NO308539B1 - Konjugat, anvendelse av konjugat, samt farmasøytisk blanding som omfatter et konjugat - Google Patents

Description

Oppfinnelsen omfatter konjugater slik som immuntoksiner for anvendelse i anti-tumorbehandling, anvendelser av slike konjugater og farmasøytiske blandinger som inneholder dem.

Ricin og ricin-liknende molekyler, slik som abrin, modecin viscumin er kjente forbindelser som blir laget av planteceller og som besitter cytotoksiske egenskaper. Toksiner av denne type består av to polypeptidkjeder som er bundet via en disulfidbro. Én av polypeptidkjedene ("A-kjeden") er først og fremst ansvarlig for de cytotoksiske egenskapene til toksinmolekylet; mens den andre polypeptidkjeden ("B-kjeden") gjør at toksinmolekylet binder seg til celleoverflatene.

Toksisiteten til ricin-liknende molekyler skjer i tre trinn:

a) Binding av toksinet til celleoverflaten gjennom reaksjon med galaktosebindingsseter på B-kjeden med glykoproteiner eller glykolipider på

celleoverflaten;

b) transport av minst A-kjeden inn i cytosolen til cellen; og

c) hemming av proteinsyntese ved at A-kjeden ødelegger aktiviteten til

ribosomale 60S subenheter.

Det antas også at B-kjeden har en viktig sekundær funksjon, utover dets primære bindingsfunksjon av toksinmolekylet til celleoverflaten ved at det letter opptaket av toksin inn i cellen. Således er atskilte A- og B-kjeder hovedsakelig ikke-toksiske, siden A-kjeden mangler evnen til å binde til celleoverflatene og transporteres inn i cytosolen av cellen i fraværet av B-kjeden; mens B-kjeden har ikke cytotoksiske egenskaper.

Som nevnt ovenfor er ricin og ricin-liknende toksinmolekyler laget av planter. I tilfellet ricin skjer produksjon i Ricinus communis, også kjent som lakseroljeplante. Det antas at et forstadie-polypeptid (kjent som preprorocin) som omfatter en ledersekvens, A-kjeden, en forbindelsessekvens og B-kjeden lages først. Under transport av dette forstadium (preproricin) i plantecellen, antas ledersekvensen å bli fjernet for å gi proricin. Ferdig ricin blir så laget fra proricin ved dannelse av en disulfidbro mellom A- og B-kjedene og fjernelse av forbindelsessekvensen.

Det er allerede blitt nevnt at toksisiteten til A-kjeden i toksiner slik som ricin kan være nyttig i anti-tumorterapi hvis den ikke-diskriminerende bindende B-kjeden kunne erstattes av en annen bærer som har evnen til å binde til tumorceller fremfor til normale celler. Forskjellige konjugater er således blitt foreslått og laget som inneholder modent ricin og A-kjeden til ricin og et tumor-spesifikt antistoff. Imidlertid, slike konjugater, immunkonjugater eler immuntoksiner har en rekke ulemper.

Et problem med kjente konjugater stammer fra en strukturell egenskap hos A-kjeden i naturlig ricin. Det antas at under syntesen av ricin i planteceller skjer N-glykosylering og at de resulterende sukkerdeler er istand til å reagere ikke-spesifikt med celleoverflatene.

Tap av selektivitet når det gjelder plante ricin-immunkonjugater antas også å skje som et resultat av enten: (a) galaktosebindingssetene på B-kjeden som reagerer på en ikke-spesifikk måte med celleoverflatene i tilfellet med hel ricin-immunkonjugater; eller (b) gjennom binding av glykansidekjeder som forekommer på plante ricin A med galaktose og mannosereseptorer på celleoverflatene, når det gjelder plante ricin A immunkonjugater.

Et ytterligere problem er at, som nevnt ovenfor, B-kjeden antas å fremme opptak av toksinmolekylet i cellen. Således, skjønt konjugatene hvor B-kjeden ikke er tilstede, dvs. de som består av A-kjeden og et antistoff, synes å være mer spesifikke enn naturlige toksiner er de rapportert å mangle virkningspotensen til det naturlige toksinet (F.L. Moolten et al., Immun Rev. 62, 47-72, 1982). Dette tap av potens antas å skyldes en reduksjon i det effektive opptak av toksinet inn i cellen. Relativt få av de rapporterte antistoffene fremmer effektiv internalisering av toksinet, og gir således opphav til immuntoksiner som mangler potens.

Så langt er konjugater som er av mulig nytte i behandling av svulster i en rekke forskjellige vev blitt laget. F.eks. PCT patentsøknad nr. WO85/003508 beskriver fremstillingen av konjugater som består av ricin A eller difteri toksin A-kjeder bundet via et forlengermolekyi til antistoffer som er spesifikke for

brystsvulster.

Antistoffer som gjenkjenner kolorektale svulstceller er også blitt omtalt, men konjugater som omfatter disse antistoffer synes å være hemmet av ikke aksepterbar binding til normalt vev og/eller lav potens. Således har kjente antistoffer som gjenkjenner kolorektale svulstceller ikke funnet anvendelse i fremstillingen av konjugater med tanke på virkelig terapeutisk interesse. Det er således et behov for et konjugat som er av terapeutisk verdi for å behandle kolorektale svulster.

Således, skjønt forskjellige konjugater har blitt nevnt og laget, er det et behov for forbedrete konjugater. Slike forbedrete konjugater kan fjerne én eller flere av ulempene forbundet med kjente konjugater. Det er også et behov for konjugater som er selektive for gastrointestinale svulster.

Den foreliggende oppfinnelse kjennetegnes ved at konjugatet omfatter en toksinrest og en målcellebindende rest og en målcellebindende rest som er selektiv for gastrointestinale tumorer og at den målcellebindende rest omfatter C242-antistoff eller en målcellebindende rest som har hovedsakelig de samme cellebindende egenskaper.

Spesielt er målcellebindingsdelen (og derfor konjugatet) selektiv for gastrointestinale svulstceller, spesielt for kolorektale- og pankreas svulstceller, mer spesielt for kolorektale tumorceller.

Målcellebindingsdelen vil generelt bestå av et C242-antistoff, et antistoff-fragment eller et derivat av et antistoff eller antistoff-fragment som har hovedsakelig de samme målbindende egenskaper.

Målcellebindingsdelen er selektiv for gastrointestinale svulstceller (spesielt kolorektale svulstceller) ved at det binder til slike celler fremfor til normale celler. Således vil målcellebindingsdelen binde til gastrointestinale svulstceller, men vil vise ingen eller bare minimal bindingsaffinitet overfor normale celler. Spesielt vil målcellebindingsdelen vise en selektivitet overfor gastrointestinale svulster i hovedsak den samme som vist av C242-antistoffet. Selektiviteten til C242-antistoffet overfor gastrointestinale svulster slik som kolorektale svulster, kan eksemplifiseres ved de immunhistokjemiske resultatene gitt nedenfor. Således, spesielt, vil en målcellebindingsdel, slik som C242-antistoff, binde til et antigen som sitter på gastrointestinale svulster, men som ikke er tilstede eller bare svakt uttrykkes i normale celler. Et spesielt eksempel på en slik målcelle bindingsdel er C242-antistoff eller en målcelle bindingsdel som har i det vesentlige de samme cellebindingsegenskapene.

Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en farmasøytisk blanding som omfatter et konjugat som definert i kravene 1-13.

Oppfinnelsen angår også anvendelser av nevnte konjugat for fremstilling av et medikament for behandling av gastrointestiale tumorer, spesielt kolorektale tumorer.

Som nevnt her er konjugatet istand til å drepe gastrointestinale svulstceller. Således blir konjugatet (eller "immuntoksinet") istand til å avgi toksindelen til svulstcellene slik at toksindelen kan utøve sine cytotoksiske egenskaper. Konjugatet vil derfor generelt være istand til å binde til svulstcellene (ved at målcellebindingsdelen binder til svulstcellene) og tillate toksindelen å transporteres inn i cellen, dvs. å la toksindelen bli "internalisert". Spesielle effektive konjugater vil generelt ha de følgende egenskapene: 1. Målcellebindingsdelen skulle være istand til å binde til et svulstcelle overflateantigen. 2. Celleoverflateantigenet skulle være tilstede i høyt kopitall på svulstcellene, f.eks. minst 10 000 pr. celle.

3. Antigenet skulle ikke uttrykkes i høyt kopitall på normale celler.

4. Antistoff:antigenkomplekset skulle internaliseres effektivt slik at toksindelen kan utøve sin cytotoksisitet intracellulært. 5. Konjugatet skulle fortrinnsvis være konstruert slik at det er tilstrekkelig stabilt for å være intakt i blodet lenge nok slik at toksindelen kan avgis til svulstcellene såvel som kunne bli spaltet for å frigi toksindelen når toksindelen er inne i cellen.

Antistoffet C242 er et gnagerantistoff av IgG-klassen som er laget ved å dyrke

i et passende medium en hybridomcellelinje som er oppnådd ved å fusjonere miltceller fra en mus, som er blitt immunisert med en human kolon adenokarsinom-cellelinje, med gnagermyelomcellelinje Sp 2/0. En hybridom cellelinje (242.11) som lager C242:ll-antistoffet (også referert herfor enkelthets skyld som C242-antistoff) ble innsendt 26. januar 1990 ifølge Budapestavtalen ved den europeiske samling av dyrecellekulturer (ECACC), PHLC Senter for anvendt mikrobiologi og forskning, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, UK, under deponeringsregistreringsnummer 90012601.

Betegnelsen "en målcellebindende del som har i det vesentlige de samme cellebindingsegenskapene" omfatter målcellebindingsdelene som har i det vesentlige den samme immunologiske spesifisitet som den som er vist av den innsendte ECACC cellelinje 90012601, dvs. å binde til den samme antigene determinant eller epitopen, og å konkurrere med C242-antistoffet for binding til det stedet.

Uttrykket "målcellebindingsdel" omfatter også antistoff-fragmenter, og spesielt fragmenter av antistoff C242 såvel som intakt antistoff. Antistoff-fragmentene vil beholde bindingsevnen og spesifisiteten til det ikke-fragmenterte immunglobulinet og omfatte f.eks. de som oppnås ved degradering av antistoffet med et proteolytisk enzym, slik som pepsin. Spesielle eksempler på fragmenter omfatter F(ab') og F(ab')2fragmenter.

Det vil forstås at målcellebindingsdelen kan lages ved hjelp av genteknologi og derfor omfatter betegnelsen målcelle bindingsfragment antistoffer og antistoff-fragmenter laget ved slike fremgangsmåter. Spesielt betegnelsen målcellebindingsdelen omfatter C242-antistoff eller et fragment av dette som er produktet av genteknologisk arbeid.

Fremstillingen av antistoff-fragmenter og spesielt humaniserte antistoff-fragmenter er beskrevet f.eks. av Carter et al., Biotechnology, Vol. 10, februar 1992.

Målcellebindingsdelen omfatter derivatforbindelser av antistoffer eller antistoff-fragmenter og spesielt humaniserte former av antistoffer eller antistoff-fragmenter som stammer fra ikke-humane kilder, f.eks. humaniserte former av gnager-antistoffer.

Antistoffet C242 er rettet mot et tumorforbundet antigen, betegnet her som

CA-242. Således omfatter spesielt målcellebindingsdelen et antistoff eller antistoff-fragment som er istand til å binde til antigenet C-242. Et spesifikt eksempel på et slikt antistoff er antistoffet C242 selv. Tumor-forbundet antigen CA-242 uttrykkes i flesteparten av kolorektale svulster, og er bare svakt produsert eller fraværende i normalt kolonvev.

Med hensyn til genetisk arbeid som nevnt ovenfor, ble cDNA fra de variable regionene til de lette og tunge kjedene i C242:ll monoklonalt antistoff klonet som vil beskrives nedenfor. Før diskusjon av dette på en detaljert måte kan det være riktig å gi en kort generell beskrivelse av den basale immunglobulin strukturenheten, med referanse til fig. 7 i de vedlagte figurene som beskriver den generelle strukturen til et antistoff, dvs. immunglobulin eller klasse G.

Med henvisning til fig. 7 består immunglobulinet av to identiske lette

(L) polypeptidkjeder og to identiske tunge polypeptidkjeder (H), de fire kjedene blir bundet sammen ved disulfidbindinger og forskjellige ikke-kovalente bindinger i en symmetrisk "Y"-konfigurasjon. Hver tunge kjede har et variabelt område (VH) ved hver ende etterfulgt av et antall konstante områder (CH), og hver lette kjede har et variabelt område (VL) ved én ende og et konstant område (C|_) ved den andre enden. Det er henholdsvis to typer lette kjeder, betegnet kappa og lambda. Det variable området i den lette kjeden blir tilpasset det variable området i den tunge kjeden, og det konstante området i den lette kjeden blir tilpasset det første konstante området i den tunge kjeden. De variable områdene i de lette og tunge kjedene danner antigenbindingssetet.

De variable områdene til de lette og tunge kjedene har den samme generelle strukturen, hverkarakterisertav tre hypervariable områder, kalt komplementaritets-bestemmende områder, eller CDR, omfatter fire omgivende områder, eller FR. CDR av hvert variable område holdes når de omgivende regionene, og to områder CDR representerer sammen spesifisiteten av antistoffet.

For å klone cDNA til de variable delene av de lette og tunge kjedene til C242:ll-antistoffet ble først et cDNA fagbibliotek laget fra C242:ll-hybridomet ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Hybridiseringsprober som dekket henholdsvis konstante deler av den tunge kjeden og den lette kjeden (kappa) ble så laget fra musegenomisk DNA ved bruk av polymerase kjedereaksjon (PCR) og passende primere. De resulterende probene ble benyttet for å undersøke cDNA-biblioteket for cDNA-kloner som inneholdt DNA-sekvenser som kodet for den tunge og kappa-kjedene til C242:ll-antistoffet. Positive hybridiseringsfagkloner ble videreutviklet og cDNA ble skåret ut i form av plasmider. De sistnevnte blekarakterisert vedrestriksjonsenzym kartlegging, og plasmidene som inneholdt innskudd av forventete størrelser ble sekvensert. For å bestemme CDR-områdene ble aminosyresekvensene kodet for av sekvensinnskuddene sammenliknet med de for tidligere kjente muse kappa tunge kjeder, ved å ta hensyn til de opprinnelige lokaliseringene til CDR-områdene slik som definert av f.eks. E.A. Kabat et al., (1987), Sequence of Proteins of Immunological Interest, 4. utg., US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health. Det ble funnet at CDR til de respektive kjedene hadde de følgende aminosyresekvensene (som er også vist i fig. 18 og 19 i de vedlagte figurene, se også SEQ ID nr. 21 og 22):

Lett kjede

CDR1 (SEQ ID NR. 1):

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr

CDR2 (SEQ ID NR. 2): Arg Met Ser Asn Leu Val Ser

CDR3 (SEQ ID NR. 3): Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

Tung kjede

CDR1 (SEQ ID NR. 4): Tyr Thr Gly Met Asn

CDR2 (SEQ ID NR. 5):

Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly

CDR3 (SEQ ID NR. 6): Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val

Med informasjonen fra disse CDR aminosyre og/eller DNA-sekvensene kan den erfarne fagmann innføre CDR-områdene i C242:ll-antistoffet i de klonete variable delene til et annet antistoff eller antistoff-fragment ved hjelp av sete-rettet mutagenese som er kjent i feltet. Slik fremgangsmåte, vanligvis kjent som "CDR transplantasjon" (beskrevet f.eks. i publisert europeisk patentsøknadsnr. EP 239 400), omfatter erstatning på DNA-nivå av CDR-kodende sekvenser til C242:ll-antistoffet for de CDR-kodende sekvensene i det mottakende antistoffet eller fragment og vil resultere i et antistoff eller antistoff-fragment som har en tilsvarende spesifisitet som C242:ll-monoklonale antistoffer. Innenfor området til den målcellebindende delen er derfor, selvfølgelig, enhver del som erkarakterisert vedet antistoff eller antistoff-fragment som har minst ett av de ovenfor definerte CDR'er (eller CDR'er som i det vesentlige definert ovenfor), antallet av CDR'er og deres arrangement på antistoffet eller antistoff-fragmentet er slik at målcellebindingsdelen i det vesentlige har samme cellebindingsegenskaper som C242-antistoffet. Det foretrekkes vanligvis at målcellebindingsdelen omfatter alle CDR'ene (dvs. CDR1, CDR2 og CDR3 i den lette kjeden og CDR1, 2 og 3 i den tunge kjeden) definert ovenfor (eller i det vesentlige som definert ovenfor). CDR'ene i det vesentlige som definert ovenfor omfatter forlengete sekvenser slik som:

Lett kjede

CDR1 (SEQ ID NR. 7):

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe CDR2 (SEQ ID NR. 8): Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val

CDR3 (SEQ ID NR. 9): Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly

Tung kjede

CDR1 (SEQ ID NR. 10): Phe Thr Tyr Thr Gly Met Asn

CDR2 (SEQ ID NR. 11):

Met Gly Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly Arg Ile CDR3 (SEQ ID NR. 12):

Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Ttr Phe Asp Val Trp Gly

Antistoffer eller antistoff-fragmenter laget ved hjelp av CDR-transplantasjon vil fortrinnsvis lages ved å overføre C242 CDR'ene inn i et omgivende område som blir valgt nær C242 med hensyn til både homologi og CDR-størrelse.

Det vil forstås at konjugatet i den foreliggende oppfinnelse ikke nødvendigvis består av ett toksinmolekyl og ett antistoff-molekyl. F.eks. kan konjugatet omfatte

mer enn ett toksinmolekyl pr. antistoff-molekyl.

Toksindelen omfatter vanligvis en komponent som besitter cytotoksiske egenskaper og derfor er istand til å drepe celler etter internalisering.

Målcellebindingsdelen karakteriseres vanligvis en målcellebindingsdel som er istand til å gjenkjenne en spesifikk antigendeterminant eller målcelle.

Toksindelen og målcelle bindingsdelen kan kobles direkte til hverandre, eller de kan kobles indirekte. Toksindelen og målcellebindingsdelen er generelt koblet slik at geometrien i konjugatene tillater målcellebindingsdelen til å binde til målcellen. Det er fordelaktig at toksindelen og målcellebindingsdelen blir koblet slik at konjugatet er stabilt ekstracellulært og ikke-stabilt intracellulært, slik at toksindelen og målcellebindingsdelen forblir koblet på utsiden av målcellen, men etter internalisering blir toksindelen frigjort. Således har et fordelaktig konjugat et intracellulært spaltbart, ekstracellulært stabilt sete.

Eksempler på konjugater hvor toksindelen er direkte koblet til målcelle-bindingsdelen omfatter de hvor toksindelen og målcellebindingsdelen er koblet ved en disulfidbro laget mellom en tiolgruppe og toksindelen og en tiolgruppe på målcellebindingsdelen.

Målcellebindingsdelen kan omfatte en del som gjenkjenner toksindelen og som derfor kobler toksindelen og målcellebindingsdelen. Et eksempel på sistnevnte er hvor målcellebindingsdelen omfatter et antistoff eller antistoff-fragment som binder til toksindelen.

Den målcellebindende delen og toksindelen kan omfatte et enkelt polypeptid, som fortrinnsvis har et intracellulært spaltningssete slik at toksindelen blir frigjort i cellen. I et slikt polypeptid kan toksin og målcellebindingsdelene bli forbundet ved hjelp av et polypeptid mellomstykke.

Eksempler på konjugater hvor toksindelen blir indirekte koblet til målcellebindingsdelen omfatter de hvor toksindelen er koblet til målcellebindingsdelen gjennom et bifunksjonelt mellomstykke, spesielt et heterobi-funksjonelt mellomstykke.

Passende mellomstykker omfatter f.eks. mellomstykker som er et polypeptid, slik som de beskrevet i PCT-patentsøknad WO 85/003508 og mellomstykker som omfatter kjemiske deler slik som de beskrevet i publisert europeisk patentsøknad nr. 169111.

Det er greit at toksindelen og målcellebindingsdelen blir koblet ved hjelp av en disulfidbinding eller en tioeterbinding. Det er generelt å foretrekke at toksindelen og målcellebindingsdelen blir koblet ved hjelp av et mellomstykke som kobler nevnte mellomstykke ved hjelp av en intracellulær spaltbar disulfid eller tioeterbinding.

Eksempler på slike mellomstykker og deres anvendelse for å lage immuntoksiner er beskrevet i publisert europeisk patentsøknad nr. 169 111; i Methods in Enzymology 112, 207-225, 1985 (A.J. Cumber, J.A. Forrester, B.M.J. Foxweel, W.C.J. Ross, P.E. Thorpe, Preparation of antibody-toxin conjugates); og i Vogel, Immunoconjugates: Antibody conjugates in radioimaging and therapy of cancer, p. 28-55 (E.J. Wawrzynczak og P.E. Thorpe - Methods for preparing immunotoxins: effects of the linkage on activity and stability).

Spesielle mellomstykker omfatter de som kan danne en disulfidbinding med en tiolgruppe på én toksindel og målcellebindingsdelen og en amidbinding med en aminogruppe på den andre toksindelen og målcellebindingsdelen.

Eksempler på spesielle mellomstykker er de med formel:

hvor X er en forlengelsesgruppe.

X kan bestå av en rettkjedet (1-6C) alkylgruppe, valgfritt substituert med én eller flere forbindelser valgt fra (1-6C)alkyl, fenyl og (1-4C)alkylfenyl; eller en (1-4C)alkylfenylgruppe, hvor alkyldelen blir valgfritt substituert med én eller to substituenter valgt fra (1-6C)alkyl, fenyl og (1-4C)alkylfenyl; og hvor fenylringen kan ha en substitusjon valgt fra f.eks. halogen, (1-4C)alkyl og (1-4C)alkoksy.

Det foretrekkes vanligvis at f.eks. i X har alkylgruppen en substitusjon valgt fra de ovenfor nevnte.

F.eks. kan X bestå av en (1-6C)alkylkjede, valgfritt substituert med én eller flere forbindelser valgt fra (1-4C)alkyl og fenyl. Spesielle verdier for X omfatter f.eks. en metylen, etylen, propylen, butylengruppe valgfritt substituert med én eller to grupper som er uavhengig valgt fra metyl, etyl, propyl og butyl (spesielt med substitusjon av metyl, etyl, propyl og butyl).

Spesifikke verdier for X av interesse er de hvor X er en metylen- eller etylengruppe valgfritt substituert med én eller to grupper som definert ovenfor.

Det er å foretrekke at X omfatter en etylengruppe som er ikke-substituert eller substituert med én eller to metylgrupper, spesielt en etylengruppe substituert med én metylgruppe.

Foretrukne konjugater av den foreliggende oppfinnelse omfatter de med formel:

hvor A erkarakterisertav en toksindel og målcellebindingsdel, og B erkarakterisertav den andre toksindelen og målcellebindingsdelen; målcellebindingsdelen kan ha én eller flere toksindeler; S-j er et svovelatom tilstede på A; NH er på B, og S2-X-CO

er mellomstykket, hvor S2er et svovelatom og X er som definert ovenfor.

Det vil forstås at S stammer fra en tiolgruppe på A.

Det vil erkjennes at når mellomstykket inneholder et kiralsentrum, kan det eksistere i og bli isolert i en optisk aktiv eller racemisk form. Oppfinnelsen omfatter anvendelsen av enhver optisk aktiv eller racemisk form av mellomstykket. Syntesen av optisk aktive former kan utføres ved hjelp av standard fremgangsmåter innen organisk kjemi vel kjent i feltet.

A omfatter fortrinnsvis toksindelen og B omfatter målcellebindingsdelen.

Som hevdet ovenfor kan toksindelen omfatte enhver komponent som besitter cytotoksiske egenskaper. Eksempler på slike komponenter inkluderer polypeptider som er istand til å inaktivere ribosomer og derfor hemme proteinsyntese. Spesielle eksempler omfatter polypeptider som finnes i naturen og komponenter av slike polypeptider. Hvor et slikt polypeptid består av en toksisk komponent og en hovedsakelig ikke-toksisk komponent, omfatter toksindelen passende den toksiske komponenten. F.eks. toksindelen kan omfatte ricin, men det er passende at toksindelen omfatter ricinets A-kjede. Toksindelen kan også værekarakterisertav deler eller analoger av polypeptider funnet i naturen, som besitter cytotoksiske egenskaper. Passende polypeptider for toksindelen og deres fremstilling er beskrevet i "Ribosome inactivating proteins up to date" - Stripe F and L. Barbieri, FEBS 3269 og referanser her. Spesielle passende polypeptider for toksindelen omfatter A-kjeden til ricin (ricin A), restrictocin og shiga-toksin. Andre passende polypeptider for toksindelen omfatter abrin, viskumin, modeccin, volkensin, gelonin, pokeweed antiviralt protein, saporin, luffin, trikosantin, kornribosom inaktiverende protein, diantiner, byodin, momordin, tritin, didekandrin, a-sarkin, mitogellin, difteritoksin, pseudomonas exotoksin A og "shiga-liknende" toksiner VT1 og VT2.

Polypeptidanaloger funnet i naturen omfatter de polypeptidene som har en primærstruktur som er beslektet med polypeptidet funnet i naturen i det at det varierer ved én eller flere aminosyre-endringer (mangler, tilsetninger, erstatninger) hvilket ikke resulterer i tap av cytotoksisk aktivitet. Spesielle eksempler på slike analoger omfatter de hvor forandringen eller forandringene underletter kobling til målcellebindingsdelen.

Hvor toksindelen erkarakterisertav et polypeptid funnet i naturen eller en del av dette kan toksindelen bli laget ved å isolere polypeptidet fra en naturlig kilde og hvor en del kreves, modifisere det isolerte polypeptidet ved hjelp av kjemiske hjelpemidler, f.eks. enzymatisk. Polypeptidet eller delen av dette kan også bli laget ved hjelp av genteknologi. Slike fremgangsmåter omfatter rekombinant DNA-teknologi hvor en DNA-sekvens som koder for det ønskete polypeptidet vanligvis blir bygget inn i en passende vektor eller plasmid. Vertsceller transformert med vektoren eller plasmid kan bli dyrket under passende betingelser for å oppnå at DNA-sekvensen uttrykkes og polypeptidet produseres.

Det foretrekkes at toksindelen omfatter ricin A, en del eller en analog av denne. Hvor toksindelen omfatter ricin A, kan ricin A oppnås fra frøene til Ricinis Communis eller lakserbønne-planten. Imidlertid foretrekkes det at A-kjeden eller ricin lages ved hjelp av gentekniske metoder. Således foretrekkes rekombinant ricin A eller ricin.

Ricin A fremstilt ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi blir vanligvis foretrukket til det som oppnås fra naturlige kilder siden rekombinant DNA-teknologi tillater fremstillingen av ricin A som ikke er kontaminert med B-kjeden til ricin, siden ricin A laget på denne måten ikke er glykosylert. Således bruk av rekombinant ricin A fører til et mer selektivt konjugat på grunn av fraværet av den ikke- diskriminerende-bindende B-kjede og har ikke sukkerdeler som er istand til ikke-spesifikk reaksjon med celleovefrlatene.

I en foretrukket utførelsesform omfatter et konjugat av den foreliggende oppfinnelse en målcellebindingdel som er selektiv for kolorektale svulstceller.

Målcelle bindingsdelen omfatter fortrinnsvis C242-antistoff eller et fragment av dette, spesielt C242-antistoff.

Toksindelen og målcellebindingsdelen foretrekkes koblet gjennom 3-merkaptobutyratradikalen -CO.Ch^.CHKCHgJ-S-. Denne radikal bindes på passende måte til målcellebindingsdelen ved hjelp av en kovalent binding mellom en NH-gruppe på målcellebindingsdelen, f.eks. NH til en lysylrest, og en disulfidbro med en tiolgruppe på toksindelen, f.eks. tiolgruppen til cysteinresten i ricin A.

Således gir den foreliggende oppfinnelse spesielt et immuntoksin som omfatter C242-antistoff og rekombinant ricin A, bundet fra en aminosyre på C242 til en tiol i cysteinresten i ricin A ved hjelp av 3-merkaptobutyratradikalen, -COCH2

CH(CH3)-S-.

Et foretrukket immuntoksin er en som omfatter C242-antistoff og rekombinant ricin A, bundet fra den terminale aminogruppen til en lysylrest i C242 til den endestilte tiol i en cysteinrest i ricin A ved hjelp av en 3-merkaptosmørsyrediradikal.

Hver antistoffenhet vil generelt bære minst én ricin A-enhet. Det vil forstås at en antistoff-enhet kan bære mer enn én rekombinant ricin A-del via passende mellomstykkedeler. Det vil forstås at antistoffet kan bære én eller flere mellomstykkedeler i tillegg til de bundet til ricin A. Disse ytterligere mellomstykkedelene kan bære et ikke-toksisk molekyl, f.eks. cystein. Slike mellomstykker kan derfor bli tilpasset ved hjelp av ikke-toksiske molekyler.

Immuntoksinene i den foreliggende oppfinnelse er av potensiell nytte i å behandle gastrointestinale svulster, og spesielt kolorektale eller pankreasvulster.

Det vil bli forstått at dosen og doseringssystemet er avhengig av den spesielle toksindelen som benyttes og målcellepopulasjonen og pasientens historie. Dosen av konjugat tilført vil typisk være i området 0,1 til 1 mg/kg pasientvekt.

Konjugatene i den foreliggende oppfinnelse vil normalt tilføres i form av en farmasøytisk blanding. Således ifølge den foreliggende oppfinnelse gis det også en farmasøytisk sammensetning som består av et konjugat (som definert her) sammen med en farmasøytisk aksepterbar fortynner eller bærer.

Farmasøytiske sammensetninger av den foreliggende oppfinnelse kan formuleres i en rekke doseringsformer. Generelt vil konjugatene i den foreliggende oppfinnelse tilføres parentéralt, fortrinnsvis intravenøst. En spesiell parenteral farma-søytisk sammensetning er én som formuleres som en doseenhetsform som passer for tilførsel ved injeksjon. Således spesielt passende blandinger består av en løsning, emulsjon eller suspensjon av immuntoksinen sammen med en farmasøytisk aksepterbar parenteral bærer eller fortynningsmiddel. Passende bærere eller fortynningsmidler inneholder vandige løsninger, f.eks. vann eller saltvann, og ikke-vandige forbindelser, f.eks. faste oljer eller liposomer. Sammensetningen kan omfatte forbindelser som øker stabiliteten til konjugatet i blandingen. F.eks. blandingen kan omfatte en buffer, f.eks. Tween. Konsentrasjonen av konjugatet vil variere, men generelt vil konjugatet bli formulert i konsentrasjoner på omtrent 1 til 10 mg/dose.

Antistoffet-C242 er selektiv for kolorektale svulstceller, og konjugater som innbefatter dette antistoff er blitt funnet å være potente immuntoksiner som er selektive for kolorektale svulstceller.

Spesielt det foretrukne konjugatet i den foreliggende oppfinnelse er blitt funnet å være en overraskende effektiv immuntoksin ved at det er både selektivt for kolorektale svulstceller og potent. Dette konjugatet har også blitt funnet å ha en relativt lavsirkulasjonsfjerningshastighet og ekstracellulær spaltning og destruksjon, hvilket fører til øket plasmavarighet. Dette har den potensielle fordel av å tillate immuntoksinet tilstrekkelig tid til å reagere med målcellene før fjernelse eller ødeleggelse finner sted.

Fremgangsmåter for å fremstille et konjugat er definert ovenfor:

(a) For konjugatene hvor målcellebindingsdelen er direkte koblet til toksindelen, reageres toksindelen med målcellebindingsdelen.

F.eks., hvor målcellebindingsdelen kobles til toksindelen gjennom en disulfidbro, kan én av målcellebindingsdelen og toksindelen bli redusert, f.eks. med ditiotreitol før reaksjon med den andre av den målbindende delen og toksindelen. For disse konjugater hvor målcellebindingsdelen kobles til toksindelen ved hjelp av et mellomstykke, reageres målcellebindingsdelen utstyrt med mellomstykket med toksindelen, eller reaksjon av toksindelen påkoblet mellomstykket med målcellebindingsdelen.

Den passende delen blir reagert med en bindingsforbindelse for å binde mellomstykket til den delen. Det er passende at den derivatiserte målcellebindingsdelen blir reagert med toksindelen.

Den derivatiserte målcellebindingsdelen eller derivatisert toksindel kan lages, f.eks. ved å løse opp den delen i en passende buffer (slik som acetat-, fosfat- eller boratbuffer) og justering av pH til en verdi som passer med sammenkoblingsforbindelsen. Sammenkoblingsforbindelsen kan så tilsettes til reaksjonsblandingen. I tilfelle hvor sammenkoblingsforbindelsen er uløselig i réaksjonsblandingen, kan en løsning av målcellebindingsdelen eller toksindelen på passende måte bli tilsatt en løsning med den gjeldende forbindelsen i en liten mengde organisk løsningsmiddel slik som dimetylsulfoksyd eller dimetylformamid. Etter reaksjon med sammenkoblingsforbindelsen kan det derivatiserte produktet atskilles ved hjelp av standard fremgangsmåter slik som gelfiltrering, dialyse eller søylekromatografi. Det derivatiserte produktet (derivatisert målcellebindingsdel eller derivatisert toksindel) kan så reageres med den andre delen for å lage det endelige konjugatet.

Det vil forstås at den nøyaktige egenskapen til sammenkoblingsforbindelsen som benyttes vil avhenge av type gruppe (f.eks. tiol, karboksy eller amino) på målcellebindingsdelen og toksindelen som er tilgjengelig for konjugering.

Toksindelen kan lages fra naturlige kilder. Det foretrekkes at toksindelen lages ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi. Denne teknologi benytter fremgangsmåter velkjente for fagmannen og omfatter fremgangsmåter for å ekstrahere mRNA, lage cDNA-bibliotek, konstruksjon av vektorer, transformering av celler og dyrkning av transformerte vertsceller for å oppnå produksjon av toksinpolypeptidet. Passende ekspresjonsverter av de ønskete toksindelene omfatter prokaryoter, f.eks. E. coli, og eukaryoter, f.eks. gjær. Disse fremgangsmåtene illustreres i fremstillingen av konjugatet beskrevet nedenfor.

Generelt omfatter målcellebindingsdelen et antistoff eller antistoff-fragment eller derivat. Det foretrekkes at antistoffet er et monoklonalt antistoff. Antistoffer kan lages ved hjelp av fremgangsmåter vel kjente i feltet. De kan isoleres fra serum, fra

milt og fra antistoff-utskillende hybridomer.

Fremstillingen av antistoffer beskrives i f.eks. Methods of Enzymology; Volum 178; Antibodies, Antigens and Molecular Mimicry, red. av J. Langone, Academic Press Inc (se spesielt del II: Engineered Antibodies); og Methods in Enzymology; volum 73; Immunochemical Techniques Part B, red. av J. Langone og H. Van Vunakis; Academic Press Inc. (se spesielt del I: Production of Antibodies).

Hvor mellomstykket består av gruppen -S-X-CO-, kan antistoffet (eller toksindelen) derivatiseres etter reaksjon med en forbindelse med formel L1-S-X-CO-L2, hvor L-j og L2er grupper som kan erstattes. F.eks. CO-L2kan være en karboksylsyregruppe eller, fortrinnsvis, en aktivert karboksylsyregruppe. F.eks. gruppen CO-L2kan omfatte en ester eller anhydridgruppe. Spesielle eksempler for L2omfatter en imidazolylgruppe eller en suksinimidylestergruppe. L1kan omfatte en gruppe som ved oksydasjon kan miste tiogruppen, f.eks. kan den omfatte en pyridingruppe. Mellomstykket reageres generelt med en redusert tiolgruppe på antistoffet eller toksindelen (fortrinnsvis toksindelen).

Hvor andre mellomstykker benyttes, blir de reagert med antistoffet og toksindelen ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Generelt blir mellomstykket reagert med tilgjengelige respektive funksjonelle grupper på målcellebindingsdelen og toksindelen. Imidlertid kan målcellebindingsdelen og toksindelene bli koblet direkte, ved dannelse av en kovalent binding, f.eks. en disulfidbinding.

Hvor toksindelen har en sulfhydrylgruppe, slik som gruppen i en cysteinrest, kan dette benyttes i konjugering. F.eks. kan det nyttes til å danne en disulfidbinding med en sulfydrylgruppe på målcellebindingsdelen eller på et mellomstykke. Hvor sulfydrylgruppen ikke er tilstede på toksindelen kan det bli derivatisert slik at det gir en slik gruppe og derfor underletter konjugering. Denne derivatisering kan utføres ved bruk av f.eks. iminotiolan.

Hvor polypeptidmellomstykker benyttes, kan mellomstykket bli reagert med frie karboksy eller aminogrupper på toksinet og målcellebindingsdelene.

Hvor toksindelen omfatter A-kjeden til ricin og mellomstykket omfatter diradikale -COCH2CH(CH3)-S-, er en passende koblingsforbindelse N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)butyrat. En foretrukket fremgangsmåte for å lage et slikt immuntoksin omfatter reaksjon mellom derivatisert målcellebindingsdel med redusert ricin A.

Målcellebindingsdelen derivatiseres gjennom reaksjon med en koblingsforbindelse, slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)-butyrat, og A-kjeden til ricin reduseres ved behandling med en passende reduserende forbindelse for å redusere tiolgruppen på den frie cysteingruppen, ved bruk av f.eks. ditiotreitol.

Vanligvis benyttes et overskudd av koblingsforbindelsen slik at den derivatiserte målcellebindingsdelen har mer enn ett mellomstykke bundet til seg. Etter reaksjon med ricin A blir ethvert mellomstykke som ikke er bundet til ricin A vanligvis endeblokkert med en blokkeringsgruppe, f.eks. cystein.

Konjugatene i den foreliggende oppfinnelse er potensielt anvendbare i å behandle svulster. Dette kan demonstreres ved hjelp av konjugatets evne til å hemme proteinsyntese i svulstceller in vitro, og/eller ved konjugatets evne til å redusere svulststørrelse eller vekst in vivo. Detaljer på passende testprotokoller er gitt nedenfor.

Kort beskrivelse av figurer:

Fig. 1 illustrerer konstruksjonen av plCI0020,

fig. 2 illustrerer konstruksjonen av pTB344,

fig. 3 illustrerer konstruksjonen av plCI0042,

fig. 4 illustrerer konstruksjonen av plCI1079,

fig. 5 illustrerer konstruksjonen av pICH 187,

fig. 6 illustrerer en Coomassie-blåfarget SDS-gel av E. co//-lysater, hvor spor A er pICM 102, B er pICI 0020 og C er molekylvektmarkører;

fig. 7 illustrerer en gelprofil av pIC11102 hvor topp R representerer ricin A,

fig. 8 er en western blot av ricin A laget av pICI 1102 og hvor spor 1 er molekylvektmarkører; 2 og 3 er ikke-ricinproduserende kloner; 4 er pICI 1102 og 5 er pICI 0020 (kontrollplasmid-ikke ricin A sekvens),

fig. 9 er en delvis sekvens av pIC11102,

fig. 10 illustrerer konstruksjonen av pIC11102,

fig. 11 beskriver et fragment benyttet i fremstillingen av plasmider,

fig. 12 er et plasmidkart av pICI 0042,

fig. 13 illustrerer sekvensen til en transkripsjonsterminator,

fig. 14 er et plasmidkart av pICI 1079,

fig. 15 illustrerer endocytose av<125>I-C242 av COLO 205-celler,

fig. 16 illustrerer in vitro cytotoksisitet på C242/ricin A immuntoksin mot COLO 205-celler,

fig. 17 illustrerer et antistoff,

fig. 18 illustrerer cDNA-sekvensen til C242 kappa-kjeden, variable region (cDNA i plasmid pKGE761); og

fig. 19 illustrerer cDNA-sekvensen til C242 tunge kjeden, variable region (cDNA i plasmid pKGE762).

Oppfinnelsen vil nå illustreres ved hjelp av de følgende eksemplene hvor, med mindre annet er nevnt:

(i) fordampninger ble utført ved roterende fordampning i vakuum,

(ii) arbeidet ble utført i romtemperatur, dvs. i området 18-26°C.

(iii) utbyttene blir gitt kun for illustrasjon og er ikke nødvendigvis det maksimalt oppnåelige ved nøyaktig prosessutvikling, (v) proton NMR-spektra ble vanligvis bestemt ved 200 MHz i deuterium dimetylsulfoksyd som løsning ved bruk av tetrametylsilan (TMS) som en intern standard og uttrykkes som kjemiske skift (deltaverdier) i deler pr. million relativ til TMS ved bruk av konvensjonelle forkortelser for betegnelse av hovedtopper, s, enkeltståelde; m, mange; t, triplett; br, bred; d, dublett; og

(vi) følgende forkortelser blir benyttet:

BSA: storfeserum

PBS: fosfatbuffret saltvann

IPTG: isopropyltio-B-galaktosid

EtOH: etanol

SDS-PAGE: natriumdodecylsulfat (SDS) polyakrylamid gelelektroforese

(PAGE)

Fremstilling av ricin A/C242 immuntoksin

En løsning av det monoklonale antistoffet-C242 (200 mg) i fosfatbuffret saltvann (natriumfosfat/150 mM natriumklorid pH 7,2) ved 4,4 mg/ml ble konsentrert i 12 mg/ml ved membranfiltrering (Amicon YM10-membran) ved 4°C. Konsentratet ble fortynnet med 0,5 volum boratbuffer (100 mM natriumborat pH 9,1). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å avlese absorbsjon ved 280 nm, og pH i den blandete løsningen ble målt å være 8,8+/- 0,1.

N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)butyrat ("mellomstykket") ble løst i tørt, redestillert dimetylformamid eller acetonitril i en konsentrasjon på 10 mg/ml. En prøve av denne løsningen (0,352 ml) som inneholdt 3,52 mg N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)butyrat ble tilsatt øyeblikkelig til den konsentrerte antistoffløsningen. Den resulterende løsning ble blandet og så tillatt å stå ved 20°C i 1 time. Løsningen ble så påsatt en avsaltende søyle (G25 Sephadex - Pharmacia, 2,6 x 58 cm, strømhastighet 2 ml/min, ekvilibrert med 50 mM natriumfosfat/150 mM natriumklorid/1 mM EDTA pH 8,0) for å fjerne overskuddsreagenser og buffer buttet fra det derivatiserte antistoffet. Alternativt kan reaksjonsproduktene fjernes ved krysstrømfiltrering. Det avsaltete derivatiserte antistoffet ble slått sammen og proteinkonsentrasjon bestemt ved å avlese absorbsjon ved 280 nm. Graden av derivatisering med mellomstykket ble bestemt ved tilsetning av overskudds ditiotreitol og avlese frigjøringen av frie tiopyridylgrupper ved 343 nm. Omfanget av derivatisering ble funnet å være 4-6 mellomstykkegrupper pr. molekyl av antistoff.

Rekombinant ricin A ble redusert ved å behandle en løsning med ricin A i fosfatbuffer ved pH 8 med overskudd ditiotreitol og konsentrert ved krysstrøm-filtrering. Overskudd reagenser ble fjernet ved søylekromatografi (G25 Sephadex - Pharmacia, 2,6 x 58 cm, strømhastighet 2 ml/min, i 50 mM natriumfosfat/150 mM natriumklorid/1 mM EDTA pH 8,0).

Rekombinant ricin A ble konjugert til derivatisert antistoff ved å blande fremstilt rekombinant ricin A (190 mg) og derivatisert antistoff (190 mg) løsninger ved en 1:1 vekt/vekt ricin A/derivatisert antistoff-forhold. Glycerol ble tilsatt til 20% v/v og karet gjennomstrømmet med argon. Den resulterende løsning ble beholdt ved 15°Ci40-65 timer.

Cystein ble så tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,2 mM (og i minst 10 ganger molart overskudd over mellomstykkegruppene på antistoffet) for å endeblokkere overskudd mellomstykkegrupper på antistoffet. Løsningen ble blandet og beholdt ved 20°C i 2-3 timer. Etter blokkering med cystein ble en prøve av det resulterende immuntoksin analysert ved behandling med overskudd ditiotreitol og avlest ved 343 nm for å kvantitere at reaksjonen var fullstendig.

Løsningen som inneholdt konjugatet ble så konsentrert ved membranfiltrering (Amicon YM10-membran) og påsatt en kromatografisøyle (HR300 Sephacryl - Pharmacia, 2,6 x 50 cm, strømhastighet 3 ml/min, buffer 50 mM natriumfosfat/ 25 mM natriumklorid/1 mM EDTA) som resulterer i atskillelse av immuntoksin og ikke-konjugert antistoff fra ikke-konjugert ricin A. Toppen som inneholder blandingen av immuntoksin og antistoff ble slått sammen og proteinkonsentrasjon bestemt ved avlesning av absorbsjon ved 280 nm.

Oppfinnelsen vil nå illustreres ved de følgende eksemplene hvor vanlige forkortelser blir benyttet, slik som BSA - storfe serumalbumin, PBS - fosfatbuffret saltvann, IPTG - isopropyltio-B-galaktosid, EtOH - etanol, og SDS-PAGE - natriumdodecylsulfat (SDS) polyakrylamid gelelektroforese (PAGE).

Fremstilling av ricin A/C242 immuntoksin

En løsning av det monoklonale antistoffet C242 (200 mg) i fosfatbuffret saltvann (natriumfosfat/150 mM natriumklorid pH 7,2) ved 4,4 mg/ml ble konsentrert til 12 mg/ml med membranfiltrering (Amicon YM10-membran) ved 4°C. Konsentratet ble fortynnet ved 0,5 volum boratbuffer (100 mM natriumborat pH 9,1). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved avlesning av absorbsjon ved 280 nm og pH

i den blandete løsningen ble målt å være 8,8 +/- 0,1.

N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)butyrat ("mellomstykket") ble løst opp i tørt, redestillert dimetylformamid eller acetonitril i en konsentrasjon på 10 mg/ml. En prøve av denne løsning (0,352 ml) som inneholdt 3,52 mg N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)butyrat ble øyeblikkelig tilsatt til den konsentrerte antistoffløsningen. Den resulterende løsningen ble blandet og så tillatt å stå ved 15°C i 1 time. Løsningen ble så påsatt en avsaltende søyle (G25 Sephadex - Pharmacia, 2,6 x 58 cm, strømhastighet 2 ml/min, ekvilibrert med 50 nM natriumfosfat/150 mM natriumklorid/1 ml EDTA pH 8,0) for å fjerne overskudd av reagenser og bufferbytte på det derivatiserte antistoffet. Alternativt kan reaksjonsproduktene bli fjernet ved krysstrømfiltrering. Det avsaltete derivatiserte antistoffet ble slått sammen og proteinkonsentrasjon bestemt ved å avlese absorbsjon ved 280 nm. Omfanget av derivatisering med mellomstykket ble bestemt ved tilsetning av overskudd ditiotreitol og avlesning av frigivelse av frie tiopyridylgrupper ved 343 nm. Omfanget av derivatisering ble funnet å være 4-6 mellomstykkegrupper pr. mol antistoff.

Rekombinant ricin A ble redusert ved å behandle en løsning ricin A i fosfatbuffer ved pH 8 med overskudd ditiotreitol og konsentrert ved krysstrøm-filtrering. Overskudd reaksjonsforbindelser ble fjernet ved søylekromatografi (G25 Sephadex - Pharmacia, 2,6 x 58 cm, strømhastighet 2 ml/min i 50 mM natriumfosfat/150 mM natriumklorid/1 mM EDTA pH 8,0).

Rekombinant ricin A ble konjugert til derivatisert antistoff ved å blande rekombinant ricin A (190 mg) og derivatisert antistoff (190 mg) løsninger i en 1:1 vekt/vekt ricin A/derivatisert antistoff-forhold. Glycerol ble tilsatt til 20% v/v og røret gjennomstrømmet med argon. Den resulterende løsningen ble holdt ved 15°C i 40-65 timer.

Cystein ble så tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,2 mM (og til minst 10 ganger molart overskudd av mellomstykkegruppene på antistoffet) for å endeblokkere overskudd mellomstykkegrupper på antistoffet. Løsningen ble blandet og holdt ved 20°C i 2-3 timer. Etter endeblokkering med cystein ble en prøve av det resulterende immuntoksin analysert ved behandling med overskudd ditiotreitol og avlest ved 343 nm for å bestemme at reaksjonen var fullstendig.

Løsningen som inneholdt konjugatet ble så konsentrert ved membranifltrering (Amicon YM10-membran) og påsatt en kromatografisøyle (HR300 Sephacryl - Pharmacia, 2,6 x 50 cm, strømhastighet 3 ml/min, buffer 50 mM natriumfosfat/25 mM natriumklorid/1 mM EDTA) som resulterer i atskillelse av immuntoksin og ikke-konjugert antistoff fra ikke-konjugert ricin A. Toppen som inneholder blandingen av immuntoksin og antistoff ble slått sammen og proteinkonsentrasjon bestemt ved avlesning av absorbsjon ved 280 nm.

Den resulterende løsningen som inneholdt både ikke-konjugert antistoff og immuntoksin ble justert til pH 6,3 ved tilsetning av 1 M HCI og påsatt en søyle som inneholdt triazin fargestoff (Mimetic A6XL, ACL plc, Cambridge, UK, 8 x 26 cm søyle, strømhastighet 1,5 ml/min). Søylen ble vasket med 100 ml startbuffer som eluerer ikke-konjugert antistoff og immuntoksinet eluerte med startbuffer som inneholdt 0,5 M natriumklorid. Immuntoksinløsningen ble dialysert mot fosfatbuffret saltvann, filtrert gjennom et 0,22 mikron filter og lagret ved 4°C.

Renheten av immuntoksinet ble bestemt ved SDS polyakrylamid elektroforese og inneholdt et totalt på 45 mg immuntoksin med sammensetningen: 50-60% mono ricin A derivat, 10-30% di ricin A derivat, 5-15% tri ricin A derivat og

< 10% ikke-derivatisert antistoff.

Alternativt kan gelfiltreringstrinnet (fjerning av rest r-ricin A) og fargeaffinitets-kromatografi-trinnet (fjerning av rest C-242 antistoff) bli overført til rensesekvensen. I denne varianten av fremgangsmåten blir konjugeringsblandingen like etter blokkering av de ikke-reagerte mellomstykkedelene med cystein (som beskrevet ovenfor) fortynnet til en ledning på mindre enn 5 mS med destillert vann. pH blir så justert til 6,0 med 1M eddiksyre og løsningen renset ved membranfiltrering. Løsningen blir så påsatt fargeligandsøylen (2,5 ml gel/mg r ricin A benyttet i konjugeringsblandingen). Søylen blir så vasket med 0,68% natriumacetat pH 6,0 til ikke-konjugerte C242-antistoffet ble vasket gjennom søylen. Immuntoksinet og rest r-ricin A kan så bli eluert fra søylen i 20 mM natriumfosfatbuffer ved pH 7,0, 0,5 M med hensyn til natriumkloridkonsentrasjonen. Dette eluatet blir så konsentrert ved krysstrømfiltrering ved bruk av en spiralsylinder ultrafiltreringssystem og påsatt en søyle av Sephacryl S300HR (2,5 ml gel for hver mg antistoff benyttet i den originale konjugeringsreaksjonen og i et volum<<>5% av det totale volumet av søylen). Søylen kan bli ekvilibrert i enhver passende bufferformulering, slik som fosfatbuffret saltvann pH 7,2.

Fremstilling av mellomstykkedelen

N-suksinimidyl-(R)-3-(2-pyridylditio)butyrat benyttet ovenfor ble laget ved bruk av den følgende fremgangsmåten, hvor, med mindre annet sies:

(i) fordampningene ble utført ved roterende fordampning i vakuum,

(ii) arbeidstrinnene ble utført ved romtemperatur, det er i området 18-26X; (iii) utbyttene er gitt kun for illustrasjon og er ikke nødvendigvis det maksimalt oppnåelige ved nøyaktig prosessutvikling; (v) proton NMR-spektra ble vanligvis bestemt ved 270 MHz i deuteriumkloroform som løsningsmiddel, ved bruk av tetrametylsilan (TMS) som en intern standard, og blir uttrykt som kjemisk endring (delta-verdier) i part pr. million relativ til TMS ved bruk av konvensjonelle forkortelser for betegnelse av hovedtopper: s, enkelt; m, multiplett; t, triplett; br, bred; d, dublett.

N-suksinimidyl-(R)-3-(2-pyridylditio)butyrat

(R)-3-(2-pyridylditio)smørsyre (90 g, 0,393 mol) ble løst opp i diklormetan (639 ml) med omrøring ved romtemperatur. N-hydroksysuksinimid (45,2 g, 0,393 mol, 1,0 molekvivalenter) ble tilsatt og vasket i løsningen med diklormetan (90 ml). Blandingen ble omrørt i 30 minutter mens den ble avkjølt til 2°C. En løsning med dicykloheksylkarbodiimid (81,08 g, 0,393 mol, 1,0 molekvivalenter) i diklormetan (540 ml) ble tilsatt over en periode på 35 minutter, mens reaksjonstemperaturen på 0°C ± 2°C ble opprettholdt, og vasket inn i løsningen med diklormetan (90 ml). Løsningen ble omrørt ved en temperatur på 0-10°C i 3 timer og 15 minutter og så tillatt å varmes opp til romtemperatur. Løsningen ble filtrert for å fjerne fast dicykloheksylurea som ble vasket med diklormetan (180 ml x 2). Filtratet ble fordampet under redusert trykk ved 20-22°C til å gi en brun olje (150 g). Oljen ble renset ved kromatografi på en søyle av Kieselgel 60 silikagel 230 - 400 mesh (1180

g) laget i toluen/etylacetat 80:20 v/v. Eluering med toluen/etylacetat (80:20 v/v) ga N-suksinimidyl-(R)-3-(2-pyridylditio)butyrat (52) som en blek gul gummi etter

fordampning under vakuum (0,25 mbar) ved 28°C.

NMR:

1,5 (d, 3H), 2,85 (m, 4H), 2,8 (dd, 1H), 3,2 (dd, 1H), 3,5 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 7,7 (m, 2H), 8,5 (d, 1H).

Elektronbasert massespektroskopi viste at forbindelsen hadde en molekylvekt på 326, med fragmentering overensstemmende med strukturen til N-suksinimidyl-

(R)-3-(2-pyridylditio)butyrat.

Startmaterialet ble laget som følger:

a. (R)-3-hydroksysmørsyre

Metyl-(R)-3-hydroksybutyrat (1,670 kg, 14,152 mol) ble avkjølt på et is/etanolbad. Vann (4698 ml) ble tilsatt, etterfulgt av 47% vekt/vekt natriumhydroksyd (965 ml, 16,98 mol, 1,2 molekvivalenter) i en slik hastighet som å beholde temperaturen ved 0°C ± 2°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C for ytterligere 1 time og 30 minutter. Konsentrert hydrokloridsyre (1490 ml, 17,28 mol, 1,22 molekvivalenter) ble tilsatt til reaksjonsblandingen over en periode på 35 minutter, mens temperaturen ble beholdt på eller mindre enn 5°C, til å gi en endelig pH på 1,5. Natriumklorid (1061 g) ble så tilsatt til blandingen, og den vandige blandingen ble ekstrahert med metyl-tert-butyleter (10 x 3,5 I). Ekstraktene ble kombinert og løsningen fjernet ved destillering under vakuum ved romtemperatur til å gi en rest. Toluen (7,5 I) ble blandet med resten og det flyktige materialet fjernet ved destillasjon under vakuum til å gi (R)-3-hydroksysmørsyre (1189 g, 81%) som en olje. Oljen ble avkjølt til 4°C og strøket ut for å tillate å danne en fast forbindelse.

b. (S)-B-butyrolakton

(R)-3-hydroksysmørsyre (530 g, 5,096 mol) ble blandet med trietylortoacetat (1322,8 g, 1488 ml, 8,154 mol, 1,6 molekvivalenter) ved 50-30°C til å gi en sløret løsning (sløret ble antatt å skyldes rest natriumklorid fra tidligere trinn).

Løsningen ble fordampet under høyt vakuum (1,0 mm) ved 30°C for å fjerne flyktig materiale. Restvæsken (1001 g) som inneholdt (2S,6R)-2-etoksy-2,6-dimetyl-1,3-dioksan-4-on ble oppvarmet til 80°C i 2 timer og så avkjølt til 40°C. Det grove produktet ble destillert gjennom en glassøyle (50 cm x 3,5 cm diameter) pakket med glass Raschig-ringer til å gi (S)-&-gutyrolakton (57,3 g), kokepunkt 59-62°C ved 10-12 mbar.

c. (R)-3-merkaptosmørsyre

(S)-G-butyrolakton (91,12 g, 1,058 mol) ble avkjølt til 5°C med omrøring under nitrogen. Tiomelkesyre (8,57 g, 75,65 ml, 1,058 mol, 1,01 molekvivalenter) ble tilsatt, mens temperaturen ble vedlikeholdt ved 5°C. Fri etylamin (146,7 ml, 1,058 mol, 1,0 molekvivalenter) ble så tilsatt over en periode på 45 minutter, mens reaksjonstemperaturen ble holdt på -5 til +5°C. Kjølebadet ble fjernet, og temperaturen steg til 65°C, hvilket ga gul/oransje løsning. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 10°C og omrørt ved romtemperatur over natt. Løsningen ble avkjølt til 0°C og vann (93 ml) ble tilsatt. Blandingen ble videre avkjølt til -10°C og så behandlet med natrium-hydroksydløsning (185 ml med 47% vekt/vekt natriumhydroksyd og 92 ml vann), tilsetningshastigheten var slik at temperaturen ble beholdt på -10 til +10°C. Blandingen ble så omrørt i 1,5 timer ved -5°C og så tillatt å varme til romtemperatur. Blandingen ble vasket med metyl-tert-butyleter (265 ml). Det vandige lag ble fortynnet med vann (185 ml), avkjølt til 0°C og behandlet med konsentrert eddiksyre (270 ml) ved 0-10°C til pH var 1-2. Den vandige blandingen ble så ekstrahert med metyl-tert-butyleter (2 x 265 ml). De organiske ekstraktene ble kombinert, vasket med vann (265 ml), tørket over anhydrid magnesiumsulfat og evaporert under redusert trykk ved 30°C til å gi en oransje olje (132,8 g). Denne oljen ble renset ved vakuumdestillasjon til å gi (R)-3-merkaptosmørsyre (96,6 g), kokepunkt 96-100°C ved 2 mbar.

d. Pyridin-2-sulfenylklorid

2,2'-dipyridyldisulfid (110,0 g, 0,5 mol) ble løst opp i diklormetan (800 ml) ved romtemperatur til å gi en blek gul løsning som ble avkjølt ved 0°C. Klorgass ble boblet inn i løsningen som ble holdt på 0-5°C. Etter 3 timer og 25 minutter ble løsningen mettet med klorin og var gylden brun i farge. Løsningen ble konsentrert under redusert trykk ved 0-5°C for å fjerne overskudd klorin og utskilt pyridin-2-sulfenylklorid som en gul fast forbindelse. Denne faste forbindelse (11,8 g) ble samlet ved filtrering og vasket med diklormetan. Diklormetanfiltratet (1624 g) inneholdt videre 133 g pyridin-2-sulfenylklorid.

e. (R)-3-(2-pyridylditio)smørsyre

Pyridin-2-sulfenylklorid (11,8 g av den gule faste forbindelsen og 1035 g av løsningen i diklormetan laget ovenfor, 0,667 mol total, 1,0 molekvivalenter) ble

fortynnet med diklormetan (50 ml). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5-10 minutter og så avkjølt til -5°C. En løsning av (R)-3-merkaptosmørsyre (80,0 g, 0,667 mol) i diklormetan (400 ml) ble tilsatt, mens temperaturen ble beholdt ved -5 til 0°C. Blandingen ble rørt over natt ved romtemperatur for å gi en brun olje og gult øvre

lag. Vann (485 ml) ble tilsatt blandingen som så ble avkjølt til 5°C og behandlet med 2N natriumhydroksydløsning (385 ml) til pH ble 4,55. Diklormetanlaget ble atskilt og den gjenværende vandige fase ekstrahert med diklormetan (200 ml). Diklormetanekstraktene ble kombinert, tørket over anhydrid magnesiumsulfat og fordampet under redusert trykk til å gi en lys brun olje. Oljen ble omrørt kraftig med heksan (325 ml) og avkjølt på isbad til en fast forbindelse ble dannet. Blandingen ble omrørt i 3 timer, og så ble den brune krystallinske faste forbindelsen samlet ved filtrering, vasket med heksan (2 x 162 ml) og tørket over natt ved romtemperatur i vakuum til å gi (R)-3-(2-pyridylditio)smørsyre (140 g).

NMR:

1,45 (d, 3H), 2,6 (dd, 1H), 2,8 (dd, 1H), 3,4 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 7,7 (m, 2H), 8,5 (m, 1H).

FREMSTILLING AV C242-ANTISTOFF (C242:ll)

Etablering av hybridomcellelinje og produksjon av C242:ll

Fremstilling av etablerte miltceller

En human kolorektal karsinomcellelinje, COLO 205, kommersiell tilgjengelig fra the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., USA, under registreringsnummer CCL 222, ble dyrket rutinemessig i Iscoves MEM tilsatt 10% føtalt kalveserum (FCS). Cellene ble dyrket først til konfluens, normalt 2-3 dager etter subkultivering og vasket tre ganger med fosfatbuffret saltvann (PBS) for immunisering.

BALB/c-mus, 4-6 uker gamle, ble immunisert intraperitonealt med en startdose på 3 x 10<7>COLO 205-celler suspendert i en 0,1 ml fosfatbuffret saltvannløsning. Dyrene ble så stimulert med en annen 0,1 ml suspensjon av 3 x 10<7>COLO 205-celler og ofret 4 dager senere og miltene fjernet. Miltene ble så løst opp i enkeltcellesuspensjon.

Fremstilling av hybridoma

1,2x10* miltceller fra den ovenfor beskrevne cellesuspensjon ble fordelt på ;to rør. Til hvert rør ble ytterligere tilsatt 10° o myelomceller fra musemyelomcellelinjen Sp2/10 (tilgjengelig fra samlingen til American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA, under registreringsnummer CRL 1581). De to rørene ble sentrifugert, og all væske ble heilt av. Til hvert rør ble så langsomt tilsatt 2 ml med ;37°C PEG-løsning (10 g PEG Mv 4000, 1 ml DMSO og 10 ml monoklonalt saltvann) ;over 1 minutt og med konstant omrøring. Rørene ble overført til vannbad ved 37°C i 90 sekunder med forsiktig røring. Fusjonen ble avbrutt ved tilsetning til hvert testrør en fysiologisk bufferløsning ifølge det følgende skjema: 2 ml under de første 30 ;sekunder, 6 ml under de følgende 30 sekunder og en annen 32 ml over 1 minutt. Etter vasking av cellesuspensjonen i kulturmedium ble den suspendert i totalt 100 ml hypoxantin/aminopterin/thymidin (HAT) supplert kulturmedium. Kulturmedium var Iscoves MEM tilsatt 10% FCS, L-asparagin (36 mg/l), L-arginin-HCI (116 mg/l), folsyre (10 mg/l), L-glutamin (292,3 mg/l), natriumpyruvat (110,1 mg/l) og merkaptoetanol (3,49 Prøver på 50^1 ble fordelt på brønnene i 96-brønns vevkulturskåler. Brønnene hadde blitt forhåndsdekket med 250fj makrofag-suspensjon fra BALB/c-mus (2 x 10<4>celler/ml) i HAT-supplert kulturmedium. Mediet ble byttet 6 dager etter fusjon. ;Undersøkelse av antistoff-hybridomer ;Det brukte medium fra dag 6 ovenfor ble testet for COLO 205 positive antistoffer som beskrevet av R.H. Kennett, "Enzyme-linked antibody assay with cells attached to polyvinyl chloride plates". Monoclonal Antibodies, Hybridomas, A new dimension in biological analyses, red. H.R. Kennett, T.J. McKelvin, K.B. Bechtol, ;Plenum Press, New York 1980. I korthet ble brønnene i Nunc immunplater type 11R ;dekket med 2 x 10<5>celler/brønn med COLO 205-celler (1 mg/100 ml PBS), dekkevolum 50^l. Den ovenfor nevnte brukte mediumkultur fra dag 6 ble så tilsatt til de dekkete brønnene, 50^l/brønn. Etter inkubasjon over natt ved romtemperatur ble peroksidasekonjugert anti-mus lg (Dakopatts P260, Dakopatts A/S, København, Danmark) fortynnet (1/500) i 1% BSA-PBS tilsatt i 100Mg/brønn og inkubert over natt ved romtemperatur. Substrat i form av 4 OPD-tabletter Dako S2000 løst i 12 ml sitronsyrebuffer, pH 5,0, pluss 5^l 30% hydrogenperoksyd, ble så tilsatt i 100^l/brønn, og absorbsjonen målt ved 450 nm etter inkubasjonen. ;Omtrent 600 hybridomkloner ble testet. 190 av disse reagerte med COLO 250-celler. Av disse reagerte 177 også med normale humane lymfocytter laget påLymphoprep fra Nyegaaard A/S, Norge, og ble kastet. En klon etablert fra en av de gjenværende klonene ble betegnet hybridom C242 og ble isotypet som IgGI-klasse. C242-hybridomet ble så gjenstand for en rekke subkloningstrinn for til slutt å lage en endelig, stabil monoklonalt antistoffproduserende klon betegnet som C242:ll. ;Således ble C242-hybridomet først klonet, hvilket resulterte i en klon kalt C242:5. Denne klon ble igjen klonet for å lage klon C242:5:2.1 begge disse kloningene ble hybridomløsningen fortynnet i hypoxantin/thymidin (HT) supplertkulturmedium til en tetthet av 4 celler/ml. 50^l (0,2 celler) ble fordelt på hver brønn i en 96-brønn kulturskål på forhånd dekket med 250^l Balb/c mus makrofag suspensjon (5x10^ makrofager/brønn) i HT-supplert medium. Etter 2-5 dager ble enkeltcellekloner påvist ved visuell inspeksjon i et mikroskop. På dag 6 ble mediet byttet og prøver av brukt medium analysert for antistoffmengde ved binding til COLO205-celler, men ikke til normale humane celler ved ELISA som beskrevet ovenfor. De beste klonene med hensyn til positiv reaksjon i COLO 205 ELISA som ga negativ reaksjon med normal celle ELISA ble valgt ut og frosset i rør i flytende nitrogen for videre utvikling. ;For å utføre en tredje kloning ble cellene tint og dyrket i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium) (5% FCS). Celler ble så sådd ut i brønnene til en 96-brønn vevskulturskål med en gjennomsnittlig tetthet på 3 celler pr. brønn. Kloningen ble utført i DMEM med 5% FCS og musemakrofager benyttet som føderceller. På denne skålen opptrådte 30 kloner der 16 ble testet for IgG-produksjon ved hjelp av nefelemetri og spesifisitet av antistoffene ved ELISA som beskrevet ovenfor. 12 av disse klonene ble funnet å produsere IgG. 10 kloner ble så utviklet i en 24-brønn vevskulturskål, fra hvilke brukt medium ble testet for IgG-produksjon og spesifisitet. Denne seleksjon resulterte i at 4 kloner ble isolert med relativt høy produktivitet. ;En endelig produktivitetstest for disse fire kloner ble utført i duplikat vevskulturflasker. Klonen som viste den høyeste produktiviteten ble valgt og betegnet som C242/CL 510 A1. Den ble frosset i flytende nitrogen for videre bruk. ;En første kloning av klonen C242/CI 510 A1 indikerte at en tredjedel av ;cellene produserte ikke IgG som bedømt ved en absorbsjon på mindre enn 0,1 i en fortynning på 1:1000 i en generell muse IgG ELISA. Fem positive subkloner ble slått sammen for å lage en klon kalt C242.I. Produktiviteten til denne klonen ble målt ved en generell HPLC-basert metode til å være 150^g av muse IgG pr. ml. ;Klon C242:l ble deretter klonet inn i en 96-brønners skål som ga 33 kloner, alle var positive for muse IgG-produksjon. Fem av disse, alle ga over 150^g/ml, ble slått sammen til å lage en endelig klon, betegnet som C242:ll, hvilket hadde en stabil produksjon på IgG. HPLC-undersøkelse viste at produktiviteten til C242:ll var 196j^g muse IgG pr. ml. Cellene ble frosset og lagret i rør i flytende nitrogen. En prøve på C242:ll-hybridomet som var laget ble deponert ved ECACC under registreringsnummer 90012601 som beskrevet ovenfor. ;Produksjon av C242 monoklonalt-antistoff ;En første cellesuspensjon av det ovenfor lagde hybridomet ble oppnådd fra et frossent rør. Celler ble sådd ut i vevskulturkammer med et totalt område på 6000 cm<2>fra Nunc A/S med en tetthet på 2 x 10<4>celler/ml (C242:ll-hybridom). Cellene ble så dyrket i DMEM modifisert ifølge Iscove (N.N. Iscove, og F. Melchers, J. Exp. Med. Vol. 147, p. 923, 1978) og tilsatt 1% gentamycin, 1% aminosyresupplement og 5% føtalt kalveserum. Cellene ble så inkubert i 4 eller 5 dager ved 37°C i en fuktig atmosfære som inneholdt 8% CO^. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene talt og prøver ble tatt for å bestemme monoklonal antistoffkonsentrasjon. Cellekultursupernatanten ble slått av og filtrert gjennom et cellulosefilter for å fjerne suspenderte celler. Supernatanten ble så konsentrert 20-30 ganger ved ultrafiltrering i en Millipore Pellican ultrafiltreringscelle ved bruk av en 30 000 molekylvekt avkuttingsmembran. En prøve fra konsentratet ble tatt for analyse av C242:ll monoklonalt antistoffkonsentrasjon og antigen reaktivitet, deretter ble det monoklonale antistoffkonsentratet lagret ved -70°C til rensing. ;Opprensing av C242 monoklonalt-antistoff ;Protein-A-Sepharose 4B (varemerke av Pharmacia AB, Uppsala, Sverige) ble laget ifølge produsentens instruksjoner med hensyn til svelling og vasking av gelen, hvor den ovenfor produserte C242:ll (også referert til her som C242-antistoff) konsentrat ble bundet til dette ved bruk av 1,5 glycin-NaOH, 3M NaCI, pH 8,9, som bindingsbuffer. Etter en første vask med bruk av samme buffer ble affinitetssøylen eluert med 0,1 M sitronsyre-NaOH, pH 5,0, og den C242 monoklonale-antistoffet samlet i rør som inneholdt 1 mol/l Tris-HCI, pH 8,0. Antistoffet som ble oppnådd ble så dialysert mot 0.02M fosfatbuffer, 0,15 M NaCI, pH 7,2, 0,2 g/l NaN3. Det dialyserte C242-antistoff ble så konsentrert ved ultrafiltrering ved bruk av en 30 000 molekylvekt avkuttingsmembran. Etter å ha tatt prøver for konsentrering og kvalitetskontrollanalyse ble C242-monoklonale lagret ved -20°C. ;FREMSTILLING AV RICIN A ;Ricin A kan bli laget ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi ved bruk av DNA-sekvenser som koder for ricin A. Slike sekvenser er beskrevet i EP 145 111; 0'Hare et al., FEBS letts, 216, p. 73-78, 1987; og Lord et al., Eur. J. Biochem, 148, p. 265-270, 1985. En DNA-sekvens som koder for ricin A vil plasseres under kontroll av passende kontrollsekvenser slik som en promotor (f.eks. en trp-promotor), ribosom bindingssete og transkripsjonsterminator. Fremstillingen og rensingen av rekombinant ricin A blir beskrevet i publisert PCT patentsøknad WO 85/03508 og publisert i europeisk søknad nr. 237 676. ;Det følgende illustrerer konstruksjonen av et rekombinant plasmid hvor den kodende sekvensen av ricin A-kjeden er plassert under transkripsjons- og translasjonskontroll til et prokaryot promotorelement. Transkripsjon blir avsluttet ved bruk av et naturlig termineringselement ved 3-enden av den kodende del. Translasjonsstart blir kontrollert av DNA-sekvensen ved den 5'-enden av den kodende del, ribosom bindingssetet (RBS). ;Fremgangsmåten for konstruksjon nødvendiggjør erstatningen av de to terminale aminosyrerestene til det nøytrale, modne ricin A-proteinet. ;Flere mellomtrinn i utviklingen av vektoren benyttet for å lage rekombinant ricin A er beskrevet. ;EKSPERIMENTELLE FREMGANGSMÅTER ;1. Syntetiske oligonukleotider ;Syntetiske oligonukleotider ble benyttet for å innføre spesifikke DNA-sekvensendringer i ricin-genet. Alle oligonukleotidene beskrevet i det følgende ble laget på en Applied Biosystems 380A DNA-syntesemaskin fra 5-dimetoksytrityl base-beskyttet nukleosid-2-cyanoetyl-N,N-diisopropylfosforamiditt og beskyttete nukleosider bundet til kontroll-poreglassunderlag på en 0,2 j^mol skala, ifølge protokollen gitt av Applied Biosystems Inc. ;Hvert oligonukleotid ble etter spalting fra det faste underlaget og fjerning av alle beskyttelsesgruppene løst opp i vann (1 ml) og et mål for absorbsjon ved 260 nm benyttet for å bestemme konsentrasjonen. ;2. Enzymer og vertsstammer ;En rekke restriksjonsendonukleaser og DNA-modifiserende enzymer ble benyttet i trinnene beskrevet nedenfor. Disse ble kjøpt fra én av et antall forhandlere (Amersham International, Bethesda Research Laboratories, Boehringer Mannheim eller New England Biolabs) og benyttet ifølge produsentenes instruksjoner med hensyn til reaksjonsbetingelser. ;Vertsstammene referert til her er generelt tilgjengelig fra tallrike kilder. F.eks., E. coli C600 er fritt tilgjengelig fra flere kilder inklusive mange kultursamlinger slik som E. coli (Genetisk lagersenter, Yale University, USA, under registreringsnummer GCSC 3004. Genotypen til E. coliCQQO er K12 thr-1 leuB6 thi-1 lacY1 ;tonA21 x supE44; E. coli HB101 og DH5aer tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories (BRL); og E. coli TG1 og K19 er tilgjengelig fra Anglia Biotechnology. ;3. Geneclean (TM) ;Analysesettet inneholder 1) 6M natriumjodid 2) en konsentrert løsning av natriumklorid, Tris og EDTA for å lage en natriumklorid/etanol/vannvask; 3) Glassmelk (TM) - et 1,5 ml rør som inneholder 1,25 ml suspensjon av silikamatriks i vann. ;Dette er en teknikk for DNA-rensing basert på fremgangsmåten til Vogelstein og Gillespie publisert i Proceedings of the National Academy of Sciences USA ;(1979) vol. 76. p. 615. ;Alternativt kan enhver av fremgangsmåtene beskrevet i "Molecular Cloning - a laboratory manual", 2. utg., Sambrook, Fritsch og Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 (referert til heretter som "Maniatis") bli benyttet. ;4. Sequenase (TM) ;Kjemisk modifisert T7 DNA-polymerase ;Basert på fremgangsmåten til Tabor og Richardson publisert i "Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1978) vol. 8., p. 4767-4771. ;5. Konstruksjon av pICI-ekspresjonsvektorene ;5a) plCI0020 ;Plasmidvektor plCI0020 er et pAT153-basert plasmid hvor 651 bp EcoRI-Accl-området er erstattet av en 167 bp EcoRI-Clal-fragment som består av: (1) en syntetisk E. coli trp-promotor og et trp leder ribosombindingssete ;(2) translasjon-startkodon ;(3) en multippel restriksjonsenzym-gjenkjennelsessekvens som stammer fra M13mp18, som inneholder setene for Kpnl, BamHI, Xbal, Sali, Pstl, Sphl og Hindlll, ;(4) en syntetisk transkripsjons-termineringssekvens. ;DNA-sekvensen i denne regionen er vist i fig. 11. ;Konstruksjonen av en plasmidvektor som inneholder en syntetisk trp- promotorsekvens er publisert (Windass et al., Nucl. Acids Res. 10, p. 6639-6657, 1982). Et promotorfragment ble isolert fra en slik vektor etter fordøyelse med enzymene EcoRI og Hpal og rensing av det riktige båndet fra en agarosegel ved elektroeluering (i "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Maniatis, Fritsch og Sambrook, publisert ved CSH-laboratoriet, annen utgave 1989). ;Et par komplementære syntetiske oligonukleotider ble laget som ville binde til Hpal-enden av promotorfragmentet for å fremskaffe det naturlige trp-leder- ribosombindingssete, et translasjonsstartkodon og et 3' Kpnl-kloningssete. Disse oligonukleotidene ble blandet i ekvimolære konsentrasjoner og tillatt å hybridisere ved oppvarming til 100°C fulgt av langsom avkjøling til romtemperatur. ;Promotorfragmentet og de bundne oligonukleotidene ble så koblet sammen og det passende båndet isolert fra en polyakrylamidgel ved elektroeluering. Dette fragment ble så ligert med et M13mp18-vektor-derivat som inneholdt den trp-svekkende sekvensen (laget fra syntetiske oligonukleotider) klonet inn i Hindlll-setet og satt inn i et ytterligere Clal-restriksjonssete 3' til "attenuatoren". Det koblete DNA ble transfektert inn i E. co//-stamme JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, p. 103, 1985) gjort kompetente ved CaC^-fremgangsmåten (Maniatis, kapittel 1, p. 82). ;Etter utsåing og inkubasjon av skålene ble plakkene undersøkt ved fremgangsmåten til Benton og Davies (Maniatis, kapittel 4, p. 41) ved bruk av en °^P-merket probe laget ved nikk-translasjon av EcoRI-Hpal-promotorfragmentet isolert tidligere. Enkeltkjedet DNA ble laget fra positive hybridiserende plakker ved en standard fremgangsmåte (Maniatis, kapittel 4, p. 29) og sekvensert ved bruk av en M13 universalprimer og Sanger dideoksy kjedetermineringsfremgangsmåte som er tilveiebrakt i analysesett-form av rekke forhandlere f.eks. Sequenase (United States Bioscience). ;RF DNA ble laget fra ett isolat hvor promotoren/ribosom bindingssetet/- "attenuator"sekvensen hadde blitt bekreftet. Dette DNA ble spaltet med EcoRI og Clal og det passende fragmentet isolert fra en polyakrylamidgel som ovenfor. Plasmid pAT153 ble spaltet med enzymene EcoRI og Accl og bundet sammen med det isolerte promotorfragmentet. Sammenbundet DNA ble transformert inn i kompetent E. coli HB101 (H.W. Boyer og D. Roulland-Dussoix, 1969, J. Mol. Biol. ;44, p. 459) (Bethesda Research Laboratories) og ampicillin-resistente kolonier valgt ut. ;Plasmid DNA fra flere kloner ble dannet og DNA-sekvens avledet fra regionen mellom EcoRI og Clal-setene. Én klon inneholdt den korrekte promotor/"attenuator"-regionen og ble betegnet plCI0020. ;Denne konstruksjon er vist i fig. 1. ;3b) plCI0042 ;plCI0042 (fig. 12) er et plasmid hvor antibiotikaresistensmarkørene i pAT153 er blitt erstattet av et enkelt, induserbart tetracyklinresistensgen fra plasmidet RP4 (kodet for av genet tetA og regulert av produktet til tetR-genet). Disse genene er blittkarakterisertav Klock et al. (J. Bacteriol., 161, p. 326-332, 1985). Fordi de nye resistensmarkørene bare blir uttrykt i nærvær av antibiotika, vil tetA genproduktet ikke være en potensiell forurenser av rekombinant ricin A i kulturer hvor plasmidet er stabilt vedlikeholdt i fravær av tetracyklin. En plasmidstabilitetsfunksjon (cer) har også blitt innsatt. ;Det første trinnet i dannelsen av denne vektoren var å lage et derivat av pAT153 fra hvilke genet som koder for tetracyklinresistens er blitt fjernet fullstendig. Et komplementært par syntetiske oligonukleotider ble laget for å erstatte EcoRI-Aval-fragmentet fra pAT153 med en kort sekvens som inneholder flere enkeltstående restriksjonsendonukleaseseter for etterfølgende kloning. ;pAT153 plasmid DNA ble spaltet med enzymene EcoRI og Aval og det 2,175 kp plasmid DNA-fragmentet isolert fra en 0,7% agarosegel ved bruk av Geneclean (Bio 101, California) ifølge produsentenes instruksjoner. Det 1425 kb fragmentet som inneholdt tetracyklinresistensgenet ble så fjernet. ;Oligonukleotidene (SEQ ID 13 og 14) ble fosforylert ved bruk av T4 polynukleotidkinase og ekvimolare mengder bundet sammen. En prøve på de sammenbundne oligonukleotidene ble så ligert med plasmidfragmentet fra pAT153. Sammenbundet DNA ble transformert inn i E. coli HB101 (BRL) og ampicillin-resistente kloner valgt ut. ;Flere kolonier ble plukket fra liten skala-plasmid DNA-fremstilling (metoden til Birnboim og Doly slik som spesifisert i Maniatis, kapittel 1, p. 25), og den ønskete konstruksjonen ble identifisert ved restriksjonsanalyse med passende enzymer, f.eks. EcoRI, Aval og BamHI. Strukturer!til 3 isolater som ble identifisert ved å ha det riktige restriksjonsmønster ble bekreftet ved DNA sekvensanalyse ved bruk av en pBR322 EcoRI-sete "clockwise" (New England Biolabs). Ett isolat ble benevnt plCI0019. ;RP4 plasmid DNA ble isolert fra lager ved fremgangsmåten til Holmes og Quigley (Maniatis, kapittel 1, p. 29). Dette DNA ble kuttet fullstendig med Bglll og så delvis med Xmal (ved 25°C i opptil 35 minutter) ved å ta prøver på forskjellige tidspunkter til et 2,45 Kbp-fragment som inneholder tetR og tetA kunne klart identifiseres. En prøve på pUC8 DNA (Amersham International) ble fordøyet fullstendig med BamHI og Xmal. Sammenbindinger ble utført for å sette inn tetracyklinresistensgenene inn i pUC8. Ligert DNA ble transformert inn i E. coli C600 (Appleyard, R.K., Genetic, 39, p. 440, 1954) gjort kompetente ved CaCI2-metoden (Maniatis, kapittel 1, p. 82) og tetracyklinresistente kloner valgt ut. Plasmid DNA ble laget fra 8 kloner (Holmes og Quigley) og tilstedeværelsen av RP4 tetR og A-gener bekreftet ved restriksjonsanalyse. Ett av disse isolatene ble betegnet pTB344. ;Tetracyklinresistensgenene ble så satt inn i plCI0019 (beskrevet ovenfor) ved å erstatte et EcoRI/Pstl-fragment fra plCI0019 med det tilsvarende fragmentet fra pTB344. Dette resulterer i erstatning av hoveddelen av ampicillinresistensgenet i plCI0019 med tetracyklinresistensgenene. Etter spaltning og ligering av plasmid DNA, etterfulgt av transformasjon i E. coli C600, ble kolonier valgt ut på basis av fenotype, dvs. Tc^ og Ap^. Plasmid DNA ble laget fra fire slike kloner og spaltet med en kombinasjon av enzymer, f.eks. BamHI/Pstl/Sstl, EcoRI/Sall, Smal, Styl/Sall og Aval/Pstl. Alle fire kloner laget restriksjonsmønstre som er forenlig med den ønskete konstruksjonen. Én av disse ble betegnet pTB351. ;Summers og Sherratt (Cell 36, p. 1097-1103, 1984) har vist at ustabiliteten til plasmider som stammer fra ColEI (f.eks. pAT153) skyldes tap av en 283bp sekvens, cer, tilstede i utgangsplasmidet. Denne sekvensen hjelper å hindre dannelsen av plasmidoligomerer, det siste synes å ødelegge plasmidfordeling på en hittil ikke definert måte. cer-sekvensen (D. Summers et al., Mol. and Gen. Genetics 201, p. 334-338, 1985; og Cell, 36, 1097-1103, 1984) ble isolert fra et fragment klonet inn i pUC18 (pKS492). pKS492 plasmid DNA ble spaltet med BamHI og Taql for å ;frigjøre et 289 bp cer-inneholdende fragment. Plasmid pTB351 DNA (isolert fra Dam "-verten E. co//'GM48 - J.A. Arraj og M.G. Marinus, J. Bact. 153 p. 562-565, 1983) ble spaltet fullstendig med BamHI og Clal og bundet sammen med spaltet pKS492 DNA. Etter transformasjon av ligert DNA inn i kompetent E. coli C600, ble tetracyklinresistente kolonier valgt ut. Restriksjonsanalyse av plasmid DNA fra mulige kloner med enzymene Aval, Mlul og Pvul ble benyttet for å bekrefte nærværet av cer. Ett isolat med den riktige strukturen ble betegnet plCI0042. ;Konstruksjonen av disse plasmidene er beskrevet i fig. 2 og 3. ;5c) plCI1079 ;Plasmidvektor plCI1079 er et ampicillinresistent, pAT153-avledet plasmid som inneholder de følgende elementene mellom EcoRI og Styl-restriksjonssetene: ;(i) et CI857-gen fra fag x, ;(ii) en >P|_-promotor, ;(iii) et syntetisk ribosombindingssete, ;(iv) en syntetisk interferon-a2-gensekvens, ;(v) en syntetisk transkripsjons terminatorsekvens, som stammer fra fag T4, mellom Sali og Styl restriksjonssetene. DNA-sekvensen til denne transkripsjonsterminatoren er vist i fig. 13. ;plCI1079 er illustrert i fig. 14. ;plCI1079 ble deponert under Budapest Treaty 19. februar 1991 ved NCIMB, 23 St. Machaer Drive, Aberdeen, Skotland, og har fått NCIMB registreringsnummer 40370. ;Plasmid plCI1079 ble benyttet som kilde for T4-transkripsjonsterminatoren for å lage den ricin A-produserende klon pICM 185 (se 7d under). Startpunktet for å lage plasmid plCI1079 var plCI1043. plCI1043 er et plasmid basert på plCI0020 (se 3a ovenfor) hvor en ekspresjonskassett som inneholder en x.P|_-promotor og interferona2-gen (Edge et al., Nuc. Acids Res. 11, p. 6419-6435, 1983) er tilstede mellom EcoRI og Sall-setene. ;Et komplementært par oligonukleotider ble syntetisert for å lage transkripsjonsterminatoren fra gen 32 i bakteriofag T4 med 5' Sali- og 3' Sphl-klebrige ender. Dette fragment ble ligert med et plasmidfragment isolert fra plCI1043 som hadde blitt fordøyet fullstendig med Sali og Sphl. Mellomstadieplasmidet som så ble laget (plCI1078) inneholdt både T4-terminatoren og trp-"attenuator"-sekvensene i tandem. ;Et annet par komplementære oligonukleotider ble så benyttet for å erstatte trp-"attenuator"sekvensen (og gjenværende del av tetracyklin resistensgenet) ved innsetting mellom Sphl og Styl-setene i plCI1078. Et enkeltstående BamHI-sete ble satt inn i dette syntetiske fragment. ;Disse forandringene er beskrevet i fig. 4. ;6. Fremstilling av en ricin A-produserende klon ;6a) Fremstilling av pUC8RA plasmid DNA ;En klon (pUC8RA) ble dannet som inneholdt cDNA for ricin A. Denne klonen innéholder A-kjede cDNA fra base nummer -74 i ledersekvensen til BamHI-setet innenfor B-kjeden (basenummer 857) ifølge den publiserte cDNA-sekvensen (I.F. Lamb, LM. Roberts, J.M. Lord, Eur. J. Biochem., 1985, 148, p. 265-270) i plasmid pUC8 (J. Vieira og J. Messing, Gene, 19, p. 259, 1982). I tillegg er seterettet mutagenése benyttet for å lage translasjons-termineringskodon like 3' til det siste kodonet av intakt ricin A (som rapportert i M. 0'Hare et al., FEBS Letts. 1987, 216, p. 73-78). Hele den A-kjedekondende region blir inkludert i et BamHI-fragment fra denne klon. ;En liten del av pUC8RA plasmid DNA ble oppnådd som beskrevet ovenfor. For videre lager ble en fortynning av dette DNA transformert inn i E. coli DH5akompetente celler (D. Hanahan, 1983, J. Mol. Biol., 166, p. 557) (Bethesda Research Laboratories) og en ampicillinresistent transformant valgt ut. Plasmid DNA fra denne klon ble laget ved en modifisert Birnboim-Doly-fremgangsmåte (Maniatis, kapittel 1, p. 25). Prøver på dette DNA ble spaltet med BamHI og Banl hver for seg og sammenliknet med tilsvarende spaltinger av det opprinnelige DNA beskrevet av Lord et al. etter elektroforese på agarosegel. Ingen forskjeller i restriksjonsmønsteret ble observert, og, på denne basis, ble de to DNA-prøvene antatt å være identiske. ;6b) Sub-kloning i M13 ;BamHI-spaltning av pUC8RA plasmid DNA og RF (replikativ form) DNA fra fag M13 stamme K19 (Anglian Biotechnology) ble "revolvermessig" bundet sammen ved bruk av standard betingelser (Maniatis, kapittel 1, p. 68). ;Kontrollsammenkoblinger ble også utført. De ligerte DNA ble transformert inn i ;E. co//-stamme TG1 (Gibson, 1984/Anglian) gjort kompetente ved CaCI2-fremgangsmåten (Maniatis, kapittel 1, p. 82). ;Transformasjonsfrekvensene viste effektiv ligering og rekombinant fag ble ventet blant etterkommerne. Rekombinant fag ble antatt å produsere klare plakk pa IPTG + X-gal (BRL) inneholdende skåler på grunn av ødeleggelse av lacZ (B-galaktosidase) genet. Villtype fag laget blå plakk på grunn av hydrolyse av X-gal ved hjelp av B-galaktosidase. ;Flere klare plakk ble plukket ut for enkeltkjede DNA-fremstilling. Direkte gelelektroforese av lyserte fagsuspensjoner indikerte at én fagklon inneholdt et stort innskudd som ble bekreftet ved sekvensering å være ricin A-kjedekodende sekvens. Bare 182 baser av den modne ricin A-kodende sekvensen ble bekreftet, men dette ble tatt som tilstrekkelig bevis for nærværet av hele ricin A-genet. Denne klon ble betegnet M13K19RA. ;6c) Mutagenese av M13K19RA ;For å skape et Kpnl-sete som var forenlig med pICI-ekspresjonsvektorene i starten av intakt ricin A, er de følgende forandringene (understreket) nødvendige: ; Endret til: ; og resulterer i et ATG-kodon som overlapper et Kpnl-sete. Et Kpnl-fragment som inneholder ricin A kan bli spaltet ut fra mutanten og satt inn i ICI-ekspresjonsvektor-seriene. To N-terminale aminosyreendringer ble gjort (ile-phe til met-val). ;Det enkeltkjedete DNA laget fra M13K19RA var templatet for mutageniseringstrinnet for hver mutasjonsstrategi. Et enkelt oligonukleotid, DTR16 som innførte alle mutasjonsforandringene i henhold til denne strategi ble syntetisert. ; Flere protokoller eksisterer for innføring av spesifikke DNA -sekvens-forandringer ved basespesifikkrettet mutagenese. Fremgangsmåtene beskrevet nedenfor ble oppnådd ved bruk av fremgangsmåten til Eckstein et al. (Nuc. Acid Res., 1985, 13, p. 8749-8764 og 1986, 14, p. 9679-9698) slik som gitt i analysesett-form (Amersham International) og benyttet ifølge produsentenes instruksjoner. ;Prinsippet ifølge denne fremgangsmåten er å starte det enkeltkjedete DNA-templatet med det mutageniserte oligonukleotid og syntetisere den komplementære kjeden og bygge inn dATPaS istedet for dATP. Bruk av dette nukleotidet resulterer i dannelsen av fosforotioatbindinger som ikke blir spaltet av visse restriksjons-enzymer (f.eks. Neil). Etter syntese av den andre kjeden blir Neil benyttet for å kutte utgangskjeden og eksonuklease III blir tilsatt løsningen for å fjerne sekvensen etter mutasjonspunktet. DNA polymerase I blir så tilsatt for å resyntetisere utgangskjeden. Derfor virker det mutageniserende oligonukleotid som en templat for resyntese, og mutasjonen blir innført i begge kjedene før transformasjon. Mutasjonsfrekvenser opptil 96% av den totale neste generasjon er krevet og undersøkelse utføres ved å plukke plakk vilkårlig for sekvensanalyse. ;I våre eksperimenter ble fire av fire utvalgte plakk korrekt mutert. ;Etter å ha valgt én mutant (MRA16), ble RF DNA laget og undersøkt for tilstedeværelsen av nydannet restriksjonsfragment, dvs. Kpnl. ;6d) Kloning, ekspresjon og første karakterisering ;pICI-seriene av ekspresjonsvektorer (se seksjon 3) kan motta DNA-fragmenter klonet i et enkelt Kpnl-restriksjonssete ved siden av Trp-promotoren. Kpnl-setet overlapper med translasjon startkodon (ATG) som er plassert 8 basepar nedstrøms fra Shine-Dalgarno-setet (AGGA) til promotoren. ;Etter å ha bekreftet sekvensen til MRA16, ble en storskala (5^g RF DNA) Kpnl-spaltning utført, og det relevante ricin A-kodende DNA-fragment ble isolert fra en agarosegel (Nu-Sieve GTG agarose, FMC Bio-products) ved fenolekstraksjon av en utskåret gelbit ifølge produsentenes protokoll. ;plCI0020 (se 3a) ble spaltet med Kpnl og så defosforylert ved bruk av alkalisk fosfatase fra kalvetarm (CIP - Boehringer Mannheim). Den sistnevnte behandling hindrer resirkulering av vektor ved ligering som kunne føre til en høy del av utgangsmaterialet i transformasjonsgenerasjonen. ;Ligeringer ble satt opp med forhold mellom plasmidvektor til isolert fragment fra 8:1 (vekt/vekt) til 3:1 for de forskjellige strategiene. Kontroll-ligeringer for å teste effektiviteten til fosfatasebehandling, ligaseaktivitet osv. ble inkludert. Ligeringsbetingelsene var passende for kilden av T4 DNA-ligase benyttet (New England Biolabs eller Amersham). Reaksjoner ble vanligvis inkubert ved 15°C over natt. ;50% av hver ligering (5^g) reaksjon ble fortynnet til 100jj med 1 x TNE (50 mM Tris, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA) og 200 Ml kompetente E. coli DS410 tilsatt. Etter en standard transformasjonsprotokoll (Maniatis, kapittel 1, p. 74) ble cellene sådd ut i L-agar pluss streptomycin (25jig/ml) og ampicillin (100j^g/ml) og inkubert ved 37°C over natt. ;Transformasjonsskålene ble undersøkt etter inkubasjon. Vanligvis ble 5-10 ganger flere kolonier sett i ligeringene sammenliknet med kontroller uten ligase. I noen tilfeller fantes liten forskjell i tallet på kolonier laget i nærvær eller fravær av ligase, hvilket antydet ufullstendig spaltning av vektoren eller dårlig ligaseaktivitet. Transformanter pluss de relevante kontrollene ble plukket på nitrocellulose- filtere plassert på L-agarskåler for hybridiseringsundersøkelse (basert på fremgangsmåten til Grunstein og Hogness som beskrevet i Maniatis, kapittel 1, p. 98). Etter inkubering ble koloniene lysert in situ ved bruk av 10% SDS og 1M NaOH, nøytralisert ved bruk av 1M Tris (pH 7,5) og tørket under vakuum ved 80°C i 2 timer. ;Hybridiseringsprobene ble dannet ved P-merking av muterende oligonukleotider ved bruk av T4 polynukleotidkinase. Filtrene ble undersøkt ved romtemperatur og så vasket i trinn opptil 55-65°C for å fjerne ikke-spesifikt bundet radioaktivitet før autoradiografi. Spesifikk hybridisering viste sannsynlige kloner som inneholdt ricin A DNA. ;Liten skala DNA-fremstilling (ved fremgangsmåtene til Holmes og Quigley eller Birnboim-Doly som spesifisert i Maniatis, kapittel 1, p. 25) ble utført fra positive hybridiserende kloner. DNA ble spaltet med de relevante restriksjonsenzymene f.eks. Kpnl og EcoRI/Bglll, og analysert ved hjelp av elektroforese på agarosegeler. Vektor-DNA og mutert RF DNA ble spaltet med de samme enzymene for å demonstrere fragmentstørrelsene som var forventet for de korrekte klonene. ;Større skala plasmid DNA-fremstillinger (Birnboim-Doly) for hver klon ble benyttet for mer detaljert restriksjonsanalyse, f.eks. Gal, Hindlll, BamHI, EcoRI/Bglll, Kpnl og Seal. På agarosegeler viste disse spaltingene størrelsen på fragmentinnskuddet, en indikasjon på deres orientering og opprettelsen av restriksjonsenzymsetet som var enkeltstående for ricin A kjedegenet. ;6e) Ekspresjonsstudier ;Klonene som ble positivt identifisert ved hybridisering og restriksjonsundersøkelse ble testet for produksjon av ricin A ved hjelp av SDS-PAGE-analyse av totale cellelysater. Standardbetingelsene for ekspresjonsstudier var: 1) Bland 10 ml L-medium + antibiotika med en enkel koloni og dyrk ved 37°C over natt under forsiktig omristing. 2) Ta 750 L-medium og sentrifuger cellene i en mikrofuge (1 min. ved 6500 rpm). 3) Resuspender pellet i 300 ul M9-medium (Maniatis, appendiks A.3) + 0,02% kaseinhydrolysat + 0,2% glukose + 50^g/ml tiamin og inokuler inn i 10 ml av samme. ;4) Inkuber i 7 timer eller over natt ved 37°C med forsiktig omristing. ;5) Etter inkubasjon mål OD^^q, sentrifuger cellene og resuspender et volum av Laemmli prøvebuffer lik den som ville gi en ODg4Qpå 10 hvis det ble suspendert i vann (Maniatis, kapittel 8, p. 53). Kok i 15 minutter. 6) Sett 20^l av totalt cellelysat på en SDS polyakrylamidgel, utført elektroforese, farg med Coomassie-blått, avfarg og fremkall. ;Av klonene studert ved hjelp av SDS-PAGE, viste bare 1 et ytterligere bånd med en passende lik molekylvekt på omtrent 29 KD (lik den som var antatt for ikke-glykosylert, moden ricin A). Gelundersøkelser antydet at produksjonsnivået var i området av 5-10% av total celleprotein. Plasmidet i denne klonen ble benevnt plCI1102. ;Konstruksjon av pICM 102 er beskrevet i fig. 5. Resultatene av ekspresjonsstudiene er vist i fig. 6 og 7. ;6f) Western-overføring og immunpåvisning av rekombinant ;ricin A ;Autentisk rekombinant ricin A kjedeprotein, først observert ved hjelp av Coomassie blåfarging av SDS-polyakrylamidgeler, ble bekreftet ved Western-blotting. Proteinbåndene ble overført til nitrocellulosefiltre og undersøkt ved bruk av ricin A spesifikt antistoff fulgt av peroksydasemerkete antiglobuliner. ;15% SDS-PAGE-geler ble kjørt over natt ved 8 mA, så ekvilibrert i minst 30 minutter i overføringsbuffer. ;Proteinbåndene på gelene ble så overført til nitrocellulosemembraner (Hybond-C, Amersham) elektroforetisk i et Bio-Rad Trans Blot-apparat ved 70V i 3 ;timer. Filterne kunne lagres, etter tørking, i lukkete plastikkposer ved -20°C. ;Ricin A.1 var et polyklonalt antistoff laget i kaniner mot et syntetisk peptidfragment av ricin A. Preliminære studier viste god affinitet for ricin A, men betydelig kryssreaktivitet med mange E. co//-proteiner. For å overkomme den høye bakgrunnen forårsaket av denne kryssreaksjonen ble antistoffet preinkubert med E. co//-lysat. ;Således ble en 10 ml L-medium over nattskultur av E. coli-stamme DS410 sentrifugert ved 4000 rpm i 10 min for å sentrifugere cellene. Bunnfallet ble resuspendert i 5 ml bakteriebuffer og sonikert ved 4-6^i 6-10 sekunders omganger med 30 sekunder avkjølingsintervaller på is. ;0,5 ml sonikat ble så blandet med 0,5 ml ricin A.1 antiserum og inkubert ved romtemperatur i 90 minutter. Cellerester ble sentrifugert ned ved 13000 rpm i 5 min, og supernatanten ble lagret ved -20°C. ;Nitrocellulosefiltrene fra Western-overføringene ble blokkert ved over natts inkubasjon ved romtemperatur i 5% BSA-PBS/Tween (PBS Tween = 5 ml Tween 20 pr. 1 liter PBS). ;Vasking i 3 x 3 min i PBS/Tween. ;Inkubert i 2 timer (eller over natt) ved romtemperatur med en 1/4000 fortynning av "blokkert" ricin A.1 antistoff i 0,5% BSA-PBS/Tween. ;Vasking i 3 x 3 min i PBS/Tween. ;Inkubert 1 time med 1/1000 fortynning av geit anti-kanin antiserum i 0,5% BSA-PBS/Tween ved romtemperatur. ;Vasket i 3 x 3 min i PBS/Tween. ;Inkubert 1 time med en 1/500 fortynning av kaninperoksydase anti-peroksydase antiserum i 0,5% BSA/PBS/Tween ved romtemperatur. ;Vasket i 3 x 3 min i PBS/Tween. ;Utviklet ved immersjon i en løsning av 4-klornaftol (60 mg) i 20 ml metanol laget til 120 ml med PBS og som inneholder 12jj hydrogen peroksyd. Membranen ble fjernet fra løsningen så snart båndene var synlige, tørket og fotografert. ;En typisk Western blot-analyse er vist i fig. 8. ;6g) Biologisk metode for rekombinant ricin A-protein ;Målet var å etablere et eksperimentelt system for å teste r-ricin A for biologisk aktivitet i en cellefri in vitro proteinsynteseundersøkelse. ;Kanin retikulocytt-lysater ble laget ifølge fremgangsmåten til Allen og Schweet (J. Biol. Chem. (1962), 237, 760-767). Undersøkelsen viser hemming av proteinsyntese i et cellefritt system ved en mangel på inkorporering av ^<4>C-merket leucin i nylig syntetisert protein. ;6.g.i) Undersøkelsesprotokoll ;Stamløsning: 1 mM aminosyreblanding minus leucin. ;En løsning inneholder alle L-aminosyrene ved 1 mM bortsett fra leucin (justert til pH 7,4 med NaOH og lagret ved -70°C). ;Løsning A: 40 mM magnesiumacetat; 2M ammoniumacetat; 0.2M Tris (pH 7,4 med HCI, lagret 4°C). ;Løsning B: ATP (Sigma A5394) 246 mg/ml; GTP (Sigma G8752) 24,4 mg/ml. ;Undersøkelsesblanding: 1 ml aminosyreblanding; 1 ml løsning A, 0,1 ml løsning B; ;103 mg kreativfosfat; 1 mg kreatinkinase; 510jj vann, 600u.1 (60^(20 L-<14>C-leucin (New England Nuclear, NEC-279E). ;Reaksjonsblanding: Testprøve 25 |J; undersøkelsesblanding 12,5^l; kaninreticulocyttlysat 25^l. ;Kontroll-løsning var 2 mg/ml BSA i PBS. ;Alle undersøkelser ble gjort i duplikat. ;12,5(il av undersøkelsesblandingen ble plassert i sterile glassrør, ;25jj BSA i PBS tilsatt hver av de første fire rørene for kontroller, ;25|J prøverør tilsatt resten av rørene, ;1 ml 0,1 M KOH tilsatt de første to rørene (bakgrunnskontroll), ;Rørene ekvilibrert ved 28°C i vannbad, ;25 jj kanin retikulocytt-lysat (tillatt å tine fra flytende nitrogentemperatur) ble tilsatt hvert rør med 20 sekunders intervaller. Når det første røret var blitt inkubert i 12 minutter, ble 1 ml 0,1 M KOH tilsatt til hvert rør igjen med 20 sekunders intervaller for å tillate alle rørene å ha 12 minutters inkubasjon. To dråper av 20% hydrogenperoksyd ble tilsatt til hver rør etterfulgt av 1 ml 20% TCA. ;Rørene ble blandet og tillatt å stå minst 1 time eller over natt ved 4°C. Bunnfallene ble filtrert på 2,5 cm GFC-filtre, vasket med 3 x 4 ml 5% TCA, overført til scintillasjonsrør og 10 ml scintilleringsvæske (Ready-Solv. MP, Beckman) tilsatt. Etter 1 time ble rørene ristet og talt. ;6.g.ii) Etablering av fremgangsmåte for bruk med E. co/;-lysater ;10 ml L-medium kultur ble dyrket over natt ved 37°C. 400(J's prøver ble sentrifugert ved 13000 rpm i 30 sekunder og mesteparten av supernatanten heilt av. ;Bunnfallene ble behandlet med 2 runder hurtig frysing i tørris/EtOH etterfulgt av tining til 37°C. 12^l av 25% sukrose i 50 mM Tris HCI pH 8,0 ble tilsatt etterfulgt av 4 ^ av en 10 mg/ml løsning lysozym. ;Etter inkubering på is i 15 minutter ble 8|J av 0.25M EDTA tilsatt og inkubasjon fortsatt i 15 minutter. Lysis ble utført ved hjelp av osmose ved å fortynne prøvene til 400|J med vann. Denne fremgangsmåte laget levedyktige celler på 80-100 pr. ml. ;Når en 25jj prøve av dette lysatet ble tilsatt undersøkelses reaksjonsblandingen, var nivået av innmerkning av ^<4>C-leucin i nysyntetisert protein omtrent 10% av kontrollen uten lysat. Dette var et liknende hemningsnivå til det som ble registrert ved 8 ng/ml ricin A. Fortynninger av E. co//-lysatet ble så laget og undersøkelsen gjentatt. Resultatet viste klart at et minimum av 16-ganger fortynning var nødvendig for å redusere effekten av lysatet til å bli lik kontrollen. ;For å være så sikker som mulig at lysis av E. coli og E. co//-lysater ikke ville ødelegge ricin A-toksisiteten, ble to kontrollundersøkelser foretatt. Den første tilsatte plante-avledet ricin A til en 16X fortynning av E. coli cellebunnfall til å gi en endelig konsentrasjon på 8 ng/ml i prøveblandingen etter cellelyse. Begge disse kontrollene viste ingen skadelig effekt fra lysatene eller lysisfremgangsmåten på den hemmende virkningen til ricin A. ;Disse fremgangsmåtene ble benyttet for å bekrefte syntesen av biologisk aktiv, rekombinant ricin A fra pICM 102 og klonene beskrevet nedenfor. ;6.h) DNA sekvensanalyse ;Plasmid DNA sekvensering ble benyttet for å analysere plCI1102. Protokollen som ble valgt ble modifisert etter Zagursky et al. (Gene Analysis Techniques Vol 2, nr. 5) og omfatter alkalisk denaturering av dobbeltkjedet plasmid DNA før primerbinding og sekvensering ved hjelp av standard fremgangsmåte slik den er gitt i kitform av flere produsenter, f.eks. Sequenase (United States Bioscience). Ved bruk av et oligonukleotid til å starte ved 5-enden av G-laktamase og flere A-kjede indre primere, var det mulig å sekvensere begge kjedene til promotoren og ricin A-genet. ;De første sekvensresultatene viste et uventet resultat ved at et ytterligere Kpnl-fragment var tilstede mellom promotoren og ricin A kodende sekvens, dvs. ;(SEQ ID Nr. 20): ; ; Det ekstra Kpnl-fragmentet er kommet fra M13K19RA og inneholder restriksjonsenzymseter pluss den delen av ricin ledersekvensen som er klonet fra pUC8RA. 5-regionen til ricin A-kjeden inneholder baseforandringene laget under ;mutagenese. ;Studie av denne sekvens viste at det første translasjons startkodon (ATG) er ute av leseramme med den ricin A-kodende sekvensen. Det er også et "i-ramme" stoppkodon (TAG) før ricin A startkodonet og en sannsynlig Shine-Dalgarno-sekvens (AGGA) som igjen kunne starte translasjon fra det andre ATG. ;Videre studier viste at dette DNA-fragmentet overførte overraskende en nyttig fordel med hensyn til produksjonsnivået av ricin A-kjede i E. coli sammenliknet med kloner der det hadde blitt fjernet. ;Den komplette DNA-sekvensen til ricin A-genet inneholdt i pICM 102 er gitt i fig. 9 (SEQ ID nr. 18). ;7. Konstruksjon av etterfølgende ricin A-produserende kloner ;7.a) Mutasjon av ricin A-klon plCI1102 for subkloning ;For å subklone de to Kpnl-fragmentene fra den tilfeldig lagde pICH 120 i riktig orientering for ricin A-produksjon ville være vanskelig. Derfor planla vi å endre det interne Kpnl gjenkjennelsessetet ved en enkel basesubstitusjon (A til T). Dette ville hindre Kpnl-spaltning på dette setet og tillate subkloning av et enkelt Kpnl-fragment i en rekke pICI ekspresjonsvektorer. Ved å erstatte adeninet i Kpnl gjenkjennelsessetet (GGTACC) med thymin (dvs. GGTTCC) blir den første resten i ricin A uforandret (GTA/GTT = Val), ;dvs.: ; ; Endret til: ; Oligonukleotidet syntetisert for å lage denne forandring har sekvensen (SEQ ID nr. 19): ; Hvor den understrekte base representerer mutasjonsendringen. ;Vi planla å klone det muterte ricin A-fragmentet i en rekke trp- ekspresjonsvektorer for sammenliknende ekspresjonsstudier. Kloning i plCI0020 gir en sammenlikning med pICH 102 for å bestemme effektene på ekspresjon, hvis de er tilstede av en enkel basesubstitusjon. ;7.b) Mutagenese ;Templatet for mutagenese var MRA16 som er M13-klonen som inneholder de to Kpnl-fragmentene tilstede i pICH 102. Etter mutagenese ble isolater som hadde de ønskete mutasjoner identifisert ved tilfeldig prøvetaking og DNA-sekvensen bestemt over regionen der det mutageniserende oligonukleotidet binder spesifikt. ;Én mutert templat ble betegnet MRA22. Dette ble analysert videre ved DNA sekvensbestemmelse av den hele ricin A-kodende sekvens for å bekrefte fraværet av ikke-spesifikke mutasjoner. ;7,c) Subkloning ;De muterte, enkeltkjedete DNA ble transformert i kompetente E. coli TG1-celler for å gi enkeltplakk. Individuelle plakk ble så plukket og replikativ form (RF, dobbelt-kjedet) DNA renset ved isolering på cesiumklorid/etidiumbromid tetthetsgradienter. Det rensete RF DNA ble spaltet fullstendig med Kpnl. Kloning ble utført ved "revolver"- ligering av det fordøyde RF DNA med det passende Kpnl-kutt og fosfatasebehandlet ekspresjonsvektor eller ved spesifikk ligering av ricin A-fragmentet etter rensing fra agarosegel. Ligert DNA ble transformert inn i E. coli TG1 eller HB101. ;Ricin A-inneholdende kloner ble identifisert ved hybridiseringsundersøkelse ved bruk av "^P-merket ricin A-probe laget ved tilfeldig heksanukleotidpriming av et Kpnl-fragment isolert fra en annen ricin A-inneholdende klon (pICH 121). Kolonier som viste positiv hybridisering ble undersøkt videre ved restriksjonsanalyse av plasmid DNA ved bruk av et Kpnl enkeltspaltning og en EcoRI/Bglll dobbelt-spaltning. Kpnl identifiserer størrelsen på det innsatte fragmentet og EcoRI/Bglll bestemmer orienteringen av fragmentet. ;Klonene som ble bekreftet å ha ricin A-fragmentet i riktig orientering for ekspresjon ble analysert ved SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie-farging og Western-blotting på duplikatgeler. Nivået av ricin A-produksjon i disse kloner var lik det som var påvist fra pICH 102. ;. Ett isolat ble valgt og plasmidet betegnet pICM 131. ;7 d) Bruk av et alternativt transkripsjons terminatorelement ;Et transkripsjons-terminatorelement lager en sekundærstruktur ved 3-enden av mRNA som er innblandet i å stoppe RNA polymeraseaktiviteten. Stabiliteten til déhne sekundærstrukturen kan bedre produksjon av proteinet ved å beskytte mRNA fra eksonukleaseangrep ved 3'-enden. T^-transkripsjonsterminatoren ble ansett som å ha en sterkere sekundærstruktur enn den til trp-"attenuatoren" tilstede i alle tidligere ricin A-konstruksjoner. ;I disse eksperimentene ble trp-promotoren og ricin A-fragmentet fra pICH 131 spaltet ved behandling med enzymene EcoRI og Sali. Det sistnevnte enzymet spalter mellom 3-enden til den ricin A-kodende sekvens og trpA transkripsjonsterminatoren. Det resulterende fragmentet ble spaltet ut fra en agarosegel (2% NuSieve GTG Agarose, FMC Bioproducts) og renset ved fenol og kloroformekstraksjoner etterfulgt av etanolbunnfelling. Det rensete fragmentet ble bundet sammen med plCI1079 og spaltet med EcoRI og Sali. Dette siste plasmidet inneholder T4-terminatoren mellom de enkeltstående Sali- og Sphl-setene (se 5.c). ;Sammenbundet DNA ble transformert i kompetent E. coli HB101 (BRL) og hybridiseringsundersøkt for å påvise tilstedeværelsen av ricin A DNA som i tidligere eksperimenter. Positive hybridiserende kloner ble valgt for plasmid DNA-fremstilling etterfulgt av restriksjonsanalyse med EcoRI og Sal I sammen for å vise tilstedeværelsen av et passende stort fragment. ;Ett isolat med riktig konstruksjon ble identifisert og betegnet pICH 185. ;7.e) Bruken av alternativ plasmidbakgrunn ;Plasmid pICM 185 ble benyttet for å lage en videre konstruksjon ved å subklone ekspresjonskassetten inn i plCI0042. Plasmid DNA ble laget fra plCI1185 og spaltet med EcoRI og Sphl sammen for å fjerne en ekspresjonskassett som inneholdt trp-promotoren/RBS/ricin-A (MRA22) fragment/T4-terminatoren. Dette fragment ble isolert ved fremgangsmåten beskrevet i 4.d og bundet sammen med plCI0042 spaltet med EcoRI og Sphl. ;Sammenbundet DNA ble transformert inn i E. coli HB101 og inkubert ved 37°C over natt. HB101-transformasjoner ble sådd ut på L-agar + tetracyklin og kolonier undersøkt ved hybridisering med en ^<2>P-merket ricin-A DNA-probe. ;I begge tilfellene ble positivt identifiserte kolonier bekreftet ved restriksjonsanalyse av plasmid DNA ved bruk av EcoRI/Sphl og EcoRI/Bglll-spaltinger. Tre isolater ble identifisert, dvs. pICM 187.1-3. ;Fig. 10 beskriver konstruksjonen av pICM 185 og pICH 187. ;7.f) Seleksjon av klon ;Plasmidene som ble isolert ble transformert inn i E. coli 71.18 (B. Gronenborn, 1976, Mol. Gen. Genet. 148, 243-250) og enkelte kolonier valgt for klonseleksjonsstudier. De resulterende helcellelysatene ble undersøkt ved elektroforese på duplikat SDS-PAGE-geler, én av disse ble farget med Coomassie-blå og den andre benyttet for Western blot-analyse. ;Den fargete gelen viste minimumsdata på ricin A-produksjon på grunn av nærværet av en samtidig vandrende protein fra E. coli 71.18. Western-blotting viste klart ricin A-produksjon i sammenlikning med positive og negative kontrollprøver. Et isolat ble gitt i fermenterings forskningsgruppen for oppskalert produksjon. ;r-ricin A-fermentering ;(a) Plasmid pICH 187 ble transformert inn i E. co//-stamme DS410 (også referert til her som MSD68) og den resulterende rekombinant (MSD1051) renset og bevart på glycerolstamløsninger ved -80°C. En prøve av kulturen ble fjernet fra stamløsningen og sådd ut på agarplater med L-tetracyklin for å atskille enkle kolonier etter over natts kultur ved 37°C. En enkelt koloni av MSD1051 ble fjernet og resuspendert i 10 ml L-tetracyklinmedium, og 100jil ble øyeblikkelig inokulert i hver av 10 250 ml Erlenmeyerflasker som inneholdt 75 ml L-tetracyklinmedium. Etter vekst i 16 timer ved 37°C på en ristemaskin ble innholdet på flaskene slått sammen og benyttet for å inokulere en fermentor som inneholdt 20 I av et modifisert LCM50 vekstmedium som har den følgende komposisjonen: ; Fermenteringer ble så utført ved en temperatur på 37°C og pH, kontrollert og automatisk tilsetning av 6M natriumhydroksydløsning, pH 6,7. Den oppløste oksygentensjonen (dOT) setpunkt var 50% luftmetning og ble kontrollert ved automatisk justering av fermentor rørehastighet. Luftstrøm til fermentoren, først 20 l/min, svarte til 1 volum pr. volum pr. minutt (WM) og ble øket til 45 l/min når fermentorrørehastigheten nærmet seg 80-90% av maksimum. ;Gjennom fermenteringen ble prøver tatt for måling av optisk tetthet (ODggg), ;celletørrvekt og produksjon av ricin A i cellene. Ricin A-produksjon ble målt ved å undersøke Coomassie-blåfargete SDS-PAGE-geler av helcellelysat fra bakterieprøver som er vel kjente i feltet. ;4,5 timer etter inokulering ble gjærekstrakt (Difco) oppløsning (225 g/l) pumpet inn i fermentorene med en hastighet på 1,7 g/l/time. ;Etter 12 timer når OD55Qnådde omtrent 50, og før fermenteringen ble oksygenbegrensende, ble bakterier høstet på en Sorval RC3B-sentrifuge (7000 g, 30 min, 4°C) og oppsamlet protein isolert fra bakteriene. (b) Plasmid pICH 187 ble transformert i E. co//-stamme DS410 (også referert til som MSD68 her) og den resulterende rekombinant (MSD1051) renset og oppbevart på glyserol stamløsninger ved -80°C. ;En prøve (100ul) av kulturen ble fjernet og øyeblikkelig sådd ut i en 2 liter Erlenmeyerflaske som inneholdt 600 ml L-tetracyklinmedium. Etter vekst i 16 timer ved 37°C på en ristemaskin, ble innholdet av flasken benyttet for å inokulere en fermenter som inneholdt et vekstmedium med den følgende sammensetning: ; Fermenteringen ble utført ved en temperatur på 37°C. pH ble kontrollert ved automatisk tilsetning av 2M svovelsyre og 6M natriumhydroksydløsning slik at pH ble kontrollert på 6,7 opptil 10 timer etter inokulering og deretter på pH 6,0. ;Den oppløste oksygentensjon (dOT)-settpunkt var 50% luftmetning og ble først kontrollert ved hjelp av automatisk justering av fermentorens rørerhastighet. Luftstrøm til fermentoren var først 20 l/min, hvilket svarte til 1 volum volum pr. minutt (WM) og ble øket til 45 l/min manuelt når fermentor rørerhastigheten nådde sin maksimum (1000 omdreininger pr. minutt). Luftstrøm til fermentoren ble manuelt nedsatt til 20 l/min når rørerhastigheten mot de senere trinn i fermenteringen automatisk hadde blitt senket til omtrent 500 omdreininger pr. minutt. Fermenteringen ble utført i 23 timer og under den tiden ble prøver tatt for måling av optisk tetthet (OD55q), celletørrvekt, oppsamling og fordeling av ricin A inne i bakteriecellene. Ricin A-produksjon ble målt ved å undersøke Coomassie-blåfargete SDS-PAGE-geler av helcellelysater av bakterieprøver som er vel kjent i feltet. Fordeling av ricin A i cytoplasmatisk (løselig) og inklusjonslegeme (uløselige) fraksjoner i cellen ble bestemt ved å sonikere prøver av bakterier som er vel kjente i feltet. ;En løsning av gjærekstrakt (225 gl"') ble pumpet inn i fermentoren 4,5 timer etter inokulering med 1,7 gl 1 'time 1'. ;Når karbonkilden i fermentoren ble utbrukt (hvilket førte til en rask økning i dOT fra 50% luftmetning), ble føde som inneholdt glycerol (714 gl"<1>) og ammoniumsulfat (143 gl"•i') pumpet inn i fermentoren med en hastighet som var tilstrekkelig til å møte det maksimale karbonbehov til bakterien. Fødehastigheten av karbonkilden og ammoniumsulfat ble så latt være uforandret under resten av fermenteringen. ;Etter 23 timer ga fermenteringen omtrent 1500 mg løselig ricin A pr. liter fermenteringsmedium. ;NOTER: ;1. E. coli DS410 (også referert til som MSD68 her) er vel kjent (Dougan og Sherratt, Molecular and General Genetics, vol. 151, p. 151-160, 1977). Denne stammen er fritt tilgjengelig til publikum, og ble videre deponert av søkerne 7. juni 1985, under Budapest-avtalen, hos National Collections Of Industrial & Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, Skotland under deponeringsnummer 12100. ;2. Sporelementløsning (TES) ;TES har følgende sammensetning: ; ; OPPRENSING AV r-RICIN A FRA E. COLI ;Under optimale fermenteringsbetingelser produseres r-ricin A som et løselig cytosolisk protein. Proteinet ble isolert ved å ødelegge cellene (homogenisering) i en buffer som fremmer stabiliteten til r-ricin A. Dette metodetrinn ble utført på levende celler ved dyrkning for å sikre løsningsstabilitet av produktet, r-ricin A ble isolert fra homogenatet ved å fjerne faste partikler (celledebris) ved sentrifugering. For at denne fremgangsmåten skal bli oppskalert, ble debris felt ut med en forbindelse (polyetylenimin) som også utfeller mesteparten av nukleinsyren som er tilstede i ekstraktet. Sentrifugesupernatanten ble så sterilfiltrert, konsentrert ved krysstrøm-filtrering og proteinet felt ut med ammoniumsulfat. Ammoniumsulfatbunnfallet ble lagret frosset ved -70°C. ;r-ricin A har et isoelektrisk punkt på 7,3 vel over det isoelektriske punktet til mange andre E. co//-proteiner. Produktet kan derfor passende renset ved ionebytterkromatografi. Alle isolerings og kromatograferingstrinnene ble utført under betingelser som fremmer r-ricin A-stabilitet: temperatur <15°C, tilstede av ditiotreitol for å opprettholde den frie tiol i en redusert tilstand og EDTA for å hindre luftoksyde-ring og proteolyse. ;Gjenvinning av r-ricin A ;Cellene ble samlet fra fermenteringsmediet ved bruk av en kontinuerlig etasje intermitterende separator. Mediet (50 I fra 2 x 25 I fermentering) ble først overført fra fermentorene til en 50 I mellomtank og transportert til et lukket system som besto av en rekke lagringstanker forbundet med separatoren og høytrykkshomogenisator. ;Mellomtanken ble forbundet i dette system og mediet pumpet gjennom en sentrifugeseparator med en strømhastighet på 40 l/time. Fjernelseshastigheten ble justert slik at sentrifugesupernatanten var klar ved inspeksjon gjennom et glass i supernatantens oppsamlingslinje. Det faste resultat (celler) fra separatoren ble samlet i et passende kar og resuspendert i 40 I buffer A (50 mM natriumdihydrogenortofosfat; 25 mM etylendiamintetraeddiksyre; 5 mM benzamidin; 2 mM ditiotreitol; pH 6,3 med 5N natriumhydroksyd) og avkjølt til 8°C i mottakerkaret for de faste forbindelsene. De suspenderte cellene ble så overført tilbake til mellomtanken via homogenisatoren justert til et arbeidstrykk på 600 bar. Det resulterende homogenatet (60 I) ble avkjølt til <20°C og fortynnet til 0,5% med hensyn til polytenemin ved tilsetning av 2,5 I av en 10% (v/v) løsning. Suspensjonen ble tillatt å flokkulere ii 10 min før overføring til oppbevaringstanken via sentrifugeseparatoren. Den klare supernatanten ble så samlet og sterilisert ved rensing gjennom et dybdefilter og positivt ladet 0,2^membranfilter. ;Ammoniumsulfatbunnfeliing ;Den sterile klare supernatant ble konsentrert til et volum på 12 I ved bruk av spiralsylinder krysstrøm filtreringssystem og løsningen gjort 40% mettet ved tilsetning av 2,9 kg faste ammoniumsulfatkrystaller. Løsningen ble så tillatt å flokkulere ved svak omrøring over natt ved 15°C og så sentrifugert. Det dannete bunnfall ble samlet og lagret ved -70°C til videre behandling. ;Gjenløsning av avsalting ;Ammoniumsulfatbunnfallet ble tint i nærvær av 14 I buffer B (50 mM natriumdihydrogenortofosfat; 25 mM etylendiamintetraeddiksyre; 2 mM ditiotreitol; pH 6,3 med 5N natriumhydroksyd). Etter 30 minutter ble suspensjonen renset ved sentrifugering og avsaltet ved filtrering mot 70 I buffer B og ledningsevnen undesøkt med tanke på at den ble redusert til under 3 mS/cm. Den avsaltete løsningen ble renset vidére ved sentrifugeringbg behandlet umiddelbart. ;Anionbyttekromatografi ;Den avsaltete løsningen ble langsomt tilsatt en "batch" kromatografitank som inneholdt 2 kg DEAE-cellulose som hadde vært ekvilibrert med 60 I buffer B. Etter omrøring i 6,5 timer ble den ikke-bundne r-ricin A-løsningen pumpet fra bunnen av tanken gjennom en 11,3 cm diam. x 10 cm søyle med pakket og ekvilibrert DEAE-cellulose med en strømhastighet på 80 ml/min. Mesteparten av r-ricin A bandt ikke og ble samlet i en rustfri ståltank. ;Kation ionebytterkromatografi ;r-ricin-A-løsningen ble justert til pH 5,5 med 1M ortofosforsyre og påsatt en 10 ;cm diameter x 10 cm søyle karboksymetylagarose ekvilibrert med 10 I buffer C (25 mM natriumdihydrogenortofosfat; 5 mM etylendiamintetraeddiksyre; 2 mM ditiotreitol, pH 5,5 med 5N natriumhydroksyd). r-ricin A bundet til denne søylen og etter vasking med 10 I buffer C ble eluert med buffer D (25 mM natriumdihydrogenortofosfat; 5 mM etylendiamintetraeddiksyre; 2 mM ditiotreitol; 100 mM natriumklorid; pH 5,5 med 5N natriumhydroksyd). Det rene r-ricin A eluerte som en enkelt topp som ble samlet og lagret ved -70°C som en frossen steril løsning til det var behov for videre behandling, r-ricin A er stabil under disse betingelsene i opptil 1 år. ;Det følgende utstyr ble benyttet: ;Anionbytter: DE-52, DEAE Cellulose (Whatman Biochemicals) ;Kationbytter: CM/Sepharose (Pharmacia) ;Sentrifuge: Westphalia CSA-1 etasjesentrifuge (Westphalia) ;Homogenisator: APV-Schroeder Lab 60/60 homogenisator (APV) ;Filtere: AMI 0057P dybdefilter, ABI NFZP-Posidyne menbranfilter (Pall) ;Batch (prøve) tank: 70 I Pharmacia Batch kromatografitank (Pharmacia) DE-kolonne: Bioprocess 113 (Pharmacia) ;DM-kolonne: K100/50 (Pharmacia) ;BIOLOGISKE EGENSKAPER TIL C242-ANTISTOFF OG IMMUNTOKSIN ;Immunhistokjemisk undersøkelse av C242 (C242.ll) i kolorektal cancer (tykktarm-endetarmkreft) og i normale vev ;Prøver fra primær kolorektal kreft og forskjellig normalt vev ble oppnådd fra pasienter som hadde kirurgisk behandling. Vevene ble holdt på is og ble frosset mindre enn 1 time etter fjernelse i isopentan på forhånd avkjølt med flytende nitrogen. Vevene ble lagret ved -70°C til de ble behandlet. De frosne biopsier ble kuttet i 5^m seksjoner og fiksert i 50% aceton i 30 sekunder ved 4°C, etterfulgt av 100% aceton i 5 minutter ved 4°C. Vevsprøvene ble lufttørket og renset i PBS i 10 minutter. Alle vevsprøvene ble så inkubert i 0,3% hydrogenperoksyd i PBS i 5 minutter for å blokkere endogen peroksydase og renset to ganger i PBS. Deretter ble seksjonene behandlet med normalt griseserum og fortynnet 1:10 i PBS-4% BSA ;i 5 minutter ved 4°C for å blokkere ikke-spesifikk binding av antistoffer. ;Alle inkubasjoner med antistoffer ble utført i en fuktig atmosfære i 30 minutter ved romtemperatur. Vevsprøvene ble først inkubert med monoklonalt antistoff-C242 (C242:ll), fremstilt som tidligere beskrevet, i PBS-4% BSA, deretter med biotinylert hesteanti-mus IgG (Vectastain - handelsmerke, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) fortynnet 1:400 i PBS-4& BSA med 2% griseanti-kanin immunoglobulin og endelig med Avidin DH/biotinylert pepperrot peroksydase H-kompleks (Dakopatts A/S, København, Danmark). Etter hver inkubasjon ble glassene renset i PBS i 15 minutter. Snittene ble så behandlet med substrat i 15 minutter, renset i PBS, sekundærfarget med haematoksylin og montert med glycerolgelatin (Merck, Darmstadt, Tyskland). Substratet som ble benyttet var 10 mg 3-amino-9-etylkarbazol (Sigman, St. Louis, Mo., SA) løst opp i 6 ml dimetylsulfoksyd og fortynnet med 50 ml 0,02 M natriumacetat, pH 5,5, som inneholdt 4 |J 30% H202. Substratløsningen ble filtrert før bruk. Seksjonene ble så undersøkt, og resultatene er vist i tabell 1 under. ; Slik det fremgår fra tabell 1, viste 63% av de undersøkte biopsiene fra tykktarm-endetarmsvulster positiv farging med monoklonalt C242:ll. Produksjonen av antigen CA242 i normal kolonvev ble funnet å være generelt svakere enn i svulstvev, fargingen var fullstendig lokalisert til sylindrisk epitel og "goblef-celler. Ikke-tykktarm normalt vev var omtrent helt fritt for reaksjon med monoklonalt C242:ll, mens positiv reaksjon ble funnet i normale brystganger, bukspyrrkjertelganger, galleganger og svettekjertler, men intensiteten av fargingen var svak. ;Immunhistokjemisk undersøkelse av C242 (C242MI) i normalt humant vev tatt post mortem (etter død) ;En omfattende rekke normalt humant vev ble samlet fra 21 individer post mortem. De beste 5 vevsprøver ble valgt for å undersøke C242:ll immunreaksjon. ;Ved post mortem ble vevene fjernet og plassert øyeblikkelig i forhåndsavkjølte rør som inneholdt et basalt medium og tilsatt antibiotika. De vevinneholdende rørene ble så transportert til laboratoriet (på is), kulturvæsken fjernet og vevet trimmet til 0,5 cm biter. Vevsbitene ble plassert på filterpapir og frosset hurtig i N2. Det frosne vevet ble lagret ved -80°C til det ble skåret. Ved skjæring ble de frosne prøvene kuttet i 6^m snitt som ble festet til mikroskopiglass. Snittene ble fiksert ved å legge glassene i 100% aceton i romtemperatur i 2 minutter. Glassene ble så fjernet fra acetonet, tillatt å lufttørke og lagret ved -20°C før bruk. ;Alle inkubasjonene ble utført i et fuktig atmosfære i 30 minutter ved romtemperatur. Snittene ble først inkubert med monoklonalt antistoff- C242:ll i Tris-buffret saltvann (TBS), deretter med pepperrotperoksydase konjugert kanin anti-mus IgG (Dako Ltd., High Wycombe, Bucks, UK) fortynnet 1:50 i TBS som inneholdt 20% humant serum (Sigman Chemical Company Ltd., Poole, Dorset, UK) og til slutt med pepperrotperoksydase konjugert gris anti-kanin IgG (Dako Ltd), fortynnet 1:50 i TBS som inneholder 20% humant serum. Etter hver inkubasjon ble glassene renset to ganger i TBS. Snittene ble så behandlet med substrat i 35 minutter, renset i TBS, sekundærfarget med Mayers haematoksylin og montert med Synthetic Mounting Medium (Shandon Scientific Ltd., Runcorn, Cheshire, UK). ;Substratet som ble benyttet var 10 mg diaminobenzidin (Sigma) løst opp i 17 ml TBS som inneholdt 17 ^l 30% H202. Substratløsningen ble filtrert før bruk. ;Seksjonene ble undersøkt og resultatene er vist i tabell 2 under. ; ; Som tabell 2 viser, hadde 72% av de normale p.m.-vevene som ble undersøkt ingen C242:ll-reaksjon. Av de 28% som ble funnet positive, var mesteparten av fargingen enten diffus, uten definisjon eller lokalisasjon, hovedsakelig begrenset til gangstrukturer i vevene. Mer heterogen, men fremdeles med minimum binding ble observert i gastrointestinalt epitel. 2-4 hudprøver farget positive med reaksjon i plateepitel og svettekjertler. Plateepitel farget også positivt på 4 tonsille (mandler) prøver undersøkt med C242:ll. ;Endocytose av C242:ll-binding til COLO 205 human tykktarmcancer ;En endocytosemetode ble utført som følger: Enkeltcellesuspensjoner ble laget fra COLO 205-celler (se fremstilling av C242-antistoff beskrevet ovenfor) og dyrket i monolag. Cellene ble trypsinert, vasket omfattende og resuspendert i kulturmedium. Jod merket C242:ll-antistoff fra over (200 00 cpm som svarte til 50 ng monoklonalt antistoff) ble tilsatt en enkeltcellesuspensjon av COLO 205-celler (10<®>celler) i 5 ml prøverør. Det endelige volum var 200(J/rør. ;Celler ble inkubert i nærvær av<125>l-C-242 i 1 time på is (0°C). Suspensjonen ble så sentrifugert og cellene vasket fritt fra ikke-bundet monoklonalt antistoff. De preinkuberte cellene ble videre inkubert ved 37°C i 10 minutters intervaller i 1 time, cellene ble avkjølt igjen og sentrifugert hver gang. Radioaktiv markør frigitt til kulturmedia ble målt fra supernatanten (LKB gammateller, Pharmacia AB, Uppsala, Sverige). Supernatanten ble også gjenstand for TCA-presipitering og radioaktiviteten i bunnfallet målt. Overflatebundet<125>I-C242 ble fjernet ved syrevask med 0,2M glycin-HCI-buffer, pH 1,5, som inneholdt 2,5 mg/ml papain, og radioaktiviteten, som representerte internalisert<125>I-C242, ble talt. Mengde overflatebundet antistoff etter hver gang, inkubert ved 37°C, ble beregnet ved å trekke fra frigitt og internalisert monoklonalt antistoff fra totalt overflatebundet monoklonalt antistoff. Degradering av frigitt antistoff ble målt fra TCA-bunnfallet av mediumsupernatant. ;Resultatene er vist i fig. 15 i de følgende fig. som viser endocytose av<125>I-C242:II i COLO 205-celler, radioaktiviteten på celleoverflaten ("Sur"), internalisert radioaktivitet ("Int"), frigitt radioaktivitet ("Res") og degradert frigitt radioaktivitet ("Deg.Re") uttrykt som prosent av total startradioaktivitet på celleoverflaten. I fig. 15 kan det ses at mer enn 20% internalisering av C242:ll ble oppnådd i løpet av 1 time når de preinkuberte cellene ble inkubert ved 37°C. Det var en liten mengde syreløselig radioaktivitet når mediumsupernatant ble TCA-bunnfelt, hvilket antyder en viss fragmentering av frigitt aktivitet etter 1 times inkubasjon. ;Cytotoksisitet til ricin A/C242-antistoff immuntoksin ;In vitro cytotoksisitet ;Denne undersøkelse viser in vitro cytotoksisitet til immuntoksin mot en human tykktarm/endetarm tumorcellelinje (Colo 205-ATCC nr. CCL 222). ;Colo 205-celler ble dyrket i suspensjon i RPM1640-medium med 2,0 g/l natriumbikarbonat, uten glutamin, med 5% varmeinaktivert føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin og 50^g/ml gentamicin. Cellene ble talt ved bruk av hemocytometer-blokker. For proteinsyntese hemningsundersøkelser ble cellene sådd ut i 2 x 10<4>celler/brønn i 96 brønners skåler i et volum på 100^l. Immuntoksinprøver ble tilsatt til 3 replikate (like) brønner. Immuntoksin ble tilsatt i 12 dobbelte fortynninger fra 2000 til 0,98 ng/ml. 100(J kulturmedium ble tilsatt noen brønner som kontroll. Hver skål ble inkubert i 24 timer ved 37°C, før 2^Ci<3>H-L-leucin ble tilsatt hver brønn. Skålene ble inkubert ved 37°C i videre 24 timer. 50|J trypsin ble tilsatt hver brønn og skålene inkubert ytterligere 15-20 minutter. Cellene ble høstet fra hver brønn/skål på glassfibermatter med radioaktivitet målt ved bruk av LKB betaplate scintillasjonsteller. Proteinsyntese hemningskurver ble laget og IC5Q-verdier beregnet. Resultatene som ble oppnådd med den foretrukne immuntoksinen (preparatet beskrevet ovenfor) er vist i fig. 16. ;In vivo cytotoksisitet ;Denne undersøkelsen viser in vivo cytotoksisiteten til immuntoksinet mot den humane svulstcellelinjen, COLO 205, når den vokser som subkutane transplantater i atymiske mus. Kontrollgrupper, som fikk antistoff alene eller fosfatbuffret saltvann ble også undersøkt. ;5x10<®>COLO 205-celler ble injisert på et enkelt subkutant sted i flankene på atymiske mus. Svulstene ble tillatt å gro og målt hver tredje til fjerde dag i to dimen- ;sjoner ved bruk av skyvelær (calipers). Injeksjon av testmaterialet ble ikke startet før svulstene hadde nådd 0,7-1,0 cm omkrets. Dette stadium er dag 0, og testforbindelsene ble injisert intravenøst i halevenene på dag 0, 1 og 2. Svulst-størrelsen ble målt videre i to dimensjoner og presentert som relativt svulstvolum. Målingen ble gjort hver 3-4 dag til eksperimentet ble avsluttet. ;Denne undersøkelse sammenlikner effektene på relativt tumorvolum mellom fosfatbuffret saltvann, C242-antistoff alene (1,2 mg/kg) og det foretrukne immuntoksin (preparat beskrevet ovenfor) (2,0 mg/kg) på tumorvekst, og resultatene illustreres i de følgende tabeller. ;Gruppe 1 Fosfatbuffret saltvann 0,1 ml/10 g/x3 daglig ; ; Gruppe 2 C242-antistoff 1,2 mg/kg/i.v./x3 daglig Gruppe 3 Immuntoksin 2,0 mg/kg/i.v./x3 daglig ; Som illustrert i tabellene ovenfor gir immuntoksinet en reduksjon itumorstørrelse (tabellene viser relativt svulstvolum) i kontrast til fosfatbuffret saltvann (PBSA) kontroll og antistoff alene. ;Reaksjon mellom C242.ll og human bukspyttkjertel-svulstvev ;Denne undersøkelse viser reaksjonen mellom C242.ll og human bukspyttkjertel-svulstvev. ;C242.ll-reaksjon mot human bukspyttkjetrel-svulstvev ble bestemt ved bruk av samme immunhistokjemiske teknikker som beskrevet for human normalt vevreaksjon. Friskt frosset bukspyttkjertel-svulstvev ble oppnådd fra finnålbiopsi-materiale og formalinfiksert/paraffinmontert vev ble laget fra svulstpreparater. 13/16 pankreassvulster farget positivt. Generelt var omfanget og mønsteret for binding bedre enn eller lik det som ble observert for prøver fra tykktarm-endetarm svulstvev. ;In wfro-potens til immuntoksin overfor bukspyttkjertel svulstcellelinjer ;Denne undersøkelse viser in vitro cytotoksisitet til immuntoksinet mot en human bukspyttkjerten (pankreas) svulstcellelinje. Cellelinjen Pan 1, som stammer fra en pankreas adenokarsinom, ble benyttet for å kvantitere den in vitro cytotoksiske potensen til immuntoksinet, og FACS-analyse ble vist å uttrykke målantigenet. For å kvantitere potensen, ble forskjellige konsentrasjoner av immuntoksinet tilsatt til Pan 1-celler i kultur, for å kunne gi en IC5q. Et MOPC ;21 :ricin A-konjugat og ricin A alene ble benyttet som negative kontroller. Den biologiske undersøkelsen ble utført tre ganger og en gjennomsnittspotens på 40 +/-18 ng/ml ble oppnådd. De negative kontrollene var ikke cytotoksiske i konsentrasjoner opptil 1000 ng/ml. Disse resultatene viser at målantigenet er tilstede på pankreas-svulstceller og at antigenpositive svulstceller er følsomme for å bli drept av immuntoksinet. ;Molekylær kloning av cDNA'ene som koder for deler av de lette og tunge kjedene til det monoklonale antistoffet-C242:ll ;A. Fremstilling av total RNA ;Total RNA fra 10<®>celler ble laget hovedsakelig ifølge fremgangsmåten til J.M. Cirgwin et al. (1979; Biochemistry 18, 5294-5299) som modifisert av ;P. Chomezynksi og N. Sacchi (1987; Anal. Biochem. 162, 156-159). I korthet ble cellebunnfallet løst opp i 15 ml kald denaturerende løsning som besto av 4 M guanidintiocyanat; 25 mM natriumcitrat, pH 7; 0,5% N-lauroylsarkosin; 0,1 M 2-merkaptoetanol. Etter oppløsning av cellematerialet ble 1,2 ml 2M natriumacetat (pH 4,0) tilsatt og blandingen ekstrahert med fenol-kloroform-isoamylalkohol (250:49:1). Etter sentrifugering ble RNA bunnfelt fra den vandige løsningen ved tilsetning av et likt volum isopropanol, og inkubert ved -20°C over natt for å bunnfelle det totale RNA. Etter sentrifugering og resuspensjon av RNA ble bunnfellingen gjentatt, og etter en ytterligere sentrifugering og bunnfelling ble det totale RNA kalkulert å være 960 f^g basert på absorbsjonsmålinger. ;B. Isolering' av mRNA ;For å isolere polyadenylert mRNA fra det ovenfor nevnte preparat av total RNA, ble PolyATract™ mRNA isoleringssystemet til Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA, benyttet ifølge produsentens instruksjoner (kfr.: Promega Technical Bulletin, nr. 090:1990). I korthet ble 960 u.g total RNA løst i vann og bunnet til en biotinylert oligo(dT) probe (50 pmol) i 0,4 x SSC (1 x SSC = 8,77 g NaCI, 4,41 g natriumcitrat pr. liter vann pH 7,0). Streptavidindekkete paramagnetiske kuler (Streptavidin Magnesphere ™) ble tilsatt og etter 10 minutters inkubasjon ble de magnetiske partiklene fjernet og vasket flere ganger med 0,1 x SSC. Det polyadenylerte mRNA ble eluert fra kulene ved inkubasjon i vann, hvilket ga 5 j^g mRNA. ;C. Fremstilling av cDNA fagbibliotek i E. coli ;cDNA ble laget fra polyadenylert mRNA fra de tidligere trinn hovedsakelig ifølge fremgangsmåten til U. Gubler og B.J. Hoffman (1983; Gene 25, 263-269) som modifisert for vektoren Uni-ZAP™ (Stratagne Inc. La Jolla, California) som tillater retningsorientert kloning av dobbeltkjedet cDNA. I korthet ble 5j^g polyadenylert mRNA overført til enkeltkjedet cDNA ved binding til Uni-ZAP™ mellomstykkeprimer (56 ng/ml), tilsetting av dATP, dGTP, dTTP og 5-metyl-dCTP til 0,6 mM og 45 U av Moloncy Murine Leukemia Virus revers transkriptase. Blandingen ble inkubert ved37°C i 1 time. Annen kjede cDNA-syntese ble utført ved tilsetting av dATP, dGTP, . dTTP og dCTP til en endelig konsentrasjon av 0,15 mM, 3,2 U RNase H og 6,5 U DNA-polymerase 1, og inkubert i 2,5 timer ved 16°C. Blandingen ble ekstrahert med fenol-kloroform (1:1) og etanolbunnfelt. Endene til cDNA ble gjort like lange ved inkubasjon med 0,16 mM dNTP og 10 U T4 DNA-polymerase ved 37°C i 30 minutter. Etter fenol-kloroformekstraksjon og etanolbunnfelling ble det resulterende like-endete cDNA bundet til EcoRI-adaptorer ved tilsetning av 3 Weiss U T4 DNA-ligase, 1 mM ATP og inkubasjon over natt ved 8°C. Etter ligering ble de EcoRI-overhengende endene kinasert ved tilsetning av 10 U T4 polynukleotidkinase i nærvær av 1 mM ATP, og inkubasjon i 30 minutter ved 37°C. Det resulterende cDNA med fosforylert EcoRI overhengende ender ble spaltet med 90 U Xhol for å ;skape en Xhol-overhengende ende fra sekvensen som kodet for av Uni-Zap™ endemellomstykke (linker) primer. Det resulterende cDNA ble så bundet til 1ug av Uni-Zap™ XR EcoRI og Xho1 lagete armer i nærvær av 2 Weiss U T4 DNA-ligase, 1 mM ATP og inkubasjon ved 12°C over natt. Bindingsblandingen ble pakket in vitro iArfagpartikler ved bruk av Gigapack II Gold^ pakkeekstrakt ifølge produsentens instruksjoner, og de resulterende fagene ble benyttet for å infisere E. coli PLK-F'. ;Det resulterende cDNA-bibliotek på 8,5 x 10<4>uavhengige kloner ble forsterket én gang til å gi et fagtiter på 7,5 x 10<8>pfu/ml. Det resulterende cDNA-biblioteket ble undersøkt ved bruk av E. coli XL1-blå som vertstamme (kfr. W. Bullock (1978) Biotechniques 5, 4) som vil bli beskrevet nedenfor. ;D. Fremstilling av hybridiseringsprober ;For å påvise cDNA-kloner som kodet for lgG1 tungkjede og kappakjede til C242:ll antistoffet, ble hybridiseringsprober som dekket det første konstante området i den tunge kjeden, CH1, og det konstante området til kappakjeden, CK, laget fra musegenomisk DNA ved hjelp av polymerase kjedereaksjon ifølge R.H. Saiki et al. (1988; Science 239, 487-491). I korthet ble oligonukleotidprimerpar som hybridiserte til 5'- og 3-områdene i eksonene som kodet for de ovenfor nevnte immunglobulinområdene benyttet for forsterkning av musegenomisk DNA. Etter opprensning ved agarose gelelektroforese ble de resulterende DNA-probe-fragmentene merket med 32p ved hjelp av vilkårlig "primer" forlengelsesfremgangs-måte ifølge A.P. Feinberg og B. Vogelstein (1983; Anal. Biochem. 132, 6). ;E. Undersøkelse med hensyn på kodende sekvenser for IgG tunge og kappakjeder og innsetting i plasmider ;cDNA-biblioteket fra seksjon C ovenfor ble undersøkt i to atskilte runder ved bruk av henholdsvis immunglobulin lgG1 og kappaprober, fra seksjon D ifølge fremgangsmåter beskrevet av J. Sambrook et al. (1989; Molecular Cloning, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Positive hybridiserende fagkloner fra de to separate hybridiseringene ble videre renset og undersøkt igjen ved bruk av de samme prober som den første undersøkelsen. Positive hybridiserende fagkloner ble utviklet i kulturer av E. coli CL1-Blue, og de resulterende faglagrene benyttet for å lage cDNA som inneholdt pBluescript SK(-) plasmider ved fagmideksisjon og videreføring hovedsakelig ifølge J.M. Short et al. (1988; Nucleic Acids REs. 16, 7583-7600). ;F. Karakterisering av plasmid cDNA fra hybridiserende kolonier ;De resulterende cDNA-inneholdende plasmider blekarakterisert vedrestriksjons enzymkartlegging, og plasmider som inneholdt innskudd av de forventete størrelser ble gjenstand for dideoksy DNA-sekvensering ifølge F. Sanger et al. (1977; Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467). Et plasmid som hybridiserte med lg kappaprobe, betegnet pKGE761, inneholdt et cDNA-innskudd hvis sekvens koder for en åpen leseramme som var nær homolog til tidligere kjente musekappa lette kjedesekvenser (kfr. E.A. Kabat et al. (1987) Sequences of Protein of Immunological Interest, 4. utg., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health). En delvis cDNA-sekvens som kodet for den variable regionen til kappa lette kjede VK, og dens translaterte proteinsekvens, er avbildet i fig. 18. De tre CDR-sekvensene, betegnet som CDR1 til CDR3, er vist ved understrekning. Et signalpeptid som går foran den aminoterminale enden til VK-segmentet er vist ved S. CK viser den konstante regionen som følger den karboksyterminale enden til VK-sekvensen. ;Et plasmid som hybridiserer med lgG1-proben, betegnet pKGE762, inneholdt et cDNA-innskudd hvis sekvens koder for en åpen leseramme som er nær homolog til tidligere kjente muse lgG1 tunge kjedesekvenser (kfr. E.A. Kabat et al. vide supra). En delvis cDNA-sekvens som koder for lgG1 tunge kjede variable regionen, VH, og dens translaterte proteinsekvens, er avbildet i fig. 19. De tre CDR-sekvensene, betegnet som CDR1 til CDR3, er vist ved understrekning. Et signalpeptid som går foran den aminoterminale enden til VH-segmentet er vist ved S. CH1 viser den konstante regionen som følger den karboksyterminale enden til VH-sekvensen. ;SAMMENSETNINGER ;Det følgende illustrerer en representativ farmakologisk doseform som inneholder et-immuntoksin fra den foreliggende oppfinnelse som kan benyttes for terapeutiske formål i mennesker. ;Injeksjonsløsning ;En steril vandig løsning for injeksjon som inneholder: ; *

Claims (16)

1. Konjugat,karakterisert vedat det omfatter en toksinrest og en målcellebindende rest som er selektiv for gastrointestinale tumorer og at den målcellebindende rest omfatter C242-antistoff eller en målcellebindende rest som har hovedsakelig de samme cellebindende egenskaper.

2. Konjugat ifølge krav 1, karakterisert vedat den målcellebindende rest omfatter C242-antistoff eller et fragment derav.

3. Konjugat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert vedat toksinresten omfatter rekombinant ricin A.

4. Konjugat ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert vedat den målcellebindende rest og toksinresten er koblet ved hjelp av en bifunksjonell linker.

5. Konjugat ifølge hvert av de foregående krav. karakterisert vedat den målcellebindende rest og toksinresten er koblet ved hjelp av en disulfid- eller tioeter-binding.

6. Konjugat ifølge hvert av de foregående krav, karakterisert vedat den målcellebindende rest og toksinresten er koblet med en linker med formelen -S-X-CO-, hvori X er en rettkjedet (1-6C)alkylgruppe, eventuelt substituert med én eller to substituenter valgt fra (1-6C)alkyl, fenyl og (1-4C)alkylfenyl; eller en (1-4C)alkyl-fenylgruppe, hvori alkylresten eventuelt er substituert med én eller to substituenter valgt fra (1-6C)alkyl, fenyl og (1-4C)alkylfenyl; og hvori fenylringen kan være en substituent valgt fra halogen, (1-4C)alkyl og (1-4C)alkoksy.

7. Konjugat ifølge krav 6, karakterisert vedat X omfatter en metylen-, etylen-, propylen- eller butylengruppe substituert med én eller to grupper valgt fra metyl, etyl, propyl og butyl.

8. Konjugat ifølge krav 6, karakterisert vedat linkeren omfatter resten -S-CH(CH3)CH2CO-.

9. Konjugat ifølge hvert av de foregående krav, karakterisert vedat den målcellebindende rest har CDR regioner med sekvenser i det vesentlige som følger: Lett kjede CDR1: Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr CDR2: Arg Met Ser Asn Leu Val Ser CDR3: Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Tung kjede CDR1: Tyr Thr Gly Met Asn CDR2: Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly CDR3: - Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val idet CDR-regionene er slik anordnet at den målcellebindende rest har hovedsakelig de samme cellebindende egenskaper som C242-antistoff.

10. Konjugat,karakterisert vedat det har formel:

hvori A omfatter rekombinant ricin A, og B omfatter en målcelle-bindende rest som omfatter C242-antistoff; S1 er et svovelatom tilstede på rekombinant ricin A; NH'et er på C242-antistoffet; S2 er en svovelatomgruppe og X er en rettkjedet (1-6C)alkyl-gruppe, eventuelt substituert med én eller to substituenter valgt fra (1-6C)alkyl, fenyl og (1-4C)alkylfenyl; eller en (1-4C)alkylfenylgruppe, hvori alkylresten eventuelt er substituert med én eller to substituenter valgt fra (1-6C)alkyl, fenyl og (1-4C)alkylfenyl; og hvori fenylringen kan være en substituent valgt fra halogen, (1-4C)alkyl og (1-4C)alkoksy.

11. Konjugat,karakterisert vedat det omfatter C242-antistoff og rekombinant ricin A, knyttet fra en aminogruppe på C242 til en tiol i cysteinresten i ricin A med en 3-merkaptosmørsyre-direst (-CO.CH2.CH(CH3)-S-).

12. Konjugat,karakterisert vedat det omfatter rekombinant ricin A og en målcellebindingsrest med minst én av CDR-regionene med sekvenser hovedsakelig som følger: lett kjede CDR1: Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr CDR2: - Arg Met Ser Asn Leu Val Ser CDR3: Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr tung kjede CDR1: Tyr Thr Gly Met Asn CDR2: Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly CDR3: Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val idet antallet av slike CDR'er og deres anordning er slik at målcellebindingsresten har hovedsakelig de samme cellebindingsegenskaper som C242-antistoff.

13. Konjugat,karakterisert vedat det omfatter en toksinrest og en målcellebindende rest som er spesifikk for en gastrointesiinal tumorepitop, hvori den målcellebindende rest er spesifikk for epitopen til hvilken C242-antistoff binder.

14. Farmasøytisk blanding,karakterisert vedat den omfatter et konjugat som definert i hvert av de foregående krav i forbindelse med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

15. Anvendelse av et konjugat ifølge hvert av kravene 1-13 for fremstilling av et medikament for behandling av gastrointestinale tumorer.

16. Anvendelse av et konjugat ifølge hvert av kravene 1-13 for fremstilling av et medikament for behandling av kolorektale tumorer.