WO2023135398A1 - Conjugues anticorps-medicament pour utilisation therapeutique - Google Patents

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WO2023135398A1
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cancer
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Ludovic S. JUEN
Estelle R. HUET
Christine BALTUS
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Mc Saf
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Definitions

  • the present invention relates to antibody-drug conjugates (“Antibody Drug Conjugate” or “ADC”) for use as a medicament, in particular for use in the treatment of cancer.
  • ADC antibody-drug conjugates
  • antibody-drug conjugates in English “Antibody Drug Conjugate” or “ADC”), these conjugates potentially representing an alternative or a complement to “conventional” therapies to deliver in a targets an active ingredient, in particular a cytotoxic drug.
  • ADC Antibody Drug Conjugate
  • the antibody-drug conjugate therefore makes it possible to combine the specificity of the targeting by the antibodies with new powerful effector functions by the agents which are conjugated to them.
  • an antibody-drug conjugate typically consists of an antibody bound to the drug by a molecule one part of which will bind the antibody and another part will couple to the drug, usually via a spacer arm (or linker) of variable length and nature.
  • the antibody After binding to its target antigen, the antibody is most often internalized in the cell by receptor-mediated endocytosis.
  • the vesicles fuse with lysosomes where the drug is released from the antibody via different mechanisms.
  • the active drug then acts directly on the cell by inducing its death and sometimes on neighboring cancer cells by transport or diffusion in the environment.
  • the antibody is therefore mainly used as a vector and brings the drug to the targeted cell.
  • Antibody-drug conjugates are described in application WO 2015/004400. Furthermore, application WO 2022/018371 describes attachment heads which make it possible to obtain compounds which, when conjugated to proteins, in particular antibodies, make it possible to obtain a "structure" such that on average, the number of conjugated hook heads per protein (antibody) is controlled: the main conjugate referred to carries either 1 molecule per protein (antibody) or 2 molecules per protein (antibody). Summary of the invention
  • the present invention relates to a conjugate of formula (I) for use as a medicament: in which :
  • - Ac is an antibody or an antibody fragment
  • the present invention also relates to a conjugate of formula (I) for use in a method of treating cancer.
  • antibody also called “immunoglobulin” refers to a heterotetramer consisting of two heavy chains of approximately 50-70 kDa each (say the H chains for Heavy) and two light chains of about 25 kDa each (say the chains L for Light), linked together by intercatenary disulphide bridges.
  • Each chain is made up, in the N-terminal position, of a region or variable domain, called VL for the light chain, VH for the heavy chain, and in the C-terminal position, of a constant region, made up of a single domain called CL for the light chain and three or four domains called CHI, CH 2 , CH3, CH4, for the heavy chain.
  • antibody fragment means any part of an immunoglobulin obtained by enzymatic digestion or obtained by bioproduction comprising at least two disulphide bridges, for example Fab′, F(ab′) 2 , or scFv-Fc.
  • the terms "Fab'", “F(ab') 2 " and “scFv-Fc” denote antibody fragments which retain the ability of said antibody to bind an antigen.
  • the F(ab') 2 fragment is obtained by enzymatic digestion of immunoglobulins with pepsin or with IdeS.
  • F(ab') 2 is formed of two Fab' fragments linked by interchain disulphide bridges.
  • the Fab' fragment is made up of the Fab region (made up of the variable regions and the CH1 and CL domains) and a hinge region.
  • the scFv-Fc fragment is a protein-engineered fragment consisting of the scFv fragment (single chain Fragment variable) and linked to an Fc fragment.
  • the scFv fragment consists only of VH and VL variable domains with a structure stabilized by a short flexible peptide arm, called a linker, which is placed between the two domains.
  • a “pharmaceutically acceptable” means approved by a federal or state regulatory agency or listed in the United States or European Pharmacopoeia, or other generally recognized pharmacopoeia, and applies to a product intended for use in animals and/or or in humans.
  • a “pharmaceutical composition” means a composition comprising a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic agent is administered.
  • These vehicles can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil , sesame oil, etc. Water is a preferred vehicle when the pharmaceutical composition is administered intravenously.
  • Saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid vehicles, especially for injection solutions.
  • Pharmaceutically acceptable excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerol, propylene glycol, l water, ethanol and the like.
  • the tablets or capsules can be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable excipients such as binding agents (for example pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose); fillers (eg lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate); lubricants (eg, magnesium stearate, talc or silica); disintegrants (eg potato starch or sodium starch glycolate); or wetting agents (eg, sodium lauryl sulfate).
  • binding agents for example pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose
  • fillers eg lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate
  • lubricants eg, magnesium stearate, talc or silica
  • disintegrants eg potato starch or sodium starch glycolate
  • wetting agents eg, sodium lauryl sulfate
  • Liquid preparations for oral administration may take the form of, for example, solutions, syrups or suspensions, or may be presented as a dry product to be reconstituted with water or another suitable vehicle before use.
  • Such liquid preparations can be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable vehicles such as suspending agents (eg sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); emulsifying agents (for example, lecithin or acacia); non-aqueous vehicles (eg almond oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils); and preservatives (eg methyl or propyl p-hydroxybenzoates or sorbic acid).
  • the pharmaceutical compositions may also contain buffering salts, flavorings, colorings and sweeteners, as appropriate.
  • the composition according to the invention is preferably a pharmaceutical composition.
  • treating encompasses any beneficial or desirable effect on a disease or disease state, and may even include minimal reduction of one or more measurable markers of the disease or disease state.
  • the treatment may, for example, involve either reducing or ameliorating the symptoms of the disease or disease state, or delaying the progression of the disease or disease state.
  • treatment does not necessarily mean the complete eradication or cure of the pathology, nor of the associated symptoms.
  • Figure 1A depicts performance evaluation of representative conjugates of the invention, compared to controls, on a HER2 positive breast cancer cell line (BT-474).
  • Figure 1B shows the performance evaluation of representative conjugates of the invention, compared to controls, on a HER2 negative breast cancer cell line (MCF-7).
  • Figure 2A depicts performance evaluation of representative conjugates of the invention, compared to controls, on a HER2 positive breast cancer cell line (BT-474).
  • Figure 2B depicts performance evaluation of representative conjugates of the invention, compared to controls, on a HER2 negative breast cancer cell line (MCF-7).
  • Figure 3A depicts performance evaluation of a representative conjugate of the invention, compared to controls, on a HER2 positive breast cancer cell line (BT-474).
  • Figure 3B shows the performance evaluation of a representative conjugate of the invention, compared to controls, on a HER2 negative breast cancer cell line (MCF-7).
  • Figure 4A depicts performance evaluation of representative conjugates of the invention, compared to controls, on a HER2 positive breast cancer cell line (SK-BR-3).
  • Figure 4B depicts performance evaluation of representative conjugates of the invention, compared to controls, on a HER2 negative breast cancer cell line (MCF-7).
  • Figure 5A depicts performance evaluation of representative conjugates of the invention, compared to controls, on a CD56 positive (WaGa) Merkel cell carcinoma cell line.
  • Figure 5B depicts performance evaluation of representative conjugates of the invention, compared to controls, on a CD56 positive (PeTa) Merkel cell carcinoma cell line.
  • FIG. 6A represents the storage stability, followed by the evolution of the mean DAR over time, of representative conjugates of the invention.
  • FIG. 6B represents the storage stability, followed by the evolution of the monomeric purity over time, of representative conjugates of the invention.
  • FIG. 7A represents the thermal stability, followed by the evolution of the mean DAR over time, of representative conjugates of the invention.
  • FIG. 7B represents the thermal stability, followed by the evolution of the monomeric purity over time, of representative conjugates of the invention.
  • FIG. 8 represents the thermal stability in the presence of HSA, followed by the evolution of the mean DAR over time, of representative conjugates of the invention.
  • FIG. 9A represents the kinetics of recognition of the HER2 antigen by TTZ and compounds 41 and 42.
  • FIG. 9B represents the kinetics of recognition of the HER2 antigen by TTZ and compounds 50 and 52.
  • the invention relates to a conjugate of formula (I) for use as a medicament: in which: a) Ac is an antibody or an antibody fragment; b) u is such that 0.5 ⁇ u ⁇ 3.5; c) the grip head is a compound of formula (II) or (II'): in which :
  • - W is -OR a , -COR 2 , -CONR3R4 or -NR3COR4;
  • R a is -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -R 5 , -(CR c R d ) r -R 5 , -COR b , -(CR c R d ) r -NHCO- (CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -R 5 , -(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -R 5 , -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-(CR c R d ) r -R 5 or -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -CONH-(CR c R d ) r -R 5 ;
  • R b is -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -R 5 , -O(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -R 5 , -(CR c R d ) r -R 5 ,
  • R 2 is -OH, -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -R 5 , -(CR c R d ) r -R 5 , -O(CH 2 CH 2 O) q -( CH 2 ) r -R 5 , -O(CR c R d ) r -R 5 , -O(CR c R d ) r -NHCO-(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -R 5 , -O(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -R 5 , O(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-( CR c R d ) r -R 5 or -O(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -CONH-(CH
  • R 3 is -H, -(Ci-C 6 )alkyl or -(CH 2 ) V -SO 3 H, preferably R 3 is -H or -(Ci-C 6 )alkyl;
  • R4 is -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -(CR c R d )rR 5 , -(CR c R d ) r -NHCO-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-(CR c R d ) r -R 5 , - (CH 2 CH 2 O) q - (CH 2 ) r -CONH-(CR c R d ) r -R 5 , -CH-[(CR c R d ) r -CONH-(CR c R d ) r - (OCH 2 CH 2 ) q -R 5 ] 2 , -CH-[(CR c R d ) r
  • each R 5 is -(CH 2 ) S R 6 or -(CH 2 ) S R 7 ;
  • R 6 is -COOH or -NR 8 R 9 ; - each R 7 is chosen from:
  • each R d is chosen from -H, -CH 2 -SO 3 H or -SO 3 H;
  • - R 8 is -H or -(Ci-C 6 )alkyl
  • - R 9 is -H or -(Ci-C 6 )alkyl
  • - R 10 is -H or -CH 3 ;
  • each q is an integer ranging from 1 to 24;
  • each r is an integer ranging from 1 to 8;
  • R 11 is a direct bond, a group R 7 -(CR c R d ) r -CO- or a group R 7 -(CH 2 CH 2 O) q - (CH 2 ) S -CO-, OR a group R 7 -(CR c R d ) r -NH- where R 7 , R c , R d , q, r and s are as defined above;
  • - A is an amino acid residue
  • the spacer is a direct bond or is chosen from:
  • - G is a sulfate, a sugar, a glucuronide, or a galactoside, said sugar being a saccharide group preferably chosen from a beta-glucuronic acid, a beta-D-galactose, a beta-D-glucose, an alpha-D -mannose, N-acetyl-D-glucosaminyl, N-acetyl-D-galactosaminyl, D-glucuronyl, L-iduronyl, D-glucopyranosyl, D-galactopyranosyl, D-mannopyranosyl or L-fucopyranosyl , preferably G is sulfate, beta-glucuronic acid, or beta-D-galactose;
  • - G can also represent a site of cleavage by a sulfatase, a glucosidase, galactosidase, iduronidase, beta-glucuronidase, mannosidase, N-acetyl-D-glucosaminidase or by N-acetyl-D-galactosaminidase;
  • M is an active principle or a radionuclide chelator, preferably M is an active principle; it being understood that at least one of the connecting arm and of the spacer is present in the conjugate of formula (I).
  • the hook head is a compound of formula (II).
  • W is -CONR 3 R 4 or -NR3COR4, preferably W is -CONR3R4;
  • R 3 is -H or - (C 1 -C 6 )alkyl
  • R4 is -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -R 5 , or -(CR c R d )rR 5 ;
  • - R5 is -(CH 2 ) s R 6 or - (CH 2 ) s R 7 ;
  • - R 7 is chosen from:
  • R c , R d , R 8 and R 9 are as defined above;
  • - q is an integer ranging from 1 to 12, preferably q is an integer ranging from 1 to 8;
  • the attachment head is a compound of formula (IIa),
  • the link arm is a direct link (in which case the spacer is not a direct link).
  • the formula -(A) z - represents a succession of z identical or different, natural or unnatural amino acid residues.
  • Said amino acids can be chosen from the group consisting of: a valine, a citrulline, a phenylalanine, a lysine, an aspartic acid, an alanine, an arginine, a glycine or a glutamic acid.
  • z is equal to 2, 3 or 4 and -(A) z - is a group of amino acids chosen from: a valine and a citrulline; a phenylalanine and a lysine; a valine and an alanine; two alanines; aspartic acid, valine and citrulline; glutamic acid, valine and citrulline; three wisteria; two glycines, one phenylalanine and one glycine.
  • z is equal to 2 and -(A) z - is a group of amino acids chosen from: a valine and a citrulline or a valine and an alanine.
  • -(A) z - can represent a cleavage site by an enzyme chosen from enzymes of the cathepsin B, cathepsin C, cathepsin D type, enzymes chosen from plasmin, a lysosomal enzyme, urokinase (also called urokinase-type plasminogen activator (uPA)), elastase, proteinase 3, cathepsin G.
  • urokinase also called urokinase-type plasminogen activator (uPA)
  • elastase proteinase 3, cathepsin G.
  • the matrix metalloproteinase (MMP) type enzyme is preferably chosen from collagenases 1, 2 and 3 (MMP-1, MMP-8, MMP-13), gelatinases A and B (MMP-2 and MMP -9), stromelysins 1 and 2 (MMP-3 and MMP-10), matrilysins 1, 2 and 3 (MMP-7, MMP-26, MMP-11), macrophage elastase (MMP-12) , membrane MMPs (MMP-14, MMP-15, MMP-16 MMP-17, MMP-24 and MMP-25), enamelysin (MMP-20), CA-MMP (MMP-23), epilysin (MMP-28), MMP-19, MMP-21 and MMP-27.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • -(A) z- can also represent a cleavage site by esterase, carboxylesterase, proteases and cathepsins.
  • cleavage site means the position where the cleavage of the peptide chain takes place by an enzyme, for example the Valine-Citrulline site.
  • the spacer is a direct bond (in which case the link arm is not a direct bond) or a group of formula: In a particular embodiment, the spacer is a direct bond or a group of formula:
  • M is an active ingredient.
  • active principle capable of being used in the context of the invention, mention may be made of the active principles of medicinal products already authorized and the molecules undergoing therapeutic evaluation, in particular:
  • - alkylating agents such as: chlorambucil, chlornaphazine, cyclophosphamide, dacarbazine, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, mannomustine, mitobronitol, melphalan, mitolactol, pipobroman, novembichine, phenesterine, prednimustine, thiotepa, trofosfamide, mustard uracil, CC-1065 (including its synthetic analogs adozelesin, carzelesin and bizelesin), duocarmycin (including the synthetic analogs KW-2189 and CBI-TMI), benzodiazepine dimers (for example, pyrrolobenzodiazepine (PBD) dimers or tomaymycin, indolinobenzodiazepines, imidazobenzothiadiazepines, or oxazolidino-benzodiazep
  • - plant alkaloids such as: Vinca alkaloids (vincristine, vinblastine, vindesine, vinorelbine, navelbine), taxoids (paclitaxel, docetaxol) and their analogues, maytansinoids (DM1, DM2, DM3, DM4, maytansine and ansamitocins) and their analogues, cryptophycins (in particular cryptophycin 1 and cryptophycin 8), epothilones, eleutherobin, discodermolide, bryostatins, dolastatins, auristatins, tubulysins, cephalostatins, pancratistatins, sarcodictyin, spongistatins;
  • Vinca alkaloids vincristine, vinblastine, vindesine, vinorelbine, navelbine
  • taxoids paclitaxel, docetaxol
  • maytansinoids DM1, DM2, DM3,
  • DNA topoisomerase inhibitors such as: epipodophyllin (9-aminocamptothecin, camptothecin, crisnatol, daunomycin, etoposide, etoposide phosphate, irinotecan, mitoxantrone, novantrone, retinoic acids (retinols), teniposide, topotecan, 9-nitrocamptothecin (RFS 2000) , mitomycins (mitomycin C), bortezomib; - anti-metabolites such as: anti-folates (DHFR inhibitors (methotrexate, trimetrexate, denopterin, pteropterin, aminopterin (4-aminopteroic acid) and other analogues of folic acid), inhibitors of IMP dehydrogenase (acid mycophenolic acid, tiazofurin, ribavirin, EICAR), ribonucleotide reducta
  • hormonal agents such as: anti-estrogens (megestrol, raloxifene, tamoxifen), LHRH agonists (goserelin, leuprolide acetate), anti-androgens (bicalutamide, flutamide, calusterone, dromostanolone propionate, epitiostanol, goserelin, leuprolide, mepitiostane, nilutamide, testolactone, trilostane), vitamin D3 analogues (CB 1093, EB 1089, KH 1060, cholecalciferol, ergocalciferol), photodynamic therapies (verteporfin, phthalocyanine, photosensitizer Pc4), cytokines (interferon-alpha, interferon-gamma, tumor necrosis (TNF), human proteins containing a TNF domain);
  • anti-estrogens megestrol, raloxifene, t
  • - kinase inhibitors such as: BIBW 2992, CYT387, E7080, axitinib, bafetinib, bosutinib, cabozantinib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, iniparib, ispinesib, lapatinib, masitinib, mubritinib, nilotinib, pazopanib, pegaptanib, ponatinib, ruxolitinib , sorafenib, sunitinib, tivozanib, vandetanib, vismodegib;
  • PARP poly(ADP-ribose)polymerase
  • - immunomodulators such as: thalidomide, lenalidomide, pomalidomide;
  • toxin such as pseudomonas exotoxin (PE), deBouganin, Bouganin;
  • the active principle is chosen from methotrexate, an immunomodulator, duocarmycin, combretastatin, calicheamicin, monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMAF), DM1, DM4, SN38, amanitine and its analogs, pyrrolobenzodiazepine, a pyrrolobenzodiazepine dimer, pyrrolopyridodiazepine, a pyrrolopyridodiazepine dimer, a histone deacetylase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, and ricin, from preferably, the active ingredient is amanitine, a pyrrolobenzodiazepine dimer, MMAF or MMAE, the latter two being represented by the following formulas:
  • M is a radionuclide chelator.
  • a radionuclide chelator capable of being used in the context of the invention of sarcophagine, DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DOTAGA (2-(4,7,10-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1-yl)pentanedioic acid), NODA (1,4,7-triazacyclononane-1,4- diacetic acid), NODAGA (l,4,7-triazacyclononane,l-glutaric acid-4,7-diacetic acid), NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid) and MANOTA (2,2',2"-[2-(aminomethyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7
  • the antibody or the Fab', F(ab') 2 , or scFv-Fc fragment of said antibody binds to a cancer-specific antigen.
  • the cancer-specific antigen can be, for example, CDla, CD3, CD4, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD39, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD66e, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79, CD80, CD86, CD117, CD138, CD194, CD205, CD227, VEGF, EpCAM, GPIIb, GPIIIa, TNF alpha, TNFR, TNT, Lewis Y, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, AXL, Protein F, IgE-Fc, C5, IL-6R, IL12, IL15, IL18, IL23, IL-1, TPO-R, GPNMB, PS
  • the antibody or a Fab', F(ab') 2 or scFv-Fc fragment of said antibody binds to HER2, CD30 or CD56. It can therefore for example be an anti-HER2 antibody, an anti-CD30 antibody or an anti-CD56 antibody.
  • the antibody, the Fab' fragment or the F(ab')2 fragment, or the scFv-Fc fragment can be of mammalian origin (for example human or murine), chimeric, humanized. It is preferably a monoclonal antibody produced recombinantly by cells genetically modified according to techniques widely described in the prior art.
  • the antibody is of the IgG type, for example IgG1, IgG2,
  • conjugation conditions are for example those described in application WO 2022/018371 or those specified below.
  • the antibody or the Fab', F(ab')2, or scFv-Fc fragment, binds to the tether head by a substitution reaction of the Br groups present in formula (III) or (III') .
  • the compounds of formula (I') can be obtained by coupling the various elements which make up their structure (attachment head (III) or (III'/connecting arm/spacer/M).
  • attachment head (III) or (III'/connecting arm/spacer/M) For example, and in a non-limiting, the compounds of formula (I') can be obtained by coupling between a compound of formula (III) or (III') and a compound of formula (V):
  • the coupling between the attachment head and the connecting arm can be done either in a conventional manner, for example by coupling of the peptide type between a carboxylic group and an amino group, or by implementing a so-called "click" reaction. .
  • a peptide-type coupling conventionally takes place between a carboxylic group carried by the attachment head, and an amine group carried by the linker arm or, where appropriate, with an amine group carried by the spacer (if the linker arm is a direct connection).
  • the reactive group of W which will form the peptide-like bond with the linker (or spacer) is, in the context of the present invention, defined as it is before the coupling reaction with the reactive group of the linker arm (or of the spacer).
  • Coupling by click reaction can take place when the attachment head and the connecting arm each carry an R 7 substituent. More specifically, the click reaction takes place between a diene (for example an azide or a diazo) and a dienophile (for example an alkene or an alkyne), each of these functions being provided by the R 7 group. Thus, the click reaction can take place between a diene provided by the R 7 group of the hook head and a dienophile provided by the R 7 group of the connecting arm, or else between a dienophile provided by the R 7 group of the hook head and a diene provided by the R 7 group of the link arm.
  • a diene for example an azide or a diazo
  • a dienophile for example an alkene or an alkyne
  • the linker arm is absent, the coupling of the hook head with the spacer occurs, still via a peptide bond, between the carboxylic group originating from W and an amino group originating from the spacer.
  • the coupling between the attachment head and the connecting arm (or, where appropriate, the spacer) of the compound of formula (V) can take place via a peptide bond as explained above.
  • the conjugates of formula (I) can also be obtained as described in application WO 2022/018371, by conjugation between an antibody, or an Fab', F(ab')2 fragment, or scFv-Fc of said antibody, with a compound of formula (III) or (III') to form an intermediate compound of formula (IV) followed by a coupling by click reaction (as described above) between a compound of formula (IV) and a compound of formula ( V):
  • attachment head of formula (II) or (II')
  • the connecting arm of formula (II) or (II')
  • the connecting arm of formula (II) or (II')
  • the connecting arm of formula (II) or (II')
  • the connecting arm of formula (II) or (II')
  • the connecting arm of formula (II) or (II')
  • the connecting arm of formula (II) or (II')
  • the connecting arm of formula (II) or (II')
  • the spacer and M are as defined above.
  • the conjugates of formula (I) have a ratio of "attached” or “conjugated” molecules per antibody (or per Fab', F(ab') 2 fragment, or scFv-Fc), designated by the letter u, included in the range from about 0.50 to about 3.50.
  • the term “molecule” means the structure of formula (I′).
  • the antibody (or Fab', F(ab') 2 fragment, or scFv-Fc) is conjugated on average at 1.00 ⁇ 0.50 (i.e. any value from from 0.50 to 1.50, for example 0.50; 0.51; >;1.49; 1.50) molecule(s), preferably 1.00 ⁇ 0.30 molecule(s).
  • the antibody (or F(ab') 2 fragment) is conjugated on average at 2.00 ⁇ 0.50 (i.e. any value ranging from 1.50 to 2.50 , for example 1.50;
  • the antibody (or F(ab') 2 fragment) is conjugated on average at 3.00 ⁇ 0.50 (i.e. any value ranging from 2.50 to 3.50 , for example 2.50;
  • the "u” ratio also called “DAR” (for "drug to antibody ratio"), is determined for each species (LHHL, LH, L, H, HH, LHH) by HRMS (High Mass Spectrometry) analysis. Resolution) under denaturing conditions.
  • drug here means the active ingredient or radionuclide chelator M.
  • the average DAR is obtained from the DAR per species weighted by the proportions of the species observed in analysis on SDS-PAGE gel under denaturing non-reducing conditions. Only the majority species LHHL and LH were considered for this calculation, the sum of the proportions of the other species (L, H, HH and LHH) being less than 18%.
  • the sum of the proportions of the LHHL and LH species was therefore reduced to 100% by not taking into account the other species.
  • the LH "half-antibody" species is observed under denaturing conditions. In solution (in native conditions) this species is not present in isolation, the weak interactions keep the two LHs together. This is why the DAR of the non-reconstructed LH-LH species corresponds to 2 times the DAR observed on the LH species.
  • the conjugate of formula (I) is present in a composition, which may for example be a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutically acceptable excipients and/or carriers.
  • the invention relates to a conjugate of formula (I) as defined above for use in a method of treating cancer.
  • the antibody or a Fab', F(ab') 2 , or scFv-Fc fragment of said antibody binds to HER2 and the cancer is a HER2+ cancer.
  • HER2 designates the "Human Epidermal growth factor Receptor 2", which is a membrane protein of the family of human epidermal growth factor receptors. “HER2” is also frequently referred to as “ErbB2”.
  • the term “HER2+ cancer” or "HER2 positive cancer” designates a cancer involving an exacerbated expression of HER2.
  • the term “HER2+ cancer” designates any case of cancer for which cancerous cells exhibit deregulation of the HER2 gene.
  • the HER2+ cancer is chosen from breast cancer, lung cancer, colorectal cancer, head and neck cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, urothelial cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer, cervical cancer, uterine cancer, vulvar cancer, bile duct cancer, cancer of the endothelium, cancer of the colon, cancer of the anus, cancer of the salivary glands, cancer of the brain, cancer of the esophagus, cancer of the intestine, cancer of the liver, cancer lacrimal glands, laryngeal cancer, peritoneal cancer, prostate cancer, testicular cancer, kidney cancer, skin cancer, adenoid cystic carcinoma, angios
  • the HER2+ cancer is selected from breast cancer, gastric cancer, gastroesophageal cancer, bladder cancer, gallbladder cancer, extrahepatic cholangiocarcinoma, preferably breast.
  • the antibody is trastuzumab; in this embodiment, the structure of formula (!') can also be conjugated to a Fab', F(ab') 2 , or scFv-Fc of trastuzumab.
  • the antibody or a Fab', F(ab')2, or scFv-Fc fragment of said antibody binds to CD30 and the cancer is a CD30+ cancer.
  • CD30 refers to "Differentiation Cluster 30", which is a membrane glycoprotein of the human tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF). “CD30” is also frequently referred to as “TNFRSF8”.
  • CD30+ cancer or “CD30 positive cancer” designates a cancer involving an exacerbated expression of CD30.
  • CD30+ cancer designates any case of cancer for which cancerous cells exhibit a deregulation of the TNFRSF8 gene.
  • the CD30+ cancer is chosen from Hodgkin's lymphoma, T-cell lymphoma, peripheral T-cell lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, hepatosplenic T-cell lymphoma, anaplastic lymphoma large cell lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, systemic anaplastic large cell lymphoma, angioimmunoblastic T-cell lymphoma, enteropathy-associated T-cell lymphoma, mycosis fungoides, diffuse large B-cell lymphoma, leukemia T in adults, Sézary syndrome, primary B-cell lymphoma of the mediastinum, nodular sclerosis Hodgkin's lymphoma, angiocentric lymphoma, myeloid splenomegaly.
  • the CD30+ cancer is selected from Hodgkin's lymphoma, anaplastic large cell lymphoma,
  • the antibody is brentuximab; in this embodiment, the structure of formula (I') can also be conjugated to an Fab', F(ab') 2 , or scFv-Fc fragment of brentuximab.
  • the antibody or a Fab', F(ab') 2 , or scFv-Fc fragment of said antibody binds to CD56 and the cancer is a CD56+ cancer.
  • CD56 refers to the "Cluster of Differentiation 56", which is a membrane glycoprotein member of the immunoglobulin (Ig) superfamily containing 5 Ig-like domains and two fibronectin type 3 domains in its extracellular part. CD56 is also frequently called “Neural-Cell Adhesion Molecule 1 (NCAM 1)”.
  • CD56+ cancer or “CD56 positive cancer” refers to a cancer expressing CD56. In particular, the term “CD56+ cancer” denotes any case of cancer for which cancerous cells exhibit expression of CD56. An expression of CD56 is frequently observed in neuroendocrine carcinomas, pediatric tumors and certain hemopathies. It is also reported in certain melanomas and soft tissue sarcomas.
  • the CD56+ cancer is chosen from leukaemias, lymphomas, nerve sheath cancer, Merkel cell carcinoma, myelodysplastic syndromes, myelomas, neuroblastoma, cancer of the ovary, lung cancer, neuroendocrine cancers, rhabdomyosarcoma, Wilms tumor, glioblastoma, synovial sarcoma, pleuropulmonary blastoma, myeloid splenomegaly.
  • the CD56+ cancer is chosen from neuroendocrine cancers, lung cancer or Merkel cell carcinoma, preferably Merkel cell carcinoma.
  • the antibody or the Fab', or the F(ab')2, or the anti-CD56 scFv-Fc comprises:
  • variable domain of a light chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 1, a CDR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 2, and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO: 3 ;
  • variable domain of a heavy chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 4, a CDR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 5, and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO : 6.
  • the light chain variable domain has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97 %, at least 98%, at least 99% or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 9; and the heavy chain variable domain having at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% , at least 99% or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 10.
  • the antibody or the Fab', or the F(ab') 2 , or the anti-CD56 scFv-Fc can have an amino acid sequence SEQ ID NO: 9 for the variable domain of the light chain and of sequence in amino acids SEQ ID NO: 10 for the variable domain of the heavy chain.
  • the antibody or the Fab', or the F(ab')2, or the anti-CD56 scFv-Fc can have an amino acid sequence SEQ ID NO: 7 for the light chain and amino acid sequence SEQ ID NO: 8 for the heavy chain.
  • the heavy chain of amino acid sequence SEQ ID NO: 8 may also have an additional lysine in the C terminal position.
  • the antibody may be the antibody described under the reference m906 in application US 2018/0214568 A1.
  • the m906 antibody is a chimeric anti-CD56 antibody of the IgG1 type with the amino acid sequence SEQ ID NO: 7 for the light chain and of amino acid sequence SEQ ID NO: 8 for the heavy chain.
  • BSA bovine serum albumin
  • DIPEA N,N-diisopropylethylamine
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagles Medium
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor 2
  • HOBt hydroxybenzotriazole
  • HSA human serum albumin
  • MMAF Monomethyl Auristatin F
  • NaCI sodium chloride
  • PBD pyrrolobenzodiazepine
  • FCS fetal calf serum
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine
  • TTZ trastuzumab
  • the exact mass of the synthesized compounds was determined by high resolution mass spectrometry (HRMS) in positive or negative mode with the ESI electrospray ionization technique, on a Bruker maXis mass spectrometer coupled to a Dionex Ultimate 3000 RSLC system from the ICOA/CBM “Research Federation” platform (FR2708).
  • HRMS high resolution mass spectrometry
  • conjugates were carried out on a sample previously deglycosylated or not.
  • a deglycosylated sample it was diluted to a concentration of 1 ⁇ g/ ⁇ L then N-glycosidase F (0.02 units/ ⁇ g of sample) was added and the sample was incubated at 37°C for at least 16 h.
  • Method 1 The analysis was carried out on a Vion IMS Qtof mass spectrometer coupled to an Acquity UPLC H-Class system from Waters (Wilmslow, UK). Before the analysis, the samples (800 ng) were injected on an XBridge BEH300 C4 2.1 x 50 mm, 1.7 ⁇ m column, or on an XBridge BEH300 C4 2.1 x 30 mm, 5 ⁇ m column heated to 90°C. A desalting step was carried out with an isocratic gradient of 95% solvent A (H 2 O + 0.1% formic acid) and 5% solvent B (MeCN + 0.1% formic acid) for 1.5-2 min at 0.5 mL/min.
  • solvent A H 2 O + 0.1% formic acid
  • solvent B MeCN + 0.1% formic acid
  • the elution of the sample was carried out with a gradient of 20% to 35% of solvent B over 7 min, from 50% to 90% of solvent B over 3 min, and an isocratic of 1 min at 90% of B, i.e. with a gradient of 5% to 50% of solvent B over 2.9 min, from 50% to 90% of solvent B over 0.5 min, an isocratic of 0.5 min at 90% of B, with a flow rate of 0.4 mL/min.
  • a bypass valve was programmed to allow solvent to enter the spectrometer between 3 and 7.5 min only.
  • Mass spectrometry data were acquired in positive mode with an ESI source over an m/z range of 500 to 4000 at a scan rate of 1 Hz and analyzed using UNIFI 1.9.4 software and the MaxEnt algorithm to deconvolution.
  • Method 2 The spectrometric analysis of certain conjugates was carried out on a Bruker maXis mass spectrometer coupled to a Dionex Ultimate 3000 RSLC system. Prior to MS analysis, samples (5 ⁇ g) were desalted on a MassPREP desalting column (2.1x10 mm, Waters), heated to 80°C using 0.1% aqueous formic acid solution as solvent A and a 0.1% solution of formic acid in acetonitrile as solvent B at 500 ⁇ L/min. After 1 min, a linear gradient from 5 to 90% B in 1.5 min was applied.
  • MS data was acquired in positive mode with an ESI source over an m/z range of 900 to 5000 at 1 Hz and analyzed using DataAnalysis 4.4 software (Bruker) and the MaxEnt algorithm for deconvolution.
  • the samples were analyzed by SDS-PAGE tris-HCI acrylamide gel. A 4% acrylamide stacking gel on a 6-7% acrylamide running gel were used. 4X Laemmli buffer (0.3 mM bromophenol blue; 2 M glycerol, 20 mM TrisBase; 0.04% sodium dodecyl sulfate) was added to the samples (1.6 ⁇ g). Under reducing conditions, the samples were reduced using a 10% solution of dithiothreitol (DTT) in water (10% v/v). Then the samples were incubated at 95°C for 10 min.
  • DTT dithiothreitol
  • the gel was run at 100 V for 10 min then at 140 V for 35 min, in NuPAGE running buffer (50 mM MOPS; 50 mM TrisBase; 0.1% SDS (v/v); 1 mM EDTA , pH 7.3). After washing with water, the gel was stained with Coomassie blue (Thermo Scientific ImperialTM Protein Stain). Densitometric analysis was performed using ImageJ software and a Windows Vanilla filter was applied for black and white analysis.
  • the relative optical density of LHHL and LH species was used to determine the average DAR of the conjugate.
  • the relative optical density measured for the LHHL species determined the reconstruction of the antibody (in %).
  • the synthesized ADCs were filtered through 0.22 ⁇ m. 50 pg of products were injected onto a MAbPac HIC-Butyl column, 5 ⁇ m, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connected to a Waters Alliance HPLC chain (e2695) equipped with a PDA (e2998) set for detection at 280nm.
  • ADCs were eluted at a flow rate of 1 mL/min by a gradient from 100% Buffer A (1.5 M ammonium sulfate, 50 mM monobasic sodium phosphate, 5% isopropanol (v/v), pH 7 .0) up to 20% buffer B (50 mM monobasic sodium phosphate, 20% isopropanol (v/v), pH 7.0) in 2 minutes then up to 85% buffer B in 30 minutes then this gradient was maintained for 1 min. The temperature was maintained at 25°C throughout the separation.
  • the synthesized ADCs were filtered through 0.22 ⁇ m. 50 pg of products were injected onto an AdvanceBio SEC 2.7 ⁇ m, 7.8 x 300 mm column (Agilent Technologies), connected to a Waters Alliance HPLC chain (e2695) equipped with a PDA (2998) set for detection at 280 nm, a Wyatt MALLS detector (miniDawnTM) and a Wyatt refractive index detector (Optilab® T-rEX).
  • ADCs were eluted at a flow rate of 1 mL/min by an isocratic buffer C (1 mM monobasic sodium phosphate, 155 mM chloride sodium, 3 mM dibasic sodium phosphate, 3 mM sodium azide, pH 7.0) in 24 minutes. The temperature was maintained at 25°C throughout the separation.
  • Bioconjugation buffer 1 IX phosphate buffer at pH 8.3, with a final NaCl concentration of 180 mM and a final EDTA concentration of 1 mM.
  • Bioconjugation buffer 2 Borate buffer IX at pH 8.3, with a final NaCl concentration of 25 mM and a final EDTA concentration of 1 mM.
  • Reducer 1 Solution of tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP.HCI) at a concentration of 1 mM in the bioconjugation buffer.
  • TCEP.HCI tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride
  • Reducer 2 Solution of dithiothreitol (DTT) at a concentration of 1 mM in the bioconjugation buffer.
  • the antibody solution in bioconjugation buffer (1.0 eq) was placed under argon.
  • the reducing agent (1.0-12.0 eq) was then added and the reaction medium was incubated at 37° C. for 2 h.
  • the solution of compound to be conjugated (1.0-15.0 eq, preferably 5.0-12.0 eq or 10.0-15.0 eq)) was added under argon and the reaction medium was stirred at a temperature between 4°C and 40°C, preferably 25°C or 37°C for 2h30.
  • the antibody solution in bioconjugation buffer (1.0 eq) was placed under argon.
  • the solutions of compound to be conjugated (1.0-15.0 eq, preferably 8.0-12.0 eq) then of reducing agent (1.0-15.0 eq, preferably 8.0-12.0 eq ) were added and the reaction medium was stirred under argon at a temperature between 4° C. and 40° C., preferably 25° C. or 37° C. for 1 h to 5 h, preferably 2 h 30 min.
  • the antibody solution in bioconjugation buffer (1.0 eq) was placed under argon.
  • the solutions of the compound of formula (I) (1.0-15.0 eq, preferably 8.0-12.0 eq or 10.6-12.0 eq) then of reducing agent (1.0-15.0 eq, preferably 8.0-12.0 eq.) were added and the reaction medium was stirred under argon at a temperature between 4°C and 40°C, preferably 25°C or 37°C for 1 a.m. to 5 a.m., preferably 2.5 hours.
  • the antibody solution in bioconjugation buffer (1.0 eq) was placed under argon.
  • the reducing agent (1.0-12.0 eq) was then added and the reaction medium was incubated at 37° C. for 2 h.
  • the solution of compound to be conjugated (1.0-15.0 eq) was added under argon and the reaction medium was stirred at a temperature between 4°C and 40°C, preferably 25°C or 37°C. C for 2h30.
  • the solution of the compound of formula (V) (1.0-30.0 eq) was then added and the reaction medium was stirred at a temperature between 4°C and 40°C, preferably 25°C or 37°C. C for 17 h or 24 h.
  • Example 1 4-Nitrophenyl 1-[4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenoxy]-3,6,9,12-tetraoxa pentadecan-15-oate (1)
  • Example 3 compound (18): conjugate trastuzumab - compound (3) - compound (4)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (3) (1 st compound) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (4) ( 2nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Example 4 compound (19): conjugate trastuzumab - compound (3) - compound
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (3) (1 st compound) (10.6 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (4) ( 2nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • the reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer.
  • Bioconjugation buffer 2 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 2 (8.0 eq), compound (5) (5.0 eq) at a concentration of 0.4 mM in a mixture of 80% DM F and 20% MeOH.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 2.00 for LHHL species and an average DAR of 1.00 for LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 6 compound (21): conjugate trastuzumab - compound (6) - compound (7)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (6) (1 st compound) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (7) (2nd compound ) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 1.00 for LHHL species and an average DAR of 1.00 for LH species. LHH, HH, H and L species were not observed. The mass increment is correct.
  • Example 7 compound (22): conjugate trastuzumab - compound (6) - compound (7)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (6) (1 st compound) (8.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (7) (2 nd compound) (8.8 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 2.00 for LHHL species and an average DAR of 1.00 for LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 8 compound (23): conjugate trastuzumab - compound (8) - compound (9)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (8) (1 st compound) (3.0 eq) at a concentration of 0.25 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (9) ( 2nd compound) (3.3 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 1.20 for LHHL species and an average DAR of 1.00 for LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 9 compound (24): conjugate trastuzumab - compound (8) - compound (9)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (8) (1 st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 30% DMF and 70% MeOH, compound (9) (2 nd compound) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 2.00 for LHHL species and an average DAR of 1.00 for LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 10 compound (25): conjugate trastuzumab - compound (10) - compound (4)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (10) (1 st compound) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (4) ( 2nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 1.00 for LHHL species and an average DAR of 1.00 for LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 11 compound (26): conjugate trastuzumab - compound (10) - compound (4)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (10) (1 st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (4) ( 2nd compound) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 2.00 for LHHL species and an average DAR of 1.00 for LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 12 compound (27): conjugate trastuzumab - compound (10) - commercial compound N3-PEG 4 -Val-Ala-PBD dimer (11)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (10) (1 st compound) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, commercial compound N 3 -PEG 4 -Val-Ala-PBD dimer (11), (2nd compound) (10 eq ) at a concentration of 0.5 mM in DMF.
  • the reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer, the concentration of the intermediate trastuzumab-compound conjugate (10) is adjusted to 1, 5 mg/mL before the addition of the commercial compound N 3 -PEG 4 -Val-Ala-PBD dimer (11) and the reaction medium was stirred for 17:40.
  • Example 13 compound (28): conjugate trastuzumab - compound (10) - commercial compound N3-PEG 4 -Val-Ala-PBD dimer (11)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (10) (1 st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, commercial compound N 3 -PEG 4 -Val-Ala-PBD dimer (11), (2 nd compound) (20 eq) at a concentration of 1 mM in DMF.
  • Bioconjugation reaction 4 the reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer, the concentration of the intermediate trastuzumab-compound conjugate (10) is adjusted to 1, 5 mg/mL before the addition of the commercial compound N 3 -PEG 4 -Val-Ala-PBD dimer (11) and the reaction medium was stirred for 17:40.
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (12) (1 st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (13) (2nd compound ) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Example 15 compound (30): conjugate trastuzumab - compound (14) - compound (4)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (14) (1 st compound) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (4) ( 2nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Example 16 compound (31): conjugate trastuzumab - compound (14) - compound (4)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (14) (1 st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (4) ( 2nd compound) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Example 17 compound (32): conjugate trastuzumab - compound (14) - commercial compound N 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (14) (1 st compound) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, commercial compound N 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15), (2nd compound ) (12.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Example 18 compound (33): conjugate trastuzumab - compound (14) - commercial compound N 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (14) (1 st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, commercial compound N 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15) (2nd compound ) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in of DMSO.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 2.00 for LHHL species and an average DAR of 1.00 for LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 19 compound (34): conjugate trastuzumab - compound (16)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (16) (10.6 eq) at 1 mM concentration in 80% mix of DM F and 20% MeOH.
  • Example 20 compound (35): conjugate trastuzumab - compound (16)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (16) (12.0 eq) at 3 mM concentration in 20% mix of DM F and 80% MeOH.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 2.00 for LHHL species and 1.00 for LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 21 compound (36): conjugate trastuzumab - compound (17) - compound (13)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (17) (1 st compound) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (13) (2 nd compound) (15.0 eq) at a concentration of 1 mM in DMSO.
  • Bioconjugation reaction 3 the reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer, the concentration of the intermediate trastuzumab-compound conjugate (17) is adjusted to 1, 5 mg/mL before adding compound (13) and the reaction medium was stirred for 22 h.
  • Example 22 compound (37): conjugate trastuzumab - compound (17) - compound (13)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 2 (8.0 eq), compound (17) (1 st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (13) (2 nd compound) (30.0 eq) at a concentration of 1 mM in DMSO.
  • Bioconjugation reaction 4 the reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer, the concentration of the intermediate trastuzumab-compound conjugate (17) is adjusted to 1, 4 mg/mL before adding compound (13) and the reaction medium was stirred for 22 h.
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average DAR of 1.70 for the LHHL species and an average DAR of 0.90 for the LH species. LHH, HH, and H species were not observed.
  • Example 23 compound (38): conjugate trastuzumab - compound (8) - compound
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (8) (1 st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 30% DMF and 70% MeOH, compound (9) (2 nd compound) (30 eq) at a concentration of 2 mM in DMSO.
  • Bioconjugation reaction 4 the reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer, the concentration of the intermediate trastuzumab-compound conjugate (8) is adjusted to 1, 4 mg/mL before adding compound (2) and the reaction medium was stirred for 17 h.
  • Example 24 In vitro evaluation of the cytotoxicity of the conjugates by XTT test on a positive line (BT-474) and a negative line (MCF-7) for the HER2 receptor
  • BT-474 and MCF-7 were obtained from ATCC (BT-474 and MCF-7). An aliquot of frozen BT-474 cells or MCF-7 cells was rapidly thawed in a 37°C water bath and the cells were washed twice with culture medium with F12/DMEM supplemented with 8% FCS, 100 pg/mL L-glutamine, 100 pg/mL sodium penicillin G, 100 pg/mL streptomycin sulfate for BT-474 cells or with DMEM GlutaMAXTM supplemented with 10% FCS, 1 % sodium penicillin G, 1% streptomycin sulfate for MCF-7 cells. The cells were then placed in a 75 cm 2 cell culture flask at a density of at least 10,000 cells/cm 2 . The cells were maintained at 37°C in a humid atmosphere with 5% CO 2 for at least one week.
  • MCF-7 and BT-474 cells were plated in 96-well plates at densities of 2,500 and 50,000 cells per well respectively for cytotoxicity assays.
  • the cells were incubated for 24 h at 37° C. before the addition of the conjugates according to the invention or of the controls tested and of the vehicle (medium alone). The percentages of DMSO have never exceeded 0.5%.
  • the conjugates tested were added at the following final concentrations: 200,000 at 0.2 ⁇ M; and incubated for 96 h.
  • compounds (24), (25), (26), (34), (35), and the control ADC have no cytotoxic effects at lowest effective concentrations tested demonstrating the absence of intrinsic toxicity of these constructions (FIGS. 1B, 2B and 3B).
  • compounds (24), (25), (26), (34), and (35) are effective on cells expressing the target at their surface only.
  • Example 25 In vitro evaluation of the cytotoxicity of the conjugates by XTT test on a positive line (SK-BR-3) and a negative line (MCF-7) for the HER2 receptor
  • Cells were obtained from ATCC (SK-BR-3 and MCF-7). An aliquot of frozen SK-BR-3 cells or MCF-7 cells was rapidly thawed in a 37°C water bath and cells were washed twice with culture medium with DMEM GlutaMAXTM supplemented with 10% FCS, 1% sodium penicillin G, 1% streptomycin sulfate for MCF-7 cells. The cells were then deposited in a 75 cm 2 cell culture flask at a density of at least 10,000 cells/cm 2 . The cells were maintained at 37°C in a humid atmosphere with 5% CO 2 for at least one week.
  • SK-BR-3 and MCF-7 cells were plated in 96-well plates at densities of 50,000 cells per well for cytotoxicity assays.
  • the cells were incubated for 24 h at 37° C. before the addition of the conjugates according to the invention and the controls tested. The percentages of DMSO have never exceeded 0.5%.
  • the conjugates tested were added at the following final concentrations: 200,000 at 0.2 ⁇ M; and incubated for 96 h.
  • Example 26 compound (39): conjugate anti-CD56 - compound (16)
  • HRMS analysis determined an average DAR of 0.86 for LHHL species, 0.60 for LH species, and 0.00 for L species. LHH, HH, and H n were not observed.
  • HIC analysis determined an average DAR of 1.02.
  • Example 27 compound (40): conjugate anti-CD56 - compound (14) - compound (11)
  • Bioconjugation reaction 3 for 2h30 at 25°C then 16h at 25°C.
  • the reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 0.68 for LHHL species, an average DAR of 1.0 for LH species, and an average DAR of 0.00 for L species.
  • LH H, HH, and H were not observed.
  • a species corresponding to a mass increment corresponding to the anti-CD56 compound—compound (14) was observed: anti-CD56 LHHL—compound (14) DAR 1 to 56%.
  • the anti-CD56 - compound (14) conjugate was not fully converted.
  • HIC analysis determined an average DAR of 0.77.
  • Example 28 In vitro evaluation of the cytotoxicity of the conjugates by XTT test on positive lines (WaGa) and (PeTa) for the CD56 receptor
  • Cells were obtained from ATCC (WaGa and PeTa). Cells were incubated with Roswell Park Memorial Institute (RPMI) culture medium supplemented with 10% FCS, 1% penicillin, streptomycin and amphotericin B. Then the cells WaGa and PeTa were plated in 96-well plates at densities of 50,000 cells per well for cytotoxicity assays. Then the addition of the conjugates according to the invention or of the controls tested was carried out. The conjugates tested were added at the following final concentrations: 200,000 at 2 ⁇ M; and incubated for 96 h.
  • RPMI Roswell Park Memorial Institute
  • XTT reagent at 1 mg/mL with 25 mM of activator (N-methyl dibenzopyrazine methyl sulfate) was added per well and the absorbance was measured at 450 nm after 4 h incubation at 37°C. Untreated cells were used as a viability standard. Cells treated with 1% Triton X100 were included to confirm that cell death is indeed detected. Absorbance at 620 nm was used as a reference. The cell viability is expressed as the mean (+/-SEM) of the percentage obtained.
  • Example 29 compound (41): conjugate trastuzumab - compound (16)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (16) (4 eq) at 1 mM concentration in 80% DMF mix and 20% MeOH.
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average DAR of 0.91 for the LHHL species and of 0.65 for the LH species. LH H, HH, H and L species were not observed.
  • Bioconjugation buffer 1 9.5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (15.0 eq), compound (16) (4 eq) at 3 mM concentration in 80% DM mix F and 20% MeOH.
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average DAR of 1.42 for the LHHL species and of 0.72 for the LH species. LH H, HH, H and L species were not observed.
  • HIC analysis determined an average DAR of 1.94.
  • Example 31 compound (43): conjugate trastuzumab - compound (14)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (4.0 eq), compound (14) (3.0 eq) at 1 mM concentration in 80% mix of DM F and 20% MeOH.
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average DAR of 1.18 for the LHHL species and of 0.91 for the LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 32 compound (44): conjugate trastuzumab - compound (14)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (15.0 eq), compound (14) (7.0 eq) at 3 mM concentration in 70% mix of DM F and 30% MeOH.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 2.00 for LHHL species, 1.00 for LH species, and 0.00 for L species. LHH, HH, and H n were not observed.
  • Example 33 compound (45): conjugate trastuzumab - compound (14) - compound (9)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (4.0 eq), compound (14) (1 st compound) (3.0 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (9) ( 2nd compound) (3.3 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Bioconjugation reaction 3 for 2h30 at 25°C then 17h at 25°C.
  • the HRMS analysis determined an average DAR of 1.08 for the LHHL species, an average DAR of 0.80 for the LH species and an average DAR of 0.00 for the L species.
  • LHH species , HH, and H were not observed.
  • No mass increment corresponding to trastuzumab-compound (14) is observed: the trastuzumab-compound (14) conjugate has been entirely converted.
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (15.0 eq), compound (14) (1 st compound) (7.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 70% DMF and 30% MeOH, compound (9) (2 nd compound) (7.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • HIC analysis determined an average DAR of 2.17.
  • Example 35 compound (47): conjugate trastuzumab - compound (14) - compound (15)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (4.0 eq), compound (14) (1 st compound) (3.0 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (15) (2 nd compound) (20.0 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Bioconjugation reaction 3 for 2h30 at 25°C then 24h at 37°C.
  • reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer, the concentration of the intermediate trastuzumab-compound conjugate (14) is adjusted to 2.0 mg/mL before the addition of compound (15) and the reaction medium was stirred for 24 h.
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average DAR of 0.87 for the LHHL species and an average DAR of 0.95 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • a mass increment corresponding to the LHHL of the compound trastuzumab - compound (14) is observed at 13%: the conjugate trastuzumab - compound (14) was converted at 87%.
  • HIC analysis determined an average DAR of 0.92.
  • Example 36 compound (48): conjugate trastuzumab - compound (14) - compound (15)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (15.0 eq), compound (14) (1 st compound) (7.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 70% DMF and 30% MeOH, compound (15) (2 nd compound) (20.0 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer, the concentration of the intermediate trastuzumab-compound conjugate (14) is adjusted to 2.0 mg/mL before the addition of compound (15) and the reaction medium was stirred for 24 h.
  • HIC analysis determined an average DAR of 1.66.
  • Example 37 compound (49): conjugate trastuzumab - compound (8)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (3.0 eq), compound (8) (2.0 eq) at a concentration of 1 mM in DMF.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 1.10 for LHHL species, 0.91 for LH species, and 0.00 for L species. LHH, HH, and H n were not observed.
  • Example 38 compound (50): conjugate trastuzumab - compound (8)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (15.0 eq), compound (8) (6.0 eq) at 3 mM concentration in DMF.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 2.28 for LHHL species, 1.00 for LH species, and 0.00 for L species. LH species H, HH, and H were not observed.
  • Example 39 compound (51): conjugate trastuzumab - compound (8) - compound (9)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (3.0 eq), compound (8) (1 st compound) (2.0 eq) at a concentration of 1 mM in DMF, compound (9) ( 2nd compound) (6.0 eq) at a concentration of 2 mM in DMSO.
  • Bioconjugation reaction 3 for 2h30 at 25°C then 16h at 25°C.
  • the final reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer.
  • Example 40 compound (52): conjugate trastuzumab - compound (8) - compound
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (15.0 eq), compound (8) (1 st compound) (6.0 eq) at a 3 mM concentration in DMF, compound (9) (2 nd compound) (9.0 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Bioconjugation reaction 3 for 2h30 at 25°C then 16h at 25°C.
  • the final reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco® pH 7.4 PBS buffer.
  • HRMS analysis determined an average DAR of 1.86 for LHHL species, an average DAR of 0.96 for LH species, and an average DAR of 0.00 for L species.
  • LH H, HH, and H were not observed.
  • a few species corresponding to a mass increment corresponding to the compound trastuzumab - compound (8) were observed: LH compound (8) DAR 1 at 3.6%, LHHL DAR 1 + compound (8) DAR 1 at 1.4% and LHHL DAR 2 + compound (8) DAR 1 at 18.7%.
  • the trastuzumab - compound (8) conjugate was not fully converted.
  • HIC analysis determined an average DAR of 1.98.
  • Example 41 storage stability of compounds (41), (42), (51) and (52)
  • Samples were eluted at a flow rate of 1 mL/min by a gradient from 100% Buffer A (1.5 M ammonium sulfate, 50 mM monobasic sodium phosphate, 5% isopropanol (v/v), pH 7 .0) up to 20% buffer B (50 mM monobasic sodium phosphate, 20% isopropanol (v/v), pH 7.0) in 2 minutes then up to 85% buffer B in buffer A in 30 minutes. The temperature was maintained at 25°C throughout the separation.
  • Buffer A 1.5 M ammonium sulfate, 50 mM monobasic sodium phosphate, 5% isopropanol (v/v), pH 7 .0
  • buffer B 50 mM monobasic sodium phosphate, 20% isopropanol (v/v), pH 7.0
  • the temperature was maintained at 25°C throughout the separation.
  • Example 42 thermal stability of compounds (41), (42), (51) and (52)
  • Two (2) 70 ⁇ L samples of the different compounds were placed in polypropylene bottles (Fisher Scientific, 0.6 mL). After shaking, the samples were incubated in an incubator (VWR INCU-line IL23) at 40°C. The flasks were removed one by one from the incubator, centrifuged for 2 minutes at 5000 g and stored at -80°C after 1 week and 4 weeks.
  • Example 43 Stability at 37° C. in the presence of HSA (Human serum albumin) of compounds (41), (42), (51) and (52)
  • PBS buffer 1 mM monobasic sodium phosphate, 3 mM dibasic sodium phosphate, 155 mM sodium chloride, 1 mM d sodium azide, pH 7.4
  • each of the 4 flasks was centrifuged for 30 seconds at 5000 g before incubation at 37° C. in an incubator (VWR INCU-line IL23).
  • the flasks were removed one by one from the incubator kept at -80°C after 1 minute (T0), 24 h, 48 h and 120 h.
  • Samples were eluted at a flow rate of 1 mL/min by a gradient from 100% Buffer A (1.5 M ammonium sulfate, 50 mM monobasic sodium phosphate, 5% isopropanol (v/v), pH 7 .0) to 100% buffer B (50 mM monobasic sodium phosphate, 20% isopropanol (v/v), pH 7.0) in 50 min. The temperature was maintained at 25°C throughout the separation.
  • Buffer A 1.5 M ammonium sulfate, 50 mM monobasic sodium phosphate, 5% isopropanol (v/v), pH 7 .0
  • buffer B 50 mM monobasic sodium phosphate, 20% isopropanol (v/v), pH 7.0
  • the different samples were diluted to a concentration of 0.1 ⁇ M in PBS Gibco IX buffer.
  • the HER2 antigen (Interchim) was immobilized overnight at 4° C. in two 96-well plates (Thermo Scientific) at a concentration of 1 pg/mL (100 ⁇ L per well).
  • the wells were then saturated with 300 ⁇ L per well of a 3% BSA solution in PBS for 1 h at 37°C.
  • the samples were deposited in the wells at decreasing concentrations from 100 to 0.001 nM (100 ⁇ L per well) then incubated for 1 hour at 37°C.
  • the L-HRP protein (ThermoFisher, 0.25 pg/ ⁇ L diluted to 1/800) was deposited in the wells (100 ⁇ L) and left to incubate for 1 hour at 37°C. 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (100 ⁇ L per well) was added and left to react for a few minutes. Finally, 1 M H 2 SO 4 (50 ⁇ L per well) was added to stop the reaction and the absorbance of the two 96-well plates was read at 450 nm using the Multiskan system (Thermo Scientific) and the ELISA software “ ascent software for iEMS Reader MF”.
  • the compounds (41), (42), (50) and (52) according to the invention recognize the HER2 antigen in a manner similar to the compound TTZ. That is to say that neither the hook pattern, nor the DAR, nor the click reaction influence the recognition of the compounds described vis-à-vis the antigen.
  • Example 45 compound (54): conjugate trastuzumab - compound (14) - compound (53)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (4.0 eq), compound (14) (1 st compound) (3.0 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (53) (2 nd compound) (30.0 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Bioconjugation reaction 3 for 2h30 at 25°C then 17h at 25°C.
  • Example 46 compound (55): conjugate trastuzumab - compound (14) - compound (9)
  • Bioconjugation buffer 1 5.0 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (15.0 eq), compound (14) (1 st compound) (7.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 70% DMF and 30% MeOH, compound (9) (2 nd compound) (70.0 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser

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Abstract

L'invention concerne un conjugué de formule (I) pour utilisation comme médicament : (I) dans laquelle Ac, la tête d'accroche, le bras de liaison, l'espaceur, M et u sont tels que définis dans la description.

Description

Conjugués anticorps-médicament pour utilisation thérapeutique
Domaine Technique
La présente invention concerne des conjugués anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») pour utilisation comme médicament, notamment pour utilisation dans le traitement du cancer.
Etat de la technique
Le début des années 2000 a vu une intensification de la recherche sur des conjugués anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC »), ces conjugués représentant potentiellement une alternative ou un complément aux thérapies « classiques » pour délivrer de manière ciblée un principe actif, notamment un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués.
La structure d'un conjugué anticorps-médicament consiste typiquement en un anticorps lié au médicament par une molécule dont une partie va fixer l'anticorps et une autre partie va se coupler au médicament, généralement par l'intermédiaire d'un bras d'espacement (ou linker) de longueur et nature variables.
Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est le plus souvent internalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament dans la cellule ciblée.
Des conjugués anticorps-médicament sont décrits dans la demande WO 2015/004400. Par ailleurs, la demande WO 2022/018371 décrit des têtes d'accroche qui permettent l'obtention de composés qui, lorsqu'ils sont conjugués à des protéines, notamment des anticorps, permettent l'obtention d'une « structure » telle qu'en moyenne le nombre de tête d'accroche conjuguée par protéine (anticorps) est contrôlé : le conjugué majoritaire visé portant soit 1 molécule par protéine (anticorps) soit 2 molécules par protéine (anticorps). Résumé de l'invention
La présente invention concerne un conjugué de formule (I) pour utilisation comme médicament :
Figure imgf000003_0001
dans laquelle :
- Ac est un anticorps ou un fragment d'anticorps ;
- la tête d'accroche, le bras de liaison, l'espaceur, M et u sont tels que définis ci-après.
La présente invention concerne également un conjugué de formule (I) pour utilisation dans une méthode de traitement du cancer.
Définitions
Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CHI, CH2 , CH3, CH4, pour la chaîne lourde.
On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins deux ponts disulfure, par exemple Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc.
Les termes « Fab' », « F(ab')2 » et « scFv-Fc » désignent des fragments d'anticorps qui conservent la capacité dudit anticorps à se lier un antigène. Le fragment F(ab')2 est obtenu par digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine ou par IdeS. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab (constituée des régions variables et des domaines CH1 et CL) et d'une région charnière. Le fragment scFv-Fc est un fragment issu de l'ingénierie des protéines est constitué du fragment scFv (single chain Fragment variable) et lié à un fragment Fc. Le fragment scFv est constitué uniquement des domaines variables VH et VL avec une structure stabilisée par un court bras peptidique flexible, appelé linker, qui est placé entre les deux domaines.
Le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie approuvé par une agence règlementaire fédérale ou d'État ou énuméré dans la pharmacopée américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue, et s'applique à un produit destiné à être utilisé chez les animaux et/ou chez l'homme. Une « composition pharmaceutique » désigne une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, un véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel l'agent thérapeutique est administré. Ces véhicules peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris ceux d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc. L'eau est un véhicule préféré lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie intraveineuse. Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en particulier pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires. Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par exemple de l'amidon de maïs prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de l'hydroxypropyl méthylcellulose); des charges (par exemple du lactose, de la cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par des procédés bien connus dans l'état de la technique. Les préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule approprié avant utilisation. De telles préparations liquides peuvent être préparées par des moyens classiques avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des dérivés de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple des p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique). Les compositions pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas. La composition selon l'invention est de préférence une composition pharmaceutique.
Le terme « traiter » ou « traitement » englobe tout effet bénéfique ou souhaitable sur une pathologie ou un état pathologique, et peut même inclure une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie ou de l'état pathologique. Le traitement peut par exemple impliquer soit la réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état pathologique. Le terme « traitement » ne signifie pas nécessairement l'éradication complète ou la guérison de la pathologie, ni des symptômes associés.
Brève description des figures
La Figure IA représente l'évaluation des performances de conjugués représentatifs de l'invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 positive (BT-474).
La Figure IB représente l'évaluation des performances de conjugués représentatifs de l'invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 négative (MCF-7).
La Figure 2A représente l'évaluation des performances de conjugués représentatifs de l'invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 positive (BT-474).
La Figure 2B représente l'évaluation des performances de conjugués représentatifs de l'invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 négative (MCF-7).
La Figure 3A représente l'évaluation des performances d'un conjugué représentatif de l'invention, comparé à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 positive (BT-474).
La Figure 3B représente l'évaluation des performances d'un conjugué représentatif de l'invention, comparé à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 négative (MCF-7). La Figure 4A représente l'évaluation des performances de conjugués représentatifs de l'invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 positive (SK-BR-3).
La Figure 4B représente l'évaluation des performances de conjugués représentatifs de l'invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 négative (MCF-7).
La Figure 5A représente l'évaluation des performances de conjugués représentatifs de l'invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de carcinome à cellules de Merkel CD56 positive (WaGa).
La Figure 5B représente l'évaluation des performances de conjugués représentatifs de l'invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de carcinome à cellules de Merkel CD56 positive (PeTa).
La figure 6A représente la stabilité au stockage, suivie par l'évolution du DAR moyen au cours du temps, de conjugués représentatifs de l'invention.
La figure 6B représente la stabilité au stockage, suivie par l'évolution de la pureté monomérique au cours du temps, de conjugués représentatifs de l'invention.
La figure 7A représente la stabilité thermique, suivie par l'évolution du DAR moyen au cours du temps, de conjugués représentatifs de l'invention.
La figure 7B représente la stabilité thermique, suivie par l'évolution de la pureté monomérique au cours du temps, de conjugués représentatifs de l'invention.
La figure 8 représente la stabilité thermique en présence de HSA, suivie par l'évolution du DAR moyen au cours du temps, de conjugués représentatifs de l'invention.
La figure 9A représente la cinétique de reconnaissance de l'antigène HER2 par le TTZ et les composés 41 et 42.
La figure 9B représente la cinétique de reconnaissance de l'antigène HER2 par le TTZ et les composés 50 et 52.
Description détaillée de l'invention
Selon un premier aspect, l'invention concerne un conjugué de formule (I) pour utilisation comme médicament :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle : a) Ac est un anticorps ou un fragment d'anticorps ; b) u est tel que 0,5 < u < 3,5 ; c) la tête d'accroche est un composé de formule (II) ou (II') :
Figure imgf000007_0001
dans lesquelles :
- W est -ORa, -COR2, -CONR3R4 ou -NR3COR4 ;
- Ra est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -CORb, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ;
Rb est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5,
-O(CRcRd)r-R5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r- R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ;
- R2 est -OH, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-R5, -O(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, O(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ;
- R3 est -H, -(Ci-C6)alkyle ou -(CH2)V-SO3H, de préférence R3 est -H ou -(Ci-C6)alkyle ;
R4 est -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, -(CH2CH2O)q- (CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r- NHCO-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-R5]2, ou -CH-[(CRcRd)r- NHCO-(CRcRd)r-R5]2, de préférence R4 est -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q- (CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ;
- chaque R5 est -(CH2)SR6 ou -(CH2)SR7 ;
- R6 est -COOH ou -NR8R9; - chaque R7 est choisi parmi :
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
- Rc est H ;
- chaque Rd est choisi parmi -H, -CH2-SO3H ou -SO3H ;
- R8 est -H ou -(Ci-C6)alkyle ; - R9 est -H ou -(Ci-C6)alkyle ;
- R10 est -H ou -CH3 ;
- chaque q est un entier allant de 1 à 24 ;
- chaque r est un entier allant de 1 à 8 ;
- chaque s est un entier allant de 0 à 6 ; - chaque v est un entier allant de 1 à 6 ; d) le bras de liaison est une liaison directe ; un pont -S-S- ; ou un groupe de formule -R11(A)z- dans laquelle :
- R11 est une liaison directe, un groupe R7-(CRcRd)r-CO- ou un groupe R7-(CH2CH2O)q- (CH2)S-CO-, OU un groupe R7-(CRcRd)r-NH- où R7, Rc, Rd, q, r et s sont tels que définis ci- dessus ;
- A est un résidu d'acide aminé ;
- z est égal à 1, 2, 3, 4 ou 5. e) l'espaceur est une liaison directe ou est choisi parmi :
Figure imgf000010_0001
- G est un sulfate, un sucre, un glucuronide, ou un galactoside, ledit sucre étant un groupe saccharide choisi de préférence parmi un acide bêta-glucuronique, un bêta-D- galactose, un beta-D-glucose, un alpha-D-mannose, un N-acétyl-D-glucosaminyle, un N- acétyl-D-galactosaminyle, un D-glucuronyle, un L-iduronyle, un D-glucopyranosyle, un D- galactopyranosyle, un D-mannopyranosyle ou un L-fucopyranosyle, de préférence G est un sulfate, un acide bêta-glucuronique, ou un bêta-D-galactose ;
- G peut également représenter un site de clivage par une sulfatase, une glucosidase, la galactosidase, l'iduronidase, la béta-glucuronidase, la mannosidase, la N-acétyl-D- glucosaminidase ou par la N-acétyl-D-galactosaminidase ;
- R12 est -H ou -NO2. f) M est un principe actif ou un chélateur de radionucléide, de préférence M est un principe actif ; étant entendu que l'un au moins du bras de liaison et de l'espaceur est présent dans le conjugué de formule (I).
Dans certains modes de réalisation, la tête d'accroche est un composé de formule (II).
Dans certains modes de réalisation, W est -CONR3R4 ou -NR3COR4, de préférence W est - CONR3R4 ;
- R3 est -H ou — (C1-C6)alkyle ;
- R4 est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, ou -(CRcRd)r-R5 ;
- R5 est -(CH2)sR6 ou -(CH2)sR7 ;
- R6 est -COOH ;
- R7 est choisi parmi :
Figure imgf000011_0001
- Rc, Rd, R8 et R9 sont tels que définis ci-dessus ;
- q est un entier allant de 1 à 12, de préférence q est un entier allant de 1 à 8 ;
- r est un entier allant de 1 à 6. Dans certains modes de réalisation, la tête d'accroche est un composé de formule (lia),
(IIb), (IIe), (IId), (IIe), (Ilf), (Ilg), (Ilh) ou (Il'a) :
Figure imgf000011_0002
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Dans certains modes de réalisation, le bras de liaison est une liaison directe (auquel cas l'espaceur n'est pas une liaison directe).
Dans certains modes de réalisation, le bras de liaison est un groupe de formule -R11-(A)Z- tel que défini ci-dessus, avec z = 2, 3 ou 4. La formule -(A)z- représente une succession de z résidus d'acides aminés identiques ou différents, naturels ou non naturels. Lesdits acides aminés peuvent être choisis dans le groupe constitué de : une valine, une citrulline, une phénylalanine, une lysine, un acide aspartique, une alanine, une arginine, une glycine ou un acide glutamique.
Avantageusement, z est égal à 2, 3 ou 4 et -(A)z- est un groupe d'acides aminés choisi parmi : une valine et une citrulline ; une phénylalanine et une lysine ; une valine et une alanine ; deux alanines ; un acide aspartique, une valine et une citrulline ; un acide glutamique, une valine et une citrulline ; trois glycines ; deux glycines, une phénylalanine et une glycine. De préférence, z est égal à 2 et -(A)z- est un groupe d'acides aminés choisi parmi : une valine et une citrulline ou une valine et une alanine.
De manière également avantageuse, -(A)z- peut représenter un site de clivage par une enzyme choisie parmi les enzymes de type cathepsine B, cathepsine C, cathepsine D, les enzymes choisies parmi la plasmine, une enzyme lysosomale, l'urokinase (également appelée activateur du plasminogène de type urokinase (uPA)), l'élastase, la protéinase 3, la cathepsine G.
-(A)z- peut aussi représenter un site de clivage par une enzyme de type métalloprotéinase matricielle (MMP). Dans ce cas, l'enzyme type métalloprotéinase matricielle (MMP) est choisie de préférence parmi les collagénases 1, 2 et 3 (MMP-1, MMP-8, MMP-13), les gélatinases A et B (MMP-2 et MMP-9), les stromélysines 1 et 2 (MMP-3 et MMP-10), les matrilysines 1, 2 et 3 (MMP-7, MMP-26, MMP-11), l'élastase des macrophages (MMP-12), les MMP membranaires (MMP-14, MMP-15, MMP-16 MMP-17, MMP-24 et MMP-25), l'énamélysine (MMP-20), la CA-MMP (MMP-23), l'épilysine (MMP-28), la MMP-19, la MMP- 21 et la MMP-27.
-(A)z- peut également représenter un site de clivage par une estérase, une carboxylestérase, les protéases et les cathepsines.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « site de clivage » la position où a lieu la coupure de la chaîne peptidique par une enzyme, par exemple le site Valine- Citrulline.
Dans certains modes de réalisation, l'espaceur est une liaison directe (auquel cas le bras de liaison n'est pas une liaison directe) ou un groupe de formule :
Figure imgf000014_0001
Dans un mode de réalisation particulier, l'espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
Figure imgf000015_0001
Dans certains modes de réalisation, M est un principe actif. A titre de principe actif susceptible d'être utilisé dans le cadre de l'invention, on peut citer les principes actifs de médicaments déjà autorisés et les molécules en cours d'évaluation thérapeutique, en particulier :
- les agents alkylants tels que : chlorambucile, chlornaphazine, cyclophosphamide, dacarbazine, estramustine, ifosfamide, méchloréthamine, chlorhydrate d'oxyde de méchloréthamine, mannomustine, mitobronitol, melphalan, mitolactol, pipobroman, novembichine, phénesterine, prednimustine, thiotépa, trofosfamide, moutarde à l'uracile, CC-1065 (y compris ses analogues synthétiques adozélésine, carzélésine et bizélésine), duocarmycine (y compris les analogues synthétiques KW-2189 et CBI-TMI), dimères de benzodiazépine (par exemple, dimères de pyrrolobenzodiazépine (PBD) ou tomaymycine, indolinobenzodiazépines, imidazobenzothiadiazépines, ou oxazolidino-benzodiazépines), nitro-urées (carmustine, lomustine, chlorozotocine, fotemustine, nimustine, ranimustine), alkyl sulfonates (busulfan, tréosulfan, improsulfan et piposulfan), triazènes (dacarbazine), composés à base de platine (carboplatine, cisplatine, oxaliplatine), aziridines (benzodopa, carboquone, meturedopa, et uredopa), éthylène-imines et mélamines (incluant altrétamine, triéthylènemélamine, triéthylenephosphoramide, triéthylènethio- phosphaoramide et triméthylolomelamine) ;
- les alcaloïdes végétaux tels que : alcaloïdes de Vinca (vincristine, vinblastine, vindésine, vinorelbine, navelbine), les taxoïdes (paclitaxel, docetaxol) et leurs analogues, les maytansinoïdes (DM1, DM2, DM3, DM4, maytansine et ansamitocines) et leurs analogues, les cryptophycines (en particulier la cryptophycine 1 et la cryptophycine 8), les épothilones, eleuthérobine, discodermolide, bryostatines, dolastatines, auristatines, tubulysines, céphalostatines, pancratistatines, sarcodictyine, spongistatines ;
- les inhibiteurs d'ADN topoisomérase tels que : épipodophylline (9-aminocamptothécine, camptothécine, crisnatol, daunomycine, étoposide, étoposide phosphate, irinotécan, mitoxantrone, novantrone, acides rétinoïques (rétinols), téniposide, topotecan, 9- nitrocamptothécine (RFS 2000), mitomycines (mitomycine C), bortezomib ; - les anti-métabolites tels que : les anti-folates (inhibiteurs DHFR (méthotrexate, trimétrexate, dénopterine, ptéroptérine, aminoptérine (acide 4-aminoptéroïque) et autres analogues de l'acide folique), les inhibiteurs de l'IMP déshydrogénase (acide mycophénolique, tiazofurine, ribavirine, EICAR), les inhibiteurs de ribonucléotide réductase (hydroxyurée, déferoxamine), les analogues de pyrimidine tels que : analogues d'uracile (ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, capécitabine, carmofur, cytarabine, didésoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, 5-fluorouracile, floxuridine, ratitrexed), analogues de cytosine (cytarabine, cytosine arabinoside, fludarabine), analogues de purine (azathioprine, fludarabine, mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine), acide folinique ;
- les agents hormonaux tels que : anti-estrogènes (mégestrol, raloxifène, tamoxifène), agonistes LHRH (goséréline, acétate de leuprolide), anti-androgènes (bicalutamide, flutamide, calustérone, propionate de dromostanolone, épitiostanol, goséréline, leuprolide, mépitiostane, nilutamide, testolactone, trilostane), analogues de la vitamine D3 (CB 1093, EB 1089, KH 1060, cholécalciférol, ergocalciférol), thérapies photodynamiques (verteporfine, phthalocyanine, photosensibilisateur Pc4), cytokines (interféron-alpha, interféron-gamma, facteur de nécrose tumorale (TNF), protéines humaines contenant un domaine TNF) ;
- les inhibiteurs de kinase tels que : BIBW 2992, CYT387, E7080, axitinib, bafetinib, bosutinib, cabozantinib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, iniparib, ispinesib, lapatinib, masitinib, mubritinib, nilotinib, pazopanib, pegaptanib, ponatinib, ruxolitinib, sorafénib, sunitinib, tivozanib, vandetanib, vismodegib ;
- les inhibiteurs de poly(ADP-ribose)polymérase (PARP) tels que : BGB-290, CEP 9722, E7016, 3-aminobenzamide, niraparib, olaparib, talazoparib, veliparib ;
- les immunomodulateurs tels que : thalidomide, lénalidomide, pomalidomide ;
- une toxine telle que l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin ;
- l'anthracycline et les dérivés de ce principe actif ;
- les oligonucléotides.
Dans un mode de réalisation particulier, le principe actif est choisi parmi le méthotrexate, un immunomodulateur, la duocarmycine, la combrétastatine, la calichéamicine, la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), DM1, DM4, SN38, l'amanitine et ses analogues, la pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l'histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et la ricine, de préférence le principe actif est l'amanitine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la MMAF ou la MMAE, ces deux dernières étant représentées par les formules suivantes :
Figure imgf000017_0001
HMAE
Dans certains modes de réalisation, M est un chélateur de radionucléide. A titre de chélateur de radionucléide susceptible d'être utilisé dans le cadre de l'invention, on peut citer la sarcophagine, le DOTA (acide 1,4,7, 10-tétraazacyclododécane-1, 4, 7,10- tétraacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10-tris(carboxyméthyl)-1,4,7,10- tétraazacyclododécan-l-yl)pentanedioïque), le NODA (acide l,4,7-triazacyclononane-1,4- diacétique), le NODAGA (acide l,4,7-triazacyclononane,l-glutarique acide-4,7-diacétique), le NOTA (acide-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacétique) et le MANOTA (acide 2,2',2"-[2- (aminométhyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triyl]triacétique).
Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou le fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à un antigène spécifique d'un cancer. L'antigène spécifique du cancer peut être, par exemple, CDla, CD3, CD4, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD39, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD66e, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79, CD80, CD86, CD117, CD138, CD194, CD205, CD227, VEGF, EpCAM, GPIIb, GPIIIa, TNF alpha, TNFR, TNT, Lewis Y, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, AXL, Protéine F, IgE-Fc, C5, IL-6R, IL12, IL15, IL18, IL23, IL-1, TPO-R, GPNMB, PSMA, PSA, PAP, PSM, Cripto, Récepteur 1 des folates, récepteurs de l'endothéline ETB, STEAP1, SLC44A4 (AGS-5), AGS-16, Guanylyl cyclase C, EGFRvIII, Mésothéline, IL2R, A33, Can, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, TGFbeta, TGFbetaR, FGF, FGFR, PDGF, PDGFR, Ang-1, Ang-2, intégrine, RANK-L, BLyS, c-MET, DR, TCRalpha,beta, ICOS, EphA2, CA6, ENPP3, FOLR1, Nectine-4, TIM-1, facteur tissulaire, LIV-1, TLR-7, AFP, HLA-DR, antigène carcinoembryonnaire (ACE), TAG-72, protéine de liaison des folates, G250, gangliosides, collagène de type 4 (collagène IV), collagène de type 18 (collagène XVIII), CA19-9, P185HER2, protéine d'activation des fibroblastes (FAP), ténascine, métalloprotéinases, l'endosialine, anhydrase carbonique, Galectine 9, Aldolase A, eIFgamma4, Galectine 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, Restin, NY-CO-38, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, HGFR, PTK 7, CCK-4, PTP-LAR, CDCP1, CADM1, IGSF4, BCAM, CEACAM6, JAM-A, PTGFRN (CD9P-1), MCAM, MCP, EMMPRIN, TfR, ClqR, hTERT, Survivine, MDM2, CYP1B1, MART-1, MART-2, protéines mélanosomales, gplOO, CDC27, MAGEs, WT1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, BRAF, TPI, fibronectine, K-ras, beta-caténine, CDK4, caspase-8, pl4ARF, pl6INK4a, bcr-abl, SYT-SSX, TRP-1, TRP-2, GnT-V, tyrosinase, TEL-AML1, protéinase 3, EBV-EBNA, HTLV-1 tax, HPV16-E7, HLA-A2 muté, HAÏ, SART3, CEACAM5, ESAT-6, RANK, fibrine, TF, PRAME,
CA19-9, CA50, CA195, CAM17.1/WGA, beta-MG, DU-PAN2, HE4, transferrine, transthyrétine, ApoAl, TROP-2, CTLA-4, GITR, PD-1, PD-L1, c-KIT, CDllb-CD18 intégrine hétérodimère, DNA/Histone Hl, protéoglycane, fibrinogène, le grand antigène T SV40, SC-Ag, ESA, mucine, CCR4, MTX1, MTX2, PECAM, Tn, cathepsine D, TYRO-3, MER, ou un complexe PF4/héparine.
Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou un fragment Fab', F(ab')2 ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à HER2, CD30 ou CD56. Il peut donc par exemple s'agir d'un anticorps anti-HER2, d'un anticorps anti-CD30 ou d'un anticorps anti-CD56.
L'anticorps, le fragment Fab' ou le fragment F(ab')2, ou le fragment scFv-Fc peut être d'origine mammifère (par exemple humain ou murin), chimérique, humanisé. Il s'agit de préférence d'un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement décrites dans l'art antérieur.
Dans certains modes de réalisation, l'anticorps est de type IgG, par exemple IgGl, IgG2,
IgG3 ou IgG4.
Les conjugués de formule (I) peuvent être obtenus comme décrit dans la demande WO
2022/018371, par exemple par conjugaison entre un anticorps, ou un fragment Fab',
F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps, et un composé de formule (I') :
Figure imgf000018_0001
(I') dans laquelle le bras de liaison, l'espaceur et M sont tels que définis ci-dessus, et la tête d'accroche répond à la formule (III) ou (III') :
Figure imgf000019_0001
dans lesquelles W est tel que défini ci-dessus.
Les conditions de conjugaison sont par exemple celles décrites dans la demande WO 2022/018371 ou celles précisées ci-après.
L'anticorps, ou le fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc, se lie à la tête d'accroche par une réaction de substitution des groupes Br présents dans la formule (III) ou (III').
Les composés de formule (I') peuvent être obtenus par couplage des différents éléments qui en composent la structure (tête d'accroche (III) ou (III'/bras de liaison/espaceur/M). Par exemple, et de manière non limitative, les composés de formule (I') peuvent être obtenus par couplage entre un composé de formule (III) ou (III') et un composé de formule (V) :
Figure imgf000019_0002
Le couplage entre la tête d'accroche et le bras de liaison peut se faire soit de manière conventionnelle, par exemple par couplage de type peptidique entre un groupement carboxylique et un groupement amino, soit par mise en œuvre d'une réaction dite « click ». Un couplage de type peptidique a classiquement lieu entre un groupe carboxylique porté par la tête d'accroche, et un groupe amine porté par le bras de liaison ou, le cas échéant avec un groupe amine porté par l'espaceur (si le bras de liaison est une liaison directe). L'homme du métier comprendra que le groupe réactif de W qui va former la liaison de type peptidique avec le bras de liaison (ou l'espaceur) est, dans le contexte de la présente invention, défini tel qu'il est avant la réaction de couplage avec le groupe réactif du bras de liaison (ou de l'espaceur). Un couplage par réaction click peut avoir lieu lorsque la tête d'accroche et le bras de liaison porte chacun un substituant R7. De manière plus précise, la réaction click s'effectue entre un diène (par exemple un azoture ou un diazo) et un diénophile (par exemple un alcène ou un alcyne), chacune de ces fonctions étant apportée par le groupe R7. Ainsi, la réaction click peut s'effectuer entre un diène apporté par le groupe R7 de la tête d'accroche et un diénophile apporté par le groupe R7 du bras de liaison, ou bien entre un diénophile apporté par le groupe R7 de la tête d'accroche et un diène apporté par le groupe R7 du bras de liaison. Ces réactions click sont bien connues de l'homme du métier, étant entendu que les deux groupes R7 sont judicieusement choisis compatibles entre eux. Le couplage entre le bras de liaison et l'espaceur, et entre l'espaceur et M, se fait de manière conventionnelle, par exemple par couplage de type peptidique.
A titre illustratif, lorsque la tête d'accroche de formule (III) ou (III') comprend un substituant W = COR2 avec R2 = OH, son couplage avec le bras de liaison du composé de formule (V) peut intervenir lorsque ce dernier est un groupe de formule -R11-(A)Z- (R11 = liaison directe), via une liaison peptidique entre le groupe carboxylique provenant de W et un groupe amino provenant de A (résidu d'acide aminé). De manière similaire, lorsque le bras de liaison est absent, le couplage de la tête d'accroche avec l'espaceur intervient, toujours via une liaison peptidique, entre le groupe carboxylique provenant de W et un groupe amino provenant de l'espaceur.
Toujours à titre illustratif, lorsque la tête d'accroche de formule (III) ou (III') comprend un groupe terminal R5 = -(CH2)SR6 avec R6 = -COOH (porté par le substituant W), le couplage entre la tête d'accroche et le bras de liaison (ou le cas échéant, l'espaceur) du composé de formule (V) peut intervenir via une liaison peptidique comme expliqué ci- dessus. Lorsque R6 = -NR8R9, le couplage entre la tête d'accroche et l'espaceur peut intervenir via une liaison peptidique entre le groupe amino provenant de R6 et un groupe carboxylique provenant de l'espaceur.
Les conjugués de formule (I) peuvent également être obtenus comme décrit dans la demande WO 2022/018371, par conjugaison entre un anticorps, ou un fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps, avec un composé de formule (III) ou (III') pour former un composé intermédiaire de formule (IV) suivi d'un couplage par réaction click (telle que décrite ci-dessus) entre un composé de formule (IV) et un composé de formule (V) :
Figure imgf000021_0001
dans laquelle la tête d'accroche (de formule (II) ou (II')), le bras de liaison, l'espaceur et M sont tels que définis ci-dessus.
Les conjugués de formule (I) possèdent un ratio de molécules « accrochées » ou « conjuguées » par anticorps (ou par fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc), désigné par la lettre u, compris dans la plage allant d'environ 0,50 à environ 3,50. On entend ici par « molécule » la structure de formule (I').
Dans certains modes de réalisation, l'anticorps (ou fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc) est conjugué en moyenne à l,00±0,50 (c'est-à-dire toute valeur allant de 0,50 à 1,50, par exemple 0,50 ; 0,51 ; > ; 1,49 ; 1,50) molécule(s), de préférence à l,00±0,30 molécule(s).
Dans certains modes de réalisation, l'anticorps (ou fragment F(ab')2) est conjugué en moyenne à 2,00±0,50 (c'est-à-dire toute valeur allant de 1,50 à 2,50, par exemple 1,50 ;
1.51 ; ; 2,49 ; 2,50) molécules, de préférence à 2,00±0,30 molécules.
Dans certains modes de réalisation, l'anticorps (ou fragment F(ab')2) est conjugué en moyenne à 3,00±0,50 (c'est-à-dire toute valeur allant de 2,50 à 3,50, par exemple 2,50 ;
2.51 ; ; 3,49 ; 3,50) molécules, de préférence à 3,00±0,30 molécules.
Le ratio « u », appelé également par la suite « DAR » (pour « drug to antibody ratio »), est déterminé pour chaque espèce (LHHL, LH, L, H, HH, LHH) par analyse SMHR (Spectrométrie de Masse Haute Résolution) en conditions dénaturantes. On entend ici par « drug » le principe actif ou chélateur de radionucléide M. Le DAR moyen est obtenu à partir du DAR par espèce pondéré par les proportions des espèces observées en analyse sur gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices. Seules les espèces majoritaires LHHL et LH ont été considérées pour ce calcul, la somme des proportions des autres espèces (L, H, HH et LHH) étant inférieure à 18%. La somme des proportions des espèces LHHL et LH a donc été ramenée à 100% en ne tenant pas compte des autres espèces. L'espèce « demi-anticorps » LH est observée en conditions dénaturantes. En solution (en conditions natives) cette espèce n'est pas présente de façon isolée, les interactions faibles maintiennent les deux LH ensembles. C'est pourquoi le DAR de l'espèce LH-LH non reconstruite correspond à 2 fois le DAR observé sur l'espèce LH.
Le DAR moyen a donc été calculé à l'aide de la formule suivante :
Figure imgf000022_0001
Dans certains modes de réalisation, le conjugué de formule (I) est présent dans une composition, qui peut être par exemple une composition pharmaceutique contenant un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables.
Selon un deuxième aspect, l'invention concerne un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus pour utilisation dans une méthode de traitement du cancer.
Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou un fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à HER2 et le cancer est un cancer HER2+.
Le terme « HER2 » désigne le « Human Epidermal growth factor Receptor 2 », qui est une protéine membranaire de la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique humain. « HER2 » est aussi appelé fréquemment « ErbB2 ».
Le terme « cancer HER2+ » ou « cancer HER2 positif » désigne un cancer impliquant une expression exacerbée de HER2. En particulier, le terme « cancer HER2+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une dérégulation du gène HER2. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein, le cancer du poumon, le cancer colorectal, le cancer de la tête et du cou, le cancer gastrique, le cancer du pancréas, le cancer urothélial, le cancer de l'endomètre, le cancer de l'ovaire, le cancer des trompes de Fallope, le cancer du col utérin, le cancer de l'utérus, le cancer de la vulve, le cancer des voies biliaires, le cancer de l'endothélium, le cancer du côlon, le cancer de l'anus, le cancer des glandes salivaires, le cancer du cerveau, le cancer de l'œsophage, le cancer de l'intestin, le cancer du foie, le cancer des glandes lacrymales, le cancer du larynx, le cancer du péritoine, le cancer de la prostate, le cancer des testicules, le cancer rénal, le cancer de la peau, le carcinome adénoïde kystique, l'angiosarcome, le cancer gastro-œsophagien, les leucémies, le cancer de la thyroïde, les lymphomes. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein, le cancer gastrique, le cancer gastro-œsophagien, le cancer de la vessie, le cancer de la vésicule biliaire, le cholangiocarcinome extrahépatique, de préférence le cancer du sein. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps est le trastuzumab ; dans ce mode de réalisation, la structure de formule (!') peut également être conjuguée à un Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc du trastuzumab.
Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou un fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à CD30 et le cancer est un cancer CD30+.
Le terme « CD30 » désigne le « Cluster de Différenciation 30 », qui est une glycoprotéine membranaire de la superfamille des récepteurs des facteurs de nécrose tumorale humaine (« tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF) »). « CD30 » est aussi appelé fréquemment « TNFRSF8 ».
Le terme « cancer CD30+ » ou « cancer CD30 positif » désigne un cancer impliquant une expression exacerbée de CD30. En particulier, le terme « cancer CD30+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une dérégulation du gène TNFRSF8. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer CD30+ est choisi parmi le lymphome de Hodgkin, le lymphome à cellules T, le lymphome périphérique à cellules T, le lymphome cutané à cellules T, le lymphome T hépatosplénique, le lymphome anaplasique à grandes cellules, le lymphome non- hodgkinien, le lymphome anaplasique systémique à grandes cellules, le lymphome T angio-immunoblastique, le lymphome T associé à l'entéropathie, le mycosis fongoïde, le lymphome diffus à grandes cellules B, la leucémie à cellules T de l'adulte, le syndrome de Sézary, le lymphome B primitif du médiastin, le lymphome de Hodgkin à sclérose nodulaire, le lymphome angio-centrique, la splénomégalie myéloïde. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer CD30+ est choisi parmi le lymphome de Hodgkin, le lymphome anaplasique à larges cellules, le lymphome périphérique à cellules T et le mycosis fongoïde.
Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps est le brentuximab ; dans ce mode de réalisation, la structure de formule (I') peut également être conjuguée à un fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc du brentuximab.
Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou un fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à CD56 et le cancer est un cancer CD56+.
Le terme « CD56 » désigne le « Cluster de Différenciation 56 », qui est une glycoprotéine membranaire membre de la super-famille des immunoglobulines (Ig) contenant 5 domaines de type Ig et deux domaines de type 3 de la fibronectine dans sa partie extracellulaire. Le CD56 est aussi appelé fréquemment « Neural-Cell Adhesion Molecule 1 (NCAM 1) ». Le terme « cancer CD56+ » ou « cancer CD56 positif » désigne un cancer exprimant le CD56. En particulier, le terme « cancer CD56+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une expression du CD56. Une expression du CD56 est fréquemment observée dans les carcinomes neuroendocrines, les tumeurs pédiatriques et certaines hémopathies. Elle est également rapportée dans certains mélanomes et sarcomes de tissus mous. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer CD56+ est choisi parmi les leucémies, les lymphomes, le cancer de la gaine nerveuse, le carcinome à cellules de Merkel, les syndromes myélodysplasiques, les myélomes, le neuroblastome, le cancer de l'ovaire, le cancer du poumon, les cancers neuroendocrines, rhabdomyosarcome, tumeur de Wilms, glioblastome, sarcome synovial, blastome pleuropulmonaire, splénomégalie myéloïde. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer CD56+ est choisi parmi les cancers neuroendocrines, le cancer du poumon ou le carcinome à cellules de Merkel, de préférence le carcinome à cellules de Merkel.
Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps ou le Fab', ou le F(ab')2, ou le scFv-Fc anti-CD56 comprend :
- un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 1, un CDR2 de séquence en acides aminés SEQ ID NO: 2, et un CDR3 de séquence en acides aminés SEQ ID NO: 3 ; et
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 4, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 5, et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 6.
Dans ce mode de réalisation particulier, le domaine variable de chaîne légère présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9 ; et le domaine variable de chaîne lourde présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10.
Ainsi, l'anticorps ou le Fab', ou le F(ab')2, ou le scFv-Fc anti-CD56 peut avoir une séquence en acides aminés SEQ ID NO : 9 pour le domaine variable de la chaîne légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 10 pour le domaine variable de la chaîne lourde. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps ou le Fab', ou le F(ab')2, ou le scFv-Fc anti-CD56 peut avoir une séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 pour la chaîne légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 pour la chaîne lourde. La chaîne lourde de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 peut également présenter une lysine additionnelle en position C terminal.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'anticorps peut être l'anticorps décrit sous la référence m906 dans la demande US 2018/0214568 Al. L'anticorps m906 est un anticorps anti-CD56 chimérique de type IgGl de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 pour la chaîne légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 pour la chaîne lourde.
L'invention est illustrée par les exemples ci-après, donnés à titre purement illustratif. Dans ces exemples, on utilise les abréviations suivantes :
ATCC = American Type Culture Collection
BSA = albumine de sérum bovin
DAR = ratio drogue-anticorps
DCC = dicyclohexylcarbodiimide
DIPEA = N, N-diisopropyléthylamine
DMAP = 4-diméthylaminopyridine
DMEM = Dulbecco's Modified Eagles Medium
DMF = N,N-diméthylformamide
DMSO = diméthyl sulfoxyde
DTT = dithiothréitol
EDTA = acide éthylènediaminetétraacétique
ESI = ionisation par electrospay
HCl = acide chlorhydrique
HER2 = Récepteur du facteur de croissance épidermique humain 2
HIC = chromatographie d'interactions hydrophobes
HOBt = hydroxybenzotriazole
HSA = albumine de sérum humain
MeCN = acétonitrile
MeOH = méthanol
MMAE = monométhyle auristatine E
MMAF = monométhyle auristatine F
NaCI = chlorure de sodium PBD = pyrrolobenzodiazépine
RMN = résonance magnétique nucléaire
RPMI = Roswell Park Memorial Institute
SEC = chromatographie d'exclusion stérique
SMHR = spectrométrie de masse à haute résolution
SVF = sérum de veau foetal
TA = température ambiante (20 °C sauf indication contraire)
TFA = acide trifluoroacétique tR = temps de rétention
TCEP = tris(2-carboxyéthyl)phosphine
TTZ = trastuzumab
UV = ultra-violet v/v = rapport volume sur volume
XTT = 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide
Méthodes d'analyse
Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton XH ont été réalisés sur un appareil Bruker Ultrashield 300 (300 MHz (1H)). Les analyses ont été réalisées dans le méthanol deutéré (CD3OD). Les déplacements chimiques (5) sont mesurés en parties par million (ppm) par rapport au signal résiduel du méthanol deutéré (5^ = 3,31 ppm).
Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hertz (Hz) et la multiplicité est décrite de la façon suivante : m = multiplet, s = singulet, t = triplet. Afin de clarifier la lecture des analyses RMN, la numérotation des atomes pour l'attribution des signaux a été fixée arbitrairement.
Spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR)
La masse exacte des composés synthétisés a été déterminée par spectrométrie de masse haute résolution (SMHR) en mode positif ou négatif avec la technique d'ionisation par électronébulisation ESI, sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex Ultimate 3000 RSLC de la plateforme « Fédération de Recherche » de l'ICOA/CBM (FR2708).
Spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR) dénaturante
L'analyse des conjugués a été réalisée sur un échantillon préalablement déglycosylé ou non. Dans le cas d'un échantillon déglycosylé, il a été dilué à une concentration de 1 pg/μL puis de la N-glycosidase F (0,02 unité/pg d'échantillon) a été ajoutée et l'échantillon a été incubé à 37 °C pendant au moins 16 h.
Méthode 1 : L'analyse a été réalisée sur un spectromètre de masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H-Class de Waters (Wilmslow, UK). Avant l'analyse, les échantillons (800 ng) ont été injectés sur une colonne XBridge BEH300 C4 2,1 x 50 mm, 1,7 pm, soit sur une colonne XBridge BEH300 C4 2,1 x 30 mm, 5 pm chauffée à 90 °C. Une étape de dessalage a été réalisée avec un gradient isocratique 95% de solvant A (H2O + 0,1% acide formique) et 5% de solvant B (MeCN + 0,1% acide formique) pendant 1,5-2 min à 0,5 mL/min. Puis, l'élution de l'échantillon a été réalisée avec un gradient de 20% à 35% de solvant B sur 7 min, de 50% à 90% de solvant B sur 3 min, et un isocratique de 1 min à 90% de B, soit avec un gradient de 5% à 50% de solvant B sur 2,9 min, de 50% à 90% de solvant B sur 0,5 min, un isocratique de 0,5 min à 90% de B, avec un débit de 0,4 mL/min. Une vanne de dérivation a été programmée pour permettre au solvant d'entrer dans le spectromètre entre 3 et 7,5 min seulement. Les données de spectrométrie de masse ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 500 à 4000 à une fréquence de scan de 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel UNIFI 1.9.4 et l'algorithme MaxEnt pour la déconvolution. Le DAR moyen par espèce (= nombre moyen de molécules conjuguées à l'anticorps utilisé pour la réaction de bioconjugaison) a été déterminé à l'aide de l'intensité des pics des espèces observés.
Méthode 2 : L'analyse spectrométrique de certains conjugués a été réalisée sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex Ultimate 3000 RSLC. Avant l'analyse MS, les échantillons (5 pg) ont été dessalés sur une colonne de dessalage MassPREP (2,1x10 mm, Waters), chauffés à 80 °C en utilisant une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% comme solvant A et une solution à 0,1% d'acide formique dans l'acétonitrile comme solvant B à 500 μL/min. Après 1 min, un gradient linéaire de 5 à 90% de B en 1,5 min a été appliqué. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 900 à 5000 à 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel DataAnalysis 4.4 (Bruker) et l'algorithme MaxEnt pour la déconvolution. Le DAR moyen par espèce (= nombre moyen de molécules conjuguées à l'anticorps utilisé pour la réaction de bioconjugaison) a été déterminé à l'aide de l'intensité des pics des espèces observés.
Gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes, non réductrices ou réductrices
Les échantillons ont été analysés par gel d'acrylamide SDS-PAGE tris-HCI. Un gel de concentration à 4% d'acrylamide sur un gel de migration à 6-7% d'acrylamide ont été utilisés. Du tampon Laemmli 4X (bleu de bromophénol 0,3 mM ; glycérol 2 M, TrisBase 20 mM ; 0,04% de dodécylsulfate de sodium) a été ajouté dans les échantillons (1,6 pg). En conditions réductrices, les échantillons ont été réduits à l'aide d'une solution de dithiothréitol (DTT) à 10% dans de l'eau (10% v/v). Ensuite, les échantillons ont été incubés à 95 °C pendant 10 min. Un marqueur de poids de moléculaire de grande amplitude (Invitrogen SeeBlue® Plus2 Prestained Standard) et l'anticorps natif ont été utilisés pour estimer les poids moléculaires des protéines. Le gel a été mis à migrer à 100 V pendant 10 min puis à 140 V pendant 35 min, dans un tampon de migration NuPAGE (MOPS 50 mM ; TrisBase 50 mM ; 0,1% SDS (v/v) ; EDTA 1 mM, pH 7,3). Après un lavage à l'eau, le gel a été coloré avec du bleu de Coomassie (Thermo Scientific Imperial TM Protein Stain). L'analyse densitométrique a été réalisée à l'aide du logiciel ImageJ et un filtre Vanilla de Windows a été appliqué pour l'analyse en noir et blanc. En conditions dénaturantes non réductrices, la densité optique relative des espèces LHHL et LH a été utilisée pour déterminer le DAR moyen du conjugué. En conditions dénaturantes réductrices, la densité optique relative mesurée pour l'espèce LHHL a déterminé la reconstruction de l'anticorps (en %).
Analyse HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography)
Les ADC synthétisés ont été filtrés sur 0,22 pm. 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 pm, 4,6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les ADC ont été élué à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu'à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu'à 85% de tampon B en 30 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 1 min. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
Analyse SEC (Size Exclusion Chromatography)
Les ADC synthétisés ont été filtrés sur 0,22 pm. 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 pm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm, d'un détecteur MALLS Wyatt (miniDawn™) et d'un détecteur d'indice de réfraction Wyatt (Optilab® T-rEX). Les ADC ont été élué à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d'azoture de sodium, pH 7,0) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
Réactions de bioconjugaison
Préparation des solutions
Tampon de bioconjugaison 1 : Tampon phosphate IX à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCI de 180 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
Tampon de bioconjugaison 2 : Tampon borate IX à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCI de 25 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
Réducteur 1 : Solution de chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP.HCI) à une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison.
Réducteur 2 : Solution de dithiothréitol (DTT) à une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison.
Réaction de bioconiuqaison 1 :
La solution d'anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Le réducteur (1,0-12,0 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37 °C pendant 2 h. Puis la solution de composé à conjuguer (1,0-15,0 éq, de préférence 5,0-12,0 éq ou 10,0-15,0 éq)) a été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à une température comprise entre 4 °C et 40 °C, de préférence 25 °C ou 37 °C pendant 2h30.
Réaction de bioconiuqaison 2 :
La solution d'anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Les solutions de composé à conjuguer (1,0-15,0 éq, de préférence 8,0-12,0 éq) puis de réducteur (1,0-15,0 éq, de préférence 8,0-12,0 éq) ont été ajoutées et le milieu réactionnel a été agité sous argon à une température comprise entre 4 °C et 40 °C, de préférence 25 °C ou 37 °C pendant 1 h à 5 h, de préférence 2h30.
Réaction de bioconiuqaison 3 :
La solution d'anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Les solutions du composé de formule (I) (1,0-15,0 éq, de préférence 8,0-12,0 éq ou 10,6-12,0 éq) puis de réducteur (1,0-15,0 éq, de préférence 8,0-12,0 éq.) ont été ajoutées et le milieu réactionnel a été agité sous argon à une température comprise entre 4 °C et 40 °C, de préférence 25 °C ou 37 °C pendant 1 h à 5 h, de préférence 2h30. La solution du composé de formule (V) (1,0-70,0 éq, de préférence 8,8-14,4 éq, par exemple 11,7 éq) a ensuite été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité à une température comprise entre 4 °C et 40 °C, de préférence 25 °C ou 37 °C pendant 17 h ou 24 h. Réaction de bioconiuqaison 4 :
La solution d'anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Le réducteur (1,0-12,0 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37 °C pendant 2 h. Puis la solution de composé à conjuguer (1,0-15,0 éq) a été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à une température comprise entre 4 °C et 40 °C, de préférence 25 °C ou 37 °C pendant 2h30. La solution du composé de formule (V) (1,0-30,0 éq) ensuite été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité à une température comprise entre 4 °C et 40 °C, de préférence 25 °C ou 37 °C pendant 17 h ou 24 h.
Exemples
Exemple 1 : 4-nitrophényl 1-[4-(6-méthyl-l,2,4,5-tétrazin-3-yl)phénoxy]- 3,6,9, 12-tétraoxa pentadécan- 15-oate (1)
[Chem24]
Figure imgf000030_0001
L'acide 4-méthyletéatrazinylphénoxy-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-oïque (12,2 mg ; 0,028 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le DMF anhydre (250 μL) puis le 4-nitrophénol (5,1 mg ; 0,036 mmol ; 1,3 éq), le DCC (7,5 mg ; 0,036 mmol ; 1,3 éq) et la DMAP (1,0 mg ; 0,008 mmol ; 0,3 éq) ont été ajoutés. Le milieu réactionnel a été placé sous agitation, sous argon à TA pendant 18h30. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 26,01 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 pm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l'eau (solvant A), et 0,1% de TFA (en volume) dans du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (1) (7,8 mg ; 50%) sous la forme d'une huile rose.
RMN (300 MHz, CD3OD) δ 8,53 - 8,42 (m ; 2H) ; 8,32 - 8,21 (m ; 2H) ; 7,42 - 7,31 (m ; 2H) ; 7,21 - 7,11 (m ; 2H) ; 4,29 - 4,20 (m ; 2H) ; 3,93 - 3,80 (m ; 4H) ; 3,75 - 3,66 (m ; 4H) ; 3,66 - 3,63 (m ; 8H) ; 3,00 (s ; 3H) ; 2,87 (t ; J= 6,0 Hz ; 2H).
SMHR (ESI) : m/z calculé pour C26H32N5O9 [M+H]+ : 558,2195 ; observé 558,2203. Exemple 2 : acide (2R)-2-[(2S)-2-[(S)-[(2R)-l-[(3S,4R,5R)-4-[(2R)-N,3- diméthyl-2-[(2R)-3-méthyl-2-{N-méthyl-1-[4-(6-niéthyl-1,2,4,5-tétrazin-3- yl)phénoxy]-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-amido}butanamido] butanamido]-3-méthoxy-5-méthylheptanoyl]pyrrolidin-2- yl](méthoxy)methyl]propanamido]-3-phénylpropanoïque (2) [Chem25]
Figure imgf000031_0001
A une solution de HOBt (2,0 mg ; 0,0151 mmol ; 2,1 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (100 μL) en présence de DIPEA anhydre (2,5 μL ; 0,0144 mmol ; 2,0 éq) a été ajouté le l-[4-(6-méthyl-1,2,4,5-tétrazin-3-yl)phénoxy]-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-oate de 4- nitrophényle (1) (7,1 mg ; 0,0128 mmol ; 1,8 éq). Puis une solution de sel d'acide trifluoroacétique de MMAF (6,1 mg ; 0,0072 mmol ; 1,0 éq.), solubilisé dans le DMF anhydre (100 μL), a été ajoutée au milieu réactionnel placé sous agitation, sous argon à 25 °C pendant 19 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 27,44 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 pm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l'eau (solvant A), et 0,1% de TFA (en volume) dans du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 90% de B sur 32 min puis 90% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (2) (1,4 mg ; 17%) sous la forme d'une huile violette.
RMN (300 MHz, CD3OD) δ 8,57 - 8,45 (m ; 2H) ; 8,41 - 8,08 (m ; 1H) ; 8,08 - 7,79 (m ; 1H) ; 7,37 - 7,06 (m ; 8H) ; 4,78 - 4,59 (m ; 1H) ; 4,32 - 4,22 (m ; 2H) ; 4,14 - 3,96 (m ; 2H) ; 3,96 - 3,85 (m ; 2H) ; 3,84 - 3,52 (m ; 13H) ; 3,48 - 3,35 (m ; 5H) ; 3,21 - 3,15 (m ; 2H) ; 3,14 - 3,03 (m ; 4H) ; 3,00 (s ; 3H) ; 2,97 - 2,89 (m ; 1H) ; 2,83 - 2,63 (m ; 1H) ; 2,61 - 2,40 (m ; 2H) ; 2,41 - 2,15 (m ; 2H) ; 2,15 - 1,67 (m ; 8H) ; 1,50 - 1,12 (m ; 3H) ; 1,12 - 0,76 (m ; 28H).
SMHR (ESI) : m/z calculé pour C59H92N9O14 [M+H]+ : 1150,6758 ; observé 1150,6754.
Les composés commerciaux ou issus de la demande PCT/FR2021/051345, utilisés pour les réactions de bioconjugaison sont résumés dans le Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Exemple 3 : composé (18) : conjugué trastuzumab - composé (3) - composé (4)
Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (3) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (4) (2eme composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2
Figure imgf000036_0001
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,17 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au composé (3) n'est observé : le conjugué trastuzumab-composé (3) a été entièrement converti.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3
Figure imgf000036_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 75% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,19.
Exemple 4 : composé (19) : conjugué trastuzumab - composé (3) - composé
(4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (3) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (4) (2eme composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4
Figure imgf000037_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au composé trastuzumab-composé (3) n'est observé : le conjugué trastuzumab-composé (3) a été entièrement converti.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5
Figure imgf000037_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 97% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00. Exemple 5 : composé (20) : conjugué trastuzumab - composé (5)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 2, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé (5) (5,0 éq) à une concentration de 0,4 mM dans un mélange de 80% de DM F et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 1.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6
Figure imgf000038_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 7 ci-dessous.
Tableau 7
Figure imgf000038_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 61% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00. Exemple 6 : composé (21) : conjugué trastuzumab - composé (6) - composé (7)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (6) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (7) (2eme composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 8 ci-dessous.
Tableau 8
Figure imgf000039_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées. L'incrément de masse est correct.
Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 9 ci-dessous.
Tableau 9
Figure imgf000039_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 58% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,07. Exemple 7 : composé (22) : conjugué trastuzumab - composé (6) - composé (7)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (6) (1er composé) (8,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (7) (2eme composé) (8,8 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 10 ci-dessous.
Tableau 10
Figure imgf000040_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 11 ci-dessous.
Tableau 11
Figure imgf000040_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 69% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00. Exemple 8 : composé (23) : conjugué trastuzumab - composé (8) - composé (9)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (8) (1er composé) (3,0 éq) à une concentration de 0,25 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (9) (2eme composé) (3,3 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 12 ci-dessous.
Tableau 12
Figure imgf000041_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,20 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 13 ci-dessous.
Tableau 13
Figure imgf000041_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,32. Exemple 9 : composé (24) : conjugué trastuzumab - composé (8) - composé (9)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (8) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 30% de DMF et 70% de MeOH, composé (9) (2eme composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 14 ci-dessous.
Tableau 14
Figure imgf000042_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 15 ci-dessous.
Tableau 15
Figure imgf000042_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 62% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00. Exemple 10 : composé (25) : conjugué trastuzumab - composé (10) - composé (4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (10) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (4) (2eme composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 16 ci-dessous.
Tableau 16
Figure imgf000043_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 17 ci-dessous.
Tableau 17
Figure imgf000043_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 77% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,00. Exemple 11 : composé (26) : conjugué trastuzumab - composé (10) - composé (4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (10) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (4) (2eme composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 18 ci-dessous.
Tableau 18
Figure imgf000044_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 19 ci-dessous.
Tableau 19
Figure imgf000044_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 84% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00. Exemple 12 : composé (27) : conjugué trastuzumab - composé (10) - composé commercial N3-PEG4-Val-Ala-PBD dimère (11)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (10) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé commercial N3-PEG4-Val-Ala-PBD dimère (11), (2eme composé) (10 éq) à une concentration de 0,5 mM dans du DMF.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé (10) est ajustée à 1,5 mg/mL avant l'ajout du composé commercial N3-PEG4-Val-Ala-PBD dimère (11) et le milieu réactionnel a été agité pendant 17h40.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 20 ci-dessous.
Tableau 20
Figure imgf000045_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,01 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n'ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 21 ci-dessous. Tableau 21
Figure imgf000046_0001
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 86% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,06.
Exemple 13 : composé (28) : conjugué trastuzumab - composé (10) - composé commercial N3-PEG4-Val-Ala-PBD dimère (11)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (10) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé commercial N3-PEG4-Val-Ala-PBD dimère (11), (2eme composé) (20 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMF.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé (10) est ajustée à 1,5 mg/mL avant l'ajout du composé commercial N3-PEG4-Val-Ala-PBD dimère (11) et le milieu réactionnel a été agité pendant 17h40.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 22 ci-dessous.
Tableau 22
Figure imgf000046_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,84 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 0,96 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n'ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 23 ci-dessous.
Tableau 23
Figure imgf000047_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 67% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,86. mple 14 : composé (29) : conjugué trastuzumab - composé (12) - composé
Figure imgf000047_0001
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (12) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (13) (2eme composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 24 ci-dessous.
Tableau 24
Figure imgf000047_0003
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,81 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 25 ci-dessous.
Tableau 25
Figure imgf000048_0001
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,84.
Exemple 15 : composé (30) : conjugué trastuzumab - composé (14) - composé (4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (14) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (4) (2eme composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 26 ci-dessous.
Tableau 26
Figure imgf000048_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,16 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 0,49 pour l'espèce LH. Les espèces LH H, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau TJ ci-dessous.
Tableau TJ
Figure imgf000049_0001
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 70% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,07.
Exemple 16 : composé (31) : conjugué trastuzumab - composé (14) - composé (4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (14) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (4) (2eme composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 28 ci-dessous.
Tableau 28
Figure imgf000049_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 29 ci-dessous.
Tableau 29
Figure imgf000050_0001
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 56% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 17 : composé (32) : conjugué trastuzumab - composé (14) - composé commercial N3-Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (14) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé commercial N3-Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15), (2eme composé) (12,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 30 ci-dessous.
Tableau 30
Figure imgf000050_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée 2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,39 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 0,95 pour l'espèce LH. Les espèces LH H, HH et H n'ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 31 ci-dessous.
Tableau 31
Figure imgf000051_0001
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 72% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,44.
Exemple 18 : composé (33) : conjugué trastuzumab - composé (14) - composé commercial N3-Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (14) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé commercial N3-Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15) (2eme composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 32 ci-dessous.
Tableau 32
Figure imgf000051_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée 2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 33 ci-dessous.
Tableau 33
Figure imgf000052_0001
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 52% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 19 : composé (34) : conjugué trastuzumab - composé (16)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (16) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DM F et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 34 ci-dessous.
Tableau 34
Figure imgf000052_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LHHL et de 0,61 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 35 ci-dessous.
Tableau 35
Figure imgf000053_0001
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 60% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,02.
Exemple 20 : composé (35) : conjugué trastuzumab - composé (16)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (16) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DM F et 80% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 36 ci-dessous.
Tableau 36
Figure imgf000053_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL et de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 37 ci-dessous. Tableau 37
Figure imgf000054_0001
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 54% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 21 : composé (36) : conjugué trastuzumab - composé (17) - composé (13)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (17) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (13) (2eme composé) (15,0 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé (17) est ajustée à 1,5 mg/mL avant l'ajout du composé (13) et le milieu réactionnel a été agité pendant 22h.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 38 ci-dessous.
Tableau 38
Figure imgf000054_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
3 : N.D. : impureté de structure non déterminée L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,02 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 0,80 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 39 ci-dessous.
Tableau 39
Figure imgf000055_0001
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,07.
Exemple 22 : composé (37) : conjugué trastuzumab - composé (17) - composé (13)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé (17) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (13) (2eme composé) (30,0 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé (17) est ajustée à 1,4 mg/mL avant l'ajout du composé (13) et le milieu réactionnel a été agité pendant 22h.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 40 ci-dessous.
Tableau 40
Figure imgf000055_0002
Figure imgf000056_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
3 : N.D. : impureté de structure non déterminée
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,70 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 0,90 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 41 ci-dessous.
Tableau 41
Figure imgf000056_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 56% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,74.
Exemple 23 : composé (38) : conjugué trastuzumab - composé (8) - composé
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (8) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 30% de DMF et 70% de MeOH, composé (9) (2eme composé) (30 éq) à une concentration de 2 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé (8) est ajustée à 1,4 mg/mL avant l'ajout du composé (2) et le milieu réactionnel a été agité pendant 17 h.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 42 ci-dessous. Tableau 42
Figure imgf000057_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,38 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 0,88 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n'ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 43 ci-dessous.
Tableau 43
Figure imgf000057_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 57% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,18.
Exemple 24 : Evaluation in vitro de la cytotoxicité des conjugués par test de XTT sur une lignée positive (BT-474) et une lignée négative (MCF-7) pour le récepteur HER2
Matériel et méthode
Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (BT-474 et MCF-7). Un aliquot de cellules BT-474 ou de cellules MCF-7 congelées a été décongelé rapidement dans un bain d'eau à 37°C et les cellules ont été lavées deux fois avec du milieu de culture avec du F12/DMEM supplémenté avec 8% de SVF, 100 pg/mL de L-glutamine, 100 pg/mL de pénicilline G de sodium, 100 pg/mL de streptomycine de sulfate pour les cellules BT-474 ou avec du DMEM GlutaMAX™ supplémenté avec 10% de SVF, 1% de pénicilline G de sodium, 1% de streptomycine de sulfate pour les cellules MCF-7. Puis les cellules ont été déposées dans une flasque de culture cellulaire de 75 cm2 à une densité d'au moins 10 000 cellules/cm2. Les cellules ont été maintenues à 37 °C dans une atmosphère humide avec 5% de CO2 pendant au moins une semaine.
Ensuite, les cellules MCF-7 et BT-474 ont été déposées dans des plaques 96-puits à des densités de 2 500 et 50 000 cellules par puits respectivement pour les essais de cytotoxicité. Les cellules ont été incubées 24 h à 37 °C avant l'addition des conjugués selon l'invention ou des contrôles testés et du véhicule (milieu seul). Les pourcentages de DMSO n'ont jamais excédé 0,5%. Les conjugués testés ont été ajoutés aux concentrations finales suivantes : 200 000 à 0,2 pM ; et incubés pendant 96 h.
Après 4 jours d'exposition aux conjugués, 25 μL de réactif XTT à 1 mg/mL avec 25 mM d'activateur (N-méthyl dibenzopyrazine méthyl sulfate) ont été ajoutés par puits et l'absorbance a été mesurée à 450 nm après 4 h d'incubation à 37 °C. La viabilité cellulaire est exprimée en moyenne (+/- SEM) du pourcentage obtenu.
Chaque concentration de composé a été réalisée en tripliqua et deux ou trois « N » expériences indépendantes ont été conduites.
Résultats
L'évaluation de la cytotoxicité sur la lignée cellulaire de cancer du sein HER2 positive BT- 474 a montré que les composés (24), (25), (26), (34), et (35) sont aussi cytotoxiques que la MMAE (toxine seule) et que l'ADC contrôle (conjugué Trastuzumab - MMAE issu de la demande PCT/FR2020/050833). Le trastuzumab (TTZ) seul (i.e. non couplé à MMAE), n'a pas d'effet cytotoxique sur cette même lignée aux plus faibles concentrations testées démontrant l'absence de toxicité intrinsèque de l'anticorps (Figures IA, 2A et 3A). Sur la lignée cellulaire de cancer du sein HER2 négative MCF-7, les composé (24), (25), (26), (34), (35), et l'ADC contrôle n'ont pas d'effets cytotoxiques aux plus faibles concentrations efficaces testées démontrant l'absence de toxicité intrinsèque de ces constructions (Figures IB, 2B et 3B). Ainsi, les composés (24), (25), (26), (34), et (35) sont efficaces sur les cellules exprimant la cible à leur surface uniquement.
Exemple 25 : Evaluation in vitro de la cytotoxicité des conjugués par test de XTT sur une lignée positive (SK-BR-3) et une lignée négative (MCF-7) pour le récepteur HER2
Matériel et méthode
Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (SK-BR-3 et MCF-7). Un aliquot de cellules SK-BR- 3 ou de cellules MCF-7 congelées a été décongelé rapidement dans un bain d'eau à 37 °C et les cellules ont été lavés deux fois avec du milieu de culture avec du DMEM GlutaMAX™ supplémenté avec 10% de SVF, 1% de pénicilline G de sodium, 1% de streptomycine de sulfate pour les cellules MCF-7. Puis les cellules ont été déposées dans une flasque de culture cellulaire de 75 cm2 à une densité d'au moins 10 000 cellules/cm2. Les cellules ont été maintenues à 37 °C dans une atmosphère humide avec 5% de CO2 pendant au moins une semaine.
Ensuite, les cellules SK-BR-3 et MCF-7 ont été déposées dans des plaques 96-puits à des densités de 50 000 cellules par puits pour les essais de cytotoxicité. Les cellules ont été incubées 24 h à 37 °C avant l'addition des conjugués selon l'invention et des contrôles testés. Les pourcentages de DMSO n'ont jamais excédé 0,5%. Les conjugués testés ont été ajoutés aux concentrations finales suivantes : 200 000 à 0,2 pM ; et incubés pendant 96 h.
Après 4 jours d'exposition aux conjugués, 25 μL de réactif XTT à 1 mg/mL avec 25 mM d'activateur (N-méthyl dibenzopyrazine méthyl sulfate) ont été ajoutés par puits et l'absorbance a été mesurée à 450 nm après 4 h d'incubation à 37 °C. L'absorbance à 620 nm a été utilisée comme référence. La viabilité cellulaire est exprimée en moyenne (+/-SEM) du pourcentage obtenu.
Chaque concentration de composé a été réalisée en tripliqua et deux ou trois « N » expériences indépendantes ont été conduites.
Résultats
L'évaluation de la cytotoxicité sur la lignée cellulaire de cancer du sein HER2 positive SK- BR-3 a montré que les composés (27) et (28) sont aussi cytotoxiques que la MMAE (toxine seule) et que l'ADC contrôle (conjugué Trastuzumab - MMAE issu de la demande WO 2020/234541) (Figure 4A). Sur la lignée cellulaire de cancer du sein HER2 négative MCF-7, les composés (27), (28), et l'ADC contrôle n'ont pas d'effets cytotoxiques aux plus faibles concentrations efficaces testées démontrant l'absence de toxicité intrinsèque de ces constructions (Figure 4B). Ainsi, les composés (27) et (28) sont efficaces sur les cellules exprimant la cible à leur surface uniquement.
Exemple 26 : composé (39) : conjugué anti-CD56 - composé (16)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, anticorps anti-CD56 à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (16) (4,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DM F et 20% de MeOH. Méthode
Réaction de bioconjugaison 2, pendant 1 h à 25 °C.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 44 ci-dessous.
Tableau 44
Figure imgf000060_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 0,86 pour l'espèce LHHL, de 0,60 pour l'espèce LH et de 0,00 pour l'espèce L. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées.
HIC
Les résultats sont présentés dans le Tableau 45 ci-dessous.
Tableau 45
Figure imgf000060_0002
L'analyse HIC a permis de déterminer un DAR moyen de 1,02.
Exemple 27 : composé (40) : conjugué anti-CD56 - composé (14) - composé (11)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, anticorps anti-CD56 à 4,8 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (14) (1er composé) (9,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (11) (2eme composé) (10,0 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3, pendant 2h30 à 25 °C puis 16 h à 25 °C. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 46 ci-dessous.
Tableau 46
Figure imgf000061_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 0,68 pour l'espèce LHHL, un DAR moyen de 1,0 pour l'espèce LH, et un DAR moyen de 0,00 pour l'espèce L. Les espèces LH H, HH, et H n'ont pas été observées. Une espèce correspondant à un incrément de masse correspondant au composé anti-CD56 - composé (14) a été observé : LHHL anti-CD56 - composé (14) DAR 1 à 56%. Le conjugué anti-CD56 - composé (14) n'a pas été entièrement converti.
HIC
Les résultats sont présentés dans le Tableau 47 ci-dessous.
Tableau 47
Figure imgf000061_0002
L'analyse HIC a permis de déterminer un DAR moyen de 0,77.
Exemple 28 : Evaluation in vitro de la cytotoxicité des conjugués par test de XTT sur des lignées positives (WaGa) et (PeTa) pour le récepteur CD56
Matériel et méthode
Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (WaGa et PeTa). Les cellules ont été incubées avec du milieu de culture Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté avec 10% de SVF, 1% de pénicilline, de streptomycine et d'amphotéricine B. Ensuite, les cellules WaGa et PeTa ont été déposées dans des plaques 96-puits à des densités de 50 000 cellules par puits pour les essais de cytotoxicité. Puis l'addition des conjugués selon l'invention ou des contrôles testés a été réalisée. Les conjugués testés ont été ajoutés aux concentrations finales suivantes : 200 000 à 2 pM ; et incubés pendant 96 h. Après 4 jours d'exposition aux conjugués, 25 μL de réactif XTT à 1 mg/mL avec 25 mM d'activateur (N-méthyl dibenzopyrazine méthyl sulfate) ont été ajoutés par puits et l'absorbance a été mesurée à 450 nm après 4 h d'incubation à 37 °C. Des cellules non- traitées ont été utilisées comme référence de viabilité. Des cellules traitées avec du Triton X100 1% ont été incluses pour confirmer que la mort cellulaire est bien détectée. L'absorbance à 620 nm a été utilisée comme référence. La viabilité cellulaire est exprimée en moyenne (+/-SEM) du pourcentage obtenu.
Chaque concentration de composé a été réalisée en tripliqua et trois « N » expériences indépendantes ont été conduites.
Résultats
L'évaluation de la cytotoxicité sur les lignées cellulaires de carcinome à cellules de Merkel CD56 positive WaGa et PeTa ont montré que le composé (40), est plus cytotoxique que la MMAE (toxine seule) et que l'ADC contrôle (conjugué m906 - MMAE issu de la demande WO 2021/170961). Le composé (39) a un effet cytotoxique sur ces mêmes lignées aux plus hautes concentrations testées démontrant l'importance du choix du cytotoxique utilisé pour obtenir un ADC efficace (Figure 5A et 5B). Ainsi, le composé (40) est efficace sur les cellules exprimant la cible à leur surface.
Exemple 29 : composé (41) : conjugué trastuzumab - composé (16)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (16) (4 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2, pendant 1 h à 25 °C.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 48 ci-dessous. Tableau 48
Figure imgf000063_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 0,91 pour l'espèce LHHL et de 0,65 pour l'espèce LH. Les espèces LH H, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 49 ci-dessous.
Tableau 49
Figure imgf000063_0002
1 : non observé L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 67% et en conditions non réductrices une reconstruction de 79%.
HIC
Les résultats sont présentés dans le Tableau 50 ci-dessous.
Tableau 50
Figure imgf000063_0003
L'analyse HIC a permis de déterminer un DAR moyen de 0,96. Exemple 30 : composé (42) : conjugué trastuzumab - composé (16)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 9,5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (15,0 éq), composé (16) (4 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 80% de DM F et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2, pendant 5 h à 37 °C.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 51 ci-dessous.
Tableau 51
Figure imgf000064_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,42 pour l'espèce LHHL et de 0,72 pour l'espèce LH. Les espèces LH H, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 52 ci-dessous.
Tableau 52
Figure imgf000064_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 72% et en conditions non réductrices une reconstruction de 75%.
HIC
Les résultats sont présentés dans le Tableau 53 ci-dessous. Tableau 53
Figure imgf000065_0001
L'analyse HIC a permis de déterminer un DAR moyen de 1,94.
Exemple 31 : composé (43) : conjugué trastuzumab - composé (14)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (4,0 éq), composé (14) (3,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DM F et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2, pendant 2h30 à 25 °C.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 54 ci-dessous.
Tableau 54
Figure imgf000065_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,18 pour l'espèce LHHL et de 0,91 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 55 ci-dessous.
Tableau 55
Figure imgf000065_0003
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 84% et en conditions non réductrices une reconstruction de 91%.
Exemple 32 : composé (44) : conjugué trastuzumab - composé (14)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (15,0 éq), composé (14) (7,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 70% de DM F et 30% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2, pendant 5 h à 25 °C.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 56 ci-dessous.
Tableau 56
Figure imgf000066_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL, de 1,00 pour l'espèce LH et de 0,00 pour l'espèce L. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 57 ci-dessous.
Tableau 57
Figure imgf000066_0002
1 : non observé L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63 % et en conditions non réductrices une reconstruction de 64%.
Exemple 33 : composé (45) : conjugué trastuzumab - composé (14) - composé (9)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (4,0 éq), composé (14) (1er composé) (3,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (9) (2eme composé) (3,3 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3, pendant 2h30 à 25 °C puis 17 h à 25 °C.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 58 ci-dessous.
Tableau 58
Figure imgf000067_0001
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,08 pour l'espèce LHHL, un DAR moyen de 0,80 pour l'espèce LH et un DAR moyen de 0,00 pour l'espèce L. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au trastuzumab - composé (14) n'est observé : le conjugué trastuzumab - composé (14) a été entièrement converti.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 59 ci-dessous. Tableau 59
Figure imgf000068_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 86% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,09.
HIC
Les résultats sont présentés dans le Tableau 60 ci-dessous.
Tableau 60
Figure imgf000068_0003
L'analyse HIC a permis de déterminer un DAR moyen de 1,22. mple 34 : composé (46) : conjugué trastuzumab - composé (14) - composé
Figure imgf000068_0001
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (15,0 éq), composé (14) (1er composé) (7,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 70% de DMF et 30% de MeOH, composé (9) (2eme composé) (7,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3, pendant 5 h à 25 °C puis 17 h à 25 °C.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 61 ci-dessous.
Tableau 61
Figure imgf000068_0004
Figure imgf000069_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,0 pour l'espèce LHHL, un DAR moyen de 1,0 pour l'espèce LH et un DAR moyen de 0,0 pour l'espèce L. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au trastuzumab - composé (14) n'est observé : le conjugué trastuzumab - composé (14) a été entièrement converti.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 62 ci-dessous.
Tableau 62
Figure imgf000069_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 71% et en conditions non réductrices une reconstruction de 76%.
HIC
Les résultats sont présentés dans le Tableau 63 ci-dessous.
Tableau 63
Figure imgf000069_0003
L'analyse HIC a permis de déterminer un DAR moyen de 2,17.
Exemple 35 : composé (47) : conjugué trastuzumab - composé (14) - composé (15)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (4,0 éq), composé (14) (1er composé) (3,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (15) (2eme composé) (20,0 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode
Réaction de bioconjugaison 3, pendant 2h30 à 25 °C puis 24 h à 37 °C.
Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab- composé (14) est ajustée à 2,0 mg/mL avant l'ajout du composé (15) et le milieu réactionnel a été agité pendant 24 h.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 64 ci-dessous.
Tableau 64
Figure imgf000070_0001
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 0,87 pour l'espèce LHHL et un DAR moyen de 0,95 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées. Un incrément de masse correspondant au LHHL du composé trastuzumab - composé (14) est observé à hauteur de 13% : le conjugué trastuzumab - composé (14) a été converti à 87%.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 65 ci-dessous.
Tableau 65
Figure imgf000070_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 83 % et en conditions non réductrices une reconstruction de 95%.
HIC
Les résultats sont présentés dans le Tableau 66 ci-dessous. Tableau 66
Figure imgf000071_0001
L'analyse HIC a permis de déterminer un DAR moyen de 0,92.
Exemple 36 : composé (48) : conjugué trastuzumab - composé (14) - composé (15)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (15,0 éq), composé (14) (1er composé) (7,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 70% de DMF et 30% de MeOH, composé (15) (2eme composé) (20,0 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3, pendant 5 h à 25 °C puis 24 h à 37 °C.
Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab- composé (14) est ajustée à 2,0 mg/mL avant l'ajout du composé (15) et le milieu réactionnel a été agité pendant 24 h.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 67 ci-dessous.
Tableau 67
Figure imgf000071_0002
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL, un DAR moyen de 0,98 pour l'espèce LH, et un DAR moyen de 0,00 pour l'espèce L. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au composé (14) n'est observé : le conjugué trastuzumab - composé (14) a été entièrement converti.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 68 ci-dessous.
Tableau 68
Figure imgf000072_0001
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 69 % et en conditions non réductrices une reconstruction de 75%.
HIC
Les résultats sont présentés dans le Tableau 69 ci-dessous.
Tableau 69
Figure imgf000072_0002
L'analyse HIC a permis de déterminer un DAR moyen de 1,66.
Exemple 37 : composé (49) : conjugué trastuzumab - composé (8)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (3,0 éq), composé (8) (2,0 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMF.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2, pendant 2h30 à 25 °C.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 70 ci-dessous.
Tableau 70
Figure imgf000072_0003
Figure imgf000073_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,10 pour l'espèce LHHL, de 0,91 pour l'espèce LH et de 0,00 pour l'espèce L. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 71 ci-dessous.
Tableau 71
Figure imgf000073_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 60% et une reconstruction de 84% en conditions non réductrices.
Exemple 38 : composé (50) : conjugué trastuzumab - composé (8)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (15,0 éq), composé (8) (6,0 éq) à une concentration de 3 mM dans du DMF.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2, pendant 2h30 à 25 °C.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 72 ci-dessous.
Tableau 72
Figure imgf000073_0003
Figure imgf000074_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,28 pour l'espèce LHHL, de 1,00 pour l'espèce LH et de 0,00 pour l'espèce L. Les espèces LH H, HH, et H n'ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 73 ci-dessous.
Tableau 73
Figure imgf000074_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 51% et une reconstruction de 47% en conditions non réductrices.
Exemple 39 : composé (51) : conjugué trastuzumab - composé (8) - composé (9)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (3,0 éq), composé (8) (1er composé) (2,0 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMF, composé (9) (2eme composé) (6,0 éq) à une concentration de 2 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3, pendant 2h30 à 25 °C puis 16 h à 25 °C.
Dans ce cas, le mélange réactionnel final a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 74 ci-dessous.
Tableau 74
Figure imgf000074_0003
Figure imgf000075_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 0,98 pour l'espèce LHHL, un DAR moyen de 0,83 pour l'espèce LH, et un DAR moyen de 0,00 pour l'espèce L. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au composé trastuzumab - composé (8) n'est observé : le conjugué trastuzumab - composé (8) a été entièrement converti.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 75 ci-dessous.
Tableau 75
Figure imgf000075_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 82% et une reconstruction de 91% en conditions non réductrices.
HIC
Les résultats sont présentés dans le Tableau 76 ci-dessous.
Tableau 76
Figure imgf000075_0003
L'analyse HIC a permis de déterminer un DAR moyen de 1,10.
Exemple 40 : composé (52) : conjugué trastuzumab - composé (8) - composé
(9)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (15,0 éq), composé (8) (1er composé) (6,0 éq) à une concentration de 3 mM dans du DMF, composé (9) (2eme composé) (9,0 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3, pendant 2h30 à 25 °C puis 16 h à 25 °C.
Dans ce cas, le mélange réactionnel final a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 77 ci-dessous.
Tableau 77
Figure imgf000076_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce non déglycosylée
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,86 pour l'espèce LHHL, un DAR moyen de 0,96 pour l'espèce LH, et un DAR moyen de 0,00 pour l'espèce L. Les espèces LH H, HH, et H n'ont pas été observées. Quelques espèces correspondant à un incrément de masse correspondant au composé trastuzumab - composé (8) ont été observées : LH composé (8) DAR 1 à 3,6%, LHHL DAR 1 + composé (8) DAR 1 à 1,4% et LHHL DAR 2 + composé (8) DAR 1 à 18,7 %. Le conjugué trastuzumab - composé (8) n'a pas été entièrement converti.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 78 ci-dessous.
Tableau 78
Figure imgf000076_0002
1 : non observé
L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 74% et une reconstruction de 72% en conditions non réductrices. HIC
Les résultats sont présentés dans le Tableau 79 ci-dessous.
Tableau 79
Figure imgf000077_0001
L'analyse HIC a permis de déterminer un DAR moyen de 1,98.
Exemple 41 : stabilité stockage des composés (41), (42), (51) et (52)
Matériel et méthode
La concentration des composés (41), (42), (51) et (52) dans du tampon PBS Gibco IX (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, pH 7,4), a été ajustée à environ 2 mg/mL. Cinq (5) échantillons de 70 μL des différents composés, ont été déposés dans des flacons en polypropylène (Fisher Scientific, 0,6 mL). Après agitation, les échantillons ont été incubés dans un réfrigérateur à 4 °C. Les flacons ont été retirés un par un de l'incubateur, centrifugés 2 minutes à 5000 g et conservés à -80 °C après 1, 2, 4, 8 et 12 semaines.
Le contenu de chacun des 5 flacons a été filtré sur 0,22 pm et analysé par HIC et SEC. HIC
Pour tous les composés, 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC- Butyl, 5 pm, 4.6 x 100 mm (Thermo Scientific), connectée à une chaîne Vanquish Flex Thermo Fisher munie d'un détecteur DAD (PhotoDiode Array, 280 nm) Thermo Fisher. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu'à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu'à 85% de tampon B dans le tampon A en 30 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
SEC
30 ou 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 pm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaîne Vanquish Flex Thermo Fisher munie d'un détecteur DAD (PhotoDiode Array, 280 nm) Thermo Fisher. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) en 20 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
Résultats
Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 4 °C pendant 12 semaines est présenté à la Figure 6A (N=l). Les résultats montrent que le DAR moyen des différents composés varie peu, démontrant une bonne stabilité des composés à 4 °C. Le suivi de l'évolution du pourcentage de monomère par la méthode SEC après incubation à 4 °C pendant 12 semaines est présenté à la Figure 6B (N=l). Les résultats montrent que le pourcentage de monomère diminue légèrement après incubation à 4°C pendant 12 semaines, cependant la pureté monomérique des composés à 12 semaines reste bonne, démontrant une stabilité des quatre composés testés.
Exemple 42 : stabilité thermique des composés (41), (42), (51) et (52)
Matériel et méthode
La concentration des composés (41), (42), (51) et (52) dans du tampon PBS Gibco IX (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, pH 7,4), a été ajustée à environ 2 mg/mL. Deux (2) échantillons de 70 μL des différents composés, ont été déposés dans des flacons en polypropylène (Fisher Scientific, 0,6 mL). Après agitation, les échantillons ont été incubés dans un incubateur (VWR INCU-line IL23) à 40 °C. Les flacons ont été retirés un par un de l'incubateur, centrifugés 2 minutes à 5000 g et conservés à -80 °C après 1 semaine et 4 semaines.
Le contenu de chacun des 2 flacons a été filtré sur 0,22 pm et analysé par HIC et SEC.
HIC
Pour tous les composés, 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC- Butyl, 5 pm, 4.6 x 100 mm (Thermo Scientific), connectée à une chaîne Vanquish Flex Thermo Fisher munie d'un détecteur DAD (PhotoDiode Array, 280 nm) Thermo Fisher. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu'à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu'à 85% de tampon B dans le tampon A en 30 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation. SEC
30 pg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 pm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaîne Vanquish Flex Thermo Fisher munie d'un détecteur DAD (PhotoDiode Array, 280 nm) Thermo Fisher. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) en 20 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
Résultats
Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 40 °C pendant 7 et 28 jours est présenté à la Figure 7A (N= 1). Les résultats montrent que le DAR moyen des différents composés varie peu démontrant une bonne stabilité des composés à 40 °C.
Le suivi de l'évolution du pourcentage de monomère par la méthode SEC après incubation à 40 °C pendant 7 et 28 jours est présenté à la Figure 7B (N= 1). Les résultats montrent que le pourcentage de monomère diminue légèrement après incubation à 40 °C pendant 28 jours, cependant la pureté monomérique des composés à 28 jours reste bonne, démontrant une stabilité des quatre composés testés.
Exemple 43 : Stabilité à 37 °C en présence de HSA (Albumine de sérum humain) des composés (41), (42), (51) et (52)
La concentration des composés (41), (42), (51) et (52) dans un tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 2 mg/mL. Quatre (4) échantillons de 20 μL de chaque composé ont été déposés dans quatre flacons en polypropylène (Fisher Scientific, 0,6 mL) puis 20 μL d'une solution de HSA à 20 mg/mL dans le tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) a été ajouté à chaque flacon. Après agitation, chacun des 4 flacons a été centrifugé 30 secondes à 5000 g avant incubation à 37 °C dans un incubateur (VWR INCU-line IL23). Les flacons ont été retirés un par un de l'incubateur conservés à -80 °C après 1 minutes (T0), 24 h, 48 h et 120 h.
Après dilution par un facteur 2 avec du tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4), le contenu de chacun des 12 flacons a été filtré sur 0,22 pm et analysé par HIC. Pour chaque composé, 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 pm, 4.6 x 100 mm (Thermo Fisher), connectée à une chaîne Vanquish Flex ThermoFisher munie d'un détecteur DAD (PhotoDiode Array, 280 nm) Thermo Fisher. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu'à 100% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 50 min. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation avec un excès de HSA à 37 °C est présenté à la Figure 8. Les résultats montrent une parfaite stabilité en présence de HSA des différents composés testés, cela s'explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
Exemple 44 : Evaluation de la reconnaissance à l'antigène des composés (41), (42), (50) et (52)
Les différents échantillons (TTZ - composés (41), (42), (50) et (52)) ont été dilués à une concentration de 0,1 pM dans du tampon PBS Gibco IX. L'antigène HER2 (Interchim) a été immobilisé une nuit à 4 °C dans deux plaques 96 puits (Thermo Scientific) à une concentration de 1 pg/mL (100 μL par puits). Les puits ont ensuite été saturés avec 300 μL par puits d'une solution de BSA 3% dans du PBS pendant 1 h à 37 °C. Les échantillons ont été déposés dans les puits à des concentrations décroissantes de 100 à 0,001 nM (100 μL par puits) puis incubés 1 h à 37 °C. Après 4 lavages successifs au PBS à 0,05% de Tween, la protéine L-HRP (ThermoFisher, 0,25 pg/μL dilué au 1/800) a été déposée dans les puits (100 μL) et laissée incuber 1 h à 37 °C. La 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (100 μL par puits) a été ajoutée et laissée réagir pendant quelques minutes. Enfin du H2SO4 à 1 M (50 μL par puits) a été ajouté pour arrêter la réaction et l'absorbance des deux plaques 96 puits a été lue à 450 nm grâce au système Multiskan (Thermo Scientific) et au logiciel ELISA « ascent software for iEMS Reader MF ».
Les cinétiques de reconnaissance de l'antigène HER2 par le TTZ et les composés (41), (42), (50) et (52) sont présentées aux Figures 9A et 9B. Ces données ont permis de déterminer la constante d'affinité de TTZ et des composés (41), (42), (50) et (52). Tableau 80
Figure imgf000081_0001
Les composés (41), (42), (50) et (52) selon l'invention reconnaissent l'antigène HER2 de façon similaire au composé TTZ. C'est-à-dire que ni le motif d'accroche, ni le DAR, ni la réaction de click n'influencent la reconnaissance des composés décrits vis-à-vis de l'antigène.
Exemple 45 : composé (54) : conjugué trastuzumab - composé (14) - composé (53)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (4,0 éq), composé (14) (1er composé) (3,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (53) (2eme composé) (30,0 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3, pendant 2h30 à 25 °C puis 17 h à 25 °C.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 81 ci-dessous.
Tableau 81
Figure imgf000081_0002
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,16 pour l'espèce LHHL, un DAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH et un DAR moyen de 0,00 pour l'espèce L. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au trastuzumab - composé (14) n'est observé : le conjugué trastuzumab - composé (14) a été entièrement converti.
Exemple 46 : composé (55) : conjugué trastuzumab - composé (14) - composé (9)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5,0 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (15,0 éq), composé (14) (1er composé) (7,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 70% de DMF et 30% de MeOH, composé (9) (2eme composé) (70,0 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3, pendant 5 h à 25 °C puis 17 h à 25 °C.
Analyse SM H R dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 82 ci-dessous.
Tableau 82
Figure imgf000082_0001
2 : non observé
L'analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,0 pour l'espèce LHHL, un DAR moyen de 1,0 pour l'espèce LH et un DAR moyen de 0,0 pour l'espèce L. Les espèces LHH, HH, et H n'ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au trastuzumab - composé (14) n'est observé : le conjugué trastuzumab - composé (14) a été entièrement converti. LISTAGE DE SEQUENCES
<110> MCSAF
<120> Conjugués anticorps-médicament pour utilisation thérapeutique
<130> 1H317490 008 FR/BN
<160> 10
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 de la chaîne légère de l'anticorps anti-CD56
<400> 1
Gin Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 de la chaîne légère de l'anticorps anti-CD56
<400> 2
Tyr Leu Gly 1
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 de la chaîne légère de l'anticorps anti-CD56
<400> 3
Cys Met Gin Ser Leu Gin Thr Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 de la chaîne lourde de l'anticorps anti-CD56
<400> 4
Gly Gly Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp 1 5 10 <210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 de la chaîne lourde de l ' anticorps anti CD56
<400> 5
Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin 1 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 de la chaîne lourde de l ' anticorps anti CD56
<400> 6
Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 1 5 10 15
<210> 7
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chaîne légère de l ' anticorps anti-CD56
<400> 7
Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser I le Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu I le Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys I le 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ser 85 90 95
Leu Gin Thr Pro Trp Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu I le Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe I le Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 8
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chaîne lourde de l ' anticorps anti-CD56
<400> 8
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp I le Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser I le Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr I le Cys Asn Val Asn His 195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro I le 325 330 335
Glu Lys Thr I le Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp I le Ala Val Glu
370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400
Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Domaine variable de la chaîne légère de l ' anticorps anti-CD56
<400> 9
Asp Val Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser l ie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu l ie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys l ie 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Asp Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Ser 85 90 95
Leu Gin Thr Pro Trp Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Vai Glu l ie Lys
100 105 110
Arg
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> Domaine variable de la chaîne lourde de l ' anticorps anti-CD56 <400> 10
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp I le Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser I le Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Val Thr Vai Ser
115 120

Claims

REVENDICATIONS
1. Conjugué de formule (I) pour utilisation comme médicament :
Figure imgf000088_0001
dans laquelle : a) Ac est un anticorps ou un fragment d'anticorps ; b) u est tel que 0,5 < u < 3,5 ; c) la tête d'accroche est un composé de formule (II) ou de formule (II') :
Figure imgf000088_0002
dans lesquelles :
- W est -ORa, -COR2, -CONR3R4 ou -NR3COR4 ;
- Ra est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -CORb, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5,
-(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ;
- Rb est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -O(CRcRd)r-R5,
-(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5,
-(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 - R2 est -OH, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-R5, - O(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, O(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
- R3 est -H, -(C1-C6)alkyle ou -(CH2)V-SO3H, de préférence R3 est -H ou -(Ci-C6)alkyle ; - R4 est -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-
(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r- R5, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r- (OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-R5]2, ou -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-R5]2, de préférence R4 est -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, ou -(CH2CH2O)q- (CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ;
- chaque R5 est -(CH2)SR6 ou -(CH2)SR7 ;
- Re est -COOH ou -NR8R9 ;
- chaque R7 est choisi parmi :
Figure imgf000090_0001
Figure imgf000091_0001
- Rc est H ;
- chaque Rd est choisi parmi -H, -CH2-SO3H ou -SO3H ;
- R8 est -H ou -(C1-C6)alkyle ; - R9 est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
- Rio est -H ou -CH3 ;
- chaque q est un entier allant de 1 à 24 ;
- chaque r est un entier allant de 1 à 8 ;
- chaque s est un entier allant de 0 à 6 ; - chaque v est un entier allant de 1 à 6 ; d) le bras de liaison est une liaison directe ; un sucre ; un glucuronide ; un pont -S-S- ; ou un groupe de formule -R11-(A)Z- dans laquelle :
- R11 est une liaison directe, un groupe R7-(CRcRd)r-CO- ou un groupe R7-(CH2CH2O)q- (CH2)S-CO-, OU un groupe R7-(CRcRd)r-NH-, où R7, Rc, Rd, q, r et s sont tels que définis ci- dessus ;
- A est un résidu d'acide aminé ;
- z est égal à 1, 2, 3, 4 ou 5 ; e) l'espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
Figure imgf000092_0001
- G est un sulfate, un sucre, un glucuronide, ou un galactoside, ledit sucre étant un groupe saccharide choisi de préférence parmi un acide bêta-glucuronique, un bêta-D- galactose, un beta-D-glucose, un alpha-D-mannose, un N-acétyl-D-glucosaminyle, un N- acétyl-D-galactosaminyle, un D-glucuronyle, un L-iduronyle, un D-glucopyranosyle, un D- galactopyranosyle, un D-mannopyranosyle ou un L-fucopyranosyle, de préférence G est un sulfate, un acide bêta-glucuronique, ou un bêta-D-galactose ;
- R12 est -H ou -NO2 ; f) M est un principe actif ou un chélateur de radionucléide, de préférence M est un principe actif ; étant entendu que l'un au moins du bras de liaison et de l'espaceur est présent dans le conjugué de formule (I).
2. Conjugué pour utilisation selon la revendication 1, dans lequel la tête d'accroche est un composé de formule (II).
3. Conjugué pour utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans lequel W est -CONR3R4 ou -NR3COR4, de préférence W est-CONR3R4 ;
- R3 est -H ou - (Ci-C6)alkyle ;
- R4 est _(CH2CH2O)q_(CH2)r _R5, ou -(CRcRd)r-R5 ;
- R5 est -(CH2)sR6 ou -(CH2)SR7 ;
- R6 est -COOH ;
- R7 est choisi parmi :
Figure imgf000093_0001
- Rc, Rd, R8 et R9 sont tels que définis à la revendication 1 ;
- q est un entier allant de 1 à 12, de préférence q est un entier allant de 1 à 8 ;
- r est un entier allant de 1 à 6.
4. Conjugué pour utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la tête d'accroche est un composé de formule (lia), (Ilb), (Ile), (Ild), (Ile), (Ilf), (Ilg), (Ilh) ou (Il'a) :
Figure imgf000093_0002
Figure imgf000094_0001
Figure imgf000095_0001
5. Conjugué pour utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le bras de liaison est un groupe de formule -R11-(A)Z- dans laquelle :
- R11 et A sont tels que définis à la revendication 1 ;
- z est égal à 2, 3 ou 4.
6. Conjugué pour utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le bras espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
Figure imgf000096_0001
7. Conjugué pour utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le bras espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
Figure imgf000096_0002
8. Conjugué pour utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel M est un principe actif choisi parmi : le méthotrexate, un immunomodulateur, la duocarmycine, la combrétastatine, la calichéamicine, la monométhylauristatine E (MMAE), la monométhylauristatine F (MMAF), la maytansine, le DM1, le DM4, le SN38, l'amanitine et ses analogues, la pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l'histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, la ricine.
9. Conjugué pour utilisation selon la revendication 8, dans lequel le principe actif est l'amanitine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la MMAF ou la MMAE.
10. Conjugué pour utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel M est un chélateur de radionucléide.
11. Conjugué pour utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'anticorps ou un fragment d'anticorps dudit anticorps se lie à un antigène spécifique d'un cancer, par exemple CDla, CD3, CD4, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD39, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD66e, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79, CD80, CD86, CD117, CD138, CD194, CD205, CD227, VEGF, EpCAM, GPIIb, GPIIIa, TNF alpha, TNFR, TNT, Lewis Y, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, AXL, Protéine F, IgE-Fc, C5, IL-6R, IL12, IL15, IL18, IL23, IL-1, TPO-R, GPNMB, PSMA, PSA, PAP, PSM, Cripto, Récepteur 1 des folates, récepteurs de l'endothéline ETB, STEAP1, SLC44A4 (AGS-5), AGS-16, Guanylyl cyclase C, EGFRvIII, Mésothéline, IL2R, A33, Can, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, TGFbeta, TGFbetaR, FGF, FGFR, PDGF, PDGFR, Ang-1, Ang-2, intégrine, RANK-L, BLyS, c-MET, DR, TCRalpha,beta, ICOS, EphA2, CA6, ENPP3, FOLR1, Nectine-4, TIM-1, facteur tissulaire, LIV-1, TLR-7, AFP, HLA-DR, antigène carcinoembryonnaire (ACE), TAG-72, protéine de liaison des folates, G250, gangliosides, collagène de type 4 (collagène IV), collagène de type 18 (collagène XVIII), CA19-9, P185HER2, protéine d'activation des fibroblastes (FAP), ténascine, métalloprotéinases, l'endosialine, anhydrase carbonique, Galectine 9, Aldolase A, eIFgamma4, Galectine 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, Restin, NY-CO-38, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, HGFR, PTK 7, CCK-4, PTP-LAR, CDCP1, CADM1, IGSF4, BCAM, CEACAM6, JAM-A, PTGFRN (CD9P-1), MCAM, MCP, EMMPRIN, TfR, ClqR, hTERT, Survivine, MDM2, CYP1B1, MART-1, MART-2, protéines mélanosomales, gplOO, CDC27, MAGEs, WT1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, BRAF, TPI, fibronectine, K-ras, beta-caténine, CDK4, caspase-8, pl4ARF, pl6INK4a, bcr-abl, SYT-SSX, TRP-1, TRP-2, GnT-V, tyrosinase, TEL-AML1, protéinase 3, EBV-EBNA, HTLV-1 tax, HPV16-E7, HLA-A2 muté, HAÏ, SART3, CEACAM5, ESAT-6, RANK, fibrine, TF, PRAME, CA19-9, CA50, CA195, CAM17.1/WGA, beta-MG, DU-PAN2, HE4, transferrine, transthyrétine, ApoAl, TROP-2, CTLA-4, GITR, PD-1, PD-L1, c-KIT, CDllb-CD18 intégrine hétérodimère, DNA/Histone Hl, protéoglycane, fibrinogène, le grand antigène T SV40, SC-Ag, ESA, mucine, CCR4, MTX1, MTX2, PECAM, Tn, cathepsine D, TYRO-3, MER, ou un complexe PF4/héparine.
12. Conjugué pour utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'anticorps ou un fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à HER2, CD30 ou CD56.
13. Conjugué pour utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'anticorps est un anticorps anti-HER2, un anticorps anti-CD30 ou un anticorps anti-CD56.
14. Conjugué pour utilisation selon la revendication 13, dans lequel l'anticorps est un anticorps anti-CD56.
15. Conjugué pour utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, ledit conjugué étant présent dans une composition, par exemple une composition pharmaceutique contenant un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables.
16. Conjugué de formule (I) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour utilisation dans une méthode de traitement du cancer.
17. Conjugué pour utilisation selon la revendication 16, dans lequel :
- l'anticorps ou un fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc de celui-ci se lie à HER2 et le cancer est un cancer HER2+, ou
- l'anticorps ou un fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc de celui-ci se lie à CD30 et le cancer est un cancer CD30+, ou
- l'anticorps ou un fragment Fab', F(ab')2, ou scFv-Fc de celui-ci se lie à CD56 et le cancer est un cancer CD56+.
18. Conjugué pour utilisation selon la revendication 16, dans lequel :
- l'anticorps est un anticorps anti-HER2 et le cancer est choisi parmi le cancer du sein, le cancer gastrique, le cancer gastro-œsophagien, le cancer de la vessie, le cancer de la vésicule biliaire, le cholangiocarcinome extra-hépatique ; ou
- l'anticorps est un anticorps anti-CD30 et le cancer est choisi parmi le lymphome de Hodgkin, le lymphome anaplasique à larges cellules et le lymphome périphérique à cellules T, le mycosis fongoïde ; ou
- l'anticorps est un anticorps anti-CD56 et le cancer est choisi parmi les cancers neuroendocrines, le cancer du poumon ou le carcinome à cellules de Merkel.
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