. insbesondere Abschnitt 1: Production of Antibodies)
- Wenn der Linker die Gruppe -S-X-CO- aufweist, kann der Antikörper (oder die Toxin-Komponente) durch Umsetzung mit einer Verbindung der Formel L&sub1;-S-X-CO-L&sub2;, wobei L&sub1; und L&sub2; austauschbare Gruppen sind, derivatisiert werden. Beispielsweise kann CO-L&sub2; eine Carbonsäure-Gruppe oder, vorzugsweise, eine aktivierte Carbonsäure-Gruppe umfassen. Beispielsweise kann die Gruppe CO-L&sub2; eine Ester- oder Anhydrid-Gruppe umfassen. Besondere Beispiele für L&sub2; sind eine Imidazolyl-Gruppe oder eine Succinimidylester-Gruppe.
- L&sub1; kann eine Gruppe umfassen, bei der es sich um eine Gruppe handelt, die durch Oxidation der Thio-Gruppe entfernt wird, beispielsweise kann es eine Pyridin-Gruppe aufweisen. Der Linker wird im allgemeinen mit einer reduzierten Thiol-Gruppe an der Antikörper- oder Toxin- Komponente (vorzugsweise der Toxin-Komponente) umgesetzt.
- Wenn andere Linker verwendet werden, werden sie mit der Antikörper- und Toxin-Komponente nach Verfahren umgesetzt, die auf dem Fachgebiet bekannt sindc Im allgemeinen wird der Linker mit entsprechenden verfügbaren funktionellen Gruppen an der Zielzell-Bindungskomponente und der Toxin- Komponente umgesetzt. Die Zielzell-Bindungs- und Toxin- Komponente können jedoch direkt gekuppelt werden, nämlich durch Bildung einer kovalenten Verknüpfung, beispielsweise einer Disulfid-Bindung.
- Wenn die Toxin-Komponente eine Suifhydryl-Gruppe aufweist, beispielsweise wie die Gruppe eines Cystein-Restes, kann diese zur Konjugation verwendet werden. Beispielsweise kann sie zur Bildung einer Disulfid-Bindung mit einer Suifhydryl-Gruppe an der Zielzell-Bindungskomponente oder an einem Linker verwendet werdenc Wenn keine Suifhydryl- Gruppe an der Toxin-Komponente vorhanden ist, kann diese so derivatisiert werden, daß eine derartige Gruppe zur Verfügung steht und dadurch die Konjugat erleichtert wird. Diese Derivatisierung kann beispielsweise unter Verwendung von Iminothiolan durchgeführt werden
- Wenn Polypeptid-Linker verwendet werden, kann der Linker mit freien Carboxy- oder Amino-Gruppen an der Toxin- und Zielzell-Bindungskomponente umgesetzt werden.
- Wenn die Toxin-Komponente die A-Kette von Ricin aufweist und der Linker den Direst -COCH&sub2;CH(CH&sub3;)-S- aufweist, ist ein geeignetes Linker-Agens N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrat. Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung eines derartigen Immunotoxins wird die derivatisierte Zielzell-Bindungskomponente mit reduziertem Ricin A umgesetzt.
- Die Zielzell-Bindungskomponente wird durch Umsetzung mit einem Kupplungsmittel, beispielsweise N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)butyrat derivatisiert, und die A-Kette von Ricin wird durch Behandlung mit einem geeigneten Reduktionsmittel zur Reduktion der Thiol-Gruppe an der freien Cystein-Gruppe, beispielsweise unter Verwendung von Dithiothreitol, reduziert.
- Bequernerweise wird ein überschuß des Linker-Agens verwendet, so daß die derivatisierte Zielzell-Bindungskomponente mehr als einen daran gebundenen Linker aufweist. Nach der Reaktion mit Ricin A werden alle Linker-Gruppen, die nicht an Ricin A gebunden sind, durch Umsetzung mit einer Blockierungsgruppe, beispielsweise Cystein, abgedeckt.
- Die Konjugate der vorliegenden Erfindung sind potentiell zur Behandlung von Tumoren nützlich. Die kann durch die Fähigkeit des Konjugats demonstriert werden, die Protein- Synthese in Tumorzellen in vitro zu inhibieren und/oder durch die Fähigkeit des Konjugats die Größe oder das Wachstum des Tumors in vivo zu verringern. Die Details geeigneter Testprotokolle sind nachstehend angegeben.
- Figur 1 veranschaulicht die Konstruktion von pICI 0020,
- Figur 2 veranschaulicht die Konstruktion von pTB344,
- Figur 3 veranschaulicht die Konstruktion von pICI 0042,
- Figur 4 veranschaulicht die Konstruktion von pICI 1079,
- Figur 5 veranschaulicht die Konstruktion von pICI 1187,
- Figur 6 ist ein mit Coomassie-Blau gefärbtes SDS-Gel von E.-coli-Lysaten, wobei Spur A pICI 1102 und Spur B pICI 0020 ist und Spur C Molekulargewichtsmarker sind,
- Figur 7 zeigt ein Geiprofil von pICI 1102, in dem Peak R Ricin A darstellt,
- Figur 8 ist ein Western-blot von Ricin A, das von pICI 1102 gebildet wird, wobei Spur 1 Molekulargewichtsmarker sind, die Spuren 2 und 3 Klone sind, die kein Ricin bilden, Spur 4 pICI 1102 und Spur 5 pICI 0020 (Kontrollplasmid - nicht-Ricin-A-Sequenz) ist.
- Figur 9 ist eine Teilsequenz von pICI 1102, Figur 10 veranschaulicht die Konstruktion von pICI 1102,
- Figur 11 beschreibt ein Fragment, das zur Herstellung von Plasmiden verwendet wird,
- Figur 12 ist eine Plasmid-Karte von pICI 0042,
- Figur 13 gibt die Sequenz eines Transkriptionsterminators an,
- Figur 14 ist eine Plasmid-Karte von pICI 1079,
- Figur 15 veranschaulicht die Endocytose von ¹²&sup5;I-C242 durch COLO-205-Zellen;
- Figur 16 veranschaulicht die In-vitro-Cytotoxizität des C242/Ricin-A-Immunotoxins für COLO-205-Zellen,
- Figur 17 veranschaulicht einen Antikörper, Figur 18 veranschaulicht die cDNA-Sequenz der C242- kappa-Kette, variable Region (cDNA in Plasmid pKGE76L), und Figur 19 veranschaulicht die cDNA-Sequenz der schweren Kette von C242, variable Region (cDNA in Plasrnid pKGE762).
- Die Erfindung wird nun anhand der folgenden nicht-beschränkenden Beispiele veranschaulicht, für die, sofern nichts anderes angegeben ist folgendes gilt:
- (i) Abdampfungen wurden durch Rotationsverdampfung im Vakuum durchgeführt,
- (ii) die Arbeitsvorgänge wurden bei Raumtemperatur, d.h. im Bereich 18-26ºC, durchgeführt,
- (iii) die Ausbeuten dienen nur zur Veranschaulichung und sind nicht notwendigerweise die durch sorgfältige Verfahrensentwicklung maximal erhältlichen,
- (v) die Protonen-NMR-Spektren wurden normalerweise bei 200 MHz in deuteriertem Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel unter Verwendung Tetramethylsilan (TMS) als internem Standard bestimmt und sind in Form der chemischen Verschiebungen (δ-Werte) in Teile pro Million Teile, auf TMS bezogen, ausgedrückt, wobei übliche Abkürzungen zur Bezeichnung der Hauptpeaks verwendet werden: s, Singulett, rn, Multiplett, t, Triplett, br, breit, d, Dublett
- (vi) folgende Abkürzungen werden verwendet:
- BSA - Rinderserumalbumin
- PBS - phosphatgepufferte Kochsalzlösung
- IPTG - Isopropylthio-β-galactosid
- ETOH - Ethanol
- SDS-PAGE - Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE)
- Eine Lösung des monoklonalen Antikörper C242 (200 mg) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Natriumphosphat/150 mM Natriumchlorid, pH 7,2) mit einer Konzentration von 4,4 mg/ml wurde durch Membranfiltration (Amicon YMLO- Membran) bei 4ºC auf 12 mg/ml konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 0,5 Volumenteilen Boratpuffer (100 mM Natriumborat, pH 9,1) verdünnt. Die Protein-Konzentration wurde durch Bestimmung der Absorption bei 280 nm ermittelt, und der pH-Wert der durchmischten Lösung betrug 8,8 +/- 0,1.
- N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrat (der "Linker") wurde in trockenem, redestillierten Dimethylformamid oder Acetonitril in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Ein Aliquot dieser Lösung (0,352 ml), das 3,52 mg N- Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrat enthielt, wurde sofort zu der konzentrierten Antikörperlösung gegeben. Die sich ergebende Lösung wurde durchmischt und dann 1 h bei 15cc stehengelassen. Dann wurde die Lösung auf eine Entsalzungssäule (G25 Sephadex - Pharmacia, 2,6 x 58 cm, Fließgeschwindigkeit 2 ml/min, mit 50 mM Natriumphosphat/150 mM Natriumchlorid/1 mM EDTA, pH 8,0, äquiulibriert) aufgetragen, um überschüssige Reagenzien zu entfernen und den Puffer des derivatisierten Antikörpers auszutauschen. Alternativ können die Reaktionsprodukte durch Querstromfiltration entfernt werden. Der entsalzte derivatisierte Antikörper wurde gepoolt und die Protein- Konzentration durch Bestimmung der Absorption bei 280 nm ermittelt. Der Grad der Derivatisierung mit dem Linker wurde durch Zugabe eines überschusses Dithiothreitol und Bestimmung der Freisetzung von freien Thiopyridyl-Gruppen bei 343 nm ermittelt. Es wurde gefunden, daß der Grad der Derivatisierung 4 bis 6 Linker-Gruppe pro Mol Antikörper beträgt.
- Das rekombinierte Ricin A wurde durch Behandlung einer Lösung von Ricin A in Phosphatpuffer bei pH 8 mit einem überschuß Dithiothreitol reduziert und durch Querstromfutration konzentriert. überschüssige Reagenzien wurden durch Säulenchromatographie (G25-Sephadex - Pharmacia, 2,6 x 58 cm, Fließgeschwindigkeit 2 rnl/min, in 50 mM Natriumphosphat/150 RIM Natriumchlorid/1 mM EDTA, pH 8,0) entfernt.
- Das rekombinierte Ricin A wurde mit dem derivatisierten Antikörper konjugiert, indern Lösungen des hergestellten rekombinierten Ricin A (190 mg) und des derivatisierten Antikörpers (190 mg) vermischt wurden, so daß sich ein Verhältnis Ricin A/derivatisierte Antikörper von 1:1 G/G ergab. Dann wurde Glycerol bis zu einer Konzentration von 20 % V/V dazugegeben und das Gefäß mit Argon gespült. Die sich ergebende Lösung wurde 40 bis 65 Stunden bei 15ºC gehalten.
- Anschließend wurde Cystein dazugegeben, so daß sich eine Endkonzentration von 0,2 mM (ein mindestens 10-facher molarer überschuß in bezug auf die Linker-Gruppen am Antikörper) ergab, um überschüssige Linker-Gruppe am Antikörper abzudecken. Die Lösung wurde durchmischt und 2 bis 3 h bei 20ºC gehalten. Nach der Abdeckung mit Cystein wurde eine Probe des sich ergebenden Immunotoxins durch Behandlung mit einem überschuß Dithiothreithol und überwachung bei 343 nm zur Quanitisierung der Vollständigkeit der Umsetzung analysiert.
- Die das Konjugat enthaltende Lösung wurde dann durch Membranfiltration (Amicon-YM10-Membran) konzentriert und auf eine Chromatographiesäule (HR300-Sephacryl - Pharmacia, 2,6 x 50 cm, Fließgeschwindigkeit 3 ml/min, Puffer: 50 mM Natriumphosphat/25 mM Natriumchlorid/1 mM EDTA) aufgebracht, was zur Abtrennung des Immunotoxins und des unkonjugierten Antikörpers von unkonjugiertem Ricin A führte. Der das Gemisch aus Immunotoxin und Antikörper enthaltende Peak wurde gepoolt und die Protein-Konzentration durch Bestimmung der Absorption bei 280 nm ermittelt.
- Die sich ergebende Lösung, die sowohl unkonjugierten Antikörper als auch Immunotoxin enthielt, wurde durch Zugabe von 1 M HCl auf pH 6,3 eingestellt und auf eine Säule aufgetragen, die eine Triazin-Farbstoff-Matrix (Mimetic A6XL, ACL plc, Cambridge, UK, 8 x 26 cm Säule, Fießgeschwindigkeit 1,5 ml/min) enthielt. Die Säule wurde mit 100 ml Startpuffer gewaschen, wodurch der unkonjugierte Antikörper eluiert wurde, und das Immunotoxin wurde mit 0,5 M Natriumchlorid enthaltendem Startpuffer eluiert. Die Immunotoxin-Lösung wurde gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert, durch ein 0,22 um-Filter futriert und bei 4ºC aufbewahrt.
- Die Reinheit des Immunotoxins wurde durch SDS Polyacrylamid-Elektrophorese bestimmt. Es waren insgesamt 45 mg Immunotoxin enthalten, was die folgenden Zusammensetzung hatte: 50 bis 60 % mono-Ricin-A-Derivat, 10 bis 30 % di-Ricin-A-Derivat, 5 bis 15 % tri-Ricin-A-Derivat und < 10 % underivatisierter Antikörper.
- Alternativ können in der Reinigungssequenz der Gelfiltrationsschritt (Entfernung von restlichem r-Ricin A) und der Farbstoffaffinitäts-Chromatographieschritt (Entfernung von restlichem C-242-Antikörper) umgekehrt werden. Bei dieser Variation des Verfahrens wird das Konjugationsgemisch unmittelbar nach dem Blockieren der nicht-umgesetzten Linker-Reste mit Cystein (wie oben beschrieben) auf eine Leitfähigkeit von weniger als 5 mS mit destilliertem Wasser verdünnt. Der pH-Wert wird dann mit 1 M Essigsäure auf 6,0 eingestellt und die Lösung durch Membran-Filtration geklärt. Dann wurde die Lösung auf eine Farbstoff-Ligandensäule aufgebracht < 2,5 ml Gel/mg r-Ricin A, das im Konjugationsgemisch verwendet wurde). Anschließend wurde die Sule mit 0,68%igem Natriumacetat, pH 6,0, gewaschen, bis der unkonjugierte C242-Antikörper durch die Säule gewaschen war. Das Immunotoxin und das restliche r- Ricin A können dann mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer mit einer Natriumchlorid-Konzentration von 0,5 M bei pH 7, eluiert werden. Dieses Eluat wird dann durch Querstromfiltration unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems mit Spiralpatrone konzentriert und auf eine Säule mit Sephacryl S300HR (2,5 ml Gel für jedes mg Antikörper, das in der ursprünglichen Konjugationsreaktion verwendet wurde, und in einem Volumen (5 % des Gesamtvolumens der Säule) aufgebracht. Die Säule wurde dann mit einem beliebigen geeigneten Formulierungspuffer wie phosphatgepufferter Kochsalziösung, pH 7,2, äquilibriert
- Das oben verwendete N-Succinimidyl-(R)-3-(2-pyridyldithio)butyrat wurde unter Anwendung des folgenden Verfahrens hergestellt, in dem, sofern nichts anderes angegeben ist, folgendes gilt:
- (i) Abdampfungen wurden durch Rotationsverdampfung im Vakuum durchgeführt,
- (ii) die Arbeitsvorgänge wurden bei Raumtemperatur, d.h. im Bereich 18-26ºC, durchgeführt,
- (iii) die Ausbeuten dienen nur zur Veranschaulichung und sind nicht notwendigerweise die durch sorgfältige Verfahrensentwicklung maximal erhältlichen,
- (v) die Protonen-NMR-Spektren wurden normalerweise bei 270 MHz in deuteriertern Chloroform als Lösungsmittel unter Verwendung von Tetramethylsilan (TMS) als internern Standard bestimmt und sind in Form der chemischen Verschiebungen (8- Werte) in Teile pro Million Teile, auf TMS bezogen, ausgedrückt, wobei übliche Abkürzungen zur Bezeichnugn der Hauptpeaks verwendet werden: 5, Singulett, m, Multiplett, t, Triplett, br, breit, d, Dublett.
- (R)-3-(2-Pyridyldithio)buttersäure) 90,0 g, 0,393 mol) wurde in Dichlormethan (630 ml) unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. Dann wurde N-Hydroxysuccinimid (45,2 g, 0,393 mol, 1,0 Moläquivalente) dazugegeben und mit Dichlormethan (90 ml) in das Gemisch eingewaschen. Dann wurde das Gemisch unter Kühlen auf 2ºC 30 min gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (81,08 g, 0,393 mol, 1,0 Moläquivalent) in Dichlormethan (540 ml) während eines Zeitraums von 35 min dazugegeben, wobei die Reaktionstemperatur bei 0ºC ± 2ºC gehalten wurde und mit Dichlormethan (90 ml) in das Gemisch eingewaschen. Die Lösung wurde bei einer Temperatur von 0 bis 10ºC 3 h und 15 min gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Dann wurde die Lösung zur Entfernung von festem Dicyclohexylharnstoff futriert, der mit Dichlormethan (180 ml x 2) gewaschen wurde. Das Filtrat wurde unter verringertem Druck bei 20 bis 22ºC unter Erhalt eines braunen Öls (150 g) eingedampft. Dieses Öl wurde durch Chromatographie auf einer Säule mit Kieselgel-60-Silicagel, 230-400 mesh (1180 g), in Toluol/Ethylacetat (80:20 V/V) hergestellt, gereinigt. Durch Elution mit Toluol/Ethylacetat (80:20 V/V) ergab sich N-Succinimidyl-(R)-3-(2- pyridyldithio)butyrat (52 g) in Form eines blaßgelben Gummis nach dem Eindampfen im Vakuum (0,25 mbar) bei 28ºC.
- NMR: 1,5 (d, 3H), 2,85 (m, 4H), 2,8 (dd, 1H), 3,2 (dd, 1H), 3,5 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 7,7 (m, 2H), 8,5 (d, 1H).
- Die Elektronenstoß-Massenspektroskopie ergab, daß die Verbindung ein Molekulargewicht von 326 und eine mit der Struktur von N-Succinimidyl-(R)-3-(2-pyridyldithio)butyrat konsistente Fragmentierung hatte.
- Das Ausgangsmaterial wurde folgendermaßen hergestellt:
- Methyl-(R)-hydroxybutyrat (1,670 kg, 14,152 mol) wurde in einem Eis/Ethanolbad abgekühlt. Dann wurde Wasser (4698 ml) dazugegeben und im Anschluß daran 47%iges (G/G) Natriumhydroxid (965 ml, 16,98 mol, 1,2 Moläquivalente) mit einer solchen Geschwindigkeit, daß die Temperatur bei 0ºC ± 2ºC gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h und 30 min bei 0ºC gerührt. Dann wurde konzentrierte Chlorwasserstoffsäure (1490 ml, 17,28 mol, 1,22 Moläquivalente) während eines Zeitraums von 35 min zu dem Reaktionsgemisch gegeben, wobei die Temperatur bei 5ºC oder tiefer gehalten wurde, so daß sich End-pH-Wert von 1,5 ergab. Anschließend wurde Natriumchlorid (1061 g) zu dem Gemisch gegeben und das wäßrige Gemisch mit Methyl-tert.-butylether (10 x 3,5 l) extrahiert. Die Extrakte wurden kombiniert und das Lösungsmittel durch Destillation im Vakuum bei Raumtemperatur unter Erhalt eines Rückstandes entfernt. Dann wurde Toluol (7,5 l) mit dem Rückstand vermischt und das flüchtige Material durch Destillation im Vakuum unter Erhalt von (R)-3-Hydroxybuttersäure (1189 g, 81 %) in Form eines Öls entfernt. Dieses Öl wurde auf 4ºC abgekühlt und zum Erhalt eines Feststoffs angeimpft.
- (R)-3-Hydroxybuttersäure (530 g, 5,096 mol) wurde mit Triethylorthoacetat (1322,8 g, 1488 ml, 8,154 mol, 1,6 Moäquivalente) bei 25 bis 30ºC unter Erhalt einer trüben Lösung vermischt (es wird angenommen, daß die Trübung auf restlichem Natriumchlorid aus der vorherigen Stufe beruht).
- Dann wurde die Lösung im Hochvakuum (1,0 mm) bei 30ºC zur Entfernung von flüchtigem Material eingedampft. Die übrigbleibende Flüssigkeit (1001 g), die (25,6R)-2-Ethoxy-2,6- dimethyl-1,3-dioxan-4-on enthielt, wurde 2 h auf 80ºC erhitzt und dann auf 40ºC abgekühlt. Das Rohprodukt wurde durch eine Glassäule (50 cmx 3,5 cm im Durchmesser), die mit Raschig-Glasringen gepackt war, unter Erhalt von Butyrolacton (57,3 g) mit einem Siedepunkt von 59 bis 62ºC bei 10 bis 12 mbar destilliert.
- (S)-β-Butyrolacton (91,12 g, 1,058 mol) wurde unter Rühren unter Stickstoff auf 5ºC abgekühlt. Dann wurde Thiolessigsäure (80,57 g, 75,65 ml, 1,058 mol, 1,0 Moläquivalente) dazugegeben, wobei die Temperatur bei 5ºC gehalten wurde. Anschließend wurde Triethylamin (146,7 ml, 1,058 mol, 1,0 Moläquivalente) während eines Zeitraums von 45 min dazugegeben, während die Temperatur der Reaktion bei -5 bis +5ºc gehalten wurde. Dann wurde das Kühlbad entfernt und die Temperatur stieg auf 65ºC, wodurch sich eine gelb/orange Lösung ergab. Das Reaktionsgemisch wurde auf -10ºc abgekühlt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Lösung auf 0ºC abgekühlt und mit Wasser (93 ml) versetzt. Anschließend wurde das Gemisch wieder auf -10ºc abgekühlt und dann mit Natriumhydroxid-Lösung (185 ml 47%iges (G/G) Natriumhydroxid und 92 ml Wasser) behandelt, und zwar mit einer solchen Zugabegeschwindigkeit, daß die Temperatur bei -10 bis +10ºC blieb. Anschließend wurde das Gemisch 1 1/2 h bei -5ºC gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Gemisch wurde mit Methyltert.-butylether (265 ml) gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde mit Wasser (185 ml) verdünnt, auf 0ºC abgekühlt und mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (270 ml) bei 0 bis 10ºC behandelt, bis der pH-Wert 1 bis 2 betrug. Das wäßrige Gemisch wurde dann mit Methyl-tert.-butylether (2 x 265 ml) behandelt. Die organischen Extrakte wurden kombiniert, mit Wasser (265 ml) gewaschen, über wasserfreiern Magnesiumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck bei 30ºC unter Erhalt eines orangen Öls (132,8 g) eingedampft.
- Dieses Öl wurde durch Vakuumdestillation unter Erhalt von (R)-3-Mercaptobuttersäure (86,6 g) mit einem Siedepunkt von 96 bis 100&sup6;C bei 2 mbar gereinigt.
- 2,2'-Dipyridyldisulfid (110,0 g, 0,5 mol) wurde in Dichlormethan (800 ml) bei Raumtemperatur unter Erhalt einer blaßgelben Lösung gelöst, die auf 0ºC abgekühlt wurde. Dann wurde Chlorgas in die Lösung eingeblubbert, die bei 0 bis 5ºC erhalten wurde. Nach 3 h 25 min war die Lösung mit Chlor gesättigt und hatte eine goldbraune Farbe. Anschließend wurde die Lösung unter verringertem Druck bei 0 bis 5ºC zur Entfernung von überschüssigem Chlor und zur Aufällung von Pyridin-2-sulfenylchlorid in Form eines gelben Feststoffs konzentriert. Dieser Feststoff (11,8 g) wurde durch Filtratiuon gesammelt und mit Dichlormethan gewaschen. Das Dichlormethan-Futrat (1624 g) enthielt weitere 133 g Pyridin-2-sulfenylchlorid.
- Pyridin-2-sulfenylchlorid (11,8 g des gelben Feststoffs und 1035 g der oben hergestellten Lösung in Dichlormethan, 0,667 mol insgesamt, 1,0 Moläquivalente) wurde mit Dichlormethan (50 ml) verdünnt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 5 bis 10 min gerührt und dann auf -5ºC abgekühlt. Anschließend wurde eine Lösung von (R)-3- Mercyptobuttersäure (80,0 g, 0,667 mol) in Dichlormethan (400 ml) dazugegeben, wobei die Temperatur bei -5 bis 0ºC gehalten wurde. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Erhalt eines braunen Öls und einer gelben oberen Schicht gerührt. Dann wurde Wasser (485 ml) zu dem Gemisch gegeben, das anschließend auf 5ºC abgekühlt und mit 2 N Natriumhydroxid-Lösung (385 ml) behandelt wurde bis der pH-Wert 4,55 betrug. Die Dichlormethan-Schicht wurde abgetrennt und die übrigbleibende wäßrige Phase mit Dichlormethan (200 ml) extrahiert. Die Dichlormethan- Extrakte wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck unter Erhalt eines leichtbraunen Öls eingedampft. Das Öl wurde mit Hexan (325 ml) kräftig gerührt und dann in einem Eisbad abgekühlt, bis sich ein Feststoff bildete. Dann wurde das Gemisch 3 h gerührt und anschließend der braune kristalline Feststoff durch Futration gesammelt, mit Hexan gewaschen (2 x 162 ml) und über Nacht bei Raumtemperatur im Vakuum unter Erhalt von (R)-3-(2-Pyridyldithio)buttersäure (140 g) getrocknet.
- NMR: 1,45 (d, 3H), 2,6 (dd, 1H), 2,8 (dd, 1H), 3,4 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 7,7 (m, 2H), 8,5 (m, 1H).
- Etablierung der Hybridom-Zellinie und Herstellung von C242 II
- Eine menschliche Kolorektalcarcinom-Zellinie, COLO 205, die kommerziell von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., USA, unter der Zugangs-Nr. CCL 222 erhältlich ist, wurde routinemäßig in Iscove's MEM, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt war, kultiviert. Die Zellen wurden vor der Konfluenz geerntet, nämlich normalerweise 2 bis 3 Tage nach der Subkultivierung, und 3mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zur Immunisierung gewaschen.
- Dann wurden BALB/c-Mäuse, 4 bis 6 Wochen alt, intraperitoneal mit einer Initialdosis mit 3 x 10&sup7; COLO-205- Zellen, die in 0,1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert waren, immunisiert. Dann wurden den Tieren weitere 0,1 ml Suspension mit 3 x 10&sup7; COLO-205-Zellen als Boosted-Dosis verabreicht, worauf sie vier Tage später getötet wurden und die Milzen entnommen wurden. Die Milzen wurden dann zu einer Suspension aus einzelnen Zellen dissoziiert.
- 1,2 x 10&sup8; Milzzellen aus der oben beschriebenen Zell- Suspension wurden in zwei Röhrchen verteilt. In jedes Röhrchen wurden zusätzlich 108 Myelomzellen der Maus- Myelom-Zellinie 5p2/0 gegeben (aus der Sammlung der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, U.S.A. unter der Zugangs-Nr. CRL 1581 erhältlich). Die zwei Röhrchen wurden zentrifugiert und sämtliche Flüssigkeit dekantiert. Dann wurden in jedes Röhrchen langsam 2 ml PEG-Lösung (10 g PEG Mw 4000, 1 ml DMSO und 10 ml Kochsalzlösung für monoklonale Antikörper) mit 37ºC während 1 min unter konstantem Rühren gegeben. Dann wurden die Röhrchen in ein Wasserbad bei 37ºC überführt und unter vorsichtigem Rühren 90 s dort belassen. Die Fusion wurde durch Zugabe einer physiologischen Puffer-Lösung in jedes Teströhrchen nach dem folgenden Schema unterbrochen: 2 ml während der ersten 30 s, 6 ml während der folgenden 30 s und weitere 32 ml während 1 min. Nach dem Waschen der Zell- Suspension in Kulturmedium wurde sie in insgesamt 100 ml mit Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin (HAT) ergänztern Kulturrnedium suspendiert. Bei dem Kulturmedium handelte es sich um Iscove's MEM, das mit 10%igem FCS, L-Asparagin (36 mg/1), L-Arginin-HCl (116 mg/l), Folsäure (10 mg/l), L- Glutamin (292,3 mg/l), Natriumpyruvat (110,1 mg/l) und Mercaptoethanol (3,49 ul/l) ergänzt war. Aliquots zu 50 ul wurden in die Vertiefungen von Gewebekulturschalten mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Vertiefungen waren mit 250 ul Macrophaen-Suspension von BALB/c-Mäusen (2 x 10&sup4; Zellen/ml) in mit HAT ergänztem Kulturmedium vorbeschichtet worden. Das Medium wurde 6 Tage nach der Fusion ausgetauscht.
- Das verbrauchte Medium vom obigen Tag 6 wurde auf COLO-205- positive Antikörper untersucht, nämlich wie von Kennett R. H., "Enzyme-linked antibody assay with cells attached to polyvinyl chloride plates", Monoclonal Antibodies, Hybridomas, A new dimension in biological analyses, Herausgeber H. R. Kennett, T. J. McKelvin, K. B. Bechtol, Plenum Press, New York 1980 beschrieben. Kurz zusammengefaßt wurden die Vertiefungen von Nunc-Immunoplatten Typ IIF mit 2 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung COLO-205-Zellen (1 mg/100 ml PBS) mit einem Beschichtungsvolumen von 50 ul beschichtet. Dann wurde das oben erwähnte verbrauchte Kulturmedium von Tag 6 mit 50 ul/Vertiefung in die beschichteten Vertiefungen gegeben. Nach der Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurde mit Peroxidase konjugiertes Anti-Maus-Ig (Dakopatts P260, Dakopatts A/S, Kopenhagen, Dänemark), in 1%igem BSA-PBS verdünnt (1/500), mit 100 ug/Vertiefung dazugegeben, worauf bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert wurde. Dann wurde das Substrat in Form von 4 OPD-Tabletten Dako S2000, in 12 ml Citronensäurepuffer, pH 5,0, gelöst, plus 5 ul 30%iges Wasserstoffperoxid, in einer Menge von 100 ul/Vertiefung dazugegeben, worauf im Anschluß an die Inkubation die Absorption bei 450 nm bestimmt wurde.
- Etwa 600 Hybridom-Klone wurden getestet. Ursprünglich waren 190 dieser mit COLO-250-Zellen reaktiv. Von diesen reagierten 177 auch mit normalen menschlichen Lymphozyten, die auf Lymphoprep von Nyegaard A/S, Norwegen, hergestellt worden waren und wurden verworfen. Ein aus den übrigen Klonen etablierter Klon wurde Hybridom C242 bezeichnet und als zur IgGl-Klasse isotypisiert. Das C242-Hybridom wurde dann einer Anzahl von Unterklonierschritten unterzogen, um schließlich einen fertigen, stabile monoklonale Antikörper bildenden Klon zu erhalten, der mit C242:II bezeichnet wurde.
- Das C242-Hybridom wurde daher zuerst unter Erhalt eines C242:5 genannten Klons kloniert. Dieser Klon wurde seinerseits zur Herstellung des Klons C242:5:2 kloniert. Bei beiden Klonierungen wurde die Hybridom-Suspension in einem mit Hypoxanthin/Thymidin (HT) ergänzten Kulturmedium auf eine Dichte von 4 Zellen/ml verdünnt. Dann wurden 50 ul (0,2 Zellen) in jede Vertiefung einer Kulturschale mit 96 Vertiefungen, die mit 250 ul Balb/c-Mäuse-Macrophagen- Suspension (5 x 10³ Macrophagen/Vertiefung) in mit HT ergänztem Medium vorbeschichtet worden waren, gegeben. Nach 2 bis 5 Tagen wurden einzelne Zellklone durch visuelle Untersuchung mit einem Mikroskop nachgewiesen. Am Tag 6 wurde das Medium ausgetauscht und Aliquots des verbrauchten Medium auf die Menge an Antikörpern untersucht, die an COLO-205-Zellen binden, aber nicht an normale menschliche Zellen, nämlich mit dem oben beschriebenen ELISA. Die Klone, welche hinsichtlich einer positiven Reaktion im COLO-205-ELISA und einer beibehaltenen negativen Reaktion im Normalzellen-ELISA am besten waren, wurde ausgewählt und in Gefäßen in flüssigem Stickstoff zur weiteren Entwicklung eingefroren.
- Zur Durchführung einer dritten Klonierung wurden die Zellen aufgetaut und in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (5 % FCS) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit einer mittleren Dichte von 3 Zellen pro Vertiefung in die Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen eingeimpft. Die Klonierung erfolgte in DMEM mit 5 % FCS, wobei Maus-Macrophagen als Feeder-Zellen verwendet wurden. Auf dieser Platte ergaben sich 30 Klone, von denen 16 hinsichtlich der IGG-Bildung durch Nephelometrie und hinsichtlich der Spezifität der Antikörper durch ELISA, nämlich wie oben beschrieben, untersucht wurden. Es wurde gefunden, daß 12 dieser Klone IGG bilden. Anschließend wurden 10 Klone auf einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen expandiert, worauf das verbrauchte Medium auf die IgG-Bildung und -Spezifität untersucht wurde. Durch diese Selektion ergaben sich 4 Klone mit verhältnismäßig hoher Produktivität. Die endgültige Untersuchung der Produktivität dieser 4 Klone wurde in doppelten Gewebekulturflaschen durchgeführt. Der Klon mit der höchsten Produktivität wurde ausgewählt und mit C242/CL 510 A1 bezeichnet. Er wurde zur weiteren Verwendung in flüssigem Stickstoff eingefroren.
- Eine erste Klonierung des Klons C242/CL 510 A1 ergab, daß ein Drittel der Zellen kein IgG bildete, was aufgrund einer Absorption von weniger als 0,1 bei einer Verdünnung von 1:1000 in einem allgemeinen Maus-IgG-ELISA festgestellt wurde. Fünf positive Subklone wurden dann gepoolt, um einen C242:1 bezeichneten Klon zu bilden. Die Produktivität dieses Klons wurde durch einen allgemeinen Assay auf HPLC- Basis quantifiziert und ergab 150 pg Maus-IgG pro ml.
- Der Klon C242:I wurde anschließend mit einer Schale mit 96 Vertiefungen kloniert, wodurch sich 33 Klone ergaben, die hinsichtlich der Maus-IgG-Bildung alle positiv waren. Fünf davon, die sämtlich über 150 ug/ml ergaben, wurden zur Herstellung eines endgültigen Klons gepoolt, der mit C242:II bezeichnet wurde und IgG stabil produzierte. Der HPLC-Assay ergab, daß die Produktivität von C242:II 196 ug Maus-IgG pro ml betrug. Die Zellen wurden eingefroren und in Gefäßen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Eine Probe des hergestellten C242:II-Hybridorns wurden bei der ECACC unter der Zugangs-Nr. 90012601, wie oben angegeben, hinterlegt.
- Eine Anfangs-Zellsuspension des oben hergestellten Hybridoms ergab sich aus einem gefrorenen Gefäß. Die Zellen wurden in Gewebekulturkammern mit einer Gesamtfläche von 6000 cm² von Nunc A/S in einer Dichte von 2 x 10&sup4; Zellen/ml (C242:II-Hybridom) eingeimpft. Dann wurden die Zellen in DMEM, das nach Iscove (Iscove N. N. und Melchers F., J. Exp. Med., Bd. 147, S. 923, 1978) modifiziert und mit 1 % Gentamycin, 1 % Aminosäure-Ergänzung und 5 % fötalem Kälberserum ergänzt worden war, kultiviert. Dann wurden die Zellen 4 oder 5 Tage bei 37ºC in einer 8 % CO&sub2; enthaltenden feuchten Atmosphäre inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen ausgezählt und zur Bestimmung der Konzentration an monoklonalen Antikörpern Proben entnommen. Der Zellkulturüberstand wurde dekantiert und durch ein Cellulose-Filter futriert, um suspendierte Zellen zu entfernen. Dann wurde der überstand durch Ultrafiltration in einer Millipore-Pellican-Ultrafiltrationszelle unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 30 000 20- bis 30-fach konzentriert.
- Eine Probe dieses Konzentrats wurde zur Analyse der Konzentration des monoklonalen C242:II-Antikörpers und der Antigenreaktivität entnommen, worauf das Konzentrat des monoklonalen Antikörpers bis zur Reinigung bei -70ºC aufbewahrt wurde.
- Protein-A-Sepharose 4B (Warenzeichen von Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) wurde nach den Anleitungen des Herstellers hinsichtlich der Schwellung und des Waschens des Gels hergestellt, worauf das oben hergestellte C242:II- Konzentrat (hier außerdem einfach mit C242-Antikörper bezeichnet) unter Verwendung von 1,5-Glycin-NaOH, 3 M NaCl, pH 8,9, als Bindungspuffer daran gebunden wurde. Nachdem zuerst unter Verwendung des gleichen Puffers gewaschen worden war, wurde die Affinitätssäule mit 0,1 M Citronensäure-NaOH, pH 5,0, eluiert und der monoklonale C242- Antikörper in Röhrchen gesammelt, die 1 mol/l Tris-HCl, pH 8,0, enthielten. Die erhaltene Antikörper wurde dann gegen 0,02 M Phosphatpuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,2, 0,2 g/l NaN&sub3; dialysiert. Anschließend wurde der dialysierte C242- Antikörper durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 30 000 konzentriert. Nach der Entnahme von Proben zur Untersuchung der Konzentration und zur Kontrolle der Qualität wurde der monoklonale C242-Antikörper bei -20ºC aufbewahrt.
- Ricin A wurde mit Hilfe der Technik zur Rekombination von DNA unter Verwendung von Ricin A kodierenden DNA-Sequenzen hergestellt. Solche Sequenzen sind in EP 145 111; O'Hare et al., FEBS Letts 216, S. 73-78, 1987 und Lord et al., Eur. J. Biochem. 148, S. 265-270, 1985 beschrieben. Eine Ricin A kodierende DNA-Sequenz wird unter die Kontrolle von geeigneten Kontrollsequenzen wie beispielsweise eines Promotors (beispielsweise eines trp-Promotors), Ribosomen-Bindungsstellen und Transkriptionsterminators gestellt. Die Herstellung und Reinigung von rekombiniertern Ricin A ist in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 85/03508 und in der veröffentlichten europaischen Anmeldung 237 676 beschrieben.
- Im folgenden wird die Konstruktion eines rekombinierten Plasmids veranschaulicht, in dem die kodierende Sequenz für die Ricin-A-Kette unter der Transkriptions- und Translationskontrolle eines prokaryotischen Promotorelements steht. Die Transkription wird durch die Einführung eines natürlichen Terminationselements am 3'-Ende der Botschaft terminiert. Die Initiation der Translation wird durch die DNA-Sequenz am 5'-Ende der Botschaft, nämlich die Ribosomen-Bindungsstelle (RBS), kontrolliert.
- Das Konstruktionsverfahren macht die Substitution von zwei N-terminalen Aminosäure-Resten des natürlichen, reifen Ricin-A- Pro teins erforderlich.
- Es werden mehrere Zwischenstufen zur Ableitung des zur Herstellung von rekombiniertem Ricin A verwendeten Vektors beschrieben.
- Zur Einführung von spezifischen Veränderungen der DNA- Sequenz im Ricin-Gen wurden synthetische Oligonukleotide verwendet. Sämtliche Oligonukleotide wurden wie nachstehend beschrieben auf einem DNA-Synthesizer von Applied Biosystems Typ 380A aus 5'-Dimethoxytrityl-basengeschützten Nukleosid-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramiditen und geschützten Nukleosiden, die im 0,2-Mikromol-Maßstab an Glasträger mit kontrollierter Porengröße gebunden waren, gemäß den von Applied Biosystems Inc. zur Verfügung gestellten Protokollen hergestellt.
- Jedes Oligonukleotid wurde nach der Abspaltung von dem festen Träger und nach der Entfernung sämtlicher Schutzgruppen in Wasser (1 ml) gelöst, worauf zur Bestimmung der Konzentration die Absorption bei 260 nm gemessen wurde.
- Für die nachstehend beschriebenen Manipulationen wurde eine Vielzahl von Restriktionsendonukleasen und DNA-modifizierenden Enzymen verwendet. Diese wurden von einer Anzahl von Lieferanten bezogen (Amersham International, Bethesda Research Laboratories, Boehringer Mannheim oder New England Biolabs) und hinsichtlich der Reaktionsbedingungen nach den Anleitungen der Hersteller verwendet.
- Die Wirtsstämme, auf die hier Bezug genommen wird, sind allgemein aus zahlreichen Quellen verfügbar. Beispielsweise ist E. coli C600 von zahlreichen Quellen frei erhältlich, beispielsweise vielen Kultursammlungen, z.B. dem E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA unter der Zugangs-Nr. GCSC 3004. Der Genotyp von E. coli C600 ist K12 thr-1 leuB6 thi-1 lacY1 tonA21 λ&supmin; supE44. E. coli HB101 und DH5α können von den Bethesda Research Laboratories (BRL) und E. coli TG1 und K19 von Anglia Biotechnology bezogen werden.
- Der Kit enthält 1) 6 M Natriumjodid, 2) eine konzentrierte Lösung von Natriumchlorid, Tris und EDTA zur Herstellung eines Natriumchlorid/Ethanol/Wasser-Gemisches zum Waschen, 3) Glassmilk (TM) - ein 1,5 ml Gefäß, das 1,25 ml einer Suspension aus Silica-Matrix in Wasser enthält.
- Dies ist eine Technik zur DNA-Reinigung, die auf dem Verfahren von Vogelstein und Gillespie, das in Proceedings of National Academy of Sciences USA (1979) Bd. 76, S. 615 veröffentlicht wurde, basiert.
- Alternativ kann jedes der in "Molecular Cloning - a laboratory manual" zweite Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 (hier mit "Maniatis" bezeichnet) beschriebenen Verfahren angewendet werden.
- Beruht auf dem Verfahren von Tabor und Richardson, das in Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1987), Bd. 84, S. 4767-4771 veröffentlicht wurde.
- Der Plasmidvektor pICI0020 ist ein auf pAT153 basierendes Plasmid, in dem die 651-bp-EcoRI-AccI-Region durch ein 167- bp-EcoRI-ClaI-Fragment ersetzt ist, das aus folgendem besteht:
- (1) einem synthetischen E.-coli-trp-Promotor und einer trp-Leader-Ribosomen Bindungsstelle
- (2) einem Translationsinitiationskodon
- (3) einer mehrfachen Restriktionsenzym-Erkennungssequenz, die von M13mp18 stammt, welche Stellen für KpnI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI und HindIII enthält
- (4) eine synthetische Transkriptionsterminationsequenz.
- Die DNA-Sequenz dieser Region ist in Figur 11 dargestellt.
- Die Konstruktion eines einer synthetische trp-Prornotor- Sequenz enthaltenden Plasmidvektors ist veröffentlicht (Windass et al., Nuc. Acids Res. 10, S. 6639-6657, 1982). Das Promotorfragment wurde aus einem derartigen Vektor nach der Verdauung mit den Enzymen EcoRI und Hpai und Reinigung der geeignete Bande aus einem Agarosegel durch Elektroelution (vgl. "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Maniatis, Fritsch und Sambrook, verlegt vom CSH laboratory, zweite Auflage 1989) isoliert.
- Ein Paar komplementärer synthetischer Oligonukleotide wurde hergestellt, die an das Hpai-Ende des Promotorfragments ligieren werden, das die natürliche trp-Leader-Ribosomen- Bindungsstelle, ein Translationsinitiationskodon und eine 3'-KpnI-Klonierstelle zur Verfügung stellt. Diese Oligonukleotide wurden in äquimolaren Konzentrationen vermischt und durch Erhitzen auf 100ºC reassoziieren gelassen und anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.
- Das Prornotorfragment und die reassozuerten Oligonukleotide wurden dann ligiert und die geeignete Bande durch Elektroelution aus einem Polyacrylamid-Gel isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit einem M13mp18-Vektor-Derivat ligiert, das die trp-Attenuator-Sequenz (aus synthetischen Oligonukleotiden hergestellt) in die HindIII-Stelle kloniert enthielt und eine zusätzliche Clai-Restriktionsstelle 3' zum Attenuator einführt. Die ligierte DNA wurde in den E.-coli-Stamm JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, S. 103, 1985) der durch das CaCl&sub2;-Verfahren (Maniatis, Kapitel 1, S. 82) kompetent gemacht worden war, transfiziert. Nach der Ausplattierung und Inkubation der Platten wurden die Plaques nach dem Verfahren von Benton und Davies (Maniatis, Kapitel 4, S. 41) unter Verwendung einer mit ³²p markierten Sonde, die durch Nick-Translation des zuvor isolierten EcoRI-HpaI-Promotorfragments hergestellt worden war, durchmustert. Einzelsträngige DNA wurde aus positiv hybridisierenden Plaques nach einem Standardverfahren (Maniatis, Kapitel 4, S. 29) präpariert und unter Verwendung des universellen M13-PriMers nach dem Dideoxy- Kettenterminationsverfahren von Sanger, der in Kit-Form von einer Anzahl von Lieferanten zur Verfügung gestellt wird, z.B. Sequenase (United States Bioscience), sequenziert.
- Die RF-DNA wurde aus einem Isolat hergestellt, in dem die Promotor/Ribosomen-Bindungsstelle/Attenuator-Sequenz festgestellt worden war. Diese DNA wurde mit EcoRI und ClaI verdaut und das geeignete Fragment wie oben aus einem Polyacrylamid-Gel isoliert. Das Plasmid pAT153 wurde mit den Enzymen EcoRI und AccI verdaut und mit dem isolierten Promotorfragment ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente E.-coli-HB101-Zellen transformiert (Boyer, H. W. und Roulland-Dussoix, D; 1969, J. Mol. Biol. 44, S. 459) (Bethesda Research Laboratories) und gegen Ampicillinresistente Kolonien selektiert.
- Plasmid-DNA aus verschiedenen Klonen wurde präpariert und die DNA-Sequenz der Region zwischen den EcoRI und ClaI- Stellen abgeleitet. Es wurde festgestellt, daß ein Klon die richtige Prornotor/Attenuator-Region enthielt, und dieser wurde mit pICI0020 bezeichnet.
- Diese Konstruktion ist in Figur 1 schematisch dargestellt.
- pICI0042 (Figur 12) ist ein Plasmid, in dem die Antibiotika-Resistenzmarker von pAT153 durch ein einzelnes, induzierbares Tetracyclin-Resistenz-Gen aus dem Plasmit RP4 (durch das Gen teta kodiert und durch das Produkt des tetR- Gens reguliert) ersetzt worden waren. Diese Gene sind von Klock et al. (J. Bacteriol. 161, S. 326-332, 1985) charakterisiert worden. Da der neue Resistenzmarker nur in Gegenwart des Antibiotikums exprimiert wird, wird das teta- Gen-Produkt, das rekombinierte Ricin A in Kulturen, in denen das Plasmid in Abwesenheit von Tetracyclin stabil gehalten wird, nicht potentiell verunreinigen. Eine Plasmid-Stabilitätsfunktion (cer) wurde ebenfalls eingeführt.
- Die Anfangsstufe bei der Herstellung diese Vektors war die Herstellung eines Derivats von pAT153, aus dem das die Tetracyclin-Resistenz kodierende Gen vollständig entfernt worden war. Ein komplementäres Paar synthetischer Oligonukleotide wurde konstruiert, um das EcoRI-AvaI-Fragment aus pAT153 durch eine kurze Sequenz zu ersetzen, die mehrere einzige Restriktionsendonuklease-Stellen für die anschließende Klonierung enthielt.
- Die pAT153-Plasmid-DNA wurde mit den Enzymen EcoRI und Aval verdaut und das 2,175Kbp-Plasrnid-DNA-Fragment aus einem 0,7%igen Agarose-Gel unter Verwendung von Geneclean (Bio 101, Kalifornien) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Das 1,425Kbp-Fragment, welches das Tetracyclin-Resistenz-Gen enthielt, wurde auf diese Weise entfernt.
- Die oligonukleotide (SEQ.-ID.-Nrn. 13 und 14 wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und in äquimolaren Mengen aneinander reassozuert. Eine Probe der reassozuerten oligonukleotide wurde dann mit dem Plasmid- Fragment von pAT153 ligiert. Die ligierte DNA wurde in E. coli HB101 (BRL) transformiert und gegen Ampicillinresistente Kolonien selektiert.
- Mehrere Kolonien wurden zur Plasmid-DNA-Präparation im kleinen Maßstab überimpft (Verfahren von Birnboim und Doly, wie in Maniatis, Kapitel 1, S. 25 beschrieben) und die gewünschte Konstruktion durch Restriktionsanalyse mit geeigneten Enzymen, z.B. EcoRI, AvaI und BamHI, identifiziert. Die Struktur von drei Isolaten, bei denen das richtige Restriktionsmuster festgestellt wurde, wurde durch DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung eines pBR322-EcoRI- Stelle-Primers, der im Uhrzeigersinn arbeitet (New England Biolabs), besttigt. Ein Isolat wurde pICI0019 bezeichnet.
- Die RP4-Plasmid-DNA wurde aus lebenden Stämmen nach dem Verfahren von Holmes und Quigley (Maniatis, Kapitel 1, S. 29) isoliert. Diese DNA wurde vollständig mit BglII und zum Teil mit XmaI (bis zu 35 min bei 25ºC) verdaut, wobei zu verschiedenen Zeitpunkten Proben entnommen wurden, bis ein 2,45-Kbp-Fragment, das tetr und teta enthielt, klar identifiziert werden konnte. Eine Probe pUC8-DNA (Amersham International) wurde vollständig mit BamHI und XmaI verdaut. Zur Insertion der Tetracyclin-Resistenz-Gene in PUC8 wurden Ligationen durchgeführt. Die ligierte DNA wurde in E. coli C600 (Appleyard, R. K., Genetics 39, S. 440, 1954), die nach dem CaCl&sub2;-Verfahren (Maniatis, Kapitel 1, S. 82) kompetent gemacht worden waren, transformiert und Tetracyclin resistente Kolonien selektiert. Die Plasmid-DNA wurde aus 8 Klonen präpariert (Holmes und Quigley) und das Vorliegen der RP4-tetR- und -A-Gene durch Restriktionsanalyse bestätigt. Eines dieser Isolate wurde mit pTB344 bezeichnet.
- Die Tetracyclin-Resistenz-Gene wurden dann in pICI0019g (oben beschrieben) durch Ersatz eines EcoRI/PstI-Fragments aus pICI0019 durch das entsprechende Fragment aus PT8344 insertiert. Dadurch ergab sich der Ersatz des Hauptteils des Ampicillin-Resistenz-Gens in pICIOOLg durch die Tetracyclin-Resistenz-Gene. Nach der Verdauung und Ligation der Plasmid-DNAs, der sich die Transformation in E. coli C600 anschloß, wurden die Kolonien auf der Grundlage des Phänotyps, d.h. TcR und Ap&sup5;, selektiert. Aus vier derartigen Klonen wurde die Pasmid-DNA präpariert und mit einer Kombination aus Enzymen verdaut, z.B. BAMHI/Psti/Ssti, EcoRI/SalI, SmaI, StyI/SalI und AvaI/PstI.
- Sämtliche vier Klone ergaben Restriktionsmuster, die mit dem gewünschten Konstrukt konsistent waren. Einer davon wurde mit pTB351 bezeichnet.
- Summers und Sherratt (Cell 36, S. 1097-1103, 1984) haben gezeigt, daß die Instabilität von Plasmiden, die von ColEI (z.B. pAT153) stammen, auf den Verlust einer 238-bp- Sequenz, nämlich cer, die im Elternplasmid vorhanden ist, zurückzuführen ist. Diese Sequenz verhindert die Bildung von Plasmid-Oligomeren, wobei letztere die Plasmidaufteilung auf eine bisher unbekannte Weise zu zerstören scheinen. Die cer-Sequenz (Summers, D. et al.; Mol. and Gen. Genetics 201, S. 334-338, 1985 und Cell 39, 1097-1103, 1984) wurde aus einem in pUC18 klonierten Fragment (pKS492) isoliert. Die pKS492-Plasmid-DNA wurde mit BamHI und TaqI zur Freisetzung eines cer-haltigen 289-bp-Fragments verdaut. Die pTB351-Plasmid-DNA (aus dem Dam&supmin;-Wirt E. coli GM48 - Arraj, J. A. und Marinus, M. G. J. Bact. 153, S. 562-565, 1983, isoliert) wurde vollständig mit Barnhi und dal verdaut und mit der verdauten pKS492-DNA ligiert. Nach der Transformation der ligierten DNA in kompetente E. coli C600 wurden tetracyclinresistente Kolonien selektiert. Zur Bestätigung des Vorliegens von cer wurde an der Plasmid-DNA von putativen Klonen mit den Enzymen AvaI, MluI und PvuI eine Restriktionsanalyse vorgenommen. Ein Isolat mit der richtigen Struktur wurde mit pICI0042 bezeichnet.
- Die Konstruktion dieser Plasmide ist in den Figuren 2 und 3 schematisch dargestellt.
- Der Plasmid-Vektor pICI1079 ist ein amipcillinresistentes, von pAT153 stammendes Plasmid, das die folgenden Elemente zwischen der EcoRI- und StyI-Restriktionsstelle enthält:
- (i) ein CI857-Gen vom Phagen λ,
- (ii) einen λPL-Promotor,
- eine synthetische Ribosomen-Bindungsstelle,
- (iv) eine synthetische Interferon-α2 -Gen-Sequenz,
- (v) eine synthetische Transkriptionsterminatorsequenz, die vom Phagen T4 stammt, zwischen der SalI- und der StyI-Restriktionsstelle. Die DNA-Sequenz dieses Transkriptionsterminators ist in Figur 13 dargestellt. pICI1079 wird in Figur 14 veranschaulicht. pICI1079 wurde am 19. Februar 1991 gemäß dem Budapester Vertrag bei der NCIMB, 23 St. Machaer Drive, Aberdeen, Schottland unter der NCIMB-Zugangs-Nr. 40370 hinterlegt.
- Das Plasmid pICI107g wurde verwendet, um eine Quelle für den T4-Transkriptionsterminator für die Herstellung des Ricin A exprimierenden Klons pICI1185 (vgl. 7.d. unten) bereitzustellen. Der Ausgangspunkt für die Herstellung von Plasmid pICI1079 war pICI1043. pICI1043 ist ein auf pICI0020 (vgl. 3.a. oben) basierendes Plasmid, in dem sich eine Expressionskassette, die einen λPL-Promotor und das Interferon-α2-Gen (Edge et al., Nuc. Acids Res. 11, S. 6419-6435, 1983) enthält, zwischen der EcoRI- und SalI- Stelle befindet.
- Zur Herstellung des Transkriptionsterminators aus dem Gen 32 des Bacteriophagen T4 mit kohäsiven 5'-SalI- und 3'- SphI-Enden wurde ein komplementäres Paar Oligonukleotide synthetisiert. Dieses Fragment wurde mit einem Plasmidfragment ligiert, das aus pICI1043 isoliert wurde, das vollständig mit SalI und SphI verdaut worden war. Das so hergestellte intermediäre Plasmid (pICI1078) enthielt sowohl die T4-Terminator- als auch trp-Attenuator-Sequenzen in Tandem-Anordnung.
- Dann wurde ein zweites Paar komplementärer Oligonukleotide verwendet, um die trp-Attenuator-Sequenz (und den restlichen Teil des Tetracyclin-Resistenz-Gens) durch Insertion zwischen die Sphi- und Styl-Stelle von pICI1078 zu ersetzen. In dieses synthetisches Fragment wurde eine einzelne BamHI-Stelle eingeführt.
- Diese Manipulationen sind in Figur 4 schematisch dargestellt.
- Es wurde ein Klon (pUCBRA) hergestellt, der cDNA für Ricin A enthielt. Dieser Klon enthielt die cDNA der A-Kette von der Basenzahl -74 in der Leader-Sequenz bis zur BamHI- Stelle in der B-Kette (Basenzahl 857), nämlich entsprechend der veröffentlichten cDNA-Sequenz (Lamb, I. F., Roberts, L. M., Lord, J. M., Eur. J. Biochem 1985, 148, 5. 265-270) im Plasmid pUC8 (Vieira, J. und Messing, J., Gene 19, S. 259, 1982). Außerdem wurde die ortsgerichtete Mutagenese angewendet, um ein Translationsterminations-Kodon unmittelbar 3' zum letzten Kodon des reifen Ricin A zu erzeugen (wie von O'Hare, M. et al., FEBS Letts 1987, 216, S. 73-78 beschrieben). Die vollständige, die A-Kette kodierende Region ist in einem BamHI-Fragment dieses Klons enthalten.
- Eine geringe Menge PUCBRA-Plasmid-DNA wurde wie oben beschrieben erhalten. Für zukünftige Stammkulturen wurde eine Verdünnung dieser DNA in kompetente E.-coli-DH5α- Zellen (Hanahan, D.; 1983, J. Mol. Biol. 166, S. 557) (Bethesda Research Laboratories) transformiert und eine gegen Ampicillin resistente Transformante selektiert. Die Plasmid-DNA aus diesem Klon wurde nach einem modifizierten Birnboim-Doly-Verfahren (Maniatis, Kapitel 1, S. 25) prapariert. Proben dieser DNA wurden separat mit BamHI und Bani verdaut und mit entsprechenden Verdauungen der Original-DNA verglichen, über die Lord et al. berichtet haben, nämlich nach der Elektrophorese auf einem Agarose- Gel. Es konnten keine Unterschiede im Restriktionsmuster festgestellt werden, und auf dieser Grundlage konnten die zwei DNA-Proben als identisch angenommen werden.
- BamHI-Verdauungen der pUC8RA-Plasrnid-DNA und der RF (replikative Form)-DNA des Stammes K19 des Phagen M13 (Anglian Biotechnology) wurden unter Anwendung von Standardbedingungen (Maniatis, Kapitel 1, S. 68) "Shotgun"-ligiert. Außerdem wurden Kontroll-Ligationen durchgeführt. Die ligierten DNAs wurden in den E.-coli- Stamm TG1 (Gibson, 1984/Anglian), der nach dem CaCl&sub2; Verfahren (Maniatis, Kapitel 1, S.82) kompetent gemacht worden war, transformiert.
- Die Transformationshäufigkeiten zeigten eine wirksame Ligation an, und es wurden rekombinierte Phagen in der Nachkommenschaft erwartet. Rekombinierte Phagen sollten klare Plaques auf IPTG + X-gal (BRL) enthaltenden Platten ergeben, und zwar aufgrund der Zerstörung des lacZ(β- Glactosidase)-Gens. Wild-Typ-Phagen bilden blaue Plaques aufgrund der Hydrolyse des X-gal durch β-Galactosidase.
- Mehrere klare Plaques wurden zur Präparation von einzelsträngiger DNA überimpft. Die direkte Gel-Elektrophorese lysierter Phagen-Suspensionen ergab, daß ein Phagen-Klon ein Insert mit bestimmbarer Größe enthielt, bei dem durch Sequenzierung bestatigt wurde, daß es sich dabei um die Sequenz handelte, welche die A-Kette von Ricin kodiert. Es wurden zwar nur 182 Basen der das reife Ricin A kodierenden Sequenz festgestellt, aber dies wurde als ausreichender Beweis für das Vorliegen des vollständigen Ricin-A-Gens angesehen. Dieser Klon wurde mit M13K19RA bezeichnet.
- Zur Erzeugung einer KpnI-Stelle, die mit pICI-Expressionsvektoren verträglich ist, waren am Anfang des reifen Ricin A die folgenden Änderungen (unterstrichen) erforderlich:
- SEQ.-ID.-Nr. 15 Ricin-Leader-Sequenz Reifes Ricin A
- verändert zu:
- SEQ.-ID.-Nr. 16 Translationsinitiation
- was zu einer ATG-Kodon-überlappung an der KpnI-Stelle führte. Ein Ricin A enthaltenes KpnI-Fragment kann aus der Mutante ausgeschnitten und in die Reihe der ICI- Expressions -Vektoren insertiert werden. Modifikationen hinsichtlich zweier N-terminaler Aminosäuren wurden vorgenommen (Ile-Phe in Met-Val).
- Die aus M13K19RA hergestellte einzelträngige DNA war die Matrize für den Mutagenese-Schritt dieser Mutations- Strategie. Es wurde ein einzelnes Oligonukleotid, nämlich DTR16, das sämtliche Mutationsänderungen für diese Strategie einführt, synthetisiert.
- DTRI6 (SEQ.-ID.-Nr. 17) 5'AACAACATGGTACCCAAACAA 3'
- Zu Einführung einer spezifischen Änderung der DNA-Sequenz durch ortsgerichtete Mutagenese gibt es mehrere Protokolle. Die unten skizzierten Prozeduren ergaben sich unter Anwendung des Verfahrens von Eckstein et al. (Nuc. Acid Res. 1985, 13, S. 8749-8764 und 1986, 14, S. 9679-9698),
- für das einen Kit gibt (Amersham International), der gemäß den Anweisungen des Herstellers ängewendet wird.
- Das Prinzip dieses Verfahrens beruht darauf, die einzelsträngige DNA-Matrize mit dem mutagenen Oligonukleotid als Primer zu versehen und den komplementären Strang unter Einführung von dATPαs anstelle von dATP zu synthetisieren. Die Verwendung dieses Nukleotids führt zur Bildung von Phosphorothioat-Bindungen, die durch bestimmte Restriktionsenzyme (z.B. NciI) nicht gespalten werden. Nach der Synthese des zweiten Strangs wird NciI verwendet, um den Elternstrang zu zerschneiden, worauf Exonuklease III hinzugegeben wurde, um über den Mutationspunkt hinaus zurückzuverdauen. Mit DNA-Polymerase I ist dann die Resynthese des Elternstranges möglich. Folglich fungiert das mutagene Oligonukleotid als Matrize für die Resynthese, und die Mutation wird vor der Transformation in beide Stränge eingeführt. Es ergeben sich Mutationshäufigkeiten von bis zu 96 % der gesamten Nachkommenschaft und die Durchmusterung erfolgt einfach, indem zufällig ausgewählte Plaques zur Sequenz-Analyse überimpft werden.
- In unseren Versuchen war vier von vier überimpften Plaques richtig mutiert.
- Nach der Wahl einer Mutante (MRA16) wurde RF-DNA präpariert und auf das Vorliegen des neu erzeugten Restriktions-Fragments, d.h. Kpni, überprüft.
- Die pICI-Reihe von Expressions-Vektoren (vgl. Abschnitt 3) kann DNA-Fragmente akzeptieren, die in eine einzige Knpi- Restriktionsstelle in Nachbarschaft von Trp-Prornotor kloniert sind. Die KpnI-Stelle überlappt das Translationsinitiationskodon (ATG), das sich 8bp stromabwärts von der Shine-Dalgarno-Stelle (AGGA) des Promotors befindet.
- Nachdem die Sequenz von MRA16 festgestellt worden war, wurden eine KpnI-Verdauung in großem Maßstab (~5 ug RF-DNA) durchgeführt und das relevante Ricin A kodierende DNA- Fragment aus einem Agarose-Gel (Nu-Sieve-GTG-Agarose, FMC Bio-products) durch Phenol-Extraktion eines ausgeschnittenen Geistreifens nach dem Protokoll des Herstellers isoliert.
- pICI0020 (vgl. 3a) wurde mit KpnI verdaut und dann unter Verwendung von alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm (CIP - Böhringer Mannheim) dephosphoryliert. Durch die letztere Behandlung wird die Rezirkularisierung des Vektors durch Ligation verhindert, was zu einem hohen Anteil der Eltern in der Transformationsnachkommenschaft führen würde.
- Für die verschiedenen Strategien wurden Ligationen mit Verhältnissen Plasrnid-Vektor zu isoliertem Fragment von 8:1 (G/G) bis 1:3 vorbereitet. Kontroll-Ligationen zur Überprüfung der Wirksamkeit der Phosphatase-Behandlung, der Ligase-Aktivität usw. wurden durchgeführt. Die Ligationsbedingungen waren für die verwendete Quelle für die T4-DNA- Ligase (New England Biolabs oder Amersham) geeignet. Die Reaktionen wurden im allgemeinen über Nacht bei 15ºC inkubiert. 50 % jeder Ligationsreaktion (5 ul) wurde mit 1 x TNE (50 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) auf 100 ul verdünnt und mit 200 ul kompetenten E. coli DS410 versetzt. Die Zellen wurden nach einem Standard-Transformationsprotokoll (Maniatis, Kapitel 1, S. 74) auf L-Agar plus Streptomycin (25 ug/ml) und Ampicillin (100 ug/ml) ausplattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert.
- Nach der Inkubation wurden die Transformationsplatten untersucht. Im allgemeinen waren 5- bis 10-mal mehr Kolonien bei den Ligationen im Vergleich zu den Kontrollen ohne Ligase feststellbar. In einigen Fällen traten nur geringe Unterschiede in der Anzahl an Kolonien, die in Abwesenheit oder Gegenwart von Ligase gebildet worden waren, auf, was eine unvollständige Verdauung des Vektors oder eine schlechte Ligase-Aktivität anzeigt.
- Die Transformanten sowie die relevanten Kontrollen wurden auf Nitrocellulose-Filter überimpft, die sich auf L- Agarplaten zur Hybridisierungsdurchmusterung (auf dem Verfahren von Grunstein und Hogness basierend, wie es in Maniatis, Kapitel 1, S. 98 beschrieben wird) befanden. Nach der Inkubation wurden die Kolonien in situ unter Verwendung von 10%igern SDS und 1 M NaOH lysiert, unter Verwendung von 1 M Tris (pH 7,5) neutralisiert und dann 2 h bei 80ºC im Vakuum getrocknet.
- Die Hybridisierungssonden wurden hergestellt, indem die Mutations-Oligonukleotide unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase mit ³²P markiert wurden. Die Filter wurden bei Raumtemperatur mit der Sonde behandelt und dann in Stufen bis zu 55 bis 65ºC gewaschen, um vor der Autoradiographie auf unspezifischer Bindung beruhende Zählimpulse zu entfernen. Durch die spezifische Hybridisierung werden putative Klone angezeigt, die Ricin-A-DNA enthalten.
- Dann wurden aus positiv hybridisierenden Klonen DNA- Präparationen im kleinen Maßstab (nach dem Verfahren von Holmes und Quigley oder Birnboim-Doly-, wie in Maniatis, Kapitel 1, S. 25 spezifiziert) hergestellt. Die DNAs wurden mit den relevanten Restriktionsenzymen, z.B. KpnI und EcoRI/BglII, verdaut und durch Elektrophorese auf Agarose- Gelen analysiert. Die Vektor-DNAs und mutierten RF-DNAs wurden mit den gleichen Enzymen geschnitten, um die für die richtigen Klone erwarteten Fragmentgrößen nachzuweisen.
- Dann wurden von jedem Klon für eine detailliertere Restriktionsanalyse, z.B. ClaI, HindIII, BamHI, EcoRI/BglII, KpnI und Scai, Plasmid-DNA-Präparationen im größeren Maßstab (Birnboim-Doly) verwendet. Auf Agarose-Gelen zeigten diese Verdauungen die Größe des insertierten Fragments, ergaben einen Hinweis auf seine Orientierung und den Gewinn an Restriktions-Enzymstellen, die für das Gen für die Ricin-A- Kette einzig sind.
- Die durch Hybridisierung und Restriktionsdurchmusterung positiv identifizierten Klone wurden hinsichtlich der Expression von Ricin A durch SDS-PAGE-Analyse von Gesamtzell-Lysaten untersucht. Die Standardbedingungen für die Expressionsstudien waren:
- 1) Inokulation von 10 ml L-Brühe + Antibiotikum(a) mit einer einzelnen Kolonie und Züchtung bei 37ºC über Nacht unter vorsichtigem Schütteln.
- 2) Abnahme von 750 ul der L-Brühe und Pelletion der Zellen in einer Mikrofuge (1 min bei 6500 Upm).
- 3) Resuspension des Pellets in 300 ul M9-Medium (Maniatis, Anhang A.3) + 0,02 % Casein-Hydrolysat + 0,2 % Glucose + 50 ug/ml Thiamin und Inokulation in 10 ml des gleichen Mediums.
- 4) Inkubation bei 37ºC unter vorsichtigem Schütteln, 7 h lang oder über Nacht.
- 5) Nach der Inkubation Bestimmung der OD&sub5;&sub4;&sub0;, Pelletion der Zellen und Resuspension in einem Volumen Laemmli- Probenpuffer, das dem entspricht, das eine OD&sub5;&sub4;&sub0; von 10 ergeben würde, wenn in Wasser suspendiert wird (Maniatis, Kapitel 18, S. 53). 15 min kochen.
- 6) Beladung des SDS-Polyacrylamid-Gels mit 20 ul des Gesamtzell-Lysats, Elektrophorese, Färbung mit Coomassie- Blau, Entfärbung und Sichtbarmachung.
- Von denen mit SDS-PAGE untersuchten Klonen zeigte nur einer eine zusätzliche Bande mit einem ungefähren äquivalenten Molekulargewicht von ~29KD (das dem für unglycosyliertes, reifes Ricin A bestimmten äquivalent ist). Gel-Abtastungen ergaben, daß die Akkumulation im Bereich von 5 bis 10 % des Zellgesamtproteins liegt. Das Plasmid dieses Klons wurde mit pICI1102 bezeichnet.
- Die Konstruktion von pICI1102 ist in Figur 5 schematisch dargestellt. Die Ergebnisse der Expressionsstudien sind in den Figuren 6 und 7 dargestellt.
- Die Echtheit des rekombinierten Proteins der Ricin-A-Kette, die anfangs durch Färbung der SDS-Polyacrylamid-Gele mit Coomassie-Blau festgestellt werden konnte, wurde durch Western-blotting bestätigt. Die Protein-Banden wurden auf Nitrocellulose-Filter übertragen und unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers für Ricin A und im Anschluß daran von mit Peroxidase markierten Antiglobulinen nachgewiesen.
- 15%ige SDS-PAGE-Gele wurden über Nacht bei 8 mA laufen gelassen und dann mindestens 30 min in Transferpuffer äquilibriert
- Die Proteinbanden auf den Gelen wurden dann auf Nitrocellulose-Membranen (Hybond-C, Amersham) übertragen, und zwar elektrophoretisch in einer Trans-Blot-Apparatur von Bio-Rad, 3 h lang bei 70 V. Die Filter können nach dem Trocknen in verschlossenen Plastikbeuteln bei -20ºC aufgewahrt werden.
- Ricin A.1 war ein polyklonaler Antikörper, der von Kaninchen gegen ein synthetisches Peptid-Fragment von Ricin A gebildet worden war. Erste Untersuchungen zeigten eine gute Affinität für Ricin A, aber eine beträchtliche Kreuzreaktivität mit vielen E.-coli-Proteinen. Zur überwindung des durch diese Kreuzreaktivität verursachten hohen Hintergrundes wurde der Antikörper mit einem E.-coli-Lysat vorinkubiert.
- 10 ml einer über-Nacht-Kultur des E.-coli-Stamms DS410 in 10 ml L-Brühe wurde 10 min bei 4000 Upm zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Pellet wurde in 5 ml Bakterienpuffer resuspendiert und bei 4-6 u beschallt, und zwar in Stößen zu 6 x 10 s mit 30-sekündigen Kühlinterwallen auf Eis.
- 0,5 ml des Sonikats wurden dann mit 0,5 ml Ricin-A.1- Antiserum vermischt und bei Raumtemperatur 90 min inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 13 000 Upm pelletiert und der überstand bei -20ºC aufbewahrt.
- Die Nitrocellulose-Filter aus den Western-übertragungen wurden blockiert, indem über Nacht bei Raumtemperatur in 5 % BSA-PBS/Tween inkubiert wurde. (PBS/Tween = 5 ml Tween 20 pro 1 l PBS).
- 3 x 3 min Waschen in PBS/Tween.
- 2-stündige Inkubation (oder über Nacht) bei Raumtemperatur mit einer 1/4000-Verdünnung des "blockierten" Ricin-A.1-Antikörpers in 0,5% BSA-PBS/Tween.
- 3 x 3 min Waschen in PBS/Tween.
- 1-stündige Inkubation mit einer 1/1000-Verdünnung Ziegen-Anti-Kaninchen-Antiserum in 0,5 % BSA-PBS/Tween bei Raumtemperatur.
- 3 x 3 min Waschen in PBS/Tween.
- 1-stündige Inkubation mit einer 1/5000-Verdünnung Kaninchen-Peroxidase-Anti-Peroxidase-Antiserum in 0, 5 % BSA/PBS/Tween bei Raumtemperatur.
- 3 x 3 min Waschen in PBS/Tween.
- Entwicklung durch Eintauchen in eine Lösung von 4- Chlornaphthol (60 mg) in 20 ml Methanol, mit PBS auf 120 ml gebracht und 12 ul Wasserstoffperoxid enthaltend. Die Membran wurde aus der Lösung entfernt sobald die Banden sichtbar waren, getrocknet und photographiert.
- Eine typische Western-Blot-Analyse ist in Fig. 8 dargestellt.
- Das Ziel war die Einrichtung eines experimentellen Systems zur Prüfung der biologischen Aktivität von r-Ricin-A in einem zell freien In-vitro-Proteinsynthese-Assay.
- Kaninchen-Reticulocyten-Lysate wurden nach dem Verfahren von Allen und Schweet (J. Biol. Chern. (1962), 237, 760-767) hergestellt. Der Assay zeigt die Inhibition der Protein- Synthese in einem zellfreien System durch einen fehlenden Einbau von ¹&sup4;C-markiertem Leucin in neu synthetisiertes Protein.
- Stammlösung 1 mM Aminosäure-Gemisch minus Leucin.
- Eine Lösung, die sämtliche L-Aminosäuren in einer Konzentration von 1 mM enthält, ausgenommen Leucin (mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt und bei -70ºC aufbewahrt).
- Lösung A: 40 mM Magnesiumacetat, 2 M Ammoniumacetat, 0,2 M Tris (pH 7,4, mit HCl eingestellt, bei 4ºC aufbewahrt).
- Lösung B: ATP (Simga A5394) 246 mg/ml; GTP (Sigma G8752) 24,4 mg/ml.
- Assay-Gemisch: 1 ml Aminosäure-Gemisch, 1 ml Lösung A, 0,1 ml Lösung B, 103 mg Creatinphosphat, 1 mg Cratinkinase, 510 ul H&sub2;O; 600 ul (60 uCi) L-¹&sup4;C-Leucin (New England Nudear, NEC-279E).
- Reaktionsgemisch: 25 ul Testprobe, 12,5 ul Assay-Gemisch, 25 ul Kaninchen-Reticulocytenlysat.
- Die Blindlösung war 2 mg/ml BSA in PBS.
- Sämtliche Assays wurden zweifach durchgeführt.
- 12,5 ul des Assay-Gemischs wurden in sterile Glasröhrchen gegeben. 25 ul BSA und PBS wurden als Blindwerte in jedes von ersten vier Röhrchen gegeben. 25 ul der Testproben wurden in die restlichen Röhrchen gegeben. 1 ml 0,1 M KOH wurde in die ersten zwei Röhrchen gegeben (Hintergrund- Blindwert). Die Röhrchen wurden in einem Wasserbad bei 28ºC äquilibriert 25 ul Kaninchen-Reticulocytenlysat (das von der Temperatur flüssigen Stickstoffs auftauen gelassen wurde) wurden in Intervallen zu 20 s in jedes Röhrchen gegeben. Nachdem das erste Röhrchen 12 min inkubiert worden war, wurden in jedes Röhrchen wieder in Intervallen zu 20 s 1 ml 0,1 M KOH gegeben, so daß sämtliche Röhrchen 12 min inkubiert wurden. Dann wurden zwei Tropfen 20%iges Wasserstoffperoxid in jedes Röhrchen gegeben und im Anschluß daran 1 ml 20%ige TCA. Die Röhrchen wurden durchmischt und mindestens 1 h, oder über Nacht, bei 4ºC stehen gelassen. Die Niederschläge wurden auf GFC-Scheiben mit einem Durchmesser von 2,5 cm filtriert, mit 3 x 4 ml 5%iger TCA gewaschen, in Szintillationsröhrchen überführt und mit 10 ml Szintillationsmittel (Ready-Solv. MP, Beckman) versetzt. Nach 1 h wurden die Gefäße geschüttelt und ausgezählt.
- Kulturen in 10 ml L-Brühe wurden bei 37ºC über Nacht angezogen. Aliquots zu 400 ul wurden 30 5 bei 13 000 Upm pelletiert und der größte Teil des überstandes dekantiert.
- Die Pellets wurden zweimal rasch in Trockeneis/ETOH eingefroren und anschließend auf 37ºC aufgetaut. Dann wurden 12 ul 25%igen Sucrose in 50 mM Tris HCl, pH 8,0, dazugegeben und im Anschluß daran 4 ul einer Lysozym-Lösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml.
- Nach 15-minütiger Inkubation auf Eis wurden 8 ul 0,25 M EDTA dazugegeben und 15 min weiterinkubiert. Die Lyse wurde osmotisch durchgeführt, indem die Proben auf 400 ul mit Wasser verdünnt wurden. Durch dieses Verfahren ergaben sich 80-100 lebende Zellen pro ml.
- Wenn ein Aliquot zu 25 ul dieses Lysats in das Assay- Reaktionsgemisch gegeben wurde, betrug die Einbaumenge von ¹&sup4;C-Leucin in neu synthetisiertes Protein ~10 % des Blindwertes ohne Lysat. Dies war ein Inhibitionsgrad, der dem von 8 ng/ml Ricin A verursachten ähnelte. Dann wurden Verdünnungen des E.-coli-Lysats hergestellt und der Assay wiederholt. Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß als Minimum eine 16-fache Verdünnung erforderlich war, um die Wirkung des Lysats auf die des Blindwertes zu verringern.
- Um so sicher wie möglich zu sein, daß die Lyse von E. coli und E.-coli-Lysaten die Toxizität von Ricin A nicht beeinträchtigt, wurden zwei Kontroll-Assays durchgeführt. Beim ersten wurde von Pflanzen stammendes Ricin A zu einem 16-fach verdünnten E.-coli-Zellpellet gegeben, so daß sich eine Endkonzentration von 8 ng/ml in dem Assay-Gemisch nach der Zell-Lyse ergab. Beide Kontrollen ergaben keine nachteilige Wirkung der Lysate oder des Lyse-Verfahrens auf die inhibierende Wirkung von Ricin A.
- Diese Techniken wurden angewendet, um die Synthese von biologisch aktivem, rekombinierten Ricin A aus pICI1102 und den nachstehend beschriebenen Klonen zu verifizieren
- Zur Analyse von pICI1102 wurde die Plasrnid-DNA- Sequenzierung angewendet. Das gewählte Protokoll war nach Zagursky et al. (Gene Analysis Techniques, Bd. 2, Nr. 5) modifiziert und mit einer alkalischen Denaturierung der doppelsträngigen Plasmid-DNA vor der Assozuerung an den Primer und der Sequenzierung nach einem Standardverfahren, für das es beispielsweise von mehreren Anbietern einen Kit gibt, z.B. Sequenase (United States Bioscience), verbunden. Durch Verwendung eines Oligonukleotids als Primer am 3'- Ende von β-Lactamase und mehrerer interner Primer für die A-Kette ist die Sequenzierung beider Stränge des Promotors und des Ricin-A-Gens möglich.
- Die am Anfang erhaltenen Sequenzierungsdaten lieferten insofern ein unerwartetes Ergebnis, als ein zusätzliches Kpni-Fragment zwischen dem Promotor und der kodierenden Sequenz für Ricin A vorhanden war, d.h. (SEQ.-ID.-Nr. 20):
- Dieses zusätzliche KpnI-Fragment stammte von M13K19RA und enthielt Restriktionsenzym-Stellen sowie den von pUC8RA klonierten Teil der Ricin-Leader-Sequenz. Die 5'-Region der Ricin-A-Kette enthält die wärend der Mutagenese induzierten Basenänderungen.
- Die Untersuchung dieser Sequenz ergab, daß das erste Translationsinitationskodon (ATG) außerhalb des Leserasters der das Ricin A kodierenden Region liegt. Außerdem gibt es ein im Leseraster liegendes Terminationskodon (TAG) vor dem Initiationskodon für Ricin A und eine putative Shine- Dalgarno-Sequenz (AGGA), welche die Translation vom zweiten ATG reinitueren könnte.
- Weitere Untersuchungen ergaben überraschenderweise, daß dieses zusätzliche DNA-Fragment sich vorteilhaft auf die Akkumulation der Ricin-A-Kette in E. coli auswirkt, nämlich im Vergleich zu Klonen, aus denen es herausgeschnitten worden war.
- Die vollständige DNA-Sequenz des Ricin-A-Gens, das in pICI1102 enthalten ist, ist in Figur 9 angegeben (SEQ.-ID.- Nr. 18).
- Die Subkionierung der zwei Kpni-Fragmente aus dem zufällig hergestellten pICI1120 in die zur Expression von Ricin A richtige Orientierung wäre schwierig. Daher wurde versucht, die interne KpnI-Erkennungsstelle durch die Substitution einer einzelnen Base (A durch T) zu verändern. Dadurch wurde die Spaltung durch KpnI an dieser Stelle verhindert und die Subkionierung eines einzelnen KpnI-Fragments in eine Reihe von pICI-Expressionsvektoren möglich. Durch die Substitution des Adenins in der KpnI-Erkennungsstelle (GGTACC) durch Thymin (d.h. GGTTCC) wird der ersten Rest von Ricin A nicht verändert (GTA/GTT = Val). Dies bedeutet: Fragment Ricin-A-Sequenz
- wird verändert zu: Ricin-A-Sequenz wird von KpnI nicht erkannt
- Das Oligonukleotid, das zur Erzeugung dieser Veränderung synthetisiert wurde, hatte folgende Sequenz (SEQ.-ID.-Nr. 19):
- 5' ATAACAACATGGTTCCCAAACAATAC 3'
- wobei die unterstrichene Base die Mutationsänderung darstellt.
- Es wurde geplant, daß mutierte Ricin-A-Fragment in eine Reihe von trp-Expressions-Vektoren für vergleichende Expressionsstudien zu klonieren. Durch die Klonierung in pICI0020 ergibt sich ein Vergleich mit pICI1102 zur Bestimmung der Wirkungen, sofern es eine gibt, der Substitution einer einzelnen Base auf die Expression.
- Die Matrize für die Mutagenese war MRAI6, bei dem es sich um den M13-Klon handelte, der die in pICI1102 vorhandenen zwei Kpni-Fragmente enthielt. Nach der Mutagenese wurde Isolate, welche die gewünschten Mutationen trugen, durch zufällige Probennahme und Bestimmung der DNA-Sequenz in dem Bereich, in dem das mutagene Oligonukleotid spezifisch bindet, identifiziert.
- Eine mutierte Matrize wurde MRA22 genannt. Diese wurde durch DNA-Sequenz-Bestimmung der vollständigen Ricin-A kodierenden Sequenz weiter analysiert, um das Fehlen von unspezifischen Mutationen zu verifizieren
- Die mutierten, einzelsträngigen DNAs wurden in kompetente E.-coli-TG1-Zellen zur Bildung einzelner Plaques transformiert. Einzelne Plaques wurden dann überimpft und die DNA in replikativer Form (RF, doppelsträngig) durch Bandenbildung in Cäsiumchlorid/Ethidiumbrom-Schwebedichtegradienten gereinigt. Die gereinigte RF-DNA wurde vollständig mit Kpni verdaut. Die Klonierung erfolgte durch "shotgun"-Ligation der verdauten RF-DNA mit dem geeigneten, mit Kpni geschnittenen und Phosphatase behandelten Expressionsvektor oder durch spezifische Ligation des Ricin-A-Fragments nach seiner Reinigung in einem Agarose- Gel. Die ligierte DNA wurde in E. coli TG1 oder HB101 transformiert.
- Ricin A enthaltene Klone wurden durch Hybridisierungsdurchmusterung unter Verwendung einer mit ³²P markierten Ricin- A-Sonde identifiziert, die hergestellt worden war, indem ein KpnI-Fragment, das aus einem anderen Ricin-A enthaltenden Klon (pICI1121) isoliert worden war, unter Verwendung von zufälligen Hexanukleotiden als Primer behandelt wurde. Kolonien mit positiver Hybridisierung wurden weiter durch Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA unter Anwendung einer Kpni-Einzelverdauung und einer EcoRI/BglII-Doppelverdauung durchmustert. Durch Kpni wird die Größe des insertierten Fragments bestimmt und mit EcoRI/BglII die Orientierung des Fragments.
- Klone, die das Ricin-A-Fragment in der richtigen Orientierung zur Expression aufwiesen, wurden durch SDS- PAGE mit sich anschließender Coomassie-Färbung und Westernblotting doppelter Gele analysiert. Der Grad der Akkumulation von Ricin A in diesen Klonen entsprach dem in pICI1102 nachgewiesenen.
- Ein Isolat wurde selektiert und das Plasmid mit pICI1131 bezeichnet.
- Eine Transkriptionsterminatorelement erzeugt eine Sekundärstruktur am 3'-Ende von mRNA, durch welche die Aktivität der RNA-Polymerase zum Stillstand kommt. Die Stabilität dieser Sekundärstruktur kann die Akkumulation von Protein verbessern, indem die mRNA am 3'-Ende gegen Exonukleaseangriff geschützt wird. Die Sekundärstruktur des T&sub4;-Transkriptionsterminators gilt als stärker als die des trp-Attenuators, der in allen bisherigen Ricin-A- Konstrukten vorhanden ist.
- In diesen Experimenten wurden der trp-Promotor und das Ricin-A-Fragment von pICI1131 durch Verdauung mit den Enzymen EcoRI und SalI ausgeschnitten. Das letztere Enzym spaltet zwischen dem 3'-Terminus der Ricin-A kodierenden Sequenz und dem trpA-Transkriptionsterminator. Das sich ergebende Fragment wurde aus einem Agarosegel ausgeschnitten (2 % Nusieve GTG-Agarose, FMC Bioprodukts) und durch Phenol- und Chloroform-Extraktionen gereinigt, denen sich die Ausfällung mit Ethanol anschloß. Das gereinigte Fragment wurde mit pICI1079, das mit EcoRI und SalI geschnitten worden war, liegiert. Das letztere Plasmid enthält den T&sub4;-Terminator zwischen einzelnen SalI- und SphI-Stellen (vgl. 5.c).
- Die ligierte DNA wurde in kompetente E. coli HB101 (BRL transformiert und die Hybridisierungsdurchmusterung angewendet, um das Vorliegen von Ricin-A-DNA wie in vorherigen Versuchen nachzuweisen. Positiv hybridisierende Klone wurden für die Plasrnid-DNA-Präparation ausgewählt, der sich die Restriktionsanalyse mit EcoRI und SalI zusammen anschloß, um das Vorliegen eines Fragments mit einer entsprechenden Größe zu zeigen.
- Ein Isolat mit der richtigen Konstruktion wurde identifiziert und mit pICI1185 bezeichnet.
- Das Plasmid pICI1185 wurde zur Herstellung eines weiteren Konstrukts durch Subklonierung der Expressionskassette in P1CI0042 verwendet. Die Plasmid-DNA wurde aus PICI1185 prapariert und mit EcoRI und SphI zusammen verdaut, um eine Expressionskassette auszuschneiden, die den trp-Promotor/- RBS1/Ricin-A(MRA22) -Fragment/T&sub4;-Terminator enthält. Dieses Fragment wurde nach dem in 4.d. dargestellten Verfahren isoliert und mit PICI0042, das mit EcoRI und SphI geschnitten worden war, ligiert.
- Die ligierte DNA wurde in E. coli HB101 transformiert und über Nacht bei 37ºC. Die HB101-Transformationen wurden auf L-Agar + Tetracyclin auspiattiert und die Kolonien durch Hybridisierung mit einer mit ³²P markierten Ricin-A-DNA- Sonde durchmustert.
- In beiden Fällen wurden positiv identifizierte Kolonien durch Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA unter Anwendung von EcoRI/SphI- und EcoRI/BglII-Verdauungen bestätigt. Es wurden drei Isolate identifiziert, d.h. PICI1187.1-3.
- Figur 10 stellt schematisch die Konstruktion von PICI1185 und pICI1187 dar.
- Die isolierten Plasmide wurden in E. coli 71.18 (Gronenborn, B., 1976, Mol. Gen. Genet. 148, 243-250) transformiert und einzelne Kolonien für Klon- Selektionsstudien überimpft. Die sich ergebenden Gesamtzell-Lysate wurden auf doppelten SDS-PAGE-Gelen elektrophoretisiert, von denen eines mit Coomassie-Blau gefärbt und das andere für die Wester-blot-Analyse verwendet wurde.
- Das gefärbte Gel ergab nur minimale Daten für die Expression von Ricin-A, und zwar wegen des Vorliegens von mitwandernden Proteinen aus E. coli 71.18. Das Westernblotting ergab aber klar im Vergleich mit positiven und negativen Kontrollproben die Expression von Ricin-A. Ein Isolat wurde der Fermentationsforschungsgruppe zur Erhöhung des Maßstabes des Verfahrens übergeben.
- (a) Das Plasmid pICI1187 wurde in den E.-coli-Stamm DS410 (hier auch mit MSD68 bezeichnet) transformiert, worauf die sich ergebende Rekombinante (MSD1051) gereinigt und bei -80ºC in Glycerol-Stammlösungen aufbewahrt wurde.
- Ein Aliquot der Kultur wurde der Stammlösung entnommen und auf Agarpiatten mit L-Tetracyclin ausgestrichen, um einzelne Kolonien nach der Anzucht bei 37ºC über Nacht zu separieren. Eine einzelne Kolonie MSD 1051 wurde entnommen und in 10 ml L-Tetracyclin-Brühe resuspendiert, worauf sofort 100 ul in jeden von 10 250 ml-Erlenmeyer-Kolben, die 75 ml L-Tetracyclin-Brühe enthielten, überimpft wurden. Nach 16-stündigem Anzüchten bei 37ºC auf einem Reziprokschüttler wurden die Inhalte der Kolben gepoolt und zum Animpfen eines Fermenters verwendet, der 20 l eines modifizierten LCM50-Wachstumsmediums mit der folgenden Zusammensetzung enthielt:
- Dann wurde bei einer Temperatur von 37ºC und einem pH-Wert von 6,7, der durch automatische Zugabe von 6 M Natriumhydroxid-Lösung geregelt wurde, fermentiert. Der Partialdruck des gelösten Sauerstoffs (dOT) wurde auf einen Sollwert von 50 % Luftsättigung eingestellt und durch automatische Einstellung der Rührergeschwindigkeit des Fermenters reguliert. Der Lufteinstrom in den Fermenter, der am Anfang 20 l/min betrug, was 1 Volumen pro Volumen pro Minute (VVM) entspricht, wurde auf 45 l/min erhöht, als die Rührergeschwindigkeit im Fermenter 80 bis 90 % ihres Maximums erreichte.
- Während der Fermentation wurden Proben zur Bestimmung der optischen Dichte (OD&sub5;&sub5;&sub0;), des Zelltrockengewichts und der Akkumulation von Ricin A in den Zellen entnommen. Die Akkumulation von Ricin A wurden durch Abtasten von mit Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gelen von Gesamtzell- Lysaten der als Probe entnommenen Bakterien bestimmt, wie es auf dem Fachgebiet gut bekannt ist.
- 4 1/2 h nach der Animpfung wurde Hefeextrakt(Difco)-Lösung (225 g/l) mit einer Geschwindigkeit von 1,7 g/l/h in die Fermenter eingepumpt.
- Nach 12 h, als die OD&sub5;&sub5;&sub0; etwa 50 erreichte und bevor die Fermentation durch den Sauerstoff eingeschränkt wurde, wurden die Bakterien mit einer Sorval-RC3B-Zentrifuge (7000 g, 30 min, 4º) geerntet und das akkumulierte Protein aus den Bakterien gewonnen.
- (b) Das Plasmid pICI1187 wurde in den E.-coli-Stamm DS410 (hier auch mit MSD68 bezeichnet) transformiert und der sich ergebende Rekombinante (MSD1051) gereinigt und in Glycerol-Stammlösungen bei -80ºC aufbewahrt.
- Ein Aliquot (100 ul) der Kultur wurde entnommen und sofort in einen 2-l-Erlenmeyerkolben, der 600 ml L-Tetracyclin- Brühe enthielt, überimpft. Nach 16-stündigem Anzüchten bei 37ºC auf einem Reziprokschüttler wurden die Inhalte der Kolben verwendet, um einen Fermenter anzuimpfen, der ein Wachstumsrnedium mit der folgenden Zusammensetzung enthielt:
- Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 37ºC durchgeführt. Der pH-Wert wurde durch atomatische Zugabe von 2 M Schwefelsäure und 6 M Natriumhydroxid-Lösung geregelt, und zwar so, daß der pH-Wert bis zu 10 h nach der Animpfung bei pH 6,7 blieb und danach bei pH 6,0.
- Für den Partialdruck des gelösten Sauerstoffs (dOT) wurde ein Sollwert von 50 % Luftsättigung eingestellt und am Anfang durch automatische Einstellung der Rührergeschwindigkeit des Fermenters kontrolliert. Der Luftstrom in dem Fermenter betrug am Anfang 20 l/min, was 1 Volumen pro Volumen pro Minute (VVM) entsprach, und wurde manuell auf 45 l/min erhöht, als die Geschwindigkeit des Fermenterrührers ihr Maximum erreichte (1000 Upm). Dann wurde der Luftstrom zum Fermenter manuell zurück auf 20 l/min erniedrigt, als in späteren Stadien der Fermentation die Rührergeschwindigkeit sich automatisch auf etwa 500 Upm erniedrigt hatte. Die Fermentation dauerte 23 h, und während dieser Zeit wurden Proben zur Bestimmung der optischen Dichte (OD&sub5;&sub5;&sub0;), des Zelltrockengewichts, der Akkumulation und Verteilung von Ricin A in den Bakterienzellen entnommen. Die Akkumulation von Ricin A wurde durch Abtasten von mit Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gelen von Gesamtzellysaten der gesammelten Bakterien bestimmt, was auf dem Fachgebiet gut bekannt ist. Die Verteilung von Ricin A in den cytoplasmatischen (löslichen) Fraktionen und in den Einschlußkörper (unlöslichen) Fraktionen der Zellen wurde bestimmt, indem die gesammelten Bakterien durch Beschallung lysiert wurden, was auf dem Fachgebiet gut bekannt ist.
- Eine Lösung Hefeextrakt (225 gl-¹) wurde 4,5 h nach der Animpfung mit 1,7 gl&supmin;¹h&supmin;¹ in den Fermenter gepumt.
- Nachdem die Kohlenstoffquelle der Fermentation verbraucht war (was zu einem raschen Anstieg des DOT von der 50 %igen Luftsättigung führte), wurde eine Lösung, die Glycerol (714 gl&supmin;¹) und Ammoniumsulfat 143 gl&supmin;¹) enthielt, in den Fermenter mit einer solchen Geschwindigkeit eingepumpt, wie es für den maximalen Kohlenstoffbedarf der Bakterien erforderlich war. Dann wurde die Zuführgeschwindigkeit der Kohlenstoffquelle und des Ammoniumsulfats während der restlichen Fermentation unverändert gelassen.
- Nach 23 h Fermentation ergaben sich etwa 1500 mg lösliches Ricin A pro Liter Fermentationsbrühe.
- 1. E. coli DS410 (hier auch mit MSD68 bezeichnet) ist gut bekannt (Dougan und Sherratt, Molecular and General Genetics, Bd. 151, S. 151-160, 1997). Dieser Stamm ist für die Öffentlichkeit frei zugänglich und wurde außerdem von den Anmeldern am 7. Juni 1985 gemäß dem Budapester Vertrag bei der National Collections of Industrial & Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, Schottland unter der Zugangs-Nr. 12100 hinterlegt.
- Die TES hatte die folgende Zusammensetzung:
- Unter optimalen Fermentationsbedingungen akkumuliert r- Ricin A als lösliches cytosolisches Protein. Dieses Protein wurde durch Aufbrechen der Zellen (Homogenisation) in einem Puffer gewonnen, der die Stabilität von r-Ricin A unterstützt. Dieses Grundverfahren wurde an geernteten lebenden Zellen durchgeführt, um die Lösungsstabilität des Produkts sicherzustellen. Das r-Ricin A wurde aus dem Homogenat durch Entfernung der Feststoffe (Zelltrümmer) durch Zentrifugation gewonnen. Zur Erhöhung des Maßstabs dieses Verfahrens wurden die Trrümer mit einem Mittel (Polythenimin) ausgeflockt, mit dem außerdem der Hauptteil der in dem Extrakt enthaltenen Nukleinsäure ausfällt. Der Zentrifugenüberstand wurde dann sterilfiltriert, durch Querstromfutration konzentriert und das Protein mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Der Ammoniumsulfat-Niederschlag wurde bei -70ºC aufbewahrt.
- r-Ricin A hat einen isoelektrischen Punkt von 7,3, der deutlich oberhalb des isoelektrischen Punktes von vielen anderen E.-coli-Proteinen liegt. Das Produkt kann daher bequem durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden. Sämtliche Gewinnungs- und Chromatographieschritte wurden unter Bedingungen durchgeführt, welche die Instabilität von r-Ricin A unterstützen: Temperatur < 15ºC, Gegenwart von Dithiothreithol, um das freie Thiol im reduzierten Zustand zu halten, und EDTA, zur Verringerung der Oxidation durch Luft und der Proteolyse.
- Die Zellen wurden aus der Fermentationsbrühe unter Verwendung eines Separators mit kontinuierlichem Scheibenstapel und intermittierender Abgabe gesammelt. Die Brühe (50 l aus 2 x 25 l-Fermentationen) wurde zunächst aus den Fermentern in einen 50 l-Rollentank überführt und zu einem Behältersystem transportiert, das aus einer Anzahl Lagertanks, die mit dem Separator und einem Hochdruckhomogenisator verbunden waren, bestand.
- Der Rollentank wurde mit diesem System verbunden und die Brühe mit einer Fließgeschwindigkeit von 40 l/h durch den Zentrifugalseparator gepumpt. Die Abgabegeschwindigkeit wurde so eingestellt, daß der Überstand der Zentrifuge bei der visuellen Uberprüfung durch ein Sichtglas in der Abgabeleitung für den überstand klar war. Der aus dem Separator abgegebene Feststoff (Zellen) wurde in einem geeigneten Gefäß gesammelt und in 40 l Puffer A (50 mM Natriumdihydrogenorthophosphat, 25 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 5 mM Benzamidin, 2 mM Dithiothreithol, pH 6,3, mit 5 N Natriumhydroxid eingestellt) resuspendiert und in dem Aufnahmegefäß für die Feststoff auf 8ºC vorgekühlt. Dann wurden die suspendierten Zellen über den Homogenisator, der auf einen Arbeitsdruck von 600 bar eingestellt war, wieder zurück in den Rollentak überführt. Das sich ergebende Homogenisat (60 1) wurde auf < 20ºC abgekühlt und durch Zugabe von 2,5 l einer Lösung mit 10 % (VIV) in bezug auf Polythenimin 0,5%ig gemacht. Dann wurde die Suspension 10 min ausflocken gelassen und dann über den Zentrifugalseparator in den Lagertank überführt. Anschließend wurde der klare überstand gesammelt und durch Reinigung durch einen Tiefenfilter und einen positiv geladenen 0,2 um- Membranfilter sterilisiert.
- Der sterile, geklärte überstand wurde unter Verwendung einer Querstromfiltrationsvorrichtung mit Spiralpatronen auf ein Volumen von 12 l konzentriert, worauf die Lösung durch Zugabe von 2,9 kg festen Ammoniumsulfat-Kristallen auf 40 % Sättigung gebracht wurde. Dann wurde die Lösung durch vorsichtiges Rühren über Nacht bei 15ºC ausflocken gelassen und dann zentrifugiert. Die entnommene Aufschlämmung wurde gesammelt und bis zur weiteren Verarbeitung bei -70ºC aufbewahrt.
- Der Ammoniumsulfat-Niederschlag wurde in Gegenwart von 14 l Puffer B (50 mM Natriumdihydrogenorthophosphat, 25 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 2 mM Dithiothreithol, pH 6,3, mit 5N Natriumhydroxid eingestellt) aufgetaut. Nach 30 min wurde die Suspension durch Zentrifugation geklärt und durch Diafutration gegen 70 1 Puffer B entsalzt, wobei überprüft wurde, ob sich die Leitfähigkeit auf unter 3 mS/cm verringert hatte. Die entsalzte Lösung wurde durch Zentrifugation weiter geklärt und sofort weiter verarbeitet.
- Die entsalzte Lösung wurde langsam in einen Batch- Chromatographietank gegeben, der 2 kg DEAE-Cellulose enthielt, die mit 60 l Puffer B äquilibriert worden war. Nach 6,5-stündigem Rühren wurde die ungebundene r-Ricin-A- Lösung vom Boden des Tanks durch eine Säule mit 11,3 cm im Durchmesser x 10 cm, die mit äquilibrierter DEAE-Cellulose gepackt worden war, mit einer Fließgeschwindigkeit von 80 ml/min gepumpt. Der Hauptteil des r-Ricin A band nicht und wurde in einem Gefäß aus rostfreiem Stahl gesammelt.
- Die r-Ricin-A-Lösung wurde mit 1 M Orthophosphorsäure auf pH 5,5 eingestellt und auf eine Säule mit 10 cm Durchmesser x 10 cm aus Carboxymethylagarose, die mit 10 1 Puffer C (25 mM Natriumdihydrogenorthophosphat, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 2 mM Dithiothreithol, pH 5,5, mit 5 N Natriumhydroxid eingestellt) äquilibriert worden war, aufgebracht. Das r-Ricin-A band an diese Säule und wurde nach dem Waschen mit 10 l Puffer C mit Puffer D eluiert (25 mM Natriumdihydrogenorthophosphat, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 2 mM Dithiothreithol, 100 mM Natriumchlorid, pH 5,5, mit 5 N Natriumhydroxid eingestellt). Das reine r-Ricin A eluierte in Form eines einzelnen Peaks, der gesammelt und als gefrorene sterile Lösung bei -70ºC aufbewahrt wurde, bis es zur weiteren Verarbeitung benötigt wurde. Das r-Ricin-A ist unter diesen Bedingungen bis zu einem Jahr stabil.
- Die folgende Ausrüstung wurde verwendet:
- Anionenaustauscher: DE-52, DEAE-Cellulose (Whatman Biochemicals)
- Kationenaustauscher: OM/Sepharose (Pharmacia)
- Zentrifuge: Scheibenstapelzentrifuge (Westphalia) CSA-1, Westphalia
- Homogenisator: APV-Schroeder Lab 60/60-Homogenisator (APV)
- Filter: AMI 0057P Tiefenfilter, ABI NFZP-Posidyne-Membranfilter (Pall)
- Batch-Tank: Pharmacia-Batch-Chrornatographietank 701 (Pharmacia)
- DE-Säule: Bioprocess 113 (Pharmacia)
- DM-Säule: K100/50 (Pharmacia)
- Immunihistochemische Untersuchung von C242 (C242.II) in Kolorektalkrebs und normalen Geweben
- Proben aus dem primären kolorektalen Karzinom und verschiedenen normalen Geweben wurden von Patienten durch chirurgische Resektion erhalten. Die Gewebe wurden auf Eis gehalten und innerhalb 1 h nach der Resektion in mit flüssigem Stickstoff vorgekühlten Isopentan eingefroren. Die Gewebe wurden bis zum Schneiden bei -70ºC aufbewahrt. Die gefrorenen Biopsien wurden in 5 um dicke Schnitte geschnitten und in 50 % Aceton 30 s bei +4ºC und im Anschluß darin in 100 % Aceton 5 min bei +4ºC fixiert. Die Schnitte wurden luftgetrocknet und 10 min mit PBS gespült. Sämtliche Schnitte wurden dann in 0,3%igem Wasserstoffperoxid in PBS 5 min inkubiert, um die endogene Peroxidase zu blockieren und dann zweimal mit PBS gespült. Danach wurden die Schnitte mit normalen Schweineserum behandelt und 1:10 in PBS-4 % BSA 5 min bei +4ºC verdünnt, um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu blockieren.
- Sämtliche Inkubationen mit Antikörpern wurden bei Raumtemperatur 30 min lang in einer feuchten Atmosphäre durchgeführt. Zuerst wurden die Schnitte mit dem monoklonalen Antikörper C242 (C242:II), der im obigen Beispiel 1 erhalten worden war, in PBS-4 % BSA inkubiert und danach mit biotinyliertem Pferde-anti-Maus-IgG (Vectastain - Warenzeichen, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), 1:400 in PBS-4 % BSA verdünnt mit 2 % Schweine-anti-Kaninchen-Immunglobulin und schließlich mit Avidin-DH/biotinylierte Meerrettichperoxidase-H-Komplex (Dakopatts A/S, Kopenhagen, Dänemark). Nach jeder Inkubation wurden die Schnitte 15 min mit PBS gespült. Dann wurden die Schnitte 15 min mit dem Substrat behandelt, mit PBS gespült, mit Haematoxylin gegengefärbt und mit Glycerolgelatine (Merck, Darmstadt, Deutschland) montiert. Bei dem verwendeten Substrat handelte es sich um 10 mg 3- Amino-9-ethylcarbazol (Sigma, St. Louis, Mo., SA), das in 6 ml Dimethylsulfoxid gelöst und mit 50 ml 0,02 M Natriumacetat, pH 5,5, das 4 ul 30%iges H&sub2;O&sub2; enthielt, verdünnt worden war. Die Substrat-Lösung wurde vor der Verwendung filtriert. Dann wurden die Schnitte untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle1
- Aus Tabelle 1 ergibt sich, daß 63 % der untersuchten Biopsien von kolorektalen Tumoren mit dem monoklonalen Antikörper C242:II eine positive Färbung zeigen. Es wurde gefunden, daß die Expression des Antigens CA242 im normalen Kolongewebe im allgemeinen schwächer ist als in Tumorgewebe, wobei die Färbung vollständig im Zylinderepithel und in den Becherzellen lokalisiert war. Normales nicht- Kolongewebe hatte meistens keine Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper C242:II, wohingegen bei normalen Brustgängen, Pankreasgängen, Gallengängen und Schweißdrüsen positive Ergebnisse erhalten wurden, wobei aber die Intensität der Färbung schwach war.
- Immunohistochernische Untersuchung von C242 (C242:II) in nach dem Tode entnommenen, normalen menschlichen Geweben
- Ein breiter Bereich normaler menschlicher Gewebe wurde von insgesamt 21 Individuen nach dem Tod gesammelt. Die besten 5 Sätze Gewebeproben wurden zur Untersuchung der Immunoreaktivität mit C242:II ausgewählt.
- Nach dem Tode wurden die Gewebe entnommen und sofort in vorgekühlte Röhrchen gegeben, die ein Basismedium mit einem hinzugefügten Antibiotikum enthielten. Die gewebehaltigen Röhrchen wurden dann in das Labor gebracht (auf Eis), worauf das Kulturfluid entfernt und die Gewebe in Würfel mit 0,5 cm³ geschnitten wurden. Die Gewebewürfel wurden dann auf Filterpapierstreifen gelegt und in flüssigem N&sub2; blitzgefroren. Dann wurden die gefrorenen Gewebe bis zum Schneiden bei -80ºC aufbewahrt. Beim Schneiden wurden die gefrorenen Proben in 6 um dicke Schnitte geschnitten, welche auf Glas-Mikroskopobjektträgern befestigt wurden. Die Schnitte wurden durch Eintauchen der Objektträger in 100 % Aceton bei Raumtemperatur, 2 min lang, fixiert. Dann wurden die Schnitte aus dem Aceton entnommen, lufttrocknen gelassen und vor der Verwendung bei -20ºC aufbewahrt.
- Sämtliche Inkubationen wurden in einer feuchten Atmosphäre 30 min lang bei Raumtemperatur vorgenommen. Die Schnitte wurden zuerst mit dem monoklonalen Antikörper C242:II in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) inkubiert und danach mit mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Kaninchen-Anti- Maus-IgG (Dako Ltd., High Wycombe, Bucks, UK), 1:50 in TBS, das 20 % menschliches Serum enthielt (Sigman Chemical Company Ltd., Poole, Dorset, UK), verdünnt, und schließlich mit mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Schweine-anti- Kaninchen-IgG (Dako Ltd), das 1:50 in TBS, das 20 % menschliches Serum enthielt, verdünnt worden war. Nach jeder Inkubation wurden die Schnitte zweimal mit TBS gespült. Dann wurden die Schnitte 3 bis 5 min mit dem Substrat behandelt, mit TBS gespült, mit Mayers Hämatoxylin gegengefärbt und mit synthetischem Fixiermedium (Shandon Scientific Ltd., Runcorn, Cheshire, UK) montiert. Bei dem verwendeten Substrat handelte es sich um 10 mg Diaminobenzidin (Sigma), das in 17 ml TBS, welches 17 ul 30%iges H&sub2;O&sub2; enthielt, gelöst worden war. Die Substrat-Lösung wurde vor der Verwendung filtriert. Dann wurden die Schnitte untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Färbung von normalen post-morten-Geweben mit C242:II
- Aus Tabelle 2 ergibt sich, daß 72 % der normalen P. M.- Gewebe, die durchmustert wurden, mit C242:II keine Reaktivität hatten. Bei den 28 % positiv bewerteten war die Färbung hauptsächlich entweder diffus ohne Definition oder fokal, und zwar vorherrschend in Gangstrukturen in den Geweben. Beim gastromtestinalen Epithel wurde eine heterogenere, aber immer noch minimale Bindung festgestellt. 2/4 Hautproben wurden positiv gefärbt, und zwar durch Reaktion mit dem Plattenepithel und mit Schweißdrüsen. Auch das Plattenepithel von vier mit C242:II durchmusterten Mandelproben wurde positiv gefärbt.
- Endocytose von c242:II und Bindung an das menschlichen Koloncarcinom COLO 205.
- Der Endocytose-Assay wurde folgendermaßen durchgeführt: Aus COLO-205-Zellen (vgl. die oben beschriebene Herstellung des C242-Antikörpers), die als Monolayer-Kultur angezogen worden waren, wurden Einzellsuspensionen hergestellt. Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt, gründlich gewaschen und in Kulturmedium resuspendiert. Dann wurde der oben erwähnte mit Jod markierte C242:II-Antikörper (200 000 cpm, entsprechend 50 ng monoklonal Antikörper) zu einer Einzelzellsuspension von COLO-205-Zellen (106 Zellen) in 5 ml Teströhrchen gegeben. Das Endvolumen betrug 200 ul/Röhrchen.
- Die Zellen wurden in Gegenwart von ¹²&sup5;I-C-242 1 h auf Eis (0ºC) inkubiert. Dann wurde die Suspension zentrifugiert und die Zellen von ungebundenem monoklonalen Antikörper freigewaschen. Die vorinkubierten Zellen wurden außerdem in Zeitintervallen zu 10 min über eine Stunde bei 37ºC inkubiert, wobei die Zellen jedesmal wieder gekühlt und pelletiert wurden. Die in das Kulturmedium abgegebene radioaktive Markierung wurde im überstand gemessen (LKB- Gamma-Zähler, Pharmacia AB, Uppsala, Schweden). Der Überstand wurde ferner einer TCA-Fällung unterzogen und die Radioaktivität des Niederschlags bestimmt. An der Oberfläche gebundenes ¹²&sup5;I-C242 wurde durch Waschen mit Säure, nämlich 0,2 M Glycin-HCl-Puffer, pH 1,5, der 2,5 mg/ml Papin enthielt, entfernt und die Radioaktivität, die das aufgenommene ¹²&sup5;I-C242 darstellt, ausgezählt. Die Menge der an die Oberfläche gebundenen Antikörper nach jedem Zeitpunkt, inkubiert bei 37ºC, wurde berechnet, indem der freigesetzte und der aufgenommene monoklonale Antikörper vom gesamten, an die Oberfläche gebundenem monoklonalen Antikörper subtrahiert wurde. Der Abbau des freigesetzten Antikörpers wurde mit Hilfe der TCA-Fällung des Überstandes des Mediums bestimmt.
- Die Ergebnisse sind in Figur 15 der Zeichnungen dargestellt, welche die Endozytose von ¹²&sup5;I-C242:II durch COLO- 205-Zellen darstellt, und zwar die Radioaktivität auf der Zelloberfläche ("Sur"), die aufgenommene Radioaktivität ("Int"), die freigesetzte Radioaktivität ("Res") und die durch Abbau freigesetzte Radioaktivität ("Deg.Re"), welche als Prozentsatz der gesamten ursprünglichen Radioaktivität an der Zelloberfläche ausgedrückt ist. Anhand von Figur 15 ergibt sich, daß innerhalb einer Stunde mehr als 20 % des C242:II aufgenommen wurden, wenn die vorinkubierten Zellen bei 37ºC inkubiert wurden. Es ergaben sich geringe Mengen an säurelöslicher Radioaktivität, wenn der Überstand des Mediums der TCA-Fällung unterzogen wurde, was bedeutet, daß nach einer Stunde Inkubation nur eine geringe Fragmentierung freigesetzter Aktivität auftritt.
- Cytotoxizität des Immunotoxin aus dem Ricin-A/C242- Antikörper
- Dieser Test zeigt die In-vitro-Cytotoxizität des Immunotoxins für eine menschliche kolorektale Tumorzellinie (Colo 205-ATCC Nr. CCL 222).
- Die-Colo-205-Zellen wurden in Suspension in RPM1640-Medium mit 2,0 g/l Natriumhydrogencarbonat, ohne Glutamin, mit 5 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin und 50 ug/ml Gentamicin angezogen. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Hämocytometerblocks ausgezählt. Für die Assays zur Bestimmung der Inhibition der Protein-Synthese wurden die Zellen in einem Volumen von 100 ul in Platten mit 96 Vertiefungen mit 2 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung ausplattiert. Die Immunotoxin-Proben wurden in drei wiederholte Vertiefungen gegeben. Das Immunotoxin wurde in 12 verdoppelnden Verdünnungen von 2 000 bis 0,98 ng/ml dazugegeben Zu einigen Vertiefungen wurden als Kontrolle 100 ul Kulturmedium gegeben. Dann wurde jede Platte bei 37ºC 24 h inkubiert, worauf 2 uci ³H-L-Leucin in jede Vertiefung gegeben wurden. Anschließend wurden die Platten weitere 24 h bei 37ºC inkubiert. Dann wurden 50 ul Trypsin in jede Vertiefung gegeben und die Platten weitere 15-20 min inkubiert. Anschließend wurden die Zellen jeder Vertiefung/Platte auf Glasfasermatten geerntet und die Radioaktivität unter Verwendung eines LKB-Betaplatten- Szintillationszählers bestimmt. Die Kurven für die Inhibition der Protein-Synthese wurden konstruiert und die IC&sub5;&sub0;-Werte berechnet. Die mit dem bevorzugten Immunotoxin (die Präparation ist oben beschrieben) erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 16 dargestellt.
- Dieser Test zeigt die In-vivo-Cytotoxizität des Immunotoxins für die menschliche Tumor-Zellinie COLO 205, die als subkutanes Xenotransplantat in athymischen Mäusen angezogen wurde. Außerdem wurden Kontrollgruppen untersucht, wobei der Antikörper alleine oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung verwendet wurden.
- 5 x 10&sup6; COLO-205-Zellen wurden an einer einzelnen subkutanen Stelle an der Flanke von athymischen Mäusen injiziert. Die Tumoren wurden wachsen gelassen und alle 3 bis 4 Tage unter Verwendung eines Tastzirkels in zwei Dimensionen ausgemessen. Die Injektion des Testmaterials wurde nicht eingeleitet, bevor die Tumoren 0,7 bis 1,0 cm im Quadrat groß waren. Dieses Stadium ist der Tag 0, worauf die Testmaterialien intravenös in die Schwanzvenen am Tag 0, 1 und 2 injiziert wurden. Die Tumorgröße in zwei Dimensionen wurde weiterhin bestimmt und als relatives Tumorvolumen dargestellt. Die Bestimmungen wurden alle 3 bis 4 Tage durchgeführt, bis der Versuch zu Ende war.
- Mit diesem Test werden die Wirkungen auf das relative Tumorvolumen von phosphatgepufferter Kochsalzlösung, C242- Antikörper alleine (1,2 mg/kg) und des bevorzugten Immunotoxins (die Herstellung ist oben beschrieben) (2,0 mg/kg), d.h. auf das Tumorwachstum verglichen. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen angegeben. Gruppe 1: phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 0,1 ml/10 g/i.v./3x täglich Gruppe 2: C242-Antikörper, 1,2 mg/kg/i.v./3x täglich Maus Gruppe 3: Immunotoxin, 2,0 mg/kg/i.v./3x täglich Maus
- Aus den obigen Tabellen ergibt sich, daß das Immunotoxin im Gegensatz zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBSA) als Kontrolle und zum Antikörper alleine zu einer Verringerung der Tumorgröße führt (in den Tabellen sind die relativen Tumorvolumina angegeben).
- Dieser Test zeigt die Reaktivität von C242.II mit menschlichem Pankreas-Tumorgewebe
- Die Reaktivität von C242.II mit menschlichem Pankreas- Tumorgewebe wurde unter Anwendung der gleichen immunohistochemischen Techniken bestimmt, die für die Reaktivität mit normalem menschlichen Gewebe bschrieben wurden. Frisches gefrorenes Pankreas-Tumorgewebe wurde aus mit einer feinen Nadel biopsiertem Material und mit Formalin fixiertes/in Paraffin eingebettetes Gewebe durch Tumorresektionen erhalten. 13/16 der Pankreas-Tumoren wurden positiv angefärbt. Im allgemeinen war das Ausmaß und das Muster der Bindung besser als die bei Proben des kobrektalen Tumorgewebes beobachtete oder gleich.
- Dieser Test zeigt die In-vitro-Cytozoxizität des Immunotoxins für eine menschliche Pankreas-Tumorzellinie. Die Zellinie Pan 1, die von einem pankreatischen Adenocarcinom stammte, wurde zur Quantifzierung der cytotoxischen Wirksamkeit des Immunotoxins in vitro verwendet. Durch FACS- Analyse wurde gezeigt, daß das Zielantigen exprimiert wird.
- Zur Quantifizierung der Wirksamkeit wurden verschiedene Konzentrationen des Immunotoxins zu Pan-1-Zellen in Kultur gegeben, um die IC&sub5;&sub0; zu bestimmen. Ein MOPC-21:Ricin-A- Konjugat und Ricin A alleine wurden als negative Kontrollen verwendet. Der Bioassay wurde dreimal durchgeführt und eine mittlere Wirksamkeit von 40 +/- 18 ng/ml erhalten. Die negativen Kontrollen waren bei Konzentrationen bis zu 1 000 ng/ml nicht cytotoxisch. Diese Daten zeigen, daß das Zielantigen auf Pankreas-Tumorzellen vorhanden ist und daß Antigen-positive Tumorzellen durch das Immunotoxin abgetötet werden.
- Die Gesamt-RNA von 108 Zellen wurde im wesentlichen nach dem Verfahren von Cirgwin, J. M. et al. (1979; Biochemistry 18, 5294-5299) nach der Modifikation von Chomezynksi, P. und Sacchi, N., (1987; Anal. Biochem. 162, 156-159) repariert. Kurz zusammengefaßt wurde das Zellpellet in 15 ml kalter Denaturierungslösung gelöst, die aus 4 M Guanidiniumthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, pH 7, 0,5 % N- Lauroylsarcosin und 0,1 M 2-Mercaptoethanol bestand. Nach der Lösung des Zellmaterials wurden 1,2 ml zu 2 M Natriumacetat (pH 4,0) gegeben und das Gemisch mit Phenol- Chloroform-Isoamylalkohol (250:49:1) extrahiert. Nach der Zentrifugation wurde die RNA aus der wäßrigen Phase durch Zugabe eines gleichen Volumenteils Isopropanol ausgefällt und über Nacht bei -20ºC inkubiert, um die Gesamt-RNA zu fällen. Nach der Zentrifugation und Resuspension der RNA wurde die Fällung wiederholt und nach einer weiteren Zentrifugation und Fällung die Ausbeute an Gesamt-RNA auf der Grundlage von Absorptionsmessungen mit 960 ug errechnet.
- Zur Isolation von polyadenylierter MRNA aus der obigen Präparation der Gesamt-RNA wurde das Polyatract -mRNA- Isolationssystem von Promega Corporation, Madison, Wisconsin, U.S.A. nach den Anweisungen des Herstellers (cf.: Promega Technical Bullentin, Nr. 090: 1990) angewendet. Kurz zusainrnengefaßt wurden 960 ug Gesamt-RNA in Wasser gelöst und mit einer biotinylierten Oligo(dT)-Sonde (50 pmol) in 0,4 x SSC (1 x SSC = 8,77 g NaCl, 4,41 g Natriumcitrat/l Wasser, pH 7,0) assoziiert. Dann wurden mit Streptavidin beschichtete paramagnetische Perlen (Streptavidin Magnesphere ) dazugegeben, worauf nach 10 min Inkubation die magnetischen Teilchen entfernt und mehrmals mit 0,1 x SSC gewaschen wurden. Die polyadenylierte mRNA wurde durch Inkubation in Wasser von den Kügelchen eluiert, wodurch sich 5 ug mRNA ergaben.
- Die cDNA wurde aus der polyadenylierten mRNA des vorherigen Schrittes im wesentlichen nach dem Verfahren von Gubler, U. und Hoffman, B. J. (1983, Gene 25, 263-269) in der Modifikation für den Vektor Uni-ZAP (Stratagne Inc. La Jolla, Kalifornien), welcher die unidirektionale Klonierung von doppelstrangiger cDNA gestattet, hergestellt. Kurz zusammengefaßt wurden 5 ug polyadenylierte MRNA in einzelsträngige cDNA umgewandelt, und zwar durch Verwendung des Uni-ZAP -Linker-Primers (56 ng/ml) als Primer und Zugabe von dATP, dGTP, dTTP und 5-Methyl-dCTP in einer Konzentration von 0,6 mM und 45 U reverser Transcriptase des Moloncy-Maus-Leukämie-Virus. Das Gemisch wurde bei 37ºC 1 h inkubiert. Die Synthese des zweiten Stranges der cDNA wurde durch Zugabe von dATP, dGTP, dTTP und dCTP bis zu einer Endkonzentration von 0,15 mM, 3,2 U RNase H und 6,5 U DNA- Polymerase 1 und 2,5-stündiges Inkubieren bei 16ºC durchgeführt. Das Gemisch wurde mit Phenol-Chloroform (1:1) extrahiert, worauf sich eine Ethanol-Fällung anschloß. Die Enden der cDNA wurden durch Inkubation mit 0,16 mM dNTP und 10 U T4 DNA-Polymerase, 30 min lang bei 37ºC, stumpf gemacht. Nach der Phenol-Chloroform-Extraktion und der Ethanol-Fällung wurde die sich ergebende stumpfendige cDNA an EcoRI-Adaptoren ligiert, und zwar durch Zugabe von 3 Weiss-U T4-DNA-Ligase, 1 mM ATP und Inkubation über Nacht bei 8ºC. Nach der Ligation wurden die klebrigen EcoRI-Enden durch Zugabe von 10 U T4-Polynukleotidkinase in Gegenwart von 1 mM ATP und 30-minütige Inkubation bei 37ºC kinasiert. Die sich ergebende cDNA mit phosphorylierten klebrigen EcoRI-Enden wurde mit 90 U Xhol verdaut, um ein klebriges Xhol-Ende an der durch den Uni-ZAP -Linker-Primer kodierten Sequenz zu erzeugen. Die sich ergebende cDNA wurde dann an 1 ug Uni-ZAP -XR an die mit EcoRI und Xhol präparierten Arme ligiert, und zwar in Gegenwart von 2 Weiss-U-T4-DNA-Ligase, 1 mM ATP und durch Inkubation über Nacht bei 12ºC. Das Ligationsgernisch wurde dann in vitro in λ-Phagenteilchen verpackt, indem der Gigapack II-Gold - Packaging-Extrakt nach den Anweisungen des Herstellers angewendet wurde, worauf die sich ergebenden Phagen zur Infektion von E. coli PLK-F' verwendet wurden. Die sich ergebende cDNA-Bibliothek aus 8,5 x 10&sup4; unabhängigen Klonen wurde einmal amplifiziert, um einen Phagentiter von 7,5 x 108 pfu/ml zu erhalten. Die sich ergebende cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von E. coli-XL1-Blau als Wirtsstamm durchmustert (cf. Bullock, W. (1978) Biotechniques 5, 4) namlich wie nachstehend beschrieben.
- Zum Nachweis von cDNA-Klonen, welche die schwere Kette und die kappa-Kette des C242:II-IgGI-Antikörpers kodieren, wurden Hybridisierungssonden, welche die erste konstante Domäne der schweren Kette, nämlich CH1, und die konstante Domäne der kappa-Kette, nämlich CK, abdecken aus genomischer Maus-DNA durch die Polymerase Kettenreaktion nach Saiki. R. H., et al. (1988; Science 239, 487-491) hergestellt. Kurz zusammengefaßt wurden Oligonukleotid-Primer- Paare, die an die 5'- und 3'-Regionen der Exonen hybridisieren, welche die obigen Immunglobulin-Domänen kodieren, zur Amplifikation genomischer Maus-DNA verwendet. Nach der Reinigung durch Agarose-Gel-Elektrophorese wurden die sich ergebenden DNA-Sondenfragmente mit 32p markiert, und zwar nach dem Verfahren zur zufälligen Primer-Extension nach Feinberg, A. P., und Vogelstein, B. (1983; Anal. Biochem. 132, 6).
- Die cDNA-Bibliothek aus dem obigen Abschnitt C wurde in zwei separaten Runden unter Verwendung der Immunglobulin- IgG1- bzw. kappa-Sonden aus Abschnitt D nach den von Sambrook J. et al. (1989; Molecular doning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschriebenen Verfahren durchmustert. Positiv hybridisierende Phagen-Klone aus den zwei separaten Hybridisierungen wurden weiter gereinigt, indem unter Verwendung der gleichen Sonden wie bei der Anfangsdurchmusterung erneut durchmustert wurde. Positiv hybridisierende Phagen-Klone wurden in Kulturen von E. coli CL1-Blau expandiert und die sich ergebenden Phagen- Stammkulturen zur Herstellung von cDNA-haltigen pBluescript-SK(-)-Plasmiden verwendet, und zwar im wesentlichen nach Short, J. H., et al. (1988; Nucleic Acids Res. 16, 7583-7600) durch Phagemid-Exzision und Propagation.
- Die sich ergebenden cDNA enthaltenden Plasmide wurden durch Restriktionsenzym-Kartierung charakterisiert und Inserte mit den erwarteten Größen enthaltende Plasmide der Dideoxy- DNA-Sequenzierung nach Sanger, F. et al. (1977; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 24, 5463-5467) unterzogen. Ein mit der Ig- kappa-Sonde hybridisierendes Plasmid, das mit pKGE761 bezeichnet wurde, enthielt ein cDNA-Insert, dessen Sequenz einen offenen Leserahmen kodiert, der stark homolog zu bereits bekannten Sequenzen für die leichte kappa-Kette der Maus ist (c.f. Kabat, E. A. et al. (1987), Sequences of Protein of Immunological Interest, 4. Auflage, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health). Eine cDNA-Teilsequenz, welche die variable Region der leichten kappa-Kette, nämlich VK, kodiert und ihre übersetzte Protein-Sequenz sind in Figur 18 dargestellt. Die drei CDR-Sequenzen, die mit CDR1 bis CDR3 bezeichnet werden, sind durch Unterstreichungen markiert. Ein Signal-Peptid, das dem aminoterminalen Ende des VK-Segments vorangeht, ist mit S mariert. CK markiert die konstante Region, welche sich dem Carboxy-terminalen Ende der VK-Sequenz anschließt.
- Ein Plasmid, das mit der IgG1-Sonde hybridisierte, welches mit PKGE762 bezeichnet wurde, enthielt ein cDNA-Insert, dessen Sequenz einen offenen Leserahmen kodiert, der zu bereits bekannten Sequenzen für die schwere Kette von Maus- Iggl stark homolog ist (c.f. Kabat, E. A., et al. vide supra). Eine cDNA-Teilsequenz, welche die variable Region der schweren Kette von IgGI, nämlich VH kodiert, und ihre übersetzte Protein-Sequenz ist in Figur 19 dargestellt. Die drei CDR-Sequenzen, die mit CDR1 bis CDR3 bezeichnet werden, sind durch Unterstreichungen markiert. Ein Signal- Peptid, das dem aminoterminalen Ende des VH-Segments vorangeht, ist mit 5 markiert. CH1 markiert die konstante Region im Anschluß an das carboxyterminale Ende der VH- Sequenz.
- Im folgenden wird eine repräsentative pharmazeutische Dosierungsform veranschaulicht, die ein Immunotoxin der vorliegenden Erfindung enthält, welche für therapeutische Zwecke in Menschen verwendet werden kann.
- Sterile, wäßrige Lösung zur Injektion, die enthält:
- Ricin-A/C242-Antikörper-Immunotoxin 1, 0 mg
- Natriumacetattrihydrat 6,8 mg
- Natriumchlorid 7,2 mg
- Tween 20 0,05 mg pro ml Lösung
- (i) Anmelderin: Imperial Chemical Industries PLC und Kabi Pharmacia AB
- (ii) Bezeichnung der Erfindung: Konjugate
- (iii) Anzahl der Sequenzen: 22
- (iv) Briefadresse:
- (A) Adressat: Rechtsabteilung: Patente
- (B) Straße: Bessemer Road
- (C) Ort: Welwyn Garden City
- (D) Land: Hertfordshire
- (E) Staat: Vereinigtes Königreich
- (F) Postleitzahl: GB-AL7 1HD
- (v) Computerlesbare Fassung:
- (A) Datenträger: Diskette, 3,50 Zoll, 1,2 Mb Speicherkapazität
- (B) Computer: 18 M PS/2
- (C) Betriebssystem: PC-DOS 3,20
- (D) Software: ASCII von WPS-PLUS
- (vi) Daten der jetzigen Anmeldung:
- (A) Anmelde-Nr.:
- (B) Anmeldetag:
- (C) Klassifikation:
- (vii) Daten der Voranmeldung:
- (A) Anmeldungs-Nr.: 9114399.0
- (B) Anmeldetag: 03. Juli 1991
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 16 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 1:
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- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 7 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 2:
- Arg Met Ser Asn Leu Val Ser
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 9 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 3:
- Leu Gin His Leu Clu Tyr Pro Phe Thr
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 5 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
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- Tyr Thr Gly Met Asn
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 17 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
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- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 5:
- Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 10 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
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- (D) Topologie: linear
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- Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 18 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzeistrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID.-Nr.: 7:
- Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 11 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 8:
- Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 11 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 9:
- Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 7 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- Phe Thr Tyr Thr Gly Met Asn
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 21 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzeistrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 11:
- Het Gly Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly Arg Ile
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 14 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 12:
- Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 25
- (B) Art: Nukleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 13:
- AATTCCCAT GCCCATCCAT CGATC 25
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 25
- (B) Art: Nukleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 14:
- GCGTACGCC TACGTAGCTA GACCC
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 21
- (B) Art: Nukleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 15:
- GATAACAACA TATTCCCCAA A
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 23
- (B) Art: Nukleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 16:
- GATAACAAC ATGGTACCC AAA
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 23
- (B) Art: Nukleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 17:
- AACAACATG GTACCCAAA CM
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 1140
- (B) Art: Nukleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 18:
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 26
- (B) Art: Nukleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 19:
- ATAACAACAT GGTTCCCAAA CAATAC
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 86
- (B) Art: Nukleinsäure
- (C) strangform: Einzels rang
- (D) Topologie: linear
- Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 20:
- AAAAAGGGTA TCGACATGGT ACCCGGGGAT CCACCTCAGG GTGGTCTTTC ACATTAGAGG ATAACAACAT GGTACCCAAA CMTAC
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 463
- (B) Art: Nukleinsäure
- (C) StrangforM: EinzeLstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 21:
- (i) Sequenzcharakteristika:
- (A) Länge: 483
- (B) Art: Nukleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ.-ID.-Nr.: 22:
Claims (18)
1.
Konjugat, das eine Toxin-Komponente und eine Zielzell-
Bindungskomponente aufweist, die selektiv für
gastrointestinale Tumoren ist, wobei die
Zielzell-Bindungskomponente den C242-Antikörper oder eine Zielzell-
Bindungskomponente mit im wesentlichen den gleichen
Zellbindungseigenschaften umfaßt.
2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Zielzell-
Bindungskomponente den C242-Antikörper oder ein
Fragment davon umfaßt.
3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Toxin-
Komponente rekombiniertes Ricin A umfaßt.
4. Konjugat nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die
Zielzell-Bindungskomponente und die Toxin-Komponente
über einen bifunktionellen Linker gekuppelt sind.
5. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei die Zielzell-Bindungskomponente und die Toxin-
Komponente über eine Disulfid- oder Thioether-Bindung
gekuppelt sind.
6. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei die Zielzell-Bindungskomponente und die Toxin-
Komponente über einen Linker der Formel
-S-X-CO-
gekuppelt sind, wobei bedeuten: X eine geradkettige
(1-6C)Alkyl-Gruppe, die gegebenenfalls mit einem oder
zwei Substituenten substituiert ist, die unter
(1-6C) Alkyl, Phenyl und (1-4C)Alkylphenyl ausgewählt
sind, oder eine (1-4C)Alkylphenyl-Gruppe, wobei der
Alkyl-Rest gegebenenfalls mit einem oder zwei
Substituenten substituiert ist, die unter (1-6C)Alkyl,
Phenyl und (1-4C)Alkylphenyl ausgewählt sind, und
wobei der Phenyl-Ring einen unter Halogen, (1-4C)Alkyl
und (1-4C)Alkoxy ausgewählten Substituenten tragen
kann.
7. Konjugat nach Anspruch 6, wobei X eine Methylen-,
Ethylen-, Propylen- oder Butylen-Gruppe umfaßt, die
mit einer oder zwei unter Methyl, Ethyl, Propyl und
Butyl ausgewählten Gruppen substituiert ist.
8. Konjugat nach Anspruch 6, wobei der Linker den Rest
-S-CH(CH&sub3;)CH&sub2;CO- umfaßt.
9. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei die Zielzell-Bindungskomponente CDR-Regionen mit
im wesentlichen den folgenden Sequenzen aufweist:
leichte Kette
CDR1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer
CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr
schwere Kette
CDR1: TyrThrGlyMetAsn
CDR2: TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPhe
LysGly
CDR3: ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal,
wobei die CDR-Regionen so angeordnet sind, daß die
Zielzell-Bindungskomponente im wesentlichen die
gleichen Zellbindungseigenschaften wie der C242-Antikörper
hat.
10. Konjugat der Formel:
A-S1-S2-X-CO -B
wobei:
A rekombiniertes Ricin A umfaßt und B eine Zielzell-
Bindungskomponente umfaßt, die den C242-Antikörper
umfaßt,
S1 ein an dem rekombinierten Ricin A vorhandenes
Schwefelatom ist,
das NH sich am C242-Antikörper befindet,
S2 eine Schwefelatom-Gruppe ist und
X eine geradkettige (1-6C)Alkyl-Gruppe, die
gegebenenfalls mit einem oder zwei Substituenten
substituiert ist, die unter (1-6C)Alkyl, Phenyl und
(1-4C)Alkylphenyl ausgewählt sind, oder eine
(1-4C)Alkylphenyl-Gruppe, wobei der Alkyl-Rest
gegebenenfalls mit einem oder zwei Substituenten
substituiert ist, die unter (1-6C)Alkyl, Phenyl und
(1-4C)Alkylphenyl ausgewählt sind, und wobei der
Phenyl-Ring einen unter Halogen, (1-4C)Alkyl und
(1-4C)Alkoxy ausgewählten Substituenten tragen kann,
ist.
11. Konjugat, das den C242-Antikörper und rekombiniertes
Ricin A aufweist, die durch eine Amino-Gruppe an C242
an ein Thiol eines Cystein-Restes in Ricin A durch
einen 3 -Mercaptobuttersäure-Direst
(-CO.CH&sub2;.CH(CH&sub3;)-S-) gebunden sind.
12. Konjugat, das rekombiniertes Ricin A und eine
Zielzell-Bindungskomponente mit mindestens einer der CDR-
Regionen mit im wesentlichen den folgenden Sequenzen
aufweist:
leichte Kette
CDR1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer
CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr
schwere Kette
CDR1: TyrThrGlyMetAsn
CDR2: TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPhe
LysGly
CDR3: ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal,
wobei die Anzahl derartiger CDRs und ihre Anordnung
derart ist, daß die Zielzell-Bindungskomponente im
wesentlichen die gleichen Zellbindungseigenschaften
wie der C242-Antikörper hat.
13. Konjugat, das eine Toxin-Komponente und eine Zielzell-
Bindungskomponente, die spezifisch für das Epitop
eines gastromtestinalen Tumors ist, aufweist.
14. Konjugat nach Anspruch 13, wobei die
Zielzell-Bindungskomponente spezifisch für das Epitop ist, an das
der C242-Antikörper bindet.
15. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach
Anspruch 1, bei dem:
(a) für solche Konjugate, bei denen die Zielzell-
Bindungskomponente direkt an die Toxin-Komponente
gekuppelt ist, die Toxin-Komponente mit der Zielzell-
Bindungskomponente umgesetzt wird, oder
(b) für solche Konjugate, bei denen die Zielzell-
Bindungskomponente über einen Linker an die Toxin-
Komponente gekuppelt ist, die mit dem Linker
denvatisierte Zielzell-Bindungskomponente mit der Toxin-
Komponente umgesetzt wird, oder die mit dem Linker
derivatisierte Toxin-Komponente mit der Zielzell-
Bindungskomponente umgesetzt wird.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein in einem der
vorhergehenden Ansprüche definiertes Konjugat in
Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen
Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.
17. Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1
bis 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur
Behandlung von gastromtestinalen Tumoren.
18. Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1
bis 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur
Behandlung von kolorektalen Tumoren.
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