CZ195297A3 - Pharmaceutical composition containing enzymatic component being specific for target cells - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká léčby využívající enzymu specificky cíleného prostřednictvím protilátek, jehož substrátem je neaktivní forma účinné látky (antibody directed enzyme prodrug therapy - ADEPT). Při této léčbě je použita mutantní forma enzymu hostitele, která se běžně nevyskytuje, zvláště pak mutantní forma ribonukleázy.

Dosavadní stav techniky

V lékařském výzkumu bylo po dlouhou dobu problémem nalézt způsob selektivního namíření léčiva proti rakovinným buňkám za účelem usmrcení těchto buněk v organizmu pacienta. ADEPT je jedním z přístupů umožňujících překonat tento problém. ADEPT využívá protilátku konjugovanou s enzymem selektivně namířenou proti nádoru. Tento konjugát je administrován do organizmu pacienta (obvykle intravenózně) a je mu ponechán dostatek času k lokalizaci v místě/místech nádoru. Pak následuje latentní perioda umožňující, aby mohla být tato první složka odstraněna krevního oběhu. Následně je do organizmu pacienta administrována neaktivní forma účinné látky, která je prostřednictvím enzymu (lokalizovaného v místech nádoru) přeměněna na aktivní formu vykazující cytotoxickou aktivitu, která ničí nádorové buňky. Jelikož jedna molekula enzymu může katalyzovat vznik mnoha molekul cytotoxicky aktivní látky, je dosaženo zesílení účinku. Navíc nádorové buňky, které nenesou antigeny rozpoznávané použitou protilátkou (nádory obvykle vykazují určitou mikroheterogenitu) jsou rovněž usmrceny enzymaticky amplifikovanou tvorbou cytotoxicky aktivní látky. Je znám systém využívající jako enzymatickou komponentu , <1 ’

-29 · ··« ·

9 9

9 9 9

9 9 · · · · prokaryotický enzym karboxypeptidázu G2 (CPG2, viz. WO 88/07378). Nevýhodou systémů využívajících prokaryotické enzymy je skutečnost, že přirozená střevní mikroflóra může obsahovat prokaryotické organizmy schopné iniciovat neselektivní tvorbu cytotoxícky aktivní látky.

Dalším problémem vyskytujícím se ve známých systémech je skutečnost, še opakovaná administrace konjugátu (protilátka-enzym) vede k indukci imunitní odpovědi hostitele, která má za následek snížení účinnosti léčby. Část konjugátu tvořená protilátkou je obvykle myší monoklonální protilátka, která může být za účelem snížení imunogenicity humanizována pomocí známých technik. Nicméně snížení imunogenicity části konjugátu tvořené enzymem se ukázalo jako problematičtější. To je způsobeno tím, že enzym přítomný v konjugátu se nesmí přirozeně vyskytovat v. krevním oběhu lidského hostitele, nebot by jinak došlo kpředčasné přeměně neaktivní formy účinné látky v cytotoxicky účinnou látku, a nebylo by tudíž pozorováno cytotoxické působení selektivně namířené proti nádorům. Akzo ve WO 90/02939 navrhl k ADEPT použiti lidských enzymů, přičemž selektivita je udržena výběrem lidského enzymu, který není za normálních okolností přítomen v krevním oběhu, jako například lysozym. Akzo si vybral lidský lysozym jako svůj enzym a vzhledem k substrátovým požadavkům {jelikož patří lysozym mezi endoglykosidázy potřebuje jako ^; substrát ke štěpení polymery. N-acetylglukosaminu spojené vazbou (NAG-chitin)) je nucen produkovat neaktivní prekurzory účinných látek obsahující takové funkční části. Za účelem zabránění vstupu neaktivního prekurzoru dovnitř buňky dále přidal k oligomeru rezidua taurinu - spoléhajíce se na skutečnost, že sulfonové kyseliny zabrání vstupu dovnitř buněk a tudíž i naměřená cytotoxicita je 20-krát menší - Obrázek 13 v WO 90/02939.

-3• ·· ·· lidského enzymu (Behringwerke DE

Použití savčího enzymu jako například alkalické fosfatázy (Senter a další, US 4975278) nebo nějakého jako například beta-glukuronidázy 42336237) nebo lysozymu (Akzo, WO

90/07929) k ADEPT má tu výhodu, že takové enzymy by měly být, ve srovnání s enzymy získanými z jiných než savčích organizmů, méně imunogenní nebo by neměly -být imuncgenní vůbec. Nevýhodou při použití savčího nebo lidského enzymu je skutečnost, že tento enzym je endogenně přítomen v .organizmu pacienta a v tomto organizmu tudíž existuje určitý potenciál umožňující přeměnu neaktivního prekurzoru na účinnou látku, přičemž tato přeměna není vyvolána působením administrovaného konjugátů protilátka-enzym. Je tudíž pravděpodobné, že tento přístup vede ke zvýšené toxicitě u tohoto typu ADEPT. Neaktivní prekurzory sloužící jako substrát pro alkalickou fosfatázu jsou, při absenci jakéhokoliv administrovaného konjugátu, rychle přeměňovány na účinné látky jak u myší (Doyle W. . T. a Vyas D. Μ. , Cancer Treatment Reviews 17, 127 až 131., 1990) tak u člověka (Hande a další, Clinical Pharmacology and.

Therapeutícs 53, 233, 1993). Tato skutečnost je způsobena, značným rozšířením alkalické fosfatázy v organizmu a dokazuje, že zmíněné rozšíření alkalické fosfatázy je kritickým problémem při využití tohoto enzymu. Data, kdy je jako neaktivní prekurzor použit substrát pro beta-glukuronidázu nebo lysozym, nejsou u lidí k dispozici. Glukuronidáza a lysozym jsou přítomny v krevní plazmě a i v různých tkáních. Akzo popsal, že lysozym je přítomen v mléku, slzách, slinách, slezině, leukocytech a monocytech. Behringwerke popsal v DE 4236237, že glukuronidáza je sekretována aktivovanými makrofágy, granulocyty a krevními destičkami. Jelikož tyto buňky jsou značně rozšířeny v celém organizmu, mohlo by docházet k nežádoucí aktivaci neaktivních prekurzoru účinné látky. Behringwerke skutečně ukázal, že u myší dochází po administraci neaktivního « · · · ,,ώ

-4•Ρ prekurzorů Doxorubicinu k akumulaci relativně vysoké hladiny volné aktivní látky ve slezině, která je bohatým zdrojem těchto buněk (viz. Tabulka 3 v DE 4236237) .

Použití lidských enzymu při tomto přístupu k ADEPT je limitováno skutečností, že mohou být použity pouze enzymy s převážně intracelulární distribucí, a že neaktivní prekurzory používané jako substráty příslušných enzymů musí být udržovány vně buněk, aby byly minimalizovány cytotoxické účinky. Tyto skutečnosti silně limitují počet možností vedoucích k vytvoření systému k ADEPT. Ačkoliv je lysozym velmi malý enzym, má tento při využití k ADEPT některé nevýhody. Lysozym neuvolňuje aktivní látku, ale uvolňuje derivát, jehož farmakologická aktivita není známa. V příkladu uvedeném v práci jejíž autorem je Akzo, jsou spíše než volný Doxorubicin uvolňovány Dox-(GlcNac)_L nebo Dox-(GlcNac)₅. Glukuronidáza může uvolnit účinnou látku, například adríamycin, z neaktivního glukuronidu a v těchto' experimentech byly zjištěny protinádorové aktivity (Bosslet, K. a další, Cancer Research 54, 2151 až 59, 1994} . Nicméně lidská glukuronidáza je enzym o vysoké, molekulové hmotnosti (150 až 300 kDa) a vzniklý konjugát (selektivně namířený proti určitému nádoru) bude pravděpodobně velmi velký. Tato skutečnost bude pravděpodobně působit problémy při penetraci do tkání jako například při penetraci do nádorů, jelikož je dobře prokázáno, že menší proteiny pronikají do pevných nádorů daleko rychleji. Glukuronidáza je navíc glykosylovšna a tato glykosylace vede, při použití k ADEPT, k rychlému odstranění konjugátu protilátka-glukuronidáza z krevního řečiště. Rychlé odstranění konjugátu z krve má za následek skutečnost, že jenom malá frakce konjugátu je lokalizována na nádorovým xenogenních štěpech. Kombinace vysoké molekulové hmotnosti a skutečnosti, že dochází k rychlému odstranění konjugátu z krve bude pravděpodobně vést ke špatné lokalizaci těchto konjugátu na nádory přítomné v

organizmu pacienta. Glukuronidáza není tudíž ideálním enzymem k ADEPT.

Podstata vynálezu

Vynález je založen na objevu, že enzym hostitele (například lidská ribonukleáza, enzym přirozeně se vyskytující v krevním oběhu) muže být upraven tak, aby jeho mutantní forma rozpoznávala neaktivní prekurzor účinné látky použitý při ADEPT, a aby tento prekurzor nebyl velkou měrou rozpoznáván enzymem přirozeně se vyskytujícím v -organizmu hostitele. Jelikož upravený enzym je, co se týká aminokyselinového složení, velmi podobný nativnímu enzymu hostitele, je jeho velkou výhodou, ve srovnání s bakteriálními enzymy jako například CPG2, podstatně snížená imunogenita, Tento upravený enzym se přirozeně nevyskytuje a tudíž je výhodně snížena pravděpodobnost nespecifické:· aktivace neaktivního prekurzoru účinné látky, způsobená přirozeně se vyskytující mikroflórou nebo přirozeně se vyskytujícími lidskými enzymy. Dalšími výhodami tohoto přístupu je skutečnost, že je tento přístup možné aplikovat na široké spektrum lidských nebo savčích enzymů, protože: tento přístup není limitován přirozenou distribucí enzymu v organizmu a může být rovněž využíván neaktivní prekurzor účinné látky, který proniká dovnitř buněk.

Zmíněné problémy byly částečně popsány v Mezinárodní patentové přihlášce ’ WO 95/13095 (Wellcome Foundation), která byla zveřejněna až po nej starším datu priority této přihlášky. V této patentové přihlášce bylo k ADEPT navrženo použití mutantních savčích enzymů schopných aktivovat neaktivní prekurzory účinných látek, které nejsou aktivovány odpovídajícím· přirozeně se vyskytujícím enzymem, nicméně nepopisuje předmět nyní předkládaného vynálezu.

Je velmi překvapivé, že náhrada elektricky nabitého zbytku, který je umístěn poblíž nebo přímo uvnitř vazebného

• *« •

místa pro substrát nebo v katalytickém místě enzymu, reziduem nesoucím opačný náboj, má za následek vznik mutantního enzymu, který má nedotčené katalytické centrum. Tento mutantní enzym se od nativního enzymu liší pouze substrátovou specifitou. Substráty jsou podobné, interagují s enzymem prostřednictvím komplementárních nábojů (interakce iontových párů), avšak substrát pro mutantní enzym musí mít opačný náboj než je tomu u substrátu pro nativní enzym.

Navíc kombinace neaktivní prekurzor/účinná látka popsané ve Wellcome (založené na methotrexátu a melphalanu) spoléhají při zamezení vstupu neaktivního prekurzoru dovnitř buňky na zablokování mechanizmů aktivního transportu. Tato skutečnost limituje spektrum použitelných kombinací neaktivní prekurzor/účinná látka, pouze na ty látky, které jsou transportovány takovými mechanizmy aktivního transportu. Narozdíl od této skutečnosti umožňuje přístup převrácené polarity popsaný v tomto vynálezu volbu takového náboje neaktivních prekurzorů (které mohou, ale nemusí, mít rovněž vlastnosti nezbytné k aktivnímu transportu), aby došlo k prekurzoru dovnitř buňky, umožňuje volbu Širšího prekurzor/účinná látka.

zablokovaní vstupu neaktivního Použití tohoto vynálezu tudíž spektra kombinací neaktivní

Jedna stránka vynálezu komplementární dvoj. složkový systém použití v organizmu hostitele. Tento popisuj e vytvořený systém obsahuje:

vzaj emne za účelem (i) první složku, kterou je část odpovědná za nasměrování. Tato část je schopná vázat se na antigen asociovaný s nádorem a je spojena s mutovaným enzymem, který je schopen přeměny neaktivního prekurzoru na antineoplasticky účinnou látku a;

-Ί • ·

(ii) druhou složku, kterou je neaktivní prekurzor účinné látky, který je možné působením příslušného enzymu přeměnit na antineoplasticky účinnou látku;

kde:

mutovaný enzym je mutovaná forma enzymu hostitele, přičemž přirozeně se vyskytující enzym hostitele rozpoznává svůj přirozený substrát prostřednictvím interakce iontových párů a při tvorbě mutovaného enzymu a komplementárního neaktivního prekurzoru je tato interakce iontových párů obrácená (převrácená polarita);

první složka je vpodstatě neimunogenní pro organizmus hostitele a;

druhá složka tvořená neaktivním prekurzorem není v organizmu hostitele působením nemutovaného enzymu hostitele přeměňována ve velké míře na antineoplasticky účinnou látku.

Ve výhodném provedení vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, v němž první složka obsahuje mutovaný enzym odvozený od enzymu získaného ze stejného druhu, ke kterému náleží hostitel, u něhož bude systém použit.

Ve výhodném provedení vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, v němž částí odpovědnou za nasměrování je nějaká protilátka, anebo její fragment. Ve výhodném provedení vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, v němž fragment protilátky je fragment F(ab)₂.

Ve výhodném provedení vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, v němž mutovaný enzym je mutovaná ribonukleáza. Ve výhodném provedení vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, v němž

-ah

mutovaný enzym je lidská ribonukleáza, která má v pozici 66 nějakou negativně nabitou aminokyselinu. Ve výhodném provedení vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, v němž negativně nabitá aminokyselina v pozicí 66 ribonukleázy je Glu.

V jiném výhodném provedení vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, v němž mutovaným enzymem je mutovaná glukuronidáza.

Vynález dále popisuje vzájemně komplementární dvoj složkový systém vytvořený za účelem použití v organizmu hostitele. Tento systém obsahuje;

(i) první složku, kterou je část odpovědná za nasměrování. Tato část je schopná vázat se na antigen asociovaný s nádorem a je spojena s mutovaným enzymem, který je schopen přeměny neaktivního prekurzoru na antineoplasticky účinnou látku a;

(ii) druhou složku, kterou je neaktivní prekurzor účinné látky, který je možné působením příslušného enzymu přeměnit na antineoplasticky účinnou látku;

kde;

mutovaný enzym je mutovaná forma enzymu hostitele první složka je v podstatě neimunogenní pro organizmus hostitele a;

neaktivní prekurzor není v organizmu hostitele působením nemutovaného enzymu hostitele přeměňován ve velké míře na antineoplasticky účinnou látku.

Termínem neaktivní prekurzor není v organizmu hostitele působením nemutovaného enzymu hostitele přeměňován ve velké míře na antineoplasticky účinnou látku rozumíme skutečnost, že při administraci neaktivního

-9• · « « «

prekurzoru do organizmu hostitele nedochází k výskytu nežádoucích problému s necílenou toxicitou.

Termínem v podstatě neimunogenní rozumíme skutečnost, že první složka může být do organizmu hostitele administrována více než jedenkrát, aniž by došlo k indukci silné imunitní odpovědi hostitele, jaká by v organizmu hostitele byla například pozorovatelná při použití myší protilátky připojené k bakteriálnímu enzymu.

Ve výhodném provedení vynálezu je mutovaný enzym odvozen od enzymu získaného ze stejného druhu, ke kterému náleží hostitel, u něhož bude tento systém použit. Mutovaný enzym může být nicméně odvozen od enzymu získaného z organizmů jiných druhů, a to za předpokladu, že struktura daného enzymu je mezi těmito druhy dostatečně konzervativní, aby nedocházelo ke vzniku problémů s imunogenicitou.

Ve výhodném provedení vynálezu je částí odpovědnou za nasměrování protilátka, zvláště pak fragment protilátky, jako například fragment F(ab')₂. Připojení protilátky nebo jejího fragmentu k enzymu může být dosaženo pomocí známých metod jako například použitím heterobifunkčních Činidel' sloužících jako zesítovače nebo prostřednictvím fúze genů nebo použitím jiných vhodných metod. Protilátka může pocházet že stejného hostitele (například použití myší protilátky v -organizmu myši) nebo může být tato protilátka pozměněna takovým způsobem, aby nebyla v organizmu zvoleného hostitele rozpoznávána jako cizorodá (například použití chimérických myších protilátek, protilátek s vloženými myšími CDR úseky v organizmu lidí).

V preklinických studiích prováděných na opicích a u pacientů bylo prokázáno podstatné snížení imunogenity protilátek hlodavců, které byly upraveny následovně: bud' připojením variabilních domén protilátek hlodavců ke

-±u-

konstantním doménám lidských protilátek {chimérické protilátky) nebo zabudováním vazebných míst pro antigen (CDR) z protilátek hlodavců do lidských protilátek (vkládání CDR úseků - CDR grafting). Dokonce i protilátky s vloženými CDR úseky obsahují v úseku základní struktury odvozeném od lidské protilátky velké množství (>50) aminokyselin pocházejících ze sekvence protilátky hlodavce.

I přes tuto skutečnost, byla u opic i u pacientů zjištěna snížená imunogenita těchto protilátek. Toto zjištění poskytuje důkazy, še mutace omezeného množství aminokyselin v katalytickém místě enzymu hostitele bude mít pravděpodobně za následek vznik enzymu s minimální imunogenitou a zcela určitě s imunogenitou nižší, než jakou by měl enzym z jiného organizmu než z organizmu hostitele. Čtenáři neché se laskavě obrátí na následující citace: A. Mountain a J. R. Adair, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 10, 1 až 142, 1992; G. Winter a W. J. Harris, Trends in Pharmacological Sciences, 14, 139 až 143, 1993 ; I. I. Singer a další, J. immunol 150, 2844 až 57, 1993; J. Hakimi a další, J. Immunol, 147, 11352 až 59, 1991 a J.D. Isacs a další, The Lancet 340, 748 až 752, 1992. Domény konstantních oblastí mohou být například domény, lidského IgA, IgE, IgG nebo IgM. Použití lidského IgG2 a IgG3 (zvláště IgG2) je výhodnější, ale izotypy IgGl a IgG4 mohou být rovněž použity. Mohou být rovněž použity samotné lidské protilátky, jako například protilátky produkované v myších geneticky manipulovaných za účelem produkce lidských protilátek.

V enzymu hostitele je provedena mutace (pomocí jakékoliv vhodné metody jako například chemickou nebo biotechnologickou syntézou genu nebo cílenou mutací) za účelem dosažení změny ve způsobu interakce, mezi aktivním místem enzymu a neaktivním prekurzorem, ve srovnání s interakcí nativního enzymu hostitele.

-11·*« · • · ·* ·

Ve výhodném provedení vynálezu je mutací v enzymu taková změna polarity v aktivním místě enzymu, že tento mutovaný enzym přeměňuje neaktivní prekurzor s komplementární polaritou; neaktivní prekurzor není v podstatě přeměňován nemutovaným enzymem hostitele. Ve výhodném provedení vynálezu rozpoznává přirozeně se vyskytující enzym hostitele svůj přirozený substrát prostřednictvím interakce iontových párů a tato interakce je převrácená v systému tvořeném mutovaným enzymem a komplementárním neaktivním prekurzorem účinné látky. Ve výhodném provedení vynálezu je zmíněným enzymem mutovaná ribonukleáza, zvláště pak lidská ribonukleáza s převrácenou polaritou (viz. Obrázky 12 až 15}.

U lidské ribonukleázy tvoří lysin 65 pozitivně nabitý zbytek, který interaguje s negativně nabitými fosfátovými skupinami přítomnými na RNA, která je přirozeným substrátem tohoto enzymu. Polarita tohoto zbytku je převrácena například metodami genového inženýrství (ale je rovněž zvažována možnost chemické syntézy) za účelem produkce negativně nabitého zbytku, jakým je například kyselina glutamová. Výsledný enzym s převrácenou polaritou rozpoznává neaktivní prekurzor účinné látky podle vynálezu, který není v podstatě rozpoznáván nemutovaným enzymem hostitele. Za účelem optimalizace vazebných charakteristik pro substrát a čísla přeměny jsou zvažovány další záměny aminokyselinových zbytků přítomných v oblasti aktivního místa. Geneticky upravené formy ribonukleázy reprezentují další stránku vynálezu. Vzhledem ke své nízké molekulové hmotnosti (přibližně 1.3600 kDa; po organizmu umožňuje dobrou penetraci do tepelné stabilitě a odolnosti vůči proteolýze, je použiti ribonukleázy velmi výhodné. Ve výhodném provedení vynálezu je neaktivním prekurzorem účinné látky derivát ribonukleotidu obsahující sloučeninu odvozenou od bis(2-chlorethyl)aminu (dále v textu bude namísto spojení obsahující administraci do tumoru) a dobré

-12• · «· · · · · ··· · *·* · · · · · • t ·*· ·»« ·· ·♦ · sloučeninu odvozenou od bis(2-chlorethyl)aminu používán anglický název mustard, například mustard-nukleotid) obecného vzorce 1 znázorněného na obrázku 11, kde:

Q je 0 nebo NH (zvláště NH);

A je skupina obecného vzorce -X-Y- kde

Y je SO₂, CO nebo jednoduchá vazba (ve výhodném provedení CO) za podmínky, že když Q je kyslík pak Y není S0₂;

X je -(CH₂)_n , kde n= 1 až 4 (ve výhodném provedení η = 1 s výjimkou případů, kdy Y představuje jednoduchou vazbu, pak n je výhodněji 2). X může být na kterémkoli uhlíkovém atomu substituováno alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku (u každého chirální ho, atomu jsou uvažovány R a/nebo S konfigurace) nebo když Y označuje CO. a n=l pak X může (ale nemusí) být na uhlíkovém atomu substituováno postranním řetězcem alaninu, valinu, leucinu, izoleucinu, methioninu, fenylalaninu, tryptofanu, šeřinu, threoninu, cysteinu, asparaginu, glutaminu, lysinu, argininu nebo histidinu (u každého chirálního atomu jsou uvažovány R a/nebo S konfigurace);

Rl je uráčil nebo cytosin, jak je znázorněno na' Obrázku 11;

R2 a R3 nezávisle jsou vždy vodík' nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku (ve výhodném provedení methyl a zvláště pak R2=R3-H);

R5 a R6 nezávisle reprezentují Cl, mesyl nebo tosyl (ve výhodném provedení R5=R6=Cl);

R7, R8, R9 a R10 nezávisle jsou vždy vodík nebo

-13• · *· ·» · · · · '· *·* ······ * · · * «»······ « · » ··· ·« ·· ·»· «·· ·· ·· · alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku (ve výhodném provedení- methylová skupina) , alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku (ve výhodném provedení methoxyskupina), F nebo Cl ( ve výhodném provedení Cl) a ve výhodném provedení symboly R8 a R9 představují jiné zbytky než atomy vodíku. Nicméně ve zvláště výhodném provedení R7=R8=R9=R10=H.

Ve výhodném provedení vynálezu je mustard-ribonukleotid jedním z mustard-ribonukleotidů v nichž;

Q	je NH;.
X	je -(CH3)n-	, kde n	je 1
Y	je -C(0)-;
Rl	je uráčil	nebo cyt	osin;
R2	a R3 jsou	H;
R5	a R6 jsou	Cl; a
R7	, R8, R9 a-	R10 jsou	H;

nebo jejich soli.

Zvláště výhodná je následující konkrétní sloučenina:

0-[(2R, 3S, 4R, 5R)-2-(2-aminoacetamidomethyl)-5-(2,4-dioxo-l,2,3,4-tetrahydropyrimidin-l-yl)-4-hydroxy-2,3,4,5,tetrahydrofuran-3-yl]-0-[4-(bis[2-chlorethyl]amino)fenoxy]hydrogenfosforečnan, který je znázorněn jako koncový produkt na Obrázku 7.

Jinou výhodnou sloučeninou je cytosinový analog koncového produktu znázorněný na Obrázku 7.

Obecným termínem alkyl jsou zde nevětvené alkylové skupiny tak alkylové rozvětveným řetězcem. Nicméně pojmenování alkylových skupin, jako například propyl, jsou specifická pouze pro nerozvětvené řetězce a pojmenování jedinečných míněny jak skupiny s jedinečných « « • · ·

·♦ «

• · · · » « · • · · · • ♦ · ·· · ·« alkylových skupin s rozvětveným řetězcem, jako například izopropyl, se týkají pouze verzí s rozvětveným řetězcem. Podobná konvence platí í pro další obecné pojmy.

Je nutné si uvědomit, že pokud se určité sloučeniny popsané Vzorcem l, vyskytují v opticky aktivních nebo racemických formách v důsledku přítomnosti asymetrických uhlíkových atomů, vynález ve své podstatě zahrnuje všechny takové opticky aktivní nebo racemické formy, které mají tu vlastnost, že jsou substrátem pro mutantní enzymy podle vynálezu.

Syntéza opticky aktivních forem může být prováděna pomocí standardních postupů organické chemie v současnosti dobře známých, jako například prostřednictvím syntézy z opticky aktivních výchozích materiálů nebo rozdělením jednotlivých racemických forem·.. Obdobně mohou být vlastnosti substrátů vzhledem k mutantním enzymům stanoveny pomocí standardních laboratorních technik.

Bodové mutace-budou značeny následovně: přirozeně se vyskytující aminokyselina (použití jednopísmenné nomenklatury), pozice, nová aminokyselina. Například označení D253K znamená, že na pozici 253 byla asparagová kyselina (D) nahrazena lysínem (K) . Mnohočetné mutace v jedné molekule enzymu budou znázorněny v hranatých závorkách.

V této patentové přihlášce zahrnuje termín CPB:

i) maturované, pro nebo prepro formy enzymu s nebo bez peptidové značky (tag, například c-myc);

ií) jakoukoliv karboxypeptidázu, která je specifická pro peptidové substráty s C koncem tvořeným Lys nebo Arg;

pankreatické nebo plazmatické CPB enzymy ( ve výhodném provedení pankreatické enzymy);

·· 9 ♦ · * · « · 4 · 9 9

99 999 9

9 9 9 9

9 99 99 9 jestliže není řečeno jinak nebo jestliže není tato skutečnost zřejmá z kontextu.

Jako mutantní CPB podle vynálezu označujeme mutanty jakýchkoliv výše zmíněných CPB, které mají vhodné vlastnosti požadované podle vynálezu. Ve výhodném provedení vynálezu se jedná o následující mutanty pankreatické HCPB: D253K, D253R a ve zvláště výhodném provedení [G251N,

D253R]; jsou rovněž zvažovány odpovídající mutace v jiných CPB. Mutantní CPB podle vynálezu mohou rovněž obsahovat další konzervativní mutace (inzerce, substituce a/nebo delece), které podstatně nepozměňují vlastnosti klíčové mutace. Pro účely tohoto dokumentu je za konzervativní aminokyselinovou substituci považována substituce, u níž je pravděpodobnost výskytu v přírodě více než desetinásobná oproti pravděpodobnosti výskytu substituce, ke které dochází náhodně (tak jak je definováno pomocí numerických metod popsaných v Dayhoff a další, Atlas of Protein Sequence and Structure, 1971, strany 95 až 96 a obrázky 9 a 10) .

PCB jsou zmíněny v následujících pracích: Folk, J. E.. v The Enzymes, Svazek III, Academie Press (1971) , strana57; Coli M a další, EMBO Journal 10, 1 až 9, 1991; Eaton,

D. L. a další, J. Biol. Chem. 266, 21833 až 21838, 1991; Yamamoto, K. a další, J. Biol. Chem, 267, 2575 až 2581, 1992; Patent Spojených Států US 5364934 (Genetech) a; Mezinárodní patentová přihláška WO 95/14096 (Eli Lilly).

Sloučeniny podle vynálezu mohou tvořit soli s různými organickými a anorganickými kyselinami a bázemi. Tyto soli jsou rovněž předmětem vynálezu. Mezi takové soli patří amonné soli, soli alkalických kovů jako například sodné nebo draselné soli, soli kovů alkalických zemin jako například vápennaté nebo hořečnaté soli, soli s organickými zásadami; například dicyklohexylamoniové soli,

N-methyl-D-glukamín, solí s aminokyselinami jako například ·* ····

-16• · · ·· · · · · ······ • · · * ······*· < ····*··· ·« φ·· ··· ·· ·· · s argininem nebo lysinem a podobně. Mohou být rovněž připraveny soli s organickými nebo anorganickými kyselinami; například s HCl, HBr, H₂SO₄, H₃PO₄, s kyselinou methansulfonovou, toluensulfonovou, maleinovou, fumarovou a kafrosulfonovou. Ve výhodném provedení vynálezu se jedná o netoxické, fyziologicky přijatelné soli, ale ostatní soli jsou rovněž užitečné; například při izolaci nebo čištění produktů.

Zmíněné soli mohou být vytvořeny prostřednictvím konvenčních postupů jako například pomocí reakce produktu ve formě volné kyseliny nebo volné báze s jedním nebo více ekvivalenty vhodné báze nebo kyseliny v rozpouštědle nebo v médiu, ve kterém je tato sůl nerozpustná nebo v rozpouštědle (jako například ve vodě), které je následně odstraněno odpařením ve vakuu nebo mrazovým sušením nebo výměnou kationtů existující soli za jiné kationty na vhodném ionexů. Sloučeniny podle vynálezu mohou být využity ve formě kompozic jako například tablet, kapslí nebo léčebných nápojů pro orální podávání, čípků pro administraci do rekta, sterilních roztoků nebo suspenzí pro parenterální nebo intramuskulární administraci a podobně.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být do organizmu pacientů (zvířat nebo lidí) administrovány při potřebě takové léčby v dávkách, při kterých bude z farmakologického hlediska dosaženo optimální účinnosti. Ačkoliv dávky se budou u jednotlivých pacientů lišit v závislosti na podstatě a závažnosti onemocnění, váze pacienta, jeho stravovacím režimu, existenci současné léčby jinými léky a jiných faktorech, odborníci zjistí, že celková denní dávka se obvykle bude pohybovat v rozmezí od 1 do 4 000 mg na jednoho pacienta. Celkové denní množství může být administrováno v jedné nebo ve více dávkách. Ve výhodném provedení vynálezu se celková denní dávka bude pohybovat v rozmezí od 100 do. 4000 mg na jednoho pacienta; ve

-17výhodnějším provedení pak v rozmezí od 500 do 3000 mg na jednoho pacienta.

Nejúčinnější způsob administrace a režim dávkování konjugátů a neaktivních prekurzorů účinné látky podle vynálezu při léčbě rakoviny závisí na řadě faktorů jako například na závažnosti onemocnění, zdraví pacienta a jeho reakci na léčbu a na úsudku ošetřujícího lékaře. Dávkování konjugátů a neaktivních prekurzorů by tudíž mělo být pro jednotlivé pacienty vyzkoušeno. Je nicméně pravděpodobné, že účinné množství konjugátu se bude pohybovat v rozmezí od 20 do přibližně 200 mg/m². Účinné množství neaktivního prekurzoru bude záviset na příslušné použité účinné látce a na toxicitě rodičovské účinné látky. Jelikož neaktivní prekurzor účinné látky je méně toxický než. rodičovská účinná látka, jako výchozí bod by mohla sloužit MTD. rodičovské aktivní látky (jestliže je známá). U neaktivních prekurzorů odvozených od mustard-fenolu (bis(2-chlorethyl)hydroxyfenylaminu), u kterých nejsou k dispozici klinická data pro rodičovskou aktivní látku, je terapeuticky účinné rozmezí méně jisté a toto rozmezí bude potřeba definovat prostřednictvím standardních toxikologických studií na zvířatech a studií u pacientů, při nichž· jsou pacientům podávány neaktivní prekurzory ve zvyšujících se množstvích (studie se začíná podáváním malých dávek). Terapeuticky účinné množství se nicméně obvykle pohybuje v rozmezí 500 až 2000 mg/m²'.

Je-li třeba, aby bylo umožněno podávání léku ve více denních dávkách, mohou být zmíněné terapeutiky účinná množství přirozeně rozdělena do více jednotlivých dávek. Velikost dávky se bude u jednotlivých pacientů lišit v závislosti na podstatě a závažnosti onemocnění, váze pacienta, jeho stravovacím režimu a dalších faktorech.

-1899 »· ···» ·

• 9

9

9 9 9 *

99

Jak je zmíněno níže, tyto kombinace mohou být obvykle formulovány do formy farmaceutických kompozic.

Přibližně 1 až 100 mg sloučeniny nebo směsi sloučenin popsaných Vzorcem 1 nebo její fyziologicky přijatelné soli je smícháno s fyziologicky přijatelným vehikulem, nosičem, excípíentem, pojivém, konzervačním prostředkem, stabilizátorem, příchutí atd. Tak je vytvořena forma dávkování léku, kterou vyžaduje přijatá farmaceutická praxe. V těchto kompozicích nebo přípravcích je množství aktivní látky takové, že je umožněno podání vhodné dávky aktivní látky v naznačeném rozmezí.

Příkladem adjuvans, která mohou být inkorporována do tablet, kapslí a podobně jsou: pojivo jako například tragant, arabská guma, kukuřičný škrob nebo želatina; excipient jako například mikrokrystalická celulóza; rozvolňovadlo jako například kukuřičný škrob,, předželatinizovaný škrob, kyselina alginová a podobně; lubríkant 'jako například stearát hořečnatý; sladidlo jako například sacharóza, laktóza nebo sacharin; příchuť jako například pepermint, libavková silice (wintergreen oil) nebo třešňová silice. Jestliže se léky podávají ve formě kapslí, tyto kapsle mohou obsahovat, mimo látek zmíněných výše, nějaký kapalný nosič jako například olej. Jako obal mohou být použity nej různější jiné materiály a tyto materiály mohou být použity i k jiné modifikaci fyzické formy, ve které je lék podáván. Tablety mohou být například obaleny šelakem, cukrem nebo oběma současně. Syrup nebo léčivý nápoj mohou obsahovat aktivní sloučeninu, sacharózu jako sladidlo, methyl nebo propyl parabeny (estery kyseliny p-hydroxybenzoové) jako konzervační činidla, barviva a příchutě jako například višňovou nebo pomerančovou příchuť.

Sterilní kompozice určené k podávání ve formě injekcí mohou být formulovány podle konvenční farmaceutické praxe tak, že se aktivní látka rozpustí nebo rozsuspenduje v

-19·· ···· ·* · « ·

nějakém vehikulu, jako například ve vodě pro podávání ve formě injekcí, v nějakém přirozeně se vyskytujícím rostlinném oleji jako například sezamovém oleji, kokosovém oleji, arašídovém oleji, bavlníkovém oleji atd. nebo v nějakém syntetickém mastném vehikulu jako například v ethylesteru kyseliny olejové a podobně. Je-li to žádoucí, mohou být rovněž začleněny pufry, konzervační přípravky, antioxidanty a podobně.

Vynález dále popisuje systém, použitelný v postupu sloužícím.k regulaci růstu neoplastických buněk v organizmu hostitele. Zmíněný postup zahrnuje administraci· účinného množství první složky do organizmu hostitele, po níž následuje latentní perioda umožňující, aby mohla být tato první složka odstraněna z krevního oběhu, a následnou administraci účinného množství druhé složky. Ve výhodném, provedení vynálezu jsou složky administrovány intravenózně.

Vynález dále popisuje postup· sloužícího k regulaci růstu neoplastických buněk v organizmu hostitele. Zmíněný postup zahrnuje administraci účinného množství první složky do organizmu hostitele (jak je zmíněno výše), po níž. následuje latentní perioda umožňující, aby mohla být tato: první složka odstraněna z krevního oběhu, a následnou administraci účinného množství druhé složky, jak je definována výše.

Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici,, která se skládá z účinného množství první složky sloužící k lokalizaci nádoru, jak je zde definována, a farmaceuticky přijatelného nosiče nebo rozpouštědla. Ve výhodném provedení vynálezu je kompozice vhodná pro intravenozní administraci. Ve výhodném provedení vynálezu je první složka dodávána ve formě suché pevné látky, která je před použitím rozpuštěna ve vhodném rozpouštědle.

-zu• · ·· • · · • · « * • · · • · ··♦ ·» ·· ·«·· • · · · « • · · *·· · • · · « • ·· ·· ·

Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici, která se skládá z účinného množství druhé složky mající protinádorovou aktivitu, jak je zde definována, a farmaceuticky přijatelného nosiče nebo rozpouštědla. Ve výhodném provedení vynálezu je tato kompozice vhodná pro intravenózní administraci. Ve výhodném provedení vynálezu je druhá složka dodávána ve formě suché pevné látky, která je před použitím rozpuštěna ve vhodném rozpouštědle.

Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici, obsahující první složku, jak je definována výše.

Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici, obsahující druhou složku, jak je definována výše.

Ve výhodném provedení vynálezu jsou farmaceutické kompozice sterilní (pro intravenózní administraci).

Další stránka vynálezu se týká první složky, jak je definována výše.

Vynález rovněž popisuje farmaceutickou kompozici obsahující mutovaný enzym, jak je definován výše.

Další stránka vynálezu popisuje plazmid pQRl62. Plazmid pQR162 byl 16. srpna 1994 uložen jako referenční vzorek NCIMB 40673 v NCIMB Limited, 23 St Machar Drive, Aberdeen- AB2 IRY, Scotland, UK v souladu s Budapešťskou smlouvou.

E. coli MSD 1646 nesoucí pCG330 (rovněž známý jako pICI1698) byly 23. listopadu 1994 uloženy v souladu s Budapešťskou dohodou v National Collection of Industrial and Marině Bacteria (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, Spojené Království AB2 IRY: referenční číslo je NCIMB 40694. NCIMB 40694 je další stránkou vynálezu.

Protilátka A5B7 byla uložena (jako referenční vzorek byl použit hybridom produkující tuto protilátku) v souladu s Budapešťskou smlouvou 14. července 1993 v ECACC, PHLS • ♦ • · ♦ · ·

-21* * · • ·

V * * * ♦ ♦ «

Centre for Applied Microbiolgy and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4OJG, UK. Výhodnější je použití humanizované protilátky A5B7 ve formě F(ab')₂.

Další protilátky použitelné k ADEPT byly popsány v následujících pracích. Protilátka BW431/26 byla popsána v Haisma H.J. a další, , Cancer Immunol. Immunother., 34:. 343 až 348 (1992). Protilátky L6, 96.5. a 1F5 byly popsány v evropském patentu 302 473. Protilátka 16.88 byla popsána v Mezinárodní patentové přihlášce W090/07929. Protilátka B72.3 byla popsána v Evropském patentu č. 392 745. Protilátka CEM231 byla popsána v Evropském patentu č. 382 411. Protilátky HMFG-1 a HMFG-11 (Unipath Ltd; Basingstoke, Hants, Spojené Království) reagují s molekulou glykoproteinu podobnou mucinu (mucin-like glycoproteín molecule) přítomnou na membránách globulí mléčného tuku a mohou být použity k nasměrování na nádory prsu a vaječníků. Protilátka SM3 (Chemicon International Ltd., London, Spojené Království) reaguje s vnitřním proteinem mucinu (core protein) a může být použita k nasměrování na nádory prsu a vaječníků. Protilátky 85A12 (Unipath Ltd., Basingstoke, Hants, Spojené Království) a ZCEA1 (Pierce Chemical Company, Chester, Spojené Království) reagují s nádorovým antigenem CEA. Protilátka PR4D1 (Dako Ltd., Hígh Wycombe, Spojené Království) reaguje s antigenem epitheliálních membrán. Protilátka C242 je dostupná z CANAG Diagnostics, Gotheríberg, Sweden. Čtenář může rovněž využít Tabulku 3 na straně 208 v Mezinárodní patentové přihlášce WO 95/13095 (Wellcome), která obsahuje data o různých protilátkách.

Obecně lze říct, že protilátky používané k ADEPT jsou špatně internalizovány prostřednictvím nádorových buněk, které jsou těmito protilátkami rozpoznávány. Tato skutečnost umožňuje, aby zacílený enzym aktivující neaktivní prekurzor účinné látky zůstal na povrchu buněk a

-22* • · • · · * · ·

z cirkulujícího

Internalizace známých postupů, a další, Cancer

Cancer Research mohl tudíž v místě nádoru vytvářet neaktivního prekurzoru účinnou látku, protilátky může být stanovována pomocí například postupy popsanými v Jafrezou Research 52: 1352, 1992 a v Press a další, 48: 2249, 1988.

Dalším využitím vynálezu je možnost použít první a druhé složky při diagnózách in vitro. Příslušný antigen můše být například detekován tak, že vystavíme diagnostikovaný vzorek působení první složky podle vynálezu, která obsahuje část odpovědnou za zacílení, jakou je například protilátka schopná vázat příslušný antigen. Poté může být nenavázaná první složka odstraněna, například promytím, a množství navázané první složky může být stanoveno využitím její schopnosti katalyzovat přeměnu druhé složky sestávající se z neaktivního prekurzoru účinné látky. Přeměna neaktivního prekurzoru můše být kvantifikována pomocí jakékoliv vhodné .metody jako například HPLC. Čtenář nechť se obrátí na A Practical Guide to ELISA od D. M. Kemeny, Pergamon Press, 1991.

Vynález dále popisuje fragment F(ab')₂ rekombinantní' myší protilátky A5B7. Tento fragment obsahuje tři disulfidické vazby mezi těžkými řetězci v pantové oblasti.

Vynález dále popisuje fragment F(ab')₂ rekombinantní myší protilátky A5B7. Sekvence .tohoto fragmentu je popsána v SEQ ID NO: 25 (sekvence těžkého řetězce) a 26 (sekvence lehkého řetězce) . Sutter a další, Gene 133, 223 až 230, 1992 tvrdí, že proto, aby bylo při produkci protilátek rekombinantními metodami dosaženo' dobré tvorby dimerů, je nezbytné zavést do pantové oblasti protilátky další cystein. Fragmenty produkované rekombinantními technikami se liší od materiálu získaného proteolytickým štěpením v tom, že neobsahují kontaminující intaktní molekuly protilátek. Materiál produkovaný rekombinantními technikami

může mít rovněž vyšší vazebnou afinitu k antigenu CEA, jak je možné stanovit pomocí zařízení Pharmacia Biacore™.

Další stránka vynálezu se týká postupu sloužícího k přípravě první složky, jak je zde definována, spojením:

části zodpovědné za nasměrování, která je schopná vázat se na antigen asociovaný s nádorem a enzymu . schopného přeměny neaktivního prekurzoru účinné látky na antineoplasticky účinnou látku, přičemž tento enzym je mutovaná forma enzymu hostitele. Mutovaný enzym a část zodpovědná za nasměrování mohou být spojeny pomocí konvenčních metod jako například použitím heterobifunkčních činidel. Uvažuje se rovněž o fúzi genů.

Mutovaný enzym a část zodpovědná za nasměrování mohou být připraveny pomocí v současnosti dobře známých technik exprese proteinů. U některých expresívních systémů je nutná transformace hostitelské buňky vektorem; takovými, v současnosti dobře známými systémy, jsou například E. coli, kvasinky a hostitelské savčí buňky (viz. Methods in Enzymology 18 5, Academie Press 19 90) . Jsou rovněž zvažovány i jiné expresívní systémy, jako například transgenní savci (ne lidé). V těchto expresívních systémech je požadovaný gen, který je ve výhodném provedení vyštěpen z vektoru, ale který jě vybaven savčím promotorem řídícím sekreci exprimovaného proteinu do mléka živočicha, zaveden do pronukleu savčí zygoty (obvykle pomocí mikroinjekce do jednoho ze dvou jader (obvykle samčího jádra) nacházejících se v pronukleu) a poté implantován do organizmu náhradní matky. Část zvířat zplozených náhradní matkou bude nést a exprimovat cizorodý gen, který se integroval do chromozomu. Integrovaný gen je obvykle předán další generaci při konvenční reprodukci a je tudíž umožněn růst chovu. Ve výhodném provedení vynálezu je požadovaný protein jednoduše

-24• · · ··· ·

4 4 · · • «44·· «· * získáván z mléka produkovaného samicí transgenního zvířete. Čtenář nechť se laskavě obrátí na následující publikace; Simons a další (1988), Bio/Technology 6: 179 až 183; Wright a další (1991), Bio/Technology 9: 830 až 834; US 4,873,191 a; US 5,322,775. Manipulace s embryem myší je popsána v Hogan a další, Manipulating the Mouše Embryo; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986.

Jsou rovněž zvažovány možnosti využití technologie transgenních rostlin, jak je například popsáno v následujících publikacích; Swain w.F. TIBTECH 9; 107 až 109, 1991; Ma J.K.C. a další Eur. J. Immunology 24: 131 až 138, 1994; Hiatt A.' a další FEBS Letters 307; 71 až 75, 1992 ; Hein M.B. a další Biotechnology Progress 7: 455 až 461, 1991; Duering K. Plant Molecular Biology 15; 281 až 294, 1990.

Je-li to žádoucí, mohou být geny hostitele inaktivovány nebo modifikovány za použiti standardních postupu ve stručnosti shrnutých níže nebo popsaných například v Gene Targeting; A Practical Approach, IRL Press, 1993. Ve výhodném provedení je cílový gen (nebo jeho část) vklonován do vektoru a dovnitř tohoto genu je vložen, selekční markér ( jako například Neo), čímž dojde k narušení funkce tohoto genu. Vektor je linearizován a tímto vektorem jsou následně transformovány (obvykle pomocí elektroporace) embryonální kmenové (ΕΞ-embryonic stem) buňky (například buňky odvozené z kmene myší 129/Ola). V části z těchto kmenových buněk poté proběhne homologní rekombinace. Kmenové buňky nesoucí gen s narušenou funkcí jsou pomnoženy a injikovány do blastocysty { jako například blastocysty získané z myší C57BL/6J) a implantovány do náhradní matky, kde dochází k vývoji. Chimérické potomstvo může být identifikováno pomocí změn barvy pokožky. Chiméričtí jedinci jsou kříženi s jedinci nesoucími genetické markéry, které umožní rozlišit mezi gametami

-25* · · · » «· · · · · • · β · · · · * ·* ·♦ · ·· · ·» «· « odvozenými od ES buněk a gametami odvozenými od buněk blastocysty. Polovina gamet odvozených od ES buněk bude nést modifikovaný gen. Mláďata jsou testována (například pomocí metody Southern blot) za účelem identifikace jedinců nesoucích modifikovaný gen (přibližně 50% potomstva). Takto vybraní jedinci budou heterozygoti a mohou být tedy kříženi s jiným heterozygotem a z jejich potomstva mohou být následně vyselektováni homozygotní jedinci (přibližně 25% populace) . Transgenní zvířata nesoucí knock-out gen mohou být křížena s transgenními zvířaty získanými pomocí známých technik jakými jsou například mikroinjekce DNA do pronukleů, fúze sféroplastů (Jakobovits a další, Nátuře 362: 255 až 258, 1993) nebo transfekce ES buněk zprostředkovaná lipidy (Lamb a další, Nátuře Genetics 5: 22 až 29, 1993). Výsledkem tohoto křížení jsou transgenní zvířata s knock-outovaným endogenním genem, který je nahrazen cizorodým genem.

ES buňky nesoucí cíleně roztržený gen mohou být dále modifikovány pomocí transformace prostřednictvím sekvence cílového genu, která obsahuje specifické změny. Tato sekvence je ve výhodném provedení zaklonována do vektoru a před vlastní transformací je tento vektor· linearizován. Po homologní rekombinaci je pozměněný gen začleněn do genomu. Tyto embryonální kmenové buňky mohou být následně použity k vytvoření transgenních živočichů postupem popsaným výše.·

V tomto kontextu označuje termín hostitelská buňka jakoukoliv prokaryotickou nebo eukaryotickou buňku vhodnou pro expresi proteinů. Takovými buňkami jsou například baktérie, kvasinky, rostlinné buňky a savčí (ne lidské) zygoty, oocyty, blastocysty, embryonální kmenové buňky a jakékoliv jiné buňky vhodné k transgenním experimentům. Je-li to z kontextu možné, pak termín hostitelská buňka zahrnuje rovněž transgenní rostliny nebo savce (ne lidi),

· «	• · ·	« ·	• · · ·
•	•	«	♦ ·	«	•	•	•
*	•	« *	• »	• «	··	•	•
•	•	»	• ft	«		9	•
• ·		• ♦ »	···	« ·	• *

kteří se vyvinuli z transformovaných savčích (ne lidských) zygot, oocytů, blastocyst, embryonálních kmenových buněk a jakýchkoliv jiných buněk vhodných k transgenním experimentům.

Další stránka vynálezu popisuje polynukleotidovou sekvenci vybranou z polynukleotidové sekvence kódující: jakoukoliv první složku, jak je definována výše; a jakýkoliv mutovaný enzym, jak je definován výše.

Vynález se dále týká vektoru- obsahujícího polynukleotid, jak je definován výše.

Vynález se dále týká buňky obsahující polynukleotid, jak je definován výše.

Příklady provedení vynálezu

Nejprve budou stručně popsány jednotlivé obrázky.

Obrázek 1 znázorňuje přípravu plazmidu pQR177. Symbol A označuje gen pro pre-RNázu, symbol B gen pro pre-RNázu K66E, v kroku 1 byla provedena RCPCR (rekombinantní kruhová PCR), v kroku 2 štěpení pomocí enzymu EcoRI, izolace malého fragmentu, ligace do plazmidu pKK223.3 a zjištěna orientace plazmidu pomocí štěpení enzymem Pstl

Obrázek 2 znázorňuje purifikaci bovinní ribonukleázy. Čistota rekombinantní RNázy byla stanovena na 16% polyakrylamidovém gelu s 0,1% SDS barveném stříbrem. Dráhy A a G odpovídají komerčně dostupné RNáze (M_r = 13 700) . V drahách C až E jsou kladně nabité proteiny získané izokratickou elucí z periplazmatického extraktu z bakteriálních kultur Escherichia coli (pQR163) indukovaných rozdílnými koncentracemi IPTG (0,5, 2 a 0 mM IPTG). Dráha F odpovídá drahám C až E, ale jako bakteriální kultura byly použity buňky Escherichia coli (pKK223.3) (kontrola). Dráha

B, purifikovaná chromatografií .

rekombinantní

RNáza

PO íonexove

Obrázek 3 znázorňuje PCR strategii vedoucí k vytvoření plazmidu pATF4. Primery 3 až 6 jsou použity v PCR reakci, pří níž (a) jsou inkorporovány bovinní signální sekvence spolu s kódující sekvencí pro hexapeptid na 5' konci genu lidské pankreatické ribonukleázy a (b) kódující sekvence pro alespoň sedm aminokyselin enzymu HP-RNázy spolu s terminačním kodónem. Primery 5 a 6 rovněž obsahují restrikční místa pro EcoRl. Symbol A označuje gen pro pre-RNázu, symbol B gen pro pre-RNázu R4A:K6A. V kroku 1 byla provedena PCR. Jako templát byl použita sekvence pro lidskou pankreatickou maturovanou RNázu vzniklá PCR reakcí z lidské genomové DNA. Dále bylo provedeno štěpení enzymem EcoRl. Vzniklý fragment byl naligován do plazmidu pUC18. V krocích 2 a 4 bylo provedeno štěpení enzymem EcoRl a následná ligace do plazmidu pKK223.3.

provedena cílená mutageneze pomocí RCPCR.

V kroku 3 bylaNa pozici 4 a 6 genu pro HP-RNázu byly zavedeny kodóny pro alanin.

Obrázek 4 znázorňuje stanovení čistoty exprimované. lidské pankreatické RNázy R4A.K6A pomocí PAGE. Dráhy A a F, 2 pg RNázy A; dráhy B a C, rozdílná množství kladně nabitých proteinů získaných izokratickou elucí z periplazmatického prostoru buněk E. coli nesoucích plazmid .pATF4 ; dráhy D a Ε, 1 fig a 500 ng purifikované HP-RNázy.

Obrázek 5 znázorňuje tvorbu pATFZ44 metodou rekombinantní kruhové PCR

Obrázek 6 znázorňuje srovnání toxicity neaktivního prekurzorů účinné látky a toxicity odpovídající účinné látky na buňkách LoVo. Cytotoxicita byla vyhodnocována pomocí barvení SRB. Křivka A plati pro neaktivní prekurzor účinné látky a křivka B pak odpovídající fenolickou účinnou

-28·« ···* ·· ♦ · ·· • · Β· ···♦<· · • · *···**

9 9 ·999 999 9 » · » Β 9 9 · Β

Β · ··· Β · Β Β · Β · · látku. Na ose χ je koncentrace látek v μΜ a na ose y procento přeživších buněk.

Obrázek 7 znázorňuje schéma syntézy neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od uracilu

Obrázek 8 znázorňuje oligonukleotidové primery použité:

I) v RCPCR pro vložení mutace K66E do genu pro RNázu, tučná písmena vyznačují mutovanou pozici

II) pro izolaci genu HP-RNázy a konstrukcí chimérického genu exprimovaného v E.coli

III) v RCPCR pro vložení mutace R4A:K6A do genu pro RNázu, tučná písmena vyznačují mutovanou pozici

Obrázek 9 znázorňuje schéma syntézy analogu neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od uracilu

Obrázek 10 znázorňuje schéma syntézy analogu neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od cytidinu

Obrázek 11 znázorňuje chemické vzorce, jako Rl můžebýt I)uráčil, II)cytosin

Obrázek 12 je schématickým diagramem komplexu aktivního místa ribonukleázy A se substrátem. Písmena B, R a P označují vazebná (pod)místa pro bázi (Β), ribózu ( R) a fosfát (P) . Místo B_x je specifické pro pyrimidinové nukleotidy a místo B₂ upřednostňuje purinové nukleotidy.

3' - pyrimidinové mononukleotidy se vážou do 5'purinové mononukleotidy se vážou do místa B₂R₂P_X. 3'- AMP se váže do místa B₂R₂.P₂. Fosfátová skupina uvolněná hydrolýzou fosfodiesterové vazby působením enzymu se váže do místa P_x. Aminokyselinové zbytky, které se účastní zmíněných vazeb v jednotlivých místech jsou naznačeny.

·· ··· ·

-29• ♦ ♦ • · · « · · ό ··· *««»»· • · « » ·««*««·« • · · · · · · ·· ♦· ··* «» ·« ·

Obrázek 13 je schématickým diagramem neaktivního prekurzoru účinné látky v aktivním místě mutantního enzymu s převrácenou polaritou, kde;

* reprezentuje aminokyselinový zbytek s převrácenou polaritou (Lys 66 v nativní ribonukleáze) a;

X je kladně nabitá skupina (připojená prostřednictvím aminokyselinového zbytku s převrácenou polaritou

Obrázek 14 znázorňuje štěpení neaktivního prekurzoru účinné látky Činností' mutantního enzymu. Symbol A vyznačuje neaktivní prekurzor účinné látky, symbol B pak vlastní toxin.

Obrázek 15 demonstruje mechanizmus činnosti nativní lidské RNázy. Sloučenina 1 je ester pyrimidin nukleosid 3' fosfátu, sloučenina 2 je 23¹-cyklickým pyrimidin nukleosid fosfátem a sloučenina 3 je pyrimidin nukleosid 3' fosfát.

Obrázek 16 znázorňuje strukturu substrátů CpA a C>p

RNázy

Obrázek 17 znázorňuje schéma syntézy neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od cytosinu podle publikace Christensen and Broom (1972), J. Org. Chem. 37, 3398-3401.

Obrázek 18 ilustruje klonování lidské pankreatické karboxypeptidázy B (HCPB)

Obrázek 19 ilustruje sekvenování pankreatické HCPB. Všech 6 klonů melo identickou sekvenci a v aktivním místě místě aspartát, který je řadí mezi karboxypeptidázy B (místo I) a vložený kodón TGC měnící sekvenci z GSSIG NA GSSCIG (misto II)

Obrázek 20 znázorňuje vektor pICI1266 « * · ·· ·« ··· • · ·· · · · · · · · · · · ··♦···

-J v ” « * > « »·· «*· · • · · · · · · ♦ ·· ··« ··» ·· «♦ ·

Obrázek 21 znázorňuje klonováni genu do expresívního vektoru pICI1266

Obrázek 22 ilustruje cytotoxicitu neaktivního prekurzoru účinné látky a odpovídající účinné látky v lidských kolorektálních nádorových buňkách LoVo. Křivka A odpovídá prekurzoru účinné látky Založenému na kyselině glutamové, křivka B pak odpovídá vlastní účinné látce fenol-mustard. Na ose x je koncentrace látek v μΜ a na ose y procento přeživších buněk.

Obrázek 23 je seznamem složek růstového média

Obrázek 24 je diagramem reprezentujícím klíčové interakce mezi aminokyselinami nativní ríbonukleázy a fragmentem ribonukleové kyseliny. Pozitivně nabitý Lys 66 v pozici P_Q je zobrazen při iontové interakci se záporně; nabitou fosfodiesterovou vazbou, zatímco aminokyselinové zbytky v pozici ?! jsou důležité pro katalytický proces.

Obrázek 25 znázorňuje interakci mezi mustard-neaktivním prekurzorem účinné látky a mutantní. RNázou. Aby bylo zabráněno přeměně působením nativní RNázy, je klíčová aminokyselina na pozici 66 změněna na záporně nabitou kyselinu glutamovou. Tato Glu-66 se účastní iontové interakce s kladně nabitým zbytkem X nacházejícím se v neaktivním prekurzoru účinné látky a uskutečňuje tudíž .interakci s převrácenou polaritou. Přepokládáme, že další mutace v pozicích R₂ a B₂ by mohly vést k silnější interakci s neaktivním prekurzorem účinné látky.

Obrázek 26 znázorňuje dvě možnosti použitelné jako kladně nabité skupiny v pozici 5' ribózy, které by měly vliv na interakci s Glu-66 na pozici P_o.

Obrázky 27 až 33 znázorňují postupy chemické syntézy.

Použitě zkratky

Ac	acetyl
ADEPT léčba využívající enzymu cíleného prostřednictvím protilátek, jehož substrátem je neaktivní forma účinné látky (antibody directed enzyme prodrug therapy)
BOC	terč-butoxykarbonyl
BP-RNáza	bovinní pankreatické ribonukleáza
DCCI	1, 3-dicyklohexylkarbodiimid
DMAP	4-dimethylaminopyridin
DMF	N, N-dimethyl-formamid
DMSOdimethylsulfoxid
Et	ethyl
EDCI	1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl-karbodiimid
HCPB	lidská CPB (human CPB)
HOBT	1-hydroxybenzotriazol
HP-RNáza	lidská pankreatické ribonukleáza
PCR	polymerázová řetězová reakce
TFA	kyselina trifluoroctová
THF	tetrahydrofuran

Referenční příklad 1

Příprava rekombinantní maturované bovinní pankreatické ribonukleázy

Rekombinantní bovinní pankreatické ribonukleáza byla připravena z kódující sekvence pro prekurzor bovinní pankreatické ribonukleázy (BP-RNáza) způsobem popsaným v Tarragona-Fiol a další, Gene 118, 239 až 245,- 1992, Protein byl exprimován z dvojcistronního expresívního fragmentu zaklonovaného v pQR163 v E.. coli a exprese byla řízena promotorem tac. Plazmid obsahuj ící dvojcistronní fragment byl označen pQRlS2 (NCIMB 40678).

-32• * I ♦ · · «« ··· • ·· ·· ·»·♦ ·· · · ♦ » · • · « · · · • « · ft ··· · » · · · · ··· »· ·« ♦

Referenční příklad 2:

Příprava lidské pankreatické ribonukleázy Arg4Ala, Lys6Ala

Kódující sekvence genu lidské pankreatické ribonukleázy (HP-RNáza) byla získána z genomové DNA extrahované z lidských lícních epitheliálních buněk použitím techniky PCR způsobem popsaným v v Tarragona-Fiol a další, Protein and Peptide Letters 1, 76 až 83, 1994. Co se týká přípravy HP-RNázy, je popsána exprese geneticky modifikované HP-RNázy v E. coli. Proto, aby byl rekombinantní lidský pankreatický enzym po expresi směrován do periplazmatického prostoru E. coli, byla k 5' konci lidského genu připojena signální sekvence bovinní pankreatické RNázy. Počáteční pokusy exprimovat rekombinantní enzym nebyly úspěšné. Proto byly, za účelem umožnění exprese v E. coli, použity techniky místně specifické mutageneze, s jejichž pomocí byl pozměněn gen pro HP-RNázu. Výsledný, metodami genového inženýrství pozměněný enzym, vykazuje podobné kinetické charakteristiky jako homologní bovinní enzym.

(a) Klonování maturované kódující sekvence RNázy Arg4Ala, Lys6Ala

Štěpení restrikčními enzymy, defosforylace, ligace, transformace a minipreparace plazmidové DNA byly prováděny způsoby popsanými v Maniatis a další, 1982, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour, Laboratory, Cold Spring Harbour, New York. Oligonukleotidy byly syntetizovány pomocí syntetizéru DNA Cyclone™.

Maturovaná sekvence genu HP-RNázy byla získána' z genomové DNA extrahované z lidských lícních epitheliálních buněk použitím techniky PCR. Stručně řečeno, epitheliální buňky byly získány energickým protřepáváním 10 ml 0,9% fyziologického roztoku v ústech po dobu 20 sekund. Suspenze lícních epitheliálních buněk (1,5 ml) byla zcentrifugována

-334 ·» ·· ···· • « « · · • « · · 9 t 9 9 99* 9 • · · · «· ** · a peleta byla rozsuspendována ve 100 μΐ 10 mM NaCl a 10 mM EDTA. Po druhé centrifugací byla buněčná peleta rozsuspendována v 75 μΐ 20 mM NaOH a inkubována při 100⁰C po dobu 30 minut. Buněčný odpad byl odstraněn centrifugací a supernatant byl skladován při -20°C. Pro PCR inkubace byly jako templát standardně používány alikvoty 2 až 3 μΐ. Pro PCR inkubaci byly použity dva primery (SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 6; viz. Obrázek 8, primery 1 a 2) komplementární k 5' a k 3' koncům maturované sekvence HP-RNázy (5 pmol jednotlivého primeru/inkubace). Inkubační směs pro PCR dále obsahovala: lidskou genomovou DNA, 0,2 mM dNTP, lx pufr Stratagene™ (lOx pufr má složení - 200 mM Tris-HCl (pH 8,2), 100 mM KCi, 60 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM MgCl₂, 1% Triton™ X-100 a 100 pg/ml BSA bez přítomnosti nukleázy) a 2,5 jednotek polymerázy pfu (Stratagene) . PCR reakce byla·· prováděna ve 30 cyklech. Každý cyklus sestával z denaturace při 92 °C po dobu 30 sekund, spojování denaturovaných vláken DNA při 55°C po dobu 30 sekund a extenze při 75°C po dobu 1 minuty. Výsledné produkty PCR reakce byly analyzovány a separovány elektroforézou na agarovém gelu. Požadované fragmenty DNA byly vyříznuty z agarózového gelu a DNA byla., extrahována za použití centrifugačních jednotek (Spin-X™, Costar). Proto, aby byl kompletní rekombinantní enzym po expresi směrován do periplazmatického prostoru buněk Escherichia coli JM107, byla· za použití technik PCR k 5' konci lidského .genu připojena signální sekvence bovinní pankreatické RNázy a ke 3' konci byla připojena spolu s terminačním kodónem rovněž kódující sekvence pro posledních sedm aminokyselin HP-RNázy. Následně byla připravena reakce PCR, kde reakčni směs obsahovala jako templát maturovanou sekvenci genu HP-RNázy připravenou pomocí PCR, která postrádá kódující sekvenci pro posledních sedm aminokyselin, sadu vzájemně se překrývajících primerů (SEQ ID NO: 7 až 10; viz. primery 3 až 6 na Obrázku 8) v rozdílných koncentracích (0,1, 0,5 a 50 pmol od vnitřního

-34- : :

φ Φ φ Φ φφ β φ φφ φφ φφφφ

Φφ φφ φ φ φ φ φ • φφφφφφ φ * «φ φφ φφφφ φ φφφ φ φ ··· φφφ φφ φφ φ ke vnějšímu primeru) 0,2 mM nukleotidy, lx pufr Stratagene (viz. výše) a 2,5 jednotek polymerázy pfu (Stratagene). Reakce byla prováděna za stejných podmínek jak jsou popsány výše. Produkty PCR byly zpracovány postupem popsaným výše a požadovaný fragment byl vyříznut a extrahován z agarózového gelu. Tento fragment byl rozštěpen pomocí EcoRI a zaligován do předem rozštěpeného a defosforylovaného plazmidu pUCl8, aby bylo možné provést sekvenování dvojvláknové DNA dideoxy metodou. Fúzní gen byl poté zaligován do expresívního vektoru pKK223.3; viz. Příklad 1. Bovinní signální sekvence tvořená sekvencí DNA kódující hexapeptid byla připojena na 5' konec otevřeného čtecího rámce. Této skutečnosti je využito k rozrušení sekundární struktury mRNA, která se vytvoří při iniciaci transkripce promotoru. Indukce, exprese a purifikace rekombinantního enzymu byla prováděna postupem popsaným výše. Analýza proteinů periplazmatického prostoru získaných tímto postupem ukázala, že v periplazmatickém prostoru se nevyskytuje žádný produkt, který by vykazoval aktivitu rekombinantní RNázy.

Skutečnost, že v těchto experimentech nedošlo k expresi lidského enzymu byla neočekávaná, protože bovinní signální sekvence již byla s úspěchem použita k namíření translokace rekombinantního bovinního enzymu do periplazmatického prostoru. Srovnání N-koncových sekvencí nativního lidského a bovinního enzymu odhalilo rozdíly na pozicích 4 a 6, na nichž jsou alaniny přítomné v bovinním enzymu nahrazeny argininem a lysinem v jeho lidském protějšku. Je známo, že přítomnost kladně nabitých aminokyselin někde blízko počátku maturované sekvence může fungovat jako stop signál, který zabrání další translokaci. Aby bylo možné překonat tento problém byla vyvinuta strategie, která vedla k náhradě lysinu a argininu na pozicích 4 a 6 v lidském enzymu alaninovými zbytky. K vytvoření rekombinantního klonu pATF3, který nese požadované substituce (viz. Obrázek 3), byla tudíž použita

4» *···

-35·· 4 • 4 44 • 4 4 • * 9

4« *· 99 9

• · 9 · 4 ··· 4 • 4

9 technika RCPCR (primery použité k zavedení požadovaných mutací jsou označeny SEQ ID NO: 11 až 14; viz. primery E až H na Obrázku 8) . Aby bylo možné potvrdit začlenění kódujících sekvencí pro alanin na pozicích 4 a 6, byl jako templát při sekvenování dvoj vláknové DNA použit takto upravený chimérický plazmid. Výsledkem restrikčního štěpení a ligace do pKK223.3 byl vznik chimérického expresívního vektoru pATF4 (Obrázek 3), který byl použit k expresi.

(b) Exprese a purifikace rekombinantní RNázy Arg4Ala, LysSAla z E. coli

Výsledkem transformace buněk Escherichia coli plazmiem pATF4 a následná indukce pomocí IPTG byla exprese geneticky upraveného lidského enzymu, který je izolován z periplazmatického prostoru s využitím protokolů popsaných v předchozím textu používaných k produkci homologniho bovinního enzymu. Geneticky upravená rekombinantní RNáza byla ze směsi přítomné v periplazmatickém prostoru izolována a vyčištěna do homogenity (viz. Obrázek 4). Bylo provedeno sekvenování N-konce rekombinantního enzymu, které potvrdilo, že bovinní signální sekvence byla odštěpena· správně. Tato skutečnost rovněž potvrdila, že došlo k záměně alaninových zbytků za Arg-4 a Lys-6,

Za použití substrátů CpA a C>p (obrázek 16) byla provedena charakterizace kinetických parametrů. Kinetické parametry Km, kcat a kcat/Km byly srovnány s hodnotami získanými pro komerčně dostupnou a rekombinantní bovinní pankreatickou RNázu při stejných podmínkách měření (viz. Tabulky). Získaná data naznačují, že kinetické vlastnosti geneticky modifikované RNázy se podstatně neliší od kinetických vlastností jejího homologniho bovinního protěj šku.

	• B	9		»B	»·	··♦·
•	•	9	• ·	B	• ·	*
*	B	Β B	• ·	* B	···	•
•	• • 4	• ···	* B III	• ··	• B ·· ·

Kinetické parametry různých enzymů při použití CpA jako substrátu při pH 7,0

kcat/Km (mM^/s-1)
Rekomb. HP-RNáza R4A:K6A	1700 (480)
Rekomb. BP-RNáza	2800 (370)
BP-RNáza	2300 (600)

Kinetické parametry různých enzymů při použití C>p jako substrátu při pH 7,0

Rekomb. HP-RNáza R4A:K6A

Rekomb. BP-RNáza

BP-RNáza

4.2 (0,8)

3,9(0,9)

2.3 (0,5)

Referenční příklad 3

Syntéza a izolace konjugátu myší A5B7-bovinní pankreatická ribonukleáza

Jednou z protilátek schopných vazby s některým, antigenem asociovaných s nádorem je myší monoklonální protilátka A5B7. Protilátka A5B7 se váže na lidský karcinoembryonální antigen (CEA-carcinoembryonic antigen) a je zvláště vhodná k nasměrování konjugátu na kolorektální karcinom. A5B7 je možné získat od DAKO Ltd., 16 Manor

Courtyard, Hughenden Avenue, High Wycombe, Bucks HP13 5RE, England, Spojené Království. Fragmenty protilátky mohou být připraveny z intaktní protilátky IgG pomocí konvenčních postupů. Například fragmenty F(ab')₂ mohou být připraveny postupem popsaným v Mariani, M. a další, Molecular Immunology 28, 69 až 77, 1991. Obecně lze říci, že konjugáty protilátka (nebo fragment protilátky)-enzym by • ·4 4 ·

-374« * «44

4··· 4* 44 44 4 ♦ · 4 *44··· * 4 * 4 44 4 · 4444 • · 4 444 ··

44« ·44 44 44 4 měly být alespoň divalentní, což znamená, že by měly být schopny vázat se alespoň ke dvěma antigenům asociovaným s nádorem (které mohou být totožné nebo rozdílné). Molekuly protilátky mohou být humanizovány pomocí známých postupů jako například vkládáním CDR úseků (CDR grafting) popsaným v EP 2394000 nebo připojením celých variabilních oblastí k lidským konstantním oblastem, které je popsáno v US 4816567. Humanizované protilátky mohou být užitečné ke snížení- imunogenity dané proti-látky - - (nebo fragmentu ’ protilátky). Humanizovaná verze protilátky A5B7 byla popsána v PCT WO 92/01059.

Hybridomy produkující monoklonální protilátku A5B7 byly uloženy v European Collection of Animal Cell Cultures, Division of Biologícs, PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Port Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Spojené Království. Hybridomy byly uloženy 14. července 1993 pod referenčním číslem No. 93071411. Protilátka A5B7 může být z uložených hybridomů získána pomocí standardních technik v současnosti dobře známých, jak jsou například popsány v Fenge C., Fraune E., a Schuegerl K., v Production of Biologicals from Animal Cells in Culture (Spier R. E., Griffiths J. R. a Meignier B., eds), Butterworth-Heinemann, 1991, 262 až 265; a Anderson B. L. a. Gruenberg M. L. v Comercial Production of Monoclonal Antibodies (Seaver S., ed.), Marcel Dekker, 1987, 175 až

195. Buňky mohou 'čas od času vyžadovat překlonování prováděné limitním zředěním, aby byla udržena vysoká hladina produkce protilátek.

Linkerem použitým při derivatizaci myší A5B7 byl ŠATA™ (ester N-hydroxysukciimidu s kyselinou S-acetyl thioglykolovou), Sigma (kód výrobku A9043).

Linkerem použitým při derivatizaci bovinni pankreatické ribonukleázy (BP-RNáza) byl SMPB (ester • · «· ·

-384-(p-maleinimidofenyl)

N-hydroxy suke i irnidu s kyselinou butanovou), Sigma (kat. č. M6139).

ŠATA (Sigma) byl rozpuštěn v DMSO (Fisons) na výslednou koncentraci 10 mg/ml. K roztoku 50 mg A5B7 o koncentraci 5,4 mg/ml v pufru tvořeném 100 mM fosforečnanem/100 mM NaCl/l mM EDTA, pH 7,2 (pufr A) bylo přidáno 309 μν (30,9 μΐ) roztoku ŠATA (což odpovídá čtyřnásobnému molárnímu nadbytku, oprot-i A5B7) . Směs byla zamíchána a ponechána po dobu 40 minut při pokojové teplotě. Za účelem odstranění nadbytku reakčních činidel byl výsledný roztok při pokojové teplotě aplikován na kolonu Sephadexu’“ G25 (Pharmacia) (210 ml, 2,6 x 38 cm) . Výsledná koncentrace derivatizované A5B7 po průchodu kolonou byla 2,09 mg/ml (celkový objem 23,5 ml). A5B7 derivatizovaná ŠATA byla smíchána s 1,0 ml 10% v/v 500 mM hydroxylaminu HC1/500 mM fosforečnanu sodného/30 mM EDTA, pH 8,0 za účelem deacetylace derivatizované A5B7. Tato reakce probíhala po dobu 40 minut při pokojové teplotě. Koncentrace proteinu byla stanovena měřením absorbance v UV oblasti při 280 nm při předpokládaném koeficientu e=l,4 (nebo stanovením koncentrace proteinů podle Bradfordové). Množství navázaného linkeru bylo určeno stanovením -SH skupin podle Ellmanse a byla zjištěna přítomnost 1,2 linkeru/mol A5B7.

BP-RNáza (Sigma) byla rozsuspendováha v 6,0 ml 100 mM fosforečnanu sodného/100 raM NaCl, pH 7,2 (pufr B) na výslednou koncentraci 8,33 mg/ml.

SMPB (Sigma) byl rozpuštěn v DMSO (Fisons) na výslednou koncentraci 10 mg/ml. Roztok 50 mg BP-RNázy byl smíchán s 6500 mg (650 ml) roztoku SMPB (což odpovídá pětinásobnému molárnímu nadbytku oproti BP-RNáze) a směs byla ponechána po dobu 120 minut při pokojové teplotě. Nadbytek reakčních činidel byl odstraněn pomocí gelové chromatografie (Sephadexu™ G25, 210 ml, 2,6 x 30 cm)..

«· ··* • · · • · • »» « · · ··· ·

Koncentrace derivát i zované‘ho proteinu byla stanovena měřením absorbance v UV oblasti při 280 nm při předpokládaném koeficientu e=0,6. Množství navázaného linkeru bylo stanoveno reverzním Ellmansovým stanovením, kdy bylo k BP-RNáze derivatizované SMPB přidáno známé množství 2-merkaptoethanolu a měřeno bylo množství nezreágóvanýeh -SH skupin.

Konjugační reakce byla provedena smícháním stejných váhových množství deacetylované derivatizované A5B7 a derivatizované BP-RNázy, zředěním směsi v deionizované vodě na výslednou koncentraci 1,0 mg/ml a mícháním pod proudem dusíku. Reakce probíhala po dobu 20 hodin při pokojové teplotě a byla ukončena přídavkem 1 mg/ml glycinu.

Surový konjugát byl dialyzován proti 50 mM fosfátu, pH 8,0 (pufr C) a získaný roztok byl nanesen na kolonu Q Sepharózy™ (Pharmacia) (30 ml 1,6 x 15 cm) předem ekvilibrované v pufru C. 2a účelem odstranění nadbytku A5B7 a BP-RNázy byla kolona promyta pufrem C a následné eluce konjugátu bylo dosaženo promytím kolony 0,5 M NaCI o průtoku 1 ml/min.

Čistota výsledného konjugátu byla stanovena pomocí SDS-PAGE a celkové množství konjugátu bylo stanoveno na

5,75 mg, přičemž pomocí laserové densitometrie bylo ukázáno, že zmíněné množství se skládá z· 88,4% konjugátu a 11,6% volné derivatizované A5B7.

Referenční příklad 4

Syntéza a izolace konjugátu myší A5B7 F (ab') ₂-bovinní pankreatická ribonukleáza

Linkerem použitým při derivatizaci A5B7 byl ŠATA™ (ester N-hydroxysukciimidu s kyselinou S-acetyl thioglykolovou), Sigma (kód výrobku A9043).

·· ·» ··«· • · · * · • t * · · • ♦ · ·· · • · · · ·· ·· » bovinní ester • · · · • · t · · » · · · ·· Μ» «··

Linkerem použitým při derivatižaci paňkreatické ribonukleázy (BP-RNáza) byl SMPB

N-hydroxysukciimidu s kyselinou 4-(p-maleinimidofenyl)butanovou), Sigma (kód výrobku M6139).

ŠATA (Sigma) byl rozpuštěn v DMSO (Fisons) na výslednou koncentraci 10 mg/ml. K roztoku 18,20 mg fragmentu F(ab')₂ o koncentraci 2,14 mg/ml v pufru tvořeném 100 mM fosforečnanem/100 mM NaCl/1 mM EDTA, pH 7,2 (pufr A) bylo přidáno 167 μ% (16,7 μΐ) roztoku ŠATA (což odpovídá čtyřnásobnému molárnímu nadbytku oproti A5B7 F(ab')₂). Směs byla zamíchána a ponechána po dobu 40 minut při pokojové teplotě. Výsledný roztok byl s použitím membrány Amicon YM10™ (s cut-off MW= 100000) zakoncentrován na celkový objem 2 ml (9 mg/ml) a nadbytek reakčních činidel byl odstraněn chromatografií na koloně Sephadexu™ G25 (Pharmacia) (50 ml, 1,6 x 16 cm) při pokojové teplotě. Výsledná koncentrace derivatizovaného A5B7 F(ab')₂ po průchodu kolonou byla 1,04 mg/ml (celkový objem 10 ml). A5B7 F(ab')₂ derivatizovaný ŠATA byla smíchána s 1,0· ml 10% v/v pufru obsahujícího 500mM hydroxylamin HCl/500mM fosforečnan sodný/30 mM EDTA pH 8,0 za účelem deacetylace. derivatizovaného A5B7 F(ab')₂. Tato reakce probíhala po dobu 40 minut při pokojové teplotě. Koncentrace proteinu byla stanovována měřením absorbance v UV oblasti při 280 nm při předpokládaném koeficientu e=l,4 (nebo stanovením koncentrace proteinů podle Bradfordové,),. Množství navázaného linkeru bylo určeno stanovením -SH skupin podle Ellmanse a byla zjištěna přítomnost 1,2 linkeru/mol F (ab') ₂.

BP-RNáza (Sigma) byla rozsuspendována ve 2,0 ml 100 mM fosforečnanu sodného/100 mM NaCI, pH 7,2 (pufr B) na výslednou koncentraci 7,5 mg/ml.

SMPB (Sigma) byl rozpuštěn v DMSO (Fisons) na výslednou koncentraci 10 mg/ml. Roztok 15 mg BP-RNázy byl

smíchán s 1949 mg (1,95 ml) roztoku SMPB (což odpovídá pětinásobnému molárnímu nadbytku oproti BP-RNáze) a směs byla ponechána po dobu 120 minut při pokojové teplotě. Nadbytek reakčních činidel byl odstraněn pomocí gelové chromatograf ie (Sephadex'* G25, 50 ml, 1,6 x 16 cm). Koncentrace derivatizovaného proteinu byla stanovována měřením absorbance v UV oblasti při 280 nm při předpokládaném koeficientu e=0,6. Množství navázaného linkeru bylo stanoveno reverzním Ellmansovým stanovením, kdy bylo k BP-RNáze derivatizované SMPB přidáno známé množství 2-merkaptoethanolu a měřeno bylo množství nezreagovaných -SH skupin.

Konjugační reakce byla provedena smícháním stejných váhových množství deacetylovaného derivatizovaného A5B7 F(ab')₂ a derivatizované BP-RNázy, zředěním směsi v deionízované vodě na výslednou koncentraci 1,0 mg/ml a mícháním pod proudem dusíku. Reakce probíhala po dobu 20 hodin při pokojové teplotě a byla ukončena přídavkem 1 mg/ml glycinu. Surový konjugát byl dialyzován proti 50 mM fosfátu, pH 8,0 (pufr C) a 5 ml (6,5 mg) získaného roztoku bylo naneseno na kolonu Mono Q™ (HR5/5) (Pharmacia) předem ekvilibrovanou v pufru C. Za účelem odstranění nadbytku A5B7 F(ab')₂ byla kolona promyta pufrem C. Následná eluce konjugátu a zbylé BP-RNázy probíhala při použití gradientu soli (0 až 1,0 M gradient o celkovém objemu 20-ti násobku objemu kolony) při průtoku 1 ml/min. Odstranění konjugátu od zbylého enzymu bylo dosaženo aplikací spojených frakcí obsahujících konjugát na kolonu S200'^M GPC (Pharmacia) (60 ml, 1,6 x 30 cm) a promýváním v PBS o průtoku 1 ml/min.

Čistota výsledného konjugátu byla stanovena pomocí SDS-PAGE a celkové množství konjugátu bylo stanoveno na 0,70 mg, přičemž pomocí laserové densitometrie bylo ukázáno, že zmíněné množství se skládá z 95,5% konjugátu a 4,5% volného derivatizovaného A5B7 F(ab')₂.

-42ι«»

Myší Α5Β7 F(ab')₂ byl připraven postupem popsaným v Referenčním příkladu 5 nebo s využitím následujícího postupu:

Protilátka A5B7, popsaná v Referenčním příkladu 3, (780 ml o koncentraci 5,4 mg/ml) byla ke štěpení upravena diafiltrací proti 7 objemům pufru o složení 0,1 M fosforečnan sodný, 3 mM EDTA (pH 6,4) za použití aparatury Amicon™ CH2 vybavené kolonkou se spirálově vinutou 130 kDa membránou. Získaný materiál (měřením absorbance při 280 nm bylo množství odhadnuto na 3682 mg) byl přefiltrován přes mikrobiální filtr 0,22μΜ a uschován pří 4°C až do doby použití. Suspenze krystalického papainu (9 ml o koncentraci 10 mg/ml; Boehringer Mannheim, kód výrobku 1080140) byla smíchána s pufrem o složení 0,1 M fosforečnan sodný, 3 mM EDTA (pH 6,4) obsahujícím 100 mM L-cysteín a ponechána po dobu 30 minut při 37°C. Přebytek cysteinu byl odstraněn použitím vylučovací chromatografie (Pharmacia G25M™, průměr kolony 2,6 cm, délka kolony 30 cm, celkový objem přibližně 160 ml). Eluce byla prováděna pufrem o složení 0,1 M fosforečnan sodný, 3 mM EDTA (pH 6,4) pří průtoku 3 ml/min. V jímaných frakcích (1 minuta) byla monitorována OD při·. 2 8 0nm a byl v nich rovněž prováděn jednoduchý DTNB spot test, aby bylo zajištěna nepřítomnost volného cysteinu .před vlastním spojením jednotlivých frakcí redukovaného papainu. Koncentrace redukovaného papainu ve spojených frakcích byla stanovena (měřením OD280, připředpokládaném e=2,5) na 1,65 mg/ml v objemu 2,8 ml. Celkové množství proteinu bylo tedy 54 mg. Štěpení bylo prováděno při 37°C při poměru redukovaný papain ku A5B7 odpovídajícímu 1/60 w/w. Byl použit všechen dostupný papain a 665 ml protilátky (před počátkem štěpení předehřáté na 37°C) o koncentraci proteinu odhadnuté na 4,9 mg/ml. Reakce byla ukončena po 20 hodinách přídavkem 100 mM N-ethylmaleimidu v 50% ethanolu o objemu 0,1-násobku celkového reakčního objemu. F(ab')₂ byly od Fc a stop nerozštěpených protilátek odstraněny za použití

kolony Protein A Sepharose FF™ (Pharmacia) (400 ml, rozměry 5 cm x 20 cm) ekvilibrované pufrem o složení 25 mM fosforečnan sodný a 150 mM chlorid sodný (pH 7,33) až do doby, kdy pH a vodivost odpovídaly hodnotám ekvilibračního pufru (19,7 mS při 15°C). Reakční směs (po skončení štěpení papainem) byla zředěna v poměru 1:1 ekvilibraČním pufrem a rozdělena na dvě části (660 ml a 340 ml) a každá z těchto částí byla aplikována na kolonu Protein A při průtoku 6,5 ml/min (lineární rychlost průtoku 0,33 ml/cm²/min) . Celkem bylo sebráno 10 frakcí. Nasycená kolona byla promývána ekvilibraČním pufrem až do chvíle, kdy hodnota absorbance při 280 nm dosáhla základní linie. První promytí bylo provedeno 50 mM octanem sodným (pH 4,5), dále pak byl jako eluční pufr použit 50 mM octan sodný (pH 4,0), následovala eluce 50 mM kyselinou citrónovou (pH 3,5} a poslední promytí bylo provedeno 50 mM kyselinou citrónovou (pH 2,8). Během promývání byly v jímaných frakcích měřeny hodnoty OD280 a spojené frakce byly poté do 30 minut neutralizovány za použití roztoku hydrogenfosforečnanu sodného (0,4 M) . Jednotlivé vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE (Pharmacia Excel™ gel, barveno Coomassie). F(ab')₂ byly eluovány pufrem o pH 4,0 a nerozštěpená A5B7 byla eluována při promývání pufry o nejnižším pH. Spojené frakce obsahující F(ab}₂ byly diafiltrací převedeny do pufru o složení 100 mM fosforečnan sodný, 100 mM chlorid sodný, 1 mM EDTA (pH 7,2) (Amicon™ CH2 membrána 30kDa, 7 násobný objem) a výsledkem bylo celkové množství 845 mg F(ab)₂ (2 mg/ml).

Referenční příklad 5

Příprava rekombinantního myšího A5B7 F(áb')₂ v myelomech.

Tento příklad popisuje přípravu cDNA z hybridomů A5B7, izolaci příslušných fragmentů Fd a L řetězců pomocí PCR, stanovení kompletní sekvence DNA u těchto fragmentů, následnou koexpresi v myelomech za účelem produkce

-44« · • · · rekombinantních fragmentů F(ab')₂, pěstování myelomů a purifikaci rekombinantního proteinu F(ab')₂.

V literatuře je popsáno několik postupů sloužících k produkci geneticky upravených protilátek v myelomech; například Neuberger a další, Nátuře 312, 604 až 608, 1984 ; Williams a Neuberger, Gene 43, 319 až 324, 1986 ; Wright a Shin, Methods 2, 125 až 135, 1991; Traunecker, Trends in Biotechnology 9, 109 až 113, 1991 a Bebbington a další, Bío/technology 10, 169 až 175, 1992. V tomto příkladu je v podstatě používám postup popsaný v práci Bebbington a další, kde je jako selekční markér použita glutamin syntetáza.

a) Příprava mRNA z hybridomů

Existuje několik postupů sloužících k izolaci polyadenylované (polyA+) mRNA z eukaryotických buněk (Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edítion, Kapitola 8, strana 3 - dále je tento manuál označován jako Maniatis). Jedna z těchto metod je založena využití kitu firmy Pharmacia a její podstatou je lýza relativně malého počtu buněk (10⁷ nebo méně) a následné navázání polyA+ mRNA na kolonu oligodT. Nežádoucí buněčné komponenty jsou, před vlastní elucí mRNA prováděné při zvýšené teplotě pomocí roztoku o vysoké koncentraci solí, odstraněny promytím kolony pufrem o nízké koncentraci solí.

mRNA byla získána z 10⁷ hybridomů A5B7 za použití kitu pro izolaci mRNA Quickprep™ (Pharmacia Biotechnology Ltd.). Koncentrace mRNA byla odhadnuta proměřením vzorku při 300 až 220 nm na spektrofotometru Uvikon 930 (Kontroh™ Instruments) a použitím faktoru 40/zg/ml/j ednotka OD při 260 nm. mRNA byla skladována po precipitaci ethanolem ve 2,5 /ig alikvotech.

-45φ φ

ΦΦ ·

b) syntéza cDNA

Metoda použitá pro syntézu cDNA vycházela z postupu popsaného Gublerem a Hofmanem, který spočívá v reverzní transkripci mRNA s navázanými primery, po níž následuje působení RNázou H, které poskytne primery potřebné k následné syntéze druhého řetězce DNA prováděné polymerázou I. Další metody syntézy cDNA jsou popsány v Maniatis (Kapitola 8).

K 5 pg vzorku mRNA byly přidány oligodT primery (směs 12-ti až 18-ti merů, Pharmacia Biotechnology Ltd., 0,5 pg) v 10 pl roztoku obsahujícím 2,5 jednotek placentárního inhibitoru RNAzy (Life Technologies Ltd.) doplněného na výsledný objem vodou bez přítomnosti RNAzy. Tato směs byla inkubována při 70°C a následně ochlazena na ledu. Poté byla zahájena syntéza prvního řetězce cDNA přidáním 4 pl 5x pufru H-RT (250 mM Tris, pH 8,3, 200 mM KC1, 30 mM MgCl₂ a 0,5 mg/ml BSA), 2 pl 0,1 M DTT (dithiothreitol), 1 pl směsi dNTP (dATP, dCTP, dGTP a dTTP o koncentracích 20 mM), 4 pl reverzní transkriptázy Superscript™ (Life Technologies Ltd.) a celá směs byla inkubována při 42°C po dobu 1 hodiny. Za účelem syntézy druhého řetězce bylo ke směsi přidáno 1,5 pl směsi dNTP (stejné složení jako je uvedeno výše), 92,5 pl vody bez přítomnosti RNAzy, 30 pl 5x reakčního pufru (125 mM Tris, pH 7) 5, 500 mM KC1, 25 mM MgCl₂, 50 mM (NH₄)₂SO„ a 0,5mg/ml β-NAD), 1 pl T4 DNA ligázy (10 jednotek, Life Technologies Ltd.}, 4 pl DNA polymerázy (40 jednotek, Life Technologies Ltd.) a 1 pl RNAzy H (2,7 jednotek, Life Technologies Ltd.) a inkubace pokračovala při 16°C další 2 hodiny. Aby bylo zajištěno, že koncovým produktem bude cDNA s tupými konci, byla reakce po přidání pl T4 DNA polymerázy (10 jednotek, Life Technologies Ltd.) ponechána probíhat při 16°C dalších 5 minut. Aktivita enzymů byla poté zainhibována inkubací při 70°C po dobu 10 minut.

• « • · 4 «

-46• * · · · · * · · · · · · •44 4 · »

4 4 4 · V « ·

c) Izolace částí genů kódujících protilátku pomocí PCR

Při izolaci fragmentů Fd a řetězců L protilátky A5B7 pomocí PCR byla jako templát použita cDNA. Fragment Fd byl ukončen ihned za sekvencí pantové oblasti (C-koncový threonin) a tento fragment bude dále nazýván Fd proteolytického typu. Termínem proteolytický Fd rozumíme v tomto příkladu skutečnost, že rekombinantní Fd je ekvivalentní fragmentu Fd připravenému proteolytickým štěpením postupem popsaným v Referenčním příkladu 4.

Jako templát je vhodný materiál získaný z reakce, při níž byl syntetizován první řetězec DNA nebo materiál získaný z reakce, při níž byl dosyntetizován druhý řetězec. Materiál může být použit přímo z ukončené reakce nebo může být zředěn (až 1 díl materiálu na 100 dílů vody) v redestilované vodě. K produkci fragmentů Fd a řetězců L byly použity oligonukleotidy (SEQ ID NOs: 17 až 24) . Pro každý fragment protilátky kódoval oligonukleotid vymezující 5' konec (SEQ ID NO: 17 pro fragment Fd a SEQ ID NO: 18 pro fragment L) restrikční místa (HindlII. pro Fd a EcoRI pro L) , konvenční Kozákovu sekvenci (GCCGCCACC), která maximalizuje iniciaci translace, a část přirozeně se vyskytující myší signální sekvence. Oligonukleotid vymezující 3' konec fragmentu Fd proteolytického typu (SEQ ID NO: 19) byl komplementární ke 3' konci kódujícímu pantovou oblast protilátky, kódoval mutace, které zaváděly dva tandemové terminační kodóny translace (TAG a TAA) v místě hned za pantem, a za touto sekvencí obsahoval restrikční místo pro EcoRI. 3' konec řetězce L byl vymezen oligonukleotidem (SEQ ID NO: 20) komplementárním ke konci kódující oblasti, který do sekvence zaváděl další terminační kodón translace (TAA) a restrikční místo pro EcoRI. Navíc k zavedení neaktivních mutaci do každého řetězce DNA, které vedly k odstranění restrikčních míst BamHI z domény CH1 fragmentu Fd a domény VL řetězce L aniž

- - ‘i

-47• · ♦ ·· • · · · « · · ··* «· by došlo ke změně v kódované aminokyselinové sekvenci, byly pro každý fragment použity dvojice částečně se překrývajících a komplementárních oligonukleotidu (SEQ ID NO: 21 a 22 pro fragment Fd a SEQ ID NO: 23 a 24 pro řetězec L) . Každý z oligonukleotidu vymezujících 5' a 3' konce fragmentů byl použit v kombinaci s odpovídajícím oligonukleotidem sloužícím k zavedení neaktivní mutace a výsledkem pak je produkce 2 mutovaných fragmentů každého řetězce protilátky. Po purifikaci byly oba fragmenty smíchány v ekvivalentních množstvím a použity jako templáty pro druhou PCR reakci při niž byly použity odpovídající oligonukleotidy vymezující 3' a 5' koncovou oblast. Výsledkem těchto reakcí byly fragment Fd a fragment řetězce L o odpovídající velikosti, ale bez restrikčních míst BamHI uvnitř sekvence.

Obvykle bylo do 100 μΐ reakční směsi obsahující 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 0,1% Želatinu, 1,5 mM MgCl₂,

1,25 mM dATP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dCTP, 1.,25 mM dGTP, 1,25- mM dTTP, 1 μΜ každého z odpovídající dvojice oligonukleotidu a 2,5 jednotek Taq DNA polymerázy (Amplitaq, Perkin-Elmér Cetus) přidáno 5 μΐ cDNA. Reakční směs byla převrstvena 100 μΐ minerálního oleje a inkubována 1,5 minut při 94 °C, 1 minutu při 50 nebo 55°C a 2,0 minuty při 72°C celkem v 25 cyklech a navíc pak byla ještě inkubována 10 minut při 72°C. Byla rovněž prováděna kontrolní reakce bez DNA.

PCR reakce byly analyzovány elektroforézou 5 μΐ vzorku z každé reakce na 0,8% agarózovém gelu (Sigma Chemical Company Ltd.) s následným barvením roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 μ9/πΐ1 (BDH Laboratory Supplies) a vizualizací DNA pomocí UV transiluminátoru. Ve všech PCR reakcích, ve kterých byla přítomna cDNA A5B7, byly patrny pásy odpovídající velikosti, což naznačuje úspěšnou amplifikaci fragmentů Fd a L řetězců. Nepřítomnost j

A,

-4l .v ..

-48• « • · · pásu DNA v kontrolní reakci znamenala, že použitá reakční Činidla neobsahovala kontaminující DNA.

Produkt každé PCR reakce byl purifikován za použití mikrokoncentrátoru Centricon 100™ (Amicon Ltd.). Každá reakční směs byla vložena do koncentrátoru a přídavkem redestilované vody byl v každé centrifugační jednotce upraven objem na 2 ml. Centrifugační jednotky byly poté centrifugovány při 500xg (stolní centrifuga Sorval RT6000B™ s rotorem H10Q0B) po dobu 5 minut a proteklé frakce byly odstraněny. Zadržený roztok byl opět doplněn redestilovanou vodou na výsledný objem 2 ml a centrifugační jednotka byla znovu centrifugována. Celý proces byl opakován ještě jednou. Výsledkem této procedury bylo odstranění nadbytku oligonukleotidů a složek pufru od amplifikované DNA. Takto purifikované molekuly DNA byly přímo použity v následujících PCR reakcích. Odpovídající dvojice fragmentů byly smíchány v ekvivalentních množstvích a jejich alikvoty byly použity pří druhých PCR reakcích s příslušnými 3' a 5' oligonukleotidy.

d) Klonování fragmentů vytvořených pomocí PCR do plazmidu pBluescript™

Produkty druhé PCR reakce vykazovaly pásy o velikosti přibližně 775bp a 730bp, což odpovídá řetězcům Fd (775bp) a L (730bp). Tyto produkty byly rovněž purifikovány za použití mikrokoncentrátoru· -Centricon 100™ postupem zmíněným výše. Každý DNA produkt byl následně precipitován v 1,5 ml roztoku obsahujícím 50 μΐ 3 M octanu sodného, 450 μΐ destilované vody a 1 ml absolutního ethanolu. Roztok byl nejméně 10 minut inkubován na ledu a poté centrifugován po dobu 10 minut při llSOOxg (MSE MicroCentaur™). Supernatant byl odstraněn a peleta byla promyta v 1 ml 70% ethanolu (v/v v destilované vodě) a následovala centrifugace po dobu 5 minut. Supernatant byl odstraněn a peleta byla vysušena ve vakuu. Každá peleta DNA byla rozsuspendována v » · ·· * · · ♦ · · · • · φ • · · φ • < φ · • φ φ φφφ φ · φ destilované vodě. Produkt Fd připravený pomocí PCR reakce byl poté rozštěpen restrikčními enzymy EcoRI a Hindlll v reakční směsi o celkovém objemu 200 μΐ obsahující 20 mM

Tris-acetát, pH 7,9, 10 mM octan hořečnatý, 50 mM octan draselný, 1 mM dithiothreitol (DTT) a 25 jednotek jak

Hindlll tak EcoRI (Promega Corporation). Řetězec L připravený pomocí PCR reakce byl rozštěpen restrikčním enzymem EcoRI v reakční směsi o celkovém objemu 30 μΐ obsahující 90 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM chlorid hořečnatý, 50 mM chlorid sodný a 10 jednotek EcoRI. Restrikční reakce byly inkubovány 1 hodinu při 37°C.

Rozštěpené fragmenty byly poté purifikovány pomocí elektroforézy na 0,75% agarózovém gelu. SeaPlaque™ GTG (EMC BioProducts Ltd.) a pásy odpovídající velikosti byly následně z gelu vyříznuty. Vyříznuté agarózové kousky byly rozpuštěny pomocí inkubace po dobu 2 minut při 65 °C, získaný roztok byl destilovanou vodou zředěn na konečný objem 450 μΐ a bylo k němu přidáno 50 μΐ 3 M octanu sodného. Tento roztok byl extrahován použitím stejného objemu kapalného fenolu ekvilibrovaného Trisovým pufrem pH·. 7,6 (Fisons Scientific Equipment) a vodná a fenolová fáze byly odděleny centrifugací po dobu 2 minut při 1160Gxg (MSE MicroCentaur™). Získaná vodná fáze byla znovu extrahována směsí fenol:chloroform (50:50, v:v), a poté pouze chloroformem. Po precipitaci ethanolem (postupem popsaným výše) byla každá purifikovaná peleta rozsuspendováná v 10 μΐ destilované vody a 1 μΐ tohoto vzorku byl podrobem elektroforéze na 0,8% agarózovém gelu za účelem odhadu množství a kvality.

K počátečnímu klonování cDNA řetězců Fd a L byl použit plazmid pBluescript™ (Stratagene Cloning Systems). Tento fágmidový vektor má unikátní klonovací místa EcoRI a Hindlll, gen nesoucí rezistenci vůči ampicilinu a počátky replikace ColEI a fi sloužící k izolaci jak jednovláknové « · · ·

-50• ·* ·· tak dvoj vláknové DNA. 5 μ<ρ DNA vektoru pBluescript™ KS bylo kompletně rozštěpeno pomocí 30 jednotek EcoRI (Promega Corporation) v reakčni směsi o celkovém objemu 100 μΐ obsahující 90 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM chlorid hořečnatý, 50 mM chlorid sodný nebo pomocí EcoRI a HindlII v reakčni směsi o celkovém objemu 100 μΐ obsahující 20 mM Tris-acetát, pH 7,9, 10 mM octan hořečnatý, 50 mM octan draselný, 1 mM dithiothreitol (DTT) a 25 jednotek jak HindlII tak EcoRI (Promega Corporation) při 37°C po dobu 1 hodiny. K plazmidu rozštěpenému restrikčním enzymem EcoRI byly za účelem odstranění fosfátových skupin na 5' koncích přidány 2 μΐ alkalické fosfatázy ze střev telat (CIAP, 2 jednotky, Boehringer Mannheim) a inkubace pokračovala při teplotě 37°C dalších 30 minut. Fosfatázová aktivita byly zaihibována inkubací směsi při 70°C po dobu 10 minut. Plazmid rozštěpený dvojicí enzymů EcoRI-Hindi II byl z agarózového gelu SeaPlaque GTG purifikován postupem, popsaným výše.

aš 50 ng rozštěpených řetězců Fd a L připravených. PCR reakcí bylo ligováno s 50 ng plazmidu pBluescript štěpeného EcoRI-HindlII (řetězec Fd) nebo vystaveného' působení EcoRI/CIAP (řetězec L) v ligační směsi o celkovém objemu 10 μΐ obsahující 30 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP a 1,5 jednotky T4 DNA ligázy (Promega Corporation) při 16°C po dobu 2,5 hodiny. K transformaci 20 μΐ kompetentních buněk E. coli DH5a (Life Technologies Ltd.) byl z každé ligační reakce použit alikvot 1 μΐ a transformace byla provedena podle protokolu dodávaného spolu s buňkami. Transformované buňky byly vysety na L-agar obsahující ampicilin v koncentraci 100 gg/ml, 1 mM IPTG a 0,2% X-gal a plotny byly inkubovány přes noc při 37°C. Klony obsahující zaklonované inzerty byly rozpoznány na základě toho, že ve výše zmíněném médiu • 4

· 4 * · · · • 4 4

4« 4 44 4 vytvářejí bílé kolonie, zatímco buňky nesoucí rodičovský plazmid bez inzertu vytvářejí modré kolonie.

e) SekveČní analýza klonů cDNA

Klony, identifikované na základě tvorby bílých kolonií, které by mohly obsahovat řetězce Fd a L, byly posbírány z agarových ploten a použity k přípravě DNA ve velkém měřítku. Jednotlivými klony bylo v 500 ml Erlemeyerových baňkách inokulováno 200 ml LB média (L-broth) obsahujícího 100 /xg/ml ampicilinu. Tyto kultury byly za stálého třepání inkubovány při 37°C přes noc. Poté byly vyrostlé buňky z každé kultury centrifugovány při 4°C po dobu 10 minut při 5000xg v centrifuze Sorvall RC5C s rotorem GS3. Buněčné pelety byly rozsuspendovány v 20 ml pufru TE a znovu centrifugovány při 4°C po dobu 10 minut při 2000xg v centrifuze Sorvall RC5C s rotorem SS-34 v centrifugačních zkumavkách se zúženým hrdlem se závitem (oak-ridge tube). Každá takto promytá buněčná peleta byla roz suspendována ve 3 ml roztoku 25% sacharózy, 50 mM Tris, pH 8,0 (o teplotě 0°C) a ponechána na ledu. K této suspenzi, byl přidám čerstvě připravený lysozym (1,0 ml 0,5 mM, roztoku, pH 8,5), obsah byl promíchán několikanásobným převrácením a inkubace pokračovala dalších 5 minut. K tomuto roztoku byl . přidán roztok kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) (1,0 ml 0,5 mM roztoku, pH 8,5) a obsah byl mírně zamíchán. Nakonec bylo přidáno 5,0 ml ledově vychlazeného roztoku Tritonu X™ (0,1% Triton X-100, 62,5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8,0), obsah byl mírně zamíchán a inkubován na ledu dalších 10 minut. Zbytky buněk byly poté odstraněny centrifugací při 4°C po dobu 30 minut při 39000xg v centrifuze Sorvall RC5C s rotorem SS-34. Supernatant obsahující plazmidovou DNA byl přidán k 16 g chloridu česného (Boehringer Mannheim) a 150 μΐ roztoku ethidium bromidu (10 mg/ml) a přídavkem pufru TE byl objem doplněn na 18,5 ml. Tento roztok byl přenesen do • 4

-52polypropylénových centrifugačních zkumavek se zúženým hrdlem bez závitu (crimp top tubes) o objemu 18,5 ml (Sorvall Instruments). Zkumavky byly uzavřeny a centrifugovány při 18°C po dobu 16 hodin při 180000xg v centrifuze 0TD65B s rotorem Sorvall TV865B (titanový, vertikální).

Po skončení centrifugace byla ve vytvořeném hustotním gradientu CsCl/EtBr plazmidová DNA viditelná jako zřetelný oranžový proužek. Plazmidová DNA byla z gradientu odstraněna propíchnutím stěny centrifugační zkumavky injekční jehlou. Vzorek získaný z gradientu byl rozpuštěn ve 3 až 4 násobném množství pufru TE a DNA byla precipitována přídavkem stejného objemového množství izopropanolu a inkubována 10 minut na ledu. Precipítovaná DNA byla centrifugována při 4°C při 17000xg v centrifuze Sorvall ŘC5C s rotorem SS-34 a supernatant po centrifugaci byl odstraněn. Získaná peleta byla promyta 70% ethanolem. (v/v) a znovu centrifugována· po dobu 5 minut. Peleta byla vysušena ve vakuu, rozsuspendována v 1,8 ml pufru TE a 200 μΐ 3M octanu sodného a pomocí odpovídajícího· objemu fenolu extrahována centrifugaci po dobu 2 minut pří 17000xg, aby došlo k oddělení fází. Vodná fáze byla znovu extrahována stejným objemem chloroformu a po této extrakci následovala precipitace DNA přidáním stejného objemu ethanolu vymraženého na -20°C a inkubací po dobu 10· minut na ledu. Purifikovaná DNA byla centrifugována postupem popsaným výše, promyta 70% ethanolem a vysušena ve vakuu. Vysušená peleta byla rozsuspendována v 500 μΐ redestllované vody a koncentrace DNA byla odhadnuta proměřením zředěného vzorku na UV spektrofotometru při vlnových délkách od 300 do 220 nm za použití koeficientu extinkce 50 ^g/ml/OD260. K purifikaci plazmidové DNA je rovněž možné použít množství kitú nesoucích ochrannou známku, například Qiagen™ (Hybaid Ltd.) .

-53» 4 • «4

Takto purifikovaná DNA byla následně použita pro sekvenční analýzu. Dvojvláknová DNA může být použita pro sekvenční analýzu prováděnou metodou podle Sangera, při níž jsou k ukončení syntézy řetězce DNA použity dideoxynukleotidy (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, strana 5463, 1977). Při této sekvenční analýze mohou být použity sekvenační kity nesoucích ochrannou známku, jako například kit Sequenase™ dodávaný firmou United States Biochemical Company a používaný v souladu s dodávaným návodem.

K sekvenční analýze DNA byly použity alikvoty (2 až 4 ^g) plazmidové DNA nesoucí klony cDNA řetězců Fd a L. Na počátku byl každý alikvot denaturován inkubací s 0,2 M NaOH, 0,2 mM EDTA při pokojové teplotě v celkovém objemu 100 μΐ po dobu 10 minut. Denaturovaná DNA byla poté precipitována přídavkem 10 μΐ 3 M octanu sodného (pH 5,0} a< 275 μΐ ethanolu a inkubována na ledu po dobu 10 minut. Precipitovaná DNA byla regenerována postupem popsaným výše pro plazmidovou DNA. K denaturované DNA byly následně pro sekvenacl připojeny primery inkubací této DNA s 0,5 pmoly každého z odpovídajících primerů v 10 μΐ reakčního pufru. Sequenase™ (40 mM Tris, pH 7,5, 25 mM MgCl_z, 50 mM NaCI)· obsahujícího 10% dimethyl sulfoxid (DMSO) při 65°C po dobu 2 minut a následným pozvolným ochlazováním až na teplotu nižší než 30°C. Takto připravené templáty byly následně použity pro· sekvenační reakce prováděné podle dodávaných protokolů. Směsi sloužící ke značení DNA a terminační směsi obsahovaly 10% DMSO.

Sekvenační reakce byly vyhodnocovány pomocí autoradiografie následující po elektroforéze s vysokým rozlišením prováděné na denaturujícím gelu o složení 6% polyakrylamid:8 M močovina (Sanger a Coulson, FEBS lett. 87, strana 107, 1978) .

Kompletní sekvence klonované cDNA řetězců Fd a L jsou uvedeny níže (SEQ ID NO: 25 pro řetězec Fd proteolytického

54typu a SEQ ID NO; 26 pro řetězec L) . Plazmid obsahující fragment Fd proteolytíckého typu byl označen pAFl a plazmid obsahující řetězec L byl označen pAF3. V každém fragmentu byla rovněž potvrzena přítomnost neaktivní mutace použité k odstranění restrikčního místa BamHI. Získané sekvence DNA naznačují, že tato protilátka je protilátkou izotypu IgGlK, jak vyplývá ze srovnání získané sekvence s publikovanými daty sekvenci DNA konstantních oblastí {Kabat, E. A., Wu, Τ. T., Bilofsky, H., Reid-Milner, M., Perry, H., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1987, Fourth Edition, Public Health Service Ν. I. H., Washington DC) .

f) klonování do vektorů určených k expresi v myelomech

K vytvoření vektorů schopných koexprese řetězců Fd a L v myelomech byl použit systém GS-Systems™ (Celltech Biologics) (WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 a WO' 89/10404).

Tato procedura vyžaduje klonování řetězce Fd do oblasti Hindlll-EcoRI vektoru pEE6 (tento vektor je odvozen od pEE6.hCMV - Stephena Cockett, Nucleic Acid Research 17,. 7110, 1989 - a restrikČní místo Hindlll nacházející se proti směru transkripce od promotoru hCMV v něm bylo přeměněno na restrikční místo BglII) a klonování řetězce L do místa EcoRI ve vektoru pEE12 (tento vektor je podobný vektoru pSH2.GS popsanému v Bebbington a další, Bio/Technology10, 169 až 175, 1992. Množství restrikčních míst původně přítomných v pSV2.GS bylo v tomto vektoru odstraněno místně specifickou mutagenezí a byla vytvořena multi-linker oblast s množstvím unikátních restrikčních míst) ’. Následně byla expresívní kazeta BglII-BamHI vektoru pEE6 s fragmentem Fd vložena do oblasti BamHI vektoru pEE12. Jinou možností je vložení expresívní kazety BglII-SalI obsahující fragment Fd do oblasti BamHI-SalI plazmidu pEE12 obsahujícího řetězec L.

-55Aby bylo možné vytvořit jednotlivé vektory (pEE6 s Fd proteolytického typu a pEE12 s řetězcem L) , byly plazmidy pAFl a pEE6 rozštěpeny restrikčními enzymy EcoRI a HindlII a plazmidy pAF3 a pEEl2 byly rozštěpeny restrikčním enzym EcoRI postupem popsaným výše. Příslušné vektory a fragmenty inzertů z každé restrikční reakce byly následně izolovány z agarózy Seaplaque'“ GTG, zaligovány dohromady a použity k transformaci kompetentních buněk DH5ct s využitím postupů popsaných výše. Transformované buňky byly vysety na plotny s L-agarem obsahujícím ampicilin o koncentraci 100 ^g/ml. Screening kolonií vyrostlých z transformovaných buněk byl proveden pomocí PCR. Kolonie byly přeneseny do 200 μΐ destilované vody a vortexovány. Suspendované buňky byly na 1 minutu ohřátý na 100°C a zcentrifugovány po dobu 2 minut při llSOOxg. Supernatant byl použit k PCR reakci. Jako primery v každé PCR reakci byl použit oligonukleotid komplementární k sekvenci uvnitř promotoru CMV {SEQ ID NO: 27) spolu s oligonukleotidem komplementárním ke 2' konci buď řetězce Fd ( SEQ ID NO: 19) nebo řetězce L ( SEQ ID NO: 20) . Jenom klony s genem kódujícím fragment protilátky vloženým po směru transkripce od promotoru CMV v orientaci vhodné k expresi budou při PCR tvořit specifické produkty o velikosti přibližně 2,0 kbp. PCR reakce byly prováděny v celkovém objemu 20 μΐ a jednotlivá reakčni směs obsahovala 20 pmolů každého z oligonukleotidu ( SEQ ID NO: 27 a buď SEQ ID NO: 19 nebo SEQ ID NO: 20), 10 mM Tris-HCI, pH 8,3, 50 mM KC1, 0,1% želatinu, 1,5 mM MgCl₂, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dCTP, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dTTP a 0,5 jednotky Taq DNA polymerázy {Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus). Každá reakčni směs byla převrstvena 20 μΐ minerálního oleje a inkubována 1,5 minut při 94°C, 1 minutu při 50°C a 2,0 minuty při 72°C celkem v 25 cyklech a navíc pak byla ještě inkubována 10 minut při 72°C. Byly rovněž prováděny kontrolní reakce s klony nesoucími jen rodičovský plazmid a kontrolní reakce bez DNA. PCR reakce byly analyzovány

-56*· · elektroforézou na agarozovém gelu a potenciálně použitelné klony byly identifikovány podle přítomnosti produktu PCR o velikosti 2,0 kbp. Tyto klony byly použity k přípravě plazmidové DNA ve velkém měřítku, byly charakterizovány štěpením restrikčními enzymy EcoRI-HindlII nebo EcoRI a sekvence inzertu byla ověřena sekvenční analýzou DNA s využitím postupu popsaných výše. Izolované vektory byly pojmenovány pAF4 (Fd proteolytického typu v plazmidu pEE6) a pAF6 (řetězec L v plazmidu pEE12).

Za účelem vytvoření koexpresního vektoru' bylo 5 až 7,5 μg plazmidu pAF4 štěpeno pomocí 30 jednotek jak BglII (Pharmacia) tak BamHI (New England Biolabs) v roztoku obsahujícím 50 mM Tris-HCI, pH 7,9, 10 mM chlorid hořečnatý, 150 mM chlorid sodný a 1 mM DTT při 37°C po dobu hodiny. Rozštěpení plazmidu bylo potvrzeno elektroforézou;. na agarozovém gelu. V roztoku o složení popsaném výše bylo při 37°C po dobu 1 hodiny štěpeno působením 25 jednotek BamHI (New England Biolabs) 5 μς plazmidu pAF6 obsahujícího řetězec L. Získaná DNA byla poté defosforylována .přídavkem jednotek CIAP a po 40-ti minutové inkubaci při 37°C následovala extrakce pomocí 10 μΐ resinu Strataclean™' (Stratagene Ltd.). Fragment expresívní kazety s inzertem Fd a vektor pAF6 (delší řetězec) získaný restrikčním štěpením popsaným výše byly následně purifikovány z agarózového gelu SeaPlaque™ GTG, použity k ligační reakci a tato ligační reakce byla použita k transformaci kompetentních buněk DH5ct postupy popsanými výše.

g) Identifikace koexpresních vektorů

Sto kolonií vyrostlých po výše zmíněné transformaci bylo přeneseno na nitrocelulózové kruhové membrány o průměru 9 cm (Schleicher a Schull) . Na jednotlivou membránu, položenou na L-agarovou plotnu s ampicilinem o koncentraci 100 /zg/ml, bylo přeneseno 50 kolonií v duplikátu (celkem dvě sady membrán po dvou). Třetí sada

Ρ ··

-57♦ «· *· * · • · • ·« • ·· ·· ploten {bez membrán) byla označena proužky a tvoří vlastně zásobní plotny. Po inkubaci přes noc při 37°C byly nitrocelulózové filtry odstraněny a dále zpracovány postupem podle Grunsteina a Hognesse (Maniatis, Kapitola 1, strana 102) sloužícím k lýze bakteriálních buněk in šitu. Filtry byly pokládány na papíry 3MM (Whatman) nasycené různými činidly - 10%-n£m SDS po dobu 2 minut, 3 M NaOH, IM NaCl po dobu 5 minut a 1 M Tris, pH 6,8 po dobu 2x2 minuty. Filtry obsahující lyžované buňky byly přeneseny na papíry 3MM navlhčené 20 x SSC (3 M NaCl, 0,3 M citrát sodný) a DNA byla k filtrům imobilizována vystavením působení UV světla v přístroji Spektrolinker™ XL 1500 (Spectronics Corporation) s intenzitou nastavenou na optional crosslink (120000 pJoulů), Před aplikací sondy (viz níže) byly filtry vysušeny na vzduchu. Zásobní plotny byly skladovány při 4°C aš do dalšího použití.K vytvoření specifických hybridizačních sond k identifikaci klonů nesoucích řetězce Fd a L byly použity oligonukleotidy specifické pro řetězce Fd a L (SEQ ID NO;. 22 a 24). Hybrídizační sonda může být připravena zesyntetického oligonukleotidu přidáním radioaktivní, fosfátové skupiny na 5' konec,· toho je dosaženo použitím γ32ρ _ATP a využitím aktivity T4 polynukleotid kinázy. 2 0 pmolů oligonukleotidu bylo k reakčni směsi o celkovém objemu 20 μΐ obsahující 100 mM Tris, pří 7,5, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM Spermidin, 2 0 mM DTT, 7,5 μΜ ATP, 0,5 μΜ γ ^3!P ATP a 2,5 jednotek T4 polynukleotid kinázy (Pharmacia Biotechnology Ltd.). Reakčni směs byla inkubována 30 minut při 37°C a dále pak 10 minut při 70°C před použitím hybrídizační sondy. Postupy použitelné k produkci z· oligonukleotidů jsou popsány v 11) . 10 μΐ alikvot radioaktivně značeného oligonukleotidu byl přidán do 10 ml 6x SSC (1 M NaCl, 0,1 M citrát sodný), 0,1% SDS (dodecylsíran sodný) a hybridizačních sond Maniatis (Kapitola

-58 · ·· · » · « ··· * * ·« *·· ··· *» ·· ·

0,25% Marvel'” {odtučněné sušené mléko) a tento roztok byl poté použit při hybridizaci sondy.

Zpracované filtry obsahující vyselektované klony (viz výše) byly pre-hybridizovány v 90 ml 6x SSC, 0,1% SDS, 0,25% Marvel™ při 65°C po dobu 3 hodin v hybridizační peci Techne HB-1 za použití rotujících skleněných trubic. Každá sada filtrů (dva filtry se stejným vzorkem kolonií) byla poté hybridizována v 10 ml roztoku s hybridizační sondou (jeden filtr se sondou VH a druhý filtr - duplikát - se sondou VL) přes noc při 65°C ve stejném přístroji. Po inkubaci byly každá sada filtrů promývána ve 100 ml SxSSC, 0,1% SDS při 65°C po dobu 15 minut, 100 ml 3xSSC, 0,1% SDS při 65°C po dobu 30 minut a 100 ml lxSSC, 0,1% SDS při-65°C po dobu 30 minut ve stejném přístroji. Promyté filtry byly vysušeny na vzduchu a byly použity k autoradiografii na Hyperfilm™ (Amersham International) prováděné v kazetě s vloženým wolframenovým kontrastním filtrem tungstate intesifying screen při teplotě -70°C. Po vyvolání filmu v automatickém zařízení Kodak byly klony potenciálně schopné exprimovat F(ab')₂ identifikovány na základě hybridizace s oběma sondami. Četnost klonů hybrídizujících s oběma, sondami specifickými jak pro řetězec Fd tak pro řetězec L byla velmi nízká (přibližně 2%).

Klony, které by mohly obsahovat koexpresívní plazmid byly posbírány ze zásobních ploten a použity k přípravě plazmidové DNA ve velkém měřítku. K určení orientace každé z expresívních kazet byla použita restrikční analýza enzymy EcoRI a HindlII. Byly identifikovány pouze klony s tandemovým uspořádáním expresívních kazet Fd a L (ne s konvergentním uspořádáním). Tento koexpresívní vektor byl označen jako pAF8 (Fd proteolytického typu a řetězec L v plazmidu pEE12) .

-59φφ' φφ φφφ* φφφ φφφ β» φφ φφφ φφφ ·· ·· ·

h) transfekce myelomů

Κ zavedení DNA do eukaryotických buněk existuje několik postupu (Bebbington, C., Methods, svazek 2, strany 136 až 145, 1991). Nedávno se stala rutinně používanou metodou elektroporace, která nahradila postup využívající koprecipitaci DNA s fosforečnanem vápennatým. Pro tento účel jsou vhodnými hostitelskými buňkami myeolmy NSO (Methods in Enzymology, 73B, strany 3 až 46, 1981, ECACC katalogové číslo 85110503), jelikož neobsahují žádné endogenně sekretované proteiny protilátek. Předpokládá se, že část kolonií pěstovaných po transfekcí koexpresívním plazmidem obsahujícím řetězce Fd a L v médiu bez přítomnosti glutaminu, bude exprimovat funkční fragmenty protilátky A5B7.

Před vlastní transfekcí bylo 40 pg plazmidové DNA pAF8 linearizováno štěpením 200 jednotkami enzymu Sall (New England Biolabs) v reakční směsi o celkovém objemu 400 pl obsahující 10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 10 mM chlorid hořečnatý, 150 mM chlorid sodný, 1 mM DTT a 10 0 pg/ml acetylovaného BSA při 37°C po dobu 1,75 hodin. Po skončení štěpení byla DNA precipitována ethanolem a rozsuspendována v 50 pl destilované vody.

Buňky NSO byly napěstovány v kultivačních lahvích pro tkáňové kultury (160 cm², Nunc nebo Costar) do stavu konfluence. Každá kultivační láhev obsahovala 50 ml neselekčního růstového média (Eaglovo médium upravené podle Dulbecca, Life Technologies, Ltd., spolu s 10% fetálním telecím sérem získaným z akreditovaného zdroje) a kultivace probíhala při 37°C v atmosféře obsahující 5% C0₂. Před transfekcí byly buňky NSO rczsuspendovány poklepáním kultivační lahve o ruku nebo desku stolu a přeneseny do kónických centrifugačních zkumavek o objemu 50 ml (Falcon). Ze suspenze byl odebrán vzorek (40 pl) tento byl použit k odhadu koncentrace buněk za použití počítače buněk Coulter «» ♦»·* • ·· «· · » ♦ · ·

-60’ « · • · • « ··

• » «·« · β · ·· · nastaveného počítání částic o velikosti 10 až 20 μπι. Buňky byly centrifugovány při 500xg po dobu 5 minut (stolní centrifuga Sorval RT6000C), promyty 45 ml vychlazeného fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem (PBS) a znovu centrifugovány. Promyté buňky- byly rozsuspendovány ve vychlazeném roztoku PBS na výslednou koncentraci 1,3 χ 10⁷ buněk na ml a uchovány na ledu. V elektroporační kývete se vzdáleností elektrod 0,4 cm (Bio-Rad Laboratories Ltd.) bylo smícháno 50 μΐ vzorku plazmidové DNA rozštěpené. Sáli s 800 μΐ (10⁷) buněk NS0 (vzorek nesmí obsahovat bubliny) a kyveta byla inkubována na ledu po dobu 5 minut. Poté byla kyveta osušena použitím tkaniny a umístěna do elektroporačního zařízení Gene Pulser™ (Bio-Rad Laboratories Ltd.) a na kyvetu byly aplikovány dva posobě jdoucí pulsy o napětí 1500V při 3 μΡ3Γ3άθοή jak je doporučeno výrobcem. Poté byly,elektroporační kyvety znovu umístěny na 5 minut na led a jejich obsah byl následně smíchán s 30 ml předehřátého neselekčního média. Přibližně 20 ml této buněčné suspenze bylo rozděleno na čtyři plotny pro kultivaci tkáňových kultur s 96 jamkami s plochým dnem (Nunc) v objemu 50 μΐ na jednu jamku. Zbylých 10 ml suspenze bylo zředěno 30 ml neselekčního média a umístěno do pěti 96-jamkových ploten. Zbylá zředěná suspenze byla ještě dále zředěna neselekčním médiem (10 ml do 40 ml) a umístěna do -dalších pěti 96-jamkových ploten. Buňky byly přes noc inkubovány pří 37°C v atmosféře obsahující 5% CO₂. Do každé jamky na 96-ti jamkových plotnách bylo přidáno selekční médium neobsahující glutamin (150 μΐ, Bebbington a další, Bio/Technology 10, 169 aš 175, 1992) a plotny byly vráceny do inkubátoru kde docházelo k pozvolnému vyčerpání glutaminu z média. Kultivace byla ukončena, jakmile byly kolonie pozorovatelné pouhým okem.

·· φφ»· • φ

-61·· · • · · · φ · · • · · · • « * • φ φφφ φφφ

i) Růst buněčných linií

Z 96-ti jamkových ploten byly vybrány kolonie z těch jamek, ve kterých byla přítomna pouze jedna kolonie. Buňky byly pipetováním rozsuspendovány a 100 pl této suspenze bylo přeneseno do jednotlivých jamek na 24 jamkové plotně a do každé jamky byl přidán 1 ml selekčního média. Dalších 100 μΐ selekčního média bylo přidáno do každé jamky na 96-ti jamkových plotnách, ze které byly odebrány kolonie, Čímž byl vytvořen záložní zdroj buněčných linií. 24 jamkové plotny byly inkubovány při 37 °C v 5% CO₂ do stavu přibližně' 50% konfluence. V tomto stádiu bylo odebráno asi 100 pl supernatantu a v tomto supernatantu byla testem ELISA (viz. níže) testována vazebná aktivita namířená proti CEA. Buněčné linie vykazující tuto vazebnou aktivitu byly dále. množeny přenesením 1 ml rozsuspendovaných buněk do lahví pro tkáňové kultury o obsahu 25 cm². Do každé lahve byl následně přidán l ml selekčního média a láhve byly inkubovány v šikmé poloze, aby došlo k zakoncentrování buněk u dna láhve. Po několika dnech inkubace byly do každé, láhve přidány 3 ml selečního média a láhve byly dále inkubovány v horizontální poloze až do doby, kdy bylodosaženo 50% až 75% konfluence. V tomto stádiu bylo selekční médium odstraněno a buňky byly opatrně promyty 5 ml· selekčního . média, které bylo ihned odstraněno a nahrazeno dalšími 5 ml selekčního média. Kultivační .lahve byly na dalších 24 hodin vráceny do inkubátoru. Poté byly buňky posbírány poklepáním kultivační láhve a buněčná hustota byla spočítána buď pomocí počítadla Coultér s limity detekce v rozmezí 10 až 20 μπι nebo použitím hemocytometru po obarvení roztoku trypanovou modří (Life Technologies) a spočítáním životaschopných (neobarvených) buněk pod mikroskopem. Buňky byly zcentrifugovány (přibližně 300xg po dobu 5 minut) a supernatant byl odstraněn a uschován při 4°C k použití k analýze exprese r*\ ··' · » ·♦ ··*··* bz ·«·· ♦>♦· * · · • · · ......

• · · « · · ·· ··· · ··· · * · · «· »·· ··« ·* ·· * fragmentů protilátky (viz. níže). Buněčná peleta byla rozsuspendováná v 50% dialyzovaného fetálního telecího média, 4 0% DMEM bez glutaminu a 10% DMSO na výslednou koncentraci 1 až 2x 10^s buněk na ml. Následně byly buňky v 1 ml alikvotech přeneseny do kryozkumavek se šrubovacím víčkem (Nunc) , zmrazený přes noc při -70°C a poté přemístěny do kapalného dusíku k dlouhodobému uskladnění.

Analýza metodou Western blot

Analýza metodou Western blot byla provedena způsobem popsaným níže.

Alikvoty (15 μΐ) z každého vzorku supernatantu byly smíchány se stejným množstvím vzorkového pufru (62,5 mM Tris, pří 6,8, 1% SDS, 10% sacharóza a 0,05% bromfenolová modř) s nebo bez redukčního činidla (50 mM DTT) . Před vlastní elektroforézou na, gradientu akryamídového gelu s gradientem 8 až 18% (gel Excel™, Pharmacia Biotechnology Products) prováděnou podle návodu poskytovaného výrobcem na přístroji Multiphor™¹ II (LKB Produkter AB) byly vzorky inkubovány po dobu 15 minut při 100°C. Po elektroforéze. byly za použití přístroje Novablot™ (Produkter AB) postupem, popsaným výrobcem přeneseny separované proteiny na membránu Hybond C-Super™ (Amersham International). Po přeblotování byla membrána vysušena na vzduchu.

Přítomnost fragmentů protilátky byla detekována pomocí protilátky namířené proti myšímu F(ab)₂ konjugované s peroxidázou (ICN Biomedicals, produkt číslo 67-430-1) . Přestože tato primární protilátka byla připravena proti myšímu F(ab}₂ bylo ukázáno, že se tato protilátka váže hlavně na řetězec L typu kappa. Přítomnost fragmentů myší protilátky A5B7 byla vizualizována pomocí detekčního systému ECL (Amersham International) postupem podle výrobce.

*4 4··» • 4

-634 · 4 ·♦···· • 4 4 · 44 ·· 4·4·

44> « 4 · ··

4* 4*4 444 44 44 4

Bylo prokázáno, že přibližně 90% materiálu přítomného v buněčném supernatantu je tvořeno proteiny F(ab')₂.

k) Analýza metodou ELISA

Standardní postupy pro ELISA stanovení jsou popsány v

Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. Burdon, R.H. a van Kippenberg, P.H., svazek 15, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Tijssen, Ρ., 1985, Elsevier Science Publishers B.V.. Jiným zdrojem informací je Antibodies - A Laboratory Manual Harlow, E. a Lané, D.P., 1988, publikované v Cold Spring Harbor

Laboratory.

K detekci přítomnosti materiálu s vazebnou aktivitou proti CEA byl použit buněčný supernatant (viz. výše) a detekce byla provedena postupem popsaným níže:

l) stanovení anti-CEA protilátek metodou ELISA

1. Připraví se potahovací pufr (1 kapsle pufru uhličitan-hydrogenuhličitan - Sigma C-3041 - ve 100 ml redestilované vody).

2. Na každou použitou 96-ti jamkovou destičku se přidá k 10 ml potahovacího pufru 5 μΐ zásobního roztoku CEA (0,2 mg/ml, Dako).

3. Do každé jamky na mikrotitrační destičce Nunc Maxisorp™ se napipetuje 100 μΐ zředěného CEA.

4. Inkubuje se při 4°C přes noc (nebo 2 hodiny při pokojové teplotě).

5. Destičky se promyjí celkem čtyřikrát po dobu 5 minut roztokem PBS + 0,01% azidem sodným (PBSA).

6. Destičky se zablokují (po vyklepání promývacího roztoku) pomocí ISO μΐ 1% BSA (Sigma A-7888) v PBSA ·· *··· “ 64 ·««« ···♦·· · ·*# ♦*···· • · 4 · 4 * · · *·· · « t · ··« · · ·* ··· ♦· *» ·· * na jednu jamku. Inkubují se dvě hodiny při pokojové teplotě.

7. Destičky se promyjí celkem čtyřikrát po dobu 5 minut roztokem PBSA.

8. Nanesou se vzorky (supenatanty z buněčné kultury) a vhodné standardy (proteolytickým štěpením připravené F(ab'}₂ ve dvojnásobných ředěních). Vzorky se zředí růstovým médiem (nebo PBS). Jako slepé vzorky se mohou použít PBSA + 1% BSA a rozpouštědlo.

9. ' Inkubuje se přes noc při 4°C.

10. Destičky se promyjí celkem šestkrát po dobu 5 minut roztokem PBSA + 0,5% Tween 20.

11. Připraví se roztok sekundární protilátky (namířená proti myším IgG F(ab')₂, kozí protilátka konjugovaná s peroxidázou - ICN 67-430-1 - o objemu 20 μΐ ve 40 ml PBSA + 1% BSA + 0,5% Tween 20) a do každé jamky se přidá 100 μΐ.

12. Inkubuje se 2 hodiny při pokojové teplotě.

13. Destičky se promyjí celkem Šestkrát po dobu 5 minut roztokem PBSA + 0,5% Tween 20.

14. Připraví se vyvíjecí roztok rozpuštěním jedné kasie pufru Fosforečnan-Citrát-Peroxoboritan (Sigma P-4922) ve 100 ml redestilované vody. Do 100 ml pufru přidejte 30 mg o-fenyldiamin dihydrochloridu (OPD, SigmaP-8287). Do každé jamky se nanese 100 μΐ.

15. Inkubuje se 15 minut při pokojové teplotě ve tmě.

16. Reakce se zastaví přídavkem 50 μΐ 2 M kyseliny sírové do každé jamky.

17. Na čtečce destiček se odečte OD při vlnové délce 490 nm.

-65··

Β ·

ΒΒ *· ♦··» • Β Β · Β

Β · Β Β Β · · * · • · ΒΒ Β Β Β Β ·Β· ·

Β Β · · Β · · * <Β ΒΒΒ ΒΒΒ Β» ·· *

m) Výpočet specifické rychlosti produkce protilátek (SPR)

Množství vazebné aktivity namířené proti CEA v každém vzorku bylo stanováno za použití programového balíku Softmax. Toto číslo bylo použito k získání přibližné hodnoty popisující množství fragmentů A5B7 F(ab')₂ přítomných v buněčném supernatantu, přičemž byla vzata do úvahy data získaná analýzou pomocí metody Western blot, která naznačují, že většina řetězců L protilátky (>90%) je přítomna ve formě F{ab')₂. Takto získaná hodnota byla použita k výpočtu specifické rychlosti produkce vyjádřené v jednotkách ^g/lO⁶ buněk/24 hodin. Specifická rychlost produkce byla použita k roztřídění buněčných linií podle produktivity. Hodnoty SPR se pro nej lepší izolované buněčné linie se obvykle pohybovaly v rozmezí 4 μ<$ aš 10 μ9/10⁶ buněk/24 hodin.

Purifikace rekombinantního A5B7 F(ab')₂

Rekombinantní materiál A5B7 F(ab')₂ byl ze supernatantu získaném po centrifugaci suspenze myelomů v selekčním médiu purifikován za použití kolony s náplní 500 mg r-Proteinu A, která je například vyráběna firmou NyGene.

Kolona byla nejprve . promyta citrátovým pufrem o koncentraci 100 mM kyseliny citrónové, pH 2,8, a poté ekvilibrována v pufru o složení 150 mM chlorid sodný, 10 mM fosforečnan sodný, pH 7,4, až do chvíle, kdy pH roztoku jímaného po průchodu kolonou odpovídalo pH ekvilibračního pufru. Oba pufry byly před použitím přefiltrovány přes filtr Millipore o velikosti pórů 0,45 gm.

Médium získané odstraněním myelomů (1,8 litru) obsahující rekombinantní A5B7 F(ab^J)₂ bylo před použitím rovněž přefiltrováno a zředěno ekvilibračním pufrem v poměru 1:1. Takto zředěné médium bylo následně naneseno na kolonu obsahující Protein A a byl jímán veškerý nezachycený ··· «

-66“ • · • · · * • · ♦ ·« ··· materiál. Jakmile byla kolona naplněna., byla tato kolona promývána ekvilibračním pufrem až do chvíle, kdy se hodnota absorbance měřená pří 280 nm vrátila základní hladinu.

Poté byl jako eluční pufr použit rovněž přefiltrovaný 100 mM octan sodný, pH 4,0. Tento eluční pufr byl jímán po 45 ml frakcích. Jakmile se absorbance měřená při 280 nm opět vrátila na základní hodnotu byl k promývání kolony použit pufr o složení 100 mM kyselina citrónová, pH 2,8.

V jednotlivých jímaných frakcích byla měřena optická hustota při 280 nm a u frakcí s vysokou absorbancí bylo pH upraveno na hodnotu 7,0 a tyto frakce byly analyzovány na SDS-PAGE.

Frakce obsahující rekombinantní A5B7 P(ab')₂ byly spojeny. Tento objem byl zakoncentrován (membrána Amicon YM10™) a dialyzován proti pufru o složení 150 mM chlorid sodný, 10 mM fosforečnan sodný a 3 mM EDTA, pH 7,4 a uskladněn při 4°C. Celkově bylo získáno 73 mg F(ab')₂ o čistotě >90%, jak bylo potvrzeno SDS-PAGE v neredukujících podmínkách.

Supernatant získaný po centrifugací myelomů použitý k výše zmíněné purifikaci byl získán postupem popsaným v Bebbíngton a další, Bio/Technology 10, 169 až 175, 1992. Média GS (kat. č. 51435) a doplněk (kat. č. 58672) je možné získat u JRH Biosciences (JRH Biosciences Europe, Hophurst Lané, Crawley Down, W. Sussex, U. K., RH10 4FF). Po skončení růstu buněk byl supernatant přefiltrován přes 0,45 μτη filtr za účelem odstranění větších částic, a do doby purifikace skladován při 4°C, což obvykle netrvalo déle než 24 hodin.

-67Referenční příklad 6

Syntéza analogu prekurzoru účinné látky odvozené od uracilu (viz. schéma na Obrázku 9)

Sloučenina 7 (5 mg) byla rozpuštěna v 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové (0,1 N) a výsledkem byl požadovaný konečný produkt (sloučenina 9) . Po 0,5 hodině při 25°C ve tmě byl roztok umístěn na led a alikvoty byly zředěny pudrem a testovány s mutantní RNázou.

Sloučenina (7) byla'z uridinu připravena následovně:

2', 3'-O-Methoxyethylidenuridin (sloučenina 1)

Uridin (5 g), monóhydrát p-toluensulfonové kyseliny (1 g) a trimethylorthoacetát byly společně míchány při 20°C po dobu 16 hodin. pH reakční směsi bylo pomocí methanolátu sodného upraveno na lehce zásaditou hodotu a reakční směs byla následně zakoncentrována do formy gumovitého zbytku. Požadovaný produkt byl purifikován chromatografií na sloupci silikagelu (Merck 9385) za použití směsi chloroform/methanol jako elučního roztoku nejprve v poměru 96:4 (objemově) a poté v poměru 92:8.

NMR (DMS0d6); (δ) 11,38 (s,lH); 7,75(d,lH); 5,9'5(d) a

5,80(d, total 1H) ; 5,62 (d,1H); 4,70-5,10(m,3H) ; 4,18(q) a 4,04(q, total 1H); 3,60(m,2H); 3,15{s) a 3,28(s, total 3H); l,57(s) a l,49(s, total 3H).

5'-Azído-5'- deoxy-2', 3'-O-Methoxy- ethylidenuridin (sloučenina 2)

K roztoku 2', 3'-O-Methoxyethylidenuridlnu (7,0 g,

23,3 mmol) v bezvodém pyridinu (80 ml) byl při 0°C přidán methylsulfonyl chlorid (1,9 ml, 24 mmol) . Po 16-tí hodinovém míchání při 4°C bylo rozpouštědlo odpařeno ve vakuové odparce a zbytek rozpuštěný v chloroformu byl promyt vodou. Vrstva organického činidla byla oddělena, « · • · · ·

	-68-	* * · • ft · · · · ·· ···	v · * • · · ··	• ♦· · * * · ·« ♦
vysušena a zakoncentrována, methansulfonát.	čímž byl	získán	surový
Surový reakční	produkt	byl rozpušt	ěn v	bezvodém
dimethyformamidu (100	ml) a byl	přidán azid	sodný	(3,25 g,

mmol) . Směs byla míchána po dobu 7 hodin pří 85 °C a poté· bylo rozpouštědlo odpařeno ve vakuové odparce a zbytek byl rozpuštěn v chloroformu a promyt roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Chloroformový extrakt byl oddělen, vysušen pomocí bezvodého síranu sodného. a zakoncentrován. Vzniklým produktem byla 5'-azido sloučenina. Surový azidový meziprodukt byl použit jako výchozí materiál při dalším kroku.

3-0(a 2'-0)-Acetyl-5'-azido-5-deoxyuridin (sloučenina 3)

Surový azid (sloučenina 2, výše) byl rozpuštěn v kyselině octové (70%) (100 ml) a po 15 minutách bylo rozpouštědlo odstraněno evaporací při sníženém tlaku. Zbytek byl opakovaně rozpouštěn v absolutním ethanolu a koncentrován, aby byly odstraněny poslední stopy kyseliny octové. Výsledkem tohoto postupu byl surový vzorek požadovaného produktu skládající se z polohových izomerů 2' a 3'.

NMR při poměru 2'acetoxy ke 3'acetoxy 2:1 v DMSQdS: (δ)

11,40 (s, 1H); 7,70 (d, 1H); 5,60 až 5,95 (m, 3H) ; 5,22 (t, 0,33H); 5,03 (dd, 0,66H); 4,41 (q, 0,66H); 4,24 (q, 0,33H);

4,14 (q, 0,66H) ; 3,9-4 (m, Q,33H); 3,62 (m, 2H) ; 2,08 (s, 0,66H); 2,06 (s, 0,33H).

3'-O(a 2'-O)-Acetyl -5'-azido -5'-deoxy-2'-0 (a 3'-O)-tetrahydropyranyluridin

Surový acetát z předchozí reakce byl rozpuštěn v bezvodém dichlormethanu (80 ml) . Do reakční nádoby byly přidány dihydropyran (6 ml) spolu s monohydrátem kyseliny

-69p-toluensulfonové (500 mg). Reakční směs byla míchána 3 hodiny při 25°C a po této době bylo použitím TCL zjištěno, že všechen výchozí materiál byl spotřebován. Reakční směs byla zředěna díchlormethanem, promyta roztokem hydrogenuhličitanu sodného a organická fáze byla před odpařením při sníženém tlaku zbavena vody. Surový produkt (směs polohových izomerů 2' a 3) byl purifikován chromatografií na sloupci silikagelu za použití směsi chloroform/methanol jako elučního roztoku nejprve v poměru 97:3 (objemově) a poté v poměru 95:5.

5'-amíno-5'-deoxy-2'-0(a 3'-O)-tetrahydropyranyluridin (sloučenina 4)

Azidový meziprodukt z předchozí reakce byl rozpuštěn v tetrahydrofuranu (100 ml) a následně byl k roztoku přidán trifenylfosfan (6,5 g, 25 mmol) a voda (0,45 ml). Po 16 hodinách míchání při 25°C byl ke směsi přidán koncentrovaný amoniak a reakce probíhala dalších 24 hodin. Reakční směs byla vysušena (odstranění rozpouštědla) a purifikována chromatografií na sloupci silikagelu za použití směsi chloroform/methanol jako elučního roztoku nejprve v poměru 9:1 (objemově) a poté v poměru 1:1. Výsledkem byl. požadovaný produkt skládající se z polohových izomerů 2' a 3'.

5'-(N-benzyloxykarbonylglycyl)amino-5'-deoxy-2'-0(a 3'-0)-tetrahydropyranyluridin (sloučenina 5)

K roztoku 5'-amino-5'-deoxy-2'-0(a 3'-O)-tetrahydropyranyluridinu (3g) v bezvodém tetrahydrofuranu byl přidán ester p-nitrofenyl N-benzyloxykarbonylglycinu (1,3 g, 9,2 mmol). Po 16 hodinách míchání při 25°C byla reakční směs zakoncentrována do formy gumovitého zbytku a purifikována chromatografií na sloupci silikagelu za použití směsi chloroform/methanol (96:4) jako elučního

jako směs

7,70(dvě d, « · ·· · φ φ · » · · · • · ·· φφφ * roztoku. Požadovaný produkt byl získán stereoizomerů (3,6 g, 75% výtěžek).

NMR v DMSOdG:(δ) 11,36 (s, 1H) ; 8,02 (b, 1H) ;

1H); 7,32(m, 6H); 5,90(d) a 5,70{d, total 1H); 5,64{d,lH); 5,444(d) a 5,20(d, total 1H); 5,02(s,2H); 4,75(m,lH); 3,20-4,25(m, 9H) ; l,35-l,80(m, 6H) .

Hmotnostní spektrum (FAB), m/e 519 (M+ H+). C24H30N409 odpovídá M+, 518.

3'-0(a 2'-0)-fosforamiditový derivát výše zmíněného produktu

K roztoku produktu (1,9 g, 3,67 mmol) připraveného předchozí reakcí a diizopropylethylaminu {1,5 ml) v bezvodém dichlormethanu (30 ml) byl přidán chlorid N, N-diizopropylmethylamidu kyseliny fosfonové. Reakční směs byla míchána po dobu 5 hodin při teplotě 25°C a poté byla zředěna chloroformem a promyta vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Chloroformový extrakt byl oddělen, zbaven vody a zakoncentrován do formy gumovitého zbytku. Surová směs byla purifikovaná na chromatografickém sloupci za použití následujících roztoků jako elučních. činidel (nejprve chloroform/triethylamin 98:2, následně chloroform/triethylamin/methanol 96:2:2) a výsledkem byl požadovaný meziprodukt obsahující fosfor (1,9 g).

Úplně chráněný meziprodukt obsahující fosfátovou skupinu (sloučenina 6)

K roztoku fosforamiditu (1,9 g, 2,4 mmol) z výše zmíněné reakce a 4-dipropylaminofenolu (0,7g, 3,6 mmol) v bezvodém acetonitrilu (40 ml) byl přidán tetrazol (0,5 g,

7,2 mmol) . Reakční směs byla míchána po dobu 16 hodin při teplotě 25^QC ve tmě a poté byl přidán terciální butylhydroperoxid (70%, 0,4 ml). Po 15 minutách byla reakční směs zakoncentrována, rozpuštěna v chloroformu a a promyta vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného.

Chloroformová vrstva byla oddělena, zbavena vody a zakoncentrována do formy gumovitého zbytku. Tento surový produkt byl purifikován chromatografií na sloupci oxidu křemičitého za použití octanu ethylnatého a následně směsi octan ethylnatý/methanol (93:7, objemově). Odpařením vhodných frakcí byl získán produkt (1,5 g), který je směsí polohových izomerů 2' a 3.

NMR v DMSOd6: (δ) ll,43(s, 1H) ; 8,10(b, 1H) ; 7,75(m, 1H) ; 7,45(M,1H); 7,35(s, 5H); 7,00(m, 2H); 6,60(m, 2H); 5,90{m, 1H); 5,69(m, 1H) ,- 5,17(m) a 4,97(m, total 1H) ; 5,02(s,2H); 4,69{bs) a 4,57(bs, total 1H) ; 4,53 (m) a 4,23'(m, total 1H) ; 4,08(m, 1H); 3,15 až 3,85{m, 13Ή); l,35-l,75(m, 10H); 0,88(t, 6H).

Hmotnostní spektrum (FAB) , m/e 787 (M+) a 788 (M++H) , C37H50N5O12P odpovídá M+, 787.

Analog prekurzoru účinné látky chráněný skupinou THP (sloučenina 7}

Plně chráněný meziprodukt z předchozí reakce (1 mmol) byl rozpuštěn v směsi ethanol (20 ml)/cyklohexen (10 ml) a poté k němu bylo přidáno 20% paladia na aktivním uhlí. Směs byla 1 hodinu vařena pod zpětným chladičem a před zakoncentrováním při sníženém tlaku byla zfíltrována. Vzniklý gumovitý zbytek byl purifikován chromatografií na sloupci oxidu křemičitého za použití směsi chloroform/methanol (9:1) jako elučního činidla. Výsledkem pak byl derivát s volnou glycylovou skupinou.

Sloučenina s fosfátovou skupinou chráněnou methylem (1 mmol) z předchozí reakce byla následně rozpuštěna v terciálním butylaminu (30 ml) . Reakčni směs byla 16 hodin vařena pod zpětným chladičem a před chromatografií na sloupci oxidu křemičitého za použití směsi chloroform/methanol (9:1) jako prvního elučního činidla a

-72Φ φ φ φ * · φ φ směsi chloroform/methanol (7:3) jako druhého elučního činidla byla zakoncentrována. Výsledkem byl požadovaný analog neaktivního prekurzoru účinné látky chráněný skupinou THP, který je směsí polohových izomerů 2' a 3.

Oddělení polohových izomerů 2' a 3' pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie

Separace byla provedena pomocí HPLC na koloně Partisil ODS-2. izokratickou elucí směsí 60:40 methanol/mravenčan amonný (0,1 M). Odpovídající frakce byly spojeny a lyofilizovány a výsledkem byl požadovaný meziprodukt připojený ke 3 uhlíku (7); viz. struktura na Obrázku 9.

NMR v DMSOd6: (δ) 8,85(s, 1H) ; 8,25{s, 1H) ; 7,75(d, 1H) ;

6,95(d, 2H) ; 6,5(d, 2H) ; 5,85(d, 1H) ; 5,6(d, 1H) ; 4,5(m,

2H) ; 4,3(m, 1H) ; 4,07{m, 1H) ; 3,2-3,6(m, 6H) ; 3,l(m,4H);

1,2-1,6(m, 10H); 0,8(m, 6H).

Referenční příklad 7

Syntéza' analogu neaktivního prekurzoru účinné látky odvozená od cytidinu (viz. schéma, Obrázek 10)

Analog neaktivního prekurzoru účinné látky odvozený od cytidinu (sloučenina 13) byl připraven obdobně jako sloučeniny odvozené od uridinu popsané v Referenčním příkladu 6. Syntéza se řídila postupem popsaným v Referenčním příkladu 6, ale .Sloučenina 7 (Obrázek 9) byla nahrazena Sloučeninou 12 (Obrázek 10).

Standardní zpracování: Zakoncentrování reakční směsi ve vakuové odparce, rozpuštění zbytku v chloroformu, promytí roztoku vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, odstranění vody pomocí Na₂SO₄, filtrace a zakoncentrování. Blesková purifikace chromatografií na sloupci za použití udané směsi rozpouštědel.

• ·

Sloučenina 12 byla připravena následovně {viz. schéma na Obráz-ku 10) .

N⁴-benzoyl-2', 3-O-methoxyethylidencytidin (sloučenina 1) byl připraven podle Green, D. P. L., Ravindranathan, T., Reese, C. B. a Saffhill, R., Tetrahedron 26, 1031, 1970. N⁴-benzoyl-5'-O- methansulfonyl -23'-O-methoxyethylidencytidin (sloučenina 2) byl připraven následovně.

Do roztoku N⁴-benzoyl-2', 3'-O-methoxyethylidencytidinu (9,85 g, 25,0 mmol) v pyridinu (100 ml) byl při 0°C za stálého míchání přidán methylsulfonyl chlorid (1,9 ml, 25 mmol). Po 16 hodinách míchání při 25°C byla reakčni směs zpracována zakoncentrováním ve vakuové odparce, rozpuštěním v chloroformu a promytím organické fáze vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Vrstva chloroformu byla oddělena, zbavena vody pomocí síranu sodného a zakoncentrována, čímž byl připraven výsledný produkt.

3'-Q-acetyl-5'-azido-N⁴-benzoyl-5'-deoxycytidin (směs s izomerem 2'-O-acetyl) (sloučenina 3) byl připraven následovně.

Surový methansulfonát (sloučenina 2) byl rozpuštěn v bezvodém DMF (100 ml) . K reakčni směsi byl přidán azid sodný (3,25 g, 50 mM) a směs byla míchána 7 hodin při 80°C. Reakčni směs byla zpracována zakoncentrováním rozpouštědla, rozpuštěním v chloroformu a promytím chloroformového extraktu vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Zbytek získaný po odpaření chloroformu zbaveného vody byl rozpuštěn ve 120 ml 70% HOAc. Po 15 minutách bylo rozpuštědlo odstanšno odpařením ve vakuové odparce a surový produkt byl purifikován na chromatografickém sloupci (95:5 CHCl₃/MeOH, poté 98:2 CHCl₃/MeOH) . Výtěžek požadovaného produktu byl 6g.

3'-O-acetyl-5 '-azido-N⁴-benzoyl-2 '-O-tetrahydropyranyl-5 '-d eoxycytidin (směs . s izomerem 3'- O-tetrahydropyranyl) (sloučenina 4) byl připraven následovně.

Sloučenina (6 g) z předchozího příkladu byla rozpuštěna v methylen chloridu (100 ml) a dihydropyranu (4 ml) . Po přidání 0,5 g monohydrátu kyseliny p-toluensulfonové byla směs míchána 16 hodin při 25°C. Surový produkt byl získán zpracováním podle postupu popsaného výše a požadovaný produkt byl získán purifikací surového produktu na chromatografickém sloupci za použití 98:2 CHCl₃/MeOH jako- elučni směsi.

5'-azido-5'-deoxy-2'-0-tetrahydropyranylcytidin (směs s izomerem 3'-0-tetrahydropyranyl) (sloučenina 5) byl připraven následovně.

Acetát (sloučenina 4, 9,0 g, obsahující nečistoty) byl rozpuštěn v methanolu (60 ml) a byl k němu přidán methoxid sodný (3,5 g) . Po 1 hodině míchání při 2 5°C byla reakční směs zakoncentrována a purifikována na chromatografickém sloupci. Výtěžek 3,7 g.

Poznámka: V tomto stádiu je možné pomocí chromatografie provést separací izomerů 2' a 3' (stejně jako ve většině následujících kroků).

5' -azido-N⁴-benzyloxykarbonyl- 5 ' - deoxy-2 ' -0- tetrahydropyran ylcytidin (směs s izomerem 3'-0-tetrahydropyranyl) (sloučenina 6) byl připraven následovně.

Sloučenina cytidinu (sloučenina 5, 3,7 g) byla rozpuštěna v bezvodém pyridinu (80 ml) a bylo k ní přidáno katalytické množství dimethylaminopyridinu (DMAP) 2 ml Z-Cl. Po 16 hodinách míchání při 25°C byla reakční směs zpracována a produkt byl purifikován chromatografií na

-75sloupci oxidu křemičitého s použitím· (CHCl₃/MeOH, 95:5) jako eluční směsi. Bylo získáno 2,3 g produktu.

5'- (N⁴-benzyloxykarbonyl)amino-5'-deoxy-2'-0-tetrahydropyra nylcytidin (směs s izomerem 3'-O-tetrahydropyranyl) (sloučenina 7) byl připraven následovně.

Azid (sloučenina 6, 3,06 g) v THF (30 ml) byl míchán s trifenylfosfanem (1,7 g) 24 hodin při 50°C. Ke směsi byla přidána voda (5 ml) a míchání pokračovalo při 50°C další hodinu. Výsledkem zakoncentrování reakční směsi a purifikace chromatografií na sloupci oxidu křemičitého s použitím (CHCl₃/MeOH, 9:1, poté 1:1 a nakonec 100% MeOH) jako eluční směsi bylo 0,9 g produktu.

N⁴ -benzyloxykarbonyl- 5'-(N-benzyloxykarbonylglycyl)amino-5' -deoxy-2'-0-tetrahydropyranylcytidin (směs s izomerem 3'-O-tetrahydropyranyl) (sloučenina 8) byl připraven následovně.

Amin (sloučenina 7, 0,9 g) byl rozpuštěn v bezvodém dichlormethanu (30 ml) a ke směsi byl přidán p-nitrofenyl-N-karbobenzyloxy-glycinát (700 mg) . Po 16 hodinách míchání při 25°C byla reakční směs zakoncentrována a surový produkt byl purifikována chromatografií na sloupci oxidu křemičitého s použitím (CHCl₃/MeOH, nejprve v poměru 97:3, poté v poměru 95:5) jako eluční směsi. Byl získán 1 g požadovaného materiálu.

N⁴-benzyloxykarbonyl-5'-(N-benzyloxykarbonylglycyl)amino-5' -deoxy-2'-O-tetrahydropyranylcytidyl-3' - (N, N-diizopropylmethyl) fosfonamidát (směs s izomerem 3') (sloučenina 9) byl připraven následovně.

··♦

Alkohol (sloučenina 8, 1 g) byl rozpuštěn v bezvodém dichlormethanu (30 ml) a ke směsi byl přidán EtN(iPr)₂ (1,7 ml) a následně pak Cl-P (OMe) N (iPr) ₂ (34 ml). Reakčni směs byla zpracována a purifikována chromatografií na sloupci oxidu křemičitého s použitím (CHCl₃/Et₃N, v poměru 98:2, a poté CHCl₃/Et₃N/MeOH v poměru 97:2:1) jako elučních směsí. Bylo získáno 1,1 g požadovaného materiálu.

(Methyl)(4-N, N-dipropylamonifenyl) [N⁴-benzyloxykarbonyl5-(N-benzyloxykarbonylglycyl)- amino-5'-deoxy-2'-0tetrahydropyranylcytidyl-3] fosfát (směs s izomerem 3') (sloučenina 10) byl připraven následovně.

Fosfonamidát (sloučenina 9, 1,1 g) byl rozpuštěn v bezvodém acetonitrilu (30 ml) a ke směsi byl přidán 4-N, N-dipropylaminofenol (200 mg) a následně pak tetrazol (420 mg) . Po 16 hodinách míchání při 25°C byl k reakčni směsi přidán 70% t-butylhydroperoxid (0,3 ml). Po 15 minutách byla reakčni směs zpracována a surový produkt byl purifikován chromatografií na sloupci oxidu křemičitého s použitím (nejprve EtOAc a následně EtOAc/MeOK 97:3) jako eluční směsi. Bylo získáno 0,85 g produktu.

(Methyl)(4-N, N-dipropylamonifenyl) (5-deoxyglycylaminocytidyl-3') fosfát (směs s izomerem 3') (sloučenina 11) byl připraven následovně.

Sloučenina chráněná bis-karbobenzyloxylovou skupinou (sloučenina 10, 0,85 g) byla rozpuštěna v ethanolu (30 ml) a cyklohexenu (15 ml) . K reakčni směsi bylo přidáno Pd-C (400 mg) a směs byla vařena za stálého míchání pod zpětným chladičem po dobu 4 hodin. Po filtraci byl roztok zakoncentrován a vzniklá látka ve formě gumy byla purifikována chromatografií na sloupci oxidu křemičitého s použitím (CHCl₃/MeOH, v poměru 95:5, a poté CHCl₃/MeOH v ·· poměru 5:1 a nakonec 100% MeOH) jako elučních směsí. Bylo získáno 100 mg produktu.

(4-N, N-dipropylamonifenyl) (5'-deoxy-glycylamino-2'-0-tetrahydropyranylcytidyl-3') hydrogenfosfát (sloučenina 12) byl připraven následovně.

Fosfát (sloučenina 11, 100 mg) byl rozpuštěn v t-butylaminu (25 ml) a vařen za stálého míchání pod zpětným chladičem po dobu 8 hodin. Po zakoncentrování byl produkt purifikován pomocí HPLC (kolona s reverzní fází Magnum 20, eluční činidlo MeOH/0,1 M mravenčan amonný v poměru 60:40) .

NMR	(DMSOdS) :	(δ)	9,1	(S, 1H);	8,19	(s,	1H) ;	7,6	(d, 1H) ;
7,2	(m, 3H);	6,95	( d,	2H); 6,45	(d,	2H) ;	5,8	(d,	1H); 5,72
(d,	1H); 4,71	(m,	1H) ;	4,45 (m,	1H) ;	4,22	(m,	1H)	; 4,1 (m,
1H) ;	3,8 (t,	1H) ;	3,7	-3,15 (m,	2H) ;	3,51	(s	2H) ;	3,35-3,5

(m, 1H); 3,0 (m, 4H); 1,8-1,2 (m, 10H); 0,8 (m, 6H). Hmotmostní spektrum FABMS [MH+] 639

Referenční příklad 8

Lokalizace konjugátu A5B7 F (ab')₂-BP-RNáza na xenogenní štěpy nádorů tvořených LoVo buňkami

Konjugát myší A5B7 F (ab')_z-BP-RNáza připravený způsobem popsaným v Referenčním příkladu 4, byl označen volným radionuklidem ^1Z5I za použití činidla IODOGEN™ (Pierce and Warriner (UK) Ltd., Chester England) postupem podle výrobce. Po označení radioaktivním jodem si konjugát uchoval >50% imunoreaktivity, což bylo in vitro potvrzeno vazbou na nádorové buňky LoVo při použití postupu popsaného v Lindo a další, J. Immunol. Meth. 72, 77 až 89, 1984.

Přibližně 10 μg konjugátu obsahujícího 10 μύί 1251 bylo intravenózně injikováno do bezthymových nahých myší (nu/nu:Alpk (outbredně křížených]) nesoucích xenogenní štěpy nádorů tvořené LoVo buňkami (7 dní předem bylo myším φ ··♦ ·· ♦· · !

• · · Í • · · · · • ♦ · · • φ* **· ·· subkutánně injikováno 1 x 10⁷ rakovinných buněk LoVo). Po injikaci konjugátu byly v různých časových intervalech po injikaci vždycky usmrceny 3 myši a těmto myším byly odebrány nádor, vzorek krve a množství dalších tkání. Tyto odebrané vzorky byly zváženy a jejich radioaktivita změřena na čítači gama pulzů. Distribuce konjugátu v nádoru a tkáních je znázorněna níže.

Lokalizace konjugátu A5B7 F (ab) ₂-BP-RNáza v nádoru a

různých tkáních
Tkáň	4 hodiny	24 hodin 48 hodin	72 hodin 96 hodin
Nádor	2,54	3,27	1,00	0,66	0,41
Krev	6,83	1,06	0,25	0,12	0,06
Játra	1,81	0,62	0,12	0,07	0,06
Ledviny	2,76	0,55	0,23	0,18	0,11
Plíce	2,85	0,28	0,15	0,09	0,08
Jednotky	= % injikovaná	dávka/ g	tkáně;	výsledky jsou

průměrné hodnoty ze 3 myší

Získané výsledky zřetelně ukazují, že konjugát A5B7 F (ab'} ₂-BP-RNáza je specificky lokalizován na xenogenní štěpy LoVo buněk: Od 24 hodiny po aplikaci konjugátu bylo v nádoru více konjugátu/ g tkáně než ve kterékoliv jiné tkáni včetně krve. Množství konjugátu v nádoru bylo podobné množství naměřenému s konjugátem A5B7 F(ab')₂-GPG2 (Blakey a další, Br. J. Cancer 69, Dodatek XXI, strana 14, 1994}. Bylo prokázáno, že toto množství konjugátu CPG2 použité v kombinaci s mustard-neaktivním prekurzorem účinné látky vede k regresi nádorů a zpomalení jejich růstu v modelech využívajících xenogenní štěpy LoVo buněk (Blakey a další, Br. J. Cancer 69, Dodatek XXI, strana 14, 1994,- Blakey a

I · ··♦ ♦ · ΐ*

- /y·· • · • · : :

• ’ • ·· další, Proceedings of the American Association for Cancer Research 35, strana 507, 1994).

Referenční příklad 9

Syntéza kyseliny Hippuryl-L-Glutamové

Dibenzyl ester kyseliny hippuryl-L-glutamové (sloučenina 3) (2,06 g, 4,2 mmol) a 30% Pd/uhlík (50% vlhkost) (0,77 g) v THF byly míchány po dobu 1,5' hodiny ve vodíkové atmosféře. Směs byla zfiltrována přes Celite™ a filtrát byl odpařen do sucha. Rozetřením s diethyl etherem vznikl požadovaný konečný produkt ve formě bílé krystalické pevné látky o hmotnosti 1,02 g (78%). Teplota tání 169 až 171°C. 20D = -2,5°.

NMR DMSO d6: 12,3, 2H (široký); 8,7, IH (t) ; 8,2, IH (t); 7,2, 2H (m) ; 7,5, 3H (m) ; 4,3, IH (m) 3,9, 2H (m) ; 2,3, 2H (t); 1,9, 2H (m).

Výchozí materiál sloučenina 3 se připraví následujícím způsobem. K roztoku kyseliny hippurové (0,90 g, 5xl0'³ mol) a dibenzyl esteru kyseliny L-glutamové (2,50 g. 5xl0³ mol) v 35 ml DMF se přidá 1-hydroxybenzotriazol (0,73g, 5,5xl0'³ mol), triethylamin (1,4 ml, 9,7xlQ'³ mol) a 1(3-dimethyl-aminopropyl) -3-ethylkarbodiimid hydrochlorid (1,05 g, 5,5xl0'³ mol). Reakčni směs se míchá přes noc za pokojové teploty, nalije se do 400 ml vody a extrahuje se dvakrát 100 ml ethyl acetátu. Spojené extrakty se promyjí nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 2N HCI a vodou. Organická fáze se vysuší inkubací nad MgSO₄ a nechá se odpařit za vzniku požadovaného výchozího materiálu ve formě žlutého oleje.

Výtěžek činí 2,06g (84%); NMR DMSO d6 8,7 IH (t); 8,4 IH (d) : 7,9 2H (m) ; 7,5 3H (m) ; 7,35 10H (m) ; 5,15 2H (s) ; 5,05 2H (s); 4,4 IH (m); 3,9 2H (t); 2,0 4H (m)

9999

..· · · · · · ,, *·· ··· ·♦ ·· ·

Referenční příklad 10

Syntéza kyseliny hippuryl -L-asparagové

Dibenzyl ester hippuryl-L-asparagové kyseliny (l,28g, 2,7xl0'³ mol) se míchá ve vodíkové atmosféře po dobu 3 hodin v THF spolu s katalyzátorem tvořeným 0,51 g 30% Pd/uhlík (50% vlhkost). Reakční směs se přefiltruje přes Celíte™ a filtrát se nechá do sucha odpařit. Rozmělněním v diethyletheru se připraví téměř čistě bílá krystalická látka. Výtěžek činí 0,62g (78%) látky s bodem tání 200 až 202°C a následujícími vlastnostmi 20D = + 7,9°; NMR DMSO d6

12,5 2H (široký); 8,7 1H (t) ; 8,2 1H (d) ; 7,7 2H (m) ; 7,5 3H (m); 4,6 1H (m); 3.9, 2H (d); 2,7 2H (m)

Výchozí materiál se připraví následujícím způsobem. K roztoku 0,90 g (5xl0'³ mol) hippurové kyseliny a 2,31 g (5xl0-³ mol) dibenzyl esteru kyseliny L-asparagové v 35 ml DMF se přidá 0,73 g (5,5xl0'³ mol) 1-hydroxybenzotriazolu, 1,4 ml (9,7xl0‘³ mol) triethylaminu a 1,05 g (5,5xl0'³ mol) hydrochloridu 1-(3-dimethyl- aminopropyl)-3ethylkarbodiimidu. Reakční směs se míchá 4 hodiny za pokojové teploty, pak se nalije do 450 ml vody a dvakrát se extrahuje 100 ml ethyl acetátu. Extrakt se promyje; nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 2N HCl a vodou. Organická fáze se vysuší nad MgSO4 a nechá se do sucha odpařit za vzniku požadovaného výchozího materiálu pro další postup ve formě žlutého oleje. Výtěžek činí 1,90 g (80%)látky s následujícími vlastnostmi NMR DMSO d6 8,7 1H (t) ; 8,45 1H, (d) ; 7,9 2H (m) ; 7,5 3H (m) ; 7,3 10H (m) ;

5,15 2H (s); 5,05 2H (s); 4,8 1H (m); 3,9 2H (m) ; 2,9 2H (m)

Referenční příklad 11:

Enzymatická aktivita rekombinantního HCPB při konverzi Hipp-Arg

-81·« *·

I · » · « ··· »

Byla testována schopnost purifikovaného lidského CPB připraveného tak, jak bylo popsáno v referenčním příkladu 20, konvertovat hippuryl-L-arginin (Hipp-Arg) na hippurovou kyselinu. Tento test byl vyhodnocován spektrofotometricky.

Konstanty Km a kcat pro nativní HCPB se stanoví měřením počáteční rychlosti konverze Hipp-Arg na hippurovou kyselinu při vlnové délce 254 nm a v rozsahu koncentrací Hipp-Arg 0,75 až 0,125 mM a pří koncentraci enzymu CPB 1 gg/ml. Měření se provádí při teplotě 37°C v 0,25mM Tris-HCl pufru (pH 7,5). Celá reakční směs (1 ml) byla umístěna v kyvetě s optickou drahou 1 cm. Měření bylo prováděno pomocí spektrofotometru Perkin Elmer Lambda 2. Hodnoty Km a Vmax byly spočítány pomocí programu ENZFITTER™ (BiosoftTM, Perkin Elmer). Kcat se spočítá z Vmax vydělením koncentrací enzymu v reakční směsi.

Výsledky konverze Hipp-Arg lidským CPB byly:

Km = 0,18 mM kcat = 65 s'¹

Uvedené výsledky ukazují, že rekombinantní HCPB je enzymaticky aktivní a je schopna štěpit amidovou vazbu,. v Hipp-Arg za uvolnění hippurové kyseliny.

Referenční příklad 12:

Syntéza naktivního prekurzoru účinné látky založeného na arginin-mustard sloučenině (viz obrázek 27) (2S),2-(3-(4-[bis-(2-chloroethyl)-amino)-fenoxykarbonyl}-pr opionyl-amino)-5-guanidino-pentanová kyselina (sloučenina 5c, obrázek 27)

Roztok 275 mg (0,44 mmol) benzyl esteru (2S),2-(3-(4-[bis- (2-chloroethyl)-amino) -fenoxykarbonyl}propionyl- amino)-5-(2-nitro)-guanidino-pentanové kyseliny (sloučenina 4c, obrázek 27} v 8 ml směsi ethyl acetát/MeOH (1:1, objemově) obsahující 10 % Pd/C (200 mg) se «« *··· ·»< ·*· ·· ·· * hydrogenuje v Paarově přístroji při tlaku 0,5512 MPa (80 psi) po dobu 6 hodin. Po přefiltrování .se. organická fáze nechá odpařit. . Výsledný olej se nechá rekrystalizovat pomocí CH₂C1₂ s diethyleterem za vzniku 180 mg požadované sloučeniny 5c ve formě bílé pevné látky. Výtěžek činí 84 % látky s vlastnostmi

IHNMR (CD3OD): 1,55 až 1,7 (m. 3H); 1,8 až 1,9 (m.lH); 2,6 až 2,7 (m. 2H) ; 2,75 až 2,85 (m. IH); 2,9 až 2,95 (m. IH); 3,1 až 3,2 (m. 2H) ; 3,6 až 3,7 (m. 4H) ; 3,7 až 3,8 (m. 4H) ; 4,3 (dd. IH); 6,75 (dd. 2H); 6,95 (dd. 2H).
Ms (ESI): 512	až 514 (MNa)+
Anal.	(C20H2gN5O4Cl2.1,5 H2O)
Vypočteno	C:47,91 H:6,43	N: 13,97
Nalezeno	C: 47,7 H: 6,21	N: 14,26
Výchozí způsobem. K	sloučenina 4c se 664 mg (1 mmol)	připraví následujícím roztoku benzyl esteru

(2S),2-amino-5-(2-nitro)-guanidino-pentanové kyseliny (sloučenina 2c) v 10 ml CHC1₃ se přidá 120 mg (2 mmol) dihydrofuran-2,5-dionu (sloučenina 1} . Poté se po kapkách přidá 202 mg (2 mmol) triethylaminu a celá reakční směs se·· 2 hodiny míchá za pokojové teploty.

Poté se nechá odpařit rozpouštědlo a surový zbytek se se rozpustí ve vodě. Pomocí 2N HCl se pH nastaví na hodnotu 2,5. Poté se pomocí ethyl acetátu extrahuje vodní fáze a organická fáze se promyje slanou vodou, vysuší nad MgSO₄ a nechá se odpařit za vzniku benzyl esteru (2S),2-(3-karboxypropionylamino)-5- (2-nitro)- guanidino-pentanové kyseliny

(sloučeniny 3c) . Výsledná	pevná	látka	se	rozetře
diethyletherem a přefiltruje.	Výtěžek	činí	280	mg (	68 %) .
IHNMR (CD3OD) : 1,52 až 1,68	(m. 2H) ,	; 1,7	až	1,8	(m.lH)
1,85 až 1,95 (m.lH); 2,45 až	2,7 (m.	4H) ;	3,15 až	3,3 (m.

2H) ; 4,5 (m.l H) ; 5,15 (dd. 2H) ; 7,25 až 7,4 (m. 5H) ·« ··»

MS (ES.I): 432 [MNa] +

K suspenzi 204 mg sloučeniny 3c (0,5 mmol) v 5 ml CHClj se přidá 135 mg 4-(bis(2-chloroethyl)amino)-fenol (sloučenina 6, 0,5 mmol), 19 mg EDCI (0,5mmol) a DMAP (18 mg: 0,75 mmol). Reakční směs 6 hodin míchá za pokojové teploty a poté se odpaří rozpouštědlo. Zbytek se rozdělí mezi ethyl acetát a vodu a vodní fáze se 2N HCl okyselí na pH = 3. Po exktrakci ethyl acetátem se organická fáze promyje solným roztokem, vysuší nad MgSO₄ a nechá se odpařit. Zbytek Se přečistí flash chromatografií. Jako eluční činidlo se použije směs CH₂Cl₂/MeOH (95:5 objemově). Výsledkem je 281 mg požadované výchozí látky 4c ve formě bílé pěny, výtěžek činí 90 %.

Vlastnosti sloučeniny 4c: 1 HNMR (CD3OD):1,55 až 1,7 (m.

2H) ; 1,7 až 1,8 (m,1 H); 1,85 až 1,95 (m,1H); 2,55 až 2,75 (m, 2H): 2,8 až 2,9 (m. 2H); 3,15 až 3,25 (m, 2H): 3,6 až

3,7 (m, 4H) ; 3,7 až 3,8 (m, 4H) ; 4,5 (dd, 1 H) ; 5,15 (dd. 2H) ; 6,7 (d, 2H) ; 6,95 (d. 2H) ; 7,32 (τη. 5H)

Ms (ESI): 647 až 649 [MNa] +

Referenční příklad 13

Syntéza mono-{4-[Ν,Ν-bis (2-chloroethyl) amino]-fenyl} esteru kyseliny jantarové (nebo rovněž intermediátu)

K suspenzi 225mg (2,25 mmol) anhydridů kyseliny jantarové v 10 ml CHCI₃ se za stálého míchání přidá 203mg (0,75 mmol) 4-[N,N-bis-(2-chloroethyl)-amino]fenol (sloučeniny 6, obrázek 27) a poté 75 mg triethylaminu (0,75 mmol) . Reakční směs se míchá přes noc poté se nechá rozpouštědlo odpařit.

Surový zbytek se rozpustí ve směsi rozpouštědel EtOAC/Et₂O/H₂O a za stálého míchání se nastaví pH na 3. Organická fáze se promyje vodou a solným roztokem a poté se vysuší nad MgSO₄ a nechá se odpařit. Výsledná olejovitá φ

»

kapalina se překrystalizuje ze systému Et₂O/hexan. Výsledná bílá pevná látka se přefiltruje a vysuší se ve vakuu za vzniku 210 mg (83% výtěžek} požadovaného konečného produktu. Bod tání činí 98 až 1OO°C.

Ms (ESI): 356 až 358 [MNa]+

1H NMR (CDC1J : 2,8 (dd, 2H) ; 2,9 (dd, 2H) ; 3,65 (dd, 4H) :

3,75 (dd, 4H) ; 6,65 (d, 2H) ; 7,0 (d, 2H)

Anal. (C₁₄H₁₇Cl₂0₄N 0,2 H₂0)

Vypočteno % C: 49,78 H: 5,19 N: 4,15

Nalezeno % C:49,9 H:5,3 N:4,2

Referenční příklad 14

Klonování lidské pankreatické karboxypeptidázy B (HCPB)

Byly použity standardní molekulárně biologické techniky jako například štěpení restrikčními enzymy, ligace, kinasové reakce defosforylace, polymerázová řetězová reakce (PCR) , transformace bakterií, gelová elektróforéza, příprava pufrů a DNA syntéza, purifikace a izolace v takovém uspořádání, jaké bylo popsáno v Maniatis’ a další. (1989) Molécular Cloning, A Laboratory Manualr druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York nebo byly použity techniky a způsoby doporučené výrobci konkrétních produktů. Nej častěji byly enzymy zakoupeny u firmy New England BioLabs, nicméně mohou být použity i jiní dodavatelé a ekvivalentní postupy. Oligonukleotidy byly nasyntetizovány pomocí DNA syntetizéru Applied Biosystems 380A z 5' dimethoxytritylovou skupinou chráněných nucleosid-2- kyanoethyl-N,N- diisopropylfosfoámidů a chráněných nukleosidů navázaných na skleněnou podporu s kontrolovanou velikostí pórů v 0,2 μιηοΙέΓηίιτι měřítku. Při této syntéze bylo postupováno podle protokolů dodaných firmou Applied Biosystems lne.

-85• · · · « ·· ·· ·

Kódující sekvence pro-proteinu lidskou pankreatickou karboxypeptidázu B byla získána z lidské pankreatické cDNA knihovny ve vektoru λ gtlO (Clontech, Lidská pankreatické 3' STRETCH cDNA, HL 1163a) pomocí PCR. Poté byla klonována do plazmidu pBluescript^II KS+ (Stratagene) .

Typicky se smíchá alikvot cDNA knihovny (5μ1 při titru > lO^apfu/ml) se lQQpmolárním množstvím dvou oligonukleotidových primerů BPTI a BPB 1, (podle Sekvence id. č.: 46 a Sekvence id.č.: 47), s deoxynukleotidtrifosfáty do celkové koncentrace 200 μΜ, reakčním pufrem pro Taq polymerázu a 2,5 U Taq polymerázy do celkového objemu 100 μΐ. Reakční směs se zahřeje na 94°C na 10 minut ještě před přidáním Taq polymerázy. Inkubační podmínky pro PCR reakci jsou následující: 30 cyklů 94°C na

1,5 minuty, 50°C na 2 minuty a 72°C na 2 minuty. Po těchto třiceti cyklech se ještě reakční směs 9,9 minut inkubuje při 72°C.

Oligonukleotidové primery byly navrženy tak, aby primer BPTI (Sekvence id. č.: 46) umístěný mezi začátkem sekvence pre-proteinu a začátkem sekvence pro-proteinu, umožňoval extenzi genu ve směru 5'->3'a primer BPB1 (Sekvence id. č. :47) umožňoval PCR extensigenu v opačném směru, viz obrázek 18. Primery BPTI a BPB I byly rovněž navrženy tak, , že zavádějí do nově vzniklé DNA unikátní restrikční místa pro enzymy Sací a Xhol.

Elektroforézou na agarozovém gelu byl analyzován alikvot PCR produktu, přičemž byla zjišťována správná velikost DNA (1250 bp) . Výsledný produkt obsahoval převážně DNA o správné velikosti. Zbylý produkt reakce byl přečištěn a zbaven přebytečných reagencií pomocí mikrokoncentrátoru Centricon™ 100 (Amicon). Poté se provede DNA izolace pomocí precipitace ethanolem a acetátem sodným, centrifugací precípitátu, vakuovým sušením a resuspenzí v destilované vodě. Izolovaná DNA se poté podrobí ·· ·»··

-86tt • · · ··

V ♦ 9

9 9

9 9

9

9 restrikčnímu štěpení enzymy Sací a Xhol. Elektroforetický proužek o správné velikosti (přibližně 1250 bp) se vyřízne, přečistí a izoluje pomocí systému glass-milk (Geneclean™, Stratec Scientific, nebo jiného podobného produktu).

Dvouvláknová DNA z vektoru pBluescript II KS+ (Stratagene) se štěpí restrikčním enzymem Sací a produkt se defosforyluje střevní telecí alkalickou fosfatázou, čímž se odstraní 5'koncové fosforylové skupiny a redukuje se transormační pozadí vzniklé re-ligaci. DNA produkt se zbaví zbytků po enzymatické reakci pomocí systému glass-milk a poté se restrikčně štěpí enzymem Xhol. DNA o správné velikosti (přibližně 2850 bp) elektroforézy na agarovém gelu, proužku a pouštím systému glass-milk (Genecleaň Scientific, nebo jiného podobného produktu).

se přečistí pomocí vyříznutím správného Stratec

Pomocí elektroforézy na agarovém gelu se zkontroluje čistota a odhadne koncetrace alikvotů purifikované a restrikčně štěpené DNA porovnáním se známými standardy. Tyto odhady se použijí při přípravě ligační směsi pro klonování genu HCPB do vektoru, přičemž se použije molární poměr vektoru ku inzertu přibližně 1 ku 2,5 (lpBluescript™II ΚΞ + ku 2,5 HCPB PCR produkt). Výsledná koncentrace DNA v reakčni směsi je přibližně 2,S ng/μΙ v přítomnosti T4 DNA ligázy a 1 mM ATP a enzymového pufru.

Po této ligační reakci se směs DNA použije k transformaci E.coli kmene DH5a (Gibco-BRL, kompetentní buňky s maximálním výěžkem). Alikvoty se vysejí na plotny s L-agarovým živným médiem obsahujícím l00^g/ml ampicillinu jakožto selekčního činidla. Plotny se inkubuj£ přes noc při teplotě 37 °C. Kolonie obsahující plazmidy s požadovaným inzertem se identifikují hybridizaci.

Bylo odebráno přibližně 200 kolonií a vyseto na dvojité sterilní nitrocelulózové filtry (Schleicher a

4·

-87• 4 • · * 4 • 4

4« 4444 • 4 · ·

4

4

Schull). Tyto filtry byly ještě předtím navlhčeny na plotnách s L-agarem obsahujícím 100 Mg/ml ampicillinu jakožto selekčního činidla pro vektor. Plotny se inkubují přes noc při teplotě 37°C. Jeden z filtrů se uschová při teplotě 4°C jakožto zdroj živých buněk pro tvorbu kolonií, zatímco druhý filtr je denaturován a DNA z jednotlivých kolonií fixována na nitrocelulózový filtr. Nitrocelulózový filtr se vyjme z agarové plotny a je postupně inkubován na filtračních papírech Whatman™ nasycených:

1.	10% SDS, 2	minuty
2 .	0,5M NaOH,	1,5M NaCI,	7 minut
3 .	0,5M NaOH.	1,5M NaCI,	4 minuty
4 .	0,5M NaOH.	1,5M NaCI,	2 minuty
5 .	0,5M Tris	pH7,4, 1,5M	NaCI, 2 minuty
6 .	2xSSC (standard šalině citráte, fyziologický roztok pufrovaný citrátem)

standardní 2 minuty

Membrána se poté umístí na filtrační papír Whatman™ nasycený lOxSSC a denaturovaná DNA se kovalentně naváže na nitro-celulózu pomocí ultrafialového záření (pomocí přístroje Uv crosslinker XL-1500 Spectrolinker™). Filtry se nechají vyschnout za pokojové teploty a poté se pre-hybridizují při teplotě 60°C po dobu jedné hodiny v roztoku 6xSSC za mírného míchání (například hybridizér Techne HB-1D). Pre-hybridizace na filtru zablokuje nespecifická vazebná místa pro DNA.

Kolonie obsahující požadovaný DNA inzert byly identifikovány pomocí hybridizace se sondou DNA značenou radionuklidem ³²P. Tato sonda byla připravena z PCR produktu genu HCPB z pankreatické c DNA knihovny (viz výše).

• ·		•	«	44	• 4
•	•	•	4 4	4	4	4
*	•	• 4	• 4	• ·	« ·	4
•	4	4	4 4	4		4
4 4		4 4 4	44 4	4 4	4 4

Přibližně 50ng DNA bylo označeno 50μΟί ³²P-dCTP (~3000Ci/mmol) pomocí T7 DNA polymerázy v celkovém objemu 50 μΐ (souprava Pharmacia T7 Quickprime).

Reakce probíhala 15 minut při teplotě 37°C. Značená sonda se poté zahřeje na teplotu 95°C na 2 minuty, čímž se denaturuje dvouvláknová DNA. Poté se okamžitě přidá k 10 ml 6xSSC o teplotě 60°C. Tímto roztokem se zamění pre-hybridizační roztok na membránách. Inkubace za stálého mírného míchání pokračuje přibližně další 3 hodiny při teplotě 60°C. Po skončení hybridizace se vylije hybridizační roztok a filtry se dvakrát promyjí v 6xSSC (pokaždé 15 minut). Filtry se poté osuší pomocí filtračního papíru a zabalí do potravinářské fólie (Saran™ wrap nebo podobné). Hybridizace je vizualizována pomocí vhodného rentgenového filmu (na příklad Kodak Xomat™-AR5) . Film je exponován přes noc za pokojové teploty. Kolonie obsahující požadovaný inzert jsou ty, které dávají na filmu nej tmavější skvrny. V tomto případě přibližně 15 % kolonií vykazovalo pozitivní signál. Z nich bylo vybráno 12 kolonií pro další výběr. Tyto kolonie byly odebrány ze záložního filtru a vysety a udržovány na plotnách s L-agarem s obsahem 100 /ig/ml ampicillínu. Pro další pokusy byly tyto kolonie pěstovány v L-vývaru s přídavkem ampicillínu o stejné koncentraci.

Vybrané izoláty byly pomocí PCR zkontrolovány, jestli obsahují inzert o správné velikosti. Při této kontrole byly použity primery BPTl a BPB1, (Sekvence id. č. 46 a Sekvence id. č. 47), a rovněž interní primery BPT2 (Sekvence id. č. 48) a BPB 1. BPT2 je navržen tak, aby hybridizoval s koncem sekvence pro-proteinu před počátkem zralého (mature) genu. Zároveň zavádí do PCR produktu restrikční místo pro Xbal.

Vybrané izoláty se odeberou z kultivačních médií, suspendují v 200 μΐ destilované vody a zahřejí na 10 minut na teplotu 100°C v uzavřené mikrozkumavce (Eppendorf™).

-89Poté se suspenze centrifuguje 10 minut v mikrocentrifuze, čímž se odstraní zbytky buněk. 1 μΐ supernatantu se použije jako templát pro PCR skríning. V typickém provedení se 1 μΐ supernatantu smísí s s 20 pmol oligonukleotidových primerú BPTI a BPBl, nebo BPT2 a BPB 1, dNTP do celkové koncetrace 200 μΜ, reakčním pufrem pro Taq polymerázu a 0,5 U Taq polymerázy. Celkový objem reakční směsi je 20 μΐ. PCR byla provedena v 25 cyklech, z nichž každý zahrnoval 1,5 minutovou inkubaci při 94°C, 2 minutovou při 50°C a 2 minutovou při 72°C. Po těchto cyklech byla reakční směs ještě zahřáta na 72°C na 9,9 minuty.

Elektroforézou na agarózovém gelu byly v PCR produktech vyhledávány proužky DNA o správné velikosti (přibližně 1250 bp pro primery BPTI a BPBl a přibližně 900 bp pro primery BPT2 a BPBl, vi2 obrázek 18}. Deset z dvanácti klonů poskytlo PCR produkty o správné velikosti. Šest z těchto produktů bylo vybráno pro produkci plazmidové DNA. Plazmidová DNA byla přečištěna pomoci soupravy Quiagen Maxi™ ze lOOml kultury, pěstované přes noc při teplotě 37°C v L-vývaru s přídavkem 100 μ9/τπ1 ampicillinu. Plazmidová' DNA byla poté sekvenována v oblasti PCR produktu pomocí sekvenační soupravy USB Sequenase™, která obsahuje DNA polymerázu bakteriofága T7. Každý z klonů byl sekvenován za pomoci 8 různých primerů, označených 676, 336, 337, 679, 677, 1280, 1279 a 1281 (Sekvence id. č. 48 až 55). Umístění primerů vzhledem k sekvenci HCPB je znázorněno na obrázek 19, přičemž primery 336, 1279, 676, 1280, 677 a 1281 jsou dopředně a primery 337 a.679 zpětné.

Pět z těchto šesti klonů mělo identickou sekvenci (Sekvence id. č. 56) sestávající z 1263 bp mezi a včetně restrikčních míst Sací a Xhol. Tato sekvence byla použita pro další experimenty. Translace DNA do příslušného polypeptidu je znázorněna v Sekvence id. č. 57, přičemž číslování začíná počátkem maturovaného proteinu.

-90Aminokyselina označená -95 je počáteční aminokyselinou pravděpodobného pro-enzymu. V klonovaném PCR produktu je obsažena pouze část vedoucí sekreční sekvence (pre-sekvence).

Při srovnání s ostatními sekvencemi pro-proteinů savčích karboxypeptidáz typu A a B vykazuje získaná sekvence zbytek kyseliny asparagové v pozicí 253, což přiřazuje tuto sekvenci mezi karboxypeptidázy skupiny B (víz aminokyseliny číslované 255, Catasus L. a další Biochem J., 287, 299 až 303, 1992) . Nicméně cysteinový zbytek na pozice 135 v klonované cloned sekvenci není obsažen v publikovaných sekvencích lidské pankreatické karboxypeptidázy B, viz Yamamoto a další, Journal Biological Chemistry, 267, strana 2575 až 2581, 1992, kde vykazuje mezeru v sekvenci po aminokyselinovém zbytku č.244 ve srovnání s jinými savčími aminokyselinovými sekvencemi pro pankreatickou karboxypeptidázu B. Na obrázku 19 jsou rovněž znázorněny přibližné pozice zbytků kyseliny asparagové v aktivním místě enzymu a cysteinový zbytek na pozici 135 maturovaného enzymu.

Jeden z klonů byl 23. listopadu 1995 uložen u Národní sbírky průmyslových a mořských bakterií, 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Skotsko) pod registračním číslem NCIMB 40694. Plazmid z tohoto klonu je označován pICIl698.

Referenční příklad 15:

Exprese aktivního HCPB-(His)_s-c-Myc v E. coli

Gen pro aktivní (mature) protein byl z plazmidu pICI1698 převeden do plazmidového vektoru, který umožnil kontrolovanou sekreci proteinu do periplazmatického prostoru. Tento sekreční vektor vhodný pro kontrolovanou expresi v bakteriálním hostiteli MSD522 byl označen. pICI266, byl uložen u Národní sbírky průmyslových a

mořských bakterií, 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Skotsko) a bylo mu uděleno registrační čídslo NCIMB 40589.

Na obrázku 20 je znázornněna mapa piazmidu pICI266. Plazmid obsahuju geny pro rezistenci k tetracyklinu a jeho indukci (geny TetA a TetR), operátor AraB, promotorovou sekvenci pro expresi vloženého genu a gen AraC pro kontrolu exprese. Promotorové sekvence je následovaná vedoucí translační sekvencí, která usměrňuje neásledující polypeptid do periplazmy. Místo pro klonování genu obsahuje několik unikátních restrikčních míst, po kterých následuje sekvence terminátoru transkripce z fága T4. Na obrázku 21 je znázorněna sekvence DNA a vlastnosti této oblasti důležité pro klonování.

Pro klonování aktivní sekvence HCPB do vektoru pICI266 byla nejprve připravena pomocí PCR DNA pro HCBP. Přitom byly provedeny rovněž některé záměny v používaných kodónech na počátku genu pro aktivní HCBP, tak aby obsahoval kodóny vhodné pro E.coli, K C-konci enzymu byla rovněž připojena značka známá jako (His)6-c-myc, která slouží ke snadné detekci a purifikaci výsledného produktu. Tato značka sestává z 6 histidinových zbytků, tipeptidu EPE' a peptidu o sekvenci (EQKLISEEDL) z c-myc, který je rozpoznáván protilátkou 9E10 (viz Evan a další Mol. Cell. Biol. 5, 129 až 136, 1985). Tuto protilátku dodávají Cambridge Research Biochemicals a další výrobci protilátek. Nazávěr se na C-konec připojí asparagin. 6 histidinový zbytek umožňuje purifikaci exprimovaného protein na koloně s chelatovaným kovovým iontem (například Ni-NTA agaróza, Qiagen). PCR primery jsou rovněž využity pro vložení unikátních restrikčních míst 5' konec (FspI) a 3' konec (EcoRI) genu. Tím se zjednoduší vložení PCR produktu do expresivního vektoru. Sekvence těchto primerů (FSPTSl a 6HIS9E10R1BS1) jsou uvedeny pod názvem Sekvence id. č. 58 a 59.

-92«« « · * · • · · * · * ·· ···» • · · ··· · ·

9 9 9 9 «4« >f » »

Pro přípravu modifikovaného genu pro klonováni do pICI'266 byla použita PCR. Tato reakce sestávala z 100 pmol primerů FSPTS 1 a 6HIS9E10R1BS1, přibližně 5 ng DNA z plazmidu pICI1698, mixu dNTP o celkové koncentraci 200 μΜ, reakčního pufru pro Taq polymerázu a 2,5U Taq polymerázy v celkovém objemu 100 μΐ. Směs se zahřeje na 94°C na 10 minut a pak se teprve přidá Taq polymeráza. Inkubační teploty pro PCR byly následující 1,5 minuty 94°C, 2 minuty 50°C a 2 minuty 72°C. Tento cyklus byl opakován 30. Na závěr byla reakčni směs zahřáta na 9,9 minuty na teplotu 72°C. Alikvot PCR produktu byl analyzován elektroforézou na agarÓzovém gelu. Byla hledána DNA o správné velikosti (přibližně 1000 bp} . Alikvot obsahoval převážně DNA o správné velikosti. Zbylý produkt reakce byl přečištěn a zbaven přebytečných reagencií pomocí mikrokoncentrátoru Centricon™ 100 (Amicon). Poté se provede DNA izolace pomocí precipitace ethanolem a acetátem sodným, centrifugací precipičátu, vakuovým sušením a resuspenzí v destilované vodě. Izolovaná DNA se poté podrobí restrikčnímu štěpení enzymy FspI a EcoRI. Elektroforetický proužek o správné velikosti (přibližně. 1000 bp) se vyřízne, přečistí a izoluje pomocí systému·, glass-milk (Geneclean™, Stratec Scientific, nebo jiného podobného produktu).

Dvouvláknová DNA z plazmidu pICI266 připravená pomocí standardních technik (například pomocí kitu firmy Qiagen), se restrikčně štěpí enzymem KpnI. Je třeba velmi dbát na úplné rozštěpení. Po skončení reakce byl enzym inaktivován zahřátím na 65 °C po dobu 10 minuta naásledovným ochlazením na ledu. 3' přesah byl poté enzymaticky odštěpen přídavkem T4 DNA polymerázy podle doporučení výrobce (New England BioLabs), t.j. v přítomnosti mixu dNTP při teplotě 16°C po 15 minutách. Enzym byl opět tepelně inaktivován

-934« 4444

444 *«4444 · · 4 44 44 4444

444 444 44

444 444 4* 44 4 zahřátím na 70°C na 15 minut. Výsledná DNA byla zbavena zbytků reakční směsi pomocí systému glass-milk.

Alikvot byl použit pro odhad výtěžku elektroforézou na agarózovém gelu a zbytek byl štěpen restrikčním enzymem EcoRI. Opět byla věnována zvýšená pozornost úplnému proběhnutí reakce. DNA o správné velikosti (přibližně 5600 bp) byla purifikována z agarózového gelu pomocí systému glass-milk GenecIean'^M . (Stratec Scientific, nebo jiného podobného produktu). Ze vzorků naštěpené a purifikované DNA byly odebrány alikvot, které byly použity pro odhadnuti koncentrace pomocí elektroforézy na agarózovém gelu a porovnáním se známými standardy. Tento odhad byl použit při přípravě ligační směsi pro lígaci a klonování genu HCPB do vektoru, přičemž molární poměr mezi vektorem a inzertem byl 1:2,5 (1 pICI266 ku 2,5 HCPB PCR produktu) . Výsledná koncentrace pro ligaci byla přibližně 2,5. ng/μΙ DNA v přítomnosti T4 DNA ligázy, ImM ATP a enzymového pufru a za podmínek vhodných pro ligaci· DNA s tupým koncem (FspI do místa KpnI zarovnaného T4 DNA polymerázou).

Po této ligační reakci se směs DNA použije k transformaci E.coli kmene DH5a (Gibco-BRL, kompetentní buňky s maximálním výěžkem). Alikvoty se vysejí na plotny s L-agarovým živným médiem obsahujícím 10 μ9/ηι1 tetracyklínu jako selekčního činidla. Plotny se inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Kolonie obsahující plazmidy s požadovaným inzertem se identifikují hybridizaci.

Bylo odebráno přibližně 350 kolonií a vyseto na dvojité sterilní nitrocelulózové filtry (Schleicher a Schull). Tyto filtry byly ještě předtím navlhčeny na plotnách s L-agarem obsahujícím 10 μρ/ιτιΐ tetracyklínu jako selekčního činidla pro vektor. Plotny se inkubují přes noc při teplotě 37°C. Jeden z filtrů se uschová při teplotě 4°C jakožto zdroj živých buněk pro tvorbu kolonií, zatímco druhý filtr je denaturován a DNA z jednotlivých kolonií

-94··· fixována na nitrocelulózový filtr. Nitrocelulózový filtr se vyjme z agarové plotny a je postupně inkubován na filtračních papírech Whatman™ nasycených:

1.	10% SDS, 2	minuty
2 .	0, 5M	NaOH,	1,5M NaCl,	7 minut
3 .	0,5M	NaOH.	1,5M NaCl,	4 minuty
4.	0,5M	NaOH.	1,5M NaCl,	2 minuty
5.	0,5M	Tris	pH 7,4, 1,5M	NaCl, 2

minuty

6. 2xSSC, 2 minuty

Membrána se poté umístí na filtrační papír Whatman™ nasycený lOxSSC a denaturovaná DNA se kovalentně naváže na nitro-celulózu pomocí ultrafialového záření (pomocí přístroje Uv crosslinker XL-1500 Spectrolinker™) . Filtry se nechají vyschnout za pokojové teploty a poté se pre-hybridizují při teplotě 60°C po dobu jedné hodiny v roztoku 6xSSC za mírného míchání (například v hybridizéru Techne HB-1D). Pre-hybridizace na filtru zablokuje nespecifická vazebná místa pro DNA.

Kolonie obsahující požadovaný DNA inzert byly identifikovány pomocí hybridizace se sondou DNA značenou radionuklidem ³²P. Tato sonda byla připravena z PCR produktu genu HCPB z pankreatické cDNA knihovny (viz výše). Přibližně 50ng DNA bylo označeno 50jU.Ci ³²P-dCTP (~3000Ci/mmol) pomocí T7 DNA polymerázy v celkovém objemu 50 μΐ (souprava Pharmacia T7 Quickprime). Reakce probíhala 15 minut při teplotě 37°C. Značená sonda se poté zahřeje na teplotu 95°C na 2 minuty, čímž se denaturuje dvouvláknová DNA. Poté se okamžitě přidá k 10 ml 6xSSC o teplotě 60°C a tento roztok se zamění za pre-hybridizační roztok na membránách.

-95,»

··		«	•	·*		·* ····
♦	•	·«	• ·		*	• · »
•	*	•	• ·		•	♦ * ·
•	•	• ·	• ·		• ·	··· ·
•	«	•	• ·		•	* *
··		·»«	• · ·	··		*6 ·

Inkubace za stálého mírného míchání pokračuje přibližně další 3 hodiny při teplotě 60°C. Po skončení hybridizace se vylije hybridizační roztok a filtry se dvakrát promyjí v 6xSSC (pokaždé 15 minut). Filtry se poté osuší pomocí filtračního papíru a zabalí do potravinářské fólie (Saran™ wrap nebo podobné) . Hybridizace je vizualizována pomocí vhodného rentgenového filmu (na příklad Kodak Xomat™-AR5) . Film je exponován přes noc za pokojové teploty. Kolonie obsahující požadovaný inzert jsou ty, které dávají na filmu nej tmavější skvrny. V tomto případě přibližně 50 % kolonií vykazovalo pozitivní signál. Z nich bylo vybráno 12 kolonií pro další výběr. Tyto kolonie byly odebrány ze záložního filtru a vysety a udržovány na plotnách s L-agarem k obsahem 10 ^g/ml tetracyklinu. Pro další pokusy byly tyto kolonie pěstovány v L-vývaru k přídavkem tetracyklinu stejné koncentraci.

Vybrané izoláty byly pomocí PCR zkontrolovány, jestli obsahují inzert o správné velikosti. Při této kontrole byly použity primery FSPTS1 a 6HIS9E10R1BS1, (Sekvence id. č. 58 a 59), a rovněž interní primery BPB2 ' (Sekvence id. č. 51) a FSPT1. Primer BPB2 je navržen tak, aby hybridizoval v úseku zralého (mature) genu za vzniku přibližně 430 bp dlouhého fragmentu.

Vybrané kolonie se odeberou z kultivačních médií, suspendují v 200 μΐ destilované vody a vaří se 10 minut při teplotě 100°C v uzavřené mikrozkumavce (Eppendorf™) . Poté se suspenze centrifuguje 10 minut v mikrocentrifuze, čímž se odstraní zbytky buněk. 1 μΐ supernatantu se použije jako templát pro PCR skríning. V typickém provedení se 1 μΐ supernatantu smísí s 20 pmol oligonukleotidových primerů FSPT1 a 6HIS9E10R1BS1, nebo FSPT1 a BPB 2, směsí dNTP do celkové koncetrace 200 μΜ, reakčním pufrem pro Taq polymerázu a 0,5 U Taq polymerázy. Celkový objem reakční směsi je 20 μΐ. PCR byla provedena v 25 cyklech, z nichž

-96«· φ • φφφ φ ♦ φ • · · · φ φ φ ··· · φφφφ * ·*

Φφφφ · Φ >

ΦΦΦ Φ Φ Φ » Φ · Φ ΦΦΦ · ΦΦΦ Φ Φ • ΦΦ ΦΦ 'ΦΦ Φ každý zahrnoval 1,5 minutovou inkubaci při 94°C, 2 minutovou při 50°C a 2 minutovou při 72°C. Po těchto cyklech byla reakční směs ještě zahřáta na 72°C na 9,9 minuty.

Elektroforézou na agarózovém gelu byly v PCR produktech vyhledávány proužky DNA o správné velikosti (přibližně 1000 bp pro primery FSPT1 a 6HIS9E10R1BS1 a přibližně 430 bp pro primery FSPT1 a BPB 2, viz obrázek 18} . Všech dvanáct klonů poskytlo PCR produkty o správné velikosti. Šest z těchto klonů bylo vybráno pro produkci plazmidové DNA. Plazmidová DNA byla přečištěna pomocí soupravy Quiagen Maxi™ ze lOOml kultury, pěstované přes noc při teplotě 37°C v L-vývaru s přídavkem lO^g/ml tetracyklinu. Plazmidová DNA byla poté .sekvenována v oblasti PCR produktu pomocí sekvenační soupravy USB Sequenase™, která obsahuje DNA polymerázu bakteriofága T7. Alternativně byly fragmenty DNA sekvenovány pomocí automatického sekvenátoru pomocí vybaveni ABI. Každý z klonů byl sekvenován za pomoci několika různých primeru. Tři z těchto primerů (1504, 1590 a 1731} byly použity ke kontrole spojovacích oblastí mezi expresivním vektorem a. vloženým genem (Sekvence id. č. 60, 61 a 62). Tyto primery rovněž poskytly data o počátku a konci vloženého inzertu. Další primery (679, 677, 1802 a 1280, Sekvence id. č. 51, 52 a 53) byly použity pro potvtrzení zbytku sekvence vloženého genu. Tento plazmid obsahující modifikovaný gen pro aktivní (mature) HCBP byl označen jako pICI1712. Potvzená sekvence klonovaného genu s vyznačenou translací od počátku PelB až k značce (His)6-c-myc je znázorněna v Sekvence id. č. 64, přičemž číslování DNA začíná prvním kodónem PelB a číslování aminokyselin začíná první aminokyselinou aktivního HCBP.

Kontrolované exprese modifikovaného HCPB bylo dosaženo transformací kompetentích kmenů E.coli plazmidem

-97*

pICI1712 v přítomnosti chloridu vápenatého. Mezi těmito kmeny byly i takové, které nejsou schopny využívat jako jediný zdroj uhlíku arabinózu. Tyto kmeny mají chromozómovou deleci v místě operonu Ara.

Výhodným kmenem je kmen MSD213 (kmen MC 1000 podle

Casadabana a dalších, Journal Molecular Biology, vl38,179 až 208, 1980), který má genotyp F-Ara Δ(Ara-Leu)ŮLacX74

GalV GalK StrR. Jiný výhodný kmen MSDS2S (nebo kmen MC1061) má genotyp AraDl3 9 Á(Ara Leu)7697 Δ Lac74 GalU HsdR RpsL. Kmeny E.coli vhodné ' pro kontrolovanou expresi genů z promotoru AraB v plazmidu pICI266 s podobným genotypem mohou být získány z Genové banky E.coli, Biologické oddělení Yalesské univerzity, CT, USA. Selekce transformantů probíhala na L-agarovém živném médiu s obsahem 10 /xg/ml tetracyklinu při teplotě 37°C přes noc. Jednotlivé kolonií kolonie byly vypíchnuty z ploten a rozetřeny a udržovány na stejném médiu. Vlastní kultivace pak probíhala v živném vývaru s obsahem 10 /xg/ml tetracyklinu.

Všechny expresívní kmeny transformované plazmidem pICI1712 byly ostřovány stejným způsobem a testovány na expresi klonovaného genu pro HCPB.

1. Jednotlivé kolonie se použijí k inokulaci 10 ml živného ' vývaru (L-broth) s obsahem 10 /xg/ml tetracyklinu 25 ml kultivační nádobě Universal. Za stálého třepání se kultury inkubují přes noc při teplotě 37°C.

2. 75 ml živného vývaru s obsahem 10 /xg/ml tetracyklinu se předehřeje na 37°C v 250 ml kónické baňce a inokuluje se 0,75 ml (objemově 1%) přes noc pěstovanou kulturou. Inkubace pokračuje při teplotě 37°C za stálého třepání. Růst bakterií se sleduje pomocí absorbance při vlnové délce 540nm. Indukci ·· ····

-98·» · Β ·· ··«* ··*·»» · • · · Β « « » * «β*»·*·····*

Β · · «Β» »» • · ·· ··· Μ ♦ » · exprese klonovaného proteinu je třeba provést během exponenciálního růstu kultury, to znamená při hodnotách O.D. ₅₄₀ v rozmezí 0,4 a 0,6. Kultury dosáhnou těchto hodnot obecně pó 90 až 150 minutách po inokulaci.

3. Poté co buňky dosáhnou požadované hustoty, kultura se nechá ochladit na přibližně 30°C třicetiminutovým stáním za pokojové teploty. Poté se přidá arabinóza do konečné koncentrace 1 % (w/v) a pokračuje se v inkubaci při teplotě 30°C za stálého třepání po dobu 4 až 6 hodin.

4. Po této inkubaci se změří konečná optická hustota a buňky se zcentrifugují. Měření optické hustoty slouží pro výpočet objemu vzorkového pufru pro proteinovou elektroforézu na akrylamidovém gelu (Laemmli) nutného pro resuspendování buněčné pelety. Pro O.D. nižší než 1 se použije 10 pl pufru na každých 0,1 O.D., pro hustoty vyšší než 1 se použije objem 15 pl na každých 0,1 O.D. Vzorkový pufr podle Laemmliho obsahuje 0,125M Tris-HCI pH 6,8, 2% SDS, 2% β-merkaptoethanol, 10% glycerol a 0,1 % Bromfenolovou modř.

5. Vzorky se resuspendují a denaturují 10 minutovým povařením při 100°C apoté se zcentrífugujί, čímž se oddělí viskózní buněčné zbytky od supernatantu.

Vzorky obyčejně o objemu 20 pl supernatantu se nanesou na 17% SDS akrylamidové gely kde se electroťoreticky separují proteiny. Většinou se stejné vzorky nanášejí na dva gely, takže jeden lze použít k detekci všech proteinů barvením Coomassie modří nebo podobným barvivém a druhý se použije k detekci specifických produktů pomocí Western blotové analýzy.

Proteiny z elektroforetického gelu se pro provedení Western-blotu převedou na nylonovou membránu (Problot™'

99· t * · · · ···* •» · · · · « * · ♦ · · * · v ♦ β ··«« • · · a « • ··· *» 99 9 například od Applied Biosystems) pomocí polosuchého blotovacího zařízení (Bio-rad nebo podobného). Před a během provádění blotu se membrána stále udržuje vlhká. Po přenosu proteinů na membránu se tato blokuje 5% roztokem odtučněného mléka (Marvel™ nebo podobného) ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Blokování probíhá 5 hodin za pokojové teploty a za stálého jemného míchání. Membrána se poté 3 krát promyje za pokojové teploty za stálého jemného míchání. Každé promývání trvá 5 minut a používá se k němu PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20.

Promyté membrány se inkubují s roztokem primární myší monoklonální protilátky 9E 10 proti c-myc peptidu (viz výše) ve vhodném zředění (typicky 1:10.000 pro ascity nebo 1:40 pro supernatanty z hybridomů) v PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20 a 0,5 % nízkotučného mléka. Inkubace s protilátkou probíhá přes noc za pokojové teploty a za stálého jemného míchání. Poté se membrána za pokojové teploty a za stálého jemného míchání 3 krát 5 minut promyje v PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20. Promyté membrány se inkubují s roztokem sekundární anti-myší (obyčejně kozí) protilátky značené křenovou peroxidázou (například A4416, Sigma) ve vhodném zředění (typicky 1:10.000) v PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20 a 0,5 % nízkotučného mléka.

Inkubace s protilátkou probíhá alespoň 3 hodiny za pokojové teploty a za stálého jemného míchání. Poté se opět membrána za pokojové teploty a za stálého jemného míchání 3 krát alespoň 10 minut promyje v PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20. Po promytí se membrána dále zpracovává technikou Amersham ECL™ pro detekci Western blotů a výsledek je zobrazen pomocí filmu Amersham Hyperfilm™ ECL. První expozice je zpravidla 30 sekund a další se upraví tak, aby na výsledném obrázku byly jasně patrné proužky exprimovaných proteinů. Může být rovněž použit jiný podobný systém se srovnatelnou citlivostí pro detekci proteinů na membránách.

•t ··*»

-100-

· * · ♦ β » ♦ · · ··

Dobrá exprese klonovaného značeného HCPB v plazmidu pICI266 (pICI1712)byla prokázána v E.coli kmenů MSD213 a MSD525 barvením Coomassie modří. Tyto kmeny vykazovaly nový proteinový proužek o velikosti přibližně 35 kDa vzhledem ke kmeni se samotným vektorem (pICI266). Proužek o shodné velikosti dával rovněž silný signál ve Western blotu detekujícím peptidovou značku c-myc.

Referenční příklad 16:

Exprese aktivního HCPB v E. coli

Způsob klonování a exprese aktivního HCPB v E.coli je velmi podobný způsobu popsanému v referenčním příkladu 15. Opět se použije plazmid pICI266 jako klonovací vektor, nicméně, v tomto případě se jako výchozí materál pro PCR amplifikaci genu aktivního HCPB použije plazmid pICH712, obsahující značený gen v expresivním vektoru. Dva oligonukleotidy označené 2264 a 2265 (Sekvence id. č.: 65 a 66) se použijí v PCR reakci místo primerů FSPTS1 a 6HIS9E10R1BS1. Reakční podmínky jsou podobné jako v referenčním příkladu 15, pouze se použije DNA z plazmidu pICI1712 místo pICI1698.

První oligonukleotidový primer 2264 byl navržen tak,, že hybridizuje s plazmidem pICI1712 a zároveň do něj zavádí restrikční místo pro enzym Ncol ve vedoucí sekvenci PelB a dále pokračuje v počátku vloženého genu HCPB (DNA báze 3 6 až 66 včetně v Sekvenci id. č.: 64). Druhý primer, označený 2265 byl navržen tak, že hybridizuje s koncem genu pro aktivní HCPB před začátkem sekvence pro značku (His)_s-c-myc ( je komplementární k DNA bažím 965 až 987 včetně v Sekvenci id. č.: 64) a zároveň zavadí na konec genu kodóny pro terminaci translace (koplementární k TAA TAA) a restrikční místo pro enzym EcoRI (GAATTC). Tento oligonukleotid hybridizuje zpět do genu tak, aby PCR poskytovala sekvenci genu pro aktivní HCPB.

·« ΒΒΒ»

-101• · · • * · ·

ΒΒΒ Β Β Β Β • « « • Β ΒΒΒ

Β Β • ΒΒΒ

Β Β ΒΒΒ

Β Β Β ΒΒ Β Β Β Β · Β

Β ΒΒ ΒΒ Β

Alikvot PCR produktu byl testován na přítomnost DNA o správné velikosti size (přibližně 970 bp) elektroforézou na agarózovém gelu. Vzorek obsahoval převážně DNA o správné velikosti. Zbytek PCR produktu byl zbaven konaminantů z reakční směsi a přečištěn způsobem obdobným referenčnímu příkladu 15. Izolovaná DNA byla restrikčně štěpena enzymy Ncol a EcoRI. DNA o správné velikosti (přibližně 940 bp) byla purifikována podobným způsobem jako v referenčnímu příkladu 15.

Dvouvláknová DNA z plazmidu pICI266, připravená podobným způsobem jako referenčním příkladu 15, byla restrikčně štěpena enzymy Ncol a EcoRI a to velmi pečlivě, tak aby štěpení proběhlo úplně. DNA o správné velikosti (přibližně 5600 bp) byla purifikována podobným způsobem jako v referenčnímu příkladu 15.

Alikvoty obou štěpených a purifikovaných vzorků DNA byly pomocí elektroforézy na agarózovém gelu otestovány na svoji čistotu a byla odhadnuta jejich koncentrace porovnáním se známými standardy. Tento odhad byl použit při přípravě ligační směsi pro klonování genu HCPB do plazmidu pICI266 podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15.

Po ligační reakci byla směs DNA použita k transformaci E.coli kmene DH5ct. Jednotlivé kolonie byly vypíchnuty párátkem a otestovány hybridizací a podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15.

Šest z těchto klonů bylo vybráno pro přípravu plazmidové DNA. Tyto klony byly poté sekvenovány v oblasti PCR produktu způsobem podobným referenčnímu příkladu 15. Klony byly sekvenovány pomocí šesti různých oligonukleotidových primerů označených 1504, 1802, 679, 1280, 677 a 1731 (Sekvence id. č.: 60, 63, 51, 53, 52 a 62). Ze sekvenačních výsledků byl vybrán klon obsahující

4« 44 *444 * 4 * 4

4 4 4 4

4 4 4*4 4 • 4 4 4

44 4

-ιυζ*

4 ·

4 ·· 44

4 4 »

4 4 4 »

4 4 4

4· 444 444 plazmid s požadovaným genem pro aktivní HCPB. byl označen pICI1736.

Tento klon

Potvrzená sekvence klonovaného genu s vyznačenou sekvencí aminokyselin začínající sekvencí PelB až po sekvenci restrikčniho místa pro EcoRI je popsána v Sekvence id. č.: 67, přičemž číslování DNA začíná na prvním kodónem PelB a aminokyselinová sekvence je číslována od počátku aktivního HCPB.

' Kontrolované exprese aktivního HCPB bylo dosaženo transformací kompetentích kmenů E.coli plazmidem pICI1736 v přítomnosti chloridu vápenatého podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15. Všechny transformované expresivní kmeny obsahující pICI 1736 byly testovány způsobem podobným referenčnímu příkladu 15 na expresi klonovaného genu pro HCPB.

Nicméně v tomto případě nemohla být použita myší monoklonální protilátka se specifitou k c-myc, protože aktivní HCPB nemá na C-konci peptidovou značku. Proto byla jako primární protilátka použita králičí protilátka proti hovězí karboxypeptidáze A (Biogenesis), která reaguje s purifikovanou lidskou pankreatickou karboxypeptidázou B. Jako sekundární protilátka byla použita kozí-anti-králičí IgG značená křenovou peroxidázou (Sigma A9169 nebo podobná).

Exprese klonovaného aktivního HCPB v plazmidu pÍCI266 (pICI1736) byla demonstrována v E.coli kmenů MSD2 13 a MSDS2S v proteinových gelech barvených Coomassie modří. V těchto gelech byl patrný nový proteinový proužek o velikosti přibližně 34 kDa vzhledem ke klonům se samotným vektorem pICI266.

Proužek o shodné velikosti dával rovněž silný signál ve Western blotu detekujícím hovězí karboxypeptidázu A.

103- ·'

Exprese aktivního (maturovaného) | ··· * ..M

Referenční příklad 17: HCPB buňkami COŠ

Gen kódující preHCPB byl vytvořen pomocí PCR z plazmidu pICI1698 (viz referenční příklad 14) . Reakčni směs pro PCR obsahovala jako templát plazmid pICI1689 (10^g) a 100 pmol každého z primerů Sekvence id. č.: 34 a 35 ve 100 μΐ pufru obsahujícím lOmM Tris-HCI (pH 8,3), 50mM KC1, l,5mM MgCl₃, 0,125mM každého z nukleotidtrifosfátů a 2,5 U Taq DNA polymerázy (Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus). Reakčni směs byla převsrtvena minerálním olejem (100 μΐ) . Reakce probíhala za těchto teplot: 94°C na 1 minutu, 53°C na 1 minutu a 72°C na 2,5 minuty. Tyto teploty se opakovaly v celkem 25 cyklech. Na závěr byla celá reakčni směs ještě 10 minut inkubována při 72°C.

PCR produkt o velikosti 985bp byl izolován elektroforézou na l % agarózovém gelu (agaróza typu I. Sigma A-6013) , proužek vyříznut a DNA přečištěna pomocí soupravy Geneclean™ (Geneclean II kit, Stratech Scientific Ltd. nebo Bio 101 Inc.). Souprava Geneclean kit obsahuje 1) 6M iodid sodný, 2) koncentrovaný roztok chloridu sodného, Tris a EDTA pro přípravu promývacích roztoků chlorid sodný/ethanol/voda, 3) Glassmilk’“ - 1,5 ml lahvička obsahující 1,25 ml suspenze speciální silikátové matrice ve vodě. Tato technika purifikace DNA je založena na způsobu Vogelsteina a Gillespie, publikovaném v Proceedings National Academy Sciences USA (1979) Vol 76, 615. Popřípadě může být použit libovolný jiný způsob popsaný v Molecular Cloning - a laboratory manual, Sambrook, Fritsch a Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Stručný popis techniky Geneclean: K jednomu dílu agaru vyříznutému z gelu se přidají tři díly roztoku iodidu sodného ze soupravy. Agaróza se roztaví zahřátím směsi na 55°C (10 minut). Pak se přidá silikátová matrice Glassmilk™ (5-10μ1) . Směs se dobře promíchá a nechá se 10 minut stát za pokojové teploty. Matrice glassmilk se stočí a 3 krát *· * * φ

-104• φ >·« φ φ · φ· promyje 500 μΐ promývacího pufru NEW WASH ze soupravy. Promývací pufr se odtraní a matrice Glassmilk se nechá oschnout na vzduchu. DNA se uvolní inkubací vysušené matrice Glassmilk s 5 až 10 μΐ vody při teplotě 55°C po dobu 5 až 10 minut. Centrifugací se získá vodný supernatant s obsahem eluované DNA. Tento eluční krok se muže opakovat a supernatanty se mohou spojit.

Gen preHCPB se 1 hodinu štěpí restrikčními enzymy EcoRI a Hindlll při teplotě 37°C v 100μ reakční směsi, která obsahuje lOOmM Tris-HCI (pH 7,5), lOmM MgCl₂, 50mM NaCl, 0,025% Triton X-100 a 25U každého z enzymů Hindlll a EcoRI (New England Biolabs). Štěpený fragment se přečistí elektroforézou na agarózovém gelu a na matrici GeneClean tak, jak bylo popsáno výše pro neštěpený fragment apoté se klonuje do plazmidu pBluescript™ (Stratagene Cloning: Systems).

DNA z plazmidu pBluescript™ KS+ (5/xg) se úplně naštěpí restrikčními enzymy EcoRI a Hindlll (25 U každého) ve 100 μΐ reakční směsi tak, jak bylo popsáno výše. K.' naŠtěpenému plazmidu se přidá telecí střevní alkalická fosfatáza (1 μΐ, New England Biolabs, 10 U/μΙ) čímž se odstraní 5' fosfátové konce. Reakční směs se inkubuje při teplotě 37°C dalších 30 minut. Fosphatáza byla inaktivována 10 minutovým zahřátím na 70°C'. Plazmid naštěpený restrikčními enzymy EcoRI-HindlII se purifikuje z agarózového gel tak, jak bylo popsáno výše. 50 ng genu preHCPB naštěpeneho restrikčními enzymy EcoRI-HindlII se liguje s výše uvedeným plazmidem v 20 μΐ reakční směsi obsahující 30mM ,Tris-HCl (pH7,8), lOmM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 μ9/πι1 BSA a 400 U T4 DNA ligázy (New England Biolabs. Inc). Reakce probíhá 4 hodiny při teplotě 25°C. Vzorky reakční směsi o velikosti 1 μΐ se použijí k transformaci 20 μΐ kompetentních E. coli kmene DH5a (kompetentních buněk s maximální účinností transformace,

Life Technologies Ltd.) za použití protokolu dodaného výrobcem. Transformované buňky se vysejí na plotny s L-agarem obohaceným 100 Mg/ml ampicilinu.

Klony potencinálně produkující preHCPB se identifikují pomocí PCR. Každý z klonů je použit pro PCR tak, jak bylo popsáno výše pro přípravu genu preHCPB s výjimkou toho, že mix s buňkami se inkubuje 5 minut při teplotě 94°C {horký start) ještě před vlastními 25 cykly PCR a místo primerů Sekvence id. č.:34 a 35 se použijí primery podle Sekvence id. č.: 36 a 37. Z reakční směsi se odebere vzorek {10 μΐ) a analyzuje se elektroforézou na 1% agarózovém gelu. Klony obsahující gen preHCPB se snadno identifikují díky přítomnosti 1.2kb dlouhého PCR produktu. Klony dávající jasný 1.2 kb dlouhý signál se použijí pro přípravu plazmidové DNA ve velkém měřítku. Sekvence inzertu se ověří sekvenční analýzou. Výsledný plazmid obsahující' gen preHCPB v piazmidu pBluescript™ byl pojmenován pMF15.

GS-System™ (Celltech Biologics) byl použit pro přípravu vektorů schopných exprese genu pro HCPB v eukaryotických buňkách (viz WO 87/04462, WO 89/01036, WO· 86/05807 a WO 89/10404). Tato technika zahrnuje klonování' gen preHCPB do HindlII-EcoRÍ oblasti vektoru pEEl2. Tento vektor je podobný vektoru pSV2.GS popsanému Bebbingtonem a dalšími (1992), Bio/Technology 10, 169 až 175, přičemž u nej byly cílenou mutagenezí odstraněny některá cílová místa, přítomná v původním vektoru pSV2.GS. Tím bylo dosaženo toho, že místa v polylinkeru jsou unikátní,

Expresivní vektor byl zkostruován tak, že byly pla2midy pEE12 a pMFl5 štěpeny restrikčními enzymy EcoRI a HindlII tak, jak bylo popsáno výše. Příslušný vektor (z piazmidu pEEl2) respektive inzert (z piazmidu pMFl5) z každého štěpení se izoluje elektroforézou na 1% agarózovém gelu. Obě' DNA se spojí ligací a použijí se pro transformaci kompetentních buněk DH5a. Transformované buňky se přenesou

na plotny s L-agarem s přídavkem 100 Mg/ml ampicillinu. Pomocí PCR se kolonie otestují tak, ják bylo popsáno výše. Jako primerů se použije Sekvence id. č. : 38 , která hybridizuje s oblastí v CMV promotoru a Sekvence id. č: 39, která hybridizuje s oblastí v genu HCPB. Klony produkující l,365kb dlouhý PCR produkt se použijí pro přípravu plazmidové DNA ve velkém měřítku. Sekvence inzertu byla potvrzena sekvenováním. Plazmid obsahující sekvenci preHCPB v původním plazmidu pEE!2 byl pojmenován pMF48.

Jiný eukaryotický expresivní plazmid pEEl2 obsahující prepro sekvence genu preproHCPB byl připraven výše popsaným způsobem. V počáteční PCR byly použity primery podle Sekvence id. č.: 40 a 41. Tato reakce slouží k izolaci sekvence prepro z plazmidu pMFl8 (viz referenční příklad 19). V tomto případě byla PCR zahájena horkým startem, t.j„ inkubací směsi bez Tag DNA polymerázy po dobu 3 minut při teplotě 94°C. Poté byly přidány 2,5 U Taq DNA polymerázy a PCR pokračovala dalšími 25 cykly tak, jak bylo popsáno výše. 360 bp dlouhý fragment byl nakloňován do plazmidu pBluescript za vzniku plazmidu pMF66 a následně do plazmidu. pEEl2 (testováno pomocí PCR s primery podle Sekvencí id. č. 40 a 41) za vzniku plazmidu pMF'67.

Pro expresi preHCPB a preproHCPB v eukaryotických buňkách byly vektory obsahující tyto geny transfikovány do COS-7 buněk. COS buňky jsou buňky' z buněčných linií z ledvin kočkodana zeleného (Afričan green monkey) CV-1, transformované d virem SV4O s defektním pořátkem replikace. Tyto buňky jsou v hojné míře využívány pro krátkodobou přechodnou expresi různých proteinů pro svoji schopnost replikovat cirkulární plazmid obsahující počátek replikace víru S.V40 a dosáhnout přitom vysokého počtu kopií plazmidu. Existují dvě hlavní dostupné linie: COS-1 a COS-7. Zaklady transfekce buněk COS jsou popsány v práci Bebbinoton v Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1991) 2, • ·

-1U7strana 141. Pro expresi genů HCPB byly plazmidové vektory pMF48 a pMF67 (4 ug každého) použity k transfekci COS-7 buněk (2xl0⁵) na šesti jamkové kultivační plotně v 2 ml média DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) s přídavkem 10% tepelně inaktivovaného fetálního telecího séra (FCS) způsobem známým jako lipofekce - transport polynukleotidů zprostředkovaný kationickými lipidy - [viz Felgner a další, Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1993) 5, strana 67 až 73) . Buňky byly 20 hodin inkubovány při teplotě 37⁰C v inkubátoru v atmosféře C0₂. Směs plazmidové DNA v 200 μΐ bez-sérového media OPTI-MEM (Reduced Sérum Medium: GibcoBRL kat. č. 31985) se opatrně smíchala s 12 μΐ činidla LIPOFECTIN (GibcoBRL kat. č.13292-011). Poté následovala 15 minutová inkubace za pokojové teploty. Pak byly buňky promyty 2 ml bez-sérového média OPTI-MEM. Nakonec se ke směsi DNA/LIPOFECTIN přidá bez-sérové medium (600μ1, OPTI-MEM) a výsledná směs se navrství na buňky, které se 6 hodin inkubují při teplotě 37°C v inkubátoru v atmosféře CO₂ Médium obsahující DNA se nahradí normálním médiem DMEM obsahujícím 10% FCS a buňky se inkubují tak, jak bylo popsáno výše po dobu 72 hodin. 250 μΐ supernatantů z buněčných kultur se testuje na HCPB aktivitu proti proti Hipp-Arg (5 hodinový test) tak, jak bylo popsáno v referenčním příkladu 11. Supernatanty buněk COS, které byly transformovány pouze činidlem LIPOFECTIN bez plazmidové DNA hydrolyzovaly 1.2 % substrátu, zatímco supernatanty buněk COS, které byly transformovány směsí plazmidů exprimujících preHCPB a preproHCPB hydrolyzovaly 61 % substrátu Hipp-Arg. COS buňky, transfikované pouze plazmidem obsahujícím preHCPB hydrolyzovaly Hipp-Arg stejnou měrou jako COS buňky ošetřené pouze činidlem LIPOFECTIN.

Činidlo LIPOFECTIN je 1:1 (w/w) lipozómový přípravek obsahující kationický lipid N-[1-(2, 3dioleyloxy)-propyl]-η.n.n-trimethylamonium chlorid (DOTMA) a dioleoyl fosfatidylethanolamin (DOPE) v membránově > 4 k · ···

-108* *♦ filtrované vodě. Tento přípravek spontánně váže DNA za vzniku komplexu lipid-DNA, viz Felgner a další v Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1987), 84, 7431.

Peferenční příklad 18: Exprese proteinu proHCPB v E. coli

Způsob klonování a exprese pro-HCPB v E.coli je velmi podbný způsobu popsanému v referenčním příkladu 13. Opět byl použit plazmid pICI266 jakožto klonovací vektor, jako výchozí materiál pro PCR amplifikaci genu pro-HCPB byl použit plazmid pICIl698 (tak, jak bylo popsáno v referenčním příkladu 14). Místo primerů FSPTS1 a 6HIS9E1OR1BS1 byly použity primery označené jako 2310 a 2265 (Sekvence id. č.: 68 a 66) . PCR reakce probíhala za podobných podmínek jako v referenčním příkladu 15.

Primer 2310 byl navržen tak, aby hybridizoval s plazmidem pICIl698, a aby zároveň zavedl do PCR produktu restrikční místo pro restrikční enzym Ncol. Primer hybridizuje od počátku vedoucí sekvence PelB (DNA báze 51 až 66 včetně v Sekvenci id. č.: 64) po začátek vloženého genu pro-HCPB (DNA báze 40 až 57 včetně v Sekvenci id. č. : 56) .

Druhý primer 2265' byl navržen tak, aby hybridizoval s koncem genu pro maturovaný HCPB před počátkem sekvence peptidové značky (His)6-c-myc tag (je komplementární s bázemi DNA 965 aš 987 včetně v Sekvenci id. č.: 64). Tento primer zároveň zavedl do PCR produktu' kodón komplementární ke kodónu pro terminaci translace (komplementární k TAA TAA) na konec kenu. Za tento kodón je vloženo restrikční místo pro enzym EcoRI (GAATTC) a báze pro vyplnění.

Tento oligonukleotid slouží jako primer směrem zpátky směrem do genu tak aby produktem PCR byla sekvence pro-HCPB.

Elektroforézou na agarózovém gelu byl analyzován alikvot PCR produktu, přičemž byla zjišťována správná

-iuívelikost DNA (1240 bp). Výsledný produkt obsahoval převážně DNA o správné velikosti. Zbylý produkt reakce byl přečištěn a zbaven přebytečných reagencií podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15. Izolovaná DNA byla štěpena restikčními enzymyNeol a EcoRI. DNA o správné velikosti (přibližně 1210 bp) byla poté purifikována podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15.

Dvouvláknová DNA plazmidu pICI266 byla připravena způsobem podobným jako v referenčním příkladu 15. Poté byla restrikčně štěpena enzymy Ncol a EcoRI, přičemž byl kladen důraz na úplné dokončení reakce. DNA o správné velikosti (přibližně 5600 bp) byla purifikována podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15.

Pomocí elektroforézy na agarovém gelu byla zkontrolována čistota a odhadnuta koncetrace DNA v alikvotech purifikované a restrikčně štěpené DNA porovnáním se známými standardy. Tyto odhady byly použity při přípravě ligační směsi pro klonování genu pro-HCPB do vektoru pICI26 podobným způsobem jako v referenčním příkladu příkladu 15.

Po této ligační reakci se směs DNA použije k transformaci E.coii kmene DH5a. Kolonie obsahující., plazmidy s požadovaným inzertem se identifikují hybridizaci odobným způsobem jako v referenčním příkladu 15.

Čtyři pozitivně hybrídizující izoláty byly podrobeny PCR detekci inzertu o správné velikosti. Při této detekci byly použity primery 2310 a 2265, (Sekvence id. č. : 68 a 66), a rovněž pár interních primerů 1279 (Sekvence id. č.: 54) a 679 (Sekvence id. č. : 51) podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15. Pomocí elektroforézy na na agarózovém gelu byly v PCR produktech vyhledána o DNA správné velikosti (přibližně 1200 baží pro primery 2310 a 2265, a přibližně 580 bp pro primery 1279 a 679} . Všechny testované klony obsahovaly DNA o správné velikosti.

-110···

PLazmidová DNA byla poté připravena ze všech čtyř klonů. Tato DNA byla poté sekvenována ’v oblasti PCR produktu a podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15. KLony byly sekvenovány pomocí šesti různých oligonukleotidových primerů označených 1504, 1802, 679, 1281, 1590 a 1592 (Sekvence id. č.: 60, 63, 51, 55, 69 a 70) . Na základě výsledků sekvenace byl vybrán plazmid obsahující požadovanou sekvenci genu pro-HCPB was selecteď. Tento plazmid byl označen pICI1738.

Sekvence id. č.: 71 znázorňuje potvrzenou sekvenci klonovaného genu pro-HCPB v plazmidu pICI1738, s vyznačenou amino kyselinovou sekvencí od počátku sekvence PelB až po restrikční místo EcoRI. Číslování DNA začíná prvním kodónem peptidu PelB. číslování a peptidu začíná od maturovaného HCPB.

Po transformaci kompetitivních buněk E.coli za přítomnosti chloridu vápenatého plazmidem pICIl738 bylo dosaženo kontrolované exprese proteinu pro-HCPB, viz referenční příklad 15. Všechny klony transformované plazmidem pICI1738 byly ošetřovány a restovány na expresi, klonovaného genu HCPB podobným způsobem jako v referenčním’ příkladu 15. Nicméně v tomto případě nebylo ve Western blotu možno použít monoklonální protilátku 9E10 specifickou proti peptidu c-myc vzhledem k tomu, že protein pro-HCPB nemá C-koncovou značku. Proto byla jako primární protilátka použita králičí protilátka proti hovězí karboxypeptidáze A (Biogenesis), která reaguje s purifikovanou lidskou pankreatickou karboxypeptidázou B. Jako sekundární protilátka byla použita kozí-anti-králičí IgG značená křenovou peroxidázou (Sigma A9169 nebo podobná).

Exprese klonovaného proteinu pro-HCPB v plazmidu pICI266 (pICI1738) byla demonstrována v E.coli kmenů MSD2 13 a MSDS2S v proteinových gelech barvených Coomassie modří. V těchto gelech byl patrný nový proteinový proužek o

-111• · velikosti přibližně 40 kDa vzhledem ke klonům se samotným vektorem' pICI266 a vzhledem ke klonům s produkujícím značený HCPB (viz referenční příklad 15). Proužek o shodné velikosti dával rovněž silný signál ve Western blotu detekujícím hovězí karboxypeptidázu A.

Referenční příklad 19: Exprese proHCPB buňkami COS

Gen kódující preproHCPB byl vytvořen pomocí PCR tak, jak bylo popsáno v referenčním příkladu 17, přičemž jako templát byl použit plazmid pICI1689 a jako primery oligonukleotidy podle Sekvence id. č. 34 a 40. Vzniklý produkt měl velikost 1270 bp.

Gen byl poté štěpen restrikčními enzymy EcoRI a Hindlll a klonován nejprve do plazmidu pBluescript KS+ (za vzniku plazmidu pMFl8) a apk do' plazmidu pEE12 v buňkách DH5a (za vzniku plazmidu pMF49) tak, jak bylo popsáno v referenčním příkladu 17.

Plazmidem pEEl2d- byly poté. transfikovány buňky COS-7 pomocí činidla LIPOFECTIN tak, jak bylo popsáno vreferenčním příkladu .17. 250 μΐ buněčného supernatantu. bylo poté 5 hodin testováno na aktivita enzymu HCPB přižemř jako substrát byl použit Hipp-Arg tak, jak bylo popsáno v referenčním příkladu 11. Poté následovala l hodinová aktivace trypsinem (700 ^g/ml) v 30mM Tris-HCl (pH7,6), 150 mM NaCI při teplotě 4°C. Za těchto podmínek došlo k úplné hydrolýze substrátu Hipp-Arg .zatímco supernatant buněk COS ošetřených pouze činidlem LIPOFECTIN bez plazmidové DNA po aktivaci trypsinem dokázal hydrolyzovat pouze 30 % substrátu Hipp-Arg.

-112ί’

Referenční příklad 20:

Purifikace nativního HCPB

Pro počáteční purifikaci nativního a různých mutantních enzymů byly navrženy dva způsoby. Nejdříve bude popsán výhodnější z nich.

Suspenze rekombinantních buněk E.coli obsahujících rekombinantní enzym byly vyjmuty z mrazáku -70°C a nachaly se roztát. Buňky byly zváženy a resuspendovány v přídavku pufru A (200mM Tris (hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid (TRIS-HCl) , 20% sacharóza (C^H^O^), pH 8,0) do objemu rovného původní hmotnosti buněk.

Buněčná suspenze byla poté 20 minut inkubována za pokojové teploty za občasného jemného míchání. Poté byl přidán stejný objem destilované vody a suspenze byla důkladně promíchána. Pak se suspenze opět 20 minut inkubuje za pokojové teploty a za občasného jemného míchání. Výsledný buněčný lyzát způsobený osmotickým šokem se zbaví nerozpustných částic 90 minutovou centrifugací při 98000 x g a při teplotě 4°C. Poté se dekantuje supernatant a přidá, se k němu deoxyribonukleáza 1 do výsledné koncentrace 0,1 mg/ml a reakčni směs se inkubuje za pokojové teploty za stálého třepání dokud viskozita směsi nepoklesne natolik, že může být nanesena na sepharózóvou afinitní kolonu s inihibitorem karboxypeptidázy (CNBr aktivovaná sepharcza). Kolona se připraví podle instrukcí dodaných s CNBr aktivovanou Sepharózou 4B od firmy Pharmacia a s inhibitorem karboxypeptidázy z bramborových hlíz (c-0279,Sigma). pH supernatantu bylo upraveno na pH8', 0 a poté byl ihned nanesen na kolonu předvrstvenou lOmM TRIS-HC1, 500mM chloridem sodným, pH 8,0. Pak byla kolona promývána elučním pufrem (lOOmM uhličitan sodný, 500mM chlorid sodný, pH 11,4) dokud absorbance průchozího pufru. nepoklesla zpět na hodnotu před nenesením vzorku. Eluované frakce byly zmraženy na -20°C a mezitím byly pomocí Western blotu s myší monoklonální protilátkou 9E10 proti c-myc identifikovány ty, které obsahují rekombinantní karboxypeptidázu. Jako konjugátu bylo použito koňské-anti.-myší protilátky s křenovou peroxidázou (a-9044, Sigma), který poskytuje barevnou reakci po přídavku 4-chloro-naftolu a peroxidu vodíku.

Frakce obsahující rekombinantní karboxypeptidázu B byly spojeny, zakoncentrovány a jejich pH nastaveno na 7,5. Poté byly rychle zamraženy na -20 °C a za této teploty skladovány. Je-li potřeba lze ještě provést další purifikaci za použití známých metod jako jsou například chromatografie na iontoměniči a gelová permeační chromatografie.

Druhým možným postupem je celková lýza buňky E.coli. jako protiklad k osmotickému Šoku použitému ve výhodném způsobu.

Rekombinantní buňky E.coli obsahující rekombinantní enzym byly resuspenovány v lyzogenním pufru (50mM TRIS-HC1, 15% sacharóza, pH 8,0). K lytické směsi se přidá lysozyme do koncentrace 1 mg/ml zároveň s 80 μΐ 25% roztoku lithium dodecylsulfátu (LDS) na 25 ml suspenze. Pak se suspenze inkubuje 3 0 minut na ledu za občasného třepání. Pak se přidá deoxyribonukleáza 1 až do koncentrace 1 mg/ml a suspenze se opět inkubuje na ledu po dobu 30 minut za občasného zatřepání.

Poté se suspenzerozdělí do 200 ml množství a sonikuje se do úplného rozbití buněk deseti 30 sekundovými dávkami s 30 sekundovými intervaly mezi těmito dávkami. Sonikované suspenze se 90 minut centrifugují při 98,000 x g při teplotě 4°C a poté se supernatant dekantuje a jeho pH nastaví na 8,0. Takto upravený supernatant se nanese na

-114• · · afinitní kolonu. předvrstvenou 10 mM TRIS-HC1, 500mM chloridem sodným, pH 8,0.

Pak se kolona promývá elučním pufrem (lOOmM uhličitan sodný, 500mM chlorid sodný, pH 11,4) dokud absorbance průchozího pufru nepoklesne zpět na hodnotu před nenesením vzorku. Eluované frakce se zmrazí na -20°C a mezitím se pomocí Western blotu s myší monoklonální protilátkou 9E10 proti c-myc identifikují ty, které obsahují rekombinantní karboxypeptidázu. Jako konjugátu se použije koňské-anti-myší protilátky s křenovou peroxidázou (a-9044, Sigma), který poskytuje barevnou reakci po přídavku 4-chloro-naftolu a peroxidu vodíku.

Frakce obsahující rekombinantní karboxypeptidázu B se spojí, zakoncentují a jejich pH nastaví na 7,5. Poté se rychle zamrazí na -20°C a za této teploty se skladují. Je-li potřeba lze ještě provést další purifikaci za použití známých metod jako jsou například chromatografie na iontoměniči a gelová permeační chromatografie.

Vzorky spojeného materiálu získaného oběma způsoby purifikace byly analyzovány SDS-PAGE a přonosem na nitrocelulózovou membránu barvenou Coomassie modří. V obou vzorcích byly nalezeny proužky s molekulovou velikostí odpovídající rekombinantní karboxypeptidáze B. Tyto proužky byly sekvenovány automatickým proteinovým sekvenátorem za použití Edmanovy degradační techniky a poskytly positivní výsledky pro konkrétní purifikované rekombinantní karboxypeptidázy B.

Referenční příklad 21:

Exprese fúzního proteinu myší A5B7 F(ab’)₂-HCPB buňkami COS

Tento příklad popisuje přípravu cDNA z hybridoma ASB7, izolaci specifických Fd a fragmentů lehkých řetězců pomocí PCR, určení úplné DNA sekvence těchto fragmentů a následnou

-115-

«· ·44·

přípravu fúzního genu Fd-HCPB fúzní a ko-expresivního vektoru schopného produkovat jak lehký řetězec tak protein Fd-HCPB v eukaryotíckých buňkách, expresi fúzního proteinu F(ab')₂-HCPB buňkami COS po ko-transfekci s preprosekvencí HCPB.

Opakuje se postup z referenčního příkladu 5 až do kroku (e) .

f) Příprava DNA sekvence pro fúzní Fd-HCPB

Gen kódující C-koncovou oblast sekvence Fd od místa Ncol v Sekvenci id. č.: 25 (od pozice 497} byl pomocí PCR spojen se sekvencí pro HCPB. V průběhu této PCR byla do genu vložena DNA pro oktapeptidový linker se sekvencí VPEVSSVF. Templátem pro PCR s horkým startem (viz referenční příklad 17) byl plazmid pAFl (popsaný v referenčním příkladu 5) , Jako primery byly použity Oligonukleotidy podle Sekvencí, id. č.: 42 a 43. Výsledný produkt má délku 338 bp. Podobně i plazmid pICI1698 sloužil jako templát pro PCR s oligonukleotidy podle Sekvencí id. č.: 44 a 34 za vzniku a 998 bp dlouhého produktu. Oba produkty byly izolovány elektroforézou na agarózovém gelu a systémem Geneclean™ tak, jak bylo popsáno v refernčním příkladu 17 a poté byly použity (0,2ng každého v 50 μΐ celkového objemu) jako templáty pro další PCR reakci s horkým stratem s 10 cykly po 1 minutové inkubaci při teplotě 94°C, 4 minutové při 63°C a 2 minutové při 94°C. Poté bylo přidáno 100 pM hraničních oligonukleotidů podle Sekvencí id. č. : 42 a 34 do 50 μΐ pufru s 2,5 U enzymu Amplitaq. Po tříminutové inkubaci při 94°C byla směs podrobena reakci s 25 cykly:

1,5 minuty při 94°C, 2 minuty při 55°C a 2 minuty při 72°C. Posledním krokem reakce byla 10 minutová inkubace při 72 °C. Produktem reakce byla DNA ve formě proužku o velikosti 1336 bp, který byl izolován tak, jak bylo již výše popsáno. Poté byla DNA rozštěpena pomocí enzymů EcoRI a Hindlll a klonována do plazmidu pBluescript™ v buňkách DH5a za

-116• · *9 ···· ··· 9 Λ · 9 9 9 « «9

999 999 9« ·· 9 vzniku plazmidu pMF35. Jednotlivé klony byly testovány pomocí PCR s oligonukleotidy podle Sekvencí id. č.: 36 a 37. Pro přípravu úplné sekvence fžního proteinu Fd-HCPB bylo naštěpeno 10 μς plazmidu pAFl a pMF35 restrikčními enzymy Ncol a EcoRI. Štepení probíhalo 2 hodiny ve 100 μΐ pufru obsahujícího 50mM octan draselný, 20mM octan-TRIS (pH 7,9), lOmM MgCl₂, lmM DTT, 40 U EcoRI a 20 U Ncol. Vektorový fragment z plazmidu pAFl (3,4 kb) byl izolován a defosforylován pomocí střevní alkalické fosfatázy, viz referenční příklad 17 a poté byl. naligován do přečištěného

1,2 kb dlouhého fragmentu pMF35. Výsledný vektor byl nakloňován do buněk DH5a za vzniku klonu pMF39. Transformované buňky byly prohledány pomocí PCR s primery podle Sekvencí id.č.: 36 a 37 a byl nalezen 1,922 dlouhý inzert. Fragment EcoRi-HindlII z plazmidu pMF3 9 byl nakloňován do pEE6 (derivát plazmidu pEE6.hCMV, viz Stephens a Cockett, (1989). Nucl. Acid Res. 17, strana 7110, ve kterém bylo místo pro HindlII proti směru transkripce od promotoru hCMV převedeno na místo BglII) do buněk DH5a. Transformované buňky byly prohledány pomocí PCR s primery podle Sekvencí id.č.: 38 a 39 a byl nalezen přibližně 2.200 dlouhý inzert. Vzniklý plazmid byl pojmenován pMF43.

Ko-expresivní vektor byl připraven naštěpením 10 μμ plazmidu pMF43 restrikčním enzymem BglII (20 U) a Sáli (40 U) ve 100 μΐ pufru obsahujícího lOmM TRIS-HCI (pH 7,9), 150mM NaCl, lOmM MgCl₂, lmM DTT a 100 μ9/Γπ1 BSA. 4348 bp dlouhý fragment byl izolován pomocí elektroforézy na agarozovém gelu a přečištěn pomocí systému Geneclean™, viz výše. Podobně plazmid pAF6 (viz e) v referenčním příkladu 5) byl naštěpen restrikčním enzymem BamHI (40 U) a Sáli (40 U). 7,8 kb dlouhý fragment vektoru byl poté izolován a ligován s BglII-SalI fragmentem z plazmidu pMF43 a nakloňován do buněk DH5ct. Vzniklé kolonie byly testovány pomocí PCR s dvěma sadami primerů (viz Sekvence id.č.: 18 a

TF-1174 4 · «····· * 4 4 4 4 « 4 · 444·

4 4 4 4 · ·

4 4 « · ♦·· ·4 ·4 4 a Sekvence id.č.: 17 a 39) . Sekvenovány byly klony vykazující PCR produkty o 360 bp respektive 1,3 kb. Klon se správnou sekvencí byl nazván pMF35- lehký řetězec/Fd-HCPB ko-expresivní vektor v buňkách DH5a.

g) Exprese A5B7 F(ab')₂-HCPB v COS buňkách

Byl zopakován postup popsaný v Referenčním příkladu 17 použitý ke kotransfekci buněk COS-7 plazmidem kódujícím prepro sekvenci (pMF67), avšak místo plazmidu pMF48 byl použit plazmid pMF53. V supernatantu buněk COS byla stanovována aktivita HCPB postupem popsaným v Referenčních příkladech ll a 17. V supernatantu COS buněk vystavených působení reakčního činidla LIPOFECTIN (ovšem bez plazmidové DNA) bylo hydrolyzováno 1,2% substrátu, kdežto v supernatantu COS buněk transfekovaných směsí plazmidů exprimujících lehký řetězec/Fd-HCPB a prepro sekvenci bylo hydrolyzováno 34% substrátu Hipp-Arg. COS buňky transfekované pouze plazmidem pMF53 hydrolyzovaly Hipp-Arg v množstvích pozorovaných u COS buněk vystavených působení samotného reakčního činidla LIPOFECTIN. Po analýze metodou Western blot (viz. bod h) byly na blotovací membráně, viditelné pásy o velikosti přibližně 80 kDa a 160 kDa,. které odpovídají Fab'-HCPB a F (ab'') ₂- (HCPB) ₂. Buněčné supernatanty (viz. výše) byly při stanoveních CEA ELISA (viz. body i a j níže) použity k detekci přítomnosti materiálu schopného specificky vázat CEA. Tato detekce byla prováděna podle protokolu popsaného v bodě j.

h) Analýza metodou Western blot

Analýza metodou Western blot byla provedena způsobem popsaným níže.

Alikvoty (20 μΐ) z každého vzorku supernatantu byly smíchány se stejným množstvím vzorkového pufru (62,5 mM Tris, pH 6,8, 1% SDS, 10% sacharóza a 0,05% bromfenolová

-ixomodř) s nebo bez redukčního činidla (50 mM DTT) . Před v-lastní elektroforézou na gradientu akryamidového gelu s gradientem 8 až 18% (gel Excel™ pro Pharmacia Biotechnology Products) prováděnou podle návodu poskytovaného výrobcem na přístroji Multiphor™ II (LKB Produkter AB) byly vzorky inkubovány po dobu 10 minut při 65°C. Po elektroforéze byly za použití přístroje Novablot™ (Produkter AB) postupem popsaným výrobcem přeneseny separované proteiny na membránu Hybond C-Super™ (Amersham International) ·. Po přeblotování byla membrána vysušena na vzduchu.

Přítomnost fragmentů protilátky byla detekována pomocí protilátky konjugované s peroxidázou namířené proti myšímu F(ab)₂ (ICN Biomedicals, produkt číslo 67-430-1). Přítomnost fragmentů myší protilátky A5B7 byla vizualizována pomocí detekčního systému ECL™ (Amersham International) postupem podle výrobce.

i) Analýza metodou ELISA

Standardní postupy pro ELISA stanovení jsou popsány v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology eds. Burdon, R.H. a van Kippenberg, P.H., svazek 15, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Tijssen,

P., 1985, Elsevier Science Publishers B.V.. Jiným zdrojem informací je Antibodies - A Laboratory Manual Harlow, E. a Lané, D.P., 1988, publikované v Cold Spring Harbor

Laboratory.

j) stanovení anti-CEA protilátek metodou ELISA

1. Připravte potahovací pufr (l kapsle pufru uhličitah-hydrogenuhličitan - Sigma C-3041 - ve 100 ml redestilované vody).

-1192. Na každou použitou 96-ti jamkovou destičku přidejte k 10 ml potahovacího pufru 5 μΐ zásobního roztoku CEA (1 mg/ml, Dako}.

3. Do každé jamky na mikrotitrační destičce Nunc Maxisorp™ napipetujte 100 μΐ zředěného CEA 50 ng/jamka/100 μΐ.

4. Destičky inkubujte při 4°C přes noc (nebo 2 hodiny při pokojové teplotě).

5. Destičky promývejte celkem čtyřikrát po dobu 5 minut roztokem PBS + 0,01%· azidem sodným (PBSA).

6. Destičky blokujte (po vyklepání promývacího roztoku) pomocí 200 μΐ 1% BSA (Sigma A-7838) v PBSA obsahujícímO,05% Tween 20 na jednu jamku. Inkubujte dvě hodiny při pokojové teplotě.

7. Destičky promývejte celkem čtyřikrát po dobu 5 minut roztokem PBSA obsahujícím 0,05% Tween 20.

8. Naneste vzorky (supenatanty z buněčné kultury) a vhodné standardy (proteolztickým štěpením připravené F(ab')₃ ve dvojnásobných ředěních). Vzorky zřeďte růstovým médiem (nebo PBS) . Jako prázdné vzorky použijte PBSA. + 1% BSA a rozpouštědlo.

9. Inkubujte 3 hodiny při pokojové teplotě.

10. Destičky promývejte celkem šestkrát po dobu 5 minut roztokem PBSA + 0,5% Tween 20.

11. Připravte roztok sekundární protilátky (namířená proti myším IgG F(ab')₂, kozí protilátka konjugovaná s peroxidázou - ICN 67-430-1 - o objemu 20 μΐ ve- 40 ml PBSA + 1% BSA + 0,5% Tween 20) a do každé jamky přidejte. 10.0 μΐ.

12. Inkubujte 1 hodinu při pokojové teplotě.

-120-

13. Destičky promývejte celkem šestkrát po dobu 5 minut roztokem PBSA + 0,5% Tween 20.

14. Připravte vyvíjecí roztok rozpuštěním jedné kasie pufru Fosforečnan-Citrát-Peroxoboritan (Sigma P-4922) ve 100 ml redestilované vody. Do 100 ml pufru přidejte 30 mg o-fehyldiamin dihydrochloridu (OPD, SigmaP-8287). Do každé jamky naneste 150 μΐ.

15. Inkubujte 15 minut při pokojové teplotě ve tmě.

16. Reakci zastavte přídavkem 50 μΐ 2 M kyseliny sírové do každé jamky.

17. Na čtečce destiček odečítejte OD při 490 nm.

Příklad 1: Příprava bovinní pankreatické ribonukleázy

Lys66Glu (a) Vytvoření genové sekvence Rnázy obsahující substituci v kodónu 66 (Lys -> Glu) pomocí rekombinantní kruhové polymerázové řetězové reakce (RCPCR).

Plamid obsahující presekvenci kódující bovinní pankreatickou Rnázu (pQR 162: NCIMB číslo 40678 a popsanou, v Tarragona-Fiol a další, Gene 118, 239 až 245, 1992) byl použit jako templát při PCR reakci. Primery pro PCR reakci byly syntetizovány v DNA syntetizéru Cyclone™ (Milligen/millipore) metodou využívající fosfotriesterů za použití kyanoethyl fosforamiditů. Primery byly navrženy takovým způsobem, aby, jsou-li použity při PCR reakci, s jejich, pomocí vytvořeným produktem byly dvojvláknové lineární molekuly DNA, které po smíchání, denaturaci a následné renaturaci vytvoří molekuly dvojvláknové DNA s nespojitými kohézivními konci tvořenými jednovláknovou DNA (spolu s orignálními molekulami zakončenými, tupými konci). Tyto kohézivní konce budou spojeny a tímto budou vytvořeny rekombinantní kruhové molekuly DNA. Tyto molekuly jsou

-121ihned použitelné k transformaci kompetentních buněk E. coli.

Dvě PCR reakce byly provedeny v cyklovači Techne PHC-1 při 25 až 30 cyklech sestávajících z 1,5 minuty při 92°C, 1,5 minuty při 55°C a 6 minut při 75°C a nakonec 10 minut při 75°C, jedna za použití oligonukleotidu SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2 (viz. primery A St B na Obrázku 8) a druhá za použití oligonukleotidu SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4 (viz. primery C & D na Obrázku 8) . Reakčni směs obsahovala pQR162 (10 ng) jako templát, 50 pmol/primer, 5 μΐ lOx pufru 1 (200 mM Tris-HCI, pH 8,5, 100 mM KC1, 60 mM (NH4)₂SO₄, 20 mM MgCl₂, 1% Triton X-100 a 100 /xg/ml BSA bez přítomnosti nukleázy) a 2,5 jednotek polymerázy pfu (termostabilní polymeráza izolovaná z Pyrococcus furiosus, Stratagene) v celkovém objemu 50 μΐ a tato reakčni směs byla převrstvena, stejným objemem parafínového oleje kvůli zamezení vypařování.

Produkty PCR reakce byly analyzovány na 1% agarózovém gelu. Fragmenty DNA vytvořené jednotlivými PCR reakcemi (přibližně 3,1 kbp) byly z gelu vyříznuty a DNA byla od agarózy oddělena centrifugací (Spin-X™, Costar). Dva extrahované fragmenty DNA byly precipitovány ethanolem a rozsuspendovány v 20 μΐ vody. Alikvoty z každého vzorku (10 μΐ) byly smíchány a doplněny na celkový objem 50 μΐ. Výsledné složení pufru bylo 10 mM Tris-HCI, pH 8,8, 10 mM NaCl a 1 mM Na₂EDTA. Smíchané fragmenty DNA byly denaturovány při 92 °C po dobu 5 minut a renaturovány po dobu 2 hodin při 55 až 57°C. Takto vytvořené rekombinantní kruhové molekuly DNA byly použity k transformaci kompetentních buněk.

Minipreparace plazmidové DNA byla prováděna podle Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982) a získané plazmidové DNA byly použity jako templáty

-122-

	4·	• 4	444·
• 4	•	4 ·	4	•	4	4
4 β	• V	4 4	4 ·	• 4	•	4
4 *		4 4	4		•	•
4 4	4 4 4	• · 4	44	a 4		4

pro sekvenční analýzu prováděnou metodou podle Sangera, při níž jsou k ukončení syntézy řetězce DNA použity dideoxynukleotidy (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, strana 5463 až 5467, 1977). Plazmid obsahující pozměněnou kódující sekvenci bez jakékoliv nepatřičné záměny v sekvenci byl označen pQR176. Fragment DNA s pozměněnou kódující sekvencí byl izolován z agarózového gelu postupem popsaným výše a zaligován do předem rozštěpeného a defosforylovaného vektoru pKK223.3 {Pharmacia Biotech: tento vektor obsahuje promotor tac regulovaný lac represorem a indukovatelný přídavkem izopropyl-p-D-thiogalaktosidu (IPTG); Brosius a Holý, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 6929, 1984) v pufru o celkovém objemu 20 μΐ obsahujícím 20 jednotek T4 DNA ligázy a ligační pufr. Produkty ligační reakce byly použity k transformaci kompetentních buněk E. coli. Byla provedena restrikční analýza plazmidu získaných z různých kolonií transformovaných rekombinantní DNA za účelem odhadu velikosti a orientace inzertů vzhledem k promotoru tac. Správný konstrukt byl pojmenován pQR177. (obrázek 1).

rekombinantního účelem exprese (b) Produkce a purifikace bovinní pankreatické ribonukleázy Lys66Glu

Strategie použitá k produkci a purifikaci enzymu využívala protokoly vyvinuté za pankreatické ribonukleázy A v E. coli (Tarragona-Fiol a další, Gene, 1992). Tento systém využívá přirozeně se vyskytující signální sekvenci bovinní pankreatické ribonukleázy k namíření produkované ribonukleázy nebo . jejích geneticky upravených mutantů do periplazmatického prostoru E. coli. Oxidativní prostředí v periplazmatickém prostoru umožňuje správné sbalení proteinu, Čímž je zajištěna exprese plně aktivnírekombinatní RNázy. Vysoká hodnota kladného náboje rekombinatních nebo geneticky upravených mutantů usnadňuje rychlou purifikaci ze směsi endogenních periplazmatických

ΒΒ «ΒΒΒ

-123ΒΒ

proteinů. Exprese a následná purifikace mutantních proteinů trvá asi 48 hodin; měřeno od inokulace média.

Plazmid pQR177 obsahuje dvě ribozomální vazebná místa (RBS), jedno poskytované promotorem tac přítomným na vektoru a druhé, určené pro translaci druhého cistronu je obsaženo v kódující sekvenci prvního cistronu. mRNA produkovaná buňkami Escherichia coli nesoucími plazmid pQR177 po indukci IPTG je dvojcistronní a translace začíná u promotoru tac. První cistron kóduje peptid tvořený 6 aminokyselinami (Met-Phe-Leu-Glu-Asp-Asp). Stop kodón prvního cistronu a startovní kodón druhého cistronu se překrývají takovým způsobem, že ribozom bude pokračovat v translaci mRNA a produkovat pre-RNázu. RNáza ve formě prekurzoru je translokována do períplazmatického prostoru a sekvenování N-konce proteinu ukázalo, že signální sekvence je odštěpena ve správném místě. Oxidátivní prostředí v periplazmatíckém prostoru umožňuje správné sbalení Rnázy, tak aby vytvořila nativní enzym, což je potvrzeno získáním plně aktivního enzymu.

(pQRl77) byly pěstovány po litrech média obsahujícího ^g/ml. Když byly buňky v

Buňky Escherichia coli dobu 8 hodin při 28°C v 5 ampicilin o koncentraci 100 exponeciální fázi růstu, bylo do růstového média přidáno IPTG, aby bylo dosaženo jeho finální koncentrace 0,5 mM, a růst pokračoval za stálého třepání přes noc při 28°C. Uvolnění proteinů z períplazmatického prostoru bylo provedeno pomocí modifikovaného postupu využívajícího osmotický šok. Buňky narostlé přes noc (5 litrů) byly centrifugovány při 10°C po dobu 10 minut při 8300xg (průměrně). Buněčná peleta byla rozsuspendována v 60 ml 200 mM Tris-HCl pH 7,5 / 20% (w/v) sacharóza (bez přítomnosti RNázy)/1 mM Na₂EDTA. Suspenze byla ponechána 30 minut při pokojové teplotě. Osmotického šoku bylo dosaženo přidáním stejného množství sterilní vody a důkladným promícháním ·· ····

-124suspenze. Sféroplasty byly centrifugovány při při 10°C po dobu 90 minut při lOOOOOxg (průměrně).

K získání periplazmatického všech kladně nabitých proteinů z prostoru byla použita ionexová chromatografie na katexu (S-Sepharose™ FF) . Pufr A měl složení 50 mM MES, pH 6,5 a pufr B měl složení 50 mM MES, 1 M NaCI, pH 6,5. Rekombinantní Rnáza byla ze směsi kladně nabitých proteinů purifikována ionexovou chromatografií na katexu (Mono-S™, Pharmacia-LKB) při použití gradientu 17,5 mM NaCl/min. Zjišťování Čistoty rekombinantní Rnázy pomocí elektroforézy na SDS-polyakryamidovém gelu a následným barvením stříbrem zřetelně prokázalo, že tato kombinace zmíněných postupů vede k purifikaci proteinu do homogenity (viz. Obrázek 2). Rnázová aktivita rekombínatního enzymu byla odhadnuta měřením hydrolýzy cytidylyl-3':5 '-adenosinu. (CpA) a cytidin-23'cyklický monofosfát (C>p) a byla naměřena stejná specifická aktivita jako u komerčně dostupných enzymů (viz. Tabulka). Koncentrace proteinu byla stanovena měřením OD při vlnové délce 278 (OD278nm=0,71 odpovídá Rnáze o koncentrací 1 - mg/ml) byla prováděna sledováním zvýšení absorbance s časem při 286 nm (Witzel a Barnard Biochem. Biophys. Res., 1962). Počáteční rychlost a hodnoty koncentrace, substrátu byly použity ke stanovení parametrů Km a kcat a jejich standardních chyb pomocí výpočetních metod založených na analýze popsané v Wilkinson, Biochem.

J. 80, 324 až 332, 1961. Rozdíly mezi těmito parametry získanými použitím různých ribonukleáz byly vyhodnoceny pomocí Studentova t-testu.. Rychlost hydrolýzy substrátu C>p byla měřena při pokojové teplotě v kyvetách o šířce 0,1 cm (Hellma) v celkovém objemu 250 μΐ. Reakční směsi obsahovaly různé koncentrace C>p v 0,1 M (1,3-bis[tris(hydroxymethyl)-methylamino] propanu), pH 7,0, 50 mM NaCI (1=0,1) a byly startovány přídavkem enzymu (viy. Tabulka). Získaná data naznačují, že kinetické vlastnosti

Kinetická měření, (hydrolýza C>p)

* · · φ · « · • φ φ φ φ φ • φ φ φ φφφ · • φ φ φ φ • Φφ ·· φφ φ geneticky manipulovaného enzymu Lys66Glu se neliší od komerčně dostupného bovinního enzymu v podstatě

BP-RNáza

BP-RNáza LysSSGlu kcat/Km (mM^/s'¹)

3,4 (0,9)

4,7 (0,1)

Příklad 2 Příprava lidské pankreatické ríbonukleázy Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu

Jako templát pro PCR reakci obsahující primery SEQ ID NO: 15 a 16 (5 pmol každého), nukleotidy (0,2 mM) , PCR pufr a

2,5 jednotek polymerázy pfu byl použit plazmid pÁTF4 (2 ng) (popsaný v referenčním příladu 2, obsahující gen kódující HP-RNázu Arg4Ala,Lys6Ala). Po' 5 minutách počáteční denaturace při 90°C bylo provedeno 30 cyklů skládajících se z denaturace (92°C, 1 minuta), renaturace (55°C, 1 minuta) a extenze sekvence DNA (75°C, 1 minuta). Fragmenty získané pomocí PCR byly izolovány elektroforézou na agarózovém gelu a následnou extrakcí postupem popsaným v Příkladu 1 a rozštěpeny pomocí EcoRI (10 až 15 jednotek) při 37°C po dobu 1 hodiny. Po tepelné inaktivaci enzymu byl fragment rozštěpený enzymem EcoRI zaligován do plazdidu pUCIS rozštěpeného působením EcoRI a defosforylovaného. Získaný plazmid byl označen pATFZl. Plazmid pATFZl byl použit k potvrzení sekvence mutovaného genu HP-RNázy.

Po vytvoření byl plazmid pATFZl použit jako templát pro RCPCR reakce prováděné postupem popsaným v Příkladu 1, ovšem s tím rozdílem, že oligonukleotidové primery SEQ ID NO: 1 až 4 byly nahrazeny oligonukleotidovými primery SEQ ID NO: 30 až 33. Výsledný plazmid byl označen pATFZ3. Gen kódující HP-RNázu Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu byl z plazmidu pATFZ3 vyštěpen pomocí enzymů EcoRI a Ncol (10 až 15 ·« ····

-126·· ·

jednotek každého) a zaligován do předem rozštěpeného (EcoRI a Ncol) a defosforylovaného plazmidu pICI266 (NCIMB 40589) za účelem exprese. Ligace, exprese a purifikace byly rpovedeny postupy popsanými v Příkladu l, ovšem s tím rozdílem, že k vyštěpení fragmentu z plazmidu pATFZ3 byly použity restrikční endonukleázy EcoRI a Ncol a tento fragment byl zaligován do předem rozštěpeného (EcoRI a Ncol) a defosforylovaného plazmidu pICI266, a že indukce byla provedena pomocí 1% arabinózy (namísto IPTG). Výsledný konstrukt byl označen pATFZ44 (viz.· Obrázek 5) . Exprese a purifikace mutantního enzymu byla provedena postupem popsaným v příkladu 1, ovšem s tím rozdílem, že k indukci byla namísto IPTG použita 1% arabinóza.

Přiklad 3: Příprava 0-[(2R,3R,4R,5R)-2-(2-amino acetamidomethyl) -3-(2,4- dioxo- 1,2,3,4tetrahydropyrimidin-1-yl) -4-hydroxy- 2,3,4,5-tetrahydrofuran-3-yl) 0-[4- (bis[2-chloroethyl] amino) fenoxy] hydrogenfosfátu (který je znázorněn jako konečný produkt na obrázku 7).

Sloučenina 4 (Obrázek 7,- 31 mg, 0,034 mM) byla rozpuštěna v 0,01 M HCI v N, N-dimethylformamidu (DMF) a k tomuto roztoku bylo jako katalyzátor přidáno 30% paladium naadsorbované na uhlíku ve formě suspenze v dimethylformamidu. Směs byla míchána po dobu 2 hodin a 45 minut v atmosféře tvořené vodíkem. Následně po filtraci přes Celíte™ byl filtrát odpařen do sucha při teplotě nižší než 30°C. Surový produkt byl rozsuspendován v bezvodém dichlórméthanu a směs byla zcentrifugována. Supernatant tvořený vrstvou dichlórméthanu byl odstraněn. Tento postup byl zopakován a pevný zbytek byl nakonec vysušen. Požadovaný produkt měl hmotnost 9,4 mg (sloučenina 5, Obrázek 7).

-127• · ···* ·· · · ft* • 9 ·· ··*· · · • · * ·»··«· • 9 · · · · · · · · · * · * a · » ·« • · · · · ··«· »« t

NMR data DMSO d6, d4 octová (δ) 3,3(lH,m); 3,5 (3H,m); 3,62 (8H,s); 4,05 (lH,m); 4,25 (lH,m); 4,53 (lH,m); 5,62 (lH,d); 5,72 (lH,d); 6,63 (2H,d);.7,05 (2H,d); 7,63 (lH,d).

Sloučenina 4 byla připravena následovně.

2'-O-benzyl-5'-bromo-5'-deoxyuridin (sloučenina 1, Obrázek 7} .

Ke směsi 2'-O-benzyluridin (Wagner a další , J. Org. Chem. 39, 24 až 30, 1974) (334 mg ' lmM) karbotetrabromidu (500 mg) a DMF (4ml) při 2Q°C v atmosféře tvořené argonem byl přidáván po dobu více než 5 minut roztok trifenylfosfinu (340 mg) v DMF (2 ml). Směs byla míchána při 20°C po dobu 2 hodin, nalita do vody (60 ml) a dvakrát extrahována ethylesterem kyseliny octové. Spojené extrakty tvořené organickou fází byly promyty vodou, vysušeny a odpařeny do formy oleje. Tento olej byl použit ke chromatografií na 20 g oxidu křemičitého (Merck, položka 9385). Eluce 5% methanolem poskytla

2'-0-benzyl-5'-bromo-5'-deoxyuridin (160 mg, 40%).

NMR (DMSO d6) δ 11,4 (slH) ; 7,6 (dlH) ; 7,3 (m5H) ; 5,95 (dlH); 5,6 (ddlH) ; 4,6 (q2H); 4,0 až 4,2 (m3H); 3,6 až- 3,8 (m2H).

5'-azido-2'-0-benzyl-5'-deoxyuridin (sloučenina 2, Obrázek 7)

2'-0-benzyl-5'-bromo-5'-deoxyuridin (4,3 g) byl rozpuštěn v DMF (86 ml) a k tomuto roztoku byl přidán azid sodný (7 g) . Směs byla míchána a zahřívána 2 hodiny při 60°C. Po ochlazení reakční směsi a dekantací DMF od nezreagovaného azidu sodného byl tento DMF odpařen do sucha. Zbytek byl rozpuštěn v ethylesteru kyseliny octové, promyt dvakrát vodou, vysušen a odpařen do sucha. 2bytek

-1284 * • * »·»

4» « 4 byl použit ke chromatografií na oxidu křemičitém (Merck, položka 9385). Eluce 10% methanolem poskytla 1,5 g čistého 5''-azido-2''-0-benzyl-5'-deoxyuridinu.

NMR (DMSO d6) δ 11,4 (slH) ; 7,6 (dlH) ; 7,3 (m5H) ; 5,9 (dlH); 5,6 (dlH); 5,4 (dlH); 4,65 (q2H); 3,9 až 4,2 (m3H);

3,6 (d2H).

2'-0-benzyl-5'-karbobenzoxyglycylamino-5'-deoxyuridin (sloučenina 3, Obrázek 7}

Ke směsi 5'-azido-2'-0-benzyl-5'-deoxyuridinu (1,5 g) , tetrahydrofuranu (25 ml) a esteru benzyloxykarbonyl glycin N-hydroxysukcinátu (1,3 g) bylo přidáno 10% paladium naadsorbované na uhlíku (50% vlhkost tvořená vodou) (1,5 g.) . Směs byla 4 hodiny míchána v atmosféře tvořené vodíkem. Následně po filtraci přes Celite™ byl filtrát odpařen do sucha. Zbytek byl rozpuštěn v ethylesteru kyseliny octové a promyt 5% vodným roztokem kyseliny citrónové (2x), roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2x) , vysušen a odpařen dosucha. Zbytek byl rozetřen s 1:1 ether/ ethylester kyseliny octové a výsledkem byla pevná látka (960 mg) (42%).

NMR (DMSO d6) δ 11,3 (slH) ; 8,0 (tlH) ; 7,6 (dlH) ; 7,4 (mlOH) ; 5,9 (dlH) ; 5,6 (dlH) ; 5,4 (dlH) ; 5,0 (s2H) ; 4,6 (q,2H); 4,0 (m2H); 3,9 (mlH); 3,6 (d2H); 3,5 (m2H).

Příprava sloučeniny 4 (viz obrázek 7)

a) Benzyloxydichlorofosfin (Scott a další, J. Org.

Chem. ' 55, 4904 až 4911,1990) (135 mg, 0,64 mM) byl rozpuštěn v bezvodém dichlormethanu (4,0 ml), směs byla ochlazena na -20 °C a k této směsi byla přidána směs diisopropylaminu (0,091 ml, 0,64 mM) a diisopropylethylaminu (0,11 ml, 0,64 mM) rozpuštěná v bezvodém dichloromethanu (2,0 ml). Roztok byl míchán 45 minut při -20°C a následně byl zahříván po dobu 30 minut na

-129·· · «· ·» ···· * · ·· «··»·· · • · · »»···· • · · ···· »«· · » » · ··· ·· ·· ··· ··· «* *» · pokojovou teplotu a poté byl při pokojové teplotě míchán dalších 30 minut. Tento roztok byl po kapkách přidáván k roztoku

2' -O-benzyl-5'-karbobenzoxyglycylamino-5'-deoxyuridinu (2 80 mg, 0,53 mM) a diisopropylethylaminu (0,335 ml, 2,14 mM) v dichlormethanu (3,0 ml) ochlazeném na 0°C. Roztok byl míchán 10 minut při 0°C a dále pak 2 hodiny při pokojové teplotě. Reakční směs byla poté zředěna dichlormethanem, vysušena a odpařena do formy oleje. Tento olej byl byl jako směs s toluenem azeotropicky destilován (2x) a tím připraven pro následující reakci.

b) Surový produkt z předcházející reakce byl rozpuštěn v bezvodém dichlormethanu (2,5 ml) k tomuto roztoku byl přidán roztok roztok 4-N,

N-bis-(2-chlorethyl)aminofenolu (125 mg. 0,534 mM) v bezvodém dichlormethanu (3 ml) . Následně byl přidán roztok 0,46 M tetrazolu v bezvodém acetonitrilu (3,2 ml) a roztok, byl míchán 2 hodiny při pokojové teplotě. Po uplynutí této doby byl k tomuto roztoku přidán roztok 70% t-butylhydroperoxidu ve vodě (0,11 ml, 0,801 mM) a vzniklý roztok byl míchán při pokojové teplotě další hodinu... Reakční směs byla zředěna dichlormethanem a promyta nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (lx), zředěným roztokem siřičitanu sodného' (lx) a nasyceným roztokem chloridu sodného (lx) a vysušena a odpařena dosucha. Surový produkt byl použit ke chromatografií na oxidu křemičitém (Merck, kat.č. 9385). Eluce 2% methanolem v dichlormethanu a následně 3,5% methanolem v dichlormethanu poskytla 118 mg čistého produktu.

NMR data. .DMSO d6 (δ) směs diastereoisomerů 3,37 ÍH (m) ; 3,42 2H (d) ; 3,67 8H (d); 4,12 ÍH (m); 4,33 ÍH (m); 4,56 2H (m) ; 5,0 2H (s) ; 5,14 3H (m) ; 5,59 ÍH (d) ; 5,91 lH(d); 6,64 2H (dd) ; 7,05 2H (t) ; 7,28 15H (m) ; 7,45 ÍH (t) ; 7,62 ÍH (dd); 8,13 ÍH (brs); 11,35 ÍH (s);.

* ·

-130> 4

4· 4

Příklad 4: Syntéza a izolace konjugátu myší A5B7

F(ab')₂ a Lys66Glu hovězí pankreatické ribonukleázy Opakuje se zde postup popsaný v referenčním příkladu 4, ale s tím rozdílem,, že hovězí pankreatické ribonukleáza je nahrazena Lys66Glu hovězí pankreatickou ribonukleázou, která je popsaná v příkladu 1.

Příklad 5; Syntéza a izolace konjugátu myší A5B7 F(ab')₂ a Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu lidské pankreatické ribonukleázy

Opakuje se postup popsaný v referenčním příkladu 4 s tím rozdílem, že hovězí pankreatické ribonukleáza je nahrazena Arg4Ala.Lys6Ala.Lys66Glu lidskou pankreatickou ribonukleázou, která je popsaná v příkladu 2.

Příklad 6: Syntéza a izolace konjugátu humanizované A5B7' F(ab')₂ a Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu lidské pankreatické ribonukleázy

Opakuje se zde postup popsaný v příkladu 5, ale s tímrozdílem, že myší A5B7 F(ab')₂ fragment je nahrazen humanizovaným A5B7 F(ab')₂ fragmentem.

Příprava humanizovaného A5B7 F(ab'}₂ fragmentu probíhá stejným způsobem, jaký je popsaný v referenčním příkladu 5 od kroku f) , myší sekvence pro Fd a lehký řetězec podle Sekvence id. č.: 25, respektive 26. jsou však nahrazeny humanizovanými sekvencemi podle Sekvenci id. č.: 28, respektive 29.

Humanizované fragmenty protilátek podle Sekvence id. č.: 28, respektive 29 mohou být připraveny různými způsoby včetně způsobu podle Edwardse (1987) Am. Biotech. Lab. 5. 38 až 44. Jayaraman et al. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 4084 až 4088. Foquet and Lubbert (1992)

-131• ·

Biotechniqu.es 13, 674 až 673 and Pierce (1994) Biotechniques 16, 708.

Příklad 7: In vitro cytotoxicita neaktivního prekurzorů účinné látky odvozeného od uracilu z příkladu 3, odpovídající účinné látky a neaktivního prekurzorů účinné látky spolu s mutantním enzymem lidskou pankreatickou-RNázou (HP-RNáza) Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu.

Odlišná cytotoxicita neaktivního prekurzorů účinné látky a odpovídající účinné látky k nádorovým buňkám je demonstrována následujícím způsobem. Kolorektální nádorové buňky Lo Vo jsou po dobu jedné hodiny při 37°C inkubovány s neaktivním prekurzorem účinné látky nebo s účinnou látkou při koncentračním rozsahu 5xl0'⁴ až 5xlO'^aM v 96 jamkových mikrotitračních destičkách (2500 buněk na. jamku). Potom se., buňky promyjí a inkubují se následující tři dny při 37°C. Pak se do jamek přidá TCA, jamky se propláchnou, čímž dojde, k odstranění mrtvých buněk, a množství buněčné bílkoviny adherované k destičce se stanoví pomocí SRB barviva, jak popisuje P.Skehan et al. J. Nati. Cancer Inst. 82 1107(1990) . Účinnost daných směsí je dána jejich koncentrací,, jenž je potřebná k 50% inhibici buněčného růstu (IC50).

Jsou-li Lo Vo buňky vystaveny účinné látce, IC50 je přibližně 1 μΜ. Ve srovnání s tím je neaktivní prekurzor účinné látky mnohem méně cytotoxický, jeho IC50 je přibližně 3 0 μΜ (obrázek 6} . Neaktivní prekurzor účinné látky vykazuje tedy přibližně 30krát menší cytotoxicitu k nádorovým buňkám než účinná látka získaná štěpením pomocí mutantní RNázy.

Přidá-li se do zkušebních jamek, které obsahují neaktivní prekurzor účinné látky, bud volná Arg4Ala,Lys6Ala.Lys66Glu HP-RNáza (10 μρ enzym) nebo konjugát A5B7 F (ab ¹ ) ₂-Arg4Ala.Lys6Ala.Lys66Glu HP-RNázy (10 μς enzym), je cytotoxicita pozorovaná v těchto jamkách

9 ♦

-132t 9 9 9 9 · · J .· ·«· ·*· ·· ·· * srovnatelná s cytotoxicitou, kterou vykazuje aktivní účinná látka, což ukazuje, že neaktivní prekurzor účinné látky je pomocí mutantního enzymu přeměněn na účinnější látku.

Tyto studie demonstrují schopnost konjugátu lidské mutantní RNázy přeměnit relativně neaktivní prekurzor účinné látky na účinnou cytotoxickou látku schopnou zabíjet nádorové buňky v ADEPT systému.

Příklad 8: Protinádorová aktivita neaktivního prekurzoru účinné látky a konjugátu protilátky a mutantní RNázy v myších s heteroštěpem

Protinádorová účinnost neaktivního prekurzoru účinné látky a . konjugátu Arg4Ala.LysGAla.Lys66Glu ΗΡ-RNázy (nebo Lys66Glu hovězí pankreatické RNázy) může být demonstrována pomocí následujícího modelu. Lo Vo nádorové buňky (10⁷) jsou injikovány myším, které byly zbaveny brzlíku. Když nádory dosáhnou velikosti 4 až 5 mm v průměru, je myším intravenózně podán konjugát v dávkách, jejichž velikost se pohybuje mezi 10 a 100 mg/kg. Když se injikovaný konjugát dostane k nádorům a zároveň uplyne dostatečně dlouhá doba k tomu, aby byly ostatní tkáně a krevní řečiště očištěny od zbytkového konjugátu (1 až 4 dny), je myším bud“ intravenózně nebo intraperitoneálně podán neaktivní prekurzor účinné látky v dávce, jejíž velikost se pohybuje v rozsahu od 100 do lOOOmg/kg. Ve srovnání s kontrolními ničím neléčenými nádory či nádory léčenými stejnou dávkou bud“ samotného konjugátu nebo samotného neaktivního prekurzoru účinné látky vede kombinace konjugátu a neaktivního prekurzoru účinné látky k podstatně pomalejšímu růstu nádorů. Tyto studie demonstrují, že konjugát Arg4Ala.LysSAla.Lys66Glu ΗΡ-RNázy v kombinací s neaktivním prekurzorem účinné látky vykazuje protinádorovou aktivitu.

-133Příklad 9: Klinické dávkování u pacientů

Ne jefektivnější způsob podávání konjugátů a neaktivních prekurzorů účinných látek popisovaných v tomto vynálezu a jejich dávkovači režim během léčby rakoviny závisí na celé řadě faktorů, kterými jsou například vážnost onemocnění, celkový zdravotní stav pacienta, jeho reakce na léčení a posudek od ošetřujícího lékaře. U jednotlivých pacientů by tedy mělo být dávkování konjugátů a prekurzorů účinných látek stanoveno podle těchto faktorů. Nicméně je pravděpodobné, že se účinná dávka konjugátu bude pohybovat v rozsahu od 20 do přibližně 200 mg/m². Účinná dávka neaktivního prekurzoru účinné látky bude záviset na konkrétní účinné látce a na toxicitě výchozí látky. Je-li známa MTD výchozí látky, může sloužit jako· výchozí bod při určování účinné dávky neaktivního prekurzoru účinné látky,, neboř neaktivní prekurzor účinné látky je vždy méně. cytotoxický než výchozí látka. Pro neaktivní prekurzory účinných látek, které jsou založené . na fenol-mustard sloučenině, kde nejsou klinické údaje o výchozí látce k dispozici, není léčebný rozsah dávek zatím přesně určen a musí býtdefinován standardními toxikologickými studiemi na: zvířatech a studiemi na pacientech, kteří budou zpočátku dostávat nízké dávky daného prekurzoru účinné látky a postupně se jim budou dávky zvyšovat. Pravděpodobně se však terapeutické dávky budou pohybovat v rozsahu od 500 do 2000 mg/m².

Příklad 10: Enzymová kinetika od uracilu odvozeného prekurzoru účinné látky z příkladu 3 (prekurzor, který je substrátem RNázy, dále zkráceně prekurzor RNázy)' versus enzymová kinetika přirozené a mutantní hovězí pankreatické RNázy Lys66Glu

Pomocí spektrofotometru Perkin Elmer Lambda 2 byly snímány absorbance prekurzoru účinné látky a odpovídající fenol

-134-

mustard účinné látce v rozsahu vlnových délek 200 až 350 nm. Byla vybírána taková vlnová délka, při které byl mezi prekurzorem účinné látky a účinnou látkou největší rozdíl v absorbanci (tento rozdíl je způsobený rozštěpením fosfátové vazby). K tomuto maximálnímu rozdílu v absorbanci došlo při vlnové délce 256 nm. Km a Vmax pak byly určeny na základě měření počátěční rychlosti přeměny neaktivního prekurzoru účinné látky na účinnou látku při této vlnové délce. Koncentrace prekurzoru účinné látky se pohybovaly v rozmezí 0,2 až 2mM, koncentrace enzymu RNázy v rozmezí 5 až 80 pg/ml. Měření byla prováděna pří teplotě 37°C v roztoku 0,025M Tris-HCl, který obsahoval 0,01%Bríj-35 pufr (pH 7,5). Byly používány kyvety firmy Hellma se stěnami silnými 0,1 cm. Celkové množství měřeného roztoku bylo 250 μΐ. Hodnota Kcat bylo spočítána vydělením V_max množstvím RNázy v reakčni směsi. Enzymatická aktivita obou enzymů vůči standardnímu substrátu, kterým byl cytidin 23cyklický monofosfát (C>p), byla měřena na základě změny v absorbanci při 284 nm, při použití rozsahu koncentrací substrátu (C>p) 0,5 až 6 mM a koncentrací enzymu RNázy 5 až 3 5 pg/ml. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.

Enzymová kinetika pro prekurzor účinné látky vhodný pro RNázu a C>p, srovnání nativní a RNázy Lys66Glu

Substrát BP-RNáza	Lys66Glu BP-RNáza
prekurzor účinné 0,37	18
látky (viz příklad 3)
C>p 3	3,0
Jednotky =	kcat/Km mM^s'1

Z výsledků je patrné, že rychlost přeměny standardního substrátu C>p pomocí přirozené a mutantní hovězí RNázy se téměř neliší. Mutantní RNáza však mnohem « 4 * · *

4 4 · · » a « 44 · · *4 · · *4 >♦ ·

-135hydrolyzuje jmenovaný rychleji než přirozený enzym prekurzor účinné látky. Výsledkem mutace Lys66Glu v molekule hovězí RNázy tedy není omezení schopnosti tohoto enzymu štěpit fosfátovou vazbu, ale naopak vytvoření enzymu, jenž je schopen specificky štěpit jmenovaný prekurzor účinné látky a tedy uvolňovat aktivní účinnou látku.

Příklad 11: Enzymová kinetika od uracilu odvozeného prekurzoru účinné látky z příkladu 3 (prekurzor, který je substrátem RNázy, dále zkráceně prekurzor RNázy} versus enzymová kinetika přirozené a mutantní

Arg4Ala,LysGAla,Lys66Glu lidské pankreatické RNázy Měření kinetik enzymatických reakcí s přirozenou RNázou a s RNázou Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu byla prováděna obdobně jako v příkladu 10, pouze s tím rozdílem, že použitým pufrem byl Ο,ΙΜ 1,3-bis [tris (hydroxymethyl).-methylamino]-propan (pH 7,0), 50 mM NaCl. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.

Enzymová kinetika pro prekurzor účinné látky vhodný pro RNázu a C>p, srovnání nativní a RNázy

Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu

Substrát	HP-RNáza	Arg4Ala, LysSAla, Ly 66Glu HP-RNáza
prekurzor účinné látky (viz příklad 3)	0,2	3,6
C>p	1,2	1,2
Jednotky = kcat/Km mM^s'1

Z výsledků je patrné, že rychlost přeměny standardního substrátu C>p pomocí přirozené a mutantní hovězí RNázy se téměř neliší. Mutantní RNáza však mnohem rychleji než přirozený enzym hydrolyzuje jmenovaný prekurzor účinné látky. Výsledkem mutace LysSSGlu v molekule lidské RNázy tedy není omezení schopnosti tohoto enzymu štěpit fosfátovou vazbu, ale naopak vytvoření enzymu, jenž je schopen specificky štěpit jmenovaný prekurzor účinné látky a tedy uvolňovat aktivní účinnou látku.

Příklad 12: Syntéza prekurzoru aktivní látky odvozeného od cytosinu (viz obrázek 17)

Opakuje Se' zde postup popsaný v příkladu 3, pouze sloučenina 4 (obrázek 7) je nahrazena sloučeninou 6 (obrázek 17). Příprava sloučeniny 6 (obrázek 17) je stejná jako příprava sloučeniny 4 (obrázek 7) , ale 2-O-benzyiuridin je nahrazen N⁴-benzyloxykarbonyl -2 -O-benzylcytídinem.

Postup přípravy ,N⁴-beňzyloxykarbonyl-2' -O-benzylcytidinu (složka 2, obrázek 17) z 2'-O-benzylcytidinu [Christensen and Broom (1972), J. Org. Chem. 37, 3398-3401] je stejný jako postup přípravy sloučeniny 6 popsaný v referenčním příkladu 7.

Příklad 13: Kinetika enzymatického působení hovězí pankreatické LysSSGlu RNázy na analogy prekurzorů aktivních látek odvozených od uridínu a cytidinu z referenčních příkladů 6, respektive 7.

Experimentální postup byl obdobný jako v příkladu 10, měření však probíhala při teplotě 25°C. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.

Enzymová kinetika pro analogy prekurzoru účinné látky pró RNázu a C>p, srovnání nativní a RNázy Arg4Ala,LysSAla,LysSSGlu « φ ·

9 9 • 9 99 9

Ί37• v * • · ♦« • · · • · · • · · • Φ ··· • ··

Substrát	BP-RNáza	Lys66Glu RNáza
Analog prekurzoru účinné látky pro použití s RNázou (ref. př. 6)	1 (0,2)	25 (6)
Analog prekurzoru účinné látky pro použití s RNázou (ref. př. 7)	5,05 (0,3)	109 (11)
C>P	3 Jednotky =	3 kcat/Km mM^s'1
Z výsledků . je	patrné,	že rychlost přeměny

standardního substrátu C>p pomocí přirozené a mutantní hovězí RNázy se téměř neliší. Mutantní RNáza však mnohem rychleji než přirozený enzym hydrolyzuje jmenované analogy prekurzorů účinný látek. Výsledkem mutace Lys66Glu v molekule hovězí RNázy tedy není omezení schopnosti tohoto enzymu štěpit fosfátovou vazbu, ale naopak vytvoření enzymu, jenž je schopen specificky štěpit jmenované analogy prekurzorů účinných látek a tedy uvolňovat aktivní účinné látky z příslušných prekurzorů.

Příklad 14 Typické farmaceutické kompozice obsahující prekurzor účinné látky podle vynálezu

A) Suché plněné kapsule, obsahující 50 mg sloučeniny podle vynálezu

Složka	Množství v jedné kapsuli (mg)
Sloučenina podle vynálezu	50
Laktóza	149
Stearát hořečnatý	1
Kapsule, velikost 1	200

• · · • · · • 99 9

-1389« 9

9

9 ·

Sloučenina podle vynálezu se může rozetřít na prášek velikosti 60 a na tento prášek se přes plátno velikosti 60 přesype laktóza a stearát hořečnatý. Tato směs se pak 10 minut míchá a naplní se jí suché, žeiatinově kapsule velikosti 1.

B) Tablety

Typická tableta může obsahovat 25 mg sloučeniny podle vynálezu, předem zgelovatěný škrob (82 mg) , mikrokrystalickou celulózu (82 mg) a 1 mg stearátu hořečnatého.

c) Čípky

Typické čípky pro rektální formu podání mohou obsahovat 0,8 až 1 mg sloučeniny podle vynálezu, edetát vápenato-disodný (0,25 až 0,5 mg) a 775 až 1600 mg polyethylen glykolů. Jiné čípky mohou být připraveny záměnou edetátu vápenato-disodného například za butylovaný hydroxytoluen (0,04 až 0,08 mg) a polyethylen glykolů za hydrogenovaný rostlinný olej (675 až 1400 mg ( jako jsou například Suppocire L, Wecobee FS, Wecobee M, Witepsols a podobné.

D) Injekce

Typická injekční forma může obsahovat 10 mg sloučeniny podle vynálezu,· 0,1 ml benzylalkoholu a 1 ml vody.

Příklad 15: Klonování a exprese D253K HCPB-(His)_s-c-Myc z E. coli

Způsob klonování a exprese D253K-HCPB v E.coli je velmi podobný tomu, který je popsaný v referenčním příkladu 15. pICI266 byl opět použit jako klonovací vektor a výchozím materiálem pro PCR amplifikaci genu pro-HCPB byl plazmid pICI1698 (tak, jak je popsáno v referenčním příkladu 14). V tomto případě však byl během PCR amplifikace cílenou mutagenezí změněn kodón pro aminokyselinu v pozici 253 v «· ·Φ·»

-139• · * « · • · · • · · · • · · ·· ·«·

♦

·»· · • · • · · genu pro maturovaný enzym z kodónu pro kyselinu asparagovou na kodón pro lysin (GAC na AAA), změna D253K. Byly připraveny dvě reakční směsi pro PCR. Množství jednotlivých složek odpovídalo tomu, které je popsáno v referenčním příkladu 15. Primery v první reakci byly FSPTS1 (podle Sekvence Id. č.: 58) a 1398 (podle Sekvence Id. č. : 72). Primery v druhé reakci byly 6HIS9E1OR1BS1 (podle Sekvence Id. č.: 59) a 1397 (podle Sekvence Id. č.: 73). Výchozí DNA v obou reakcích byla pICI1698. Primery 1398 a 1397 (Podle Sekvence Id. č.:72 a 73) byly konstruovány tak, aby hybridizovaly podél kodónu pro aminokyselinu v pozici 253, zavedly v DNA sekvenci změnu kodónu GAC na AAA a vytvořily komplementární sekvence na koncích obou PCR produktů. Druhé dva primery, FSPTS1 a 6HIS9E1OR1BS1 (Podle Sekvence Id. č..: 58 and 59), jsou popsané v referenčním příkladu 15. Pomocí elektroforézy v agarózovém gelu byly analyzovány alikvoty z těchto dvou PCR reakcí, byla detekována DNA správné velikosti (přibližně 750 a 250 bp) a odhadnuta její koncentrace. Vzorky obsahovaly převážně DNA správné velikosti.

Pro další PCR bylo použito přibližně 4ng z každého z prvních PCR produktů. Reakce probíhaly v přítomnosti dNTP, jejichž konečná koncentrace byla 200 μΜ, Taq polymerázového reakčního pufru, 2U Taq polymerázy v konečném objemu 80 μΐ. Před přidáním Taq enzymu byla směs po dobu 10 minut zahřívána při teplotě 94°C, PCR inkubace pak probíhala v deseti cyklech - při 94°C po dobu 1 minuty a při 63°C po dobu 4 minut. Na závěr těchto' cyklů byla reakční směs doplněna do 120 μΐ přidáním 120pmolů každého z primerů, FSPTS1 a 6HIS9E1OR1BS1 (Sekvence Id. č.: 58 a 59), dalšího dNTP (přibližně 100 μΜ), Taq polymerázového reakčního pufru a 4 U Taq polymerázy. Před přidáním Taq enzymu byla směs po dobu 10 minut zahřívána při teplotě 94°C, PCR inkubace pak probíhala v třiceti cyklech - při 94°C po dobu 1,5 minuty, při 50°C po dobu 2 minut a při 72°C po dobu 2 minut. Na ·» ···» • · ·· · • · ·· « · · • · · * * » «» ·* ·*» * » · • · ··» » • · • · · konci reakce pak byla provedena jednorázová inkubace při 72°C po dobu 9,9 minut.

Pomoci elektroforézy v agarózovém gelu byl analyzován alikvot z PCR produktu, byla detekována DNA správné velikosti (přibližně 1000 bp) . Vzorky obsahovaly převážně DNA správné velikosti. Zbytek produktu z reakčni směsi byl purifikován obdobným způsobem jako v referenčním příkladu 15. Izolovaná DNA byla štěpena restrikčními enzymy FspI a EcoRI a bendy správné velikosti (přibližně lOOObp) byly purifikovány podobným způsobem jako v příkladu 15.

pICI26S dvouvláknová ' DNA, připravená podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15, byla štěpena restrikčním enzymem KpnI a tupý konec byl podroben působení T4 DNA polymerázy, s důrazem na to, aby bylo zajištěno kompletní rozštěpení. Purifikovaná DNA pak byla štěpena, restrikčním enzymem EcoRI. DNA správné velikosti (přibližně·. 5600 bp) byla purifikována podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15.

Byla zkontrolována čistota alikvotu obou restrikčně štěpených a purifikovaných vzorků DNA a koncentrace odhadnutá pomocí elektroforézy v agarovém gelu byla. porovnána se známými standardy. Na základě těchto odhadů byly podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15 připraveny ligační směsi pro klonování genu HCPB do plazmidu pICI266 vektoru.

Po ligační reakci byla DNA směs použita k transformaci E.coli kmenu DH5a, kolonie byly sebrány a testovány hybridizaci podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15.

Za použití primerů FSP1TS1 a 6HIS9E1OR1BS1 (podle Sekvencí Id. č.:58 a 59) bylo šest pozitivně hybridizujících izolátů pomocí PCR překontrolováno na přítomnost inzertů o správné velikosti, a na hybridizaci s

-141··· interními primery FSPTS 1 {podle Sekvence Id. č.: 58) a 679 (podle Sekvence id. č. : 51) podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15. PCR produkty byly analyzovány a detekována DNA správné velikosti (přibližně 1000 bp od primerů FSPTSl k 6HIS9E1OR1BS1, a přibližně 430 bp od primerů FSPTSl k 679) pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. DNA produkty PCR amplifikace všech klonů měly správnou velikosti.

Všech šest klonů pak bylo použito na přípravu plazmidové DNA a dva byly sekvenovány v oblasti PCR produktu podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15. Klony byly sekvenovány pomocí osmí samostatných oligonukleotidových primerů označených 1281, 677, 1504, 679, 1802, 1590, 1280 a 1731 (Podle Sekvence Id. č.: 55, 52, 60, 51, 63, 61, 53 a 62). Na základě výsledků sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid s požadovanou D253K-HCPB genovou sekvencí a který je znám jako pICH7l3.

Ověřená sekvence klonovaného D253K-HCPB genu v pICI1713, s vyznačenoun translací aminokyselin od počátku PelB sekvence k EcoRl restrikčnímu místu, je označena jako Sekvence Id. č.: 74 s číslováním DNA, které začíná od 1 v prvním kodonu PelB a číslováním peptidů, které začíná od 1 v HCPB genu pro maturovaný protein.

S cílem dosáhnout kontrolované exprese D253K-HCPB byla pICI1713 plazmidové DNA transformovaná do expresivních kmenů E.coli vhodných pro transformaci, jenž rostly v prostředí chloridu sodného, podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15. K testování exprese klonovaného D253K-HCPB genu byly všechny pICH7l3 transformované expresívní kmeny zpracovány podobným způsobem jako v příkladu 15. V tomto případě byla ve Westernové analýze použita 9E10 monoklonální protilátka specifická pro C-myc

-142-

tt *	• ··	tt t a·t
•	•	a	a ♦	t	t ♦ ·
β	a	a *	• a	t t	tat a
*	a	a	• a	a	a a
ta		a » a	a a a tt		at ·

značenou část peptidu, neboč D253K-HCPB má (His)6-c-myc značku podobně jako v referenčním

C-terminalní příkladu 15.

Exprese klonovaného značeného D253K-HCPB v pICI266 (pICIl7l3) v E. coli byla prokázána pomocí gelů obarvených v Coomassie blue, z nichž byl patrný, na rozdíl od klonů obsahujících pouze vektor (pICI266) či klonů produkujících značený HCPB (referenční příklad 15), velký obsah proteinů o velikosti přibližně 35,000 Daltonů. Proteiny stejné velikosti byly detekovány i pomocí Western analýzy, jenž využívala c-myc značení peptidu.

Příklad 16: Klonování a exprese D253R HCPB-(His)6-c-Myc z E. coli

Způsob klonování a exprese D253R-HCPB v E.coli je velmi podobný tomu, který je popsaný v referenčním příkladu 16. pICI266 byl opět použit jako- klonovací vektor a výchozím materiálem pro PCR pro-HCPB genu byl plazmid píCI1712 (tak, jak je popsáno v referenčním příkladu 15). V tomto případě však byl během PCR amplifikace cílenou mutagenezí změněn kodón pro aminokyselinu v pozici 253 v genu pro maturovaný enzym z kodónu pro kyselinu asparagovou na kodón pro: arginin (GAC na CGC), změna D253R . Byly připraveny dvě PCR směsi. Způsob jejich přípravy byl podobný tomu, jenž je popsán v referenčních příkladech 15 a 16. Primery v první reakci byly 2264 (podle Sekvence Id. č. : 65) a 2058 (podle Sekvence Id. č. : 75) . Primery v druhé reakci byly 6HIS9E1OR1BS1 (podle Sekvence Id. č.: 59) a 2054 (podle Sekvence Id. č. : 76) . Výchozí DNA v obou reakcích byla pICI1712.

Primery 2058 a 2054 (Podle Sekvence Id.'č.:75 a 76) byly konstruovány tak, aby hybridizovaly kolem kodónu pro aminokyselinu v pozici 253, zavedly v DNA sekvenci změnu kodónu GAC na CGC a vytvořily komplementární sekvence na koncích obou PCR produktů. Druhé dva primery, 2264 a

ΒΒ MM

-1436HIS9E1OR1BS1 (Podle Sekvence Id. č. : 65 and 59) , jsou popsané v referenčním příkladu 15. Pomocí elektroforézy v agarózovém gelu byly analyzovány alikvoty z těchto dvou PCR reakcí, byla detekována DNA správné velikosti (přibližně 750 a 250 bp) a odhadnuta její koncentrace. Vzorky obsahovaly převážně DNA správné velikosti. Pro další PCR reakci bylo použito přibližně 4ng z každého z prvních PCR produktů. Reakce probíhaly v přítomnosti dNTP, jejichž konečná koncentrace byla 20ΟμΜ, Taq polymerázového reakčního pufru a 2U Taq polymerázy v konečném objemu 80 μΐ. Před přidáním Taq enzymu byla směs po dobu 10 minut zahřívána při teplotě 94°C, PCR inkubace pak probíhala v deseti cyklech - při 94°C po dobu 1 minuty a při 63°C po dobu 4 minut. Na závěr těchto cyklů byla reakční směs doplněna do 120 μΐ přidáním 120pmolů každého z primerů, 2264 a 6HIS9E1OŘ1BS1 (podle Sekvence Id. č.: 65 a 59), dalšího dNTP (přibližně 100μΜ), Taq polymerázového reakčního pufru a 4U Taq polymerázy. Před přidáním Taq enzymu byla směs po dobu 10 minut zahřívána při teplotě 94°C, PCR inkubace pak probíhala v třiceti cyklech - při 94°C po dobu 1,5 minuty, při 50°C po dobu 2 minut a při 72°C po dobu 2 minut. Na konci reakce pak byla provedena jednorázová inkubace při 72°C po dobu 9,9 minut.

Pomocí elektroforézy v agarózovém gelu byl analyzován alikvot z PCR produktu a byla detekována DNA správné velikosti (přibližně 1000 bp) . Vzorky obsahovaly převážně DNA správné velikosti. Zbytek produktu z reakční směsi byl purifikován obdobným způsobem jako v referenčním příkladu 15. Izolovaná DNA byla štěpena restrikčními enzymy Fspl a EcoRI a bendy správné velikosti (přibližně lOOObp) byly purifikovány podobným způsobem jako v příkladu 15.

pICI266 dvouvláknová DNA, připravená podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15, byla štěpena restrikčními enzymemy KpnI a EcoRI s důrazem na to, aby •r ···· « · • · t ··· »·

DNA SDrávné velikosti

-144bylo zajištěno kompletní rozštěpení.

(přibližně 5600 bp) byla purifikována podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15.

Byla zkontrolována čistota alikvot obou restrikčně štěpených a purifikovaných vzorků DNA a koncentrace odhadnutá pomocí elektroforézy v agarovém gelu byla porovnána se známými standardy. Na základě těchto odhadů byly podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15 připraveny ligační směsi pro klonování genu HCPB do plazmidu pICI266 vektoru.

PO ligační reakci byla DNA směs použita k transformaci E.coli kmenu DH5ct, kolonie byly sebrány a testovány hybridizací podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15.

Tři klony pak byly použity k přípravě plazmidové DNA a byly sekvenovány v oblasti PCR produktu podobným způsobem jako v referenčním příkladu 15. Klony byly sekvenovány pomocí devíti samostatných oligonukleotidových primerů označených 1281, 677, 1504, 679, 1802, 1590, 1280, 1731 a 1592 (Podle Sekvence Id. č. : 55, 52, 60, 51, 63, 61, 53, 62a 70). Na základě výsledků sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid s požadovanou D253R-HCPB genovou sekvencí a který je znám jako pICH7l3.

Ověřená sekvence klonovaného D253R-HCPB genu v pICI1746, s vyznačenoůn translací aminokyselin od počátku PelB sekvence k EcoRI restrikčnímu místu, je označena jako Sekvence Id. č.: 77 s číslováním DNA, které začíná od 1 v prvním kodónu PelB a číslováním peptidu, které začíná od 1 v HCPB genu pro maturovaný protein.

S cílem dosáhnout kontrolované exprese D253R-HCPB byla pICI1746 plazmidová DNA transformovaná do expresivních kmenů E.coli vhodných pro transformaci, jenž rostly v prostředí chloridu sodného, podobným způsobem jako v

-145• · · • · · · · · · · ·· ··· ·«« ·· ·· · referenčním příkladu 15. K testování exprese klonovaného D253R-HCPB genu byly všechny pICIl746 transformované expresivní kmeny zpracovány podobným způsobem jako v příkladu 15. V tomto případe byla ve Western analýze použita 9E10 monoklonální protilátka specifická pro C-myc značenou část peptidu, neboť D253R-HCPB má C-terminalní (His)6-c-myc značku podobně jako v referenčním příkladu 15.

Exprese klonovaného značeného D253R-HCPB v pICI266 (pICH746) v E. coli byla prokázána pomocí gelů obarvených v Coomassie blue, z nichž byl patrný, na rozdíl od klonů obsahujících pouze vektor (pICI266) či klonů produkujících značený HCPB (referenční příklad 15), velký obsah proteinů o velikosti přibližně 35,000 Daltonů. Proteiny stejné velikosti byly detekovány i pomocí Western analýzy, jenž využívala c-myc značení peptidu.

Purifikace bylo dosaženo použitím obdobné metody jako v příkladu 17.

Příklad 17: Purifikace mutantních proteinů D253K HCPB-(His) ₆-c-Myc z kultury E. coli

Nejprve bude popsán 20 litrový fermentační proces pro produkci analogu karboxypeptidázy B D253K v buněčné kultuře E.coli. E. coli K12 kmene MSD1924 byly transformovány plazmidem p2enl713 (pICI 1713: viz příklad 15 výše) a výsledný kmen MSD2230 (MSD1924 pZen 1713) byl uskladněn v glycerolové mrazicí směsi při teplotě -80°C.

Buňky kmene MSD 2230 byly rozetřeny na agarové plotny obsahující 10 p.g/ml L-tetracyklinu tak, aby mohly být druhého dne odebrány jednotlivé kolonie. Bakterie byly pěstovány při inkubační teplotě 37°C. Šest jednotlivých kolonií kmene MSD2230 byly odebráno z kultivační plotny s tetracyklinem a resuspendováno v 10 ml vývaru s 10 gg/ml L-tetracyklinu. 100μ1 této kultury bylo okamžitě naočkováno šest 250 ml Erlenmeyerových baněk obsahujících 75 ml

-146“

4 · 4 4 4 · · 4 • 4 4 44 · 4 4444 444 « 4 44

Μ 4·4 «44 4· ·· 4 živného vývaru s 10 Mg/ml L-tetracyklinu. Po inkubaci trvající 15 až 16 hodin v shakeru při 300 otáčkách v minutě byly obsahy všech baněk shromážděny a použity k naočkování 15 litrového fermentoru obsahujícího médium podle obrázku 23 (U30D, B.Braun, Melsungen, SRN).

Valstní fermentace probíhala při teplotě 37°C za pH 6,7. pH bylo auomaticky kontrolováno přídavkem 6M hydroxidu sodného nebo 2M kyseliny sírové. Tlak rozpuštěného kyslíku byl nastaven na hodnotu 50% nasycení vzduchem a byl udržován regulací otáček míchadla mezi 200 až 1000 min'¹. Průtok vzduchu fermentorem byl udržován na hodnotě 20 standardních litrů v minutě což odpovídá 1,3 násobku obsahu nádoby za minutu automatickým regulátorem průtoku vzduchu firmy Tylan.

4,5 hodiny po naočkování začaly být bakterie ve fermentoru živeny přídavkem kvasničného extraktu (225 g.l'¹) přičemž rychlost přidávání činila ,190 až 210 ml. h'¹. Tato výživa byla do fermentoru přidávána po 28,5 hodin. 1,5 hodiny začátky přidávání extraktu bylo sníženo nastavení inkubační teploty fermentoru na 25’C. Když bylo této teploty asi po hodině dosaženo, začala indukce exprese analogu karboxypeptidázy D253K jednorázovým přídavkem 50% arabinózy do výsledné koncentrace 0,5% ve fermentační nádobě. Jednu až dvě hodiny po této indukci až do konce fermentace byla. do fermentoru přidávána směs glycerolu (714 g.l'¹) a síranu amonného (143 g.l'¹) rychlosti 45 až 55 ml za hodinu. Kultura byla sklizena asi 75 hodin po inokulaci a jendolitrové alikvoty kultury byly převedeny do centrifugačních kyvet o objemu ll.

Vyčerpané médium· bylo odděleno od bakteriálních buněk centrifugací v centrifuze Sorvall RC-3B při 7,000 x g za teploty 4°C. Centrifugace probíhala 30 minut. Centrifugací

-147φφ · • Φ φ φφ bakteriální kultury za těchto podmínek lze typicky získat zhruba 20 g sušiny na litr média.

Buněčná hmota byla purifikována následujícím způsobem. Buněčná hmota obsahující rekombinantní E.coli s rekombinantním enzymem, D253K HCPB byla vyjmuta z mrazáku, kde byla skladována pří teplotě -70°C a nechala se rozmrazit. Navážením byla stanovena hmotnost buněk na 309 gramů. Buňky byly poté resuspendovány přídavkem pufru A (obsahuje 2 0 0mM Tris (hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid (TRIS-HCl), 20% sacharózu, pH 8,0) za vzniku 320 ml konečné buněčné suspenze.

Suspenze byla poté inkubována 20 minut za pokojové teploty za občasného jemného míchání. Poté byl za pokojové teploty přidán stejný objem destilované vody a důkladně, promíchán se suspenzí. Buněčná suspenze se pak opět 20 minut inkubuje za pokojové teploty a občasného jemného míchání.

Osmoticky narušené buňky se poté zcentrifugují při 98000 x g (90 minut) a při teplotě 4°C. Po skončení centrifugace byl supernatant dekantací oddělen od peletovaných nerozpustných zbytků buněk. Objem čirého supernatantu činil 240 ml.

Deoxyribonukleáza 1 se rozpustí v 5 ml destilované vody, přidá se k supernatantu a reakční směs se 3 0 minut inkubuje za pokojové teploty a za stálého třepání aby viskozita směsi poklesla natolik, še může být nanesena na sepharózóvou afinitni kolonu s karboxypeptidázy (CNBr aktivovaná sepharÓza) připraví podle instrukcí dodaných s CNBr Sepharózou™ 4B od firmy Pharmacia a s karboxypeptidázy z bramborových hlíz (c-0279, Sigma). Suprenatant byl naředen 1:1 pufrem B (10 mM Tris-HCl, 500mM chlorid sodný, pH 8,0). pH supernatantu bylo upraveno na pH inihibitorem Kolona se aktivovanou inhibitorem

-148««9 «····· • 9 * * 9 · 9 · · · · 9 • 99 ««· 9 ·· 9 · · *·· 9 · 9« 9

8,0 a poté byl nanesen na kolonu předvrstvenou pufrem B o teplotě 4°C. Pak byla kolona přes noc promývána elučním pufrem (lOOmM uhličitan sodný, 500mM chlorid sodný, pH 11,4) o teplotě 4°C a při průtoku elučního pufru 05 ml/min dokud absorbance průchozího pufru nepoklesla zpět na hodnotu před nenesením vzorku.

Eluované lml frakce byly zmraženy na -20°C a poté byly pomocí Western blotu s myší monoklonální protilátkou 9E10 proti c-myc identifikovány ty, které obsahují rekombinantní karboxypeptidázu. Jako konjugátu bylo použito koňské-anti-myší protilátky s křenovou peroxidázou (a-9044, Sigma), který poskytuje barevnou reakci po přídavku 4-chloro-naftolu a peroxidu vodíku.

Frakce 11 až 44 obsahující rekombinantní karboxypeptidázu B byly spojeny, jejich pH nastaveno na 7,5 a poté zakoncentrovány pomocí centrifugační kolonky Millipore Ultrafree™ 20 (s prahem propustnosti 10 kDa). Poté byly rychle zamraženy na -20 °C a za této teploty skladovány. Purifikaci bylo získáno 4,7 mg mutované karboxypaptidázy D253K o 80% čistotě v objemu 0,95 ml.

Příklad 18: Syntéza neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od aspartát fenol mustard sloučeniny (sloučenina 5a, obrázek 27) (2S),2-(3-{4 -[bis-(2-chloroethyl) -amino)fenoxykarbonyl}-propionyl-amino)-jantarová kyselina K sytéze jsou použity podobné způsoby jako v referenčním příkladu 12. Dibenzyl ester (2S),2-(3- {4- [bis(2-chloroethyl) - amino) -fenoxykarbonyl}-propionylamino) jantarové kyseliny (sloučenina 4a) se 2 hodiny hydrogenuje při tlaku 0,5512 MPa (80 psi) za vzniku požadované konečného produkt, sloučeniny 5a. Výtěžek činí 86 %.

Vlastností sloučeniny 5a: 1HNMR (CD3OD) : 2,65 až 2,75 (t, 2H); 2,8 až 2,9 (m. 4H); 3,7 až 3,75 (m. 4H): 3,8 až 3,85

-149* · • · · · ·« · · a* • · «a· a a a a · a· a

(m, 4H) : 4,75	(t, 1H): 6,7 až 6,8	(m, 2H) ; 7,0 až 7,1 (m,
2H) .
MS (ESI): 471	až 4 73 (MNa)+
Anal.:	(CiaH22N2O7Cl2 1,4 H20)
Vypočteno:	%C:45,56 H: 5,27	N: 5,90
Nalezeno:	%C:4S.,79 H: 5,60	N: 5,91
Výchozí materiál sloučenina' 4a se připraví následujícím
způsobem.

Dibenzyl ester (2S),2-amino-jantarové kyseliny (sloučenina -2a) se nechá reagovat se sloučeninou 1 za vzniku dibenzyl esteru (2S),2-(3- karboxypropionylamino)-jantarové kyseliny (sloučeniny 3a) pó rekrystalizaci z diethyl etheru/hexanu. Výtěžek činí 80% Sloučenina 3a: 1HNMR (CDC1₃) : 2,42 až 2,66 (m, 2H) : 2,6 až 2,75 (m, 2H) ;

2,85 (dd, 2H) ; 3,1 (dd, 1H) ; 4,9 (dd, 1H) ; 5,05 (dd, 2H) ;

5,15 (s, 2H); 6,7 (d,lH); 7,25 až 7,5 (m, 10H).

MS (ESI) : 436 .[MNa] +

Anal. : (C₂₂H₂₃N0₇ O.4H₂0) :

Vypočteno: %C: 62,82 H: 5,70

Nalezeno: %C: 63,2 H: 5,75 N: 2,9

N: 3,33

Reakcí sloučeniny 3a vznikl požadovaný výchozí materiál sloučenina 4a s výtěžkem 78 %. Reakčni směs byla 3 hodiny míchána za pokojové teploty a sloušenina 4a byla purifikována mžikovou, chromatografií za použití diethyl etheru/hexanu (70/30 objemově) jako elučního činidla.

Sloučenina 4a; 1HNMR (CDCl₃) ; 2,55 až 2,65 (m, 2H); 2,8 aŽ

2,9 (m, 2H); 2,9 (dd, 1H); 3,1 (dd,lH); 3,6 (dd, 4H) ; 3,7 (dd, 4H) ; 4,9 (dd, 1H) ; 5,05 (dd, 2H) ; 5,15 (s, 2H) ; 6,58 (d, 1H); 6,65 (d, 2H); 6,95 (d, 2H); 7,25 až 7,4 (m, 10H).

-150• · • * ·

MS (ESI): 651 až 653 (MNa)+

Příklad 19: Syntéza neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od glutamát fenol-mustard (sloučenina 5b; obrázek 27) (2S),2-(3-{4-[bis-(2-chlornethyl)-amino)- fenoxykarbonyl} -propionyl -amino-pentandiová kyselina

K sytéze byly použity analogické způsoby jako v referenčním příkladu 12. Dibenzyl ester (2S),2-(3- {4-{bis(2-chloroethyl)- amino)- fenoxykarbonyl}propionylamino)-pentandiové kyseliny (sloučenina 4b) se 3 hodiny hydrogenuje za tlaku 0,4134 MPa (60 psi) přičemž vzniká požadovaný konečný produkt sloučenina 5b s výtěžkem 93 %.

Sloučenina 5b: 1HNMR (CD₃OD) : 1,9 až 2,0 (m, 1H) ; 2,1 až

2,2 (m, 1H); 2,35 až 2,45 (m,2H); 2,55 až 2,7 (m, 2H); 2,8 až 2,9 (m, 2H) ; 3,65 až 3,7 (m, 4H) ; 3,72 až 3,8 (m, 4H) ; 4,4 až 4,5 (m, 1 H); 6,75 (d, 2H); 6,95 (d, 2H).

MS (ESI): 485 až 487 (MNa)+

Výchozí materiál sloučenina 4b se připraví následujícím způsobem.

Dibenzyl . ester (2S),2-amino-pentandiové kyseliny (sloučenina 2b) se nechala reagovat za vzniku dibenzyl esteru (23),2-(3- karboxypropionylamino)-pentandiové kyselina (sloučeniny 3b) s kvantitativním výtěžkem.

Sloučenina 3b: 1 HNMR (CDC1J : 2,0 až 2,1 (m, 1H) ; 2 2 až

2.3 (m, 1H) ; 2,3 až 2,5 (m, 4H) ; 2,6 až 2,7 (m, 2H) ; 4,65 (dd, 1 H) ; 5,05 (s, 2H) ; 5,15 (s, 2H) ; 6,5 (d, 1 H) ; 7,3 až

7.4 (m, 10 H) .

-151• * • « · ·· ·

MS (ESI): 450 [MNa]+

Reakcí sloučeniny 3b vzniká požadovaný výchozí materiál sloučenina 4b s 82% výtěžkem.

Slo'	učenina 4b	: 1H	[NMR (CDClj)	: 1,	95 až 2,05 (m, 1H)	; 2,2 až
2,3	(m, 1H) ;	2,3	až 2,5 (m,	2H)	; 2,6 (dt, 2H); 2,	8 až 3,0
(m,	2H); 3,6	(dd,	4H); 3,7	(dd,	4H); 4,7 (dd, 1H);	5,1 (s,
2H)	; 5,2 (s,	2H) ;	6,3 (d, 1	H) ;	6,6 (d, 2H); 6,95	(d, 2H);
7,3	až 7,4 (m	, io	H) .
MS	(ESI): 665	až	667 (MNa)+

Příklad 20: Stanovení aktivity mutované lidské CPB a nativní lidské CPB proti analogům· neaktivních prekurzorů účinné látky Hipp-Asp a Hipp-Glu.

Purifikované mutantní lidské karboxypeptidázy B (CPB, D253K a D253R: viz příklady 15 až 17) a nativní lidské CPB připravené podle referenčního příkladu 20, byly testovány na svoji schopnost konverze hippuryl-L-asparagové kyseliny (Hipp-Asp, viz referenční příklad 10), hippuryl-L-glutamové kyseliny (Hipp-Glu, viz referenční příklad 9) nebo hippuryl-L-argininu (Sigma Chemical Company - Kat. č. H6625) na hippurovou kyselinu. Schopnost konverze byla testována pomocí HPLC.

250 μΐ reakční směsi obsahovalo 4 μg lidské CPB (nativní nebo mutantní) a 0,5 mM Hipp-Asp nebo Hipp-Glu v 0,025 M Tris-HCI, pH 7,5. Vzorky byly 5 hodin inkubovány při teplotě 37°C. Reakce byla ukončena přídavkem 250 μΐ‘80 % methanolu, 20 % destilované vody, 0,2 % trifluorooctové kyseliny. Množství vzniklé kyseliny hippurové bylo stanoveno pomocí HPLC.

HPLC analýza byla provedena pomocí HPLC systému Hewlett Packard 1090 Series 11 (s diodovým polem). Vzorky _ic9- ·♦ · · · · · · *·· ·

S ** 0 0 · « 0 0 0 0

0 00 0 00 0 0 0 0 0 0 po 50 μΐ byly natříknuty na kolonu Hichrom Hi-RPB (25 cm) rozděleny pomocí mobilní fáze sestávající z 40% methanolu, 60% destilované vody a 0,1 % trifluorooctové kyseliny pří průtokové rychlosti 1 ml/min. Množství produktu (hippurové kyseliny) vzniklé enzymatickou reakcí bylo stanoveno podle kalibračních křivek získaných ze známých množství kyseliny hippurové (Sigma-H6375). Výsledky jsou vyjádřeny jako procento konverze substrátu na produkt za 5 hodin při teplotě 37°C a s 4 μ$ enzymu, viz tabulka.

Konverze substrátů Hipp-Asp a Hipp-Glu mutantní a nativní lidskou karboxypeptidázou B (CPB)

Hipp-Asp Hipp-Glu Hipp-Asg % převedené na kyselinu hippurovou

Nativní CPB		0		0	100
mutantní CPB	D253K	78		91	<2
mutantní CPB	D253R	72		52	3
2 dat	vyplývá,	v ze	vložení	lysinového nebo
argininového	zbytku	na pozici	253 v lidské CPB místo zbytku
kyseliny asparagové	v	nativním enzymu	mění substrátovou
specilicitu	enzymu	tak,	v ze	je schopen	konverze Hipp-Asp

nebo Hipp-Glu. Naproti tomu nativní enzym není schopen konvertovat žádnou z těchto sloučenin na kyselinu hippurovou, ale konvertuje Hipp-Arg na hippurovou kyselinu. Nejvyšší aktivitu vykazoval .mutant D253K se substrátem Hipp-Glu.

Příklad 21 Stanovení Km á kcat mutantního enzymu HCPB D253K se substráty Hipp-Asp a Hipp-Glu

-153« ·

Purifikovaný HCPB D253K byl připraven tak, jak bylo popsáno v příkladul7. Tento zmutovaný enzym byl testován na svoji schopnost konverze Hipp-Asp {viz referenční příklad 10) a Hipp-Glu (viz referenční příklad 9) a byly určeny hodnoty jeho Km a kcat platné pro tyto substráty. Hipp-Glu a Hipp-Asp byly naředěny v rozsahu 0,25 až 8,0 mM respektive 0,25 až 5,0 mM v 0,025 M Tris-HCl pufru o pH 7,5. V případě potřeby bylo pří vzorků nastaveno na pH 7,5 pomocí 1M NaOH.

Pak byla k těmto vzorkům přidána mutovaná HCPB D253K (4 /ig/ml pro Hipp-Asp a 0,5 gg/ml pro Hipp-Glu) do celkového objemu 500 μΐ. Vzorky byly poté 5 ' hodin inkubovány při teplotě 37°C. Reakce byly ukončeny přídavkem 500 μΐ 80% methanolu s 0,2% triflorooctovou kyselinou. Množství hippurové kyseliny vzniklé reakcí bylo kvantifikováno pomocí HPLC, viz příklad 20.

Hodnoty konstant Km a Vmax byly spočítány za použití programu ENZFITTER™ (Biosoft, Perkin Elmer). Konstanta kcat byla spočítána z konstanty Vmax vydělením koncentrací enzymu v reakční směsi (molekulová hmotnost HCPB je 34 KDa). Výsledky viz tabulka.

Hodnoty Km a kcat pro konverzi Hipp-Asp a Hipp-Glu mutantní HCPB D253K

	Km(mM)	kcat (s*1)	kcat/Km (mM*1 .s1)
Hipp-Asp	2,7	0,26	0,1
Hipp-Glu	5,3	3,8	0,7

Údaje potvrzují, že nahrazením zbytku kyseliny asparagové lysinovým zbytkem na pozici 253 v lidské CPB vedou ke vzniku enzymu, schopného konvertovat jak Hipp-Asp tak i Hipp-Glu na hippurovou kyselina s rozumnou enzymovou

-154-

t* *	• ··	··
«	•	«	• ·	·	• · «
•	•	* «	• ·	* «	··· *
•	•	*	« *	•	• ·
··		·♦ ·	·· ·	»»	» · *

kinetikou. Poměr konstant kcat/Km je přibližně 7-krát vyšší se substrátem Hipp-Glu než se Hipp-Asp.

Příklad 22: Stanovení aktivity mutované HCPB a nativní HCPB proti neaktivnímu prekurzoru účinné látky odvozenému od kyseliny glutamové

Purifikovaná HCPB D253K a nativní lidská karboxypeptidáza B připravená podle příkladu 17 respektive referenčního příkladu 20 byly testovány na svoji schopnost enzymaticky odštěpit kyselinu glutamovou od neaktivního prekurzoru účinné látky založeného na kyselině glutamové (viz příklad 18). Štěpením se uvolňuje meziprodukt (viz referenční příklad 13), který se sám, ne-enzymaticky rozkládá za uvolnění aktivní fenol-mustard účinné látky. Konverze neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od kyseliny glutamové na tento meziprodukt byla měřena pomocí HPLC.

Neaktivní prekurzor účinné látky byl naředěn v rozsahu 0,25 až 5,0 mM v pufru 0,025 M Tris-HCI o pH 7,5. V případě potřeby bylo pH vzorků upraveno na 7,5 přídavkem IM NaOH·'. Mutantní HCPB D253K nebo nativní HCPB byly přidány do výsledné koncentrace 0,25 mg/ml. Vzorky byly ještě před přídavkem enzymu předehřátý na teplotu 37°C. Celkový reakčni objem činil 250 μΐ. Vzorky se 4 minuty inkubují pří teplotě 37°C. Reakce byla ukončena přídavkem 250 μΐ 98,8% MeCN, 0,2% TFA a vzorky dány na led. Množství vzniklého meziproduktu bylo stanoveno pomocí HPLC.

HPLC byla provedena tak, jak bylo popsáno v příkladu 20 kromě toho, že jako mobilní fáze bylo použito směsi MeCN/destilovaná voda (55 ku 45 objemově) s přídavkem 0,1 % TFA. Tento eluční roztok umožní separaci neaktivního prekurzoru účinné látky (retenční čas 4,9 minuty) a meziproduktu (retenční čas 8,4 minuty). Množství vzniklého meziproduktu bylo stanoveno pomocí kalibračních křivek získaných ze známých množství meziproduktu.

»« ·*· * · • · *»· · • * ·» *

-155• · «· ·· ·

Množství vzniklého meziproduktu, vzniklého z 5,0 mM a 0,2 mM roztoku neaktivního prekurzoru účinné látky činností nativní a mutované formy HCPB (D253K) v opakovaných vzorcích ukazuje tabulka str. 105.

Konverze neaktivního prekurzoru účinné látky na meziprodukt činností nativní a mutované formy HCPB (D253K)

	Koncentracew	intermediátu
Koncentrace neaktivního	Nativní HCPB	Mutantní HCPB
prekurzoru účinné látky (mM)
5,0	0,0	0,023 0,022
0,25	0,0	0,005 0,005

Hodnoty Km, Vmax a kcat pro lidský mutovaný enzym (D253K) a příslušný neaktivní prekurzor účinné látky se spočítá z množství meziproduktu vzniklého z různých koncetrací substrátu (0,25 až 3,0 mM) pomocí programu ENZFITTER™ viz příklad 21.

Výsledky pro· mutantní formu HCPB D253K:

Km = 1,25 mM

Vmax = 1,17 x 10'“mM. sec'¹ kcat = 0,016 sec'¹

Údaje potvrzují, že nahrazením zbytku kyseliny asparagové lysinovým zbytkem na pozici 253 v lidské CPB vedou ke změně substrátové specifity za vzniku enzymu, schopného konvertovat neaktivní prekurzor účinné látky odvozený od kyseliny glutamové na samovolně se rozkládající meziprodukt. Naproti tomu nativní forma enzymu není schopna této konverze. Vzehledem k tomu, že neaktivní prekurzor účinné látky má reletivně nízkou cytotoxicitu (viz příklad 23) a meziprodukt se ne-enzymaticky rozkládá za uvolnění volné fenol-mustard účinné látky, která zabíjí tumorové buňky (viz příklad 23) , ukazují výsledky mutace v aktivním •φ φφφφ

156 • φ · > φ φ φφ φ· φ místě CPB může dát vzniknout mutantní formě lidského enzymu, která je schopná konverze relativně málo cytotoxického prekurzorů účinné látky na účinnou cytotoxic látku schopnou usmrtit tumorové buňky.

Příklad 23: Cytotoxicita neaktivního prekurzorů účinné látky odvozeného od kyseliny glutamové a účinné látky fenol-mustard v lidských buňkách LoVo z kolorektálního nádoru.

Různá cytotoxicita neaktivního ' prekurzorů účinné látky odvozeného od kyseliny glutamové a odpovídající účinné látky s fenol mustard pro nádorové buňkky byla dokázána následujícím způsobem.

Nádorové buňky LoVo z kolorektálního tumoru byly 1 hodinu inkubovány s prekurzorem účinné látky nebo s účinnou látkou o různých konečných koncentracích v rozmezí 5 χ 10'⁴, až 5 x 10‘^a M. v 96-jamkových mikrotitračních deskách (2,500 buněk na jamku) při teplotě 37°C. Poté byly buňky promyty a další 3 dny inkubovány při teplotě 37° C. Poté byla do jamek přidána TCA a jamky byly promytím zbaveny mrtvých buněk. Množství buněčných proteinů adherujících ke stěnám jamky bylo stanoveno pomocí barviva SRB tak, jak bylo popsáno v publikaci P. Skehan a další J. Nati. Cancer Inst. 82, 107 (19.90) . Účinost jednotlivých sloučenin byla vyjádřena koncentrace nutnou k inhibici buněčného růstu o 50% (IC50).

Z pokusu s Lo Vo buňkami ošetřenými přímo účinnou látkou fenol-mustard vyplynula IC50 této účinné látky přibližně 1 μΜ. Naproti tomu neaktivní prekurzor účinné látky založený na glutamové kyselině byl mnohem méně cytotoxický (IC50 byla přibližně 50μΜ), viz obrázek 22. Z toho vyplývá, že neaktivní prekurzor účinné látky s glutamovou kyselinou je přibližně 50-krát méně cytotoxický pro nádorové buňky než vlastní účinná látka fenol-mustard.

• 4

-15744 »

4

44 44 4*44

4 4 «4 4

4 4 4 · 4

4 4 « «44 4

4« 44

444 44 44 4

Když se přidá 100 μg mutantantní HCPB D253K připravené podle příkladu 17 do testovacích jamek obsahujících neaktivní prekurzor účinné látky s glutamovou kyselinou, může být pozorována cytotoxicita srovnatelná s aktivní účinnou látkou. To dokazuje konverzi neaktivního prekurzoru účinné látky mutovaným enzymem za vzniku mnohem silněkší látky účinné.Přitom přídavek lOOpg nativní lidské CPB do každé jamky nijak významně cytotoxicitu naektivního prekurzoru účinné látky nezvýší. Tyto pokusy dokazují schopnost zmutované lidské karboxypeptidázy B D253K selektivně konvertovat poměrně neaktivní prekurzor účinné látky na silnou, cytotoxicky účinnou látku schopnou usmrtit nádorové buňky.

Příklad 24: Příprava fúzního proteinu: humanizovaný fragment A5B7 F(ab¹)2-D253K HCPB

Opakuje se postup popsaný v referenčním příkladu 21, ale⁷ místo sekvencí pro myší lehký řetězec A5B7 a Fd se použijí sekvence pro humanizovaný fragment A5B7 a místo sekvence pro HCPB se použije sekvence pro HCPB D253K. Fúzní protein je poté exprimován buňkami COS po kotransfekcí sekvencí pro prepro-HCPB tak, jak bylo popsáno v referenčním příkladu 21.

Exprese fúzního proteinu ve velkém měřítku byla provedena tak, že do ll buněk COS-7 byl transientně vložen plazmidový vektor s (750 μg každého z vektorů), viz referenční příklad 21. Výsledný produkt byl purifikován buď průchodem supernatantu. obsahujícího fúzní protein přes imobilizovaný protein A a elucí vázaného fúzního proteinu pufrem s vysokým pH nebo průchodem supernatantu obsahujícího fúzní protein přes imobilizovaný inhibitor karboxypeptidázy a dalším pokračováním purifikace rekombinantní karboxypeptidázy podle příkladu 12. Oba způsoby mohou zahrnovat další purifikaci fúzního proteinu buď gelovou permeační chromatografií, chromatografií na • 4

4 ·

-158- ; *

4

4« 4

44 44 4444 · 4 4 · ·

4 4 4 4 4 4 4 4 4 « >44 4

4 4 4 4

44444 44 4 iontoměniči nebo hydrofobní interakční chromatografií nebo jejich kombinací.

Dále se opakuje postup popsaný v referenšním příkladu 21, ale myší sekvence Fd a lehký řetězec podle Sekvencí id. č.: 25 a 26 jsou nahrazeny humanizovanými sekvencemi podle Sekvencí id. č.28 respektive 29. Sekvence pro nativní HCPB z referenčního příkladu 21 je nahrazena sekvence pro karboxypeptidázu D253K [viz příklad 15, ale bez (His)6-c-Myc značky).. Templát .pro PCR z referenčního příkladu 21 (pICI1698) je nahrazen plazmidem pldl7l3 (viz příklad 15).

Humanizované sekvence podle Sekvencí id. č.; 28 a 29 mohou být připraveny mnoha způsoby včetně těch popsaných v publikacích Edwards (1987) Am. Biotech. Lab. 5, 38 až 44..

Jayaraman a další (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88,. 4084 až 4088, Foguet a Lubben (1992) Biotechniques 13, 674' až 675 a Pierce (1994) Biotechniques 16, 708.

Příklad 25: Přípravu D253K HCP.B fermentací v třepané nádobě

E.coli kmene MSD 213 se transformují plazmidem pICI 1713 (viz příklad 15) a výsledný kmen MSD 213 pZen 1713 se uskladní v glycerolu za teploty -80°C. Alikvot buněk kmene MSD 213 pZen 1713 se rozetře na agarové plotny s L-tetracyklin tak, aby se druhého dne po inkubaci při teplotě 37°C mohly to separovat jednotlivé kolonie. Jediná kolonie MSD 213 pZen 1713 byla odebrána z této plotny použita k naočkování 250ml Erlenmeyer baňky obsahující 75ml vývaru s L-ťetracyklinem. Po inkubaci trvající 16h při teplotě 37°C na třepačce byl použit obsah baňky pro naočkování devíti 21 Erlenmeyerových baněk obsahujících 600ml vývaru s L-tetracyklinem do OD_sso=0,l. Tyto baňky se poté na třepačce inkubují při teplotě 20°C dokud OD_S50 nedosáhne hodnoty 0,5. V tomto okamžiku se indukuje »* A···

-159Μ «. * ·· • · ·» ·**·»· » • · · *··♦♦♦ * · · * · · · *«»· « · · · · · · · ·· ··· ··» ·· ·· produkce heterologického proteinu přídavkem L-arabinózy do kultivačního média do výsledné koncentrace 0,01% w/v a v inkubaci se pokračuje při teplotě 20°C tak, jak bylo popsáno výše po dalších 42 hodin. Vyčerpané médium se oddělí od bakteriálních buněk centrifugací na centrifuze Sorvall RC-3B (7000 x g, 4°C, 30 minut) a buněčná hmota se uskladní při -70°C.

Příklad 26: Použití ADEPT v autologní transplantaci kostní dřeně

Autologní transplantace kostní dřeně zahrnuje odebrání části vlastní dřeně pacienta jetě předtím, než je mu poskytnuta intenzivní radiochemoterapie. Poté se pacientovi navrátí jeho vlastní kostní dřeň. U některých druhů nádorových onemocnění jako například u leukémií a lymfomů. B- a T-buněk a karcinomů prsu, plic nebo střeva infiltrují maligní buňky dřeň a musí být zničeny ještě před vrácením dřeně pacientovi. K tomuto účelu byly používány konjugáty protilátka -toxin viz Blakey, D. C. a další, Prog. Allergíe svazek 45, 50, 1988) .

K tomuto účelu může být použit ADEPT, zvláště pak, jsou-li použita reaktivní alkylační činidla založená na látce mustard jakožto účinné složky. Kostní dřeň pacienta, obsahující nádorové buňky se inkubuje s vhodným konjugátem protilátka-enzym. Poté co se- protilátka selektivně naváže na nádorové buňky, přebytečný konjugát se vymyje. Poté se přidá neaktivní prekurzor účinné látky a v blízkosti antigen-pozitivních nádorových buněk se začne tvořit účinná látka. Výsledkem je selektivní usmrcení nádorových buněk.' Normální buňky kostní dřeně mohou být chráněny vhodným ředěním kostní dřeň tak, aby byla zajištěna dostatečná vzdálenost mezi místem vzniku účinné látky na nádorové buňce a zdravými buňkami kostní dřeně. Dojde tak dříve k inaktivaci účinné látky než k zasažení buněk kostní dřeně. Přídavek proteinu, který pak tvoří nukleofil pro reaktivní

-160φ φ φ φ «φ φ φ φ ·· • φ φ • ΦΦΦ • · φ φφ φφφ φφφ «φ

ΦΦ φφφφ φ φ · φφφ φ φ φ » • · • Φ · mustard účinnou látku, může být rovněž použit pro minimalizaci poškození normální kostní dřeně.

Příklad 27: Použití mutované glukuronidázy pro ADEPT s opačnou polaritou

Lidská glukuronidáza dalším enzymem u kterého může být použit koncept 'reverzní polarity' pro přípravu specifického lidského enzymu, schopného štěpení neaktivního prekurzoru účinné látky za uvolnění aktivní účinné látky. Bosslet a další, Cancer Res. 54, 2151, 1994 popisují neaktivní prekurzor účinné látky založený na adriamycin-glukuronidu jako substrátu pro nativní lidskou glukuronidázu a popisují rovněž syntézu škály alternativních prekurzorů účinné látky z nichž pak vznikají příslušné účinné látky, viz Bosslet v patentové přihlášce AU - 50225/93. Endogenní nativní glukuronidáza přítomná v krvi a tkáních však může popřípadě konvertovat tyto prekurzory účinných látek za uvolnění aktivní účinné látky bez nutné přítomnosti konjugátu protilátka-glukuronidáza a tím·vlastně snížit specifitu léčby. Cheng a Touster (J.B.C. 247, 2650, 1972) popisují, že v aktivním místě glukuronidázy je pozitivně nabitá aminokyselina, která reaguje s negativně nabitou karboxylovou skupinou na glukuronidovém kruhu.

HO

OH

-161«44 «4

4

4

4

4 «4

4«

4 4 4 4 β

4 4 » 4 «

44 4444

4 4 4 4

4 4« 4 * 4 •4 4444

Glukuronid múze být bud' přímo navázán na cytotoxické činidlo nebo s ním muže být spojen linkerem například takovým, jaký je popsán v publikaci Bosslet a další, (Cancer Res.) 54, 2151, 1994 a Patent Au-A-50225/93). Je-li negativně nabitá karboxylová skupina glukuronidového kruhu nahrazena pozitivně nabitou skupinou R, například = L-CH₂-NH₂ nebo L-CH₂-NHR' (kde R' = C_{x ai 4} alkyl a L = [CH₂]_{Oaí 3} nebo jiné vhodné linkery) přestane být tento prekurzor účinné látky substrátem pro nativní glukuronidázu. A 'je-li kladně nabitý zbytek v aktivním miste glukuronidázy zaměněn za záporně nabitou aminokyselinu nqapříklad glutamovou nebo asparagovou, pak tato mutantní glukuronidáza bude konvertovat selektivně kladně nabitý prekurzor účinné látky podobným způsobem jako analogické příklady RNázy a karboxypeptidázy B. Tím může být koncept reverzní polarity rozšířen i na lidskou glukuronidázu a kladně nabité prekurzory účinné látky.

LÁTKA ····

- J. V Za ·· · » * ·♦ • · * • · · f • · · tl »·· «· ·· ♦ » • · · • « · · • · · ttt 99

9 • ·

99· 9

9 ·

Seznam sekvencí

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 1:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 30 basí
<B)	TYP: nukleová kyselina
(O	POČET VLÁKEN: jedno
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(xi)	POPIS SEKVENCE ID.Č. 1:
GGTCTGCCCA TTCTCGCAGC CAACATTTTT
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 2:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 30 basí
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	POČET VLÁKEN: jedno
(D)	TOPOLOGIE; 1ineární
(xi)	POPIS SEKVENCE ID.Č. 2:
TGCTACCAGA GCTACTCCAC CATGAGCATC
INFORMACE, 0 SEKVENCI ID. Č. 3:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 30 basí
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	POČET VLÁKEN: jedno
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(xi)	POPIS SEKVENCE ID.Č. 3:

AATGTTGCCT GCGAGAATGG GCAGACCCAAT INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 4:

(l) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 4:

CTGGGAGCAC ACGGCCTGGA CATCAGCCA

-163-

•	Φ «·		• ·	MM
«	» ·	•	• ·	*
• v	• ·	• ·	* ··	•
• ·· ·	• « ··* ··	•	• • ·	• •

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 5:

CGCGCGAATT CGGGTCCAGC CTTCCCTGGG C INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 6:

GGCCGGAATT CCATCAAAGT GGACTGGCAC A INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE.· lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 7:

CGCTGTTGGT CCTGGTGCTG CTGCTGGTGC GGGTCCAGCC TTCCC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 8:

TGATGGCTCT GAAGTCCCTG GTCCTGTTGT CGCTGTTGGT CCTGG

-164φ· · · ·· ···»·*

Φ v «· · · · · · · ·

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 46 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 9:

GCGCGAATTC ATGTTCTTGG AGGATGATTG ATGGCTCTGA AGTCCC INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 10:

CGCGGAATTC CTAGGTAGAG TCTTCAACAG AAGCATCAAA GTGGACTG INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:· (A) DÉLKA: 33 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 11:

AAGGAATCCG CTGCCGCTAA ATTCCAGCGG CAG INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: ' (A) DÉLKA: 30 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 12:

GGAAGGCTGG ACCCGCACCA GCAGCAGCAC a ··»· * a

-165»a a a aa a a a a · · a a a a a · a a a a · á * * a · · · «· a a · a a a aa

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 13:

CTGGAATTTA GCGGCAGCGG ATTCCTTGCC CAG INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 14:

CATATGGACT CAGACAGTTC CCCCAGCAGC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 15:

GTGTGAATTC CCATGGCGAA GGAATCCGCT GCCGCTAAA INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 basí (B) TYP: nukleová kyselina <C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 16:

GTGTGAATTC CTAGGTAGAG TCTTCAACAG AAGC

•		ft	•	« *		ft ·
•	•	•	« ·		ft	•	ft
•	•	• ·	• *		• ·	• ·	ft
	•	•	• ft		•		•
• ·		ft· ·	• ·	• ft		•

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 17:

ATATAAAGCT TGCCGCCACC ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 18:

ATCGAATTCG CCGCCACCAT GGATTTTCAA GTGCAGATTT TCAGCTTC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 19:

TGAGAATTCT TACTATGTAC ATAGCAAGG CTTACAAGG CAATC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 20:

GCGCCGAATT CTTATTAACA CTCATTCCTG TTGAA ·· ····

-167-

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 21
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 30 basí
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	POČET VLÁKEN: jedno
(D)	TOPOLOGIE; lineární
(xi)	POPIS SEKVENCE ID.Č. 21:

GACCTGGAAC TCTGGATCTC TGTCCAGCGG INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 basí (8) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (XÍ) POPIS SEKVENCE ID.Č. 22:

AGGTGCAC ACCGCTGGAC AGAGATCCAG INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 23:

TGGTACCAGC AGAAGCCAGG TTCCTCCCCC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 24:

GGATTTGGGG GAGGAACCTG GCTTCTGCTG • « « *

-168INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 777 páru basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 25:

AAG

CTT

GCC

GCC

ACC

ATG AAG

TTG TGG Leu Trp

CTG AAC TGG ATT

TTC Phe

CTT Leu 10

GTA Val

43

Met 1

Lys

Leu 5

Asn

Trp

Ile

ACA

CTT

TTA

AAT

GGT

ÁTC

CAG

TGT

GAG

GTG

AAG

CTG

GTG

GAG

TCT

GGA

96

Thr

Leu

Leu

Asn

Gly

Ile

Gin

Cys

Glu

Val

Lys

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

15

20

25

GGA

GGC

TTG

GTA

CAG

CCT

GGG

GGT

TCT

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GCA

ACT

144

Gly

Gly

Leu

Val'

Gin

Pro

Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Thr

30

35

40

TCT

GGG

TTC

ACC

TTC

ACT

GAT

TAC

TAC

ATG

AAC

TGG

GTC

CGC

CAG

CCT

192

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Thr

Asp

Tyr

Tyr

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

45

50

55

CCA

GGA

AAG

GCA

CTT

GAG

TGG

TTG

GGT

TTT

ATT

GGA

AAC

AAA

GCT

AAT

240

Pro

Gly

Lvs

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Asn

Lys

Ala

Asn

60

65

70

75

GGT

TAC

ACA

ACA

GAG

TAC

AGT

GCA

TCT

GTG

AAG

GGT

CGG

TTC

ACC

ATC

238

Gly

Tyr

Thr

Thr

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

30

85

90

TCC

AGA

GAC

AAA

TCC

CAA

AGC

ATC

CTC

TAT

CTT

CAA

ATG

AAC

ACC

CTG

336

Ser

Arg

Asp

Lys

Ser

Gin

Ser

Ile

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Thr

Leu

95

100

IOS

AGA

GCT

GAG

GAC

AGT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGT

ACA

AGA

GAT

AGG

GGG

CTA

384

Arg- Ala

Glu

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Asp

Arg

Gly

Leu

110

115

120

CGG

TTC

TAC

TTŤ

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGC

ACC

ACT

CTC

ACA

GTC

TCC

432

Arg

Phe

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

125

130

135

TCA

GCC

AAA

ACG

ACA

ccc

CCA

TCT

GTC

TAT

CCA

CTG

GCC

CCT

GGA

TCT

480

Ser

Ala

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Ser

140

145

150

155

···· • Φ φ • * ··

-169- : : :

• · ·» «·»

GCT

GCC

CAA

ACT

AAC

TCC

ATG

GTG

ACC

CTG

GGA

TGC

CTG

Ala

Ala

Gin

Thr

Asn 160

Ser

Met

Val

Thr

Leu 165

Gly

Cys

Leu

TAT

TTC

CCT

GAG

CCA

GTG

ACA

GTG

ACC

TGG

AAC

TCT

GGA

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Thr

Trp

Asn

Ser

Gly

175 180

GTC	AAG	GGC
Val	Lys	Gly
	170
TCT	CTG	TCC
Ser	Leu	Ser
185

528

576

AGC GGT GTG Ser Gly Val

CAC ACC TTC CCA GCT

GTC Val

CTG Leu

CAG TCT GAC CTC

TAC Tyr

ACT Thr

624

His

Thr Phe Pro Ala 195

Gin Ser

Asp 200

Leu

190

CTG

AGC

AGC

TCA

GTG

ACT

GTC

CCC

TCC

AGC

ACC

TGG

CCC

AGC

GAG

ACC

672

Leu

Ser

Ser

Ser

Val

Thr

Val.

Pro

Ser

Ser

Thr

Trp

Pro

Ser

Glu

Thr

205

210

215

GTC

ACC

TGC

AAC

GTT

GCC

CAC

CCG

GCC

AGC

AGC

ACC

AAG

GTG

GAC

AAG

720

Val

Thr

Cys

Asn

Val

Ala

His

Pro

Ala

Ser

Ser

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

220

225

230

225

AAA

ATT

GTG

CCC

AGG

GAT

TGT

GGT

TGT

AAG

CCT

TGC

ATA

TGT

ACA

TAG

768

Lys Ile	Val	Pro Axg Asp	Cys	Gly	Cys	Lys	Pro Cys Ile Cys Thr End
		240				245	250
TAA GAA	TTC							777
INFORMACE	O	SEKVENCI	ID .	Č .	26 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 732 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina ÍC) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 26:

GAA

TTC

GCC GCC ACC ATG GAT TTT CAA GTG CAG

ATT TTC

AGC TTC CTG

48

Met Asp 1

Phe

Gin Val 5

Gin

Ile

Phe

Ser

Phe 10

Leu

CTA

ATC

AGT

GCT

TCA

GTC

ATA

ATG

TCC

AGA

GGA

CAA

ACT

GTT

CTC

TCC

96

Leu

Ile

Ser

Ala

Ser

Val

Ile

Met

Ser

Arg

Gly

Gin

Thr

Val

Leu

Ser

15

20

25

CAG

TCT

CCA

GCA

ATC

CTG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACA

ATG

144

Gin

Ser

Pro

Ala

Ile

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

30

35

40

»· ···

-170-

ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA ACT TAC ATT CAC TGG TAC CAG CAG

192

Thr Cys 45

Arg

Ala

Ser Ser

Ser Val 50

Thr Tyr

Ile

His SS

Trp Tyr

Gin

Gin

AAG

CCA

GGT

TCC

TCC

CCC

AAA

TCC

TGG

ATT

TAT

GCC

ACA

TCC

AAC

CTG

240

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Ser

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

60

65

70

75

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

GCT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

238

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

80

85

90

TAC

TCT

CTC

ACA

ATC

AGC

AGA

GTG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

336

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

95

100

105

TAC

TGC

CAA

CAT

TGG

AGT

AGT

AAA

CCA

CCG

ACG

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

384

Tyr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ser

Lys

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly Gly

Gly

Thr

110

115

120

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

GCT

GAT

GCT

GCA

CCA

ACT

GTA

TCC

ATC

TTC

432

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

Ile

Phe

125

130

135

CCA

CCA

TCC

AGT

GAG

CAG

TTA

ACA

TCT

GGA

GGT

GCC

TCA

GTC

GTG

TGC

480

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu

Gin

Leu

Thr

Ser

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Val

Cys

140

145

150

15S

TTC

TTG

AAC

AAC

TTC

TAC

CCC

AAA

GAC

ATC

AAT

GTC

AAG

TGG

AAG

ATT

S28

Phe

Leu

Asn

Asn

Phě

Tyr

Pro

Lys

Asp

Ile'

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

Ile

160

165

170

GAT

GGC

AGT.

GAA

CGA

CAA

AAT

GGC

GTC

CTG

AAC

AGT

TGG

ACT

GAT

CAG·

576

Asp

Gly

Ser

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

175

180

185

GAC

AGC

AAA

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

ATG

AGC

AGC

ACC

CTC

ACG

TTG

ACC

624

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

190

195

200

AAG

GAC

GAG

TAT

GAA

CGA

CAT

AAC

AGC

TAT

ACC

TGT

GAG

GCC

ACT

CAC

672

Lys

Asp

Glu

Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

GlU

Ala

Thr

His

205

210

215

AAG

ACA

TCA

ACT

TCA

CCC

ATT

GTC

AAG

AGC

ŤTC

AAC

AGG

AAT

GAG

TGT

720

Lys

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu·

Cys

220

225

230

235

TAA TAA GAA TTC

End End

732 ···· 4···*· 4

Ii-i-j 444 444*44 /X” 44 ·« 4>4· 444 4

444 4*4 44

444 «44 44 44 ·

INFORMACE Ο SEKVENCI ID. Č. 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 27:

TCGCTATTAC CATGGTGAGT CGGTTTTGGC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 777 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 28:

AAG CTT GCC

GCC

ACC ATG Met 1

AAG TTG TGG

CTG AAC TGG ATT TTC CTT GTA

48

Lys

Leu

Trp

Leu 5

Asn Trp

Ile

Phe.

Leu 10

Val

ACA

CTT

TTA

AAT

GGT

ATC

CAG

TGT

GAG

GTG

CAG

CTG

CTG

GAG

TCT

GGA

96

Thr

Leu

Leu

Asn

Gly

Ile

Gin

Cys

Glu

Val

Gin

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

1Ξ

20

25

GGA

GGA

CTG

GTG

CAG

CCT

GGA

GGA

TCT

CTG

AGA

CTG

TCT

TGT

GCA

ACA

144

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Thr·

30

35

40

TCT

GGA

TTC

ACC

TTC

ACA

GAC

TAC

TAC

ATG

AAT

TGG

GTG

AGA

CAG

GCA

192

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Thr

Asp

Tyr

Tyr

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

45

50

55

CCT

GGA

AAG

GGA

CTC

GAG

TGG

CTG

GGC

TTC

ATC

GGA

AAT

AAG

GCA

AAT

240

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Asn

Lys

Ala

Asn

60

65

70

75

GGA

TAC

ACA

ACA

GAG

TAC

TCT

GCA

TCT

GTG

AAG

GGA

AGA

TTC

ACA

ATT

268

Gly

Tyr

Thr

Thr

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

60

85

90

TCC

AGA

GAC

AAG

AGC

AAG

TCC

ACA

CTG

TAC

CTG

CAG

ATG

AAT

ACA

CTG

336

Ser

Arg

Asp

Lys

Ser

Lys

Ser

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Thr

Leu

100 105

-172• 9 · 99 ··· ·9

CAG GCA GAG GAC TCT

GCA ATT TAC TAC TGT ACA AGA GAC AGA GGA CTG

384

Gin Ala Glu

Asp Ser

Ala

Ile

Tyr 115

Tyr

Cys

Thr Arg Asp 120

Arg

Gly

Leu

110

AGA

TTC

TAC

TTC

GAC

TAC

TGG

GGA

CAG

GGA

ACA

CTG

GTG

ACA

GTG

TCT

432

Arg

Phe

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

125

130

135

TCT

GCT

AGC

ACC

AAG

GGA

CCA

TCG

GTC

TTC

CCC

CTG

GCC

CCC

TGC

TCC

480

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

140

145

150

155

AGG

AGC

ACC

TCC

GAG

AGC

ACA

GCC

GCC

CTG

GGC

TGC

CTG

GTC

AAG

GAC

528

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

160

165

170

TAC

TTC

CCC

GAA

CCG

GTG

ACG

GTG

TCG

TGG

AAC

TCA

GGC

GCT

CTG

ACC

576

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

175

180

105

AGC

GGC

GTG

CAC

ACC

TTC

CCG

GCT

GTC

CTA

CAG

TCC

TCA

GGA

CTC

TAC

624

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

ser

Gly

Leu

Tyr

190

195

200

TCC

CTC

AGC

AGC

GTC

GTG

ACG

GTG

CCC

TCC

AGC

AAC

TTC

GGC

ACC

CAG

672

Ser

Leu

ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

205

210

215

ACC

TAC

ACC

TGC

AAC

GTA

GAT

CAC

AAG

CCC

AGC

AAC

ACC

AAG

GTG

GAC

720

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

220

225

230

235

AAG

ACA

GTT

GAG

CGC

AAA

TGT

TGT

GTC

GAG

TGC

CCA

CCG

TGC

CCG

TAA·

768

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

End

240

245

250

TAG GAA TTC End

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 732 párů basí (S) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 29:

•I ····

-173* »♦· * ♦ • · • · • » • · * » · · ·*· · « · »· ·

GAA

TTC

GCC

GCC ACC

ATG MeC 1

GAT Asp

TTT CAA Phe Gin

GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG

48

Val 5

Gin

Ile

Phe

Ser

Phe 10

Leu

CTA

ATC

AGT

GCT

TCA

GTC

ATA

ATG

TCC

AGA

GGA

CAG

ACT

GTA

CTC

ACT

96

Leu

Ile

Ser

Ala

Ser

Val

Ile

Met

Ser

Arg

Gly

Gin

Thr

Val

Leu

Thr

15

20

25

CAG

AGT

CCA

AGT

AGT

CTC

AGT

GTA

AGT

GTA

GGT

GAT

AGG

GTA

ACT

ATG

144

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Mec

30

35

40

ACT

TGT

AGC

GCC

AGT

AGT

AGT

GTA

ACT

TAT

ATC

CAT

TGG

TAT

CAG

CAG

192

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

val

Thr

Tyr

Ile

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

45

50

55

AAA

CCA

GGT

CTC

GCC

CCA

AAA

AGT

TGG

ATC

TAT

GCC

ACT

AGT

AAC

CTC

240

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

Ser

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

60

65

70

75

GCC

AGT

GGT

GTA

CCA

TCT

AGA

TTC

AGT

GGT

AGC

GGT

AGT

GGT

ACT

GAT

288

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

80

85

90

TAT

ACT

CTC

ACT

ATC

AGT

AGT

CTC

CAG

CCA

GAA

GAT

ATC

GCC

ACT

TAC

336

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

95

100

105

TAT

TGC

CAG

CAT

TGG

AGT

AGT

AAA

CCA

CCA

ACT

TTC

GGT

CAG

GGT

ACT

384

Tyr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ser

Lys

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

110

115

120

AAA

GTA

GAA

GTA

AAA

CGT

ACT

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

432

Lys

val

Glu

Val

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pra

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

125 130 135

CCG

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

480

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

140

145

150

1SS

CTG

CTG

AAT

AAC

TTC

TAT

CCC

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAG

GTG

528

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

160

16S

170

GAT

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

, CAG

S76

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

val

Thr

Glu

Gin

175

130

185

·· · · · ·· ···· ···· «· · · · · · τ *7 A · · · ···♦·· ” X / 4: - » * ·· * » t · »·· ·

GAC Asp

AGC Ser

AAG Lys 190

GAC AGC ACC Asp Ser Thr

TAC AGC

CTC Leu

aa AGC Ser

aaa AGC Ser

a ACC Thr

• · ··

aa CTG Leu

a AGC Ser

624

CTG Leu 200

ACG Thr

Tyr

Ser 195

AAA

GCA

GAC

TAC

GAG

AAA

CAC

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

672

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

205

210

215

CAG

GGC

CTG

AGT

TCG

CCC

GTC

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

720

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

220

225

230

235

TAA

TAG

GAA

TTC

732

End End

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 30:

AAGGTCACCT GCGAAAACGG GCAGGGCAAC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 31:

CTGGAAACAG ACATTCTGGA CATCT INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 32;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) · DÉLKA: 30 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE; lineární

4···

-175• 4

44« • 4 4 4 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 32:

GCCCTGCCCG TTTTCGCAGG TGACCTTTTC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 33:

TGCTACAAGA GCAACTCCAG CATGCA INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 34:

CTCTAGGAAT TCTTATTAGT ACAGGTGTTC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 35:

CAGGACGTAG C (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 108 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (Xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 35:

CCCAAGCTTG CCGCCACCAT GTTGGCAGTC TTGGTTCTGG TGACTGTGGC CCTGGCATCT GCTGCAACAG GACACAGTTA TGAGAAGTAC AACAAGTGGG AAACGATA

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:16 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (Dj TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 36:

-176··· • *·

AACAGCTATG ACCATG

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 37:

GTAAAACGAC GGCCAGT INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 38:

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 39:

CAGACTCTGČ AGCAGGTCCA CAG INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 40 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární

-177(xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 40:

CCCAAGCTTG CCGCCACCAT GTTGGCACTC TTGGTTCTGG TGACTGTGGC CCTG

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 41
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 39 basí
(8)	TYP: nukleová kyselina
(C)	POČET VLÁKEN: jedno
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(xi)	POPIS SEKVENCE ID.Č. 41:

CTCATAACTG AATTCTTATT AACGAACCCG GCTATCAAA INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 42:

GGATCTGCTG CCCAAGCTTA CTCCATGGTG ACCC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 80 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (Xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 43:

CTTCTCATAA CTGTGTCCTG TTGCGAACAC GCTGCTCACC TCGGGCACTG TACATATGCA AGGCTTACAA CCACAATCCC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární

-178(xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 44:

GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTGCCC GAGGTGAGCA GCGTGTTCGC AACAGGACAC AGTTATGAGA AGTACAAC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA,: 2 7 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 45:

CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TGCCTCC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 basí (8) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 46:

GTTGGAGCTC TTGGTTCTGG INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 basi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 47:

CAAGGCCTCG AGCTTTCTCA AC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární

- J. / 27 • • * * * * · * · ·· • · · · » • · · ··· · * · · · ·» ·· ·

(xi)	POPIS SEKVENCE ID.C.	49 :
GTTTGATTCT AGAGTTCGTG C
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č.	4 9
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 22 basí
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	POČET VLÁKEN: jedno
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(xi)	POPIS SEKVENCE ID.Č.	49 :

TTGTAAAACG ACGGCCAGTG AG

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 50
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 24 basí
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	POČET VLÁKEN: jedno
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(xi)	POPIS SEKVENCE ID.Č. 50:

GAAACAGCTA TGACCATGAT TACG INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 basí . (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (XÍ) POPIS SEKVENCE ID.Č. 51:

CAGACTCTGC AGCAGGTCCA CAG INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární

444

4 • 4 · · *

4 · 4 • · ·

4« ·* · (Xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 52:

GGACCTGCTG CAGAGTCTG INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 53:

GCCTGTGCTC AATATTGATG G INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 54:

CCGTGTTAAA GCAGAAGATA CTG INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE;

(A) DÉLKA: 23 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 55:

GCTACTGTGA AAGAACTTGC CTC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1263 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární

0-4

-181• · Mil • Φ Φ φ φφ • ♦ ··' ·»·· φ « · φ·· ·>·♦♦· * · · · φ · · φ · · · · « · · ··· · ♦ φφ ΦΦ· ··· ·· φ· · (χΐ) POPIS SEKVENCE ID.C. 56:

GAGCTCTTGG TTCTGGTGAC TGTGGCCCTG GAAGGCGAGA AGGTGTTCCG TGTTAACGTT GAGTTGGCCA GCACGACCCA GATTGACTTC CCTCACAGTA CAGTTGACTT CCGTGTTAAA CTAAAGCAGA ATGAACTACA ATACAAGGTA GCTCAGTTTG ATAGCCGGGT TCGTGCAACA GAAACGATAG AGGCTTGGAC TCAACAAGTC AGTGTTATCG GAACCACATT TGAGGGACGC GGACAAAATA AGCCTGCCAT TTTCATGGAC CCTGCATTCT GCCAGTGGTT TGTAAGAGAG GTGACAGAGC TTCTCGACAA GTTAGACTTT TACATCTACA CCTGGACCAA GAGCCGATTT TCTAGCTGCA TTGGCACAGA CCCCAACAGA GCCTCTCGAA ACCCCTGTGA TGAAACTTAC ACCAAGGCCC TGGCTGATTT CATCCGCAAC ATCCACTCGT ACTCCCAAAT GATGATCTAC AACAATGCTG AGTTGAATGC CCTGGCTAAA GGCACCAAGT ACACATATGG CCCGGGAGCT GACGACTGGG CTTATGACCA AGGAATCAGA GGCAGATATG GCTTTCTCCT TCCAGAATCC CTGGCAATCA AGTATGTTGC CAGCTACGTC GAG .1263 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA; 415 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYO MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 57;

GCATCTGCTC ATCATGGTGG TGAGCACTTT GAAGATGAAA ATCACATTAA CATAATCCGC TGGAAGCCAG ATTCTGTCAC ACAAATCAAA GCAGAAGATA CTGTCACTGT GGAGAATGTT CTGATAAGCA ACCTGAGAAA TGTGGTGGAG GGACACAGTT ATGAGAAGTA CAACAAGTGG GCCACTGAGA ATCCAGCCCT CATCTCTCGC GCTATTTACC TCCTGAAGGT TGGCAAAGCT TGTGGTTTCC ATGCCAGAGA GTGGATTTCT GCTGTTCGTA -CCTATGGACG TGAGATCCAA TATGTCCTGC CTGTGCTCAA TATTGATGGC TGGAGAAAGA CTCGCTCCAC CCATACTGGA AATTTTGATG CTGGTTGGTG TGAAATTGGA TGTGGACCTG CCGCAGAGTC TGAAAAGGAG AAACTCTCTT CCATCAAGGC ATATCTGACA CCTTACTCAT ATGCTTACAA ACTCGGTGAG GCTACTGTGA AAGAACTTGC CTCAC7GCAC ACAACAATCT ATCCTGCTGC TGGGGGCTCT TATTCCTTCA CCTTTGAACT TCGAGATACA CAGATCCGGG CTACCTGCGA GGAGACCTTC CTGGAACACC TGTACTAGTT GAGAAAGC.TC

120 180 240 300 360 420 480 54 0 600 eso 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260

Glu

Leu

Leu

Val -105

Leu

Val

Thr

Val

Ala -100

, Leu

Ala

Ser

Ala

His -95

His

Gly

'Gly

Glu

His -90

Phe

Glu

Gly

Glu

Lys -85

Val

Phe

Arg

Val

Asn -80

Val

Glu

Asp

Glu

Asn -75

His

Ile

Asn

Ile

Ile -70

Arg

Glu

Leu

Ala

Ser -65

Thr

Thr

Gin

Ile

Asp -60

Phe

Trp

Lys

Pro

Asp -55

Ser

val

Thr

Gin

Ile -50

Lys

Pro

His

Ser

Thr -45

Val

Asp

Phe

Arg

Val -40

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr -35

Val

Thr

Val

Glu

Asn -30

Val

-182 φ φ φ < φ ·· « • φ ·· · φ · ♦ > · * φ φ·φ •φ φφφ ·

Leu

Lys

Gin

Asn -25

Glu Leu

Gin

Tyr

Lys -20

Val

Leu

Ile

Ser Asn -15

Leu

Arg

Asn

Val

Val

Glu

Ala

Gin

Phe

Asp

Ser

Arg

Val

Arg

Ala

Thr

Gly

His

-TO

-5

1

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

5

10

15

20

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

25

30

35

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

Ala

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

40

45

50

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

55

60

65

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

70

75

80

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

SS

90

95

100

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

105

110

115

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

120

125

130

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

13S

140

14 5

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

150

155

160

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

165

170

175

íao

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

185

ř

190

195

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala.

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

200

205

210

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

215

220

225

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

230 235 240

-183-

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

245

250

255

260

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

265

270

275

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

230

285

290

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

Ala

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

End

295 300 305 307

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 58:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 58:

GCCGGTTTG CGCAACTGGT CACTCTTACG AGAAG INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) ' DÉLKA: 88 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 59:

CCGGAATTCT TATTAGTTCA GGTCCTCCTC AGAGATCAGC TTCTGCTCCT CGAACTCATG GTGGTGATGG TGGTGGTACA GGTGTŤCC gg

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 60:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA.: 22 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 60:

TTAGCGGATC CTGCCTGACG GT

-184-

INFORMACE O SEKVENCI ID·. Č. 61:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 61:

GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 62:

ACCTCTAGGG TCCCCAATTA INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 63:

CAAGTCGCCA CTGAGAATCC AGC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1053 basí (B) TYP: nukleová kyselina . (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 64:

ATG AAA TAC ČTA TTG CCŤ ACG GCA GCC GCT GGA Met Lys- Tyr. Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly

-20 -15

TTG TTA TTA CTC GCT 48 Leu Leu Leu Leu Ala

-185• · «

GCC CAA Ala Gin

CCA GCC

ATG Met

GCG Al a -1

GCA Ala

ACT Thr

GGT CAC TCT

TAC GAG AAG TAC AAC 96

Pro

Ala

Gly His

Ser 5

Tyr Glu

Lys

Tyr

Asn 10

-5

AAG

TGG

GAA

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

.GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

15

20

25

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

192

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

35 ' 40

GCT ATT

TAC Tyr 45

CTC Leu

CTG- AAG GTT

GGC AAA GCT GGA CAA AAT AAG

CCT Pro

GCC Ala

240

Ala

Ile

Leu

Lys

Val

Gly Lys Ala 50

Gly Gin Asn 55

Lys

ATT

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

288

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

65 70

TTC TGC CAG TGG TTT GTA AGA GAG GCT GTT CGT ACC TAT GGA CGT GAG 336

Phe Cys 75

Gin

Trp

Phe

Val Arg 80

Glu Ala

Val

Arg 85

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu 90

ATC

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

384

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

95

100

105

GTG

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

110

115

120

TGG

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

480

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125

130

135

GAC

CCC

AAC

AGA

AAT'

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

528

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

150

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

576

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

155

160

165

170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175 180 185

-186-

• •

V · 4

4 4 4 • ·

4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

i : a ·

4

e 4 » 4 4 4 '

4 4 4

4 4 • 4 4

ATC

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

672

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

190

195

200

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205

210

215

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

76S

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

230

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

816

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

245

250

GGC

TCT

GAC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

064

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

260·

2SS

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

230

CAG

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

960

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

235

290

295

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

CAC

CAC

CAT

CAC

CAC

CAT

GAG

1008

Ala

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

His

His

His

His

His

His

Glu

300

305

310

TTC

GAG

GAG

CAG

AAG

CTG

ATC

TCT

GAG

GAG

GAC

CTG

AAC

TAA

TAA

1053

Phe

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

End

End

315

320

325

327

INFORMACE 0

SEKVENCI

ID .

č.

65 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA; 31 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 55:

GTTATTACTC GCTGCCCAAC CAGCCATGGC G

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 basí (B, TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. :66

CTCTAGGAAT TCTTATTAGT ACAGGTGTTC CAGGACGTAG C INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 999 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 67:

ATG Měr

AAA Lys

TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG

TTA Leu -10

TTA CTC

GCT Ala

43

Tyr -20

Leu Leu

Pro Thr Ala -15

Ala

Ala

Gly

Leu

Leu

Leu

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

AAC

96

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

Ala

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

-5

1

5

10

AAG

TGG

GAA

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAÁ

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

is

20

25

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

192

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

30

35

40

GCT

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

240

Ala

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

45

50

55

ATT

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

2B8

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

60

65

70

TTC

TGC

CAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

33S

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

75

80

85

90

-188-

ATC Ile

CAA Gin

GTG ACA GAG

CTT Leu

CTC GAC AAG Leu Asp Lys

TTA Leu 100

GAC Asp

TTT Phe

TAT Tyr

GTC Val

CTG Leu 105

CCT Pro

384

Val

Thr

Glu 95

GTG

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

110

115

120

TGG

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

480

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125

130

135

GAG

CCC

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

52B

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

150

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

576

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

155

ISO

165

170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

180

185

ATC

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

672

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

190

.195

200

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

.Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205

210

215

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT-

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

763

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

23 0

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

816

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

245

250

GGC

TCT

GAC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

864

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

2S0

26S

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

280

	-189-	44 • 4 4 * 4 4 • · »4	• · 4 4 4 4 • 44	44 4 4 • 4 44	4*44 4 4 4 4 4 · 4 *4 «44 4 4 * 4 4 44 44 *
CAG ATC CGG GCT ACC TGC GAG	GAG ACC TTC CTG	GCA ATC	AAG	TAT	GTT 960
Gin He Arg Ala Thr Cys Glu	Glu Thr Phe Leu	Ala Ile	Lys	Tyr	Val
285	290	295
GCC AGC TAC GTC CTG GAA CAC	CTG TAC TAA TAA	GAATTC	999
Ala Ser Tyr Val Leu Glu His	Leu Tyr End End
300 305	307
INFORMACE O SEKVENCI	ID. Č. 68:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 basí (B) TYP; nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (Xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 68:

CCAACCAGCC ATGGCGCATC ATGGTGGTGA GCAC INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 69:

GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 70:

GGAGAAAGCC ATATCTGCCT G

-1904 4

444

4·4

4 *

4 4

4 4

444

4 ·

4

4

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE;

(A) DÉLKA; 1234 basí (B) TYP; nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN; jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 71:

ATG AAA Met Lys -117

TAC CTA Tyr Leu -115

TTG Leu

CCT Pro

ACG Thr

GCA GCC Ala Ala -110

GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT

49

Ala

Gly

Leu

Leu Leu -105

Leu

Ala

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

CAT

CAT

GGT

GGT

GAG

CAC

TTT

GAA

GGC

GAG

95

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

Ala

Kis

Kis

Gly

Gly

Glu

His

Phe

Glu

Gly

Glu

-100

-55

-90

AAG

GTG

TTC

CGT

GTT

AAC

GTT

GAA

GAT

GAA

AAT

CAC

ATT

AAC

ATA

ATC

144

Lys

Val

Phe

Arg

Val

Asn

Val

Glu

As?

Glu

Asn

His

Ile

Asn

Ile

Ile

-35

-90

-75

-70

CGC

GAG

TTG

GCC

AGC

ACG

ACC

CAG

ATT

GAC

TTC

TGG

AAG

CCA

GAT

TCT

192

Arg

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Thr

Gin

Ile

Asp

Phe

Trp

Lys

Pro

Asp

Ser

-55

-60

-55

GTC

ACA

CAA

ATC

AAA

CCT

CAC

AGT

ACA

GTT

GAC

TTC

CGT

GTT

AAA

GCA

240

Val

Thr

Gin

Ile

Lys

Pro

His

Ser

Thr

Val

Asp

Phe

Arg

Val

Lys

Ala

-50

-45

-40

GAA

GAT

ACT

GTC

ACT

GTG

GAG

AAT

GTT

CTA

AAG

CAG

AAT

GAA

CTA

CAA

238

Glu·

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asn

Val

Leu

Lys

Gin

Asn

Glu

Leu

Gin

-35

-30

-25

TAC

AAG

GTA

CTG

ATA

AGC

AAC

CTG

AGA

AAT

GTG

GTG

GAG

GCT

CAG

TTT

336

Tyr

Lys

Val

Leu

Ile

Ser

Asn

Leu

Arg

Asn

Val

Val

Glu

Ala

Gin

Phe

-20

-15

-10

GAT

AGC

CGG

GTT

CGT

GCA

ACA

GGA

CAC

AGT

TAT

GAG

AAG

TAC

AAC

AAG

334

Asp

Ser

Arg

Val

Arg

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

Lys

-5.

1

5

10

TGG GAA ACG ATA Trp Glu Thr Ile

GAG GCT TGG

ACT CAA CAA GTC GCC ACT GAG AAT CCA

432

Glu Ala

Trp

Thr Gin Gin 20

Val Ala Thr

Glu 25

Asn

Pro

15

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

GCT

430

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

Ala

35 40

.. i,.

-191φφφ • φφ φ φ « ··· φ·

ATT TAC CTC CTG AAG GTT GGC AAA GCT GGA CAA AAT AAG CCT GCC ATT

528

Ile Tyr Leu 45

Leu

Lys

Val Gly 50

Lys Ala

Gly Gin Asn Lys 55

Pro Ala

Ile

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

TTC

576

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

Phe

60

65

70

75

TGC

CAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

ATC

624

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

Ile

80

85

90

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

GTG

672

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

Val

95

100

105

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

TGG

720

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

Trp

110

115

120

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

GAC

758

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

Asp

12S

130

135

CCC

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

CGA

816

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

Arg

140

145

150

155

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

AAG

864

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

Lys

160

165

170

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

ATC

912

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

Ile

175

180

185

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

CCT

960

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

Pro

190 195 200

TAC TCA TAT GCT

TAC Tyr

AAA Lys

CTC Leu 210

GGT GAG AAC AAT GCT GAG TTG

AAT GČC

1008

.Tyr Ser Tyr 205

Ala

Gly Glu

Asn

Asn

Ala Glu 215

Leu

Asn

Ala

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

AAG

1056

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

Lys

22 0

225

230

235

* ·

-192·*· **· ·» ··

TAC Tyr

ACA TAT GGC CCG GGA

GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG GGC

1104

Thr Tyr

Gly Pro 240

Gly

Ala Thr

Thr

Ile Tyr 245

Pro

Ala

Ala

Gly 2S0

Gly

TCT

GAC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

TTT

1152

Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

Phe

255

260

265

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

CAG

1200

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

Gin

270

275

2Θ0

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

GCC

1248

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

Ala

285

290

300

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

TAA

TAA

GAATTC

1284

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

End

End

305

310

312

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. .72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 72:

¹ GGTCATAAGC CCAGTCTTTA GAGCC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 73:

CCTGCTGCTG GGGGCTCTAA AGACTGG

-193t fc · * » · • » · · ··· · * » · · · ··· ·« ·· ·

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1059 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 74:

ATG

AAA

TAC

CTA

TTG

CCT

ACG

GCA

GCC

GCT

GGA

TTG

TTA

TTA

CTC

GCT

48

MeC

Lys

Tyr -20

Leu

Leu

Pro

Thr

Ala -15

Ala

Ala

Gly

Leu

Leu -10

Leu

Leu

Ala

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

AAC

96

Ala

Gin -5

Pro

Ala

Met

Ala

Ala 1

Thr

Gly

His

Ser 5

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn 10

AAG

TGG

GAA

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile 15

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin 20

Gin

Val

Ala

Thr

Glu 25

Asn

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

.CGC

192

Pro

Ala

Leu

Ile 30

Ser

Arg

Ser

Val

Ile 35

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu 40

Gly

Arg

'GCT

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

240

Ala

Ile

Tyr 45

Leu

Leu

Lys

Val

Gly Lys 50

Ala

Gly

Gin

Asn 55

Lys

Pro

Ala

ATT

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

2SS

Ile

Phe SO

MeC

Asp

cys

Gly

Phe 65

His

Ala

Arg

Glu

Trp 70

Ile

Ser

Pro

Ala

TTC

TGC

CAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

336

Phe 75

cys

Gin

Trp

Phe

Val 80

Arg

Glu

Ala

Val

Arg 85

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu 90

ATC

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

384

Ile

Gin

Val

Thr

Glu 95

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu 100

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu 105

Pro

GTG

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

Val

Leu

Asn

Ile 110

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr 115

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser 120

Arg

Phe

TGG

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

480

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125 130 135 ” T • * * · ·· ·

-194« *

·*

··· ·· ··

GAC

CCC

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT GGA GCC TCT

528

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile Gly Ala Ser

140

145

150

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA GAG TCT GAA

576

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala Glu Ser Glu

155

160

165

170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA CTC TCT TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys Leu Ser Ser

175

180

185

ATC

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG ATG ATC TAC

672

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met Met Ile Tyr

190

195

200

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT GAG TTG AAT

720

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala Glu Leu Asn

205

210

215

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG CAC GGC ACC

768

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu His Gly Thr

220

225

230

AAG TAC ACA TAT

GGC CCG GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG

816

Lys Tyr Thr 235

Tyr

Gly

Pro 240

Gly Ala Thr Thr

Ile Tyr Pro Ala Ala Gly

245

250

GGC

TCT

AAA

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

864

Gly

Ser

Lys

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

260

265

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

280

CAG

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

960

Gin

Ile

Arg

Ala' Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

285

290

295

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

CAC

CAC

CAT

CAC

CAC

CAT

GAG

1008

Ala

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

His

His

His

His

His

His

Glu

300

305

310

TTC

GAG

GAG

CAG

AAG

CTG

ATC

TCT

GAG

GAG

GAC

CTG

AAC

TAA

TAA

GAA

1056

Phe

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

End

End

315

320

325 327

TTC 1059

9 t

• t • * »«

« » » » t *·· . t

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 75
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 25 basí
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	počet vláken: j edno
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(xi)	POPIS SEKVENCE ID.Č. 75:

GGTCATAAGC CCAGTCGCGA GAGCC INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 7 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 basí (B) TYP: nukleová kyselina' (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 76:

CCTGCTGCTG GGGGCTCTCG CGACTGG INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 77:

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1059 basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č.· 77:

ATG

AAA

TAC

CTA

TTG

CCT

ACG

GCA

GCC

GCT

GGA

TTG

TTA

TTA

CTC

GCT

48

Met

Lys

Tyr -20

Leu

Leu

Pro

Thr

Ala -15

Ala

Ala

Gly

Leu

Leu -10

Leu

Leu

Ala

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

AAC

96

Ala

Gin -5

Pro

Ala

Met

Ala

Ala 1

Thr

Gly

His

Ser 5

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn 10

AAG

TGG

GAA

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

ČAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile 15

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin 20

Gin

Val

Ala

Thr

Glu 25

Asn

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

192

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

35 40 or ov t>f O kr . k‘ nejí

-196-

Ií «3	«ϊΐι· c e.
»3j	»? t· ·.<
I?· tH	* (; <!'
J|>,	r »; t
	•:tt ce

W** «

e o

O v

GCT

ATT

TAC.

CTC CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

240

Ala

Ile

Tyr

Leu Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

45

50

55

, ,v

·*

*. v

r i.

ATT.

TTC

ATG.

GAC.TGT

GGT

TTC

CAT

GCC'

AGA

GAG·

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

288

Ile

Phe

Met

Asp Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

65 70 _ - «I AU ’ R * ^J .

1. :_w.. k r -M ¹ ·'*** ’

TTC TGC,CAG.TGG TTT,GTA AGA GAG GCT GTT CGT ACC TAT GGA CGT GAG 336

· *

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

(

75

30

es

90

t

. ,·*. i f .1'

|.

Pii 1 *

; < ,

>i G

• T.

t

T ATC

r CAA

. GTG

ACA

. GAG

CTT

CTC

, GAC

AAG

íTTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

384

A \ . » T’* '* ’ '

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

AŠp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

i

95

100

105

·.·*' » Λ·

A t

Z CCG T31

r

*

-

• ?·

'

.·. GTG

CTC

AAT

ATT,GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

' TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

f.2 . * *

Val

LeufAsn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

*

110

115

120

--.I „ -* -» f * ''

- , - ·

• »

i A·*·

'3

, - \ , * r 1

ΤΦ

, AGA

AAG

ACT

CGC .TCC

,ACC

CAT

ACT

GGÁ

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

480

Trp·

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125

130

135

4 4 Ji

GAC

CCC

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT í, GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

528

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

150

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCŤ

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

576

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pra

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

155

160

165

170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

'ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

180

185

ATC

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA ATG

ATG

ATC

TAC

672

Ile

Lys

Ala'

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

190

195

200

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205 210 215

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC 768

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

22S

230

197·« • · » · ··* *

··· ··♦ ··

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

816

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

24S

250

GGC

TCT

CGC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

364

Gly

Ser

Arg

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

250

265

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly Arg

Tyr

Gly

Phe Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

27S

280

CAG

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

960

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

235

290

300

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

CAC

CAC CAT

CAC

CAC

CAT

GAG

1008

Ala

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

His

His His

His

His

His

Glu

305

310

315

TTC

GAG

GAG

CAG

AAG

CTG

ATC

TCT

GAG

GAG

GAC CTG

AAC

TAA

TAA

GAA

10S6

Phe

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu

Glu

Asp Leu

Asn

End

End

320

325

330

332

TTC 10S9

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Cí: O í* (Γ 4 4.

   é c *' ? »J » í?

   £ r ·

   CC C«?ť tr ft® it 4·*» t 6 Ď B · l· » · | b · · · · l ti * to ··* · ti tr · « t <5<5G ftto ✓?(**/

   1. Dvousložkový systém pro použití v hostiteli vyznačující se tím, že (i) první složka sestává ze specifické vazebné skupiny schopné vazby na antigen asociovaný s nádorem, která je navázána ná zmutovanou formu enzymu, schopnou konverze neaktivního prekurzoru účinné látky na protinádorově účinnou, látku (ii) druhou složkou je neaktivní prekurzor účinné látky,. který je za přítomnosti enzymu konvertován na protinádorovou účinnou látku r <' -i * 4 í přičemž , .

   zmutovaný enzym ' je mutantní formou hostitelského enzymu, který ve své.přirozené formě rozeznává substrát na základě interakcí iontového páru a ve zmutované formě je < I tato polarita převrácena (reverzní polarita);

   první složka není v hostiteli v podstatě imunogenní a neaktivní prekurzor účinné látky není v podstatě přirozenými, nemutovanými hostitelovými enzymy konvertovatelný na protinádorově účinnou látku.

   i
2. 2. Systém podle nároku 1 vyznačující se tím, že první složka obsahuje zmutovanou formu * I enzymu, který je odvozený od enzymu téhož druhu, jako

   - χ , - · .

   jé hostitel, pro jehož léčbu je kompozice určena.
3. 3. Systém podle libovolného z nároků 1 až 2 - vyznačující se tím, že specifickou vazebnou skupinou je protilátka nebo její fragment.
4. 4. Systém podle nároku 3 vyznačující se tím, že fragmentem protilátky je F(ab')₂ fragment.

   ·· «·«» > « · ► * · ··* ·

   -199» * »
5. 5. Systém podle libovolného vyznačující se nároku tím az ze zmutovanou formou enzymu je zmutovaná ribonukleáza.
6. 6. Systém ¹ podle libovolného z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že zmutovanou formou enzymu je lidská ribonukláza s negativně nabitým aminokyselinovým zbytkem na pozici 66.
7. 7. Systém podle nároku 6vyznačující se tím, že negativně nabitým ami©kyselinovým zbytkem na pozici 66 je Glu.
8. 8. Systém podle vyznačuj formou enzymu j libovolného z nároků ící se tím, že e zmutovaná glukuronidáza.

   1 až 4 zmutovanou * ( *
9. 9. Druha složka podle nároku 1, kterou je ribonukleotid derivovaný sloučeninou odvozenou od bis(2-chlorethyl) aminu, obecného, vzorce l

   Q je 0 nebo NH,

   A je skupina obecného vzorce -X-Y- s Y navázaným na

   Q, kde »· ···*

   Β ·

   -200• Β • Β Β

   Β Β

   Β ·

   Β Β

   ΒΒ Β

   Β ΒΒ

   ΒΒ Β Β «

   Β Β Β ·

   Β Β · · ·Β·

   Β Β Β Β

   ΒΒΒ ΒΒ Β Β

   Υ je SO₂, CO nebo jednoduchá vazba s tím, že je-li Q kyslík, pak Y není SO₂,

   X je -(CH₂)„-, kde n je 1 až 4, popřípadě substituovaný na libovolném atomu uhlíku alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, a je-li Y CO a η = 1 pak X je popřípadě substituován na uhlíku postraním řetězcem alaninu, valinu, leucinu, izoleucinu, methioninu, fenylalaninu, tryptofanu, šeřinu, threoninu, cysteinu, aparaginu, glutaminu, argininu nebo histidinu;

   Rl je uráčil nebo. cytosin,

   R2 a R3 jsou nezávisle na sobě vždy vodík nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku,

   R5 a RS jsou nezávisle na sobě Cl, mesyl nebo tosyl;

   R7, R8, R9 a R10 jsou nezávisle na sobě vždy vodík, alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, F nebo Cl nebo jeho soli.
10. 10. Ribonukleotid derivovaný sloučeninou odvozenou od bis(2-chlorethyl)]aminu podle nároku 9

    v y z n a č u jící s e Q je NH; X je -{CH₂)_n- , kde n jel Y je ~C(0)-; Rl je uráčil nebo cyt' osin; R2 a R3 jsou H; R5 a R6 jsou cl; a R7 , R8, R9 a R10 jsou H;

    nebo jeho soli.

    ia ι»ι·

    201• *· • φ · * · · · a · φ · a • Φ · Φ · φφφφ • φ φ Φ φ • φφφ φφ φφ φ
11. 11. Druhá složka podle nároku 1 vyznačující se tím, že jde o 0-[(2R,3S,4R,5R)-2-(2-aminoacetamidomethyl)-5-(2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-l-yl)-4-hydroxy-2,3,4,5-tetrahydrofuran-3-yl]-0-(4-(bis[2-chlorethyl]amino)fenoxy]hydrogenfosforečnan nebo jeho sůl.
12. 12. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, še obsahuje první složku podle libovolného z nároků 1 až 8.
13. 13. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje druhou složku podle libovolného z nároků 1 nebo 9 až 11.
14. 14. Farmaceutická kompozice podle libovolného z nároku 12. až 13 vyznačující se tím, že je sterilní.
15. 15. První složka podle libovolného z nároků 1 až 8.
16. 16. Mutovaná forma enzymu podle libovolného z nároků 1,

    2, 5, 6, 7 nebo 8.
17. 17. Způsob kontroly růstu nádorovách buněk v hostiteli, vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství první složky podle libovolného z nároků 1 až 8 hostiteli, čekání po dobu dostatečnou pro vymizení této složky z obecného oběhu tothoto hostitele a následného podání účinného množství druhé složky podle libovolného z nároků 1 nebo 9 až 11.
18. 18. Plazmid pQR162 uložený pod registračním číslem NCIMB 40678.
19. 19. Polynukleotidová sekvence vyznačující se tím, že obsahuje libovolnou první složku vybranou • 4 4 4 4 4 4

    4 4 4 4 4 4

    4 4 · · ·· · a • ♦ · 4 ·

    444 44 *· 4 • v*

    -202·· » • · ·· • 44 • 4 · 4

    4 4 4 «4 ··· podle libovolného z nároků 1 až 8 a zmutovanou formu enzymu podle libovolného z nároků 1, 2, 5, 6, 7 nebo 8 .
20. 20, Vektor vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotid podle nároku 19.
21. 21. Buňka vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotid podle nároku 19.