JPH05320065A - 複合体、その製造方法及びこれを含有する医薬組成物 - Google Patents

複合体、その製造方法及びこれを含有する医薬組成物

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JPH05320065A
JPH05320065A JP4177212A JP17721292A JPH05320065A JP H05320065 A JPH05320065 A JP H05320065A JP 4177212 A JP4177212 A JP 4177212A JP 17721292 A JP17721292 A JP 17721292A JP H05320065 A JPH05320065 A JP H05320065A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 腸管腫瘍例えば結腸直腸腫瘍の治療に有用な
複合体であって、抗体例えばＣ242 抗体と毒素例えばリ
シンＡとを含有してなる複合体の提供。 【構成】 毒素部分と胃腸腫瘍に対して選択的な標的細
胞結合部分とからなる複合体。複合体の標的細胞結合部
分はＣ242 抗体又は実質的に同一の細胞結合性を有する
標的細胞結合部分からなり、毒素部分は組換え体リシン
Ａからなり、標的細胞結合部分と毒素部分は二官能性リ
ンカーによって連結されている。さらに、該複合体を含
有する医薬組成物、該複合体の製造法並びに腸管腫瘍の
治療方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗腫瘍治療(anti-tumour
therapy) において使用するための免疫毒素(immunotox
in) のごとき複合体(conjugate) 、かかる複合体の製造
方法及びかかる複合体を含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその解決すべき課題】リシン(ricin)
及びリシン型分子、例えばアブリン(abrin) 、モデシン
(modecin) 及びビスクミン(viscumin)は植物細胞内で産
生されるかつ細胞毒性( 細胞障害性) (cytotoxic prope
rty)を有する既知化合物である。この種の毒素はジスル
フィド架橋によって連結されている２個のポリペプチド
鎖からなる。ポリペプチド鎖の一方（"A鎖")は主として
毒素分子が細胞毒性を示す原因となるものであり、ポリ
ペプチド鎖の他方（"B鎖")は毒素分子を細胞表面に結合
させるものである。
【０００３】リシン型分子の毒性は３つの段階を経て作
動する： (a) B 鎖上のガラクトース結合部位と、細胞表面に暴露
されている糖タンパク質又は糖脂質との相互作用によ
る、細胞表面への毒素の結合； (b) 少なくとも A鎖の、細胞の細胞質ゾル（シトソー
ル）中への浸透；及び (c) リボソーム 60Sサブユニットの活性を破壊する A鎖
によるタンパク合成の抑制。
【０００４】B鎖は、また、毒素分子を細胞表面に結合
させるというその一次的な機能の他に、毒素の細胞内へ
の吸収を促進するという点で重要な二次的な機能を有す
ると考えられている。従って、 A鎖は、B 鎖が存在しな
い場合には、細胞表面に結合しかつ細胞の細胞質ゾル中
に浸透する能力に欠けており、、一方、B 鎖は細胞毒性
を有していないので、分離された A鎖及び B鎖は本質的
に無毒性である。
【０００５】前記したごとく、リシン及びリシン型毒素
分子は植物によって産生される。リシンそれ自体の場合
には、その産生はヒマシ油植物(caster oil plant)とし
ても知られているヒマ( Ricinus communis）内で生起
する。リーダー配列、A 鎖、連結配列(connecting sequ
ence) 及び B鎖からなる先駆体ポリペプチド［プレプロ
リシン(preproricin) として知られている］が最初に生
成すると考えられている。植物細胞内でのこの先駆体
（プレプロリシン）の輸送（transport)の際に、リーダ
ー配列が除去されてプロリシン（proricin) が生ずると
考えられる。ついで、A 鎖と B鎖の間にジスルフィド架
橋が形成されそして連結配列が除去されることによっ
て、プロリシンから成熟リシン（mature ricin) が生成
される。
【０００６】リシンのごとき毒素の A鎖の毒性は、無差
別に(indiscriminately)結合している B鎖を正常細胞よ
りも腫瘍細胞に結合する能力を有する別のキャリヤーに
よって置換することができる場合には、抗腫瘍治療に有
用であり得ることがすでに示唆されている。かくして、
種々の成熟リシン又はリシンの A鎖及び腫瘍特異性抗体
を含有する種々の複合体が示唆されかつ製造されてい
る。しかしながら、かかる複合体、免疫複合体(immunoc
onjugate) 又は免疫毒素は多くの不利益を有する。 既
知の複合体についての問題の一つは天然リシンの A鎖の
構造的特徴から生じる。植物細胞内でリシンが合成され
る際に、N-グリコシル化（N-glycosylation)が生起し、
その結果、生成した糖部分が細胞表面と非特異的相互作
用を行い得るものと考えられる。
【０００７】また、（a)全リシン−免疫複合体（whole
ricin-immunoconjugate)の場合、 B鎖上のガラクトース
結合部位が細胞表面と非特異的に相互作用を行う；か又
は、(b)植物リシン A−免疫複合体の場合、植物リシン
A上で発現されたグリカン側側鎖(glycan side side cha
in ）と細胞表面のガラクトース及びマンノースレセプ
ターとが結合すること；により、植物リシン−免疫複合
体についての選択性の低下が生ずると考えられる。 別
の問題は、前記したごとく、B 鎖は毒素分子の細胞内へ
の吸収を促進すると考えられることである。例えば、B
鎖が存在しない複合体、即ち、A 鎖と抗体とからなる複
合体は、天然毒素より特異的であるが、これらの複合体
は天然毒素の効力（potency)に欠けると報告されている
(Moolten等、Immun Rev,62,47-72,1982 参照）。この
効力の損失は毒素の細胞内への効果的な吸収の減少によ
るものと考えられる。従って、従来報告されている抗体
の比較的小数のものが毒素の効果的なインターナリゼー
ション（internalisation)を促進し、その結果、効力に
欠ける免疫毒素を生じる。
【０００８】従来、多数の異なる組織の腫瘍を処置する
のに有用な複合体が製造されている。例えば、PCT 特許
出願第 WO85/003508号にはスペーサー分子を介して乳房
腫瘍(breast tumour) に対して特異的な抗体に連結され
ているリシン A又はジフテリア毒素 Aからなる複合体の
製造が記載されている。
【０００９】結腸直腸（colorectal) 腫瘍細胞を認識す
る抗体も報告されているが、これらの抗体を含有する複
合体は正常細胞と結合するという欠点及び/ 又は効力が
低いという欠点を有する。従って、結腸直腸腫瘍細胞を
認識する既知の抗体は実際の治療的興味を有する複合体
の調製においては利用性のないものであった。従って、
結腸直腸腫瘍の治療において価値のある複合体が求めら
れていた。
【００１０】かくして、種々の複合体が提案され、製造
されているが、改善された複合体が求められていた。か
かる改善された複合体は既知の複合体の欠点の一つ又は
それ以上を改善し得るものである。また、胃腸腫瘍に対
して選択的である複合体も求められている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、毒素部
分(toxin moiety)と胃腸腫瘍細胞(gastrointestinaltum
our cell)に対して選択的な標的細胞結合部分(target c
ell binding moiety)とからなる複合体が提供される。
【００１２】特に、標的細胞結合部分（及び従って複合
体）は結腸直腸腫瘍細胞及び膵臓腫瘍細胞（pancreatic
tumour cell) 、特に、結腸直腸腫瘍細胞に対して選択
的である。
【００１３】標的細胞結合部分は、例えば、通常、抗
体、抗体フラグメント又は抗体又は抗体フラグメントの
誘導体からなるであろう。
【００１４】標的細胞結合部分は正常細胞よりも胃腸腫
瘍細胞（特に結腸直腸腫瘍細胞）に結合するということ
において、かかる細胞に対して選択的である。例えば、
標的細胞結合部分は胃腸腫瘍細胞には結合するが、正常
細胞に対しては結合親和性(bonding affinity)を示さな
いか又は僅かしか示さないであろう。特に、標的細胞結
合部分は胃腸腫瘍に対して、C242抗体によって示される
選択性と実質的に同一の選択性を示すであろう。結腸直
腸腫瘍のごとき胃腸腫瘍に対するC242抗体の選択性は後
記する免疫組織化学的(immunohistochemical) データー
によって例示される。例えば、特に、C242抗体のごとき
標的細胞結合部分は胃腸腫瘍細胞中には存在するが正常
細胞中には存在しないか又は極めて弱く発現される抗原
に結合するであろう。かかる標的細胞結合部分の特定の
例はC242抗体又は実質的に同一の細胞結合性を有する標
的細胞結合部分である。
【００１５】本明細書中で述べるごとく、複合体は胃腸
腫瘍細胞を死滅させることができる。即ち、複合体［又
は" 免疫毒素" ("immunotoxin") ］は、毒素部分がその
細胞毒性を発揮し得るように、毒素部分を腫瘍細胞に移
行させる(deliver) ことができる。従って、複合体は、
通常、（標的細胞結合部分が腫瘍細胞に結合することに
より）腫瘍細胞に結合し、毒素部分を腫瘍細胞内に送入
することができる；即ち、複合体は毒素部分を "インタ
ーナライズ"("internalise")させる（内在させる）こと
ができる。特に効果的な複合体は、通常、下記のごとき
性質を有するであろう： 1.標的細胞結合部分は腫瘍細胞表面抗原に結合すること
ができるものであるべきである。
【００１６】2.腫瘍細胞表面抗原は腫瘍細胞上に高いコ
ピー数、例えば、細胞１個当り、少なくとも10/1000 の
コピー数で存在すべきである。
【００１７】3.腫瘍細胞表面抗原は正常細胞上では高い
コピー数で発現されるべきではない。 4.抗体：抗原複
合物 (antibody: antigen complex)は毒素部分が細胞内
でその細胞毒性を発揮できるように効果的にインターナ
ライズさせる（内在させる）(internalise) べきであ
る。
【００１８】5.複合体は毒素部分を腫瘍細胞に移行させ
るのに十分な時間、血液内で変化しない程度の安定性を
有するように構成されていることそして毒素部分が一旦
細胞内に移行した後に毒素部分を放出するために十分に
解裂し得るように構成されていることが好ましい。
【００１９】抗体 C242 はIgG クラスのマウス抗体であ
り、ヒト結腸腺癌細胞系(colonicadenocarcinoma cell
line) で感作されたマウスからの脾細胞とマウス骨髄腫
(myeloma) 細胞系 Sp2/0とを融合させることによって得
られるハイブリドーマ細胞を適当な媒体中で培養したと
きに生成する。C242:II 抗体( 本明細書では、単に、C2
42抗体とも称する) を生成するハイブリドーマ細胞系
（242.II) はブタペスト条約に従って European Collec
tion of Animal Cell Cultures (ECACC)、PHLS Centre
for Applied Microbiology and Research （英国、ウイ
ルトシャー州、ソールズベリー、ポートンダウン所在）
に1990年 1月26日に寄託受理番号 90012601 で寄託され
ている。
【００２０】" 実質的に同一の細胞結合性を有する標的
細胞結合部分 "という用語は寄託されているECACC 細胞
系 90012601 によって生成されるものと実質的に同一の
免疫学的特異性(immunological specifity) を有する標
的細胞結合部分、即ち、同一の抗原決定基又はエピトー
プに結合しかつその部位に結合するためのC242抗体と競
合する標的細胞結合部分を包含する。
【００２１】" 標的細胞結合部分 "という表現は、ま
た、抗体フラグメント、特に、抗体C242及び無傷抗体(i
ntact antibody) のフラグメントを包含する。抗体フラ
グメントは非フラグメント化(unfragmented)免疫グロブ
リンの結合能力と特異性とを保有しており、例えば抗体
をペプシンのごときタンパク分解酵素で分解することに
よって得られる抗体フラグメントを包含する。フラグメ
ントの特定の例としては F(ab')及びF(ab')２フラグメ
ントが挙げられる。
【００２２】標的細胞結合部分は遺伝子工学操作によっ
て調製し得ること及び従って標的細胞結合フラグメント
という用語はかかる操作によって生ずる抗体及び抗体フ
ラグメントを包含することは理解されるであろう。特
に、標的細胞結合部分という用語は遺伝子工学操作の生
成物である C242 抗体又はそのフラグメントを包含す
る。
【００２３】抗体フラグメント及び特に人間化された(h
umanised) 抗体フラグメントの調製は、例えば、Carter
等により Biotechnology,Vol.10(1992年 2月号）に記載
されている。
【００２４】標的細胞結合部分は誘導体の形の抗体又は
抗体フラグメント、特に、ヒト以外の供給源から誘導さ
れた、人間化された形の抗体又は抗体フラグメント、例
えば、人間化された形のマウス抗体を包含する。
【００２５】抗体C242は腫瘍を伴った抗原（本明細書に
おいてはCA-242と称する）に向けられる。例えば、特
に、標的細胞結合部分は抗原CA-242に結合することので
きる抗体又は抗体フラグメントからなる。かかる抗体の
特定の例は抗体C242それ自体である。腫瘍随伴抗原 CA-
242 は大部分の結腸−直腸腫瘍において発現され、正常
な結腸組織においては僅かしか発現されないか又は存在
しない。
【００２６】前記したごとき遺伝子工学操作について、
C242:II モノクロナール抗体のL 鎖及びH 鎖の可変領域
(variable region) のcDNAを以下に述べるごとくクロー
ンした。これを検討する前に、基本的な免疫グロブリン
構造単位について簡単に概説する必要がある；以下にお
いては、抗体、即ち、免疫グロブリン又はクラス Gの一
般的構造が記載されている図18を参照する。
【００２７】図18において、免疫グロブリンは２本の同
一の軽（L)ポリペプチド鎖と２本の同一の重（H)ポリペ
プチド鎖とからなる；４本のポリペプチド鎖はジスルフ
ィド結合と種々の非共有結合力(non-covalent force)に
より対称な"Y" 字型に連結されている。各 H鎖はその端
部に可変部(variable domain)( VＨ) を有し、これに続
いて多数の不変部(constant domain)( CＨ )を有してお
り、各 L鎖は一方の端部に可変部（ VＬ）を有し、他方
の端部に不変部（ CＬ )を有する。それぞれ、カッパー
及びラムダで示される２種の L鎖が存在する。 L鎖の可
変部は H鎖の可変部と並んでおり、 L鎖の不変部は H鎖
の第１の不変部と並んでおり、 L鎖及びH鎖の可変部は
抗原結合部位を形成している。
【００２８】L鎖及び H鎖の可変部は同一の一般的構造
を有しており、各々、相補性決定領域(complementarity
determining region)、即ち CDRと呼ばれる３つの超可
変部(hypervariable region)を有する；これらの超可変
部は４つのフレーム構造領域(framework region)、即
ち、FRの間に挿入されている。各可変部のCDR はフレー
ム構造領域によって接近して保持されており、２組のCD
R によって抗体の特異性が提供される。
【００２９】C242:II 抗体の L鎖及び H鎖の可変部のcD
NAをクローンするために、最初、C242:II ハイブリドー
マからそれ自体既知の方法によってcDNAファージライブ
ラリーを調製した。ついで、ポリメラーゼ鎖反応（poly
merase chain reaction)(PCR) と適当なプライマー（pr
imer) を使用して、それぞれ、H 鎖及び L鎖（カッパ
ー）の不変部をカバーするハイブリダイゼーションプロ
ーブ(hybridizationprobe) をマウスゲノムDNA から調
製した。得られたプローブを使用して、C242:II 抗体の
L鎖及びカッパー鎖をエンコードするDNA 塩基配列を含
有するcDNAクローンについてのcDNAライブラリーをスク
リーンした。正にハイブリダイズするファージクローン
（positively hybridizing phage clone) を伸長させ(e
xpanded)、cDNAをプラスミドの形で切り出した(excis
e)。このプラスミドの特徴を制限酵素マッピングにより
調べ、所期のサイズのインサート(insert)を含有するプ
ラスミドについて配列決定を行った。CDR 領域を決定す
るために、例えば、Kabat等(1987)により Sequence of
Proteins of Immunological Interest,第4 版, U.S. De
partment of Health and Human Service,National Inst
itutes of Healthに定義されているごときCDR の基本的
な位置を考慮しながら、シークエンスインサート（sequ
ence insert)によってエンコードされるアミノ酸配列
を、従来から既知のマウスカッパー鎖及び H鎖のアミノ
酸配列と比較した。それぞれの鎖のCDR は下記のごとき
（及び図19及び20に示すごとき）アミノ酸配列を有する
ことが認められた（SEQ.ID.No.21及び22も参照）：L鎖 H鎖
【００３０】これらのCDR アミノ酸及び/ 又はDNA 塩基
配列についての知識を使用して、それ自体既知の、特定
部位の突然変異誘発(site-directd mutagenesis)によ
り、C242:II 抗体のCDR 領域を他の抗体又は抗体フラグ
メントのクローンされた可変部に導入し得る。かかる方
法は、一般的に、"CDRグラフテイング"("CDR graftin
g") として知られており（例えば、公開欧州特許出願 E
P 239,400 号に記載されている）、受容体抗体(recipie
nt antibody)又はフラグメントのCDR エンコード配列を
DNA レベルでC242:II 抗体のCDR エンコード配列で置換
し、対応する特異性を有する抗体又は抗体フラグメント
をC242:II モノクロナール抗体として得ることからな
る。標的細胞結合部分の範囲内には、勿論、上記で定義
したごときCDR （又は実質的に上記で定義したごときCD
R ）の少なくとも一つを有する抗体又は抗体フラグメン
トからなる任意のかかる部分が包含される；抗体又は抗
体フラグメント上のCDR の数及びその配列は標的細胞結
合部分がC242抗体と実質的に同一の細胞結合性を有する
ようなものである。標的細胞結合部分が上記で定義した
ごとき（又は実質的に上記で定義したごとき） CDR( 即
ち、L 鎖のCDR1,CDR2 及びCDR3及び H鎖のCDR1,CDR2 及
びCDR3) の全てを含有していることが一般的に好まし
い。実質的に上記で定義したごとき CDRとしては下記の
ごとき伸長した配列が挙げられる： L鎖 H鎖
【００３１】CDR グラフテイングにより調製される抗体
又は抗体フラグメントは、相同性及びCDR サイズの両者
においてC242に近似するように選択されたフレーム構造
上にC242 CDRをグラフテイングすることにより調製する
ことが好ましい。
【００３２】本発明よれば、更に、毒素部分と、C242抗
体からなる標的細胞結合部分又は同一の細胞結合性を有
する標的細胞結合部分とからなる複合体が挙げられる。
【００３３】本発明の複合体は必ずしも１個の毒素分子
と１個の抗体分子から構成されるものでないことは理解
されるであろう。例えば、複合体は抗体分子１個当り２
個以上の抗体分子を含有し得る。
【００３４】毒素部分は、通常、細胞毒性を有し従って
インターナリゼーションの後に細胞を死滅させることの
できる成分からなる。
【００３５】標的細胞結合部分は、通常、特定の抗原決
定基又は標的細胞を認識できる標的細胞結合部分からな
る。
【００３６】毒素部分と標的細胞結合部分はその一方
を、直接、他方に連結させるか又はこれらを間接的に連
結させ得る。毒素部分と標的細胞結合部分は、通常、複
合体の形状(geometry)が標的細胞結合部分のその標的細
胞への結合を許容するように連結される。毒素部分と標
的細胞結合部分は、複合体が細胞外では(extracellular
ly) 安定であり、細胞内では(intracellularly) 不安定
であり従って毒素部分と標的細胞結合部分が標的細胞の
外部では連結されたままであるが、インターナリゼーシ
ョンの後に毒素部分が放出されるように連結されている
ことが有利である。即ち、複合体は細胞内では解裂性(c
leavable) であり、細胞外では安定である部位を有する
ことが有利である。
【００３７】毒素部分が標的細胞結合部分に直接結合し
ている複合体の例としては、毒素部分と標的細胞結合部
分が毒素部分上のチオール基と標的細胞結合部分上のチ
オール基との間に形成されたジスルフィド架橋によって
連結されているものが挙げられる。
【００３８】標的細胞結合部分は毒素部分を認識し従っ
て毒素部分と標的細胞結合部分とに連結する部分を含有
し得る。かかる部分を含有する場合の例は標的細胞結合
部分が毒素部分に連結する抗体又は抗体フラグメントを
含有する場合である。
【００３９】標的細胞結合部分と毒素部分は単一のポリ
ペプチドからなることができる；このポリペプチドは細
胞内で解裂性の部位を含有し、その結果、毒素部分が細
胞内で放出されるようなものであることが好ましい。か
かるポリペプチドにおいては毒素部分と標的細胞結合部
分はポリペプチドリンカーによって連結し得る。
【００４０】毒素部分が標的細胞結合部分に間接的に結
合している複合体の例としては、毒素部分が二官能性リ
ンカー、特にヘテロ−二官能性リンカー(heterobi-func
tional linker)によって標的細胞結合部分に連結されて
いるものが挙げられる。
【００４１】適当なリンカーとしては、例えば、PCT 特
許出願 WO85/003508号に記載されているごときポリペプ
チドからなるリンカー及び公開欧州特許出願第 169,111
号に記載されているごとき結合基（chemical moiety)か
らなるリンカーが挙げられる。 毒素部分と標的細胞結
合部分はジスルフィド結合又はチオエーテル結合によっ
て連結させることが好ましい。一般的には、毒素部分と
標的細胞結合部分は、これらの部分を細胞内で解裂性の
ジスルフィド結合又はチオエーテル結合により連結させ
るリンカーによって連結されることが好ましい。かかる
リンカー及び免疫毒素を調製する際のその使用は公開欧
州特許出願第 169,111号; Methods in Enzymology,112,
207-225,1985,(Cumber,A.J.,Forrester,J.A.,Foxweel,
B.M.J.,Ross,W.C.J.,Thorpe,P.E.-Preparation of anti
body-toxin conjugates);及びVogel,Immunoconjugates:
Antibody conjugates in radioimaging and theory of
cancer,pp28-55,(Wawrzynczak ,E.J. 及びThorpe,P.E.
-Mehtods for preparing immunotoxins:effects of the
linkage on activity and stability)に記載されてい
る。
【００４２】特定のリンカーとしては毒素部分と標的細
胞結合部分の一方の上でチオール基とジスルフィド結合
を形成し、毒素部分と標的細胞結合部分の他方の上でア
ミノ基とアミド結合を形成することのできるものを挙げ
ることができる。
【００４３】リンカーの特定の例としては、式： -S-X-CO- ( X はスペーサー基である) で表されるものを挙げるこ
とができる。
【００４４】X は（1-6 C)アルキル基、フェニル基及び
（1-4 C)アルキルフェニル基から選ばれた１個又は２個
の置換基によって置換されていてもよい直鎖アルキル基
であるか、又は、アルキル部分が（1-6 C)アルキル基、
フェニル基及び（1-4 C)アルキルフェニル基から選ばれ
た１個又は２個の置換基によって置換されていてもよく
そしてフェニル環がハロゲン、(1-4 C) アルキル基及び
(1-4 C) アルコキシ基から選ばれた置換基を有し得る、
(1-4 C) アルキルフェニル基からなり得る。
【００４５】一般的には、X は上記した置換基から選ば
れた置換基を有するアルキル基であることが好ましい。
【００４６】例えば、X は（1-4C) アルキル基及びフェ
ニル基から選ばれた１個又は２個の置換基によって置換
されていてもよい（1-6 C)アルキル基からなり得る。X
の特定の例としては、例えば、メチル基、エチル基、プ
ロピル基及びブチル基から選ばれた置換基の１個又は２
個の置換基によって置換されていてもよい（特にメチル
基、エチル基、プロピル基及びブチル基によって置換さ
れている）メチレン基、エチレン基、プロピレン基及び
ブチレン基が挙げられる。
【００４７】好ましいX の特定の例としては Xが前記し
た置換基の１個又は２個により置換されていてもよいメ
チレン基又はエチレン基からなるものが挙げられる。
【００４８】X は１個又は２個のメチル基によって置換
されているか又は置換されていないエチレン基、特に、
１個のメチル基によって置換されているエチレン基であ
ることが好ましい。
【００４９】本発明の好ましい複合体としては、式： A- S１-S２-X-CONH-B ［式中、A は毒素部分及び標的細胞結合部分の一方から
なり、B は毒素部分及び標的細胞結合部分の他方からな
り；標的細胞結合部分は１個又はそれ以上の毒素部分を
担持することができ； S１はA 上に存在する硫黄原子で
あり、NHは B上にあり；-S２-X-CO-（ S２は硫黄原子で
あり、X は前記したものである）はリンカーである］で
表される複合体が挙げられる。s が A上のチオール基か
ら誘導されることは理解されるであろう。
【００５０】リンカーが不斉中心（chiral centre)を含
有する場合には、リンカーは光学活性体又はラセミ体の
形で存在しかつこの形で単離され得ることは理解される
であろう。本発明は光学活性体又はラセミ体の形のリン
カーの使用も包含する。光学活性体の形のリンカーの調
製は当業者に周知の有機化学の技術によって行い得る。
【００５１】A は毒素部分からなり、B は標的細胞結合
部分からなることが好ましい。前記したごとく、毒素成
分は細胞毒性を有する任意の成分からなり得る。かかる
成分の例としてはリボソームを不活性化することができ
る従ってタンパク質合成を抑制することができるポリペ
プチドを挙げられる。その特定の例としては天然に産生
するポリペプチド及びかかるポリペプチドの成分が挙げ
られる。かかるポリペプチドが毒素成分と実質的に無毒
成分とからなる場合には、毒素部分は毒素成分からなる
ことが好都合である。例えば、毒素部分はリシンからな
り得るが、毒素部分はリシンの A鎖からなることが好都
合である。毒素部分は細胞毒性を有する、天然に産生す
るポリペプチドの部分(portion) 又は同族体（analogu
e)からなり得る。毒素部分のために適当なポリペプチド
及びその調製は"Ribosomeinactivating proteins up to
date"-Stripe F及び Barbieri.L,FEBS3269及びその参
照文献に記載されている。毒素部分のために特に適当な
ポリペプチドとしてはリシン（リシン A) の A鎖、レス
トリクトシン(restrictocin)及びシガトキシン（Shiga
toxin)が挙げられる。毒素部分のために適当な他のポリ
ペプチドとしてはアブリン(abrin) 、ビスクミン(viscu
min)、モデッシン(modeccin)、ボルケンシン(volkensi
n) 、ゲロニン(gelonin) 、ポークウイード抗菌性タン
パク質(pokeweed antiviral protein)、サポリン(sapor
in) 、ルフィン(ruffin)、トリコサンシン(tricosanthi
n)、大麦リボソーム不活性化タンパク質、ジアシンス(d
iathins)、ビオジン(biodine) 、モモルジン(momordi
n)、トリチン（tritin) 、ドデカンドリン(dodecandri
n) 、α−サルシン( α−sarcin) 、ミトゲリン(mitoge
llin)、ジフテリアトキシン、シュウドモナスエキソト
キシン(pseudomonas exotoxin) A及び" シガ状 "("Shig
a-like) トキシン,VT1及びVT2 が挙げられる。
【００５２】天然に産生するポリペプチドの同族体とし
ては、細胞毒性活性の損失を生ずることのない一つ又は
それ以上のアミノ酸の変更(alteration)（削除、付加、
置換）により異なるという点で天然に産生するポリペプ
チドに関連する一次構造を有するポリペプチドが挙げら
れる。かかる同族体の例としては一つ又はそれ以上の変
更によって標的細胞結合部分への連結が促進されている
ものが挙げられる。
【００５３】毒素部分が天然に産生するポリペプチド又
はその一部分からなる場合には、毒素部分は天然供給源
からポリペプチドを単離することにより調製することが
でき、また、天然に産生するポリペプチドの一部分が必
要な場合には単離されたポリペプチドを化学的な手段に
よって変性することにより、例えば、酵素で処理するこ
とにより(enzymatically) 調製することができる。ポリ
ペプチド又はその一部分は遺伝子工学技術によっても調
製し得る。かかる技術としては組換え体DNA 技術が挙げ
られ、この場合、所望のポリペプチドをエンコードする
DNA配列が、通常、適当なベクター又はプラスミド中に
組み込まれる。ベクター又はプラスミドを用いて形質転
換させた宿主細胞を適当な条件下で培養して DNA配列を
発現させ、ポリペプチドを製造する。
【００５４】毒素部分はリシン A、その部分又はその同
族体からなることが好ましい。毒素部分がリシン Aから
なる場合には、リシン Aはヒマ(Ricinus Communis 即
ち"Castor bean"plant) の種子から取得し得る。しかし
ながら、A 鎖又はリシンは遺伝子工学技術によって調製
することが好ましい。即ち、組換え体リシン A又はリシ
ンが好ましい。
【００５５】組換え体DNA 技術によって得られるリシン
Aは、通常、天然の供給源から得られるものより好まし
いが、これは組換え体DNA 技術によればリシンのB 鎖が
混入していないリシン Aの調製が可能であり従ってこの
方法で得られるリシン Aはグリコシル化(glycosylate)
されないという理由に基づくものである。従って、組換
え体DNA リシン Aを使用した場合には、無差別に（indi
scrimately) 結合している B鎖が存在せず、また、細胞
表面と非特異的相互作用を行うことができる糖部分が存
在しないため、より選択的な複合体が得られる。
【００５６】好ましい態様においては、本発明の複合体
は結腸直腸腫瘍細胞について選択的な標的細胞結合部分
を含有している。
【００５７】標的細胞結合部分は C242 抗体又はそのフ
ラグメント、特に、 C242 抗体からなるこのが好まし
い。
【００５８】毒素部分と標的細胞結合部分は3-メルカプ
ト酪酸基-CO.CH２.CH(CH３)-S-を介して連結されている
ことが好ましい。この基は標的細胞結合部分上のNH基、
例えば、リシル(lysyl) 残基のNHとの間での共有結合
と、毒素部分上のチオール基、例えば、リシン A中のシ
ステイン残基上のチオール基とのジスルフィド架橋によ
って標的細胞結合部分に連結されていることが好都合で
ある。
【００５９】従って、本発明によれば、特に、3-メルカ
プト酪酸基-CO.CH２.CH(CH３)-S-によって C242 上のア
ミノ残基から、リシン A中のシステイン残基に連結され
ている、 C242 抗体と組換え体リシン Aとからなる免疫
毒素が提供される。
【００６０】好ましい免疫毒素は3-メルカプト酪酸基に
よって、C242中のリシル残基の末端アミノ基から、リシ
ン A中のシステイン残基の末端チオール基に連結されて
いる、 C242 抗体と組換え体リシン Aとからなる。
【００６１】各抗体単位は、通常、少なくとも１個のリ
シン A単位を担持しているであろう。抗体単位が、それ
ぞれのリンカー部分を介して２個以上の組換え体リシン
A部分を担持し得ることは理解されるであろう。抗体が
リシン Aに連結しているものの他に１個又はそれ以上の
リンカー部分を含有しうることも理解されるであろう。
これらの追加的なリンカー部分は無毒性分子、例えば、
システインを担持し得る。従ってかかるリンカーは無毒
性分子によって "キャップ"("capped)され得る。
【００６２】本発明の免疫毒素は胃腸腫瘍、特に、結腸
直腸腫瘍又は膵臓腫瘍の処置において重要な用途を有す
る。従って、本発明によれば、有効な量の複合体( 前記
で定義したもの）をヒトのごとき温血動物に投与するこ
とを特徴する胃腸腫瘍の処置方法も提供される。
【００６３】投与量と投与方法は、使用される特定の毒
素部分、標的細胞の集団(population)及び患者の病歴に
よって変動することは理解されるであろう。複合体の投
与量は典型的には患者の体重１kg当り0.1 〜 1mgであろ
う。
【００６４】本発明の複合体は、通常、医薬組成物の形
で投与されるであろう。従って、本発明によれば、更
に、複合体( 前記で定義したもの）と薬学的に許容され
る稀釈剤又は担体とからなる医薬組成物が提供される。
【００６５】本発明の医薬組成物は種々の投与形態に製
剤し得る。一般的には、本発明の複合体は非経口的に、
好ましくは、静脈内に投与され得るであろう。特定の非
経口的医薬組成物は注射によって投与するのに適当な単
位投与形態に製剤されたものである。従って、特に適当
な組成物は薬学的に許容される担体又は稀釈剤と組合わ
された免疫毒素の溶液、エマルジョン又は懸濁液からな
る。適当な担体又は稀釈剤としては水性ビヒクル、例え
ば、水又は食塩水及び非水性ビヒクル、例えば、不揮発
油又はリポソームが挙げられる。医薬組成物は該組成物
中での複合体の安定性を増大させる薬剤を含有し得る。
例えば、組成物は緩衝剤、例えば、ツイーン(Tween) を
含有し得る。複合体の濃度は変動させ得るが、一般的に
は、複合体は１投与当り約 1〜10mgの濃度に製剤される
であろう。
【００６６】抗体 C242 は結腸直腸腫瘍細胞について選
択的であり、そして、この抗体を組込まれている複合体
は結腸直腸腫瘍細胞について選択的である、重要な免疫
毒素であることが認められた。
【００６７】特に、本発明の好ましい複合体は、結腸直
腸腫瘍細胞について選択的でありかつこの細胞に対して
効果的であることにおいて、驚くべきほどに効果的な免
疫毒素であることが認められた。この複合体は、また、
比較的低い血液排除率(bloodclearance)と細胞外開裂性
(cleavage)及び破壊性(destruction) を有しており、従
って、改善された血漿遺存性(plasma persistence)がも
たらされることが認められた。このことは免疫毒素に、
排除(clearance) と破壊が生起する前にその標的細胞と
十分な時間、相互作用を行わせるという重要な利点を有
する。
【００６８】本発明によれば、更に、前記で定義したご
とき複合体の製造方法が提供される： (a) 標的細胞結
合部分が、直接、毒素部分に連結されている複合体につ
いては、毒素部分と標的細胞結合部分とを反応させる。
【００６９】例えば、標的細胞結合部分がジスルフィド
架橋を介して毒素部分に連結されている場合には、標的
細胞結合部分と毒素部分の一方を、例えばジチオトレイ
トールを使用して還元しついで標的細胞結合部分と毒素
部分の他方と反応させる。
【００７０】(b) 標的細胞結合部分がリンカーによって
毒素部分に連結されている複合体については、リンカー
を結合させることにより誘導された標的細胞結合部分と
毒素部分とを反応させるか又はリンカーを結合させるこ
とにより誘導された毒素部分と標的細胞結合部分とを反
応させる。
【００７１】適当な部分( 毒素部分と標的細胞結合部
分) は連結剤(linking agent) と反応させて該部分にリ
ンカーを結合させることにより誘導される。誘導体化標
的細胞結合部分を毒素部分と反応させることが好都合で
ある。
【００７２】誘導体化(derivatised) 標的細胞結合部分
（リンカーを結合させた標的細胞結合部分）又は誘導体
化毒素部分（リンカーを結合させた毒素部分）の調製
は、例えば、該部分を適当な緩衝液( 例えば、酢酸塩、
燐酸塩又は硼酸塩緩衝液) に溶解しついでpHを連結剤と
両立し得る値に調整しついで反応混合物に連結剤を添加
することにより行い得る。連結剤が反応混合物に不溶性
である場合には、標的細胞結合部分又は毒素部分の溶液
を、少量の有機溶剤、例えば、ジメチルスルホキシド又
はジメチルホルムアミド中の連結剤の溶液に添加し得
る。連結剤との反応の後、誘導体化生成物をゲル濾過、
透析又はカラムクロマトグラフィーのごとき標準的な方
法で分離し得る。ついで誘導体化生成物（誘導体化標的
細胞結合部分又は誘導体化毒素部分）を他方の部分と反
応させて最終複合体を得ることができる。
【００７３】使用される連結剤の正確な種類は、複合体
化(conjugation) を行うために利用し得る標的細胞結合
部分及び毒素部分上の基( 例えばチオール、カルボキシ
又はアミノ基) の種類に依存することは理解されるであ
ろう。
【００７４】毒素部分は天然供給源から調製し得る。毒
素部分を組換え体 DNA技術によって調製することが好ま
しい。この技術は当業者に周知の技術を使用するもので
あり、mRNAを抽出し、cDNAライブラリー(library) を調
製し、ベクターを構成し、細胞を形質転換させついで形
質転換宿主細胞を培養して毒素ポリペプチドを発現させ
る技術を包含している。所望の毒素部分を発現させるの
に適当な宿主としては原核生物、例えば、大腸菌 (E.Co
li) 及び真核生物、例えば、酵母菌が挙げられる。これ
らの工程は後記する複合体の調製に例示されている。
【００７５】標的細胞結合部分は、通常、抗体又は抗体
フラグメント又は誘導体からなる。抗体はモノクロナー
ル抗体からなることが好ましい。抗体は既知の方法によ
って調製し得る。抗体は血清、脾臓及び抗体分泌ハイブ
リドーマから単離し得る。
【００７６】抗体の調製は、例えば、Methods in Enzym
ology; Vol.178;Antibodies,Antigens and Molecular M
imicry;J.Langone編;Academic Press Inc （特に、Sect
ionII,Engineered Antibodies 参照）；及びMethod in
Enzymology; Vol.73;Immunochemical Techniques Part
B;J.Langone及びH van Vunakis 編;Academic PressInc
（特に、Section I:Production of Antibodies参照）に
記載されている。
【００７７】リンカーが基 -S-X-CO- からなる場合に
は、抗体（又は毒素部分）は式：L１-S-X-CO-L ２（式
中、 L１及び L２は置換可能な基である）の化合物との
反応により誘導体化し得る。例えば、CO-L２はカルボン
酸基、好ましくは、活性化されたカルボン酸基からなり
得る。例えば、基CO-L２はエステル基又は無水物基から
なり得る。 L２についての特定の例としてはイミダゾリ
ル基又はスクシンイミヂルエステル(succinimidyl este
r)基が挙げられる。 L１はチオ基の酸化の際に置換され
る基からなり得る；例えば L１はピリジン基からなり得
る。リンカーは、通常、抗体又は毒素部分（好ましくは
毒素部分）上の還元されたチオール基と反応させる。
【００７８】他のリンカーが使用される場合には、これ
らのリンカーを当業者に既知の方法により抗体及び毒素
部分と反応させる。通常、リンカーを標的細胞結合部分
及び毒素部分上の利用し得るそれぞれの官能基と反応さ
せる。しかしながら、標的細胞結合部分と毒素部分は共
有結合、例えば、ジスルフィド結合を形成させることに
より、直接、連結させ得る。
【００７９】毒素部分がスルフィドリル(sulphydryl)
基、例えば、システイン残基のスルフィドリル基を有す
る場合には、この基を複合体形成に利用し得る。例え
ば、この基は標的細胞結合部分上又はリンカー上のスル
フィドリル基とのジスルフィド結合を形成させるのに利
用し得る。スルフィドリル基が毒素部分上に存在しない
場合には、毒素部分をかかる基を提供するように誘導体
化して複合体の形成を促進し得る。毒素部分についての
この誘導体化は例えばイミノチオランを使用して行い得
る。
【００８０】ポリペプチドリンカーを使用する場合に
は、このリンカーを毒素部分上又は標的細胞結合部分上
の遊離のカルボキシル基又はアミノ基と反応させ得る。
【００８１】毒素部分がリシンの A鎖からなり、リンカ
ーがジラジカル -COCH２CH (CH３)-S-からなる場合に
は、適当な連結剤はN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジル
ジチオ）ブチレートである。かかる免疫毒素を調製する
のに好ましい方法は誘導体化された標的細胞結合部分と
還元されたリシン Aとを反応させることからなる。
【００８２】標的細胞結合部分の誘導体化（リンカーの
導入）はN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ）ブ
チレートのごときカップリング剤との反応によって行う
ことができ、リシンの A鎖の還元は適当な還元剤で処理
して、例えばジチオトレイトールを使用して、遊離シス
テイン基上のチオール基を還元することにより行い得
る。
【００８３】過剰の連結剤を使用して誘導体化標的細胞
結合部分に２個以上のリンカーを結合させることが好都
合である。リシン Aとの反応の後、リシン Aに結合して
いない連結剤はブロッキング基(blocking group)、例え
ば、システイン基と反応させることによりキャップする
(capped)ことが好都合である。
【００８４】本発明の複合体は腫瘍の処置において有用
であり得る。このことは生体外での腫瘍細胞におけるタ
ンパク質合成を抑制する複合体の能力及び/ 又は生体内
での腫瘍の大きさ又は生長を抑制する複合体の能力によ
って示される。適当な試験方法は後記する。
【００８５】本発明を次の実施例により説明するが、こ
れに限定されるものではない。但し書きがない場合に
は： (ｉ) 蒸発は真空中で回転蒸発により実施した； (ii) 操作は室温で即ち１８〜２６℃の範囲で実施し
た； (iii) 収量は単に説明のためにのみ与えてあり、必らず
しも勤勉な処理発現により達成し得る最大値ではない； (iv) プロトンＮＭＲスペクトルは内部標準としてテト
ラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いて、溶剤としてジュー
テロ化したジメチルスルホキシド中で２００ＭＨｚで通
常測定され、しかも主要ピークを表示する慣用の略号を
用いてＴＭＳに関してｐｐｍでの化学シフト（△値）と
して表わされる；ｓ，一重項；ｍ，多重項；ｔ，三重
項；ｂｒ，ブロード；ｄ，二重項；及び （ｖ）次の略号を使用する： ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン ＰＢＳ−リン酸緩衝溶液 ＩＰＴＧ−イソプロピルチオ−β−ガラクトシド ＥｔＯＨ−エタノール ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ） リシンＡ／Ｃ２４２免疫毒素（イムノトキシン）の製造 ４．４ｍｇ／ｍｌでリン酸緩衝溶液（リン酸ナトリウム
／１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．２）中のモノクロ
ーナル抗体Ｃ２４２（２００ｍｇ）の溶液を４℃で膜濾
過（アミコンＹＭ１０メンブラン）により１２ｍｇ／ｍ
ｌに濃縮した。該濃厚液を０．５容量のホウ酸塩緩衝液
（１００ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨ９．１）で希釈し
た。タンパク質の濃度は２８０ｎｍで吸光度を監視する
ことにより測定し、混合溶液のｐＨは８．８＋／−０．
１であると認められた。
【００８６】Ｎ−サクシンイミジル ３−（２−ピリジ
ルジチオ）ブチレート（“リンカー”）を１０ｍｇ／ｍ
ｌの濃度で乾燥、再蒸留したジメチルホルムアミド又は
アセトニトリルに溶解した。３．５２ｍｇのＮ−サクシ
ンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）ブチレートを
含有するこの溶液の一部分（０．３５２ｍｌ）を濃縮済
みの抗体溶液に直ちに添加した。得られる溶液を混合
し、次いで２０℃で１時間放置させた。次いで該溶液を
脱塩カラム（Ｇ２５セファデックス−ファルマシア社
製、２．６×５８ｃｍ、流速２ｍｌ／分、５０ｍＭリン
酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ ｐＨ８．０で平衝した）に添加して過剰の試薬
を除去し、緩衝剤は誘導化した抗体を交替させる。別の
場合には、反応生成物は直交流（crossflow)濾過により
取出し得る。脱塩した且つ誘導化した抗体をプールし、
タンパク質の濃度は２８０ｎｍでの吸光度を監視するこ
とにより測定した。リンカーを用いての誘導化の程度は
過剰のジチオトレイトールを添加し、３４３ｎｍでの遊
離チオピリジル基の放出を監視することにより測定し
た。誘導化の程度は１モルの抗体当り４〜６個のリンカ
ー基であると見出された。
【００８７】組換えリシンＡはｐＨ８のリン酸緩衝液中
のリシンＡの溶液を過剰のジチオトレイトールで処理す
ることにより還元され、直交流濾過により濃縮された。
過剰の反応剤はカラムクロマトグラフィー（Ｇ２５セフ
ァデックス−ファルマシア社製、２．６×５８ｃｍ、流
速２ｍｌ／分、５０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ
塩化ナトリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ中、ｐＨ８．０）に
より除去された。
【００８８】組換えリシンＡは、生産した組換えリシン
Ａ（１９０ｍｇ）と誘導化した抗体（１９０ｍｇ）溶液
とを１：１（重量／重量）のリシンＡ／誘導化抗体比で
混合することにより誘導化抗体に複合させた。グリセロ
ールを２０容量／容量％まで添加し、容器をアルゴンで
掃気した。得られる溶液を４０〜６５時間１５℃に維持
した。
【００８９】抗体上の過剰のリンカー基をキャップする
ために次いでシステインを０．２ｍＭの最終濃度にまで
添加し且つ抗体上のリンカー基に対して少なくとも１０
倍のモル過剰量で添加した。該溶液を混合し２０℃で２
〜３時間維持した。システインでキャップ形成したのに
続いて、得られる免疫毒素の試料は過剰のジチオトレイ
トールで処理することにより分析し、反応の完了を定量
するのに３４３ｎｍで監視した。
【００９０】次いで複合体含有溶液は膜濾過（アミコン
ＹＭ１０メンブラン）により濃縮し、クロマトグラフィ
ーカラム（ＨＲ３００セファクリル−ファルマシア社
製、２．６×５０ｃｍ、流速３ｍｌ／分、緩衝液５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム／２５ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ
ＥＤＴＡ）に施用し、これにより非複合リシンＡから
免疫毒素及び非複合抗体が分離される。免疫毒素と抗体
との混合物を含有するピークをプールし、タンパク質濃
度は２８０ｎｍでの吸光度を監視することにより測定し
た。
【００９１】かくして非複合抗体と免疫毒素との両方を
含有して得られる溶液は１Ｍ ＨＣｌの添加によりｐＨ
６．３に調節し、これを、トリアジン染料基質を含有す
るカラム（マイメチックＡ６×Ｌ、ＡＣＬ社、英国、８
×２６ｃｍカラム、流速１．５ｍｌ／分）に施用した。
カラムは非複合抗体を溶離する原料緩衝液１００ｍｌで
洗浄し、免疫毒素は０．５Ｍの塩化ナトリウムを含有す
る原料緩衝液で溶離した。免疫毒素溶液はリン酸緩衝溶
液に対して透析し、０．２２ミクロンのフィルターを通
して濾過し、４℃で貯蔵した。
【００９２】免疫毒素の純度はＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動により測定し、次の組成を有する免疫毒素を
全部で４５ｍｇ含有した：５０〜６０％のモノリシンＡ
誘導体、１０〜３０％のジリシンＡ誘導体、５〜１５％
のトリリシンＡ誘導体及び＜１０％の非誘導化抗体。
【００９３】あるいは別法として、ゲル濾過工程（残留
ｒ−リシンＡの除去）及び染料アフィニティークロマト
グラフィー工程（残留Ｃ−２４２抗体の除去）は精製順
列に移行し得る。この方法の変更例では、未反応のリン
カー部分を前記の如くシステインでブロックした直後
に、複合混合物を蒸留水で５ｍＳ以下の導電率にまで希
釈する。次いで１Ｍ酢酸でｐＨを６．０に調節し、該溶
液は膜濾過により清澄化した。次いで該溶液を染料リガ
ンドカラム（２．５ｍｇゲル／複合混合物で用いたｒ−
リシンＡｍｇ）に施用した。次いで非複合Ｃ２４２抗体
がカラムを通して洗い出されてしまうまで０．６８％酢
酸ナトリウム（ｐＨ６．０）でカラムを洗浄した。次い
で免疫毒素及び残留ｒ−リシンＡはｐＨ７．０の２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムの緩衝液中で塩化ナトリウム濃度に
関して０．５Ｍでカラムから溶離し得る。次いでこの溶
離液は螺旋状カートリッジの限外濾過系を用いて直交流
濾過により濃縮させ、セファクリルＳ３００ＨＲのカラ
ム（最初の複合反応で用いた抗体の各ｍｇ毎につき２．
５ｍｌのゲルしかもカラムの全容量の＜５％の容量で）
に施用した。カラムはリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）の
如き何れか適当な組成の緩衝液で平衝させ得る。
【００９４】リンカー部分の製造 前記で用いたＮ−サクシンイミゾル（Ｒ）−３−（２−
ピリジルジチオ）ブチレートは次の方法を用いて製造し
たが、但し書きがなければ： （ｉ）蒸留は真空中で回転蒸発により実施した； (ii) 操作は室温で即ち１８〜２６℃の範囲で実施し
た； (iii) 収量は単に説明のためにのみ与えてあり、必らず
しも勤勉は処理発現により達成し得る最大値ではない； （iv) プロトンＮＭＲスペクトルは内部標準としてテト
ラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いて溶剤としてジューテ
ロ化したクロロホルム中で２７０ＭＨｚで通常測定され
しかも主要ピークを表わす慣用の略号を用いてＴＭＳに
関してｐｐｍでの化学シフト（△値）として表わされ
る：ｓ，一重項；ｍ，多重項；ｔ，三重項；ｂｒ，ブロ
ード；ｄ，二重項。
【００９５】Ｎ−サクシンイミジル （Ｒ）−３−（２
−ピリジルジチオ）ブチレート 室温で攪拌しながら（Ｒ）−３−（２−ピリジルジチ
オ）酪酸（９０．０ｇ，０．３９３モル）をジクロロメ
タン（６３０ｍｌ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミド（４５．２ｇ、０．３９３モル、１．０モル当
量）を添加し、ジクロロメタン（９０ｍｌ）で該混合物
中を洗浄した。該混合物を−２℃に冷却しながら３０分
間攪拌した。反応温度を０℃±２℃に維持しながらジク
ロロメタン（５４０ｍｌ）中のジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（８１．０８ｇ、０．３９３モル、１．０モル
当量）の溶液を３５分間に亘って添加し、ジクロロメタ
ン（９０ｍｌ）で該混合物中を洗浄した。該溶液を０〜
１０℃の温度で３時間１５分攪拌し、次いで室温まで昇
温させた。該溶液を濾過して固体のジシクロヘキシル尿
素を取出しこれをジクロロメタン（１８０ｍｌ×２）で
洗浄した。濾液を減圧下に２０〜２２℃で蒸発させると
褐色油（１５０ｇ）が得られた。この油状物をトルエン
／酢酸エチル８０：２０（容量／容量）で調製したキー
ゼルゲル６０シリカゲル２３０〜４００メッシュ（１１
８０ｇ）のカラム上でクロマトグラフィーにより精製し
た。トルエン／酢酸エチル（８０：２０容量／容量）で
溶離すると２８℃で真空（０．２５ｍｂａｒ）下に蒸発
させた後に淡黄色ゴム状物としてＮ−サクシンイミジル
（Ｒ）−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（５
２ｇ）が得られた。
【００９６】ＮＭＲ： １．５（ｄ，３Ｈ），２．８５（ｍ，４Ｈ），２．８
（ｄｄ，１Ｈ），３．２（ｄｄ，１Ｈ），３．５（ｍ，
１Ｈ），７．１（ｍ，１Ｈ），７．７（ｍ，２Ｈ），
８．５（ｄ，１Ｈ）。
【００９７】電子衝撃質量分光分析法により該化合物が
３２６の分子量を有することを示し、その際細片部はＮ
−サクシンイミジル （Ｒ）−３−（２−ピリジルジチ
オ）ブチレートの構造と合致するものである。
【００９８】原料は次の如く調製された： ａ．（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸 メチル（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（１．６７０
ｋｇ、１４．１５２モル）を氷／エタノール浴中で冷却
した。水（４６９８ｍｌ）を添加し、続いて４７重量／
重量％の水酸化ナトリウム（９６５ｍｌ、１６．９８モ
ル、１．２モル当量）を０℃±２℃の温度を維持するよ
うな割合で添加した。反応混合物を０℃で更に１時間３
０分攪拌した。温度を５℃又はそれ以下に維持しながら
濃塩酸（１４９０ｍｌ、１７．２８モル、１．２２モル
当量）を３５分の期間に亘って反応混合物に添加して
１．５の最終ｐＨを得た。次いで塩化ナトリウム（１０
６１ｇ）を反応混合物に添加し、水性混合物をメチルte
rt−ブチルエーテル（１０×３．５ｌ）で抽出した。抽
出液を合し、溶剤を真空下に室温で蒸留することにより
除去すると残渣を得た。トルエン（７．５ｌ）を残渣と
混合し、揮発性物質を真空下での蒸留により除去すると
油状物として（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（１１８９
ｇ、８１％）を得た。この油状物を４℃に冷却し、結晶
させて固体を得た。
【００９９】ｂ．（Ｓ）−β−ブチロラクトン （Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（５３０ｇ、５．０９６モ
ル）をトリエチル オルトアセテート（１３２２．８
ｇ、１４８８ｍｌ、８．１５４モル、１．６モル当量）
と２５〜３０℃で混合すると白濁した溶液を得た（この
白濁は前段階からの残留塩化ナトリウムによるものであ
ると考えられる）。該溶液を高真空下（１．０ｍｍ）に
３０℃で蒸発させて揮発性物質を除去した。（２Ｓ，６
Ｒ）−２−エトキシ−２，６−ジメチル−１，３−ジオ
キサン−４−オンを含有する残留液体（１００１ｇ）を
８０℃で２時間加熱し次いで４０℃に冷却した。粗製物
を、ガラス製のラシッヒ（Raschig)環を詰めたガラスカ
ラム（５０ｃｍ×３．５ｃｍ直径）に通して蒸留すると
（Ｓ）−β−ブチロラクトン（５７．３ｇ）を得た、１
０〜１２ｍバールでの沸点５９〜６２℃。
【０１００】ｃ．（Ｒ）−３−メルカプト酪酸 （Ｓ）−β−ブチロラクトン（９１．１２ｇ、１．０５
８モル）を窒素下に攪拌しながら５℃に冷却した。温度
を５℃に維持しながらチオール酢酸（８０．５７ｇ、７
５．６５ｍｌ、１．０５８モル、１．０モル当量）を添
加した。次いで反応温度を−５〜＋５℃に維持しながら
トリエチルアミン（１４６．７ｍｌ、１．０５８モル、
１．０モル当量）を４５分間に亘って添加した。冷却浴
を取去り、温度を６５℃に昇温させると黄色／橙色溶液
を得た。反応混合物を１０℃に冷却し、室温で一夜攪拌
した。該溶液を０℃に冷却し、水（９３ｍｌ）を添加し
た。該混合物を更に−１０℃に冷却し、次いで水酸化ナ
トリウム溶液（４７重量／重量％の水酸化ナトリウムの
１８５ｍｌ及び水９２ｍｌ）で処理し、添加の割合は温
度を−１０〜＋１０℃に維持するようなものである。次
いで該混合物を−５℃で１．５時間攪拌し、次いで室温
にまで加温させた。該混合物をメチル tert−ブチルエ
ーテル（２６５ｍｌ）で洗浄した。水性相を水（１８５
ｍｌ）で希釈し、０℃に冷却し、ｐＨが１〜２となるま
で濃塩酸（２７０ｍｌ）で０〜１０℃で処理した。次い
で水性混合物をメチル tert−ブチルエーテル（２×２
６５ｍｌ）で抽出した。有機抽出液を合し、水（２６５
ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、
３０℃で減圧下に蒸発させると橙色油（１３２．８ｇ）
を得た。この油状物を真空蒸留により精製すると（Ｒ）
−３−メルカプト酪酸（８６．６ｇ）を得た、２ｍバー
ルで沸点９６〜１００℃。
【０１０１】ｄ．ピリジン−２−スルフェニル クロラ
イド ２，２′−ジピリジルジスルフィド（１１０．０ｇ，
０．５モル）を室温でジクロロメタン（８００ｍｌ）に
溶解させて淡黄色溶液を得、これを０℃に冷却した。塩
素ガスを該溶液中で泡出させ、これを０〜５℃に維持し
た。３時間２５分後に該溶液は塩素で飽和され、金褐色
となった。該溶液を０〜５℃で減圧下に濃縮して過剰の
塩素を除去し、黄色の固体としてピリジン−２−スルフ
ェニルクロライドを沈殿させた。この固体（１１．８
ｇ）を濾過により収集し、ジクロロメタンで洗浄した。
ジクロロメタン濾液（１６２４ｇ）は別量１３３ｇのピ
リジン−２−スルフェニルクロライドを含有した。
【０１０２】ｅ．（Ｒ）−３−（２−ピリジルジチオ）
酪酸 ピリジン−２−スルフェニルクロライド（黄色固体１
１．８ｇ及び前記で調製したジクロロメタン中の溶液の
１０３５ｇ、全部で０．６６７モル、１．０モル当量）
をジクロロメタン（５０ｍｌ）で希釈した。該混合物を
室温で５〜１０分攪拌し次いで−５℃に冷却した。温度
を−５℃〜０℃に維持しながらジクロロメタン（４００
ｍｌ）中の（Ｒ）−３−メルカプト酪酸（８０．０ｇ、
０．６６７モル）の溶液を添加した。該混合物を室温で
一夜攪拌させると褐色油と黄色上層とを得た。水（４８
５ｍｌ）を該混合物に添加し、次いでこれを５℃に冷却
し、ｐＨが４．５５となるまで２Ｎ水酸化ナトリウム溶
液（３８５ｍｌ）で処理した。ジクロロメタン相を分離
し、残留水性相をジクロロメタン（２００ｍｌ）で抽出
した。ジクロロメタン抽出液を合し、無水硫酸マグネシ
ウム上で乾燥させ、減圧下に蒸発させると淡褐色の油状
物を得た。この油状物をヘキサン（３２５ｍｌ）と共に
激しく攪拌し、固体が生成されるまで氷浴中で冷却し
た。該混合物を３時間攪拌し、次いで褐色の結晶質固体
を濾過により収集し、ヘキサン（２×１６２ｍｌ）で洗
浄し、真空中室温で一夜乾燥させると（Ｒ）−３−（２
−ピリジルジチオ）酪酸（１４０ｇ）を得た。
【０１０３】ＮＭＲ； １．４５（ｄ，３Ｈ），２．６（ｄｄ，１Ｈ），２．８
（ｄｄ，１Ｈ），３．４（ｍ，１Ｈ），７．１（ｍ，１
Ｈ），７．７（ｍ，２Ｈ），８．５（ｍ，１Ｈ）。
【０１０４】Ｃ２４２抗体（Ｃ２４２：II）の産生 ハイブリドーマ細胞系の樹立及びＣ２４２：IIの産生樹立脾臓細胞の産生 受理番号Ｎｏ．ＣＣＬ２２２号としてアメリカン タイ
プ カルチュア コレクション（American Type Cultur
e Collection：ＡＴＣＣ）から工業的に入手し得るヒト
の結腸直腸ガン腫細胞系、ＣＯＬＯ２０５を、１０％の
子ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足したイスコーブ（Isco
ve) のＭＥＭ中で定常的に培養した。継代培養してから
通常２日〜３日後に、融合前に細胞を椄取し、免疫のた
めリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。
【０１０５】４〜６周令のＢＡＬＢ／ｃマイスを、０．
１ｍｌのリン酸緩衝塩溶液に懸濁させた基本投与量の３
×１０7 ＣＯＬＯ２０５細胞で腹腔内免疫にした。次い
でマイスを３×１０7 ＣＯＬＯ２０５細胞の別量０．１
ｍｌの懸濁液で効能増強させ、４日後に屠殺し、脾臓を
取出した。次いで脾臓を解離して単一の細胞懸濁物にし
た。
【０１０６】ハイブリドーマの産生 前記した細胞懸濁物からの１．２×１０8 脾臓細胞を２
本の試験管の間に分配した。各々の管に、受理番号ＣＲ
Ｌ１５８１としてＡＴＣＣの寄託物から入手し得るマウ
スの骨髄腫細胞系からの１０8 個の骨髄腫細胞を追加的
に添加した。２本の試験管を遠心分離し、全ての液体を
傾シャした。次いで各々の管に１分間に亘ってしかも絶
えず攪拌しながら２ｍｌの３７℃ＰＥＧ溶液（１０ｇの
ＰＥＧ分子量４０００，１ｍｌのＤＭＳＯ及び１０ｍｌ
のモノクローナル塩水）を徐々に添加した。これらの管
を温和に攪拌しながら９０秒間３７℃の水浴に変化させ
た。細胞の融合は次の計画予定：最初の３０秒間は２ｍ
ｌ、続いての３０秒間は６ｍｌ及び１分間に亘って別量
３２ｍｌにより生理緩衝溶液を各々の試験管に添加する
ことにより中断した。培地中の細胞懸濁物の洗浄後に、
該細胞懸濁物を全部で１００ｍｌのハイポキサンチン／
アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）補足培地に懸濁し
た。培地は１０％のＦＣＳとＬ−アスパラギン（３６ｍ
ｇ／ｌ）とＬ−アルギニン−ＨＣｌ（１１６ｍｇ／ｌ）
と葉酸（１０ｍｇ／ｌ）とＬ−グルタミン（２９２．３
ｍｇ／ｌ）とピルビン酸ナトリウム（１１０．１ｍｇ／
ｌ）とメルカプトエタノール（３．４９μｌ／ｌ）とを
補足したイスコーブのＭＥＭであった。５０μｌの分量
を９６個の溜り部（well) の組織培養皿の溜り部に分配
した。溜り部はＨＡＴ補足した培地中のＢＡＬＢ／ｃマ
イス（２×１０4 細胞／ｍｌ）からのマクロファージ懸
濁物２５０μｌで予備被覆しておいた。培地は融合して
から６日後に変化した。
【０１０７】抗体ハイブリドーマのスクリーニング 前記６日目からの消費培地をH.R. Kennettの“ポリ塩化
ビニルプレートに結合した細胞での酵素結合した抗体の
評価”モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、生物学的
分析の新規次元（１９８０）により記載の如くＣＯＬＯ
２０５陽性抗体について試験した。要約すると、ヌンク
（Nunc) イムノプレート型IIＦの溜り部を２×１０5 細
胞／ＣＯＬＯ２０５細胞の溜り部（１ｍｇ／１００ｍｌ
ＰＢＳ）で被覆した：被覆容量５０μｌ。次いで前記の
６日目からの消費培地を被覆済み溜り部に添加した、５
０μｌ／たまり部。室温で一夜培養反応した後に、１％
のＢＳＡ−ＰＢＳに希釈した（１／５００）ペルオキシ
ダーゼ複合アンチマウスＩｇ（Dakopatts ｐ２６０、Da
kopatts 社、デンマーク）を１００μｇ／溜り部で添加
し、室温で一夜反応させた。次いで１２ｍｌのクエン酸
緩衝液、ｐＨ５．０＋５μｌの３０％過酸化水素に溶か
した４ＯＰＤ−タブレットＤａｋｏ Ｓ２０００の形の
基質を１００μｌ／たまり部で添加し、反応に続いて吸
光度を４５０ｎｍで測定した。
【０１０８】約６００個のハイブリドーマクローンを試
験した。最初はこれらのうち１９０個がＣＯＬＯ２５０
細胞と反応した。これらのうち１７７個がまたNyegaard
社（ノルウェー）からのリンホプレプ上に生産した正常
なヒトのリンパ球と反応し、これらを廃棄した。残りの
クローンのうちの１つから樹立したクローンをハイブリ
ドーマＣ２４２と呼び、ＩｇＧ１クラスとイソタイプし
た。次いでＣ２４２ハイブリドーマを多数のサブクロー
ン化工程にかけて、Ｃ２４２：IIと呼ばれるクローンを
産生する最終的に安全なモノクローナル抗体を結局産生
した。
【０１０９】即ち、Ｃ２４２ハイブリドーマを先ずクロ
ーン化してＣ２４２：５と呼ばれるクローンを得た。こ
のクローンを次いでクローン化してクローンＣ２４２：
５：２を形成した。これらの両方のクローン化におい
て、ハイブリドーマ懸濁物をハイポキサンチン／チミジ
ン（ＨＴ）補充した培地中に希釈して４個の細胞／ｍｌ
の密度にした。５０μｌ（０．２個の細胞）を、ＨＴ補
足した培地中のＢａｌｂ／ｃマイス マクロファージ懸
濁物（５×１０3 マクロファージ／たまり部）の２５０
μｌで予備被覆した９６個の溜り部の培養皿中の各々の
溜り部に分散させた。２〜５日後に、単一の細胞クロー
ンは顕微鏡での肉眼検査により検出された。６日目に、
培地は変化し、消費培地の或る分量は、前記の如くＥＬ
ＩＳＡにより正常なヒトの細胞にでなくてＣＯＬＯ２０
５細胞に結合する抗体の量について分析した。正常な細
胞はＥＬＩＳＡにおける陰性反応を保留しながらＣＯＬ
Ｏ２０５ＥＬＩＳＡにおける陽性反応により最良のクロ
ーンを選択し、更なる発現のため液体窒素で小ビン中に
凍結させた。
【０１１０】第３のクローン化を行なうため、前記細胞
を解凍し、ＤＭＥＭ（ダルベッコーの改質イーグル培
地）（５％ＦＣＳ）中で培養した。次いで細胞を１個の
溜り部当り３個の細胞の平均密度で９６個の溜り部の組
織培養プレートの溜り部中に播種した。クローン化は５
％のＦＣＳを有するＤＭＥＭ中で行ない、マウスのマク
ロファージを支持細胞として使用した。このプレート上
に、３０個のクローンが生起し、そのうち１６個は、前
記した如くＥＬＩＳＡにより比濁法及び抗体の特異性に
よってＩｇＧの生産を試験した。これらのクローンのう
ち１２個がＩｇＧを生産することが見出された。次いで
１０個のクローンを２４溜り部の組織培養プレート上に
展開させ、該プレートから消費培地はＩｇＧの生産と特
異性とを試験した。この選択により比較的高い生産率で
４個のクローンが節約された。これら４個のクローンの
最終的な生産率試験は重複組織培養フラスコ中で行なっ
た。最高の生産率を示すクローンを選抜しＣ２４２／Ｃ
Ｌ５１０Ａ１と呼称した。これを更なる使用のため液体
窒素中で凍結させた。
【０１１１】クローンＣ２４２／ＣＬ５１０Ａ１の第１
のクローン化が示す所によれば細胞の１／３は一般のマ
ウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ中の１：１０００の希釈率で
０．１より小さい吸光度により判断される通りＩｇＧを
生産しなかった。５個の陽性サブクローンをプールして
Ｃ２４２：Ｉと呼ばれるクローンを生成した。このクロ
ーンからの生産率を一般的なＨＰＬＣ−基質の評価によ
り定量化すると１５０μｇのマウスＩｇＧ／ｍｌであっ
た。
【０１１２】続いてクローンＣ２４２：Ｉを９６溜り部
の培養皿中でクローン化すると３３個のクローンが得ら
れ、全てマウスＩｇＧの生産に陽性であった。これらの
クローンのうち５個は全て１５０μｇ／ｍｌのマウスＩ
ｇＧを生成するものであり、これらをプールしてＩｇＧ
の安定な生産率を有するＣ２４２：IIと呼称される最終
クローンを生成した。ＨＰＬＣ分析によればＣ２４２：
IIの生産率は１９６μｇのマウスＩｇＧ／ｍｌであるこ
とを示した。これらのクローン細胞を液体窒素で凍結さ
せ小ビン中に貯蔵した。生産したＣ２４２：IIハイブリ
ドーマの１試料を前記の如く受理番号９００１２６０１
としてＥＣＡＣＣに寄託した。
【０１１３】Ｃ２４２モノクローナル抗体の生産 前記で生成したハイブリドーマの原料細胞懸濁物を凍結
した小ビンから得た。これらの細胞を２×１０4 細胞／
ｍｌの密度でヌンクＡ／Ｓから６０００ｃｍ2の全面積
で組織培養室中に播種した（Ｃ２４２：IIハイブリドー
マ）。次いでイスコーブ（Iscove N,N及びＭelchers
F.,J.Exp.Med. １４７巻、９２３頁、１９７８）により
改質されしかも１％のゲンタマイシンと１％のアミノ酸
補体と５％の子ウシ胎児血清とを補充したＤＭＥＭ中
で、これらの細胞を培養した。次いでこれらの細胞を８
％のＣＯ2 含有加湿雰囲気中で３７℃で４日又は５日間
培養反応させた。培養の終了時に、細胞を計数し、モノ
クローナル抗体濃度の測定のため試料を取出した。細胞
培養物の上澄み液を傾シャし、セルロースフィルターに
通して濾過して懸濁した細胞を除去した。次いで３０，
０００分子量の遮断膜を用いてミリポアペリカン限外濾
過セル(Millipore Pellican Ultrafiltration cell) 中
で限外濾過により上澄み液を２０〜３０倍濃縮した。濃
厚液からの１試料をＣ２４２：IIモノクローナル抗体濃
度及び抗原反応性の分析のため取出し、しかる後にモノ
クローナル抗体濃厚物を精製まで−７０℃で貯蔵した。
【０１１４】Ｃ２４２モノクローナル抗体の精製 プロテイン−Ａ−セファローズ４Ｂ（ファルマシア社の
商標名）をゲルの膨潤及び洗浄に関する生産者の指示に
より製造し、しかる後に前記で生成したＣ２４２：II
（またこゝでは簡単にＣ２４２抗体と記載する）濃厚物
を、結合用緩衝液として１．５グリシン−ＮａＯＨ、３
Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．９を用いてプロテイン−Ａ−セ
ファローズ４Ｂに結合させた。同じ緩衝液を用いて最初
の洗浄後に、アフィニティーカラムを０．１Ｍクエン酸
−ＮａＯＨ、ｐＨ５．０で溶離させ、Ｃ２４２モノクロ
ーナル抗体を１モル／ｌのTris−ＨＣｌ，ｐＨ８．０含
有試験管中に収集した。次いで得られた抗体を０．０２
Ｍリン酸緩衝液、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２、
０．２ｇ／ｌ ＮａＮ3 に対して透析した。次いで３
０，０００分子量の遮断膜を用いて限外濾過により透析
済みＣ２４２抗体を濃縮した。濃度及び特性の対照分析
のため試料を取出した後に、Ｃ２４２モノクローナル抗
体を−２０℃で貯蔵した。
【０１１５】リシンＡの製造 リシンＡは、リシンＡをコードするＤＮＡ配列を用いて
組換えＤＮＡ技法により製造し得る。かゝる塩基配列は
ＥＰ１４５．１１１；Ｏ′HareらのＦＥＢＳLetts 、２
１６、ｐ７３〜７８、１９８７；及びLordらのEur.J.Bi
ochem.１４８、ｐ２６５〜２７０、１９８５に記載され
ている。リシンＡをコードするＤＮＡ配列はプロモータ
ー（例えばｔｒｐプロモーター）、リボソーム結合部位
及び転写ターミネーターの如き適当な制御配列の調節下
に置かれるものである。組換えリシンＡの製造及び精製
は公告されたＰＣＴ特許出願ＷＯ ８５／０３５０８及
び公告された欧州特許Ｎｏ．２３７，６７６号に記載さ
れている。
【０１１６】次に組換えプラスミドの構成を説明する
が、該プラスミドにおいてリシン−Ａ連鎖のコード化配
列は原核プロモーターエレメントの転写的及びホン訳的
制御下に置かれる。転写はメッセージの３′末端に天然
終結成分の組込みにより終結する。ホン訳開始はメッセ
ージ５′末端でリボソーム結合部位（ＲＢＳ）でＤＮＡ
配列により調節する。構成方法は天然の成熟リシンＡタ
ンパク質の２個のＮ−末端アミノ酸残基の置換を必要と
する。
【０１１７】組換えリシンＡを製造するのに用いたベク
ターを誘導するのに幾つかの中間段階を記載する。
【０１１８】実験方法 １．合成オリゴヌクレオチド 合成オリゴヌクレオチドを使用してリシン遺伝子（ジー
ン）中に特異なＤＮＡ改変物を導入した。以下に記載し
た全てのオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステ
ムズ(Applied Biosystems)社によって供給された記録書
により、０．２マイクロモルスケール上の調節済み細孔
のガラス支持体に結合した５′−ジメトキシトリチル塩
基保護したヌクレオチド−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルホスホルアミジト及び保護ヌクレオチド
からアプライドバイオシステムズ３８０Ａ ＤＮＡ合成
機により製造された。
【０１１９】固体支持体から脱離し且つ全ての保護基を
除去した後の各々のオリゴヌクレオチドを水（１ｍｌ）
に溶解させ、２６０ｎｍでの吸光度の測定を行なって濃
度を測定した。
【０１２０】２．酵素及び宿主菌株 種々の制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ修飾陽酵素を
以下に記載した操作で使用した。これらは多数の供給元
（アメルシャム インターナショナル、ベテスダ リサ
ーチ ラボラトリーズ、ベーリンガー マンハイム又は
ニューイングランド バイオラブ）の１つから購入され
しかも反応条件に関して生産者の指示により使用され
た。
【０１２１】本明細書に記載した宿主菌株は多数の供給
源から一般に入手し得る。例えば大腸菌（E.coli）Ｃ６
００は受理番号ＧＣＳＣ３００４として米国のE.coliゼ
ネティック ストックセンターの如き多数の培養物収集
機関を含めて多数の供給源から自由に入手できる。E.co
liＣ６００の遺伝子型はＫ１２ｔｈｒ−１ ｌｅｕＢ６
ｔｈｉ−１ ｌａｃＹ１ ｔｏｎＡ２１ λ- ｓｕｐ
Ｅ４４であり；E.coliＨＢ１０１及びＤＨ５αはベテス
ダリサーチ ラボラトリーズ（ＢＲＬ）から入手でき；
E.coliＴＧ１及びＫ１９はアングリアバイオテクノロジ
ーから入手できる。
【０１２２】３．ゼネクリーン(Geneclean) （ＴＭ） 反応容器は１）６Ｍヨウ化ナトリウムと２）塩化ナトリ
ウム／エタノール／水洗液を形成するため塩化ナトリウ
ムとＴｒｉｓとＥＤＴＡとの濃厚溶液と３）ガラスミル
ク(Glassmilk) （ＴＭ）−水中のシリカ母材の懸濁物の
１．２５ｍｌを含有する１．５ｍｌの小ビンとを収容す
る。
【０１２３】これはプロシーディングズ オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンス(Proceedings
of the National Academy of Sciences) （１９７９）
７６巻６１５頁に発表されたVogelstein及びGillespie
の方法に基づいたＤＮＡ精製用の技術である。
【０１２４】別法として“Molecular Cloning - a labo
ratory manual ”第２版、Sambrook、Fritsch 及びMani
atis（１９８９）（以下では“Maniatis”と記載する）
に記載された方法の何れかを使用できる。
【０１２５】４．セクエナーゼ(Sequenase) （ＴＭ） 化学的に修飾したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ “Proceedings of the National Academy of Sciences
（１９８７）８４巻４７６７〜４７７１頁に発表された
Tabor及びRichardsonの方法に基づいた。
【０１２６】５．ｐＩＣＩ発現ベクターの構成 ５ａ）ｐＩＣＩ００２０ プラスミドベクターｐＩＣＩ００２０は、６５１ｂｐＥ
ｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ領域が （１）合成E.coli ｔｒｐ プロモーター及びｔｒｐリ
ーダーリボソーム結合部位、 （２）ホン訳開始コドン （３）ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、Ｐ
ｓｔＩ、ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄIII 用の部位を含有する
Ｍ１３ｍｐ１８から誘導された多数の制限酵素認識配
列： よりなる１６７ｂｐＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩフラグメント
によって置換されたｐＡＴ１５３基質のプラスミドであ
る。
【０１２７】この領域のＤＮＡ配列は図１２に示してあ
る。
【０１２８】合成ｔｒｐプロモーター配列を含有するプ
ラスミドベクターの構成は発表されている（Windass ら
のNuc.Acids Res ．１０ ｐ６６３９〜６６５７、１９
８２）。プロモーターフラグメントは酵素ＥｃｏＲＩ及
びＨｐａＩで消化し且つ電気溶離によりアガロースゲル
から特定なバンドを精製した後にかゝるベクターから単
離された (“Molecular Cloning −A laboratory Manua
l ”Maniatis、Fritsch 及びSambrook、第２版１９８
９）。
【０１２９】一対の相補性の合成オリゴヌクレオチドを
製造し、これは天然のｔｒｐリーダーリボソーム結合部
位とホン訳開始コドンと３′ＫｐｕＩクローニング部位
とを与えるプロモーターフラグメントのＨｐａＩ末端に
連結するものである。これらのオリゴヌクレオチドを当
モル濃度で混合し且つ１００℃に加熱し続いて室温に徐
々に冷却することによりアニールさせた。
【０１３０】次いでプロモーターフラグメント及びアニ
ールしたオリゴヌクレオチドを連結させしかも適当なバ
ンドを電気溶離によりポリアミドゲルから単離した。次
いでこのフラグメントを、ＨｉｎｄIII 部位にクローン
化したｔｒｐアテニュエーター配列（合成オリゴヌクレ
オチドから生成した）を含有し且つ該アテニュエーター
に追加のＣｌａＩ制限部位３′を導入するＭ１３ｍｐ１
８ベクター誘導体と連結させた。連結したＤＮＡを、Ｃ
ａＣｌ2 法（Maniatis、１章、８２頁）により有能とさ
せたE.coli菌株ＪＭ１０９(Yanisch−Perronらの遺伝
子、３３、１０３頁、１９８５）に感染させた。平板を
被覆し且つ培養反応させた後に、プラークは前もって単
離したE.coliＲＩ−ＨｐａＩプロモーターフラグメント
のニックホン訳により生成した32Ｐ標識のプローブを用
いてBenton及びDaviesの方法（Maniatis、４章、４１
頁）により篩分した。標準法（Maniatis、４章、２９
頁）により陽性的にハイブリッド化しているプラークか
ら一本鎖ＤＮＡを製造し、多数の供給剤例えばセクエナ
ーゼ（米国Bioscience）により組立て形で与えられる如
きＭ１３ユニバーサルプライマー及びサンガー(Sanger)
ジデオキシ連鎖終結法を用いて配列した。
【０１３１】ＲＦ ＤＮＡをプロモーター／リボソーム
結合部位／アテニュエーター配列が確認された１つの単
離品から製造した。このＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＣｌａ
Ｉで消化させ、特定のフラグメントを前記の如くポリア
クリルアミドから単離した。プラスミドｐＡＴ１５３を
酵素ＥｃｏＲＩ及びＡｃｃＩで消化させ且つ単離したプ
ロモーターフラグメントと連結させた。連結したＤＮＡ
を有能なE.coliＨＢ１０１（Boyer,H.W.及びRoulland-D
ussoix,D；１９６９，J.Mol.Biol.,４４ ｐ４５９）(B
ethesda Research Laboratories)に形質転換させアンピ
シリン耐性コロニーを選択した。
【０１３２】幾つかのクローンからプラスミドＤＮＡを
製造し、ＤＮＡ配列をＥｃｏＲＩとＣｌａ部位との間の
領域から誘導した。１つのクローンは正確なプロモータ
ー／アテニュエーター領域を含有していると確認されこ
れｐＩＣＩ１００２０と呼称した。
【０１３３】この構成を図１に概説する。
【０１３４】３ｂ）ｐＩＣＩ１００４２ ｐＩＣＩ１００４２（図１３）はｐＡＴ１５３の抗生物
質耐性マーカーがプラスミドＲＲ４（遺伝子ｔｅｔＡに
よりエンコードされしかもｔｅｔＲ遺伝子の生産品によ
り調節された）からの単一の誘導性テトラサイクリン耐
性遺伝子によって置換されているプラスミドである。こ
れらの遺伝子はKlock ら（J.Bacteriol.１６１ ｐ３２
６〜３３２、１９８５）によって特徴付けられていた。
新規な耐性マーカーは抗生物質の存在下でのみ発現され
る故に、ｔｅｔＡ遺伝子生成物はプラスミドがテトラサ
イクリンの不在下に安定に維持される培養物中で組換え
リシンＡの潜在的な汚染物ではないものである。プラス
ミド安定性機能（ｃｅｒ）もまた組入れられた。
【０１３５】このベクターを生成する最初の段階は、テ
トラサイクリン耐性をエンコードする遺伝子が完全に除
去されたｐＡＴ１５３の誘導体を製造するものである。
相補対の合成オリゴヌクレオチドはｐＡＴ１５３からの
ＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩを次後のクローニングのため幾つ
かの特異な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する短か
い配列で置換するように意図される。
【０１３６】ｐＡＴ１５３プラスミドＤＮＡを酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＡｖａＩで消化させ、生産者の指図によりゼ
ネクリーン（Ｂｉｏ１０１、カリホルニア）を用いて
０．７％アガロースゲルから２．１７５Ｋｂｐプラスミ
ドＤＮＡフラグメントを単離した。かくしてテトラサイ
クリン耐性遺伝子を含有する１．４２５Ｋｂｐフラグメ
ントを除去した。
【０１３７】Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオ
リゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤの１３及び１４）をホ
スホリル化し、当モル量を互いにアニールした。次いで
アニールしたオリゴヌクレオチドの１試料をｐＡＴ１５
３からのプラスミドフラグメントと連結反応させた。連
結したＤＮＡをE.coliＨＢ１０１（ＢＲＬ）に形質転換
させ、アンピシリン耐性コロニーを選択した。
【０１３８】幾つかのコロニーを小規模のプラスミドＤ
ＮＡの製造（Maniatis、１章、２５頁に明記した如きBi
rnboin及びDolyの方法）のため選択し、所望の構造は適
当な酵素、例えばＥｃｏＲＩ、ＡｖａＩ及びＢａｍＨＩ
での制限分析により同定した。正確な制限パターンを有
すると同定した３つの単離物の構造はｐＢＲ３２２Ｅｃ
ｏＲＩ部位の時計方向のプライマー(New England Biola
bs) を用いてＤＮＡ配列分析により確認された。１つの
単離物はｐＩＣＩ００１９と呼称した。
【０１３９】ＲＰ４プラスミドＤＮＡはHolmes及びQuig
ley の方法（Maniatis、１章、２９頁）により現存のス
トックから単離した。ｔｅｔＲ及びｔｅｔＡを含有する
２．４５Ｋｂｐフラグメントが明白に同定し得るまで種
々の時点で試料を取出しながらこのＤＮＡを切出してＢ
ｇｌII及び次いで部分的にＸｍａＩで完成させる（２５
℃で３５分以下）。ｐＵＣ８ ＤＮＡ(Amersham Intern
ational)をＢａｍＨＩ及びＸｍａＩで完成するまで消化
した。連結はテトラサイクリン耐性遺伝子をｐＵＣ８中
に挿入するのに実施した。連結したＤＮＡは、ＣａＣｌ
2 法（Maniatis、１章、８２頁）により有能とさせたE.
coliＣ６００（Appleyard,R.K.Genetics３９ ｐ４４
０，１９５４）に形質転換させ、テトラサイクリン耐性
コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを８個のクロー
ンから製造し（Holmes及びQuigley ）、ＲＰ４ｔｅｔＲ
及びＡ遺伝子の存在は制限分析により確認した。これら
の単離物の１つをｐＴＢ３４４と呼称した。
【０１４０】次いでｐＩＣＩ００１９からのＥｃｏＲＩ
／ＰｓｔＩフラグメントをｐＴＢ３４４からの対応のフ
ラグメントで置換することによりテトラサイクリン耐性
遺伝子をｐＩＣＩ００１９（前記した）に挿入した。こ
れによりｐＩＣＩ００１９中のアンピシリン耐性遺伝子
の大部分がテトラサイクリン耐性遺伝子で置換される。
消化し、プラスミドＤＮＡを連結し、続いてE.coliＣ６
００に形質転換した後に、コロニーを表現型に基づいて
選択し、即ちＴｃR 及びＡｐS を選択した。プラスミド
ＤＮＡはかゝる４つのクローンから製造し、これを酵素
の組合せ例えばＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ／ＳｓｔＩ，Ｅｃ
ｏＲＩ／ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＳｔｙＩ／ＳａｌＩ及び
ＡｖａＩ／ＰｓｔＩで消化した。全ての４つのクローン
は所望の構成に合致する制限パターンを生じた。これら
のクローンのうちの１つをｐＴＢ３５１と呼称した。
【０１４１】Summers 及びSherratt（Cell ３６ ｐ１
０９７〜１１０３、１９８４）が示す処によればＣｏｌ
ＥＩ（例えばｐＡＴ１５３）から誘導されるプラスミド
の不安定性は親プラスミドに存在する２８３ｂｐ配列、
ｃｅｒの欠損によるものである。この配列はプラスミド
オリゴマーの形成を防止するのに役立ち、プラスミドオ
リゴマーは或る仕方で但し尚未確定の仕方でプラスミド
の分配を破壊すると思われる。ｃｅｒ配列（Summers ら
のMol. and Gen. Genetics ２０１、ｐ３３４〜３３
８、１９８５；及びCell、３６、１０９７〜１１０３、
１９８４）をｐＵＣ１８（ｐＫＳ４９２）にクローン化
したフラグメントから単離した。ｐＫＳ４９２プラスミ
ドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＴａｑＩで消化させて２８９
ｂｐｃｅｒ含有フラグメントを離脱した。プラスミドｐ
ＴＢ３５１ＤＮＡ（Ｄａｍ- 宿主E. coliＧＭ４８から単
離した−Arraj,J.A.及びMarinus,M.G.J.Bact. １５３
ｐ５６２〜５６５、１９８３）をＢａｍＨＩ及びＣｌａ
Ｉで完成するまで消化させしかも消化したｐＫＳ４９２
ＤＮＡと連結させた。連結したＤＮＡの有能なE.coliＣ
６００への形質転換後に、テトラサイクリン耐性コロニ
ーを選択した。酵素ＡｖａＩ、ＭｌｕＩ及びＰｖｕＩで
推定クローンからのプラスミドＤＮＡの制限分析を使用
してｃｅｒ．の存在を確認した。正確な構造を有する１
つの単離物をｐＩＣＩ００４２と呼称した。
【０１４２】これらのプラスミドの構成を図２及び３に
概説する。
【０１４３】５ｃ）ｐＩＣＩ１０７９ プラスミドベクターｐＩＣＩ１０７９はＥｃｏＲＩ及び
ＳｔｙＩ制限部位の間に次の成分を含有するアンピシリ
ン耐性のｐＡＴ１５３誘導プラスミドである： （ｉ）λファージからのＣＩ８５７遺伝子； （ii）λＰL プロモーター； (iii) 合成リボソーム結合用部位； (iv) 合成インターフェロンα２遺伝子配列； （ｖ）ＳａｌＩ及びＳｔｙＩ制限部位の間でファージＴ
４から誘導された合成転写ターミネーター配列。
【０１４４】この転写ターミネーターのＤＮＡ配列は図
１４に示してある。ｐＩＣＩ１０７９は図１５に示して
ある。ｐＩＣＩ１０７９はブダペスト条約により１９９
１年２月１９日にＮＣＩＭＢに寄託されており、ＮＣＩ
ＭＢ受理番号Ｎｏ．４０３７０が付与されている。
【０１４５】プラスミドｐＩＣＩ１０７９を使用して、
リシンＡ発現性のクローンｐＩＣＩ１１８５を生成する
Ｔ４転写ターミネーターの供給源を与えた（以下の７．
ｄ参照）。プラスミドｐＩＣＩ１０７９を生成する開始
点はｐＩＣＩ１０４３である。ｐＩＣＩ１０４３は、λ
ＰL プロモーター及びインターフェロンα２遺伝子（Ed
geらのNuc.Acids Res. １１ ｐ６４１９〜６４３５、
１９８３）を含有する表現カセットがＥｃｏＲＩ及びＳ
ａｌＩ部位の間に存在するｐＩＣＩ００２０（前記３．
ａ参照）に基づいたプラスミドである。
【０１４６】オリゴヌクレオチドの相補対を合成して、
５′ＳａｌＩ及び３′ＳｐｈＩ付着端を有するバクテリ
オファージＴ４の遺伝子３２から転写ターミネーターを
生成した。このフラグメントを、ＳａｌＩ及びＳｐｈＩ
で完成するまで消化させておいたｐＩＣＩ１０４３から
単離したプラスミドフラグメントと連結させた。かくし
て産生した中間体プラスミド（ｐＩＣＩ１０７８）は直
列にＴ４ターミネーターとｔｒｐアテニュエーターとの
両方の配列を含有した。
【０１４７】別の一対の相補性オリゴヌクレオチドを次
いで使用して、ｐＩＣＩ１０７８のＳｐｈＩ及びＳｔｙ
Ｉ部位の間に挿入することによりｔｒｐアテニュエータ
ー配列（及びテトラサイクリン耐性遺伝子の残りの部
分）を置換した。特異なＢａｍＨＩ部位をこの合成フラ
グメント内に導入した。
【０１４８】これらの操作を図４に概説する。
【０１４９】6.リシン A発現クローンの生成 6.a) pUC8RA プラスミドDNA の調製 リシン AについてのcDNAを含有するクローン(pUC8RA)を
生成させた。このクローンはプラスミドpUC8(Vieira,J
及び Messing,J. Gene, 19 ,p259,1982)中に、リーダー
配列中の塩基番号-74 から公表されているcDNA配列 (La
mb,I.F.,Roberts,L.M.,Lord,J.M. Eur.J.Biochem,1985,
148 ,p265-270) に従った、 B鎖内の B amHI部位（塩基
番号857)までの A鎖 cDNA を含有している。更に、特定
部位の突然変異誘発を使用して、（O'Hare,M等,FEBS Le
tts,1987, 216 ,p73-78 に報告されるごとき）成熟リシ
ン A(mature ricin A)の最終コドンに 3' で隣接する翻
訳停止コドンを生成させた。全 A鎖コード領域はこのク
ローンからの BamHIフラグメント中に包含されている。
【０１５０】少量のpUC8RAプラスミドDNA を上記のごと
くして得た。別のストックを調製するために、このDNA
の稀釈物(dilution)を使用してE.Coli DH5αコンピテン
ト細胞(Hanahan,D,;1983,J.Mol.Biol., 166 ,p557)(Bet
heda Research Laboratories) を形質転換し、アンピシ
リン耐性形質転換細胞を選択した。このクローンからの
プラスミド DNAをBirnboim-Doly 法(Maniatis,chapter
1,p25)の変法によって調製した。このDNA の試料を Bam
HIと BanI を使用して別個に消化しついで、アガロース
ゲル上での電気泳動を行った後、Lord等によって報告さ
れている元のDNA の対応する消化物と比較した。制限パ
ターンに差異は認められず、これに基づいて、２つのDN
A 試料は同一であると推定された。
【０１５１】6.b) M13中へのサブ−クローニング pUC8RAプラスミドDNA の BamHI消化物(digest)とファー
ジ M13株 K19（Anglian Biotechnology)からのRF( 複製
型）DNA を標準的な条件(Maniatis, chapter 1,p68) を
使用して" ショットガン" 連結した。対照の連結も行っ
た。連結されたDNA を使用して、CaCl2 法(Maniatis, c
hapter 1,p82) によってコンピテント(compitent) にせ
しめたE.Coli株TG1 (Gibson,1984/Anglian) を形質転換
させた。
【０１５２】形質転換頻度(transformation frequence)
は効率的な連結が行われたことを示し、組換え体ファー
ジが後代において期待された。組換え体ファージは、la
cZ(β−ガラクトシダーゼ）遺伝子の分裂(disruption)
のために、IPTG+X-gal(BRL)含有プレート上に透明プラ
ークを生成させると断定された。野生型(wild type)フ
ァージはβ−ガラクトシダーゼによるX-gal 加水分解の
ために青色プラークを生成する。
【０１５３】一本鎖DNA を調製するために種々の透明プ
ラークを採取した。溶解(lysed) ファージ懸濁液の直接
ゲル電気泳動により、１個のファージクローンが、配列
決定によりリシン A鎖コード配列であると確認されたか
なり大きい挿入断片(insert)を含有していることが示さ
れた。成熟リシン Aコード配列の182 塩基だけが確認さ
れたが、これは全リシン A遺伝子の存在を示す十分な証
拠として採用された。このクローンをM13K19RAと命名し
た。
【０１５４】6.c)M13K19RAの突然変異誘発 成熟リシン Aの開始時にpICI発現ベクターと両立し得る
KpnI 部位を生成させるためには、下記の変化（下線を
付した部分）即ち、配列番号15の配列番号16への変化が
必要である： 配列番号 15 配列番号 16 その結果、 KpnI 部位と重複するATG コドンが得られ
る。リシンA を含有するKpnI 部位フラグメントを突然
変異体から切取り、ICI 発現ベクター系列に挿入し得
る。二つのN-末端アミノ酸修飾が行われる（ ile−phe
から met−val への変化）。
【０１５５】M13K19RAから調製した一本鎖DNA を各突然
変異方法(mutation strategy) についての突然変異誘発
のための鋳型とした。この突然変異方法についての全て
の突然変異的変化(mutational change) を誘導する一本
鎖オリゴヌクレオチド、DTR16 を合成した。
【０１５６】 特定部位の突然変異誘発により特定のDNA 配列の変化を
誘導するためには種々のプロトコールが存在する。以下
で概説する手順は、キットフォーム(kit form)(Amersha
m International)で提供されるかつ製造業者の指示書に
従って使用されるEckstein等の方法(Nuc.Acid Res.,198
5,13 ,p 8749-8764 及び1986, 14 ,p 9679-9698)を使用
して行った。
【０１５７】この方法の原理は一本鎖 DNA鋳型を突然変
異原性の(mutagenic) オリゴヌクレオチドを用いて初回
免疫し(prime) 、dATPの代わりにdATPαS を組込む相補
的鎖(complementary strand)を合成することである。こ
のヌクレオチドを使用することにより、ある種の制限酵
素 (例えば NciI)によって開裂(cleave)されないホスホ
ロチオエート結合が形成される。第２の鎖の合成の後、
NciI を使用して、親鎖(parent strand) と、突然変異
点(mutation point)を越えて消化復帰 (digest back)を
行うために添加されたエキソヌクレアーゼ IIIとに切れ
目を付ける(nick)。ついで DNAポリメラーゼ Iにより親
鎖を再合成する。従って、突然変異原性オリゴヌクレオ
チドは再合成のための鋳型としての働きを行い、突然変
異は形質転換の前に両者の鎖中に導入される。全後代の
96 %までの突然変異頻度(mutation frequency)が認めら
れ、スクリーニングは単に配列分析(sequence analysi
s) のために無作為的にプラークを採取することによっ
て行った。
【０１５８】本発明者等の行った実験においては、採取
された４個のプラークからの４個が正しく突然変異を生
じた(mutate)。
【０１５９】１個の突然変異体を選択して、RF DNAを調
製し、新たに生じた制限フラグメント、即ち、 KpnI の
存在を検査した。
【０１６０】6.d)クローニング、発現及び初期特性表示
(initial characterisation) pICI系列の発現ベクター（前記 3) 参照）は Trpプロモ
ーターに隣接するユニーク(unique) Kpn I制限部位中に
クローンされたDNA フラグメントを受容し得る。 Kpn I
制限部位は Trpプロモーターのシャイン−ダルガルノ部
位(Shine-Dalgarno site) (AGGA)から 8bp下流に位置す
る翻訳開始コドン(ATG) と重複する。
【０１６１】MRA16 の配列を確認した後、大規模の(5μ
g RF DNA以上) Kpn Iによる消化を行い、適切な(relev
ant)リシン Aコード DNAフラグメントを、製造業者のプ
ロトコールに従って切徐ゲルスライス(excised gel sli
ce) のフェノール抽出を行うことによって、アガロース
ゲル(Nu-sieve GTG アガロース、Bio-product)から単離
した。
【０１６２】pICI10020 （3)参照）を Kpn Iにより消化
しついでウシ腸内アルカリ性ホスファターゼ(CIP-Boehr
inger Mannheim) を使用して脱リン酸(dephosphorylat
e) を行った。後者の処理を行うことによって、連結(li
gation)の際に形質転換後代(transformation progeny)
中に高い割合の親(parental)をもたらすベクターの再環
化(recircularisation) が防止される連結は種々の方法
について 8:1〜1:3(v/v)のプラスミドベクター：単離フ
ラグメントの比率を使用した開始した。ホスファターゼ
処理の効率、リガーゼ活性等を試験するために対照連結
試験も行った。連結条件は使用したT4 DNAリガーゼ(New
England Biolabs又はAmersham) の供給源について適当
なものあった。反応混合物は、通常、15℃で一夜インキ
ュベートした。
【０１６３】各連結混合物(5μl)の50% を 1xTNE(50mM
Tris,50mM NaCl,1mM EDTA)により100 μl に稀釈し、20
0 μl のコンピテントE.coli DS410を添加した。標準的
な形質転換プロトコール(Maniatis, chapter 1,p74) を
行った後、細胞をストレプトマイシン(25 μg/ml) 及び
アンピシリン(100μg/ml) を含有する Lアガー上に載せ
そして37℃で一夜インキュベートした。
【０１６４】インキュベーションを行った後、形質転換
プレートを試験した。一般的には、リガーゼを使用しな
い対照と比較して、5 〜10倍多いコロニーが連結物中に
認められた。ある場合には、リガーゼを存在させた場合
と存在させない場合とでは、生成したコロニーの数に僅
かな差異が生じ、これはベクターの消化が不完全なこと
又はリガーゼの活性が不良なことを示している。
【０１６５】形質転換細胞と関連対照物とを Lアガー上
に載せたニトロセルロースフィルター上に載せ、(Mania
tis,chapter 1 ,p98に記載される Grunstein及びHognes
s の方法に従って) ハイブリダイゼーションスクリーニ
ング(hybridisation screening) を行った。インキュベ
ーションの後、10% SDS 及び1M NaOH を使用してその場
で溶解し(lyse), 1M Tris (pH 7.5)を使用して中和しつ
いで80℃で2 時間、真空下で乾燥した。
【０１６６】T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して突
然変異オリゴヌクレオチドを32P 標識する( 32P labell
ing)ことによりハイブリダイゼーションプローブを形成
した。フィルターを室温でプローブし、55〜65℃まで数
段階で洗浄して、非特異的に結合した連結物(count) を
除去しついでオートラジオグラフィーで測定した。特定
のハイブリダイゼーションはリシン A DNAを含有する想
定的(putative)クローン（リシン A DNAを含有するクロ
ーン考えられるもの）を示した。
【０１６７】正に(positively)ハイブリダイズしている
クローンから、（Maniatis,chapter1,p25に記載されるH
olmes及びQuigley の方法又はBirnboim-Doly の方法に
よって）少規模の DNAを調製した。この DNAを適切な制
限酵素、例えば、 KpnI 及びRcoRI/ BglIIを使用して
消化しついでアガロースゲル上での電気泳動により分析
した。ベクター DNAと突然変異 RF DNA を同一の制限酵
素で切断して、適正なクローンについて期待されるフラ
グメントサイズを示すた。
【０１６８】各クローンについての、より大規模のプラ
スミド DNAを調製し(Birnboim-Doly) 、制限酵素、例え
ば ClaI,Hind III, BamHI, RcoRI/ BglII 、 KpnI
及びScaI を使用して、より詳細な制限分析を行った。
アガロースゲル上では、これらの消化物は挿入されたフ
ラグメントのサイズ、その配列（orientation)の指示(i
ndication)及びリシン A鎖遺伝子に対して特有の制限酵
素部位の増加（gain)を示した。
【０１６９】6.e)発現試験 (expression study) ハイブリダイゼーションと制限スクリーニングにより正
に同定されたクローンを全細胞ライゼート(lysate)のSD
S-PAGE分析によりリシン Aの発現について試験した。発
現試験についての標準的な条件は下記の通りであった： 1)L-ブロス(L-broth)10ml+抗生物質に単一コロニーを接
種し、穏やかに振盪しながら37℃で一夜生長させる。
【０１７０】2)750 μl のL-ブロスを採取し、マイクロ
フュージ(microfuge) 内でペレット化する( 6500rpm で
1 分間）。
【０１７１】3)ペレットを300 μl の M9 メジウム(Man
iatis,補遺( appendix) A.3)+0.02%のカゼイン加水分解
物+0.2% のグルコース+ 50μg/mlのチアミン中に再懸濁
させそして上記のもの10ml中に接種する。
【０１７２】4)穏やかに振盪しながら37℃で 7時間又は
一夜インキュベートする。
【０１７３】5)インキュベートした後、OD540 を測定
し、細胞をペレット化しついで、水に懸濁させた場合に
は10のOD540 を与える容量(Maniatis,chapter 18,p53)
に均等な、ある容量のラエミリ試料緩衝液(Laemmili sa
mple buffer)中に再懸濁させる。15分間沸騰させる。
【０１７４】6)SDS ポリアクリルアミドゲル上に 20 μ
l の全細胞ライゼートを載せ、電気泳動させ、クーマシ
ーブルーで染色し、再度、脱色し(destain) 、可視状態
にする。
【０１７５】SDS-PAGEにより分析したクローンの内、１
個のクローンだけが( 非グリコシル化成熟リシン Aにつ
いて評価されたものに等しい）29KD以上の近似等量分子
量（approximate equivalent molecular weight)につい
ての追加的なバンドを示した。ゲルスキャン(gel scan)
は蓄積水準(accumulation level)が全細胞タンパク質の
5 〜10% の範囲にあることを示した。このクローン中の
プラスミドをpIC I1102 と命名した。
【０１７６】pICI 1102 の構造は図 5に示されている。
発現試験の結果は図 6及び 7に示されている。
【０１７７】6.f)組換え体リシン Aのウエスタンブロッ
テイング(western transfer)及び免疫検出(immunodetec
tion) SDS-ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色
することによって当初に観察される組換え体リシン Aプ
ロテインの信頼性(authenticity)を、ウエスタンブロッ
テイングにより確認した。プロテインバンド(protein b
and)をニトロセルロースフィルターに移し、ついでリシ
ン A特異的抗体およびついでペルオキシダーゼ標識抗グ
ロブリン(peroxidase labelled antigulobulin) を使用
して検出した。
【０１７８】15% SDS-PAGEゲルを一夜 8mAで操作しつい
で少なくとも30分間トランスファー緩衝液(transfer bu
ffer) 中で平衡化した。
【０１７９】ついで、ゲル上のプロテインバンドをビオ
−ラド トランス ブロット装置(Bio-Rad Trans Blot
apparatus)中で、70V で 3時間、電気泳動的にニトロセ
ルロース膜(Hybond-C,Amersham) に移行させた。フィル
ターは、乾燥後、密閉したプラスチック袋内に-20 ℃で
貯蔵することができた。
【０１８０】リシン A.1はリシン Aの合成ペプチドフラ
グメントに対してウサギ中で生ずるポリクロナール抗体
である。予備的試験においてはリシン Aに対して良好な
親和性を有するが、E.Coliプロテインとのかなりの交差
反応性を有することが示された。この交差反応性によっ
て生ずる重大な問題を解決するために、この抗体をE.Co
liライゼートと共にプレ−インキュベート(pre-incubat
e)した。
【０１８１】即ち、L-ブロス内で一夜培養したE.Coli株
DS410 10ml を4000rpm で10分間遠心分離して細胞をペ
レット化した。このペレットを 5mlの細菌緩衝液(bacte
rialbuffer)に再懸濁させついで氷上での30秒間の冷却
を行いながら、4 〜6 μで10秒間の超音波処理(sonicat
e)を6 回行った。
【０１８２】ついで 0.5mlの超音波処理液(sonicate)を
0.5ml のリシン A.1抗血清と混合し、室温で 90 分間イ
ンキュベートした。細胞破壊物 (cell debris)を1300rp
m で5分間遠心分離し、上澄液を-20 ℃で貯蔵した。
【０１８３】ウエスタンブロッテイングからのニトロセ
ルロースフィルターを 5% BSA-PBS/ツイーン(tween) 中
で室温で一夜インクベーションすることによりブロック
した。( PBS/ツイーン＝PBS 1 リッター当り、ツイーン
5ml) 。
【０１８４】PBS/ツイーン中で、3 回、各々、3 分間洗
浄した。
【０１８５】" ブロックされた" リシン A.1抗体を、0.
5% BSA-PBS/ ツイーンにより1/4000にした稀釈物と共に
2時間（又は一夜）インキュベートした。
【０１８６】" ブロックされた" リシン A.1抗体を0.5%
BSA-PBS/ ツイーンにより稀釈した。PBS/ツイーン中
で、3 回、各々、3 分間洗浄した。
【０１８７】ヤギ抗ウサギ血清(goat anti rabbit seru
m)を、0.5% BSA-PBS/ ツイーンにより1/1000に稀釈した
稀釈物と共に室温で 1時間，インキュベートした。
【０１８８】PBS/ツイーン中で、3 回、各々、3 分間洗
浄した。
【０１８９】ウサギペルオキシダーゼ 抗ペルオキシダ
ーゼ血清を、0.5% BSA-PBS/ ツイーンにより 1/5000 に
稀釈した稀釈物と共に室温で 1時間、インキュベートし
た。PBS/ツイーン中で、3 回、各々、3 分間洗浄した。
【０１９０】4-クロルナフトール(60mg)のメタノール20
ml中の溶液をPBS で 120mlにしたかつ12μl の過酸化水
素を含有する溶液に浸漬して展開(develop) させた。バ
ンドが見えるようになった直後に膜を取出し、乾燥しつ
いで写真を撮影した。
【０１９１】典型的なウェスタン・ブロット分析を図８
に示す。
【０１９２】6.g)組換え(recombinant) リシンＡ蛋白質
の生物学的検定 この目的は、無細胞(cell-free) 試験管内蛋白質合成の
検定における生物学的活性についてr-リシンＡを試験す
る実験系を確立することであった。
【０１９３】ウサギの網状赤血球溶解物(lysates) を、
Allen とSchweet の方法〔J. Biol.Chem.,237,760-767
(1962)〕に従って調製した。この検定は、無細胞系にお
ける蛋白質合成阻害を、新たに合成された蛋白質中に14
Ｃ- 標識したロイシンの取り込みがないことにより例証
するものである。
【０１９４】6.g.i)検定方法 貯蔵溶液：ロイシン以外のアミノ酸混合１mM ロイシン以外の全てのL-アミノ酸1mM を含有する溶液
（NaOHを用いてpH7.4 に調整し、−70℃で保存した） 溶液Ａ：酢酸マグネシウム40mM；酢酸アンモニウム２M
；トリス(Tris)緩衝液0.2M(HClでpH7.4 に調整し、４
℃で保存した） 溶液Ｂ：ATP(Sigma A5394) 246mg/ml; GTP(Sigma G875
2) 24.4mg/ml 検定混合物：アミノ酸混合物１ml；溶液Ａ 1 ml ；溶液
Ｂ 0.1ml；燐酸クレアチン 103mg；クレアチンキナーゼ
１mg；水 510μリットル；L-14C-ロイシン(NewEngland
Nuclear、NEC-279E) 600μリットル（60μCi) 反応混合物；供試試料25μリットル；検定混合物12.5μ
リットル；ウサギ網状赤血球溶解物25μリットル ブランク(blank) 溶液はPBS に溶解したBSA 2mg/mlであ
った。
【０１９５】検定は全て二重反復して(in duplicate)行
った。検定混合物12.5μリットルを滅菌ガラス管にい
れ、その最初のガラス管４本それぞれにはブランク用と
してPBS に溶解したBSA 25μリットルを加え、残りのガ
ラス管には供試試料25μリットルを加え、その最初のガ
ラス管２本に0.1M KOH1mlを加えた（バックグランド・
ブランク）。これらのガラス管を水浴中で28℃に平衡化
し、各々のガラス管にウサギ網状赤血球溶解物（液体窒
素温度からそのままにして溶かしたもの）25μリットル
を20秒間隔で加えた。その最初のガラス管１本を12分間
インキュベートした際に、各ガラス管に0.1M KOH 1mlを
再度20秒間隔で加えてガラス管全部をそのまま12分間イ
ンキュベートした。各ガラス管に20％過酸化水素２滴を
加え、次いで20％TCA １mlを加えた。これらのガラス管
を混合し、次いで４℃で少なくとも１時間又は１夜放置
しておいた。得られた沈殿物を2.5cm GFC(ゲル濾過クロ
マトグラフィー）ディスク(disc)上で濾過し、５％TCA
４mlで３回洗浄し、シンチレーション用バイアル管(via
l)に移し、次いでシンチラント(scintillant)(Ready-So
lv.MP 、Beckman 製）10mlを加えた。１時間後に、上記
バイアル管を振盪し、シンチレーションを数えた。
【０１９６】6.g.ii) 大腸菌溶解物と共に使用する方法
の確立 10ml L- ブロス培養菌液(culture) を、37℃で１夜増殖
させた。その部分試料(aliquot) 400 μリットルを1300
0rpmで30秒間ペレット化し、上清の大部分を廃棄した。
【０１９７】得られたペレットを、ドライアイス／エタ
ノール中で急速凍結し次いで37℃で溶解させ、このサイ
クルをもう一度繰り返した。トリスHCl 緩衝液(pH8.0)
50mMに溶解した25％蔗糖液12μリットルを加え、次いで
リゾチームの10mg/ml 溶液４μリットルを加えた。
【０１９８】氷上で15分間インキュベートした後に、0.
25M EDTA 8μリットルを加え、インキュベーションを15
分間続けた。該試料を水で 400μリットルまで希釈する
ことにより、溶菌を浸透的に(osmotically) 生じさせ
た。この操作により１ml当たりの80〜100 個の生存細胞
数が得られた。
【０１９９】この溶菌液の部分試料25μリットルを前記
の検定用反応混合物に加えた場合には、新たに合成され
た蛋白質中に取り込まれた14C-ロイシンの量(level)
は、溶菌液が存在しない場合の上記ブランクの10％以上
であった。これはリシンＡ 8ng/ml により生成されたも
のと同様の合成阻害(inhibition)のレベルであった。次
いで、大腸菌溶菌液の希釈液を調製し、検定を反復し
た。得られた結果により、該大腸菌溶菌液の効果を、上
記ブランクの同等の効果まで低下させるには最少限度16
倍希釈が必要であることが明確に示された。
【０２００】大腸菌の溶菌及び大腸菌溶菌液がリシンＡ
の毒性を低下させない(not compromise)ことをできる限
り確信することを目的として、２つの対照検定を行っ
た。最初の検定は、細胞溶解後の検定混合物において8n
g/mlの最終濃度が得られるように、16倍希釈した大腸菌
ペレットに植物由来のリシンＡを加えた。これらの両方
の対照試験(controls)により、リシンＡの阻害作用に対
して溶菌液又は溶菌操作により悪い影響を受けないこと
が明らかにされた。
【０２０１】これらの方法を使用してプラスミドpICI 1
102 及び後記のクローンからの生物学的に活性な組換え
リシンＡの合成を実証した。
【０２０２】6.h) DNA配列分析 プラスミドDNA 配列決定法を使用してプラスミドpICI 1
102 を分析した。選択した方法はZagurskyらの方法(Gen
e Analysis Techniques,Vol.2,No.5) を改変したもので
あり、二本鎖プラスミドDNA をアルカリ変成し、その後
に標準的方法例えばいくつかの供給者からキット(kit)
の形態で提供されている方法例えばSequenase(United S
tates Bioscience製）によりアニリーニングを開始さ
せ、次いで配列決定することを伴うものである。オリゴ
ヌクレチドを使用してβ- ラクタマーゼ(lactamase) 及
びいくつかのＡ- 鎖内部プライマーの３´末端で開始さ
せることにより、プロモーター及びリシンＡ遺伝子の両
方の鎖の配列決定が可能であった。
【０２０３】最初の配列決定データにより、付加的 Kpn
Ｉ断片がプロモーターとリシンＡコード配列、すなわち
下記の配列（配列番号20）： との間に存在するという予期しない結果を示された。
【０２０４】付加的 KpnＩ断片は、M13K19RAから生じて
おり、しかも制限酵素部位とプラスミドpUC8RAからクロ
ーン化されたリシン・リーダー配列の部分とを含む。リ
シンＡ鎖の５´領域は突然変異誘発中に誘導された塩基
変化を含む。
【０２０５】この配列についての研究により、最初の翻
訳開始コドン(ATG) は、リシンＡコドン領域をもつ枠の
範囲外である(out of frame with that the ricin A co
dingregion)。また、リシンＡ翻訳開始コドンと、２番
目のATG から翻訳を再開できるシャイン・ダルガノ配列
(AGGA)と考えられる配列との前に、枠内終始コドン(TA
G) が存在する。
【０２０６】次後の(subsequent)研究により、意外にも
この付加的DNA 断片が、該断片が切除されているクロー
ンと比較した場合に、大腸菌中のリシンＡ鎖の蓄積の量
(level) について有益な利点を与えることが明らかにさ
れた。
【０２０７】プラスミドpICI 1102 中に含まれているリ
シンＡの完全なDNA 配列を図９と図10とにわたって一つ
の配列（配列番号18）として示す。
【０２０８】7. 次後のリシンＡ発現クローンの生成 7.a)サブクローニングを可能にするリシンＡクローンpI
CI 1102 の突然変異 リシンＡの発現に関する正しい配向(orientation) をも
って偶然に生成したプラスミドpICI 1102 から、前記の
２個の KpnＩ断片をサブクローン化することは困難であ
る。従って、本発明者らは、配列内の KpnＩ認識部位
を、１個の塩基を置換する（ＡをＴに）ことにより改変
することを意図した。この改変により、この部位での K
pnＩによる切断が防がれ、しかも１個の KpnＩ断片をpI
CI発現ベクターの領域中にサブクローニングすることが
可能になる。上記の KpnＩ認識部位のアデニン（ＧＧＴ
ＡＣＣ）をチミンで置換する（すなわちＧＧＴＴＣＣ
に）ことにより、リシンＡの第１の残基(redisue) は改
変されない（ＧＴＡ／ＧＴＴ＝Ｖａｌ）。
【０２０９】すなわち、下記の配列： を下記の配列： に改変した。
【０２１０】この変化を生じさせるために合成したオリ
ゴヌクレオチドは下記の配列〔配列番号(SEQ. ID. NO.)
19〕 を有する。上記配列中の下線を付した塩基は突然変異(m
utational)変化を表わす。
【０２１１】本発明者らは、上記の突然変異させたリシ
ンＡ断片を発現の比較研究を目的としてtrp 発現ベクタ
ーの領域中にクローン化することを意図した。プラスミ
ドpICI 0020 中にクローン化することによって、プラス
ミドpICI 1102 と比較して、もしあるならば上記の１個
の塩基置換による発現に対する影響を決定することがで
きる。
【０２１２】7.b)突然変異誘発 突然変異誘発用の鋳型はMRA 16であり、これはプラスミ
ドpICI 1102 中に存在する２個の KpnＩ断片を含有する
Ｍ13クローンである。突然変異誘発後に、所望の突然変
異を保持している分離体(isolates)を、無作為標本抽出
し（ランダムサンプリング）し、突然変異原性オリゴヌ
クレオチドが特異的に結合する領域についてDNA 配列を
決定することにより同定した。
【０２１３】突然変異させた鋳型をMRA 22と命名した。
これを、さらにリシンＡコード配列(coding sequence)
全体のDNA 配列を決定することにより分析して、非特異
的な突然変異が存在しないことが正しいことを確認し
た。
【０２１４】7.c)サブクローニング 突然変異させた複数個の一本鎖DNA をコンピテント大腸
菌TG１細胞中に形質転換させて単一の(single)プラーク
を生成させた。次いで、個々のプラークを選び取り、複
製型（RFという, 二本鎖)DNAを塩化セシウム／エチジウ
ムブロミド浮遊密度勾配法でバンドを作らせること(ban
ding) により精製した。精製したRF DNAを制限酵素 Kpn
Ｉで完全に消化した。クローニングは、消化したRF DNA
と、 KpnＩ切断しホスファターゼ化した(phosphatased)
適当な発現ベクターとの“ショットガン(shotgun) ”連
結反応によるか、又はアガロースゲルから精製した後の
リシンＡ断片の特異的連結反応により達成された。連結
したDNA を大腸菌TG 1又はHB 101中に形質転換させた。
【０２１５】リシンＡ含有クローン類を、別のリシンＡ
含有クローン(pICI 1121) から単離した１個の KpnＩ断
片をランダム・ヘキサヌクレオチドプライミング（prim
ing)することによって生成させた32Ｐ標識リシンＡプロ
ーブを使用してハイブリダイゼーションスクリーニング
により同定した。陽性のハイブリッド形成を示すコロニ
ーを、制限酵素 KpnＩ単一消化と、制限酵素EcoRＩ／Bg
l IIによる二重消化とを使用してプラスミドDNA を制限
分析することによってさらに選別した。挿入された断片
の大きさ(size)は KpnＩにより同定され、断片の配向(o
rientation) はEcoRＩ／Bgl IIにより決定される。
【０２１６】発現に関する正しい配向をもったリシンＡ
断片を有することが確認された複数のクローンを、SDS-
PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム- ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動）により分析し、次いで二重反復(duplicat
e）ゲルのクーマシー染色及びウェスタン・ブロッティ
ングにより分析した。これらのクローン類のリシンＡ蓄
積の量(level）は、プラスミドpICI 1102 から検出され
た量に相当する。
【０２１７】１つの分離体(isolate）を選別し、このプ
ラスミドをpICI 1131 と命名した。
【０２１８】7.d)別の転写ターミネーター要素の使用 転写ターミネーター要素(element) は、RNA ポリメラー
ゼ活性を停止させるのに関連する(involve in halting)
mRNAの３´末端において二次構造を生成する。この二次
構造の安定性は、mRNAを３´末端におけるエキソヌクレ
アーゼの攻撃から保護することにより蛋白質の蓄積を改
善できる。Ｔ4 転写ターミネーターは、先のリシンＡ組
立て体の全てに存在する trpアテニュエーター(attenua
tor)の構造よりも強い二次構造をもつと考えられる。
【０２１９】これらの実験においては、プラスミドpICI
1131 から trpプロモーターとリシンＡ断片とを、制限
酵素EcoRＩと SalＩとで消化することにより切り取った
(excised) 。制限酵素 SalＩは、リシンＡコード配列の
３´末端とtrp A 転写ターミネーターとの間を切断す
る。得られた断片を、アガロースゲル（2% NuSieve GTG
Agarose、FMC Bioproducts 製）から切り取り、フェノ
ール抽出し、次いでクロロホルム抽出し、その後にエタ
ノール沈殿させることにより精製した。精製した断片
を、制限酵素EcoRＩと SalＩとを用いて切断したプラス
ミドpICI 1079 に連結した。このプラスミドpICI 1079
は、唯一の SalＩ認識部位と SphＩ認識部位との間にＴ
4 転写ターミネーターを含む（5.c 参照）。
【０２２０】連結したDNA をコンピテント大腸菌HB 101
(BRL) 中に形質転換し、先の実験におけるようにハイブ
リダイゼーションスクリーニングを使用してリシンＡの
存在を検出した。陽性のハイブリッドを形成する(posit
ively hybridising)クローンを、プラスミドDNA の調
製、次後の適当な大きさに分けた断片の存在を明らかに
するために制限酵素EcoRＩとSal Ｉとを一緒に用いる制
限分析用に選択した。
【０２２１】正しい組み立て(construction)をもつ１つ
の分離体を同定し、プラスミドpICI1185 と命名した。
【０２２２】7.e)別のプラスミド・バックグランド(bac
kground)の使用 プラスミドpICI 1185 を使用して、発現カセットをプラ
スミドpICI 0042 中にサブクローニングすることによ
り、別の組立て体を生成させた。プラスミドDNAをプラ
スミドpICI 1185 から調製し、制限酵素EcoRＩと SalＩ
とを一緒に用いて消化して trpプロモーター／RBS 1 ／
リシンＡ(MRA 22)断片／Ｔ4 ターミネーターを含む発現
カセットを切り取った。この断片を4.d に概説した方法
で単離し、EcoRＩと SphＩとを用いて切断したプラスミ
ドpICI 0042 に連結した。
【０２２３】連結したDNA をコンピテント大腸菌HB 101
中に形質転換し、37℃で１夜インキュベートした。HB 1
01形質転換体を、テトラサイクリンを加えたＬ寒天上に
置いて、32Ｐ標識したリシンＡ DNAプローブを用いてハ
イブリダイゼーションすることによりコロニーを選別し
た。
【０２２４】上記両方の場合において、陽性と同定され
たコロニーを、制限酵素EcoRＩ／SphＩ消化と制限酵素E
coRＩ／Bgl II消化とを使用してプラスミドDNA を制限
分析することにより確認した。
【０２２５】図11にプラスミドpICI 1185 とpICI 1187
の組み立てを概説する。
【０２２６】7.f)クローンの選別 単離した上記の複数のプラスミドを大腸菌71.18 〔Gron
enborn, B.の論文；「Mol. Gen. Genet.」,148,243-259
(1976)〕中に形質転換し、単一のコロニーをクローン選
別研究用に選び取った。得られた細胞溶解液全部を二重
反復(duplicate)SDS-PAGE ゲル上で電気泳動させ、その
うちの１枚をクーマシー・ブルーで染色し、他の１枚を
ウェスタン・ブロット分析に使用した。
【０２２７】染色したゲルにより、大腸菌71.18 から一
緒に移入する(co-migrating)蛋白質の存在に基づいて(d
ue to)リシンＡ発現に関する最小限度のデータが得られ
た。ウェスタン・ブロッティングにより、陽性対照試料
及び陰性対照試料との比較においてリシンＡの発現が明
確に示された。１つの単離体を方法スケールアップ用の
発酵研究群に提供した。
【０２２８】r-リシンＡ発酵 (a) プラスミドpICI 1187 を大腸菌株DS410(本明細書で
はMSD68 ともいう）中に形質転換し、次いで得られた組
換え体(MSD 1051)を精製し、−80℃でグリセロール貯蔵
庫(stocks)に保存した。
【０２２９】培養液の部分試料を貯蔵物から取り出し、
L-テトラサイクリンの寒天板上に画線し、37℃で１夜増
殖させた後に単一のコロニーを分離した。組換え体MSD
1051の単一コロニーを取り出し、L-テトラサイクリン・
ブロス10mlに再懸濁し、直ちにその100 μリットルを、
L-テトラサイクリン・ブロス75mlを入れた 250mlエルレ
ンマイヤーフラスコ10個の各々に接種した。往復振盪機
上で37℃で16時間増殖させた後に、各フラスコの内容物
をプールし、これを使用して、下記の組成をもつ改良(m
odified)LCM 50増殖培地20リットルを入れた発酵槽に接
種した。
【０２３０】改良LCM 50増殖培地の組成は次の通りであ
る。 成 分 蒸留水１リットル当たりのｇ数(g/l) KH２PO4 ３．０ Na２ＨPO4 ６．０ NaCl ０．５ カゼイン加水分解物(Oxoid L41) ２．０ （NH４）２SO4 １０．００ 酵母エキス(Difco社製） ２０．００ グリセロール ３５．００ MgSO4 ・7H２O ０．５ CaCl2 ・2H２O ０．０３ チアミン ０．００８ FeSO4 ／クエン酸 ０．０４／０．０２ 微量元素溶液(TES) ０．５mlｅ-1
【０２３１】次いで、発酵を温度37℃、pH6.7(6M 水酸
化ナトリウム溶液を自動添加することにより調整した）
で行った。溶存酸素電圧(tension)(dOT)設定値は、50％
空気飽和であり、発酵槽攪拌速度を自動調整することに
より制御した。発酵槽への通気量は、最初は20リットル
／分〔１分当たりの容量当たり１容量(VVM) に相当す
る〕であり、発酵槽攪拌速度がその最大値の80〜90％に
近くなった時に該通気量を45リットル／分に増加させ
た。
【０２３２】発酵中は、光学濃度（OD550 ）、細胞乾燥
重量及び細胞中のリシンＡの蓄積量の測定用として試料
を採取した。リシンＡの蓄積量は、当業者に周知である
ように、試料採取した細菌の細胞溶解物全部のクーマシ
ー・ブルー染色したSDS-PAGEゲルを走査する(scanning)
ことにより測定した。
【０２３３】接種後4.5 時間から、発酵槽に酵母エキス
(Difco社製）溶液(225g/リットル)を1.7g／リットル／
時間の量でポンプで供給した。
【０２３４】12時間後すなわちOD550 値が約50に達した
後で、しかも発酵が酸素がわずかになる(become oxygen
-limited) 前に、細菌をSorval RC3B 遠心分離機（7000
g 、30分、４゜）で収穫し、次いで該細菌から蓄積した
蛋白質を回収した。
【０２３５】(b) プラスミドpICI 1187 を大腸菌株DS41
0(本明細書ではMSD68 ともいう）中に形質転換し、次い
で得られた組換え体(MSD 1051)を精製し、−80℃でグリ
セロール貯蔵庫上で保存した。
【０２３６】培養液の部分試料(100μリットル）を取り
出し、直ちにL-テトラサイクリン・ブロス 600mlを入れ
た２リットル容エルレンマイヤーフラスコに接種した。
往復振盪機で37℃で16時間増殖させた後に、各フラスコ
の内容物を使用して下記の組成をもつ増殖培地を入れた
発酵槽に接種した。
【０２３７】増殖培地の組成は次の通りである。 成 分 蒸留水１リットル当たりのｇ数(g/l) KH２PO4 ３．０ Na２ＨPO4 ６．０ NaCl ０．５ カゼイン加水分解物(Oxoid L41) ２．０ （NH４）２SO4 １０．００ 酵母エキス(Difco社製） ２０．００ グリセロール ３５．００ MgSO4 ・7H２O ０．５ CaCl2 ・2H２O ０．０３ チアミン ０．００８ FeSO4 ／クエン酸 ０．０４／０．０２ 微量元素溶液(TES) （０．５ml l-1） テトラサイクリン （１０mg l-1）
【０２３８】発酵は温度37℃で行った。pHが接種後10時
間まではpH6.7 に、その後はpH6.0に制御されるように2
M 硫酸と 6M 水酸化ナトリウム溶液を自動添加するこ
とにより、pHを制御した。
【０２３９】溶存酸素電圧(dOT) 設定値は、50％空気飽
和であり、最初は発酵槽攪拌速度を自動調整することに
より制御した。発酵槽への通気量は最初は、20リットル
／分〔１分当たりの容量当たり１容量(VVM) に相当す
る〕であり、これを発酵槽攪拌速度がその最大値（１分
当たり1000回転）に達した時に手動で45リットル／分に
増加させた。発酵槽への通気量は、発酵の終りの段階(t
he later stages)近くに攪拌速度が１分当たり約500 回
転まで自動的に低下してしまった時には、手動で20リッ
トル／分に戻した。発酵を23時間行いその間中、光学濃
度（OD550 ）、細胞乾燥重量並びに細胞中のリシンＡの
蓄積量及び割合(partitioning)について測定するために
試料を採取した。リシンＡの蓄積量は、当業者に周知の
ようにして試料採取した細菌の細胞溶解物全部のクーマ
シー・ブルー染色したSDS-PAGEゲルを走査することによ
り測定した。細胞の細胞質体（可溶性）画分及び封入体
（不溶性）画分におけるリシンＡの割合(partitioning)
は、当業者に周知のようにして試料採取した細菌を超音
波処理溶解に供することにより測定した。
【０２４０】接種後4.5 時間から、発酵槽に酵母エキス
溶液(225g/リットル) を1.7g／リットル／時間の量でポ
ンプ供給した。
【０２４１】発酵において炭素源が消費された（すなわ
ちdOT 値が50％空気飽和から急速な上昇をもたらす）場
合には、グリセロール(714g/リットル) と硫酸アンモニ
ウム(143g/リットル) を含有する供給材料を、細菌の最
大炭素要求量を満たすのに十分な量で発酵槽にポンプ供
給した。次いで、炭素源及び硫酸アンモニウムの供給速
度は、その後の発酵(the rest of fermentation)の間は
変化させないでそのままにしておいた。
【０２４２】23時間後に、発酵により発酵ブロス 1リッ
トル当たり可溶性リシンＡ約1500mgが得られた。
【０２４３】注：１．大腸菌DS410(本明細書ではMSD68
ともいう）は周知である〔DouganとSherrattの論文「Mo
lecular and Genaral Genetics」,151,151-160(197
7)〕。この菌株は、公的に自由に入手でき、さらに本出
願人により1985年６月７日付けでブダペスト条約のもと
にスコットランド、アバディーン(Aberdeen)のザ・ナシ
ョナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・ア
ンド・マリン・バクテリア・リミテッド(the National
Collections of Industrial & Marine Bacteria Ltd)に
寄託番号12100 として寄託されてある。
【０２４４】注２．微量元素溶液(TES) TES は下記の組成をもつ。 成 分 mg/10ml(脱イオン水） AlCl3 ・6H２O ２．０ CoCl2 ・6H２O ０．８ KCr(SO4 ）2 ・ 12H２O ０．２ CuCl2 ・2H２O ０．２ H３BO3 ０．１ KI ２．０ MnSO4 ・ H２O ２．０ NiSO4 ・6H２O ０．０９ Na２MoＯ４・2H２O ０．４ ZnSO4 ・7H２O ０．４
【０２４５】大腸菌からのr-リシンＡの精製 最適培養条件下では、r-リシンＡは可溶性の細胞質蛋白
質として蓄積する。この蛋白質は、r-リシンＡの安定性
を助長する緩衝液中で細胞を破壊する（ホモジナイゼー
ション）ことによって回収される。この単一操作は、生
成物の溶液安定性を確実にするために収穫時の生細胞に
ついて行われる。r-リシンＡは、ホモジネートから固形
物（細胞砕片）を遠心分離により除去することによって
回収される。この操作をスケールアップするために、抽
出物中に存在する核酸の塊(bulk)をも沈殿させる薬剤
〔ポリテン(polythene) イミン〕を用いて、細胞砕片を
凝集させた。次いで遠心分離上清を滅菌濾過し、十字流
(cross flow)濾過により濃縮し、硫酸アンモニウムを用
いて蛋白質を沈殿させた。硫酸アンモニウム沈殿物を−
70℃で冷凍保存した。
【０２４６】r-リシンＡは、多くの他の大腸菌蛋白質の
等電点よりも十分に高い7.3 の等電点をもつ。従って、
生成物はイオン交換クロマトグラフィーにより都合よく
精製し得る。回収工程及びクロマトグラフィー工程の全
ては、r-リシンＡ安定性を助長する条件下：すなわち温
度＜15℃、還元状態で遊離のチオールを保持するための
ジチオトレイトールと、空気酸化及び蛋白質分解を低減
させるためのEDTAとの存在下で行った。
【０２４７】r-リシンＡの回収 連続的にディスクを積み重ねた間欠吐出式分離機(conti
nuous disc stack intermittent discharge separator)
を使用して発酵ブロスから細胞を回収した。このブロス
(25 リットル発酵を２回行うことにより得た50リット
ル）を最初に発酵槽から50リットル容トランドル(trund
le) タンクに移し、分離機及び高圧ホモジナイザーに連
結された多数の保持(holding) タンクからなる収容系
（containedsystem) に移送した。この収容系にトラン
ドルタンクを連結し、上記ブロスを40リットル／時間の
流量で遠心分離機にポンプで通送した。吐出速度は、上
清吐出管(line)における覗きガラス(an eyeglass) の目
視検査により遠心分離上清が透明であるように調整し
た。遠心分離機からの固体排出物（細胞類）を適当な容
器に集め、緩衝液Ａら〔オルト燐酸二水素ナトリウム50
mM；エチレンジアミン四酢酸25mM；ベンズアミジン５m
M；ジチオトレイトール２mM；pH6.3(５N 水酸化ナトリ
ウムによる）〕 40 リットル中に再懸濁し、次いで固体
受器中で８℃まで予備冷却した。次いで、懸濁した細胞
を作動圧 600バールに調整されたホモジナイザーを経由
してトランドルタンクに戻した。得られたホモジネート
（60リットル）を＜20℃に冷却し、次いでポリテンイミ
ンについて10％（容量／容量）溶液 2.5リットルを添加
することにより0.5 ％濃度に調整した。この懸濁液をそ
のまま10分間凝集させた後に、遠心分離機を経由させて
保持タンクに移送した。次いで、透明な上清を集め、厚
い濾紙(depth filter)及び正に荷電した 0.2μの濾過膜
を通して精製することにより滅菌した。
【０２４８】硫安沈殿 滅菌清澄化した上清をスパイラルカートリッジ式(spira
l cartridge)十字流濾過装置を使用して容量12リットル
まで濃縮し、得られた溶液を固体硫酸アンモニウムの結
晶2.9kg を加えることにより40％飽和にした。この溶液
を、15℃で１夜穏やかに攪拌することにより凝集させ、
次いで遠心分離した。放出されたスラリーを集め、他の
操作に必要とするまで−70℃で保存した。
【０２４９】再可溶化及び脱塩 上記の硫安沈殿物を緩衝液Ｂ〔オルト燐酸二水素ナトリ
ウム50mM；エチレンジアミン四酢酸25mM；ジチオトレイ
トール２mM；pH6.3(５N 水酸化ナトリウムで調整し
た）〕14リットルの存在下で溶解させた。30分後に、得
られた懸濁物を遠心分離することにより清澄化し、緩衝
液Ｂ 70 リットルに対してダイアフィルトレーション(d
iafiltration) により脱塩し、その導電率を導電率が３
mS/cm まで低下していることを調べて確認した。脱塩し
た溶液を遠心分離によりさらに清澄化し、直ちに加工処
理した（processed)。
【０２５０】陰イオン交換クロマトグラフィー 上記の脱塩溶液を、緩衝液Ｂ 60 リットルで予め平衡化
させてあるDEAE- セルロース２kgを入れたバッチ（batc
h ）クロマトグラフィータンクに、徐々に加えた。6.5
時間攪拌した後に、未結合r-リシンＡを上記タンクの底
から、DEAE- セルロースを充填し平衡化したカラム（直
径11.3cm×10cm）に80ml／分の流量でポンプ供給した。
r-リシンＡの本体〔バルク(bulk)ともいう〕は結合せ
ず、ステンレススチール製容器に集められた。
【０２５１】陽イオン交換クロマトグラフィー 得られたr-リシンＡ溶液を１M オルト燐酸を用いてpH5.
5 に調整し、緩衝液Ｃ〔オルト燐酸二水素ナトリウム25
mM；エチレンジアミン四酢酸５mM；ジチオトレイトール
２mM；pH5.5(５N 水酸化ナトリウムで調整した）〕 10
リットルで平衡化したカルボキシメチルアガロースのカ
ラム（直径10cm×10cm）に供給した。このカラムに結合
したr-リシンＡを、緩衝液Ｃ 10 リットルで洗浄した後
に、緩衝液Ｄ〔オルト燐酸二水素ナトリウム25mM；エチ
レンジアミン四酢酸５mM；ジチオトレイトール２mM；塩
化ナトリウム100mM ；pH5.5(５N 水酸化ナトリウムで調
整した）〕で溶出した。単一ピークとして溶離された純
粋なr-リシンＡを採取し、他の操作に必要とするまで凍
結滅菌溶液として−70℃で保存した。r-リシンＡはこれ
らの条件下では最大１年間は安定である。
【０２５２】使用した装置は下記の通りである。 陰イオン交換体：DE-52 、DEAE- セルロース（Whatman
Biochemicals製） 陽イオン交換体：CM／セファロース（Pharmacia 製） 遠心分離機：Westphalia CSA-1ディスクスタック(disc
stack)遠心分離機(Westphalia 製） ホモジナイザー：APV-Schorder Lab 60/60ホモジナイザ
ー(APV製） 濾過機：AMI 0057P Depth 濾過機、ABI NFZP-posidyne
濾過膜（Pall製） 回分処理タンク：701 Pharmacia Batch Chromatography
Tank(Pharmacia 製） DE- カラム：Bioprocess 113（Pharmacia 製） DM- カラム：K100/50 (Pharmacia製）
【０２５３】C242抗体及び免疫毒素の生物学的性質 結腸直腸癌及び正常組織におけるC242(C242.II) 抗体の
免疫組織化学的評価 初期の結腸−直腸癌腫(colo-rectal carcinoma) 及び種
々の正常組織からの試料を、外科摘出手術を受けた患者
から得た。得られた組織を氷の上で保管し、摘出後１時
間以内に、液体窒素で予備冷却したイソペンテン中で凍
結させた。この組織を切片化するまで−70℃で保存し
た。凍結させた生検試料(biopsies)を５μｍの切片に切
断し、50％アセトン中で＋４℃で30秒間固定し、次いで
100 ％アセトン中で＋４℃で５分間固定した。得られた
切片を風乾し、次いでPBS 中で10分間洗浄した(rinse
d)。次いで、切片全部を、PBS に溶解した 0.3％過酸化
水素中で５分間インキュベートして内因性ペルオキシダ
ーゼを遮断し、PBS 中で２回洗浄した。その後に、得ら
れた切片を標準ブタ(swine）血清で処理し、次いでPBS-
４％BSA(ウシ血清アルブミン）中に＋４℃で５分間1:10
希釈して抗体の非特異的結合を遮断した。
【０２５４】抗体とのインキュベーションは全て湿潤雰
囲気中で室温で30分間行った。得られた切片を先ずPBS-
４％BSA 中で、前記実施例１で得たモノクロナール抗体
C242(C242:II) と共にインキュベートし、その後に２％
ブタ抗ウサギ免疫グロブリンC242抗体及び免疫毒素の生物学的性質 結腸直腸癌及び正常組織におけるC242(C242.II) 抗体の
免疫組織化学的評価 初期の結腸−直腸癌腫(colo-rectal carcinoma) 及び種
々の正常組織からの試料を、外科摘出手術を受けた患者
から得た。得られた組織を氷の上で保管し、摘出後１時
間以内に、液体窒素で予備冷却したイソペンテン中で凍
結させた。この組織を切片化するまで−70℃で保存し
た。凍結させた生検試料(biopsies)を５μｍの切片に切
断し、50％アセトン中で＋４℃で30秒間固定し、次いで
100 ％アセトン中で＋４℃で５分間固定した。得られた
切片を風乾し、次いでPBS 中で10分間洗浄した(rinse
d)。次いで、切片全部を、PBS に溶解した 0.3％過酸化
水素中で５分間インキュベートして内因性ペルオキシダ
ーゼを遮断し、PBS 中で２回洗浄した。その後に、得ら
れた切片を標準ブタ(swine）血清で処理し、次いでPBS-
４％BSA(ウシ血清アルブミン）中に＋４℃で５分間1:10
希釈して抗体の非特異的結合を遮断した。
【０２５５】抗体とのインキュベーションは全て湿潤雰
囲気中で室温で30分間行った。得られた切片を先ずPBS-
４％BSA 中で、前記実施例１で得たモノクロナール抗体
C242(C242:II) と共にインキュベートし、その後に２％
ブタ抗ウサギ免疫グロブリンを用いてPBS-４％BSA 中に
1 : 400 に希釈したビオチニル化(biotinylated)ウマ抗
マウスIgG 〔Vectastain（商標）、Vector Laboratorie
s(米国カリフォルニア州バーリンゲーム所在）製〕と共
にインキュベートし、最後にAvidin DH/ビオチニル化セ
イヨウワサビペルオキシダーゼＨ複合体〔Dakopatts A/
S(デンマーク国コペンハーゲン所在の会社）製〕と共に
インキュベートした。各インキュベーションの後に、ス
ライド(slides)をPBS 中で15分間洗浄した。次いで、切
片を15分間基質で処理し、PBS 中で洗浄し、ヘマトキシ
リンを用いて対比染色し、その後にグリセロールゼラチ
ン〔Merck(ドイツ国Darmstadt 所在の会社）製〕を用い
て固定した。使用した基質は、ジメチルスルホキシド６
mlに溶解し、30％Ｈ２Ｏ2４μリットルを含有する0.02M
酢酸ナトリウム(pH5.5) 50mlで希釈した3-アミノ-9-
エチルカルバゾール〔Sigma(米国ミズリー州セントルイ
ス所在の会社）製〕10mgであった。基質溶液は濾過して
から使用した。次いで、各切片を調べ、得られた結果を
下記の表１に示す。
【０２５６】 表１ 抗体C242:II による結腸−直腸腫瘍及び種々の正常組織の染色 組織 染色された数／試料総数 結腸−直腸癌腫 ２６／４１ 正常な結腸 ８／１６ 乳腺 ２／３ 耳下腺 ２／２ 皮膚 ０／１ 汗腺が僅かに染色されている 肝臓 ０／２ 胆管が弱く染色されている 腎臓 ０／１ 膵臓 ２／２ 膵管 胃 ０／１ 小腸 ０／１
【０２５７】表１から明らかなように、調べた結腸−直
腸腫瘍から得た生検試料うちの60％は、モノクロナール
抗体C242:II で正の染色を示した。正常な結腸組織にお
ける抗原CA242 の発現は、腫瘍組織よりも一般的に弱い
ことが認められ、染色は円柱上皮及び杯状細胞に完全に
限定される。非結腸正常組織はモノクロナール抗体C24
2:II との反応性がほとんどなかったが、これに対し正
常な乳管(breast ducts)、大膵管、胆管及び汗腺におい
ては反応性は陽性であることが認められるが染色の強さ
は弱かった。
【０２５８】死後に採取した正常なヒト組織におけるC2
42(C242:II) の免疫組織化学的評価 広範囲にわたる正常なヒト組織を全体で21人の死体から
採取した。組織試料のうちの最もよい５組(set) を、モ
ノクロナール抗体C242:II 免疫反応性の評価用として選
択した。
【０２５９】死後に、組織を取り出し、抗生物質を加え
た基礎(basic) 培地を入れた予備冷却した管に直ちに入
れた。次いで、組織を入れた管を実験室に移し（氷上
で）、培養液を除去し、組織を 0.5cm3 の立方体に揃え
た(trimmed) 。得られた組織立方体を濾紙片上に置き、
液体窒素中で素早く凍結させた。凍結組織を薄片化する
まで−80℃で保存した。薄片に切り分ける際には、冷凍
組織試料を６μｍの切片に切断し、それを顕微鏡用ガラ
ススライドに付着させた。該スライドを 100％アセトン
中に室温で２分間浸すことにより、切片を固定した。次
いで、スライドをアセトンから取り出し、そのまま風乾
し、−20℃で保存した後に使用した。
【０２６０】インキュベーションは全て湿潤雰囲気中で
室温で30分間行った。切片を先ず、トリス緩衝塩溶液(T
BS) に溶解したモノクロナール抗体C242:II と共にイン
キュベートし、その後に20％ヒト血清〔Sigman Chemica
l Company Ltd(英国ドーセットシャー州Poole 所在の会
社）製〕を含有するTBS に1 : 50に希釈したセイヨウワ
サビペルオキシダーゼ複合化ウサギ抗マウスIgG 〔Dako
Ltd（英国バッキンガムシャー州High Wycombe所在の会
社）製〕と共にインキュベートし、最後に20％ヒト血清
を含有するTBS に1 : 50に希釈したセイヨウワサビペル
オキシダーゼ複合化ブタ抗ウサギIgG (Dako Ltd 製）と
共にインキュベートした。各インキュベーションの後
に、スライドをTBS 中で２回洗浄した。次いで、切片を
３〜５分間基質で処理し、TBS 中で洗浄し、マイエル(M
ayers)ヘマトキシリンで対比染色し、次いで合成封入剤
(Synthetic Mounting Medium）〔Shandon Scientific L
td (英国チェシャー州Runcorn 所在の会社）製〕を用い
て封入した。使用した基質は、30％Ｈ２Ｏ2 17μリット
ルを含有するTBS 17ml中に溶解したジアミノベンジジン
(Sigma製）10mgであった。基質溶液は濾過してから使用
した。切片を調べ、得られた結果を下記の表２に示す。
【０２６１】 表２ 抗体C242:II を用いた死後正常組織の染色 組織 染色された数／試料総数 小脳 ０／３ 大脳 ０／３ 中脳 ０／３ 心臓 １／５ 微かな、散在性の反応性 肺 ０／５ 末梢神経 ０／３ 腎臓 １／５ 基部／末端部の管に対して反応性 肝臓 １／５ 胆管に対して僅かな反応性 膵臓 ２／２ 大膵管及び膵臓小房 結腸 ２／３ 上皮に対して僅かな反応性 小腸 ３／３ 上皮に対して僅かな反応性 副腎 ２／５ 嚢に対して僅かな反応性 膀胱 １／５ 散在性 甲状腺 １／５ 散在性 上皮小体 ０／２ 皮膚 ２／４ 偏平上皮及び汗腺 横紋筋 １／５ 散在性 脾臓 ０／５ リンパ腺 ０／５ 胃 ３／３ 上皮に対して僅かな反応性 睾丸 ０／３ 耳下腺 １／１ 耳下腺管に対して僅かな反応性 扁桃腺 ４／４ 偏平上皮対して反応性
【０２６２】表２から明らかなように、調べた正常な死
後(P.M) 組織の72％は、モノクロナール抗体C242:II 反
応性を持たなかった。陽性と評点した28％のうちの大部
分の染色は、主として組織内の管構造に対してはっきり
と限定されずに散在しているか又は局部的に集中してい
るかいずれかであった。胃腸上皮に対しては、より以上
に不均質であるが、さらに最小限の結合は認められなか
った。皮膚試料の２／４は、偏平上皮及び汗腺に対して
反応性をもって陽性に染色された。モノクロナール抗体
C242:II を用いて選抜した扁桃腺試料４個についても偏
平上皮が陽性に染色された。
【０２６３】ヒト結腸癌腫COLO 205に対して結合するC2
42:II のエンドサイトーシス エンドサイトーシス(endocytosis) 検定を下記のように
して行った。単層培養物として増殖させたCOLO 205細胞
（前記のC242抗体の調製参照）から単一の細胞懸濁液を
調製した。上記細胞をトリプシン処理し、広範囲にわた
って(extensively) 洗浄し、次いで培養液に再懸濁し
た。上記由来の沃素標識したC242:II 抗体(200,000cpm
はモノクロナール抗体の50ngに相当する）を、５ml試験
管中のCOLO 205細胞（106 個）の単一細胞懸濁液に加え
た。最終的容量は200 μリットル／試験管であった。
【０２６４】細胞を 125I-C 242 の存在下に氷上で（０
℃）１時間インキュベートした。次いで、この細胞懸濁
液を遠心分離し、細胞を洗浄して未結合モノクロナール
抗体を除いた。前インキュベートした細胞を、37℃で10
分間隔で１時間さらにインキュベートし、細胞を再冷却
し、次いで各時間ごとにペレット化した。培養液に放出
された放射能標識を上清から測定した〔LKB γ計数管、
Pharmacia AB（スウェーデン国Uppsala 所在の会社）
製〕。また上記の上清をTCA 沈殿に供し、沈殿物の放射
能を測定した。 125I-C 242 を結合した表面を、パパイ
ン(papain)2.5mg/mlを含有する0.2Mグリシン-HCl緩衝液
(pH1.5) で酸洗いし、放射能（ 125I-C 242 が取り込ま
れたことを示す）を測定した。37℃でインキュベートし
た各時間後の表面に結合した抗体の量を、表面に結合し
たモノクロナール抗体の全体量から、放出され且つ取り
込まれたモノクロナール抗体を減じることによって計算
した。放出された抗体の分解(degradation) を、培養液
上清のTCA 沈殿から測定した。
【０２６５】得られた結果を添付図面の図16に示す。図
16にはCOLO 205細胞による 125Ｉ-C242のエンドサイト
ーシスを示し、細胞表面の放射能（“Sur ”として示し
た）、取り込まれた放射能（“Int ”として示した）及
び分解し放出された放射能（“Deg.Re”として示した）
を、細胞表面に対する最初の放射能全体の％として示し
た。図16により、前インキュベートした細胞を37℃でイ
ンキュベートした場合には、１時間以内に20％を越える
モノクロナール抗体C242:II のインターナリゼーション
(internalizaton)が得られたことが認められる。培養液
上清をTCA 沈殿させた場合には酸可溶性の放射能の量は
少量であり、それはインキュベート１時間後には放出さ
れた活性のフラグメント化(fragmentation) がほとんど
ないことを示す。
【０２６６】リシンＡ／C242抗体免疫毒素の細胞毒性 この試験はヒト結腸−直腸腫瘍細胞系統(Colo 205-ATCC
No.CCL 222)に対する免疫毒素の生体外(in vitro)細胞
毒性を明らかにするものである。
【０２６７】Colo 205細胞を、RPM 1640培地中で重炭酸
ナトリウム2.0g／リットルと、グルタミンなしで、５％
の加熱不活性化した胎児性子ウシ血清、L-グルタミン 2
mM及びゲンタマイシン（gentamicin) 50μg/mlと共に懸
濁状態で増殖させた。細胞の個数を血球計数器ブロック
(blocks)を使用して数えた。蛋白質合成阻害を検定(ass
ay) するために、容量 100μリットルの96ウェル(well)
プレート中に細胞を２×104 個／ウェルで移植した。免
疫毒素試料を３連制(replicate) のウェルに加えた。免
疫毒素を2,000 ng/ml から 0.98 ng/ml までの12倍加希
釈液(doublingdilutions)で加えた。培養液 100μリッ
トルを幾つかのウェルに対照(control)として加えた。
各プレートを37℃で24時間インキュベートして、その後
に各ウェルに 3H-L-ロイシン２μCiを加えた。プレート
を37℃でさらに24時間インキュベートした。各ウェルに
トリプシン50μリットルを加え、プレートをさらに15〜
20分間インキュベートした。細胞を各プレートの各ウェ
ルからガラス繊維マット上に収穫し、その放射能をLKB
ベータープレート(betaplate) シンチレーションカウン
ターを使用して測定した。蛋白質合成阻害曲線を作成
し、IC50値を求めた。好ましい免疫毒素（前記で調製し
たもの）について得られた結果を図17に示す。
【０２６８】生体内細胞毒性 この試験は、無胸腺マウスにおいて皮下異種移植片とし
て増殖させたヒト腫瘍細胞系統COLO 205に対する前記免
疫毒素の生体内(in vivo) 細胞毒性を明らかにするもの
である。対照群として抗体単独又は燐酸塩緩衝食塩水を
使用して試験した。
【０２６９】COLO 205細胞の５×106 個を無胸腺マウス
の脇腹の１カ所の皮下部位に注射した。腫瘍を増殖さ
せ、３〜４日ごとにカリパス(calipers)を用いて長さと
幅(twodimension) について測定した。供試物質の投与
は、腫瘍が0.7 〜1.0cm 平方に達するまで行わなかっ
た。この段階を０日とし、０日、１日及び２日目にマウ
ス尾静脈に供試物質を静脈内(i.v.)投与した。腫瘍の大
きさを長さと幅について連続的に測定し、相対腫瘍容積
(relative tumor volume) として示した。腫瘍の測定
は、３〜４日ごとに実験を終えるまで行った。
【０２７０】この試験は、腫瘍増殖に対する効果を燐酸
塩緩衝食塩水、C 242 抗体単独(1.2mg/kg)及び好ましい
免疫毒素（前記で調製したもの）(2.0mg/kg)の相対腫瘍
容積により比較し、得られた結果を以下の表に示す。
【０２７１】第１群：燐酸塩緩衝食塩水 0.1ml/10g/ i.
v.投与/ １日３回投与
【０２７２】第２群：C 242 抗体 1.2mg/kg / i.v.投与
/ １日３回投与
【０２７３】第３群：免疫毒素 2.0mg/kg / i.v.投与/
１日３回投与
【０２７４】上記の表に示したように、本発明の免疫毒
素は、燐酸塩緩衝食塩水(PBSA)対照群及び抗体単独群と
比べて腫瘍の大きさ（上記各表にその相対腫瘍容積を示
す）の減少を生じる。
【０２７５】ヒト膵臓腫瘍組織に対する抗体C242:II の
反応性 この試験は、ヒト膵臓腫瘍組織に対するモノクロナール
抗体C242:II の反応性を明らかにするものである。
【０２７６】前記のヒト正常組織反応性について記載の
方法と同じ免疫組織学的方法を用いて、ヒト膵臓腫瘍組
織に対するモノクロナール抗体C242:II の反応性を調べ
た。新鮮な凍結膵臓腫瘍組織を、微細針状生体組織検査
材料から得、ホルマリン固定／パラフィン包埋した組織
を腫瘍摘出物から得た。膵臓腫瘍の13／16は陽性として
染色された。一般に、結合の範囲及び様式は結腸−直腸
腫瘍組織の試料について認められたものと同等か又はそ
れよりも良いものであった。
【０２７７】ヒト膵臓腫瘍細胞系統における免疫毒素の
生体外効果 この試験は、ヒト膵臓腫瘍細胞系統に対する免疫毒素の
生体外細胞毒性を明らかにするものである。
【０２７８】膵臓腺癌(adenocarcinoma)由来の細胞系統
Pan 1 を使用して免疫毒素の生体外(in vitro)細胞毒性
効果を定量し、FACS（蛍光発色式細胞分取器）分析によ
り標的抗原が発現することを明らかにした。効果を定量
するために、種々の濃度の免疫毒素を培養液中のPan 1
細胞に加え、IC50値を求めた。MOPC 21 とリシンＡの複
合体と、リシンＡ単独とを陰性対照(negative control)
として使用した。バイオアッセイを３回行い、40±18ng
／mlの平均効果を得た。上記の陰性対照は、最大1,000n
g/mlまでの濃度で細胞毒性を示さなかった。このデータ
は、標的抗原が膵臓腫瘍細胞に存在すること及び抗原陽
性腫瘍細胞が免疫毒素による致死感受性であることを説
明する。
【０２７９】モノクロナール抗体C242:II の軽鎖（すな
わちＬ鎖）と重鎖（すなわちＨ鎖）の cDNAのコード化部
分の分子クローニング Ａ．全RNA の調製 108 個の細胞からRNA 全部を本質的には、Chomezynksi,
P. とSacchi, N.〔Anal. Biochem.,162,156-159(198
7)〕により改良されたようなCirgwin, J.M. らの方法
〔Biochemistry, 18,5294-5299(1979)〕に従って調製し
た。 簡潔に述べると、グアニジニウムチオシアネート
４M ；クエン酸ナトリウム(pH7) 25mM；0.5%N-ラウロイ
ルザルコシン；2-メルカプトエタノール 0.1M からなる
変成剤溶液15mlの冷却溶液に、前記の細胞ペレットを溶
解した。細胞材料を溶解した後に、２M クエン酸ナトリ
ウム（pH4.0) 1.2mlを加え、得られた混合物をフェノー
ル- クロロホルム- イソアミルアルコール(250:49:1)混
合物で抽出した。遠心分離した後に、等量のイソプロパ
ノールを加えることによってRNA を水層から沈殿させ、
次いで−20℃で１夜インキュベートしてRNA 全部を沈殿
させた。RNA を遠心分離し再懸濁した後に、沈殿を繰り
返し、さらにまた遠心分離し再懸濁した後に、吸光度測
定することにより、得られたRNA 全部は 960μg である
と算出された。
【０２８０】Ｂ．mRNAの単離 前記で調製した全RNA からポリアデニル化されたmRNAを
単離するするために、PolyATract〔登録商標；Promega
Corporation(米国ウィスコンシン州Madison 所在の会
社）製のmRNA単離系〕を製造元の指示書（Promega Tech
nical Bulletin,No.090:1990参照) に従って使用した。
簡潔に述べると、RNA 全部 960μg を水に溶解し、0.4
×SSC(標準食塩−クエン酸塩緩衝液)(１×SSC=pH7.0 の
水１リットル当たりNaCl 8.77g、クエン酸ナトリウム
4.41gを含む) 中でビオシチニル化(biotinylated)した
オリゴ(dT)プローブ(50pモル) を用いてアニール化し
た。Streptavidin被覆された常磁性ビーズ〔Streptavid
in Magnesphere（登録商標）〕を加え、10分間インキュ
ベートした後に上記磁性粒子を取り除き、0.1 ×SSC で
数回洗浄した。ポリアデニル化されたmRNAを、水中でイ
ンキュベートすることにより上記磁性球から溶離させて
mRNA 5μg を得た。
【０２８１】Ｃ．大腸菌中でのcDNAファージライブラリ
ーの調製 二重鎖cDNAの非方向性の(undirectional) クローニング
を可能にするベクターであるUni-ZAP(登録商標）〔Stra
tagne Inc.（米国カリフォルニア州La Jolla所在の会
社）製〕を部分改変した Gubler, U. とHoffman, B.J.
の方法〔Gene ,25,263-269(1983)〕に本質的に従って、
前記工程のポリアデニル化mRNAから cDNAを調製した。
簡潔に述べると、ポリアデニル化mRNA５μg を、上記Un
i-ZAP リンカープライマー(linker primer)(56ng/ml)を
用いて開始し(priming) 、デオキシヌクレオチドdATP、
dGTP、dTTP及び5-メチル-dCTP の0.6mM と、モロニー(M
oloney) マウス白血病ウイルス逆転写酵素の45Ｕとを加
えることにより一本鎖cDNAに変えた。得られた混合物を
37℃で１時間インキュベートした。最終濃度0.15mMまで
のデオキシヌクレオチドdATP、dGTP、dTTP及びdCTPと、
リボヌクレアーゼＨ 3.2Ｕと、DNA ポリメラーゼ 6.5Ｕ
とを加え、次いで16℃で2.5 時間インキュベートするこ
とにより、第二の鎖cDNA合成を行った。得られた混合物
をフェノール−クロロホルム(1:1) で抽出し、エタノー
ル沈殿させた。上記cDNAの両方の末端を、dNTP 0.16mM
とＴ4 DNA ポリメラーゼ10Ｕと共に37℃で30分間インキ
ュベートすることにより平滑にした。フェノール−クロ
ロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った後に、得られ
た平滑末端化cDNAをＴ4 DNA リガーゼ３Weiss ＵとATP
1mM とを加え、次いで８℃で１夜インキュベートするこ
とによりEcoRＩアダプターに連結した。連結反応後に、
EcoRＩ付着末端を、ATP 1mM の存在下でＴ4 ポリヌクレ
オチドキナーゼ10Ｕを加え、次いで30℃で30分間インキ
ュベートすることによりキナーゼ化した。Uni-ZAP リン
カープライマーによりコード化された配列から XhoＩ付
着末端を作ることを目的として、得られた燐酸化された
EcoRＩ付着末端をもつcDNAを、制限酵素 XhoＩ 90Uで消
化した。次いで、得られたcDNAを、 Uni-ZAP XR EcoRＩ
と XhoＩとで調製したアーム(arm) １μg に、Ｔ4 DNA
リガーゼ２Weiss ＵとATP 1mM との存在下で連結し、次
いで12℃で１夜インキュベートした。得られた連結反応
混合物を、製造元の指示書に従ってGigapack II Gold
（登録商標）パッケージング抽出(packaging extract)
を使用してλ- ファージ粒子中に試験管内パッケージン
グ(in vitro packaging)し、次いで得られたファージを
使用して大腸菌PLK-F'に感染させた。得られた独立(ind
ependent) クローン8.5 ×104 個のcDNAライブラリーを
１度増幅させてファージ力価7.5 ×108 pfu/mlを得た。
得られたcDNAライブラリーを以下に記載のようにして宿
主菌株として大腸菌XL 1- ブルー〔Bullock, W. の論文
「Biotechniques 」,5,4(1978)参照〕を使用して選別し
た。
【０２８２】Ｄ．ハイブリダイゼーションプローブの調
製 C242:II 抗体のIgG 1 重鎖とκ鎖とをコードするcDNAを
検出するために、該重鎖の第一の定常部ドメイン(const
ant domain) すなわちCH 1とκ鎖の定常部ドメインすな
わちCKとを覆うハイブリダイゼーションプローブを、Sa
iki. R.H. らの論文〔Science, 239,487-491(1988)〕に
よるポリメラーゼ連鎖反応により、マウス遺伝子DNA か
ら調製した。簡潔に述べると、前記免疫グロブリンをコ
ードするエキソンの5'領域と3'領域に対してハイブリド
形成するオリゴヌクレオチド・プライマーの対をマウス
遺伝子DNA の増幅(amplification) に使用した。アガロ
ースゲル電気泳動により精製した後に、得られたDNA プ
ローブ断片をFeinberg, A.P.とVogelstein,B. によるラ
ンダムプライマー伸長法〔Anal. Biochem.,132,6(198
3)〕により32Ｐで標識した。
【０２８３】Ｅ．配列をコード化するIgG 1 重鎖及びκ
鎖のスクリーニング並びにプラスミド中への挿入 Sambrook, J.らの方法〔「Molecular Cloning 」第２
版、Cold Spring HarborLaboratory Press 発行、1989
年〕に従って、前記Ｄで得た免疫グロブリンIgG1 プロ
ーブ及びκプローブそれぞれを使用して、前記Ｃで得た
cDNAを選別した。２つの別々のハイブリダイゼーション
から陽性的にハイブリド形成しているファージクローン
類をさらに、最初のスクリーニングにおけるプローブと
同じプローブを使用して再びスクリーニングすることに
より精製した。陽性的にハイブリド形成しているファー
ジクローン類を大腸菌CL 1- ブルーの培養株中に拡張さ
せ(expand)、得られたファージストック(stocks)を使用
してShort, J.M. らの方法〔Nucleic Acids REes.,16,7
583-7600(1988)〕に本質的に従ってファージミド(pharg
emid) を切除し繁殖させることにより、cDNAを含有する
pBluescript SK(-) プラスミドを調製した。
【０２８４】Ｆ．クローンをハイブリド形成させること
によるプラスミドcDNAの特定 得られたcDNA含有プラスミドを、制限酵素マッピングに
より特定し、所定の大きさの挿入断片を含有するプラス
ミドを、Sanger, F.らのジデオキシDNA 配列決定法
〔「Proc. Natl. Acad. Sci.USA 」74,5463-5467(197
7)〕に供した。Ig κプローブとハイブリド形成するプ
ラスミド（pKGE 761と命名する）はcDNA挿入断片を含ん
でいた。該cDNA挿入断片の配列は、既に知られているマ
ウスκ軽鎖配列(Kabat,E.A. らの著作「Sequences of P
rotein of Immunological Interest」、第４版、U.S. D
epartment of Health and Human Services, Natinal In
stitutesof Health参照) に近似した読み取り枠(open r
eading frame)をコード化する。κ軽鎖の可変部領域す
なわちVK及びその翻訳された蛋白質配列をコード化する
部分的cDNA配列を図19に示した。CDR 1 〜CDR 3 として
示した３つのCDR 配列を下線を付すことにより示した。
VKセグメントのアミノ末端の先にあるシグナルペプチド
(signal peptide)を、VK配列のカルボキシメチル末端の
後ろに続く定常部領域を示す記号(S.)CKにより示さす。
【０２８５】IgG 1 プローブとハイブド形成するプラス
ミド（pKGE 762という）はcDNA挿入断片を含んでいた。
該cDNA挿入断片の配列は、既に知られているマウスIgG
1 重鎖配列(Kabat, E.A.らの上記著作参照) に近似した
読み取り枠をコード化する。IgG 1 重鎖可変部領域すな
わちVH及びその翻訳された蛋白質配列をコード化する部
分的cDNA配列を図20に示した。CDR 1 〜CDR 3 として示
した３つのCDR 配列を下線を付すことにより示した。VH
セグメントのアミノ末端の先にあるシグナルペプチド
を、VH配列のカルボキシメチル末端の後ろに続く定常部
領域を示す記号(S.)CH 1により示す。
【０２８６】組成物 人の治療用に使用し得る本発明の免疫毒素を含有する代
表的な医薬製剤を下記に示す。
【０２８７】注射剤溶液 下記成分を含有する注射用の滅菌水溶液 リシンＡ／C242抗体免疫毒素 1.0 mg（溶液１ml当たり） 酢酸ナトリウム３水和物 6.8 mg（溶液１ml当たり） 塩化ナトリウム 7.2 mg（溶液１ml当たり） Tween 20 0.05mg（溶液１ml当たり）
【０２８８】
【配列表】(1) 一般情報 (i) 出願人：インペリアル・ケミカル・インダストリー
ズ・ピーエルシー及びカビ・ファルマシア・エイビー(K
abi Pharmacia AB) (ii)発明の名称：複合体 (iii) 配列の数：22 (ix)通信先住所： (A) 名宛人：法務部(Legal Deparatment):特許(Patent
s) (B) 市街名：ベッセマー・ロード (C) 市名：ウェルウィン・ガーデン・シティー (D) 州名：ハートフォードシャー (E) 国名：英国 (F) 郵便番号：GB-AL7 1HD (v) コンピューター読み取り様式： (A) 媒体型式：ディスケット、3.50インチ、記憶容量1.
2Mb (B) コンピューター：18 M PS/2 (C) オペレーティングシステム：PC-DOS 3.20 (D) ソフトウエア：WPS-PLUSからのASCII (vi)本出願のデータ： (A) 出願番号 (B) 出願日： (C) 分類： (vii) 優先権データ： (A) 出願番号：No.9114399.0 (B) 出願日：1991年７月３日
【０２８９】(2) 配列番号１に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸16個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号(SEQ ID NO) １
【０２９０】(2) 配列番号２に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸７個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号２
【０２９１】(2) 配列番号３に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸９個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号３
【０２９２】(2) 配列番号４に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸５個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号４
【０２９３】(2) 配列番号５に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸17個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号５
【０２９４】(2) 配列番号６に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸10個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号６
【０２９５】(2) 配列番号７に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸18個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号７
【０２９６】(2) 配列番号８に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸11個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号８
【０２９７】(2) 配列番号９に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸11個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号９
【０２９８】(2) 配列番号10に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸７個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号10
【０２９９】(2) 配列番号11に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸21個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号11
【０３００】(2) 配列番号12に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：アミノ酸14個 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号12
【０３０１】(2) 配列番号13に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：25 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号13
【０３０２】(2) 配列番号14に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：25 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号14
【０３０３】(2) 配列番号15に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：21 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号15
【０３０４】(2) 配列番号16に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：23 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号16
【０３０５】(2) 配列番号17に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：23 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号17
【０３０６】(2) 配列番号18に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：1140 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号18
【０３０７】(2) 配列番号19に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：26 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号19
【０３０８】(2) 配列番号20に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：86 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号20
【０３０９】(2) 配列番号21に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：463 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号21
【０３１０】(2) 配列番号22に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：483 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列：配列番号22
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpICI 0020 の組み立てを説明する図
である。
【図２】プラスミドpTB 344 の組み立てを説明する図で
ある。
【図３】プラスミドpICI 0042 の組み立てを説明する図
である。
【図４】プラスミドpICI 1079 の組み立てを説明する図
である。
【図５】プラスミドpICI 1102 の組み立てを説明する図
である。
【図６】大腸菌溶解物のクーマシー・ブルー染色したSD
S ゲルを説明する図であり、トラックＡはプラスミドpI
CI 1102 であり、トラックＢはプラスミドpICI 0020 で
あり、トラックＣは分子量標識である。
【図７】プラスミドpICI 1102 のゲル・プロフィルを説
明する図であり、ピークＲはリシンＡを示す。
【図８】プラスミドpICI 1102 により生成されたリシン
Ａのウェスタン・ブロットを示す図であり、トラック１
は分子量標識であり、トラック２及び３はリシンを生成
しないクローンであり、トラック４はプラスミドpICI 1
102 であり、トラック５はプラスミドpICI 0020(対照プ
ラスミド- 非リシンＡ配列）である。
【図９】プラスミドpICI 1102 の部分配列を示す図であ
る。
【図１０】図９に示したプラスミドpICI 1102 の部分配
列の続きを示す図である。
【図１１】プラスミドpICI 1187 の組み立てを説明する
図である。
【図１２】プラスミドの調製に使用した断片を説明する
図である。
【図１３】プラスミドpICI 0042 のプラスミド地図を示
す図である。
【図１４】転写ターミネーターの配列を説明する図であ
る。
【図１５】プラスミドpICI 1079 のプラスミド地図を示
す図である。
【図１６】COLO 205細胞による 125Ｉ-C242 のエンドサ
イトーシスを説明する図である。
【図１７】COLO 205細胞に対するC242／リシンＡ免疫毒
素の生体外(in vitro)細胞毒性を説明する図である。
【図１８】抗体を説明する図である。
【図１９】抗体C242のκ鎖、すなわち可変部領域（プラ
スミドpKGE 761中のcDNA）のcDNA配列を説明する図であ
る。
【図２０】抗体C242の重鎖、すなわち可変部領域（プラ
スミドpKGE 762中のcDNA）のcDNA配列を説明する図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 45/00 8415−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 15/12 7731−4Ｈ // Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 ＺＮＡ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ライト，アンドリユー・フアーマン イギリス国．エスケイ10・４テイジイ．チ エシヤー．マツクレスフイールド．オール ダーレイ・パーク（番地その他表示なし) (72)発明者 ブラケイ，デービツド・チヤールス イギリス国．エスケイ10・４テイジイ．チ エシヤー．マツクレスフイールド．オール ダーレイ・パーク（番地その他表示なし) (72)発明者 フイツトン，ジヨン・エドワード イギリス国．エスケイ10・４テイジイ．チ エシヤー．マツクレスフイールド．オール ダーレイ・パーク（番地その他表示なし) (72)発明者 リンドホルム，リーフ スウエーデン国．エス−751 82・ウプサ ラ．（番地その他表示なし）カビ・フアー マシア・アクチボラグ内 (72)発明者 リンド，ペーター スウエーデン国．エス−751 82・ウプサ ラ．（番地その他表示なし）カビ・フアー マシア・アクチボラグ内 (72)発明者 ホルムグレン，ヤン スウエーデン国．エス−421 74・ヴエス トラ・フレルンダ．コルベツトガタン・１ デイ

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 毒素部分と胃腸腫瘍に対して選択的な標
    的細胞結合部分とからなる複合体。
  2. 【請求項２】 標的細胞結合部分はC242抗体又は実質的
    に同一の細胞結合性を有する標的細胞結合部分からな
    る、請求項１に記載の複合体。
  3. 【請求項３】 毒素部分は組換え体リシン Aからなる、
    請求項１又は２に記載の複合体。
  4. 【請求項４】 標的細胞結合部分と毒素部分は二官能性
    リンカーによって連結されている、請求項１、２又は３
    に記載の複合体。
  5. 【請求項５】 標的細胞結合部分と毒素部分はジスルフ
    ィド結合又はチオエーテル結合によって連結されてい
    る、前記請求項のいずれか一つに記載の複合体。
  6. 【請求項６】 標的細胞結合部分と毒素部分は式：-S-X
    -CO-［式中、X は（1-6 C)アルキル基、フェニル基及び
    （1-4 C)アルキルフェニル基から選ばれた１個又は２個
    の置換基によって置換されていてもよい直鎖(1-6 C) ア
    ルキル基であるか、又は、アルキル部分が（1-6 C)アル
    キル基、フェニル基及び（1-4 C)アルキルフェニル基か
    ら選ばれた１個又は２個の置換基によって置換されてい
    てもよくそしてフェニル環がハロゲン、(1-4 C) アルキ
    ル基及び(1-4 C) アルコキシ基から選ばれた置換基を有
    し得る、(1-4 C) アルキルフェニル基である］のリンカ
    ーによって連結されている、前記請求項のいずれか一つ
    に記載の複合体。
  7. 【請求項７】 X がメチル基、エチル基、プロピル基及
    びブチル基から選ばれた１個又は２個の基によって置換
    されているメチレン基、エチレン基、プロピレン基又は
    ブチレン基である、請求項６に記載の複合体。
  8. 【請求項８】 リンカーは基 -S-CH-(CH３) CH２CO- か
    らなる請求項６に記載の複合体。
  9. 【請求項９】 標的細胞結合部分が実質的に下記のごと
    き配列：L 鎖 H 鎖 を有するCDR 領域を有しており、CDR 領域は標的細胞結
    合部分がC242抗体と実質的に同一な細胞結合性を有する
    ように配列されている、前記請求項のいずれか一つに記
    載の複合体。
  10. 【請求項１０】 式 A- S１-S２-X-CONH-B ［式中、A は組換え体リシン Aからなり、B はC242抗体
    からなる標的細胞結合部分からなり； S１は組換え体リ
    シン A上に存在する硫黄原子であり；NHはC242抗体上に
    あり； S２は硫黄原子であり；X は（1-6 C)アルキル
    基、フェニル基及び（1-4 C)アルキルフェニル基から選
    ばれた１個又は２個の置換基によって置換されていても
    よい直鎖(1-6 C) アルキル基であるか、又は、アルキル
    部分が （1-6 C)アルキル基、フェニル基及び（1-4 C)
    アルキルフェニル基から選ばれた１個又は２個の置換基
    によって置換されていてもよくそしてフェニル環がハロ
    ゲン、(1-4 C) アルキル基及び(1-4 C) アルコキシ基か
    ら選ばれた置換基を有し得る、(1-4 C) アルキルフェニ
    ル基である］を有する複合体。
  11. 【請求項１１】 3-メルカプト酪酸ジラジカル（-CO.CH
    ２.CH(CH３)-S-) によってC242抗体上のアミノ基から、
    リシン A中のシステイン残基のチオール基に連結されて
    いる、C242抗体と組換え体リシン Aとからなる複合体。
  12. 【請求項１２】 組換え体リシン Aと、実質的に下記の
    ごとき配列：L 鎖 H 鎖 を有するCDR 領域の少なくとも一つを有する標的細胞結
    合部分（かかる CDRの数とその配置は標的細胞結合部分
    がC242抗体と実質的に同一の細胞結合性を有するような
    ものである）とからなる複合体。
  13. 【請求項１３】 毒素部分と、胃腸腫瘍エピトープに対
    して特異的な標的細胞結合部分とからなる複合体。
  14. 【請求項１４】 標的細胞結合部分はC242抗体が結合し
    ている胃腸腫瘍エピトープに対して特異的である、請求
    項１３に記載の複合体。
  15. 【請求項１５】 （a)標的細胞結合部分が毒素部分に直
    接連結している複合体については、毒素部分と標的細胞
    結合部分とを反応させること；また(b) 標的細胞結合部
    分がリンカーによって毒素部分に連結している複合体に
    ついては、リンカーを用いて誘導される標的細胞結合部
    分と毒素部分とを反応させるか又はリンカーを用いて誘
    導される毒素部分と標的細胞結合部分とを反応させるこ
    とを特徴とする請求項１に記載の複合体の製造方法。
  16. 【請求項１６】 前記請求項のいずれか一つに記載の複
    合体と薬学的に許容される稀釈剤又は担体とからなる医
    薬組成物。
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