EP4110405A1 - Conjugués anticorps-médicament anti-cd56 et leur utilisation en thérapie - Google Patents

Conjugués anticorps-médicament anti-cd56 et leur utilisation en thérapie

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EP4110405A1
EP4110405A1 EP21714002.9A EP21714002A EP4110405A1 EP 4110405 A1 EP4110405 A1 EP 4110405A1 EP 21714002 A EP21714002 A EP 21714002A EP 4110405 A1 EP4110405 A1 EP 4110405A1
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EP
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antibody
drug conjugate
drug
mmae
less
Prior art date
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Pending
Application number
EP21714002.9A
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German (de)
English (en)
Inventor
Ludovic JUEN
Christine BALTUS
Audrey DESGRANGES
Antoine TOUZÉ
Thibault KERVARREC
Valérie LEBLOND
Mahtab SAMIMI
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Mcsaf Inside Onocology
Original Assignee
Mcsaf Inside Onocology
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to novel antibody-drug conjugates comprising an antibody directed against the CD56 antigen coupled to a cytotoxic drug and their use as a drug, in particular in anti-cancer therapy.
  • An antibody-drug conjugate (in English "Antibody Drug Conjugate” or “ADC”) constitutes a means of selective delivery of a cytotoxic drug.
  • the antibody-drug conjugate therefore makes it possible to combine the specificity of targeting by the antibodies with new powerful effector functions by the agents which are conjugated to them.
  • the general structure of an antibody-drug conjugate is that of formula (I).
  • the part that binds the antibody and the drug is called the linker arm or linker. It can be grafted onto the antibody via at least one of the eight cysteines forming the 4 inter-chain disulfide bridges.
  • the number of cytotoxic drug molecules grafted onto the antibody determines a ratio called the Drug-to-Antibody Ratio (DAR).
  • DAR Drug-to-Antibody Ratio
  • the antibody After binding to its target antigen, the antibody is internalized in the cell by endocytosis mediated by receptors. The vesicles fuse with lysosomes where the cytotoxic drug is released from the antibody via different mechanisms. The active cytotoxic drug then acts on the cell by inducing its death and sometimes on neighboring cancer cells by transport or diffusion in the environment.
  • the antibody is therefore mainly used as a vector and delivers the cytotoxic drug into the targeted cell.
  • Merkel cell carcinoma is an aggressive skin cancer occurring in the elderly.
  • the treatment of inoperable metastatic patients relied on polychemotherapy based on platinum salts, with no benefit on survival.
  • the use of immunotherapy targeting PD-L1 (avelumab) in the first line allows an objective response to be obtained in approximately 50% of patients with inoperable MCC with a sustained response observed in half of responder patients.
  • the persistence of non-responder patients encourages the development of new therapeutic strategies.
  • the development of targeted therapy in CCM appears to be a promising strategy.
  • CD56 has been identified as a therapeutic target strongly expressed by the majority of TLCs.
  • IMGN901 which is an anti-CD56 ADC coupled to mertansine (DM1) by a first generation technology, inhibits the polymerization of tubulin.
  • DM1 mertansine
  • An acceptable tolerance of IMGN901 has been demonstrated by several phase I studies in patients with solid tumors expressing CD56 including cases of TLC.
  • a phase II study has been proposed with the same molecule in small cell carcinoma of the lung, in combination with chemotherapy (cisplatin etoposide).
  • a first subject of the invention relates to an antibody-drug conjugate of formula (I) below: in which :
  • A is an anti-CD56 antibody or antibody fragment;
  • the attachment head is represented by one of the following formulas:
  • the linkage arm is a cleavable linkage arm chosen from the following formulas:
  • the spacer is represented by the following formula: m is an integer ranging from 1 to 10; n is an integer ranging from 1 to 4.
  • a second object of the invention relates to a composition comprising one or more antibody-drug conjugate (s) according to the invention.
  • a third subject of the invention relates to an antibody-drug conjugate according to the invention or a composition according to the invention, for use as a drug.
  • a fourth subject of the invention relates to an antibody-drug conjugate according to the invention or a composition according to the invention, for use in the treatment of CD56 + cancer.
  • a fifth object of the invention relates to a process for preparing an antibody-drug conjugate according to the invention comprising the following steps:
  • the linkage arm is a cleavable linker arm chosen from the following formulas:
  • the spacer is represented by the following formula: X is Br, Cl, I or F; m is an integer ranging from 1 to 10, advantageously ranging from 2 to 7, from 3 to 6, advantageously equal to 4 or 5; and
  • step (ii) reacting the cytotoxic conjugate obtained in step (i) with an anti-CD56 antibody or an anti-CD56 antibody fragment.
  • the process for preparing an antibody-drug conjugate according to the invention comprises a step which consists in reacting 6- (2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amido- / V-hexanamide-valine-citrulline-p- aminobenzoyl carbamate from MMAE or 6 - ((2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amino) -6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate from 6- (2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amido- / V-hexanamide-valine-citrulline-p- aminobenzoyl carbamate from MMAE or 6 - ((2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amino) -6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate from
  • MMAE with an anti-CD56 antibody or an anti-CD56 antibody fragment.
  • cytotoxic conjugate denotes a conjugate which comprises a cytotoxic drug.
  • a cytotoxic conjugate denotes a conjugate of formula (II) below: in which: the attachment head is represented by one of the following formulas: the linkage arm is a cleavable linker arm chosen from the formulas following: the spacer is represented by the following formula: X is Br, Cl, I or F; m is an integer ranging from 1 to 10.
  • cytotoxic drug denotes any natural or synthetic molecule capable of inhibiting or preventing the function and / or development of cells.
  • cytotoxic is understood to mean the property for a chemical or biological agent of altering cells, possibly to the point of destroying them.
  • the cytotoxic drug is chosen from any compound having obtained Marketing Authorization and which is used in anti-cancer or anti-inflammatory therapy, any molecule under clinical evaluation in therapy anti-cancerous or anti-inflammatory.
  • the cytotoxic drug will be chosen, for example, from paclitaxel (Taxol®) or docetaxel (Taxotère®) or one of its derivatives, topotecan, bortezomib, daunorubicin, daunorubicin analogues, vincristine, mitomycin C, retinoic acid, methotrexate, ilomedine, aspirin, IMIDs, lenalidomide, pomalidomide.
  • the cytotoxic drug is selected from the group consisting of duocarmycin and its analogues, dolastatins, combretastatin and its analogues, calicheamicin, N-acetyl-y-calicheamycin (CMC), a derivative of calicheamycin, maytansin and its analogues, such as a maytansinoid derivative, for example DM1 and DM4, auristatins and their derivatives, such as auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMAF), tubulysin, disorazole, epothilones, echinomycin, estramustine, cemadotine, eleutherobin, methopterin, actinomycin, mitomycin A, camptothecin, a camptothecin derivative,
  • the cytotoxic drug is chosen from methotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatin, calicheamicin, monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitin, pyrrolobenzodiazepine, pyrrolobenzodiazepine dimer, pyrrolopyridodiazepine, pyrrolopyridodiazepine dimer, a histone deacetylase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, and ricin, preferably MMAE, represented by the following formula:
  • the cytotoxic conjugate corresponds to the following formula (IIa) or to the following formula (lia '):
  • the term "antibody”, also called “immunoglobulin” denotes a heterotetramer consisting of two heavy chains of about 50-70 kDa each (called the H chains for Heavy) and two light chains of about 25 kDa each ( say L chains for Light), linked together by intra- and inter-chain disulfide bridges.
  • Each chain consists, in the N-terminal position, of a region or variable domain, called VL for the light chain, VH for the heavy chain, and in the C-terminal position, of a constant region, consisting of a single domain called CL for the light chain and three or four domains called CH1, CH2, CH3, CH4, for the heavy chain.
  • VL region or variable domain
  • CL constant region
  • chimeric antibody is meant an antibody in which the sequences of the variable regions of the light chains and of the heavy chains belong to a different species from that of the sequences of constant regions of the light chains and of the heavy chains.
  • the sequences of the variable regions of the heavy and light chains are preferably of murine origin while the sequences of the constant regions of the heavy and light chains belong to a non-murine species.
  • all species of non-murine mammals are likely to be used, and in particular man, monkey, suidae, bovidae, animals. equines, felids, canids or even birds, this list not being exhaustive.
  • the chimeric antibodies according to the invention contain sequences of constant regions of heavy and light chains of human origin and sequences of variable regions of heavy and light chains of murine origin.
  • humanized antibody is meant an antibody of which all or part of the sequences of the regions involved in the recognition of the antigen (the hypervariable regions or CDR: Complementarity Determining Region) and sometimes certain amino acids of the FR regions (regions Framework) are of non-human origin while the sequences of constant regions and variable regions not involved in antigen recognition are of human origin.
  • human antibody is meant an antibody containing only human sequences, both for the variable and constant regions of the light chains and for the variable and constant regions of the heavy chains.
  • antibody fragment means any part of an immunoglobulin obtained by enzymatic digestion or obtained by bioproduction comprising at least one disulfide bridge, for example Fab, Fab ', F (ab') 2 , Fab ' -SFI, scFv-Fc or Fc.
  • the enzymatic digestion of the immunoglobulins by papain generates two identical fragments, which are called the Fab fragments (Fragment antigen binding), and an Fc fragment (Crystallizable fragment).
  • Enzymatic digestion of immunoglobulins by pepsin generates an F (ab ') 2 fragment and an Fc fragment split into several peptides.
  • F (ab ') 2 is formed from two Fab' fragments linked by inter-chain disulfide bridges.
  • the Fab parts consist of the variable regions and the CH1 and CL domains.
  • the Fab 'fragment consists of the Fab region and a hinge region.
  • Fab'-SFI refers to an Fab 'fragment in which the cysteine residue of the hinge region carries a free thiol group.
  • the scFv single Chain Fragment variable
  • the structure is stabilized by a short flexible peptide arm, called a linker, which is placed between the two domains.
  • the scFv fragment can be linked to an Fc fragment to give an scFv-Fc.
  • CD56 designates the “Differentiation Cluster 56", which is a membrane glycoprotein member of the superfamily of immunoglobulins (Ig) containing 5 domains of Ig type and two domains of type 3 of fibronectin in its extracellular part. CD56 is also frequently referred to as “Neural-Cell Adhesion Molecule 1 (NCAM 1)”.
  • CD56 + cancer or “CD56 positive cancer” denotes a cancer expressing CD56.
  • CD56 + cancer designates any case of cancer for which cancer cells exhibit CD56 expression. CD56 expression is frequently observed in neuroendocrine carcinomas, pediatric tumors and some blood diseases. It is also reported in certain melanomas and soft tissue sarcomas.
  • the CD56 + cancer is chosen from melanoma, blastema tumors, hemopathies, such as acute myeloid leukemias, myelomas, neoplasms with blast plasmacytoid dendritic cells and neuroendocrine carcinomas, such as small cell carcinoma of the lung and Merkel cell carcinoma.
  • the CD56 + cancer is a carcinoma selected from neuroendocrine carcinomas, such as small cell carcinoma of the lung or Merkel cell carcinoma, preferably Merkel cell carcinoma.
  • identity is calculated by comparing two sequences aligned in a comparison window.
  • the alignment of the sequences makes it possible to determine the number of positions (nucleotides or amino acids) in common for the two sequences in the comparison window.
  • the number of positions in common is therefore divided by the total number of positions in the comparison window and multiplied by 100 to obtain the percentage of identity.
  • the determination of the percent sequence identity can be done manually or by well known computer programs.
  • the identity or the homology corresponds to at least one substitution, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 substitutions , of an amino acid residue, preferably at least one substitution of an amino acid residue carried out conservatively.
  • Constantly accomplished amino acid residue substitution involves replacing one amino acid residue with another amino acid residue, having a side chain having similar properties.
  • the families of amino acids possessing side chains with similar properties are well known, for example basic side chains (eg lysine, arginine, histidine), acid side chains (eg aspartic acid, glutamic acid) can be mentioned.
  • polar and uncharged side chains e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • nonpolar side chains e.g.
  • the antibodies or fragments of homologous antibodies or "variants of antibodies or of fragments of antibodies” that is to say antibodies or fragments of antibodies having the same function
  • a person skilled in the art uses his general knowledge to determine the number of substitutions which can be made and their location in order to be able to preserve the function of the antibody or of the antibody fragment.
  • antibody variants or antibody fragments In order to determine the capacity of one or more antibody variants or antibody fragment to bind specifically to an antigen, several suitable methods, well known to those skilled in the art and described in the prior art, can be used.
  • the antibodies or antibody fragments can therefore be tested by binding methods, such as, for example, the ELISA method, the affinity chromatography method, etc.
  • Variants of antibodies or antibody fragments can be generated for example by the “phage display” method making it possible to generate a phage library.
  • a large number of methods are known in order to generate a “phage display” library and target the antibody variants or antibody fragments having the desired functional characteristics.
  • purified and isolated is meant, with reference to an antibody according to the invention, that the antibody is present in the substantial absence of other biological macromolecules of the same type.
  • purified as used herein preferably means at least 75 wt%, more preferably at least 85 wt%, still more preferably at least 95 wt%, and most preferably at least 98 wt%. antibody, relative to all the macromolecules present.
  • a “pharmaceutically acceptable” means approved by a federal or state regulatory agency or listed in the American or European Pharmacopoeia, or in another generally recognized pharmacopoeia, for use in animals and in humans.
  • a “pharmaceutical composition” means a composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic agent is administered.
  • These vehicles can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil. , sesame oil, etc. Water is a preferred vehicle when the pharmaceutical composition is administered intravenously.
  • Saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid vehicles, particularly for injectable solutions.
  • Pharmaceutically acceptable excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerol, propylene glycol, l water, ethanol and the like.
  • tablets or capsules can be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable excipients such as binding agents (eg, pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose); fillers (eg lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate); lubricants (eg, magnesium stearate, talc or silica); disintegrants (eg potato starch or sodium starch glycolate); or wetting agents (eg, sodium lauryl sulfate).
  • binding agents eg, pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose
  • fillers eg lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate
  • lubricants eg, magnesium stearate, talc or silica
  • disintegrants eg potato starch or sodium starch glycolate
  • wetting agents eg, sodium lauryl sulfate
  • Liquid preparations for oral administration may take the form, for example, of solutions, syrups or suspensions, or may be presented as a dry product to be reconstituted with water or other suitable vehicle before use.
  • Such liquid preparations can be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable vehicles such as suspending agents (eg sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); emulsifying agents (eg, lecithin or acacia); non-aqueous vehicles (eg almond oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils); and preservatives (eg methyl or propyl p-hydroxybenzoates or sorbic acid).
  • Pharmaceutical compositions may also contain buffer salts, flavorings, colorants and sweeteners, as appropriate.
  • the composition according to the invention is preferably a pharmaceutical composition.
  • treat encompasses any beneficial or desirable effect on a pathology or condition, and may even include a minimal reduction of one or more measurable markers of the condition or condition. Treatment may, for example, involve either reducing or ameliorating the symptoms of the disease or condition, or delaying the progression of the disease or condition. The term “treatment” does not necessarily mean complete eradication or cure of the condition, or of the associated symptoms.
  • Native mass spectrometry is understood to mean a mass spectrometry analysis carried out under conditions which do not denature the proteins, thus making it possible to retain the non-covalent bonds. From Native mass spectrometry methods are widely described in the literature, for example in reference [4]
  • the invention relates to an antibody-drug conjugate of the following formula (I): in which :
  • A is an anti-CD56 antibody or antibody fragment;
  • the attachment head is represented by one of the following formulas:
  • the linkage arm is a cleavable linkage arm chosen from the following formulas:
  • the spacer is represented by the following formula: m is an integer ranging from 1 to 10, advantageously ranging from 2 to 7, from 3 to 6, advantageously equal to 4 or 5; n is an integer ranging from 1 to 4.
  • the antibody or the anti-CD56 antibody fragment according to the invention can be of mammalian (eg human or mouse), humanized or chimeric origin. It is preferably a monoclonal antibody produced recombinantly by cells genetically modified according to techniques widely described in the prior art.
  • A is an anti-CD56 antibody, it is preferably an IgG, for example lgG1, lgG2, lgG3 or lgG4.
  • A is an antibody or an anti-CD56 antibody fragment which comprises:
  • variable domain of a light chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 1, a CDR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 2, and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO: 3 ;
  • variable domain of a heavy chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 4, a CDR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 5, and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO : 6.
  • the light chain variable domain has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 15; and the heavy chain variable domain having at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% , at least 99% or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 16.
  • A can be an antibody or an antibody fragment of amino acid sequence SEQ ID NO: 15 for the variable domain of the light chain and of amino acid sequence SEQ ID NO: 16 for the variable domain of the heavy chain.
  • A is an antibody of amino acid sequence SEQ ID NO: 7 for the light chain and of amino acid sequence SEQ ID NO: 8 for the heavy chain.
  • the heavy chain of amino acid sequence SEQ ID NO: 8 may also have an additional lysine in the C terminal position.
  • A is the antibody described under the reference m906 in application US 2018/0214568 A1 and in reference [1].
  • the m906 antibody is a chimeric anti-CD56 antibody of IgG1 type with amino acid sequence SEQ ID NO: 7 for the light chain and amino acid sequence SEQ ID NO: 8 for the heavy chain.
  • the antibody-drug conjugate of the invention has one of the following formulas
  • the antibody-drug conjugate of the invention has the following formula (la) or has the following formula:
  • the antibody-drug conjugate identified in the examples under the reference "MF-m906-MMAE” corresponds to an antibody-drug conjugate of formula (Ia).
  • “M906” corresponds to the m906 antibody, that is to say an anti-human CD56 antibody of the IgG1 type with amino acid sequence SEQ ID NO: 7 for the light chain and amino acid sequence SEQ ID NO: 8 for the heavy chain.
  • the antibody-drug conjugate according to the invention is purified (or isolated) using known purification techniques, such as purification on a chromatography and / or affinity column.
  • the antibody-drug conjugate When n is equal to 1, the antibody-drug conjugate is commonly called “DAR1". When n is 2, the antibody-drug conjugate is commonly referred to as “DAR2”. When n is 3, the antibody-drug conjugate is commonly referred to as “DAR3”. When n is 4, the antibody-drug conjugate is commonly referred to as "DAR4".
  • the antibody-drug conjugate exhibits one or more effector functions mediated by the attenuated Fc part.
  • the effector function (s) mediated by the Fc part is / are chosen from ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) and CDC (Complement-dependent cytotoxicity).
  • ADCC Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CDC Complement-dependent cytotoxicity
  • Those skilled in the art will have no difficulty in attenuating one or more effector functions mediated by the Fc part with regard to the teaching of the prior art, for example by mutating the Fc part.
  • Many mutations are known to decrease effector functions mediated by the Fc part. It may, for example, be a mutation aimed at deglycosylating the Fc part, in particular at suppressing glycosylation at the level of asparagine 297.
  • the antibody-drug conjugate is deglycosylated at the level of the Fc part, for example the antibody-drug conjugate no longer carries glycosylation at the level of asparagine 297.
  • the invention also relates to a composition comprising one or more antibody-drug conjugate (s) of formula (I), for example of formula (la) or of formula (la ’), as defined above. It may be a pharmaceutical composition comprising one or more antibody-drug conjugate (s) of formula (I) as defined above, for example of formula (la) or of formula (la '), and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • composition according to the invention has the characteristic of being particularly homogeneous, which can result in better stability, better efficiency and / or a reduction in the side effects of the composition, compared to a composition which does not is not homogeneous.
  • the composition according to the invention is characterized by the following characteristics: a) at least 50%, preferably at least 55%, at least 60%, at least 65 %, for example at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least less than 99% of the antibody-drug conjugates of the composition have an n equal to 4; b) the average Drug-to-Antibody Ratio (average DAR) is between 3 and 4.5, preferably between 3.5 and 4, between 3.7 and 4, between 3.8 and 4, for example equal to 3.9 ⁇ 0.1, for example equal to 3.89.
  • average DAR average DAR
  • the average DAR is generally determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method or by native mass spectrometry.
  • HIC Hadrophobia Interaction Chromatography
  • native mass spectrometry The HIC method and the native mass spectrometry method are widely described in the literature. Reference may be cited, for example, [3] for the HIC method and reference [4] for the native mass spectrometry method; c) at least 95%, preferably at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% of the antibody-drug conjugates are present as a monomer. The percentage of monomer is generally determined by the SEC (Size Exclusion Chromatography) method.
  • the SEC method is widely described in the literature, for example in reference [2]; d) one or more of the ratios of n defined below; or e) a combination of two, three or four characteristics selected from a), b, c) and d).
  • composition according to the invention can be characterized by ratios of n below:
  • composition according to the invention can also be characterized by ratios of n below:
  • the ratios of n can be determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method or by native mass spectrometry.
  • composition according to the invention can be characterized by ratios of n determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method below:
  • the antibody-drug conjugates of the composition have an n equal to 2,
  • composition according to the invention can also be characterized by ratios of n determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method below:
  • n 4
  • composition according to the invention can be characterized by ratios of n determined by native mass spectrometry below:
  • composition according to the invention can also be characterized by ratios of n determined by native mass spectrometry below:
  • n 1
  • n 2
  • the composition according to the invention can also comprise DAROs, that is to say antibodies without cytotoxic conjugate. Preferably less than 10%, less than 9%, less than 8%, less than 7%, less than 6%, less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, less than 1%, less than 0.5%, less than 0.4%, less than 0.2%, less than 0.1% of DARO, for example about 0% of DARO.
  • the percentage of DARO can be determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method or by native mass spectrometry.
  • composition according to the invention can also comprise DAR5, that is to say antibody-drug conjugates having 5 cytotoxic conjugates. Preferably less than 25%, less than 20%, less than 15%, less than 10%, less than 9%, less than 8%, less than 7%, less than 6%, less than 5% of DAR5.
  • DAR5 that is to say antibody-drug conjugates having 5 cytotoxic conjugates.
  • the presence of DAR5 in antibody-drug conjugate compositions is widely described in the literature, however the exact structure of DAR5 is little studied.
  • the composition according to the invention does not comprise a DAR greater than DAR5, for example DAR6, DAR7, etc.
  • the percentages of DAR5 and above can be determined by the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) method or by native mass spectrometry.
  • the composition according to the invention exhibits the HIC profile of FIG. 1 or the native mass spectrometry profile of FIG. 3.
  • the invention also relates to an antibody-drug conjugate of formula (I) according to the invention or a composition comprising an antibody-drug conjugate of formula (I) according to the invention for use as a drug, for example for use in the treatment of CD56 + cancer, such as melanoma, blastema tumors, blood diseases, such as acute myeloid leukemias, myelomas, plasmacytoid blast dendritic cell neoplasias and neuroendocrine carcinomas.
  • CD56 + cancer is chosen from neuroendocrine carcinomas, such as small cell carcinoma of the lung or Merkel cell carcinoma, preferably Merkel cell carcinoma.
  • the antibody-drug conjugate or the composition according to the invention is preferably formulated for parenteral administration, for example intravascular (intravenous or intraarterial), intraperitoneal or intramuscular administration.
  • parenterally administered refers to modes of administration other than enteral and topical administration, generally by injection, and includes, without limitation, intravascular, intravenous, intramuscular, intravenous administration.
  • Intravenous administration is preferred in the context of the present invention, for example by intravenous infusion.
  • the dose of antibody-drug conjugate administered to a subject in need thereof will vary depending on several factors, including, without limitation, the route of administration, the type and severity of the condition being treated, the condition. of the patient, the build of the patient, the age of the patient, etc.
  • One skilled in the art can easily determine, based on his knowledge in this field, the required dosage range based on these and other factors.
  • the appropriate dose can also be determined with animal models or with clinical trials.
  • the typical doses of antibody-drug conjugate according to the invention can be from 5 mg / m 2 to 250 mg / m 2 , for example from 30 mg / m 2 to 150 mg / m 2 , from 5 mg / m 2 2 to 75 mg / m 2 , from 75 mg / m 2 to 120 mg / m 2 , by example equal to 100 mg / m 2 , 75 mg / m 2 , 60 mg / m 2 .
  • the administration can be done in one go or, more generally, in several times.
  • the administration schedule may include an initial loading dose followed by maintenance doses, for example weekly, every 2 weeks, every three weeks, every month, or more. The duration of treatment may vary depending on the pathology treated and the subject.
  • the antibody-drug conjugate or the composition according to the invention can be used as monotherapy or in combination with drugs whose therapeutic interest is recognized in the pathology under consideration. It may be, for example, paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, cyclophosphamide, lenalidomide, dexamethasone, carboplatin, etoposide, or an antibody used in anti-cancer immunotherapy such as a anti-PD1 or anti-PD-L1.
  • the description also relates to a method of treating CD56 + cancer in a subject comprising the administration to the subject of an effective therapeutic amount of an antibody-drug conjugate of formula (I) according to the invention or of a composition comprising an antibody-drug conjugate of formula (I) according to the invention.
  • the description also relates to a process for the preparation of an antibody-drug of formula (I) as defined above, in which a cytotoxic conjugate of the following formula (II) is reacted: as defined above, with an antibody or an anti-CD56 antibody fragment as defined above.
  • the invention relates to a process for preparing an antibody-drug conjugate according to the invention comprising the following steps:
  • a cytotoxic conjugate by coupling a binding head of formula: with a compound of formula in which: the linkage arm is a cleavable linker arm chosen from the following formulas: the spacer is represented by the following formula: X is Br, Cl, I or F; m is an integer ranging from 1 to 10, advantageously ranging from 2 to 7, from 3 to 6, advantageously equal to 4 or 5; and
  • step (ii) reacting the cytotoxic conjugate obtained in step (i) with an anti-CD56 antibody or an anti-CD56 antibody fragment.
  • the attachment head is described in more detail in the definition of “cytotoxic conjugate”. and in the “antibody-drug conjugate” section above, with the difference that the head attachment used in the method comprises a terminal carboxylic acid function.
  • linker arm is described in more detail in the definition of “cytotoxic conjugate” and in the “antibody-drug conjugate” part above, with the difference that the linker arm used in the method comprises a terminal amine function.
  • cytotoxic drug is described in more detail in the definition of “cytotoxic conjugate” and in the “antibody-drug conjugate” section above.
  • anti-CD56 antibody is described in more detail in the definition of "cytotoxic conjugate” and the “antibody-drug conjugate” section above.
  • step (i) provides a cytotoxic conjugate of formula (IIa) or (IIa ’).
  • the process for preparing a cytotoxic conjugate according to step (i) comprises a step which consists in coupling 6- (2,6-bis (bromomethyl) pyridin- acid. 4-yl) amidohexanoic acid or 6- ((2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amino) -6-oxohexanoic acid with valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE or a salt of this compound.
  • the process for preparing a cytotoxic conjugate according to the invention makes it possible to obtain 6- (2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amido- / V-hexanamide-valine -citrulline-p-aminobenzoyl carbamate from MMAE or 6 - ((2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amino) -6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate from MMAE, respectively.
  • the process for preparing an antibody-drug conjugate according to the invention comprises a step which consists in reacting 6- (2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl ) amido- / V- hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyl carbamate of MMAE or 6- ((2,6-bis (bromomethyl) pyridin-4-yl) amino) -6-oxohexanamide-valine-citrulline-p - MMAE aminobenzoyl carbamate with an anti-CD56 antibody or an anti-CD56 antibody fragment.
  • FIG. 1 represents the HIC (Hydrophobia Interaction Chromatography) profile of an antibody-drug conjugate composition according to the invention.
  • the figure shows that the composition is enriched in DAR4, with more than 50% of DAR4.
  • FIG. 2 represents a SEC (Size Exclusion Chromatography) analysis of an antibody-drug conjugate composition according to the invention. The figure shows that the composition is extremely homogeneous, with more than 99% monomer.
  • FIG. 3 shows a native mass spectrometric analysis on a Vion IMS Qtof mass spectrometer coupled to an Acquity UPLC H-Class system from Waters (Wilmslow, UK) of an antibody-drug conjugate composition according to the invention. This method makes it possible to identify with certainty each species of ARD.
  • the figure shows that the composition is enriched in DAR4, with nearly 75% of DAR4.
  • FIG. 4 shows the expression of CD56 on different cell lines (4 from TLC and one breast cancer control line) by flow cytometry after incubation with the anti-CD56 antibody labeled with the fluorophore FITC (Fluorescein IsoThioCyanate).
  • FIG. 5A], [Fig 5B], [Fig 5C], [Fig 5D], [Fig 5E] represent the performance evaluation of the MF-m906-MMAE ADC, compared to the m906 controls (uncoupled antibody), MF- TTZ-MMAE (ADC Trastuzumab coupled to MMAE) and MMAE (toxin only) on TLC (Figure 5A: WaGa, Figure 5B: PeTa, Figure 5C: MS-1 and Figure 5D: MKL-2) and cancer cell lines breast ( Figure 5E: SK-BR3).
  • the experiments were performed independently twice (6 biological replicates / experiment). The results are expressed as the average (+/- SEM) of the percentage obtained.
  • FIG. 6A-6C represents the evaluation of the specificity of MF-m906-MMAE in the WaGa lines after knock-down of CD56.
  • WaGa cells have been independently transduced with lentiviral vectors containing two distinct doxycycline (Dox) inducible shRNAs (A, B and C) and targeting CD56 sequences. After antibiotic selection (puromycin), cells were exposed to doxycycline for 7 days before evaluation.
  • (ABC): Confirmation of knock-down of CD56 by RT-qPCR in real time (A) ( * : p ⁇ 0.05, the control cells without doxycycline are used as reference), by Western blot (attenuated mass of CD56 140 KDa) (B).
  • FIG. 7 illustrates the performance evaluation of the MF-m906-MMAE conjugate and controls (PBS and MF-TTZ-MMAE a Trastuzumab ADC coupled to MMAE) in TLC xenograft model.
  • Figure 7 shows the relative tumor volume curves (mean +/- SEM) during the study.
  • Each point represents the mean of VTRs for the groups treated with MF-m906-MMAE, MF-TTZ-MMAE and PBS, gray arrows indicate injection times.
  • FIG. 8 illustrates the performance evaluation of the MF-m906-MMAE conjugate and controls (PBS and MF-TTZ-MMAE a Trastuzumab ADC coupled to MMAE) in TLC xenograft model.
  • FIG. 8 represents the weight of the tumors at the end of the study in the experimental group and the control groups ( * : p ⁇ 0.05).
  • the horizontal lines are the means, quartiles and limits.
  • FIG. 9 represents the performance evaluation of MF-m906-MMAE ADC, compared to controls m906 (uncoupled antibody), MF-TTZ-MMAE (ADC Trastuzumab coupled to MMAE) and MMAE (toxin only) on the cell line small cell carcinoma of the lung H69.
  • the experiments were performed independently three times (6 biological replicates / experiment). The results are expressed as the average (+/- SEM) of the percentage obtained. Examples
  • Example 1 Synthesis of a cytotoxic conjugate according to the invention
  • Isonicotinic acid (1) (5.00 g; 40.614 mmol; 1.0 eq) was dissolved in thionyl chloride (15 mL; 206.77 mmol; 5.1 eq) and heated to reflux overnight. After returning to ambient temperature, the excess thionyl chloride was removed by evaporation under reduced pressure, then the residue obtained was dissolved in anhydrous dichloromethane (55 mL). The alcohol Benzyl was added (4.2 ml; 40.614 mmol; 1.0 eq) and the mixture was stirred at reflux for 10 h. After returning to ambient temperature, the reaction medium was neutralized with saturated sodium hydrogencarbonate solution and extracted with dichloromethane (3x100 mL).
  • Benzyl isonicotinate (2) (2.48 g; 11.630 mmol; 1.0 eq) was dissolved in methanol (43 mL), stirred at 50 ° C and concentrated sulfuric acid (320 ⁇ L; 6.016 mmol; 0.52 eq) was added.
  • a solution of ammonium persulfate (26,500 g; 116,000 mmol; 10.0 eq) in water (43 mL) was added in two steps: a first rapid addition of 30 drops, a white suspension forms, then in fast drip for 5 min. The reaction races up to 75 ° C, then the resulting yellow solution was stirred at 50 ° C for an additional 1 h. After returning to room temperature, the methanol was evaporated under reduced pressure.
  • 2,6-bis (hydroxymethyl) isonicotinic acid (4) (50 mg; 0.273 mmol; 1 eq) was dissolved in anhydrous A /, A / -dimethylformamide (3.0 mL), the solution was cooled to 0 ° C, then HATU (156 mg; 0.410 mmol; 1.5 eq) and 2,6-lutidine (147.0 ⁇ L; 1.260 mmol; 4.7 eq) were added. The activating solution was stirred at 0 ° C for 15 min then methyl 6-aminohexanoate (59 mg; 0.322 mmol; 1.2 eq) was added.
  • the walls of the flask were rinsed with 2 mL of anhydrous A /, A / -dimethylformamide and the reaction medium was stirred at room temperature for 15 h.
  • the reaction mixture was diluted with ethyl acetate, washed three times with saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • the product was purified by flash chromatography (dichloromethane / methanol, 90:10) to give (5) (76 mg; 91%) as an off-white solid.
  • Antibody used to produce the antibody-drug conjugate according to the invention m906.
  • Bioconjugation buffer 1X saline buffer, for example phosphate, borate, acetate, glycine, tris (hydroxymethyl) aminomethane, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid in a pH range between 6 and 9, with a final NaCl concentration of between 50 and 300 mM and a final concentration of EDTA of between 0.1 and 10 mM.
  • 1X saline buffer for example phosphate, borate, acetate, glycine, tris (hydroxymethyl) aminomethane, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid in a pH range between 6 and 9, with a final NaCl concentration of between 50 and 300 mM and a final concentration of EDTA of between 0.1 and 10 mM.
  • m906 at a concentration of between 1 and 10 mg / mL in the bioconjugation buffer.
  • Reducing agent Solution of a reducing agent chosen from dithiotreitol, b-mercaptoethanol, tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, tris (hydroxypropryl) phosphine at a concentration of between 0.1 and 10 mM in the bioconjugation buffer.
  • a reducing agent chosen from dithiotreitol, b-mercaptoethanol, tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, tris (hydroxypropryl) phosphine at a concentration of between 0.1 and 10 mM in the bioconjugation buffer.
  • Linker solution compound 8 at a concentration of between 0.1 and 10 mM in a mixture of organic solvents chosen from dimethylsulfoxide, A /, A / -dimethylformamide, methanol, tetrahydrofuran, acetonitrile, N, N-dimethylacetamide, dioxane.
  • the reaction mixture was purified on PD-10 (GE Healthcare) with Gibco PBS buffer pH 7.4 the number of times necessary to remove the residual chemical reagents, i.e. purified 3 times.
  • Example 3 analyzes of the antibody-drug conjugate (MF-m906-MMAE)
  • the MF-m906-MMAE ADC was diluted to 1 mg / mL with PBS pH 7.4 before being filtered through 0.22 ⁇ m. 50 ⁇ g of products were injected onto a MAbPac HIC-Butyl column, 5 ⁇ m, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connected to a Waters Alliance HPLC chain (e2695) equipped with a PDA (e2998) set for detection. at 280 nm.
  • MF-m906-MMAE ADC was eluted at a flow rate of 1 mL / min by gradient from 100% buffer A (1.5 M ammonium sulfate, 50 mM sodium phosphate monobasic, 5% isopropanol (v / v), pH 7.0) up to 20% buffer B (50 mM sodium phosphate monobasic, 20% isopropanol (v / v), pH 7.0) in 2 minutes then up to 85% buffer B in buffer A over 30 minutes then this gradient was maintained for 1 min. The temperature was maintained at 25 ° C throughout the separation.
  • the results obtained for MF-m906-MMAE are presented in Figure 1, and in Table 1 below.
  • the MF-m906-MMAE ADC was diluted to 1 mg / mL with PBS pH 7.4 before being filtered through 0.22 ⁇ m. 50 pg of products were injected onto an AdvanceBio SEC 2.7 ⁇ m, 7.8 x 300 mm column (Agilent Technologies), connected to a Waters Alliance HPLC chain (e2695) equipped with a PDA (2998) set for detection at 280 nm.
  • the MF-m906-MMAE ADC eluted at a flow rate of 1 mL / min with isocratic buffer C (1 mM sodium phosphate monobasic, 155 mM sodium chloride, 3 mM sodium phosphate dibasic, 3 mM d (sodium azide, pH 7.0) over 24 minutes. The temperature was maintained at 25 ° C throughout the separation.
  • the mass spectrometric analysis was carried out on a Vion IMS Qtof mass spectrometer coupled to an Acquity UPLC H-Class system from Waters (Wilmslow, UK). Prior to MS analysis, samples (20 ⁇ g) were desalted on a BEH SEC 2.1 x 150 mm 300 ⁇ desalting column by a gradient isocratic (50 mM ammonium acetate, pH 6.5) at 40 pL / min. A bypass valve was programmed to allow solvent to enter the spectrometer for only 6.5-9.5 min. MS data was acquired in positive mode with an ESI source over an m / z range of 500 to 8000 at 1 Hz and analyzed using UNIFI 1.9 software and the MaxEnt algorithm for deconvolution.
  • Example 4 in vitro evaluation of the antibody-drug conjugate MF-m906-MMAE
  • the immunohistochemical labeling with a commercial anti-CD56 antibody (123C3, Ventana, Prediluted) was carried out on a cohort of 90 TLC tumors included in a micro array tissue using a benchMark XT platform following the instructions of the supplier. .
  • CD56 expression was assessed by a person skilled in the art using the following semi-quantitative score: 0: absence of expression, 1: weak and / or heterogeneous positivity; 2: intense and diffuse positivity.
  • the tumor cells were incubated in the presence of an anti-CD56 antibody coupled to FITC (BioLegend, clone: HCD56) or of the control isotype according to the indications provided. by the manufacturer. The cells were then washed twice in PBS + 1% fetal calf serum and then analyzed.
  • FITC BioLegend, clone: HCD56
  • m906 and of trastuzumab were carried out with the m906 antibody used at 650 ng / ml, or the trastuzumab antibody. (Herceptin 150 mg Roche) at 40 ng / ml then revealed using a secondary antibody coupled to peroxidase.
  • WaGa (RRID: CVCL_E998).
  • MS-1 (RRID: CVCL_E995).
  • PeTa (RRID: CVCL_LC73).
  • MKL-2 (RRID: CVCL_D027).
  • the WaGa, MS-1, PeTa and MKL-2 cells are Merkel cell carcinoma cell lines (hereinafter TLC). All of the above lines are CD56-positive ( Figure 4).
  • SK-BR-3 (RRID: CVCL_0033): HER2-positive breast cancer line, chosen as a control because it does not express CD56.
  • the m906 antibody was conjugated with Alexa Fluor 750 using the “SAIVI Rapid Antibody Labeling Kit” (Thermoscientific) according to the instructions given by the manufacturer.
  • the WaGa cells 500,000 cells were incubated for 30 min at room temperature with the m906-Alexa Fluor 750 conjugate in a buffer solution (1X PBS, 2% feta calf serum, 0.1% sodium azide) .
  • the cells were then fixed using BD Cytofix / Cytoperm (BD Biosciences) and permeabilized with Permwash (BD Biosciences, diluted 1/10) according to the manufacturer's instructions.
  • the nuclear and lysosomal compartments were labeled with Hoechst 33342 (BD Pharmigen, 1/10000) and an anti-LAMP1 antibody coupled to phycoerythrin-Cyanine 5 (BD Pharmigen, H4A3), respectively.
  • Analysis of labeled cells was performed using an Amnis ® lmageStream ® X Mark II Imaging Flow Cytometer (Amnis Corp., part of EMD Millipore, Seattle, WA) equipped with 4 lasers (375 nm , 488 nm, 642 nm and 785 nm (SSC)). Images of WaGa were captured with Inspire TM imaging flow cytometry software at 60X magnification and extended depth of field (EDF).
  • EDF extended depth of field
  • the cells of interest were identified using the “Gradient RMS” tool of the Bright Field image (BF: white light). Debris and cell doublets were excluded from analysis based on the aspect ratio to the area plot of the BF image.
  • the area and mean intracellular fluorescence intensity (IMF) of m906 conjugated to Alexa Fluor 750 (channel 12) was evaluated for two different incubation times (5 and 30 min) using the “surface” tools. mask ”and“ cytoplasm mask ”with the IDEAS ® v6.2 software.
  • the internalization score of m906 conjugated to Alexa Fluor 750 (channel 12) was determined using the internalization function to define the ratio of the intensity of intracellular fluorescence to the intensity of whole cells.
  • the co-localization assistant using the 'Bright Detail Similarity' (BDS) function was employed to quantify the level of colocalization between the anti-LAMP1 antibody conjugated to phycoerythrin-Cyanine 5 (channel 5) and m906. conjugated to Alexa Fluor 750 (channel 12).
  • the positive BDS score (n. 1) indicates the lysosomal localization of m906.
  • the anti-CD56 antibody m906 is internalized in the lysosome in the WaGa cells expressing CD56 (Table 5). This is a critical step for drug release from ADC, making m906 a good antibody candidate for ADC development.
  • XTT cytotoxicity test was carried out.
  • the cells were deposited in 7 replicas in a 96-well plate (50,000 cells / well).
  • the MF-m906-MMAE and MF-TTZ-MMAE (ADC control) ADCs were added in incremental concentrations.
  • Culture medium served as a negative control.
  • 25 ⁇ l of XTT reagent was added per well and absorption was measured at 450 nm after 4 hours of incubation at 37 ° C. The absorption at 620 nm was used as a reference.
  • Lentiviral supernatants were produced in HEK293T cells (RRID: CVCL_0063) as previously described [6-7]
  • the harvested supernatant was sterilized by filtration (0.45 ⁇ m) and polybrene was added (1 ⁇ g / ml) before l 'infection.
  • the target cells were washed and then subjected to antibiotic selection (puromycin).
  • antibiotic selection puromycin
  • the cells were exposed to doxycycline for 7 days before analysis.
  • Example 5 in vivo evaluation of the antibody-drug conjugate (MF-m906-MMAE)
  • mice Twenty 7 week old NOD / SCID female mice (Janvier Labs) were maintained under aseptic conditions. All animal related procedures have been approved by the local ethics committee (Apafis-10076- 2017053015488124 v4).
  • the CD56-positive TLC cell line "WaGa" [8] was used for tumor induction.
  • the isoflurane anesthetized mice were injected subcutaneously with 10 7 cells in Matrigel (injection site: back).
  • the size of the tumor determined by measuring the width, length and height with a caliper and the general condition of the animal were monitored every 2 days for the duration of the procedure.
  • the volume of tumor was determined with the following formula width x length x height xw / d. When the tumor volume reached 50 mm 3 , the mice were included in the study and randomly assigned to the experimental or control groups.
  • the animals received an intravenous injection of ADC (either MF-m906-MMAE or MF-TTZ-MMAE, 10 mg / kg) or the injection in equivalent volume of PBS for the control mice.
  • a new injection was given if the tumor volume doubled in the experimental group.
  • Mice were sacrificed 30 days after inclusion or if they reached a critical point (tumor ulceration, 20% weight loss or prostration).
  • An autopsy of the animals was performed and all organs were macroscopically examined by a pathologist. The weight and volume of the tumors were evaluated after dissection. Microscopic examination of tumors, lungs and liver was performed to detect potential metastatic progression.
  • Continuous data are described in averages and limits. Categorical data are described in number and percentage of interpretable cases. Associations were assessed by Fisher's exact test for categorical data or by Mann-Whitney or Kruskall Wallis tests for continuous data. Statistical analyzes were performed using XLStat software (Addinsoft, Paris, France). p ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • MF-m906-MMAE reduced tumor growth in a mouse model of MCC cell line xenograft.
  • FIG. 7 relative tumor volumes
  • FIG. 8 tumor mass at the end study.
  • similar tumor growth was observed, with an average coefficient of slope of the growth curve of 105 % of initial tumor volume per day (limits 35-166) and 108% of initial tumor volume per day (limits 33-318) for the PBS and MF-TTZ-MMAE group, respectively).

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Abstract

L'invention concerne des conjugués anticorps-médicament, et leur utilisation en thérapie, notamment pour traiter les cancers CD56+.

Description

Conjugués anticorps-médicament anti-CD56 et leur utilisation en thérapie
Domaine Technique
[0001] La présente invention concerne des nouveaux conjugués anticorps- médicaments comprenant un anticorps dirigé contre l’antigène CD56 couplé à un médicament cytotoxique et leur utilisation comme médicament, notamment en thérapie anti-cancéreuse.
Technique antérieure
[0002] Un conjugué anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») constitue un moyen de délivrance sélective d'un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués.
[0003] La structure générale d'un conjugué anticorps-médicament est celle de la formule (I). La partie liant l'anticorps et le médicament est appelée bras de liaison ou linker. Il peut être greffé sur l'anticorps via l'une au moins des huit cystéines formant les 4 ponts disulfures inter-chaînes. Le nombre de molécules de médicaments cytotoxiques greffées sur l'anticorps détermine un ratio appelé Drug-to-Antibody Ratio (DAR).
[0004] Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est internalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament cytotoxique est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament cytotoxique actif agit ensuite sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament cytotoxique dans la cellule ciblée.
[0005] Le carcinome à cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané agressif survenant chez le sujet âgé. Jusqu’à récemment, le traitement des patients métastatiques inopérables reposait sur une poly-chimiothérapie à base de sels de platine, sans bénéfice sur la survie. L’utilisation d’une immunothérapie ciblant le PD-L1 (avelumab) en première ligne permet d’obtenir une réponse objective chez environ 50% des patients avec un CCM inopérable avec une réponse durable observée chez la moitié des patients répondeurs. Cependant, la persistance de patients non répondeurs incite à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce contexte, le développement d’une thérapie ciblée dans le CCM semble constituer une stratégie prometteuse.
[0006] Dans ce contexte, le CD56 a été identifié comme une cible thérapeutique fortement exprimée par la majorité des CCM. En effet, le IMGN901 qui est un ADC anti-CD56 couplé à la mertansine (DM1) par une technologie de première génération, inhibe la polymérisation de la tubuline. Une tolérance acceptable de l’IMGN901 a pu être démontrée par plusieurs études de phase I chez les patients avec tumeurs solides exprimant le CD56 dont des cas de CCM. De plus, une étude de phase II a été proposée avec la même molécule dans le carcinome à petites cellules du poumon, en combinaison avec la chimiothérapie (cisplatine étoposide). Cette étude n’a pas montré de bénéfice sur la survie du fait de la survenue fréquente d’effets secondaires dans le groupe traité par IMGN901 et notamment de neutropénie fébrile (infection liée à une diminution des neutrophiles) suggérant une toxicité non spécifique du produit. Il existe donc un besoin de développer des conjugués anti-CD56-médicament cytotoxiques plus homogènes, plus stables et donc plus efficaces et/ou qui génèrent moins d’effets secondaires. De plus, la technologie décrite dans le présent brevet permet de délivrer spécifiquement la molécule cytotoxique aux cellules tumorales tout en limitant son relargage non spécifique dans la circulation limitant de ce fait les toxicités non spécifiques induites par la drogue.
Résumé de l’invention
[0007] Un premier objet de l’invention concerne un conjugué anticorps-médicament de formule (I) suivante : dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d’anticorps anti-CD56 ; la tête d’accroche est représentée par l’une des formules suivantes : le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes : l’espaceur est représenté par la formule suivante : m est un entier allant de 1 à 10 ; n est un entier allant de 1 à 4.
[0008] Un second objet de l’invention concerne une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l’invention.
[0009] Un troisième objet de l’invention concerne un conjugué anticorps-médicament selon l’invention ou une composition selon l’invention, pour utilisation comme médicament. [0010] Un quatrième objet de l’invention concerne un conjugué anticorps- médicament selon l’invention ou une composition selon l’invention, pour utilisation dans le traitement d’un cancer CD56+.
[0011] Un cinquième objet de l’invention concerne un procédé de préparation d’un conjugué anticorps-médicament selon l’invention comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique en couplant une tête d’accroche de formule : dans laquelle : le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes : l’espaceur est représenté par la formule suivante : X est Br, Cl, I ou F ; m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 4 ou 5 ; et
(ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l’étape (i) avec un anticorps anti- CD56 ou un fragment d’anticorps anti-CD56.
[0012] De préférence, le procédé de préparation d’un conjugué anticorps- médicament selon l’invention comprend une étape qui consiste à faire réagir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-/V-hexanamide-valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4- yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de
MMAE avec un anticorps anti-CD56 ou un fragment d’anticorps anti-CD56.
Description détaillée
[00131 Définitions [0014] Le terme « conjugué cytotoxique » désigne un conjugué qui comprend un médicament cytotoxique. Dans le cadre de la présente invention, un conjugué cytotoxique désigne un conjugué de formule (II) suivante : dans laquelle : la tête d’accroche est représentée par l’une des formules suivantes : le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes : l’espaceur est représenté par la formule suivante : X est Br, Cl, I ou F ; m est un entier allant de 1 à 10.
[0015] Le terme « médicament cytotoxique » désigne toute molécule naturelle ou de synthèse, capable d'inhiber ou d'empêcher la fonction et/ou le développement des cellules. On entend par « cytotoxique », la propriété pour un agent chimique ou biologique, d'altérer des cellules, éventuellement jusqu'à les détruire.
[0016] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament cytotoxique est choisi parmi tout composé ayant obtenu une AMM et qui est utilisé en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire, toute molécule en cours d'évaluation clinique en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire. Le médicament cytotoxique sera choisi par exemple parmi le paclitaxel (Taxol®) ou le docetaxel (Taxotère®) ou l'un de ses dérivés, le topotecan, le bortezomib, la daunorubicine, les analogues de daunorubicine, la vincristine, la mitomycine C, l'acide rétinoïque, le méthotrexate, ilomédine, l'aspirine, un IMIDs, le lénalidomide, le pomalidomide. [0017] Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament cytotoxique est sélectionné dans le groupe constitué de la duocarmycine et ses analogues, les dolastatines, la combretastatine et ses analogues, la calichéamicine, la N-acétyl-y-calichéamycine (CMC), un dérivé de calichéamycine, la maytansine et ses analogues, tel qu’un dérivé de type maytansinoïde, par exemple le DM1 et le DM4, les auristatines et leurs dérivés, tels que l'auristatine E, l'auristatine EB (AEB), l'auristatine EFP (AEFP), la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), la tubulysine, le disorazole, les epothilones, l'echinomycine, l'estramustine, la cemadotine, l'eleutherobine, la méthoptérine, l'actinomycine, la mitomycine A, la camptothécine, un dérivé de la camptothécine, le SN38, le TK1, l'amanitine, une pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, une pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un intercalant de l'ADN, un inhibiteur d'histone désacétylase, ou un inhibiteur de tyrosine kinase. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament M est sélectionné parmi l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin, la toxine diphtérique (DT) et la ricine.
[0018] Dans un mode de réalisation particulier, le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calichéamicine, monométhyle auristatine E (MMAE), monométhyle auristatine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazépine, dimère de pyrrolobenzodiazépine, pyrrolopyridodiazépine, dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE, représentée par la formule suivante :
[0019] Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l’invention, le conjugué cytotoxique répond à la formule (lia) suivante ou à la formule (lia’) suivante : [0020] Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N- terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constitué d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1 , CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde.
[0021] Par « anticorps chimérique », on entend un anticorps dont les séquences des régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce non-murine. A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant pas exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon l'invention contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et légères d'origine murine.
[0022] Par « anticorps humanisé », on entend un anticorps dont tout ou partie des séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les régions hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine.
[0023] Par « anticorps humain », on entend un anticorps contenant uniquement des séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes lourdes.
[0024] On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins un pont disulfure, par exemple Fab, Fab’, F(ab')2, Fab'-SFI, scFv-Fc ou Fc.
[0025] La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère deux fragments identiques, qu'on appelle les fragments Fab (Fragment antigen binding), et un fragment Fc (Fragment cristallisable). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SFI fait référence à un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre. Le scFv (single Chain Fragment variable) est un fragment issu de l'ingénierie des protéines qui est constitué uniquement des domaines variables VH et VL. La structure est stabilisée par un court bras peptidique flexible, appelé linker, qui est placé entre les deux domaines. Le fragment scFv peut être lié à un fragment Fc pour donner un scFv-Fc.
[0026] Le terme « CD56 » désigne le « Cluster de Différenciation 56 », qui est une glycoprotéine membranaire membre de la super-famille des immunoglobulines (Ig) contenant 5 domaines de type Ig et deux domaines de type 3 de la fibronectine dans sa partie extracellulaire. Le CD56 est aussi appelé fréquemment « Neural-Cell Adhesion Molécule 1 (NCAM 1) ».
[0027] Le terme « cancer CD56+ » ou « cancer CD56 positif » désigne un cancer exprimant le CD56. En particulier, le terme « cancer CD56+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une expression du CD56. Une expression du CD56 est fréquemment observée dans les carcinomes neuroendocrines, les tumeurs pédiatriques et certaines hémopathies. Elle est également rapportée dans certains mélanomes et sarcomes de tissus mous. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer CD56+ est choisi parmi le mélanome, les tumeurs de blastème, les hémopathies, telles que les leucémies aigues myéloïdes, les myélomes, les néoplasies à cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques et les carcinomes neuroendocrines, tels que le carcinome à petites cellules du poumon et le carcinome à cellules de Merkel. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer CD56+ est un carcinome choisi parmi les carcinomes neuroendocrines, tel que le carcinome à petites cellules du poumon ou le carcinome à cellules de Merkel, de préférence le carcinome à cellules de Merkel.
[0028] Au sens de la présente invention, « l'identité » ou « l’homologie » est calculée en comparant deux séquences alignées dans une fenêtre de comparaison. L'alignement des séquences permet de déterminer le nombre de positions (nucléotides ou acides aminés) en commun pour les deux séquences dans la fenêtre de comparaison. Le nombre de positions en commun est donc divisé par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et multiplié par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité. La détermination du pourcentage d'identité de séquence peut être effectuée manuellement ou grâce à des programmes informatiques bien connus. [0029] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, l’identité ou l’homologie correspond à au moins une substitution, par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 substitutions, d’un résidu d’acide aminé, de préférence au moins une substitution d’un résidu d’acide aminé réalisée de façon conservative. La « substitution d’un résidu d’acide aminé réalisée de façon conservative » consiste à remplacer un résidu d’acide aminé par un autre résidu d’acide aminé, ayant une chaîne latérale possédant des propriétés similaires. Les familles d’acides aminés possédant des chaînes latérales avec des propriétés similaires sont bien connues, on peut citer par exemple les chaînes latérales basiques (ex. lysine, arginine, histidine), les chaînes latérales acides (ex. acide aspartique, acide glutamique), les chaînes latérales polaires et non chargées (ex. glycine, asparagine, glutamine, serine, thréonine, tyrosine, cystéine), les chaînes latérales apolaires (ex. glycine, cystéine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane), les chaînes latérales beta-ramifiées (ex. thréonine, valine, isoleucine) et les chaînes latérales aromatiques (ex. tyrosine, phénylalanine, tryptophane, histidine).
[0030] Les anticorps ou fragments d’anticorps homologues ou « variants d’anticorps ou de fragments d’anticorps » (c’est-à-dire des anticorps ou fragments d’anticorps ayant la même fonction) possèdent donc certains acides aminés qui peuvent être substitués par d’autres acides aminés au niveau des régions constantes et/ou des régions variables, sans perdre la capacité de liaison à l’antigène. Il est préférable que cette substitution soit réalisée au sein de la séquence d’ADN qui code pour l’anticorps ou le fragment d’anticorps, c’est-à-dire que la substitution soit conservative en nature. L’Homme du métier utilise ses connaissances générales pour déterminer le nombre de substitutions qui peuvent être réalisés et leur localisation afin de pouvoir conserver la fonction de l’anticorps ou du fragment d’anticorps. Afin de déterminer la capacité d’un ou plusieurs variants d’anticorps ou de fragment d’anticorps à se lier spécifiquement à un antigène, plusieurs méthodes appropriées, bien connues de l’homme du métier et décrites dans l’art antérieur, peuvent être utilisées. Les anticorps ou les fragments d’anticorps peuvent donc être testés par les méthodes de liaison, comme par exemple la méthode ELISA, la méthode par chromatographie d’affinité, etc. Les variants d’anticorps ou de fragments d’anticorps peuvent être générés par exemple par la méthode de « phage display » permettant de générer une librairie de phage. Un grand nombre de méthodes sont connues afin de générer une librairie de « phage display » et cibler les variants d’anticorps ou de fragments d’anticorps ayant les caractéristiques fonctionnelles recherchées.
[0031] Par « purifié » et « isolé », on entend, en se référant à un anticorps selon l'invention, que l’anticorps est présent en l'absence substantielle d'autres macromolécules biologiques du même type. Le terme "purifié" tel qu'utilisé ici signifie de préférence au moins 75% en masse, plus préférablement au moins 85% en masse, encore plus préférablement au moins 95% en masse, et le plus préférablement au moins 98% en masse d’anticorps, par rapport à l’ensemble des macromolécules présentes.
[0032] Le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie approuvé par une agence règlementaire fédérale ou d’État ou énuméré dans la pharmacopée américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue, destiné à être utilisé chez les animaux et chez l’homme. Une « composition pharmaceutique » désigne une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, un véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel l'agent thérapeutique est administré. Ces véhicules peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris ceux d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc. L'eau est un véhicule préféré lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie intraveineuse. Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en particulier pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires. Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par exemple de l'amidon de maïs prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de l'hydroxypropyl méthylcellulose); des charges (par exemple du lactose, de la cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par des procédés bien connus dans l’état de la technique. Les préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule approprié avant utilisation. De telles préparations liquides peuvent être préparées par des moyens classiques avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des dérivés de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple des p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique). Les compositions pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas. La composition selon l'invention est de préférence une composition pharmaceutique.
[0033] Le terme « traiter » ou « traitement » englobe tout effet bénéfique ou souhaitable sur une pathologie ou un état pathologique, et peut même inclure une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie ou de l'état pathologique. Le traitement peut par exemple impliquer soit la réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état pathologique. Le terme « traitement » ne signifie pas nécessairement l'éradication complète ou la guérison de la pathologie, ni des symptômes associés.
[0034] On entend par « spectrométrie de masse native » une analyse de spectrométrie de masse réalisée dans des conditions ne dénaturant pas les protéines, permettant ainsi de conserver les liaisons non-covalentes. Des procédés de spectrométrie de masse native sont largement décrits dans la littérature, par exemple dans la référence [4]
[0035] Conjugué anticorps-médicament
[0036] L’invention concerne un conjugué anticorps-médicament de formule (I) suivante : dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d’anticorps anti-CD56 ; la tête d’accroche est représenté par l’une des formules suivantes : le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes : l’espaceur est représenté par la formule suivante : m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 4 ou 5 ; n est un entier allant de 1 à 4.
[0037] L’anticorps ou le fragment d’anticorps anti-CD56 selon l’invention peut être d’origine mammifère (ex. humain ou de souris), humanisé ou chimérique. Il s’agit de préférence d’un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement décrites dans l’art antérieur.
[0038] Lorsque A est un anticorps anti-CD56, il s’agit de préférence d’une IgG, par exemple lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4.
[0039] Dans un mode de réalisation particulier, A est un anticorps ou un fragment d’anticorps anti-CD56 qui comprend :
- un domaine variable d’une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 1, un CDR2 de séquence en acides aminés SEQ ID NO: 2, et un CDR3 de séquence en acides aminés SEQ ID NO: 3 ; et
- un domaine variable d’une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 4, un CDR2 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 5, et un CDR3 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 6.
[0040] Dans ce mode de réalisation particulier, le domaine variable de chaîne légère présente au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 15 ; et le domaine variable de chaîne lourde présentant au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 16. [0041] Ainsi, A peut être un anticorps ou un fragment d’anticorps de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 15 pour le domaine variable de la chaîne légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 16 pour le domaine variable de la chaîne lourde. [0042] Dans un mode de réalisation particulier, A est un anticorps de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 pour la chaîne légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 pour la chaîne lourde. La chaîne lourde de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 peut également présenter une lysine additionnelle en position C terminal. [0043] Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, A est l’anticorps décrit sous la référence m906 dans la demande US 2018/0214568 A1 et dans référence [1]. L’anticorps m906 est un anticorps anti-CD56 chimérique de type lgG1 de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 pour la chaîne légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 pour la chaîne lourde. [0044] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l’invention a l’une des formules suivantes
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque A est m906, le conjugué anticorps-médicament de l’invention a la formule (la) suivante ou a la formule (la’) suivante : [0045] Le conjugué anticorps-médicament identifié dans les exemples sous la référence « MF-m906-MMAE » correspond à un conjugué anticorps-médicament de formule (la). « m906 » correspond à l’anticorps m906, c’est-à-dire un anticorps anti-CD56 humain de type lgG1 de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 pour la chaîne légère et de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8 pour la chaîne lourde.
[0046] Avantageusement, le conjugué anticorps-médicament selon l’invention est purifié (ou isolé) en mettant en œuvre des techniques de purification connues, telle que la purification sur colonne de chromatographie et / ou d’affinité.
[0047] Lorsque n est égal à 1, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR1 ». Lorsque n est égal à 2, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR2 ». Lorsque n est égal à 3, le conjugué anticorps- médicament est communément appelé « DAR3 ». Lorsque n est égal à 4, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR4 ».
[0048] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament présente une ou plusieurs fonctions effectrices médiées par la partie Fc atténuée. De préférence, la ou les fonctions effectrices médiées par la partie Fc est/sont choisies parmi l’ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) et la CDC (Complement-dependent cytotoxicity). L’Homme du métier n’aura aucune difficulté à atténuer une ou plusieurs fonctions effectrices médiées par la partie Fc au regard de l’enseignement de l’art antérieur, par exemple en mutant la partie Fc. De nombreuses mutations sont connues pour diminuer les fonctions effectrices médiées par la partie Fc. Il peut s’agir par exemple d’une mutation visant à déglycosyler de la partie Fc, notamment à supprimer la glycosylation au niveau de l’asparagine 297.
[0049] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament est déglycosylé au niveau de la partie Fc, par exemple le conjugué anticorps- médicament ne porte plus de glycosylation au niveau de l’asparagine 297.
[0050] Composition
[0051] L’invention concerne également une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de formule (I), par exemple de formule (la) ou de formule (la’), tel que défini ci-dessus. Il peut s’agir d’une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de formule (I) tel que défini ci-dessus, par exemple de formule (la) ou de formule (la’), et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
[0052] La composition selon l’invention a la caractéristique d’être particulièrement homogène, ce qui peut se traduire par une meilleure stabilité, une meilleure efficacité et/ou une diminution des effets secondaires de la composition, par rapport à une composition qui n’est pas homogène.
[0053] Avantageusement, lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition selon l’invention se caractérise par les caractéristiques suivantes : a) au moins 50%, de préférence au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4 ; b) le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3 et 4,5, de préférence compris entre 3,5 et 4, entre 3,7 et 4, entre 3,8 et 4, par exemple égal à 3,9 ± 0,1 , par exemple égal à 3,89. Le DAR moyen est généralement déterminé par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native. La méthode HIC et la méthode de spectrométrie de masse native sont largement décrites dans la littérature. Il peut être cité par exemple la référence [3] pour la méthode HIC et la référence [4] pour la méthode de spectrométrie de masse native ; c) au moins 95%, de préférence au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% des conjugués anticorps-médicament sont présents sous forme de monomère. Le pourcentage de monomère est généralement déterminé par la méthode SEC (Size Exclusion Chromatography). La méthode SEC est largement décrite dans la littérature, par exemple dans la référence [2] ; d) un ou plusieurs des ratios de n définis ci-après ; ou e) une combinaison de deux, trois ou quatre caractéristiques choisies parmi a), b, c) et d).
[0054] Lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition selon l’invention peut se caractériser par des ratios de n ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,2%, moins de 0,1%, par exemple environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1,
- moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 25%, moins de 20%, moins de 18%, moins de 17% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 56%, au moins 57%, au moins 58%, au moins 59%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins 71%, au moins 72%, au moins 73%, au moins 74% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0055] Lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition selon l’invention peut également se caractériser par des ratios de n ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1% des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- entre 0% et 10%, entre 0% et 7%, entre 0% et 6%, entre 3% et 6%, entre 5% et 6%, entre 0% et 5%, entre 0% et 4%, entre 0% et 3%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 25%, entre 5% et 20%, entre 10% et 20%, entre 15% et 17% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 85%, entre 50% et 80%, entre 50% et 75%, entre 70% et 85%, entre 70% et 80%, entre 70% et 75%, entre 50% et 60%, entre 55% et 60%, des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0056] Les ratios de n peuvent être déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0057] Dans un premier mode de réalisation particulier, lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition selon l’invention peut se caractériser par des ratios de n déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,2%, moins de 0,1% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1,
- moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, par exemple environ 5,5% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 25%, moins de 20%, moins de 18%, moins de 17%, par exemple environ 16% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 56%, au moins 57%, au moins 58%, au moins 59%, par exemple environ 60% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0058] Ainsi, lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition selon l’invention peut également se caractériser par des ratios de n déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1% des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 1 ,
- entre 0% et 10%, entre 0% et 7%, entre 0% et 6%, entre 3% et 6%, entre 5% et 6% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 25%, entre 5% et 20%, entre 10% et 20%, entre 15% et 17% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 75%, entre 50% et 60%, entre 55% et 60%, des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0059] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition selon l’invention peut se caractériser par des ratios de n déterminés par spectrométrie de masse native ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,2%, moins de 0,1%, par exemple environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1,
- moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, par exemple environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2,
- moins de 25%, moins de 20%, moins de 18%, moins de 17% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou
- au moins 50%, au moins 55%, au moins 56%, au moins 57%, au moins 58%, au moins 59%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins 71%, au moins 72%, au moins 73%, au moins 74% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0060] Ainsi, lorsque A est un anticorps, par exemple m906, la composition selon l’invention peut également se caractériser par des ratios de n déterminés par spectrométrie de masse native ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1 %, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1% des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 1 , - entre 0% et 10%, entre 0% et 7%, entre 0% et 6%, entre 0% et 5%, entre 0% et 4%, entre 0% et 3%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1% des conjugués anticorps- médicament de la composition ont un n égal à 2,
- entre 0% et 25%, entre 5% et 20%, entre 10% et 20%, entre 15% et 17% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et
- entre 50 et 85%, entre 50% et 80%, entre 50% et 75%, entre 70% et 85%, entre 70% et 80%, entre 70% et 75% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4. Lorsque A est un anticorps, la composition selon l’invention peut également comprendre des DARO, c’est-à-dire des anticorps sans conjugué cytotoxique. De préférence, moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,5%, moins de 0,4%, moins de 0,2%, moins de 0,1% de DARO, par exemple environ 0% de DARO. Le pourcentage de DARO peut être déterminé par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0061] La composition selon l’invention peut également comprendre des DAR5, c’est-à-dire des conjugués anticorps-médicament ayant 5 conjugués cytotoxiques. De préférence, moins de 25%, moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins de 5% de DAR5. La présence de DAR5 dans des compositions de conjugués anticorps-médicament est largement décrite dans la littérature, néanmoins la structure exacte des DAR5 est peu étudiée. Ainsi, le DAR moyen est calculé en tenant compte de l’ensemble des DARs présents dans la composition, c’est-à- dire les DARO, les DAR1 (i.e. n=1), les DAR2 (i.e. n=2), les DAR3 (i.e. n=3), les DAR4 (i.e. n=4), les DAR5, etc. De préférence, lorsque A est un anticorps, la composition selon l’invention ne comprend pas de DAR supérieur à DAR5, par exemple DAR6, DAR7, etc. Les pourcentages de DAR5 et plus peuvent être déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native. Dans un mode de réalisation très particulier, la composition selon l’invention présente le profil HIC de la Figure 1 ou le profil de spectrométrie de masse native de la Figure 3. [0062] Utilisation thérapeutique
[0063] L’invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de formule (I) selon l’invention ou une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament de formule (I) selon l’invention pour utilisation comme médicament, par exemple pour utilisation dans le traitement d’un cancer CD56+, tel que le mélanome, les tumeurs de blastème, les hémopathies, telles que les leucémies aigues myéloïdes, les myélomes, les néoplasies à cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques et les carcinomes neuroendocrines. Avantageusement, le cancer CD56+ est choisi parmi les carcinomes neuroendocrines, tel que le carcinome à petites cellules du poumon ou le carcinome à cellules de Merkel, de préférence le carcinome à cellules de Merkel.
[0064] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l’invention est de préférence formulé pour une administration parentérale, par exemple une administration intravasculaire (intraveineuse ou intra-artérielle), intrapéritonéale ou intramusculaire. Le terme « administré par voie parentérale », tel qu'utilisé ici, désigne des modes d'administration autres que l'administration entérale et topique, généralement par injection, et comprend, sans limitation, l’administration intravasculaire, intraveineuse, intramusculaire, intra-artérielle, intrathapsale, intracapsulaire, intraorbitaire, intratumorale, intracardiaque, intradermique, intra péritonéale, par injection, perfusion transtrachéale, sous-cutanée, intra- articulaire, sous-capsulaire, sous-arachnoïdienne, intraspinale et intrasternale. L’administration par voie intraveineuse est préférée dans le cadre de la présente invention, par exemple par perfusion intraveineuse.
[0065] La dose de conjugué anticorps-médicament administrée à un sujet qui en a besoin variera en fonction de plusieurs facteurs, y compris, sans limitation, la voie d'administration, le type et la gravité de la pathologie traitée, l’état du patient, la corpulence du patient, l'âge du patient, etc. L'Homme du métier peut facilement déterminer, sur la base de ses connaissances dans ce domaine, la plage posologique requise en fonction de ces facteurs et d'autres. La dose appropriée peut également être déterminée avec des modèles animaux ou avec des essais cliniques. Par exemple, les doses typiques de conjugué anticorps- médicament selon l’invention peuvent être de 5 mg/m2 à 250 mg/m2, par exemple de 30 mg/m2à 150 mg/m2, de 5 mg/m2 à 75 mg/m2, de 75 mg/m2à 120 mg/m2, par exemple égale à 100 mg/m2, 75 mg/m2, 60 mg/m2. L’administration peut se faire en une seule fois ou, plus généralement, en plusieurs fois. Le schéma d’administration peut comprendre une dose de charge initiale puis des doses d’entretien, par exemple hebdomadaires, toutes les 2 semaines, toutes les trois semaines, tous les mois, ou plus. La durée de traitement peut varier selon la pathologie traitée et le sujet.
[0066] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l’invention peut être utilisé en monothérapie ou en association avec des médicaments dont l’intérêt thérapeutique est reconnu dans la pathologie considérée. Il peut s’agir par exemple du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du cyclophosphamide, du lenalidomide, de la dexamethasone, du carboplatine, de l’etoposide, ou d’un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu’un anti-PD1 ou anti-PD-L1.
[0067] La description concerne également une méthode de traitement d’un cancer CD56+ chez un sujet comprenant l’administration au sujet d’une quantité thérapeutique efficace d’un conjugué anticorps-médicament de formule (I) selon l’invention ou d’une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament de formule (I) selon l’invention.
[0068] Procédé de préparation
La description concerne également un procédé de préparation d’un anticorps- médicament de formule (I) tel que défini ci-dessus, dans lequel on fait réagir un conjugué cytotoxique de formule (II) suivante : tel que défini ci-dessus, avec un anticorps ou un fragment d’anticorps anti-CD56 tel que défini ci-dessus.
[0069] L’invention concerne un procédé de préparation d’un conjugué anticorps- médicament selon l’invention comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique en couplant une tête d’accroche de formule : avec un composé de formule dans laquelle : le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes : l’espaceur est représenté par la formule suivante : X est Br, Cl, I ou F ; m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 4 ou 5 ; et
(ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l’étape (i) avec un anticorps anti- CD56 ou un fragment d’anticorps anti-CD56.La tête d’accroche est décrite plus en détail dans la définition de « conjugué cytotoxique » et dans la partie « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus, à la différence que la tête d’accroche mise en œuvre dans le procédé comprend une fonction acide carboxylique terminale.
[0070] Le bras de liaison est décrit plus en détail dans la définition de « conjugué cytotoxique » et dans la partie « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus, à la différence que le bras de liaison mise en œuvre dans le procédé comprend une fonction amine terminale.
[0071] L’espaceur est décrit plus en détail dans la définition de « conjugué cytotoxique » et dans la partie « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus.
[0072] Le médicament cytotoxique est décrit plus en détail dans la définition de « conjugué cytotoxique » et dans la partie « conjugué anticorps-médicament » ci- dessus.
[0073] L’anticorps anti-CD56 est décrit plus en détail dans la définition de « conjugué cytotoxique » et la partie « conjugué anticorps-médicament » ci-dessus.
[0074] Lorsque le médicament cytotoxique est MMAE, l’étape (i) permet d’obtenir un conjugué cytotoxique de formule (lia) ou (lia’).
[0075] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d’un conjugué cytotoxique selon l’étape (i) comprend une étape qui consiste à coupler de l’acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque ou de l’acide 6- ((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoïque avec le valine- citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE ou un sel de ce composé. Dans ce mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d’un conjugué cytotoxique selon l’invention permet d’obtenir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin- 4-yl)amido-/V-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanamide- valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE, respectivement .
[0076] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d’un conjugué anticorps-médicament selon l’invention comprend une étape qui consiste à faire réagir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-/V- hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE ou du 6- ((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p- aminobenzoyle carbamate de MMAE avec un anticorps anti-CD56 ou un fragment d’anticorps anti-CD56.
Brève description des figures [0077] [Fig. 1] représente le profil HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) d’une composition de conjugué anticorps-médicament selon l’invention. La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec plus de 50% de DAR4.
[0078] [Fig. 2] représente une analyse SEC (Size Exclusion Chromatography) d’une composition de conjugué anticorps-médicament selon l’invention. La figure montre que la composition est extrêmement homogène, avec plus de 99% de monomère.
[0079] [Fig. 3] représente une analyse spectrométrique de masse native sur un spectromètre de masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H- Class de Waters (Wilmslow, UK) d’une composition de conjugué anticorps- médicament selon l’invention. Cette méthode permet d’identifier avec certitude chaque espèce de DAR. La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec près de 75% de DAR4.
[0080] [Fig. 4] représente l’expression du CD56 sur différentes lignées cellulaires (4 de CCM et une lignée contrôle de cancer du sein) par cytométrie en flux après incubation avec l’anticorps anti-CD56 marqué avec le fluorophore FITC (Fluorescein IsoThioCyanate).
[0081] [Fig. 5A], [Fig 5B], [Fig 5C], [Fig 5D], [Fig 5E] représentent l’évaluation des performances de l’ADC MF-m906-MMAE, comparées aux contrôles m906 (anticorps non couplé), MF-TTZ-MMAE (ADC Trastuzumab couplé à MMAE) et MMAE (toxine seule) sur les lignées cellulaires de CCM (Figure 5A : WaGa, Figure 5B : PeTa, Figure 5C : MS-1 et Figure 5D : MKL-2) et de cancer du sein (Figure 5E : SK-BR3). Les expériences ont été réalisées de façon indépendante deux fois (6 réplicats biologiques/expérience). Les résultats sont exprimés en moyenne (+/-SEM) du pourcentage obtenu. [0082] [Fig. 6A-6C] représente l’évaluation de la spécificité de MF-m906-MMAE dans les lignées WaGa après knock-down du CD56. Les cellules WaGa ont été transduites indépendamment avec des vecteurs lentiviraux contenant deux shRNA distincts inductibles par doxycycline (Dox) (A, B et C) et ciblant les séquences du CD56. Après sélection antibiotique (puromycine), les cellules ont été exposées à la doxycycline pendant 7 jours avant évaluation. (A-B-C) : Confirmation du knock-down du CD56 par RT- qPCR en temps réel (A) (*: p<0.05, les cellules contrôles sans doxycycline sont utilisées en tant que référence), par Western blot (masse atténué du CD56 = 140 KDa) (B). (C) Évaluation de l’effet cytotoxique de MF-m906-MMAE sur les cellules exprimant le CD56 (-Dox) ou non (+Dox) en utilisant trois shRNA différents (Sh RNA A, Sh RNA B et Sh RNA C). Les expériences ont été réalisées de façon indépendante deux fois (6 réplicats biologiques/expérience). Les résultats sont exprimés en moyenne (+/-SEM) du pourcentage obtenu.
[0083] [Fig. 7] illustre l’évaluation des performances du conjugué MF-m906-MMAE et des contrôles (PBS et MF-TTZ-MMAE un ADC Trastuzumab couplé à MMAE) en modèle xénogreffes de CCM. La Figure 7 représente les courbes de volume tumoral relatif (moyenne +/-SEM) durant l’étude. Les volumes tumoraux relatifs (VTR) sont calculés en utilisant comme référence le volume tumoral de début d’étude (Volume à jO =100%). Chaque point représente la moyenne de VTRs pour les groupes traités par le MF-m906-MMAE, le MF-TTZ-MMAE et le PBS, les flèches grises indiquent les temps d’injections.
[0084] [Fig. 8] illustre l’évaluation des performances du conjugué MF-m906-MMAE et des contrôles (PBS et MF-TTZ-MMAE un ADC Trastuzumab couplé à MMAE) en modèle xénogreffes de CCM. La figure 8 représente le poids des tumeurs en fin d’étude dans le groupe expérimental et les groupes contrôles (*: p <0.05). Les lignes horizontales sont les moyennes, les quartiles et les limites.
[0085] [Fig. 9] représente l’évaluation des performances de l’ADC MF-m906-MMAE, comparée aux contrôles m906 (anticorps non couplé), MF-TTZ-MMAE (ADC Trastuzumab couplé à MMAE) et MMAE (toxine seule) sur la lignée cellulaire de carcinomes à petites cellules du poumon H69. Les expériences ont été réalisées de façon indépendante trois fois (6 réplicats biologiques/expérience). Les résultats sont exprimés en moyenne (+/-SEM) du pourcentage obtenu. Exemples
[0087] Exemple 1 : synthèse d’un conjugué cytotoxique selon l’invention
Schéma réactionnel général
(a) BnOH, SOCI2, DCM, 18h, 75 °C; (b) APS, MeOH, H20, H2S04, 1h, 50 °C; (c) H2, Pd/C, MeOH, 2h, TA; (d) HATU, 2,6-lutidine, DMF, H2N-(CH2)5-COOMe, 15h, 0 °C, puis TA; (e) PBr3, MeCN, 2h, 45 °C; (f) LiOH, THF, H20, 8,5h, TA; (g) EEDQ, DIPEA, DMF, MeCN, H2N-VCPABC-MMAE, 2h20, 25 °C.
[0088] Schéma réactionnel détaillé
[0089] Préparation de l’isonicotinate de benzyle (2)
[0091] L’acide isonicotinique (1) (5,00 g ; 40,614 mmol ; 1,0 eq) a été solubilisé dans le chlorure de thionyle (15 mL ; 206,77 mmol ; 5,1 eq) et chauffé à reflux pendant la nuit. Après retour à température ambiante, l’excès de chlorure de thionyle a été éliminé par évaporation sous pression réduite, puis le résidu obtenu a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (55 mL). L’alcool benzylique a été additionné (4,2 ml_ ; 40,614 mmol ; 1 ,0 eq) et le mélange a été agité à reflux pendant 10 h. Après retour à température ambiante, le milieu réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée d’hydrogénocarbonate de sodium et extrait avec du dichlorométhane (3x100 mL). Les phases organiques ont été rassemblées, lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit obtenu a été purifié par chromatographie flash (Si02, cyclohexane/acétate d’éthyle 50:50) pour donner (2) (6,97 g ; 80%) sous la forme d’une huile incolore.
[0092] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 8,80 (dd ; J = 6,1 ; 1 ,6 Hz ; 2H1 5), 7,86 (dd ; J = 6,1 ; 1 ,6 Hz, 2H2,4), 7,56 - 7,29 (m ; 5H9-I3), 5,39 (s ; 2H7).
[0093] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 165,0 (1C6) ; 151 ,3 (20^) ; 137,2 (1C3) ; 136,1 (1C8) ; 129,0 (2CIO,I2) ! 128,8 (1Cn) ; 128,6 (2C9,I3) ; 123,0 (2C2,4) ; 67,4 (1 C7).
[0094] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour Ci3HnN02 [M] : 213,0790 ; observée 213,0796.
[0095] Préparation de 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (3)
[0097]L’isonicotinate de benzyle (2) (2,48 g ; 11 ,630 mmol ; 1 ,0 eq) a été solubilisé dans le méthanol (43 mL), agité à 50 °C et de l’acide sulfurique concentré (320 pL ; 6,016 mmol ; 0,52 eq) a été ajouté. Une solution de persulfate d’ammonium (26,500 g ; 116,000 mmol ; 10,0 eq) dans l’eau (43 mL) a été ajoutée en deux étapes : un premier ajout rapide de 30 gouttes, une suspension blanche se forme, puis en goutte à goutte rapide pendant 5 min. La réaction s’emballe jusqu’à 75°C, puis la solution jaune obtenue a été agitée à 50°C pendant 1 h supplémentaire. Après retour à température ambiante, le méthanol a été évaporé sous pression réduite. 50 mL d’acétate d’éthyle ont été ajoutés et le milieu a été neutralisé par ajout d’une solution saturée d’hydrogénocarbonate de sodium. La phase aqueuse a été extraite avec de l’acétate d’éthyle (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (Si02, dichlorométhane/méthanol, 95:5) pour donner (3) (1 ,56 g ; 49%) sous la forme d’un solide beige.
[0098] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 7,81 (s; 2H2,4) ; 7,55 - 7,32 (m ; 5H9-I3) ; 5,60 (t ; J= 5,9 Hz ; 2H15,I7) ! 5,40 (s ; 2H7) ; 4,59 (d ; J = 5,9 Hz ; 4H14,I6).
[0099] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 165,0 (1C6) ; 162,8 (2C1 ,5) ; 138,0 (1C3) ; 135,7 (1C8) ; 128,6 (2C10,12) ; 128,4 (1C11) ; 128,3 (2C9,13) ; 117,0 (2C2,4) ; 66,9 (1C7) ; 63,9 (2C14,16).
[0100] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour Ci5H-i5N04 [M] : 273,1001 ; observée 273,1001.
[0101] Préparation de l’acide 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinique (4)
[0102] Le 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (3) (1 ,33 g ; 4,867 mmol ; 1 ,0 eq) a été dissous dans le méthanol (50 mL) et la solution a été dégazée avec de l’argon pendant 15 min. Du palladium sur charbon 10% wt (133 mg) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante sous atmosphère d’hydrogène pendant 2 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur dicalite (rinçage méthanol). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (4) (849 mg ; 95%) sous la forme d’un solide beige.
[0103] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d 7,78 (s ; 2H24) ; 5,54 (s large ; 2H9,n) ; 4,59 (s ; 4H8,IO). [0104] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 166,7 (1C6) ; 162,5 (2CI ,5) ; 139,4 (1C3) ; 117,3 (2C2,4) ; 64,0 (2C8,io).
[0105] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C8H9N04[M] : 183,0532 ; observée 183,0526. [0106] Préparation du 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (5)
[0108] L’acide 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinique (4) (50 mg ; 0,273 mmol ; 1 eq) a été dissous dans le A/,A/-diméthylformamide anhydre (3,0 mL), la solution a été refroidie à 0°C, puis le HATU (156 mg ; 0,410 mmol ; 1,5 eq) et la 2,6- lutidine (147,0 pL ; 1,260 mmol ; 4,7 eq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée à 0°C pendant 15 min puis le 6-aminohexanoate de méthyle (59 mg ; 0,322 mmol ; 1 ,2 eq) a été ajouté. Les parois du ballon ont été rincées avec 2 mL de A/,A/-diméthylformamide anhydre et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 h. Le mélange réactionnel a été dilué dans l’acétate d’éthyle, lavé à trois reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (5) (76 mg ; 91%) sous la forme d’un solide blanc cassé.
[0109] RMN 1 H (300 MHz, DMSO) d 8,79 (t ; J = 5,6 Hz ; 1 H7) ; 7,71 (s ; 2H2,4) ; 5,50 (t ; J= 5,8 Hz ; 2H16,IS) ; 4,57 (d ; J= 5,8 Hz ; 4H15,i7) ! 3,57 (s ; 3H14) ; 3,25 (m ; 2H8) ; 2,30 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H12) ; 1 ,62 - 1 ,45 (m ; 4H9,n) ; 1 ,37 - 1 ,21 (m ; 2H10). [0110] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 173,3 (1Ci3) ; 165,1 (1C6) ; 161,8 (2^) ; 142,9 (1 C3) ; 115,8 (2C2,4) ; 64,1 (2CI5,I7) ; 51 ,2 (1 Ci4) ; 38,5 sous le DMSO (1 C8) ; 33,2 (1C12) ; 28,6 (1C9) ; 25,9 (1Cn) ; 24,2 (1C10).
[0111] SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour Ci5H22N205 [M] : 310,1529 ; observée 310,1526.
[0112] Préparation du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (6)
[0114] Le 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (5)
(55 mg ; 0,177 mmol ; 1 eq) a été mis en suspension dans l’acétonitrile anhydre (10,5 mL) puis le tribromure de phosphore (50 pL ; 0,532 mmol ; 3,0 eq) a été ajouté goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à 45 °C pendant 2 h. La solution a été refroidie à 0°C, neutralisée avec de l’eau (10 mL) et extraite à l’acétate d’éthyle (3x15 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (Si02, cyclohexane/acétate d’éthyle 60:40) pour donner (6) (57 mg ; 74%) sous la forme d’un solide blanc.
[0115] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) d 8,83 (t, J= 5,6 Hz ;1H7) ; 7,84 (s ; 2H24) ; 4,74 (s ; 4H15,I6) ! 3,57 (s, 3H14) ; 3,31 - 3,20 (m ; 2H8) ; 2,31 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H12) ; 1 ,64 - 1 ,45 (m ; 4H9,n) ; 1 ,39 - 1 ,22 (m, 2H10).
[0116] RMN 13C (75 MHz, DMSO) d 173,3 (1C13) ; 163,8 (1C6) ; 157,5 (20^) ; 144,2 (1C3) ; 120,8 (2C2,4) ; 51 ,2 (1Ci4) ; 38,9 sous le DMSO (1C8) ; 34,1 (2CI5,I6) ; 33,2 (1Ci2) ; 28,5 (1C9) ; 25,9 (1Cn) ; 24,2 (1Cio).
[0117] SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour Ci5H2oBr2N203 [M] : 433,9841 observée 433,9832. [0118] Préparation de l’acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4- yl)amidohexanoïque (7)
[0120] Le 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (6) (57 mg ; 0,131 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane (4 mL) et une solution d’hydroxyde de lithium hydraté (8 mg ; 0,327 mmol ; 2,5 eq) dans l’eau (4 mL) a été ajoutée doucement. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 8,5 h. Le tétrahydrofurane a été évaporé sous pression réduite et le résidu aqueux a été traité avec une solution aqueuse d’acide chlorhydrique 1N et extrait avec de l’acétate d’éthyle (3x10 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (7) (44 mg ; 80%) sous la forme d’un solide blanc.
[0121] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) d 12,00 (s ; 1H14) ; 8,83 (t ; J = 5,5 Hz ; 1H7) ; 7,84 (s ; 2H24) ; 4,74 (s ; 4H15,i7) ! 3,31 - 3,21 (m ; 2H8) ; 2,21 (t ; J = 7,3 Hz ; 2H12) ; 1 ,60 - 1 ,46 (m ; 4H9,n) ; 1 ,39 - 1 ,25 (m ; 2H10).
[0122] RMN 13C (75 MHz ; DMSO) d 174,4 (1C13) ; 163,8 (1C6) ; 157,5 ; 144,1 (1C3) ; 120,8 (2C2,4) ; 39,0 sous le DMSO (1C8) ; 34 ,1 (2C15,I 6) ! 33,6 (1 C12) ;
28,6 (1C9) ; 26,0 (1 Ou) ; 24,2 (1Cio).
[0123] SMHR (ESI) : m/z calculée pour Ci4H19Br2N203 [M+H]+ : 420,9757 ; observée 420,9752. Préparation de 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-/V-hexanamide- valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (8)
[0124] Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 6- (2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque (7) (13,2 mg ; 0,0313 mmol ; 2,28 eq) a été dissous dans l’acétonitrile anhydre (1,2 mL) puis la N- éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ) (21,2 mg ; 0,0857 mmol ; 6,25 eq) a été ajouté. Le milieu d’activation a été agité à 25°C pendant 1 h 20. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline- p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (17,0 mg ; 0,0137 mmol ; 1,0 eq), solubilisé dans du N,N- diméthylformamide anhydre (300 pL) en présence de A/,A/-diisopropyléthylamine (9,4 pL ; 0,0537 mmol ; 3,92 eq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25°C pendant 1 h. Le mélange a été dilué par 2 avec du A/,A/-diméthylformamide et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (ÎR = 22,1 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 pm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1 % d’acide trifluoroacétique (en volume) dans l’eau (solvant A), et de l’acétonitrile (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (8) (18,2 mg ; 87%) sous la forme d’un solide blanc.
[0125] RMN 1H (300 MHz, DMSO) d (ppm) 10,04 - 9,95 (m ; 1H) ; 8,94 - 8,79 (m ; 1 H) ; 8,20 - 8,06 (m ; 2H) ; 7,98 - 7,87 (m ; 1H) ; 7,84 (s ; 2H) ; 7,81 (s ; 1H) ; 7,70 - 7,61 (m ; 1 H); 7,58 (d ; J = 8,2 Hz ; 2H) ; 7,38 - 7,11 (m ; 6H) ; 6,07 - 5,92 (m ; 1 H) ; 5,47 - 5,37 (m ; 1 H) ; 5,15 - 4,96 (m ; 1 H) ; 4,73 (s ; 4H) ; 4,54 - 4,29 (m ; 2H) ; 4,32 - 4,12 (m ; 1 H) ; 4,05 - 3,92 (m ; 1 H) ; 3,30 - 3,08 (m ; 9H) ; 3,06 - 2,93 (m ; 2H) ; 2,91 - 2,77 (m ; 2H) ; 2,24 - 2,05 (m ; 2H) ; 2,21 - 2,11 (m ; 3H) ; 2,02 - 1,88 (m ; 1H) ; 1,60 - 1,44 (m ; 5H) ; 1,36 - 1,13 (m ; 4H) ; 1,08 - 0,93 (m ; 6H) ; 0,93 - 0,67 (m ; 28H).
[0126] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C72HinBr2N120i4 [M+H]+ : 1525,6704 ; observée 1525,6700.
[0127] Exemple 2 : synthèse d’un conjugué anticorps-médicament selon l’invention
[0128] Code du produit synthétisé : MF-m906-MMAE (correspondant à la formule (la), également appelé ci-après « conjugué anticorps-médicament selon l’invention » ou de manière générale « ADC »).
[0129] Anticorps utilisé pour produire le conjugué anticorps-médicament selon l’invention : m906.
[0130] Préparation des solutions
[0131] Tampon de bioconjugaison : Tampon salin 1X, par exemple phosphate, borate, acétate, glycine, tris(hydroxymethyl)aminométhane, acide 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineéthanesulfonique dans une plage de pH comprise entre 6 et 9, avec une concentration finale en NaCI comprise entre 50 et 300 mM et une concentration finale en EDTA comprise entre 0,1 et 10 mM.
[0132] m906 à une concentration comprise entre 1 et 10 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison.
[0133] Réducteur : Solution d’un réducteur choisi parmi le dithiotréitol, le b- mercaptoéthanol, l’hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine, la tris(hydroxypropryl)phosphine à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans le tampon de bioconjugaison.
[0134] Solution de linker : composé 8 à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans un mélange de solvants organiques choisis parmi le diméthylsulfoxide, le A/,A/-diméthylformamide, le méthanol, le tétrahydrofurane, l’acétonitrile, le N,N- diméthylacétamide, le dioxane. [0135] Réaction de bioconiuqaison
[0136] Sous atmosphère inerte, au m906 dans le tampon bioconjugaison (1 mg ; 1 éq) a été ajouté le réducteur (4 à 100 éq) puis le tout a été incubé entre 15 et 40 °C pendant 0,25 à 3 h puis la solution de composé 8 (4 à 100 éq) a été ajoutée sous atmosphère inerte et le milieu réactionnel a été agité entre 15 et 40 °C pendant 0,5 à 15 h. Cette réaction a été dupliquée, en parallèle, autant de fois que nécessaire pour obtenir la quantité d’ADC final souhaitée, i.e. 18 fois.
[0137] Purification de l’ADC
[0138] Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco pH 7,4 le nombre de fois nécessaire pour éliminer les réactifs chimiques résiduels, i.e. purifié 3 fois.
[0139] Résultat
[0140] Les étapes décrites ci-dessus ont permis d’obtenir 12,87 mg de MF-m906- MMAE (71%).
[0141] Exemple 3 : analyses du conjugué anticorps-médicament (MF-m906- MMAE)
[0142] Analyse HIC (Hydrophobie Interaction Chromatoqraphy)
[0143] Matériel et méthode
[0144] L’ADC MF-m906-MMAE a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d’être filtré sur 0,22 pm. 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 pm, 4,6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. L’ADC MF-m906-MMAE a été élué à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu’à 85% de tampon B dans le tampon A en 30 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 1 min. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation. [0145] Les résultats obtenus pour MF-m906-MMAE sont présentés en Figure 1, et dans le Tableau 1 ci-dessous.
[0146] [Table 1] [01471 Analyse SEC (Size Exclusion Chromatoqraphy)
[0148] Matériel et méthode
[0149] L’ADC MF-m906-MMAE a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d’être filtré sur 0,22 pm. 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 pm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaîne HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm. L’ADC MF-m906-MMAE été élué à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d’azoture de sodium, pH 7,0) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
[0150] Les résultats sont présentés à la Figure 2 et dans le Tableau 2 ci-dessous.
[0151] [Table 2]
[0152] Analyse MS native (native Mass Spectrometry) [0153] Matériel et méthode
[0154] L’analyse spectrométrique de masse a été réalisée sur un spectromètre de masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H-Class de Waters (Wilmslow, UK). Avant l’analyse MS, les échantillons (20 ug) ont été dessalés sur une colonne de dessalage BEH SEC 2,1 x 150 mm 300 À par un gradient isocratique (50 mM d’acétate d’ammonium, pH 6,5) à 40 pL/min. Une vanne de dérivation a été programmée pour permettre au solvant d’entrer dans le spectromètre entre 6,5 et 9,5 min seulement. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 500 à 8000 à 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel UNIFI 1.9 et l’algorithme MaxEnt pour la déconvolution.
[0155] Les résultats sont présentés à la Figure 3 et dans le Tableau 3 ci-dessous.
[0156] [Table 3]
1 : glycosylation G0F/G0F 2 : n.o. = non observé
G0F/G0F
[0157] Exemple 4 : évaluation in vitro du conjugué anticorps-médicament MF- m906-MMAE
[0158] 4.1. Reconnaissance des cellules tumorales par le m906 : carcinome à cellules de Merkel
[0159] Immunohistochimie sur tumeurs de patients
[0160] Matériel et méthode
[0161] Le marquage immunohistochimique avec un anticorps commercial anti-CD56 (123C3, Ventana, Prediluted) a été réalisé sur une cohorte de 90 tumeurs CCM incluses dans un tissue micro array en utilisant une plate-forme benchMark XT en suivant les instructions du fournisseur. L’expression du CD56 a été évaluée par un homme du métier en utilisant le score semi-quantitatif suivant : 0 : absence d'expression, 1 : positivité faible et/ou hétérogène ; 2 : positivité intense et diffuse.
[0162] Résultats : De manière générale, 66% des cas étaient positifs (n = 59) avec une expression intense et diffuse (score 2) détectée dans 37% des cas (n = 33).
[0163] Cytométrie en flux et Immunohistochimie sur les lignées de CCM
[0164] Matériel et méthode
[0165] Pour évaluer l’expression du CD56 par les lignées cellulaires, les cellules tumorales ont été incubées en présence d’un anticorps anti-CD56 couplé au FITC (BioLegend , clone : HCD56) ou de l’isotype contrôle selon les indications fournies par le fabricant. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois en PBS + 1% de sérum de veau fœtal puis analysées.
[0166] Pour l’évaluation de la fixation du m906 et du trastuzumab (anticorps anti- HER2 contrôle) sur les cellules tumorales, des marquages immunocytochimiques ont été effectués avec l’anticorps m906 utilisé à 650 ng/ml, ou l’anticorps trastuzumab (Herceptin 150 mg Roche) à 40 ng/ml puis révélés à l’aide d’un anticorps secondaire couplé à la péroxidase.
[0167] Lignées cellulaires testées
[0168] WaGa (RRID:CVCL_E998).
[0169] MS-1 (RRID:CVCL_E995).
[0170] PeTa (RRID:CVCL_LC73).
[0171] MKL-2 (RRID:CVCL_D027).
[0172] Résultats :
[0173] Les cellules WaGa, MS-1, PeTa et MKL-2 sont des lignées cellulaires de carcinome à cellules de Merkel (ci-après CCM). Toutes les lignées ci-dessus sont CD56-positives (Figure 4).
[0174] SK-BR-3 (RRID :CVCL_0033) : lignée de cancer du sein HER2-positive, choisie comme contrôle car n’exprime pas le CD56. [0175] Les fixations du m906 et du trastuzumab (TTZ), inclus comme contrôle, ont été testées sur les lignées par étude immunohistochimique. Cette analyse montrait une fixation du m906 sur l’ensemble des lignées de CCM alors qu’il n’était pas observé de fixation avec le TTZ (Tableau 4 : confirmation de la fixation du m906 sur les lignées de CCM).
[0176] [Table 4]
+ : présence d'une fixation de l'anticorps à la cellule cible révélée par la péroxidase, - absence de fixation
[0177] Cytométrie de flux d'imagerie - m906 et coloration de compartiment intracellulaire et acquisition d'image
[0178] Matériel et méthode
[0179] Pour confirmer son internalisation dans les cellules tumorales, l'anticorps m906 a été conjugué avec l’Alexa Fluor 750 en utilisant le kit “SAIVI Rapid Antibody Labeling Kit” (Thermoscientific) selon les instructions données par le fabricant. Les cellules WaGa (500 000 cellules) ont été incubées pendant 30 min à température ambiante avec le conjugué m906-Alexa Fluor 750 dans une solution tampon (PBS 1X, 2% sérum de veau fêtai, 0,1% d'azide de sodium). Les cellules ont ensuite été fixées à l'aide du BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) et perméabilisées avec du Permwash (BD Biosciences, dilué à 1/10e) selon les instructions du fabricant. Les compartiments nucléaire et lysosomal ont été marqués par le Hoechst 33342 (BD Pharmigen, 1/10000) et un anticorps anti- LAMP1 couplé à la phycoerythrin-Cyanine 5 (BD Pharmigen, H4A3), respectivement. L’analyse des cellules marquées a été réalisée à l'aide d'un cytomètre imageur en flux Amnis® lmageStream®X Mark II (Amnis Corp., une partie d'EMD Millipore, Seattle, WA) équipé de 4 lasers (375 nm, 488 nm, 642 nm et 785 nm (SSC)). Les images des WaGa ont été capturées avec le logiciel de cytométrie de flux d'imagerie Inspire™ au grossissement 60X et avec une profondeur de champ étendue (EDF). [0180] Des compensations ont été réalisées avant chaque analyse. Les cellules d’intérêt ont été identifiées en utilisant l’outil « Gradient RMS » de l'image Bright Field (BF : lumière blanche). Les débris et les doublets cellulaires ont été exclus de l'analyse en fonction du rapport d'aspect par rapport à la parcelle de zone de l'image BF. La surface et l'intensité moyenne de fluorescence intracellulaire (IMF) du m906 conjugué à l'Alexa Fluor 750 (canal 12) a été évaluée pour deux temps d'incubation différents (5 et 30 min) à l'aide des outils « surface mask » et « cytoplasm mask » avec le logiciel IDEAS® v6.2. Le score d'internalisation du m906 conjugué à l’Alexa Fluor 750 (canal 12) a été déterminé en utilisant la fonction d'internalisation permettant de définir le rapport de l'intensité de fluorescence intracellulaire sur l'intensité des cellules entières. Les cellules avec anticorps internalisés ont des scores positifs. L'assistant de co-localisation utilisant la fonction de « similitude de détail lumineux » (BDS) a été employé pour quantifier le niveau de colocalisation entre l’anticorps anti-LAMP1 conjugué à la phycoerythrine-Cyanine 5 (canal 5) et le m906 conjugué à l’Alexa Fluor 750 (canal 12). Le score positif de BDS (n. 1) indique la localisation lysosomale du m906.
[0181] Résultats
[0182] Le m906 anticorps anti-CD56 est internalisé dans le lysosome dans les cellules WaGa exprimant le CD56 (Tableau 5). C’est une étape cruciale pour la libération de drogues par un ADC, ce qui fait du m906 un bon candidat anticorps pour le développement d’un ADC.
[0183] [Table 5]
*1 Mean Fluorescence Intensity *2 Bright Detail Similarity
[0184] 4.2. Cytotoxicité de MF-m906-MMAE sur les lignées in vitro
[0185] Evaluation de la viabilité (test de prolifération) [0186] Matériel et méthode
[0187] Pour évaluer la viabilité cellulaire, un test de cytotoxicité par le XTT a été réalisé. Les cellules ont été déposées en 7 réplicas dans une plaque 96 puits (50 000 cellules/puits). Les ADCs MF-m906-MMAE et MF-TTZ-MMAE (ADC contrôle) ont été ajoutés en concentrations incrémentielles. Le milieu de culture a servi de contrôle négatif. Après 4 jours d’exposition à la drogue, 25 pi de réactif XTT ont été ajoutés par puits et l'absorption a été mesurée à 450 nm après 4 heures d’incubation à 37 °C. L'absorption à 620 nm a été utilisée comme référence.
[0188] Résultats
[0189] L’évaluation de la cytotoxicité sur lignées cellulaires a montré que l’ADC MF- m906-MMAE est aussi cytotoxique que la MMAE libre (IC50 entre 1-10 nM) pour toutes les lignées de CCM. Par ailleurs, ni l’anticorps m906 (i.e. non couplé à MMAE), ni l’ADC MF-TTZ-MMAE (ADC contrôle) n’ont d’effet cytotoxique sur ces mêmes lignées aux plus faibles concentrations efficaces testées démontrant l’absence de toxicité intrinsèque de la construction Figure 5).
[0190] L’évaluation de la cytotoxicité sur la lignée H69 (RRID:CVCL_1579), une lignée cellulaire de carcinome à petites cellules du poumon, a montré que l’ADC MF-m906-MMAE est aussi cytotoxique que la MMAE libre (IC50 entre 1-2 nM). Par ailleurs, ni l’anticorps m906 (i.e. non couplé à MMAE), ni l’ADC MF-TTZ- MMAE (ADC contrôle) n’ont d’effet cytotoxique sur cette lignée aux plus faibles concentrations efficaces testées démontrant l’absence de toxicité intrinsèque de la construction Figure 9).
[0191] 4.3. Confirmation de la spécificité du m906 : L’effet cytotoxique observé est dépendant de CD56 (Figure 6)
[0192] Plasmides et transduction lentivirale
[0193] Matériel et méthode
[0194] Trois shRNA ciblant la séquence du CD56 ont été générés (séquences obtenues à partir du Consortium RNAi (A : TRCN0000373085 (SEQ ID NO 9-10) / B : TRCN0000373034 (SEQ ID NO°11-12) / C : TRCN0000073460 (SEQ ID NO°13-14)) et clonés dans un vecteur lentiviral FHItUTG comme décrit précédemment [5]. À noter, dans cette construction, l'activité du promoteur contrôlant la transcription des séquences de shRNA est inductible par la doxycycline. Les surnageants lentiviraux ont été produits dans les cellules HEK293T (RRID:CVCL_0063) comme précédemment décrit [6-7] Le surnageant récolté a été stérilisé par filtration (0,45 pm) et du polybrène a été ajouté (1pg/ml) avant l'infection. Après 14-20 h d’incubation avec les surnageants contenant les lentivirus, les cellules cibles ont été lavées puis soumises à une sélection antibiotique (puromycine). Pour l’invalidation de l’expression du CD56 dans les lignées tumorales (knock-down), les cellules ont été exposées à la doxycycline pendant 7 jours avant analyse.
[0195] Résultats
[0196] La cytotoxicité induite par MF-m906-MMAE a été largement réduite lors du knock-down du CD56 et ce pour les trois shRNAs (Figure 6) confirmant que la reconnaissance du CD56 par le m906 est essentielle pour induire une cytotoxicité de MF-m906-MMAE.
[0197] Exemple 5 : évaluation in vivo du conjugué anticorps-médicament (MF- m906-MMAE)
[0198] Performances thérapeutiques du m906 dans un modèle de xénogreffe de lignées cellulaires de CCM sur souris NOD/SCID
[0199] Matériel et méthode
[0200] Modèle de souris
[0201] Vingt souris femelles NOD/SCID (Janvier Labs) de 7 semaines ont été maintenues dans des conditions aseptiques. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le comité d'éthique local (Apafis-10076- 2017053015488124 v4). La lignée cellulaire de CCM CD56-positive « WaGa » [8] a été utilisée pour l'induction tumorale. Les souris anesthésiées par l’isoflurane ont reçu une injection sous-cutanée de 107 cellules dans du Matrigel (site d’injection : dos). La taille de la tumeur déterminée en mesurant la largeur, la longueur et la hauteur avec un pied à coulisse et l'état général de l'animal ont été surveillés tous les 2 jours pendant toute la durée de la procédure. Le volume de tumeur a été déterminé avec la formule suivante largeur x longueur x hauteur x p/d. Quand le volume de la tumeur a atteint 50 mm3, les souris ont été incluses dans l'étude et aléatoirement assignées aux groupes expérimentaux ou contrôle.
[0202] Procédure expérimentale
[0203] Après inclusion, les animaux ont reçu une injection intraveineuse d'ADC (soit MF-m906-MMAE, soit MF-TTZ-MMAE, 10 mg/kg) ou l'injection en volume équivalent de PBS pour les souris contrôles. Une nouvelle injection a été exécutée en cas de doublement du volume de la tumeur dans le groupe expérimental. Les souris ont été sacrifiées 30 jours après l'inclusion ou en cas d’atteinte d’un point critique (ulcération tumorale, perte de poids de 20 % ou prostration). Une autopsie des animaux a été réalisée et l’ensemble des organes a été examiné macroscopiquement par un pathologiste. Le poids et le volume des tumeurs ont été évalués après dissection. L'examen microscopique des tumeurs, des poumons et du foie a été réalisé pour détecter une potentielle progression métastatique.
[0204] Analyse statistique
[0205] Des données continues sont décrites en moyennes et limites. Les données catégorielles sont décrites en nombre et pourcentage de cas interprétables. Les associations ont été évaluées par le test exact de Fisher pour les données catégorielles ou par les tests Mann-Whitney ou Kruskall Wallis pour les données continues. Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le logiciel XLStat (Addinsoft, Paris, France). p<0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.
[0206] Résultats
[0207] MF-m906-MMAE a réduit la croissance tumorale dans un modèle murin de xénogreffe de lignées cellulaires de MCC.
[0208] Les résultats de l’administration d’une triple dose de 10 mg/kg de MF-m906- MMAE, MF-TTZ-MMAE ou PBS sont présentés en Figure 7 (volumes tumoraux relatifs) et Figure8 (masse tumorale en fin d’étude). Dans les deux derniers groupes, utilisés comme contrôles, une croissance tumorale similaire a été observée, avec un coefficient moyen de pente de la courbe de croissance de 105 % du volume tumoral initial par jour (limites 35-166) et 108 % du volume tumoral initial par jour (limites 33-318) pour le groupe PBS et MF-TTZ-MMAE, respectivement). Pour le groupe expérimental, traité avec MF-m906-MMAE, la croissance tumorale a été significativement retardée (coefficient moyen de pente de la courbe de croissance de 18 % du volume tumoral initial par jour (limites 1- 53); Test de Kruskal Wallis : p= 0,01). En conséquence, le poids médian final des tumeurs a été réduit dans le groupe traité par MF-m906-MMAE comparé aux animaux témoins (Figure 8) (poids moyen 0,7g (bornes : 0,4-1.3) contre 2,03g (bornes : 1,3-3, 7) et 1,78g (bornes : 1-2,7), test de Kruskal Wallis : p-0.02). Après le sacrifice, aucune métastase n'a été observée dans le groupe expérimental ni dans les groupes contrôles. Aucun signe de toxicité de MF-m906-MMAE n'a été observé sur les tissus non tumoraux prélevés lors de l'autopsie.
Listage de séquences
[Table 6] [0209] Références citées sous le format « [numéro de référence] » :
1. Feng, Y. et al., MAbs, May-Jun; 8(4): 799-810, 2016
2. Goyon, A et al., J. Chromatogr. B, 1065-1066, 35-43, 2017
3. Fekete, S. et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 130, 3-18, 2016 4. Barran, P. et al., EuPA Open Proteomics, 11, 23-27, 2016
5. Flouben, R. et al., International journal of Cancer, 130, 847-856, 2012
6. Angermeyer S. et al., J. Invest. Dermatol., 133(8):2059-2064,2013
7. Aragaki M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 368(4) :923-929, 2008
8. Houben R, et al., J. Virol.\ 84(14):7064-7072, 2010

Claims

REVENDICATIONS
1. Conjugué anticorps-médicament de formule (I) suivante : dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-CD56 ; la tête d'accroche est représentée par l'une des formules suivantes : le bras de liaison est un bras de liaison clivable représenté par la formule suivante : l'espaceur est représenté par la formule suivante : m est un entier allant de 1 à 10 ; n est un entier allant de 1 à 4.
2. Conjugué anticorps-médicament selon la revendication 1 , dans lequel m est égal à 4 ou 5.
3. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate,
IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calicheamicine, monométhylauristatine E (MMAE), monométhylauristatine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE.
4. Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 de formule suivante :
5. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel A est m906.
6. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 de formule (la) suivante : ou de formule (la') suivante :
7. Composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 6.
8. Composition selon la revendication 7, dans laquelle au moins 50%, de préférence environ 60%, des conjugués anticorps-médicament ont un n égal à 4.
9. Composition selon l’une quelconque des revendications 7 ou 8, dans laquelle A est un anticorps et le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4, de préférence compris entre 3,8 et 4, par exemple égal à 3,9 ±0,1.
10. Composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, comprenant en outre du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine et/ou du cyclophosphamide, du lenalidomide, de la dexamethasone, du carboplatine, de l'etoposide et/ou un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu’un anti-PD1 ou un anti-PD-L1.
11. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ou composition selon l’une quelconque des revendications 7 à 10, pour utilisation comme médicament.
12. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ou composition selon l’une quelconque des revendications 7 à 10, pour utilisation dans le traitement d’un cancer CD56+, de préférence le mélanome, les tumeurs de blastème, les hémopathies, telles que les leucémies aigues myéloïdes, les myélomes, les néoplasies à cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques et les carcinomes neuroendocrines.
13. Conjugué anticorps-médicament pour utilisation selon la revendication 12, dans lequel le cancer CD56+ est choisi parmi les carcinomes neuroendocrines, tel que le carcinome à petites cellules du poumon ou le carcinome à cellules de Merkel, de préférence le carcinome à cellules de Merkel.
14. Procédé de préparation d'un conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 comprenant les étapes suivantes : (i) préparer un conjugué cytotoxique en couplant une tête d'accroche de formule : avec un composé de formule dans laquelle : le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
X est Br, Cl, I ou F ; m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 4 ou 5 ; et
(ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un anticorps anti-CD56 ou un fragment d'anticorps anti-CD56. Procédé de préparation d'un conjugué anticorps-médicament selon la revendication 14, comprenant une étape qui consiste à faire réagir du 6-(2,6- bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-ALhexanamide-valine-citrulline- 7- aminobenzoyle carbamate de MMAE ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4- yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline- T-aminobenzoyle carbamate de MMAE avec un anticorps anti-CD56 ou un fragment d'anticorps anti-CD56.
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