KR100387452B1 - 변형된탄수화물보체를갖는이작용성당단백질및이를포함하는약제학적제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탄수화물 보체-변형된 이작용성 당단백질 및 종양-선택적 치료법에서의 이의 용도를 기술하고 있다. 이작용성 당단백질은 종양-특이적 항원과 특이적으로 결합하는 제1 성분과 무독성 프로드럭을 절단하여 세포독성 약물로 만드는 효소 활성을 갖는 제2 성분으로 구성되어 있다. 탄수화물 보체는 만노스, 갈락토스, N-아세틸글루코스아민, 락토스 및 퓨코즈로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 노출된 탄수화물 잔기를 포함한다. 변형된 탄수화물 보체는 종양부위에서 당단백질의 상대적 농도를 증가시키고, 전신 순환계와 비-종양 부위로 부터의 제거를 증가시키는데 기여한다.

Description

변형된 탄수화물 보체를 갖는 이작용성 당단백질 및 이를 포함하는 약제학적 제제.
본 발명은 표적화 단백질 및 효소 특성을 갖는 이작용성 당단백질에 관한 것이다. 보다 특히는, 본 발명은 탄수화물 잔기의 보체가 이들 분자의 순환중의 제거와 종양 결합의 선택성을 증강시키는 방법으로 변형되어진 단백질에 관한 것이다. 전술한 효소 특성은, 동시적으로 또는 후속적으로 투여되는 무독성 "프로드럭(prodrug)"을 종양 세포를 공격하는 세포독성 "약물"로 분해시키는 특성이다.
본 발명은 또한, 이 단백질을 사용한 종양의 치료 방법, 및 재조합적 제조 및 유전자전이(transgenic)된 동물에 의한 제조를 포함하는 당해 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
종양을 억제하고자 하는 노력으로, 지난 20여년간 항체의 특이성을 기초로한 선택적 치료 효과를 성취하기 위한 시도가 있어왔다. 그러나, 충실성 종양의 경우 아직까지 중요한 치료요법이 성취되지 못하고 있다. 비록 표적화 목적으로 고도로 특이적인 종양-선택성 모노클로날 항체가 사용되고는 있으나, 면역요법에서 선행 시도가 성공하지 못한 것은 주로 충실성 종양에 국재(localization)할 수 있는 모노클로날 항체 분자가 소량이기 때문이었다. 일반적으로 치료용으로 불충분한, 이와 같은 낮은 정도의 국재에 대한 한가지 이유는 종양내에 확산 장벽이 존재하기 때문이다[참조: Jain. R. K., Cancer Res. 47: 3039 (1987)]. 약물 투여량을 증가시켜 이를 보충하려는 종래의 시도는 비-종양 구조물에 광범위한 비-특이적 결합 및 일반화된 독성 부작용의 문제에 봉착했다.
선행 기술 화합물은 (a) 모노클로날 항체 또는 종양- 결합성 단백질 파트너의 특이성 및 (b) 효소의 촉매적 증폭 퍼텐셜을 활용하는데 주력해왔다. 이와 같은 항체-효소 접합체를 환자에게 투여할 수 있고, 종양과 결합하기 위한 시간을 부여한다. 그후, 접합체의 효소부위에 의해 분해되어 세포독성 약물을 생성하는 무독성 프로드럭을 환자에게 투여한다. 이론상, 종양에 결합하는 분자의 효소 부위는 종양의 인접부위에서 프로드럭을 종양에 대해 세포독성인 약물로 전환시킨다. 그러나, 실제에 있어서, 이러한 화합물은 여러가지 단점을 갖는다.
첫째, 이와 같은 항체-효소 접합체는 사람에게 고도로 면역원성인데, 이는 이들이 대체적으로, 마우스 항체 및 이종 기원성 효소로 구성된 화학적 접합체를 나타내기 때문이다. 따라서 동일 환자에 대한 동일한 항체-효소 접합체의 반복 사용은 실망스립게 된다[참조: Bagshawe et al., Disease Markers, 9: 233 (1991)].
둘째, 접합체는 혈장으로부터 비교적 느리게 제거되어, 선택적 및 효과적인 프로드럭 활성화는, 예를 들어, 반감기를 단축시키고 효소 활성을 차단시키는 시약으로서 갈락토실화 항-효소 모노클로날 항체("mAb")를 주입한 후에야 가능하게 된다[참조: Sharma et al., Brit. J. Cancer 61: 659, 1990].
상기 언급한 이종기원성 항체-효소 접합체의 면역원성 문제는 주로 순수하게 사람 성분으로 구성되는 재조합 융합 단백질을 사용하여 해결한다. 이와 같은 융합 단백질 제조의 상세한 내용은 전체가 본원에서 참고로 인용되고 있는 유럽 특허 출원 EP-A-0 501 215호에 기술되어 있다. 이 문헌에서, 예를 들어 단백질은 hutuMab-L-β-gluc의 일반식으로 기술되어 있는데, hutuMab는 사람화된, 또는 사람의, 종양-특이적 모노클로날 항체 또는 여전히 종양에 결합하는 이의 일부이며, L은 링커 잔기를 나타내며, β-gluc은 사람 β-글루쿠로니다제를 나타낸다.
그러나, 상기-언급한 타입의 융합 단백질에 대한 약리학적 시험을 수행함에 있어서, 예기치 않게도 사람 종양-보유 누드 마우스에 융합 단백질을 정맥내 주입한 후 매우 짧은 기간(1 내지 3분)에서 조차 상당량의 단백질이 혈관과 근접한 영역( 용이하게 접근 가능한 부위 = EAS)에서 종양 세포에 결합하는 것이 발견되었다. 또한, 이같은 이른시간에 다량의 융합 단백질이 혈장내에 여전히 존재함으로써, 융합 단백질의 주입후 이와 같이 이른 시기에는 종양내에서 적당한 프로드럭의 선택적 및 효과적 활성화가 가능하지 못했다.
본 발명자들은 선행의 문제에 대한 해결책을 개발함으로써 비교적 소량의 분자가 종양에 선택적으로 국재하더라도 치료 효과를 달성할 수 있게 되었다. 이 같은 해결책은 다음에 기술한다.
본 발명은, 첫 번째 치료 단계에서, 종양 환자에게 이작용성 당단백질 또는 이작용성 당단백질 접합체를 포함하는 화합물(이 화합물은 효소 활성을 갖는 제 1 부위 및 종양-특이적 항원에 우선적으로 결합하는 제 2 부위를 포함한다)을 정맥내투여("i. v.")함을 포함한다. 이 화합물의 탄수화물 보체는 만노스, 갈락토스, N-아세틸글루코스아민, 락토스 및 퓨코스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 노출된 탄수화물 잔기를 포함하며, 이 노출된 잔기는 당해 화합물의 유리한 결합 및 제거 특성을 담당한다. 제 1 부위의 효소 활성은 당해 화합물 투여와 동시에 또는 후속적으로 피검자에게 투여되는 무독성 약물을 종양 세포에 대해 세포 독성적인 형태로 절단시킨다.
편의상, 용어 "변형된 탄수화물 보체" 등은 본원에서 만노스, 갈락토스, N-아세틸글루코스아민, 락토스 및 퓨코스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 노출된 탄수화물 잔기를 포함하는 당단백질의 탄수화물 보체를 나타내는 것으로 사용된다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 종양 표적화 부위, 효소 부위 및 변형된 탄수화물 보체를 함유하는 이작용성 융합 당단백질("FUP")이 제공된다. 이 변형된 탄수화물 보체는 종양에 결합하는 FUP의 상대적으로 증가된 농도 및 일반적 순환 및 비특이적 결합 부위로부터 FUP의 증가된 제거에 기여한다. FUP의 효소부위는 무독성 약물을 종양 세포독성 약물로 절단시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 콜로니 선택, 재조합 DNA 및 유전자전이 동물 기술 및 화학적 또는 효소적 반응에 의해 변형된 탄수화물 보체를 갖는 FUP를 제조하는 방법이 제공되고 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 변형된 탄수화물 보체를 갖는 이작용성 항체-효소 접합체("AEC")가 제공되고 있으며, 여기에서 항체 잔기는 종양-특이적 항원상의 에피토프에 대한 것이며, 효소는 무독성 약물을 종양 세포독성 약물로 전환시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, AEC의 탄수화물 보체를 적절하게 변형시키기 위한 방법이 제공되고 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 언급한 탄수화물-변형된 FUP 또는 AEC의 유효량을 환자에게 제공하는 약제학적 제제를 투여하고, 동시에 또는 후속적으로 이 환자에게 효소에 의해 절단되어 종양 세포 독성 약물로 되는 무독성 약물의 유효량을 투여함을 포함하여, 종양 세포독성 약물로 충실성 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공되고 있다.
이들 및 기타 본 발명의 양태는 본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구의 범위를 참조로 용이하게 자명할 것이다.
도면의 상세한 설명
제1도는 VH및 VL유전자의 증폭을 나타낸다. 고유 시그날 서열을 포함하는 VH유전자는 올리고뉴클레오타이드 pAB-Back 및 링커-안티(Linker-Anti, 표 1 참조)을 사용하여 pABstop431/26 hum VH로 부터 증폭시킨다[참조: Gussow et al., Meth Enzymology, 203: 99 (1991)]. VL유전자는 올리고뉴클레오타이드 링커-센스(Linker-Sense) 및 VL-(Mut)-For(표 2 참조)를 사용하여 pABstop431/26 hum VL로부터 증폭시킨다.
제2도는 링커를 통해 VL유전자에 결합된 VH로 구성된 PCR 단편을 나타낸다.
제3a도는 플라스미드 pAB 431 VH로 부터 Hind III 내지 Bgl II 제한 단편의 제거에 의한 벡터의 제조를 나타낸다.
제3b도는 제2도로부터의 PCR 단편을 제3A도로부터의 벡터내로 삽입시켜 플라스미드 pMCG-E1을 제조함을 나타내고 있으며, 이의 클론은 사람화된sFv431/26, 힌지 엑손(hinge exon) 및 완전한 β-글루쿠로니다제를 함유하며, 이의 클론으로 BHK 세포를 형질 감염시킨다.
제4도는 네오마이신 내성 유전자를 형질감염된 BHK 세포내로 운반하는 플라스미드 pRMH 140을 나타낸다.
제5도는 메토트렉세이트 내성 유전자를 형질감염된 BHK 세포내로 운반하는 플라스미드 pSV2를 나타낸다.
제6도는 PCR 증폭 도식을 나타낸다.sFv431/26 단편(a)는 올리고 pAB-Back(표 2 참조) 및sFv-For (표 5 참조)를 사용하는 PCR에 대한 주형으로서 사용된다. 이는 BgIII 및 Hind III 절단 부위가 새로이 생성되는sFv431/26 단편(b)의 3' 말단에 도입되는 결과를 낳는다. 이 PCR 단편을 정제하고 Hind III로 분해시킨 후, Hind III로 절단하고 알칼린 포스파타제로 처리한 PUC18 벡터에 결합시킨다. BgIII 절단 부위를 갖는sFv단편을 함유하는 플라스미드 클론 pkB01을 분리한다.
제7도는 올리고스 이.콜라이 β-gluc-Back1(표 6) 및 이.콜라이 β-gluc.-For(표7)를 사용하는 PCR에 의한 벡터 pRAJ275로 부터의 이.콜라이 β-글루쿠로니다제를 암호화하는 유전자의 증폭을 나타내고 있으며, 동시에 BgIII 절단 부위, Xbal 절단부위 및 5' 말단에 링커를 암호화하는 서열이 제공된다. 생성된 단편을 정제하고 BgIII/Xbal로 분해시킨후, 마찬가지로 BgIII/Xbal로 분해시킨 벡터 pKBO1내로 클로닝시킨다. 링커서열을 통해 이.콜라이 β-글루쿠로러다제에 결합된sFv431/26을 함유하는 플라스미드 클론 pkBO2를 분리한다.
제8도는 HindIII/Xbal로 분해시킴으로써 벡터 pkB02로 부터 수득된sFv-이,콜라이 β-gluc. 단편을 나타내고 있으며, 이 단편을 정제한후, 마찬가지로 HindIII/Xbal로 절단시킨 발현 벡터 pABstop에 결합시킨다. 사람화된sFv431/26, 링커 및 완전한 이.콜라이 β-글루쿠로니다제를 함유하는 플라스미드 클론 pKB03을 분리한다.
본 발명의 탄수화물 보체-변형된 FUP 또는 AEC를 투여함으로써, 비-종양 조직에 대한 세포독성 약물의 유해한 효과없이 또는 이러한 효과를 감소시키면서, 세포독성 약물에 의해 환자의 충실성 종양이 생체내에서 효과적으로 치료될 수 있음이 발견되었다. FUP의 표적 부위 또는 AEC의 표적 항체에 의해 융합 당단백질 또는 당단백질 접합체가 종양 세포내 또는 종양 세포상의 특정 부위로 향하게 되며, FUP 또는 AEC의 효소 부분은 프로드럭을 절단시켜 종양 세포독성 약물로 만들수가 있다. 전술한 바와 같이, 변형된 탄수화물 보체는 종양 부위에서 FUP 또는 AEC의 상대 농도 모두를 증가시키며, 비-특이적 부위 및 전신적 순환계로 부터 이들 단백질의 제거를 증가시킨다.
한편으로는 종양에 결합하여 잔류하면서, FUP 또는 AEC가 일단 혈장 및 정상 조직으로 부터 실질적으로 제거되면, 두번째 단계에서 비독성이면서 세포외로 방출되는 친수성 프로드럭을 적절한(예를 들어 높은) 농도로 정맥내 투여한다. 그후 FUP 또는 AEC에 의해 프로드럭이 절단되면, 이는 선택적으로 종양상에 세포외적으로 위치하게 되어 종양 세포독성 친지질성 약물이 수득된다.
당단백질은 세린 또는 트레오닌의 측쇄 산소원자를 통한 0-글리코시드 결합으로 단백질 쇄(들)에 결합하거나, 또는 N-글리코시드 결합으로 아스파라긴 잔기의 측쇄 질소에 결합한 소당류(oligosaccharide) 단위로 구성되어 있다. 당단백질의 소당류 단위의 총합을 탄수화물 보체로 부른다. N-결합된 소당류는 하기 스케치 I(고 만노스 타입)에 나타낸 바와 같은 3개의 만노스(MAN) 및 2개의 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc)잔기로 구성된 일반적인 5탄당 핵을 함유한다.
소당류 핵의 복합형은 스케치 II에 나타내었으며 N-아세틸뉴라민산(시알산, SIA) 잔기를 말단 탄수화물로서, 퓨코스(FUC) 잔기를 측쇄로서, 갈락토스(Gal) 잔기를 끝에서 두번째 메이트 당으로서 나타내고 있다.
추가의 당을 여러가지 상이한 방법으로 상기한 공통적인 핵에 부착시켜 대단히 다양한 소당류 패턴을 형성시킨다. 당단백질중 말단당의 특성은, 특히, 기관, 대식세포 및 기타 조직에 의한 당단백질의 흡수에 영향을 주는 것으로 공지된 복합인지 시스템의 일부이다[참조: Steer et al., Prog. Liver Dis., 8:99 (1986): Stahl. Curr. Opin. Immunol., 4:49 (1992); Brady et al., J. Inherit. Metab. Dis., (1994)인쇄 참조]. 이같은 영향은 고도로 조직 특이적이고 당단백질 특이적이며, 특정 조직에 의한 특정 순환성 당단백질의 증가된 제거 패턴을 예상하는 것은 아직까지 공지된 바 없다.
FUP를 갈락토실화시키거나 또는 뉴라미니다제로 처리하여 단백질로부터 말단뉴라민산 잔기를 제거함으로써 혈장내의 FUP의 반감기가 단축된다. 놀랍게도, 이런 방법으로 변형된 융합 단백질은, 비록 초기 시점에라도 이의 특이성, 결합 활성 및 효소활성을 보유하면서 EAS에 계속 결합한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 융합 단백질은 문헌[참조: Sharma et al., Brit. J. Cancer 61: 659 (1990)]에 기재된 바와 같은 제거용 제 2 항체를 주입할 필요없이, 혈장으로부터 1 내지 3시간 이내에 효율적이고 적절한 프로드럭의 종양-선택적 활성화가 효과적으로 이루어지도록 하는 정도로 제거된다. 또한, 본 발명자들은, 예를 들어, 갈락토스와 갈락토실화 FUP를 혼합시킴으로써 더욱 효과적인 종양 국재화에 성공하였다. 본 발명의 범주내에서, 갈락토실화하거나 뉴라미니다제로 처리한 추가의 FUP 및 AEC에 대하여 이들의 생물학적 특성을 유지시키면서 상기와 같은 발견을 성공적으로 확장시킬 수 있었다.
본 발명의 일반적 활용도는 4가지 상이한 화학적 조성물, 즉, 이종기원성 항체-효소 복합체, 사람화된 2-쇄 융합 단백질, 사람화된 단쇄 융합 단백질 및 이종기원성 단쇄 융합 단백질을 사용하여 입증할 수 있으며, 이는 항체 단편-효소 접합체 뿐만아니라sFv-효소 접합체 I 및 리간드- 효소 접합체에도 확장시킬 수 있다.
대표적인 AEC는 완전한 마우스 모노클로날 항체(예를 들어, 본원에서 참고로 인용되고 있는 EP-A-0 388 914에 기술한 바와 같음)로 구성되어 있으며, 이는 본원에서 참고로 인용되고 있는 문헌[참조: Haisima et al., Brit, J. Cancer 66: 474(1991), Wang et al , Cancer Res. 52: 4484 (1992)]에 기술된 바와 같이 헤테로이작용성제에 의해 효소 이.콜라이 글루쿠로니다제에 화학적으로 결합한다. 작용성 AEC를 발생시키게 되는 추가의 결합 가능성은 본원에서 참고로 인용되고 있는 문헌에 요약되어 있다[참조: Bioconjugate Chem. 1: 2(1990)].
사람화된, 2-쇄 융합 단백질은 EP-A-0 501 215에 상세히 기술되고 있다. 이는 두개의 폴리펩타이드쇄로 구성된 단백질로서 유전자 조작으로 제조된 바 있다. 하나의 쇄는 사람화된 VHCH1힌지 S 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 β-글루쿠로니다제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 결합시켜 제조한다(S는 폴리펩타이드 스페이서를 암호화 하는 올리고뉴클레오타이드이다). 형질감염시키고 적절한 발현 시스템, 바람직하게는 BHK 또는 CHO 세포에서 발현시킨후, 사람화된 VLCL쇄와 함께 상기-언급한 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드는 사람화된 2-쇄 융합 단백질을 생성하게 된다.
사람화된 단쇄 융합 단백질은, 적절한 발현시스템, 바람직하게는 BHK 또는 CHO 세포내에서 발현시킨 후, 사람화된 VHSVL힌지 S 영역(단쇄 Fv,sFv)을 암호화하는 뉴클레오타이드와 사람 β-글루쿠로니다제를 암호화하는 뉴클레오타이드를 연결시켜 제조한다. 대표적인 사람화된 단쇄 융합 단백질의 작제는 하기 실시예 1 내지 4에서 기술되어 있다. 이종기원성 단쇄 융합 단백질은 하기 실시예 5에서 기술되어 있다.
적절한 벡터내로 재클로닝시킨후, 하기 실시예중에 기술된 작제물은 또한 다른 발현시스템, 예를 들어, 이.콜라이, 사카로마이세스 세레비지애 및 한세눌라 폴리몰파(Hansenula polymorpha), 곤충세포 또는 유전자전이된 동물중에서 발현시킬수 있다.
사람을 제외한 유전자 전이된 포유동물을 유전자적으로 조작하여, 종양을 가진 환자(사람)를 치료하기에 적절한 양 및 형태로 본 발명의 재조합 사람 탄수화물 -변형된 FUP를 용이하게 수득가능한 체액, 예를들면 밀크, 혈액 및 뇨로 분비시킬 수 있다.
본원에서 "동물"이란 사람을 제외한 모든 포유 동물을 포함한다. 이는 또한 배발생 또는 태아 단계를 포함한 모든 발생 단계의 각각의 동물도 포함한다. "유전자전이된" 동물이란, 미세주입 또는 재조합체 바이러스를 사용한 감염과 같이 아세포적 수준에서의 의도적인 유전자 조작에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 수여된 유전 정보를 지닌 세포를 함유하는 모든 동물을 나타낸다.
본원에서의 "유전자전이"란 고전적인 교잡 또는 생체외 수정을 의미하기 보다는 하나 이상의 세포가 재조합 DNA 분자를 수용한 동물을 나타낸다. 물론 이 분자가 동물체의 염색체내로 통합되는 것이 매우 바람직하지만, 본 발명은 또한 유전자 조작에 의해 효모의 인공 염색체내로 넣는 경우와 같이 염색체외적으로 복제되는 DNA 서열을 사용하는 것도 고려하고 있다.
"생식 세포주 유전자전이된 동물"이란 유전 정보가 취합되어 생식세포주에 통합됨으로써 후손에게 당해 정보를 전달할 수 있는 능력을 부여하는 유전자전이된 동물을 의미한다. 실제로, 만일 이러한 후손들이 당해 정보의 일부 또는 전부를 보유한다면, 이들 역시 유전자전이된 동물이다.
동물내로 도입될 정보는 수용체가 속한 동물종에 대해서 외래적인 것(즉, "이종성")이 바람직하지만, 이 정보는 특정한 수용체 개체에게만 외래적이거나, 또는 수용체가 이미 당해 유전정보를 지니고 있을 수도 있다. 마지막의 경우라면, 도입되는 유전자는 고유 유전자에 비해 상이하게 발현될 수도 있다.
본 발명의 유전자전이된 동물은 밀크, 혈청 및 노를 생성하는 사람을 제외한 동물일 수도 있다. 본 발명의 범주에는 가축(돼지, 염소, 양, 소, 말, 토끼 등), 설치류(예: 마우스) 및 애완동물(예를 들어, 고양이 및 개)이 포함된다.
본 발명의 유전자전이된 동물체는, 폴리뉴클레로타이드가 성체 동물의 생식 세포주의 DNA내로 안전하게 통합되어 정상의 멘델의 법칙에 따라 유전되는 방법으로, 본 발명의 FUP를 암호화하는 적절한 폴리뉴클레오타이드를 단세포배에 도입시켜 제조하는 것이 가장 바람직하다.
배 미세 조작기술의 발전에 따라 이제 이종성 DNA를 수정된 포유동물 난세포로 도입시킬 수 있게 되었다. 예를 들어, 전능성 또는 다능성 간 세포(stem cell)를 미세주입술, 인산칼슘 매개 침전, 리포좀 융합, 레트로바이러스 감염 또는 기타 다른 수단으로 형질전환시킬 수 있으며, 이후 형질전환된 세포를 배에 도입하여, 배가 유전자전이된 동물로 발생하도록 한다.
바람직한 방법에서, 발생중인 배를 목적하는 DNA를 함유하는 레트로바이러스로 감염시키면, 이 감염된 배로부터 유전자전이된 동물이 만들어진다. 그러나, 가장 바람직한 방법에서, 적절한 DNA를, 바람직하게는 단세포 단계에서 배의 전핵 또는 세포질에 동시 주입시키고 배가 성숙한 유전자전이된 동물로 발생하도록 한다. 이런 기술은 널리 공지된 것이다. 예를 들어, 수정된 포유동물 난세포내로 이종성DNA를 미세주입시키는 표준 실험실 방법에 대한 총설은, 본원에서 참고로 그 전문이 인용되는 문헌을 참조한다[참조: Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, 1986; Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:(1991): Palmiter et al., Cell 41:343 (1985); kraemer et al., Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1985: Hammer et al., Nature, 315: 680 (1985); Meade et al., U, S, 4,873,316: Wagner et al., U,S, 5,175,385; Krimpenfort et al., U.S. 5,175,384]. 메이드 등[참조: Meade et al , U.S, 4,873,316]의 방법은, 예를 들어 포유동물 선(gland)내에서 β-카제인 프로모터의 조절하에 융합 단백질을 발현시키는 유전자전이된 염소를 사용한, 한가지 유익한 방법을 제공한다.
본 발명의 FUP를 제조하기 위한 유전자전이된 동물내로의 게놈 도입을 위한 유전자는 하기 실시예 및 예로든 전술한 참고 문헌에 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 사람화된 2쇄 융합 당단백질을 암호화하는 유전자는 EP-A-0 501 215에 기술되어 있다. 대표적인 단쇄 융합 당단백질에 대한 유전자의 작제는 하기 실시예 1내지 4에 기술되어 있다. 단쇄 융합 당단백질에 대한 유전자는 실시예 5에 기술되어 있다. 본원에 기술된 재조합으로 제조한 변형물의 범위내에서, 예를 들어, 시알릴 트랜스퍼라제 합성 사이클이 결핍 또는 결손된 작제물을 선택하여, 말단 시알산 잔기가 수적으로 감소하거나 또는 부존재하는 융합 단백질을 제조할 수 있다.
목적하는 FUP를 암호화하는 cDNA를, 적절한 판독 프레임중에, 적절한 조절 시그날과 함께 융합시켜 유전자 작제물을 제조할 수 있으며, 이는 그후, 예를 들어, 통상적인 방법에 따라 박테리아 벡터에서의 제법에 의해 증폭시킨다[참조:Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989, 본원에서 인용되고 있음]. 그후 증폭된 작제물을 벡터로부터 절단해내고 유전자전이된 동물을 만들기 위해 정제한다. 정제는 1회 이상의 음이온성 HPLC 사이클 성취할 수 있으며; 다른 기술로는 수크로스 또는 NaCl 구배를 이용한 한외원심분리, 겔 전기영동 후의 아가로스 처리 및 에탄올 침전 또는 저압 크로마토그래피 등이 포함된다. 수회 사이클의 HPLC에 의한 정제는 현저하게 높은 형질 전환 빈도, 마우스 및 돼지 모두에서 20% 이상의 정도를 허용한다.
상기 언급한 조절 시그날에는 융합 단백질의 선-특이적 발현 및 이의 해독후 글리코실화; 발현된 융합 당단백질의 밀크 또는 기타 체액내로의 분비; 및 완전한 생물학적 활성의 발현에 필요한 시스-작용성 시그날이 포함된다.
이와 같은 조절 시그날에는 융합 유전자의 발현을 유도하는 프로모터가 포함된다. 선 세포에서 특이적으로 활성이고, 밀크 단백질과 관련된 프로모터가 매우 바람직하다. 이런 프로모터중, 바람직한 것은 유장(whey) 산성 단백질(WAP), 단쇄및 장쇄의 α, β 및 κ 카제인, α-락트 알부민 및 β-락토글로불린(BLG) 프로모터이다.
프로모터는 다양한 동물의 밀크의 고유 단백질 조성을 기초로하여 선택될 수 있다. 예를 들어, WAP 및 BLG 프로모터가 유전자전이된 설치류, 돼지 및 양에 특히 유용하다.
이들 프로모터에 대한 유전자는 분리되어 특성이 결정되었다[참조: 본원에서참고로 인용되고 있는 문헌: Clark et al., TIBTECH 5:20 (1987): Henninghausen, Protein Expression and Purification 1:3 (1990)]. 프로모터는 통상적인 제한 엔도뉴클레아제 및 아클로닝 단계로 분리될 수 있다. 물론 마우스 유전자의 "장쇄" WAP 프로모터(5' 4.2kb Sau 3A-Kpn1 프로모터)도 또한 적절하지만, WAP 시그날 서열에 대해 인접한 5'인 2.6kb EcoR1-kpn1 단편으로서 분리되는 마우스 WAP 프로모터가 사용될 수 있다.
유전자전이된 동물 양태에서 중요한 것은 밀크 및/또는 기타 체액으로 단백질의 분비를 지시하는 조절서열이다. 일반적으로, 본 발명의 범주에는 밀크 이외의 다른 체액으로 단백질의 분비를 지시하는 시그날 서열이 포함되지만, 밀크 단백질의 분비를 지시하는 것으로 공지된 동종 또는 이종성 조절인자 서열, 예를 들어 밀크로 부터의 시그날 서열이나 초기의 표적 폴리펩타이드가 사용될 수 있다.
상기한 것외에 전사를 조절하는 유용한 서열중에는 인핸서(enhancer), 스플라이스(splice) 시그날, 전사 종결 코돈 및 폴리아데닐화 부위가 있다.
주입된 DNA 서열은 또한 목적하는 융합 단백질을 암호화 하는 DNA의 3'-미해독 영역 하부 또는 조절에 필요한 밀크 단백질 유전자를 포함한다. 이 영역은 발현 시스템의 RNA 전사체를 안정화시키며, 이에 따라 목적하는 융합 단백질의 수율을 증가시킨다. 이와 관련되어 유용한 이들 3' 미해독 영역중에는 폴리 A 시그날을 제공하는 서열이 있다. 이와 같은 서열은, 예를 들어, SV40 소형 t 항원, 카제인 3' 미해독 영역 및 당해 분야에 널리 공지된 다른 것으로부터 유래될 수 있다.
유전자전이된 암컷 동물로 부터의 밀크의 수득은 통상적으로행해진다[참조:McBurney et al., J. Lab. Clin. Med., 64:485 (1964); Velander et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 89: 12003 (1992)].
재조합적으로 제조된 변형체의 범주내에서, 예를 들어, 시알릴 트랜스퍼라제에 대한 유전자가 불활성이거나 결여된, 또는 시알릴 트랜스퍼라제 합성 사이클의 다른 효소가 불완전 하거나 결핍된 유전자들이 사용된다. 다른 바람직한 발현 시스템은 갈락토실 트랜스퍼라제 또는 만노스-6-포스페이트 신테타제/트랜스퍼라제의 과잉 발현을 나타낸다. 또한, 예를 들어, EP-A-0 330 977(본원에서 참고로 인용됨)에 따라 이중 선택에 의해 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 대단히 높은 능력을 갖는 CHO 세포로 부터 제조된 클론은 시알릴화가 결핍되어 있음이 밝혀겼다. 따라서, 이와 같은 클론은 발현 시스템으로서 사용하기에 대단히 적절하다.
이들 단백질(이미 예로써 기술한 바 있는 항체-효소 접합체, 사람화된 2-쇄융합 단백질, 사람화된 단쇄 융합 단백질 및 이종기원성 단쇄 융합 단백질)을 일단 항-이디오타입 및/또는 항-β-글루쿠로니다제 면역친화성 크로마토그래피로 정제한 후 본원에서 참고로 인용되고 있는 문헌[참조: Krantz et al., Biochemistry 15:3963 (1976)]에 따라 화학적으로 갈락토실화시키거나, 달리는 담체-결합된 뉴라미니다제로 처리한다. 이후에 이들을 변형된 당단백질이라 부른다.
이 변형된 단백질을, BHK 세포내에서 발현시킨 대조용 비변형된 출발 단백질과 시험관내 및 생체내 비교한다. 특이성, 친화도, 정량적 면역반응성 및 정량적 효소 활성에 대한 시험관내 시험은 변형된 단백질이 대조 단백질과는 이러한 관점에서 현저하게 상이하지 않음을 입증한다. 이와 달리, 마우스 및 래트 혈장(생체내)에서 변형된 단백질의 반감기(t1/2β)는 현격하게 단축된다(표 6, 7).
종양을 갖는 누드 마우스에 갈락토실화 단백질을 정맥내 주입한지 1 내지 3 시간째에 상기한 t1/2β의 급격한 단축의 결과로서, 변형된 단백질이 혈장내에서 더 이상 검출되지 않는다. 탈시알릴화된 단백질의 경우, 탈시알릴화된 단백질이 48시간후에는 혈장중에서 더 이상 검출되지 않는 정도까지 t 1/2 β가 단축된다. 이와 동시에, 작용적으로 활성인 변형된 단백질의 종양중의 농도는 종양 g당 200 내지 400ng 범위이다(결국 마우스당 약 400μg의 변형된 단백질 주입에 따라 대단히 높은 특이성 비 100:1 초과가 수득된다).
절대적인 용어의 관점에서, 변형된 단백질의 농도는 상당히 긴 시간후에, 생체내에서 비변형된 출발 단백질을 사용한 비견할만한 특이성 비율에 대해 달성된 것보다 2 내지 3배 더 높다. 게다가, 상기 언급한 변형된 단백질에 대한 높은 특이성 비율(종양 g당 변형된 단백질 μg: 정상 조직 g당 변형된 단백질 μg)은 수시간만에 (각각 1 내지 3시간 또는 48시간) 얻어진 반면에 비변형된 출발 단백질의 경우 비견할만한 특이성 비율(종양 g당 비변형된 출발 단백질 μg: 정상조직 g당 비변형된 출발 단백질 μg)은 수일 만에 (7 내지 8일) 도달되거나 또는 심지어 정상 조직으로부터 제거 속도를 촉진시키는 데 제 2 항체의 사용을 필요로 한다.
당-결합 수용체를 통한 내부화(internalization) 방법으로 생물체의 혈장 및 세포의 영역으로부터 변형된 단백질을 신속히 제거함으로써 [참조: 주로 간내의 갈락토스 수용체; Thornburg et al., J, Biol. Chem. 255: 6820 (1980)] 특히 항체-효소 접합체 및 이종기원성 단쇄 융합 단백질의 경우에 사람에서 감퇴된 면역원성을 갖는 변형된 단백질이 유도된다. 따라서, 이는 또한 항-종양 요법에서 이종기원성 또는 사람화된 FUP의 사용을 용이하게 하거나 또는 적어도 이와 같은 사용이 최초로 가능하게 보이도록 한다.
특히 유용한 사람화된 2쇄 융합 단백질을, 대단히 높은 발현 수준 때문에 선택된 CHO 세포내에서 발현시키고 항-이디오타입 친화성 크로마토그래피로 정제한다. 정맥내 주사 3 내지 7일 후, 이 FUP는 종양중에 BHK 세포내에서 발현되는 동족 융합 단백질 보다 2 내지 3배 높은 정도로 농축된다(표8). 또한, CHO 세포내에 발현된 FUP는 BHK 세포내에서 발현된 융합 단백질보다 훨씬 더 효율적으로 혈장으로부터 제거되므로, CHO 융합 단백질의 경우, 15 이상의 종양: 혈장비가 3일만에 나타난다. BHK 융합 단백질의 경우, 상응하는 비율은 1 미만이다(표8 참조). 7일째에, CHO 융합 단백질의 경우 종양:혈장 비율은 130 범위내에 있으나 BHK 융합 단백질의 경우는 20의 범위에 있다(표8 참조).
CHO 세포 또는 BHK 세포내에서 발현된 사람화된 2-쇄 융합 단백질간의 이같이 매우 뚜렷한 약물역학적 차이는 융합 단백질의 탄수화물 함량의 차이로서 설명되어질 수 있다. 특히, CHO 발현 생성물중 N-아세틸뉴라민산의 함량은, BHK-발현 생성물의 것(5.37mol/mol)과 비교하여 분명하게 감소한다(4.21mol/mol). N-아세틸뉴라민산 함량의 이같은 변화에 의해, 효소적으로 탈시알릴화된 BHK-발현 생성물과 비교하여, 혈장내에서의 반감기가 단축된다. 게다가, 글리칸 맵핑(mapping)은 정상적인 BHK 발현 생성물과 비교하여 CHO-발현 생성물에서 높은 만노스/비시알로-구조물(상기 스케치 II 참조)의 높은 함량을 나타낸다.
효소 활성 시험에서 측정된 고농도의 β-글루쿠로니다제는 쥐과의 내인성 β-글루쿠로니다제의 활성과 FUP의 활성 뿐만 아니라 잠재적으로 발생될 수 있는 절단에 의해 분리될 수도 있는 모든 사람 β-글루쿠로니다제의 활성을 나타낸다. 효소-조직화학적방멉 [참조: Murray et al., J. Histochem. Cytochem. 37: 643(1989)]을 사용하여, 이러한 효소 활성이 정상 조직에서 세포내 활성으로서 존재한다는 것이 입증되었다. 따라서, 이러한 촉매적 잠재능은 세포외적으로 전염되는 친수성 프로드럭의 절단에 기여하지 않거나 단지 대수롭지 않을 정도로만 기여한다.
다음에 예시된 몇몇 실시양태는 본원 명세서와 특허청구의 범위에 기재된 발명의 영역을 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 내지 4
사람화된 종양 항체 잔기와 사람 β-글루쿠로니다제로부터 사람화된 단쇄 융합 단백질의 재조합적 제조
실시예 1
올리고뉴클레오타이드 pAB-Back 및 링커-안티(표1)를 사용하여, 자신의 시그날 서열을 포함하는 VH유전자를 pABstop431/26 hum VH로부터 증폭시킨다[참조:Gussow et al., 1991, 상기]. 올리고뉴클레보타이드 링커-센스와 VL(Mut)-For(표2)를 사용하며, VL유전자를 pABstop431/26 hum VL로 부터증폭시킨다[제1도][참조:Gussow et al,, 1991, 상기].
표 1
표 2
실시예 2
올리고뉴클레오타이드 링커-안티와 링커-센스는 서로에 대해 부분적으로 상보적이며, VH도메인과 VL도메인을 연결하여sFv단편을 형성시키는 폴리펩타이드 링커를 암호화한다. 증폭된 VH와 VL단편을 융합시키기 위해서는, 이들을 정제한 다음, 다음과 같이 10-사이클 반응에 도입시킨다.
반응 혼합물의 표면을 파라핀으로 밀봉하고 94℃에서 1분; 55℃에서 1분, 72 ℃에서 2분간의 프로그램을 사용하여 PCR 장치 속에서 10-사이클 반응을 연속적으로 수행 한다. 이후 플랭킹 프라이머 pAB-Back 및 VL(Mut)- For 2.5pM을 가하고 20 사이클을 추가로 수행한다. 링커를 통하여 VL유전자에 연결된 VH유전자로 이루어진 PCR 단편을 수득한다(제4도). VH유전자 자신의 시그날 서열도 또한 VH유전자앞에 위치한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 VL(Mut)-For를 사용한 결과, VL유전자의 마지막 뉴클레오타이드 염기인 C는 동시에 G로 대체된다. 이러한 PCR 단편은 사람화된 단쇄 Fv(sFv)를 암호화한다.
실시예 3
실시예 2로부더의sFv단편을 HindIII와 BanHI으로 제한 절단시키고, 이를 Hind III에 의해 완전히 절단되고 BgIII에 의해서는 부분적으로 절단된 벡터 pABstop431/26VHhuβgluc1H로 연결시킨다. 벡터 pABstop1/26VHhuβgluc1H는 VH-특이적 시그날 서열을 포함하는 VH엑손과 이에 이어서 CH1 엑손, 사람 IgG3 C 유전자의 힌지 엑손 및 사람 β-글루쿠로니다제의 완전한 cDNA를 함유한다. 사람화된sFv431/26, 힌지 엑손 및 완전한 β-글루쿠로니다제를 함유하는 플라스미드 클론 pMCG-E1를 분리시킨다(제3a도).
벡터 pABstop431/26 VHhuβgluc는 본 명세서내에 참조로 인용되는 문헌[참조: Bosslet et al., Brit. J, Cancer 65;234 (1982)]에 기재되어 있으며 상기 문헌에서 나머지 개개의 성분에 관한 정보는 본 명세서에 기재된 다른 참조문헌으로 부터 얻을 수 있다.
실시예 4
네오마이신 내성 유전자를 지니는 플라스미드 pRMH 140(제4도) 및 메토트렉세이트 내성 유전자를 지니는 플라스미드 pSV2(제5도)와 함께 클론 pMCG-E1을 BHK세포내로 형질감염시킨다. 이때, BHK 세포는 Mab BW 431/26hum의 항원 결합 특성과 사람 β-글루쿠로커다제의 효소적 활성 모두를 보유하는 융합 단백질을 발현한다(실시예 8 및 9 참조).
실시예 5
이종 기원성 단쇄 융합 단백질의 작제
사람화된 VH, S, VL힌지와 S 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(실시예 1 내지 4와 다음 실시예 참조)을 이 콜라이 β-클루쿠로너다제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 연결함으로써, 적합한 발현 시스템, 특히 BHK 세포내에서 발현되는 이종 기원성 단쇄 융합 단백질이 제조된다.
사람화된sFv(안티CEA)와 이.콜라이 β-글루쿠로니다제로부터의 단쇄 융합 단백질의 작제는 아래에 상세히 기재되어 있다.
올리고 pAB-Back(표1)과sFv-For(표3)을 사용하는 PCR에 대한 주형으로서sFv431/26 단편(a)을 사용한다. 이와 같은 방법에서는, BgIII와 HindIII 절단 부위를 새로이 생성된sFv431/26 단편(b)의 3' 말단에 도입한다.
PCR 단편을 정제하고 HindIII로 분해시킨 다음, HindIII로 절단하고 알칼린포스파타제로 처리시킨 pUC18 벡터내로 연결시킨다. BgIII 절단 부위를 갖는sFv단편을 함유하는 플라스미드 클론 pkB01를 분리시킨다(도 6).
이.콜라이 β-글루쿠로니다제를 암호화하는 유전자를, 올리고 이.콜라이 β-gluc-Back1 (표4) 및 이.콜라이 β-gluc-For(표5)를 사용하여 PCR에 의해 벡터 pRAJ260[참조: Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8447 (1986)]
로 부터 증폭시키고, 이와 동시에 5' 말단에 BgIII 절단 부위를 제공하고, 3' 말단에 Xbal 절단 부위를 제공하며 5' 말단에 추가로 링커를 암호화하는 서열을 제공한다. 생성된 단편을 절제하고 BgIII/Xbal로 분해시킨 다음, BgIII/Xbal로 마찬가지로 분해시킨 벡터 pKB01내로 클로닝한다. 링커 서열을 통하여 이.콜라이 β-글루쿠로니다제에 연결된sFv431/26을 함유하는 플라스미드 클론 pkB02를 분리한다(제7도).
HindIII/Xbal 분해에 의해 벡터 pKB02로부터 수득된sFv-이. 콜라이 βgluc. 단편을 정제한 다음, 마찬가지로 HindIII/Xbal로 절단한 발현 벡터 pABstop[참조:Zettlmeissel et al., Behring Institute Mitteilungen (communications) 82: 26(1988)]에 연결시킨다. 사람화된sFv431/26, 링커 및 완전한 이.콜라이 β-글루쿠로니다제를 함유하는 플라스미드 클론 pKB03을 분리한다(제8도).
표 3
표 4
표 5
[vy 6]
[표 6] 계속
[표 7]
[표 8]
실시예 6
2-쇄 융합 단백질의 갈락토실화
융합 단백질의 갈락토실화는 본원에 전문이 인용되어 있는 방법[참조:Mattes, J. Natl Canccr Inst., 79:855(1987)]을 변형하여 수행한다.
시아노메틸-2,3,4,6-테트라-0-아세틸-1-티오-β-D- 갈락토피라노사이드(시그마 제조: 250mg)를 무수 메탄올(머크제조: 6.25ml)중에 용해시킨 다음 메탄올성 나트륨 메톡사이드 용액 (5.4mg/ml) 625μl를 피펫으로 가한다. 실온에서 48시간동안 항온처리한 후, 활성화된 갈락토오즈 유도체 5ml 분취량을 분리해내어 질소 스트림에서 매탄올을 증발제거하고, 융합 단백질 용액(0.25M 붕산나트륨 1mg/ml, pH 8.5) 100ml을 남은 잔사에 가하고, 혼합물을 실온에서 24시간동안 항온처리한다. 이어서 PBS로 밤새 투석한다.
예비형성된 BW 431/26-이.콜라이 β-글루쿠로니다제 접합체 및 모노클로날항체 BW 431/26의 갈락토실화를 유사한 방법으로 수행한다. 유사하게 AEC 및 FUP의 락토실화, N-아세틸-락토실화 및 글루코실화를 수행할 수 있다.
실시예 7
융합 단백질 측정을 위한 기관/종양의 후처리
하기 순서의 단계를 수행한다:
1. 피하 종양을 보유하고 있으며 융합 단백질 또는 항체-효소 접합체로 처리된 누드 마우스(CD1)의 안와 후부(retroorbital)를 출혈시킨 다음 희생시킨다.
2. 혈액을 이미 리쿠에민 25000[Liquemin 25000; Hoffman LaRoche AG] 10μl을 함유한 에펜도르프 튜브에 즉시 가한다.
3. 상기 2번에서 처리된 혈액을 2500rpm에서 10분동안 원심분리(Megafuge 1.0원심분리기; Heraeus)하고, 혈장을 분리한 다음 시험할때까지 동결시킨다.
4. 기관 또는 종양을 분리해내어 칭량한 다음 PBS (pH 7.2)중 1% BSA 2ml와 완전히 균질화시킨다.
5. 종양 균질물을 0.1N HCl을 사용하여 pH 4.2로 조정한다(이 샘플은 과도적정되어서는 안되며, β-글루쿠로니다제는 pH 3.8 미만에서 조숙하게 활성화될 것이다).
6, 균질물을 16000g에시 30분 동안 원심분리하고; 청명한 상층 유체를 분리해내어 0.1N NaOH로 중화시킨다.
7. 상층액 및 혈장을, 하기 실시예에 기술된 바와 같이 OFAT(FUP 농도를 측정) 또는 EAT(β-글루쿠로니다제 농도를 측정)로 시험할 수 있다.
실시예 8
OFAT(기관 융합 단백질 활성 시험;Organ Fusion Protein Activity Test)
시험은 다음의 방법에 따른다:
1. PBS(pH 7.2)중에 1:300으로 희석시킨 염소 항-사람-κ 항체(서던 바이오테크놀러지 어소시에이티스 제조, 주문번호 2060-01) 75μl를 미세역가측정 플레이트(폴리스티렌 U형, 타입 B, Nunc에서 구입, 주문번호 4-60445)의 각각의 웰에 가한다.
2. 미세역가측정 플레이트를 피복하고 실온에서 밤새 항온처리한다.
3. 그후 미세역가측정 플레이트를 웰당, 250μl의 0.05M 트리스-시트레이트 완충액(pH 7. 4)으로 3회 세척한다.
4. 상기의 방법으로 피복시킨 이들 미세역가측정 플레이트를 실온에서 웰당 250μl의 차단 용액(PBS 중의 1% 카제인, pH 7.2)과 함께 30분간 항온처리한다(비-특이적 결합 부위의 차단).
(필요하지 않은 피복된 미세역가측정 플레이트를 실온에서 24시간 건조시킨후, 장기 보관을 위해 피복된 알루미늄백중에 건조제 카트리지와 함께 밀봉시킨다).
5. 차단을 진행하는중에도 기질을 제조한다(각각의 시험을 위한 신선한 기질: 200mM Na 아세테이트 + 0.01% BSA(pH 4.5)중의 2.5mM 4-메틸움베리페닐 β-D-글루쿠로나이드, 주문번호: M-9130, 시그마 제조).
6. 그후, 10개 샘플 + 1개의 양성 대조군 + 1개의 음성 대조군을, 미처리된 96-웰 U-자형 바닥을 갖는 미세역가 플레이트(폴리스티렌, 레너 제조, 주문번호 12058)에서 8단계(150μ1의 샘플로부터 출발하여, 샘플 75μ1을 카제인 침전 용액75μ1에 피페팅시킨다. 등)로 PBS(pH 7.2)중의 1% 카제인중에 1:2로 희석시킨다.
7. 항-사람-κ 항체로 피복시킨 미세역가측정 플레이트로부터 차단 용액을 흡입 제거하고, 희석시킨 샘플 50μl를 희석 플레이트로 부터 시험 플레이트의 각 웰로 옮긴 다음, 시험 플레이트를 실온에서 30분간 항온처리한다.
8. 시험 플레이트를 ELISA 세척 완충액(베링베르케 제조, 주문번호 OSEW96)으로 3회 세척한다.
9. 웰당 50μ1의 기질을 적용시키고, 시험 플레이트를 피복한 다음 37℃에서 2시간 동안 배양한다.
10. 그후 각각의 웰에 스톡 용액(0.2M 글리신 + 0.2% SDS, pH 11.7) 150μl 을 가한다.
11. 355nm의 여기 파장 및 450nm의 방출 파장에서 플루오로스캔 II(ICN 바이오메디칼스 제조, 카탈로그 번호 78-611-00)로 형광측정 평가를 실시한다.
12. 동일한 실험중에 포함되는 양성 대조군(표준곡선으로서 정제된 융합 단백질을 갖는 일련의 희석물)에 대한 형광값의 도움으로, 샘플중의 미확인 융합 단백질의 농도를 측정한다.
실시예 9: EAT (효소 활성 시험: Enzyme Activity Test)
이 시험은 하기 방식으로 수행된다:
1. 10개의 샘플 + 1개의 양성 대조군 + 1개의 음성 대조군을 96-웰 미세역가플레이트(폴리스티렌, Renner로부터 입수, 주문번호 12058)에서 8회의 희석 단계로 pH가 7.2인 PBS중 1% 카세인 중에서 1:2로 희석하여 각 웰이 샘플 50μl를 함유하도록 한다.
2. 기질[200mM Na 아세테이트 + 0.01% BSA (pH 4.5)중의 2.5mM 4-메틸움벨리페릴 β-D-글루쿠로나이드(시그마 제조, 주문번호 U-9130)] 50μl를 각 웰에 가한다.
3. 미세역가 플레이트를 피복하고 37 ℃에서 2시간 동안 항온처리한다.
4. 다음 스톡 용액(0.2M 글리신 + 0.2% SDS, pH 11.7) 150μl를 각 웰에 가한다.
5. 형광측정 평가를 355nm의 여기 파장 및 460nm의 방사 파장에서 플루오로스캔 II(Fluoroscan II; ICN Biomedicals 제조원, 카탈로그 번호 78-611-00)로 수행한다.
6. 포함된 양성 대조군(표준 곡선으로서 정제된 융합 단백질을 갖는 일련의희석물)의 도움으로, 샘플 농도를 계산할 수 있다.
실시예 10
2-쇄 융합 당단백질의 탈시알릴화
2-쇄 융합 단백질을 문헌[참조; Murray; Methods in Enzymology 149: 251(1986)]에 따라 탈시알릴화한다. 아가로즈에 커플링된 뉴라미니다제(시그마 제조, 클로스트리디움 퍼프린젠스로부터의 X-A형) 8단위를 pH가 5인 100mM 아세트산나트륨 완충액 40ml로 3회 세척한 다음 1:1의 현탁액으로서 회수한다. 2-쇄 융합 단백질(pH가 5인 아세트산 나트륨 완충액중 1mg/ml) 100㎖를 이 현탁액에 가한 다음 37℃에서 4시간 동안 온화하게 진탕하면서 항온처리한다. 고정된 뉴라미니다제를 원심분리로 제거하고, 융합 단백질을 PBS에 대해 밤새 투석한다.
실시예 11
변형된 융합 단백질의 신속한 제거의 입증
사람화된 2-쇄 융합 당단백질 100mg을 유럽 특히 공개 공보 제0 051 215호의 10 내지 11 페이지에 기술된 바와 같이, BHK 형질감염 상층액으로부터 정제한다. 정제된 단백질을 상술한 실시예에 기술된 바와 같이, 갈락토실화 또는 탈시알릴화 시킨다.
이렇게 수득한 변형된 단백질, 본 경우에는 갈락토실화되고 사람화된 2-쇄융합 단백질 400μg을 누드 마우스에 정맥내 주사한다. 당해 마우스에는 이미 10일전에 106CEA-발현성 사람 위암종 세포(MZ-Sto-1)를 경피주사하였다. 다양한 시간 간격으로, 마우스를 치사시키고, 기능적으로 활성인 변형된 단백질의 농도를 종양, 혈장 및 정상 조직내에서 OFAT 또는 EAT를 사용하여 측정한다(참조: 실시예 7,8 및 9).
각 경우 1×106CEA-음성 사람 종양(Oat-75)가 제공된 누드 마우스를 항원 대조군으로서 사용한다. 또한 사람화된 2-쇄 융합 단백질(출발 단백질) 또는 고체상 뉴라미니다제로 처리한 사람화된 2-쇄 융합 단백질(탈시알릴화된 단백질) 샘플의 동일한 양을 단백질 대조군으로서 정맥내 주사한다(참조: 실시예 10). 이 대표적인 실시예에서는 기관중에서 발견된 기능적으로 활성인 단백질의 양을 표6 및 7에 나타낸다.
CEA-양성 결장암종, CEA-양성 직장암종, CEA-양성 폐 선암, CEA-양성 췌장암종, CEA-양성 갑상선암종, 및 CEA-양성 유방암종의 예를 사용한 동일한 동물 모델 시스템에서 비교 결과를 얻는다.
예를 들어, 유럽 특허 공개 공보 제0 511 917호에 기술된 바와 같은 적당한 무독성 프로드럭을, 변형된 단백질이 혈장으로 부터 대부분 제거되거나, 또는 정상 조직내에서 내부화되고 분해되는 시점에서 사용하는 경우, 표준 화학치료법 보다 우수한 치료효과를 얻을 수 있다. 이 효과는 다량의 갈락토즈를 변형된 관련 단백질에 가함으로써 추가로 더욱 향상되어 약물역학의 최적화를 나타낼 수 있다.
글루코즈, 포스페이트 이온 또는 메타요오도벤질구아니딘을 변형된 관련 단백질에 가하거나, 이 화합물을 단백질에 앞서 주입함으로써, 문헌의방법[참조;Jahde et al., Cancer Res. 52; 6209 (1992)]에 따라 더욱 향상될 수 있다. 이 방법은 종양내 pH를 저하시킨다. 이결과, 본 발명에 따른 변형된 단백질 및 비변형된 단백질에서 사용된 효소에 의해 프로드럭이 더욱 효율적으로 촉매화 된다. 한편, HCO3또한 종양내 pH를 저하시키는데 사용될 수 있다[참조: Gulliono Gullino et al., J Nat. Cancer Inst 34: 857, (1965)].
본 발명의 조성 및 방법에 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게는 익숙할 것이다. 따라서, 본 발명은 이러한 변형 및 변화를 수용하며, 이러한 변형 및 변화는 본 발명의 청구범위 및 이의 균등물 영역내에 부합되는 것으로 이해된다.
상기에서 인용한 모든 공보의 내용은 각각의 공보에서 참조로 인용한 것과 동일한 정도로서 이들 전체를 참고문헌으로서 본원에서 인용하였다. 35 USC § 119하에서 권익이 청구된 독일연방공화국 특허 출원 제P 43 14 556.6호는 본원에 이의 전체내용이 명백히 인용되어 있다.
제1도는 VH및 VL유전자의 증폭을 도시한 것이다.
제2도는 링커론 통해 VL유전자에 결합된 VH로 구성된 PCR 단편을 도시한 것이다.
제3a도는 플라스미드 pAB 431 VH로 부터 Hind III 내지 BgIII의 제한 단편의 제거에 의한 벡터의 제조를 도시한 것이다.
제3b도는 제2도로부터의 PCR 단편을 제3A도로 부터의 벡터내로 삽입시켜 플라스미드 pMCG-E1를 제조함을 도시한 것이다.
제4도는 네오마이신 내성 유전자를 형질감염된 BHK 세포내로 운반하는 플라스미드 pRMH 140을 도시한 것이다.
제5도는 메토트렉세이트 내성 유전자를 형질감염된 BHK 세포내로 운반하는 플라스미드 pSV2를 도시한 것이다.
제6도는 PCR 증폭 도식도이다.
제7도는 올리고 이.콜라이 β-gluc-Back1 및 이.콜라이 β-gluc.-For을 사용하여 PCR에 의해 벡터 pRAJ275로부터 이 콜라이 β-글루쿠로니다제를 암호화하는유전자의 증폭을 도시한 것이다.
제8도는 Hind III/Xbal으로 분해시킴으로써 벡터 pKBO2로 부터 수득된 sFv-이.콜라이 β-gluc. 단편을 도시한 것이다.

Claims (7)

  1. 만노스, 갈락토스, N-아세틸글루코스아민, 락토스 및 퓨코스로부터 선택된 노출된 말단 탄수화물 잔기로 이루어진 변형된 탄수화물 보체를 갖는, 하기 일반식의 이작용성 융합 당단백질.
    상기식에서,
    huTuMab는 사람 종양 특이적 모노클로날 항체 또는 이의 종양 결합 단편이고, L은 링커 분자이며,
    13 -Gluc는 사람 β -글루쿠로니다제이다.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체 BW 431/26 또는 이의 Fv 영역인 이작용성 융합 당단백질.
  3. 약제학적으로 허용되는 비히클중에 제항 또는 제2항에 따르는 이작용성 융합 당단백질을 함유하는 종양 치료용 약제학적 제제.
  4. a) 제1항 또는 제2항에 따르는 융합 당단백질을 암호화하는 DNA를 제조하는단계,
    b) 이 DNA를 발현 벡터내로 삽입시키는 단계,
    c) 이 DNA를 진핵성 발현 시스템내에서 발현시키는 단계, 및
    d) 발현된 융합 당단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 제1항 또는 제10항에 따른 이작용성 융합 당단백질의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 진핵 발현 시스템이 당 단백질의 높은 수준의 발현을 위해 선택되는 CHO 세포인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 당단백질의 노출된 탄수화물 잔기가 효소 분해로 생성되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 효소적 분해가 엔도글리코시다제, 엑소글리코시다제, 뉴라미니다제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소로 수행되는 방법.
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