CN1095677C - 化合物 - Google Patents

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Abstract

改进的用于寻靶酶药物前体治疗，特别是抗体指导的酶药物前体治疗(ADEPT)的系统，其中所用的酶是宿主酶的突变形式，其中天然宿主酶如核酸核酸酶通过离子对的相互作用而识别其天然底物，而突变酶和互补药物前体可逆转(“逆转极性”)所述的相互作用。

Description

化合物
本发明涉及使用宿主酶的非天然突变形式，特别是核糖核酸酶的突变形式的抗体指导的酶药物前体治疗(ADEPT)。
长期以来，药物选择性地寻靶以杀死患者体内的癌细胞都是医学研究的一个问题。ADEPT是克服所述问题的方法。ADEPT使用与酶结合的肿瘤选择性抗体。将结合物施用给患者(通常是静脉内)，使其定位在肿瘤位点，然后从大循环中清除。随后，将药物前体施用于患者，所述药物前体被所述酶(定位在肿瘤位点的)转变成可杀死肿瘤细胞的细胞毒药物。由于一分子酶可以催化产生许多细胞毒药物分子，所以就产生了放大作用。此外，通过酶促放大产生的细胞毒药物也可杀死不呈现抗体识别的抗原的肿瘤细胞(肿瘤通常表现出微异质性)。已知的系统使用原核细胞酶羧肽酶G2(CPG2)作为酶组分(参见WO 88/07378)。使用原核细胞酶的缺陷在于正常肠菌丛可能含有能够引发非选择性细胞毒药物产生的原核细胞生物。
已知系统的另一问题是重复施用结合物会导致宿主免疫反应，从而使治疗效果减小。抗体组分通常是用已知技术可以人化以降低免疫原性的小鼠单克隆。这是因为酶组分不一定天然存在于人宿主循环中，而可以使药物前体的成熟前形式转变成细胞毒药物，但不会观察到对肿瘤的选择性毒性。Akzo在WO 90/02939中建议施用人酶用于ADEPT，可以由所选的通常不在循环中的人酶，如溶菌酶保持选择性。Akzo已选用人溶菌酶作为其酶，而且因为底物需要的性质(作为内糖苷酶，它需要N-乙酰葡糖胺β1-4链联的聚合物(-NAG几丁质)进行裂解)它们被迫产生含所述官能度的药物前体。为了防止细胞进入，它们还用牛磺酸残基制成了寡聚物-依赖于磺酸以防止细胞进入并因此细胞毒性低了20倍-WO 90/02939图13。
将哺乳动物酶如碱性磷酸酶(Senter et al.US4975278)或人酶如β-葡糖苷酸酶(Behringwerke DE 42336237)或溶菌酶(Akzo；WO90/07929)用于ADEPT是有利的，因为所述酶与非哺乳动物酶相比已经降低或除去了免疫原性。施用哺乳动物或人源酶的缺点在于它在患者体内，是内源性的，因此它们可以将药物前体转变成药物，而不是由于施用了抗体-酶结合物。用这种ADEPT方法，可能会导致毒性增加。在没有施用任何结合物的情况下，由于内源碱性磷酸酶的广泛分布，在小鼠(Dolye.T.W.and Vyas.D.M.Cancer Treatment Reviews 17，127-131，1990)和人(Hande et al.，Clinical Pharmacology andTherapeutics 53，233，1993)中，碱性磷酸酶的药物前体均能迅速地转变成药物，因此可以确定这对于该酶是一至关重要的问题。还尚未得到有关β-葡糖苷酸酶或溶菌酶之药物前体的人数据。葡糖苷酸酶和溶菌酶存在于血浆和其它组织位点中。Akzo报告在牛奶，眼泪，唾液，脾，白细胞和单核细胞中有溶菌酶。Behringwerke在DE4236237中报告了激活的巨噬细胞，粒细胞和血小板分泌葡糖苷酸酶。由于这些细胞广泛分布在体内，所以可能会导致不期望的药物前体激活作用。的确，Behringwerke已经表明，在小鼠中，施用阿霉素药物前体后，相对高水平的游离药物在这些细胞丰富的脾中积累(参见DE4236237中的表3)。
在这种ADPT方法中使用人源酶的局限性在于只能使用细胞内分布广的酶，必须要将与其一起使用的药物前体不进入细胞以使毒性最小。这样严重限制了产生ADEPT系统的可选择的数量。尽管是一种小酶，但溶菌酶对于ADEPT来说也有缺陷。溶菌酶不释放活性药物，但释放未知药物活性的衍生物。在Akzo所给的实例中，释放Dox-(glcNac)1或Dox-(glcNac)5而不是游离阿霉素。葡糖苷酸酶可以从葡糖苷酶药物前体中释放活性药物如阿霉素，并已经报告了抗肿瘤活性(bosslet.K.et al.，Cancer Research54，2151-59，1994)。然而，人葡糖苷酸酶是一种高分子量酶(150-300KDa)，因此可能会使所得的寻靶结合物很大。这可能引起浸润到组织，如肿瘤中，因为已经表明较小的蛋白质能更迅速地浸润到实体瘤中。另外，葡糖苷酸酶被糖基化，这种糖基化作用会使在ADEPT中所用的抗体-葡糖苷酸酶结合物受到迅速地血液清除。这种迅速的血液清除使得几乎没有结合物能够定位于肿瘤异种移植物高分子量和快速的血液清除率可能会导致在患者中的定位很差。因此葡糖苷酸酶不是ADEPT的理想酶。
本发明是基于可以工程化宿主酶(例如人源核糖核酸酶，在大循环中天然存在的一种酶)以便它可以识别由天然宿主酶不能明显识别的ADEPT治疗的药物前体。由于工程酶与天然宿主酶的氨基酸组成很相似，所以与细菌酶如CPG2相比，它的免疫原性显著降低。工程酶不是天然存在的，因此通过天然菌丛或人源酶引起的非选择性的药物前体激活就可以得到降低。所述方法的其它优点是，适用于广泛的人源或哺乳动物酶，原因在于不受酶的天然分布及采用的进入细胞的药物前体的限制。
这些问题部分已经由于本发明最早优先权日之后公开的国际专利申请WO 95/13095(Wellcome Foundataion)提出。该申请建议使用突变哺乳动物酶激活相应的天然酶不能激活的药物前体，但目前未公开所要求的发明。
令人很惊奇的是用相反电荷的残基取代带电残基，该残基位于或接近酶底物结合或催化位点，可以得到有完整催化中心的突变酶，所述突变酶不同于天然酶，仅在具有相关的互补的但有电荷相反的底物特异性需求。
此外，Wellcome中公开的药物前体/药物(以氨甲喋呤和左旋溶肉瘤素为基础)主要是阻断活性运输机制以防止药物前体进入细胞。这样将药物前体/药物可能性的范围限制在具有所述的活性运输机制。相反，本文公开的反向极性方法可以选择药物前体的电荷特性(可以有或没有活性运输特性)以阻断药物前体进入细胞，因此本发明可以有更广泛的药物前体/药物选择。
根据本发明的一个方面，提供了设计用于宿主中的匹配的两个组分，其中组分含有；
(I)第一组分是能够与肿瘤相关抗原结合的寻靶部分，寻靶部分与能够将药物前体转变成抗肿瘤药物的突变酶相连和；
(ii)第二组分是在所述酶影响下，可转变成抗肿瘤药物的药物前体；
其中：
突变酶是宿主酶的突变形式，其中天然宿主酶通过离子配对相互作用来识别其天然底物，而所述相互作用在突变酶和互补药物前体的设计中是逆转的(“逆转极性”)；
第一组分在宿主中基本上是非免疫原性的和；
药物前体第二组分在宿主中通过未突变的宿主酶不能明显转变成抗肿瘤药物。
优选的上述系统是包含突变酶的第一组分，该突变酶基于来自于该系统试图应用的宿主的相同种的酶。
优选的上述系统是其中寻靶部分是抗体或其片段的系统。优选上述系统是其中抗体是F(ab’)2片段的系统。
优选上述系统是其中突变酶是核糖核酸酶的系统。优选上述系统是其中突变酶是在66位含有负电荷氨基酸的人源核糖核酸酶。优选上述系统是其中核糖核酸酶66位负电荷氨基酸是Glu的系统。
上述系统的另一优选实施方案是其中突变酶是突变葡糖苷酸酶的系统。
根据本发明的另一方面，提供了提供了设计用于宿主中的匹配的两个组分系统，其中组分含有：
(I)第一组分是能够与肿瘤相关抗原结合的寻靶部分，寻靶部分与能够将药物前体转变成抗肿瘤药物的突变酶相连和；
(ii)第二组分是在所述酶影响下，可转变成抗肿瘤药物的药物前体；
其中：
突变酶是宿主酶的突变形式；
第一组分在宿主中基本上是非免疫原性的和；宿主中的天然未突变的宿主酶不能明显将药物前体转变成抗肿瘤药物。
术语“宿主中的天然未突变的宿主酶明显不能将药物前体转变成抗肿瘤药物”指在给宿主施用后，药物前体没有不适当的未寻靶毒性问题。
术语“基本上是非免疫原性的”指第一组分可以在不止一种情况下施用给宿主而不会引起如在人宿主中用例如与细菌酶相连的小鼠抗体所见到的显著的宿主免疫反应。
优选的突变酶是基于来自与所打算应用之宿主相同种的酶，但突变酶可以基于不同种的宿主酶，只要种之间的酶结构是足够保守的，从而不会产生不适当的免疫原性问题。
优选的寻靶部分是抗体，特别是抗体片段如F(ab’)2。可以用已知方法，如利用异双功能试剂或通过基因融合或任何其它适宜的方法完成与酶的连接。抗体可以来自相同的宿主(如学小鼠中使用小鼠抗体)或可以操作抗体以便在所选的宿主中，作为外源物质而不会明显被识别(例如在人中使用嵌合的，CDR移植的或包被的小鼠抗体)。
在猴和患者临床前研究中已经表明，将啮齿类抗体的可变区移植到人源抗体的恒定区(嵌合抗体)或将啮齿类抗体的抗原结合环(CDR)加到人抗体(CDR移植)中可以大大降低啮齿类抗体的免疫原性。甚至CDR移植的抗体可以将一来自啮齿类抗体序列的大量(＞50)氨基酸掺入到人框架中。尽管如此，已经报道在猴和患者中大大降低了免疫原性。这样提供了迹象表明，突变宿主酶催化位点中很有限量的氨基酸可能会使酶的免疫原性最小，而且当然比非宿主酶的免疫原性更低。读者可以参考下列文献：A.Mountain and J.R.akair.生物技术和遗传工程综述，10，1-142，1992；G.Winter and W.J.Harris.药物学中的趋势，14，139-143，1993；I.I.Singer等，免疫学期刊，150，2844-57，1993；J.Hakimi等，免疫学期刊，147，11352-59，1991和J.D.Isacs等，The Lancet，340，748-752，1992。恒定区可以是例如人IgA，IgE，IgG或IgM区。人IgG2和3(特别是IgG2)是优选的，但也可以使用IgG1和4同族型。也可以使用人抗体本身如在小鼠工程化中以产生人抗体而产生的。
突变宿主酶(通过任何适宜的方法，如化学或生物技术基因合成或靶突变)以使与天然宿主酶相比，酶活性位点和药物前体之间的相互作用方式改变。
优选酶突变是在其活性位点的极性改变以便它可以改变药物前体以具有互补极性；未突变的宿主酶不能明显转变药物前体。优选天然宿主酶通过离子配对相互作用识别其天然底物，在突变酶和互补药物前体的设计中，这种作用正好相反。优选酶是突变的核糖核酸酶，特别是有反向极性的人核糖核酸酶(参见图12-15)。
在人核糖核酸酶的赖氨酸66电荷正电荷残基，它与该酶天然RNA底物上的负电荷磷酸基团相互作用。例如通过遗传工程(但化学合成也可以)改变该残基的极性以给出负电荷残基如谷氨酸。所得的“逆转极性”酶识别未突变天然宿主酶不能明显识别的本发明的药物前体。也考虑到在天然位点区对残基的其它改变以优化底物的结合和转变特征。核糖核酸酶的工程形式代表了本发明的另一方面。核糖核酸酶是一种有利的酶，由于其分子量低(约13600Da；在施用后有良好的肿瘤穿透性)以及对热作用和蛋白水解有良好的稳定性。优选药物前体是图11中所示分子式1的氮芥-核糖核苷酸，其中：
Q是O或NH(特别是NH)；
A是式-X-Y的基团，其中
Y是SO2，CO或单键(优选CO)，条件是
当Q是氧时，Y不是SO2；
X是-(CH2)n，其中n＝1-4(优选地，n＝1除当Y是单键时，n优选是2)
可选的由碳原子(任何手性原子上都可以是R和/或S构象)上C1-4烷基取代
或
当Y是CO和n＝1时，X在碳上可选的有侧链Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Try，Ser，Thr，Cys，Asp，Glu，Lys，Arg或His(在任何手性原子均可考虑，R和/或S构象)；
如图11所示，R1是尿嘧啶或胞嘧啶；
R2和R3分别独立的是H或C1-4烷基(优选甲基而且特别是R2＝R3＝H)；
R5和R6分别独立的是Cl，甲磺酰基或甲苯磺酰基(优选R5＝R6＝Cl)；
R7，R8，R9和R10分别独立的是H，C1-4烷基(优选甲基)，C1-4烷氧基(优选甲氧基)，F或Cl(优选Cl)，而除H外的代表性基团的优选位置是R8和R9，但R7-R8＝R9＝R10＝H是特别优选的。
在优选的实施方案中，氮芥核糖核酸酶是其中：
Q是NH；
X是-(CH2)n，其中n＝1-4；
Y-C(O)-；
R1是尿嘧啶或胞嘧啶；
R2和R3是H；
R5和R6是Cl；和
R7，R8，R9和R10是H；
或其盐。
下列具体的化合物是特别优选的：
在图7中所示的末端产物O-[(2R，3S，4R，5R)-2-(2-氨基乙酰氨基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-1-基)-4-羟基-2，3，4，5-四氢呋喃-3-基]O-[4-(双[2-氯乙基]氨基)苯氧基]磷酸氢酯。
另一优选化合物是图7中的末端产物胞嘧啶类似物。
在本说明书中，普通术语“烷基”包括直链和支链烷基。但是，对于特定的烷基如“丙基”仅指直链的情况，而特定的支链烷基如“异丙基”仅指支链的情况。类似的规则也适用于其它普通术语。
应当理解，到目前为止就一个或多个不对称的碳原子来说，确定的式1化合物可能以旋光活性或外消旋形式存在，本发明包括其定义的具有本发明突变酶底物特性的任何所述旋光活性或外消旋形式。
用本领域熟知的有机化学的标准技术，例如通过从光学活性起始材料合成或外消旋形式的拆开可以合成旋光活性形式。相似的，用标准实验室技术可以评估对突变酶的底物特性。
点突变的命名如下：天然氨基酸(用1个字母命名)，位置，新氨基酸。例如“D253K”指在位置253的天冬氨酸(D)已经被变成赖氨酸(K)。在平方框之间表示一个酶中的多个突变。
在本说明书中，术语CPB包括：
(i)有或没有“tags”(如c-myc)的酶的成熟，原和前原形式；
(ii)对在C-末端含Lys或Arg的肽底物有特异性的任何羧肽酶；胰和血浆CPB酶(胰酶是优选的)；
除非特别说明或从本文中可以看出。
本发明的突变CPB是任何有本发明所需特性的上述CPB的突变体。下列胰HCPB是优选的：D253K，D253R和特别是[G251N，D253R]；其它CPB中的相应突变也是可行的。本发明的突变体CPB可以含有不明显改变关键突变特性的其它“保守”突变(插入，取代和/或缺失)。为了所述目的，保守氨基酸取代是其天然发生的可能性比偶然发生取代的可能性大10倍的取代(如由Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence andStructure，1971，p95-96和图9-10描述的计算方法)。
有关CPB的参考文献如下：Folk JE in The Enzymes Vol III，academicPress(1971)，p57；Coll et al.，(1991)EMBO Journal 10，1-9；Eaton DL etal.，(1991)J Biol Chem 266，21833-21838；Yamamo to K et al.，(1992)J.Biol.Chem 267，2575-2581；美国专利5364934(Genentech)和国际专利申请WO 95/14096(Eli Lilly)。
本发明的化合物可以与也在本发明范围内的各种无机和有机酸和碱形成盐。所述盐包括铵盐，碱金属盐，象钠和钾盐，碱土金属盐如钙和镁盐，与有机碱形成的盐如二环己基铵盐，N-甲基-D-葡糖胺，与氨基酸如精氨酸，赖氨酸等形成的盐。可以制备与有机和无机酸形成的盐，如HCl，HBr，H2SO4，H3PO4，甲磺酸，苯甲磺酸，马来酸，富马酸和樟脑磺酸。无毒性生理学可接受的盐是优选的，尽管其它盐也是有用的；如在分离或纯化的产物中。
通过常规方法如在盐不可溶的溶剂或介质中，或在然后真空除去的溶剂如水中通过将产物的游离酸或游离碱形式与一或多当量的适宜碱或酸反应或通过在适宜的离子交换树脂上将现有盐的阳离子换成另一种阳离子可以形成所述盐。可以在组合物如口服片剂，胶囊或酏剂直肠给药的栓剂，胃肠外或肌肉内给药的无菌溶液或悬浮液等中使用本发明的化合物。
可以将本发明的化合物按可提供最佳药效的剂量需要施用给患者(动物和人)。尽管剂量随疾病的性质和严重程度，患者的体重，患者的特殊饮食，同时施用的药物以及本领域专业人员可以了解的其它因素而不同，但剂量范围通常约为1-4000mg/患者/天，可以单或多剂量施用。优选剂量范围是约100-4000mg/患者/天；更优选的是约500-3000mg/患者/天。
在癌症治疗中，本发明结合物和药物前体施用的最有效方式和剂量方案取决于许多因素，如疾病的严重程度，患者的健康，对治疗的反应和医生的判断。因此应确定个体患者结合物和药物前体的剂量。然而，结合物的有效剂量可能是在20-200mg/m2范围内。药物前体的有效剂量取决于所用的特定药物和母体药物的毒性。由于药物前体的细胞毒性低于母体药物的，母体药物的MTD(如果已知的话)可以作为起始点。对于母体药物临床数据得不到的酚介子基药物前体来说，治疗剂量范围不太肯定，需要通过标准动物毒学研究，在患者中从低剂量开始，剂量逐步上升的研究来确定。但是，治疗剂量通常为500-2000mg/m2。
当然，可以以单位为基础，按需要调整这些剂量范围以便分成每天的剂量，如上所述，剂量可以随疾病的性质和严重程度，患者的体重，特定的饮食以及其它因素而不同。
通常可以将这些组合配制成下文讨论的药物组合物。
将1-100mg的化合物或式1化合物的化合物或其生理学可接受的盐于生理学可接受的载体，赋形剂，结合剂，防腐剂，稳定剂，调味剂等以称为接受的药物实施的单位剂量形式混合。这些组合物或制剂中活性物质的量是表明范围内的适宜剂量。
可以掺入到片剂，胶囊等中的佐剂的实例如下：结合剂如黄蓍胶，阿拉伯胶，玉米淀粉或明胶；赋形剂如微晶纤维素；崩解剂如玉米淀粉，预胶化淀粉，藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖，乳糖或糊精；调味剂如薄荷，冬青或樱桃油。当剂量单位是胶囊时，它可以含有除上述物质外，还有液体载体如脂肪油。各种其它材料可以作为包衣或修饰剂量单位的物理形式。例如可以用滑石，糖或两者同时包衣片剂。糖浆或酏剂可以含有活性化合物，蔗糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和丙酯作为防腐剂，，着色剂和调味剂如樱桃或橙调味剂。
可以按常规药物学实践，通过将活性物质溶剂或悬浮在用于注射的载体如水，天然植物油如芝麻油，椰子油，花生油，棉籽油等或合成脂肪载体如油酸乙酯等中来配制注射用无菌组合物。按需要也可以掺入缓冲剂，防腐剂，抗氧化剂等。
根据本发明的另一方面，提供了本文所定义的系统，用于控制宿主中肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括给所述宿主施用有效量的第一组分，使第一组分基本上从大循环中清除，然后施用有效量的第二组分。优选静脉内施用所述组分。
本发明的另一方面提供了在宿主体内控制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括给所述宿主施用有效量的上述第一组分，使第一组分基本上从大循环中清除，然后施用有效量的上述第二组分。
本发明的另一方面提供了药物组合物，含有有效肿瘤定位量的本文所定义的第一组分和可药用载体或稀释剂。优选所述组合物适宜于静脉内施用。优选第一组分作为使用前用适宜稀释剂再建的干固体提供。
本发明的另一方面提供了药物组合物，含有有效抗肿瘤量的本文所定义的第二组分和可药用载体或稀释剂。优选所述组合物适宜于静脉内施用。优选第一组分作为使用前用适宜稀释剂再建的干固体提供。
本发明的另一方面提供了含有上述第一组分的药物组合物。
本发明的另一方面提供了含有上述第二组分的药物组合物。
优选的药物组合物是无菌的(用于静脉内施用)。
本发明的另一方面提供了上述第一组分。
本发明的另一方面提供了上述突变酶。
本发明的另一方面提供了质粒pQR162。根据布达佩斯条约质粒pQR162于1994年8月16日保藏在NCIMB Limited，23 St.Machar Drive，AberdeenAB2 1RY，苏格兰，保藏号为NCIMB 40678。
根据布达佩斯条约，含pCg330(也称为pIC1698)的大肠杆菌MSD1646于1994年11月23日保藏在工业和海洋细菌国家收集中心(NCIMB)，23 St.Machar Drive，Aberdeen苏格兰，英国AB2 1RY，；保藏号为NICMB40694。NICMB 40694是本发明的另一方面。
根据布达佩斯条约，抗体A5B7于1993年7月14日保藏在ECACC，PHLSCentre for Applied Mocrobiology & Research，PortonDown，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG.UK.，保藏号为93071411。优选F(ab’)2形式的人化抗体。
将在ADEPT中有用的抗体描述如下。在Haisma，H.J等人，(Cancerimmunol.I mmunother.)，34：343-348(1992)中描述的抗体BW431/26。在欧洲专利302473中描述的抗体16.88。在欧洲专利392745中描述的抗体B72.3。在欧洲专利382411中描述的抗体CEM231。抗体HMFG-1和HMFG-11(Unipath Ltd.Basingstoke，Hants.，英国)与在牛奶脂肪小球膜上的粘蛋白样糖蛋白分子反应，而且可用于寻靶乳腺和卵巢癌。抗体SM3(Chemicon International Ltd.伦敦，英国)与粘蛋白的核心蛋白反应，而且可用于寻靶乳腺和卵巢癌。抗体85A12(UnipathLtd.Basingstoke，Hants.，英国)和ICEA，(Pierce Chemical Company，Chest，UK)与肿瘤抗原CEA反应。抗体PR4D1(Serotec，Oxford，UK)与结肠癌相关抗原反应。抗体E29(Dako Ltd，High Wgcombe，与上皮膜抗原反应。抗体C242可从CANAG Diagnostics，Gothenberg，瑞典得到。读者还可参考在国际专利申请WO 95/13095(Wellcome)中第208页上的表3，包括了各种抗体的资料。
通常在ADEPT中有用的抗体很难被它们所识别的肿瘤细胞内部化。这使得靶向的药物前体-激活酶停留在细胞表面，因此从循环中的药物前体在肿瘤位点产生药物。可以用已知技术，如Jafrezou等人，在癌症研究52：1352(1992)和Press等人，在癌症研究48：2249(1988)中所列的技术检测抗体的内部化。
本发明的另一实用性是体外利用第一和第二组分进行诊断。例如通过将诊断样品暴露于含有寻靶部分如能够与抗原结合的抗体的本发明的第一组分，可以检测特定的抗原。此后例如通过洗涤可以除去未结合的第一组分，然后，通过其催化第二组分药物前体转变的能力可以确定结合的第一组分的量。通过任何适宜的方法，如HPLC可以确定药物前体转变的量。读者可以参考D.M.Kemeny的ELISA操作指南，Pergamon Press1991。
根据本发明的另一方面，提供了抗体A5B7的重组鼠F(ab’)2片段，其中所述片段在铰链区的重链之间，含有3个链间二硫键。
根据本发明的另一方面，提供了抗体A5B7的重组鼠F(ab’)2片段，所述片段含有分别为重链和轻链编码的SEQ ID NO：25和26所列的序列。Sutter等人在基因113(1992)223-230中教导了需要在抗体的铰链区再导入半胱氨酸以便在重组生产中形成良好的二聚物。由于没有所有的抗体污染物，所以重组生产的片段不同于蛋白水解生产的物质。正如用Pharmacia BiacoreTM装置确定的，重组生产的物质对于CEA抗原有较高的结合亲和性。
根据本发明的另一方面，提供了通过连接下列物质而制备本文所述的第一组分的方法：
能够与肿瘤相关抗原结合的靶向部分和
能够将药物前体转变成抗肿瘤药物的酶，其中所述酶是宿主酶的突变形式。可以用本领域已知的常规方法，如通过异双功能试剂，可以连接突变酶和靶向部分，基围融合亦可考虑。
通过本领域已知的表达技术可以制备突变酶和靶向部分。一些表达系统包括用载体转化宿主细胞；所述系统是熟知的，如在大肠杆菌酵母和哺乳动物宿主中(参见酶学方法，185，Academic Press 1990)。其它表达系统如转基因非人哺乳动物也可行，其中将所需基因(优选是从载体中切出的，但含有乳房启动子以便使表达的蛋白质进入所述动物的乳汁中)导入哺乳动物受精卵的前核中(通常是通过在前核中微注射两个核(通常是雄性核))此后植入抚育母亲。由抚育母亲生产的动物将携带并表达已经整合到染色体中的导入基因。通常通过常规育种，可以将整合基因传给子代，因此使原种扩展。优选简单地从雌性转基因动物的乳汁中收集所表达的蛋白质。读者可以参考下列文献：Simons et al.，(1988).生物/技术6：179-183；Wright等人(1991)生物/技术9：830-834；US4873191和US5322775。在Hogan等人的“小鼠胚胎操作：实验室手册”，冷泉港实验室，1986中描述了小鼠胚胎的操作。
在下列文献中也描述了转基因植物技术：Swain W.F.(1991)TIBTECH9：107-109；Ma J.K.C.等人(1994)欧洲免疫学期刊24：131-138；Hiatt A等人(1992)FEBS Letters307：71-75；HeinM.B.等人(1991)生物技术进展7：455-461；Duering K.(1990)植物分子生物学15：281-294。
如果需要，可以用下列例如在“基因寻靶；一种实践方法”，IRL出版社1993概述并描述的标准方法失活或修饰宿主基因。优选将靶基因(或其部分)克隆到有选择标记(如Neo)的载体中，所述标记插入到所述基因中以破坏其功能。将所述载体线性化然后转化(通常通过电穿孔)到胚胎干细胞(ES)(如得自小鼠129/Ola菌株的)中，然后在干细胞中进行同源重组。扩展含基因破坏的干细胞，然后注射到胚泡(如来自C57BL/6J小鼠)中，植入抚育母亲中进行发育。用毛色标记(coat colour marker)可以鉴定嵌合子代。通过交配有遗传标记的小鼠而将嵌合体进行育种以确定ES细胞对精系的贡献，所述遗传标记可以使ES衍生的和宿主胚泡衍生的配子之间产生区别。半数的ES细胞衍生的配子带有基因修饰。筛选子代(例如通过Southern印迹)以鉴定有基因破坏的子代(约占子代的50％)。这些所选的子代是杂合体，因此可以与另一杂合体配种，此后选择纯合体子代(约占子代的25％)。可以将有基因knockout的转基因动物与用已知技术，如将DNA微注射到前核中，原生质融合(Jakobovits etal.(1993)自然362：255-258)或脂介导的ES细胞的转染(Lamb etal.，(1993)天然遗传学5：22-29)(以产生带有内源基因knockout和外源基因置换之转基因动物)而生产的转基因动物杂交。
通过与含特定改变的靶基因序列转化，还可以进一步修饰含靶向基因破坏的ES细胞，可以优选将所述靶基因序列克隆到载体中，然后在转化前线性化。在同源重组后，将被改变的基因导入了基因组。随后用这些胚胎干细胞按上述产生转基因动物。
在本文中术语“宿主细胞”包括适用于表达技术的任何原核或真核细胞，例如细菌，酵母，植物细胞和非人哺乳动物受精卵，卵母细胞，胚细胞，胚胎干细胞和任何其它适用于转基因技术的细胞。如果本文这样允许，术语“宿主细胞”还包括从转化的非人哺乳动物受精卵，卵母细胞，胚细胞，胚胎干细胞和任何其它适用于转基因技术的细胞发育成的转基因植物或非人哺乳动物。
根据本发明的另一方面，提供了选自编码下列物质之多核苷酸序列的多核苷酸序列：
上述的任何第一组分；和
上述任何突变的酶。
根据本发明的另一方面，提供了含上述多核苷酸的载体。
根据本发明的另一方面，提供了含上述多核苷酸的细胞。
现在将用下列实施例说明本发明，其中：
图1描述质粒pQR177的构建。
图2描述牛核糖核酸酶的纯化。在银染色的0.1％SDS-16％聚丙烯酰胺凝胶上评估重组RNase的纯度。泳道A和G是市售RNase(Mr13700)。泳道C-E含有在isocratic洗脱从大肠杆菌[pQR163]培养物中提取的外周胞质并用不同浓度的IPTG(分别为0.5，2和0mM)诱导后得到的正电荷蛋白质。泳道F与泳道3-5一样，但培养物含大肠杆菌[pKK223.3]细胞(对照)。泳道B在离子交换层析后纯化的重组RNase。
图3描述了质粒pATF4的PCR策略。在PCR反应中所用的引物3-6(a)掺入了牛信号序列加人胰核糖核酸酶基因5’六肽的编码序列，而(b)HP-RNase酶最后7个氨基酸的编码序列加终止密码子。引物5和6也掺入了EcoRI的限制位点。
图4描述了通过表达R4A.K6A人胰RNase的PAGE来评估纯度。泳道A和F，2ug RNase；泳道B和C，不同量的从含pATF4之E.coli细胞的外周胞质空间得到的正电荷蛋白质；泳道D和E，1ug和500ng纯化的HP-RNase。
图5描述pATFZ44的重组环PCR生产。
图6描述比较药物前体和相应药物对Lovo细胞的毒性。
图7描述尿嘧啶基药物前体的合成图。
图8是寡核苷酸引物。
图9是尿嘧啶基药物前体类似物的合成图。
图10是胞嘧啶基药物前体类似物的合成图。
图11是化学分子式。
图12是核糖核酸酶A-底物复合物活性位点图，其中B，R和P分别是碱基，核糖和磷酸的结合亚位点。B1是嘧啶特异性的，B2“偏好”嘌呤。3’-嘧啶单核苷酸于B1R1P1结合。5’-嘌呤单核苷酸于B2R2P2结合。3’AMP与B2R2P2结合。由所述酶水解的磷酸二酯键的磷酸基团于P1结合。表明了在各位点中涉及的已知残基。
图13是在反向极性突变酶的活性位点中，药物前体的图，其中
*表示反向极性残基(天然核糖核酸酶中的Lys66)和；
X是正电荷基团(通过反向极性残基相连)。
图14说明通过逆转极性突变酶裂解药物前体。
图15说明天然人RNase作用的机制。
图16描述CpA&C＞p RNase底物的结构。
图17描述胞嘧啶基药物前体的合成图。
图18说明胰HCPB的克隆。
图19说明胰腺HCPB测序。
图20是载体pICI1266。
图21是pICI1266表达载体基因克隆。
图22说明药物前体和相应药物的细胞毒性。
图23列出了生长培养基的组成。
图24是天然核糖核酸酶和核酸片段之间关键氨基酸的相互作用图。在位置P0的正电荷的Lys66与带负电荷的磷酸二酯键有离子相互作用，而在P1的残基在催化过程中是很重要的。
图25描述了氮芥药物前体和突变RNase之间的相互作用。为了避免受天然RNase的逆转，已经讲6位的氨基酸变成带负电荷的谷氨酸。该Glu-66与药物前体中带正电荷的“X”部分相互作用，因此完成了反向极性相互作用。设想在位置R2和B2的突变会增强与药物前体的相互作用。
图26在核糖5’带正电荷部分的两个可能的选自以便与P0的Glu-66发生相互作用。
图27-33说明化学合成方法。
缩写：
Ac酰基
ADEPT抗体指导的酶药物前体治疗
BOC叔-丁氧基羰基
BP-RNase牛胰核糖核酸酶
CPB羧肽酶B
DCCI 1，3-二环己基碳化二亚胺
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMSO二甲亚砜
Et乙基
EDCI 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳化二亚胺
HCPB 人CPB
HOBT 1-羟基苯并三唑
HP-RNase 人胰核糖核酸酶
PCR  聚合酶链反应
TFA  三氟乙酸
THF  四氢呋喃
参考实施例1
制备重组成熟牛胰核糖核酸酶
按Tarragona-Fiol等人在基因(1992)118：239-245中的描述，从牛胰核糖核酸酶(BP-RNase)前体的编码序列制备重组牛胰核糖核酸酶。在tac启动子的控制下，从pQR163中的两个顺反子表达片段表达所述蛋白质。含所述两个随份子片段的质粒称为pQR162(NCIMB 40678)。
参考实施例2
制备Arg4Ala，Lys6Ala人胰核糖核酸酶
按Tarragona-Fiol等人在Protein and PeptideLetters(1994)1，76-83中的描述，用PCR技术，从人颊上皮细胞中提取的基因组DNA得到人胰核糖核酸酶(HP-RNase)的编码序列。有关HP-RNase的制备，描述了在E.coli中工程HP-RNase的表达。为了指导重组人胰酶在E.coli的周质空间表达，将牛胰RNase信号与所述人基因的5’融合。表达重组酶的开始的努力并未成功。结果用定点诱变技术用遗传工程方法得到能够在E.coli中表达的HP-RNase基因。所得的工程酶表明与同源牛酶有相似的动力学特征。
(a)克隆Arg4Ala，Lys6Ala HP-RNase的成熟编码序列
按Maniatis等人(1982)分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，(冷泉港实验室，纽约)中的描述完成限制酶消化，去磷酸化，连接，转化以及小规模质粒DNA的纯化。用CycloneTM DNA合成仪合成寡核苷酸。
用PCR技术，从人颊上皮细胞中提取的基因组DNA得到人胰核糖核酸酶(HP-RNase)的成熟序列。简而言之，通过在口中剧烈搅拌10ml 0.9％的盐水20秒而得到上皮细胞。通过离心沉淀颊上皮细胞的悬浮液(1.5ml)，然后重悬在100ul 10 NaCl，10mMEDTA中。进一步离心后，将细胞沉淀重悬在75ul 20mM的NaOH中，然后在100℃保温30分钟。沉淀细胞碎片，将上清液于-20℃贮存。一份(2-3ml)通常在PCR保温中作为模板。在PCR保温中使用与成熟HP-RNase序列的5’和3’末端互补的两种引物(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；参见图8，引物1&2)(各5pmol)，在PCR保温中还含有人基因组DNA，0.2mMdNTPs，StratageneTM缓冲液(1x)[10X缓冲液是200mM Tris-HCl(pH8.2)和100mM KCl，60mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2，1％ TritonTM X-100和100ug/ml无核酸酶BSA]和2.5单位的pfu聚合酶(Stratagene)。用30个循环的在92℃变性30秒，在55℃退火30秒和在75℃延伸1分钟来完成PCR保温。分析所得的PCR产物，然后用琼脂糖凝胶电泳分离。从琼脂糖凝胶中切出所需的DNA片段，用离心装置(Spin-XTM，Costar)提取DNA。为了为了指导完全的重组酶在E.coli JM107细胞的外周胞质空间中表达，用PCR技术将牛胰RNase的信号序列与人基因的5’末端融合，并将HP-RNase最后7个氨基酸的编码序列加终止密码子与3’末端连接。然后完成PCR保温，其中以该PCR衍生的不含最后7个氨基酸之编码序列的HP-RNase基因的成熟序列为模板，一组不同浓度(从内到最外的引物分别为0.1，0.5和50pmol)重叠引物，0.2mM核苷酸，Stratagene缓冲液(1x，见上文)和2.5单位的pfu聚合酶(Stratagene)。用与上述相同的条件完成保温。按上述处理PCR产物，切下所需的片段，然后从琼脂糖凝胶中提取。用EcoRI裂解该片段，然后连接到预先消化并去磷酸化的pUC18中以便能够通过双脱氧进行双链DNA测序。然后将融合的基因连接到表达载体pKK223.33中；见实施例1。已经将牛信号序列掺入一编码开放阅读框架5’六肽的DNA序列。在启动子开始转录后，用其破坏所产生的mRNA的二级结构。按上述完成重组酶的导入，表达和纯化。分析用该方法得到的外周胞质蛋白质表明没有表现出重组RNase活性的产物。
在这些试验中没有表达人酶并不意外，因为已经成功地用牛信号序列指导重组牛酶转移到外周胞质空间。比较天然人和牛酶的N-末端序列表明在4和6位上有不同，其中在牛酶中的Ala残基在人对应物中分别被Arg和Lys所取代。已知在成熟序列中早期存在带正电荷的氨基酸可以终止转移信号以防止进一步转移。为了克服这个问题，研究了一个对策用Ala残基取代在人酶4和6位上的Arg和Lys。用RCPCR(用于导入所需突变的引物是SEQ ID NO：11-14；参见图8中的引物E-H)得到含所需取代的重组克隆pATF3(参见图3)。在双链DNA测序中，用该质粒嵌合体作为模板以确定是否掺入了4和6位Ala残基的编码序列。用EcoRI切割，与pKK223.3连接产生用于表达工程人酶的嵌合表达载体pATF4(图3)。
(b)从E.coli中表达并纯化重组Arg4Ala，Lys6Ala HP-Rnase
用pATF4转化大肠杆菌细胞并用IPTG诱导导致工程重组人酶的表达，用上述用于生产同源牛酶的方法从外周胞质中分离所述酶。从外周胞质中分离重组HP-Rnase，然后纯化至均一(见图4)。完成重组酶的N-末端测序，并表明已经正确裂解了牛信号序列。这也证明用Ala完成了Arg-4和Lys-6的取代。
用CpA和C＞p底物完成动力学表征(图6)。将动力学参数Km，kcat和kcat/Km与市售和重组牛胰RNase得到的值在相同的检测条件下进行比较(见表)。数据表明工程HP-酶的动力学特性于同源牛对应物没有显著差异。
CpA为底物，在pH7.0不同酶的动力学参数
                                           kcat/Km(mM-1/S-1)
重组HP-RNaseR4A：K6A                           1700(480)
重组BP-Rnase                                   2800(370)
BP-RNase                                       2300(600)
C＞p底物，在pH 7.0不同酶的动力学参数
                                           kcat/Km(mM-1/s-1)
重组HP-RNaseR4A：K6A                           4.2(0.8)
重组BP-Rnase                                   3.9(0.9)
BP-RNase                                       2.3(0.5)
(n)表明标准误差。
参考实施例3
合成并分离鼠A5B7-牛胰核糖核酸酶结合物
能够与肿瘤相关抗原结合的特定抗体是小鼠单克隆抗体A5B7。抗体A5B7与人癌胚胎抗原(CEA)结合而且特别适用于寻靶直肠癌。A5B7是从DAKO Ltd.，16 Manor Coutyard，Hughenden Avenue，HighWycombe.Bucks HP 135 RE，England，United Kingdom得到的。通过常规方法，如Mariani.M等人(1991)分子免疫学28：69-77中描述的F(ab’)2片段从全IgG抗体制备抗体片段。通常抗体(或抗体片段)-酶结合物应至少是二价的，即至少能够与2个肿瘤相关抗原(可以是相同或不同的)结合。用已知方法，如在EP239400中描述的“CDR移植”或按US4816567中描述的通过将完整的可变区移植到人恒定区上可以将抗体分子人化。人化的抗体可用于降低抗体(或抗体片段)的免疫原性。在PCT WO92/01059中已经公开了人化的抗体A5B7。
将生产单克隆抗体A5B7的杂交瘤保藏在欧洲的动物细胞培养物收集中心，Division of Biologics，PHLS Centre for Applied Microbiologyand Research.Porton Down.Salisbury.Wiltshire SP4 OJG.英国。保藏日期为1993年7月14日，保藏号为93071411。可以从保藏的杂交瘤，用本领域移植的标准技术，如Fenge C，Fraune E & Schuegerl K在“Production of biologicals from Animal Cells in Culture”(SpierRE.，Griffiths JR & Meignier B，编)Butterworth-Heinemann，1991，262-265 and Anderson BL & Gruenberg ML在“commercial Production of Monoclonal Antibodies”(Seaver S.ed)，Marcel Dekker，1987，175-195中描述的，得到抗体A5B7。要通过限制稀释不时地再克隆细胞以便保持良好的抗体生产水平。
用于衍生鼠A5 B7的连接物是SATATM(S-乙酰基硫羟乙酸N-羟琥珀酰亚胺酯)，Sigma(产品号A9043)。
用于牛胰核糖核酸酶(BP-RNase)的连接物是SMPB(4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸N-羟琥珀酰亚胺酯)，Sigma(产品号M6139)。
以10mg/ml的浓度将SATA(Sigma)溶解在DMSO(Fisons)中。向50mg以5.4mg/ml在100mM磷酸盐/100mMEDTA，pH7.2(缓冲液A)中的A5B7溶液加入309ug(30.9ul)SATA溶液(表示比A5B7有4摩尔过量)，混合，然后使其在室温保持40分钟。使所得的溶液通过SephadexTMG25柱(Pharmacia)(210ml 2.6×38cm)以在室温除去过量的试剂得到终浓度为2.09mg/ml的衍生的A5B7(总体积为23.5ml)。将SATA衍生的A5B7与1.0ml 10％ v/v 500mM羟胺HCl/500mM磷酸钠/30mMEDTApH8.0混合以使衍生的A5B7去乙酰基，反应在室温进行40分钟。用UV在280nm的吸收值确定蛋白质浓度，e＝l.4(或用BradfordProtein检测)。用Ellmans-SH检测确定连接物的负载，发现为1.2连接物/molA5B7。
将BP-RNase(Sigma)重悬在6.0ml 100mM磷酸钠/100mM NaCl pH7.2(缓冲液B)中以得到8.33mg/ml的浓度。
以10mg/ml的浓度，将SMPB(Sigma)溶解在DMSO中。将50mg BP-RNase溶液与6500mg(650ml)SMPB溶液(表示比BP-RNase5摩尔过量)混合，然后在室温放置120分钟。通过凝胶渗透层析(SephadexG25210ml 2.6×30cm)除去过量的试剂。用UVA280确定衍生的蛋白质浓度，e＝0.6。通过将已知量的2-巯基乙醇加到马来酰亚胺衍生的BP-RNase中，然后，检测未反应的SH基团，通过反向Ellmans试验确定连接物的量。
通过加入等量的去乙酰基化衍生的A5B7和衍生的BP-RNase来进行结合反应，用去离子水稀释以使浓度达到1.0mg/ml，在氮气下混合。使反应室温进行20小时，然后通过加入1mg/ml含水甘油来终止。
通过透析，将粗结合物缓冲交换到50mM磷酸盐pH8.0(缓冲液C)中，然后将所得的溶液用于缓冲液C平衡的Q SepharoseTM(Pharmacia)柱(30ml 1.6×15cm)。用缓冲液C洗涤该柱以除去过量A5B7和B RNase，然后以1ml/分的流速，用0.5M NaCl洗涤液洗脱结合物。
用SDS-PAGE确定所得结合物的纯度，共含5.75g结合物，用激光密度测定法，确定组成为88.4％的结合物和11.6％的游离衍生A5B7。
参考实施例4
合成并分离鼠A5B7 F(ab’)2-牛胰核糖核酸酶结合物
用于A5B7 F(ab’)2衍生的连接物是SATATM(S-乙酰基硫羟乙酸N-羟琥珀酰亚胺酯)，Sigma(产品号A9043)。
用于牛胰核糖核酸酶(BP-RNase)的连接物是SMPB(4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸N-羟琥珀酰亚胺酯)，Sigma(产品号M6139)。
以10mg/ml的浓度将SATA(Sigma)溶解在DMSO(Fisons)中。向以2.14mg/ml在100mM磷酸盐/100mMEDTA，pH7.2(缓冲液A)中的18.20mg F(ab’)2片段溶液加入167ug(16.7ul)SATA溶液(表示比A5B7F(ab’)2有4摩尔过量)，混合，然后使其在室温保持40分钟。使所得的溶液经Amicon YM10TM(100,000MW截断)浓缩至2.0ml(9mg/ml)，然后通过SephadexTMG25柱(Pharmacia)(50ml 1.6×16cm)以在室温除去过量的试剂得到终浓度为1.04mg/ml的衍生的A5B7 F(ab’)2(总体积为10ml)。将SATA衍生的A5B7 F(ab’)2与1.0ml 10％v/v 500mM羟胺HCl/500mM磷酸钠/30mM EDTA pH8.0混合以使衍生的A5B7 F(ab’)2去乙酰基，反应在室温进行40分钟。用UV在280 nm的吸收值确定蛋白质浓度，e＝1.4(或用Bradford Protein检测)。用Ellmans-SH检测确定连接物的负载，发现为1.2连接物/mol A5B7。
将BP-RNase(Sigma)重悬在2.0ml 100mM磷酸钠/100mM NaCl pH7.2(缓冲液B)中以得到7.50mg/ml的浓度。
以10mg/ml的浓度，将SMPB(Sigma)溶解在DMSO中。将15mg BP-RNase溶液与1949mg(1.95ml)SMPB溶液(表示比BP-RNase5摩尔过量)混合，然后在室温放置120分钟。通过凝胶渗透层析(Sephadex G25210ml 2.6×30cm)除去过量的试剂。用UVA280确定衍生的蛋白质浓度，e＝0.6。通过将已知量的2-巯基乙醇加到马来酰亚胺衍生的BP-RNase中，然后，检测未反应的SH基团，通过反向Ellmans试验确定连接物的量。
通过加入等量的去乙酰基化衍生的A5B7 F(ab’)2来进行结合反应，用去离子水稀释和衍生的A5B7 F(ab’)2以使浓度达到1.0mg/ml，在氮气下混合。使反应室温进行20小时，然后通过加入1mg/ml含水甘油来终止。
通过透析，将粗结合物缓冲交换到50mM磷酸盐pH8.0(缓冲液C)中，然后将所得的溶液用于缓冲液C平衡的Q SepharoseTM(Pharmacia)柱(30ml 1.6×15cm)。用缓冲液C洗涤该柱以除去过量A5B7 F(ab’)2，然后用盐梯度(在20个柱体积内0-0.1M)以1ml/分的流速液洗脱结合物和剩余的BP-RNase。通过将含结合物的收集的部分用于S200TMGP
C柱(Pharmacia)(60ml 1.6×30cm)，然后在PBS中以1ml/分的流速跑而从残留的酶中分离结合物。
用SDS-PAGE确定所得结合物的纯度，共含0.70mg结合物，用激光密度测定法，确定组成为95.5％的结合物和4.5％的游离衍生A5B7F(ab’)2。
按参考实施例5中的描述，或用下列方法制备鼠A5B7 F(ab’)2
用含130KDa膜的AmiconTM CH2spiral cartridge装置，通过对7体积0.1M磷酸钠，3mM EDTA(pH6.4)，透析，制备用于消化的A5B7抗体，在参考实施例3中所述的。将回收的物质(用ABS@280评估的3682mg)是0.22uM过滤的，并于4℃贮存直到使用。将晶体木瓜酶悬浮液(10mg/ml，9ml；Boehringer Mannheim，产品编号1080140)与含100mM L-半胱氨酸的0.1M磷酸钠，3mM EDTA(pH6.4)混合，然后在37℃放置30分钟。用0.1M磷酸钠，3mM EDTA(pH6.4)以3ml/分的流速通过大小排阻层析(Pharmacia G25MTM，柱大小为直径2.6cm，长为30cm，总体积约160ml)除去过量的半胱氨酸。收集分离的部分(1分钟)，用OD280检测，用简单的DTNB点试验在收集还原的木瓜酶池前确保清除游离的半胱氨酸。确定还原木瓜酶合并液的浓度(用OD280评估E＝2.5)为1.65mg/ml，体积为32.8ml，总蛋白质为54mg。在37℃，用1/60的还原木瓜酶与A5B7完成消化，使用所有的木瓜酶和655ml的抗体(在开始消化前加热到37℃)，而且评估蛋白质的浓度为4.9mg/ml。在20小时后，在50％乙醇中用0.1×总反应体积的100mM N-乙基马来酰亚胺猝冷反应。从Fc和痕量未消化的抗体中，用400ml经25mM磷酸钠，150 mM氯化钠(pH7.33)平衡的(直到pG和导电率与平衡缓冲液(在15oC19.7mS)的相匹配)Protein A Sepharose FFTM(Pharmacia)柱(体积为5cm×20cm)纯化F(ab’)2。用柱缓冲液以1∶1稀释粗消化物，然后分成2份(660ml和840ml)，各以6.5ml/分(0.33ml/cm2/分的线性流速)负载到蛋白质A柱上。收集10ml馏分。负载后，用平衡缓冲液洗涤该柱，直到吸收值@280nm接近基线。开始的洗涤液由50mM醋酸钠(pH4.5)组成，然后由50mM醋酸钠(pH4.0)扩展，然后是50mM柠檬酸(pH3.0)，接着是50mM柠檬酸(pH2.8)洗涤。在洗涤过程中测量OD280值，然后用正磷酸氢二钠溶液(0.4M)在30分钟内中和合并液。用SDSPAGE(Pharmacia ExcelTM凝胶，考马斯蓝染色的)分析合并液样品。用pH4.0缓冲液洗脱F(ab’)2，用最低pH洗涤液洗脱未消化的A5B7。将F(ab’)2收集的样品透析到100mM磷酸钠，100mM氯化钠，1mMEDTA(pH7.2)。(AmiconTM CH2 30KDa膜，7体积透析)，得到845mg F(ab’)2(@2mg/ml)。
参考实施例5
在骨髓瘤细胞中制备重组鼠A5B7 F(ab’)2
本实施例描述从A5B7杂交瘤制备cDNA，用PCR分离特异性Fd和L，确定这些片段的完整DNA序列，然后在骨髓瘤细胞中共表达以得到重组F(ab’)2片段，培养骨髓瘤细胞并纯化重组F(ab’)2蛋白质。
在文献中描述了数种遗传工程方法在骨髓瘤细胞中生产抗体的方法，包括Neuberger等人(1984)自然312，604-608，Williams andNeuberger(1986)基因43，319-324，Wright and Shin(1991)方法2，125-135，Traunecker(1991)生物技术趋势9，109-113和Bebbington等人(1992)Bio/technology10，169-175。为了方便，本实施例基本上使用Bebbington等人以谷氨酰胺合成酶(GS)基因为选择性标记的方法。
a)从杂交瘤细胞制备mRNA
有数种方法可以从真核细胞中分离polyA+mRNA(SambrookJ.，Fritsch，E.F.，Maniatis T.，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版，第2版，1989，第8章p3，下文称为Maniatis)。一种所述方法是由Pharmacia以试剂盒形式提供的，是依赖于溶解相对少量的细胞(107或更少的)，然后使polyA+mRNA与oligo dT柱结合。通过在升高的温度在高盐溶液中洗脱mRNA前，用低盐浓度洗涤除去不想要的细胞组分。用QuickpripTM mRNA试剂盒(Pharmacia Biotechnology Ltd.)从107 A5B7杂交瘤细胞制备mRNA。通过用Uvikon 930分光光度计(KontronTM Instruments)从300-220扫描样品，并用260nm的40ug/ml/单位OD为因子来评估mRNA的浓度。将mRNA以2.5ug的等份沉淀在乙醇中贮存。
b)cDNA合成
用于cDNA合成的方法是基于Gubler和Hofman的，它们依赖于从引发的mRNA反转录，然后用RNAse H处理以便用DNA聚合酶引发并合成第二条链。用于合成cDNA的其它方法在Maniatis(第8章)中有综述。
在含2.5u胎盘RNAse抑制剂(Life Technologies Ltd.)的10ul溶液中用oligo dT(12-18单体混合物，Pharmacia BiotechnologyLtd.，0.5ug)引发5ug的mRNA，所述溶液是通过用无RNAse水在70℃保温然后在冰上冷却而制备的。通过加入4ul 5xH-RT缓冲液(250mMTris，pH8.3，200mM KCl，30mM MgCl2和0.5mg/ml BSA)，2ul 0.1MDTT(二硫苏糖醇)，1ul dNTP混合物(20mM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，4ulSuperscriptTM Rrverse转录酶(Life Technologies Ltd.)，然后在42℃保温1小时来完成第一条cDNA链的合成。对于第二条链反应，加入1.5ul dNTP(如上述)，92.5ul无RNAse水，30ul 5x反应缓冲液(125mMTris，pH7.5，500mM  KCl，25mM MgCl2，50mM(NH4)2SO4就0.5mg/ml β-NAD)，1ul T4DNA连接酶(10u，Life Technologies Ltd.)，4ul DNA聚合酶I(40u，Life Technologies Ltd.)和1ul RNAse(2.7u，LifeTechnologies Ltd.)，然后在16℃再继续保温2小时。为了确保制备平整末端的cDNA，在加入2ul T4DNA聚合酶(10u，Life TechnologiesLtd.)后，在16℃最终保温5分钟。通过在70℃保温10分钟而停止酶活性。
c)用PCR分离抗体基因片段
用cDNA为模板分离A5B7 Fd和L链片段。Fd片段终止于铰链区序列(C-末端苏氨酸)，下文称为蛋白水解型Fd。在本实施例中蛋白水解Fd指重组Fd等价于在参考实施例4中描述的蛋白水解产生的Fd。
来自第一链cDNA反应或第二链反应后的材料适用于用作模板。可以使用来自完成反应的纯的材料或用双蒸水稀释(达1∶100)使用。在Fd和L链片段的生产中使用寡核苷酸(SEQ ID NO：17-24)。对于各抗体片段，5’区的寡核苷酸(Fd的SEQ ID NO：17和L链的SEQ ID NO：18)编码使翻译起始最大化的限制酶位点(Fd的HindIII和L链的EcoRI)共有序列Kozak序列(GCCGCCACC)和部分天然鼠信号序列。蛋白水解型Fd片段的3’区寡核苷酸(SEQ ID NO：19)与抗体铰链区的3’末端互补，编码突变以在铰链区后导入串联翻译终止密码子(TAG和TAA)，而且在该序列外含有EcoRI限制酶位点。L链的3’区通过与编码区末端互补的寡核苷酸(SEQ ID NO：20)来确定，导入另一翻译终止密码子(TAA)和EcoRI限制位点。除部分重叠的碱基对外，用各片段的互补寡核苷酸(Fd的SEQ ID NO：21和22，L链的SEQ ID NO：23和24)在各DNA中导入沉默突变以便从Fd片段的CH1除去BamHI并从L链除去VL而不会改变编码氨基酸序列。将各5’和3’寡核苷酸与适宜的诱变寡核苷酸一起适宜以在各抗体链产生2个突变片段。纯化后，将2片段等比例混合，作为使用相关的5’和3’区寡核苷酸的第二PCR反应的模板。这些反应的产物是不含BamHI的全长Fd和L链片段。
通常，将5ul cDNA加到含10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，0.1％明胶，1.5mM MgCl2，各1.25mM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，各1uM的适宜寡聚碱基对，和2.5u TaqDNA聚合酶(Amplitaq，Perkin-Elmer Cetus)的100ul反应中。用100ul矿物油覆盖各反应，然后在94℃保温1.5分钟，在50或55℃保温1.0分钟并在72℃保温2.0分钟进行25个循环，加在72℃保温10分钟。同时进行没有DNA的对照反应。
通过将各5ul的样品在0.8％琼脂糖(Sigma Chemical Company Ltd)上跑胶，然后用1ug/ml溴化乙锭(BDH实验室提供)溶液染色并用UV透射器(fransilluminator)肉眼观察DNA来分析PCR反应物。在有A5B7cDNA存在的所有PCR中均可见到适宜大小的带，表明成功地扩增了Fd和L链。在对照反应中没有DNA带，表明所用的试剂不含有污染的DNA。
用Centricon 100TM微浓缩仪(Amicon Ltd)纯化各PCR产物。将各反应物加到浓缩仪中，通过加入双蒸馏水使体积增加到2ml。然后以500xg离心(带有H1000B的Sorval RT6000BTM半敞开的离心机)所述单位5分钟，去掉“流出物”。将残留物再稀释到2ml，然后再进行单位离心。将该过程再重复第3次。该过程使得从扩增的DNA中除去过量的寡核苷酸缓冲组分。在随后的PCR反应中直接使用这些纯化的DNA。等比例混合适宜的片段对，在有相应5’和3’寡核苷酸的第二PCR中使用各等份。
d)将PCR产生的片段亚克隆到pBluescriptTM
第二PCR反应的产物有约775bp和730bp的带，分别与全长Fd和L链相符。同样按上述用Centricon 100TM微浓缩仪纯化这些产物。然后用含50ul 3M乙酸钠，500ul蒸馏水和1ml无水乙醇的1.5ml溶液沉淀各DNA产物。在以11600xg离心10分钟(MSE MicroCentarrTM)前将溶液在冰上至少保温10分钟。除去上清液，用1ml 70％乙醇(v/v在蒸馏水中)洗涤沉淀，再离心5分钟。除去上清液，在真空下干燥DNA沉淀。将各DNA沉淀重悬在蒸馏水中。然后在200ul含20mM Tris-乙酸盐，pH7.9，10mM乙酸镁，50mM乙酸钾，1mM二硫苏糖醇(DTT)和各25uHindIII和EcoRI(Promega Corporation)的反应液中用EcoRI和HindIII消化FdPCR产物。在含90 mM Tris-HCl，pH7.5，10mM氯化镁，50mM氯化钠和10u EcoRI的30ul反应液中消化L链产物。将消化产物在37℃保温1小时。
然后在0.75％SeaplaqueTMGTG琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts Ltd)上电泳纯化消化的片段，然后从凝胶上切下适宜的带。通过在65℃保温2分钟再溶解琼脂糖凝胶片，用蒸馏水稀释到450ul的终体积，加入50ul3M乙酸钠。用等体积的液化酚萃取该溶液，用Tris缓冲液pH7.6平衡(Fisons Scientific Equipment)，以11600xg离心2分钟(MSEMicroCentarrTM)以分离水相和酚相。然后再用酚∶氯仿混合物(50∶50 v∶v)再萃取水相，按上述，在用乙醇沉淀前再用氯仿萃取。将各纯化的沉淀重悬在10ul的蒸馏水中，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳观察1ul样品以评估数量和浓度。
用pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems)开始Fd和L量cDNA。该噬菌粒有单一的EcoRI和HindIII克隆位点。氨苄青霉素抗性基因，和分离双或单链DNA的ColEI和f1复制起点。用30u EcoRI(PromegaCorporation)在100ul含90mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，50mMNaCl的反应液中或用EcoRI和HindIII在100ul含20mM Tris-乙酸盐，pH7.9，10mM酸镁，50mM乙酸钾，1mM二硫苏糖醇(DTT)和各25u的EcoRI和HindIII(Promega Corporation)反应液中于37℃将5ug pBluescriptTM KS-DNA消化1小时。将2ul的牛肠碱性磷酸酶(2ubohringer Mannheim)加到EcoRI消化的质粒中以除去5’磷酸基，然后在37℃继续再保温30分钟。通过在70℃保温10分钟而破坏磷酸酶活性。按上述从SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶中纯化EcoRI-HindIII切割的质粒。
在含30mM Tris-HCl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP和。1.5u T4 DNA连接酶(Promega Corporation)的10ul溶液中，于16℃将25-50ng消化的Fd或L链PCR产物与EcoRI-HindIII或EcoRI/CIP分别处理的pBluescript连接2.5小时。使用用细胞提供的方法，用1ul的各反应液转化20ul的感受态E.coliDH5α细胞(Life TechnologiesLtd.)。将转化的作保铺在L-琼脂加100ug/ml氨苄青霉素，1mM IPTG和0.2％X-gal的平板上，在37℃保温过夜。基于含亲本质粒细胞产生蓝色而在上述培养基中产生白色菌落的事实为基础，筛选含克隆插入片段的克隆。
e)cDNA克隆的DNA序列分析
从琼脂平板中检出通过颜色筛选而鉴定的潜在Fd和L链cDNA克隆，然后用于大规模的质粒DNA的制备。用各克隆接种在500ML中的200ML的L肉汤和100ug/ml氨苄青霉素，将培养物保温在37℃振荡过夜，生长后在4℃用Sorvall RC5C离心机和GS3旋转器以5000xg离心10分钟沉淀各培养物中的细胞。将各培养物的细胞沉淀重悬在20ML的TE缓冲液中，然后在4℃ oak-ridge管用Sorvall RC5C离心机和GS3旋转器以2000xg再离心10分钟。将各洗涤的细胞沉淀重悬在3ML冰冷25％蔗糖，mMtrisph8.0中，然后放在冰中。加入新鲜的溶菌酶溶液(10mg/ml，1.0ml)，通过旋转试管混合内含物，然后在冰上继续保温5分钟。加入乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液(0.5mm，1.0ML PH8.5)，缓慢混合内含物。最后加入5.0ML冰Triton XTM溶液(0.1％ Triton100，62.5mMEDTA，50mM Tris，pH8.0)，缓慢混合内含物，在冰上再保温10分钟，在4℃橡树边用Sorvall RC5C离心机和SS-34旋转器以39000xg再离心30分钟沉淀细胞碎片。将含质粒DNA的上清液加入到16g氯化铯(Bohringer Mannheim)和150ul溴化乙锭溶液(10g/ml)中，然后加入TE缓冲液使体积增加到18.5ml。将该溶液转移到18.5ml crimptop，聚丙烯离心试管(Sorvall Instruments)中。密封该试管，然后用Sorvall TV865B(titanium，vertical)旋转器和OTD65B离心仪于18℃以180000xg离心。
离心后，在形成的CsCl.EtBR密度梯度中，质粒DNA为不同的橙色带。用皮下针管刺透试管壁，从梯度中去除质粒DNA。用TE缓冲液将从梯度中去除的样品稀释3-4倍，然后加入等体积的异丙醇沉淀DNA，并在冰上保温10分钟。在4℃用Sorvall RC5C离心机和SS-34旋转器以17000xg离心沉淀沉淀的DNA。然后除去上清液。用70％乙醇(v/v)洗涤所得的沉淀，然后再离心5分钟。然后在真空下干燥沉淀，再悬在1.8ml TE缓冲液和200ul 3M乙酸钠中，然后以17000xg离心2分钟用等体积酚萃取以分离相。在于-20℃加入等体积乙醇沉淀DNA前并在冰上保温10分钟，用等体积氯仿再萃取水相。胺上述沉淀纯化的DNA，用5ml 70％乙醇洗涤，真空干燥沉淀。将干燥的沉淀重悬在500ul蒸馏水中，用50ug/ml/OD260的消光系数，UV分光光度计从300-220nm扫描稀释的样品，以确定DNA浓度。许多专利试剂盒，如QiagenTM(Hybaid Ltd)可用于质粒DNA的纯化。
然后用所述纯化的质粒DNA进行DNA序列分析。使用专利测序试剂盒如由美国生物化学公司提供的SequenaseTM和方法的Sanger(Pro.Nat.Acad.Sci.USA 74，1977，p5463)的双脱氧链终止法可以分析双链DNA的DNA序列。
将Fd和L链cDNA克隆质粒DNA等份样品(2-4ug)用于DNA序列分析。开始通过在室温，与终体积为100ul的0.2mNaOH，0.2mM EDTA保温10分钟而使各样品变性。然后通过加入10ul 3M乙酸钠(pH5.0)和275ul乙醇，然后在冰上保温10分钟来沉淀变性的DNA。按上述有关质粒DNA的描述回收沉淀的DNA。通过在10ul SeqenaseTM反应缓冲液(10mMTris，pH7.5，25 mM MgCl2，50mM NaCl)中与0.5pmol的适宜引物在65℃保温2分钟，然后逐渐降到30℃以下而引发变性的DNA进行测序，所述缓冲液含10％二甲亚砜(DMSO)。然后根据加到标记和终止混合物中的10％DMSO的方法，将这些引发的模板用于测序反应。
在6％聚丙烯酰胺：8M尿凝胶上高分辨率电泳后，通过放射自显影分析测序反应(Sangerand Coulson，1978，FEBS lett.87，p107)。
下面给出克隆cDNA的完整Fd和L链序列(蛋白水解型Fd链的SEQ IDNO：25和L链的SEQ ID NO：26)。含蛋白水解型Fd的质粒称为pAF1，含L链的质粒称为pAF3。还确定在用于除去BamHI位点的各片段存在沉默突变。DNA序列表明，与公开的恒定区DNA序列数据(在Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Bilofsky，H.Reid-Milner，M.，Perry，H.，1987Seqences of Proteins of Immunological Interest，FourthEdition.Public Health Service N.I.H.Washington DC)。
f)亚克隆到骨髓瘤表达载体中
为了得到能够在骨髓瘤细胞中共表达Fd和L链的载体，适宜GS-SystemTM系统(Colltech Biologics)(WO 87/04462，WO 89/01036，WO 86/05807和WO 89/10404)。
该方法需要将Fd链克隆到pEE6[pEE6.hCMV-(Stephens andCockett(1989)Nucleic Acids Research 17，7110-其中已经将hCMV启动子上游的HindIII位点变成BglII位点)的衍生物]HindIII-EcoRI区，将L链克隆到pEE12[该载体与Bebbington etal.，(1992)Bio/Technology，10，169-175中描述的pSV2.GS相似，有许多最初存在于pSV2.GS中的限制位点，通过定点诱变来除去以在多接头区提供特有的位点]中。结果，将pEE6的BglII-BamHI Fd表达盒插入到pEE12的BamHI区。另外，可以将含Fd表达盒的BglII-SalI片段插入到含L链之pEE12质粒的BamHI-SalI区。
为了构建各个载体(在pEE6中的蛋白水解Fd和在pEE12中的L链)，按上述用EcoRI和HindIII消化质粒pAF1和pEE6，用EcoRI消化pAF3和pEE12。然后从SeaplaqueTMGTG琼脂糖中分离适宜的载体和来自各消化产物的插入片段，连接在一起，按前述用于转化感受态DH5α细胞。将转化细胞铺在L琼脂加100ug/ml氨苄青霉素上。用PCR方法从转化体中筛选菌落。将菌落转移到200ul蒸馏水中，然后旋转混合。然后将悬浮细胞加热到100℃ 1分钟，然后在PCR反应中使用上清液前，以11600xg离心2分钟。在各PCR反应中，将引发的CMV启动子内的寡核苷酸(SEQ IDNO：27)与互补于Fd3’区(SEQ ID NO：19)或L链3’区(SEQ ID NO：20)的寡核苷酸一起使用为宜。在各种情况下，只有其中抗体片段基因以表达方向插入到CMV启动子下游的克隆才产生约2.0kbp的特异性PCR产物。取20ul的PCR反应物，其中含有各20pmol的各种寡核苷酸(SEQID NO：27与SEQ ID NO：19或20)，10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mMKCl，0.1％明胶，1.5mM MgCl2，各1.25mM的dATPdCTP，dGTP和dTTP和0.5uTaqDNA聚合酶(AmplitaqTM，Perkin-Elmer Cetus)。用20ul矿物油覆盖各反应，然后在94℃保温1.5分钟，50℃ 1.0分钟，72℃ 2.0分钟共25个循环，加上在72℃再保温10分钟。同时进行用含亲本质粒和不含DNA的对照反应。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应，通过2.0kbp PCR产物的存在来鉴定潜在的克隆。将这些可能的克隆用于大规模制备质粒DNA，通过限制酶EcoRI-HindIII或EcoRI消化来表征，然后按上述通过DNA序列分析确定插入序列。将分离物命名为pAF4(在pEE6中的蛋白水解型Fd)和pAF6(在pEE12中的L链)。
为了得到共表达载体，用在含50mM Tris-HCl，pH7.9，10mM氯化镁，150mM氯化钠和1mM DTT溶液中的各30u的BglII(Pharmacia)和BamHI(NewEngland Biolabs)，在37℃将5-7.5ug的Fd质粒pAF4消化1小时。通过琼脂糖凝胶电泳确定消化。在37℃，用上述溶液中的25单位的BamHI(New England Biolabs)通过保温1小时消化5ug的L链质粒pAF6。然后通过加入2单位的CIP将DNA去磷酸化，在37℃保温40分钟，接着用10ul StratacleanTM树脂(Stratagene Ltd.)抽提三次。从SeaPlaqueTMGTG琼脂糖凝胶纯化Fd表达盒片段和主要pAF6质粒带，适宜地组合连接在一起，然后按前述用连接产物转化感受态DH5α细胞。
g)鉴定共表达载体
在50批中一式两份从上述转化中捡出100个菌落，放到铺了L-琼脂加100ug/ml氨苄青霉素平板的9cm硝酸纤维素片(schlercher andSchull)上。将第三组没有滤纸的平板划痕以形成筛选菌落的原种。37℃保温过夜，取出硝酸纤维素片，然后按Grunstein and Hogness(Maniatis，第1章，102页)的方法处理以在原位溶解细菌。将滤纸覆盖在浸于不同试剂的3MM纸(whatman)上，-10％SDS 2分钟，3MNaOH，1MNaCl 5分钟以及1M Tris，pH6.8 2×2分钟。将含溶解细胞的滤纸转移到用20学SSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠)润湿的3MM纸，然后通过暴露于设定选择性交联(120000u Joules)的SpectrolinkerTMXL(Spectronics Corporation)中的UV光而使DNA与滤纸交联。在检测(见下文)前将滤纸空气干燥。将原种平板于4℃贮存直到使用。
用Fd和L链特异性的寡核苷酸(分别为SEQ ID NO：22和24)产生含-Fd和L链克隆特异性的杂交探针。可以通过T4多核苷酸激酶的作用，加入来自γ32P ATP的放射性5’磷酸基团，从合成的核苷酸形成杂交探针。将20pmol的寡核苷酸加到含100mM Tris pH7.5，10mM MgCl2，0.1mM亚精胺，20mM DTT，7.5uM ATP，0.5uM γ32P ATP和2.5单位T4多核苷酸激酶(Pharmacia Biotechnology Ltd.)的20ul反应物中。在37℃将反应物保温30分钟，在杂交前于70℃保温10分钟。在Maniatis(第11章)中提供了用于从寡核苷酸产生杂交探针的方法。将10ul的放射性标记的寡核苷酸加到然后用作探针溶液的10ml 6×SSC(1M NaCl，0.1M柠檬酸钠)，0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)和0.25％MarvelTM(脂肪还原的干燥奶粉)中。
在使用旋转玻璃试管的Techne HB-1杂交箱中，一式两份分别在90ml6×SSC，0.1％SDS，0.25％MarvelTM中于65℃，将处理的含所选克隆的滤纸(见上述)预杂交3小时。然后在相同的装置中，将每个两份组在10ml探针溶液(一组用VH探针，另一组用VL)在65℃过夜检测。保温后，在相同的装置中，将各组滤纸分别按下列进行洗涤，65℃ 100ml6×SSC，0.1％SDS 15分钟， 65℃ 100ml 3×SSC，0.1％SDS 30分钟，以及65℃ 100ml 1×SSC，0.1％SDS 30分钟。将洗涤的滤纸空气干燥，在-70℃，用HyperfilmTM MP(Amersham International)与钨酸盐增强屏放射自显影。用柯达自动胶片处理器将胶片显影后，通过两种探针的杂交来鉴定潜在的F(ab’)2表达克隆。与Fd和L链特异性探针杂交的克隆频率很低(约2％)。从原种平板中捡出潜在的共表达克隆，然后用于大规模制备质粒DNA。通过EcoRI和HindIII的限制消化分析来确定各表达盒的方向。鉴定只含有串联方向(而不是收缩的)之L和Fd表达盒的克隆。得到共表达载体pAF8(在pEE12中的蛋白水解Fd和L)。
h)转染骨髓瘤细胞
现有数种方法可以将DNA导入到真核细胞中(Bebbington，C.，1991，方法，2卷，136-145)。最近通常使用电穿孔来代替磷酸钙-DNA共沉淀法。由于没有任何内源分泌的抗体蛋白质，所以NS0骨髓瘤细胞(酶学方法，1981，73B，3-46，ECACC cat no.85110503)是这项工作适宜的宿主细胞。在转染Fd和L链后，预期在无谷氨酰胺培养基中产生的菌落比例，共表达质粒将表达功能A5B7抗体片段。
在转染前，在37℃将40ug的pAF8质粒DNA通过用200单位SalI(NewEngland Biolabs)在400ul反应液中消化1.75小时而线性化，所述反应液含有10mM Tris-HCl，pH7.9，10mM氯化镁，150mM氯化钠，1mM DTT和100ug/ml酰化BSA。消化后，用乙醇沉淀各DNA，然后重悬在50ul的蒸馏水中。
于37℃5％CO2中，在含50ml非选择性生长培养基(Dubecco’s改性Eagle培养基，Lefe Technologies Ltd.加来自认可源的10％胎牛血清)的160cm2组织培养烧瓶(Nunc或Costar)中，使NS0细胞生长接近汇合。转染前，通过将烧瓶对手或工作台轻敲来重悬NS0细胞，然后转移到50ml的锥形离心试管(Falcon)中。取一份样品(40ug)，用设置在10-20um间的Coulter计数器评估细胞浓度。以500xg离心5分钟(Sorval RT6000Cbenchtop离心)而沉淀细胞，用45ml冰冷磷酸缓冲盐(PBS)洗涤，然后再离心。将洗涤的细胞重悬在冰冷PBS中，达到每ml1.3×107细胞并在冰上贮存。将各50ul SalI消化的质粒DNA于800ul(107)NS0细胞中0.4cm径长的电穿孔小瓶中混合，避免小泡，然后在冰上将小瓶保温5分钟。用一组织将小瓶擦干，放在Gene PulseTM电穿孔仪(Bio-RadLaboratories Ltd)上，根据制造商的说明，以3u，1500v进行连续2个脉冲。电穿孔后，在与30ml预热的非选择性培养基混合前，将小瓶再放在冰上。将约20ml的该细胞悬浮液以每孔50ul分散到4×平底96孔组织培养板(Nunc)中。用30ml非选择性培养基再稀释另10ml，并铺在5×96孔平板中。再用(10-40ml)非选择性培养基稀释已稀释过的悬浮液并铺在5×96孔平板中。然后在37℃将细胞于5％CO2中保温过夜。将无谷氨酰胺选择性培养基(150ul Bebbington etal.，(1992)Bio/Technology 10，169-175)加到96孔平板的各孔中，然后将平板放回到保温箱中以逐渐消耗谷氨酰胺，直到用肉眼可观察到菌落。
I)扩大细胞系
从每孔有一个菌落的96孔平板中筛选菌落。通过吸起和放下而重悬细胞，并将100ul转移到24孔平板的孔中，向根孔加入1ml的选择性培养基。再将100ul选择性培养基加回到已取出菌落以提供细胞系后备源的96孔平板的孔中。在37℃，5％CO2中保温24孔平板直到约50％的细胞生长汇合。在该阶段，取出100ul的培养上清液，用ELIDA试验检测抗CEA结合活性(见下文)。再通过吸起和放下扩大有结合活性的细胞系，并转移1ml至25cm2组织培养烧瓶中。再将1ml的选择培养基加到各烧瓶中，将烧瓶倾斜保温以使细胞向烧瓶底部浓度。保温数天后，将3ml的选择培养基加到各烧瓶中，然后水平保温，直到细胞达到50-75％的汇合。在该阶段，从细胞中除去培养基，然后用5ml选择培养基仔细洗涤细胞，再将培养基除去，并用另5ml选择培养基代替。将烧瓶放回到保温箱中保温24小时。然后敲击烧瓶以收集细胞，用在10-20um检测范围的Coulter计数器或使用苔盼蓝溶液(Life Technologies)染色，然后在显微镜下计数活细胞(未染色的)来计数细胞密度。离心(～300xg 5分钟)沉淀细胞，取出上清液并于4℃贮存以用于分析抗体片段的表达(见下文)。用50％透析胎牛血清培养基，40％无谷氨酰胺DMEM和10％DMSO重悬细胞，达到每ml1-2×106g细胞的浓度。将1ml一份的细胞转移到螺旋帽的低温试管(Nunc)中，于-70℃冷冻过夜，然后转移到液氮中长期贮存。
Western印迹分析
按如下完成Western印迹分析。
将各上清液样品等份(15ul)与含有或不含有还原剂的等体积的样品缓冲液(62.5mM Tris，pH6.8，1％SDS，10％蔗糖和0.0 5％溴酚蓝)混合。在8-18％丙烯酰胺梯度凝胶(ExcelTM Produkter AB)按制造商说明电泳前，在100℃将样品保温15分钟。电泳后，用NovablotTM装置(LKBProdukter AB)，按制造商提供的方法将分离的蛋白质转移到HybondC-SuperTM膜(Amersham International)上。印迹后，将膜空气干燥。
用抗鼠F(ab’)2抗体-过氧化物酶结合物(ICN Biomedicals，产品号67-430-1)检测抗体片段的存在。尽管产生的是抗鼠F(ab’)2的一级抗体，但已经表明主要与κL链结合。用ECL检测系统(AmershamInternational)，按照提供的方法观察鼠A5B7抗体片段的存在。这表明在细胞上清液中约90％的材料是F(ab’)2蛋白质。
k)ELISA分析
标准ELISA检测方法参见生物化学和分子生物学实验室技术(“Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology”，)Burdon.R.H.and van Kippenberg，P.H.，编，15卷，酶免疫检测实践和理论(“Practice and Theory of EnzymeImmunoassays”.)Tijsen.P.1985，Elsevier Science Publishers B.V.。另一资料源是抗体-实验室操作(“Antibodies-A LaboratoryManual”)Harlow.E.and Lane D.P.1988，由冷泉港实验室出版。用细胞上清液(见上文)按下列方法检测抗CEA结合物质：
1)抗CEA ELISA
1 制备包被缓冲液(碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液1胶囊-SigmaC-3041-在100ml双蒸馏水中)。
2 将5ul CEA原种溶液(0.2mg/ml，DALO)加到各96孔平板的10ml包被缓冲液中。
3 将100ul稀释的CEA加到Nunc“MaxisorpTM”微滴定板的各孔中。
4 4℃将平板保温过夜(或室温2小时)。
5 各用磷酸缓冲盐+0.01％叠氮化钠(PBSA)将平板洗涤4次5分钟。
6 用在PBSA中每孔150ul的1％BSA(Sigma A-7888)阻断平板(banging干燥后)。在室温保温2小时。
7 各用PBSA洗涤平板4次5分钟。
8 按适宜量负载样品(培养上清液)和标准物(双倍稀释的蛋白水解A5B7F(ab’)2)。用生长培养基(或PBS)稀释样品。PBSA+1％BSA和稀释物作为空白。
9 4℃保温过夜。
10 各用PBSA+0.5％吐温20将平板洗涤6次5分钟。
11 制备二级抗体溶液(抗-小鼠IgGF(ab’)2，来自山羊过氧化物酶结合物-ICN 67-430-1-在40ml PBSA+1％BSA+0.5％吐温20中20ul)，每孔加入100ul。
12 在室温保温2小时。
13 各用PBSA+0.5％吐温20将平板洗涤6次5分钟。
14 通过将磷酸盐-柠檬酸过硼酸盐缓冲液(Sigma P-4922)溶解中100ml双蒸馏水中来制备显色溶液。每100ml缓冲液加入30mg o-苯二胺二氢氯化物(OPD，Sigma P-8287)。每孔加100ul。
15 在黑暗中室温保温15分钟。
16 通过每孔加入50ul 2M硫酸停止反应。
17 用平板阅读器读出490nm的OD。
m)计算特定的生产率(SPR)
用Softmax数据处理包确定各样品中抗CEA结合活性的量。参考表明大部分的抗体L链(＞90％)是作为F(ab’)而存在的Western印迹分析数据，从该图可以近似地得出细胞上清液中所存在的A5B7F(ab’)2片段量的图。然后用该图以ug/106/24小时计算特定的生产率，用ug/106/24按照生产率将细胞系分成等级。通常分离的最好细胞系的SPR为4ug-10ug/106/24小时。
纯化重组A5B7F(ab’)2
用r-蛋白质A 500mg盒，如由NyGene制造的，从骨髓瘤培养基上清液中纯化重组A5B7 F(ab’)2物质。首先用100mM柠檬酸pH8.2柠檬酸盐缓冲液洗涤所述盒，然后用150mM氯化钠10mM磷酸钠pH7.4平衡直到洗涤pH与平衡缓冲液的pH相配。均用Millipore滤器预过滤这两种缓冲液。
同样预过滤含重组A5B7 F(ab’)2的(1.8升)，然后用平衡缓冲液以1∶1稀释。将稀释的培养基负载到蛋白质A盒上，收集所有未结合的洗涤液。负载后，用平衡缓冲液将盒彻底洗涤直到在280nm的吸收值回到基线。
将缓冲液换成100mM乙酸钠pH4.0，同样预过滤。将该洗脱缓冲液收集为45ml分馏份。在280280nm的吸收值回到基线后，将缓冲液换成100mM柠檬酸pH2.8，以便洗涤柱。确定馏份280nm的光密度，将含显著吸收值的那些滴定到pH7.0，然后用SDS PAGE分析。
基本上按Bebbington等人(1992)在Bio/Technology 10，169-175中的描述滴定在上述纯化中所用的骨髓瘤细胞上清液。GS培养基(目录号51435)和补充培养基(目录号586729从JRH Biosciences(JRHBiosciences Europe.Hophurst Lane.Crawley Down.W.Sussex.U.K.，RH10 4FF)得到。在发酵过程结束时，使上清液通过0.45m滤器过滤以除去任何颗粒物质，于4℃贮存直到纯化，通常不超过24小时。
参考实施例6
合成尿嘧啶基的药物前体类似物(参见图9中的流程图)
将化合物7(5mg)溶解在0.5ml盐酸(0.1N)中以得到所需的终产物(化合物9)。25℃黑暗中半小时后，将原种溶液保持在冰上，然后用含有突变RNase的试验缓冲液稀释样品份。
按如下从尿苷制备化合物(7)：
2’3’-O-甲氧基亚乙基尿苷(化合物1)
20℃将尿苷(5mg)，对甲苯磺酸单水合物(1g)和三甲基正乙酸(15ml)一起搅拌16小时。用甲醇甲醇钠使反应混合物呈弱碱性，然后浓缩成胶。氯仿/甲醇混合物作为洗脱剂，并开始以96∶4(体积)，然后以92∶8的比例在硅胶(Merck 9385)上进行柱层析来纯化所需的产物。
NMR(DMSOd6)：(δ)11.38(s，1H)；7.75(d，1H)：5.95(d)and 5.80(d，total 1H)；5.62(d，1H)；
4.70-5.10(m，3H)；4.18(q)and 4.04(q，total 1H)；3.60(m，2H)；3.15(s)and 3.28(s，total 3H)；
1.57(s)and 1.49(s，total 3H).
5’-叠氮基-5’-脱氧-2’3’-O-甲氧基亚乙基尿苷(化合物2)
0℃，向干吡啶(80ml)中2’3’-O-甲氧基-亚乙基尿苷(7.0g，23.3mmol)的溶液中加入甲磺酰氯(1.9ml，24mmol)。在4℃搅拌16小时后，真空蒸发掉溶剂，用水洗去溶解在氯仿中的残留物。分离有机层，干燥并浓缩以得到粗甲磺酰化物(mesylate)。
将粗反应产物溶解在干二甲甲酰胺(100ml)中，加入叠氮化钠(3.25g 50mmol)。将混合物在85℃搅拌7小时，然后真空蒸发掉溶剂以得到溶解在氯仿中的胶然后用碳酸氢钠溶液洗涤。分离氯仿提取物，在无水硫酸钠上干燥，并浓缩以得到粗5’-叠氮基产物。用粗叠氮中间产物作为下一步的起始物质。
3’-O(和2’-O)-乙酰基-5’-叠氮基-5’-脱氧尿苷(化合物3)
将粗叠氮化物(化合物2，上述)溶解在乙酸(70％)(100ml)中，15分钟后，减压除去溶剂。将残留物重复溶解在纯乙醇中，并浓缩以除去最后的痕量乙酸。该过程得到为2’和3’-区异构体(regioisomer)混合物的所需产物的粗样品。
在DMSOd6中，2’乙酰氧基与3’乙酰氧基的比例为2∶1的NMR：
                                                           (δ)11.40(s，1H)；7.70(d，1H)；
5.60-5.95(m，3H)；5.22(t，0.33H)；5.03(dd，0.66H)；4.41(q，0.66H)；4.24(q，0.33H)；4.14
(q，0.66H)；3.94(m，0.33H)；3.62(m，2H)；2.08(s，0.66H)；2.06(s，0.33H).
3’-O(和2’-O)-乙酰基-5’-叠氮基-5’-脱氧-2’-O(和3’-O)-四氢吡喃尿苷
将来自前述反应的粗乙酸盐溶解在干二氯甲烷(80ml)中。将而氢吡喃(6ml)加对甲苯磺酸单水合物(500mg)加到反应烧瓶中。将混合物在25℃搅拌3小时，此后tlc表明已经消耗了起始物质。用二氯甲烷稀释反应混合物，用碳酸氢钠溶液洗涤，在加压蒸发前干燥有机层。用氯仿/甲烷为洗脱剂(先是97∶3体积，然后95∶5)在硅胶柱上纯化粗产物(2’和3’-区异构体的混合物)。
5’-氨基-5’-脱氧-2’-O(和3’-O)-四氢吡喃尿苷(化合物4)
将来自前述反应的叠氮化物中间产物溶解四氢呋喃(100ml)中并加入三苯膦(6.5g 25mmol)，然后加入水(0.45ml)。在25℃搅拌16小时后，加入浓缩氨，然后反应再继续24小时。将反应化合物浓缩干并用柱层析(先用氯仿/甲烷9∶1，然后氯仿/甲烷1∶1)纯化以得到为2’和3’-区异构体混合物的所需产物。
5’-(N-苄氧基羰基甘氨酰)氨基-5’-脱氧-2’-O(和3’-O)-四氢吡喃尿苷(化合物5)
向在无水四氢呋喃中的5’-氨基-5’-脱氧-2’-O(和3’-O)-四氢吡喃尿苷(3g)溶液中加入N-苄氧基羰基甘氨酸对硝基苯酯(3.1g，9.2mmol)。将溶液在25℃搅拌16小时，浓缩成胶，然后以氯仿/甲醇(96∶6)为洗脱剂在硅胶上用柱层析纯化。得到为区异构体化合物的所需产物(3.6g，75％产率)。
在DMSOd6中的NMR：(δ)11.36(s，1H)；8.02(b，1H)；7.70(two d，1H)；7.32(m，6H)；5.90(d)and
     5.70(d，total 1H)；5.64(d，1H)；5.444(d)and 5.20(d，total 1H)；5.02(s，2H)；4.75(m，1H)；
     3.20-4.25(m，9H)；1.35-1.80(m，6H).
质谱(FAB)，m/e 519(M+H+).C24H30N409需要M+518。
上述产物的3’-O(和2’-O)亚磷酰胺衍生物
向在干燥二氯甲烷(30ml)中的来自上述反应产物(1.9g 3.67mmol)和二异丙基乙胺(1.5ml)的溶液中加入N，N-二异丙基甲基phosphonamidic氯化物。在25℃搅拌5小时后，用氯仿稀释反应物，然后用碳酸氢钠水溶液洗涤。分离氯仿抽提物，干燥并浓缩成胶。用下列洗脱剂(氯仿/三乙胺98∶2，然后氯仿/三乙胺/甲醇96∶2∶2)用柱层析纯化粗混合物以得到含中间产物的所需磷(1.9g)。
全保护的磷酸盐中间产物(化合物6)
相来自上述反应的亚磷酰胺和在干燥乙腈(40ml)中的4-二丙基氨基酚(0.7g，3.6mmol)溶液中加入四唑(0.5g，7.2mmol)。在25℃黑暗中搅拌16小时后，加入叔丁基氢过氧化物(70％，0.4ml)。15分钟后，浓缩反应混合物，溶解在氯仿中，然后用碳酸氢钠水溶液洗涤。分离氯仿层，干燥然后浓缩成胶。用乙酸乙酯，然后用乙酸乙酯/甲醇(93∶7体积)在硅胶上经柱层析纯化。蒸发适宜的馏份得到为2’和3’-区异构体混合物的产物(1.5g)。
DMSOd6中的NMR：
             (δ)11.43(s，1H)；8.10(b，1H)；7.75(m，1H)；7.45(m，1H)；7.35(s，5H)；
  7.00(m，2H)；6.60(m，2H)；5.90(m，IH)；5.69(m，1H)；5.17(m)and 4.97(m total 1H)；5.02(s，
  2H)；4.69(bs) and 4.57(bs，total 1H)；4.53(m)and 4.23(m，total 1 H)；4.08(m，1H)；3.15-3.85
  (m，13H)；1.35-1.75(m，10H)；0.88(t，6H).
质谱(FAB).m/e.787(M+)和788(M++H)。C37H50N5012P需要M+787。
THP保护的药物前体类似物(化合物7)
在加入20％钯碳(150mg)前，将来自前反应的全保护的中间产物(1mmol)溶解在乙醇(20ml)环己烷(10ml)。将混合物回流1小时，然后在减压浓缩前过滤。用氯仿/甲烷(9∶1)为洗脱剂，在硅胶上用柱层析纯化所得的胶以得到游离甘氨酰衍生物。
接着将甲基保护的磷酸盐(1mmol)溶解在叔丁胺(30ml)中。将反应混合物回流16小时，浓缩，然后用氯仿/甲烷(9∶1)然后用氯仿/甲烷(7∶3)为洗脱剂，在硅胶上用柱层析纯化以得到为2’&3’区异构体混合物的THP保护的药物前体类似物。
用高盐液相色谱分离2’和3’区异构体
在Partisil ODS-2柱通过HPLC，用60∶40甲醇/甲酸胺(0.1M)经isocratic洗脱完成分离。收集适宜的馏份，然后冷冻干燥以得到所需的3’连接的中间产物(7)；参见图9中的结构。
DMSOd6中的NMR：
               (δ)8.85(s，1H)；8.25(s，1H)；7.75(d，1H)；6.95(d，2H)；6.5(d，2H)；5.85
     (d，1H)；5.6(d，1H)；4.5(m，2H)；4.3 (m，1H)；4.07(m，1H)；3.2-3.6(m，6H)；3.1(m，4H)；
     1.2-1.6(m，10H)；0.8(m，6H).
参考实施例7
合成胞苷药物前体类似物(见图10的流程图)
胞苷药物前体类似物(化合物13)的制备与参考实施例6中所述的尿苷化合物的制备类似。沿用参考实施例6中的方法，除用化合物12(图10)代替化合物7(图9)外。
标准方法：真空浓缩反应混合物，溶解在CHCl3中，用NaHCO3洗涤，在NaSO4上干燥，过滤并浓缩。用表明的溶剂混合物经闪烁柱层析纯化。
按如下制备化合物12(参见图10)
按照D.P.L.Green.T Ravindranathan，C B Reese and RSaffhill，Tetrahedron 26，1031(1970)制备N4-苄基-2’3’-O-甲氧基亚乙基胞苷(化合物1)。按如下制备N4-苄基-5’-O-2’3’-O-甲氧基亚乙基胞苷(化合物2)。
于0℃向在吡啶(100ml)中的N4-苄基-2’3’-O-甲氧基亚乙基胞苷(9.85g 25.0mmol)的搅拌溶液中加入甲磺酰氯(1.9ml，25mmol)。在25℃搅拌16小时后，在真空下浓缩溶液，再溶解在氯仿中然后用碳酸氢钠水溶液洗涤有机层，从而加工反应混合物。分离氯仿层，在硫酸钠上干燥，然后浓度得到产物。
按如下制备3’-O-乙酰基5’-叠氮基-N4-苄基-5’脱氧胞苷(与2’-O-乙酰基异构体的混合物)(化合物3)。
将粗甲磺酰化物(化合物2)溶解在无水DMF(100ml)中加入叠氮化物(3.25g，50mM)，将反应混合物在80℃搅拌7小时。通过浓缩溶剂，再溶解在氯仿中，然后用碳酸氢钠溶液洗涤氯仿抽提物来完成反应。将浓缩干燥氯仿层得到的残留物溶解在120ml 70％HOAc中。15分钟后，真空去除溶剂，用柱层析(95∶5氯仿/甲醇，然后92∶8氯仿/甲醇)纯化粗产物。所需产物的产率为6g。
按如下制备3’-O-乙酰基5’-叠氮基-N4-苄基-2’-O-四氢吡喃基-5’脱氧胞苷(与3’-O-四氢吡喃基异构体的混合物)(化合物4)。
将来自上述实施例的化合物3(6g)溶解在二氯甲烷(100ml)和二氢吡喃(4ml)中。加入0.5g对甲苯磺酸单水合物后，将混合物在25℃搅拌16小时。完成与上述相似的过程，得到用98∶2氯仿/甲醇洗脱的经柱层析纯化的粗产物，以得到所需的产物。
按如下制备5’-叠氮基-5’脱氧-2’-O-四氢吡喃胞苷(与3’-O-四氢吡喃基异构体的混合物)(化合物5)。
将乙酸盐(化合物4，9.0g不纯的)溶解在甲醇(60ml)中，加入甲氧化钠(3.5g)。在25℃搅拌1小时后，浓缩反应混合物，用闪烁柱层析纯化。产率3.7g。
注意：在该阶段(以及接下来的大部分步骤中)可以用层析分离2’和3’异构体。
按如下制备5’-叠氮基-N4-苄氧羰基-5’脱氧-2’-O-四氢吡喃胞苷(与3’-O-四氢吡喃基异构体的混合物)(化合物6)。
将胞苷混合物(化合物5，3.7g)溶解在无水吡啶(80ml)中，加入催化量的二甲基氨基-吡啶(DMAP)和2ml Z-Cl。25℃搅拌16小时后，完成反应，在硅胶上，(CHCl3/MeOH，95∶5)为洗脱剂，用柱层析纯化产物。得到2.3g的产物。
按如下制备5’-(N-苄氧基羰基)氨基-5’-脱氧-2’-O-四氢吡喃胞苷(与3’-O-四氢吡喃基异构体的混合物)(化合物7)。
将在THF(30ml)中的叠氮化物(化合物6，3.06g)于三苯膦(1.7g)在50℃一起搅拌24小时。加入水(5ml)，在50℃再继续搅拌1小时。浓缩反应混合物，用(先CHCl3/MeOH 9∶1，然后1∶1，最后100％MeOH)在硅胶柱上纯化，得到0.9g产物。
按如下制备N4-苄氧基羰基-5’(N-苄氧基羰基甘氨酰)氨基-5’脱氧-2’-O四氢吡喃胞苷(与3’-O-四氢吡喃基异构体的混合物)(化合物8)。
将胺(化合物7.09g)溶解在无水二氯甲烷(30ml)中，加入对硝基苯-N-羰苄氧基-甘氨酸盐(700mg)中。在25℃搅拌16小时后，浓缩反应混合物，用(CHCl3/MeOH，97∶3，然后95∶5)的柱层析纯化，得到1g所需物质。
按如下制备N4-苄氧基羰基-5’-N(苄氧基羰基甘氨酰)氨基-5’脱氧-2’-O四氢吡喃胞苷基-3’-(N，N-二异丙基甲基)亚磷酰胺，(与3’异构体的混合物)(化合物9)。
将醇(化合物8，1g)溶解在无水二氯甲烷(30ml)中，加入EtN(iPr)2(1.7ml)，然后加入Cl-P(OMe)N(iPr)2(34ml)。在25℃搅拌6小时后，在硅胶上用(CHCl3/Et3N 98∶2，然后CHCl3/Et3N/MeOH 97∶2∶1)柱层析纯化完成的混合物。得到1.1g产物。
按如下制备(甲基)(4-N，N-二丙基氨基苯基)[N4-苄氧基羰基-5’(N-苄氧基羰基甘氨酰)氨基-5’-脱氧-2’O-四氢吡喃胞苷基-3’]-磷酸盐(与3’异构体的混合物)(化合物10)。
将亚磷酰胺(化合物9，1.1g)溶解在无水乙腈(30ml)中，加入4-N，N-二丙基氨基酚(200mg)，加入四唑(420mg)。在25℃搅拌16小时后，加入70％叔-丁基氢过氧化物(0.3ml)。15分钟后，反应混合物完成反应，用EtOAc，然后用EtOAc/MeOH 97∶3洗脱，在硅胶柱层析上纯化粗产物，得到0.85g产物。
按如下制备(甲基)(4-N，N-二丙基氨基苯基)(5’-脱氧-5-甘氨酰氨基胞苷基-3’)-磷酸盐(与3’异构体的混合物)(化合物11)。
将顺-羰苄氧基保护的化合物(化合物10，0.85g)溶解在乙醇(30ml)和环己烷(15ml)中。加入Pd-C20％(400mg)，将搅拌的混合物加热回流4小时。过滤后，浓缩溶液在硅胶上用：首先CHCl3/MeOH 95∶5，然后5∶1，最后100％MeOH洗脱，经柱层析纯化胶。得到100mg产物。
按如下制备(4-N，N-二丙基氨基苯基)(5’-脱氧-5-甘氨酰氨基-2’-O-四氢吡喃胞苷基-3’)-磷酸氢盐(化合物12)。
将磷酸盐(化合物11，100mg)溶解在叔-丁胺(25ml)中，然后加热回流8小时。浓缩后，用HPLC纯化产物(Magnum 20反相柱，洗脱剂MeOH/0.1M甲酸胺，比率为60∶40)。
NMR(DMSd6)：
NMR(DMSOd6)；(δ)9.1(s，1H)，8.19(s，1H)，7.6(d，1H)，7.2(m，3H)，6.95(d，2H)，6.45
(d，2H)，5.8(d，1H)，5.72(d，1H)，4.71(m，1H)，4.45(m，1H)，4.22(m，1H)，4.1(m，1H)，
3.8(t，1H)，3.7-3.15(m，2H)，3.51(s，2H)，3.35-3.5(m，1H)，3.0(m，4H)，1.8-1.2(m，10H)，
0.8(m，6H).
质谱FAB MS[MH+]639
参考实施例8
将A5B7F(ab’)2-BP-RNase结合物定位于LoVo肿瘤异种移植物
按参考实施例4中所述制备的鼠A5B7F(ab’)2-BP-RNase结合物用IODOGENTM试剂(Pierce and Warriner(UK)Ltd.Chester England)，按照制造商说明的方法，经无载体125I放射碘化。用Lindmo等人，J.Immunol.Meth，72，77-891984中的方法，通过与LoVo肿瘤细胞的结合来确定放射碘化后，＞50％免疫活性的体外保留。将含10uCi125I的约10ug结合物静脉内注射到带建立的LoVo肿瘤异种移植物的无毛无胸腺小鼠(nu/nu：Al[k[outbred])(预先皮下注射7天1×107LoVo肿瘤细胞。注射结合物后，在此后的不同时间杀死小鼠，取出肿瘤，血液样品和其它组织，称重，用γ计数器技术。结合物在肿瘤和组织中的分布如下。
A5B7F(ab’)2-BP-RNase的肿瘤和组织定位
组织      4小时      24小时     48小时     72小时     96小时
肿瘤      2.54       3.27       1.00       0.66       0.41
血液      6.38       1.06       0.25       0.12       0.06
肝        1.81       0.62       0.12       0.07       0.06
肾        2.76       0.55       0.23       0.18       0.11
肺        2.85       0.28       0.15       0.09       0.08
单位＝％注射剂量/g组织；结果是来自3个小鼠的平均值。
结果清除地表明A5B7F(ab’)2-BP-RNa se结合物特异性地定位于LoVo异种移植物。在24小时以上，与保护血液的任何其它组织相比，在肿瘤中的结合物/g组织都更多。肿瘤中结合物的水平与用A5B7F(ab’)2-CPG2结合物(Blakey等人，Br.J.Cancer.6 9补充XX1，p14，1994)达到的相似。已经表明用该CPG2结合物的水平足以与氮芥药物前体结合以便导致肿瘤退化，而且延长了在LoVo异种移植物模型中的生长延迟(Blakey等人，Br.J.Cancer.69补充XX1，p14，1994；Blakey等人，Proceedings of the American Association for CancerResearch，35p507，1994)。
参考实施例9
合成马尿酰-L-谷氨酸(见图28)
马尿酰-L-谷氨酸二苄酯(化合物3)(2.06g，4.2×10-3moles)和30％钯碳(50％半体)(0.77g)于THF中于氢气氛中搅拌1.5小时。用Cel.4eTM过滤混合物，将滤液蒸发。用乙醚研制得到白色晶体1.02g(78％)终产物。熔点169-171℃。20D＝-2.5°NMR DMSO d6 12.3，2H(broad)；8.7，1H(t)；8.2，1H(t)；7.9，2H(m)；7.5，3H(m)；4.3，1H(m)；3.9.2H(m)；2.3，2H(t)；1.9，2H(m)
按如下制备起始物质化合物3。向在DMF(35ml)中的马尿酸(0.90g，5×10-3mol)和L-谷氨酸二苄基酯(2.50g，5×10-3mol)溶液中加入1-羟基苯并三唑(0.73g，5.5×10-3mol)，三乙胺(1.05g，9.7×10-3mol)和1(3-二甲基-氨基丙基)3-乙基碳化二亚胺HCl盐(1.05g，5.5×10-3mol)。在室温将混合物搅拌过夜，倒到水(400ml)中，用乙酸乙酯(100ml)抽提两次。用饱和碳酸氢钠溶液，水，2N HCl和水洗涤混合的抽提物。在MgSO4上干燥有机相，蒸发达到为黄色油的起始物质，2.96g(84％)。
NMR DMSO d6 8.7，1H(t)；8.4，1H(d)；7.9，2H(m)；7.5，3H(m)；7.35，10H(m)；5.15，2H
(s)；5.05，2H(s)；4.4，1H(m)；3.9，2H(t)；2.0，4H(m)
参考实施例10
合成马尿酰-L-天冬氨酸
氢气中搅拌在THF中的马尿酰-L-谷氨酸二苄基酯(1.28g，2.7×10-3mol)和30％Pd/碳(50％湿度)(0.51g)3小时。通过CeliteTM过滤混合物，然后将过滤物蒸发干燥。与二乙基醚研制得到所需的终产物，为灰白色晶体固体0.62g(78％)。熔点200-202℃。20D＝+7.9°。
NMR DMSO d6 12.5，2H(broad)；8.7，1H(t)；8.2，1H (d)；7.7，2H(m)；7.5，3H(m)；4.6，1H
(m)；3.9，2H(d)；2.7，2H(m)
按如下合成起始物质。向在DMF(35ml)中的马尿酸(0.90g，5×10-3mol)和L-天冬氨酸二苄基酯(2.31g，5×10-3mol)溶液中加入1-羟基苯并三唑(0.73g，5.5×10-3mol)，三乙胺(1.05g，9.7×10-3mol)和1(3-二甲基-氨基丙基)3-乙基碳化二亚胺HCl盐(1.05g，5.5×10-3mol)。在室温将混合物搅拌4小时，倒到水(450ml)中，用乙酸乙酯(100ml)抽提两次。用饱和碳酸氢钠溶液，水，2N HCl和水洗涤混合的抽提物。在MgSO4上干燥有机相，蒸发得到为黄色油的起始物质，1.90g(80％)。
NMR DMSO d6 8.7，1H，(t)；8.45，1H，(d)；7.9，2H(m)；7.5，3H(m)；7.3，10H(m)；5.15，2H
(s)；5.05，2H(s)；4.8，1H(m)；3.9，2H(m)；2.9，2H(m)
参考实施例11
重组HCPB对Hipp-Arg的酶活性
用分光光度检测法检测纯化人CPB(按参考实施例20中所述生产的)将马尿酰-L-精氨酸(Hipp-Arg)转变成马尿酸的能力。
用浓度为0.75-0.125mM的Hipp-Arg和酶浓度为1ug/ml的CPB，在254nM通过Hipp-Arg转变成马尿酸的起始速率来确定天然HCPB的Km和kcat。37℃，用Perkin Elmer λ2分光光度计，使用1cm径长小瓶用1.0的总体积在0.25mM Tris HCl缓冲液，pH7.5中完成测量。用ENZFOTTERTM软件程序(BiosoftTM，Perkin Elmer)计算Km和Vmax值。用Vmax除以反应混合物中的酶浓度来计算Kcat。
人CPB抗Hipp-Arg的结果是：
Km＝0.18mM
Kcat＝65s-1
结果表明重组HCPB有酶活性而且可以裂解Hipp-Arg中的酰胺键释放马尿酸。
参考实施例12
合成精氨酸氮芥药物前体(见图27)
(2S)，2-(3-(4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-苯氧基羰基)-丙酰基-氨基)-5-胍基-戊酸(化合物5c，图27)
在Paar装置中，以80psi将在含10％Pd/C(200mg)的乙酸乙酯/MeOH(1/1；V/V)中的(2S)，2-(3-(4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-苯氧基羰基)-丙酰基-氨基)-5-(2-硝基)-胍基-戊酸苄酯(化合物4c，图27)(275mg；0.44mmol)氢化6小时。过滤后，蒸发有机层。用CH2Cl2/二乙酯将所得的油再结晶以得到为白色固体的所需化合物5c(180mg)，产率84％。
1HNMR(CD3OD)：1.55-1.7(m，3H)；1.8-1.9(m，1H)；2.6-2.7(m，2H)；2.75-2.85(m，1H)：
2.9-2.95(m，1H)；3.1-3.2(m，2H)；3.6-3.7(m，4H)；3.7-3.8(m，4H)；4.3(dd，1H)；6.75(dd，
2H)；6.95(dd，2H).
MS(ESI)：512-514(MNa)+
Anal(C20H29N5O4Cl21.5H2O)
计算值  C：47.91 H：6.43 N：13.97
实测值  C：47.7  H：6.21 N：14.26
按如下制备起始物质化合物4c。向在CHCl3(10ml)中的(2S)，2-氨基-5-(2-硝基)-胍基-戊酸苄酯(化合物2c)(654mg；1mmol)溶液加入二氢呋喃2，5-二酮(化合物1)(120mg；2mmol)，然后逐滴加入三乙胺(202mg；2mmol)。在室温搅拌2小时后，蒸发溶剂，将粗残留物溶解在水中。用2NHCl将pH调整到2.5。用乙酸乙酯抽提水层。用盐水洗涤有机层，干燥(MgSO4)，蒸发以得到(2S)，2-(3-羧基-丙酰基氨基)-5-(2-硝基)-胍基-戊酸苄酯(化合物3c)。用二乙醚研制所得的固体，过滤掉：280mg(68％)。
1HNMR(CD3OD)：1.52-1.68(m，2H)；1.7-1.8(m，1H)；1.85-1.95(m，1H)；2.45-2.7(m，4H)；
3.15-3.3(m，2H)；4.5(m，1H)；5.15(dd，2H)；7.25-7.4(m，5H)
MS(ESI)：432(MNa)+
向在CHCl3(5ml)中的化合物3c(204mg；0.5mmol)悬浮液中加入4-[双(2-氯乙基)氨基]-酚(化合物6)，EDCI(19mg；0.5mmol)，然后加入DMAP(18mg；0.75mmol)。在室温搅拌6小时，蒸发溶剂。在乙酸乙酯和水之间分离残留物，然后用2NHCl将水相酸化到pH＝3。用乙酸乙酯抽提后，用盐水洗涤有机层，干燥(MgSO4)，蒸发。用CH2Cl2/MeOH(95/5；V/V)为洗脱剂用闪层析纯化残留物以得到为白色泡沫的所需起始物质(281mg)，产率90％。
4c：1HNMR(CD3OD)：1.55-1.7(m，2H)；1.7-1.8(m，1H)；1.85-1.95(m，1H)；2.55-2.75(m，
2H)；2.8-2.9(m，2H)；3.15-3.25(m，2H)；3.6-3.7(m，4H)；3.7-3.8(m，4H)；4.5(dd，1H)；5.15
(dd，2H)；6.7(d，2H)；6.95(d，2H)；7.32(m，5H)
MS(ESI)：647-649[MNa]+
参考实施例13
合成琥珀酸单-(4-[N，N-双(2-氯乙基)-氨基]-苯基)酯(本文也称为中间产物)
搅拌下，向在CHCl3(10ml)中的琥珀酸酐(225mg；2.25mmol)悬浮液中加入4-[N，N-顺(2-氯乙基)-氨基]酚(化合物6，图27，203mg；0.75mmol)，然后加入三乙胺(75mg，0.75mmol)。搅拌化合物过夜，蒸发溶剂。将粗残留物溶解在EtOA/Et2O/H2O中，搅拌下，将pH调到3。用水，盐水洗涤有机层，干燥(MgSO4)，蒸发。从Et2O/环己烷中结晶所得的油，过滤出白色固体，真空下干燥以得到所需的终产物(210mg；产率83％)。熔点98-100℃。
MS(ESI)：356-358[MNa]+
1H NMR(CDCl3)；2.8(dd，2H)；2.9(dd，2H)；3.65(dd，4H)；3.75(dd，4H)；6.65(d，2H)；7.0
(d，2H)
分析(C14H17Cl2O4N0.2H2O)：
计算值：％C：49.78 H：5.19 N：4.15
实测值：％C：49.9  H：5.3  N：4.2
参考实施例14
克隆人胰羧肽酶B(HCPB)
按Maniatis等人(1989)分子克隆，实验室操作手册：第2版，；冷泉港实验室，冷泉港纽约所述，或按特定产物的制造商提供的方法说明完成标准分子生物学技术，如限制酶消化，连接，激酶反应，去磷酸化，聚合酶链反应(PCR)，细菌转化，凝胶电泳，缓冲液制备和DNA产生，纯化和分离。在大多数情况下，从New England Biolabs或其它供应商处购买酶，可以使用等价的过程。用Applied Biosystems 380A DNA合成仪，按照Applied Biosystems Inc.提供的方法，从5’二甲氧基三甲苯游基饱和的核苷-2-氰乙基-N，N’-二异丙基-亚磷酰胺和与在0.2umol规模上控制孔玻璃支持物相连的被保护的核苷制备寡核苷酸序列。
用PCR技术，从克隆在λgt10载体(Clontech.Human胰5’STRETCHcDNA.HL1163a)中的人胰cDNA文库得到编码人胰羧肽酶B的序列，然后克隆到质粒载体(Stratagene)。
通常，将一份cDNA文库样品(滴定度＞108pfu/ml，5ul)与100pmol的两种寡核苷酸引物BPT1和BPB1(SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47)，终浓度为200uM的dNTP，Taq聚合酶反应缓冲液以及终体积为100ul的2.5U Taq聚合酶混合。在加入Taq酶前，将混合物加热到94℃ 10分钟，用30个循环的94℃ 1.5分钟，50℃ 2分钟，和72℃ 2分钟，然后在反应结束时再在72℃保温9.9分钟来完成PCR保温。
设计这两种寡核苷酸引物，以使PCR从BPT1基因(SEQ ID NO：46)的5’(在前序列起始和原序列起始之间)延伸，然后BPB1基因(SEQ IDNO：47)的3’末端PCR延伸回来，如图18所示。还设计BPT1和BPB1分别将特有的限制位点SacI和XhoI导入到PCR产物中。
用琼脂糖凝聚电泳分析一份PCR产物DNA的正确大小(约1250bp)，发现明显含有正确大小的带。纯化来自反应混合物的其它产物，用CentriconTM100微浓缩柱(Amicon)从过量试剂中分离，然后用乙醇/乙酸钠沉淀分离DNA，离心，真空干燥然后再悬浮在蒸馏水中。用限制酶SacI和XhoI限制消化分离的DNA，纯化正确大小的带(约1250个碱基对)，然后切下并用glass-milk(GenecleanTM，Stratec Scientific，或其它相似的产物)从琼脂糖凝胶电泳中分离。
用SacI酶限制消化pBluescriptTM II KS+双链DNA(Stratagene)，用牛肠碱性磷酸酶处理，使产物去磷酸化以除去5’磷酸基团，减少转化后的再连接和载体背景。用glass-milk从酶反应污染物中纯化DNA产物，然后用XhoI酶限制消化。通过切下和玻璃奶(GenecleanTM，StratecScientific，或其它相似的产物)用琼脂糖凝胶电泳纯化并分离正确大小的DNA(约2850个碱基对)。
通过与已知标准比较，用琼脂糖凝胶电泳检测限制并纯化的DNA样品的纯度和浓度。从这些估计中制备连接混合物以便在存在T4DNA连接酶，1mM ATP和酶缓冲液的条件下，以载体与插入片段的摩尔比为约1∶2.5(1 pBluescriptTM II KS+：2.5 HCPB PCR产物)，DNA终浓度为约2.5ng/ul将HCPB基因克隆到载体中。
连接反应后，用DNA混合物转化E.coli菌株DH5α(Gibco-BRL，最大效力的感受态细胞)。将细胞铺在含有用100ug/ml氨苄青霉素筛选质粒的L-琼脂营养培养基上，在37℃保温过夜。通过增加鉴定含带有所需插入片的菌落。
捡出约200个菌落，一式两份铺在无菌硝酸纤维素滤纸(Schleicherand Shull)上，在含用100ug/ml氨苄青霉素筛选质粒载体的L-琼脂营养培养基上预湿，在37℃保温过夜。将一式两份平板于4℃贮存，作为菌落的活细胞源，处理其它平板变性，将来自个体菌落的DNA固定到硝酸纤维素上。从琼脂平板中取出硝酸纤维素滤纸，连续放在以如下方式浸渍的WhatmanTM滤纸上：
1  10％ SDS 2分钟
2  0.5M NaOH，1.5M NaCl 7分钟
3  0.5M NaOH，1.5M NaCl 4分钟
4  0.5M NaOH，1.5M NaCl 2分钟
5  0.5M，Tris pH7.4，1.5M NaCl 2分钟
6  (标准盐柠檬酸盐)2分钟
然后将滤纸放在浸在10×SSC中的WhatmanTM滤纸上，通过紫外光处理，将变性的DNA与硝酸纤维素交联(SpectrolinkerTM XL-1500 UV交联器)。然后在室温使滤纸空气干燥，在6×SSC溶液中于60℃预杂交1小时，同时缓慢搅拌(例如用Techne HB-1D杂交仪)。预杂交阻断在滤纸上的非特异性DNA结合位点。
为了确定哪些菌落含有所需的DNA插入片段，将与硝酸纤维素滤纸交联的DNA与用从胰cDNA文库的HCPB PCR产物(见上述)制备的放射性标记的32P-DNA探针杂交。用在50ul总体积中的T7 DNA聚合酶，经50uCi32P-dCTP(～3000Ci/mmol)标记约50ng的DNA(Pharmacia T7 Quickprime试剂盒)，使反应在37℃进行15分钟。然后将标记的探针加热到95℃ 2分钟以使双链DNA变性，随即加到60℃的6×SSC中，用该溶液代替在滤纸上的预杂交溶液。在60℃再继续搅拌保温约3小时。此后，倒掉杂交溶液，在60℃用2×SSC洗涤滤纸，每次15分钟。然后缓慢印干滤纸，用黏附胶片(SaranTM wrap或相似的)覆盖，在室温下透过X-线胶片(例如柯达XomatTM-AR5)暴露过夜。胶片显色后，鉴定含所需插入片段的菌落是在X-线胶片下，有最强暴露(最暗的点)的那些。从中选出12个菌落用于进一步筛选。从两份滤纸中捡出这些菌落划痕，然后在含100ug/ml氨苄青霉素的L-肉汤营养培养基中生长。
用引物BPT1和BPB1(SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47)，用内引物BPT1(SEQ ID NO：48)和BPB1引发，经PCR检测所选分离物有正确大小的插入片段。设计BPT2在原序列的末端，成熟基因开始前引发并导入XbaI位点。为了进行PCR筛选，捡出所选的分离物菌落，然后分散在200ul蒸馏水中，在密封的EppendorfTM试管中在100℃加热10分钟。在微离心管中，将悬浮液离心10分钟以沉淀细胞碎片，然后在PCR中用1ul的上清液作为DNA模板。通常，将1ul的上清液与20pmol的两种寡核苷酸引物BPT1和BPB1，或BPT2和BPB1，终浓度为200uM的dNTP，Taq聚合酶缓冲液，0.5U在20ul终体积中的Taq聚合酶混合。用25个循环的94℃ 1.5分钟，50℃ 2分钟，72℃ 2分钟，然后再在反应结束时72℃ 9.9分钟来完成PCR反应。
用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物是否有正确大小的DNA(来自引物BPT1到BPB1的约1250个碱基对，来自引物BPT2到BPB1的约900个碱基对，见图18)。12个克隆中的10个含有带正确大小的PCR DNA产物。取10个克隆中的6个制备质粒DNA(用Qiagen MaxiTM试剂盒，来自100ml在37℃含100ug/ml氨苄青霉素的L-肉汤的过夜培养物)。然后有USBSequenaseTM DNA测序试剂盒，其中有T7 DNA聚合酶，测定PCR产物插入片段上的这些质粒DNA制品的序列。用不同的寡核苷酸引物，已知为676，336，337，679，677，1280，1279和1281(SEQ ID NO：48-55)测定每个克隆的序列。在图19中表明了HCPB序列中测序引物的位置，336，1279，676，1280，677和1281是“前向的”，而337和679是“后向的”。
在并包括SacI和XhoI限制位点之间，发现6个克隆中的5个有相同的序列(SEQ ID NO：56)碱基对，用该序列进行进一步的试验。在SEQID NO：57中列出了DNA序列翻译成的其多肽序列，从成熟蛋白质序列开始标1。氨基酸-95表明是推测的原酶序列。只有部分酶分泌前导序列(前序列)位于克隆的PCR成熟的DNA中。多肽序列表明在253位有一天冬氨酸残基，当将整个序列与其它哺乳动物羧肽酶A和B序列相比时，表明是B型特异性(参见由Catasus L.等人标的氨基酸255，生物化学期刊287，299-303，1992和讨论)。然而，克隆序列的135位的半胱氨酸残基在其它公开的人胰羧肽酶B序列(如由Yamamoto等人，在生物化学期刊(Journal of Biological Chemistry，267，2575-2581，1992)中公开的)中未观察到，当与其它哺乳动物胰羧肽酶B的氨基酸序列相比时，Yamamoto表明在其序列中，表明的244位，有一缺口。图19所示也表明在酶识别位点中是天冬氨酸残基的近似位点，在成熟酶的135位的半胱氨酸也是近似位点。
将其中一个克隆于1995年11月23日保藏在工业与海洋细菌的国家收集中心(the National Collectin of Industrial and Marine BacteriaLimited(23 St.Machar Drive，Aberdeen AB21RY.Scotland))，保藏号为NCIMB 40694。将来自该克隆的质粒称为pICI1698。
参考实施例15
在E.coli中表达成熟HCPB-(His)-6-c-Myc
为了在.coli中表达成熟HCPB，将来自pICI1698的成熟基因转移到可以控制蛋白质产物分泌到细菌胞质中的质粒载体中。已经将在细菌宿主MSD522适用于控制表达的该分泌载体，称为pICI266于1993年10月11日保藏在工业与海洋细菌的国家收集中心(AberdeenAB21RY.Scotland)，保藏号为NCIMB 40589。图20是pICI266的质粒图谱。该质粒有四环素抗性基因(TetAh TetR)，并导入用于插入基因表达的AraB操作子和启动子序列，用于表达控制的AraC基因。启动子后为使在其后的多肽序列进入胞质的PelB翻译前导序列。基因克隆位点有数个特有的限制位点，其后为噬菌体T4转录终止序列。图21说明了该区的DNA序列和基因克隆的特征。
为了将成熟HCPB克隆到pICI266中，决定用PCR产生HCPB DNA并在成熟基因的开始对密码子作些改变以导入E.coli优选密码子。另外，为了有助于检测并纯化表达构建体，将称为(His)-6-c-myc的C-末端肽tag加到酶中。tag由6个组氨酸，一个三肽接头(EPE)和来自由抗体9E10(由Evan等人，分子细胞生物学5，129-136，1985公开，并可以从Cambridge Research Biochemicals和其它抗体供应商处得到)识别的c-myc的肽序列组成。通过加入一天冬氨酸得到C-末端。6个组氨酸残基使得可以在金属螯盒柱(例如Qiagen的Ni-NTA琼脂糖)上纯化表达的蛋白质。此外，还用PCR引物在基因的5’(FspI)和3’(EcoRI)导入特有的限制位点以便有利于将PCR产物导入到表达载体中。两个引物的序列，称为FSPTS1和6HIS9E10R1S1列在SEQ ID NO：58和59中。为了得到用于克隆到pICI266中的修饰的基因，在操作约5ng pICI1698 DNA，终浓度为200uM dNTP，Taq聚合酶反应缓冲液，和终体积为100ul 2.5U Taq聚合酶的情况下，用100pmol的引物FSPTS1和6HIS9E10R1S1完成PCR。在加入Taq酶前，将混合物在94℃加热10分钟，用30个循环的94℃1.5分钟，50℃ 2分钟，72℃ 2分钟，然后在反应结束时，再在72℃保温9.9分钟来完成PCR。用琼脂糖凝胶电泳分析一份PCR产物是否有正确大小的DNA(约1000个碱基对)，发现明显含有一正确大小的带。用CentriconTM 100微离心柱(Amicon)，然后通过乙醇/乙酸钠沉淀，离心，真空改造并再悬于蒸馏水中二重过量试剂中纯化并分离反应混合物中剩余的产物。用酶FspI和EcoRI限制消化分离的DNA，通过切下和glass-milk(GenecleanTM，Stratec Scietific或其它相似的产品)从琼脂糖凝胶电泳中纯化分离正确大小的带(约1000个碱基对)。
用KpnI酶限制消化用标准DNA技术(Qiagen质粒试剂盒或相似的产品)制备的pICI266，要非常仔细以确保完全消化。然后通过在65℃保温10分钟，再在冰上冷却而使酶失活。操作dNTP的条件下，胺供应商(NewEngland BioLabs)的说明通过加入T4 DNA聚合酶并在16℃保温15分钟来酶促消化KpnI成熟的3’悬垂端。通过在70℃加热15分钟使酶失活而停止反应。用glass-milk从酶反应污染物中纯化DNA产物，一份用琼脂糖凝胶电泳检测产率，剩余的用EcoRI酶限制消化。仔细地进行以确保完全限制消化。通过切下和glass-milk(GenecleanTM，StratecScietific或其它相似的产品)从琼脂糖凝胶电泳中纯化分离正确大小的带(约5600个碱基对)。
通过与已知标准比较，用琼脂糖凝胶电泳检测限制和纯化DNA样品的纯度和浓度估计值。在存在T4 DNA连接酶，1mM ATP和酶缓冲液的条件下，以载体与插入片段的摩尔比为约1∶2.5(1 pICI266：2.5 HCPB PCR产物)，DNA终浓度为约2.5ng/ul，使用适用于连接平整末端DNA(KpnI处理的FspI到T4 DNA聚合酶)从这些估计中制备连接混合物以便将HCPB基因克隆到载体中。
连接反应后，用DNA混合物转化E.coli菌株DH5α(Gibco-BRL，最大效力的感受态细胞)。将细胞铺在含有用10ug/ml四环素筛选质粒的L-琼脂营养培养基上，在37℃保温过夜。通过增加鉴定含带有所需插入片的菌落。
捡出约350个菌落，一式两份铺在无菌硝酸纤维素滤纸(Schleicherand Shull)上，在含用10ug/ml四环素筛选质粒载体的L-琼脂营养培养基上预湿，在37℃保温过夜。将一式两份平板于4℃贮存，作为菌落的活细胞源，处理其它平板变性，将来自个体菌落的DNA固定到硝酸纤维素上。从琼脂平板中取出硝酸纤维素滤纸，连续放在以如下方式浸渍的WhatmanTM滤纸上：
1  10％ SDS 2分钟
2  0.5M NaOH，1.5M NaCl 7分钟
3  0.5M NaOH，1.5M NaCl 4分钟
4  0.5M NaOH，1.5M NaCl 2分钟
5  0.5M，Tris pH7.4，1.5M NaCl 2分钟
6  (标准盐柠檬酸盐)2分钟
然后将滤纸放在浸在10×SSC中的WhatmanTM滤纸上，通过紫外光处理，将变性的DNA与硝酸纤维素交联(SpectrolinkerTM XL-1500 UV交联器)。然后在室温使滤纸空气干燥，在6×SSC溶液中于60℃预杂交1小时，同时缓慢搅拌(例如用Techne HB-1D杂交仪)。预杂交阻断在滤纸上的非特异性DNA结合位点。
为了确定哪些菌落含有所需的DNA插入片段，将与硝酸纤维素滤纸交联的DNA与用从胰cDNA文库的HCPB PCR产物(见上述)制备的放射性标记的32P-DNA探针杂交。用在50ul总体积中的T7 DNA聚合酶，经50uCi32P-dCTP(～3000Ci/mmol)标记约50ng的DNA(Pharmacia T7 Quickprime试剂盒)，使反应在37℃进行15分钟。然后将标记的探针加热到95℃ 2分钟以使双链DNA变性，随即加到60℃的6×SSC中，用该溶液代替在滤纸上的预杂交溶液。在60℃再继续搅拌保温约3小时。此后，倒掉杂交溶液，在60℃用2×SSC洗涤滤纸，每次15分钟。然后缓慢印干滤纸，用黏附胶片(SaranTM wrap或相似的)覆盖，在室温下透过X-线胶片(例如柯达XomatTM-AR5)暴露过夜。胶片显色后，鉴定含所需插入片段的菌落是在X-线胶片下，有最强暴露(最暗的点)的那些。在这一系列的试验中约50％的菌落有阳性最近。从中选出12个菌落用于进一步筛选。从两份滤纸中捡出这些菌落划痕，然后在含10ug/ml氨四环素的L-肉汤营养培养基中生长。
用引物FSPTS1和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59)，用内引物BPB2(SEQ ID NO：51)和FSPTS1引发，经PCR检测所选分离物有正确大小的插入片段。设计BPT2在成熟基因内引发并产生约430个碱基对的片段。
为了进行PCR筛选，捡出所选的分离物菌落，然后分散在200ul蒸馏水中，在密封的EppendorfTM试管中在100℃加热10分钟。在微离心管中，将悬浮液离心10分钟以沉淀细胞碎片，然后在PCR中用1ul的上清液作为DNA模板。通常，将1ul的上清液与20pmol的两种寡核苷酸引物FSPTS1和6HIS9E10R1BS1，或FSPTS1和BPB2，终浓度为200uM的dNTP，Taq聚合酶缓冲液，0.5U在20ul终体积中的Taq聚合酶混合。用25个循环的94℃ 1.5分钟，50℃ 2分钟，72℃ 2分钟，然后再在反应结束时72℃ 9.9分钟来完成PCR反应。
用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物是否有正确大小的DNA(来自引物FSPTS1和6HIS9E10R1BS1的约1000个碱基对，来自引物FSPTS1和BPB2的约430个碱基对，)。所有12个克隆均含有带正确大小的PCR DNA产物。取6个克隆制备质粒DNA(用Qiagen MaxiTM试剂盒，来自100ml在37℃含10ug/ml四环素的L-肉汤的过夜培养物)。然后有USB SequenaseTMDNA测序试剂盒，其中有T7 DNA聚合酶，测定PCR产物插入片段上的这些质粒DNA制品的序列。另外，用自动DNA测序仪(使用ABI测序装置)测定DNA序列。用不同的寡核苷酸引物。用已知为1504，1590和1731的三个引物检测表达载体和插入基因之间的克隆连接(SEQ ID NO：60，61和62)并给出插入基因开始末端的序列资料。用其它引物，包已知为679，677，1802和1280(SEQ ID NO：51，52，63和53)确定插入基因序列剩余部分的序列。含修饰成熟HCPB的质粒称为pICI712。确定克隆基因的序列，有氨基酸翻译的，从PelB序列的开始到(His)6-c-myc tag的结束列在SEQ ID NO：64中，从PelB第一个密码子开始标1。
为了得到控制表达的修饰的HCPB，用氯化钙转化方法，将pICI712质粒DNA转化到感受态E.coli表达菌株中。在这些菌株中包括能够以阿糖为主要碳源生长的那些，并且是染色体缺失阿糖(Ara)操作子。优选的菌株是MSD213(Casadaban等人，分子生物学期刊，v138，179-208，1980)，有部分基因型，F-Ara Δ (Ara-Leu) Δ LacX74 GalV GalKStrR。另一优选菌株是MSD525(菌株MC106)，基因型为AraS139 Δ(Ara-Leu)7697 Δ Lac74GalU HsdR RpsL。可以从The E.coli GeneticStock Centre.Department of Biology，Yale University，CT，USA得到基因型相似，适用于从pICI266中的AraB启动子控制表达基因的E.coli菌株。37℃，在含10ug/ml四环素的L-琼脂营养培养基中过夜筛选转化体。从转化平板中捡出单个菌落，划线纯化，保持在含10ug/ml四环素的L-琼脂营养培养基中，然后在含10ug/ml四环素的L-琼脂营养培养基中生长。
用相同的方法处理所有pICI712转化的表达菌株以检测克隆HCPB基因的表达。
1 用单个菌落接种在25ml Universal容器中的含10ug/ml四环素的L-琼脂营养培养基，在37℃保温过夜，同时振荡。
2 用0.75ml(1％v/v)的过夜培养物接种在250ml锥形烧瓶中75ml预加热到37℃，含10ug/ml四环素的L-琼脂营养培养基。在37℃继续保温振荡，通过在540nm的吸收值检测生长情况。在培养物的指数生长期诱导克隆蛋白质的表达，在540nm的OD为0.4-0.6，从接种逐渐取90-150分钟。
3 当细胞达到所需的光密度时，通过将烧瓶在室温放30分钟而使培养物冷却到约30℃。然后加入阿糖达到1％(v/v)的终浓度，在30℃继续保温振荡4-6小时。
4 保温后，进行最后的光密度测量，离心收集细胞。用最后的OD值计算蛋白质丙烯酰胺凝胶(Laemmli)负载缓冲液的体积，所述缓冲液用于重悬细胞沉淀。OD小于1时，每0.1OD单位为10ul体积，OD大于1时，每0.1OD单位为15ul体积。Laemmli负载缓冲液由0.125M Tris-HClpH6.8组成，含2％SDS，2％β巯基乙醇，10％甘油和0.1％溴酚蓝。
5 重悬后，通过在100℃加热10分钟而使样品变性，然后离心从上清液中分离粘细胞碎片。将表达样品(通常20ul的上清液)负载到用于电泳分离蛋白质的17％SDS丙烯酰胺凝胶上。通常制备双份凝胶以便一个用于总蛋白质染色(用考马斯蓝或相似的染料和标准条件)，另一个可以处理后用Western分析确定特定产物。
为了进行Western分析，用半干电泳印迹装置(Bio-rad或相似的)将跑凝胶中的蛋白质转移到尼龙膜(例如ProblotTM，AppliedBiosystems)。在处理前或处理期间必须非常小心以确保膜保持润湿。蛋白质从凝胶上转移后，在室温，用在磷酸合成盐(PBS)中的5％低脂奶粉(MarvelTM或相似物)溶液缓慢搅拌5小时阻断进一步的结合。将膜在室温洗涤3次，每次用含0.05％吐温20的PBS，每次5分钟同时搅拌。室温将洗涤膜与用含吐温20和0.5％低脂奶粉的PBS适宜稀释(通常1在10000腹水中或1在杂交瘤培养上清液中)的一级抗体，单克隆9E10小鼠抗-c-myc肽(见上述)保温过夜，同时搅拌。将膜在室温洗涤3次，每次用含0.05％吐温20的PBS，每次5分钟同时搅拌。室温将洗涤膜与用含吐温20和0.5％低脂奶粉的PBS适宜稀释(通常1∶10000)的二级抗体，辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(通常在山羊中产生的，如来自Sigma的A4416)保温至少3小时，同时搅拌。将膜在室温洗涤3次，每次用含0.05％吐温20的PBS，每次至少10分钟同时搅拌。然后用AmershamECLTM Western检测试剂盒方法处理膜，在第一瞬间靠AmershamHyperfilmTM暴露30秒，然后再暴露适宜的时间以达到表达蛋白质带的清晰图象。可以使用另一种检测过氧化物酶表达之蛋白质的相似的敏感方法。
用考马斯蓝染色凝胶确定在E.coli菌株MSD213和MSD525中，很好表达了在pICI226(pICI712)中克隆标志的HCPB，与单独的载体(pICI226)克隆比较时，在约35000道尔顿另有一强蛋白质带，而且用Western分析检测c-myc-肽标志表明有一相同大小的带有强信号。
参考实施例16
在E.coli中表达成熟HCPB
在E.coli中克隆和表达成熟HCPB的方法于参考实施例15中所描述的方法很相似。再用pICI226为克隆载体，但此时成熟HCPB基因PCR的起始物质是质粒pICI1712，在该表达载体中的标志基因。使用与参考实施例15相似的条件，但用pICI1712 DNA代替pICI1698的，在PCR反应中用两种寡核苷酸，称为2264和2265(SEQ ID NO：65和66)。首先，设计在pICI1712上引发的顶链，寡核苷酸2264，并在PelB前导序列包括NcoI限制酶，然后持续到插入的成熟HCPB基因的开始(SEQ ID NO：64中的DNA碱基36-66)。设计第二条链，底链，寡核苷酸2265，以在成熟HCPB基因末端，(His)6-c-myc tag序列前(与SEQ ID NO：64中的DNA碱基965-987互补)引发，并在基因末端导入终止翻译密码子(与TAA TAA互补)，然后是EcoRI(GAATTC)限制酶位点并补平碱基。该寡核苷酸引发回到PCR中的基因以分离成熟基因序列。
用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物样品份是否是正确大小的DNA(约970个碱基对)。用与参考实施例15相似的方法纯化反应混合物中剩余的产物。用酶NcoI和EcoRI限制消化分离的DNA，用预参考实施例15相似的方法纯化正确大小的带(约940个碱基对)。
用NcoI和EcoRI限制消化按照与参考实施例15相似的方法制备的pICI266双链DNA，要非常仔细以确保完全消化。用参考实施例15相似的方法纯化正确大小的DNA。
通过与已知标准相比，用琼脂糖凝胶电泳检测限制并纯化的DNA样品的纯度和浓度估算值。用预参考实施例15相似的方法，从这些估算值制备连接混合物以便将HCPB基因克隆到pICI266载体中。
用参考实施例15相似的方法，连接反应后，用DNA混合物转化E.coliDH5α，捡出菌落并通过最近检测。
用参考实施例15相似的方法，取6个克隆制备质粒DNA，然后在PCR产物区上测序。用称为1504，1802，679，1280，677和1731(SEQID NO：60，63，51，53，52和62)的6个不同的寡核苷酸引物测定克隆的序列。从测序结果中，筛选含带有所需成熟HCPB基因序列之质粒的克隆，称为pICI1736。
确定克隆基因的序列，有氨基酸翻译的，从PelB序列的开始到EcoRI限制位点列在SEQ ID NO：67中，DNA从PelB第一个密码子开始标1，肽从成熟HCPB开始标1。
为了控制成熟HCPB的表达，用与参考实施例15相似的方法，用氯化钙转化将pICI1736质粒DNA转化到感受态E.coli表达菌株中。用与参考实施例15相似的方法检测所有pICI1736转化的表达菌株以检测克隆HCPB基因的表达。但在这种情况下，在Western分析中不能使用c-myc肽标志特异性的9E10单克隆抗体，因为成熟HCPB没有C-末端标志。因此，一级抗体是抗牛羧肽酶。在兔中产生的(来自Biogenesis)，已经表明与纯化人胰羧肽酶B发生交联反应。二级抗体是用辣根过氧化物酶标记并在山羊中产生的抗-兔IgG抗体(Sigma或相似物)。
用考马斯蓝染色凝胶确定在E.coli菌株MSD213和MSD525中，很好表达了在pICI226(pICI712)中克隆标志的HCPB，与单独的载体(pICI226)克隆比较时，在约34000道尔顿另有一强蛋白质带，而且用Western分析检测c-myc-肽标志表明有一相同大小的带有强信号。
参考实施例17
在COS细胞中表达成熟HCPB
从pICI1698(参考实施例14)用PCR得到编码preHCPB的基因在含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，各0.125mM的dATP，dCTP，dGTP和dGGP以及2.5U Taq DNA聚合酶(Amplitaq，Perkin-Elmer Cetus)的缓冲液中，用模板pICI1698(10ug)和寡核苷酸SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35(各100pmol)完成PCR。用矿物油(100ul)覆盖反应，并在94℃ 1分钟，53℃ 1分钟，72℃ 2.5分钟，经25个循环，加上再在72℃保温10分钟。通过在1％琼脂糖(I型琼脂糖，Sigma A-6013)凝胶上电泳，然后从凝胶上切下带，用GenecleanTM(GenecleanII试剂盒，Stratech Scientific Ltd.或Bio 101 Inc.)分离DNA来分离985bp的PCR产物。Geneclean试剂盒含1)6M碘化钠2)浓缩的氯化钠溶液，用于制备氯化钠/乙醇/水洗涤液的Tris和EDTA；3)GlassmilkTM-一含1.25ml用水特定配制的硅胶悬浮液的小瓶。
这是以Vogelstein and Gillespie(公开于Proceedings of theNational Academy of Sciences USA(1979)Vol.76.p615中)的方法为基础的DNA纯化技术。可以使用在“分子克隆-实验室操作手册”(第2版，Sambrook.Fritsch and maniatis(冷泉港实验室，1989))中描述的其它任何方法。总之，Geneclean方法如下。向1体积的胶薄片中加入3体积来自试剂盒的碘化钠溶液。通过在55℃将混合物加热10分钟融解琼脂糖，然后加入Glassmilk(5-10ul)，充分混合并在室温放置10分钟。离心掉Glassmilk，用试剂盒中的NEW WASH(500ul)洗涤3次。在空气中干燥从Glassmilk上除去洗涤缓冲液。通过将保温干燥的Glassmilk与水(5-10ul)在55℃保温5-10分钟来洗脱DNA。离心回收含洗脱DNA的含水上清液。可以重复洗脱步骤并收集上清液。
在含100mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM氯化镁，50mM NaCl 0.025％tritonX-100和各25u的HindIII和EcoRI(New England Biolabs)的100ul反应液中，用EcoRI和HindIII在37℃将preHCPB消化1小时。用琼脂糖凝胶电泳和GeneClean按上述用于未切割片段和克隆到pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems)的方法纯化消化的片段。
在上述100ul反应液中，用EcoRI和HindIII完全消化pBluescriptTMKS+DNA(5ug)。将牛肠碱性磷酸酶(1ul；New EnglandBiolabs.10u/ul)加到交换的质粒中以除去5’磷酸基团，然后孜孜37℃再继续保温30分钟。通过在70℃保温10分钟来破坏磷酸酶活性。按上述从琼脂糖凝胶中纯化EcoRI-HindIII切割的质粒。将消化的preHCPB基因(50ng)与上述切割的质粒DNA在20ul含30mMTris-HCl(pH7.8)，10mM MgCl2，10mM DTT 1mMATP，50ug/ml BSA和400u T4 DNA连接酶(New England Biolabs Inc.)的溶液中于25℃保温4小时。用备有所述细胞的装置，用1ul反应液转化20ul的感受态E.coli DH5α细胞(最大效力的DH5α感受态细胞，Life Technologies Ltd.)。将转化的细胞铺在L-琼脂加100ug/ml氨苄青霉素上。用PCR鉴定潜在的preHCPB克隆。使各克隆按上述进行PCR以制备preHCPB基因，除在进行25个循环的PCR前在94℃(热开始法)将含细胞的混合物保温5分钟并用寡核苷酸SEQ ID NO：36和37代替SEQ ID NO：34和35外。在1％琼脂糖凝胶上电泳分析PCR反应样品(10ul)。通过存在1.2kb的PCR产物来鉴定含preHCPB基因的克隆。用生产1.2kb的克隆大规模制备质粒DNA，然后通过DNA序列分析确定插入片段的序列。含pBluescriptTM中preHCPB基因的质粒称为pMF15。
为了得到能够在真核细胞中表达HCPB的载体，使用GS-SystemTM(Celltech Biologics)(WO 87/04462，WO 89/01036，WO86/05807，和WO 89/10404)。该方法要求将preHCPB基因克隆到载体pEE12[该载体与Bebbington等人(1992)Bio/Technology 10，169-175中描述的pSV2.GS相似，通过定点诱变除去了原存在于pSV2.GS中的数个限制位点以便在多接头区提供单一的位点]中。为了构建表达载体，按上述用EcoRI和HindIII消化质粒pEE12和pMF15。从1％琼脂糖凝胶中分离来自各消化产物指南个的适宜载体(来自pEE12)h插入片段(来自pMF15)，然后连接在一起，用于转化感受态的DH5α细胞。将转化的细胞铺在L-琼脂加100ug/ml氨苄青霉素上。按上述，用PCR筛选菌落，使用在CMV启动子(SEQ ID NO：38)和HCPB基因(SEQ ID NO：39)内引发的寡核苷酸。用产生1.365kb PCR产物的克隆大规模制备质粒DNA，用DNA序列分析确定插入片段的序列。含pEE12中preHCPB序列的质粒称为pMF48。
按上述制备第二个真核表达质粒，含preproHCPB的前原序列的pEE12。在开始PCR中使用寡核苷酸SEQ ID NO：40和41以便从pMF18(在参考实施例19中描述的)中分离前原序列的基因。在这种情况下，用热开始方法，通过首先将不含Taq DNA聚合酶的混合物在94℃保温5分钟来完成PCR。然后加入Taq DNA聚合酶(2.5u)，按上述继续PCR，完成25个循环。将360bp的片段克隆到pBluescript中以定点pMF66，随后克隆到pEE12中(通过PCR，用SEQ ID NO：41和41筛选)以定点pMF67。
为了在真核细胞中表达，将含有能够表达前HCPB和前原序列之基因的载体共转染到COS-7细胞中。COS细胞是非洲绿猴肾细胞系，CV-1，用源缺陷型SV40病毒转化的，而且已经广泛地用于短期瞬时表达各种蛋白质，因为它们能够复制很多拷贝的含SV40复制源的环状质粒。有两种可广泛得到的COS细胞克隆，COS-1和COS-7。由Bebbington在Methods：A Companion to Methods inEnzymolohy(1991)2，p.141中描述了转染COS细胞的基本方法。为了表达HCPB，通过已知的脂染(liporection)-阳离子脂介导的多核苷酸传递方法[Felgner et al.，inMethods：A Companion to Methods inEnzymolohy(1993)5，67-75]，用质粒载体pMF4 8和pMF67(各4ug)转染在2ml Dulbecco’s改性Eagle’s培养基(DMEM)中的6孔培养平板，所述DMEM含有10％热失活的胎牛血清(FCS)。将细胞在CO2保温箱中于37℃保温20小时。将在无血清培养基(200ul；OPTI-MEM减少的血清培养基；GibcoBRL目录号31985)中的质粒DNA混合物缓慢与LIPOFECTIN试剂(12ul；GibcoBRL目录号18292-011)混合，然后在室温保温15分钟。用无血清培养基(2ml；OPTI-MEM)洗涤细胞。将无血清培养基(600ul；OPTI-MEM)加到DNA/LIPOFECTIN中，将混合物覆盖到在CO2保温箱中于37℃ 6小时的细胞上。用正常含10％FCS的DEMEM代替含DNA的培养基，按前述将细胞保温72小时。按参考实施例11中的描述分析细胞上清液对Hipp-Arg的HCPB活性(5小时检测)。已经用LIPOFECTIN试剂处理的，不含质粒DNA的COS细胞上清液水解1.2％的底物，而用表达前HCPB和前原序列的混合物转染的COS细胞上清液水解61％的Hipp-Arg底物。仅用前HCPB质粒转染的COS细胞以用于已经只用LIPOFECTIN试剂处理之COS细胞的水平水解Hipp-Arg。
LIPOFECTI N试剂是在膜过滤水中的1∶1(w/w)阳离子脂N-[(1-2，3-二油基氧)丙基]-n，n，n三甲基氯化胺(DOTMA)和油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。它自发与DNA结合以形成脂-DNA复合物-参见Felgner等人，在Proc.Acad.Sci.美国(1987)84，7431中的描述。
参考实施例18
在E.coli中表达原HCPB
在E.coli中克隆并表达原HCPB的方法与参考实施例15中描述的方法很相似。再用pICI266作为克隆载体，原HCPB基因PCR的起始材料是pICI1698(在参考实施例14中描述)。用与参考实施例15相似的条件，在PCR反应中用两种寡核苷酸，已知为2310和2265(SEQ ID NO：68和66)(代替引物FSPT1和6HIS9E10R1BS1)。
设计第一条链，顶链寡核苷酸，2310，以在pICI1698上引发，并在PelB前导序列(SEQ ID NO：64中的DNA碱基51-66)和插入的原HCPB基因起始(SEQ ID NO：40-57)之间加入NcoI限制酶位点。设计第二条链，底链，寡核苷酸2265以在成熟HCPB基因的末端，(His)6-c-myctag序列开始前(与SEQ ID NO：64中的DNA碱基965-987互补)引发，并在EcoRI(GAATTC)限制酶位点之后的该基因末端导入翻译终止密码子(与TAA TAA互补)，然后为并补平碱基。该寡核苷酸引回到PCR中的基因以分离原基因序列。
琼脂糖电泳分析PCR产物是否有正确大小的DNA(约1240个碱基对)，发现明显含一正确大小的带。用与参考实施例15相似的方法从反应混合物中纯化剩余的产物。用NcoI和EcoRI消化分离的DNA，用与参考实施例15相似的方法纯化正确大小的带(约1210个碱基对)。
用NcoI和EcoRI消化用与参考实施例15相似的方法制备的pICI266双链DNA，要非常仔细以确保完全消化。用与参考实施例15相似的方法纯化正确大小的带(约5600个碱基对)。
琼脂糖凝胶电泳，与已知标准比较检测限制并纯化的DNA样品的纯度和浓度估计值。用与参考实施例15相似的方法，从这些估计中，制备连接混合物以便将原-HCPB基因克隆到pICI266中。
用与参考实施例15相似的方法，连接反应后，用DNA混合物转化E.coli菌株DH5α，捡出菌落并杂交检测。
用与参考实施例15相似的方法，用引物2310和2265，通过PCR检测4个阳性杂交分离物的插入片段的大小是否正确以及用一对内引物1279(SEQ ID NO：54)和679(SEQ ID NO：51)的引发情况。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的DNA的大小是否正确(从引物2310到2265约1200个碱基对，从引物1279到679约580个碱基对)。所有克隆都有正确大小的PCR DNA产物。
用与参考实施例15相似的方法，取所有四个克隆制备质粒DNA，然后在PCR产物区上进行测序。用已知为1504，1802，679，1281，1590和1592(SEQ ID NO：60，63，51，55，69和70)的6个不同寡核苷酸引物测序。从测序结果中筛选含有所需原-HCPB基因序列之质粒的克隆，并称为pICI1738。
pICI1738中克隆的原-HCPB基因的确定序列(有氨基酸翻译)，从PelB序列开始到EcoRI限制位点示于SEQ ID NO：71，DNA的编号从PelB的第一个密码子开始，肽的编号从成熟HCPB开始。
为了控制表达原-HCPB，用与参考实施例15相似的方法，将pICI1738质粒DNA用氯化钙转化方法转化到感受态E.coli表达菌株中。用与参考实施例15相似的方法检测所有pICI1738转化的表达菌株以检测克隆HCPB基因的表达情况。然而，在这种情况下，在Western印迹中不能使用c-myc肽标志特异性的9E10单克隆抗体，引物原-HCPB没有C-末端标志。因此，一级抗体是在兔中产生的抗牛羧肽酶A(来自Biogenesis)，以前已经表明该抗体与纯化的和胰羧肽酶B有交叉反应。二级抗体是用辣根过氧化物酶标记的并在山羊中产生的抗兔IgG抗体(Sigma A0545或相似物)。
用考马斯染色凝胶从E.coli中确定pICI266中克隆的原-HCPB(pICI1738)的表达，当与仅含载体(pICI266)的克隆(该克隆产生标志的HCPB(参考实施例15))相比，表明有另一约40000道尔顿的蛋白质带。用抗牛羧肽酶A，通过Western分析检测得到相同大小的带。
参考实施例19
在COS细胞中表达原HCPB
用模板pICI1698和寡核苷酸SEQ ID NO：34和40，按参考实施例17中的描述，通过PCR制备前原HCPB的基因以得到1270bp的PCR产物。用EcoRI和HindIII消化所述基因，然后按参考实施例17中的描述，先克隆到在DH5α中的pBluescript KS+(以得到pMF18)，然后克隆到pEE12。按参考实施例17的描述，用LIPOFECTIN试剂将质粒pEE12转染到COS-7细胞中，按参考实施例11中的描述检测细胞上清液(250ul)对Hipp-Arg的HCPB活性(5小时检测)，然后在50mMTris-HCl(pH7.6)，150mM NaCl中用胰蛋白酶(700ug/ml)于4℃激活1小时。在这些条件下，完全水解Hipp-Arg底物，而已经只用LIPOFECTIN试剂处理的COS细胞上清液(不含质粒DNA)，当用胰蛋白酶激活时，水解30％的Hipp-Arg底物。
参考实施例20
纯化天然HCPB
已经确定了用于经两种途径开始纯化天然和不同突变体酶的系统。首先描述优选途径。
从-70℃的贮存中，取含重组酶的重组E.coli细胞膏并使其融解。细胞膏的重量以克计，加入缓冲液A(200mM Tris(羟甲基)氨基甲烷盐酸(TRIS-HCl))，20％蔗糖(C12H22O11)，pH8.0至等于细胞膏开始重的体积来重悬细胞膏。在加入等体积蒸馏水前，将细胞悬浮液在室温保温20分钟，同时偶尔缓慢混合，然后彻底混合。将细胞悬浮液在室温再保温20分钟，同时偶尔缓慢混合。4℃，通过以98000xg离心90分钟来澄清所得的粗等渗休克物(shockate)，此后从沉淀的不溶馏份中倒掉上清液。将脱氧核糖核酸酶加到上清液中达到0.1mg/ml的终浓度。将混合物在室温保温，同时连续振荡，直到粘度降低足以将其负载到羧肽酶抑制剂CNBr激活的琼脂糖亲和柱上，所述亲和柱是根据PharmaciaCNBr激活的琼脂糖4B所带的说明而制备的，羧肽酶抑制剂来自马铃薯茎(c-0279，Sigma)。将上清液的pH调到8.0，然后负载到用10mM TRIS-HCl，50mM氯化钠，pH8.0预平衡的亲和柱上。负载上清液后，洗涤柱，直到流出物的吸收值回到基线，然后用洗脱缓冲液(100mM碳酸钠，50mM氯化钠，pH11.4)从柱上洗脱结合的物质。将洗脱的馏份于-20℃冷冻，而用抗c-myc标志抗体(9E10)，然后是暴露于4-氯-萘酚和过氧化氢有颜色反应的抗-小鼠-辣根过氧化物酶结合物(a-9044，Sigma)，通过Western印迹分析，确定含重组羧肽酶的那些馏份。
收集含重组羧肽酶B的馏份，浓缩，将pH调到7.5，然后猝冷并于-20℃贮存。如果需要，可以用已知方法，如离子交换和凝胶渗透层析进一步纯化收集的样品。
第二种途径包括用胞质休克溶解E.coli细胞，如在优选途径中所用的。
取含重组酶的重组E.coli细胞膏，重悬在溶解缓冲液(50mMTRIS-HCl，15％蔗糖pH8.0)中。将溶菌酶加到1mg/ml的浓度，同时加入十二烷基磺酸锂(LDS)(每25ml悬浮液80ul的25％溶液)。将悬浮液在冰上保温30分钟，同时偶尔振荡，然后加入脱氧核糖核酸酶达到1mg/ml的浓度，再将悬浮液在冰上保温30分钟，同时偶尔振荡。
随后将悬浮液分成200ml体积，声处理以便在冲击之间以30秒的间隔，经10×30秒个冲击完全破碎细胞。将声处理的细胞于4℃，通过以98000xg离心90分钟，此后从沉淀的不溶馏份中倒掉上清液。将脱氧核糖核酸酶加到上清液中达到0.1mg/ml的终浓度。将混合物在室温保温，同时连续振荡，直到粘度降低足以将其负载到羧肽酶抑制剂CNBr激活的琼脂糖亲和柱上，所述亲和柱是根据PharmaciaCNBr激活的琼脂糖4B所带的说明而制备的，羧肽酶抑制剂来自马铃薯茎(c-0279，Sigma)。将上清液的pH调到8.0，然后负载到用10mM TRIS-HCl，50mM氯化钠，pH8.0预平衡的亲和柱上。负载上清液后，洗涤柱，直到流出物的吸收值回到基线，然后用洗脱缓冲液(100mM碳酸钠，50mM氯化钠，pH11.4)从柱上洗脱结合的物质。将洗脱的馏份于-20℃冷冻，而用抗c-myc标志抗体(9E10)，然后是暴露于4-氯-萘酚和过氧化氢有颜色反应的抗-小鼠-辣根过氧化物酶结合物(a-9044，Sigma)，确定含重组羧肽酶的那些馏份。收集含重组羧肽酶B的馏份，浓缩，将pH调到7.5，然后猝冷并于-20℃贮存。如果需要，可以用已知方法，如离子交换和凝胶渗透层析进一步纯化收集的样品。通过SDS-PAGE和考马斯染色的硝酸纤维素印迹分析的来自两种途径的收集物的样品在重组羧肽酶B的正确分子量处有考马斯染色的带。用Edman降解技术，通过自动蛋白质/肽测序仪，测序的这些带与纯化的特定重组羧肽酶B有阳性匹配。
参考实施例21
在COS细胞中表达鼠A5B7F(ab’)2融合蛋白
本实施例描述从A5B7杂交瘤中制备cDNA，用PCR分离特异性Fd和轻链，确定这些片段的完整DNA序列，随后制备Fd-HCPB融合基因和在真核细胞中能够生产轻链和Fd-HCPB融合蛋白的共表达载体，用来自HCPB的前原序列，通过共转染在COS细胞中共表达F(ab’)2-HCPB。
重复参考实施例15中的制备方法到(e)项。
f)制备Fd-HCPB融合DNA序列
通过PCR将编码Fd序列C-末端区的基因(SEQ ID NO：25(位置497))与HCPB相连。在该过程中导入8个氨基酸接头序列(VPEVSSVF)的DNA。按参考实施例17中的描述，用寡核苷酸SEQ ID NO：42和43，使质粒pAF1(参考实施例5中描述的)经PCR达到338bp的产物。相似的，用寡核苷酸SEQ ID NO：44和34，使质粒pAF1(参考实施例5中描述的)经PCR得到998bp的产物。按参考实施例17中的描述，经琼脂糖凝胶电泳和GenecleanTM分离这两种产物，然后在第二热起始PCR中使用(在50ul总体积中各0.2ng)，所述PCR为94℃ 1分钟，63℃ 4分钟，然后94℃ 2分钟，共10个循环。将空白寡核苷酸(SEQ ID NO：42和34；各10pM)加到50ul含Amplitaq(2.5u)的缓冲液中。于94℃加热3分钟后，使混合物经在94℃ 1.5分钟，55℃ 2分钟，72℃ 2分钟，共25个循环，然后再在72℃ 10分钟。所述产物是在1336bp的带，按前述分离，然后用EcoRI和hindIII切割并克隆到在DH5α(用寡核苷酸SEQ ID NO：36和37，通过PCR筛选的克隆)内的pBluescriptTM中得到pMF35。为了制备完整的Fd-HCPB融合序列，在含50mM乙酸钾，20mMTris-乙酸盐(pH7.9)，10mM MgCl2，1mM DTT，EcoRI(40u)和NcoI(20u)的缓冲液(100ul)中用NcoI和EcoRI(各10ug)切割质粒pAF1和pMF35。按参考实施例17中的描述分离来自pAF1的载体片段(3.4kb)，用牛肠碱性磷酸酶消化，然后于来自pMF35的纯化的1.2kb片段相连。将所得的载体克隆在DH5α(用1922bp插入片段的寡核苷酸SEQ ID NO：36和37，通过PCR筛选的)中，称为pMF39。将来自pMF39的EcoRI-HindIII片段克隆到DH5α(用2200bp插入片段的寡核苷酸SEQ ID NO：38和39，通过PCR筛选的)内的pEE6[这是pEE6.hCMV的衍生物-Stephens andCockett(1989)Nucleic Acids Research 17，7110-其中已经将hCMV启动子上游的HindIII位点转变成BglII位点]中以得到pMF43。
为了制备共表达载体，在含在含50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐(pH7.9)，10mM MgCl2，1mM DTT和BSA(100ug/ml)的缓冲液(100ul)中，用BglII(20u)和SalI(40U)切割pMF43，用琼脂糖凝胶定义分离4348bp片段，按前述，用GenecleanTM纯化。相似的，用BamHI(40u)和SalI(40u)切割pAF6(在参考实施例5中描述的)，分离7.8kb的载体片段，与pMF43的BglII-SalI片段相连，然后克隆到DH5α中。用2组寡核苷酸(SEQ ID NO：18和45，以及SEQ ID NO：17和39)，通过PCR筛选菌落。通过DNA测序表征分别为360bp和1.3kb的产生PCR产物的克隆。将含有正确序列的克隆称为pMF53-在DH5α中的轻链/Fd-HCPB共表达载体。
g)在COS细胞中表达A5B7F(ab’)2-HCPB
用pMF53代替pMF48，重复参考实施例17中描述的用于用编码前原序列的质粒(pMF67)共转染COS-7细胞的方法。按参考实施例11和17中的描述检测COS细胞上清液的HCPB活性。已经用LIPOFECTIN试剂处理的，但不含质粒DNA的COS细胞上清液水1.2％的底物，而用表达轻链/Fd-HCPB和前原序列的质粒混合物转染的COS细胞上清液水解34％的Hipp-Arg底物。仅用pMF53质粒转染的COS细胞以已经用LIPOFECTIN试剂处理的COS细胞水解底物的水平水解Hipp-Arg。通过Western分析(见下文h)，可见到约80kDa和160kDa的带，分别相当于F(ab’)2，和F(ab’)2-HCPB2。在CEA ELISA检测(见下文i和j)中，根据j中所给的方法，用细胞上清液(见上文)检测是否操作CEA结合的物质。
h)Western印迹分析
按下文所述完成Western印迹分析。
将各上清液样品(20ul)与等体积含有和不含有还原剂的样品缓冲液(62.5mM Tris，pH6.8，1％ SDS，10％蔗糖和0.05％溴酚蓝)混合。65℃将样品保温10分钟，然后按照制造商的说明，在MultiphorTMII装置(LKBProdukter AB)中的8-18％丙烯酰胺梯度凝胶(ExcelTM凝胶系统，Pharmacia Biotechnology产品)上电泳。电泳后，用NovablotTM装置(LKBProdukter AB)按制造商提供的方法，将分离的蛋白质转移到HybondTMC-Super膜(Amersham International)上。印迹后，空气干燥膜。
用抗鼠F(ab’)2抗体-过氧化物酶结合物(INC Biomedicals，产品号67-430-1)检测抗体片段的存在。用ECLTM检测系统(AmershamInternational)，按照提供的方法肉眼观察鼠A5B7抗体片段的存在。
i)ELISA分析
在生物化学和分子生物学实验室技术(“Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology”eds.Burdon.R.H.and VanKippenberg，P.H.volume 15)，酶免疫检测实践和理论(“Practice andTheory of Enzyme Immunoassays”，Tijssen，P.1985，Elsever SciencePublishers B.V.)中有ELISA的标准方法。另一资料来源是抗体-实验室手册(“Antibody-A Laboratory Manual”，Harlow.E.and laneD.P.1988，冷泉港实验室公开的)。
j)抗-CEA ELISA
1 制备包被缓冲液(1个碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液胶囊-sigma C-3041-在100ml双蒸馏水中)。
2 将5ul CEA贮存液(1mg/ml，Doko)加到各96孔平板的10ml包被缓冲液中。
3 将100ul稀释的CEA加到微滴定板的各孔的Nunc“MaxisorpTM”-50ng/孔/100ul。
4 将平板在42保温过夜(或室温保温2小时)。
5 用磷酸盐合成盐-0.01％叠氮化钠(PBSA)-0.05％吐温20洗涤平板4次，每次5分钟。
6 用以每孔200ul含0.05％吐温20的PBSA中的1％BSA(sigmaA-7888)阻断平板。室温保温2小时。
7 用含0.05％吐温20的PBSA洗涤平板4次，每次5分钟。
8 负载适宜量的样品(培养上清液)和标准(双倍稀释的蛋白水解A5B7F(ab’)2)。用生长培养基(或PBS)稀释样品。包括PBSA+1％BSA和稀释剂为空白。
9 在室温保温3小时。
10 用含0.05％吐温20的PBSA洗涤平板6次，每次5分钟。
11 从山羊，过氧化物酶结合的-ICN67-430-1制备二级抗体溶液(抗-小鼠IgG F(ab’)2-在40ml PBSA+1％BSA+0.5％吐温20中20ul)然后每孔加100ul。
12 室温保温1小时。
13 用PBSA+0.05％吐温20洗涤平板6次，每次5分钟。
14 通过将1个胶囊的磷酸盐-柠檬酸过硼酸盐缓冲液(Sigma P-4922)中制备显色溶液。每100ml缓冲液加入30mg o-苯二胺二氯化物(OPD，Sigma P-8287)。每孔加150ul。
15 室温黑暗保温15分钟。
16 通过每孔加入50ul 2M硫酸来停止反应。
17 用平板阅读器读490nm的OD。
实施例1
制备牛Lys66Glu胰核糖核酸酶
(a)经重组环聚合酶链反应(RCPCR)构建66位密码子(Lys->G/u)含取代的RNase基因序列。
在PCR反应中，用含牛胰RNase前编码序列的质粒(pQR162：NCIMB No40678并由Tarragona-Foil et al.，Gene(1992)描述)作为模板。在CycloneTM DNA合成仪(milligen/Millipore)上，用氰乙基亚磷酰胺，通过亚磷酸-三酯方法合成用于PCR的引物。设计引物以便当在PCR中使用它们时，在结合，变性并再退火后，除源平整末端产物外，还与组合单元，粘性，单链末端形成双链DNA后，产生的产物是双链，线性DNA分子。这些膜退火形成重组DNA环。然后将这些分子准备用于转化到感受态E.coli细胞中。
使两个PCR反应，一个用寡核苷酸SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(见图8中的引物A&B)，另一用寡核苷酸SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4(见图8中的引物C&D)，在Techne PHC-1热循环仪中，于92℃ 1.5分钟，55℃ 1.5分钟，75℃ 6分钟经25-30个循环，最后在75℃再保温10分钟。所述反应在50ul的总体积中含pQR162为模板(10ng)，50pmol/引物，5ul 10×缓冲液[200mM Tris-Hcl(pH8.2)，100mMKCl，60mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2，1％TritonX-100100ug/ml无核酸酶BSA]和2.5U pfu聚合酶(Pyrococcus furiosus的热温度聚合酶，Stratagene)，用相同体积的石蜡油覆盖以防止蒸发。
在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。从凝胶上取出从各PCR反应产生的DNA片段(约3.1kb)，离心(Spin-XTM，Costar)从琼脂糖中分离DNA。用乙醇沉淀两种提取的DNA片段，重悬在20ul水中。将各样品(10ul)混合在含10mM Tris/Hcl pH8.8，10mM NaCl和1mM Na2EDTAd 50ul体积中。92℃将混合的DNA片段变性5防止，然后于55-57℃再退火2小时。用因此形成的重组环转化感受态细胞。
完成分离质粒的小制备(mini-preps)[Maniatis等人(1982)分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约]，并作为用双脱氧链终止法[Sangerd等人(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.美国74，5463-5467]进行双链DNA测序的膜。含改变的编码序列而没有任何错掺入的质粒称为pQR176。在20ul总体积的含20UEcoRI和反应缓冲液中消化所述质粒。按上述从琼脂糖凝胶中得到含有改变的编码序列的DNA片段，与前述消化并去磷酸化的pKK223.3[Pharmacia Biotech：该载体含tac启动子，由lac阻遏物调节并通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)而诱导]在20ul含20U T4 DNA连接酶和反应缓冲液中相连。用连接的产物转化一份E.coli感受态细胞。限制酶分析从不同重组菌落中得到的质粒，以根据tac启动子确定插入片段的大小和方向。将正确的构建体命名为pQR177(图1)。
(b)生产并纯化Lys66Glu牛胰RNase
生产并纯化工程序列的策略沿用用于在E.coli中表达牛胰核糖核酸酶而研制的方法(Tarra gona-Foil et al.Gene 1992)。该系统利用牛胰核糖核酸酶的天然信号序列以指导核糖核酸酶或其工程突变体生产到E.coli的外周胞质中。外周胞质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，从而表达有完整活性的重组RNase。重组或工程突变体的高净正电荷有利于从内源外周胞质蛋白质中迅速纯化。突变体蛋白质的表达以及随后纯化至均一发生在接种培养基的48小时内。
质粒pQR177含两个核糖体结合位点(RBS)，一个由载体的tac启动子通过，另一个为了翻译第二个顺反子，而被包含在第一顺反子的编码序列内。IPTG诱导含pQR177的大肠杆菌后，产生的mRNA是双顺反子的，而且从tac启动子开始。第一顺反子编码6个氨基酸的肽(Met-Phe-Leu-Glu-asp-Asp)。第一顺反子的终止密码子和第二顺反子的起始密码子重叠以便核糖体继续翻译mRNA并产生前RNase。合成的RNase前体形式被转移到外周胞质，N末端测序表明正确裂解了信号序列。外周胞质的氧化环境可以正确地折叠RNase以形成回收全活性酶而证明的天然酶。
28℃，在5升含100ug Ap/ml的培养基中生长大肠杆菌[pQR177]8小时。当细胞处于指数生长期时，加入IPTG达到0.5mM的终浓度，然后使细胞继续于28℃生长过夜，同时振荡。用改进的原生质球/渗压休克法释放外周胞质中的蛋白质。10℃以8300xg(平均)离心10分钟重叠来自过夜培养物(5升)的细胞。将细胞沉淀重悬在60ml 200mM Tris-HClpH7.5/20％(w/v)蔗糖(无RNase)/1mM Na2EDTA中。将悬浮液在室温放置30放置。通过加入等体积的无菌水并彻底混合而达到渗压休克。将混合物在室温再放30放置。10℃以100000xg(平均)离心9 0放置彻底原生质球。
用阳离子交换层析(S-SepharoseTMEF)从物质提取物中得到所有带正电荷的蛋白质。缓冲液A是50mM MES，pH6.5，缓冲液B是50mM MES，1MNaCl，pH6.5。用阳离子交换层析(Mono-STM，Pharmacia-LKB)在17.6mMNaCl/分的梯度上从带正电荷蛋白质池中纯化重组RNase。用PAGE-SDS电泳评估重组RNase的纯度，银染色清除地表明技术的这种组合可以纯化将蛋白质纯化到均一(见图2)。根据水解胞苷酰(cytidylyl)-3，5-腺苷(CpA)和胞苷-2’，3’-环单磷酸盐(C＞p)估算重组酶的RNase活性，表明与市售酶有相同的比活性(见表)。测量在278nm的OD(OD278＝1mg/ml的RNase)来确定蛋白质浓度。通过在286nm吸收值随时间的增加(C＞p水解)来进行动力学测量[Witzel and Barnard(1962)生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)7，295-299]。用起始速度和底物浓度值通过以Wilkinson(1961)Biochem.J.80，324-332中描述的分析为基础的计算方法确定参数Km和kcat以及其标准误差。用学生t-试验估计用不同核糖核酸酶得到的这些参数之间的差异。在0.1cm径长(Hellma)的小容器中，于250ul的总体积内室温测量C＞p水解水解率。反应物在0.1M(1，3-顺[三(羟基甲基)-甲基氨基]丙烷)pH7.0，50mM NaCl(I＝0.1)中含不同浓度的C＞p，并通过加入所述酶而启始(见表)。数据表明工程Lys66Glu Rnase酶的动力学特性与市售牛酶没
有显著差异。
表
                                              kcat/Km(mM-1s-1)
BP-Rnase                                         3.4(0.9)
Lys66Glu Rnase                                   4.7(0.1)
实施例2
制备Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu人胰核糖核酸酶
质粒pATF3(参考实施例2中描述的，含Arg4Ala，Lys6Ala HP-RNase基因)在含引物SEQ ID NO：15和16(各5pmol)，核苷酸(0.2mM)，PCR缓冲液和2.5单位pfu聚合酶的PC人中作为模板(2ng)。于92℃先变性5分钟后，完成30个循环的变性(92℃，1分钟)，退火(55℃，1分钟)和延伸(75℃，1分钟)。按实施例1中所述凝胶提取PCR片段，然后37℃用EcoRI消化1小时。酶热失活后，将EcoRI片段连接到EcoRI消化并去磷酸化的pUC18中。所得质粒称为pATFZ1。用质粒pATFZ1确定突变HP-RNase基因的DNA序列。
为了产生Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66GluHP-RNase，用pATFZ1在按实施例1所述的RCPCR反应中作为模板，但使用寡核苷酸引物SEQID NO：30-33分别代替SEQ ID NO：1-4。所得质粒称为pATFZ3。通过用EcoRI和NcoI(各10-15单位)消化而从pATFZ3中切出Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66GluHP-RNase的基因，然后与预先消化(EcoRI和NcoI)并去磷酸化的pICI266(NCIMB)相连。按实施例1中所述完成连接，表达和纯化，除按上述用NcoI和EcoRI双消化从pATFZ3切出所述片段外，然后与预先取磷酸化并消化(用EcoRI和NcoI)的pICI266相连，用1％阿糖(代替IPTG)完成诱导。所得的构建体称为pATFZ44(见图5)。突变酶的表达与纯化按实施例1所述进行，但用1％阿糖代替IPTG完成诱导。
实施例3
制备O-[(2R，3S，4R，5R)-2-(2-氨基乙酰氨基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-1-基)-4-羟基-2，3，4，5-四氢呋喃-3-基]O-[4-(双[2-氯乙基]氨基)苯氧基]磷酸氢酯(是图7中所示的终产物)。
将化合物4(图7；31mg，0.034mM)溶解在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的0.01MHCl中，加入在碳催化剂上的30％钯(60mg)作为二甲基甲酰胺中的悬浮液。在氢气下，将混合物搅拌2小时45分钟。通过CeliteTM过滤后，蒸发过滤物以在＜30℃干燥。将粗产物悬浮在干二氯甲烷中，然后将混合物离心。去掉上清液二氯甲烷层。重复该过程，干燥最后的固体残留物以得到所需产物9.4mg(化合物5，图7)。
NMR数据DMSO d6，d4 Acetic(δ)3，3(1H，m)；3.5(3H，m)；3.62(8H，s)；4.05(1H，m)；4.25
(1H，m)；4.53(1H，m)；5.62(1H，d)；5.72(1H，d)；6.63(2H，d)；7.05(2H，d)；7.63(1H，d).
按如下方法制备化合物4。
2’-O-苄基-5’-溴-5’-脱氧尿苷(化合物1，图7)
20℃，氩气下，向2’-O-苄基尿苷[Wagner etal.，(1974)，J.Org.Chem.39，24-30](334mg 1mM)四溴化碳(500mg)和DMF(4ml)的混合物中在5分钟内，加入在DMF(2ml)中的三苯膦溶液(340mg)。20℃将混合物搅拌2小时，倒到水(60ml)中，用乙酸乙酯抽提两次。用水洗涤混合的有机提取物，干燥并蒸发成油。在20gMerck硅凝胶(Art.9385)上将该油色谱分析。用甲苯中的5％甲醇洗脱得到2’-O-苄基-5’-溴-5’-脱氧尿苷(160mg，40％)。
NMR(DMSO d6)δ11.4(s1H)；7.6(d1H)；7.3(m5H)；5.95(d1H)；5.6(dd1H)；4.6(q2H)；
4.0-4.2(m3H)；3.6-3.8(m2H)
5’-叠氮基-2’-O-苄基-5’-脱氧尿苷(化合物2，图7)
将2’-O-苄基-5’-溴-5’-脱氧尿苷(4.3g)溶解在DMF(86ml)中，加入叠氮化钠(7g)。搅拌混合物，然后在60℃加热45分钟。冷却并倒掉未反应的叠氮化钠后，蒸发DMF至干燥。将残留物溶解在乙酸乙酯中，用水洗涤两次，干燥并蒸发至干。在20g Merck硅凝胶(Art.9385)上色谱分析残留物。用甲苯中的5％甲醇洗脱得到1.5g纯5’-叠氮基-2’-O-苄基-5’-脱氧尿苷。
NMR(DMSO d6)δ11.4(s1H)；7.6(d1H)；7.3(m5H)；5.9(d1H)；5.6(d1H)；5.4(d1H)；
4.65(q2H)；3.9-4.2(m3H)；3.6(d2H).
2-O-苄基-5’-羰基苯氧基甘氨酰氨基-5’-脱氧尿苷(化合物3，图7)
向5’-叠氮基-2’-O-苄基-5’-脱氧尿苷(1.5g)，四氢呋喃(25ml)和苯氧基羰基甘氨酸N-羟基琥珀酰酯(1.3g)的混合物中加入碳(50％的湿度)上的10％铂(1.5g)。氢气下搅拌混合物4小时。通过CeliteTM过滤后，蒸发过滤物至干燥。将残留物溶解在乙酸乙酯中并用5％柠檬酸水溶液(x2)洗涤，碳酸氢钠溶液(x2)干燥然后蒸发至干。用1∶1醚/乙酸乙酯研制残留物以得到固体(960mg)(42％)。
NMR(DMSO d6)δ11.3(s1H)；8.0(t1H)；7.6(d1H)；7.4(m10H)；5.9(d1H)；5.6(d1H)；
5.4(d1H)；5.0(s2H)；4.6(q.2H)；4.0(m2H)；3.9(m1H)；3.6(d2H)；3.5(m2H)
制备化合物4(图7)
a)将苯氧基二氯膦[Scott et al.，(1990)，J.Org.Chem.，55，4904-4911](135 mg，0.64mM)溶解在干二氯甲烷(4.0ml)中，将溶液冷却到-20℃，加入溶解在干二氯甲烷(2.0ml)中的二异丙胺(0.091ml，0.64mM)和二异丙基乙胺(0.1ml，0.64mM)。将溶液在-20℃搅拌45分钟，然后室温在30分钟内热，然后室温再搅拌30分钟。将该溶液逐滴加到2-O-苄基-5’-羰基苯氧基甘氨酰氨基-5’-脱氧尿苷(280mg，0.53mM)溶液和在二氯甲烷(3.0ml)中的二异丙基乙胺(0.336，2.14mM)中，冷却到0℃。0℃搅拌所述溶液10分钟，室温搅拌2小时。用二氯甲烷稀释反应混合物，用饱和碳酸氢钠(x2)洗涤，干燥并蒸发成油。用甲苯(2x)共沸所述油用于下步反应。
b)将上步粗产物溶解在二氯甲烷(2.5ml)中，加入在干二氯甲烷中的4-N，N-双(2-氯乙基)氨基酚(125mg，0.534mM)。然后加入在干乙腈(3.2ml)中的0.46M四唑溶液，将溶液在室温搅拌2小时，此后，加入70％叔-丁基过氧化氢水溶液(0.11ml，0.801mM)，然后将溶液在室温再搅拌1小时。用二氯甲烷稀释反应混合物，用饱和碳酸氢钠(1x)洗涤，亚硫酸氢钠(1x)稀释，饱和氯化钠饱和(1x)，干燥并蒸发至干。在Merck硅凝胶(ART 9385)上色谱分析粗产物，用2％在二氯甲烷中的甲醇，然后用3.5％在二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到纯产物118mg。
NMR数据，DMSOd6(δ)Mixture of diastereoisomers 3.371H(m)；3.42 2H(d)；3.67 8H(d)；
4.12 1H(m)；4.33 1H(m)；4.56 2H(m)；5.02H(s)；5.14 3H(m)；5.59 1H(d)；5.91 1H(d)；
6.64 2H(dd)；7.05 2H(t)；7.28 15H(m)；7.45 1H(t)；7.62 1H(dd)；8.13 1H(brs)；11.35 1H
(s).
实施例4
合成并分离鼠A5B7F(ab’)2-Lys66Glu牛胰核糖核酸酶结合物
重复参考实施例4中的方法，但用Lys66Glu牛胰核糖核酸酶(实施例1中所述的)代替牛胰核糖核酸酶。
实施例5
合成并分离鼠A5B7F(ab’)2-Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu人胰核糖核酸酶结合物
重复参考实施例4中所述的方法，但用Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu人胰核糖核酸酶(实施例2中所述的)代替牛胰核糖核酸酶。
实施例6
合成并分离人化A5B7F(ab’)2-Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu人胰核糖核酸酶结合物
重复实施例5中所述的方法，但用人化A5B7F(ab’)2代替鼠A5B7F(ab’)2。
按如下制备人化A5B7F(ab’)2。接着参考实施例5中所述方法的步骤f)，但Fd和轻链的鼠序列(分别为SEQ ID NO：25和26)分别用SEQ IDNO：28和29所示的人化序列代替。
可以用各种方法，包括Edwards(1987)Am.Biotech.Lab.5，38-44，Jayaraman等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，4084-4088，Foguet  和Lubbert(1992)Biotechniquew 13，674-674和Pierce(1994)Biotechniques16，708描述的方法制备SEQ ID NO：28和29所示的人化序列。
实施例7
实施例3的尿嘧啶基药物前体，相应药物和药物前体加突变酶Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu人胰-RNase(HP-RNase)的体外细胞毒性。
用下列方法说明RNase药物前体和相应药物对肿瘤细胞的不同细胞毒性。37℃，在96孔(2500个细胞/孔)微滴定板中，将LoVo结肠直肠肿瘤细胞与5×10-1-5×10-8M的终浓度范围内的药物前体或药物保温1小时。然后洗涤细胞，37℃再保温3天。然后将TCA加到孔中，洗涤除去死细胞后，胺P.Skehan等人在J.Natl.Cancer Inst.82，1107(1990)中的描述，通过加入SRB评估粘附与平板上的细胞蛋白质量。用抑制细胞50％生长所需的浓度评估所述化合物的效力。
用药物处理LoVo细胞后，发现IC50为约1uM。相反，药物前体的细胞毒性低很多，IC50约为30uM(图6)。因此，与通过用突变RNase裂解而产生的药物相比，RNase药物前体对肿瘤细胞的细胞毒性约低30倍。
如果将游离Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu HP-RNase(10ug酶)或A5B7F(ab’)2-Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu HP-RNase结合物(10ug酶)加到含药物前体的检测孔中，可以发现细胞毒性可以与活性药物的相比，说明突变酶转变了药物前体，从而释放出更有效的药物。
这些研究说明突变人RNase的结合物有将相对无活性药物前体转变成在ADEPT系统中能够杀死肿瘤细胞的有效细胞毒性药物。
实施例8
在异种移植小鼠中RNase药物前体和抗体-突变RNase结合物的抗肿瘤活性
在下列模型中说明RNase药物前体和Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu HP-RNase结合物(或Lys66Glu牛胰RNase)的抗肿瘤效力。将LoVo肿瘤细胞(107)皮下注射到无胸腺裸鼠中。当肿瘤直径达4-5mm时，以10-100mg/kg的剂量静脉内施用所述结合物。结合物定位与肿瘤后，经一适宜的时间间隔以使残留结合物从血液和正常组织中清除(1-4天)，然后静脉内或腹膜内以100-1000mg/kg的剂量将药物前体施用于小鼠。结合物与药物前体的结合会使肿瘤的生长显著慢于未处理的对照肿瘤或仅用相同剂量结合物或药物前体处理的肿瘤。这些研究表明Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu HP-RNase结合物与药物前体结合有抗肿瘤活性。
实施例9
患者中的临床剂量
本发明结合物和药物前体在癌症治疗中的最有效给药模式和剂量方案取决于许多因素，如疾病的严重程度，患者的健康状况以及对质粒的反应和治疗医生的判断。因此，应滴定每个患者的结合物和药物前体剂量。然而，结合物的有效剂量可能在20-约200mg/m2的范围内。药物前体的有效剂量取决于所用的特定药物和母体药物的毒性。由于药物前体的细胞毒性比母体药物的低，如果已知的话，母体药物的MTD提供一开始点。对于酚氮芥基的药物前体，若没有亲本药物的临床数据，则治疗剂量范围不太确定并需要通过标准动物毒性学研究和从低剂量开始，患者中剂量逐渐提高的研究来确定。但是，治疗剂量可以在500-2000mg/m2的范围内。
实施例10
实施例3尿嘧啶基药物前体(RNase药物前体)对天然和突变Lys66Glu牛胰RNase的酶动力学
用分光光度计(Perkin Elmer Lambda2)从200-350nm扫描RNase前后和相应酚氮芥的吸光度，选择的波长是药物前体和药物之间吸光度差别最大的，(由于磷酸键的切除)所述吸收值为256nm。在一定的药物前体浓度(0.2-2mM)和RNase酶浓度(5-80ug/ml)范围内，在该波长，通过测量药物前体转变成药物的起始速率确定km和Vmax。37℃，在0.1cm径长(Hellma)的小瓶中的0.025M Tris OHCl加0.01％Brij-35缓冲液，pH7.5中，总体积250ul，完成测量。用Vmax除以反应混合物中的RNase量来计算Kcat。通过确定在284nm吸收值的变化，并使用C＞p 0.5-6mM和RNase酶为5-35ug/ml的浓度来测量两种酶对标准底物胞苷2’3’环单磷酸盐(C＞p)的酶活性。结果如下。
用牛天然和突变Lys66Glu RNase，RNase药物前体和C＞p的Kcat/Km酶动力学
底物                BP-Rnase             Lys66Glu BP-Rnase
               (kcat/Km mM-1s-1)
RNase药物前体
(实施例3)             0.37                       18
C＞p                      3.0                     3.0
结果表明天然和突变牛RNase以相似的速度转变标准底物(C＞p)。相反，突变RNase对药物前体的水解比天然酶的要快得多。因此，在RNase中导入突变Lys66Glu不会损害牛酶裂解磷酸键的能力，但会产生特异性裂解RNase药物前体(实施例3)以释放活性药物的酶。
实施例11
实施例3尿嘧啶基药物前体(RNase药物前体)对天然和Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu人胰RNase的酶动力学
按实施例10中所述，用天然HP-RNase和Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66GluHP-RNase测量酶动力学，除所用的缓冲液是0.1M1，3-双[三(羟基甲基)-甲基氨基]-丙烷，pH7.0，50mM NaCl。结果如下。
用天然HP-RNase和Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu HP-RNase，RNase药物前体的Kcat/Km酶动力学和C＞p
底物            HP-Rnase            Arg4Ala，Lys6Ala，Lys66Glu
                                             HP-Rnase
RNase药物前体
(实施例3)         0.2                          3.6
 C＞p             1.2                          1.2
单位＝kcat/Km mM-1s-1
结果表明天然和突变人酶以相似的速度转变标准底物。相反，突变人RNase对V药物前体的水解比天然酶的要快得多。因此，在RNase中导入突变Lys66Glu不会损害人酶裂解磷酸键的能力，但会产生特异性裂解RNase药物前体(实施例3)以释放活性药物的酶。
实施例12
合成胞苷基药物前体(见图17)
按实施例3中所述的方法，但用化合物6(图17)代替化合物4(图7)。根据用于制备化合物4(图7)的方法制备化合物6(图17)，但用N4-苄氧基羰基-2’-O-苄基胞苷代替2’-O-苄基尿苷。按照参考实施例7中用于制备化合物6的方法，从2’-O-苄基胞苷(Christensen和Broom(1972)，J.Org.Chem，37，3398-3401)制备N4-苄氧基羰基-2’-O-苄基胞苷(化合物2，图17)。
实施例13
牛Lys66Glu胰RNase分别对参考实施例6和7中尿苷和胞苷基药物前体类似物的酶活性
用与实施例10中所述相似的方法完成试验，但在25℃完成检测。结果如下。
用牛天然和突变体Lys66Glu RNase的RNase药物前体类似物的Kcat/Km酶动力学和C＞p
底物                     BP-Rnase               Lys66Glu BP-Rnase
                      (kcat/Km mM-1s-1)
 RNase药物前体类似物1    (0.2)                        25(6)
(参考实施例6)
RNase药物前体类似物
(参考实施例7)            5.5(0.3)                     109(11)
C＞p                     3.0                          3.0
结果表明天然和突变牛RNase以相似的速度转变标准底物(C＞p)。相反，突变RNase对药物前体类似物的水解比天然酶的要快得多。因此，在RNase中导入突变Lys66Glu不会损害牛酶裂解磷酸键的能力，但会产生特异性裂解RNase药物前体类似物(参考实施例6&7)以释放含有适宜药物前体的活性药物的酶。
实施例14
含本发明药物前体化合物的典型药物组合物
A：每胶囊含50mg活性成分的干填充胶囊
成分                                         每胶囊量(mg)
化合物                                           50
乳糖                                             149
硬脂酸镁                                       1
胶囊(大小1)                                    200
将化合物粉碎成60号粉末，然后使乳糖和硬脂酸镁通过60号印迹布，然后放到粉末上。将合并的成分混合约10分钟，然后填充到1号干明胶胶囊中。
B：片剂
典型片剂含有化合物(25mg)，预胶化淀粉USP(82mg)，微晶纤维素(82mg)和硬脂酸镁(1mg)。
C：栓剂
直肠给药的典型栓剂可含有化合物(0.08-1.0mg)，乙二胺四乙酸二钠钙(0.25-0.5mg)，和聚乙二醇(775-1600mg)。其它栓剂制剂可以通过代替，如丁基化羟甲苯(0.04-0.08mg)代替乙二胺四乙酸二钠钙，氢化植物油(675-1400mg)如Soppocire L.Wecobee FS，Wecobee M，Witepsols.，等，代替聚乙二醇。
D：注射
典型的可注射制剂含有化合物(10mg)苄基醇(0.01ml)和用于注射用的水(1.0ml)。
实施例15
在E.coli中克隆并表达D253K HCPB-(His)6-c-Myc
在E.coli中克隆并表达D253K HCPB的方法与参考实施例15中描述的方法很相似。仍用pICI266作为克隆载体，原-HCPB基因PCR的起始材料是质粒pICI1698(在参考实施例14中所述的)。但是，在这种情况下，在该基因的PCR扩增过程中，用定点诱变以在突变基因中改变253位的氨基酸密码子，从天冬氨酸变成赖氨酸(GAC到AAA)，D253K改变。用与参考实施例15所述相似的方法制备两种PCR引物。在第一个反应中，引物是FSPTS1(SEQ ID NO：58)和1398(SEQ ID NO：72)。两个反应的起始DNA均是pICI1698。设计引物1398和1397(SEQ ID NO：72和73)一般在253位氨基酸周围退火，在DNA序列中导入GAC到AAA的改变。在参考实施例15中描述了其它两种引物，FSPTS1和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO：58和59)。分析两个PCR反应氧DNA的正确大小(约750和250个碱基对)，用琼脂糖凝胶电泳评估浓度，发现明显含有正确到小的带。然后存在终浓度为200uM dNTP，Taq聚合酶反应缓冲液，终体积为80ul的2U Taq聚合酶的条件下，用各约4ng的第一组的两个PCR产物进行另一PCR。将混合物在94℃加热10分钟，然后加入Taq酶，用94℃ 1分钟，63℃ 4分钟，10个循环完成PCR反应。完成这些循环后，通过加入各120pmol的末端引物FSPTS1和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO：58和59)，另外的dNTP(约额外的100uM)，Taq聚合酶反应混合物，和4U Taq聚合酶而使反应混合物增加到120ul。将混合物在94℃加热10分钟，然后加入Taq酶，94℃，1.5分钟，50℃ 2分钟，72℃ 2分钟，30个循环，然后在反应结束时再在72℃保温9.9分钟完成PCR反应。
用琼脂糖凝胶电泳分析一份PCR产物DNA的正确大小(约1000个碱基对)，发现明显含有正确大小的带。用与参考实施例15相似的方法纯化反应混合物中的剩余产物。用FspI和EcoRI限制消化分离的DNA，用与参考实施例15相似的方法纯化正确大小的带(约1000个碱基对)。
用KpnI酶限制消化用与参考实施例15相似的制备的pICI266双链DNA，用T4 DNA聚合酶补平，要很仔细以确保完全消化。用限制酶EcoRI消化纯化的DNA。用与参考实施例15相似的方法纯化正确大小的DNA(约5600个碱基对)。
通过与标准比较，用琼脂糖凝胶电泳检测限制并纯化的DNA样品的纯度和浓度。用与参考实施例15相似的方法，从这些估计值制备连接混合物以便将HCPB基因克隆到pICI266中。
连接反应后，用与参考实施例15相似的方法，用DNA混合物转化E.coli菌株DH5α，捡出菌落并用杂交检测。
用与参考实施例15相似的方法，用引物FSPTS1和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO：58和59)并用内引物FSPTS1(SEQ ID NO：58)和679(SEQ ID NO：51)引物，通过PCR检测6个阳性杂交分离物。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物是否有正确大小的DNA(从引物FSPTS1到6HIS9E10R1BS1约1000个碱基对，从FSPTS1到679约430个碱基对)。所有克隆均有正确大小的PCR DNA产物。
用与参考实施例15相似的方法，取所有6个克隆制备质粒DNA，两个在PC产物区测序。用8个不同的寡核苷酸，已知为1281，677，1504，679，1802，1590，1280和1731(SEQ ID NO：55，52，60，51，63，61，53和62)测定克隆序列。从测序结果中，筛选含所需D253K-HCPB基因的克隆，称为pICI1713。
确定的在pICI1713中克隆的D253K-HCPB基因的序列，有氨基酸翻译，从PelB序列的开始到EcoRI限制位点示于SEQ ID NO：74，DNA从PelB的第一个密码子开始编1，肽从成熟HCPB开始编1。
为了控制表达D253K-HCPB，用与参考实施例15相似的方法，用氯化钙转化方法，将pICI1713质粒DNA转化到感受态E.coli表达菌株中。用与参考实施例15相似的方法处理所有pICI1713转化的表达菌株以检测克隆D253K-HCPB基因的表达情况。在这种情况下，用与参考实施例15相似的方法，在Western分析中用C-myc肽标志特异性的9E10单克隆抗体，D253K-HCPB有C-末端(His)6-c-myc标志。
用考马斯染色的凝胶，从E.coli中说明在pICI266(pICI1713)中，克隆标志的D253K-HCPB的表达情况，表明与仅用载体(pICI266)的克隆和删除标志HCPB的克隆(参考实施例15)相比，在约35000道尔顿有一强蛋白质带。用Western分析检测c-myc标志，相同大小的带有强信号。
实施例16
在E.coli中克隆并表达D253R HCPB-(His)6-c-Myc
在E.coli中克隆并表达D253R HCPB的方法与参考实施例16中所述的方法很相似。仍用pICI266作为克隆载体，原-HCPB基因PCR的起始材料是质粒pICI1712(在参考实施例15中所述的)。但是，在这种情况下，在该基因的PCR扩增过程中，用定点诱变以在突变基因中改变253位的氨基酸密码子，从天冬氨酸变成赖氨酸(GAC到CGC)，D253R改变。用与参考实施例15和16所述相似的方法制备两种PCR引物。在第一个反应中，引物是22641(SEQ ID NO：65)和2058(SEQ ID NO：75)。第二个反应引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO：59)和2054(SEQ IDNO：76)。两个反应的起始DNA均是pICI1712。
设计引物2058和2054(SEQ ID NO：75和76)一般在253位氨基酸周围退火，在DNA序列中导入GAC到CGC的改变，在两个PCR产物的末端成熟互补序列。在参考实施例15和16中描述了其它两种引物，2264和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO：65和59)。分析两个PCR反应氧DNA的正确大小(约750和250个碱基对)，用琼脂糖凝胶电泳评估浓度，发现明显含有正确到小的带。然后存在终浓度为200uM dNTP，Taq聚合酶反应缓冲液，终体积为80ul的2U Taq聚合酶的条件下，用各约4ng的第一组的两个PCR产物进行另一PCR。将混合物在94℃加热10分钟，然后加入Taq酶，用94℃ 1分钟，63℃ 4分钟，10个循环完成PCR反应。完成这些循环后，通过加入各120pmol的末端引物2264和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO：65和59)，另外的dNTP(约额外的100uM)，Taq聚合酶反应混合物，和4U Taq聚合酶而使反应混合物增加到120ul。将混合物在94℃加热10分钟，然后加入Taq酶，94℃，1.5分钟，50℃ 2分钟，72℃ 2分钟，30个循环，然后在反应结束时再在72℃保温9.9分钟完成PCR反应。
用琼脂糖凝胶电泳分析一份PCR产物DNA的正确大小(约1000个碱基对)，发现明显含有正确大小的带。用与参考实施例15相似的方法纯化反应混合物中的剩余产物。用FspI和EcoRI限制消化分离的DNA，用与参考实施例15相似的方法纯化正确大小的带(约1000个碱基对)。
用NcoI和EcoRI酶限制消化用与参考实施例15相似的制备的pICI266双链DNA，要很仔细以确保完全消化。用与参考实施例15相似的方法纯化正确大小的DNA(约5600个碱基对)。
通过与标准比较，用琼脂糖凝胶电泳检测限制并纯化的DNA样品的纯度和浓度。用与参考实施例15相似的方法，从这些估计值制备连接混合物以便将HCPB基因克隆到pICI266中。
连接反应后，用与参考实施例15相似的方法，用DNA混合物转化E.coli菌株DH5α，捡出菌落并用杂交检测。
用与参考实施例15相似的方法，取所有3个克隆制备质粒DNA，两个在PC产物区测序。用8个不同的寡核苷酸，已知为1281，677，1504，679，1802，1590，1280和1592(SEQ ID NO：55，52，60，51，63，61，53和70)测定克隆序列。从测序结果中，筛选含所需D253K-HCPB基因的克隆，称为pICI1746。
确定的在pICI1746中克隆的D253R-HCPB基因的序列，有氨基酸翻译，从PelB序列的开始到EcoRI限制位点示于SEQ ID NO：77，DNA从PelB的第一个密码子开始编1，肽从成熟HCPB开始编码为1。
为了控制表达D253R-HCPB，用与参考实施例15相似的方法，用氯化钙转化方法，将pICI1746质粒DNA转化到感受态E.coli表达菌株中。用与参考实施例15相似的方法处理所有pICI1746转化的表达菌株以检测克隆D253R-HCPB基因的表达情况。在这种情况下，用与参考实施例15相似的方法，在Western分析中用C-myc肽标志特异性的9E10单克隆抗体，D253R-HCPB有C-末端(His)6-c-myc标志。
用考马斯染色的凝胶，从E.coli中说明在pICI266(pICI1713)中，克隆标志的D253K-HCPB的表达情况，表明与仅用载体(pICI266)的克隆和删除标志HCPB的克隆(参考实施例15)相比，在约35000道尔顿有一强蛋白质带。用Western分析检测c-myc标志，相同大小的带有强信号。
用与下列实施例17相似的方法纯化。
实施例17
从E.coli中纯化突变体D253K HCPB-(His)6-c-Myc蛋白质
首先描述用于细胞膏中羧肽酶B类似物D253K的20升发酵方法。用质粒pZen1713(pICI1713，将上述实施例15)转化E.coli菌株MSD1924，-80℃甘油冷冻贮存所得的菌株MSD2230(MSD 1924 pZen1713)。
将MSD2230划线到含L-四环素(10mgml-1)培养基的琼脂平板上以在37℃过夜生长后，分离单个菌落。从L-四环素(10mgml-1)琼脂表面取出6个MSD2230，再悬浮在10ml L-四环素(10mgml-1)肉汤中，将100ul该培养物立即分别接种到6个250ml含75ml L-四环素(10mgml-1)肉汤的erlenmeyer烧瓶中。37℃在往复振荡仪上(300rpm)生长15-16小时后，收集烧瓶内含物，然后用于接种含15升图23所述生长培养基的单个发酵罐(U30D，B.Braun，Melsungen，Germany)。
37℃，pH6.7完成发酵，通过加入6M氢氧化钠或2M硫酸而自动将pH控制在6.7。溶解氧张力(DOT)定点是50％空气饱和，而且通过在200-1000rpm之间自动调整发酵罐搅拌器速度来保持。将流向发酵罐的气流速度保持了每分20个标准升，用Tylan质量流控制器，相当于每分1.3容量体积(vvm)。接种4.5小时后，以190-210mlh-1的速率将酵母提取物溶液(225gl-1)补到发酵罐中，补加28.5小时。开始用酵母提取物供料1.5小时后，将发酵温度定点降到25℃。保持该温度，约1小时后，一个注料量在加入50％阿糖以使在发酵罐容积中的终浓度为0.5％，从而诱导羧肽酶类似物D253K的表达。诱导1-2小时后，将甘油(714gl-1)和硫酸胺(143gl-1)的混合物以45-55mlh-1的速率补料到发酵罐中直到收集。在这些条件下继续发酵直到接种发酵罐后约75小时，通过将发酵罐中的内含物转移到1升离心瓶中来收集培养物。通过用Sorvall RC-3B离心器(7000xg，4℃，30分钟)离心将耗尽的培养基与细菌细胞分开。该过程通常得到约20gl-1的干重。
按如下纯化细胞膏。从-70℃的贮存物中取含重组酶D253K HCPB的重组E.coli细胞并使其融化。称量细胞膏的重量，发现为309克。通过加入缓冲液A[200mM Tris(羟基甲基)氨基甲烷氯化物(TRIS-HCl)，20％蔗糖，pH8.0]，得到320ml的重悬体积，从而重悬浮所述膏。室温将细胞悬浮液保温20分钟，同时偶尔缓慢混合，然后加入等体积蒸馏水并彻底混合。将细胞悬浮液在室温再保温20分钟，同时偶尔缓慢混合。
4℃，以98000xg离心90分钟澄清所得的粗等渗休克物，此后从沉淀的不可溶馏份中倒出上清液，得到240ml的澄清体积。将脱氧核糖核酸酶(24mg)溶解在蒸馏水(5ml)中，并加到上清液中。将混合物在室温保温30分钟同时时常振荡，以降低上清液的粘度，使其足以负载到羧肽酶抑制剂CNBr激活的SepharoseTM亲和柱上，所述柱按照Pharmacia的CNBr激活的SepharoseTM4B的说明来制备，羧肽酶抑制剂来自马铃薯茎(c-0279，Sigma)。用10mM TRIS-HCl，500mM氯化钠，pH8.0(缓冲液B)，1∶1稀释上清液，调整到pH8.0，负载，过夜，以0.5ml/分负载到羧肽酶抑制剂亲和柱上。4℃用缓冲液B预平衡所述柱。负载上清液后，洗涤所述柱直到用洗脱缓冲液(100mM碳酸钠，500mM氯化钠，pH11.4)从柱上洗脱结合的物质前，流出物的吸收值回到基线，以1ml收集馏份。将洗脱物放于-20℃冷冻，此后取样以确定含重组羧肽酶的那些。使用抗-c-myc标志抗体(9E10)，然后用暴露于4-氯-萘和过氧化氢有颜色反应的抗-小鼠-辣根过氧化物酶结合物(a-9044，Sigma)，通过Western印迹分析完成检测。
确定馏份11-44含重组羧肽酶B。集中这些馏份，将pH调到7.5，然后用Millipore Centifugal UltrafreeTM-20(10000分子量截断)浓缩，然后快速冷冻并于-20℃贮存。在此，详细的纯化方法在0.95ml体积中得到4.7mg的D253K突变羧肽酶，纯度为80％。
实施例18
合成天冬氨酸酚氮芥药物前体(化合物5a，图27)(2S)，2-3-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基)-苯氧基羰基}-丙酰-氨基)-琥珀酸
使用与参考实施例12类似的方法。
将(2S)，2-3-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基)-苯氧基羰基}-丙酰-氨基)-琥珀酸二苄基酯(4a)以80psi氢化2小时得到所需的末端产物5a(产率80％)。
5a：1HNMR(CD3OD)：2.65-2.75(t，2H)；2.8-2.9(m，4H)；3.7-3.75(m，4H)；3.8-3.85(m，
4H)；4.75(t，1H)；6.7-6.8(m，2H)；7.0-7.1(m，2H).
MS(ESI)：471-473(MNa)+
分析.(C18H22N2O7Cl21.4H2O)
计算值 ％C：45.56 H：5.27 N：5.90
实测值 ％C：45.79 H：5.60 N：5.91
按如下制备启始材料化合物4a。
将(2S)，2-氨基-琥珀酸二苄基酯(化合物2a)与化合物1反应以便在用乙醚/己烷再结晶后得到(2S)，2-(3-羧基丙酰氨基)-琥珀酸二苄基酯(化合物3a)(产率：80％)。
3a：1HNMR(CDCl3)：2.42-2.6(m，2H)；2.6-2.75(m，2H)；2.85 (dd， 2H)；3.1(dd，1H)；4.9
(dd，1H)；5.05(dd， 2H)；5.15(s，2H)；6.7(d，1H)；7.25-7.5(m，10H).
MS(ESI)：436[MNa]+
分析.(C22H23NO7O.4H2O)：
计算值 ％C：62.82 H：5.70 N：3.33
发现值 ％C：63.2  H：5.75 N：2.9
反应化合物3a以得到所需的起始物质4a(产率7 8％)，室温保持搅拌3小时，用二乙基醚/乙基(70/30 v/v为洗脱剂)通过快速层析纯化。
4a：1HNMR(CDCl3)：2.55-2.65(m，2H)；2.8-2.9(m，2H)；2.9(dd，1H)；3.1(dd，1H)；3.6(dd，
4H)；3.7(dd，4H)；4.9(dd，1H)；5.05(dd，2H)；5.15(s，2H)；6.58(d，1H)；6.65(d，2H)；6.95
(d，2H)；7.25-7.4(m，10H).
MS（ESI)：651-653(MNa)+
实施例19
合成谷氨酸酚氮芥药物前体(5b，图27)(2S)，2-(3-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基)-苯氧基羰基}-丙酰-氨基)-戊二烯酸
使用与参考实施例12类似的方法。
将(2S)，2-3-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基)-苯氧基羰基}-丙酰-氨基)-戊二烯酸二苄基酯(4b)以60psi氢化3小时得到所需的末端产物5b(产率93％)。
5b：1HNMR(CD3OD)：1.9-2.0(m，1H)；2.1-2.2(m，1H)；2.35-2.45(m，2H)；2.55-2.7(m，
2H)；2.8-2.9(m，2H)；3.65-3.7(m，4H)；3.72-3.8(m，4H)；4.4-4.5(m，1H)；6.75(d，2H)；6.95
(d，2H).
MS(ESI)：485-487(MNa)+
按如下制备启始材料化合物4b。
将(2S)，2-氨基-戊二烯酸二苄基酯(2b)反应以便得到(2S)，2-(3-羧基丙酰氨基)-戊二烯酸二苄基酯(化合物3b)(产率：定量的)。
3b：1HNMR(CDCl3)：2.0-2.1(m，1H)：2.2-2.3(m，1H)；2.3-2.5(m，4H)；2.6-2.7(m，2H)；
4.65(dd，1H)；5.05(s，2H)；5.15(s，2H)；6.5(d，1H)；7.3-7.4(m，10H).
MS(ESI)：450[MNa]+
反应化合物3b以得到所需的起始物质4b(产率82％)。
4b：1HNMR(CDCl3)：1.95-2.05(m，1H)；2.2-2.3(m，1H)；2.3-2.5(m，2H)；2.6(dt，2H)；
2.8-3.0(m，2H)；3.6(dd，4H)；3.7(dd，4H)；4.7(dd，1H)；5.1(s，2H)；5.2(s，2H)；6.3(d，1H)；
6.6(d，2H)；6.95(d，2H)；7.3-7.4(m，10H).
MS(ESI)：665-667(MNa)+
实施例20
检测突变人CPB和天然人CPB对Hipp-Asp和Hipp-Glu药物前体类似物的活性
用基于HPLC检测方法检测按参考实施例20所述制备的纯化人CPB(D253K和D253R：实施例15-17)突变体和天然CPB将马尿酰-L-天冬氨酸(Hipp-Asp-参考实施例10)，马尿酰-L-谷氨酸(Hipp-Glu-参考实施例9)或马尿酰-L-
精氨酸(Sigma Chemical Company-目录号H6625)转变成马尿酸的能力。
反应混合物(250μl)在0.025M Tris-HCl，pH7.5中含有4μg人CPB(天然或突变体)和0.5mM Hipp-Asp或Hipp-Glu。37℃将样品保温5小时。通过加入250ul 80％甲醇，20％蒸馏水，0.2％三氟乙酸终止反应，用HPLC确定产生的马尿酸量。
用Hewlett Packard 1090(有二极排列)HPLC系统完成HPLC分析。将样品(50ul)注射到Hichrom Hi-RPB柱(25cm)上，用用40％甲醇，60％蒸馏水，0.1％三氟乙酸以1ml/分的硫酸分离。从用马尿酸(Sigma-H6375)已知量而作的校对曲线确定产生的产物(马尿酸)量。结果列于表中，并表示为37℃，5小时内，用4ug酶转变底物的百分比。
用突变体和天然人CPB转变Hipp-Asp和Hipp-Glu
                             Hipp-Asp    Hipp-Glu    Hipp-Arg
                                    (转变成马尿酸的％)
天然CPB                         0            0          100
D253K突变体CPB                  78           91         ＜2
D253R突变体CPB                  72           52         3
数据表明在人CPB的253位导入赖氨酸或精氨酸代替天然酶中的天冬氨酸可以改变酶的底物特异性，以便所述酶能够转变Hipp-Asp或Hipp-Glu。相反，天然酶不能将这些化合物转变成马尿酸，但可将Hipp-Arg转变成马尿酸。最好的活性是用D253K和Hipp-Glu底物。
实施例21
用Hipp-Asp和Hipp-Glu确定D253K突变HCPB的Km和kcat
检测按照实施例17所述产生的纯化D253K HCPB对Hipp-Asp(参考实施例10)和Hipp-Glu(参考实施例9)的作用以确定对这些底物的Km和kcat。用0.025M Tris-HCl缓冲液，pH7.5稀释Hipp-Asp和Hipp-Glu，使其分别为0.25-0.8mM和0.25-5.0mM。用1M NaOH将必需底物样品的pH调到7.5。
将D253K HCPB(Hipp-Asp用4ug/ml和Hipp-Glu用0.5ug/ml)加到这些底物(500ul反应体积)中以起始反应。将样品在37℃保温5小时。通过加入500ul含0.2％TFA的甲醇/蒸馏水(80/20)终止反应。按实施例20所述用HPLC确定产生的马尿酸量。
用ENAFITTER软件程序(biosoft，Perkin Elmer)计算Km和kcat。用Vmax除以反应混合物中的酶浓度计算kcat(HCPB的分子量为34KDa)。结果列出表中。
用D253K突变HCPB，Hipp-Asp和Hipp-Glu的Km和kcat
               Km(mM)          kcat(s-1)       kcat/Km
                                                (mM-1s-1)
Hipp-Asp         2.7             0.26              0.1
Hipp-Glu         5.3             3.8               0.7
数据表明用赖氨酸取代在人CPB253位的天冬氨酸可以得到能够将Hipp-Asp和Hipp-Glu转变成马尿酸的酶，所述酶有有显著的酶动力学。与Hipp-Asp底物相比，用Hipp-Glu，kcat/Km约大7倍。
实施例22
检测突变HCPB和天然HCPB对谷氨酸药物前体的活性
检测分别按照实施例17和参考实施例20产生的纯化D253K HCPB和天然人HCPB从谷氨酸药物前体(实施例18)酶促裂解成谷氨酸的能力。裂解释放自我非酶促断裂释放活性酚氮芥药物的中间产物(参考实施例13)。用HPLC基础的检测方法测量谷氨酸药物前体向中间产物的转变。
用0.025M Tris-HCl缓冲液，pH7.5将药物前体稀释到0.25-5.0mM。用1M NaOH将必需底物样品的pH调到7.5。将终浓度均为0.25mg/ml的D253K突变HCPB或天然HCPB加到这些底物(在37℃预热2分钟的250ul反应体积)以起始反应。将样品37℃保温4分钟。通过加入250ul 98.8％MeCN，0.2％TFA终止反应，然后将样品放在冰上。用HPLC确定产生的中间产物量。
按照实施例20所述完成HPLC分离，除使用含0.1％TFA的MeCN/蒸馏水(55/45 V/V)来分离药物前体(滞留时间4.9分钟)和中间产物(滞留时间8.4分钟)。用已知量的中间产物而作的校对曲线确定产生的中间产物量。
表中列出了在两份样品中用天然和突变(D253K)HCPB以5.0mM和0.25mM药物前体形成的中间产物量。
用天然和突变HCPB将药物前体转变成中间产物
        药物前体浓度                    中间产物浓度(mM)
           (mM)                      天然HCPB      突变HCPB
            5.0                         0，0     0.023，0.022
            0.25                        0，0     0.005，0.005
用实施例21中叙述的ENZFITTERTM软件从底物浓度产生的中间产物量计算突变人酶(D253K)和药物前体的Km，Vmax和kcat。
D253K突变HCPB的结果是：
Km＝1.25mM
Vmax＝1.17×10-4mMsec-1
kcat＝0.016sec-1
数据表明在人CPB的253位导入赖氨酸或精氨酸代替天然酶中的天冬氨酸可以改变酶的底物特异性，以便所述酶能够将谷氨酸药物前体转变成其自我断裂的中间产物。相反，天然酶不能将药物前体转变成中间产物。由于药物前体是相对非细胞毒性的(实施例23)，而且可以非酶促断裂中间产物以释放杀死肿瘤细胞的游离酚氮芥药物(实施例23)，这些结果表明，CPB活性残基的突变可以产生人突变酶，所述酶可以将相对非细胞毒性的药物前体转变成能够杀死肿瘤细胞的有效细胞毒性药物。
实施例23
谷氨酸药物前体酚氮芥药物在LoVo人结肠直肠肿瘤细胞的细胞毒性
用下列方法说明谷氨酸药物前体相应酚氮芥药物对肿瘤细胞的不同细胞毒性。
37℃，在96孔(2500个细胞/孔)微滴定板中，将LoVo人结肠直肠肿瘤细胞与5×10-4-5×10-8M终浓度的药物前体和药物一起保温1小时。洗涤细胞，然后37℃再保温3天。将TCA加到孔中，洗涤后去除死细胞，胺P.Skehan et al.，J.Natl.Cancer Inst.82，1107(1990)所述，通过加入SRB染料估算粘附到平板上的细胞蛋白质量。用抑制50％(IC50)细胞生长所需的浓度估算化合物的效力。
用酚氮芥药物处理LoVo细胞后，发现IC50为约1uM。相反，谷氨酸药物前体的细胞毒性更低，IC50约为50uM(图22)。因此，突变CPB谷氨酸药物前体的细胞毒性比酚氮芥药物的约低50倍。
如果将按照实施例17所述产生的100ug突变HCPB(D253K)加到含谷氨酸药物前体的检测孔中，可以发现细胞毒性可以与活性药物的相比，因此表明用突变酶转变药物前体可以释放更有效的药物。将100ug天然人CPB加到各孔中没有显著增强谷氨酸药物前体的细胞毒性。这些研究表明突变人CPB酶(D253K)有选择性地将相对无活性药物前体转变成能够杀死肿瘤细胞的有效细胞毒性药物的潜力。
实施例24
制备人化A5B7 F(ab’)2-D253K HCPB融合蛋白
重复参考实施例21中所述的方法，但用人化A5B7代替鼠A5B7轻链和Fd序列，用D253K序列代替HCPB序列。按照参考实施例21所述，用HCPB前原序列，通过共转染在COS细胞中表达融合蛋白。基本上按照参考实施例21所述，通过瞬时将质粒载体(各750ug)导入到COS-7细胞(11)中来大规模表达融合蛋白。通过使含融合蛋白的上清液通过固定的蛋白质A，然后用高pH缓冲液洗脱结合的融合蛋白或者流过使含融合蛋白的上清液流过固定的羧肽酶抑制剂，然后使用用于纯化重组羧肽酶的常规纯化方法，并用含实施例12中酶的相同的高pH溶液洗脱来纯化产物。这两种方法均还可包括用凝胶渗透层析，离子交换层析，疏水相互作用层析，单独或结合使用来进一步纯化所述融合蛋白。
重复参考实施例21中所述的方法，但分别用示于SEQ ID NO：28和29的人化序列分别代替示于SEQ ID NO：25和26的鼠Fd和轻链序列。用D253K序列(实施例15中所述的，但没有(His)6-c-Myc标志)代替参考实施例21中的HCPB序列。用pICI1713(实施例15中所述的)代替参考实施例21中的PCR模板(pICI1698)。
用各种方法，包括Edwards(1987)Am，Biotech.Lab.5，38-44，jayaramanet al，(1991)Proc.Natl.acad.Sci.USA 88，4084-4088，Foguet andLubbert(1992)Biotechniques 13，674-675 andPierce(1994)Biotechniques 16，708所述的那些制备示于SEQ ID NO：28和29的人化序列。
实施例25
振荡烧瓶发酵制备D253K HCPB
用质粒pICI1713(参见实施例15)转化E.coli菌株MSD 213将所得菌株MSD 213pZen 1713作为甘油贮存液于-80℃贮存。将一份MSD213pZen 1713划线到L-四环素的琼脂平板上以便在37℃过夜生长后分开单个菌落。取出MSD 213pZen 1713的单个菌落，接种到含75ml L-四环素肉汤的250ml Erlenmeyer烧瓶中。37℃，在往复振荡仪上生长16小时后，用烧瓶内含物接种9个OD550＝0.1的含600ml L-四环素肉汤的2L Erlenmeyer烧瓶，20℃烧瓶在往复振荡仪上保温直到生长后OD550＝0.5，用培养物的光密度测量估算。此时，将通过将L-阿糖加到培养物中，达到0.01％的终浓度来诱导异源蛋白质生产，然后在20℃按上述再保温42小时。用Sorvall RC-3B离心仪(7000xg，4℃，30分钟)通过离心将消耗的培养基与细菌细胞分开，然后将细胞膏于-70℃贮存。
实施例26
在自体骨髓移植中使用ADEPT
自体骨髓移植包括在该患者进行强化疗之前取出患者自己的骨髓。在完成治疗后，将骨髓放回到患者体内。在某些癌症如中，例如白血病和B-和T细胞谱系的淋巴瘤以及乳腺，肺和结肠癌中，恶性细胞侵入骨髓而且应在再植入骨髓以便有利于存活之前将其除去。以前已经用抗体-毒素结合物消除用于自体骨髓的这些肿瘤细胞(Blakey，D.C.etal.，Prog.Allergy vol 45，50，1988)。
特别是如果用short-lived反应性氮芥烷基化试剂作为药物组分，就可以将ADEPT用于这些目的。因此可以将含肿瘤细胞的自体骨髓与适宜的抗体-酶结合物一起保温。结合物与肿瘤细胞选择性地结合后，可以洗掉残留的结合物。然后加入药物前体，在邻近阳性肿瘤细胞处产生药物以选择性地杀死肿瘤细胞。可以通过优化稀释骨髓以确保肿瘤细胞上的药物产生位点与骨髓细胞之间有足够的距离，以便由于化学降解，使药物在到达骨髓细胞前失活，从而保护正常骨髓细胞。也可以通过加入作为反应性氮芥药物的亲核物质的蛋白质来使对正常骨髓的损害最小。
实施例27
将突变葡糖醛酸酶用于反极性ADEPT
人葡糖醛酸酶是另一种酶，可以用“反极性”概念产生尿苷裂解药物前体释放活性药物的特异性人酶。Bosslet等人(Cancer Res.54，2151，1994)已经描述了天然人葡糖醛酸酶的阿霉素-葡糖醛酸酶药物前体，而且描述了释放一系列药物的一系列不同药物前体的合成方法(Bossle t在专利申请AU-50225/93)。在没有抗体-葡糖醛酸酶结合物的条件下，存在于血液和组织中的内源天然葡糖醛酸酶有能力将这些药物前体转变成活性药物，并因此降低了方法的特异性。Cheng和Touster(J.B.B.247，2650，1972)报道了在葡糖醛酸酶的活性位点有带正电荷的氨基酸，它们与葡糖醛酸化物环上的带负电荷的羧基反应。
Figure C9519698600921
接头可以是葡糖醛酸化物和细胞毒性药物之间的直链或自我imolating接头，例如可以是由Bosslet等人(Cancer Res.54，2151，1994和专利AU-A-50225/93)描述的类型。如果用带正电荷的R基团取代葡糖醛酸化物环上的带负电荷的羧基，例如R＝L-CH2-NH2或L-CH2-NHR’(其中R’＝C1-4烷基，L＝[CH2]0-3或其它适宜的接头，那么，带正电荷药物前体就不再是天然葡糖醛酸酶的底物。然后如果将葡糖醛酸酶活性位点中带正电荷的参见转变成带负电荷的氨基酸，如谷氨酸天冬氨酸，那么，该突变葡糖醛酸酶将以类似于RNase和CPB实施例中的方法，选择性地转变带正电荷的药物前体。因此，可以将反极性概念延伸到人葡糖醛酸酶和带正电荷的葡糖醛酸酶基药物前体。
Figure C9519698600931
序列表SEQ ID NO：1的资料：(I)序列特征：(A)长度：30个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
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GACCTGGAAC TCTGGATCTC TGTCCAGCGGSEQ ID NO：22的资料：(I)序列特征：(A)长度：30个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
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GGATTTGGGG GAGGAACCTG GCTTCTGCTGSEQ ID NO：25的资料：(I)序列特征：(A)长度：777个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：AAG CTT GCC GCC ACC ATG AAG TTG TGG CTG AAC TGG ATT TTC CTT GTA    48
                Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val
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                Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu
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                                                               732End EndSEQ ID NO：27的资料：(I)序列特征：(A)长度：30个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGCSEQ ID NO：28的资料：(I)序列特征：(A)长度：777个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：AAG CTT GCC GCC ACC ATG AAG TTG TGG CTG AAC TGG ATT TTC CTT GTA  48
                Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val
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125                 130                 135CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC    480Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys140                 145                 150                 155CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG    528Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
            160                 165                 170GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG    576Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
        175                 180                 185GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC    624Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
    190                 195                 200AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT    672Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
205                 210                 215CAG GGC CTG AGT TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT    720Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys220                 225                 230                 235TAA TAG GAA TTC                                                    732End EndSEQ ID NO：30的资料：(I)序列特征：(A)长度：30个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：
AAGGTCACCT GCGAAAACGG GCAGGGCAACSEQ ID NO：31的资料：(I)序列特征：(A)长度：25个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：
CTGGAAACAG ACATTCTGGA CATCTSEQ ID NO：32的资料：(I)序列特征：(A)长度：30个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：
GCCCTGCCCG TTTTCGCAGG TGACCTTTTCSEQ ID NO：33的资料：(I)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：
TGCTACAAGA GCAACTCCAG CATGCASEQ ID NO：34的资料：(I)序列特征：(A)长度：41个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：
CTCTAGGAAT TCTTATTAGT ACAGGTGTTC CAGGACGTAG CSEQ ID NO：35的资料：(I)序列特征：(A)长度：108个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：CCCAAGCTTG CCGCCACCAT GTTGGCAGTC TTGGTTCTGG TGACTGTGGC CCTGGCATCTGCTGCAACAG GACACAGTTA TGAGAAGTAC AACAAGTGGG AAACGATASEQ ID NO：36的资料：(I)序列特征：(A)长度：16个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：
AACAGCTATG ACCATGSEQ ID NO：37的资料：(I)序列特征：(A)长度：17个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：
GTAAAACGAC GGCCAGTSEQ ID NO：38的资料：(I)序列特征：(A)长度：30个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：
TCGCTATTAC CATGGTGATG  CGGTTTTGGCSEQ ID NO：39的资料：(I)序列特征：(A)长度：23个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：
CAGACTCTGC AGCAGGTCCA CAGSEQ ID NO：40的资料：(I)序列特征：(A)长度：54个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：
CCCAAGCTTG  CCGCCACCAT GTTGGCACTC TTGGTTCTGG TGACTGTGGC CCTGSEQ ID NO：41的资料：(I)序列特征：(A)长度：39个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：
CTCATAACTG AATTCTTATT AACGAACCCG GCTATCAAASEQ ID NO：42的资料：(I)序列特征：(A)长度：34个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：
GGATCTGCTG  CCCAAGCTTA CTCCATGGTG ACCCSEQ ID NO：43的资料：(I)序列特征：(A)长度：80个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：
CTTCTCATAA CTGTGTCCTG TTGCGAACAC GCTGCTCACC TCGGGCACTG TACATATGCA
AGGCTTACAA CCACAATCCCSEQ ID NO：44的资料：(I)序列特征：(A)长度：78个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：
GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTGCCC GAGGTGAGCA GCGTGTTCGC AACAGGACAC
AGTTATGAGA AGTACAACSEQ ID NO：45的资料：(I)序列特征：(A)长度：27个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：
CCGTTTGATC TCGAGCTTGG  TGCCTCCSEQ ID NO：46的资料：(I)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：
GTTGGAGCTC TTGGTTCTGGSEQ ID NO：47的资料：(I)序列特征：(A)长度：22个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：
CAAGGCCTCG AGCTTTCTCA ACSEQ ID NO：48的资料：(I)序列特征：(A)长度：21个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：
GTTTGATTCT AGAGTTCGTG CSEQ ID NO：49的资料：(I)序列特征：(A)长度：22个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：
TTGTAAAACG ACGGCCAGTG AGSEQ ID NO：50的资料：(I)序列特征：(A)长度：24个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：
GAAACAGCTA TGACCATGAT TACGSEQ ID NO：51的资料：(I)序列特征：(A)长度：23个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：
CAGACTCTGC AGCAGGTCCA CAGSEQ ID NO：52的资料：(I)序列特征：(A)长度：19个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：
GGACCTGCTG CAGAGTCTGSEQ ID NO：53的资料：(I)序列特征：(A)长度：21个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：53：
GCCTGTGCTC AATATTGATG GSEQ ID NO：54的资料：(I)序列特征：(A)长度：23个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：
CCGTGTTAAA GCAGAAGATA CTGSEQ ID NO：55的资料：(I)序列特征：(A)长度：23个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：
GCTACTGTGA AAGAACTTGC CTCSEQ ID NO：56的资料：(I)序列特征：(A)长度：1263个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：GAGCTCTTGG TTCTGGTGAC TGTGGCCCTG GCATCTGCTC ATCATGGTGG TGAGCACTTT    60GAAGGCGAGA AGGTGTTCCG TGTTAACGTT GAAGATGAAA ATCACATTAA CATAATCCGC   120GAGTTGGCCA GCACGACCCA GATTGACTTC TGGAAGCCAG ATTCTGTCAC ACAAATCAAA   180CCTCACAGTA CAGTTGACTT CCGTGTTAAA GCAGAAGATA CTGTCACTGT GGAGAATGTT   240CTAAAGCAGA ATGAACTACA ATACAAGGTA CTGATAAGCA ACCTGAGAAA TGTGGTGGAG   300GCTCAGTTTG ATAGCCGGGT TCGTGCAACA GGACACAGTT ATGAGAAGTA CAACAAGTGG   360GAAACGATAG AGGCTTGGAC TCAACAAGTC GCCACTGAGA ATCCAGCCCT CATCTCTCGC   420AGTGTTATCG GAACCACATT TGAGGGACGC GCTATTTACC TCCTGAAGGT TGGCAAAGCT   480GGACAAAATA AGCCTGCCAT TTTCATGGAC TGTGGTTTCC ATGCCAGAGA GTGGATTTCT   540CCTGCATTCT GCCAGTGGTT TGTAAGAGAG GCTGTTCGTA CCTATGGACG TGAGATCCAA   600GTGACAGAGC TTCTCGACAA GTTAGACTTT TATGTCCTGC CTGTGCTCAA TATTGATGGC   660TACATCTACA CCTGGACCAA GAGCCGATTT TGGAGAAAGA CTCGCTCCAC CCATACTGGA   720TCTAGCTGCA TTGGCACAGA CCCCAACAGA AATTTTGATG CTGGTTGGTG TGAAATTGGA   780GCCTCTCGAA ACCCCTGTGA TGAAACTTAC TGTGGACCTG CCGCAGAGTC TGAAAAGGAG   840ACCAAGGCCC TGGCTGATTT CATCCGCAAC AAACTCTCTT CCATCAAGGC ATATCTGACA   900ATCCACTCGT ACTCCCAAAT GATGATCTAC CCTTACTCAT ATGCTTACAA ACTCGGTGAG   960AACAATGCTG AGTTGAATGC CCTGGCTAAA GCTACTGTGA AAGAACTTGC CTCACTGCAC  1020GGCACCAAGT ACACATATGG CCCGGGAGCT ACAACAATCT ATCCTGCTGC TGGGGGCTCT  1080GACGACTGGG CTTATGACCA AGGAATCAGA TATTCCTTCA CCTTTGAACT TCGAGATACA  1140GGCAGATATG GCTTTCTCCT TCCAGAATCC CAGATCCGGG CTACCTGCGA GGAGACCTTC  1200CTGGCAATCA AGTATGTTGC CAGCTACGTC CTGGAACACC TGTACTAGTT GAGAAAGCTC  1260GAG      1263SEQ ID NO：57的资料：(I)序列特征：(A)长度：415氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：57：
Glu Leu Leu Val Leu Val Thr Val Ala Leu Ala Ser Ala His His Gly
           -105                -100                 -95
Gly Glu His Phe Glu Gly Glu Lys Val Phe Arg Val Asn Val Glu Asp
        -90                 -85                 -80
Glu Asn His Ile Asn Ile Ile Arg Glu Leu Ala Ser Thr Thr Gln Ile
    -75                 -70                 -65
Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Val Thr Gln Ile Lys Pro His Ser Thr
-60                 -55                 -50                 -45
Val Asp Phe Arg Val Lys Ala Glu Asp Thr Val Thr Val Glu Asn Val
                -40                 -35                 -30Leu Lys Gln Asn Glu Leu Gln Tyr Lys Val Leu Ile Ser Asn Leu Arg
        -25                 -20                 -15Asn Val Val Glu Ala Gln Phe Asp Ser Arg Val Arg Ala Thr Gly His
    -10                  -5                   1Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Thr Gln5                  10                  15                  20Gln Val Ala Thr Glu Asn Pro Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val Ile Gly
             25                  30                  35Thr Thr Phe Glu Gly Arg Ala Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly Lys Ala
         40                  45                  50Gly Gln Asn Lys Pro Ala Ile Phe Met Asp Cys Gly Phe His Ala Arg
     55                  60                  65Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu Ala Val
 70                  75                  80Arg Thr Tyr Gly Arg Glu Ile Gln Val Thr Glu Leu Leu Asp Lys Leu85                  90                  95                 100Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr
            105                 110                 115Trp Thr Lys Ser Arg Phe Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His Thr Gly
        120                 125                 130Ser Ser Cys Ile Gly Thr Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp
    135                 140                 145Cys Glu Ile Gly Ala Ser Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr Cys Gly
150                 155                 160Pro Ala Ala Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile165                 170                 175                 180Arg Asn Lys Leu Ser Ser Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His Ser Tyr
            185                 190                 195Ser Gln Met Met Ile Tyr Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu Gly Glu
        200                 205                 210Asn Asn Ala Glu Leu Asn Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys Glu Leu
    215                 220                 225Ala Ser Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala Thr Thr
230                 235                 240Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ala Tyr Asp Gln Gly245                 250                 255                 260Ile Arg Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg Tyr Gly
            265                 270                 275Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ile Arg Ala Thr Cys Glu Glu Thr Phe
        280                 285                 290Leu Ala Ile Lys Tyr Val Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr End
    295                 300                 305     307SEQ ID NO：58的资料：(I)序列特征：(A)长度：35个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：
GCCGGGTTTG CGCAACTGGT CACTCTTACG AGAAGSEQ ID NO：59的资料：(I)序列特征：(A)长度：88个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：
CCGGAATTCT TATTAGTTCA GGTCCTCCTC AGAGATCAGC TTCTGCTCCT CGAACTCATG  60
GTGGTGATGG TGGTGGTACA GGTGTTCC                          88SEQ ID NO：60的资料：(I)序列特征：(A)长度：22个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：
TTAGCGGATC CTGCCTGACG GTSEQ ID NO：61的资料：(I)序列特征：(A)长度：23个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：
GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTTSEQ ID NO：62的资料：(I)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：
ACCTCTAGGG TCCCCAATTASEQ ID NO：63的资料：(I)序列特征：(A)长度：23个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：63：
CAAGTCGCCA CTGAGAATCC AGCSEQ ID NO：64的资料：(I)序列特征：(A)长度：1053个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：64：ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
    -20                 -15                 -10GCC CAA CCA GCC ATG GCG GCA ACT GGT CAC TCT TAC GAG AAG TAC AAC 96Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn
 -5              -1                   5                  10AAG TGG GAA ACG ATA GAG GCT TGG ACT CAA CAA GTC GCC ACT GAG AAT 144Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Thr Gln Gln Val Ala Thr Glu Asn
             15                  20                  25CCA GCC CTC ATC TCT CGC AGT GTT ATC GGA ACC ACA TTT GAG GGA CGC 192Pro Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg
         30                  35                  40GCT ATT TAC CTC CTG AAG GTT GGC AAA GCT GGA CAA AAT AAG CCT GCC 240Ala Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gln Asn Lys Pro Ala
     45                  50                  55ATT TTC ATG GAC TGT GGT TTC CAT GCC AGA GAG TGG ATT TCT CCT GCA 288Ile Phe Met Asp Cys Gly Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala
 60                  65                  70TTC TGC CAG TGG TTT GTA AGA GAG GCT GTT CGT ACC TAT GGA CGT GAG 336Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu75                  80                  85                  90ATC CAA GTG ACA GAG CTT CTC GAC AAG TTA GAC TTT TAT GTC CTG CCT 384Ile Gln Val Thr Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro
             95                 100                 105GTG CTC AAT ATT GAT GGC TAC ATC TAC ACC TGG ACC AAG AGC CGA TTT 432Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe
        110                 115                 120TGG AGA AAG ACT CGC TCC ACC CAT ACT GGA TCT AGC TGC ATT GGC ACA 480Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr
    125                 130                 135GAC CCC AAC AGA AAT TTT GAT GCT GGT TGG TGT GAA ATT GGA GCC TCT 528Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser
140                 145                 150CGA AAC CCC TGT GAT GAA ACT TAC TGT GGA CCT GCC GCA GAG TCT GAA 576Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu155                 160                165                  170AAG GAG ACC AAG GCC CTG GCT GAT TTC ATC CGC AAC AAA CTC TCT TCC 624Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser
            175                 180                 185ATC AAG GCA TAT CTG ACA ATC CAC TCG TAC TCC CAA ATG ATG ATC TAC 672Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Ile Tyr
        190                 195                 200CCT TAC TCA TAT GCT TAC AAA CTC GGT GAG AAC AAT GCT GAG TTG AAT 720Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn
    205                 210                 215GCC CTG GCT AAA GCT ACT GTG AAA GAA CTT GCC TCA CTG CAC GGC ACC 768Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr
220                 225                 230AAG TAC ACA TAT GGC CCG GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG 816Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly235                 240                 245                 250GGC TCT GAC GAC TGG GCT TAT GAC CAA GGA ATC AGA TAT TCC TTC ACC 864Gly Ser Asp Asp Trp Ala Tyr Asp Gln Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr
            255                 260                 265TTT GAA CTT CGA GAT ACA GGC AGA TAT GGC TTT CTC CTT CCA GAA TCC 912Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser
        270                 275                 280CAG ATC CGG GCT ACC TGC GAG GAG ACC TTC CTG GCA ATC AAG TAT GTT 960Gln Ile Arg Ala Thr Cys Glu Glu Thr Phe Leu Ala Ile Lys Tyr Val
    285                 290                 295GCC AGC TAC GTC CTG GAA CAC CTG TAC CAC CAC CAT CAC CAC CAT GAG 1008Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr His His His His His His Glu
300                 305                 310TTC GAG GAG CAG AAG CTG ATC TCT GAG GAG GAC CTG AAC TAA TAA 1053Phe Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn End End315                 320                 325     327SEQ ID NO：65的资料：(I)序列特征：(A)长度：31个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：65：
GTTATTACTC GCTGCCCAAC CAGCCATGGC GSEQ ID NO：66的资料：(I)  序列特征：(A)  长度：41个碱基对(B)  类型：核酸(C)  链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：
CTCTAGGAAT TCTTATTAGT ACAGGTGTTC CAGGACGTAG CSEQ ID NO：67的资料：(I)序列特征：(A)长度：999个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：67：ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
    -20                 -15                 -10GCC CAA CCA GCC ATG GCG GCA ACT GGT CAC TCT TAC GAG AAG TAC AAC 96Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn
 -5                   1               5                 10AAG TGG GAA ACG ATA GAG GCT TGG ACT CAA CAA GTC GCC ACT GAG AAT 144Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Thr Gln Gln Val Ala Thr Glu Asn
             15                  20                  25CCA GCC CTC ATC TCT CGC AGT GTT ATC GGA ACC ACA TTT GAG GGA CGC 192Pro Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg
         30                  35                 40GCT ATT TAC CTC CTG AAG GTT GGC AAA GCT GGA CAA AAT AAG CCT GCC 240Ala Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gln Asn Lys Pro Ala
     45                  50                  55ATT TTC ATG GAC TGT GGT TTC CAT GCC AGA GAG TGG ATT TCT CCT GCA 288Ile Phe Met Asp Cys Gly Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala
 60                  65                  70TTC TGC CAG TGG TTT GTA AGA GAG GCT GTT CGT ACC TAT GGA CGT GAG 336Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu75                  80                  85                  90ATC CAA GTG ACA GAG CTT CTC GAC AAG TTA GAC TTT TAT GTC CTG CCT 384Ile Gln Val Thr Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro
             95                 100                 105GTG CTC AAT ATT GAT GGC TAC ATC TAC ACC TGG ACC AAG AGC CGA TTT 432Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe
        110                 115                 120TGG AGA AAG ACT CGC TCC ACC CAT ACT GGA TCT AGC TGC ATT GGC ACA 480Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr
    125                 130                 135GAC CCC AAC AGA AAT TTT GAT GCT GGT TGG TGT GAA ATT GGA GCC TCT 528Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser
140                 145                 150CGA AAC CCC TGT GAT GAA ACT TAC TGT GGA CCT GCC GCA GAG TCT GAA 576Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu155                 160                 165                 170AAG GAG ACC AAG GCC CTG GCT GAT TTC ATC CGC AAC AAA CTC TCT TCC 624Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser
            175                 180                 185ATC AAG GCA TAT CTG ACA ATC CAC TCG TAC TCC CAA ATG ATG ATC TAC 672Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Ile Tyr
        190                 195                 200CCT TAC TCA TAT GCT TAC AAA CTC GGT GAG AAC AAT GCT GAG TTG AAT 720Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn
    205                 210                 215GCC CTG GCT AAA GCT ACT GTG AAA GAA CTT GCC TCA CTG CAC GGC ACC 768Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys Glu LeuA la Ser Leu His Gly Thr
220                 225                 230AAG TAC ACA TAT GGC CCG GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG 816Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly235                 240                 245                 250GGC TCT GAC GAC TGG GCT TAT GAC CAA GGA ATC AGA TAT TCC TTC ACC 864Gly Ser Asp Asp Trp Ala Tyr Asp Gln Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr
            255                 260                 265TTT GAA CTT CGA GAT ACA GGC AGA TAT GGC TTT CTC CTT CCA GAA TCC 912Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser
        270                 275                 280CAG ATC CGG GCT ACC TGC GAC GAG ACC TTC CTG GCA ATC AAG TAT GTT 960Gln Ile Arg Ala Thr Cys Glu Glu Thr Phe Leu Ala Ile Lys Tyr Val
   285                  290                 295GCC AGC TAC GTC CTG GAA CAC CTG TAC TAA TAA GAATTC 999Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr End End
300                 305     307SEQ ID NO：68的资料：(I)序列特征：(A)长度：34个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：68：
CCAACCAGCC ATGGCGCATC ATGGTGGTGA GCACSEQ ID NO：69的资料：(I)序列特征：(A)长度：23个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：69：
GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTTSEQ ID NO：70的资料：(I)序列特征：(A)长度：21个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：70：
GGAGAAAGCC ATATCTGCCT GSEQ ID NO：71的资料：(I)序列特征：(A)长度：1284个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：71：ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT    48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-117    -115                -110                -105GCC CAA CCA GCC ATG GCG CAT CAT GGT GGT GAG CAC TTT GAA GGC GAG    96Ala Gln Pro Ala Met Ala His His Gly Gly Glu His Phe Glu Gly Glu
-100                -95                 -90AAG GTG TTC CGT GTT AAC GTT GAA GAT GAA AAT CAC ATT AAC ATA ATC    144Lys Val Phe Arg Val Asn Val Glu Asp Glu Asn His Ile Asn Ile Ile-85                 -80                 -75                 -70CGC GAG TTG GCC AGC ACG ACC CAG ATT GAC TTC TGG AAG CCA GAT TCT    192Arg Glu Leu Ala Ser Thr Thr Gln Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser
            -65                 -60                 -55GTC ACA CAA ATC AAA CCT CAC AGT ACA GTT GAC TTC CGT GTT AAA GCA    240Val Thr Gln Ile Lys Pro His Ser Thr Val Asp Phe Arg Val Lys Ala
        -50                 -45                 -40GAA GAT ACT GTC ACT GTG GAG AAT GTT CTA AAG CAG AAT GAA CTA CAA    288Glu Asp Thr Val Thr Val Glu Asn Val Leu Lys Gln Asn Glu Leu Gln
    -35                 -30                 -25TAC AAG GTA CTG ATA AGC AAC CTG AGA AAT GTG GTG GAG GCT CAG TTT    336Tyr Lys Val Leu Ile Ser Asn Leu Arg Asn Val Val Glu Ala Gln Phe
-20                 -15                 -10GAT AGC CGG GTT CGT GCA ACA GGA CAC AGT TAT GAG AAG TAC AAC AAG    384Asp Ser Arg Val Arg Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn Lys-5                   1               5                  10TGG GAA ACG ATA GAG GCT TGG ACT CAA CAA GTC GCC ACT GAG AAT CCA    432Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Thr Gln Gln Val Ala Thr Glu Asn Pro
         15                  20                  25GCC CTC ATC TCT CGC AGT GTT ATC GGA ACC ACA TTT GAG GGA CGC GCT    480Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Ala
     30                  35                  40ATT TAC CTC CTG AAG GTT GGC AAA GCT GGA CAA AAT AAG CCT GCC ATT    528Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gln Asn Lys Pro Ala Ile
 45                  50                  55TTC ATG GAC TGT GGT TTC CAT GCC AGA GAG TGG ATT TCT CCT GCA TTC    576Phe Met Asp Cys Gly Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe60                  65                  70                  75TGC CAG TGG TTT GTA AGA GAG GCT GTT CGT ACC TAT GGA CGT GAG ATC    624Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu Ile
             80                  85                  90CAA GTG ACA GAG CTT CTC GAC AAG TTA GAC TTT TAT GTC CTG CCT GTG    672Gln Val Thr Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val
         95                 100                 105CTC AAT ATT GAT GGC TAC ATC TAC ACC TGG ACC AAG AGC CGA TTT TGG    720Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe Trp
    110                 115                 120AGA AAG ACT CGC TCC ACC CAT ACT GGA TCT AGC TGC ATT GGC ACA GAC    768Arg Lys Thr Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr Asp
125                 130                 135CCC AAC AGA AAT TTT GAT GCT GGT TGG TGT GAA ATT GGA GCC TCT CGA    816Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser Arg140                 145                 150                 155AAC CCC TGT GAT GAA ACT TAC TGT GGA CCT GCC GCA GAG TCT GAA AAG    864Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu Lys
            160                 165                 170GAG ACC AAG GCC CTG GCT GAT TTC ATC CGC AAC AAA CTC TCT TCC ATC    912Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser Ile
        175                 180                 185AAG GCA TAT CTG ACA ATC CAC TCG TAC TCC CAA ATG ATG ATC TAC CCT    960Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Ile Tyr Pro
    190                 195                 200TAC TCA TAT GCT TAC AAA CTC GGT GAG AAC AAT GCT GAG TTG AAT GCC    1008Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn Ala
205                 210                 215CTG GCT AAA GCT ACT GTG AAA GAA CTT GCC TCA CTG CAC GGC ACC AAG    1056Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr Lys220                 225                 230                 235TAC ACA TAT GGC CCG GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG GGC    1104Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly
            240                 245                 250TCT GAC GAC TGG GCT TAT GAC CAA GGA ATC AGA TAT TCC TTC ACC TTT    1152Ser Asp Asp Trp Ala Tyr Asp Gln Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr Phe
        255                 260                 265GAA CTT CGA GAT ACA GGC AGA TAT GGC TTT CTC CTT CCA GAA TCC CAG    1200Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln
    270                 275                 280ATC CGG GCT ACC TGC GAG GAG ACC TTC CTG GCA ATC AAG TAT GTT GCC    1248Ile Arg Ala Thr Cys Glu Glu Thr Phe Leu Ala Ile Lys Tyr Val Ala
285                 290                 300AGC TAC GTC CTG GAA CAC CTG TAC TAA TAA GAATTC    1284Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr End End305                 310     312SEQ ID NO：72的资料：(I)序列特征：(A)长度：25个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：
GGTCATAAGC CCAGTCTTTA GAGCCSEQ ID NO：73的资料：(I)序列特征：(A)长度：27个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：73：
CCTGCTGCTG GGGGCTCTAA AGACTGGSEQ ID NO：74的资料：(I)序列特征：(A)长度：1059个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：74：ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
    -20                 -15                 -10GCC CAA CCA GCC ATG GCG GCA ACT GGT CAC TCT TAC GAG AAG TAC AAC 96Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn
 -5                   1               5                  10AAG TGG GAA ACG ATA GAG GCT TGG ACT CAA CAA GTC GCC ACT GAG AAT 144Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Thr Gln Gln Val Ala Thr Glu Asn
             15                  20                  25CCA GCC CTC ATC TCT CGC AGT GTT ATC GGA ACC ACA TTT GAG GGA CGC 192Pro Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg
         30                  35                  40GCT ATT TAC CTC CTG AAG GTT GGC AAA GCT GGA CAA AAT AAG CCT GCC 240Ala Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gln Asn Lys Pro Ala
     45                  50                  55ATT TTC ATG GAC TGT GGT TTC CAT GCC AGA GAG TGG ATT TCT CCT GCA 288Ile Phe Met Asp Cys Gly Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala
 60                  65                  70TTC TGC CAG TGG TTT GTA AGA GAG GCT GTT CGT ACC TAT GGA CGT GAG 336Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu75                  80                  85                  90ATC CAA GTG ACA GAG CTT CTC GAC AAG TTA GAC TTT TAT GTC CTG CCT 384Ile Gln Val Thr Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro
             95                 100                 105GTG CTC AAT ATT GAT GGC TAC ATC TAC ACC TGG ACC AAG AGC CGA TTT 432Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe
        110                 115                 120TGG AGA AAG ACT CGC TCC ACC CAT ACT GGA TCT AGC TGC ATT GGC ACA 480Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr
    125                 130                 135GAC CCC AAC AGA AAT TTT GAT GCT GGT TGG TGT GAA ATT GGA GCC TCT 528Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser
140                 145                 150CGA AAC CCC TGT GAT GAA ACT TAC TGT GGA CCT GCC GCA GAG TCT GAA 576Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu155                 160                 165                 170AAG GAG ACC AAG GCC CTG GCT GAT TTC ATC CGC AAC AAA CTC TCT TCC 624Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser
            175                 180                 185ATC AAG GCA TAT CTG ACA ATC CAC TCG TAC TCC CAA ATG ATG ATC TAC 672Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Ile Tyr
        190                 195                 200CCT TAC TCA TAT GCT TAC AAA CTC GGT GAG AAC AAT GCT GAG TTG AAT 720Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn
    205                 210                 215GCC CTG GCT AAA GCT ACT GTG AAA GAA CTT GCC TCA CTG CAC GGC ACC 768Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr
220                 225                 230AAG TAC ACA TAT GGC CCG GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG 816Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly235                 240                 245                 250GGC TCT AAA GAC TGG GCT TAT GAC CAA GGA ATC AGA TAT TCC TTC ACC 864Gly Ser Lys Asp Trp Ala Tyr Asp Gln Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr
            255                 260                 265TTT GAA CTT CGA GAT ACA GGC AGA TAT GGC TTT CTC CTT CCA GAA TCC 912Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser
        270                 275                 280CAG ATC CGG GCT ACC TGC GAG GAG ACC TTC CTG GCA ATC AAG TAT GTT 960Gln Ile Arg Ala Thr Cys Glu Glu Thr Phe Leu Ala Ile Lys Tyr Val
    285                 290                 295GCC AGC TAC GTC CTG GAA CAC CTG TAC CAC CAC CAT CAC CAC CAT GAG 1008Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr His His His His His His Glu
300                 305                 310TTC GAG GAG CAG AAG CTG ATC TCT GAG GAG GAC CTG AAC TAA TAA GAA 1056Phe Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn End End315                 320                 325     327TTC   1059SEQ ID NO：75的资料：(I)序列特征：(A)长度：25个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：75：
GGTCATAAGC CCAGTCGCGA GAGCCSEQ ID NO：76的资料：(I)序列特征：(A)长度：27个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：76：
CCTGCTGCTG GGGGCTCTCG CGACTGGSEQ ID NO：77的资料：(I)序列特征：(A)长度：1059个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：77：
ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT 48
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
        -20                 -15                -10
GCC CAA CCA GCC ATG GCG GCA ACT GGT CAC TCT TAC GAG AAG TAC AAC 96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn
     -5                   1               5                  10
AAG TGG GAA ACG ATA GAG GCT TGG ACT CAA CAA GTC GCC ACT GAG AAT 144
Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Thr Gln Gln Val Ala Thr Glu Asn
                 15                  20                  25
CCA GCC CTC ATC TCT CGC AGT GTT ATC GGA ACC ACA TTT GAG GGA CGC 192
Pro Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg
             30                  35                  40GCT ATT TAC CTC CTG AAG GTT GGC AAA GCT GGA CAA AAT AAG CCT GCC 240Ala Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gln Asn Lys Pro Ala
     45                  50                  55ATT TTC ATG GAC TGT GGT TTC CAT GCC AGA GAG TGG ATT TCT CCT GCA 288Ile Phe Met Asp Cys Gly Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala
 60                  65                  70TTC TGC CAG TGG TTT GTA AGA GAG GCT GTT CGT ACC TAT GGA CGT GAG 336Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu75                  80                  85                  90ATC CAA GTG ACA GAG CTT CTC GAC AAG TTA GAC TTT TAT GTC CTG CCT 384Ile Gln Val Thr Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro
             95                 100                 105GTG CTC AAT ATT GAT GGC TAC ATC TAC ACC TGG ACC AAG AGC CGA TTT 432Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe
        110                 115                 120TGG AGA AAG ACT CGC TCC ACC CAT ACT GGA TCT AGC TGC ATT GGC ACA 480Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr
    125                 130                 135GAC CCC AAC AGA AAT TTT GAT GCT GGT TGG TGT GAA ATT GGA GCC TCT 528Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser
140                 145                 150CGA AAC CCC TGT GAT GAA ACT TAC TGT GGA CCT GCC GCA GAG TCT GAA 576Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu155                 160                 165                 170AAG GAG ACC AAG GCC CTG GCT GAT TTC ATC CGC AAC AAA CTC TCT TCC 624Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser
            175                 180                 185ATC AAG GCA TAT CTG ACA ATC CAC TCG TAC TCC CAA ATG ATG ATC TAC  672Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Ile Tyr
        190                 195                 200CCT TAC TCA TAT GCT TAC AAA CTC GGT GAG AAC AAT GCT GAG TTG AAT 720Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn
    205                 210                 215GCC CTG GCT AAA GCT ACT GTG AAA GAA CTT GCC TCA CTG CAC GGC ACC 768Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr
220                 225                 230AAG TAC ACA TAT GGC CCG GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG 816Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly235                 240                 245                 250GGC TCT CGC GAC TGG GCT TAT GAC CAA GGA ATC AGA TAT TCC TTC ACC 864Gly Ser Arg Asp Trp Ala Tyr Asp Gln Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr
            255                 260                 265TTT GAA CTT CGA GAT ACA GGC AGA TAT GGC TTT CTC CTT CCA GAA TCC 912Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser
        270                 275                 280CAG ATC CGG GCT ACC TGC GAG GAG ACC TTC CTG GCA ATC AAG TAT GTT 960Gln Ile Arg Ala Thr Cys Glu Glu Thr Phe Leu Ala Ile Lys Tyr Val
    285                 290                 300GCC AGC TAC GTC CTG GAA CAC CTG TAC CAC CAC CAT CAC CAC CAT GAG 1008Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr His His His His His His Glu
305                 310                 315TTC GAG GAG CAG AAG CTG ATC TCT GAG GAG GAC CTG AAC TAA TAA GAA 1056Phe Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn End End320                 325                 330     332TTC  1059
序列表注：
在本说明书中，说明书中的序列号与直接包括在说明书中的序列表(不是用Patentin软件制作的)中的一致。还需提供Patentin制作的序列表，这在本申请申请时已经完成，而且其内容具体引入本文作为参考。
由于当核酸序列含编码区(CDS)时，Patentin软件产生额外序列(只含氨基酸序列)，这在Patentin和非Patentin产生的SEQ ID NOS编号之间产生了矛盾。用Patentin产生的序列表提交的表格列出了2组SEQ IDNOS的比较。
读者还应注意在目前Patentin软件版本1.30中的下列“bug”。在含CDS的序列中，有时氨基酸的序列编号从较早的CDS延伸(而不是从启始开始)。所述bug影响Patentin产生的序列表中SEQ ID NO：27，30和32的编号。

Claims (13)

1.设计用于宿主中的匹配的两种组分系统，其中所述组分含有：
(I)第一组分是寻靶部分，它是能够与肿瘤相关抗原结合的抗体或其片段，寻靶部分与能够将药物前体转变成抗肿瘤药物的在66位含有Glu的人核糖核酸酶相连和；
(ii)第二组分是在所述酶影响下可转变成抗肿瘤药物的药物前体；
其中：
第一组分在宿主中基本上是非免疫原性的和；
药物前体第二组分在天然未突变宿主酶的作用下在宿主体内不会显著地转变成抗肿瘤药物。
2.根据权利要求1的系统，其中所述抗体片段是F(ab’)2片段。
3.权利要求1中定义的第二组分，它是式1的氮芥核糖核苷酸
其中：
Q是O或NH；
A是式-X-Y的基团，Y与Q相邻，其中
Y是SO2，CO或单键，其前提如下：
当Q是氧时，Y不是SO2；
X是-(CH2)n-其中n＝1-4在
任何碳原子上由C1-4烷基可选地取代，
或当Y是CO且n＝1时，X在碳上可选地由丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，赖氨酸，精氨酸或组氨酸侧链取代；
R1是尿嘧啶或胞嘧啶；
R2和R3分别独立地是H或C1-4烷基；
R5和R6分别独立地是Cl，甲磺酰基或甲苯磺酰基；
R7，R8，R9和R10分别独立地是H，C1-4烷基，C1-4烷氧基，F或Cl或其盐。
4.根据权利要求3的氮芥核糖核苷酸，其中：
Q是NH；
X是-(CH2)n-，n＝1-4；
Y是-(CO)-；
R1是尿嘧啶或胞嘧啶；
R2和R3是H；
R5和R6是Cl；和
R7，R8，R9和R10是H；
或其盐。
5.权利要求1所定义的第二组分，它是化合物O-[(2R，3S，4R，5R)-2-(2-氨基乙酰氨基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-1-基)-4-羟基-2，3，4，5-四氢呋喃-3-基]O-[4-(双[2-氯乙基]氨基)苯氧基]磷酸氢酯或其盐。
6.含有权利要求1-2任一定义的第一组分的药物组合物。
7.含权利要求1或3-5任一定义的第二组分的药物组合物。
8.根据权利要求6-7的药物组合物，它是无菌的。
9.权利要求1-2任一定义的第一组分。
10.在66位包含Glu的人核糖核酸酶。
11.选自编码下列物质之多核苷酸序列的多核苷酸序列：
权利要求1-2任一定义的第一组分；和在66位包含Glu的人核糖核酸酶。
12.含有权利要求11定义的多核苷酸的载体。
13.含有权利要求11定义的多核苷酸的细胞。
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