FR3101541A1 - conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie - Google Patents

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Abstract

Conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie L’invention concerne des conjugués anticorps-médicament, et leur utilisation en thérapie, notamment pour traiter les cancers CD30+.

Description

conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie
La présente invention concerne des nouveaux conjugués anticorps-médicaments comprenant un anticorps dirigé contre l’antigène CD30 couplé à un médicament cytotoxique et leur utilisation comme médicament, notamment en thérapie anti-cancéreuse.
Un conjugué anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») constitue un moyen de délivrance sélective d'un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués.
La structure générale d'un conjugué anticorps-médicament est celle de la formule (I). La partie liant l'anticorps et le médicament est appelée bras de liaison ou linker. Il peut être greffé sur l'anticorps via l'une au moins des huit cystéines formant les 4 ponts disulfures inter-chaînes. Le nombre de molécules de médicaments cytotoxiques greffées sur l'anticorps détermine un ratio appelé Drug-to-Antibody Ratio (DAR).
Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est internalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament cytotoxique est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament cytotoxique actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament cytotoxique dans la cellule ciblée.
Les anticorps anti-CD30 ont déjà été conjugués à des médicaments cytotoxiques, dont la Monométhyle auristatine E (MMAE). Un conjugué cytotoxique portant la MMAE, utilisant un bras de liaison maléimide, a été développé sous le nom de « vedotin ». Ce médicament cytotoxique a été utilisé avec divers anticorps monoclonaux pour la préparation de conjugués anticorps-médicament (ADC). Il est notamment utilisé dans la préparation du brentuximab vedotin, un ADC qui cible le CD30 [1].
Toutefois, la stabilité, en particulier la stabilité du DAR au cours du temps, et l’homogénéité du brentuximab vedotin ne sont pas optimales [2].
Il existe donc un besoin de développer des conjugués anti-CD30-médicament cytotoxiques plus homogènes, plus stables et donc plus efficaces.
Un premier objet de l’invention concerne un conjugué anticorps-médicament de formule (I) suivante :
[Chem. 1]

dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d’anticorps anti-CD30 ;
la tête d’accroche est représentée par la formule suivante : 
[Chem. 2]
;
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
[Chem. 3]
ou
[Chem. 4]
 ;
l’espaceur est représenté par la formule suivante :
[Chem. 5]
 ;

m est un entier allant de 1 à 10 ;
n est un entier allant de 1 à 4.
Un second objet de l’invention concerne une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l’invention.
Un troisième objet de l’invention concerne un conjugué anticorps-médicament selon l’invention ou une composition selon l’invention, pour utilisation comme médicament.
Un quatrième objet de l’invention concerne un conjugué anticorps-médicament selon l’invention ou une composition selon l’invention, pour utilisation dans le traitement d’un cancer CD30+.
Description détaillée
Définitions
Le terme « conjugué cytotoxique » désigne un conjugué qui comprend un médicament cytotoxique. Dans le cadre de la présente invention, un conjugué cytotoxique désigne un conjugué de formule (II) suivante :
[Chem. 6]

dans laquelle :
la tête d’accroche est représentée par la formule suivante :
[Chem. 7]
;
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
[Chem. 3]
ou
[Chem. 4]
 ;
l’espaceur est représenté par la formule suivante :
[Chem. 5]
;
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10.
Le terme « médicament cytotoxique » désigne toute molécule naturelle ou de synthèse, capable d'inhiber ou d'empêcher la fonction des cellules. On entend par « cytotoxique », la propriété pour un agent chimique ou biologique, d'altérer des cellules, éventuellement jusqu'à les détruire.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament cytotoxique est choisi parmi tout composé ayant obtenu une AMM et qui est utilisé en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire, toute molécule en cours d'évaluation clinique en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire. Le médicament cytotoxique sera choisi par exemple parmi le paclitaxel (Taxol®) ou le docetaxel (Taxotère®) ou l'un de ses dérivés, le topotecan, le bortezomib, la daunorubicine, les analogues de daunorubicine, la vincristine, la mitomycine C, l'acide rétinoïque, le méthotrexate, ilomédine, l'aspirine, un IMIDs, le lénalidomide, le pomalidomide.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament cytotoxique est sélectionné dans le groupe constitué de la duocarmycine et ses analogues, les dolastatines, la combretastatine et ses analogues, la calichéamicine, la N-acétyl-y-calichéamycine (CMC), un dérivé de calichéamycine, la maytansine et ses analogues, tel qu’un dérivé de type maytansinoïde, par exemple le DM1 et le DM4, les auristatines et leurs dérivés, tels que l'auristatine E, l'auristatine EB (AEB), l'auristatine EFP (AEFP), la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), la tubulysine, le disorazole, les epothilones, l'echinomycine, l'estramustine, la cemadotine, l'eleutherobine, la méthoptérine, l'actinomycine, la mitomycine A, la camptothécine, un dérivé de la camptothécine, le SN38, , le TK1, l'amanitine, une pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, une pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un intercalant de l'ADN, un inhibiteur d'histone désacétylase, ou un inhibiteur de tyrosine kinase. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament M est sélectionné parmi l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin, la toxine diphtérique (DT) et la ricine.
Dans un mode de réalisation particulier, le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calicheamicine, monométhyle auristatine E (MMAE), monométhyle auristatine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE, représentée par la formule suivante :
[Chem. 8]
Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l’invention, le conjugué cytotoxique répond à la formule (IIa) suivante :
[Chem. 9]
Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constitué d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde.
Par « anticorps chimérique », on entend un anticorps dont les séquences des régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce non-murine. A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant pas exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon l'invention contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et légères d'origine murine.
Par « anticorps humanisé », on entend un anticorps dont tout ou partie des séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les régions hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine.
Par « anticorps humain », on entend un anticorps contenant uniquement des séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes lourdes.
On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins un pont disulfure, par exemple Fab, Fab’, F(ab') 2, Fab'-SH, scFv-Fc ou Fc.
La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère deux fragments identiques, qu'on appelle les fragments Fab (Fragment antigen binding), et un fragment Fc (Fragment cristallisable). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SH fait référence à un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre. Le scFv (single chain Fragment variable) est un fragment issu de l'ingénierie des protéines qui est constitué uniquement des domaines variables VH et VL. La structure est stabilisée par un court bras peptidique flexible, appelé linker, qui est placé entre les deux domaines. Le fragment scFv peut être lié à un fragment Fc pour donner un scFv-Fc.
Le terme « CD30 » désigne le « Cluster de Différenciation 30 », qui est une glycoprotéine membranaire de la superfamille des récepteurs des facteurs de nécrose tumorale humaine (« tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF) »). « CD30 » est aussi appelé fréquemment «TNFRSF8».
Le terme « cancer CD30+ » ou « cancer CD30 positif » désigne un cancer impliquant une activation exacerbée de CD30. En particulier, le terme « cancer CD30+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une dérégulation du gène TNFRSF8. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer CD30+ est choisi parmi les cancers du sang et les cancers du système lymphatique, également appelés lymphomes, tels que le lymphome de Hodgkin, le lymphome anaplasique à larges cellules, le lymphome T périphérique, la forme aigue ou lymphomatose de la leucémie à lymphocytes T de l’adulte, le lymphome cutané à cellules T, par exemple le lymphome primitif cutané T ou le mycosis fongoïde, le lymphome B diffus à grandes cellules, le lymphome non hodgkinien, le lymphome angio-immunoblastique à cellules T. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer CD30+ est choisi parmi le lymphome de Hodgkin, le lymphome anaplasique à larges cellules et le lymphome T périphérique.
Par « purifié » et « isolé », on entend, en se référant à un anticorps selon l'invention, que l’anticorps est présent en l'absence substantielle d'autres macromolécules biologiques du même type. Le terme "purifié" tel qu'utilisé ici signifie de préférence au moins 75% en masse, plus préférablement au moins 85% en masse, encore plus préférablement au moins 95% en masse, et le plus préférablement au moins 98% en masse d’anticorps, par rapport à l’ensemble des macromolécules présentes.
Le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie approuvé par une agence règlementaire fédérale ou d’État ou énuméré dans la pharmacopée américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue, destiné à être utilisé chez les animaux et chez l’homme. Une « composition pharmaceutique » désigne une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, un véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel l'agent thérapeutique est administré. Ces véhicules peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris ceux d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc. L'eau est un véhicule préféré lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie intraveineuse. Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en particulier pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires. Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par exemple de l'amidon de maïs prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de l'hydroxypropyl méthylcellulose); des charges (par exemple du lactose, de la cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par des procédés bien connus dans l’état de la technique. Les préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule approprié avant utilisation. De telles préparations liquides peuvent être préparées par des moyens classiques avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des dérivés de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple desp-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique). Les compositions pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas. La composition selon l'invention est de préférence une composition pharmaceutique.
Le terme « traiter » ou « traitement » englobe tout effet bénéfique ou souhaitable sur les symptômes d’une pathologie ou d'un état pathologique, et peut même inclure une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie ou de l'état pathologique. Le traitement peut par exemple impliquer soit la réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état pathologique. Le terme « traitement » ne signifie pas nécessairement l'éradication complète ou la guérison de la pathologie, ni des symptômes associés.
Conjugué anticorps-médicament
L’invention concerne un conjugué anticorps-médicament de formule (I) suivante :
[Chem. 1]

dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d’anticorps anti-CD30 ;
la tête d’accroche est représenté par la formule suivante : 
[Chem. 2]
;
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
[Chem. 3]
ou
[Chem. 4]
 ;
l’espaceur est représenté par la formule suivante :
[Chem. 5]
 ;
m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 5 ;
n est un entier allant de 1 à 4.
L’anticorps ou le fragment d’anticorps anti-CD30 selon l’invention peut être d’origine mammifère (ex. humain ou de souris), humanisé ou chimérique. Il s’agit de préférence d’un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement décrites dans l’art antérieur.
Lorsque A est un anticorps anti-CD30, il s’agit de préférence d’une IgG, par exemple IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
Dans un mode de réalisation particulier, A est une IgG1 dans laquelle CDR1 de la chaîne légère consiste en la séquence SED ID NO: 1, CDR2 de la chaîne légère consiste en la séquence en acides aminés « AAS » (soit les trois acides aminés Ala Ala Ser), CDR3 de la chaîne légère consiste en la séquence SED ID NO: 2, et dans lequel CDR1 de la chaîne lourde consiste en la séquence SED ID NO: 3, CDR2 de la chaîne lourde consiste en la séquence SED ID NO: 4, CDR3 de la chaîne lourde consiste en la séquence SED ID NO: 5.
Dans un mode de réalisation particulier, A est une IgG1 de séquence SEQ ID NO : 6 pour la chaine légère et de SEQ ID NO : 7 pour la chaine lourde. La chaîne lourde de séquence SEQ ID NO :7 peut également présenter une lysine additionnelle en position C terminal.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, A est le brentuximab. Brentuximab est un anticorps anti-CD30 chimérique de type IgG1 de séquence SEQ ID NO : 6 pour la chaine légère et SEQ ID NO : 7 pour la chaine lourde. Brentuximab vedotin est un ADC connu, notamment commercialisé par la société Seattle Genetics sous le nom Adcetris®.
Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l’invention a la formule suivante :
[Chem. 10]
Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l’invention a la formule (Ia) suivante :
[Chem. 11]
Le conjugué anticorps-médicament identifié dans les exemples sous la référence « MF-BTX-MMAE » correspond à un conjugué anticorps-médicament de formule (Ia).
Avantageusement, le conjugué anticorps-médicament selon l’invention est purifié (ou isolé) en mettant en œuvre des techniques de purification connues, telle que la purification sur colonne de chromatographie et / ou d’affinité.
Lorsque n est égal à 1, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR1 ». Lorsque n est égal à 2, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR2 ». Lorsque n est égal à 3, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR3 ». Lorsque n est égal à 4, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR4 ».
Composition
L’invention concerne également une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de formule (I) tel que défini ci-dessus. Il peut s’agir d’une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de formule (I) tel que défini ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La composition selon l’invention a la caractéristique d’être particulièrement homogène, ce qui peut se traduire par une meilleure stabilité et / ou efficacité de la composition, par rapport à une composition qui n’est pas homogène.
Avantageusement, lorsque A est un anticorps, par exemple brentuximab, la composition selon l’invention se caractérise par les caractéristiques suivantes :
a) au moins 50%, de préférence au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4 ;
b) le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4,5, de préférence compris entre 3,8 et 4,2, entre 3,9 et 4,1, entre 3,9 et 4, par exemple égal à 4 ± 0,1, par exemple égal à 3,99. Le DAR moyen est généralement déterminé par la méthode HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) ;
c) au moins 95%, de préférence au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% des conjugués anticorps-médicament sont présents sous forme de monomère. Le pourcentage de monomère est généralement déterminé par la méthode SEC (Size Exclusion Chromatography). La méthode SEC et la méthode HIC sont largement décrites dans la littérature. Il peut être cité par exemple la référence [3] pour la méthode SEC et la référence.[4] pour la méthode HIC ;
d) un ou plusieurs des ratios de n définis ci-après ; ou
e) une combinaison de deux, trois ou quatre caractéristiques choisies parmi a), b, c) et d).
Lorsque A est un anticorps, par exemple brentuximab, la composition selon l’invention peut se caractériser par des ratios de n ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, par exemple environ 0,7% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1,
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, par exemple environ 2%, des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 25%, moins de 20%, moins de 15%, par exemple environ 14,6% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, par exemple environ 62,6% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
Lorsque A est un anticorps, par exemple brentuximab, la composition selon l’invention peut également se caractériser par des ratios de n ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1%, entre 0% et 0,75%, entre 0,5% et 0,75% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1,
- entre 0% et 5%, entre 0% et 4%, entre 0% et 3%, entre 0% et 2%, entre 1% et 2% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 25%, entre 5% et 20%, entre 10% et 20%, entre 10% et 15% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 75%, entre 60% et 70%, entre 60% et 65%, des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
Les ratios de n sont généralement déterminés par la méthode HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography).
Lorsque A est un anticorps, la composition selon l’invention peut également comprendre des DAR0, c’est-à-dire des anticorps sans conjugué cytotoxique. De préférence, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,5%, moins de 0,4%, moins de 0,3%, moins de 0,2% de DAR0. Le pourcentage de DAR0 est généralement déterminé par la méthode HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography).
La composition selon l’invention peut également comprendre des DAR5, c’est-à-dire des conjugués anticorps-médicament ayant 5 conjugués cytotoxiques. De préférence, moins de 25%, moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5% de DAR5. La présence de DAR5 dans des compositions de conjugués anticorps-médicament est largement décrite dans la littérature, néanmoins la structure exacte des DAR5 est peu étudiée. Ainsi, le DAR moyen est calculé en tenant compte de l’ensemble des DARs présents dans la composition, c’est-à-dire les DAR0, les DAR1 (i.e. n=1), les DAR2 (i.e. n=2), les DAR3 (i.e. n=3), les DAR4 (i.e. n=4), les DAR5, etc. De préférence, lorsque A est un anticorps, la composition selon l’invention ne comprend pas de DAR supérieur à DAR5, par exemple DAR6, DAR7, etc. Les pourcentages de DAR5 et plus sont généralement déterminés par la méthode HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography). Dans un mode de réalisation très particulier, la composition selon l’invention présente le profil HIC de la Figure 1.
Utilisation thérapeutique
L’invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de formule (I) selon l’invention ou une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament de formule (I) selon l’invention pour utilisation comme médicament, par exemple pour utilisation dans le traitement d’un cancer CD30+, tel que les cancers du sang ou les lymphomes.
Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l’invention est de préférence formulé pour une administration parentérale, par exemple une administration intravasculaire (intraveineuse ou intra-artérielle), intrapéritonéale ou intramusculaire. Le terme « administré par voie parentérale », tel qu'utilisé ici, désigne des modes d'administration autres que l'administration entérale et topique, généralement par injection, et comprend, sans limitation, l’administration intravasculaire, intraveineuse, intramusculaire, intra-artérielle, intrathapsale, intracapsulaire, intraorbitaire, intratumorale, intracardiaque, intradermique, intra-péritonéale, par injection, perfusion transtrachéale, sous-cutanée, intra-articulaire, sous-capsulaire, sous-arachnoïdienne, intraspinale et intrasternale. L’administration par voie intraveineuse est préférée dans le cadre de la présente invention, par exemple par perfusion intraveineuse.
La dose de conjugué anticorps-médicament administrée à un sujet qui en a besoin variera en fonction de plusieurs facteurs, y compris, sans limitation, la voie d'administration, le type et la gravité de la pathologie traitée, l’état du patient, la corpulence du patient, l'âge du patient, etc. L'Homme du métier peut facilement déterminer, sur la base de ses connaissances dans ce domaine, la plage posologique requise en fonction de ces facteurs et d'autres. La dose appropriée peut également être déterminée avec des modèles animaux ou avec des essais cliniques. Par exemple, les doses typiques de conjugué anticorps-médicament selon l’invention peuvent être de 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg ou plus, par exemple 1,8 mg/kg. L’administration peut se faire en une seule fois ou, plus généralement, en plusieurs fois. Le schéma d’administration peut comprendre une dose de charge initiale puis des doses d’entretien, par exemple hebdomadaires, toutes les 2 semaines, toutes les trois semaines, tous les mois, ou plus. La durée de traitement peut varier selon la pathologie traitée et le sujet.
Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l’invention peut être utilisé en monothérapie ou en association avec des médicaments dont l’intérêt thérapeutique est reconnu dans la pathologie considérée. Il peut s’agir par exemple du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du cyclophosphamide, du prednisone, de la vinblastine, de la dacarbazine, de la gemcitabine, d’un inhibiteur de l'aromatase tel que l’anastrozole, ou d’un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu’un anti-PD1.
La description concerne également une méthode de traitement d’un cancer CD30+ chez un sujet comprenant l’administration au sujet d’une quantité thérapeutique efficace d’un conjugué anticorps-médicament de formule (I) selon l’invention ou d’une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament de formule (I) selon l’invention.
Procédé de préparation
La description concerne également un procédé de préparation anticorps-médicament de formule (I) tel que défini ci-dessus, dans lequel on fait réagir un conjugué cytotoxique tel que défini ci-dessus avec un anticorps ou un fragment d’anticorps anti-CD30.
Brève description des figures
représente le profil HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) d’une composition de conjugué anticorps-médicament selon l’invention. La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 62% de DAR4.
représente une analyse SEC (Size Exclusion Chromatography) d’une composition de conjugué anticorps-médicament selon l’invention. La figure montre que la composition est extrêmement homogène, avec plus de 98% de monomère.
représente la répartition des DAR de 3 bioconjugaisons indépendantes à l’échelle 1 mg. Cette figure montre la grande reproductibilité de la bioconjugaison.
représente la répartition des DAR de différentes bioconjugaisons à différentes échelles (échelles 250 µg, 500 µg, 850 µg et 1 mg). Cette figure montre la grande reproductibilité de la bioconjugaison à différentes échelles à une concentration fixée.
représente la reconnaissance de l’antigène CD30 par MF-BTX-MMAE, en comparaison avec l’ADC de référence (brentuximab vedotin) et un ADC de contrôle (ciblant l’antigène HER2).
représente la cytotoxicité in vitro de MF-BTX-MMAE, en comparaison avec l’ADC de référence (brentuximab vedotin).
représente l’évolution du DAR moyen en solution à 37 °C de MF-BTX-MMAE, par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin) mesurée par la méthode HIC en mesurant les aires sous les courbes (AUC). Cette figure montre la meilleure stabilité du conjugué anticorps-médicament selon l’invention par rapport à l’ADC de référence.
représente l’évolution du DAR moyen en solution en présence de HSA (Human Serum Albumin) à 37 °C de MF-BTX-MMAE, par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin) mesurée par la méthode HIC. Cette figure montre la meilleure stabilité du conjugué anticorps-médicament selon l’invention par rapport à l’ADC de référence.
représente l’évolution du DAR moyen en solution à 40 °C pendant 28 jours de MF-BTX-MMAE, par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin) mesurée par la méthode HIC.
représente l’évolution du pourcentage de DAR4 en solution à 40 °C pendant 28 jours de MF-BTX-MMAE, par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin) mesurée par la méthode HIC.
représente l’évolution du pourcentage de monomère en solution à 40 °C pendant 28 jours de MF-BTX-MMAE, par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin) mesurée par la méthode SEC.
représente l’évolution du volume tumoral (en moyenne +/- Standard error of mean (SEM) mm3) de souris traitées avec 0,5 mg/kg de MF-BTX-MMAE, 0,5 mg/kg de l’ADC de référence (brentuximab vedotin) ou un véhicule sans ADC.
représente le pourcentage de survie après injection (en jour) des souris traitées avec 0,5 mg/kg de MF-BTX-MMAE, 0,5 mg/kg de l’ADC de référence (brentuximab vedotin) ou d’un véhicule sans ADC. Cette figure montre la survie améliorée avec le conjugué anticorps-médicament selon l’invention par rapport à l’ADC de référence à une dose de 0,5 mg/kg.
représente l’évolution du volume tumoral (en moyenne +/- SEM mm3) de souris traitées avec 1 mg/kg de MF-BTX-MMAE, 1 mg/kg de l’ADC de référence (brentuximab vedotin) ou un véhicule sans ADC. Cette figure montre l’efficacité similaire de MF-BTX-MMAE par rapport à l’ADC de référence à la dose de 1 mg/kg.
représente le pourcentage de survie après injection (en jour) des souris traitées avec 1 mg/kg de MF-BTX-MMAE, 1 mg/kg de l’ADC de référence (brentuximab vedotin) ou d’un véhicule sans ADC. Cette figure montre l’efficacité similaire de MF-BTX-MMAE par rapport à l’ADC de référence à la dose de 1 mg/kg.
Exemples
Exemple 1  : s ynthèse d’un conjugué cytotoxique selon l’invention
Schéma réactionnel général
(a) BnOH, SOCl2, DCM, 18 h, 75 °C; (b) APS, MeOH, H2O, H2SO4, 1h, 50 °C; (c) H2, Pd/C, MeOH, 2h, TA; (d) HATU, 2,6-lutidine, DMF, H2N-(CH2)5-COOMe, 15h, 0 °C, puis TA; (e) PBr3, MeCN, 2h, 45 °C; (f) LiOH, THF, H20, 8,5h, TA; (g) EEDQ, DIPEA, DMF, MeCN, H2N-VCPABC-MMAE, 2h20, 25 °C.
Schéma réactionnel détaillé
Préparation de l’ i sonicotinate de benzyle (2)
(2)
L’acide isonicotinique (1)(5,00 g ; 40,614 mmol ; 1,0 eq) a été solubilisé dans le chlorure de thionyle (15 mL ; 206,77 mmol ; 5,1 eq) et chauffé à reflux pendant la nuit. Après retour à température ambiante, l’excès de chlorure de thionyle a été éliminé par évaporation sous pression réduite, puis le résidu obtenu a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (55 mL). L’alcool benzylique a été additionné (4,2 mL ; 40,614 mmol ; 1,0 eq) et le mélange a été agité à reflux pendant 10 h. Après retour à température ambiante, le milieu réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée d’hydrogénocarbonate de sodium et extrait avec du dichlorométhane (3x100 mL). Les phases organiques ont été rassemblées, lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit obtenu a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/acétate d’éthyle 50:50) pour donner( 2 ) (6,97 g ; 80%) sous la forme d’une huile incolore.
RMN1H (300 MHz, DMSO) δ 8,80 (dd ;J= 6,1 ; 1,6 Hz ; 2H1,5), 7,86 (dd ;J= 6,1 ; 1,6 Hz, 2H2,4), 7,56 – 7,29 (m ; 5H9-13), 5,39 (s ; 2H7).
RMN13C (75 MHz, DMSO) δ 165,0 (1C6) ; 151,3 (2C1,5) ; 137,2 (1C3) ; 136,1 (1C8) ; 129,0 (2C10,12) ; 128,8 (1C11) ; 128,6 (2C9,13) ; 123,0 (2C2,4) ; 67,4 (1C7).
SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C13H11NO2[M] : 213,0790 ; observée 213,0796.
Préparation de 2,6- b is( hydroxyméth yl ) isonicotinate de benzyle (3)
( 3 )
L’ isonicotinate de benzyle (2)(2,48 g ; 11,630 mmol ; 1,0 eq) a été solubilisé dans le méthanol (43 mL), agité à 50 °C et de l’acide sulfurique concentré (320 µL ; 6,016 mmol ; 0,52 eq) a été ajouté. Une solution de persulfate d’ammonium (26,500 g ; 116,000 mmol ; 10,0 eq) dans l’eau (43 mL) a été ajoutée en deux étapes : un premier ajout rapide de 30 gouttes, une suspension blanche se forme, puis en goutte à goutte rapide pendant 5 min. La réaction s’emballe jusqu’à 75 °C, puis la solution jaune obtenue a été agitée à 50 °C pendant 1 h supplémentaire. Après retour à température ambiante, le méthanol a été évaporé sous pression réduite. 50 mL d’acétate d’éthyle ont été ajoutés et le milieu a été neutralisé par ajout d’une solution saturée d’hydrogénocarbonate de sodium. La phase aqueuse a été extraite avec de l’acétate d’éthyle (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium, puis concentrées sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/méthanol, 95:5) pour donner( 3 ) (1,56 g ; 49%) sous la forme d’un solide beige.
RMN1H (300 MHz, DMSO) δ 7,81 (s; 2H2,4) ; 7,55 – 7,32 (m ; 5H9-13) ; 5,60 (t ;J= 5,9 Hz ; 2H15,17) ; 5,40 (s ; 2H7) ; 4,59 (d ;J= 5,9 Hz ; 4H14,16).
RMN13C (75 MHz, DMSO) δ 165,0 (1C6) ; 162,8 (2C1,5) ; 138,0 (1C3) ; 135,7 (1C8) ; 128,6 (2C10,12) ; 128,4 (1C11) ; 128,3 (2C9,13) ; 117,0 (2C2,4) ; 66,9 (1C7) ; 63,9 (2C14,16).
SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C15H15NO4[M] : 273,1001 ; observée 273,1001.
Préparation de l’acide 2,6-bis( hydroxyméthyl ) isonicotinique (4)
(4)
Le2,6-bis( hydroxyméthyl ) isonicotinate de benzyle (3)(1,33 g ; 4,867 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le méthanol (50 mL) et la solution a été dégazée avec de l’argon pendant 15 min. Du palladium sur charbon 10% wt (133 mg) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante sous atmosphère d’hydrogène pendant 2 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur dicalite (rinçage méthanol). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner(4)(849 mg ; 95%) sous la forme d’un solide beige.
RMN1H (300 MHz, DMSO) δ 7,78 (s ; 2H2,4) ; 5,54 (s large ; 2H9,11) ; 4,59 (s ; 4H8,10).
RMN13C (75 MHz, DMSO) δ 166,7 (1C6) ; 162,5 (2C1,5) ; 139,4 (1C3) ; 117,3 (2C2,4) ; 64,0 (2C8,10).
SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C8H9NO4[M] : 183,0532 ; observée 183,0526.
Préparation du 6-((2,6- b is( hydroxyméthyl )pyridin-4-y l) amidohexanoate de méthyle (5)
(5)
L’acide 2,6- bis( hydroxyméthyl ) isonicotinique (4)(50 mg ; 0,273 mmol ; 1 eq) a été dissous dans leN,N-diméthylformamide anhydre (3,0 mL), la solution a été refroidie à 0 °C, puis le HATU (156 mg ; 0,410 mmol ; 1,5 eq) et la 2,6-lutidine (147,0 µL ; 1,260 mmol ; 4,7 eq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée à 0 °C pendant 15 min puis le 6-aminohexanoate de méthyle (59 mg ; 0,322 mmol ; 1,2 eq) a été ajouté. Les parois du ballon ont été rincées avec 2 mL deN ,N -diméthylformamide anhydre et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 h. Le mélange réactionnel a été dilué dans l’acétate d’éthyle, lavé à trois reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner(5)(76 mg ; 91%) sous la forme d’un solide blanc cassé.
RMN1H (300 MHz, DMSO) δ 8,79 (t ;J= 5,6 Hz ; 1H7) ; 7,71 (s ; 2H2,4) ; 5,50 (t ;J= 5,8 Hz ; 2H16,18) ; 4,57 (d ;J= 5,8 Hz ; 4H15,17) ; 3,57 (s ; 3H14) ; 3,25 (m ; 2H8) ; 2,30 (t ;J= 7,4 Hz ; 2H12) ; 1,62 – 1,45 (m ; 4H9,11) ; 1,37 – 1,21 (m ; 2H10).
RMN13C (75 MHz, DMSO) δ 173,3 (1C13) ; 165,1 (1C6) ; 161,8 (21,5) ; 142,9 (1C3) ; 115,8 (2C2,4) ; 64,1 (2C15,17) ; 51,2 (1C14) ; 38,5 sous le DMSO (1C8) ; 33,2 (1C12) ; 28,6 (1C9) ; 25,9 (1C11) ; 24,2 (1C10).
SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C15H22N2O5 [M] : 310,1529 ; observée 310,1526.
Préparation du 6-(2,6- b is( bromométhyl )pyridin-4-y l) amidohexanoate de méthyle (6)
(6)
Le6-((2,6- b is( hydroxyméthyl )pyridin-4-yl) amidohexanoate de méthyle (5)(55 mg ; 0,177 mmol ; 1 eq) a été mis en suspension dans l’acétonitrile anhydre (10,5 mL) puis le tribromure de phosphore (50 µL ; 0,532 mmol ; 3,0 eq) a été ajouté goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à 45 °C pendant 2 h. La solution a été refroidie à 0 °C, neutralisée avec de l’eau (10 mL) et extraite à l’acétate d’éthyle (3x15 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/acétate d’éthyle 60:40) pour donner( 6 ) (57 mg ; 74%) sous la forme d’un solide blanc.
RMN1H (300 MHz ; DMSO) δ 8,83 (t,J= 5,6 Hz ;1H7) ; 7,84 (s ; 2H2,4) ; 4,74 (s ; 4H15,16) ; 3,57 (s, 3H14) ; 3,31 – 3,20 (m ; 2H8) ; 2,31 (t ;J= 7,4 Hz ; 2H12) ; 1,64 – 1,45 (m ; 4H9,11) ; 1,39 – 1,22 (m, 2H10).
RMN13C (75 MHz, DMSO) δ 173,3 (1C13) ; 163,8 (1C6) ; 157,5 (2C1,5) ; 144,2 (1C3) ; 120,8 (2C2,4) ; 51,2 (1C14) ; 38,9 sous le DMSO (1C8) ; 34,1 (2C15,16) ; 33,2 (1C12) ; 28,5 (1C9) ; 25,9 (1C11) ; 24,2 (1C10).
SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C15H20Br2N2O3[M] : 433,9841 ; observée 433,9832.
Préparation de l’acide 6-(2,6- bis( bromométhyl )p yridin-4-yl) amidohexanoïque (7)
(7)
Le6-(2,6- bis( bromométhyl )pyridin-4-yl) amidohexanoate de méthyle (6)(57 mg ; 0,131 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane (4 mL) et une solution d’hydroxyde de lithium hydraté (8 mg ; 0,327 mmol ; 2,5 eq) dans l’eau (4 mL) a été ajoutée doucement. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 8,5 h. Le tétrahydrofurane a été évaporé sous pression réduite et le résidu aqueux a été traité avec une solution aqueuse d’acide chlorhydrique 1N et extrait avec de l’acétate d’éthyle (3x10 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner(7)(44 mg ; 80%) sous la forme d’un solide blanc.
RMN1H (300 MHz ; DMSO) δ 12,00 (s ; 1H14) ; 8,83 (t ;J= 5,5 Hz ; 1H7) ; 7,84 (s ; 2H2,4) ; 4,74 (s ; 4H15,17) ; 3,31 – 3,21 (m ; 2H8) ; 2,21 (t ;J= 7,3 Hz ; 2H12) ; 1,60 – 1,46 (m ; 4H9,11) ; 1,39 – 1,25 (m ; 2H10).
RMN13C (75 MHz ; DMSO) δ 174,4 (1C13) ; 163,8 (1C6) ; 157,5 (2C1,5) ; 144,1 (1C3) ; 120,8 (2C2,4) ; 39,0 sous le DMSO (1C8) ; 34 ,1 (2C15,16) ; 33,6 (1C12) ; 28,6 (1C9) ; 26,0 (1C11) ; 24,2 (1C10).
SMHR (ESI) :m/zcalculée pour C14H19Br2N2O3[M+H]+ : 420,9757 ; observée 420,9752.
Préparation de 6-(2,6- bis( bromométhyl)pyridin-4-yl)amido- N -hexanamide-valine-citrulline- p -amin obenzoyle carbamate de MMAE (8)
(8)
Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 6-(2,6- bis( bromométhyl )pyridin-4-yl) amidohexanoïque (7)(13,2 mg ; 0,0313 mmol ; 2,28 eq) a été dissous dans l’acétonitrile anhydre (1,2 mL) puis laN-éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ) (21,2 mg ; 0,0857 mmol ; 6,25 eq) a été ajouté. Le milieu d’activation a été agité à 25 °C pendant 1 h 20. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (17,0 mg ; 0,0137 mmol ; 1,0 eq), solubilisé dans duN,N-diméthylformamide anhydre (300 µL) en présence deN,N-diisopropyléthylamine (9,4 µL ; 0,0537 mmol ; 3,92 eq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été dilué par 2 avec duN,N-diméthylformamide et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR= 22,1 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1 % d’acide trifluoroacétique (en volume) dans l’eau (solvant A), et de l’acétonitrile (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner( 8)(18,2 mg ; 87%) sous la forme d’un solide blanc.
RMN1H (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 10,04 – 9,95 (m ; 1H) ; 8,94 – 8,79 (m ; 1H) ; 8,20 – 8,06 (m ; 2H) ; 7,98 – 7,87 (m ; 1H) ; 7,84 (s ; 2H) ; 7,81 (s ; 1H) ; 7,70 – 7,61 (m ; 1H); 7,58 (d ;J= 8,2 Hz ; 2H) ; 7,38 – 7,11 (m ; 6H) ; 6,07 – 5,92 (m ; 1H) ; 5,47 – 5,37 (m ; 1H) ; 5,15 – 4,96 (m ; 1H) ; 4,73 (s ; 4H) ; 4,54 – 4,29 (m ; 2H) ; 4,32 – 4,12 (m ; 1H) ; 4,05 – 3,92 (m ; 1H) ; 3,30 – 3,08 (m ; 9H) ; 3,06 – 2,93 (m ; 2H) ; 2,91 – 2,77 (m ; 2H) ; 2,24 – 2,05 (m ; 2H) ; 2,21 – 2,11 (m ; 3H) ; 2,02 – 1,88 (m ; 1H) ; 1,60 – 1,44 (m ; 5H) ; 1,36 – 1,13 (m ; 4H) ; 1,08 – 0,93 (m ; 6H) ; 0,93 – 0,67 (m ; 28H).
SMHR (ESI) :m/zcalculée pour C72H111Br2N12O14[M+H]+ : 1525,6704 ; observée 1525,6700.
Exemple 2  : synthèse d’un conjugué anticorps-médicament selon l’invention
Code du produit synthétisé: MF-BTX-MMAE (correspondant à la formule (Ia), également appelé ci-après « conjugué anticorps-médicament selon l’invention » ou de manière générale « ADC »).
Anticorps utilisé : brentuximab (aussi appelé cAC10).
Préparation des solutions
Tampon de bioconjugaison : Tampon salin 1X, par exemple phosphate, borate, acétate, glycine, tris(hydroxymethyl)aminomethane, acide 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic dans une plage de pH comprise entre 6 et 9, avec une concentration finale en NaCl comprise entre 50 et 300 mM et une concentration finale en EDTA comprise entre 0,1 et 10 mM.
Brentuximab à une concentration comprise entre 1 et 10 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison.
Réducteur : Solution d’un réducteur choisi parmi le dithiotréitol, le β-mercaptoéthanol, l’hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine, la tris(hydroxypropryl)phosphine à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans le tampon de bioconjugaison.
Solution de linker : conjugué cytotoxique( 8 )à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans un mélange de solvants organiques choisis parmi le diméthylsulfoxide, leN ,N-diméthylformamide, le méthanol, le tétrahydrofurane, l’actéonitrile, leN,N-diméthylacétamide, le dioxane.
Réaction de bioconjugaison
Sous atmosphère inerte, au brentuximab dans le tampon bioconjugaison (1mg ; 1 éq) a été ajouté le réducteur (4 à 100 éq) et le milieu réactionnel a été incubé entre 15 et 40 °C pendant 0,25 à 3 h puis la solution de linker (4 à 100 éq) a été ajoutée sous atmosphère inerte et le milieu réactionnel a été agité entre 15 et 40 °C pendant 0,5 à 15 h. Cette réaction a été dupliquée, en parallèle, autant de fois que nécessaire pour obtenir la quantité d’ADC final souhaitée,i.e.quatre fois.
Purification de l’ADC
Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco pH 7,4 le nombre de fois nécessaire pour éliminer les réactifs chimiques résiduels, i.e. purifié 2 fois.
Résultat
Les étapes décrites ci-dessus ont permis d’obtenir 2,6 mg de MF-BTX-MMAE (65%).
Exemple 3  : analyses du conjugué anticorps-médicament (MF-BTX-MMAE)
Analyse HIC ( Hydrophobic Interaction Chromatography )
Matériel et méthode
L’ADC MF-BTX-MMAE a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d’être filtré sur 0,22 µm. 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 µm, 4,6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. L’ADC MF-BTX-MMAE a été élué à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu’à 85% de tampon B en 30 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 1 min. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
Les résultats sont présentés à la Figure 1 et dans le Tableau 1 ci-dessous.
MF-BTX-MMAE DAR 0 DAR 1 DAR 2 DAR 3 DAR 4 DAR 5
Temps de rétention (min) 5,61 8,34 12,24 16,68 20,15 24,76
Aire (%) 0,13 0,68 1,95 14,64 62,62 19,97
DAR moyen 3,99
Analyse SEC (Size Exclusion Chromatography )
Matériel et méthode
L’ADC MF-BTX-MMAE a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d’être filtré sur 0,22 µm. 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 µm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm. L’ADC MF-BTX-MMAE a été élué à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d’azoture de sodium, pH 7,0) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
Les résultats sont présentés à la Figure 2 et dans le Tableau 2 ci-dessous.
MF-BTX-MMAE Agrégats solubles Agrégats solubles Oligomères Monomères
Temps de rétention (min) 2,71 5,06 5,59 6,44
Aire (%) 0,05 0,41 0,99 98,54
Reproductibilité
Les résultats de reproductibilité sont présentés à la Figure 3 (reproductibilité sur 3 bioconjugaisons indépendantes à une échelle de 1 mg, analyse par HIC) et à la Figure 4 (reproductibilité sur différentes échelles sur 250 µg, 500 µg, 850 µg et 1 mg, à une même concentration de MF-BTX-MMAE, analyse par HIC).
Conclusion : la bioconjugaison est parfaitement reproductible sur une même échelle et sur différentes échelles.
Exemple 4  : évaluation in vitro du conjugué anticorps-médicament ( MF-BTX-MMAE )
Liaison à l’antigène CD30 : reconnaissance de l’antigène CD30 sur une lignée positive (Karpas-299) avec l’ADC MF-BTX-MMAE en comparaison avec un ADC de référence décrit dans l’art antérieur, appelé brentuximab vedotin (commercialisé sous le nom commercial Adcetris®) et avec un ADC contrôle négatif ciblant l’antigène HER2 (ADC comprenant l’anticorps trastuzumab référencé MF-TTZ-MMAE).
Matériel et méthode
Les cellules ont été obtenues de DSMZ (Karpas-299). Les cellules ont été cultivées en suspension dans du milieu de culture (RPMI 1640 supplémenté avec 20% de SVF) à 37 °C, dans une atmosphère humide (5% de CO2, 95% air). Les cellules sont comptées et leur viabilité est vérifiée avec un test au bleu de trypan 0,25%.
Ensuite, les cellules ont été lavées avec du tampon FCM (DPBS contenant 0,2% de BSA et 0,02% d’azoture de sodium) et incubées en duplicats pendant 1 h à 0 °C avec du PBS, 10 µg/mL de MF-BTX-MMAE, 10 µg/mL de brentuximab vedotin ou 10 µg/mL de MF-TTZ-MMAE. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du tampon FCM, resuspendues dans 50 µL de tampon FCM contenant l’anticorps secondaire (Fab chèvre anti-IgG humaine Fc-PE) et incubées 1 h à 0 °C. Les cellules ont été lavées de nouveau avec du tampon FCM et resuspendues dans 800 µL de tampon FCM, avant d’être analysées par cytométrie en flux (BD FACSCalibur équipé avec un laser d’excitation à 488 nm). L’acquisition a été conduite, pour chaque échantillon, jusqu’à enregistrement de 10000 évènements ou pour au maximum 2 minutes.
Résultats
Les résultats, présentés à la Figure 5, montrent que la reconnaissance de CD30 par MF-BTX-MMAE est similaire à la reconnaissance de CD30 par l’ADC de référence (brentuximab vedotin). L’ADC contrôle négatif (anti-HER2) ne reconnait pas l’antigène CD30.
Cytotoxicité (MTS assay ) : effet cytotoxique de MF-BTX-MMAE sur une lignée positive (Karpas-299) comparé à l’ADC de référence (brentuximab vedotin).
Matériel et méthode
Les cellules ont été cultivées à densité optimale dans des plaques 96-puits (ref 167008, Nunc, Dutscher, Brumath, France) et incubées dans 190 µL de milieu de culture (RPMI 1640 supplémenté avec 20% de SVF) à 37 °C dans une atmosphère humide (5% de CO2, 95% air) pendant 6 h avant le début du traitement. Les ADC testés ont été ajoutés (10 µL) aux concentrations finales suivantes : 0,3 ; 1 ; 3 ; 10 ; 30 ; 100 ; 300 ; 1000 ; 3000 ng/mL ; et incubés pendant 96 h à 37 °C dans une atmosphère 5% de CO2.
La viabilité cellulaire a été déterminée par test MTS par ajout de 40 µL d’une solution stérile de MTS (20 mL à 2 mg/mL ; ref: G1111, Promega, Charbonnières, France) et de PMS (1 mL à 0,92 mg/mL ; ref: P9625, Sigma) dans du tampon DPBS (ref: 17 513F, Cambrex ). L’absorbance est mesurée à 490 nm avec un lecteur de plaque Envision multilabeled counter (PerkinElmer, Courtaboeuf, France). Chaque échantillon de la gamme de concentration de composé a été réalisé en tripliqua et deux expériences indépendantes ont été conduites.
R ésultats
Les résultats, présentés à la Figure 6, montrent un effet cytotoxique similaire du MF-BTX-MMAE par rapport l’ADC de référence, le brentuximab vedotin.
Exemple 5  : stabilité de la bio conjugaison
Stabilité à 37 °C en présence ou non de HSA (Albumine sérique humaine)
Matériel et méthode
La concentration de MF-BTX-MMAE et de l’ADC de référence brentuximab vedotin, dans un tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’azoture de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 2 mg/mL. Douze (12) échantillons de 20 µL de MF-BTX-MMAE et de l’ADC de référence brentuximab vedotin ont été déposés dans douze flacons en polyproprylène (fisher scientific, 0,6 mL) puis 20 µL de tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’azoture de sodium, pH 7,4) ou 20 µL d’une solution de HSA (Sigma Aldrich) à 20 mg/mL dans le tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’azoture de sodium, pH 7,4) a été ajouté à chaque flacon. Après agitation, chacun des 12 flacons est centrifugé 30 secondes à 5000 g avant incubation à 37 °C dans un incubateur (VWR INCU-line IL23). Les flacons ont été retirés trois par trois de l’incubateur conservés à -80 °C après 1 minute (T0), 24 h, 48 h et 120 h.
Après dilution par un facteur 2 avec du tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’azoture de sodium, pH 7,4), le contenu de chacun des 12 flacons est filtré sur 0,22 µm et analysé par HIC. Pour MF-BTX-MMAE, 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 µm, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 100% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 50 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
Pour l’ADC de référence, brentuximab vedotin, 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 µm, 4,6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, pH 7,0) jusqu’à 80% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) dans le tampon A en 60 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min. La température a été maintenue à 30 °C tout au long de la séparation.
Résultats
Le suivi de l’évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 37 °C est présenté à la Figure 7. Les résultats montrent une parfaite stabilité à 37 °C de MF-BTX-MMAE, ce qui n’est pas le cas pour l’ADC de référence, brentuximab vedotin. Cela s’explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l’invention.
Le suivi de l’évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation avec un excès de HSA à 37 °C est présenté à la Figure 8. Les résultats montrent une parfaite stabilité en présence de HSA de MF-BTX-MMAE, ce qui n’est pas le cas pour l’ADC de référence, brentuximab vedotin. Cela s’explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l’invention.
Stabilité à 40 °C
Matériel et méthode
La concentration de MF-BTX-MMAE et de l’ADC de référence, brentuximab vedotin, dans un tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 1 mg/mL. Six (6) échantillons de 150 µL de MF-BTX-MMAE et de l’ADC de référence, brentuximab vedotin, ont été déposés dans six flacons en polyproprylène (Eppendorf Protein LoBind, 0,5 mL). Après agitation, les échantillons sont incubés dans un incubateur (VWR INCU-line IL23) à 40 °C. Les flacons ont été retirés trois par trois de l’incubateur, centrifugé 2 minutes à 5000 g et conservés à -80 °C après 1 minutes et 4 semaines.
Le contenu de chacun des 6 flacons est filtré sur 0,22 µm et analysé par HIC et SEC.
HIC
Pour MF-BTX-MMAE, 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 µm, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 20% de tampon de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu’à 85% de tampon B dans le tampon A en 30 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
Pour l’ADC de référence, brentuximab vedotin, 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 µm, 4,6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, pH 7,0) jusqu’à 80% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) dans le tampon A en 45 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min. La température a été maintenue à 30 °C tout au long de la séparation.
SEC
50 µg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 µm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm. L’ADC MF-BTX-MMAE été élué à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d’azoture de sodium, pH 7,4) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
Résultats
Le suivi de l’évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté à la Figure 9 (N=2). Les résultats montrent que le DAR moyen de brentuximab vedotin varie de 3,47 (à t0) à 2,32 (à t28) attestant d’un manque de stabilité dans les conditions stressantes simulées alors que celui de MF-BTX-MMAE varie peu (3,99 (à t0) à 3,94 (à t28)) démontrant sa stabilité améliorée par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin).
Le suivi de l’évolution du pourcentage de DAR4 par la méthode HIC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté à la Figure 10 (N=2). Les résultats montrent que le pourcentage de DAR4 diminue au cours du temps pour brentuximab vedotin (36 % à t0 contre 19% à t28) alors que celui de MF-BTX-MMAE varie peu (62% à t0 contre 60% à t28). Cela démontre la stabilité accrue et la meilleure conservation du pourcentage de DAR4 de MF-BTX-MMAE par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin).
Le suivi de l’évolution du pourcentage de monomère par la méthode SEC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté à la Figure 11 (N=2). Les résultats montrent que le pourcentage de monomère diminue davantage pour brentuximab vedotin (<80% à t28) que pour MF-BTX-MMAE (>84% à t28). Cela démontre la stabilité accrue de MF-BTX-MMAE par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin).
Exemple 6   : évaluation in vivo du conjugué anticorps-médicament ( MF-BTX-MMAE )
Matériel et méthode
Toutes les expériences ont été conduites dans un environnement conforme aux recommandations des autorités françaises (Agrément N° A 91 962 106). L’étude de survie a été réalisée sur un modèle de xénogreffe Karpas-299 (DSMZ). Une suspension de cellules tumorales a été implantées en sous-cutanée dans des souris immunodéprimées CB17-SCID (Charles River) 72 h après une irradiation complète avec une source γ (1,44 Gy, 60Co, BioMep, Bretenières, France). Après prise du greffon tumoral, les souris ont été randomisées en groupes (N=5) une fois le volume moyen ayant atteint 100-200 mm3. Les ADCs (MF-BTX-MMAE ou l’ADC de référence brentuximab vedotin) ou un véhicule (PBS à pH 7,4) ont été administrés au jour 1 par voie intraveineuse (IV, bolus) dans la veine caudale des souris à 1 ou 0,5 mg/kg. Le volume tumoral en fonction du temps a été calculé deux fois par semaine en utilisant la formule suivante : (Longueur x épaisseur²)/2. Les animaux ont été euthanasiés quand les volumes tumoraux ont atteint 10% de leur poids, soit approximativement 2000 mm3.
La survie des souris a été mesurée en pourcentage en fonction des jours après injection du MF-BTX-MMAE, de l’ADC de référence brentuximab vedotin ou du véhicule (contrôle négatif).
Résultats
Les résultats de l’administration d’une dose de 0,5 mg/kg sont présentés à la Figure 12 et à la Figure 13. Les résultats de l’administration d’une dose de 1 mg/kg sont présentés à la Figure 14 et à la Figure 15. Les résultats montrent qu’à la dose de 0,5 mg/kg, MF-BTX-MMAE est plus efficace que l’ADC de référence (brentuximab vedotin). En particulier, la survie du groupe traité par MF-BTX-MMAE est améliorée par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin). A 1 mg/kg, MF-BTX-MMAE et l’ADC de référence brentuximab vedotin permettent une régression tumorale complète chez l’ensemble des animaux (N=8).
Listage de séquences
Numéro de séquence Type de séquences Séquence en acides aminés
SEQ ID NO : 1 CDR1 de la chaîne légère du brentuximab QSVDFDGDSY
SEQ ID NO : 2 CDR3 de la chaîne légère du brentuximab QQSNEDPWT
SEQ ID NO : 3 CDR1 de la chaîne lourde du brentuximab GYTFTDYY
SEQ ID NO : 4 CDR2 de la chaîne lourde du brentuximab IYPGSGNT
SEQ ID NO : 5 CDR3 de la chaîne lourde du brentuximab ANYGNYWFAY
SEQ ID NO : 6 Chaine légère du brentuximab DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO : 7 Chaine lourde du brentuximab QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Références citées sous le format « [numéro de référence] » :
1.Peter D Senter et Eric L Sievers,Nature B iotechnology, 30(7), 631-637, 2012
2.Pabstet al.,Journal of Controlled Release, 253, 160-164, 2017
3.Goyon, Aet al.,J. Chromatogr . B ,1065–1066, 35-43, 2017
4.Fekete, S.et al.,J. Pharm. Biomed . Anal. ,130, 3–18, 2016

Claims (13)

  1. Conjugué anticorps-médicament de formule (I) suivante :
    [Chem. 1]
    dans laquelle :
    A est un anticorps ou un fragment d’anticorps anti-CD30 ;
    la tête d’accroche est représentée par la formule suivante :
    [Chem. 2]
    ;
    le bras de liaison est un bras de liaison clivable représenté par la formule suivante :
    [Chem. 3]
    ou
    [Chem. 4]
    ;
    l’espaceur est représenté par la formule suivante :
    [Chem. 5]
     ;
    m est un entier allant de 1 à 10 ;
    n est un entier allant de 1 à 4.
  2. Conjugué anticorps-médicament selon la revendication 1, dans lequel m est égal à 5.
  3. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calicheamicine, monométhylauristatine E (MMAE), monométhylauristatine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE.
  4. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 de formule suivante :
    [Chem. 10]
  5. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel A est Brentuximab.
  6. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 de formule (Ia) suivante :
    [Chem. 11]
  7. Composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 6.
  8. Composition selon la revendication 7, dans laquelle au moins 50%, de préférence au moins 60%, des conjugués anticorps-médicament ont un n égal à 4.
  9. Composition selon l’une quelconque des revendications 7 ou 8, dans laquelle A est un anticorps et le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4,5, de préférence compris entre 3,8 et 4,2, par exemple égal à 4 ±0,1.
  10. Composition selon l’une quelconque des revendications 7 à 9, comprenant en outre du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du cyclophosphamide, du prednisone, de la vinblastine, de la dacarbazine, de la gemcitabine, d’un inhibiteur de l'aromatase tel que l’anastrozole et / ou un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu’un anti-PD1.
  11. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ou composition selon l’une quelconque des revendications 7 à 10, pour utilisation comme médicament.
  12. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ou composition selon l’une quelconque des revendications 7 à 10, pour utilisation dans le traitement d’un cancer CD30+, de préférence les cancers du sang ou les lymphomes.
  13. Conjugué anticorps-médicament pour utilisation selon la revendication 12, dans lequel le cancer CD30+ est choisi parmi le lymphome de Hodgkin, le lymphome anaplasique à larges cellules et le lymphome T périphérique.
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