JP2023515845A - 抗－ｃｄ５６抗体－薬物複合体およびその治療での使用 - Google Patents

Abstract

【課題】より均一で、より安定しており、より効果的で、かつ／または発生する二次的影響がより少ない抗体－薬物複合体の提供。【解決手段】本発明は、抗体－薬物複合体、およびその治療での使用、特にＣＤ５６＋癌の治療でのその使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞傷害性薬剤と結合させたＣＤ５６抗原に対する抗体を含む新規な抗体－薬物複合体およびその薬剤としての使用、特に抗癌治療での使用に関する。

抗体－薬物複合体（「ＡＤＣ」）は、細胞傷害性薬剤を選択的に送達するための手段を構成する。よって、抗体－薬物複合体を用いて、抗体による標的の特異性と、抗体と結合させた薬剤の新規で強力なエフェクター機能とを組み合わせることができる。

抗体－薬物複合体の一般的な構造は式（Ｉ）である。抗体と薬剤を結合する部分をリンカーと言う。リンカーは、４個の鎖間ジスルフィド結合を形成する８個のシステインのうち、少なくとも１個を介して抗体にグラフトさせることができる。抗体にグラフトされた細胞傷害性薬剤の分子の数が、薬物抗体比（ＤＡＲ）として知られる比を決定する。

抗体は標的抗原に固定された後、受容体によって媒介されたエンドサイトーシスにより細胞内に内部移行される。小胞はリソソームと融合し、リソソームで細胞傷害性薬剤は異なる機構によって抗体から放出される。そして、活性細胞傷害性薬剤が細胞に作用し、細胞の死を誘発するが、輸送または環境への分散により隣接する癌細胞に作用することもある。よって、抗体は原則としてベクターとして用いられて、細胞傷害性薬剤を標的細胞へ送達する。

メルケル細胞癌（ＭＣＣ）は、高齢者で発症する悪性皮膚癌である。最近まで、手術できない転移のある患者の治療には、白金塩に基づく多剤併用化学療法が生存利益もなく用いられていた。第一選択療法としてのＰＤ－Ｌ１を標的する抗体療法（アベルマブ）の使用は、手術できないＭＣＣ患者の約５０％で客観的反応を得ることができ、その反応があった患者の半分で持続的反応を得ることができた。しかしながら、反応しなかった患者が残ったことが、新規な治療戦略の開発を促進した。この文脈において、ＭＣＣにおける標的治療の開発は、見込みのある戦略をなしているように思われる。

この文脈において、ＣＤ５６は、主要なＭＣＣによって強く発現される治療標的として同定された。事実、第一世代の技術によりメルタンシン（ＤＭ１）と結合させた抗ＣＤ５６ＡＤＣであるＩＭＧＮ９０１は、チューブリンの重合を阻害する。ＩＭＧＮ９０１の許容範囲は、ＭＣＣの症例を含む、ＣＤ５６を発現している固形癌の患者に対するいくつかの第１相試験によって求めることができた。また、小細胞肺癌の同じ分子と化学療法（シスプラチン－エトポシド）とを組み合わせた第二相試験が提案された。ＩＭＧＮ９０１で治療した群に二次的影響、特に発熱性好中球減少症（好中球減少に関連する感染症で、この物質の非特異的毒性を示唆している）が頻繁に起きたため、この試験では何ら生存利益が示されなかった。よって、より均一で、より安定しており、より効果的で、かつ／または発生する二次的影響がより少ない細胞傷害性抗ＣＤ５６－薬剤複合体の開発が求められている。また、本特許に記載された技術を用いて細胞傷害性分子を特異的に腫瘍細胞に送達することができると同時に、循環への細胞傷害性分子の非特異的放出を制限することにより前記薬剤によって誘発される非特異的毒性を制限することができる。

本発明の第１の目的は、下記式（Ｉ）で表される抗体－薬物複合体に関する。

ここで、Ａは抗ＣＤ５６抗体または抗体断片であり、
前記付加ヘッドは下記式の一方によって表され、

または

前記リンカーは下記式から選択される開裂可能なリンカーであり、

または

前記スペーサーは下記式で表され、

ｍは１～１０の整数であり、
ｎは１～４の整数である。

第２の目的として、本発明は、本発明による１種以上の抗体－薬物複合体を含む組成物に関する。

第３の目的として、本発明は、薬剤として使用するための本発明による抗体－薬物複合体または組成物に関する。

第４の目的として、本発明は、ＣＤ５６＋癌の治療に使用するための本発明による抗体－薬物複合体または組成物に関する。

第５の目的として、本発明は、本発明の抗体－薬物複合体を調製する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む。
（ｉ）下記式で表される付加ヘッド

または

を下記式で表される化合物に結合させることにより細胞傷害性複合体を調製する工程、

（式中、前記リンカーは下記式から選択される開裂可能なリンカーであり、

または

前記スペーサーは下記式で表され、

ＸはＢｒ、Ｃｌ、Ｉ、またはＦであり、
ｍは１～１０、好ましくは２～７、３～６の整数であり、好ましくは４または５に等しい。）、および、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞傷害性複合体を抗ＣＤ５６抗体または抗ＣＤ５６抗体断片と反応させる工程。

好ましくは、本発明による抗体－薬物複合体を調製する方法は、ＭＭＡＥカルバミン酸６－（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミド－Ｎ－ヘキサンアミド－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルまたはＭＭＡＥカルバミン酸６－（（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミノ）－６－オキソヘキサンアミド－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルを抗ＣＤ５６抗体または抗ＣＤ５６抗体断片と反応させることからなる工程を含む。

定義

用語「細胞傷害性複合体」は、細胞傷害性薬剤を含む複合体を指す。本発明の文脈において、細胞傷害性複合体は下記式（ＩＩ）で表される複合体を指す。

ここで、付加ヘッドは下記式の一方で表され、

または

リンカーは下記式から選択される開裂可能なリンカーであり、

または

スペーサーは下記式によって表され、

ＸはＢｒ、Ｃｌ、Ｉ、またはＦであり、
ｍは１～１０の整数である。

用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞の機能および／または発達を阻害あるいは防止することができるいずれかの天然分子または合成分子を指す。用語「細胞傷害性」は、可能であれば破壊するまで細胞を変化させる化学薬または生物薬の特徴を指す。

本発明の特定の実施形態では、細胞傷害性薬剤は、ＭＡを得た抗癌治療または抗炎症治療に用いられるいずれかの化合物、および抗癌治療または抗炎症治療について臨床的評価を受けたいずれかの分子から選択される。前記細胞傷害性薬剤は、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））またはドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））あるいはその誘導体の１つ、トポテカン、ボルテゾミブ、ダウノルビシン、ダウノルビシンの類縁体、ビンクリスチン、マイトマイシンＣ、レチノイン酸、メトトレキサート、イロメジン（登録商標）、アスピリン、ＩＭＩＤ（免疫調節イミド薬剤）、レナリドミド、ポマリドミドから選択される。

本発明の他の特定の実施形態では、前記細胞傷害性薬剤は、デュオカルマイシンおよびその類縁体、ドラスタチン、コンブレタスタチンおよびその類縁体、カリケアマイシン、Ｎ－アセチル－ｙ－カリケアマイシン（ＣＭＣ）、カリケアマイシンの誘導体、メイタンシンおよびその類縁体（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４などのメイタンシノイド型の誘導体）、オーリスタチンおよびそれらの誘導体（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ））、ツブリシン、ジソラゾール、エポチロン、エキノマイシン、エストラムスチン、セマドチン、エレウテロビン、メトプテリン、アクチノマイシン、マイトマイシンＡ、カンプトテシン、カンプトテシンの誘導体、ＳＮ３８、ＴＫ１、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピンの二量体、ピロロピリドジアゼピン、ピロロピリドジアゼピンの二量体、ＤＮＡ挿入剤、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤、またはチロシンキナーゼの阻害剤からなる群より選択される。本発明の他の特定の実施形態では、前記薬剤Ｍはシュードモナス外毒素（ＰＥ）、デボーガニン、ボーガニン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、およびリシンより選択される。

特定の一実施形態では、前記細胞傷害性薬剤はメトトレキサート、ＩＭＩＤ、デュオカルマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４、ＳＮ３８、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、ピロロピリドジアゼピン、ピロロピリドジアゼピン二量体、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤、チロシンキナーゼの阻害剤、およびリシンから選択され、好ましくは下記式で表されるＭＭＡＥである。

よって、本発明の特に好ましい実施形態では、前記細胞傷害性複合体は下記式（ＩＩａ）

または下記式（ＩＩａ’）

で表される。

用語「抗体」はまた「免疫グロブリン」として知られているが、鎖内および鎖間ジスルフィド架橋によって結合された、それぞれが約５０～７０ｋＤａの２つの重鎖（重鎖をＨ鎖と表す）と、それぞれが約２５ｋＤａの２つの軽鎖（軽鎖をＬ鎖と表す）とからなるヘテロ四量体を指す。各鎖は、Ｎ－末端位置の可変領域（軽鎖ではＶＬと知られる領域、重鎖ではＶＨとして知られる領域）、Ｃ－末端位置の定常領域（軽鎖ではＣＬという単一領域、重鎖ではＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４という３つまたは４つの領域）によって構成される。

用語「キメラ抗体」は、軽鎖の可変領域の配列と重鎖の可変領域の配列が、軽鎖の定常領域の配列と重鎖の定常領域の配列が由来する種とは異なる種に属する抗体を意味する。本発明の目的のため、好ましくは、重鎖および軽鎖の可変領域の配列は、マウス由来であり、重鎖および軽鎖の定常領域の配列は非マウス種に属する。これに関連して、定常領域にはいずれかの非マウス哺乳類種、特に、ヒト、類人猿、ブタ（イノシシ）、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、または事実上の鳥種のものを用いることができるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明によるキメラ抗体は、ヒト由来の重鎖および軽鎖の定常領域の配列と、マウス由来の重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含む。

用語「ヒト化抗体」は、抗原の認識に関わる領域（超可変部または相補性決定領域（ＣＤＲ））の配列のすべてまたは一部、および場合によってはフレームワーク領域（ＦＲ）領域の特定のアミノ酸が非ヒト由来であり、定常領域の配列と抗原の認識に関与しない可変領域の配列がヒト由来である抗体を意味する。

用語「ヒト抗体」は、軽鎖の可変領域および定常領域と重鎖の可変領域および定常領域の両方でヒト配列のみを含む抗体を意味する。

用語「抗体断片」は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’－ＳＨ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、またはＦｃなど、少なくとも１つのジスルフィド架橋を含む、酵素による消化またはバイオ産生により得られた免疫グロブリンのいずれかの部分を意味する。

パパインによる免疫グロブリンの酵素による消化は、Ｆａｂ断片（抗原結合断片）として知られる２つの同一の断片と１つのＦｃ断片（結晶可能断片）を生成する。ペプシンによる免疫グロブリンの酵素による消化は、Ｆ（ａｂ’）_２断片と、いくつかのペプチドに分割されたＦｃ断片を生成する。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、鎖間ジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ’断片により形成されている。Ｆａｂ部分は可変領域、ＣＨ１、およびＣＬ領域によって構成される。Ｆａｂ’断片はＦａｂ領域およびヒンジ領域によって構成される。Ｆａｂ’－ＳＨは、ヒンジ領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片を指す。ｓｃＦｖ（一本鎖可変領域断片）は、タンパク質を操作することにより得られた、可変領域ＶＨおよびＶＬのみから構成される断片である。この構造は、これら２つの領域の間に位置するリンカーとして知られる短く柔軟性のあるペプチドアームにより安定化されている。ｓｃＦｖ－Ｆｃを得るために、ｓｃＦｖ断片をＦｃ断片に結合させてもよい。

用語「ＣＤ５６」は、その細胞外部分に５つのＩｇ型ドメインと２つのフィブロネクチン３型ドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの一員である膜糖タンパク質である「分化抗原群５６」を指す。ＣＤ５６はまた、「神経細胞接着分子１（ＮＣＡＭ１）」としても知られていることが多い。

用語「ＣＤ５６＋癌」または「ＣＤ５６陽性癌」はＣＤ５６を発現する癌を指す。特に、用語「ＣＤ５６＋癌」は、癌細胞がＣＤ５６の発現を提示するようないずれかの癌の症例を指す。ＣＤ５６の発現は、しばしば、神経内分泌上皮性悪性腫瘍、小児腫瘍、および特定の血液疾患で観察される。また、特定のメラノーマおよび軟組織肉腫においても報告されている。好ましくは、本発明の文脈では、ＣＤ５６＋癌はメラノーマ、芽体腫瘍、急性骨髄白血病などの血液疾患、骨髄腫、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、および小細胞肺癌およびメルケル細胞癌などの神経内分泌上皮性悪性腫瘍から選択される。好ましい一実施形態では、ＣＤ５６＋癌は、小細胞肺癌またはメルケル細胞癌などの神経内分泌上皮性悪性腫瘍から選択される上皮性悪性腫瘍、好ましくはメルケル細胞癌である。

本発明の文脈では、「同一性」または「相同性」は比較窓に並べた２つの配列を比較することにより算出される。配列の並びは、比較窓における２つの配列に共通する位置（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を決定することができることを意味する。従って、百分率同一性の得るためには、共通する位置の数を比較窓の位置の総数で除して、１００を乗じる。配列の百分率同一性の決定は、手動で、あるいはよく知られたコンピュータプログラムの助けを借りて行ってもよい。

本発明の特定の実施形態では、同一性または相同性は、少なくとも１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個）のアミノ酸残基の置換に対応し、好ましくは保存的に行われた少なくとも１個のアミノ酸残基の置換に対応する。「保存的に行われたアミノ酸残基の置換」は、１個のアミノ酸残基を同様の特性を有する側鎖を持つ他の１個のアミノ酸残基で置換することからなる。同様の特性を有する側鎖を持つアミノ酸ファミリーはよく知られており、そのような側鎖としては、例えば、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性の非電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。

従って、抗体または抗体断片相同体あるいは「抗体または抗体断多様体」（すなわち、同じ機能を持つ抗体または抗体断片）は、定常領域および／また可変領域において抗原結合能を失わずに他のアミノ酸で置換されてもよい特定のアミノ酸を有する。この置換は、抗体または抗体断片をコードするＤＮＡ配列内で行われることが好ましい。すなわち、この置換は事実上、保存的である。当業者は一般的な知識を用いて、実行してもよい置換の数、および抗体または抗体断片の機能を保存することができる位置を決定する。抗原に特異的に結合する１種以上の抗体または抗体断片多様体の能力を決定するため、当業者によく知られ、従来技術で記載された複数の適切な方法が用いられてもよい。従って、抗体または抗体断片は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、親和性クロマトグラフィーなどの結合方法を用いて試験されてもよい。抗体または抗体断片多様体は、例えば、ファージライブラリーを生成することができる「ファージ提示」法を用いて生成されてもよい。「ファージ提示」ライブラリーを生成し、所望の機能特性を有する抗体または抗体断片多様体を標的するために、多くの方法が知られている。

本発明による抗体に言及する際、用語「精製された」および「単離された」は、同じ種類の他の生物学的巨大分子が実質的にない状態でその抗体が存在することを意味する。本明細書で用いられる場合、用語「精製された」は、存在する巨大分子全体に対して好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％の抗体を意味する。

用語「医薬的に許容可能な」は、連邦または州規制機関により承認されているか、米国または欧州薬局方、あるいは動物またはヒトに用いられることが意図された他の一般に認識された薬局方にリストされていることを意味する。「医薬組成物」は、医薬的に許容可能な媒体を含む組成物を指す。一例として、医薬的に許容可能な媒体は、それにより治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体であってもよい。これらの媒体は、殺菌液体、例えば、水および油（ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油などの動物、野菜、または合成由来の油を含む）であってもよい。医薬組成物を静脈内投与する場合は、水は好ましい媒体である。生理食塩水、水性ブドウ糖、およびグリセロール溶液は、液体媒体として、特に注射可能な溶液として用いられてもよい。医薬的に容認可能な賦形剤としては、澱粉、グルコース、ラクトース、サッカロース、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、スキムミルク粉末、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。医薬組成物が経口投与に好適である場合、従来の手段を用いて医薬的に許容可能な賦形剤と共に錠剤またはカプセルを調製してもよい。そのような賦形剤としては、結着剤（例えば、ゼラチン化前のトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、片栗粉またはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる。錠剤は従来技術でよく知られている方法を用いて被覆されていてもよい。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取ってもよく、あるいは使用前に水または他の適切な媒体で再構成するための乾燥品の形態で提供されてもよい。この種の液体製剤は、従来の手段を用いて医薬的に許容可能な媒体と共に調製されてもよい。そのような媒体としては、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または食用水添脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）；および保存料（例えば、ソルビン酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル、またはｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピル）が挙げられる。前記医薬組成物はまた、場合によっては緩衝塩、香味料、着色剤、および甘味料を含んでいてもよい。本発明による組成物は好ましくは医薬組成物である。

用語「治療する」または「治療」は、病理学または病的状態に対する何らかの恩恵のある効果または望ましい効果を包含し、病理学または病態の１種以上の測定可能なマーカーで最小の低減をも含んでいてもよい。例えば、治療は、病理学の症状または病的状態の低減あるいは改善、または病気や病的状態の進行の遅延を含んでいてもよい。用語「治療」は、病気や関連する症状の完全な根絶や治癒を必ずしも意味しない。

用語「ネイティブ質量分析」は、タンパク質を変性しない条件下で行われる質量分析を意味し、非共有結合を保存することができることを意味する。ネイティブ質量分析法は、例えば参考文献［４］などの文献で広く記載されている。

抗体－薬物複合体

本発明は、下記式（Ｉ）で表される抗体－薬物複合体に関する。

ここで、Ａは抗ＣＤ５６抗体または抗体断片であり、
付加ヘッドは下記式の一方で表され、

および

リンカーは下記式から選択される開裂可能なリンカーであり、

または

スペーサーは下記式で表され、

ｍは１～１０、好ましくは２～７、３～６の整数であり、好ましくは４または５に等しく、
ｎは１～４の整数である。

本発明による抗ＣＤ５６抗体または抗体断片は、哺乳類由来（例えば、ヒトまたはマウス）、ヒト化、あるいはキメラであってもよい。好ましくは、従来技術で広く記載されている技術を用いて遺伝的に修飾された細胞によって組み換えで製造されたモノクローナル抗体である。

Ａが抗ＣＤ５６抗体である場合、抗ＣＤ５６抗体または抗体断片は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４が好ましい。

特定の一実施形態では、Ａは以下を含む抗ＣＤ５６抗体または抗体断片である。
・配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖の可変領域、および
・配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖の可変領域。

この特定の実施形態では、軽鎖の可変領域は配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％の相同性を有し、重鎖の可変領域は配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有する。

よって、Ａは、軽鎖の可変領域に配列番号１５のアミノ酸配列を有し、重鎖の可変領域に配列番号１６のアミノ酸配列を有する抗体または抗体断片であってもよい。

特定の一実施形態では、Ａは、軽鎖に配列番号７のアミノ酸配列、重鎖に配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体である。配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖はまた、Ｃ－末端位置にさらなるリジンを有していてもよい。

特に好ましい一実施形態では、Ａは、米国出願第２０１８／０２１４５６８Ａ１号および参考文献［１］で記載された基準ｍ９０６を有する抗体である。抗体ｍ９０６は、軽鎖に配列番号７のアミノ酸配列、重鎖に配列番号８のアミノ酸配列を有するＩｇＧ１型の抗ＣＤ５６キメラ抗体である。

特定の一実施形態では、本発明の抗体－薬物複合体は下記式

または

のいずれかを有する。
特定の一実施形態では、Ａがｍ９０６であるとき、本発明の抗体－薬物複合体は下記式（Ｉａ）

を有するか、あるいは下記式（Ｉａ’）

を有する。

基準「ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥ」を用いた例で同定された抗体－薬物複合体は、式（Ｉａ）を有する抗体－薬物複合体に対応する。「ｍ９０６」は、抗体ｍ９０６、すなわち、軽鎖が配列番号７のアミノ酸配列であり、重鎖が配列番号８のアミノ酸配列であるＩｇＧ１型のヒト抗ＣＤ５６抗体に対応する。

利点として、本発明による抗体－薬物複合体は、クロマトグラフィーおよび／または親和性カラム精製など既知の精製技術を行うことにより精製（または単離）されている。

ｎが１に等しい場合、抗体－薬物複合体を一般に「ＤＡＲ１」と言う。ｎが２に等しい場合、抗体－薬物複合体を一般に「ＤＡＲ２」と言う。ｎが３に等しい場合、抗体－薬物複合体を一般に「ＤＡＲ３」と言う。ｎが４に等しい場合、抗体－薬物複合体を一般に「ＤＡＲ４」と言う。

特定の一実施形態では、前記抗体－薬物複合体は、弱毒化されたＦｃ部分によって媒介された１つ以上の有効機能を有する。好ましくは、上記有効機能、すなわちＦｃ部分によって媒介された機能は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から選択される。当業者であれば、例えば、Ｆｃ部分を変異させるなど、従来技術の教示を考慮してＦｃ部分によって媒介される１つ以上の有効機能を難なく弱毒化する。Ｆｃ部分によって媒介される有効機能を低減させる多くの突然変異が知られている。例えば、それはＦｃ部分を脱グリコシル化させる、特にアスパラギン２９７のグリコシル化を抑制することを目的とする突然変異であってもよい。

特定の一実施形態では、抗体－薬物複合体はＦｃ部分が脱グリコシル化されており、例えば、前記抗体－薬物複合体はアスパラギン２９７でのグリコシル化が起こらないようになっている。

組成物

本発明はまた、式（Ｉ）、例えば、上で規定された式（Ｉａ）または式（Ｉａ’）で表される１種以上の抗体－薬物複合体を含む組成物に関する。それは、式（Ｉ）、例えば、上で規定された式（Ｉａ）または式（Ｉａ’）で表される１種以上の抗体－薬物複合体、および医薬的に許容可能な媒体を含む医薬組成物であってもよい。

本発明による組成物は特に均質であるという特徴を有し、これによって均質ではない組成物に比べて安定性が高く、有効性が高く、かつ／または組成物の二次的影響がより低減されることがある。

利点として、Ａが抗体（例えば、ｍ９０６）である場合、本発明による組成物は以下の特徴によって特徴付けられる。
ａ）前記組成物のうち少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の抗体－薬物複合体は、ｎが４に等しい。
ｂ）平均薬物抗体比（平均ＤＡＲ）は３と４．５の間、好ましくは３．５と４の間、３．７と４の間、３．８と４の間であり、例えば、３．９±０．１に等しく、例えば、３．８９に等しい。平均ＤＡＲは一般に、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法またはネイティブ質量分析によって求められる。ＨＩＣ法およびネイティブ質量分析法は、文献で広く記載されている。引用されてもよい例としては、ＨＩＣ法については参考文献［３］、ネイティブ質量分析法については参考文献［４］が挙げられる。
ｃ）前記抗体－薬物複合体の少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％が単量体の形態で存在する。単量体の百分率は一般に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法によって求められる。ＳＥＣ法は、例えば、参考文献［２］などの文献で広く記載されている。
ｄ）ｎが、以下で規定される比率の１つ以上である。
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）より選択された２つ、３つ、または４つの特徴の組み合わせである。

Ａが抗体（例えば、ｍ９０６）である場合、本発明による組成物は、ｎについて以下の比率によって特徴付けられていてもよい。
・前記組成物のうち５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．２％未満、０．１％未満、例えば、約０％の抗体－薬物複合体はｎが１に等しい。
・前記組成物のうち１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の抗体－薬物複合体はｎが２に等しい。
・前記組成物のうち２５％未満、２０％未満、１８％未満、１７％未満の抗体－薬物複合体はｎが３に等しい。かつ／または
・前記組成物のうち少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％の抗体－薬物複合体はｎが４に等しい。

Ａが抗体（例えば、ｍ９０６）である場合、本発明による組成物は、ｎについて以下の比率によって特徴付けられていてもよい。
・前記組成物のうち０％と５％の間、０％と２％の間、０％と１％の間、０％と０．７５％の間、０％と０．５％の間、０％と０．２５％の間、０％と０．１％の間の抗体－薬物複合体はｎが１に等しい。
・前記組成物のうち０％と１０％の間、０％と７％の間、０％と６％の間、３％と６％の間、５％と６％の間、０％と５％の間、０％と４％の間、０％と３％の間、０％と２％の間、０％と１％の間の抗体－薬物複合体はｎが２に等しい。
・前記組成物のうち０％と２５％の間、５％と２０％の間、１０％と２０％の間、１５％と１７％の間の抗体－薬物複合体はｎが３に等しい。かつ、
・前記組成物のうち５０と８５％の間、５０％と８０％の間、５０％と７５％の間、７０％と８５％の間、７０％と８０％の間、７０％と７５％の間、５０％と６０％の間、５５％と６０％の間の抗体－薬物複合体はｎが４に等しい。

ｎの比率は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法またはネイティブ質量分析によって求めてられてもよい。

第一の特定の実施形態では、Ａが抗体（例えば、ｍ９０６）である場合、本発明による組成物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法で求められた以下のｎの比率によって特徴付けられていてもよい。
・前記組成物のうち５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．２％未満、０．１％未満の抗体－薬物複合体はｎが１に等しい。
・前記組成物のうち１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、例えば、約５．５％の抗体－薬物複合体はｎが２に等しい。
・前記組成物のうち２５％未満、２０％未満、１８％未満、１７％未満、例えば、約１６％の抗体－薬物複合体はｎが３に等しい。かつ／または
・前記組成物のうち少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、例えば、約６０％の抗体－薬物複合体はｎが４に等しい。

よって、Ａが抗体（例えば、ｍ９０６）である場合、本発明による組成物はまた、（疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法によって求められた以下のｎの比率により特徴付けられていてもよい。
・前記組成物のうち０％と５％の間、０％と２％の間、０％と１％の間、０％と０．７５％の間、０％と０．５％の間、０％と０．２５％の間、０％と０．１％の間の抗体－薬物複合体はｎが１に等しい。
・前記組成物のうち０％と１０％の間、０％と７％の間、０％と６％の間、３％と６％の間、５％と６％の間の抗体－薬物複合体はｎが２に等しい。
・前記組成物のうち０％と２５％の間、５％と２０％の間、１０％と２０％の間、１５％と１７％の間の抗体－薬物複合体はｎが３に等しい。かつ、
・前記組成物のうち５０と７５％の間、５０％と６０％の間、５５％と６０％の間の抗体－薬物複合体はｎが４に等しい。

第二の特定の実施形態では、Ａが抗体（例えば、ｍ９０６）である場合、本発明による組成物はネイティブ質量分析によって求められた以下のｎの比率により特徴付けられていてもよい。
・前記組成物のうち５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．２％未満、０．１％未満、例えば、約０％の抗体－薬物複合体はｎが１に等しい。
・前記組成物のうち１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、例えば、約０％の抗体－薬物複合体はｎが２に等しい。
・前記組成物のうち２５％未満、２０％未満、１８％未満、１７％未満の抗体－薬物複合体はｎが３に等しい。かつ／または
・前記組成物のうち少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％の抗体－薬物複合体はｎが４に等しい。

よって、Ａが抗体（例えば、ｍ９０６）である場合、本発明による組成物はまた、ネイティブ質量分析によって求められた以下のｎの比率により特徴付けられていてもよい。
・前記組成物のうち０％と５％の間、０％と２％の間、０％と１％の間、０％と０．７５％の間、０％と０．５％の間、０％と０．２５％の間、０％と０．１％の間の抗体－薬物複合体はｎが１に等しい。
・前記組成物のうち０％と１０％の間、０％と７％の間、０％と６％の間、０％と５％の間、０％と４％の間、０％と３％の間、０％と２％の間、０％と１％の間の抗体－薬物複合体はｎが２に等しい。
・前記組成物のうち０％と２５％の間、５％と２０％の間、１０％と２０％の間、１５％と１７％の間の抗体－薬物複合体はｎが３に等しい。かつ、
・前記組成物のうち５０％と８５％の間、５０％と８０％の間、５０％と７５％の間、７０％と８５％の間、７０％と８０％の間、７０％と７５％の間の抗体－薬物複合体はｎが４に等しい。Ａが抗体である場合、本発明による組成物はまたＤＡＲ０、すなわち細胞傷害性複合体を持たない抗体を含んでいてもよい。好ましくは、ＤＡＲ０は１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．２％未満、０．１％未満、例えば、約０％である。ＤＡＲ０の百分率は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法またはネイティブ質量分析により求められてもよい。

本発明による組成物はまたＤＡＲ５、すなわち５つの細胞傷害性複合体を有する抗体－薬物複合体を含んでいてもよい。好ましくは、ＤＡＲ５は２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満である。抗体－薬物複合体組成物中のＤＡＲ５の存在は文献で広く記載されているが、ＤＡＲ５の正確な構造は詳細には研究されていない。よって、平均ＤＡＲは、組成物中に存在するすべてのＤＡＲ、すなわちＤＡＲ０、ＤＡＲ１（すなわち、ｎ＝１）、ＤＡＲ２（すなわち、ｎ＝２）、ＤＡＲ３（すなわち、ｎ＝３）、ＤＡＲ４（すなわち、ｎ＝４）、ＤＡＲ５などを考慮して算出される。好ましくは、Ａが抗体である場合、本発明による組成物はＤＡＲ５より大きいいずれかのＤＡＲ、例えば、ＤＡＲ６、ＤＡＲ７などを含まない。ＤＡＲ５およびそれより大きいＤＡＲの百分率は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法またはネイティブ質量分析によって求められてもよい。特定の実施形態では、本発明による組成物は図１のＨＩＣプロファイルまたは図３のネイティブ質量分析プロファイルを有する。

治療での使用

本発明はまた、式（Ｉ）で表される本発明による抗体－薬物複合体、式（Ｉ）で表される抗体－薬物複合体を含み、例えば、メラノーマ、芽体腫瘍、急性骨髄白血病などの血液疾患、骨髄腫、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、および神経内分泌上皮性悪性腫瘍などのＣＤ５６＋癌の治療で薬剤として使用される本発明による組成物に関する。利点として、前記ＣＤ５６＋癌は、小細胞肺癌またはメルケル細胞癌などの神経内分泌上皮性悪性腫瘍より選択され、好ましくはメルケル細胞癌である。

本発明による抗体－薬物複合体または組成物は、好ましくは非経口投与用、例えば、血管内投与（静脈内投与または動脈内投与）用、腹腔内または筋肉内投与用に処方される。本明細書で使用される場合、用語「非経口投与される」は、一般に、注射による腸内投与および局所投与以外の投与方式を指す。そのような投与形態としては、注射による血管内投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、包膜内（ｉｎｔｒａｔｈａｐｓａｌ）投与、嚢内投与、眼窩内投与、腫瘍内投与、心臓内投与、皮内投与、腹腔内投与、気管内灌流、皮下投与、関節内投与、被膜下投与、くも膜下投与、髄腔内投与、および胸骨内投与が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の文脈では、例えば、静脈内灌流による静脈内投与が好ましい。

必要とする対象者への抗体－薬物複合体の投与量は、これらに限定されないが、投与方法、治療中の病気の種類および重症度、患者の症状、患者の肥満レベル、患者の年齢など多数の因子の関数として変動する。当業者であれば、薬量学分野の知識に基づいてこれら因子および他の因子の関数として必要とされる薬量学的範囲を容易に決定するであろう。また、動物モデルまたは臨床試験により適切な投与量を決定してもよい。一例として、本発明による抗体－薬物複合体の典型的な投与量は、５ｍｇ／ｍ^２～２５０ｍｇ／ｍ^２、例えば、３０ｍｇ／ｍ^２～１５０ｍｇ／ｍ^２、５ｍｇ／ｍ^２～７５ｍｇ／ｍ^２、７５ｍｇ／ｍ^２～１２０ｍｇ／ｍ^２であってもよく、例えば、１００ｍｇ／ｍ^２、７５ｍｇ／ｍ^２、６０ｍｇ／ｍ^２に等しくてもよい。投与は一括で行ってもよく、あるいはより一般には数回の投与量で行ってもよい。投与計画は、初期投与量と維持投与量を含んでいてもよく、例えば、２週間ごと、３週間ごと、１月ごと、あるいはそれより長い間隔であってもよい。治療期間は、治療中の病気および対象者の関数として変動してもよい。

本発明による抗体－薬物複合体または組成物は、単剤治療に用いられてもよく、あるいは検討中の病気に治療効果が認められている薬剤と組み合わせて用いられてもよい。そのような薬剤は、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル，ドキソルビシン、シクロホスファミド、レナリドミド、デキサメタゾン、カルボプラチン、エトポシド、あるいは抗癌抗体療法に用いられる抗体（例えば、抗ＰＤ１または抗ＰＤ－Ｌ１）であってもよい。

本明細書はまた、対象者のＣＤ５６＋癌の治療方法に関し、前記方法は前記対象者に治療有効量の式（Ｉ）で表される本発明による抗体－薬物複合体または式（Ｉ）で表される本発明による抗体－薬物複合体を含む組成物を投与することを含む。

調製方法
本明細書はまた、上で規定された式（Ｉ）で表される抗体－薬物の調製方法に関する。ここで、上で規定された下記式（ＩＩ）で表される細胞傷害性複合体

は、上で規定された抗ＣＤ５６抗体または抗体断片と反応させられる。

本発明は、本発明による抗体－薬物複合体の調製方法に関し、前記方法は以下の工程を含む。
（ｉ）下記式で表される付加ヘッド

または

を下記式で表される化合物に結合させることにより細胞傷害性複合体を調製する工程、

（式中、リンカーは下記式から選択される開裂可能なリンカーであり、

または

スペーサーは下記式で表され、

ＸはＢｒ、Ｃｌ、Ｉ、またはＦであり、
ｍは１～１０、好ましくは２～７、３～６の整数であり、好ましくは４または５に等しい。）、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞傷害性複合体を抗ＣＤ５６抗体または抗ＣＤ５６抗体断片と反応させる工程。付加ヘッドは、上記の「細胞傷害性複合体」の定義および「抗体－薬物複合体」の項でより詳細に記載されているが、前記方法で採用されている付加ヘッドは末端カルボン酸官能基を含む点で異なっている。

リンカーは、上記の「細胞傷害性複合体」の定義および「抗体－薬物複合体」の項でより詳細に記載されているが、前記方法で採用されているリンカーは末端アミン官能基を含む点で異なっている。

スペーサーは上記の「細胞傷害性複合体」の定義および「抗体－薬物複合体」の項でより詳細に記載されている。

細胞傷害性薬剤は上記の「細胞傷害性複合体」の定義および「抗体－薬物複合体」の項でより詳細に記載されている。

抗ＣＤ５６抗体は上記の「細胞傷害性複合体」の定義および「抗体－薬物複合体」の項でより詳細に記載されている。

細胞傷害性薬剤がＭＭＡＥである場合、工程（ｉ）を用いて式（ＩＩａ）または（ＩＩａ’）で表される細胞傷害性複合体を得ることができる。

特定の一実施形態では、工程（ｉ）に従って細胞傷害性複合体を調製する方法は、６－（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミドヘキサン酸または６－（（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミノ）－６－オキソヘキサン酸をＭＭＡＥカルバミン酸バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルまたはこの化合物の塩と結合させることからなる工程を含む。この特定の実施形態では、本発明による細胞傷害性複合体を調製する方法を用いて、ＭＭＡＥカルバミン酸６－（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミド－Ｎ－ヘキサンアミド－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルまたはＭＭＡＥカルバミン酸６－（（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミノ）－６－オキソヘキサンアミド－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルをそれぞれ得ることができる。

特定の一実施形態では、本発明による抗体－薬物複合体を調製する方法は、ＭＭＡＥカルバミン酸６－（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミド－Ｎ－ヘキサンアミド－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルまたはＭＭＡＥカルバミン酸６－（（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミノ）－６－オキソヘキサンアミド－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルを抗ＣＤ５６抗体または抗ＣＤ５６抗体断片と反応させることからなる工程を含む。

図１は、本発明による抗体－薬物複合体組成物の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるプロファイルを表す。この図は、組成物ではＤＡＲ４が５０％超とＤＡＲ４に富んでいることを示している。 図２は、本発明による抗体－薬物複合体組成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す。この図は、組成物が非常に均質であり、単量体が９９％超であることを示している。 図３は、Ｗａｔｅｒｓ（英国ウィルムスロー）製のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓシステムに連結されたＶｉｏｎ ＩＭＳ Ｑｔｏｆ質量分光光度計による本発明による抗体－薬物複合体組成物のネイティブ質量分析を示す。この方法を用いて、それぞれのＤＡＲの種類を明確に同定することができる。この図は、組成物がＤＡＲ４に富んでおり、ＤＡＲ４が７５％近く存在することを示している。 図４は、異なる細胞株（４種のＭＣＣおよび１種の乳癌対照株）について、蛍光色素分子フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した抗ＣＤ５６抗体と共にインキュベーションした後、フローサイトメトリーによるＣＤ５６の発現を表す。 図５Ａは、ＭＣＣ細胞株（図５Ａ：ＷａＧａ）に対する、ｍ９０６対照（非結合抗体）、ＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥに結合させたトラスツズマブＡＤＣ）、およびＭＭＡＥ（毒素のみ）と比較したＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの性能評価を示す。実験は、独立して、同じものを２つ作製して（６個の生物学的に同じもの／実験）行われた。結果は得られた百分率の平均（＋／－ＳＥＭ）として表わされている。 図５Ｂは、ＭＣＣ細胞株（図５Ｂ：ＰｅＴａ）に対する、ｍ９０６対照（非結合抗体）、ＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥに結合させたトラスツズマブＡＤＣ）、およびＭＭＡＥ（毒素のみ）と比較したＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの性能評価を示す。実験は、独立して、同じものを２つ作製して（６個の生物学的に同じもの／実験）行われた。結果は得られた百分率の平均（＋／－ＳＥＭ）として表わされている。 図５Ｃは、ＭＣＣ細胞株（図５Ｃ：ＭＳ－１）に対する、ｍ９０６対照（非結合抗体）、ＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥに結合させたトラスツズマブＡＤＣ）、およびＭＭＡＥ（毒素のみ）と比較したＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの性能評価を示す。実験は、独立して、同じものを２つ作製して（６個の生物学的に同じもの／実験）行われた。結果は得られた百分率の平均（＋／－ＳＥＭ）として表わされている。 図５Ｄは、ＭＣＣ細胞株（図５Ｄ：ＭＫＬ－２）に対する、ｍ９０６対照（非結合抗体）、ＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥに結合させたトラスツズマブＡＤＣ）、およびＭＭＡＥ（毒素のみ）と比較したＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの性能評価を示す。実験は、独立して、同じものを２つ作製して（６個の生物学的に同じもの／実験）行われた。結果は得られた百分率の平均（＋／－ＳＥＭ）として表わされている。 図５Ｅは、乳癌細胞株（図５Ｅ：ＳＫ－ＢＲ３）に対する、ｍ９０６対照（非結合抗体）、ＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥに結合させたトラスツズマブＡＤＣ）、およびＭＭＡＥ（毒素のみ）と比較したＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの性能評価を示す。実験は、独立して、同じものを２つ作製して（６個の生物学的に同じもの／実験）行われた。結果は得られた百分率の平均（＋／－ＳＥＭ）として表わされている。 図６Ａ～図６Ｃは、ＣＤ５６をノックダウンした後のＷａＧａ株におけるＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの特異性の評価を示す。ＷａＧａ細胞は、独立して、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）によって誘導可能な２種類の異なるｓｈＲＮＡを含み、ＣＤ５６の配列を標的するレンチウイルスベクターで形質導入された（Ａ、Ｂ、およびＣ）。抗生物質（ピューロマイシン）選択の後、細胞を評価する前に７日間ドキシサイクリンに曝露させた。（Ａ－Ｂ－Ｃ）：リアルタイムＲＴ－定量ＰＣＲ（＊：ｐ＜０．０５、ドキシサイクリンのない対照細胞を基準として用いた）（Ａ）、ウエスタンブロット（弱毒化されたＣＤ５６の質量＝１４０ＫＤａ）（Ｂ）によるＣＤ５６のノックダウンの確認。（Ｃ）ＣＤ５６（－Ｄｏｘ）を発現している細胞またはＣＤ５６（＋Ｄｏｘ）を発現していない細胞に対するＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの細胞傷害性効果について３種の異なるｓｈＲＮＡ（ＳｈＲＮＡ Ａ、ＳｈＲＮＡ Ｂ、およびＳｈＲＮＡ Ｃ）を用いた評価。実験は、独立して同じものを２つ作製して（６個の生物学的に同じもの／実験）行われた。結果は得られた百分率の平均（＋／－ＳＥＭ）として表わされている。 図７は、ＭＣＣの異種移植モデルにおいて複合体ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥおよび対照（ＰＢＳ、ＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＥに結合させたトラスツズマブＡＤＣ）の性能の評価を示す。図７は、試験中の相対腫瘍体積（平均＋／－ＳＥＭ）のプロットを示す。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）は、試験の開始時の腫瘍体積を基準（ｄ０＝１００％での体積）として用いて算出された。各点は、ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥ、ＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ、およびＰＢＳで治療した群のＲＴＶの平均を示しており、灰色の矢印は注射の時間を示している。 図８は、ＭＣＣの異種移植モデルにおいて複合体ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥおよび対照（ＰＢＳ、ＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＥに結合させたトラスツズマブＡＤＣ）の性能の評価を示す。図８は、実験群および対照群（＊：ｐ＜０．０５）における試験終了時の腫瘍の重量を表す。横線は、中央値、四分位数、および両端である。 図９は、対照ｍ９０６（非結合抗体）、ＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥに結合させたトラスツズマブＡＤＣ）、およびＭＭＡＥ（毒素のみ）と比較した、小細胞肺癌Ｈ６９の細胞株に対するＡＤＣ ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの性能の評価を示す。実験は、独立して同じものを３つ作製して（６個の生物学的に同じもの／実験）行われた。結果は得られた百分率の平均（＋／－ＳＥＭ）として表わされている。

実施例１：本発明による細胞傷害性複合体の合成
一般的反応スキーム

（ａ）ＢｎＯＨ、ＳＯＣｌ_２、ＤＣＭ、１８時間、７５℃；（ｂ）ＡＰＳ、ＭｅＯＨ、Ｈ_２Ｏ、Ｈ_２ＳＯ_４、１時間、５０℃；（ｃ）Ｈ_２、Ｐｄ／Ｃ、ＭｅＯＨ、２時間、ＴＡ；（ｄ）ＨＡＴＵ、２，６－ルチジン、ＤＭＦ、Ｈ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_５－ＣＯＯＭｅ、１５時間、０℃、次いでＴＡ；（ｅ）ＰＢｒ_３、ＭｅＣＮ、２時間、４５℃；（ｆ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、Ｈ_２Ｏ、８．５時間、ＴＡ；（ｇ）ＥＥＤＱ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、ＭｅＣＮ、Ｈ_２Ｎ－ＶＣＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ、２時間２０分、２５℃。

詳細な反応スキーム

イソニコチン酸ベンジル（２）の調製

イソニコチン酸（１）（５．００ｇ；４０．６１４ｍｍｏｌ；１．０当量）を塩化チオニル（１５ｍＬ；２０６．７７ｍｍｏｌ；５．１当量）に溶解させて、還流下で一晩加熱した。周囲温度に戻した後、減圧下で蒸発させて過剰の塩化チオニルを除去し、次いで、得られた残留物を無水ジクロロメタン（５５ｍＬ）に溶解させた。ベンジルアルコール（４．２ｍＬ；４０．６１４ｍｍｏｌ；１．０当量）を加えて、混合物を還流下で１０時間撹拌した。周囲温度に戻した後、反応媒質を炭酸水素ナトリウム飽和溶液で中和して、ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて、塩化ナトリウム飽和溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、シクロヘキサン：酢酸エチルが５０：５０）で精製して、無色のオイルとして（２）（６．９７ｇ；８０％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ８．８０（ｄｄ；Ｊ＝６．１；１．６Ｈｚ；２Ｈ_１，５），７．８６（ｄｄ；Ｊ＝６．１；１．６Ｈｚ，２Ｈ_２，４），７．５６－７．２９（ｍ；５Ｈ_９－１３），５．３９（ｓ；２Ｈ_７）．

^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６５．０（１Ｃ_６）；１５１．３（２Ｃ_１，５）；１３７．２（１Ｃ_３）；１３６．１（１Ｃ_８）；１２９．０（２Ｃ_{１０，１２}）；１２８．８（１Ｃ_１１）；１２８．６（２Ｃ_９，１３）；１２３．０（２Ｃ_２，４）；６７．４（１Ｃ_７）．

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１３Ｈ_１１ＮＯ_２［Ｍ］の算出された中性質量：２１３．０７９０；観察された中性質量：２１３．０７９６．

２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸ベンジル（３）の調製

イソニコチン酸ベンジル（２）（２．４８ｇ；１１．６３０ｍｍｏｌ；１．０当量）をメタノール（４３ｍＬ）に溶解して、５０℃で撹拌し、濃硫酸（３２０μＬ；６．０１６ｍｍｏｌ；０．５２当量）を添加した。過硫酸アンモニウム（２６．５００ｇ；１１６．０００ｍｍｏｌ；１０．０当量）の水（４３ｍＬ）溶液を２つの工程で添加した。第一の工程では３０滴を素早く添加して白色懸濁液を形成し、その後すぐに１滴ずつ５分間添加した。７５℃まで反応を行って、得られた黄色の溶液をさらに１時間５０℃で撹拌した。周囲温度に戻した後、メタノールを減圧下で蒸発させた。５０ｍＬの酢酸エチルを添加して、炭酸水素ナトリウム飽和溶液を加えて溶媒を中和した。水相を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出して、合わせた有機相を塩化ナトリウム飽和溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。不純な生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、ジクロロメタン：メタノールが９５：５）により精製して、薄茶色の固体として（３）（１．５６ｇ；４９％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ７．８１（ｓ；２Ｈ_２，４）；７．５５－７．３２（ｍ；５Ｈ_９－１３）；５．６０（ｔ；Ｊ＝５．９Ｈｚ；２Ｈ_{１５，１７}）；５．４０（ｓ；２Ｈ_７）；４．５９（ｄ；Ｊ＝５．９Ｈｚ；４Ｈ_{１４，１６}）．

^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６５．０（１Ｃ_６）；１６２．８（２Ｃ_１，５）；１３８．０（１Ｃ_３）；１３５．７（１Ｃ_８）；１２８．６（２Ｃ_{１０，１２}）；１２８．４（１Ｃ_１１）；１２８．３（２Ｃ_９，１３）；１１７．０（２Ｃ_２，４）；６６．９（１Ｃ_７）；６３．９（２Ｃ_{１４，１６}）．

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１５Ｈ_１５ＮＯ_４［Ｍ］の算出された中性質量：２７３．１００１；観察された中性質量：２７３．１００１．

２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸（４）の調製

２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸ベンジル（３）（１．３３ｇ；４．８６７ｍｍｏｌ；１．０当量）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解させて、この溶液をアルゴンで１５分間脱気した。パラジウム炭素触媒を１０重量％（１３３ｍｇ）添加して、反応媒質を水素雰囲気中、周囲温度で２時間撹拌した。反応媒質をＤｉｃａｌｉｔｅ（メタノールで洗浄済み）で濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、薄茶色の固体として（４）（８４９ｍｇ；９５％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ７．７８（ｓ；２Ｈ_２，４）；５．５４（ｓ ｂｒｏａｄ；２Ｈ_９，１１）；４．５９（ｓ；４Ｈ_８，１０）．

^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６６．７（１Ｃ_６）；１６２．５（２Ｃ_１，５）；１３９．４（１Ｃ_３）；１１７．３（２Ｃ_２，４）；６４．０（２Ｃ_８，１０）．

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_８Ｈ_９ＮＯ_４［Ｍ］の算出された中性質量：１８３．０５３２；観察された中性質量：１８３．０５２６．

６－（（２，６－ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン－４－イル）アミドヘキサン酸メチル（５）の調製

２，６－ビス（ヒドロキシメチル）イソニコチン酸（４）（５０ｍｇ；０．２７３ｍｍｏｌ；１当量）を無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．０ｍＬ）に溶解させて、この溶液を０℃まで冷却し、次いで、ＨＡＴＵ（１５６ｍｇ；０．４１０ｍｍｏｌ；１．５当量）と２，６－ルチジン（１４７．０μＬ；１．２６０ｍｍｏｌ；４．７当量）を添加した。この活性化溶液を０℃で１５分間撹拌し、次いで、６－アミノヘキサン酸メチル（５９ｍｇ；０．３２２ｍｍｏｌ；１．２当量）を添加した。フラスコの壁を２ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドで洗浄して、反応媒質を周囲温度で１５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈して、塩化ナトリウム飽和溶液で３回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させて、濾過し、減圧下で濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノールが９０：１０）で精製して、オフホワイト色の固体として（５）（７６ｍｇ；９１％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ８．７９（ｔ；Ｊ＝５．６Ｈｚ；１Ｈ_７）；７．７１（ｓ；２Ｈ_２，４）；５．５０（ｔ；Ｊ＝５．８Ｈｚ；２Ｈ_{１６，１８}）；４．５７（ｄ；Ｊ＝５．８Ｈｚ；４Ｈ_{１５，１７}）；３．５７（ｓ；３Ｈ_１４）；３．２５（ｍ；２Ｈ_８）；２．３０（ｔ；Ｊ＝７．４Ｈｚ；２Ｈ_１２）；１．６２－１．４５（ｍ；４Ｈ_９，１１）；１．３７－１．２１（ｍ；２Ｈ_１０）．

^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７３．３（１Ｃ_１３）；１６５．１（１Ｃ_６）；１６１．８（２Ｃ_１，５）；１４２．９（１Ｃ_３）；１１５．８（２Ｃ_２，４）；６４．１（２Ｃ_{１５，１７}）；５１．２（１Ｃ_１４）；ＤＭＳＯピーク（１Ｃ_８）下で３８．５；３３．２（１Ｃ_１２）；２８．６（１Ｃ_９）；２５．９（１Ｃ_１１）；２４．２（１Ｃ_１０）．

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１５Ｈ_２２Ｎ_２Ｏ_５［Ｍ］の算出された中性質量：３１０．１５２９；観察された中性質量：３１０．１５２６．

６－（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミドヘキサン酸メチル（６）の調製

６－（（２，６－ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン－４－イル）アミドヘキサン酸メチル（５）（５５ｍｇ；０．１７７ｍｍｏｌ；１当量）を無水アセトニトリル（１０．５ｍＬ）懸濁液に取り込んで、三臭化リン（５０μＬ；０．５３２ｍｍｏｌ；３．０当量）を滴下した。反応媒質を４５℃で２時間撹拌した。この溶液を０℃で冷却して、水（１０ｍＬ）で中和し、酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を塩化ナトリウム飽和溶液で洗浄して、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、シクロヘキサン：酢酸エチルが６０：４０）で精製して、白色の固体として（６）（５７ｍｇ；７４％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ）δ８．８３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ；１Ｈ_７）；７．８４（ｓ；２Ｈ_２，４）；４．７４（ｓ；４Ｈ_{１５，１６}）；３．５７（ｓ，３Ｈ_１４）；３．３１－３．２０（ｍ；２Ｈ_８）；２．３１（ｔ；Ｊ＝７．４Ｈｚ；２Ｈ_１２）；１．６４－１．４５（ｍ；４Ｈ_９，１１）；１．３９－１．２２（ｍ，２Ｈ_１０）．

^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７３．３（１Ｃ_１３）；１６３．８（１Ｃ_６）；１５７．５（２Ｃ_１，５）；１４４．２（１Ｃ_３）；１２０．８（２Ｃ_２，４）；５１．２（１Ｃ_１４）；ＤＭＳＯピーク（１Ｃ_８）下で３８．９；３４．１（２Ｃ_{１５，１６}）；３３．２（１Ｃ_１２）；２８．５（１Ｃ_９）；２５．９（１Ｃ_１１）；２４．２（１Ｃ_１０）．

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１５Ｈ_２０Ｂｒ_２Ｎ_２Ｏ_３［Ｍ］の算出された中性質量：４３３．９８４１；観察された中性質量：４３３．９８３２．

６－（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミドヘキサン酸（７）の調製

６－（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミドヘキサン酸メチル（６）（５７ｍｇ；０．１３１ｍｍｏｌ；１．０当量）をテトラヒドロフラン（４ｍＬ）に溶解させて、水和水酸化リチウム（８ｍｇ；０．３２７ｍｍｏｌ；２．５当量）の水（４ｍＬ）溶液をゆっくりと添加した。反応媒質を周囲温度で８．５時間撹拌した。テトラヒドロフランを減圧下で蒸発させて、水性残留物を１Ｎの塩酸水溶液で処理し、酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を塩化ナトリウム飽和溶液で洗浄して、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノールが９０：１０）で精製して、白色の固体として（７）（４４ｍｇ；８０％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ）δ１２．００（ｓ；１Ｈ_１４）；８．８３（ｔ；Ｊ＝５．５Ｈｚ；１Ｈ_７）；７．８４（ｓ；２Ｈ_２，４）；４．７４（ｓ；４Ｈ_{１５，１７}）；３．３１－３．２１（ｍ；２Ｈ_８）；２．２１（ｔ；Ｊ＝７．３Ｈｚ；２Ｈ_１２）；１．６０－１．４６（ｍ；４Ｈ_９，１１）；１．３９－１．２５（ｍ；２Ｈ_１０）．

^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ；ＤＭＳＯ）δ１７４．４（１Ｃ_１３）；１６３．８（１Ｃ_６）；１５７．５（２Ｃ_１，５）；１４４．１（１Ｃ_３）；１２０．８（２Ｃ_２，４）；ＤＭＳＯピーク（１Ｃ_８）下で３９．０；３４．１（２Ｃ_{１５，１６}）；３３．６（１Ｃ_１２）；２８．６（１Ｃ_９）；２６．０（１Ｃ_１１）；２４．２（１Ｃ_１０）．

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１４Ｈ_１９Ｂｒ_２Ｎ_２Ｏ_３［Ｍ＋Ｈ］^＋の算出されたｍ／ｚ：４２０．９７５７；観察されたｍ／ｚ：４２０．９７５２．

ＭＭＡＥカルバミン酸６－（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミド－Ｎ－ヘキサンアミド－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイル（８）の調製

不活性雰囲気中、暗所、無水条件下で、６－（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミドヘキサン酸（７）（１３．２ｍｇ；０．０３１３ｍｍｏｌ；２．２８当量）を無水アセトニトリル（１．２ｍＬ）に溶解させて、次いで、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）（２１．２ｍｇ；０．０８５７ｍｍｏｌ；６．２５当量）を添加した。この活性化溶媒を２５℃下で１時間２０分撹拌した。ＭＭＡＥカルバミン酸バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイル（１７．０ｍｇ；０．０１３７ｍｍｏｌ；１．０当量）のトリフルオロ酢酸塩溶液をＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（９．４μＬ；０．０５３７ｍｍｏｌ；３．９２当量）の存在下、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３００μＬ）に溶解させて、活性化溶媒に添加した。得られた反応媒質を２５℃で１時間撹拌した。この混合物をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドで２倍に希釈して、セミ分取高圧液体クロマトグラフィー（ｔ_Ｒ＝２２．１分；Ｇｉｌｓｏｎ ＰＬＣ２０５０システム［ＡＲＭＥＮ Ｖ２（ポンプ）およびＥＣＯＭ ＴＯＹＤＡＤ６００（ＵＶ検出器）にて］、２５４ｎｍ、２５℃でＵＶ検出；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ－１８（商標）カラム；５μｍ（２５０ｍｍ×１９．００ｍｍ）；０．１体積％トリフルオロ酢酸の水（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）溶液で溶出；Ｂの勾配を３２分間で２０％から１００％とし、その後、１７．１ｍＬ／分で６分間、Ｂを１００％）により精製して、白色の固体として（８）（１８．２ｍｇ；８７％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）１０．０４－９．９５（ｍ；１Ｈ）；８．９４－８．７９（ｍ；１Ｈ）；８．２０－８．０６（ｍ；２Ｈ）；７．９８－７．８７（ｍ；１Ｈ）；７．８４（ｓ；２Ｈ）；７．８１（ｓ；１Ｈ）；７．７０－７．６１（ｍ；１Ｈ）；７．５８（ｄ；Ｊ＝８．２Ｈｚ；２Ｈ）；７．３８－７．１１（ｍ；６Ｈ）；６．０７－５．９２（ｍ；１Ｈ）；５．４７－５．３７（ｍ；１Ｈ）；５．１５－４．９６（ｍ；１Ｈ）；４．７３（ｓ；４Ｈ）；４．５４－４．２９（ｍ；２Ｈ）；４．３２－４．１２（ｍ；１Ｈ）；４．０５－３．９２（ｍ；１Ｈ）；３．３０－３．０８（ｍ；９Ｈ）；３．０６－２．９３（ｍ；２Ｈ）；２．９１－２．７７（ｍ；２Ｈ）；２．２４－２．０５（ｍ；２Ｈ）；２．２１－２．１１（ｍ；３Ｈ）；２．０２－１．８８（ｍ；１Ｈ）；１．６０－１．４４（ｍ；５Ｈ）；１．３６－１．１３（ｍ；４Ｈ）；１．０８－０．９３（ｍ；６Ｈ）；０．９３－０．６７（ｍ；２８Ｈ）．

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７２Ｈ_１１１Ｂｒ_２Ｎ_１２Ｏ_１４［Ｍ＋Ｈ］^＋の算出されたｍ／ｚ：１５２５．６７０４；観察されたｍ／ｚ：１５２５．６７００．

実施例２：本発明による抗体－薬物複合体の合成

合成された生成物のコード：ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥ（式（Ｉａ）に対応、また以下の「本発明による抗体－薬物複合体」あるいは一般に「ＡＤＣ」として示される）。

本発明による抗体－薬物複合体を産生するのに用いられる抗体：ｍ９０６

溶液の調製

バイオ結合（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）緩衝液：例えば、リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸をｐＨが６と９の間の範囲で含む生理食塩水緩衝液１倍、含まれるＮａＣｌの最終濃度が５０ｍＭと３００ｍＭの間であり、含まれるＥＤＴＡの最終濃度が０．１ｍＭと１０ｍＭの間である。

ｍ９０６：バイオ結合緩衝液中１ｍｇ／ｍＬと１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度で含まれる。

還元剤：バイオ結合緩衝液中０．１ｍＭと１０ｍＭの間の濃度で含まれるジチオトレイトール、β－メルカプトエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィンより選択される還元剤の溶液。

リンカー溶液：ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、メタノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジオキサンより選択された有機溶媒の混合物中に０．１ｍＭと１０ｍＭの間の濃度で含まれる化合物８。

バイオ結合反応

不活性雰囲気中で還元剤（４～１００当量）をバイオ結合緩衝液（１ｍｇ；１当量）中、ｍ９０６に添加し、次いで１５℃と４０℃の間で０．２５時間から３時間、その全体をインキュベートした。そして、化合物８（４～１００当量）の溶液を不活性雰囲気中で添加して、反応媒質を１５℃と４０℃の間で０．５時間から１５時間撹拌した。この反応は並行して重複して行い、所望の最終量のＡＤＣを得るのに必要な回数、すなわち１８回行った。

ＡＤＣの精製

ＰＢＳ Ｇｉｂｃｏ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて反応混合物をＰＤ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、残留化学試薬を除去するのに必要な回数、すなわち３回精製した。

結果

上記の工程より、１２．８７ｍｇのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥ（７１％）が得られた。

実施例３：抗体－薬物複合体（ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥ）の分析

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析

方法および装置

ＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、０．２２μｍで濾過した。２８０ｎｍで検出するよう設定されたＰＤＡ（ｅ２９９８）を備えたＨＰＬＣ Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（ｅ２６９５）に結合されたＭＡｂＰａｃ ＨＩＣ－ブチルカラム（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に５０μｇの生成物を注入した。ＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥを以下の条件で１ｍＬ／分で溶出させた。勾配を２分で１００％の緩衝液Ａ（１．５ｍＭの硫酸アンモニウム、５０ｍＭの一塩基リン酸ナトリウム、５％のイソプロピルアルコール（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．０）から２０％の緩衝液Ｂ（５０ｍＭの一塩基リン酸ナトリウム、２０％のイソプロピルアルコール（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．０）とし、次いで、３０分で緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂを８５％とし、そして、この勾配を１分間保持した。この分離工程を通して温度を２５℃に保持した。

ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥについて得られた結果を図１および下記の表１に示す。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析

方法および装置

ＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍＬまで希釈して、０．２２μｍで濾過した。２８０ｎｍで検出するように設定されたＰＤＡ（２９９８）を備えたＨＰＬＣ Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（ｅ２６９５）に接続されたＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ２．７μｍカラム、７．８×３００ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に５０μｇの生成物を注入した。１ｍＬ／分でＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥを等張緩衝液Ｃ（１ｍＭの一塩基リン酸ナトリウム、１５５ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの二塩基リン酸ナトリウム、３ｍＭのナトリウムアジド、ｐＨ７．０）により２４分で溶出させた。この分離工程を通して温度を２５℃に保持した。

結果を図２および以下の表２に示す。

ネイティブＭＳ分析（ネイティブ質量分析）

方法および装置

質量分析は、Ｗａｔｅｒｓ（英国ウィルムスロー）製のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓシステムに連結されたＶｉｏｎ ＩＭＳ Ｑｔｏｆ質量分析計で行った。ＭＳ分析の前に、４０μＬ／分で試料（２０ｕｇ）をＢＥＨ ＳＥＣ ２．１×１５０ｍｍ ３００Å脱塩カラムで等張勾配（５０ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５）により脱塩した。溶媒が６．５分と９．５分の間のみ分光計に入るように迂回バルブをプログラムした。ＥＳＩ源を用いて１Ｈｚでｍ／ｚが５００～８０００の範囲に亘ってＭＳデータをポジティブモードで得て、ＵＮＩＦＩ １．９ソフトウェアおよび逆重畳積分のためのＭａｘＥｎｔアルゴリズムを用いて分析した。

結果を図３および以下の表３に示す。

実施例４：抗体－薬物複合体ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥのインビトロ評価

４．１．ｍ９０６による腫瘍細胞の認識：メルケル細胞癌

患者由来の腫瘍に対する免疫組織化学

方法および装置

供給者の指示に従ってｂｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴプラットフォームを用いて、マイクロアレイ組織に含まれる９０個のＭＣＣ腫瘍の集団に対して市販の抗ＣＤ５６抗体（１２３Ｃ３、Ｖｅｎｔａｎａ、予め希釈済み）による免疫組織化学的標識を行った。当業者によりＣＤ５６の発現を以下の半定量的スコアを用いて評価した。０：発現なし、１：弱い、かつ／または異種性の陽性、２：強く広範囲に陽性。

結果：一般に、症例の６６％が陽性であり（ｎ＝５９）、その症例の３７％（ｎ＝３３）で強く広範囲の発現（スコア２）が検出された。

ＭＣＣ株に対するフローサイトメトリーおよび免疫組織化学

方法および装置

細胞株によるＣＤ５６の発現を評価するため、製造者から支給された指示に従って、ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン：ＨＣＤ５６）と結合させた抗ＣＤ５６抗体または対照アイソタイプの存在下で腫瘍細胞をインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ＋１％ウシ胎仔血清で２回洗浄して、分析した。

ｍ９０６およびトラスツズマブ（抗ＨＥＲ２抗体対照）の腫瘍細胞への固定を評価するため、ｍ９０６抗体を６５０ｎｇ／ｍＬで用いて、あるいはトラスツズマブ抗体（ハーセプチン１５０ｍ、Ｒｏｃｈｅ）を４０ｎｇ／ｍＬで用いて免疫細胞化学的標識を行い、ペルオキシダーゼと結合させた二次抗体の助けを借りて解明された。

試験した細胞株

ＷａＧａ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ｅ９９８）

ＭＳ－１（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ｅ９９５）

ＰｅＴａ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿ＬＣ７３）

ＭＫＬ－２（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ｄ０２７）

結果：

ＷａＧａ、ＭＳ－１、ＰｅＴａ、およびＭＫＬ－２細胞はメルケル細胞癌細胞株（以後、ＭＣＣ）である。上記株のすべてはＣＤ５６陽性である（図４）。

ＳＫ－ＢＲ－３（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００３３）：ＣＤ５６を発現しないため対照として選択されたＨＥＲ２陽性乳癌株。

免疫組織化学的研究により、これらの株に対してｍ９０６および対照として含まれるトラスツズマブ（ＴＴＺ）の固定を試験した。この分析により、すべてのＭＣＣ株に対してｍ９０６の固定が示されたが、ＴＴＺでは固定は観察されなかった（表４：ＭＣＣ株に対するｍ９０６の固定の確認）。

画像処理フローサイトメトリー：ｍ９０６、細胞内区画の着色、および画像の獲得

方法および装置

腫瘍細胞への内部移行を確認するため、製造者により供給された指示に従って「ＳＡＩＶＩ Ｒａｐｉｄ抗体標識キット」（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて抗体ｍ９０６をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０と結合させた。緩衝液溶液（１倍のＰＢＳ、２％のウシ胎仔血清、０．１％のナトリウムアジド）中でＷａＧａ細胞（５０００００細胞）を複合体ｍ９０６－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０と共に周囲温度で３０分間インキュベートした。次いで、製造者からの指示に従って、細胞をＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の助けを借りて固定し、Ｐｅｒｍｗａｓｈ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１／１０ｅに希釈）で透過処理した。核およびリソソーム区画をそれぞれ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、１／１００００）とフィコエリスリン－シアニン５と結合させた抗ＬＡＭＰ１抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、Ｈ４Ａ３）とで標識した。４つのレーザー（３７５ｎｍ、４８８ｎｍ、６４２ｎｍ、および７８５ｎｍ（ＳＳＣ））を備えたＡｍｎｉｓ（登録商標）ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）Ｘ Ｍａｒｋ ＩＩフローサイトメトリー画像処理装置（Ａｍｎｉｓ社、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの一部、ワシントン州シアトル）の助けを借りて標識化細胞の分析を行った。ＷａＧａ細胞の画像は６０倍の倍率、拡張被写界深度（ＥＤＦ）にてＩｎｓｐｉｒｅ（商標）画像処理フローサイトメトリーソフトウェアによって撮影された。

各分析の前に補償を行った。対象の細胞を明視野画像（ＢＦ：白色光）の「Ｇｒａｄｉｅｎｔ ＲＭＳ」ツールを用いて同定した。破片および細胞二重線は、ＢＦ画像のゾーンに対するアスペクト比の関数として分析から排除された。ＩＤＥＡＳ（登録商標）ｖ６．２ソフトウェアを用いて、「表面マスク」と「細胞質マスク」を利用して２つの異なるインキュベーション時間（５分および３０分）でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０（チャンネル１２）と結合させたｍ９０６の表面積蛍光発光および細胞内蛍光発光（ＩＭＦ）の平均強度を評価した。内部移行関数を用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０（チャンネル１２）と結合させたｍ９０６の内部移行スコアを決定し、細胞細胞の強度に対する細胞内蛍光発光の強度を規定することができた。内部移行した抗体を有する細胞は正のスコアを有している。「明るい詳細な類似性」（Ｂｒｉｇｈｔ Ｄｅｔａｉｌ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ：ＢＤＳ）機能を用いた共局在支援を用いて、フィコエリスリン－シアニン５（チャンネル５）と結合させた抗ＬＡＭＰ１抗体とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０（チャンネル１２）と結合させたｍ９０６との共局在レベルを定量した。ＢＤＳが正のスコア（ｎ．１）であることは、ｍ９０６のリソソーム局在を示している。

結果

ｍ９０６抗ＣＤ５６抗体は、ＣＤ５６を発現しているＷａＧａ細胞においてリソソームに内部移行している（表５）。これは、ＡＤＣによる薬剤の放出には重要な過程であり、これによってｍ９０６はＡＤＣ開発のためのよい候補抗体となる。

４．２．インビトロでのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの細胞株に対する細胞傷害性

生存率の評価（増殖試験）

方法および装置

細胞生存率を評価するため、ＸＴＴを用いて細胞傷害性試験を行った。細胞を９６ウェルプレート（５００００細胞／ウェル）に入れて、おなじものを７つ作製した。ＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥおよびＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ（ＡＤＣ対照）を濃度を増加させながら添加した。培地は陰性対照として作用した。薬剤に４日間晒した後、１ウェルあたり２５μＬの試薬ＸＴＴを添加して、３７℃で４時間インキュベートした後に吸光度を４５０ｎｍで測定した。６２０ｎｍでの吸光度を基準として用いた。

結果

細胞株に対する細胞傷害性の評価により、すべてのＭＣＣ株に対してＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥはＭＭＡＥのみ（ＩＣ_５０は１ｎＭと１０ｎＭの間）と同程度の細胞傷害性を有することが示された。さらに、抗体ｍ９０６（すなわち、ＭＭＡＥと結合されていない）もＡＤＣとしてのＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ（ＡＤＣ対照）も、試験した最小有効濃度ではこれら同じ細胞株に対する細胞傷害性効果がなく、構築物固有の毒性はないことが示された（図５）。

小細胞肺癌細胞株のＨ６９株（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿１５７９）に対する細胞傷害性の評価から、ＡＤＣとしてのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥはＭＭＡＥのみ（ＩＣ_５０が１ｎＭと２ｎＭの間）と同程度の細胞傷害性を有することが示された。さらに、抗体ｍ９０６（すなわち、ＭＭＡＥに結合されていない）もＡＤＣとしてのＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ（ＡＤＣ対照）も、試験した最小有効濃度ではこの細胞株に対する細胞傷害性効果がなく、構築物固有の毒性はないことが示された（図９）。

４．３．ｍ９０６の特異性の確認：観察された細胞傷害性効果はＣＤ５６に依存する（図６）

プラスミドおよびレンチウイルス形質導入

方法および装置

ＣＤ５６の配列を標的する３種類のｓｈＲＮＡを作製し（ＲＮＡｉコンソーシアムから得た配列（Ａ：ＴＲＣＮ００００３７３０８５（配列番号９－１０）／Ｂ：ＴＲＣＮ００００３７３０３４（配列番号１１－１２）／Ｃ：ＴＲＣＮ０００００７３４６０（配列番号１３－１４））、上記［５］に記載したようにＦＨ１ｔＵＴＧレンチウイルスベクターでクローニングした。なお、この構築物では、ｓｈＲＮＡの配列の転写を制御するプロモーターの活性をドキシサイクリンによって誘導することができる。上記［６－７］に記載したようにレンチウイルス上澄みをＨＥＫ２９３Ｔ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００６３）細胞で産生した。回収した上澄みをろ過（０．４５μｍ）により殺菌し、感染前にポリブレンを添加した（１μｇ／ｍＬ）。レンチウイルスを含む上澄みと共に１４～２０時間インキュベートした後、標的細胞を洗浄し、次いで抗生物質（ピューロマイシン）選択を行った。腫瘍株でＣＤ５６の発現が認められない場合（ノックダウン）、分析の前に細胞を７日間ドキシサイクリンに晒した。

結果

ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥによって誘発される細胞傷害性は、ＣＤ５６ノックダウン時には実質的に低減した。これは前記３種類のｓｈＲＮＡの場合に当てはまり（図６）、ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの細胞傷害性を誘発するためにはｍ９０６によるＣＤ５６の認識が重要であることが確認された。

実施例５：抗体－薬物複合体（ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥ）のインビボ評価

ＭＣＣ細胞株の異種移植モデルにおけるｍ９０６のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対する治療性能

方法および装置

マウスモデル

７週齢のメスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ）２０匹を無菌条件下で飼育した。これら動物に関するすべての手順は、地元の倫理委員会（Ａｐａｆｉｓ－１００７６－２０１７０５３０１５４８８１２４ ｖ４）によって承認された。ＣＤ５６－陽性ＭＣＣ細胞株「ＷａＧａ」［８］を腫瘍の誘導に用いた。マウスをイソフルレンで麻酔して、マトリゲル中１０^７細胞を皮下注射した（注射部位：背中）。キャリパーで幅、長さ、および高さを測定して腫瘍の大きさを決定し、この手順の間中２日ごとに動物の一般的な状態を監視した。下記式：幅×長さ×高さ×π／６を用いて腫瘍体積を求めた。腫瘍の体積が５０ｍｍ^３になったら、マウスを試験に含めて、実験群または対照群にランダムに割り当てた。

実験手順

試験に含めた後、これら動物にＡＤＣ（ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥまたはＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥのいずれかを１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。対照マウスには当量体積のＰＢＳを注射した。実験群で腫瘍体積が二倍になったら新たに注射を行った。試験に含めてから３０日目、あるいは臨界点（腫瘍潰瘍、２０％の体重減少、または虚弱）に達したら、マウスを犠牲にした。これら動物を解剖して、病理学者により肉眼ですべての器官が調べられた。解剖後、腫瘍の重量および体積を評価した。何らかの転移の可能性がある進行を検出するため、腫瘍、肺、および肝臓を顕微鏡で調べた。

統計分析

中央値および両端を用いて連続データを記載した。解釈可能な症例の数と百分率により分類データを記載した。分類データにはフィッシャーの正確検定、連続データにはマン・ホイットニー検定またはクラスカル－ウォリス検定を用いて、これらの組み合わせを評価した。ＸＬＳｔａｔソフトウェア（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ、フランス、パリ）を用いて統計分析を行った。ｐ＜０．０５が統計的に有意であると見なされた。

結果

ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥは、ＭＣＣ細胞株のマウス異種移植モデルにおいて腫瘍の成長を低減させた。

１０ｍｇ／ｋｇのＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥ、ＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ、またはＰＢＳを３回投与した結果を図７（相対腫瘍体積）および図８（試験終了時の腫瘍の質量）に示す。対照として用いられた最後の２つの群では同様の腫瘍の成長が観察され、ＰＢＳ群およびＭＦ－ＴＴＺ－ＭＭＡＥ群について１日あたりの初期腫瘍体積の成長曲線の傾きの平均係数をそれぞれ１０５％（両端：３５～１６６）、１０８（両端：３３～３１８）であった。ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥで治療した実験群では、腫瘍の成長は有意に低減した（１日あたりの初期腫瘍体積の成長曲線の傾きの平均係数が１８％（両端：１～５３）；クラスカル－ウォリス検定：ｐ＝０．０１）。結論として、腫瘍の最終中心値重量は、対照動物の２．０３ｇ（両端：１．３～３．７）および１．７８ｇ（両端：１～２．７）、クラスカル－ウォリス検定：ｐ＝０．０２）と比べて、ＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥで治療した群では低減していた（図８）（平均重量：０．７ｇ（両端：０．４～１．３）。犠牲にした後、実験群でも対照群でも転移は観察されなかった。解剖時に除去した非腫瘍組織においてＭＦ－ｍ９０６－ＭＭＡＥの毒性の兆候は観察されなかった。
配列リスト

「［参照番号］」の形式で引用された参考文献
１．Ｆｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，Ｍａｙ－Ｊｕｎ；８（４）：７９９－８１０，２０１６
２．Ｇｏｙｏｎ，Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，１０６５－１０６６，３５－４３，２０１７
３．Ｆｅｋｅｔｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１３０，３－１８，２０１６
４．Ｂａｒｒａｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＥｕＰＡ Ｏｐｅｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１１，２３－２７，２０１６
５．Ｈｏｕｂｅｎ，Ｒ．．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１３０，８４７－８５６，２０１２
６．Ａｎｇｅｒｍｅｙｅｒ Ｓ．ａｎｄ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１３３（８）：２０５９－２０６４．２０１３
７．Ａｒａｇａｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３６８（４）：９２３－９２９，２００８
８．Ｈｏｕｂｅｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．；８４（１４）：７０６４－７０７２，２０１０

Claims (15)

1. 下記式（Ｉ）で表される抗体－薬物複合体。
   

   

   （式中、
   Ａは抗ＣＤ５６抗体または抗体断片であり、
   前記付加ヘッドは下記式の一方によって表され、
   

   

   および
   

   

   前記リンカーは下記式から選択される開裂可能なリンカーであり、
   

   

   または
   

   

   前記スペーサーは下記式で表され、
   

   

   ｍは１～１０の整数であり、
   ｎは１～４の整数である。）
2. ｍは４または５に等しい、請求項１に記載の抗体－薬物複合体。
3. 前記細胞傷害性薬剤は、メトトレキサート、ＩＭＩＤ、デュオカルマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４、ＳＮ３８、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、ピロロピリドジアゼピン、ピロロピリドジアゼピン二量体、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤、チロシンキナーゼの阻害剤、およびリシンから選択され、好ましくはＭＭＡＥである、請求項１または２に記載の抗体－薬物複合体。
4. 下記式
   

   

   または
   

   

   で表される請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体。
5. Ａはｍ９０６である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体。
6. 下記式（Ｉａ）
   

   

   または下記式（Ｉａ’）
   

   

   で表される請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の１種以上の抗体－薬物複合体を含む組成物。
8. 前記抗体－薬物複合体のうち少なくとも５０％、好ましくは約６０％はｎが４に等しい、請求項７に記載の組成物。
9. Ａは抗体であり、平均薬物抗体比（平均ＤＡＲ）は３．５と４の間、好ましくは３．８と４の間、例えば、３．９±０．１に等しい、請求項７または８に記載の組成物。
10. パクリタキセル、ドセタキセル，ドキソルビシン、および／またはシクロホスファミド、レナリドミド、デキサメタゾン、カルボプラチン、エトポシド、および／または抗ＰＤ１あるいは抗ＰＤ－Ｌ１などの抗癌抗体療法に用いられる抗体をさらに含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 薬剤として使用される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体または請求項７～１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. ＣＤ５６＋癌、好ましくはメラノーマ、芽体腫瘍、急性骨髄白血病などの血液疾患、骨髄腫、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、および神経内分泌上皮性悪性腫瘍の治療に使用される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体または請求項７～１０のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記ＣＤ５６＋癌は小細胞肺癌またはメルケル細胞癌などの神経内分泌上皮性悪性腫瘍から選択され、好ましくはメルケル細胞癌である、請求項１２に記載の抗体－薬物複合体。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体を調製する方法であって、以下の工程、
    （ｉ）下記式で表される付加ヘッド
    

    

    または
    

    

    を下記式で表される化合物に結合させることにより細胞傷害性複合体を調製する工程、
    

    

    （式中、前記リンカーは下記式から選択される開裂可能なリンカーであり、
    

    

    または
    

    

    前記スペーサーは下記式で表され、
    

    

    ＸはＢｒ、Ｃｌ、Ｉ、またはＦであり、
    ｍは１～１０、好ましくは２～７、３～６の整数であり、好ましくは４または５に等しい。）、および、
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞傷害性複合体を抗ＣＤ５６抗体または抗ＣＤ５６抗体断片と反応させる工程を含む、方法。
15. ＭＭＡＥカルバミン酸６－（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミド－Ｎ－ヘキサンアミド－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルまたはＭＭＡＥカルバミン酸６－（（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン－４－イル）アミノ）－６－オキソヘキサンアミド－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルを抗ＣＤ５６抗体または抗ＣＤ５６抗体断片と反応させることからなる工程を含む、請求項１４に記載の抗体－薬物複合体を調製する方法。

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