FR3131836A1 - Conjugués anticorps-médicament pour utilisation thérapeutique - Google Patents

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Estelle R. HUET
Christine BALTUS
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Abstract

L’invention concerne un conjugué de formule (I) pour utilisation comme médicament : (I) dans laquelle Ac, la tête d’accroche, le bras de liaison, l’espaceur, M et u sont tels que définis dans la description.

Description

Conjugués anticorps-médicament pour utilisation thérapeutique
La présente invention concerne des conjugués anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») pour utilisation comme médicament, notamment pour utilisation dans le traitement du cancer.
 Etat de la technique
Le début des années 2000 a vu une intensification de la recherche sur des conjugués anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC »), ces conjugués représentant potentiellement une alternative ou un complément aux thérapies « classiques » pour délivrer de manière ciblée un principe actif, notamment un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués.
La structure d'un conjugué anticorps-médicament consiste typiquement en un anticorps lié au médicament par une molécule dont une partie va fixer l’anticorps et une autre partie va se coupler au médicament, généralement par l’intermédiaire d’un bras d’espacement (ou linker) de longueur et nature variables.
Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est le plus souvent internalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament dans la cellule ciblée.
Des conjugués anticorps-médicament sont décrits dans la demande
WO 2015/004400. Par ailleurs, la demande PCT/FR2021/051345, déposée le 19 juillet 2021, décrit des têtes d’accroche qui permettent l’obtention de composés qui, lorsqu’ils sont conjugués à des protéines, notamment des anticorps, permettent l’obtention d’une « structure » telle qu’en moyenne le nombre de tête d’accroche conjuguée par protéine (anticorps) est contrôlé : le conjugué majoritaire visé portant soit 1 molécule par protéine (anticorps) soit 2 molécules par protéine (anticorps).
La présente invention concerne un conjugué de formule (I) pour utilisation comme médicament :
(I)
dans laquelle :
- Ac est un anticorps ou un fragment d’anticorps ;
- la tête d’accroche, le bras de liaison, l’espaceur, M et u sont tels que définis ci-après.
La présente invention concerne également un conjugué de formule (I) pour utilisation dans une méthode de traitement du cancer.
Définitions
Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde.
On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins deux ponts disulfure, par exemple Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc.
Les termes « Fab’ », « F(ab')2» et « scFv-Fc » désignent des fragments d’anticorps qui conservent la capacité dudit anticorps à se lier un antigène. Le fragment F(ab')2est obtenu par digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine ou par IdeS. F(ab')2est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab (constituée des régions variables et des domaines CH1 et CL) et d'une région charnière. Le fragment scFv-Fc est un fragment issu de l'ingénierie des protéines est constitué du fragment scFv (single chain Fragment variable) et lié à un fragment Fc. Le fragment scFv est constitué uniquement des domaines variables VH et VL avec une structure stabilisée par un court bras peptidique flexible, appelé linker, qui est placé entre les deux domaines.
Le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie approuvé par une agence règlementaire fédérale ou d’État ou énuméré dans la pharmacopée américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue, et s’applique à un produit destiné à être utilisé chez les animaux et/ou chez l’homme. Une « composition pharmaceutique » désigne une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, un véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel l'agent thérapeutique est administré. Ces véhicules peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris ceux d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc. L'eau est un véhicule préféré lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie intraveineuse. Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en particulier pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires. Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par exemple de l'amidon de maïs prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de l'hydroxypropyl méthylcellulose); des charges (par exemple du lactose, de la cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par des procédés bien connus dans l’état de la technique. Les préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule approprié avant utilisation. De telles préparations liquides peuvent être préparées par des moyens classiques avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des dérivés de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple desp-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique). Les compositions pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas. La composition selon l'invention est de préférence une composition pharmaceutique.
Le terme « traiter » ou « traitement » englobe tout effet bénéfique ou souhaitable sur une pathologie ou un état pathologique, et peut même inclure une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie ou de l'état pathologique. Le traitement peut par exemple impliquer soit la réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état pathologique. Le terme « traitement » ne signifie pas nécessairement l'éradication complète ou la guérison de la pathologie, ni des symptômes associés.
Brève description des figures
La représente l’évaluation des performances de conjugués représentatifs de l’invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 positive (BT-474).
La représente l’évaluation des performances de conjugués représentatifs de l’invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 négative (MCF-7).
La représente l’évaluation des performances de conjugués représentatifs de l’invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 positive (BT-474).
La représente l’évaluation des performances de conjugués représentatifs de l’invention, comparés à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 négative (MCF-7).
La représente l’évaluation des performances d’un conjugué représentatif de l’invention, comparé à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 positive (BT-474).
La représente l’évaluation des performances d’un conjugué représentatif de l’invention, comparé à des contrôles, sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2 négative (MCF-7).
 Description détaillée de l’invention
Selon un premier aspect, l’invention concerne un conjugué de formule (I) pour utilisation comme médicament :
(I)
dans laquelle :
a) Ac est un anticorps ou un fragment d’anticorps ;
b) u est tel que 0,5 ≤ u ≤ 3,5 ;
c) la tête d’accroche est un composé de formule (II) ou (II’) :
(II) ;
(II’) ;
dans lesquelles :
- W est -ORa, -COR2, -CONR3R4ou -NR3COR4;
- Raest -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -CORb, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou
-(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
- Rbest -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5,
-O(CRcRd)r-R5,-(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
- R2est -OH, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-R5, -O(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
- R3est -H, -(C1-C6)alkyle ou –(CH2)v-SO3H, de préférence R3est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
- R4est -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5,
-(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-R5]2, ou -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-R5]2, de préférence R4est -(CH2CH2O)qR5,
-(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
- chaque R5est -(CH2)sR6ou -(CH2)sR7;
- R6est -COOH ou -NR8R9;
- chaque R7est choisi parmi :
;
- Rcest H ;
- chaque Rdest choisi parmi -H, -CH2-SO3H ou -SO3H ;
- R8est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
- R9est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
- R10est -H ou -CH3;
- chaque q est un entier allant de 1 à 24 ;
- chaque r est un entier allant de 1 à 8 ;
- chaque s est un entier allant de 0 à 6 ;
- chaque v est un entier allant de 1 à 6 ;
d) le bras de liaison est une liaison directe ; un pont -S-S- ; ou un groupe de formule –R1 1-(A)z- dans laquelle :
- R1 1est une liaison directe, un groupe R7-(CRcRd)r-CO- ou un groupe R7-(CH2CH2O)q-(CH2)s-CO-, ou un groupe R7-(CRcRd)r-NH- où R7, Rc, Rd, q, r et s sont tels que définis ci-dessus ;
- A est un résidu d’acide aminé ;
- z est égal à 1, 2, 3, 4 ou 5.
e) l’espaceur est une liaison directe ou est choisi parmi :
- G est un sulfate, un sucre, un glucuronide, ou un galactoside, ledit sucre étant un groupe saccharide choisi de préférence parmi un acide bêta-glucuronique, un bêta-D-galactose, un beta-D-glucose, un alpha-D-mannose, un N-acétyl-D-glucosaminyle, un N-acétyl-D-galactosaminyle, un D-glucuronyle, un L-iduronyle, un D-glucopyranosyle, un D-galactopyranosyle, un D-mannopyranosyle ou un L-fucopyranosyle, de préférence G est un sulfate, un acide bêta-glucuronique, ou un bêta-D-galactose ;
- G peut également représenter un site de clivage par une sulfatase, une glucosidase, la galactosidase, l’iduronidase, la béta-glucuronidase, la mannosidase, la N-acétyl-D-glucosaminidase ou par la N-acétyl-D-galactosaminidase ;
- R12est -H ou -NO2.
f) M est un principe actif ou un chélateur de radionucléide, de préférence M est un principe actif.
Dans certains modes de réalisation, la tête d’accroche est un composé de formule (II).
Dans certains modes de réalisation, W est -CONR3R4ou -NR3COR4, de préférence W est -CONR3R4;
- R3est -H ou –(C1-C6)alkyle ;
- R4est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, ou -(CRcRd)r-R5;
- R5est -(CH2)sR6ou -(CH2)sR7;
- R6est -COOH ;
- R7 est choisi parmi :
;
- Rc, Rd, R8et R9sont tels que définis ci-dessus ;
- q est un entier allant de 1 à 12, de préférence q est un entier allant de 1 à 8 ;
- r est un entier allant de 1 à 6.
Dans certains modes de réalisation, la tête d’accroche est un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf), (IIg), (IIh) ou (II’a) :
(IIa) ;
(IIb) ;
(IIc) ;
(IId) ;
(IIe) ;
(IIf) ;
(IIg) ;
(IIh) ;
(II’a).
Dans certains modes de réalisation, le bras de liaison est une liaison directe.
Dans certains modes de réalisation, le bras de liaison est un groupe de formule –R1 1-(A)z- tel que défini ci-dessus, avec z = 2, 3 ou 4.
La formule -(A)z- représente une succession de z résidus d’acides aminés identiques ou différents, naturels ou non naturels. Lesdits acides aminés peuvent être choisis dans le groupe constitué de : une valine, une citrulline, une phénylalanine, une lysine, un acide aspartique, une alanine, une arginine, une glycine ou un acide glutamique.
Avantageusement, z est égal à 2, 3 ou 4 et -(A)z- est un groupe d’acides aminés choisi parmi : une valine et une citrulline ; une phénylalanine et une lysine ; une valine et une alanine ; deux alanines ; un acide aspartique, une valine et une citrulline ; un acide glutamique, une valine et une citrulline ; trois glycines ; deux glycines, une phénylalanine et une glycine. De préférence, z est égal à 2 et -(A)z- est un groupe d’acides aminés choisi parmi : une valine et une citrulline ou une valine et une alanine.
De manière également avantageuse, -(A)z- peut représenter un site de clivage par une enzyme choisie parmi les enzymes de type cathepsine B, cathepsine C, cathepsine D, les enzymes choisies parmi la plasmine, une enzyme lysosomale, l’urokinase (également appelée activateur du plasminogène de type urokinase (uPA)), l’élastase, la protéinase 3, la cathepsine G.
-(A)z- peut aussi représenter un site de clivage par une enzyme de type métalloprotéinase matricielle (MMP). Dans ce cas, l’enzyme type métalloprotéinase matricielle (MMP) est choisie de préférence parmi les collagénases 1, 2 et 3 (MMP-1, MMP-8, MMP-13), les gélatinases A et B (MMP-2 et MMP-9), les stromélysines 1 et 2 (MMP-3 et MMP-10), les matrilysines 1, 2 et 3 (MMP-7, MMP-26, MMP-11), l’élastase des macrophages (MMP-12), les MMP membranaires (MMP-14, MMP-15, MMP-16 MMP-17, MMP-24 et MMP-25), l’énamélysine (MMP-20), la CA-MMP (MMP-23), l’épilysine (MMP-28), la MMP-19, la MMP-21 et la MMP-27.
-(A)z- peut également représenter un site de clivage par une estérase, une carboxylestérase, les protéases et les cathepsines.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « site de clivage » la position où a lieu la coupure de la chaîne peptidique par une enzyme, par exemple le site Valine-Citrulline.
Dans certains modes de réalisation, l’espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
.
Dans un mode de réalisation particulier, l’espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
.
Dans certains modes de réalisation, M est un principe actif. A titre de principe actif susceptible d’être utilisé dans le cadre de l’invention, on peut citer les principes actifs de médicaments déjà autorisés et les molécules en cours d’évaluation thérapeutique, en particulier :
- les agents alkylants tels que : chlorambucile, chlornaphazine, cyclophosphamide, dacarbazine, estramustine, ifosfamide, méchloréthamine, chlorhydrate d’oxyde de méchloréthamine, mannomustine, mitobronitol, melphalan, mitolactol, pipobroman, novembichine, phénesterine, prednimustine, thiotépa, trofosfamide, moutarde à l’uracile, CC-1065 (y compris ses analogues synthétiques adozélésine, carzélésine et bizélésine), duocarmycine (y compris les analogues synthétiques KW-2189 et CBI-TMI), dimères de benzodiazépine (par exemple, dimères de pyrrolobenzodiazépine (PBD) ou tomaymycine, indolinobenzodiazépines, imidazobenzothiadiazépines, ou oxazolidino-benzodiazépines), nitro-urées (carmustine, lomustine, chlorozotocine, fotemustine, nimustine, ranimustine), alkylsulfonates (busulfan, tréosulfan, improsulfan et piposulfan), triazènes (dacarbazine), composés à base de platine (carboplatine, cisplatine, oxaliplatine), aziridines (benzodopa, carboquone, meturedopa, et uredopa), éthylène-imines et mélamines (incluant altrétamine, triéthylènemélamine, triéthylenephosphoramide, triéthylènethio-phosphaoramide et triméthylolomelamine) ;
- les alcaloïdes végétaux tels que : alcaloïdes de Vinca (vincristine, vinblastine, vindésine, vinorelbine, navelbine), les taxoïdes (paclitaxel, docetaxol) et leurs analogues, les maytansinoïdes (DM1, DM2, DM3, DM4, maytansine et ansamitocines) et leurs analogues, les cryptophycines (en particulier la cryptophycine 1 et la cryptophycine 8), les épothilones, eleuthérobine, discodermolide, bryostatines, dolastatines, auristatines, tubulysines, céphalostatines, pancratistatines, sarcodictyine, spongistatines ;
- les inhibiteurs d’ADN topoisomérase tels que : épipodophylline (9-aminocamptothécine, camptothécine, crisnatol, daunomycine, étoposide, étoposide phosphate, irinotécan, mitoxantrone, novantrone, acides rétinoïques (rétinols), téniposide, topotecan, 9-nitrocamptothécine (RFS 2000), mitomycines (mitomycine C), bortezomib ;
- les anti-métabolites tels que : les anti-folates (inhibiteurs DHFR (méthotrexate, trimétrexate, dénopterine, ptéroptérine, aminoptérine (acide 4-aminoptéroïque) et autres analogues de l’acide folique), les inhibiteurs de l’IMP déshydrogénase (acide mycophénolique, tiazofurine, ribavirine, EICAR), les inhibiteurs de ribonucléotide réductase (hydroxyurée, déferoxamine), les analogues de pyrimidine tels que : analogues d’uracile (ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, capécitabine, carmofur, cytarabine, didésoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, 5-fluorouracile, floxuridine, ratitrexed), analogues de cytosine (cytarabine, cytosine arabinoside, fludarabine), analogues de purine (azathioprine, fludarabine, mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine), acide folinique ;
- les agents hormonaux tels que : anti-estrogènes (mégestrol, raloxifène, tamoxifène), agonistes LHRH (goséréline, acétate de leuprolide), anti-androgènes (bicalutamide, flutamide, calustérone, propionate de dromostanolone, épitiostanol, goséréline, leuprolide, mépitiostane, nilutamide, testolactone, trilostane), analogues de la vitamine D3 (CB 1093, EB 1089, KH 1060, cholécalciférol, ergocalciférol), thérapies photodynamiques (verteporfine, phthalocyanine, photosensibilisateur Pc4), cytokines (interféron-alpha, interféron-gamma, facteur de nécrose tumorale (TNF), protéines humaines contenant un domaine TNF) ;
- les inhibiteurs de kinase tels que : BIBW 2992, CYT387, E7080, axitinib, bafetinib, bosutinib, cabozantinib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, iniparib, ispinesib, lapatinib, masitinib, mubritinib, nilotinib, pazopanib, pegaptanib, ponatinib, ruxolitinib, sorafénib, sunitinib, tivozanib, vandetanib, vismodegib ;
- les inhibiteurs de poly(ADP-ribose)polymérase (PARP) tels que : BGB-290, CEP 9722, E7016, 3-aminobenzamide, niraparib, olaparib, talazoparib, veliparib ;
- les immunomodulateurs tels que : thalidomide, lénalidomide, pomalidomide ;
- une toxine telle que l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin, la
Dans un mode de réalisation particulier, le principe actif est choisi parmi le méthotrexate, un immunomodulateur, la duocarmycine, la combrétastatine, la calichéamicine, la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), DM1, DM4, SN38, l’amanitine et ses analogues, la pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et la ricine, de préférence le principe actif est l’amanitine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la MMAF ou la MMAE, ces deux dernières étant représentées par les formules suivantes :
.
Dans certains modes de réalisation, M est un chélateur de radionucléide. A titre de chélateur de radionucléide susceptible d’être utilisé dans le cadre de l’invention, on peut citer la sarcophagine, le DOTA (acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10-tris(carboxyméthyl)-1,4,7,10-tétraazacyclododécan-1-yl)pentanedioïque), le NODA (acide 1,4,7-triazacyclononane-1,4-diacétique), le NODAGA (acide 1,4,7-triazacyclononane,1-glutarique acide-4,7-diacétique), le NOTA (acide-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacétique) et le MANOTA (acide 2,2’,2"-[2-(aminométhyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triyl]triacétique).
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps ou le fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à un antigène spécifique d’un cancer. L’antigène spécifique du cancer peut être, par exemple, CD1a, CD3, CD4, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD39, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD66e, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79, CD80, CD86, CD117, CD138, CD194, CD205, CD227, VEGF, EpCAM, GPIIb, GPIIIa, TNF alpha, TNFR, TNT, Lewis Y, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, AXL, Protéine F, IgE-Fc, C5, IL-6R, IL12, IL15, IL18, IL23, IL-1, TPO-R, GPNMB, PSMA, PSA, PAP, PSM, Cripto, Récepteur 1 des folates, récepteurs de l'endothéline ETB, STEAP1, SLC44A4 (AGS-5), AGS-16, Guanylyl cyclase C, EGFRvIII, Mésothéline, IL2R, A33, Can, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, TGFbeta, TGFbetaR, FGF, FGFR, PDGF, PDGFR, Ang-1, Ang-2, intégrine, RANK-L, BLyS, c-MET, DR, TCRalpha,beta, ICOS, EphA2, CA6, ENPP3, FOLR1, Nectine-4, TIM-1, facteur tissulaire, LIV-1, TLR-7, AFP, HLA-DR, antigène carcinoembryonnaire (ACE), TAG-72, protéine de liaison des folates, G250, gangliosides, collagène de type 4 (collagène IV), collagène de type 18 (collagène XVIII), CA19-9, p185HER2, protéine d'activation des fibroblastes (FAP), ténascine, métalloprotéinases, l’endosialine, anhydrase carbonique, Galectine 9, Aldolase A, eIFgamma4, Galectine 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, Restin, NY-CO-38, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, HGFR, PTK 7, CCK-4, PTP-LAR, CDCP1, CADM1, IGSF4, BCAM, CEACAM6, JAM-A, PTGFRN (CD9P-1), MCAM, MCP, EMMPRIN, TfR, C1qR, hTERT, Survivine, MDM2, CYP1B1, MART-1, MART-2, protéines mélanosomales, gp100, CDC27, MAGEs, WT1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, BRAF, TPI, fibronectine, K-ras, beta-caténine, CDK4, caspase-8, p14ARF, p16INK4a, bcr-abl, SYT-SSX, TRP-1, TRP-2, GnT-V, tyrosinase, TEL-AML1, protéinase 3, EBV-EBNA, HTLV-1 tax, HPV16-E7, HLA-A2 muté, HA1, SART3, CEACAM5, ESAT-6, RANK, fibrine, TF, PRAME, CA19-9, CA50, CA195, CAM17.1/WGA, beta-MG, DU-PAN2, HE4, transferrine, transthyrétine, ApoA1, TROP-2, CTLA-4, GITR, PD-1, PD-L1, c-KIT, CD11b-CD18 intégrine hétérodimère, DNA/Histone H1, protéoglycane, fibrinogène, le grand antigène T SV40, SC-Ag, ESA, mucine, CCR4, MTX1, MTX2, PECAM, Tn, cathepsine D, TYRO-3, MER, ou un complexe PF4/héparine.
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps ou un fragment Fab’, F(ab')2ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à HER2, CD30 ou CD56. Il peut donc par exemple s’agir d’un anticorps anti-HER2, d’un anticorps anti-CD30 ou d’un anticorps anti-CD56.
L’anticorps, le fragment Fab’ ou le fragment F(ab')2, ou le fragment scFv-Fc peut être d’origine mammifère (par exemple humain ou murin), chimérique, humanisé. Il s’agit de préférence d’un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement décrites dans l’art antérieur.
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps est de type IgG, par exemple IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
Les conjugués de formule (I) peuvent être obtenus comme décrit dans la demande PCT/FR2021/051345, par exemple par conjugaison entre un anticorps, ou un fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps, et un composé de formule (I’) :
(I’)
dans laquelle le bras de liaison, l’espaceur et M sont tels que définis ci-dessus, et la tête d’accroche répond à la formule (III) ou (III’) :
(III)
(III’)
dans lesquelles W est tel que défini ci-dessus.
Les conditions de conjugaison sont par exemple celles décrites dans la demande PCT/FR2021/05134 ou celles précisées ci-après.
L’anticorps, ou le fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc, se lie à la tête d’accroche par une réaction de substitution des groupes Br présents dans la formule (III) ou (III’).
Les composés de formule (I’) peuvent être obtenus par couplage des différents éléments qui en composent la structure (tête d’accroche/bras de liaison/espaceur/M). Par exemple, et de manière non limitative, les composés de formule (I’) peuvent être obtenus par couplage entre un composé de formule (III) ou (III’) et un composé de formule (V) :
(V).
Le couplage entre la tête d’accroche et le bras de liaison peut se faire soit de manière conventionnelle, par exemple par couplage de type peptidique entre un groupement carboxylique et un groupement amino, soit par mise en œuvre d’une réaction dite « click ». Un couplage de type peptidique a classiquement lieu entre un groupe carboxylique porté par la tête d’accroche, et un groupe amine porté par le bras de liaison ou, le cas échéant avec un groupe amine porté par l’espaceur (si le bras de liaison est une liaison directe). L’homme du métier comprendra que le groupe réactif de W qui va former la liaison de type peptidique avec le bras de liaison (ou l’espaceur) est, dans le contexte de la présente invention, défini tel qu’il est avant la réaction de couplage avec le groupe réactif du bras de liaison (ou de l’espaceur). Un couplage par réaction click peut avoir lieu lorsque la tête d’accroche et le bras de liaison porte chacun un substituant R7. De manière plus précise, la réaction click s’effectue entre un diène (par exemple un azoture ou un diazo) et un diénophile (par exemple un alcène ou un alcyne), chacune de ces fonctions étant apportée par le groupe R7. Ainsi, la réaction click peut s’effectuer entre un diène apporté par le groupe R7de la tête d’accroche et un diénophile apporté par le groupe R7du bras de liaison, ou bien entre un diénophile apporté par le groupe R7de la tête d’accroche et un diène apporté par le groupe R7du bras de liaison. Ces réactions click sont bien connues de l’homme du métier, étant entendu que les deux groupes R7sont judicieusement choisis compatibles entre eux. Le couplage entre le bras de liaison et l’espaceur, et entre l’espaceur et M, se fait de manière conventionnelle, par exemple par couplage de type peptidique.
Les conjugués de formule (I) peuvent également être obtenus comme décrit dans la demande PCT/FR2021/051345, par conjugaison entre un anticorps, ou un fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps, avec un composé de formule (III) ou (III’) pour former un composé intermédiaire de formule (IV) suivi d’un couplage par réaction click entre un composé de formule (IV) et un composé de formule (V) :
(IV)
(V).
dans laquelle la réaction click, la tête d’accroche, le bras de liaison, l’espaceur et M sont tels que définis ci-dessus.
Les conjugués de formule (I) possèdent un ratio de molécules « accrochées » ou « conjuguées » par anticorps (ou par fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc), désigné par la lettre u, compris dans la plage allant d’environ 0,50 à environ 3,50. On entend ici par « molécule » la structure de formule (I’).
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps (ou fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc) est conjugué en moyenne à 1,00±0,50 (c’est-à-dire toute valeur allant de 0,50 à 1,50, par exemple 0,50 ; 0,51 ; ..... ; 1,49 ; 1,50) molécule(s), de préférence à 1,00±0,30 molécule(s).
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps (ou fragment F(ab’)2) est conjugué en moyenne à 2,00±0,50 (c’est-à-dire toute valeur allant de 1,50 à 2,50, par exemple 1,50 ; 1,51 ; ….. ; 2,49 ; 2,50) molécules, de préférence à 2,00±0,30 molécules.
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps (ou fragment F(ab’)2) est conjugué en moyenne à 3,00±0,50 (c’est-à-dire toute valeur allant de 2,50 à 3,50, par exemple 2,50 ; 2,51 ; ….. ; 3,49 ; 3,50) molécules, de préférence à 3,00±0,30 molécules.
Le ratio « u », appelé également par la suite « DAR » (pour « drug to antibody ratio »), est déterminé pour chaque espèce (LHHL, LH, L, H, HH, LHH) par analyse SMHR (Spectrométrie de Masse Haute Résolution) en conditions dénaturantes. On entend ici par « drug » le principe actif ou chélateur de radionucléide M. Le DAR moyen est obtenu à partir du DAR par espèce pondéré par les proportions des espèces observées en analyse sur gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices. Seules les espèces majoritaires LHHL et LH ont été considérées pour ce calcul, la somme des proportions des autres espèces (L, H, HH et LHH) étant inférieure à 18%. La somme des proportions des espèces LHHL et LH a donc été ramenée à 100% en ne tenant pas compte des autres espèces.
L’espèce « demi-anticorps » LH est observée en conditions dénaturantes. En solution (en conditions natives) cette espèce n’est pas présente de façon isolée, les interactions faibles maintiennent les deux LH ensembles. C’est pourquoi le DAR de l’espèce LH-LH non reconstruite correspond à 2 fois le DAR observé sur l’espèce LH.
Le DAR moyen a donc été calculé à l’aide de la formule suivante :
Dans certains modes de réalisation, le conjugué de formule (I) est présent dans une composition, qui peut être par exemple une composition pharmaceutique contenant un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables.
Selon un deuxième aspect, l’invention concerne un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus pour utilisation dans une méthode de traitement du cancer.
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps ou un fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à HER2 et le cancer est un cancer HER2+.
Le terme « HER2 » désigne le « Human Epidermal growth factor Receptor 2 », qui est une protéine membranaire de la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique humain. « HER2 » est aussi appelé fréquemment « ErbB2 ».
Le terme « cancer HER2+ » ou « cancer HER2 positif » désigne un cancer impliquant une expression exacerbée de HER2. En particulier, le terme « cancer HER2+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une dérégulation du gène HER2. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein, le cancer du poumon, le cancer colorectal, le cancer de la tête et du cou, le cancer gastrique, le cancer du pancréas, le cancer urothélial, le cancer de l’endomètre, le cancer de l’ovaire, le cancer des trompes de Fallope, le cancer du col utérin, le cancer de l’utérus, le cancer de la vulve, le cancer des voies biliaires, le cancer de l’endothélium, le cancer colorectal, le cancer du côlon, le cancer de l’anus, le cancer des glandes salivaires, le cancer du cerveau, le cancer de l’œsophage, le cancer de l’intestin, le cancer du foie, le cancer des glandes lacrymales, le cancer du larynx, le cancer du péritoine, le cancer de la prostate, le cancer des testicules, le cancer rénal, le cancer de la peau, le carcinome adénoïde kystique, l’angiosarcome, le cancer gastro-œsophagien, les leucémies, le cancer de la thyroïde, les lymphomes. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein, le cancer gastrique, le cancer gastro-œsophagien, le cancer de la vessie, le cancer de la vésicule biliaire, le cholangiocarcinome extra-hépatique, de préférence le cancer du sein.
Dans un mode de réalisation particulier, l’anticorps est le trastuzumab ; dans ce mode de réalisation, la structure de formule (I’) peut également être conjuguée à un Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc du trastuzumab.
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps ou un fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à CD30 et le cancer est un cancer CD30+.
Le terme « CD30 » désigne le « Cluster de Différenciation 30 », qui est une glycoprotéine membranaire de la superfamille des récepteurs des facteurs de nécrose tumorale humaine (« tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF) »). « CD30 » est aussi appelé fréquemment « TNFRSF8 ».
Le terme « cancer CD30+ » ou « cancer CD30 positif » désigne un cancer impliquant une expression exacerbée de CD30. En particulier, le terme « cancer CD30+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une dérégulation du gène TNFRSF8. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer CD30+ est choisi parmi le lymphome de Hodgkin, le lymphome à cellules T, le lymphome périphérique à cellules T, le lymphome cutané à cellules T, le lymphome T hépatosplénique, le lymphome anaplasique à grandes cellules, le lymphome non-hodgkinien, le lymphome anaplasique systémique à grandes cellules, le lymphome T angio-immunoblastique, le lymphome T associé à l’entéropathie, le mycosis fongoïde, le lymphome diffus à grandes cellules B, la leucémie à cellules T de l’adulte, le syndrome de Sézary, le lymphome B primitif du médiastin, le lymphome de Hodgkin à sclérose nodulaire, le lymphome angio-centrique, la splénomégalie myéloïde. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer CD30+ est choisi parmi le lymphome de Hodgkin, le lymphome anaplasique à larges cellules, le lymphome périphérique à cellules T et le mycosis fongoïde.
Dans un mode de réalisation particulier, l’anticorps est le brentuximab ; dans ce mode de réalisation, la structure de formule (I’) peut également être conjuguée à un fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc du brentuximab.
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps ou un fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à CD56 et le cancer est un cancer CD56+.
Le terme « CD56 » désigne le « Cluster de Différenciation 56 », qui est une glycoprotéine membranaire membre de la super-famille des immunoglobulines (Ig) contenant 5 domaines de type Ig et deux domaines de type 3 de la fibronectine dans sa partie extracellulaire. Le CD56 est aussi appelé fréquemment « Neural-Cell Adhesion Molecule 1 (NCAM 1) ».
Le terme « cancer CD56+ » ou « cancer CD56 positif » désigne un cancer exprimant le CD56. En particulier, le terme « cancer CD56+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une expression du CD56. Une expression du CD56 est fréquemment observée dans les carcinomes neuroendocrines, les tumeurs pédiatriques et certaines hémopathies. Elle est également rapportée dans certains mélanomes et sarcomes de tissus mous. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer CD56+ est choisi parmi les leucémies, les lymphomes, le cancer de la gaine nerveuse, le carcinome à cellules de Merkel, les syndromes myélodysplasiques, les myélomes, le neuroblastome, le cancer de l’ovaire, le cancer du poumon, les cancers neuroendocrines, rhabdomyosarcome, tumeur de Wilms, glioblastome, sarcome synovial, blastome pleuropulmonaire, splénomégalie myéloïde. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer CD56+ est choisi parmi les cancers neuroendocrines, le cancer du poumon ou le carcinome à cellules de Merkel, de préférence le carcinome à cellules de Merkel.
Dans un mode de réalisation particulier, l’anticorps ou le Fab’, ou le F(ab')2, ou le scFv-Fc anti-CD56 comprend :
- un domaine variable d’une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 1, un CDR2 de séquence en acides aminés SEQ ID NO: 2, et un CDR3 de séquence en acides aminés SEQ ID NO: 3 ; et
- un domaine variable d’une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 4, un CDR2 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 5, et un CDR3 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 6.
Dans ce mode de réalisation particulier, le domaine variable de chaine légère présente au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 9 ; et le domaine variable de chaine lourde présentant au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 10.
Ainsi, l’anticorps ou le Fab’, ou le F(ab')2, ou le scFv-Fc anti-CD56 peut avoir une séquence en acides aminés SEQ ID NO : 9 pour le domaine variable de la chaine légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 10 pour le domaine variable de la chaine lourde.
Dans un mode de réalisation particulier, l’anticorps ou le Fab’, ou le F(ab')2, ou le scFv-Fc anti-CD56 peut avoir une séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 pour la chaine légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 pour la chaine lourde. La chaîne lourde de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 peut également présenter une lysine additionnelle en position C terminal.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’anticorps peut être l’anticorps décrit sous la référence m906 dans la demande US 2018/0214568 A1. L’anticorps m906 est un anticorps anti-CD56 chimérique de type IgG1 de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 pour la chaine légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 pour la chaine lourde.
L’invention est illustrée par les exemples ci-après, donnés à titre purement illustratif. Dans ces exemples, on utilise les abréviations suivantes :
DCC = dicyclohexylcarbodiimide
DIPEA =N,N-diisopropyléthylamine
DMAP = 4-diméthylaminopyridine
DMF =N,N-diméthylformamide
DMSO = diméthylsulfoxyde
EDTA = acide éthylènediaminetétraacétique
HCl = acide chlorhydrique
HOBt = hydroxybenzotriazole
MeCN = acétonitrile
MeOH = méthanol
NaCl = chlorure de sodium
TA = température ambiante (20 °C sauf indication contraire)
TFA = acide trifluoroacétique
tR = Temps de rétention
v/v = rapport volume sur volume
Méthodes d’analyse
Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton1H ont été réalisés sur un appareil Bruker Ultrashield 300 (300 MHz (1H)). Les analyses ont été réalisées dans le méthanol deutéré (CD3OD). Les déplacements chimiques (δ) sont mesurés en parties par million (ppm) par rapport au signal résiduel du méthanol deutéré (δ1H = 3,31 ppm).
Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hertz (Hz) et la multiplicité est décrite de la façon suivante : d = doublet, dd = doublet de doublet, dt = doublet de triplet, m = multiplet, p = pentuplet, s = singulet, t = triplet. Afin de clarifier la lecture des analyses RMN, la numérotation des atomes pour l’attribution des signaux a été fixée arbitrairement.
Spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR)
La masse exacte des composés synthétisés a été déterminée par spectrométrie de masse haute résolution (SMHR) en mode positif ou négatif avec la technique d’ionisation par électronébulisation ESI, sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex Ultimate 3000 RSLC de la plateforme « Fédération de Recherche » de l’ICOA/CBM (FR2708).
Spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR) dénaturante
Méthode 1: L’analyse des conjugués a été réalisée sur un échantillon préalablement déglycosylé ou non. Dans le cas d’un échantillon déglycosylé, il a été dilué à une concentration de 1 μg/μL puis de laN-glycosidase F (0,02 unité/μg d’échantillon) a été ajoutée et l’échantillon a été incubé à 37 °C pendant au moins 16 h.
L’analyse a été réalisée sur un spectromètre de masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H-Class de Waters (Wilmslow, UK). Avant l’analyse, les échantillons (800 ng) ont été injectés sur une colonne XBridge BEH300 C4 2,1 x 50 mm, 1,7 μm, soit sur une colonne XBridge BEH300 C4 2,1 x 30 mm, 5 µm chauffée à 90 °C. Une étape de dessalage a été réalisée avec un gradient isocratique 95% de solvant A (H2O + 0,1% acide formique) et 5% de solvant B (MeCN + 0,1% acide formique) pendant 1,5-2 min à 0,5 mL/min. Puis, l’élution de l’échantillon a été réalisée avec un gradient de 20% à 35% de solvant B sur 7 min, de 50% à 90% de solvant B sur 3 min, et un isocratique de 1 min à 90% de B, soit avec un gradient de 5% à 50% de solvant B sur 2,9 min, de 50% à 90% de solvant B sur 0,5 min, un isocratique de 0,5 min à 90% de B, avec un débit de
0,4 mL/min. Une vanne de dérivation a été programmée pour permettre au solvant d’entrer dans le spectromètre entre 3 et 7,5 min seulement. Les données de spectrométrie de masse ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 500 à 4000 à une fréquence de scan de 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel UNIFI 1.9.4 et l’algorithme MaxEnt pour la déconvolution. Le DAR moyen par espèce (= nombre moyen de molécules conjuguées à l’anticorps utilisé pour la réaction de bioconjugaison) a été déterminé à l’aide de l’intensité des pics des espèces observés.
Méthode 2: L’analyse spectrométrique de certains conjugués a été réalisée sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex Ultimate 3000 RSLC. Avant l’analyse MS, les échantillons (5 µg) ont été dessalés sur une colonne de dessalage MassPREP (2,1x10 mm, Waters), chauffés à 80 °C en utilisant une solution aqueuse d’acide formique à 0,1% comme solvant A et une solution à 0,1% d’acide formique dans l’acétonitrile comme solvant B à 500 µL/min. Après 1 min, un gradient linéaire de 5 à 90% de B en 1,5 min a été appliqué. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 900 à 5000 à 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel DataAnalysis 4.4 (Bruker) et l’algorithme MaxEnt pour la déconvolution. Le DAR moyen par espèce (= nombre moyen de molécules conjuguées à l’anticorps utilisé pour la réaction de bioconjugaison) a été déterminé à l’aide de l’intensité des pics des espèces observés.
Gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes, non réductrices ou réductrices
Les échantillons ont été analysés par gel d’acrylamide SDS-PAGE tris-HCl. Un gel de concentration à 4% d’acrylamide sur un gel de migration à 6-7% d’acrylamide ont été utilisés. Du tampon Laemmli 4X (bleu de bromophénol 0,3 mM ; glycérol 2 M, TrisBase 20 mM ; 0,04% de dodécylsulfate de sodium) a été ajouté dans les échantillons (1,6 μg). En conditions réductrices, les échantillons ont été réduits à l’aide d’une solution de dithiothréitol (DTT) à 10% dans de l’eau (10% v/v). Ensuite, les échantillons ont été incubés à 95 °C pendant 10 min. Un marqueur de poids de moléculaire de grande amplitude (Invitrogen SeeBlue® Plus2 Prestained Standard) et l’anticorps natif ont été utilisés pour estimer les poids moléculaires des protéines. Le gel a été mis à migrer à
100 V pendant 10 min puis à 140 V pendant 35 min, dans un tampon de migration NuPAGE (MOPS 50 mM ; TrisBase 50 mM ; 0,1% SDS (v/v) ; EDTA 1 mM, pH 7,3). Après un lavage à l’eau, le gel a été coloré avec du bleu de Coomassie (Thermo Scientific Imperial TM Protein Stain). L’analyse densitométrique a été réalisée à l’aide du logiciel ImageJ et un filtre Vanilla de Windows a été appliqué pour l’analyse en noir et blanc. En conditions dénaturantes non réductrices, la densité optique relative des espèces LHHL et LH a été utilisée pour déterminer le DAR moyen du conjugué. En conditions dénaturantes réductrices, la densité optique relative mesurée pour l’espèce LHHL a déterminé la reconstruction de l’anticorps (en %).
Réactions de bioconjugaison Préparation des solutions
Tampon de bioconjugaison 1 : Tampon phosphate 1X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCl de 180 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
Tampon de bioconjugaison 2 : Tampon borate 1X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCl de 25 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
Réducteur 1 : Solution de chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP.HCl) à une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison.
Réducteur 2 : Solution de dithiothréitol (DTT) à une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison.
Réaction de bioconjugaison 1 :
La solution d’anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Le réducteur (1,0-12,0 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37°C pendant 2h. Puis la solution de composé à conjuguer (1,0-15,0 éq, de préférence 5,0-12,0 éq ou 10,0-15,0 éq)) a été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence 25°C ou 37°C pendant 2h30.
Réaction de bioconjugaison 2 :
La solution d’anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Les solutions de composé à conjuguer (1,0-15,0 éq, de préférence 8,0-12,0 éq) puis de réducteur (1,0-12,0 éq) ont été ajoutées et le milieu réactionnel a été agité sous argon à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence 25°C ou 37°C pendant 2h30.
Réaction de bioconjugaison 3 :
La solution d’anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Les solutions du composé de formule (I) (1,0-15,0 éq, de préférence 8,0-12,0 éq ou 10,6-12,0 éq) puis de réducteur (1,0-12,0 éq) ont été ajoutées et le milieu réactionnel a été agité sous argon à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence 25°C ou 37°C pendant 2h30. La solution du composé de formule (V) (1,0-30,0 éq de préférence 8,8-14,4 éq, par exemple 11,7 éq) a ensuite été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence 25°C ou 37°C pendant 17h.
Réaction de bioconjugaison 4 :
La solution d’anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Le réducteur (1,0-12,0 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37 C pendant 2h. Puis la solution de composé à conjuguer (1,0-15,0 éq) a été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence 25°C ou 37°C pendant 2h30. La solution du composé de formule (V) (1,0-30,0 éq) ensuite été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence 25°C ou 37°C pendant 17h.
Exemples
Exemple 1 : 4-nitrophényl 1-[4-(6-méthyl-1,2,4,5-tétrazin-3-yl)phénoxy]-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-oate (1)
(1)
L’acide 4-méthyletéatrazinylphénoxy-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-oïque (12,2 mg ; 0,028 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le DMF anhydre (250 μL) puis le 4-nitrophénol (5,1 mg ; 0,036 mmol ; 1,3 éq), le DCC (7,5 mg ; 0,036 mmol ; 1,3 éq) et la DMAP (1,0 mg ; 0,008 mmol ; 0,3 éq) ont été ajoutés. Le milieu réactionnel a été placé sous agitation, sous argon à TA pendant 18h30. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR= 26,01 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25°C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner(1)(7,8 mg ; 50%) sous la forme d’une huile rose.
RMN1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,53 – 8,42 (m ; 2H) ; 8,32 – 8,21 (m ; 2H) ; 7,42 – 7,31 (m ; 2H) ; 7,21 – 7,11 (m ; 2H) ; 4,29 – 4,20 (m ; 2H) ; 3,93 – 3,80 (m ; 4H) ; 3,75 – 3,66 (m ; 4H) ; 3,66 – 3,63 (m ; 8H) ; 3,00 (s ; 3H) ; 2,87 (t ;J= 6,0 Hz ; 2H).
SMHR (ESI) :m/zcalculé pour C26H32N5O9[M+H]+: 558,2195 ; observé 558,2203.
Exemple 2 : acide (2R)‐2‐[(2S)‐2‐[(S)‐[(2R)‐1‐[(3S,4R,5R)‐4‐[(2R)‐N,3‐diméthyl‐2‐[(2R)‐3‐méthyl‐2‐{N‐méthyl‐1‐[4‐(6-méthyl‐1,2,4,5‐tétrazin‐3‐yl)phénoxy]‐3,6,9,12‐tétraoxapentadécan‐15-amido}butanamido]
butanamido]‐3‐méthoxy‐5‐méthylheptanoyl]pyrrolidin‐2-yl](méthoxy)methyl]propanamido]‐3‐phénylpropanoïque (2)
(2)
A une solution de HOBt (2,0 mg ; 0,0151 mmol ; 2,1 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (100 μL) en présence de DIPEA anhydre (2,5 μL ; 0,0144 mmol ; 2,0 éq) a été ajouté le 1-[4-(6-méthyl-1,2,4,5-tétrazin-3-yl)phénoxy]-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-oate de 4-nitrophényle(1)(7,1 mg ; 0,0128 mmol ; 1,8 éq). Puis une solution de sel d’acide trifluoroacétique de MMAF (6,1 mg ; 0,0072 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF anhydre (100 μL), a été ajoutée au milieu réactionnel placé sous agitation, sous argon à 25°C pendant 19h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR= 27,44 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25°C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 90% de B sur 32 min puis 90% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner(2)(1,4 mg ; 17%) sous la forme d’une huile violette.
RMN1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,57 – 8,45 (m ; 2H) ; 8,41 – 8,08 (m ; 1H) ; 8,08 – 7,79 (m ; 1H) ; 7,37 – 7,06 (m ; 8H) ; 4,78 – 4,59 (m ; 1H) ; 4,32 – 4,22 (m ; 2H) ; 4,14 – 3,96 (m ; 2H) ; 3,96 – 3,85 (m ; 2H) ; 3,84 – 3,52 (m ; 13H) ; 3,48 – 3,35 (m ; 5H) ; 3,21 – 3,15 (m ; 2H) ; 3,14 – 3,03 (m ; 4H) ; 3,00 (s ; 3H) ; 2,97 – 2,89 (m ; 1H) ; 2,83 – 2,63 (m ; 1H) ; 2,61 – 2,40 (m ; 2H) ; 2,41 – 2,15 (m ; 2H) ; 2,15 – 1,67 (m ; 8H) ; 1,50 – 1,12 (m ; 3H) ; 1,12 – 0,76 (m ; 28H).
SMHR (ESI) :m/zcalculé pour C59H92N9O14[M+H]+: 1150,6758 ; observé 1150,6754.
Les composés commerciaux ou issus de la demande PCT/FR2021/051345, utilisés pour les réactions de bioconjugaison sont résumés dans le Tableau 1 ci-dessous.
Numéro (#) Nom et structure
(3) N-(2-((((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)carbonyl)amino)méthyl)-19-(11,12-didéhydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-3,14,19-trioxo-7,10-dioxa-4,13-diazanonadec-1-yl)-2,6-bis(bromométhyl)pyridine-4-carboxamide
[Chem26]
(4) 6-azidohexanamido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
[Chem27]
(5) 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propamido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
[Chem28]
(6) 2-(2-(2-(2-(4-(méthyltétrazinylphénoxy)éthoxy)éthoxy)éthoxy)-éthyl)carbamoylpropane-1,3-diyl(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamide)
[Chem29]
(7) 1-trans-cyclooctènyl-1-oxo-5,8,11,14-tétraoxa-2-azahetaptadécan-17-amide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
[Chem30]
(8) 2-(2-(2-(trans-cyclooctènylcarbamoyl)éthoxy)éthoxy)éthyl)carbamoylpropane-1,3-diyl(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamide)
[Chem31]
(9) 4-méthyletéatrazinylphénoxy-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-amide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
[Chem32]
(10) 4‐{2‐azatricyclo[10.4.0.04,9]hexadeca‐1(12),4(9),5,7,13,15‐hexaen‐10‐yn‐2‐yl}‐N‐(2‐{2‐[2‐(3‐{[2,6‐bis(bromométhyl)pyridin‐4‐yl]formamido}‐2‐({[2,6‐bis(bromométhyl)pyridin‐4‐yl]formamido}méthyl)-propanamido)éthoxy]éthoxy}éthyl)‐4‐oxobutanamide
[Chem33]
(11) composé commercial N3-PEG4-Val-Ala-PBD dimère obtenu auprès de la société Levena Biopharma
[Chem34]
(12) N,N'-(2-((2-(2-(2-(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthoxy)éthyl)-carbamoyl)propane-1,3-diyl)bis(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamide)
[Chem35]
(13) (4‐{2‐[2‐(6‐{2‐azatricyclo[10.4.0.04,9]hexadéca‐1(12),4(9),5,7,13,15‐hexaen‐10‐yn‐2‐yl}‐6‐oxohexanamido)‐3‐méthylbutanamido]‐5‐(carbamoylamino)pentanamido}phényl)méthylN‐{1‐[(1‐{[1‐(2‐{2‐[(1‐hydroxy‐1‐phénylpropan‐2‐yl)carbamoyl]‐1‐méthoxy‐2‐méthyléthyl}pyrrolidin‐1‐yl)‐3‐méthoxy‐5‐méthyl‐1‐oxoheptan‐4‐yl](méthyl)carbamoyl}‐2‐méthylpropyl)carbamoyl]‐2‐méthylpropyl}‐N‐méthylcarbamate
[Chem36]
(14) bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylméthyl(4-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)methyl)-1-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)-1,5-dioxo-9,12,15,18-tétraoxa-2,6-diazaicosan-20-yl)carbamate
[Chem37]
(15) composé commercial N3-Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine obtenu auprès de la société Levena Biopharma
[Chem38]
(16) 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-méthyl)propanamido)-3-sulfopropanamido-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
[Chem39]
(17) N 1,N 5-bis(2-(2-(2-(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthoxy)éthyl)-3-(3-(2,6-bis(bromométhyl)-isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propanamido)-pentanediamide
[Chem40]
Exemple 3 : composé (18) : conjugué trastuzumab – composé (3) – composé (4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(3)(1ercomposé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé(4)(2èmecomposé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous.
LHHL LH L
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)
DAR 0 n.o.2 14 72585 100 23439
DAR 1 83 147259 86 74674 n.o.2
DAR 2 17 149352 n.o.2 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,17 1,00 0,00
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,17 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au composé(3)n’est observé : le conjugué trastuzumab-composé(3)a été entièrement converti.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 97 n.o.1 n.o.1 3 n.o.1 n.o.1
+ 75 n.o.1 n.o.1 8 10 7
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 75% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,19.
Exemple 4 : composé (19) : conjugué trastuzumab – composé (3) – composé (4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(3)(1ercomposé) (10,6 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé(4)(2èmecomposé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco®pH 7,4.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 n.o.2 100 74674
DAR 2 100 149347 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 2,00 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au composé(3)n’est observé : le conjugué trastuzumab-composé(3)a été entièrement converti.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 5 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 90 n.o.1 n.o.1 10 n.o.1 n.o.1
+ 97 n.o.1 n.o.1 3 n.o.1 n.o.1
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 97% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 5 : composé (20) : conjugué trastuzumab – composé (5)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 2, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé(5)(5,0 éq) à une concentration de 0,4 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 1.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1
Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 n.o.2 100 74184
DAR 2 100 148367 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 2,00 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 7 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 68 n.o.1 n.o.1 32 n.o.1 n.o.1
+ 61 n.o.1 5 27 6 2
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 61% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 6 : composé (21) : conjugué trastuzumab – composé (6) – composé (7)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(6)(1ercomposé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé(7)(2èmecomposé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 8 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 100 147391 100 74804
DAR 2 n.o.2 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,00 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. L’incrément de masse est correct.
Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 9 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 84 n.o.1 n.o.1 6 n.o.1 10
+ 58 n.o.1 n.o.1 10 17 15
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 58% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,07.
Exemple 7 : composé (22) : conjugué trastuzumab – composé (6) – composé (7)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(6)(1ercomposé) (8,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé(7)(2èmecomposé) (8,8 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 10 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 n.o.2 100 74805
DAR 2 100 149610 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 2,00 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 11 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 75 n.o.1 n.o.1 25 n.o.1 n.o.1
+ 69 n.o.1 n.o.1 26 n.o.1 5
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 69% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 8 : composé (23) : conjugué trastuzumab – composé (8) – composé (9)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(8)(1ercomposé) (3,0 éq) à une concentration de 0,25 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé(9)(2èmecomposé) (3,3 éq) à une concentration de 10mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 12 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 80 150241 100 76206
DAR 2 20 152421 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,20 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,20 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 13 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 81 n.o.1 n.o.1 14 n.o.1 5
+ 63 n.o.1 n.o.1 25 n.o.1 12
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,32.
Exemple 9 : composé (24) : conjugué trastuzumab – composé (8) – composé (9)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé(8)(1ercomposé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 30% de DMF et 70% de MeOH, composé(9)(2èmecomposé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 14 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 n.o.2 100 76208
DAR 2 100 152418 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 2,00 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 15 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 66 n.o.1 n.o.1 34 n.o.1 n.o.1
+ 62 n.o.1 n.o.1 33 n.o.1 5
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 62% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 10 : composé (25) : conjugué trastuzumab – composé (10) – composé (4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(10)(1ercomposé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé(4)(2èmecomposé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 16 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 100 147233 100 74645
DAR 2 n.o.2 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,00 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 17 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 87 n.o.1 n.o.1 n.o.1 7 6
+ 77 n.o.1 n.o.1 14 1 8
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 77% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,00.
Exemple 11 : composé (26) : conjugué trastuzumab – composé (10) – composé (4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(10)(1ercomposé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé(4)(2èmecomposé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 18 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 n.o.2 100 74649
DAR 2 100 149324 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 2,00 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 19 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 86 n.o.1 n.o.1 14 n.o.1 n.o.1
+ 89 n.o.1 n.o.1 11 n.o.1 n.o.1
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 84% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 12 : composé (27) : conjugué trastuzumab – composé (10) – composé commercial N 3 -PEG 4 -Val-Ala-PBD dimère (11)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(10)(1ercomposé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé commercialN 3 -PEG 4 -Val-Ala-PBD dimère (11), (2èmecomposé) (10 éq) à une concentration de 0,5 mM dans du DMF.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco®pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé(10)est ajustée à 1,5 mg/mL avant l’ajout du composé commercialN 3 -PEG 4 -Val-Ala-PBD dimère (11)et le milieu réactionnel a été agité pendant 17h40.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 20 ci-dessous.
LHHL LH L
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)
DAR 0 29 148861 n.o.2 100 23405
DAR 1 41 150069 100 76018 n.o.2
DAR 2 30 152071 n.o.2 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,01 1,00 0
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,01 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 21 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 95 n.o.1 n.o.1 5 n.o.1 n.o.1
+ 86 n.o.1 3 6 3 1
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 86% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,06.
Exemple 13 : composé (28) : conjugué trastuzumab – composé (10) – composé commercial N 3 -PEG 4 -Val-Ala-PBD dimère (11)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé(10)(1ercomposé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé commercialN 3 -PEG 4 -Val-Ala-PBD dimère (11), (2èmecomposé) (20 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMF.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco®pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé(10)est ajustée à 1,5 mg/mL avant l’ajout du composé commercialN 3 -PEG 4 -Val-Ala-PBD dimère (11)et le milieu réactionnel a été agité pendant 17h40.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 22 ci-dessous.
LHHL LH L
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)
DAR 0 n.o.2 4 74831 100 23439
DAR 1 16 150883 96 76014 n.o.2
DAR 2 84 152066 n.o.2 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,84 0,96 0
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,84 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 0,96 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 23 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 76 n.o.1 n.o.1 24 n.o.1 n.o.1
+ 67 n.o.1 n.o.1 33 n.o.1 n.o.1
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 67% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,86.
Exemple 14 : composé (29) : conjugué trastuzumab – composé (12) – composé (13)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé(12)(1ercomposé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé(13)(2èmecomposé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 24 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 2 148639 n.o.2
DAR 1 17 150086 100 76049
DAR 2 81 152101 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,79 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,81 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 25 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 68 n.o.1 n.o.1 24 n.o.1 8
+ 63 n.o.1 n.o.1 28 n.o.1 9
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,84.
Exemple 15 : composé (30) : conjugué trastuzumab – composé (14) – composé (4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(14)(1ercomposé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé(4)(2èmecomposé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 26 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 6 148841 51 74032
DAR 1 78 150099 49 76067
DAR 2 16 152139 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,08 0,49
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,16 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 0,49 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 27 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 85 n.o.1 n.o.1 7 2 6
+ 70 n.o.1 n.o.1 8 12 10
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 70% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,07.
Exemple 16 : composé (31) : conjugué trastuzumab – composé (14) – composé (4)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé(14)(1ercomposé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé(4)(2èmecomposé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 28 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 n.o.2 100 76068
DAR 2 100 152138 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 2,00 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 29 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 73 n.o.1 n.o.1 22 n.o.1 5
+ 56 n.o.1 n.o.1 37 n.o.1 7
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 56% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 17 : composé (32) : conjugué trastuzumab – composé (14) – composé commercial N 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(14)(1ercomposé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé commercialN 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15), (2èmecomposé) (12,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 30 ci-dessous.
LHHL LH L
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)
DAR 0 n.o.2 5 74032 100 23439
DAR 1 61 150395 95 76367 n.o.2
DAR 2 39 152747 n.o.2 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,39 0,95 0
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,39 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 0,95 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 31 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 86 n.o.1 n.o.1 9 3 2
+ 72 n.o.1 4 14 8 2
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 72% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,44.
Exemple 18 : composé (33) : conjugué trastuzumab – composé (14) – composé commercial N 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé(14)(1ercomposé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé commercialN 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanitine (15)(2èmecomposé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 32 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 n.o.2 100 76367
DAR 2 100 152735 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 2,00 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 33 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 55 n.o.1 1 39 4 1
+ 52 n.o.1 2 38 7 1
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 52% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 19 : composé (34) : conjugué trastuzumab – composé (16)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(16)(10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 34 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 39 74029
DAR 1 100 149703 61 75664
DAR 2 n.o.2 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,00 0,61
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LHHL et de 0,61 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 35 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 85 n.o.1 n.o.1 7 n.o.1 8
+ 60 n.o.1 n.o.1 15 15 10
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 60% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,02.
Exemple 20 : composé (35) : conjugué trastuzumab – composé (16)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(16)(12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 2.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 36 ci-dessous.
LHHL LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1
DAR 0 n.o.2 n.o.2
DAR 1 n.o.2 100 75666
DAR 2 100 151332 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 2,00 1,00
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 37 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 56 n.o.1 n.o.1 34 n.o.1 10
+ 54 n.o.1 n.o.1 37 n.o.1 9
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 54% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,00.
Exemple 21 : composé (36) : conjugué trastuzumab – composé (17) – composé (13)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé(17)(1ercomposé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé(13)(2èmecomposé) (15,0 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 3. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco®pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé(17)est ajustée à 1,5 mg/mL avant l’ajout du composé(13)et le milieu réactionnel a été agité pendant 22h.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 38 ci-dessous.
LHHL LH L
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)
DAR 0 2 148057 15 74026 80 23405
N.D. 3 10 150747 5 76712 n.o.2
DAR 1 73 151852 80 77817 20 27223
DAR 2 15 155650 n.o.2 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,02 0,80 0,20
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
3 : N.D. : impureté de structure non déterminée
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,02 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 0,80 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, et H n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 39 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 91 n.o.1 n.o.1 9 n.o.1 n.o.1
+ 63 n.o.1 6 15 12 4
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,07.
Exemple 22 : composé (37) : conjugué trastuzumab – composé (17) – composé (13)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé(17)(1ercomposé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé(13)(2èmecomposé) (30,0 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco®pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé(17)est ajustée à 1,4 mg/mL avant l’ajout du composé(13)et le milieu réactionnel a été agité pendant 22h.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 40 ci-dessous.
LHHL LH L
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)
DAR 0 n.o.2 n.o.2 100 23405
DAR 1 14 151858 90 77817 n.o.2
N.D. 3 8 154529 10 76712 n.o.2
DAR 2 78 155640 n.o.2 n.o.2
DAR 3 n.o.2 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 1,70 0,90 0
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
3 : N.D. : impureté de structure non déterminée
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 1,70 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 0,90 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, et H n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 41 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 61 n.o.1 n.o.1 39 n.o.1 n.o.1
+ 56 n.o.1 3 36 5 n.o.1
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 56% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 1,74.
Exemple 23 : composé (38) : conjugué trastuzumab – composé (8) – composé (2)
Réactifs
Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé(8)(1ercomposé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 30% de DMF et 70% de MeOH, composé(9)(2èmecomposé) (30 éq) à une concentration de 2 mM dans du DMSO.
Méthode
Réaction de bioconjugaison 4. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco®pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé(8)est ajustée à 1,4 mg/mL avant l’ajout du composé(2)et le milieu réactionnel a été agité pendant 17 h.
Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2
Les résultats sont présentés dans le Tableau 42 ci-dessous.
LHHL LH L
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)
DAR 0 n.o.2 12 74693 100 23468
DAR 1 n.o.2 88 75812 n.o.2
DAR 2 62 151625 n.o.2 n.o.2
DAR 3 38 153443 n.o.2 n.o.2
DAR moyen 2,38 0,88 0
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée
2 : non observé
L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,38 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 0,88 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées.
Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices
Les résultats sont présentés dans le Tableau 43 ci-dessous.
Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L
Densité optique
(%) 		- 63 n.o.1 1 29 4 4
+ 57 n.o.1 4 29 5 5
1 : non observé
L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 57% et en conditions non réductrices un DAR moyen de 2,18.
Exemple 24 : Evaluation in vitro de la cytotoxicité des conjugués par test de XTT sur une lignée positive (BT-474) et une lignée négative (MCF-7) pour le récepteur HER2
Matériel et méthode
Les cellules ont été obtenues de l’ATCC (BT-474 et MCF-7). Un aliquot de cellules BT-474 ou de cellules MCF-7 congelées a été décongelé rapidement dans un bain d’eau à 37°C et les cellules ont été lavés deux fois avec du milieu de culture respectivement avec du F12/DMEM supplémenté avec 8% de SVF, 100 µg/mL de L-glutamine, 100 µg/mL de pénicilline G de sodium, 100 µg/mL de streptomycine de sulfate pour les cellules BT-474 ou avec du DMEM GlutaMAX™ supplémenté avec 10% de SVF, 1% de pénicilline G de sodium, 1% de streptomycine de sulfate pour les cellules MCF-7. Puis les cellules ont été déposées dans une flasque de culture cellulaire de 75 cm² à une densité d’au moins 10 000 cellules/cm². Les cellules ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humide avec 5% de CO2 pendant au moins une semaine.
Ensuite, les cellules MCF-7 et BT-474 ont été déposées dans des plaques 96-puits à des densités de 2 500 et 50 000 cellules par puits respectivement pour les essais de cytotoxicité. Les cellules ont été incubées 24 h à 37°C avant l’addition des conjugués selon l’invention ou des contrôles testés et du véhicule (milieu seul). Les pourcentages de DMSO n’ont jamais excédé 0,5%. Les conjugués testés ont été ajoutés aux concentrations finales suivantes : 200 000 à 0,2 pM ; et incubés pendant 96h.
Après 4 jours d’exposition aux conjugués, 25 µL de réactif XTT à 1 mg/mL avec 25 mM d’activateur (N-méthyl dibenzopyrazine méthyl sulfate) ont été ajoutés par puits et l'absorbance a été mesurée à 450 nm après 4h d’incubation à 37°C. L'absorbance à
620 nm a été utilisée comme référence. La viabilité cellulaire est exprimée en moyenne (+/-SEM) du pourcentage obtenu.
Chaque concentration de composé a été réalisée en tripliqua et deux ou trois « N » expériences indépendantes ont été conduites.
Résultats
L’évaluation de la cytotoxicité sur la lignée cellulaire de cancer du sein HER2 positive BT-474 a montré que les composés(24),(25),(26),(34), et(35)sont aussi cytotoxiques que la MMAE (toxine seule) et que l’ADC contrôle (conjugué Trastuzumab - MMAE issu de la demande PCT/FR2020/050833). Le trastuzumab (TTZ) seul (i.e.non couplé à MMAE), n’a pas d’effet cytotoxique sur cette même lignée aux plus faibles concentrations testées démontrant l’absence de toxicité intrinsèque de l’anticorps ( ). Sur la lignée cellulaire de cancer du sein HER2 négative MCF-7, les composé(24), (25), (26), (34), (35), et l’ADC contrôle n’ont pas d’effets cytotoxiques aux plus faibles concentrations efficaces testées démontrant l’absence de toxicité intrinsèque de ces constructions ( ). Ainsi, les composés (24), (25), (26), (34), et (35) sont efficaces sur les cellules exprimant la cible à leur surface uniquement.
LISTAGE DE SEQUENCES
<110> MC SAF
<120> Conjugués anticorps-médicament pour utilisation
thérapeutique
<130> 1H317490 008 FR/BN
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 de la chaîne légère de l'anticorps anti-CD56
<400> 1
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 de la chaîne légère de l'anticorps anti-CD56
<400> 2
Tyr Leu Gly
1
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 de la chaîne légère de l'anticorps anti-CD56
<400> 3
Cys Met Gln Ser Leu Gln Thr Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 de la chaîne lourde de l'anticorps anti-CD56
<400> 4
Gly Gly Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 de la chaîne lourde de l'anticorps anti-CD56
<400> 5
Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln
1 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 de la chaîne lourde de l'anticorps anti-CD56
<400> 6
Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
1 5 10 15
<210> 7
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chaine légère de l'anticorps anti-CD56
<400> 7
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 8
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chaine lourde de l'anticorps anti-CD56
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps anti-CD56
<400> 9
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps anti-CD56
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120

Claims (17)

  1. Conjugué de formule (I) pour utilisation comme médicament :
    [Chem1](I)
    dans laquelle :
    a) Ac est un anticorps ou un fragment d’anticorps ;
    b) u est tel que 0,5 ≤ u ≤ 3,5 ;
    c) la tête d’accroche est un composé de formule (II) ou de formule (II’) :
    (II)
    (II’)
    dans lesquelles :
    - W est -ORa, -COR2, -CONR3R4ou -NR3COR4;
    - Raest -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -CORb, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou
    -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
    - Rbest -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -O(CRcRd)r-R5,
    -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5,
    -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
    - R2est -OH, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -(CRcRd)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-R5, -O(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5ou -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
    - R3est -H, -(C1-C6)alkyle ou –(CH2)v-SO3H, de préférence R3est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
    - R4est -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-R5]2, ou -CH-[(CRcRd)r-NHCO-(CRcRd)r-R5]2, de préférence R4est -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5,
    -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5;
    - chaque R5est -(CH2)sR6ou -(CH2)sR7;
    - R6est -COOH ou -NR8R9;
    - chaque R7est choisi parmi :

    ;
    - Rcest H ;
    - chaque Rdest choisi parmi -H, -CH2-SO3H ou -SO3H ;
    - R8est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
    - R9est -H ou -(C1-C6)alkyle ;
    - R10est -H ou -CH3;
    - chaque q est un entier allant de 1 à 24 ;
    - chaque r est un entier allant de 1 à 8 ;
    - chaque s est un entier allant de 0 à 6 ;
    - chaque v est un entier allant de 1 à 6 ;
    d) le bras de liaison est une liaison directe ; un sucre ; un glucuronide ; un pont -S-S- ; ou un groupe de formule –R1 1-(A)z- dans laquelle :
    - R11est une liaison directe, un groupe R7-(CRcRd)r-CO- ou un groupe R7-(CH2CH2O)q-(CH2)s-CO-, ou un groupe R7-(CRcRd)r-NH-, où R7, Rc, Rd, q, r et s sont tels que définis ci-dessus ;
    - A est un résidu d’acide aminé ;
    - z est égal à 1, 2, 3, 4 ou 5 ;
    e) l’espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :

    - G est un sulfate, un sucre, un glucuronide, ou un galactoside, ledit sucre étant un groupe saccharide choisi de préférence parmi un acide bêta-glucuronique, un bêta-D-galactose, un beta-D-glucose, un alpha-D-mannose, un N-acétyl-D-glucosaminyle, un N-acétyl-D-galactosaminyle, un D-glucuronyle, un L-iduronyle, un D-glucopyranosyle, un D-galactopyranosyle, un D-mannopyranosyle ou un L-fucopyranosyle, de préférence G est un sulfate, un acide bêta-glucuronique, ou un bêta-D-galactose ;
    - R12est -H ou -NO2 ;
    f) M est un principe actif ou un chélateur de radionucléide, de préférence M est un principe actif.
  2. Conjugué pour utilisation selon la revendication 1, dans lequel la tête d’accroche est un composé de formule (II).
  3. Conjugué pour utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans lequel W est
    -CONR3R4ou -NR3COR4, de préférence W est-CONR3R4;
    - R3est -H ou –(C1-C6)alkyle ;
    - R4est -(CH2CH2O)q-(CH2)r-R5, ou -(CRcRd)r-R5;
    - R5est -(CH2)sR6ou -(CH2)sR7;
    - R6est -COOH ;
    - R7 est choisi parmi :
    ;
    - Rc, Rd, R8et R9sont tels que définis à la revendication 1 ;
    - q est un entier allant de 1 à 12, de préférence q est un entier allant de 1 à 8 ;
    - r est un entier allant de 1 à 6.
  4. Conjugué pour utilisation selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle la tête d’accroche est un composé de formule (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf), (IIg), (IIh) ou (II’a) :
    (IIa) ;
    (IIb) ;
    (IIc) ;
    (IId) ;
    (IIe) ;
    (IIf) ;
    (IIg) ;
    (IIh) ;
    (II’a).
  5. Conjugué pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le bras de liaison est un groupe de formule –R1 1-(A)z- dans laquelle :
    - R11et A sont tels que définis à la revendication 1 ;
    - z est égal à 2, 3 ou 4.
  6. Conjugué pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le bras espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
    .
  7. Conjugué pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le bras espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
    .
  8. Conjugué pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel M est un principe actif choisi parmi : le méthotrexate, un immunomodulateur, la duocarmycine, la combrétastatine, la calichéamicine, la monométhylauristatine E (MMAE), la monométhylauristatine F (MMAF), la maytansine, le DM1, le DM4, le SN38, l’amanitine et ses analogues, la pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, la ricine.
  9. Conjugué pour utilisation selon la revendication 8, dans lequel le principe actif est l’amanitine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la MMAF ou la MMAE.
  10. Conjugué pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’anticorps ou un fragment d’anticorps dudit anticorps se lie à un antigène spécifique d’un cancer, par exemple CD1a, CD3, CD4, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD39, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD66e, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79, CD80, CD86, CD117, CD138, CD194, CD205, CD227, VEGF, EpCAM, GPIIb, GPIIIa, TNF alpha, TNFR, TNT, Lewis Y, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, AXL, Protéine F, IgE-Fc, C5, IL-6R, IL12, IL15, IL18, IL23, IL-1, TPO-R, GPNMB, PSMA, PSA, PAP, PSM, Cripto, Récepteur 1 des folates, récepteurs de l'endothéline ETB, STEAP1, SLC44A4 (AGS-5), AGS-16, Guanylyl cyclase C, EGFRvIII, Mésothéline, IL2R, A33, Can, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, TGFbeta, TGFbetaR, FGF, FGFR, PDGF, PDGFR, Ang-1, Ang-2, intégrine, RANK-L, BLyS, c-MET, DR, TCRalpha,beta, ICOS, EphA2, CA6, ENPP3, FOLR1, Nectine-4, TIM-1, facteur tissulaire, LIV-1, TLR-7, AFP, HLA-DR, antigène carcinoembryonnaire (ACE), TAG-72, protéine de liaison des folates, G250, gangliosides, collagène de type 4 (collagène IV), collagène de type 18 (collagène XVIII), CA19-9, p185HER2, protéine d'activation des fibroblastes (FAP), ténascine, métalloprotéinases, l’endosialine, anhydrase carbonique, Galectine 9, Aldolase A, eIFgamma4, Galectine 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, Restin, NY-CO-38, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, HGFR, PTK 7, CCK-4, PTP-LAR, CDCP1, CADM1, IGSF4, BCAM, CEACAM6, JAM-A, PTGFRN (CD9P-1), MCAM, MCP, EMMPRIN, TfR, C1qR, hTERT, Survivine, MDM2, CYP1B1, MART-1, MART-2, protéines mélanosomales, gp100, CDC27, MAGEs, WT1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, BRAF, TPI, fibronectine, K-ras, beta-caténine, CDK4, caspase-8, p14ARF, p16INK4a, bcr-abl, SYT-SSX, TRP-1, TRP-2, GnT-V, tyrosinase, TEL-AML1, protéinase 3, EBV-EBNA, HTLV-1 tax, HPV16-E7, HLA-A2 muté, HA1, SART3, CEACAM5, ESAT-6, RANK, fibrine, TF, PRAME, CA19-9, CA50, CA195, CAM17.1/WGA, beta-MG, DU-PAN2, HE4, transferrine, transthyrétine, ApoA1, TROP-2, CTLA-4, GITR, PD-1, PD-L1, c-KIT, CD11b-CD18 intégrine hétérodimère, DNA/Histone H1, protéoglycane, fibrinogène, le grand antigène T SV40, SC-Ag, ESA, mucine, CCR4, MTX1, MTX2, PECAM, Tn, cathepsine D, TYRO-3, MER, ou un complexe PF4/héparine.
  11. Conjugué pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’anticorps ou un fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc dudit anticorps se lie à HER2, CD30 ou CD56.
  12. Conjugué pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’anticorps est un anticorps anti-HER2, un anticorps anti-CD30 ou un anticorps anti-CD56.
  13. Conjugué pour utilisation selon la revendication 12, dans lequel l’anticorps est un anticorps anti-CD56.
  14. Conjugué pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, ledit conjugué étant présent dans une composition, par exemple une composition pharmaceutique contenant un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables.
  15. Conjugué de formule (I) tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 14 pour utilisation dans une méthode de traitement du cancer.
  16. Conjugué pour utilisation selon la revendication 15, dans lequel :
    - l’anticorps ou un fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc de celui-ci se lie à HER2 et le cancer est un cancer HER2+, ou
    - l’anticorps ou un fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc de celui-ci se lie à CD30 et le cancer est un cancer CD30+, ou
    - l’anticorps ou un fragment Fab’, F(ab')2, ou scFv-Fc de celui-ci se lie à CD56 et le cancer est un cancer CD56+.
  17. Conjugué pour utilisation selon la revendication 15, dans lequel :
    - l’anticorps est un anticorps anti-HER2 et le cancer est choisi parmi le cancer du sein, le cancer gastrique, le cancer gastro-œsophagien, le cancer de la vessie, le cancer de la vésicule biliaire, le cholangiocarcinome extra-hépatique ; ou
    - l’anticorps est un anticorps anti-CD30 et le cancer est choisi parmi le lymphome de Hodgkin, le lymphome anaplasique à larges cellules et le lymphome périphérique à cellules T, le mycosis fongoïde ; ou
    - l’anticorps est un anticorps anti-CD56 et le cancer est choisi parmi les cancers neuroendocrines, le cancer du poumon ou le carcinome à cellules de Merkel.
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