SK209792A3 - Conjugates - Google Patents

Description

Oblasť techniky i

i ž

KONJUGÁTY I

•...... 4 «

i i

( se týká konjugátu pri protinádorové

CO

Q &

o jsou imunotoxiny, pro jako terapii, procesu

Tento vynález které se používaj í prípravu takových konjugátu a farmaceutických smési, které je obsahuj í.

Dosavadní stav techniky

Ricin modecin a rostlinnými

Toxíny ŕetézcú a molekuly podobné viscumin jsou známé které maj í jsou složeny disulf idickým ( A jsou abrin, produkované vlastnosti.

bunkami, tohoto typu spojených z polypeptidových ŕetézcú (A ŕetézec) je primárne zodpovedný za cytotoxické vlastnosti molekuly toxínu, zatímco druhý polypeptidový ŕetézec (B ŕetézec) sprostredkováva väzbu molekuly toxínu na bunečný povrch.

ricinu, jako sloučeniny cytotoxické ze dvou polypeptidových mústkem. Jeden

Toxické pôsobení molekúl ricínového typu je rozloženo do tŕí fází:

a) vazba toxínu na bunečný povrch prostŕednictvím interakce vazebných mist obsahujicich galaktosu na B ŕetézci s glykoproteiny nebo glykolipidy, prítomnými na bunéčném povrchu

b) penetrace A ŕetézce do cytosolu bunky

c) inhib'ice syntézy bílkovin zpusobené blokovánim aktivity ribosomální 60S podjednotek ŕetézcem A

Dále se též uvažuje o tom, že B ŕetézec má , nezávisle na své primárni funkci, vázat molekulu toxínu na bunečný povrch, i duležitou sekundárni funkci, která spočívá v usnadnéni prístupu toxínu do bunky. Odélené jsou ŕetézce A a B absolutné netoxické, protože ŕetézec A postrádá v neprítomnosti ŕetézce B schopnost väzby na. bunečný povrch a penetrace do cytosolu bunky, zatimco ŕetézec B nemá cytotoxické vlastnosti.

Jak bylo výše uvedeno jsou ricin a molekuly ricínového typu produkovány rostlinami. V prípade samotného ricinu jde o rostlinu Ricinus communis, která je jinak známa jako producent ricínového oleje. Pŕedpokládá se, že prekursorový polypeptid (známý jako preproricin) obsahující vedoucí sekvencľ, ŕetézec A, spojovací sekvenci a ŕetézec B je produkován nejdŕíve. Pravdépodobné béhem transportu tohoto prekursoru uvnitŕ rostlinné bunky je eliminována vedoucí sekvence a vzniká proricin. Ricin vzniká z proricinu po vytvorení disulfidického mustku mezi ŕetézci

A a B a eliminaci spojovací sekvence.

Dále se pŕedpokládá, že toxicita A ŕetézce toxinú jako je ricin by mohla být použitelná u protinádorové terapie,

a.v pŕípadé, kdy by náhodné se vázající B ŕetézec mohl být nahrazen j iným nosičem se schopnosti vázat se k rakovinným bunkám prednostné pred normálními. Byla navržena a pripravená rada konjugátu, které obsahuj i ricin nebo A ŕetézec ricinu a nádorové špecifickou protilátku.

U známých konjugátu však vzniká jeden problém spojený s určitou štrukturálni vlastnosti pŕirozeného ricinu. Pŕedpokládá se, že béhem syntézy ricinu v rostlinných bunkách, dochází k N-glykosylaci a tudiž výsledné cukerné části jsou schopné nešpecifických interakcí s bunečným povrchem.

₍ Dále se uvažuje o tom, že ztráta selektivity imunokonjugatu s rostlinným ricinem je též výsledkem buď:

a) prítomnosti galaktosových vazebných mist na B ŕetézci, které nešpecifickým zpúsobem reaguj i s bunečným povrchem v pŕipadé celých ricínových imunokonjugátú, nebo

b) väzby postrannich ŕetézcú glykanu, které se vytváŕejí na rostlinném ricinu A, s galaktosovými nebo mannosovými receptory na bunéčném povrchu v prípade imunokonjugátú _± s rostlinným ricinem A.

< Ďalší problém vyplýva z vlastnosti ŕetézce B, který, jak bylo výše uvedeno, umožňuje príjem molekuly toxínu do bunky. Uvádí se, že ačkoli konjugáty, které neobsahuj! B ŕetézec, tedy konjugáty skladající se z ŕetézce

A a protilátky, máji tendenci být specifičtéjši ve srovnáni s nativnimi toxíny nemaj í účinek jako natívni toxin (Moolten,

- 2bF.L a kol., Immun. Rev., 62, 47-72, 1982). Pŕedpokládá se, že tato ztráta účinnosti je dusledkem sniženi účinného príjmu toxínu bunkou. Z toho dúvodu jen pomerné malá část dosud popsaných protilátek je schopná zprostŕedkovat efektívni internalizaci toxínu, a vétšina jich proto poskytuje imunotoxiny které postrádaji aktivitu.

Bylo pripraveno mnoho konjugátu s potencionálnim využitím pri ošetrení nádoru rady tkání. Napr. PCT Patent Application No W085/003508 popisuje prípravu konjugátu, které jsou složeny z ricinu A nebo ŕetézce difteria toxínu A, spojených vloženou molekulou s protilátkami špecifickými pro v nádory prsu.

Protilátky, které rozpoznávaj! bunky rakoviny stŕevního traktu byly již také popsány, avšak konjugáty,které zahrnúj í tyto protilátky, trpí často tendenci k neprijatelné vazbé s normálni tkání a/anebo nízkou účinností. Takže známé protilátky které rozpoznávaj! nádorové bunky stŕeva nebo konečníku žatím nenalezly použití v príprave konjugátu se “· skutečným terapeutickým významem. Je proto stálá potreba konjugátu který by mél terapeutickou hodnotu pri ošetŕování *’ tumoru stŕevního traktu.

Pŕesto, že již byly navrženy a pripravený nejrúznéjši konjugáty, stále je potreba vytvoŕit lepší konjugáty. Tyto vylepšené konjugáty by mély zlepšit jednu či více nevýhod spojených s dosud známými konjugáty. Je zejména potreba získat konjugáty selektívni pro gastrointestinálni tumory.

Technická podstata vynálezu

Pŕedkládaný vynález popisuje konjugáty, které se skládaji z toxinové složky a a ze složky pro väzbu s cilovou bunkou která je selektívni pro nádorové bunky tráviciho traktu.

Složka pro väzbu s cilovou bunkou ( a tedy celý konjugát) je zejména selektívni pro nádorové bunky tlustého stŕeva, konečníku a slinivky, obzvlášté pak pro bunky nádoru tlustého stŕeva a konečníku.

Skupina pro väzbu s cilovou bunkou je selektívni pro nádorové bunky tráviciho traktu (zejména tumoru tlustého stŕeva a konečníku) tím zpúsobem, že se váze k takovýmto bunkám preferenčné oproti normálním bunkám. Takže skupina pro väzbu k cílové. buňce se bude vázat k buňce nádoru tráviciho traktu, avšak bude vykazovat nulovou nebo nebo pouze minimálni vazebnou afinitu vúči normálním bunkám. Zejména je dúležité, že skupina pro väzbu k cílové buňce vykáže selektivitu vúči gastrointestinálnim tumorúm v podstate stejnou jakou vykazuje protilátka C242. Selektivita protilátky C242 vúči gastrointestinálnim tumorúm, jako jsou kolorektální tumory je ilustrována imunohistochemickými údaji uvedenými dále. Tak zejména skupina pro väzbu k cílové buňce jako je protilátka C242, se bude vázat na antigén související s tumory trávicího traktu, který je však neprítomný nebo jen slabé exprimován v normálních bunkách. Zvláštni prípad takové skupiny pro väzbu k cilové buňce je protilátka C242 nebo skupina pro väzbu cilové bunky, která by méla v podstaté shodné vazebné vlastnosti vúči bunkám.

Jak je zde uvedeno, konjugát je schopný zničit bunky nádoru trávici soustavy. Takže konjugát (neboli imunotoxin ) je schopen dopravit toxinovou část k tumorové buňce tak, aby toxinová část mohla uplatnit své cytotoxické schopnosti. Konjugát proto bude, obecné, schopen vázat se k nádorovým bunkám (prostŕednictvím části pro väzbu k cilové buňce vážící se k tumorové buňce) a umožní toxinové části proniknout do bunky, to znamená, že umožní toxinové části jej í internalisaci. Obzvlášté efektívni konjugáty budou obecné mít nasledující vlastnosti-

1. Část pro väzbu k cilové buňce má být schopná vázat se na povrchový antigén tumorové bunky.

2. Antigén na bunéčném povrchu musí být pŕítomen ve vysokém počtu kópií na nádorových bunkách, napríklad alespoň v počtu deset tisíc na bunku.

3. Antigén by nemél být exprimován ve vysokém počtu kópií v normálních bunkách.

4. Komplex antigen-protilátka by mél být účinné internalisován tak, aby jeho toxinová část mohla uplatnit vnitrobunéčné svou cytotoxicitu.

5. Konjugát by mél být výhodné konstruován tak, aby byl natolik stabilní, že zústane v krvi dostatečné dlouho intaktni, než je toxinová část dopravená k rakovinným bunkám a současné by mél být vhodné štépitelný tak, aby došlo k uvolnéní toxinové části, jakmile se tato část dostane dovnitŕ bunky.

Protilátka C242 je myšši protilátka zarazená do skupiny IgG protilátek, která je produkována tehdy, jestliže v pŕíslušném médiu jsou kultivovány hybridomové bunky pocházejicí z línie získané fuzí myššich slezinných bunék, které byly imunizovány bunkami z lidského stŕevního adenokarcinomu, a myššich myelomových bunék linie Sp 2/0. Linie hybridomových bunék ( 242.11), které produkuj í C242:II protilátku (zde též jednoduše označovanou jako C242 protilátka) byla uložená 26. ledna, 1990 v souladu s Budapešťským ujednáním v Evropské sbírce pro živočišné tkáňové kultury (ECACC), PHLS Centrum pro aplikovanou mikrobiológii a výzkum, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, United Kingdom, pod číslem 90012601.

Výraz část, vázající se k cílové buňce, která má v podstaté stejné vazebné vlastnosti zahrnuje skupiny vázající se k cílové buňce, které mají v podstaté stejnou imunologickou specifitu jakou má bunečná linie uložená v ECACC pod číslem 90012601, která se váže na stejnou antigenní determinantu nebo epitop, a soutéží o toto vazebné místo s C242 protilátkou.

Výraz část vázající se k cílové buňce také zahrnuje fragmenty protilátky a zvlášté fragmenty protilátky C242 stejné tak jako intaktní protilátku. Fragmenty protilátky, včetné téch, získaných napr. degradaci protilátky pusobenim proteolytických enzýmu jako je pepsin, si zachovávaj í vazebnou schopnost a specifitu jako má nefragmentovaný imunoglobulin. Zvláštními prípady fragmentu jsou F(ab ) a F(ab )₂ fragmenty.

Bylo by výhodné, kdyby skupina, která se váze k cílové buňce, mohla být pripravená metódami genetického inženýrství a v tom prípade výraz fragment vážící se k cílové buňce zahrnuje protilátky a fragmenty protilátek pripravované takovýmito technikami. Zejména tento termín zahrnuje protilátku C242 nebo jej í fragment, který je produktem génového inženýrství.

Príprava fragmentu protilátek a zejména humanisovaných

	forem protilátek nebo	jej ich fragmentú humanisované formy	odvozených myšších
z nehumánních zdroju, protilátek.	napi-
•	Protilátka C242	je	orientována proti	tumorovému
•	antigénu, zde značenému	jako	CA-242. Proto je	zejména ve

skupiné vázající se k cílové buňce obsažena protilátka nebo fragment protilátky schopný vázat se k antigénu CA-242.

Špecifickým pŕikladem takové protilátky je právé sama protilátka C242. Antigén CA-242 spjatý s tumorem je exprimován ve vétšiné nádoru tlustého stŕeva a konečníku, a v normálni stŕevni tkáni neni pŕítomen vúbec nebo je exprimován pouze slabé.

Straň genetického inženýrství, jak již bylo uvedeno vyše, cDNA variabilních oblastí téžkých a lehkých retézcú C242:II monoklonální protilátky byly klonovány zpúsobem, který bude dále popsán. Dŕive však, pred podrobnéj ši diskusi, nemuže být od veci, podat stručný obecný popis základní imunoglobulinové štruktúrni jednotky s odkážem na obr. 17 doprovodných ilustraci, který popisuje základní strukturu protilátky, tzn. imunoglobulinu, nebo tŕídy G. .

Podie obr. 17, imunoglobulin se skládá ze dvou identických lehkých polypeptidových retézcú (L) a dvou identických téžkých polypeptidových retézcú (H). Tyto čtyŕi ŕetézce jsou spojený disulfidickými väzbami a radou nekovalentních vazeb do symetrické Y konfigurace. Každý téžký ŕetézec má na každém konci variabilní doménu V^ za níž následuje rada konstantních domén C^. Každý lehký ŕetézec má variabilní doménu na jednom konci V_L a konštantní doménu C_L má na druhém konci. Pritom existuj í dva typy lehkých retézcú, označované jako kappa. a lambda. Variabilní doména lehkého ŕetézce je umísténa do jedné rady s variabilní doménou téžkého ŕetézce, konštantní doména lehkého ŕetézce je pak v jedné ŕadé s první konštantní doménou téžkého ŕetézce.

Variabilní domény lehkých a téžkých retézcú tvorí vazebné místo.

Variabilní oblasti lehkých a téžkých ŕetézcú máji stejnou základní strukturu, každá se skládá ze tri hypervariabilních oblastí, které se nazývaj í oblastmi určujicimi komplementaritu , nebo CDR, zasazené mezi čtyŕi segmenty základní blokové štruktúry , označované jako FR. CDR každé variabilní domény jsou segmenty základni štruktúry drženy v tésné blízkosti a dvé sady CDR společné zodpovidají za specifitu protilátky.

Aby mohla být klonována cDNA variabilnich oblasti lehkých a téžkých ŕetézcú protilátky C242:II, byla nejdŕíve z hybridomu C242:II známými metódami pripravená cDNA fágová knihovna (génová banka). Hybridizační nukleotidové sondy zahrnující konštantní části téžkého a lehkého ŕetézce (kappa), byly dále pripravený z myšši genomové DNA metodou PCR s použitím vhodných primerú. Výsledné nukleotidové sondy byly pak použitý ke screeningu knihovny cDNA pro cDNA klony, obsahující sekvence DNA, které koduji' téžké a kappa ŕetézce C242:II protilátky. Hybridizované fágové klony byly rozvinutý a cDNA byla vyŕíznuta ve forme plasmidú. Ty byly posléze mapovány za použití restrikčních enzýmu a plasmidy, které obsahovaly inzerty očekávané velikosti byly sekvenovány. Aby mohly být určený CDR oblasti, byly aminokyselinové oblasti kódované nukleotidovými sekvencemi insertu porovnávány s dŕíve známými myšími kappa a téžkými ŕetézci s ohledem na základní umísténí CDR oblastí jak je definováno napr Kabatem a kol. (1987) v Sequence of Proteins of Immunological

Interest, 4. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health. Bylo zjišténo, že CDR oblasti príslušných ŕetézcú mély následuj.ici aminokyselinové sekvence (jak je též uvedeno na obr. 18 a 19 doprovodných ilustrací-viz též SEQ. ID. č. 21 a 22):

Lehký ŕetézec

CDR1	(SEQ.	ID
CDR2	(SEQ.	ID
CDR3	(SEQ.	ID

ČI):ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnThrTyrLeuTyr

Č2):ArgMetSerAsnLeuValSer

Č3) :LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr

Téžký ŕetézec

CDR1 (SEQ. ID. Č 4):TyrThrGlyMetAsn

CDR2 (SEQ: ID. Č5):

TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAsp PheLysGly

CDR3 (SEQ. ID. Č6):ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal

V prípade, že tyto CDR amino a/nebo DNA sekvence jsou známy, múže odborník vnést CDR oblasti C242:II protilátky do klonovaných variabilnich části j iné protilátky nebo fragmentu bežné z literatúry známou metodou usmernené mutageneze.

Tento postup obecné známy jako CDR transplantace-roubování) napr. popsané v Application č. EP 239,400), zahrnujíci, grafting (CDR

European Patent na úrovni DNA, substituci CDR kódujících sekvencí C242:II protilátky pro CDR kódující sekvence recipientni protilátky nebo fragmentu, která poskytne protilátku nebo fragment protilátky s odpovidající specifitou jako má monoklonální protilátka C242:II. Mezi skupiny vázajici se k cilové buňce lze proto samozrejmé zahrnout jakýkoli celek, který obsahuje protilátku nebo fragment protilátky majicí alespoň jednu z vyše definovaných CDR oblasti (nebo v podstate vyše definované CDR oblasti), pokud počet CDR oblasti a jej ich uspoŕádáni v protilátce nebo fragmentu protilátky je takové, že část vázajici se k cilové buňce má v podstate stejné vazebné vlastnosti vuči bunkám jako protilátka C242. Je obecné výhodné, jestliže část vázajici se k cilové buňce zahrnuje všechny CDR oblasti (což jsou CDR1, CDR2 a CDR3 lehkého ŕetézce a CDR1 CDR2 a CDR3 téžkého ŕetézce) definované vyše (nebo v podstate definované vyše). CDR oblasti uvádéné jako v podstate vyše definované zahrnuj í rozšírené aekvence jako j sou:

Lehký ŕetézec

CDR1 (SEQ. ID. Č7) :

ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyrTrpPhe

CDR2 (SEQ. ID. Č8):IleTyrArgMetSerAsnLeuValSerGlyVal

CDR3 (SEQ. ID. Č9):LeuGlnHisLeuGluTyrPRoPheThrPheThrPheGly

Téžký ŕetézec

CDR1 (SEQ. ID. Č10) : PheThrTyrThrGlyMetAsn

CDR2 (SEQ. ID. Čll):

MetGLyTrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly

Arglle

CDR3 (SEQ. ID. Č12):

AlaArgArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspValTrpGly

Protilátky nebo fragmenty protilátek pripravené metodou CDŔ transplantace budou výhodné pripravený vnášením CDR oblastí C242 protilátky do základni štruktúry, která je vybrána tak, aby byla blízká C242 homologií i velikostí CDR.

Pŕedkládaný vynález také popisuje konjugát, který obsahuje toxinovou část a část vázajici se k cilové buňce, která obsahuje C242 protilátku nebo část vázajici se k cilové buňce, která má v podstate stejné v’azebné vlastnosti.

Lze kladné hodnotit, že konjugát který je pŕedmétem pŕedkládaného vynálezu, nemusí nutné sestávat z jedné molekuly toxínu a z jedné molekuly protilátky. Napríklad konjugát múže obsahovat více než jednu molekulu toxínu na molekulu protilátky.

Toxinová část obecné obsahuje komponentu, která má cytotoxické vlastnosti a je tedy schopná následné . po internalisaci zabijet bunky.

Část molekuly zodpovédná za väzbu k cilové buňce obecné obsahuje složku vázajici se k cilové buňce, která je schopná rozpoznat špecifickou antigenní determinantu cilové bunky.

Toxinová část a část vázajici se k cilové buňce mohou být buď vzájemné spojený pŕímo, anebo mohou být spojený nepŕímo. Toxinová část a část vázajici se k cilové buňce jsou obecné vzájemné spojený takovým zpusobem, že geometrie výsledného konjugátu umožňuje části pro väzbu k cilové buňce navázat se na svou cílovou buňku. Zejména výhodné je, že toxinová část a část vázajici se k cilové buňce jsou spojený takovým zpusobem, že konjugát je extracelulárné stálý, a intracelulárné nestálý, takže toxinová část a část vázajici se k cilové buňce zústávaji spojený pokud jsou mimo buňku, avšak po internalisaci je uvnitŕ buňky toxinová část uvolnéna. Takto s výhodou má konjugát intracelulárné štépitelné avšak extracelulárné stálé místo.

Príklady konjugátu v nichž je toxinová část pŕímo spojená s části vázajici se k cilové buňce zahrnuj! i ty, v nichž je toxinová část s části vázajici se k cilové buňce spojená disulfidovým mustkem skupinou na toxinové části a vytvoreným mezi thiolovou thiolovou skupinou na části vázajici se k cilové buňce.

Část vázajici se k cilové buňce múže zahrnovat oblast která rozpoznává toxinovou část a která tedy sama váze toxinovou část s části vázajici se k cilové buňce. Pŕíkladem posledné zmĺnéného je prípad kdy část vázajici se k cilové buňce zahrnuje protilátku nebo fragment protilátky který se váže k toxinové části.

Část vázajici se k cilové buňce a toxinová část múže obsahovat jednoduchý polypeptido který by mél nejlépe zahrnovať intracelulárné štépitelnou oblast tak, aby toxinová část byla uvolnéna do bunky. V takovém polypeptidu mohou být toxinová část a část vázajici se k cilové buňce spojený pomoci polypeptidové spojky.

Príklady konjugátu,kde je toxinová část spojená nepŕimo s částí vázajici se k cilové buňce zahrnuj! i ty, kde je toxinová část spojená s část! vázajici se k cilové buňce prostŕednictvím bifunkčniho činidla, zejména prostŕednictvím heterobi-funkčního činidla,

Vhodná spojovací činidla zahrnuj! napríklad spojky které sestávají z polypeptidu, jako ty, které jsou popsány v patentové pŕihlášce PCT WO 85/003508 a spojky které zahrnuj i chemické skupiny takového typu jako jsou popsány v Published European Patent Application č. 169,111.

S výhodou lze též vázajici se k cilové buňce prostŕednictvím disulfidové väzby, nebo prostŕednictvím thioetherové väzby, preferováno aby toxinová část s částí vázajici buňce byly spojený väzbou, která spojuje intracelulárné štépitelné spojovat toxinovou část s části disulfitové zminéné nebo

Obecné je se k cilové části pomoci thioetherové väzby.

Príklady takových imunotoxinu jsou Application č. 207-225,

B.M.J., spojek popsány 169,111;

(Cumber,

w.c.J., a jejich v Published v Methods in

A.J., Forrester, Thorpe, P.E.

použití

European Patent

Enzymology 112, J.A., Foxweel, Preparation of v príprave

1985,

Ross , antibody-toxin conjugates); a v publikaci Vogel, Immunoconjugates: Anibody conjugates in radioimaging and therapy of cancer, pp 28-55, (Wawrzynczak, E.J. and Thorpe, P.E. - Methods for preparing imunotoxins: effects of the linkage on activity and stability).

Mezi špeciálni spojky lze zahrnout ty, které jsou schopné tvoŕit disulfidické väzby s thiolovou skupinou na jedné z toxinových částí a části vázající se k cilové buňce a dále amidovou väzbu s aminoskupinou na druhé strane toxinové části a části vázající se k cilové buňce.

Pŕíkladem téchto speciálních spojek jsou ty, které mají obecný vzorec:

-s-x-cokde X je skupina tvoŕící prostorové (dištanční) raménko.

X je tvoŕeno alkylovou skupinou libovolné substituovanou jedním nebo dvéma substituenty, které jsou vybrány z (l-6C)alkyl, fenyl a' (1-4C)alkylfenyl, nebo (l-4C)alkylfenyl skupiny, v níž alkylová část je libovolné substituována jedním nebo dvéma substituenty vybranými z (l-6C)alkyl, fenyl a (l-4C)alkylfenylu, a zde múže fenylový kruh nést substituent vybraný napŕ.ze skupín halogénových, (l-4C)alkyl a (1-4C)alkoxy.

Je obecné výhodné , jestliže napr. alkylová skupina prostorového raménka X nese substituent vybraný z téch, které byly výše uvedený.

Napr. X múže být tvoŕeno (l-6C)alkyl ŕetézcem, volné substituovaným jednám nebo dvéma substituenty vybranými z (l-4C)alkyl a fenylových skupín. Určité hodnoty X zahrnují napr. methylenovou, ethylenovou, propylenovou, butylenovou skupinu volné substituovanou jednou nebo dvéma skupinami nezávisle vybranými z methylových, ethylových, propylových a butylových zbytku (zvlášté, když jde o substituci methylem, ethylem, propylem a butylem).

Špecificky zajímavé hodnoty X jsou ty, kde X je tvoŕeno methylenovou nebo ethylenovou skupinou libovolné substituovanou jednou nebo dvéma výše definovanými skupinami.

Výhodné je X tvoŕeno ethylenovou skupinou, která je nesubstituovaná nebo substituovaná jednou či dvéma methylovými skupinami, zejména pak ethylenovou skupinou substituovanou jednou methylenovou skupinou.

Mezi výhodné konjugáty uvádéné v tomto vynálezu patrí ty, které máji vzorec:

H

A-S1-S₂-X-^C°N-B kde A je tvoŕeno jednou toxinovou části a části vázajici se k cílové buňce, a B je tvoŕeno j inou toxinovou skupinou

a skupinou vázajíci se	k cílové	buňce, pritom skupina
vázající se k cílové	buňce	múže	nést jednu	nebo více
toxinových části
Sj_je atóm síry prítomný	na A
NH je vázáno na B a
S2-X-CO je spojka, kde	S2 je	atóm	síry a x je	def inováno
výše.
Bude výhodné, jestliže	S bude pocházet	z thiolové

skupiny prítomné na A.

Bude výhodné, že v prípade, že spojka obsahuje chirálni centrum, múže existovat a také být isolována v opticky aktivní nebo racemické forme. Vynález zahrnuje použití spojek, které jsou ve formé opticky aktivní nebo racemické sloučeniny. Syntéza opticky aktivních forem sloučenin múže být provedena z literatúry dobre známými standardními technikami, které jsou použivány v organické chémii.

Výhodné je A tvoreno toxinovou vázající se k cílové buňce.

Jak bylo výše konstatováno, tvorená jakoukoli složkou, která má části a B obsahuje část múže být toxinová část cytotoxické vlastnosti.

Pŕíkladem takových látek jsou polypeptidy, které jsou schopné inaktivovat ribosomy a tudíž inhibovat proteosyntézu. Zvláštními príklady takových polypeptidú jsou ty, které byly nalezený v prírode a jejich složky. Pokud takový polypeptid sestává z toxické komponenty a ze zásadné netoxické komponenty, toxinová část konjugátu s výhodou obsahuje toxickou komponentu. Napríklad toxinová část múze být tvorená ricinem, ale s výhodou múze být toxinová část tvorená A-ŕetézcem ricinu. Toxinová část muže také zahrnovat části nebo analogy polypeptidu nalezených v prírode, které máji cytotoxické vlastnosti. Vhodné polypeptidy pro toxinovou část ajej í prípravu jsou popsány v Ribosome inactivating proteins up to dáte - Stripe, F. and Barbieri, L., FEBS 3269, a v citacích zde uvedených. Zejména vhodné polypeptidy pro toxinovou část zahrnuj! A-ŕetézec ricinu (ricin A), restriktocin a shiga toxin. Ďalšími vhodnými polypeptidy pro toxinovou část mohou být abrin, viskumin, modecin, volkensin, gelonin, protivirálni protein plevele, saporin, lufin, trichsanthin, protein inaktivujicí ribosómy ječmene, dianthiny, byodin, momordin, tritin, dodekandrin, alfa-sarcin, mitogellin, záškrtový difteria toxin, exotoxin A ze pseudomonad a toxíny podobné shiga toxínu, shiga-like toxíny VT1 a VT2.

Skupina analog polypeptidu nacházených v prírode zahrnuje ty polypeptidy, které maj í primárni strukturu spŕíznénou s polypeptidy nalezenými v prírode do té míry, že se liší jednou nebo nékolika zmenami v aminokyselinách (delece, adice, substituce) které nevedou ke ztráté cytotoxické aktivity. Zvláštními prípady takovýchto analog jsou ty, u nichž zmena či zmeny podporuj! väzbu k části vázající se k cílové buňce.

V prípade, že toxinová část obsahuje polypeptid •x.

nalezený v prírode nebo jeho určitý úsek, muže být toxinová část pripravená isolací polypeptidu z pŕírodniho zdroje, a kde je požadována jeho část, modifikací isolovaného polypeptidu chemickými prostŕedky, napríklad enzymové. Polypeptid nebo jeho část mohou být pripravený pomoci technik génového inženýrství. Tyto techniky zahrnuj i napríklad takové metódy génového inženýství, kde je sekvence DNK kódujíci požadovaný polypeptid obvykle inkorporována do vhodného vektoru nebo plasmidu. Hostitelské bunky transformované tímto vektorem nebo plasmidem mohou být kultivovány za vhodných podminek tak, aby došlo k expresi príslušné sekvence DNK a k produkci polypeptidu.

Je výhodné, jestliže toxinová část je tvorená ricinem A, jeho části nebo analogem. Pokud toxinová. část obsahuje ricin A, múze být ricin A ziskán ze semen rostliny Ricinus communis. S výhodou Ize však pripravovať A-ŕetézec nebo celý ricin pomoci génového inženýrství. Jsou tedy preferovány rekombinantní ricin A nebo ricin.

Obecné je preferován ricin A získaný metódami génového inženýrství pred ricinem ziskávaným z pŕirozenýc.h .. zdroju, vzhledem k tomu, že génové inženýrství umožňuje prípravu ricinu A, který není kontaminován B-retézcem. ricinu a dále také proto, že ricin A pripravený tímto zpusobem není glykosylován. Proto použití rekombinantního ricinu A vede v dúsledku neprítomnosti cukerných části schopných vytváŕet nešpecifické interakce na bunéčném povrchu k získáni selektivnéjšího konjugátu.

Ve výhodné forme, konjugát uvádéný v tomto vynálezu je tvoŕen částí vázajici se k cílové buňce, která je selektívni k rakovinným bunkám tlustého stŕeva a konečníku.

Část vázajici se k cilové protilátku C242 nebo její fragment, buňce výhodné obsahuje zejména však protilátku

C242 .

Toxinová část a část vázajici se k cilové buňce jsou výhodné spojený pŕes -CO.CH₂.CH(CH)₃-S-. Tento kovalentni väzbou mezi NH

3-merkaptobutanový radikál, radikál je vhodné pŕipojen skupinou, na části vázajici se k cilové buňce, napr. NH skupinou lysylového zbytku k časti vázajici se k cilové buňce, a disulfidickým mústkem s thiolovou skupinou toxinové části, napr. thilovou skupinou cysteinového zbytku ricinu A.

Tak tento vynález zejména popisuje imunotoxin, k'terý je tvoŕen protilátkou C242 a rekombinantním ricinem A, spojených z amino zbytku na C242 k thiolu cysteinového zbytku ricinu A merkaptobutanovým radikálem, -COCH₂CH(CH)3-S-.

Preferovaný imunotoxin je ten, který je tvoŕen C242 protilátkou a rekombinantním ricinem A, spojených z koncové aminoskupiny lysylového zbytku v C242 ke koncovému thiolu cysteinového zbytku ricinu A diradikálem 3-merkaptobutanové kyseliny (merkaptomáselné).

Obecné každá jednotka protilátky bude nést alespoň jednu jednotku ricinu A. Bude však výhodné, jestliže jednotka protilátky bude moci pŕes príslušné spojovací části nést více než jednu jednotku rekombinantniho ricinu A. Tyto další spojovací části mohou nést netoxickou molekulu, napr cystein. Takové spojky mohou být tudíž upravený čepičkou, která je tvorená netoxickou molekulou.

Imunotoxiny popisované v tomto vynálezu mohou být využity pri léčení gastrointestinálních nádoru, zejména nádoru tlustého stŕeva , konečníku a slinivky bŕisni. Dále tento vynález popisuje metódu léčení gastrointestinálních nádoru, včetné dávkováni účinného množství konjugátu (zde definovaného) určeného teplokrevnému savci jako’je človek.

Bude vhodné, jestliže dávka a dávkovací režim budou závislé na použité toxinové části, populaci cílových bunék a pacientovi. Dávka poskytovaného konjugátu se typicky pohybuje v rozsahu od 0,1 do lmg/kg pacientovy hmotnosti.

Konjugáty popisované v tomto vynálezu budou bežné podávány ve formé farmaceutických pŕípravkú. Proto tento vynález též poskytuje popis farmaceutických pŕípravkú, které obsahují konjugát (zde definovaný) spolu s farmaceutický pŕijatelnou ŕedící složkou nebo nosičem.

Farmaceutické prípravky popisované v tomto vynálezu mohou být pŕipravovány v rúzných dávkách. Obecné, konjugáty popisované v tomto vynálezu budou podávány parenterálné, výhodnej i pŕípravek dávkovací Obzvlášté intravenosné. Určitý parenterálni farmaceutický je takový, který je pŕipraven v jednotkové forme, která je vhodná pro podáni pomoci injekce. vhodné prípravky proto obsahuj í roztok, emulsi nebo imunotoxinu spolu s farmaceutický prijateľným suspensi parenterálním nosičem nebo ŕedíci složkou. Vhodné nosiče nebo zŕed’ovaci pufr, a liposomy. stabilitu obsahovať složky nevodné

Prípravky mohou konjugátu v pufr, popŕ. obecné bude zahrnuj í vodné prostŕedky, napr. vodu nebo prostŕedky, napr. fixujicí oleje nebo obsahovať činidla, která zvyšují prípravku. Napríklad pŕípravek múže Tween. Koncentrace rúzná, ale asi 1 do 10 mg/dávku.

konjugát pŕipraven v konjugátu bude koncentracích od

Protilátka je selektívni vúči tlustého stŕeva obsahující tuto jsou selektívni a konečníku.

C242 a konečníku a bylo zjišténo, protilátku jsou silnými vúči nádorovým bunkám nádorovým bunkám že konjugáty imunotoxiny, které tlustého stŕeva

Zejména bylo zjišténo, že výhodný konjugát popisovaný v tomto vynálezu je prekvapivé účinným imunotoxinem, a to tím, že je silným a současné selektivním imunotoxinem k nádorovým bunkám tlustého stŕeva a konečníku. Dále bylo zjišténo, že tento konjugát se vyznačuje relatívne malou rýchlostí rozkladu v krvi, extracelulárního štepení a destrukce, což vede ke zlepšení jeho stability v plašme. Tyto vlastnosti pak pŕináší potenciálni výhodu v poskytnutí dostatečné doby pro interakci imunotoxinu s jeho cilovými bunkami než dôjde k rozkladu a destrukci.

Tento vynález dále popisuje zpusoby prípravy výše definovaného konjugátu:

a) Takových konjugátu, v nichž část vázajici se k cilové buňce je pŕimo pripojená k toxinové skupiné, reakci toxinové části s části vázajici se k cilové buňce.

Napríklad tam, kde je část vázajici se k cilové buňce pripojená k toxinové části disulfidickým mústkem, mohou být jedna z části vázajici se k cilové buňce či toxinová část

redukovány, pred reakci s j inou části vázajici se	k cilové použití
buňce a toxinovou části, a to dithiothreitolu.	napr	za
Takových konjugátu u nichž část	vázaj ící	se '	k cilové

buňce je pripojená spojkou s toxinovou části, reakci části vázajici se k cilové buňce se spojkou a toxinovou části nebo reakci toxinové části, která je derivatisována spojkou, s části vázajici se k cilové buňce.

Príslušná část je derivatisována reakci se spojovacím činidlem tak, aby došlo k väzbe spojky k dané části. Vhodné derivatisovaná část vázajici se k cilové buňce reaguje s toxinovou části.

Derivatisovaná část vázajici cílovou buňku nebo derivatisovaná toxinová část múže být pripravená napríklad rozpušténim této části ve vhodném pufru (jako je acetátový, fosfátový nebo borátový tlumivý roztok) a úpravou pH na hodnotu odpovidajici vazebnému činidlu. Vazebné činidlo pak múže být pŕidáno k reakční smési. V pŕípadech, kde je vazebné činidlo nerozpustné v reakční smési, múže být část vázajíci cílové bunky nebo toxinová část, podie toho co je vhodnejší, pŕidána k roztoku vazebného činidla v malém množství organického rozpouštédla jako je dimethylsulfoxid nebo dimethylformamid. Následné po reakci s vazebným činidlem múže být derivatisovaný produkt separován standardními postupy jako je gelová filtrace, dialysa nebo kolonová chromatografie. Derivatisovaný produkt (derivát části vázajíci cílovou bunku nebo derivát toxinové části) pak múže být podroben reakci s druhou části, aby byl ziskán konečný konjugát.

Snahou bude, aby presná povaha vazebného činidla byla zvolená v závislosti na povaze funkčních skupín (napríklad thiolové, karboxy- nebo aminoskupiny), které jsou na části vázajíci se k cílové buňce nebo na toxinové části dostupné pro konjugaci.

Toxinová část múže být pripravená z pŕirodních zdrojú. S výhodou lze toxinovou část pŕipravit pomoci metód génového inženýrství. Tato technika využívá techniky dobre známé tém, kdo máji zkušenost v oboru a zahrnuje postupy pro extrakci mRNA, prípravu knihoven cDNA, konstrukci vektorú, transformaci bunék a kultivaci transformovaných hostitelských bunék, jejichž výsledkem je dosažení exprese toxinového polypeptidu. Vhodnými hostiteli pro expresi požadovaných toxinových části mohou být prokaryota, napríklad E. coli, a eukaryota, napríklad kvasinky. Tyto postupy jsou ilustrovány v niže popsané príprave konjugátu.

Část vázajici cilovou bunku se skládá obecné z protilátky, z fragmentu protilátky nebo derivátu. Výhodné predstavuje protilátku monoklonálni protilátka. Protilátky lze pripravovať dobre známými metódami. Mohou být pŕipravovány ze séra, ze sleziny a z hybridomú vylučujícich protilátky.

Príprava protilátek je napríklad popsána v Methods in Enzymology; Volume 178; Antibodies, Antigens ' '“and Molecular Mimicry, Edited by J. Langone, Academic Press, Inc. (viz. zejména Section II: Engineered Antibodies); a Methods in Enzymology; Volume 73; Immunochemical Techniques Part B; edited by J. Langone and H. Van Vunakis; Academic Press, Inc. (viz. zejména Section I: Production of Antibodies).

Pokud je spojka tvorená skupinou -S-X-CO-, protilátka (nebo toxinová část) múže být derivatisována reakci se sloučeninou vzorce LJI-S-X-CO-L2, kde L-[_ a L₂ jsou zameniteľné skupiny. Napríklad CO-L₂ múže být tvorená skupinou odvozenou od karboxylové kyseliny nebo, s výhodou, od aktivované karboxylové kyseliny. Napríklad skupina CO-L₂ múže obsahovať esterovou nebo anhydridovou skupinu. Zvláštnimi príklady L₂ jsou imidazolová skupina nebo sukcinimidylesterová skupina. L_x múže obsahovať skupinu, která je nahrazena pri oxidaci thioskupiny, napríklad múže obsahovať pyridinovou skupinu. Spojka obecné reaguje s redukovanou thiolovou skupinou na protilátce nebo na toxinové části).

Pokud jsou používány s protilátkou a toxinovou části části (výhodné na toxinové j iné spojky, pak reakce je provádéna v oboru známymi metódami. Obecné spojka reaguje s príslušnými dostupnými funkčními skupinami na části vázající se k cílové buňce a na toxinové části. Část vázající se k cílové buňce a toxinová část mohou být spojený pŕímo vytvorením kovalentniho spojení, napríklad d'isulf idické väzby.

Pokud toxinová část obsahuje sulfhydrylovou skupinu, jako je skupina cysteinového zbytku, múže být tato použitá pri konjugaci. Napríklad ji Ize použit k vytvorení disulfidového mústku se sulfhydrylovou skupinou na části vázající se k cílové buňce nebo na spojce. Tam, kde sulfhydrylová skupina není v toxinové části prítomna,

Ize tuto derivatisovat príslušnou skupinu derivatisace múže takovým zpusobem, aby obsahovala a tak umožnila konjugaci. Taková být napríklad provedena pomoci iminothiolanu.

Pokud jsou použitý polypeptidové spojky, spojka múže reagovať s volnými karboxy- nebo aminoskupinami na toxínu nebo na části vázajíci se k cílové buňce.

Pokud toxinová část obsahuje A-ŕetézec ricinu a spojka obsahuje dvojradikál -COCH₂CH(CH-j )-S-, pak vhodným vazebným činidlem je N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrát. S výhodou lze k príprave takového imunotoxinu použít postup, kdy reaguje derivatisovaná část vázajíci se k cílové buňce s redukovaným ricinem A.

Část vázajíci se k cílové buňce je derivatisována reakcí s vazebným činidlem jako je N-sukcinimidyl-3-(2pyridyldithio)butyrát, a A-ŕetézec ricinu je redukován reakcí s vhodným redukčním činidlem aby došlo k redukci thiolové skupiny na volnou cysteinovou skupinu, napríklad použitím dithiothreitolu.

S výhodou lze použít prebytku vazebného činidla., takže derivatizovaná část vázajíci se k cílové buňce obsahuje více než jednu spojku. Následné po reakci s ricinem. A lze jakékoli vazebné skupiny, které nejsou vázány k ricinu A, zamaskovať reakci s blokující skupinou, napríklad s cysteinem.

Konjugáty, které jsou pŕedmétem pŕedkládaného vynálezu, jsou potenciálne užitečné pri léčení nádoru. Toto lze demonštrovať na schopnosti konjugátú inhibovat syntézu bílkovin v nádorových bunkách in vitro, a/anebo na schopnosti konjugátú redukovať velikost tumoru nebo jej ich rúst in vivo. Deatily príslušných testovacích postupu jsou uvedený níže.

Stručný popis obrázku:Obrázek 1 ilustruje konstrukci pICI 0020;

Obrázek 2 ilustruje konstrukci pTB344;

Obrázek 3 ilustruje konstrukci pICI 0042;

Obrázek 4 ilustruje konstrukci pICI 1079;

Obrázek 5 ilustruje konstrukci pICI 1187;

Obrázek 6 ilustruje SDS gel lyzátu E.coli obarvený Coomassie blue, kde proužek A odpovidá pICI 1102; B je pICI 0020, a C jsou markery molekulové váhy;

Obrázek 7 ilustruje gelový profil pICI 1102 v némž pík R predstavuje ricin A;

Obrázek 8 znázorňuje western blot ricinu A pICI 1102, v némž dráhu 1 predstavuj i markery molekulové váhy; 2 a 3 jsou kmeny neprodukuj lei ricin; 4 je pICI 1102, a 5 je pICI 0020 (kontrolní plasmid se sekvencí non-ricin A);

Obrázek 9 je parciálni sekvence pICI 1102;

Obrázek 10 ilustruje konstrukci pICI 1102;

Obrázek 11 popisuje fragment použitý pri príprave plasmidu;

Obrázek 12 je plasmidová mapa pICI 0042;

Obrázek 13 ilustruje sekvenci terminátoru transkripce;

Obrázek 14 je mapa plasmidu pICI 1079;

Obrázek 15 ilustruje endocytosu ¹²⁵I-C242 bunkami COLO 205;

Obrázek 16 ilustruje in vitro cytotoxicitu imunotoxinu C242/ricin A vuči bunkám COLO 205;

Obrázek 17 zobrazuje protilátku;

Obrázek 18 ilustruje sekvenci cDNA ŕetézce kappa C242, variabilní oblasti (cDNA v plasmidu pKGE761); a

Obrázek 19 ilustruje sekvenci cDNA téžkého ŕetézce C242, variabilní oblasti (cDNA v plasmidu pKGE762);

Vynález bude nyní dokumentován následujícími Príklady, které však predmet vynálezu nikterak neomezují a v nichž, pokud neni uvedeno j inak:- (i) odpaŕování bylo provádéno na rotačnim iodparováku ve vákuu;

(ii) operace byly provádény pri pokojové teploté, tzn. v rozsahu od 18 do 26°C (iii) udávané výtéžky jsou uvádény pouze za účelem lepši predstavy a jejich hodnota tedy neni nezbytné maximem, které by bylo dosažitelné pečlivým vývojem procesu (v) protonová NMR spektra byla béžné stanovována pri 200 MHz v deuterovaném dimethylsulfoxifu použitém jako rozpouštédlo, s využitím tetramethylsilanu jako vnitŕniho štandardu, a jsou vyjádŕena jako chemické posuny (delta hodnoty) v ppm (dilech na milión) vztažených k TMS za použití konvenčních zkratek pro popis hlavních piku (signálu): s, singlet, m, multiplet, t, triplet, br, široký, d, dublet, a (vi) následující zkratky predstavuj í:

BSA - hovézi serový albumín

PBS - fosfátový tlumivý roztok s NaCl

IPTG - isopropylthio-beta-galaktosid

EtOH - ethanol

SDS-PAGE - elektroforézu provádénou v polyakrylamidovém gélu v prítomnosti dodecylsulfátu sodného

PRÍPRAVA IMUNOTOXINU RICIN A/C242

Roztok monoklonální protilátky C242 (200mg) ve fosfátovém pufru (fosfát sodný/150mM chloridu sodného pH 7,2) v koncentraci 4,4 mg/ml byl zakoncentrován membránovou filtraci (s membránou Amicon YM10) na koncentraci 12mg/ml pri 4°C. Koncentrát byl dále zŕedén polovinou objemu borátového pufru (100 mM borát sodný pH 9,1). Koncentrace bilkoviny byla určená méŕením absorbance pri vlnové délce 280 nm a pH smésného roztoku bylo stanoveno na hodnotu 8,8 +/- 0,1.

N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrát (spojka) byl rozpuštén v suchém redestilovaném dimethylformamidu nebo acetonitrilu v koncentraci 10 mg/ml. Alikvot tohoto roztoku (0,325 ml), obsahující 3,25 mg N-sukcinimydyl-3-(2-pyridyl dithio)butyrátu, byl okamžité pŕidán do roztoku koncentrované protilátky. Výsledný roztok byl po zamícháni ponechán štát jednu hodinu pri teploté 20°C. Dále byl roztok aplikován na odsolovaci kolonu (G-25 Sephadex-Pharmacia, o rozmérech 2,6x58 cm, prutokem 2 ml/min, ekvilibrovanou 50 mM roztokem fosfát sodný/150mM chlorid sodný/1 mM EDRA pH 8,0), aby mohl být odstranén pŕebytek činidel a byla provedena zámena pufru derivatisované protilátky. Jiným zpúsobem, který lze použít pro odstránením reakčních produktu je metóda filtrace s pŕíčným tokem. Odsolená derivatisovaná protilátka byla jímána a výsledná koncentrace protilátky byla stanovená méŕením absorbance pri vlnové délce 280 nm. Rozsah derivatisace spojkou byl určen po pŕidání prebytku dithiothreitolu a méŕením uvolňování volných thiopyridylových skupín pri vlnové délce 343 nm. Bylo zjišténo, že rozsah derivatisace predstavuje 4-6 skupín spojky na mol protilátky.

Redukovaný rekombinantni ricin A, redukce byla provedena pusobením dithiothreitolu, který byl pŕidán k roztoku ricinu A ve fosfátovém pufu pH 8,0, byl zakoncentrován metodou filtrace s pŕičným tokem. Prebytky činidel byly odstránený kolonovou chromátografii (G-25 Sephadex - Pharmacia, o rozmérech 2,6x58 cm, s prutokem 2 ml/min, v roztoku obsahujícím 50mM fosfátu sodného/150 mM chloridu sodného/lmM EDTA pH 8,0)

Rekombinantní ricin A byl konjugován s derivatisovanou protilátkou smicháním pripraveného rekombinantniho Ricinu A (190 mg) a derivatisované protilátky (190 mg) v pomeru 1:1 w/w Ricin A/ derivatisované protilátka. Byl pŕidán glycerol aby výsledná koncentrace byla 20% v/v a nádoba byla promývána argonem. Výsledný roztok byl uchováván od 40 do 65 hodin pri 15°C.

V dalším byl pŕidán cystein do výsledné koncentrace 0,2 mM (a v nejméné desetinásobném molárním prebytku oproti vazebným skupinám na protilátce) za účelem zamaskování pŕebytečných vazebných skupín na protilátce. Roztok byl michán a udržován pri teplote 20°C po dobu 2-3 hodin. Následné po zamaskování cysteinem byl vzorek výsledného imunotoxinu analysován po prídavku prebytku dithiothreitolu a pri 343 nm bylo kvantitatívne zhodnoceno ukončení reakce.

Roztok obsahující konjugát byl pote zakoncentrován membránovou filtrací (membrána Amicon YM10 ) a nanesen na chromatografickou kolonu (HR300 Sephacryl - Pharmacia, 2,6 x 50 cm, prútok 3 ml/min, pufr 50 mM fosfát sodný/25 mM chlorid sodný/1 mM EDTA). Výsledkem bylo oddéleni imunotoxinu a nekonjugované protilátky od nekonjugovaného Ricinu A. Pík obsahujicí smés imunotoxinu a protilátky byl shromáždén a koncentrace bilkoviny byla stanovená méŕenim absorbance pri vlnové délce 280 nm.

Vynález bude nyni dokumentován následujicimi Príklady, které však pŕedmét vynálezu nikterak neomezuji, v nichž jsou použitý bežné zkratky, jako je BSA - hovézi serový albumín; PBS - fosfátový tlumivý roztok s NaCl; IPTG

- isopropylthiogalaktosid; EtOH - ethanol; a SDS-PAGE

- elektroforesa v polyakrylamidovém gel,u . (PAGE) s dodecylsulfátem sodným (SDS).

PRÍPRAVA IMUNOTOXINU RICIN A/C242

Roztok monoklonální protilátky C242 (200 mg) ve fosfátovém pufru s NaCl (fosfát sodný/150 mM chlorid sodný pH7,2) o koncentraci 4,4 mg/ml byl zahuštén na 12 mg/'ml membránovou filtraci (membrána Amicon YM10) pri 4°C. Koncentrát byl zŕedén polovinou objemu borátového pufru (100 ml borátu sodného pH9,1). Koncentrace bilkoviny byla stanovená méŕenim absorbance pri 280 nm a pH smésného roztoku bylo stanoveno na 8,8 +/- 0,1.

N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrát (spojka) byl rozpuštén v suchém redestilovaném dimethylformamidu nebo acetonitrilu v koncentraci 10 mg/ml. Alikvotní díl tohoto roztoku (0,352 ml), obsahující 3,52 mg N-sukcinimidyl-3-(2pyridyldithio)butyrátu byl ihned pŕidán ke koncentrovanému roztoku protilátky. Vzniklý roztok byl míchán a potom ponechán štát pri 15°C po dobu jedné hodiny. Roztok byl dále nanesen na odsolovací kolonu (Sephadex G25 - Pharmacia, 2,6 x 58 cm, prutok 2 ml/min, ekvilibrováno roztokem 50 mM fosfátu sodného/150 mM chloridu sodného/l mM EDTA pH8,0) za účelem odstránení pŕebytečných činidel a zámény pufru u derivatisované protilátky. Alternativné mohou být reakční produkty odstránený také filtraci s pŕíčným proudéním. Odsolená derivatisovaná protilátka byla nahromadená a koncentrace bílkoviny stanovená méŕením absorbce pri 280 spojkou byl stanoven pŕidavkem a méŕením množství uvolnéných skupín pri 343 nm. Rozsah jako 4 až 6 skupín spojek na mol nm. Rozsah derivatisace prebytku dithiothreitolu volných thiopyridylových derivatisace byl stanoven protilátky.

Rekombinantni ricin A byl redukován reakci roztoku ricinu A ve fosfátovém pufru pri pH 8 s pŕebytečným dithithreitolem a zakoncentrován filtraci činidla byla odstranéna

G25 - Pharmacia, 2,6 x s pŕíčným proudéním. Pŕebytečná kolonovou chromatografií (Sephadex 58 cm, prutok 2 ml/min, v 50 mM fosfátu sodného/150 mM chloridu sodného/l mM EDTA pH 8,0).

Rekombinantni ricin A byl konjugován s derivatisovanou protilátkou smícháním pripravených roztoku rekombinantního Ricinu A (190 mg) a derivatisované protilátky (190 mg) ve váhovém poméru 1:1 w/w Ricin A/derivatisovaná protilátka. Byl pŕidán glycerol do 20 % objemových (v/v) a nádoba byla promyta argonem. Výsledný roztok byl uchováván pri 15°c po dobu 40 až 65 hodin.

Dále byl pŕidán cystein do konečné koncentrace 0,2 mM (a v nejméné desetinásobném molárnim prebytku nad vazebnými skupinami na protilátce) za účelem zamaskování pŕebytečných vazebných skupin na protilátce. Roztok byl míchán a udržován pri teploté 20°C po dobu 2-3 hodin. Následné po zamaskování cysteinem byl vzorek výsledného imunotoxinu analysován po prídavku prebytku dithiothreitolu a pri 343 nm bylo kvantitatívne zhodnoceno ukončení reakce.

Roztok. obsahující konjugát byl poté membránovou filtrací (membrána Amicon YM10) chromatografickou kolonu (HR300 Sephacryl zakoncentrován a aplikován na Pharmacia, 2,6 x 50 cm, prutok 3 ml/min, pufr 50 mM fosfát sodný/25 mM chlorid sodný/1 mM EDTA). Výsledkem bylo oddélení imunotoxinu a nekonjugované protilátky od nekonjugovaného Ricinu A. Pík obsahující smés imunotoxinu a protilátky byl shromáždén a koncentrace bílkoviny byla stanovená méŕením absorbance pri

280 nm.

U výsledného roztoku obsahujícího jak nekonjugovanou protilátku, tak imunotoxin, bylo upraveno pH na 6,3 pŕídavkem 1 M HC1 a roztok byl aplikován na kolonu obsahující nosič s triazinovým barvivem (Mimetic A6XL, ACL plc, Cambridge, UK., 8 x 26 cm, prutok 1,5 ml/min). Kolona byla promyta 100 ml startovniho pufru, který vymývá nekonjugovanou protilátku, a imunotoxin byl eluován štartovným pufrem s pŕídavkem 0,5 M chloridu sodného. Roztok imunotoxinu byl dialysován proti fosfátovému pufru s NaCl, zfiltrován pŕes filtr s velikostí póru 0,22 mikrónu a uskladnén pri 4°C.

Čistota imunotoxinu byla stanovená elektroforézou v polyakrylamidovém gélu s SDS a bylo zjišténo, že obsahuje celkové 45 mg imunotoxinu o složení: 50-60% derivátu Ricinu A, 10-30% diderivátu Ricinu A, 5-15 % triderivátu Ricinu A a < 10% nederivatisované protilátky.

Alternativné, provedení gelové filtrace (krok pri kterém je odstranén residuálni r-ricin A) a afinitní chromatografie s barvičkou (krok, kdy je odstranéna residuálni protilátka C-242) múže být pŕevedeno a uskutečnéno pri purifikaci. V takovém pŕipadé je konjugační smés ihned po provedení blokování nezreagovaných části spojky pomoci cysteinu, ihned zŕedéna destilovanou vodou, aby výsledná vodivosť roztoku méla hodnotu menší než 5mS. Dále je pomoci IM kyseliny octové upraveno pH na 6,0 a roztok je vyčeŕen membránovou filtrací. Roztok je dále aplikován na kolonu s barevným ligandem (-2,5 konjugační smési. Kolona je 6,0 dokud nedôjde k vymytí z kolony. Imunotoxin z kolony eluovány ve 20mM fosfátovém pufru pri pH 7,0, 0,5 s ohledem na koncentraci chloridu sodného. Tento eluát je dále zahuštén metodou filtrace s pŕičným tokem využívající ultrafiltrační systém se ml gelu/mg r-ricinu A použitého v promývána 0,68% octanem sodným pH nekonjugované protilátky C242 a residuálni r-ricin A mohou být špirálovou patrónou a aplikován na kolonu se Sephacrylem S300HR (2,5 ml gélu na každý mg protilátky použité v púvodni konjugační reakci a v objemu <5%celkového objemu kolony). Kolona múže být ekvilibrována jakýmkoli vhodným tlumivým roztokem jako je napr. fosfátový pufr s NaCl pH 7,2.

PRÍPRAVA SPOJKY

N-sukcinimidyl-(R)-3-(2-pyridyldithio)butyrát, výše používaný, byl pŕipraven následujicim postupem v némž, není-li uvedeno j inak:

(i) odpaŕování bylo provádéno na rotačnim odpaŕováku ve vákuu;

(ii) operace byly provádény pri pokojové teploté, tzn. v rozsahu od 18 do 26°C (iii) udávané výtéžky jsou uvádény pouze za účelem lepši predstavy a jej ich hodnota tedy neni nezbytné maximem, které by bylo dosažitelné pečlivým vývojem procesu (v) protonová NMR spektra byla béžné stanovována pri 200 MHz v deuterovaném dimethylsulfoxifu použitém jako rozpouštédlo, s využitím tetramethylsilanu jako vnitŕního štandardu, a jsou vyjádŕena jako chemické posuny (delta hodnoty) v ppm (dílech na milión) vztažených k TMS za použití konvenčních zkratek pro popis hlavnich piku (signálu): s, singlet, m, multiplet, t, triplet, br, široký, d, dublet, a

N-sukcinimidyl-(R)-3-(2-pyridyldithio)butyrát

N-sukcinimidyl-(R)-3-(2-pyridyldithio)butanová kyselina (90,0g, 0,393 molu) byla rozpustená pri pokojové téploté v dichlormethanu (630 ml) za současného míchání. N-hydroxysukcinimid (45,2 g, 0,393 molu, 1,0 molárni ekvivalenty) byl pŕidán a pŕeveden do smési spláchnutím dichlormethanem (90 ml). Smés byla za současného chlazeni pri -2°C michána po dobu 30 minút. Roztok dicyklohexylkarbodiimidu (81,08 g, 0,393 molu, 1 molárni ekvivalenty) v dichlormethanu (540 ml) byl pŕidáván v prubéhu 35 minút, zatimco reakční teplota byla udržovaná na 0°C +/2°C, a spláchnut do smési dichlormethanem (90 ml). Roztok byl míchán pri teplote 0 - 10°C po dobu 3 hodin a 15 minút a poté nechán ohŕát na pokojovou teplotu. Roztok byl pŕefiltrován, aby se odstránila pevná dicyklohexylmočovina, která byla promyta dichlormethanem (2 x 180 ml). Filtrát byl odpaŕen za sniženého tlaku pri 20 - 22°C až do vzniku hnedého olejovitého zbytku (150 g). Tento olej byl pŕečistén chromatografií na koloné silikagélu Kieselgel 60, 230 - 400 mesh (1180 g) pripraveného ve smési toluen/ethylacetát 80 : 20 v/v. Eluce smési toluen/ethylacetát (80:20 v/v) poskytla po odparení ve vákuu (0,25 mbar) pri 28°C N-sukcinimidyl-(R)-3-( 2-pyridyldithio) butyrát (52 g) ve forme bledé žluté gumy.

NMR:

1.5 (d,3H), 2,85 (m, 4H), 2,8 (dd, 1H), 3,2 (dd, 1H), 3,5 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 7,7 (m, 2H), 8,5 (d, 1H).

Hmotová spektroskopie využívajicí ionisace po srážce s elektronem ukázala, že sloučenina má molekulovou hmotnost

326, s fragmentaci shodnou se strukturou N-sukcinimidyl(R)-3-(2-pyridyldithio)butyrátu.

Výchozí materiál byl pŕipraven následujícim zpusobem:a. (R)-3-HYDROXYBUTANOVÁ KYSELINA

Methyl (R)-3-hydroxybutyrát (1,670 kg, 14,152 mol) byl ochlazen v lázni z ledu a ethanolu. Byla pŕidána voda (4698 ml), a poté 47% W/W hydroxyd sodný (965 ml, 16,98 mol, 1,2 molárních ekvivalentu), a to takovou rýchlostí, aby se teplota udržela na 0°C +/- 2°C. Reakční smés byla michána pri 0°C po další 1 hodinu a 30 minút. Koncentrovaná kyselina chlorovodíková (1490 ml, 16,98 mol, 1,22 molárních ekvivalentu) byla pŕidána k reakční smési v prubéhu 35 minút, zatímco teplota byla udržována na, nebo méné než 5°C, tak aby konečné pH bylo 1,5. Ke smési byl potom pŕidán chlorid sodný (1061 g) a vodná smés byla extrahována methyl-terc. butyletherem (10 x 3,5 1). Extrakty byly spojený a rozpouštédlo bylo odstranéno destilaci ve vákuu pri pokojové teplote za vzniku zbytku. Zbytek byl smíchán .s toluenem (7,5 1), a tékavý materiál byl odstranén destilaci ve vákuu až poskytl (R)-3-hydroxybutanovou kyselinu (1189 g, 81%) ve formé oleje. Tento olej byl ochlazen na teplotu 4°C a po pŕidání krystalizačních jader poskytl pevnou látku.

b. (S)-beta-BUTYROLAKTON (R) -3-hydroxybutanová kyselina (530 g, 5,096 molu) byla smíchána s triethylorthoacetátem (1322,8 g, 1488 ml, 8,154 mol, 1,6 molárních ekvivalentu) pri 25-30°C za vzniku zakaleného roztoku (zákal je pŕipisován prítomnosti zbytkú chloridu sodného z pŕedchozího kroku).

Aby byly odstranény tékavé složky byl roztok za vysokého vakua (1,0 mm) pri 30°C odpaŕován. Zbylá kapalina (1001 g), obsahuj ící (2S,6R)-2-ethoxy-2,6-dimethyl-l,3-dioxan-4-on, byla dvé hodiny zahŕivána pri 80°C a pote ochlazena na 40°C. Surový produkt byl destilován ve sklenené koloné (50 cm x 3,5 cm v prúméru) naplnéné Rashigovými kuličkami, za vzniku (S)-butyrolaktonu (57,3 g), s bodem varu 59-62°C pri 10-12 mbarech.

c. (R)-3-MERKAPTOBUTANOVÁ KYSELINA (S) - -butyrolakton (91,13 g, 1,058 molu) byl za stálého míchání dusíkem ochlazen na 5°C. Pri udržování teploty na 5°C byla pŕidána thioloctová kyselina (80,57 g, 75,65 ml, 1,058 molu, 1,0 molární ekvivalenty). Triethylamin (146,7 ml, 1,058 molu, 1,0 molární ekvivalenty) byl pri udržování reakční teploty na -5°C - +5°C pŕidáván po dobu 45 minút. Po odstránení ochlazovaci lázné vzrostla teplota na 65°C za vzniku žlutooranžového roztoku. Reakční smés byla ochlazena na 10°C a dále míchána preš noc pri pokojové teploté. Roztok byl ochlazen na 0°C a byla pŕidána voda (93 ml). Dále byla smés ochlazena na -10°C a poté byl pŕidáván roztok hydroxidu sodného (185 ml 47% w/w a 92 ml vody), a to takovou rýchlostí, aby se reakční teplota pohybovala v rozmezí od

-10°C do +10°C. Dále byla smés míchána púl hodiny pri -5°C a poté byla ponechána pri pokojové teplote. Smés byla promyta methyl-1,1-dimethylethyletherem (methyl-terc.butyletherem) (265 ml). Vodná vrstva byla zŕedéna vodou (185 ml), ochlazena na 0°C a poté byla pŕidána pri teplote 0-10°C koncentrovaná kyselina chlorovodíková (270 ml) až do dosažení pH roztoku 1-2. Vodná smés byla dále extrahována methyl-terc.butyletherem (2x265 ml). Organické extrakty byly spojený, promyty vodou (265 ml), vysušený bezvodým siranem horečnatým a odparený za sniženého tlaku pri 30°C za vzniku oranžového oleje (132,8 g). Tento olej byl purifikován vákuovou destilaci za vzniku (R)-3-merkaptobut.anové kyseliny (86,6 g), s bodem varu 96-100°C pri 2 mbarech.

d. PYRIDIN-2-SULFENYLCHLORID

2,2 -dipyridyldisulfid (110,0 g 0,5 molu) byl rozpuštén v dichlormethanu (800 ml) pri pokojové teploté za vzniku svétle žlutého roztoku, který byl ochlazen na 0°C. Roztok byl probubláván chlorem pri teploté 0-5°C. Po 3 hodinách a 25 minutách byl roztok chlorem nasycen a jeho barva se zmenila na zlatohnédou. Roztok byl za účelem odstránení chlóru zahuštén pri 0-5°C za sniženého _ tlaku a pyridin-2-sulfenylchlorid byl vysrážen jako žlutá tuhá látka. Tato látka (11,8 g) byla filtraci spojená a promyta dichlormethanem. Filtrát dichlormethanu (1624 g) obsahoval dalších 133 g pyridin-sulfenylchloridu.

e. (R)-3-(2-PYRIDYLDITHIO)BUTANOVÁ KYSELINA

Pyrídin-2-sulfenylchlorid (11,8 g žluté pevné látky a 1035 g roztoku v dichlormethanu výše pripraveného,· 0,667 molu celkové, 1,0 molárnich ekvivalentu) bylo zŕedéno dichlorrnethanem (50 ml). Smés byla pri pokojové teploté michána po dobu 5-10 minút a posléze ochlazena na -5°C. Pri teploté udržované na -5°C - 0°C byl pŕidán roztok (R)-3-merkaptobutanové kyseliny (80,0 g , 0,667 molu) v dichlormethanu (400 ml). Smés byla pŕes noc michána pri pokojové teploté za vzniku hnédého oleje a žluté horní vrstvy. Byla pŕidána voda (485 ml) a smés byla ochlazena na 5°C. Dále byl pŕidáván 2N roztok hydroxidu (385 ml) až do dosažení pH 4,55. Vrstva dichlormethanu byla oddélena a • I zbývajici vodná fáse byla extrahována dichlorrnethanem (200 ml). Extrakty vzniklé po extrakci dichlorrnethanem byly spojený, vysušený bezvodým siranem horečnatým, odpaŕovány za sníženého tlaku za vzniku svétle hnédého oleje. Olej byl prudce zamíchán s hexanem (325 ml) a ochlazen v ledové lázni než se vytvorila pevná byla filtrací sebrána byla promyta hexanem pokojové teploté (R)-3-(2-pyridyldithio)butanové látka. Smés byla michána hnedá kryštalická tuhá (2x162 ve ml), vysušená vákuu hodiny, pak látka, která pŕes za noc pri vzniku kyseliny (140 g).

NMR:

1,45 (d,3H), 2,6 (dd,lH), 2,8 (dd,lH), 3,4 (m,lH), 7,l(m,lH), 7,7(m,2H), 8,5 (m,1H).

PRÍPRAVA PROTILÁTKY C242 (C242:II)

Vytvorení hybridomové bunéčné línie a produk.ce C24 2:II

Príprava suspenze slezinných bunék

Bunečná linie lidských nádorových bunék tlustého streva a konečníku, COLO 205, komerčné dostupná ve sbírce Američan Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., USA, pod číslem CCL 222, béžné kultivovaná v Iscoveho médiu MEM doplnéném 10% telecím zárodečným serem (FCS). bunky byly pred slitím sklizeny, obvykle 2a 3 dny po subkultivaci a trikrát pred imunizaci promyty fosfátovým pufrem s NaCl.

BALB/c myš, 4-6 týdnú stará, byla intraperitoneálné imunizována první dávkou 3xl0⁷ COLO 205 bunék suspendovaných v roztoku 0,lml fosfátového pufru s NaCl. Zvífatum byla potom injikována dalši davka 0,1 ml suspenze obsahujíci 3x10 COLO 205 bunék. Po čtyŕech dnech byla zvíŕata zabita a sleziny z nich byly vyňaty. Sleziny byly dále rozvolnény v jednobunéčnou suspenzi.

Príprava hybridomu

1,2 x 10® bunék sleziny z výše uvedené bunéčné suspense byly rozdelený do dvou zkumavek. Do každé zkumavky bylo navíc pŕidáno 10® myelomových bunék z bunéčné linie myšího myelomu Sp2/0 (dostupného se sbírky Američan Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. , USA, pod číslem CRL 1581). Obé zkumavky byly odstŕedény a veškerá kapalina byla slita. Do každé zkumavky byly dále pomalú pŕidávány 2 ml roztoku PEG o teplote 37°C (10 g PEG M_w 4000, 1 ml DMSO a 10 ml monoklonálového fysiologického roztoku) béhem jedné minutý a za stálého míchání. Zkumavky byly potom pŕemístény do vodní lázné o teploté 37°C na 90 sekúnd za jemného míchání. Fúze byla prerušená pŕidánim fysiologického roztoku pufru do každé zkumavky podie následujícího schematu: 2 ml béhem prvních 30 sekúnd, 6 ml béhem dalších 30 sekúnd a dalších 32 ml v prúbéhu jedné minutý. Po vymytí bunečné suspense kultivačním mediem byly bunky suspendovány v celkem 100 ml kultivačního média doplneného hypoxanthinem/ aminopterinem/thymidinem (HAT). Kultivačním mediem bylo médium dle Iscoveho MEM doplnené o 10% FCS, L-asparagin (36 mg/1), L-arginin-HCl (116 ml/1), kyselinu listovou (10 mg/1), L-glutamin (292,3 mg/1), pyruvát sodný (110,1 mg/1) a merkaptoethanol (3,49 ul/11). Alikvoty o 50 ul byly prenesený do jamek v miskách určených pro tkáňové kultury, z nichž každá obsahovala 96 jamek. Do jamky bylo pŕedem naneseno 250 ul suspense makrofágu z myši BALB/c (2 x 10⁴ bunék/ml) v kultivačním médiu doplnéném HAT. Médium bylo vyménéno 6 dni po fúzi.

Analýza hybridomú produkujicích protilátky

V médiu byla po 6 dnech kultivace, jak je výše uvedeno, sledována prítomnosť positivních COLO 205 protilátek tak, jak je popsáno Kenettem v Enzyme-linked antibody assay with cells attached to plyvinyl chloride plates. Monoclonal Antibodies, Hybridomas, Anew dimension in biological analyses, ed. H.R.Kennett, T.J. McKelvin, K.B. Bechtol, Plénum Press, New York 1980. V krátkosti, bylo do jamek Nunc imunodestiček typu IIF naneseno 2 x 10⁵ bunék /jamku s COLO 205 bunkami (1 mg/100 ml PBS), nanášený objem byl 50 ul.

- 43 Výše uvedené kultivační médium získané po 6 dnech kultivace bylo naneseno do jamek, a to v objemu 50 ul/jamku. Po inkubaci, která trvala celou noc pri pokojové teploté bylo pŕidáno s peroxidasou konjugované myši Ig (Dakopatts P260, Dakopatts A/S, Copenhagen, SNR) rozpušténé (1/500) v 1% BSA-PBS v množství 1-OOug/jamku a nasledovala inkubace preš noc pri pokojové teploté. Substrát ve forme OPD tablet Dáko

S2000 rozpustený v 12 ml citrátového pufru, pH 5,0 s 5 ul 30í peroxidu vodíku byl pŕidán v následujíci inkubaci byla méŕena 450 nni.

Približné bylo testováno objemu 100 ul/jamku a po absorbance pri vlnové délce

600 hybridomových klonu.

Nejdŕive bylo testováno 190 z téch, které reagovaly s COLO 250 bunkami. 177 z nich reagovalo též s obyčejhými lidskými lymfocyty, které byly pripravený pomoci zarízení Lymphoprep z Nyegaardu A/S, Norsko a ty nebyly dále použivány. Kloň získaný z jednoho ze zbylých klonu byl určen jako hybridom C242, který svým isotypem patrí do tŕídy IgGl. C242 hybridom byl dále podroben ŕadé dalších subklonovacich kroku, pomoci nichž byl na konci získán výsledný stabilní kloň označený jako C242:II, produkujíci monoklonální protilátku.

C242 byl nejdŕive klonován za vzniku klonu nazvaném

C242:5. Tento kloň byl obratem dále klonován za vzniku klonu C242:5:2. V prubéhu obou klonovacich postupu byla hybridomová suspenze rozpušténa v kultivačnim médiu doplnéném o smés hypoxanthin/thymidin (HT) tak, aby výsledná hustota byla 4 buňky na ml. 50 ul (0,2 bunék) bylo pŕeneseno do každé jamky v kultivačnich miskách obsahujících 96 jamek do nichž bylo pŕedem naneseno 250 ul Balb/c myší makrofágové suspense v HT

makrofágú visuálné vyménéno kvantitaivního doplnéném médiu (5 x 10³ jednobunéčné klony byly Šestý den bylo médium anylysovány z hlediska vázajících COLO 205 bunky, Elisa testu jak je vyše Nej lepší klony, poskytující ELISA testu po provedení bunkami, byly vybrány a pred zmraženy kapalným dusíkem.

Po 2-5 dnech, mikroskopu, média byly protilátek pri použití na jamku).

detekovány v a alikvoty obsahu avšak nevázající, popsáno, obyčejné lidské bunky.

positivní reakci pri COLO 205 negatívni reakce s obyčejnými dalším použitím byly v nádobkách

Pred provedením tŕetího klonováni byly bunky rozmrazený a kultivovány v médiu DMEM (Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium) (5% FCS). Do jamek kultivačnich destiček s 96 jamkami byly zaočkovány bunky v hustoté 3 bunky na jamku. Klonováni bylo provádéno v DMEM médiu s 5% FCS a myšími makrofágy užívanými jako bunečný dávkovač. Na této destičce se objevilo 30 klonu z nichž 16 bylo nefelometricky testováno na produkci IgG. Specifita protilátek byla určována výše popsaným ELISA testem. 12 z téchto klonú produkovalo IgG. 10 klonu bylo dále rozetŕeno na kultivační destičku obsahujicí 24 jamek a kultivační médium izolované z destičky bylo testováno na produkci a specifitu IgG. Tato selekce byla ukončená získáním klonú s produktivita kultivačnich relatívne vysokou produktivitou. Konečná téchto 4 klonú byla provedena v duplicitních nádobách pro tkáňové kultury. Byl vybrán kloň vyznačujicí se nejvyšší produktivitou, který byl označen jako C242/CL 510 Al. Kloň byl zmražen v kapalném dusíku.

První klonováni klonu C242/CL 510 Al ukázalo, že jedna tretina bunék neprodukuje IgG, což bylo prokázáno méŕením absorbance, jej íž hodnota byla nižší než 0,1 ve zŕedéní 1:1000 pri základnim myším IgG ELISA testu. Pét positivních subklonú bylo spojeno a vytvorilo kloň .nazvaný C242:I. Produktivita tohoto klonu byla určená metodou HPLC a stanovená na 150 ug myšiho IgG na ml.

Kloň C242:I byl následné klonován na destičce obsahujicí 96 jamek s výtéžkem 33 klonú positivních na produkci myšiho IgG. Pét z nich, všechny produkovaly více než 150 ug/ml IgG, bylo spojeno za vzniku klonu, který byl označen jako C242:II a vyznačoval se stabilní produkci IgG. Stanovení HPLC prokázalo, že produkce IgG klonem C242:II je 196 ug myšiho IgG na ml. Bunky byly zmrazený a uchovávaný v nádobách v kapalném dusíku. Vzorek hybridomu C24 2:II byl uložen v ECACC pod číslem 90012601 jak již bylo uvedeno dŕíve.

Produkce C242 monoklonální protilátky

Počáteční bunečná suspenze byla ziskána z výše pripraveného hybridomu ze zmrazené nádoby. Bunky byly zaočkovány do komurek určených pro kultivaci tkáčových kultur o celkové ploše 6000 cm^ z Nunc A/S v hustote 2 x 10⁴ bunék /ml (C242:II hybridomu). Bunky byly dále kultivovány v DMEM médiu modifikovaném podie Iscoveho (Iscove Ň.N. a Melchers F., J.Exp.Med. díl 147, str. 923, 1978) obohaceném 1% gentamycinem, 1% smési aminokyselín a 5% telecím zárodečným sérem. Bunky byly inkubovány 4-5 dní pri 37°C ve zvlhčené atmosfére obsahujici 8% C0₂. Na konci inkubace byly bunky spočítány a monoklonálni dekantován a ve vzorcích byla stanovená koncentrace protilátky. Supernatant po kultivaci byl filtrován pŕes celulosový filtr, aby byly odstránený suspendované bunky.Dále byl supernatant 20-30 krát zahuštén ultrafiltrací na zaŕizení Millipore Pellican Ultrafiltration s použitím filtru s mezi propustnosti pro molekulovou hmotnost 30 000. Vzorek koncentrátu byl analysován z hlediska koncentrace monoklonálni protilátky a reaktivity s antigenem, zatímco koncentrát monoklonálni protilátky byl pred purifikací zmražen pri -70°C.

Purifikace monoklonálni protilátky C242

Protein-A-Sepharosa 4B (Trademark Pharmacia AB Upsala, Švédsko) byla pripravená podie návodu výrobce zahrnující bobtnání a promývání gélu, zatímco vyše pripravený koncentrát C242:II (zde jednoduše označovaná jako protilátka C242) byl na gel navázán s použitím vazebného pufru o složení 1,5 glycin-NaOH, 3M NaCl, pH 8,9. Po počátečnim promytí stejným pufrem byla kolona nesouci afinitní nosič promývána 0,1 M pufrem citrát-NaOH, pH 5,0 a monoklonálni protilátka byla jímána do zkumavek obsahujicích lmol/1 Tris-HCl pufru pH 8,0. Získaná protilátka byla dialyzována proti fosfátovému pufru, s 0,15 M NaCl, pH 7,2, s 0,2 g/l azidu sodného. Po dialýze byla protilátka zahušténa ultrafiltrací s použitím filtru s hranici propustnosti pro molekuloovu hmotnost 30 000. Po zahušténí a kvalitativním stanovení, byla C242 protilátka uchovávána pri -20°C.

4Ί

PRÍPRAVA RICINU A

Ricin A muže být pŕipraven.. . .metódami génového inženýrstvi s použitím DNA sekvenci, které kóduj i ricin A. Tyto sekvence jsou popsány v EP 145,111, O Hare a kol., FEBS Letters, 216, str. 73-78, 1987, a Lord a kol., Eur.J.Biochem, 148, str.265-270, 1985. DNA sekvence kodujici ricin A bude umisténa pod kontrolou príslušných kontrolních sekvenci jako jsou promotor (napr. trp promotor), ribosomální vazebné misto a transkripční terminátor. Príprava a purifikace rekombinantniho ricinu A jsou popsány v PCT patent application WO 85/03508 a European application č.237,676.

V nasledujícim textu je popsána konstrukce rekombinantniho plasmidu do néjž je sekvence kodujici ŕetézec ricinu A vložená pod kontrolou prokaryotického transkripčního a translačního promotorového elementu. Transkripce je ukončená inkorporaci pŕir.oz.eného terminačniho elementu na 3 konci. Začátek translace je pod kontrolou sekvenci DNA na 5 konci sekvence pro ribosomální vazebné misto.

Metoda konstrukce nezbytné vyžaduje .....substi.tuci . dvou N-koncových aminokyselinových zbytku, pŕirozeného, hotového ricinu A.

Dále je popsáno nékolik intermediátnich kroku odvození vektoru použitých pri príprave rekombinantniho ricinu A.

EXPERIMENTÁLNI POSTUPY

1.Syntetické oligonukleotidy

Syntetické oligonukleotidy byly použitý k zavedení špecifických zmén v DNA sekvenci oligonukleotidy dále popsané do génu ricinu A. Všechny byly pripravený pomoci syntetizátoru

Applied

Biosystems

380A

DNA z 5 -dimethoxytrityl basemi chránéných nukleosid-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylfosforoamidu a chránéných nukleosidu navázaných na kontrolní porézni sklenéné nosiče podie návodú dodaných firmou Applied Biosystems Inc. v koncentraci 0,2 mikromolú.

Každý oligonukleotid byl po odštépeni z pevného nosiče a odstranéní ochranných skupín rozpuštén ve vodé (lml) a jeho koncentrace byla stanovená méŕením absorbance pri 260 nm.

2.Enzymy a hostitelské kmeny

V níže popsaných manipulacích byla použitá rada restrikčních endonukleas a enzýmu modifikujicich DNA. Enzymy byly dodány jedním z rady dodavatelu (Amersham International, Bethesda research Laboratorie, Boehringer Mannheim nebo New England Biolabs) a byly použitý podie instrukcí výrobce s ohledem na reakční podminky.

Hostitelské kmeny, které jsou zde uvádény, jsou obecné dostupné z rady zdroju. Napr. E. coli C6000 je volné dostupná z mnohá zdroju včetné sbírek jako je E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA pod číslem GCSC 3004. Genotyp E.coli C6000 je K12 thr-1 leuB6 thi-1 lacYl tonA21 lambda sup E44, E. coli HB101 a DHSalfa jsou dostupné v Bethesda Research Laboratories (BRL), a E.coli TG1 a K19 jsou dostupné v Anglia Biotechnology.

3.Čistení génu (TM)

Souprava obsahujici 1) 6M jodid sodný 2) koncentrovaný roztok chloridu sodného, Tris a EDTA pro prípravu smési chlorid sodný/ethanol/voda, 3) mléčné sklo (TM)- nádoba o objemu 1,5ml obsahujici 1,25 -suspenze kŕemenné matrice ve vodé.

Toto je zpúsob pro čistení DNA založené na postupu popsaném Vogelsteinem a Gillespiem publikované™ v časopise Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1979) díl 76, str.615.

Naproti tomu mohou být použitý všechny metódy popsané v druhém vydáni publikace Molecular Cloning -a laboratory manual, Sambrook, Fritsch a Maniats Cold Spring Harbor Laboratory, 1989(dále označované dále jako Maniatis.

4.Sekvenasa (TM)

Chemicky modifikovaná T7 DNA plymerasa

Založeno na postupu popsaném Taborem a Richardsonem publikovaném v Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1987), dil 84, str.4767-4771

5.Konstrukce pICI expresních vektoru

5.a) pICIOO20

Plasmidový vektor pICI0020 je odvozený od plasmidu pAT153 v némž oblast EcoRI-AccI o velikosti 651 bp je nahrazena fragmentem EcoRI-Clal o velikosti 167 bp obsahující:

1) syntetický E.coli trp promotor a trp vedoucí sekvence pro ribosomální vazebné místo

2) translační iniciační kodon

3) mnohačetné rozpoznávací sekvence pro reštrikční enzymy odvozené z M13mpl8, obsahujícím místa pro KpnI, BamHI, Xbal, Sali, PstI, Sphl, a HindlII

4) syntetickou terminační sekvenci pro transkripci

Sekvence DNA tohoto úseku je uvedená na obrázku 11.

Konstrukce plasmidového vektoru obsahujícího sekvenci syntetického trp promotoru byla publikována Windassem a kol. v Nuc.Acids Res. 10, str' 6639-6657, 1982). Promotorový fragment byl isolován z takového vektoru po štepení enzymy EcoRI a Hpal a purifikaci príslušného proužku z agarosového gélu elektroelucí (viz Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch and Sambrook, vydáno CSH laboratory, druhé vydání 1989).

Byl pŕipraven pár komplementárnich syntetických oligonukleotidú, které by po ligaci na Hpal konci promotorového fragmentu poskytly sekvenci pŕirozeného trp vedoucí sekvence ribosomálního vazebného místa, translační iniciační kodon a 3 KpnI klonovací misto. Tyto oligonukleotidy byly smíchány v ekvimolárním množství a po zahŕátí na 100°C spojený. Následovalo pomalé ochlazování na pokojovou teplotu.

Fragment promotoru a spojené oligonukleotidy byly dále ligovány a príslušný proužek byl isolován ’ z polyakrylamidového gélu elektroelucí. Tento fragment byl dále ligován s odvozeným M13mpl8 vektorem, který obsahoval trp atenuátor (získaný ze synthetických oligonukleotidú) klonovaný do místa pro HindlII a vnásející další Clal reštrikční místo na 3 konec atenuatoru. Ligovaná DNA byla transfektována do kmene E. coli JM109 (Yanisch-Perron a kol,

Gene, 33, str.103, 1985) po vytvorení vhodných podmínek metodou s CaCl₂ (Maniatis, kap.l, str.82). Po rozetŕeni na misky a inkubaci byly vzniklé plaky anylyzovány metodou podie Bentona a Daviese (Maniatis, kap.4, str.41) s použitím ³²P značené nukleotidové sondy získané translací zlomu fragmentu promotoru EcoRI-Hpal, který byl již dŕive izolován.

Jednovláknová DNA štandardní metodou za použití M13 byla pripravená po úspešné hybridizaci (Maniatis, kap.4, str. 29) a sekvenována universálního primeru a Sangerovy dideoxyterminační metódy, což umožňuj í soupravy rady výrobcu napr. Sekvenasa (United States Bioscience).

RF DNA byla pripravená z jednoho isolátu v némž byla prítomna sekvence promotor/ribosomální vazebné místo/atenuátor. Tato DNA byla štepená enzymy EcoRI a Clal a príslušný fragment byl z polyakrylamidového gélu isolován výše popsaným postupem. Plasmid pAT153 byl štépen enzymy EcoRI a Accl a ligován s izolovaným fragmentem promotoru. Ligovaná DNA byla transformována do kompetentnich E. coli HB101 bunék (Boyer, H.W. a Roulland-Dussoix D., 1969, J.Mol.Biol., 44, str.459) (Bethesda Research Laboratories). Po kultivaci byly izolovány kolonie resistentni k ampicilinu.

Byla pripravená plasmidová DNA z nékolika klonú a DNA sekvence z úseku mezi misty EcoRI a Clal. Jeden kloň v némž byla potvrzena pňítomnost správného úseku promotor/atenuátor byl označen jako pICI0020.

Tato konstrukce je znázornénna na obr.l.

3.b) pICI0042 pICI0042 (obr.12) je plasmid, v némž značky pro resistenci k antibiotikum vektoru pAT153 byly nahrazeny jedním, induktivním genem pro resistenci k tetracyklínu z plasmidu RP4 (kodován genem tetA a regulován produktem tetR genu).Tyto gény byly charakterisovány KdLockem a kol. v J.Bacteriol. , 161, str326-332, 1985). Vzhledem k tomu že nový marker (značka) pro resistenci k tetracyklínu je exprimován pouze v prítomnosti tohoto antibiotika, nebude produkt génu tetA potencálním kontaminantem rekombinantního ricinu A v kulturách, kde je plasmid trvalé udržován v neprítomnosti tetracyklínu. Byla inkorporována též sekvence zajišbujíci funkční stabilitu plasmidu (cer).

Počátečni stupeň v príprave tohoto vektoru spočíval v produkci derivátu pAT153, z néhož byl zcela odstranén gen kódující resistenci k tetracyklínu. Byl navržen komplementárni pár syntetických oligonukleotidových sekvencí, s krátkou sekvencí obsahujíci nékolik jednotlivých míst pro reštrikční enzymy využívané v následujicím klonování, které by mély nahradit fragment EcoRI-Aval z pAT153.

DNA plasmidu pAT153 byla štepená enzymy EcoRI a AVal a plasmidová DNA o velikosti 2,175Kbp byla isolována z 0,7% agarosového gélu použitím metódy Čišténí génu (Bio 101, California) podie návodu výrobce. Fragment o. velikosti l,425Kbp obsahující gen pro resistenci k tetracyklínu byl odstranén.

Oligonukleotidy (SEQ ID 13 a 14) byly fosforylovány T4 polynukleotidkinasou a ekvimolární množstvi byla spajena dohromady. Vzorek spojených oligonukleotidu byl ligován s fragmentem plasmidu pocházejícim z pAT153.

Nékolik kolonií bylo vybráno pro prípravu plasmidové DNA v malém méŕítku (metóda Birnboima a Dolyho uvedená v Maniatisoco, kap. 1, str. 25). Požadovaná konstrukce byla identifikována pomoci reštrikční analysy s vhodnými enzymy napr. EcoRI, Aval a BamHI. Štruktúra u 3 isolátu, u nichž bylo zjisténo,že maj í správné uspoŕádání restrikčních míst, byla ovéŕena DNA sekvenačni analýzou s použitím EcoRI mista primeru pBR322 (New England Biolabs). Jeden isolát byl nazván pICI0019.

RP4 plasmidová DNA byla isolována z existujících zásob metodou podie Holmese a Quigleyho (Maniatis, kap 1, str 29). Tato DNA byla zcela rozštépena enzymem BglII a dále částečné Xmal (pri 25°C , 35 minút). Vzorky byly v prúbéhu reakce v rúzných časových bodech odebirány, a to tak dlouho, dokud nebyl jasné identifikován fragment o velikosti 2,45Kbp obsahujici tetR a tetA gény. Vzorek pUC8 DNA (Amersham

I *

International) byl úplné rozštépen enzymy BamHI a Xmal. Aby byla dokončená inserce génu nesoucí vlastnosť, resistence k tetracyklínu do pUC8 byla provedena ligace. Ligovaná DNA byla transformována do bunék E. coli C600 (Appleyard, R.K. Genetics 39, str.440, 1954) po vytvorení vhodných podmínek CaCl₂ (Maniatis, kap. 1, str.82) a byly vybrány kolonie resistentni k tetracyklínu. Plasmidová DNA byla pripravená z 8 klonú (Holmes a Quigley) a prítomnosť RP4 tetR a A génu byla ovéŕena reštrikční analýzou. Jeden z izolátú byl nazván pTB344.

Gény pro resistenci k tetracyklínu byly insertovány do pICI0019 (popsaného výše) nahrazenim EcoRI/PstI fragmentu z pICIOO19 odpovídajícim fragmentem z pTB344. Tato operace méla za následek nahrazení vétsiny génu pro resistenci k ampicilinu v pICI0019 gény nesoucimi schopnosť resistence k tetracyklínu. Po štepení a ligaci plasmidových DNA následovala transformace do bunék E. coli C600 a kolonie byly vybrány na zakladé fenotypového projevu tj. Tc^R a Ap^s. Plasmidová DNA byla pripravená ze 4 klonú a dále byla štépena kombinaci enzýmu napr. BamHI/Pstl/Sstl, EcoRI/Sall, Smal, Stal/Sall a Aval/Pstl. Všechny čtyŕi klony produkovaly reštrikční štruktúry shodné s požadovaným konstruktem. Jeden z nich byl nazván pTB351.

Summers a Sherratt (Celí 36, str.1097-1103, 1984) ukázali, že nestabilita plasmidu odvozených z ColEI (napr. pAT153) je zpúsobena ztrátou 283bp dlouhé sekvence, cer, prítomná v púvodnim plasmidu. Tato sekvence pomáhá zabránit vzniku plasmidových oligomerú, plasmidové delení dosud (SUmmers D. a kol., Mol.

které, jak se uká/alo ' narušuj i nezjišténým zpúsobem. Cer sekvence and Gen. genetics 201, str.334-338,

1985, a Celí, 36, str.1097-1103, 1984) byla izolována z fragmentu klonovaném do pUC18 (pKS492). pKS492 plasmidová DNA byla štépena enzymy BamHI a Taql, aby došlo k uvolnéní fragmentu obsahujícím cer sekvenci. DNA plasmidu pTB351 (isolovaná z Dam^- hostitelských bunék E. coli GM48-Arraj, J.A. a Marinus, M.G., J.Bact. 153, str.562-565, 1983) byla úplné štépena enzymy BamHI a Clal a dále ligována s naštépenou pKS492 DNA. Po transformaci ligované DNA do kompetentních bunék E. coli C600 byly vybrány kolonie resistentni vuči tetracyklínu. K overení prítomnosti sekvence cer byla použitá reštrikční analýza plasmidové DNA pocházející z príslušných kolonii, za použití enzýmu Aval, Mlul a Pvul. Jeden z isolátu se správnou strukturou byl označen pICI0042.

Konstrukce téchto plasmidu je znázornená na obrázcich 2 a 3.

5.c) pICI1079

Plašmidový vektor pICI1079 nese resistenci k ampicilinu, je odvozený od plasmidu pAT153 a mezi EcoRI a Styl restrikčnimi misty obsahuje následujici elementy:

(i) CI857 gen z fágu lambda (ii) lambdaP_L promotor (iii) syntetické ribosomálni vazebné místo.

(iv) synteticky pripravenou sekvenci pro gen interferonu alfa2 ^J (v) synteticky pripravenou transkripční terminačni sekvenci, odvozenou z fágu T4, mezi restrikčnimi misty pro Sali a Styl.DNA sekvence tohoto transkripčniho terminátoru je uvedeno na obrázku 13.

pICI1079 je uveden na obrázku 14.

pICI1079 byl uložen podie Budapešťské dohody z 19. února 1991 do depositu v NCIMB, 23 St. Machaer Drive, Aberdeen, Scotland, plasmidu bylo pŕidéleno NCIMB katalógové číslo 40370.

Plasmid pICI1079 byl použit jako zdroj T4 transkripčniho terminátoru pro vznik expresního klonu pICI1185 ricinu A (viz níže 7d). Startovním bodem pro tvorbu plasmidu pICI1079 byl pICI1043. pICI1043 je plasmid odvozený z pICI0020 (viz 3.a výše) v némž je expresní kazeta obsahující lambdaP_L promotor a gen pro alfa2 interferon (Edge a kol., Nuc.Acids Res . 11, str.6419-6435, 1983) prítomna mezi EcoRI a Sali místy. Transkripčni terminátor z génu 32 bakteriofágu T4 s 5 Sali a 3 Sphl kohesivními konci vznikl po syntéze komplementárního páru oligonukleotidu. Tento fragment byl ligován s fragmentem plasmidu, který byl isolován z pICI1043 po jeho úplném naštépení Sali a Sphl.

Druhý pár komplementárních nukleotidu byl pak dále využit k nahrazeni sekvence trp atenuátoru (a zbývajicí části génu pro resistenci k tetracyklínu) insercí pICI1078 mezi Sphl a STyl místa. Jediné misto pro enzým BamHI bylo využito pro zavedení tohoto syntetického fragmentu.

Tyto manipulace jsou znázornény na obrázku 4.

6. Príprava ricínového expresního klonu

6.a) Príprava DNA plasmidu pUC8RA

Byl pŕipraven kloň (pUC8RA), který obsahoval cDNA pro ricin A. Tento kloň obsahuje, podie publikované cDNA sekvence v plasmidu pUC8, A-ŕetézec cDNA od base s číslem 74 ve vedoucí sekvenci pŕes misto pro enzým BamHI uvnitŕ B-ŕetézce (číslo base 857 ) (Lamb I.F., Roberts L.M.., Lord J.M., Eur.J.Biochem., 148, str. 265-270, 1985) a Vieira J. a Messing J., Gene 19, str. 259, 1982). Dále metodou usmérnéné mutageneze byl vytvoŕen translačni terminační kodón následujicí 3 konec, a tím byl dokončen kodon pro celý ricin

A (viz O Hare M. a kol., FEBS Letts, 216, str. 73-78, 1987). Celý úsek kódující A-ŕetézec je včlenén v BamHI fragmentu, který pocházi z tohoto klonu.

Jak bylo popsáno výše, bylo získáno malé množství pUC8RA plasmidové DNA. Pro ziskáni budoucich zásob byl roztok této DNA použit k transformaci E. coli DH5alfa kompetentních bunék (HanahanD., J.Mol.Biol. 166, str. 557, 1983) a byly vybrány izoláty s resistenci k ampicilinu. Plasmidová DNA z tohoto klonu byla pripravená modifikovaným postupem podie Birnboima-Dolyho (Maniatis, kap. 1, str.25). Vzorky této DNA byly oddélené štépeny enzymy BamHI a Bani a po elektroforeže v agarosovém gélu byly naštépené úseky porovnány s odpovídajícimi štépy puvodni DNA popisované, Lordem a kol. Vzhledem k tomu, že nebyly zjištény žádhé rozdily v reštrikční štruktúre byly oba dva vzorky DNA považovány za identické.

6.b) Sub-klonování do fágu M13

Štépy získané štepením pUC8RA a RF (replikativní forma) DNA Biotechnology) byly ligovány (Maniatis, kap. 1, str.68).

plasmidové DNA pomoci BamHI fágu M13 kmene K19 (Anglian za standardních podmínek Byla provedena též kontrola ligace. Ligované DNA byly transformovaný do bunék E. coli TG1 (Gibson, 1984/Anglian) po vytvorení vhodných podmínek CaCl₂ (Maniatis, kap.l, str 82).

Frekvence transformaci prokázaly dostatečnou ligaci a v potomstvu byla očekávána pŕítomnost rekombinantního fágu.

Pŕedpokládalo se, že rekombinantni fág bude produkovat jasné plaky na médiu IPTG+X-gal (BRL) vzhledem k prerušení lacZ génu (gen pro beta-galaktosidasu). Divoký typ fágu produkuje modré plaky vzhledem k hydrolýze X-gal enzymem beta-galaktosidasou.

Nékolik svetlých jednovláknové DNA. suspenze prokázala, o vhodné velikosti.

plakú bylo odebráno pro prípravu Gelová elektroforéza lysované fágové že jeden fágový kloň obsahuje insert Provedením sekvenace bylo potvrzeno, že tento insert predstavuje sekvenci A-ŕetézce ricinu. Byla prokázána existence pouze 182 baží tvoŕicích sekvenci kódující výsledný ricin A , avšak toto číslo bylo pŕijato jako dostatečný dúkaz prítomnosti úplného génu ricinu A.

Tento kloň byl nazván M13K19RA.

6.c) Mutageneze M13K19RA

K získání KpnI místa kompatibilního s pICI expresními vektory na počátku zrání ricinu A, jsou nezbytné následující zmeny (podtrhnuté) :

SEQ. ID. 15

5¹.....GATAACAACATATTCCCCAAA......3'

......vedoucí sequence ricinu /---zralý ricin A--zménén na :

SEQ. ID. 16

5¹.....GATAACAACATGGTACCCAAA......3' / Kpnl /

iniciace translace a výsledek v ATG kodonu prekrývající Kpnl místo. Kpnl fragment obsahujici ricin A múže být z mutantu vyŕiznut a včlenén do sérií expresního vektoru ICI. Jsou pripravený modifikace dvou N-terminálnich aminokyselín (ile-phe na met-val).

Jednovláknová DNA pripravená z M13K19RA byla templátem pro mutagenesi pro všechny mutační postupy. Byl syntetizován jeden oligonukleotid DTR16, který pri tomto postupu zavádi všechny mutační zmény.

DTR16 (SEQ. ID. 17) 5¹ AACAACATGGTACCCAAACAA 3’

Bylo pospáno nékolik postupú pro zavedení špecifických zmén sekvence DNA pomoci cílené mutagenese.Použitý postup níže uvedený vychází z metódy- popsané Ecksteinem a kol.

(Nuc.Acid.Res.,1985,13,p.8749-8764 a 1986, 14, p. 9679-9698), která využívá kit (Amersham Intrnational) aplikovaný dle instrukci výrobce.

Principem této metódy je príprava jednovláknové DNA s mutagením oligonukleotidem a syntéza komplementárneho ŕetézce se zabudovaným dATPoS misto dATP. Použití tohoto nukleotidu má za následek vznik fosfothiolových vazeb, které nejsou štepený určitými restrikčními endonukleázami (eg.Ncil).

Po syntéze druhéhé ŕetézce, Ncil je používána k štépení rodičovského ŕetézce a pridaná exonukleáza III štépi zadní část mutačního místa. DNA polymeráza I potom umožňuje resyntézu rodičovského ŕetézce. Tedy mutagenní ôligonukleotid púsobí jako templát pro resyntézu a mutace je zavedená do obou ŕetézcú pred transformací. Je požadována 96% frekvence mutací počítáno na celkový počet získaných bunék. Výber je je jednoduše provádén náhodným výbérem plaku pro analýzu sekvencí.

V našich pokusech 4 z 4 vybraných plaku mély žádanou mutaci.

Byl vybrán mutant (MRA16), RF DNA byla pripravená a zkontrolována na pŕitomnost nové vzniklého restrikčního fragmentu KpnI.

6.d) Klonováni, Exprese a Počáteční Charakterizace

Šerie pICI expresních vektoru (viz část 3) múže akceptovať fragmenty DNA klonované do jedinečného KpnI restrikčniho mista, které sousedi s Trp promotorem. KpnI misto pŕekrývá iniciační translačni kodon (ATG), který je umístén 8bp po smeru od Shine-Dalgarnového mista (AGGA) promotoru.

Pro ovéŕeni sekvence MRA16, bylo pripraveno vétší množství ( 5 ug RF DNA) KpnI digestu a dle návodu výrobce byl z vyŕiznutých proužku agarosového gélu (Nu-Sieve GTG agarosa, FMC Bio products) fenolovou extrakcí isolován odpovídající fragment DNA kodujici ricin A.

pICI0020 (viz 3a) byl štépen KpnI a potom defosforylován za použití telecí alkalické fosfatázy (CIP-Boehringer Mennheim). Defosforylace bráni recirkulaci vektoru pri ligaci, což by vedlo k vysokému pomeru rodičovkého genomu v transformovaném potomstvu.

Pro ruzné postupy byly ligace provádény v pomérech, plasmidový vektor : isolovanému fragmentu od 8:1 (w/w)ku 1:3. Byly provádény kontrolní ligace pro overení efektívnosti pôsobení fosfatázy, ligásové aktivity apod. Podminky ligace byly vhodné pro používanou T4 DNA ligasu (New England Biolabs or Amersham). Reakce probíhaly obecné pŕes noc pri 15°C .

Padesát procent ( 5 ul) každé ligačni reakce bylo naredéno na lOOul lxTNE (50 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) a k tomu bylo pŕidáno 200 ul kompetentních bunék E.coli DS410. Po probéhnutí štandardní transformace (Maniatis, kapitola 1, p.

74) byly bunky vyočkovány na L agar se streptomycinem (25 ug/ml) a ampicilinem (100 ug/ml) a inkubovány pŕes noc pri

Ί

37°C.

Po inkubaci byly sledovaný transformované misky. Obecné 5-10 krát více kolonii bylo pozorováno pri ligaci ve srovnání s kontrolami bez ligasy. V nékterých pŕípadech byly malé rozdíly v počtu kolonii produkovaných v prítomnosti nebo v neprítomnosti ligasy, což ukazuje na neúplné štepení vektoru nebo na nízkou aktivitu ligasy.

Pro testování hybridizace ( postup založený na metodé Grunsteina a Hognesse, popsané v Maniatisovi, kap. 1, p.98). byly transformanti a významné kontroly prenesený na nitrocelulosové filtry umísténé na miskách s L agarem. Po inkubaci byly kolonie lysovány in situ za použití 10% .SD.S a IM NaOH, neutralizovány IM Tris (pH 7.5) a sušený 2 hodiny ve vákuu pri 80°C.

Próby pro hybridizaci byly pripravený značením mutačního oligonukleotidu ³²P za použití T4 polynukleotid kinasy. Próba byly nanesená na filtry pri pokojové teplote a potom promyty v láznich pri 55-65°C, aby se pred autoradigrafií odstránilo nešpecifický navázané množství. Špecifická hybridizace indikuje klony obsahující ricin A.

Z pozitívne hybridizovaných klonú byla pripravená DNA v malém množství ( metodou Holmese a QUigley nebo Birnboim-Dolyho, jak je specifikováno v Maniatisovi, kap.l, p.25). DNA byly štépeny odpovídajicimi restrikéními enzymy tj. KpnI a EcoRI/BglII, a analyzovány elektroforesou na agarosových gelech. Vektor DNA a mutovaná RF DNA byly štépeny stejnými enzymy, aby se tím ukázala správná délka fragmentu v klonech.

Príprava plasmidové DNA z každého klonu ve vétším množstvi (Birnboim-Doly) byla použitá pro podrobnejší reštrikční analýzu, tj. Clal, HindlII, BamHI, EcoRI/BglII, KpnI a Scal. Na agarosových gelech, ukazovaly tyto štépy délku vloženého fragmentu, jejich orientaci a množstvi restrikčních míst na génu ricinu A.

6.e) Sledování exprese

Klony s pozitívni hybridizací a restrikčnim výberem byly testovány na expresi ricinu A pomoci SDS-PAGE analýzy úplného lyzátu bunék. Štandardní podmínky pro sledoání exprese byly následujíci :

1) 10 ml L média s antibiotiky bylo inokulováno jednotlivou kolónií a rostlo pŕes noc za mirného tŕepání pri 37°C.

2) 750 ul L-media s pelety bunék bylo odstŕedéno (1 min pri 6 500 rpm).

3) Pelety byly resuspendovány v 300 ul M9 média (Maniatis, apendix A.3) s 0,02% hydrolyzátu kaseinu, 0,2% glukosy a 50 ug/ml thiaminu. Suspenze byla použitá k inokulaci 10 ml stejného média.

4) Inkubace probíhala 7 hod nebo pŕes noc za mírného trepaní pri 37°C.

5) Po inkubaci byla zméŕena optická densita OD pri 540 nm, pelety bunék byly resuspendovány v takovém objemu vzorku Laemmliho pufru, který by odpovídal OD^q 10, vodné suspenze (Maniatis, kap.18,p.53). Po té byla suspenze vaŕena 15 min.

6) 20 ul celkového bunéčného lyzátu bylo naneseno na SDS polyakrylamidový gel, po elektroforeže obarcveno Coomassie modrí, odbarveno a visualizováno.

Z klonu. které byly studovány pomoci SDS-PAGE, pouze 1 vykazoval proužek navic s molekulovou hmotností približné 29KD (ekvivalentní k té co byla stanovená pro neglykosylovaný, zralý ricin A). Prohlídka gélu ukazuje na akumulační hladina se pohybuje v rozmezí od 5-10% celkových bunéčných bílkovin. Plasmid tohoto klonu byl nazván PICI1102.

Konstrukce pICI1102 je ukázán na obr 5. Výsledky sledování exprese jsou ukázány na obr.6 a 7.

6.f) Western prenosy a imunodetekce rekombinantního ricinu A

Autentičnost rekombinantního bilkovinného ŕetézce ricinu A, púvodné pozorovaného po obarvení SDS-poly- akrylamidového gélu Coomassie modri, byla potvrzena Western blotting.

Proužky bílkoviny byly prenesený na nitrocelulosové filtry a degované za použití špecifické protilátky ricinu A, na kterou navazuje peroxidasou značený antiglobulin.

Elektroforéza na 15% SDS-PAGE gelech probíhala pŕes noc pri 8mA a potom byla ekvilibrována alespoň 30 min ve transfer pufru.

Proužky bilkovin na gelech byly potom elektroforeticky prenesený na nitrocelulosové membrány (Hybond-C, Amersham) v Bio-Rad Trans Blot prístroji pri 70 V po dobu 3 hod. Filtry mohou být po usušení a zatavení v plastikových pytlících skladovány pri -20°C.

Ricin Al byla polyklonální protilátka tvorená v králičích proti syntetickému fragmentu peptidu ricinu A. Pŕedchozi štúdie ukazovaly na dobrou afinitu k ricinu A, ale i značné krížové reakce s mnohá proteny E.coli. Aby se odstránilo značné pozadí zpusobené touto krížovou reaktivitou, protilátka byla pre-inkubována s lyzátem bunék E.coli.

Tak, 10 ml kultury E.coli, kmeň DS410, narostlé pŕes noc na L-mediu bylo odstŕedéno pri 4000 rpm po dobu 10 min. Získané pelety bunék byly rsuspendovány v ml bakteriálního pufru a sonikováno pri 4-6 u po dobu 6 xlO sekúnd s 30 sekundovými intrvaly chlazení v ledu.

0,5 ml sonikátu bylo smicháno s 0,5 ml antisera ricinu A.la inkubováno 90 min pri pokojové teplote. Zbytky bunék byly odstredený po 5 min pri 13000 rpm a supernatant byl skladován pri -20°C.

Nitrocelulosové filtry z Western prenosu byly zastavený inkubací v 5% BSA-PBS/Tween pŕes noc pri pokojové teploté. (PBS Tween = 5 ml Tween 20 /11 PBS).

Promyty 3x3 minutý v PBS/Tween.

Inkubovány 2 hodiny (nebo pŕes noc) pri pokojové teploté s 1/4000 ŕedénim zastavené protilátky k ricinu A.l v 0,5% BSA-PBS/Tween.

Promyty 3x3 minutý v PBS/Tween.

Inkubovány 1 hodinu s 1/1000 ŕedénim koziho proti králičím antiserem v 0,5% BSA-PBS/Tween pri pokojové teploté.

Promyty 3x3 minutý v PBS/Tween.

Inkubovány 1 hodinu s 1/5000 ŕedénim králičí peroxidasy

anti-peroxidasovým	antiserem	v	0,5%	BSA/PBS/Tween	pri
pokojové teploté.
Promyty 3x3 minutý	PBS/Tween.
Vyvíjeny imerzí v	roztoku 4	-chlornaftolu (60mg) v	20	ml
methanolu doplneného	• na 120	ml	PBS	a obsahujiciho	12	ug
peroxidu vodíku. Membrána byla	vyndána	z roztoku hned	jak	se

objevily proužky, usušená a fotografována.

Typická Western blot analýza je ukázána na obr.8.

6.g) Biologické stanovení rekombinantního proteínu ricinu A

Úkolem bylo vyvinout experimentálni systém na testování r-ricinu A na biologickou aktivitu v bezbunéčném in vitro stanovení syntézy bílkovin.

Lysáty králičích retikulocytu byly pripravený dle metódy Allena a Schweeta (J.Biol.Chem. (1962), 27, 760-767).

Stanovení demonštruje inhibici proteosyntézy v bezbunéčném systému nedostatečnou inkorporací leucinem-^^C do nové se syntetizující bílkoviny.

6.g.i) Popis stanovení

Yásobní roztok : 1 mM smés aminokyselín bez leucinu.

Roztok obsahující všechny L-aminokyseliny v 1 mM koncentraci kromé leucinu (pH upravené na 7,4 pomoci NaOH a uchováván pri -70°C).

Roztok A: 40 mM octan hoŕečnatý, 2 M octan amónny, 0,2 M Tris (pH 7,4 upravené HC1, skladován pri 4°C).

Roztok B: ATP (Sigma A5394) 246 mg/ml, GTP (Sigma G8752)

24,4 mg/ml.

Smés pro stanovení : 1 ml smési aminokyselín, 1 ml roztoku A, 0,1 ml roztoku B, 103 mg kreatinfosfátu, 1 mg kreatinkinasy, 510 ul H₂O, 600 ul (60uCi)L-¹^C-leucin (New England Nuclear, NEC-279E).

Reakční smés : vzorek 25 ul, smés pro stanovení 12,5 ul, lyzát králičích retikulocytu 25 ul.

Slepý pokus byl 2 mg/ml BSA v PBS.

Všechny pokusy byly provádény paralelné.

12,5 ul smési pro stanovení bylo napipetováno do sklenéných zkumavek ul BSA v PSB bylo pŕidáno do čtyŕech prvních zkumavek jako slepý pokus ul vzorku bylo pŕidáno do zbylých zkumavek ml 0,1 M KOH bylo pŕidáno do prvních dvou zkumavek (pozadí slepého pokusu)

Zkumavky byly temperovány na 28°C ve vodní lázni ul lyzátu králičích retikulocytú (ponechán roztát z teploty kapalného dusíku) bylo pŕidáno do každé zkumavky ve 20 vteŕinových intervalech. Když prvni zkumavka byla inkubována 12 minút, 1 ml 0,1 M KOH bylo pŕidáno do každé zkumavky opét v 20 vteŕinových intervalech, tak aby všechny zkumavky byly inkubovány 12 minút. Do každé zkumavky byly pridaný dve kapky peroxidu vodíku nasledované 1 ml 20% TCA.

Obsah zkumavek byl promíchán a zkumavky byly ponechány alespoň hodinu nebo pŕes noc, pri 4°C. sraženiny byly odfiltrovány na 2,5 cm GFS filtrech, promyty 3 x 4 ml 5% TCA, prenesený do scintilačních ampulek, do kterých bylo pŕidáno 10 ml scintilačního roztoku (Ready-Solv. MP, Beckman). Po 1 hodiné byly ampulky protŕepány a proméŕeny.

ô.g.ii) Návod techniky pro použití lyzátu E.coli ml kultury v L-mediu rostlo pŕes noc pri 37°C. Pro získání peletú bylo 400 ul alikvotních podílú odstŕedéno pri 13000 rpm po dobu 30 vteŕin a vétšina supernatantu byla dekantována.

Pelety byly podrobený dvakrát se opakujícímu rychlému zmrazení smési suchého ledu a EtOH následované tánim pri 37°C. K peletum bylo postupné pŕidáno 12 ul 25% sacharosy v 50 mM Tris HC1 pH 8,0 a 4 ul roztoku lysozymu o koncentraci 10 mg/ml.

Po 15 minútové inkubaci v ledu, bylo pŕidáno 8 ul 0,25 M EDTA a inkubace pokračovala dalších 15 minút. Lysé byla zpusobena osmoticky naŕedénim roztoku na 400 ul vodou.Timto -postupem bylo ziskáno 80-100 životaschopných bunék na 1 ml.

Když 25 ul alikvotu tohoto lyzátu bylo pŕidáno ke smési pro stanovení, hladina inkorporace ¹⁴C-leucinu do nové syntetizované bílkoviny byla 10% vzhledem ke slepému pokusu bez lyzátu. To byla obdobná hladina inhibice jaka byla zpusobena 8 ng/ml ricinu A. Potom byly pripravený ŕedéní lyzátu E.coli a stanovení bylo opakováno. Výsledky jasné ukazovaly, že je nutné minimálné 16 -ti násobné ŕedéní, aby byl eliminován vliv lyzátu na slepý pokus.

Aby bylo co nejduvéryhodnéji potvrzeno, že lysé a lyzáty E.coli nevyrovnávají toxicitu ricinu A, bylo nutno udélat dvé kontrolní stanovení. Nejdŕive byl pŕidán ricin A získaný z rostlin, k 16 X ŕedéným bunečným peletum E.coli, tak aby konečná koncentrace ve smési pro stanovení po lysy bunék byla 8 ng/ml.

Obé tyto kontroly potvrdily, že ani lyzáty ani samotný postup lýze bunék nemá nežádouci vliv na inhibiční účinek ricinu A.

Tyto techniky byly použitý k ovéŕeni syntézy biologicky aktivního, rekombinantního ricinu A z pICI1102 a klonu popsaných níže.

6.h) Sekvenování DNA

Sekvenování plasmidové Vybraný postup je modifikací Analysis Techniques Vol 2, denaturaci k analýze pICI1102.

DNA bylo použito

Zagurskéhp a kol. (gene a zahrnuje alkalickou DNA predražené zahŕátí metódami, které jsou ruznými výrobci napr.

Bioscience). Použitím 3 konce beta-iakatamázy A-ŕetézce, sekvenování obou postupu Techniques Vol 2, No 5) dvouŕetézcové plasmidové sekvenování standardnimi ve formé kitú, dodávaných

States priméru z priméru génu a génu ricinu A je umožnéno.

primeru a provádény Sequenasa oligonukleotidu a nékolika ŕetézcú promotorového (United j ako vnitŕních

Počáteční údaje sekvenování ukázaly nepŕedpokládané výsledky, a to, že dodatečný KpnI fragment byl prítomen mezi promotorem a sekvencí kódující ricin A, t.j. (SEQ. ID. NO 20) :

x

KpnI

5' AAAAAGGGTATCGACATGGTACCCGGGGATCCACCTCAGGGTGG

KpnI

TCTTTCACATTAGAGGATAACAACATGGTACCCAAACAATAC 3'

Dodatečný fragment KpnI pochází z M13K19RA a obsahuje reštrikční místa a část vedoucí sekvence ricinu klonované z pUC8RA. 5 konec ricínového A ŕetézce obsahuje zmeny baží indukované béhem mutagenese.

Studium této sekvence ukazuje , že první iniciační kodon translace (ATG) je mimo rámec, ve kterém je oblast kóduj ící ricin A.

Tedy, je zde in-frame terminační kodon (TAG) pŕedcházející iniciačnímu kodonu ricinu A a údajná Shine-Dalgarnova sekvence (AGGA), které mohou re-iniciovat translaci z druhého ATG.

Ďalší štúdie ukázaly, kupodivu, že dodatečný fragment DNA dává prospešnou výhodu s ohledem na hladinu akumulace ŕetézce

ricinu A vyŕíznut.	v E.coli,	ve srovnáni s	klony, ze	kterých byl
Kompletní	sekvence	DNA ricínového	A génu	obsaženého
v pICI1102	je dána na	obr.9 (SEQ. ID. NO	18) .

7. Príprava následujícich ricin A expresivnich klonú

7.a) Mutace ricin A klonu pICI1102 umožňujicí subklonování

Subklonováni dvou KpnI fragmentú z náhodné vzniklého pICI1102 ve správné orientaci pro expresi ricinu A je obtížné. Tedy jsme plánovaly zménit vnitŕní KpnI 'rozpoznávací místosubstitucí jedné báze (A na T). To by zabránilo uvolnéni KpnI z tohoto místa a umožnilo by to subklonováni jednoho KpnI fragmentu do oblasti pICI expresnich vektoru. Substitucí adeninu v KpnI rozpoznávacím místé (GGTACC) za thymin (tj. GGTTCC) se nemení první zbytek ricinu A (GTA/GTT = Val).

t j . :
K^nl	53bp fragment KpnI sekvence ricinu A 1	KpnI
GGTACC	“ 1 ATGGTACC TGA	GGTACC

I

Zmenená na :

»

KpnI 53bp fragment sekvence ricinu A KpnI

GGTACC ATGGTTCC TGA GGTACC ⁴ I nerozeznatelná KpnI oligonukleotidová syntéza dávající tgto zmény má sekvenci (SEQ. ID. NO 19):

5' ATAACAACATGGTT_CCCAAACAATAC3'

Kde podtržená báze predstavuje mutační zménu.

Pro srovnávací studium exorese jsme plánovali klonování zmutovaného fragmentu ricinu-A do oblasti trp expresních vektoru. Klonování do pICI10020 a srovnání s pICI 1102 dává možnost stanovit vlivu substituce jedné báze, jestliže existuje, na expresi.

7.b) Mutagenese » Templátem pro mutagenesi byl MRA16 , který je M13 klonem obsahujícím dva KpnI fragmenty prítomné v pICI1102. Po · mutagenesi, isoláty nesoucí žádanu mutaci byly identifikovaný náhodným testovaním vzorku a stanovením DNA sekvence v celé oblasti, na kterou se špecificky váže mutagenni oligonukleotid.

Jeden ze zmutovaných templátu byl pojmenován dále analyzován stanovením DNA sekvenci kódující ricin-A na overení neprítomnosti mutaci.

MRA22. Ten byl celé sekvence ňespecif ických

7.c) Subklonování

Zmutované, jednoretézcové DNA byly prenesený do kompetentních bunék E.coli TG1, za účelem produkce jednotlivých plakú.

jednotlivé plaky byly potomodebrány a replikativní forma DNA (RF, dvouŕetézcová) byla purifikována navázáním na cesium chlorid/ethidium bromidový hustotní gradient. Pro doplnéní údaju byla purifikovaná RF DNA štépena provádéno shotgun ligacínaštépené expresnim vektorem štepeným KpnI a

KpnI. Klonování bylo RF DNA s vhodným fosfatásovaným nebo špecifickou ligací fragmentu ricinu Apo jeho purufikaci z agarosového gélu. Ligovaná DNA byla prenesená do E.coli

TG1 nebo HB101.

Klony obsahujici ricin-A byly identifikovány hybridizací za použití značené próby ricinu-A ³²P pripravená pomoci náhodného hexanukleotidového primeru pro Kpnl fragment isolovaného z jiného klonu obsahujícího ricin--A (pICI 1121). kolonie vykazující pozitívni hybridizacibyly dále testovány reštrikční analýzou plasmidové DNA za použití jednoduchých štepu Kpnl a dvojitých štepil Eco/RI/BglII.Kpnl určuje délku fragmentu a EcoRI/BglII stanovuje orientaci fragmentu.

Klony, u kterých bylo zjišténo, že obsahuj í fragment ricinu-A ve správné orientaci pro expresi, byly analyzovány SDS-PAGE elektroforezou následovanou barvením Coomassie modrí a Western blotting duplikovaných gelú. Hledina akumulace ricinu A v téchto klonech byla ekvivalentntni té, která byla detegována u pICI1102.

Jeden isolát byl vybrán a plasmid byl pojmenován pICI 1131.

7.d) Použití alternativního prepisu terminátorového elementu

Prepis terminátorového elementudává sekundárni strukturu na 3 konci mRNA, která je zapojená do zastavení aktivity RNA polymerasy.

Stabilita této sekundárni štruktúry múže zlepsit akumulaci bílkovin tím ,že chráni mRNA od exonukleasové aktivity na 3 konci. T₄ terminátor transkripce je doporučen pro svou silnou a trpA terminatorem transkripce. vyŕíznut z agarosového gélu (2% Bioproducts) a čištén fenolovou a následovanou ethanolovým srážením k detekci v pŕedcházejicích pokusech. byly vybrány pro prípravu reštrikční analýzou s EcoRI a fragmentú vhodné délky.

DNA

Jeden isolát se správnou sekundárni strukturu než že slouži trp atenuátoru prítomnám ve všech pŕedcházejicích ricin-A konstruktech.

V téchto pokusech. trp promotor a fragment ricinu-A z pICI1131 byl vyŕíznut štepením enzymy EcoRI a Sali. Druhý enzým štéoi väzbu mezi 3 koncern sekvence kódujíci ricin-A Získaný fragment byl NuSieve GTG agarose,FMC chloroformovou extrakcí, Vyčišténý. fragment byl ligován se štepy pICI 1079 získané po štepení s EcoRI a Sali. Jmenovaný plasmid obsahuje T₄ terminátor mezi jedinými Sali a Sphl místy (viz 5c).

Ligovaná DNA byla prenesená do kompetentnich bunék

E.colíHBlOl (BRL) a hybridizační screening používaný ricinu-A byl stejný jako Pozitivné -hybridizované ·kmeny plasmidové DNA s následujicí Sali, aby se ukázala pŕítomnost strukturou byl identifikován a nazván pICI1185.

7.e) Použití alternativního pozadí plasmidu

Plasmid pICI1185 byl použit pro prípravu dalšího konstruktu

- 78 subklonováním souboru expresních genú do pICI 0042. Plasmidová DNA byla pripravená z pICI1185 a štepená EcoRI a Sphl současné , aby byl vyŕiznut soubor expresních genú obsahujici trp promotor /RBSl/fragment ricinu-A (MRA22(/T₄ terminátor. Tento fragment byl isolován metodou popsanou v bodu 4.d a ligován s pICI 0042 štepený EcoRI a Sphl.

Ligovaná ĎNA byla prenesená do bunék E.coli HB101 a inkubována pŕes noc pri 37°C. Transformované bunky HB101 byly vyočkovány na L agars tetracyklinema kolonie byly vybrány hybridizací s DNA probou ricinu-A značenou ³²P.

V obou pŕípadech, pzitivní kolonie byly overený reštrikční analýzou plasmidové DNA za použití EcoRI/Sphl a EcoR.I/BglII štepení. Tri isoláty byly určený t.j. pICI1187.1-3.

Obr.10 ukazuje konstrukci pICI1185 a pICI1187.

7.f) Výbér klonú

Isolované plasmidy byly prenesený - do......E.coli - · 71.18 (Gronenborn,B., 1976, Mol.Gen.Genet. 148, 243-250) a jednotlivé kolonie byly vybrány ke studiu selekce klonú. Získané lyzáty celých bunék byly podrobený elektroforeže na dvou SDS-PAGE gelech, jeden z nich byl barven Coomassie modrí a druhý použit pro Western blot analýzu.

Obarvený gel poskytoval minimálni údaje o expresi ricinu-A, což bylo zpúsobeno prítomností co-migrující bilkoviny z E.coli 71.18. Western blotting jasné ukazoval expresi ricinu-A ve srovnání s pozitivními a negativními kontrolními vzorky. Jeden isolát byl poskytnúť Fermentation research Group pro prípravu ve provozním méŕítku.

Fermentace r-Ricinu A (a) Plasmid pICI 1187 byl transformován do kmene E.coli DS410 (také uvádén jakop MSD68) a výsledný rekombinant (MSD1051)byl pŕečištén a uchováván v glycerolu pri -80°C.

Pro získání jednotlivých kolonií byla část uchovávané kultury rozetŕena na agarové misky s . tetracyklinem a ponechána kultivovať pŕes noc pri 37°C. Jednotlivé kolónie MSD 1051 byly resuspendovány v 10 ml L-media s tetracyklinem a 100 ul bylo hned použito k zaočkování 10 250 Erlemayerových banék obsahujicích 75 ml L-media s tetracyklinem. Po 16ti hodinovém rústu pri 37°C na reciproké tŕepačce byl obsah banék spojen a použiť pro inokulaci fermentoru obsahujícího 201 modifikovaného LCM50 rústového média následujiciho složení :

rozpušténo v destilované H₂O g/i kh₂po₄

Na₂HPO₄

NaCl hydrolyzát kaseinu (Oxoid L41) (nh₄)₂so₄

3,0

6,0

0,5

2,0 kvasničný extrakt glycerol

MgS0₄ . 7H₂O

CaCl₂ · 2H₂O thiamin

FeSO₄/kys.citrónová roztok stopových prvku (TES)

20,0

35,0

0,5

0,03

0,008

0,04/0,02

0,5 ml/1

Fermentace probihala pri teplote 37°C a pH bylo automaticky udržována na hodnote 6,7 pŕídavkem 6 M roztoku hydroxidu sodného. Obsah rozpusteného kyslíku (dOT) byl automaticky udržován na 50% vzdušného nasycení úpravou rýchlosti míchání fermentace. Vzušnéni ve fermentoru , púvodné 201/min., odpovídajíci 1 objemu na objem za minutu (WM), bylo zvýšeno na 45 1/min., když rychlost míchání ve fermentoru dosáhla 80-90% jejího maxima.

Béhem fermentace byly odebírány vzorky na zjišténí optické density í°^D550>' bunečné sušiny a akumulace ricinu-A v bunkách. Akumulace ricinu-A byla zjišťována elektroforézou lyzátu celých bunék baktérií na SDS-PAGE gelech obarvených Coomassie modrí.

4,5 hodin po inokulaci, byl do fermentoru pŕidáván roztok kvasničného extraktu (Difco) (225 g/l) rýchlostí 1,7 g/l/h.

Po 12 hodinách, když OD₅₅₀ dosáhlo približné 50, a když baktérie rust baktérií začínal být limitován kyslike, byly baktérie odstŕedény na Sorval RC3B odstŕedivce (7 000 g, 30 min, 4°C) a bilkovina nahromadená v bunkách byla získána.

(b) Plasmid pICI 1187 byl pŕenesen do E.coli kmeň DS410 ( zde také uvádén jako MSD68) a vzniklý rekombinant(MSD 1051) byl pŕečištén a uchováván v glycerolu pri -80°C.

Alikvotní část kultury (100 ul) byla použitá pro inokulaci 2 litrové Erlenmayerovy banky obsahující 600 ml L-media s tetracyklinem. Po 16ti hodinovém na reciproké tŕepačce pri 37°C, byl obsah banky použit pro iokulaci fermentoru obsahujícího rústové médium následujícího složení :

Složka rozpustená v destilované H₂0 (g/1)

kh2po4	3,0
Na2HPO4	6,0
NaCl	0,5
hydrolyzát kaseinu (Oxoid L41)	2,0
(nh4)2so4	10,0
kvasničný extrakt(Difco)	20,0
glycerol	35,0
MgSO4 .7H20	0,5
CaCl2 .2H20	0,03
thiamin	0,008
FeSO4/kys.citrónová	0,04/0,02
roztok stopových prvku	(0,5 ml/1)

tetracyklín (10 mg/1)

Fermentace probíhala pri teploté 37°C, pH bylo 10 hodin po inokulaci automaticky udržováno na hodnoté 6,7, pomoci 2M kyseliny sírové a 6M hydroxidu sodného, a potom na hodnoté 6,0.

Obsah rozpušténého kyslíku (dOT) byl nastaven na 50% vzdušného nasycení a automaticky udržován na této hodnoté úpravou rýchlosti míchání fermentoru. Vzdušnéní ve fermentoru bylo púvodné 201/min, odpovídajici 1 objemuna objem za minutu(WM) a bylo ručné zvýšeno na 451/minutu tehdy, když rychlost míchání fermentoru dosáhla maxima (1-000 otáček za minutu). Vzdušnéní fermentoru bylo ručné sníženo zpét na 201/minutu bezprostredné poté, když byla rychlost míchání automaticky snižena na približné 500 otáček za minutu. Fermentace probíhala 23 hodin a béhem této doby byly odebirány vzorky na stanovení optické density (°^D55o) bunečné sušiny, akumulace a rozddéleni ricinu

A v bakteriálních bunkách. Akumulace ricinu-A byla sledována po elektroforéze lyzátu celých bunék baktérii na SDS-PAGE gelech po obarvení Coomassie modrí. Rozdelení ricinu A v cytoplasmé (rozpustný) a ve formé nerozpustných inkluzí v buňce bylo stanoveno po sonikaci vzorku baktérii.

4,5 hodin po inokulaci byl do fermentoru pŕidáván vzorek kvasničného extraktu (225g/l) rýchlosti 1,7 g/l/h.

Když byl pri fermentaci vyčerpán zdroj uhlíku (vedouci k rychlému zvýšení dOT pri 50% vzdušnéni) byl pŕidáván do fermentoru glycero (714 g/1) a síran amonný (143 g/1) v rýchlosti, která zajišéovala maximálni nároky baktérií na uhlík. Rychlost prítoku živín (zdroje uhlíku a síranu amonného) zústala nezmenená až do ukončení fermentace.'

Po 23 hodinách fermentace dosáhlo množsti ricinu A približné 1500 mg rozpustného ricinu A na litr fermentačniho média.

POZNÁMKY :

1. E.coli DS410 (také zde uvádén jako MSD68) je dobre znám (Dougan a Sherratt, Molecular and Generál Genetics, Vol.151, p. 151-160, 1977). Tento kmeň volné dostupný pro veňejnost, a navíc byl aplikanty deponován ·7. června

1985, podie Budapešťstké dohody do sbírky National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd, Aberdeen,' Scotland' pod číslem 12100.

2. Roztok stopových prvku (TES)

TES má následující složeni :

mg/lOml (deionizované vody)

A1C13.6H2O	2,0
CoC12.6H20	0,8
KCr(SO4)2.12H2O	0,2
CuC12.2H2O	0,2
h3bo3	0,1

KI	2,0
MnSO4.H2O	2,0
NÍSO4.6H2O	0,09
Na2Mo04.2H2O	0,4
ZnSO4.7H2O	0,4

Purifikace r-ricinu z E.coli

Za optimálních podminek fermentace se r-ricin A hromadil jako cytoplasmatická rozpustná bílkovina. Tato bílkovina byla zísávána porozbití bunék (homogenizací) v pufru, který podporoval stabilitu r-ricinu A. Tato operace byla provedena na živých odstredených bunkách, aby byla zajišténa stabilita produktu v roztoku. r-Ricin A byl získán z homogenátu odstránením pevných části(zbytky bunék) odstŕedénim. Aby tato procedúra mohla bát provádéna ve velkém, zbytky byly flokulovány pomoci polyethylen .iminu, který také srážel pŕevážnou část nukleových kyselin obsažených v extraktu. Odstredený supernatant byl poté sterilné filtrován, zakoncentrován cross flow filtrací a bílkovina byla vysrážena siranem amonným. Síranová sraženina byla uchovávána ve zmrzlém stavu pri -70°C.

r-Ricin A má isoelektrický bod rozdílná hodnota, ve srovnání s

7,3, což je dostatečné ostatními bílkovinami

E.coli.

Produkt múže být tedy bežné čištén iontovou chromatografií. Všechny postupy uvolnéní a produktu a jeho prečistení (chromatografie)byly provádény za podminek zajištujícich stabilitu r-ricinu A:teplota < 15°C, prítomnosť dithiotreitolu, zajišťující volný thiol v redukpvaném stavu a EDTA pro redukci vzdušné oxidace a proteolýzy.

Získávání r-Ricinu A

Bunky byly odseparovány z fermentačniho média pomoci kontinuálniho diskového nahromad'ovacího periodického prútočného separátoru. Médium (501 z 2 x 251 fermentaci) bylo pŕeneseno z fermentorú do 50 1 širokého tanku a pŕevedeno do systému obsahujícího nékolik skladovacích tanku, pripojených k separátoru a vysokotlakému homogenizátoru.

Skladovací tank byl pripoj en k systému a médium bylo hnáno pŕes odstredivku rýchlosti byla upravená tak, aby odstŕedéný čistý pŕes sklíčko v prútočné ŕadé

401/h. Prútočná rýchlosť supernatant byl visuálné .Pevný zbytek (bunky) ze separátoru byly sebrány do vhodných nádob a byla resuspendovány ve 401 pufru A (50 mM dihydrogen ortofosfátu sodného,, 25 mM EDTA, 5 mM benzimidinu, 2 . mM dithiotreitolu, pH 6,3 s 5 N hydroxydem sodným) a pŕedchlazeny na 8°C v pevných nádobách. Suspendované bunky byly potom prenesený zpét do širokých tanku pŕes homogenizátor s pracovním tlakem nastaveným na 600 barru. Vznikající homogenát (601) byl zchlazen na teplotu < 20°C a byl pŕipraven 0,5% s ohledem na polyethylenimin pŕídavkem 2,51 10% (v/v) roztoku. Suspenze byla ponechána po 10 min flokulovat a prenesená do skladovacích tanku preš odstredivku- separátor. Čistý supernatant byl nahromadén a sterilizován čistením pŕes hloubkový filtr a membránový filtr 0,2 u s pozitivním náboj em.

Sráženi siranem amonným

Sterilní prečistený supernatant byl zakoncentrován na objem 121 za použití prutočného filtračního zaŕizeni se špirálovou kolonou a k roztoku byl pŕidán pevný kryštalický síran amonný do 40% nasycení tj. 2,9 kg. Vysrážení roztoku probíhalo pŕes noc za mírného mícháni pri 15°C a po té byla sraženina odstredená. Kašovitá vrstva byla nahromadéna a uchovávána pri -70°C do doby dalšiho zpracováhí.

Rozpoušténí a odsolováni

Síranová sraženina po roztátí v prítomnosti 141 pufru B (50 mM dihydrogen orthofosfátu sodného), 25 mM EDTA, 2 mM dithiotreitolu, pH 6,3 s 5 N hydroxidu sodného). Po 30 minutách byla suspenze čišténa odstŕedéním ..a odsolována dialýzou proti 70 1 pufru B , kdy sledovaná vodivost klesla pod hodnotu 3mS/cm. Odsolený roztok byl čištén dalšim odstŕedéním a byl zpracován okamžité.

Ionexová chromatogarfie (Anex)

Odsolený roztok byl pomalú pŕidáván do vsádkového chromatografického tanku, obsahujíciho 2 kg DEAE- celulosy, který byl ekvilibrován 601 pufru B. Po 6-ti hodinovém míchání byl roztok nenavázaného r-ricinu A pumpován ze dna tanku pŕes kolonu o rozmérech 11,3 cm prúméru x 10 cm, naplnéné ekvilibrovanou DEAE- celulosou pri rýchlosti prutoku 80ml/min. Pŕevážná část r-ricinu A se nenavázala a byla nahromadéna v nerezavéjící ocelové nádobe.

lonexová chromatografie (Katex) pH roztoku r-ricinu A bylo upraveno na pH 5,5 pomoci 1 M orthofosforečné kyseliny a roztok byl nanesen na kolonu o rozmérech lOcm prumér x lOcm, naplnénou karboxymethyl celulosou ekvilibrovanou 10 1 pufru C (25 mM dihydrogen orthofosfátu sodného, 5 mM EDTA, 2 mM dithitreitol, pH 5,5 s 5 N hydroxydem sodným). r-Ricin se navázal na tuto kolonu a po promytí 10 1 pufru C byl z ní eluován 10 1 pufru D (25 mM dihydrogen orthofosfátu sodného), 5 mMEDTA, 2 mM dithiotreitolu, 100 mM chloridu sodného, pH 5,5 s 5 N hydroxydem sodným). čistý r-ricin A eluovaný jako jediný pík byl nahromadén a skladován pri -70°C, jako sterilní zmrzlý roztok do dalšího zpracování. r-Ricin A je za téchto podmínek stabilní více než rok.

Pro čistení bylo použito následující vybavení: Anex : DE-52, DEAE celulosa (Whatman Biochemicals) Katex : CM/Sepharosa (Pharmacia)

Odstredivka : Westphalia CSA-1, disková nahromaďující odstredivka (Westphalia)

Homogenizátor: APV-Schroeder Lab 60/60 homogenizátor (APV)

Filtry : AMI 0057P Hloubkový filtr, ABI NFZP-Posidyne membránový filtr (Pall)

Vsádkový tank : 701 Pharmacia vsádkový chromatografický tank (Pharmacia)

DE- kolona : Bioprocess 113 (Pharmacia)

DM-kolona : K100/50 (Pharmacia).

BIOLOGICKÉ VLASTNOSTI PROTILÁTKY C242 A IMUNOTOXINU

Imunohistochemické využití C242 (C242.II) u kolorektálního nádoru a normálni tkáné.

Vzorky primárního karcinomu tlustého stŕeva a konečníku a rúzné normálni tkáné byly ziskány od pacientu, kterí se podrobili chirurgickým zákrokúm. Tkáné byly uchovávány v ledu a byly zmrazený béhem hodiny po resekci v isopentanu pŕedmrazeným v tekutém dusíku. Tkáné byly uchovávány pri -70°C do rozdélení. Zmrzlé biopsie byly naŕezány na 5 um části a fixovány v 50% acetónu po dobu 30 vteŕin pri 4°C,dále pak 100% acetonem po dobu 5 minút pri 4°C. části byly sušený vzduchem a ponorený do PBS na 10 minút. Všechny části byly inkubovány v 0,3% peroxidu vodíku v PBS po dobu 5 minút, za účelem odblokování endogénni peroxidasy a ponorený dvakrát do PBS. Po té byly části ošetrený normálním vepfovým serem a naŕedéným 1:10 minút pri 4°C, aby se zabránilo v PBS-4%BSA po dobu nešpecifické vazbé protilátek.

Všechny	inkubace s
atmosfére	PO	dobu 30 minút
nejdríve	inkubovány s

(C242.II) , protilátkami probihaly ve vlhké pri pokojové teplote. Části byly monoklonálni protilátkou C242 získané podie príkladu 1, uvedeného výše, v PBS-4%BSA, po té s biotynylovaným konským, proti-myším IgG (Vectastain-trademark, Vector Laboratories, Burlingame,

CA,USA) redéným 1:400 v PBS-4%BSA se 2% vepŕového proti-králičiho inmunoglobulinu a konečné s Avidin DH/biotinylovaným H komplexem kŕenové peroxidasy (Dakopatts A/S, Copenhagen, Denmark). Po každé inkubaci byly plátky ponorený do PBS na dobu 15 minút. Části byly potom ošetrený substrátem po dobu 15 minút, ponorený do PBS, a pro počítáni obarveny haematoxylinem a zality do glycerolželatiny (Merck, Darmstadt, Germany). Jako substrát bylo použito 10 mg 3-amino-9-ethylkarbazolu (Sigma, St.Louis, Mo., SA), rozpušténých v 6 ml dimethylsulfoxidu a naŕedéných 50 ml 0,02 M acetátu sodného, pH 5,5, obsahujícího 4 ul 30% peroxidu vodíku. Roztok substrátu byl pred použitím filtrován. Části byly potom sledovány a výsledky jsou uvedené v Tab.l .

Tabulka 1 : Barvení nádoru tlustého stŕeva, konečníku a ruzných normálních tkání pomoci C242.II

Tkáň

Obarvená/Celková kolo-rektální normálni část prsní žláza pŕíušnice t

kú ž e játra nádor 26/41 tlustého stŕeva 8/16

2/3

2/2

0/1 lehké zbarvení potních ž'láz

0/2 slabé zbarvení žlučovodu ledviny pankreas žaludek

0/2

2/2 trubice

0/1 malé stŕevo

0/1

Jak je patrné z Tab.l, 63% sledovaných biopsii z nádoru tlustého stŕeva a konečníku vykazovalo pozitívni barvení monoklonálnim C242:II. Exprese antigénu CA242 v normálnich tkáních tlustého stŕeva bylo obecné slabší než v nádorových tkánich, barvení bylo úplné lokalizováno ve sloupcovém epithelu a pohárkovitých bunkách. Ostatní normálni tkáné (mimo tlustého stŕeva), téméŕ nevykazovaly reaktivitu s monoklonální C242:II. zatímco pozitívni reakce byla nalezená u normálnich dýchacích trubíc, pankreatických trubíc, žlučovodú a potních kanálku, ale barvení stŕeva bylo slabé.

Imunohistochemické využití C242 (0242:11) v normálnich lidských tkáních odebraných po smrti.

Široká paleta normálnich lidských tkání byla shromáždéna celkem od 21 jedincu (post mortem). Z nejlepšich sad tkáni bylo vybráno pro stanovení 0242:11 imunoreaktivity.

Po smrti byly tkáné odebrány a umístény ihned v pŕedem vychlazených zkumavkách obsahujících základní médium s pridanými antibiotiky. Zkumavky obsahující tkáné byly potom prenesený v ledové lázni do laboratoŕe, tekutina byla odstránená a tkáné byly upravený na 0,5 cm³ kostek. Kôstky tkání byly umístény na proužky filtračniho papiru rýchle zchlazeny v tekutém dusíku. Zmrazené tkáné byly uchovávány pri -80°C do naŕezání. Pri délení na části, byly zmrazené vzorky naŕezány na 6 um části, které byly umístény na mikroskopických skličkách. části byly fixovány ponorením + 93 skliček do 100% acetónu pri pokojové teploté po dobu 2 minút. Sklíčka byla potom vyndána z acetónu, usušená na vzduchu a skladována pri -20°C do použití.

Všechny inkubace probihaly ve vlhkém prostredí po dobu 30 minút pri pokojové teploté. Části byly nejdŕive inkubovány s monoklonálni protilátkou C242:IIv Tris pufru/NaCl (TBS), po té s konjugátem kŕenové peroxidasy a králičím proti- myším IgG (Dáko Ltd, High Wycombe, Bucks, UK), ŕedéným 1:50 v TBS obsahujicim 20% lidského séra (Sigman Chemical Company Ltd., Poole, Dorset, UK) a nakonec s konjugátem kŕenové peroxidasy a vepŕovým proti-králičím IgG(Dako Ltd.), ŕedéným 1:50 TBS obsahujicim 20% lidského séra.Po každé inkubaci byla sklíčka ponorená dvakrát do TBS. Části byly potom ošetrený substrátem po dobu 3-5 minút, ponorený do TBS, pro počitáni obarveny Mayers haematoxylinem a fixovány syntetickým fixovacim mediem (Shadon Scientific Ltd, Runcorn, Cheshire, UK.).

Jako substrát bylo použito 10 mg diaminobenzidinu (Sigma) rozpustených v 17 ml TBS obsahujicich 17 ul 30% peroxidu vodíku. Roztok substrátu byl pred použitím filtrován. Části byly sledovány a výsledky jsou uvedený v Tab.2.

Table 2.: Barveni normálnich tkání odebraných po smrti

C242:II

Tkáň	Obarvené/Ce1kový	počet
malý mozek	0/3
velký mozek	0/3
strední mozek	0/3
srdce	1/5	nezŕetelná	difusni reakce
plice	0/5
periférni nervy	0/3
ledviny	1/5	reaktivita	k blízkým/vzdá-

leným tubulúm

játra	1/5	nezŕetelná reaktivita v
		trubicich
pankreas	2/2
část tlustého stŕeva	2/3	nezŕetelná reaktivita v

epithelu tenké stŕevo nadledvinky žlučnik štítná žláza pŕíštítné télísko kuže pruhované svalstvo slezina lymfatické uzliny žaludek varlata pŕíusni

3/3 nezreteľná reaktivita v epithelu

2/5 nezreteľná reaktivita v kúre

1/5 difuse

1/5 difuse

0/2

2/4 šupinatý epithel a potní žlázy

1/5 difuse

0/5

0/5

3/3 nezreteľná reaktivita v epithelu

0/3

1/1 nezreteľná reaktivita v trubici mandle 4/4 reaktivita v šupinatém epithelu

Jak je patrné z Tab.2, 72% z testovaných tkání odebraných po smrti, nevykazovalo žádnou reaktivitu s C242:II. Z 28% pozitivnich vzorku vétšina méla barveni bud' difuzniho charakteru, bez ohraničení, nebo v ohnisku pŕevážné v tkánich trubicové štruktúry . Vice heterogénni, stále však ješté minimálni vazba, byla pozorována na epithelu tráviciho traktu. Dva ze čtyŕ testovaných vzorku kuže, reagujícich pozitívne, byly šupinatý epithel a potní žlázy. Šupinatý epithel se také barvil pozitívne u 4 vzorku mandli testovaných s C242:II.

Endocytosa C242:II vázajícího se na COLO 205, lidský nádor tlustého stŕeva

Stanovení endocytosy bylo provádéno následujicim zpúsobem:

Suspenze jednotlivých bunék byly pripravený .ž COLO 205 bunék (viz príprava C242 protilátky dŕive popsaná) rostoucich jako jednovrstevná kultura. Bunky byly trypsinovány, účinné promyty a resuspendovány v kultivačnim médiu. Jodem označená protilátka proti C242:II výse uvedená (200 OOOcpm odpovídá 50 ng monoklonálni protilátky) byla suspenzi jednotlivých bunék COLO 205 bunék (10⁶ ml zkumavce. Konečný objem byl 200 ul/zkumavku.

byly inkubovány v ledu (0°C) v prítomnosti po dobu jedné hodiny. Suspenze byla pot-é a bunky byly zbavený nenavázané monoklonálni promytim. Pre-inkubované buňky byly dále pri 37°C v 10 minútových časových intervalech po dobu jedné hodiny, mezi jednotlivými intervaly byly buňky ochlazeny a peletovány. Rádioaktívni značení uvolnéné do gama počítač, Pharmacia byl také podroben TCA byla méŕena. Povrchová kyselým promytim 0,2

M glycin-HCl pufrem, pH 1,5, obsahujicim 2,5 mg/ml papainu, a rádioaktivita, reprezentovaná vnitŕnim ¹²⁵I-C242, byla méŕena. Množství povrchové vázané protilátky po jednotlivých inkubacich pri 37°C bylo zjišťováno odečitánim uvolnéné a vnitŕni monoklonálni protilátky. Degradace uvolnéné protilátky byla méŕena ze TCA sráženiny supernatantu.

pŕidána k bunék) v 5

Buňky ¹²⁵I-C-242 odstredená protilátky inkubovány média bylo mereno v supernatantu (LKB AB, Uppsala, Sweden). Supernatant sráženi a rádioaktivita sráženiny i nc vazba ^±Z^I-C242 byla odstránená

Výsledky uvedené v Obr.15 jsou ukazujicimi endocytosu ¹²^I-C242:II vyjadrené krivkami

COLO 205 bunék.

Rádioaktivita na bunéčném povrchu (Sur), vnitŕni rádioaktivita (Int), uvolnéná rádioaktivita (Res) a rozložená uvolnéná rádioaktivita (Deg.Re) jsou vyjádŕeny jako procenta celkové puvodni rádioaktivity bunečného povrchu. Na Obr.15 je možno vidét, že vice než 20% vnitŕni C242:II bylo ziskáno béhem jedné hodiny, když pre-inkubované bunky byly inkubovány pri 37°C. Bylo zde malé množstvi v kyseline rozpustné rádioaktivity, když byl supernatant srážen TCA, což indikuje malou fragmentaci uvolnéné aktivity po jedné hodine inkubace.

Cytotoxicita imunotoxinu ricin A/C242 protilátky

In vitro toxicita

Tento test sleduje in vitro cytotoxicitu imunotoxinu proti bunečné linii lidského nádoru tlustého stŕeva a konečníku (Colo 205-ÁTCC No.CCL 222).

Colo 205 buňky rostly v suspenzi v RPM1640 médiu s 2,0 g/1 bikarbonátu sodného, bez glutaminu, s 5% teplem inaktivovaným embryonálnim telecim serem, 2 mM L-glutaminem a 50 ug/ml gentamicinem. Buňky byly počítány za použití haemocytometrových blokú. Pro stanovení inhibice syntézy bilkovin, byly buňky v množstvi 2 x 10⁴bunék /jamku nanesený na destičku s 96 jamkami v objemu 100 ul. Vzorky imunotoxinu byly nanesený 12 paralelnich ŕedéním kultivačniho média bylo

Každá destička bylo pridáno 2 byly inkubovány bylo pridáno <

kontrola .

do 3 jamek. Imunotoxin byl pŕidán v od 2000 do pridáno do byla inkubována uCí H-L-leucinu dalšich 24 hod.

do každé jamky

0,98 ng/ml. 100 ul nékolika jame k jako hod.pri 37°C, do každé jamky.. pri 37°C. 50 ul a destičky byly dríve než Destičky trypsinu inkubovány dalšich 15-20 minút. Bunky byly odstránený z každé jamky v destičce podložkou ze sklenéných vláken a rádioaktivita byla stanovená za použití LKB beta scintilátoru. Byla sestavena odečteny hodnoty IC₅₀· preferovaným imunotoxinem uvedený na Obr.16.

podložkou ze stanovená za krivka inhibice proteosyntezy a Výsledky získané získané s (prípravu popsána vyše) jsou

In vivo cytotoxicita

Tento test sleduje in vivo cytotoxicitu imunotoxinu proti bunéčné linii lidských nádorových bunék, COLO 205, narostlé pod kúži myši bez brzliku. Současne byly testovány kontrolní skupiny, využivajici protilátku samotnou nebo fosfátem pufrovaný fysiologický roztok.

Myši bez brzliku byly imunizovány COLO 205 bunkami v koncentraci 5 x 10 podkožnim vpichem do bokú. U rostoucich nádorú byly méŕeny každé 3-4 dny dva rozmery obkročnými kružidly (kaliperem). Testovaná látka byla injikována až v dobé, kdy nádor dosáhl rozmérú 0,7-l,0cm x 0,7-1,0 cm. Toto štádium bylo bráno jako nulový stav (den 0) a testované látky

100 byly v této dobé injikovány intravenózne do ocasni žily ve dnech 0, 1 a 2. Velikost nádoru byla dále mérena ve dvouch rozmérech a výsledky byly presentována jako relatívni objem nádoru. Méŕeni bylo provádéno každé 3-4 dny až do ukončení pokusu.

Tento test srovnává vliv fosfátu pufrovaného fysiologického roztoku, samotné protilátky C242 (l,2mg/kg) a preferovaného imunotoxinu (príprava popsána výše) (2,0 mg/kg) na rúst nádoru a výsledky jsou uvedený v následujicich tabulkách.

SKUPINA 1 Fosfátem pufrovaný fysiologický roztok₍0,l ml/10 g/ intravenózne 3 x denné

Myš

Den	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
0	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1.
4	2,02	1,15	2,28	1,02	0,51	0,80	2,05	1,58	0,79	1,23
8	5,0 4	3,27	5,08	2,18	1,09	1,83	4,54	4,75	1,59	3,63
10	6,41	4,32	5,24	3,94	1,96	2,44	5,58	5,91	1,85	4,43
15			7,72	5,24	4,13	2,94	7,25	9,45	2,71	7,02
18			11,81	6,78	3,53	8,02		14,39	3,30	11,48

101

SKUPINA 2 Protilátka C242 1,2 mg/kg/intravenózné 3 x denné Myš

Den	1 ,	2	3	4	5	6	7	8	9	10
0	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
4	1,64	2,19	1,85	1,08	1,48	2,07	1,65	1,36	2,14	2,47
8	3,31	4,30	3,28	4,07	3,38	4,78	6,08	2,96	3,34	7,31
10	4,46	4,65	4,88	4,85	3,44	5,11	8,82	4,19	4,12	7,43
15				5,29			10,80	2,57
18							15,03

SKUPINA 3

Imunotoxin 2,0 mg/kg/intravenózné x denné

Myš

Den	1	2	3	4	5	6	7	8	9
0	1	1	1	1	1	1	1	1	1
4	0,63	0 86	1,40	0,64	0,48	0,43	0,73	0,91	0,77
8	0,44	0,87	1,08	0,48	0,58	0,41	0,67	0,93	1,07
10	0,48	0,71	1,39	0,29	0,55	0,51	0,56	1,13	1,21

Jak je patrné z uvedených tabulek, imunotoxin redukuje velikost nádoru (v tabulkách jsou uvádény relatívni objemy nádoru) ve srovnáni s fysiologickým roztokem pufrovaným fosfátem a protilátkou samotnou.

102

Reaktivita C242:II s lidskou pankreatickou nádorovou tkáni

Tento test sleduje reaktivitu C242 k lidské pankreatické nádorové tkáni.

Reaktivita C242:II k lidské pankreatické nádorové tkáni byla stanovená za použití imunohistologických technik používaných pro stanovení normálni reaktivity lidských tkáni. Čerstvé zmrazená pankreatická nádorová tkáň byla ziskána biopsii ostrou jehlou a formalinem fixovaná do parafínu zalitá tkáň byla ziskána zpŕi resekci nádoru. 13 ze 16 pankreatických nádoru se barvilo pozitívne. Obecné lze ŕici, _: že šíre a zpúsob väzby byl lepši nebo stejný se šíri a zpúsobem väzby pozorovaným u vzorkú nádorových tkáni tlustého stŕeva a konečníku.

In vitro potence imunotoxinu v linii bunék pankreatického nádoru

Tento test sleduje in vitro cytotoxicitu imunotoxinu proti linii bunék lidského pankreatického nádoru. Bunečná linie Pan 1, odvozená od pankreatického adenokarcinomu, byla použivána pro kvantifikaci cytotoxické potence imunotoxinu in vitro a FACS analýzou byl exprimován cilový antigén. Pro kvantifikováni sily imunotoxinu byly k Pan 1 buňkám v kultuŕe pŕidávány rúzné koncentrace imutoxinu za účelem zjistit IC50· Konjugát MOPC 21 a ricinu A nebo ricin A samotný byly

103 použivány jako negatívni kontroly. Bioassay bala provedena trikrát a zminéná potence dosahovala hodnot 40 +/- 18 ng/ml. Negatívni kontroly nebyly cytotoxické pri koncentracich do 1000 ng/ml. Tyto hodnoty ukazuj!, že cilový antigén je prítomný na nádorových bunkách pankreasu a že antigén pozitívni nádorové bunky jsou citlivé na imunotoxin.

Molekulárni klonování části cDNA kodujicich lehký a téžký ŕetézec monoklonálni protilátky C242:II

A.Príprava celkové RNA

Q

Celková RNA z 10 bunek byla pŕiravena dle metódy Cirgwina, J.M. a kol. (1979, Biochemistry 18, 5294-5299) , která byla modifikována Chomezynksim,P. a Sacchim,N (2987, Anál Biochem.162, 156-159). Stručné, pelet bunék byl rozpuštén v 15 ml studeného denaturačniho roztoku složeného z 4 M guanidinthiokyanátu, 25 mM citrátu sodného, pH 7, 0,5% N-lauroyl sarkosinu, 0,lM 2-merkaptoethanolu. Po rozpušténi bunéčného materiálu bylo pŕidáno 1,2 ml 2M acetátu sodného (pH 4,0) a smés byla extrahována fenol-chloroformisoamylalkohol (250:49:1). Po odstredení byla RNA srážena z vodné fáze pŕidavkem stejného objemu isopropanolu a inkubace pŕes noc pri -20°C zajistila vysráženi celkové RNA. Po odstŕedéni a resuspendaci RNA bylo sráženi opakováno a po dalšim odstŕed'ováni a sráženi bylo na základe méŕeni absorbance stanoveno celkové množství RNA 960 ug.

104

B. Isolace mRNA

Aby byla získaná polyadenylovaná mRNA z vyše pripravené celkové RNA, byl použit PolyATract™ mRNA isolačni systém Promega Corporation, Madison, Wisconsin, U.S.A., dle instrukcí výrobce (citace : Promega Technical Bulletin, No. 090:1990). Stručné, 960 ug celkové RNA bylo rozpušténo ve vode a spojeno s biotinylovaným oligo (dT) probou (50 pmol) v 0,4 x SSC (1 x SSC = 8,77 g NaCl, 4,41 g citrátu sodného na litr vody, pH 7,0). Streptevidinem potažené paramagnetické kuličky (Streptavidm Magnesphere^x“) byly pŕidány a po 10 minutách inkubace byly magnetické částice odstránený a promyty nékolikrát 0,1 x SSC. Polyadenylovaná mRNA byla eluována z kuliček inkubaci ve vode. Takto bylo ...získáno 5 ug mRNA.

C. Príprava cDNA fágové knihovny v E.coli.

cDNA byly pripravená z polyadenylované mRNA z pŕedcházejiciho kroku dle metódy Gublera,U. a Hoffmana,B.J. (1983, Gene 25,263-269) modifikované pro vektor Uni-ZAP™ (Stratagne Inc. La Jolla, California), která umožňuje nepŕimé klonováni dvoušroubovicové cDNA. Stručné, 5 ug · polyadenylované mRNA bylo pŕevedeno na jednovláknovou cDNA s využitím primeru Uni-Zap™ (56 ng/ml) a prídavku dATP, dGTP, dTTP a 5-methyl-dCTP v koncentraci 0,6 mM a 45 U reverzní transkriptázy z viru leukemie Mloncy Murinae. Smés byla inkubována po dobu 1 hodiny pri 37°C. Syntéza druhého

105 vlákna cDNA byla zajišténa pŕidavkem dATP, dGTP, dTTP a CTP do konečné koncentrace 0,15 mM, 3,2 U RNasy H a 6,5 U DNA Polymerázy 1. Inkubace probihala po dobu 2,5 hodin pri 16°C. Smés byla extrahována smési fenol:chloroform {1:1) a srážena ethanolem. Konce cDNA byla prevedený na tupé konce inkubaci s 0,16 mM dNTP a 10 U T4 DNA polymerázy po dobu 30 minút pri 37°C. Po fenol:chloroformové extrakci a ethanolovém sráženi, byly výsledné tupé konce cDNA ligovány s EcoRI adaptory pŕidánim 3 Weiss U T4 DNA ligázy, 1 mM ATP a inkubaci pŕes noc pri 8°C. Po ligaci byly kohesivni konce EcoRI fosforylovány za prítomnosti 10 U T4 polynukleotid kinasy a 1 mM ATP a inkubaci po dobu 30 minút pri 37°C. Získaná cDNA s fosforylovanými kohezivnimi konci EcoRI byla štepená- 90 U Xhol tak, aby vznikly Xhol kohezivni konce ze sekvence zakódované Uni-ZAP™vazebným primerem. Takto získaná cDNA byla potom ligována s 1 ug Uni-ZAP™XR EcoRI a částmi pripravenými pomoci Xhol v prítomnosti 2 Weiss U T4 DNA ligasy a 1 mM ATP. Inkubace probihala pŕes noc pri 12°C. Ligačni smés byla in vitro sbalena do částice lambda-fágu za použití Gigapack II Gold^ sbalujici extrakt dle popisu výrobce a vznikájici fágy byly použitý pro infekci E.coli. PLK-F . Získaná cDNA knihovna obsahujici 8,5 x 10⁸ nezávislých klonil byla jednou amplifikována, aby dala fágový titr 7,5 x 10⁸ pfu/ml. Vzniklá cDNA knihovna byla vybiraná pomoci hostitelského kmene E.coli XLl-Blue (Bullock,W. (1978) Biotechniques, 5, 4) dle metódy popsané dále.

106

D. Príprava hybridizační próby

Pro detekování klonú cDNA kodujicích téžký ŕetézec IgGl a kapa ŕetézec protilátky hybridizační próba pokrývajici ŕetézce, CH1, a stálou oblast

C242:II, byla pripravená první stálou oblast téžkého kapa ŕetézce, CK, z myšiho genómu (DNA) metodou PCR (polymerase chain reaction) dle

Saiki,R.H. a kol. (1988, Science 239, 487-491). Stručné, páry oligonukleotidových primeru, hybridizujici s 5 a 3 konci exonú kodujicích oblasti výše zminéného imunoglobulinu, byly použitý pro amplifikaci myši genomové DNA.. Po purifikaci elektroforezou na agarosovém gélu byly vzniklé fragmenty DNA próby značený P, metodou využivajici náhodného primeru dle

Feinberga,A.P. a Vogelsteina,

B. (1983, Anál. Biochem..

2, .6) .

E. Výbér ŕetézce a sekvenci inserce do kodujicích plasmidu

IgGl téžký ŕetézec a kapa knihovna z kapitoly c DNA oddelených IgGl nebo

Sambrookem,J. a kol.(1989, Molecular

Spring Harbor laboratory Press). Pozitivné hybridizované fágové klony z obou hybridizačnich pokusu byly dále purifikovány opakovaným výbérem za použití stejných prób jako v počátečnim výberu. Pozitivné hybridizované fágové klony byly prevedený do kultury E.coli CLl-Blue, a vzniklé fágové

C používajicich popsané v kap. kol.(1989, Harbor laboratory Press). klony z pokusech kapa, a byla testována bud'

D, ve dvou próby imuglobulinu dle metódy popsané Cloning, 2ndEd, Cold

107 kultury byly použitý pro prípravu cDNA, obsahujici pBlue SK(-)plasmidy, za použití vyŕiznuti fagu a namnožení dle metódy Shorta,J.M.. a kol. (1988, Nucleic Acids Res. 16, 7583-7600).

F. Charakterizace plsmidové cDNA z hybridizovaných kolonií

Vznikla cDNA obsahujici plasmidy byla charakterizována mapováním restrikčnimi enzymy a plasmidy obsahujici inserty pŕedpokládané délky byly podrobený dideoxy DNA sekvenováni dle Sangera, F. a kol. (1977, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 5463-5467). Plasmid hybridizujici s Ig kapa probou, označený jako pKGE761, obsahoval cDNA insert jehož sekvence kodovaly otevŕený čteci rámec úzce homologni dŕive známým sekvencím myšiho kapa lehkého ŕetézce.(Kabat, E.A. a kol. (1987) Sequences of Protein of Immunological Interest, 4th Ed., U.S.Départment of Health and Human Services, National Institutes of Health). Částečná cDNA sekvence kodujíci rúzné oblasti kapa lehkého ŕetézce, VK a jemu odpovídájici bilkovinné sekvence je namalována na Obr.18. Tri CDR sekvence, označené jako CDR1 až CDR3, jsou zvýraznený podtrženim. Signálni peptid pŕedcházejici amino konci VK segmentu je označen S. CK značí stálou oblast následujici za karboxy koncern VK sekvence.

Hybridizace plasmidu s IgGl probou, označená jako pKGE762, obsahujici cDNA insert jehož sekvence koduji otevŕený čteci rámec úzce homologni k dŕive známým sekvencím

108 myšiho IgGl téžkého ŕetézce (Kabát,E.A. a kol. . viz vyše). Částečné sekvence cDNA kodujici ruzné oblasti IgGl téžkého ŕetézce, VH, a jemu odpovidajici bilkovinné sekvence je namalována na Obr.19. Tri CDR sekvence, označené jako CDR1 až CDR3, jsou zvýraznený podtrženim. Signálni peptid pŕedcházejici amino konci VK segmentu je označen S. CH1 značí stálou oblast následujici za karboxy koncern VK sekvence.

SLOŽENÍ

Následné je uveden príklad farmaceutické dávkovací formy obsahujici imunotoxin, jenž je pŕedmétem podávané patentové prihlášky, která by mohla být využitá pro terapeutické účely u lidi.

Injekční roztok sterilní vodný injekční roztok obsahuje :

imunotoxin ricin A/protilátka C242 trihydrát octanu sodného chlorid sodný

Tween 20

1,0 mg

6,8 mg

7,2 mg

0,05 mg/ml roztoku

GS36441

08JUN92 JMC

109

	SEZNAM SEKVENCI
	(1) ZÁKLADNÍ	INFORMACE
•	(i)	APLIKANT : Imperiál Chemical Industries PLC and Kabi Pharmacia AB
.	(ϋ)	NÁZEV PATENTOVÉ PŔIHLÄŠKY : KONJUGÁTY
	(iii)	POČET SEKVENCI : 22
	(iv)	KONTAKTNÍ ADRESA : (A) ADRESÁT : Legal Department:Patents
		(B) ULICE : Bessemer Road
*·'		(C) MESTO : Welwyn Garden City
		(D) OKRES : Hertfordshire (E) ZEME : United Kingdom .(F) KÓD : GB-AL7 1HD
	(v)	FORMA CTENÁ POČÍTAČEM (A) TYP UCHOVÁVANÍ : Disketa, 3,50 inch 1,2Mb paméť (B) POČÍTAČ : 18 M PS/2
		(C) OPERAČNÍ SYSTÉM : PC-DOS 3,20
		(D) SOFTWARE : ASCII z WPS-PLUS
•	(vi)	SOUČASNÉ ZADANÉ ÚDAJE : (A) ČÍSLO ZADANÍ
e		(B) DÁTUM VYPLNÉNÍ : (C) KLASIFIKACE :
	(vii)	PUVODNÉ ZADANÉ ÚDAJE :

110 (A) ČÍSLO ZADANÍ : 9114399.0 (B) DÁTUM VYPĹNÉNÍ : 03.7.1991 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:1 :

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 16 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xí) POPIS SEKVENCE : SERQ ID NO :1:

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly A.sn Thr Tyr 14

Leu Tyr 16 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 7 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni

111 (xi) POPIS SEKVENCE :SEQ ID NO:2:

Arg Met Ser Asn Leu Val Ser 7 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 9 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:3:

Leu Gin His LeU Glu Tyr Pro Phe Thr 9 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 5 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jqdnoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:4:

112

Tyr Thr Gly Met Asn (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 17 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xí) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:5:

Trp íle Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala* Glu ’Asp '14

Phe Lys Gly 17 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 10 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:6:

Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val

113 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 18 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:7:

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 14

Leu Tyr Trp Phe · 18 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 11 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:8:

íle Tyr Arg Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val

114 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 11 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:10:

Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 7 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:10:

Phe Thr Tyr Thr Gly Met Asn

115 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 21 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinoý (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:11:

Met Gly Trp íle Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala

Glu Asp Phe Lys Gly Arg íle (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 14 Aminokyselín (B) TYP : Aminokyselinový (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (Xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO :12:

Ala Arg. Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 14

116 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 25 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:13:

AATTCGCAT GCGG ATCCAT CGATC

Pozn.pŕekl.: v originále chybí 1 báze v první desítce j

(2) ÚDAJE O SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 25 (B) TYP: Nukleová kyselina (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:14:

GCGTACGCC TAGGTAGCTA GAGCC

Pozn.pŕekl.: v originále chybí 1 báze v první desítce

117 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCÍ :

(A) DÉLKA :21 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:15:

GATAACAACA TATTCCCCAA A (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 23 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:16:

GATAACAAC ATGGTACCC AAA

Pozn.pŕekl.: v originále chybí po 1 bázi v obou desitkách

118 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 23 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:17:

AACAACATG GTACCCAAA CAA 23

Pozn.pŕekl.: v originále chybí po 1 bázi v obou desitkách (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 1140 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŔÉTÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:18:

TTCTGGCAAA TATTCTGAAA TGAGCTGTTG ACAATTAATC ATCGAACTAG

TTAACTAGTA CGCAAGTTCA CGTAAAAAGG GTATCGACAA TGGTACCCGG

100

119

GGATCCACCT	CAGGGTGGTC	• TTTCACATTA	GAGGATAACA	ACATGGTACC	150
CAAACAATAC	CCAATTATAA	ACTTTACCAC	AGCGGGTGCC	GCTACACAAA	200
GCTACACAAA	CTTTATCAGA	GCTGTTCGCG	GTCGTTTAAC	AACTGGAGCT	250
GATGTGAGAC	ATGAAATACC	AGTGTTGCCA	AACAGAGTTG	GTTTGCCTAT	300
AAACCAACGG	TTTATTTTAG	TTGAACTCTC	AAATCATGCA	GAGCTTTCTG	350
TTACATTAGC	CCTGGATGTC	ACCAATGCAT	ATGTGGTCGG	CTACCGTGCT	400
GCAAATAGCG	CATATTTCTT	TCATCCTGAC	AATCAGGAAG	ATGCAGAAGC	450
AATCACTCAT	CTTTTCACTG	ATGTTCAAAA	TCGATATACA	TTCGCCTTTG	500
GTGGTAATTA	TGATAGACTT	GAACAACTTG	CTGGTAATCT	GAGAGAAAAT	550
ATCGAGTTGG	GAAATGGTCC	ACTAGAGGAG	GCTATCTCAG	CGCTTTATTA	600
TTACAGTACT	GGTGGCACTC	AGCTTCCAAC	TCTGGCTCGT	TCCTTTATAA	650
TTTGCATCCA	AATGATTTCA	GAAGCAGCAA	GATTCCAATA	TATTGAGGGA	700
GAAATGCGCA	CGAGAATTAG	GTACAACCGG	AGATCTGCAC	CAGATCCTAG	750
CGTAATTACA	CTTGAGAATA	GTTGGGGGAG	ACTTTCCACT	GCAATTCAAG	800
AGTCTAACCA	AGGAGCCTTT	GCTAGTCCAA	TTCAACTGCA	AAGACGTAAT	850

120

GGTTCCAAAT	TCAGTGTGTA	CGATGTGAGT	ATATTAATCC	CTATCATAGC	900
TCTCATGGTG	TATAGATGCG	CACCTCCACC	ATCGTCACAG	TTTTGATTGC	950
TTATAAGGCC	AGTGGTACCC	GGGGATCCTC	TAGAGTCGAC	CTGCAGGCAT	1000
GCAAGCTTAG	CCCGCCTAAT	GAGCGGGCTT	TTTTTTATCG	ACCGATGCCC	1050
TTGAGAGCCT	TCAACCCAGT	CAGCTCCTTC	CGGTGGGCGC	GGGGCATGAC	1100
TATCGTCGCC	GCACTTATGA	CTGTCTTCTT	TATCATGCAA		1140

(2) ÚDAJE O SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA 26 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:19:

ATAACAACAT GGTTCCCCAAA CAATAC (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:20:

121 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 86 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:20:

AAAAAGGGTA TCGACATGGT ACCCGGGGAT CCACCTCAGG GTGGTCTTTC 50

ACATTAGAGG ATAACAACAT GGTACCCAAA CAATAC (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 463 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:21:

GGAATTCGGA ACGAGGAGT TTTTTGTATC AAGTTCTCAGA ATG AGG

TGC Cys

Met Arg

CTA

GCT

GAG

TTC

CTG

GGG

CTG

CTT

GTG

CTC

TGG

ATC

CCT

GGA

Glu

Ala

Glu

Phe

Leu

Gly

Leu

Leu

Val

Leu

Trp

íle

Pro

Gly

122

GCC

ATT

GGG

GAT

ATT

GTG

ATG

ACT

CAG

GCT

GCA

CCC

TCT

GTA

133

Ala

íle

Gly

Asp

íle

Val

Met

Thr

Gin

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

CCT

GTC

ACT

CCT

GGA

GAG

TCA

GTA

TCC

ATC

TCC

TGC

AGG

TCT

175

Pro

Val

Thr

Pro

Gly

Glu

Ser

Val

Ser

íle

Ser

Cys

Arg

Ser

AGT

AAG

AGT

CTC

CTG

CAT

AGT

AAT

GGC

AAC

ACT

TAC

TTG

TAT

217

Ser

Lys

Ser

Leu

Leu

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Tyr

TGG

TTC

CTC

CAG

AGG

CCA

GGC

CAG

TCT

CCT

CAG

CTC

CTG

ATA

259

Trp

Phe

Leu

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

íle

TAT

CGG

ATG

TCC

AAC

CTT

GTC

TCA

CGA

GTC

CCA

GAC

AGG

TTC

301

Tyr

Arg

Met

Ser

Asn

Leu

Val

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

AGT

GGC

AGT

GGG

TCA

GGA

ACT

GCT

TTC

ACA

CTG

AGA

ATC

AGT

343

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ala

Phe

Thr

Leu

Arg

íle

Ser

AGA

GTG

GAG

GCT

GAG

GAT

GTG

GGT

GTT

TAT

TAC

TGT

ATG

CAA

385

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Leu

Gin

CAT

CTA

GAG

TAT

CCG

TTC

ACG

TTC

GGT

CCT

GGG

ACC

AAG

CTG

427

His

Leu

Glu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Leu

GAG

CTG

AAA

CGG

GCT

GAT

GCT

GCA

CCA

ACT

GTA

ACG

463

G1U

Leu

Lys

Arg

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Thr

123 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 483 (B) TYP : Nukleová kyselina (C) ŔETÉZEC : Jednoduchý (D) TOPOLOGIE : Lineárni (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:22:

GAATTCGGCA CGAGATTGAG CCCAAGTCTT AGACATC ATG GAT TGG CTG 4 9

Met Asp Trp Leu

CGG

AAC

TTG

CTA

TTC

CTG

ATG

GCA

GCT

GCC

CAA

AGT

ATC

CAA

91

Arg

Asn

Leu

Leu

Phe

Leu

Met

Ala

Ala

Ala

Gin

Ser

íle

Gin

GCA

CAG

GTC

CAG

TTG

GTG

CAG

TCT

GGA

CCT

GAG

CTG

AAG

AAG

133

Ala

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Lys

Lys

CCT

GGA

GAG

ACA

GTC

AAG

ATC

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GAT

TAT

175

Pro

Gly

Glu

Thr

Val

Lys

íle

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Asp

Tyr

ACC

TTC

ACA

TAC

TAT

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

AAG

CAG

GCT

CCG

217

Thr

Phe

Thr

Tyr

Tyr

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

GGA

AAG

GGT

TTA

AAG

TGG

ATG

GGC

TGG

ATA

GAC

ACC

ACC

ACT

259

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

Gly

Trp

íle

Asp

Thr

Thr

Thr

GGA

GAG

CCA

ACA

TAT

GCT

GAA

GAT

TTT

AAG

GGA

CGG

ATT

GCC

301

124

Gly

Glu

Pro

Thr

Tyr

Ala

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

íle

Ala

TTC

TCT

TTG

GAG

ACC

TCT

GCC

AGC

ACT

GCC

TAT

TTG

CAG

ATC

343

Phe

Ser

Leu

Glu

Thr

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gin

íle

AAA

AAC

CTC

AAA

AAT

GAG

GAC

ACG

GCT

ACA

TAT

TTC

TGT

GCA

385

Lys

Asn

Leu

Lys

Asn

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

cys

Ala

AGA

CGG

GGG

CCT

TAC

AAC

TGG

TAC

TTT

GAT

GTC

TGG

GGC

GCA

427

Arg

Arg

Gly

Pro

Tyr

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GCC

AAA

ACG

ACN

CCC

CCA

469

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Lys

Thr

Thr

Pro

Ser

TCT GTC

TAT

CC

483

Ser Val Tyr Pro

Pozn.pŕekl.: v predposlední ŕádce (469) v tretím tripletu r

odieva' byla v originále tretí báze označená jako N (múže být A,G nebo C) , v poslední ŕádce (483) chybí v originále 3 báze.

Claims (16)

1. Patentové nároky

   1. Konjugát, vyznačujici se tím, že obsahuje toxinovou část a část, která se selektívne váze na cilovou bunku, která je nádorovou bunkou trávicího traktu.
2. 2. Konjugát dle nároku 1,vyznačujici se tím, že část, která se váže na cilovou bunku, obsahuje C242 protilátku nebo takové vazebné místo, které má v podstate stejné bunéčné vazebné schopnosti.
3. 3. Konjugát dle nároku 1 nebo 2, vyznačuj icise tím, že toxinová část obsahuje rekombinantni ricin A.
4. 4. Konjugát dle nároku 1,2 nebo 3, vyznačuj ici s e t í m, že část, která se váže na cilovou bunku a toxinová část jsou spojený pomoci bifunkčni spojky.
5. 5. Konjugát dle kteréhokoliv z uvedených nároku, vyznačujici se tím, že část, která se váže na cilovou bunky a toxinová část jsou spojený pomoci disulfidové nebo thioetherové väzby.
6. 6. Konjugát dle kteréhokoliv z uvedených nároku, vyznačujici se tím, že část, která se váže na cilovou bunku a toxinová část jsou spojený spojovacím činidlem o vzorci -S-X-CO-, kde X je pŕimý ŕetézec (1-6 C) alkylového typu, s možnou substituci jedním nebo dvéma substituenty odvozenými od (1-6 C) alkylu, fenylu a (1-4 C)

   1 26 alkylfenylu; nebo (1-4 C) alkylfenylového typu, ve kterém muže být alkylová část nahrazena jedním nebo dvéma substituenty odvozenými od (1-6 C) alkylu, fenylu a (1-4 C) alkylfenylu; a kde fenylový kruh múže nést substituent odvozený od halogénu, (1-4 C) alkylu a (1-4 C) alkoxylu.
7. 7. Konjugát dle nároku 6, vyznačuj icí se tím, že X obsahuje methylenovou, ethylenovou, propylenovou nebo butylenovou skupinu nahrazenou jednou nebo dvéma skupinami odvozenými od methylu, ethylu, propylu nebo butylu.
8. 8. Konjugát dle nároku 6, vyznačujíci se tím, že spojka obsahuje radikál -S-CH(CH₃) CH CO-.
9. 9. Konjugát dle kteréhokoliv z uvedených -“nároku vyznačujíci se tím, že část, která se váže na cílovou bunku má CDR oblasti obsahující následujíci sekvence:

   lehký ŕetézec

   CDR1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr

   CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer

   CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr téžký ŕetézec

   CDR1: TyrThrGlyMetAsn

   CDR2: TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly

   CDR3 : ArgGlyProTyrAsnTrp.TyrPheAspVal

   CDR sekvence jsou uspoŕádány tak, aby část, která se váže na

   1 27 cilovou bunku, méla pŕevážné stejné vazebné vlastnosti bunky jako protilátka C242.
10. 10. Konjugát, v yznačujíci se ti m, že má následujici vzorec :

    H

    A-S1-S2-X-CON-B kde

    A obsahuje rekombinantní ricin A, a B obsahuje část, která .se váze k cílové buňce, která obsahuje protilátku C242,

    51 je atóm síry umisténý na rekombinantním ricinu A, NH je na protilátce C242

    52 je atóm síry a X je pŕímý ŕetézec (1-6 C) alkylové skupiny, pŕevážné substituován jedním nebo dvéma substituenty odvozenými od (1-6 C) alkylu, fenylu a (1-4 C) alkylfenylu, nebo (1-4 C) alkylfenylové skupiny, ve kterém je alkylová část pŕevážné substituována jedním nebo dvéma substituenty odvozenými od (1-6 C) alkylu, fenylu a (1-4 C) alkylfenylu, a kde fenylový kruh múze nést substituent odvozený od halogénu, (1-4 C) alkylu a (1-4 C) alkoxylu.
11. 11. Konjugát, vyznačujíci se tím, že obsahuje protilátku C242 a rekombinantní ricin A, vázaný z amino skupiny na C242 na thiol cysteinového zbytku v ricinu A pomoci diradikálové 3-merkaptomáselné kyseliny

    1 28 (-co.ch₂.ch(ch₃)-S-).
12. 12· Konjugát, vyznačuj rekombinantni ricin A a část, má alespoň jeden z CDR následujici sekvence:

    ící se tím, že obsahuje která se váže k ’ cilové buňce oblasti obsahující pŕevážné lehký ŕetézec

    CDR1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr

    CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer

    CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr téžký ŕetézec

    CDR1: TyrThrGlyMetAsn

    CDR2: TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly

    CDR3: ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal počet CDR oblastí a jejich uspoŕádáni je takové, že část, která se váže na cilovou buňku má pŕevážné stejné vazebné vlastnosti buňky jako protilátka C242.
13. 13. Konjugát, vyznačujici se tím, že toxinová část a část, která se váže na cilovou buňku, je špecifická pro epitop nádoru tráviciho traktu.
14. 14. Konjugát, dle nároku 13,vyznačuj ici se ti m, že část, která se váže na cilovou buňku je špecifická pro

    129

    C.

    epitop, na který se váže protilátka C242.
15. 15. Zpúsob výroby konjugátu dle nároku 1, vyznačuj ίο í s e t í m, že obsahuje:

    (a) pro takové konjugáty, ve kteŕých je část, která se váže na cilovou bunku pŕímo spojená s toxinovou části, reaguje toxinová část s části, která se váže na cilovou bunku.

    (b) pro takové konjugáty, ve kterých část, která se váže na cilovou bunku je spojená s toxinovou části pomoci spojky reaguje část, která se váže na cilovou bunku, derivatizována linkerem ,s toxinovou části nebo reaguje toxinová část derivatizovaná linkerem s části, která se váže na cilovou bunku.
16. 16. Farmaceutické složení, vyznačuj i se tím, že obsahuje konjugát, který byl již definován v kterémkoliv z pŕedcházejicich nároku, ve spojení s farmaceutický akceptovatelným rozpouštédlem nebo nosičem.