PL184031B1 - Koniugat zawierający cząsteczkę kierującą i kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Abstract

1. Koniugat zawierajacy czasteczke kierujaca, która jest przeciwcialo lub fragment przeciwciala zdolne do wiazania sie z antygenem zwiazanym z nowotworem, polaczona z enzymem, znamienny tym, ze jako enzym zawiera zmutowana ludzka rybonukleaze zawierajaca Glu w pozycji 66. 3. Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca substancje czynna i typowe substancje pomocnicze, znamienna tym, ze jako substancje czynna zawiera koniugat zawierajacy czasteczke kierujaca, która jest przeciwcialo lub fragment przeciwciala zdolne do wiaza- nia sie z antygenem zwiazanym z nowotworem, polaczona z enzymem, którym jest zmu- towana ludzka rybonukleaza zawierajaca Glu w pozycji 66. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest koniugat zawierający cząsteczkę kierującą, którą jest przeciwciało lub fragment przeciwciała zdolne do wiązania się z antygenem związanym z nowotworem i kompozycja farmaceutyczna zawierająca taki koniugat.

Wynalazek ma zastosowanie w terapii prolekiem opartej na kierowaniu enzymu przeciwciałami (ADEPT) z użyciem nie występującej naturalnie zmutowanej postaci enzymu gospodarza, zwłaszcza zmutowanych postaci rybonukleazy.

Kierowanie leków tak aby wybiórczo niszczyły komórki nowotworowe w organizmie pacjenta od dawna stanowiło problem. ADEPT jest jednym z podejść w celu przezwyciężenia problemu. ADEPT korzysta z przeciwciała swoistego wobec nowotworu sprzęgniętego z enzymem. Koniugat podaje się pacjentowi (zwykle dożylnie) i pozostawia w celu zlokalizowania w nowotworze i zniknięcia z krążenia. Następnie, podaje się pacjentowi prolek, który ulega przemianie pod wpływem enzymu (zlokalizowanego w pobliżu nowotworu) w lek cytotoksyczny, który niszczy komórki nowotworowe. Ponieważ jedna cząsteczka enzymu może katalizować powstanie wielu cząsteczek leku cytotoksycznego występuje efekt amplifikacji. Ponadto komórki nowotworowe nie wykazujące antygenu rozpoznawanego przez przeciwciało (nowotwory wykazują często mikroheterogenność) są również niszczone enzymatycznie amplifikowanym wytwarzaniem leku cytotoksycznego. W znanym układzie stosuje się jako składnik enzymatyczny prokariotyczną karboksypeptydazę G2 (CPG2) (patrz, WO 88/07378). Wadą układów opartych na enzymach prokariotycznych jest to, że normalna flora jelitowa może zawierać mikroorganizmy zdolne do wyzwalania tworzenia leku cytotoksycznego w sposób nieselektywny. Innym problemem znanych układów jest to, że powtarzane podawanie koniugatu powoduje odpowiedź odpornościową gospodarza czyniącą leczenie mniej skutecznym. Składnik będący przeciwciałem jest zwykle mysim przeciwciałem monoklonalnym, które może być humanizowane z użyciem znanych technik zmniejszających immunogenność. Jednakże, zmniejszenie immunogenności składnika enzymatycznego okazało się bardziej problematyczne. Jest to spowodowane tym, że składnik enzymatyczny nie może być obecny naturalnie w krwiobiegu gospodarza, w przeciwnym wypadku nastąpi przedwczesna konwersja proleku w lek cytotoksyczny i nie będzie obserwowana wybiórcza toksyczność wobec nowotworu. W zgłoszeniu patentowym firmy Akzo, opublikowanym pod numerem WO 90/02939, zaproponowano zastosowanie ludzkich enzymów w technice ADEPT, o selektywności utrzymanej przez dobór

184 031 enzymu ludzkiego nieobecnego normalnie w krwiobiegu, takiego jak lizozym. Według Akzo wybrano lizozym ludzki jako składnik enzymatyczny i z powodu wymagań dotyczących substratu (jako endoglikozydaza wymaga on do cięcia polimerów N-acetylo-glukozaminy (NAGchityny) związanych wiązaniem βι -4) wytwarzane proleki zawierały takie grupy funkcyjne. Aby zapobiec wnikaniu do komórek należało jeszcze opracować oligomer z resztami tauryny - opierając się na kwasach sulfonowych zapobiegających wnikaniu do komórek i zmniejszających cytotoksyczność 20-krotnie - fig. 13 w WO 90/02939.

Zastosowanie do ADEPT enzymu ssaków, takiego jak fosfataza alkaliczna (Senter i in.; USA nr 4,975,278) albo ludzkiego enzymu, takiego jak β-glukuronidaza (Behringwerke DE 42336237), albo lizozymu (WO 90/07929) ma taką zaletę, że enzymy te mają zmniejszoną albo żadną immunogenność w porównaniu z enzymami nie pochodzącymi od ssaków. Wadą stosowania ssaczego albo ludzkiego enzymu jest to, że jest on obecny endogennie w organizmie pacjenta powodując możliwość przemiany proleku w lek, co nie będzie spowodowane podaniem koniugatu przeciwciało-enzym. Może to powodować zwiększoną toksyczność podczas stosowania tego rodzaju ADEPT. Proleki dla fosfatazy alkalicznej są natychmiast przetwarzane w leki zarówno u myszy (Doyle T. W. i Vyas D. M., Cancer Treatment Revews 17, 127-131, 1990) jak i u ludzi (Hande i in., Clinical Pharmacology and Therapeutics 53, 233, 1993) bez podawania jakiegokolwiek koniugatu, z powodu powszechnego występowania endogennej fosfatazy alkalicznej, potwierdzając w ten sposób, że jest to kluczowy problem przy stosowaniu tego enzymu. Nie są dostępne dane dotyczące prób na ludziach proleków dla β-glukuronidazy albo lizozymu. Glukuronidaza i lizozym są obecne w osoczu oraz w wielu innych tkankach. W zgłoszeniu Akzo opisano obecność lizozymu w mleku, łzach, ślinie, monocytach i leukocytach śledziony. W zgłoszeniu patentowym Behringwerke nr DE 4236237 opisano, że aktywowane makrofagi, granulocyty i płytki wydzielają glukuronidazę. Ponieważ komórki te są szeroko rozpowszechnione w organizmie, może to prowadzić do niepożądanej aktywacji proleku. W zgłoszeniu Behringwerke wykazano na przykładzie myszy, że po podaniu proleku Doxorubicyny względnie wysoki poziom wolnego leku gromadzi się w śledzionie, która jest obfitym źródłem tych komórek (patrz, tabela 3 w DE 4236237).

Zastosowanie ludzkich enzymów w tym podejściu ADEPT ograniczone jest przez fakt, że mogą być zastosowane tylko enzymy o rozmieszczeniu głównie wewnątrzkomórkowym, zaś w celu minimalizacji toksyczności stosowane proleki muszą być utrzymywane zewnątrzkomórkowo. Ogranicza to poważnie liczbę opcji układu ADEPT. Lizozym, jakkolwiek jest małym enzymem wykazuje wady dla ADEPT. Lizozym nie uwalnia czynnego leku, a jedynie pochodną o nieznanej aktywności farmakologicznej. W przykładach danych przez Akzo, zamiast wolnej Doxorubicyny uwalniane są Dox-(GlcNAc)i albo Dox-(GlcNAc)5. Glukuronidaza może uwalniać z proleku czynny lek np. adriamycynę i opisywana jest aktywność przeciwnowotworowa (Bosslet i in., Cancer Research 54, 2151-59, 1994). Jednakże, ludzka glukuronidaza jest enzymem o dużym ciężarze cząsteczkowym (150-300 kDa), a więc powstały koniugat będzie bardzo duży. Może to powodować problemy z penetracją do tkanek takich jak nowotwór, ponieważ jest dobrze udokumentowana lepsza penetracja małych białek do guzów litych. Oprócz tego, glukuronidaza jest glikozylowana, co prowadzi do błyskawicznego klirensu koniugatu przeciwciało-glukuronidaza stosowanego w ADEPT. Błyskawiczny klirens powoduje słabą lokalizację koniugatu w ksenogenicznych guzach. Kombinacja wysokiego ciężaru cząsteczkowego i błyskawiczny klirens z krwi powinien prowadzić do słabej lokalizacji w nowotworze u pacjentów. Tak więc, glukuronidaza nie jest idealnym enzymem do ADEPT.

Niniejszy wynalazek oparty jest na spostrzeżeniu, że enzym gospodarza (przykładowo ludzka rybonukleaza, enzym naturalnie występujący w krążeniu ogólnym) może być skonstruowany w taki sposób, że będzie rozpoznawał prolek dla ADEPT, który nie jest rozpoznawany w istotny sposób przez naturalny enzym gospodarza. Ponieważ skonstruowany enzym jest bardzo podobny do natywnego pod względem składu aminokwasowego, korzystnie wykazuje znacznie zmniejszoną immunogenność w porównaniu z enzymami bakteryjnymi takimi jak CPG2. Skonstruowany enzym nie występuje naturalnie, więc nieselektywne wyzwalanie

184 031 aktywacji proleku przez naturalne enzymy flory albo ludzkie, jest korzystnie zmniejszone. Podejście to ma dodatkowe zalety, że jest możliwe do zastosowania dla licznych ludzkich albo ssaczych enzymów ponieważ nie jest ograniczone naturalnym rozmieszczeniem enzymu i można zastosować proleki wnikające do komórek.

Problemy te zostały częściowo uwzględnione w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 95/13095 (Wellcome Fundation), które opublikowano po najwcześniejszej dacie pierwszeństwa niniejszego wynalazku. Zgłoszenie opisywało ADEPT z użyciem zmutowanych enzymów ssaczych do aktywacji proleków, które nie są aktywowane przez odpowiednie enzymy natywne, ale nie ujawniało niniejszego wynalazku.

Jest niezwykle zaskakujące, że zastąpienie reszty obdarzonej ładunkiem, jednej położonej w lub w pobliżu miejsca wiązania substratu albo centrum katalitycznego enzymu, przez resztę o znaku przeciwnym daje zmutowany enzym o kompletnym centrum katalitycznym, który to zmutowany enzym różni się od enzymu natywnego jedynie swoistością wobec pokrewnego substratu komplementarnego, choć o odwróconym znaku. Ponadto, kombinacje prolek/lek ujawnione przez Wellcome (oparte na metotreksacie i melfalanie) polegają na blokowaniu mechanizmów transportu aktywnego w celu zapobieżenia penetracji proleku do komórki. Ogranicza to zakres możliwych układów prolek/lek do posiadających takie mechanizmy transportu aktywnego. W przeciwieństwie do odwróconej polarności, ujawnione tu podejście pozwala na dobór właściwości ładunku proleków (które mogą, ale nie muszą posiadać właściwości transportu aktywnego) do blokowania wnikania do komórki proleku, a więc umożliwiają zastosowanie do wynalazku szerszego zakresu możliwych układów prolek/lek.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest koniugat przeznaczony do zastosowania w organizmie gospodarza, który zawiera cząsteczkę kierującą zdolną do wiązania się z antygenem związanym z nowotworem, połączoną ze zmutowanym enzymem zdolnym do przekształcania proleku w lek przeciwnowotworowy, przy czym enzymem jest zmutowana ludzka rybonukleaza zawierająca Glu w pozycji 66.

Cząsteczką kierującą w koniugacie według wynalazku jest przeciwciało albo jego fragment. Korzystnie fragmentem przeciwciała jest fragment F(ab')2.

Koniugat według wynalazku jest zasadniczo nieimmunogenny dla gospodarza, a prolek nie jest w istotny sposób możliwy do przekształcenia w lek przeciwnowotworowy przez naturalny niezmutowany enzym gospodarza w jego organizmie.

Określenie prolek nie jest w istotny sposób możliwy do przekształcenia w lek przeciwnowotworowy przez naturalny niezmutowany enzym gospodarza w jego organizmie oznacza, że prolek nie stwarza niepożądanych problemów z nieukierunkowaną toksycznością po podaniu gospodarzowi.

Określenie zasadniczo nieimmunogenny oznacza, że koniugat może być podawany gospodarzowi więcej niż jeden raz bez wywoływania znaczącej odpowiedzi odpornościowej gospodarza, jak to można by obserwować w przypadku zastosowania u człowieka przeciwciała mysiego sprzęgniętego z enzymem bakteryjnym.

Zmutowany enzym oparty jest na enzymie od tego samego gatunku co gospodarz, u którego układ ma być zastosowany, ale zmutowany enzym może być oparty na enzymie gospodarza innego gatunku, o ile struktura enzymu jest wystarczająco zakonserwowana międzygatunkowo, tak że nie powoduje niepożądanych problemów z immunogennością.

Sprzęgnięcie enzymu może być osiągnięte znanymi sposobami takimi jak zastosowanie odczynników heterobifunkcjonalnych jako związków sieciujących albo przez fuzję genów albo inną odpowiednią metodą. Przeciwciało może pochodzić od tego samego gospodarza (np. zastosowanie przeciwciała mysiego u myszy) albo może zostać zmienione tak, że nie jest rozpoznawane w istotny sposób jako obce w organizmie gospodarza (np. zastosowanie u człowieka mysiego przeciwciała chimerycznego, o przeszczepionych CDR albo obudowanego).

Przeszczepianie domen zmiennych przeciwciał gryzoni do domen stałych ludzkich przeciwciał (przeciwciała chimeryczne) albo wbudowywanie pętli wiążących antygen (CDR) gryzoni do przeciwciał ludzkich (przeszczepianie CDR) istotnie zmniejsza, jak wykazano, immunogenność przeciwciał gryzoni w badaniach przedklinicznych na małpach i ludziach. Nawet przeciwciała o przeszczepionych CDR obejmują znaczną (> 50) liczbę

184 031 reszt aminokwasowych sekwencji przeciwciała gryzonia w ludzkich regionach zrębowych. Mimo tego, donosi się o znacznie zmniejszonej immunogenności u małp i ludzi. Dostarcza to dowodów, że mutowanie bardzo ograniczonej liczby aminokwasów w centrum katalitycznym enzymu gospodarza powinno dawać enzym o minimalnej immunogenności i znacznie mniejszej immunogenności w porównaniu z enzymem nie pochodzącym od gospodarza (patrz odnośniki: Mountain i Adair, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 10, 1-142, 1992; Winter i Harris, Trends in Pharmacological Sciences 14, 139-143, 1993; Singer i in., J. Immunol. 150, 2844-57, 1993; Hakimi i in., J. Immunol., 147, 11352-59, 1991 i Isacs i in., The Lancet 340, 748-752, 1992). Domeny regionów stałych mogą być przykładowo domenami ludzkich IgA, IgE, IgG albo IgM. Korzystne są ludzkie IgG2 i 3 (zwłaszcza IgG2), ale mogą być również zastosowane izotypy IgGl i 4. Mogą być również stosowane przeciwciała ludzkie wytworzone w organizmach myszy przekształconych w taki sposób, że wytwarzają przeciwciała ludzkie.

Enzym gospodarza jest mutowany (dowolną odpowiednią metodą taką jak, np. synteza chemiczna albo biotechnologiczna genu albo ukierunkowana mutacja) dając zmianę w sposobie oddziaływania pomiędzy centrum aktywnym enzymu i prolekiem, w porównaniu z natywnym enzymem gospodarza.

Korzystnie, mutacja enzymu jest zmianą polarności w centrum aktywnym tak, że przekształca on prolek o komplementarnej polarności, który nie jest w istotny sposób przekształcany przez niezmutowany enzym gospodarza. Korzystnie, naturalny enzym gospodarza rozpoznaje swój naturalny substrat dzięki oddziaływaniu pary jonów, zaś to oddziaływanie jest odwracane przez budowę zmutowanego enzymu i komplementarny prolek. Enzym jest zmutowaną ludzką rybonukleazą o odwróconej polarności (patrz. fig. 12-15).

Lizyna 66 w rybonukleazie ludzkiej jest dodatnio naładowaną resztą oddziaływującą z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi naturalnego RNA, który jest substratem dla enzymu. Polarność tej reszty jest odwrócona, przykładowo, technikami inżynierii genetycznej (choć rozważana jest również synteza chemiczna) dając resztę naładowaną ujemnie, taką jak kwas glutaminowy. Powstały enzym o odwróconej polarności rozpoznaje proleki, które nie są w istotny sposób rozpoznawane przez niezmutowany enzym gospodarza. Rozważane są również dalsze zmiany reszt natywnego regionu w celu optymalizacji wiązania substratu i charakterystyki przekształcania. Rybonukleaza jest korzystnym enzymem z powodu swego niskiego ciężaru cząsteczkowego (około 13600 Da; umożliwiającego po podaniu dobrą penetrację do guza) i dobrą stabilność na proteolizę i wstrząs cieplny.

Korzystnie, prolek jest rybonukleotydem iperytowym o wzorze 1 przedstawionym na fig. 11, w którym:

Q oznacza O albo NH (zwłaszcza NH);

A oznacza grupę o wzorze -X-Y w którym:

Y oznacza SO2, CO albo pojedyncze wiązanie (korzystnie CO) pod warunkiem, że: gdy Q oznacza tlen, wtedy Y nie jest SO2;

X oznacza -(CH2)n, gdzie n=1-4 (korzystnie n=1 z wyjątkiem sytuacji gdy Y jest wiązaniem pojedynczym, wtedy n korzystnie wynosi 2) ewentualnie podstawiony Cr- alkilem na dowolnym atomie węgla (przy dowolnym atomie chiralnym rozważane są konfiguracje R i/lub S);

albo gdy Y oznacza CO i n=1, wtedy X jest ewentualnie podstawiony przy atomie węgla łańcuchem bocznym w postaci alaniny, waliny, leucyny, izoleucyny, metioniny, fenyloalaniny, tryptofanu, seryny, treoniny, cysteiny, asparaginy, glutaminy, lizyny, argininy albo histydyny (przy dowolnym atomie chiralnym rozważane są konfiguracje R i/lub S);.

R1 oznacza uracyl albo cytozynę jak pokazano na fig. 11;

R2 i R3 niezależnie oznaczają H albo alkil Cm (korzystnie metyl, a zwłaszcza R2=R3=H) ;

R5 i R6 niezależnie oznaczają Cl, mezyl albo tosyl (korzystnie R5=R6=CI);

184 031

R7, R8, R9 i R10 niezależnie oznaczają H, alkil Ci - (korzystnie metyl), alkoksyl Cm (korzystnie metoksy), F albo Cl (korzystnie Cl) zaś korzystnymi pozycjami dla rodników innych niż H sąR8 i R9, ale R7=R8=R9=R10=H jest szczególnie korzystne.

Korzystnym jest taki rybonukleotyd iperytowy, w którym:

Q oznacza NH;

X oznacza - (CH,)n- gdzie n oznacza 1-4;

Y oznacza -C(O)-;

R1 oznacza uracyl albo cytozynę;

R2 i R3 oznaczają H;

R5 i R6 oznaczają Cl; i

R7, R8, R9 i R10 oznaczająH; albo jego sole.

Poniższy związek jest szczególnie korzystny:

O-[4-(bis[2-chloroetylo]amino)fenoksy]wodorofosfOran-O-[(2R,3S,4R,5R)-2-(2-aminoacetamidometylo)-5--2,4-diokso-1,2,3,4-tetrahydropirymidyn-1-ylo)-4-hydroksy-2,3,4,5-tetra-hydrofUran-3-ylo], który pokazano jako produkt końcowy na fig. 7.

Innym korzystnym związkiem jest analog cytozynowy produktu końcowego pokazanego na fig. 7.

W poniższym opisie, określenie alkil obejmuje zarówno grupy alkilowe o łańcuchu prostym, jak i łańcuchu rozgałęzionym. Jednakże, odniesienie do konkretnych grup alkilowych takich jak propylowa dotyczy wyłącznie grup o łańcuchu prostym, zaś odniesienie do poszczególnych grup o łańcuchu rozgałęzionym takich jak izopropylowa dotyczy wyłącznie wersji o rozgałęzionym łańcuchu. Analogiczna konwencja dotyczy innych określeń.

Należy rozumieć, że jeżeli pewne związki o wzorze 1 mogą występować w postaci optycznie czynnej albo racemicznej, dzięki obecności jednego lub wielu asymetrycznych atomów węgla, wynalazek obejmuje w swej definicji dowolną spośród takich aktywnych optycznie albo racemicznych postaci, jeżeli posiadają taką właściwość, że są substratem dla zmutowanych enzymów według wynalazku.

Synteza optycznie czynnych postaci może być przeprowadzona technikami standardowymi chemii organicznej, dobrze znanymi w stanie techniki, przykładowo, przez syntezę z optycznie czynnych materiałów wyjściowych albo przez rozdział form racemicznych. Podobnie, właściwości substratu wobec enzymów zmutowanych mogą być badane z użyciem standardowych technik laboratoryjnych.

Mutacje punktowe będą określane w poniższy sposób: aminokwas naturalny (w nomenklaturze jednoliterowej), pozycja, aminokwas nowy. Przykładowo, D253K oznacza, że w pozycji 253 kwas asparaginowy (D) został zastąpiony przez lizynę (K). Liczne mutacje w jednym enzymie zostaną pokazane w nawiasach kwadratowych.

W poniższym opisie określenie CPB obejmuje jak niżej:

i) dojrzałe postacie pro- i prepro- enzymu z lub bez znaczników (np. c-myc);

ii) dowolną karboksypeptydazę o swoistości wobec substratów peptydowych posiadających Lys albo Arg na końcu C; enzymy CPG trzustkowe i osoczowe (korzystny jest enzym trzustkowy); jeżeli inaczej nie zaznaczono albo nie wynika to w sposób oczywisty z kontekstu.

Zmutowane CPB według wynalazku są mutantami dowolnej spośród powyższych CPB posiadających właściwości wymagane dla wynalazku. Korzystne są poniższe HCPB trzustkowe: D,53K, D253R i; szczególnie [G251N,D253R]; odpowiednie mutacje w innych CPB są również rozważane. Zmutowane CPB według wynalazku mogą również obejmować inne mutacje konserwatywne (insercje, zastąpienia i/lub delecje) które nie zmieniają w sposób istotny właściwości mutacji kluczowej. Dla celów niniejszego dokumentu, konserwatywne zastąpienie aminokwasowe jest zastąpieniem, którego prawdopodobieństwo wystąpienia w naturze jest większe niż dziesięciokrotne prawdopodobieństwo zastąpienia przypadkowego (jak to określono metodami komputerowymi opisanymi przez Dayhoff i in., Atlas of Protem Sequence and Structure, 1971, str. 95-96 i fig. 9-100).

184 031

Literatura dotycząca CPB obejmuje: Folk JE w The Enzymes tom III, Academic Press (1971), str. 57; Coli i in., (1991) EMBO J. 10, 1-9; Eaton i in., (1991) J. Biol. Chem., 266, 21833-21838; Yamamoto i in., (1992) J. Biol. Chem. 267, 2575-2581; patent USA 5364934 (Genentech) i międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 95/14096 (Eli Lilly).

Związki mogą tworzyć sole z różnymi kwasami organicznymi i nieorganicznymi oraz zasadami. Sole takie obejmują sole amonowe, sole metali alkalicznych takie jak sole sodowe i potasowe, sole metali ziem alkalicznych takie jak sole wapniowe i magnezowe, sole z zasadami organicznymi np. sole dicykloheksaminy, N-metylo-D-glukaminy, sole z aminokwasami takimi jak arginina, lizyna i inne. Mogą być również wytworzone sole z kwasami organicznymi i nieorganicznymi np. z HCl, HBr, H2SO4, H3PO4, kwasem metanosulfonowym, toluenosulfonowym, maleinowym, fumarowym i kamforosulfonowym. Korzystne są również nietoksyczne, dopuszczalne fizjologicznie sole, jakkolwiek inne sole są również dopuszczalne np. do izolacji i oczyszczania produktu.

Sole mogą być wytwarzane konwencjonalnymi sposobami takimi jak poddanie reakcji produktu w postaci wolnego kwasu albo wolnej zasady z jednym lub wieloma równoważnikami odpowiedniej zasady albo kwasu w rozpuszczalniku albo ośrodku, w którym sól jest nierozpuszczalna, albo w rozpuszczalniku takim jak woda, która jest następnie usuwana pod próżnią albo przez liofilizację albo przez wymianę jonową istniejącej soli na inny kation, na odpowiedniej żywicy jonowymiennej.

Koniugaty według wynalazku mogą być wykorzystywane w kompozycjach farmaceutycznych w takich postaciach użytkowych, jak tabletki, kapsułki albo eliksiry do podawania doustnego, czopki do podawania doodbytniczego, sterylne roztwory albo zawiesiny do podawania pozajelitowego albo domięśniowego, itp. Można je podawać pacjentom (zwierzętom albo ludziom) wymagającym takiego leczenia, w dawkach zapewniających optymalną skuteczność terapeutyczną. Jakkolwiek, dawka będzie się różniła u różnych pacjentów zależnie od rodzaju i ciężkości choroby, ciężaru pacjenta, diety stosowanej przez pacjenta, równoczesnego leczenia i innych czynników uznawanych przez specjalistów, i zawiera się od około 1 do 4000 mg na pacjenta na dzień, co można podawać w dawce pojedynczej albo w licznych dawkach. Korzystnie, dawkowanie zawiera się od około 100 do 4000 mg na pacjenta na dzień; korzystniej około 500 do 3000 mg na pacjenta na dzień.

Najskuteczniejszy sposób podawania i schemat dawkowania dla koniugatów według wynalazku i proleków w leczeniu raka zależy od wielu czynników takich jak ciężkość choroby, stan zdrowia pacjenta i odpowiedź na leczenie oraz ocena lekarza prowadzącego. Dawkowanie koniugatów i proleków powinno być dobrane indywidualnie dla pacjenta. Jednakże, skuteczna dawka koniugatu powinna zawierać się od 20 do około 200 mg/m². Skuteczna dawka proleku powinna zależeć od konkretnego stosowanego leku i toksyczności leku macierzystego. Ponieważ prolek jest mniej cytotoksyczny niż lek macierzysty wartość MTD leku macierzystego jeśli jest znany, powinna stanowić wartość wyjściową. Dla proleków opartych na iperycie fenolowym, dla którego nie są znane dane kliniczne dotyczące leku macierzystego, dawka lecznicza jest mniej precyzyjna i powinna zostać określona standardowymi testami toksykologicznymi na zwierzętach i badaniami rosnącej dawki na ludziach, począwszy od niskich dawek. Jednakże, dawka lecznicza ogólnie zawiera się w zakresie od 500 do 2000 mg/m2.

Naturalnie, zakresy dawek mogą być dobrane na podstawie pojedynczej dawki umożliwiając dawkowanie podzielone i, jak to zaznaczono wyżej, dawka może być różna w zależności od rodzaju i ciężkości choroby, ciężaru pacjenta, diety i innych czynników'.

Zwykle, kombinacje te mogą być wytwarzane w postaci kompozycji farmaceutycznej jak to dyskutowane jest niżej. Około 1 do 100 mg związku, albo mieszaniny związków o wzorze 1 albo ich dopuszczalnej fizjologicznie soli jest łączona z dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem, zaróbką, wypełniaczem, środkiem wiążącym, konserwantem, stabilizatorem, środkiem zapachowym, itp. w jednostkowych postaciach dawkowania, jak się to określa w praktyce farmaceutycznej. Ilość substancji czynnej w tych kompozycjach albo preparatach jest taka, że uzyskuje się odpowiednie dawkowanie we wskazanym zakresie.

Przykładami substancji pomocniczych, które mogą być włączone do tabletek, kapsułek itp., są: substancje wiążące takie jak żywica tragakantowa, guma arabska, skrobia kukurydziana

184 031 albo żelatyna; zarobki takie jak celuloza mikrokrystaliczna; substancje ułatwiające rozpadanie · albo rozsadzające, takie jak skrobia kukurydziana, skrobia żelatynowana, kwas alginowy itp.; środki poślizgowe takie jak stearynian magnezu; słodziki takie jak sacharoza, laktoza albo sacharyna; środki smakowo-zapachowe takie jak mięta pieprzowa, olejek z pomocnika baldaszkowatego albo wiśni. Gdy jednostką dawkowania jest kapsułka, może ona zawierać oprócz materiałów opisanych wyżej ciekły nośnik taki jak olej. Inne materiały mogą być również obecne jako powłoczki albo substancje w inny sposób modyfikujące postać fizyczną jednostki dawkowania. Przykładowo, tabletki mogą być powlekane szelakiem, cukrem albo jednym i drugim. Syrop albo eliksir może zawierać składnik czynny, sacharozę jako słodzik, paraben metylowy i propylowy jako konserwanty, barwnik oraz środek zapachowy jak aromat wiśniowy albo pomarańczowy.

Sterylne kompozycje do wstrzyknięć mogą być wytwarzane według standardowej praktyki farmaceutycznej przez rozpuszczanie albo zawieszanie substancji czynnej w nośniku takim jak woda do wstrzyknięć, olejach roślinnych występujących naturalnie takich jak olej sezamowy, olej kokosowy, olej arachidowy, olej bawełniany itp. albo syntetycznym nośniku tłuszczowym takim jak oleinian etylu itp. Jeżeli to konieczne mogą być dodawane bufory, konserwanty, przeciwutleniacze itp.

Wynalazek niniejszy umożliwia kontrolowanie wzrostu komórek nowotworowych w organizmie gospodarza przez podawanie gospodarzowi skutecznej ilości koniugatu, ewentualnie w postaci kompozycji farmaceutycznej i po zasadniczym zniknięciu go z krwiobiegu, podanie skutecznej ilości proleku. Korzystnie składniki są podawane dożylnie.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje skuteczną do lokalizacji guza ilość koniugatu według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze. Korzystnie, kompozycja jest odpowiednia do podawania dożylnego. Korzystnie koniugat dostarczany jest jako sucha substancja stała, która jest rozpuszczana przed zastosowaniem przy użyciu odpowiedniego rozcieńczalnika.

Korzystne kompozycje farmaceutyczne są sterylne (do podawania dożylnego).

Korzystnym przeciwciałem jest przeciwciało A5B7 zdeponowane jako hybrydoma pod numerem 93071411 według Traktatu Budapesztańskiego dnia 14 lipca 1993 w ECACC, PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK. Korzystne jest przeciwciało A5B7 w postaci F(ab')2.

Poniżej opisano inne przeciwciała przydatne w ADEPT. Przeciwciało BW431/26 zostało opisane przez Haisma i in., Cancer. Immunol. Immunother., 34:343-348 (1992). Przeciwciała L6, 96.5 i 1F5 opisano w opisie patentu europejskiego 302 473. Przeciwciało 16.88 zostało opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym W090/07929. Przeciwciało B72.3 zostało opisane w opisie patentu europejskiego nr 392 745. Przeciwciało CEM231 zostało opisane w opisie patentu europejskiego nr 382 411. Przeciwciała HMFG-1 i HMFG-11 (Unipath Ltd. Basingstoke, Hants, UK) reagują z cząsteczką glikoproteiny przypominającej mucynę w błonach pęcherzyków tłuszczowych mleka i mogą być zastosowane do celowania na raki sutka i jajnika. Przeciwciało SM3 (Chemicon International Ltd. Londyn, UK), reaguje z białkiem rdzeniowym mucyny i może być zastosowane do kierowania na raki sutka i jajnika. Przeciwciała 85Al2 (Unipath Ltd, Basingstoke, Hants, UK) i ZCEA1 (Pierce Chemical Company, Chester, UK) reagują z antygenem nowotworowym CEA. Przeciwciało PR4D1 (Serotec, Oxford, UK) reaguje z antygenem związanym z rakiem okrężnicy. Przeciwciało E29 (Dako Ltd, High Wycombe, UK) reaguje z antygenem nabłonkowym. Przeciwciało C242 jest dostępne z CANAG Diagnostics, Gothenberg, Szwecja. Patrz również, tabela 3 na str. 208 międzynarodowego zgłoszenia patentowego W095/13095 (Wellcome) gdzie zawarte są dane dotyczące różnych przeciwciał.

Ogólnie, przeciwciała przydatne w ADEPT są słabo intemalizowane przez komórki nowotworowe, które rozpoznają. Umożliwia to ukierunkowanemu enzymowi aktywującemu prolek pozostanie na powierzchni komórki i wytwarzanie w miejscu nowotworu aktywnego leku z krążącego proleku. Internalizacja przeciwciał może być badana znanymi technikami, przykładowo, jak to opisano przez Jafrezou i in., Cancer Research 52:1352 (1992) i Priess i in., Cancer Research 48:2249 (1988).

184 031

Innym zastosowaniem koniugatu według niniejszego wynalazku jest zastosowanie go do diagnostyki in vitro. Przykładowo, wykrycie konkretnego antygenu może być osiągnięte przez eksponowanie próbki diagnostycznej na koniugat według wynalazku obejmujący cząsteczkę kierującą, taką jak przeciwciało zdolne do wiązania z antygenem. Następnie niezwiązany koniugat może być usunięty, przykładowo przez odpłukanie, a następnie związany koniugat może być zmierzony dzięki swej zdolności do katalitycznego przekształcania proleku. Przekształcanie może być mierzone dowolną odpowiednią metodą taką jak HPLC. Patrz, A Practical Guide to ELISA, D.M. Kemeny, Pergamon Press 1991.

Sposób wytwarzania koniugatu według wynalazku polega na połączeniu: cząsteczki kierującej, zdolnej do wiązania z antygenem związanym z nowotworem, którą jest przeciwciało lub jego fragment i enzymu zdolnego do przekształcania proleku w lek przeciwnowotworowy, który to enzym jest zmutowaną postacią enzymu gospodarza. Zmutowany enzym i cząsteczka kierująca mogą być połączone konwencjonalnymi sposobami znanymi w technice, takimi jak stosowanie reagentów heterobifunkcjonalnych. Uwzględnia się również fuzję genów'.

Zmutowany enzym i cząsteczka kierująca mogą być wytwarzane w oparciu o technologie ekspresji znane w technice. Niektóre układy ekspresyjne obejmują transformowanie komórki gospodarza wektorem; układy takie są dobrze znane, np. w E. coli, drożdżach i komórkach ssaków (patrz, Methods in Enzymology 185, Academic Press 1990). Uwzględnione są również inne układy ekspresyjne, takie jak transgeniczne ssaki z wyłączeniem ludzi, u których interesujący gen, korzystnie wycięty z wektora, ale z promotorem swoistym dla tkanki sutka, który kieruje ekspresjonowane białko do mleka, jest wprowadzony do przedjądrza zygoty ssaka (zwykle przez mikroinjekcję do jednego lub dwóch jąder (zwykle jądra męskiego) w przedjądrzu), która jest następnie wszczepiana matce zastępczej. Pewna część zwierząt urodzonych przez zastępczą matkę powinna nieść i ekspresjonować wprowadzony gen, integrowany do chromosomu. Zwykle, integrowany gen przekazywany jest potomstwu przez standardowe krzyżowanie, umożliwiając w ten sposób łatwe namnożenie szczepu. Korzystnie, interesujące białko jest po prostu pobierane z mleka samic zwierząt transgenicznych (patrz, Simons i in., (1988), Bio/Technology 6:179-183; Wright i in., (1991) Bio/Technology 9:830-834; patent USA 4,873,191 i 5,322,775. Manipulacja mysimi zarodkami opisana jest w Hogan i in., Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory 1986).

Uwzględniana jest również technologia roślin transgenicznych, taka jak, przykładowo opisana w Swain WE, (1991) TIBTECH 9:107-109; Ma JKC i in., (1994) Eur. J. Immunology 24:131-138; Hiatt i in., (1992) FEBS Lett. 307:71-75; Hein i in., (1991) Biotechnology Progress 7:455-461; Duering K (1990) Plant Mol. Biol. 15:281-294.

Jeżeli to konieczne, geny gospodarza mogą być inaktywowane albo modyfikowane z użyciem standardowych procedur, jak to opisano pokrótce niżej, oraz jak opisano np. w Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press 1993. Gen docelowy (albo jego część) jest korzystnie klonowany do wektora wraz z wybiórczym markerem (takim jak Neo) wprowadzonym do genu, niszcząc jego funkcję. Wektor jest linearyzowany, a następnie transformowany (zwykle metodą elektroporacji) do zarodkowych komórek macierzystych (ES) (np. uzyskanych ze szczepu myszy 129/Ola), po czym w pewnej części komórek macierzystych zachodzi zjawisko rekombinacji homologicznej. Komórki macierzyste zawierające zniszczony gen są namnażane i wstrzykiwane do blastocysty (przykładowo, myszy szczepu C57BL/6) i wszczepiane matce zastępczej w celu dalszego rozwoju. Potomstwo chimeryczne może być zidentyfikowane dzięki znacznikowi koloru sierści. Chimery są krzyżowane zapewniając dostarczanie komórek ES linii zarodkowej, przez krzyżowanie z myszami, których znaczniki genetyczne umożliwiają rozróżnienie pomiędzy gametami pochodzącymi z ES i gospodarza. Połowa gamet pochodzących z komórek ES niesie modyfikację genu. Potomstwo jest badane przesiewowe (np. badaniem metodą Southern błot) w kierunku identyfikacji osobników ze zniszczonym genem (około 50% potomstwa). Wyselekcjonowane potomstwo jest heterozygotyczne, a więc może być krzyżowane z inną heterozygotą, po czym wybierane jest potomstwo homozygotyczne (około 25% potomstwa). Zwierzęta transgeniczne z wyłączonym genem mogą być krzyżowane ze zwierzętami transgenicznymi wytworzonymi znanymi technikami, takimi jak mikroinjekcja DNA do przedjądrzy, fuzja sferoplastów

184 031 (Jakobovits i in., (1993) Naturę 362:255-258) albo transfekcja za pomocą lipidów (Lamb i in., (1993) Naturę Genetics 5:22-29) komórek ES dając zwierzęta transgeniczne z wyłączonym genem endogennym i zastąpieniem genem obcym.

Komórki ES zawierające uszkodzenie genu docelowego mogą być dalej modyfikowane przez transformowanie sekwencją genu docelowego, zawierającą pewną zmianę, która jest klonowana do wektora i linearyzowana przed transformacją. Po rekombinacji homologicznej, zmieniony gen jest wprowadzany do genomu. Takie embrionalne komórki macierzyste mogą być następnie zastosowane do tworzenia zwierząt transgenicznych jak to opisano wyżej.

Określenie komórka gospodarza w tym kontekście obejmuje komórki prokariotyczne albo eukariotyczne odpowiednie do technologii ekspresji, takie jak komórki bakterii, drożdży i roślin oraz zygoty, oocyty, blastocysty, embrionalne komórki macierzyste ssaków z wyłączeniem ludzi, oraz inne komórki odpowiednie do technologii transgenicznej. Jeżeli dopuszcza to kontekst, określenie komórka gospodarza obejmuje również roślinę transgeniczną albo komórki ssaka z wyłączeniem człowieka, uzyskane z transformowanych, nie pochodzących od człowieka ssaczych zygot, oocytów, blastocyst, embrionalnych komórek macierzystych, komórek roślinnych i inne komórki przydatne w technologii transgenicznej.

Wynalazek zostanie zilustrowany poniższymi przykładami w których:

Figura 1 przedstawia budowę plazmidu pQR177 .

Figura 2 przedstawia oczyszczanie rybonukleazy bydlęcej. Ocena czystości rekombinowanej RNazy na barwionym srebrem 16% żelu poliakrylamidowym- 0,1% SDS. Ścieżki A i G odpowiadają RNazie dostępnej w handlu (Mr 13700). Ścieżki C-E zawierają dodatnio naładowane białka uzyskane po elucji izokratycznej ekstraktów periplazmatycznych hodowli E. coli [pQR163] i indukowanych różnymi stężeniami IPTG (odpowiednio, 0,5, 2 i 0 mM). Ścieżka F, podobnie jak ścieżki 3-5, ale hodowla zawierała komórki E. coli [pKK223.3] (kontrola). Ścieżka B, oczyszczona rekombinowana RNaza po chromatografii jonowymiennej.

Figura 3 przedstawia strategie PCR prowadzące do uzyskania pATF4. Startery 3-6 zastosowane są w reakcji PCR, która (a) wprowadza bydlęcą sekwencję sygnałową wraz z sekwencją kodującą heksapeptyd w pozycji 5' od genu ludzkiej rybonukleazy trzustkowej, i (b) sekwencję kodującą ostatnich siedmiu aminokwasów enzymu HP-RNazy wraz z kodonem przerywającym. Startery 5 i 6 wprowadzały również miejsce restrykcyjne EcoRI.

Figura 4 przedstawia ocenę czystości ludzkiej RNazy trzustkowej R4A,K6A przez PAGE: Ścieżki A i F, 2pg RNazy A; ścieżki B i C, różne ilości białek naładowanych dodatnio z przestrzeni periplazmatycznej komórek E. coli zawierających pATF4; ścieżki D i E, 1 pg i 500 ng oczyszczonej HP-RNazy.

Figura 5 przedstawia wytwarzanie pATFZ44 przez kolistą rekombinację PCR.

Figura 6 przedstawia porównanie toksyczności wobec komórek LoVo, pomiędzy prolekiem i odpowiednim lekiem.

Figura 7 przedstawia schemat syntezy proleku opartego na uracylu.

Figura 8 przedstawia startery oligonukleotydowe.

Figura 9 przedstawia schemat syntezy analogu proleku opartego na uracylu.

Figura 10 przedstawia schemat syntezy analogu proleku opartego na cytydynie.

Figura 11 przedstawia wzory chemiczne.

Figura 12 jest schematem centrum aktywnego rybonukleazy A - kompleks substratów gdzie B, R i P oznaczają odpowiednio, miejsca wiązania zasady, rybozy i fosforanu, B1 jest swoiste wobec pirymidyn zaś B2 wiąże puryny. Mononukleotydy 3'-pirymidynowe wiążą się z BiRip]. Mononukleotydy 5'-purynowe wiążą się z B2R2p2. 3'-AMP wiąże się z B2R2P1. Grupa fosforanowa wiązania fosfodiestrowego hydrolizowana przez enzym wiąże się z P2. Zaznaczono reszty, o których wiadomo, że wiążą się z każdym z miejsc.

Figura 13 jest schematem proleku w centrum aktywnym zmutowanego enzymu o odwróconej polarności:

* oznacza reszty o odwróconej polamości (Lys66 w natywnej rybonukleazie) zaś;

X oznacza grupę naładowaną dodatnio (przyłączoną przez resztę o odwrotnej polarności).

Figura 14 przedstawia cięcie proleku przez zmutowany enzym o odwrotnej polarności.

Figura 15 przedstawia mechanizm działania natywnej ludzkiej RNazy.

184 031

Figura 16 przedstawia budowę substratów RNazy CpA i C > p.

Figura 17 przedstawia schemat syntezy proleków opartych na cytozynie.

Figura 18 przedstawia klonowanie HCPB trzustkowej.

Figura 19 przedstawia sekwencjonowanie HCPB trzustkowej.

Figura 20 przedstawia wektor pICI1266.

Figura 21 przedstawia klonowanie wektora ekspresyjnego pICI1266.

Figura 22 przedstawia cytotoksyczność proleku i odpowiedniego leku.

Figura 23 przedstawia skład pożywki hodowlanej.

Figura 24 jest schematem pokazującym oddziaływanie kluczowych aminokwasów pomiędzy natywną rybonukleazą i fragmentem kwasu nukleinowego. Dodatnio naładowana Lys66 w pozycji Po przedstawiona jest podczas oddziaływania jonowego z ujemnie naładowanym wiązaniem fosfodiestrowym, podczas gdy reszty w Pt są istotne dla procesu katalitycznego.

Figura 25 przedstawia oddziaływanie pomiędzy prolekiem iperytowym i zmutowaną RNazą. W celu uniknięcia przekształcania przez natywną RNazę, kluczowy aminokwas w pozycji 66 został zmieniony na ujemnie naładowany kwas glutaminowy. Glu-66 powoduje oddziaływanie jonowe z dodatnio naładowaną cząsteczką X w proleku, dopełniając w ten sposób oddziaływanie o odwróconej polarności. Przewiduje się, że dalsze mutacje w pozycjach R2 i B2 powinny prowadzić do wzmocnionego oddziaływania z prolekiem.

Figura 26 przedstawia dwie możliwości dodatnio naładowanej reszty w pozycji 5' rybozy, która wpływa na oddziaływanie z Glu-66 w P0.

Figury 27-33 przedstawiają procedury syntezy chemicznej.

Skróty:

Ac acetyl

ADEPT terapia prolekiem oparta na kierowaniu enzymu przy użyciu przeciwciała

BOC tert-butoksykarbonyl

BP-RNaza bydlęca rybonukleaza trzustkowa

CPB karboksypeptydaza B

DCCI 1,3-dicykloheksylokarbodiimid

DMAP 4-dimetyloaminopirydyna

DMF N,N-dimetyloformamid

DMSO dimetylosulfotlenek

Et etyl

EDCI l-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylo-karbodiimid

HCPB ludzka CPB

HOBT 1 -hydroksybenzotriazol

HP-RNaza ludzka rybonukleaza trzustkowa

PCR reakcja łańcuchowej polimerazy

TFA kwas trifluorooctowy

THF tetrahydrofuran

Przykład odniesienia 1

Wytwarzanie rekombinowanej bydlęcej dojrzałej rybonukleazy trzustkowej

Rekombinowaną bydlęcą rybonukleazę trzustkową wytworzono z sekwencji kodującej dla prekursora bydlęcej rybonukleazy trzustkowej (BP-RNaza) jak to opisano w TarragonaFiol i in., Gene (1992) 118, 239-245. Białko ekspresjonowano z E. coli pod kontrolą promotora tac z dwucistronowego fragmentu ekspresyjnego w pQR163. Plazmid zawierający fragment dwucistronowy oznaczono pQR162 (NCIMb 40678).

Przykład odniesienia 2

Wytwarzanie ludzkiej rybonukleazy trzustkowej Arg4Ala, Lys6Ala

Sekwencję kodującą gen ludzkiej rybonukleazy trzustkowej (HP-RNaza) otrzymano z fragmentów genomowego DNA ekstrahowanego z ludzkich policzkowych komórek nabłonkowych stosując technikę PCR jak to opisano przez Tarragona-Fiol i in., Protein and Peptide Letters (1994) 1, 76-83. W celu wytworzenia HP-RNazy, opisano ekspresję rekombinowanej HP-RNazy

184 031 w E. coli. W celu skierowania ekspresji rekombinowanego ludzkiego enzymu trzustkowego do przestrzeni periplazmatycznej E. coli, sekwencję sygnałową bydlęcej RNazy trzustkowej poddano fuzji w pozycji 5' ludzkiego genu. Początkowe próby ekspresji enzymu rekombinowanego nie powiodły się. W związku z tym, w celu umożliwienia ekspresji w E. coli, zastosowano technikę kierowanej mutagenezy w celu modyfikacji genetycznej genu HP-RNazy. Powstały rekombinowany enzym wykazywał podobną charakterystykę kinetyczną z homologicznym enzymem bydlęcym.

(a) Klonowanie dojrzałej sekwencji kodującej dla HP-RNazy Arg4Ala, Lys6Ala

Trawienia enzymami restrykcyjnymi, defosforylacje, ligacje, transformacje i oczyszczanie plazmidowego DNA na małą skalę przeprowadzono jak to opisano w Maniatis i in., (1982) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York. Oligonukleotydy wytworzono stosując syntezator DNA Cyclone™.

Dojrzałą sekwencję genu HP-RNazy uzyskano z genomowego dNa ekstrahowanego z policzkowych komórek nabłonkowych stosując technikę PCR. Pokrótce, komórki nabłonkowe uzyskano przez energiczne płukanie jamy ustnej l0 ml 0,9% NaCl przez 20 sekund. Zawiesinę policzkowych komórek nabłonkowych (1,5 ml) żwirowano i zawieszono w 100 ml 10 mM NaCl, 10 mM EDTA. Po dalszym odwirowaniu, osad komórkowy zawieszono w 75 ml 20 mM NaOH i inkubowano przez 30 minut w 100°C. Resztki komórkowe żwirowano zaś nadsącz przechowywano w -20°C. Porcję (2-3 ml) stosowano normalnie jako matrycę w inkubacjach PCR. W inkubacjach PCR zastosowano dwa startery (Identyfikator Sekw. Nr 5 i Identyfikator Sekw. Nr 6; patrz. fig. 8, startery 1 i 2) komplementarne do końców 5' i 3' dojrzalej sekwencji HP-RNazy (po 5 pmol każdego); jak również ludzki genomowy DNA, 0,2 mM dNTP, bufor Stratagene (1x) [bufor 10x zawierał 200 mM Tris-HCl (pH 8,2), 100 mM KC1, 60 mM (NH4)₂S04, 20 mM MgCl₂, 1%o Triton Χ-100 i 100 mg/ml BSA bez aktywności nukleazy) oraz 2,5 jednostek polimerazy pfu (Stratagene). Inkubację PCR przeprowadzono w ciągu 30 cykli denaturacji w 92°C przez 30 sekund, hybrydyzacji w 55°C przez 30 sekund i wydłużania w 75°C przez 1 minutę. Powstałe produkty PCR analizowano i rozdzielano przez elektroforezę na żelu agarozowym. Interesujący fragment DNA wycięto z żelu, po czym ekstrahowano DNA stosując jednostki do odwirowywania (Spin-X™, Costar). W celu skierowania ekspresji kompletnego rekombinowanego enzymu do przestrzeni periplazmatycznej komórek Escherichia coli JM 107, sekwencję sygnałową bydlęcej RNazy trzustkowej poddano fuzji z końcem 5' ludzkiego genu, zaś sekwencję kodującą co najmniej siedmiu aminokwasów HP-RNazy wraz z kodonem kończącym przyłączono do końca 3', stosując technikę PCR. Następnie nastawiono inkubację PCR zawierającą dojrzałą sekwencję uzyskaną przez PCR genu HP-RNazy pozbawionego sekwencji kodującej przynajmniej 7 aminokwasów, jako matrycę, zestaw nakładających się starterów (Identyfikatory Sekw. Nr 7 do 10; patrz, startery 3-6, fig. 8) w różnych stężeniach (0,1, 0,5 i 50 pmoli, odpowiednio od startera wewnętrznego wobec najbardziej zewnętrznego), 0,2 mM nukleotydów, buforu Stratagene (1x, patrz wyżej) i 2,5 jednostki polimerazy pfu (Stratagene). Inkubację przeprowadzono stosując te same warunki co opisane wyżej. Produkt PCR traktowano jak to opisano wyżej zaś interesujący fragment wycięto i ekstrahowano z żelu agarozowego. Fragment ten cięto EcoRI i poddano ligacji do uprzednio trawionego i defosforylowanego pUC18 w celu sekwencjonowania dwuniciowego DNA (metodą dideoxy 3). Poddany fuzji gen poddano ligacji do wektora ekspresyjnego pKK223.33; (patrz przykład 1). Bydlęca sekwencja sygnałowa wprowadziła sekwencję DNA kodującą heksapeptyd w kierunku 5' od otwartej ramki odczytu. Zastosowano ją do zniszczenia drugorzędowej sekwencji mRNA wytworzonego po zapoczątkowaniu transkrypcji promotora. Indukcję, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego enzymu przeprowadzono w wyżej opisany sposób. Analiza białek periplazmatycznych uzyskanych po tej procedurze nie wykazała produktu wykazującego aktywność rekombinowanej RNazy.

Brak ekspresji ludzkiego enzymu w tym doświadczeniu był nieoczekiwany, ponieważ bydlęca sekwencja sygnałowa była stosowana z powodzeniem do przeniesienia rekombinowanych enzymów bydlęcych do przestrzeni periplazmatycznej. Porównanie sekwencji N-końcowej natywnych enzymów ludzkich i bydlęcych wykazało różnice w pozycjach 4 i 6, gdzie reszty alaninowe w enzymie bydlęcym zastąpione są przez, odpowiednio, resztę argininy

184 031 i lizyny w odpowiedniku ludzkim. Wiadomo, że obecność dodatnio naładowanych aminokwasów na początku sekwencji może działać jako sygnał zatrzymania przenoszenia zapobiegający dalszemu przenoszeniu. W celu przezwyciężenia tego problemu, opracowano strategię polegającą na zamianie argininy i lizyny w pozycjach 4 i 6 w ludzkim enzymie, resztami alaniny. Tak więc, zastosowano technikę RCPCR (startery zastosowane wprowadzenia pożądanej mutacji o Identyfikatorach Sekw. Nr 11 do 14; patrz, startery E-H na fig. 8) w celu wytworzenia rekombinowanego klonu pATF3, zawierającego pożądaną zamianę (patrz. fig. 3). Ten plazmid chimeryczny zastosowano jako matrycę do sekwencjonowania dwuniciowego DNA, w celu potwierdzenia wprowadzenia sekwencji kodujących reszty alaninowe w pozycjach 4 i 6. Wycięcie EcoRI i ligacja z pKK223.3 spowodowała powstanie chimerycznego wektora ekspresyjnego pATF4 (figura 3), który zastosowano do ekspresji rekombinowanego enzymu ludzkiego.

(b) Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanej HP-RNazy Arg4Ala, Lys6Ala z E. coli Transformacja komórek Escherichia coli plazmidem pATF4 i indukcja IPTG spowodowała ekspresję rekombinowanego enzymu ludzkiego, który izolowano z zawartości periplazmatycznej, stosując protokoły opisane wyżej do wytwarzania homologicznego enzymu bydlęcego. Rekombinowany enzym HP-RNazę izolowano z zawartości periplazmatycznej i oczyszczano do homogenności (patrz fig. 4). Przeprowadzono sekwencjonowanie końca N enzymu rekombinowanego, które wykazało, że bydlęca sekwencja sygnałowa była cięta prawidłowo. Potwierdziło to również zastąpienie Arg-4 i Lys-6 przez alaniny. Przeprowadzono charakteryzację kinetyczną stosując CpA i C>p jako substraty (fig. 16). Parametry kinetyczne Km, kcat i kcat/Km porównano z wartościami uzyskanymi dla bydlęcej RNazy dostępnej w handlu i rekombinowanej trzustkowej w tych samych warunkach testowych (patrz tabele). Dane wskazują, że właściwości kinetyczne rekombinowanego enzymu HP-RNazy nie różnią się istotnie od homologicznego odpowiednika bydlęcego. Parametry kinetyczne różnych enzymów dla CpA jako substratu przy pH 7,0.

kcat/Km(mM'1/s'¹)

Rek. HP-RNaza R4A:K6A 1700 (480)

Rek. BP-RNaza 2800 (370)

BP-RNaza 2300 (600)

Parametry kinetyczne dla różnych enzymów dla C > p jako substratu przy pH 7,0 kcat/Km^nM'¹ /s ¹ )

Rek. HP-RNaza R4A:K6A ^,2 ^0,^)

Rek. BP-RNaza 3,9 (0,9)

BP-RNaza 2,3 (0/5) (n) oznacza błąd standardowy

Przykład odniesienia 3

Synteza i izolacja koniugatu mysiego A5B7-bydlęce j trzustkowej rybonukleazy Konkretnym przeciwciałem zdolnym do wiązania z antygenem związanym z nowotworem jest mysie przeciwciało monoklonalne A5B7. Przeciwciało A5B7 wiąże się z ludzkim antygenem karcynoembrionalnym (CEA) i jest szczególnie przydatne do kierowania na raka okrężnicy i odbytnicy. A5B7 jest dostępne z DAKO Ltd, 16 Manor Courtyard, Hughenden Avenue, High Wycombe, Bucks HP 13 5RE, Anglia. Fragmenty przeciwciał mogą być wytworzone z całego przeciwciała IgG standardowymi sposobami takimi jak, przykładowo, fragmenty F(ab')2 jak to opisano w Mariani i in., (1991), Molecular Immunology 28, 69-77. Ogólnie, koniugaty przeciwciało (albo fragment przeciwciała)-enzym powinny być przynajmniej biwalentne, czyli zdolne do wiązania przynajmniej 2 antygenów związanych z nowotworem (które mogą być te same albo różne). Cząsteczki przeciwciał mogą być humanizowane znanymi sposobami, takimi jak, przykładowo przeszczepianie CDR, jak to ujawniono w EP239400 albo przez przeszczepianie kompletnych regionów zmiennych do ludzkich

184 031 regionów stałych, jak to ujawniono w patencie USA 4816567. Przeciwciała humanizowane mogą być przydatne do zmniejszania immunogenności przeciwciała (albo fragmentu przeciwciała). Humanizowaną odmianę przeciwciała A5B7 ujawniono w PCT W092/01059.

Hybrydomę wytwarzającą przeciwciało monoklonalne A5B7 zdeponowano w European Collection of Animal Celi Cultures, Division of Biologies, PHLC Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK. Depozyt złożono 14 lipca 1993 pod numerem 93071411. Przeciwciało A5B7 można otrzymać ze zdeponowanej hybrydomy z użyciem standardowych technik, znanych w technice, jak to dokumentuje Fenge C, Fraune E i Schuegerl K w Production of Biologicals from Animal Cells in Culture (wyd. Spier RE, Griffiths JR i Meignier B), Butterworth-Heinemann, 1991, 262-265 i Andersen BL i Gruenberg ML w Commercial Production of Monoclonal Antibodies (wyd. Seaver S) Marcel Dekker, 1987, 175-195. Komórki mogą wymagać ponownego klonowania od czasu do czasu przez skrajne rozcieńczenia, w celu utrzymania odpowiedniego poziomu wytwarzania przeciwciał. Do derywatyzacji mysiego przeciwciała A5B7 zastosowano SATA™ (ester N-hydroksysukcynimidu i kwasu S-acetylotioglikolowego) Sigma (nr kat. A9043).

Do derywatyzacji bydlęcej RNazy trzustkowej (BP-RNaza) zastosowano łącznik SMPB (ester N-hydroksybursztynowy kwasu 4-(p-maleimidofenylo)masłowego) Sigma (nr kat. Mól 39).

SATA (Sigma) rozpuszczono w DMSO (Fisons) w stężeniu 10 mg/ml. Do roztworu 50 mg A5B7 w stężeniu 5,4 mg/ml 2 100 mM fosforanie/100 mM NaCl/1 mM EDTA pH 7,2 (bufor A) dodano 309 mg (30,9 ml) roztworu SATA (stanowiącego 4-krotny nadmiar molarny wobec A5B7) zmieszano i pozostawiono w spokoju w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Powstały roztwór przepuszczono przez kolumnę Sephadex™ G25 (Pharmacia) (210 ml 2,6x38 cm) w celu usunięcia nadmiaru reagentów w temperaturze pokojowej, uzyskując stężenie końcowe 2,09 mg/ml derywatyzowanego A5B7 (objętość całkowita 23,5 ml). A5B7 derywatyzowane SATA zmieszano z 1,0 ml 10% obj./obj. 500 mM hydroksylaminy/500 mM fosforanu sodu/30 mM EDTA pH 8,0, w celu deacetylowania derywatyzowanego A5B7, przy czym reakcja przebiegała w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Stężenie białka oznaczono przez absorbancję UV przy długości fali 280 nm, zakładając e=1,4 (albo metodą Bradforda). Ilość łącznika badano metodą Ellmansa na -SH i stwierdzono 1,2 łącznika/mol A5B7.

BP-RNazę (Sigma) rozpuszczono w 6,0 ml 100 mM fosforanu sodu/100 mM NaCl pH 7,2 (Bufor B) otrzymując stężenie 8,33 mg/ml.

SMBP (Sigma) rozpuszczono w DMSO (Fisons) w stężeniu 10 mg/ml. Roztwór 50 mg BP-RNazy zmieszano z 6500 mg (650 ml) roztworu SMBP (stanowiącego 5-krotny nadmiar molarny nad BP-RNzą) i pozostawiono w spokoju przez 120 minut w temperaturze pokojowej. Nadmiar reagentów usunięto przez chromatografię żelową (Sephadex G25 210 ml 2,6x30 cm). Stężenie derywatyzowanego białka oznaczano przez UV A280 przyjmując e=0,6.

Ilość łącznika określano odwróconą metodą Ellmana, przez dodanie znanej ilości 2-merkaptoetanolu do BP-RNazy derywatyzowanej maleimidem i badanie nieprzereagowanych grup -SH. Reakcję koniugacji przeprowadzono przez dodanie równych ilości deacetylowanego derywatyzowanego A5B7 i derywatyzowanej BP-RNazy i rozcieńczenie wodą dejonizowaną do stężenia 1,0 mg/ml, po czym mieszano pod azotem. Reakcję prowadzono przez 20 godzin w temperaturze pokojowej, po czym przerwano przez dodanie 1 mg/ml glicyny w roztworze wodnym.

Surowy produkt koniugacji poddano wymianie buforu przez dializę do 50 mM fosforanu pH 8,0 (Bufor C) zaś powstały roztwór wprowadzono do kolumny Q Sepharose™ (Pharmacia) (30 ml 1,6x15 cm) zrównoważonej Buforem C. Kolumnę przepłukano buforem C w celu usunięcia nadmiaru A5B7 i BP-RNazy po czym eluowano koniugat 0,5 M NaCl przy przepływie 1 ml/min. Czystość powstałego koniugatu oceniano przez SDS-PAGE, i okazało się, że całkowita ilość 5,75 mg koniugatu obejmowała w składzie 88,5% koniugatu i 11,6% wolnego derywatyzowanego A5B7 densytometrią laserową.

Przykład odniesienia 4

Synteza i izolacja koniugatu mysiego F(ab')2 A5B7-bydlęcej rybonukleazy trzustkowej

184 031

Do derywatyzacji F(ab')2 A5B7 zastosowano SATA (ester N-hydroksysukcynimidu i kwasu S-acetylotioglikolowego) Sigma (nr kat. A9043).

Do derywatyzacji bydlęcej RNazy trzustkowej (BP-RNaza) zastosowano łącznik SMPB (ester N-hydroksysukcynimidu i kwasu 4-(p-maleimidofenylo)masłowego) Sigma (nr kat. M6139).

SATA (Sigma) rozpuszczono w DMSO (Fisons) w stężeniu 10 mg/ml. Do roztworu 18,2 mg fragmentu F(ab')2 w stężeniu 2,14 mg/ml w 100 mM fosforan.ie/100 mM NaCl/1 mM EDTA pH 7,2 (bufor A) dodano 167 mg (16,7 ml) roztworu SATA (stanowiącego 4-krotny nadmiar molarny wobec F(ab')2 A5B7) zmieszano i pozostawiono w spokoju w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Powstały roztwór zatężano do 2,0 ml (9 mg/ml) stosując membranę Amicon YM10™ (ciężar cząsteczkowy odcięcia 100000), a następnie przepuszczono przez kolumnę Sephadex™ G25 (Phamacia) (50 ml 1,6x16 cm) w celu usunięcia nadmiaru reagentów w temperaturze pokojowej, uzyskując stężenie końcowe 1,04 mg/ml derywatyzowanego F(ab')2 A5B7 (objętość całkowita 10 ml). F(ab')2 A5B7 derywatyzowane SATA zmieszano z 1,0 ml 10% obj./obj. 500 mM hydroksylaminy/500 mM fosforanu sodu/30 mM EDTA pH 8,0, w celu deacetylowania derywatyzowanego F(ab')2 A5B7, przy czym reakcja przebiegała w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Stężenie białka oznaczono przez absorbancje w UV przy długości fali 280 nm, zakładając e=1,4 (albo metodą Bradforda). Ilość łącznika badano metodą Ellmana na -SH i stwierdzono 1,2 łącznika/mol Fab2.

BP-RNazę (Sigma) rozpuszczono w 2,0 ml 100 mM fosforanu sodu/100 mM NaCl pH 7,2 (Bufor B) otrzymując stężenie 7,50 mg/ml.

SMBP (Sigma) rozpuszczono w DMSO (Fisons) w stężeniu 10 mg/ml. Roztwór 15 mg BP-RNazy zmieszano z 1949 mg (1,95 ml) roztworu SMBP (stanowiącego 5-krotny nadmiar molamy nad BP-RNzą) i pozostawiono w spokoju przez 120 minut w temperaturze pokojowej. Nadmiar reagentów usunięto przez chromatografię żelową (Sephadex G25 50 ml 1,6x16 cm). Stężenie derywatyzowanego białka oznaczano przez UV A280 przyjmując e=0,6. Ilość łącznika określano odwróconą metodą Ellmana, przez dodanie znanej ilości 2-merkaptoetanolu do BP-RNazy derywatyzowanej maleimidem i badanie nieprzereagowanych grup SH. Reakcję koniugacji przeprowadzono przez dodanie równych ilości deacetylowanego derywatyzowanego F(ab')2 A5B7 i derywatyzowanej BP-RNazy i rozcieńczenie wodą de jonizowaną do stężenia 1,0 mg/ml, po czym mieszano pod azotem. Reakcję pozostawiono na 20 godzin w temperaturze pokojowej, po czym przerwano przez dodanie 1 mg/ml glicyny w roztworze wodnym. Surowy produkt koniugacji poddano wymianie buforu przez dializę w 50 mM Tris pH 8,0 (Bufor C), zaś powstały roztwór wprowadzono do kolumny Mono Q (HR5/5) (Pharmacia) zrównoważonej Buforem C. Kolumnę przepłukano buforem C w celu usunięcia nadmiaru F(ab')2 A5B7 i BP-RNazy po czym eluowano koniugat i pozostałą BPRNazę gradientem soli (0-1,0 M NaCl w 20 objętościach kolumny) przy przepływie 1 ml/min. Izolację koniugatu od pozostałego enzymu uzyskano przez wprowadzenie połączonych frakcji zawierających koniugat na kolumnę S200™ GPC (Pharmacia) (60 ml 1,6x16 cm) i płukanie PBS przy przepływie 1,0 ml/min.

Czystość powstałego koniugatu oceniano przez SDS-PAGE, i okazało się że całkowita ilość 0,70 mg koniugatu obejmowała 95,5% koniugatu i 4,5% wolnego derywatyzowanego F(ab')2 A5B7 densytometrią laserową.

Mysie F(ab')2 A5B7 wytworzono tak, jak to opisano w przykładzie 5, albo według poniższej procedury:

Przeciwciało A5B7 opisane w przykładzie 3 (780 ml w stężeniu 5,4 mg/ml) przygotowano do trawienia przez diafiltrację wobec 7 objętości 0,1 M fosforanu sodu, 3 mM EDTA (pH 6,4), stosując spiralny wkład Amicon™ CH2, zawierający membranę 130 kDa. Odzyskany materiał (3682 mg jak oceniono przez absorbancję przy długości fali 280 nm) filtrowano przez 0,22 mm i przechowywano w 4°C do momentu zastosowania. Zawiesinę krystalicznej papainy (9 ml o stężeniu 10 mg/ml; Boehringer Mannheim, nr kat. 1080140) zmieszano z 0,1 M fosforanem sodu, 3 mM EDTA (pH 6,4) zawierającym 100 mM L-cysteinę i pozostawiono na 30 minut w 37°C. Nadmiar cysteiny usunięto przez chromatografię żelową (kolumna Pharmacia G25M™, 2,6 cm średnicy, 30 cm długości, objętość całkowita około 160 ml) stosując 0,1 M

184 031 fosforan sodu, 3 mM EDTA (pH 6,4) przy prędkości przepływu 3 ml/min. Frakcje (1-minutowe) zbierano i badano przy OD 280 oraz prostym testem plamkowym DTNB w celu upewnienia się, że próbka jest wolna od cysteiny, przed połączeniem z porcją zredukowanej papainy. Stężenie zredukowanej papainy oznaczono (przez OD280, zakładając E=2,5) na 1,65 mg/ml, objętość 32,8 ml, białko całkowite 54 mg. Trawienie przeprowadzono stosując stosunek 1/60 wag./wag. zredukowanej papainy do A5B7 w 37°C stosując całą dostępną papainę i 655 ml przeciwciała (podgrzanego do 37°C przed rozpoczęciem trawienia) w stężeniu białka ocenionym na 4,9 mg/ml. Po 20 godzinach reakcję zadano 0,1-krotną objętością 100 mM N-etylomaleimidu w 50% roztworze etanolu. F(ab')2 oczyszczono od Fc i śladów niestrawionego białka przy użyciu 400 ml kolumny białko A-Sepharose FF™ (Pharmacia) (rozmiary 5 cm x 20 cm) równoważonej 25 mM fosforanem sodu, 150 mM chlorkiem sodu (pH 7,33) do momentu gdy pH i przewodność osiągnęły wartość buforu (19,7 mS przy 15°C). Surowy produkt trawienia rozcieńczono 1:1 buforem kolumny i rozdzielono na dwie partie (660 ml i 840 ml), po czym każdą z nich wprowadzono do kolumny Białka A przy przepływie 6,5 ml/min (liniowa prędkość przepływu równa 0,33 ml/cm2/min). Zbierano frakcje po 10 ml. Przepłukano kolumnę buforem równoważącym dopóki absorbancja przy 280 nm nie osiągnęła poziomu podstawowego. Początkowa płukana składała się z 50 mM octanu sodu (pH 4,5), następnie 50 mM octanu sodu (pH 4,0), następnie 50 mM kwasu octowego pH 3,5, po czym 50 mM kwasu cytrynowego (pH 2,8). Podczas płukania, były mierzone wartości ÓD280, po czym porcje zobojętniano w ciągu 30 minut stosując roztwór ortofosforanu disodowego (0,4 M). Próbki porcji analizowano przez SDS-PAGE (żel Pharmacia Excel™, barwiony metodą Coomassie). F(ab')2 eluowano przy pH buforu równym 4,0, zaś niestrawione A5B7 eluowało przy niższym pH. Próbki połączonych F(ab')2 diafiltrowano w 100 mM fosforanie sodu, 100 mM chlorku sodu, 1 mM EDTA (pH 7,2), (membrana Amicon™ CH2 30 kDa, 7 objętości diafiltracji) uzyskując 845 mg F(ab')2 (w stężeniu 2 mg/ml).

Przykład odniesienia 5

Wytwarzanie rekombinowanego F(ab')2 A5B7 w komórkach szpiczaka

Przykład opisuje otrzymywanie cDNA z hybrydomy A5B7, izolację swoistych fragmentów łańcuchów Fd i L przez PCR, określanie kompletnej sekwencji DNA tych fragmentów, ekspresję równoległą w komórkach szpiczaka w celu wytworzenia rekombinowanych fragmentów F(ab')2, hodowlę komórek szpiczaka i oczyszczanie rekombinowanego białka F(ab')2. Niektóre sposoby wytwarzania genetycznie konstruowanych przeciwciał w komórkach szpiczaka są opisane w literaturze, np. Neuberger i in., (1984) Naturę 312, 604-608, Williams i Neuberger (1986) Gene 43, 319-324, Wright i Shin (1991) Methods 2, 125-135, Traunecker (1991) Trends in Biotechnology 9, 109-113 i Bebbington i in., (1992) Bio/Technology 10, 169-175. Dla wygody, przykład niniejszy korzysta zasadniczo z procedury opisanej przez Bebbingtona i in., w oparciu o gen syntazy glutaminowej (GS) jako wybiórczy marker.

a) Otrzymywanie mRNA z komórek hybrydoma

Istnieje kilka sposobów izolacji poliA+mRNA z komórek eukariotycznych (Sambrook J, Fritsch EF i Maniatis T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbou Laboratory Press, wyd. drugie, 1989, Rozdział 8 str. 3, określane dalej jako Maniatis). Jeden ze sposobów dostarczony jest w zestawie z Pharmacia i polega na lizie względnie małej liczby komórek (10⁷ albo mniej), a następnie wiązaniu poliA+mRNA na kolumnie oligo dT. Niepożądane składniki komórki są usuwane przez płukanie słabym roztworem soli przed elucją mRNA wysokim stężeniem soli w podwyższonej temperaturze. mRNA wyizolowano z 10' komórek hybrydomy A5B7 stosując zestaw Quickprepa mRNA (Pharmacia Biotechnology Ltd.). Stężenie mRNA oceniono przez skanowanie próbki w spektrofotometrze Uvikon 930 (Kontron™ Instruments) w zakresie 300-220 nm i stosując współczynnik 40 mg/ml/jednostkę Od przy 260 nm. mRNA przechowywano w porcjach po 2,5 mg precypitowane w etanolu.

b) synteza cDNA

Sposób zastosowany do syntezy cDNA oparty był na opisanym przez Gublera i Hofmana, polegającym na odwrotnej transkrypcji z aktywowanego mRNA, a następnie trawieniu

184 031

RNazą H w celu aktywacji i syntezy drugiej nici przez polimerazę I DNA. Inne sposoby syntezy cDNA opisane są w Maniatisie (rozdział 8).

mg próbkę mRNA aktywowano oligo dT (mieszanina 12-18 merów, Pharmacia Biotechnology Ltd, 0,5 mg) w 10 ml roztworu zawierającego 2,5 jednostki łożyskowego inhibitora RNazy (Life Technologies Ltd.) rozcieńczonego wodą wolną od RNaz przez inkubację w 70°C ą następnie schodzenie na lodzie. Syntezę pierwszej nici cDNA wykonano przez dodanie 4 ml 5x buforu H-RT (250 mM Tris, pH 8,3, 200 mM KC1, 30 mM MgCl₂ i 0,5 mg/ml BSA), 2 ml 0,1 M DTT (ditiotreitol), 1 ml mieszaniny dNTP (dATP, dCTP, dGTP i dTTP w stężeniach 20 mM), 4 ml odwrotnej transkryptazy Superscript™ (Life Technologies Ltd.) i inkubację w 42°C przez godzinę. Do reakcji drugiej nici, dodano 1,5 ml mieszaniny dNTP (jak wyżej), 92,5 ml wody wolnej od DNaz, 30 ml 5x buforu reakcyjnego (125 mM Tris, pH 7,5, 500 mM KC1, 25 mM MgCl₂, 50 mM (NHa)₂SO4 i 0,5 mg/ml (p-NAD), 1 31 ligazy DNA T4 (10 jednostek, Life Technologies Ltd.) 4 pl polimerazy DNA I (40 jednostek, Life Technologies Ltd.) i 1 pl RNazy H (2,7 jednostek, Life Technologies Ltd.) po czym inkubację kontynuowano w 16°C przez dalsze 2 godziny. W celu upewnienia się, że powstał tępo zakończony DNA, wykonano końcową inkubację w 16°C przez 5 minut po dodaniu 2 ml polimerazy DNA T4 (10 jednostek, Life Technologies Ltd.). Aktywność enzymu przerwano przez inkubację w 70°C przez 10 minut.

c) izolacja fragmentów genów przeciwciała przez PCR

Izolację fragmentów łańcuchów Fd i L A5B7 wykonano stosując cDNA jako matrycę. Fragment Fd przerwano bezpośrednio po sekwencji zawiasowej (C-końcowa treonina) co dalej określano jako proteolityczny typ Fd. Przez proteolityczny Fd rozumie się w tym przykładzie rekombinowany zamiennik Fd, wytworzonego proteolitycznie, jak to opisano w przykładzie 4.

Materiał z reakcji pierwszej nici cDNA albo po zakończeniu reakcji drugiej nici jest odpowiedni jako matryca. Materiał może być zastosowany bezpośrednio z zakończonej reakcji, albo po rozcieńczeniu (do 1 w 100) w wodzie bidestylowanej. Oligonukleotydy (Identyfikator Sekw. Nr 17-24) zastosowano do wytworzenia fragmentów łańcucha Fd i L. Dla każdego fragmentu przeciwciała oligonukleotyd końca 5' (Identyfikator Sekw. Nr 17 dla fragmentu Fd i Identyfikator Sekw. Nr 18 dla łańcucha L) kodował miejsce restrykcyjne (Hindlll dla łańcucha Fd i EcoRI dla L), sekwencję zgodności Kozaka (GCCGCCACC) w celu maksymalizacji zapoczątkowywania translacji oraz część naturalnej mysiej sekwencji sygnałowej. Oligonukleotyd regionu 3' dla fragmentu proteolitycznego typu Fd (Identyfikator Sekw. Nr 19 był komplementarny do końca 3' regionu zawiasowego, kodował mutację w celu wprowadzenia kolejnych kodonów przerwania translacji (TAG i TAA) bezpośrednio po zawiasie i zawierał miejsce restrykcyjne EcoRI poza sekwencją. Region 3' łańcucha L określony był przez oligonukleotyd (Identyfikator Sekw. Nr 20) komplementarny do końca regionu kodującego, wprowadzał dodatkowy kodon przerywający translację (TAA) i miejsce restrykcyjne EcoRI. Oprócz tego, zastosowano pary częściowo nakładających się i komplementarnych oligonukleotydów dla każdego fragmentu (Identyfikator Sekw. Nr 21 i 22 dla Fd i Identyfikator Sekw. Nr 23 i 24 dla łańcucha L), w celu wprowadzenia niemych mutacji do każdej nici DNA, powodując usunięcie BamHI z fragmentu CHi Fd i VL z łańcucha L, bez zmiany kodowanej sekwencji aminokwasowej. Każdy z oligonukleotydów 5' i 3' zastosowano z odpowiednim oligonukleotydem mutagennym w celu wytworzenia 2 zmutowanych fragmentów każdego z łańcuchów przeciwciał. Po oczyszczeniu dwa fragmenty zmieszano w równych proporcjach i zastosowano jako matryce do drugiej reakcji PCR stosując odpowiednie oligonukleotydy regionów 5' i 3'. Produkty tych reakcji były fragmentami łańcuchów Fd i L pełnej długości, bez wewnętrznych miejsc BamHI.

Ogólnie, 5 ml cDNA dodano do 100 ml reakcji zawierającej 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1, 0,1% żelatynę, 1,5 mM MgCl₂, 1,25 mM każdego z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 1 mM każdej z odpowiednich par oligonukleotydów i 2,5 jednostki polimerazy DNA Tag (Amplitag, Perkin-Elmer Cetus). Każdą z reakcji pokryto 100 ml oleju mineralnego i inkubowano w 94°C przez 1,5 minuty, 50 albo 55°C przez minutę i 72°C przez 2 minuty w ciągu 25 cykli i 10 minut w 72°C. Nastawiono również reakcje kontrolne.

184 031

Reakcje PCR analizowano przez puszczenie próbki 5 ml każdej z nich na 0,8% żelu agarozowym (Sigma Chemical Company Ltd.), który następnie zabarwiono roztworem 1 mg/ml bromku etydyny (BDH Laboratory Supplies) po czym DNA obrazowano na prześwietlarce UV. Prążki o odpowiedniej wielkości były widoczne we wszystkich PCR z obecnym cDNA A5B7 co wskazywało na pomyślną amplifikację fragmentów łańcuchów Fd i L. Nieobecność prążków DNA w reakcjach kontrolnych wskazuje na to, że odczynniki nie zawierały zanieczyszczeń DNA. Każdy z produktów PCR oczyszczano przez zastosowanie przyrządu do zatężania Centricon 100 (Amicon Ltd.) Każdą z reakcji wprowadzono do przyrządu i zwiększono objętość do 2 ml' przez dodanie podwójnie destylowanej wody. Jednostkę odwirowano przy 500 g (wirówka stołowa Sorval RT6000Ba z rotorem H1000B) przez 5 minut po czym usunięto przesącz. Retentat rozcieńczono ponownie do 2 ml i ponownie odwirowano. Proces powtarzano trzykrotnie. Procedura ta spowodowała oddzielenie nadmiaru składników bufora i oligonukleotydów od amplifikowanego DNA. Oczyszczone DNA zastosowano bezpośrednio do kolejnych reakcji PCR. Odpowiednie pary fragmentów zmieszano w równych proporcjach i porcje zastosowano do drugiej PCR z odpowiednimi oligonukleotydami 5' i 3'.

d) Klonowanie fragmentów wytworzonych w PCR do pBluescript™

Produkty drugiej reakcji PCR wykazywały prążki wielkości około 775 bp i 730 bp odpowiednio z łańcuchami Fd i L pełnej długości. Produkty te były również oczyszczane przez zastosowanie urządzeń do stężania Centricon 100™. Każdy produkt PCR precypitowano następnie w 1,5 ml roztworu zawierającego 50 pl 3 M octanu sodu, wody destylowanej do 500 pl i 1 ml alkoholu absolutnego. Roztwór inkubowano na lodzie przez co najmniej 10 minut, po czym odwirowano przy 11600 x g przez 10 minut (MSE MicroCentaur™). Nadsącz usunięto zaś osad przemyto 1 ml 70% etanolu (obj./obj. w wodzie destylowanej) przez odwirowanie przez kolejne 5 minut. Nadsącz usunięto zaś osad DNA wysuszono pod próżnią. Każdy z osadów DNA rozpuszczono w wodzie destylowanej. Produkt PCR Fd trawiono EcoRl i Hindlll w 200 pl reakcji zawierającej 20 mM octan Tris, pH 7,9, 10 mM octan magnezu, 50 mM octan potasu, 1 mM ditiotreitol (DTT) i po 25 jednostek Hindin i EcoRI (Promega Corporation). Produkt łańcucha L trawiono EcoRI w 30 p l reakcji zawierającej 90 mM TrisHCI, pH 7,5, 10 mM chlorek magnezu, 50 mM chlorek sodu i 10 jednostek EcoRI. Reakcję trawienia inkubowano przez godzinę w 37°C.

Trawione fragmenty oczyszczono przez elektroforezę na 0,75% żelu agarozowym SeaPlaque™ GTG (FMC BioProducts Ltd) po czym wycięto odpowiednie prążki z żelu. Skrawki żelu agarozowego rozpuszczono przez inkubację w 65°C przez 2 minuty, rozcieńczono do objętości końcowej 450 pl wodą destylowaną i dodano 50 pl 3 M octanu sodu. Roztwór ekstrahowano równą objętością płynnego fenolu, buforowanego Tris pH 7,6, (Fisons Scientific Equipment) stosując odwirowanie przy 11600 x g przez 2 minuty (MSE MicroCentaur™) w celu rozdzielenia fazy wodnej i fenolowej. Następnie fazę wodną ponownie ekstrahowano mieszaniną fenol:chloroform (50:50, obj./obj.) po czym ponownie chloroformem, po czym precypitowano etanolem jak to opisano wyżej. Każdy oczyszczony osad zawieszano w 10 pl wody destylowanej i 1 pl próbkę wizualizowano przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym w celu ocenienia jakości i stężenia. Do początkowego klonowania cDNA łańcucha Fd i L zastosowano pBluescript™ (Stratagene Cloning Systems). Ten wektor fagemidowy posiada pojedyncze miejsca klonowania EcoRI i Hin-dlH, gen oporności na ampicylinę i początki replikacji Co-IEI i fl do izolacji DNA dwu- albo jednoniciowego. 5 pg DNA pBluescript™ KS trawiono całkowicie 30 jednostkami EcoRI (Promega Corporation) w 100 pl reakcji zawierającej 90 mM Tris-HCI pH 7,5, 10 mM MgCk, 50 mM NaCl albo EcoRI i HindDI w 100 pl reakcji zawierającej 20 mM octan Tris pH 7,9, 10 mM octan magnezu, 50 mM octan potasu, 1 mM ditiotreitol (DTT) i po 25 jednostek EcoRI i Hindin (Promega) w 37°C przez godzinę. 2 pl cielęcej jelitowej fosfatazy alkalicznej (2 jednostki, Boehringer Mannheim) dodano do produktu trawienia plazmidu EcoRI w celu usunięcia grup fosforanowych 5' i prowadzono inkubację przez dalsze 30 minut w 37°C. Aktywność fosfatazy zniszczono przez inkubację w 70°C przez 10 minut. Plazmid przecięty EcoRI-Hindlll oczyszczono z żelu agarozowego SeaPlaque™ jak to opisano wyżej.

184 031

25-50 ng trawionego produktu PCR łańcucha Fd albo L poddano ligacji z 50 ng pBluescript™ trawionego, odpowiednio, EcoRI-Hindlll albo EcoRI/CIP, w 10 pl roztworu zawierającego 30 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 1 mM ATP i 1,5 jednostki ligazy DNA T4 (Promega) w 16°C przez 2,5 godziny,'1 pl każdej z reakcji zastosowano do transformacji 20 pl kompetentnych komórek E. coli DH5a (Life Technologies Ltd.) stosując protokół dostarczony z komórkami. Transformowane komórki wysiano na agar L z dodatkiem 100 pg/ml ampicyliny, 1 mM IPTG i 0,2% X-gal i inkubowano przez noc w 37°C. Klony zawierające wstawki wyizolowano na podstawie tworzenia białych kolonii na powyższym podłożu, w porównaniu z niebieskimi koloniami tworzonymi przez komórki zawierające plazmid macierzysty.

e) Analiza sekwencji DNA klonów cDNA

Potencjalne klony cDNA łańcuchów Fd i L, zidentyfikowane dzięki selekcji kolorów, pobrano z płytki agarowej i zastosowano do wytwarzania plazmidu na wielką skalę. Każdy z klonów zastosowano do inokulacji 200 ml pożywki L z dodatkiem 100 ug/m.l ampicyliny w 500 ml butelce stożkowej . Hodowle inubbowano wytrząaając w 77C3 prezz noc. Po hodowli, komórki z każdej z butelek żwirowano przy 5000 x g, przez 10 minut w wirówce Sorvall RC5C i rotorze GS3 w 4°C. Osad komórek z każdej z hodowli zawieszono w 20 ml buforu TE i ponownie odwirowano przy 2000 x g przez 10 minut w wirówce Sorvall RC5C i rotorze SS-34 w 4°C w probówce typu nak-rl0ge. Każdy z osadów komórkowych zawieszono w 3 ml lodowatej 25% sacharozy, 50 mM Tris, pH 8,0 i pozostawiono na lodzie. Dodano świeżego roztworu lizozymu (1,0 ml w stężeniu 10 mg/ml), zawartość probówki zamieszano przez obracanie i pozostawiono na lodzie przez 5 minut. Dodano roztwór etyleandiamiantetpjnotaa sodu (EDTA) (1,0 ml o stężeniu 0,5 mM, pH 8,5) i zawartość delikatnie wymieszano. Na koniec, dodano 5,0 ml lodowatego roztworu Tritna X™ (0,1% Triton Χ-100, 62,5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8,0), zawartość delikatnie wymieszano i ianubnwaan na lodzie przez dalsze 10 minut. Resztki komórkowe odwirowano przy 39000 x g przez 30 minut w wirówce Sorvall RC%C i rotorze SS-34 w 4°C. Nadsącz zawierający plazmidowy DNA dodano do 16 g chlorku cezu (Boehringer Mannheim) i 150 ml roztworu bromku etydyny (10 mg/ml) i zwiększono objętość do 18,5 ml przez dodanie buforu TE. Roztwór ten ppzeaiesinan do

18,5-ml polipropylenowej probówki wirowaiczej o zatapianym końcu (Sorvall Iastrumeats). Probówkę zatopiono i odwirowano przy 180000 x g przez 16 godzin w rotorze Sorvall TV865B (tytanowy, pionowy) i wirówce OTD65B w 18°C.

Po odwirowaniu plazmidowy DNA był widoczny jako odgraniczony pomarańczowy prążek, na gradiencie gęstości CsCl/EtBR, który się wytworzył. Plazmidowy DNA pobrano z gradientu przy użyciu igły podskórnej, którą przebito ścianę probówki, próbkę pobraną z gradientu rozcieńczono 3-4 krotnie buforem TE i precypitowano DNA przez dodanie równej objętości alkoholu izopropylowego i inkubację na lodzie przez 10 minut. Precypitowany DNA żwirowano przy 17000 x g w wirówce Sorvall RC5C i rotorze SS-34 w 4°C, po czym usunięto aa0szcz. Powstały osad płukano 70% etanolem (obj./obj.) i ponownie wirowano przez 5 minut. Osad wysuszono pod próżnią, rozpuszczono w 1,8 ml buforu TE i 200 ml 3 M octanu sodu, po czym ekstrahowano równą objętością fenolu stosując wirowanie przy 17000 x g przez 2 minuty w celu rozdzielenia faz. Fazę wodną ponownie ekstrahowano równą objętością chloroformu, po czym precypitowano DNA przez dodanie równej objętości etanolu w temperaturze -20°C i inkubację na lodzie przez 10 minut. Oczyszczony DNA żwirowano jak wyżej, płukano 5 ml 70% etanolu i suszono osad pod próżnią. Wysuszony osad rozpuszczono w 500 ml wody ^destylowanej i oznaczono stężenie DNA przez skanowanie rozcieńczonej próbki od 300 do 220 nm w spektrofotometrze UV stosując współczynnik ekstynkcji równy 50 mg/ml/OD260. Dostępnych jest również wiele zestawów do izolacji plazmidowego DNA np. Qiagena (Hybaid Ltd.).

Oczyszczony plazmidowy DNA zastosowano do analizy sekwencji DNA. Dwuniciowy DNA może być użyty do analizy sekwencji DNA metodą zakańczania łańcucha przy użyciu dideznksynuklentydów wg Sangera (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1977, 5463), stosując dostępny w handlu zestaw taki jak Seguenasea dostarczany przez United States Biochemicals Company w oparciu o załączony protokół.

184 031

Porcje (2-4 mg) plazmidowego DNA klonów cDNA łańcucha Fd i L zastosowano do analizy sekwencji DNA. Każdą porcję denaturowano początkowo przez inkubację z 0,2 M NaOH, 0,2 mM EDTA w objętości końcowej 100 ml w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Denaturowany DNA precypitowano przez dodanie 10 ml 3 M octanu sodu (pH 5,0) i 275 ml etanolu i inkubację na lodzie przez 10 minut. Precypitowany DNA odzyskano jak to opisano dla DNA plazmidowego. Denaturowany DNA z.aktywowano do sekwencjonowania przez inkubację z 0,5 pmola odpowiedniego startera w 10 ml buforu reakcyjnego Sequenase™ (40 mM Tris, pH 7,5, 25 mM MgCl₂, 50 mM NaCl) zawierającego 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) w 65°C przez 2 minuty, a następnie przez powolne studzenie do poniżej 30°C. Zaktywowane matryce zastosowano do reakcji sekwencjonowania według dołączonego protokołu z 10% DMSO dodanym do mieszanin do reakcji znakowania i zakańczania.

Reakcje sekwencjonowania analizowano przez autoradiografię po elektroforezie wysokiej rozdzielczości na 6% denaturującym żelu poliakrylamidowym z 8 M mocznikiem (Sanger i Coulson, 1978, FEBS Lett. 87,107).

Kompletne sekwencje klonowanych cDNA łańcucha Fd i L podano niżej (Identyfikator Sekw. nr 25 dla proteolitycznego typu łańcucha Fd i Identyfikator Sekw. nr 26 dla łańcucha L). Plazmid zawierający Fd typu proteolitycznego nazwano pAFI, zaś łańcuch L pAF3. Potwierdzono również obecność niemej mutacji w każdym z fragmentów, w celu usunięcia miejsca BamHI. Sekwencja DNA wskazuje również, że przeciwciało jest izotypu IgGlkappa, po porównaniu z opublikowanymi danymi dotyczącymi DNA regionu stałego (Kabat EA, Wu TT, Bilofsky H, Reid-Milner M, Perry H., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. czwarte, Public Health Service NEH, Washington, DC).

f) klonowanie do wektorów ekspresyjnych szpiczaka

W celu wytworzenia wektorów zdolnych do równoległej ekspresji łańcucha Fd i L w komórkach szpiczaka, zastosowano układ GS-System™ (Celltech Biologicals) (WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 i WO 89/10404).

Procedura wymaga klonowania łańcucha Fd w region Hindlll-EcoRI wektora pEE6 (pochodna pEE6.hCMV - Stephens i Cockett (1989) Nuci. Acids. Res. 17, 7110 - w której miejsce Hindlll powyżej promotora hCMV przerobiono na miejsce Bglll) zaś łańcuch L w miejsce EcoRI pEE12 (wektor ten jest podobny do p3V2.GS opisanego przez Bebbingtona i in., (1992) Bio/Technology 10, 169-175, z wieloma miejscami obecnymi oryginalnie w pSV2.GS, usuniętymi ukierunowaną mutagenezą w celu zapewnienienia unikalnych miejsc w regionie łącznika). Następnie, Kaseta ekspresji z pEE6 wprowadzana jest w region BamHI pEE12. Alternatywnie, fragment Bglll-Sall zawierający kasetę ekspresji Fd może być wprowadzony w region BamHI-Sall plazmidu pEE12 zawierającego łańcuch L.

W celu stworzenia indywidualnych wektorów (proteolitycznego Fd w pEE6 i łańcucha L w pEE12) plazmidy pAFI i pEE6 trawiono EcoRI i Hindlll, zaś pAF3 i pEE12 trawiono EcoRI jak to opisano wyżej. Odpowiednie fragmenty wektora i wstawki z każdego z trawień izolowano z agarozy Seaplaque™ GTG i ligowano ze sobą, po czym stosowano do transformacji kompetentnych komórek DH5a, jak to opisano wcześniej. Przesiewanie kolonii po transformacji przeprowadzono metodą PCR. Kolonie przeniesiono do 200 ml wody destylowanej i zmieszano. Zawieszone komórki podgrzano następnie do 100°C przez minutę i odwirowano przy 11600 x g przez 2 minuty, przed zastosowaniem nadsączu do reakcji PCR. W każdej reakcji PCR, stosowano oligomer startujący w obrębie promotora CMV (Identyfikator Sekw. nr 27), wraz z, jak to konieczne, oligomerem komplementarnym z regionem 3' Fd (Identyfikator Sekw. nr 19) albo łańcucha L (Identyfikator Sekw. nr 20). Jedynie klony z fragmentem genu przeciwciała wprowadzonym w orientacji ekspresjonującej poniżej promotora CMV powinny dawać swoiste produkty PCR w każdym przypadku o wielkości około 2,0 kbp. Nastawiono reakcje PCR po 20 ml, zawierające 20 pmoli każdego ze starterów (Identyfikator Sekw. nr 27 z Identyfikator Sekw. nr 19 albo 20), 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 50 mM KC1, 0,1% żelatynę, 1,5 mM MgCl₂, 1,25 mM każdego spośród dATP, dCTP, dGTP i dTTP, oraz 0,5 jednostki polimerazy DNA Taq (Amplitaga, Perkin-Elmer Cetus). Każdą z reakcji pokryto 20 ml oleju mineralnego i inkubowano w 94°C przez 1,5 minuty, 50°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty przez 25 cykli i przez 10 minut w 72°C. Reakcje PCR

184 031 analizowano przez elektroforezę na żelu agarozowym i identyfikowano potencjalne klony przez obecność produktu PCR wielkości około 2,0 kbp. Te prawdopodobne klony zastosowano do wytwarzania plazmidowego DNA na wielka, skalę, charakteryzowano trawieniem enzymami restrykcyjnymi EcoRI-Hindlll oraz EcoRI, zaś sekwencję wstawki potwierdzano analizą sekwencji jak to opisano wyżej. Izolaty nazwano pAF4 (Fd typu proteolitycznego w pEE6) i pAF6 (łańcuch L w pEE12).

W celu wytworzenia wektorów koekspresjonujących, 5-7,5 mg plazmidu Fd pAF4 trawiono 30 jednostkami każdego z Bglll (Pharmacia) i BamHI (New England Biolabs) w roztworze zawierającym 50 mM Tris-HCI, pH 7,9, 10 mM chlorek magnezu, 150 mM chlorek sodu i 1 mM DTT, przez godzinę w 37°C. Trawienie potwierdzono przez elektroforezę na żelu agarozowym. 5 mg plazmidu łańcucha L pAF6 trawiono 25 jednostkami BamHI (New England Biolabs) w roztworze opisanym wyżej przez inkubację przez godzinę w 37°C. DNA defosforylowano przez dodanie 2 jednostek CIP i inkubację w 37°C przez 40 minut, po czym trzykrotnie ekstrachowano 10 ml żywicy Stratacleana (Stratagene Ltd). Fragment kasety ekspresji Fd i główny prążek plazmidu pAF6 oczyszczono z żelu agarozowego SeaPlaąuea GTG, odpowiednią kombinację poddano ligacji i zastosowano do transformowania kompetentnych komórek DH5a jak to opisano wyżej.

g) Identyfikacja wektorów koekspresjonujących

Sto kolonii z powyższej transformacji pobrano w powtórzeniach w partiach po 50 na krążki nitrocelulozowe średnicy 9 cm (Schleicher & Schuel), położono na płytkach z agaru L z dodatkiem 100 mg/ml ampicyliny. Trzeci zestaw płytek bez filtrów zdrapano tworząc wyjściowy bank wybranych kolonii. Po całonocnej inkubacji w 37 °C, filtry nitrocelulozowe pobrano i poddano obróbce, jak to opisano w Grunstein i Hogness (Maniatis, rozdział 1, 102) w celu lizy komórek bakterii in situ. Filtry pokryto papierem 3 MM (Whatman) zanurzono w różnych odczynnikach - 10% SDS na dwie minuty, 3 M NaOH, 1 M NaCl przez 5 minut, i 1 M Tris pH 6,8, dwa razy po 2 minuty. Filtry zawierające rozłożone komórki przeniesiono na papier 3 MM zwilżony 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M octan sodu) i sieciowano DNA z filtrem przez ekspozycję na UV w urządzeniu Spectrolinkera XL1500 (Spectronics Corporation) nastawionym na dowolne sieciowanie (120000 mJouli). Filtry wysuszono na powietrzu przed zastosowaniem ich do sondowania (patrz niżej) płytki z wyjściowymi bankami przechowywano w 4°C do momentu zastosowania.

W celu wytworzenia sond swoistych wobec kolonii zawierających łańcuchy Fd i L zastosowano oligonukleotydy swoiste dla łańcucha Fd i L (odpowiednio, Identyfikator Sekw'. nr 22 i 24). Sonda hybrydyzacyjna może być wytworzona z syntetycznych oligonukleotydów przez dodanie radioaktywnej grupy fosforanowej 5' z g^P-ATP dzięki aktywności kinazy polinukleotydowej T4. 20 pmoli oligonukleotydu dodano 20 ml reakcji zawierającej 100 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCh, 0,1 mM spermidyny, 20 mM DTT, 7,5 mM ATP, 0,5 mM g^P ATP i 2,5 jednostki kinazy polinukleotydowej T4 (Pharmacia Biotechnology Ltd). Reakcje inkubowano przez 30 minut w 37°C, a następnie przez 10 minut w 70°C przed zastosowaniem hybrydyzacją. Sposoby wytwarzania sond z oligonukleotydów dostarczone są w Maniatisie (rozdział 11). 10 ml porcję oligomeru znakowanego radioaktywnie dodano do 10 ml 6x SSC (1 M NaCl, 0,1 M cytrynian sodu), 0,1% SDS (sodowy siarczan dodecylowy) i 0,25% Marvela (odtłuszczone sproszkowane mleko), które zastosowano jako roztwór do sondowania.

Obrobione filtry zawierające wyselekcjonowane klony (patrz wyżej) prehybrydyzowano w powtórzeniu w partiach w 90 ml 6x SSC, 0,1% SDS, 0,25% Marvela w 65°C przez 3 godziny w piecu hybrydyzacyjnym Techne HB-1 z użyciem obrotowych szklanych pojemników. Każdy zestaw powtórzenia sondowano 10 ml roztworu do sondowania (jeden zestaw z sondą VH zaś drugi z sondą VL) w 65°C przez noc, w tym samym urządzeniu. Po inkubacji, każdy zestaw filtrów płukano w 100 m 6x SSC, 0,1% sDs, w 65°C przez 10 minut, 100 ml 3x SSC, 0,1% SDS w 65°C przez 30 minut i 100 ml lx SSC, 0,1% SDS w 65°C przez 30 minut w tym samym urządzeniu. Płukane filtry następnie suszono na powietrzu i poddawano autoradiografii stosując Hyperfilma MP (Amersham International) w połączeniu z ekranem wzmacniającym w -70°C. Po wywołaniu w automatycznym urządzeniu Kodak, potencjalne klony ekspresjonujące F(ab')2 identyfikowano jako hybrydyzujące z obiema sondami. Częstość występowania

184 031 klonów wykazujących hybrydyzację z sondami swoistymi wobec łańcuchów Fd i L była bardzo niska (około 2%). Potencjalne klony równolegle ekspresjonujące wybrano z płytek wyjściowych i zastosowano do wytwarzania plazmidowego DNA na wielką skalę. Analizę trawieniem restrykcyjnym enzymami EcoRI i Hindlll zastosowano w celu potwierdzenia orientacji każdej z kaset ekspresji. Zidentyfikowano wyłącznie klony o położeniu kaset ekspresji L i Fd w położeniu tandemowym (w przeciwieństwie do położenia zbieżnego). Powstały wektor nazwano pAF8 (proteolityczny Fd i L w pEE12).

h) Transfekcja komórek szpiczaka

Istnieje kilka sposobów wprowadzania DNA do komórek eukariotycznych (Bebbington C, Methods, tom 2, 136-145). Elektroporacja staje się rutynowo stosowaną metodą, zastępując metodę precypitacji DNA fosforanem wapnia. Komórki szpiczaka NSO (Methods in Enzymology, 1981, 73B, 3-46, ECACC nr 85110503) są odpowiednim gospodarzem do tego celu z powodu nieobecności innych endogennie wydzielanych przeciwciał. Oczekuje się, że pewna część komórek powstających w pożywce bezglutaminowej po transfekcji plazmidem koekspresjonującym łańcuchy Fd i L powinna ekspresjonować funkcjonalne fragmenty przeciwciała A5B7. Przed transfekcją, 40 mg plazmidowego DNA pAF 8 linearyzowano przez trawienie 200 jednostkami Sali (New England Biolabs) w 400 ml reakcji zawierającej 10 mM Tris-HCI pH 7,9, 10 mM chlorek magnezu, 150 mM chlorek sodu, 1 mM DTT i 100 mg/ml acetylowanej BSA w 37°C przez 1,75 godziny. Po trawieniu każdy z DNA precypitowano w etanolu i zawieszano w 50 ml wody destylowanej.

Komórki NSO hodowano prawie do zlewności w 160 cm2 butelce hodowlanej (Nunc albo Costar) zawierającej 50 ml nieselektywnej pożywki hodowlanej (DMEM, Life Technologies Ltd., z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej) inkubując w 37°C w atmosferze 5% CO2. Przed transfekcją, komórki NSO zawieszono przez uderzanie butelką o rękę lub stół i przeniesiono do 50 ml probówki wirowniczej stożkowodennej (Falcon). Próbkę (40 ml) pobrano w celu oceny ilości komórek przy użyciu licznika Coulter nastawionego na liczenie od 10 do 20 ml. Komórki żwirowano przy 500 x g przez 5 minut (wirówka stołowa Sorval RT6000) a następnie płukano w 45 ml lodowatego roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS) i ponownie odwirowano. Płukane komórki zawieszono w lodowatym PBS w gęstości 1,3x10⁷ komórek na ml i przechowywano na lodzie. 50 ml próbkę trawionego Sali plazmidowego DNA zmieszano z 800 ml (107) komórek NSO w kuwecie do elektroporacji o odstępie 0,4 cm (Bio-Rad Laboratories Ltd.) unikając tworzenia pęcherzyków powietrza po czym kuwetę inkubowano na lodzie przez 5 minut. Kuwetę wytarto do sucha i umieszczono w urządzeniu do elektroporacji Gene Puls-era (Bio-Rad) i dostarczono dwa kolejne pulsy po 1500 wolt i 3 mFarady, według instrukcji producenta. Po elektroporacji kuwety umieszczono ponownie na lodzie na 5 minut po czym zmieszano z 30 ml ogrzanej pożywki selekcyjnej. Około 20 ml zawiesiny komórek rozdzielono do czterech 96-studzienkowych płaskodennych płytek hodowlanych (Nunc) po 50 ml na studzienkę. Dalsze 10 ml rozcieńczono 30 ml pożywki nieselektywnej i wysiano do pięciu płytek 96-studzienkowych. Rozcieńczoną zawiesinę dalej rozcieńczono (10 ml do 40 ml) pożywką nieselektywną) i wysiano do 5 płytek 96-studzienkowych. Komórki inkubowano w 37°C w 5% CO2 przez noc. Selektywną pożywkę bez glutaminy (150 ml, Bebbington i in., (1992) Bio/Technology 10, 169-175) dodano do każdej ze studzienek płytek 96-studzienkowych po czym płytki z powrotem umieszczono w inkubatorze umożliwiając stopniowe zniknięcie glutaminy i dokąd kolonie nie były widoczne gołym okiem.

i) Namnażanie linii komórkowych

Wyselekcjonowano kolonie z płytek 96-studzienkowych w których obecna była pojedyncza kolonia. Komórki zawieszono przez pipetowanie i 100 ml przeniesiono do studzienki płytki 24-studzienkowej i dodano do każdej studzienki po 1 ml pożywki selektywnej. Dalsze 100 ml pożywki selektywnej dodano ponownie do każdej ze studzienek płytki 96-studzienkowej z których pobrano kolonie zapewniając w ten sposób zapas komórek. Płytki 24studzienkowe inkubowano w 37°C w 5% CO2 do 50% zlewnego wzrostu. Na tym etapie pobrano 100 ml nadsączu komórek i badano w kierunku wiązania z CEA w teście ELISA (patrz niżej). Linie komórkowe wykazujące aktywność wiązania dalej namnażano przez pipetowanie i przeniesienie 1 ml do butelki hodowlanej 25 cm2. Kolejny 1 ml pożywki selektywnej dodawano

184 031 do każdej butelki po czym butelki inkubowano w przechyle w celu zgromadzenia komórek na dnie butelki. Po kilku dniach inkubacji, 3 ml pożywki selektywnej dodano do każdej z butelek, które następnie inkubowano poziomo dokąd komórki nie osiągnęły 50-75% wzrostu zlewnego. Na tym etapie pobrano pożywkę z nad komórek, po czym komórki delikatnie przepłukano 5 ml pożywki selektywnej, które następnie usunięto z nad komórek i zastąpiono 5 ml świeżej pożywki selektywnej. Butelki ponownie przeniesiono do cieplarki na 24 godziny. Następnie komórki zebrano przez uderzanie butelką, gęstość komórkową policzono stosując licznik Coulter w zakresie od 10 do 20 mm, albo stosując hemocytometr po zabarwieniu roztworem błękitu trypanu (Life Technologies) i licząc żywe (nie zabarwione) komórki pod mikroskopem. Komórki żwirowano (około 300 x g przez 5 minut) po czym nadsącz pobrano i przechowywano w 4°C do analizy ekspresji fragmentów przeciwciał (patrz niżej). Komórki zawieszono w 50% dializowanej surowicy płodowej cielęcej, 40% bezglut aminowej DMEM i 10% DMSO w gęstości 1-2x106 komórek/ml. Następnie komórki przeniesiono w 1 ml porcjach do zakręcanych probówek do mrożenia (Nunc), zamrożono w -70°C przez noc, a następnie przeniesiono do płynnego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

Analiza metodą Western biot

Porcje (15 pl) każdego z nadsączy zmieszano z równą objętością buforu do próbek (62,5 mM Tris, pH 6,8, 1% SDS, 10% sacharoza i 0,05% błękit bromofenolowy) z lub bez substancji redukującej (50 mM DTT). Próbki inkubowano w 100°C przez 15 minut, po czym poddano elektroforezie na żelu o gradiencie 8-18% akrylamidu (Excel™, Pharmacia Biotechnology Products) w aparacie Multiphor™ (LKB Produkter AB) według instrukcji producenta. Po elektroforezie, rozdzielone białka przeniesiono na membranę Hybond C-Super™ (Amersham International) stosując aparat Navablot™ (LKB) według protokołu dostarczonego przez producenta. Po przeniesieniu, membrany wysuszono na powietrzu.

Obecność fragmentów przeciwciał badano stosując koniugat przeciwciała przeciwko mysim F(ab')2 z peroksydazą (ICN Biomedicals, nr kat. 67-430-1). Jakkolwiek, przeciwciało to wywołano przeciwko mysim F(ab')2, wykazano, że wiąże się ono przede wszystkim z łańcuchem k. Obecność fragmentów przeciwciała A5B7 obrazowano stosując układ wykrywający ECL™ (Amersham) według dostarczonego protokołu. Wykazano, że około 90% materiału obecnego w nadsączu komórek stanowi białko F (ab')2.

k) Analiza metodą ELISA

Standardowe procedury testu ELISA są dostępne w Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology wyd. Burdon i van Kippenberg, tom 15 Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Tijssen P., 1985, Elsevier Science Publishers B.V. Inne źródło informacji stanowi Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow i Lane, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory. Nadsącza komórkowe (patrz wyżej) zastosowano do wykrywania obecności materiału wiążącego CEA w oparciu o poniższy protokół:

l) ELI SA na CEA

1. Przygotować bufor do opłaszczania (1 kapsułka buforu węglanowo-dwuwęglanowego - Sigma nr kat. C 3041 - w 100 ml wody destylowanej).

2. Dodać 5 ml roztworu wyjściowego CEA (0,2 mg/ml, Dako) do 10 ml buforu do opłaszczania na każdą płytkę 96-studzienkową.

3. Dodać 100 ml rozcieńczonego CEA do każdej ze studzienek płytki do mikromiareczkowania Nunc Maxisorpa.

4. Inkubować płytki w 4°C przez noc (w temp. pokojowej przez 2 godziny).

5. Płukać płytki 4-krotnie po 5 minut w roztworze soli buforowanym fosforanem z dodatkiem 0,01%) azydku sodu (PBSA).

6. Zablokować płytki (po otrząśnięciu do sucha) 1% BSA (Sigma A 7888) w PBSA po 150 ml na studzienkę.

7. Płukać płytki 4-krotnie po 5 minut w PBSA.

8. Wprowadzić próbki (nadsącza hodowlane) i standard (dwukrotne rozcieńczenia proteolitycznego fragmentu F(ab' )2). Próbki rozcieńczyć w pożywce hodowlanej (albo PBS). Dołączyć PBSA + 1% BSA oraz sam rozcieńczalnik jako kontrolę negatywną.

9. Inkubować przez noc w 4°C.

184 031

10. Płukać płytki 6-krotnie po 5 minut w PBSA + 0,5% Tween 20.

11. Przygotować roztwór przeciwciała wtórnego (kozie przeciwciała przeciwko mysim IgG F(ab')2 sprzęgnięte z peroksydazą - ICN 67-430-1 - w ilości 20 ml w 40 ml PBSA + 1% BSA + 0,5% Tween 20) i dodać po 100 ml na studzienkę.

12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.

13. Płukać płytki 6-krotnie po 5 minut w PBSA + 0,5% Tween

14. Przygotować roztwór do wywoływania przez rozpuszczenie 1 kapsułki buforu fosforan-boran cytrynianowy (Sigma P 4922) w 100 ml wody ^destylowanej. Dodać 30 mg dichlnrnwn0nrku nfenyleandiamlny (OPD, Sigma P8287) na ml buforu. Dodać po 100 ml na studzienkę.

15. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

16. Zatrzymać reakcję przez dodanie do każdej studzienki po 50 ml 2 M kwasu siarkowego.

17. Odczytać OD przy 490 nm w czytniku płytek.

m) Obliczanie tempa właściwego produkcji (SPR)

Ilość aktywności wiążącej CEA w każdej z próbek określana była z użyciem pakietu obróbki danych Softmax. Ilość ta. obliczono w celu przybliżenia ilości fragmentu F(ab')2 A5B7 obecnego w nadsączu komórkowym wziąwszy pod uwagę analizę danych z badania Western biot, które wskazywało, że większość łańcucha L przeciwciała (> 90%) jest obecna w postaci F(ab')2. Wielkość ta zastosowano do obliczenia tempa właściwego wytwarzania rzędu mg/ΚΓ komórek^ godziny, który zastosowano do sklasyfikowania linii komórkowych pod kątem produktywności. Obliczenie SPR dla najlepszej wyizolowanej linii komórkowej zawierało się zwykle od 4 mg do 10 mg/106 komórek/24 godziny.

Oczyszczanie peknmbianwaaegn F(ab')2 A5B7

Rekombinowany materiał F(ab')2 A5B7 oczyszczono z nadsączu hodowlanego szpiczaka stosując wkład 500 mg r-białka A, przykładowo wytwarzany przez NyGene. Wkład płukano początkowo buforem cytrynianowym zawierającym 100 mM kwas cytrynowy pH 2,8, a następnie równoważono 150 mM chlorkiem sodu, 10 mM fosforanem sodu pH 7,4 dopóki pH płukanki nie zrównało się z pH buforu równoważącego. Oba bufory uprzednio filtrowano przez filtr Millipore 0,45 mm.

Również pożywkę szpiczaka (1,8 litra) zawierającą reknmbianwaay F(ab')2 A5B7 filtrowano uprzednio i rozcieńczano 1:1 buforem do równoważenia. Tę rozcieńczoną pożywkę wprowadzano do wkładu z białkiem A, zbierając całą nie związaną płukankę. Po wprowadzeniu, wkład płukano buforem równoważącym dokąd absorbancja przy 280 nm nie powróciła do poziomu wyjściowego.

Bufor zmieniono na 100 mM octan sodu pH 4,0, również uprzednio filtrowany. Ten bufor elucyjny zebrano jako 45 frakcji. Gdy ponownie absorbancja przy 280 nm powróciła do poziomu wyjściowego, bufor zmieniono na 100 mM kwas cytrynowy pH 2,8, w celu wypłukania kolumny. Gęstość optyczną przy 280 nm oznaczono we frakcjach, zaś te które zawierały istotne ilości miareczkowano do pH 7,0 i badano przez SDS-PAGE. Frakcje zawierające peknmblanwaae F(ab')2 A5B7 łączono ze sobą. Objętość tą stężono (membrana Amiona YMa) i dializowano w 150 mM chlorku sodu, 10 mM fosforanie sodu i 3 mM soli dwusodowej EDTA, pH 7,4 i przechowywano w 4°C. Otrzymano w sumie 73 mg F(ab')2 o czystości > 90% jak noealnnn przez nie redukującą SDS-PAGE.

Nadsącz komórek szpiczaka zastosowany jak wyżej otrzymano zasadniczo jak opisano w Bebbington i in., (1992) Bin/Teohanlngy 10, 169-175. Pożywka GS (nr kat. 51435) i dodatek (nr kat. 58627) dostępne są z JHR Biosciences (JHR Binsoiences Europę, Hophurst Lane, Crawley Down, W. Sussex, UK., RH10 4FF). Na zakończenie procesu fermentacji nadsącz filtrowano przez filtr 0,45 mm w celu usunięcia jakichkolwiek części stałych i przechowywano w 4°C zwykle nie dłużej niż 24 godziny.

Przykład odniesienia 6

Synteza analogu proleku opartego na uracylu (patrz schemat na fig. 9)

184 031

Związek 7 (5 mg) rozpuszczono w 0,5 ml kwasu solnego (0,1 N) uzyskując pożądany produkt końcowy (związek 9). Po 0,5 godziny w 25°C w ciemności roztwór wyjściowy trzymano na lodzie i rozcieńczano próbki buforem w celu badania ze zmutowaną RNazą.

Związek (7) wytworzono z urydyny następującym sposobem:

2.3'-0-metoksyetylidenourydyna (związek 1)

Urydynę (5 g), monohydrat kwasu p-toluenosulfonowego (1 g) i ortooctan trimetylu (15 ml) mieszano razem w temperaturze 20°C przez 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną lekko zalkalizowano metanolowym roztworem metanolanu sodu, a następnie zatężono to postaci żywicy. Żądany produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (Merck 9385), stosując jako eluent mieszaninę chloroform/metanol najpierw w stosunku 96:4 (objętościowo), a następnie 92:8.

MNR (DMSOd₆) (5) 11,38 (s, 1H); 7,75 (d, 1H); 5,95 (d); 5,80 (d, cały 1H); 5,62 (d, 1H); 4,70-5,10 (m, 3H); 4,18 (q); 4,04 (q, cały 1H); 3,60 (m, 2H); 3,15 (s) i 3,28 (s, cały 3H); 1,57 (s) i 1,49 (s, cały 3H).

5'-azydo-5'-deoksy-2l.3l-O-metoksyetylidenourydyna (związek 2)

Do roztworu 2',3'-0-metoksyetylidenourydyny (7,0 g, 23,3 mmola) w suchej pirydynie (80 ml) w temperaturze 0°Ć dodano chlorku metanosulfonylu (1,9 ml, 24 mmole). Po mieszaniu przez 16 godzin w temperaturze 4°C rozpuszczalnik odparowano pod próżnia, a pozostałość rozpuszczono w chloroformie i przemyto wodą. Oddzielono warstwę organiczną, wysuszono i zatężono uzyskując surowy mezylan.

Surowy produkt reakcji rozpuszczono w suchym dimetyloformamidzie (100 ml) i dodano azydku sodu (3,25, 50 mmoli). Mieszaninę mieszano w temperaturze 85°C przez 7 godzin, po czym rozpuszczalnik odparowano pod próżnią i otrzymano żywicę, którą rozpuszczono w chloroformie i przemyto roztworem wodorowęglanu sodu. Oddzielono ekstrakt chloroformowy, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i zatężono, uzyskując surowy produkt z grupą 5'-azydową. Surowy azydkowy produkt przejściowy stosowano jak produkt wyjściowy w następnym etapie.

3'-Q(i 2'-O)-acetylo-5'-azydo-5'-deoksyurydyna (związek 3)

Surowy azydek (związek nr 2, powyżej) rozpuszczono w kwasie octowym (70%) (100 ml) i po 15 minutach usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość kilka razy rozpuszczono w absolutnym etanolu i zatężono aby usunąć śladowe ilości kwasu octowego. Procedura ta dała surową próbkę żądanego produktu w postaci mieszaniny 2' i 3'-regioizomerów.

NMR, 2'-acetoksy i 3'-acetoksy w stosunku 2:1 w DM.SOd_(> - 2:1: (S) 11,40 (s, 1H); 7,70 (d, 1H); 5,60-5,95 (m, 3H); 5,22 (t, 0,33H); 5,03 (dd. O,66H); 4,41 (q, 0,66H); 4,24 (q, 0,33H); 4,14 (q, 0,66H); 3,94 (m, 0,33H); 3,62 (m, 2H); 2,08 (s, 0,66H); 2,06 (s, 0,33H).

3,^(1 2'-O)-acetylo-5'-azydo-5'-deokSy-2’-Q(i 3'-O)-tetrahydropiranylourydyna

Surowy octan z poprzedniej reakcji rozpuszczono w suchym dichlorometanie (80 ml). Do kolby reakcyjnej dodano dihydropiranu (6 ml) i monohydratu kwasu p-toluenosulfo-nowego (500 mg). Mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C przez 3 godziny, po czym tle wykazała, że materiał wyjściowy został zużyty. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono dichlorometanem, przemyto wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, a warstwę organiczną wysuszono przed odparowaniem pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt (mieszaninę 2' i 3'-regioizomerów) oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym stosując jako eluent mieszaninę chloroform/metanol (najpierw 97:3, a następnie 95:5).

5l-amino-5'-deoksy-2'-O(i 3'-O)-tetrahydropiranylourydyna (związek 4)

Produkt przejściowy - azydek z poprzedniej reakcji, rozpuszczono w tetrahydrofuranie (100 ml) i dodano tr10enylo0os0my (6,5 g, 25 mmoli), a następnie wody (0,45 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C przez 16 godzin, po czym dodano stężonego amoniaku i pozostawiono na 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną zatężono do suchości i oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej (stosując najpierw mieszaninę chloroform/metanol, 9:1, a następnie chloroform/metanol, 1:1). Otrzymano surowy produkt w postaci mieszaniny 2' i 3'-regioizomerów. '

5'-(N-benzyloksykarbonyloglicylo)amino-5^,-deoksy-2^,-O(i 3'-O)-tetrahydrspiranylourydyna (związek 5)

184 031

Do roztworu 5'-amino-5'-deoksy-2'-O(i' 3'-0)-tetrahydropiranylourydyny (3 g) w bezwodnym tetrahydrofuranie dodano estru p-nitrofenylowego N-benzyloksykarbonyloglicyny (3,1 g, 9,2 mmola). Roztwór mieszano przez 16 godzin w temperaturze 25°C, zatężono do żywicy i oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce stosując jako eluent mieszaninę chloroformu i metanolu (96:4). Otrzymano żądany produkt w postaci mieszaniny regioizomerów (3,6 g, 75% wydajności).

NMR w DMSOd6 (5) 11,36 (s, 1H); 8,02 (b, 1H); 7,70 (dwa d, 1H); 7,32 (m, 1H); 5,90 (d) i 5,70 (d, cały 1H); 5,64 (d, 1H); 5,444 (d) i 5,20 (d, cały 1H); 5,02 (s, 2H); 4,75 (m, 1H); 3,20-4,25 (m, 9H); 1,35-1,80 (m, 6H).

Widmo mas (F.AB). m/e 519 (M+H+). C24H30N4O9 wymaga M+ 518

3'-Q(i 2'-O)-fosforamidvnowa pochodna powyższego produktu

Do roztworu produktu (1,9 g, 3,67 mmola) z powyższej reakcji i diizopropyloetyloaminy (1,5 ml) w suchym dichlorometanie (30 ml) dodano chlorku kwasu N.N-diizopropylometylofosfonamidynowego. Mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C przez 5 godzin, po czym rozcieńczono chloroformem i przemyło wodnym roztworem wodorowęglanu sodu. Ekstrakt chloroformowy oddzielono, wysuszono i zatężono, uzyskując żywicę. Surową mieszaninę oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej, stosując następujące eluenty (najpierw mieszanina chloroform/trietyloamina 98:2, a następnie mieszanina chloroform/trietyloamina/metanol 96:2:2). Otrzymano żądany produkt przejściowy zawierający fosfor (1,9 g).

Całkowicie chroniony fosforanowy produkt przejściowy (związek 6)

Do roztworu fosforamidynu (1,9 g, 2,4 mmola) z powyższej reakcji i 4-dipropyloaminofenolu (0,7 g, 3,6 mmola) w suchym acetonitrylu (40 ml) dodano tetrazolu (0,5 g, 7,2 mmola). Mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C przez 16 godzin w ciemności, po czym dodano wodoronadtlenku tert-butylu (70%, 0,4 ml). Po 15 minutach mieszaninę reakcyjną zatężono, rozpuszczono w chloroformie i przemyto wodnym roztworem wodorowęglanu sodu. Oddzielono warstwę chloroformową, wysuszono i zatężono do żywicy, po czym oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce, stosując octan etylu a następnie mieszaninę octan etylu/metanol (93:7, objętościowo). Po odparowaniu odpowiednich frakcji uzyskano produkt (1,5 g) w postaci mieszaniny 2' i 3'-regioizomerów.

NMR w DMSOde (5) 11,43 (s, 1H); 8,10 (b, 1H); 7,75 (m, 1H); 7,45 (m, 1H); 7,35 (s, 5H); 7,00 (m, 2H); 6,60 (m, 2h), 5,90 (m, 1h), 5,69 (m, 1H); 5,17 (m) i 4,97 (m, cały 1H); 5,02 (s, 2H); 4,69 (bs) i 4,57 (bs, cały 1H); 4,53 (m) i 4/23 (m, cały 1H); 4,08 (m, 1H); 3,15-3,85 (m, 13H); 1,35-1,75 (m, 10H); 0,88 (t, 6H).

Widmo mas (FAB). m/e 787 (M+) i 788 (M+ +H), C37H 50N ₅012P. wymaga M+ 787.

Analog proleku chroniony THP (związek 7)

Całkowicie chroniony produkt przejściowy z poprzedniej reakcji (1 mmol) rozpuszczono w mieszaninie etanolu (20 ml) i cykloheksenu (10 ml), po czym dodano 20% palladu na węglu drzewnym (150 mg). Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę, a następnie przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wytworzoną żywicę oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce, stosując jako eluent mieszaninę chloroform/metanol (9:1) i otrzymano wolną pochodna, glicylową.

Chronionym metylem fosforan (1 mmol) z poprzedniej reakcji rozpuszczono następnie w tert-butyloaminie (30 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną, po czym zatężono i oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce, stosując jako eluent mieszaninę chloroform/metanol (9:1), a.następnie chloroform/metanol (7:3). Otrzymano żądany analog proleku chroniony THP w postaci mieszaniny 2' i 3'-regioizomerów.

Rozdzielanie 2' i 3'-regioizomerów metoda wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej

Rozdzielanie metodą HPLC prowadzono na kolumnie Partisil ODS-2 przez izokratyczne eluowanie mieszaniną metanol/mrówczan amonu, 60:40, (0,1 M). Odpowiednie frakcje zebrano i liofilizowano, uzyskując żądany 3'-związany produkt przejściowy (7), patrz wzór na fig. 9.

184 031

NMR w DMSOd6 (δ) 8,85 (s, 1H); 8,25 (s, 1H); 7,75 (d, 1H); 6,95 (d, 2H); 6,5 (d, 2H);

6,5 (d, 2H); 5,85 (d, 1H); 5,6 (d, 1H); 4,5 (m, 2H); 4,3 (m, 1H); 4,3 (m, 1H); 4,07 (m, 1H); 3,2-3,6 (m, 6H); 3,1 (m, 4H); 1,2-1,6 (m, 10H); 0,8 (m, 6H).

Przykład odniesienia 7

Synteza analogu proleku cvtvdynv (patrz Schemat na fig, 10)

Analog proleku cytydyny (związek 13) wytworzono analogicznie do sposobu wytwarzania związku urydyny, opisanego w przykładzie odniesienia 6. Powtórzono procedurę opisaną w przykładzie odniesienia 6, ale związek 7 (fig. 9) zastąpiono związkiem 12 (fig. 10).

Standardowa obróbka: Zatężenie mieszaniny reakcyjnej pod próżnią, rozpuszczenie pozostałości w CHCI3, przemycie roztworu wodnym roztworem NaHCO3, wysuszenie nad Na₂SO4, przesączenie i zatężenie. Oczyszczenie metodą szybkiej chromatografii kolumnowej przy użyciu wskazanej mieszaniny rozpuszczalników.

Związek 12 wytworzono następującym sposobem (patrz schemat na fig. 10)

N⁴-benzoilo-2'3'-Q-metoksyetylidenocytydynę (związek 1) wytworzono sposobem opisanym przez D.P.L. Green, T. Ravindranathan, C.B. Reese i R. Saffhill w Tetrahedron 26, 1031 (1970).

N4-benzoilo-5'-O-metanosulfonylo-2'3'-O-metoksyetylidenocytydynę (związek 2) wytworzono, jak następuje:

Do roztworu N-benzoilo-2',3'-O-metoksyetylidenocytydyny (9,85 g, 25,0 mmoli) w pirydynie (100 ml) dodano podczas mieszania w temperaturze 0°C chlorku metanosulfonylu (1,9 ml, 25 mmoli). Mieszaninę mieszano przez 16 godzin w temperaturze 25°C, po czym mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią, ponownie rozpuszczono w chloroformie, a warstwę organiczną przemyło wodnym roztworem wodorowęglanu sodu. Warstwę chloroformową oddzielono, wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono, uzyskując produkt 3'-O-acetylo-5'-azydo-N4 -benzoilo-5'-deoksycytydynę (mieszaninę z izomerem 2'-O-acetylo-) (związek 3) wytworzono, jak następuje:

Surowy mezylan (związek 2) rozpuszczono w bezwodnym DMF (100 ml). Dodano azydku sodu (3,25 g, 50 mM) i mieszaninę reakcyjną mieszano w 80°C przez 7 godzin. Rozpuszczalnik zatężono, mieszaninę ponownie rozpuszczono w chloroformie i ekstrakt chloroformowy przemyto roztworem wodorowęglanu sodu. Pozostałość otrzymaną przez zatężenie warstwy suchego chloroformu rozpuszczono w 120 ml 70% HOAc. Po 15 minutach rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, a surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej (z mieszaniną CHCh/MeOH, 95:5, a następnie CHCh/MeOH, 92:8). Wydajność żądanego produktu wynosiła 6 g.

3'-O-acetylo-5'-azydo-N4-benzoilo-2'-O-tetrahycho-piranylo-5^,-deoksycytydyny (mieszanina z izomerem 3'-O-tetrahydropiranylo-) (związek 4) wytworzono, jak następuje:

Octan (związek 4, 9,0 g, zanieczyszczony) rozpuszczono w metanolu (60 ml) i dodano metanolanu sodu (3,5 g). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 25°C przez 1 godzinę, po czym zatężono i oczyszczono metodą szybkiej chromatografii kolumnowej. Wydajność 3,7 g.

Uwaga: Na tym etapie możliwe jest rozdzielenie izomerów 2' i 3' (jak również w większości następnych etapów) metodą chromatografii.

'-azydo-N4-benzyloksykarbonylo-5 '-deoksy-2'-O-tetrahydropiranylocytydynę (mieszaninę z izomerem 3'-O-tetrahydropiranylo-) (związek 6 g) wytworzono, jak następuje:

Cytydynę (związek 6, 5,37 g) rozpuszczono w bezwodnej pirydynie (80 ml) i dodano katalityczną ilość dimetyloamino-pirydyny (DMAP) i 2 ml Z-Cl. Mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C przez 16 godzin, a następnie oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując mieszaninę CHCty/MeOH, 95:5, jako eluent. Otrzymano 2,3 g produktu.

5'-(N-benzyloksykarbonylo)amino-5'-deoksy-2'-O-tetrahydropiranylocytydynę (w mieszaninie z izomerem 3'-O-tetrahydropiranylo-) (związek 7) wytworzono, jak następuje:

Azydek (związek 6, 3,06 g) w THF (30 ml) mieszano z trifenylofosfiną (1,7 g) przez 24 godziny w temperaturze 50°C. Dodano wody (5 ml) i mieszano jeszcze przez 1 godzinę w temperaturze 50°C. Po zatężeniu mieszaniny reakcyjnej i oczyszczeniu na kolumnie

184 031 z krzemionką, przy użyciu najpierw mieszaniny CHCh/MeOH, 9:1, następnie 1:1, a na końcu 100% MeOH, otrzymano 0,9 g produktu.

N4-benzyloksykarbonylo-5'-(N-benzyloksykarbonyloglicylo)-amino-5'-deoksy-2'-O-tetrahydropiranylocytydynę (mieszaninę z izomerem 3'-O-tetrahydropiranylo-) (związek 8) wytworzono, jak następuje:

Aminę (związek 7, 0,9 g) rozpuszczono w bezwodnym dichlorometanie (30 ml) i dodano N-karbobenzyloksy-glicynianu p-nitrofenylu (700 mg). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 16 godzin w temperaturze 25°C, po czym zatężono i oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej, stosując mieszaninę CHCh/MeOH, najpierw w stosunku 97:3, następnie 95:5. Otrzymano 1 g żądanego związku.

N4-benzyloksykarbonylo-5'-N-(benzyloksykarbonylog]icylo)-amino-5'-deoksy-2'-O)-tetrahydropiranylocytydylo-3'-(N.N.-diizopropylometylo)fosfonoamidynian (w mieszaninie z izomerem 3') wytworzono, jak następuje:

Alkohol (związek 8,1 g) rozpuszczono w bezwodnym dichlorometanie (30 ml) i dodano EtN(iPr)2 (1,7 ml), a następnie Cl-P(Ome)N(i CHCh/MeOH Pr)2 (34 ml). Mieszaninę mieszano przez 6 godzin w temperaturze' 25°C, po czym oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej stosując najpierw mieszaninę CHCb/EtjN, 98:2, a następnie CHCh/EhN/MeOH, 97:2:1. Otrzymano 1,1 g produktu.

(4-N.N-dipropyloaminofenylo) [N4-benzyloksykarbonylo-5'-(N-benzyloksykarbonyloglicylo)amino-5'-deoksy-2'-O-tetrahydropiranylocytydylo-3']-fosforan metylu (w mieszaninie z izomerem 3') (związek 10) wytworzono, jak następuje:

Fosfonoamidynian (związek 9, 1,1 g) rozpuszczono w bezwodnym acetonitrylu (30 ml) i dodano 4-N,N-dipropyloamino-fenolu (200 mg), a następnie tetrazolu (420 mg). Mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C przez 16 godzin, po czym 70% wodoronadtlenku t-butylu (0,3 ml). Po 15 minutach surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce, stosując najpierw EtOAc, a następnie mieszaninę EtOAc/MeOH 97:3. Otrzymano 0,85 g produktu.

(4,N,N-diizopropyloaminofenylo)(5'-deoksy-5'-glicyloamino-cytydylo-3')-fosforan metylu (związek 11) wytworzono, jak następuje:

Związek z bis-karbobenzyloksylową grupą ochronną (związek 10, 0,85 g) rozpuszczono w etanolu (30 ml) i cykloheksenie (15 ml), dodano 20% Pd-C (400 mg) i mieszaninę podczas mieszania ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 4 godziny. Po przesączeniu roztwór zatężono, a żywicę oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce, eluując najpierw mieszaniną CHCh/MeOH, 95:5, potem 5:1, a na końcu 100% MeOH). Otrzymano 100 mg produktu.

(5'-^^i^(^l^!^;^'^^''^i^li^l^(^^loamino-2^,-0^-^1^£^ir^£h^y^c^i^c^f^]^i^ćn^)^^c^(^jty^t^yll(^^^')-^w^c^c^c^i^olbsforan (4-N,N-dipropyloaminofenylu) (związek 12) wytworzono, jak następuje:

Fosforan (związek 11, 100 mg) rozpuszczono w t-butyloaminie (25 ml) i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 8 godzin. Po zatężeniu produkt oczyszczono metodą HPLC (kolumna Magnum 20, odwrócone fazy, eluent: mieszanina MeOH/0,1 M mrówczan amonu w stosunku 60:40).

NMR w DMSOd6 (6) 9,1 (s, 1H); 8,19 (s, 1H); 7,6 (d, 1H); 7,2 (m, 3H); 6,95 (d, 2H); 6,45 (d, 2H); 5,8 (d, 1H); 4,71 (m, 1H); 4,45 (m, 1H); 4,45 (m, 1H); 4,22 (m, 1H); 4,1 (m, 1H); 3,8 (t, 1H); 3,7-3,15 (m, 2H); 3,51 (s, 2H); 3,35-3,5 (m, 1H); 3,0 (m, 4H); 1,8-1,2 (m, 10H); 0,8 (m, 6H).

Widmo mas FABMS [MH+] 639

Przykład odniesienia 8 .

Lokalizacja koniugatu A5B7 F(ab')2-BP-RNazy w ksenogenicznych guzach LoVo

Mysi koniugat A5B7 F (ab')2-BP-RNazy wytworzono tak, jak to opisano w przykładzie 4, jodowano radioaktywnie wolnym ¹²⁵I stosując odczynnik IODOGENa (Pierce and Warriner (UK) Ltd. Chester England) według procedury zalecanej przez producenta. Potwierdzono zatrzymywanie in vitro > 50% immunoreaktywności po jodowaniu radioaktywnym, przez wiązanie z komórkami guza LoVo stosując metodę Lindmo i in., J. Immun. Meth., 7277-89, 1984. Około 10 mg koniugatu zawierającego 10 mCi 125 wstrzyknięto dożylnie myszom bezgrasiczym

184 031 (nu/nu:Alpk [nie wsobne]) niosącym ksenngeniczae guzy LoMo (1x10⁷ komórek nowotworu LnVn wstrzykniętych podskórnie 7 dni wcześniej). Po wstrzyknięciu koniugatu, grupy po 3 myszy zabijano w różnych okresach czasu, po czym pobierano guz, próbki krwi i szereg innych tkanek, ważono i badano w liczniku gamma. Rozmieszczenie koniugatu w guzie i tkankach pokazano poniżej.

Lokalizacja w guzie i tkankach A5B7 F (ab')2-BP-RNazy

Tkanka	4 h.	24 h.	48 h.	72 h.	96 h.
Guz	2,54	3,27	1,0	0,66	0,41
Krew	6,83	1,06	0,25	0,12	0,06
Wątroba	1,81	0,62	0,12	0,07	0,06
Nerki	2,76	0,55	0,23	0,18	0,11
Płuca	2,85	0,28	0,15	0,09	0,08

Jednostki = % wstrzykniętej dawki/gram tkanki; wyniki są średnią z 3 myszy.

Wyniki pokazują jasno, że koniugat A5B7 F(ab')2-BP-RNazy swoiście lokalizuje się w kseangeniozayoh guzach LoVo. Od 24 godzin w górę, występuje więcej koniugatu/g tkanki w guzie niż jakiejkolwiek innej tkance, z krwią włącznie. Poziomy koniugatu w guzie były podobne do uzyskanych dla koniugatu A5B7 F(ab')2-CPG2 (Blakey i in., Br. J. Cancer, 69 suplement XXI, 14, 1994). Poziomy te dla koniugatu CPG2 były, jak wykazano, wystarczające w kombinacji z prolekiem iperytowym do spowodowania regresji guza i przedłużonego trwania wzrostu w modelu guzów kseangealoznyoh LoMo (Blakey i in., Br. J. Cancer, 69 suplement XXI, 14, 1994; Blakey i in., PrnoeeOings of the American Assnoiaolnn for Cancer Research, 35, 507, 1994).

Przykład odniesienia 9

Synteza kwasu hlpur·yk)-L-glutamianwegn (patrz fig. 28)

Ester Oibenzylnwy kwasu hlpurγln-L-glutaminnwegn (związek 3) (2,06 g, 4,2 x 10- mola) i 30% Pd/węglu (50% wilgotności) (0,77 g) w THF mieszano w atmosferze wodoru przez 1,5 godziny. Mieszaninę przesączono przez Celite™, a przesącz odparowano do suchości. Po roztarciu z eterem dietylowym otrzymano żądany produkt końcowy w postaci krystalicznej substancji stałej 1,02 g (78%). Temperatura topnienia 169-171 °C. 20D = -2,5°.

NMR w DMSOd6 12,3 (szeroki); 8,7 1H (t); 8,2, 1H (t); 7,9, 2H (m); 7,5, 3H (m); 4,3, 1H (m); 3,9, 2H (m); 2,3, 2H (t); 1,9, 2H (m).

Związek wyjściowy 3 wytworzono, jak następuje. Do roztworu kwasu hipurowego (0,90 g, 5 x 10-3 mola) i estru dlbeazylnwegn kwasu L-glutaminowego (2,50 g, 5 x W³ mola) w DMF (35 ml) dodano 1-hy0rnksybeazntrijznlu (0,73 g, 5,5 x 10'³ mola), trietyloaminy (1,4 ml, 9,7 x 10-3 mola) i ohlnrnwn0nrku l-(3-dimetylo-aminopropylo)-3-etylnkarbn01imidu (1,05 g, 5,5 x 1()-3). Mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, przelano do wody (400 ml) i ekstrahowano dwukrotnie octanem etylu (100 ml). Połączone ekstrakty przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu, wodą, 2N HC1 i wodą. Fazę organiczną wysuszono nad MgSO4 i odparowano, uzyskując żądany produkt wyjściowy w postaci żółtego oleju. 2,06 g (84%).

NMR DMSOd6 8,7 1H (t); 8,4, 1H (d); 7,9, 2H (m); 7,5, 3H (m); 7,35, 10H (m); 5,15, 2H (s); 5,05, 2H (s); 4,4, 1H (m); 3,9, 2H (t); 2,0, 4H (m).

Przykład odniesienia 10

Synteza kwasu hipurylo-L-asp alginowego

Ester dibenzylowy kwasu hlpupyln-L-asparaglanwegn (1,28 g, 2,7 x W³ mola) i 30% Pd/C (50% wilgotności) (0,51 g) w THF mieszano w atmosferze wodoru przez 3 godziny. Mieszaninę przesączono przez Celite™, a przesącz odparowano do suchości. Po roztarciu z eterem dietylowym uzyskano 0,62 g (78%) białawej krystalicznej substancji stałej. Temperatura topnienia 200-202°C. 20D = +1,9°

184 031

NMR DMSOd^ 12,5, 2H (szeroki); 8,7, 1H (t); 8,2, 1H (d); 7,7, 2H, (m); 7,5, 3H (m);

4,6, 1H (m); 3,9, 2H (d); 2,7, 2H (m).

Związek wyjściowy wytworzono, jak następuje. Do roztworu kwasu hipurowego (0,90 g, x 10'³ mola) i estru dibenzylowego kwasu L-asparaginowego (2,31 g, 5 x 10³ mola) w DMF (35 ml) dodano l-hydroksybenzotriazolu (0,73 g, 5,5 x 10'3 mola), trietyloaminy (1,4 ml, 9,7 x 10'3 mola) i chlorowodorku 1-(3-dimetylo-aminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (1,05 g, 5,5 x 10'³). Mieszaninę mieszano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, po czym przelano do wody (450 ml) i dwukrotnie ekstrahowano octanem etylu (100 ml). Ekstrakt przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu, wodą, 2N HC1 i wodą. Fazę organiczną wysuszono nad MgSO4 i odparowano do suchości, uzyskując 1,90 g (80%) związku wyjściowego w postaci żółtego oleju.

NMR DMSOd₆ 8,7, 1H (t); 8,45, 1H, (d); 7,9, 2H (m); 7,5, 3H (m); 7,3, 10H (m); 5,15, 2H (s); 5,05, 2H (s); 4,8, 1H (m); 3,9, 2H (m); 2,9, 2H (m).

Przykład odniesienia 11

Aktywność enzymatyczna rekombinantowego HCPB przeciwko Hipp-Arg.

Oczyszczone ludzkie CPB, wytworzone jak opisano w przykładzie odniesienia 20, poddawano badaniu pod kątem jego zdolności do przeprowadzania hipurylo-L-argininy (HippArg) w kwas hipurowy, stosując testy spektrofotometryczne.

Km i kcat dla natywnego HCPB wyznaczono przez pomiar początkowego stosunku konwersji Hipp-Arg w kwas hipurowy przy 254 nM, stosując zakres stężeń Hipp-Arg (0,75-0,125 mM) i stężenie enzymu CPB 1 pM/ml. Pomiarów dokonywano w temperaturze 37°C w 0,25 mM buforze Tris HC1, pH 7,5, stosując kuwety o długości ścieżki 1 cm i całkowitą objętość 1,0 ml, przy użyciu spektrofotometru Perkin Elmer Lambda 2. Wartości Km i Vmax obliczono, stosując oprogramowanie komputerowe ENZFITTER™ (Biosoft™, Perkin Elmer). Kcat obliczono na podstawie Vmax, dzieląc przez stężenie enzymu w mieszaninie reakcyjnej.

Wyniki dla ludzkiego CPB przeciwko Hipp-Arg były:

Km = 0,18 mM kcat = 65 s'¹

Wyniki wykazują, że rekombinantowy HCPB jest enzymatycznie aktywny i może rozszczepiać wiązanie amidowe w Hipp-Arg, uwalniając kwas hipurowy.

Przykład odniesienia 12

Synteza arginonoiperytowego proleku (patrz fig. 27)

Kwas (2S),2-(3- {4-[bis-(2-chloroetylo)-amino)-fenoksykarbonylo} -propionyloamino)5-guanidyno-pentanowy (związek 5c, fig. 27)

Roztwór estru benzylowego kwasu (2S),2-(3-{4-[bis-(2-chloroetylo)-amino)-fenoksykarbonylo)-propionylo-amino)-5-(2-nitro)-guanidyno-pentanowego (związek 4c, fig. 27) (275 mg, 0,44 mola) w mieszaninie octan etylu/MeOH (1:1, obj./obj.) (8 ml) zawierającej 10% Pd/C (200 mg) poddawano uwodornieniu w kolbie Paara przy ciśnieniu 80 psi przez godzin. Po przesączeniu warstwę organiczną odparowano. Wytworzony olej rekrystalizowano przy użyciu mieszaniny ClLCh/eter dietylowy i otrzymano żądany związek 5c w postaci białej substancji stałej (180 mg), wydajność 84%.

^]NMR (CD3OD): 1,55-1,7 (m, 3H); 1,8-1,9 (m, 1H); 2,6-2,7 (m, 2H); 2,75-2,85 (m, 1H); 2,9-2,95 (m, 1H); 3,1-3,2 (m, 1H); 3,1-3,2 (m, 2H); 3,6-3,7 (m, 4H); 3,7-3,8 (m, 4H); 4,3 (dd, 1H); 6,75 (dd, 2H); 6,95 (dd, 2H).

MS (ESI): 512-514 (MNa)+

Analiza (C20H29N5O4CI2 1,5 H20)

Obliczono C: 47,91; H: 6,43; N:13,97

Znaleziono C: 47,7; H: 6,21; N : 14,26

Wyjściowy związek 4c wytworzono, jak następuje. Do roztworu estru benzylowego kwasu (2S),2-amino-5-(2-nitro)-guanidyno-pentanowego (związek 2c) (654 mg; 1 mmol) w CHCI3 (10 ml) wkroplono dihydro-furano-2,5-dion (związek 1) (120 mg, 2 mmole), a następnie trietyloaminę (202 mg, 2 mmole). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, po czym rozpuszczalnik odparowano, a surową pozostałość rozpuszczono

184 031 w wodzie. pH doprowadzono do wartości 2 dodatkiem 2,5 N HC1 Warstwę wodną ekstrahowano octanem etylu. Warstwę organiczną przemyto solanką, wysuszono (MgSO4) i odparowano, uzyskując ester benzylowy kwasu (2S),2-(3-karboksy-propionyloamino)-5-(2-nitro)guanidyno-pentanowego (związek 3c). Otrzymaną substancję stałą roztarto z eterem dietylowym i odsączono. Uzyskano 280 mg związku (68%).

'HNMR (CD3OD): 1,52-1,68 (m, 2H); 1,7-1,8 (m, 1H); 1,85-1,95 (m, 1H); 2,45-2,7 (m, 4H); 3,15-3,3 (m, 2H); 4,5 (m, 1H); 5,15 (dd, 2H); 7,25-7,4 (m, 5H).

MS (ESI): 432 [MNa]+

Do zawiesiny związku 3c (204 mg, 0,5 mmola) w CHCI3 (5 ml) dodano 4-[bis(2-chloroetylo)amino]-fenolu (związek 6) (135 mg, 0,5 mmola), EDCI (19 mg, 0,5 mmola), a następnie DMAP (18 mg, 0,75 mmola). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, po czym rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość rozdzielono pomiędzy octan etylu i wodę i fazę wodną zakwaszono do pH = 3 dodatkiem 2N HC1. Po ekstrahowaniu octanem etylu warstwę organiczną przemyto solanka, wysuszono (MgSO4) i odparowano. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii stosując jako eluent mieszaninę C^CE/Me-OH (95/5, obj./obj.). Otrzymano żądany związek wyjściowy 4c w postaci białej piany (281 mg), wydajność: 90%.

4c: 'HNMR (CD3OD): 1,55-1,7 (m, 2H); 1,7-1,8 (m, 1H); 1,85-1,9 (m, 1H); 2,55-2,75 (m, 2H); 2,8-2,9 (m, 2H); 3,15-3,25 (m, 2H); 3,6-3,7 (m, 4H); 3,7-3,8 (m, 4H); 4,5 (dd, 1H); 5,15 (dd, 2H); 6,7 (d, 2H); 6,95 (d, 2H); 7,32 (m, 5H).

MS (ESI): 647-649 [MNa]+

Przykład odniesienia 13

Synteza estru mono-{4-[N,N-bis(2-chloroetylo)amino)-fenylowego} kwasu bursztynowego (określanego tu również jako związek „przejściowy”)

Do zawiesiny bezwodnika kwasu bursztynowego (225 mg, 2,25 mmola) w CHCI3 (10 ml) podczas mieszania dodano 4-[NN-bis(2-chloroetylo)-ammo]fenolu (związek 6, fig. 27; 203 mg, 0,75 mmola), a następnie trietyloaminy (75 mg, 0,75 mmola). Mieszaninę mieszano przez noc, po czym rozpuszczalnik odparowano. Surowy produkt rozpuszczono w mieszaninie EtO-Ac/Et2O/H2O i podczas mieszania pH doprowadzono do wartości 3. Warstwę organiczną przemyto wodą, solanką, wysuszono (MgSO4) i odparowano. Wytworzony olej krystalizowano z mieszaniny Et2O/heksan, a białą substancję stałą odsączono i wysuszono pod próżnuą uzyskując żądany produkt końcowy (210 mg, wydajność 83%). Temperatura topnienia 98-100°C.

MS (ESI): 356-358 [MNa]+ 'HNMR (CDCI3): 2,8 (dd, 2H); 2,9 (dd, 2H); 3,65 (dd, 4H); 3,75 (dd, 4H); 6,65 (d, 2H); 7,0 (d, 2H).

Analiza (CuHnChOąN 0,2 H2O)

Obliczono % C :49,79 H:5,19 Ν:4Ί5

Znaleziono % C: 49,9 H:5,3 N: 4,2

Przykład odniesienia 14

Klonowanie ludzkiej trzustkowej karboksypeptydazy B (HCPB) Standardowe techniki biologii .molekularnej takie jak trawienie enzymami restrykcyjnymi, ligacja, reakcje kinazy, defosforylacja, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), transformacje bakterii, elektroforeza na żelu, przygotowywanie buforów i wytwarzanie, oczyszczanie i izolacja DNA, przeprowadzono jak to opisano w Maniatis i in., (1989) Molecular cloning: A Laboratory manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, albo w oparciu o procedury zalecane przez wytwórców konkretnych produktów. W większości przypadków enzymy nabyto w New England Biolabs, ale inni dostawcy oraz zamienne procedury mogą być zastosowane. Sekwencje oligonukleotydowe wykonano na syntezatorze DNA Applied Biosystems 380A znukleozydo-2-cyjanoetylo-N,N'-diizopropylo-fosforamidanów chronionych zasadą 5'dimetoksytrytylową zaś chronione nukleozydy wiązano z podłożem szklanym o kontrolowanej wielkości porów w skali 0,2 mmol, według protokołu dostarczonego przez Applied Biosystems Inc.

184 031

Sekwencję kodującą ludzkiej trzustkowej karboksypeptydazy B, uzyskano z biblioteki cDNA ludzkiej trzustki, klonowanej do wektora Xgt10 (Clontech, Human pancreas 5'STRETCH cDNA, HLl,163a) z użyciem technologii PCR i klonowano do wektora plazmidowego pBluescriptail KS+ (Stratagene).

Zwykle, porcję biblioteki cDNA (5 ml o mianie > 10⁸ pfu/ml) mieszano z 100 pmolami dwóch starterów oligonukleotydowych, BPT1 i BPB1, (Identyfikator Sekw. nr 46 i Identyfikator Sekw. nr 47), dNTP w stężeniu końcowym 200 mM, bufor reakcyjny polimerazy Taq i 2,5 jednostki polimerazy Taq w objętości końcowej 100 ml. Mieszaninę podgrzewano do 94°C przez 10 minut przed dodaniem enzymu Taq i przeprowadzano inkubacje PCR stosując 30 cykli po 94°C przez 1,5 minuty, 50°C przez 2 minuty i 72°C przez 2 minuty, a następnie pojedynczą inkubację w 72°C przez 9,9 minut na zakończenie reakcji. Zaprojektowano dwa startery oligonukleotydowe w celu przeprowadzenia reakcji PCR wydłużającej koniec 5' genu od BPT1 (Identyfikator Sekw. Nr 46) pomiędzy początkiem sekwencji pre- i początkiem sekwencji pro-, i reakcji pCR od końca 3' genu od BPB1 (Identyfikator Sekw. Nr 47), jak pokazano na fig. 18. BPT1 i BPB1 zaprojektowano tak, aby wprowadzały unikalne miejsca restrykcyjne SacI i XhoI do produktu PCR. Porcję produktu PCR analizowano przez elektroforezę na żelu agarozowym pod kątem obecności DNA o odpowiedniej wielkości (około 1250 par zasad) i stwierdzono, że zawiera głównie prążek o prawidłowej wielkości. Pozostałą część produktu w mieszaninie reakcyjnej oczyszczono i oddzielono od nadmiaru odczynników stosując kolumnę Centricon™ 100 (Amicon), a następnie izolację DNA przez precypitację etanolem/octanem sodu, odwirowanie, suszenie pod próżnią i rozpuszczenie w wodzie destylowanej. Izolowany DNA trawiono restrykcyjnie enzymami SacI i XhoI, zaś prążek o odpowiedniej długości (około 1250 par zasad) oczyszczano i izolowano z żelu agarozowego stosując wycięcie i mleko szklane (Geneclean™, Stratec Scientific albo inny podobny produkt).

Dwuniciowy DNA pBluescript™II KS+ (Stratagene) trawiono restrykcyjnie enzymem SacI, zaś produkt defosforylowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną w celu usunięcia grup fosforytowych 5' i zmniejszenia religacji i tła po transformacji wektora. Produkt DNA oczyszczano z zanieczyszczeń po reakcyjnych stosując mleko szklane, po czym trawiono restrykcyjnie enzymem XhoI. DNA o odpowiedniej wielkości (około 2850 par zasad) oczyszczano i izolowano przez elektroforezę na żelu agarozowym stosując wycięcie i mleko szklane (Geneclean™, Stratec Scientific albo inny podobny produkt). Porcje trawionego i oczyszczonego DNA badano pod kątem czystości i stężenia stosując elektroforezę na żelu agarozowym i porównaniu ze znanymi standardami. Na podstawie tych obliczeń, przygotowano mieszaniny w celu klonowania genu HCPB do wektora, stosując stosunek molowy równy około 1 wektorowi na 2,5 wstawki (1 pBluescript™II KS+ na 2,5 produktu PCR HCPB) i końcowe stężenie DNA rzędu około 2,5 ng/pl, w obecności ligazy DNA T4,1 mM ATP i bufora.

Po reakcji ligacji mieszaninę DNA zastosowano do transformowania E. coli szczepu DH5(a (Gibco-BRL·, komórki kompetentne o maksymalnej efektywności). Porcje komórek wysiano na podłoże L-agar zawierające ampicylinę 100 pg/ml jako selekcja dla wektora plazmidowego, po czym inkubowano przez noc w 37°C. Kolonie zawierające plazmid z interesującą wstawką identyfikowano przez hybrydyzację. Pobrano około 200 kolonii i wysiano na podwójne filtry nitrocelulozowe (Schleicher & Schuell), zwilżonych na płytkach z agarem zawierającym ampicylinę 100 (pg/ml jako selekcja dla wektora, i inkubowano przez noc w 37°C. Jeden z kompletów przechowywano w 4°C i służył jako źródło żywych bakterii do tworzenia kolonii, drugi poddano działaniu denaturującemu i przytwierdzającemu DNA z indywidualnych kolonii 'do nitrocelulozy. Filtr nitrocelulozowy pobierano z płytki agarowej i umieszczano kolejno na filtrach papierowych Whatman™ zwilżonych:

1. 10% SDS na 2 minuty;

2. 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl na 7 minut;

3. 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl na 4 minuty;

4. 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl na 2 minuty;

5. 0,5 M Tris pH 7,4, 1,5 M NaCl na 2 minuty;

6. 2xSSC (standardowy roztwór soli buforowany cytrynianem) na 2 minuty.

184 031

Filtr umieszczono na filtrze papierowym Whatman™ zwilżonym w 10xSSC i sieciowano denaturowany DNA z filtrem przez działanie ultrafioletem (Spectrolinker™, XL-1500 UV). Filtry pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej i prehybrydyzowano w 60°C przez godzinę w roztworze 6xSSC przy delikatnym wytrząsaniu (przykładowo w piecu hybrydyzacyjnym Techne HB-1D). Prehybrydyzacja blokuje nieswoiste miejsca wiązania DNA na filtrze.

W celu określenia, które kolonie zawierają interesujące wstawki DNA, DNA sieciowany z filtrem nitrocelulozowym hybrydyzowano ze znakowaną radioaktywnie sondą ³²P-DNA wytworzoną z produktu PCR biblioteki cDNA trzustki (patrz wyżej). Około 50 ng DNA znakowano 50 pCi 32P-dCTP (~3000 Ci/mmol) stosując polimerazę DNA T7 w objętości końcowej 50 pl (zestaw Pharmacia T7 Quickprime) a następnie reakcję pozostawiono na 15 minut w 37°C. Znakowaną sondę podgrzano do 95°C przez 2 minuty, w celu denaturacji dwuniciowego DNA, natychmiast dodano do 10 ml 6xSSC w temperaturze 60°C, a następnie roztwór ten zastosowano do zastąpienia roztworu prehybrydyzacyjnego. Inkubację z delikatnym wytrząsaniem prowadzono przez około 3 godziny w temperaturze 60°C. Po tym czasie, roztwór hybrydyzacyjny wylano, zaś filtry płukano dwukrotnie w 60°C w 2xSSC przez 15 minut. Filtry delikatnie osuszono, przykryto folią (Saran™wrap albo podobną) i eksponowano na nie kliszę rentgenowską (przykładowo. Kodak Xomat™-AR5) przez noc w temperaturze pokojowej. Po wywołaniu filmu, kolonie zawierające interesujące wstawki identyfikowano jako te, które dawały najsilniejszy sygnał (najciemniejszą plamkę) na kliszy rentgenowskiej. W tej serii doświadczeń, około 15% kolonii dawało pozytywną hybrydyzację. Kolonie te pobrano z drugiego filtra, rozmazano i utrzymywano na pożywce agar-L z 100 (pg/ml ampicyliny i hodowano na takiej samej pożywce.

Wybrane izolaty badano metodą PCR na obecność wstawki o prawidłowej długości, stosując starter BPT1 i BPB1 (Identyfikator Sekw. Nr 46 i Identyfikator Sekw. Nr 47) oraz starter wewnętrzny BPT2 (Identyfikator Sekw. Nr 48) i BPB1. BPT2 został zaprojektowany tak, aby startował od końca sekwencji pro-, przed początkiem dojrzałego genu i wprowadzał miejsce restrykcyjne Xbal. W celu przesiewania przez PCR, kolonie wybranych izolatów pobrano i zawieszono w 200 pl wody destylowanej i podgrzano do 100°C przez 10 minut w zamkniętej probówce Eppendorfa. Zawiesinę odwirowano przez 10 minut w mikrowirówce w celu osadzenia resztek komórkowych i stosowano 1 pl nadsączu jako matryca DNA do przesiewania PCR. Zwykle, 1 pl nadsączu mieszano z 20 pmolami dwóch starterów oligonukleotydowych BPT1 i BPB1 albo BPT2 i BPB1, dNTP w stężeniu końcowym 200 pM, buforem polimerazy Taq i 0,5 jednostki polimerazy Taq w objętości końcowej 20 pl. Inkubację PCR przeprowadzono w ciągu 25 cykli po 1,5 minuty w 94°C, 2 minuty w 50°C i 2 minuty w 72°C, a następnie 9,9 minuty w 72°C na zakończenie reakcji.

Produkty PCR analizowano w kierunku DNA o odpowiedniej długości przez elektroforezę na żelu agarozowym (około 1250 pary zasad ze starterów BPT1 i BPB1, i około 900 par zasad ze starterów BPT1 i BPB1, patrz fig. 18). Dziesięć spośród 12 klonów dawało produkt PCR o prawidłowej wielkości. Sześć spośród dziesięciu klonów pobrano w celu wytwarzania DNA plazmidowego (stosując zestaw Qiagen Maxi™, ze 100 ml całonocnej hodowli w 37°C w pożywce L ze 100 pg/ml ampicyliny) . Te peeparaty DNA ee^weenc-onowano prezz caty region wstawki produktu PCR stosując zestaw do sekwencjonowania DNA USB ' Seguenase™, zawierający polimera^ DNA bakteriofaga T7. Każdy klon sekwencjonowano stosując osiem starterów oligonukleotydowych oznaczonych jako: 676, 337, 679, 1280, 1279 i 1281 (Identyfikatory Sekw. Nr od 48 do 55). Położenie starterów sekwencjonujących. w sekwencji HCPB pokazano schematycznie na fig. 19, gdzie startery 336, 1279, 676, 1280, 677 i 1281 są starterami naprzód, zaś 337 i 679 wstecz.

Pięć spośród sześciu klonów miało identyczne sekwencje (Identyfikator Sekw. Nr 56) 1263 par zasad pomiędzy miejscami restrykcyjnymi SacI i Xhol, i sekwencję tą zastosowano w dalszych doświadczeniach. Translacja sekwencji DNA na sekwencję polipeptydową pokazano na Identyfikatorze Sekw-·. Nr 57, numerując od 1 na początku dojrzałej sekwencji białkowej. Aminokwas o numerze -95 stanowi początek prawdopodobnej sekwencji pro-enzymu. Wyłącznie część sekwencji sygnałowej wydzielania (sekwencja prę-) jest obecna w klonowanych PCR

184 031 wytworzonych z DNA. Sekwencja polipeptydowa pokazuje resztę asparaginianową. w pozycji 253, która powoduje, że gdy pełna sekwencja zostanie przyporządkowana do innych sekwencji ssaczych· karboksypeptydaz A i B, wskazuje na swoistość B (patrz, aminokwas nr 255 według Catasusa i in., Biochem. J. 287, 299-303, 1992 i dyskusja). Jednakże, cysteina w pozycji 135 w klonowanej sekwencji nie jest obserwowana z żadnej innej publikowanej sekwencji ludzkiej trzustkowej karboksypeptydazy B, jak to podkreślił Yamamoto i in., J. Biol. Chem., 267, 2575-2581, 1992, gdzie wykazała przerwę w jej sekwencji po nr 244, po przyporządkowaniu z innymi ssaczymi sekwencjami aminokwasowymi karboksypeptydaz B. Na fig. 19 pokazano również przybliżone miejsca reszt asparaginowych w miejscu rozpoznającym enzymu, oraz resztę cysteiny w pozycji 135 dojrzałego enzymu.

Jeden z klonów zdeponowano 23 listopada 1995 w National Collection of Industrial and Marinę Bacteria Ltd (23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Szkocja, UK) jako NCIMB 40694. Plazmid tego klonu znany jest jako pICI1698.

Przykład odniesienia 15

Ekspresja dojrzałej HCPB-(His)₆-c-Myc w E. coli

W celu uzyskania ekspresji dojrzałej HCPB w E. coli, dojrzały gen z pICI1698 przeniesiono do wektora plazmidowego, umożliwiającego kontrolowane wydzielanie produktu białkowego do periplazmy bakterii. Wektor ten, znany jako pICI1266 w bakterii MSD522, odpowiedniej do kontrolowanej ekspresji, zdeponowano 11 października· w National Collection of Industrial and Marinę Bacteria Ltd (Aberdeen AB2 1RY, Szkocja, UK) jako NCIMB 40589. Mapa plazmidowa pICI1266 pokazana jest na fig. 20. Plazmid posiada geny oporności na tetracyklinę i indukowanie (TetA i TetR), operator AraB i sekwencję promotora do ekspresji wprowadzonego genu oraz sekwencję AraC do kontrolowania ekspresji. Po sekwencji promotora następuje sekwencja sygnałowa PelB, która kieruje sekwencję polipeptydową do periplazmy. Miejsce klonowania zawiera kilka unikalnych miejsc restrykcyjnych oraz sekwencję przerywającą f aga T4. Sekwencja DNA tego regionu i cechy klonowania genu pokazano schematycznie na fig. 21.

Do klonowania dojrzałej sekwencji HCPB w pICI1266 zdecydowano się na wytworzenie DNA HCPB przez PCR, zaś w celu wykonania pewnych zmian w doborze kodonów na początku sekwencji dojrzałego genu wprowadzając kodony preferowane przez E. coli. W celu ułatwienia wykrywania i oczyszczania konstruktu ekspresyjnego dodano również C-końcowy znacznik peptydowy, znany jako (His)6-c-Myc. Znacznik zbudowany był z sześciu histydyn, łącznika trójpeptydowego (EPE) i sekwencji peptydowej (EQKLISEEDL) z c-myc, którą rozpoznaje przeciwciało 9E10 (Jak opublikowano w Evan i in., Mol. Celi Biol., 5, 129-136, 1985; i dostępne z Cambridge Research Biochemicals i innych dostawców przeciwciał). Koniec C jest zakończony przez asparaginę. 6 reszt histydynowych umożliwia oczyszczanie ekspresjonowanego białka na kolumnie helatującej metal (przykładowo agaroza Ni-NTA firmy Qiagen). Oprócz tego, zastosowane startery PCR wprowadzały unikalne miejsca restrykcyjne na końcu 5' (Fspl) i 3' (EcoRI) genu, w celu ułatwienia wprowadzania produktu PCR do wektora ekspresyjnego. Sekwencję obu starterów, znanych jako FSPTSl i 6HIS9E10R1BS1 pokazano jako Identyfikator Sekw. Nr 58 i Identyfikator Sekw. Nr 59. W celu wytworzenia modyfikowanego genu do klonowania do pICI1266, nastawiono PCR stosując około 100 pM starterów FSPTSl i 6HIS9E10R1BS1 w obecności około 5 ng DNA pICI1698, dNTP w stężeniu końcowym 200 pM, bufor reakcyjny polimerazy Taq i 2,5 jednostki polimerazy Taq w objętości końcowej 100 pl. Mieszaninę podgrzewano do 94°C przez 10 minut przed dodaniem enzymu Taq i przeprowadzano inkubacje PCR stosując 30 cykli po 94°C przez 1,5 minuty, 50°C przez 2 minuty i 72°C przez 2 minuty, a następnie pojedynczą inkubację w 72°C przez 9,9 minut na zakończenie reakcji. Porcje produktu PCR analizowano na obecność DNA o odpowiedniej wielkości (około 1000 par zasad) przez elektroforezę na żelu agarozowym i stwierdzono, że zawiera przede wszystkim prążek o prawidłowej wielkości. Pozostałą część produktu w mieszaninie reakcyjnej oczyszczono i oddzielono od nadmiaru odczynników stosując kolumnę Centricon™ 100 (Amicon), a następnie izolację DNA przez precypitację etanolem/octanem sodu, odwirowanie, suszenie pod próżnią i rozpuszczenie w wodzie destylowanej. Izolowany DNA trawiono restrykcyjnie enzymami Fspl i EcoRI, zaś prążek

184 031 o odpowiedniej długości (około 1000 par zasad) oczyszczano i izolowano z żelu agarozowego stosując wycięcie i mleko szklane (Geneclean™, Stratec Scientific albo inny podobny produkt).

Dwuniciowy DNA pICI1266 wytworzono stosując standardową technologię DNA (zestaw Quiagen plazmid albo podobny), trawiono restrykcyjnie enzymem KpnI, upewniając się co do kompletnego strawienia. Enzym inaktywowano przez podgrzanie do 65°C przez 10 minut i oziębiono na lodzie. Nawis 3' wytworzony przez KpnI trawiono enzymatycznie przez dodanie polimerazy DNA T4, jak to zalecił producent (New England Biolabs) w obecności dNTP i inkubowano w 16°C przez 15 minut. Reakcję zatrzymano przez inaktywację enzymu przez ogrzanie do 70°C przez 15 minut. Produkt DNA oczyszczono z zanieczyszczeń przy użyciu mleka szklanego, próbkę zbadano pod kątem uzysku przez elektroforezę na żelu agarozowym, zaś pozostałość trawiono enzymem EcoRI. Ponownie upewniono się co do kompletności trawienia. DNA o prawidłowej wielkości (około 5600 par zasad) oczyszczano i izolowano z żelu agarozowego stosując wycięcie i mleko szklane (Geneclean™, Stratec Scientific albo inny podobny produkt).

Na podstawie tych obliczeń, przygotowano mieszaniny w celu klonowania genu HCPB do wektora, stosując stosunek molowy równy około 1 wektorowi na 2,5 wstawki (1 pICI1266 na 2,5 produktu PCR HCPB) i końcowe stężenie DNA rzędu około 2,5 ng/pl, w obecności ligazy DNA T4,1 mM ATP i bufora, stosując warunki odpowiednie do ligacji tępo zakończonych DNA (Fspl do KpnI traktowanego polimerazą DNA).

Po reakcji ligacji mieszaninę DNA zastosowano do transformowania E. coli szczepu DH5a (Gibco-BRL, komórki kompetentne o maksymalnej efektywności). Porcje komórek wysiano na podłoże L-agar zawierające tetracyklinę 10 pg/ml jako selekcja dla wektora plazmidowego, po czym inkubowano przez noc w 37°C. Kolonie zawierające plazmid z interesującą wstawką identyfikowano przez hybrydyzację.

Pobrano około 350 kolonii i wysiano na podwójne filtry nitrocelulozowe (Schleicher & Schuell), zwilżonych na płytkach z agarem zawierającym tetracyklinę 10 pg/ml jako selekcja dla wektora, i inkubowano przez noc w 37°C. Jeden z kompletów przechowywano w 4°C i służył jako źródło żywych bakterii do tworzenia kolonii, drugi poddano działaniu denaturującemu i przytwierdzającemu DNA z indywidualnych kolonii do nitrocelulozy; Filtr nitrocelulozowy pobierano z płytki agarowej i umieszczano kolejno na filtrach papierowych Whatman™ zwilżonych:

1. 10% SDS na 2 minuty;

2. 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl na 7 minut;

3. 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl na 4 minuty;

4. 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl na 2 minuty;

5. 0,5 M Tris pH 7,4, 1,5 M NaCl na 2 minuty;

6. 2xSSC (standardowy roztwór soli buforowany cytrynianem) na 2 minuty.

Filtr umieszczono na filtrze papierowym Whatman™ zwilżonym w 10xSSC i sieciowano denaturowany DNA z filtrem przez działanie ultrafioletem (Spectrolinker™, XL-1500 UV). Filtry pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej i prehybrydyzowano w 60°C przez godzinę w roztworze 6xSSC przy delikatnym wytrząsaniu (przykładowo w piecu hybrydyzacyjnym Techne HB-1D). Prehybrydyzacja blokuje nieswoiste miejsca wiązania DNA na filtrze.

W celu określenia, które kolonie zawierają interesujące wstawki DNA, DNA sieciowany z filtrem nitrocelulozowym hybrydyzowano ze znakowaną radioaktywnie sondą ^P-DNA wytworzoną z produktu PCR biblioteki cDNA trzustki (patrz wyżej). Około 50 ng DNA znakowano 50 pCi 32P-dCTP (-3000 Ci/mmol) stosując polimerazę DNA T7 w objętości końcowej 50 pl (zestaw Pharmacia T7 Quickprime) a następnie reakcję pozostawiono na 15 minut w 37°C. Znakowaną sondę podgrzano do 95°C przez 2 minuty, w celu denaturacji dwuniciowego DNA, natychmiast dodano do 10 ml 6xSSC w temperaturze 60°C, a następnie roztwór ten zastosowano do zastąpienia roztworu prehybrydyzacyjnego. Inkubację z delikatnym wytrząsaniem prowadzono przez około 3 godziny w temperaturze 60°C. Po tym czasie, roztwór

184 031 hybrydyzacyjny wylano, zaś filtry płukano dwukrotnie w 60°C w 2xSSC przez 15 minut. Filtry delikatnie osuszono, przykryto folią (Saran™wrap albo podobną) i eksponowano na nie kliszę rentgenowską (przykładowo. Kodak Xo-mat™-AR5) przez noc w temperaturze pokojowej. Po wywołaniu filmu, kolonie zawierające interesujące wstawki iOentyfiknwjan jako te, które dawały najsilniejszy sygnał (najciemniejszą plamkę) na kliszy rentgenowskiej. W tej serii doświadczeń, około 50% kolonii dawało pozytywną hybrydyzację. Wybrano z tego 12 kolonii do dalszego przesiewania. Kolonie te pobrano z drugiego filtra, rozmazano i utrzymywano na pożywce agar-L z 10 pg/ml tetracykliny i hodowano na takiej samej pożywce.

Wybrane izolaty badano metodą PCR na obecność wstawki o prawidłowej długości, stosując starter FSPTSl i 6HIS9E10R1BS1 (Identyfikator Sekw. Nr 58 i Identyfikator Sekw. Nr 59) oraz starter wewnętrzny BPB2 (Identyfikator Sekw. Nr 51) i FSPT1. BPT2 został zaprojektowany tak, aby startował w dojrzałym genie i tworzył fragment wielkości około 430 par zasad. W celu przesiewania przez PCR, kolonie wybranych izolatów pobrano i zawieszono w 200 pl wody destylowanej i podgrzano do 100°C przez 10 minut w zamkniętej probówce Eppendorfa. Zawiesinę odwirowano przez 10 minut w mikrowirówce w celu osadzenia resztek komórkowych i stosowano 1 p l nadsączu jako matryca DNA do przesiewania PCR. Zwykle, 1 pl nadsączu mieszano z 20 pmolami dwóch starterów nllgnnuklentydnwyoh FSPT1 i 6HIS9E10R1BS1 albo FSPT1 i BPB2, dNTP w stężeniu końcowym 200 pM, buforem polimerazy Taq i 0,5 jednostki polimerazy Taq w objętości końcowej 20 pl. Inkubację PCR przeprowadzono w ciągu 25 cykli po 1,5 minuty w 94°C, 2 minuty w 50°C i 2 minuty w 72°C, a następnie 9,9 minuty w 72°C na zakończenie reakcji.

Produkty PCR analizowano w kierunku DNA o odpowiedniej długości przez elektroforezę na żelu agamrow^ (około 1000 par zasad ze starterów FSPT1 i 6H3S9E10R1BS1 albo 430 par zasad z FSPT1 i BPB2). Wszystkie 12 klonów dawało produkt PCR o prawidłowej wielkości. Sześć spośród dziesięciu klonów pobrano w celu wytwarzania DNA plazmidowego (stosując zestaw Qiagen Maxi™, ze 100 ml całonocnej hodowli w 37°C w pożywce L z 10 pg/ml tetracykliny) . Te prepaaaty DNA rekwencionowano pzzzz cłfy region wsawwki produktu PCR sOsuażcc zestaw do sekwrnojnnnwaaia DNA USB Seeueajsr™, zawierający pnlimerazę DNA bakteriofaga T7. Trzy z tych starterów: 1504, 1590 i 1731 zastosowano do sprawdzenia klnanwjayoh połączeń pomiędzy wektorem ekspresyjnym a wprowadzonym genem (Identyfikator Sekw. Nr 60, 61 i 62) jak również dających sekwencję od startu do końca wprowadzonego genu. Inne startery, znane jako 679, 677, 1802 i 1280 (Identyfikator Sekw. Nr 51, 52, 63 i 53) zastosowano do potwierdzenia pozostałej części genu. Plazmid ten zawierający zmodyfikowany dojrzały gen HCPB znany jest jako pICn712. Potwierdzona sekwencja klonowanego genu pokazująca translację aminokwasów, od początku od sekwencji PelB do końca do znacznika (His^-c-myc pokazano na Identyfikatorze Sekw'. Nr 64 o numeracji rnzpnozyaająorj się od 1 w pierwszym kn0naie PelB i numeracji peptydów od 1 w dojrzałej HCPB.

W celu uzyskania knntrnlnwjaęj ekspresji zmodyfikowanej HCPB w pICI1712, plazmidowy DNA transformowano metodą chlorku wapniowego do szczepu ekspresyjnego kompetentnych E. coli. Wśród tych szczepów występuje wiele niezdolnych do wzrostu z wykorzystaniem arabinnży jako głównego źródła węgla, i posiadających defekt chromosoma^y npernnu arabino/y (Ara). Korzystny szczep znany jest jako MSD213 (szczep MC1000 w/g Casadabana i in., J. Molec. Biol., 138, 179-208, 1980) i posiada częściowy genotyp F-jaaΔ(Ara-Leu) ALacX74GalVStrR. Inny korzystny szczep znany jest jako MSD525 (Szczep MC1061) i ma genotyp AraD139A (AIjLeu)7697ΔLacGalUHsORRpsL. Szczepy E. coli o podobnym genotypie, odpowiednie do kontrolowanej ekspresji genów pod kontrolą promotora AraB w plazmidzie pI-CI266 mogą być uzyskane z The E. coli Genetic Stock Centre, Dept, of Biology, Yale Un^^sity, CT, USA. Selekcja transfnrmaatów odbywała się na podłożu agar-L z dodatkiem 10 (pg/ml tetracykliny, przez noc w 37°C. Z płytek transformacyjnych pobrano pojedyncze kolonie, oczyszczono przez rozmazanie i utrzymywano na pożywce L-agar z dodatkiem 10 pg/ml tetracykliny, i hodowano na tej samej pożywce.

Wszystkie szczepy ekspresyjne transformowane pICI1712 traktowano w ten sam sposób w celu zbadania ekspresji klonowanego genu HCPB.

184 031

1. Do inokulacji 10 ml pożywki L zawierającej 10 pg/ml tetracykliny używano pojedynczej kolonii i inkubowano w standardowym pojemniku 25 ml, w 37°C przez noc z wytrząsaniem.

2. 75 ml pożywki L zawierającej 10 pg/ml tetracykliny ogrzanej do 37°C w 250 ml stożkowej butelce inokulowano 0,75 ml (1%) hodowli całonocnej. Inkubację prowadzono przez noc w 37°C z wytrząsaniem, i monitorowano wzrost mierząc absorbancję przy 540 nm. indukcja ekspresji klonowanego białka była konieczna podczas wykładniczej fazy wzrostu hodowli, i przeprowadzano ją między 0,4 i 0,6 OD przy 540 nm, zwykle 90 do 150 minut po inokulacji.

3. Gdy komórki osiągnęły wymaganą, gęstość optyczną pozostawiono je do wystygnięcia do około 30°C przez umieszczenie butelek w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie dodano arabinozę w stężeniu końcowym 1%, i inkubowano w 30°C przez 4 do 6 godzin z wytrząsaniem.

4. Po inkubacji zmierzono końcową gęstość optyczną i komórki zebrano przez odwirowanie. Końcowy pomiar OD pobrano w celu wyliczenia objętości buforu do wprowadzania białka na żel poliakrylamidowy (Laemmli) który zastosowano do zawieszenia osadu komórkowego. Dla OD mniejszej niż 1 stosowano objętość 10 pl na każdą 0,1 OD, zaś dla OD wyższej niż 1 stosowano objętość 15 pl na każdą 0,1 OD. Bufor składał się z 0,125 mM Tris-HCI pH 6,8, zawierał 2% SDS, 2% β-merkaptoetanolu, 10% gliceryny i 0,1% błękitu bromofenolowego.

5. Po zawieszeniu, próbki denaturowano przez ogrzanie do 100°C przez 10 minut, odwirowano w celu oddzielenia lepkiego osadu komórkowego od nadsączu. Próbki ekspresji, zwykle 20 pl nadsączu, wprowadzano na 17% żel SDS-poliakrylamidowy do elektroforetycznego rozdziału białek. Zwykle przygotowywano podwójny żel, tak, że jeden mógł być barwiony na białko całkowite (barwienie Coomassie albo podobne i standardowe warunki) zaś drugi mógł być zastosowany do analizy Western biot.

Do analizy Western błot białka z żelu przenoszono na błonę nylonową (Problot™, przykładowo, Applied Biosystems), stosując półsuchy aparat do elektroforetycznego przenoszenia, (BioRad albo podobny). Przed i podczas procesu upewniono się, że błony są zwilżone. Po przeniesieniu białek z żelu, dalsze wiązanie zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku (Marvel™ albo podobne) w roztworze soli buforowanej fosforanem w temperaturze pokojowej z delikatnym wytrząsaniem przez 5 godzin. Membrany płukano 3-krotnie w temperaturze pokojowej z delikatnym wytrząsaniem przez 5 minut w PBS zawierającym 0,05% Tween 20. Płukane membrany inkubowano z przeciwciałem pierwotnym, monoklonalnym mysim 9E10 przeciwko peptydowi c-myc (patrz wyżej) w odpowiednim rozcieńczeniu (zwykle 1:10000 dla wysięku albo 1:40 dla nadsączu hodowli hybrydoma) w PBS zawierającym 0,05% Tween 20 i 0,5% odtłuszczonego mleka w proszku, w temperaturze pokojowej przy delikatnym wytrząsaniu przez noc. Membrany płukano 3-krotnie w temperaturze pokojowej w PBS zawierającym 0,05% Tween 20. Płukane membrany inkubowano z przeciwciałem wtórnym, przeciwciałem przeciwko mysim IgG sprzęgniętym z peroksydazą chrzanową (zwykle kozim, jak np. A4416 z Sigma), w odpowiednim rozcieńczeniu (zwykle 1:10000) w PBS zawierającym 0,05% Tween 20 i 0,5% odtłuszczone mleko w proszku. Membrany płukano 3-krotnie w temperaturze pokojowej po 10 minut w PBS zawierającym 0,05% Tween 20. Membrany wywoływano stosując procedurę zestawu Amersham ECL™ Western detection kit, i eksponowano na kliszę Amersham Hyperfilm™ ECL przez 30 sekund na początku, a następnie odpowiednio długo aby otrzymać wyraźny obraz prążków ekspresjonowanego białka. Można zastosować inne sposoby o podobnej czułości do wykrywania znakowanych peroksydazą białek na membranach.

Wykazano dobrą ekspresję klonowanego znakowanego pICI1266(pICI1712) w szczepie E. coli MSD213 i MSD525 przez barwienie żelu Coomassie wykazując dodatkowy prążek białka wielkości około 35 kDa w porównaniu z klonami z pustym wektorem (pICI1266) i prążek o tej samej wielkości dający silny sygnał w analizie Western ze znacznikiem peptydowym c-myc.

184 031

Przykład odniesienia 16.

Ekspresja dojrzałej HCPB w E. coli

Sposób klonowania i ekspresji dojrzałej HCPB w E. coli był bardzo podobny do sposobu opisanego w przykładzie 15. Ponownie, jako wektora użyto pICI266, ale w tym wypadku materiałem wyjściowym do PCR dojrzałego genu HCPB był plazmid pICI1712, znakowany gen w wektorze ekspresyjnym. Dwa oligonukleotydy, znane jako 2264 i 2265 (Identyfikator Sekw. Nr 65 i 66) zastosowano do reakcji PCR (zamiast starterów FSPTSl i 6HIS9E10R1BS1) stosując podobne warunki co w przykładzie 15, ale stosując DNA pICI1712 zamiast pICI1698. Najpierw, zaprojektowano oligonukleotyd 2264 w taki sposób, że rozpoczynał reakcję w pICH712 i obejmował miejsce restrykcyjne Ncol w sekwencji liderowej PelB i ciągnął się do początku wprowadzonego dojrzałego genu HCPB (zasady 36 do 66 w Identyfikatorze Sekw'. Nr 64). Po drugie, zaprojektowano oligonukleotyd 2265 tak, aby rozpoczynał reakcję na końcu genu HCPB przed początkiem sekwencji znacznika (His)6-c-myc (komplementarnej do zasad 965 do 987 w Identyfikatorze Sekw. Nr 64) i wprowadzał kodon przerwania translacji (komplementarne do TAA TAA) pod koniec genu, po czym następowało miejsce restrykcyjne EcoRI (GAATTC) i zasady wypełniające. Ten oligonukleotyd startował reakcję z powrotem w obręb genu.

Porcję produktu PCR analizowano pod kątem zawartości DNA o prawidłowej wielkości (około 970 bp) przez elektroforezę na żelu agarozowym, i stwierdzono, że zawiera przede wszystkim prążek o prawidłowej wielkości. Pozostałość oczyszczono w podobny sposób jak w przykładzie 15. Izolowany DNA trawiono restrykcyjnie enzymami Ncol i EcoRI, zaś prążek o prawidłowej wielkości (około 940 bp) oczyszczono w sposób podobny, jak w przykładzie 15.

Dwuniciowy DNA pICI266 przygotowany, jak w przykładzie 15 trawiono restrykcyjnie Ncol i EcoRI upewniając się co do kompletności trawienia. DNA o prawidłowej wielkości (5600 bp) oczyszczono w sposób podobny jak w przykładzie 15. Porcje próbek DNA oczyszczonych i trawionych zbadano pod kątem czystości i stężenia stosując elektroforezę na żelu agarozowym i porównując ze znanymi standardami. Na podstawie tych obliczeń wykonano mieszaninę ligacyjną w celu klonowania genu HCPB do pICI266 w sposób podobny do Przykładu 15. Po ligacji, mieszaninę reakcyjną zastosowano do transformowania E. coli szczepu DH5a, pobrano kolonie i badano przez hybrydyzację podobnie jak w przykładzie 15.

Sześć klonów pobrano w celu wytwarzania plazmidowego DNA, po czym sekwencjonowano je przez region produktu PCR w sposób podobny jak w przykładzie 15. Klony sekwencjonowano stosując sześć starterów do sekwencjonowania znanych jako: 1504, 1802, 679, 1280, 677 i 1731 (Identyfikatory Sekw. Nr 60, 63, 51, 53, 52 i 62). Na podstawie wyników sekwencjonowania wybrano klon zawierający plazmid z pożądaną sekwencją dojrzałego genu HCPB, znany jako pICI1736.

Potwierdzona sekwencja klonowanego genu, pokazująca translację na aminokwasy, od początku sekwencji PelB do miejsca restrykcyjnego EcoRI pokazana jest na Identyfikatorze Sekw. Nr 67 z numeracją DNA rozpoczynającą się od 1 na pierwszym kodonie PelB i peptydach numerowanych od 1 od dojrzałej HCPB. W celu uzyskania kontrolowanej ekspresji dojrzałej HCPB, DNA plazmidowy pICI1736 transformowano metodą chlorku wapnia do kompetentnego szczepu ekspresyjnego E. coli w sposób podobny jak w przykładzie 15. Wszystkie szczepy ekspresyjne E. coli traktowano w sposób podobny jak w przykładzie 15, w celu zbadania ekspresji klonowanego genu HCPB. Jednakże, w tym przypadku nie można było zastosować przeciwciała monoklonalnego 9E10 swoistego wobec znacznika peptydowego c-myc w analizie Western błot, ponieważ dojrzała sekwencja HCPB nie miała znacznika na końcu C. Tak więc, jako przeciwciało pierwotne zastosowano przeciwciało przeciwko bydlęcej karboksypeptydazie A, wywołane u królików (Biogenesis), które jak wcześniej wykazano reaguje krzyżowo z oczyszczoną trzustkową karboksypeptydazą B. Wtórnym przeciwciałem było przeciwciało przeciwko króliczym IgG znakowane peroksydazą chrzanową, wywołane u kóz (Sigma A9169 albo podobne).

Ekspresję klonowanej dojrzałej HCPB w pICI266 (pICI1736) wykazano w szczepach MSD213 i MSD525 przez barwienie żeli Coomassie wykazujące dodatkowy prążek białka wielkości około 34 kDa w porównaniu z klonami zawierającymi pusty wektor. Prążek o podobnej

184 031 wielkości dawał sygnał w badaniu Western z użyciem przeciwciała przeciwko bydlęcej karboksypeptydazie A.

Przykład odniesienia 17

Ekspresja dojrzałej HCPB w komórkach COS

Gen kodujący preHCPB wytworzono przez PCR z pICI1698 (przykładzie 14). PCR nastawiono z matrycą pICI1689 (10 pg) i oligonukleotydami o Identyfikatorze Sekw. Nr 34 i Identyfikatorze Sekw. Nr 35 (100 pM każdy) w buforze (100 pl) zawierającym 10 mM TrisHCI (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 0,125 każdego z dNTP i 2,5 jednostki polimerazy DNA Taq (Amplitag, Perkin-Elmer Cetus). Reakcje pokryto olejem mineralnym (100 (pl) i inkubowano przez 25 cykli po 94°C przez 1 minutę, 53°C przez 1 minutę i 72°C przez 2,5 minuty oraz dodatkowo w 72°C przez 10 minut. Produkt PCR wielkości 985 bp izolowano przez elektroforezę na 1% agarozie (typ I, Sigma A6013) a następnie wycięcie prążka z żelu i izolację fragmentu DNA przy użyciu Geneclean™ (zestaw Geneclean II, stratech Scientific). Zestaw Geneclean zawierał 1) 6 M jodek sodu, 2) stężony roztwór chlorku sodu, Tris, EDTA do wytwarzania płukanki chlorek sodu/etanol/woda, 3) Glassmilk™, 1,5 ml fiolkę zawierającą 1,25 ml zawiesiny specjalnie przygotowanej macierzy krzemionkowej w wodzie.

Jest to technika oczyszczania DNA oparta na metodzie Vogelsteina i Gillespie, PNAS USA (1979), 76, 615. Ewentualnie, można zastosować dowolną metodę opisaną w Maniatis i in., (1982) Molecular Cloning; A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York. Pokrótce, procedura Geneclean: 1 objętość skrawka żelu zalać 3 objętościami roztworu jodku sodu z zestawu. Agaroza rozpuszcza się dzięki podgrzewaniu mieszaniny w 55°C przez 10 minut, po czym dodaje się Glassmilk (5-10 pl), miesza i pozostawiana na 10 minut w temperaturze otoczenia. Mleko szklane odwirowuje się i płucze trzykrotnie NEW WASH z zestawu (500 p l). Bufor do płukania zlewa się znad osadu Glassmilk, który pozostawia się do wyschnięcia na powietrzu. DNA eluuje się z wysuszonego Glassmilk przez inkubację z wodą (5-10 p l) w 55°C przez 5-10 minut. Wodny roztwór zawierający eluowany DNA odzyskuje się przez odwirowanie. Etap elucji może być powtórzony zaś nadsącza połączone.

Gen preHCPB trawiono przez godzinę w 37°C przy użyciu EcoRI i Hindlll w 100 pl mieszaniny zawierającej 100 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM chlorek magnezu, 50 mM NaCl, 0,025% Triton Χ-100 i 25 jednostek Hindlll i EcoRI (New England Biolabs). Trawiony fragment oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym i Geneclean, jak to opisano wyżej, dla fragmentu nie ciętego, i klonowano do pBluescript™. DNA pBluescript™KS+ (5 pg) trawiono całkowicie EcoRI i Hindlll (25 jednostek każdego) w 100 pl jak to opisano wyżej. Dodano cielęcą jelitową fosfatazę alkaliczną 91 pl, New England Biolabs, 10 jedn./ pl) do trawionego plazmidu, w celu usunięcia grup fosforanowych 5', i kontynuowano inkubację w 37°C przez dalsze 30 minut. Aktywność fosfatazy zniszczono przez inkubację w 70°C przez 10 minut. Plazmid cięty EcoRI-Hindlll oczyszczono z żelu agarozowego jak to opisano wyżej. Gen preHCPB trawiony EcoRI-Hindlll (50 ng) poddano ligacji z przeciętym plazmidem w 20 pl roztworu zawierającego 30 mM Tris-HCI (pH 7,8), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 pg/ml,BSA i 400 jednostek ligazy DNA T4 (New England Biolabs) w 25°C przez 4 godziny, 1 pl porcję mieszaniny reakcyjnej zastosowano do transformowania 20 pl kompetentnych komórek E. coli DH5(x (komórki kompetentne DH5(.a o maksymalnej efektywności, Life Technologies Ltd.) stosując protokół dostarczony z komórkami. Transformowane komórki wysiano na płytki z agarem L z dodatkiem 100 pg/ml ampicyliny. Potencjalne klony preHCPB identyfikowano przez PCR. Każdy z klonów poddano PCR jak to opisano wyżej przy wytwarzaniu genu preHCPB z takim wyjątkiem, że mieszaninę z komórkami inkubowano w 94°C (procedura hot-start) przez 5 minut, przed 25 cyklami PCR i oligonukleotydami o Identyfikatorze Sekw-'. Nr 34 i 35 zastąpionymi przez oligonukleotydy o Identyfikatorze Sekw. Nr 36 i 37. Próbkę (10 pl) reakcji PCR analizowano przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym. Klony zawierające gen preHCPB identyfikowano na podstawie obecności produktu PCR wielkości 1,2 kb. Klony dające produkt 1,2 kb zastosowano do wytwarzania plazmidowego DNA na wielką skalę zaś sekwencję wstawki potwierdzono analizą sekwencji DNA. Plazmid zawierający gen preHCPB w pBluescript™ nazwano pMF15.

184 031

W celu wytworzenia wektorów zdolnych do ekspresjonowania HCPB w komórkach eukariotycznych zastosowano układ GS-System™ (Celltech Biologics) (WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 i WO 89/10404). Procedura wymaga klonowania genu preHCPB w region Hindlll-EcoRI wektora pEE12 (wektor ten jest podobny do pSV2.GS opisanego przez Bebbingtona i in., (1992) Bio/Technology 10, 169-175, z wieloma miejscami obecnymi oryginalnie w pSV2.GS, usuniętymi ukierunkowaną, mutagenezą w celu zapewnienienia unikalnych miejsc w regionie łącznika). W celu stworzenia indywidualnych wektorów plazmidy pAFI i pEE6 trawiono EcoRI i Hindlll, zaś pAF3 i pEE12 trawiono EcoRI jak to opisano wyżej. Odpowiednie fragmenty wektora (z pEE12) i wstawki (z pMF15) z każdego z trawień izolowano z 1% agarozy i ligowano ze sobą, po czym stosowano do transformacji kompetentnych komórek DH5a. Transformowane komórki wysiewano na agar L z ampicyliną (100 pg/ml). Przesiewanie kolonii po transformacji przeprowadzono metodą PCR, stosując oligonukleotydy, które rozpoczynały reakcję w promotorze CMV (Identyfikator Sekw. Nr 38) i genie HCPB (Identyfikator Sekw. Nr 39). Klony dające produkt PCR wielkości 1,365 kb zastosowano do wytwarzania plazmidowego DNA na wielką skalę, zaś sekwencję wstawki potwierdzono sekwencjonowaniem DNA. Plazmid zawierający sekwencję preHCPB w pEE12 nazwano pMF48. Drugi eukariotyczny wektor ekspresyjny pEE12 zawierający sekwencję preproHCPB wytworzono jak to opisano wyżej. W początkowej PCR zastosowano oligonukleotydy o Identyfikatorze Sekw·'. Nr 40 i 41, w celu izolowania genu o sekwencji prepro z pMF18 (opisane w przykładzie 19). W tym przypadku, PCR wykonano przez inkubowanie mieszaniny bez polimerazy DNA Taq przez 5 minut w 94°C. Następnie dodano polimerazę DNA Taq (2,5 jednostki) i kontynuowano PCR przez 25 cykli jak to opisano wyżej. Fragment wielkości 360 bp klonowano do pBluescript otrzymując pMF66, a następnie do pEE12 (przesiewanie przez PCR z Identyfikatorem Sekw·'. Nr 40 i 41) otrzymując pMF67.

Do ekspresji w komórkach eukariotycznych, wektory zawierające geny zdolne do ekspresji preHCPB i sekwencji prepro transfekowano równolegle do komórek COS-7. Komórki COS są linią komórek nerki afrykańskiej małpy zielonej, CV-1, transformowane wirusem SV40 pozbawionym początku replikacji, i są szeroko stosowane do przejściowej, krótkotrwałej ekspresji różnych białek, z powodu ich zdolności do replikacji kolistych plazmidów zawierających początek replikacji SV40 w wielkiej liczbie kopii. Są dwa szeroko dostępne klony komórek COS, COS-1 i COS-7. Podstawową metodykę transfekcji komórek COS opisał Bebbington w Methods: a Companion to Methods in Enzymology (1991) 2, 141. Do ekspresji HCPB wektory plazmidowe pMF48 i pMF67 (po 4 pg każdego) zastosowano do transfekowania komórek COS-7 (2x11)5) w płytkach 6-studzienkowych w 2 ml pożywki DMEM zawierającej 10% surowicy płodowej cielęcej inaktywowanej ciepłem (FCS), metodą znaną jako lipofekcja, czyli wprowadzanie polinukleotydów za pośrednictwem liposomów kationowych (Felgner i in., Methods: a Companion to Methods in Enzymology (1993) 5, 67-75). Komórki inkubowano w 37°C w inkubatorze CO2 przez 20 godzin. Mieszaninę plazmidowego DNA w pożywce bezsurowiczej (200 pl; Opti-MEM Reduced Serum Medium; Gibco BRL, nr 31985) zmieszano delikatnie z reagentem LIPOFECTIN (12 pl, Gibco BRL, nr 18292011) i inkubowano w temperaturze otoczenia przez 15 minut. Komórki płukano pożywką bezsurowiczą (2 ml; Opti-MEM). Do DNA/Lipofectin dodano pożywkę bezsurowiczą (600 pl; Opti-MEM) po czym mieszaninę wylano na komórki inkubowane w 37°C przez 6 godzin w inkubatorze CO2. Pożywkę zawierającą DNA zastąpiono normalną DMEM zawierającą 10 FCS i inkubowano komórki przez 72 godziny. Nadsącze komórkowe (250 pl) analizowano pod kątem aktywności HCPB wobec Hipp-Arg (w teście 5-godzinnym) jak to opisano w przykładzie 11. Nadsącz z komórek COS transferowanych reagentem Lipofectin, ale bez DNA, hydrolizował 1,2% substratu, podczas gdy nadsącz z komórek COS transfekowanych mieszaniną plazmidów ekspresjonujących preHCPB i sekwencją prepro hydrolizowały 61% substratu Hipp-Arg. Komórki COStransfekowane wyłącznie plazmidem preHCpB na poziomie komórek COS, traktowanych tylko reagentem Lipofectin.

Reagent Lipofectin jest formulacją liposomów 1:1 lipidu kationowego chlorku N-[-(2,3-dioleiloksy)propylo]-n,n,n-trimetyloamonowy (DOTMA) i dioleilofosfatydyloetanolaminy

184 031 w wodzie filtrowanej przez membranę. Wiążą się one spontanicznie z DNA tworząc kompleks lipid-DNA - patrz Feigner i in., PNAS USA (1987) 84,7431.

Przykład odniesienia 18

Ekspresja proHCPB w E. coli

Sposób klonowania i ekspresj onowania proHCPB był bardzo podobny do sposobu opisanego w przykładzie 15. Jako wektor do klonowania ponownie zastosowano pICI266 zaś jako materiał wyjściowy do PCR genu proHCPB zastosowano plazmid pICI1698 (jak to opisano w przykładzie 14). W reakcjach PCR zastosowano oligonukleotydy znane jako 2310 i 2265 (Identyfikator Sekw. Nr 68 i 66) (zamiast starterów FSPTSl i 6HIS9E10R1BS1), stosując warunki podobne do opisanych w przykładzie 15.

Najpierw, zaprojektowano oligonukleotyd 2310 w taki sposób, że rozpoczynał reakcję w pICI1698 i dodawał miejsce Ncol w sekwencji liderowej PelB i ciągnął się do początku wprowadzonego dojrzałego genu HCPB (zasady 51 do 66 w Identyfikatorze Sekw. Nr 64) do początku wprowadzonego genu proHCPB (zasady 40 do 57 Identyfikatora Sekw. Nr 56). Po drugie, zaprojektowano oligonukleotyd 2265 tak, aby rozpoczynał reakcję na końcu genu HCPB przed początkiem sekwencji znacznika (His)₆-c-myc (komplementarnej do zasad 965 do 987 w Identyfikatorze Sekw. Nr 64) i wprowadzał kodon przerwania translacji (komplementarne do TAA TAA) pod koniec genu, po czym następowało miejsce restrykcyjne EcoRI (GAATTC) i zasady wypełniające. Ten oligonukleotyd startował reakcję z powrotem w obręb sekwencji pro-genu.

Porcję produktu PCR analizowano pod kątem zawartości DNA o prawidłowej wielkości (około 1240 bp) przez elektroforezę na żelu agarozowym, i stwierdzono, że zawiera przede wszystkim prążek o prawidłowej wielkości. Pozostałość oczyszczono w podobny sposób jak w przykładzie 15. Izolowany DNA trawiono restrykcyjnie enzymami Ncol i EcoRI, zaś prążek o prawidłowej wielkości (około 1240 bp) oczyszczono w sposób podobny, jak w przykładzie 15.

Dwuniciowy DNA pICI266 przygotowany, jak w przykładzie 15 trawiono restrykcyjnie Ncol i EcoRI upewniając się co do kompletności trawienia. DNA o prawidłowej wielkości (5600 bp) oczyszczono w sposób podobny jak w przykładzie 15. Porcje próbek dNa oczyszczonych i trawionych zbadano pod kątem czystości i stężenia stosując elektroforezę na żelu agarozowym i porównując ze znanymi standardami. Na podstawie tych obliczeń wykonano mieszaninę ligacyjną w celu klonowania genu pro-HCPB do pICI266 w sposób podobny do przykładu 15.

Po ligacji, mieszaninę reakcyjną zastosowano do transformowania E. coli szczepu DH5a, pobrano kolonie i badano przez hybrydyzację podobnie jak w przykładzie 15.

Cztery pozytywne klony badano przez PCR w kierunku wstawki o prawidłowej wielkości, stosując startery 2310 i 2265 (Identyfikator Sekw. Nr 68 i 66) oraz do startowania reakcji parą wewnętrznych starterów 1279 (Identyfikator Sekw. Nr 54) i 679 (Identyfikator Sekw. Nr 51) w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15. Produkty PCR analizowano w kierunku DNA o prawidłowej wielkości (około 1200 bp) ze starterów 2310 i 2265, i około 580 bp ze starterów 1279 i 679) przez elektroforezę na żelu. Wszystkie klony dawały produkt prawidłowej wielkości.

Cztery klony pobrano w celu wytwarzania plazmidowego DNA, po czym sekwencjonowano je przez region produktu PCR w sposób podobny jak w przykładzie 15. Klony sekwencjonowano stosując sześć starterów do sekwencjonowania znanych jako: 1504, 1802, 679, 1280, 677 i 1731 (Identyfikatory Sekw. Nr 60, 63, 51, 53, 52 i 62). Na podstawie wyników sekwencjonowania wybrano klon zawierający plazmid z pożądaną sekwencją genu proHCPB, znanyjako pICI1738.

Potwierdzona sekwencja klonowanego genu, pokazująca translację na aminokwasy, od początku sekwencji PelB do miejsca restrykcyjnego EcoRI pokazana jest na Identyfikatorze Sekw. Nr 71 z numeracją DNA rozpoczynającą się od 1 na pierwszym kodonie PelB i peptydach numerowanych od 1 od dojrzalej HCPB. W celu uzyskania kontrolowanej ekspresji proHCPB, DNA plazmidowy pICI1738 transformowano metodą chlorku wapnia do kompetentnego szczepu ekspresyjnego E. coli w sposób podobny jak w przykładzie 15. Wszystkie

184 031 szczepy ekspresyjne E. coli traktowano w sposób podobny jak w przykładzie 15, w celu zbadania ekspresji klonowanego genu proHCPB. Jednakże, w tym przypadku nie można było zastosować przeciwciała monoklonalnego 9E10 swoistego wobec znacznika peptydowego c-myc w analizie Western błot, ponieważ sekwencja proHCPB nie miała znacznika na końcu C. Tak więc, jako przeciwciało pierwotne zastosowano przeciwciało przeciwko bydlęcej karboksyeeetydazie A, wywołane u królików (Biogenesis), które jak wcześniej wykazano reaguje krzyżowo z oczyszczoną trzustkową karboksypeptydazą B. Wtórnym przeciwciałem było przeciwciało przeciwko króliczym IgG znakowane peroksydazą chrzanową, wywołane u kóz (Sigma A0545 albo podobne).

Ekspresję klonowanej proHCPB w pICI266 (pICI1738) wykazano w E. coli przez barwienie żeli Coomassie wykazujące dodatkowy prążek białka wielkości około 40 kDa w porównaniu z klonami zawierającymi pusty wektor. Prążek o podobnej wielkości dawał sygnał w badaniu Western z użyciem przeciwciała przeciwko bydlęcej kαaboksyeeptydarie A.

Przykład odniesienia 19

Ekspresja proHCPB w komórkach COS

Gen ereproHCPB wytworzono przez PCR jak to opisano w przykładzie 17, stosując jako matrycę pICI1689 i oligonukleotydy o Identyfikatorach Sekw. Nr 34 i 40, otrzymując produkt PCR wielkości 1270 bp. Gen trawiono EcoRI i Hindlll i klonowano początkowo do eBluescrietKS+ (otrzymując pMF18) a następnie do pEE12 w DH5a (otrzymując pMF49) jak to opisano w przykładzie 17. Plazmid pEE12 transfekowano do komórek COS-7 stosując reagent Lipofectin jak to opisano w przykładzie 17 zaś nadsącza (250 pl) badano na aktywność HCPB wobec Hipp-Arg (test 5-godzinny), jak to opisano w przykładzie 11, po aktywacji trypsyną (700 pg/ml) w 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 150 mM NaCl w 4°C przez godzinę. W tych warunkach uzyskiwano całkowitą hydrolizę substratu Hipp-Arg, podczas gdy nadsącz z komórek COS, które traktowano samym reagentem Lipofectin (bez. plazmidowego DNA) i aktywowano trypsyną, hydrolizował 30% substratu Hipp-Arg.

Przykład odniesienia 20

Oczyszczanie natywnej HCPB

Układ przeznaczony jest do wstępnego oczyszczania natywnych i zmutowanych enzymów dwiema drogami. Korzystną drogę opisano najpierw.

Osad komórkowy rekombinowanych komórek E. coli zawierających rekombinowany enzym pobrano z miejsca przechowywania w -70°C i pozostawiono do rozmrożenia. Zmierzono ciężar osadu komórkowego w gramach i zawieszono osad w buforze A (200 mM Tris-HCI, 20% sacharozy, pH 8,0) w objętości równej początkowemu ciężarowi osadu komórkowego. Zawiesinę komórek inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 minut, mieszając co jakiś czas, po czym dodano równą objętość wody destylowanej i energicznie wymieszano. Zawiesinę komórek ponownie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 minut mieszając co jakiś czas. Powstały surowy produkt szoku osmotycznego sklarowano przez odwirowanie przy 98000 x g przez 90 minut w 4°C, po czym zebrano nadsącz znad nierozpuszczalnej frakcji osadu. Do nadsączu dodano dezoksyrybonukleazę 1, w stężeniu końcowym 0,1 mg/ml. Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej, ciągle mieszając, dopóki lepkość nie zmniejszyła się do stopnia umożliwiającego wprowadzenie nadsączu do kolumny z sefarozy aktywowanej CNBr z inhibitorem karboksypeptydazy, wytworzonej według instrukcji z sepharose 4B aktywowanej CNBr (Pharmacia) i inhibitora karboksypeptydazy z bulwy kartofla (C0279, Sigma). Nadsącz doprowadzono do pH 8,0 i wprowadzono do kolumny powinowactwa, zrównoważonej 10 mM Tris-HCI, 500 mM chlorkiem sodu pH 8,0. Po załadowaniu nadsączu, kolumnę płukano dopóki absorbancja płukanki nie powróciła do poziomu wyjściowego, po czym związany materiał eluowano z kolumny buforem do elucji (100 mM węglan sodu, 500 mM chlorek sodu pH 11,4). Eluowane frakcje zamrażano w -20°C o ile zawierały karboksypeetydazę co stwierdzano w badaniu Western biot stosując przeciwciała przeciwko znacznikowi c-myc (9E10), i koniugat peroksydazy chrzanowej z przeciwciałem przeciwmysim (A9044, Sigma) po reakcji barwnej z 4-chloronaftolem i nadtlenkiem wodoru.

Frakcje zawierające rekombinowaną karboksypeptydazę B połączono, stężono i doprowadzono pH do 7,5, po czym zamrożono i przechowywano w -20°C. Możliwe jest dalsze

184 031 oczyszczanie połączonych próbek, przy zastosowaniu znanych metod takich jak wymiana jonowa i chromatografia żelowa.

Druga droga obejmuje całkowitą lizę komórek E. coli poddanych szokowi periplazmatycznemu.

Do osadu rekombinowanych komórek E. coli zawierających rekombinowany enzym dodano bufor do lizy (50 mM Tris-HCl, 15% sacharoza, pH 8,0). Dodano lizozym w stężeniu 1 mg/ml i w tym samym stężeniu siarczan dodecylanu litu (LDS) (80 pl roztworu 25% na 25 ml zawiesiny). Zawiesinę inkubowano na lodzie przez 30 minut mieszając co jakiś czas, a następnie dodano dezoksyrybonukleazę 1 w stężeniu 1 mg/ml i ponownie inkubowano na lodzie przez 30 minut z wytrząsaniem co jakiś czas.

Nadsącz podzielono na objętości po 200 ml i sonikowano do całkowitego zniszczenia komórek 10x po 30 sekund z 30 sekundowymi odstępami. Sonikowaną zawiesinę odwirowano przy 98000x g przez 90 minut w 4°C po czym zebrano nadsącz znad osadu. Nadsącz doprowadzono do pH 8,0 i wprowadzono do kolumny powinowactwa, zrównoważonej 10 mM Tris-HCI, 500 mM chlorkiem sodu pH 8,0. Po załadowaniu nadsączu, kolumnę płukano dopóki absorbancja płukanki nie powróciła do poziomu wyjściowego, po czym związany materiał eluowano z kolumny buforem do elucji (100 mM węglan sodu, 500 mM chlorek sodu pH 11,4). Eluowane frakcje zamrażano w -20°C o ile zawierały karboksypeptydazę co stwierdzano w badaniu Western błot stosując przeciwciała przeciwko znacznikowi c-myc (9E10), i koniugat peroksydazy chrzanowej z przeciwciałem przeciw-mysim (A9044, Sigma) po reakcji barwnej z 4-chloro-naftolem i nadtlenkiem wodoru.

Frakcje zawierające rekombinowaną karboksypeptydazę B połączono, stężono i doprowadzono pH do 7,5, po czym zamrożono i przechowywano w -20°C. Możliwe jest dalsze oczyszczanie połączonych próbek, przy zastosowaniu znanych metod takich jak wymiana jonowa i chromatografia żelowa. Próbki z połączonych frakcji oczyszczanych obiema drogami analizowano przez SDS-PAGE, zaś barwione Coomassie membrany nitrocelulozowe z przeniesionymi białkami wykazały zabarwiony prążek o ciężarze cząsteczkowym właściwym dla karboksypeptydazy B. Prążki te sekwencjonowano na automatycznym sekwenatorze białek/peptydów stosując technikę degradacji Edmana, potwierdzając prawidłową sekwencję rekombinowanych karboksypeptydaz B.

Przykład odniesienia 21

Ekspresja mysiego białka fuzyjnego A5B7F(ab')2-HCPB w komórkach COS

Przykład niniejszy opisuje wytwarzanie cDNA z hybrydomy A5B7, izolację fragmentów swoistych dla łańcuchów Fd i L przez PCR, określanie kompletnej sekwencji DNA tych fragmentów i wytwarzanie genu fuzyjnego Fd-HCPB i ekspresję równoległą wektora zdolnego do wytwarzania łańcucha lekkiego i białka fuzyjnego Fd-HCPB w komórkach eukariotycznych, ekspresję A5B7F(ab')2-HCPB w komórkach COS przez ko-transfekcję sekwencją HCPB.

Procedurę opisaną w przykładzie 5 powtórzono do punktu (e). f) Wytwarzanie fuzyjnej sekwencji DNA Fd-HCPB

Gen kodujący koniec C sekwencji Fd, od miejsca Ncol w Identyfikatorze Sekw. Nr 25 (pozycja 497) połączono sekwencją HCPB przez PCR. W tym procesie wprowadzono DNA dla sekwencji łącznika 8-aminokwasowego (VPEVSSVF) Plazmid pAFI (opisany w przykładzie 5) poddano reakcji PCR (proces hot-start) jak to opisano w przykładzie 17, ze starterami o Identyfikatorach Sekw. Nr 42 i 43 otrzymując produkt PCR wielkości 338 bp. Podobnie pICI1698 poddano PCR ze starterami o Identyfikatorach Sekw. Nr 44 i 34 otrzymując produkt wielkości 998 bp. Oba produkty izolowano przez elektroforezę na żelu agarozowym Geneclean™ jak to opisano w przykładzie 17, po czym zastosowano (0,2 ng każdego w 50 pl całkowitej objętości) w drugiej PCR z 10 cyklami po 1 minutę w 94°C i 4 minuty w 63°C a następnie 2 minuty w 94°C. Startery flankujące (Identyfikator Sekw. Nr 42 i 34; każdy 100 pM) dodano w 50 pl buforu z AmpliTaq (2,5 jednostki). Po ogrzaniu do 94°C przez 3 minuty mieszaninę poddano 25 cyklom po 1,5 minuty w 94°C, 2 minuty w 55°C i 2 minuty w 72°C, a następnie 10 minut w 72°C. Produkt wielkości 1336 bp izolowano jak to opisano wcześniej, cięto EcoRI i Hindlll i klonowano do pBluescript™

184 031 w DH5a (klony przesiewano PCR ze starterami o Identyfikatorach Sekw. Nr 36 i 37) otrzymując pMF35. W celu wytworzenia kompletnej sekwencji fuzyjnej Fd-HCPB, plazmidy pAFI i pMF35 cięto (10 pg każdego) Ncol i EcoRI przez 2 godziny w buforze (100 μΐ) zawierającym 50 mM octan potasu, 20 mM octan Tris (pH 7,9), 10 mM MgC12, 1 mM DTT, EcoRI (40 jednostek) i Ncol .(20 jednostek). Fragment wektora (3,4 kb) z pAFI wyizolowano i traktowano cielęcą jelitową fosfatazą alkalicznąjak to opisano w przykładzie 17, po czym poddano ligacji z oczyszczonym fragmentem 1,2 kb z pMF35. Powstały wektor klonowano w DH2(a (przesiewano PCR ze starterami o Identyfikatorze Sekw·: Nr 36 i 37, w poszukiwaniu wstawki 1,922 bp) i nazwano pMF39. Fragment EcoRI-HindlU z pMF39 klonowano do pEE6 (pochodna pEE6.hCMV - Stephens i Cockett (1989) Nuci. Acids. Res. 17, 7110 - w której miejsce HindUI powyżej promotora hCMV przerobiono na miejsce Bglll) w DH5a (przesiewano PCR ze starterami o Identyfikatorze Sekw. Nr 39 i 38, w poszukiwaniu wstawki 2,200 bp) otrzymując pMF43.

W celu wytworzenia wektora ko-ekspresyjnego, pMF43 (10 μ g) cięto Bglll (20 jednostek) i Sali (40 jednostek) w buforze (100 μΐ) zawierającym 50 mM octan potasu, 20 mM octan Tris (pH 7,9), 10 mM MgCh, 1 mM DTT i BSA (100 pg/ml) i izolowano fragment 4348 bp przez elektroforezę na żelu agarozowym i GeneClean™ jak to opisano uprzednio. Podobnie, pAF6(opisany we) w przykładzie 5) cięto BamHI (40 jednostek) i Sali (40 jednostek) i izolowano fragment wektora wielkości 7,8 kb i ligowano z fragmentem Bglll-Sall z pMF43 i klonowano w DH5a. Kolonie przesiewano PCR z dwoma zestawami starterów (Identyfikator Sekw. Nr 18 i 45, i Identyfikator Sekw. Nr 17 i 39). Kolonie dające produkty PCR odpowiednio wielkości 309 bp i 1,3 bp charakteryzowano sekwencjonując DNA. Klon o poprawnej sekwencji nazwano pMF53 - wektor ko-ekspresyjny łańcucha lekkiego/FdHCPB w DH5a.

g) Ekspresja A5B7F (ab')2-HCPB w komórkach COS Powtórzono procedurę opisaną w przykładzie 17 dla kotransfekcji komórek COS plazmidem kodującym sekwencję prepro (pMF67) zastępując pMF48 przez pMF53. Nadsącz komórek COS badano na aktywność HCPB jak to opisano w przykładzie 11 i 17. Nadsącz komórek COS traktowanych reagentem Lipofectin, ale bez DNA, hydrolizował 1,2% substratu, podczas gdy nadsącz komórek COS transfekowanych mieszaniną plazmidów ekspresjonująćych łańcuch lekki/Fd-HCBP i sekwencję prepro hydrolizował 34% substrat Hipp-Arg. Komórki COS transfekowane tylko pMF53 hydrolizowały Hipp-Arg tak samo jak komórki COS traktowane samym reagentem Lipofectin. W analizie Western biot (patrz wyżej, h)) widoczne były prążki wielkości około 80 kDa i 160 kDa, odpowiadające odpowiednio fragmentom Fab'-HCPB i F(ab')2-(HCPB)2. W teście ELISA CEA (patrz i i j poniżej ) zastosowano nadsącza (patrz wyżej) w celu wykrycia obecności materiału wiążącego CEA według protokołu podanego w J).

h) Analiza Western biot

Porcje (20 μΐ) każdego z nadsączy zmieszano z równą objętością buforu do próbek (62,5 mM Tris, pH 6,8, 1% SDS, 10% sacharoza i 0,05% błękit bromofenolowy) z lub bez substancji redukującej (50 mM DTT). Próbki inkubowano w 100°C przez 15 minut, po czym poddano elektroforezie na żelu o gradiencie 8-18% akrylamidu (Excel™, Pharmacia Biotechnology Products) w aparacie Multiphor™II (LKB Produkter AB) według instrukcji producenta. Po elektroforezie, rozdzielone białka przeniesiono na membranę Hybond C-Super™ (Amersham International) stosując aparat Navablot™ (LKB) według protokołu dostarczonego przez producenta. Po przeniesieniu, membrany wysuszono na powietrzu.

Obecność fragmentów przeciwciał badano stosując koniugat przeciwciała przeciwko mysim F(ab')2 z peroksydazą (ICN Bio-medicals, nr kat. 67-430-1). Jakkolwiek, przeciwciało to wywołano przeciwko mysim F(ab')2, wykazano, że wiąże się ono przede wszystkim z łańcuchem k. Obecność fragmentów przeciwciała A5B7 obrazowano stosując układ wykrywający ECL (Amersham) według dostarczonego protokołu. Wykazano, że około 90% materiału obecnego w nadsączu komórek stanowi białko F(ab')2.

i) Analiza metodą ELISA

Standardowe procedury testu ELISA są dostępne w Laboratory Technigues in Biochemistry and Molecular Biology wyd. Burdon i van Kippenberg, tom 15 Practice and Theory

184 031 of Enzyme Immunoassays, Tijssen P., 1985, Elsner Science Publishers B.V. Inne źródło informacji stanowi AatibnOirs - A Laboratory Manual, Hartowi Lane, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory. Na0sąozj komórkowe (patrz wyżej) zastosowano do wykrywania obecności materiału wiążącego CEA w oparciu o poniższy protokół:

j) ELISAna CEA

1. Przygotować bufor do opła-szczania (1 kapsułka buforu węglaanwn-Owuwęglaanwego - Sigma rn kat. C 3041 - w 100 ml wody destylowanej).

2. Dodać 5 ml roztworu wyjściowego CEA (0,2 mg/ml, Dako) do 10 ml buforu do opłas/czania na każdą płytkę 96-studzlraknwą.

3. Dodać 100 ml rnzolrńcznnrgn CEA do każdej ze studzienek płytki do mikaomiareozknwaara Nunc Maxisoap™.

4. Inkubować płytki w 4°C przez noc^ temp. pokojowej przez 2 godziny).

5. Płukać płytki 4-krntaie po 5 minut w roztworze soli buforowanym fosforanem z dodatkiem 0,01% azydku sodu (PBSA).

6. Zablokować płytki (po nSaząśnlęolu do sucha) 1% BSA (Sigma A 7888) w PBSA po 150 ml na studzienkę.

7. Płukać płytki 4-krotnie po 5 minut w PBSA.

8. Wprowadzić próbki (na0sąoza hodowlane) i standard (dwukrotne rnzoirńo/raia ppnSenlityozaegn fragmentu F (ab')2)Próbki w pożywce hodowlanej (albo PBS).

Dołączyć PBSA +1% BSA oraz sam rn/oirńozalalk jako kontrolę negatywną.

9. Inkubować przez noc w 4°C.

10. Płukać płytki 6-krntnlr po 5 minut w PBSA + 0,5% Twem 20.

11. Przygotować roztwór przroiwolała wtórnego (kozie przeciwciała przeciwko mysim IgG F(ab')2 sprzęgnięte z prrnksydazą - ICN 67-430-1 - w ilości 20 ml w 40 ml PBSA + 1% BSA + 0,5% Tween 20) i dodać po 100 ml na studzienkę.

12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.

13. Płukać płytki ó-krotnie po 5 minut w PBSA + 0,5% Tween 20.

14. Przygotować roztwór do wywoływania przez rnzpuszozrale 1 kapsułki buforu fosforan-bnran cytrynianowy (Sigma P 4922) w 100 ml wody bidestytowanej. Dodać 30 mg diohlnrnwo0nrku nfeaylean0iamiay (OPD, Sigma P8287) na ml buforu. Dodać po 100 pl na studzienkę.

15. Inkubować w oiemanśoi w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

16. Zatrzymać reakcję przez dodanie do każdej studzienki po 50 ml 2 M kwasu siarkowego.

17. Odczytać OD przy 490 nm w czytniku płytek.

Przykład 1

Wytwarzanie bydlęcej rybnauklrjzy trzustkowej Lys66Glu (a) Konstruowanie sekwencji genu RNazy zawierającej zastąpienie w kodon^ 66 (Lys-»Glu) drogą ^kombinacyjnej cyklicznej reakcji łańcuchowej polimerazy (RCPCR) Plazmid zawierający sekwencję prękodującą bydlęcą RNazę trzustkową (pQR162; NCIMB nr 40678, opisana przez TarragnaaFiol i in., Gene (1992) 118:239) zastosowano jako matrycę do inkubacji PCR. Startery wytwnr/nan metodą triestrów-fosfitu z użyciem f’nsfnramidaaów cyjanoetylu w urządzeniu do syntezy DNA Cyclone™ (Milligea/Millipnrr). Startery zaprojektowano w taki sposób, że po zastosowaniu w inkubacji PCR wytworzony produkt był 0wunioinwą, liniową cząsteczką DNA która po kombinacji, deaaturaoji i aeligacji tworzyły 0wunioinwy DNA o ciągłych, lepkich jednnnicinwyoh końcach oprócz oryginalnych tempo zakończonych produktów. Końce te łączyły się ze sobą twnaząo koliste cząsteczki DNA. Cząsteczki te są gotowe do transformacji do kompetentnych komórek E. coli.

Przeprnwadznan dwie inkubacje PCR, jedną z nlignnuklentyOami o Identyfikatorach Sekw. Nr 1 i 2 (patrz, startery A i B fig. 8) i dwoma nlignnuklenSyOami o Identyfikatorach Sekw. Nr 3 i 4 (patrz, startery C i D, fig. 8), po 25-30 cykli po 1,5 minuty w 92°C, 1,5 minuty w 55°C i 6 minut w 75°C, z końcową inkubacją 10 minut w 75°C w urządzeniu Techne PHC-1. Reakcja zawierała pQR162 jako matrycę (10 ng), 50 pmol starterów, 5 pl 10 x buforu (200 mM Tris-HCI (pH 8,2), 100 mM KC1, 60 mM (NH^fiSOt, 20 mM MgCh, 1% Taitna X-100

184 031 i 100 (pg/ml BSA) i 2,5 jednostki polimerazy pfu w objętości 50 pl pokrytych olejem parafinowym.

Produkty PCR analizowano na 1% żelu agarozowym. Fragment DNA wytworzony w każdej z reakcji PCR (około 3,1 kb) pobrano z żelu i oddzielono od agarozy przez odwirowanie (SpinX™, Co-star). Dwa ekstrahowane fragmenty precypitowano etanolem i zawieszono w 20 pl wody. Porcje z każdej (10 pl) połączono w objętości 50 pl zawierających 10 mM Tris-HCI pH 8,8, 10 mM NaCl i 1 mM Na2EDTA. Połączone fragmenty DNA denaturowano przez 5 minut w 92°C i poddano anilingowi przez 2 godziny w 55-57°C. Rekombinowane koła zastosowano do transformowania porcji komórek kompetentnych.

Preparaty plazmidów wykonano jak to opisano (Maniatis i in., wyżej) i zastosowano jako matryce do sekwencjonowania dwuniciowego DNA stosując metodę przerywania łańcuchów didezoksy nukleotydami (Sanger i in., wyżej). Plazmid zawierający zmienioną sekwencję kodującą bez błędów oznaczono pQR176. Trawiono go w objętości 20 pl zawierających 20 U EcoRI i bufor reakcyjny. Fragment DNA posiadający zmienioną sekwencję kodującą uzyskano z żelu agarozowego jak to opisano wyżej i ligowano do trawionego i defosforylowanego pKK223.3 (Pharmacia Biotech, wektor zawierał promotor tac, regulowany przez represor lac, i indukowany przez IPTG; Brosius i Holy, PnAs USA (1984) 81:6929) w objętości końcowej 20 pl zawierającej 20 U polimerazy DNA T4 i bufor reakcyjny. Ligowane produkty zastosowano do transformowania porcji E. coli. Analiza restrykcyjna plazmidu uzyskanego z różnych kolonii rekombinowanych została przeprowadzona w celu potwierdzenia wielkości i orientacji wstawki w odniesieniu do promotora tac. Prawidłowy konstrukt nazwano pQR177 (fig. 1).

(b) Wytwarzanie i oczyszczanie bydlęcej RNazy trzustkowej Lys66Glu

Strategia wytwarzania i oczyszczania sekwencji rekombinowanej oparta była na protokole opracowanym dla ekspresji bydlęcej RNazy A w E. coli (Tarragona-Fiol i in., Gene 1992). Układ wykorzystywał naturalne sekwencje sygnałowe bydlęcej RNazy trzustkowej do kierowania produkcji rybonukleazy albo jej rekombinowanych mutantów do periplazmy. Oksydatywne warunki peryplazmy ułatwiają prawidłowe fałdowanie białka powodując ekspresję w pełni czynnej rekombinowanej RNazy. Wysoki ładunek dodatni netto rekombinowanych albo przekonstruowanych mutantów ułatwia szybkie oczyszczanie z białek endogennych przestrzeni peryplazmatycznej. Ekspresja i oczyszczanie do homogenności zmutowanych białek ma miejsce w 48 godzinnej inokulacji pożywki. Plazmid pQR177 zawierał dwa miejsca wiążące rybosom (RBS) jedno dostarczone z promotorem tac i drugie do translacji drugiego cistronu, zawarte w sekwencji cistronu. mRNA-wytworzony po indukcji IPTG E. coli niosących pQR177 jest bicistronowy i rozpoczyna się od promotora tac. Pierwszy cistron koduje peptyd 6-aminokwasowy (Met-Phe-Leu-Glu-Asp-Asp). Kodon stop pierwszego cistronu i kodon start drugiego cistronu nakładają się w taki sposób, że rybosomy kontynuują translację mRNA i wytwarzają pre-RNazę. Syntetyzowany prekursor RNazy jest przenoszony do peryplazmy i jak wykazało sekwencjonowanie końca N, sekwencja sygnałowa jest odcinana prawidłowo. Oksydatywne warunki periplazmy ułatwiają prawidłowe fałdowanie białka powodując ekspresję w pełni czynnej rekombinowanej RNazy. Komórki E. coli (pQR177) hodowano w 5 litrach pożywki zawierającej 100 pg/ml Ap przez 8 godzin w 28°C. Gdy komórki osiągnęły wykładniczą fazę wzrostu, dodano IPTG w stężeniu końcowym równym 0,5 mM i prowadzono hodowlę komórek w 28°C z wytrząsaniem. Uwolnienie białek periplazmatycznych przeprowadzono stosując zmodyfikowaną metodę szoku osmotycznego. Komórki z hodowli całonocnej (5 litrów) zebrano przez odwirowanie w 8300 x g przez 10 minut, w 10°C. Osad komórek zawieszono w 60 ml 200 mM Tris-HCI pH 7,5/20% sacharozy/l mM Na2EDTA. Zawiesinę pozostawiono przez 30 minut w temp. pokojowej. Szok osmotyczny wywołano przez dodanie równej objętości sterylnej wody i energiczne mieszanie. Mieszaninę pozostawiono na dalsze 30 minut w temp. pokojowej. Sferoplasty zebrano przez odwirowanie przy 10000 x g przez 90 minut w 10°C.

Chromatografię kationowymienną (S-Sepharose™FF) zastosowano w celu uzyskania wszystkich dodatnio naładowanych białek z ekstraktu peryplazmatycznego. Bufor A miał skład: 50 mM MES, pH 6,5, zaś bufor B: 50 mM MES, 1 M NaCl, pH 6,5. Rekombinowaną

184 031

RNazę oczyszczano z pul naładowanych dodatnio białek, przez chromatografię kationowymienną (Mono-S™, Pharmacia LKB) na gradiencie 17,5 mM NaCl/min. Ocena czystości rekombinowanej RNazy przez SDS-PAGE i barwienie srebrem wykazała, że ta kombinacja technik powoduje oczyszczenie białka do homogenności (fig. 2). Aktywność RNazy rekombinowanego enzymu oceniona została na podstawie - hydrolizy cytydylo-3'5'-adenozyny (CpA) i cytydynylo-2'3'-mono fosforanu cyklicznego (C > p) i wykazała identyczną, aktywność co enzym dostępny w handlu (patrz, tabela). Stężenie białka oznaczono przez pomiar OD przy 278 nm (OD278nm = 0,71 jest równoważne z 1 mg/ml RNazy). Pomiar kinetyczny przeprowadzono przez monitorowanie zwiększania (hydroliza C > p) absorbancji w czasie przy 286 nm (Witzel i Barnard 91962) Biochem. Biphys. Res. Commun., 7, 295-299). Początkowa, szybkość i stężenie substratów zastosowano do oznaczenia parametrów Km i kcat i ich odchyleń standardowych metodą komputerową w oparciu o analizę opisaną przez Wilkinsona (1961) Bioche. J., 80:324-332. Różnice pomiędzy tymi parametrami uzyskanymi dla różnych rybonukleaz oceniano stosując test t-Studenta. Tempo hydrolizy C > p mierzono w temperaturze pokojowej w kuwetach o długości 0,1 cm (Hellma) w objętości całkowitej 250 pl. Reakcje zawierały różne stężenia C > p w 0,1 M Tris pH 7,0, 50 mM NaCl (I = 0,1) i rozpoczęto je przez dodanie enzymu (patrz tabela). Dane wskazują, że właściwości kinetyczne rekombinowanej RNazy Lys66Glu nie różnią się istotnie od dostępnego w handlu enzymu bydlęcego.

Tabela kcat/Km (mM’¹ s'¹)

BP-RNaza 3,4 (0,9)

Lys66Glu BP-RNaza 4,“7 (0,1)

Przykład 2

Wytwarzanie Arg4Ala,Lys66Glu ludzkiej rybonukleazy trzustkowej

Plazmid pATF3 (opisany w przykładzie 2, zawierający gen Arg4Ala,Lys66Glu ludzkiej rybonukleazy trzustkowej) został zastosowany jako matryca (2 ng) w inkubacji PCR zawierającej startery o Identyfikatorze Sekw. Nr 15 i 16 (po 5 pmol każdego), nukleotydy (0,2 mM), bufor PCR i 2,5 jednostki polimerazy pfu. Po 5 minutach wstępnej denaturacji w 92°C, przeprowadzono 30 cykli denaturacji (92°C, 1 min.), annilingu (55°C, 1 min.) i wydłużania (75°C, 1 min.). Fragment PCR ekstrahowano z żelu jak to opisano w przykładzie 1, i trawiono EcoRI (10-15 jednostek^ 37°C przez godzinę. Po inaktywacji enzymu ciepłem, fragment EcoRI ligowano do trawionego EcoRI i defosforylowanego pUC18. Powstały plazmid nazwano pATFZl. Plazmid ten zastosowano do potwierdzenia sekwencji DNA zmutowanego genu HP-RNazy.

W celu wytworzenia Arg4Ala,Lys66Glu HP-RNazy, zastosowano pATFZl jako matryce w inkubacjach RCPCR jak to opisano w przykładzie 1, ale ze starterami o Identyfikatorze Sekw. Nr od 30 do 33, zastępując Identyfikator Sekw. Nr 1 do 4). Powstały plazmid nazwano pATFZ3. Gen dla Arg4Ala,Lys66Glu HP-RNazy wycięto z pATFZ3 przez trawienie EcoRI i Ncol (10-15 jednostek każdego) i ligowano do uprzednio trawionego (EcoRI i Ncol) i defosforylowanego pICI266 (NCIMB 40589) w celu zbadania ekspresji. Ligacje, ekspresję i oczyszczanie przeprowadzono jak w przykładzie 1, z takim wyjątkiem, że zastosowano podwójne trawienie wobec wyciętego fragmentu z pAT-FZ3, jak to opisano wyżej, i ligowano do uprzednio trawionego (EcoRI i Ncol) i defosforylowanego pICI266 oraz indukcję przeprowadzano przy użyciu 1% arabinozy (zamiast IPTG). Powstały konstrukt nazwano pATFZ44 (patrz. fig. 5). Ekspresja i oczyszczanie zmutowanego enzymu zostały opisane w przykładzie 1, ale z użyciem 1% arabinozy zamiast IPTG.

Przykład 3

Wytwarzanie 5-(2,4-diokso-1,2,3,4-tetrahydro-pirymidyn-1-ylo)-4-hydroksy-2,3,4,5-tetrahydrofuran-3-ylo)]-Q-[4--bis[2-chloroetylo] amino)fenoksy]wodorofosforanu Q-[(2R,3S,5R)-2-(2-aminoacetamidometylu) (który przedstawiono jako produkt końcowy na fig. 7)

184 031

Związek 4 (fig. 7; 31 mg, 0,034 mM) rozpuszczono w 0,01 M. HC1 w N.N-dimetyloformamidzie (DMF) i dodano 30% palladu na węglu jako katalizatora (60 mg) w postaci zawiesiny w di-metyloformamidzie. Mieszaninę mieszano w atmosferze wodoru przez 2 godziny i 45 minut. Po przesączeniu przez Celit™ przesącz odparowano do suchości w temperaturze < 30°C. Surowy produkt zawieszono w suchym dichlorometanie i mieszaninę odwirowano. Supematant z warstwy dichlorometanu odrzucono. Czynność tę powtórzono i otrzymaną stałą substancję wysuszono, uzyskując 9,4 mg żądanego produktu (związek 5, fig. 7).

Dane NMR DMSO d6, d4, octowy (8) 3,3 (1H, m); 3,5 (3H, m); 3,62 (8H, s); 4,05 (1H, m); 4,25 (1H m); 4,53 (1H, m); 5,62 (1H, d); 5,72 (1H, d); 6,63 (2H, d); 7,05 (2H, d); 7,63 (1H, d).

Związek 4 wytworzono następującym sposobem.

2'-O-benzyls-5'-bromo-5'-desksyιlrydyna (związek 1. fig. 7)

Do mieszaniny 2'-O-benzyk>urydyny [Wagner i in., J. Org. Chem. 39, 24-30] (334 mg, 1 mM), tetrabromku węgla (500 mg) i DMF (4 ml) w temperaturze 20°C i pod argonem w ciągu 5 minut dodano roztworu trifenylofsu0my (340 mg) w DMF (2 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze 20°C przez 2 godziny, przelano do wody (60 ml) i ekstrahowano dwa razy octanem etylu. Połączone ekstrakty organiczne przemyto wodą, wysuszono i odparowano do oleju. Olej ten poddano chromatografu na 20 g żelu krzemionkowego Merck (Art. 9385). Po eluowaniu 5% metanolem w toluenie uzyskano 2'-O-benzylo-5'-brsmo-5'-desksyurydynę (160 mg, 40%).

NMR (DMSO d6) (δ) 11,4 (slH); 7,6 (d1H); 7,3(m5H); 5,95 (d1H); 5,6 (dd1H);

4,6 (q2H); 4,0-4,2 (m3H); 3,6-3,8 (m2H).

5'-azydo-2'-Q'-benzylo-5'-deoksyurydyna (związek 2, fig. 7)

2'-O-benzyls-5'-bromo-5'-deoksyurydyne (4,3 g) rozpuszczono w DMF (86 ml) i dodano azydku sodu (7 g). Mieszaninę mieszano i ogrzewano w temperaturze 60°C przez 45 minut. Po oziębieniu i zdekantowaniu nieprzereagowanego azydku sodu DMF odparowano do suchości. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto dwukrotnie wodą, wysuszono i odparowano do suchości. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym Merck (Art. 9385). Po eluowaniu 10% metanolem w toluenie uzyskano 1,5 g czystej 5'-azydo-2'-O-benzyls-5'-deoksyurydyny.

NMR (DMSO d6) (8) 11,4 (s1H); 7,6 (d1H); 7,3(m5H); 5,9 (d1H); 5,4 (d1H); 4,65 (q2H); 3,9-4,2 (m3H); 3,6 (d2H). 2'-O-benzyls-5'-karbobenzoksyglicyloamino-5'-deoksyurydyna (związek 3, fig. 7)

Do mieszaniny 5'-azydo-2'-O-benzyls-5'-deoksyurydyny (1,5 g), tetrahydrofuranu (25 ml) i estru N-hydroksybursztynowego benzyloksykarbonyloglicyny. (1,3 g) dodano 10% platyny na węglu (50% zwilżony wodą) (1,5 g). Mieszaninę mieszano w atmosferze wodoru przez 4 godziny. Po przesączeniu przez Celite™ przesącz odparowano do suchości. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto 5% roztworem kwasu cytrynowego (2 x), wodą, roztworem wodorowęglanu sodu (x 2), wysuszono i odparowano do suchości. Pozostałość roztarto z mieszaniną eter/octan etylu 1:1 i otrzymano substancję stałą (960 mg) (42%).

NMR (DMSO d6) 8 11,3 (s1H); 8,0 (t, 1H); 7,6 (d1H); 7,4 (mlOH); 5,9 (d1H); 5,6 (d1H); 5,4 (d1H); 5,0 (s2H); 4,6 (q, 2H); 4,0 (m2H); 3,9 (m1H); 3,6 (d2H); 3,5 (m2H).

Wytwarzanie związku 4 (fig. 7)

a) BenzyloksydichlorofssOmę [Scott i in., (1990), J. Org. Chem. 55, 4904-4911] (135 mg, 0,64 mM) rozpuszczono w suchym dichlorometanie (4,0 ml), roztwór oziębiono do -20°C i dodano mieszaninę diizopropyloaminy (0,091 ml, 0,64 mM) i diizopropyloetyloaminy (0,11 ml, 0,64 mM) rozpuszczoną w suchym dichlorometanie (2,0 ml). Roztwór mieszano w -20°C przez 45 minut, a następnie pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej w ciągu 30 minut, po czym mieszano w temperaturze pokojowej jeszcze przez 30 minut. Następnie roztwór ten wkroplono do roztworu 2'-0-benzylo-5'-karbobenzskuygli-cyloamino-5'-desksyurydyny (280 mg, 0,53 mM) i diizopropyloetyloaminy (0,336 ml, 2,14 mM) w dichlorometanie (3,0 ml) i oziębiono do 0°C. Roztwór mieszano przez 10 minut w temperaturze 0°C i w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono następnie dichlorometanem, przemyto nasyconym roztworem

184 031 wodorowęglanu sodu (2 x) i odparowano do oleju. Olej poddano destylacji αzeotaoeowęj z toluenem (2 x) i stosowano bezpośrednio w następnej reakcji.

b) Surowy produkt z poprzedniego etapu rozpuszczono w suchym dichlorometanie (2,5 ml) i dodano roztworu 4-N,N-bls-(2-chloroetylo)rmlnofenolu (125 mg, 0,534 mM) w suchym dichlorometanie (3,0 ml). Następnie dodano roztworu 0,46 M tetrazolu w suchym rcetonltaylu (3,2 ml) i roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Dodano 70% roztworu wodoronadtlenku t-butylu w wodzie (0,11 ml, 0,801 mM) roztwór mieszano jeszcze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono dichlorometanem i przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (1 x), rozcieńczonym roztworem wodoroslracrynu sodu (1 x), nasyconym roztworem chlorku sodu (1 x), wysuszono i odparowano do suchości. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym Merck (Art. 9385), eluując 2% metanolem w dichlorometanie, a następnie 3,5% metanolem w dichlorometanie. Otrzymano 118 mg czystego produktu.

Dane NMR DMSO d6 (8) mieszanina dirstereoizomerów 3,37 1H (m); 3,42 (d); 3,67 H (d); 4,12 1H (m); 4,33 (m); 4,56 2H (m); 5,0 (s); 5,14 3H (m); 5,59 1H (d); 5,91 1H (d); 6,64 2H (dd); 7,05 2H (t); 7,28 15H (m); 7,45 1H (t); 7,62 1H (dd); 8,13 1H (brs); 11,35 1H (s).

Przykład 4

Synteza i izolacja koniugatu mysiego A5B7 F(ab')2-Lys66Glu bydlęcej rybonukleazy trzustkowej.

Procedura opisana w przykładzie 4 została powtórzona, ale z zastąpieniem bydlęcej rybonukleazy trzustkowej przez Lys66Glu bydlęcą rybonukleazą trzustkową.

Przykład 5

Synteza i izolacja koniugatu mysiego A5B7 F(rb')2-Arg4Alr, Lys6Ala, Lys66Glu ludzkiej aybonuklerry trzustkowej. Procedura opisana w przykładzie 4 została powtórzona, ale z zastąpieniem bydlęcej rybonukleazy trzustkowej przez Arg4Ala, Lys6Ala, Lys66Glu ludzką aybonuklerrę trzustkową (opisane w przykładzie 2).

Przykład 6

Synteza i izolacja koniugatu humanizowanego A5B7 F(ab')2-Ag4Ala, Lys6Ala, Lys66Glu ludzkiej rybonukleazy trzustkowej. Procedurę opisaną w przykładzie 5 powtórzono ale zastępując mysi Ftyb^ przez humanizowany F(ab')₂. Humanizowany F(ab')2 wytworzono w następujący sposób. Procedura z przykładu 5 została powtórzona od etapu f) ale mysie sekwencje dla Fd i łańcucha lekkiego, pokazane odpowiednio, na Identyfikatorze Sekw. Nr 25 i 26, zostały zastąpione przez sekwencje humanizowane pokazane, odpowiednio, na Identyfikatorze Sekw. Nr 28 i 29.

Sekwencje humanizowane pokazane w Identyfikatorze Sekw. Nr 28 i 29 mogą być wytworzone różnymi sposobami, w tym opisanymi przez Edwardsa (1987) Am. Biotech. Lab., 5; 38-44; Jayaarmrn i in., (1991) pNaS USA 88:4084-4088, Foguet i Lubbert (1992) Biotechnigues 13:674-675 i Pierce (1994) Biotechniques 16:708.

Przykład 7

Cytotoksyczność in vitro proleku opartego na uracylu według przykładu 3, odpowiedniego leku i proleku ze zmutowanym enzymem Arg4Ala, Lys6Ala, Lys66Glu ludzkiej rybonuklerzy trzustkowej 9HP-PNrry)

Różnicująca cytotoksyczność wobec komórek nowotworowych proleku RNazy i odpowiedniego leku wykazana została w poniższy sposób. Komórki raka okrężnicy i odbytu LoVo inkubowano z prolekiem i odpowiednim lekiem w zakresie stężeń końcowych od 5x10- do 5x10’⁸ M w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania (2500 komórek/studzienkę) przez godzinę w 37°G. Komórki następnie płukano i inkubowano przez dalsze 3 dni w 37°C. Następnie do studzienek dodawano TCA i po odpukaniu martwych komórek badano ilość białka komórkowego przylegającego do płytek przez dodanie barwnika SRB jak to opisano przez P. Skekana i in., J. Natl. Canc. Inst., 82, 1107 (1990). Siłę związku oceniano przez stężenie niezbędne do rrhrmowanir wzrostu komórek w 50% (IC50).

Po traktowaniu lekiem komórek LoVo obserwowano IC50 rzędu 1 pM. W przeciwieństwie do powyższego, prolek był znacznie mniej cytotoksyczny, IC50 rzędu 30 pM (fig. 6).

184 031

Tak wiec, prolek RNazy jest około 30-razy mniej cytotoksyczny dla komórek nowotworowych niż lek wytworzony przez cięcie zmutowaną RNazą.

Jeżeli do studzienek zawierających prolek dodano wolnej Arg4Ala, Lys6Ala, Lys66Glu HP-RNazy (10 p g enzymu) albo koniugatu A5B7 F (ab')2-Arg4Ala, Lys6Ala, Lys66Glu-HPRNazy (10 pg enzymu) obserwowano cytotoksyczność porównywalna z lekiem czynnym, wykazując w ten sposób konwersję proleku przez zmutowany enzym z uwolnieniem silniejszego leku.

Badania te wykazały aktywność koniugatu zmutowanej HP-RNazy konwertującą względnie nieaktywny prolek w cytotoksyczny lek zdolny do niszczenia komórek nowotworowych w układzie ADEPT.

Przykład 8

Aktywność przeciwnowotworowa proleku RNazy i koniugatu przeciwciała-zmutowanej RNazy u myszy z przeszczepami ksenogenicznymi

Aktywność przeciwnowotworową proleku RNazy i koniugatu Arg4Ala, Lys6Ala, Lys66Glu-HP-RNazy (albo Lys66Glu bydlęcej trzustkowej RNazy) może być wykazana w poniższym modelu. Komórki LoVo (10⁷) wstrzykiwano podskórnie myszom bezgrasiczym. Gdy guzy osiągnęły wielkość 4-5 mmi średnicy, podawano koniugat i.v. w dawkach pomiędzy 10 i 100 mg/kg. Po lokalizacji koniugatu w guzach i odczekaniu odpowiedniego czasu dla zniknięcia koniugatu z krążenia i normalnych tkanek (1-4 dni) podawano myszom prolek, i.v. albo i.p. w dawkach pomiędzy 100 i 1000 mg/kg. Kombinacja koniugatu i proleku powodowała znacznie wolniejszy wzrost guzów w porównaniu z nie leczonymi myszami kontrolnymi albo guzami leczonymi samą dawką koniugatu albo samego proleku. Badania te wykazały, że koniugat Arg4Ala, Lys6Ala, Lys66Glu-HP-RNazy w kombinacji z prolekiem wykazuje działanie przeciwnowotworowe.

Przykład 9

Dawkowanie kliniczne dla pacjentów

Najskuteczniejsza droga podawania i schemat dawkowani koniugatu i proleków według wynalazku w leczeniu nowotworów zależy od wielu czynników takich jak ciężkość choroby, stan zdrowia pacjenta, i odpowiedź na leczenie oraz ocena lekarza prowadzącego. Nawiązując, dawkowanie koniugatu i proleku powinno być dobrane indywidualnie dla pacjenta. Jednakże, skuteczna dawka koniugatu wydaje się zawierać w zakresie od 20 do około 200 mg/m2. Skuteczna dawka proleku zależy od konkretnego leku i toksyczności leku macierzystego. Ponieważ prolek jest mniej cytotoksyczny niż lek macierzysty MTD leku macierzystego powinno stanowić punkt wyjścia. Dla proleków fenolowo iperytowych dla których nie są dostępne dane kliniczne, zakres dawek leczniczych jest mniej pewny i powinien być określony w standardowych badaniach toksykologicznych na zwierzętach i badaniach na ludziach począwszy od niskich dawek. Jednakże, dawka lecznicza może być w zakresie 500-2000 mg/m .

Przykład 10

Kinetyka enzymatyczna proleków opartych na uracylu według przykładu 3 (prolek RNazy) w stosunku do natywnej i zmutowanej Lys66Glu bydlęcej RNazy trzustkowej.

Absorbancje proleku RNazy i odpowiedniego leku fenolowo iperytowego badano w zakresie 200-350 nm stosując spektrofotometr (Perkin Elmer lambda2) i wybrano długość fali gdzie różnica absorbancji (spowodowana cięciem wiązania fosforanowego) pomiędzy prolekiem i lekiem była największa. Była to absorbancja przy 256 nm. km i Vmax określono przez pomiar początkowego tempa konwersji proleku do leku przy tej długości fali stosując zakres stężeń proleku (0,2-2 mM) i enzymu RNazy (5-80 pg/ml). Pomiar przeprowadzano przy 37°C w 0,025 M Tris-HCI z dodatkiem 0,01% Brij-35 pH 7,5 w kuwetach długości 0,1 cm (Hellma) w objętości końcowej 250 pL. Kcat wyliczono z Vmax przez podzielenie ilości Rnazy w mieszaninie reakcyjnej. Aktywność enzymatyczna obu enzymów wobec standardowego substratu cytydynylo-2'3'monofosforanu cyklicznego (C > p) zmierzono przez określenie zmian absorbancji przy 284 nm stosując zakres stężeń C > p (), 5-6 mM) i enzymu Rnazy (5-35 p g/ml). Wyniki przedstawiono poniżej.

Kinetyka enzymatyczna Kcat/Km dla proleku RNazy i C > p z natywną i zmutowaną bydlęcą RNazą Lys66Glu

184 031

Substrat BP-Rnaza Lys66Glu BP-RNaza (kcat/Km mM^q s-)

Prolek RNazy (przykładzie 3) 0,37 18

C >p 3,0 3,0

Wyniki pokazują, że zarówno natywna jak i zmutowana bydlęca RNaza przetwarza standardowy substrat C > p z podobną szybkością. W przeciwieństwie, zmutowana RNaza hydrnli/uje prolek zaacznir szybciej niż enzym natywny. Tak więc, wprowadzenie mutacji Lys66Glu do RNazy nie zaburza zdolności bydlęcego enzymu do cięcia wizzaaia fosforanowego, ale daje enzym, który swoiście tnie prolek RNazy (przykładzie 3) dając czynny lek.

Przykład 11

Kinetyka enzymatyczna proleku opartego na uracylu według przykładu 3 (paolek RNazy) w stosunku do natywnej i zmutowanej Aag4Ala, Lys6Ala, Lys66Glu ludzkiej RNazy trzustkowej. Pomiary kinetyki enzymatycznej z użyciem aaSywaej HP-RNazy i Aag4Ala, Lys6Ala, Lys66Glu-HP-RNazy przrprowadznan jak to opisano w przykładzie 10, z takim wyjątkiem, że zastosowany bufor zawierał 0,1 M Tris pH 7,0, 50 mM NaCl. Wyniki pokazano poniżej.

Kinetyka enzymatyczna Kcat/Km dla proleku RNazy i C > p z natywną i zmutowaną ludzką RNazą Aag4Ala, Lys6Ala, Lys66Glu

Substrat	HP-Rnaza	Arg4Aja,Lys6Aja,Lys66 Glu-HP-RNaza
		(koat/Kal mM-1 s-)
Prolek RNazy (przykładzie 3)	0,2	3,6
C > p	1,2	1,2

Wyniki pokazują, że zarówno aaSywaj jak i zmutowana ludzka RNaza przetwarza standardowy substrat C > p z podobną szybkością. W przeciwieństwie, zmutowana RNaza hydrolizuje prolek zaaoznlr szybciej niż enzym natywny. Tak więc, wprowadzenie mutacji Lys66Glu do ludzkiej RNazy nie zaburza zdolności ludzkiego enzymu do cięcia wiązania fosforanowego, ale daje enzym, któay swoiście tnie prolek RNazy (przykładzie 3) dając czynny lek.

Przykład 12

Synteza proleku opartego na cytozynie (pataz, schemat na fig. 17)

Pnwtórznnn procedurę opisaną w przykładzie 3, ale stosowano związek 6 (fig. 17) zamiast związku 4 (fig. 7). Związek 6 (fig. 17) wytwnaznan sposobem opisanym dla związku 4 (fig. 7), ale stosowano N⁴-brnzylnksykarbnnyln-Q-benzylncytyOyną zamiast 2'-O-brazylnurydyny. N⁴ brazylnksykaabnayln-2'-Q-brazylnoytytyaę (związek 2, fig. 17) wySwnaznnn z 2'-O-beazylnoyty0yay [Chaistensen i Broom (1972), J. Org. Chem., 21, 3398-3401], sposobem stosowanym do wytworzenia związku 6 w przykładzie n0aiesieaia 7.

Przykład 13

Aktywność enzymatyczna bydlęcej Lys66Glu trzustkowej RNazy wobec proleków opartych na analogach urydyny i cytydyny według przykładu 6 i 7.

Doświadczenie przeprowadzono w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 10 ale test wykonywano w temperaturze 25°C. Wyniki pokazano poniżej.

Kinetyka enzymatyczna Kcat/Km dla proleku RNazy i C > p z natywną i zmutowaną bydlęcą RNazą Lys66Glu

184 031

Substrat	BP-Rnaza	Lys66Glu BP-RNaza (kcat/Km mM- s'1)
Analog proleku R-	1(0,2)	25(6)
Nazy (przykładzie 6)
Analog proleku R	5,5(0,30	109(11)
Nazy (przykładzie 7)
C > p	3,0	3,0

Wyniki pokazują, że zarówno natywna jak i zmutowana bydlęca RNaza przetwarza standardowy substrat C > p z podobną szybkością. W przeciwieństwie, zmutowana RNaza hydrolizuje prolek znacznie szybciej niż enzym natywny. Tak więc, wprowadzenie mutacji Lys66Glu do RNazy nie zaburza zdolności bydlęcego enzymu do cięcia wiązania fosforanowego, ale daje enzym, który swoiście tnie analogi proleku RNazy (przykładzie 6 i 7) dając czynny lek.

Przykład 14

Typowe kompozycje farmaceutyczne zawierające prolek według wynalazku

A: Kapsułki wypełnione suchą substancją, zawierające 50 mg składnika czynnego w kapsułce

Składnik	Ilość na kapsułkę (mg)
Składnik czynny	50
Laktoza	149
Stearynian magnezu	1
Kapsułka (rozmiar 1)	200

Składnik może być rozdrobniony do ziarnistości Nr 60, zaś laktoza i stearynian magnezu może być przesiana przez sito Nr 60. Połączone składniki mogą być zmieszane przez 10 minut i wsypane do suchych kapsułek żelatynowych Nr 1.

B: Tabletki

Typowa tabletka powinna zawierać substancję czynną (25 mg), żelatynizowaną skrobię USP (82 mg), celulozę mikrokrystaliczną (82 mg) i stearynian magnezu (1 mg).

C: Czopek

Typowa formulacja czopka do podawania doodbytniczego może zawierać substancję czynną (0,08-1,0 mg), wersenian disodowo wapniowy (0,25-0,5 mg) i poliglikol etylenowy (775-1600 mg). Inne formulacje czopka mogą być wytworzone przez zastąpienie wersenianu butylowanym hydroksytoluenem (0,04-0,08 mg) oraz poliglikolu etylenowego uwodornionym olejem roślinnym (675-1400 mg) takim jak Suppocire L, Wecobee FS, Wecobee M, Witepsols itp.

D: Wstrzyknięcia

Typowa formulacja do wstrzyknięć powinna zawierać substancję czynną (10 mg), alkohol benzylowy (0,01 ml) i wodę do wstrzyknięć (1,0 ml).

Przykład 15

Klonowanie i ekspresja D253K HCPB- (His)(,-c-myc w E. coli

Sposób klonowania i ekspresjonowania D252K-HCPB w E. coli jest bardzo podobny do sposobu opisanego w przykładzie 15.

Ponownie, pICI266 zastosowano jako wektor do klonowania, oraz plazmid pICI1698 (jak to opisano w przykładzie 14) jako materiał wyjściowy do PCR genu pro-HCPB. Jednakże w tym przypadku zastosowano ukierunkowaną, mutagenezę, podczas amplifikacji PCR genu, w celu zmiany aminokwasu w pozycji 253 z asparaginianu w lizynę (GAC do AAA). Przygotowano dwie mieszaniny PCR, w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15. W pierwszej reakcji starterami były: FSPTSl (Identyfikator Sekw. Nr 58) i 1398 (Identyfikator

184 031

Sekw. Nr 72). W drugiej reakcji starterami były: 6HIS9E10R1BS1 (Identyfikator Sekw. Nr 59) i 1397 (Identyfikator Sekw. Nr 73). W obu· reakcjach wyjściowym DNA był pICI1698. Startery 1398 i 1397 (Identyfikator Sekw. Nr 72 i 73) zostały zaprojektowane tak, aby przylegały dookoła kodonu aminokwasy 253, Wprowadzając w sekwencji DNA zmianę GAC do AAA i tworząc sekwencję komplementarną na końcach dwóch produktów PCR. Inne dwa startery FSPTS1 i 6HIS9E10R1BS1 (Identyfikator Sekw. Nr 58 i 59) opisane są w przykładzie 15. Porcje dwóch reakcji PCR analizowano w poszukiwaniu dNa o prawidłowej długości (około 750 i 250 bp), po czym zmierzono stężenie przez elektroforezę na żelu agarozowym i stwierdzono, że zawierają one głównie prążki o prawidłowej wielkości. Inne PCR nastawiono stosując około 4 pg każdego z pierwszych dwóch produktów PCR, w obecności dNTP w stężeniu końcowym 200 pM, buforu reakcyjnego polimerazy Taq, w objętości końcowej 80 pl. Mieszaninę podgrzano do 94°C przez 10 minut przed dodaniem 2U polimerazy Taq i poprowadzono inkubacje PCR w ciągu 10 cykli po 1 min w 94°C i 4 min, w 63°C. Na zakończenie tych cykli, mieszaninę reakcyjną doprowadzono do 12 pl przez dodanie 120 pmol każdego ze starterów FSPTSl i 6HIS9E10R1BS1 (Identyfikator Sekw. Nr 58 i 59), dodatkowych dNTP (około 100 μΜ), buforu polimerazy Taq i 4U polimerazy Taq. Mieszaninę podgrzano do 94°C przez 10 minut przed dodaniem polimerazy Taq i poprowadzono inkubacje PCR stosując 30 cykli po 1,5 min w 94°C, 2 min i 72°C przez 2 minuty, zakończone pojedynczą inkubacją w 72°C przez 10 minut.

Porcję produktu PCR analizowano pod kątem DNA o prawidłowej wielkości (około 1000 bp) przez elektroforezę na żelu agarozowym i stwierdzono, że zawiera głównie prążek o prawidłowej wielkości. Pozostałość produktu oczyszczono z mieszaniny reakcyjnej w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15. Izolowany DNA cięto enzymami fspl i EcoRI po czym oczyszczano prążek o prawidłowej długości (około 1000 bp) w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15.

Dwuniciowy DNA pICI266, wytworzony w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15 trawiono KpnI, końce stępiono polimerazą DNA T4 i upewniono się co do kompletności reakcji. Oczyszczony DNA trawiono EcoRI. DNA o prawidłowej wielkości (około 5600 bp) oczyszczono w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15.

Porcje trawionego i oczyszczonego DNA sprawdzono pod względem czystości i stężenia przez elektroforezę na żelu agarozowym w porównaniu ze znanymi standardami. Na podstawie tych obliczeń wytworzono mieszaninę ligacyjną w celu klonowania genu HCPB do wektora pICI266 w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15.

Po ligacji mieszaninę DNA zastosowano do transformowania E. coli szczepu DH5a, pobrano kolonie i badano przez hybrydyzację w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15. Wyizolowano sześć klonów pozytywnych, które sprawdzono przez PCR na obecność wstawki prawidłowej wielkości, stosując startery FSP1TS1 i 6HIS9E10R1BS1 (Identyfikator Sekw. Nr 58 i 59) oraz startując reakcję wewnętrznymi starterami FSPTSl (Identyfikator Sekw: Nr 58) i 679 (Identyfikator Sekw. Nr 51) w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15. Produkty PCR analizowano pod kątem obecności DNA o prawidłowej wielkości (około 1000 bp dla pary starterów FSP1TS1 i 6HIS9E10R1BS1 i około 430 bp dla starterów FSPTSl i 679) przez elektroforezę na żelu. Wszystkie klony pozytywne dawały produkty PCR DNA o prawidłowej wielkości.

Wszystkich sześć klonów użyto do wytwarzania plazmidowego DNA, zaś dwa użyto do sekwencjonowania poprzez region produktu PCR w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15. Klony sekwencjonowano stosując sześć starterów do sekwencjonowania znanych jako: 1504, 1802, 679, 1280, 677 i 1731 (Identyfikatory Sekw. Nr 60, 63, 51, 53, 52 i 62). Na podstawie wyników sekwencjonowania wybrano klon zawierający plazmid z pożądaną sekwencją genu D253K-HCPB, znany jako pI-CI1713.

Potwierdzona sekwencja klonowanego genu D253K-HCPB w pI-CI1713, pokazująca translację na aminokwasy, od początku sekwencji PelB do miejsca restrykcyjnego EcoRI pokazana jest na Identyfikatorze Sekw. Nr 74 z numeracją DNA rozpoczynającą się od 1 na pierwszym kodonie PelB i peptydach numerowanych od 1 od dojrzałej HCPB.

184 031

W celu uzyskania kontrolowanej ekspresji D253K-HCPB DNA plazmidowy pICI1713 transformowano metodą chlorku wapnia do kompetentnego szczepu ekspresyjnego E. coli w sposób podobny jak w przykładzie 15. Wszystkie szczepy ekspresyjne E. coli traktowano w sposób podobny jak w przykładzie 15, w celu zbadania ekspresji klonowanego genu D253K-HCPB. W tym przypadku w analizie metodą Western biot zastosowano przeciwciało monoklonalne 9E10 swoiste wobec znacznika peptydowego c-myc, ponieważ D253K-HCPB ma na końcu znacznik (His^-c-myc. Ekspresja klonowanego znakowanego D253K-HCPB w pICI266 -(pICI1713) została wykazana w żelach z E. coli, barwionych Coomassie wykazujących silny prążek białka wielkości około 35000 Da w porównaniu z klonami zawierającymi sam wektor (pICI266, i klonami wytwarzającymi znakowane HCPB (przykładzie 15). Prążek o tej samej wielkości dawał silny sygnał w analizie metodą Western biot wykrywającej znacznik c-myc.

Przykład 16

Klonowanie i ekspresja D253R HCPB-(His)6-c-myc w E. coli

Sposób klonowania i ekspresjonowania D252R-HCPB w E. coli jest bardzo podobny do sposobu opisanego w przykładzie 16. Ponownie, pICI266 zastosowano jako wektor do klonowania, oraz plazmid pICl1 1712 (jak to opisano w przykładzie 15) jako materiał wyjściowy do PCR genu pro-HCPB. Jednakże w tym przypadku zastosowano ukierunkowaną mutagenezę, podczas amplifikacji PCR genu, w celu zmiany aminokwasu w pozycji 253 z asparaginianu w argininę (GAI do CGC). Przygotowano dwie mieszaniny PCR, w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15 i 16. W pierwszej reakcji starterami były: 2264 (Identyfikator Sekw. Nr 65) i 2058 (Identyfikator Sekw. Nr 75). W drugiej reakcji starterami były: 6HIS9E10R1BS1 (Identyfikator Sekw·'. Nr 59) i 2054 (Identyfikator Sekw. Nr 76). W obu reakcjach wyjściowym DNA był pICI1712.

Startery 2058 i 2054 (Identyfikator Sekw. Nr 75 i 76) zostały zaprojektowane tak, aby przylegały dookoła kodonu aminokwasu 253, wprowadzając w sekwencji DNA zmianę GAC do CGC i tworząc sekwencję komplementarną na końcach dwóch produktów PCR. Inne dwa startery 2264 i 6HIS9E10R1BS1 (Identyfikator Sekw. Nr 65 i 59) opisane są w przykładzie 15 i 16. Porcje dwóch reakcji PCR analizowano w poszukiwaniu DNA o prawidłowej długości (około 750 i 250 bp), po czym zmierzono stężenie przez elektroforezę na żelu agarozowym i stwierdzono, że zawierają one głównie prążki o prawidłowej wielkości. Inne PCR nastawiono stosując około 4 p g każdego z pierwszych dwóch produktów PCR, w obecności dNTP w stężeniu końcowym 200 pM, buforu reakcyjnego polimerazy Taq, w objętości końcowej 80 pl. Mieszaninę podgrzano do 94°C przez 10 minut przed dodaniem 2 U polimerazy Taq i poprowadzono inkubacje PCR w ciągu 10 cykli po 1 min w 94°C i 4 min w 63°C. Na zakończenie tych cykli, mieszaninę reakcyjną doprowadzono do 12 pl przez dodanie 120 pmol każdego ze starterów 2264 i 6HIS9E10R1BS1 (Identyfikator Sekw. Nr 65 i 59), dodatkowych dNTP (około 100 p M), buforu polimerazy Taq i 4U polimerazy Taq. Mieszaninę podgrzano do 94°C przez 10 minut przed dodaniem polimerazy Taq i poprowadzono inkubacje PCR stosując 30 cykli po 1,5 min w 94°C, 2 min i 72°C przez 2 minuty, zakończone pojedynczą inkubacją w 72°C przez 10 minut.

Porcję produktu PCR analizowano pod kątem DNA o prawidłowej wielkości (około 1000 bp) przez elektroforezę na żelu agarozowym stwierdzono, że zawiera głównie prążek o prawidłowej wielkości. Pozostałość produktu oczyszczono z mieszaniny reakcyjnej w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15. Izolowany DNA cięto enzymami Fspl i EcoRI, po czym oczyszczano prążek o prawidłowej długości (około 1000 bp) w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15.

Dwuniciowy DNA pICI266, wytworzony w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15 trawiono Ncol i EcoRI, końce stępiono polimerazą DNA T4 i upewniono się co do kompletności reakcji: Oczyszczony DNA trawiono EcoRI. DNA o prawidłowej wielkości (około 5600 bp) oczyszczono w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15.

Porcje trawionego i oczyszczonego DNA sprawdzono pod względem czystości i stężenia przez elektroforezę na żelu agarozowym w porównaniu ze znanymi standardami. Na podstawie

184 031 tych obliczeń wySwnaznnn mieszaninę ligacyjną w celu klonowania genu HCPB do wektora pICI266 w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15.

Po ligacji mieszaninę DNA zastosowano do transformowania E. coli szczepu DH5a, pobrano kolonie i badano przez hybrydyzację w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15.

Trzy klony użyto do wytwarzania plazmidowego DNA i użyto do sekwencJnnnwania poprzez region produktu PCR w sposób podobny do opisanego w przykładzie 15. Klony sekwracjnnnwann stosując sześć starterów do srkwracjnanwania znanych jako: 1504, 1802, 679, 1280, 677 i 1731 (Identyfikatory Sekw. Na 60, 63, 51, 53, 52 i 62). Na podstawie wyników sekwracjnnnwanla wybrano klon zawierający plazmid z pożądaną sekwencją genu D253R-HCPB, znany jako pICI1746.

Potwierdzona sekwencja klonowanego genu D253R-HCPB w pICI1746, pokazująca translację na aminokwasy, od początku sekwencji PelB do miejsca restrykcyjnego EcoRI pokazana jest na Identyfikatorze Sekw. Nr 77 z numeracją DNA rnzpnczynającą się od 1 na pierwszym kodzie PelB i peptydach numerowanych od 1 od dojrzałej HCPB.

W celu uzyskania knntrnlnwjarj ekspresji D253R-HCPB DNA plazmidowy pICI1746 transformowano metodą chlorku wapnia do kompetentnego szczepu ekspresyjnego E. coli w sposób podobny jak w przykładzie 15. Wszystkie szczepy ekspresyjne E. coli traktowano w sposób podobny jak w przykładzie 15, w celu zbadania ekspresji klonowanego genu D253R-HCPB. W tym przypadku w analizie metodą Western błot zastosowano przeciwciało mnanklnaalne 9E10 swoiste wobec zaaozaika eeptyOnwrgn c-myc, ponieważ D253R-HCPB ma na końcu znacznik (His^-c-myc. Ekspresja klonowanego znakowanego D253R-HCPB w pICI266 (pICI1743) została wykazana w żelach z E. coli, barwionych Cnnmassie wykazujących silny prążek białka wielkości około 35000 Da w porównaniu z klonami zawierającymi sam wektor (pICI266), i klonami wytwarzającymi znakowane HCPB (przykładzie 15). Prążek o tej samej wielkości dawał silny sygnał w analizie metodą Western błot wykrywającej znacznik c-myc.

Oczyszczanie uzyskano stosując metody analogiczne do przedstawionych w przykładzie 17, niżej.

Przykład 17

Oczyszczanie zmutowanego białka D253K HCPB-(His)6-c-myc z E. coli.

Najpierw zostanie opisany proces fermentacji 20 litrów dla analogu kaaboksypeptydazy B D253K w zawiesinie komórek. Szczep MSD 1924 E. coli K12 traasfnrmnwaan plazmidem pZen 1713 (pICI1713‘, patrz przykład 15 wyżej), po czym powstały szczep MSD 2230 (MSD 1924 pZen 1713) przechnwywjan w mieszaninie do zamrażania z gliceryną w -80°C.

MSD 2230 rn/mazjan po płytkach agarowych zawierających L-tetracyklinę (10 pg/ml) w celu rnzO/ieleaia pojedynczych knlnail po całonocnym wzroście w 37°C. Pobrano z powieazohai płytek sześć pojedynczych kolonii MSD 2230, zawieszono w 10 ml pożywki z L-tetaacykliną (10 pg/ml) i natychmiast lnnkulnwjan pazy użyciu 100 pl zawiesiny sześć 250 ml butelek Erlenmeyera zawierających 75 ml pożywki z L-tetracykliną (10 pg/ml). Po 15-16 gnOzlaaej hodowli w 37°C na wytrząsarce (300 nbr./mia) zawartość butelek pnłącznnn i zastosowano do innkulaojl pojedynczego feametatora naczynie U30D, B. Braun, Melsungen, Niemcy) zawierającego 15 litrów pożywki hodowlanej opisanej na fig. 23.

Fermentację prowadzono w temperaturze 37°C i pH 6,7, pazy czym pH było kontrolowane automatycznie w zadanym zakresie przez dodawanie 6 M wodorotlenku sodu albo 2 M kwasu siarkowego. Punkt aastawozy ciśnienia rozpuszoznaegn tlenu (dOT) ustawiony był na 50% saturacji powietrza i utrzymywany przez automatyczne dostrajanie prędkości mieszadła fermratatnra w zakresie od 200 do 1000 oba/min. Przepływ powietrza przez feamratatnr utrzymywany był na pnzlnmlr 20 litrów na minutę, co odpowiadało 1,3 objętości naczynia na minutę (wm), przez urządzenie kontrolujące Tylan 4,5 godziny po iankulacjil rozpoczęto podawanie do frrmratatnaa ekstraktu drożdżowego (225 g/l) z prędkością 190-210 ml/gn-OZiaę przez

28,5 godziny. 1,5 godziny po rozpnczęolu podawania ekstraktu drożdżowego nastawę temperatury obniżono dd 25°C. Po osiągnięciu tej temperatury, około godziny później, indukowano ekspresję analogu D253K przez pojedynczy puls 50% aaabianzy do stężenia końcowego równego 0,5%. 1-2 godziny po indukcji rozpnozętn podawanie mieszaniny gliceryny (714 g/l)

184 031 i siarczanu amonu (143 g/l) z prędkością 45-55 ml/godzinę, do momentu zbierania komórek. Fermentację prowadzono w tych warunkach do 75 godzin po inokulacji, kiedy to zawartość fermentatora zebrano przez przeniesienie porcji zawartości do 1 litrowych butelek. Zużytą pożywkę oddzielono od komórek przez odwirowanie w wirówce Sorvall RC-5B (7000 x g, 4°C, 30 minut). Proces ten pozwalał zwykle uzyskać 20 g suchej masy/litr. Osad bakterii oczyszczano jak opisano poniżej. Osad rekombinowanych bakterii zawierających rekombinowany enzym D253K HCPB pobrano z miejsca przechowywania w -70°C i pozostawiono do rozmrożenia. Zważono osad komórek i stwierdzono że waży 309 gramów. Osad zawieszono w buforze A (200 mM Tris-HCI, 20% sacharoza, pH 8,0) uzyskując objętość 320 ml. Zawiesinę komórek inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 minut, co jakiś czas mieszając, po czym dodano równą objętość wody destylowanej i dokładnie wymieszano. Zawiesinę komórek ponownie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Powstały surowy produkt szoku osmotycznego sklarowano przez odwirowanie przy 98000 x g przez 90 minut w 4°C, po czym zebrano nadsącz znad nierozpuszczalnej frakcji osadu. Do nadsączu dodano dezoksyrybonukleazę 1 (24 mg) po rozpuszczeniu w 5 ml wody destylowanej. Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej, ciągle mieszając, dopóki lepkość nie zmniejszyła się do stopnia umożliwiającego wprowadzenie nadsączu do kolumny z Sefarozy aktywowanej CNBr z inhibitorem karboksypeptydazy, wytworzonej według instrukcji z sepharose 4B aktywowanej CNBr (Pharmacia) i inhibitora karboksypeptydazy z bulwy kartofla (C0279, Sigma). Nadsącz doprowadzono do pH 8,0 i wprowadzono do kolumny powinowactwa, zrównoważonej 10 mM Tris-HCI, 500 mM chlorkiem sodu pH 8,0. Po załadowaniu nadsączu, kolumnę płukano dopóki absorbancja płukanki nie powróciła do poziomu wyjściowego, po czym związany materiał eluowano z kolumny buforem do elucji (100 mM węglan sodu, 500 mM chlorek sodu pH 11,4). Eluowane frakcje zamrażano w -20°C o ile zawierały karboksypeptydazę co stwierdzano w badaniu Western błot stosując przeciwciała przeciwko znacznikowi c-myc (9E10), i koniugat peroksydazy chrzanowej z przeciwciałem przeciw-mysim (A9044, Sigma) po reakcji barwnej z 4-chloronaftolem i nadtlenkiem wodoru.

Frakcje od 11 do 14 zawierały rekombinowaną karboksypeptydazę B. Frakcje te połączono, doprowadzono pH do 7,5 i stężono stosując urządzenie Millipore Centrifugal Ultrafree™20 (ciężar cząsteczkowy odcięcia 10000), po czym zamrożono i przechowywano w -20°C. Oczyszczanie przedstawione powyżej dostarczyło 4,7 mg zmutowanej karboksypeptydazy D253K o czystości 80% w objętości 0,95 ml.

Przykład 18

Synteza fenoloiperytowego proleku z kwasem asparaginowym (związek 5a, fig. 27)

Kwas (2S),2-(3- {4-[bis-(2-chloroetylo)-amino)-fenoksykarbonylo}-propionylo-amino)bursztynowy

Stosowano sposób analogiczny do opisanego w przykładzie odniesienia 12.

Ester dibenzylowy (4a) kwasu (2S),2-(3-{4-[bis-(2-chloroetylo)-amino)-fenoksykarbonylo}-propionyloamino)-bursztynowego (4a) poddawano uwodornieniu przez 2 godziny pod ciśnieniem 80 psi i otrzymano żądany produkt końcowy 5a (wydajność: 86%).

5a: 'HNMR (CD3OD): 2,65-2,75 (t, 2H); 2,78-2,9 (m, 4H); 3,7-3,75 (m, 4H); 3,8-3,85 (m, 4H); 4,75 (t, 1H); 6,7-6,8 (m, 2H); 7,0-7,1 (m, 2H).

MS (ESI): 471-473 (MNa)+

AnalizaCCigH^NzObCh 1,4 H2O)

Obliczono % C: 45,56 H: 5,27 N :5,90

Znaleziono % C: 45,79 H: 5,60 N : 5,91

Związek wyjściowy 4a wytworzono, jak następuje:

Ester dibenzylowy kwasu (2S), 2-amino-bursztynowego (związek 2a) poddano reakcji ze związkiem 1 i otrzymano ester dibenzylowy kwasu (2S), 2-(3-karboksypropionyloamino)bursztynowego (związek 3a) po rekrystalizacji z mieszaniny eter dietylowy/heksan: (Wydajność: 80%).

3a: ’HNMR (CDCb): 2,42-2,6 (m, 2H); 2,6-2,75 (m, 2H); 2,85 (dd, 2H); 3,1 (dd, 1H); 4,9 (dd, 1H); 5,05 (dd, 2H); 5,15 (s, 2H); 6,7 (d, 1H); 7,25-7,5 (m, 10H).

MS (ESI): 436 [MNa]+

184 031

Analiza (C22H23NO7 0,4 H2O):

Obliczono % C :62,82 H: 5,70 N: 3,33

Znaleziono % C: 63,2 H: 5,75 N: 2,9

Związek 3a poddano reakcji z wytworzeniem żądanego związku wyjściowego 4a (wydajność: 78%), mieszając przez 3 godziny w temperaturze pokojowej i poddając oczyszczaniu metodą chromatografii, stosując jako eluent mieszaninę eter dietylowy/heksan, 70/30, obj./obj.

4a: 'HNMR (CDCI3) :2,55-2, 65 (m, 2H); 2,8-2,9 (m, 2H); 2,9 (dd, 1H); 3,1 (dd, 1H);

3,6 (dd, 4H); 3,7 (dd, 4H); 4,9 (dd, 1H); 4,9 (dd, 1H); 5,05 (dd, 2H); 5,15 (dd, 2H); a6,58 (d, 1H); 6,65 (d, 2H); 6,95 (d, 2H); 7,25-7,4 (m, 10H).

MS (ESI): 651-653 (MNa)+

Przykład 19

Synteza fenoloiperytowego proleku z kwasem glutaminowym (5b, fig. 27)

Kwas (2S),2-(3-{4-[bis-(2-chloroetylo)-amino)-fenoksykarbonylo}-propionylo-ammo)pentanodionowego

Stosowano sposób analogiczny do opisanego w przykładzie odniesienia 12.

Ester dibenzylowy kwasu (2£),2-(3-{4-[bis-(2-chloroetylo)-amino)-fenoksykarbonylo}propionyloamino)-petanodionowego (4b) poddawano uwodornieniu przez 3 godziny pod ciśnieniem 60 psi i otrzymano żądany związek końcowy 5b (wydajność: 93%).

5b: 'HNMR (CD3OD): 1,9-2,0 (m, 1H); 2,1-2,2 (m, 1H); 2,35-2,45 (m, 2H); 2,55-2,7 (m, 2H); 2,8-2,9 (m, 2H); 3,65-3,7 (m, 4H); 3,72-3,8 (m, 4H); 4,4-4,5 (m, 1H); 6,75 (d, 2H); 6,95 (d, 2H).

MS (ESI): 485-487 (MNa)+

Wyjściowy związek 4b wytworzono, jak następuje.

Ester dibenzylowy kwasu (2£)-2-amino-pentanodionowego (2b) podano reakcji i otrzymano ester dibenzylowy kwasu (23), 2-(3-karboksypropionyloamino)-pentanodionowego (3b). (Wydajność: ilościowa).

3b: 'HNMR (CDCI3): 2,0-2,1 (m, 1H); 2,2-2,3 (m, 1H); 2,3-2,5 (m, 4H); 2,6-2,7 (m, 2H); 4,65 (dd, 1H); 5,05 (s, 2H); 5,15 (s, 2H); 6,5 (d, 1H); 7,3-7,4 (m, 10H).

MS (ESI): 450 [MNa]+

Związek 3b poddano reakcji i otrzymano żądany związek wyjściowy 4b (wydajność: 82%).

4b: ^HNMR (CDC13): 1,95-2,05 (m, 1H); 2,2-2,3 (m, 1H); 2,3-2,5 (m, 1H); 2,5 (dt, 2H); 2,8-3,0 (m, 2H); 3,6 (dd, 4H); 3,7 (dd, 4H); 5,1 (s, 2H); 5,2 (s, 2H); 6,3 (d, 1H); 6,6 (d, 2H); 6,95 (d, 2H); 7,3-7,4 (m, 10H).

MS (ESI): 665-667 (MNa)+

Przykład 20

Test aktywności zmutowanej CPB i natywnej ludzkiej CPB wobec analogów proleku Hipp-Asp i Hipp-Glu

Oczyszczone mutanty, CPB (D253K i D253R, przykłady 15-17) i natywną ludzką CPB, wytworzone jak to opisano w przykładzie 20, badano na ich zdolność do konwertowania kwasu hipurylo-L-asparaginowego (Hipp-Asp, przykład 10), kwasu hipurylo-L-glutaminowego (Hipp-Glu, przykład 9) albo hipurylo-L-argininy (Sigma, nr kat. H6625) do kwasu hipurynowego, stosując test oparty na HPLC.

Mieszanina reakcyjna (250 μΐ) zawierała 4 μ g ludzkiej CPG (natywnej albo zmutowanej) i-0,5 mM Hipp-Asp albo Hipp-Glu w 0,025 M Tris-HCl, pH 7,5. Próbki inkubowano przez 5 godzin w 37°C. Reakcje przerwano przez dodanie 250 fil metanolu, 20% wody destylowanej i 0,2% kwasu trifiuorooctowego, po czym mierzono ilość wytworzonego kwasu hipurowego analiza HPLC. Analizę HPLC przeprowadzono stosując układ Hewlett-Packard 1090 Series 11 (z zestawem diod). Próbki (50 pil) wstrzyknięto do kolumny Hichrom Hi-RPB (25 cm) i rozdzielono stosując fazę ruchliwą 40% metanolu, 60% wody destylowanej i 0,1% kwasu trifiuorooctowego przy przepływie równym 1 ml/min. Ilość wytworzonego produktu (kwasu hipurowego) określono z krzywych kalibracyjnych wykreślonych przy użyciu znanych ilości kwasu hipurowego (Sigma H6375). Wyniki pokazano na tabeli i są wyrażone w procentach przekształcania substratu w produkt w ciągu 5 godzin w 37°C przez 4 fig enzymu. Konwersja Hipp-Asp i Hipp-Glu przez zmutowaną ludzką i natywną CPB

184 031

Hipp-Asp Hipp-Glu Hipp-Arg (% konwersji do kwasu hipurowego)

NatywnaCPB 0 0 100 mutant D253K CPB 78 91 <2 mutant D253R CPB 77 55. 3

Dane wskazują, że wprowadzenie lizyny albo argininy w pozycję 253 ludzkiej CPB zamiast reszty asparaginianu obecnej w enzymie natywnym zmienia swoistość wobec substratu w taki sposób, że enzym konwertuje Hipp-Asp albo Hipp-Glu. W przeciwieństwie do powyższego, natywny enzym nie jest zdolny do konwertowania tych związków w kwas hipurowy ale potrafi konwertować Hipp-Arg do kwasu hipurowego. Najlepszą aktywność obserwowano w przypadku mutanta D253K i substratu Hipp-Glu.

Przykład 21

Oznaczanie Km, i kcat zmutowanej D253K HCPB wobec Hipp-Asp i Hipp-Glu

Oczyszczoną D253K HCPB, wytworzoną według przykładu 17, badano wobec HippAsp (przykładzie 10) i Hipp-Glu (przykładzie 9) w celu określenia Km i kcat dla tych substratów. Hipp-Asp i Hipp-Glu rozcieńczono w zakresie odpowiednio od 0,25 do 8,0 mM i 0,25-5,0 mM w 0,025 mM Tris-HCI pH 7,5. Gdy było to konieczne pH próbek substratów ustalano do pH 7,5 przy użyciu 1 M NaOH.

D253K HCpB (4 pg/ml dla Hipp-Asp i 0,5 pg dla Hipp-Glu) dodano do substratów (500 p l objętości reakcji) w celu rozpoczęcia reakcji. Próbki inkubowano przez 5 godzin w 37°C. Reakcje przerywano przez dodanie 500 pl mieszaniny metanol/woda destylowana (80/20) zawierającej 0,2% TFA. Ilość wytworzonego kwasu hipurowego mierzono przez HPLC jak to opisano w przykładzie 20.

Wartości Km i kcat wyliczono stosując oprogramowanie ENZFIT-TER (Biosoft, Perkin Elmer), kcat wyliczono z Vmax przez podzielenie stężenia enzymu w mieszaninie reakcyjnej (przyjmując ciężar cząsteczkowy HCPB równy 34 kDa). Wyniki przedstawiono na tabeli.

Dane dotyczące Km i kcat dla Hipp-Asp i Hipp-Glu ze zmutowaną HCPB D253K

	Km (mM)	kcatfs-) mM3 s1	kcat/Km
Hipp-Asp	2,7	0,26	0,1
Hipp-Glu	5,.3	3,8	0,-7

Dane potwierdzają, że zastąpienie asparaginianu resztą lizyny w pozycji 253 ludzkiej CPB daje enzym, który konwertuje zarówno Hipp-Asp jak i Hipp-Glu w kwas hipurowy z rozsądną kinetyką. kcat/Km jest około 7-krotnie większe dla Hipp-Glu w porównaniu z substratem Hipp-Asp.

Przykład 22

Test aktywności zmutowanej i natywnej HCPB wobec proleku kwasu glutaminowego

Oczyszczona D253K HCPB i natywna ludzka CPB, wytworzone jak to opisano w przykładzie 17 i przykładzie 20, badano na ich zdolność do enzymatycznego odcinania kwasu glutaminowego od proleku kwasu glutaminowego (przykładzie 18). Cięcie uwalniało związek pośredni (przykładzie 13), który rozkładał się samoistnie wydzielając aktywny lek fenolowo iperytowy. Konwersję proleku kwasu glutaminowego do związku pośredniego mierzono stosując test oparty na HPLC.

Prolek rozcieńczono w zakresie od 0,25-5,0 mM w 0,025 M Tris-HCI pH 7,5. Jeżeli to było konieczne, pH próbki proleku ustalano na 7,5 przy użyciu 1 M NaOH. Zmutowana HCPB albo natywna HCPB obie w stężeniach 0,25 mg/ml, dodano do substratów (objętość 250 #1 ogrzana do 37°C przez 2 minuty) w celu rozpoczęcia reakcji. Próbki inkubowano przez 4

184 031 minuty w 37°C. Reakcje przerywano przez dodanie 250 #1 98,8% MeCN, 0,25% TFC i umieszczono próbki na lodzie. Ilość związku pośredniego obliczano przez HPLC.

Rozdzielenie HPLC przeprowadzano jak to opisano w przykładzie 20 z takim wyjątkiem, że faza ruchliwa MeCN/woda destylowana (55/45) zawierała 0,1% TFA. Ilość związku pośredniego obliczono w oparciu o krzywe kalibracyjne wykreślone na podstawie znanych ilości związku pośredniego.

Ilość związku pośredniego wytworzonego przez 5,0 mM i 0,25 mM proleku przez natywną i zmutowaną (D253K) HCPB w powtórzonych próbkach jak pokazano na tabeli.

Konwersja proleku do związku pośredniego przez natywną i zmutowaną (D253K) HCPB

Stężenie proleku

5,0

0,25

Stężenie związku pośredniego (mM) Natywna HCPB Zmutowaną HCPB

0,0 0,023,C>,022’

0,0 0,005,0,005

Wartości Vmax ,i kcc^at dla zmutowanego enzymu ludzki ego (D253K) i proleku s)t)lίi^2^s^no z ilości wytworzonego związku pośredniego w zakresie stężenia substratów (0,25-5,0 mM) z użyciem oprogramowania ENZFITTER opisanego w przykładzie 21.

Wyniki dla zmutowanej D253K HCPB:

Km = 1,25 mM

Vmax = 1,17x10’4mMsec'¹ kcat = 0,016sec~1

Dane pokazują, że wprowadzenie reszty lizyny w pozycję 253 w ludzkiej CPB zamiast reszt asparaginianowej obecnej w natywnym enzymie zmienia swoistość substratu enzymu w taki sposób, że jest on zdolny do konwersji proleku kwasu glutaminowego do samoistnie rozkładającej się formy pośredniej. W przeciwieństwie, natywny enzym jest niezdolny do konwersji proleku do związku pośredniego. Ponieważ prolek jest względnie nietoksyczny (przykładzie 23), zaś związek pośredni nie jest rozkładany enzymatycznie, z wydzieleniem wolnego leku fenolowo iperytowego, który niszczy komórki nowotworowe (przykładzie 23) wyniki te pokazują, że mutacja reszt centrum aktywnego CPB może dostarczyć zmutowanego enzymu ludzkiego zdolnego do konwertowania względnie nietoksycznego proleku do silnie cy-totoksycznego leku zdolnego do niszczenia komórek nowotworowych.

Przykład 23

Cytotoksyczność proleku kwasu glutaminowego i leku fenolowo iperytowego dla komórek raka okrężnicy i odbytu LoVo

Różnicująca cytotoksyczność wobec komórek nowotworowych proleku kwasu glutaminowego i odpowiedniego leku wykazana została w poniższy sposób.

Komórki raka okrężnicy i odbytu LoVo inkubowano z prolekiem i odpowiednim lekiem w zakresie stężeń końcowych od 5x10- do 5x10'8 M w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania (2500 komórek/studzienkę) przez godzinę w 37°C. Komórki następnie płukano i inkubowano przez dalsze 3 dni w 37°C. Następnie do studzienek dodawano TCA i po odpłukaniu martwych komórek badano ilość białka komórkowego przylegającego do płytek przez dodanie barwnika SRB jak to opisano przez P. Skehana i in., J. Natl. Canc. Inst., 82, 1107 (1990). Siłę związku oceniano przez stężenie niezbędne do zahamowania wzrostu komórek w 50% (IC50).

Po traktowaniu lekiem fenolowo iperytowym komórek LoVo obserwowano IC50 rzędu 1 pM. W przeciwieństwie do powyższego, prolek kwasu glutaminowego był znacznie mniej cytotoksyczny, IC50 rzędu 50 pM (fig. 22). Tak wiec, prolek RNazy jest około 50-razy mniej cytotoksyczny dla komórek nowotworowych niż lek wytworzony przez cięcie zmutowaną RNazą,

Jeżeli do studzienek zawierających prolek kwasu glutaminowego dodano 100 pg zmutowanej HCPB (D253K) obserwowano cytotoksyczność porównywalną z opisaną w przykładzie 17,

184 031 wykazując w ten sposób konwersję proleku przez zmutowany enzym z uwolnieniem silniejszego leku. Dodanie 100 pg natywnej ludzkiej CPB do każdej ze studzienek nie wpłynęło istotnie na cytotoksyczność proleku.

Badania te wykazały aktywność zmutowanej CPB (D253K) konwertującą względnie nieaktywny prolek w cytotoksyczny lek zdolny do niszczenia komórek nowotworowych.

Przykład 24

Wytwarzanie białka fuzyjnego humanizowanego A5B7(Fab')2-D253K HCPB

Powtórzono procedurę opisaną w przykładzie 21, ale zastąpiono sekwencje mysiego łańcucha lekkiego i Fd A5B7 przez sekwencje humanizowanego A5B7, zaś sekwencje HCPB zastąpiono sekwencją D253K. Białko fuzyjne ekspresjonowano w komórkach COS przez kotransfekcję sekwencją preproHCPB opisaną w przykładzie 21. Ekspresję białka fuzyjnego na wielką skalę przeprowadzono przez przejściowe wprowadzenie wektorów plazmidowych (750 #g) każdego do komórek COS-7 (11) zasadniczo, jak to opisano w przykładzie 21. Produkt oczyszczono przez przepuszczenie nadsączu zawierającego białko fńzyjne przez unieruchomione białko A i eluowanie związanego białka fuzyjnego buforem o wysokim pH albo przez przepuszczenie nadsączu zawierającego białko fuzyjne nad unieruchomionym inhibitorem kαaboksyeeptydrzy, a następnie metoda oczyszczania enzymu rekombinowanego karboksypeptydazy i elucja tym samym buforem jest stosowana jak w przypadku enzymu w przykładzie 12. Obie metody mogą obejmować dalsze oczyszczanie białka fuzyjnego przez chromatografię żelową, chromatografię jonowymienną chromatografie oddziaływania hydrofobowego albo ich kombinacje.

Powtórzono procedurę opisaną w przykładzie 21, ale zastąpiono sekwencje mysiego łańcucha lekkiego i Fd A5B7 jak pokazano na Identyfikatorze Sekw. nr 25 i 26, przez sekwencje humanizowanego A5B7 pokazane jako Identyfikator Sekw. nr 28 i 29. Sekwencje HCPB według przykładu 21 zastąpiono sekwencją D253K (opisana w przykładzie 15 ale bez znacznika (His)6-c-myc). Matrycę do PCR w przykładzie 21 (pICI1698) zastąpiono przez pICI1713 (opisano w przykładzie 15).

Humanizowane sekwencje pokazane jako Identyfikator Sekw. nr 28 i 29, są wytwarzane różnymi sposobami w tym opisane przez Edwardsa (1987) Am. Biotech. Lab., 5;38-44; Jayaraman i in., (1991) PNAS USA 88:4084-4088, Foguet i Lubbert (1992) Biotechniques 13:674-675 i Pierce (1994) Biotechniques 16:708.

Przykład 25

Fermentacja w wytrząsanych butelkach do wytwarzania D253K HCPB

Szczep E. coli MSD 213 transformowano plazmidem pICI1713 (patrz przykład 15) po czym powstały szczep MSD 213 pZenl713 (MSD 1924 pZenl713) przechowywano w mieszaninie do zamrażania z gliceryną w -80°C.

MSD 213 pZenl713 rozmażano po płytkach agarowych zawierających L-tetracyklinę (10 pg/ml) w celu rozdzielenia pojedynczych koloni, po całonocnym wzroście w 37°C. Pobrano z powierzchni płytek sześć pojedynczych kolonii MSD 213 pZenl713, zawieszono w 10 ml pożywki z L-tetracykliną (10 pg/ml) i natychmiast inokulowano przy użyciu 100 pl zawiesiny 250 ml butelkę Erlenmeyera zawierającą 75 ml pożywki z L-tetracykliną (10 pg/ml). Po 15-16 godzinnej hodowli w 37°C na wytrząsarce (300 obr/min) zawartość butelki zastosowano do inokulacji dziewięciu butelek Erlenmeyera zawierających 600 ml pożywki z L-tetracykliną. Butelki inkubowano w 20°C na wytrząsarce do uzyskania OD550=0,5. W tym momencie indukowano ekspresję białka heterologicznego przez dodanie L-arabinory w stężeniu końcowym 0,01% i prowadzono dalej inkubację w 20°C jak to opisano wyżej przez 42 godziny. Zużytą pożywkę oddzielono od komórek bakterii przez odwirowanie w wirówce Sorvall RC-5B (7000 x g, 4°C 30 minut) a osad komórek przechowywano w -70°C.

Przykład 26

Zastosowanie ADEPT w autologicznym przeszczepieniu szpiku

Autologiczne przeszczepienie szpiku obejmuje pobranie od pacjenta jego własnego szpiku przed podaniem mu intensywnej radiochemioteraeii. Szpik zwraca się pacjentowi po za-kończeniu leczenia. W niektórych nowotworach, takich jak białaczka i chłoniaki linii limfocytów B i T oraz w rakach sutka, płuc, okrężnicy, komórki nowotworowe naciekają szpik,

184 031 i powinny być wyeliminowane przed ponownym wprowadzeniem szpiku, w celu polepszenia przeżywalności. Uprzednio stosowano koniugaty przeciwciała i toksyny w celu eliminacji komórek nowotworowych do autologicznego przeszczepu szpiku (Blakey DC i in., Próg. Alergy., 45, 50, 1988).

ADPT może być zastosowane w tym celu, zwłaszcza w połączeniu z krótkotrwałymi aktywnymi iperytowymi czynnikami alkilującymi zastosowanymi jako składnik leku. Tak więc, autologiczny szpik zawierający komórki nowotworowe może być inkubowany z odpowiednim koniugatem przeciwciała i enzymu. Po związaniu koniugatu swoiście z komórkami nowotworowymi pozostały koniugat może być odpłukany. Następnie dodaje się proleku, zaś lek wytworzony w pobliżu komórek nowotworowych dodatnich pod względem abntygenu może niszczyć komórki nowotworowe. Normalne komórki szpiku mogą być chronione przez odpowiednie ustalenie rozcieńczenia komórek szpiku w celu zapewnienia odpowiedniego dystansu pomiędzy miejscem wytwarzania leku na komórkach nowotworowych i komórkami szpiku w taki sposób, że lek jest unieczynniany zanim osiągnie komórki szpiku. Dodanie białka działającego jako nukleofil do reaktywnego leku iperytowego powinno również zmniejszyć uszkodzenie normalnych komórek szpiku.

184 031

LISTA SEKWENCJI

INFORMACJA. DLA ID. SEKW. NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:1:

GGTCTGCCCA TTCTCGCAGG CAACATTTTT

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:2:

TGCTACCAGA GCTACTCCAC CATGAGCATC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ci) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 3:

AATGTTGCCT GCGAGAATGG GCAGACCAAT

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 4:

CTGGGAGCAC ACGGCCTGGA CATCAGCCA

184 031

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 5:

CGCGCGAATT CGGGTCCAGC CTTCCCTGGG C

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 6:

GGCCGGAATT CCATCAAAGT GGACTGGCAC A

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 7:

CGCTGTTGGT CCTGGTGCTG CTGCTGGTGC GGGTCCAGCC TTCCC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 8:

TGATGGCTCT GAAGTCCCTG GTCCTGTTGT CGCTGTTGGT CCTGG

184 031

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 46 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:9:

GCGCGAATTC ATGTTCTTGG AGGATGATTG ATGGCTCTGA AGTCCC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 48 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:10:

CGCGGAATTC CTAGGTAGAG TCTTCAACAG AAGCATCAAA GTGGACTG

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:11:

AAGGAATCCG CTGCCGCTAA ATTCCAGCGG CAG

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:12:

GGAAGGCTGG ACCCGCACCA GCAGCAGCAC

184 031

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:13:

CTGGAATTTA GCGGCAGCGG ATTCCTTGCC CAG

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:14:

CATATGGACT CAGACAGTTC CCCCAGCAGC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:15:

GTGTGAATTC CCATGGCGAA GGAATCCGCT GCCGCTAAA

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:16:

GTGTGAATTC CTAGGTAGAG TCTTCAACAG AAGC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 50 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:17:

ATATAAAGCT TGCCGCCACC ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT

184 031

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 48 zasad (B) TYP¹: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:18:

ATCGAATTCG CCGCCACCAT GGATTTTCAA GTGCAGATTT TCAGCTTC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:19:

TGAGAATTCT TACTATGTAC ATATGCAAGG CTTACAACCA CAATC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:20:

GCGCCGAATT CTTATTAACA CTCATTCCTG TTGAA

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:21:

GACCTGGAAC TCTGGATCTC TGTCCAGCGG

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:22:

184 031

AGGTGTGCAC ACCGCTGGAC AGAGATCCAG

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:23:

TGGTACCAGC AGAAGCCAGG TTCCTCCCCC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:24:

GGATTTGGGG GAGGAACCTG GCTTCTGCTG

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 777 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:25:

AAG

CTT

GCC

GCC

ACC

ATG Met

AAG Lys 1

TTG Leu

TCG5 Τη?

CTG Leu 5

AAC Asn

TGG Trp

ATT Ile

TTC Phe 10

CTT Leu

GTA Val

44

ACA

CTT

TTA

AAT

GGT

ATC

(CAG

TGT

GAG

GTG

TAAG

CTG

GTG

GAG

TCT

GGA

99

Thr

Leu

Leu

Asn

Gly

Ile 15

Gin

Cys

Glu

Val 20

Lys

Leu

Val

Glu Ser 25

Gly

GGA

GGC

TTG

GTA

CAG

CCT

GGG

GGT

TCT

CTG

AdA

CTT

TCC

TGT

GCA

ACT

14 T

Gly

Gly

Leu

Val

Gin 30

Pro

Gly

Gly

SSr

Leu 35

TArg

Llu

SSe

Cys 40

Ala

Thr

TCT

GGG

TTC

ACC

TTC

ACT

GAT

TAC

TAC

ATG

TA^C

TTG

GGT

CGC

CAG

CCT

192

Ser

Gly

Phe; Thr 45

Phe

Thr

Asp

Tyr 50

Tyr

Met

Asn

PTp

PV1 55

TArg

Gin

Ppo

ACA

GGA

AAG

GCA

CTT

GAG

T(G3

TTG

GGT

TTT

PAT

TGA

TAA

TAAA

GCT

TAC

240

Pro

Gly Lys 60

Ala

Leu

Glu

Trp 65

Llu

Gly

Phe

Pil 70

T^

Adi

TLy

Ala

Asn 75

GGT

TAC

ACA

ACA

GAG

TAC

AGT

GCA

TCT

GTG

AAG

GGT

CGG

TTC

ACC

ATC

288

Gly

Tyr

Thr

Thr

Glu

Tyr 80

Ser 1

Ala

Ser

Val

Lys

Gly 85

Arg

Phe

Thr 90

Ile 1

184 031

TCC

AGA

GAC

TAA

TCC

AGC

ATC

CTC

TAT

CTT

CTA

ATG

TAC

ACC

CTG

336

Ser

Arg

Asp

Lys

Ser

Gln

SSr

11 e

Leu

Tyr

Leu

GGl

Met

Asn

Thr

Leu

95

100

105

AGA

GCT

GAG

GAC

AGT

GtCCC

ACT

TAT

TAC

TGT

ACTA

AGA

GAT

AGG

IG3G

CTA

384

Arg

Ala

Glu

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

CCS

Thr

PAg

Asp

Arg

Gly

Leu

110

115

120

CGG

TTC

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGC

ACC

ACT

CTC

ACTA

GTC

TCC

433

Arg

Phe

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Τηρ

Gly

Gln

Gly

Thr

Thr

Llu

Thr

Val

Ser

125

130

Π5

TCA

GCC

AAA

ACG

ACA

CCC

CCA

TCT

GTC

TAT

CCSA

CTG

GCC

CCT

GIGA

TCT

440

Ser

Ala

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

ALa

Pro

Gly

Ser

140

145

150

GCT

GCC

CAA

ACT

AAC

TCC

ATG

GTG

ACC

CTG

GA

TGC

CAG

GTC

PAG

GC

522

Ala

Ala

Gln

Thr

Asn

Ser

Met

Val

Thr

Leu

Gly

C/s

Llu

Val

Lys

Gly

155

160

165

170

TAT

TTC

CCT

GAG

CCA

GTG

AAA

GTG

ACC

TG

PAC

TTT

G(A

TCT

CTG

TCC

576

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Thr

Trp

Asn

SSe

GGy

Ser

Leu

SSr

175

180

185

AGC

GGT

GTG

CAC

ACC

TTC

CCA

gct

GTC

CTG

cag

TTT

GGA

CTC

TAC

ACT

662

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

SSe

JAp

Leu

Tyr

Thr

190

195

200

CTG

AGC

AGC

TCA

GTG

ACT

GTC

CCC

TCC

AGC

ACC

TG

PCT

PA.C

GAG

ACC

667

Leu

Ser

Ser

Ser

Val

Thr

Val

Pro

SSe

SSe

Thr

Tto

Ppo

See

Glu

Tł^h?

205

210

211

GTC

ACC

TGC

AAC

GTT

GCC

CAC

CCG

GCC

AGC

AGC

AAC

PAA

ATG

GAC

PAG

772

Val

Thr

Cys

Asn

Val

Ala

His

Pro

ALa

SSr

SSe

TTr

PLS

Val

Asp

Lls

220

225

230

235

AAA

ATT

GTG

CCC

AGG

GAT

TGT

GGT

TGT

TAG

CTT

PTG

AT/T.

ACjT

ACA

PTA

778

Lys

Ile

Val

Pro

Arg

Asp

Cys

Gly

CCS

Lys

Pro

(Cs

Ile

Ics

Phi:

End

240

245

250

TAA GAA TTC Koniec

777

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 732 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:26:

GAA TTC GCC GCC ACC ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG 48 Met Asp Phe Gln

Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu 1

10

184 031

96

CTA Leu

ATC Ile

AGT Ser

GCT TCA ATC Ala Ser Val 15

ATA ATG Ile Met

TCC Ser

AGA GAA Arg Gly 20

CAA Cln

ACT ATT Thr Val 25

CTC Leu

TCC Ser

CAG

TCT

CCA

GCA ATC CTG

TCT GCA

TCT

CCA AAi

GAC

AAA CTC

AAA

ATG

144

Gln

Ser

Pro

Ala Ile Leu

Ser Ala

Ser

Pro Gly

ilu

Lys Val

Thr

Met

30

35

40

ACT

TGC

AGG

GCC AGC TCA

AGT GTA

ACT

TAC ATT

CAC

TGG TAC

CAG

CAG

192

Thr Cys Arg

Ala Ser

Ser

Ser Val

Thr

Tyr I1a

His

Tgp

Gln

Gln

45

50

55

AAG

CCA

GGT

TCC TCC CCC

AAA TCC

TGA

Att TAT

CCC

ACA TCC

GAAC

CTG

240

Lys

Pro

Gly

Ser Ser Pro

Lys Ser

Trp

Ile Tyr

Ala

Thr Ser

Asn

Leu

60

6G

70

75

GCT

TCT

AAA

GTC CCT ACT

CiC TTC

AGT

GGC AGT

CCG

CCT GAG

ACC

TCT

288

Ala

Ser

Gly

Val Pro Ala

Arg Phe

Ser

Gly Ser

Aly

Ser Gly

Thr

Ser

80

85

90

TAC

TCT

CTC

ACA ATC AGC

AGA GTG

GAG

ACT GAA

CAT

GCT GCC

ACT

TAT

336

Tyr

SSr

Leu

Thr Ile Ser

Arg Val

Glu

Ala Glu

Asp

Ala Ala

Thr

Tyr

95

100

105

TAC

TGC

CAA

AAT TGG AGT

AGT AAA

CCA.

ccc; aca

TTC

(ATT GGA

GGC

ACC

38 4

Tyr Cys Gln

His Tgp

Ser

SSr Lys

Pro

Pro Thr

Phe

Gly

Gly

Thr

110

115

120

AAG

CTG

AAA

ATC AAA CGG

GCT GAT

GCT

GCA CAA

ACT

ATA TCC

ATC

TTC

432

Lys

Leu

Glu

Ile Lys Arg

Ala Asp

Ala

Ala Pro

Thr

Val Ser

Ile

Phe

125

130

135

140

CCA

CCA

TCC

AGT AAG CAG

TTA ACA

TCT

CCA CCT

CCC

TCA CTC

GTG

TGC

480

Pro

Pro

Ser

SSr Gil Gln

Liu Thr

Se r

GGy Gil

Aly

Ser Val

Va 1

Cys

145

150

115

TTC

TTC

AAC

AAG GTC GAC

TAC AAA

GAA

AG i AAT

AAT

AAG TGG

AAG

ATT

528

Phe

Leu

Asn

Asn Phe Tyr

Pro Lys

Asp

Ile Asn

Val

Lys Trp

Lys

Ile

160

165

170

GAT

GGC

AGT

GAA CGA CAA

AAT GGC

ATC

CTC AAC

AAT

TGG ACT

AAT

CAi

576

Asp

Gly

Ser

G 1a Arg G ln

Aln Gly

Vg1

Lgv Ase

Asr

Te? gpt

Gga

pil

175

180

185

GAC

AGC

AAA

GAA AAi GCC

AAC AGC

AGA

AGA AAi

AAC

CTC ACG

TTG

ACC

624

Asp

Ser

Lys

Asp Ser Thr

Tyr Ser

Met

Ser Ser

Thr

Leu Th?

Leu

Th?

190

195

200

184 031

672

AAG Lys

GAC Asp

GAG Glu 205

TAT Tyr

GAA Glu

CGA Arg

CAT His 210

AAC Asn

AGC Ser

TAT Tyr

ACC Thr

TGT GAG Cys Glu 215

GCC Ala

ACT Thr

CAC His

AAG

ACA

TCA

ACT

TCA

CCC

ATT

GTC

AAG

AGC

TTC

AAC AGG

AAT

GAG

TGT

720

Lys

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn Arg

Asn

Glu

Cys

220

225

230

235

TAA

TAA

GAA

TTC

732 koniec

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:27:

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC

INFORMACJA. DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 777 PAR ZASAD (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:28:

AAG Met

CTT GCC

GCC ACC ATG AAG

TTG TGG CTG

(AAC Val

TGG

ATT

TTC

CTT 10

GTA

Lys

Leu

Τη?

Leu Asn 1

Τη?

Ile

Phe

Leu 5

ACA

CTT

TTA

HAT

GGT

ATC

CAG

TGT

GAG

GTG

CAG

CTG

CTG

GAG

TCT

GGA

Thr

Leu

Leu

AAsn

Gly

Ile

Gin

Cys

Glu

Val

Gin

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

15

20

25

GGA

GGA

CTG

GTG

CAG

CCT

©GA

GGA

TCT

CTG

AGA

CTG

TCT

TGT

GCA

ACA

144

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Tłh

30

:35

40

TCT

GGA

TTC

ACC

TTC

ACA

GAC

TAC

TAC

ATG

AAT

TGG

GTG

AGA

CAG

GGA

192

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Thr

Asp

Tyr

Tyr

Met

Asn

Trp

Val

(Arg

Gin

All

45

50

55

CCT

GGA

AAAG

GGA

CTC

GAG

TGG

CTG

GG3C

TTC

ATC

GGA

AAAT

AUG

GCA

(AA

240

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Asn

Lys

Akia

A.—

60

(55

70

76

184 031

280

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

GGA

TAC ACA ACA GAG

TAC

TCT

GCA TCT

GTG GAG GGA AGA TTC ACA ATT

Gly

Tyr

Thr

Thr

G1g

uyr

Ter

Ala

Ac r

Val

Lys

(Al y

Arg

ype

Thr

11 e

80

85

90

TCC

AGA

GAC

TAC

AGA

AAG

TCC

ACA

CTG

TAC

CTG

TGCG

ATG

AGT

ACA

CTG

Ser

Arg

Asp

Lys

SeS

rys

Ser

Thr

Le u

Tyr

Leu

Gln

Met

Asn

Thr

Le u

95

100

105

CAG

GCA

GAG

GAA

TCT

TCA

ATT

TAC

TAC

TGT

ACA

AGA

(TGC

A(Al

GGA

CTG

Gln

Ala

Glu

Aap

AeS

Ala

Ile

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Ar g

Asp

.Arg

Gl y

leu

110

]^^5

120

AGA

TTC

TAC

TTC

CAC

CAC

TGG

GGA

CAG

G<GI

ACA

CTG

GTG

ACA

GTG

T'T

Arg

Phe

Tyr

Phe

Asa

Tyr

Typ

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Vay

Thy

VcV

Sir

125

130

135

TCT

GCT

AGC

AAC

AAC

GGA

CCCI

TCG

GT C

TTC

CCC

CTG

GCC

CCC

TGC

TCC

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

140

145

150

155

AGG

AGC

ACC

TCC

GAG

GGC

GCA

GCC

GCC

CTG

GGC

TGC

CTG

GTC

CCG

GUC

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Sec

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Lys

Asp

160

16l

170

TAC

TTC

CCC

GCGl

CCG

GTG

ACG

GTG

TCG

TGG

GCCC

TCA

GGC

GCT

CTG

ACC

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

IPn

SSr

Gly

Ala

Leu

Thr

175

185

AGC

GGC

GTG

CAC

ACC

TTC

CCG

GCT

GTC

CTA

CAG

TCC

TCC

GCCA

CTC

TAC

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

SSr

Ser

Gly

Leu

Tyr

190

195

200

TCC

CTC

AGC

AGC

GTC

GTG

ACG

GTG

CCC

TCC

AGC .

AAC

TTC

GGC

ACC

CAG

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

GGn

205

210

215

ACC

TAC

ACC

TGC

GGC

GTA

GAT

CAC

AAG

CCC

AGC

AAC

ACC

ACG

GTG

GAC

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Csn

TTa

Lls

Val

Aap

220

225

230

223

AAG

ACA

GTT

GAG

CGC

GGG

TGT

TGT

GTC

GAG

TGC

CCA

CCC

CTC

CCG

TTC

Lys

Thr

Val

GGs

Arg

Lys

Cys

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Ppa

lEd

240

245

225

777

TAG GCC TTC koniec

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:2 9

184 031 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 732 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) SEQUENTE DESCRIPTION: SEQ. ID NO 29:

GAA TTC GCC GCC ACC ATG GAT TTT ClA GTG KG ATT TTC AGC TTC CTG

Met Asp Phe

Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu

96

CTA Leu

ATC lie

AGT Ser

GAT Ala 15

1 TCA S er

GTA Va1

ATA Ile

ATG Met

5 TTT Ss r 20

AGA Arg

GGA Gly

CAG Gln

ATT Thr

10 GTA Val 25

ttt Le u

ATT Thr

TAG

AGT

CK

ACT

AGT

CT C

AGT

GTA

AGT

GTA

GGT

GAT

AGG

GTA

ACT

ATG

144

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

Ser

Val

Gly

Asp

Alg

Val

Thr

Met

30

35

40

ACT

TGT

AGG

GCC

AGT

AGT

AGC

GTA

ACT

CAC

ATC

CAT

TGG

TAT

CAG

CAkCS

192

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Thr

Tyr

Ile

His

Trp

T^y:c

Gln

GGl

45

50

55

AAA

CCA

GGT

TCT

GCC

CCA

AAA

AGC

TGG

ATC

TAC

GCC

ACT

AGT

saac

CTC

240

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

Ser

Trp

Ile

Tyr

Ala

Ths

Ses

Asn

Leu

60

65

70

75

GCC

AGT

GGT

GTA

CCA

CCC

AGA

TTC

.AGT

GGT

AGT

GTA

GTA

GTs

ACs

GAT

288

Ala

Ser

GliT

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

80

85

90

TAT

ACT

CCC

ATT

ATC

AGT

AGT

CTC

CAG

CCA

GAA

GAT

ATC

GCC

ACT

TAC

336

Tyr

Thr

LeL

Thr

S le

e sr

Ser

Leu

GSn

Pro

Glu-

As p

Ile

Ala

Thr

Tyr

95

100

H5

TAT

TGC

CAG

CAC

TGG

AGT

AGT

AAA

CK

CK

ATT

TTC

GGT

CAG

GGT

ACT

384

Tyr

Cys

(Gln

His

Trp

Ser

Ses

Lys

Pos

Ppo Thr

Phe

Gly Gln Gly Thr

110

115

120

AAA

GTA

GAA

GCA

AAA

CGC

ACT

GTG

GAC

GCA

CCA

TCT

TTG

CTC

ATC

scc

432

Lys

Val

Glu

Val

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

SeS

Vsl

lhe

sIl

shh

125

130

135

CCG

CCA

CCC

GAC

GAG

CAG

TCG

AAA

TCT

GGA

ACT

GCG

tst

CTT

sgt

sCG

480

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys

Se r

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

140

145

150

155

CTG

CTG

AAC

AAC

TTC

CAC

CCC

A(AG

GGC

saka

GTA

CAG

TGG

AAGG

GTG

528

184 031

Leu Leu Asn Asn

Phe 160

Tyr Pro Arg Glu

Ala 1.65

Lys

Val

Gln

Trp

Lys 170

Val

GAT

AAC

GCC

CT C

GAA

TCG

GGT

AACC

TCC

CAG

CAG

AGT

GTC

ACA

(GAG

CAG

576

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

175

180

185

GAC

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

624

Asp

Ser

Lys

AAs

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

SSr

190

195

220

AAA

GCA

GAC

TAA

GAG

AAA

CAC

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GGA

GTC

ACC

CCT

672

Lys

Ala

Asp

T Tr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

205

21T

215

CAG

GGC

CTG

AAT

TCG

CCC

GTC

ACA

AA^G

AGC

TTC

AAC

AGG

(GA

GAG

TG^T

720

Gln

Gly

Leu

Seer

Ser

Pro

Val

Tir

Lys

Ser

PŁie

Asn

Arg

Gly

Glu

Ccs

220

222

230

223

TAA

TAG

GAA

TTC

732

koniec

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:30:

AAGGTCACCT GCGAAAACGG GCAGGGCAAC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 25 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:31:

CTGGAAACAG ACATTCTGGA CATCT

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:32:

184 031

GCTTTGCCTG TTyTCGTACC yGATTTTTTC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 26 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ci) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:33:

TGTTATAACA GCAACyCCAC TATGTA

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 41 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ci) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 34:

CTCTAGCAAT TCTTAyyACy ATACCTGTTC TACCACCTAC C

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 108 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 35:

CCTAAGCTTG CCG^A^AT GTyCCTAGTC TyGGTTTTCG TCACTCTGGT CCTGGCATCy CTyGCAACAG CATACACTTA TGACAACTAC AACAACyCCG CAATCAy

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 36:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 16 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 36:

AACAGCTATC ACCAyG

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 17 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

184 031 (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW·. NR: 37:

TΑASAΑCGΑC GGCCAGT

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 38:

TCGCTATTAC CAATGTGATT CGTATTTGTC

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 39:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa {xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 39:

CATACTCTTC AGCATGACCS CAG

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 54 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 40:

CCCAΑGCTTT CCTCCSCCAA TTTGTCACTC ATTGATCTGG ATACTGATTC CCTG

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 41:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 39 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 41:

CΑCΑΑSΑCΑG SAAACAAATA SACGSACCCG GCTATCSSA

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 34 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

184 031 (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: '42:

GGATCTGCTG CCCAAGCTTA CTCCATGGTG ACCC

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 80 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 43:

CTTCTCATAA CTGTGTCCTG TTGCGAACAC GCTGCTCACC TCGGGCACTG TACATATGCA AGGCTTACAA CCACAATCCC

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 78 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 44:

GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTGCCC GAGGTGAGCA GCGTGTTCGC AACAGGACAC AGTTATGAGA AGTACAAC

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 27 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 45:

CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TGCCTCC

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 46:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 20 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 46:

GTTGGAGCTC TTGGTTCTGG

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 47:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

184 031 (A) DŁUGOŚĆ: 22 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 47:

GGAGGGGCGG CGCCCCCCGC CC

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 48:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 21 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 48:

GTTTGATTGT AGAGCCCGCG C

INFORMACJA DLC IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 49:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 22 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 49:

CTGCACAΑGG AGGGGCACCG CC

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 50:

(i) CHARAKCERYSCYKC SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 24 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 50:

GCAACrGCTr TGAGGCCGAC TCCG

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 51:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(Α) DŁUGOŚĆ: 23 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 51:

GAGACCCCGC AGCAGGTCCA CCG

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 52:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

184 031 (A) DŁUGOŚĆ: 19 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 52:

TGΑCCTGCΑT CAGAGACTT

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 53:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 21 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW/. NR: 53:

TCCTTAGCTC SATAATTAAT G

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 54:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 54:

CCTTTTASAA GCAGAAGATA CTG

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 55:

^TAC^TGA SAGSACTATC CTC

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 56:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 1263 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 56:

GATCTCATGG AACTTTATAC AGTTGCCCTT GCATCTGCAC AACATGTTTT TTSTCACTTT 60

GAAGGCGAGA AGGTTAACCT TGTTSACGTT TSATATTAAA SΑCΑCΑΑTSΑ 120

CAT^TCCGC

184 031

	CAGTTCCTCA	GTACCACCCA	GAyycAcyyτ	TCCAAGTTAG	AyτcycτcAC
ATAAATTAAA	180 TTyTATACTA	TACTTGACTy	CTGyGTTAAA	GTAGAAGAyA	τycycAτycτ
CCAGAAyCTT	240 TyAAACTACA	AyCAATyATA	AyATAACCyA	TTGAyAACTA	ATTTGACAAA
TGTGGyGCAG	300 GTTCACTyTC	ATACTTGGCT	yτcycτAATA	GCATACACyT	AyGAGAACTA
CAATAACTCC	360 GAAATCATAC	ACCTyTCCAT	TTAATAAGTT	GCTATTGAGA	ATTCAGTTTy
cAτττcyccc	420 AcycτyAτcG	CAACTATATy	yCΑCGCΑTCT	CCyATTTATT	yττyGCAGcτ
yGCCAAAGCT	480 CCACAAAATA	AGTCTGCTAy	ττycAyccAc	TGTGGyyyτc	AyCCCACACA
GTGGAyTTCy	540 CTTCCAyTTT	GCTAcyGcyy	TGTAACAGAC	GcτGyyccyA	ττyAyccACG
TCACATCCAA	600 CTCATAGAGC	yTCTCGATAA	GyTACACTTT	TAyGyccτcc	cycyGCττAA
TATTCAyGGC	660 yATAycyACA	CCyCCACTAA	cACτcGAτyy	yCGACAAACA	τyτcττττAT
TTATACTGCA	720 TTyACTTGCA	yTCCCACAGA	CCCCAACAGA	AAyTTyGAyC	τycGτyccτG
TGAAATTGCA	780 GTTTTTTCAA	ACττcyGycA	TGCAATyTAT	TGyccATτyc	TTCTAGAGTC
yCAAAAGCAG	840 ATCAACGTTC	yGGcycAτyy	TATTCCCAAC	AAAcyτττyτ	TTAyCAACCC
ATATCTGACA	900 AyτcAτyτcτ	ATTCCTCAAy	GATGAyCTAT	CTTTACTTAT	AyCCyTATAA
ACyCCCTGAG	960 AATAAyGTTG	AGyTGCAyGC	CCTCCCTAAA	GCTACyCTCA	AACAAcyyGC
CTCACyGCAT	1020 CGTATCAACT	ATATATAyGC	ccccccACτy	ACAATAATCy	AyτcyGTTGC
TGCCCGCTCy	1080 CATGACTCCG	CTTAyGACTA	AGGACyTACA	τAyττcτττA	cτyτyGAAττ
TCGAGAyATA	1140 CCTAGAyAyG	cττyycτcττ	yCCACAATTC	TAGATCTCGC	TTACCyGTGA
GGAGACCyTC	1200 TyCGCAATCA	AcτAyGτycc	TACCyACGTC	CTGGAACATC	τcyAτyAcττ
CAGAAACCTT	12 60 GAG 1263

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 57:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.

(A) DŁUGOŚĆ: 415 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) MOLECULE TYP: białko (xi) OPIS SEKW.: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 57:

Glu Leu Leu Val Leu Val

Thr

Val Ala -100

Leu

Ala

Ser

Ala -95

His

His

Gly

-105

Gly

Glu

His

Phe Glu

Gly

Glu

Lys Val

Phe

Arg

Val

Asn

Val

Glu

Asp

90

-85

80

Glu

Asn

His

Ile Asn

Ile

Ile

Arg Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Thr

Gln

Ile

-75 -70 -65

184 031

Asp -60	Phe	Trp	Lys	Pro Asp -55	Ser	Val Thr Gln Ile Lys -50	Pro His	Ser 45	Thr
Val	Asp	Phe	Arg	Val Lys	Ala	Glu Asp Thr Val Thr	Val Glu	Asn	Val
		-	40			-35 -	30
Leu	Lys	Gln	Asn	Glu Leu	Gln	Tyr Lys Val Leu Ile	Ser Asn	Leu	Arg
			-25			-20	-15
Asn	Val	Val	Glu	Ala Gln	Phe	Asp Ser Arg Val Arg	Ala Thr	Gly	His
	-	10				-5	1
Ser	Tyr	Glu	Lys	Tyr Asn	Lys	Trp Glu Thr Ile Glu	Ala Trp	Thr	Gln
5				10	15
Gln	Val	Ala	Thr	Glu Asn	Pro	Ala Leu Ile Ser Arg	Ser Val	Ile	Gly
		25			30	35
Thr	Thr	Phe	Glu	Gly Arg	Ala	Ile Tyr Leu Leu Lys	Val Gly	Lys	Ala
			40			45	50
Gly	Gln	Asn	Lys	Pro Ala	Ile	Phe Met Asp Cys Gly	Phe His	Ala	Arg
	55			60 65
Glu	Trp	Ile	Ser	Pro Ala	Phe	Cys Gln Trp Phe Val	Arg Glu	Ala	Val
70				75		80
Arg	Thr	Tyr	Gly	Arg Glu	Ile	Gln Val Thr Glu Leu	Leu Asp	Lys	Leu
85				90		95	100
Asp	Phe	Tyr	Val	Leu Pro	Val	Leu Asn Ile Asp Gly	Tyr Ile	Tyr	Thr
		105			110 115
Trp	Thr	Lys	Ser	Arg Phe	Trp	Arg Lys Thr Arg Ser	Thr His	Thr	Gly
			120			125	130
Ser	Ser	Cys	Ile	Gly Thr	Asp	Pro Asn Arg Asn Phe	Asp Ala	Gly	Trp
	135				140 145
Cys	Glu	Ile	Gly	Ala Ser	Arg	Asn Pro Cys Asp Glu	Thr Tyr	Cys	Gly
150				155		160
Pro	Ala	Ala	Glu	Ser Glu	Lys	Glu Thr Lys Ala Leu	Ala Asp	Phe	Ile
165				170		175			180
Arg	Asn	Lys	Leu	Ser Ser	Ile	Lys Ala Tyr Leu Thr	Ile His	Ser	Tyr
		185			190 195
Ser	Gln	Met	Met	Ile Tyr	Pro	Tyr Ser Tyr Ala Tyr	Lys Leu	Gly	Glu
			200			205	210
Asn	Asn	Ala	Glu	Leu Asn	Ala	Leu Ala Lys Ala Thr	Val Lys	Glu	Leu
	215				220 225
Ala	Ser	Leu	His	Gly Thr	Lys	Tyr Thr Tyr Gly Pro	Gly Ala	Thr	Thr
230				235		240
Ile	Tyr	Pro	Ala	Ala Gly	Gly	Ser Asp Asp Trp Ala	Tyr Asp	Gln	Gly
245				250		255			260
Ile	Arg	Tyr	Ser	Phe Thr	Phe	Glu Leu Arg Asp Thr	Gly Arg	Tyr	Gly

265 270 275

184 031

Phe

Leu Leu

Pro

Glu

Ser

Gln

Ile Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

280

285

290

Leu

Ala Iie

Lys

Tyr

Val

Ala

Ser Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

End

295

300

305

33)7

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 58:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW. :

(A) DŁUGOŚĆ: 35 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:58:

GCCGGGTTTG CGCAACTGGT CACTCTTACG AGAAG

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 59:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW. :

(A) DŁUGOŚĆ: 88 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:59:

CCGGAATTCT TATTAGTTCA GGTCCTCCTC AGAGATCAGC TTCTGCTCCT CGAACTCATG 60

GTGGTGATGG TGGTGGTACA GGTGTTCC 88

INFORMACJA. DLA ID. SEKW. NR: 60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW. :

(A) DŁUGOŚĆ: 22 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:60:

TTAGCGGATC CTGCCTGACG GT

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 61:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 61:

GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 62:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

184 031 (A) DŁUGOŚĆ: 20 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:62:

AGGTCTAGGG CGGGCCrTTA

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 63:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW. :

(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:63:

GAAGCGGCGr GTGrGAATGC GGC

INFORMACJA DLC ID. SEKW. NR: 64:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(Α) DŁUGOŚĆ: 1053 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:64:

CTG GCA TAC

CTA TTG

CCC Pro

ACG GCA Thr Ala -15

GCC GCC

GGA TTG TTA

TTA CTC

GCT Ala

48

Met

Lys

Tyr -20

Leu

Leu

Ala

Ala

Gly

Leu

Leu --0

Leu

Leu

GCC

CCA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

<GGT

TCT

TAC

CGCG

aag

TAC

AAC

96

Ala

Gln

Pro

Ala

Met

Cla

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

-5

-1

5

10

CCG

TGG

GAC

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CCC

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gln

Gln

Val

Ala

Thr

GSu

Asn

15

20

22

CCA

GCC

CCC

ATC

CCC

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TCT

GAG

GGC

CGC

192

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

PPa

Glu

Gly

Arg

30

35

40

GCT

AAT

TAC

CTC

CTG

CCG

GTT

GGC

iACC

GCT

GGA

CCC.

AGAT

CCCG

CCT

GCC

240

Ala

ISe

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gln

Asn

Lls

Pro

Ala

45

50

55

GCT

CTC

ACG

GAC

TGT

GGC

TTC

CCCT

GCC

AGA

GAG

TGG

AAT

TCT

CCT

GCA

288

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Tta

I1s

SSr

Pro

Ala

60

65

70

TCC

TGC

CAG

TGG

CTT

GTA

AGA

CAG

GCT

GCT

CC^G

ACC

CAC

GGA

CGT

GGn

336

Phe

Cys

Gln

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

TCa

.Ty

CGy

Arg

Glu

75

80

88

90

ATC CCA GTG ACA GAG CCC CCC GGC CCG TTA GCC CTT CAT GTC CTG CCC 384

184 031

Ile

Gln

Val

Thr 95

Glu

Leu

Leu

Asp 100

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr 105

Val

Llu

Ppo

GGT

ATC

GAT

GTT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ASC

GGG

ASC

AGG

AGC

CGA

GGG

432

Val

Leu

Asn

Ile

Asp 110

Gly

Tyr

Ile

Tyr

TIo 115

Trp

Thr

Lys

Ser Arg 120

Phe

TG

AGG

AAG

GCT

CGC

TCT

ATT

SAT

GCT

GGA

TAT

GGS

TGC

ATT

GGT

GSG

480

Trp

Arg

Lys 125

Thr

Arg

Ser

Thr

His 130

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys 135

Ile

Gly

Thr

GAS

ACT

AAC

GGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GT

TG

TGT

GGA

ATT

GG

GCC

TCT

528

Asp

Pro 140

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp 145

Ala

Gly

Trp

Cys 150

Glu

Ile

Gly

Gla

Ser

CGA

AAC

CAC

TOT

GAT

GAA

AST

TAS

GTG

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

57 6

Arg 357

Asn

Pro

Tys

Asp

Glu Thr 160

Tyr

Sys

Gly

Pro

Ala

Ala 165

Glu

Ser

Glu

110

GAG

GAG

ACC

AAG

PCC

CTG

GT

©AT

TTC

ATS

SGC

AAS

AAA

CTT

TCT

TTC

62 4

Lys

Glu

Thr

L ls 175

Ala

Leu

Ala

Asp 180

PPh

Ile

Arg

Asn

Lys 115

Leu

Ser

See

ATT

GAG

GCG

TAT

TTG

GCG

ATC

SAS

TAG

TAS

TCT

CAA

ATG

ATG

ATT

TGC

672

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu 190

Thr

Ile

His

Ser

Tyr 195

Ser

Gln

Met

Met Ile 200

Tyr

CCT

TAC

TCA

TAT

GTT

TGC

GAA

CTS

GGT

GAG

AAT

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser 205

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu 210

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala 215

Glu

Leu

Asn

GAC

ATG

TTP

AAP

GCT

ACT

GTG

PAAA

©A

CTT

GCT

TCA

CTG

CGC

GGC

AAS

7 P8

Ala

Leu 220

Ala

L ys

Ala

Thr

Val 225

Lls

ATe

Leu

Ala 230

Ser

Leu

His

Gly

TTh

AGG

TAC

GCG

TAT

GGC

CCG

GGA

GST

ASA

ASA

ATC

TAT

SCT

GTT

GCT

GGG

816

Lys 235

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro Gly 220

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro 224

Gla

Gla

Gly

225

GS

TAT

GAA

GAT

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTS

GCC

8 64

Gly

Ser

Asp

Asp 255

Trp

Ala

Tyr

Asp 260

Gln

Gly

Ile

Arg

Tyr 2 26

Ser

Phe

Thr

GGG

GAA

ATT

CGA

GAT

ACA

GGS

GGA

TAT

GGS

TGT

CTC

CTT

TCG

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp 270

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly 227

Phe

Leu

Leu

Pro Glu 220

Ser

TAG

ATC

AGG

GCT

ATC

TGC

GAG

GAG

ASS

GGS

TTG

GCG

ATC

AAG

TGT

GTT

960

Gln

Ile

Arg 285

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu 220

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile 330

Lys

Tyr

Val

GCC

AGC

TAC

GTT

ATG

GAA

SAS

ATG

TAS

SAS

CAC

CAT

CAC

CAT

CAT

GAG

1008

Ala

Ser 305

Tyr

Val

Leu

Glu

His 310

Leu

Tyr

His

His 315

His

His

His

His

Glu

TTA Phe 320

GAG Glu

GAG Glu

SGG Gln

GAG Lys

ATG ATS Leu Ile 325

TAT Ser

GAG Glu

GAG Glu

GAC Asp

ATG Leu

AAC Asn 330

TGG End

TAG End 332

105 3

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 65

184 031 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:65:

TAAAATATAC GCATCCCAAC CATCCAATGC G

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 66:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW. :

(A) DŁUGOŚĆ: 41 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:66:

TACAAAGSAA TCTTATTAGT ACSGTTGAAC TAGAATGTAG C

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 999 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:67:

ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CCC GCT 48

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

-20 -15 -10

GCC CAA CCA GCC ATG GCG GCA ACT GGT CAC TCT TAC GAG AAG TTA (AA 96

Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tjzx· AA^n

-5 1 5 10

SAG TGG GGAA ACG ATA GAG GCT TGG ACT CAA CCA GTC GCC ACT GAC AAC 144

Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Thr Gln Gln Val Ala Thr GG.u Ass

20 25

CCA GCC CTC ATC TCT CGC AGT GTT ATC GGA ACC ACA TTT GAG GG^G. TCG 192

Pro Ala Leu I1t Ser Arg Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu GGu Aso

35 40

GCT ATT TTCC CTC CTG TSSG GTT GGC AAA GCT GGA CCSC TSST (SAG CCC CTC 240

Ala Ile Tyr Leu Liu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gln Asn Lys Ppo ASu

50 55

ATT TTC ATG GAC TGT GGT TTC CAT GCC AGA GAG TGG ATT TCT CCT CTC 28T

Ili Phe Met Asp Cys Gly Phi His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Prr AAl

65 70

TTC TGC CAG TGG TTT GTA AGA (GAG GCT GTT CCT ACC TAT GGA CCT TG^A T3T

Phi Cys Gln Trp Phi Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly AAr TGu

80 85

184 031

ATC Ile

CAA GTG AAA G^tG

CTT Leu

CTC GAC AAG TTA GAC TTC

TAT Tyr 105

GTC Val

CTG Leu

CCT Pro

38s

Gln

Vil

Thr 95

Glu

Leu

Asp 110

Lys

Leu

Asp

Phe

GTG

CTT

AAT

ATT

GA.T

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ATT

GTAG

AGT

CGA

TTT

432

Vil

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Tho

Lys

Ser

Arg

Phe

110

115

120

TGG

AGA

TAG

ACT

CGC

TCC

ATT

CAT

ATT

GGA

TCT

AGT

TGC

ATT

GGT

ATA

480

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Sur

Cys

Ile

Gly

Thr

125

113

135

TAT

ACT

AAT

AGA

AAAT

ttt

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

528

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

150

CGA

AAC

CTC

TGT

GATT

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GTT

GCA

GAG

TTT

GAA

57s

Arg

Asn

Pro

Cys

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

155

110

165

1-70

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

TAT

AAT

CTC

TCT

TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

110

115

ACT

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

(GAC

TCG

TAC

TCC

TTA

ATG

ATG

ATC

TAC

^62.

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gln

Met

Met

Ile

Tyr

190

195

200

TTC

CAC

CTA

TAT1

GCT

TAC

siAA

CTC

GGT

GAG

GTAC

AAT

GCT

G-AG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205

221

221

GAA

ACT

GCC

GUTT

GCT

ACT

GTG

siTT

GGTC

CTT

GCC

TTA

CTG

CAC

GGC

ACC

7s 6

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

GTu

Lsu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

230

AAG

TAC

ACA

TAT?

TGC

CAG

GGA

stt

ACA

ACA

M^C

CAC

CTT

GCT

GCT

GGG

8 les

Lys

Tyr

Thr

Tyc

Ppo

Gly

Ala

Thr

Thr

Ili

Tyr

Ppo

Ala

Ala

Gly

235

240

224

250

GGT

TCT

GAA

gag:

CCG

GTT

TAT

GGC

CAA.

sta

stc

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

88 6

Gly

Ser

Asp

As.

pcv

sAa

scs

Ais

GTn

sTl

sIl

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

226

226

TCT

GAA

CTT

CGA.

AAT

ACA

sgg

AGA

sat

GGT

stt

CTT

CTT

CCA

GGTk

TCC

991

Phe

Glu

Leu

Arg

Ais

sAh

sGl

sao

scs

sTl

shh

Leu

Lsu

Pro

Glu

Sor

270

227

220

TAG

ACC

TGG

GCT

AAC

stt

saa

saa

sCA

scc

sta

GCA

AAC

siAG

TAT

GTT

960

Gln

Ile

Arg

Al a

ICh

ses

sTl

sTl

sCh

shh

ssu

Ala

Ili

ssn

Tyn

Val

285

290

300

TAT

AGC

TAC

G TC

sta

gsa

GAA

CTT

tsc

TAG

TGkA

gaatst TTT

Ala

Ser

Tyr

V v1

seL

usu

Glu

Lss

u yr

TnO

End

305

310

312

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 68:

184 031

Val

Thr

Gln

He

Lys -50

Pro

His

Ser

Thr

Val --5

Asp

Phe

Arg

Val Lys --0

Ala

GAA

GAT

ACT

GTC

ACT

GTG

GGG

AAT

GTT

CTA

(AAG

CAG

(AAT

GA

CTA

CA

288

Glu

Asp

Thr -35

Val

Thr

Val

Glu

Asn -30

Val

Leu

Lys

Gln

Asn --2

Glu.

Leu

Gln

TAC

AAG

GTA

CTG

ATA

AGC

AAC

CTG

AGA

(AAT

GTG

dG

GAG

GCT

CCAG

TTT

336

Tyr

Lys -20

Val

Leu

Ile

Ser

Asn -15

Leu

Arg

Asn

Val —-1

Val

Glu

TALa

Gln

Phe

GAT

AGC

CGG

GTT

CGT

GICA

ACA

GGA

CAC

AGT

TAT

GAG

ag

TAC

AC

TllG

384

Asp -5

Ser

Arg

Val

Arg

Ala

Thr 1

Gly

His

Ser

Tyr 5

Glu

Lyy

Tyr

Asn

Lys 10

TGG

GAA

ACG

AAA

GAG

GCT

TGG

ACT

CA

(CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AT

CCA

432

Trp

Glu

Thr

Ile

idu 15

Ala

Trp

Thr

Gln

Gln 20

Val

Ala

Thr

Glu An 22

Pro

GCC

CTC

ATC

TCT

AGT

GH

ATC

©Gt

ACCC

ACA

'TT

GAG

GGA

CGC

GCT

480

Ala

Leu

Ile 30

Ser

Arg

Ser Val 35

Ile

Gly

Thr

Thr 4

Phe 40

Glu

Gly

TArg

Al ił

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AGA

GCT

GGA

CA

AAT

(GAG

CCC

GCC

ATT

528

lie

Tyr 45

Leu

Leu

Lys

Val

Gly 50

Lys

Ala

Gly

Gln 55

Asn

Lys

Ppo

Ala

Ile

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GIGA

TTC

576

Phe 60

Met

Asp

Cys

Gly

Phe 1

His S5

Ala

(Arg

Glu

Trp

Iie

Sse 77

Ppo

Ala

Phe

75

TGC

CAG

TGG

TTT

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CCT

GAG

ATC

624

Cys

Gln

Trp

Phe 80

Val

Arg

Glu

Ala 88

vai

Arg

Tir

Tyr

Gly 99

TArg

Glu

Ile

CAG

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

(GAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GGC

CTC

CCT

GTG

672

Gln

Val

Thr

Glu

Leu 95

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp 110

ΡΡτ

Tyr

Val

Leu Ppo 110

Val

CTC

AAT

ATT

GAT

TAC

ATC

TAC

ACCC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TH

TGG

720

Leu

Asn

Ile 110

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr 115

Thr

Trp

flir

Lys

Ssu 112

(Ag

Phe

Trp

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCC

AGO

TGC

AAT

TGG

ACA

GAC

768

Arg

Lys 125

Thr

Arg

Ssr

Thr

His 130

Thr

Gly

Ssu

Ssu 113

Cys

Ile

TGu

Ητ

Asp

CCC

AAC

AGA

.AAT

TH

(GAT

GCT

GGT

TTG

TOT

Tdi

TTT

GGG

TGC

TCC

CGA

816

Pro 140

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp Ala 115

Gly

Τ'ρ

Ccs

GGu

Ile

GGu HO

Alu.

Tsu

TArg

155

AAC

CCC

TGT

GAT

GA

ACT

TAC

TTG?

GGC

TCT

TGC

GCA

GGG

TCC

GA

AG

864

Asn

Pro

Cys

Asp 160

GGu

Thr

Tyr

Cys 116

GGy

Tpo

TA i

Ala

GGu HO

Tsu

GGu

Lls

GAG

ACC

AAG

GCC

CCT

GCT

GAT

TTC

TlT

TCG

TAA

AA

CTC

TCC

TCC

ATC

912

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu 175

Ala

Asp

PPie

TIl

AAg 110

Tm

Lys

Leu

Ssr Ssu 118

Hii

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATC

ATG

GTC

TGC

CCT

960

184 031 (JA) DŁUGOŚĆ: 34 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (T) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:68:

CTSACTAGCC AAGTCTCAAC ATTGAGATAA GTAC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 69:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (T) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:69:

AACTGGAATC TCATATGCTA CTT

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 70:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW. :

(A) DŁUGOŚĆ: 21 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:70:

GAAAASAACC ATAACATCCA G

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 1284 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (T) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:71:

ATG TTT Mit Lys -117

TAT CTA Tyr 1ut -115

TTG Leu

CCT ACG

GCA GCC Ala Ala

GCT Ala 110

GGA TTG

TTA TTA Le^u Leu -105

CTC Leu

GCT Ala

48

Ppo

Thr

Gly

Leu

GCC CAA

CCA GTT

ATG

GCG

CAT

CAT GGT

GG^T

GAG

CAC

TTT GGA

GGC

GAG

96

Ala Gln

Pro Ala

Met

Ala

His

His Gly

Gly

Glu

HlS

PPie GGu

Gly

Glu

-100

_ <

95

90

AAG TAT

TTC TGT

GTT

AAC

GTT

GGAA (G«C

GAA

HAT

CCA

ATT TAC

ATA

ATC

144

Lys Val

Phe Arg

Val

Asn

Val

Glu Asp

Glu

Asn

His

IIu Asn

Hu

He

-85

-80

-75

-70

CGC GAG

TTG GTC

AGC

ACG

ACC

CAG ATT

GAC

TTC

TGG

TAG CCC.

(ΑΓ

TCC?

192

Arg Glu

Leu Ala

Ser

TTr

Tto

GGn He

Asp

Phe

TTp

Tyy Trr

Asp

Sse

-65

-60

-55

GTC ACA

CAA ATT

TTA

CCT

CAC

AGT ACA

GTT

GAC

TTC·

AGT GTT

TTA

GCA

240

184 031

Lys

Ala Tyr 190

Leu Thr

Ile

His

Ser Tyr 195

Ser

Gin

Met

Met 200

Ile

Tyr

Pro

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

GCC

1008

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

205

210

215

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

AAG

1056

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

Lys

220

225

230

235

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

GGC

1104

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

Gly

240

245

250

TCT

GAC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

TTT

1152

Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

Phe

255

260

265

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

CAG

1200

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

Gin

270

275

280

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

GCC

1248

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

Ala

285

290

300

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

TAA

TAA

GAATTC

1284

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

koniec

305 310 312

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 72:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:72:

GGTCATAAGC CCAGTCTTTA GAGCC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 73:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:73:

CCTGCTGCTG GGGGCTCTAA AGACTGG

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 74:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 1059 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

184 031 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:74:

ATA Met	AAA TAC	CTA Leu	TTC L se	GCC G r?	ACG GCA GCC Ghr Ala GALa -15	ACT Ala	(AGA TTG TTA TTA CCC Gly Lsu Leu Leu Leu -10	GCT GA.a	48
Lys	Tyg -20
ACC	CAA	CCA	GCC	AAG	GCG	GCA ACT GGT	CAC	TCT TAC GAG AAG TAC	GAC	96
Ala	Gln -5	Pro	Ala	Mee	AAl	.Ala Thr Gly 1	iis	S«5r Tyr Glu Lys Tyr 5 :	Asn 10
AAG	ClG	GAA	CiG	GAA	AAG	GCT Tm ACT	CAA	CCA. GlC GiC ACT GAG	GAT	144
Lys	Tgp	Alu	The 15	G li	Gil	Ala Tjgp Thr 20	Cln	Gln Val Ala Thr Glu 25	Asn
CCA	GCC	CTC	ATC	CCC	CiC	AGT CCC ACC	CCA	ACC ACA TTC AAG AAA	CGC	192
Pro	Ala	Leu	Ile	Ser 30	Agg	Ser Val Ile	Gly 35	Thr Th? Phe Glu Aly 40	Arg
ACT	ATT	TAC	CTC	CTG	•GAA	GTT GGC A?A	CCC	GGA CCA- GAT GAG CCT	GCC	240
Ala	lie	Tyg 45	Les	L eu	L yy	Gal Gly Lls 50	Ala	Gly Gln GAn Lys Ppo 55	Ala
ATT	TTC	ATG	GAC	TiT	GiT	TCC CAT GCC	AGA	GAG TGG ATT TCT CCT	ACA	288
lie	Phe 60	Met	Asp	Cys	Aly	Phe iis Ala 66	Agg	Glu Trp lie Se? Pro 70	Ala
TTC	TGC	CAG	TGG	CCC	GTA	AGA GAG iCC	GCC	ClT ACC TAT GAA CGT	GAG	33 6
Phe 75	Cys	Gln	Tgp	Phe	Val Agg Glu Ala 80	Val	Arg Thr Tyr Aly Arg 85	Alu	90
ATC	CAA	GTG	ACA	GAG	CCC	CCC GAC AAi	TCA	GAC TTT TAT GCC CTG	CCT	38 4
lie	Gln	Val	Thr 95	Glu	Leu	Leu Asp Lys 100	Leu	Asp Phe Tyr Val Leu 105	Pro
GTG	CTC	AAT	ATT	GAT	GGC	TAC ACC CAC	ACC	TGG ACC AAA AGC CAA	TTC	432
Val	Leu	Asn	Ile	Asp 110	Gly	Tyr Ile Ty?	Thr 115	Trp Thr Lys Ser Arg 120	Phe
TGG	AGA	AAA	ACT	CiC	TCC	ACC CAT ACT	AlA	CCC AlC TGC ATT AGC	ACA	480
Trp	Arg	Lys 125	Thr	Agg	Ser	Thr iis Th? 113	Aly	Se? Ser Cys lie Gly 115	Thr
GAC	CCC	AAC	AGA	AAC	TCT	GAT GCT llC	TGl	CGT GAA ACT GlA ACC	TCT	528
Asp	Pro 140	Asn	Arg	Asn	Phe	Asp Ala Gly 115	Trp	Cys Glu lie Aly Ala 110	Se?
CGA	AAC	CCC	TGT	GAC	GAA	ACT TAC ClT	GAA	CCC GCC GCA GAA TCT	GAA	57 6
Agg 155	Asn	Pro	Cys	Asp,	ilu Thr Tyr Cys 110	Aly	Pro Ala Ala Glu Ser 116	Alu	110
AAG	GAG	ACC	AAi	GCC	CTG	CCC GAC CTC	ATC	CGC AAC .AAA CTC TCT	TCC	62 4
Lys	Glu	Thr	Lys 175	Ala	Leu	Ala Asp Phe 188	Ile	Arg Asn Lys Leu Ser 118	Se?
ATC	AAA	GCA	TAT	CCi	ACA	ATC CAC TCi	TAC	CCC CAA ATG ATG ATC	TAC	672
lie	Lys	Ala	Tyr	Leu 190	Th?	lie iis Ser	Ty? 195	Se? Gln Met Met Ile 200	Ty?

184 031

CCC TAC

TCA Ser 205

TAT Tyr

GCT Ala

TAC Tyr

CAAC CCC

GAG GGy

GAG AAC AAT Glu Asn Asn

GCT Ala 215

GAG TTG ACT Glu Leu Asn

720

Pro

Tyr

Lls

Llu 220

GCC

CAG

GCT

TACc

GCT

ACT?

GTG

ASA

GACY

CTT GCC TCA

CTG

CAC GGC ACC

7 68

Ala

Leu 220

Ala

LyS

Ala

Thr

Val 222

Lls

GGu

Leu Ala Ser 230

Leu

His Gly Thr

CAG

TAC

AGA

CTT^C?

GGC

CCG

CGAC

GCC

ACA

ACA ATC TAT

CCT

GCT GCT GGG

816

Lys 235

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Ppo GGy 240

Ala

TTa

Thr Ile Tyr

Pro 245

Ala Ala Gly

250

GGC

TCT

AAA

GAC

TGG

GCT

ΤΑΤ

GGA

CCC.

GGA ATC AGA

TAT

TCC TTC ACC

864

GSy

Suo

Lys

Asp

Trp Ala 255

T?r

Asp

GGn Gly Ile Arg 260

Tyr

Ser Phe Thr 265

CTC

GAG

CTC?

CGGC

GAT

ACA

GGC

AGA

CAC

GGC TTT CTC

CTT

CCA GAA TCC

912

Phr

GSu

Leu

Arg

Asp 270

Thr

GGy

Arg

CCr

Gly Phe Leu 275

Leu

Pro Glu Ser 280

CAC

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GGA

GAG

ACC

TTC CTG GCCC

ATC

GAG TAT GTT

960

Gln ISe Arg TALa Thr Ccs GGu CGu CAa Phe Leu Ala IIe Lys Tyr Val

285 299 300

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GCAC

CCA

CCT

CAA

CAC

CAC

CCC?

CAC

CCC (CCT

GAG

1008

ASa

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Llu

CAr

His

His

His

His

His His

Glu

305

3H

315

CCC

GAG

GAG

CAG

cacg

CCA

AC? TC

CCC

CAG

CAG

GAC

CTG

CACC

ACA TTCC

GAA

105 6

Phe

Glu

Glu

Gln

Lys

Llu

Ul

CSe

CGu

Glu

Asp

Leu

Asn

koniec

320

325

330

332

CCC 1059

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 75:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:75:

GGTCATCCGC GCCGCGGGGA AGTCCC

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 76:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xś) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:76:

CCTTCCGCCG GGCGCCGCCG CGACC''

INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 77:

184 031 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKW.:

(A) DŁUGOŚĆ: 1059 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS IDENTYFIKATORA SEKW. NR:77:

ATG	STA	TAG	CTA	TTG	CCT	ACG	GCA
Mit	Lys	Tyr -20	Luu	Leu	Pro	Thr 15	Ala
GCC	CAA	CCA	GTT	ATG	GCG	GCA	ACT
Ala	Gin -5	Pro	Ala	Met	Ala	Ala 1	Thr
TAG	T^	G.AG	ACG	ATA	gag	GCT	TGG
Lys	Trp	Glu	ThT 15	Ile	Glu	Ala	Trp 20
GCA	GCC	CTC	ATC	TCT	CGC	AGT	GTT
Pro	Ala	Leu	liT	Ser 30	Arg	Ser	Val
GCT	ATT	TAC	CTC	CTG	TAG	GTT	GGC
Ala	lii	Tyr 45	Leu	Leu	Lys 1	Val 50	Gly
ATT	TTT	ATG	GAC	TGT	CTT	TTT	CAT
lie	Phe 60	Met	Asp	Cys	Gly	Phi 66	His
TTC	TGG	GAG	TGG	TTT	GTT	AGA	GAG
Phi 75	Cys	Gln	Trp	Phi	Val Arg 80	Glu
ATC	CTA	GTG	ATA	TAT	TTT	CTC	GAC
lii	Gln	Val	Thr 95	Glu	Leu	Leu	Asp 100
TAG	CTC	ATT	ATT	GAT	GGC	TAC	ATC
Val	Liu	Asn	Ile	Asp 110	Gly	Tyr	Ili
	AGA	TTG	ATT	CGC	TCT	ATT	CAT
Trp	Arg	Lys 125	Thr	Arg	Sir	Thr	His 130
GAC	CTC	TTC	AGA	AAT	TTT	GAT	GCT
Asp	Poo 140	Asn	Arg	Asn	Phe	Asp 114	Ala
GGA	AAC	CCC	AAA	GAT	GTT	ACT	TAC
Arg 155	Asn	Pro	Cys	Asp	Glu Tho 110	Typ
TAG	GAG	ACĆ	AAG	GCC	TTG	GCT	GTT
Lys	Glu	Thr	Lys 175	Ala	Leu	Ala	Asp 110

GCC	GGA	GGA	TTG	TTA	TTA	CTC	GCT	48
Ala	Ala	Gly	Leu -10	Leu	Leu	Leu	Ala
GGT	CCA	TTT	TAC	GAG	TAG	TAC	TAC	96
Gly	(Us	Ssi 5	Tyr	Glu	Lys 10	Tyr	Asn
ACT	CTA	cca	GGO	GCC	ACT	GAG	TAT	144
Thr	GGil	Gln	Val	Ala 22	Thr	Glu	Asn
ATC	GGA	ACC	ACA	TT?T	(GAG	GIGA	CGC	192
IIl	GGy 35	Tłu	Thr	PP.e	Glu Gly 40	Arg
TTA	GCT	GGA	TCA	TAA’	TAG	CCT	GCC	240
Les	GTn	TGu	G].n	Asn	Lls	Pro	Ala

GCC TTT Ala Arg	GAG Glu 70	TGG Trp	ATT Ile	TCT Ser	CCT Pro	GCTT Ala	288
GCT	GT’	CGT	ACC	TAT	GGA	CGT	TAG	336
Ala	Val	Arg	Thr	Tyr 85	Gly	TSrg	Glu	99
TTT	TTA	GAC	TT T	TAT	GTC	CTG	CCT	38 4
Lys	Liu	Asp	EPie	Tyr 110	Val	Leu	Pro
TTC	ACC	TGG	ACC	AAG	AGC	CTA	ttt	432
Tyo	Thr 111	Τη?	Thr	Lys	Ssi Arg 112	PPh
ACT	GTT	TCT	AGC	TGC	ATT	GGC	ACA	480
Thr	Gly	Ser	Ser	Cys 113	Ili	GG.|	ΤΆτ
CT’	hTT	TGT	GGA	ATT	GGG	CTT	Τ’Τ	528
Gly	Trp	Cyc	Glu	Ile	GGu	Gaił	Tse

115

hTh	GGT	CCT	GCC	GCTT	G.GS;	TTT	GGA.	57 T
Cys	Gly	Pro	Ala	Ala 116	GGu	Tsu	TGu	110
TTC	ATC	CGC	TAC	TTSC	CTT	Τ’Τ	TTC	62 T
Phi	Ili	Arg	Ass	Tys 185	Leu	Tsu	Tse

184 031

ATC Ile

AAG Lys

GCA AAa

TAT Tyr

CTG Leu 190

ACA Thr

ATC Ile

CAC His

TCG SSr

TAC Tyr 119

TCC SSr

CCA Gin

ATG Met

ATG ATC Met IIlr 200

TAC Tyr

672

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

TAAA

CTC

GGT

GAG

TAC

TAT

GCHC

GAG Td

AAT

720

Pro

Tyr

Ser 205

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu 210

CZLit

Glu

Asn

Asn

TAa 215

Glu Llu

Asn

GCC

CTG

GCT

yAcc

GCT

ACT

GTG

TAAA

GTGG

CTT

GCC

TCA

CCT

CAC Gd

ACC

768

Ala

Leu 220

Ala

Lys

Ala

Thr

Val 225

Lys

Glu

Leu

Ala 220

SSe

Llu

His dy

Thr

AAG

TAC

AAA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACCA

ACA

ATC

TAT

CCC

GCT GCT

GGG

816

Lys 235

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro Gly 240

Ala

Thr

Thr

IIe

Tyr

Ppo 245

Ala Ala

Gly

250

dC

TCT

CGC

o^cr

TGG

GCT

TAT

GAC

CCA

GGA

ATC

AHA

TTT

TCC Td

ACC

864

Gly

Ser

Arg

Asp 255

Τη?

Ala

Tyr

Asp 260

Gin

Gly

Ul

TArg

Τ^ 265

Ser PP.e

Thr

TTT

GAA

CTT

CGGA

sat

ACCA

GGC

ASA

TTA

GGC

TTT

CCC

CCT

CCA GGA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

TArg

Asp 270

Thr

Gly

TArg-

Τ!ττ

Gly 225

Płie

Llu

Llu

Pro du 280

Ser

CAG

ATC

CGG

GC^T

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CCG

GCA

Ad

AAG TAi

GTT

960

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

TTe

Pile

Leu

Ala

Ik

Lys TiT

Val

285 220 300

GCC

Ad

TAC

GTC

CTG

GGA

CAC

CTG

TTA:

TCA

CAA

CClA

CCA

CAC CCA

GAG

1008

Ala

Srr

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Τ^

Tii

HHi

Ηί^

Hhi

His Hhi

Glu

305

330

331

yyτ

GAG

GACA

CAG

TAG

CCG

ATC

dC

GGA

GAG

GAA

CC^G

TAe

TAA TTA

GAA

1056

Phr

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ul!

Ser

GG.U

GJLu

Asp

Llu

AAn

koniec

320

332

330

332

TTC 1059

184 031

Fig.2.

A B C 0 E F G

Fig.4.

ABC D E F

184 031

Fig.3.

lEg.ti

Starter 5 Primer 5--—

Starter 4 Primer 4,Starter 3 Primer 3 Dojrzała sekwencja HP-RNazy maturę sequence of HP-RNase(-7aas) (-7aas) otrzymana po inkuba- obtained after a PCR incubation using cji PCR z użyciem ludzkiego _h(jman g_enomj_c DNA as template genomowego DNA jako matrycy ³ . ^r

Primer 6 Starter 6

PCR incubation EcoRI digestion Ligation into pUC18 inkubacja PCR trawienie EcoRI ligacja do pUC 18 EcoRI

EcoRI

184 031

PCR pATFJ- >pATTFZl Fig.5.

RCPCR

Digescion Trawienie Ligation Ligacja

- >pATFZ3-----------»pATFZ44

HP-RNaza HP-RNaae R4A:KSA

W pUC18 in pŁJCIS

HP-RNaae HP-RNaza R4A:K6A in pUCie w pUC18

HP-RNaza κρ-RNaae

R4A:K6A:KSSE

W pUC18 in pUC16

HP-RNaae HP-RNaza

R4A:KSA:K66E in pICX2S6 w pICI266

Fig. 11.

Uracrt Cytosne

Cytozyna

Uracyl

184 031

sc ©

o c

o u

Stężenie

co o

r>.

-i-r--r § 8 (BAhung (|B0 %

CN i^ajowo^ TQsouxeftX?3z«3tI %

184 031

ο :ę

184 031

Startery stosowane w RCPCR do wpro- Fig.8.

wadzani^mL^ę^i/r^ ^CPCR for lhe imrodncrion oflhe mulalion K66E in RNaee. Starte A primer A: 5'-GOT CTG CCC ATT CTC GCA GGC AAC ATTTTT-3'

Starter B Primer B: J’-TGC TAC CAG AGC TAC TCC ACC ATG AGC ATC-3'

Starter C Pnmer C: 5*-AAT GTT GCC TGC GAG AAT GGG CAG ACC AAT-3'

Starter D ^Pl™“ ^D: J’-ctg gga gca cac ggc ctg gac atc agc ca-3^- nucleotides in bold indicate position to be mutated. Nukleotydy wytłuszczonym drukiem wskazują pozycje, które mają by.

Starter 1 Starter 2 ;r 3

Starter

Starter

Primers for the isolation of the HP-RNase gene and for the construction of a chimeric gene ezpressable in E.coli. startery do izolacji genu HP-RNazy i do konsruowania genu chimery Primer 1: S'-CGC GCG AAT TCG GOT CCA GCCTTC CCT GGG C-3' CZnegO

Primer 2: 5'-GGC CGG AAT TCC ATC AAA CTG GAC TGG CAC A-3'

Primer 3: J'-CGC TCT TGG TCC TGG TGC TGC TGC TGG TGC GGG TCC AGC CTT CCC-3' ;er 4Primer 4: J’-TGATGG CTC TGA ACT CCC TGG TCC TGT TCT CGC TCT TGG TCC TGG-3’

Primer 5: 5'-GCG CGA ATT CAT CTT CTT GGA GGA TGA TTG ATG GCT CTG AAG TCC C-3’ Primer 6: 5'-CGC CGA ATT CCT AGC TAG ACT CTT CAA CAG AAG CAT CAA ACT GGA CTG-3'

Primers used in RCPCR for the introducńon ofthe mutańons R4A:K6A in HP-RNase. Startery stosowan Starter E primer E: 5’-aag gaa tcc GCT gcc GCT aaattc cag cgg cag-3’ ^w ^CPCR do wprowadzania mutacji

Starter P Primer F: J’-GGA AGG CTG GAC CCG CAC CAG CAG CAG CAC-3’ ^R4^{A :} wHP-Rifazie

Starter G Primer G: 5’-CTG GAA TTT AGC GGC AGC GGA TTC CTT GCC CAG-3'

StarterH ?rimer H: J'<AT ATG GAC TCA GAC ACT TCC CCC AGC AGC-3' nucleotides in bold indicate position to be mutated.

nukleotydy wytłuszczonym drukiem wskazują pozycje, które mają być zmutowane

184 031

Synthesis of uridine basea prodrug analogue p-j λ

Synteza analogu proleku opartego na urydynie lly.y.

HO-1 U N _ u N - u

I 3 O. i 3 .O, I °° ’ MsCI

Me O^ 2. NaN3 o

H

H

O. .0 ÓH

AcOH (1)

O O

Me O (2) ' G%

2. Ph3P/H2O

3. NH3 (3) (plus 2-acetate) (₊ 2^οοtan)

H/h n ^U

pn (plus 3'-isomer) (₊ >i_ZCmer) <-> ^Jv>-0

- Ό ester Z-gly-pnitrofenylowy(6)

CBZ-NHCH2C0NH-1 „ U

Ty.

1. CPP(0Me)N(i-Pr)2

2· nof^~ n t tetrazot

3. t-BuOOH \ (móc of 2' and 3' regioisomers) (mieszanina 2i 3 regioizomerów) .Pd/C. etanol/cyklohexsen

2.1-BUNH2

Z-gfy-p-mtrophenyf ester

CBZ-NHCH2C0N

(5) (as mixture of (jako mieszanina

2' and 3' regioisomers) 2^i 3 regioizome\ , \ (as mncture of 2' and 3' regioisomers:

jako miesz. 2 i 3 thenpunfyZ) sgioizomerów; następ- -nhschzconh rów)

	0 II
u =

+

NH3CH2C0NH

184 031

Synzeza analogu proleku opartego na cytydynie

Synthesis ot cytidine based prodrug analogue Fig. 10.

Me^O'

Me O

OH OTHP

(+3~izonier)

184 031

Fig. 13.

Po

Glu⁺66* Ala 122

Thr 45 Phe120 Ser 123

O=P-O

θ2

Asn 71 Glu 111

184 031

Fig. 14.

2:3-cykliczny fosforan urydyny

PRODRUG ΤΟΧΙΝ

FROLEK TOKSYNA

Exampie of Prodrug for ux with a mutant RNase K66E.

Przykład proleku do zaszosowania ze zmutowaną RNazą ΚδοΕ

184 031

O O

0'

Py

OH

I

O ^e p — 0' I o OH

O= p - O I

OR·

Esier of pynmidme nucleosidc 3’-phosphnic

Ester 3-fosforanu nukleozydu pirymidynowego

2?3-cyKliczny fosforan nukleozydu pirymidynowego rynmidjne nucleosidc 2\3‘ cyclic phosphate

Mechanism of action of RNase

Mechanizm działania RNazy

3-fosforan nukleozydu pi rymidynowego

Pyrimidine nucleosid

3'-phosphaie

CpA

I

o

O, o'

C>p

184 031

Ο

CO /=2

ΙΟ

I %

w u

φ

-μ

X ω χ 2 2' ν ο t>J

5*1

184 031

Fig.18.

Human Pancreatic Carboxypeptidase B

Ludzka Trzustkowa Karboksypeptydaza B

Cloning

Klonowanie

Pancreas carboxvoeptidase B.

Trzustkowa karboksypeptydaza B

Saci

Xbal

Xhoi

BPT1

PPT2

Pre Pro i l ^Mature Dojrzała cDNA

I I

45

330

End Koniec μι—

1250

-<

BPBI

Fig. 19.

Human Pancreatic Carboxypeptidase B

Ludzka Trzustkowa Kaoboksypuptydaza B

Seguencing s ekwuncjonowanie

1279 1280 —————— —

336 676

Pro Maturę dojrzała

-►

677

1281

End >koniec pBluescnpt

205

679

1226

337

Wszystkie 6 klonów ma identyczną sekwencję i wszyskie zawierają:

$ asparaginian w miejscu rozpoznawania enzymu tj. kaoboksypuptydazyE W porównaniu z opublikowaną sekwencją:

(*) wstawiony kodon TGC zmieniający polipeptyd GSSIG na GESCIG...

184 031

Fig.20.

	CM O
TJ
c	5 CL
—	CL o
X	CQ Lu

€0

184 031

CM

Ó)

LL *Ο c

α>

ω φ

•Η c

Φ ϊ

ο

C ο

rM kO \£) CM W O t—<

α >» c

O

CO

Φ

U

o.

CO

Φ ίο +J

Φ *S5

OT

C c

o o

©i

C I ©

OT

O o

© >

g tfl tfl ©

k.

o.

to to £J o

CL

O r~ u

O <

h»

D

CJ <

O

L>

L5 <J

U

O < Cł o < ’ < o o < < < o o o

<

u <

t_J

184 031

X3jgoK«i osouienAzazJtl i

Concentrallon (uM)

184 031

FIG. 23

Pożywka hodowlana

Składnik	Stężenie w g/l wody dejonizowanej
d izasadowy ortofosforan potasu	3,0
wodoroortofosforan disodowy	6,0
chlorek sodu	0,5
hydrolizat kazeiny	2,0
siarczan amonu	10,0
gliceryna	35,0
ekstrakt drożdżowy	20,0
heptahydrat siarczanu magnezu	0,5
dihydrat chlorku wapnia	0,03
tiamina	0,008
heptahydrat siarczanu żelaza	0,04
kwas cytrynowy	0,02
roztwór pierwiastków śladowych (TES)*	0,5 ml/l
chlorowodorek tetracykliny	0,01

* Roztwór pierwiastków śladowych (TES)

Składnik	mg na 10 ml wody dejonizowanej
heksahydrat chlorku glinu	2,0
heksahydrat chlorku kobaltu	0,8
dodekahydrat siarczanu potasowo-chromowego	0,2
dihydrat chlorku miedzi	0,2
kwas borny	0,1
jodek potasu	2,0
monohydrat siarczanu manganu	2,0
heksahydrat siarczanu niklu	0,09
dihydrat molibdenianu sodu	0,4
heptahydrat siarczanu cynku	0,4

184 031

Fig.24.

184 031

Χ-Υ =

Fig.25.

*2

Ala-4

Phe-8 zmutować

Mutate

Me₂NCH₂CH₂-Oh₂nch₂co-nhThr-45

Phe-120

Ser-123

B,

Asn-71, Glu 1 ]

Zmutować tutaj w celu lepszego przyswojenia proleku

Mutate here to accommodate prodrug

Fig.26.

Cl

Cl

184 031

Fig.27.

COOCHjPh

Η,Ν-S —

HOOC o COOCHjPh

X

2a - c

Cl «2-4:

a X = COOCH2Ph b X = CH2COOCH2Ph \ VI ( ,—c O COOCH.Ph / > o ^x ) O c X=(CH2)2NH^_n__NOj NHj

O COOH

NHw 5a, X = COOH w 5b, X=CH₂COOH w ^5c'^X= V-N _M >^N/ H h-n

a)CHCl3.B3N b) 6. CHO3. EDCI. DMAP c) P&C HZ ACOB, MaOH

Ck

Cl

Ν-θ-°^Η ·

1HCI

6:

184 031

Fig.28.

// \

o

h'^Nh

H—O

184 031

Fig.29.

^F^lJ- ^γ-<

Z(P₂)

OH

CO₂(P₂) p,-o-4 O \ χ_^ Z(P₂) ^{3 Y—}

CO₂(P₂)

R¹ R⁶ r3 ^XN—O ^/ W /(P₂) ² R⁵ 'R^{4 Y_}\

CO₂(P₂) h-o-Ą o ^Xx-< /(^p2) ^Y-\

CO₂(P₂)

R⁶ R³

N

°Λ ⁰ ^χ—/ ?² R⁵ R⁴ CO₂H

184 031 o_ a.

Ζ>Ν /

184 031

184 031

Fig.32.

R

BOCNH—L-CO^ /(P₂) ^Y—\

CO₂(P₂)

BOCNH—CO- γ—ζ ,z(P₂)

CO₂(P₂)

Fig.33.

184 031

NCIMB

40678

Ligacja do pKK223·

Digestion EcoRI Trawienie EcoRI Isolation smali fragment Izolacja małego fi —/Ligation into pKK223.3

Ascertain orientation with Pstl 'ragmentu.

Sprawdzenie orientacji przy użyciu Pstl pre-

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Koniugat zawierający cząsteczkę kierującą, którą jest przeciwciało lub fragment przeciwciała zdolne do wiązania się z antygenem związanym z nowotworem, połączoną z enzymem, znamienny tym, że jako enzym zawiera zmutowaną ludzką rybonukleazę zawierającą Glu w pozycji 66.
2. 2. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że fragmentem przeciwciała jest fragment F(ab')23. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i typowe substancje pomocnicze, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera koniugat zawierający cząsteczkę kierującą, którą jest przeciwciało lub fragment przeciwciała zdolne do wiązania się z antygenem związanym z nowotworem, połączoną z enzymem, którym jest zmutowana ludzka rybonukleaza zawierająca Glu w pozycji 66.
3. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera koniugat, w którym fragmentem przeciwciała jest fragment F(ab')2.
4. 5. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jest sterylna.