CN116472064A - 抗体-药物偶联物及其应用 - Google Patents

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CN116472064A CN202180069652.9A CN202180069652A CN116472064A CN 116472064 A CN116472064 A CN 116472064A CN 202180069652 A CN202180069652 A CN 202180069652A CN 116472064 A CN116472064 A CN 116472064A
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Abstract

一种抗体‑药物偶联物、其制备方法及应用，所述抗体‑药物偶联物是将化合物(T)与抗体(AB)经由下式(III)或(VII)表示的接头连接而成，T表示式(II)所示化合物。所述抗体‑药物偶联物具有更快起效时间、更长药物半衰期、更适中的稳定性、良好的生物相容性、低免疫原性和安全性，并且可以防止聚集，具有优异的抗肿瘤效果。AB‑S‑Q1‑L1‑L2‑La‑T(IV)AB‑S‑Q2‑L3‑L4‑LP‑Lb‑T(VIII)‑Q1‑L1‑L2‑La‑(III)‑Q2‑L3‑L4‑LP‑Lb‑(VII)

Description

抗体-药物偶联物及其应用 技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说，本发明涉及一类全新结构的接头结构、包括该接头结构的药物-接头化合物，以及包括所述药物-接头化合物的抗体-药物偶联物、上述药物-接头化合物和抗体-药物偶联物的制备方法及应用。
背景技术
抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate，下文简称“ADC”或“偶联物”)相对于单纯的抗体药物而言已经显示出独特的优势，其通过将具有肿瘤细胞表面抗原结合特异性的单克隆抗体与具有生物活性的细胞毒素相连，从而将抗体的肿瘤识别靶向性和细胞毒素的高效杀伤作用相结合，巧妙的同时解决了抗体疗效偏低和毒素缺乏靶向性导致毒性过大的缺陷。这使得ADC与传统的抗肿瘤药物相比，在准确的靶向肿瘤细胞的同时，降低对正常细胞的影响，大幅提高了抗肿瘤药物的有效性和安全性。
ADC一般包括三个部分：抗体、接头和毒素。抗体为ADC的靶向功能大分子，发挥将毒素富集到肿瘤组织部位附近以提高毒素的杀伤效率的作用。目前针对各大热门靶点如HER-2、Trop-2、PDL-1、CD30等的抗体开发如火如荼，同时也带动了针对这些靶点的ADC开发。
ADC接头分为可裂解和不可裂解两种类型，理想的接头应符合“稳定性好、释放效率高”的要求，即使得ADC在血液循环中保持稳定，并在到达肿瘤细胞内后能快速释放毒素、杀伤肿瘤细胞。接头对于ADC是否能发挥作用至关重要，不稳定的接头会导致ADC脱靶，增加安全性风险，而过于稳定的接头则影响毒素释放速度，从而影响药效。另外，如何根据特定抗体和特定毒素的理化性质、空间结构、靶细胞生理环境等因素选择适用于具体ADC的接头结构，是目前ADC研发中的热点问题，仍有迫切的研发需求。
ADC的毒素部分为发挥杀伤作用的药物小分子，一般通过抑制DNA或蛋白合成、抑制细胞有丝分裂等方式来杀伤肿瘤细胞。目前用于ADC开发的毒素主要包括微管抑制剂美登素类(参见EP0425235、US5208020、US5416064、US7276497)和奥瑞他汀(MMAE/MMAF，参见US2016304621A)。目前上市的代表性药物有Genetech开发的T-DM1，T-DM1是一种由通过稳定的硫醚连接子MCC(4-[N-顺丁烯二酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)缀合至类美登素类毒素DM1的曲妥株单抗组成的ADC(US8337856)。其他种类的细胞毒素还包括卡奇霉素类(Calicheamicin，参见US5606040)，苯并二吡咯类衍生物(duocarmycin，参见US7129261)，咯并苯二氮卓类(PBDs，参见WO2005/040170)和喜树碱类衍生物。其中喜树碱类衍生物包括SN-38、CPT-11、依沙替康、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱等。目前采用喜树碱类毒素的ADC是第一三共株式会社开发的DS-8201，它采用的是细胞毒性较强的依沙替康作为毒素部分。
然而，由无论是T-DM1，还是DS-8201，都仍旧存在以下不足：
就T-DM1而言，首先，T-DM1的药效不足，一是因为其DAR低，只有3-4，二是因为其采用了SMCC的接头与DM-1连接，而SMCC为不可降解的接头，这降低了T-DM1的药效；其次，T-DM1使用DM-1作为毒素，该毒素为微管抑制剂，细胞膜的透过性较弱；再次，T-DM1存在降低白细胞等较严重的毒副作用。
就DS-8201而言，依沙替康虽然毒性高于SN-38 10倍，但因依沙替康细胞杀伤活性强，无法单独成药，其对接头的稳定性要求较高，其ADC的接头也仅有一个酶裂解位点，这一定程度上也延长了ADC在胞内的起效时间。此外，依沙替康在血液中半衰期短，这虽然降低了毒副作用，但面临着药物半衰期短的风险。
由此可见，本领域仍有开发更为有效，兼顾安全的喜树碱类ADC的需求，制备具有更快的起效时间，更长的药物半衰期，同时在稳定性、亲疏水性、防聚集作用等安全性指标方面具有优势的喜树碱类ADC迫在眉睫。
发明内容
为解决上述问题，本发明人设计了适用于喜树碱衍生物的接头结构，将其作为喜树碱衍生物与抗体的连接结构，从而形成具有更快起效时间、更长药物半衰期、更适中的稳定性和良好安全性、防聚集的抗体-药物偶联物，该ADC具有优异的抗肿瘤效果。
本发明的第一方面，提供一种式(I)表示的化合物，
其中，R 11为羧基取代的C 1-C 6烷基，R 12为氰基取代的C 2-C 6炔基，X、Y、X’和Y’中有1-2个C原子被N原子取代；优选地，R 11为羧基取代的C 1-C 3烷基，R 12为氰基取代的C 2-C 3炔基。
在一些实施方案中，X、Y、X’和Y’中有且只有1个C原子被N原子取代。
在一些实施方案中，X、Y、X’和Y’中有2个C原子被N原子取代，且X、Y中有且只有1个C原子被N原子取代，以及X’、Y’中有且只有1个C原子被N原子取代。
在一些实施方案中，该化合物结构如下所示，
在一些实施方案中，该化合物作为抗体-药物偶联物中的连接单元，通过R 12的炔基碳与存在于抗体的铰链部的二硫键部分形成硫醚键而与抗体连接。
本发明的第二方面，提供一种式(I)表示的化合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)让5-溴吡啶-2-羧酸在Boc 2O，DMAP，t-BuOH存在下反应；所述5-溴吡啶-2-羧酸可替换为6-溴烟酸或5-溴嘧啶-2-羧酸；
(2)步骤(1)的反应产物与Pd(PPh 3) 2Cl 2，三乙胺，丙炔-3-醇在四氢呋喃中反应；
(3)步骤(2)的反应产物与TEMPO，PhI(OAC) 2，NH 4OAC在CH 3CN/H 2O为9：1的溶液中反应；
(4)步骤(3)产物在TFA/DCM的作用下生成产物。
本发明的第三方面，提供一种式(IV)表示的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其特征在于，AB表示抗体，T表示式(II)所示化合物，所述抗体-药物偶联物是将化合物(T)与抗体(AB)经由下式(III)表示的接头连接而成的：
AB-S-Q 1-L 1-L 2-L a-T (IV)
-Q 1-L 1-L 2-L a- (III)
其中，
式(II)中，
R 1选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、被-OC(＝O)R 13或-NR 7R 8取代的C 1-C 6烷基、被-SiMe 3取代的C 1-C 6烷基、或-CH＝N-O-(C 1-C 6烷基)；
R 2选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、饱和或不饱和C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、被-NR 7R 8取代的C 1-C 6烷基或被C 2-C 6烯基取代的C 1-C 6烷基；
R 3选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、-NR 7R 8C(＝O)O-基或5-6元含氮杂环基-C(＝O)-C 1-C 6烷氧基；
R 4选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、或C 1-C 6烷氧基；
或者R 1和R 2可以连接在一起与母体部分形成任选被R 9取代的5-6元环；
或者R 3和R 4可以连接在一起与母体部分形成任选被R 9取代的5-6元含氧杂环；
R 7和R 8每次出现时各自独立地选自氢、C 1-C 6烷基、被羟基或氨基取代的C 1-C 6酰基；或者R 7与R 8可以与所连接的N原子一起形成任选被R 9取代的5-6元含氮杂环；
优选地，R 7和R 8每次出现时各自独立地选自氢、甲基、异丙基、 或者R 7与R 8可以与所连接的N原子一起形成任选被R 9取代的5-6元含氮杂环；
R 9每次出现时各自独立地选自卤素、羟基、硝基、-NR 7R 8、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、任选被C 1-C 6烷基取代的哌啶基；
优选地，R 9每次出现时各自独立地选自甲基、-NR 7R 8、哌啶基；
R 13表示羧基取代的C 1-C 6烷基；
式(III)中，
L 1表示-NR 10-W-(CH 2CH 2-O-)n 1-(CH 2)n 2-NR 10-(C＝O)-CH 2OCH 2-(C＝O)-，n 1表示1～24的整数，n 2表示1～4的整数；
L 2表示缬氨酸残基、胍氨酸残基、苯丙氨酸残基、赖氨酸残基、D-缬氨酸残基、甘氨酸残基、丙氨酸残基、天冬氨酸残基；
L a表示-NR 10-(CH 2)n 3-、-NR 10-(CH 2)n 4-NR 10-(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-；
R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基；
n 3表示1～4的整数，n 4表示1～4的整数；
Aryl表示任选地被R 9取代的C 6-C 10芳基；
W为单键或 其中，位置①表示与-NR 10-相连，位置②表示与(CH 2CH 2-O-)n 1-相连；
式(IV)中，
Q 1为本发明第一方面所述化合物，其通过R 11的羧基与L 1式中的左端氨基-NR 10-形成酰胺键而连接，通过R 12的炔基碳与抗体铰链部的二硫键形成硫醚键而连接，
式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(III)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分。
在一些实施方案中，R 1表示氢、C 1-C 4烷基、被-NH(C 1-C 4烷基)取代的C 1-C 4烷基、被 取代的C 1-C 4烷基、被-SiMe 3取代的C 1-C 4烷基、-CH＝N-O-(C 3-C 6烷基)或-(CH 2) 2O(C＝O)(CH 2) 2(C＝O)OH。
在一些实施方案中，R 1表示氢、乙基、 取代的甲基、 -CH＝NO-叔丁基、-(CH 2) 2O(C＝O)(CH 2) 2(C＝O)OH、。
在一些实施方案中，R 2表示氢、C 3-C 4烯基、硝基、氨基、被-N(C 1-C 4烷基) 2取代的C 1-C 4烷基或被C 2-C 4烯基取代的C 1-C 4烷基。
在一些实施方案中，R 2表示氢、硝基、氨基、
在一些实施方案中，R 3表示氢、卤素、羟基、C 1-C 4烷基、
在一些实施方案中，R 3表示氢、F、羟基、甲基、
在一些实施方案中，R 4表示氢或卤素。
在一些实施方案中，R 4表示氢或F。
在一些实施方案中，R 1和R 2连接在一起形成以下所示的基团 其中 部分表示连接于母体基团的键。
在一些实施方案中，R 1和R 2连接在一起形成以下所示的基团 其中 部分表示连接于母体基团的键。
在一些实施方案中，R 3和R 4连接在一起形成以下所示的基团 其中 部分表示连接于母体基团的键。
在一些实施方案中，式(II)表示的化合物如下所示：
在一些实施方案中，式(IV)表示的化合物为吉马替康或吉咪替康，更优选为吉咪替康：
在一些实施方案中，L 1表示-NR 10-W-(CH 2CH 2-O-)n 1-(CH 2)n 2-NR 10-(C＝O)CH 2-O-CH 2-(C＝O)-，n 1表示4～12的整数(优选8)，n 2表示1～2的整数(优选2)，R 10表示氢或C 1-C 4烷基(优选甲基)。
在一些实施方案中，L 2表示赖氨酸残基。
在一些实施方案中，L a表示-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-，n 4表示1～2的整数，R 10表示氢或C 1-C 4烷基(优选甲基)，Aryl表示苯环基团，优选地，-NR 10-基团和-(CH 2)n 4-基团位于苯环的对位。
在一些实施方案中，L a表示
在一些实施方案中，式(III)表示的接头为选自以下所示的基团：
在一些实施方案中，对于一个抗体分子，所述接头-药物的平均连接数目为2～8个，优选为4～8个、更优选为6～8个，例如3.3、3.5、5.5、6.2、6.5、6.6、6.8、7.0、7.1、7.2、7.4、7.5或7.8个。
在一些实施方案中，所述抗体(AB)为全长抗体或其抗原结合片段，或双特异性抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体选自抗Her-2抗体、Trop-2抗体、EGFR抗体、B7-H3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、HER-3、HER-4抗体、CD20抗体、CD30抗体、CD19抗体、CD33抗体；优选地，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体；优选地，所述人源化抗体是全人源抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab') 2、单链Fv(scFv)、Fv和dsFv。
在一些实施方案中，所述抗体为抗TROP-2抗体，其中，所述抗Trop-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由KASQDVSIAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASYRYT氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYITPLT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由NYGMN氨基酸序列组成的CDR1，由WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列组成的CDR2，和由GGFGSSYWYFDV氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链和重链的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
在一些实施方案中，所述抗体为抗Her-2抗体，其中，所述抗Her-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由RASQDVNTAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASFLYS氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYTTPPT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由DTYIH 氨基酸序列组成的CDR1，由RIYPTNGYTRY氨基酸序列组成的CDR2，和由WGGDGFYAMDY氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Her-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
本发明的第四方面，提供一种式(VI)表示的接头-药物中间体化合物，其特征在于，T表示式(II)所示化合物，所述中间体化合物是将化合物(T)与下式(V)表示的接头连接而成的：
Q 1-L 1-L 2-L a-T (VI)
Q 1-L 1-L 2-L a- (V)
其中，
R 1、R 2、R 3、R 4的定义如的定义如本发明说明书所述；
L 1、L 2、L a的定义如本发明说明书所述；
Q 1为本发明第一方面所述化合物，其通过R 11的羧基与L 1式中的左端氨基-NR 10-形成酰胺键而连接，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(V)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分。
在一些实施方案中，所述式(II)所示的化合物如前所述。
在一些实施方案中，所述接头-药物中间体化合物是选自以下的化合物，
本发明的第五方面，提供通式(III)所示的接头结构：
-Q 1-L 1-L 2-L a- (III)
其中，Q 1、L 1、L 2、L a的定义的定义如本发明说明书所述。
本发明的第六方面，提供本发明第三方面的抗体-药物偶联物的制备方法，所述方法包括：
使式(VI)所示的接头-药物中间体化合物与AB-SH反应，以通过由抗体的铰链部的二硫键部分形成的硫醚键将式(VI)所示的接头-药物中间体化合物与抗体连接；
其中，R 1、R 2、R 3、R 4的定义如的定义如本发明说明书所述；
Q 1、L 1、L 2、L a的定义如的定义如本发明说明书所述；
T表示式(II)所示的化合物，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(V)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分；
AB-SH表示携带巯基的抗体，AB表示抗体。
本发明的第七方面，提供本发明第四方面的接头-药物中间体化合物的制备方法，所述方法包括：
(1)将N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N'-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]-L-赖氨酸(CN-CMTC-1)和PABOH溶解在二氯甲烷：甲醇的溶液中，在EEDQ的作用下反应，重结晶纯化得到产物；
(2)用哌啶乙腈溶液处理步骤(1)产物，而后纯化产物；
(3)用DCC，NHS与O-(2-叠氮乙基)-O-[2-(二羟乙酰基-氨基)乙基]七聚乙二醇(CN-CMTC-4)在DMF溶液中反应生成CN-CMTC-4活性酯；
(4)步骤(3)的活性酯与步骤(2)的产物反应生成化合物；
(5)吉咪替康-Boc或吉马替康-Boc用三光气，DMAP，与二氯甲烷作用生成甲酰氯化合物，再加入步骤(4)的反应化合物，后用TFA/DCM脱保护处理；
(6)步骤(5)的产物与本发明第一方面所述的化合物进行Click反应，用TFA/DCM处理后得最终产物；
任选地，步骤(6)还可用以下步骤替代：步骤(5)的产物与SM-1加入DMSO/H 2O的溶液中，再加入CuBr催化，反应完全，纯化后加入TFA/DCM脱保护，得最终产物；
所述SM-1为
本发明的第八方面，提供一种式(VIII)表示的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其特征在于，AB表示抗体，T表示式(II)所示化合物，所述抗体-药物偶联物是将化合物(T)与抗体(AB)经由下式(VII)表示的接头连接而成的：
AB-S-Q 2-L 3-L 4-L P-L b-T (VIII)
-Q 2-L 3-L 4-L P-L b- (VII)
其中，
式(II)中，
R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明说明书所述；
式(VII)中，
L 3表示-Z-W-(CH 2CH 2-O)n 5-W’-、-(CH 2)n 5’-C(＝O)-NR 10-(CH 2CH 2-O)n 5-或单键，n 5’表示1～3的整数，各n 5独立地表示1～8的整数，W、W’表示 或单键，其中，W的位置①表示与Z相连，位置②表示与(CH 2CH 2-O-)n 5-相连，W’的位置①表示与(CH 2CH 2-O-)n 5-相连，位置②表示与L 4的-CH 2-相连，且W、W’不同时为 Z表示-CH 2-Cyclo-C(＝O)-NR 10-或单键，Cyclo表示环己烷基团，
优选地，L 3表示 或单键，各n独立地表示1-6的整数(例如2)；
L 4表示-(CH 2)n 6-C(＝O)-或-(CH 2)n 6a-NR 10-C(＝O)-(CH 2)n 6b-O-(CH 2)n 6b-C(＝O)-，n 6表示1～6的整数，n 6a表示1～4的整数,n 6b表示1～3的整数，
L P表示由1～7个氨基酸构成的肽残基，
L b表示-NR 10-(CH 2)n 7-、-NR 10-(CH 2)n 7-O-、-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-、-NR 10-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-、-NR 10-(CH 2)n 8-O-(CH 2)n 8-(C＝O)-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-、-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-、-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-，各Aryl独立地表示任选地被R 9取代的C 6-C 10芳基，各n 7独立地表示1～4的整数，各n 8独立地表示1～4的整数，
R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基(优选甲基)，
Q 2表示-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-、或-Q 1-NR 10-，Q 1的定义如本发明第一方面所述化合物，Q 1通过R 11的羧基与-NR 10-形成酰胺键而与L 3连接，
式(VIII)中，
Q 2表示的-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-，如下式结构：
以该结构的3位与抗体连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头内的亚甲基连接，
或者Q 2表示的-Q 1-NR 10-，通过R 12的炔基碳与抗体铰链部的二硫键形成硫醚键而连接，
式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(VII)表示的接头中L b的右端-C(＝O)-、-O-或-CH 2-部分。
在一些实施方案中，式(II)表示的化合物如前所述。
在一些实施方案中，L P的肽残基为由选自丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸中的氨基酸形成的肽残基。
在一些实施方案中，L P的肽残基为由选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸中的氨基酸形成的肽残基。
在一些实施方案中，L P为由1-5个氨基酸构成的肽残基。
在一些实施方案中，L P为选自以下的肽残基：
-VA-；
-K-；
-GGFG-；
-VC-；
-EVC-；
-DVC；
-EGGFG-；
-DGGFG-。
在一些实施方案中，L P为选自以下的肽残基：
-K-；
-GGFG-；
-VC-；
-EVC-；
-DVC；
-EGGFG-；
-DGGFG-。
在一些实施方案中，L 4表示-(CH 2)n 6-C(＝O)-或-(CH 2)n 6a-NR 10-C(＝O)-(CH 2)n 6b-O-(CH 2)n 6b-C(＝O)-，n 6表示2～5的整数，n 6a表示1～3的整数,n 6b表示1～2的整数，R 10表示氢或C 1-C 4烷基(优选甲基)。
在一些实施方案中，L 4表示
在一些实施方案中，L b表示-NR 10-(CH 2)n 7-、-NR 10-(CH 2)n 7-O-、-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-C(＝O)-、、-NR 10-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-、-NR 10-(CH 2)n 8-O-(CH 2)n 8-(C＝O)-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-、-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-C(＝O)-、-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10- (C＝O)-，其中各R 10独立地表示氢或C 1-C 4烷基(优选甲基)，各n 7独立地表示1～2的整数，各n 8独立地表示1～2的整数，Aryl表示苯环基团。
在一些实施方案中，L b表示
在一些实施方案中，-NR 10-基团和-(CH 2)n 8-基团位于苯环的对位。
在一些实施方案中，式(VII)表示的接头为选自以下所示的基团，其中，各n独立地表示1-8的整数：
在一些实施方案中，对于一个抗体分子，所述接头-药物的平均连接数目为2～8个，优选为4～8个、更优选为6～8个，例如3.3、3.5、5.5、6.2、6.5、6.6、6.8、7.0、7.1、7.2、7.4、7.5或7.8个。
在一些实施方案中，所述抗体(AB)为全长抗体或其抗原结合片段，或双特异性抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体选自抗Her-2抗体、Trop-2抗体、EGFR抗体、B7-H3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、HER-3、HER-4抗体、CD20抗体、CD30抗体、CD19抗体、CD33抗体；优选地，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体；优选地，所述人源化抗体是全人源抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab') 2、单链Fv(scFv)、Fv和dsFv。
在一些实施方案中，所述抗体为抗TROP-2抗体，其中，所述抗Trop-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由KASQDVSIAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASYRYT氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYITPLT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由NYGMN氨基酸序列组成的CDR1，由WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列组成的CDR2，和由GGFGSSYWYFDV氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链和重链的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
在一些实施方案中，所述抗体为抗Her-2抗体，其中，所述抗Her-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由RASQDVNTAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASFLYS氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYTTPPT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由DTYIH氨基酸序列组成的CDR1，由RIYPTNGYTRY氨基酸序列组成的CDR2，和由WGGDGFYAMDY氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Her-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
本发明的第九方面，提供一种式(X)表示的接头-药物中间体化合物，其特征在于，T表示式(II)所示化合物，所述中间体化合物是将化合物(T)与下式(IX)表示的接头连接而成的：
Q’ 2-L 3-L 4-L P-L b-T (X)
Q’ 2-L 3-L 4-L P-L b- (IX)
其中，
R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明说明书所述；
Q’ 2表示(马来酰亚胺-N)-或Q 1-NR 10-，Q 1的定义如本发明第一方面所述化合物，；
L 3、L 4、L P、L b的定义如本发明说明书所述；
R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基；
式(IX)中，
Q’ 2表示的(马来酰亚胺-N)-，如下式结构：
以该结构在1位的氮原子上与包含该结构的接头内的亚甲基连接，或者Q’ 2表示的Q 1-NR 10-，Q 1通过R 11的羧基与-NR 10-形成酰胺键而与L 3连接；
式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(IX)表示的接头中L b的右端-C(＝O)-、-O-或-CH 2-部分。
在一些实施方案中，所述式(II)所示的化合物如前所述。
在一些实施方案中，所述接头-药物中间体化合物是选自以下的化合物，其中，各n独立地表示1-8的整数：
本发明的第十方面，提供一种提供通式(VII)所示的接头结构：
-Q 2-L 3-L 4-L P-L b- (VII)
其中，Q 2、L 3、L 4、L P、L b的定义如本发明说明书所述。
本发明的第十一方面，提供本发明第八方面的抗体-药物偶联物的制备方法，所述方法包括：
使式(X)所示的接头-药物中间体化合物与AB-SH反应，以通过由抗体的铰链部的二硫键部分形成的硫醚键将式(X)所示的接头-药物中间体化合物与抗体连接；
其中，R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明说明书所述；
Q 2、Q’ 2、L 3、L 4、L P、L b的定义如本发明说明书所述；
T表示式(II)所示的化合物，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(IX)表示的接头中L b的右端-C(＝O)-、-O-或-CH 2-部分；
AB-SH表示携带巯基的抗体，AB表示抗体。
本发明的第十二方面，提供本发明第九方面的接头-药物中间体化合物的制备方法。
在某些实施方式中，包括如下步骤：
(1)Boc-GGFG与PABOH在EEDQ的作用下，二氯甲烷与甲醇作溶剂，室温搅拌过夜，生成Boc-GGFG-PABOH；
(2)Boc-GGFG-PABOH在TFA/DCM的作用下脱掉Boc生成GGFG-PABOH；
(3)GGFG-PABOH与N 3-PEGn-NHS活性酯反应生成N 3-PEGn-GGFG-PABOH，n＝0，2，4，6或8；
(4)吉咪替康-Boc、SN-38-Boc或吉马替康与DMAP，三光气在二氯甲烷的溶剂中反应5mins，加入步骤(3)的N 3-PEGn-GGFG-PABOH，生成N 3-PEGn-GGFG-PABC-吉咪替康-Boc，或N 3-PEGn-GGFG-PABC-SN-38-Boc，或N 3-PEGn-GGFG-PABC-吉马替康，
(5)步骤(4)产物与炔烃-马来酰亚胺(n＝2,4,6,8时)或炔烃-PEGm-马来酰亚胺(n＝0)用Click的条件得最终化合物，m＝2,4,6,8。
在另一些实施方式中，包括如下步骤：
(1)Boc-GGFG在TFA/DCM的作用下脱掉Boc，除掉TFA与二氯甲烷后，与N 3-PEGn-NHS在二氯甲烷中反应，用DIEA做碱，得到化合物N 3-PEGn-GGFG，n＝0，2，4，6或8；
(2)N 3-PEGn-GGFG与N-Boc-N-甲基乙二胺缩合，再用TFA/DCM脱掉Boc后，得化合物N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-NH-CH 3；
(3)N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-NH-CH 3与吉咪替康-PNP(或吉马替康-PNP，SN-38-PNP)在TEA，DMF的条件下反应得化合物N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-N(CH 3)-C(O)-吉咪替康(或SN-38，或吉马替康-PNP)，
(4)步骤(3)产物与炔烃-马来酰亚胺(n＝2,4,6,8时)或炔烃-PEGm-马来酰亚胺(n＝0)用Click的条件得最终化合物，m＝2,4,6,8。
本发明的第十三方面，提供式(XI)、(XII)的中间体化合物：
Q 1-L 1-L 2-L a-H (XI)
Q 2-L 3-L 4-L P-L b-H (XII)
本发明的第十四方面，提供一种药物组合物，其包含本发明第三方面、第八方面的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，以及任选的药学上可接受的载体。
本发明的第十五方面，提供一种药物制剂，其包含本发明第三方面、第八方面的所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物。
本发明的第十六方面，提供本发明第三方面、第八方面的所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、第十四方面所述的药物组合物或第十五方面所述的药物制剂，其用于预防和/或治疗肿瘤或癌症；
或者，提供本发明第三方面、第八方面的所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、第十四方面所述的药物组合物或第十五方面所述的药物制剂在制备预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述的肿瘤或癌症选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肾癌、尿道癌、胶质细胞瘤、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌；优选地，所述癌症是原位癌或转移癌；优选地，所述乳腺癌为三阴交乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌。
本发明的第十七方面，提供一种预防或治疗肿瘤或癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明第三方面、第八方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、第十四方面所述的药物组合物或第十五方面所述的药物制剂。
在一些实施方案中，所述的肿瘤或癌症选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肾癌、尿道癌、胶质细胞瘤、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌；优选地，所述癌症是原位癌或转移癌；优选地，所述乳腺癌为三阴交乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌。
本发明的第十八方面，提供第三方面、第八方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、第十四方面所述的药物组合物或第十五方面所述的药物制剂用于制备试剂的用途，所述试剂用于抑制癌细胞生长、增殖或迁移。
本发明的第十九方面，提供第三方面、第八方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、第十四方面所述的药物组合物或第十五方面所述的药物制剂，其用于抑制癌细胞的生长、增殖或迁移。
本发明的第二十方面，提供一种抑制癌细胞生长、增殖或迁移的方法，其包括给癌细胞施用有效量的本发明第三方面、第八方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、第十四方面所述的药物组合物或第十五方面所述的药物制剂。
本发明的第二十一方面，提供一种抑制癌细胞生长、增殖或迁移的试剂盒，其包括本发明第三方面、第八方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、第十四方面所述的药物组合物或第十五方面所述的药物制剂。
本发明的第二十二方面，提供式(IV)表示的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，AB表示抗体，T表示式(II)所示化合物，所述抗体-药物偶联物是将化合物(T)与抗体(AB)经由下 式(III)表示的接头连接而成的：
AB-S-Q 1-L 1-L 2-L a-T (IV)
-Q 1-L 1-L 2-L a- (III)
其中，
式(II)中，
R 1选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、被-OC(＝O)R 13或-NR 7R 8取代的C 1-C 6烷基、被-SiMe 3取代的C 1-C 6烷基、或-CH＝N-O-(C 1-C 6烷基)；
R 2选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、饱和或不饱和C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、或被-NR 7R 8取代的C 1-C 6烷基；
R 3选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、或-NR 7R 8C(＝O)O-基；
R 4选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、或C 1-C 6烷氧基；
或者R 1和R 2可以连接在一起与母体部分形成任选被R 9取代的5-6元环；
或者R 3和R 4可以连接在一起与母体部分形成任选被R 9取代的5-6元含氧杂环；
R 7和R 8每次出现时各自独立地选自氢、C 1-C 6烷基、被羟基或氨基取代的C 1-C 6酰基；或者R 7与R 8可以与所连接的N原子一起形成任选被R 9取代的5-6元含氮杂环；
R 9每次出现时各自独立地选自卤素、羟基、硝基、-NR 7R 8、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、任选被C 1-C 6烷基取代的哌啶基；
R 13表示羧基取代的C 1-C 6烷基；
式(III)中，
L 1表示-NR 10-W-(CH 2CH 2-O-)n 1-(CH 2)n 2-NR 10-(C＝O)-CH 2OCH 2-(C＝O)-，n 1表示1～24的整数，n 2表示1～4的整数；
L 2表示缬氨酸残基、胍氨酸残基、苯丙氨酸残基、赖氨酸残基、D-缬氨酸残基、甘氨酸残基、丙氨酸残基、天冬氨酸残基；
L a表示-NR 10-(CH 2)n 3-、-NR 10-(CH 2)n 4-NR 10-(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-；
R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基，n 3表示1～4的整数，n 4表示1～4的整数；
Aryl表示任选地被R 9取代的C 6-C 10芳基；
W为单键或 其中，位置①表示与-NR 10-相连，位置②表示与(CH 2CH 2-O-)n 1-相连；
式(IV)中，
Q 1为本发明第一方面所述化合物，其通过R 11的羧基与L 1式中的左端氨基-NR 10-形成酰胺键而连接，通过R 12的炔基碳与抗体铰链部的二硫键形成硫醚键而连接，
式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3 或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(III)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分。
在一些实施方案中，R 1表示氢、C 1-C 4烷基、被-NH(C 1-C 4烷基)取代的C 1-C 4烷基、被 取代的C 1-C 4烷基、被-SiMe 3取代的C 1-C 4烷基、-CH＝N-O-(C 3-C 6烷基)或-(CH 2) 2O(C＝O)(CH 2) 2(C＝O)OH。
在一些实施方案中，R 2表示氢、C 3-C 4烯基、硝基、氨基、或被-N(C 1-C 4烷基) 2取代的C 1-C 4烷基。
在一些实施方案中，R 3表示氢、卤素、羟基、或
在一些实施方案中，R 4表示氢或卤素。
在一些实施方案中，R 1和R 2连接在一起形成以下所示的基团 其中 部分表示连接于母体基团的键。
在一些实施方案中，R 3和R 4连接在一起形成以下所示的基团 其中 部分表示连接于母体基团的键。
在一些实施方案中，式(II)表示的化合物如下所示：
优选地，式(II)表示的化合物为吉马替康或吉咪替康，更优选为吉咪替康：
在一些实施方案中，L 1表示-NR 10-W-(CH 2CH 2-O-)n 1-(CH 2)n 2-NR 10-(C＝O)CH 2-O-CH 2-(C＝O)-，n 1表示4～12的整数，n 2表示1～2的整数，R 10表示氢或C 1-C 4烷基。
在一些实施方案中，L 2表示赖氨酸残基。
在一些实施方案中，L a表示-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-，n 4表示1～2的整数，R 10表示氢或C 1-C 4烷基，Aryl表示苯环基团，优选地，-NR 10-基团和-(CH 2)n 4-基团位于苯环的对位。
在一些实施方案中，式(III)表示的接头为选自以下所示的基团：
在一些实施方案中，对于一个抗体分子，所述接头-药物的平均连接数目为2～8个，优选为4～8个、更优选为6～8个。
在一些实施方案中，所述抗体(AB)为全长抗体或其抗原结合片段，或双特异性抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体选自抗He-r2抗体、Trop-2抗体、EGFR抗体、B7-H3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、HER-3、HER4抗体、CD20抗体、CD30抗体、CD19抗体、CD33抗体。
在一些实施方案中，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体；优选地，所述人源化抗体是全人源抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab') 2、单链Fv(scFv)、Fv和dsFv。
在一些实施方案中，所述抗体为抗TROP-2抗体，其中，所述抗Trop-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由KASQDVSIAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASYRYT氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYITPLT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由NYGMN氨基酸序列组成的CDR1，由WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列组成的CDR2，和由GGFGSSYWYFDV氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链和重链的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
在一些实施方案中，所述抗体为抗Her-2抗体，其中，所述抗Her2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由RASQDVNTAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASFLYS氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYTTPPT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由DTYIH氨基酸序列组成的CDR1，由RIYPTNGYTRY氨基酸序列组成的CDR2，和由WGGDGFYAMDY氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Her2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
本发明的第二十三方面，提供式(VI)表示的接头-药物中间体化合物，其中，T表示式(II)所示化合物，所述中间体化合物是将化合物(T)与下式(V)表示的接头连接而成的：
Q 1-L 1-L 2-L a-T (VI)
Q 1-L 1-L 2-L a- (V)
其中，
R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明第二十二方面所述；
L 1、L 2、L a的定义如本发明第二十二方面所述；
Q 1为本发明第一方面所述化合物，其通过R 11的羧基与L 1式中的左端氨基-NR 10-形成酰胺键而连接，
式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(V)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分。
在一些实施方案中，所述式(II)所示的化合物如本发明第二十二方面所述。
在一些实施方案中，所述接头-药物中间体化合物是选自以下的化合物，
本发明的第二十四方面，提供接头，其中，其为下式(III)表示，
-Q 1-L 1-L 2-L a- (III)
其中，Q 1、L 1、L 2、L a的定义如本发明第二十二方面所述。
在一些实施方案中，所述接头为选自本发明第二十二方面中的接头。
本发明的第二十五方面，提供式(VIII)表示的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，AB表示抗体，T表示式(II)所示化合物，所述抗体-药物偶联物是将化合物(T)与抗体(AB)经由下式(VII)表示的接头连接而成的：
AB-S-Q 2-L 3-L 4-L P-L b-T (VIII)
-Q 2-L 3-L 4-L P-L b- (VII)
其中，
式(II)中，
R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明第二十二方面所述；
式(VII)中，
L 3表示-Z-W-(CH 2CH 2-O)n 5-W’-或单键，n 5表示1～8的整数，W、W’表示 或单键，其中，W的位置①表示与Z相连，位置②表示与(CH 2CH 2-O-)n 5-相连，W’的位置①表示与(CH 2CH 2-O-)n 5-相连，位置②表示与L 4的-CH 2-相连相连，且W、W’不同时为 Z表示-CH 2-Cyclo-C(＝O)-NR 10-或单键，Cyclo表示环己烷基团；
L 4表示-(CH 2)n 6-C(＝O)-，n 6表示1～6的整数；
L P表示由2～7个氨基酸构成的肽残基；
L b表示-NR 10-(CH 2)n 7-、-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-，Aryl表示任选地被R 9取代的C 6-C 10芳基，n 7表示1～4的整数，n 8表示1～4的整数；
R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基；
Q 2表示-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-、或-Q 1-NR 10-，Q 1为本发明第一方面所述化合物，Q 1通过R 11的羧基与-NR 10-形成酰胺键而与L 3连接；
式(VIII)中，
Q 2为-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-，如下式结构：
以该结构的3位与抗体连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头内的亚甲基连接，或者Q 2为-Q 1-NR 10-，通过R 12的炔基碳与抗体铰链部的二硫键形成硫醚键而连接，
式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(VII)表示的接头中L b的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分。
在一些实施方案中，式(II)表示的化合物如本发明第二十二方面中所述。
在一些实施方案中，L P的肽残基为由选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸中的氨基酸形成的肽残基。
在一些实施方案中，L P为由2-5个氨基酸构成的肽残基。
在一些实施方案中，L P为选自以下的肽残基：
-GGFG-；
-VC-；
-EVC-；
-DVC；
-EGGFG-；
-DGGFG-。
在一些实施方案中，L 4表示-(CH 2)n 6-C(＝O)-，n 6表示2～5的整数。
在一些实施方案中，L b表示-NR 10-(CH 2)n 7-、-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-C(＝O)-、-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-C(＝O)-，其中R 10表示氢或C 1-C 4烷基，n 7表示1～2的整数，n 8表示1～2的整数，Aryl表示苯环基团。
在一些实施方案中，-NR 10-基团和-(CH 2)n 8-基团位于苯环的对位。
在一些实施方案中，式(VII)表示的接头为选自以下所示的基团：
在一些实施方案中，对于一个抗体分子，所述接头-药物的平均连接数目为2～8个，优选为4～8个、更优选为6～8个。
在一些实施方案中，所述抗体(AB)为全长抗体或其抗原结合片段，或双特异性抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体选自抗Her-2抗体、Trop-2抗体、EGFR抗体、B7-H3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、HER3、HER4抗体、CD20抗体、CD30抗体、CD19抗体、CD33抗体。
在一些实施方案中，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体；优选地，所述人源化抗体是全人源抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab') 2、单链Fv(scFv)、Fv和dsFv。
在一些实施方案中，所述抗体为抗TROP-2抗体，其中，所述抗Trop-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由KASQDVSIAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASYRYT氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYITPLT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由NYGMN氨基酸序列组成的CDR1，由WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列组成的CDR2，和由GGFGSSYWYFDV氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链和重链的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
在一些实施方案中，所述抗体为抗Her-2抗体，其中，所述抗Her2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由RASQDVNTAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASFLYS氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYTTPPT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由DTYIH氨基酸序列组成的CDR1，由RIYPTNGYTRY氨基酸序列组成的CDR2，和由WGGDGFYAMDY氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Her2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
本发明的第二十六方面，提供式(X)表示的接头-药物中间体化合物，其中，T表示式(II)所示化合物，所述中间体化合物是将化合物(T)与下式(IX)表示的接头连接而成的：
Q’ 2-L 3-L 4-L P-L b-T (X)
Q’ 2-L 3-L 4-L P-L b- (IX)
其中，
R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明第二十二方面所述；
Q’ 2表示(马来酰亚胺-N)-或Q 1-NR 10-，Q 1为本发明第一方面所述化合物，；
L 3、L 4、L P、L b的定义如本发明第二十五方面所述；
R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基；
式(IX)中，
Q’ 2表示(马来酰亚胺-N)-，如下式结构：
以该结构在1位的氮原子上与包含该结构的接头内的亚甲基连接，或者Q’ 2表示Q 1-NR 10-，Q 1通过R 11的羧基与-NR 10-形成酰胺键而与L 3连接；
式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(IX)表示的接头中L b的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分。
在一些实施方案中，所述式(II)所示的化合物如本发明第二十二方面所述。
在一些实施方案中，所述接头-药物中间体化合物是选自以下的化合物：
本发明的第二十七方面，提供接头，其中，其为下式(VII)表示
-Q’ 2-L 3-L 4-L P-L b- (VII)
其中，Q’ 2、L 3、L 4、L P、L b的定义如本发明第二十五方面或第二十六方面所述。
在一些实施方案中，所述接头为选自本发明第二十五方面的结构。
本发明的第二十八方面，提供一种药物组合物，其包含本发明第二十二方面或第二十五方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，以及任选的药学上可接受的载体。
本发明的第二十九方面，提供一种药物制剂，其包含本发明第二十二方面或第二十五方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物。
本发明的第三十方面，提供本发明第二十二方面或第二十五方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、本发明第二十八方面的药物组合物和/或本发明第二十九方面所述的药物制剂的用途，其用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。
在一些实施方案中，所述的肿瘤或癌症选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肾癌、尿道癌、胶质细胞瘤、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌；优选地，所述癌症是原位癌或转移癌；优选地，所述乳腺癌为三阴交乳腺癌。
本发明的第三十一方面，提供一种预防或治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明第二十二方面或第二十五方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、本发明第二十八方面的药物组合物和/或本发明第二十九方面所述的药物制剂。
本发明的第三十二方面，提供本发明第二十二方面或第二十五方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、本发明第二十八方面的药物组合物和/或本发明第二十九方面所述的药物制剂的用途，所述试剂用于抑制癌细胞生长、增殖或迁移。
本发明的第三十三方面，提供本发明第二十二方面或第二十五方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、本发明第二十八方面的药物组合物和/或本发明第二十九方面所述的药物制剂，其用于抑制癌细胞的生长、增殖或迁移。
本发明的第三十四方面，提供一种抑制癌细胞生长、增殖或迁移的方法，其包括给癌细胞施用有效量本发明第二十二方面或第二十五方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、本发明第二十八方面的药物组合物和/或本发明第二十九方面所述的药物制剂。
本发明的第三十五方面，提供一种抑制癌细胞生长、增殖或迁移的试剂盒，其包括本发明第二十二方面或第二十五方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、本发明第二十八方面的药物组合物和/或本发明第二十九方面所述的药物制剂。
本发明的第三十六方面，提供本发明第二十二方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物的制备方法，所述方法包括：
使式(VI)所示的接头-药物中间体化合物与AB-SH反应，以通过由抗体的铰链部的二硫键部分形成的硫醚键将式(VI)所示的接头-药物中间体化合物与抗体连接；
其中，R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明第二十二方面所述；
Q 1、L 1、L 2、L a的定义如本发明第二十二方面所述；
T表示式(II)所示的化合物，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(V)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分；
AB-SH表示携带巯基的抗体，AB表示抗体。
本发明的第三十七方面，提供本发明第二十三方面接头-药物中间体化合物的制备方法，所述方法包括：
(1)将N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N'-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]-L-赖氨酸(CN-CMTC-1)和PABOH溶解在二氯甲烷：甲醇的溶液中，在EEDQ的作用下反应，重结晶纯化得到产物；
(2)用哌啶乙腈溶液处理步骤(1)产物，而后纯化产物；
(3)用DCC，NHS与O-(2-叠氮乙基)-O-[2-(二羟乙酰基-氨基)乙基]七聚乙二醇(CN-CMTC-4)在DMF溶液中反应生成CN-CMTC-4活性酯；
(4)步骤(3)的活性酯与步骤(2)的产物反应生成化合物；
(5)吉咪替康-Boc或吉马替康-Boc用三光气，DMAP，与二氯甲烷作用生成甲酰氯化合物，再加入步骤(4)的反应化合物，后用TFA/DCM脱保护处理；
(6)步骤(5)的产物与本发明第一方面所述的化合物进行Click反应，用TFA/DCM处理后得最终产物；
任选地，步骤(6)还可用以下步骤替代：步骤(5)的产物与SM-1加入DMSO/H 2O的溶液中，再加入CuBr催化，反应完全，纯化后加入TFA/DCM脱保护，得最终产物；
所述SM-1为
本发明的第三十八方面，提供本发明第二十五方面所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂 合物的制备方法，所述方法包括：
使式(X)所示的接头-药物中间体化合物与AB-SH反应，以通过由抗体的铰链部的二硫键部分形成的硫醚键将式(X)所示的接头-药物中间体化合物与抗体连接；
其中，R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明第二十二方面所述；
Q 2、Q’ 2、L 3、L 4、L P、L a的定义如本发明第二十五或第二十六方面所述；
T表示式(II)所示的化合物，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(V)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分；
AB-SH表示携带巯基的抗体，AB表示抗体。
本发明的第三十九方面，提供本发明第二十六方面的接头-药物中间体化合物的制备方法，所述方法包括：
方案A：
(1)Boc-GGFG与PABOH在EEDQ的作用下，二氯甲烷与甲醇作溶剂，室温搅拌过夜，生成Boc-GGFG-PABOH；
(2)Boc-GGFG-PABOH在TFA/DCM的作用下脱掉Boc生成GGFG-PABOH；
(3)GGFG-PABOH与N 3-PEGn-NHS活性酯反应生成N 3-PEGn-GGFG-PABOH，n＝0，2，4，6或8；
(4)吉咪替康-Boc、SN-38-Boc或吉马替康与DMAP，三光气在二氯甲烷的溶剂中反应，加入步骤(3)的N 3-PEGn-GGFG-PABOH，生成N 3-PEGn-GGFG-PABC-吉咪替康-Boc，或N 3-PEGn-GGFG-PABC-SN-38-Boc，或N 3-PEGn-GGFG-PABC-吉马替康，
(5)步骤(4)产物与炔烃-马来酰亚胺(n＝2,4,6,8时)或炔烃-PEGm-马来酰亚胺(n＝0)用Click反应得最终化合物，m＝2,4,6,8；或者，
方案B：
(1)Boc-GGFG在TFA/DCM的作用下脱掉Boc，除掉TFA与二氯甲烷后，与N 3-PEGn-NHS在二氯甲烷中反应，用DIEA做碱，得到化合物N 3-PEGn-GGFG，n＝0，2，4，6或8；
(2)N 3-PEGn-GGFG与N-Boc-N-甲基乙二胺缩合，再用TFA/DCM脱掉Boc后，得化合物N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-NH-CH 3；
(3)N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-NH-CH 3与吉咪替康-PNP(或吉马替康-PNP，SN-38-PNP)在有TEA，DMF的条件下反应得化合物N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-N(CH 3)-C(O)-吉咪替康(或SN-38，或吉马替康)，
(4)步骤(3)产物与炔烃-马来酰亚胺(n＝2，4，6，8时)或炔烃-PEGm-马来酰亚胺(n＝0)用Click反应得最终化合物，m＝2，4，6，8。
附图说明
图1为ADC-1的SEC-HPLC结果。
图2为ADC-5的SEC-HPLC图谱。
图3为ADC-6的SEC-HPLC图谱。
图4为ADC-8的SEC-HPLC图谱。
图5为ADC-10的SEC-HPLC图谱。
图6为ADC-11的SEC-HPLC图谱。
图7为ADC-12的SEC-HPLC图谱。
图8为ADC-13的SEC-HPLC图谱。
图9为ADC-14的SEC-HPLC图谱。
图10为ADC-15的SEC-HPLC图谱。
图11为ADC-16的SEC-HPLC图谱。
图12为ADC-17的SEC-HPLC图谱。
图13为ADC-5小分子的释放-出峰定位图。
图14为ADC-5小分子的释放-折线图。
图15为CL2A-CM样品中主峰面积百分比变化。
图16为CL2A-CM样品中CM峰面积百分比变化。
图17为ADC-5样品中主峰面积百分比变化。
图18为ADC-5样品中CM峰面积百分比变化。
图19为4种ADC对BXPC-3细胞活性的抑制结果。
图20为待测药在BxPC-3上的IC50。
图21为待测药在COLO 205上的IC50。
图22为待测药在Calu-3上的IC50。
图23为待测药在Calu-6上的IC50。
图24为待测药在NCI-N87上的IC50。
图25为ADC-5在BxPC-3肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
图26为ADC-5对BxPC-3模型体重的影响。
图27为ADC-137、ADC-5在COLO 205肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
图28为ADC-137、ADC-5对COLO 205模型体重的影响。
图29为ADC-137、ADC-5在BxPC-3肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
图30为ADC-137、ADC-5对BxPC-3模型体重的影响。
图31为ADC-137、ADC-5在Calu-3肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
图32为ADC-137、ADC-5对Calu-3模型体重的影响。
图33为ADC-137、ADC-5在Capan-1肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
图34为ADC-137、ADC-5对Capan-1模型体重的影响。
图35为ADC-16、ADC-5和ADC-17对COLO 205模型体重的影响。
图36为ADC-16、ADC-5和ADC-17在COLO 205肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
图37为ADC-8、ADC-11、ADC-5和ADC-12在BxPC-3肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
图38为ADC-8、ADC-11、ADC-5和ADC-12对BxPC-3模型体重的影响。
具体实施方式
定义
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明中，“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR1-3)。
本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本发明中，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab') 2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，Methods in Molecular Biology，Vol 207:Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约10 7-10 8M -1的Ka)抗原的抗体。“功能片段”或“抗Her-2抗体的类似物”是可防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段”含义相同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab') 2等等。“Fv”片段由一条重链的可变结构域和一条轻链的可变结构域以非共价结合方式而形成的二聚体(V H-V L二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDRs相互作用，以确定V H-V L二聚体表面上的靶结合位点，与完整抗体的情况一样。所述六个CDRs共同赋予完整抗体的靶结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包括3个靶特异的CDRs的Fv的一半)，仍可具有识别和结合靶的能力。
本发明中，术语“双特异性”(Bispecific antibody，BsAb)指抗体和/或抗原结合分子能够特异性结合两种不同的抗原性决定簇，通常，双特异性抗体和/或抗原结合分子包含两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗体和/或抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
本发明中，“单克隆抗体”或“单抗”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
本发明中，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH 1-CH 2-CH 3或VH-CH 1-CH 2-CH 3-CH 4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab') 2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白 的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过一个或两个。因此，本发明所述人源化抗体还涵盖CDR内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。
本发明中，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1×10 7M -1或1x10 8M -1或更大的亲和常数Ka(或者1x10 -7M或1×10 -8M或更低的解离常数(Kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购。
本发明中，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。如本文所使用，术语“核酸分子”意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cDNA。
本发明中，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
本发明中，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如，启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸，从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。
本发明中，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
本发明中，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。
本发明中，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
本发明中，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
本发明中，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。 表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
本发明所述的“药物(药物化合物)”，即“毒素”，指细胞毒性药物，即式(I)所示的化合物(抗肿瘤化合物)，能在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞凋亡。该术语包括毒素，如真菌、细菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如I 131、Y 90、Re 186、I 125)，毒性药物，化疗药物，抗生素和核溶酶，优选为毒性药物，更优选喜树碱类衍生物，更优选吉咪替康、吉马替康。
本发明中，“C a-C b”(a和b表示1以上的整数，a＜b)包括a至b个碳的任何一种具体情况，例如C 1-C 6包括C 1、C 2、C 3、C 4、C 5、C 6，也包括a至b中的任何一个范围，例如C 1-C 6包括C 1-C 3、C 1-C 4、C 1-C 5、C 2-C 5、C 2-C 4、C 3-C 6等；同理，“a-b元环”(a和b表示1以上的整数，a＜b)表示成环原子数为a至b个的环结构，例如3-6元环包括3元环、4元环、5元环、6元环，也包括a至b中的任何一个范围，例如3-6元环包括3-4元环、3-5元环、4-6元环、4-5元环等。
本发明中，“卤素”是指氟、氯、溴、碘。
本发明中，“C 1-C 6烃基”是指从含有1-6个碳原子的烷烃部分去除一个氢原子而衍生得到的直链或支链的烷基，具体地，本发明中的“C 1-C 6烃基”可以是饱和的，即“C 1-C 6烷基”，C 1-6烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1-甲基-2-甲基丙基等；所述“C 1-4烷基”是指从含有1-4个碳原子的烷烃部分去除一个氢原子而衍生得到的直链或支链的烷基，具体地，C 1-4烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。本发明中的“C 1-C 6烃基”可以是不饱和的，例如“C 2-C 6烯基”，“C 3-C 4烯基”，“C 3-C 4烯基”包括但不限于丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基等。
本发明中，“C 1-6烷氧基”是指上文所定义的“C 1-6烷基”经由氧原子与分子其余部分连接的基团，即“C 1-6烷基-O-”基团，具体的，包括但不限于，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基、正己氧基等；所述的“C 1-4烷氧基”是指上文所定义的“C 1-4烷基”通过氧原子与分子其余部分连接的基团，即“C 1-4烷基-O-”基团，具体地，包括但不限于，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。
本发明中，“5-6元环”是指具有5-6个成环原子的非芳香性环状结构，所述成环原子可以均为碳原子，从而形成碳环；还可以含有1-3个各自独立地选自N、O或S的环杂原子，从而形成杂环(例如，含氧杂环、含氮杂环、含硫杂环)；所述5-6元环可以为饱和结构，还可以为含有1或2个碳碳双键或碳碳三键的不饱和结构。
本发明中，“5-6元含氮杂环”包括但不限于哌啶、哌嗪，优选哌啶。
本发明中，“C 6-C 10芳基”是指具有6-10个成环碳原子的芳香性环状烃基，其可以是一价基团或根据需要的二价以上的基团，包括单环芳基和稠环芳基，“稠环芳基”是指基团中的每个环与其他环共用相邻一对环碳原子的含有多个环(例如含有2个)的芳基。本发明中，“C 6-C 10元芳基”可以具体列举出苯基、萘基。
本发明中，结构式中的 表示作为该部分或取代基与核心或骨架结构的连接点的键。
本发明所述“接头”、“接头结构”或“连接子”或“连接单元”是指一端与抗体连接而另一端与药物(药物化合物)相连的化学结构片段或键，也可以连接其它接头后再与药物化合物相连。本发 明的接头结构可以通过本领域已知方法合成，也可使用本发明所述的方法进行合成。
本发明所述“抗体-药物偶联物”，即ADC，指配体通过稳定的连接单元与具有生物活性的药物相连。在本发明中是指将单克隆抗体或者片段通过接头结构与具有生物活性的毒性药物相连。
本发明中，“药学上可接受的盐”是指相对无毒的本发明的偶联物的酸加成盐或碱加成盐。所述酸加成盐为本发明的偶联物与合适的无机酸或者有机酸形成的盐，这些盐可通过使本发明的偶联物与适宜的有机酸或无机酸在适当的溶剂中进行反应来制备。代表性酸加成盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月硅酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、碳酸盐、碳酸氢盐、甲苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、鞣酸盐、扑酸盐、藻酸盐、萘磺酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。所述碱加成盐为本发明的偶联物与合适的无机碱或者有机碱形成的盐，这些盐可通过使本发明的偶联物与适宜的无机碱或者有机碱在适当的溶剂中进行反应来制备。代表性碱加成盐包括例如与碱金属、碱土金属、季铵阳离子形成的盐，例如钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐、四甲基季铵盐、四乙基季铵盐等；胺盐，包括与氨(NH 3)、伯胺、仲胺或叔胺形成的盐，如甲胺盐、二甲胺盐、三甲胺盐、三乙胺盐、乙胺盐等。
本发明的偶联物可以存在特定的几何或立体异构体形式，本发明的偶联物中，手性中心可以存在于抗肿瘤化合物(式(I)所示的化合物)中，可以存在于接头结构(式(II)所示的接头)中，还可以存在于抗体及其衍生物中。本发明中，所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，均包括在本发明的范围之内。
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本发明的偶联物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
本发明中，本发明的偶联物的溶剂合物(例如水合物)也在本发明的范围内。作为适当的溶剂合物，具体而言，可以列举本发明的偶联物与丙酮、2-丁醇、2-丙醇、乙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、二乙醚等形成的溶剂合物。还可以列举出水合物或乙醇化物。
本发明中，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的ADC以及本文所提供的药物组合物、药物制剂的任何药学用途。
本发明中，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
本发明中，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
本发明中，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
本文中提及的文献均以其整体援引加入本文中。
[抗肿瘤化合物]
以下，对于连接于本发明的抗体-药物偶联物的抗肿瘤化合物进行说明。作为抗肿瘤化合物，只要是具有抗肿瘤效果的化合物、具有能连接于接头结构的取代基的化合物即可，没有特别限制。对于抗肿瘤化合物而言，接头的一部分或全部在肿瘤细胞内被切断而游离出抗肿瘤化合物部分从而显示抗肿瘤效果。在与药物的连接部分切断接头时，以抗肿瘤化合物的本来的结构游离出抗肿瘤化合物，发挥其本来的抗肿瘤效果。
本发明中的抗肿瘤化合物为下式(II)表示的化合物。
式(II)中，
R 1选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、被-OC(＝O)R 13或-NR 7R 8取代的C 1-C 6烷基、被-SiMe 3取代的C 1-C 6烷基、或-CH＝N-O-(C 1-C 6烷基)；
R 2选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、饱和或不饱和C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、或被-NR 7R 8取代的C 1-C 6烷基；
R 3选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、或-NR 7R 8C(＝O)O-基；
R 4选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、或C 1-C 6烷氧基；
或者R 1和R 2可以连接在一起与母体部分形成任选被R 9取代的5-6元环；
或者R 3和R 4可以连接在一起与母体部分形成任选被R 9取代的5-6元含氧杂环；
R 7和R 8每次出现时各自独立地选自氢、C 1-C 6烷基、被羟基或氨基取代的C 1-C 6酰基；或者R 7与R 8可以与所连接的N原子一起形成任选被R 9取代的5-6元含氮杂环；
R 9每次出现时各自独立地选自卤素、羟基、硝基、-NR 7R 8、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、任选被C 1-C 6烷基取代的哌啶基；
R 13表示羧基取代的C 1-C 6烷基。
在某些优选实施方案中，R 1表示氢、C 1-C 4烷基、被-NH(C 1-C 4烷基)取代的C 1-C 4烷基、被 取代的C 1-C 4烷基、被-SiMe 3取代的C 1-C 4烷基、-CH＝N-O-(C 3-C 6烷基)或-(CH 2) 2O(C＝O)(CH 2) 2(C＝O)OH。
在某些优选实施方案中，R 2表示氢、C 3-C 4烯基、硝基、氨基、或被-N(C 1-C 4烷基) 2取代的C 1-C 4烷基。
在某些优选实施方案中，R 3表示氢、卤素、羟基、或
在某些优选实施方案中，R 4表示氢或卤素。
在某些优选实施方案中，R 1和R 2连接在一起形成以下所示的基团 其中 部分表示连接于母体基团的键。
在某些优选实施方案中，R 3和R 4连接在一起形成以下所示的基团 其中 部分表示连接于母体基团的键。
在某些优选实施方案中，式(I)表示的化合物为选自以下的化合物：
在某些优选实施方案中，式(I)表示的化合物为吉马替康或吉咪替康：
本发明中，在抗体-药物偶联物中，连接于1分子的抗体的接头-药物的连接数(载药量(DAR，durg to antibody ratio))影响偶联物的有效性、安全性。对于抗体-药物偶联物的制造而言，为了使接头-药物的连接数为定数，可规定反应的原料·试剂的使用量等的反应条件而进行实施，但与低分子化合物的化学反应不同，通常以连接不同数目的药物的混合物的形式获得。因此，本发明中，用平均值即平均药物连接数表示连接于每一个分子抗体的接头-药物的连接数。本发明中，原则上只要没有特别说明，除了表示具有不同的药物连接数的抗体-药物偶联物混合物中包含的具有特定的药物连接数的抗体-药物偶联物的情况之外，药物的连接数是指平均值。可控制连接于抗体分子的抗肿瘤化合物的连接数，作为每抗体的药物平均连接数，可连接1～10个左右的抗肿瘤化合物，优选为2～8个，更优选为4～8个，更优选为6～8。需要说明的是，本领域技术人员可根据本申请的实施例的记载，来设计在抗体上连接必要数目的药物的反应，可得到控制了抗肿瘤化合物的连接数的抗体。在本申请实施例中，未实际测定每一个抗体分子上连接的游离巯基的数目，通过控制反应物摩尔比、反应条件，可以预期每一个抗体分子上所连接的巯基的平均数目m为6-8。
[接头结构]
对于本发明的抗体-药物偶联物中将抗肿瘤化合物与抗体连接的接头结构进行说明。
本发明提供一种式(I)表示的化合物，
其中，R 11为C 1-C 6羧基烷基，R 12为C 2-C 6氰基炔基，X、Y、X’和Y’中有1-2个C原子被N原子取代；优选地，R 11为C 1-C 3羧基烷基，R 12为C 2-C 3氰基炔基。
在本发明的某些实施方案中，X、Y、X’和Y’中有且只有1个C原子被N原子取代；
在本发明的某些实施方案中，X、Y、X’和Y’中有2个C原子被N原子取代，且X、Y中有且只有1个C原子被N原子取代，以及X’、Y’有且只有1个C原子被N原子取代；
在本发明的某些实施方案中，该化合物结构如下所示，分别命名为CN-A，CN-B,CN-C和CN-D
在本发明的某些实施方案中，式(I)化合物作为抗体-药物偶联物中的连接单元，通过R 12的炔基碳与存在于抗体的铰链部的二硫键部分形成的硫醚键而与抗体相连，也即R 12的炔基与抗体铰链部的二硫键反应使得R 12的炔基碳连接到抗体铰链部的还原型巯基(-SH-)上，通过R 11的羧基与存在于接头末端的氨基形成酰胺键而与接头内的其他连接单元相连。
在本发明的某些实施方式中，提供了式(I)化合物的制备方法：(1)SM-A(5-溴吡啶-2-羧酸)在Boc 2O，DMAP，t-BuOH的作用下，50℃反应12小时，生成A-1；(2)A-1与Pd(PPh 3) 2Cl 2，三乙胺，丙炔-3-醇在四氢呋喃中70℃反应12小时，得化合物A-2(3)A-2与TEMPO，PhI(OAC) 2，NH 4OAC在CH 3CN/H 2O为9：1的溶液中室温反应12小时，得化合物A-3；(4)A-3在TFA/DCM的作用下生成化合物CN-A。步骤(1)中，将SM-A替换为SM-B(6-溴烟酸)或SM-C(5-溴嘧啶-2-羧酸)可制备获得CN-B和CN-C。
本发明的接头具有下式(III)所示的结构：
-Q 1-L 1-L 2-L a- (III)
式(III)中，L 1表示-NR 10-W-(CH 2CH 2-O-)n 1-(CH 2)n 2-NR 10-(C＝O)-CH 2OCH 2-(C＝O)-，n 1表示1～24的整数，n 2表示1～4的整数；
L 2表示缬氨酸残基、胍氨酸残基、苯丙氨酸残基、赖氨酸残基、D-缬氨酸残基、甘氨酸残基、丙氨酸残基、天冬氨酸残基；
L a表示-NR 10-(CH 2)n 3-、-NR 10-(CH 2)n 4-NR 10-(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-；
R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基，n 3表示1～4的整数，n 4表示1～4的整数；
Aryl表示任选地被R 9取代的C 6-C 10芳基；
W为单键或 其中，位置①表示与-NR 10-相连，位置②表示与(CH 2CH 2-O-)n 1-相连；
[L 1部分]
L 1表示-NR 10-W-(CH 2CH 2-O-)n 1-(CH 2)n 2-NR 10-(C＝O)-CH 2OCH 2-(C＝O)-，n 1表示1～24的整数， n 2表示1～4的整数，其中，-(CH 2CH 2-O-)n 1部分表示聚乙二醇部分，通过聚乙二醇部分，使得药物的溶解度得到增强。
在本发明的某些实施方案中，Q 1通过R 11的羧基与L 1式中的左端氨基-NR 10-形成酰胺键而连接。
在本发明的某些实施方案中，n 1表示6、7、8、9、10、11或12，n 2表示1或2。
在本发明的某些实施方案中，R 10表示氢或C 1-C 4烷基。
[L 2部分]
L 2表示单个氨基酸残基，例如缬氨酸残基、胍氨酸残基、苯丙氨酸残基、赖氨酸残基、D-缬氨酸残基、甘氨酸残基、丙氨酸残基、天冬氨酸残基。
在本发明的某些实施方案中，L 2表示赖氨酸残基。
[L a部分]
L a表示-NR 10-(CH 2)n 3-、-NR 10-(CH 2)n 4-NR 10-(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-；R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基，n 3表示1～4的整数，n 4表示1～4的整数。
在本发明的某些实施方案中，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(III)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分。
在本发明的某些实施方案中，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述L a表示的-NR 10-(CH 2)n 4-NR 10-(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-右端-C(＝O)-部分。
在本发明的某些实施方案中，式(II)表示的化合物当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述L a表示的-NR 10-(CH 2)n 3-右端-CH 2-部分。
在本发明的某些实施方案中，L a表示-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-，其中n 4表示1或2；R 10每次出现时各自独立地表示氢、任选被1个羟基取代的甲基、乙基、丙基、异丙基。
在本发明的某些实施方案中，L a表示由4-氨基苄醇衍生得到的结构。
在本发明的某些实施方案中，L 2所示的氨基酸C端连接于L a所示的基团的末端氨基。
在本发明的某些实施方案中，式(III)表示的接头为选自以下所示的基团：
本发明的接头具有下式(VII)所示的结构：
-Q 2-L 3-L 4-L P-L b- (VII)
式(VII)中，L 3表示-Z-W-(CH 2CH 2-O)n 5-W’-或单键，n 5表示1～8的整数，W、W’表示 或单键，其中，W的位置①表示与Z相连，位置②表示与(CH 2CH 2-O-)n 5-相连，W’的位置①表示与(CH 2CH 2-O-)n 5-相连，位置②表示与L 4的-CH 2-相连，且W、W’不同时为 Z表示-CH 2-Cyclo-C(＝O)-NR 10-或单键，Cyclo表示环己烷基团，
L 4表示-(CH 2)n 6-C(＝O)-，n 6表示1～6的整数，
L P表示由2～7个氨基酸构成的肽残基，
L b表示-NR 10-(CH 2)n 7-、-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-，Aryl表示任选地被R 9取代的C 6-C 10芳基，n 7表示1～4的整数，n 8表示1～4的整数，
R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基，
Q 2表示-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-，如下式结构：
以该结构的3位与抗体连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头内的亚甲基连接，或者Q 2为-Q 1-NR 10-，Q 1的定义如本发明的定义所述，通过R 12的炔基碳与抗体铰链部的二硫键形成硫醚键而连接，也即R 12的炔基与抗体铰链部的二硫键反应使得R 12的炔基碳连接到抗体铰链部的还原型巯基(-SH-)上，通过R 11的羧基与-NR 10-形成酰胺键而与L 3连接。
[L 4部分]
在本发明的某些实施方案中，L 4表示-(CH 2)n 6-C(＝O)-，n 6表示2、3、4或5。
[L P部分]
L P表示由2～7个氨基酸构成的肽残基。即，通过2-7个氨基酸以肽键连接而成的寡肽的残基而构成。对于构成L P的氨基酸没有特别限制，例如为L-或D-氨基酸，优选为L-氨基酸。另外，除了α-氨基酸之外，也可以是β-丙氨酸、ε-氨基己酸、γ-氨基丁酸等结构的氨基酸，此外，可以是例如经N-甲基化的氨基酸等非天然型的氨基酸。
对于L P部分的氨基酸序列没有特别限制，作为构成的氨基酸，可举出苯丙氨酸(Phe；F)、酪氨酸(Tyr；Y)、亮氨酸(Leu；L)，甘氨酸(Gly；G)、丙氨酸(Ala；A)、缬氨酸(Val；V)、赖氨酸(Lys；K)、瓜氨酸(Cit；C)、丝氨酸(Ser；S)、谷氨酸(Glu；E)、天冬氨酸(Asp；D)等。这些中可优选举出苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸。可根据氨基酸的种类，来控制药物游离的模式。氨基酸的数目可以是2-7个。
在本发明的某些实施方案中，L P所示的肽残基在N末端与L 2部分连接，在C末端与L a部分连接。
在本发明的某些实施方案中，L P为由2-5个氨基酸构成的肽残基。
在本发明的某些实施方案中，L P为选自以下的肽残基：
-GGFG-；
-VC-；
-EVC-；
-DVC-；
-EGGFG-；
-DGGFG-。
[L b部分]
在本发明的某些实施方案中，L b表示-NR 10-(CH 2)n 7-、-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-C(＝O)-、-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-C(＝O)-，其中R 10表示氢或C 1-C 4烷基，n 7表示1～2的整数，n 8表示1～2的整数，Aryl表示苯环基团。
在本发明的某些实施方案中，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(VII)表示的接头中L b的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分。
在本发明的某些实施方案中，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述L a表示的-NR 10-(CH 2)n 4-NR 10-(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-右端-C(＝O)-部分。
在本发明的某些实施方案中，式(II)表示的化合物当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述L b表示的-NR 10-(CH 2)n 3-右端-CH 2-部分。
在本发明的某些实施方案中，L b表示-NR 10-(CH 2)n 4-NR 10-(C＝O)-，n 4表示1或2；R 10每次出现时各自独立地表示氢、任选被1个羟基取代的甲基、乙基、丙基、异丙基。
在本发明的某些实施方案中，L b表示-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-，其中n 4表示1或2；R 10每次出现时各自独立地表示氢、任选被1个羟基取代的甲基、乙基、丙基、异丙基。
在本发明的某些实施方案中，L b表示由4-氨基苄醇衍生得到的结构。
在本发明的某些实施方案中，L P所示的肽残疾的C末端连接于L b所示的基团，更具体而言，C末端连接于L b所示的基团中的末端氨基。
在本发明的某些实施方案中，式(VII)表示的接头为选自以下所示的基团：
[接头中间体化合物]
本发明的接头中间体化合物，如下式(XI)、(XII)所示：
Q 1-L 1-L 2-L a-H (XI)
Q’ 2-L 3-L 4-L P-L b-H (XII)
R 1、R 2、R 3、R 4、Q 1、Q’ 2L 1、L 2、L 3、L 4、L P、L a、L b的定义如本发明说明书所述。
[接头-药物中间体化合物]
本发明的接头-药物中间体化合物是将T表示式(II)所示化合物，所述中间体化合物是将化合物(T)与下式(V)表示的接头连接而成的：
Q 1-L 1-L 2-L a-T (VI)
Q 1-L 1-L 2-L a- (V)
其中，R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明说明书所述；
Q 1、L 1、L 2、L a的定义如本发明说明书所述。
在本发明的某些实施方案中，接头-药物中间体化合物是选自以下的化合物，
本发明的接头-药物中间体化合物是将T表示式(II)所示化合物，所述中间体化合物是将化合物(T)与下式(IX)表示的接头连接而成的：
Q’ 2-L 3-L 4-L P-L b-T (X)
Q’ 2-L 3-L 4-L P-L b- (IX)
其中，R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明说明书所述；
Q’ 2表示(马来酰亚胺-N)-或Q 1-NR 10-，
Q’ 2表示的(马来酰亚胺-N)-，如下式结构：
以该结构在1位的氮原子上与包含该结构的接头内的亚甲基连接，
或者Q 2表示的Q 1-NR 10-，Q 1通过R 11的羧基与-NR 10-形成酰胺键而与L 3连接；
Q 1、R 10、L 3、L 4、L P、L b的定义如本发明说明书所述。
在本发明的某些实施方案中，接头-药物中间体化合物是选自以下的化合物，
在式(II)表示的化合物为吉马替康或吉咪替康的情况下，在L a表示-NR 10-(CH 2)n 4-NR 10--(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-时，L b表示-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-时，作为抗肿瘤化合物的吉马替康或吉咪替康与式(III)、(VII)所示的接头结构以carbamate的结构(-NC(＝O)O-)进行连接，在血液中更稳定，毒副作用更小。
在式(II)表示的化合物为吉咪替康的情况下，在L a、L b表示-NR 10-(CH 2)n 3-时，作为抗肿瘤化合物的吉咪替康与式(III)、(VII)所示的接头结构以结构-N-CH 2-O-进行连接，吉咪替康有19位和10位两个连接位点，为ADC提供了更多样的选择。
[抗体-药物偶联物]
本发明的抗体-药物偶联物(IV)是将化合物(T)与抗体(AB)经由下式(III)表示的接头连接而成的：
AB-S-Q 1-L 1-L 2-L a-T (IV)
-Q 1-L 1-L 2-L a- (III)
R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明说明书所述；Q 1、L 1、L 2、L a的定义如本发明说明书所述；AB表示抗体。
本发明的抗体-药物偶联物(VIII)是将化合物(T)与抗体(AB)经由下式(VII)表示的接头连接而成的：
AB-S-Q 2-L 3-L 4-L P-L b-T (VIII)
-Q 2-L 3-L 4-L P-L b- (VII)。
R 1、R 2、R 3、R 4的定义如本发明说明书所述；Q 2、L 3、L 4、L P、L b的定义如本发明说明书所述；AB表示抗体。
[抗体-药物偶联物的制造方法]
下面，对于本发明的抗体-药物偶联物或其制造中间体的代表性的制造方法进行说明。
具体而言，本发明中，经由硫醚而将抗体和接头结构连接的抗体-药物偶联物例如可通过下述的方法来制造。
或者，
即，使式(VI)、(X)所示的接头-药物中间体化合物与AB-SH反应，以通过由抗体的铰链部的二硫键部分形成的硫醚键将式(VI)、(X)所示的接头-药物中间体化合物与抗体连接；制备得到式(IV)、(VIII)表示的抗体-药物偶联物。其中，R 1、R 2、R 3、R 4、Q 1、Q 2、Q’ 2、L 1、L 2、L 3、L 4、L P、L a、L b的定义如本发明说明书所述。
式中，AB-SH表示携带巯基的抗体，AB表示抗体，式(VI)、(X)所示的化合物即为本发明上述的接头-药物中间体化合物，作为产物的式(IV)、(VIII)所示的化合物即为本发明的抗体-药物偶联物。
为了便于说明，式(IV)、(VIII)所示的化合物中，以1个从药物至接头末端的结构部分与1个抗体连接而成的结构的形式进行了记载，但实际上，相对于1个抗体分子而言连接有多个该结构部分的情况较多。例如，如上所述，在一个抗体分子上连接2～8个、优选为4～8个、更优选为6～8个接头-药物中间体化合物。该情况在以下的制造方法的说明中也同样。实际上，如上所述，本发明中，以平均药物连接数表示连接于每一个分子抗体的接头-药物的平均数目。
即，如上所示，通过使本发明上述的接头-药物中间体化合物与具有巯基的抗体AB-SH反应，可制造式(IV)所示的抗体-药物偶联物。
具有巯基的抗体可利用本领域技术人员公知的方法获得(Hermanson，G.T、Bioconjugate Techniques、pp.56-136、pp.456-493、Academic Press(1996))。例如，可举出以下方法：使Traut举出试剂与抗体的氨基作用；使N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代链烷酸酯(N-succinimidyl S-acetylthioalkanoate)类与抗体的氨基作用后，与羟基胺作用；在使N-琥珀酰亚胺基3-(吡啶基二硫代)丙酸酯作用后，使还原剂作用；使二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)等还原剂与抗体作用而将抗体内铰链部的二硫键还原从而产生巯基；等等，但不限于这些方法。
具体而言，作为还原剂，相对于每一个抗体内铰链部二硫键，使用0.3～3摩尔当量TCEP，在含有螯合剂的缓冲液中，使其与抗体反应，由此，可得到部分或完全地将抗体内铰链部二硫醚还原而得到的携带巯基的抗体(AB-SH)。作为螯合剂，可举出例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)等。可以以1mM～20mM的浓度使用它们。作为缓冲液，可使用磷酸钠、硼酸钠、乙酸钠溶液等。在具体的例子中，于4℃～37℃使抗体与TCEP反应1～4小时，由此，可得到部分或完全还原而具有巯基的抗体AB-SH。
相对于每一个具有巯基的抗体AB-SH，可使用2～20摩尔当量的式(VI)、(X)所示的化合物，制造1个抗体连接2个-8个药物而成的抗体-药物偶联物(IV)、(VIII)。具体而言，在含有具有巯基的抗体AB-SH的缓冲液中，添加溶解有式(VI)、(X)所示的化合物的溶液并使其进行反应。此处，作为缓冲液，可使用乙酸钠溶液、磷酸钠、硼酸钠等。反应时的pH为5～9，更优选在pH7附近反应。作为溶解化合物(2)(即式(II)所示化合物)的溶剂，可使用二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡啶酮(NMP)等有机溶剂。可以以1～20％v/v将溶解有式(VI)、(X)所示的化合物的有机溶剂溶液添加到含有具有巯基的抗体AB-SH的缓冲液中并进行反应。反应温度为0～37℃、更优选为10～25℃，反应时间为0.5～2小时。可通过利用含硫醇试剂使未反应的式(VI)、(X)所示的化合物的反应性失活而结束反应。含硫醇试剂例如为半胱氨酸或N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)。更具体而言，添加相对于使用的式(VI)、(X)所示的化合物而言1～2摩尔当量的NAC，于室温孵育10～30分钟，由此使反应结束。
对于制造的抗体-药物偶联物(IV)、(VIII)，可利用以下的共通操作，进行浓缩、缓冲液交换、纯化等的操作。
共通操作A：抗体或抗体-药物偶联物水溶液的浓缩
在容器内，放入抗体或抗体-药物偶联物溶液，使用离心机进行离心操作(例如，以2000G～3800G离心5～20分钟)，将抗体或抗体-药物偶联物溶液浓缩。
共通操作B：抗体的浓度测定
使用UV测定器，按照制造商规定的方法，进行抗体浓度的测定。
此时，使用随着抗体不同而显示不同的280nm吸光系数(1.3mLmg -1cm -1～1.8mLmg -1cm -1)。
共通操作C-1：抗体的缓冲液交换
按照制造商说明书的方法，用含有氯化钠(例如，137mM)及乙二胺四乙酸(EDTA，例如，5mM)的磷酸缓冲液(例如，10mM，pH6.0)(本说明书中也称为PBS6.0/EDTA)。将使用了Sephadex G-25载体的NAP-25柱平衡化。针对一根该NAP-25柱，装填2.5mL抗体水溶液，然后分离用PBS6.0/EDTA3.5mL洗脱的级分(3.5mL)。利用共通操作A将该级分浓缩，使用共通操作B，进行抗体浓度的测定，然后使用PBS6.0/EDTA，将抗体浓度调整为10mg/mL。
共通操作C-2：抗体的缓冲液交换
按照制造商规定的方法，用含有氯化钠(例如，50mM)及EDTA(例如，2mM)的磷酸缓冲液(例如，50mM，pH6.5，本说明书中也称为PBS6.5/EDTA)。将使用了Sephadex G-25载体的NAP-25柱平衡化。针对一根该NAP-25柱，装填2.5mL抗体水溶液，然后分离获取用PBS6.5/EDTA 3.5mL洗脱的级分(3.5mL)。利用共通操作A将该级分浓缩，使用共通操作B进行抗体浓度的测定，然后使用PBS6.5/EDTA，将抗体浓度调整为5mg/mL。
共通操作D-1：抗体-药物偶联物的纯化
使用市售的磷酸缓冲液(例如，PBS7.4)、含有氯化钠(例如，137mM)的磷酸钠缓冲液(例如，10mM，pH6.0；本说明书中也称为PBS6.0)，或含有山梨糖醇(例如，5％)的乙酸缓冲液(例如，10mM，pH5.5；本说明书中也称为ABS)中的任一种缓冲液将NAP-25柱平衡化。 在该NAP-25柱中装填抗体-药物偶联物反应水溶液(例如，约1.5mL)，用制造商规定的量的缓冲液洗脱，由此分离获取抗体级分。将该分离获取的级分再次装填至NAP-25柱，用缓冲液洗脱，进行凝胶过滤纯化操作，反复操作计2～3次，由此，得到了除去了未连接的药物接头、低分子化合物(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)，N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，二甲基亚砜)的抗体-药物偶联物。
共通操作D-2：抗体-药物偶联物的纯化
使用市售的磷酸缓冲液(例如，PBS7.4)、含有氯化钠(例如，137mM)的磷酸钠缓冲液(例如，10mM，pH6.0；本说明书中也称为PBS6.0)，或含有山梨糖醇(例如，5％)的乙酸缓冲液(例如，10mM，pH5.5；本说明书中也称为ABS)中的任一种缓冲液将AKTA柱(填料：sephadex G 25)平衡化。进样器装载抗体-药物偶联物反应水溶液(例如，约2mL)，用制造商规定的量的缓冲液洗脱，由此分离获取抗体级分。由此，得到了除去了未连接的药物接头、低分子化合物(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)，N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，二甲基亚砜)的抗体-药物偶联物。
[接头-药物中间体化合物的制造方法]
在某些具体实施方式中，接头-药物中间体化合物的制备方法包括如下步骤：
将N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N'-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]-L-赖氨酸(CN-CMTC-1)和PABOH溶解在1：1的二氯甲烷：甲醇的溶液中，加入2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)，避光室温搅拌过夜，生成CN-CMTC-2。过柱纯化后，用5％的哌啶乙腈溶液处理，生成CN-CMTC-3。过柱纯化后，用DCC，NHS与CN-CMTC-4在DMF溶液中反应生成CN-CMTC-4的活性酯，CN-CMTC-4的活性酯与CN-CMTC-3反应生成化合物CN-CMTC-5，制备纯化后得纯度95％以上的目标产物。
吉咪替康-Boc(或SN-38-Boc，或吉马替康)用三光气，DMAP，与二氯甲烷作用生成吉咪替康的甲酰氯化合物，再加入CN-CMTC-5，反应约5mins后，用甲醇猝灭后，过短柱，得CN-CMTC-6化合物的粗品。Pre-HPLC纯化后得纯品CN-CMTC-6，再用TFA/DCM处理脱保护得CN-CMTC-7，再与CN-A，B，C，D进行Click反应得化合物CN-CMTC-8，化合物8用TFA/DCM处理后得最终产物CN-CMTC(见下图)。
其中，CN表示本申请的连接子接头CN-A,CN-B，CN-C或CN-D，CMTC表示吉咪替康，上述反应中，吉咪替康(CMTC)可以替换为SN-38或吉马替康(GMTC)等喜树碱衍生物。
在某些具体实施方式中，接头-药物中间体化合物的制备方法包括如下步骤：
将CN-CMTC-7与SM-1加入DMSO/H2O的溶液中，再加入CuBr后，常温搅拌约30mins，HPLC检测反应完全，生成SMCC-PEG8-Lys(MMt)-PABC-CMTC，Pre-HPLC纯化后，再加入TFA/DCM脱保护，得目标产物SMCC-PEG8-Lys-PABC-CMTC。
在另一些具体实施方式中，接头-药物中间体化合物的制备方法包括如下步骤：
将CN-CMTC-7-NH 2加入CN-C(或CN-A，CN-B，CN-D)的活性酯的DMF溶液中，反应约2小时后，HPLC显示原料反应完全，有目标产物CN-C(CN-A，CN-B，CN-D)-PEG 8-Lys(MMt)-PABC-CMTC的生成，纯化后，用TFA/DCM处理后，得目标产物。
在某些具体实施方式中，接头-药物中间体化合物的制备方法包括如下步骤：
Boc-GGFG与PABOH在EEDQ的作用下，二氯甲烷与甲醇作溶剂，室温搅拌过夜，生成Boc-GGFG-PABOH；
Boc-GGFG-PABOH在TFA/DCM的作用下脱掉Boc生成GGFG-PABOH；再与N 3-PEGn-NHS活性酯反应生成N 3-PEGn-GGFG-PABOH，n＝0，2，4，6，8；
吉咪替康(SN-38，吉马替康)与DMAP，三光气在二氯甲烷的溶剂中反应5mins后，再加入N 3-PEGn-GGFG-PABOH继续反应5mins后生成N 3-PEGn-GGFG-PABC-CMTC(SN-38，GMTC)，Pre-HPLC纯化后再与炔烃-马来酰亚胺(n＝2，4，6，8时)或炔烃-PEGm-马来酰亚胺(n＝0时)用Click反应条件得最终目标产物，m＝2，4，6，8。该步骤中的吉咪替康(CMTC)可替换为SN-38、吉马替康(GMTC)。
在某些具体实施方式中，接头-药物中间体化合物的制备方法包括如下步骤：
Boc-GGFG在TFA/DCM的作用下脱掉Boc，除掉TFA与二氯甲烷后，与N3-PEGn-NHS在二氯甲烷中反应，n＝0，2，4，6，8；
用DIEA做碱，得到化合物N 3-PEGn-GGFG，Pre-HPLC纯化后再与N-Boc-N-甲基乙二胺缩合，缩合剂使用HATU，吡啶做碱，DMF作溶剂得到目标产物；
用TFA/DCM脱掉Boc后，Pre-HPLC纯化得化合物N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-NH-CH 3。
N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-NH-CH 3和CMTC-PNP在TEA做碱，DMF做溶剂的条件下反应30mins后，得化合物N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-N(CH 3)-C(O)-CMTC，再与炔烃-马来酰亚胺(n＝2，4，6，8时)或炔烃-PEGm-马来酰亚胺(n＝0时)用Click反应条件得最终目标产物，m＝2，4，6，8。该步骤中的吉咪替康(CMTC)可替换为SN-38、吉马替康(GMTC)。
本发明的抗体-药物偶联物中，所述的抗体(AB)为全长抗体或其抗原结合片段，或双特异性抗体或其抗原结合片段。在本发明的某些实施方案中，所述抗体选自Her-2抗体、抗Trop-2抗体、EGFR抗体、B7-H3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、HER-3、HER-4抗体、CD20、CD30抗体、CD19抗体、CD33抗体。
本发明优选的抗体为抗TROP-2抗体，或其抗原结合片段，包括双特异性抗体和抗体功能性衍生物。TROP-2抗体属于TACSTD家族，是由TACSTD2基因编码表达的细胞表面糖蛋白，又名肿瘤相关钙离子信号转导子2(TACSTD2)、表皮糖蛋白1(EGP-1)、胃肠肿瘤相关抗原(GA733-1)、表面标志物1(M1S1)。TROP-2在多种恶性肿瘤中过表达，是一种与恶性肿瘤发生、侵袭和转移有关的癌基因。
本发明中的天然序列的TROP-2可以从自然界分离得到，也可以通过重组DNA技术、化学合成法或它们的组合制备得到。
本发明中所用的抗体优选为抗人TROP-2抗体。
在某些优选实施方案中，所述抗人TROP-2抗体中的重链和轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3分别为RS7单抗重链和轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3。
在某些优选实施方案中，所述抗人TROP-2抗体可以为人源化抗体或全人源抗体。
在某些优选实施方案中，所述抗Trop-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由KASQDVSIAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASYRYT氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYITPLT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由NYGMN氨基酸序列组成的CDR1，由WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列组成的CDR2，和由GGFGSSYWYFDV氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链和重链的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
本发明优选的抗体为Her-2抗体或其抗原结合片段，包括双特异性抗体和抗体功能性衍生物。Her-2也称为人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2)，或受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，也称为CD340(分化簇340)、原癌基因Neu、Erbb2(啮齿动物)或ERBB2(人类)，是一种人类中由ERBB2基因编码的蛋白质。
已显示Her-2过表达在乳腺癌的某些侵袭性类型的发展和进展中起重要作用。大约15-30％的乳腺癌中发生Her-2过表达。近年来，该蛋白质已成为大约30％乳腺癌患者的重要生物标志物和治疗靶标。Her-2过表达还发生在卵巢癌、肠胃癌和侵袭形式的子宫癌例如浆液性子宫内膜癌中。
可用于本发明的Her-2抗体的实例包括但不限于：记载于US5821337的曲妥珠单抗(trastuzumab)，记载于CN101981056B的帕妥珠单抗(pertuzumab)，可用于本发明的抗体还可以通过CN103476941A中公开的载体设计、构建和构建展示抗体的抗体库的方法筛选获得，也可以索伦托医疗公司(Sorrento Therapeutics，Inc.)的文库进行筛选获得。
本发明中的天然序列的Her-2可以从自然界分离得到，也可以通过重组DNA技术、化学合成法或它们的组合制备得到。
本发明中所用的抗体优选为抗人Her-2抗体。
在某些优选实施方案中，所述抗人Her-2抗体中的重链和轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3分别为RS7单抗重链和轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3。
在某些优选实施方案中，所述抗人Her-2抗体可以为人源化抗体或全人源抗体。
在某些优选实施方案中，所述Her-2抗体为US5821337所述曲妥珠抗体，其轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由RASQDVNTAVA氨基酸序列组成的CDR1；由SASFLYS氨基酸序列组成的CDR2；和由QQHYTTPPT氨基酸序列组成的CDR3，并且其重链可变区的CDR包括由DTYIH氨基酸序列组成的CDR1；由RIYPTNGYTRY氨基酸序列组成的CDR2；和由WGGDGFYAMDY氨基酸序列组成的CDR3。曲妥珠抗体的轻链序列及重链序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。还可包括那些对上述抗体进行保守氨基酸取代后，保留了Her-2结合活性的抗体。
本发明的抗体-药物偶联物可优选向哺乳动物给予，更优选人。
作为含有本发明的抗体-药物偶联物的药物组合物中使用的物质，可考虑给予量、给予浓度，从本领域中通常使用的制剂添加物或其他物中适当选择使用。
在本发明的某些实施方案中，本发明的抗体-药物偶联物可以以含有1种以上的药学上的适应性成分的药物组合物或药物制剂的形式给予。例如，上述药物组合物或药物制剂中，代表性地，可以含有1种以上的药学上可接受的载体(例如灭菌的液体(例如水及油(包含石油、动物、植物、或合成来源的油(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)))。在静脉内给予上述药物组合物的情况下，水是更具有代表性的载体。另外，食盐水溶液、以及葡萄糖水溶液及甘油水溶液也可作为液体载体，尤其是可用于注射用溶液。适当药学赋形剂在该领域中是已知的。根据需要，上述组合物中还可以含有微量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲化剂。适当的药学载体的例子记载于E.W.Martin的“W.Martin载体的例子Parmaceutical Sciences”中。其处方与给予的方式相对应。
各种输送系统是已知的，可以为了给予本发明的抗体-药物偶联物而使用。作为导入方法，可举出皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、及皮下路径，但不限于这些。例如可以利用输液或快速浓注进行给予。在特定的优选实施方式中，上述抗体-药物偶联物的给予利用输液进行。肠胃外的给予是优选的给予路径。
代表性的实施方式中，将上述药物组合物形成向人静脉内给予的药物组合物，按照常规步骤形成处方。代表性地，用于静脉内给予的组合物是灭菌的等张性的水性缓冲液中的溶液。根据需要，上述药物组合物还可以含有增溶剂及用于缓解注射部位的疼痛的局麻剂(例如利多卡因)。通常，上述成分可以通过以下任一方式供给：以经密封的容器(例如将显示活性剂的量的安瓿或药囊等密封)中的干燥冷冻干燥粉末或无水的浓缩物的形式，分别地或在单位剂型中一起混合地供给。预定通过输液来给予上述药物时，例如可将上述药物放入到含有灭菌的制药级的水或食盐水的输液瓶中。当通过注射来给予上述药物时，可提供注射用灭菌水或食盐水的安瓿，以使得例如在给予前混合上述成分。
本发明的药物组合物或药物制剂，可以是仅含有本发明的抗体-药物偶联物的药物组合物或药物制剂，也可以是含有抗体-药物偶联物及至少一种其他癌治疗剂的药物组合物。也可将本发明的抗体-药物偶联物与其他癌治疗剂一同给予，由此，可增强抗癌效果。出于这种目的使用的其他抗癌剂，可与抗体-药物偶联物同时地、分别地或连续地向个体给予，也可改变给予间隔而进行给予。作为这样的癌治疗剂，可举出白蛋白结合型紫杉醇、卡铂、顺铂、吉西他滨、伊立替康(CPT-11)、紫杉醇、培美曲塞、索拉非尼、长春碱或国际公开第WO2003/038043号小册子中记载的药剂、以及LH-RH类似物(亮丙瑞林、戈舍瑞林等)、磷酸雌二醇氮芥、雌激素拮抗剂(他莫昔芬、雷洛昔芬等)、芳香酶抑制剂(阿那曲唑、来曲唑、依西美坦)等，但只要是具有抗肿瘤活性的药剂，就不受限制。
这样的药物组合物可以作为具有选定的组成和必要的纯度的制剂，以冷冻干燥制剂或液状制剂的形式形成制剂。作为冷冻干燥制剂而形成制剂时，可以是含有本领域中可使用的适当的制剂添加物的制剂。另外，在液体制剂的情况也同样，可以作为含有本领域中可使用的各种的制剂添加物的液状制剂而形成制剂。
药物组合物的组成及浓度根据给予方法的不同而变化，但从本发明的药物组合物中包含的抗体-药物偶联物针对抗体-药物偶联物的抗原的亲和性、即针对抗原的解离常数(Kd值)方面考虑，亲和性越高(Kd值越低)时，即使为少量的给予量，也能发挥药效。因此，当确定抗体-药物偶联物的给予量时，也可基于抗体-药物偶联物与抗原的亲和性的状况来设定给予量。当将本发明的抗体-药物偶联物向人给予时，例如，可以以约0.001～100mg/kg给予1次，或以1～180天1次的间隔多次给予。
本发明的抗体-药物偶联物、药物组合物、药物制剂可以用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。关于作为预防和/或治疗对象的肿瘤或癌症，只要是表达抗体-药物偶联物中的抗体可识别的蛋白的癌细胞即可。在本发明的某些实施方案中，所述肿瘤或癌症选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肾癌、尿道癌、胶质细胞瘤、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌；优选地，所述癌症是原位癌或转移癌；优选地，所述乳腺癌为三阴交乳腺癌。
在本发明的某些实施方案中，向需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的抗体-药物偶联物、药物组合物或药物制剂，用于抑制癌细胞的生长、增殖或迁移。
在本发明的某些实施方案中，提供一种抑制癌细胞生长、增殖或迁移的试剂盒，其包括本发明的抗体-药物偶联物、药物组合物或药物制剂。
本发明的技术效果：
本发明的抗体-药物偶联物具有快速高效的肿瘤细胞杀伤活性，同时具有良好的生物相容性、低免疫原性、生物安全性和稳定性。
本发明的如式(II)的接头结构具有如下的优势：(1)本发明的接头结构分子量和亲疏水性合适，具有较高的载药量(DAR，durg to antibody ratio)>7；(2)本发明的接头结构能够提高接头-药物化合物的抗聚集能力；有助于提高抗肿瘤化合物中吉马替康、吉咪替康的亲水性，增加ADC的生物安全性；(3)本发明的接头结构释放的情况尤其适用于优选毒素吉马替康、吉咪替康，更优选吉咪替康，与其细胞毒性、药代动力学，以及肿瘤抑制性等特性匹配，该接头自裂解的速度更快，有助于毒素分子快速释放，大大增强了药效；(4)本发明设计的接头的大小、理化性质，以及偶联位点不会影响抗体的生理活性；(5)本发明的接头合物合成方法简易， 适合工业化生产。
优选的是，本发明的抗肿瘤化合物选择吉马替康、吉咪替康，吉马替康毒性是SN-38的10倍左右，与依沙替康相当，但其安全性大大优于依沙替康，其可单独作为口服制剂成药。吉咪替康与SN-38，伊立替康等一样，都属于喜树碱类毒素，其是在10位羟基取代和9位烯丙基取代，有很好的抗肿瘤活性，吉咪替康(10-羟基-9-烯丙基喜树碱)抗各种肿瘤细胞的体外活性实验结果表明，它对各种肿瘤细胞的IC50大部分都在几个到十几个nM水平，总体来说活性要好于拓扑替康、9-硝基喜树碱和9-羟基喜树碱，且对大部分细胞株的活性也好于SN-38(CN1903201A)。SN-38目前已被临床试验证明其是优良的ADC毒素分子，吉咪替康在结构上虽与SN-38非常接近，但目前仍未见有成功将其作为ADC毒素分子的临床报道，可见其用于ADC药物具有技术难度。且吉咪替康水溶性仍旧不好，因此无法设计为直接口服或采用通常的注射剂。
基于此，本发明通过对连接子的优化设计，将吉咪替康和吉马替康与具有一定亲水性的连接子连接，以在增加靶向给药的同时，解决毒素分子水溶性的难题。同时，本发明自行设计的式(I)接头分子与目前的马来酰亚胺相比，其与抗体的连接更稳定，减少了在非靶点位置脱落的可能性，提高了安全性，并能达到高载药量。此外，连接子的吉马替康具有很强渗透细胞膜的能力，让它们在杀伤吞入ADC的癌细胞之后，能够杀死附近的癌细胞。
实施例
下面结合具体实施例，对本发明的方案进行解释。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
曲妥珠抗体(Herceptin抗体)购自Genentech Inc.。
以下实施例中，ADC-137仅作为对照，购自常州辰鸿生物科技有限公司，CAS#:1279680-68-0。
实施例1：hRS7抗体的制备和检测
1.基因合成、转染和抗体制备
hRS7抗体在CHO细胞产生。含hRS7抗体基因的表达载体分别用常规的分子生物学方法构建，hRS7抗体轻链和重链核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。将上述两序列插入到同一表达载体中，大量提取制备转染质粒，并转染到CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)中，具体转染和抗体制备的过程如下：
(1)细胞培养：CHO-K1细胞悬浮生长于ActiPro(GE HyClone)培养基，于37℃，7％CO 2，140rpm，90％相对湿度进行培养；
(2)转染：在进入对数生长期后，取细胞离心，重悬于新鲜的ActiPro培养基，计数并调节细胞密度到1.35×10 7个/毫升，转500μl细胞悬液到电击杯中，然后加入40μg构建好的质粒，将细胞与质粒混匀，然后用电转方式导入质粒(Bio-rad电转仪)；
(3)亚克隆：电转后的细胞用37℃的ActiPro培养基重悬，每孔100μl分装于96孔板。测定细胞上清以测定抗体的表达水平。将表达水平较高的克隆从96孔板转移到24孔板培养，而后再转入6孔板培养，测定细胞的抗体产量和产率，选择表达量最高的3个克隆进行亚克隆，而后转入摇瓶，放在培养箱中继续培养。
2抗体的纯化
收集摇瓶培养的高表达的细胞液，用蛋白A亲和纯化(GE，Mab Select SuRe)和离子交换纯化(GE，Capto S)。采用SDS-PAGE和SEC-HPLC对纯化后的抗体进行分子量和纯度分析。SDS-PAGE测定结果表明制备的hRS7分子量符合预期，用SEC-HPLC法测得抗体纯度为99.1％。
实施例2：接头化合物A的合成
I-1化合物5-溴吡啶甲酸叔丁酯A-1的制备
向5-溴吡啶甲酸SM-A(8.0g，39.60mmol)在t-BuOH(50mL)中的溶液中加入(Boc) 2O(12.96g，59.40mmol)和DMAP(0.484g，3.96mmol)。将混合物在50℃下搅拌12小时。LCMS监测反应。将该溶液减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(石油醚/乙酸乙酯＝12∶1)，得到5-溴吡啶甲酸叔丁酯A-1(7.96g，78.04％收率)，为白色固体。LCMS:M-56+H +＝202,纯度:99.18％. 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.83(d,J＝2.0Hz,1H),8.24(dd,J＝8.4,2.3Hz,1H),7.93(d,J＝8.2Hz,1H),1.56(s,9H).
I-2化合物5-(3-羟基丙-1-炔-1-基)吡啶甲酸叔丁酯A-2的制备
在N 2下，向5-溴吡啶甲酸叔丁酯A-1(7.46g，28.9mmol)在THF(80mL)中的溶液中添加TEA(8.77g，86.7mmol)，prop-2-yn-1-ol SM2(2.3ml，37.6mmol)和Pd(PPh 3) 2Cl 2(1.0g，1.45mmol)。将混合物在70℃下搅拌12小时。LCMS监测反应。将该溶液减压浓缩。残余物通过硅胶色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1：1)，得到5-(3-羟基丙-1-炔-1-基)吡啶甲酸叔丁酯A-2(5.8g，86.7％产率)。黄色固体。LCMS:M-56+H +＝178,纯度:93.52％. 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ8.80(d,J＝1.4Hz,1H),8.00(dd,J＝8.1,0.7Hz,1H),7.82(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),4.54(d,J＝6.3Hz,2H),2.39(t,J＝6.3Hz,1H),1.64(s,9H).
I-3 5-(氰基乙炔基)吡啶甲酸叔丁酯A-3的制备
向5-(3-羟基丙-1-炔-1-基)吡啶甲酸叔丁酯A-2(3.2g，13.72mmol)的CH 3CN(45mL)和H 2O(5ml)溶液中加入TEMPO(107.2mg，0686mmol)，PhI(OAC) 2(9.7g，30.2mmol)和NH 4OAc(4.2g，54.87mmol)。将混合物在室温搅拌12小时。LCMS监测反应。将该溶液减压浓缩。加入H 2O(100ml)，并将混合物用EtOAc(50ml)萃取。有机层用盐水(50ml)洗涤，经Na 2SO 4干燥，并将滤液浓缩至干。残余物通过硅胶色谱法纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10∶1)，得到5-(氰基乙炔基)吡啶甲酸叔丁酯A-3(1.2g，收率38.7％)，为白色固体。
LCMS:M-56+H +＝173,纯度:99.67％. 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ8.94(dd,J＝2.0,0.7Hz,1H),8.10(dd,J＝8.1,0.8Hz,1H),8.03(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),1.65(s,9H).
I-5 5-(氰基乙炔基)吡啶甲酸叔丁酯目标A的制备
向5-(氰基乙炔基)吡啶甲酸叔丁酯A-3(1.2g，5.3mmol)在DCM(80mL)中的溶液中添加TFA(80ml)。将混合物在室温搅拌3小时。LCMS监测反应。将该溶液减压浓缩。将残余物用乙醚(150ml)研磨。过滤混合物，滤饼用乙醚(50ml)洗涤。将滤饼真空干燥，得到5-(氰基乙炔基)吡啶甲酸叔丁酯目标A(600mg，66％产率)，为白色固体。
LCMS:MH +＝173，纯度:99.03％. 1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.71(s,1H),9.09(dd,J＝2.0,0.7Hz,1H),8.42(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),8.21-8.05(m,1H).
实施例3：接头化合物B的合成
II-1 6-溴烟酸叔丁酯B-1的制备
在室温和N 2条件下，向6-溴烟酸SM-B(5g，25mmol)在t-BuOH(50mL)的溶液中搅拌加入Boc 2O(11g)和DMAP(300mg)。将反应在60℃下搅拌过夜。TLC监测反应。将反应混合物用氯化铵水溶液(50mL)稀释，并用EtOAc(100mL)萃取。合并的有机层经无水 硫酸钠干燥，并真空蒸发至干。残余物通过柱纯化(己烷/乙酸乙酯＝10∶1)，得到6-溴烟酸叔丁酯B-1(5g，产率78％)，为白色固体。
LCMS:[M+H] +＝259.9,纯度:99％.
II-2 6-(3-羟基丙-1-炔-1-基)烟酸酯叔丁酯B-2的制备
将6-溴烟酸叔丁酯B-1(5g，19.46mmol)和2-炔-1-丙醇(3.26g，25.3mmol)加入烧瓶中，然后添加Pd(PPh 3) 2Cl 2(0.98g，1.4mmol)和CuI(0.45g，2.3mmol)。用氮气吹扫烧瓶3次以除去氧气后。通过注射器加入DMF(64mL)和TEA(10mL)。将反应在80℃下搅拌过夜，并通过LCMS监测。反应消耗后，将反应用饱和氯化铵(300mL)淬灭。然后将反应物用水稀释并用乙酸乙酯(50mL)洗涤3次。然后将有机相用无水硫酸钠干燥。浓缩并通过柱子(石油醚/乙酸乙酯＝2：1)纯化，得到所需的6-(3-羟基丙-1-炔-1-基)烟酸酯叔丁酯B-2(3.1g，收率68％)为棕色油状。LCMS:[M+H] +＝234,纯度:93％. 1H NMR(400MHz,CDC1 3)δ9.08(d,J＝1.3Hz,1H),8.21(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,1H),4.55(s,2H),1.61(d,J＝7.3Hz,9H).
II-3 6-(3-羟基丙-1-炔-1-基)烟酸叔丁酯B-3的制备
向6-(3-羟基丙-1-炔-1-基)烟酸酯叔丁酯B-2(3.1g，13.3mmol)，TEMPO(105mg，0.67mmol)，PhI(OAc) 2(9.42g，29.26mmol)和NH 4OAc(4.096g，53.2mmol)加入CH 3CN/H 2O(45mL/5mL)。将反应混合物在室温搅拌4小时。LCMS监测反应。将反应真空浓缩。然后将反应物用水稀释并用乙酸乙酯洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥。并通过快速柱浓缩纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)，得到6-(丙-1-炔-1-基)烟酸叔丁酯B-3(900mg，收率30％)，为绿色固体。LCMS:[M+H] +＝229,纯度:97％； 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ9.51-9.02(m,1H),8.31(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),7.70(dd,J＝8.1,0.8Hz,1H),1.62(s,10H).
II-4 6-(氰基乙炔基)烟酸靶标B的制备
在室温下，向6-(丙-1-炔-1-基)烟酸酯叔丁基B-3(900mg，3.95mmol)在CH 2Cl 2(50mL)的溶液中缓慢加入TFA(50mL)。然后将其在室温搅拌3小时。LCMS监测反应。然后将溶液真空浓缩。向混合物中加入水(100mL)和乙酸乙酯(100mL)。然后将反应物用水稀释并用乙酸乙酯洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥。通过快速柱浓缩(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到6-(氰基乙炔基)烟酸目标B(463mg，收率68％)，其为棕色固体。LCMS:[M+H] +＝172.9,纯度:99％； 1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.86(s,1H),9.14(d,J＝2.0Hz,1H),8.41(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),8.11(d,J＝8.0Hz,1H).
实施例4：接头化合物C的合成
III-1 5-溴嘧啶-2-羧酸叔丁酯C-1的制备
向5-溴嘧啶-2-羧酸SM-C(4.5g，22.2mmol)的t-BuOH(45mL)的溶液中，加入(Boc) 2O(9.67g，44.40mmol)和DMAP(0.270g，2.22mmol)。将混合物在50℃下搅拌12小时。TLC监测反应。将该溶液减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(石油醚/乙酸乙酯＝12∶1)，得到5-溴嘧啶-2-羧酸叔丁酯C-1(4.8g，84.20％收率)，为白色固体。LCMS:M-56+H +＝203,纯度:99.41％. 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ8.95(s,2H),1.66(s,9H).
III-2 5-(3-羟基丙-1-炔-1-基)嘧啶-2-羧酸叔丁酯C-2的制备
向5-溴嘧啶-2-羧酸叔丁酯C-1(4.8g，18.6mmol)在THF(60mL)的溶液中加入TEA(9.6ml)，2-炔-1-丙醇SM2 3.3ml，55.8mmol)，CuI(0.425g，2.23mmol)和Pd(PPh 3) 2Cl 2(0.94g，1.34mmol)。将混合物在70℃下搅拌12h。LCMS监测反应。用饱和氯化铵溶液(300ml)淬灭该溶液。用水(300ml)稀释混合物，并用EtOAc(500ml)洗涤3次。然后将有机相用无水硫酸钠干燥，将滤液减压浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1：1)，得到5-(3-羟基丙-1-炔-1-基)嘧啶-2-羧酸叔丁酯C-2(3.12g，收率为72.6％)，为白色固体。LCMS:M-56+H +＝179,纯度:98.03％. 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ8.92(s,2H),4.57(d,J＝6.4Hz,2H),2.33(t,J＝6.4Hz,1H),1.67(s,9H).
III-3 5-(氰基乙炔基)嘧啶-2-羧酸叔丁酯C-3的制备
向5-(3-羟基丙-1-炔-1-基)嘧啶-2-羧酸叔丁酯C-2(2.13g，9mmol)的CH 3CN(36mL)和H 2O(4ml)溶液中，加入Tempo(141mg，0.9mmol)，PhI(OAC) 2(6.42g，19.9mmol)和NH 4OAc(2.79g，36.2mmol)。将混合物在室温搅拌12h。LCMS监测反应。将该溶液减压浓缩。加入H 2O(100毫升)。用EA(50ml)萃取混合物3次。有机层用盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并将滤液浓缩至干。残余物通过硅胶色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10∶1)，得到5-(氰基乙炔基)嘧啶-2-羧酸叔丁酯C-3(1.5g，75％产率)，为黄色固体。LCMS:M-56+H +＝174,纯度:97.73％. 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ9.10(s,2H),1.67(s,9H).
III-4 5-(氰乙基)嘧啶-2-羧酸靶C的制备
向5-(氰基乙炔基)嘧啶-2-羧酸叔丁酯C-3(1.5g，6.5mmol)在DCM(80mL)中的溶液中添加TFA(80ml)。将混合物在室温搅拌3小时。LCMS监测反应。将该溶液减压浓缩。将残余物在碱性条件下通过制备型HPLC纯化，得到5-(氰基乙炔基)嘧啶-2-羧酸目标C(500mg，44.2％产率)，为黄色固体。LCMS:M+H +＝174,纯度:96.53％. 1H NMR(400MHz,DMSO)δ14.02(s,1H),9.41(d,J＝27.6Hz,2H).
实施例5：偶联物ADC-1的制备
IV-1中间体CN-C-CMTC的制备
IV-1.1将CN-CMTC-1(640mg,1.0mmol),PABOH(123mg,1.0mmol)与EEDQ(370mg,1.5mmol)溶解在DCM/MeOH(10mL/10mL)中，在室温条件下反应过夜，HPLC检测有新峰生成，原料CN-CMTC-1完全消失，向反应液中加入适量的乙醚沉降后，有固体析出，离心得固体，固体重复用乙醚洗3次，离心，干燥后，得白色固体粗品CN-CMTC-2 650mg左右,产率：87.2％。LCMS：[M+1] +＝746.5。
IV-1.2将CN-CMTC-2(640mg,0.86mmol)用二乙胺(10mL)溶解后反应3小时，TLC检测，反应完全，溶液旋干后，用50mL的乙酸乙酯溶解，再用饱和氯化钠溶液洗三次后，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干后得油状物，用MeOH：DCM＝50：1的洗脱液过柱后得白色固体约240mg,产率：53.4％；LCMS:524.3.
IV-1.3将CN-CMTC-4(230mg,0.42mmol),DCC(104mg,0.50mmol)与NHS(53mg,0.46mmol)溶解在DMF(5mL)中，在室温条件下2小时后，TLC检测CN-CMTC-4完全消失，反 应液加入CN-CMTC-3(219mg,0.42mmol)的DMF(2mL)溶液，室温条件下反应过夜，HPLC检测有新峰生成，Pre-HPLC纯化后得目标产物CN-CMTC-5约210mg.产率：47.8％。LCMS：[M+1] +＝1060.7.
IV-1.4将CMTC-Boc(50mg，0.1mmol),DMAP(61mg，0.5mmol)与三光气(24mg,0.08mmol)称量好后加入圆底烧瓶。加入DCM(1mL)后，搅拌大约5分钟，TLC显示，CMTC-Boc已经反应完全，再加入CN-CMTC-5(105mg,0.1mmol),继续搅拌10分钟左右，LCMS显示大部分为目标产物，部分掉Boc的产物，反应液过一个短的硅胶柱，用DCM：MeOH＝10：1的洗脱剂洗脱后，浓缩，Pre-HPLC纯化后得产物CN-CMTC-6大约45mg，产率：28.3％。LCMS:[1/2M+1]+＝794.9.
IV-1.5将化合物CN-CMTC-6(40mg,0.025mmol)溶解在TFA/DCM(1mL/1mL)的溶液中，室温条件20mins小时后，HPLC检测，CN-CMTC-6已经完全消失，减压蒸馏除掉TFA/DCM，加入适量的NaHCO 3溶液，调节pH为中性，Pre-HPLC纯化后得目标产物约25mg.产率：66.8％；LCMS：[1/2M+1]+＝745.7.
IV-1.6将CN-CMTC-7(20mg,0.013)与CN-C(3mg，0.014)溶解在DMSO/H2O(0.4/0.4mL)中，加入CuBr(2mg)，反应液在室温条件下搅拌1小时，HPLC显示反应完全，并有新峰生成，Pre-HPLC纯化后得产物CN-CMTC-8大约(15mg).产率：72.1％；LCMS：[1/2M+1]+＝850.9。
IV-1.7将CN-CMTC-8(10mg)溶解在DCM(1mL)中，反应液中加入TFA(0.3mL),反应约30mins,HPLC显示反应完全，Pre-HPLC纯化，得CN-C-CMTC的三氟乙酸盐约5mg,产率：59.5％；LCMS:[1/2M+1]+＝714.9.
IV-2偶联粗产物ADC-1的合成
将实施例1的hRS7抗体在5mg/mL的pH 7.2 PBS/EDTA溶液中首先用TCEP 6倍的物质的量在室温进行还原2小时。接着向抗体溶液中加入16倍的物质的量的溶解在DMSO中的化合物CN-C-CMTC(DMSO终浓度10％)。在室温条件下搅拌避光反应3小时，得到偶联粗产物ADC-1。
IV-3偶联粗产物ADC-1的SEC检测
偶联反应粗产品用SEC检测，SEC色谱条件如下：
色谱柱型号：TSKgel G4000SWxl 7.8mmI.D.*30cm，8μm
流动相条件：0.1MPB+0.2MNaCL+5％IPA
检测器波长：280nm/363nm
柱温：30℃
流速：0.4mL/min
洗脱方式：等度洗脱
进样体积：10μL
运行时间：40min
通过SEC的检测，进行280nm与363nm对比，蛋白出峰位置的363nm吸收明显增强，表明小分子已经偶联到蛋白上。
IV-4偶联反应产品纯化：
通过AKTA(填料：sephadex G 25)脱盐纯化后，得偶联物，偶联物再换液到PBS/海藻糖5％的溶液中，SEC检测，小分子已经完全除掉。纯化后的ADC-1见图1。样品超滤浓缩到5mg/mL，冻干保存。图1中，较高的峰表示抗体部分，较低的峰表示喜树碱化合物部分，二者峰保留时间位置相同，可见二者已形成了ADC偶联物。
IV-5 DAR的测定
用紫外分光光度计测定偶联物与裸抗在280nm与363nm吸光度值。偶联物中吉咪替康的浓度由363nm的吸光值按照标准曲线计算而得。偶联物中抗体的浓度由280nm的吸光值减去吉咪替康在280的吸光值计算而得。DAR值由这两个浓度的比值计算而得为6.5。即，n为6.5。
本实施例中的CN-C可以替换为CN-A，CN-B，CN-D；吉咪替康(CMTC)可以替换为SN-38，吉马替康(GMTC)。
实施例6：偶联物ADC-2的制备
V-1中间体SMCC-PEG 2-GGFG-PABC-CMTC的制备
V-1.1将N 3-PEG-NHS(300mg,1.0mmol)与GGFG-PABOH(441mg,1.0mmol)溶解在NMP(5mL)中，在室温条件下反应过夜，HPLC显示有新峰生成，Pre-HPLC纯化后得N 3-PEG 2-GGFG-PABOH大约410mg,产率大约65.5％.LCMS：[M+1] +＝627.5；
V-1.2将CMTC-Boc(50mg，0.1mmol),DMAP(61mg，0.5mmol)与三光气(24mg,0.08mmol)称量好后加入圆底烧瓶。加入DCM(1mL)后，搅拌大约5分钟，TLC显示，CMTC-Boc已经反应完全，再加入N 3-PEG 2-GGFG-PABOH(63mg,0.1mmol),继续搅拌10分钟左右，LCMS显示大部分为目标产物，部分掉Boc的产物，反应液过硅胶柱，用DCM：MeOH＝10：1的洗脱剂洗脱后，浓缩，Pre-HPLC纯化后得产物N 3-PEG 2-GGFG-PABC-CMTC-Boc大约48mg，产率：41.9％。LCMS:[M+1] +＝1157.8.
V-1.3将SMCC-YNE(8mg,0.03)与N 3-PEG 2-GGFG-PABC-CMTC-Boc(30mg，0.03)溶解在DMSO/H 2O(0.4/0.4mL)中，加入CuBr(2mg)反应液在室温条件下搅拌1小时，HPLC显示反应完全，并有新峰生成，Pre-HPLC纯化后得产物大约(20mg)，产率：53.9％；LCMS：[1/2M+1]+＝716.5。
V-1.4将SMCC-PEG 2-GGFG-PABC-CMTC-Boc(15mg)溶解在DCM(1mL)中，反应液中加入TFA(0.3mL),反应约30mins,HPLC显示反应完全，Pre-HPLC纯化，得SMCC-PEG 2-GGFG-PABC-CMTC约8mg,产率：57.5％；LCMS:[M+1] +＝1331.7。
V-2偶联粗产物ADC-2的合成
将实施例1的hRS7抗体在5mg/mL的pH 7.2 PBS/EDTA溶液中首先用TCEP 6倍的物质的量在室温进行还原2小时。接着向抗体溶液中加入16倍的物质的量的溶解在DMSO中的化合物SMCC-PEG2-GGFG-PABC-CMTC(DMSO终浓度10％)。在室温条件下搅拌避光反应1小时，得到偶联粗产物ADC-2。
V-3偶联粗产物ADC-2的SEC检测
检测方法如实施例4步骤IV-3所述。
V-4偶联反应产品纯化：
通过AKTA(填料：sephadex G 25)脱盐纯化后，得偶联物，偶联物再换液到PBS/海藻糖5％的溶液中，SEC检测，小分子已经完全除掉。纯化后的ADC-2类似图1的ADC-1。样品超滤浓缩到5mg/mL，冻干保存。
V-5 DAR的测定
DAR的测定如实施例4步骤IV-5所述。ADC-2的DAR值为7.0。即，n为7.0。
本实施例中的吉咪替康(CMTC)可以替换为SN-38，吉马替康(GMTC)。
实施例7：偶联物ADC-3的制备
VI-1中间体CN-C-PEG 2-GGFG-PABC-CMTC的制备
VI-1.1将CN-C(6mg,0.03mmol)与N 3-PEG 2-GGFG-PABC-CMTC-Boc(30mg，0.03mmol)溶解在DMSO/H 2O(0.4/0.4mL)中，加入CuBr(2mg)反应液在室温条件下搅拌1小时，HPLC显示反应完全，并有新峰生成，Pre-HPLC纯化后得产物大约(18mg).产率：50.8％；LCMS：[M+1] +＝1367.9。
VI-1.2将CN-C-PEG 2-GGFG-PABC-CMTC-Boc(15mg)溶解在DCM(1mL)中，反应液中加入TFA(0.3mL),反应约30mins,HPLC显示反应完全，Pre-HPLC纯化，得CN-C-PEG 2-GGFG-PABC-CMTC约6mg,产率：43.1％；LCMS:[M+1] +＝1267.6.
VI-2偶联粗产物ADC-3的合成
将实施例1的hRS7抗体在5mg/mL的pH 7.2 PBS/EDTA溶液中首先用TCEP 6倍的物质的量在室温进行还原2小时。接着向抗体溶液中加入16倍的物质的量的溶解在DMSO中的化合物CN-C-PEG 2-GGFG-PABC-CMTC(DMSO终浓度10％)。在室温条件下搅拌避光反应3小时，得到偶联粗产物ADC-3。
VI-3偶联粗产物ADC-3的SEC检测
检测方法如实施例4步骤IV-3所述。
VI-4偶联反应产品纯化：
通过AKTA(填料：sephadex G 25)脱盐纯化后，得偶联物，偶联物再换液到PBS/海藻糖5％的溶液中，SEC检测，小分子已经完全除掉。纯化后的ADC-3类似图1的ADC-1。样品超滤浓缩到5mg/mL，冻干保存。
VI-5 DAR的测定
DAR的测定如实施例4步骤IV-5所述。ADC-3的DAR值为6.8。即，n为6.8。
本实施例中的CN-C可以替换为CN-A，CN-B，CN-D；吉咪替康(CMTC)可以替换为SN-38，吉马替康(GMTC)。
实施例8：偶联物ADC-4的制备
VII-1中间体MC-GGFG-CMTC的制备
VII-1.1将Boc-GGFG-OH(436mg，1.0mmol),DCC(247mg，1.2mmol)与NHS(148mg,1.1mmol)溶解在DCM(15mL)后，搅拌大约1小时，HPLC显示，Boc-GGFG-OH已经反应完全，并有Boc-GGFG-NHS的峰生成，再加入甘氨酸(75mg,10mmol),继续搅拌5小时后，HPLC显示，Boc-GGFG-NHS的峰完全消失，并有新峰生成，LCMS确认为目标产物，浓缩，Pre-HPLC纯化后得产物Boc-GGFGG大约380mg，产率：77.1％。LCMS:[M+1] +＝494.2.
VII-1.2向Boc-GGFGG-OH(200mg，0.4mmol),四氢呋喃(6mL),甲苯(2mL)的溶液中滴加吡啶(4.7mL,0.48mmol)及四乙酸铅(212mg,0.48mmol),加热回流5小时后，反应液冷却至室温，用硅藻土过滤后，有机相减压蒸馏除去，再用乙酸乙酯溶解，用饱和食盐水洗两次，有机层用无水硫酸钠干燥后，有机相减压蒸馏除去，用石油醚：乙酸乙酯＝10：1过柱，得目标产物约150mg,产率：73.9％，LCMS：[M+1] +＝508.3。
VII-1.3在0℃条件下向Boc-GGFG-AC(140mg,0.27mmol)和吉咪替康(218mg,0.54mmol)的四氢呋喃(15mL)溶液中加入叔丁醇钾(60.48mg,0.54mmol)，反应液在室温条件下搅拌15mins后，HPLC检测有新峰生成，在0℃的条件下，加入乙酸乙酯和水，用乙酸乙酯与氯仿进行萃取，有机层用无水硫酸钠干燥后，有机层减压蒸馏除去，得粗品约120mg,可直接用于下一步反应。
VII-1.4将Boc-GGFG-CMTC(80mg)溶解在DCM(2mL)中，反应液中加入TFA(0.6mL),反应约30mins,HPLC显示反应完全，Pre-HPLC纯化，得GGFG-CMTC约50mg,产率：70.6％；LCMS:[M+1] +＝752.5.
VII-1.5将GGFG-CMTC(30mg,0.04mmol)与MC-NHS(13mg,0.04mmol)溶解在NMP(3 mL)中，在室温条件下反应过夜，HPLC显示有新峰生成，Pre-HPLC纯化后得MC-GGFG-CMTC大约18mg,产率大约47.7％.LCMS：[M+1] +＝945.5；
VII-2偶联粗产物ADC-4的合成
将实施例1的hRS7抗体在5mg/mL的pH 7.2 PBS/EDTA溶液中首先用TCEP 6倍的物质的量在室温进行还原2小时。接着向抗体溶液中加入16倍的物质的量的溶解在DMSO中的化合物MC-GGFG-CMTC(DMSO终浓度10％)。在室温条件下搅拌避光反应1小时，得到偶联粗产物ADC-4。
VII-3偶联粗产物ADC-4的SEC检测
检测方法如实施例4步骤IV-3所述。
VII-4偶联反应产品纯化：
通过AKTA(填料：sephadex G 25)脱盐纯化后，得偶联物，偶联物再换液到PBS/海藻糖5％的溶液中，SEC检测，小分子已经完全除掉。纯化后的ADC-4类似图1的ADC-1。样品超滤浓缩到5mg/mL，冻干保存。
VII-5 DAR的测定
DAR的测定如实施例4步骤IV-5所述。ADC-4的DAR值为7.4。即，n为7.4。
实施例9：偶联物ADC-X的制备
I-1中间体A的制备
I-1.1将A1(170mg,0.4mmol)与VC-PABOH(150mg,0.4mmol)溶解在DMF(5mL)中，在室温条件下反应过夜，HPLC显示有新峰生成，Pre-HPLC纯化后得A2纯品大约120mg，产率大约43.5％.LCMS：[M+1] +＝690.6。
I-1.2.将吉马替康(Gimatecan)(44.7mg，0.1mmol)、DMAP(36.6mg，0.3mmol)与三光气(14.8mg,0.05mmol)称量好后加入圆底烧瓶。加入DCM(2mL)后，搅拌大约5分钟，TLC显示，Gimatecan已经反应完全，再加入A2(68.9mg,0.1mmol)，继续搅拌4分钟左右，反应液过一个短的硅胶柱，用DCM：MeOH＝10：1的洗脱剂洗脱后，浓缩，Pre-HPLC纯化后得产物A 10mg左右，产率：8.6％。LCMS：[M+1] +＝1164.3。
I-2偶联粗产物ADC-X的合成
将实施例1制备的hRS7抗体在5mg/mL的pH 6.5 10mM磷酸盐溶液中首先用TCEP 5倍的物质的量在室温进行还原2小时。接着向抗体溶液中加入8倍的物质的量的溶解在DMF中的化合物A(DMF终浓度15％)。在室温条件下搅拌避光反应1小时，得到偶联粗产物ADC-X-a。
或者：
将Herceptin抗体在6mg/mL的pH 7.2 PBS溶液中首先用TCEP 9.5倍的物质的量在室温进行还原30分钟。接着向抗体溶液中加入12倍的物质的量的溶解在DMF中的化合物A(DMF 终浓度10％)。在4℃条件下搅拌避光反应3小时，得到偶联粗产物ADC-X-b。
I-3偶联粗产物ADC-X的检测
偶联反应粗产品用SEC检测，SEC色谱条件如下：
色谱柱型号：TSKgel G4000SWxl 7.8mmI.D.*30cm，8μm
检测器波长：280nm/363nm
柱温：30℃
流速：1mL/min
洗脱方式：等度洗脱
进样体积：10μL
运行时间：55min
通过SEC的检测，进行280nm与363nm对比，蛋白出峰位置的363nm吸收明显增强，表明小分子已经偶联到蛋白上。
I-4偶联反应产品纯化：
通过脱盐柱PD-10(填料：sephadex G 25)脱盐纯化后，得偶联物，偶联物再换液到PBS/蔗糖5％的溶液中，SEC检测，小分子已经完全除掉。纯化后的ADC-X样品超滤浓缩到5mg/mL，冻干保存。
I-5 DAR的测定
用紫外分光光度计测定偶联物与裸抗在280nm与363nm吸光度值。偶联物中Gimatecan的浓度由363nm的吸光值按照标准曲线计算而得。偶联物中抗体的浓度由280nm的吸光值减去gimatecan在280的吸光值计算而得。结果如所示。
抗体为实施例1制备的hRS7抗体时：
ADC-X-a的DAR值由这两个浓度的比值计算而得为2.7，即，n为2.7。
抗体为Herceptin抗体时：
ADC-X-b的DAR值由这两个浓度的比值计算而得为7.3，即，n为7.3。
实施例10偶联物ADC-5的制备
偶联物ADC-5
VII-1中间体A的制备
VII-1.1将G1(475mg,1.18mmol)溶解在DCM(3.0mL)的反应液中，加入TBSCl(401mg，2.95mmol),再加入DIPEA(481mg,3.7mmol)后反应1小时，HPLC检测已经反应完全，加入甲醇猝灭后，过硅胶柱后得目标产物G2 510mg,产率：86.1％.LCMS：[M+1] +＝505.6.
VII-1.2将G2(40mg，0.08mmol),DMAP(44mg，0.36mmol)与三光气(14mg,0.05mmol)称量好后加入圆底试管。加入DCM(0.5mL)后，搅拌大约7分钟，TLC显示，G2已经反应完全，再加入CL2-L(60mg,0.06mmol),继续搅拌10分钟左右，加入1d甲醇猝灭，旋干后，Pre-HPLC纯化后得目标产物G3 39mg左右,产率31.2％.LCMS：[M+1] +＝1575.6.
VII-1.3将G3(39mg，0.025mmol)溶解在TBAF/DMF(1mL)的反应液中，30mins后，Pre-HPLC纯化后得到目标产物，冻干后得G4 25mg左右，产率：68.5％.LCMS：[M+1]+＝1475.6.
VII-1.4将G4(40mg,0.026mmol)溶解在DMF/H2O(0.8mL/1.2mL)中，室温条件下加入G5(13mg,0.052mmol),反应液在室温条件下搅拌5mins，HPLC显示有新峰生成，LCMS显示有目标产物生成，Pre-HPLC纯化后得产物G6大约25mg,产率：54.7％.LCMS：[1/2M+1] +＝1749.9.
VII-1.5将G6(20mg,0.011mmol)溶解在DCM/DCA/苯甲醚(1mL/0.1mL/0.1mL)的溶液中， 在室温条件下反应0.5h,HPLC显示有新峰生成，原料已经全部消失，加入适量乙醚沉降后，Pre-HPLC纯化，冻干得目标产物G约12mg,产率：70.6％.LCMS：[M-1] -＝1492.8.
VI-2偶联粗产物ADC-5的合成
将实施例1制备的hRS7抗体在5mg/mL的pH 6.5 10mM磷酸盐溶液中首先用TCEP 7倍的物质的量在37℃进行还原2小时。接着向抗体溶液中加入16倍的物质的量的溶解在DMSO中的化合物G(DMSO终浓度10％)。在室温条件下搅拌避光反应20分钟，得到偶联粗产物ADC-5。
VI-3偶联粗产物ADC-5的检测
检测方法如实施例9步骤I-3所述。
VI-4偶联反应产品纯化：
通过脱盐柱PD-10(填料：sephadex G 25)脱盐纯化后，得偶联物，偶联物再换液到PBS/蔗糖5％的溶液中，SEC检测，小分子已经完全除掉，样品超滤浓缩到5mg/mL，冻干保存。
VI-5 DAR的测定
DAR的测定如实施例9步骤1-5所述。ADC-5的SEC-HPLC图谱如图2所示。
ADC-5的DAR值为7.8。即，n为7.8。
实施例11：ADC-6的合成
合成方法：
1.1将S1(16mg，0.032mmol),DMAP(17mg，0.144mmol)与三光气(6mg,0.02mmol)称量好后加入圆底试管中。加入DCM(0.5mL)后，搅拌大约3分钟，TLC显示，S1大部分消失，再加入A1(20mg,0.03mmol),继续搅拌4分钟左右，将反应液加入乙醚中沉降两次后，Pre- HPLC纯化后得产物大约4.5mg,产率：15.5％.LCMS：[M+1] +＝1165.6.
1.2将A2(4.5mg)溶解在TFA/DCM(0.5mL/0.5mL)的反应液中，3mins后，加入乙醚稀释，猝灭，旋干后，Pre-HPLC纯化后得到目标产物，冻干后得A 2.5mg左右,产率：60.9％.LCMS：[M+1] +＝1065.6.
1.3 A与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，获得的ADC-6的SEC-HPLC结果如图3所示。
ADC-6的DAR值为5.5。即，n为5.5。
实施例12：ADC-7的合成
合成方法：
1.1将B1(475mg,1.18mmol)溶解在DCM(3.0mL)的反应液中，加入TBSCl(401mg，2.95mmol),再加入DIPEA(481mg,3.7mmol)后反应1小时，HPLC检测已经反应完全，加入甲醇猝灭后，过硅胶柱后得目标产物510mg,产率：86.1％.LCMS：[M+1] +＝505.6.
1.2将B2(40mg，0.08mmol),DMAP(44mg，0.36mmol)与三光气(14mg,0.05mmol)称量好后加入圆底试管。加入DCM(0.5mL)后，搅拌大约7分钟，TLC显示，B2已经反应完全，再加入N3-PEG8-Lys(MMT)-PABOH(60mg,0.06mmol),继续搅拌10分钟左右，加入1d甲醇猝灭，旋干后，Pre-HPLC纯化后得目标产物39mg左右,产率31.2％.LCMS：[M+1] +＝1575.6.
1.3将B3(39mg，0.025mmol)溶解在TBAF/DMF(1mL)的反应液中，30mins后，Pre-HPLC纯化后得到目标产物，冻干后得25mg左右，产率：68.5％.LCMS：[M+1] +＝1475.6.
1.4向B4(19mg,0.013mmol)与炔乙胺(5mg,0.1mmol)溶解在DMSO/H2O(1mL/1mL)的溶液中，加入CuBr(0.2mg,0.001mmol)反应1.5小时后，HPLC显示目标产物生成，Pre-HPLC纯化得目标产物约15mg产率：76.1％.LCMS：[M+1] +＝1529.7.
1.5将B5(7mg,0.0046)溶解在DMF/H2O(0.8mL/1.2mL)中，室温条件下加入CN-B-4F(3mg,0.0071mmol),反应液在室温条件下搅拌5mins，HPLC显示有新峰生成，LCMS显示有目标产物生成，Pre-HPLC纯化后得产物B6大约4mg,产率：54.05％.LCMS：[1/2M+1] +＝843.8.
将B6(4mg,0.0024mmol)溶解在DCM/DCA/苯甲醚(1mL/0.1mL/0.1mL)的溶液中，在室温条件下反应0.5h,HPLC显示有新峰生成，原料已经全部消失，加入适量乙醚沉降后，Pre-HPLC纯化，冻干得目标产物约2mg,产率：59.0％.LCMS：[M-1] -＝1425.8.
1.6 B与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，最后获得ADC-7。
实施例13：ADC-8的合成
合成方法：
1.1将C1(80mg，0.1mmol),C2(52mg,0.1mmol)与DIEA(25mg.0.2mmol)溶解在DMF(2mL)的反应液中，在室温条件下搅拌2h后，HPLC检测C2完全消失，Pre-HPLC纯化后得目标产物约30mg,产率：50.9％.LCMS：[M+1] +＝1179.2.
1.2 C与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，最后获得ADC-8，其SEC-HPLC结果如图4所示。
ADC-8的DAR值为3.3。即，n为3.3。
实施例14：ADC-9的合成
合成方法：
1.1将D2(51.8mg，0.1mmol),DMAP(36.6mg，0.3mmol)与三光气(14.8mg,0.05mmol)称量好后加入圆底烧瓶。加入DCM(2mL)后，搅拌大约5分钟，TLC显示，D2已经反应完全，再加入D1(87mg,0.1mmol),继续搅拌4分钟左右，反应液过一个短得硅胶柱，用DCM：MeOH＝10：1的洗脱剂洗脱后，浓缩，Pre-HPLC纯化后得产物D3 40mg左右，产率：28.3％。LCMS：[M+1] +＝1119.6.
1.2将D3(19mg,0.015mmol),溶解在TFA/DCM(0.2mL/0.8mL)的反应液中，反应2h后，HPLC显示原料已基本消失，Pre-HPLC纯化新峰得目标化合物约(10mg),产率为：56.8％。LCMS：[M+1] +＝1249.6.
1.3 D与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，获得ADC-9。
实施例15：ADC-10的合成
合成方法：
1.1将E1(404mg,1.0mmol),E2(285mg,1.0mmol)与K 2CO3(207mg,1.5mmol)溶解在DMF(15mL)的反应液中，室温条件下反应5h后，HPLC显示有部分原料剩余，新峰生成后，加入适量的NH4Cl调节pH为中性后，柱层析纯化得目标产物约140mg,产率：22.9％.
LCMS：[M+1] +＝610.6.
1.2将E3(61mg,0.1mmol)溶解在TFA/DCM(0.5mL/0.5mL)的反应液中反应30mins后，HPLC显示有新峰生成，粗品得目标化合物约40mg,产率：78.4％。LCMS：[M+1] +＝510.6.
1.3将E5(26mg,0.05mmol)与EDCl(19mg,1.0mmol),HOBt(13mg,1.0mmol)在DMF(3mL)的反应液中搅拌3h后，加入E4(25mg,0.05mmol)反应1h后，E4完全消失后，有新峰生成，纯化后得目标产物约4mg,产率7.8％。LCMS：[M+1] +＝1021.3。
1.4E与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，获得的ADC-10的SEC-HPLC结果如图5所示。
ADC-10的DAR值为3.5。即，n为3.5。
实施例16：ADC-11的合成
合成方法：
1.1将F1(26mg,0.5mmol)与EDCl(19mg,1.0mmol),HOBt(13mg,1.0mmol)在DMF(3mL)的反应液中搅拌3h后，加入F2(25mg,0.05mmol)反应1h后，F2完全消失后，有新峰生成，纯化后得目标产物约30mg,产率58.8％。LCMS：[M+1] +＝1016.3。
1.2 F与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，最后获得ADC-11，其SEC-HPLC结果如图6所示。
ADC-11的DAR值为7.1。即，n为7.1。
实施例17：ADC-12的合成
合成方法：
1.1将G1(30mg,0.041mmol),G2(21mg,0.041mmol)与DIEA(10mg,0.08mmol)溶解在DMF(2mL)的反应液中，在室温条件下搅拌2h后，HPLC检测G2完全消失，Pre-HPLC纯化后得目标产物G约30mg,产率：53.7％.LCMS：[M+1] +＝1179.2.
1.2 G与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，最后获得ADC-12，其SEC-HPLC结果如图7所示。
ADC-12的DAR值为6.2。即，n为6.2。
实施例18：ADC-13的合成
合成方法：
1.1将H1(404mg,1.0mmol),H2(285mg,1.0mmol)与K 2CO3(207mg,1.5mmol)溶解在DMF(15mL)的反应液中，室温条件下反应5h后，HPLC显示有部分原料剩余，新峰生成后，加入适量的NH4Cl调节pH为中性后，柱层析纯化得目标产物H3约210mg,产率：39.7％.
LCMS：[M+1] +＝530.6.
1.2将H3(53mg，0.1mmol),DMAP(61mg，0.5mmol)与三光气(14.8mg,0.05mmol)称量好后加入圆底烧瓶。加入DCM(2mL)后，搅拌大约15分钟，TLC显示，H3已经反应完全，再加入H4(104mg,0.1mmol),继续搅拌10分钟左右，Pre-HPLC纯化后得产物H5约80mg左右，产率：50.0％。LCMS：[M+1] +＝1599.6.
1.3将H5(48mg,0.03mmol)溶解在DMSO/H 2O(0.8mL/1.2mL)中，室温条件下加入H6(15mg,0.05),反应液在室温条件下搅拌1h后，HPLC显示有新峰生成，LCMS显示有目标产物生成，Pre-HPLC纯化后得产物大约40mg，产率：71.4％.LCMS：[1/2M+1] +＝937.7.
1.4将H7(30mg,0.016mmol)溶解在DCM/DCA/苯甲醚(1mL/0.1mL/0.1mL)的溶液中，在试问条件下反应0.5h,HPLC显示有新峰生成，原料已经全部消失，加入适量乙醚沉降后，Pre-HPLC纯化，冻干得目标产物约18mg,产率：72.1％.LCMS：[M+1] +＝1617.
1.5 H与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，最后获得ADC-13，其SEC-HPLC结果如图8所示。
ADC-13的DAR值为7.5。即，n为7.5。
实施例19：ADC-14的合成
合成方法：
1.1将K2(26mg,0.05mmol)与EDCl(19mg,1.0mmol),HOBt(13mg,1.0mmol)在DMF(3mL)的反应液中搅拌3h后，加入K1(25mg,0.05mmol)反应1h后，K1完全消失后，有新峰生成，纯化后得目标产物约5mg,产率10.0％。LCMS：[M+1] +＝959.3.
1.2 K与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，最后获得ADC-14，其SEC-HPLC图谱如图9所示。
ADC-14的DAR值为7.8。即，n为7.8。
实施例20：ADC-15的合成
合成方法：
1.1在L1(1g,2.82mmol)的THF(30mL)/甲苯(10mL)溶液中加入四乙酸铅(3.75g,8.47mmol)和吡啶(0.56g,7.05mmol)，将反应液升温至80℃反应3小时。将反应液用水稀释(100mL),用乙酸乙酯(50mL x 2)萃取，合并有机相后用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干后过硅胶柱得目标产物L2大约811mg白色固体，产率：78.01％。LCMS：[M+1] +＝369.3.
1.2.在L2(200mg,0.543mmol)的THF(8mL)溶液中于冰水浴条件下加入CMTC(219.56mg,0.543mmol)和氢氧化锂(26mg,1.09mmol)，将反应液升至室温条件下反应30分钟，HPLC显示有新峰生成。将反应液于冰水浴条件下用柠檬酸淬灭后直接送Pre-HPLC纯化后得目标产物L3大约124mg左右，产率：32.04％。LCMS：[M+1] +＝713.7.
1.3.在L3(70mg,0.098mmol)的DMF(2mL)溶液中加入哌啶(41.7mg,0.49mmol)。将反应液在室温条件下反应1小时，HPLC显示有新峰生成。将反应液于冰水浴条件下用柠檬酸淬灭后直接送Pre-HPLC纯化后得目标产物L4大约27mg左右，产率：56.05％。LCMS：[M+1] +＝491.4.
1.4在MC-GGFG-OH(68.9mg,0.0146mm ol)的DMF(4mL)溶液中加入吡啶(21mg,0.26mmol)和HATU(75.58mg,0.2mmol)。将在室温条件下反应半小时后加入化合物L4(65mg,0.132mmol)并于室温条件下搅拌反应5小时。HPLC显示有新峰生成，将反应液直接送Pre-HPLC纯化后得目标产物L大约31mg左右，产率：24.76％。LCMS：[M+1] +＝945.8.
1.5 L与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，最后获得ADC-15，其SEC-HPLC结果如图10所示。
ADC-15的DAR值为7.2。即，n为7.2。
实施例21：ADC-16的合成
合成方法：
1.1在N-(叔丁氧羰基)乙醇胺M1(50mg,0.31mmol)的DCM(3mL)溶液中加入三乙胺(62.77mg,0.62mmol)和二(对硝基苯)碳酸酯(94.36mg,0.31mmol)，在室温条件下反应16小时，HPLC显示有新峰生成，将反应液直接旋干后得粗品大约101mg,产率大约99.8％。将粗品M2直接用于下一步反应，不进行进一步纯化。
1.2.在M2(12.1mg,0.037mmol)的DMF(1mL)溶液中加入三乙胺(7.5mg,0.074mmol)和CMTC(15mg,0.037mmol)，在室温条件下反应3小时，HPLC显示有新峰生成。将反应液直接送Pre-HPLC纯化后得目标产物M3大约21mg左右，产率：95.7％。LCMS：[M+1] +＝592.4.
1.3.在M3(18mg,0.03mmol)的DCM(2mL)溶液中加入三氟乙酸(0.5mL)。将反应液在室温条件下反应半小时，HPLC显示有新峰生成。向反应液中加入乙醚(1mL)后有固体析出，震 荡后离心沉降。出去溶剂后将固体干燥得目标产物M4大约14.9mg左右，产率：99.64％。
1.4在MC-GGFG-OH(24.16mg,0.046mmol)的DMF(2mL)溶液中加入吡啶(4.18mg,0.061mmol)和HATU(17.49mg,0.046mmol)。将在室温条件下反应半小时后加入化合物M4(14.95mg,0.030mmol)并于室温条件下搅拌反应3小试。HPLC显示有新峰生成，将反应液直接送Pre-HPLC纯化后得目标产物M大约21mg左右，产率：68.83％。LCMS：[M+1] +＝1003.3.
1.5 M与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2-VI-5，最后获得ADC-16，其SEC-HPLC结果如图11所示。
ADC-16的DAR值为7.2。即，n为7.2。
实施例22：ADC-17的合成
合成方法：
1.1将N1(20mg)溶解在DCM(2mL)中，加入DIEA(38m g)再加入三光气(21mg)，反应液搅拌1h后，加入CMTC(40mg),再加入DMAP(36mg)反应5h后，HPLC检测又新峰生成，pre-HPLC纯化后，冻干，得目标产物N2 26mg.LCMS：[M+1] +＝619.3.
1.2将N2(26mg)加入T FA/DCM(0.5mL/0.5mL)的反应液中，反应半小时后，旋干，得目标产物N3 16mg，可直接用于下一步反应。LCMS：[M+1] +＝519.3
1.3将N3(10mg)，N4(8mg)与HATU(9mg)溶解在DMF(1mL)的反应液中，加入DIEA(0.008mL)，反应液室温条件下反应2h后，HPLC显示有新峰生成，LCMS显示为目标产物，Pre-HPLC纯化后得目标产物N 8mg.LCMS：[M+1] +＝1117.2
1.4 N与实施例1制备的hRS7抗体的偶联、纯化、检测步骤同实施例10中的步骤VI-2- VI-5，最后获得ADC-17，其SEC-HPLC结果如图12所示。
ADC-17的DAR值为6.6。即，n为6.6。
实施例23 ADC-5的稳定性
1.实验目的
考察ADC-5在冻存冻融过程中的稳定性。
2.实验设计
ADC-5样品在特定的缓冲液中保存，其经过-20℃的冻存与冻融后考察其载药变化和抗体的聚集变化。
3.实验方法
3.1 ADC-5样品-20℃冻存稳定性
ADC-5(-20℃冻存)湿冰上融解，分装，并直接进样检测RPC4和SEC；分装好的样品-20℃冻存，每间隔至少1天取出一份，湿冰上融解，直接进样分析，RPC4和SEC。同时用ADC-137(常州辰鸿生物科技有限公司，CAS#:1279680-68-0)作为对照。
4.结果处理与分析
4.1液相方法
4.1.1 RP-C4(UPLC)
色谱柱：YMC Triart Bio C4 3μm 3.0*150mm(编号QCC-RP-025)
流速：0.6mL/min 柱温：70℃ 样品盘温度：4℃ 进样量：5μL
紫外检测器波长：280nm、363nm、383nm
流动相A：0.1％TFA in water流动相B:0.1％TFA in CAN
表1 RP-C4梯度
Time/min ％A ％B
2 80 20
4 40 60
9 40 60
10 5 95
12 5 95
12.5 80 20
15 80 20
4.1.2 SEC(HPLC)
色谱柱：TSKgel G3000SWxl 5μm 7.8*300mm
流速：0.4mL/min 柱温：30℃
样品盘温度：4℃ 进样量：30μL
紫外检测器波长：280nm、363nm、383nm
流动相：0.1M PB&0.2M NaCl pH7.0&5％IPA,等度洗脱40min
4.2对照ADC-137/ADC-5样品-20℃冻存稳定性
4.2.1样品RP分析结果
表2样品RP分析
上表中，Area％/363nm表示指363nm检测条件下，各时间出峰所占总面积百分比。RT3.2指出峰时间为3.2分钟，这个位置是ADC-137中小分子SN-38的出峰时间。后四列的出峰位置均为ADC-137的出峰位置，主峰位置是RT4.67。
上表中，RT4.12表示ADC-5偶联的小分子CM(即吉咪替康)的出峰时间，后六列的出峰时间均为ADC-5的出峰时间。RT4.69是ADC-5的主峰位置。
在-20℃冻存21天后，ADC-137和ADC-5主峰面积百分比下降不明显，从游离的SN38和CM的变化来看，ADC-137和ADC-5均相对较为稳定。
实施例24 ADC-5在血清和缓冲溶液中小分子的释放
1.1实验设计：
ADC-5在猴血清(pH7.4)和PBS缓冲溶液(pH7.4)经过37℃孵不同的时间后，检测溶液中游离的小分子的浓度。样品经过有机溶剂(甲醇)沉淀蛋白萃取后，含有游离小分子的上清液直接进样分析，并以ADC-5总小分子含量为基础得到释放百分比。
1.2实验方法：
样品放置：50μL ADC(等体积样品缓冲液做空白)分别加入450μL缓冲溶液或血清(猴混合血清)，混匀后37℃放置孵育，间隔取样(0/1/2/4/8/24/48h-即后续每隔24小时取样，视情况调整时间间隔)；
样品处理：取30μL样品/空白，加入150μL沉淀剂(含1.2μg/mL SN38内标)，涡旋充分混匀，14800rpm 5min 4℃，取上清液进样分析。
1.3样品信息
样品名称 蛋白浓度 DAR
ADC-5 2.162 7.8
1.4液相方法
1.5样品进样设计
样品进样设计
Blank-MeOH
IS-SN38
CM-0.2μg/mL
CM-2μg/mL
CM-20μg/mL
CM-100μg/mL
ADC-5-缓冲液-0～n h
ADC-5-Serum-0～n h
(0/1/2/4/8/24/48h～，即后续每隔24小时取样，视情况调整时间间隔)
1.6检测结果
16.1实验结果(连续监测349h结果)
实验结果如图13、图14和下表3所示。
表3：ADC-5小分子的释放(连续监测349h数据统计结果)
ADC-5样品，其小分子CM在PBS和猴血清中的半衰期分别为约55小时和75小时。经过349h后，ADC-5在PBS中解离最高达到94.22％，而在血清中，其最高解离比例为79.23％。
实施例25：ADC-5在不同pH条件下的稳定性
1.实验目的
考察ADC-5在不同pH条件中的稳定性，与CM、CL2A-CM对比。
2.实验设计
在不同的pH条件中，ADC-5的降解杂质通过RP-C4分析，可以统计ADC-5主峰、CL2A-CM、CM等峰面积变化，同时可以研究其他降解有关物质。
其中，CM指的是吉咪替康，CL2A-CM的结构式为
3.实验方法
3.1溶液配制
先配制50mM PB溶液，分别调节pH至6.0/6.5/7.0/7.5/8.0，然后再配制含10％DMSO的PB溶液(50mM PB pH6.0/6.5/7.0/7.5/8.0分别加入10％DMSO即可)。
3.2样品放置条件
先使用DMSO分别配制1mg/mL的CM溶液和CL2A-CM溶液，然后分别取20μL 1mg/mL的CM溶液和CL2A-CM溶液至50mM PB pH6.0/6.5/7.0/7.5/8.0溶液中，DMSO终浓度为10％；接着放置于25℃进样盘，于0h/3h/6h/9h/12h/15h C18-RP进样2μL分析(0h样品混匀后马上直接进样分析)。
取20μL ADC-5溶液至180μL 50mM PB pH6.0/6.5/7.0/7.5/8.0&10％DMSO溶液中，DMSO终浓度为10％；接着放置于25℃进样盘，于0h/3h/6h/9h/12h/15h C4-RP进样25μL分析。(0h样品混匀后马上直接进样分析)。
3.3液相方法
C18-RP:
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18,1.7μm,2.1*100mm
流动相：A:0.1％TFA in water；B:0.1％TFA in ACN
DAD:245nm,363nm,383nm
流速：0.4mL/min
运行时间：14min
进样量：2μL 柱温35℃
Time/min A％ B％
0 95 5
8.4 5 95
10 0 100
10.1 95 5
11.5 95 5
C4-RP:
色谱柱：YMC Trait Bio C4,3μm,4.6*150mm
流动相：A:0.1％TFA in water；B:0.1％TFA in ACN
DAD:245nm,363nm,383nm
流速：0.6mL/min
运行时间：15min
进样量：25μL 柱温70℃
Time/min A％ B％
0 80 20
2 80 20
4 40 60
9 40 60
10 5 95
12 5 95
12.5 80 20
15 80 2
4.结果处理与分析
4.1 CL2A-CM的稳定性分析
混合溶液的pH值
表4空白溶液(50mM PB)与10％DMSO混合后pH
PB缓冲液pH值： 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
混合后的pH值： 6.38 6.89 7.34 7.84 8.32
上表4以及图15、图16的结果表明：在不同的pH中，CL2A-CM随时间不断降解，且在pH6-8之间pH越高降解越快，相应的CM也随pH增高而加快。
4.2 ADC-5样品的稳定性统计
表5 ADC-5样品统计结果
由上表5和图17、图18可知，在pH6.0 PB&10％DMSO中，ADC-5存在溶解度明显降低现象，其面积百分比降低明显。随着时间和pH的增加，CM的绝对量(峰面积)依次增加，其中pH8.0降解最快。
5.结果与结论
在25℃不同pH条件中,CM相对较为稳定，没有产生明显的杂质；CL2A-CM随着时间的增加逐渐释放CM，且pH越高CM释放越快；ADC-5中没有发现较多的CL2A-CM的存在，而是以CM的形式释放，且pH越低释放越快。
实施例26：ADC细胞杀伤试验
将RPMI-1640 Gibco，22400089)培养基与FBS(四季青，13011-8611)按9:1比例混合，配置成完全培养基。培养人原位胰腺腺癌BXPC-3( CRL-168 TM)细胞，当细胞覆盖整个培养皿底面积的80％以上时，对细胞进行传代并计数，将细胞浓度调整到0.8×10 5个/mL，取100μL加入到96孔板中继续培养。在37℃，CO 2细胞培养箱中继续培养24h后取出。弃去原培养液后，改用含有1％FBS的培养液继续培养30min。
配置不同浓度的受试品：将实施例5-8制备的ADC1-4，以及实施例1制备的hSR7单抗作为阴性对照，用1％FBS的培养液按10 000nmol/L的起始梯度进行10倍稀释，得到1 000nmol/L、100nmol/L、10nmol/L、1nmol/L、0.1nmol/L、0.01nmol/L、0.001nmol/L和0.0001nmol/L共9个浓度点，每孔三个复孔，弃去96孔板中的原培养液，将上述配制好的不同浓度的受试品加入96孔板中，每孔100μl，放入到CO 2培养箱中继续培养72h。向每孔中加入10μL CCK8试剂(碧云天生物技术Beyotime Biotechnology，C0040)，放入到CO 2细胞培养箱中进行孵育2h。然后经SpectraMax M5多功能酶标仪，在450nm波长进行读数，通过检测线粒体内的脱氢酶活性而指试对细胞增殖的抑制作用。
本发明的ADC体外抑制实验结果如图19所示，其中，纵坐标具体而言，其为细胞给药后，细胞量减少后，吸光值也会降低，然后用检测的值和空白对照的比值作图。
相较于空白对照组，4种ADC受试品均显示对BXPC-3活性的抑制作用，并随着受试品的浓度升高，细胞活性明显降低，即呈剂量依赖性。另外，还分别测试4种ADC对HCT-116、Capan-1、NCI-N87、HCC1806、H1975和Calu-3细胞的抑制活性，发现本发明制备的ADC对这几种细胞活性也具有抑制作用(表6)。
表6
受试品 IC 50值(nmol/L) R 2
ADC-1 1.099 0.972
ADC-2 0.748 0.957
ADC-3 13.16 0.958
ADC-4 4.811 0.980
实施例27 ADC-137和ADC-5样品的细胞杀伤试验
本实验的研究目的是评估4种药物对5个细胞系的细胞增殖影响。通过检测在不同药物浓度处理后的细胞活力，计算50％抑制浓度。具体的是：在5株细胞中测定两个ADC样品ADC-137(作为对照，常州辰鸿生物科技有限公司，CAS#:1279680-68-0)、ADC-5，以及两个其对应的小分子样品SN-38和吉咪替康的细胞杀伤活性，并每株细胞设定一个质控参照对照、一个空白对照和一个溶媒对照。每个化合物9个浓度，3个复孔，72小时后用检测细胞活力，并计算IC50。
(1)实验材料
细胞系
序号 细胞系 组织来源 质控参照对照 处理时间
1 BxPC-3 Pancreas 顺铂 72h
2 Calu-3 Lung 顺铂 72h
3 COLO 205 Large intestine/Colorectum 顺铂 72h
4 NCI-N87 Stomach 顺铂 72h
5 Calu-6 Lung 顺铂 72h
所有细胞将置于37℃、5％CO 2和95％湿度条件下培养。用于细胞培养的培养基品牌是Hyclone/Gibco，并加入10-15％的胎牛血清。
试剂和耗材
1.细胞培养常规培养液和耗材
2.胎牛血清FBS(ExCell Bio.,Cat#FND500)
3.CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega，Cat#G7573)
4. 96孔黑壁透明平底细胞培养板(Corning，Cat#3340)
待测药
编号 名称 溶剂 体积(μl) 浓度
1 ADC-137 PBS 0.9mL*2 50μg/mL
2 ADC-5 PBS 0.9mL*2 45μg/mL
3 SN-38 DMSO 5.2mg
4 吉咪替康 DMSO 6.5mg
质控参照对照药
名称 分子量 包装 供货商 浓度 保存
顺铂 300.05 20mg 齐鲁制药 3.33mM RT
仪器
EnVision多标记微孔板检测仪，PerkinElmer，2104-0010A；
细胞计数仪，Inno-Alliance Biotech,Countstar；
CO2培养箱，Thermo Scientific，Model 3100 Series；
生物安全柜，Thermo Scientific，Model 1300 Series A2；
倒置显微镜，Olympus，CKX41SF；
冰箱，SIEMENS，KK25E76TI。
(2)实验方法
1.收获处于对数生长期的细胞并用培养液稀释成细胞悬液，转移至96孔细胞板中，置于37℃、5％CO 2和95％湿度条件下培养过夜，第二天至细胞密度至80％时开始进行药物处理。
2.用相应溶剂溶解被测化合物形成储存液并进行梯度稀释，得到10倍工作浓度溶液；同样制备顺铂阳性药的10倍溶液。
3.在已接种细胞的96孔板中每孔加入10μL药物溶液，每个细胞浓度设置三个复孔(参考附录2)。被测化合物最高浓度为10μM，9个浓度，3.16倍稀释。
4.将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下继续培养72小时。
5.72小时后，将CellTiter-Glo试剂和药物处理细胞培养板放置于室温平衡30分钟。
6.每孔加入50μL的CellTiter-Glo试剂。
7.在定轨摇床上振动2分钟使细胞充分裂解。
8.将细胞培养放置于室温平衡10分钟。
9.用EnVision读取化学发光值。
(3)数据处理
使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC 50值。
细胞存活率(％)＝(Lum 待测药-Lum 培养液对照)/(Lum 细胞对照-Lum 培养液对照)×100％.
Lum 细胞对照-Lum 培养液对照设为100％，Lum Medium control值设为0％.
扩增倍数＝(第五天Lum None treated-Lum Medium control)/(第二天Lum None treated-Lum Medium control)
实验结果
表7-1.化合物在5株细胞系的IC50值
表7-2.化合物在5株细胞系的最大浓度抑制率)
实验结果如上表7-1、7-2和图20-24所示。
实施例28 ADC-137和ADC-5样品的动物学抑瘤实验结果
(1)实验方法
细胞培养
将人胰腺腺癌细胞BxPC-3(ATCC CRL-1687)、人结肠癌细胞Colo205(ATCC CCL-222)、人肺腺癌细胞Calu-3(ATCC HTB-55)和人胰腺癌细胞Capan-1(ATCC HTB-79)体外单层培养，培养条件为1640培养基中加10％热灭活胎牛血清并加琼脂，于37℃、含5％CO 2空气的培养箱中培养。一周两次用0.25％胰酶进行消化处理传代。当细胞呈指数生长期时，收取细胞，计数，接种。
肿瘤细胞接种及瘤块传代
将5.0×10 6肿瘤细胞悬浮于0.1ml PBS与Matrigel混合物(1:1)，接种于5只裸鼠右侧肩胛处(P1代)。待肿瘤长至500-800mm 3时，将荷瘤小鼠用CO 2麻醉处死，取出瘤块，去除周围坏死的组织，将状态较好的将瘤块切成20-30mm 3的小瘤块，接种到新的一批裸鼠(P2代)。
瘤块接种种及分组给药
本试验使用P6代肿瘤组织进行受试品的抗肿瘤活性评价。待P5代肿瘤长至500-800mm 3时，将荷瘤小鼠用CO 2麻醉处死，取出瘤块，去除周围坏死的组织，将状态较好的将瘤块切成20-30mm 3的小瘤块，接种到正式实验用鼠的右侧肩胛处，一共接种70只鼠。瘤块接种13天后肿瘤平均体积达到约135mm 3时，剔除瘤体积过小或过大的小鼠，将剩余的50只小鼠根据瘤体积随机分组并开始给药。
实验观察和数据收集
肿瘤细胞接种后，除了观察肿瘤生长情况，还对药物治疗对动物行为的影响进行监测：实验动物的活动性，摄食和饮水，体重变化(体重每周测量2次)，眼睛、被毛及其它异常情况。实验过程中观察到的临床症状均记录在原始数据中。肿瘤体积计算方法为：肿瘤体积(mm 3)＝1/2×(a×b 2)(其中a表示长径，b表示短径)。
当单只动物的体重下降超过15％时(BWL>15％)，给予相应单只动物停药处理，体重下降恢复到10％以内，恢复给药。当单只小鼠体重下降>20％，按照动物福利对其实施安乐死。
疗效评价标准
相对肿瘤增殖率，T/C％，即在某一时间点，治疗组和对照组的相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。计算公式如下：T/C％＝T RTV/C RTV×100％(T RTV：治疗组平均RTV；C RTV：溶媒对照组平均RTV；RTV＝V t/V 0，V 0为分组时该动物的瘤体积，V t为治疗后该动物的瘤体积)；或T/C％＝T TW/C TW×100％(T TW：治疗组实验终结时平均瘤重；C TW：溶媒对照组实验终结时平均瘤重)。
统计分析
本实验用one-way ANOVA进行各组间肿瘤均值的比较。方差齐性分析得出F值有显著性差异，在ANOVA分析之后用Dunnet’s T3(方差不齐)法再进行多重比较。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。
(2)实验结果
实验结果如下表和图25-34所示。
实施例29 ADC-16、ADC-5和ADC-17的动物学抑瘤实验
1.实验方法
1.1细胞培养
Colo205细胞体外单层培养，培养条件为1640培养基中加10％热灭活胎牛血清并加琼脂，于37℃、含5％CO 2空气的培养箱中培养。一周两次用0.25％胰酶进行消化处理传代。当细胞呈指数生长期时，收取细胞，计数，接种。
1.2肿瘤细胞接种及瘤块传代
将5.0×10 6Colo205肿瘤细胞悬浮于0.1ml PBS与Matrigel混合物(1:1)，接种于5只裸鼠右侧肩胛处(P1代)。待肿瘤长至500-800mm 3时，将荷瘤小鼠用CO 2麻醉处死，取出瘤块，去除周围坏死的组织，将状态较好的将瘤块切成20-30mm 3的小瘤块，接种到新的一批裸鼠(P2代)。
1.3瘤块接种种及分组给药
本试验使用P6代肿瘤组织进行受试品的抗肿瘤活性评价。待P5代肿瘤长至500-800mm 3时，将荷瘤小鼠用CO 2麻醉处死，取出瘤块，去除周围坏死的组织，将状态较好的将瘤块切成20-30mm 3的小瘤块，接种到正式实验用鼠的右侧肩胛处，一共接种70只鼠。瘤块接种13天后肿瘤平均体积达到约135mm 3时，剔除瘤体积过小或过大的小鼠，将剩余的50只小鼠根据瘤体积随机分组并开始给药。给药方案见下表。
备注：IV表示静脉注射，QW*4表示每周给药一次，共4次
1.5实验观察和数据收集
肿瘤细胞接种后，除了观察肿瘤生长情况，还对药物治疗对动物行为的影响进行监测：实验动物的活动性，摄食和饮水，体重变化(体重每周测量2次)，眼睛、被毛及其它异常情况。实验过程中观察到的临床症状均记录在原始数据中。肿瘤体积计算方法为：肿瘤体积(mm 3)＝1/2×(a×b 2)(其中a表示长径，b表示短径)。
当单只动物的体重下降超过15％时(BWL>15％)，给予相应单只动物停药处理，体重下降恢复到10％以内，恢复给药。当单只小鼠体重下降>20％，按照动物福利对其实施安乐死。
1.6疗效评价标准
相对肿瘤增殖率，T/C％，即在某一时间点，治疗组和对照组的相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。计算公式如下：T/C％＝T RTV/C RTV×100％(T RTV：治疗组平均RTV；C RTV：溶媒对照 组平均RTV；RTV＝V t/V 0，V 0为分组时该动物的瘤体积，V t为治疗后该动物的瘤体积)；或T/C％＝T TW/C TW×100％(T TW：治疗组实验终结时平均瘤重；C TW：溶媒对照组实验终结时平均瘤重)。
1.7实验终点
最后一次给药1周后，所有小鼠取肿瘤，并称重、拍照。
1.8统计分析
本实验用one-way ANOVA进行各组间肿瘤均值的比较。方差齐性分析得出F值有显著性差异，在ANOVA分析之后用Dunnet’s T3(方差不齐)法再进行多重比较。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。
2.实验结果
实验结果如下表和图35、图36所示。
实施例30 ADC-8、ADC-11、ADC-5和ADC-12样品的动物学抑瘤实验结果
实验方法
1.1细胞培养
BxPC-3细胞体外单层培养，培养条件为1640培养基中加10％热灭活胎牛血清并加琼脂，于37℃、含5％CO 2空气的培养箱中培养。一周两次用0.25％胰酶进行消化处理传代。当细胞呈指数生长期时，收取细胞，计数，接种。
1.2肿瘤细胞接种及瘤块传代
将5.0×10 6BxPC-3肿瘤细胞悬浮于0.1ml PBS与Matrigel混合物(1:1)，接种于5只裸鼠右侧肩胛处(P1代)。待肿瘤长至500-800mm 3时，将荷瘤小鼠用CO 2麻醉处死，取出瘤块，去除周围坏死的组织，将状态较好的将瘤块切成20-30mm 3的小瘤块，接种到新的一批裸鼠(P2代)。
1.3瘤块接种种及分组给药
本试验使用P6代肿瘤组织进行受试品的抗肿瘤活性评价。待P5代肿瘤长至500-800mm 3时，将荷瘤小鼠用CO 2麻醉处死，取出瘤块，去除周围坏死的组织，将状态较好的将瘤块切成20-30mm 3的小瘤块，接种到正式实验用鼠的右侧肩胛处，一共接种70只鼠。瘤块接种13天后肿瘤平均体积达到约135mm 3时，剔除瘤体积过小或过大的小鼠，将剩余的50只小鼠根据瘤体积随机分组并开始给药。给药方案见下表。
1.5实验观察和数据收集
肿瘤细胞接种后，除了观察肿瘤生长情况，还对药物治疗对动物行为的影响进行监测：实验动物的活动性，摄食和饮水，体重变化(体重每周测量2次)，眼睛、被毛及其它异常情况。实验过程中观察到的临床症状均记录在原始数据中。肿瘤体积计算方法为：肿瘤体积(mm 3)＝1/2×(a×b 2)(其中a表示长径，b表示短径)。
当单只动物的体重下降超过15％时(BWL>15％)，给予相应单只动物停药处理，体重下降恢复到10％以内，恢复给药。当单只小鼠体重下降>20％，按照动物福利对其实施安乐死。
1.6疗效评价标准
相对肿瘤增殖率，T/C％，即在某一时间点，治疗组和对照组的相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。计算公式如下：T/C％＝T RTV/C RTV×100％(T RTV：治疗组平均RTV；C RTV：溶媒对照组平均RTV；RTV＝V t/V 0，V 0为分组时该动物的瘤体积，V t为治疗后该动物的瘤体积)；或T/C％＝T TW/C TW×100％(T TW：治疗组实验终结时平均瘤重；C TW：溶媒对照组实验终结时平均瘤重)。
1.7实验终点
最后一次给药1周后，所有小鼠取肿瘤，并称重、拍照。
1.8统计分析
本实验用one-way ANOVA进行各组间肿瘤均值的比较。方差齐性分析得出F值有显著性差异，在ANOVA分析之后用Dunnet’s T3(方差不齐)法再进行多重比较。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。
3.实验结果
实验结果如图37、图38所示。
产业实用性
本发明中，通过包含新型的接头结构的抗体-药物偶联物，实现了高载药量，同时得到起效时间更快、药物半衰期更长、稳定性优异、生物相容性良好、低免疫原性和安全性良好的抗体-药物偶联物。本发明的的抗体-药物偶联物表现出优异的抗肿瘤效果。

Claims (43)

  1. 式(VIII)表示的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其特征在于，AB表示抗体，T表示式(II)所示化合物，所述抗体-药物偶联物是将化合物(T)与抗体(AB)经由下式(VII)表示的接头连接而成的：
    AB-S-Q 2-L 3-L 4-L P-L b-T (VIII)
    -Q 2-L 3-L 4-L P-L b- (VII)
    其中，
    式(II)中，
    R 1选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、被-OC(＝O)R 13或-NR 7R 8取代的C 1-C 6烷基、被-SiMe 3取代的C 1-C 6烷基、或-CH＝N-O-(C 1-C 6烷基)；
    R 2选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、饱和或不饱和C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、被-NR 7R 8取代的C 1-C 6烷基或被C 2-C 6烯基取代的C 1-C 6烷基；
    R 3选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、NR 7R 8C(＝O)O-基或5-6元含氮杂环基-C(＝O)-C 1-C 6烷氧基；
    R 4选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、C 1-C 6烷基、或C 1-C 6烷氧基；
    或者R 1和R 2可以连接在一起与母体部分形成任选被R 9取代的5-6元环；
    或者R 3和R 4可以连接在一起与母体部分形成任选被R 9取代的5-6元含氧杂环；
    R 7和R 8每次出现时各自独立地选自氢、C 1-C 6烷基、被羟基或氨基取代的C 1-C 6酰基；或者R 7与R 8可以与所连接的N原子一起形成任选被R 9取代的5-6元含氮杂环；
    优选地，R 7和R 8每次出现时各自独立地选自氢、甲基、异丙基、 或者R 7与R 8可以与所连接的N原子一起形成任选被R 9取代的5-6元含氮杂环；
    R 9每次出现时各自独立地选自卤素、羟基、硝基、-NR 7R 8、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、任选被C 1-C 6烷基取代的哌啶基；
    优选地，R 9每次出现时各自独立地选自甲基、-NR 7R 8、哌啶基；
    R 13表示羧基取代的C 1-C 6烷基；
    式(VII)中，
    L 3表示-Z-W-(CH 2CH 2-O)n 5-W’-、-(CH 2)n 5’-C(＝O)-NR 10-(CH 2CH 2-O)n 5-或单键，n 5’表示1～3的整数，各n 5独立地表示1～8的整数，W、W’表示 或单键，其中，W的位置①表示与Z相连，位置②表示与(CH 2CH 2-O-)n 5-相连，W’的位置①表示与(CH 2CH 2-O-)n 5-相连，位置②表示与L 4的-CH 2-相连，且W、W’不同时为 Z表示-CH 2-Cyclo-C(＝O)-NR 10-或单键，Cyclo表示环己烷基团；
    优选地，L 3表示 或单键，各n独立地表示1-6的整数(例如2)；
    L 4表示-(CH 2)n 6-C(＝O)-或-(CH 2)n 6a-NR 10-C(＝O)-(CH 2)n 6b-O-(CH 2)n 6b-C(＝O)-，n 6表示1～6的整数，n 6a表示1～4的整数,n 6b表示1～3的整数；
    L P表示由1～7个氨基酸构成的肽残基；
    L b表示-NR 10-(CH 2)n 7-、-NR 10-(CH 2)n 7-O-、-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-、-NR 10-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-、-NR 10-(CH 2)n 8-O-(CH 2)n 8-(C＝O)-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-、-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-、-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-，各Aryl独立地表示任选地被R 9取代的C 6-C 10芳基，各n 7独立地表示1～4的整数，各n 8独立地表示1～4的整数；
    R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基(优选甲基)；
    Q 2表示-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-、或-Q 1-NR 10-，Q 1为以下式(I)所述化合物，Q 1通过R 11的羧基与-NR 10-形成酰胺键而与L 3连接；
    其中，式(I)表示的化合物如下所示：
    其中，R 11为羧基取代的C 1-C 6烷基，R 12为氰基取代的C 2-C 6炔基，X、Y、X’和Y’中有1-2个C原子被N原子取代；优选地，R 11为羧基取代的C 1-C 3烷基，R 12为氰基取代的C 2-C 3炔基；
    优选地，X、Y、X’和Y’中有且只有1个C原子被N原子取代；
    优选地，X、Y、X’和Y’中有2个C原子被N原子取代，且X、Y中有且只有1个C原子被N原子取代，以及X’、Y’中有且只有1个C原子被N原子取代；
    式(VIII)中，
    Q 2为-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-，如下式结构：
    以该结构的3位与抗体连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头内的亚甲基连接，或者Q 2为-Q 1-NR 10-，通过R 12的炔基碳与抗体铰链部的二硫键形成硫醚键而连接，
    式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(VII)表示的接头中L b的右端-C(＝O)-、-O-或-CH 2-部分。
  2. 根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，R 1表示氢、C 1-C 4烷 基、被-NH(C 1-C 4烷基)取代的C 1-C 4烷基、被 取代的C 1-C 4烷基、被-SiMe 3取代的C 1-C 4烷基、-CH＝N-O-(C 3-C 6烷基)或-(CH 2) 2O(C＝O)(CH 2) 2(C＝O)OH；
    优选地，R 1表示氢、乙基、 被 取代的甲基、 -CH＝NO-叔丁基、-(CH 2) 2O(C＝O)(CH 2) 2(C＝O)OH、。
  3. 根据权利要求1或2所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，R 2表示氢、C 3-C 4烯基、硝基、氨基、被-N(C 1-C 4烷基) 2取代的C 1-C 4烷基或被C 2-C 4烯基取代的C 1-C 4烷基；
    优选地，R 2表示氢、硝基、氨基、
  4. 根据权利要求1-3任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，R 3表示氢、卤素、羟基、C 1-C 4烷基、
    优选地，R 3表示氢、F、羟基、甲基、
  5. 根据权利要求1-4任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，R 4表示氢或卤素；
    优选地，R 4表示氢或F。
  6. 根据权利要求1-5任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，R 1和R 2连接在一起形成以下所示的基团 其中 部分表示连接于母体基团的键；
    优选地，R 1和R 2连接在一起形成以下所示的基团 其中 部分表示连接于母体基团的键。
  7. 根据权利要求1-6任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，R 3和R 4连接在一起形成以下所示的基团 其中 部分表示连接于母体基团的键。
  8. 根据权利要求1-7任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，式(II)表示的化合物如下所示：
    优选地，式(II)表示的化合物为吉马替康或吉咪替康，更优选为吉咪替康：
  9. 根据权利要求1-8任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，式(I)表示的化合物的结构如下所示，
  10. 根据权利要求1-9任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，式(I)表示的化合物作为抗体-药物偶联物中的连接单元，通过R 12的炔基碳与存在于抗体的铰链部的二硫键部分形成硫醚键而与抗体连接。
  11. 根据权利要求1-10任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，L P的肽残基为由选自丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸中的氨基酸形成的肽残基；
    或者，L P为由1-5个氨基酸构成的肽残基；
    或者，L P为选自以下的肽残基：
    -VA-；
    -K-；
    -GGFG-；
    -VC-；
    -EVC-；
    -DVC；
    -EGGFG-；
    -DGGFG-。
  12. 根据权利要求1-11任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，L 4表示-(CH 2)n 6-C(＝O)-或-(CH 2)n 6a-NR 10-C(＝O)-(CH 2)n 6b-O-(CH 2)n 6b-C(＝O)-，n 6表示2～5的整数，n 6a表示1～3的整数,n 6b表示1～2的整数，R 10表示氢或C 1-C 4烷基(优选甲基)；
    优选地，L 4表示
  13. 根据权利要求1-12任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，L b表示-NR 10-(CH 2)n 7-、-NR 10-(CH 2)n 7-O-、-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-C(＝O)-、、-NR 10-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-、-NR 10-(CH 2)n 8-O-(CH 2)n 8-(C＝O)-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-、-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-C(＝O)-、-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 8-O-(C＝O)-NR 10-(CH 2)n 8-NR 10-(C＝O)-，其中各R 10独立地表示氢或C 1-C 4烷基(优选甲基)，各n 7独立地表示1～2的整数，各n 8独立地表示1～2的整数，Aryl表示苯环基团；
    优选地，-NR 10-基团和-(CH 2)n 8-基团位于苯环的对位；
    优选地，L b表示
  14. 根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，式(VII)表示的接头为选自以下所示的基团，其中，各n独立地表示1-8的整数：
  15. 根据权利要求1-14任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，对于一个抗体分子，所述接头-药物的平均连接数目为2～8个，优选为4～8个、更优选为6～8个例如3.3、3.5、5.5、6.2、6.5、6.6、6.8、7.0、7.1、7.2、7.4、7.5或7.8个。
  16. 根据权利要求1-15任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，所述抗体(AB)为全长抗体或其抗原结合片段，或双特异性抗体或其抗原结合片段；
    优选地，所述抗体选自抗Her-2抗体、Trop-2抗体、EGFR抗体、B7-H3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、HER-3、HER-4抗体、CD20抗体、CD30抗体、CD19抗体、CD33抗体；优选地，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体；优选地，所述人源化抗体是全人源抗体；
    优选地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab') 2、单链Fv(scFv)、Fv和dsFv；
    更优选地，所述抗体为抗TROP-2抗体，其中，所述抗Trop-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由KASQDVSIAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASYRYT氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYITPLT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由NYGMN氨基酸序列组成的CDR1，由WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列组成的CDR2，和由GGFGSSYWYFDV氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链和重链的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
    更优选地，所述抗体为抗Her-2抗体，其中，所述抗Her-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由RASQDVNTAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASFLYS氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYTTPPT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由DTYIH氨基酸序列组成的CDR1，由RIYPTNGYTRY氨基酸序列组成的CDR2，和由WGGDGFYAMDY氨基酸序列组成的 CDR3；优选地，所述抗Her-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
  17. 式(X)表示的接头-药物中间体化合物，其特征在于，T表示式(II)所示化合物，所述中间体化合物是将化合物(T)与下式(IX)表示的接头连接而成的：
    Q’ 2-L 3-L 4-L P-L b-T (X)
    Q’ 2-L 3-L 4-L P-L b- (IX)
    其中，
    R 1、R 2、R 3、R 4的定义如权利要求1-7中任一项所述；
    Q’ 2表示(马来酰亚胺-N)-或Q 1-NR 10-，Q 1为式(I)所述化合物，式(I)所述化合物如权利要求1、9-10任一项所限定；
    L 3、L 4、L P、L b的定义如权利要求1、11-13中任一项所述；
    R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基；
    式(IX)中，
    Q’ 2表示(马来酰亚胺-N)-，如下式结构：
    以该结构在1位的氮原子上与包含该结构的接头内的亚甲基连接，或者Q’ 2表示Q 1-NR 10-，Q 1通过R 11的羧基与-NR 10-形成酰胺键而与L 3连接；
    式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(IX)表示的接头中L b的右端-C(＝O)-、-O-或-CH 2-部分。
  18. 权利要求17所述的接头-药物中间体化合物，其中，所述式(II)所示的化合物为权利要求8所述的化合物；优选地，所述接头-药物中间体化合物是选自以下的化合物，其中，各n独立地表示1-8的整数：
  19. 接头，其特征在于，其为下式(VII)表示
    -Q 2-L 3-L 4-L P-L b- (VII)
    其中，Q 2、L 3、L 4、L P、L b的定义如权利要求1、9-13中任一项所述；优选的是，所述接头为选自权利要求14所示的基团。
  20. 式(IV)表示的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其特征在于，AB表示抗体，T表示式(II)所示化合物，所述抗体-药物偶联物是将化合物(T)与抗体(AB)经由下式(III)表示的接头连接而成的：
    AB-S-Q 1-L 1-L 2-L a-T (IV)
    -Q 1-L 1-L 2-L a- (III)
    其中，
    式(II)中，
    R 1、R 2、R 3、R 4的定义如权利要求1-7中任一项所述；
    式(III)中，
    L 1表示-NR 10-W-(CH 2CH 2-O-)n 1-(CH 2)n 2-NR 10-(C＝O)-CH 2OCH 2-(C＝O)-，n 1表示1～24的整数，n 2表示1～4的整数；
    L 2表示缬氨酸残基、胍氨酸残基、苯丙氨酸残基、赖氨酸残基、D-缬氨酸残基、甘氨酸残基、丙氨酸残基、天冬氨酸残基；
    L a表示-NR 10-(CH 2)n 3-、-NR 10-(CH 2)n 4-NR 10-(C＝O)-或-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-；
    R 10每次出现时各自独立地选自氢、任选被1或2个羟基取代的C 1-C 6烷基；
    n 3表示1～4的整数，n 4表示1～4的整数；
    Aryl表示任选地被R 9取代的C 6-C 10芳基；
    W为单键或 其中，位置①表示与-NR 10-相连，位置②表示与(CH 2CH 2-O-)n 1-相连；
    式(IV)中，
    Q 1为式(I)所述化合物，式(I)所述化合物如权利要求1、9-10任一项所限定，其通过R 11的羧基与L 1式中的左端氨基-NR 10-形成酰胺键而连接，通过R 12的炔基碳与抗体铰链部的二硫键形成硫醚键而连接，
    式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(III)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分。
  21. 根据权利要求20的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，L 1表示-NR 10-W-(CH 2CH 2-O-)n 1-(CH 2)n 2-NR 10-(C＝O)CH 2-O-CH 2-(C＝O)-，n 1表示4～12的整数(优选8)，n 2表示1～2的整数(优选2)，R 10表示氢或C 1-C 4烷基(优选甲基)。
  22. 根据权利要求20-21任一项的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，L 2表示赖氨酸残基。
  23. 根据权利要求20-22任一项的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，L a表示-NR 10-Aryl-(CH 2)n 4-O-(C＝O)-，n 4表示1～2的整数，R 10表示氢或C 1-C 4烷基(优选甲基)，Aryl表示苯环基团，优选地，-NR 10-基团和-(CH 2)n 4-基团位于苯环的对位；
    优选地，L a表示
  24. 根据权利要求20所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，式(III)表示的接头为选自以下所示的基团：
  25. 根据权利要求20-24任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，对于一个抗体分子，所述接头-药物的平均连接数目为2～8个，优选为4～8个、更优选为6～8个，例如3.3、3.5、5.5、6.2、6.5、6.6、6.8、7.0、7.1、7.2、7.4、7.5或7.8个。
  26. 根据权利要求20-25任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，其中，所述抗体(AB)为全长抗体或其抗原结合片段，或双特异性抗体或其抗原结合片段；
    优选地，所述抗体选自抗Her-2抗体、Trop-2抗体、EGFR抗体、B7-H3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、HER-3、HER-4抗体、CD20抗体、CD30抗体、CD19抗体、CD33抗体；优选地，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体；优选地，所述人源化抗体是全人源抗体；
    优选地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab') 2、单链Fv(scFv)、Fv和dsFv；
    更优选地，所述抗体为抗TROP-2抗体，其中，所述抗Trop-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由KASQDVSIAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASYRYT氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYITPLT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由NYGMN氨基酸序列组成的CDR1，由WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列组成的CDR2，和由GGFGSSYWYFDV氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；优选地，所述抗Trop-2抗体的轻链和重链的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
    更优选地，所述抗体为抗Her-2抗体，其中，所述抗Her-2抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括由RASQDVNTAVA氨基酸序列组成的CDR1，由SASFLYS氨基酸序列组成的CDR2，和由QQHYTTPPT氨基酸序列组成的CDR3；重链可变区的CDR包括由DTYIH氨基酸序列组成的CDR1，由RIYPTNGYTRY氨基酸序列组成的CDR2，和由WGGDGFYAMDY氨基酸序列组成的CDR3；优选地，所述抗Her-2抗体的轻链及重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
  27. 式(VI)表示的接头-药物中间体化合物，其特征在于，T表示式(II)所示化合物，所述中间体化合物是将化合物(T)与下式(V)表示的接头连接而成的：
    Q 1-L 1-L 2-L a-T (VI)
    Q 1-L 1-L 2-L a- (V)
    其中，
    R 1、R 2、R 3、R 4的定义如权利要求1-7中任一项所述；
    L 1、L 2、L a的定义如权利要求20-23中任一项所述；
    Q 1为式(I)所述化合物，式(I)所述化合物如权利要求1、9-10任一项所限定，其通过R 11的羧基与L 1式中的左端氨基-NR 10-形成酰胺键而连接，
    式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(V)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分。
  28. 权利要求27所述的接头-药物中间体化合物，其中，所述式(II)所示的化合物为权利要求8所述的化合物；优选地，所述接头-药物中间体化合物是选自以下的化合物，
  29. 接头，其特征在于，其为下式(III)表示，
    -Q 1-L 1-L 2-L a- (III)
    其中，Q 1、L 1、L 2、L a的定义如权利要求20-23中任一项所述；优选的是，所述接头为选自权利要求24所示的基团。
  30. 一种药物组合物，其包含权利要求1-16或20-26任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物，以及任选的药学上可接受的载体。
  31. 一种药物制剂，其包含权利要求1-16或20-26任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物。
  32. 权利要求1-16或20-26任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、权利要求30所述的药物组合物和/或权利要求31所述的药物制剂的用途，其用于预防和/或治疗肿瘤或癌症；
    或者，权利要求1-16或20-26任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、权利要 求30所述的药物组合物和/或权利要求31所述的药物制剂在制备预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物中的用途；
    优选地，所述的肿瘤或癌症选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肾癌、尿道癌、胶质细胞瘤、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌；优选地，所述癌症是原位癌或转移癌；优选地，所述乳腺癌为三阴交乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌。
  33. 一种预防或治疗肿瘤或癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的权利要求1-16或20-26任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、权利要求30所述的药物组合物和/或权利要求31所述的药物制剂；
    优选地，所述的肿瘤或癌症选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肾癌、尿道癌、胶质细胞瘤、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌；优选地，所述癌症是原位癌或转移癌；优选地，所述乳腺癌为三阴交乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌。
  34. 权利要求1-16或20-26任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、权利要求30所述的药物组合物和/或权利要求31所述的药物制剂用于制备试剂的用途，所述试剂用于抑制癌细胞生长、增殖或迁移。
  35. 权利要求1-16或20-26任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、权利要求30所述的药物组合物和/或权利要求31所述的药物制剂，其用于抑制癌细胞的生长、增殖或迁移。
  36. 一种抑制癌细胞生长、增殖或迁移的方法，其包括给癌细胞施用有效量权利要求1-16或20-26任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、权利要求30所述的药物组合物和/或权利要求31所述的药物制剂。
  37. 一种抑制癌细胞生长、增殖或迁移的试剂盒，其包括权利要求1-16或20-26任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物、权利要求30所述的药物组合物和/或权利要求31所述的药物制剂。
  38. 权利要求1-16任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物的制备方法，所述方法包括：
    使式(X)所示的接头-药物中间体化合物与AB-SH反应，以通过由抗体的铰链部的二硫键部分形成的硫醚键将式(X)所示的接头-药物中间体化合物与抗体连接；
    其中，R 1、R 2、R 3、R 4的定义如权利要求1-7中任一项所述；
    Q 2、Q’ 2、L 3、L 4、L P、L b的定义如权利要求1、11-13或17中任一项所述；
    T表示式(II)所示的化合物，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(IX)表示的接头中L b的右端-C(＝O)-、-O-或-CH 2-部分；
    AB-SH表示携带巯基的抗体，AB表示抗体。
  39. 权利要求17-18所述的接头-药物中间体化合物的制备方法，所述方法包括：
    方案A：
    (1)Boc-GGFG与PABOH在EEDQ的作用下，二氯甲烷与甲醇作溶剂，室温搅拌过夜，生成Boc-GGFG-PABOH；
    (2)Boc-GGFG-PABOH在TFA/DCM的作用下脱掉Boc生成GGFG-PABOH；
    (3)GGFG-PABOH与N 3-PEGn-NHS活性酯反应生成N 3-PEGn-GGFG-PABOH，n＝0，2，4，6或8；
    (4)吉咪替康-Boc、SN-38-Boc或吉马替康与DMAP，三光气在二氯甲烷的溶剂中反应，加入步骤(3)的N 3-PEGn-GGFG-PABOH，生成N 3-PEGn-GGFG-PABC-吉咪替康-Boc，或N 3-PEGn-GGFG-PABC-SN-38-Boc，或N 3-PEGn-GGFG-PABC-吉马替康，
    (5)步骤(4)产物与炔烃-马来酰亚胺(n＝2,4,6,8时)或炔烃-PEGm-马来酰亚胺(n＝0)用Click反应得最终化合物，m＝2,4,6,8；或者，
    方案B：
    (1)Boc-GGFG在TFA/DCM的作用下脱掉Boc，除掉TFA与二氯甲烷后，与N 3-PEGn-NHS在二氯甲烷中反应，用DIEA做碱，得到化合物N 3-PEGn-GGFG，n＝0，2，4，6或8；
    (2)N 3-PEGn-GGFG与N-Boc-N-甲基乙二胺缩合，再用TFA/DCM脱掉Boc后，得化合物N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-NH-CH 3；
    (3)N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-NH-CH 3与吉咪替康-PNP(或吉马替康-PNP，SN-38-PNP)在有TEA，DMF的条件下反应得化合物N 3-PEGn-GGFG-NH-C 2H 4-N(CH 3)-C(O)-吉咪替康(或SN-38，或吉马替康)，
    (4)步骤(3)产物与炔烃-马来酰亚胺(n＝2，4，6，8时)或炔烃-PEGm-马来酰亚胺(n＝0)用Click反应得最终化合物，m＝2，4，6，8。
  40. 权利要求20-26任一项所述的抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或所述抗体-药物偶联物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的溶剂合物的制备方法，所述方法包括：
    使式(VI)所示的接头-药物中间体化合物与AB-SH反应，以通过由抗体的铰链部的二硫键部分形成的硫醚键将式(VI)所示的接头-药物中间体化合物与抗体连接；
    其中，R 1、R 2、R 3、R 4的定义如权利要求1-7中任一项所述；
    Q 1、L 1、L 2、L a的定义如权利要求20-23中任一项所述；
    T表示式(II)所示的化合物，式(II)表示的化合物以19位的羟基中的氧作为连接部位，或者当R 3或R 4为羟基时，以R 3或R 4的羟基中的氧作为连接部位，连接于上述式(V)表示的接头中L a的右端-C(＝O)-或-CH 2-部分；
    AB-SH表示携带巯基的抗体，AB表示抗体。
  41. 权利要求27-28所述的接头-药物中间体化合物的制备方法，所述方法包括：
    (1)将N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N'-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]-L-赖氨酸(CN-CMTC-1)和PABOH溶解在二氯甲烷：甲醇的溶液中，在EEDQ的作用下反应，重结晶纯化得到产物；
    (2)用哌啶乙腈溶液处理步骤(1)产物，而后纯化产物；
    (3)用DCC，NHS与O-(2-叠氮乙基)-O-[2-(二羟乙酰基-氨基)乙基]七聚乙二醇(CN-CMTC-4)在DMF溶液中反应生成CN-CMTC-4活性酯；
    (4)步骤(3)的活性酯与步骤(2)的产物反应生成化合物；
    (5)吉咪替康-Boc或吉马替康-Boc用三光气，DMAP，与二氯甲烷作用生成甲酰氯化合物，再加入步骤(4)的反应化合物，后用TFA/DCM脱保护处理；
    (6)步骤(5)的产物与式(I)所述的化合物进行Click反应，用TFA/DCM处理后得最终产物，式(I)所述化合物如权利要求1、9-10任一项所限定；
    任选地，步骤(6)还可用以下步骤替代：步骤(5)的产物与SM-1加入DMSO/H 2O的溶液中，再加入CuBr催化，反应完全，纯化后加入TFA/DCM脱保护，得最终产物；
    所述SM-1为
  42. 式(I)表示的化合物，
    其中，R 11为羧基取代的C 1-C 6烷基，R 12为氰基取代的C 2-C 6炔基，X、Y、X’和Y’中有1-2个C原子被N原子取代；优选地，R 11为羧基取代的C 1-C 3烷基，R 12为氰基取代的C 2-C 3炔基；
    优选地，X、Y、X’和Y’中有且只有1个C原子被N原子取代；
    优选地，X、Y、X’和Y’中有2个C原子被N原子取代，且X、Y中有且只有1个C原子被N原子取代，以及X’、Y’中有且只有1个C原子被N原子取代；
    优选地，式(I)表示的化合物结构如下所示，
    优选地，式(I)表示的化合物作为抗体-药物偶联物中的连接单元，通过R 12的炔基碳与存在于抗体的铰链部的二硫键部分形成硫醚键而与抗体连接。
  43. 权利要求42所述化合物的制备方法，所述方法包括：
    (1)让5-溴吡啶-2-羧酸在Boc 2O，DMAP，t-BuOH的作用下反应；所述5-溴吡啶-2-羧酸可替换为6-溴烟酸或5-溴嘧啶-2-羧酸；
    (2)步骤(1)的反应产物与Pd(PPh 3) 2Cl 2，三乙胺，丙炔-3-醇在四氢呋喃中反应；
    (3)步骤(2)的反应产物与TEMPO，PhI(OAC) 2，NH 4OAC在CH 3CN/H 2O为9：1的溶液中反应；
    (4)步骤(3)产物在TFA/DCM的作用下生成产物。
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