FR3131835A1 - Procédé de préparation de conjugués anticorps-médicament - Google Patents

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Estelle R. HUET
Camille R. GELY
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Abstract

L’invention concerne un procédé de préparation d’un mélange de conjugués de formule (I) : (I) dans laquelle la tête d’accroche, le bras de liaison, l’espaceur, M et u sont tels que définis dans la description, procédé qui comprend une étape de réaction entre un anticorps ou un fragment d’anticorps et un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (III) ou (IV) tel que défini dans la description.

Description

Procédé de préparation de conjugués anticorps-médicament
La présente invention concerne un procédé de préparation d’un mélange de conjugués anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») et les conjugués susceptibles d’être obtenus par ce procédé.
 Etat de la technique
Le début des années 2000 a vu une intensification de la recherche sur des conjugués anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC »), ces conjugués représentant potentiellement une alternative ou un complément aux thérapies « classiques » pour délivrer de manière ciblée un principe actif, notamment un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués.
La structure d'un conjugué anticorps-médicament consiste typiquement en un anticorps lié au médicament par une molécule dont une partie va fixer l’anticorps et une autre partie va se coupler au médicament, généralement par l’intermédiaire d’un bras d’espacement (ou linker) de longueur et nature variables.
Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est le plus souvent internalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament dans la cellule ciblée.
Des conjugués anticorps-médicament sont décrits dans la demande
WO 2015/004400. Par ailleurs, la demande PCT/FR2021/051345, déposée le 19 juillet 2021, décrit des têtes d’accroche qui permettent l’obtention de composés qui, lorsqu’ils sont conjugués à des protéines, notamment des anticorps, permettent l’obtention d’une « structure » telle qu’en moyenne le nombre de tête d’accroche conjuguée par protéine (anticorps) est contrôlé : le conjugué majoritaire visé portant soit 1 molécule par protéine (anticorps) soit 2 molécules par protéine (anticorps).
La présente invention concerne un procédé de préparation d’un mélange de conjugués de formule (I) :
(I)
dans laquelle la tête d’accroche, le bras de liaison, l’espaceur, M et u sont tels que définis ci-après.
La présente invention concerne également un mélange de conjugués susceptible d’être obtenu par le procédé susmentionné.
La présente invention concerne également une composition contenant un mélange de conjugués de formule (I), et l’utilisation de cette composition comme médicament, notamment pour le traitement du cancer.
Définitions
Le terme « anticorps » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde.
Le terme « F(ab')2» désigne un fragment d’anticorps qui conserve la capacité dudit anticorps à se lier un antigène. Le fragment F(ab')2est obtenu par digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine ou par IdeS. F(ab')2est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab (constituée des régions variables et des domaines CH1 et CL) et d'une région charnière.
Brève description des figures
Les Figures 1A, 1B et 1C représentent la structure de conjugués obtenus par le procédé conforme à l’invention. Dans ces figures, le carré gris représente la tête d’accroche, l’ovale comportant la lettre M représente le principe actif et l’ovale gris entre M et la tête d’accroche représente le motif bras de liaison-espaceur.
 Description détaillée de l’invention
Selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé de préparation d’un mélange de conjugués anticorps-médicament de formule (I) :
(I)
dans laquelle :
i) la tête d’accroche est un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) :
(IIa)
(IIb)
(IIc)
(IId)
dans lesquelles :
- T représente –(CH2)y– , y étant un entier allant de 0 à 6 ;
- W est -ORa, -COR2, -CONR3R4ou -NR3COR4;
- Raest -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -CORb, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou
-(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
- Rbest -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5,
-O(CRcRd)r-R5,-(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
- R2est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-R5,
-O(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5,
-O(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ;
- R3est -H, -(C1-C6)alkyle ou –(CH2)v-SO3H, de préférence R3est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
- R4est -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5,
-(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-R5]2, ou -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-R5]2, de préférence R4est -(CH2CH2O)qR5,
-(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
- chaque R5est -(CH2)sR6;
- chaque R6est choisi parmi :
;
- Rcest H ;
- chaque Rdest choisi parmi -H, -CH2-SO3H ou -SO3H ;
- R7est -H ou -CH3;
- chaque q est un entier allant de 1 à 24 ;
- chaque r est un entier allant de 1 à 8 ;
- chaque s est un entier allant de 0 à 6 ;
- chaque v est un entier allant de 1 à 6 ;
ii) le bras de liaison est une liaison directe ; un pont -S-S- ; ou un groupe de formule -(A)z-
- A est un résidu d’acide aminé ;
- z est égal à 1, 2, 3, 4 ou 5 ;
iii) l’espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
- G est un sulfate, un sucre, un glucuronide, ou un galactoside, ledit sucre étant un groupe saccharide choisi de préférence parmi un acide bêta-glucuronique, un bêta-D-galactose, un bêta-D-glucose, un alpha-D-mannose, un N-acétyl-D-glucosaminyle, un N-acétyl-D-galactosaminyle, un D-glucuronyle, un L-iduronyle, un D-glucopyranosyle, un D-galactopyranosyle, un D-mannopyranosyle ou un L-fucopyranosyle, de préférence G est un sulfate, un acide bêta-glucuronique, ou un bêta-D-galactose ;
- R12est -H ou -NO2;
iv) M est une molécule d’intérêt ; et
v) u, qui représente le rapport entre M et l’anticorps (ou F(ab’)2), est compris dans la gamme allant de 2 à 5 ;
étant entendu que le mélange contient au moins 50% (en masse) d’un conjugué de formule (I) dans lequel u = 2, 3 ou 5 ;
ledit procédé de préparation comprenant :
a1) la réaction d’un anticorps (ou d’un fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IIa) ou (IIb) ;
b1) la réaction du composé obtenu à l’étape a1) avec un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) tel que défini ci-dessus ;
étant entendu que :
- si un composé (IIa) est utilisé à l’étape a1) et un composé (IIa) est utilisé à l’étape b1), les deux composés (IIa) ont une structure différente ;
- si un composé (IIb) est utilisé à l’étape a1) et un composé (IIb) est utilisé à l’étape b1), les deux composés (IIb) ont une structure différente ;
c1) la réaction du composé obtenu à l’étape b1) avec deux composés identiques ou non, répondant chacun à la formule (III) :
(III)
dans laquelle :
- R8est R6-(CRcRd)r-CO-, R6-(CH2CH2O)q-(CH2)s-CO-, R6-(CRcRd)r-NH-, où R6, Rc, Rd, q, r et s sont tels que définis ci-dessus ;
- le bras de liaison, l’espaceur et M sont tels que définis ci-dessus, M étant identique ou non dans chaque composé (III) ;
ou bien
a1) la réaction d’un anticorps (ou d’un fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IIa) ou (IIb) ;
b2) la réaction du composé obtenu à l’étape a1) avec un composé de formule (IV) :
(IV)
dans laquelle :
i) la tête d’accroche est un composé de formule (II’a), (II’b), (II’c), ou (II’d) :
(II’a)
(II’b)
(II’c)
(II’d)
dans lesquelles :
- T est tel que défini ci-dessus ;
- Y est -OR’a, -COR’2, -CONR’3R’4ou -NR’3COR’4;
- R’aest -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CRcRd)r-R’5, -COR’b, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5ou
-(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R’5;
- R’best -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CRcRd)r-R’5,
-O(CRcRd)r-R’5,-(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R’5;
- R’2est -OH, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CRcRd)r-R’5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -O(CRcRd)r-R’5, -O(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -O(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5,
-O(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5ou -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R’5;
- R’3est -H, -(C1-C6)alkyle ou –(CH2)v-SO3H, de préférence R’3est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
- R’4est -(CH2CH2O)qR’5, -(CRcRd)rR’5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R’5,
-(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R’5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R’5, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R’5]2, -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R’5]2, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-R’5]2, ou -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5]2, de préférence R’4est -(CH2CH2O)qR’5,
-(CRcRd)rR’5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R’5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R’5,
-(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5, ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R’5;
- chaque R’5est -(CH2)sR’6ou -(CH2)sR’7;
- R’6est choisi parmi :
;
- R’7est -COOH ou –NR’8R’9;
- R’8est -H, -(C1-C6)alkyle ;
- R’9est -H, -(C1-C6)alkyle ;
- R’10est -H ou -CH3;
où Rc, Rd, q, r et s sont tels que définis ci-dessus ; et
ii) le bras de liaison est une liaison directe ; un pont -S-S- ; ou un groupe de formule
-R’11-(A)z- ;
- R’11est une liaison directe, un groupe R’6-(CRcRd)r-CO-, R’6-(CH2CH2O)q-(CH2)s-CO-, R’6-(CRcRd)r-NH-, où R’6, Rc, Rd, q, r et s sont tels que définis ci-dessus ;
- A est un résidu d’acide aminé ;
- z est égal à 1, 2, 3, 4 ou 5 ; et
iii) l’espaceur et M sont tels que définis à l’étape c1) ;
c2) la réaction du composé obtenu à l’étape b2) avec un composé de formule (III) tel que défini à l’étape c1), la molécule d’intérêt M du composé (III) étant identique à ou différente de la molécule d’intérêt M du composé (IV) ;
ou bien
a1) la réaction d’un anticorps (ou d’un fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IIa) ou (IIb) ;
b3) la réaction du composé obtenu à l’étape a1) avec un composé de formule (III) tel que défini ci-dessus ;
c3) la réaction du composé obtenu à l’étape b3) avec un composé de formule (IV) tel que défini ci-dessus, la molécule d’intérêt M du composé (IV) étant identique à ou différente de la molécule d’intérêt M du composé (III) ;
ou bien
a1) la réaction d’un anticorps (ou d’un fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IIa) ou (IIb) ;
b3) la réaction du composé obtenu à l’étape a1) avec un composé de formule (III) tel que défini ci-dessus ;
c4) la réaction du composé obtenu à l’étape b3) avec un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) tel que défini ci-dessus ;
d1) la réaction du composé obtenu à l’étape c4) avec un composé de formule (III) tel que défini ci-dessus, la molécule d’intérêt M étant identique ou non dans chaque composé (III).
Les conjugués anticorps-médicament de formule (I) peuvent également être préparés par un procédé comprenant :
a2) la réaction d’un anticorps (ou fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IV) tel que défini ci-dessus, dans laquelle la tête d’accroche est uniquement un composé de formule (II’a) ou (II’b) ;
b4) la réaction du composé obtenu à l’étape a2) avec un composé de formule (IV) tel que défini ci-dessus, M étant identique ou non dans chaque composé (IV), étant entendu que :
- si un composé (II’a) est utilisé à l’étape a2) et un composé (II’a) est utilisé à l’étape b4), les deux composés (II’a) ont une structure différente ;
- si un composé (II’b) est utilisé à l’étape a2) et un composé (II’b) est utilisé à l’étape b4), les deux composés (II’b) ont une structure différente ;
ou bien
a2) la réaction d’un anticorps (ou fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IV) tel que défini ci-dessus, dans laquelle la tête d’accroche est uniquement un composé de formule (II’a) ou (II’b) ;
b5) la réaction du composé obtenu à l’étape a2) avec un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) tels que définis ci-dessus ;
c5) la réaction du composé obtenu à l’étape b5) avec un composé de formule (III) tel que défini ci-dessus, la molécule d’intérêt M du composé (III) étant identique à ou différente de la molécule d’intérêt M du composé (IV).
L’étape a1) du procédé de l’invention consiste à faire réagir un anticorps (ou le fragment F(ab’)2dudit anticorps) avec une tête d’accroche de formule (IIa) ou (IIb). L’anticorps, ou le fragment F(ab')2, se lie à la tête d’accroche par une réaction de substitution des groupes Br présents dans la formule (IIa) ou (IIb).
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps (ou le fragment F(ab’)2) est mis à réagir avec la tête d’accroche, en présence d’un agent réducteur. Dans certains modes de réalisation, la tête d’accroche et l’agent réducteur sont présents en excès, par rapport à l’anticorps (ou au fragment F(ab’)2). On entend par « excès » (et ceci est applicable pour la description et les revendications) une quantité (exprimée en équivalent) au moins 2 fois supérieure, par exemple au moins 5 fois, au moins 10 fois ou au moins 15 fois supérieure. Dans certains modes de réalisation, la tête d’accroche est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
On obtient à l’issue de l’étape a1) un « composé » de structure :
L’étape b1) du procédé de l’invention consiste à faire réagir le composé obtenu à l’étape a1) avec une seconde tête d’accroche, distincte de celle utilisée à l’étape a1), de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId). De manière similaire à ce qui est indiqué pour l’étape a1), l’anticorps, ou le fragment F(ab')2, se lie à la seconde tête d’accroche par une réaction de substitution des groupes Br présents dans la formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId).
Dans certains modes de réalisation, le composé obtenu à l’étape a1) est mis à réagir avec la seconde tête d’accroche en présence d’un agent réducteur. Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de seconde tête d’accroche et d’agent réducteur, par rapport au composé obtenu à l’étape a1). Dans certains modes de réalisation, on fait d’abord réagir le composé obtenu à l’étape a1) avec l’agent réducteur, puis on ajoute la seconde tête d’accroche. Dans certains modes de réalisation, la seconde tête d’accroche est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
On obtient à l’issue de l’étape b1) un « composé » de structure :
L’étape c1) du procédé de l’invention consiste à faire réagir le composé obtenu à l’issue de l’étape b1) avec deux composés identiques ou non de formule (III).
Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de chacun des composés de formule (III), par rapport au composé obtenu à l’étape b1). Dans certains modes de réalisation, les composés de formule (III) sont chacun en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau. Dans certains modes de réalisation, les deux composés de formule (III) sont ajoutés concomitamment. Dans certains modes de réalisation, les deux composés de formule (III) sont ajoutés séquentiellement.
La réaction entre le composé obtenu à l’étape b1) et les deux composés de formule (III) est mise en œuvre par chimie « click ». Cette réaction a lieu entre un groupe R6porté par chacune des têtes d’accroches et un groupe R6porté par chacun des composés de formule (III). De manière plus précise, la réaction de click s’effectue entre un diène (par exemple un azoture ou un diazo) et un diénophile (par exemple un alcène ou un alcyne), chacune de ces fonctions étant apportée par un groupe R6. Ainsi, la réaction de click peut s’effectuer entre un diène apporté par le groupe R6de chacune des têtes d’accroche et un diénophile apporté par le groupe R6du composé (III), ou bien entre un diénophile apporté par le groupe R6de chacune des têtes d’accroche et un diène apporté par le groupe R6du composé (III). Ces réactions de click sont bien connues de la personne du métier, étant entendu que les groupes R6sont judicieusement choisis compatibles entre eux. Lorsque les deux composés de formule (III) sont ajoutés concomitamment, la réaction de click est effectuée en une seule étape. Lorsque les deux composés de formule (III) sont ajoutés séquentiellement, deux réactions de click successives sont mises en œuvre, l’ordre d’ajout des composés de formule (III) étant fonction de la compatibilité des fonctions de click (R6) utilisées.
Dans certains modes de réalisation le composé obtenu à l’étape a1) et/ou le composé obtenu à l’étape b1) peu(ven)t être purifié(s) avant d’être utilisé(s) à l’étape suivante. De la même manière, lorsque la réaction de click est effectuée en une seule étape, le mélange de conjugués obtenu à l’issue de l’étape c1) peut également être purifié. Lorsque deux réactions de click successives sont mises en œuvre à l’étape c1), une purification peut avoir lieu à l’issue de l’une ou l’autre réaction de click (ou bien des deux). La purification s’effectue selon des techniques bien connues de la personne du métier.
On obtient à l’issue de l’étape c1) un mélange de conjugués dont le conjugué majoritaire est tel que représenté sur la , 1B, ou 1C. Ce conjugué majoritaire possède 2, 3 ou 5 molécules d’intérêt M portées par l’anticorps (u = 2, 3, ou 5).
L’étape b2) du procédé de l’invention consiste à faire réagir le composé obtenu à l’étape a1) avec un composé de formule (IV).
Dans certains modes de réalisation, le composé obtenu à l’étape a1) est mis à réagir avec le composé de formule (IV) en présence d’un agent réducteur. Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de composé de formule (IV) et d’agent réducteur, par rapport au composé obtenu à l’étape a1). Dans certains modes de réalisation, le composé de formule (IV) est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
On obtient à l’issue de l’étape b2) un « composé » ayant l’une des structures ci-après :
L’étape c2) du procédé de l’invention consiste à faire réagir le composé obtenu à l’étape b2) avec un composé de formule (III). Cette étape s’effectue par réaction de click selon une méthode similaire à celle décrite pour l’étape c1).
Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de composé de formule (III), par rapport au composé obtenu à l’étape b2). Dans certains modes de réalisation, le composé de formule (III) est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
Dans certains modes de réalisation le composé obtenu à l’étape a1) et/ou le composé obtenu à l’étape b2) peu(ven)t être purifié(s) avant d’être utilisé(s) à l’étape suivante. De la même manière, le mélange de conjugués obtenu à l’issue de l’étape c2) peut également être purifié. La purification s’effectue selon des techniques bien connues de la personne du métier.
On obtient à l’issue de l’étape c2) un mélange de conjugués dont le conjugué majoritaire est tel que représenté sur la , 1B ou 1C. Ce conjugué majoritaire possède 2, 3 ou 5 molécules d’intérêt M portées par l’anticorps (u = 2, 3 ou 5).
L’étape b3) du procédé de l’invention consiste à faire réagir le composé obtenu à l’étape a1) avec un composé de formule (III).
Cette étape s’effectue par réaction de click selon une méthode similaire à celle décrite pour l’étape c1).
Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de composé de formule (III), par rapport au composé obtenu à l’étape a1). Dans certains modes de réalisation, le composé de formule (III) est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
On obtient à l’issue de l’étape b3) un « composé » de structure :
L’étape c3) du procédé de l’invention consiste à faire réagir le composé obtenu à l’étape b3) avec un composé de formule (IV).
Dans certains modes de réalisation, le composé obtenu à l’étape b3) est mis à réagir avec le composé de formule (IV) en présence d’un agent réducteur. Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de composé de formule (IV) et d’agent réducteur, par rapport au composé obtenu à l’étape b3). Dans certains modes de réalisation, le composé de formule (IV) est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
Dans certains modes de réalisation le composé obtenu à l’étape a1) et/ou le composé obtenu à l’étape b3) peu(ven)t être purifié(s) avant d’être utilisé(s) à l’étape suivante. De la même manière, le mélange de conjugués obtenu à l’issue de l’étape c3) peut également être purifié. La purification s’effectue selon des techniques bien connues de la personne du métier.
On obtient à l’issue de l’étape c3) un mélange de conjugués dont le conjugué majoritaire est tel que représenté sur la , 1B ou 1C. Ce conjugué majoritaire possède 2, 3 ou 5 molécules d’intérêt M portées par l’anticorps (u = 2, 3 ou 5).
L’étape c4) du procédé de l’invention consiste à faire réagir le composé obtenu à l’étape b3) avec une seconde tête d’accroche, de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId).
Dans certains modes de réalisation, le composé obtenu à l’étape b3) est mis à réagir avec la seconde tête d’accroche en présence d’un agent réducteur. Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de seconde tête d’accroche et d’agent réducteur, par rapport au composé obtenu à l’étape b3). Dans certains modes de réalisation, on fait d’abord réagir le composé obtenu à l’étape b3) avec l’agent réducteur, puis on ajoute la seconde tête d’accroche. Dans certains modes de réalisation, la seconde tête d’accroche est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
On obtient à l’issue de l’étape c4) un « composé » ayant l’une des structures ci-après :
L’étape d1) du procédé de l’invention consiste à faire réagir le composé obtenu à l’étape c4) avec un composé de formule (III).
Cette étape s’effectue par réaction de click selon une méthode similaire à celle décrite pour l’étape c1).
Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de composé de formule (III), par rapport au composé obtenu à l’étape c4). Dans certains modes de réalisation, le composé de formule (III) est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
Dans certains modes de réalisation le composé obtenu à l’étape a1) et/ou le composé obtenu à l’étape b3) et/ou le composé obtenu à l’étape c4) peu(ven)t être purifié(s) avant d’être utilisé(s) à l’étape suivante. De la même manière, le mélange de conjugués obtenu à l’issue de l’étape d1) peut également être purifié. La purification s’effectue selon des techniques bien connues de la personne du métier.
On obtient à l’issue de l’étape d1) un mélange de conjugués dont le conjugué majoritaire est tel que représenté sur la , 1B ou 1C. Ce conjugué majoritaire possède 2, 3 ou 5 molécules d’intérêt M portées par l’anticorps (u = 2, 3 ou 5).
L’étape a2) du procédé de l’invention consiste à faire réagir un anticorps (ou fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IV) tel que défini ci-dessus, dans lequel la tête d’accroche répond uniquement à la formule (II’a) ou (II’b). L’anticorps, ou le fragment F(ab')2, se lie à la tête d’accroche du composé (IV) par une réaction de substitution des groupes Br présents dans la formule (II’a) ou (II’b).
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps (ou le fragment F(ab’)2) est mis à réagir avec le composé de formule (IV) en présence d’un agent réducteur. Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de composé de formule (IV) et d’agent réducteur, par rapport à l’anticorps. Dans certains modes de réalisation, le composé de formule (IV) est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
On obtient à l’issue de l’étape a2) un « composé » de structure :
L’étape b4) consiste à faire réagir le composé obtenu à l’étape a2) avec un second composé de formule (IV).
Dans certains modes de réalisation, le composé obtenu à l’étape a2) est mis à réagir avec le second composé de formule (IV) en présence d’un agent réducteur. Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de second composé de formule (IV) et d’agent réducteur, par rapport au composé obtenu à l’étape a2). Dans certains modes de réalisation, le second composé de formule (IV) est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
Dans certains modes de réalisation le composé obtenu à l’étape a2) peut être purifié avant d’être utilisé à l’étape suivante. De la même manière, le mélange de conjugués obtenu à l’issue de l’étape b4) peut également être purifié. La purification s’effectue selon des techniques bien connues de la personne du métier.
On obtient à l’issue de l’étape b4) un mélange de conjugués dont le conjugué majoritaire est tel que représenté sur la , 1B ou 1C. Ce conjugué majoritaire possède 2, 3 ou 5 molécules d’intérêt M portées par l’anticorps (u = 2, 3 ou 5).
L’étape b5) du procédé de l’invention consiste à faire réagir le composé obtenu à l’étape a2) avec une tête d’accroche de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId).
Dans certains modes de réalisation, le composé obtenu à l’étape a2) est mis à réagir avec la tête d’accroche en présence d’un agent réducteur. Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de tête d’accroche et d’agent réducteur, par rapport au composé obtenu à l’étape a2). Dans certains modes de réalisation, on fait d’abord réagir le composé obtenu à l’étape a2) avec l’agent réducteur, puis on ajoute la tête d’accroche. Dans certains modes de réalisation, la tête d’accroche est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
On obtient à l’issue de l’étape b5) un « composé » ayant l’une des structures ci-après :
L’étape c5) du procédé de l’invention consiste à faire réagir le composé obtenu à l’étape b5) avec un composé de formule (III).
Cette étape s’effectue par réaction de click selon une méthode similaire à celle décrite pour l’étape c1).
Dans certains modes de réalisation, on utilise un excès de composé de formule (III), par rapport au composé obtenu à l’étape b5). Dans certains modes de réalisation, le composé de formule (III) est en solution dans un solvant miscible à l’eau ou un mélange de solvants miscibles à l’eau.
Dans certains modes de réalisation le composé obtenu à l’étape a2) et/ou le composé obtenu à l’étape b5) peu(ven)t être purifié(s) avant d’être utilisé(s) à l’étape suivante. De la même manière, le mélange de conjugués obtenu à l’issue de l’étape c5) peut également être purifié. La purification s’effectue selon des techniques bien connues de la personne du métier.
On obtient à l’issue de l’étape c5) un mélange de conjugués dont le conjugué majoritaire est tel que représenté sur la , 1B ou 1C. Ce conjugué majoritaire possède 2, 3 ou 5 molécules d’intérêt M portées par l’anticorps (u = 2, 3 ou 5).
Certains des modes de réalisation décrits ci-dessus font intervenir un agent réducteur. La personne du métier saura choisir judicieusement un tel agent parmi les composés utilisés de manière conventionnelle dans les réactions de bioconjugaison, à titre d’exemple on peut mentionner : le dithiothréitol, le bêta-mercaptoéthanol, l’hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine ou la tris(hydroxypropryl)phosphine.
Dans certains modes de réalisation, le procédé conforme à l’invention comprend les étapes a1), b1) et c1).
Dans certains modes de réalisation, la tête d’accroche utilisée à l’étape a1) et à l’étape b1) répond à l’une des formules (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) dans lesquelles :
- W est -CONR3R4ou -NR3COR4, de préférence W est -CONR3R4;
- R3est -H ou –(C1-C6)alkyle ;
- R4est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, ou -(CRcRd)r-R5;
- R6 est choisi parmi :
;
- Rc, Rdsont tels que définis ci-dessus ;
- q est un entier allant de 1 à 12, de préférence q est un entier allant de 1 à 8 ;
- r est un entier allant de 1 à 6.
Dans certains modes de réalisation, la tête d’accroche est un composé de formule (IIa1), (IIa2), (IIa3), (IIa4), (IIa5), ou (IIa6) :
(IIa1) ;
(IIa2) ;
(IIa3) ;
(IIa4) ;
(IIa5) ;
(IIa6).
Dans certains modes de réalisation, le procédé conforme à l’invention comprend les étapes a1), b2) et c2).
Dans certains modes de réalisation, la tête d’accroche utilisé à l’étape b2) répond à l’une des formules (II’a), (II’b), (II’c) ou (II’d) dans lesquelles :
- Y est –CONR’3R’4ou –NR’3COR’4, de préférence Y est –CONR’3R’4;
- R’3est -H ou –(C1-C6)alkyle ;
- R’4est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, ou -(CRcRd)r-R’5;
- R’5est -(CH2)sR’6;
- R’6est choisi parmi :
;
- Rc, Rdsont tels que définis ci-dessus ;
- q est un entier allant de 1 à 12, de préférence q est un entier allant de 1 à 8 ;
- r est un entier allant de 1 à 6.
Dans certains modes de réalisation, la tête d’accroche est un composé de formule (II’a1), (II’a2), (II’a3), (II’a4), (II’a5), (II’a6), (II’a7), (II’a8) ou (II’b1) :
(II’a1) ;
(II’a2) ;
(II’a3) ;
(II’a4) ;
(II’a5) ;
(II’a6) ;
(II’a7) ;
(II’a8) ;
(II’b1).
Dans certains modes de réalisation, le bras de liaison est une liaison directe.
Dans certains modes de réalisation, le bras de liaison est un groupe de formule –R1 1-(A)z- dans laquelle R11et A sont tels que définis ci-dessus, et z est égal à 2, 3 ou 4.
A est un résidu d’acide aminé qui peut être choisi dans le groupe constitué de : une valine, une citrulline, une phénylalanine, une lysine, un acide aspartique, une méthionine, une asparagine, une proline, une isoleucine, une alanine, une arginine, une glycine ou un acide glutamique. Avantageusement, z est égal à 2 ou 3, de préférence 2 et -(A)z- est un résidu d’acides aminés choisi parmi le résidu de : valine-citrulline ; phénylalanine-lysine ; valine-alanine ; valine-acide aspartique ; lysine-méthionine ; lysine-asparagine ; proline-isoleucine ; proline-lysine ; valine-lysine ; alanine-lysine ; phénylalanine-phénylalanine-lysine ; phénylalanine-phénylalanine-alanine ; arginine-arginine ; lysine-arginine ; lysine-acide glutamique ; glycine-arginine ; ou glycine-glycine-arginine (l’ordre des acides aminés est donné ici à titre indicatif, par exemple un résidu de citrulline-valine est également compris dans la définition de -(A)z-).
Dans certains modes de réalisation, le bras espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
, de préférence une liaison directe ou un groupe de formule :
.
Dans certains modes de réalisation, M est un principe actif. A titre de principe actif susceptible d’être utilisé dans le cadre de l’invention, on peut citer les principes actifs de médicaments déjà autorisés et les molécules en cours d’évaluation thérapeutique, en particulier :
- les agents alkylants tels que : chlorambucile, chlornaphazine, cyclophosphamide, dacarbazine, estramustine, ifosfamide, méchloréthamine, chlorhydrate d’oxyde de méchloréthamine, mannomustine, mitobronitol, melphalan, mitolactol, pipobroman, novembichine, phénesterine, prednimustine, thiotépa, trofosfamide, moutarde à l’uracile, CC-1065 (y compris ses analogues synthétiques adozélésine, carzélésine et bizélésine), duocarmycine (y compris les analogues synthétiques KW-2189 et CBI-TMI), dimères de benzodiazépine (par exemple, dimères de pyrrolobenzodiazépine (PBD) ou tomaymycine, indolinobenzodiazépines, imidazobenzothiadiazépines, ou oxazolidino-benzodiazépines), nitro-urées (carmustine, lomustine, chlorozotocine, fotemustine, nimustine, ranimustine), alkylsulfonates (busulfan, tréosulfan, improsulfan et piposulfan), triazènes (dacarbazine), composés à base de platine (carboplatine, cisplatine, oxaliplatine), aziridines (benzodopa, carboquone, meturedopa, et uredopa), éthylène-imines et mélamines (incluant altrétamine, triéthylènemélamine, triéthylenephosphoramide, triéthylènethio-phosphaoramide et triméthylolomelamine) ;
- les alcaloïdes végétaux tels que : alcaloïdes de Vinca (vincristine, vinblastine, vindésine, vinorelbine, navelbine), les taxoïdes (paclitaxel, docetaxol) et leurs analogues, les maytansinoïdes (DM1, DM2, DM3, DM4, maytansine et ansamitocines) et leurs analogues, les cryptophycines (en particulier la cryptophycine 1 et la cryptophycine 8), les épothilones, eleuthérobine, discodermolide, bryostatines, dolastatines, auristatines, tubulysines, céphalostatines, pancratistatines, sarcodictyine, spongistatines ;
- les inhibiteurs d’ADN topoisomérase tels que : épipodophylline (9-aminocamptothécine, camptothécine, crisnatol, daunomycine, étoposide, étoposide phosphate, irinotécan, mitoxantrone, novantrone, acides rétinoïques (rétinols), téniposide, topotecan, 9-nitrocamptothécine (RFS 2000), mitomycines (mitomycine C), bortezomib ;
- les anti-métabolites tels que : les anti-folates (inhibiteurs DHFR (méthotrexate, trimétrexate, dénopterine, ptéroptérine, aminoptérine (acide 4-aminoptéroïque) et autres analogues de l’acide folique), les inhibiteurs de l’IMP déshydrogénase (acide mycophénolique, tiazofurine, ribavirine, EICAR), les inhibiteurs de ribonucléotide réductase (hydroxyurée, déferoxamine), les analogues de pyrimidine tels que : analogues d’uracile (ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, capécitabine, carmofur, cytarabine, didésoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, 5-fluorouracile, floxuridine, ratitrexed), analogues de cytosine (cytarabine, cytosine arabinoside, fludarabine), analogues de purine (azathioprine, fludarabine, mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine), acide folinique ;
- les agents hormonaux tels que : anti-estrogènes (mégestrol, raloxifène, tamoxifène), agonistes LHRH (goséréline, acétate de leuprolide), anti-androgènes (bicalutamide, flutamide, calustérone, propionate de dromostanolone, épitiostanol, goséréline, leuprolide, mépitiostane, nilutamide, testolactone, trilostane), analogues de la vitamine D3 (CB 1093, EB 1089, KH 1060, cholécalciférol, ergocalciférol), thérapies photodynamiques (verteporfine, phthalocyanine, photosensibilisateur Pc4), cytokines (interféron-alpha, interféron-gamma, facteur de nécrose tumorale (TNF), protéines humaines contenant un domaine TNF) ;
- les inhibiteurs de kinase tels que : BIBW 2992, CYT387, E7080, axitinib, bafetinib, bosutinib, cabozantinib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, iniparib, ispinesib, lapatinib, masitinib, mubritinib, nilotinib, pazopanib, pegaptanib, ponatinib, ruxolitinib, sorafénib, sunitinib, tivozanib, vandetanib, vismodegib ;
- les inhibiteurs de poly(ADP-ribose)polymérase (PARP) tels que : BGB-290, CEP 9722, E7016, 3-aminobenzamide, niraparib, olaparib, talazoparib, veliparib ;
- les immunomodulateurs tels que : thalidomide, lénalidomide, pomalidomide ;
- une toxine telle que l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin, la
Dans un mode de réalisation particulier, le principe actif est choisi parmi le méthotrexate, un immunomodulateur, la duocarmycine, la combrétastatine, la calichéamicine, la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), DM1, DM4, SN38, l’amanitine et ses analogues, la pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et la ricine, de préférence le principe actif est l’amanitine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la MMAF ou la MMAE, ces deux dernières étant représentées par les formules suivantes :
.
Dans certains modes de réalisation, M est un chélateur de radionucléide. A titre de chélateur de radionucléide susceptible d’être utilisé dans le cadre de l’invention, on peut citer la sarcophagine, le DOTA (1,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N′,N″,N′″-tétraacétique acide), DOTAGA (tétraazacyclododécane triacétique acide glutarique acide), le NODA (1,4,7-triazacyclononane-1,4-diacétique acide), le NODAGA (triazacyclononane diacétique acide glutarique acide), le NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacétique acide) et le MANOTA (méthyle amino triazacyclononane triacétique acide).
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps ou le fragment F(ab’)2dudit anticorps se lie à un antigène spécifique d’un cancer. L’antigène spécifique du cancer peut être, par exemple, CD1a, CD3, CD4, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD39, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD66e, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79, CD80, CD86, CD117, CD138, CD194, CD205, CD227, VEGF, EpCAM, GPIIb, GPIIIa, TNF alpha, TNFR, TNT, Lewis Y, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, AXL, Protéine F, IgE-Fc, C5, IL-6R, IL12, IL15, IL18, IL23, IL-1, TPO-R, GPNMB, PSMA, PSA, PAP, PSM, Cripto, Récepteur 1 des folates, récepteurs de l'endothéline ETB, STEAP1, SLC44A4 (AGS-5), AGS-16, Guanylyl cyclase C, EGFRvIII, Mésothéline, IL2R, A33, Can, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, TGFbeta, TGFbetaR, FGF, FGFR, PDGF, PDGFR, Ang-1, Ang-2, intégrine, RANK-L, BLyS, c-MET, DR, TCRalpha,beta, ICOS, EphA2, CA6, ENPP3, FOLR1, Nectine-4, TIM-1, facteur tissulaire, LIV-1, TLR-7, AFP, HLA-DR, antigène carcinoembryonnaire (ACE), TAG-72, protéine de liaison des folates, G250, gangliosides, collagène de type 4 (collagène IV), collagène de type 18 (collagène XVIII), CA19-9, p185HER2, protéine d'activation des fibroblastes (FAP), ténascine, métalloprotéinases, l’endosialine, anhydrase carbonique, Galectine 9, Aldolase A, eIFgamma4, Galectine 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, Restin, NY-CO-38, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, HGFR, PTK 7, CCK-4, PTP-LAR, CDCP1, CADM1, IGSF4, BCAM, CEACAM6, JAM-A, PTGFRN (CD9P-1), MCAM, MCP, EMMPRIN, TfR, C1qR, hTERT, Survivine, MDM2, CYP1B1, MART-1, MART-2, protéines mélanosomales, gp100, CDC27, MAGEs, WT1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, BRAF, TPI, fibronectine, K-ras, beta-caténine, CDK4, caspase-8, p14ARF, p16INK4a, bcr-abl, SYT-SSX, TRP-1, TRP-2, GnT-V, tyrosinase, TEL-AML1, protéinase 3, EBV-EBNA, HTLV-1 tax, HPV16-E7, HLA-A2 muté, HA1, SART3, CEACAM5, ESAT-6, RANK, fibrine, TF, PRAME, CA19-9, CA50, CA195, CAM17.1/WGA, beta-MG, DU-PAN2, HE4, transferrine, transthyrétine, ApoA1, TROP-2, CTLA-4, GITR, PD-1, PD-L1, c-KIT, CD11b-CD18 intégrine hétérodimère, DNA/Histone H1, protéoglycane, fibrinogène, le grand antigène T SV40, SC-Ag, ESA, mucine, CCR4, MTX1, MTX2, PECAM, Tn, cathepsine D, TYRO-3, MER, ou un complexe PF4/héparine.
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps ou le fragment F(ab’)2dudit anticorps se lie à HER2, CD30 ou CD56. Il peut donc par exemple s’agir d’un anticorps anti-HER2, d’un anticorps anti-CD30 ou d’un anticorps anti-CD56.
L’anticorps ou le fragment F(ab’)2peut être d’origine mammifère (par exemple humain ou de souris), murine, chimérique, humanisé ou humain. Il s’agit de préférence d’un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement décrites dans la littérature.
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps est de type IgG, par exemple IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
Les composés de formule (III) :
(III)
peuvent être obtenus de manière conventionnelle, par exemple par couplage de type peptidique entre d’une part le bras de liaison (portant le groupe R8) et l’espaceur, et d’autre part entre l’espaceur et M. Un tel couplage s’effectue de manière classique entre un groupe carboxylique porté par le bras de liaison (respectivement, l’espaceur), et un groupe amine porté par l’espaceur (respectivement M).
Les composés de formule (IV) :
peuvent être achetés ou obtenus par exemple comme décrit dans la demande PCT/FR2021/051345 ou dans la demande PCT/FR2020/050833.
Le procédé de préparation de l’invention permet d’obtenir un mélange de conjugués anticorps-médicament de formule (I). L’homme du métier comprendra que, par abus de langage, la structure de la tête d’accroche (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) telle que représentée pour les conjugués de formule (I) correspond en fait la structure avant sa liaison avec l’anticorps (ou le fragment F(ab’)2), liaison qui s’opère par substitution des groupes partants Br de la tête d’accroche. Ce mélange de conjugués est caractérisé en ce qu’il contient majoritairement (càd au moins 50% (en masse)) un conjugué anticorps-médicament qui comprend 2, 3 ou 5 molécules d’intérêt M fixées sur l’anticorps (ou le fragment F(ab’)2). Le nombre de molécules fixées sur l’anticorps (ou le fragment F(ab’)2) correspond au nombre « u » de la formule (I). La proportion de l’espèce attendue (u = 2, 3 ou 5) est déterminée par analyse SMHR (Spectrométrie de Masse Haute Résolution) en conditions dénaturantes. Lorsque les conjugués de formule (I) comprennent un anticorps entier (plutôt qu’un fragment F(ab’)2), l’analyse est réalisée après digestion des conjugués par IdeS, sur le fragment F(ab’)2. Le mélange de conjugués de formule (I) obtenu par le procédé de l’invention peut être présent dans une composition, qui peut être par exemple une composition pharmaceutique contenant un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables.
Ainsi, selon un autre aspect, l’invention concerne une composition comprenant un mélange de conjugués anticorps-médicament de formule (I) susceptible d’être obtenu par le procédé décrit ci-dessus. Comme indiqué ci-dessus, ce mélange contient majoritairement un conjugué anticorps-médicament qui comprend 2, 3 ou 5 molécules d’intérêt M fixées sur l’anticorps (ou le fragment F(ab’)2).
Dans certains modes de réalisation, lorsque le mélange contient majoritairement un conjugué anticorps-médicament qui comprend 2 molécules d’intérêt M fixées sur l’anticorps (ou le fragment F(ab’)2), ces 2 molécules M sont différentes l’une de l’autre.
Selon un autre aspect, l’invention concerne une composition telle que définie ci-dessus pour utilisation comme médicament.
L’invention est illustrée par les exemples ci-après, donnés à titre purement illustratif. Dans ces exemples, on utilise les abréviations suivantes :
DCC = dicyclohexylcarbodiimide
DIPEA =N,N-diisopropyléthylamine
DMAP = 4-diméthylaminopyridine
DMF =N,N-diméthylformamide
DMSO = diméthylsulfoxyde
EDTA = acide éthylènediaminetétraacétique
HCl = acide chlorhydrique
HOBt = hydroxybenzotriazole
MeCN = acétonitrile
MeOH = méthanol
NaCl = chlorure de sodium
TA = température ambiante (20 °C sauf indication contraire)
TFA = acide trifluoroacétique
tR = temps de rétention
v/v = rapport volume sur volume
Méthodes d’analyse
Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton1H ont été réalisés sur un appareil Bruker Ultrashield 300 (300 MHz (1H)). Les analyses ont été réalisées dans le méthanol deutéré (CD3OD). Les déplacements chimiques (δ) sont mesurés en parties par million (ppm) par rapport au signal résiduel du méthanol deutéré (δ1H = 3,31 ppm).
Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hertz (Hz) et la multiplicité est décrite de la façon suivante : d = doublet, dd = doublet de doublet, dt = doublet de triplet, m = multiplet, p = pentuplet, s = singulet, t = triplet.
Spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR)
La masse exacte des composés synthétisés a été déterminée par spectrométrie de masse haute résolution (SMHR) en mode positif ou négatif avec la technique d’ionisation par électronébulisation ESI, sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex Ultimate 3000 RSLC de la plateforme « Fédération de Recherche » de l’ICOA/CBM (FR2708)).
Spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR) dénaturante
Afin d’éliminer l’hétérogénéité liée aux sucres et d’augmenter la réponse en masse, les parties Fc des anticorps à analyser ont été coupées à l’aide de la protéase IdeS. L’analyse des conjugués a donc été réalisée sur un échantillon préalablement clivé par la protéase IdeS : à 10 µL d’échantillon a été ajouté 1 µL d’IdeS à une concentration de 0,8 g/L puis l’échantillon a été incubé à 37°C pendant au moins 16 h. L’analyse spectrométrique des conjugués a été réalisée sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex Ultimate 3000 RSLC. Avant l’analyse MS, les échantillons (5 µg) ont été dessalés sur une colonne de dessalage MassPREP (2,1x10 mm, Waters), chauffés à 80°C en utilisant une solution aqueuse d’acide formique à 0,1% comme solvant A et une solution à 0,1% d’acide formique dans l’acétonitrile comme solvant B à 500 µL/min. Après 1 min, un gradient linéaire de 5 à 90% de B en 1,5 min a été appliqué. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 900 à 5000 à 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel DataAnalysis 4.4 (Bruker) et l’algorithme MaxEnt pour la déconvolution. La proportion d’espèce d’intérêt obtenue a été déterminé à l’aide de l’intensité des pics des espèces observés sur le fragment F(ab’)2.
Réactions de bioconjugaison Préparation des solutions
Tampon 1 : Tampon phosphate 1X (1 mM KH2PO4, 180 mM NaCl et 3 mM de Na2HPO4.7H2O) à un pH de 8,3, et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
Tampon 2 : Tampon phosphate 1X (1 mM KH2PO4, 180 mM NaCl et 3 mM de Na2HPO4.7H2O) à un pH de 7,4.
Réducteur : Solution de chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP.HCl) à une concentration de 1 mM dans le tampon 1.
Réaction de bioconjugaison 1
La solution d’anticorps dans le tampon 1 (1,0 éq) a été placée sous argon. La solution du composé de formule (IIa), (IIb), (II’a) ou (II’b) (1,0-15,0 éq, de préférence 3,0-12,0 éq) puis la solution de réducteur (1,0-12,0 éq, de préférence 3,0-8,0 éq) ont été ajoutées et le milieu réactionnel a été agité sous argon à 37°C pendant 2h30.
Purification 1
Si nécessaire, le composé obtenu à l’issue de la réaction de bioconjugaison 1 a été purifié par Sephadex® avec le tampon 2. Les fractions contenant le composé purifié (dosage par NanoDrop) ont été rassemblées puis concentrées par Vivaspin® (10 kDa). Sur la solution concentrée, un échange de tampon a été réalisé par Vivaspin® (10 kDa) pour obtenir le composé qui a été utilisé en tampon 1 à l’étape suivante.
Réaction de bioconjugaison 2
Le composé éventuellement purifié obtenu à l’issue de la réaction de bioconjugaison 1 (1,0 éq) a été placé sous argon. Le réducteur (7,0-30,0 éq, de préférence 8,0-15,0 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37°C pendant 2h. Puis la solution du composé (IIa), (IIb), (IIc), (IId), ou (IV) (5,0-30,0 éq, de préférence 12,0-15,0 éq) a été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à 37°C pendant 2h30.
Purification 2
Si nécessaire, le composé obtenu à l’issue de la réaction de bioconjugaison 2 ou à l’issue de la réaction de click en une étape (voir ci-dessous) a été purifié par Sephadex® avec le tampon 2. Les fractions contenant le composé purifié (dosage par NanoDrop®) ont été rassemblées pour être utilisées à l’étape suivante.
Réaction de click
En une étape : ajout d’un seul composé (III) ou ajout concomitant de deux composés (III)
Au composé éventuellement purifié obtenu à l’issue de la réaction de bioconjugaison 2 (1,0 éq) a été ajouté la ou les solutions du ou des composés (III) (5,0-30,0 éq, de préférence 15,0-30,0 éq) et le milieu réactionnel a été agité à 37°C pendant au moins 16h.
En deux étapes : ajout séquentiel de deux composés (III)
Au composé éventuellement purifié obtenu à l’issue de la réaction de bioconjugaison 2 (1,0 éq) a été ajouté une solution du premier composé (III) (5,0-30,0 éq, de préférence 15,0-30,0 éq) et le milieu réactionnel a été agité à 37°C ou 25°C pendant au moins 16h. Le composé intermédiaire obtenu est éventuellement purifié (voir ci-dessous). Puis une solution du deuxième composé (III) a été ajoutée (5,0-30,0 éq, de préférence 15,0-30,0 éq) et le milieu réactionnel a été agité à 37°C ou 25°C pendant au moins 16h.
Purification 3
Lorsque deux réactions de click ont été mises en œuvre séquentiellement, le composé obtenu à l’issue de la première réaction de click a été avantageusement purifié par Sephadex® avec le tampon 2. Les fractions contenant le composé purifié (dosage par NanoDrop®) ont été rassemblées puis concentrées par Vivaspin® (10 kDa) pour être utilisées dans la deuxième réaction de click.
Exemples
Exemple 1 : 4-nitrophényl 1-[4-(6-méthyl-1,2,4,5-tétrazin-3-yl)phénoxy]-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-oate (1)
(1)
L’acide 4-méthyletéatrazinylphénoxy-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-oïque (12,2 mg ; 0,028 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le DMF anhydre (250 μL) puis le 4-nitrophénol (5,1 mg ; 0,036 mmol ; 1,3 éq), le DCC (7,5 mg ; 0,036 mmol ; 1,3 éq) et la DMAP (1,0 mg ; 0,008 mmol ; 0,3 éq) ont été ajoutés. Le milieu réactionnel a été placé sous agitation, sous argon à TA pendant 18h30. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR= 26,01 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner(1)(7,8 mg ; 50%) sous la forme d’une huile rose.
RMN1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,53 – 8,42 (m ; 2H) ; 8,32 – 8,21 (m ; 2H) ; 7,42 – 7,31 (m ; 2H) ; 7,21 – 7,11 (m ; 2H) ; 4,29 – 4,20 (m ; 2H) ; 3,93 – 3,80 (m ; 4H) ; 3,75 – 3,66 (m ; 4H) ; 3,66 – 3,63 (m ; 8H) ; 3,00 (s ; 3H) ; 2,87 (t ;J= 6,0 Hz ; 2H).
SMHR (ESI) :m/zcalculé pour C26H32N5O9[M+H]+: 558,2195 ; observé 558,2203.
Exemple 2 : acide (2R)‐2‐[(2S)‐2‐[(S)‐[(2R)‐1‐[(3S,4R,5R)‐4‐[(2R)‐N,3‐diméthyl‐2‐[(2R)‐3‐méthyl‐2‐{N‐méthyl‐1‐[4‐(6-méthyl‐1,2,4,5‐tétrazin‐3‐yl)phénoxy]‐3,6,9,12‐tétraoxapentadécan‐15-amido}butanamido]
butanamido]‐3‐méthoxy‐5‐méthylheptanoyl]pyrrolidin‐2-yl](méthoxy)methyl]propanamido]‐3‐phénylpropanoïque (2)
(2)
A une solution de HOBt (2,0 mg ; 0,0151 mmol ; 2,1 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (100 μL) en présence de DIPEA anhydre (2,5 μL ; 0,0144 mmol ; 2,0 éq) a été ajouté le 1-[4-(6-méthyl-1,2,4,5-tétrazin-3-yl)phénoxy]-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-oate de 4-nitrophényle(1)(7,1 mg ; 0,0128 mmol ; 1,8 éq). Puis une solution de sel d’acide trifluoroacétique de MMAF (6,1 mg ; 0,0072 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF anhydre (100 μL), a été ajoutée au milieu réactionnel placé sous agitation, sous argon à 25°C pendant 19h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR= 27,44 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 90% de B sur 32 min puis 90% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner(2)(1,4 mg ; 17%) sous la forme d’une huile violette.
RMN1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,57 – 8,45 (m ; 2H) ; 8,41 – 8,08 (m ; 1H) ; 8,08 – 7,79 (m ; 1H) ; 7,37 – 7,06 (m ; 8H) ; 4,78 – 4,59 (m ; 1H) ; 4,32 – 4,22 (m ; 2H) ; 4,14 – 3,96 (m ; 2H) ; 3,96 – 3,85 (m ; 2H) ; 3,84 – 3,52 (m ; 13H) ; 3,48 – 3,35 (m ; 5H) ; 3,21 – 3,15 (m ; 2H) ; 3,14 – 3,03 (m ; 4H) ; 3,00 (s ; 3H) ; 2,97 – 2,89 (m ; 1H) ; 2,83 – 2,63 (m ; 1H) ; 2,61 – 2,40 (m ; 2H) ; 2,41 – 2,15 (m ; 2H) ; 2,15 – 1,67 (m ; 8H) ; 1,50 – 1,12 (m ; 3H) ; 1,12 – 0,76 (m ; 28H).
SMHR (ESI) :m/zcalculé pour C59H92N9O14[M+H]+: 1150,6758 ; observé 1150,6754.
Les composés commerciaux, issus de la demande PCT/FR2021/051345 ou de la demande PCT/FR2020/050833, utilisés pour les réactions de bioconjugaison sont résumés dans le Tableau 1 ci-dessous.
Numéro (#) Nom et structure
(3) bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylméthyl(4-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)methyl)-1-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)-1,5-dioxo-9,12,15,18-tétraoxa-2,6-diazaicosan-20-yl)carbamate
[Chem42]
(4) 2-(2-(2-(trans-cyclooctènylcarbamoyl)éthoxy)éthoxy)éthyl)carbamoylpropane-1,3-diyl(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamide)
[Chem43]
(5) 4‐{2‐azatricyclo[10.4.0.04,9]hexadeca‐1(12),4(9),5,7,13,15‐hexaen‐10‐yn‐2‐yl}‐N‐(2‐{2‐[2‐(3‐{[2,6‐bis(bromométhyl)pyridin‐4‐yl]formamido}‐2‐({[2,6‐bis(bromométhyl)pyridin‐4‐yl]formamido}méthyl)-propanamido)éthoxy]éthoxy}éthyl)‐4‐oxobutanamide
[Chem44]
(6) 2-(2-(2-(2-(4-(méthyltétrazinylphénoxy)éthoxy)éthoxy)éthoxy)-éthyl)carbamoylpropane-1,3-diyl(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamide)
[Chem45]
(7) N,N'-(2-((2-(2-(2-(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthoxy)éthyl)-carbamoyl)propane-1,3-diyl)bis(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamide)
[Chem46]
(8) 6-azidohexanamido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
[Chem47]
(9) (4‐{2‐[2‐(6‐{2‐azatricyclo[10.4.0.04,9]hexadéca‐1(12),4(9),5,7,13,15‐hexaen‐10‐yn‐2‐yl}‐6‐oxohexanamido)‐3‐méthylbutanamido]‐5‐(carbamoylamino)pentanamido}phényl)méthylN‐{1‐[(1‐{[1‐(2‐{2‐[(1‐hydroxy‐1‐phénylpropan‐2‐yl)carbamoyl]‐1‐méthoxy‐2‐méthyléthyl}pyrrolidin‐1‐yl)‐3‐méthoxy‐5‐méthyl‐1‐oxoheptan‐4‐yl](méthyl)carbamoyl}‐2‐méthylpropyl)carbamoyl]‐2‐méthylpropyl}‐N‐méthylcarbamate
[Chem48]
(10) 1-trans-cyclooctènyl-1-oxo-5,8,11,14-tétraoxa-2-azahetaptadécan-17-amide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
[Chem49]
(11) 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
[Chem50]
(12) composé commercial Mc-Val-Cit-PAB-MMAE (CAS : 646502-53-6)
[Chem51]
(13) 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-méthyl)propanamido)-3-sulfopropanamido-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
[Chem52]
Exemple 3 Etape a1) Réactifs
Trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (7,0 éq), composé(6)(10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 1.
Etape b1) Réactifs
Composé issu de a1) à 3,2 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (8,0 éq) et composé(7)(15,0 éq) à une concentration de 10 mM dans le MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2.
Etape c1) Réactifs
Composé issu de b1) à 2,6 mg/mL dans le tampon 1, composé(9)(16,5 éq) et composé(10)(11,6 éq) à une concentration de 10 mM dans le DMSO.
Méthode
Réaction de click à 25°C pendant 17h. Dans ce cas les composés(9)et(10)ont été ajoutés concomitamment. On a obtenu un mélange de conjugués dont l’analyse SMHR ci-dessous a permis de déterminer la présence majoritaire du conjugué (14) dont la structure est telle que représentée dans la .
Analyse SMHR dénaturante
Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous.
Composé MM attendue (Da) MM observée (Da) Proportion (%)
(14) 101870 101871 56
Exemple 4 Etape a1) Réactifs
Trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (7,0 éq), composé(3)(10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 1 puis purification 1.
Etape b2) Réactifs
Composé issu de a1) à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (15,0 éq) et composé(11)(15,0 éq) à une concentration de 2 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2 puis purification 2.
Etape c2) Réactifs
Composé issu de b2) à 1,3 mg/mL dans le tampon 2 et composé(2)(15,0 éq) à une concentration de 1 mM dans le DMSO.
Méthode
Réaction de click à 25°C pendant 23h puis purification 2. On a obtenu un mélange de conjugués dont l’analyse SMHR ci-dessous a permis de déterminer la présence majoritaire du conjugué (15) dont la structure est telle que représentée dans la .
Analyse SMHR dénaturante
Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous.
Composé MM attendue (Da) MM observée (Da) Proportion (%)
(15) 102263 102263 64
Exemple 5 Etape a1) Réactifs
Trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (7,0 éq), composé(3)(10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 1 puis purification 1.
Etape b2) Réactifs
Composé issu de a1) à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (15,0 éq) et composé(12)(15,0 éq) à une concentration de 2 mM dans le DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2 puis purification 2.
Etape c2) Réactifs
Composé issu de b2) à 0,7 mg/mL dans le tampon 2 et composé(2)(15,0 éq) à une concentration de 1 mM dans le DMSO.
Méthode
Réaction de click à 25°C pendant 23h puis purification 2. On a obtenu un mélange de conjugués dont l’analyse SMHR ci-dessous a permis de déterminer la présence majoritaire du conjugué (16) dont la structure est telle que représentée dans la .
Analyse SMHR dénaturante
Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-dessous.
Composé MM attendue (Da) MM observée (Da) Proportion (%)
(16) 104799 104799 88
Exemple 6 Etape a1) Réactifs
Trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (7,0 éq), composé(3)(10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 1 puis purification 1.
Etape b2) Réactifs
Composé issu de a1) à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (15,0 éq) et composé(13)(15,0 éq) à une concentration de 2 mM dans le DMF.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2 puis purification 2.
Etape c2) Réactifs
Composé issu de b2) à 0,9 mg/mL dans le tampon 2 et composé(2)(15,0 éq) à une concentration de 1 mM dans le DMSO.
Méthode
Réaction de click à 25°C pendant 23h puis purification 2. On a obtenu un mélange de conjugués dont l’analyse SMHR ci-dessous a permis de déterminer la présence majoritaire du conjugué (17) dont la structure est telle que représentée dans la .
Analyse SMHR dénaturante
Les résultats sont présentés dans le Tableau 5 ci-dessous.
Composé MM attendue (Da) MM observée (Da) Proportion (%)
(17) 101164 101165 63
Exemple 7 Etape a1) Réactifs
Trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (7,0 éq), composé(3)(10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 1 puis purification 1.
Etape b1) Réactifs
Composé issu de a1) à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (15,0 éq) et composé(4)(15,0 éq) à une concentration de 2 mM dans le DMF.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2 puis purification 2.
Etape c1) Réactifs
Composé issu de b1) à 0,6 mg/mL dans le tampon 2, composé(8)(15,0 éq) à une concentration de 1 mM dans le DMSO (« click 1 »), puis composé issu de de « click 1 » à 1,8 mg/mL dans le tampon 2, composé(2)(15,0 éq) à une concentration de 2 mM dans le DMSO (« click 2 »).
Méthode
Click séquentielle.
Click 1 : réaction de click à 37°C pendant 23h puis purification 3.
Click 2 : réaction de click à 37°C pendant 18h. On a obtenu un mélange de conjugués dont l’analyse SMHR ci-dessous a permis de déterminer la présence majoritaire du conjugué (18) dont la structure est telle que représentée dans la .
Analyse SMHR dénaturante
Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 ci-dessous.
Composé MM attendue (Da) MM observée (Da) Proportion (%)
(18) 101453 101451 53
Exemple 8 Etape a1) Réactifs
Trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (7,0 éq), composé(3)(10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 1 puis purification 1.
Etape b1) Réactifs
Composé issu de a1) à 5,0 mg/mL dans le tampon 1, réducteur (15,0 éq) et composé(5)(15,0 éq) à une concentration de 2 mM dans le DMF.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2 puis purification 2.
Etape c1) Réactifs
Composé issu de b1) à 1,0 mg/mL dans le tampon 2 et composé(2)(15,0 éq) à une concentration de 1 mM dans le DMSO (« click 1 »), puis composé issu de de « click 1 » à 1,2 mg/mL dans le tampon 2 et composé(8)(15,0 éq) à une concentration de 1 mM dans le DMSO (« click 2 »).
Méthode
Click séquentielle.
Click 1 : réaction de click à 25°C pendant 23h puis purification 3.
Click 2 : réaction de click à 37°C pendant 18h. On a obtenu un mélange de conjugués dont l’analyse SMHR ci-dessous a permis de déterminer la présence majoritaire du conjugué (19) dont la structure est telle que représentée dans la .
Analyse SMHR dénaturante
Les résultats sont présentés dans le Tableau 7 ci-dessous.
Composé MM attendue (Da) MM observée (Da) Proportion (%)
(19) 101588 101588 55

Claims (13)

  1. Procédé de préparation d’un mélange de conjugués anticorps-médicament de formule (I) :
    (I)
    dans laquelle :
    i) la tête d’accroche est un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) :
    (IIa)
    (IIb)
    (IIc)
    (IId)
    dans lesquelles :
    - T représente –(CH2)y– , y étant un entier allant de 0 à 6 ;
    - W est -ORa, -COR2, -CONR3R4ou -NR3COR4;
    - Raest -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -CORb, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
    - Rbest -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5,
    -O(CRcRd)r-R5,-(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
    - R2est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-R5, -O(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
    - R3est -H, -(C1-C6)alkyle ou –(CH2)v-SO3H, de préférence R3est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
    - R4est -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5,
    -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-R5]2, ou -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-R5]2, de préférence R4est -(CH2CH2O)qR5,
    -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
    - chaque R5est -(CH2)sR6;
    - chaque R6est choisi parmi :

    ;
    - Rcest H ;
    - chaque Rdest choisi parmi -H, -CH2-SO3H ou -SO3H ;
    - R7est -H ou -CH3;
    - chaque q est un entier allant de 1 à 24 ;
    - chaque r est un entier allant de 1 à 8 ;
    - chaque s est un entier allant de 0 à 6 ;
    - chaque v est un entier allant de 1 à 6 ;
    ii) le bras de liaison est une liaison directe ; un pont -S-S- ; ou un groupe de formule -(A)z-
    - A est un résidu d’acide aminé ;
    - z est égal à 1, 2, 3, 4 ou 5 ;
    iii) l’espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :

    - G est un sulfate, un sucre, un glucuronide, ou un galactoside, ledit sucre étant un groupe saccharide choisi de préférence parmi un acide bêta-glucuronique, un bêta-D-galactose, un beta-D-glucose, un alpha-D-mannose, un N-acétyl-D-glucosaminyle, un N-acétyl-D-galactosaminyle, un D-glucuronyle, un L-iduronyle, un D-glucopyranosyle, un D-galactopyranosyle, un D-mannopyranosyle ou un L-fucopyranosyle, de préférence G est un sulfate, un acide bêta-glucuronique, ou un bêta-D-galactose ;
    - R12est -H ou -NO2;
    iv) M est une molécule d’intérêt ; et
    v) u, qui représente le rapport entre M et l’anticorps (ou F(ab’)2), est compris dans la gamme allant de 2 à 5 ;
    étant entendu que le mélange contient au moins 50% (en masse) d’un conjugué de formule (I) dans lequel u = 2, 3 ou 5 ;
    ledit procédé comprenant :
    a1) la réaction d’un anticorps (ou fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IIa) ou (IIb) :
    b1) la réaction du composé obtenu à l’étape a1) avec un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) tel que défini ci-dessus ;
    étant entendu que :
    - si un composé (IIa) est utilisé à l’étape a1) et un composé (IIa) est utilisé à l’étape b1), les deux composés (IIa) ont une structure différente ;
    - si un composé (IIb) est utilisé à l’étape a1) et un composé (IIb) est utilisé à l’étape b1), les deux composés (IIb) ont une structure différente ;
    c1) la réaction du composé obtenu à l’étape b1) avec deux composés identiques ou non, répondant chacun à la formule (III) :
    (III)
    dans laquelle :
    - R8est R6-(CRcRd)r-CO-, R6-(CH2CH2O)q-(CH2)s-CO-, R6-(CRcRd)r-NH-, où R6, Rc, Rd, q, r et s sont tels que définis ci-dessus ;
    - le bras de liaison, l’espaceur et M sont tels que définis ci-dessus, M étant identique ou non dans chaque composé (III) ;
    ou bien
    a1) la réaction d’un anticorps (ou fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IIa) ou (IIb) ;
    b2) la réaction du composé obtenu à l’étape a1) avec un composé de formule (IV) :
    (IV)
    dans laquelle :
    i) la tête d’accroche est un composé de formule (II’a), (II’b), (II’c), ou (II’d) :
    (II’a)
    (II’b)
    (II’c)
    (II’d)
    dans lesquelles :
    - T est tel que défini ci-dessus ;
    - Y est -OR’a, -COR’2, -CONR’3R’4ou -NR’3COR’4;
    - R’aest -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CRcRd)r-R’5, -COR’b, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R’5;
    - R’best -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CRcRd)r-R’5,
    -O(CRcRd)r-R’5,-(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R’5;
    - R’2est -OH, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -(CRcRd)r-R’5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -O(CRcRd)r-R’5, -O(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -O(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5ou -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R’5;
    - R’3est -H, -(C1-C6)alkyle ou –(CH2)v-SO3H, de préférence R’3est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
    - R’4est -(CH2CH2O)qR’5, -(CRcRd)rR’5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R’5,
    -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R’5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R’5, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R’5]2, -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R’5]2, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-R’5]2, ou -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5]2, de préférence R’4est -(CH2CH2O)qR’5,
    -(CRcRd)rR’5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R’5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R’5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R’5, ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R’5;
    - chaque R’5est -(CH2)sR’6ou -(CH2)sR’7;
    - R’6est choisi parmi :

    ;
    - R’7est -COOH ou –NR’8R’9;
    - R’8est -H, -(C1-C6)alkyle ;
    - R’9est -H, -(C1-C6)alkyle ;
    - R’10est -H ou -CH3;
    où Rc, Rd, q, r et s sont tels que définis ci-dessus ; et
    ii) le bras de liaison est une liaison directe ; un pont -S-S- ; ou un groupe de formule -R’11-(A)z- ;
    - R’11est une liaison directe, un groupe R’6-(CRcRd)r-CO-, R’6-(CH2CH2O)q-(CH2)s-CO-, R’6-(CRcRd)r-NH-, où R’6 -, Rc, Rd, q, r et s sont tels que définis ci-dessus ;
    - A est un résidu d’acide aminé ;
    - z est égal à 1, 2, 3, 4 ou 5 ; et
    iii) l’espaceur et M sont tels que définis à l’étape c1) ;
    c2) la réaction du composé obtenu à l’étape b2) avec un composé de formule (III) tel que défini à l’étape c1), la molécule d’intérêt M du composé (III) étant identique à ou différente de la molécule d’intérêt M du composé (IV) ;
    ou bien
    a1) la réaction d’un anticorps (ou fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IIa) ou (IIb) ;
    b3) la réaction du composé obtenu à l’étape a1) avec un composé de formule (III) tel que défini ci-dessus ;
    c3) la réaction du composé obtenu à l’étape b3) avec un composé de formule (IV) tel que défini ci-dessus, la molécule d’intérêt M du composé (IV) étant identique à ou différente de la molécule d’intérêt M du composé (III) ;
    ou bien
    a1) la réaction d’un anticorps (ou fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IIa) ou (IIb) ;
    b3) la réaction du composé obtenu à l’étape a1) avec un composé de formule (III) tel que défini ci-dessus ;
    c4) la réaction du composé obtenu à l’étape b3) avec un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) tel que défini ci-dessus ;
    d1) la réaction du composé obtenu à l’étape c4) avec un composé de formule (III) tel que défini ci-dessus, la molécule d’intérêt M étant identique ou non dans chaque composé (III).
  2. Procédé de préparation selon la revendication 1, qui comprend les étapes a1), b1) et c1).
  3. Procédé de préparation selon la revendication 2, dans lequel la tête d’accroche utilisée à l’étape a1) et à l’étape b1) répond à l’une des formules (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) dans lesquelles :
    - W est -CONR3R4ou -NR3COR4, de préférence W est -CONR3R4;
    - R3est -H ou –(C1-C6)alkyle ;
    - R4est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, ou -(CRcRd)r-R5;
    - chaque R5est -(CH2)sR6;
    - R6est choisi parmi :
    ;
    - Rc, Rdsont tels que définis ci-dessus ;
    - q est un entier allant de 1 à 12, de préférence q est un entier allant de 1 à 8 ;
    - r est un entier allant de 1 à 6.
  4. Procédé de préparation selon la revendication 3, dans lequel la tête d’accroche est un composé de formule (IIa1), (IIa2), (IIa3), (IIa4), (IIa5), ou (IIa6) :
    (IIa1) ;
    (IIa2) ;
    (IIa3) ;
    (IIa4) ;
    (IIa5) ;
    (IIa6).
  5. Procédé de préparation selon la revendication 1, qui comprend les étapes a1), b2) et c2).
  6. Procédé de préparation selon la revendication 5, dans lequel la tête d’accroche utilisé à l’étape b2) répond à l’une des formules (II’a), (II’b), (II’c) ou (II’d) dans lesquelles :
    - Y est –CONR’3R’4ou –NR’3COR’4, de préférence Y est –CONR’3R’4;
    - R’3est -H ou –(C1-C6)alkyle ;
    - R’4est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R’5, ou -(CRcRd)r-R’5;
    - R’5est -(CH2)sR’6;
    - R’6est choisi parmi :
    ;
    - Rc, Rdsont tels que définis ci-dessus ;
    - q est un entier allant de 1 à 12, de préférence q est un entier allant de 1 à 8 ;
    - r est un entier allant de 1 à 6.
  7. Procédé de préparation selon la revendication 6, dans lequel la tête d’accroche est un composé de formule (II’a1), (II’a2), (II’a3), (II’a4), (II’a5), (II’a6), (II’a7), (II’a8) ou (II’b1) :
    (II’a1) ;
    (II’a2) ;
    (II’a3) ;
    (II’a4) ;
    (II’a5) ;
    (II’a6) ;
    (II’a7) ;
    (II’a8) ;
    (II’b1).
  8. Procédé de préparation d’un mélange de conjugués anticorps-médicament de formule (I) telle que définie à la revendication 1, qui comprend :
    a2) la réaction d’un anticorps (ou fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IV) tel que défini à la revendication 1, dans laquelle la tête d’accroche est uniquement un composé de formule (II’a) ou (II’b) ;
    b4) la réaction du composé obtenu à l’étape a2) avec un composé de formule (IV) tel que défini à la revendication 1, M étant identique ou non dans chaque composé (IV), étant entendu que :
    - si un composé (II’a) est utilisé à l’étape a2) et un composé (II’a) est utilisé à l’étape b4), les deux composés (II’a) ont une structure différente ;
    - si un composé (II’b) est utilisé à l’étape a2) et un composé (II’b) est utilisé à l’étape b4), les deux composés (II’b) ont une structure différente ;
    ou bien
    a2) la réaction d’un anticorps (ou fragment F(ab’)2) avec un composé de formule (IV) tel que défini à la revendication 1, dans laquelle la tête d’accroche est uniquement un composé de formule (II’a) ou (II’b) ;
    b5) la réaction du composé obtenu à l’étape a2) avec un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId) tels que définis à la revendication 1 ;
    c5) la réaction du composé obtenu à l’étape b5) avec un composé de formule (III) tel que défini à la revendication 1, la molécule d’intérêt M du composé (III) étant identique à ou différente de la molécule d’intérêt M du composé (IV).
  9. Procédé de préparation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le bras de liaison est une liaison directe ou un groupe de formule –R11-(A)z- dans laquelle R11et A sont- tels que définis à la revendication 1, et z est égal à 2, 3 ou 4.
  10. Procédé de préparation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
    ; de préférence un groupe de formule :
    .
  11. Procédé de préparation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel M est un principe actif choisi parmi : le méthotrexate, un immunomodulateur, la duocarmycine, la combrétastatine, la calichéamicine, la monométhylauristatine E (MMAE), la monométhylauristatine F (MMAF), la maytansine, le DM1, le DM4, le SN38, l’amanitine et ses analogues, la pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, la ricine ; de préférence M est l’amanitine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la MMAF ou la MMAE.
  12. Mélange de conjugués anticorps-médicament de formule (I) susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, ledit mélange comprenant majoritairement un conjugué dans lequel u = 2, 3 ou 5, étant entendu que lorsque le mélange contient majoritairement un conjugué comprenant deux molécules d’intérêt M fixées sur l’anticorps ou sur le fragment F(ab’)2(u = 2), ces 2 molécules d’intérêt M sont différentes l’une de l’autre.
  13. Composition comprenant un mélange de conjugués anticorps-médicament selon la revendication 12.
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