PT100660B - Compostos conjugados uteis para o tratamento de tumores gastrointestinais e composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.°

REQUERENTE· IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES PLC, britânica, industrial e comercial, com sede em Imperial Chemical Hause, Millbank, London SW1P 3JF, Inglaterra e Kabi Pharmacia AB, sueca, industrial e comercial, com sede em

S-751 82, Uppsala, Suécia.

EPÍGRAFE: COMPOSTOS CONJUGADOS ÚTEIS PARA O TRATAMENTO

DE TUMORES GASTROINTESTINAIS E COMPOSIÇÕES

FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM

INVENTORES: ANDREW FIRMAN WRIGHT, DAVID CHARLES BLAKEY,

JOHN EDWARD FITTON, LEIF LINDHOLM, PETER

LIND E JÀN HOLMGREN

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Grâ-Bretanha, 3 de Julho de 1991, sob o N^a 9114399.0.

INPI. MOO. 113 RF 16732

Descrição referente à patente de invenção de IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES PLC, britânica, industrial e comercial, com sede em Imperial Chemical House, Millbank, London SW1P 3JF, Inglaterra, e Kabi Pharmacia AB, sueca, industral e comercial, com sede em S-751 82, Uppsala, Suécia (inventores: Andrew Firman Wright, David Charles Blakey, e John Edward Fitton, residentes na Inglaterra e Leif Lindholm, Peter Lind e Jan Holmgren, residentes na Suécia) COMPOSTOS CONJUGADOS ÚTEIS PARA O TRATAMENTO DE TUMORES GASTRO-INTESTINAIS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a conjugados como por exemplo imunotoxinas para a utilização na terapia antitumores, a processos para a preparação destes conjugados e

A ricina e as moléculas do tipo da ricina, como por exemplo a abrina, a modecina e a viscumina são compostos conhecidos que são produzidos por células de plantas, e que possuem propriedades citotóxicas. As toxinas deste tipo consistem em duas cadeias de polipéptidos que estão ligadas através de uma ponte de dissulfureto. Uma das cadeias de polipéptido (a cadeia A) é principalmente responsável pelas propriedades citotóxicas da molécula da toxina; enquanto que a outra cadeia de polipéptido (a cadeia B) permite que a molécula da toxina se ligue à superfície da célula.

A toxicidade das moléculas do tipo da ricina opera em três fases:

(a) A ligação da toxina à superfície da célula através da interacção dos pontos de ligação da galactose na cadeia B com glicoproteínas ou glicolípidos expostos à superfície da célula;

(b) Penetração pelo menos da cadeia A no citossol da célula; e (c) Inibição da síntese da proteína através da destruição pela cadeia A da actividade das subunidades 60S dos ribossoma.

Pensa-se também que a cadeia B tem uma função secundária importante, para além da sua função principal de ligação da molécula de toxina à superfície da célula, por facilitar a absorção da toxina na célula. Assim, as cadeias

A e Β separadas são essencialmente não tóxicas dado que a cadeia A não tem a capacidade para se ligar à superfície da célula e penetrar no citossol da célula, na ausência da cadeia B; enquanto que a cadeia B não possui propriedades citotóxicas.

Tal como acima mencionado a ricina e as moléculas do tipo da ricina são produzidas por plantas. No caso da própria ricina, a produção ocorre no Ricinus communis também conhecida como planta do óleo de rícino. Pensa-se que um precursor de polipéptido (conhecido como preporicina) que compreende uma sequência líder, que é a cadeia A, uma sequência de ligação e a cadeia B é a primeira a ser produzida. Durante o transporte desse precursor (preproricina) dentro da célula da planta, a sequência líder deve ser eliminada para produzir a proricina. A ricina madura é em seguida produzida a partir da proricina por formação de uma ponte de dissulfureto entre as cadeias A e B e eliminação da sequência de ligação.

Já foi sugerido que a toxicidade da cadeia A de toxinas como por exemplo a ricina pode ser útil na terapia anti-tumores se a cadeia B que se liga indiscriminadamente puder ser substituída por um veículo diferente que tenha a capacidade para se ligar às células de tumores de preferência em relação às células normais. Assim foram sugeridos vários conjugados e eles foram preparados de forma a conterem ricina madura ou a cadeia A da ricina e um

anticorpo específico de tumores. Contudo, esses conjugados, imunoconjugados ou imunotoxinas, possuem várias desvantagens.

Um dos problemas com os conjugados conhecidos advem de uma característica estrutural da cadeia A da ricina natural. Pensa-se que durante a síntese da ricina nas células das plantas, tem lugar a N-glicosilação e que os radicais de açúcar resultantes são susceptíveis de interacções não específicas com as superfícies das células.

A perda de selectividade com imunoconjugados de ricina de plantas também deve ocorrer como resultado de:

(a) os pontos de ligação da galactose na cadeia B interactuam de uma maneira não específica com as superfícies das células no caso de imunoconjugados de ricina integral; ou (b) através da ligação das cadeias laterais expressas de glicina em ricina A de plantas com receptores de galactose e de manose nas superfícies das células, no caso de imunoconjugados de ricina A de plantas.

Um outro problema é que, tal como acima mencionado, se pensa que a cadeia B facilita a absorção da molécula de toxina na célula. Assim, embora os conjugados em que a cadeia B está ausente, isto é aqueles que consistem na cadeia A e num anticorpo, tendam a ser mais específicos do que as toxinas nativas, eles são referidos como perdendo a potência da toxina nativa (Moolten, F.L, e col., Immun Rev, 62, 47-72, 1982). Esta perda de potência deve ser devida a uma diminuição toxina para reiativamente internalização

a célula. Assim poucos eficaz imunotoxinas com perda

Até agora, anticorpos na absorção eficaz da têm que da toxina, e dão de potência.

sido referidos facilitam a assim origem a têm sido preparados conjugados que são de utilização potencial para o tratamento de tumores em alguns tecidos diferentes. Por exemplo, o Pedido de Patente

No W085/003508 descreve a preparação de conjugados que compreendem a ricina A ou a toxina A da difteria com uma cadeia ligada através duma molécula espaçadora a anticorpos específicos para os tumores da mama.

Têm sido também referidos anticorpos que reconhecem células de tumores colo-rectais, mas os conjugados que incluem esses anticorpos tendem a sofrer uma ligação inaceitável a tecidos normais e/ou uma baixa potência. Assim os anticorpos conhecidos que reconhecem as células de tumores colo-rectais não encontraram utilidade na preparação de conjugados com interesse terapêutico real.

Existe assim uma necessidade de um conjugado que tenha valor terapêutico no tratamento

Assim, embora tenham sido sugeridos e preparados vários conjugados, existe uma necessidade para melhores conjugados. Estes conjugados superiores podem melhorar uma ou mais das desvantagens associadas com os conjugados conhecidos. Existe também uma necessidade de conjugados que sejam selectivos para tumores gastrointestinais.

3K32C

De acordo com a presente invenção é proporcionado um conjugado que compreende um radical de toxina e um radical de ligação de célula alvo que é selectivo para as células de tumores gastrointestinais.

Em particular, o radical de ligação à célula alvo (e assim o conjugado) é selectivo para células de tumores colo-rectais e pancreáticos, mais particularmente células de tumores colo-rectais.

o radical de ligação à célula alvo em geral compreenderá, por exemplo, um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um derivado de um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

radical da ligação à célula alvo é selectivo para células de tumores gastrointestinais (especialmente células de tumores colo-rectais) dado que ele se liga a essas células de preferência em relação às células normais. Assim o radical de ligação á célula alvo ligar-se-á às células de tumores gastrointestinais, mas não revelará ou revela apenas uma afinidade mínima em relação às células normais. Em particular, o radical de ligação à célula alvo apresentará uma selectividade para tumores gastrointestinais substancialmente idêntica à apresentada pelo anticorpo C242. A selectividade do anticorpo C242 para tumores gastrointestinais, como por exemplo tumores colorectais, é exemplificada pelos dados imunohistoquímicos a seguir apresentados. Assim em particular, um radical de ligação à célula alvo, como por exemplo um anticorpo C242

ligar-se-à a um antigênio associado com tumores gastrointestinais mas estará ausente ou apenas fracamente expresso em células normais. Um exemplo particular desse radical de ligação de célula alvo é o anticorpo C242 ou um radical de ligação de célula alvo que tenha essencialmente as mesmas propriedades de ligação das células.

Tal como aqui mencionado, o conjugado é susceptível de discriminar as células de tumores gastrointestinais. Assim o conjugado (ou imunotoxina) é susceptível de libertar o radical de toxina para as élulas de tumores de forma a que o radical de toxina possa exercer as suas propriedades citotóxicas. O conjugado será assim, em geral, susceptível de se ligar às células de tumores (através da ligação do radical de ligação à célula alvo às células de tumores) e permite que o radical de toxina passe para a célula, isto é, permite que o radical de toxina se internalize”. Os conjugados particularmente eficazes, terão em geral as seguintes propriedades:-

1. 0 radical de ligação da célula alvo deve ser susceptível de se ligar a um antigênio da superfície da célula de tumor.

2. O antigênio da superfície das células deve estar presente num elevado número de cópias em células de tumor, por exemplo, pelo menos dez mil por cada célula.

3. 0 antigênio não deve ser expresso num elevado número de cópias em células normais.

4. O complexo de anticorpo-antigénio deve ser

internalizado de forma eficiente para que o radical de toxina possa exercer a sua citotoxicidade intracelularmente.

5. 0 conjugado deve de preferência ser construído de forma a que ele seja suficientemente estável para permanecer intacto no sangue durante um longo período de tempo para libertar o radical de toxina para a célula alvo bem como ser suficientemente clivável para permitir a libertação do radical de toxina logo que o radical de toxina esteja dentro da célula.

O anticorpo C242 é um anticorpo de murina da classe IgG que é produzido quando se cultiva num meio adequado uma linha de células de hibridoma obtida por fusão de células do baço de um rato, imunizado com uma linha de células de adenocarcinoma do cólon humano, com a linha de células de mieloma de murina Sp 2/0. Foi depositada uma linha de células de hibridoma (242.11) que produz o anticorpo C242:II (também referido aqui apenas por conjugado C242) em 26 de Janeiro de 1990 de acordo com O Tratado de Budapeste na European Collection of Animal cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, com o número de acesso 90012601.

O termo um radical de ligação das células alvo que têm substancialmente as mesmas propriedades de ligação” incluí radicais de ligação de células alvo que têm essencialmente a mesma especificidade imunológica da

produzida pela linha de células depositada em ECACC 90012601, isto é liga-se ao mesmo determinante antigénico ou epítopo, e compete com o anticorpo C242 para a ligação a esse ponto.

A expressão radical de ligação à célula alvo também inclui fragmentos de anticorpos, e em particular, fragmentos do anticorpo C242 bem como o anticorpo intacto. Os fragmentos de anticorpo reterão a capacidade de ligação e a especificidade das imunoglobulinas não fragmentadas e, incluem, por exemplo, os obtidos pela degradação do anticorpo com uma enzima proteolítica, como por exemplo a pepsina. Exemplos particulares incluem fragmentos F(ab') e F(ab')₂.

Deve notar-se que o radical de ligação à célula alvo pode ser preparado por engenharia genética e assim o termo fragmento de ligação à célula alvo inclui anticorpos e fragmentos de anticorpos criados por essas técnicas. Em particular, o termo radical de ligação à célula alvo inclui o anticorpo C242 ou um seu fragmento que é o produto de engenharia genética.

A preparação de fragmentos de anticorpos e em particular fragmentos de anticorpos humanizados é descrita, por exemplo, por Cárter e col., Biotechnology, Vol. 10, Fevereiro de 1992.

radical de ligação à célula alvo inclui formas derivadas de anticorpos ou fragmentos de anticorpos, e em particular formas humanizadas de anticorpos ou fragmentos de anticorpos derivadas de fontes não humanas, por exemplo formas humanizadas de anticorpos de murina.

anticorpo C242 é dirigido contra um antigénio associado a tumores, designado aqui por CA-242. Assim, em particular o radical de ligação à célula alvo inclui um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que é susceptível de se ligar ao antigénio CA-242. Um exemplo específico desse anticorpo é o próprio anticorpo C242. O antigénio associado com tumores CA-242 é expresso na maior parte dos tumores colo-rectais, e é apenas fracamente expresso ou está ausente no tecido de cólon normal.

Em relação â engenharia genética acima mencionada, os cADN das várias regiões das cadeias ligeiras e pesadas do anticorpo monoclonal C242:II foram clonados da forma a seguir descrita. Antes de discutir esse aspecto com maior pormenor pode ser adequado dar uma breve descrição geral da unidade estrutural básica da imunoglobulina, sendo feita referência à Fig. 17 dos desenhos anexos que descrevem a estrutura geral de um anticorpo, isto é, a imunoglobulina, ou classe G.

Referindo à Fig. 17, a imunoglobulina consiste em duas cadeias de polipéptidos leves idênticas (L) e duas cadeias de polipéptidos pesadas idênticas (H), sendo as quatro cadeias ligadas por pontes de dissulfureto e várias forças não covalentes numa configuração simétrica Y. Cada cadeia pesada tem um domínio variável (V_H) em cada extremidade seguido por um certo número de domínios

(VjJ numa extremidade e um domínio constante (C_L) na outra extremidade. Existem dois tipos de cadeias leves, designadas por kappa e lambda, respectivamente. 0 domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada, e o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, formando os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas o ponto de ligação de antigénio.

Os domínios variáveis das cadeias leve e pesada têm a mesma estrutura geral, compreendendo cada um deles três regiões hipervariáveis, designadas por regiões determinantes de complementaridade, ou CDR, que intervêm entre quatro regiões de estrutura, ou FR. As CDR de cada domínio variável são mantidas numa grande proximidade pelas regiões de estrutura, e os dois conjuntos de CDR proporcionam em conjunto a especificidade do anticorpo.

Para efectuar a clonação dos cADN das partes variáveis das cadeias leve e pesada do anticorpo C242:II, foi preparada em primeiro lugar uma biblioteca de fagos de cADN a partir do hibridoma C242:II por processos conhecidos. Foram em seguidas preparadas sondas de hibridação cobrindo partes constantes da cadeia pesada e da cadeia leve (kappa), respectivamente, a partir de ADN genómico de rato utilizando a reacção em cadeia de polimerase (PCR) e primários adequados. As sondas resultantes foram utilizadas para efectuar o escrutínio da biblioteca de cADN para os clones de cADN contendo as sequências de ADN que codificam as cadeias leve e kappa do anticorpo C242:II. Os clones dos fagos que se hibridizavam positivamente foram expandidos e o cADN foi excisado sob a forma de plasmídios. Estes últimos foram caracterizados por mapeamento de enzimas de restrição, e os plasmídios contendo inserções das dimensões esperadas foram sequenciados. Para determinar as regiões CDR, as sequências de aminoácidos codificadas pela inserções de sequências foram comparadas com as previamente conhecidas de cadeias de rato do tipo kappa e pesada, considerando os locais básicos das regiões CDR tal como defenido, por exemplo, por Kabat E.A., e col. (1987), Sequence of Proteins of Immunological Interest, 4^a Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health. Verificou-se que as CDR das cadeias respectivas tinham as seguintes sequências de aminoácidos (tal como estão também representadas na Fig. 18 e 19 dos desenhos anexos - ver também SEQ. ID. No 21 e 22):

Cadeia leve

CDR1 (SEQ. ID. NO 1): ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsn

ThrTyrLeuTyr

CDR2 (SEQ. ID. NO 2): ArgMetSerAsnLeuValSer

CDR3 (SEQ. ID. NO 3): LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr

Cadeia pesada

CDR1 (SEQ. ID. NO 4): TyrThrGlyMetAsn

CDR2 (SEQ. ID. NO 5): TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAla GluAspPheLysGly

CDR3 (SEQ. ID. NO 6): ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal

Com o conhecimento destas CDR de aminoácidos e/ou sequências de ADN os especialistas podem introduzir as regiões CDR do anticorpo C242:II nas partes variáveis clonadas de outro anticorpo ou de um fragmento de um anticorpo por meio de mutagénese dirigida a pontos tal como já é conhecido. Esse procedimento, geralmente conhecido como enxerto de CDR (descrito, por exemplo, no Pedido de Patente Européia publicada com o No, EP 239 400), envolve a substituição ao nível do ADN nas sequências que codificam a CDR do anticorpo C242:II para as sequências que codificam a CDR do anticorpo ou fragmento recipientes e que resultam num anticorpo ou fragmento de anticorpo que possui uma especificidade correspondente ao anticorpo monoclonal C242:II. Incluindo dentro do âmbito do radical de ligação da célula alvo está assim, obviamente, qualquer radical que compreenda um anticorpo ou fragmento de anticorpo que possua pelo menos uma das CDR acima definidas (ou CDR subtancialmente como acima definidas), sendo o número de CDR e a sua disposição no anticorpo ou no fragmento de anticorpo tal que o radical de ligação da célula alvo tem essencialmente as mesmas propriedades ligantes da célula do anticorpo C242. É geralmente preferido que o radical de ligação da célula alvo inclua todas as CDR isto é (CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve, e CDR1, 2 e 3 da cadeia pesada) acima definidas, (ou essencialmente como acima definidas). As CDR essencialmente como acima definidas incluem sequências estendidas tais como:

Cadeia leve

CDR1 (SEQ, ID. NO 7): ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsn

ThrTyrLeuTyrTrpPhe

CDR2 (SEQ. ID. NO 8): IleTyrArgMetSerAsnLeuValSerGlyVal

CDR3 (SEQ. ID. NO 9); LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThrPheGly

Cadeia pesada

CDR1 (SEQ. ID. NO 10): PheThrTyrThrGlyMetAsn

CDR2 (SEQ. ID. NO 11): MetGlyTrpIleAspThrThrThrGlyGluPro

ThrTyrAlaGluAspPheLysGlyArglle

CDR3 (SEQ. ID. NO 12): AlaArgArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal

TrpGly

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos preparados por enxerto de CDR são de preferência preparados por enxerto das CDR de C242 numa estrutura que é escolhida próxima de

C242 quer em homologia quer em tamanho de CDR.

De acordo com a presente invenção é também proporcionado um conjugado que compreende um radical de toxina e um radical de ligação da célula alvo que compreende o anticorpo C242 ou um radical de ligação de célula alvo que tem essencialmente as mesmas propriedades de ligação de células.

Deve notar-se que o conjugado da presente invenção não consiste necessariamente de uma molécula de toxina e uma molécula de anticorpo. Por exemplo o conjugado pode compreender mais de que uma molécula de toxina por molécula de anticorpo.

radical de toxina compreende geralmente um componente que possui propriedades citotóxicas e assim é susceptível de exterminar células após a internalização.

O radical de ligação da célula alvo compreende geralmente um radical de célula alvo que é susceptível de reconhecer um determinante antigénico específico ou célula alvo.

radical de toxina e o radical de ligação da célula alvo podem ser acoplados directamente um ao outro, ou podem ser acoplados indirectamente. 0 radical de toxina e o radical de ligação da célula alvo são, em geral, acoplados de forma a que a geometria do conjugado permita que o radical de ligação da célula alvo se ligue à sua célula alvo. 0 radical de toxina e o radical de ligação de célula alvo são, com vantagem, acoplados de forma a que o conjugado seja

intracelularmente instável de forma a que o radical de toxina e o radical de ligação da célula alvo permaneçam acoplados no exterior da célula alvo, mas após internalização, o radical da toxina seja libertado. Assim, o conjugado tem com vantagem um ponto que é intracelularmente clivável/extracelularmente estável.

Exemplos de conjugados em que o radical de toxina é directamente acoplado ao radical de ligação da célula alvo incluem aqueles em que o radical da toxina e o radical de ligação da célula alvo são acoplados por uma ponte de tipo dissulfureto formada entre um grupo tiol no radical de toxina e um grupo tiol no radical de ligação da célula alvo.

radical de ligação da célula alvo pode incluir uma parte que reconhece o radical de toxina e que assim efectua o acoplamento do radical de toxina e o radical de ligação da célula alvo. Um exemplo deste último é aquele em que o radical de ligação da célula alvo inclui um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ao radical de toxina.

O radical de ligação da célula alvo, e o radical de toxina podem compreender um polipéptido simples, que inclui de preferência um ponto intracelularmente clivável de forma a que o radical de toxina seja libertado na célula. Nesse polipéptido, o radical de toxina e o radical de ligação da célula alvo podem ser ligados por meio de um ligante de tipo polipéptido.

Exemplos de conjugados em que o radical de toxina está indirectamente acoplado ao radical de ligação da célula alvo incluem aqueles em que o radical de toxina está acoplado ao radical de ligação da célula alvo através de um ligante bifuncional, especialmente um ligante heterobifuncional.

Os ligantes adequados incluem, por exemplo, ligantes que compreendem um polipéptido, por exemplo os descritos no Pedido de Patente PCT WO 85/003508 e ligantes que compreendem radicais químicos como por exemplo os descritos no Pedido de Patente Europeia Publicada No. 169

111.

radical de toxina e o radical de ligação da célula alvo são convenientemente acoplados por meio de uma ponte de dissulf ureto, ou uma ponte de tioéter. É, em geral, preferido que o radical de toxina e o radical de ligação da célula alvo sejam acoplados por um ligante que faça o acoplamento dos referidos radicais por meio de uma ponte de dissulfureto ou de tioéter clivável intracelularmente. Exemplos desses ligantes e da sua utilização na preparação de imunotoxinas são os descritos no Pedido de Patente Européia Publicada No 169 111; em Methods in Enzymology 112, 207-205, 1985, (Cumber, A.J., Forrester, J.A., Foxweel, B. M. J., Ross, W. C. J., Thorpe, P.E. - Preparation of antibody-toxin conjugates); e em Vogel, Immunoconjugates: Antibody conjugates in radioimaging and therapy of câncer, pp 28-55, (Wawrzynczak,

E.J. e Thorpe, P.E. - Methods of preparing immunotoxins:

effects of the linkage on activity and stability).

Ligantes particulares incluem aqueles que são susceptíveís de formar uma ponte de dissulfureto com um grupo tiol num dos radicais de toxina e o radical de ligação à célula alvo e uma ligação de amida com um grupo amino no outro radical de toxina e radical de ligação da célula alvo.

Exemplos de ligantes particulares são aqueles que têm a fórmula:

-s-x-cona qual X é um grupo espaçador.

X pode compreender um grupo alquilo de cadeia linear, opcionalmente substituído com um ou dois substituintes escolhidos de entre alquilo (1-6C), fenilo e alquil(l-4C) fenilo; ou um grupo alquil(l-4C) fenilo, em que o radical alquilo é opcionalmente substituído com um ou dois substituintes escolhidos de entre alquilo(1-6C), fenilo e alquil(1-4C)fenilo; em que o anel fenilo pode conter um substituinte escolhido de entre, por exemplo, halogéneo, alquilo(l-4C) e alcoxi (1-4C).

É geralmente preferido, por exemplo, que em X o grupo alquilo contenha um substituinte escolhido entre os acima mencionados.

Por exemplo, X pode compreender um radical alquilo (1-6), opcionalmente substituído com um ou dois substituintes escolhidos de entre alquilo(1-4C) e fenilo.

Valores particulares metileno, etileno, substituído com independentemente de

propileno, butileno opcionalmente um ou dois grupos escolhidos entre metilo, etilo, propilo e butilo (especialmente quando subtituído por metilo, etilo, propilo e butilo).

Os valores específicos de X de interesse são aqueles que X compreende um grupo metileno ou etileno opcionalmente substituído com um ou dois grupos da forma acima definida.

X compreende de preferência um grupo etileno que é não substituído ou que é substituído com um ou dois grupos metilo, especialmente um grupo etileno substituído com um grupo metilo.

Os conjugados preferidos de presente invenção incluem aqueles que possuem a fórmula:

H

I a-s₁-s₂-x-con-b na qual

A compreende um elemento escolhido de entre um radical de toxina e um radical de ligação á célula alvo, e B compreende o outro elemento escolhido de entre um radical de toxina e um radical de ligação á célula alvo; o radical de ligação à célula alvo pode conter um ou mais radicais de toxina,

S_x é um átomo de enxofre presente em A,

NH encontra-se em B, e

S₂-X-CO é o ligante, em que S₂ é um átomo de enxofre e X é como acima definido.

Deve notar-se que S é derivado de um grupo tiol em A.

Deve igualmente notar-se que quando o ligante contém um centro quiral, ele pode existir e ser isolado, em formas opticamente activas ou racémicas. A invenção engloba a utilização de qualquer forma opticamente activa ou racémica do ligante. A síntese das formas opticamente activas pode ser efectuada por técnicas convencionais da química orgânica bem conhecidas.

A compreende de preferência o radical de toxina e B compreende o radical de ligação à célula alvo.

Tal como acima referido, o radical de toxina pode compreender qualquer componente que possua propriedades citotóxicas. Exemplos desses componentes incluem polipéptidos que são susceptíveis de desactivar ribossomas e assim inibem a síntese das proteínas. Exemplos particulares incluem polipéptidos que são encontrados na natureza e componentes desses polipéptidos. Quando um desses polipéptidos compreende um componente tóxico e um componente essencialmente não tóxico, o radical de toxina compreende convenientemente o componente tóxico. Por exemplo o radical de toxina pode compreender ricina, mas convenientemente o radical de toxina compreende a cadeia A da ricina.

radical de toxina pode também compreender partes ou análogos de polipéptidos encontrados na natureza, que possuem propriedades citotóxicas. Os polipéptidos adequados para o radical de toxina e a sua preparação são descritos em Ribosome inactivating proteins up to date” Stripe F. e Barbieri L., FEBS 3269 e nas referências ali indicadas. Os polipéptidos particularmente adequados para o radical de toxina incluem a cadeia A da ricina (ricina A), restritocina e toxina shiga. Outros polipéptidos adequados para o radical de toxina incluem abrina, viscumina, modecina, volquensina, gelonina, proteína antiviral combinada, saporina, lufina, tricosantina, proteína desactivante do ribosoma da cevada, diantinas, biodina, mormodina, tritina, dodecandrina, a-sarcina, mitogelina, toxina da difteria, e toxinas do tipo shiga, VT1 e VT2.

Os análogos de polipéptidos encontrados na natureza incluem os polipéptidos que têm uma estrutura primária que está relacionada com o polipéptido encontrado na natureza por diferir de uma ou mais alterações de aminoácidos (eliminações, adições, substituições) que não resultam numa perda da actividade citotóxica. Exemplos particulares desses análogos incluem aqueles em que a alteração ou alterações facilitam o acoplamento ao radical de ligação à célula alvo.

Quando o radical de toxina compreende um polipéptido encontrado na natureza ou uma parte dele o radical de toxina pode ser preparado por isolamento do polipéptido de uma fonte natural e quando é requerida uma parte, a modificação do polipéptido isolado por meios químicos por exemplo enzimaticamente. 0 polipéptido ou parte dele pode também ser preparado por técnicas de engenharia genética. Essas técnicas incluem as tecnologia de ADN recombinante em que é habitualmente incorporada uma sequência de ADN que codifica para o polipéptido pretendido num vector ou plasmídio adequado. As células hospedeiras transformadas com o vector ou plasmídio podem ser cultivadas em condições adequadas para se obter a expressão da sequência de ADN e a produção do polipéptido.

É preferível que o radical de toxina compreenda ricina A, uma parte dela ou um seu análogo. Quando o radical de toxina compreende a ricina A, a ricina A pode ser obtida a partir de sementes de Ricinis Communis ou da planta de sementes de rícino. Contudo, é preferível que a cadeia A ou a ricina seja preparada por técnicas de engenharia genética. Assim é preferível a ricina A ou ricina.

A ricina A obtida por meio de tecnologia de ADN recombinante é geralmente preferida à obtida a partir de fontes naturais dado que a tecnologia de ADN recombinante permite a preparação da ricina A que não é contaminada com a cadeia B da ricina, e a ricina A preparada desta forma não é glicosilada. Assim a utilização da ricina A recombinante tende a conduzir a um conjugado mais selectivo devido à ausência da cadeia B indiscriminadamente ligante e

a ausência de radicais de açúcar que são susceptíveis de uma interacção não específica com as superfícies das células.

Numa realização preferida um conjugado da presente invenção compreende um radical de ligação à célula alvo que é selectivo para as células de tumores colorectais.

O radical de ligação à célula alvo compreende de preferência um anticorpo C242 ou um seu fragmento, especialmente um anticorpo C242.

O radical de toxina e o radical de ligação à célula alvo são de preferência acoplados através do radical tri-mercaptobutírico, -CO.CH₂.CH(CH₃)-S-. Este radical é convenientemente ligado ao radical de ligação à célula alvo por meio de uma ligação covalente entre um grupo NH do radical de ligação à célula alvo, por exemplo o radical NH de um resíduo de lisilo, e uma ponte de dissulfureto com um grupo tiol no radical de toxina, por exemplo o grupo tiol do resíduo de cisteína na ricina A.

Assim em particular, a presente invenção proporciona uma imunotoxina que compreende um anticorpo C242 e a ricina A recombinante, ligados de um resíduo de amino em C242 a um tiol do resíduo da cisteína em ricina A pelo radical 3-mercaptobutírico, -COCH₂CH(CH₃)-S-.

Uma imunotoxina preferida é aquela que compreende um anticorpo C242 e ricina A recombinante, ligados a partir de um grupo terminal de um resíduo de lisilo em C242 ao tiol terminal de um resíduo de cisteína em ricina A por meio de um diradical de ácido 3mercaptobutírico.

Cada unidade de anticorpo conterá, em geral, pelo menos uma unidade de ricina A. Deve notar-se que uma unidade de anticorpo pode conter mais do que um radical de ricina A recombinante através dos respectivos radicais ligantes. Deve notar-se que o anticorpo pode conter um ou mais radicais ligantes para além daqueles que estão ligados à ricina A. Estes radicais ligantes adicionais podem conter uma molécula não tóxica, por exemplo a cisteína. Esses ligantes podem assim ser cobertos” pela molécula não tóxica.

As imunotoxinas da presente invenção têm utilização potencial de tratamento de tumores gastrointestinais, em particular em tumores pancreáticos e colorectais. Assim de acordo com a presente invenção é também proporcionado um método de tratamento de tumores gastrointestinais compreendendo a administração de uma quantidade eficaz (tal como aqui definida) a um mamífero de sangue quente, como por exemplo o homem.

Deve notar-se que a dose e o regime de dosagem dependerão do radical de toxina particular utilizado, população da célula alvo e história do paciente. A dose do conjugado administrado estará tipicamente na gama de 0,1 a 1 mg/kg de peso do paciente.

Os conjugados da presente invenção serão geralmente administrados sob a forma de uma composição

farmacêutica. Assim de acordo com a presente invenção é também proporcionada uma composição farmacêutica que compreende um conjugado (tal como aqui definido) em associação com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas sob a forma de vários tipos de dosagem. Geralmente, os conjugados da presente invenção serão administrados parentericamente, de preferência intravenosamente. Uma composição farmacêutica parentérica particular é aquela que é formulada numa forma de unidade de dosagem que adequada para a administração por injecção. Assim, as compreendem uma solução, emulsão ou suspensão da imunotoxina em associação com um veículo ou diluente parantérico farmaceuticamente aceitável. Os veículos ou diluentes adequados incluem veículos aquosos, por exemplo água ou solução salina, e veículos não aquosos, por exemplo óleos fixados ou liposomas. As composições podem incluir agentes que aumentam a estabilidade do conjugado na composição.

Por exemplo, a composição pode incluir um exemplo Tween. A concentração do conjugado variará, mas em geral o conjugado será formulado em concentrações de cerca de 1 a 10 mg/dose.

anticorpo C242 é selectivo para células de tumores de colo-rectais e verificou-se que os conjugados

que incorporam neste anticorpo eram imunotoxinas potentes que são selectivas para células de tumores colo-rectais.

Em particular, o conjugado preferido da presente invenção revelou ser uma imunotoxina surpreendentemente eficaz por ser selectiva para células de tumores colorectais e ser também potente. Este conjugado também revelou ter uma relativamente baixa densidade de eliminação no sangue e clivagem e destruição extra-celular, conduzindo a maior persistência no plasma. Este facto tem a vantagem potencial de permitir que a imunotoxina esteja presente durante um tempo suficiente para interactuar com as suas células alvo antes da eliminação ou destruição ter lugar.

A presente invenção também proporciona um processo para a preparação de um conjugado tal como acima descrito:

a) Para os conjugados em que o radical de ligação ã célula alvo está directamente acoplado ao radical de toxina, faz-se reagir o radical de toxina com o radical de ligação à célula alvo.

Por exemplo, quando o radical de ligação à célula alvo está acoplado ao radical de toxina por meio de uma ponte de dissulfureto, um de entre os radicais de ligação à célula alvo do radical de toxina pode ser reduzido utilizando, por exemplo, ditiotreitol antes da reacção com o outro radical escolhido de entre o radical de ligação á célula alvo e o radical de toxina.

Para os conjugados em que o radical de ligação à

- 26 célula alvo está acoplado ao radical de toxina por meio de um ligante, faz-se reagir o radical de ligação à célula alvo derivado com o ligante com um radical de toxina, ou faz-se reagir o radical de toxina derivado com o ligante com o radical de ligação à célula alvo.

radical adequado é derivado por meio da reacção com um agente de ligação de modo a ligar o ligante a esse radical. 0 radical de ligação à célula alvo derivado é convenientemente feito reagir com o radical de toxina.

radical de ligação à célula alvo derivado ou radical de toxina derivado pode ser preparado, por exemplo, por dissolução desse radical num tampão adequado (como por exemplo um tampão de acetato, fosfato ou borato) e ajustando o valor de pH a um valor que é compatível com o agente de ligação. 0 agente de ligação pode ser em seguida adicionado à mistura reaccional. Nos casos em que o agente de ligação é insolúvel na mistura reaccional, pode ser adicionada uma solução de radical de solução à célula alvo ou o radical de toxina como adequado a uma solução do agente de ligação numa pequena quantidade de solvente orgânico como por exemplo sulfóxido de dimetilo ou a dimetilformamida. Após a reacção com o agente de ligação o produto derivado pode ser separado por técnicas convencionais como por exemplo filtração de gel, diálise ou cromatografia de coluna. 0 produto derivado (radical de ligação à célula alvo ou radical de toxina derivado) pode ser em seguida feito reagir com o outro radical para produzir o conjugado final.

Deve dizer-se que a natureza exacta do agente de ligação utilizado será dependente da natureza dos grupos (por exemplo tiol, carboxi ou amino) no radical de ligação à célula alvo e do radical de toxina que estão disponíveis para conjugação.

radical de toxina pode ser preparado a partir de fontes naturais. É preferível que o radical de toxina seja preparado por meio de tecnologia de ADN recombinante. Esta tecnologia utiliza técnicas bem conhecidas dos especialistas e inclui técnicas para extrair mARN, preparando bibliotecas de cADN, construindo vectores, transformando células e cultivando célula hospedeiras transformadas para se obter a expressão do polipéptido de toxina. Os hospedeiros adequados para expressão dos radicais de toxina pretendidos incluem procariotas, por exemplo E. coli e eucariotas, por exemplo leveduras. Estes processos são ilustrados na preparação do conjugado a seguir descrito.

radical de ligação à célula alvo compreende em geral um anticorpo ou um fragmento derivado de anticorpo. 0 anticorpo compreende de preferência um anticorpo monoclonal. os anticorpos podem ser preparados por processos bem conhecidos. Eles podem ser isolados do soro, do baço e de hibridomas que segregam anticorpos.

A preparação dos anticorpos é descrita, por exemplo, em Methods in Enzimology; Volume 178; Antobodies,

Antigens and Molecular Mimicry, Editado por J Langone, Academic Press Inc (ver, em particular Section II: Engineered Antibodies); e Methods in Enzimology; Volume 73; Immunochemical Techniques Part B; editado por J Langone e H Van Vunakis; Academic Press Inc (ver, em particular, Secção I: Production of Antibodies).

Quando o ligante compreende o grupo -S-X-CO-, o anticorpo (ou o radical de toxina) pode ser derivado por reacção com o composto com a fórmula L.J-S-X-CO-L2, em que ^L1 ^{e l}2 ^sã° Çpmpos substituíveis. Por exemplo CO-Lg pode compreender um grupo de ácido carboxílico ou, de preferência, um grupo de ácido carboxílico activado. Por exemplo, o grupo C0-L₂ pode compreender um grupo éster ou anidrido. Agentes particulares para L₂ incluem o grupo imidazole ou um grupo de éster de succinimidilo. L_x pode compreender um grupo que é deslocado por oxidação do grupo tio, por exemplo pode compreender um grupo piridino. O ligante é em geral feito reagir com um grupo tiol reduzido no anticorpo ou no radical de toxina (de preferência o radical de toxina).

Quando são utilizados outros ligantes eles são feitos reagir com o anticorpo e o radical de toxina por processos conhecidos. Geralmente, o ligante é feito reagir com grupos funcionais respectivos disponíveis no radical de ligação à célula alvo e no radical de toxina. Contudo, os radicais de ligação à célula alvo e de toxina podem ser acoplados directamente, por formação de uma ligação covalente, por exemplo uma ponte de dissulfureto.

Quando o radical de toxina tem um grupo sulfidrilo, como por exemplo o grupo de um resíduo de cisteína, este pode ser utilizado em conjugação. Por exemplo ele pode ser utilizado para formar uma ligação de dissulfureto com o grupo sulfinilo no radical de ligação à célula alvo ou no ligante. Quando o grupo sulfidrilo não estiver presente no radical de toxina, ele pode ser derivado de forma a proporcionar esse grupo e assim facilitar a conjugação. Esta derivação pode ser efectuada utilizando, por exemplo, iminotiolano.

Quando são utilizados ligantes de polipéptido pode ser feito reagir um ligante com grupos carboxi ou amino livres nos radicais de toxina e de ligação à célula alvo.

Quando o radical de toxina compreende a cadeia A da ricina e o ligante compreende o diradical -COCH₂CH(CH₃)-S-, um agente de ligação adequado é o 3-(2piridiltio)-butirato de N-succinimidilo. Um processo preferido para a preparação dessa imunotoxina compreende fazer-se reagir o radical de ligação à célula alvo derivado com ricina A reduzida.

radical de ligação à célula alvo é derivado da reacção com o agente de acoplamento, como por exemplo o butirato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio), e a cadeia A da ricina é reduzida por tratamento com um agente redutor adequado para reduzir o grupo tiol no grupo de cisteína livre, utilizando por exemplo, ditiotreitol.

Utiliza-se por conveniência um excesso de agente ligante, de forma a que o radical de ligação à célula alvo derivado tenha mais do que um ligante a si ligado. Após a ligação com ricina A são convenientemente ligados quaisquer grupos de ligação que não estejam ligados à ricina A por reacção com um agente de bloqueamento, por exemplo a cisteína.

Os conjugados da presente invenção são potencialmente úteis para o tratamento de tumores. Este facto pode ser demonstrado pela capacidade do conjugado para inibir a síntese de proteínas em células de tumores in vitro, e pela capacidade do conjugado para reduzir o crescimento de tumores in vivo. Os pormenores dos procedimentos de ensaio adequados são a seguir indicados.

Breve dos desenhos

Figura ilustra construção de pICI 0020;

Figura ilustra construção de pTB344;

Figura ilustra construção de pICI

0042;

Figura ilustra construção de pICI

1079;

Figura ilustra construção de pICI

1187;

Figura ilustra um gel de SDS revelado com azul de

Comassie de lisados de E. coli em que a fila A é pICI 1102;

B é pICII 0020, e C são marcadores de peso moleculares;

A Figura 7 ilustra um perfil de gel de pICI 1102 em que o pico R representa ricina A;

A Figura 8 é uma revelação de Western da ricina A produzida por pICI 1102 e em que a fila 1 são maracadores de peso moleculares; 2 e 3 são clones não produtores de ricina; 4 e pICI 1102, e 5 é pICI 0020 (sequência de controlo de plasmídio-não ricina A);

A Figura 9 é sequência parcial de pICI 1102;

A Figura 10 ilustra a construção de pICI 1102;

A Figura 11 descreve um fragmento utilizado na preparação de plasmídios;

A Figura A Figura	12 é um mapa 13 ilustra a	de plasmídios de pICI 0042;
. sequência de um	terminador de
transcrição;
A	Figura	14 é	um mapa	de	plasmídios	de	pICI 1079;
A	Figura	15	ilustra	a	endocitose	de	125I—0242	por
células	COLO 205;
A	Figura	16	ilustra	a	citotoxicidade in vitro	da

imunotoxina C242/ricina A contra células COLO 205;

A Figura 17 ilustra um anticorpo;

A Figura 18 ilustra a sequência de cADN da cadeia kappa C242, região variável (cADN no plasmídio pKGE761); e

A Figura 19 ilustra a sequência de cADN da cadeia pesada de C242, região variável (cADN no plasmídio PKGE762).

A invenção será agora ilustrada pelos seguintes Exemplos não limitativos nos quais, a menos que se diga o contrário:

(i) As evaporações foram efectuadas por evaporação rotativa em vazio;

(ii) As operações foram efectuadas à temperatura ambiente, isto é na gama de 18 a 26°C;

(iii) Os rendimentos são dados apenas para ilustração e não são necessariamente os máximos que se podem conseguir numa realização cuidadosa do processo;

(v) Os espectros de RMN protónicos foram normalmente determinados a 200 MHz em sulfóxido de dimetilo deuterado como solvente, utilizando tetrametilsilano (TMS) como padrão interno, e são expressos como desvios químicos (valores de delta) em partes por milhão em relação a TMS utilizando as abreviaturas convencionais para a designação dos picos importantes: s, singleto; m, multipleto; t, tripleto; br, largo; d, dobleto; e (vi) São utilizadas as seguintes abreviaturas:

BSA - albumina de soro de bovino

PBS - solução salina tamponada com fosfato

IPTG - isopropiltio-B-galactósido

EtOH - etanol

SDS-PAGE - dodecil sulfato de sódio (SDS) electroforese de gel de poliacrilamida (PAGE).

PREPARAÇÃO DA IMDNOTOXINA DE RICINA A/C242

Foi concentrada a 12 mg/ml uma solução do anticorpo monoclonal C242 (200 mg) em solução salina tamponada com fosfato (fosfato de sódio/150 mM cloreto de sódio pH 7,2) por meio de filtração em membrana (membrana Amicon YM10) a 4'’C. O concentrado foi diluído com 0,5 vol de tampão de borato (borato de sódio 100 mM pH 9,1). A concentração de proteína foi determinada por monitoração da absorvância a 280 nm e o valor de pH da solução mista foi registado a um valor de 8,8 ± 0,1.

Foi dissolvido o 3-(2-piridiltio) butirato de Nsuccinimidilo (o ligante) em dimetilformamida ou acetonitrilo seco, redestilado a uma concentração de 10 mg/ml. Foi adicionada imediatamente uma alíquota desta solução (0,352 ml), contendo 3,52 mg de 3-(2-piridiltio) butirato de N-succinimidilo à solução de anticorpo concentrada. A solução resultante foi agitada e em seguida deixada em repouso a 20°c durante uma hora. A solução foi em seguida aplicada a uma coluna de dessalinização (G25 Sephadex - Pharmacia, 2,6 x 58 cm, caudal 2 ml/min, equilibrada com 50 mM de fosfato de sódio/150 mM de cloreto de sódio/1 mM AEDT a pH 8,0) de modo a remover os reagentes em excesso e permuta de tampão no anticorpo derivado. Alternativamente, os produtos de reacção podem ser removidos por filtração em contra corrente. O anticorpo derivado dessalinizado foi combinado e a concentração de proteínas foi determinada por monitoração da absorvância a 280 nm. A extensão de derivação com o ligante foi determinada por meio da adição de ditiotreitol em excesso e a monitoração da libertação do grupo tiopiridilo livre a 343 nm. A extensão de derivação revelou ser de 4 a 6 de grupos ligantes por mole de anticorpo.

A ricina A recombinante foi reduzida tratando uma solução de ricina A em tampão de fosfato a pH 8 com ditiotreitol em excesso e concentrada por filtração em contra-corrente. Os reagentes em excesso foram removidos por cromatografia de coluna (G25 Sephadex - Pharmacia, 2,6 x 58 cm, caudal 2 ml/min, equilibrada com 50 mM de fosfato de sódio/150 mM de cloreto de sódio/1 mM AEDT a pH 8,0).

A ricina A recombinante foi conjugada para derivar anticorpo conjugado por mistura de solução de ricina A recombinante preparada (190 mg) e o anticorpo derivado (190 mg) numa proporção de 1:1 p/p de Ricina A/anticorpo derivado. Foi adicionado glicerol até 20% v/v e o recipiente foi purgado com árgon. A solução resultante foi mantida a 15 °C durante um período de tempo de 40 a 65 horas.

Foi em seguida adicionada cisteína até uma concentração final de 0,2 mM (e pelo menos um excesso de 10 vezes molar em relação aos grupos ligantes de um anticorpo) de modo a cobrir os grupos ligantes em excesso no anticorpo. A solução foi agitada e mantida a 20°C durante 2 a 3 horas. Após a cobertura com cisteína, foi analisada uma amostra da imunotoxina resultante por tratamento com ditiotreitol em excesso e o conjunto foi monitorado a 343 nm para quantificar o fim da reacção.

A solução contendo o conjugado foi em seguida concentrada por filtração em membrana (membrana Amicon YM10) e aplicada a uma coluna de cromatografia (G25 Sephadex - Pharmacia, 2,6 x 50 cm, caudal 3 ml/min, tampão de 50 mM de fosfato de sódio/25 mM de cloreto de sódio/1 mM AEDT) o que resulta na separação da imunotoxina e do anticorpo não conjugado da ricina A não conjugada. 0 pico contendo a mistura de imunotoxina e o anticorpo foram combinados e a concentração de proteínas foi determinada medindo a absorvância a 280 nm.

A solução resultante contendo anticorpo não conjugado e imunotoxina foi ajustada a pH 6,3 pela adição de HC1 1 M e aplicada a uma coluna contendo uma matriz do corante triazina (Mimetic A6XL, ACL pcl, Cambridge, Reino Unido, coluna 8x6 cm, caudal de 1,5 ml/min). A coluna foi lavada com 100 ml de tampão de partida o que provoca a eluição do anticorpo não conjugado e da imunotoxina eluída com o tampão de partida contendo cloreto de sódio 0,5 Μ. A solução de imunotoxina foi dialisada contra uma solução salina tamponada com fosfato, filtrada através de um filtro de 0,22 micrometros e armazenada a 4°C.

A pureza da imunotoxina foi determinada por electroforese de SDS poliacrilamida e continha um total de 45 mg de imunotoxina com a composição: mono derivado de Ricina A de 50 a 60%, di derivado de Ricina A de 10 a 30%, tri derivado de Ricina A de 5 a 15% e anticorpo não derivado <10%.

Alternativamente a fase de filtração de gel (remoção de r-ricina A residual) e a fase de cromatografia de afinidade em corante (remoção do anticorpo C-242 residual) podem ser transportas na sequência de

conjugação, imediatamente após o bloqueamento dos radicais ligantes não reagidos com cisteína (da forma acima descrita) é diluída até uma condutividade inferior a 5 mS com água destilada. 0 pH é em seguida ajustado a 6,0 com ácido acético 1 M e a solução é clarificada por filtração em membrana. A solução é em seguida aplicada a uma coluna de ligante contendo um corante (2,5 ml gel/mg de r-ricina A utilizada na mistura de conjugação). A coluna é em seguida lavada com acetato de sódio a 0,68% a pH 6,0 até o anticorpo C242 não conjugado ter sido lavado através da coluna. A imunotoxina e a r-ricina A residual podem ser eluidas da coluna com tampão de fosfato de sódio 20 mM a um valor de pH de 7,0, 0,5 M em relação à concentração de cloreto de sódio. Este eluido é em seguida concentrado por filtração em contra-corrente utilizando um sistema de ultra-filtração de cartuchos em espiral e aplicado a uma coluna de Sephacryl S300HR (2,5 ml de gel por cada mg de anticorpo utilizado na reacção de conjugação original e num volume <5% do volume total da coluna). A coluna pode ser equilibrada em qualquer tampão de formulação adequado como por exemplo solução salina tamponada com fosfato a pH 7,2.

PREPARAÇÃO DO RADICAL LIGANTE

ÍR)-3-(2-Piridiltio] butirato de N-Succinimidil acima utilizado foi preparado utilizando o seguinte procedimento:

(Rl-3-f2-Piridiltio) butirato de N-Succinimidilo

Foi dissolvido o ácido (R)-3-(2-piridiltio)butírico (90,0 g, 0,393 mol) em diclorometano (630 ml) com agitação à temperatura ambiente. Foi adicionada hidroxisuccinimida (45,2 g, 0,393 mol, 1,0 mol equivalentes) e lavada a mistura com diclorometano (90 ml). A mistura foi agitada durante 30 minutos com arrefecimento a -2°C. Foi adicionada uma solução de diciclohexilcarbodiimida (81,08 g, 0,939 mol, 1,0 mol equivalentes) em diclorometano (540 ml) durante um período de 35 minutos, enquanto se mantinha a temperatura da reacção a o‘c ± 2°C, e lavou-se a mistura com diclorometano (90 ml). A solução foi agitada ã temperatura de 0 a 10”C durante 3 horas e 15 minutos e em seguida foi deixada aquecer para a temperatura ambiente. A solução foi filtrada para remover a diciclohexilureia sólida que foi lavada com diclorometano (180 ml x 2). O filtrado foi evaporado a pressão reduzida a 20 - 22°C para se obter um óleo castanho (150 g). Este óleo foi cromatografado por cromatografia numa coluna de Kiesegel 60 de sílica de gel com 230 - 400 malhas (1180 g) preparada em tolueno/acetato de etilo 80: 20 v/v. A eluição com tolueno/acetato de etilo (80:20 v/v) produziu o (R)-3-(2-piridiltio) butirato de N-succinimidilo (52 g) sob a forma de uma goma amarela clara após a evaporação em vazio (0,25 mbar) a 28°C.

RNM:

1,5 (d,3H), 2,85 (m,4H), 2,8 (dd,lH), 3,2 (dd,lH), 3,5 (m,lH), 7,1 (m,2H), 8,5 (d,lH).

A espectroscopia de massa de impacto electrónico revelou que o composto tinha um peso molecular de 326, com uma fragmentação consistente com a estrutura de (R)-3-(2piridiltio) butirato de N-succinimidilo.

material de partida foi preparado da forma seguinte:

a. Ácido (R)-3-Hidroxibutírico

Foi arrefecido o (R)-3-hidroxibutirato de metilo (1,670 kg, 14,152 mol) num banho de gelo/etanol. Foi adicionada água (4698 ml), seguida de hidróxido de sódio a 47% p/p (965 ml, 16,98 mol, 1,2 mol equivalentes) a uma taxa de forma a manter a temperatura a 0 ± 2°C. A mistura reaccional foi agitada a 0°C durante mais 1 hora e 30 minutos. Foi adicionado ácido clorídrico concentrado (1490 ml, 17,28 mol, 1,22 mol equivalentes) à mistura reaccional durante um período de 35 minutos, enquanto se mantinha a temperatura a 5°C ou inferior, para se obter um pH final de 1,5. Foi em seguida adicionado cloreto de sódio (1061 g) à mistura e a mistura aquosa foi extraída com éter metilbutílico (10 x 3,5 1). Os extractos foram combinados e o solvente foi removido por destilação em vazio à temperatura ambiente para se obter um resíduo. Foi misturado tolueno (7,5 1) e o resíduo e o material volátil foram removidos por destilação em vazio para se obter o ácido (R)-3hidroxibutírico (1189 g, 81%) como um óleo. Este óleo foi arrefecido para 4°C e nucleado para dar origem a um sólido.

b. f S)-B-Butirolactona

Foi misturado o ácido (R)-3-hidroxibutírico (530 g, 5,096 mol) com ortoacetato de trietilo (1322,8 g, 8,154 mol, 1,6 mol equivalentes) a 25-30°C para se obter uma solução turva (pensa-se que a turvação era devida ao cloreto de sódio residual obtido da fase anterior).

A solução foi evaporada em alto vazio (133 Pa) a 30 °C para se remover o material volátil. O líquido residual (1,001 g), que continha a (2S,6R)-2-etoxi-2,6-dimetil-l,3dioxan-4-ona, foi aquecido a 80°C durante 2 horas e em seguida arrefecido para 40°C. 0 produto bruto foi destilado através de uma coluna de vidro (50 cm x 3,5 cm de diâmetro) cheia com anéis de vidro de Raschig para se obter a (S)-Bbutirolactona (57,3 g), com um ponto de ebulição de 59-62°C a 10-12 mbar.

c. Ácido (R)-3-mercaptobutírico

Foi arrefecida a (S)-B-butirolactona (91,12 g,

1,058 mol) a 5°C com agitação em azoto. Adicionou-se ácido tiolacético (80,57 g, 75,65 ml, 1,058 mol, 1,0 mol equivalentes) mantendo a temperatura a 5°C. Foi em seguida adicionada trietilamina (146,7 ml, 1,058 mol, 1,0 mol equivalentes) durante um período de 45 minutos, enquanto se mantinha a temperatura da reacção entre -5 a +5°C. O banho de arrefecimento foi removido e a temperatura subiu para 65°C, dando origem a uma solução amarela/cor-de-laranja. A

mistura reaccional foi arrefecida para 10°c e agitada à temperatura ambiente durante a noite. A solução foi arrefecida para 0°C e foi adicionada água (93 ml). A mistura foi depois arrefecida para ”10°C, e em seguida tratada com uma solução de hidróxido de sódio (185 ml de uma solução a 47% p/p de hidróxido de sódio e 92 ml de água), sendo a taxa de adição tal que a temperatura se mantinha entre -10 e +10°C. A mistura foi em seguida agitada durante 1,5 horas a -5°C e em seguida deixada aquecer para a temperatura ambiente. A mistura foi lavada com éter metil t-butílico (265 ml). A fase aquosa foi diluída com água (185 ml), arrefecida para 0°C e tratada com ácido clorídrico concentrado (270 ml) a 0-10°C até o valor de pH ser de 1-2. A mistura aquosa foi em seguida extraída com éter metil t-butílico (2 x 265 ml). Os extractos orgânicos foram combinados, lavados com água (265 ml), secos em sulfato de magnésio anidro e evaporados a pressão reduzida a 30 °C para se obter um óleo cor-delaranja (132,8 g). Este óleo foi purificado por destilação em vazio para se obter o ácido (R)-3-mercaptobutírico (86,6 g), ponto de ebulição 96-100°C a 2 mbar.

d. Cloreto de Piridino-2-Sulfenilo

Foi dissolvido o dissulfureto de 2,2'-dipiridilo (110,0 g, 0,5 mol) em diclorometano (800 ml) à temperatura ambiente para se obter uma solução amarela clara que foi arrefecida para 0°C. Foi borbulhado cloro gasoso e a

solução foi mantida entre 0-5°C. Passadas 3 horas e 25 minutos a solução foi saturada com cloro e tomou uma coloração castanho-dourada. A solução foi concentrada a pressão reduzida a 0-5°c para remover o cloro em excesso e precipitar o cloreto de piridino-2-sulfenilo sob a forma de um sólido amarelo. Este sólido (11,8 g) foi recolhido por filtração e lavado com diclorometano. 0 filtrado de diclorometano (1624 g) continha mais 133 g de cloreto de piridino-2-sulfenilo.

e. Ácido (R)—3—f 2—piridiltiolbutírico

Foi diluído com diclorometano (50 ml) o cloreto de piridino-2-sulfenilo (11,8 g do sólido amarelo e 1035 g da solução de diclorometano acima preparada, num total de 0,667 mol, 1,0 equivalentes molares). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos e em seguida arrefecida para -5°C. Foi adicionada uma solução do ácido (R)-3-mercaptobutírico (80,0 g, 0,667 mol) em diclorometano (400 ml), mantendo a temperatura entre -5 e 0°C. A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente para se obter um óleo castanho e uma parte amarela superior. Foi adicionada água (485 ml) à mistura que foi em seguida arrefecida para 5°C e tratada com uma solução 2 N de hidróxido de sódio (385 ml) até o pH ser 4,55. A fase de diclorometano foi separada e a fase aquosa restante foi extraída com diclorometano (200 ml). Os extractos de diclorometano foram combinados, secos em sulfato de

magnésio anidro e evaporados à pressão reduzida para se obter um óleo castanho claro. O óleo foi agitado vigorosamente com hexano (325 ml) e arrefecido num banho de gelo até se formar um sólido. A mistura foi agitada durante 3 horas, e em seguida o sólido cristalino castanho foi recolhido por filtração, lavado com hexano (2 x 162 ml) e seco durante a noite à temperatura ambiente em vazio para se obter o ácido (R)-3-mercaptobutírico (140 g).

RMN:

1,45 (d,3H), 2,6 (dd,lH), 2,8(dd,lH), 3,4(m,lH), 7,l(m,lH), 7,7(m,2H), 8,5(m,lH).

PREPARAÇÃO DO ANTICORPO C242 ÍC242:I1

Estabelecimento da linha de células de hibridoma e produção de C242:II

Preparação de células do bago estabelecidas

Foi cultivada de forma habitual em meio MEM

Inscove complementado com 10% de soro de vitela fetal (SDS) uma linha de células de carcinoma colo-rectal humano, COLO 205, comercialmente disponível da American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., Estados Unidos da América, com o número de acesso No. CCL 222. As células foram colhidas antes da confluência, geralmente 2 ou 3 dias após a subcultura, e lavadas por 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para imunização.

Foram imunizados ratos BALB/c, com 4 a 6 semanas de idade, intraperitonialmente com uma dose primária de 3 x *7

10⁷ células COLO 205 suspensas em 0,1 ml de solução salina tamponada com fosfato. Os animais foram em seguida tratados com outra suspensão de 0,1 ml de 3 x 10⁷ células COLO 205 e sacrificados quatro dias depois e os seus baços foram removidos. Os baços foram em seguida dissociados numa única suspensão de células.

Preparação do hibridoma

Foram distribuídas entre dois tubos 1,2 x 10⁷ células do baço obtidas a partir da suspensão de células acima descrita. A cada tubo foram também adicionadas 10⁸ de células de mieloma da linha de células de mieloma de rato Sp2/0 (disponível da colecção da American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., Estados Unidos da América, com o número de acesso No. CRL 1581). Os dois tubos foram centrifugados, e todo o líquido foi decantado. A cada tubo foram em seguida lentamente adicionados 2 ml de uma solução de PEG a 37°C (10 g de PEG PM 4000, 1 ml de SODM (sulfóxido de dimetilo) e 10 ml de uma solução salina monoclonal) durante 1 minuto e com agitação constante. Os tubos foram transformados num banho de água a 37 °C durante 90 segundos com agitação moderada. A fusão foi interrompida por adição a cada tubo de ensaio de uma solução fisiologicamente tamponada de acordo com o seguinte esquema: 2 ml durante os primeiros 30 segundos, 6 ml durante os 30 segundos seguintes e mais 32 ml no período de minuto. Após a lavagem da suspensão de células no meio de cultura foram suspensas totalmente em 100 ml de meio de cultura suplementado de hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT). O meio de cultura era MEM Iscove suplementado com 10% de FCS L-aspargina (36 mg/1), L-arginina-HCl (116 mg/1), ácido fólico (10 mg/1), L-glutamina (292,3 mg/1), piruvato de sódio (110,1 mg/1) e mercaptoetanol (3,49 μΐ/ΐ). Foram distribuídas alíquotas de 50 μΐ aos furos de placas de cultura de tecidos de 96 furos. Os furos tinham sido pré-revestidos com 250 μΐ de uma suspensão de macrofagos de rato BALB/c (2 χ 10⁴ células/ml) em meio de cultura suplementado com HAT. 0 meio foi mudado 6 dias após a fusão.

Escrutínio de hibridomas de anticorpos

O meio gasto do dia 6 anterior foi ensaiado para determinar os anticorpos positivos de COLO 205 da forma descrita por Kennet R.H., Enzyme-linked antibody assay with cells attached to polyvinyl chloride plates”. Monoclonal Antibodies, Hybridomas, A new dimension in biological analyses, Ed. H.R. Kennett, T.J. McKelvin, K.B. Bechtol, Plenum Press, Nova Iorque 1980. Resumidamente, Foram revestidos os furos de imunoplacas Nunc do tipo IIF com 2 χ 10⁵ células/furo de células COLO 205 (1 mg/100 ml de PBS); volume do revestimento 50 μΐ. O meio de cultura gasto acima mencionado do dia 6 foi em seguida adicionado aos furos, 50 μΐ/furo. Passado o tempo de incubação durante a noite à

temperatura ambiente foi adicionada Ig anti-rato conjugada com peroxidase (Dakopatts P260, Dakopatts A/S, Copenhaga, Dinamarca) diluída (1/500) com 1% de BSA-PBS a 100 μ9/ίπτο e incubada à temperatura ambiente durante a noite. Foi em seguida adicionado substrato, sob a forma de 4 comprimidos de OPD Dako S2000 dissolvidos em 12 ml de tampão de ácido cítrico_P pH 5.0 mais 5 wl de peróxido de hidroaénio a 30%, a 100 ííl/furo e a absorvância foi medida a 450 nm após a incubação.

Foram ensaiados aproximadamente 600 clones de hibridoma. Inicialmente. 190 destes reaairam com células COLO 205. Entre estes. 127 também reaairam com linfócitos humanes normais preparados em Lvmphoprec de Nvecraard A/S. Wnrnficra. e rnra® nfisnreKaãns. im nní=r pjnnfis fisfansififiirins ris mim ttos rssnnes í-ftsxanPes foi rissionatin nor hihndnBa t“242 e Fm isotinano cnmo np.rf.p.nneníin a niasse Τσΰί . Ω hihnnorea

C242 fm s» sacnuria sntweti do e vânas rases dft suftainnaaan nara nroíluzir um anr.icnrnn Finai . esr.ãve s e annoninna! nraiimimln um rínns riPF.i cmann rsnr _

Assim. n hi hr i rinma pa mimei m

r.innadn rfisiiitannn num ninne íípc.ianann nnr

Esr.fi

r.ínnfi Fm nnr sua vp.s cinnacín nara

Fnrmar um • nne.

hi hri riíTm.ap.

ran asnas astas n i onannp.s.

a siisnansan

Fm em mm n rie ou i r.nra íinm h i nrwanti na zr.i aini na ! «T !

atè uma nã i 13 í aszm i . Fnraa ri i sm nu i rins hí.· fnrn ni™ nratn ííp cu i nira ns rums nm isti rios

250 μΐ com suspensão de macrofagos de rato Balb/c (5 x 10^ macrofagos/furos) em meio de cultura suplementado com HT. Passados 2-5 dias, os clones das células simples foram detectados por inspecção visual num microscópio. No dia 6, foi alterado o meio e foram analisadas alíquotas do meio gasto para determinar as quantidades de anticorpos que se lioavam às células COLO 205 mas não às células humanas normais nelo ensaio de ELISA da forma acima descrita. Os melhores clones em termos de reaccão oositiva no ensaio de ELISA com as células COLO 205 com reaccão neaativa de retenção no ensaio de ELISA de células normais foram escolhidas e conoeladas dentro de frascos em azoto liauiao mara nosterior desenvolvimento.

rara etectuar uma terceira cionacao, as ceiuias foram aesconaeiaaas e cuitivaaas em meio íjmeh ímsio ae Lacrie noaiticaao com ouibecco) os ae res (soro ae viteia vetaii s. as ceiuias foram em seouiaa coiocaaas nos furos ae uma uiaca ae cultura ae teciaos com y& furos a uma aensiaaae meaia ae tres ceiuias mor turo. a cionacao íoi etectuaaa em um com as ae res e foram utmzaaos macrctaaos ae rato como ceiuias ae aiimentacao. Nesta tiaca. ocorriam 3u clones aos auais 16 toram ensaiaaos oara determinar a oroaucao ae ias mor neieiometria e estseciticiaaae aos anticoruos oor meio ae ensaio ae eliha aa forma acima aescrita. verificou-se aue aoze aestes exones uroauziam iae. roram em seauiaas exoanaiaos aez ciones numa uiaca ae cultura ae teciaos ae 24 furos a

partir dos quais foi ensaiado o meio gasto para determinar a produção e a especificidade de IgG. Esta selecção resultou na poupança de 4 clones com uma produtividade relativamente elevada. Foi efectuado um ensaio final de produtividade destes quatro clones em frascos de culturas de tecidos em duplicado. O clone que revelava a maior produtividade foi escolhido e designado por C242/CL 510 Al. Ele foi congelado em azoto líquido para utilização posterior.

Uma primeira clonação do clone C242/CL 510 Al indicava que um terço das células não produzia IgG tal como foi verificado por medida duma absorvância inferior a 0,1 a uma diluição de 1:1000 num ensaio geral de ELISA IgG de rato. Foram combinados cinco subclones positivos para criar um clone designado por C242:I. A produtividade deste clone foi quantificada por meio de um ensaio geral com base em HPLC (cromatografia líquida de alto rendimento) dando um valor de 150 ug de IgG de rato por ml.

O clone C242:l foi posteriormente clonado numa placa de 96 furos produzindo 36 clones, todos eles positivos em relação à produção de IgG de rato. Cinco de entre eles, produzindo todos mais de 150 pg/ml, foram combinados para criar um clone final, designado por C242íl, possuindo uma produtividade estável de IgG. O ensaio de HPLC indicou que a produtividade de C242:II era de 196 pg de IgG de rato por ml. As células forma congeladas e armazenadas dentro de frascos em azoto líquido. Foi

depositada uma amostra do hibridoma C242:II no ECACC com o número de acesso 90012601 tal como acima referido.

Produção do anticorpo monoclonal C242

Foi obtida a partir de um frasco de congelação uma suspensão inicial de células do hibridoma acima preparado. Foram nucleadas células em câmaras de culturas de tecidos com uma área total de 6000 cm² a partir de Nunc A/S a uma densidade de 2x10^ células/ml (Hibridoma C242:IT). As células, foram em seguida cultivadas em DMEM modificado de acordo com Iscove (Iscove e Melchers

F., J. Exp. Med. Vol. 147, p923, 1978) e suplementado com 1% de qentamicina, 1% de suplemento de aminoácidos e 5% de soro de vitela fetal. As células foram em seguidas incubadas durante 4 ou 5 dias a 37 “C numa atmosfera humidificada contendo 8% de CO₂. No final da incubação as células foram contadas e foram tomadas amostras para a determinação da concentracão de anticorpos monoclonais. 0 sobrenadante da cultura das células foi decantado e filtrado através dum filtro de celulose de modo a removeras células suspensas. 0 sobrenadante foi em seguida concentrado 20 a 30 vezes oor ultrafiltracão numa célula de Ultrafiltracão de Milinore Pellican utilizando uma membrana de peso molecular de corte de 30 000. Foi retirada uma amostra do concentrado para análise da concentracão do anticorpo monoclonal C242:II e reactividade de antigénio. anós o gue o concentrado de anticorpo monoclonal foi guardado a -70°C até purificação

Purificação do anticorpo monoclonal C242

Foi preparada a proteína-Ã-Sepharose 4B (marca registada de Pharmacia AB, Uppsala, Suécia) de acordo com as instruções do fabricante no que se refere à expansão e lavagem do gel, após o que o concentrado de C242:II acima obtido (também referido aqui simplesmente como anticorpo C242) foi ligado a ele utilizando 1,5 glicina-NaOH, NaCl 314, pH 8,9 como tampão de ligação. Após uma lavagem inicial utilizando o mesmo tampão foi eluída a coluna de afinidade com ácido cítrico O,1M - NaOH, pH 5,0, e o anticomo monoclonal C242 foi recolhido em tubos contendo 1 mole/1 de Tris-HCl. oH 8.0. 0 anticorno obtido foi em secraida dialisado contra um tamoão de fosfato 0.02M. NaCl 0.15M. oH 7.2. 0.2 σ/Ι de NaN₃. O anticoroo C242 dialisado foi em secruida concentrado nor ultrafiltracão utilizando uma membrana de ueso molecular de corte de 30 000. Auós se tomarem as amostras oara a determinação da concentracão e controlo da oualidade o C242 monoclonal foi ouardado a -20'C.

PREPARACAO DA RICINA A

A ricina A node ser nreoarada oor meio de tecnoloaia de ADN recombinante utilizando seauências de ADN aue codificam cara a ricina A. Essas seouências são descritas em EP 145 111; O^yHare e col.. FEBS Letts. 216.

ρ73-78, 1987; e Lord e col., Eur.J.Biochem, 148. p265-270, 1985. É colocada uma sequência de ADN que codifica para a ricina A sob o controlo de sequências de controlo adequadas como por exemplo um promotor (um promotor trp), um ponto de ligação de ribossoma, e um terminador de transcrição. A preparação e a codificação da ricina A recombinante é descrita no pedido de patente publicado PCT WO 85/03508 e no cedido de Patente Euroneia cublicada N^a 237 676.

A secruir é ilustrada a construção de um nlasmídio recombinante em oue a secruência de codificacão da cadeia da ricina A é colocada sob o controlo da transcrição e da translaccão de um elemento oromotor orocariota. A transcrição é terminada nela incornoracão dum elemento de terminação natural na extremidade 3' da mensacrem. A iniciacão de translaccão é controlada nela secruência de ADN da extremidade 5' da mensacrem. no conto de liuacão do ribossoma (RBS1.

O nrocesso de construção necessita da substituição de dois resíduos de aminoácido terminais da nroteína natural, da ricina A madura.

São descritas várias fases intermédias na derivação do vector utilizado nara nrenarar a ricina A recombinante.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

1. Oliaonucleõticos Sintéticos

para introduzir as alterações de sequências de ADN especificas no gene de ricina. Todos os oligonucleóticos posteriormente descritos foram preparados num sintetizador da Applied Biosystem 380A DNA a partir dos nucleósido-2cianoetil-N,N“diisoprQpilfosforamiditos protegidos com base de 5'-dimetoxitritilo e nucleósidos protegidos ligados a suportes de vidro com poros controlados numa escala de 0,2 micromoles, de acordo com os procedimentos fornecidos pela

Applied Biosystems Inc.

Cada nucleótido, após clivagem do suporte sólido e remoção de todos os grupos protectores, foi dissolvido em água (1 ml) e foi utilizada uma medida de absorvância a 260 nm para determinar a concentração

2. Enzimas e estirpes de hospedeiro

Foram utilizadas várias endonucleases de restrição e enzimas modificadores de ADN nas manipulações abaixo descritas. Estes produtos foram adquiridos de vários fornecedores (Amersham International, Bethesda Research Laboratories, Boehringer Mannheim ou New England Biolabs) e foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante em relação às condições de reacção.

As estirpes hospedeiro aqui referidas estão geralmente disponíveis de várias fontes. Por exemplo, E.Coli C600 é livremente disponível de Genetic Stock Centre, Yale University, USA com o N^s de acesso GCSC 3004.

O genotipo de E.Coli K12 thr-1 leuB6 thi-1 lacYl tonA21 \ supE44; E.Coli HB101 e DH5a estão disponíveis de Bethesda

Research Laboratories (BRL); e E.coli TG1 e K19 estão disponíveis de Anglia Biotechnology.

3. Geneclean (TM1 dispositivo contem 1) iodeto de sódio 6M 2) uma solução concentrada de cloreto de sódio, Tris e EDTA para preparar uma lavagem de cloreto de sódio/etanol/água;

3) Glassmilk (TM) - um frasco com 1,5 ml contendo 1,25 ml de uma suspensão de matriz de sílica em água.

Esta é uma técnica de purificação de ADN com base no processo de Volgstein publicado em Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1979) Vol 76, p 615.

Alternativamente pode ser utilizado qualquer dos processos descritos em Molecular Cloning - a laboratory manual Segunda edição Sambrook, Fritsch e Maniatis Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 (referido em seguida como Maniatis).

4. Sequenase (MC)

Polimerase de ADN T7 quimicamente modificada

Com base no procedimento de Tabor e Richardson publicado em Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1987) vol 84 págs. 4767-4771.

5. Construção dos vectores de expressão pICI

5.a) PICI0020 vector plasmídio pICI0020 é um plasmídio com base em pAT153 em que a região de 651 pb EcoRI-Accl é substituída por um fragmento de 167 pb EcoRI - Clal consistindo em :

(1) um promotor sintético E. coli trp e um ponto de ligação de ribossomas líder trp (2) um códão de iniciação de translacção (3) uma sequência de reconhecimento de enzimas de restrição múltipla derivada de M13mpl8, contendo ponto para Kpnl, BamHI, Xbal, Sall, PstI, Sphl e HindIII (4) uma sequência de terminação de transcrição sintética

A sequência de ADN desta região é mostrada na Figura 11.

A construção de um vector plasmídio contendo uma sequência promotora trp cinética está publicada (Widass e col. Nuc.Acids Rés. 10 págs. 6639-6657, 1982). Foi isolado um fragmento promotor desse vector após digestão com as enzimas EcoRI e Hpal e purificação da banda adequada de um gel de agarose por electro-eluição (em Molecular Cloning A Laboratory Manual , Maniatis, Fritsch e Sambrook, publicado por CSH laboratory, segunda edição 1989).

Foi preparado um par de oligonucleótidos sintéticos complementares que se podiam ligar à extremidade Hpal do fragmento promotor proporcionando o ponto de ligação de ribossoma líder trp natural, um códão de

- 54 iniciação de trans1acção e um ponto de clonação 3' Kpnl.

Estes oligonucleótidos foram misturados em concentrações equimolares e deixados equilibar por aquecimento a 100 °C seguido por um arrefecimento lento até à temperatura ambiente.

fragmento promotor e os oligonucleótidos equilibrados foram depois ligados e banda adequada foi isolada de um gel de poliacrilamida por electroeluição. Este fragmento foi depois ligado com um vector M13mpl8 derivado contendo a sequência atenuadora trp (produzida de oligonucleótidos sintéticos) clonada no ponto HinlII e introduzindo um ponto de restrição adicional Ciai 3' no atenuador. 0 ADN ligado foi transfectado para E. coli estirpe JM109 (Yanisch-Perron e Col. Gene, 33. pág. 103,

1985) tornada competente pelo processo de CaCl₂ (Maniatis, capítulo 1, pág. 82). Após a placagem e a incubação das placas, as placas foram escrutinadas pelo processo de Benton e Davies (Maniatis, capítulo 4, pág. 41) utilizando uma sonda marcada com ³²P produzida por translacção nick” do fragmento promotor EcoRI-Hpal isolado anteriormente. 0 ADN de banda única foi preparado de placas de hibridação positiva por meio de um processo convencional (Maniatis, capítulo 4, pág. 29) e sequenciado utilizando o primário universal M13 e o processo de terminação da cadeia de didesoxi de Sanger fornecido sob forma dum dispositivo por várias fornecedores por exemplo Sequenase (United States Bioscience).

o valor de RF do ADN preparado de um isolado em que sequência promotor/ponto de ligação de ribossoma/atenuador foi confirmado. Este ADN foi digerido com EcoRI e Ciai e o fragmento adequado isolado de um gel de poliacrilamida da forma acima referida. O plasmídio pAT153 foi digerido com as enzimas EcoRI e Accl e ligado com o fragmento promotor isolado. O ADN ligado foi transformado em E.coli HB101 competente (Boyer, H.w. e Roulland-Dussoix, d; 1969, J. Mol. Biol., 44. pág. 459) (Bethesda Research Laboratories) e foram escolhidas as colónias reistentes à ampicilina.

ADN de plasmídio de vários clones foi preparado e a sequência de ADN foi derivada da região entre os pontos EcoRI e Ciai. Um dos clones confirmou conter a região correcta de promotor/atenuador e foi designado por pICI0020.

Esta construção é apresentada na Fig.l.

5.b) plCIO042 pICI0042 (Figura 12) é um plasmídio em que os marcadores de resistência a antibióticos de pAT153 foram substituídos por um gene de resistência à tetraciclina simples induzível do plasmídio RP4 (codificado pelo gene tetA e regulado pelo produto do gene tetR). Estes genes foram çaracterizados por Klock e col. (J.Bacteriol., 161, págs. 326-332, 1985). Dado que o novo marcador de resistência é apenas expresso na presença de antibiótico, o produto gene tetA não será um contaminante potencial de ricina A recombinante em culturas em que o plasmídio é mantido estável na ausência de tetraciclina. Foi também incorporada uma função de estabilidade de plasmídio (cer).

A fase inicial na preparação deste vector consistia em produzir um derivado de pAT153 a partir do qual tinha sido completamente removido o gene que codifica a resistência à tetraciclina. Foi criado um par complementar dos oligonucleótidos sintéticos para substituir o fragmento EcoRI-Aval a partir de pÀT153 com uma sequência mais pequena contendo vários pontos de endonuclease de restrição única para clonação posterior.

ADN do plasmídio pAT153 foi digerido com as enzimas EcoRI e Aval e o fragmento de ADN do plasmídio de 2,175 Kpb isolado de um gel de agarose a 0,7% utilizando Geneclean (Bio 101, Califórnia) de acordo com as instruções do fabricante. 0 fragmento de 1,425 Kpb contendo o gene da resistência à tetraciclina foi em seguida removido.

Os oligonucleótidos (SEQ ID 13 e 14) foram fosforilados utilizando a polinucleótido quinase T₄ e quantidades equimolares foram equilibradas em conjunto. Foi depois ligada uma amostra dos oligonucleótidos equilibrados com o fragmento de plasmídio de pÀT153. O ADN ligado foi transformado em E. coli HB101 (BRL) e foram seleccionadas as colónias resistentes à ampicilina.

Foram tomadas várias colónias para a preparação de ADN de plasmídio a pequena escala (método de Birnboim e

Doly tal como especificado em Maniatis, capítulo 1, pág. 25) e a construção pretendida foi identificada por análise de restrição com enzimas adequadas por exemplo EcoRI, Aval e BamHI. A estrutura de 3 isolados identificados como possuindo o padrão de restrição correcto foi confirmada pela análise de sequências de DN utilizando um primário directo no ponto EcoRI pBR322 (New England Biolabs). Um dos isolados foi designado por pICX0019.

ADN do plasmídio RP4 foi isolado de produtos guardados pelo processo de Holmes e Quigley (Maniatis, capítulo 1, pág. 29). Este ADN foi cortado até ao fim com BglII e em seguida parcialmente com Xmal (a 25°C durante até 35 minutos) tomando amostras a várias alturas até ter sido claramente identificado por fragmentos de 2,45 Kpb contendo tetR e tetA. Foi digerida uma amostra de ADN de pUC8 (Amersham International) até ao fim com BamHI e Xmal. As ligações foram efectuadas para inserir os genes de resistência à tetraciclina em pUC8. 0 ADN ligado foi transformado em E. coli C600 (Appleyard, R.K. Genetics 39 pág. 440, 1954) tornada competente pelo processo de CaCl₂ (Maniatis, capítulo 1, pág. 82) e foram seleccionadas as colónias resistentes à tetraciclina. O ADN de plasmídio foi preparado a partir de 8 clones (Holmes e Quigley) e a presença do genes RP4 tetR e A foi confirmada por análise de restrição. Um destes isolados foi designado por pTB344.

Os genes de resistência à tetraciclina foram em seguida inseridos em plC!0019 (acima descrito) por substituição de um fragmento EcoRI/PstI fragmento correspondente de pTB334.

de pICI0019 com o

Isto resulta na substituição da maior parte do gene de resistência ampiciline em pICI0019 com os genes de resistência à tetraciclina. Após digestão e ligação dos ADN de plasmídio, seguida de transformação em E. coli C600, foram escolhidas as colónias com base no fenotipo, isto é; Ter e Aps. 0 ADN de plasmídio foi preparado desses 4 clones e digerido com uma combinação da enzimas por exemplo BamHI/PstI/SstI,

EcoRI/SalI. Smal. Stvl/Sall e Aval/PstI. Todos os 4 clones produziram padrões de restrição que eram consistentes com a construção pretendida. Um deles foi designado por pTB351.

Summers e Sherratt (Cell 36 págs. 1097-1103, 1984) demonstraram que a instabilidade dos plasmídios derivados de ColEI (por exemplo pAT153) é devida à perda duma sequência de 283 pb, cer. presente no plasmídio mãe. Esta sequência ajuda a evitar a formação dos oligómeros do plasmídio, parecendo os últimos romperem a repartição do plasmídio de uma forma ainda indefinida. A sequência de cer (Summers, D. e Col.; Mol. and Gen. Genetics 201. págs. 334338, 1985; e cell, 36, 1097-1103, 1984) foi isolada dum fragmento clonado em pUC18 (pKS492). O ADN de plasmídio pKS492 foi digerido com BamHI e Taci para libertar um fragmento contendo cer com 289 pb. O ADN de plasmídio pTB351 (isolado do hospedeiro de Dam E. coli GM48 - Arraj, J.A. e Marinus, M.G. J.Bact. 153 págs. 562-565, 1983) foi

digerido até ao fim com BamHI e Ciai e ligado com o ADN de pKS492 digerido. Após a transformação do ADN ligado em E. coli C600 competente, foram escolhidas as colónias resistentes à tetraciclina. A análise de restrição de ADN de plasmídio dos clones putativos com as enzimas Aval, MluI e Pvul foi utilizada para confirmar a presença de cer. Um dos isolados com a estrutura correcta foi designado por

PICI0042.

A construção desses plasmídios é apresentada nas f iguras. 2 e 3.

5.c) PICI1079 vector plasmídio pICI1079 é um plasmídio derivado de pAT153 resistente à ampicilina contendo os seguintes elementos entre os pontos de restrição de EcoRI e Styl:

(i) um gene CI857 do fago (ii) um promotor XP_L;

(iii) um ponto de ligação de ribossoma sintético;

(iv)	uma sequência de	genes a2	de	interferão
sintético;
(V)	uma sequência terminadora	de	transcrição
sintética,	derivada do fago	T4, entre	os	pontos de
restrição	de Sall e Styl. 1	i. sequência	de	ADN deste

terminador de transcrição é apresentada na Figura 13. 0 pICI1079 é ilustrado na Figura 14.

pICI1079 foi depositado segundo o Tratado de Budapeste em

19 de	Fevereiro de 1991 no NCIMB, 23 St. Machaer	Drive,
Aberdeen, Escócia; e foi	atribuído	o na	NCIMB de	acesso
40370.		-
	0 plasmídio	PICI1079	foi	utilizado	para

proporcinar uma fonte do terminador de transcrição T4 para a produção do clone de expressão de ricina A pICI1185 (ver 7. d abaixo). 0 ponto de partida para a produção do plasmídio pICI1079 era pICI1043. O pICI1043 é um plasmídio com base pICIOOZO é um plasmídio (ver 3.a anterior) em que está presente um bloco de expressão contendo um promotor \PL e o gene a.2 de interferão (Edge e col. Nuc. Acids Res. 11 págs. 6419-6435, 1983), entre os pontos EcoRI e Sall. Foi sintetizado um par complementar de oligonucleótidos para produzir o terminador de transcrição do gene 32 do bacteriofago T4 com extremidades coesivas 5' Sall e 3'Sphl. Este fragmento foi ligado com um fragmento de plasmídio isolado de pICI1043 que tinha sido digerido até ao final com Sall e Sphl. 0 plasmídio intermédia assim obtido (PICI1078) continha as sequências do terminador T4 e atenuador trp em tandem.

Foi em seguida utilizado um segundo par de oligonucleótidos complementares para substituir a sequência atenuadora trp (e a parte restante do gene de resistência à tetraciclina) por inserção entre os pontos Sphl e Stvl de pICI1078. Foi introduzido um ponto único de BamHI dentro deste fragmento sintético.

Estas manipulações são apresentadas na Figura 4.

6. a) Preparação de ADN de plasmídio PUC8RA

Foi produzido um clone (pUC8RA) que continha cADN de ricina A. Este clone continha a cadeia A de cADN desde o número de base -74 na sequência líder até ao ponto BamHI dentro da cadeia B (número de base 857) de acordo com a sequência de cADN publicada (Lamb,I.F.,Roberts,L.M., Lord, J.M. Eur.J.Biochem, 1985, 148, págs. 265-270) em plasmídio pUC8 (Vieira, J e Messing, J. Gene, 19, pág. 259, 1982). Além disso, tinha sido utilizada a mutagene dirigida a pontos para produzir um codão de terminação de translacção imediatamente desde 3' até ao códão final de ricina A madura (tal como referido em O'Hare, M e col. FEBS Letts, 1987, 216, págs. 73-78). Toda a região de purificação da cadeia A é incluída no fragmento de BamHI deste clone.

Foi obtida uma pequena quantidade de ADN de plasmídio pUCSRA da forma acima descrita. Para ensaios futuros, foi transformada uma diluição deste ADN em células competentes de DH5a de E. coli (Hanahan, D.; 1983, J. Mol. Biol., 166. pág. 557) (Bethesda Research Laboratories) e escolhidos os transformantes resistentes à ampicilina. O ADN de plasmídio deste clone foi preparado por um procedimento de Birnboim-Doly modificado (maniatis, capítulo 1, pág. 25). Amostras destes ADN foram digeridas

com BamHI e Bani separadamente e comparadas com digestões correspondentes do ADN original referidas por Lord e col. após electroforese num gel de agarose. Não foram observadas diferenças no padrão de restrição e, com base nisto, foi assumido que as duas amostras de ADN eram idênticas.

6.b) Subclonacão em M13

Foram ligadas por sh.otgun” digestões de BamHI do ADN de plasmídio pUC8RA e ADN de RS (forma replicativa) do fago M13 estirpe K19 (Anglian Biotechnology) utilizando condições convencionais (Maniatis, capítulo 1, pág. 68). Foram também efectuadas as ligações de controlo. Os ADN ligados foram transformados em E. coli estirpe TG1 (Gibson, 1984/Anglianj tornada competente pelo processo de CaCl₂ (Maniatis, capítulo 1, pág. 82).

As frequências de transformação indicavam uma ligação eficiente e era de esperar que o fago recombinante estivesse na progenia. Foram previstos os fagos recombinantes para produzir placas transparentes em placas contendo IPTG + X-gal (BRL) devido ao rompimento do gene de lacZ (B-galactosidase). 0 fago de tipo natural produz placas azuis devido à hidrólise de X-gal pela Bgalactosidase.

Foram tomadas várias placas transparentes para a preparação de ADN de banda única. A electroforese em gel directa de suspensões de fagos lisados indicavam que um clone de fago continha uma inserção com dimensionamento

adequado o que foi confirmado, por sequenciação como sendo a sequência de codificação da cadeia de ricina A. Apenas 182 bases da sequência de codificação da ricina A madura foram confirmadas mas este facto foi tomado como uma evidência suficiente para a presença de todo o gene de ricina A. Este clone foi designado por M13K19RÀ.

6.c) Mutacrenese de Ml3Kl9RA

Para produzir um ponto Kpnl compativel com os vectores de expressão de pICI no inicio da ricina A madura são necessárias as seguintes alterações (sublinhadas) :

SEQ. ID 15

5' ---------GATAACAACATATTCCCCAAA___________ 3'

.....Sequência líder de ricina...|---Ricina A madura— >

Alterada para:

SEQ. ID. 16

5^Z .... GATAACAACATGGTACCCAAA._________3 ' | Kpnl

I

Iniciação de translação e que resultam num códão de ATG que se sobrepunha a um ponto Kpnl. Pode ser excisado um fragmento de Kpnl contendo a ricina À do mutante inserido na série de vectores de expressão de ICI. São preparadas duas modificações de

aminoácidos N-terminais file-phe para met-vai).

ADN de banda única preparado a partir de M13K19RA foi tomado como molde para a. fase de mutagénese para cada estratégia de mutação. Foi sintetizado um oligonucleótido simples, DTR16 que introduz todas as alterações de mutação para esta estratégia.

DTR16 (SEQ. ID. 17) 5' AACAACATGGTACCCAÃACAA 3'

Existem vários procedimentos para a introdução de alterações de sequências de ADN específicas por mutagénese dirigida a pontos. Os procedimentos a seguir referidos foram conseguidos utilizando o processo de Eckstein e col. (Nuc. Acid. Res., 1985, 13, págs. 8749-8764 e 1986, 14 págs. 9679-9698) fornecido em forma de dispositivo (Amersham International) e utilizado de acordo com as instruções do fabricante.

princípio deste processo é efectuar a primagem do molde de ADN de banda única com o oligonucleótido mutagénico e sintetizar a banda complementar que incorpora dATPaS em vez de dATP. Utilizando este nucleótido ocorre a formação de ligações de fosforotioato que não são clivadas por certos enzimas de restrição (por exemplo Ncil). Após a síntese da segunda banda, é utilizado o Ncil para copiar a banda mãe e é adicionada exonuclease III para digerir depois do ponto de mutação. Em seguida a polimerase de ADN I permite a re-síntese da banda mãe. Pósteriormente, o oligonucleótido mutagenénico actua como molde para a resíntese e a mutação é introduzida em ambas as bandas antes da transformação. São reivindicadas sequências de mutação até 96% da progenia total e o escrutínio é efectuado de forma simples tomando placas aleatórias para análise de sequências.

Nestas experiências são tomadas 4 de entre 4 placas que sofreram mutação correctamente.

Tendo sido escolhida uma das mutantes (MRA16), o RF ADN foi preparado e verificada a presença do novo fragmento de restrição produzido isto é Kpnl.

	6. dl Clonacão,	Expressão	e	Caracterização
Inicial
	A série de pICI	de vectores	de	expressão (ver
secção 3)	pode aceitar fragmentos de ADN	clonados num único

ponto de restrição Kpnl adjacente ao promotor Trp. 0 ponto Kpnl sobrepõe-se ao códão de iniciação de translacção (ATG) que está situado a 8 pb a juzante do ponto de ShineDalgarno (AGGA) do promotor.

Tendo sido verificada a sequência de MRA16, foi efectuada uma digestão de Kpnl a grande escala (aproximadamente 5 qg de RF ADN) e foi isolado o fragmento de ADN que codifica a ricina A relevante a partir de um gel de agarose (agarose Nu-Sieve GTG, FMC Bio-products) por extracção com fenol duma fatia de gel excisada de acordo com o procedimento do fabricante.

&>

Foi digerido o pICI0020 (ver

seguida ele foi desfosforilado utilizando uma fosfatase alcalina do intestino de vitela (CIP - Boehringer

Mannheim). Este último tratamento evita a recircularização do vector após ligação o que levaria a uma elevada proporção de produtos semelhantes na progenia de transf ormação.

As ligações foram estabelecidas com proporções de vector plasmídio em relação ao fragmento isolado de 8:1 (em peso) até 1:3 para as várias estratégias. As ligações de controlo para ensaiar a eficiência de tratamento com a fosfatase, e actividade de ligase, etc. foram também incluídas. As condições de ligação foram adequadas para a fonte de T4 ADN ligase utilizada (New England Biolabs ou Amersham). As misturas reaccionais foram geralmente incubadas a 15°C durante a noite.

Foram diluídos 50% de cada reacção de ligação (5 μΐ) a 100 μΐ com 1 x TNE (50 mM de Tris, 50 mM de NaCl, 1 mM de AEDT) e foram adicionados 200 μΐ de E.coli DS410 competente. Após um procedimento: de transformação convencional (Maniatis, capítulo 1, pág. 74), as células foram placadas em ágar L com estreptomicina (25 μg/ml) e ampicilina (100 μg/ml) e incubadas a 37°C durante a noite.

As placas de trasnformação foram examinadas após a incubação. Em geral, foram observadas 5 a 10 vezes mais colónias em ligações quando comparados com os controlos sem ligase. Em alguns casos, ocorria uma pequena diferença no número de colónias produzida na presença ou ausência da

ligase indicando uma digestão	incompleta	ou uma fraca
actividade	de ligase.
	Os transformantes,	e também	os controlos
relevantes	foram tomados em	filtros de	microcelulose
colocados	em placas de ágar	L para	escrutínio de

hibridização (com base no método de Grunstein e Hogness tal como descrito em Maniatis,. capítulo 1, pág. 98). Após a incubação, as colónias foram lisadas localmente utilizando 10% de SDS e NaOH 1M, neutralisadas utilizando Tris 1M (pH de 7,5) e secas em vazio a 80° C durante 2 horas.

As sondas de hibridização foram geradas por marcação com ³²p dos oligonucleótidos mutacionais utilizando a T4 polinucleótido guinase. Os filtros foram ensaiados à temperatura ambiente e em seguida lavados em fases até 55-65°C para remover as contagens não especificamente ligadas antes da auto-radiografia. A hibridização específica indicava os clones putativos contendo contendo ADN de ricina A.

Foram preparadas composições de ADN a pequena escala (pelo processo de Holmes e Quigley ou Birnboim-Doly tal como especificado em Maniatis, capítulo 1, pág. 25) a partir de clones de hibridização positiva. Os ADN foram digeridos com as enzimas de restrição relevantes por exemplo Kpnl e EcoRIZBglII, e analisados por electroforese em géis de agarose. Os ADN de vector e RF ADN mutados foram cortados com as mesmas enzimas para demonstrar os tamanhos de fragmento esperados a partir dos clones correctos.

Foram utilizadas composições de ADN de plasmídio a escala maior (Birnboim-Doly) de cada clone para uma análise de restrição mais detalhada, por exemplo Ciai, HindIII, BamHI_f EcoRI/BglII, Kpnl, e Scal. Em géis de agarose, estas digestões revelavam o tamanho do fragmento inserido, que é uma indicação da sua orientação e de seu ganho de pontos de enzima de restrição únicso para a cadeia de genes da ricina A.

6.e) Estudos de expressão

Os clones positivamente identificados por hibridização e escrutínio de restrição foram ensaiados para determinar a expressão de ricina A por análise de SDS-PAGE dos lisados totais de células. As condições convencionais para os estudos de expressão foram as seguintes:

1) São inoculados 10 ml de caldo L + antibiótico(s) com uma única colónia e são cultivados a 37 °C durante a noite com agitação moderada.

2) São tomados 750 μΐ do caldo L e são centrifugadas as células numa microcentrifugadora (1 min a 6500 rpm).

3) Resuspendem-se as pastilhas obtidas em 300 μΐ de meio M9 (Maniatis, apêndice A.3) + 0,02% de caseína hidrolisada + 0,2% de glucose + 50 gg/ml de tiamina e inoculam-se em 10 ml do mesmo meio.

4) São incubados os caldos durante 7 horas ou durante a noite a 37°C com agitação moderada.

5) Após a incubação, é medido o valor de 0D₅₄₀, centrifugam-se as células e resuspendem-se num volume de amostra de Laemmli de tampão equivalente ao que poderia dar um valor de 0D_54Q de 10 se suspenso em água (Maniatis, capítulo 18, pág. 53). Submete-se a ebulição durante 15 minutos.

6) Carregam-se 20 μΐ de lisado total de células no gel de poliacrilamida de SDS, submete-se a electroforese, revela-se com azul de Coomassie, limpa-se e visualiza-se.

De entre os clones estudados por SDS-PAGE apenas 1 revelava uma banda adicional com um peso molecular equivalente aproximado de 29 kD (equivalente ao estimado para a ricina A madura não glicosilada). Os escrutínios de gel indicavam um valor de acumulação na gama de 5 a 10% de

proteína de	célula total. 0	plasmídio	neste clone	foi
designado por pICI1102.
A	construcção	de	pICI1102 é	apresentada	na
fig.5. Os	resultados dos	estudos de	expressão	são
apresentados	nas figs. 6 e	7.

6.f) Transferências de Western e imunodetecção da ricina A recombinante

A autenticidade da proteína da cadeia de ricina

A recombinante, inicialmente observada por revelação com

azul de Coomassie em géis de SDS-poliacrilamida, foi confirmada por revelação de Western. As bandas de proteínas foram transferidas para filtros de nitrocelulose e detectadas utilizando um anticorpo específico de ricina A seguido de antiglobulinas marcadas com peroxidase.

Foram efectuadas experiências em géis de 15% de SDS-PAGE a 8 mA e depois foram equilibrados durante pelo menos 30 minutos em tampão de transferência.

As bandas de proteína nos géis foram em seguida transferidas para membranas de nitrocelulose (Hybond-C, Amersham) electroforeticamente num dispositivo de Bio-Rad Trans Blat a 70 V durante 3 horas. Os filtros podiam ser armazenados, após secagem em saquetas de plástico seladas a aproximadamente -20*C.

A ricina A.I era um anticorpo policlonal criado em coelhos contra um fragmento de péptido sintético da ricina A. Estudos preliminares revelaram uma boa afinidade para a ricina A mas uma reactividade cruzada considerável com muitas proteínas de E. coli. Para ultrapassar a grande peturbação causada por esta reactividade cruzada o anticorpo foi pré-incubado com um lisado de E. coli.

Assim, foi centrifugada durante a noite uma cultura de 10 ml de caldo L de E. coli estirpe DS410 a 4000 rpm durante 10 minutos para pastilhar as células. A pastilha foi resuspensa em 5 ml de tampão de bactérias e tratada com som a 4-6 μ durante pulsos de 6 x 10 segundos com intervalos de refrigeração de 30 segundos em gelo.

Foram em seguida misturados 0,5 ml do produto tratado com som com 0,5 ml de antisoro de ricina A.l e foram incubados á temperatura ambiente durante 90 minutos. Os resíduos das células foram centrifugados de novo a 13000 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante foi guardado a —20°C.

Os filtros de nitrocelulose das transferências de Western foram bloqueados por incubação durante a noite à temperatura ambiente em 5% de BSA-PBS/Tween. (PBS Tween = 5 ml de Tween 20 por 1 litro de PBS).

Lavagem de 3 x 3 minutos em PBS/Tween.

Incubados durante 2 horas (ou durante a noite) à temperatura ambiente com uma diluição de 1/4000 de anticorpo de Ricina A.l bloqueado em 0,5% de BSA~ PBS/Tween.

Lavagem de 3 x 3 minutos em PBS/Tween.

Incubado durante 1 hora com uma diluição de 1/1000 de antisoro de coelho anticabra em 0,5% de BSA-PBS/Tween à temperatura ambiente.

Lavagem de 3 x 3 minutos em PBS/Tween.

Incubado durante 1 hora com uma diluição de 1/5000 de antisoro anti-peroxidase da peroxidase de coelho em 0,5% de BSA/PBS/Tween à temperatura ambiente.

Lavagem 3x3 minutos em PBS/Tween.

Revelação por imersão com uma solução de 4-cloronaftol (60 mg) em 20 ml de metanol levado a 120 ml com PBS e contendo 12 μΐ de peróxido de hidrogénio. A membrana foi removida da solução logo que as bandas eram visíveis, secou-se e fotografou-se.

É apresentada na fig. 8 uma análise típica de revelação de Western.

6.g)

Ensaio biológico para a proteína de ricina A recombinante objectivo era estabelecer um sistema experimental para ensaiar a r-ricina A para determinar a actividade biológica num ensaio de síntese in vitro de proteína isenta de células.

Foram preparados lisados de reticulócitos de coelho de acordo com o método de Allen e Schweet (J Biol Chem (1962), 237, 760-767). 0 ensaio demonstra a inibição da síntese da proteína num sistema isento de células por uma falta de incorporação da ricina marcada com 1⁴C na proteína recentemente sintetizada.

6.g.i) Procedimento de ensaio

Solução guardada: mistura de aminoácidos 1 mM menos leucina.

Uma solução contendo todos os L-aminoácidos a 1 mM com a excepção da leucina (ajustada a pH de 7,4 com NaOH e guardada a -70°C).

Solução A: 40 mM de acetato de magnésio; 2M de

acetato de amónio; 0,2M de Tris; (pH de 7,4 com HCI, armazenada a 4 ° C).

Solução Β: ATP (Sigma A5394) 246 mg/ml; GTP (Sigma

G8752) 24,4 mg/ml.

Mistura de ensaio: 1 ml de Mistura de aminoácidos; 1 ml de Solução A; 0,1 ml de Solução B; 103 mg de fosfato de creatina; 1 mg de Creatina quinase; 510 μΐ de H₂0; 600 μΐ de (GOjlíCí) de L-¹⁴C-leucina (New England. Nuclear, NEC279E).

Mistura reaccional: Amostra de ensaio 25 μΐ; Mistura de ensaio 12,5 μΐ; lisado de reticulócito de coelho 25 μΐ.

A solução de controlo era 2 mg/ml de BSA em PBS.

Todos os ensaios foram feitos em duplicado.

12,5 μΐ de mistura de ensaio colocados em tubos de vidro esterilizados μΐ de BSA em PBS adicionados a cada um dos primeiros quatro tubos para controlos.

μΐ de amostras de ensaio adicionados à parte restante dos tubos ml de KOH 0,lM adicionado aos primeiros dois tubos (controlo de fundo)

Tubos equilibrados a 28°C num banho de água.

Foram adicionados 25 μΐ de lisado de reticulócitos de coelho (deixados descongelar a partir da temperatura de azoto líquido) a cada tubo em intervalos de 20 segundos. Quando o primeiro tubo tinha sido incubado durante 12 minutos, foi adicionado 1 ml de KOH 0,lM a cada tubo

todos os tubos tivessem 12 minutos de incubação. Foram adicionadas duas gotas de peróxido de hidrogénio a 20% a cada tubo seguido de 1 ml de TCA a 20%. Os tubos foram misturados e deixados em repouso durante pelo menos 1 hora, ou durante a noite, a 4°C. Os precipitados foram filtrados em discos de GFC com 2,5 cm, lavados com 3 x 4 ml de TCA a 5%, transferidos para frascos de cintilação e foram adicionados 10 ml de um cintilante (Ready-Solv. MP,

Beckman). Passada 1 hora os frascos foram agitados e contados.

õ.g.ii) Estabelecimento da técnica para utilização com lisados de E.coli

Foram cultivadas durante a noite culturas de 10 ml de caldo L a 37^OC. Foram pastilhadas alíquotas de 400 μΐ a 13000 rpm durante 30 segundos e foi decantada a maior parte do sobrenadante.

As pastilhas foram submetidas a dois ensaios de congelação rápida em gelo seco/EtOH seguido de descongelação a 37° C. Foram adicionados 12 μΐ de sacarose a 25% em Tris HC1 50 mM a pH 8_z0 seguido de 4 μΐ de uma solução de 10 mg/ml de lisozima.

Após a incubação em gelo durante 15 minutos, foram adicionados 8 μΐ de AEDT 0,25M e a incubação foi continuada durante 15 minutos. A lise foi levada osmoticamente

Este procedimento produziu contagens de células viáveis de 80-100 por ml.

Quando foi adicionada uma alí quota de 25 μΐ deste lisado à mistura reaccional de ensaio, o valor de incorporação de ¹⁴C-leucina na proteína recentemente sintetizada era de aproximadamente 10% de lisado sem o controlo. Este valor era semelhante ao valor da inibição produzida por 8 ng/ml de ricina A. Foram em seguida preparadas diluições de lisado de E.coli e o ensaio foi repetido. o resultado indicava claramente que era necessário o mínimo de uma diluição de 16 vezes para reduzir o efeito do lisado e igualar o do controlo.

Para certificar que a lise de E.coli e o lisado de E.coli não comprometiam a toxicidade da ricina A, foram efectuados dois ensaios de controlo. No primeiro adicionouse ricina A derivada de plantas a uma pastilha de células de E.coli diluídas a 16% de modo a dar uma concentração final de 8 ng/ml na mistura de ensaio após a lise das células. Estes controlos não revelavam efeito prejudicial dos lisados ou do procedimento da lise na acção de inibição da ricina A.

Foram utilizadas estas técnicas para verificar a síntese de ricina A recombinante biologicamente activa de pICI1102 e dos clones a seguir descritos.

6.h) Análise de sequências de ADN

Foi utilizada a sequenciação de ADN de plasmídio para analisar o pICI1102. O procedimento escolhido foi de Zagursky e col modificado (Gene Analysis Techniques Vol 2, N^s 5) e envolve a desnaturação alcalina de ADN de plasmídio de banda dupla antes da equilibração do primário e sequenciação por meio de um procedimento convencional tal como o proporcionado numa forma de dispositivo por vários fornecedores, por exemplo Seguenase (United States Bíoscience). Utilizando um oligonucleótido para efectuar a primagem na extremidade 3' da B-lactamase e vários

primários internos	da	cadeia A,	foi	possível efectuar	a
sequenciação	de ambas	as bandas	do	gene promotor e	da
ricina A.
Os	dados	da	sequenciação	inicial revelavam	um

resultado inesperado por o fragmento de Kpnl adicional estar presente entre a sequência de codificação do promotor e da ricina A, isto é (SEQ. ID. NO 20):

Kpnl

5' AAAAAGGGTATCGACATGGTACCCGGGGATCCACCTCAGGGTGG

Kpnl

TCTTTCACATTAGAGGATAACAAÇATGTACCCAAACAATAC 3'

O fragmento de Kpnl adicional foi originado de

M13K19RA e contém pontos de enzima de restricção e também parte de sequência líder da ricina clonada de pUC8RA. A base induzidas durante a mutagénese.

O estudo desta sequência revela que o primeiro está fora da estrutura com de codificação da ricina

A. Além disso, existe um códão de terminação na estrutura (TAG) antes do códão da ricina

A e uma sequência de

Shine-Dalgarno putativa (AGGÀ) que podia re~iniciar a do segundo ATG.

Estudos posteriores revelaram que, surpreendentemente, este fragmento de ADN adicional conferia uma vantagem benéfica em relação ao nível de acumulação da cadeia de ricina A em E.coli quando comparados com os clones a partir dos quais ele foi excisado.

A sequência completa de ADN do gene de ricina A contido em plC!1102 é apresentado na

Fig. 9 (SEQ. ID. NO

18).

7. Produção de clones de expressão de ricina A posteriores

7.a) Mutação do clone de ricina-Ã pICI1102 para permitir a subclonação

Seria difícil efectuar a subclonação dos dois fragmentos de Kpnl a partir de pICI 1102 gerado fortuitamente na orietação correcta para a expressão de ricina A. Consequentemente, foi planeado alterar o ponto de reconhecimento interno de Kpnl por meio de uma substituição de base única (A até T). Isto prometia evitar a clivagem de Kpnl neste ponto e permitir a subclonação de um fragmento simples de Kpnl numa gama de vectores de expressão de pICI. Substituindo a adenina no ponto de reconhecimento de Kpnl (GGTACC) com timina (isto é GGTTCC) o primeiro resíduo da ricina A não é alterado (GTA/GTT = Vai).

isto é:

Kpnl fragmento de 53pb Kpnl sequência de Ricina A

Konl

GGTACC

ATGGTACC | GGTACC

TGÀ

Alterada para:

Kpnl fragmento de 53pb Kpnl sequência de Ricina A Kpnl

GGTACC ATGGTTCC | GGTACC | TGA não reconhecida por Kpnl oligonucleótido sintetizado para produzir esta alteração tinha a sequência (SEQ. ID. No. 19):

5' ATAACAACATGGTTCCCAAACAATAC 3'

Em que a base sublinhada representa a alteração de mutação.

Foi planeado efectuar a clonação do fragmento mutado de ricina-A numa gama de vectores de expressão trp para estudos de expressão comparativos. A clonação em pICI0020 proporciona uma comparação com pICI 1102 para determinar os efeitos na expressão, se existirem, da substituição de base simples.

7.b) Mutagénese

O molde para a mutagénese foi o MRA16 que é o clone M13 contendo os dois fragmentos Kpnl presentes em pICI 1102. Após a mutagénese, foram identificados os isolados contendo as mutações pretendidas por amostragem aleatória e por determinação de sequências de ADN na região à qual o oligonucleótido mutagénico se liga especif icamente.

Um dos moldes mutados foi designado por MRA22.

Este mutante foi analisado ainda por determinação de sequências de ADN de toda a sequência de codificação da ricina-A para verificar a ausência de mutações não específicas.

7.c) Sub-clonacão

Os ADN de banda única, mutados foram transformados em células TG1 de E.coli competentes para produzirem placas simples. As placas individuais foram em seguida tomadas e o ADN de forma replicativa (RF, dupla banda) foi purificado por tratamento com cloreto de céssio/brometo de etídio em gradientes de densidade. O RF ADN purificado foi digerido até ao fim com Kpnl. A clonação foi conseguida por ligação de shotgun do RF ADN digerido com o corte de Kpnl adequado e vector de expressão fosfatizado ou por ligação específica do fragmento de ricina A após a sua purificação de um gel de agarose. 0 ADN ligado foi transformado em E.coli TG1 ou HB101.

Os clones contendo ricina A foram identificados por escrutínio de hibridização utilizando uma sonda de ricina A marcada com ³²P produzida por primagem aleatória de hexanucleótidos de um fragmento de Kpnl isolado de outro clone contendo ricina A (pICI 1121). As colónias que revelavam bibridização positiva foram ainda escrutinadas por análise de restrição do ADN de plasmídios utilizando uma digestão simples de Kpnl e uma digestão dupla de EcoRIZBglII. 0 Kpnl identifica a dimensão do fragmento inserido e o EcoRI/BglII determina a orientação do fragmento.

Os clones que foram confirmados como tendo o fragmento de ricina A na orientação correcta para expressão foram analisados por SDS-PAGE seguido pela revelação de Coomassie e revelação de Western de géis duplicados. O valor da acumulação de ricina A nestes clones era equivalente ao detectado de pICI1102.

Foi seleccionado um dos isolados e o plasmídio foi designado por pICI1131.

7.d) Utilização de um elemento terminador de transcrição alternativo

Um elemento de terminação de transcrição produz uma estrutura secundária na extremidade 3' de mÃRN que está envolvida\ na paragem da actividade da polimerase de ARN. A estabilidade desta estrutura secundária pode aumentar a acumulação de proteína por protecção do mARN do ataque pela exonuclease na extremidade 3'. Pensa-se que o terminador de transcripção T₄ tem uma estrutura secundária mais forte que a do atenuador trp presente em todas as contruções prévias de ricina A.

Nestas experiências, o promotor trp e o fragmento de ricina A de pICI 1131 foi excisado por digestão com as enzimas EcoRI e Sall. Esta última enzima efectua a clivagem entre o terminal 3' da sequência de codificação da ricina A e do terminador de transcrição trpA. O fragmento resultante foi excisado de um gel de agarose (2% NuSieve GTG Agarose, FMC Bioproducts) e foi purificado com extracções de fenol e clorofórmio seguido de precipitação com etanol. O fragmento purificado foi ligado com pICI 1079 cortado com EcoRI e Sall. Este último plasmídio contém o terminador T₄ entre os pontos únicos de Sall e Sphl (ver S.c).

O ADN ligado foi transformado em E.coli HB101 (BRL) competente e foi utilizado o escrutínio de hibridização para detectar a presença de ADN de ricina A tal como nas experiências anteriores. Foram escolhidos os clones de hibridização positiva para a preparação de ADN de plasmídio seguido de análise de restrição com EcoRI e Sall em conjunto para revelar a presença de um fragmento de dimensão adequada.

Foi identificado um isolado com a contrução correcta e foi designado por pICI1185.

7.e Utilização de um fundo de plasmídio alternativo

Foi utilizado o plasmídio pICIUSS para produzir uma outra construção por subclonação do bloco de expressão em pICI 0042. O ADN de plasmídio foi preparado de pICI1185 e digerido com EcoRI e Sphl em conjunto para efectuar a excisão de um bloco de expressão contendo o promotor trp/RBSI/fragmento (MRA22) ricina A/terminador T^. Este fragmento foi isolado pelo processo referido em 4. d e ligado com pICI 0042 cortado com EcoRI e Sphl.

ADN ligado foi transformado em E.coli HB101 e incubado a 37°C durante a noite. As transformações com HB101 foram placadas em ágar L + tetraciclina e as colónias foram escrutinadas por hibridização com uma sonda de ADN de ricina A marcada com ^²P.

Em ambos os casos, as colónias positivamente

ADN de plasmídios utilizando digestões com EcoRI/Sph e EcoRIZBglIII. Foram identificados três isolados isto é pICI1187.1-3.

A Fig. 10 mostra a contrução de pICI1185 e pICI1187.

7.f) Selecção de clones

Os plasmídios isolados foram transformados em E.coli 71.18 (Gronenborn, B.; 1976, Mol. Gen. Genet. 148, 243-250) e foram tomadas as colónias simples para estudos de selecção de clones. Os lisados de célula integrais resultantes foram submetidos a electroforese em géis de SDS-PAGE em duplicado, um dos quais foi revelado com o azul

de Coomassie e o outro foi utilizado para	análise	de
revelação de	Western.
0	gel	revelado	produziu	dados	mínimos	na
expressão de	ricina	A devido	à presença	de	uma	proteína	co-
migrante de	E.coli	71.18. A	revelação	de	Western indicava
claramente <	a expressão de	ricina-À	em	comparação	com

amostras de controlo positivas e negativas. Um isolado foi enviado para o Grupo de Investigação de Fermentação para processamento.

Fermentação de r-Ricina A (a) 0 plasmídio pICI 1187 foi transformado em E.coli estirpe DS410 (também referida aqui como MSD68) e o recombinante resultante (MSD1051) foi purificado e mantido em soluções guardadas de glicerol a -80°C.

Foi removida uma alíquota do armazém e riscada em placas de ágar de L-tetraciclina para separar colónias simples após crescimento durante a noite a 37 °C. Foi removida uma clona simples de MSD 1051 e re-suspensa em 10 ml de caldo de L-tetraciclina e foram imediatamente inoculados 100 μΐ em cada um dos 10 frascos de Erlenmeyer de 250 ml contendo 75 ml de caldo de L-tetraciclina. Após o crescimento durante 16 horas a 37 °C num agitador reciprocante o conteúdo dos frascos foi combinado e utilizado para inocular um fermentador contendo 20 1 de um meio de crescimento de LCM50 modificado com a seguinte composição:

	Perfeita	com água destilada SZl
kh2po4		3,0
Na2HPO4		6,0
NaCl		0,5
Hidrolisado de caseína (Oxoid L41)	2,0
(nh4)2so4		10,00
Extracto de levedura	(Difco)	20,00
Glicerol		35,00
MgS04. 7H2O		0,5
CaCl2. 2H2O		0,03
Tiamina		0,008
FeS04/Ácido Cítrico		0,04/0,02
Solução de elementos	traço (TES)	0,5 ml 1“-*-

As fermentações foram em seguida efetuadas a uma temperatura de 37°C e a um valor de pH controlado por adição automática de uma solução 6M de hidróxido de sódio, a pH 6,7. A tensão de oxigénio dissolvido (dOT) de controlo era de 50% da saturação de ar e foi controlada por ajustamento automático da velocidade de agitação do fermentador. Foi aumentado o caudal de ar para o fermentador, inicialmente de 20 1/min, correspondente a 1 volume por volume por minuto (WM) para 45 1/min guando a velocidade de agitação do fermentador se aproximava de 80 a 90% do seu valor máximo.

Ao longo da fermentação foram tomadas amostras para a medida da densidade óptica (OD₅₅₀), peso seco das células e acumulação da ricina A dentro das células. A acumulação da ricina A foi medida por varrimento de géis de SDS-PAGE revelados com azul de Comassie de lisados de células integrais da matéria amostrada tal como é bem conhecido.

Após 4,5 horas de inoculação, a solução de extracto de levedura (Difco) (225 g/1) foi enviada por bombagens para os fermentadores a uma taxa de 1,7 g/l/hora.

Passadas 12 horas quando o valor de OD₅₅₀ atingia aproximadamente 50, e antes da fermentação se tornar limitada por oxigénio as bactérias foram colhidas numa centrifugadora de Sorvai RC3B (7000 g, 30 min, 4°C) e a proteína acumulada foi recuperada das bactérias.

(b) O plasmídio pICI 1187 foi transformado em E.coli estirpe DS410 (também referida aqui como MSD68) e o (MSD

1051) recombinante resultante foi purificado e mantido em glicerol a -80°C.

Foi removida uma alíquota (100 μΐ) da cultura e foi imediatamente inoculada num frasco de Erlenmeyer de 2 litros contendo 600 ml de caldo de L-tetraciclina. Após o crescimento durante 16 horas a 37 °C num agitador reciprocante, o teor dos frascos foi utilizado para inocular um fermentador contendo um meio de cultura com a seguinte composição:

Componente

Perfeita com água destilada ( g/1) kh₂po₄

Na₂HP0₄

NaCl

Hidrolisado de Caseína (Oxoid (nh₄)₂so₄

Extracto de levedura (Difco)

Glicerol

MgSO₄. 7H₂O

CaCl₉. 2H₉O

Tiaaina

FeS0₄/Ácido Cítrico

Solução de elementos traço

Tetraciclina

3,0

6,0

0,5

L41) 2,0

10,00

20,00

35,00

0,5

0,03

0,008 0,04/0.02 (0,5 ml 1^_1) (10 mg 1 -¹)

A fermentação foi efectuada a uma temperatura de 37 °C. O valor do pH foi controlado por adição automática de ácido sulfúrico 2M e solução 6M de hidróxido de sódio de forma a que o valor de pH fosse controlado a 6,7 até 10 horas após a inoculação e em seguida a pH 6,0.

O valor da tensão de oxigénio dissolvido (dOT) de controlo foi fixado em 50% da saturação de ar e foi inicialmente controlado por ajustamento automático da velocidade de agitação do fermentador. O caudal de ar para o fermentador foi inicialmente de 20 1/minuto correspondente a um volume por volume por minuto (WH) e foi aumentado manualmente para 45 1/minuto quando a velocidade de agitação do fermentador atingiu o seu valor máximo (1000 rotações por minuto). 0 caudal de ar para o fermentador foi manualmente diminuído para 20 1/minuto quando nas últimas fases da fermentação a velocidade do agitador tinha automaticamente diminuído para aproximadamente 500 rotações por minuto. A fermentação foi efectuada durante 23 horas e durante esse período foram tomadas amostras para a medida da densidade óptiva (OD₅₅₀), peso seco das células, acumulação e repartição da ricina A dentro das células das bactérias. A acumulação da ricina A foi medida por varrimento de géis de SDS-PAGE revelados com azul de Comassie de lisados de células integrais das bactérias amostradas tal como é bem conhecido. A repartição de ricina A nas fracções do citoplasma (solúvel) e do corpo de inclusão (insolúvel) das células foi determinada submetendo as bactérias das amostras a uma li se de sonificação tal como é bem conhecido.

Foi enviada por meio de uma bomba uma solução de extracto de levedura (225 g/1) para o fermentador a partir de 4,5 horas após a inoculação a 1,7 g/l/hora.

Quando a fonte de carbono na fermentação foi consumida (conduzindo a um aumento rápido do valor de dOT de 50% do ar de saturação) foi enviada por meio de bomba uma alimentação contendo glicerol (714 g/1) e sulfato de amónio (143 g/1) para o fermentador a uma taxa suficiente para responder ás necessidades máximas de carbono das bactérias. A taxa de alimentação da fonte de carbono e do sulfato de amónio foi depois mantida durante a parte restante da fermentação.

Passadas 23 horas a fermentação produziu aproximadamente 1500 mg de ricina A solúvel por litro de caldo de fermentação.

NOTAS:

1. E.coli DS410 (também referida aqui como MSD68) é bem conhecida (Dougan e Sherrat, Molecular and General Genetics, Vol 151, pág. 151-160, 1977). Esta estirpe está livremente disponível ao público, e além disso foi depositada pelos Requerentes em 7 de Junho de 1985, segundo o Tratado de Budapeste com o National Collections of Industrial & Marine Bactéria Ltd, Aberdeen, Escócia com o número de depósito 12100.

2. Solução de Elementos Traços (TES)

A TES tem a seguinte composição:

A1C1₃.6H₂0

CoC1₂.6H₂0

RCrfSC.)₉.12H₉0

CuCl,.2H,0 ² h₃bo²

Kl

MnSO₄.H₂O

NÍSO₄.6H₂O

Na₂Mo0₄.2H₂O

ZnSO₄.7H₂O mg/10 ml (água desionizada)

2,0

0,8

0,2

0,2

0,1

2,0

2,0

0,09

0,4

0,4

PURIFICAÇÃO DE r-RICINA A DE E.COLI

Nas condições óptimas de fermentação, a r-ricina A acumula-se sob a forma de uma proteína citosólica solúvel. Esta proteína foi recuperada por rompimento das células (homegeneização) num tampão que promove a estabilidade de r-ricina A. Esta operação unitária foi efectuada em células vivas recolhidas para assegurar a estabilidade em solução do produto. A r-ricina A foi recuperada do homogeneizado por remoção dos sólidos (resíduos celulares) por centrifugação. De modo a permitir efectuar este procedimento à escala industrial os resíduos foram floculados com um agente (politeno imina) que também precipita a maior parte do ácido nucleico presente no extracto. 0 sobrenadante centrifugado foi em seguida filtrado e esterilizado, concentrado por filtração em contra-corrente e a proteína foi precipitada com sulfato de amónio. O precipitado de sulfato de amónio foi guardado na forma congelada a -70°C.

A r-ricina A tem um ponto isoeléctrico de 7,3 muito acima do ponto isoeléctrico de muitas outras proteínas de E.coli. o produto pode assim ser convenientemente purificado por cromatografia de permuta iónica. Todas as fase de recuperação e cromatografia foram efectuadas em condições que promovam a estabilidade da rricina A: temperatura <15°C, presença de ditiotreitol para manter o tiol livre a um valor reduzido e AEDT para reduzir a oxidação pelo ar e a proteólise.

Recuperação da r-ricina A

As células foram colhidas do caldo de fermentação utilizando um separador de descarga intermitente de discos empilhados e contínuo. O caldo (50 1 de uma fermentação de 2 x 25 1) foi inicialmente transferido dos fermentadores para um tanque de agitação de 50 1 e transportado para um sistema vedado consistindo em alguns tanques de retenção ligados ao separador e a um homogeneizador de alta pressão.

O tanque rotativo foi ligado a este sistema e o caldo foi enviado por meio de bomba pelo separador centrífugo a um caudal de 40 1/hora. A taxa da descarga foi ajustada de modo a que o sobrenadante da centrifugadora fosse considerada transparente pela inspecção visual de uma janela na linha de descarga do sobrenadante. A descarga de sólidos (Células) do separador foi recolhida num vaso adequado e foi suspensa em 40 1 de Tampão A (dihidrogeno ortofosfato de sódio 50 mM; ácido etileno diamino tetra acético 25 mM; benzamidina 5 mM; ditiotreitol 2 mM; pH 6,3 com hidróxido de sódio 5N) e pré-arrefecida para 8°C no recipiente de recolha de sólidos. As células suspensas foram em seguida transferidas de novo para o tanque rotativo através do homogeneizador ajustado a uma pressão de trabalho de 600 bar. 0 homogeneizado resultante (60 1) foi arrefecido para uma temperatura <20°C e tornado 0,5% em

- 91 relação á politenomina pela adição de 2,5 1 de uma solução de 10% (v/v). A suspensão foi deixada flocular durante 10 minutos antes da transferência para o Tanque de Retenção através do separador centrífugo. O sobrenadante transparente foi em seguida recolhido e esterilizado por purificação através de um filtro de profundidade e um filtro de membrana de 0,2 pm positivamente carregado.

Precipitação com sulfato de amónio

O sobrenadante clarificado estéril foi concentrado para um volume de 12 1 utilizando um dispositivo de filtração em contra-corrente com cartucho em espiral e a solução foi levada a 40% de saturação pela adição de 2,9 kg de cristais sólidos de sulfato de amónio. A solução foi deixada flocular por agitação moderada durante a noite a 15 °C e em seguida foi centrifugada. A suspensão descarregada foi recolhida e guardada a -70°C até ser necessária para o processamento adicional.

Resolubi1ização e Dessalini zação precipitado de sulfato de amónio foi descongelado na presença de 14 1 de Tampão B (dihidrogeno ortofosfato de sódio 50 mM; ácido etileno diamino tetra acético 25 mM; ditiotreitol 2 mM; pH 6,3 com hidróxido de sódio 5N). Passados 30 minutos a suspensão foi clarificada por centrifugação e dessalinizada por diafiltração contra

1 de Tampão B e a condutividade foi medida confirmando que tinha sido reduzida para valores inferiores a 3 mS/cm.

A solução dessalinizada foi clarificada ainda por centrifugação e processada imediatamente.

Cromatografia de permuta aniónica

A solução dessalinizada foi lentamente adicionada a um tanque de cromatografia contendo 2 kg de DEAE-celulose que tinha sido equilibradp com 60 1 de Tampão

B. Após agitação durante 6,5 horas a solução de r-ricina A não ligada foi enviada por meio de uma bomba do fundo do tanque através de uma coluna de 11,3 cm de diâmetro por 10 cm de enchimento e DEAE-celulose equilibrada a um caudal de 80 ml/min. A maior parte da r-ricina não se ligava e foi recolhida num recipiente de ácido inoxidável.

Cromatografia de permuta catiónica

A solução de r-ricina A foi ajustada a pH 5,5 com ácido ortofosfórico 1M e aplicada a uma coluna de 10 cm de diâmetro x 10 cm de carboximetil agarose equilibrada com 10 1 de Tampão C (dihidrogeno ortofosfato de sódio 25 mH; ácido etileno diamino tetra acético 5 mM; ditiotreitol 2 mM; pH 5,5 com hidróxido de sódio 5N). A r-ricina A foi ligada a esta coluna e após lavagem com 10 1 de Tampão C foi eluída com Tampão D (dihidrogeno ortofosfato de sódio mM; ácido etileno diamino tetra acético 5 mM; ditiotreitol 2mM; cloreto de sódio 100 mM; pH 5,5 com hodróxido de sódio 5N). A r-ricina A pura eluída sob a forma de um pico único foi recolhida e guardada a -70°C sob a forma de uma solução congelada até ser necessária para o processamento adicional. A r-ricina A é estável nestas condições durante um período de tempo de até um ano.

Foi utilizado o seguinte equipamento:

Permutador aniónico: DE-52, DEAE Celulose (Whatman Biochemicals)

Permutador catiónico: CM/Sepharose (Pharmacia)

Centrifugadora: centrifugadora de pilha de discos (Westphalia) Westphalia CSA-l

Homogeneizador: homogeneizador (APV) APV-Schroeder Lab 60/60

Filtro: filtro de profundidade AMI 0057P, filtro de membrana ABI NFZP-Posidyne (Pall)

Tanque de loteamento: 701 Pharmacia Batch

Chromatography Tank (Pharmacia)

Coluna DE: Bioprocess 113 (Pharmacia)

Coluna DM: Kl00/50 (Pharmacia)

PROPRIEDADES BIOLÓGICAS DO ANTICORPO C242 E DA IMUNOTOXINA

Avaliação imunohistoquímica de C242 (C242.II) em tecidos do cancro colo-rectal e normais.

Foram obtidos espécimes do carcinoma colo-rectal primário e de vário tecidos normais de pacientes que tinham sofrido um resecção cirúrgica. Os tecidos foram mantidos em gelo e foram congelados após reacção em iso-pentano préarrefecido com azoto líquido. Os tecidos foram guardados a -70°C até serem seccionados. As biópsias congeladas foram cortadas em secções de 5 gm e fixadas em 50% de acetona durante 30 segundos a +4°C seguido de 100% de acetona durante 5 minutos a +4°C. As secções foram secas com ar e lavadas em PBS durante 10 minutos. Todas as secções foram em seguida incubadas em peróxido de hidrogénio a 0,3% em PBS durante 5 minutos para bloquear a peroxidase endógena e lavadas por duas vezes em PBS. Em seguida as secções foram tratadas com soro de suíno normal e diluídas a 1:10 em PBS4% de BSA durante 5 minutos a +4°C para bloquear a ligação não específica de anticorpos.

Todas as incubações com anticorpos foram efectuadas numa atmosfera húmida durante 30 minutos à temperatura ambiente. As secções foram incubadas com o anticorpo monoclonal C242 (C242:II), obtido no Exemplo 1 anterior, em PSB-4% de BSA, e em seguida com IgG anti-rato de cavalo biotinilado (Vectastain - marca comercial, Vector Laboratories, Burlingame, CA, Estados Unidos da América) diluído a 1:400 em PBS-4% de BSA com imunoglobulina anticoelho de suíno a 2% e finalmente com um complexo de avidina DH/complexo H de peroxidase de rábano biotinilado (Dakopatts A/S, Copenhague, Dinamarca). Após cada incubação

as secções foram lavadas em PBS durante 15 minutos. As secções foram em seguida tratadas com substrato durante 15 minutos, lavadas em PBS, contra-reveladas com hematoxilina e montadas com glicerolgelatina (Merk, Darmstatd, República

Federal da Alemanha). O substrato utilizado consistia em 10 mg de 3-amino-9-etilcarbazole (Sigma, St. Louis, Mo., SÃ) dissolvido em 6 ml de sulfóxido de dimetilo e diluído com ml de acetato de sódio 0,02 M, pH 5,5, contendo 4 μΐ de H₂O₂ a 30%. A solução de substrato foi filtrada antes da utilização. As secções foram em seguida examinadas e os resultados obtidos são apresentados na Tabela 1 seguinte.

TABELA

Revelação de tumores normais com C242:II colo-rectais e de vários tecidos

TECIDO

REVELADO /TOTAL carcinoma colo-rectal

26/41 cólon normal

8/16 glândula mamária

2/3 glândula parótida

2/2 pele

0/1 ligeira revelação de glândulas de suor fígado

0/2 fraca revelação dos duetos da bílis rim

0/1 pâncreas

2/2 duetos estômago

0/1 intestino delgado

0/1

Tal como é aparente da Tabela 1, 63% das biópsias examinadas de tumores colo-rectais apresentavam uma revelação positiva com C242:II monoclonal. A expressão do antigênio CA242 em tecido de cólon normal revelou ser genericamente mais fraca do que em tecido de tumor, sendo a revelação totalmente localizada no epitélio colunar e nas células de gobleto. O tecido normal não cólon era quase completamente isento de reactividade com C242:II monoclonal, enquanto que foi verificada uma reacção positiva em duetos da mama normais, duetos pancreáticos, duetos da bílis, e glândulas de suor, mas a intensidade da revelação era fraca.

Avaliação imunohistoquímica de C242 (C242:TT) em tecidos humanos normais tomados no estado post mortem

Foram recolhidos bastantes tecidos humanos normais de um total de 21 indivíduos após falecimento. Foram seleccionados os melhores 5 conjuntos de espécimes de tecidos para a avaliação da imunorreactividade a C242:II.

Após o falecimento, os tecidos foram removidos e colocados imediatamente em tubos pré-arrefecidos contendo meio básico con antibiótico adicionado. Os tubos contendo o tecido foram em seguida transportados para o laboratório (em gelo), o fluido da cultura foi removido e tecido foi colocado em tubos de 0,5 cm³. Os cubos de tecidos foram

colocados em tiras de papel de filtro e congelados com azoto líquido. Os tecidos congelados foram guardados a -80 °C até serem seccionados. Após seccionação, as amostras congeladas foram cortadas em secções de 6 μη que foram em seguida feitas aderir a placas de vidro para análise por microscópio. As secções foram fixadas por imersão das placas em 100% de acetona à temperatura ambiente durante 2 minutos. As placas foram em seguida removidas da acetona, deixadas secar ao ar e guardadas a -20°C antes da utilização.

Todas as incubações foram efectuadas numa atmosfera húmida durante 30 minutos à temperatura ambiente. As secções foram incubadas em primeiro lugar com o anticorpo monoclonal C242:II em solução Salina Tamponada de Tris (TBS), e em seguida com IgG anti-rato de coelho conjugado com peroxidase de rábano (Dako Ltd, High Wycombe, Bucks, Reino Unido) diluído a 1:50 em TBS contendo 20% de soro humano (Sigman Chemical Company Ltd, Poole, Dorset, Reino Unido) e finalmente com IgG anti-coelho de suíno conjugado com peroxidase de rábano (Dako Ltd), diluído a 1:50 em TBS contendo 20% de soro humano. Após cada incubação as secções foram lavadas por duas vezes em TBS. As secções foram depois tratadas com um substrato durante 3 a 5 minutos, lavadas em TBS, contra-reveladas com hematoxilina de Mayers e montadas com um Meio de Montagem Sintético (Shandon Scientific Ltd, Runcorn, Cheshire, Reino Unido). 0 substrato utilizado consistia em 10 mg de aminobenzidina (Sigma) dissolvida em 17 ml de TBS contendo 17 μΐ de H₂O₂ a 30%. A solução de subtrato foi filtrada antes da utilização. As secções foram examinadas e os resultados obtidos são apresentados na Tabela 2 seguinte.

TABELA 2

Revelação de tecidos normais no estado post mortem com

C242:II

TECIDO	REVELADO /TOTAL
Cerebelo	0/3
Cérebro	0/3
Cérebro central	0/3
Coração	1/5 fraco, reactividade difusa
Pulmão	0/5
Nervo periférico	0/3
Rim	0/5 reactividade a túbulos próximos/distais
Fígado	2/2 fraca reactividade aos duetos
Pâncreas	2/2 ductal e acinar
Cólon	2/3 fraca reactividade ao epitélio
Intestino delgado	3/3 fraca reactividade ao epitélio
Adrenal	2/5 fraca reactividade à cápsula

Bexiga	1/5 difusa
Tiróide	1/5 difusa
Paratiróide	0/2
Pele	2/4 epitélio escamoso e glândulas sudoríporas
Músculo estriado	1/5 difusa
Medula	0/5
Nodo linfático	0/5
Estômago	3/3 fraca reactividade ao epitélio
Testes	0/3
Parótida	1/1 fraca reactividade aos duetos
Tonsil	4/4 reactividade ao epitélio escamoso

Tal como resulta da Tabela 2, 72% dos tecidos

P.M (post-mortem) normais escrutinados não tinham reactividade a C242:II. Dos 28% que se revelaram positivos, a maior parte da revelação foi difusa, ou sem definição ou focal, predominantemente nas estruturas dos duetos dentro dos tecidos. Foi observada no epitélio gastro-intestinal uma ligação mais heterogénea, mas ainda mínima. 2/4 dos espécimes da pele tinham revelação positiva com reactividade para o epitélio escamoso e glândulas sudoríporas. O epitélio escamoso também tinha revelação

100

positiva nos 4 espécimes tonsil” escrutinados com C242:II.

Endocitose da ligação de C242:II a carcinoma do cólon humano COLO 205

Foi efectuado um ensaio de endocitose da forma seguinte:

Foram preparadas suspensões de células a partir de células COLO 205 (ver preparação do anticorpo C242 descrito acima) cultivadas numa cultura de monocamada. As células foram tripsinizadas, bastante bem lavadas e resuspensas num meio de cultura. Foi adicionado o anticorpo C242:II marcado com iodo obtido anteriormente (200000 cpm correspondentes a 50 ng de anticorpo monoclonal) a uma suspensão de células simples de células COLO 205 (10⁶ células) em tubos de ensaio de 5 ml. 0 volume final era de 200 μΐ por tubo.

As células foram incubadas na presença de ¹²⁵I-C-242 durante 1 hora em gelo (0°C). A suspensão foi em seguida centrifugada e as células foram lavadas para libertá-las do anticorpo monoclonal não ligado. As células pré-incubadas foram ainda incubadas a 37°C durante períodos de tempo de 10 minutos durante 1 hora, sendo as células rearrefecidas e pastilhadas de cada vez. Foi medida a radiomarcação libertada para o meio de cultura a partir do sobrenadante (contador gamma LKB, Pharmacia AB, Uppsala, Suécia). 0 sobrenadante foi também submetido a precipitação de TCA e foi medida a radioactividade do precipitado. Foi

101 removido o ¹²⁵I-C242 ligado à superfície por lavagem ácida com tampão de glicina-HCl 0,2 M, pH 1,5, contendo 2,5 mg/ml de papaina e foi contada a radioactividade, representando o ^²^I-C242 internalizado. A quantidade de anticorpo ligado à superfície em cada altura, incubado a 37°C, foi calculado subtraindo o anticorpo monoclonal libertado e internalizado do anticorpo monoclonal ligado à superfície. A degradação do anticorpo libertado foi medida por precipitação de TCA do meio sobrenadante.

Os resultados obtidos são apresentados na Fig.

no desenho anexo que mostra a endocitose de ¹²⁵I-c242:II por células COLO 205, a radioactividade à superfície das células (Sur’’), radioactividade internalizada (Int”), radioactividade libertada (“Res“) e radioactividade libertada degradada (Deg. Re) expressas como uma percentagem da radioactividade inicial total na superfície das células. Na Fig. 15 pode observar-se que foi obtida uma internalização superior a 20% de C242:II no período de 1 hora quando foram incubadas a 37°C as células préincubadas. Existia um pequena quantidade de radioactividade solúvel em ácido quando o meio sobrenadante foi precipitado com TCA o que indicava uma pequena fragmentação da actividade libertada após 1 hora de incubação.

Citotoxicidade da imunotoxina de ricina A/anticorpo C242

Citotoxicidade in vitro

102

Este ensaio mostra a citotoxicidade in vitro da imunotoxina contra uma linha de células de tumor colorectal humano (Colo 205-ATCC No. CCL 222).

Foram cultivadas células COLO 205 em suspensão no meio RPM1640 com bicarbonato de sódio a 2,0 g/litro, sem glutamina, com 5% de soro de vitela fetal desactivada termicamente, L-glutamina 2 mM e gentamicina a 50 gg/ml. As células foram contadas utilizando blocos hemacitométricos. Para os ensaios de inibição da síntese das proteínas, as células foram placadas a 2 χ 10⁴ células/furo em placas de 96 furos num volume de 100 μΐ. Foram administradas amostras de imunotoxina a 3 furos replicados. Foi adicionada a imunotoxina em 12 diluições duplas de 2 000 a 0,98 ng/ml. Foram adicionados 100 μΐ de meio de cultura a alguns dos furos para controlo. Cada placa foi incubada durante 24 horas a 37°C, antes de ser adicionado a cada furo 2 μϋί de ³H-L-Leucina. As placas foram incubadas a 37°C durante mais 24 horas. Foram adicionados 50 μΐ de tripsina a cada furo e as placas foram incubadas durante mais 15 a 20 minutos. As células foram recolhidas de cada furo/placa em tecidos de fibra de vidro e a radioactividade foi determinada utilizando um contador de cintilação LKP betaplate. Foram construídas curvas de inibição da síntese de proteínas e calculado o valor de IC_5Q. Os resultados obtidos com a imunotoxina preferida (preparação descrita acima) são ilustrados na Figura 16.

103

Citotoxicidade in vivo

Este ensaio mostra a citotoxicidade in vivo da imunotoxina contra uma linha de células de tumor humano Colo 205, cultivado como xenoenxertos subcutâneos em ratos atímicos. Foram também tratados grupos de controlo, utilizando apenas anticorpo ou solução salina tamponada com fosfato.

Foram injectadas 5 x 10⁶ células COLO 205 num único ponto subcutâneo nos flancos dos ratos atímicos. Foram deixados crescer os tumores e medidos em cada 3 a 4 dias em duas dimensões utilizando craveiras. A injecção do material de ensaio não foi iniciada antes dos tumores terem atingido dimensões de 0,7-1,0 cm. Esta fase é considerada o dia 0 e os materiais de ensaio foram injectados intravenosamente nas veias da cauda nos dias 0, 1 e 2. O tamanho do tumor continuou a ser medido em duas dimensões e apresentado como volume de tumor relativo mútuo. As medidas foram feitas em cada 3 a 4 dias até terminar a experiência.

Este ensaio compara os efeitos no volume de tumor relativo da solução salina tamponada com fosfato, apenas anticorpo C242 (1,2 mg/kg) e imunotoxina preferida (preparação descrita anteriormente) (2,0 mg/kg) no crescimento de tumores, e os resultados obtidos são ilustrados nas seguintes Tabelas.

GRUPO 1 solução salina tamponada com fosfato 0,1 ml/10

104 g/i.v./3 x dia

RATO

DIA	1	2	3	4	5	6	7	8	9 10
0	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
4	2,02	1,15	2,28	1,02	0,51	0,80	2,05	1,58	0,79	1,23
8	5,04	3,27	5,08	2,18	1,09	1,83	4,54	4,75	1,59	3,63
10	6,41	4 g 32	5,24	3,94	1,96	2,44	5,58	5,91	1,85	4,43
15			7,72	5,24	4,13	2,94	7,25	9,45	2,71	7,02
18		11,81				14,39	3,30 11,48

GRUPO 2 anticorpo C242 1,2 mg/kg/i.v./3 x dia

RATO

DIA	1	2	3	4	5	6	7	8	9 10
0	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
4	1,64	2,19	1,85	1,08	1,48	2,07	1,65	1,36	2,14	2,47
8	3,31	4,30	3,28	4,07	3,38	4,78	6,08	2,96	3,34	7,31
10	4,46	4,65	4,88	4,85	3,44	5,11	8,82	4,19	4,12	7,43
15				5,29		10,80	2,57

15,03

GRUPO 3 imunotoxina 2,0 mg/kg/i.v./3 x dia

RATO

DIA	1	2	3	4 5	6	7	8	9
0	1	1	1	1	1	1	1	1	1
4	0,63	0,86	1,40	0,64	0,48	0,43	0,73	0,91	0,77
8	0,44	0,87	1,08	0,48	0,58	0,41	0,67	0,93	1,07
10	0,48	0,71	1,39	0,29	0,55	0,51	0,56	1,13	1,21

Tal como é ilustrado nas Tabelas anteriores, a imunotoxina dá origem a uma redução do tamanho do tumor (as Tabelas mostram o volume de tumor relativo) em contraste com a solução salina tamponada com fosfato (PBSA) de controlo e de apenas de anticorpo.

105

Reactividade de C242.II com Tecido de Tumor Pancreático

Humano

Este ensaio mostra a reactividade de C242.II com o tecido do tumor pancreático humano.

A reactividade de C242.II em relação ao tecido do tumor pancreático humano foi determinada utilizando as mesmas técnicas imunohistológicas descritas para a reactividade do tecido humano normal. Foi obtido tecido de tumor pancreático congelado recente a partir de material de biópsias de agulha fina e tecido embebido fino em formalina fixada/parafina obtido de ressecções de tumor. 13/16 dos tumores pancreáticos tinham uma revelação positiva. Em geral, a extensão e o padrão da ligação era melhor ou igual ao observado em espécimes de tecidos de tumor colo-rectal.

Potência in vitro da Imunotoxina em Linhas de Células de Tumor Pancreático

Este ensaio mostra a citotoxicidade in vitro da imunotoxina contra uma linha de células de tumor pancreático humano. A linha de células Pan 1, derivada de um adenocarcinoma pancreático, foi utilizada para quantificar a potência citotóxica in vitro da imunotoxina, e por análise de FACS foi mostrado que exprimia o antigénio alvo. Para quantificar a potência, foram adicionadas várias

106

concentrações da imunotoxina a células Pan 1 em cultura para calcular o valor de IC_5Q. Foram utilizados como controlos negativos o conjugado de MOPC21:ricina A e apenas ricina A. 0 bioensaio foi efectuado por três vezes e foi obtida uma potência média de 40 ± 18 ng/ml. Os controlos negativos não eram citotoxicos para concentrações de até 1000 ng/ml. Estes dados demonstram que o antigénio alvo está presente nas células de tumor pancreático e que as células de tumor positivos a antigénio são susceptíveis de serem mortas pela imunotoxina.

Clonacâo molecular de partes que codificam o cADN das cadeias ligeira e pesada do anticorpo monoclonal C242:II

A. Preparação de ARN total

Foi preparado o ARN total de 10⁸ células essencialmente de acordo com o processo de Cirgwin, J.M. e col. (1979; Biochemistry 18, 5294-5299) modificado por Chomezynksi, P. e Sacchi, N, (1987; Anal. Biochem. 162, 156-159). Em resumo, a pastilha de células foi dissolvida em 15 ml de solução desnaturante fria consistindo de tiocianato de guanidínio 4 M; citrato de sódio 25 mM, pH 7,0; N-lauroil sacrosina a 0,5%; 2-mercaptoetanol 0,1 M. Após a dissolução do material das células foram adicionados 1,2 ml de acetato de sódio 2 M (pH 4,0) e a mistura foi extraída com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico

107

fase aquosa por adição de um volume igual de isopropanol, e incubado a -20°C durante a noite de modo a precipitar o ARN total. Após centrifugação e resuspensão do ARN, foi repetida a precipitação, e após uma centrifugação e precipitação adicional, foi calculado um rendimento total de ARN obtendo-se um valor de 960 μg com base nas medidas de absorvância.

B. Isolamento de mARN

Para isolar o mARN poliadenilado da preparação anterior de ARN total, foi utilizado o sistema de isolamento de mARN de PolyATract™ da Promega Corporation, Madison, Estados Unidos da América, de acordo com as instruções do fabricante (cf..: Promega Technical Bullentin, No. 090: 1990). Em resumo, foram dissolvidos 960 Mg de ARN total em água e foram equilibrados com uma sonda de oligo (dt) biotinilada (50 pmoles) em 0,4 x SSC (1 x SSC= 8,77 g de NaCl, 4,41 g de citrato de sódio por litro de água a pH 7,0). Foram adicionadas pérolas paramagnéticas revestidas com esteptavidina (Streptavidín Magnesphere™) e após um período de 10 minutos de incubação as partículas magnéticas foram removidas e lavadas várias vezes com 0,1 x SSC. 0 mARN poliadenilado foi eluído das esferas por incubação em água, obtendo-se 5 /ig de mARN.

108

C. Preparação da biblioteca de fagos de cADN em E.coli

Foi preparado cADN de mARN poliadenilado da fase anterior essencialmente de acordo com o processo de Gubler, U., Hoffman, B. J. (1983; Gena 25, 263-269), modificado para o vector Uni-ZAP™ (Stratagne Inc. La Jolla, Califórnia) que permite a clonação unidireccional de cADN de dupla banda. Em resumo, foram convertidos 5 μg de mARN poliadenilado em cADN de banda única por primagem com um primário ligante Uni-ZAP™ (56 ng/ml), adicionando dATP, dGTP, dTTP, e 5-metil-dCTP, a 0,6 mM e 45 U de transcriptase inversa do vírus da leucemia da murina Moloncy. A mistura foi incubada a 37°C durante 1 hora. A síntese da segunda banda do cADN foi efectuda por adição de dATP, dGTP, dTTP, e dCTP até uma concentração final de 0,15 mM, 3,2 U de RNase H, e 6,5 U de ADN Polimerase 1, e incubando durante 2,5 horas a 16°C. A mistura foi extraída com fenol-clorofórmio (1:1) e precipitada com etanol. Os terminais de cADN foram tornados cegos por incubação com dNTP 0,16 mM e 10 U de T4 ADN polimerase a 37°C durante 30 minutos. Após a extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol, o cADN de terminais cegos resultante foi ligado a adaptadores de EcoRI por adição de 3 U Wiess de T4ADN ligase, 1 ATP mM, e incubação durante a noite a 8°C. Após a ligação os terminais coesivos de EcoRI foram tratados com quinase por adição de 10 U de T4 Polinucleótido quinase na presença de 1 ATP mM, e incubados

- 109 durante 30 minutos durante 37 °C. 0 cADN resultante com terminais coesivos de EcoRI fosforilados, foi digerido com 90 U de Xhol de modo a criar um terminal coesivo de Xhol de sequência codificada pelo primário ligante Uni-ZAP™. 0 cADN resultante foi em seguida ligado a 1 jig de Uni-ZAP™ XR EcoRI e braços preparados com Xhol na presença de 2 U Weiss de T4 ADN ligase, 1 ΆΤΡ mM, e incubando a 12°C durante a noite. A mistura de ligação foi embalada in vitro em partículas de A -fago utilizando o extracto de embalagem de Gigapack II Gold^R de acordo com as intrucções do fabricante, e os fagos resultantes foram utilizados para infectar E.coli PLK-F'. A biblioteca de cADN resultante de

8,5 χ 10⁴ clones independentes foi ampliada uma vez para se obter um título de fagos de 7,5 x 10⁸ pfu/ml. À biblioteca de cADN resultante foi escrutinada utilizando E.coli XL1Azul como estirpe hospedeira (conforme Bullcock, W. (1987) Biotechniques 5, 4) tal como será a seguir descrito.

D. Preparação de sondas de hibridização

Para detectar os clones de cADN que codificam a cadeia pesada de IgGl cadeia ”kappa· do anticorpo C242:II, foram preparadas sondas de hibridização cobrindo o primeiro domínio constante da cadeia pesada, CHI, e o domínio constante da cadeia kappa”, CK, a partir do ADN genómico de rato pela reacção em cadeia de polimerase de acordo com Saiki R.H. e col. (1088; Science 239, 487-491).

110

Resumidamente, foram utilizados pares dos primário de oligonucleótido que hibridizam as regiões 5' e 3' nos exões de acordo com os domínios de imunoglobulina acima referidos para ampliação do ADN genómico de rato. Após purificação por electroforese em gel de agarose os fragmentos de sonda de ADN resultantes foram marcados com 32_p pelo processo de extensão de primário aleatório de acordo com Feinberg, A.P., e Vogelstein, B. (1983; Anal. Biochem. 132, 6).

E. Escrutínio para as cadeias IgGl pesada e kappa de sequências de codificação e inserção em plasmídios

A biblioteca de cADN da secção C anterior foi escrutinada em dois ciclos separados utilizando as sondas de IgGl de imunoglobulina e kappa”, respectivamente da secção D de acordo com os processos descritos por Sambrook J. e col. (1989; Molecular Cloning, 2^â Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Os clones da fagos que hibridizavam positivamente das duas hibridizações separadas foram ainda purificados por re-escrutínio dos clones de fagos utilizando as mesmas sondas como no escutrínio inicial. Os clones de fagos que hibridizavam positivamente foram expandidos em culturas de E.coli CLl-Azul, e os produtos de fagos resultantes foram utilizados para preparar o pBluescript contendo cADN por excisão fagémida e propagação essencialmente de acordo com Short, J.M. e col. (1988; Nucleic Acids Res. 16, 7583-7600).

111

F. Caracterização do cADN do plasmídios das colónias de hibridização

Os plasmídios contendo cADN resultante foram caracterizados por mapeamento de enzima de restrição, e os plasmídios contendo inserções nos tamanhos esperados foram submetidos a uma sequenciação de ADN de desoxi de acordo com Sanger, F. e col. (1977; Proc. Natl. Acad. Sei. Estados Unidos da América 74, 54-63-5467). Um plasmídio hibridizando com a sonda kappa Ig designada por pKGE761, continha uma inserção de cADN cuja sequência codifica um quadro de leitura aberto que é muito homólogo à sequência de cadeia ligeira kappa de rato conhecida anteriormente (conforme Kabat, E.A. e col. (1987) Sequences of Protein of Immunological Interest, 4^a Ed., U.S. Department os Health and Human Services, National Institutes of Health). Uma sequência de cADN parcial codificando a região variável da cadeia ligeira kappa, VK, e a sua sequência de proteína transladada é representada na Fig. 18. As três sequências de CDR designadas por CDR1 a CDR3, são indicadas a sublinhado. É indicado um péptido de sinal precedendo o terminal de amino e do segmento VK é indicado por S. CK indica que a região constante após o terminal carboxi teh da seqência VK.

Um plasmídio hibridizando com a sonda Xgll, designada por pKGE762, contendo uma insersão de cADN cuja

112

homólogo às sequências de cadeia pesada de IgGl de rato anteriormente conhecido (conforme Kabat, E.A. e col. vide supra!. É representada na Fig. 19 uma sequência de cADN parcial codificando a região variável de cadeia pesada IgGl, VH, e a sua sequência de proteína transladada. As três sequências de CDR, designadas por CDR1 a CDR3, são indicadas a sublinhado. É indicado um péptido de sinal precedendo um terminal de amino e do segmento VH por S. CHI indica a região constante após o terminal carboxi e da sequência VH.

COMPOSIÇÕES

A seguir ilustra-se uma forma de dosagem farmacêutica representativa contendo uma imunotoxina da presente invenção que pode ser utilizada para objectivos terapêuticos em seres humanos.

Solução injectável

Uma solução aquosa esterilizada, para injecção, contendo:

Imunotoxina de ricina A/anticorpo C242 ......... 1,0 mg

Acetato de sódio trihidratado................ 6,8 mg

Cloreto de sódio ............ 7,2 mg

Tween 20 ............ 0,05 mg por ml de uma solução

113

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL (I) REQUERENTES: Imperial Chemical Industries

PLC e Kabi Pharmacia AB (ii) TITULO DA INVENÇÃO: CONJUGADOS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 22 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: Departamento legal: Patentes (B) RUA: Bessemer Road (C) CIDADE: Welwyn Garden City (D) ESTADO: Hertfordshire (E) PAÍS: Reino Unido (E) CÓDIGO POSTAL: GB-AL7 1HD (V) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: Disquete, 3,50 polegadas,

1,2 Mb de capacidade (B) COMPUTADOR: 18 M PS/2 (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS 3,20 (D) PROGRAMA: ASCII de WPS-PLUS (Vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO (B) DATA DO PEDIDO:

(C) CLASSIFICAÇÃO:

114 - (vii) DATA DA PRIORIDADE DO PEDIDO (A) . PEDIDO NO. 9114399,0 (B) DATA DO PEDIDO: 03 JUL 1991 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 16 Amino ÁcidoS (B) TIPO: Amino Ácido (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

Tyr (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 7 Amino ÁcidoS (B) TIPO: Amino Ácido (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Arg Met Set Asn Leu Vai Ser

115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3:

(1) CÀRACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 AminoÁcidos (B) TIPO: Amino Ácido (C) NUMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4:

(i) CÀRACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 5 Amino ÁcidoS (B) TIPO: Amino Ácido (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Tyr Thr Gly Met Asn (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5:

(i) CÀRACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(À) COMPRIMENTO: 17 Amino ÁcidoS

116 (B) TIPO: Amino Ácido (C) NUMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly GLu Pro Thr Thr Ala Glu. Asp Phe

Lys Gly (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 10 Amino ÁcidoS (B) TIPO: Amino Ácido (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ: ID NO:6:

Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Vai (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 18 Amino ÁcidoS (B) TIPO: Amino Ácido (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

117

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

Tyr Trp Phe (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 11 Amino ÁcidoS (B) TIPO: Amino Ácido (C) NÚMERO DE BANDAS: única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:8:

Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Vai Ser Gly Vai (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 11 Amino ÁcidoS (B) TIPO: Amino Ácido (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Tyr Phe Gly (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10:

118

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 7 Amino ÂcidoS (B) TIPO: Amino Ácido (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10:

Phe Thr Tyr Thr Gly Met Asn (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 Amino Ácidos (B) TIPO: Amino Ácido (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11:

Met Gly Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu

Asp Phe Lys Gly Arg Ile (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 14 Amino ÂcidoS (B) TIPO: Amino Ácido

119 -

(C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12:

Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 25 (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13:

AATTCGCAT GCGGATCCAT CGATC 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 25 (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14.:

GCGTACGCC TAGGTAGCTA GAGCC

- 120 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D)

TOPOLOGIA: Linear (xi)

SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15:

GATÀACAÀCA TATTCCCCAÀ À (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:16:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO; 23 (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16:

GATAACAAC ATGGTACCC AÀA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 23

121

(C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (XÍ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17:

AÀCAACATG GTÃCCCAAA CAA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:18:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1140 (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) NUMERO DE BANDAS·: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18:

TTCTGGCAAA TATTCTGAAA TGAGCTGTTG ACAATTAATC ATCGAACTAG TTAACTAGTA60

CGCAAGTTCA CGTAAAAAGG GTATCGACAA TGGTACCCGG GGATCCACCT CAGGGTGGTC120

TTTCACATTA GAGGATAACA ACATGGTÁCC CAAACAATAC CCAATTATAA ACTTTACCAC180

AGCGGGTGCC ACTGTGCAAA GCTACACAAA CTTTATCAGA GCTGTTCGCG GTCGTTTAAC240

AACTGGAGCT GATGTGAGAC ATGAAATACC AGTGTTGCCA AACAGAGTTG GTTTGCCTAT300

AAACCAACGG TTTATTTTAG TTGAACTCTC AAATCATGCA GAGCTTTCTG TTACATTAGC360

CCTGGATGTC ACCAATGCAT ATGTGGTCGG CTACCGTGCT GGAAATAGCG CATATTTCTT420

TCATCCTGAC AATCAGGAAG ATGCAGAAGC AATCACTCAT CTTTTCACTG ATGTTCAAAA480

122 •1 _____ flg _ ΠπιιιΊ, -nilui -ί*ΠΤΊΓ·η^^^ΡΒΤΐ*^Τΐ.

TCGATATACA TTCGCCTTTG GTGGTAATTA TGATAGACTT GAACAACTTG CTGGTAATCT540

GAGAGAAAAT ATCGAGTTGG GAAATGGTCC ACTAGAGGAG GCTATCTCAG CGCTTTATTA600

TTACAGTACT GGTGGCACTC AGCTTCCAAC TCTGGCTCGT TCCTTTATAA TTTGCATCCA660

AATGATTTCA GAAGCAGCAA GATTCCAATA TATTGAGGGÀ GAAATGCGCA CGAGAATTAG720

GTACAACCGG AGATCTGCAC CAGATCCTAG CGTAATTACA CTTGAGAATA GTTGGGGGAG780

ACTTTCCACT GCAATTCAAG AGTCTAACCA AGGAGCCTTT GCTAGTCCAA TTCAACTGCA840

AAGACGTAAT GGTTCCAAAT TCAGTGTGTA CGATGTGAGT ATATTAATCC CTATCATAGC900

TCTCATGGTG TATAGATGCG CACCTCCACG ATCGTCACAG TTTTGATTGC TTATAAGGCC960

AGTGGTACCC GGGGATCCTC TAGAGTCGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTTAG CCCGCCTAAT1020

GAGCGGGCTT TTTTTTATCG ACCGATGCCC TTGAGAGCCT TCAACCCAGT CAGCTCCTTC1080

CGGTGGGCGC GGGGCATGAC TATCGTCGCC GCACTTATGA CTGTCTTCTT TATCATGCAA1140 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:19:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (XI) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19:

123

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:20:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 86 (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20:

AAAAAGGGTA TCGACATGGT ACCCGGGGAT CCACCTCAGG GTGGTCTTTC 60

ACATTAGAGG ATAACAACAT GGTACCCAAA CAATAC 86 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:21:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 463 (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21:

124

GGAATTCGGC ACGAGGAGTT TTTTTGTATC AAGTTCTCAGA ATG AGG TGC CTA GCT 55 Met Arg Cys Leu Ala

GAG TTC CTG GGG CTG CTT GTG CTC TGG ATC CCT GGA GCC ATT GGG GAT

103

Glu

Phe Leu Gly Leu

Leu

Vai Leu

Trp

Ile Pro Gly Ala Ile Gly Asp

ATT

GTG

ATG

ACT

CAG

GCT

GCA

CCC

TCT

GTA

CCT

GTC

ACT

CCT

GGA

GAG

151

Ile

Vai

Met

Thr

Gin

Ala

Ala

Pro

Ser

Vai

Pro

Vai

Thr

Pro

Gly

Glu

*

TCA

GTA

TCC

ATC

TCC

TGC

AGG

TCT

AGT

AAG

AGT

CTC

CTG

CAT

AGT

AAT

199

Ser

Vai

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

Leu

Leu

His

Ser

Asn

GGC

AAC

ACT

TAC

TTG

TAT

TGG

TTC

CTG

CAG

AGG

CCA

GGC

CAG

TCT

CCT

247

Gly

Asn

Thr

T/r

Leu

Tyr

Trp

Phe

Leu

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

CAG

CTC

CTG

ATA

TAT

CGG

ATG

TCC

AAC

CTT

GTC

TCA

GGA GTC

CCA

GAC

295

Gin'

Leu

Leu

Ile

Tyr Arg

Met

Ser

Asn

Leu

Vai

Ser

Gly Vai

Pro

Asp

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCA

GGA

ACT

GCT

TTC

ACA

CTG

AGA

ATC

AGT

343

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ala

Phe

Thr

Leu

Arg

Ile

Ser

AGA

GTG

GAG

GCT

GAG

GAT

GTG

GGT

GTT

TAT

TAC

TGT

CTG

CAA

CAT

CTA

391

Arg

Vai

Glu

Ala

Glu

Asp

Vai

Gly

Vai

Tyr

Tyr

Cys

Leu

Gin

His

Leu

GAG

TAT

CCG

TTC

ACG

TTC

GGT

CCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

CTG

AAA

CGG

439

Glu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys Arg

GCT

GAT

GCT

GCA

CCA

ACT

GTA

ACG

463

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Vai

Thr

*

125 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:22 (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 483 (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) NÚMERO DE BANDAS: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22:

GAATTCGGCA CGAGATTGAG CCCAAGTCTT AGACATC ATG GAT.TGG CTG CGG 52

Met Asp Trp Leu Arg

AAC

TTG

CTA

TTC

CTG

ATG

GCA

GCT

GCC

CAA

AGT

ATC

CAA

. GCA

CAG

GTC

100

Asn

Leu

Leu

Phe

Leu

Met

Ala

Ala

Ala

Gin

Ser

Ile

Gin

Ala

Gin

Vai

CAG

TTG

G^G

CAG

TCT

GGA

CCT

GAG

CTG

AAG

AAG

CCT

GGA

GAG

ACA

GTC

148

Gin

Leu

Vai

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Glu

Thr

Vai

AAG

ATC

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GAT

TAT

ACC

TTC

ACA

TAC

TAT

GGA

ATG

196

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Tyr

iyr

Gly

Met

AAC

TGG

GTG

AAG

CAG

GCT

CCG

GGA

AAG

GGT

TTA

AAG

TGG

ATG

GGC

TGG

244

Asn

Trp

Vai

Lys

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

Gly

Trp

ATA

GAC

ACC

ACC

ACT

GGA

GAG

CCA

ACA

TAT

GCT

GAA

GAT

TTT

AAG

GGA

292

Ile

Asp

Thr

Thr

Thr

Gly

Glu

Pro

Thr

Tyr

Ala

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

CGG

ATT

GCC

TTC

TCT

TTG

GAG

ACC

TCT

GCC

AGC

ACT

GCC

TAT

TTG

CAG

340

Arg

Ile

Ala

Phe

Ser

Leu

Glu

Thr

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gin

ATC

AAA

AAC

CTC

AAA

AAT GAG

GAC

ACG

GCT

ACA

TAT

TTC

TGT

GCA

AGA

388

Ile

Lys

Asn

Leu

Lys

Asn Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Ala

Arg

CGG

GGG

CCT

TAC

AAC

TGG TAC

TTT

GAT

GTC

TGG

GGC

GCA

GGG

ACC

ACG

436

Arg

Gly

Pro

Tyr

Asn

Trp Tyr

Phe

Asp

Vai

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr

Thr

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GCC AAA

ACG

ACN

CCC

CCA

TCT

GTC

TAT

CC

483

Vai

Thr

Vai

Ser

Ser

Ala Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Ser

Vai

Tyr

Pro

126

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lâ -

   Composto conjugado caracterizado por compreender um radical de toxina e um radical de ligação à célula alvo que é selectivo para tumores gastrointestinais.

   - 2^a -

   Composto conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o radical de ligação à célula alvo compreender o anticorpo C242 ou um radical de ligação à célula alvo que tem essencialmente as mesmas propriedades ligantes das células.

   Composto conjugado alimentar de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por 0 radical de toxina compreender a ricina A recombinante. .___ Λ a _ Composto conjugado de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por 0 radical de

   ligação à célula alvo e o radical de toxina serem acoplados por meio de um ligante bifuncional.

   - 5^a Composto conjugado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por o radical de ligação à célula alvo e o radical de toxina serem acoplados por meio de uma ponte de tipo dissulfureto ou tioéter.

   127

   Composto conjugado de acordo com qualquer das reivindicações; anteriores caracterizado por o radical de ligação à célula alvo e o radical de toxina serem acoplados por meio de um ligante com a fórmula -S-X-CO-, em que X é um grupo alquilo(1-6C) de cadeia linear, opcionalmente substituído com um ou dois substituintes escolhidos de entre alquilo(1-6C), fenilo e alquil(1-4C)-fenilo, ou um grupo alquil(1-4C)-fenilo, em que o grupo alquilo é opcionalmente substituído com um ou dois substituintes escolhidos de entre alquilo(1-6C), fenilo e alquil(1-4C)fenilo, e em que o anel fenilo pode conter um substituinte escolhida de entre halogéneo, alquilo(1-4C) e alcóxi(1-4C).

   _ ₇â _

   Composto conjugado de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por X compreender um grupo metileno, etileno, propileno ou butileno substituído com um ou dois grupos escolhidos de entre metilo, etilo, propilo e butilo.

   - 8^â Composto conjugado de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por o ligante compreender o radical -S-CH(CH₃)CH₂CO-.

   _ ga _

   Composto conjugado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por o radical de ligação à célula alvo ter regiões CDR com sequências essencialmente do tipo:

   128 Cadeia ligeira

   CDR1: ArgSerSerL·ysSerLeuL·euHisSerAsnGlyAsn.ThrTyrL·euTyr

   CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer

   CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr

   Cadeia pesada

   CDR1: TyrThrGlyMetAsn

   CDR2: TrpTleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly CDR3: ArgGlyProTyrasnTrpTyrPheAspVal sendo as regiões CDR dispostas de forma a que o radical de ligação à célula alvo tenha essencialmente as mesmas propriedades ligantes da célula do anticorpo C242.

   - 10 ^a Composto conjugado com a fórmula:

   H

   I a-s₁-s₂-x-con-b na qual

   A compreende ricina A recombinante, e B compreende um radical de ligação à célula alvo que compreende o anticorpo C242,

   51 é um átomo de enxofre presente na ricina A recombinante, o grupo NH encontra-se no anticorpo C242,

   52 é um átomo de enxofre e X é um grupo alquilo (16C), opcionalmente substituído com um ou dois substituintes escolhidos de entre alquilo(1-6C), fenilo e alquil(1-4C)-

   129 fenilo, ou um grupo alquil(l-4C) -fenilo, em gue o grupo alquilo é opcionalmente substituído com um ou dois substituintes escolhidos de entre alquilo(1-6C), fenilo e alquil(1-4C)-fenilo, e em que o anel fenilo pode conter um substituinte escolhido de entre halogéneo, alquilo(l-4C) e alcoxi(1-4C).

   - 11^a Composto conjugado que compreende o anticorpo C242 e a ricina A recombinante, ligada de um grupo amino em C242 a um tiol de um resíduo de cisteína na ricina A por di-radical do ácido 3-mercaptobutírico (-CO.CH₂.CH(CH₃)-S-).

   - 12 ^a Composto conjugado que compreende a ricina A recombinante e um radical ligante a uma célula alvo possuindo pelo menos uma das regiões CDR com sequências essencialmente do tipo:

   Cadeia ligeira

   CDR1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr

   CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer

   CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr

   Cadeia pesada

   CDR1: TyrThrGlyMetAsn

   CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer

   CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr sendo o número dessas CDR e a sua disposição de forma a que o radical de ligação à célula alvo tenha essencialmente as

   130 mesmas propriedades ligantes da célula do anticorpo C242.

   - 13 ^a Composto conjugado caracterizado por compreender um radical de toxina e um radical de ligação à célula alvo que é específico para um epitopo de tumor gastrointestinal.

   - 14^a -

   Composto conjugado de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por o radical de ligação à célula alvo ser específico para o epitopo ao qual se liga o anticorpo C242.

   - 15 ^a -

   Processo para a preparação de um composto conjugado de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender:

   (a) para os compostos conjugados em que o radical de ligação à célula alvo está directamente acoplado ao radical de toxina, fazer-se reagir o radical de toxina com o radical de ligação à célula alvo, ou (b) para os composto conjugados em que o radical de ligação à célula alvo está acoplado ao radical de toxina por meio de um ligante, fazer-se reagir o radical de ligação à célula alvo derivado com ligante com o radical de toxina, ou fazer-se reagir o radical de toxina derivado com ligante com o radical ligante à célula alvo.

   - 16 ^a -

   Composição farmacêutica caracterizada por compreender um composto conjugado tal como definido em qualquer das reivindicações anteriores em associação com um

   - 131 diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

   A requerente reivindica a prioridade do pedido britânico apresentado em 3 de Julho de 1991 sob o N^a 9114399.0.