CZ209792A3 - Conjugates - Google Patents

Description

Tento vynález se týká konjugátů jako jsou imunotoxiny, které se používají při protinádorové terapii, procesů pro přípravu takových konjugátů a farmaceutických směsí, které je obsahuj í.

Dosavadní stav cechniky

Ricin a molekuly podobné ricinu, jako jsou abrin, sloučeniny produkované cytotoxické vlastnosti.

modecin a viscumin jsou známe rostlinnými buňkami, které mají

Toxiny tohoto typu jsou složeny ze dvou polypeptidových řetězců spojených disulfidickým můstkem. Jeden z polypeptidových řetězců (A řetězec) je primárně zodpovědný za cytotoxické vlastnosti molekuly toxinu, zatímco druhý polypeptidový řetězec (B řetězec) zprostředkovává vazbu molekuly toxinu na buněčný povrch.

Toxické působení molekul ricinového typu je rozloženo do tří fází:

a) vazba toxinu na buněčný povrch prostřednictvím interakce vazebných míst obsahujících galaktosu na B řetězci s glykoproteiny nebo glykolipidy, přítomnými na buněčném povrchu

b) penetrace A řetězce do cytosolu buňky

c) inhibice syntézy bílkovin způsobené blokováním aktivity ribosomální 60S podjednotek řetězcem A

Dále se též uvažuje o tom, že B řetězec má , nezávisle na své primární funkci, vázat molekulu toxinu na buněčný povrch, i důležitou sekundární funkci, která spočívá v usnadnění přístupu toxinu do buňky. Oděleně jsou řetězce A a B absolutně netoxické, protože řetězec A postrádá v nepřítomnosti řetězce B schopnost vazby na buněčný povrch a penetrace do cytosolu buňky, zatímco řetězec B nemá cytotoxické vlastnosti.

Jak bylo výše uvedeno jsou ricin a molekuly ricinového typu produkovány rostlinami. V případě samotného ricinu jde o rostlinu Ricinus communis, která je jinak známa jako producent ricinového oleje. Předpokládá se, že prekursorový polypeptid (známý jako preproricin) obsahující vedoucí sekvenci, řetězec A, spojovací sekvenci a řetězec B je produkován nejdříve. Pravděpodobně během transportu tohoto prekursoru uvnitř rostlinné buňky je eliminována vedoucí sekvence a vzniká proricin.

vytvoření disulfidického

Ricin vzniká z proricinu po můstku mezi řetězci

A a B a eliminaci spojovací sekvence.

Dále se předpokládá, že toxicita A řetězce toxinů jako je ricin by mohla být použitelná u protinádorové terapie,

- 2a·v případě, kdy by náhodné se vázající B řetězec mohl být nahrazen jiným nosičem se schopností vázat se k rakovinným buňkám přednostně před normálními. Byla navržena a připravena řada konjugátů, které obsahují ricin nebo A řetězec ricinu a nádorově specifickou protilátku.

U známých konjugátů však vzniká jeden problém spojený s určitou strukturální vlastností přirozeného ricinu. Předpokládá se, že během syntézy ricinu v rostlinných buňkách, dochází k N-glykosylaci a tudíž výsledné cukerné části jsou schopné nespecifických interakcí s buněčným povrchem.

Dále se uvažuje o tom, že ztráta selektivity imunokonjugatu s rostlinným ricinem je též výsledkem buď:

a) přítomnosti galaktosových vazebných míst na B řetězci, které nespecifickým způsobem reagují s buněčným povrchem v případě celých ricinových imunokonjugátů, nebo

b) vazby postranních řetězců glykanu, které se vytvářejí na rostlinném ricinu A, s galaktosovými nebo mannosovými receptory na buněčném povrchu v případě imunokonjugátů s rostlinným ricinem A.

Další problém vyplývá z vlastnosti řetězce B, který, jak bylo výše uvedeno, umožňuje příjem molekuly toxinu do buňky. Uvádí se, že ačkoli konjugáty, které neobsahují B řetězec, tedy konjugáty skládající se z řetězce A a protilátky, mají tendenci být specifičtější ve srovnání s nativními toxiny nemají účinek jako nativní toxin (Moolten,

- 2bF.L a kol., Immun. Rev., 62, 47-72, 1982). Předpokládá se, že tato ztráta účinnosti je důsledkem snížení účinného příjmu toxinu buňkou. Z toho důvodu jen poměrné malá část dosud popsaných protilátek je schopna zprostředkovat efektivní internalizaci toxinu, a většina jich proto poskytuje imunotoxiny které postrádají aktivitu.

Bylo připraveno mnoho konjugátů s potencionálním využitím při ošetření nádorů řady tkání. Např. PCT Patent Application No W085/003508 popisuje přípravu konjugátů, které jsou složeny z ricinu A nebo řetězce difteria toxinu A, spojených vloženou molekulou s protilátkami specifickými pro nádory prsů.

Protilátky, které rozpoznávají buňky rakoviny střevního traktu byly již také popsány, avšak konjugáty,které zahrnují tyto protilátky, trpí často tendencí k nepřijatelné vazbě s normální tkání a/anebo nízkou účinností. Takže známé protilátky které rozpoznávají nádorové buňky střeva nebo konečníku zatím nenalezly použití v přípravě konjugátů se skutečným terapeutickým významem. Je proto stálá potřeba konjugátu který by měl terapeutickou hodnotu při ošetřování tumorů střevního traktu.

Přesto, že již byly navrženy a připraveny nejrůznější konjugáty, stále je potřeba vytvořit lepší konjugáty. Tyto vylepšené konjugáty by měly zlepšit jednu či více nevýhod spojených s dosud známými konjugáty. Je zejména potřeba získat konjugáty selektivní pro gastrointestinální tumory.

Technická podstata vynálezu

Předkládaný vynález popisuje konjugáty, které se skládají z toxinové složky a a ze složky pro vazbu s cílovou buňkou která je selektivní pro nádorové buňky trávicího traktu.

Složka pro vazbu s cílovou buňkou ( a tedy celý konjugát) je zejména selektivní pro nádorové buňky tlustého střeva, konečníku a slinivky, obzvláště pak pro buňky nádorů tlustého střeva a konečníku.

Skupina pro vazbu s cílovou buňkou je selektivní pro nádorové buňky trávicího traktu (zejména tumorů tlustého střeva a konečníku) tím způsobem, že se váže k takovýmto buňkám preferenčně oproti normálním buňkám. Takže skupina pro vazbu k cílové buňce se bude vázat k buňce nádoru trávicího traktu, avšak bude vykazovat nulovou nebo nebo pouze minimální vazebnou afinitu vůči normálním buňkám. Zejména je důležité, že skupina pro vazbu k cílové buňce vykáže selektivitu vůči gastrointestinálním tumorům v podstatě stejnou jakou vykazuje protilátka C242. Selektivita protilátky C242 vůči gastrointestinálním tumorům, jako jsou kolorektální tumory je ilustrována imunohistochemickými údaji uvedenými dále. Tak zejména skupina pro vazbu k cílové buňce jako je protilátka C242, se bude vázat na antigen související s tumory trávicího traktu, který je však nepřítomný nebo jen slabé exprimován v normálních buňkách. Zvláštní případ takové skupiny pro vazbu k cílové buňce je protilátka C242 nebo skupina pro vazbu cílové buňky, která by méla v podstatě shodné vazebné vlastnosti vůči buňkám.

Jak je zde uvedeno, konjugát je schopný zničit buňky nádorů trávicí soustavy. Takže konjugát (neboli imunotoxin) je schopen dopravit toxinovou část k tumorové buňce tak, aby toxinová část mohla uplatnit své cytotoxické schopnosti. Konjugát proto bude, obecně, schopen vázat se k nádorovým buňkám (prostřednictvím části pro vazbu k cílové buňce vážící se k tumorové buňce) a umožní toxinové části proniknout do buňky, to znamená, že umožní toxinové části její internalisaci. Obzvláště efektivní konjugáty budou obecně mít následující vlastnosti1. Část pro vazbu k cílové buňce má být schopná vázat se na povrchový antigen tumorové buňky.

2. Antigen na buněčném povrchu musí být přítomen ve vysokém počtu kopií na nádorových buňkách, například alespoň v počtu deset tisíc na buňku.

3. Antigen by neměl být exprimován ve vysokém počtu kopií v normálních buňkách.

4. Komplex antigen-protilátka by měl být účinně internalisován tak, aby jeho toxinová část mohla uplatnit vnitrobuněčně svou cytotoxicitu.

5. Konjugát by měl být výhodně konstruován tak, aby byl natolik stabilní, že zůstane v krvi dostatečně dlouho intaktní, než je toxinová část dopravena k rakovinným buňkám a současně by měl být vhodně štěpitelný tak, aby došlo k uvolnění toxinové části, jakmile se tato část dostane dovnitř buňky.

Protilátka C242 je myšší protilátka zařazená do skupiny IgG protilátek, která je produkována tehdy, jestliže v příslušném mediu jsou kultivovány hybridomové buňky pocházející z linie získané fúzí myšších slezinných buněk, které ^Ίγ imunizovány buňkami z lidského střev” adenokar·.....-mu, a myšších myelomových buněk linie Sp ./0. Linie hybridomových buněk (242.11), které produkují C242:II protilátku (zde též jednoduše označovanou jako C242 protilátka) byla uložena 26. ledna, 1990 v souladu s Budapešťským ujednáním v Evropské sbírce pro živočišné tkáňové kultury (ECACC), PHLS Centrum pro aplikovanou mikrobiologii a výzkum, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, United Kingdom, pod číslem 90012601.

Výraz část, vázající se k cílové buňce, která má v podstatě stejné vazebné vlastnosti zahrnuje skupiny vázající se k cílové buňce, které mají v podstatě stejnou imunologickou specifitu jakou má buněčná linie uložená v ECACC pod číslem 90012601, která se váže na stejnou antigenní determinantu nebo epitop, a soutěží o toto vazebné místo s C242 protilátkou.

Výraz část vázající se k cílové buňce také zahrnuje fragmenty protilátky a zvláště fragmenty protilátky C242 stejně tak jako intaktní protilátku. Fragmenty protilátky, včetně těch, získaných např. degradací protilátky působením proteolytických enzymů jako je pepsin, si zachovávají vazebnou schopnost a specifitu jako má nefragmentovaný imunoglobulin. Zvláštními případy fragmentů jsou F(ab ) a F(ab )₂ fragmenty.

E. výhodné, kdyby skupina, která se váže k cílové buňce, mohla být připravena metodami genetického inženýrství a v tom případě výraz fragment vážící se k cílové buňce zahrnuje protilátky a fragmenty protilátek připravované takovýmito technikami. Zejména tento termín zahrnuje protilátku C242 nebo její fragment, který je produktem genového inženýrství.

Příprava fragmentů protilátek a zejména humanisovaných forem protilátek nebo jejich fragmentů odvozených z nehumánních zdrojů, např humanisované formy myšších protilátek.

Protilátka C242 je orientována proti tumorovému antigenu, zde značenému jako CA-242. Proto je zejména ve skupině vázající se k cílové buňce obsažena protilátka nebo fragment protilátky schopný vázat se k antigenu CA-242.

Specifickým příkladem takové protilátky je právě sama protilátka C242. Antigen CA-242 spjatý s tumorem je exprimován ve většině nádorů tlustého střeva a konečníku, a v normální střevní tkáni není přítomen vůbec nebo je exprimován pouze slabě.

Stran genetického inženýrství, jak již bylo uvedeno výše, cDNA variabilních oblastí těžkých a lehkých řetězců C242:II monoklonální protilátky byly klonovány způsobem, který bude dále popsán. Dříve však, před podrobnější diskusí, nemůže být od věci, podat stručný obecný popis základní imunoglobulinové strukturní jednotky s odkazem na obr. 17 doprovodných ilustrací, který popisuje základní strukturu protilátky, tzn. imunoglobulinu, nebo třídy G.

Podle identických identických řetězce jsou nekovalentních obr. 17, imunoglobulin se skládá ze dvou lehkých polypeptidových řetězců (L) a dvou těžkých polypeptidových řetězců (H). Tyto čtyři spojeny disulfidickými vazbami a vazeb do symetrické Y konfigurace řadou Každý za níž těžký řetězec má na každém konci variabilní doménu V_H následuje řada konstantních domén C_H. Každý lehký řetězec má variabilní doménu na jednom konci V^ a konstantní doménu C_L má na druhém konci. Přitom existují dva typy lehkých řetězců, označované jako kappa a lambda. Variabilní doména lehkého řetězce je umístěna do jedné řady s variabilní doménou těžkého řetězce, konstantní doména lehkého řetězce je pak v jedné řadě s první konstantní doménou těžkého řetězce. Variabilní domény lehkých a těžkých řetězců tvoří vazebné místo.

Variabilní oblasti lehkých a těžkých řetězců mají stejnou základní strukturu, každá se skládá ze tří hypervariabilních oblastí, které se nazývají oblastmi určujícími komplementaritu , nebo CDR, zasazené mezi čtyři segmenty základní blokové struktury , označované jako FR. CDR každé variabilní domény jsou segmenty základní struktury drženy v těsné blízkosti a dvé sady CDR společně zodpovídají za specifitu protilátky.

Aby mohla být klonována cDNA variabilních oblastí lehkých a těžkých řetězců protilátky C242:II, byla nejdříve z hybridomu C242:II známými metodami připravena cDNA fágová knihovna (genová banka). Hybridizační nukleotidové sondy zahrnující konstantní části těžkého a lehkého řetězce (kappa), byly dále připraveny z myšší genomové DNA metodou PCR s použitím vhodných primerů. Výsledné nukleotidové sondy byly pak použity ke screeningu knihovny cDNA pro cDNA klony, obsahující sekvence DNA, které kódují těžké a kappa řetězce C242:II protilátky. Hybridizované fágové klony byly rozvinuty a cDNA byla vyříznuta ve formě plasmidů. Ty byly posléze mapovány za použití restrikčních enzymů a plasmidy, které obsahovaly inzerty očekávané velikosti byly sekvenovány. Aby mohly být určeny CDR oblasti, byly aminokyselinové oblasti kódované nukleotidovými sekvencemi insertů porovnávány s dříve známými myšími kappa a těžkými řetězci s ohledem na základní umístění CDR oblastí jak je definováno např Kabatem a kol. (1987) v Sequence of Proteins of Immunological

Interest, 4. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health. Bylo zjištěno, že CDR oblasti příslušných řetězců měly následující aminokyselinové sekvence (jak je též uvedeno na obr. 18 a 19 doprovodných ilustrací-viz též SEQ. ID. č. 21 a 22):

Lehký řetězec

CDR1 (SEQ. ID. ČI):ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnThrTyrLeuTyr

CDR2 (SEQ. ID. Č2):ArgMetSerAsnLeuValSer

CDR3 (SEQ. ID. Č3):LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr

Těžký řetězec

CDR1 (SEQ. ID. Č4):TyrThrGlyMetAsn

CDR2 (SEQ: ID. Č5):

TrpI1eAspThrThrThrGlyG1uProThrTyrAlaG1uAsp PheLysG1y CDR3 (SEQ. ID. Č6):ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal

V případě, že tyto CDR amino a/nebo DNA sekvence jsou známy, může odborník vnést CDR oblasti C242:II protilátky do klonovaných variabilních částí jiné protilátky nebo fragmentu běžně z literatury známou metodou usměrněné mutageneze. Tento grafting (CDR European Patent na úrovni DNA, postup obecně známý jako CDR transplantace-roubování) např. popsané v Application č. EP 239,400), zahrnující, substituci CDR kódujících sekvencí C242:II protilátky pro CDR kódující sekvence recipientní protilátky nebo fragmentu, která poskytne protilátku nebo fragment protilátky s odpovídající specifitou jako má monoklonální protilátka C242-.II. Mezi skupiny vázající se k cílové buňce lze proto samozřejmě zahrnout jakýkoli celek, který obsahuje protilátku nebo fragment protilátky mající alespoň jednu z výše definovaných CDR oblastí (nebo v podstatě výše definované CDR oblasti), pokud počet CDR oblastí a jejich uspořádání v protilátce nebo fragmentu protilátky je takové, že část vázající se k cílové buňce má v podstatě stejné vazebné vlastnosti vůči buňkám jako protilátka C242. Je obecně výhodné, jestliže část vázající se k cílové buňce zahrnuje všechny CDF oblasti (což jsou CDR1, CDR2 a CDR3 lehkého řetěze i CDR2 a CDR3 těžkého řetězce) definované výše (nebe catě definované výše). CDR oblasti uváděné jako v podstatě výše definované zahrnují rozšířené sekvence jako jsou:

Lehký řetězec

CDR1 (SEQ. ID. Č7):

ArgS ers erLys SerLeuLeuHi sSerAsnG1yAsnThrTyrLeuTyrTrpPhe CDR2 (SEQ. ID. Č8):IleTyrArgMetSerAsnLeuValSerGlyVal CDR3 (SEQ. ID. Č9):LeuGlnHisLeuGluTyrPRoPheThrPheThrPheGly

Těžký řetězec

CDR1 (SEQ. ID. Č10): PheThrTyrThrGlyMetAsn

CDR2 (SEQ. ID. Čil):

MetGLyTrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly

Arglle

CDR3 (SE ID. Č12):

AlaArg^-.gGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspValTrpGly

Protilátky nebo fragmenty protilátek připravené metodou CDR transplantace budou výhodně připraveny vnášením CDR oblastí C242 protilátky do základní struktury, která je vybrána tak, aby byla blízká C242 horaologií i velikostí CDR.

Předkládaný vynález také popisuje konjugát, který obsahuje toxinovou část a část vázající se k cílové buňce, která obsahuje C242 protilátku nebo část vázající se k cílová buňce, která má v podstatě stejné vazebné vlastnosti.

Lze kladné hodnotit, že konjugát který je předkládaného vynálezu, nemusí nutné sestávat molekuly toxinu a z jedné molekuly protilátky, konjugát může obsahovat více než jednu molekulu molekulu protilátky.

předmětem z j edné

Například toxinu na

Toxinová část obecně obsahuje komponentu, která má cytotoxické vlastnosti a je tedy schopna následně po internalisaci zabíjet buňky.

Část molekuly zodpovědná za vazbu k cílové buňce obecně obsahuje složku vázající se k cílové buňce, která je schopná rozpoznat specifickou antigenní determinantu cílové buňky.

Toxinová část a část vázající se k cílové buňce mohou být bud vzájemné spojeny přímo, anebo mohou být spojeny nepřímo. Toxinová část a část vázající se k cílové buňce jsou způsobem, že geometrie pro vazbu k cílové buňce Zejména výhodné je, že obecné vzájemně spojeny takovým výsledného konjugátu umožňuje části navázat se na svou cílovou buňku, toxinová část a část vázající se k cílové buňce jsou spojeny takovým způsobem, že\ konjugát je extracelulárně stálý, a intracelulárně nestálý, takže toxinová část a část vázající se k cílové buňce zůstávají spojeny pokud jsou mimo buňku, avšak po internalisaci je uvnitř buňky toxinová část uvolněna. Takto s výhodou má konjugát intracelulárně štěpitelné avšak extracelulárně stálé místo.

Příklady konjugátů v nichž je toxinová část přímo spojena s částí vázající se k cílové buňce zahrnují i ty, v nichž je toxinová část s částí vázající se k cílové buňce spojena disulfidovým můstkem skupinou na toxinové části a vázající se k cílové buňce.

vytvořeným mezi thiolovou thiolovou skupinou na části

Část vázající se k cílové buňce může zahrnovat oblast která rozpoznává toxinovou část a která tedy sama váže toxinovou část s částí vázající se k cílové buňce. Příkladem posledně zmíněného je případ kdy část vázající se k cílové buňce zahrnuje protilátku nebo fragment protilátky který se váže k toxinové části.

Část vázající se k cílové buňce a toxinová část může obsahovat jednoduchý polypeptido který by měl nejlépe zahrnovat intracelulárné štěpítelnou oblast tak, aby toxinová část byl- olněna do buňky. V takovém polypeptidú mohou být toxinová cast a část vázající se k cílové buňce spojeny pomocí polypeptidové spojky.

Příklady konjugátů,kde je toxinová část spojena nepřímo s částí vázající se k cílové buňce zahrnují i ty, kde je toxinová část spojena s částí vázající se k cílové buňce prostřednictvím bifunkčního činidla, zejména prostřednictvím heterobi-funkčního činidla,

Vhodná spojovací činidla zahrnují například spojky které sestávají z polypeptidú, jako ty, které jsou popsány v patentové přihlášce PCT WO 85/003508 a spojky které zahrnují chemické skupiny takového typu jako jsou popsány v Published European Patent Application č. 169,111.

S výhodou lze též spojovat toxinovou část s částí vázající se k cílové buňce prostřednictvím disulfidové vazby, nebo prostřednictvím thioetherové vazby. Obecně je preferováno aby toxinová část s částí vázající se k cílové buňce byly spojeny vazbou, která spojuje zmíněné části pomocí intracelulárné štěpitelné disulfitové nebo thioetherové vazby.

Příklady takových imunotoxinů j sou spojek popsány

Application č. 207-225, 1985, B.M.J., ROSS, a jejich použití v přípravě v Published European Patent 169,111; v Methods in Enzymology 112, (Cumber, A.J., Forrester, J.A., Foxweel, W.C.J., Thorpe, P.E. - Preparation of antibody-toxin conjugates); a v publikaci Vogel, Xmmunoconjugates: Anibody conjugates in radioimaging and therapy of cancer, pp 28-55, (Wawrzynczak, E.J. and Thorpe, P.E. - Methods for preparing imunotoxins: effects of the linkage on activity and stability).

Mezi speciální spojky lze zahrnout ty, které jsou schopné tvořit disulfidické vazby s thiolovou skupinou na jedné z toxinových částí a části vázající se k cílové buňce a dále amidovou vazbu s aminoskupinou na druhé straně toxinové části a části vázající se k cílové buňce.

Příkladem těchto speciálních spojek jsou ty, které mají obecný vzorec:

-s-x-cokde X je skupina tvořící prostorové (distanční) raménko.

X je tvořeno alkylovou skupinou libovolně substituovanou jedním nebo dvéma substituenty, které jsou vybrány z (1-6C)alkyl, fenyl a (l-4C)alkylfenyl, nebo (l-4C)alkylfenyl skupiny, v níž alkylová část je libovolně substituována jedním nebo dvěma substituenty vybranými z (1-6C)alkyl, fenyl a (l-4C)alkylfenylu, a zde může fenylový kruh nést substituent vybraný např.ze skupin halogenových, (l-4C)alkyl a (1-4CJalkoxy.

Je obecně výhodné , jestliže např. alkylová skupina prostorového raménka X nese substituent vybraný z těch, které byly výše uvedeny.

Např. X může být tvořeno (1-6C)alkyl řetězcem, volně substituovaným jedním nebo dvěma substituenty vybranými z (1-4C)alkyl a fenylových skupin. Určité hodnoty X zahrnují např. methylenovou, ethylenovou, propylenovou, butylenovou skupinu volně substituovanou jednou nebo dvěma skupinami nezávisle 'branými z methylových, ethylových, propylových a butylový .. zbytků (zvláště, když jde o substituci methylem, ethylem, propylem a butylem).

Specificky zajímavé hodnoty X jsou ty, kde X je tvořeno methylenovou nebo ethylenovou skupinou libovolně substituovanou jednou nebo dvěma výše definovanými skupinami.

Výhodně je X tvořeno ethylenovou skupinou, která je nesubstituovaná nebo substituovaná jednou či dvěma methylovými skupinami, zejména pak ethylenovou skupinou substituovanou jednou methylenovou skupinou.

Mezi výhodné konjugáty uváděné v tomto vynálezu patří ty, které mají vzorec:

H ^A-S1^S2“^X-CON_B kde A je tvořeno jednou toxinovou částí a částí vázající se k cílové buňce, a B je tvořeno jinou toxinovou skupinou a skupinou vázající se· k cílové vázající se k cílové buňce může toxinových částí

S^je atom síry přítomný na A NH je vázáno na B a

S₂-X-CO je spojka, kde S₂ je atom výše.

buňce, přitom skupina nést jednu nebo více síry a X je definováno

Bude výhodné, jestliže skupiny přítomné na A.

S bude pocházet z thiolové

Bude výhodné, že v případě, že spojka obsahuje chirální centrum, může existovat a také být isolována v opticky aktivní nebo racemické formě. Vynález zahrnuje použití spojek, které jsou ve formě opticky aktivní nebo racemické sloučeniny. Syntéza opticky aktivních forem sloučenin může být provedena z literatury dobře známými standardními technikami, které jsou používány v organické chemii.

Výhodně je A tvořeno toxinovou částí a B obsahuje část vázající se k cílové buňce.

Jak bylo výše konstatováno, může být toxinová část tvořena jakoukoli složkou, která má cytotoxické vlastnosti. Příkladem takových látek jsou polypeptidy, které jsou schopné inaktivovat ribosomy a tudíž inhibovat proteosyntézu. Zvláštními příklady takových polypeptidů jsou ty, které byly nalezeny v přírodě a jejich složky. Pokud takový polypeptid sestává z toxické komponenty a ze zásadně netoxické komponenty, toxinová část konjugátu s výhodou obsahuje toxickou komponentu. Například toxinová část muže být tvořena ricinem, ale s výhodou může být toxinová část tvořena A-řetězcem ricinu. Toxinová část může také zahrnovat části nebo analogy polypeptidů nalezených v přírodě, které mají cytotoxické vlastnosti. Vhodné polypeptidy pro toxinovou část ajejí přípravu jsou popsány v Ribosome inactivating proteins up to dáte - Stripe, F. and Barbieri, L., FEBS 3269, a v citacích zde uvedených. Zejména vhodné polypeptidy pro toxinovou část zahrnují A-řetězec ricinu (ricin A), restriktocin a shiga toxin. Dalšími vhodnými polypeptidy pro toxinovou část mohou být abrin, viskumin, modecin, volkensin, gelonin, protivirální protein plevele, saporin, lufin, protein inaktivující ribosomy ječmene, byodin, momordin, tritin, dodekandrin, mitogellin, záškrtový difteria toxin, exotoxin

A ze pseudomonad a toxiny podobné shiga toxinu, shiga-like toxiny VT1 a VT2.

trichsanthin, dianthiny, alfa-sarcin,

Skupina analog polypeptidů nacházených v přírodě zahrnuje ty polypeptidy, které mají primární strukturu spřízněnou s polypeptidy nalezenými v přírodě do té míry, že se liší jednou nebo několika změnami v aminokyselinách (delece, adice, substituce) které nevedou ke ztrátě cytotoxické aktivity. Zvláštními případy takovýchto analog jsou ty, u nichž změna či změny podporují vazbu k části vázající se k cílové buňce.

V případě, že toxinová část obsahuje polypeptid nalezený v přírodě nebo jeho určitý úsek, může být toxinová část připravena isolaci polypeptidu z přírodního zdroje, a kde je požadována jeho část, modifikací isolovaného polypeptidu chemickými prostředky, například enzymové. Polypeptid nebo jeho část mohou být připraveny pomocí technik genového inženýrství. Tyto techniky zahrnují například takové metody genového inženýství, kde je sekvence DNK kódující požadovaný polypeptid obvykle inkorporována do vhodného vektoru nebo plasmidu. Hostitelské buňky transformované tímto vektorem nebo plasmidem mohou být kultivovány za vhodných podmínek tak, aby došlo k expresi příslušné sekvence DNK a k produkci polypeptidu.

Je výhodné, jestliže toxinová část je tvořena ricinem A, jeho částí nebo analogem. Pokud toxinová část obsahuje ricin A, může být ricin A získán ze semen rostliny Ricinus communis. S výhodou lze však připravovat A-řetězec nebo celý ricin pomocí genového inženýrství. Jsou tedy preferovány rekombinantní ricin A nebo ricin.

Obecně je preferován ricin A získaný metodami genového inženýrství před ricinem získávaným z přirozených zdrojů, vzhledem k tomu, že genové inženýrství umožňuje přípravu ricinu A, který není kontaminován B-řetězcem ricinu a dále také proto, že ricin A připravený tímto způsobem není glykosylován. Proto použití rekombinantního ricinu A vede v důsledku nepřítomnosti cukerných částí schopných vytvářet nespecifické interakce na buněčném povrchu k získání selektivnějšího konjugátu.

Ve výhodné formě, konjugát uváděný v tomto vynálezu je tvořen částí vázající se k cílové buňce, která je selektivní k rakovinným buňkám tlustého střeva a konečníku.

Část vázající se k cílové buňce výhodně obsahuje protilátku C242 nebo její fragment, zejména však protilátku C242.

Toxinová část výhodně spojeny -CO.CH₂·CH(CH)₃-S-.

a část vázající se k cílové buňce jsou přes 3-merkaptobutanový radikál, Tento radikál je vhodně připojen kovalentní vazbou mezi NH skupinou, na části vázající se k cílové buňce, např. NH skupinou lysylového zbytku k části vázající se k cílové buňce, a disulfidickým můstkem s thiolovou skupinou toxinové části, např. thilovou skupinou cysteinového zbytku ricinu A.

Tak tento vynález zejména popisuje imunotoxin, který je tvořen protilátkou C242 a rekombinantním ricinem A, spojených z amino zbytku na C242 k thiolu cysteinového zbytku ricinu A merkaptobutanovým radikálem, -COCH₂CH(CH)₃-S-.

Preferovaný imunotoxin je ten, který je tvořen C242 protilátkou a rekombinantním ricinem A, spojených z koncové aminoskupiny lysylového zbytku v C242 ke koncovému thiolu cysteinového zbytku ricinu A diradikálem 3-merkaptobutanové kyseliny (merkaptomáselné).

Obecné každá jednotka protilátky bude nést alespoň jednu jednotku ricinu A. Bude však výhodné, jestliže jednotka protilátky bude moci přes příslušné spojovací části nést více než jednu jednotku rekombinantniho ricinu A. Tyto další spojovací části mohou nést netoxickou molekulu, např cystein. Takové spojky mohou být tudíž upraveny čepičkou, která je tvořena netoxickou molekulou.

Imunotoxiny popisované v tomto vynálezu mohou být využity při léčení gastrointestinálních nádorů, zejména nádorů tlustého střeva , konečníku a slinivky břišní. Dále tento vynález popisuje metodu léčení gastrointestinálních nádorů, včetně dávkování účinného množství konjugátu (zde definovaného) určeného teplokrevnému savci jako je člověk.

Bude vhodné, jestliže dávka a dávkovači režim budou závislé na použité toxinové části, populaci cílových buněk a pacientovi. Dávka poskytovaného konjugátu se typicky pohybuje v rozsahu od 0,1 do lmg/kg pacientovy hmotnosti.

Konjugáty popisované v tomto vynálezu budou běžně podávány ve formě farmaceutických přípravků. Proto tento vynález též poskytuje popis farmaceutických přípravků, které obsahují konjugát (zde definovaný) spolu s farmaceuticky přijatelnou ředící složkou nebo nosičem.

Farmaceutické přípravky popisované v tomto vynálezu mohou být připravovány v různých dávkách. Obecné, konjugáty popisované v tomto vynálezu budou podávány parenterálně, výhodněji intravenosně. Určitý parenterální farmaceutický přípravek je takový, který je připraven v jednotkové dávkovači formě, která je vhodná pro podání pomocí injekce. Obzvláště vhodné přípravky proto obsahují roztok, emulsi nebo suspensi imunotoxinu spolu s farmaceuticky přijatelným parenterálním nosičem nebo ředící složkou. Vhodné nosiče nebo zředovací složky zahrnují vodné prostředky, např. vodu nebo pufr, a nevodné prostředky, např. fixující oleje nebo liposomy. Přípravky mohou obsahovat činidla, která zvyšují stabilitu konjugátu v přípravku. Například přípravek může obsahovat pufr, popř. Tween. Koncentrace konjugátu bude různá, ale obecně bude konjugát připraven v koncentracích od asi 1 dc 19 mg/dávku.

Protilátka C242 je selektivní vůči nádorovým buňkám tlustého střeva a konečníku a bylo zjištěno, že konjugáty obsahující -:uto protilátku jsou silnými imunotoxiny, které jsou selektivní vůči nádorovým buňkám tlustého střeva a konečníku.

Zejména bylo zjištěno, že výhodný konjugát popisovaný v tomto vynálezu je překvapivě účinným imunotoxinem, a to tím, že je silným a současné selektivním imunotoxinem k nádorovým buňkám tlustého střeva a konečníku. Dále bylo zjištěno, že tento konjugát se vyznačuje relativně malou rychlostí rozkladu v krvi, extracelulárního štěpení a destrukce, což vede ke zlepšení jeho stability v plasmě. Tyto vlastnosti pak přináší potenciální výhodu v poskytnutí dostatečné doby pro interakci imunotoxinu s jeho cílovými buňkami než dojde k rozkladu a destrukci.

Tento vynález dále popisuje způsoby přípravy výše definovaného konjugátu:

a) Takových konjugátů, v nichž část vázající se k cílové buňce je přímo připojena k toxinové skupině, reakcí toxinové části s částí vázající se k cílové buňce.

Například tam, kde je část vázající se k cílové buňce připojena k toxinové části disulfidickým můstkem, mohou být jedna z částí vázající se k cílové buňce a toxinová část redukovány, před reakcí s jinou částí vázající se k cílové buňce a toxinovou částí, a to např. za použití dithiothreitolu.

Takových konjugátů u nichž část vázající se k cílové buňce je připojena spojkou s toxinovou částí, reakcí části vázající se k cílové buňce se spojkou a toxinovou částí nebo reakcí toxinové části, která je derivatisována spojkou, s částí vázající se k cílové buňce.

Příslušná část je derivatisována reakcí se spojovacím činidlem tak, aby došlo k vazbě spojky k dané části. Vhodně derivatisovaná část vázající se k cílové buňce reaguje s toxinovou částí.

Derivatisovaná část vázající cílovou buňku nebo derivatisovaná toxinová část může být připravena například rozpuštěním této části ve vhodném pufru (jako je acetátový, fosfátový nebo borátový tlumivý roztok) a úpravou pH na hodnotu odpovídající vazebnému činidlu. Vazebné činidlo pak může být přidáno k reakční směsi. V případech, kde je vazebné činidlo nerozpustné v reakční směsi, může být část vázající cílové buňky nebo toxinová část, podle toho co je vhodnější, přidána k roztoku vazebného činidla v malém množství organického rozpouštědla jako je dimethylsulfoxid nebo dimethylformamid. Následně po reakci s vazebným činidlem může být derivatisovaný produkt separován standardními postupy jako je gelová filtrace, dialysa nebo kolonová chromatografie. Derivatisovaný produkt (derivát části vázající cílovou buňku nebo derivát toxinové části) pak může být podroben reakci s druhou částí, aby byl získán konečný konjugát.

Snahou bude, aby přesná povaha vazebného činidla byla zvolena v závislosti na povaze funkčních skupin (například thiolové, karboxy- nebo aminoskupiny), které jsou na části vázající se k cílové buňce nebo na toxinové části dostupné pro konjugaci.

Toxinová část může být připravena z přírodních zdrojů. S výhodou lze toxinovou část připravit pomocí metod genového inženýrství. Tato technika využívá techniky dobře známé těm, kdo mají zkušenost v oboru a zahrnuje postupy pro extrakci mRNA, přípravu knihoven cDNA, konstrukci vektorů, transformaci buněk a kultivaci transformovaných hostitelských buněk, jejichž výsledkem je dosažení exprese toxinového polypeptidu. Vhodnými hostiteli pro expresi požadovaných toxinových částí mohou být prokaryota, například E. coli, a eukaryota, například kvasinky. Tyto postupy jsou ilustrovány v níže popsané přípravě konjugátů.

část vázající cílovou buňku se skládá obecně z protilátky, z fragmentu protilátky nebo derivátu. Výhodně představuje protilátku monoklonální protilátka. Protilátky lze připravovat dobře známými metodami. Mohou být připravovány ze séra, ze sleziny a z hybridomů vylučujících protilátky.

Příprava protilátek je například popsána v Methods in Enzymology; Volume 178; Antibodies, Antigens and Molecular Mimicry, Edited by J. Langone, Academie Press, lne. (viz. zejména Section II: Engineered Antibodies); a Methods in Enzymology; Volume 73; Immunochemical Techniques Part B; edited by J. Langone and H. Van Vunakis; Academie Press, lne. (viz. zejména Section I: Production of Antibodies).

Pokud je spojka tvořena skupinou -S-X-CO-, protilátka (nebo toxinová část) může být derivatisována reakcí se sloučeninou vzorce L₁-S-X-CO-L₂, kde a L₂ jsou zaměnitelné skupiny. Například CO-L₂ může být tvořena skupinou odvozenou od karboxylové kyseliny nebo, s výhodou, od aktivované karboxylové kyseliny. Například skupina CO-L₂ může obsahovat esterovou nebo anhydridovou skupinu. Zvláštními příklady L₂ jsou imidazolová skupina nebo sukcinimidylesterová skupina, může obsahovat skupinu, která je nahrazena při oxidaci thioskupiny, například může obsahovat pyridinovou skupinu.

Spojka obecně reaguje s redukovanou protilátce nebo na toxinové části části).

thiolovou skupinou na (výhodné na toxinové

Pokud jsou používány jiné spojky, pak reakce s protilátkou a toxinovou částí je prováděna v oboru známými metodami. Obecně spojka reaguje s příslušnými dostupnými funkčními skupinami na části vázající se k cílové buňce a na toxinové části. Část vázající se k cílové buňce a toxinová část mohou být spojeny přímo vytvořením kovalentního spojení, například disulfidické vazby.

Pokud toxinová část obsahuje sulfhydrylovou skupinu, jako je skupina cysteinového zbytku, může být tato použita při konjugaci. Například ji lze použít k vytvoření disulfidového můstku se sulfhydrylovou skupinou na části vázající se k cílové buňce nebo na spojce. Tam, kde sulfhydrylová skupina není v toxinové části přítomna, lze tuto derivatisovat příslušnou skupinu derivatisace může iminothiolanu.

takovým způsobem, aby obsahovala a tak umožnila konjugaci. Taková být například provedena pomocí

Pokud jsou použity polypeptidové spojky, spojka může reagovat s volnými karboxy- nebo aminoskupinami na toxinu nebo na části vázající se k cílové buňce.

Pokud toxinová část obsahuje A-řetězec ricinu a spojka obsahuje dvojradikál -COCH₂CH(CH₃)-S-, pak vhodným vazebným činidlem je N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrát. S výhodou lze k přípravě takového imunotoxinu použít postup, kdy reaguje derivatisovaná část vázající se k cílové buňce s redukovaným ricinem A.

Část vázající se k cílové buňce je derivatisována reakcí s vazebným činidlem jako je N-sukcinimidyl-3-(2pyridyldithio)butyrát, a A-řetězec ricinu je redukován reakcí s vhodným redukčním činidlem aby došlo k redukci thiolové skupiny na volnou cysteinovou skupinu, například použitím dithiothreitolu.

S výhodou lze použít přebytku vazebného činidla, takže derivatizovaná část vázající se k cílové buňce obsahuje více než jednu spojku. Následně po reakci s ricinem A lze jakékoli vazebné skupiny, které nejsou vázány k ricinu A, zamaskovat reakcí s blokující skupinou, například s cysteinem.

Konjugáty, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, jsou potenciálně užitečné při léčení nádorů. Toto lze demonstrovat na schopnosti konjugátů inhibovat syntézu bílkovin v nádorových buňkách in vitro, a/anebo na schopnosti konjugátů redukovat velikost tumorů nebo jejich růst in vivo. Deatily příslušných testovacích postupů jsou uvedeny níže.

Stručný popis obrázků:Obrázek 1 ilustruje konstrukci pICI 0020;

Obrázek 2 ilustruje konstrukci pTB344;

Obrázek 3 ilustruje konstrukci picí 0042;

Obrázek 4 ilustruje konstrukci pICI 1079;

Obrázek 5 ilustruje konstrukci pICI 1187;

Obrázek 6 ilustruje SDS gel lyzátů E.coli obarvený Coomassie blue, kde proužek A odpovídá pICI 1102; B je pICI 0020, a C jsou markéry molekulové váhy;

Obrázek 7 ilustruje gelový profil pICI 1102 v němž pík R představuje ricin A;

Obrázek 8 znázorňuje western blot ricinu A pICI 1102, v němž dráhu 1 představují markéry molekulové váhy; 2 a 3 jsou kmeny neprodukující ricin; 4 je pICI 1102, a 5 je pICI 0020 (kontrolní plasmid se sekvencí non-ricin A);

Obrázek 9 je parciální sekvence pICI 1102;

Obrázek 10 ilustruje konstrukci pICI 1102;

Obrázek 11 popisuje fragment použitý při přípravě plasmidů; Obrázek 12 je plasmidová mapa pICI 0042;

Obrázek 13 ilustruje sekvenci terminátoru transkripce;

Obrázek 14 je mapa plasmidu pICI 1079;

Obrázek 15 ilustruje endocytosu ¹²⁵I-C242 buňkami COLO 205; Obrázek 16 ilustruje in vitro cytotoxicitu imunotoxinu C242/ricin A vůči buňkám COLO 205;

Obrázek 17 zobrazuje protilátku;

Obrázek 18 ilustruje sekvenci cDNA řetězce kappa C242, variabilní oblasti (cDNA v plasmidu pKGE761); a Obrázek 19 ilustruje sekvenci cDNA těžkého řetězce C242, variabilní oblasti (cDNA v plasmidu pKGE762);

Vynález bude nyní dokumentován následujícími Příklady, které však předmět vynálezu nikterak neomezují a v nichž, pokud není uvedeno jinak:(i) odpařování bylo prováděno na rotačním odpařováku ve vakuu;

(ii) operace byly prováděny při pokojové teplotě, tzn. v rozsahu od 18 do 26°C (iii) udávané výtěžky jsou uváděny pouze za účelem lepší představy a jejich hodnota tedy není nezbytně maximem, které by bylo dosažitelné pečlivým vývojem procesu (v) protonová NMR spektra byla běžně stanovována při 200 MHz v deuterovaném dimethylsulfoxifu použitém jako rozpouštědlo, s využitím tetramethylsilanu jako vnitřního standardu, a jsou vyjádřena jako chemické posuny (delta hodnoty) v ppm (dílech na milion) vztažených k TMS za použití konvenčních zkratek pro popis hlavních píků (signálů): s, singlet, m, multiplet, t, triplet, br, široký, d, dublet, a (vi) následující zkratky představují:

BSA - hovězí sérový albumin PBS - fosfátový tlumivý roztok s NaCl IPTG - isopropylthio-beta-galaktosid EtOH - ethanol

SDS-PAGE - elektroforézu prováděnou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného

PŘÍPRAVA IMUNOTOXINU RICIN A/C242

Roztok monoklonální protilátky C242 (200mg) ve fosfátovém pufru (fosfát sodný/150mM chloridu sodného pH 7,2) v koncentraci 4,4 mg/ml byl zakoncentrován membránovou filtrací (s membránou Amicon YM10) na koncentraci 12mg/ml při 4°C. Koncentrát byl dále zředěn polovinou objemu borátového pufru (100 mM borát sodný pH 9,1). Koncentrace bílkoviny byla určena měřením absorbance při vlnové délce 280 nm a pH směsného roztoku bylo stanoveno na hodnotu 8,8 +/- 0,1.

N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrát (spojka) byl rozpuštěn v suchém redestilovaném dimethylformamidu nebo acetonitrilu v koncentraci 10 mg/ml. Alikvot tohoto roztoku (0,325 ml), obsahující 3,25 mg N-sukcinimydyl-3-(2-pyridyl dithio)butyrátu, byl okamžité přidán do roztoku koncentrované protilátky. Výsledný roztok byl po zamíchání ponechán stát jednu hodinu při teplotě 20°C. Dále byl roztok aplikován na odsolovací kolonu (G-25 Sephadex-Pharmacia, o rozměrech 2,6x58 cm, průtokem 2 ml/min, ekvilibrovanou 50 mM roztokem fosfát sodný/150mM chlorid sodný/1 mM EDRA pH 8,0), aby mohl být odstraněn přebytek činidel a byla provedena záměna pufru derivatisované protilátky. Jiným způsobem, který lze použít pro odstraněním reakčních produktů je metoda filtrace s příčným tokem. Odsolená derivatisovaná protilátka byla jímána a výsledná koncentrace protilátky byla stanovena měřením absorbance při vlnové délce 280 nm. Rozsah derivatisace spojkou byl určen po přidání přebytku dithiothreitolu a měřením uvolňování volných thiopyridylových skupin při vlnové délce 343 nm. Bylo zjištěno, že rozsah derivatisace představuje 4-6 skupin spojky na mol protilátky.

ricin A, redukce byla provedena který byl přidán k roztoku ricinu 8,0, byl zakoncentrován metodou . Přebytky činidel byly odstraněny (G-25 Sephadex - Pharmacia, s průtokem 2 ml/min, v roztoku sodného/150 mM chloridu sodného/lmM

Redukovaný rekombinantní působením dithiothreitolu, A ve fosfátovém pufu pH filtrace s příčným tokem kolonovou chromatografií o rozměrech 2,6x58 cm, obsahujícím 50mM fosfátu EDTA pH 8,0)

Rekombinantní ricin A byl konjugován s derivatisovanou protilátkou smícháním připraveného rekombinantního Ricinu A (190 mg) a derivatisované protilátky (190 mg) v poměru 1:1 w/w Ricin A/ derivatisovaná protilátka. Byl přidán glycerol aby výsledná koncentrace byla 20% v/v a nádoba byla promývána argonem. Výsledný roztok byl uchováván od 40 do 65 hodin při 15°C.

V dalším byl přidán cystein do výsledné koncentrace 0,2 mM (a v nejméně desetinásobném molárním přebytku oproti vazebným skupinám na protilátce) za účelem zamaskování přebytečných vazebných skupin na protilátce. Roztok byl míchán a udržován při teplotě 20°C po dobu 2-3 hodin. Následně po zamaskování cysteinem byl vzorek výsledného imunotoxinu analysován po přídavku přebytku dithiothreitolu a při 343 nm bylo kvantitativně zhodnoceno ukončení reakce.

Roztok obsahující konjugát byl poté zakoncentrován membránovou filtrací (membrána Amicon YM10) a nanesen na chromatografickou kolonu (HR300 Sephacryl - Pharmacia, 2,6 x 50 cm, průtok 3 ml/min, pufr 50 mM fosfát sodný/25 mM chlorid sodný/1 mM EDTA). Výsledkem bylo oddělení imunotoxinu a nekonjugované protilátky od nekonjugovaného Ricinu A. Pík obsahující směs imunotoxinu a protilátky byl shromážděn a koncentrace bílkoviny byla stanovena měřením absorbance při vlnové délce 280 nm.

Vynález bude nyní dokumentován následujícími Příklady, které však předmět vynálezu nikterak neomezují, v nichž jsou použity běžné zkratky, jako je BSA - hovězí sérový albumin; PBS - fosfátový tlumivý roztok s NaCl; IPTG

- isopropylthiogalaktosid; EtOH - ethanol; a SDS-PAGE

- elektroforesa v polyakrylamidovém gelu (PAGE) s dodecylsulfátem sodným (SDS).

PŘÍPRAVA IMUNOTOXINU RICIN A/C242

Roztok monoklonální protilátky C24 2 (200 mg) ve fosfátovém pufru s NaCl (fosfát sodný/150 mM chlorid sodný pH7,2) o koncentraci 4,4 mg/ml byl zahuštěn na 12 mg/ml membránovou filtrací (membrána Amicon YM10) při 4°C. Koncentrát byl zředěn polovinou objemu borátového pufru (100 ml borátu sodného pH9,l). Koncentrace bílkoviny byla stanovena měřením absorbance při 280 nm a pH směsného roztoku bylo stanoveno na 8,8 +/- 0,1.

N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrát (spojka) byl rozpuštěn v suchém redestilovaném dimethylformamidu nebo acetonitrilu v koncentraci 10 mg/ml. Alikvotní díl tohoto roztoku (0,352 ml), obsahující 3,52 mg N-sukcinimidyl-3-(2pyridyldithio)butyrátu byl ihned přidán ke koncentrovanému roztoku protilátky. Vzniklý roztok byl míchán a potom ponechán stát při 15°C po dobu jedné hodiny. Roztok byl dále nanesen na odsolovací kolonu (Sephadex G25 - Pharmacia, 2,6 x 58 cm, průtok 2 ml/min, ékvilibrováno roztokem 50 mM fosfátu sodného/150 mM chloridu sodného/1 mM EDTA pH8,0) za účelem odstranění přebytečných činidel a záměny pufru u derivatisované protilátky. Alternativně mohou být reakční produkty odstraněny také filtrací s příčným prouděním. Odsolená derivatisovaná protilátka byla nahromaděna a koncentrace bílkoviny stanovena měřením absorbce při 280 nm. Rozsah derivatisace spojkou byl stanoven přídavkem a měřením množství uvolněných skupin při 343 nm. Rozsah přebytku dithiothreitolu volných thiopyridylových derivatisace byl protilátky.

stanoven jako 4 až 6 skupin spojek na mol

Rekombinantní ricin A byl redukován reakcí roztoku ricinu A ve fosfátovém pufru při pH 8 s přebytečným dithithreitolem a zakoncentrován filtrací činidla byla odstraněna G25 - Pharmacia, 2,6 x s příčným prouděním. Přebytečná kolonovou chromatografií (Sephadex 58 cm, průtok 2 ml/min, v 50 mM fosfátu sodného/150 mM chloridu sodného/1 mM EDTA pH 8,0).

Rekombinantní ricin A byl konjugován s derivatisovanou protilátkou smícháním připravených roztoků rekombinantního Ricinu A (190 mg) a derivatisované protilátky (190 mg) ve váhovém poměru 1:1 w/w Ricin A/derivatisovaná protilátka. Byl přidán glycerol do 20 % objemových (v/v) a nádoba byla promyta argonem. Výsledný roztok byl uchováván při 15°C po dobu 40 až 65 hodin.

Dále byl přidán cystein do konečné koncentrace 0,2 mM (a v nejméně desetinásobném molárním přebytku nad vazebnými skupinami na protilátce) za účelem zamaskování přebytečných vazebných skupin na protilátce. Roztok byl míchán a udržován při teplotě 20°C po dobu 2-3 hodin. Následně po zamaskování cysteinem byl vzorek výsledného imunotoxinu analysován po přídavku přebytku dithiothreitolu a při 343 nm bylo kvantitativně zhodnoceno ukončení reakce.

zakoncentrován a aplikován na Pharmacia, 2,6

Roztok obsahující konjugát byl poté membránovou filtrací (membrána Amicon YM10) chromatografickou kolonu (HR300 Sephacryl x 50 cm, průtok 3 ml/min, pufr 50 mM fosfát sodný/25 mM chlorid sodný/1 mM EDTA). Výsledkem bylo oddělení imunotoxinu a nekonjugované protilátky od nekonjugovaného Ricinu A. Pík obsahující směs imunotoxinu a protilátky byl shromážděn a koncentrace bílkoviny byla stanovena měřením absorbance při 280 nm.

U výsledného roztoku obsahujícího jak nekonjugovanou protilátku, tak imunotoxin, bylo upraveno pH na 6,3 přídavkem 1 M HCl a roztok byl aplikován na kolonu obsahující nosič s triazinovým barvivém (Mimetic A6XL, ACL plc, Cambridge, UK., 8 x 26 cm, průtok 1,5 ml/min). Kolona byla promyta 100 ml startovního pufru, který vymývá nekonjugovanou protilátku, a imunotoxin byl eluován startovním pufrem s přídavkem 0,5 M chloridu sodného. Roztok imunotoxinu byl dialysován proti fosfátovému pufru s NaCl, zfiltrován přes filtr s velikostí pórů 0,22 mikronů a uskladněn při 4°C.

Čistota imunotoxinu byla stanovena elektroforézou v polyakrylamidovém gelu s SDS a bylo zjištěno, že obsahuje celkově 45 mg imunotoxinu o složení: 50-60% derivátu Ricinu A, 10-30% diderivátu Ricinu A, 5-15 % triderivátu Ricinu A a < 10% nederivatisované protilátky.

Alternativně, provedení gelové filtrace (krok při kterém je odstraněn residuální r-ricin A) a afinitní chromatografie s barvičkou (krok, kdy je odstraněna residuální protilátka C-242) může být převedeno a uskutečněno při purifikaci. V takovém případě je konjugační směs ihned po provedení blokování nezreagovaných částí spojky pomocí cysteinu, ihned zředěna destilovanou vodou, aby výsledná vodivost roztoku měla hodnotu menší než 5mS. Dále je pomocí 1M kyseliny octové upraveno pH na 6,0 a roztok je vyčeřen membránovou filtrací. Roztok je dále aplikován na kolonu s barevným ligandem (2,5 ml gelu/mg r-ricinu A použitého v konjugační směsi. Kolona je promývána 0,68% octanem sodným pH 6,0 dokud nedojde k vymytí nekonjugované protilátky C242 a residuální r-ricin A mohou být fosfátovém pufru při pH 7,0, 0,5 s ohledem na koncentraci chloridu sodného. Tento eluát je dále zahuštěn metodou filtrace s příčným tokem využívající ultrafiltrační systém se z kolony. Imunotoxin z kolony eluovány ve 20mM spirálovou patronou a aplikován na kolonu se Sephacrylem S300HR (2,5 ml gelu na každý mg protilátky použité v původní konjugační reakci a v objemu <5%celkového objemu kolony). Kolona může být ekvilibrována jakýmkoli vhodným tlumivým roztokem jako je např. fosfátový pufr s NaCl pH 7,2.

PŘÍPRAVA SPOJKY

N-sukcinimidyl-(R)-3-(2-pyridyldithio)butyrát, výše používaný, byl připraven následujícím postupem v němž, není-li uvedeno jinak:

(i) odpařování bylo prováděno na rotačním odpařováku ve vakuu;

(ii) operace byly prováděny při pokojové teplotě, tzn. v rozsahu od 18 do 26°C (iii) udávané výtěžky jsou uváděny pouze za účelem lepší představy a jejich hodnota tedy není nezbytně maximem, které by bylo dosažitelné pečlivým vývojem procesu (v) protonová NMR spektra byla běžně stanovována při 200 MHz v deuterovaném dimethylsulfoxifu použitém jako rozpouštědlo, s využitím tetramethylsilanu jako vnitřního standardu, a jsou vyjádřena jako chemické posuny (delta hodnoty) v ppm (dílech na milion) vztažených k TMS za použití konvenčních zkratek pro popis hlavních píků (signálů): s, singlet, m, multiplet, t, triplet, br, široký, d, dublet, a

N-sukcinimidyl-(R)-3-(2-pyridyldithio)butyrát

N-sukcinimidyl-(R)-3-(2-pyridyldithio)butanová kyselina (90,0g, 0,393 molu) byla rozpuštěna při pokojové teplotě v dichlormethanu (630 ml) za současného míchání. N-hydroxysukcinimid (45,2 g, 0,393 molu, 1,0 molární ekvivalenty) byl přidán a převeden do směsi spláchnutím dichlormethanem (90 ml). Směs byla za současného chlazení při -2°C míchána po dobu 30 minut. Roztok dicyklohexylkarbodiimidu (81,08 g, 0,393 molu, 1 molární ekvivalenty) v dichlormethanu (540 ml) byl přidáván v průběhu 35 minut, zatímco reakční teplota byla udržována na 0°C +/2°C, a spláchnut do směsi dichlormethanem (90 ml). Roztok byl míchán při teplotě 0 - 10°C po dobu 3 hodin a 15 minut a poté nechán ohřát na pokojovou teplotu. Roztok byl přefiltrován, aby se odstranila pevná dicyklohexylmočovina, která byla promyta dichlormethanem (2 x 180 ml). Filtrát byl odpařen za sníženého tlaku při 20 - 22°C až do vzniku hnědého olejovitého zbytku (150 g). Tento olej byl přečištěn chromatografií na koloně silikagelu Kieselgel 60, 230 - 400 mesh (1180 g) připraveného ve směsi toluen/ethylacetát 80 : 20 v/v. Eluce směsí toluen/ethylacetát (80:20 v/v) poskytla po odpaření ve vakuu (0,25 mbar) při 28°C N-sukcinimidyl-(R)-3-(2-pyridyldithio) butyrát (52 g) ve formě bledě žluté gumy.

NMR:

1.5 (d,3H), 2,85 (m, 4H), 2,8 (dd, 1H), 3,2 (dd, 1H), 3,5 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 7,7 (m, 2H), 8,5 (d, 1H).

Hmotová spektroskopie využívající ionisace po srážce s elektronem ukázala, že sloučenina má molekulovou hmotnost

326, s fragmentací shodnou se strukturou N-sukcinimidyl(R)-3-(2-pyridyldithio)butyrátu.

Výchozí materiál byl připraven následujícím způsobem:a. (R)-3-HYDR0XYBUTAN0VÁ KYSELINA

Methyl (R)-3-hydroxybutyrát (1,670 kg, 14,152 mol) byl ochlazen v lázni z ledu a ethanolu. Byla přidána voda (4698 ml), a poté 47% W/W hydroxyd sodný (965 ml, 16,98 mol, 1,2 molárních ekvivalentů), a to takovou rychlostí, aby se teplota udržela na 0°C +/- 2°C. Reakční směs byla míchána při 0°C po další 1 hodinu a 30 minut. Koncentrovaná kyselina chlorovodíková (1490 ml, 16,98 mol, 1,22 molárních ekvivalentů) byla přidána k reakční směsi v průběhu 35 minut, zatímco teplota byla udržována na, nebo méně než 5°C, tak aby konečné pH bylo 1,5. Ke směsi byl potom přidán chlorid sodný (1061 g) a vodná směs byla extrahována methyl-terc. butyletherem (10 x 3,5 1). Extrakty byly, spojeny a rozpouštědlo bylo odstraněno destilací ve vakuu při pokojové teplotě za vzniku zbytku. Zbytek byl smíchán s toluenem (7,5

1), a těkavý materiál byl odstraněn destilací ve vakuu až poskytl (R)-3-hydroxybutanovou kyselinu (1189 g, 81%) ve formě oleje. Tento olej byl ochlazen na teplotu 4°C a po přidání krystalizačních jader poskytl pevnou látku.

b. (S)-beta-BUTYROLAKTON (R) -3-hydroxybutanová kyselina (530 g, 5,096 molu) byla smíchána s triethylorthoacetátem (1322,8 g, 1488 ml, 8,154 mol, 1,6 molárních ekvivalentů) při 25-30°C za vzniku zakaleného roztoku (zákal je připisován přítomnosti zbytků chloridu sodného z předchozího kroku).

Aby byly odstraněny těkavé složky byl roztok za vysokého vakua (1,0 mm) při 30°C odpařován. Zbylá kapalina (1001 g), obsahuj ící (2S,6R) -2-ethoxy-2,6-dimethyl-l,3-dioxan-4-on, byla dvě hodiny zahřívána při 80°C a poté ochlazena na 40°C. Surový produkt byl destilován ve skleněné koloně (50 cm x 3,5 cm v průměru) naplněné Rashigovými kuličkami, za vzniku (S)-butyrolaktonu (57,3 g), s bodem varu 59-62°C při 10-12 mbarech.

C. (R)-3-MERKAPTOBUTANOVÁ KYSELÍNA (S) - -butyrolakton (91,13 g, 1,058 molu) byl za stálého míchání dusíkem ochlazen na 5°C. Při udržování teploty na 5°C byla přidána thioloctová kyselina (80,57 g, 75,65 ml, 1,058 molu, 1,0 molární ekvivalenty). Triethylamin (146,7 ml, 1,058 molu, 1,0 molární ekvivalenty) byl při udržování reakční teploty na -5°C - +5°C přidáván po dobu 45 minut. Po odstranění ochlazovací lázně vzrostla teplota na 65°C za vzniku žlutooranžového roztoku. Reakční směs byla ochlazena na 10°C a dále míchána přes noc při pokojové teplotě. Roztok byl ochlazen na 0°C a byla přidána voda (93 ml). Dále byla směs ochlazena na -10°C a poté byl přidáván roztok hydroxidu sodného (185 ml 47% w/w a 9 2 ml vody), a to takovou rychlostí, aby se reakční teplota pohybovala v rozmezí od

-10°C do +10°C. Dále byla směs míchána půl hodiny při -5°C a poté byla ponechána při pokojové teplotě. Směs byla promyta methyl-1,1-dimethylethyletherem (methyl-terč.butyletherem) (265 ml). Vodná vrstva byla zředěna vodou (185 ml), ochlazena na 0°C a poté byla přidána při teplotě 0-10°C koncentrovaná kyselina chlorovodíková (270 ml) až do dosažení pH roztoku

1-2. Vodná směs byla dále extrahována methyl-terc.butyletherem (2x265 ml). Organické extrakty byly spojeny, promyty vodou (265 ml), vysušeny bezvodým síranem hořečnatým a odpařeny za sníženého tlaku při 30°C za vzniku oranžového oleje (132,8 g). Tento olej byl purifikován vakuovou destilací za vzniku (R)-3-merkaptobutanové kyseliny (86,6 g), s bodem varu 96-100°C při 2 mbarech.

d. PYRIDIN-2-SULFENYLCHLORID

2,2 -dipyridyldisulfid (110,0 g 0,5 molu) byl rozpuštěn v dichlormethanu (800 ml) při pokojové teplotě za vzniku světle žlutého roztoku, který byl ochlazen na 0°C. Roztok byl probubláván chlorem při teplotě 0-5°C. Po 3 hodinách a 25 minutách byl roztok chlorem nasycen a jeho barva se změnila na zlatohnědou. Roztok byl za účelem odstranění chlóru zahuštěn při 0-5°C za sníženého tlaku a pyridin-2-sulfenylchlorid byl vysrážen jako žlutá tuhá látka. Tato látka (11,8 g) byla filtrací spojena a promyta dichlormethanem. Filtrát dichlormethanu (1624 g) obsahoval dalších 133 g pyridin-sulfenylchloridu.

e. (R)-3-(2-PYRIDYLDITHIO)BUTANOVÁ KYSELINA

Pyridin-2-sulfenylchlorid (11,8 g žluté pevné látky a 1035 g roztoku v dichlormethanu výše připraveného, 0,667 molu celkové, 1,0 molárních ekvivalentů) bylo zředěno dichlormethanem (50 ml). Směs byla při pokojové teplotě míchána po dobu 5-10 minut .a posléze ochlazena na -5°C. Při teplotě udržované na -5°C - 0°C byl přidán roztok (R)-3-merkaptobutanové kyseliny (80,0 g , 0,667 molu) v dichlormethanu (400 ml). Směs byla přes noc míchána při pokojové teplotě za vzniku hnědého oleje a žluté horní vrstvy. Byla přidána voda (485 ml) a směs byla ochlazena na 5°C. Dále byl přidáván 2N roztok hydroxidu (385 ml) až do dosažení pH 4,55. Vrstva dichlormethanu byla oddělena a zbývající vodná fáse byla extrahována dichlormethanem (200 ml). Extrakty vzniklé po extrakci dichlormethanem byly spojeny, vysušeny bezvodým síranem hořečnatým, odpařovány za sníženého tlaku za vzniku světle hnědého oleje. Olej byl prudce zamíchán s hexanem (325 ml) a ochlazen v ledové lázni než se vytvořila pevná látka. Směs byla míchána 3 hodiny, pak byla filtrací sebrána hnědá krystalická tuhá látka, která 2x162 ml), vysušena přes noc při ve vakuu za vzniku byla promyta hexanem pokojové teplotě (R)-3-(2-pyridyldithio)butanové kyseliny (140 g).

NMR:

1,45 (d,3H), 2,6 (dd,lH), 2,8 (dd,lH), 3,4 (m,lH), 7,l(m,lH), 7,7(m,2H), 8,5 (m,lH).

PŘÍPRAVA PROTILÁTKY C242 (C242:II)

Vytvoření hybridomové buněčné linie a produkce C242:II

Příprava suspenze slezinných buněk

Buněčná linie lidských nádorových buněk tlustého střeva a konečníku, COLO 205, komerčně dostupná ve sbírce American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. , USA, pod číslem CCL 222, běžné kultivovaná v Iscoveho mediu MEM doplněném 10% telecím zárodečným šerem (FCS). buňky byly před slitím sklizeny, obvykle 2a 3 dny po subkultivaci a třikrát před imunizací promyty fosfátovým pufrem s NaCl.

BALB/c myš, 4-6 týdnů stará, byla intraperitoneálně imunizována první dávkou 3xl0⁷ COLO 205 buněk suspendovaných v roztoku 0,lml fosfátového pufru s NaCl. Zvířatům byla potom injikována další dávka 0,1 ml suspenze obsahující 3xl0⁷ COLO 205 buněk. Po čtyřech dnech byla zvířata zabita a sleziny z nich byly vyňaty. Sleziny byly dále rozvolněny v jednobuněčnou suspenzi.

Příprava hybridomu

Q *

1,2 x 10° buněk sleziny z výše uvedene buněčné suspense byly rozděleny do dvou zkumavek. Do každé zkumavky bylo navíc přidáno 10° myelomových buněk z buněčné linie myšího myelomu Sp2/0 (dostupného se sbírky American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. , USA, pod číslem CRL 1581). Obé zkumavky byly odstředěny a veškerá kapalina byla slita. Do každé zkumavky byly dále pomalu přidávány 2 ml roztoku PEG o teplotě 37°C (10 g PEG M_w 4000, 1 ml DMSO a 10 ml monoklonálového fysiologického roztoku) během jedné minuty a za stálého míchání. Zkumavky byly potom přemístěny do vodní lázně o teplotě 37°C na 90 sekund za jemného míchání. Fúze byla přerušena přidáním fysiologického roztoku pufru do každé zkumavky podle následujícího schématu: 2 ml během prvních 30 sekund, 6 ml během dalších 30 sekund a dalších 32 ml v průběhu jedné minuty. Po vymytí buněčné suspense kultivačním mediem byly buňky suspendovány v celkem 100 ml kultivačního media doplněného hypoxanthinem/ aminopterinem/thymidinem (HAT). Kultivačním mediem bylo medium dle Iscoveho MEM doplněné o 10% FCS, L-asparagin (36 mg/1), L-arginin-HCl (116 ml/1), kyselinu listovou (10 mg/1), L-glutamin (292,3 mg/1), pyruvát sodný (110,1 mg/1) a merkaptoethanol (3,49 ul/11). Alikvoty o 50 ul byly přeneseny do jamek v miskách určených pro tkáňové kultury, z nichž každá obsahovala 96 jamek. Do jamky bylo předem naneseno 250 ul suspense makrofágů z myší BALB/c (2 χ 10⁴ buněk/ml) v kultivačním mediu doplněném HAT. Medium bylo vyměněno 6 dní po fúzi.

Analýza hybridomů produkujících protilátky

V mediu byla po 6 dnech kultivace, jak je výše uvedeno, sledována přítomnost positivních COLO 205 protilátek tak, jak je popsáno Kenettem v Enzyme-linked antibody assay with cells attached to plyvinyl chloride plates. Monoclonal Antibodies, Hybridomas, Anew dimension in biological analyses, ed. H.R.Kennett, T.J. McKelvin, K.B. Bechtol, Plenům Press, New York 1980. V krátkosti, bylo do jamek Nunc imunodestiček typu IIF naneseno 2 x 10⁵ buněk /jamku s COLO 205 buňkami (1 mg/100 ml PBS), nanášený objem byl 50 ul.

Výše uvedené kultivační medium získané po 6 dnech kultivace bylo naneseno do jamek, a to v objemu 50 ul/jamku. Po inkubaci, která trvala celou noc při pokojové teplotě bylo přidáno s peroxidasou konjugované myší Ig (Dakopatts P260, Dakopatts A/S, Copenhagen, SNR) rozpuštěné (1/500) v 1% BSA-PBS v množství lOOug/jamku a následovala inkubace přes noc při pokojové teplotě. Substrát ve formě OPD tablet Dako S2000 rozpuštěný v 12 ml citrátového pufru, pH 5,0 s 5 ul 30% peroxidu vodíku byl přidán v objemu 100 ul/jamku a po následující inkubaci byla měřena absorbance při vlnové délce 450 nm.

Přibližně bylo testováno 600 hybridomových klonů. Nejdříve bylo testováno 190 z těch, které reagovaly s COLO 250 buňkami. 177 z nich reagovalo též s obyčejnými lidskými lymfocyty, které byly připraveny pomocí zařízení Lymphoprep z Nyegaardu A/S, Norsko a ty nebyly dále používány. Klon získaný z jednoho ze zbylých klonů byl určen jako hybridom C242, který svým isotypem patří do třídy IgGl. C242 hybridom byl dále podroben řadě dalších subklonovacích kroků, pomocí nichž byl na konci získán výsledný stabilní klon označený jako C242:II, produkující monoklonální protilátku.

C242 byl nejdříve klonován za vzniku klonu nazvaném C242:5. Tento klon byl obratem dále klonován za vzniku klonu C242:5:2. V průběhu obou klonovacích postupů byla hybridomová suspenze rozpuštěna v kultivačním mediu doplněném o směs hypoxanthin/thymidin (HT) tak, aby výsledná hustota byla 4 buňky na ml. 50 ul (0,2 buněk) bylo přeneseno do každé jamky v kultivačních miskách obsahujících 96 jamek do nichž bylo předem naneseno 250 ul Balb/c myší makrofágové suspense v HT doplněném mediu (5 χ 10³ makrofágů na jamku). Po 2-5 dnech, jednobuněčné klony byly visuálně detekovány v mikroskopu. Šestý den bylo medium vyměněno a alikvoty media byly anylysovány z hlediska kvantitaivního obsahu protilátek vázajících COLO 205 buňky, avšak nevázající, při použití Elisa testu jak je výše popsáno, obyčejné lidské buňky. Nej lepší klony, poskytující positivní reakci při COLO 205 ELISA testu po provedení negativní reakce s obyčejnými buňkami, byly vybrány a před dalším použitím byly v nádobkách zmraženy kapalným dusíkem.

produktivita kultivačních

Před provedením třetího klonování byly buňky rozmraženy a kultivovány v mediu DMEM (Dulbeccovo modifikované Eagleovo medium) (5% FCS). Do jamek kultivačních destiček s 96 jamkami byly zaočkovány buňky v hustotě 3 buňky na jamku. Klonování bylo prováděno v DMEM mediu s 5% FCS a myšími makrofágy užívanými jako buněčný dávkovač. Na této destičce se objevilo 30 klonů z nichž 16 bylo nefelometricky testováno na produkci IgG. Specifita protilátek byla určována výše popsaným ELISA testem. 12 z těchto klonů produkovalo IgG. 10 klonů bylo dále rozetřeno na kultivační destičku obsahující 24 jamek a kultivační medium izolované z destičky bylo testováno na produkci a specifitu IgG. Tato selekce byla ukončena získáním 4 klonů s relativně vysokou produktivitou. Konečná těchto 4 klonů byla provedena v duplicitních nádobách pro tkáňové kultury. Byl vybrán klon vyznačující se nejvyšší produktivitou, který byl označen jako C242/CL 510 Al. Klon byl zmražen v kapalném dusíku.

První klonování klonu C242/CL 510 Al ukázalo, že jedna třetina buněk neprodukuje IgG, což bylo prokázáno měřením absorbance, jejíž hodnota byla nižší než 0,1 ve zředění 1:1000 při základním myším IgG ELISA testu. Pět positivních subklonů bylo spojeno a vytvořilo klon nazvaný C242:I. Produktivita tohoto klonu byla určena metodou HPLC a stanovena na 150 ug myšího IgG na ml.

Klon C242:I byl následně klonován na destičce obsahující 96 jamek s výtěžkem 33 klonů positivních na produkci myšího IgG. Pět z nich, všechny produkovaly více než 150 ug/ml IgG, bylo spojeno za vzniku klonu, který byl označen jako C242:II a vyznačoval se stabilní produkcí IgG. Stanovení HPLC prokázalo, že produkce IgG klonem C242.-II je 196 ug myšího IgG na ml. Buňky byly zmraženy a uchovávány v nádobách v kapalném dusíku. Vzorek hybridomu C242:II byl uložen v ECACC pod číslem 90012601 jak již bylo uvedeno dříve.

Produkce C242 monoklonální protilátky

Počáteční buněčná suspenze byla získána z výše připraveného hybridomu ze zmražené nádoby. Buňky byly zaočkovány do komůrek určených pro kultivaci tkáňových kultur o celkové ploše 6000 cm² z Nunc A/S v hustotě 2 x 10⁴ buněk /ml (C242:II hybridomu). Buňky byly dále kultivovány v DMEM mediu modifikovaném podle Iscoveho (Iscove N.N. a Melchers F., J.Exp.Med. díl 147, str. 923, 1978) obohaceném 1% gentamycinem, 1% směsí aminokyselin a 5% telecím zárodečným sérem. Buňky byly inkubovány 4-5 dní při 37°C ve zvlhčené atmosféře obsahující 8% C0₂. Na konci inkubace byly buňky spočítány a monoklonální dekantován a ve vzorcích byla stanovena koncentrace protilátky. Supernatant po kultivaci byl filtrován přes celulosový filtr, aby byly odstraněny suspendované buňky.Dále byl supernatant 20-30 krát zahuštěn ultrafiltrací na

Ultrafiltration s použitím molekulovou hmotnost 30 zařízení Millipore Pellican filtru s mezí propustnosti pro 000. Vzorek koncentrátu byl analysován z hlediska koncentrace monoklonální protilátky a reaktivity s antigenem, zatímco koncentrát monoklonální protilátky byl před purifikací zmražen při -70°C.

Purifikace monoklonální protilátky C242

Protein-A-Sepharosa 4B (Trademark Pharmacia AB Upsala, Švédsko) byla připravena podle návodu výrobce zahrnující bobtnání a promývání gelu, zatímco výše připravený koncentrát C242:II (zde jednoduše označovaná jako protilátka C242) byl na gel navázán s použitím glycin-NaOH, 3M NaCl, pH 8,9. pufrem byla kolona nesoucí vazebného pufru o složení 1,5 Po počátečním promytí stejným afinitní nosič promývána 0,1

M pufrem citrát-NaOH, pH 5,0 a monoklonální protilátka byla jímána do zkumavek obsahujících lmol/1 Tris-HCl pufru pH 8,0. Získaná protilátka byla dialyzována proti fosfátovému pufru, s 0,15 M NaCl, pH 7,2, s 0,2 g/1 azidu sodného. Po dialýze byla protilátka zahuštěna ultrafiltrací s použitím filtru s hranicí propustnosti pro molekuloovu hmotnost 30 000. Po zahuštění a kvalitativním stanovení, byla C242 protilátka uchovávána při -20°C.

- 47 PŘÍPRAVA RICINU A

Ricin A může být připraven metodami genového inženýrství s použitím DNA sekvencí, které kódují ricin A. Tyto sekvence jsou popsány v EP 145,111, 0 Hare a kol., FEBS Letters, 216, str. 73-78, 1987, a Lord a kol., Eur.J.Biochem, 148, str.265-270, 1985. DNA sekvence kódující ricin A bude umístěna pod kontrolou příslušných kontrolních sekvencí jako jsou promotor (např. trp promotor), ribosomální vazebné místo a transkripční terminátor. Příprava a purifikace rekombinantního ricinu A jsou popsány v PCT patent application WO 85/03508 a European application č.237,676.

V následujícím textu je popsána konstrukce rekombinantního plasmidu do nějž je sekvence kódující řetězec ricinu A vložena pod kontrolou prokaryotického transkripčního a translačního promotorového elementu. Transkripce je ukončena inkorporací přirozeného terminačního elementu na 3 konci. Začátek translace je pod kontrolou sekvencí DNA na 5 konci sekvence pro ribosomální vazebné místo.

Metoda konstrukce nezbytně vyžaduje substituci dvou N-koncových aminokyselinových zbytků, přirozeného, hotového ricinu A.

Dále je popsáno několik intermediátních kroků odvození vektoru použitých při přípravě rekombinantního ricinu A.

EXPERIMENTÁLNÍ POSTUPY

1.Syntetické oligonukleotidy

Syntetické oligonukleotidy byly použity k zavedení specifických změn v DNA sekvenci do genu ricinu A. Všechny oligonukleotidy dále popsané byly připraveny pomocí syntetizátoru Applied Biosystems 380A DNA z 5 -dimethoxytrityl basemi chráněných nukleosid-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylfosforoamidů a chráněných nukleosidů navázaných na kontrolní porézní skleněné nosiče podle návodů dodaných firmou Applied Biosystems lne. v koncentraci 0,2 mikromolú.

Každý oligonukleotid byl po odštěpení z pevného nosiče a odstranění ochranných skupin rozpuštěn ve vodě (lml) a jeho koncentrace byla stanovena měřením absorbance při 260 nm.

2.Enzymy a hostitelské kmeny

V níže popsaných manipulacích byla použita řada restrikčních endonukleas a enzymů modifikujících DNA. Enzymy byly dodány jedním z řady dodavatelů (Amersham International, Bethesda research Laboratorie, Boehringer Mannheim nebo New England Biolabs) a byly použity podle instrukcí výrobce s ohledem na reakční podmínky.

Hostitelské kmeny, které jsou zde uváděny, jsou obecné dostupné z řady zdrojů. Např. E.coli C6000 je volně dostupná z mnoha zdrojů včetně sbírek jako je E.coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA pod číslem GCSC 3004. Genotyp E.coli C6000 je K12 thr-1 leuB6 thi-1 lacYl tonA21 lambda“ sup E44, E.coli HB101 a DH5alfa jsou dostupné v Bethesda Research Laboratories (BRL), a E.coli TG1 a K19 jsou dostupné v Anglia Biotechnology.

3.Čištění genu (TM)

Souprava obsahující 1) 6M jodid sodný 2) koncentrovaný roztok chloridu sodného, Tris a EDTA pro přípravu směsi chlorid sodný/ethanol/voda, 3) mléčné sklo (TM)- nádoba o objemu 1,5ml obsahující 1,25 suspenze křemenné matrice ve vodě.

Toto je způsob pro čištění DNA založené na postupu popsaném Vogelsteinem a Gillespiem publikovaném v časopise Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1979) díl 76, str.615.

Naproti tomu mohou být použity všechny metody popsané v druhém vydání publikace Molecular Cloning -a laboratory manual, Sambrook, Fritsch a Maniats Cold Spring Harbor Laboratory, 1989(dále označované dále jako Maniatis.

4.Sekvenasa (TM)

Chemicky modifikovaná T7 DNA plymerasa

Založeno na postupu popsaném Táborem a Richardsonem publikovaném v Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1987), díl 84, str.4767-4771

5.Konstrukce pICI expresních vektorů

5.a) pICI0020

Plasmidový vektor pICI0020 je odvozený od plasmidu pAT153 v němž oblast EcoRI-AccI o velikosti 651 bp je nahrazena fragmentem EcoRI-Clal o velikosti 167 bp obsahující:

1) syntetický E.coli trp promotor a trp vedoucí sekvence pro ribosomální vazebné místo

2) translační iniciační kodon

3) mnohačetné rozpoznávací sekvence pro restrikční enzymy odvozené z M13mpl8, obsahujícím místa pro KpnI, BamHI, Xbal, Sáli, Pstl, Sphl, a HindlII

4) syntetickou terminační sekvenci pro transkripci

Sekvence DNA tohoto úseku je uvedena na obrázku 11.

Konstrukce plasmidového vektoru obsahuj ícího sekvenci syntetického trp promotoru byla publikována Windassem a kol. v Nuc.Acids Res. 10, str 6639-6657, 1982). Promotorový fragment byl isolován z takového vektoru po štěpení enzymy EcoRI a Hpal a purifikaci příslušného proužku z agarosového gelu elektroelucí (viz Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch and Sambrook, vydáno CSH laboratory, druhé vydání 1989).

Byl připraven pár oligonukleotidů, které promotorového fragmentu komplementárních syntetických by po ligaci na Hpal konci poskytly sekvenci přirozeného trp vedoucí sekvence ribosomálního vazebného místa, translační iniciační kodon a 3 KpnI klonovací místo. Tyto oligonukleotidy byly smíchány v ekvimolárním množství a po zahřátí na 100°C spojeny. Následovalo pomalé ochlazování na pokojovou teplotu.

Fragment promotoru a spojené oligonukleotidy byly dále ligovány a příslušný proužek byl isolován z polyakrylamidového gelu elektroelucí. Tento fragment byl dále ligován s odvozeným M13mpl8 vektorem, který obsahoval trp atenuátor (získaný ze synthetických oligonukleotidů) klonovaný do místa pro HindlII a vnášející další Clal restrikční místo na 3 konec atenuatoru. Ligovaná DNA byla transfektována do kmene E.coli JM109 (Yanisch-Perron a kol,

Gene, 33, str.103, 1985) po vytvoření vhodných podmínek metodou s CaCl₂ (Maniatis, kap.l, str.82). Po rozetření na misky a inkubaci byly vzniklé plaky anylyzovány metodou podle Bentona a Daviese (Maniatis, kap.4, str.41) s použitím ³²P značené nukleotidové sondy získané translací zlomu fragmentu promotoru EcoRI-Hpal, který byl již dříve izolován. Jednovláknová DNA byla připravena po úspěšné hybridizaci standardní metodou· (Maniatis, kap.4, str. 29) a sekvenována za použití M13 universálního primeru a Sangerovy dideoxyterminační metody, což umožňují soupravy řady výrobců např. Sekvenasa (United States Bioscience).

RF DNA byla připravena z jednoho isolátu v němž byla přítomna sekvence promotor/ribosomální vazebné místo/atenuátor. Tato DNA byla štěpena enzymy EcoRI a Clal a příslušný fragment byl z polyakrylamidového gelu isolován výše popsaným postupem. Plasmid pAT153 byl štěpen enzymy EcoRI a AccI a ligován s izolovaným fragmentem promotoru. Ligovaná DNA byla transformována do kompetentních E.coli HB101 buněk (Boyer, H.W. a Roulland-Dussoix D. , 1969, J.Mol.Biol., 44, str.459) (Bethesda Research Laboratories). Po kultivaci byly izolovány kolonie resistentní k ampicilinu.

Byla připravena plasmidová DNA z několika klonů a DNA sekvence z úseku mezi místy EcoRI a Clal. Jeden klon v němž byla potvrzena přítomnost správného úseku promotor/atenuátor byl označen jako pICI0020.

Tato konstrukce je znázorněnna na obr.l.

3.b) pICI0042 pICI0042 (obr.12) je plasmid, v němž značky pro resistenci k antibiotikům vektoru pAT153 byly nahrazeny jedním, induktivním genem pro resistenci k tetracyklinu z plasmidů RP4 (kodován genem tetA a regulován produktem tetR genu).Tyto geny byly charakterisovány Klockem a kol. v J.Bacteriol., 161, str326-332, 1985). Vzhledem k tomu že nový markér (značka) pro resistenci k tetracyklinu je exprimován pouze v přítomnosti tohoto antibiotika, nebude produkt genu tetA potencálním kontaminantem rekombinantního ricinu A v kulturách, kde je plasmid trvale udržován v nepřítomnosti tetracyklinu. Byla inkorporována též sekvence zajištující funkční stabilitu plasmidu (cer).

Počáteční stupeň v přípravě tohoto vektoru spočíval v produkci derivátu pAT153, z něhož byl zcela odstraněn gen kódující resistenci k tetracyklinu. Byl navržen komplementární pár syntetických oligonukleotidových sekvencí, s krátkou sekvencí obsahující několik jednotlivých míst pro restrikční enzymy využívané v následujícím klonování, které by měly nahradit fragment EcoRI-Aval z pAT153.

DNA plasmidu pAT153 byla štěpena enzymy EcoRI a AVal a plasmidová DNA o velikosti 2,175Kbp byla isolována z 0,7% agarosového gelu použitím metody Čištění genu (Bio 101, California) podle návodů výrobce. Fragment o velikosti l,425Kbp obsahující gen pro resistenci k tetracyklinu byl odstraněn.

Oligonukleotidy (SEQ ID 13 a 14) byly fosforylovány T4 polynukleotidkinasou a ekvimolární množství byla spojena dohromady. Vzorek spojených oligonukleotidů byl ligován s fragmentem plasmidu pocházejícím z pAT153.

Několik kolonií bylo vybráno pro přípravu plasmidové DNA v malém měřítku (metoda Birnboima a Dolyho uvedená v Maniatisoco, kap. 1, str. 25). Požadovaná konstrukce byla identifikována pomocí restrikční analysy s vhodnými enzymy např. EcoRI, Aval a BamHI. Struktura u 3 isolátů, u nichž bylo zjištěno,že mají správné uspořádání restrikčních míst, byla ověřena DNA sekvenační analýzou s použitím EcoRI místa primeru pBR322 (New England Biolabs). Jeden isolát byl nazván pICI00l9.

RP4 plasmidová DNA byla isolována z existujících zásob metodou podle Holmese a Quigleyho (Maniatis, kap 1, str 29). Tato DNA byla zcela rozštěpena enzymem BglII a dále částečné Xmal (při 25°C , 35 minut). Vzorky byly v průběhu reakce v různých časových bodech odebírány, a to tak dlouho, dokud nebyl jasně identifikován fragment o velikosti 2,45Kbp obsahující tetR a tetA geny. Vzorek p(JC8 DNA (Amersham International) byl úplně rozštěpen enzymy BamHI a Xmal. Aby byla dokončena inserce genů nesoucí vlastnost resistence k tetracyklinu do pUC8 byla provedena ligace. Ligovaná DNA byla transformována do buněk E.coli C600 (Appleyard, R.K. Genetics 39, str.440, 1954) po vytvoření vhodných podmínek CaCl₂ (Maniatis, kap. 1, str.82) a byly vybrány kolonie resistentní k tetracyklinu. Plasmidová DNA byla připravena z 8 klonů (Holmes a Quigley) a přítomnost RP4 tetR a A genů byla ověřena restrikční analýzou. Jeden z izolátů byl nazván pTB344.

Geny pro resistenci k tetracyklinu byly insertovány do pICI0019 (popsaného výše) nahrazením EcoRI/Pstl fragmentu z pICIOO19 odpovídajícím fragmentem z pTB344. Tato operace měla za následek nahrazení většiny genů pro resistenci k ampicilinu v pICI0019 geny nesoucími schopnost resistence k tetracyklinu. Po štěpení a ligaci plasmidových DNA následovala transformace do buněk E. coli C600 a kolonie byly vybrány na zakladě fenotypového projevu tj. Tc^R a Ap . Plasmidová DNA byla připravena ze 4 klonů a dále byla štěpena kombinací enzymů např. BamHI/Pstl/Sstl, EcoRI/SalI, Smál, Stal/Sall a Aval/Pstl. Všechny čtyři klony produkovaly restrikční struktury shodné s požadovaným konstruktem. Jeden z nich byl nazván pTB351.

Summers a Sherratt (Cell 36, str.1097-1103, 1984) ukázali, že nestabilita plasmidu odvozených z ColEI (např. pAT153) je způsobena ztrátou 283bp dlouhé sekvence, cer, přítomná v původním plasmidu. Tato sekvence pomáhá zabránit vzniku plasmidových oligomerů, které, jak se ukázalo narušují plasmidová dělení dosud nezjištěným způsobem. Cer sekvence (SUmmers D. a kol., Mol. and Gen. genetics 201, str.334-338, 1985, a Cell, 36, str.1097-1103, 1984) byla izolována z fragmentu klonovaném do pUC18 (pKS492). pKS492 plasmidová DNA byla štěpena enzymy BamHI a Taql, aby došlo k uvolnění fragmentu obsahujícím cer sekvenci. DNA plasmidu pTB351 (isolovaná z Dam” hostitelských buněk E.coli GM48-Arraj,

J.A. a Marinus, M.G., J.Bact. 153, str.562-565, 1983) byla úplně štěpena enzymy BamHI a Clal a dále ligována s naštěpenou pKS492 DNA. Po transformaci ligované DNA do kompetentních buněk E.coli C600 byly vybrány kolonie resistentní vůči tetracyklinu. K ověření přítomnosti sekvence cer byla použita restrikční analýza plasmidové DNA pocházející z příslušných kolonií, za použití enzymů Aval, Mlul a Pvul. Jeden z isolátů se správnou strukturou byl označen pICI0042.

Konstrukce těchto plasmidú je znázorněna na obrázcích 2 a 3.

5.c) pICI1079

Plasmidový vektor pICI1079 nese resistenci k ampicilinu, je odvozený od plasmidú pAT153 a mezi EcoRI a Styl restrikčními místy obsahuje následující elementy:

(i) CI857 gen z fágu lambda (ii) lambdaP_L promotor (iii) syntetické ribosomální vazebné místo (iv) synteticky připravenou sekvenci pro gen interferonu alfa2 (v) synteticky připravenou transkripční terminační sekvenci, odvozenou z fágu T4, mezi restrikčními místy pro Sáli a Styl.DNA sekvence tohoto transkripčního terminátoru je uvedeno na obrázku 13.

pICI1079 je uveden na obrázku 14.

pICI1079 byl uložen podle Budapešťské dohody z 19. února 1991 do depositu v NCIMB, 23 St. Machaer Drive, Aberdeen, Scotland, plasmidú bylo přiděleno NCIMB katalogové číslo 40370.

Plasmid pICI1079 byl použit jako zdroj T4 transkripčního terminátoru pro vznik expresního klonu pICI1185 ricinu A (viz níže 7d). Startovním bodem pro tvorbu plasmidú pICI1079 byl pICI1043. pICI1043 je plasmid odvozený z pICI0020 (viz 3.a výše) v němž je expresní kazeta obsahující lambdaP_L promotor a gen pro alfa2 interferon (Edge a kol., Nuc.Acids Res. 11, str.6419-6435, 1983) přítomna mezi EcoRI a Sáli místy. Transkripční terminátor z genu 32 bakteriofágu T4 s 5 Sáli a 3 Sphl kohesivními konci vznikl po syntéze komplementárního páru oligonukleotidů. Tento fragment byl ligován s fragmentem plasmidu, který byl isolován z pICI1043 po jeho úplném naštěpení Sáli a Sphl.

Druhý pár komplementárních nukleotidů byl pak dále využit k nahrazení sekvence trp atenuátoru (a zbývající části genu pro resistenci k tetracyklinu) insercí pICI1078 mezi Sphl a STyl místa. Jediné místo pro enzym BamHI bylo využito pro zavedení tohoto syntetického fragmentu.

Tyto manipulace jsou znázorněny na obrázku 4.

6. Příprava ricinového expresního klonu

6.a) Příprava DNA plasmidu pUC8RA

Byl připraven klon (pUC8RA), který obsahoval cDNA pro ricin

A. Tento klon obsahuje, podle publikované cDNA sekvence v plasmidu pUC8, A-řetězec cDNA od base s číslem 74 ve vedoucí sekvenci přes místo pro enzym BamHI uvnitř B-řetézce (číslo base 857) (Lamb I.F., Roberts L.M., Lord J.M. , Eur.J.Biochem., 148, str. 265-270, 1985) a Vieira J. a Messing J., Gene 19, str. 259, 1982). Dále metodou usměrněné mutageneze byl vytvořen translační terminační kodón následující 3 konec, a tím byl dokončen kodon pro celý ricin

A (viz O Hare M. a kol., FEBS Letts, 216, str. 73-78, 1987). Celý úsek kódující A-řetězec je včleněn v BamHI fragmentu, který pochází z tohoto klonu.

Jak bylo popsáno výše, bylo získáno malé množství pUC8RA plasmidové DNA. Pro získání budoucích zásob byl roztok této DNA použit k transformaci E. coli DH5alfa kompetentních buněk (HanahanD., J.Mol.Biol. 166, str. 557, 1983) a byly vybrány izoláty s resistencí k ampicilinu. Plasmidová DNA z tohoto klonu byla připravena modifikovaným postupem podle Birnboima-Dolyho (Maniatis, kap. 1, str.25). Vzorky této DNA byly oddělené štěpeny enzymy BamHI a Bani a po elektroforeze v agarosovém gelu byly naštěpené úseky porovnány s odpovídajícími štěpy původní DNA popisované Lordem a kol. Vzhledem k tomu, že nebyly zjištěny žádné rozdíly v restrikční struktuře byly oba dva vzorky DNA považovány za identické.

6.b) Sub-klonování do fágu M13

Štěpy získané štěpením pUC8RA plasmidové DNA pomocí BamHI a RF (replikativní forma) DNA fágu Biotechnology) byly ligovány za (Maniatis, kap. 1, str.68). Byla ligace. Ligované DNA byly transformovány do buněk E.coli TG1 (Gibson, 1984/Anglian) po vytvoření vhodných podmínek CaCl₂ (Maniatis, kap.l, str 82).

M13 kmene K19 (Anglian standardních podmínek provedena též kontrola

Frekvence transformací prokázaly dostatečnou ligaci a v potomstvu byla očekávána přítomnost rekombinantního fágu. Předpokládalo se, že rekombinantní fág bude produkovat jasné plaky na mediu IPTG+X-gal (BRL) vzhledem k přerušení lacZ genu (gen pro beta-galaktosidasu). Divoký typ fágu produkuje modré plaky vzhledem k hydrolýze X-gal enzymem beta-galaktosidasou.

Několik světlých plakú bylo odebráno pro přípravu jednovláknové DNA. Gelová elektroforéza lysované fágové suspenze prokázala, že jeden fágový klon obsahuje insert o vhodné velikosti. Provedením sekvenace bylo potvrzeno, že tento insert představuje sekvenci A-řetězce ricinu. Byla prokázána existence pouze 182 baží tvořících sekvenci kódující výsledný ricin A , avšak toto číslo bylo přijato jako dostatečný důkaz přítomnosti úplného genu ricinu A. Tento klon byl nazván M13K19RA.

6.c) Mutageneze M13K19RA .

K získání KpnI místa kompatibilního s pICI expresními vektory na počátku zrání ricinu A, jsou nezbytné následující změny (podtrhnuté) :

SEQ. ID. 15

5¹.....GATAACAACATATTCCCCAAA......3¹

......vedoucí sequence ricinu /---zralý ricin A--změněn na :

SEQ. ID. 16

5¹.....GATAACAACATGGTACCCAAA......3' / KpnI / iniciace translace a výsledek v ATG kodonu překrývající KpnI místo. KpnI fragment obsahující ricin A může být z mutantu vyříznut a včleněn do sérií expresního vektoru ICI. Jsou připraveny modifikace dvou N-terminálních aminokyselin (ile-phe na met-val).

Jednovláknová DNA připravená z M13K19RA byla templátem pro mutagenesi pro všechny mutační postupy. Byl syntetizován jeden oligonukleotid DTR16, který při tomto postupu zavádí všechny mutační změny.

DTR16 (SEQ. ID. 17) 5' AACAACATGGTACCCAAACAA 3’

Bylo pospáno několik postupů pro zavedení specifických změn sekvence DNA pomocí cílené mutagenese.Použitý postup níže uvedený vychází z metody popsané Ecksteinem a kol.

(Nuc.Acid.Res.,1985,13,p.8749-8764 a 1986, 14, p. 9679-9698), která využívá kit (Amersham Intrnational) aplikovaný dle instrukcí výrobce.

Principem této metody je příprava jednovláknové DNA s mutagením oligonukleotidem . a syntéza komplementárního řetězce se zabudovaným dATPoS místo dATP. Použití tohoto nukleotidu má za následek vznik fosfothiolových vazeb, které nejsou štěpeny určitými restrikčními endonukleázami (eg.Ncil).

Po syntéze druhéhé řetězce, Ncil je používána k štěpení rodičovského řetězce a přidaná exonukleáza III štěpí zadní část mutačního místa. DNA polymeráza I potom umožňuje resyntézu rodičovského řetězce. Tedy mutagenní oligonukleotid působí jako templát pro resyntézu a mutace je zavedena do obou řetězců před transformací. Je požadována 96% frekvence mutací počítáno na celkový počet získaných buněk. Výběr je je jednoduše prováděn náhodným výběrem plaků pro analýzu sekvencí.

V našich pokusech 4 z 4 vybraných plaků měly žádanou mutaci.

Byl vybrán mutant (MRA16), RF DNA byla připravena a zkontrolována na přítomnost nově vzniklého restrikčního fragmentu KpnI.

6.d) Klonování, Exprese a Počáteční Charakterizace

Serie pICI expresních vektorů (viz část 3) může akceptovat fragmenty DNA klonované do jedinečného KpnI restrikčního místa, které sousedí s Trp promotorem. KpnI místo překrývá iniciační translační kodon (ATG), který je umístěn 8bp po směru od Shine-Dalgarnového místa (AGGA) promotoru.

Pro ověření sekvence MRA16, bylo připraveno větší množství ( 5 ug RF DNA) KpnI digestu a dle návodu výrobce byl z vyříznutých proužků agarosového gelu (Nu-Sieve GTG agarosa, FMC Bio products) fenolovou extrakcí isolován odpovídající fragment DNA kódující ricin A.

pICI0020 (viz 3a) byl štěpen KpnI a potom defosforylován za použití telecí alkalické fosfatázy (CIP-Boehringer Mennheim). Defosforylace brání recirkulaci vektoru při ligaci, což by vedlo k vysokému poměru rodičovkého genomu v transformovaném potomstvu.

Pro různé postupy byly ligace prováděny v poměrech, plasmidový vektor : isolovanému fragmentu od 8:1 (w/w) ku 1:3. Byly prováděny kontrolní ligace pro ověření efektivnosti působení fosfatázy, ligásové aktivity apod. Podmínky ligace byly vhodné pro používanou T4 DNA ligasu (New England Biolabs or Amersham). Reakce probíhaly obecně přes noc při 15°C .

Padesát procent ( 5 ul) každé ligační reakce bylo naředěno na lOOul lxTNE (50 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) a k tomu bylo přidáno 200 ul kompetentních buněk E.coli DS410. Po proběhnutí standardní transformace (Maniatis, kapitola 1, p. 74) byly buňky vyočkovány na L agar se streptomycinem (25 ug/ml) a ampicilinem (100 ug/ml) a inkubovány přes noc při

37°C.

Po inkubaci byly sledovány transformované misky. Obecné 5-10 krát více kolonií bylo pozorováno při ligaci ve srovnání s kontrolami bez ligasy. V některých případech byly malé rozdíly v počtu kolonií . produkovaných v přítomnosti nebo v nepřítomnosti ligasy, což ukazuje na neúplné štěpení vektoru nebo na nízkou aktivitu ligasy.

Pro testování hybridizace ( postup založený na metodě Grunsteina a Hognesse, popsané v Maniatisovi, kap. 1, p.98). byly transformanti a významné kontroly přeneseny na nitrocelulosové filtry umístěné na miskách s L agarem. Po inkubaci byly kolonie lysovány in sítu za použití 10% SDS a 1M NaOH, neutralizovány 1M Tris (pH 7.5) a sušeny 2 hodiny ve vakuu při 80°C.

Proby pro hybridizaci byly připraveny značením mutačního oligonukleotidu ³²P za použití T4 polynukleotid kinasy. Proba byly nanesena na filtry při pokojové teplotě a potom promyty v lázních při 55-65°C, aby se před autoradigrafií odstranilo nespecificky navázané množství. Specifická hybridizace indikuje klony obsahující ricin A.

Z pozitivně hybridizovaných klonů byla připravena DNA v malém množství ( metodou Holmese a QUigley nebo Birnboim-Dolyho, jak je specifikováno v Maniatisovi, kap.l, p.25). DNA byly štěpeny odpovídajícími restrikčními enzymy tj. KpnI a EcoRI/BglII, a analyzovány elektroforesou na agarosových gelech. Vektor DNA a mutovaná RF DNA byly štěpeny stejnými enzymy, aby se tím ukázala správná délka fragmentů v klonech.

Příprava plasmidové DNA z každého klonu ve větším množství (Birnboim-Doly) byla použita pro podrobnější restrikční analýzu, tj. Clal, HindlII, BamHI, EcoRI/BglII, KpnI a Seal. Na agarosových gelech, ukazovaly tyto štěpy délku vloženého fragmentu, jejich orientaci a množství restrikčních míst na genu ricinu A.

6.e) Sledování exprese

Klony s pozitivní hybridizací a restrikčním výběrem byly testovány na expresi ricinu A pomocí SDS-PAGE analýzy úplného lyzátu buněk. Standardní podmínky pro sledoání exprese byly následující :

1) 10 ml L media s antibiotiky bylo inokulováno jednotlivou kolonií a rostlo přes noc za mírného třepání při 37°C.

2) 750 ul L-media s pelety buněk bylo odstředěno (1 min při 6 500 rpm).

3) Pelety byly resuspendovány v 300 ul M9 media (Maniatis, apendix A.3) s 0,02% hydrolyzátu kaseinu, 0,2% glukosy a 50 ug/ml thiaminu. Suspenze byla použita k inokulaci 10 ml stejného media.

4) Inkubace probíhala 7 hod nebo přes noc za mírného třepání při 37°C.

5) Po inkubaci byla změřena optická densita OD při 540 nm, pelety buněk byly resuspendovány v takovém objemu vzorku Laemmliho pufru, který by odpovídal OD₅₄₀ 10, vodné suspenze (Maniatis, kap.18,p.53). Po té byla suspenze vařena 15 min.

6) 20 ul celkového buněčného lyzátu bylo naneseno na SDS polyakrylamidový gel, po elektroforeze obarcveno Coomassie modří, odbarveno a visualizováno.

Z klonů, které byly studovány pomocí SDS-PAGE, pouze 1 vykazoval proužek navíc s molekulovou hmotností přibližné 29KD (ekvivalentní k té co byla stanovena pro neglykosylovaný, zralý ricin A). Prohlídka gelu ukazuje na akumulační hladina se pohybuje v rozmezí od 5-10% celkových buněčných bílkovin. Plasmid tohoto klonu byl nazván PICI1102.

Konstrukce pICI1102 je ukázán na obr 5. Výsledky sledování exprese jsou ukázány na obr.6 a 7.

6.f) Western přenosy a imunodetekce rekombinantního ricinu A

Autentičnost rekombinantního bílkovinného řetězce ricinu A, původně pozorovaného po obarvení SDS-poly- akrylamidového gelu Coomassie modří, byla potvrzena Western blotting.

Proužky bílkoviny byly přeneseny na nitrocelulosové filtry a degované za použití specifické protilátky ricinu A, na kterou navazuje peroxidasou značený antiglobulin.

Elektroforéza na 15% SDS-PAGE gelech probíhala přes noc při 8mA a potom byla ekvilibrována alespoň 30 min ve transfer pufru.

Proužky bílkovin na gelech byly potom elektroforeticky přeneseny na nitrocelulosové membrány (Hybond-C, Amersham) v Bio-Rad Trans Blot přístroji při 70 V po dobu 3 hod. Filtry mohou být po usušení a zatavení v plastikových pytlících skladovány při -20°C.

Ricin Al byla polyklonální protilátka tvořená v králících proti syntetickému fragmentu peptidu ricinu A. Předchozí studie ukazovaly na dobrou afinitu k ricinu A, ale i značné křížové reakce s mnoha proteny E.coli. Aby se odstranilo značné pozadí způsobené touto křížovou reaktivitou, protilátka byla pre-inkubována s lyzátem buněk E.coli.

Tak, 10 ml kultury E.coli, kmen DS410, narostlé přes noc na L-mediu bylo odstředěno při 4000 rpm po dobu 10 min. Získané pelety buněk byly rsuspendovány v ml bakteriálního pufru a sonikováno při 4-6 u po dobu 6 xlO sekund s 30 sekundovými intrvaly chlazení v ledu.

0,5 ml sonikátu bylo smícháno s 0,5 ml antisera ricinu A.la inkubováno 90 min při pokojové teplotě. Zbytky buněk byly odstředěny po 5 min při 13000 rpm a supernatant byl skladován při -20°C.

Nitrocelulosové filtry z Western přenosů byly zastaveny inkubací v 5% BSA-PBS/Tween přes noc při pokojové teplotě. (PBS Tween = 5 ml Tween 20 /11 PBS).

Promyty 3x3 minuty v PBS/Tween.

Inkubovány 2 hodiny (nebo přes noc) při pokojové teplotě s 1/4000 ředěním zastavené protilátky k ricinu A.l v 0,5% BSA-PBS/Tween.

Promyty 3x3 minuty v PBS/Tween.

Inkubovány 1 hodinu s 1/1000 ředěním kozího proti králičím antiserem v 0,5% BSA-PBS/Tween při pokojové teplotě.

Promyty 3x3 minuty v PBS/Tween.

Inkubovány 1 hodinu s 1/5000 ředěním králičí peroxidasy

anti-peroxidasovým pokojové teplotě.	antiserem	v	0,5%	BSA/PBS/Tween		při
Promyty 3x3 minuty	PBS/Tween.
Vyvíjeny imerzi v	roztoku 4	-chlornaftolu (60mg) v	20	ml
methanolu doplněného	na 120	ml	PBS	a obsahujícího	12	ug
peroxidu vodíku. Membrána byla	vyndána	z roztoku hned	jak	se

objevily proužky, usušena a fotografována.

Typická Western blot analýza je ukázána na obr.8.

6.g) Biologické stanovení rekombinantního proteinu ricinu A

Úkolem bylo vyvinout experimentální systém na testování r—ricinu A na biologickou aktivitu v bezbunéčném in vitro stanovení syntézy bílkovin.

Lysáty králičích retikulocytů byly připraveny dle metody Allena a Schweeta (J.Biol.Chem. (1962), 27, 760-767). Stanovení demonstruje inhibici proteosyntézy v bezbunéčném systému nedostatečnou inkorporací leucinem-¹⁴C do nově se syntetizující bílkoviny.

6.g.i) Popis stanovení

Yásobní roztok : 1 mM směs aminokyselin bez leucinu.

Roztok obsahující všechny L-aminokyseliny v l mM koncentraci kromě leucinu (pH upravené na 7,4 pomocí NaOH a uchováván při -70°C).

Roztok A: 40 mM octan hořečnatý, 2 M octan amonný, 0,2 M Tris (pH 7,4 upravené HCl, skladován při 4°C).

Roztok Β: ATP (Sigma A5394) 246 mg/ml, GTP (Sigma G8752)

24,4 mg/ml.

Směs pro stanovení : 1 ml směsi aminokyselin, 1 ml roztoku A, 0,1 ml roztoku B, 103 mg kreatinfosfátu, 1 mg kreatinkinasy, 510 ul H₂0, 600 ul (60uCi)L-¹⁴C-leucin (New England Nuclear, NEC-279E).

Reakční směs : vzorek 25 ul, směs pro stanovení 12,5 ul, lyzát králičích retikulocytů 25 ul.

Slepý pokus byl 2 mg/ml BSA v PBS.

Všechny pokusy byly prováděny paralelně.

12,5 ul směsi pro stanovení bylo napipetováno do skleněných zkumavek ul BSA v PSB bylo přidáno do čtyřech prvních zkumavek jako slepý pokus ul vzorku bylo přidáno do zbylých zkumavek ml 0,1 Μ KOH bylo přidáno do prvních dvou zkumavek (pozadí slepého pokusu)

Zkumavky byly temperovány na 28°C ve vodní lázni ul lyzátu králičích retikulocytů (ponechán roztát z teploty kapalného dusíku) bylo přidáno do každé zkumavky ve 20 vteřinových intervalech. Když první zkumavka byla inkubována 12 minut, 1 ml 0,1 M KOH bylo přidáno do každé zkumavky opět v 20 vteřinových intervalech, tak aby všechny zkumavky byly inkubovány 12 minut. Do každé zkumavky byly přidány dvě kapky peroxidu vodíku následované 1 ml 20% TCA. Obsah zkumavek byl promíchán a zkumavky byly ponechány alespoň hodinu nebo přes noc, při 4°C. sraženiny byly odfiltrovány na 2,5 cm GFS filtrech, promyty 3 x 4 ml 5% TCA, přeneseny do scintilačních ampulek, do kterých bylo přidáno 10 ml scintilačního roztoku (Ready-Solv. MP, Beckman). Po 1 hodině byly ampulky protřepány a proměřeny.

6.g.ii) Návod techniky pro použití lyzátů E.coli ml kultury v L-mediu rostlo přes noc při 37°C. Pro získání peletů bylo 400 ul alikvotních podílů odstředěno při 13000 rpm po dobu 30 vteřin a většina supernatantu byla dekantována.

Pelety byly podrobeny dvakrát se opakujícímu rychlému zmrazení směsí suchého ledu a EtOH následované táním při 37°C. K peletům bylo postupně přidáno 12 ul 25% sacharosy v 50 mM Tris HC1 pH 8,0 a 4 ul roztoku lysozymu o koncentraci 10 mg/ml.

Po 15 minutové inkubaci v ledu, bylo přidáno 8 ul 0,25 M EDTA a inkubace pokračovala dalších 15 minut. Lyse byla způsobena osmoticky naředěním roztoku na 400 ul vodou.Tímto postupem bylo získáno 80-100 životaschopných buněk na 1 ml.

Když 25 ul alikvotu tohoto lyzátu bylo přidáno ke směsi pro stanovení, hladina inkorporace ¹⁴C-leucinu do nové syntetizované bílkoviny byla 10% vzhledem ke slepému pokusu bez lyzátu. To byla obdobná hladina inhibice jaká byla způsobena 8 ng/ml ricinu A. Potom byly připraveny ředění lyzátu E.coli a stanovení bylo opakováno. Výsledky jasně ukazovaly, že je nutné minimálně 16 -ti násobné ředění, aby byl eliminován vliv lyzátu na slepý pokus.

Aby bylo co nejdůvěryhodněji potvrzeno, že lyse a lyzáty E.coli nevyrovnávají toxicitu ricinu A, bylo nutno udělat dvě kontrolní stanovení. Nejdříve byl přidán ricin A získaný z rostlin, k 16 X ředěným buněčným peletům E.coli, tak aby konečná koncentrace ve směsi pro stanovení po lysy buněk byla 8 ng/ml.

Obě tyto kontroly potvrdily, že ani lyzáty ani samotný postup lýze buněk nemá nežádoucí vliv na inhibiční účinek ricinu A.

Tyto techniky byly použity k ověření syntézy biologicky aktivního, rekombinantního ricinu A z pICI1102 a klonů popsaných níže.

6.h) Sekvenování DNA

Sekvenování plasmidové DNA bylo použito k analýze pICI1102. Vybraný postup je modifikací postupu Zagurského a kol. (gene Analysis Techniques Vol 2, No 5) a zahrnuje alkalickou denaturaci dvouřetězcové plasmidové DNA předřazené zahřátí primeru a sekvenování standardními metodami, které jsou prováděny ve formě kitů, dodávaných různými výrobci např. Sequenasa (United States Bioscience). Použitím oligonukleotidu jako priméru z 3 konce beta-lakatamázy a několika vnitřních primérů A-řetězce, sekvenování obou řetězců promotorového genu a genu ricinu A je umožněno.

Počáteční údaje sekvenování ukázaly nepředpokládané výsledky, a to, že dodatečný KpnI fragment byl přítomen mezi promotorem a sekvencí kódující ricin A, t.j. (SEQ. ID. NO 20):

KpnI

AAAAAGGGTATCGACATGGTACCCGGGGATCCACCTCAGGGTGG

KpnI

TCTTTCACATTAGAGGATAACAACATGGTACCCAAACAATAC 3'

Dodatečný fragment KpnI pochází z M13K19RA a obsahuje restrikční místa a část vedoucí sekvence ricinu klonované z pUC8RA. 5 konec ricinového A řetězce obsahuje změny baží indukované během mutagenese.

Studium této sekvence ukazuje , že první iniciační kodon translace (ATG) je mimo rámec, ve kterém je oblast kódující ricin A.

Tedy, je zde in-frame terminační kodon (TAG.) předcházející iniciačnímu kodonu ricinu A a údajná Shine-Dalgarnova sekvence (AGGA), které mohou re-iniciovat translaci z druhého ATG.

Další studie ukázaly, kupodivu, že dodatečný fragment DNA dává prospěšnou výhodu s ohledem na hladinu akumulace řetězce ricinu A v E.coli, ve srovnání s klony, ze kterých byl vyříznut.

Kompletní sekvence DNA ricinového A genu obsaženého v pICI1102 je dána na obr.9 (SEQ. ID. NO 18).

7. Příprava následujících ricin A expresivních klonů

7.a) Mutace ricin A klonu pICI1102 umožňující subklonování.

Subklonování dvou KpnI fragmentů z náhodně vzniklého pICI1102 ve správné orientaci pro expresi ricinu A je obtížné. Tedy jsme plánovaly změnit vnitřní KpnI rozpoznávací místosubstitucí jedné báze (A na T). To by zabránilo uvolnění KpnI z tohoto místa a umožnilo by to subklonování jednoho KpnI fragmentu do oblasti pICI expresních vektorů. Substitucí adeninu v KpnI rozpoznávacím místě (GGTACC) za thymin (tj. GGTTCC) se nemění první zbytek ricinu A (GTA/GTT = Val).

Kde podtržená báze představuje mutační změnu.

Pro srovnávací studium exorese jsme plánovali klonováni zmutovaného fragmentu ricinu-A do oblasti trp expresních vektorů. Klonování do pICI10020 a srovnání s pICI 1102 dává možnost stanovit vlivu substituce jedné báze, jestliže existuje, na expresi.

7.b) Mutagenese

Templátem pro mutagenesi byl MRA16 , který je M13 klonem obsahujícím dva KpnI fragmenty přítomné v pICI1102. Po mutagenesi, isoláty nesoucí žádánu mutaci byly identifikovány náhodným testováním vzorků a stanovením DNA sekvence v celé oblasti, na kterou se specificky váže mutagenní oligonukleotid.

Jeden ze zmutovaných templátů byl pojmenován dále analyzován stanovením DNA sekvencí kódující ricin-A na ověření nepřítomnosti mutací.

MRA22. Ten byl celé sekvence nespecifických

7.c) Subklonování

Zmutované, jednořetězcové DNA byly přeneseny do kompetentních buněk E.coli TG1, za účelem produkce jednotlivých plaků. jednotlivé plaky byly potomodebrány a replikativní forma DNA (RF, dvouřetězcová) byla purifikována navázáním na cesium chlorid/ethidium bromidový hustotní gradient. Pro doplnění údajů byla purifikovaná RF DNA štěpena KpnI. Klonování bylo prováděno shotgun ligacínaštěpené expresním vektorem štěpeným KpnI a fragmentu ricinu

RF DNA s vhodným fosfatásovaným nebo Apo jeho purufikaci specifickou ligací z agarosového gelu

Ligovaná DNA byla přenesena do E.coli

- 76 TG1 nebo HB101.

Klony obsahující ricin-A byly identifikovány hybridizací za použití značené proby ricinu-A ³²P připravená pomocí náhodného hexanukleotidového prímeru pro KpnI fragment isolovaného z jiného klonu obsahujícího ricin-A (píci 1121). kolonie vykazující pozitivní hybridizacibyly dále testovány restrikční analýzou plasmidové DNA za použití jednoduchých štěpů KpnI a dvojitých štěpů Eco/RI/BglII.KpnI určuje délku fragmentu a EcoRI/BglII stanovuje orientaci fragmentu.

Klony, u kterých bylo zjištěno, že obsahují fragment ricinu-A ve správné orientaci pro expresi, byly analyzovány SDS-PAGE elektrofořežou následovanou barvením Coomassie modří a Western blotting duplikovaných gelů. Hledina akumulace ricinu A v těchto klonech byla ekvivalentntní té, která byla detegována u pICI1102.

Jeden isolát byl vybrán a plasmid byl pojmenován pící 1131.

7.d) Použití alternativního přepisu terminátorového elementu

Přepis terminátorového elementudává sekundární strukturu na 3 konci mRNA, která je zapojena do zastavení aktivity RNA polymerasy.

Stabilita této sekundární struktury může zlepšit akumulaci bílkovin tím , že chrání mRNA od exonukleasové aktivity na 3 konci. T₄ terminátor transkripce je doporučen pro svou silnou sekundární strukturu než že slouží trp atenuátoru přítomném ve všech předcházejících ricin-A konstruktech.

V těchto pokusech. trp promotor a fragment ricinu-A z pICI1131 byl vyříznut štěpením enzymy EcoRI a Sáli. Druhý enzym štěoí vazbu mezi 3 koncem sekvence kódující ricin-A

Získaný fragment byl NuSieve GTG agarose,FMC chloroformovou extrakcí,

Vyčištěný fragment byl a trpA terminátorem transkripce, vyříznut z agarosového gelu (2%

Bioproducts) a čištěn fenolovou a následovanou ethanolovým srážením ligován se štěpy pICI 1079 získané po štěpení s EcoRI a Sáli. Jmenovaný plasmid obsahuje T₄ terminátor mezi jedinými Sáli a Sphl místy (viz 5c).

Ligovaná DNA byla přenesena do kompetentních buněk E.coliHBIOl (BRL) a hybridizační screening používaný k detekci přítomnosti DNA ricinu-A byl stejný jako v předcházejících pokusech. Pozitivně hybridizované kmeny byly vybrány pro přípravu plasmidové DNA s následující restrikční analýzou s EcoRI a Sáli, aby se ukázala přítomnost fragmentů vhodné délky.

Jeden isolát se správnou strukturou byl identifikován a nazván pICI1185.

7.e) Použití alternativního pozadí plasmidu

Plasmid pICI1185 byl použit pro přípravu dalšího konstruktu subklonováním souboru expresních genů do pICI 0042. Plasmidová DNA byla připravena z pICI1185 a štěpena EcoRl a Sphl současně , aby byl vyříznut soubor expresních genů obsahující trp promotor /RBSl/fragment ricinu-A (MRA22(/T₄ terminátor. Tento fragment byl isolován metodou popsanou v bodu 4.d a ligován s pICI 0042 štěpený EcoRl a Sphl.

Ligovaná DNA byla přenesena do buněk E.coli HB101 a inkubována přes noc při 37°C. Transformované buňky HB101 byly vyočkovány na L agars tetracyklinema kolonie byly vybrány hybridižací s DNA probou ricinu-A značenou ³²P.

V obou případech, pzitivní kolonie byly ověřeny restrikční analýzou plasmidové DNA za použití EcoRI/Sphl a EcoRI/BglII štěpení. Tři isoláty byly určeny t.j. pICI1187.1-3.

Obr. 10 ukazuje konstrukci pICIH85 a pICIll87.

7.f) Výběr klonů

Isolované plasmidy byly přeneseny do E.coli 71.18 (Gronenborn,B., 1976, Mol.Gen.Genet. 148, 243-250) a jednotlivé kolonie byly vybrány ke studiu selekce klonů. Získané lyzáty celých buněk byly podrobeny elektroforeze na dvou SDS-PAGE gelech, jeden z nich byl barven Coomassie modří a druhý použit pro Western blot analýzu.

Obarvený gel poskytoval minimální údaje o expresi ricinu-A,

- 79 což bylo způsobeno přítomností co-migrující bílkoviny z E.coli 71.18. Western blotting jasné ukazoval expresi ricinu-A ve srovnání s pozitivními a negativními kontrolními vzorky. Jeden isolát byl poskytnut Fermentation research Group pro přípravu ve provozním měřítku.

Fermentace r-Ricinu A (a) Plasmid pICI 1187 byl transformován do kmene E.coli DS410 (také uváděn jakop MSD68) a výsledný rekombinant (MSD1051)byl přečištěn a uchováván v glycerolu při -80°C.

Pro získání jednotlivých kolonií byla část uchovávané kultury rozetřena na agarové misky s tetracyklinem a ponechána kultivovat přes noc při 37°C. Jednotlivé kolonie MSD 1051 byly resuspendovány v 10 ml L-media s tetracyklinem a 100 ul bylo hned použito k zaočkování 10 250 Erlemayerových baněk obsahujících 75 ml L-media s tetracyklinem. Po 16ti hodinovém růstu při 37°C na reciproké třepačce byl obsah baněk spojen a použit pro inokulaci fermentoru obsahujícího 201 modifikovaného LCM50 růstového media následujícího složení :

rozpuštěno v destilované H₂O g/i

KH₂PO₄ 3,0 Na₂HPO₄ 6,0 NaCl 0,5 hydrolyzát kaseinu (Oxoid L41) 2,0 (nh₄)₂so₄ 10,0 kvasničný extrakt glycerol

MgSO₄ . 7H₂O

CaCl₂ . 2H₂O thiamin

FeSO₄/kys.citrónová roztok stopových prvků (TES)

20,0

35,0

0,5

0,03

0,008 0,04/0,02 0,5 ml/1

Fermentace probíhala při teplotě 37°C a pH bylo automaticky udržována na hodnotě 6,7 přídavkem 6 M roztoku hydroxidu sodného. Obsah rozpuštěného kyslíku (dOT) byl automaticky udržován na 50% vzdušného nasycení úpravou rychlosti míchání fermentace. Vzušnění ve fermentoru , původně 201/min., odpovídající 1 objemu na objem za minutu (WM), bylo zvýšeno na 45 1/min., když rychlost míchání ve fermentoru dosáhla 80-90% jejího maxima.

Během fermentace byly odebírány vzorky na zjištění optické density (°^D55o)' buněčné sušiny a akumulace ricinu-A v buňkách. Akumulace ricinu-A byla zjišťována elektroforézou lyzátů celých buněk bakterií na SDS-PAGE gelech obarvených Coomassie modří.

4,5 hodin po inokulaci, byl do fermentoru přidáván roztok kvasničného extraktu (Difco) (225 g/1) rychlostí 1,7 g/l/h.

Po 12 hodinách, když OD₅₅₀ dosáhlo přibližné 50, a když bakterie růst bakterií začínal být limitován kyslíke, byly bakterie odstředěny na Sorval RC3B odstředivce (7 000 g, 30 min, 4°C) a bílkovina nahromaděná v buňkách byla získána.

(b) Plasmid pICI 1187 byl přenesen do E.coli kmen DS410 ( zde také uváděn jako MSD68) a vzniklý rekombinant(MSD 1051) byl přečištěn a uchováván v glycerolu při -80°C.

Alikvotní část kultury (100 ulj byla použita pro inokulaci 2 litrové Erlenmayerovy baňky obsahující 600 ml L-media s tetracyklinem. Po 16ti hodinovém na reciproké třepačce při 37°C, byl obsah baňky použit pro iokulaci fermentoru obsahujícího růstové medium následujícího složení :

Složka rozpuštěná v destilované H₂0 (g/1) kh₂po₄

Na₂HPO₄

NaCl hydrolyzát kaseinu (Oxoid L41) (nh₄)₂so₄ kvasničný extrakt(Difco) glycerol

MgSO₄ .7H₂0

CaCl₂ .2H₂0 thiamin

FeSO₄/kys.citrónová roztok stopových prvků tetracyklin

3,0

6,0

0,5

2,0

10,0

20,0

35,0

0,5 0,03 0,008 0,04/0,02 (0,5 ml/1) (10 mg/1)

Fermentace probíhala při teplotě 37°C, pH bylo 10 hodin po inokulaci automaticky udržováno na hodnotě 6,7, pomocí 2M kyseliny sírové a 6M hydroxidu sodného, a potom na hodnotě 6,0.

Obsah rozpuštěného kyslíku (dOT) byl nastaven na 50% vzdušného nasycení a automaticky udržován na této hodnotě úpravou rychlosti míchání fermentoru. Vzdušnění ve fermentoru bylo původně 201/min, odpovídající 1 objemuna objem za minutu(WM) a bylo ručně zvýšeno na 4 51/minutu tehdy, když rychlost míchání fermentoru dosáhla maxima (1000 otáček za minutu). Vzdušnění fermentoru bylo ručně sníženo zpět na 201/minutu bezprostředně poté, když byla rychlost míchání automaticky snížena na přibližně 500 otáček za minutu. Fermentace probíhala 23 hodin a během této doby byly odebírány vzorky na stanovení optické density (0D₅₅₀) buněčné sušiny, akumulace a rozddélení ricinu

A v bakteriálních buňkách. Akumulace ricinu-A byla sledována po elektroforéze lyzátu celých buněk bakterií na SDS-PAGE gelech po obarvení Coomassie modří. Rozdělení ricinu A v cytoplasmě (rozpustný) a ve formé nerozpustných inkluzí v buňce bylo stanoveno po sonikaci vzorku bakterii.

4,5 hodin po inokulaci byl do fermentoru přidáván vzorek kvasničného extraktu (225g/l) rychlostí 1,7 g/l/h.

Když byl při fermentaci vyčerpán zdroj uhlíku (vedoucí k rychlému zvýšení dOT při 50% vzdušnění) byl přidáván do fermentoru glycero (714 g/1) a síran amonný (143 g/1) v rychlosti, která zajišťovala maximální nároky bakterií na uhlík. Rychlost přítoku živin (zdroje uhlíku a síranu amonného) zůstala nezměněna až do ukončení fermentace.

Po 23 hodinách fermentace dosáhlo množstí ricinu A přibližné 1500 mg rozpustného ricinu A na litr fermentačního media.

POZNÁMKY :

1. E.coli DS410 (také zde uváděn jako MSD68) je dobře znám (Dougan a Sherratt, Molecular and General Genetics, Vol.151, p. 151-160, 1977). Tento kmen volně dostupný pro veřejnost, a navíc byl aplikanty deponován '7. června

1985, podle Budapešťstké dohody do sbírky National Collection of Industrial and Marině Bacteria Ltd, Aberdeen, Scotland pod číslem 12100.

2. Roztok stopových prvků (TES)

TES má následující složení :

mg/lOml (deionizované vody)

A1C1₃.6H₂O

CoC1₂.6H₂0

KCr(SO₄)₂.12H₂O

CuC1₂.2H₂O h₃bo₃

2,0

0,8

0,2

0,2

0,1

Kl	2,0
MnSO4.H2O	2,0
NÍSO4.6H2O	0,09
Na2Mo04.2H2O	0,4
ZnSO4.7H2O	0,4

Purifikace r-ricinu z E.coli

Za optimálních podmínek fermentace se r-ricin A hromadil jako cytoplasmatická rozpustná bílkovina. Tato bílkovina byla zísávána porozbití buněk (homogenizací) v pufru, který podporoval stabilitu r-ricinu A. Tato operace byla provedena na živých odstředěných buňkách, aby byla zajištěna stabilita produktu v roztoku. r-Ricin A byl získán z homogenátu odstraněním pevných částí(zbytky buněk) odstředěním. Aby tato procedura mohla bát prováděna ve velkém, zbytky byly flokulovány pomocí polyethylen iminu, který také srážel převážnou část nukleových kyselin obsažených v extraktu. Odstředěný supernatant byl poté sterilně filtrován, zakoncentrován cross flow filtrací a bílkovina byla vysrážena síranem amonným. Síranová sraženina byla uchovávána ve zmrzlém stavu při -70°C.

r-Ricin A má isoelektrický bod rozdílná hodnota, ve srovnání s E.coli. Produkt může být tedy chromatografií. Všechny postupy uvolnění a produktu a jeho přečištění (chromatografie), byly prováděny za podmínek

7,3, což je dostatečně ostatními bílkovinami běžně čištěn iontovou zajišťujících stabilitu r-ricinu A:teplota < 15°C, přítomnost dithiotreitolu, zajišťující volný thiol v redukpvaném stavu a EDTA pro redukci vzdušné oxidace a proteolýzy.

Získávání r-Ricinu A

Buňky byly odseparovány z fermentačního media pomocí kontinuálního diskového nahromadovacího periodického průtočného separátoru. Medium (501 z 2 x 251 fermentací) bylo přeneseno z fermentorů do 50 1 širokého tanku a převedeno do systému obsahujícího několik skladovacích tanků, připojených k separátoru a vysokotlakému homogenizátoru.

Skladovací tank byl připojen k systému a medium bylo hnáno přes odstředivku rychlostí byla upravena tak, aby odstředěný čistý přes sklíčko v průtočné řadě separátoru byly sebrány do

401/h. Průtočná rychlost supernatant byl visuálně .Pevný zbytek (buňky) ze vhodných nádob a byla resuspendovány ve 401 pufru A (50 mM dihydrogen ortofosfátu sodného,, 25 mM EDTA, 5 mM benzimidinu, 2 mM dithiotreitolu, pH 6,3 s 5 N hydroxydem sodným) a předchlazeny na 8°C v pevných nádobách. Suspendované buňky byly potom přeneseny zpět do širokých tanků přes homogenizátor s pracovním tlakem nastaveným na 600 barrů. Vznikající homogenát (601) byl zchlazen na teplotu < 20°C a byl připraven 0,5% s ohledem na polyethylenimin byla ponechána přídavkem 2,51 10% (v/v) roztoku. Suspenze po 10 min flokulovat a přenesena do skladovacích tanků přes odstředivku- separátor. Čistý supernatant byl nahromaděn a sterilizován čištěním přes hloubkový filtr a membránový filtr 0,2 u s pozitivním nábojem.

Srážení síranem amonným

Sterilní přečištěný supernatant byl zakoncentrován na objem 121 za použití průtočného filtračního zařízení se spirálovou kolonou a k roztoku byl přidán pevný krystalický síran amonný do 40% nasycení tj. 2,9 kg. Vysrážení roztoku probíhalo přes noc za mírného míchání při 15°C a po té byla sraženina odstředěna. Kašovitá vrstva byla nahromaděna a uchovávána při -70°C do doby dalšího zpracování.

Rozpouštění a odsolování

Síranová sraženina po roztátí v přítomnosti 141 pufru B (50 mM dihydrogen orthofosfátu sodného), 25 mM EDTA, 2 mM dithiotreitolu, pH 6,3 s 5 N hydroxidu sodného). Po 30 minutách byla suspenze čištěna odstředěním a odsolována dialýzou proti 70 1 pufru B , kdy sledovaná vodivost klesla pod hodnotu 3mS/cm. Odsolený roztok byl čištěn dalším odstředěním a byl zpracován okamžitě.

Ionexová chromátogarfie (Anex)

Odsolený roztok byl pomalu přidáván do vsádkového chromatografického tanku, obsahujícího 2 kg DEAE- celulosy, který byl ekvilibrován 601 pufru B. Po 6-ti hodinovém míchání byl roztok nenavázaného r-ricinu A pumpován ze dna tanku přes kolonu o rozměrech 11,3 cm průměru x 10 cm, naplněné ekvilibrovanou DEAE- celulosou při rychlosti průtoku 80ml/min. Převážná část r-ricinu A se nenavázala a byla nahromaděna v nerezavějící ocelové nádobě.

Ionexová chromatografie (Katex) pH roztoku r-ricinu A bylo upraveno na pH 5,5 pomocí 1 M orthofosforečné kyseliny a roztok byl nanesen na kolonu o rozměrech lOcm průměr x lOcm, naplněnou karboxymethyl celulosou ekvilibrovanou 10 1 pufru C (25 mM dihydrogen orthofosfátu sodného, 5 mM EDTA, 2 mM dithitreitol, pH 5,5 s 5 N hydroxydem sodným). r-Ricin se navázal na tuto kolonu a po promytí 10 1 pufru C byl z ní eluován 10 1 pufru D (25 mM dihydrogen orthofosfátu sodného), 5 mMEDTA, 2 mM dithiotreitolu, 100 mM chloridu sodného, pH 5,5 s 5 N hydroxydem sodným), čistý r-ricin A eluovaný jako jediný pík byl nahromaděn a skladován při -70°C, jako sterilní zmrzlý roztok do dalšího zpracování. r-Ricin A je za těchto podmínek stabilní více než rok.

Pro čištění bylo použito následující vybavení: Anex : DE-52, DEAE celulosa (Whatman Biochemicals) Katex : CM/Sepharosa (Pharmacia)

Odstředivka : Westphalia CSA-1, disková nahromadil j ící odstředivka (Westphalia)

Homogenizátor: APV-Schroeder Lab 60/60 homogenizátor (APV) Filtry : AMI 0057P Hloubkový filtr, ABI NFZP-Posidyne membránový filtr (Pall)

Vsádkový tank : 701 Pharmacia vsádkový chromatografický tank (Pharmacia)

DE- kolona : Bioprocess 113 (Pharmacia)

DM-kolona : K100/50 (Pharmacia).

BIOLOGICKÉ VLASTNOSTI PROTILÁTKY C242 A IMUNOTOXINU

Imunohistochemické využití C242 (C242.II) u kolorektálního nádoru a normální tkáně.

Vzorky primárního karcinomu tlustého střeva a konečníku a různé normální tkáně byly získány od pacientů, kteří se podrobili chirurgickým zákrokům. Tkáně byly uchovávány v ledu a byly zmrazený během hodiny po resekci v isopentanu předmrazeným v tekutém dusíku. Tkáně byly uchovávány při -70°C do rozdělení. Zmrzlé biopsie byly nařezány na 5 um části a fixovány v 50% acetonu po dobu 30 vteřin při

4°C,dále pak 100% acetonem po dobu 5 minut při 4°C. Části byly sušeny vzduchem a ponořeny do PBS na 10 minut. Všechny části byly inkubovány v 0,3% peroxidu vodíku v PBS po dobu minut, za účelem odblokování endogenní peroxidasy a ponořeny dvakrát do PBS. Po té byly části ošetřeny normálním vepřovým šerem a naředěným 1:10 v PBS-4%BSA po dobu minut při protilátek.

4°C, aby se zabránilo nespecifické vazbě

Všechny atmosféře po inkubace s protilátkami probíhaly ve vlhké dobu 30 minut při pokojové teplotě. Části byly nejdříve inkubovány s monoklonální protilátkou C242 (C242.II), získané podle příkladu 1, uvedeného výše, v PBS-4%BSA, po té s biotynylovaným koňským, proti-myším IgG (Vectastain-trademark, Vector Laboratories, Burlingame, CA,USA) ředěným 1:400 v PBS-4%BSA se 2% vepřového proti-králičiho inmunoglobulinu a konečně s Avidin DH/biotinylovaným H komplexem křenové peroxidasy (Dakopatts A/S, Copenhagen, Denmark). Po každé inkubaci byly plátky ponořeny do PBS na dobu 15 minut. Části byly potom ošetřeny substrátem po dobu 15 minut, ponořeny do PBS, a pro počítání obarveny haematoxylinem a zality do glycerolželatiny (Merck, Darmstadt, Germany). Jako substrát bylo použito 10 mg

3-amino-9-ethylkarbazolu (Sigma, St.Louis, Mo., SA), rozpuštěných v 6 ml dimethylsulfoxidu a naředěných 50 ml 0,02 M acetátu sodného, pH 5,5, obsahujícího 4 ul 30% peroxidu vodíku. Roztok substrátu byl před použitím filtrován. Části byly potom sledovány a výsledky jsou uvedené v Tab.1 .

Tabulka 1 : Barvení nádorů tlustého střeva, konečníku a různých normálních tkání pomocí C242.II

Tkáň	Obarvená/Celková
kolo-rektální nádor	26/41

normální část tlustého střeva 8/16 prsní žláza 2/3 příušnice 2/2 *

kůže	0/1
	lehké zbarvení potních žlá
játra	0/2 slabé zbarvení žlučovodů
ledviny	0/2
pankreas	2/2 trubice
žaludek	0/1

malé střevo

0/1

Jak je patrné z Tab.l, 63% sledovaných biopsií z nádorů tlustého střeva a konečníku vykazovalo pozitivní barvení monoklonálním C242:II. Exprese antigenu CA242 v normálních tkáních tlustého střeva bylo obecné slabší než v nádorových tkáních, barvení bylo úplné lokalizováno ve sloupcovém epithelu a pohárkovitých buňkách. Ostatní normální tkáně (mimo tlustého střeva), téměř nevykazovaly reaktivitu s monoklonální C242:II. zatímco pozitivní reakce byla nalezena u normálních dýchacích trubic, pankreatických trubic, žlučovodů a potních kanálků, ale barvení střeva bylo slabé.

Imunohistochemické využití C242 (C242:II) v normálních lidských tkáních odebraných po smrti.

Široká paleta normálních lidských tkání byla shromážděna celkem od 21 jedinců (post mortem). Z nejlepších sad tkání bylo vybráno pro stanovení C242:II imunoreaktivity.

Po smrti byly tkáně odebrány a umístěny ihned v předem vychlazených zkumavkách obsahujících základní medium s přidanými antibiotiky. Zkumavky obsahující tkáné byly potom přeneseny v ledové lázni do laboratoře, tekutina byla odstraněna a tkáné byly upraveny na 0,5 cm² kostek. Kostky tkání byly umístěny na proužky filtračního papíru rychle zchlazeny v tekutém dusíku. Zmrazené tkáně byly uchovávány při -80°C do nařezání. Při dělení na části, byly zmrazené vzorky nařezány na 6 um části, které byly umístěny na mikroskopických sklíčkách. Části byly fixovány ponořením

- «U+ 93 sklíček do 100% acetonu při pokojové teplotě po dobu 2 minut. Sklíčka byla potom vyndána z acetonu, usušena na vzduchu a skladována při -20°C do použití.

Všechny inkubace probíhaly ve vlhkém prostředí po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Části byly nejdříve inkubovány s monoklonální protilátkou C242:IIv Tris pufru/NaCl (TBS), po té s konjugátem křenové peroxidasy a králičím proti- myším IgG (Dako Ltd, High Wycombe, Bucks, UK), ředěným 1:50 v TBS obsahujícím 20% lidského sera (Sigman Chemical Company Ltd., Poole, Dorset, UK) a nakonec s konjugátem křenové peroxidasy a vepřovým proti-králičím IgG(Dako Ltd.), ředěným 1:50 TBS obsahujícím 20% lidského séra.Po každé inkubaci byla sklíčka ponořena dvakrát do TBS. části byly potom ošetřeny substrátem po dobu 3-5 minut, ponořeny do TBS, pro počítáni obarveny Mayers haematoxylinem a fixovány syntetickým fixovacím mediem (Shadon Scientific Ltd, Runcorn, Cheshire, UK.).

Jako substrát bylo použito 10 mg diaminobenzidinu (Sigma) rozpuštěných v 17 ml TBS obsahujících 17 ul 30% peroxidu vodíku. Roztok substrátu byl před použitím filtrován. Části byly sledovány a výsledky jsou uvedeny v Tab.2.

Table 2.: Barvení normálních tkání odebraných po smrti C242;II

Tkáň	Obarvené/Celkový počet
malý mozek	0/3
velký mozek	0/3
střední mozek	0/3
srdce	1/5	nezřetelná difusni reakce
plíce	0/5
periferní nervy	0/3
ledviny	1/5	reaktivita k blízkým/vzdáleným tubulům
játra	1/5	nezřetelná reaktivita v trubicích
pankreas	2/2
část tlustého střeva	2/3	nezřetelná reaktivita v

epithelu tenké střevo nadledvinky žlučník štítná žláza příštitné tělísko kůže pruhované svalstvo slezina lymfatické uzliny žaludek varlata příušní

3/3 nezřetelná reaktivita v epithelu

2/5 nezřetelná reaktivita v kůře

1/5 difuse

1/5 difuse

0/2

2/4 šupinatý epithel a potní žlázy

1/5 difuse

0/5

0/5

3/3 nezřetelná reaktivita v epithelu

0/3

1/1 nezřetelná reaktivita v trubici mandle

4/4 reaktivita v šupinatém epithelu

Jak je patrné z Tab.2, 72% z testovaných tkání odebraných po smrti, nevykazovalo žádnou reaktivitu s C24 2:II. Z 28% pozitivních vzorků většina měla barvení bud' difuzního charakteru, bez ohraničení, nebo v ohnisku převážně v tkáních trubicové struktury . Více heterogenní, stále však ještě minimální vazba, byla pozorována na epithelu trávicího traktu. Dva ze čtyř testovaných vzorků kůže, reagujících pozitivně, byly šupinatý epithel a potni žlázy. Šupinatý epithel se také barvil pozitivně u 4 vzorků mandlí testovaných s C242:II.

Endocytosa C242:II vázajícího se na COLO 205, lidský nádor tlustého střeva

Stanovení endocytosy bylo prováděno následujícím způsobem:

Suspenze jednotlivých buněk byly připraveny z COLO 205 buněk (viz příprava C242 protilátky dříve popsaná) rostoucích jako jednovrstevná kultura. Buňky byly trypsinovány, účinně promyty a resuspendovány v kultivačním mediu. Jodem označená protilátka proti C242:II výše uvedená (200 OOOcpm odpovídá 50 ng monoklonální protilátky) byla přidána k suspenzi jednotlivých buněk COLO 205 buněk (10⁶ buněk) v 5 ml zkumavce. Konečný objem byl 200 ul/zkumavku.

Buňky 'I-C-242 odstředěna protilátky

125byly inkubovány v ledu (0°C) v přítomnosti po dobu jedné hodiny. Suspenze byla poté a buňky byly zbaveny nenavázané monoklonální promytim. Pre-inkubované buňky byly dále inkubovány při 37°C v 10 minutových časových intervalech po dobu jedné hodiny, mezi jednotlivými intervaly byly buňky ochlazeny a peletovány. Radioaktivní značení uvolněné do media bylo měřeno v supernatantu (LKB gama počítač, Pharmacia AB, Uppsala, Sweden). Supernatant byl také podroben TCA sráženi a radioaktivita sraženiny vazba ¹²⁵I-C242 byla odstraněna byla měřena. Povrchová kyselým promytim 0,2 M glycin-HCl pufrem, pH 1,5, obsahujícím 2,5 mg/ml papainu, a radioaktivita, reprezentovaná vnitřním ¹²⁵I-C242, byla měřena. Množství povrchově vázané protilátky po jednotlivých inkubacích při 37°C bylo zjišťováno odečítáním uvolněné a vnitřní monoklonální protilátky. Degradace uvolněné protilátky byla měřena ze TCA sráženiny supernatantu.

vyjádřené křivkami COLO 205 buněk. (Sur),

Výsledky uvedené v Obr.15 jsou ukazujícími endocytosu ¹²⁵I-C242:II Radioaktivita na buněčném povrchu (Sur), vnitřní radioaktivita (Int), uvolněná radioaktivita (Res) a rozložená uvolněná radioaktivita (Deg.Re) jsou vyjádřeny jako procenta celkové původní radioaktivity buněčného povrchu. Na Obr.15 je možno vidět, že více než 20% vnitřní C242:II bylo získáno během jedné hodiny, když pre-inkubované buňky byly inkubovány při 37°C. Bylo zde malé množství v kyselině rozpustné radioaktivity, když byl supernatant srážen TCA, což indikuje malou fragmentaci uvolněné aktivity po jedné hodině inkubace.

Cytotoxicita imunotoxinu ricin A/C242 protilátky

In vitro toxicita

Tento test sleduje in vitro cytotoxicitu imunotoxinu proti buněčné linii lidského nádoru tlustého střeva a konečníku (Colo 205-ÁTCC No.CCL 222).

Colo 205 buňky rostly v suspenzi v RPM1640 mediu s 2,0 g/1 bikarbonátu sodného, bez glutaminu, s 5% teplem inaktivovaným embryonálním telecím šerem, 2 mM L-glutaminem a 50 ug/ml gentamicinem. Buňky byly počítány za použití haemocytometrových bloků. Pro stanovení inhibice syntézy bílkovin, byly buňky v množství 2 x 10⁴buněk /jamku naneseny na destičku s 96 jamkami v objemu 100 ul. Vzorky imunotoxinu byly naneseny do 3 jamek. Imunotoxin byl přidán v 12 paralelních ředěním od 2000 do 0,98 ng/ml. 100 ul přidáno do několika jamek jako byla inkubována 24 hod.při 37°C, uCi ^JH-L-leucmu do každé jamky. . dalších 24 hod. při 37°C. 50 ul kultivačního media bylo kontrola. Každá destička dříve než bylo přidáno 2 Destičky byly inkubovány trypsinu bylo přidáno do každé jamky a destičky byly inkubovány dalších 15-20 minut. Buňky byly odstraněny z každé jamky v destičce podložkou ze skleněných vláken a radioaktivita byla stanovena za použiti LKB beta scintilátoru. Byla sestavena křivka inhibice proteosyntezy a odečteny hodnoty IC₅₀. Výsledky získané získané s preferovaným imunotoxinem (přípravu popsána výše) jsou uvedeny na Obr.16.

In vivo cytotoxicita

Tento test sleduje in vivo cytotoxicitu imunotoxinu proti buněčné linii lidských nádorových buněk, COLO 205, narostlé pod kůží myší bez brzlíku. Současně byly testovány kontrolní skupiny, využívající protilátku samotnou nebo fosfátem pufrovaný fysiologický roztok.

Myši bez brzlíku byly imunizovány COLO 205 buňkami v koncentraci 5 χ 10⁶ podkožním vpichem do boků. U rostoucích nádorů byly měřeny každé 3-4 dny dva rozměry obkročnými kružidly (kaliperem). Testovaná látka byla injikována až v době, kdy nádor dosáhl rozměrů 0,7-l,0cm x 0,7-1,0 cm. Toto stadium bylo bráno jako nulový stav (den 0) a testované látky

100 byly v této době injikovány intravenózně do ocasní žíly ve dnech 0, 1 a 2. Velikost nádoru byla dále měřena ve dvouch rozměrech a výsledky byly presentována jako relativní objem nádoru. Měření bylo prováděno každé 3-4 dny až do ukončení pokusu.

Tento test srovnává vliv fosfátu pufrovaného fysiologického roztoku, samotné protilátky C242 (l,2mg/kg) a preferovaného imunotoxinu (příprava popsána výše) (2,0 mg/kg) na růst nádoru a výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách.

SKUPINA 1 Fosfátem pufrovaný fysiologický roztok 0,1 ml/10 g/ intravenózně 3 x denně

Myš

Den	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
0	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
4	2,02	1,15	2,28	1,02	0,51	0,80	2,05	1,58	0,79	1,23
8	5,04	3,27	5,08	2,18	1,09	1,83	4,54	4,75	1,59	3,63
10	6,41	4,32	5,24	3,94	1,96	2,44	5,58	5,91	1,85	4,43
15			7,72	5,24	4,13	2,94	7,25	9,45	2,71	7,02
18			11,81	6,78	3,53	8,02		14,39	3,30	11,48

101

SKUPINA 2 Protilátka C242 1,2 mg/kg/intrávenozně 3 x denně Myš

Den	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
0	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
4	1,64	2,19	1,85	1,08	1,48	2,07	1,65	1,36	2,14	2,47
8	3,31	4,30	3,28	4,07	3,38	4,78	6,08	2,96	3,34	7,31
10	4,46	4,65	4,88	4,85	3,44	5,11	8,82	4,19	4,12	7,43
15				5,29			10,80	2,57
18							15,03

SKUPINA 3 Imunotoxin 2,0 mg/kg/intravenózně 3 x denně Myš

Den 1	2	3	4	5	6	7	8	9
0	1	1	1	1	1	1	1	1	1
4	0,63	0 86	1,40	0,64	0,48	0,43	0,73	0,91	0,77
8	0,44	0,87	1,08	0,48	0,58	0,41	0,67	0,93	1,07
10	0,48	0,71	1,39	0,29	0,55	0,51	0,56	1,13	1,21
	Jak je	patrné	Z i	uvedených tabulek,	imunotoxin	redukuje

velikost nádoru (v tabulkách jsou uváděny relativní objemy nádorů) ve srovnání s fysiologickým roztokem pufrovaným fosfátem a protilátkou samotnou.

102

Reaktivita C242:II s lidskou pankreatickou nádorovou tkání

Tento test sleduje reaktivitu C242 k lidské pankreatické nádorové tkáni.

Reaktivita C242:II k lidské pankreatické nádorové tkáni byla stanovena za použiti imunohistologických technik používaných pro stanovení normální reaktivity lidských tkáni. Čerstvě zmrazená pankreatické nádorová tkáň byla získána biopsii ostrou jehlou a formalínem fixovaná do parafinu zalitá tkáň byla získána zpři resekci nádoru. 13 ze 16 pankreatických nádorů se barvilo pozitivně. Obecně lze říci, že šíře a způsob vazby byl lepší nebo stejný se šíří a způsobem vazby pozorovaným u vzorků nádorových tkání tlustého střeva a konečníku.

In vitro potence imunotoxinu v linii buněk pankreatického nádoru

Tento test sleduje in vitro cytotoxicitu imunotoxinu proti linii buněk lidského ,pankreatického nádoru. Buněčná linie Pan 1, odvozená od pankreatického adenokarcinomu, byla používána pro kvantifikaci cytotoxické potence imunotoxinu in vitro a FACS analýzou byl exprimován cílový antigen. Pro kvantifikování sily imunotoxinu byly k Pan 1 buňkám v kultuře přidávány různé koncentrace imutoxinu za účelem zjistit IC₅₀. Konjugát MOPC 21 a ricinu A nebo ricin A samotný byly

103 používány jako negativní kontroly. Bioassay bala provedena třikrát a zmíněná potence dosahovala hodnot 40 +/- 18 ng/ml. Negativní kontroly nebyly cytotoxické při koncentracích do 1000 ng/ml. Tyto hodnoty ukazují, že cílový antigen je přítomný na nádorových buňkách pankreasu a že antigen pozitivní nádorové buňky jsou citlivé na imunotoxin.

Molekulární klonování částí cDNA kódujících lehký a těžký řetězec monoklonální protilátky C242:II

A.Příprava celkové RNA

Celková RNA z 10⁸ buněk byla přiravena dle metody Cirgwina, J.M. a kol. (1979, Biochemistry 18, 5294-5299) , která byla modifikována Chomezynksim,P. a Sacchim,N (2987, Anal Biochem.162, 156-159). Stručně, pelet buněk byl rozpuštěn v 15 ml studeného denaturačního roztoku složeného z 4 M guanidinthiokyanátu, 25 mM citrátu sodného, pH 7, 0,5% N-lauroyl sarkosinu, 0,lM 2-merkaptoethanolu. Po rozpuštění buněčného materiálu bylo přidáno 1,2 ml 2M acetátu sodného (pH 4,0) a směs byla extrahována fenol-chloroformisoamylalkohol (250:49:1). Po odstředění byla RNA srážena z vodné fáze přídavkem stejného objemu isopropanolu a inkubace přes noc při -20°C zajistila vysrážení celkové RNA. Po odstředění a resuspendaci RNA bylo srážení opakováno a po dalším odstřelování a srážení bylo na základě měření absorbance stanoveno celkové množství RNA 960 ug.

104

B. Isolace mRNA

Aby byla získaná polyadenylovaná mRNA z výše připravené celkové RNA, byl použit PolyATract™ mRNA isolační systém Promega Corporation, Madison, Wisconsin, U.S.A., dle instrukcí výrobce (citace : Promega Technical Bulletin, No. 090:1990). Stručně, 960 ug celkové RNA bylo rozpuštěno ve vodě a spojeno s biotinylovaným oligo (dT) probou (50 pmol) v 0,4 x SSC (1 x SSC = 8,77 g NaCl, 4,41 g citrátu sodného na litr vody, pH 7,0). Streptevidinem potažené paramagnetické kuličky (Streptavidin Magnesphere™) byly přidány a po 10 minutách inkubace byly magnetické částice odstraněny a promyty několikrát 0,1 x SSC. Polyadenylovaná mRNA byla eluována z kuliček inkubací ve vodě. Takto bylo získáno 5 ug mRNA.

C. Příprava cDNA fágové knihovny v E.coli.

cDNA byly připravena z polyadenylované mRNA z předcházejícího kroku dle metody Gublera,U. a Hoffmana,B.J. (1983, Gene 25,263-269) modifikované pro vektor Uni-ZAP™ (Stratagne lne. La Jolla, California), která umožňuje nepřímé klonování dvoušroubovicové cDNA. Stručně, 5 ug polyadenylované mRNA bylo převedeno na jednovláknovou cDNA s využitím primeru Uni-Zap™ (56 ng/ml) a přídavku dATP, dGTP, dTTP a 5-methyl-dCTP v koncentraci 0,6 mM a 45 U reverzní transkriptázy z viru leukemie Mloncy Murinae. Směs byla inkubována po dobu 1 hodiny při 37°C. Syntéza druhého

- 105 vlákna cDNA byla zajištěna přídavkem dATP, dGTP, dTTP a CTP do konečné koncentrace 0,15 mM, 3,2 U RNasy H a 6,5 U DNA Polymerázy 1. Inkubace probíhala po dobu 2,5 hodin při 16°C. Směs byla extrahována směsí fenol:chloroform (1:1) a srážena ethanolem. Konce cDNA byla převedeny na tupé konce inkubací s 0,16 mM dNTP a 10 U T4 DNA polymerázy po dobu 30 minut při 37°C. Po fenol:chloroformové extrakci a ethanolovém srážení, byly výsledné tupé konce cDNA ligovány s EcoRI adaptory přidáním 3 Weiss U T4 DNA ligázy, 1 mM ATP a inkubaci přes noc při 8°C. Po ligaci byly kohesivní konce EcoRI fosforylovány za přítomnosti 10 U T4 polynukleotid kinasy a 1 mM ATP a inkubaci po dobu 30 minut při 37°C. Získaná cDNA s fosforylovanými kohezivními konci EcoRI byla štěpena 90 U Xhol tak, aby vznikly Xhol kohezivní konce ze sekvence zakódované Uni-ZAP^Tř*vazebným primerem. Takto získaná cDNA byla potom ligována s 1 ug Uni-ZAP™XR EcoRI a částmi připravenými pomoci Xhol v přítomnosti 2 Weiss U T4 DNA ligasy a 1 mM ATP. Inkubace probíhala přes noc při 12°C. Ligační smés byla in vitro sbalena do částice lambda-fágu za použití Gigapack II Gold^R sbalující extrakt dle popisu výrobce a vznikající fágy byly použity pro infekci E.coli. PLK-F . Získaná cDNA knihovna obsahující 8,5 x 10⁸ nezávislých klonů byla jednou amplifikována, aby dala fágový titr 7,5 x 10⁸ pfu/ml. Vzniklá cDNA knihovna byla vybíraná pomocí hostitelského kmene E.coli XLl-Blue (Bullock,W. (1978) Biotechniques, 5, 4) dle metody popsané dále.

106

D. Příprava hybridizačni proby genomu (DNA) Saiki,R.H. a

Pro detekování klonů cDNA kódujících těžký řetězec IgGl a kapa řetězec protilátky C242:II, byla připravena hybridizační proba pokrývající první stálou oblast těžkého řetězce, CH1, a stálou oblast kapa řetězce, CK, z myšího metodou PCR (polymerase Chain reaction) dle kol. (1988, Science 239, 487-491). Stručně, páry oligonukleotidových primerů, hybridizující s 5 a 3 konci exonů kódujících oblasti výše zmíněného imunoglobulinu, byly použity pro amplifikaci myší genomové DNA. Po purifikaci elektroforezou na agarosovém gelu byly vzniklé fragmenty DNA proby značeny ³²P, metodou využívající náhodného primeru dle Feinberga,A.P. a Vogelsteina, B. (1983, Anal. Biochem. 132, 6).

E. Výběr sekvenci kódujících IgGl těžký řetězec a kapa řetězce a inserce do plasmidu cDNA knihovna z kapitoly C byla testována ve dvou oddělených pokusech používajících buď proby imuglobulinu IgGl nebo kapa, popsané v kap. D, dle metody popsané Sambrookem,J. a kol.(1989, Molecular Cloning, 2ndEd, Cold Spring Harbor laboratory Press). Pozitivně hybridizované fágové klony z obou hybridizačních pokusů byly dále purifikovány opakovaným výběrem za použiti stejných prob jako v počátečním výběru. Pozitivně hybridizované fágové klony byly převedeny do kultury E.coli CLl-Blue, a vzniklé fágové

107 kultury byly použity pro SK(-)plasmidy, za použiti metody Shorta,J.M. a kol 7583-7600).

přípravu cDNA, obsahující pBlue vyříznutí fagu a namnožení dle (1988, Nucleic Acids Res. 16,

F. Charakterizace plsmidové cDNA z hybridizovaných kolonií

Vzniklá cDNA obsahující plasmidy byla charakterizována mapováním restrikčními enzymy a plasmidy obsahující inserty předpokládané délky byly podrobeny dideoxy DNA sekvenování dle Sangera, F. a kol. (1977, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 74, 5463-5467). Plasmid hybridizující s Ig kapa probou, označený jako pKGE761, obsahoval cDNA insert jehož sekvence kódovaly otevřený čtecí rámec úzce homologní dříve známým sekvencím myšího kapa lehkého řetězce.(Kabat, E.A. a kol. (1987) Sequences of Protein of Immunological Interest, 4th Ed. , U.S.Department of Health and Human Services, National Institutes of Health), částečná cDNA sekvence kódující různé oblasti kapa lehkého řetězce, VK a jemu odpovídající bílkovinné sekvence je namalována na Obr.18. Tři CDR sekvence, označené jako CDR1 až CDR3, jsou zvýrazněny podtržením. Signální peptid předcházející amino konci VK segmentu je označen S. CK značí stálou oblast následující za karboxy koncem VK sekvence.

Hybridizace plasmidu s IgGl probou, označená jako pKGE762, obsahující cDNA insert jehož sekvence kódují otevřený čtecí rámec úzce homologní k dříve známým sekvencím

108 myšího IgGl těžkého řetězce (Kabát,E.A. a kol. viz výše). Částečná sekvence cDNA kódující různé oblasti IgGl těžkého řetězce, VH, a jemu odpovídající bílkovinné sekvence je namalována na Obr.19. Tři CDR sekvence, označené jako CDR1 až CDR3, jsou zvýrazněny podtržením. Signální peptid předcházející amino konci VK segmentu je označen S. CH1 značí stálou oblast následující za karboxy koncem VK sekvence.

SLOŽENÍ

Následně je uveden příklad farmaceutické dávkovači formy obsahující imunotoxin, jenž je předmětem podávané patentové přihlášky, která by mohla být využita pro terapeutické účely u lidí.

Injekční roztok sterilní vodný injekční roztok obsahuje imunotoxin ricin A/protilátka C242 trihydrát octanu sodného chlorid sodný

Tween 20

1,0 mg 6,8 mg 7,2 mg 0,05 mg/ml roztoku

GS36441 08JUN92 JMC

109

SEZNAM SEKVENCÍ (1) ZÁKLADNÍ (i) (ϋ) (iii) (iv) (v)

INFORMACE

APLIKANT : Imperiál Chemical Industries PLC and Kabi Pharmacia AB

NÁZEV PATENTOVÉ PŘIHLÁŠKY : KONJUGÁTY POČET SEKVENCÍ : 22 KONTAKTNÍ ADRESA :

(A) ADRESÁT : Legal Department:Patents (B) ULICE : Bessemer Road (C) MĚSTO : Welwyn Garden City (D) OKRES : Hertfordshire (E) ZEMĚ : United Kingdom (F) KÓD : GB-AL7 1HD

FORMA ČTENÁ POČÍTAČEM

(A)	TYP UCHOVÁVÁNÍ :	Disketa, 3,50 inch, 1,2Mb pamět
(B)	POČÍTAČ : 18 M PS/2
(C)	OPERAČNÍ SYSTÉM :	PC-DOS 3,20
(D)	SOFTWARE : ASCII	z WPS-PLUS

(vi) (vii)

SOUČASNÉ ZADANÉ ÚDAJE :

(A) ČÍSLO ZADÁNÍ (B) DATUM VYPLNĚNÍ :

(C) KLASIFIKACE :

PŮVODNĚ ZADANÉ ÚDAJE :

110 (A) ČÍSLO ZADÁNÍ : 9114399.0 (B) DATUM VYPLNĚNÍ : 03.7.1991 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:1 :

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 16 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SERQ ID NO :1:

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 14

Leu Tyr 16 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 7 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární

111 (xi) POPIS SEKVENCE :SEQ ID NO:2:

Arg Met Ser Asn Leu Val Ser 7 (2) ÚDAJE 0 SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 9 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (Xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:3:

Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr 9 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 5 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETĚZEC : Jqdnoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:4:

112

Tyr Thr Gly Met Asn 5 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 17 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:5:

Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp 14 Phe Lys Gly 17 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 10 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (Xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:6:

Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val

113 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 18 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:7:

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 14

Leu Tyr Trp Phe 18 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 11 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:8:

Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val

114 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 11 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (Xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:10:

Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 7 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (Xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:10:

Phe Thr Tyr Thr Gly Met Asn

115 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 21 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinoý (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:11:

Met Gly Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala

Glu Asp Phe Lys Gly Arg Ile (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 14 Aminokyselin (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO :12:

Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 14

116 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 25 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:13:

AATTCGCAT GCGG ATCCAT CGATC

Pozn.překl.: v originále chybí 1 báze v první desítce (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 25 (B) TYP: Nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:14:

GCGTACGCC TAGGTAGCTA GAGCC

Pozn.překl.: v originále chybí 1 báze v první desítce

117 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCÍ :

(A) DÉLKA : 21 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:15:

GATAACAACA TATTCCCCAA A (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 23 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (Xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:16:

GATAACAAC ATGGTACCC AAA

Pozn.překl.: v originále chybí po 1 bázi v obou desítkách

118 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 23 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:17:

AACAACATG GTACCCAAA CAA 23

Pozn.překl.: v originále chybí po 1 bázi v obou desítkách (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 1140 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŘÉTÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (Xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:18:

TTCTGGCAAA TATTCTGAAA TGAGCTGTTG ACAATTAATC ATCGAACTAG

TTAACTAGTA CGCAAGTTCA CGTAAAAAGG GTATCGACAA TGGTACCCGG

100

119

GGATCCACCT	CAGGGTGGTC	TTTCACATTA	GAGGATAACA	ACATGGTACC	150
CAAACAATAC	CCAATTATAA	ACTTTACCAC	AGCGGGTGCC	GCTACACAAA	200
GCTACACAAA	CTTTATCAGA	GCTGTTCGCG	GTCGTTTAAC	AACTGGAGCT	250
GATGTGAGAC	ATGAAATACC	AGTGTTGCČA	AACAGAGTTG	GTTTGCCTAT	300
AAACCAACGG	TTTATTTTAG	TTGAACTCTC	AAATCATGCA	GAGCTTTCTG	350
TTACATTAGC	CCTGGATGTC	ACCAATGCAT	ATGTGGTCGG	CTACCGTGCT	400
GCAAATAGCG	CATATTTCTT	TCATCCTGAC	AATCAGGAAG	ATGCAGAAGC	450
AATCACTCAT	CTTTTCACTG	ATGTTCAAAA	TCGATATACA	TTCGCCTTTG	500
GTGGTAATTA	TGATAGACTT	GAACAACTTG	CTGGTAATCT	GAGAGAAAAT	550
ATCGAGTTGG	GAAATGGTCC	ACTAGAGGAG	GCTATCTCAG	CGCTTTATTA	600
TTACAGTACT	GGTGGCACTC	AGCTTCCAAC	TCTGGCTCGT	TCCTTTATAA	650
TTTGCATCCA	AATGATTTCA	GAAGCAGCAA	GATTCCAATA	TATTGAGGGA	700
GAAATGCGCA	CGAGAATTAG	GTACAACCGG	AGATCTGCAC	CAGATCCTAG	750
CGTAATTACA	CTTGAGAATA	GTTGGGGGAG	ACTTTCCACT	GCAATTCAAG	800
AGTCTAACCA	AGGAGCCTTT	GCTAGTCCAA	TTCAACTGCA	AAGACGTAAT	850

120

GGTTCCAAAT	TCAGTGTGTA	CGATGTGAGT	ATATTAATCC	CTATCATAGC	900
TCTCATGGTG	TATAGATGCG	CACCTCCACC	ATCGTCACAG	TTTTGATTGC	950
TTATAAGGCC	AGTGGTACCC	GGGGATCCTC	TAGAGTCGAC	CTGCAGGCAT	1000
GCAAGCTTAG	CCCGCCTAAT	GAGCGGGCTT	TTTTTTATCG	ACCGATGCCC	1050
TTGAGAGCCT	TCAACCCAGT	CAGCTCCTTC	CGGTGGGCGC	GGGGCATGAC	1100
TATCGTCGCC	GCACTTATGA	CTGTCTTCTT	TATCATGCAA		1140

(2) ÚDAJE 0 SEQ ID NO:19:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE : (A) DÉLKA 26 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární
(xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:19:
ATAACAACAT GGTTCCCCAAA CAATAC	26

(2) ÚDAJE O SEQ ID NO:20:

121 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 86 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:20:

AAAAAGGGTA TCGACATGGT ACCCGGGGAT CCACCTCAGG GTGGTCTTTC 50

ACATTAGAGG ATAACAACAT GGTACCCAAA CAATAC 86 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 463 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:21:

.... ϋ

GGAATTCGGA ACGAGGAGTT TTTTTGTATC AAGTTCTCAGA. ATG AGG TGC 49 Met Arg Cys

CTA GCTjGAG TTC CTG GGG CTG CTT GTG CTC TGG ATC CCT GGA 91

Gfú Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro Gly

A /! i'

122

GCC

ATT

GGG

GAT ,

ATT

GTG

ATG

ACT

CAG

GCT

GCA

CCC

TCT

GTA

133

Ala

Ile

Gly

1 Asp/ 1

Ile

Val

Met

Thr

Gin

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

CCT

GTC

ACT

CCT

GGA

GAG

TCA

GTA

TCC

ATC

TCC

TGC

AGG

TCT

175

Pro

Val

Thr

Pro

Gly

Glu

Ser

Val

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

AGT

AAG

AGT

CTC

CTG

CAT

AGT

AAT

GGC

AAC

ACT

TAC

TTG

TAT

217

Ser

Lys

Ser

Leu

Leu

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Tyr

TGG

TTC

CTC

CAG

AGG

CCA

GGC

CAG

TCT

CCT

CAG

CTC

CTG

ATA

259

Trp

Phe

Leu

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

TAT

CGG

ATG

TCC

AAC

CTT

GTC

TCA

CGA

GTC

CCA

GAC

AGG

TTC

301

Tyr

Arg

Met

Ser

Asn

Leu

Val

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

AGT

GGC

AGT

GGG

TCA

GGA

ACT

GCT

TTC

ACA

CTG

AGA

ATC

AGT

343

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ala

Phe

Thr

Leu

Arg

Ile

Ser

AGA

GTG

GAG

GCT

GAG

GAT

GTG

GGT

GTT

TAT

TAC

TGT

ATG

CAA

385

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Leu

Gin

CAT

CTA

GAG

TAT

CCG

TTC

ACG

TTC

GGT

CCT

GGG

ACC

AAG

CTG

427

His

Leu

Glu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Leu

GAG

CTG

AAA

CGG

GCT

GAT

GCT

GCA

CCA

ACT

GTA

ACG

463

Glu

Leu

Lys

Arg

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Thr

123 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 483 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:22:

GAATTCGGCA CGAGATTGAG CCCAAGTCTT AGACATC ATG GAT TGG CTG 49 Met Asp Trp Leu

CGG

AAC

TTG

CTA

TTC

CTG

ATG

GCA

GCT

GCC

CAA

AGT

ATC

CAA

91

Arg

Asn

Leu

Leu

Phe

Leu

Met

Ala

Ala

Ala

Gin

Ser

Ile

Gin

GCA

CAG

GTC

CAG

TTG

GTG

CAG

TCT

GGA

CCT

GAG

CTG

AAG

AAG

133

Ala

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Lys

Lys

CCT

GGA

GAG

ACA

GTC

AAG

ATC

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GAT

TAT

175

Pro

Gly

Glu

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Asp

Tyr

ACC

TTC

ACA

TAC

TAT

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

AAG

CAG

GCT

CCG

217

Thr

Phe

Thr

Tyr

Tyr

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

GGA

AAG

GGT

TTA

AAG

TGG

ATG

GGC

TGG

ATA

GAC

ACC

ACC

ACT

259

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Asp

Thr

Thr

Thr

GGA

GAG

CCA

ACA

TAT

GCT

GAA

GAT

TTT

AAG

GGA

CGG

ATT

GCC

301

124

Gly

Glu

Pro

Thr

Tyr

Ala

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Ile

Ala

TTC

TCT

TTG

GAG

ACC

TCT

GCC

AGC

ACT

GCC

TAT

TTG

CAG

ATC

343

Phe

Ser

Leu

Glu

Thr

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gin

Ile

AAA

AAC

CTC

AAA

AAT

GAG

GAC

ACG

GCT

ACA

TAT

TTC

TGT

GCA

385

Lys

Asn

Leu

Lys

Asn

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Ala

AGA

CGG

GGG

CCT

TAC

AAC

TGG

TAC

TTT

GAT

GTC

TGG

GGC

GCA

427

Arg

Arg

Gly

Pro

Tyr

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GCC

AAA

ACG

ACN • _/

D - ccc

CCA

469

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Lys

Thr

Thr

Pro

Ser

TCT GTC TAT CC 483

Ser Val Tyr Pro

Pozn.překl.: v předposlední řádce (469) v třetím tripletu é .

odleva byla v originále třetí báze označená jako N (muže být A,G nebo C) , v poslední řádce (483) chybí v originále 3 báze.

Claims (16)

1. Patentové nároky

   1. Konjugát, vyznačující se tím, že obsahuje_____ toxinovou část a část, která se selektivně váže na cílovou buňku, která je nádorovou buňkou trávicího traktu. ΛΛ3Γ90V

   1VNA/1 0
2. 2. Konjugát dle nároku 1, vyznačuj ící se ---tím, že část, která se váže na cílovou buňku, obsahuje ^! c 6 ίΙΛ £

   C242 protilátku nebo takové vazebné místo, které má ‘ v podstatě stejné buněčné vazebné schopnosti. 'A2S.O3
3. 3. Konjugát dle nároků 1 nebo 2,vyznačující se 0 υ 6 0 f tím, že toxinová část obsahuje rekombinantní ricin A. |
4. 4. Konjugát dle nároků 1,2 nebo 3, vyznačuj ící se t i m, že část, která se váže na cílovou buňku a toxinová část jsou spojeny pomocí bifunkční spojky.
5. 5. Konjugát dle kteréhokoliv z uvedených nároků, vyznačující se tím, že část, která se váže na cílovou buňky a toxinová část jsou spojeny pomocí disulfidové nebo thioetherové vazby.
6. 6. Konjugát dle kteréhokoliv z uvedených nároků, vyznačující se tím, že část, která se váže na cílovou buňku a toxinová část jsou spojeny spojovacím činidlem o vzorci -S-X-CO-, kde X je přímý řetězec (1-6 C) alkylového typu, s možnou substitucí jedním nebo dvěma substituenty odvozenými od (1-6 C) alkylu, fenylu a (1-4 C)

   1 26 alkylfenylu; nebo (1-4 C) alkylfenylového typu, ve kterém muže být alkylová část nahrazena jedním nebo dvěma substituenty odvozenými od (1-6 C) alkylu, fenylu a (1-4 C) alkylfenylu; a kde fenylový kruh muže nést substituent odvozený od halogenu, (1-4 C) alkylu a (1-4 C) alkoxylu.
7. 7. Konjugát dle nároku 6,vyznačuj ící se tím, že X obsahuje methylenovou, ethylenovou, propylenovou nebo butylenovou skupinu nahrazenou jednou nebo dvěma skupinami odvozenými od methylu, ethylu, propylu nebo butylu.
8. 8. Konjugát dle nároku 6, vyznačující se tím, že spojka obsahuje radikál -S-CH(CH₂) CH C0-.
9. 9. Konjugát dle kteréhokoliv z uvedených nároků vyznačuj*ící se tím, že část, která se váže na cílovou buňku má CDR oblasti obsahující následující sekvence:

   lehký řetězec

   CDR1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr

   CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer

   CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr těžký řetězec

   CDR1: TyrThrGlyMetAsn

   CDR2: TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly CDR3: ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal

   CDR sekvence jsou uspořádány tak, aby část, která se váže na

   1 27 cílovou buňku, měla převážné stejné vazebné vlastnosti buňky jako protilátka C242.
10. 10. Konjugát, v yznačující se ti m, žerná následující vzorec :

    H

    A-S1-S2-X-CON-B kde

    A obsahuje rekombinantní ricin A, a B obsahuje část, která se váže k cílové buňce, která obsahuje protilátku C242,

    51 je atom síry umístěný na rekombinantním ricinu A,

    NH je na protilátce C242

    52 je atom síry a X je přímý řetězec (1-6 C) alkylové skupiny, převážně substituován jedním nebo dvěma substituenty odvozenými od (1-6 C) alkylu, fenylu a (1-4 C) alkylfenylu, nebo (1-4 C) alkylfenylové skupiny, ve kterém je alkylová část převážné substituována jedním nebo dvěma substituenty odvozenými od (1-6 C) alkylu, fenylu a (1-4 C) alkylfenylu, a kde fenylový kruh může nést substituent odvozený od halogenu, (1-4 C) alkylu a (1-4 C) alkoxylu.
11. 11. Konjugát, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku C242 a rekombinantní ricin A, vázaný z amino skupiny na C242 na thiol cysteinového zbytku v ricinu A pomocí diradikálové 3-merkaptomáselné kyseliny

    1 28 (-co.ch₂.ch(ch₃)-s-).
12. 12. Konjugát, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní ricin A a část, která se váže k cílové buňce má alespoň jeden z CDR oblastí obsahující převážně následující sekvence:

    lehký řetězec

    CDRl: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr

    CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer

    CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr těžký řetězec

    CDRl: TyrThrGlyMetAsn

    CDR2: TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly CDR3: ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal počet CDR oblastí a jejich uspořádáni je takové, že část, která se váže na cílovou buňku má převážně stejné vazebné vlastnosti buňky jako protilátka C242.
13. 13. Konjugát, vyznačující se tím, že toxinová část a část, která se váže na cílovou buňku, je specifická pro epitop nádoru trávicího traktu.
14. 14. Konjugát, dle nároku 13,vyznačující se tím, že část, která se váže na cílovou buňku je specifická pro

    129 epitop, na který se váže protilátka C242.
15. 15. Způsob výroby konjugátu dle nároku 1, vyznačuj í c í se t í m, že obsahuje:

    (a) pro takové konjugáty, ve kterých je část, která se váže na cílovou buňku přímo spojena s toxinovou částí, reaguje toxinová část s částí, která se váže na cílovou buňku.

    (b) pro takové konjugáty, ve kterých část, která se váže na cílovou buňku je spojena s toxinovou částí pomocí spojky reaguje část, která se váže na cílovou buňku, derivatizována linkerem , s toxinovou částí nebo reaguje toxinová část derivatizovaná linkerem s částí, která se váže na cílovou buňku.
16. 16. Farmaceutické složení, vyznačují se tím, že obsahuje konjugát, který byl již definován v kterémkoliv z předcházejících nároků, ve spojení s farmaceuticky akceptovatelným rozpouštědlem nebo nosičem.