WO2022018371A1 - Composes capables de se lier a des proteines et conjugues obtenus a partir de ces composes - Google Patents

Composes capables de se lier a des proteines et conjugues obtenus a partir de ces composes Download PDF

Info

Publication number
WO2022018371A1
WO2022018371A1 PCT/FR2021/051345 FR2021051345W WO2022018371A1 WO 2022018371 A1 WO2022018371 A1 WO 2022018371A1 FR 2021051345 W FR2021051345 W FR 2021051345W WO 2022018371 A1 WO2022018371 A1 WO 2022018371A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
formula
species
observed
bis
Prior art date
Application number
PCT/FR2021/051345
Other languages
English (en)
Inventor
Ludovic JUEN
Camille GELY
Estelle HUET
Original Assignee
Mc Saf
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mc Saf filed Critical Mc Saf
Priority to JP2023504036A priority Critical patent/JP2023534815A/ja
Priority to EP21755528.3A priority patent/EP4181964A1/fr
Priority to US18/006,070 priority patent/US20230277678A1/en
Priority to CA3186027A priority patent/CA3186027A1/fr
Priority to CN202180064094.7A priority patent/CN116472268A/zh
Publication of WO2022018371A1 publication Critical patent/WO2022018371A1/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/81—Amides; Imides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms

Definitions

  • the present invention relates to compounds capable of binding to proteins, and the use of these compounds for preparing conjugates with proteins, said conjugates being able further comprise an active principle.
  • STATE OF THE ART The beginning of the 2000s saw an intensification of research on conjugates between a protein, in particular an antibody, and a molecule of interest, in particular an active drug ingredient, these conjugates potentially representing an alternative or a complement to "conventional" therapies to selectively deliver an active ingredient.
  • an antibody-drug conjugate in English “Antibody Drug Conjugate” or “ADC” constitutes a means of selective delivery of a drug, in particular of a cytotoxic drug.
  • the antibody-drug conjugate therefore makes it possible to combine the specificity of the targeting by the antibodies with new powerful effector functions by the agents which are conjugated to them.
  • the structure of an antibody-drug conjugate typically consists of an antibody bound to the drug by a molecule one part of which will bind the antibody and another part will couple to the drug, usually via a spacer arm (or linker) of variable length and nature.
  • the antibody After binding to its target antigen, the antibody is most often internalized in the cell by receptor-mediated endocytosis.
  • the vesicles fuse with lysosomes where the drug is released from the antibody via different mechanisms.
  • the active drug then acts directly on the cell by inducing its death and sometimes on neighboring cancer cells by transport or diffusion in the environment.
  • the antibody is therefore mainly used as a vector and brings the drug to the targeted cell.
  • the stability of antibody-drug conjugates depends in particular on the capacity of the molecule which fixes the antibody to reconstruct the reduced disulfide bridges between the heavy chains and the light chains. of the antibody. It is however desirable to be able to limit the toxicity of the conjugates between a protein and a molecule of interest such as an active ingredient of a medicine, in particular in the context of a therapeutic use of these conjugates.
  • attachment heads also called hereafter “attachment heads”
  • attachment heads which, when they are conjugated to proteins, in particular antibodies, make it possible to obtain a “structure” such that, on average, the number of conjugated attachment heads per protein (antibody) is controlled: the targeted majority conjugate carrying either 1 molecule per antibody or 2 molecules per antibody.
  • the present invention relates to a compound of formula (I): in which X, A, Y and X 1 have the meaning given below in the detailed description of the invention.
  • the present invention also relates to a compound of formula (II): in which the attachment head, the connecting arm, the spacer and M have the meaning given below in the detailed description of the invention.
  • the present invention also relates to a conjugate which can be obtained by conjugation between a protein comprising at least two disulphide bridges and a compound of formula (I) or compound of formula (II).
  • the present invention also relates to a composition comprising at least one aforementioned conjugate.
  • aryl is meant a phenyl or naphthyl group.
  • saturated, unsaturated or partially unsaturated heterocycle having from 5 to 15 members, and comprising from 1 to 4 heteroatoms chosen from nitrogen, oxygen and sulphur” a monocyclic, bicyclic or tricyclic group, optionally fused, saturated, unsaturated or partially unsaturated, comprising from 1 to 4 heteroatoms, preferably from 1 to 3 heteroatoms, and more preferably 1 or 2 heteroatoms, chosen from nitrogen, oxygen and sulphur.
  • an unsaturated monocycle mention may be made of the pyrrolyl, pyrazolyl, imidazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, triazolyl, oxadiazolyl, furanyl, thienyl, thiazolyl, isothiazolyl, thiadiazolyl, pyridyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl, azepinyl, oxepinyl or thiepinyl.
  • a saturated monocycle mention may be made of the pyrrolidinyl, tetrahydrofuryl, tetrahydrothienyl, pyrrolidinyl, imidazolidinyl, thiazolidinyl, isoxazolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, morpholinyl, thiomorpholinyl or hexahydroazepinyl groups.
  • a partially unsaturated monocycle mention may be made of the dihydro(is)oxazole group.
  • each leaving group X is halogen, tosylate or mesylate, preferably each X is halogen.
  • each X is Br.
  • each A is the residue of a pyridyl.
  • each Y is selected from a direct bond, -CO- and -NH-. In this embodiment, one of the groups Y and Z is advantageously -CO- and the other is advantageously -NH-.
  • X 1 is - W is -COR 2 or -CONR 3 R 4 ; - Z is -CO- or -NH-; - R 2 is -OH or -(C 1 -C 6 )alkoxy; - R 4 is –H, -(C 1 -C 6 )alkyl, -(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , or -(CR c R d ) r R 5 ; - R 5 is -(CH 2 ) s R 6 or -(CH 2 ) s R 7 ; - R 6 is -COOR 8 , -CONR 8 R 9 or -NR 8 COR 9 ; - R 7 is chosen from:
  • R c , R d , R 3 , R 8 and R 9 are as defined above; - m and n are each independently of one another an integer ranging from 0 to 3; - p is equal to 0, 1 or 2; - each q is an integer ranging from 1 to 12; - each r is an integer ranging from 1 to 6; - each s is an integer ranging from 0 to 4.
  • X 1 is a group: chosen from:
  • - W is -COR 2 or -CONR 3 R 4 ;
  • - Z is -CO- or -NH-;
  • - R 2 is -OH or -(C 1 -C 6 )alkoxy;
  • - R 3 is -H or -(C 1 -C 6 )alkyl;
  • - R 4 is -H, -(C 1 -C 6 )alkyl, -(CR c R d ) r R 5 , or -(CH 2 CH 2 O) q R 5 ;
  • - R 5 is -(CH 2 ) s R 6 or -(CH 2 ) s R 7 ;
  • - R 6 is -COOR 8 , -CONR 8 R 9 or -NR 8 COR 9 ;
  • - R 7 is chosen from: ; - R c , R d , R 8 and R 9 are as defined above; - each q is an integer ranging from
  • X 1 is advantageously chosen from: .
  • X 1 is:
  • the compound of formula (I) is a compound of formula (Ia), (Ib) or (Ic): ( ); in each of these formulas W is as defined above.
  • W is -COR 2 or -CONR 3 R 4 ;
  • R 2 is -OH or -(C 1 -C 6 )alkoxy;
  • R 3 is -H or -(C 1 -C 6 )alkyl;
  • R 4 is -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , or -(CR c R d ) r R 5 ;
  • R 5 is -(CH 2 ) s R 6 or -(CH 2 ) s R 7 ;
  • R 6 is -COOR 8 ;
  • R 7 is chosen from: ;
  • R 8 is -H or -(C 1 -C 6 )alkyl;
  • R c is -H and each R d is -H or -SO 3 H;
  • each q is an integer ranging from 1 to 12;
  • each r is an integer ranging from 1 to 6;
  • each s is an integer ranging from 0 to 4.
  • the compounds of formula (I) are particularly suitable for the homogeneous conjugation and the reconstruction of proteins comprising at least two disulphide bridges, in particular for the reconstruction of antibodies.
  • antibody and “immunoglobulin” refer to a heterotetramer consisting of two heavy chains of about 50-70 kDa each (say the H chains for Heavy) and two light chains of about 25 kDa each (say the L chains for Light), linked together by interchain disulphide bridges.
  • Each chain is made up, in the N-terminal position, of a region or variable domain, called VL for the light chain, VH for the heavy chain, and in the C-terminal position, of a constant region, made up of a single domain called CL for the light chain and three or four domains called CH1, CH2, CH3, CH4, for the heavy chain.
  • antibody fragment means any part of an immunoglobulin obtained by enzymatic digestion, bioproduction or protein engineering comprising at least two disulphide bridges, for example, F(ab′) 2 . Enzymatic digestion of immunoglobulins with pepsin generates an F(ab') 2 fragment and an Fc fragment split into several peptides.
  • F(ab') 2 is formed of two Fab' fragments linked by interchain disulphide bridges. Fab parts are consisting of the variable regions and the CH1 and CL domains. The Fab' fragment consists of the Fab region and a hinge region. The ability of the compounds of formula (I) to reconstruct proteins comprising at least two disulphide bridges makes it possible to envisage their use for preparing conjugates between such proteins and a molecule of interest, where appropriate via a spacer arm.
  • the present invention relates to a compound of formula (II): in which: - the hook head is a compound of formula (I) as defined above (it being understood that within the framework of the definition of the compound of formula (II) the acid compounds 2,6-bis[2 ,6-bis(bromomethyl)phenyl]benzoic acid and 1,3-bis[[3,5-bis(bromomethyl)phenoxy]-methyl]-5-prop-2-ynoxy-benzene are an integral part of formula (I) ); - The connecting arm is a direct connection; an amino acid residue; a peptide residue; a sugar ; a glucuronide; an -SS- bridge; -NHCH[CH 2 COR 10 ] 2 -; or a formula group: wherein R 10 is a direct bond, a peptide residue (preferably a dipeptide residue), -(CR c R d ) r R 5 , or -(CH 2 CH 2 O)
  • an acid or ester group carried by the compound of formula (I) has reacted with an amino group to form an amide-type bond between the hook head and the linker arm (if present) or the spacer (if present) or the molecule of interest.
  • the expression “molecule of interest” given in the definition of formula (II) must in fact be understood as meaning “residue of molecule of interest”.
  • the part of formula (II) consisting of the connecting arm and the spacer is represented by one of formulas (III) or (IV):
  • the molecule of interest is an active principle, a fluorophore or a cage for radioelements.
  • - alkylating agents such as: chlorambucil, chlornaphazine, cyclophosphamide, dacarbazine, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, mannomustine, mitobronitol, melphalan, mitolactol, pipobroman, novembichine, phenesterine, prednimustine, thiotepa, trofosfamide, uracil mustard, CC-1065 (y including its synthetic analogues adozelesin, carzelesin and bizelecin), duocarmycin (including the synthetic analogues KW-2189 and CBI-TMI), benzodiazepine dimers (for example, pyrrolobenzodiazepine (
  • the active principle is chosen from duocarmycin and its analogues, dolastatins, combretastatin and its analogues, calicheamicin, N-acetyl-y-calicheamycin (CMC), a derivative of calicheamycin, maytansin and its analogues, such as a maytansinoid derivative, for example DM1 and DM4, auristatins and their derivatives, such as auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMAF), tubulysin, disorazole, epothilones, echinomycin, estramustine, cemadotin, eleutherobin, methopterin, actinomycin , mitomycin C, camptothecin, a camptothecin derivative, SN38,
  • the active ingredient is selected from pseudomonas exotoxin (PE), deBouganin, Bouganin, diphtheria toxin (DT) and ricin.
  • the active principle is chosen from methotrexate, an immunomodulator, duocarmycin, combretastatin, calicheamicin, monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMAF), maytansine, DM1, DM4 , SN38, amanitine and its analogs, pyrrolobenzodiazepine, a pyrrolobenzodiazepine dimer, pyrrolopyridodiazepine, a pyrrolopyridodiazepine dimer, a histone deacetylase inhibitor, a (tyrosine) kinase inhibitor, and ricin, preferably the principle active ingredient is amanitine or MMAE, represented by the following formula: According to another aspect, the invention relates
  • the compounds 2,6-bis[2,6-bis(bromomethyl)phenyl]benzoic acid and 1,3-bis[[3,5-bis(bromomethyl)phenoxy] -methyl]-5-prop-2-ynoxy-benzene are an integral part of formula (I) for alternatives (c1) and (c3).
  • the compounds of formula (I) and of formula (V) react with each other by carrying out a so-called “click” reaction.
  • the click reaction between the compound of formula (I) and the compound of formula (V) takes place between a diene (for example an azide or a diazo) and a dienophile (for example an alkene or an alkyne) , each of these species being respectively provided by R 7 on the one hand in the compound of formula (I), by R 11 , on the other hand in the compound of formula (V).
  • a diene for example an azide or a diazo
  • a dienophile for example an alkene or an alkyne
  • the click reaction can occur: - between a diene carried by the R 7 originating from the compound of formula (I) and a dienophile carried by the R 11 originating from the compound of formula (V); or - between a dienophile carried by the R 7 originating from the compound of formula (I) and a diene carried by the R 11 originating from the compound of formula (V).
  • Click reactions are well known to those skilled in the art, and include for example a cycloaddition reaction between a dienophile and a diene. Examples of click reactions are shown in the following diagram:
  • the protein comprising at least two disulphide bridges is an antibody or an antibody fragment as defined above.
  • the antibody or antibody fragment binds to the tether head by substitution of the leaving groups represented by substituent X in formula (I).
  • the reactions (c1) to (c3) described above lead to the reconstruction of the antibody, after reduction of the interchain disulphide bridges.
  • the reconstruction of an antibody is defined as obtaining a majority of whole LHHL antibodies.
  • the proportion of whole LHHL antibodies and of the other species (LHH, HH, LH, H, L) is determined using the optical density measured by analysis on SDS-PAGE gel under denaturing reducing conditions. Good reconstruction is achieved when the proportion of LHHL exceeds 50%.
  • the various reactions (c1) to (c3) make it possible to obtain a “molecule-to-antibody ratio” (MAR) (or ratio of molecules “attached” or “conjugated” by antibody) included in the range from about 0.50 to about 2.50.
  • MAR molecule-to-antibody ratio
  • the antibody or antibody fragment is conjugated on average at 1.00 ⁇ 0.50 (i.e. any value from 0.50 to 1.50, e.g. 0 .50; 0.51; ....; 1.49; 1.50) molecule, preferably 1.00 ⁇ 0.30 molecule.
  • the antibody or antibody fragment is conjugated on average at 2.00 ⁇ 0.50 (i.e. any value from 1.50 to 2.50, e.g.
  • molecule should be understood either as a compound of formula (I), or a compound of formula (II), or the product of the reaction (click) between a compound of formula (I) and a compound of formula (V).
  • the conjugate formed at the end of reactions (c1), (c2) or (c3) can be represented schematically by the following structure:
  • Ac is an antibody or antibody fragment; the molecule is as defined above (it being understood that the antibody or the antibody fragment binds to the attachment head of the molecule by substitution of the leaving groups X); and MAR represents the average number of molecule(s) bound to the antibody or the antibody fragment.
  • the MAR is determined for each species (LHHL, LH, L, H, HH, LHH) by HRMS (High Resolution Mass Spectrometry) analysis under denaturing conditions.
  • the average MAR is obtained from the MAR per species weighted by the proportions of the species observed in analysis on SDS-PAGE gel under denaturing non-reducing conditions.
  • the invention relates to a composition comprising one or more conjugates as defined above.
  • the composition can be a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutically acceptable excipients and/or carriers.
  • the compounds of formulas (I), (II) and (V) can be prepared according to techniques described in the literature and/or in the examples below.
  • the bioconjugation reaction (c1) or (c2) can be implemented by reaction of the protein comprising at least two disulphide bridges with the compound of formula (I) or (II) to be conjugated, in the presence of a reducing agent.
  • the protein is in solution in a buffer.
  • the reducer is added before the compound to be conjugated.
  • the reducing agent and the compound to be conjugated are added simultaneously.
  • Reaction (c3) can be carried out by (i) reaction, in the presence of a reducing agent, of the protein comprising at least two disulphide bridges with the compound of formula (I) then addition of the compound of formula (V) and click reaction or by (ii) reaction, in the presence of a reducing agent, of the protein comprising at least two disulphide bridges with a compound resulting from a prior click reaction between the compounds of formula (I) and (V).
  • the protein is in solution in a buffer.
  • the analyzes were carried out in deuterated chloroform (CDCl 3 ), in deuterated dimethyl sulphoxide (DMSO-d 6 ), in heavy water (D 2 O) or in deuterated methanol (MD 3 OD).
  • High Resolution Mass Spectrometry The exact mass of the synthesized compounds was determined by high resolution mass spectrometry (HRMS) in positive or negative mode with the ESI electrospray ionization technique, either on a Bruker maXis mass spectrometer coupled to a Dionex Ultimate 3000 RSLC system from the ICOA/CBM "Research Federation" platform (FR2708), or on a Waters Vion IMS QTof mass spectrometer coupled to a Waters Acquity UPLC H-Class system from the GICC (EA7501). Denaturing High-Resolution Mass Spectrometry (HRMS) Method 1: The analysis of the conjugates was carried out on a sample previously deglycosylated or not.
  • N-glycosidase F (0.02 units/ ⁇ g of sample) was added and the sample was incubated at 37°C for at least 16 h.
  • the analysis was carried out on a Vion IMS Qtof mass spectrometer coupled to an Acquity UPLC H-Class system from Waters (Wilmslow, UK). Before analysis, the samples (800 ng) were injected on an XBridge BEH300 C4 2.1 x 50 mm, 1.7 ⁇ m column, or on an XBridge BEH300 C4 2.1 x 30 mm, 5 ⁇ m column heated to 90°C.
  • a desalting step was carried out with an isocratic gradient of 95% solvent A (H 2 O + 0.1% formic acid) and 5% solvent B (MeCN + 0.1% formic acid) for 1.5-2 min at 0.5 mL/min. Then, the elution of the sample was carried out with a gradient of 20% to 35% of solvent B over 7 min, from 50% to 90% of solvent B over 3 min, and an isocratic of 1 min at 90% of B, i.e. with a gradient of 5% to 50% of solvent B over 2.9 min, from 50% to 90% of solvent B over 0.5 min, an isocratic of 0.5 min at 90% of B, with a flow rate of 0.4 mL/min.
  • a bypass valve was programmed to allow solvent to enter the spectrometer between 3 and 7.5 min only.
  • Mass spectrometry data were acquired in positive mode with an ESI source over an m/z range of 500 to 4000 at a scan rate of 1 Hz and analyzed using UNIFI 1.9.4 software and the MaxEnt algorithm to deconvolution.
  • Method 2 The spectrometric analysis of certain conjugates was carried out on a Bruker maXis mass spectrometer coupled to a Dionex Ultimate 3000 RSLC system.
  • MS analysis Prior to MS analysis, samples (5 ⁇ g) were desalted on a MassPREP desalting column (2.1x10 mm, Waters), heated to 80°C using 0.1% aqueous formic acid solution as solvent A and a 0.1% solution of formic acid in acetonitrile as solvent B at 500 ⁇ L/min. After 1 min, a linear gradient from 5 to 90% of B in 1.5 min was applied. MS data was acquired in positive mode with an ESI source over an m/z range of 900 to 5000 at 1 Hz and analyzed using DataAnalysis 4.4 software (Bruker) and the MaxEnt algorithm for deconvolution.
  • SDS-PAGE gel under denaturing, non-reducing or reducing conditions The samples were analyzed by SDS-PAGE tris-HCl acrylamide gel. A 4% acrylamide stacking gel on a 6-7% acrylamide running gel were used. 4X Laemmli buffer (0.3 mM bromophenol blue; 2 M glycerol, 20 mM TrisBase; 0.04% sodium dodecyl sulfate) was added to the samples (1.6 ⁇ g).
  • the samples were reduced using a 10% solution of dithiothreitol (DTT) in water (10% v/v). Then the samples were incubated at 95°C for 10 min. A large amplitude molecular weight marker (Invitrogen SeeBlue® Plus2 Prestained Standard) and the native antibody were used to estimate the molecular weights of the proteins.
  • the gel was run at 100 V for 10 min then at 140 V for 35 min, in NuPAGE running buffer (50 mM MOPS; 50 mM TrisBase; 0.1% SDS (v/v); 1 mM EDTA , pH 7.3). After washing with water, the gel was stained with Coomassie blue (Thermo Scientific ImperialTM Protein Stain).
  • Bioconjugation reactions Preparation of solutions Bioconjugation buffer 1: 1X phosphate buffer at pH 8.3, with a final NaCl concentration of 180 mM and a final EDTA concentration of 1 mM. Bioconjugation buffer 2: 1X borate buffer at pH 8.3, with a final NaCl concentration of 25 mM and a final EDTA concentration of 1 mM.
  • Reducer 1 Solution of tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP.HCl) at a concentration of 1 mM in the bioconjugation buffer.
  • Reducer 2 Solution of dithiothreitol (DTT) at a concentration of 1 mM in the bioconjugation buffer.
  • Bioconjugation reaction 1 The antibody solution in bioconjugation buffer (1.0 eq) was placed under argon. The reducing agent (8.0-12.0 eq) was then added and the reaction medium was incubated at 37° C. for 2 h.
  • Bioconjugation reaction 2 The solution of antibodies in the bioconjugation buffer (1.0 eq) was placed under argon. The solutions of compound to be conjugated (1.0-15.0 eq, preferably 8.0-12.0 eq) then of reducing agent (7.0-12.0 eq) were added and the reaction medium was stirred under argon at 37°C for 2 h 30.
  • Bioconjugation reaction 3 The solution of antibodies in the bioconjugation buffer (1.0 eq) was placed under argon.
  • TBDMSOTf (5.5 mL; 23.974 mmol; 4.2 eq) was added dropwise over 10 min, then the reaction medium was stirred under argon at AT for 19 h. The medium was cooled to 0° C. then neutralized by adding a saturated solution of NaHCO 3 . The aqueous phase was extracted with DCM (3 ⁇ 100 mL) and the combined organic phases were washed with saturated NaCl solution, dried over MgSO 4 , filtered, then concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash chromatography (SiO 2 , cyclohexane/AcOEt, 90:10) to give (3) (2.50 g; 87%) in the form of a beige solid.
  • Step 1 methyl 2,3-bis(dibenzylamino)propanoate (7) Racemic methyl 2,3-dibromopropanoate (154.4 ⁇ L; 1.22 mmol; 1.0 eq) was dissolved in 6 mL of absolute EtOH. Then Bn 2 NH (939 ⁇ L; 4.88 mmol; 4.0 eq) was added slowly with stirring, a precipitate formed after about 1 min. The reaction medium was stirred under argon at reflux (71° C.) for 1 hour 30 minutes. The amine salts were filtered off on a frit. Then the filtrate was evaporated under reduced pressure.
  • the beige solid obtained was taken up in DCM (20 mL) and then washed with water (2x20 mL) and saturated NaCl solution (1x20 mL). The organic phase was then dried over MgSO 4 and concentrated under reduced pressure. The product was purified by flash chromatography (SiO 2 , cyclohexane/AcOEt 80:20) to give (7) (471 mg; 81%) in the form of a colorless oil.
  • Step 3 Methyl 2,3-bis(2,6-bis(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)isonicotinamido)propanoate (9)
  • Methyl 2,3-diaminopropanoate hydrochloride (8) (99.7 mg; 0.645 mmol; 1.0 eq) was dissolved in anhydrous DMF (2.4 mL) and anhydrous DIPEA (381.7 ⁇ L 2.19 mmol; 3.4 eq) was added. The reaction medium was stirred under argon at RT for 2 h 20.
  • Table 1 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 2 below.
  • Table 2 1 not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 55% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 3 methyl 3-(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)methyl)propanoate (16) and 3-(2,6-bis( bromomethyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromomethyl)- isonicotinamido)methyl)propanoic acid (17)
  • General reaction scheme (a) BnNH 2 , DIPEA, CHCl 3 , 4:25 p.m., 0°C then AT; (b) H 2 , Pd(OH) 2 /C, 1,1,2-trichloroethane, MeOH, 62 h, RT; (c) HATU, 2,6-lutidine, DMF, Compound 4.5h, TA; (d) TBAF, THF, 7:30 a.m.
  • Step 1 Methyl 3-(benzylamino)-2-((benzylamino)methyl)propanoate (12), double salt of TFA Methyl 3-bromo-2-(bromomethyl)propanoate (549 ⁇ L; 3.85 mmol; 1.0 eq) was dissolved in anhydrous CHCl 3 (9.6 mL). Then benzylamine (1.68 mL; 15.4 mmol; 4.0 eq) was added dropwise with stirring at 0°C. A precipitate was observed.
  • the reaction medium was stirred under argon at 0° C. for 25 min. Then anhydrous DIPEA (1.41 mL; 8.1 mmol; 2.1 eq) was added to the reaction medium drop by drop, the disappearance of the precipitate was observed.
  • the reaction medium was stirred under argon at AT for 16 h. The CHCl 3 was evaporated off under reduced pressure. The residue was taken up in AcOEt (15 mL), then washing was carried out with water (5x15 mL) and saturated NaCl solution (1x20 mL). The organic phase was then dried over MgSO 4 and concentrated under reduced pressure.
  • 1,1,2-trichloroethane (393 ⁇ L; 4.23 mmol, 2.8 eq) was added and the solution was degassed with argon for 15 min. Then Pd(OH) 2 /C 20% by mass (327.2 mg, 40% m/m) was added. The reaction medium was stirred under a hydrogen atmosphere at AT for 62 h. The Pd(OH) 2 /C was filtered through DicaliteTM then the filtrate was concentrated under reduced pressure. The product (13) (376.1 mg, 99%) salified (1.4 HCl; 0.6 TFA, NMR assay) was obtained in the form of a brown heterogeneous oil.
  • Step 5 Methyl 3-(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromomethyl)-isonicotinamido)methyl)propanoate (16) Methyl 3-(2,6-bis(hydroxymethyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(hydroxymethyl)isonicotinamido)- methyl)propanoate (15) (86.3 mg; 0.187 mmol; 1.0 eq) was suspended in anhydrous MeCN (4.3 mL) then PBr 3 (105 ⁇ L; 1.12 mmol; 6.0 eq) was added dropwise. The reaction medium was stirred at 45° C. for 2 h 30.
  • Step 6 3-(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)methyl)propanoic acid (17) Methyl 3-(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)- methyl)propanoate (16) (56.8 mg; 0.080 mmol; 1.0 eq) was dissolved in THF (4.4 mL) and a solution of hydrated LiOH (4.8 mg; 0.199 mmol; 2.5 eq) in water (1.99 mL) was added slowly.
  • reaction medium was stirred at RT (25°C) for 2 h 10.
  • the reaction medium was acidified at 0° C. with an aqueous solution of 0.1 N HCl then extracted with AcOEt (4x10 mL) .
  • the combined organic phases were washed with saturated NaCl solution, dried over MgSO 4 and concentrated under reduced pressure.
  • Table 3 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and an average MAR of 1.06 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing conditions The results are presented in Table 4 below.
  • Table 4 1 not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under non-reducing conditions an average MAR of 2.03.
  • Example 5 Nivolumab - Compound (16) Conjugate Reagents Bioconjugation Buffer 1, 5 mg/mL nivolumab in Bioconjugation Buffer, Reducer 2 (8.0 eq), Compound (16) (6.0 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH.
  • Table 5 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.64 for the LHHL species and an average MAR of 1.01 for the LH species.
  • LHH, HH and H species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 6 below.
  • Table 6 1 not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 79% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.75.
  • Example 6 Trastuzumab - compound (16) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, 10 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (16) (10.6 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH.
  • Denaturing HRMS analysis according to method 1 The results are presented in Table 7 below. Table 7 1: molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed The HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.29 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species. LHH, HH and H species were not observed.
  • Table 9 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.25 for the LHHL species and an average MAR of 1.04 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 10 below.
  • Table 10 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 54% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.16.
  • Example 8 N-(2-((((2,6-bis(bromomethyl)pyridin-4-yl)carbonyl)amino)-methyl)-19-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5 (6H)-yl)-3,14,19-trioxo-7,10-dioxa-4,13-diazanonadec-1-yl)-2,6-bis(bromomethyl)pyridine-4-carboxamide (20) and 6 -azidohexanamido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE (22) General reaction scheme
  • Step 1 tert-butyl (2-(2-(2-((6-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanoyl)amino)ethoxy)ethoxy) ethyl)carbamate (18) 6-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanoic acid (32.1 mg; 0.104 mmol; 1.2 eq) was suspended in the Anhydrous DMF (750 ⁇ L).
  • HATU (66.6 mg; 0.175 mmol; 2.0 eq) and 2,6-lutidine (26.2 ⁇ L; 0.225 mmol; 2.6 eq) were added.
  • the activation solution was stirred under argon at RT (19°C) for 10 min.
  • tert-butyl (2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (20.6 ⁇ L; 0.087 mmol; 1.0 eq) was slowly added to the activation medium.
  • the reaction medium obtained was stirred under argon at AT for 1 hour 30 minutes.
  • the DMF was evaporated under reduced pressure.
  • the reaction medium was stirred under argon in the dark and at 25° C. for 1 hour 40 minutes.
  • Step 5 6-azidohexanamido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate from MMAE (22) 6-Azidohexanoic acid (21) (1.3 mg; 0.008 mmol; 2.0 eq) was dissolved in anhydrous DMF (100 ⁇ L). The solution was cooled to 0°C, then HATU (6.1 mg; 0.016 mmol; 4.0 eq) and 2,6-lutidine (2.8 ⁇ L; 0.024 mmol; 6.0 eq) were added. The activation solution was stirred under argon at 0°C for 15 min.
  • Table 11 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.87 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 12 below.
  • Table 12 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 96% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.88.
  • Example 10 Trastuzumab - Compound (20) Conjugate Reagents Bioconjugation Buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in Bioconjugation Buffer, Reducer 1 (7.0 eq), Compound (20) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH.
  • Denaturing HRMS Analysis According to Method 1 The results are shown in Table 13 below. Table 13 1: molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed The HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.19 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species. LHH, HH and H species were not observed.
  • Example 11 Conjugate trastuzumab – compound (20) – compound (22) Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in the bioconjugation buffer, reducer 1, compound (20) ( 1st compound) (10.6 eq ) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (22) (2 nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 3. The reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with PBS buffer pH 7.4 Gibco ®. Denaturing HRMS Analysis According to Method 1 The results are shown in Table 15 below.
  • Table 15 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed. No mass increment corresponding to compound (20) is observed: the trastuzumab-compound (20) conjugate has been entirely converted.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 16 below.
  • Table 16 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 97% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 12 Trastuzumab – compound (20) – compound (22) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in bioconjugation buffer, reducer 1, compound (20) ( 1st compound) (10.6 eq ) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (22) ( 2nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 3 Denaturing HRMS analysis according to method 1 The results are presented in Table 17 below.
  • Table 17 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.17 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed. No mass increment corresponding to compound (20) is observed: the trastuzumab-compound (20) conjugate has been entirely converted.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 18 below.
  • Table 18 1 not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 75% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.19.
  • Table 19 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 20 below.
  • Table 20 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 61% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 15 Methyl 3,5-bis(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)benzoate (26)
  • Step 1 Methyl 3,5-bis(2,6-bis(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-isonicotinamido)benzoate (24) 2,6-bis(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)isonicotinic acid (4) (1.39 g; 3.376 mmol; 2.5 eq) was suspended in peptide DMF (8.0 mL), then HATU (1.54 g; 4.050 mmol; 3.0 eq) and 2,6-lutidine (0.63 mL; 5.439 mmol; 4.0 eq) were added. The activation solution was stirred under argon at RT (25°C) for 45 min.
  • Step 3 Methyl 3,5-bis(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)benzoate (26) ( ) Methyl 3,5-bis(2,6-bis(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)isonicotinamido)benzoate (25) (64 mg; 0.129 mmol; 1.0 eq) was suspended in MeCN anhydrous (5 mL) then PBr 3 (74 ⁇ L; 0.780 mmol; 6.0 eq) was added dropwise. The suspension was stirred under argon at 45°C for 4 h.
  • Example 16 Trastuzumab - compound (26) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (26) (12.0 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH.
  • Method Bioconjugation reaction 1. Denaturing HRMS analysis according to method 1 The results are presented in Table 21 below.
  • Table 21 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.36 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • the LHH, HH and H species were not observed SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 22 below.
  • Table 22 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 78% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.30.
  • Example 17 3,5-bis(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)benzoic acid (28)
  • General reaction scheme (a) LiOH, THF, H 2 O, 43 h, RT; (b) PBr 3 , DMF, 3 h 30, 0°C then AT.
  • Step 1 3,5-bis(2,6-bis(hydroxymethyl)isonicotinamido)benzoic acid (27) Methyl 3,5-bis(2,6-bis(hydroxymethyl)isonicotinamido)benzoate (25) (312 mg; 0.628 mmol; 1.0 eq) was suspended in THF (35 mL) and a solution of hydrated LiOH (42 mg; 1.754 mmol; 2.8 eq) in water (17.5 mL) was added. The reaction medium was stirred at RT (25° C.) for 43 h. The medium was acidified with an aqueous solution of 1 N HCl to pH 1 and the THF was evaporated under reduced pressure.
  • Step 2 3,5-bis(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)benzoic acid (28) 3,5-bis(2,6-bis(hydroxymethyl)isonicotinamido)benzoic acid (27) (20 mg; 0.041 mmol; 1.0 eq) was suspended in anhydrous DMF (1.3 mL) at 0° C. then PBr 3 (32 ⁇ L; 0.337 mmol; 8.2 eq) was added dropwise. The suspension was stirred under argon at RT (25 ° C) for 3 h 30.
  • Example 18 Trastuzumab - compound (28) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (12.0 eq), compound (28) (12.0 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH.
  • Method Bioconjugation reaction 1. Denaturing HRMS analysis according to method 1 The results are presented in Table 23 below. Table 23 1: molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed HRMS analysis determined an average MAR of 2.27 for LHHL species and an average MAR of 1.00 for LH species.
  • Step 1 methyl 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxymethyl)isonicotinamido)benzamido)-hexanoate (29) 3,5-bis(2,6-bis(hydroxymethyl)isonicotinamido)benzoic acid (27) (98 mg; 0.203 mmol; 1.0 eq) was suspended in anhydrous DMF (8.0 mL) under argon at 0° C., then HATU (116 mg; 0.305 mmol; 1.5 eq) and 2,6-lutidine (110 ⁇ L; 0.950 mmol; 4.7 eq) were added. The activation solution was stirred under argon at 0°C for 15 min.
  • the suspension was stirred under argon at 45°C for 50 min.
  • the viscous cream-white reaction medium was suspended by adding anhydrous DMF (1.4 mL).
  • the white suspension obtained was stirred at 45° C. for 1 hour 10 minutes.
  • the reaction medium was neutralized with water and extracted with AcOEt (3 ⁇ 30 mL). The combined organic phases were washed with saturated NaCl solution, dried over MgSO 4 , filtered and concentrated under reduced pressure.
  • Table 27 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH and H species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 28 below.
  • Table 28 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 54% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 22 6-(3,5-bis(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)-benzamido)hexanoic acid (32)
  • Step 1 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxymethyl)isonicotinamido)benzamido)-hexanoic acid (31) Methyl 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxymethyl)isonicotinamido)benzamido)hexanoate (29) (110 mg; 0.180 mmol; 1.0 eq) was suspended in THF (9 mL) and a solution of 0.1 M LiOH (10.8 mg; 0.451 mmol; 2.5 eq) in water (4.5 mL) was added.
  • the reaction medium was stirred at AT (25° C.) for 25 h.
  • the medium was acidified with an aqueous solution of 1 N HCl to pH 1 and the THF was evaporated under reduced pressure.
  • Step 2 6-(3,5-bis(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)benzamido)-hexanoic acid (32) 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxymethyl)isonicotinamido)benzamido)hexanoic acid (31) (48.7 mg; 0.082 mmol; 1.0 eq) was suspended in MeCN anhydrous (4 mL) then PBr 3 (47 ⁇ L; 0.495 mmol; 6.0 eq) was added dropwise. The suspension was stirred under argon at 45°C for 3 h 10.
  • the activation medium was stirred under argon at 25°C for 1 hour 30 minutes.
  • a solution of trifluoroacetic acid salt of 6-aminohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE (6) (9.0 mg 0.0067 mmol; 1.0 eq), dissolved in anhydrous DMF (134 ⁇ L) in the presence of DIPEA (4.7 ⁇ L; 0.0270 mmol; 4.0 eq), was added to the activation medium .
  • the reaction medium obtained was stirred at 25° C. for 2 h.
  • t R 22.6 min; on the Gilson PLC 2050 system [ARMEN V2 (pump) and ECOM TOYDAD600 (UV detector)] detection UV at 254 nm at 25°C; Waters XBridgeTM C-18 column; 5 ⁇ m (250 mm x 19.00 mm
  • the activation medium was stirred under argon at 25°C for 30 min.
  • a solution of 4-methyltetrazinylphenoxy-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amine (3.0 mg; 0.008 mmol; 1.0 eq)
  • anhydrous DIPEA 13.1 ⁇ L; 0.075 mmol; 10.0 eq
  • the reaction medium obtained was stirred under argon at 25° C. for 1 h.
  • Example 25 1-trans-cyclooctenyl-1-oxo-5,8,11,14-tetraoxa-2-azahetaptadecan-17-amide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate from MMAE (35) 1-trans-cyclooctenyl-1-oxo-5,8,11,14-tetraoxa-2-azahetaptadecan-17-oic acid (5.5 mg; 0.013 mmol; 1.6 eq) was dissolved in DMF anhydrous (200 ⁇ L).
  • the reaction medium was cooled to 0° C., then HATU (12.7 mg; 0.033 mmol; 4.1 eq) and 2,6- lutidine (5.6 ⁇ L; 0.049 mmol; 5.2 eq) were added.
  • the activation solution was stirred under argon at 0°C for 15 min.
  • a solution of trifluoroacetic acid salt of valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE (10.0 mg; 0.008 mmol; 1.0 eq), solubilized in anhydrous DMF (200 ⁇ L), was added to the medium of activation.
  • the reaction medium was placed under stirring, under argon at RT for 16 h.
  • Example 26 Trastuzumab - Compound (34) Conjugate Reagents Bioconjugation Buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in Bioconjugation Buffer, Reducer 1 (7.0 eq), Compound (34) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH.
  • Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 29 below. Table 29 1: molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed The HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.00 for the LHHL species and of 0.77 for the LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Table 30 1 not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 61% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.02.
  • Example 27 Trastuzumab – compound (34) – compound (35) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in bioconjugation buffer, reducer 1, compound (34) ( 1st compound) (10.6 eq ) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (35) (2 nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Example 28 Trastuzumab - Compound (34) Conjugate Reagents Bioconjugation Buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in Bioconjugation Buffer, Reducer 1 (8.0 eq), Compound (34) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH.
  • Method Bioconjugation reaction 1. Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 33 below. Table 33 1: molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed The HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and of 1.00 for the LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 29 Trastuzumab – compound (34) – compound (35) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1, compound (34) (1 st compound) (8.0 eq ) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (35) (2 nd compound) (8.8 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 3 3. Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 35 below.
  • Table 35 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing conditions The results are presented in Table 36 below.
  • Table 36 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 69% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 30 2-(2-(2-(trans-cyclooctenylcarbamoyl)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoylpropane-1,3-diyl(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamide) (36) Under an inert atmosphere, in the dark and under anhydrous conditions, 3-(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)methyl)-propanoic acid (17 ) (14.7 mg; 0.021 mmol; 2.2 eq) was suspended in anhydrous MeCN (1.4 mL) then EEDQ (39.2 mg; 0.159 mmol; 16.4 eq) was added .
  • the activation medium was stirred under argon at 25°C for 30 min.
  • a solution of trans-cyclooctenyl(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (2.9 mg; 0.010 mmol; 1.0 eq), dissolved in anhydrous DMF (1.25 mL) in the presence of anhydrous DIPEA (17.0 ⁇ L; 0.098 mmol; 10.1 eq), was added to the activation medium.
  • the reaction medium obtained was stirred under argon at 25° C. for 1 hour.
  • Example 31 4-methyleteatrazinylphenoxy-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate from MMAE (37) 4-Methylteatrazinylphenoxy-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oic acid (4.5 mg; 0.011 mmol; 1.3 eq) was dissolved in anhydrous DMF (200 ⁇ L).
  • the reaction medium was cooled to 0° C., then HATU (12.2 mg; 0.032 mmol; 3.9 eq) and 2,6-lutidine (5.6 ⁇ L; 0.049 mmol; 6.0 eq) were added.
  • the activation solution was stirred under argon at 0°C for 15 min.
  • a solution of trifluoroacetic acid salt of valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE (10.1 mg; 0.008 mmol; 1.0 eq), solubilized in anhydrous DMF (200 ⁇ L), was added to the medium of activation.
  • the reaction medium was placed under stirring, under argon at RT for 16 h.
  • Example 32 Trastuzumab - Compound (36) Conjugate Reagents Bioconjugation Buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in Bioconjugation Buffer, Reducer 1 (7.0 eq), Compound (36) (3.0 eq) at a concentration of 0.25 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH.
  • Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 37 below. Table 37 1: molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed The HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.18 for the LHHL species and 1.0 for the LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 33 Trastuzumab – compound (36) – compound (37) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1, compound (36) (1 st compound) (3.0 eq ) at a concentration of 0.25 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (37) (2 nd compound) (3.3 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 3 3. Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 39 below.
  • Table 39 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed HRMS analysis determined an average MAR of 1.20 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species. LHH, HH, H and L species were not observed. SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing conditions The results are presented in Table 40 below. Table 40 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 63% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.32.
  • Example 34 panitumumab – compound (36) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, panitumumab at 5 mg/mL in bioconjugation buffer, reducer 1 (10.6 eq), compound (36) (18.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH.
  • Method Bioconjugation reaction 1. Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 41 below. Table 41 1: molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed The HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 0.98 for the LHHL species and of 1.00 for the LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Table 43 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 44 below.
  • Table 44 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 60% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 36 Trastuzumab – compound (36) – compound (37) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (36) (1 st compound ) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 30% DMF and 70% MeOH, compound (37) ( 2nd compound) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 4 Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 45 below.
  • Table 45 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 46 below.
  • Table 46 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 62% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 37 4- ⁇ 2-azatricyclo[10.4.0.0 4.9 ]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-yn-2-yl ⁇ -N- (2- ⁇ 2-[2-(3- ⁇ [2,6-bis(bromomethyl)pyridin-4-yl]formamido ⁇ -2-( ⁇ [2,6-bis(bromomethyl)pyridin-4-yl] formamido ⁇ methyl) - propanamido)ethoxy]ethoxy ⁇ ethyl) ⁇ 4 ⁇ oxobutanamide (38) Under an inert atmosphere, in the dark and under anhydrous conditions, 3-(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)methyl)-propanoic acid (17 ) (17.7 mg; 0.025 mmol; 2.1 eq) was suspended in anhydrous MeCN (1.69 m
  • the activation medium was stirred under argon at 25°C for 30 min.
  • the reaction medium obtained was stirred under argon at 25° C.
  • Table 47 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.07 for the LHHL species.
  • LHH, HH, LH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 48 below.
  • Table 48 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 93% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.07.
  • Example 39 Conjugate trastuzumab – compound (38) – compound (22) Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in the bioconjugation buffer, reducer 1, compound (38) ( 1st compound) (10.6 eq ) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (22) ( 2nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 3 Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 49 below.
  • Table 49 1 molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.00 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 50 below.
  • Table 50 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 77% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.00.
  • Example 40 conjugate trastuzumab - compound (38) - commercial compound AF488 Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in the bioconjugation buffer, reducer 1, compound (38) ( 1st compound) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, commercial compound (AF488, marketed by the company ThermoFisher Scientific) ( 2nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in of DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 3 Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 51 below.
  • Table 51 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.27 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 52 below.
  • Table 52 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 94% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.28.
  • Example 41 Trastuzumab - Compound (38) Conjugate Reagents Bioconjugation Buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in Bioconjugation Buffer, Reducer 1 (7.0 eq), Compound (38) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH.
  • Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 53 below. Table 53 1: molecular mass of the deglycosylated species 2: not observed The HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and of 1.00 for the LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 42 Trastuzumab – compound (38) – compound (22) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1, compound (38) (1 st compound) (12.0 eq ) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (22) ( 2nd compound) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Example 44 (4- ⁇ 2 - [2 - (6 - ⁇ 2 - azatricyclo[10.4.0.0 4.9 ]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15- hexaen - 10 -yn-2-yl ⁇ -6-oxohexanamido)-3-methylbutanamido]-5-(carbamoylamino)pentanamido ⁇ phenyl)methyl N- ⁇ 1-[(1- ⁇ [1-(2- ⁇ 2-[( 1-hydroxy-1-ph enylpropan-2-yl)carbamoyl]-1-m ethoxy-2-methylethyl ⁇ pyrrolidin-1-yl)-3-m ethoxy-5-m ethyl-1-oxohepta n-4- yl](methyl)carbamoyl ⁇ -2-m ethylpropyl)carbamoyl]-2-m ethylpropy
  • the reaction medium was stirred at AT, and HATU (3.0 mg; 0.008 mmol; 2.0 eq) and 2,6-lutidine (1.2 ⁇ L; 0.010 mmol; 2.5 eq) were added.
  • the activation solution was stirred under argon at 21°C for 10 min.
  • a solution of trifluoroacetic acid salt of valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE (5.0 mg; 0.004 mmol; 1.0 eq), solubilized in anhydrous DMF (100 ⁇ L), was added to the medium of activation.
  • the reaction medium was stirred, under argon at RT for 1 h 30.
  • Table 57 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 58 below.
  • Table 58 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 66% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 46 Conjugate trastuzumab - compound (39) - compound (40) Reagents Bioconjugation buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (39) (1 st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (40) ( 2nd compound) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 4 Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 59 below.
  • Table 59 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed 3: intermediate compound trastuzumab – compound (39) not clicked with compound (40)
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.81 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 60 below.
  • Table 60 1 not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 63% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.84.
  • Example 47 bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl (4-((2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)methyl)-1-(2,6-bis(bromomethyl)pyridin-4 - yl)-1,5-dioxo-9,12,15,18-tetraoxa-2,6-diazaicosan-20-yl)carbamate (41) Under an inert atmosphere, in the dark and under anhydrous conditions, 3-(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)methyl)-propanoic acid (17 ) (8.3 mg; 0.012 mmol; 1.6 eq) was suspended in anhydrous MeCN (1.4 mL) then EEDQ (30.3 mg; 0.123 mmol; 17.0 eq) was added .
  • the activation medium was stirred under argon at 25°C for 30 min.
  • a solution of bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl (14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradecyl)carbamate (3.8 mg; 0.007 mmol; 1.0 eq), dissolved in anhydrous DMF (1 mL) in the presence of anhydrous DIPEA (15.0 ⁇ L; 0.086 mmol; 11.9 eq), was added to the activation medium.
  • the reaction medium obtained was stirred under argon at 25° C. for 1 h.
  • Example 48 Trastuzumab Conjugate - Compound (41) Reagents Bioconjugation buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (7.0 eq), compound (41) (10.6 eq) at 1 mM concentration in 80% DMF mix and 20% MeOH.
  • Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 61 below. Table 61 1: molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed The HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.05 for the LHHL species and of 1.00 for the LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 49 Trastuzumab – compound (41) – compound (22) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in bioconjugation buffer, reducer 1, compound (41) ( 1st compound) (10.6 eq ) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (22) ( 2nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 3 Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 63 below.
  • Table 63 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed 3: intermediate compound trastuzumab – compound (41) not clicked with compound (22)
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.16 for the LHHL species and an average MAR of 0.49 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 64 below.
  • Table 64 1 not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 70% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.07.
  • Example 50 Conjugate trastuzumab - compound (41) - commercial compound AF488 Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in the bioconjugation buffer, reducer 1, compound (41) ( 1st compound) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, commercial compound (AF488) ( 2nd compound) (11.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO. ( ) Method Bioconjugation reaction 3. Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 65 below.
  • Table 65 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.26 for the LHHL species and an average MAR of 0.86 for the LH species.
  • LHH, HH and H species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 66 below.
  • Table 66 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 69% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.30.
  • Example 51 Conjugate trastuzumab - compound (41) - commercial compound N 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanintine Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in bioconjugation buffer, reducer 1, compound ( 41) ( 1st compound) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, commercial compound (N 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanintine , obtained from the company Levena Biopharma) ( 2nd compound) (12.7 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Table 68 1 not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 72% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.44.
  • Example 52 Trastuzumab - Compound (41) Conjugate Reagents Bioconjugation Buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in Bioconjugation Buffer, Reducer 1 (8.0 eq), Compound (41) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH. Method Bioconjugation reaction 1. Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 69 below.
  • Table 69 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 70 below.
  • Table 70 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 62% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 53 Trastuzumab – compound (41) – compound (22) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (41) (1 st compound ) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (22) ( 2nd compound) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 4 Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 71 below.
  • Table 71 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and an average MAR of 1.00 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 72 below.
  • Table 72 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 56% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 54 Conjugate trastuzumab - compound (41) - commercial compound AF488 Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in bioconjugation buffer, reducer 1 (8.0 eq), compound (41) ( 1st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (AF488) ( 2nd compound) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO .
  • Example 55 Conjugate trastuzumab - compound (41) - commercial compound N 3 -Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanintine Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in bioconjugation buffer, reducer 1 (8, 0 eq), compound (41) ( 1st compound) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, commercial compound (N 3 -Cap-Val-Cit -PAB-C6-amanintine) ( 2nd compound) (13.2 eq) at a concentration of 10 mM in DMSO.
  • Table 76 1 not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 52% and under non-reducing conditions an average MAR of 2.00.
  • Example 56 MMAE 2-amino-3-sulfopropanamido-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate, TFA salt (42) ( ) 2-( ⁇ [(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl ⁇ amino)-3-sulfopropanoic acid (4.9 mg; 0.013 mmol; 1.6 eq) was dissolved in anhydrous DMF (200 ⁇ L).
  • the reaction medium was cooled to 0°C, then HATU (15.2 mg; 0.040 mmol; 5.0 eq) and 2,6-lutidine (5.6 ⁇ L; 0.049 mmol; 6.0 eq) were been added.
  • the activation solution was stirred under argon at 0°C for 5 min.
  • a solution of the trifluoroacetic acid salt of valine-citrulline-p- aminobenzoyl carbamate of MMAE (10.0 mg; 0.008 mmol; 1.0 eq), dissolved in anhydrous DMF (200 ⁇ L), was added to the activation medium.
  • the reaction medium was placed under stirring, under argon at RT for 15 h 40.
  • the activation medium was stirred under argon at 25°C for 40 min.
  • a solution of (42) (4.7 mg; 0.0034 mmol; 1.0 eq), dissolved in anhydrous DMF (68 ⁇ L) in the presence of anhydrous DIPEA (5.9 ⁇ L; 0.034 mmol; 10.0 eq), was added to the activation medium.
  • the reaction medium obtained was stirred under argon at 25° C. for 3 h.
  • Table 77 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.00 for the LHHL species and of 0.61 for the LH species.
  • LHH, HH, H and L species were not observed.
  • SDS-PAGE gel analysis under denaturing non-reducing and reducing conditions The results are presented in Table 78 below.
  • Table 78 1: not observed Analysis on SDS-PAGE gel made it possible to determine under reducing conditions a reconstruction of 60% and under non-reducing conditions an average MAR of 1.02.
  • Example 59 Trastuzumab - Compound (43) Conjugate Reagents Bioconjugation Buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in Bioconjugation Buffer, Reducer 1 (7.0 eq), Compound (43) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH.
  • Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 79 below. Table 79 1: molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed The HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 2.00 for the LHHL species and of 1.00 for the LH species. LHH, HH, H and L species were not observed.
  • Example 60 MMAE amine 3-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]-propanamido-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate, TFA salt (44) 1-(9H-fluoren-9-yl)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4-azatridecan-13-oic acid (4.0 mg; 0.010 mmol; 1.2 eq) was dissolved in anhydrous DMF (200 ⁇ L). The reaction medium was cooled to 0°C, then HATU (12.5 mg; 0.033 mmol; 4.0 eq) and 2,6-lutidine (5.6 ⁇ L; 0.049 mmol; 5.8 eq) were been added.
  • TFA salt (44) 1-(9H-fluoren-9-yl)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4-azatridecan-13-oic acid (4.0 mg; 0.010 mmol; 1.2 eq) was
  • the activation solution was stirred under argon at 0°C for 15 min.
  • a solution of trifluoroacetic acid salt of valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE (10.3 mg; 0.008 mmol; 1.0 eq), solubilized in anhydrous DMF (200 ⁇ L), was added to the medium of activation.
  • the reaction medium was placed under stirring, under argon at RT for 16 h. Piperidine (80 ⁇ L, 20% v/v) was added and the reaction medium was stirred under argon at AT for 10 min.
  • the activation medium was stirred under argon at 25°C for 30 min.
  • a solution of (44) (2.5 mg; 0.002 mmol; 1.0 eq), dissolved in anhydrous DMF (360 ⁇ L) in the presence of anhydrous DIPEA (3.1 ⁇ L; 0.018 mmol; 10.0 eq), was added to the activation medium.
  • the reaction medium obtained was stirred under argon at 25° C. for 1 hour.
  • the reaction medium was cooled to 0°C, then a solution of HATU (30.9 mg; 0.081 mmol; 3.0 eq) and 2,6-lutidine (18.8 ⁇ L; 0.162 mmol; 6.0 eq ), solubilized in peptide DMF (150 ⁇ L), was added.
  • the activation solution was stirred under argon at 0°C for 10 min.
  • Example 63 N 1 ,N 5 -bis(2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-3-(3-(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)-2- ((2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)methyl)propanamido)pentanediamide (47) ( ) Under an inert atmosphere, in the dark and under anhydrous conditions, 3-(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamido)methyl)-propanoic acid (17) (16.3 mg; 0.023 mmol; 1.6 eq) was suspended in anhydrous MeCN (400 ⁇ L) then EEDQ (6.2 mg; 0.025 mmol; 1.7 eq) was added .
  • the activation medium was stirred under argon at 25°C for 45 min.
  • a solution of (46) (8.0 mg; 0.0146 mmol; 1.0 eq), dissolved in anhydrous DMF (100 ⁇ L) in the presence of anhydrous DIPEA (11.8 ⁇ L; 0.068 mmol; 4.7 eq ), was added to the activation medium.
  • the reaction medium obtained was stirred under argon at 25° C. for 1 hour.
  • Example 64 Trastuzumab - Compound (47) Conjugate Reagents Bioconjugation Buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in Bioconjugation Buffer, Reducer 2 (8.0 eq), Compound (47) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH.
  • Method Bioconjugation reaction 1. Denaturing HRMS analysis according to method 2 The results are presented in Table 81 below. Table 81 1: molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed The HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.87 for the LHHL species and of 1.00 for the LH species. LHH, HH, and H species were not observed.
  • Example 65 Trastuzumab – compound (47) – compound (40) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in bioconjugation buffer, reducer 2 (8.0 eq), compound (47) (1 st compound ) (12.0 eq) at a concentration of 3 mM in a mixture of 20% DMF and 80% MeOH, compound (40) ( 2nd compound) (30.0 eq) at a concentration of 1 mM in DMSO.
  • Method Bioconjugation reaction 4 4.
  • the reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with PBS buffer Gibco ® pH 7.4, the concentration of the intermediate conjugate trastuzumab-compound (47) is adjusted to 1 4 mg/mL before adding compound (40) and the reaction medium was stirred for 22 h.
  • Denaturing HRMS Analysis According to Method 2 The results are shown in Table 83 below. Table 83 1: molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed 3: ND: structural impurity not determined
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.70 for the LHHL species and an average MAR of 0. 90 for the LH species. LHH, HH, and H species were not observed.
  • Example 66 Trastuzumab - Compound (47) Conjugate Reagents Bioconjugation Buffer 1, 5 mg/mL trastuzumab in Bioconjugation Buffer, Reducer 1 (7.0 eq), Compound (47) (10.6 eq) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH. Method Bioconjugation reaction 2.
  • Example 67 Trastuzumab – compound (47) – compound (40) conjugate Reagents Bioconjugation buffer 1, trastuzumab at 5 mg/mL in bioconjugation buffer, reducer 1, compound (47) ( 1st compound) (10.6 eq ) at a concentration of 1 mM in a mixture of 80% DMF and 20% MeOH, compound (40) (2 nd compound) (15.0 eq) at a concentration of 1 mM in DMSO.
  • the reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with PBS buffer Gibco ® pH 7.4, the concentration of the intermediate conjugate trastuzumab-compound (47) is adjusted to 1 .5 mg/mL before adding compound (40) and the reaction medium was stirred for 22 h.
  • Denaturing HRMS Analysis According to Method 2 The results are shown in Table 87 below.
  • Table 87 1 molecular mass of the non-deglycosylated species 2: not observed 3: ND: impurity of undetermined structure
  • the HRMS analysis made it possible to determine an average MAR of 1.02 for the LHHL species and an average MAR of 0.80 for the LH species. LHH, HH, and H species were not observed.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

L'invention concerne un composé de formule (I) : dans laquelle X, A, Y et X! sont tels que définis dans la description. L'invention concerne également un conjugué entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfures et un composé de formule (I).

Description

Composés capables de se lier à des protéines et conjugués obtenus à partir de ces composés Domaine Technique La présente invention concerne des composés capables de se lier à des protéines, et l'utilisation de ces composés pour préparer des conjugués avec des protéines, lesdits conjugués pouvant comprendre en outre un principe actif. Etat de la technique Le début des années 2000 a vu une intensification de la recherche sur des conjugués entre une protéine, notamment un anticorps, et une molécule d'intérêt, notamment un principe actif de médicament, ces conjugués représentant potentiellement une alternative ou un complément aux thérapies « classiques » pour délivrer de manière sélective un principe actif. En particulier, un conjugué anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») constitue un moyen de délivrance sélectif d'un médicament, notamment d'un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps- médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués. La structure d'un conjugué anticorps-médicament consiste typiquement en un anticorps lié au médicament par une molécule dont une partie va fixer l'anticorps et une autre partie va se coupler au médicament, généralement par l'intermédiaire d'un bras d'espacement (ou linker) de longueur et nature variables. Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est le plus souvent internalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament dans la cellule ciblée. Dans le contexte de l'obtention d'ADC par bioconjugaison sur ponts disulfures, la stabilité des conjugués anticorps-médicament dépend notamment de la capacité de la molécule qui fixe l'anticorps à reconstruire les ponts disulfures réduits entre les chaînes lourdes et les chaînes légères de l'anticorps. Il est toutefois souhaitable de pouvoir limiter la toxicité des conjugués entre une protéine et une molécule d'intérêt telle qu'un principe actif de médicament, en particulier dans le contexte d'une utilisation thérapeutique de ces conjugués. Dans ce contexte, les inventeurs se sont attachés à mettre au point des composés (appelés également par la suite « têtes d'accroche ») qui, lorsqu'ils sont conjugués à des protéines, notamment des anticorps, permettent l'obtention d'une « structure » telle qu'en moyenne le nombre de tête d'accroche conjuguée par protéine (anticorps) est contrôlé : le conjugué majoritaire visé portant soit 1 molécule par anticorps soit 2 molécules par anticorps. Il existe également un besoin d'optimiser la reconstruction des anticorps, notamment dans la perspective de préparer des conjugués anticorps-médicament ayant une homogénéité et une stabilité améliorée du fait de la moindre présence d'espèces inégalement reconstruites. C'est avec ce « cahier des charges » à l'esprit que les inventeurs ont mis au point la présente invention. Résumé de l'invention La présente invention concerne un composé de formule (I) :
Figure imgf000003_0001
dans laquelle X, A, Y et X1 ont la signification donnée ci-après dans la description détaillée de l'invention. La présente invention concerne également un composé de formule (II) :
Figure imgf000003_0002
dans laquelle la tête d'accroche, le bras de liaison, l'espaceur et M ont la signification donnée ci-après dans la description détaillée de l'invention. La présente invention concerne également un conjugué susceptible d'être obtenu par conjugaison entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfures et un composé de formule (I) ou composé de formule (II). La présente invention concerne également une composition comprenant au moins un conjugué susmentionné. Description détaillée Selon un premier aspect, l'invention concerne un composé de formule (I) :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle : - chaque A est le résidu d'un phényle ou d'un pyridyle ; - chaque X est un groupe partant ; - chaque Y est une liaison directe, -CH2-, -O-, -S-, -CO-, -NH- ou -C(=NR1)- ; - X1 est choisi parmi :
Figure imgf000004_0002
et
Figure imgf000004_0003
- chaque Z est indépendamment une liaison directe, -CH2-, -O-, -S-, -CO-, -NH- ou -C(=NR1)- ; - W est -ORa, -COR2, -CONR3R4 ou -NR3COR4 ; - Ra est -(C1-C6)alkyle, -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -CORb, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -(CH2CH2O)q- (CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ; - Rb est -(C1-C6)alkyle, -(C1-C6)alcoxy, -(CH2CH2O)qR5, -O(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -O(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ; - R1 est -H, -OH ou -(C1-C6)alkyle ; - R2 est -OH, -(C1-C6)alkyle, -(C1-C6)alcoxy, -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -O(CH2CH2O)qR5, -O(CRcRd)rR5, -O(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -O(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5; - R3 est -H, -(C1-C6)alkyle ou –(CH2)u-SO3H, de préférence R3 est –H ou -(C1-C6)alkyle ; - R4 est -H, -(C1-C6)alkyle, -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, -(CH2CH2O)q- (CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r- NHCO-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-R5]2, ou -CH-[(CRcRd)r- NHCO-(CRcRd)r-R5]2, de préférence R4 est -H, -(C1-C6)alkyle, -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r- NHCO-(CRcRd)r-R5, ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ; - R5 est -(CH2)sR6 ou -(CH2)sR7 ; - R6 est -COOR8, -COSR8, -CONR8R9 ou -NR8COR9 ; - R7 est choisi parmi :
Figure imgf000005_0001
- Rc est -H ; - chaque Rd est -H ou -SO3H ou -CH2-SO3H, de préférence chaque Rd est -H ou -SO3H ; - R8 est -H ou -(C1-C6)alkyle ; - R9 est -H ou -(C1-C6)alkyle ; -
Figure imgf000006_0001
est un (C3-C6)cycloalkyle, un (C6-C10)aryle ou un hétérocycle saturé, insaturé ou partiellement insaturé, ayant de 5 à 15 chaînons et comprenant de 1 à 4 hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre ; - m, n et p sont chacun indépendamment l'un de l'autre un entier allant de 0 à 8 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 24 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 8 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 6 ; - chaque u est un entier allant de 1 à 6 ; à l'exception des composés suivants : acide 2,6-bis[2,6-bis(bromométhyl)phényl]benzoïque, et 1,3-bis[[3,5-bis(bromométhyl)phénoxy]méthyl]-5-prop-2-ynoxy-benzène. Définitions On entend par « aryle » un groupe phényle ou naphtyle. On entend par « hétérocycle saturé, insaturé ou partiellement insaturé, ayant de 5 à 15 chaînons, et comprenant de 1 à 4 hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre » un groupe monocyclique, bicyclique ou tricyclique, éventuellement fusionné, saturé, insaturé ou partiellement insaturé, comprenant de 1 à 4 hétéroatomes, de préférence de 1 à 3 hétéroatomes, et de préférence encore 1 ou 2 hétéroatomes, choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre. A titre d'exemple de monocycle insaturé, on peut citer les groupes pyrrolyle, pyrazolyle, imidazolyle, oxazolyle, isoxazolyle, triazolyle, oxadiazolyle, furanyle, thiényle, thiazolyle, isothiazolyle, thiadiazolyle, pyridyle, pyridazinyle, pyrimidinyle, pyrazinyle, triazinyle, azépinyle, oxepinyle ou thiépinyle. A titre d'exemple de monocycle saturé, on peut citer les groupes pyrrolidinyle, tétrahydrofuryle, tétrahydrothiényle, pyrrolidinyle, imidazolidinyle, thiazolidinyle, isoxazolidinyle, pipéridinyle, pipérazinyle, morpholinyle, thiomorpholinyle, ou hexahydroazépinyle. A titre d'exemple de monocycle partiellement insaturé, on peut citer le groupe dihydro(is)oxazole. A titre d'exemple de bicycle ou tricycle, insaturé ou partiellement insaturé, éventuellement fusionné, on peut citer les groupes isoquinolyle, quinolyle, 1,4-dihydroquinolinyle, 2,4- dihydroquinolinyle, 1,2,3,4-tétrahydroquinolinyle, 1H-pyrrolo[3,2-b]pyridinyle, benzimidazolyle, benzopyrazinyle, indolyle, 2,3-dihydroindolyle, indolynyle, benzofuranyle, 2,3-dihydrobenzofuranyle, benzothiazolyle, benzothiadiazolyle, benzisoxazolyle, 3,4- dihydro-1,4-benzoxazinyle, 2,4-dihydro-1,4-benzoxazinyle, 1,3-benzodioxolyle, 2,3- dihydrobenzodioxinyle, imidazothiazolyle, benzoxazolyle, benzoxazinyle, 4,5-dihydro-1,5- benzoxazépinyle, 2,3-dihydropyrido[4,3-b][1,4]oxazinyle, 3,4-dihydropyrido[3,2- b][1,4]oxazinyle, spiro[benzoxazine-2,1'-cyclobutane]-yle, chromanyle, chroményle, spiro[chromane-2,1'-cyclobutane], spiro[chromène-2,1'-cyclobutane], spiro[cyclopentane- 1,3'-indoline]-yle, spiro[indoline-3,3'-tétrahydrofurane]-yle, spiro[indoline-3,3'- tétrahydropyrane]-yle, dihydrocyclopropa[b]indol-2-yle, hexahydrocarbazolyle, tétrahydrocarbazolyle, dihydrocarbazolyle ou tétrahydrocyclopenta[b]indol-4-yle. Les différents modes de réalisation qui figurent dans la présente description peuvent être combinés entre eux. Dans un mode de réalisation, chaque groupe partant X est un halogène, un tosylate ou un mésylate, de préférence chaque X est un halogène. De manière avantageuse, chaque X est Br. Dans un mode de réalisation, chaque A est le résidu d'un pyridyle. Dans un mode de réalisation, chaque Y est choisi parmi une liaison directe, -CO- et -NH-. Dans ce mode de réalisation, l'un des groupes Y et Z est avantageusement -CO- et l'autre est avantageusement -NH-. Dans un mode de réalisation, X1 est
Figure imgf000007_0001
- W est -COR2 ou -CONR3R4 ; - Z est -CO- ou -NH- ; - R2 est -OH ou -(C1-C6)alcoxy ; - R4 est –H, -(C1-C6)alkyle, -(CH2CH2O)q-R5, ou -(CRcRd)rR5 ; - R5 est -(CH2)sR6 ou -(CH2)sR7 ; - R6 est -COOR8, -CONR8R9 ou -NR8COR9 ; - R7 est choisi parmi :
Figure imgf000008_0001
- Rc, Rd, R3, R8 et R9 sont tels que définis ci-dessus ; - m et n sont chacun indépendamment l'un de l'autre un entier allant de 0 à 3 ; - p est égal à 0, 1 ou 2 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 6 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 4. Dans un mode de réalisation, X1 est un groupe :
Figure imgf000008_0002
choisi parmi :
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
- W est -COR2 ou -CONR3R4 ; - Z est -CO- ou -NH- ; - R2 est -OH ou -(C1-C6)alcoxy ; - R3 est -H ou -(C1-C6)alkyle ; - R4 est -H, -(C1-C6)alkyle, -(CRcRd)rR5, ou -(CH2CH2O)qR5 ; - R5 est -(CH2)sR6 ou -(CH2)sR7 ; - R6 est -COOR8, -CONR8R9 ou -NR8COR9 ; - R7 est choisi parmi :
Figure imgf000010_0002
; - Rc, Rd, R8 et R9 sont tels que définis ci-dessus ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 6 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 4. Dans ce mode de réalisation, X1 est avantageusement choisi parmi :
Figure imgf000011_0001
. De préférence X1 est :
Figure imgf000011_0002
Dans un mode de réalisation, le composé de formule (I) est un composé de formule (Ia), (Ib) ou (Ic) :
Figure imgf000011_0003
Figure imgf000012_0001
( ) ; dans chacune de ces formules W est tel que défini ci-dessus. Avantageusement, W est -COR2 ou -CONR3R4 ; R2 est -OH ou -(C1-C6)alcoxy ; R3 est -H ou -(C1-C6)alkyle ; R4 est -(CH2CH2O)qR5, ou -(CRcRd)rR5 ; R5 est -(CH2)sR6 ou -(CH2)sR7 ; R6 est -COOR8 ; R7 est choisi parmi :
Figure imgf000012_0002
; R8 est -H ou -(C1-C6)alkyle ; Rc est -H et chaque Rd est -H ou -SO3H ; chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; chaque r est un entier allant de 1 à 6 ; chaque s est un entier allant de 0 à 4. Les composés de formule (I) sont particulièrement adaptés pour la conjugaison homogène et la reconstruction de protéines comprenant au moins deux ponts disulfures, en particulier pour la reconstruction d'anticorps. Les termes « anticorps » et « immunoglobuline » désignent un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde. On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique, bioproduction ou ingénierie des protéines comprenant au moins deux ponts disulfures, par exemple, F(ab')2. La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. La capacité des composés de formule (I) à reconstruire des protéines comprenant au moins deux ponts disulfures permet d'envisager leur utilisation pour préparer des conjugués entre de telles protéines et une molécule d'intérêt, le cas échéant via un bras d'espacement. Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention concerne un composé de formule (II) :
Figure imgf000013_0001
dans laquelle : - la tête d'accroche est un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus (étant entendu que dans le cadre de la définition du composé de formule (II) les composés acide 2,6- bis[2,6-bis(bromométhyl)phényl]benzoïque et 1,3-bis[[3,5-bis(bromométhyl)phénoxy]- méthyl]-5-prop-2-ynoxy-benzène font partie intégrante de la formule (I)) ; - le bras de liaison est une liaison directe ; un résidu d'acide aminé ; un résidu de peptide ; un sucre ; un glucuronide ; un pont -S-S- ; -NHCH[CH2COR10]2- ; ou un groupe de formule :
Figure imgf000013_0002
dans laquelle R10 est une liaison directe, un résidu de peptide (de préférence un résidu de dipeptide), -(CRcRd)rR5, ou -(CH2CH2O)qR5, Rc, Rd, R5, q et r étant tels que définis ci-dessus pour le composé de formule (I) ; de préférence R10 est une liaison directe ou un résidu de peptide, de préférence un résidu de dipeptide ; - l'espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
Figure imgf000013_0003
- M est une molécule d'intérêt. La liaison entre chacune des différentes parties du composé de formule (II), à savoir tête d'accroche, bras de liaison, espaceur et molécule d'intérêt, est effectuée via une liaison de type amide, ester, éther, carbamate ou carbonate. L'homme du métier réalisera que la définition donnée pour la tête d'accroche dans la formule (II) n'est pas à proprement parler correcte et qu'en réalité il faut lire « résidu de composé de formule (I) », l'un des groupes réactifs porté par le composé de formule (I) ayant réagi pour former la liaison susmentionnée de type amide, ester, éther, carbamate ou carbonate. Par exemple, un groupe acide ou ester porté par le composé de formule (I) a réagi avec un groupe amino pour former une liaison de type amide entre la tête d'accroche et le bras de liaison (s'il est présent) ou l'espaceur (s'il est présent) ou la molécule d'intérêt. De la même manière, on comprend que l'expression « molécule d'intérêt » donnée dans la définition de la formule (II) doit en fait être comprise comme signifiant « résidu de molécule d'intérêt ». Dans un mode de réalisation, la partie de la formule (II) constituée par le bras de liaison et l'espaceur est représentée par l'une des formules (III) ou (IV) :
Figure imgf000014_0001
Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un principe actif, un fluorophore ou une cage pour radioéléments. A titre de principe actif susceptible d'être utilisé dans le cadre de l'invention, on peut citer les principes actifs de médicaments déjà autorisés et les molécules en cours d'évaluation thérapeutique, en particulier : - les agents alkylants tels que : chlorambucile, chlornaphazine, cyclophosphamide, dacarbazine, estramustine, ifosfamide, méchloréthamine, chlorhydrate d'oxyde de méchloréthamine, mannomustine, mitobronitol, melphalan, mitolactol, pipobroman, novembichine, phénesterine, prednimustine, thiotépa, trofosfamide, moutarde à l'uracile, CC-1065 (y compris ses analogues synthétiques adozélésine, carzélésine et bizélésine), duocarmycine (y compris les analogues synthétiques KW-2189 et CBI-TMI), dimères de benzodiazépine (par exemple, dimères de pyrrolobenzodiazépine (PBD) ou tomaymycine, indolinobenzodiazépines, imidazobenzothiadiazépines, ou oxazolidino-benzodiazépines), nitro-urées (carmustine, lomustine, chlorozotocine, fotemustine, nimustine, ranimustine), alkylsulfonates (busulfan, tréosulfan, improsulfan et piposulfan), triazènes (dacarbazine), composés à base de platine (carboplatine, cisplatine, oxaliplatine), aziridines (benzodopa, carboquone, meturedopa, et uredopa), éthylène-imines et mélamines (incluant altrétamine, triéthylènemélamine, triéthylenephosphoramide, triéthylènethio- phosphaoramide et triméthylolomelamine) ; - les alcaloïdes végétaux tels que : alcaloïdes de Vinca (vincristine, vinblastine, vindésine, vinorelbine, navelbine), les taxoïdes (paclitaxel, docetaxol) et leurs analogues, les Maytansinoïdes (DM1, DM2, DM3, DM4, maytansine et ansamitocines) et leurs analogues, les cryptophycines (en particulier la cryptophycine 1 et la cryptophycine 8), les épothilones, eleuthérobine, discodermolide, bryostatines, dolastatines, auristatines, tubulysines, céphalostatines, pancratistatines, sarcodictyine, spongistatines ; - les inhibiteurs d'ADN topoisomérase tels que : épipodophylline (9-aminocamptothécine, camptothécine, crisnatol, daunomycine, étoposide, étoposide phosphate, irinotécan, mitoxantrone, novantrone, acides rétinoïques (rétinols), téniposide, topotecan, 9- nitrocamptothécine (RFS 2000), mitomycines (mitomycine C), bortezomib ; - les anti-métabolites tels que : les anti-folates (inhibiteurs DHFR (méthotrexate, trimétrexate, dénopterine, ptéroptérine, aminoptérine (acide 4-aminoptéroïque) et autres analogues de l'acide folique), les inhibiteurs de l'IMP déshydrogénase (acide mycophénolique, tiazofurine, ribavirine, EICAR), les inhibiteurs de ribonucléotide réductase (hydroxyurée, déferoxamine), les analogues de pyrimidine tels que : analogues d'uracile (ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, capécitabine, carmofur, cytarabine, didésoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, 5-fluorouracile, floxuridine, ratitrexed), analogues de cytosine (cytarabine, cytosine arabinoside, fludarabine), analogues de purine (azathioprine, fludarabine, mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine), acide folinique ; - les agents hormonaux tels que : anti-estrogènes (mégestrol, raloxifène, tamoxifène), agonistes LHRH (goséréline, acétate de leuprolide), anti-androgènes (bicalutamide, flutamide, calustérone, propionate de dromostanolone, épitiostanol, goséréline, leuprolide, mépitiostane, nilutamide, testolactone, trilostane), analogues de la vitamine D3 (CB 1093, EB 1089, KH 1060, cholécalciférol, ergocalciférol), thérapies photodynamiques (verteporfine, phthalocyanine, photosensibilisateur Pc4), cytokines (interféron-alpha, interféron-gamma, facteur de nécrose tumorale (TNF), protéines humaines contenant un domaine TNF) ; - les inhibiteurs de kinase tels que : BIBW 2992, CYT387, E7080, axitinib, bafetinib, bosutinib, cabozantinib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, iniparib, ispinesib, lapatinib, masitinib, mubritinib, nilotinib, pazopanib, pegaptanib, ponatinib, ruxolitinib, sorafénib, sunitinib, tivozanib, vandetanib, vismodegib ; - les inhibiteurs de poly(ADP-ribose)polymérase (PARP) tels que : BGB-290, CEP 9722, E7016, 3-aminobenzamide, niraparib, olaparib, talazoparib, veliparib ; - les immunomodulateurs tels que : thalidomide, lénalidomide, pomalidomide. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le principe actif est choisi parmi la duocarmycine et ses analogues, les dolastatines, la combretastatine et ses analogues, la calichéamicine, la N-acétyl-y-calichéamycine (CMC), un dérivé de calichéamycine, la maytansine et ses analogues, tel qu'un dérivé de type maytansinoïde, par exemple le DM1 et le DM4, les auristatines et leurs dérivés, tels que l'auristatine E, l'auristatine EB (AEB), l'auristatine EFP (AEFP), la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), la tubulysine, le disorazole, les épothilones, l'échinomycine, l'estramustine, la cémadotine, l'eleuthérobine, la méthoptérine, l'actinomycine, la mitomycine C, la camptothécine, un dérivé de la camptothécine, le SN38, le TK1, l'amanitine et ses analogues, une pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, une pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un intercalant de l'ADN, un inhibiteur d'histone désacétylase, ou un inhibiteur de (tyrosine) kinase. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le principe actif est sélectionné parmi l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin, la toxine diphtérique (DT) et la ricine. Dans un mode de réalisation particulier, le principe actif est choisi parmi le méthotrexate, un immunomodulateur, la duocarmycine, la combrétastatine, la calichéamicine, la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), la maytansine, DM1, DM4, SN38, l'amanitine et ses analogues, la pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l'histone désacétylase, un inhibiteur de (tyrosine) kinase, et la ricine, de préférence le principe actif est l'amanitine ou la MMAE, représentée par la formule suivante :
Figure imgf000017_0001
Selon un autre aspect, l’invention concerne un conjugué susceptible d’être obtenu : (c1) par conjugaison entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfures et un composé de formule (I) tel que défini précédemment, ou (c2) par conjugaison entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfures et un composé de formule (II) tel que défini précédemment, ou (c3) par réaction entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfures, un composé de formule (I) et un composé de formule (V) :
Figure imgf000017_0002
( ) dans laquelle : - R11 est R7-(CH2)s-CO-, R7-(CH2)s-CONHCH[CH2CO-]2, R7-(CH2)s-(O-CH2-CH2)q-CO-, R7-(CH2)s-(O-CH2-CH2)q -CONHCH[CH2CO-]2, ou un composé de formule :
Figure imgf000017_0003
- R7 est tel que défini ci-dessus ; - R10 est une liaison directe, un résidu de peptide (de préférence un résidu de dipeptide), -(CRcRd)rR5, ou -(CH2CH2O)qR5, Rc, Rd, R5, q et r étant tels que définis ci-dessus pour le composé de formule (I) ; de préférence R10 est une liaison directe ou un résidu de peptide, de préférence un résidu de dipeptide ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 6 ; - t est 1 ou 2, de préférence t est 1 ; - le bras de liaison, l’espaceur et M sont tels que définis ci-dessus. Dans le contexte de la définition du conjugué ci-dessus, les composés acide 2,6-bis[2,6- bis(bromométhyl)phényl]benzoïque et 1,3-bis[[3,5-bis(bromométhyl)phénoxy]-méthyl]-5- prop-2-ynoxy-benzène font partie intégrante de la formule (I) pour les alternatives (c1) et (c3). Dans la réaction décrite dans l'alternative (c3), les composés de formule (I) et de formule (V) réagissent entre eux par mise en œuvre d'une réaction dite « click ». De manière plus précise la réaction click entre le composé de formule (I) et le composé de formule (V) s'effectue entre un diène (par exemple un azoture ou un diazo) et un diénophile (par exemple un alcène ou un alcyne), chacune de ces espèces étant respectivement apportée par R7 d'une part dans le composé de formule (I), par R11, d'autre part dans le composé de formule (V). On comprend donc que la réaction click peut intervenir : - entre un diène porté par le R7 provenant du composé de formule (I) et un diénophile porté par le R11 provenant du composé de formule (V) ; ou - entre un diénophile porté par le R7 provenant du composé de formule (I) et un diène porté par le R11 provenant du composé de formule (V). Les réactions click sont bien connues de l'homme du métier, et incluent par exemple une réaction de cycloaddition entre un diénophile et un diène. Des exemples de réaction click sont représentés dans le schéma suivant :
Figure imgf000019_0001
Dans ces exemples, un seul régio-isomère par réaction a été représenté, étant entendu que les réactions de cycloaddition peuvent générer plusieurs régio-isomères. Dans un mode de réalisation, la réaction click est effectuée entre un composé de formule (I) et un composé de formule (V) dans laquelle R11 est N3-(CH2)5-CO-, t = 1 et le bras de liaison est représenté par la formule (VI) :
Figure imgf000020_0001
Dans un mode de réalisation, la protéine comprenant au moins deux ponts disulfures est un anticorps ou un fragment d'anticorps tel que défini ci-dessus. Dans ce mode de réalisation, l'anticorps ou le fragment d'anticorps se lie à la tête d'accroche par substitution des groupes partants représentés par le substituant X dans la formule (I). Toujours dans ce mode de réalisation, les réactions (c1) à (c3) décrites ci-dessus entraînent la reconstruction de l'anticorps, après réduction des ponts disulfures intercaténaires. Dans le contexte de la présente invention la reconstruction d'un anticorps est définie comme l'obtention d'une majorité d'anticorps entier LHHL. La proportion d'anticorps entier LHHL et des autres espèces (LHH, HH, LH, H, L) est déterminée à l'aide de la densité optique mesurée par analyse sur gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes réductrices. Une bonne reconstruction est atteinte lorsque la proportion de LHHL dépasse 50%. Dans un mode de réalisation, les différentes réactions (c1) à (c3) permettent d'obtenir un « molecule-to-antibody ratio » (MAR) (ou ratio de molécules « accrochées » ou « conjuguées » par anticorps) compris dans la plage allant d'environ 0,50 à environ 2,50. Dans un mode de réalisation, l'anticorps ou le fragment d'anticorps est conjugué en moyenne à 1,00±0,50 (c'est-à-dire toute valeur allant de 0,50 à 1,50, par exemple 0,50 ; 0,51 ; ..... ; 1,49 ; 1,50) molécule, de préférence à 1,00±0,30 molécule. Dans un mode de réalisation, l'anticorps ou le fragment d'anticorps est conjugué en moyenne à 2,00±0,50 (c'est-à-dire toute valeur allant de 1,50 à 2,50, par exemple 1,50 ; 1,51 ; ….. ; 2,49 ; 2,50) molécule(s), de préférence à 2,00±0,30 molécule(s). Dans le contexte de la présente invention, il faut comprendre par « molécule » soit un composé de formule (I), soit un composé de formule (II), soit le produit de la réaction (click) entre un composé de formule (I) et un composé de formule (V). On peut représenter de manière schématique le conjugué formé à l'issue des réactions (c1), (c2) ou (c3) par la structure suivante :
Figure imgf000021_0001
dans laquelle Ac est un anticorps ou un fragment d'anticorps ; la molécule est telle que définie ci-dessus (étant entendu que l'anticorps ou le fragment d'anticorps se lie à la tête d'accroche de la molécule par substitution des groupes partants X) ; et MAR représente le nombre moyen de molécule(s) fixée(s) sur l'anticorps ou le fragment d'anticorps. Le MAR est déterminé pour chaque espèce (LHHL, LH, L, H, HH, LHH) par analyse SMHR (Spectrométrie de Masse Haute Résolution) en conditions dénaturantes. Le MAR moyen est obtenu à partir du MAR par espèce pondéré par les proportions des espèces observées en analyse sur gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices. Seules les espèces majoritaires LHHL et LH ont été considérées pour ce calcul, la somme des proportions des autres espèces (L, H, HH et LHH) étant inférieure à 18%. La somme des proportions des espèces LHHL et LH a donc été ramenée à 100% en ne tenant pas compte des autres espèces. L'espèce « demi-anticorps » LH est observée en conditions dénaturantes. En solution (en conditions natives) cette espèce n'est pas présente de façon isolée, les interactions faibles maintiennent les deux LH ensembles. C'est pourquoi le MAR de l'espèce LH-LH non reconstruite correspond à 2 fois le MAR observé sur l'espèce LH. Le MAR moyen a donc été calculé à l'aide de la formule suivante : [Math1]
Figure imgf000021_0002
Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) tel(s) que défini(s) ci-dessus. La composition peut être une composition pharmaceutique contenant un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables. Les composés de formules (I), (II) et (V) peuvent être préparés selon des techniques décrites dans la littérature et/ou dans les exemples ci-après. La réaction de bioconjugaison (c1) ou (c2) peut être mise en œuvre par réaction de la protéine comprenant au moins deux ponts disulfures avec le composé de formule (I) ou (II) à conjuguer, en présence d'un réducteur. Dans un mode de réalisation la protéine est en solution dans un tampon. Dans un mode de réalisation, le réducteur est ajouté avant le composé à conjuguer. Dans un autre mode de réalisation, le réducteur et le composé à conjuguer sont ajoutés simultanément. La réaction (c3) peut être mise en œuvre par (i) réaction, en présence d'un réducteur, de la protéine comprenant au moins deux ponts disulfures avec le composé de formule (I) puis ajout du composé de formule (V) et réaction click ou par (ii) réaction, en présence d'un réducteur, de la protéine comprenant au moins deux ponts disulfures avec un composé issu d'une réaction click préalable entre les composés de formule (I) et (V). Dans un mode de réalisation la protéine est en solution dans un tampon. L'invention est illustrée par les exemples ci-après, donnés à titre purement illustratif. Dans ces exemples, on utilise les abréviations suivantes : AcOEt = acétate d'éthyle APS = persulfate d'ammonium ASB = albumine sérique bovine BnOH = alcool benzylique CHCl3 = chloroforme DBCO = dibenzylcyclooctyne DCM= dichlorométhane DIPEA = N,N-diisopropyléthylamine DMF = N,N-diméthylformamide DMSO = diméthylsulfoxyde EDTA = acide éthylènediaminetétraacétique EEDQ = N-éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoline EtOH = éthanol FmocCl = chlorure de fluorénylméthoxycarbonyle HATU = O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tétraméthyluronium hexafluorophosphate HCl = acide chlorhydrique LiOH = hydroxyde de lithium MeCN = acétonitrile MeOH = méthanol MgSO4 = sulfate de magnésium NaCl = chlorure de sodium Na2CO3 = carbonate de sodium NaHCO3 = hydrogénocarbonate de sodium NaN3 = azoture de sodium PBr3 = tribromure de phosphore Pd/C = palladium sur charbon Pd(OH)2/C = hydroxyde de palladium sur charbon SiO2 = silice SOCl2 = chlorure de thionyle TA = température ambiante (20 °C sauf indication contraire) TBAF = fluorure de tétrabutylammonium TBDMSOTf = trifluorométhanesulfonate de tert-butyldiméthylsilyle TFA = acide trifluoroacétique THF = tétrahydrofurane Tr = Temps de rétention v/v = rapport volume sur volume Méthodes d'analyse Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton 1H, du carbone 13C et du fluor 19F ont été réalisés sur un appareil Bruker Ultrashield 300 (300 MHz (1H), 75 MHz (13C) et 282 MHz (19F)). Les analyses ont été réalisées dans le chloroforme deutéré (CDCl3), dans le diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO-d6), dans l'eau lourde (D2O) ou dans le méthanol deutéré (MD3OD). Les déplacements chimiques (δ) sont mesurés en parties par million (ppm) par rapport au signal résiduel du chloroforme deutéré (CDCl3) (δ1H = 7,26 ppm, δ13C = 77,1 ppm), au signal résiduel du diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO-d6) (δ1H = 2,50 ppm, δ13C = 39,5 ppm), au signal résiduel de l'eau lourde (δ1H = 4,79 ppm), ou au signal résiduel du méthanol deutéré (δ1H = 3,31 ppm, δ13C = 49,0 ppm). Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hertz (Hz) et la multiplicité est décrite de la façon suivante : d = doublet, dd = doublet de doublet, dt = doublet de triplet, m = multiplet, p = pentuplet, s = singulet, t = triplet. Afin de clarifier la lecture des analyses RMN, la numérotation des atomes pour l'attribution des signaux a été fixée arbitrairement. Spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR) La masse exacte des composés synthétisés a été déterminée par spectrométrie de masse haute résolution (SMHR) en mode positif ou négatif avec la technique d'ionisation par électronébulisation ESI, soit sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex Ultimate 3000 RSLC de la plateforme « Fédération de Recherche » de l'ICOA/CBM (FR2708), soit sur un spectromètre de masse Waters Vion IMS QTof couplé à un système Waters Acquity UPLC H-Class du GICC (EA7501). Spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR) dénaturante Méthode 1 : L'analyse des conjugués a été réalisée sur un échantillon préalablement déglycosylé ou non. Dans le cas d'un échantillon déglycosylé, il a été dilué à une concentration de 1 µg/µL puis de la N-glycosidase F (0,02 unité/µg d'échantillon) a été ajoutée et l'échantillon a été incubé à 37 °C pendant au moins 16 h. L'analyse a été réalisée sur un spectromètre de masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H-Class de Waters (Wilmslow, UK). Avant l'analyse, les échantillons (800 ng) ont été injectés sur une colonne XBridge BEH300 C4 2,1 x 50 mm, 1,7 µm, soit sur une colonne XBridge BEH300 C4 2,1 x 30 mm, 5 µm chauffée à 90 °C. Une étape de dessalage a été réalisée avec un gradient isocratique 95% de solvant A (H2O + 0,1% acide formique) et 5% de solvant B (MeCN + 0,1% acide formique) pendant 1,5-2 min à 0,5 mL/min. Puis, l'élution de l'échantillon a été réalisée avec un gradient de 20% à 35% de solvant B sur 7 min, de 50% à 90% de solvant B sur 3 min, et un isocratique de 1 min à 90% de B, soit avec un gradient de 5% à 50% de solvant B sur 2,9 min, de 50% à 90% de solvant B sur 0,5 min, un isocratique de 0,5 min à 90% de B, avec un débit de 0,4 mL/min. Une vanne de dérivation a été programmée pour permettre au solvant d'entrer dans le spectromètre entre 3 et 7,5 min seulement. Les données de spectrométrie de masse ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 500 à 4000 à une fréquence de scan de 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel UNIFI 1.9.4 et l'algorithme MaxEnt pour la déconvolution. Le MAR moyen par espèce (= nombre moyen de molécules conjuguées à l'anticorps utilisé pour la réaction de bioconjugaison) a été déterminé à l'aide de l'intensité des pics des espèces observés. Méthode 2 : L'analyse spectrométrique de certains conjugués a été réalisée sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex Ultimate 3000 RSLC. Avant l'analyse MS, les échantillons (5 µg) ont été dessalés sur une colonne de dessalage MassPREP (2,1x10 mm, Waters), chauffés à 80 °C en utilisant une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% comme solvant A et une solution à 0,1% d'acide formique dans l'acétonitrile comme solvant B à 500 µL/min. Après 1 min, un gradient linéaire de 5 à 90% de B en 1,5 min a été appliqué. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 900 à 5000 à 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel DataAnalysis 4.4 (Bruker) et l'algorithme MaxEnt pour la déconvolution. Le MAR moyen par espèce (= nombre moyen de molécules conjuguées à l'anticorps utilisé pour la réaction de bioconjugaison) a été déterminé à l'aide de l'intensité des pics des espèces observés. Gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes, non réductrices ou réductrices Les échantillons ont été analysés par gel d'acrylamide SDS-PAGE tris-HCl. Un gel de concentration à 4% d'acrylamide sur un gel de migration à 6-7% d'acrylamide ont été utilisés. Du tampon Laemmli 4X (bleu de bromophénol 0,3 mM ; glycérol 2 M, TrisBase 20 mM ; 0,04% de dodécylsulfate de sodium) a été ajouté dans les échantillons (1,6 µg). En conditions réductrices, les échantillons ont été réduits à l'aide d'une solution de dithiothréitol (DTT) à 10% dans de l'eau (10% v/v). Ensuite, les échantillons ont été incubés à 95 °C pendant 10 min. Un marqueur de poids de moléculaire de grande amplitude (Invitrogen SeeBlue® Plus2 Prestained Standard) et l'anticorps natif ont été utilisés pour estimer les poids moléculaires des protéines. Le gel a été mis à migrer à 100 V pendant 10 min puis à 140 V pendant 35 min, dans un tampon de migration NuPAGE (MOPS 50 mM ; TrisBase 50 mM ; 0,1% SDS (v/v) ; EDTA 1 mM, pH 7,3). Après un lavage à l'eau, le gel a été coloré avec du bleu de Coomassie (Thermo Scientific Imperial TM Protein Stain). L'analyse densitométrique a été réalisée à l'aide du logiciel ImageJ et un filtre Vanilla de Windows a été appliqué pour l'analyse en noir et blanc. En conditions dénaturantes non réductrices, la densité optique relative des espèces LHHL et LH a été utilisée pour déterminer le MAR moyen du conjugué. En conditions dénaturantes réductrices, la densité optique relative mesurée pour l'espèce LHHL a déterminé la reconstruction de l'anticorps (en %). Réactions de bioconjugaison Préparation des solutions Tampon de bioconjugaison 1 : Tampon phosphate 1X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCl de 180 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM. Tampon de bioconjugaison 2 : Tampon borate 1X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCl de 25 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM. Réducteur 1 : Solution de chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP.HCl) à une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison. Réducteur 2 : Solution de dithiothréitol (DTT) à une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison. Réaction de bioconjugaison 1 : La solution d'anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Le réducteur (8,0-12,0 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37 °C pendant 2 h. Puis la solution de composé à conjuguer (5,0-15,0 éq, de préférence 5,0-12,0 éq ou 10,0-15,0 éq)) a été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à 37 °C pendant 2 h 30. Réaction de bioconjugaison 2 : La solution d'anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Les solutions de composé à conjuguer (1,0-15,0 éq, de préférence 8,0-12,0 éq) puis de réducteur (7,0-12,0 éq) ont été ajoutées et le milieu réactionnel a été agité sous argon à 37 °C pendant 2 h 30. Réaction de bioconjugaison 3 : La solution d'anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Les solutions du composé de formule (I) (1,0-15,0 éq, de préférence 8,0-12,0 éq ou 10,6-12,0 éq) puis de réducteur (7,0 éq) ont été ajoutées et le milieu réactionnel a été agité sous argon à 37 °C pendant 2 h 30. La solution du composé de formule (V) (1,0- 15,0 éq de préférence 8,8-14,4 éq, par exemple 11,7 éq) a ensuite été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité à 25 °C pendant 17 h. Réaction de bioconjugaison 4 : La solution d'anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Le réducteur (8,0-12,0 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37 °C pendant 2 h. Puis la solution de composé à conjuguer (10,0-15,0 éq) a été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à 37 °C pendant 2 h 30. La solution du composé de formule (V) (11,0-30,0 éq) ensuite été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité à 25 °C pendant 17 h. Exemples Préparation 1 : isonicotinate de benzyle (1)
Figure imgf000027_0001
De l'acide isonicotinique (5,00 g ; 40,614 mmol ; 1,0 éq) a été solubilisé dans du SOCl2 (15 mL ; 206,775 mmol ; 5,1 éq) et chauffé à reflux pendant 15 h. Après retour à TA, l'excès de SOCl2 a été éliminé par évaporation sous pression réduite, puis le résidu obtenu a été dissous dans du DCM anhydre (55 mL). BnOH a été additionné (4,2 mL ; 40,614 mmol ; 1,0 éq) et le mélange a été agité à reflux pendant 10 h. Après retour à TA, le milieu réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée de NaHCO3 et extrait avec du DCM (3x100 mL). Les phases organiques ont été rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et concentrées sous pression réduite. Le produit obtenu a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/AcOEt 50:50) pour donner (1) (6,97 g ; 80%) sous la forme d'une huile incolore. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 8,80 (dd ; J = 6,1 ; 1,6 Hz ; 2H1,5) ; 7,86 (dd ; J = 6,1 ; 1,6 Hz, 2H2,4) ; 7,56 – 7,29 (m ; 5H9-13) ; 5,39 (s ; 2H7). RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 165,0 (1C6) ; 151,3 (2C1,5) ; 137,2 (1C3) ; 136,1 (1C8) ; 129,0 (2C10,12) ; 128,8 (1C11) ; 128,6 (2C9,13) ; 123,0 (2C2,4) ; 67,4 (1C7). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C13H11NO2 [M] : 213,0790 ; observée 213,0796. Préparation 2 : 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (2)
Figure imgf000027_0002
L'isonicotinate de benzyle (1) (2,48 g ; 11,630 mmol ; 1,0 éq) a été solubilisé dans MeOH (43 mL), agité à 50 °C et H2SO4 concentré (320 µL ; 6,016 mmol ; 0,5 éq) a été ajouté. Une solution de APS (26,500 g ; 116,126 mmol ; 10,0 éq) dans l'eau (43 mL) a été ajoutée en deux étapes : un premier ajout rapide de 30 gouttes, une suspension blanche se forme, puis en goutte à goutte rapide pendant 5 min. La réaction s'est emballée jusqu'à 75 °C, puis la solution jaune obtenue a été agitée à 50 °C pendant 1 h supplémentaire. Après retour à TA, MeOH a été évaporé sous pression réduite. 50 mL d'AcOEt ont été ajoutés et le milieu a été neutralisé par ajout d'une solution saturée de NaHCO3. La phase aqueuse a été extraite avec de AcOEt (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (SiO2, DCM/MeOH, 95:5) pour donner (2) (1,56 g ; 49%) sous la forme d'un solide beige. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 7,81 (s ; 2H2,4) ; 7,55 – 7,32 (m ; 5H9-13) ; 5,60 (t ; J = 5,9 Hz ; 2H15,17) ; 5,40 (s ; 2H7) ; 4,59 (d ; J = 5,9 Hz ; 4H14,16). RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 165,0 (1C6) ; 162,8 (2C1,5) ; 138,0 (1C3) ; 135,7 (1C8) ; 128,6 (2C10,12) ; 128,4 (1C11) ; 128,3 (2C9,13) ; 117,0 (2C2,4) ; 66,9 (1C7) ; 63,9 (2C14,16). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C15H15NO4 [M] : 273,1001 ; observée 273,1001. Préparation 3 : 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)-isonicotinate de benzyle (3)
Figure imgf000028_0001
( ) Le 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (2) (1,56 g ; 5,708 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du DCM anhydre (12 mL), la 2,6-lutidine (3,6 mL ; 28,542 mmol ; 5,0 éq) a été ajoutée et la solution a été refroidie à 0 °C. TBDMSOTf (5,5 mL ; 23,974 mmol ; 4,2 éq) a été ajouté goutte à goutte en 10 min, puis le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 19 h. Le milieu a été refroidit à 0 °C puis neutralisé par ajout d'une solution saturée de NaHCO3. La phase aqueuse a été extraite avec du DCM (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4, filtrées, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/AcOEt, 90:10) pour donner (3) (2,50 g ; 87%) sous la forme d'un solide beige. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,97 (s ; 2H2,4) ; 7,57 – 7,28 (m ; 5H9-13) ; 5,39 (s ; 2H7) ; 4,84 (s ; 4H14,21) ; 0,95 (s ; 18H18-20,25-27) ; 0,12 (s ; 12H15,16,22,23). RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 165,6 (1C6) ; 161,8 (2C1,5) ; 138,9 (1C3) ; 135,6 (1C8) ; 128,8 (2C10,12) ; 128,5 (1C11) ; 128,2 (2C9,13) ; 117,8 (2C2,4) ; 67,4 (1C7) ; 65,9 (2C14,21) ; 26,0 (6C18-20,25-27) ; 18,5 (2C17,24) ; -5,2 (4C15,16,22,23). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C27H44NO4Si2 [M+H]+ : 502,2803 ; observé 502,2801. Préparation 4 : acide 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)- oxy)méthyl)isonicotinique (4)
Figure imgf000029_0002
Le 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinate de benzyle (3) (2,50 g ; 4,982 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans 60 mL d'un mélange MeOH/AcOEt (5:1) et la solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Du Pd/C à 10% en masse (250 mg ; 10% m/m) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à TA sous atmosphère d'hydrogène pendant 5 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur Dicalite™ (rinçage MeOH). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (4) (1,93 g ; 94%) sous la forme d'un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,01 (s ; 2H2,4) ; 4,90 (s ; 4H8,15) ; 0,97 (s ; 18H12-14,19-21) ; 0,13 (s ; 12H9,10,16,17). RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 170,2 (1C6) ; 161,8 (2C1,5) ; 139,3 (1C3) ; 118,4 (2C2,4) ; 65,7 (2C8,15) ; 26,1 (6C12-14,19-21) ; 18,6 (2C11,18) ; -5,2 (4C9,10,16,17). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C20H37NO4Si2 [M] : 411,2261 ; observée 411,2257. Préparation 5 : acide 6-(Fmoc-amino)hexanoïque (5)
Figure imgf000029_0001
L'acide 6-aminohexanoïque (1,00 g ; 7,623 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans un mélange eau/1,4-dioxane (1:1 ; 38 mL) à 0 °C. Na2CO3 (2,42 g ; 22,832 mmol ; 3,0 éq) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à 0 °C pendant 10 min. FmocCl (1,97 g ; 7,623 mmol ; 1,0 éq) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à TA pendant 5 h. Le milieu a été acidifié par ajout d'une solution d'HCl à 1 M jusqu'à atteindre un pH de 6 et le précipité formé a été filtré et rincé à l'eau (3x20 mL). Le solide a été purifié par chromatographie flash (SiO2, DCM/MeOH, 95:5) pour donner (5) (2,32 g ; 86%) sous la forme d'un solide blanc. RMN 1H (300 MHz ; DMSO) δ 7,89 (d ; J = 7,4 Hz ; 2H16,19) ; 7,68 (d ; J = 7,4 Hz ; 2H13,22) ; 7,48 – 7,38 (m ; 2H15,20) ; 7,37 – 7,29 (m ; 2H14,21) ; 7,26 (t ; J = 5,6 Hz ; 1H8) ; 4,35 – 4,25 (m ; 2H10) ; 4,25 – 4,13 (m ; 1H11) ; 3,04 – 2,87 (m ; 2H7) ; 2,18 (t ; J = 7,3 Hz ; 2H3) ; 1,58 – 1,31 (m ; 4H4,6) ; 1,31 – 1,18 (m ; 1H5). RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 174,5 (1C2) ; 156,1 (1C9) ; 144,0 (2C12,23) ; 140,8 (2C17,18) ; 127,6 (2C15,20) ; 127,1 (2C14,21) ; 125,2 (2C13,22) ; 120,1 (2C16,19) ; 65,2 (1C10) ; 46,8 (1C11) ; 39,7 sous le DMSO (1C7) ; 33,7 (1C3) ; 29,1 (1C6) ; 25,8 (1C5) ; 24,2 (1C4). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C21H23NO4 [M] : 353,1627 ; observée 353,1633. Préparation 6 : 6-aminohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE, sel de TFA (6)
Figure imgf000030_0001
L'acide 6-(Fmoc-amino)hexanoïque (5) (11,8 mg ; 0,034 mmol ; 2,0 éq) a été dissous dans du DMF anhydre (300 µL), la solution a été refroidie à 0 °C, puis le HATU (25,5 mg ; 0,067 mmol ; 4,0 éq) et la 2,6-lutidine (5,8 µL ; 0,050 mmol ; 3,0 éq) ont été ajoutés. La solution d'activation a été agitée sous argon à 0 °C pendant 15 min. Une solution de sel d'acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (20,7 mg ; 0,017 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (300 µL) en présence de 2,6- lutidine (5,8 µL ; 0,050 mmol ; 3,0 éq), a été ajoutée au milieu d'activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à TA pendant 21 h. La pipéridine (120 µL, 20% v/v) a été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 2 h. Le mélange a été dilué par 2 avec du MeOH et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 15,8 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l'eau (solvant A), et de l'acétonitrile (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (6) (17,2 mg ; 76%) sous la forme d'un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 10,14 – 9,95 (m ; 1H) ; 8,41 – 8,26 (m ; 1H) ; 8,19 – 8,06 (m ; 1H) ; 7,91 (d ; J = 8,7 Hz ; 1H) ; 7,83 (d ; J = 8,7 Hz ; 1H) ; 7,76 – 7,53 (m ; 5H) ; 7,40 – 7,22 (m ; 5H) ; 7,21 – 7,12 (m ; 1H) ; 6,01 (s ; 1H) ; 5,43 (s ; 3H) ; 5,18 – 4,91 (m ; 3H) ; 4,82 – 4,56 (m ; 2H) ; 4,52 – 4,34 (m ; 3H) ; 4,32 – 4,15 (m ; 3H) ; 4,08 – 3,89 (m ; 4H) ; 3,35 – 3,27 (m ; 1H) ; 3,27 – 3,08 (m ; 8H) ; 3,08 – 2,92 (m ; 4H) ; 2,91 – 2,82 (m ; 3H) ; 2,82 – 2,71 (m ; 3H) ; 2,47 – 2,34 (m ; 3H) ; 2,33 – 2,22 (m ; 2H) ; 2,22 – 2,06 (m ; 4H) ; 2,05 – 1,87 (m ; 2H) ; 1,87 – 1,63 (m ; 4H) ; 1,62 – 1,42 (m ; 6H) ; 1,39 – 1,21 (m ; 4H) ; 1,08 – 0,94 (m ; 6H) ; 0,94 – 0,52 (m ; 21H). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C64H105N11O13 [M] : 1235,7893 ; observée 1235,7889. Exemple 1 : 2,3-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)propanoate de méthyle (11) Schéma réactionnel général
Figure imgf000031_0001
(a) Bn2NH, EtOH, 1h30, 71 °C ; (b) H2, Pd(OH)2/C, 1,1,2-trichloroéthane, MeOH, 64 h, TA; (c) HATU, 2,6-lutidine, DIPEA, DMF, composé 4, 22 h 20, TA; (d) TBAF, THF, 5 h 30, TA ; (e) PBr3, MeCN, 2 h 15, 45 °C. Etape 1 : 2,3-bis(dibenzylamino) propanoate de méthyle (7)
Figure imgf000032_0001
Le 2,3-dibromopropanoate de méthyle racémique (154,4 µL ; 1,22 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans 6 mL d'EtOH absolu. Puis Bn2NH (939 µL ; 4,88 mmol ; 4,0 éq) a été ajoutée lentement sous agitation, un précipité s'est formé après environ 1 min. Le milieu réactionnel a été agité sous argon au reflux (71 °C) pendant 1 h 30. Les sels d'amine ont été filtrés sur fritté. Puis le filtrat a été évaporé sous pression réduite. Le solide beige obtenu a été repris dans du DCM (20 mL) puis un lavage a été réalisé avec de l'eau (2x20 mL) et une solution de NaCl saturée (1x20 mL). La phase organique a ensuite été séchée sur MgSO4 et concentrée sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/AcOEt 80:20) pour donner (7) (471 mg ; 81%) sous la forme d'une huile incolore. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,38 – 7,14 (m ; 20H7-11,14-18,21-25,28-32) ; 3,82 (d ; J = 14,0 Hz ; 2H5,12,19,26) ; 3,73 (s ; 3H4) ; 3,68 (dd ; J = 8,6, 5,3 Hz ; 1H2) ; 3,55 – 3,37 (m ; 6H5,12,19,26) ; 3,01 (dd ; J = 12,8 ; 8,6 Hz ; 1H1) ; 2,72 (dd ; J = 12,8 ; 5,3 Hz ; 1H1). RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 172,7 (1C3) ; 139,7(2C6,13,20,27) ; 139,0 (2C6,13,20,27) 129,1 (4C7,11,14,18,21,25,28,32) ; 129,0 (4C7,11,14,18,21,25,28,32) ; 128,3 (4C8,10,15,17,22,24,29,31) ; 128,2 (4C8,10,15,17,22,24,29,31) ; 127,1 (2C9,16,23,30) ; 127,0 (2C9,16,23,30) ; 60,1 (1C2) ; 58,4 (4C5,12,19,26) ; 55,1 (4C5,12,19,26) ; 54,3 (1C1) ; 51,2 (1C4). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C32H35N2O2 [M+H]+ : 479,2693 ; observé 479,2693. Etape 2 : chlorhydrate de 2,3-diaminopropanoate de méthyle (8)
Figure imgf000032_0002
Le 2,3-bis(dibenzylamino) propanoate de méthyle (7) (219,6 mg ; 0,459 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du MeOH (3,5 mL). Du 1,1,2-trichloroéthane (119,6 µL ; 1,29 mmol, 2,8 éq) a été ajouté et la solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Puis du Pd(OH)2/C 20% en masse (87,8 mg, 40% m/m) a été ajouté. Le milieu réactionnel a été agité sous atmosphère d'hydrogène à TA pendant 64 h. Pd(OH)2/C a été filtré sur Dicalite™ puis le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le produit (8) (89,8 mg, rendement quantitatif) a été obtenu sous forme d'une huile hétérogène jaune. RMN 1H (300 MHz, D2O) δ 4,38 (dd ; J = 7,9 ; 5,5 Hz ; 1H2) ; 3,75 (s ; 3H4) ; 3,57 – 3,30 (m ; 2H1). RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 8,69 (s ; 5H5,6) ; 4,40 (t ; J = 6,1 Hz ; 1H2) ; 3,79 (s ; 3H4) ; 3,34 – 3,25 (m, 2H1 ; sous l'H2O du DMSO). RMN 13C (75 MHz, D2O) δ 167,2 (1C3) ; 54,2 (1C4) ; 49,5 (1C2) ; 37,8 (1C1). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C4H11N2O2 [M+H]+ : 119,0815 ; observé 119,0815. Etape 3 : 2,3-bis(2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido) propanoate de méthyle (9)
Figure imgf000033_0001
Le chlorhydrate de 2,3-diaminopropanoate de méthyle (8) (99,7 mg ; 0,645 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du DMF anhydre (2,4 mL) et de la DIPEA anhydre (381,7 µL ; 2,19 mmol ; 3,4 éq) été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 2 h 20. Puis le mélange d'acide 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinique (4) (434,5 mg ; 1,06 mmol ; 1,6 éq) préalablement activé avec du HATU (603,4 mg ; 1,59 mmol ; 2,5 éq) et de la 2,6-lutidine (184,4 µL ; 1,59 mmol ; 2,5 éq) dans du DMF anhydre (4,8 mL) sous agitation et sous argon à TA pendant 2 h 20, a été ajouté au milieu réactionnel. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 20 h. Le DMF a été évaporé sous pression réduite. Puis le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/acétone, 80:20) pour donner (9) (116,8 mg ; 20%) sous la forme d'une huile incolore. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 9,13 (d ; J = 7,3 Hz ; 1H5) ; 8,96 (t ; J = 5,7 Hz ; 1H26) ; 7,67 (s ; 2H8,11,29,32) ; 7,59 (s ; 2H8,11,29,32) ; 4,75 (s ; 4H12,19,33,40) ; 4,74 (s ; 4H12,19,33,40) ; 4,73 – 4,66 (m ; 1H2) ; 3,85 – 3,69 (m ; 2H1) ; 3,64 (s ; 3H4) ; 0,87 (s ; 36H15-17,23-25,37- 39,43-45) ; 0,06 (s ; 24H13,14,20,21,34,35,41,42). RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 175,8 (1C3) ; 171,8 (1C6,27) ; 171,0 (1C6,27) ; 166,1 (2C9,10,30,31) ; 166,0 (2C9,10,30,31) ; 148,6 (1C7,28) ; 147,9 (1C7,28) ; 121,6 (2C8,11,29,32) ; 121,4 (2C8,11,29,32) ; 71,0 (4C12,19,33,40) ; 58,1 (1C2) ; 57,5 (1C4) ; 39,7 sous le DMSO (1C1); 31,2 (12C15-17,23-25,37-39,43-45) ; 23,4 (4C18,22,36,46) ; 0,0 (8C13,14,20,21,34,35,41,42). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C44H81N4O8Si4 [M+H]+ : 905,5125 ; observé 905,5123. Etape 4 : 2,3-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)propanoate de méthyle (10)
Figure imgf000034_0001
Le 2,3-bis(2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)propanoate de méthyle (9) (26,5 mg ; 0,029 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le THF (310 µL) et une solution de TBAF à 1 M dans du THF (164 µL ; 0,164 mmol ; 5,6 éq) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA (23 °C) pendant 5h30. Le THF a été évaporé sous pression réduite. Le brut a été solubilisé dans un mélange de MeCN (1 mL), d'eau (0,1 mL), de DMF (0,1 mL) et de DMSO (0,1 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 7,1 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV), SEDEX FP SAGA (détecteur DEDL)] détection UV à 254 nm à 25 °C et DEDL à 60 °C ; colonne Waters XBridge™ C- 18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% d'acide trifluoroacétique (en volume) dans l'eau (solvant A), et de l'acétonitrile (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis de 60 à 100% de B sur 5 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (10) (10,7 mg ; 80%) sous la forme d'un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,90 (s ; 2H8,11,19,22) ; 7,86 (s ; 2H8,11,19,22) ; 5,00 – 4,91 (m ; 1H2) ; 4,81 (s ; 4H12,14, 23,25) ; 4,79 (s ; 4H12,14, 23,25) ; 4,09 – 3,85 (m ; 2H1) ; 3,80 (s ; 3H4). RMN 13C (75 MHz, CD3OD) δ 171,57 (1C3) ; 168,78 (1C6, 17) ; 167,89 (1C6, 17) ; 162,27 (2C9,10,20,21) ; 162,23 (1C9,10,20,21) ; 145,99 (1C7,18) ; 145,65 (1C7,18) ; 118,63 (2C8,11,19,22) ; 118,53 (2C8,11,19,22) ; 64,55 (2C12,14, 23,25) ; 64,53 (2C12,14, 23,25) ; 54,68 (1C2) ; 53,20 (1C4) ; 41,90 (1C1). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C20H24N4O8 [M] : 448,1594 ; observée 448,1589. Etape 5 : 2,3-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido) propanoate de méthyle (11)
Figure imgf000035_0001
Le 2,3-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido) propanoate de méthyle (10) (5,8 mg ; 0,013 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du MeCN anhydre (500 µL) puis du PBr3 (12,1 µL ; 0,13 mmol ; 10,0 éq) a été ajouté lentement. Le milieu réactionnel a été agité à 45 °C pendant 2 h 15. La solution a été refroidie à 0 °C, neutralisée avec de l'eau (1 mL) et extraite à l'AcOEt (3x5 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de NaCl saturée, séchées sur MgSO4 et concentrées sous pression réduite. Le produit (11) (7,1 mg ; 79%) a été obtenu sous la forme d'un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,82 (s ; 2H8,11,17,20) ; 7,78 (s ; 2H8,11,17,20) ; 4,93 (dd ; J = 7,7 ; 5,0 Hz ; 1H2) ; 4,65 (s ; 4H12,13,21,22) ; 4,63 (s ; 4H12,13,21,22) ; 3,99 (dd ; J = 13,9 ; 5,0 Hz ; 1H1) ; 3,90 (dd ; J = 13,9 ; 7,7 Hz ; 1H1) ; 3,80 (s ; 3H4). RMN 13C (75 MHz, CD3OD) δ 171,54 (1C3) ; 168,12 (1C6, 15) ; 167,25 (1C6, 15) ; 159,55 (2C9,10,18,19) ; 159,52(2C9,10,18,19) ; 145,57 (1C7,16) ; 145,19 (1C7,16) ; 121,98 (2C8,11,17,20) ; 121,87 (2C8,11,17,20) ; 54,57 (1C2) ; 53,22 (1C4) ; 41,89 (1C1) ; 33,27 (2C12,13,21,22) ; 33,26 (2C12,13,21,22). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C20H20Br4N4O4 [M] : 695,8218 ; observée 695,8194. Exemple 2 : conjugué trastuzumab – composé (11) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (11) (12,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1
Figure imgf000036_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée 2 : non observé L'analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2
Figure imgf000036_0002
1 : non observé L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 55% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 3 : 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propanoate de méthyle (16) et acide 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)- isonicotinamido)méthyl)propanoïque (17) Schéma réactionnel général
Figure imgf000037_0001
(a) BnNH2, DIPEA, CHCl3, 16 h 25, 0 °C puis TA ; (b) H2, Pd(OH)2/C, 1,1,2- trichloroéthane, MeOH, 62 h, TA; (c) HATU, 2,6-lutidine, DMF, composé 4, 5 h, TA ; (d) TBAF, THF, 7 h 30, TA ; (e) PBr3, MeCN, 2 h 30, 45 °C ; (f) LiOH, THF, H2O, 2 h 10, TA. Etape 1 : 3-(benzylamino)-2-((benzylamino)méthyl)propanoate de méthyle (12), sel double de TFA
Figure imgf000037_0002
Le 3-bromo-2-(bromométhyl)propanoate de méthyle (549 µL ; 3,85 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du CHCl3 anhydre (9,6 mL). Puis la benzylamine (1,68 mL ; 15,4 mmol ; 4,0 éq) a été ajoutée goutte à goutte sous agitation à 0 °C. Un précipité a été observé. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à 0 °C pendant 25 min. Puis de la DIPEA anhydre (1,41 mL ; 8,1 mmol ; 2,1 éq) a été ajoutée au milieu réactionnel goutte à goutte, la disparition du précipité a été observée. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 16 h. Le CHCl3 a été évaporé sous pression réduite. Le résidu a été repris dans de l'AcOEt (15 mL), puis un lavage a été réalisé avec de l'eau (5x15 mL) et une solution de NaCl saturée (1x20 mL). La phase organique a ensuite été séchée sur MgSO4 et concentrée sous pression réduite. Le produit a ensuite été salifié en chlorhydrate : il a été solubilisé dans du MeOH (38 mL), puis une solution de HCl à 1,25 M dans EtOH (9,23 mL ; 11,5 mmol, 3,0 éq) a été ajoutée sous agitation à 0 °C. Le MeOH a été évaporé sous pression réduite. Le brut a été solubilisé dans un mélange de MeOH (9 mL) et de DMF (100 µL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi- préparative (tR = 14,5 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV), détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l'eau (solvant A), et de MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis de 60 à 100% de B sur 5 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (12) (875 mg ; 42%) sous la forme d'une huile incolore. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,39 (s ; 10H9-13,17-21) ; 4,13 (d ; J = 13,1 Hz ; 2H7,15) ; 4,07 (d ; J = 13,0 Hz ; 2H7,15) ; 3,64 (s ; 3H4) ; 3,63 – 3,57 (m ; 1H2) ; 3,41 – 3,22 (m ; 4H1, 5) RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 170,4 (1C3) ; 130,1 (4C9,10,12,13,17,18,20,21) ; 130,1 (2C11,19) ; 129,6 (2C8,16) ; 129,5 (4C9,10,12,13,17,18, 20,21) ; 53,5 (1C4) ; 52,5 (2C7,15) ; 45,7 (2C1,5) ; 40,0 (1C2). RMN 19F (282 MHz, CDCl3) δ -75,75 (s, TFA). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C19H24N2O2 [M] : 312,1838 ; observée 312,1834. Etape 2 : 3-amino-2-(aminométhyl)propanoate de méthyle, sel double de TFA (0,6) et de HCl (1,4) (13)
Figure imgf000038_0001
Le 3-(benzylamino)-2-((benzylamino)méthyl)propanoate de méthyle (12) (814,5 mg ; 1,51 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du MeOH (16 mL). Du 1,1,2-trichloroéthane (393 µL ; 4,23 mmol, 2,8 éq) a été ajouté et la solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Puis du Pd(OH)2/C 20% en masse (327,2 mg, 40% m/m) a été ajouté. Le milieu réactionnel a été agité sous atmosphère d'hydrogène à TA pendant 62 h. Le Pd(OH)2/C a été filtré sur Dicalite™ puis le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le produit (13) (376,1 mg, 99%) salifié (1,4 HCl ; 0,6 TFA, dosage RMN) a été obtenu sous forme d'une huile hétérogène brune. RMN 1H (300 MHz, D2O) δ 3,72 (s ; 3H4) ; 3,35 – 3,09 (m ; 5H1,2,5). RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 8,16 (s ; 6H6,7) ; 3,71 (s ; 3H4) ; 3,16 (s ; 1H2) ; 3,14 (s ; 4H1, 5). RMN 19F (282 MHz, D2O) δ -75,68 (s ; TFA). RMN 13C (75 MHz, D2O) δ 171,64 (1C3) ; 53,46 (1C4) ; 40,25 (1C2) ; 38,09 (2C1,5). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C5H13N2O2 [M+H]+ : 133,0972 ; observé 133,0973. Etape 3 : 3-(2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)-2- ((2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoate de méthyle (14)
Figure imgf000039_0001
L'acide 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinique (4) (291,1 mg ; 0,707 mmol ; 2,5 éq) a été activé avec du HATU (323,6 mg ; 0,851 mmol ; 3,0 éq) et de la 2,6- lutidine (231 µL ; 1,98 mmol ; 7,0 éq) dans du DMF anhydre (2,7 mL) sous agitation et sous argon à TA (24 °C) pendant 1h15. Puis le 3-amino-2-(aminométhyl)propanoate de méthyle salifié (0,6 TFA ; 1,4 HCl) (71 mg, 0,282 mmol, 1,0 éq) solubilisé dans du DMF anhydre (0,8 mL) a été ajouté au milieu réactionnel. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 3 h 45. Le DMF a été évaporé sous pression réduite. Puis le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/AcOEt, 70:30) pour donner (14) (112,9 mg ; 44%) sous la forme d'une laque incolore. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 8,89 (t ; J = 5,8 Hz, 2H6,27) ; 7,61 (s ; 4H9,12,30,33) ; 4,76 (s ; 8H13,20,34,41) ; 3,58 (s ; 3H4) ; 3,55 – 3,42 (m ; 4H1,5) ; 3,03 (p ; J = 7,6 Hz ; 1H2) ; 0,91 (s ; 36H17-19,24-26,38-40,45-47) ; 0,09 (s ; 24H14,15,21,22,35,36,42,43) RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 172,5 (1C3) ; 165,8 (2C7,28) ; 160,6 (4C10,11,31,32) ; 143,3 (2C8, 29) ; 116,0 (4C9,12,30,33) ; 65,5 (4C13,20,34,41) ; 51,6 (1C4) ; 44,7 (1C2) ; 38,7 sous le DMSO (2C1,5) ; 25,8 (12C17-19,24-26,38-40,45-47) ; 18,0 (4C16,23,37,44) ; -5,4 (8C14,15,21, 22,36,35,42,43). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C45H82N4O8Si4 [M] : 919,5282 ; observée 919,5288. Etape 4 : 3-(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)-2-((2,6- bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)méthyl)propanoate de méthyle (15)
Figure imgf000039_0002
Le 3-(2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(((tert- butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)méthyl)propanoate de méthyle (14) (260,9 mg ; 0,284 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le THF (2,0 mL) et une solution de TBAF à 1 M dans du THF (1,30 mL ; 1,31 mmol ; 4,6 éq) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA (25 °C) pendant 7 h 30. Le THF a été évaporé sous pression réduite. Le brut a été solubilisé dans du MeOH (4 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 9,1 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV), SEDEX FP SAGA (détecteur DEDL)] détection UV à 254 nm à 25 °C et DEDL à 60 °C ; colonne Waters XBridge™ C- 18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l'eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis de 60 à 100% de B sur 5 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (15) (95,1 mg ; 72%) sous la forme d'un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 9,00 (t ; J = 5,7 Hz ; 2H6,17) ; 7,77 (s ; 4H9,12,20,23) ; 4,62 (s ; 8H13,15,24,26) ; 3,60 (s ; 3H4) ; 3,58 – 3,43 (m ; 4H1,5) ; 3,06 (p ; J = 6,6 Hz ; 1H2). RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 172,6 (1C3) ; 165,3 (2C7,18) ; 161,4 (4C10,11,21,22) ; 143,3 (2C8,19) ; 116,4 (4C9,12,23,20) ; 63,5 (4C13,15,24,26) ; 51,8 (1C4) ; 44,7 (1C2) ; 39,2 sous le DMSO (2C1,5). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C21H27N4O8 [M+H]+ : 463,1823 ; observé 463,1819. Etape 5 : 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)- isonicotinamido)méthyl)propanoate de méthyle (16)
Figure imgf000040_0001
Le 3-(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)- méthyl)propanoate de méthyle (15) (86,3 mg ; 0,187 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (4,3 mL) puis du PBr3 (105 µL ; 1,12 mmol ; 6,0 éq) a été ajouté goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à 45 °C pendant 2 h 30. La solution a été refroidie à 0 °C, neutralisée avec de l'eau (6 mL) et extraite à l'AcOEt (3x20 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et concentrées sous pression réduite. Le brut a été solubilisé dans un mélange de MeOH (2,9 mL) et de DMF (1,2 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 30,26 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l'eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 30 à 80% de B sur 49 min puis de 80 à 100% de B sur 2 min puis 100% de B sur 3 min à 17,1 mL/min) pour donner le produit (16) (64,7 mg ; 49%) sous la forme d'un solide légèrement bleuté. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,93 (t ; J = 5,8 Hz ; 2H6,15) ; 7,81 (s ; 4H9,12,18,21) ; 4,65 (s ; 8H13,14,22,23) ; 3,74 (s ; 3H4) ; 3,73 – 3,67 (m ; 4H1,5) ; 3,13 (p ; J = 6,7 Hz ; 1H2). RMN 13C (75 MHz, CD3OD) δ 159,5 (4C11,10,19,20) ; 145,7 (2C8,17) ; 121,8 (4C9,12,18,21) ; 52,8 (1C4) ; 46,3 (1C2) ; 40,3 (2C1,5) ; 33,2 (4C13,14,22,23) ; C3, C7 et C16 non observés. SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C21H22N4O4Br4 [M] : 709,8374 ; observée 709,8349. Etape 6 : acide 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propanoïque (17)
Figure imgf000041_0001
Le 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)- méthyl)propanoate de méthyle (16) (56,8 mg ; 0,080 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le THF (4,4 mL) et une solution de LiOH hydraté (4,8 mg ; 0,199 mmol ; 2,5 éq) dans l'eau (1,99 mL) a été ajoutée doucement. Le milieu réactionnel a été agité à TA (25 °C) pendant 2 h 10. Le milieu réactionnel a été acidifié à 0 °C avec une solution aqueuse d'HCl 0,1 N puis extrait avec de l'AcOEt (4x10 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4 et concentrées sous pression réduite. Le brut a été solubilisé dans un mélange de MeOH (1,7 mL) et de DMF (0,7 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 31,13 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l'eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 60% de B sur 33 min puis de 60 à 100% de B sur 2 min puis 100% de B sur 2 min à 17,1 mL/min) pour donner le produit (17) (33,6 mg ; 60%) a été obtenu sous la forme d'un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,96 (t ; J = 5,7 Hz ; 2H6,15) ; 7,83 (s ; 4H9,12,18,21) ; 4,65 (s ; 8H13,14,22,23) ; 3,82 – 3,61 (m ; 4H1,5) ; 3,18 – 3,04 (m ; 1H2). RMN 13C (75 MHz, CD3OD) δ 175,6 (1C3) ; 167,5 (1C7,16) ; 159,5 (4C11,10,19,20) ; 145,7 (2C8,17) ; 121,9 (4C9,12,18,21) ; 46,1 (1C2) ; 40,4 (2C1,5) ; 33,2 (4C13,14,22,23). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C20H20N4O4Br4 [M] : 695,8290 ; observée 695,8218. Exemple 4 : conjugué trastuzumab – composé (16) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé (16) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Dans ce cas, le réducteur 2 a été éliminé par purification sur membrane (10 kDa) avant l'ajout du composé (16). Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous. Tableau 3
Figure imgf000042_0001
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée 2 : non observé L'analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l'espèce LHHL et un MAR moyen de 1,06 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-dessous. Tableau 4
Figure imgf000043_0001
1 : non observé L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,03. Exemple 5 : conjugué nivolumab – composé (16) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, nivolumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé (16) (6,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Dans ce cas, le réducteur 2 a été éliminé par purification sur membrane (10 kDa) avant l'ajout du composé (16). Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 5 ci-dessous. Tableau 5
Figure imgf000043_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée 2 : non observé L'analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,64 pour l'espèce LHHL et un MAR moyen de 1,01 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n'ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 ci-dessous. Tableau 6
Figure imgf000044_0001
1 : non observé L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 79% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,75. Exemple 6 : conjugué trastuzumab – composé (16) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 10 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (16) (10,6 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 7 ci-dessous. Tableau 7
Figure imgf000044_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée 2 : non observé L'analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,29 pour l'espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n'ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 8 ci-dessous. Tableau 8
Figure imgf000045_0001
1 : non observé L'analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 100% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,29. Exemple 7 : conjugué trastuzumab – composé (17) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (17) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 9 ci-dessous. Tableau 9
Figure imgf000045_0002
1 : masse moléculaire de l'espèce déglycosylée 2 : non observé L'analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,25 pour l'espèce LHHL et un MAR moyen de 1,04 pour l'espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n'ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 10 ci-dessous. Tableau 10
Figure imgf000046_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 54% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,16. Exemple 8 : N-(2-((((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)carbonyl)amino)- méthyl)-19-(11,12-didéhydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-3,14,19-trioxo- 7,10-dioxa-4,13-diazanonadec-1-yl)-2,6-bis(bromométhyl)pyridine-4- carboxamide (20) et 6-azidohexanamido-N-hexanamide-valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE (22) Schéma réactionnel général
Figure imgf000046_0002
Figure imgf000047_0001
(a) NH2-PEG2-(CH2)2NH2, HATU, 2,6-lutidine, DMF, 1h40, TA ; (b) TFA, DCM, 2 h 20, TA ; (c) composé (17), EEDQ, DIPEA, DMF, MeCN, 2 h, 25 °C ; (d) NaN3, DMF, 16 h, 100 °C ; (e) TFA.NH2-val-cit-PABC-MMAE, HATU, 2,6-lutidine, DMF, 15 h, 0 °C à TA. Etape 1 : tert-butyl (2-(2-(2-((6-(11,12-didéhydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)- yl)-6-oxohexanoyl)amino)éthoxy)éthoxy)éthyl)carbamate (18)
Figure imgf000048_0001
L’acide 6-(11,12-didéhydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanoïque (32,1 mg ; 0,104 mmol ; 1,2 éq) a été mis en suspension dans le DMF anhydre (750 µL). Puis le HATU (66,6 mg ; 0,175 mmol ; 2,0 éq) et la 2,6-lutidine (26,2 µL ; 0,225 mmol ; 2,6 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à TA (19 °C) pendant 10 min. Puis du tert-butyl (2-(2-(2-aminoéthoxy)éthoxy)éthyl)carbamate (20,6 µL ; 0,087 mmol ; 1,0 éq) a été ajouté au milieu d’activation lentement. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à TA pendant 1h30. Le DMF a été évaporé sous pression réduite. Puis le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, DCM/MeOH, 95:5) pour donner (18) (55,6 mg ; conversion 100%, PRMN : 81%) sous la forme d’une huile jaune. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,67 – 7,61 (m ; 1Har) ; 7,51 – 7,42 (m ; 4Har) ; 7,39 – 7,27 (m ; 2Har) ; 7,26 – 7,21 (m ; 1Har) ; 5,12 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H12) ; 3,68 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H12) ; 3,56 (s ; 4H25,26) ; 3,51 – 3,43 (m ; 4H24,27) ; 3,26 (t ; J = 4,7 Hz ; 2H23) ; 3,19 (t ; J = 5,6 Hz ; 2H28) ; 2,26 – 2,12 (m ; 1H17,20) ; 2,01 – 1,88 (m ; 3H17,20) ; 1,41 (s ; 9H32- 34) ; 1,36 – 1,19 (m ; 4H18-19). RMN 13C (75 MHz, CD3OD) δ 175,8 (1C21) ; 175,3 (1C16) ; 153,0 (1C11,13,14,15) ; 149,5 (1C11,13,14,15) ; 133,5 (1Car) ; 130,4 (1Car) ; 129,9 (1Car) ; 129,7 (1C30) ; 129,6 (1Car) ; 129,2 (1Car) ; 128,9 (1Car) ; 128,1 (1Car) ; 126,5 (1Car) ; 124,3 (1C11,13,14,15) ; 123,7 (1C11,13,14,15) ; 115,8 (1C5-6) ; 108,9 (1C5-6) ; 71,3 (2C25-26) ; 71,1(1C31) ; 70,6 (2C24-27) ; 56,6 (1C12) ; 41,2 (1C28) ; 40,3 (1C23) ; 36,5 (1C17-20) ; 35,6 (1C17-20) ; 28,8 (3C32-34) ; 26,2 (1C18-19) ; 25,9 (1C18-19). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C32H41N3O6 [M] : 563,2995 ; observée 563,5991. Etape 2 : N-(2-(2-(2-aminoéthoxy)éthoxy)éthyl)-6-(11,12-didéhydro- dibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanamide, sel de TFA (19)
Figure imgf000049_0001
Le tert-butyl (2-(2-(2-((6-(11,12-didéhydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanoyl)- amino)éthoxy)éthoxy)éthyl)carbamate (52,2 mg ; 0,093 mmol ; 1,0 éq) a été dissous du DCM (930 µL). Puis du TFA (93,0 µL ; 10% v/v) a été ajouté. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à TA pendant 2 h 20. Le milieu réactionnel a été concentré sous pression réduite et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 20,06 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 60% de B sur 33 min puis 60 à 100% de B sur 2 min et 100% de B sur 2 min à 17,1 mL/min) pour donner (19) (21,3 mg ; 40%) sous la forme d’une huile légèrement rose. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,69 – 7,63 (m ; 1Har) ; 7,54 – 7,43 (m ; 4Har) ; 7,41 – 7,30 (m ; 2Har) ; 7,28 – 7,23 (m ; 1Har) ; 5,13 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H12) ; 3,71 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H12) ; 3,68 – 3,62 (m ; 2H27) ; 3,63 – 3,57 (m ; 4H25,26) ; 3,49 (t ; J = 5,8 Hz ; 3H24) ; 3,31 – 3,26 (m ; 2H23) ; 3,08 (t ; 2H28) ; 2,30 – 2,13 (m ; 1H17,20) ; 1,98 (t ; J = 7,0 Hz ; 2H17,20) ; 1,95 – 1,87 (m ; 1H17,20) ; 1,45 – 1,20 (m ; 4H18-19). RMN 13C (75 MHz, CD3OD) δ 175,9 (1C21) ; 175,3 (1C16) ; 152,9 (1C11,13,14,15) ; 149,5 (1C11,13,14,15) ; 133,5 (1Car) ; 130,4 (1Car) ; 130,0 (1Car) ; 129,7 (1Car) ; 129,2 (1Car) ; 128,9 (1Car) ; 128,1 (1Car) ; 126,5 (1Car) ; 124,4 (1C11,13,14,15) ; 123,7 (1C11,13,14,15) ; 115,7 (1C5-6) ; 108,8 (1C5-6) ; 71,4 (1C25-26) ; 71,3 (1C25-26) ; 70,6 (1C24) ; 67,9 (1C27) ; 56,6 (1C12) ; 40,7 (1C28) ; 40,1 (1C23) ; 36,5 (1C17-20) ; 35,6 (1C17-20) ; 26,2 (1C18-19) ; 25,9 (1C18-19). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C27H33N3O4 [M] : 463,2471 ; observée 463,2466. Etape 3 : N-(2-((((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)carbonyl)amino)méthyl)- 19-(11,12-didéhydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-3,14,19-trioxo-7,10-dioxa- 4,13-diazanonadec-1-yl)-2,6-bis(bromométhyl)pyridine-4-carboxamide (20)
Figure imgf000050_0001
Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoïque (17) (20,4 mg ; 0,029 mmol ; 1,7 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (1,98 mL) puis la EEDQ (56,1 mg ; 0,23 mmol ; 13,0 éq) a été ajoutée. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 30 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de N-(2-(2-(2-aminoéthoxy)éthoxy)éthyl)-6-(11,12- didéhydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-6-oxohexanamide (19) (10,1 mg ; 0,018 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (1,68 mL) en présence de DIPEA (12,18 µL ; 0,070 mmol ; 4,0 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Puis de la DIPEA (12,18 µL ; 0,070 mmol ; 4,0 éq) a été ajouté au milieu réactionnel. Le milieu réactionnel a été agité sous argon dans l’obscurité et à 25 °C pendant 1h40. Le mélange a été dilué avec du DMF (800 µL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 29,25 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 37 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (20) (17,2 mg ; 86%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,88 (t ; J = 5,9 Hz ; 2H33,43) ; 8,19 (t ; J = 5,8 Hz ; 1H22,29) ; 7,82 (s ; 4H36,39,46,49) ; 7,82 (s ; 1H22,29) ; 7,67 – 7,60 (m ; 1Har DBCO) ; 7,54 – 7,40 (m ; 4Har DBCO) ; 7,38 – 7,26 (m ; 2Har DBCO) ; 7,26 – 7,20 (m ; 1Har DBCO) ; 5,12 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H12) ; 4,63 (s ; 8H40,41,50,51) ; 3,68 (d ; J = 14,0 Hz ; 1H12) ; 3,64 – 3,56 (m ; 4H32,42) ; 3,55 – 3,44 (m ; 6H24,25,26,27) ; 3,44 – 3,36 (m ; 2H24,25,26,27) ; 3,32 sous MeOH (2H23) ; 3,23 (t ; J = 5,5 Hz ; 2H28) ; 3,09 – 2,97 (m ; 1H31) ; 2,26 – 2,13 (m ; 1H17-20) ; 2,04 – 1,80 (m ; 3H17-20) ; 1,45 – 1,15 (m ; 4H18-19). RMN 13C (75 MHz, CD3OD) δ 167,2 (2C34,44); 159,5 (4C37,38,47,48); 145,7 (2C35,45) ; 133,5 (1C1-4,7-10) ; 130,4 (1C1-4,7-10) ; 130,0 (1C1-4,7-10) ; 129,6 (1C1-4,7-10) ; 129,2 (1C1-4,7-10) ; 128,9 (1C1-4,7-10) ; 128,1 (1C1-4,7-10) ; 126,5 (1C1-4,7-10) ; 121,9 (4C36,39,46,49); 71,3 (1C23,24,25,26,27,28); 71,0 (1C23,24,25,26,27,28); 70,6 (1C23,24,25,26,27,28); 70,5 (1C23,24,25,26,27,28); 56,6 (1C12); 47,3 (1C31); 41,2 (2C32,42); 40,2 (1C23,24,25,26,27,28); 40,1 (1C23,24,25,26,27,28), 36,5 (1C17- 20) ; 35,6 (1C17-20) ; 33,3 (4C40,41,50,51); 26,2 (1C18-19); 26,0 (1C18-19). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C47H51N7O7Br4 [M] : 1141,0583 ; observée 1141,0540. Etape 4 : acide 6-azidohexanoïque (21)
Figure imgf000051_0001
L’acide 6-bromohexanoïque (100 mg ; 0,513 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du DMF peptidique (5 mL) et du NaN3 (167 mg ; 2,56 mmol ; 5,0 éq) a été ajouté. Le milieu réactionnel a été agité à 100 °C pendant 16 h. Le DMF a été évaporé sous pression réduite. Le résidu a été repris dans du DCM (20 mL), puis un lavage a été réalisé avec 1x20 mL d’une solution aqueuse d’HCl 0,1 M puis 1x20 mL d’une solution de NaCl saturée. La phase organique a ensuite été séchée sur MgSO4 et concentrée sous pression réduite. Le produit (21) (81 mg, 100%) a été obtenu sous forme d’une huile opaque blanche. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,75 (s ; 1H7) ; 3,28 (t ; J = 6,8 Hz ; 2H5) ; 2,36 (t ; J = 7,3 Hz ; 2H1) ; 1,76 – 1,55 (m ; 4H2,4) ; 1,52 – 1,34 (m ; 2H3). RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 179,1 (1C6) ; 51,4 (1C1) ; 34,1 (1C5) ; 28,7 (1C2) ; 26,3 (1C3) ; 24,4(1C4). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C6H10N3O2 [M-H]- : 156,0779 ; observé 156,0779. Etape 5 : 6-azidohexanamido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (22)
Figure imgf000051_0002
L’acide 6-azidohexanoïque (21) (1,3 mg ; 0,008 mmol ; 2,0 éq) a été dissous dans le DMF anhydre (100 µL). La solution a été refroidie à 0 °C, puis le HATU (6,1 mg ; 0,016 mmol ; 4,0 éq) et la 2,6-lutidine (2,8 µL ; 0,024 mmol ; 6,0 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à 0 °C pendant 15 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (5,0 mg ; 0,004 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF anhydre (100 µL), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à TA pendant 15 h. Le mélange a été dilué par 4 avec du DMF anhydre et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 19,3 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (22) (3,8 mg ; 75%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 9,99 (s ; 1H) ; 8,31 (s ; 1H) ; 8,09 (d ; J = 7,4 Hz ; 2H) ; 7,87 (dd ; J = 16,9 ; 8,7 Hz ; 2H) ; 7,61 (dd ; J = 15,3 ; 8,5 Hz ; 3H) ; 7,40 – 7,21 (m ; 7H) ; 7,22 – 7,10 (m ; 1H) ; 5,97 (s ; 1H) ; 5,41 (s ; 2H) ; 5,16 – 4,90 (m ; 2H) ; 4,73 (s ; 1H) ; 4,54 – 4,31 (m ; 3H) ; 4,30 – 4,13 (m ; 2H) ; 4,13 – 3,87 (m ; 2H) ; 3,78 (d ; J = 11,4 Hz ; 1H) ; 3,29 (t ; J = 6,9 Hz ; 1H) ; 3,23 (d ; J = 4,8 Hz ; 2H) ; 3,20 (s ; 1H) ; 3,17 (s ; 1H) ; 3,11 (s ; 1H) ; 2,97 (s ; 2H) ; 2,86 (d ; J = 11,1 Hz ; 2H) ; 2,27 (dd ; J = 10,3 ; 8,5 Hz ; 1H) ; 2,23 – 2,05 (m ; 3H) ; 2,05 – 1,89 (m ; 1H) ; 1,87 – 1,63 (m ; 3H) ; 1,53 (dd ; J = 14,1 ; 6,8 Hz ; 6H) ; 1,41 – 1,19 (m ; 4H) ; 1,11 – 0,94 (m ; 6H) ; 0,94 – 0,68 (m ; 26H). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C64H103N13O13 [M] : 1261,7798 ; observée 1261,7758. Exemple 9 : conjugué trastuzumab – composé (20) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (20) (10,6 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 11 ci-dessous. Tableau 11
Figure imgf000053_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,87 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 12 ci-dessous. Tableau 12
Figure imgf000053_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 96% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,88. Exemple 10 : conjugué trastuzumab – composé (20) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (20) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 13 ci-dessous. Tableau 13
Figure imgf000054_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,19 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 14 ci-dessous. Tableau 14
Figure imgf000054_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 77% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,22. Exemple 11 : conjugué trastuzumab – composé (20) – composé (22) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (20) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (22) (2ème composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 15 ci-dessous. Tableau 15
Figure imgf000055_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au composé (20) n’est observé : le conjugué trastuzumab-composé (20) a été entièrement converti. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 16 ci-dessous. Tableau 16
Figure imgf000055_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 97% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 12 : conjugué trastuzumab – composé (20) – composé (22) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (20) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (22) (2ème composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 17 ci-dessous. Tableau 17
Figure imgf000056_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,17 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au composé (20) n’est observé : le conjugué trastuzumab-composé (20) a été entièrement converti. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 18 ci-dessous. Tableau 18
Figure imgf000056_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 75% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,19. Exemple 13 : 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6 bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propamido-N-hexanamide-valine- citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (23)
Figure imgf000057_0001
Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoïque (17) (12,0 mg ; 0,017 mmol ; 1,5 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (1,3 mL) puis EEDQ (34,2 mg ; 0,138 mmol ; 12,0 éq) a été ajouté. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 30 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de 6-aminohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (6) (15,5 mg ; 0,012 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (1,1 mL) en présence de DIPEA (8,0 µL ; 0,046 mmol ; 4,0 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Puis de la DIPEA (8,0 µL ; 0,046 mmol ; 4,0 éq), a été ajouté au milieu réactionnel. Le milieu réactionnel a été agité sous argon dans l’obscurité et à 25 °C pendant 1h30. Le mélange a été dilué avec du DMF (1 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 27,35 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 37 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (23) (13,9 mg ; 63%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 9,99 (s ; 1H) ; 8,91 (t ; J = 5,6 Hz ; 2H) ; 8,32 (s ; 1H) ; 8,10 (d ; J = 7,8 Hz ; 1H) ; 7,98 – 7,89 (m ; 2H) ; 7,87 – 7,82 (m ; 4H) ; 7,73 (d ; J = 8,3 Hz ; 1H) ; 7,67 – 7,51 (m ; 3H) ; 7,41 – 7,22 (m ; 6H) ; 7,18 (t ; J = 7,1 Hz ; 1H) ; 5,97 (t ; J = 5,0 Hz ; 1H) ; 5,42 (s ; 2H) ; 5,02 (dd ; J = 29,8 ; 10,6 Hz ; 1H) ; 4,79 (d ; J = 11,7 Hz ; 1H) ; 4,72 (s ; 8H) ; 4,67 – 4,57 (m ; 1H) ; 4,53 – 4,32 (m ; 2H) ; 4,32 – 4,14 (m ; 2H) ; 4,09 – 3,87 (m ; 2H) ; 3,78 (d ; J = 8,6 Hz ; 3H) ; 3,62 – 3,53 (m ; 2H) ; 3,21 (dd ; J = 14,9 ; 6,2 Hz ; 5H) ; 3,12 (s ; 1H) ; 3,08 – 2,93 (m ; 3H) ; 2,86 (d ; J = 10,4 Hz ; 3H) ; 2,18 – 2,02 (m ; 3H) ; 2,02 – 1,87 (m ; 2H) ; 1,86 – 1,62 (m ; 2H) ; 1,61 – 1,45 (m ; 2H) ; 1,43 – 1,26 (m ; 6H) ; 1,15 (dd ; J = 13,5 ; 7,3 Hz ; 1H) ; 1,01 (dt ; J = 15,2 ; 7,6 Hz ; 5H) ; 0,91 – 0,67 (m ; 25H). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C84H123N15O16Br4 [M] : 1913,6006 ; observée 1913,6059. Exemple 14 : conjugué trastuzumab – composé (23) Réactifs Tampon de bioconjugaison 2, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé (23) (5,0 éq) à une concentration de 0,4 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 19 ci-dessous. Tableau 19
Figure imgf000058_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 20 ci-dessous. Tableau 20
Figure imgf000058_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 61% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 15 : 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (26) Schéma réactionnel général
Figure imgf000060_0001
(a) HATU, 2,6-lutidine, DMF, 20 h, TA ; (b) TBAF, THF, 21 h, TA ; (c) PBr3, MeCN, DMF, 7 h, 45 °C. Etape 1 : 3,5-bis(2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)- isonicotinamido)benzoate de méthyle (24)
Figure imgf000061_0001
L’acide 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinique (4) (1,39 g ; 3,376 mmol ; 2,5 éq) a été mis en suspension dans le DMF peptidique (8,0 mL), puis le HATU (1,54 g ; 4,050 mmol ; 3,0 éq) et la 2,6-lutidine (0,63 mL ; 5,439 mmol ; 4,0 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à TA (25 °C) pendant 45 min. Puis une solution de 3,5-diaminobenzoate de méthyle (225 mg ; 1,354 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF peptidique (1,0 mL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à TA (25 °C) pendant 20 h. Le mélange réactionnel a été repris dans l’AcOEt et concentré sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (cyclohexane/AcOEt, 85:15) pour donner (24) (778 mg ; 60%) sous la forme d’un solide blanc cassé. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 10,91 (s ; 2H9,30) ; 8,66 (t ; J = 2,0 Hz ; 1H6) ; 8,21 (d ; J = 2,0 Hz ; 2H4,8) ; 7,80 (s ; 4H12,15,33,36) ; 4,82 (s ; 8H16,23,37,44) ; 3,90 (s ; 3H1) ; 0,93 (s ; 36H20-22,27-29,41-43,48-50) ; 0,12 (s ; 24H17,18,24,25,38,39,45,46). RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 166,4 (1C2) ; 165,1 (2C10,31) ; 162,1 (4C13,14,34,35) ; 143,3 (2C5,7) ; 138,7 (2C11,32) ; 132,0 (1C3) ; 117,5 (2C4,8) ; 116,1 (1C6) ; 115,5 (4C12,15,33,36) ; 66,0 (4C16,23,37,44) ; 52,6 (1C1) ; 26,1 (12C20-22,27-29,41-43,48-50) ; 18,6 (4C19,26,40,47) ; -5,2 (8C17,18,24,25,38,39,45,46). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C48H81N4O8Si4 [M+H]+ : 953,5126 ; observé 953.5121. Etape 2 : 3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (25)
Figure imgf000062_0001
( ) Le 3,5-bis(2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (24) (119 mg ; 0,125 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le THF anhydre (560 µL) et une solution de TBAF 1 M dans le THF (580 µL ; 0,580 mmol ; 4,6 éq) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 21 h. Le THF a été évaporé sous pression réduite et le résidu a été repris dans le DMSO (3,0 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 10,6 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 34 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (25) (62 mg ; 100%) sous la forme d’un solide jaune pâle. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 10,89 (s ; 2H9,20) ; 8,73 (t ; J = 2,0 Hz ; 1H6) ; 8,22 (d ; J = 2,0 Hz ; 2H4,8) ; 7,88 (s ; 4H12,15,23,26) ; 4,64 (s ; 8H16,18,27,29) ; 3,90 (s ; 3H1). RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 165,9 (1C2) ; 164,8 (2C10,21) ; 162,0 (4C13,14,24,25) ; 143,0 (2C5,7) ; 139,4 (2C11,22) ; 130,3 (1C3) ; 117,0 (3C4,6,8) ; 116,3 (4Cc12,15,23,26) ; 64,1 (4C13,14,24,25) ; 52,4 (1C1). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C24H24N4O8 [M] : 496,1594 ; observée 496,1597. Etape 3 : 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (26)
Figure imgf000062_0002
( ) Le 3,5-bis(2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (25) (64 mg ; 0,129 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (5 mL) puis PBr3 (74 µL ; 0,780 mmol ; 6,0 éq) a été ajouté goutte à goutte. La suspension a été agitée sous argon à 45 °C pendant 4 h. Après retour à TA, 1 mL de DMF anhydre a été ajouté, puis la solution a été agitée sous argon à 45 °C pendant 3 h. Le milieu réactionnel a été neutralisé avec de l’eau (10 mL) et extrait à l’AcOEt (3x30 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, DCM/AcOEt, 80:20) pour donner (26) (41 mg ; 43%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 10,89 (s ; 2H9,18) ; 8,72 (s ; 1H6) ; 8,19 (s ; 2H4,8) ; 8,00 (s ; 4H12,15,21,24) ; 4,79 (s ; 8H16,17,25,26) ; 3,90 (s ; 3H1). RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 165,8 (1C2) ; 163,5 (2C10,19) ; 157,6 (4C13,14,22,23) ; 144,1 (2C5,7) ; 139,2 (2C11,20) ; 130,4 (1C3) ; 121,2 (4C12,15,21,24) ; 117,0 (2C4,8) ; 116,6 (1C6) ; 52,4 (1C1) ; 34,0 (4C16,17,25,26). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C24H20Br4N4O4 [M] : 743,8218 ; observée 743,8207. Exemple 16 : conjugué trastuzumab – composé (26) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (26) (12,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 21 ci-dessous.
Tableau 21
Figure imgf000064_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,36 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 22 ci-dessous. Tableau 22
Figure imgf000064_0003
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 78% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,30. Exemple 17 : acide 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzoïque (28) Schéma réactionnel général
Figure imgf000064_0001
(a) LiOH, THF, H2O, 43 h, TA ; (b) PBr3, DMF, 3 h 30, 0 °C puis TA. Etape 1 : acide 3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzoïque (27)
Figure imgf000065_0001
Le 3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (25) (312 mg ; 0,628 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans le THF (35 mL) et une solution de LiOH hydraté (42 mg ; 1,754 mmol ; 2,8 éq) dans l’eau (17,5 mL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à TA (25 °C) pendant 43 h. Le milieu a été acidifié avec une solution aqueuse d’HCl 1 N jusqu’à pH 1 et le THF a été évaporé sous pression réduite. Le résidu aqueux a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 10,9 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (27) (252 mg ; 83%) sous la forme d’un solide jaune pâle. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 10,83 (s ; 2H9,20) ; 8,67 (t ; J = 1,7 Hz ; 1H6) ; 8,18 (d ; J = 2,0 Hz ; 2H4,8) ; 7,86 (s ; 4H12,15,23,26) ; 5,56 (t ; J = 5,8 Hz ; 4H17,19,28,30) ; 4,63 (d ; J = 5,7 Hz ; 8H16,18,27,29). RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 167,0 (1C2) ; 164,8 (2C10,21) ; 162,0 (4C13,14,24,25) ; 143,0 (2C5,7) ; 139,3 (2C11,22) ; 131,5 (1C3) ; 117,3 (2C4,8) ; 116,7 (1C6) ; 116,3 (4C12,15,23,26) ; 64,1 (4C16,18,27,29). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C23H22N4O8 [M] : 482,1438 ; observée 482,1447. Etape 2 : acide 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzoïque (28)
Figure imgf000065_0002
L’acide 3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzoïque (27) (20 mg ; 0,041 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans le DMF anhydre (1,3 mL) à 0 °C puis le PBr3 (32 µL ; 0,337 mmol ; 8,2 éq) a été ajouté goutte à goutte. La suspension a été agitée sous argon à TA (25 °C) pendant 3 h 30. Le milieu réactionnel a été neutralisé avec de l’eau (1,5 mL), le précipité blanc formé a été filtré, rincé à l’eau et au n-pentane pour donner (28) (24 mg ; 81%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,59 (t ; J = 2,1 Hz ; 1H6) ; 8,21 (d ; J = 2,1 Hz ; 2H4,8) ; 7,97 (s ; 4H12,15,21,24) ; 4,69 (s ; 8H16,17,25,26). RMN 13C (75 MHz, CD3OD) δ 167,0 (1C2) ; 165,8 (2C10,19) ; 159,6 (4C13,14,22,23) ; 146,3 (2C5,7) ; 140,2 (2C11,20) ; 133,3 (1C3) ; 122,2 (4C12,15,21,24) ; 119,6 (2C4,8) ; 118,8 (1C6) ; 33,3 (4C16,17,25,26). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C23H18Br4N4O4 [M] : 729,8062 ; observée 729,8069. Exemple 18 : conjugué trastuzumab – composé (28) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (12,0 éq), composé (28) (12,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 23 ci-dessous. Tableau 23
Figure imgf000066_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,27 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 24 ci-dessous. Tableau 24
Figure imgf000067_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 56% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,19. Exemple 19 : conjugué trastuzumab – composé (28) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (12,0 éq), composé (28) (12,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 25 ci-dessous. Tableau 25
Figure imgf000067_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,40 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 26 ci-dessous. Tableau 26
Figure imgf000068_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 60% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,43. Exemple 20 : 6-(3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzamido)- hexanoate de méthyle (30) Schéma réactionnel général
Figure imgf000069_0001
(a) NH2(CH2)5CO2CH3.HCl, HATU, 2,6-lutidine, DMF, 25 h, 0 °C puis TA ; (b) PBr3, DMF, 2 h, 45 °C. Etape 1 : 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzamido)- hexanoate de méthyle (29)
Figure imgf000070_0001
L’acide 3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzoïque (27) (98 mg ; 0,203 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans le DMF anhydre (8,0 mL) sous argon à 0 °C, puis le HATU (116 mg ; 0,305 mmol ; 1,5 éq) et la 2,6-lutidine (110 µL ; 0,950 mmol ; 4,7 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à 0 °C pendant 15 min. Puis le chlorhydrate de 6-aminohexanoate de méthyle (44 mg ; 0,242 mmol ; 1,2 éq) a été ajouté. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA (25 °C) pendant 25 h. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 16,4 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (29) (110 mg ; 89%) sous la forme d’un solide jaune pâle. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 10,80 (s ; 2H9,20) ; 8,49 (t ; J = 1,8 Hz ; 1H6) ; 8,48 – 8,41 (m ; 1H1) ; 7,94 (d ; J = 1,9 Hz ; 2H4,8) ; 7,87 (s ; 4H12,15,23,26) ; 4,64 (s ; 8H16,18,27,29) ; 3,58 (s ; 3H37) ; 3,30 – 3,20 (m ; 2H31) ; 2,32 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H35) ; 1,64 – 1,47 (m ; 4H32,34) ; 1,40 – 1,26 (m ; 2H33). RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 173,4 (1C36) ; 166,3 (1C2) ; 164,4 (2C10,21) ; 161,5 (4C13,14,24,25) ; 143,9 (2C5,7) ; 138,8 (2C11,22) ; 136,2 (1C3) ; 116,9 (4C12,15,23,26) ; 115,9 (2C4,8) ; 115,7 (1C6) ; 63,5 (4C16,18,27,29) ; 51,2 (1C37) ; 38,9 sous le DMSO (1C31) ; 33,3 (1C35) ; 28,8 (1C32) ; 26,0 (1C33) ; 24,2 (1C34). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C30H35N5O9 [M] : 609,2435 ; observée 609,2429. Etape 2 : 6-(3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzamido)- hexanoate de méthyle (30)
Figure imgf000071_0001
Le 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzamido)hexanoate de méthyle (29) (22 mg ; 0,036 mmol ; 1,0 éq) a été solubilisé dans le DMF anhydre (1,4 mL) puis le PBr3 (21 µL ; 0,221 mmol ; 6,2 éq) a été ajouté goutte à goutte. La suspension a été agitée sous argon à 45 °C pendant 50 min. Le milieu réactionnel blanc crème visqueux a été mis en suspension par l’ajout de DMF anhydre (1,4 mL). La suspension blanche obtenue a été agitée à 45 °C pendant 1 h 10. Après retour à TA, le milieu réactionnel a été neutralisé avec de l’eau et extrait à l’AcOEt (3x30 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/acétate d’éthyle, 70:30) puis par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 24,3 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (30) (9 mg ; 29%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 10,89 (s ; 2H9,18) ; 8,95 (s ; 1H1) ; 8,64 (t ; J = 1,8 Hz ; 1H6); ; 7,98 (s ; 4H12,15,21,24) ; 7,77 (d ; J = 2,0 Hz ; 2H4,8) ; 4,79 (s ; 8H16,17,25,26) ; 3,75 (t ; J = 7,2 Hz ; 2H27) ; 3,57 (s ; 3H33) ; 2,32 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H31) ; 1,63 – 1,51 (m ; 4H28,30) ; 1,38 – 1,28 (m ; 2H29). RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,13 – 9,02 (m ; 2H9,18) ; 8,94 (s ; 1H1) ; 8,49 (t ; J = 1,9 Hz ; 1H6) ; 7,82 (s ; 4H12,15,21,24) ; 7,64 (d ; J = 1,6 Hz ; 2H4,8) ; 4,57 (s ; 8H16,17,25,26) ; 3,84 (t ; J = 6,4 Hz ; 2H27) ; 3,56 (s ; 3H33) ; 2,33 (t ; J = 7,1 Hz ; 2H31) ; 1,72 – 1,54 (m ; 4H28,30) ; 1,43 – 1,28 (m ; 2H29). RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 175,0 (1C32) ; 171,7 (1C2) ; 163,8 (2C10,19) ; 158,3 (4C13,14,22,23) ; 143,9 (2C5,7) ; 139,0 (2C11,20) ; 135,4 (1C3) ; 120,6 (4C12,15,21,24) ; 116,9 (2C4,8) ; 115,6 (1C6) ; 51,9 (1C33) ; 40,6 (1C27) ; 34,06 (1C31) ; 32,9 (4C16,17,25,26) ; 27,6 (1C28) ; 26,3 (1C29) ; 24,7 (1C30). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C30H31Br4N5O5 [M] : 856,9059 ; observée 856,9080. Exemple 21 : conjugué trastuzumab – composé (30) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (12,0 éq), composé (30) (12,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 1 Les résultats sont présentés dans le Tableau 27 ci-dessous. Tableau 27
Figure imgf000072_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 28 ci-dessous. Tableau 28
Figure imgf000073_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 54% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 22 : acide 6-(3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)- benzamido)hexanoïque (32) Schéma réactionnel général
Figure imgf000074_0001
(a) LiOH, THF, H20, 25 h, TA; (b) PBr3, MeCN, 5 h, 45 °C. Etape 1 : acide 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzamido)- hexanoïque (31)
Figure imgf000075_0001
Le 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzamido)hexanoate de méthyle (29) (110 mg ; 0,180 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans le THF (9 mL) et une solution de LiOH 0,1 M (10,8 mg ; 0,451 mmol ; 2,5 éq) dans l’eau (4,5 mL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à TA (25 °C) pendant 25 h. Le milieu a été acidifié avec une solution aqueuse d’HCl 1 N jusqu’à pH 1 et le THF a été évaporé sous pression réduite. Le résidu aqueux a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 13,4 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (31) (84 mg ; 79%) sous la forme d’un solide jaune pâle. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 10,82 (s ; 2H9,20) ; 8,53 – 8,48 (m ; 1H6) ; 8,48 – 8,42 (m ; 1H1) ; 7,93 (d ; J = 1,6 Hz ; 2H4,8) ; 7,90 (s ; 4H12,15,23,26) ; 4,66 (s ; 8H16,18,27,29) ; 3,31 – 3,19 (m ; 2H31) ; 2,22 (t ; J = 7,3 Hz ; 2H35) ; 1,62 – 1,46 (m ; 4H32,34) ; 1,40 – 1,26 (m ; 2H33). RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ 174,5 (1C36) ; 166,2 (1C2) ; 164,5 (2C10,21) ; 161,6 (4C13,14,24,25) ; 143,5 (2C5,7) ; 138,8 (2C11,22) ; 136,1 (1C3) ; 116,6 (4C12,15,23,26) ; 115,8 (2C4,8) ; 115,7 (1C6) ; 63,7 (4C16,18,27,29) ; 38,9 sous le DMSO (1C31) ; 33,7 (1C35) ; 28,8 (1C32) ; 26,0 (1C33) ; 24,3 (1C34). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C29H33N5O9 [M] : 595,2278 ; observée 595,2271. Etape 2 : acide 6-(3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzamido)- hexanoïque (32)
Figure imgf000076_0001
L’acide 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzamido)hexanoïque (31) (48,7 mg ; 0,082 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (4 mL) puis PBr3 (47 µL ; 0,495 mmol ; 6,0 éq) a été ajouté goutte à goutte. La suspension a été agitée sous argon à 45 °C pendant 3 h 10. Après retour à TA, un ajout de PBr3 (24 µL ; 0,253 mmol ; 3,1 éq) supplémentaire a été réalisé goutte à goutte et la suspension a été agitée sous argon à 45 °C pendant 1 h 45. Après refroidissement à 0 °C, le milieu réactionnel a été neutralisé avec de l’eau et concentré sous pression réduite. Le résidu aqueux (1 mL) a été dilué dans le DMF anhydre (3,5 mL) et le produit a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 19,9 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (32) (6,0 mg ; 9%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 12,00 (s ; 1H33) ; 10,84 (s ; 2H9,18) ; 8,64 – 8,36 (m ; 2H1,6) ; 8,03 (s ; 4H12,15,21,24) ; 7,93 (d ; J = 1,8 Hz ; 2H4,8) ; 4,90 (s ; 8H16,17,25,26) ; 3,28 – 3,20 (m ; 2H27) ; 2,21 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H31) ; 1,63 – 1,47 (m ; 4H28,30) ; 1,43 – 1,26 (m ; 2H29). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C24H29Br4N5O5 [M] : 743,8218 ; observée 743,8207. Exemple 23 : 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzamido-N- hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (33)
Figure imgf000076_0002
Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3,5-bis(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzoïque (28) (10,0 mg ; 0,0136 mmol ; 2,0 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (536 µL) EEDQ (10,0 mg ; 0,0404 mmol ; 6,0 éq) a été ajouté. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 1 h 30. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de 6-aminohexanamide-valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE (6) (9,0 mg ; 0,0067 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (134 µL) en présence de DIPEA (4,7 µL ; 0,0270 mmol ; 4,0 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25 °C pendant 2 h. Le mélange a été dilué par 2 avec du DMF et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 22,6 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (33) (6,0 mg ; 46%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 10,82 (s ; 2H) ; 10,06 – 9,91 (m ; 1H) ; 8,57 – 8,44 (m ; 2H) ; 8,18 – 8,03 (m ; ; 2H) ; 8,00 (s ; 4H) ; 7,93 (d ; J = 1,9 Hz ; 2H) ; 7,92 – 7,76 (m ; 2H) ; 7,70 – 7,53 (m ; 3H) ; 7,39 – 7,21 (m ; 7H) ; 7,21 – 7,10 (m ; 1H) ; 6,01 – 5,92 (m ; 1H); 5,61 – 5,22 (m ; 6H); 5,15 – 4,96 (m ; 3H); 4,79 (s ; 8H); 4,54 – 4,45 (m ; 2H); 4,45 – 4,33 (m ; 3H); 4,30 – 4,15 (m ; 3H); 4,12 – 3,89 (m ; 4H); 3,26 – 2,91 (m ; 9H); 2,91 – 2,80 (m ; 4H); 2,23 – 2,06 (m ; 1H); 2,05 – 1,88 (m ; 1H); 1,86 – 1,63 (m ; 2H); 1,53 (s ; 4H); 1,38 – 1,18 (m ; 3H); 1,08 – 0,93 (m ; 9H); 0,92 – 0,68 (m ; 27H). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C87H121Br4N15O16 [M] : 1947,5849 ; observée 1947,5891. Exemple 24 : 2-(2-(2-(2-(4-(méthyltétrazinylphénoxy)éthoxy)éthoxy)éthoxy)- éthyl)carbamoylpropane-1,3-diyl(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamide) (34)
Figure imgf000077_0001
Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoïque (17) (11,5 mg ; 0,016 mmol ; 2,2 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (1,1 mL) puis la EEDQ (32,5 mg ; 0,131 mmol ; 17,5 éq) a été ajoutée. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 30 min. Une solution de 4- méthyltétrazinylphénoxy-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-amine (3,0 mg ; 0,008 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (1 mL) en présence de DIPEA anhydre (13,1 µL ; 0,075 mmol ; 10,0 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 24,85 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (34) (4,4 mg ; 54%) sous la forme d’un lyophilisat rose. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,44 (d ; J = 9,0 Hz, 2H5,6) ; 7,83 (s ; 4H25,26,35,36) ; 7,11 (d ; J = 9,0 Hz ; 2H7,8) ; 4,63 (s ; 8H29,30,39,40) ; 4,21 (m ; 2H10) ; 3,64 (m ; 2H11) ; 3,38-3,67 (m ; 21H12,13,14,15,16,17,20,21,31) ; 3,01 (s, 3H1). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C37H44Br4N9O7 [M+H]+ : 1042,0088 ; observé 1042,0090. Exemple 25 : 1-trans-cyclooctènyl-1-oxo-5,8,11,14-tétraoxa-2- azahetaptadécan-17-amide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (35)
Figure imgf000078_0001
L’acide 1-trans-cyclooctènyl-1-oxo-5,8,11,14-tétraoxa-2-azahetaptadécan-17-oïque (5,5 mg ; 0,013 mmol ; 1,6 éq) a été dissous dans du DMF anhydre (200 µL). Le milieu réactionnel a été refroidi à 0 °C, puis le HATU (12,7 mg ; 0,033 mmol ; 4,1 éq) et la 2,6- lutidine (5,6 µL ; 0,049 mmol ; 5,2 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à 0 °C pendant 15 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (10,0 mg ; 0,008 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF anhydre (200 µL), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel a été placé sous agitation, sous argon à TA pendant 16 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 23,51 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (35) (11,1 mg ; 95%) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,61 (d ; 2H) ; 7,21-7,40 (m ; 10H) ; 5,34-5,55 (m ; 6H) ; 5,16-5,18 (m ; 2H) ; 4,49-4,55 (m ; 6H) ; 4,17-4,26 (m ; 6H) ; 3,73-3,77 (m ; 4H) ; 3,49- 3,55 (m ; 4H) ; 3,08-3,11 (m ; 3H) ; 2,92-2,95 (m ; 5H) ; 2,46-2,57 (m ; 5H) ; 2,32-2,35 (m ; 3H) ; 1,67-2,28 (m ; 21H) ; 1,34-1,59 (m ; 6H) ; 1,17-1,29 (m ; 6H) ; 1,13-1,16 (m ; 8H) ; 0,85-0,97 (m ; 25H) SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C78H127N11O19 [M] : 1521,9310 ; observée 1521,9261. Exemple 26 : conjugué trastuzumab – composé (34) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (34) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 29 ci-dessous. Tableau 29
Figure imgf000080_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LHHL et de 0,77 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 30 ci-dessous. Tableau 30
Figure imgf000080_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 61% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,02. Exemple 27 : conjugué trastuzumab – composé (34) – composé (35) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (34) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (35) (2ème composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 31 ci-dessous. Tableau 31
Figure imgf000081_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. L’incrément de masse est correct. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 32 ci-dessous. Tableau 32
Figure imgf000081_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 58% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,07. Exemple 28 : conjugué trastuzumab – composé (34) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (34) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 33 ci-dessous. Tableau 33
Figure imgf000082_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 34 ci-dessous. Tableau 34
Figure imgf000082_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 66% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 29 : conjugué trastuzumab – composé (34) – composé (35) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (34) (1er composé) (8,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (35) (2ème composé) (8,8 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 35 ci-dessous. Tableau 35
Figure imgf000083_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 36 ci-dessous. Tableau 36
Figure imgf000083_0003
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 69% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 30 : 2-(2-(2-(trans-cyclooctènylcarbamoyl)éthoxy)éthoxy) éthyl)carbamoylpropane-1,3-diyl(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamide) (36)
Figure imgf000083_0001
Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoïque (17) (14,7 mg ; 0,021mmol ; 2,2 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (1,4 mL) puis la EEDQ (39,2 mg ; 0,159 mmol ; 16,4 éq) a été ajoutée. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 30 min. Une solution de trans- cyclooctènyl(2-(2-(2-aminoéthoxy)éthoxy)éthyl)carbamate (2,9 mg ; 0,010 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (1,25 mL) en présence de DIPEA anhydre (17,0 µL ; 0,098 mmol ; 10,1 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 37,49 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (36) (5,1 mg ; 54%) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,83 (s ; 4H24,25,34,35) ; 5,35-5,60 (m ; 2H7,8) ; 4,6 (s ; 8H28,29,38,39) ; 4,23 (m ; 1H4) ; 3,14-3,65 (m ; 17H11,12,13,14,15,16,19,20,30) ; 1,44-1,92 (m, 10H1,2,3,5,6). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C35H47Br4N6O7 [M+H]+ : 979,0234 ; observé 979,0229. Exemple 31 : 4-méthyletéatrazinylphénoxy-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15- amide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (37)
Figure imgf000084_0001
L’acide 4-méthyletéatrazinylphénoxy-3,6,9,12-tétraoxapentadécan-15-oïque (4,5 mg ; 0,011 mmol ; 1,3 éq) a été dissous dans le DMF anhydre (200 µL). Le milieu réactionnel a été refroidi à 0 °C, puis le HATU (12,2 mg ; 0,032 mmol ; 3,9 éq) et la 2,6-lutidine (5,6 µL ; 0,049 mmol ; 6,0 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à 0 °C pendant 15 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE (10,1 mg ; 0,008 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF anhydre (200 µL), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel a été placé sous agitation, sous argon à TA pendant 16 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 23,21 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (37) (7,1 mg ; 56%) sous la forme d’un lyophilisat rose. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,51 (d ; 2H) ; 7,61 (d ; 2H) ; 7,31-7,39 (m ; 7H) ; 7,18 (d ; 2H) ; 4,20-4,28 (m ; 6H) ; 3,90 (m, 2H) ; 3,56-3,74 (m ; 17H) ; 2,93-2,96 (m ; 4H) ; 2,47-2,55 (m ; 7H) ; 1,60-2,23 (m ; 18H) ; 1,50-1,60 (m ; 4H) ; 1,31-1,42 (m ; 10H) ; 1,12-1,19 (m ; 7H) ; 0,88-0,99 (m ; 32H) SMHR (ESI) : m/z calculé pour C78H122N14O18 [M+2H]2+ : 771,4525 ; observé 771,4524. Exemple 32 : conjugué trastuzumab – composé (36) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (36) (3,0 éq) à une concentration de 0,25 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 37 ci-dessous. Tableau 37
Figure imgf000085_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,18 pour l’espèce LHHL et 1,0 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 38 ci-dessous. Tableau 38
Figure imgf000086_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 66% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,23. Exemple 33 : conjugué trastuzumab – composé (36) – composé (37) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (36) (1er composé) (3,0 éq) à une concentration de 0,25 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (37) (2ème composé) (3,3 éq) à une concentration de 10mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 39 ci-dessous. Tableau 39
Figure imgf000086_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,20 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 40 ci-dessous. Tableau 40
Figure imgf000087_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,32. Exemple 34 : conjugué panitumumab – composé (36) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, panitumumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (10,6 éq), composé (36) (18,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 41 ci-dessous. Tableau 41
Figure imgf000087_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 0,98 pour l’espèce LHHL et de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 42 ci-dessous. Tableau 42
Figure imgf000088_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 61% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,01. Exemple 35 : conjugué trastuzumab – composé (36) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (36) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 30% de DMF et 70% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 43 ci-dessous. Tableau 43
Figure imgf000088_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 44 ci-dessous. Tableau 44
Figure imgf000089_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 60% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 36 : conjugué trastuzumab – composé (36) – composé (37) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (36) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 30% de DMF et 70% de MeOH, composé (37) (2ème composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 4. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 45 ci-dessous. Tableau 45
Figure imgf000089_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 46 ci-dessous. Tableau 46
Figure imgf000090_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 62% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 37 : 4‐ {2 ‐ azatricyclo[10.4.0.04,9]hexadeca‐ 1(12),4(9),5,7,13,15 ‐ hexaen‐ 10 ‐ yn ‐ 2 ‐ yl} ‐ N ‐ (2 ‐ {2 ‐ [2 ‐ (3 ‐ {[2,6 ‐ bis(bromométhyl)pyridin ‐ 4 ‐ yl]formamido}‐ 2 ‐ ({[2,6 ‐ bis(bromométhyl)pyridin ‐ 4 ‐ yl]formamido}méthyl) - propanamido)éthoxy]éthoxy}éthyl) ‐ 4 ‐ oxobutanamide (38)
Figure imgf000090_0001
Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoïque (17) (17,7 mg ; 0,025 mmol ; 2,1 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (1,69 mL) puis la EEDQ (48,2 mg ; 0,195 mmol ; 16,5 éq) a été ajoutée. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 30 min. Une solution de N‐ {2‐ [2 ‐ (2 ‐ aminoéthoxy)éthoxy]éthyl} ‐ 4 ‐ {2 ‐ azatricyclo[10.4.0.04,9]hexadéca ‐ 1(12),4(9),5,7,13,15 ‐ hexaen ‐ 10 ‐ yn ‐ 2 ‐ yl} ‐ 4 ‐ oxobutanamide (6,5 mg ; 0,012 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (1,43 mL) en présence de DIPEA anhydre (20,8 µL ; 0,119 mmol ; 10,1 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 34,84 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (38) (5,1 mg ; 36%) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,83 (t ; J = 5,7 Hz ; 1H) ; 8,12 (t ; J = 5,5 Hz ; 1H) ; 7,81 (s ; 4H) ; 7,65-7,52 (m ; 2H) ; 7,48-7,40 (m ; 2H) ; 7,35-7,18 (m ; 3H) ; 5,10 (d ; J = 14,0 Hz ; 1H) ; 4,63 (s ; 8H) ; 3,68 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H) ; 3,64-3,56 (m ; 4H) ; 3,54- 3,42 (m, 4H) ; 3,43-3,33 (m ; 6H) ; 3,18 (m ; 2H) ; 3,02 (p ; J = 6,0 Hz ; 1H) ; 2,68 (dt, J = 16,2 et 7,4 Hz ; 1H) ; 2,43-2,28 (m ; 1H) ; 2,25-2,11 (m ; 1H) ; 2,06-1,91 (m ; 1H). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C45H48Br4N7O7 [M+H]+ : 1114,0343 ; observé 1114,0351. Exemple 38 : conjugué trastuzumab – composé (38) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (38) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 47 ci-dessous. Tableau 47
Figure imgf000091_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,07 pour l’espèce LHHL. Les espèces LHH, HH, LH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 48 ci-dessous. Tableau 48
Figure imgf000092_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 93% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,07. Exemple 39 : conjugué trastuzumab – composé (38) – composé (22) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (38) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (22) (2ème composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 49 ci-dessous. Tableau 49
Figure imgf000092_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 50 ci-dessous. Tableau 50
Figure imgf000093_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 77% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,00. Exemple 40 : conjugué trastuzumab – composé (38) – composé commercial AF488 Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (38) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé commercial (AF488, commercialisé par la société ThermoFisher Scientific) (2ème composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Figure imgf000093_0001
Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 51 ci-dessous. Tableau 51
Figure imgf000094_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,27 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 52 ci-dessous. Tableau 52
Figure imgf000094_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 94% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,28. Exemple 41 : conjugué trastuzumab – composé (38) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (38) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 53 ci-dessous. Tableau 53
Figure imgf000095_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 54 ci-dessous. Tableau 54
Figure imgf000095_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 84% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 42 : conjugué trastuzumab – composé (38) – composé (22) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (38) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (22) (2ème composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 55 ci-dessous. Tableau 55
Figure imgf000096_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 56 ci-dessous. Tableau 56
Figure imgf000096_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 84% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 43 : N,N'-(2-((2-(2-(2-(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthoxy)éthyl)- carbamoyl)propane-1,3-diyl)bis(2,6-bis(bromomethyl)isonicotinamide) (39)
Figure imgf000097_0001
( ) Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoïque (17) (15,6 mg ; 0,022 mmol ; 1,5 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (800 µL) puis la EEDQ (33,6 mg ; 0,136 mmol ; 9,3 éq) a été ajoutée. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 30 min. Une solution de 2-(2- (2-(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthoxy)éthan-1-amine (3,2 mg ; 0,015 mmol ; 1,0 éq), solubilisée dans du DMF anhydre (500 µL) en présence de DIPEA anhydre (20,0 µL ; 0,115 mmol ; 7,8 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 26,18 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (39) (3,9 mg ; 30 %) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,86 (s ; 4H14,17,23,24) ; 4,97 (s ; 8H18,19,26,28) ; 3,58-3,72 (m ; 16H1,2,3,4,5,6,7,8) ; 3,43 (m ; 2H11,20) ; 3,03 (m ; 1H10). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C28H37Br4N8O6 [M+H]+ : 896,9564 ; observé 896,9546. Exemple 44 : (4‐ {2 ‐ [2 ‐ (6 ‐ {2 ‐ azatricyclo[10.4.0.04,9]hexadéca‐ 1(12),4(9),5,7,13,15‐ hexaen ‐ 10 ‐ yn ‐ 2 ‐ yl} ‐ 6 ‐ oxohexanamido) ‐ 3 ‐ méthylbutanamido]‐ 5 ‐ (carbamoylamino)pentanamido}ph ényl)méthyl N‐ {1 ‐ [(1‐ {[1 ‐ (2 ‐ {2 ‐ [(1 ‐ hydroxy ‐ 1 ‐ ph énylpropan‐ 2 ‐ yl)carbamoyl] ‐ 1 ‐ m éthoxy‐ 2 ‐ méthyléthyl}pyrrolidin‐ 1 ‐ yl) ‐ 3 ‐ m éthoxy‐ 5 ‐ m éthyl‐ 1 ‐ oxohepta n‐ 4 ‐ yl](méthyl)carbamoyl}‐ 2 ‐ m éthylpropyl)carbamoyl]‐ 2 ‐ m éthylpropyl}‐N‐ méthylcarbamate (40)
Figure imgf000098_0001
( ) L’acide 6‐ {2 ‐ azatricyclo[10.4.0.04,9]hexadéca‐ 1(12),4(9),5,7,13,15 ‐ hexaen ‐ 10 ‐ yn ‐ 2 ‐ yl} ‐ 6‐ oxohexano ïque (2,0 mg ; 0,006 mmol ; 1,5 éq) a été dissous dans le DMF anhydre (100 µL). Le milieu réactionnel a été agité à TA, et HATU (3,0 mg ; 0,008 mmol ; 2,0 éq) et la 2,6-lutidine (1,2 µL ; 0,010 mmol ; 2,5 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à 21 °C pendant 10 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (5,0 mg ; 0,004 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF anhydre (100 µL), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel a été placé sous agitation, sous argon à TA pendant 1 h 30. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 25,30 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 16 min puis 100% de B sur 4 min à 17,1 mL/min) pour donner (40) (3,3 mg ; 57%) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 9,14 (s ; 1H) ; 7,61 (m ; 3H) ; 7,39-7,50 (m ; 12H) ; 6,26- 6,65 (m ; 2H) ; 4,85-4,95 (m ; 4H) ; 4,63-4,85 (m ; 2H) ; 4,15 (s ; 1H) ; 3,99 (s ; 3H) ; 3,83 (s ; 1H) ; 3,64-3,71 (m ; 2H) ; 3,39 (m ; 7H) ; 2,75-3,30 (m ; 16H) ; 2,17 (m ; 2H) ; 2,04 (m ; 3H) ; 1,49-2,02 (m ; 13H) ; 1,35 (s ; 4H) ; 1,24 (m ; 5H) ; 0,77-1,22 (m ; 32H). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C79H112N11O14 [M+H]+ : 1438,8335 ; observée 1438,8330. Exemple 45 : conjugué trastuzumab – composé (39) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé (39) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 57 ci-dessous. Tableau 57
Figure imgf000099_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 58 ci-dessous. Tableau 58
Figure imgf000099_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 66% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 46 : conjugué trastuzumab – composé (39) – composé (40) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (39) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (40) (2ème composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 4 Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 59 ci-dessous. Tableau 59
Figure imgf000100_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé 3 : composé intermédiaire trastuzumab – composé (39) non clické avec le composé (40) L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,81 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 60 ci-dessous. Tableau 60
Figure imgf000100_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,84. Exemple 47 : bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylméthyl (4-((2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)methyl)-1-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4- yl)-1,5-dioxo-9,12,15,18-tétraoxa-2,6-diazaicosan-20-yl)carbamate (41)
Figure imgf000101_0001
Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoïque (17) (8,3 mg ; 0,012 mmol ; 1,6 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (1,4 mL) puis la EEDQ (30,3 mg ; 0,123 mmol ; 17,0 éq) a été ajoutée. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 30 min. Une solution de bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl (14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradecyl)carbamate (3,8 mg ; 0,007 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (1 mL) en présence de DIPEA anhydre (15,0 µL ; 0,086 mmol ; 11,9 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 22,64 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (41) (3,2 mg ; 68%) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,87 (s ; 4H27,29,36,38) ; 4,67 (s ; 8H31,32,40,41) ; 4,13 (d ; J = 8,1Hz ; 1H1) ; 3,50-3,68 (m ; 25H12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,23,24,33) ; 2,02-2,25 (m ; 8H4,5,6,7) ; 1,3-1,35 (m ; 3H1,2,3). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C41H55Br4N6O9 [M+H]+ : 1091,0759 ; observé 1091,0758. Exemple 48 : conjugué trastuzumab – composé (41) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (41) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 61 ci-dessous. Tableau 61
Figure imgf000102_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,05 pour l’espèce LHHL et de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 62 ci-dessous. Tableau 62
Figure imgf000102_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 87% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,05. Exemple 49 : conjugué trastuzumab – composé (41) – composé (22) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (41) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (22) (2ème composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 63 ci-dessous. Tableau 63
Figure imgf000103_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé 3 : composé intermédiaire trastuzumab – composé (41) non clické avec le composé (22) L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,16 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 0,49 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 64 ci-dessous. Tableau 64
Figure imgf000103_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 70% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,07. Exemple 50 : conjugué trastuzumab – composé (41) – composé commercial AF488 Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (41) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé commercial (AF488) (2ème composé) (11,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Figure imgf000104_0001
( ) Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 65 ci-dessous. Tableau 65
Figure imgf000104_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,26 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 0,86 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 66 ci-dessous. Tableau 66
Figure imgf000105_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 69% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,30. Exemple 51 : conjugué trastuzumab – composé (41) – composé commercial N3-Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanintine Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (41) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé commercial (N3-Cap-Val-Cit- PAB-C6-amanintine, obtenu auprès de la société Levena Biopharma) (2ème composé) (12,7 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Figure imgf000105_0001
(N3-Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanintine) Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 67 ci-dessous. Tableau 67
Figure imgf000105_0003
Figure imgf000106_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,39 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 0,95 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 68 ci-dessous. Tableau 68
Figure imgf000106_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 72% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,44. Exemple 52 : conjugué trastuzumab – composé (41) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (41) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 69 ci-dessous. Tableau 69
Figure imgf000106_0003
Figure imgf000107_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observée. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 70 ci-dessous. Tableau 70
Figure imgf000107_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 62% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 53 : conjugué trastuzumab – composé (41) – composé (22) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (41) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (22) (2ème composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 4. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 71 ci-dessous. Tableau 71
Figure imgf000107_0003
Figure imgf000108_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 72 ci-dessous. Tableau 72
Figure imgf000108_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 56% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 54 : conjugué trastuzumab – composé (41) – composé commercial AF488 Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (41) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (AF488) (2ème composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Figure imgf000109_0001
Méthode Réaction de bioconjugaison 4. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 73 ci-dessous. Tableau 73
Figure imgf000109_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 74 ci-dessous. Tableau 74
Figure imgf000110_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 55% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 55 : conjugué trastuzumab – composé (41) – composé commercial N3-Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanintine Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (41) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé commercial (N3-Cap- Val-Cit-PAB-C6-amanintine) (2ème composé) (13,2 éq) à une concentration de 10 mM dans du DMSO.
Figure imgf000110_0001
(N3-Cap-Val-Cit-PAB-C6-amanintine) Méthode Réaction de bioconjugaison 4. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 75 ci-dessous. Tableau 75
Figure imgf000110_0003
Figure imgf000111_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 76 ci-dessous. Tableau 76
Figure imgf000111_0003
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 52% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 56 : 2-amino-3-sulfopropanamido-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE, sel de TFA (42)
Figure imgf000111_0001
( ) L’acide 2-({[(9H-fluorén-9-yl)méthoxy]carbonyl}amino)-3-sulfopropanoïque (4,9 mg ; 0,013 mmol ; 1,6 éq) a été dissous dans le DMF anhydre (200 µL). Le milieu réactionnel a été refroidi à 0 °C, puis le HATU (15,2 mg ; 0,040 mmol ; 5,0 éq) et la 2,6-lutidine (5,6 µL ; 0,049 mmol ; 6,0 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à 0 °C pendant 5 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE (10,0 mg ; 0,008 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF anhydre (200 µL), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel a été placé sous agitation, sous argon à TA pendant 15 h 40. La pipéridine (80 µL, 20% v/v) a été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 2 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 13,07 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (42) (4,7 mg ; 42%) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 9,86 (s ; 1H) ; 8,76 (d ; J = 8,2 Hz ; 1H) ; 8,24 (d ; J = 7,6 Hz ; 1H) ; 8,18 – 8,06 (m ; 3H) ; 7,90 (d ; J = 8,9 Hz ; 1H) ; 7,72 – 7,54 (m ; 3H) ; 7,35 – 7,21 (m ; 7H) ; 7,22 – 7,11 (m ; 1H) ; 6,03 – 5,87 (m ; 1H) ; 5,54 – 5,35 (m ; 1H) ; 5,14 – 4,93 (m ; 2H) ; 4,46 (dd ; J = 16,1 ; 6,1 Hz ; 1H) ; 4,39 – 4,14 (m ; 3H) ; 4,11 – 3,91 (m ; 2H) ; 3,24 (d ; J = 4,8 Hz ; 7H) ; 3,19 (d ; J = 7,8 Hz ; 5H) ; 3,12 (s ; 2H) ; 3,10 – 2,92 (m ; 6H) ; 2,91 – 2,82 (m ; 4H) ; 2,46 – 2,42 (m ; 6H) ; 2,16 – 2,03 (m ; 2H) ; 1,09 – 0,94 (m ; 8H) ; 0,95 – 0,68 (m ; 30H). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C61H100N11O16S [M+H]+ : 1274,7065 ; observé 1274,7064. Exemple 57 : 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6 bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propanamido)-3-sulfopropanamido- valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (43)
Figure imgf000112_0001
Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoïque (17) (4,5 mg ; 0,0064 mmol ; 1,9 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (371 µL) puis la EEDQ (12,6 mg ; 0,051 mmol ; 15,0 éq) a été ajoutée. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 40 min. Une solution de (42) (4,7 mg ; 0,0034 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (68 µL) en présence de DIPEA anhydre (5,9 µL ; 0,034 mmol ; 10,0 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à 25 °C pendant 3 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 31,11 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 30 à 80% de B sur 49 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (43) (4,1 mg ; 62%) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,88 – 7,84 (m ; 2H) ; 7,81 (d ; J = 1,5 Hz ; 2H) ; 7,57 (d ; J = 8,0 Hz ; 2H) ; 7,41 – 7,35 (m ; 2H) ; 7,35 – 7,25 (m ; 2H) ; 7,25 – 7,12 (m ; 3H) ; 5,14 – 4,94 (m ; 5H) ; 4,65 (s ; 8H) ; 4,62 – 4,49 (m ; 5H) ; 4,32 (t ; J = 7,4 Hz ; 1H) ; 4,28 – 4,11 (m ; 4H) ; 4,11 – 3,80 (m ; 1H) ; 3,79 – 3,59 (m ; 5H) ; 3,45 – 3,37 (m ; 4H) ; 3,34 (d ; J = 1,2 Hz ; 8H) ; 3,26 (s ; 2H) ; 3,25 – 3,16 (m ; 2H) ; 3,12 – 3,01 (m ; 2H) ; 3,00 – 2,84 (m ; 3H) ; 2,58 – 2,40 (m ; 2H) ; 2,34 – 2,09 (m ; 2H) ; 2,07 – 1,74 (m ; 3H) ; 1,74 – 1,51 (m ; 1H) ; 1,49 – 1,23 (m ; 10H) ; 1,22 – 1,07 (m ; 7H) ; 1,07 – 0,71 (m ; 30H). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C81H118Br4N15O19S [M+H]+ : 1952,5177 ; observé 1952,5090. Exemple 58 : conjugué trastuzumab – composé (43) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (43) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 77 ci-dessous. Tableau 77
Figure imgf000113_0001
Figure imgf000114_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LHHL et de 0,61 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 78 ci-dessous. Tableau 78
Figure imgf000114_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 60% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,02. Exemple 59 : conjugué trastuzumab – composé (43) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (43) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 79 ci-dessous. Tableau 79
Figure imgf000114_0003
Figure imgf000115_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 80 ci-dessous. Tableau 80
Figure imgf000115_0003
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 54% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 60 : 3-[2‐(2‐aminoéthoxy)éthoxy]-propanamido-valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE amine, sel de TFA (44)
Figure imgf000115_0001
L’acide 1-(9H-fluorén-9-yl)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4-azatridecan-13-oïque (4,0 mg ; 0,010 mmol ; 1,2 éq) a été dissous dans le DMF anhydre (200 µL). Le milieu réactionnel a été refroidi à 0 °C, puis le HATU (12,5 mg ; 0,033 mmol ; 4,0 éq) et la 2,6-lutidine (5,6 µL ; 0,049 mmol ; 5,8 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à 0 °C pendant 15 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE (10,3 mg ; 0,008 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF anhydre (200 µL), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel a été placé sous agitation, sous argon à TA pendant 16 h. La pipéridine (80 µL, 20% v/v) a été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 10 min. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 18,24 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (44) (4,8 mg ; 45%) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 8,29 (m ; 1H) ; 7,99-8,05 (m ; 2H) ; 7,61 (m ; 2H) ; 7,28- 7,41 (m ; 7H) ; 5,36 (m ; 1H) ; 4,53 (m ; 1H) ; 4,22 (m ; 4H) ; 3,78 (m ; 2H) ; 3,65 (m ; 3H) ; 2,94 (m ; 4H) ; 2,47-2,59 (m, 5H) ; 2,21 (m ; 3H) ; 1,59-2,18 (m ; 11H) ; 1,41-1,59 (m ; 4H) ; 1,34 (s ; 17) ; 1,02 (m ; 7H) ; 0,80-1,01 (m ; 34H). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C65H109N11O15 [M+2H]2+ : 641,9047 ; observé 641,9046. Exemple 61 : 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6 bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propanamido)-3-(2-(2- aminoéthoxy)éthoxy)propanamido-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (45)
Figure imgf000116_0001
( ) Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoïque (17) (2,8 mg ; 0,004 mmol ; 2,2 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (421 µL) puis la EEDQ (7,7 mg ; 0,031 mmol ; 17,5 éq) a été ajoutée. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 30 min. Une solution de (44) (2,5 mg ; 0,002 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (360 µL) en présence de DIPEA anhydre (3,1 µL ; 0,018 mmol ; 10,0 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 32,59 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (45) (2,3 mg ; 65%) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 9,83 (s ; 1H) ; 8,90 (m ; 2H) ; 8,33 (m ; 1H) ; 7,78-7,84 (m ; 8H) ; 7,69-7,84 (m ; 3H) ; 7,41-7,68 (m ; 6H) ; 7,20-7,31 (m ; 1H) ; 5,02-5,27 (m ; 4H) ; 4,53 (s ; 2H) ; 4,26 (m ; 5H) ; 3,89 (m ; 1H) ; 3,62-3,86 (m ; 10H) ; 3,10 (m ; 5H) ; 2,93 (m ; 4H) ; 2,51 (m ; 4H) ; 2,24-2,47 (m ; 3H) ; 2,07 (s ; 3H) ; 1,94-2,05 (m ; 7H) ; 1,60 (m ; 5H) ; 1,31 (m ; 11H) ; 1,08-1,25 (m ; 8H) ; 0,71-1,06 (m ; 32H). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C90H127Br4N13O16 [M+2H]2+ : 980,8123 ; observé 980,8108. Exemple 62 : 3-amino-N,N'-bis(2-{2-[2-(2-azidoéthoxy)- éthoxy]éthoxy}éthyl)pentanediamide (46)
Figure imgf000117_0001
L’ acide 3‐ ({[(9 H‐ fluorén ‐ 9 ‐ yl)méthoxy]carbonyl}amino)pentanedio ïque (10,0 mg ; 0,027 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le DMF peptidique (200 µL). Le milieu réactionnel a été refroidi à 0 °C, puis une solution de HATU (30,9 mg ; 0,081 mmol ; 3,0 éq) et de 2,6- lutidine (18,8 µL ; 0,162 mmol ; 6,0 éq), solubilisée dans le DMF peptidique (150 µL), a été ajoutée. La solution d’activation a été agitée sous argon à 0°C pendant 10 min. Une solution de 2-(2-(2-(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthoxy)éthan-1-amine (15,4 mg ; 0,070 mmol ; 2,6 éq), solubilisé dans le DMF anhydre (100 µL), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel a été placé sous agitation, sous argon à TA pendant 3 h 40. La pipéridine (90 µL, 20% v/v) a été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 16 h. Le mélange a été évaporé à sec puis le résidu a été repris dans le DMF peptidique (3 mL) et directement purifié par chromatographie liquide haute pression semi- préparative (tR = 25,47 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV), SEDEX FP SAGA (détecteur DEDL)] détection UV à 254 nm à 25 °C et DEDL à 60 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec de l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 10% de B sur 20 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (46) (6,2 mg ; 42%) sous la forme d’une huile incolore. RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ 8,01 (t ; J = 5,5 Hz ; 2H) ; 3,65 – 3,56 (m ; 5H) ; 3,56 – 3,47 (m ; 19H) ; 3,24 – 3,16 (m ; 8H) ; 2,94 – 2,87 (m ; 1H) ; 2,23 – 2,00 (m ; 4H). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C21H42N9O8 [M+H]+ : 548,3151 ; observé 548,3147. Exemple 63 : N1,N5-bis(2-(2-(2-(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthoxy)éthyl)-3-(3- (2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propanamido)pentanediamide (47)
Figure imgf000118_0001
( ) Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6- bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)- propanoïque (17) (16,3 mg ; 0,023 mmol ; 1,6 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (400 µL) puis la EEDQ (6,2 mg ; 0,025 mmol ; 1,7 éq) a été ajoutée. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 45 min. Une solution de (46) (8,0 mg ; 0,0146 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (100 µL) en présence de DIPEA anhydre (11,8 µL ; 0,068 mmol ; 4,7 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 18,38 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec de l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 78% de B sur 22 min puis 78% de B sur 8 min, puis 78 à 100% de B sur 3 min, puis 100% de B sur 4 min à 17,1 mL/min) pour donner (47) (2,3 mg ; 13%) sous la forme d’un film incolore. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,88 (s ; 4H) ; 4,65 (s ; 8H) ; 4,59 (m ; 4H) ; 3,74 – 3,53 (m ; 30H) ; 3,49 (t ; J = 5,4 Hz ; 4H) ; 3,39 – 3,34 (m ; 4H) ; 2,91 (m ; 1H) ; 2,54 – 2,33 (m ; 4H). SMHR (ESI) : m/z calculé pour C41H60Br4N13O11 [M+H]+ : 1226,1263 ; observé 1226,1262. Exemple 64 : conjugué trastuzumab – composé (47) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé (47) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 81 ci-dessous. Tableau 81
Figure imgf000119_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,87 pour l’espèce LHHL et de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 82 ci-dessous. Tableau 82
Figure imgf000119_0002
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 55% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,92. Exemple 65 : conjugué trastuzumab – composé (47) – composé (40) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé (47) (1er composé) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (40) (2ème composé) (30,0 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 4. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé (47) est ajustée à 1,4 mg/mL avant l’ajout du composé (40) et le milieu réactionnel a été agité pendant 22 h. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 83 ci-dessous. Tableau 83
Figure imgf000120_0001
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé 3 : N.D. : impureté de structure non déterminée L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,70 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 0,90 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 84 ci-dessous. Tableau 84
Figure imgf000121_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 56% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,74. Exemple 66 : conjugué trastuzumab – composé (47) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), composé (47) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 85 ci-dessous. Tableau 85
Figure imgf000121_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,13 pour l’espèce LHHL et de 0,85 pour l’espèce LH. Les espèces HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 86 ci-dessous. Tableau 86
Figure imgf000122_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,16. Exemple 67 : conjugué trastuzumab – composé (47) – composé (40) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (47) (1er composé) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (40) (2ème composé) (15,0 éq) à une concentration de 1 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4, la concentration du conjugué intermédiaire trastuzumab-composé (47) est ajustée à 1,5 mg/mL avant l’ajout du composé (40) et le milieu réactionnel a été agité pendant 22 h. Analyse SMHR dénaturante selon la méthode 2 Les résultats sont présentés dans le Tableau 87 ci-dessous. Tableau 87
Figure imgf000122_0002
1 : masse moléculaire de l’espèce non déglycosylée 2 : non observé 3 : N.D. : impureté de structure non déterminée L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,02 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 0,80 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices et réductrices Les résultats sont présentés dans le Tableau 88 ci-dessous. Tableau 88
Figure imgf000123_0001
1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 63% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,07.

Claims

REVENDICATIONS 1. Composé de formule (I) :
Figure imgf000124_0001
dans laquelle : - chaque A est le résidu d’un phényle ou d’un pyridyle ; - chaque X est un groupe partant ; - chaque Y est une liaison directe, -CH2-, -O-, -S-, -CO-, -NH- ou -C(=NR1)- ; - X1 est choisi parmi :
Figure imgf000124_0002
- chaque Z est indépendamment une liaison directe, -CH2-, -O-, -S-, -CO-, -NH- ou -C(=NR1)- ; - W est -ORa, -COR2, -CONR3R4 ou -NR3COR4 ; - Ra est -(C1-C6)alkyle, -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -CORb, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -(CH2CH2O)q- (CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ; - Rb est -(C1-C6)alkyle, -(C1-C6)alcoxy, -(CH2CH2O)qR5, -O(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -O(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5 ; - R1 est -H, -OH ou -(C1-C6)alkyle ; - R2 est -OH, -(C1-C6)alkyle, -(C1-C6)alcoxy, -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -O(CH2CH2O)qR5, -O(CRcRd)rR5, -O(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -O(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5 ou -O(CH2CH2O)q-(CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5; - R3 est -H ou -(C1-C6)alkyle ou –(CH2)u-SO3H ; - R4 est -H, -(C1-C6)alkyle, -(CH2CH2O)qR5, -(CRcRd)rR5, -(CRcRd)r-NHCO-(CH2CH2O)q-R5, -(CRcRd)r-CONH-(CH2CH2O)q-R5, -(CH2CH2O)q-(CH2)r-NHCO-(CRcRd)r-R5, -(CH2CH2O)q- (CH2)r-CONH-(CRcRd)r-R5, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r- NHCO-(CRcRd)r-(OCH2CH2)q-R5]2, -CH-[(CRcRd)r-CONH-(CRcRd)r-R5]2, ou -CH-[(CRcRd)r- NHCO-(CRcRd)r-R5]2 ; - R5 est -(CH2)sR6 ou -(CH2)sR7 ; - R6 est -COOR8, -COSR8, -CONR8R9 ou -NR8COR9 ; - R7 est choisi parmi :
Figure imgf000125_0001
- Rc est -H ; - chaque Rd est -H ou -SO3H ou -CH2-SO3H ; - R8 est -H ou -(C1-C6)alkyle ; - R9 est -H ou -(C1-C6)alkyle ; -
Figure imgf000126_0001
est un -(C3-C6)cycloalkyle, un -(C6-C10)aryle ou un hétérocycle saturé, insaturé ou partiellement insaturé, ayant de 5 à 15 chaînons et comprenant de 1 à 4 hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre ; - m, n et p sont chacun indépendamment l’un de l’autre un entier allant de 0 à 8 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 24 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 8 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 6 ; - chaque u est un entier allant de 1 à 6 ; à l’exception des composés suivants : acide 2,6-bis[2,6-bis(bromométhyl)phényl]benzoïque, et 1,3-bis[[3,5-bis(bromométhyl)phénoxy]méthyl]-5-prop-2-ynoxy-benzène.
2. Composé selon la revendication 1, dans lequel chaque X est un halogène, un tosylate ou un mésylate, de préférence chaque X est un halogène.
3. Composé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel chaque X est Br.
4. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel chaque A est le résidu d’un pyridyle.
5. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel chaque Y est choisi parmi une liaison directe, -CO- et -NH-.
6. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l’un des groupes Y et Z est -CO- et l’autre est -NH-.
7. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel X1 est
Figure imgf000126_0002
- W est -COR2 ou -CONR3R4 ; - Z est -CO- ou -NH- ; - R2 est -OH ou -(C1-C6)alcoxy ; - R4 est –H, -(C1-C6)alkyle, -(CH2CH2O)q-R5, ou -(CRcRd)rR5 ; - R5 est -(CH2)sR6 ou -(CH2)sR7 ; - R6 est -COOR8, -CONR8R9 ou -NR8COR9 ; - R7 est choisi parmi :
Figure imgf000127_0001
; - Rc, Rd, R3, R8 et R9 sont tels que définis à la revendication 1 ; - m et n sont chacun indépendamment l’un de l’autre un entier allant de 0 à 3 ; - p est égal à 0, 1 ou 2 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 6 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 4.
8. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel X1 est un groupe :
Figure imgf000128_0001
Figure imgf000129_0001
- W est -COR2 ou -CONR3R4 ; - Z est -CO- ou -NH- ; - R2 est -OH ou -(C1-C6)alcoxy ; - R3 est -H ou -(C1-C6)alkyle ; - R4 est -H, -(C1-C6)alkyle, -(CRcRd)rR5, ou -(CH2CH2O)qR5 ; - R5 est -(CH2)sR6 ou -(CH2)sR7 ; - R6 est -COOR8, -CONR8R9 ou -NR8COR9 ; - R7 est choisi parmi :
Figure imgf000130_0001
; - Rc, Rd, R8 et R9 sont tels que définis à la revendication 1 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 6 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 4.
9. Composé selon la revendication 8, dans lequel X1 est choisi parmi :
Figure imgf000130_0002
10. Composé selon la revendication 1, qui est un composé de formule (Ia), (Ib) ou (Ic) :
Figure imgf000131_0001
dans chacune de ces formules W est tel que défini à la revendication 1.
11. Composé de formule (II) :
Figure imgf000131_0002
dans laquelle : - la tête d’accroche est un composé de formule (I) dans laquelle A, X, X1 et Y sont tels que définis dans l’une quelconque des revendications 1 à 9, ou un composé de formule (Ia), (Ib) ou (Ic) tel que défini dans la revendication 10 ; - le bras de liaison est une liaison directe ; un résidu d’acide aminé ; un résidu de peptide ; un sucre ; un glucuronide ; un pont -S-S- ; -NHCH[CH2COR10]2- ; ou un groupe de formule :
Figure imgf000132_0001
dans laquelle R10 est une liaison directe, un résidu de peptide, -(CRcRd)rR5, ou -(CH2CH2O)qR5, Rc, Rd, R5, q et r étant tels que définis pour le composé de formule (I) dans la revendication 1, de préférence R10 est un résidu de dipeptide ; - l’espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule :
Figure imgf000132_0002
; - M est une molécule d’intérêt.
12. Composé selon la revendication 11, dans lequel la partie de la formule (II) constituée par le bras de liaison et l’espaceur est représentée par l’une des formules (III) ou (IV) :
Figure imgf000132_0003
13. Composé selon l’une quelconque des revendications 11 à 12, dans lequel la molécule d’intérêt est un principe actif, un fluorophore ou une cage pour radioéléments. 14. Composé selon la revendication 13, dans lequel le principe actif est choisi parmi : le méthotrexate, un immunomodulateur, la duocarmycine, la combrétastatine, la calichéamicine, la monométhylauristatine E (MMAE), la monométhylauristatine F (MMAF), la maytansine, le DM1, le DM4, le SN38, l’amanitine et ses analogues, la pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et la ricine, de préférence le principe actif est l’amanitine ou la MMAE. 15. Conjugué susceptible d’être obtenu : (c1) par conjugaison entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfures et un composé de formule (I) dans laquelle A, X, X1 et Y sont tels que définis dans l’une quelconque des revendications 1 à 9 ou composé de formule (Ia), (Ib) ou (Ic) tel que défini dans la revendication 10, ou (c2) par conjugaison entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfures et un composé de formule (II) tel que défini dans l’une quelconque des revendications 11 et 12, ou (c3) par réaction entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfures, un composé de formule (I) dans laquelle A, X, X1 et Y sont tels que définis dans l’une quelconque des revendications 1 à 9 ou composé de formule (Ia), (Ib) ou (Ic) tel que défini dans la revendication 10, et un composé de formule (V) :
Figure imgf000133_0001
dans laquelle : - R11 est R7-(CH2)s-CO-, R7-(CH2)s-CONHCH[CH2CO-]2, R7-(CH2)s-(O-CH2-CH2)q-CO-, R7-(CH2)s-(O-CH2-CH2)q -CONHCH[CH2CO-]2, ou un composé de formule :
Figure imgf000133_0002
- R7 est tel que défini dans la revendication 1 ; - R10 est tel que défini dans la revendication 11 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 6 ; - t est 1 ou 2, de préférence t est 1 ; - le bras de liaison, l’espaceur et M sont tels que définis dans l’une quelconque des revendications 11 à 14. 16. Conjugué selon la revendication 15, dans lequel la protéine comprenant au moins deux ponts disulfures est un anticorps ou un fragment d’anticorps. 17. Conjugué selon la revendication 16, de structure suivante :
Figure imgf000134_0001
dans laquelle : - Ac est un anticorps ou un fragment d’anticorps ; - la molécule est soit un composé de formule (I) dans laquelle A, X, X1 et Y sont tels que définis dans l’une quelconque des revendications 1 à 9, soit un composé de formule (Ia), (Ib) ou (Ic) tel que défini dans la revendication 10, soit un composé de formule (II) tel que défini dans l’une quelconque des revendications 11 à 12, soit le produit de la réaction entre un composé de formule (I) dans laquelle A, X, X1 et Y sont tels que définis dans l’une quelconque des revendications 1 à 9, ou un composé de formule (Ia), (Ib) ou (Ic) tel que défini dans la revendication 10, et un composé de formule (V) tel que défini dans la revendication 15 ; - MAR, qui représente le nombre moyen de molécule(s) fixée(s) sur l’anticorps ou le fragment d’anticorps, est compris dans la gamme allant de 0,50 à 2,50. 18. Conjugué selon la revendication 17, dans lequel MAR = 1,00±0,50. 19. Conjugué selon la revendication 17, dans lequel MAR = 2,00±0,50. 20. Composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) selon l’une quelconque des revendications 15 à 19.
PCT/FR2021/051345 2020-07-20 2021-07-19 Composes capables de se lier a des proteines et conjugues obtenus a partir de ces composes WO2022018371A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023504036A JP2023534815A (ja) 2020-07-20 2021-07-19 タンパク質に結合可能な化合物および該化合物から得られる複合体
EP21755528.3A EP4181964A1 (fr) 2020-07-20 2021-07-19 Composes capables de se lier a des proteines et conjugues obtenus a partir de ces composes
US18/006,070 US20230277678A1 (en) 2020-07-20 2021-07-19 Compounds capable of binding to proteins and conjugates obtained from these compounds
CA3186027A CA3186027A1 (fr) 2020-07-20 2021-07-19 Composes capables de se lier a des proteines et conjugues obtenus a partir de ces composes
CN202180064094.7A CN116472268A (zh) 2020-07-20 2021-07-19 能够与蛋白质结合的化合物和从这些化合物中获得的缀合物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FRFR2007589 2020-07-20
FR2007589A FR3112547B1 (fr) 2020-07-20 2020-07-20 Composés capables de se lier à des protéines et conjugués obtenus à partir de ces composés

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022018371A1 true WO2022018371A1 (fr) 2022-01-27

Family

ID=72885751

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2021/051345 WO2022018371A1 (fr) 2020-07-20 2021-07-19 Composes capables de se lier a des proteines et conjugues obtenus a partir de ces composes

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230277678A1 (fr)
EP (1) EP4181964A1 (fr)
JP (1) JP2023534815A (fr)
CN (1) CN116472268A (fr)
CA (1) CA3186027A1 (fr)
FR (1) FR3112547B1 (fr)
WO (1) WO2022018371A1 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023012437A1 (fr) * 2021-08-05 2023-02-09 Mc Saf Conjugués anticorps-médicament
WO2023135397A1 (fr) 2022-01-17 2023-07-20 Mc Saf Procédé de préparation de conjugués anticorps-médicament
WO2023135398A1 (fr) 2022-01-17 2023-07-20 Mc Saf Conjugues anticorps-medicament pour utilisation therapeutique

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2708E (fr) 1902-08-14 1904-10-05 Jean Marie Lallemand Procédé et produit dénommé phospho-zinco-alumino-magnésien applicable au traitement des vidanges et toutes eaux contenant des matières organiques et albuminoides insalubres
WO2015004400A1 (fr) * 2013-07-11 2015-01-15 Universite Francois Rabelais Nouveaux conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie
WO2016064749A2 (fr) * 2014-10-20 2016-04-28 Igenica Biotherapeutics, Inc. Nouveaux conjugués anticorps-médicament et composés, compositions et procédés d'utilisation s'y rapportant
WO2016123412A1 (fr) * 2015-01-28 2016-08-04 Sorrento Therapeutics, Inc. Conjugués anticorps-médicament
CA3106493A1 (fr) * 2018-12-17 2020-06-25 Remegen, Co., Ltd. Lieur pour des conjugues anticorps-medicament et utilisations connexes
WO2020234541A1 (fr) * 2019-05-20 2020-11-26 Mc Saf Conjugues anticorps-medicament et leur utilisation en therapie

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2708E (fr) 1902-08-14 1904-10-05 Jean Marie Lallemand Procédé et produit dénommé phospho-zinco-alumino-magnésien applicable au traitement des vidanges et toutes eaux contenant des matières organiques et albuminoides insalubres
WO2015004400A1 (fr) * 2013-07-11 2015-01-15 Universite Francois Rabelais Nouveaux conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie
WO2016064749A2 (fr) * 2014-10-20 2016-04-28 Igenica Biotherapeutics, Inc. Nouveaux conjugués anticorps-médicament et composés, compositions et procédés d'utilisation s'y rapportant
WO2016123412A1 (fr) * 2015-01-28 2016-08-04 Sorrento Therapeutics, Inc. Conjugués anticorps-médicament
CA3106493A1 (fr) * 2018-12-17 2020-06-25 Remegen, Co., Ltd. Lieur pour des conjugues anticorps-medicament et utilisations connexes
WO2020234541A1 (fr) * 2019-05-20 2020-11-26 Mc Saf Conjugues anticorps-medicament et leur utilisation en therapie

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAO NAIRONG ET AL: "Effect of Macromonomer Branching on Structural Features and Solution Properties of Long-Subchain Hyperbranched Polymers: The Case of Four-Arm Star Macromonomers", MACROMOLECULES, vol. 52, no. 17, 22 August 2019 (2019-08-22), Washington DC United States, pages 6566 - 6577, XP055783164, ISSN: 0024-9297, DOI: 10.1021/acs.macromol.9b01103 *
LÜNING U ET AL: "Concave Benzoic Acids", CHEMISCHE BERICHTE, vol. 124, February 1991 (1991-02-01), pages 397 - 402, XP002802316 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023012437A1 (fr) * 2021-08-05 2023-02-09 Mc Saf Conjugués anticorps-médicament
FR3125965A1 (fr) * 2021-08-05 2023-02-10 Mc Saf Conjugués anticorps-médicament
WO2023135397A1 (fr) 2022-01-17 2023-07-20 Mc Saf Procédé de préparation de conjugués anticorps-médicament
WO2023135398A1 (fr) 2022-01-17 2023-07-20 Mc Saf Conjugues anticorps-medicament pour utilisation therapeutique
FR3131836A1 (fr) * 2022-01-17 2023-07-21 Mc Saf Conjugués anticorps-médicament pour utilisation thérapeutique
FR3131835A1 (fr) * 2022-01-17 2023-07-21 Mc Saf Procédé de préparation de conjugués anticorps-médicament

Also Published As

Publication number Publication date
FR3112547B1 (fr) 2023-01-20
JP2023534815A (ja) 2023-08-14
CN116472268A (zh) 2023-07-21
EP4181964A1 (fr) 2023-05-24
CA3186027A1 (fr) 2022-01-27
US20230277678A1 (en) 2023-09-07
FR3112547A1 (fr) 2022-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022018371A1 (fr) Composes capables de se lier a des proteines et conjugues obtenus a partir de ces composes
CA2937731C (fr) Agents cytotoxiques bifonctionnels
EP2780039B9 (fr) Peptides cytotoxiques et conjugués anticorps-médicaments de ceux-ci
WO2016207098A1 (fr) Conjugués anticorps-principe actif (adc) d'inhibiteurs de ksp avec des anticorps anti-cd123
TW201512174A (zh) 細胞增生抑制劑及其結合物
JP2018524313A (ja) キネシンスピンドルタンパク質（ｋｓｐ）阻害剤の抗ｂ７ｈ３抗体との抗体薬物複合体
WO2015096982A1 (fr) Conjugués de liant (conjugué anticorps-médicament) comprenant des inhibiteurs de la protéine kinésine du fuseau
EP3233127A1 (fr) Conjugués anticorps-principe actif (adc) d'inhibiteurs de la ksp ayant des anticorps anti-tweakr aglycosylés
CN107921145A (zh) Ksp抑制剂与抗‑tweakr抗体的抗体药物缀合物（adc）
TW201141846A (en) Dimeric IAP inhibitors
EP3972652A1 (fr) Conjugues anticorps-medicament et leur utilisation en therapie
CN115209922A (zh) 缀合物及其用途
CN107660208B (zh) 包含cti药效团的双功能细胞毒性剂
WO2023135397A1 (fr) Procédé de préparation de conjugués anticorps-médicament
WO2023135398A1 (fr) Conjugues anticorps-medicament pour utilisation therapeutique
WO2023012437A1 (fr) Conjugués anticorps-médicament
FR3101541A1 (fr) conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie
AU2015264844B2 (en) Cytotoxic peptides and antibody drug conjugates thereof
WO2024127332A1 (fr) Composés cytotoxiques
JP2020117509A (ja) 疾患を処置するためのコンジュゲート

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21755528

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3186027

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023504036

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021755528

Country of ref document: EP

Effective date: 20230220

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202180064094.7

Country of ref document: CN