JPH10509326A - 酵素プロドラッグ治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はプロドラッグと共に使用する分子キメラに関し、該分子キメラは、標的ほ乳類細胞中で活性化され得る転写調節ＤＮＡ配列と、該転写調節ＤＮＡ配列と機能的にリンクし且つ分泌シグナルペプチドおよび異種酵素をコードするＤＮＡコード化配列とを具備しており、標的細胞中で前記コード化配列が活性化されると、前記異種酵素は細胞原形質膜を通過することができ、且つ細胞外において前記プロドラッグの細胞毒剤もしくは細胞抑制剤への変換を触媒することができるような分子キメラに関する。この分子キメラが、酵素プロドラッグ療法に向けられた遺伝子またはウイルス中に用いられると、プロドラッグの細胞毒剤または細胞抑制剤への変換が細胞外で増大するように当該酵素が分泌されてという事実によって、隣接する細胞の死滅は増大される。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素プロドラッグ治療 本発明は、新規標的酵素プロドラッグ治療に関する。 標的酵素プロドラッグは、化学療法剤の活性を特定の標的部位に制限する方法 を提供する。これは、化学療法剤の全身的な存在が望ましくない副作用を生じる 場合に望ましい。標的化アプローチが望ましい治療方式のいかなるものにも適用 可能ではあるものの、この技術は明らかに、治療方式が健常及び腫瘍化細胞の両 者に対して非選択的な様式でそれらの効果を発揮する細胞毒性の高い化合物の全 身性導入を包含していたガンの治療に特に適用可能である。 ガンの化学療法の領域での研究により、効力の程度が異なる様々な抗腫瘍剤が 生成されている。臨床上有用な標準的薬剤には、アドリアマイシン、アクチノマ イシンD、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、シス−プラチナ、ビンク リスチン及びビンブラスチンが含まれる。しかしながら、これらの現在利用可能 な抗腫瘍剤は、健常細胞に対する毒性及び特定の腫瘍型の耐性のような様々な不 利な点を有することが知られている。手術のような別の形態の治療も知られてい る。しかしながら、この疾患を臨床的に管理することの大きな進歩が達成される ならば、ガン治療の新規アプローチ及び実体が必要となることは明らかである。 標的酵素プロドラッグ治療は、単独で、もしくは既に存在する治療方式と組み 合わせて、ガン治療における重大な改善を提供し得る。そのような治療の１つは 、異種酵素をコードし、標的細胞に搬送される分子キメラの使用に関連する。こ の酵素の分子内発現は、引き続いて投与されるプロドラッグをその活性細胞毒性 もしくは細胞増殖抑制形態に触媒することを可能にする。この治療は、遺伝子も しくはウイルス指向性酵素プロドラッグ治療（ＧＤＥＰＴもしくはＶＤＥＰＴ） として知られる、 ＷＯ−Ａ−９０ ０７９３６は、冒された細胞におけるトランス作用性因子の 存在によって特徴付けられる感染もしくは過剰増殖性障害の治療を記述している が、このトランス作用性因子は、このトランス作用性因子によって調節されるシ ス作用性制御配列、及び前記細胞を防御もしくは破壊に対して感受性にするエフ ェクタ遺伝子を有するポリヌクレオチド構築体を細胞に挿入することにより、遺 伝子の発現を調節することが可能である。例えば、このシス作用性領域がＨＩＶ ｔａｒ領域に相同であり、エフェクタ遺伝子がリシチンＡもしくはＨＳＶ−１ チミジンキナーゼをコードしてもよい。ＨＩＶに感染した際、このＨＩＶ ｔａ ｒタンパク質がｔａｒ領域を活性化し、リシチンＡの転写及び発現を誘導してこ れが細胞死を生じ、あるいはＨＳＶ−１ ｔｋの転写及び発現を誘導してこれが アシクロビル及びガンシクロビルのようなジデオキシヌクレオシド剤での治療の 際の細胞死を生じる。 ＥＰ−Ａ−０ ３３４ ３０１は、組換えレトロウイルスを用いるベクターの 搬送方法であって、該ベクター構築物は、細胞毒性をほとんど持たないか、もし くは全く持たない化合物を病原性作用因子の存在下において毒性生成物に活性化 し、それにより病原性作用因子に対する局所治療を行うタンパク質の発現を指向 することを特徴とする、上記のベクタ搬送方法を記述する。 ＥＰ−Ａ−０ ４１５ ７３１は、哺乳類細胞中において選択的に活性化され ることが可能な転写制御ＤＮＡ配列、該転写制御ＤＮＡ配列に機能するように結 合していて、上記細胞に対して毒性の薬剤へのプロドラッグの変換を触媒するこ とが可能な異種酵素をコードしたＤＮＡ配列を具備することを特徴とした、プロ ドラッグと共に使用するための分子キメラを記述している。 既に存在するＧＤＥＰＴ及びＶＤＥＰＴ方式は、異種酵素の細胞内発現とプロ ドラッグの細胞内触媒とを包含する。これは、例えば、固形腫瘍の僅かに１ない し１０％の細胞しかレトロウイルスに感染し得ないレトロウイルス仲介ターゲッ ティングを用いる腫瘍治療における治療効率を制限する。したがって、治療はそ れらの１ないし１０％の感染細胞に限られ、隣接する９０−９９％の細胞は処置 されないままである。明らかに、過剰増殖条件下においては細胞を殺すことを最 大にすることが望ましく、そのため非感染隣接細胞を殺す能力が非常に重要であ る。 “隣接細胞を殺すこと”が制限されている標的酵素プロドラッグ治療の代替戦 略は、抗体指向性酵素プロドラッグ治療（ＡＤＥＰＴ）であるが、この治療は、 プロドラッグの細胞外変換が起こり得る標的細胞ポピュレーションに対する酵素 を指向し、これに細胞外で付着するターゲッティング抗体に異種酵素を結合させ ることを包含する。その後、活性薬剤を拡散させ、その効果を隣接細胞内で発揮 させることが可能である。しかしながら、例えばＥＰ−Ａ−０ ３８２ ４１１ 及びＷＯ−Ａ−８８／０７３７８に記述されるこのアプローチは、異種酵素／タ ーゲッティング抗体複合体に対する免疫反応を生じる可能性があり、かつこの抗 体／酵素複合体のサイズが大きいため標的部位に搬送される酵素の量が制限され 、顕著な治療効果を付与するには不十分であることがあり得る。 加えて、ＧＤＥＰＴ及びＶＤＥＰＴでは、分裂細胞に優先的に感染するレトロ ウイルスの使用、又はその発現が特定の細胞もしくはガンの型、例えば肝細胞癌 の治療で用いるための肝臓特異的プロモーター、に限定される転写制御配列の存 在のいずれかにより、標的細胞ポピュレーションに対して与えられる化学療法の 活性がある程度限定される。しかしながら、このレベルの限定でさえ、治療効果 は、特定の細胞、すなわち分裂細胞、肝細胞等に、それらがガン性であろうと健 常であろうと、向けるのみである。搬送される化学療法剤が細胞毒性剤である場 合、標的とされる細胞に対する制限が病変に特異的であり、化学療法剤の顕著な 発現が非病変健常細胞で生じないことが明らかに望ましい。本発明の目的の１つ は、病理学的障害を有する細胞中で治療効果を優先的に発揮するように設計され たシステムを使用することにより、この望ましい要求を実質的に満足させること にある、 本発明は、プロドラッグと共に使用するための分子キメラであって、該分子キ メラは、標的哺乳類細胞中で活性化し得る転写制御ＤＮＡ配列及び、この転写制 御ＤＮＡ配列に機能するように結合していて、シグナルペプチド及び異種酵素を コードするＤＮＡコーディング配列を、前記コーディング配列が標的細胞中で発 現する際に該異種酵素が細胞原形質膜を通過することが可能であり、またプロド ラッグの細胞毒性もしくは細胞増殖抑制剤への細胞外変換を触媒することが可能 である、ＤＮＡコード配列を具備した、上記の分子キメラを提供する。 したがって本発明によると、分子キメラが標的細胞中に導入され、そこでそれ らが有するコーディング配列の、転写制御配列の制御の下での発現が、シグナル ペプチドを有する酵素を生成し、それにより該酵素が細胞膜を通して搬出される 。投与されたプロドラッグは、この酵素によって細胞外で活性化合物に触媒され 、隣接細胞に拡散してそこでその治療効果を発揮する。 本発明の一態様によると、異種酵素は、標的哺乳類細胞の細胞外の病理学的に 関連するプロテアーゼによるタンパク質分解性開裂部位での開裂により、酵素前 駆体から得られる。 重要な触媒活性を発現することが可能となる前にタンパク質分解的に開裂され て成熟酵素となることが必要な酵素前駆体は、プロエンザイムもしくはプレプロ エンザイムの形態で自然に生じる。あるいは、組換えＤＮＡ技術を用いて阻止ペ プチドを遺伝的に結合して翻訳される酵素を生成させるか、又は病理学的に関連 したプロテアーゼによるタンパク質分解性開裂部位での開裂によって阻止ペプチ ドが除去されるまで酵素の触媒活性が阻止されるように、プロテアーゼ感受性ア ミノ酸もしくはアミノ酸配列を経由して組換えＤＮＡを酵素に結合させることに 上り、それらを人工的に産生させることができる。これらの比較的不活性な酵素 の全ては、それらが天然のものであろうと人工的に作製されたものであろうと、 本発明において用いられる酵素前駆体であり、本願ではプロエンザイムと呼ぶこ とがある。 本発明の好ましい態様においてこの酵素前駆体は、酵素及び該酵素の細胞外搬 出を容易にし、このプロセスの間に開裂して細胞外成熟酵素を生成する分泌シグ ナル配列を具備する。 病理学的に関連するプロテアーゼは、特定の細胞の病変の結果として全ての細 胞ポピュレーションに関連して排他的に発現するか、または特定の細胞の病変に 相関する上昇レベルで発現するあらゆるプロテアーゼである。プロテアーゼの上 昇レベルは、腫瘍型の範囲の特徴であり、明らかに腫瘍原性プロセス、特には転 移性プロセス、に関連している(ＦＡＳＥＢ７，１４３４−１４４１(１９９３)) 。このような腫瘍関連プロテアーゼの例には、ウロキナーゼ、ゲラチナーゼ（例 えば、７２ｋＤ）及びストロモリシンが含まれる。 本発明によると、このような病理学的に関連したプロテアーゼは、酵素の翻訳 後変性に対する制御を、その酵素が病理学的に関連したプロテアーゼによって開 裂されない限り、かつ開裂されるまで、その触媒活性を全く、もしくは少なくと も治療効果を得るのに十分な程度発現することが不可能であるように発揮するこ とにより、標的酵素プロドラッグ治療の信頼性を増大させる機構を提供する。こ の触媒活性は、そのプロドラッグを細胞毒性もしくは細胞増殖抑制性化合物に変 換するのに必要である。したがって、炎症、ウイルス感染、腫瘍原性等の結果と して毒性作用因子が、病理学的に関連したプロテアーゼを発現する標的細胞に関 連して、排他的ではないにしろ優先的に生成する。 ガン患者においては、この転移性プロセスがしばしば二次腫瘍を生成し、これ らの二次腫瘍がしばしば最終的な死因となる。イン・ビボでの研究により、分泌 されたマトリックスメタロプロテアーゼの活性を薬理学的に阻害することによっ て転移が阻止されることが示された(Ｒｅｉｃｈ,ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ ４０ ３３０７−３３１２（１９８８）)。 マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、構造および触媒特性が良好に 特徴付けられている、亜鉛メタロ酵素の一族である。これらの酵素は全て、活性 化の間にアミノ末端ドメインのタンパク質分解性開裂を受け、また配列の類似性 、金属キレート剤による阻害、及びメタロプロテアーゼの組織阻害剤による阻害 によってさらに定義されるプロエンザイムとして分泌される。この一族のよりよ く特徴付けられたメンバーには、腸コラゲナーゼ、好中球コラゲナーゼ、ストロ メリシン−１、ストロメリシン−２、マトリリシン、ゲラチナーゼＡ及びゲラチ ナーゼＢが含まれる。複数の研究により、ＭＭＰ発現、侵襲性挙動、及び転移能 力の間の正の相関が明瞭に示された。ヒトの腫瘍におけるＭＭＰ発現の研究によ り、これらのプロテアーゼが、乳ガン、前立腺ガン、結腸ガン、肺ガン、卵巣ガ ン、及び甲状腺ガンを含む多くの腫瘍の侵襲性表現型の重要な構成要素であるこ とが示唆された。したがって、本発明の特定の態様に従って使用するための特に 好ましい異種酵素前駆体には、ここに記述されるマトリックスメタロプロテアー ゼによって開裂し得るプロテアーゼ開裂部位を有するものが含まれる。このよう なプロテアーゼ開裂配列は当該技術分野においてよく知られており、本発明の態 様に従って使用するのに適した異種酵素の適切なプロエンザイムに自然に存在す ることがあり、または組換えＤＮＡ技術を用いてそのようなプロエンザイムに組 込む ことが可能である。本発明による治療に特に適する腫瘍には、このようなマトリ ックスメタロプロテアーゼを発現するものが含まれる。 特に好ましいものは、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ、Ａ ｌａ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｖ ａｌ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｖａｌ、Ｖ ａｌ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｍｅｔ、及びＡｌａ −Ｌｅｕのうちの１つを含むジペプチドプロテアーゼ開裂部位を有するものを含 む、コラゲナーゼによって成熟酵素に開裂することが可能なプロエンザイム；Ｇ ｌｕ−Ｖａｌ、Ｈｉｓ−Ｐｈｅ、Ａｓｎ−Ｐｈｅ、Ｈｉｓ−Ｉｌｅ、Ａｌａ−Ｇ ｌｕ、Ｐｒｏ−Ｍｅｔ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇ ｌｙ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ及びＧｌｙ−Ｐｈｅを具備した部位を有するもの を含むストロメリシンによって開裂することが可能なプロエンザイム、並びにＧ ｌｙ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｘ、Ｇｌｙ−Ｐ ｈｅ、Ｇｌｙ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ及びＡｓｎ−Ｔｙｒを具備した部位を有 するものを含むゲラチナーゼ／ＩＶ Ｂ型コラゲナーゼによって開裂することが 可能なプロエンザイムである。 本願で用いられる“異種酵素”という用語は、標的哺乳類細胞中に自然には存 在しないあらゆる酵素を意味する。これは、酵母もしくは細菌から誘導される非 補乳類酵素、及び天然変異哺乳類酵素またはは組換えＤＮＡ技術によって生成し た変異補乳類酵素を含む哺乳類酵素を具備している。 本発明に従って使用するのに好ましい酵素には、細胞膜を通過することが可能 であり、プロドラッグの治療上活性な化合物への変換に適する触媒活性を有する あらゆるものが含まれる。このような酵素には、プロドラッグである５−フルオ ロシトシンを毒性５−フルオロウラシルに変換するシトシンデアミナーゼ、プロ ドラッグであるパラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）−アミノベンゾイルグルタ ミン酸を安息香酸マスタードに変換するヒトカルボキシペプチダーゼＡ１、プロ ドラッグであるエトポシデホスフェート、ドキソルビシンホスフェート及びミト マイシンホスフェートを対応する毒性脱ホスホリル化代謝物に変換する酵素アル カリホスファターゼ並びにドキソルビシンもしくはメルファランのフェニルアセ トアミド誘導体であるプロドラッグを、その対応する毒性代謝物に変換する酵素 ペニシリン−Ｖ−アミダーゼが含まれる。他の好ましい非哺乳類酵素には、ＥＰ −Ａ−０ ４０４ ０７０及びＷＯ−Ａ−９４ ０１１３７に開示される、プロ ドラッグと共に使用することができるβ−ラクタマーゼが含まれる。 本発明に従って使用するのに最も好ましい酵素は、ＷＯ−Ａ−９５ １３０９ ５に記述される変異哺乳類酵素である。この変異哺乳類酵素は、好ましくは、新 規の基質特異性を生じる１以上の変異を有する野生型哺乳類酵素である。この変 異は、対応した内在性野生型酵素による触媒に対して耐性でありつつも、適切な プロドラッグが触媒され得るように、該酵素の基質特異性を僅かにシフトさせる ことを許容する。 本発明の変異補乳類酵素の本質的な特徴は、フランキングなアミノ酸配列に関 わりなく、変異基質結合部位が存在することである。したがって、本発明の変異 哺乳類酵素の定義では、変異基質結合部位及び１種以上の異なる酵素に由来する フランキング配列を含むキメラ酵素が含まれる。このようなキメラ酵素は、組換 えＤＮＡ技術及び／又はタンパク質工学によって産生することができる。 指向性変異生成に適する酵素には、プロドラッグを薬剤に変換することが可能 な触媒活性を有するあらゆる酵素が含まれる。このような触媒活性には、トラン スフェラーゼ、ヒドロラーゼ、オキシド−レダクターゼ、イソメラーゼ、リアー ゼもしくはリガーゼが含まれる。この指向性変異生成は、新規の基質特異性を生 じるが、関与する触媒活性のクラスを保存する。例えば、本発明の変異イソメラ ーゼは、その変異イソメラーゼによる活性化に感受性のプロドラッグがその変異 酵素が誘導されるイソメラーゼの存在下において実質的に安定なままであること を確実なものとするに十分な程度、それが誘導されるイソメラーゼと異なる新規 のイソメラーゼ活性を有する。この活性の劇的なシフトは、触媒部位で僅かに１ つの残基を変更することにより達成することが可能であり、この活性の必要とさ れるシフトを得るのに必要な最小数の残基の変更は酵素の構造の連続性を確実な ものとする。 本発明において用いるのに好ましい変異酵素は、変異哺乳類カルボキシペプチ ダーゼＡ（ＣＰＡ）である。この酵素は、カルボキシ末端の芳香族及び脂肪族ア ミノ酸残基を開裂する一般的な活性を有し、種の多様性及び組織特異的変種にお いて特徴付けられている。特に好ましい変異カルボキシペプチダーゼには、ヒト 膵臓カルボキシペプチダーゼＡ１（Ｃａｔａｓｕｓ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．Ｊ．２８７．２９９−３０３，（１９９２））、ヒト肥満細胞カルボキシペ プチダーゼＡ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ８９ ２７３−２８２，（１９９２））、及びヒト膵臓カルボキシペプチダーゼ Ａ２から誘導される変異体が含まれる。これらのカルボキシペプチダーゼの共通 の特徴が、酵素の全配列または構造とは関わりなく、ＣＰＡ様基質結合ポケット 及び関連酵素活性の存在であり、このＣＰＡ様基質結合ポケットを有する酵素が 本発明の変異カルボキシペプチダーゼへの変異に馴染むことは認められるであろ う。 特に好ましい態様において、変異酵素は変異ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼ Ａ１もしくはＡ２（ＣＰＡ１もしくはＣＰＡ２）であり、より好ましくは、野生 型（ｗ．ｔ．）酵素のアミノ酸配列の残基２０３、２１０、２４２、２４４、２ ５０、２５３、２５５、２６７、２６８、２６９及び３０５の１つ以上でアミノ 酸置換が生じているＣＰＡ１もしくはＣＰＡ２である。残基置換の特に好ましい 組み合わせには、残基２５３及び２５５がｗ．ｔ．である場合の２５０及び２６ ８のＧｌｙ；２５０及び２５５がｗ．ｔ．である場合の２５３及び２６８のＧｌ ｙ；２５３及び２５５がｗ．ｔ．である場合の２５０のＧｌｙ及び２６８のＨｉ ｓ；２５３、２５５及び２６８がｗ．ｔ．である場合の２５０のＧｌｙ；２５０ 及び２５３がｗ．ｔ．である場合の２５５のＡｌａ及び２６８のＨｉｓ、並びに ２５０、２５３及び２５５がｗ．ｔ．である場合の２６８のＨｉｓが含まれる。 最も好ましい変異体は、１つの置換；２６８のＧｌｙを含むカルボキシペプチダ ーゼＡ１もしくはＡ２変異体である。 ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＡは、プロエンザイム、続いて成熟酵素に処 理されるプレプロエンザイムとして発現される。本発明に従って使用するための 変異カルボキシペプチダーゼは、プレプロエンザイム、プロエンザイムまたは成 熟酵素の変異体であり得るが、好ましくは成熟酵素の変異体である。これらの変 異体は、プレプロエンザイム、プロエンザイムもしくは成熟酵素のいずれかから 誘導することができる。 本発明において用いるための変異酵素は、前に論じられている活性を有するあ らゆる酵素のＤＮＡまたはＲＮＡ源から、分子生物学の分野におけるよく知られ た方法により生成することが可能である。 本発明において用いるための変異酵素の酵素活性及び一次配列の選択は、問題 となるプロドラッグの性質、及びプロドラッグの一部を除去することにより活性 化されるタイプのプロドラッグである場合には、その部分の正確な構造に明らか に依存する。 変異酵素の基質結合または活性部位は、対応する非変異酵素とは異なり、酵素 性触媒を容易にするような方法でプロドラッグと相互作用可能でなければならな い。この活性を発揮する変異酵素の能力は、その活性部位の三次元構造における 僅かな変更に依存し、これは該タンパク質のこの領域の一次アミノ酸配列に依存 する。タンパク質工学の標準技術による酵素の一次配列の変更は、本発明に従っ て対応したプロドラッグと共に用いるための適正な変異酵素の産生を可能にする 。 細胞膜を通しての分泌が可能となるために、酵素はアミノ末端にシグナル配列 を有するべきであるが、これは、それが天然のシグナル配列を有する分泌酵素で あるか、あるいはその酵素を発現するキメラが、発現した酵素がシグナル配列の 特性を有する追加のアミノ酸配列を含むように加工されているためである。この ようなシグナル配列は当該技術分野においてよく知られていて、以下のものと、 それらに収載される参考文献に示され、もしくはそれらから誘導可能なものを含 む（Ｎｏｔｈｗｅｈｒ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，２１７ ９７−２１８０３（１９９０）、Ｎｏｔｈｗｅｈｒ ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１７２０２−１７２０８（１９９０）及びＫｏ ｈａｒａ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ.３１１,２２６−２３０(１９９２) ）。 本発明に従って用いるためのプロドラッグは、本発明における使用に適する酵 素によって触媒される際に、化学療法化合物を生じる、いかなる化合物であって もよい。このようなプロドラッグは、好ましくは抗炎症剤、抗ウイルスまたは抗 ガン剤である化合物であり、より好ましくは窒素マスタード剤、抗葉酸剤、ヌク レオシド類縁体、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、ミトマイシン、ブ レオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジン族の薬剤、ポドフィオフィロ トキシン、（ＥＰ−Ａ−０ ２２２ ４７５に記述されるような）スルホニル尿 素、及びトリコテセン及びコルチシンのような低分子量トキシンのような細胞毒 性化合物である化学療法化合物を産生する。特には、ドキソルビシン、ダウノル ビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、タキソール、メトプテリン、ジク ロロメトトレキセート、ミトマイシンＣ、ポルフィルモイシン、５−フルオロウ ラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、 エトポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、デサセチルビン ブラスチンヒドラジド、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシン、トリコテセン 及びデサセチルコルチシンが含まれる。 本発明において用いるのに特に好ましいプロドラッグ、及びここに記述される 好ましいカルボキシペプチダーゼ変異酵素との使用に特に好ましいものは、ＷＯ −Ａ−９５ １３０９５に記述されている。 ここで用いられる変異ヒト酵素は、この治療が施される患者の酵素のアミノ酸 配列（１つもしくは複数）とは少なくともアミノ酸が１つ異なる配列を有するあ らゆるヒト酵素であると考えられる。本願で“薬剤”と呼ぶことにある“化学療 法剤”は、ヒト治療における活性を有するあらゆる分子を含む。このような化学 療法剤には、ガンまたはウイルス感染の治療において用いられる細胞増殖抑制も しくは細胞毒性化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。本願で “プロドラッグ”と呼ぶことのある“機能的に不活性な前駆体”は、酵素の作用 下で化学療法剤に変換され得るあらゆる化合物を含む。このような機能的に不活 性な前駆体は、典型的には、この機能的に不活性な前駆体の酵素性開裂によって 化学療法剤に変換され、化学療法剤及び“プロドラッグ部分”を生じる。機能的 に不活性な前駆体から化学療法剤へのこのような変換は、酵素仲介異性化によっ ても生じ得る。 機能的に不活性な前駆体は一般に、例えば化学的に誘導体化されてその正常な 薬理学的活性が減少した結果として、酵素的に変換される化学療法剤が有する臨 床上重要なレベルの治療活性を示さない。細胞毒性化学療法剤の機能的に不活性 な前駆体は、それ自体では臨床上重要な細胞毒性を示さず、治療の間、機能的に 不活性な前駆体が化学療法剤に変換される部位、すなわち標的細胞の部位でのみ 臨床上重要なレベルの細胞毒性が生じるように、イン・ビボで十分に安定である 。 本発明による分子キメラにおいては、そのコーディング配列は、少なくともプ ロモーター及び好ましくはエンハンサーを具備し、それらの各々が、発現が生じ る細胞の型とは無関係に非特異的に発現し得るか、または細胞の環境に依存する 発現の選択性を示し得るかのいずれかである転写制御配列（ＴＲＳ）の制御下に ある。好ましいＴＲＳは、サイトメガロウイルスプロモータ／エンハンサー、Ｓ Ｖ４０プロモーター／エンハンサー及びレトロウイルスのＬＴＲプロモーター／ エンハンサーのような非特異的な強力プロモーター／エンハンサーの組み合わせ である。他の好ましいＴＲＳには、β−アクチン、グリセルアルデヒド−Ｓ−ホ スフェート及びチューブリンのものが含まれる。 また、ＴＲＳ、特にはプロモーター及びエンハンサー配列の選択が標的細胞の 型に依存する、細胞型依存性発現を示すＴＲＳも好ましい。その例には、正常肝 細胞及び形質転換肝細胞それぞれについてのアルブミン(ＡＬＢ)及びアルファ・ フェトプロテイン（ＡＦＰ）ＴＲＳ；胃腸管、肺、乳房及び他の組織の形質転換 細胞において用いるためのガン胎児性抗原（ＣＥＡ）のＴＲＳ；神経芽細胞腫に おいて用いるためのチロシンヒドロキシラーゼ、コリンアセチルトランスフェラ ーゼまたはニューロン特異的エノラーゼのＴＲＳ；グリア芽細胞腫において用い るためのグリア線維酸性タンパク質；及び膵臓の腫瘍において用いるためのイン シュリンのＴＲＳが含まれる。さらなる例には、特定の肝腫瘍において用いるた めのガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ、及び特定の肺腫瘍において用い るためのドーパデカルボキシラーゼに特異的なＴＲＳが含まれる。 加えて、特定の癌遺伝子についてのＴＲＳを、これらが特定の腫瘍型において 優勢に発現する場合、用いることができる。これらには、乳腫瘍において発現す るＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子ＴＲＳ及び神経芽細胞腫に対するＮ−ｍｙｃ癌遺 伝子に特異的なＴＲＳが含まれる。 ＡＬＢ及びＡＦＰ遺伝子は、核酸配列、遺伝子構造、アミノ酸配列及びタンパ ク質二次折り畳みに関して広範囲の相同性を示す(レビューは、Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７８，４６９ ４−４６９８（１９８１）を参照のこと)。これらの遺伝子は、個体発生におい て独立に、しかしながら相反して発現する。正常な発生においては、ＡＬＢの転 写は誕生の直前に開始され、成人期を通して継続する。成人におけるＡＬＢの転 写発現は肝臓に限定されている。ＡＦＰは通常、胎児の肝臓、卵黄嚢の内臓内胚 葉及び胎児の胃腸管で発現するが、誕生直後に検出不可能なレベルにまで減少し 、非病原性または非再生性の成人肝臓、又は他の正常成人組織においてはほとん ど発現しない。しかしながら、成人肝臓におけるＡＦＰ転写は、しばしば、ヘプ タ細胞（ｈｅｐｔａｃｅｌｌｕｌａｒ）癌（ＨＣＣ）において劇的に増加する。 加えて、精巣の非精上皮腫性及び定着癌；特定の奇形ガンにおける内胚用血脈洞 腫瘍及び特定の胃腸腫瘍においても転写が増大することがある。ＡＦＰ及びＡＬ Ｂの肝臓特異的発現は、それらの遺伝子の制御配列と肝臓からの核抽出物に見出 されるトランス作用性転写因子との相互作用の結果である。ＡＦＰ及びＡＬＢ ＴＲＳは、これらのＡＦＰ及びＡＬＢ遺伝子が転写レベルで調節され、またそれ らのｍＲＮＡは肝臓中で最も多量のポリメラーゼＩＩ転写物であるため、それぞ れ、分子的に結合した遺伝子の肝ガン特異的もしくは一般的な肝臓特異的発現の 生成に好ましい。 幾つかの哺乳類ＡＬＢ及びＡＦＰプロモーター及びエンハンサー配列が同定さ れている（レビューは、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ １，２６８−２ ７６（１９８７）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，５３−５８（１９８７）；Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４８１２−４８１８（１９８７）を参照のこと）。 これらの配列は、それぞれ、肝細胞（正常及び形質転換済）及び肝ガンにおける 遺伝子の選択的かつ特異的な発現を可能にする。 ＡＬＢ遺伝子の制御構造と同様に、ＡＦＰ遺伝子の制御配列は、ＨＣＣ（Ｍｏ ｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．６，４７７−４８７（１９８６）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２ ３５，５３−５８（１９８７））のような特定の肝臓病理における組織特異的な 発現を促進する。哺乳類ＡＦＰ遺伝子の制御配列は、（幾らかの哺乳類種におい ては遺伝子の５’側８５ないし５２ｂｐに位置する）特異的５’プロモーター近 傍領域からなる。この配列は肝ガンにおける転写に必須である。加えて、古典的 なエンハンサーとして挙動するネズミＡＦＰ遺伝子についてよく定義されている 上流（５’）制御配列が存在する（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６，４７７− ４８７（１９８６）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，５３−５８（１９８７））。こ れらの上流制御配列は配列Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩと呼ばれ、ＡＦＰネズミ遺伝子に ついての転写開始部位の５’側１，０００ないし７，６００ｂｐに位置する。こ れらの３種類のエンハンサードメインは、ＡＦＰの組織特異的発現を生じる際に 機能的に等価ではない。配列Ｉ及びＩＩは、ＡＦＰの肝臓特異的発現を誘導する 最も高い能力を有する。アルファ・フェトプロテイン遺伝子の制御配列が、組織 特異的転写の活性化のための配列だけではなく、ＡＦＰを発現するべきではない 組織における発現を抑制するための配列を有利に有することに注意することが重 要である。同様の方式で、ヒトアルファ・フェトプロテイン遺伝子の制御領域が 特徴付けられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４８１２−４８１８（ １９８７））。ＡＦＰ制御配列の３’側に正しい向きで配置される構造遺伝子は 、その構造遺伝子が胎児肝ガン、精巣の非精上皮腫、特定の奇形ガン、特定の胃 腸腫瘍並びにＡＦＰを特異的に発現する正常及び病変組織において選択的に発現 されることを可能にする。 プロモーター及びエンハンサー配列は、好ましくは、アルブミン（ＡＬＢ）、 アルファ・フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）（Ｊ．ＤＮ Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｐｐｉｎｇ，Ｖｏｌ４，１８５−１９ ６）、チロシンヒドロキシラーゼ、コリンアセチルトランスフェラーゼ、ニュー ロン特異的エノラーゼ（ｅｎｃｌａｓｅ）、グリア線維酸性タンパク質、インシ ュリンもしくはガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ｇａｍａｇｌｕｔａｍ ｙｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、ドーパデカルボキシラーゼ、ＨＥＲ−２／ ｎｅｕもしくはＮ−ｍｙｃ癌遺伝子又は他の適切な遺伝子のうちの１つに対する ＴＲＳから選択される。最も好ましくは、ＡＬＢもしくはＡＦＰに対するＴＲＳ が、それぞれ、肝臓特異的もしくは肝ガン特異的発現を導くのに用いられる。 本発明の好ましい態様においては、分子キメラが標的細胞ポピュレーションで 選択的に発現する。これは、このキメラが標的において非標的細胞ポピュレーシ ョンでよりも高いレベルで発現し、好ましくは、そのポピュレーションにおいて 優勢に、もしくは排他的に発現することを意味するものと理解することができる 。 選択的発現は、上述の標的細胞特異的ＴＲＳ（エンハンサーを伴うが、もしくは 伴わないプロモーター）を取込むことにより達成することが可能であり、または そのキメラを標的細胞に搬送する方法の産物であってもよい。配列の安定な組み 込み及び発現を伴うこのキメラの標的細胞特異的搬送を提供することが可能な方 法には、リン酸カルシウム形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジ ェクション、リポソームトランスファー、連続弾道弾（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｂ ａｒｒａｇｅ）又はレトロウイルス感染もしくはアデノウイルスもしくはアデノ 随伴ウイルスを用いる感染が含まれる。この論題のレビューは、Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌ．６ Ｎｏ．７（１９８８）を参照のこと。 このような選択性はこのような様々な技術によって得ることができる。標的細 胞への生理学的に局在化されたキメラの搬送は、非標的細胞がこのキメラを発現 する可能性を低減する。これは、例えばレトロウイルスもしくはリポソーム仲介 搬送を用いる場合に達成することが可能であり、標的細胞を供給することが知ら れている血管に直接注入することを包含する。また、選択性は、過剰増殖障害の 治療においてレトロウイルス仲介キメラ搬送を用いても得ることができる。レト ロウイルスは分裂している細胞にのみ感染し、したがって、分裂している細胞に のみキメラを導入する。リポソーム技術は、リポソームのコート構造になされて いる適正な修飾に基づいて、そこに収容される標的となるキメラの特定の細胞型 への搬送を可能にする。本発明による好ましい態様においては、そのような選択 性を得るための多くの方法が組み合わせられて、選択的発現の厳密性が改善され る。例えば、肝細胞癌の治療においては、キメラはＡＬＢもしくはＡＦＰのよう な肝臓特異的遺伝子プロモーターから誘導されるＴＲＳを具備することがあり、 レトロウイルスに組込んで肝動脈に直接搬送される。したがって、まず全てのレ トロウイルスが肝細胞に有効に感染することを確実にする局在化された搬送、次 に分裂している癌細胞にのみ感染するレトロウイルスの使用、その次にそれらの ＴＲＳの肝臓特異的発現によって、３倍のレベルの特異性が得られる。 レトロウイルスを用いて搬送される本発明の分子キメラの選択的発現を得るた めの本発明による特定の方法の１つは、肝細胞の選択的感染を促進することによ り達成される。この技術は、宿主感染に対する特異性を定義するパッケージング 細胞系に存在するレトロウイルスｅｎｖ遺伝子に関わる。このパッケージング細 胞系の構築に用いられるｅｎｖ遺伝子は、肝細胞に選択的に感染する人工的な感 染性ビリオンを生成するように修飾されている。例として、パッケージング細胞 に導入されるレトロウイルスｅｎｖ遺伝子は、人工的な感染性ビリオンのエンベ ロープ糖タンパク質がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって利用される特異的受 容体仲介結合によって肝細胞に選択的に感染するような方法で修飾することが可 能である。ＨＢＶは、特異的受容体仲介結合により、主として肝細胞に感染する 。ｐｒｅ−Ｓ１及びｐｒｅ−Ｓ２配列によって包まれるＨＢＶタンパク質は、Ｈ ＢＶの肝細胞への付着において重要な役割を果たす（Ｈｅｐａｄｎａ Ｖｉｒｕ ｓｅｓ ｅｄｉｔｅｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ １８９−２０３，２０ ５−２２１（１９８７）を参照のこと）。パッケージング細胞のｅｎｖ遺伝子は 、ラージＳ ＨＢＶエンベロープタンパク質の肝細胞結合部位を含むように修飾 される。パッケージング細胞に導入されるｅｎｖ遺伝子のこのような修飾は、当 該技術分野においてよく知られた標準的な分子生物学的技術によって行うことが 可能であり、標的組織へのウイルスの取込みを容易にする。 標的細胞特異的搬送系を具備した選択的活性化を得る方法において、ＴＲＳは 標的細胞に特異的である必要はなく、β−アクチン、グリセルアルデヒド−３− ホスフェート及びサイトメガロウイルス（例えば、極初期遺伝子）（Ｈｕｂｅｒ ，ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３，４６１９−４６２６（ １９９３）を参照のこと）のような遺伝子から誘導されるＴＲＳを用いることが できる。 本発明の分子キメラは標準組換えＤＮＡ技術を利用して作製することができる 。よって、例えば、シトシンデアミネート遺伝子のコード配列及びポリアデニル 化シグナルがＡＬＢまたはＡＦＰ ＴＲＳに対して正しく３’方向に配置される 。これらの分子キメラは通常、それぞれＡＬＢまたはＡＦＰ ＴＲＳから発現す る、細胞中でのシトシンデアミネートの選択的発現を可能にする。 したがって、哺乳類細胞中で活性化し得るＴＲＳを具備したＤＮＡ配列を、細 胞膜を通過することが可能であり、かつプロドラッグの細胞毒性または細胞増殖 抑制剤への変換を触媒することが可能な酵素をコードするＤＮＡ配列に、機能す るように結合することを具備した分子キメラの構築方法も提供される。 人工遺伝子を組込むための細胞のレトロウイルス感染技術は、当該技術分野に おいてよく知られたレトロウイルスシャトルベクターを使用する（例えば、Ｍｏ ｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６，２８９５−２９０２（１９８６）を参照 のこと）。本質的に、レトロウイルスシャトルベクターは、プラスミドに含まれ るＤＮＡ形態のレトロウイルスを用いて生成する。これらのプラスミドは、細菌 中での選択及び成長に必要な配列も含む。レトロウイルスシャトルベクターは、 当該技術分野においてよく知られた標準的な分子生物学的技術を用いて構築され る。レトロウイルスシャトルベクターは、親の内在性レトロウイルス遺伝子（例 えば、ｇａｇ ｐｏｌ及びｅｎｖ）が取り除かれていて、既に記述されている分 子キメラのような関心のあるＤＮＡ配列が挿入されている、。しかしながら、そ れらは、ウイルスのカプシド形成、標的ゲノムへのプロウイルスの挿入、メッセ ージスプライシング、終止及びポリアデニル化のための適正なレトロウイルス制 御配列を有する。レトロウイルスシャトルベクターはマウスモロニー白血病ウイ ルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）から誘導されているが、密接に関連するマウスモロニー肉 腫ウイルスのような他のレトロウイルスを用いることができることが評価される であろう。特定のＤＮＡウイルスも、搬送系として有用であることが立証され得 る。ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）は染色体外で複製するため、ＢＰＶに基 づく搬送系は、搬送された遺伝子が組込まれない状態に維持されるという利点を 有する。 したがって、本発明のさらなる面により、本願で上に定義した分子キメラを含 むレトロウイルスシャトルベクターが提供される。 レトロウイルス仲介遺伝子搬送系の利点は、標的組織への遺伝子搬送及びウイ ルスゲノムに関する（５’及び３’ＬＴＲ配列での）配列特異的な組込みの高い 効率と、他のＤＮＡ搬送系と比較して搬送されたＤＮＡの再構成が少ないことで ある。 したがって、本発明の好ましい態様において、５’ウイルス性ＬＴＲ配列、シ ス作用性ｐｓｉカプシド形成配列、本願で上に定義した分子キメラ、及び３’ウ イルス性ＬＴＲ配列を具備したＤＮＡ配列を有するレトロウイルスシャトルベク ターが提供される。 好ましい態様において、分子キメラの標的非特異的発現を排除するため、分子 キメラは５’レトロウイルスＬＴＲに対して反対の転写方向に配置される。加え て、５’ＬＴＲ配列から転写により駆動される優勢選択可能マーカー遺伝子も含 めてもよい。このような優勢選択可能マーカー遺伝子は、真核細胞にネオマイシ ン類縁体のＧ４１８硫酸塩（ゲネチシン−商標）への抵抗性を付与する細菌性ネ オマイシン耐性遺伝子ＮＥＯ（アミノグリコシド−３−ホスホトランスフェラー ゼＩＩ型）であってもよい。このＮＥＯ遺伝子は、これらの配列を有するパッケ ージング細胞の選択を補助する。 用いられるレトロウイルスベクターはマウスモロニー白血病ウイルスを基にし てもよいが、他のベクターを用いることが可能であることは理解されるであろう 。そのようなＮＥＯ遺伝子を選択可能マーカーとして含むベクター、例えばＮ２ ベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３９５−１３９８（１９８５））、は既 に記述されている。 レトロウイルスシャトルベクターに関連する理論的な問題は、宿主ゲノムの組 込み部位において、細胞の癌遺伝子を活性化するレトロウイルスＬＴＲ制御配列 の潜在能力である。この問題は、ＳＩＮベクターを作製することにより低減する ことができる。ＳＩＮベクターは、レトロウイルスＬＴＲ内のプロモーター及び エンハンサー領域を具備した欠損を有する自己不活性化ベクターである。ＳＩＮ ベクターのＬＴＲ配列は、転写により５もしくは３ゲノム配列を活性化すること はない。このウイルスＬＴＲ配列の転写性不活性化は、隣接する標的細胞ＤＮＡ 配列の挿入活性化を低減し、搬送された分子キメラの選択発現も補助する。ＳＩ Ｎベクターは３ウイルスＬＴＲ配列のおおよそ２９９ｂｐを除去することにより 作製される（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，５０４−５１２（１９８６）） 。 したがって、好ましくは、本発明のレトロウイルスシャトルベクターはＳＩＮ ベクターである。 これらのシャトルベクターからは親のレトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅ ｎｖ遺伝子が除去されているので、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖレトロウイルス遺 伝子産物トランスを付与してこのレトロウイルスベクターを感染性ビリオンに充 填もしくはカプシド形成するのにヘルパーウイルス系を利用することが可能であ る。これは、感染性合成ウイルスを生成することは可能であるものの検出可能な 野生型ウイルスを生成する能力には欠けている特殊化“パッケージング”細胞系 を利用することにより達成される。このようにして、この人工合成ウイルスは、 野生型ヘルパーウイルスを含むことなく、合成人工感染性ビリオンに充填されて いる本発明のキメラを有する。これは、このパッケージング細胞に安定に組込ま れるヘルパーウイルスが、ウイルスの構造遺伝子を含むものの、それが感染性ウ イルス粒子内に包膜されるためにはウイルスのゲノムＲＮＡ分子に含まれなけれ ばならないｐｓｉ部位及びシス作用性制御配列を欠いているという事実に基づい ている。 したがって本発明は、本願で上に記載のレトロウイルスシャトルベクターを具 備した感染性ビリオンであって、ウイルスタンパク質中にカプシド形成されて人 工的な感染性複製欠失レトロウイルスを作製する、前記の感染性ビリオンを提供 する。 ｐｓｉ部位の除去に加えて、ヘルパーウイルスがビリオン中に充填されず、か つ逆転写及びウイルスの組み込みのレベルでブロックされるのを確実にするため に、そのヘルパーウイルスのＬＴＲ制御配列にさらに変更を加えることができる 。 あるいは、ヘルパーウイルスの構造遺伝子（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅ ｎｖ）を個別に、かつ独立にパッケージング細胞系に移入することが可能である 。これらのウイルス構造遺伝子はパッケージング細胞のゲノム内で分離している ため、野生型ウイルスを生成する変換組換えの機会はほとんどない。 本発明のさらなる面においては、本願で上記した本発明の分子キメラを具備し た人工レトロウイルスシャトルベクターをパッケージング細胞系に搬送すること による本発明の感染性ビリオンを産生する方法が提供される。 このパッケージング細胞系は、ｐｓｉ部位、及び本願で上記した他の制御配列 を欠いたヘルパーウイルスが安定に組み込まれていてもよく、あるいは、このパ ッケージング細胞系はそのゲノム内にヘルパーウイルスの構造遺伝子が含まれる ように加工されていてもよい。 本発明はさらに、治療において用いるための、特には、ガンの治療において用 いるための、さらには、肝細胞癌、精巣の非精上皮腫癌、特定の奇形ガン及び特 定の胃腸腫瘍において用いるための、本願で上に記載した感染性ビリオンを提供 する。 本発明による感染性ビリオンは、当該技術分野においてよく知られた技術によ って処方することが可能であり、それらの薬学的に許容可能な担体を伴う処方と して存在し得る。この場合の薬学的に許容可能な担体は、この感染性ビリオンを 患者に導入するためのビヒクルとしての使用に適する液体媒体を具備していても よい。このような担体の例は生理食塩水である。この感染性ビリオンは、このよ うなビヒクル中の溶液もしくは懸濁液であり得る。安定化剤及び酸化防止剤及び 、又は賦形剤も、このような通常のあらゆる方法、例えば、経口もしくは非経口 経路で哺乳類に投与可能な医薬処方中に存在していてもよい。特には、この感染 性ビリオンは、静脈内もしくは動脈内注射によって投与することができる。ＨＣ Ｃの治療においては、肝動脈内注射が有利であり得る。 したがって本発明は、感染性ビリオンもしくはリポソームもしくはパッケージ ング細胞混合物のうちの１つに含まれる、本発明の分子キメラを薬学的に許容可 能な担体と混合した状態で含有する医薬処方、及び本発明の分子キメラビリオン 、ベクター、リポソームもしくはパッケージング細胞混合物を薬学的に許容可能 な担体と混合した状態で含有する医薬処方を提供する。 加えて、本発明は、分子キメラを含む人工感染性ビリオンを薬学的に許容可能 な担体と混合することを具備した、本願で上記した医薬処方の作製方法を提供す る。 また本発明は、ヒトの治療、及び病理状態の治療において用いるための医薬の 製造における、本発明のあらゆる分子キメラ、ベクター、ビリオン、リポソーム もしくは医薬処方の使用も含む。 また本発明は、本発明のあらゆる分子キメラ、ベクター、ビリオン、リポソー ムもしくは医薬処方の使用を具備した医学治療方法も含む。 また、本発明の分子キメラによってコードされるタンパク質、及びそのような タンパク質とそのタンパク質の酵素成分によって触媒され得るプロドラッグとの あらゆる組み合わせも本発明の範囲内に含まれる。 患者に投与される正確な投与量は、最終的には担当医師の裁量及び専門的な判 断に依存し、選択された特定の標的指向機構の産物である。本願に含まれるレト ロウイルス、リポソーム等の標的指向性への参照により、適正な投与量レベルの 決定に使用することができる。 本発明を、添付の図面を参照する以下の例において説明する。これらの図にお いて、 図１は、ヒト２８６Ｇ−ＨＣＰＡＩをＨＴ１０８０細胞での発現に適する形態 で含むプラスミド２６８Ｇ−ＨＣＰＡＩのマップであり； 図２は、様々なプロドラッグ治療での、分泌２６８Ｇ−ＨＣＰＡＩを発現する 細胞におけるＨＴ１０８０細胞の成長の阻害を示し； 図３は、分泌２６８Ｇ−ＨＣＰＡＩを発現する細胞からの培養培地によるプロ ドラッグＢ（Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル） メチルアミノ）ベンゾイル−Ｌ−グルタム（ｇｌｕｔａｎ）−１−イル−３−シ クロブチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｍｉｎｅ）からのメト トレキセートの生成を示し； 図４は、分泌性β−ラクタマーゼ構築体が形質移入されている哺乳類細胞にお けるβ−ラクタマーゼ活性の細胞位置を示し； 図５は、大腸菌ＤＨ５α及びｐＣＭＶ−ｐｇａ１もしくはｐＣＭＶ−ｐｇａ２ で形質転換されているＤＨ５αの成長曲線を示し； 図６は、ｐＣＭＶ−ｐｇａクローン及び大腸菌ｐｇａゲノム配列の模式的描写 を示す。 例１ （ｉ）２６８Ｇ−ＨＣＰＡ１を発現するためのＨＴ１０８０細胞の操作 ヒト２６８Ｇ−ＨＣＰＡ１の全コード配列を含有するＨｉｎｄ III−ＸｂａＩ 断片を、同様にＨｉｎｄ IIIとＸｂａＩで制限処理した真核生物発現ベクターで あるｐｃＤＮＡＩＮｅｏ（インビトロゲン（Ｉnvitrogen,Ｉnc））に挿入した。 ２６８Ｇ−ＨＣＰＡ１（図１参照）と呼ぶ、得られたプラスミド構築物を、陽イ オン性脂質混合物であるリポフェクチン（登録商標）（ギブコ・ビーアールエル （ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ,Ｉnc））を用いて、ＨＴ１０８０細胞中にトランスフェク ションし、Ｇ４１８（５００g/ml）で組換え細胞を選択した。クローニングリン グを使用して各細胞クローンを得て、細胞培養培地中で産生させたＨＣＰＡ１酵 素活性により性状解析した。 （ii）分泌された２６８Ｇ−ＨＣＰＡ１を発現する細胞での、プロドラッグ処理 によるＨＴ１０８０細胞増殖の阻害 対照（ｐｃＤＮＡ）のＨＴ１０８０細胞または２６８Ｇ−ＨＣＰＡ１（２６８ Ｇ）を発現するように操作したＨＴ１０８０細胞を、ｐＨ３．２で室温で２時間 前処理し次に中和した、１０％ヒト血清を含有する正常培地中で、９６ウェルプ レートに蒔いた。２４時間後、指定の薬剤を規定された濃度で加えた。プレート を３７℃で３日間インキュベートし、ＭＴＴ測定法により細胞の生存度を求めた 。結果を図２に示す。 （iii）分泌性２６８Ｇ−ＨＣＰＡ１を発現する細胞の培養液による、プロドラ ッグＢからのメトトレキセートの産生 前記のＨＴ１０８０細胞を、指定の培地中でプレートに蒔き、３７℃で３日間 インキュベートした。細胞にプロドラッグＢ（Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミ ノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタム− １−イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニン；２０μＭ）を加え、メト トレキセート産生の分析のために、１時間、３時間、および２０時間目に一定分 割量を採取した。以下の細胞を試験した：ｐｃＤＮＡ対照細胞；２６８Ｇ−ＨＣ ＰＡ１を発現する２６８Ｇ−細胞；５％ヒト血清中に蒔いた５％ＨＳ−細胞；前 記のように酸で前処理した５％ヒト血清中に蒔いた５％ＨＳ−酸−細胞 例２ ヒトカルボキシペプチダーゼＡ１ ｃＤＮＡの配列決定 エム・フィリップス（Ｍ．Ｐhillips）博士（ＵＣＳＦ）から提供されたｐＭ Ｐ３６から、ラットのプレプロカルボキシペプチダーゼＡ１（ＣＰＡ１）をコー ドするＨｉｎｄ III−ＳａｌＩ ｃＤＮＡ断片(Ｇardellら、Ｎature、317、551 -555(1985))を単離した。１．２kbのＨｉｎｄ III−ＳａｌＩラットＣＰＡ１ ｃＤＮＡを、［³²Ｐ］ｄＣＴＰとプライム−イット（Ｐrime-it）キット(ストラ タジーン(Ｓtratagene))により放射標識し、次に記載の方法(Ｇrunstein and Ｈ ogness Ｐroc Ｎatl.Ａcad.Ｓci ＵＳＡ、72、5016-5020(1975))に従って、ラム ダｇｔ１１ヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック（Ｃlontech））をス クリーニングするのに使用した。３回のスクリーニングの後、ラットのＣＰＡ１ ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズする、精製された単離プラークを得た。 キアゲン（Ｑiagen）カラムと製造業者の方法（キアゲン（Ｑiagen））を用い て、一晩増殖させた液体培養物から、精製プラークからのラムダＤＮＡを調製し た。ＥｃｏＲＩで消化し、低融点アガロースゲル電気泳動によりｃＤＮＡ挿入体 を精製して、ラムダＤＮＡからヒトＣＰＡ１ ｃＤＡＮ挿入体を放出させた。Ｅ ｃｏＲＩ ｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ ７ｚ（＋）（プロメガ（Ｐromega））のＥｃ ｏＲＩ部位にクローン化し、ｐＨＣＰＡプラスミドと命名した。液体培養物中で 一晩増殖させた後、キアゲン(Ｑiagen)カラムを用いてプラスミドｐＨＣＰＡ ＤＮＡを調製した。 単離したラムダプラークと、ＨＣＰＡ１ ｃＤＮＡを含有するプラスミドとの ＤＮＡの配列決定は、［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰとｆｍｏｌ配列決定システム（プロメガ （Ｐromega））を用いて行なった。最初、ラムダｇｔ１１のクローニング部位ま たはｐＧＥＭ７（＋）とＴＡベクター（インビトロゲン（Ｉnvitrogen））の多 クローニング部位にフランキングするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 ｃＤＮＡ配列を決定した。ＨＣＰＡ１の両方の鎖の全ｃＤＮＡ配列の決定を可能 にする、決めておいた配列の領域に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合 成した。配列は、配列番号：１および２に示す。 例３ （ｉ）ヒトの細胞発現用の大腸菌（Ｅ.coli）β−ラクタマーゼのクローニング 我々は、ヒトの細胞に送達した時、機能性β−ラクタマーゼを発現する、細菌 のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有するユニークなＤＮＡ構築物を作製した。プロ ドラッグ活性化酵素としてのβ−ラクタマーゼの利点は、１）この酵素は動力学 的に非常に効率的であり、２）ユニークな活性化機構のため、実質的に任意の薬 剤のプロドラッグを、この酵素の効率的な基質とすることができることである。 癌治療に対するこのことの意味は、これは、耐性現象に対する組合せプロドラッ グ療法の使用を可能にするとともに、腫瘍標的に対して適当な薬剤を選択するこ とを可能にすることである。例えば、肺癌を標的にする場合、メトトレキセート のプロドラッグ（５４９８Ｗ９３）と５−フルオロウラシルのプロドラッグ（１ ６１４Ｗ９４）が合成されている。 （ii）分泌性β−ラクタマーゼ構築物の作製 ヒト細胞中で分泌性β−ラクタマーゼを発現するであろうＤＮＡ構築物を作成 するために、ＴＥＭ β−ラクタマーゼのコード配列（Ｓykes and Ｍatthews, Ｊ.Ａntimicrob.Ｃhemo.,2,115-157(1976);Ａmbler and Ｓcott,Ｐroc.Ｎatl.Ａ cad.Ｓci.ＵＳＡ,75,3732-3736(1978)）を使用した。これは細菌の周辺質に存在 するため、ＴＥＭ β−ラクタマーゼの修飾されていないコード領域はシグナル ペプチドを含有する（Ｓutcliffe,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,75,3737-374 1(1978)）。真核生物中のこの遺伝子のクローニングと発現に有用な配列を、Ｐ ＣＲプライマーの配列を含有させることにより、ＰＣＲ中に隣接配列に付加させ た。前進プライマー（ＪＭ１）の配列は、 ５'-ＴＴＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴ ＴＣＣＧＴＧＴＣ（４２量体−配列番号３）、後退プライマー（ＪＭ２）の配列 は、 ５'-ＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧ ＧＣ（３６量体−配列番号４）である。前進プライマーは、ＰＣＲ産物の以後の クローニングのためのＨｉｎｄ III制限部位（ＡＡＧＣＴＴ）と、脊椎動物で最 適の翻訳効率を与える配列（ＧＣＣＡＣＣ）（Ｋozak,Ｊ.Ｃell Ｂiol.115.887- 903(1991)）を、β−ラクタマーゼ コード配列のイニシエーターであるメチオニンコドン（ＡＴＧ）のすぐ５−プラ イムに有する。後退プライマーは、β−ラクタマーゼコード配列の停止コドン（ ＴＡＡ）に隣接してＸｂａＩ制限部位（ＴＣＴＡＧＡ）を含有する。 ＰＣＲ反応は、標準的条件を用いて、４mＭのＭｇＳＯ₄中のＶｅｎｔＤＮＡポ リメラーゼ(ニューイングランドバイオラボズ社(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs,Ｉnc. )、ビバリー、マサチューセッツ州、米国)と２００μＭの各ｄＮＴＰおよび１ピ コモル/μlの前進プライマーと後退プライマーを用いて、２５サイクル行なった 。ＰＣＲ熱サイクル条件は、９５℃を１分；６０℃を１分；７５℃を１分を２５ サイクル行い、次に７５℃を５分行なった。グラス−マックス（Ｇlass-Ｍax） キット（ライフテクノロジーズ社（Ｌife Ｔechnologies,Ｉnc.）、ゲーサーズ バーグ、メリーランド州、米国）を用いて、約８００塩基対のＰＣＲ産物をゲル 精製した。精製したＰＣＲ産物を、Ｈｉｎｄ IIIとＸｂａＩで制限消化し、ゲル 電気泳動による再精製し、そしてｐＲｃ／ＣＭＶベクター（インビトロゲン社（ ＩnＶitrogenＩnc.）、サンジエゴ、カリホルニア州）の多クローニング部位に 連結した。このベクター中のβ−ラクタマーゼの配向は、β−ラクタマーゼ遺伝 子を極／初期（intermediate/early）ＣＭＶプロモーターの転写制御下に置き、 ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）付加シグナルの後に続くものである。構築物（ｐＣ ＭＶ−ＢＬと呼ぶ）の配列は、配列番号：５と６に、挿入された分泌性β−ラク タマーゼのアミノ酸配列とともに示す。 （iii）ターゲティングされたβ−ラクタマーゼタンパク質の細胞の位置の決定 β−ラクタマーゼ構築物の予測される位置の確認は、哺乳類細胞株中の一過性 ＤＮＡトランスフェクションを用いて行なった。トランスフェクションは、リポ フェクタミン（ライフテクノロジーズ社（Ｌife Ｔechnologies,Ｉnc.）、ゲー サーズバーグ、メリーランド州、米国）を用いて、リポソーム仲介ＤＮＡ送達に より行なった。実験は、製造業者の説明書に従って、細胞の数、トランスフェク ション試薬の量、および最適条件を決定するためのＤＮＡの量を変化させて行な った。典型的には、約３×１０⁵〜１×１０⁶細胞を含有する６０×１５mm組織培 養プレートを使用した。ｐＣＭＶ−ＢＬを用いてトランスフェクションした後、 トランスフェクションした細胞を、５０mＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、０． １ mＭ ＥＤＴＡ（ＰＭＳＦとロイペプチン含有）中に再懸濁し、氷上で１０分間膨 潤させ、次にダウンス（Ｄounce）ホモジナイザーを用いて溶解した。８００× ｇで６分間遠心分離後、上清（細胞質画分）を、ベックマンエアフュージ(Ｂeck manＡirＦuge)中で３０psiで２０分間再遠心分離した。両方の遠心分離からのペ レット（膜と核を含有する）を一緒にした。各画分を、最終濃度２０mＭになる ように加えた発色性基質ＰＡＤＡＣ（カルビオケム社（Ｃalbiochem Ｃorp）） を用いて、活性について測定した。５７０nmの吸光度を、コントロン（Ｋontron ）モデル９３１０分光光度計の自動速度測定法を用いて測定した。分泌されたβ −ラクタマーゼレベルを評価するために、トランスフェクション後に細胞を含ま ない培地でＰＡＤＡＣ測定法を行なった。β−ラクタマーゼ酵素活性は、β−ラ クタマーゼ活性の発色生産性基質となるＰＡＤＡＣ（カルビオケム社(Ｃalbioch em Ｃorp.)）を用いて測定した（Ｓchindler and Ｈuber、酵素インヒビター、 Ｂrodbede編、169-176頁、フェアラークケミエ(Ｖerlag Ｃhemie)、バインハイ ム(Ｗeinheim)(1980)）。５００μＭのＰＡＤＡＣストックを水の中で作成し、 ０．２２μｍのフィルターを通してろ過し、最終濃度２０μＭになるように培地 に加えた。５７０nmの吸光度の低下を、コントロン（Ｋontron）ＵＶ／Ｖｉｓ分 光光度計の自動速度測定法を用いて測定した。 図４に示すデータは、リポフェクタミンによるトランスフェクション後４８時 間で、ｐＣＭＶ−ＢＬでトランスフェクションした細胞から多量のβ−ラクタマ ーゼが分泌されることを示す。この構築物で見られる細胞活性は、おそらく排出 される過程の分泌性顆粒に含有される酵素であろう。この活性の大きさに基づき 、我々は分泌性β−ラクタマーゼ構築物からの酵素は、１つの細胞について２４ 時間で作成された細胞の総タンパク質の５〜１０％を占めると予測した。 （iv）細胞へのβ−ラクタマーゼ送達はセファロスポリンプロドラッグに対する 感受性を与える Ａ．β−ラクタマーゼは５７９８Ｗ９３と１６１４Ｗ９４を効率的に活性化する メトトレキセート（５７９８Ｗ９３）と５−フルオロウラシル（１６１４Ｗ９４ ）のプロドラッグは、セファロチンに関連する親薬剤である。プロドラッグ活性 化の薬物動態パラメータは、種々の濃度のプロドラッグを、精製したβ−ラクタ マ ーゼでインキュベートし、次にＨＰＬＣ解析して、プロドラッグ変換の速度を定 量して求めた。β−ラクタマーゼは、５７９８Ｗ９３と１６１４Ｗ９４を、Ｋ_{ca t} ／Ｋ_M（特異定数）をそれぞれ２７２と６７sec^-1mＭ^-1で効率的に活性化する。 Ｂ．β−ラクタマーゼ遺伝子と５７９８Ｗ９３および１６１４Ｗ９４の組合せは 毒性を与える 我々は、β−ラクタマーゼ遺伝子の存在下と非存在下で、β−ラクタマーゼプ ロドラッグのインビトロ毒性を評価した。細胞毒性は、ＳＲＢ−ベースの増殖阻 害測定法（Ｎairら、Ｊ.Ｍed.Ｃhem.32,1277-1279(1989)）を用いて処理したＡ ５４９ヒト肺腺癌細胞のＩＣ₅₀ｓを測定して定量した。 β−ラクタマーゼ遺伝子の非存在下で、メトトレキセートはメトトレキセート プロドラッグ５７９８Ｗ９３より１０倍毒性が強く、フルオロウラシルは、フル オロウラシルプロドラッグ１６１４Ｗ９４より２０倍毒性が強かった（表１）。 分泌性β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａ５４９−ＢＬ）が安定に取り込まれたコピー を含有したＡ５４９細胞を試験すると、メトトレキセートおよびそのプロドラッ グ５７９８Ｗ９３は、同程度に毒性があった（表１）。この実験は、腫瘍細胞へ のβ−ラクタマーゼ遺伝子の腫瘍細胞への送達は、これらをセファロスポリンプ ロドラッグへに対してより耐性にすることを意味している。 β−ラクタマーゼ遺伝子の非存在下でのメトトレキセートと５−フルオロウラ シルおよび各プロドラッグの毒性の間の比較的小さな差は予想外であった。これ は、両方の親薬剤について、作用機構が充分理解され、これらの化合物にセファ ロチンを結合させることによる化学的修飾は、薬剤を明瞭に無毒化するためであ る。例えば、細胞へのメトトレキセートの輸送は、５７９８Ｗ９３中で阻止され る、末端グルタミン残基があるがどうかに依存する。Ｎ１基は、グリコシド結合 の形成と同時にヌクレオシド形成に必要なため、５−フルオロウラシルの毒性は Ｎ１基があるかどうかに依存する。Ｎ１基は、１６１４Ｗ９４中で阻止される。 これらのプロドラッグのインビトロで観察された毒性は、ＩＣ₅₀測定で使用され る７２時間インキュベーションの間のプロドラッグの有意な破壊を引き起こす、 プロドラッグのある程度の化学的不安定性を反映していることは明らかである。 この考え方の支持は、２種類の証拠に由来する。第１に、いずれの薬剤も、親 薬剤についてＬＤ₁₀₀と等しい投与量でマウスに投与した時、毒性を示さない。 これらのケースでの毒性の欠如は、インビトロで７２時間プロドラッグに細胞を 曝露することに対して、インビボでの薬剤の比較的短い半減期（ｔ_1/2＝約２０ 分）により説明される。 第２の証拠は、短時間測定法（細胞をプロドラッグに３時間曝露）によるイン ビトロの毒性の直接測定により示される。チミジレート合成酵素とＤＮＡ合成の 阻害を測定する、細胞毒性の感度の高い測定法である、６−［³Ｈ］−デオキシ ウリジンに基づく測定法を用いて、我々は、３時間という短い時間間隔で毒性を 測定することができた。この短い間隔の間、プロドラッグと親薬剤の間の差は有 意に増加した（表２）。これらのデータは、表１に報告されるプロドラッグの毒 性は、これらの実験の長時間（７２時間）に渡るプロドラッグの化学的不安定性 に起因するという考え方に一致する。 （ｖ）リポソーム仲介ＤＮＡ送達を用いる分泌性β−ラクタマーゼのin vivo抗 癌性評価 皮下（ｓ．ｃ．）にＡ５４９ヒト肺腺癌を有するマウスで抗癌作用について、 分泌性β−ラクタマーゼとシトシンデアミナーゼＤＮＡ構築物を比較した。結果 を表３に示す。非特異的ＣＭＶプロモーターの転写制御下でシトシンデアミナー ゼ（ＣＤ）または分泌性β−ラクタマーゼ（ＢＬ）をコードするプラスミドＤＮ Ａ発現ベクターを、陽イオン性リポソーム中にカプセル化した（２５μｇ ＤＮ Ａ；２５ナノモルのリポソーム）。Ａ５４９皮下腫瘍を有するマウスを、リポソ ームＤＮＡの５回の腫瘍内注射で処理した。ＤＮＡ処理の２日後、プロドラッグ 療法（１６１４Ｗ９４（５０mg/kg；腹腔内投与、１回／日×５）または５−Ｆ Ｃ（５００mg/kg；腹腔内投与、１回／日×５）を開始した。４７日目に腫瘍増 殖の阻害を測定した。ＣＤとＢＬ構築物の両方とも、インビボで同様の抗癌活性 を示した。１６１４Ｗ９４投与により、腫瘍増殖の約６０％が阻害された(表３) 。５−ＦＣ投与では、腫瘍増殖の約７０％が阻害され、一方ＤＮＡリポソームの みと5-ＦＵのみ（２５ｍｇ/ｋｇ、腹腔内注射、１回／日Ｘ５）では、腫瘍増殖 の約２０％が阻害されたのみである（表３）。すなわち、リポソームＤＮＡ／５ −Ｆ Ｕプロドラッグの組合せは、皮下腫瘍の退縮を引き起こした。 分泌性β−ラクタマーゼとシトシンデアミナーゼＤＮＡ構築物もまた、癌を有 したマウスの胸膜スペースにリポソームＤＮＡを胸郭内（ｉ．ｔ．）に注射して 評価した、結果を表４に示す。ヒト大細胞肺Ｈ４６０ｉ．ｔ．腫瘍に、ＣＭＶプ ロモーターの転写制御下にあるＣＤまたはＢＬのいずれかをコードするＤＮＡを 投与した。ＤＮＡは、６、７、１２および１３日にｉ．ｔ．注射で投与した。各 酵素のプロドラッグを、７〜１６日に投与した（５−ＦＣ、５００mg/kg；１６ １４Ｗ９４、７０mg/kg；腹腔内投与、１回／日×１０）。マウスの生存率を、 腫瘍移植の３０日後に評価した。すべての非処理マウスと５−ＦＵ（３０mg/kg 、腹腔内投与、１回／日×５）で処理したマウスは、３０日以内に腫瘍が原因で 死んだ。ＣＭＶ−ＢＬ／１６１４Ｗ９４処理は、生存率を６０％まで上昇させ、 ＣＭＶ−ＣＤ／５−ＦＣ処理もまた、生存率を４０％に上昇させた（表４）。 例４ （ｉ）一般的アプローチ 広範囲の細胞毒性薬剤の必須のアミノ基のアシル化により、毒性がかなり喪失 される。ペニシリンＧアミダーゼおよび関連するペニシリンＶアミダーゼは、こ れらの非毒性薬剤からフェニルアセチル基を除去して、これらの細胞毒性薬剤を 活性化する（Ｓenter,Ｔhe ＦＡＳＥＢ Ｊournal,4.188-193(1990);Ｋerrら、Ｃ ancer Ｉmmunol.Ｉmmunother.,31,202-206(1990); Ｂignamlら、Ｃancer Ｒesea rch,52,5759-5764(1992)）。目標は、遺伝子指令（gene directed）酵素プロド ラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）アプローチを利用して、腫瘍部位での酵素の長期の高 レベルのタンパク質蓄積の可能性を利用することである。ペニシリンＧアミダー ゼ遺伝子を用いるＧＤＥＰＴアプローチが成功するために、遺伝子はヒト細胞中 で発現する必要がある。大腸菌（Ｅ.coli）では、ペニシリンＧアミダーゼ遺伝 子の発現は複雑である。この酵素は、分子量が２４，０００ダルトン（ａ）と６ ５，０００ダルトン（ｂ）の２つのサブユニットから構成され、これらは、９４ ，０００ダルトンの前駆体（Ｂockら、ＲＥＭＳ Ｍicrobil.Lett.,20,141-144(1 983)）のタンパク質分解的切断により、アミノ末端シグナルペプチド（Ｏliver ら、Ｇene,40,9-14(1985)）と、２つのサブユニットを連結する５４アミノ酸エ ンドペプチドを除去することにより産生される（Ｓchumacherら、Ｎucl.Ａcids Ｒes 14,5713-5727(1986)）。大腸菌（Ｅ.coli）では、酵素の処理は、酵素が周 辺細胞質に輸送される時に起きる。我々は、この酵素を示す未修飾のコード領域 は、低レベルではあるが、ヒト細胞で発現され得ることを示す。 （ii）材料と方法 大腸菌（Ｅ.coli）ＡＴＣＣ１１１０５からのゲノムＤＮＡの調製 − Ｃurr ent Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology（２．４．１節）を若干変更して、細 菌のゲノムＤＮＡを調製した。ＬＢブロス中で増殖させたＡＴＣＣ１１１０５（ アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、ロックヴィル、メリー ランド州、米国）のコンフルエントな培養物５０mlをペレットにし、上清を除去 した。ペレットを、２．２mlの１０mＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、ＥＤＴＡ １mＭ、０．５％ＳＤＳ、および０．１mg/mlプロテイナーゼＫ中に再懸濁して 、３７℃ で１時聞、ときどき混合してインキュベートした。等量の緩衝液で飽和したフェ ノールを加え（ライフテクノロジーズ社（Ｌife Ｔechnologies,Ｉnc.）、ゲー サーズバーグ、メリーランド州、米国）、転倒して静かに混和し、次に遠心分離 した。口径の大きいピペットを用いて水層を除き、フェノールでさらに２回前記 のように処理した。酢酸アンモニウムを最終濃度２Ｍになるように加え、次に周 囲温度で２部の１００％エタノールを加えた。シールしたパスツールピペットを 用いて、ピペットの周りでＤＮＡを攪拌し、次に新しい試験管に移した。試料を 遠心分離して、過剰の液体を除去した。ペレットを７０％エタノールで２回洗浄 した。２回目の洗浄後、ＤＮＡを３００μｌの１０mＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７． ５）、１mＭ ＥＤＴＡに再懸濁した、２７ゲージの針に通してＤＮＡを剪断し、 次にウシ膵臓由来の、ＤＮＡｓｅフリーＲＮＡｓｅ（ベーリンガーマンハイム（ Ｂoehringer-Ｍannheim））を５μg/mlで使用して、３７℃で１時間ＤＮＡを消 化した。次にＤＮＡを、プロメガ(Ｐromega)ＤＮＡクリーンアップ(Ｃlean Ｕp) キット（プロメガ社（Ｐromega Ｃorp.））を用いて精製した。ＤＮＡをエタノ ールで沈殿させ、１０mＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡに再 懸濁し、４℃で保存した。 大腸菌（Ｅ.coli）ペニシリンＧアミダーゼコード領域の単離 − ＡＴＣＣ１ １１０５の大腸菌（Ｅ.coli）ペニシリンＧアミダーゼ遺伝子の配列が報告され ている(Ｏhら、Ｇene,56,87-97(1987)、Ｓchumacherら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.14,571 3-5727(1986))。大腸菌（Ｅ.coli）ペニシリンＧアミダーゼのフランキング（fl anking）配列であるオリゴヌクレオチドプライマーを合成（オリゴセラピューテ ィクス社（Ｏlig Ｔherapeutics Ｉnc.）、ウィルソンビル（Ｗilsonville）、 オレゴン州、米国）して、ヌクレオチド１９９（公表されている配列から番号付 け）〜２７９９、および結合したフランキングなＨｉｎｄ IIIとＸｂａＩ制限部 位を作成した。約２．７ＫbのＰＣＲ産物を、グラス−マックス（Ｇlass-Ｍax） キット（ライフテクノロジーズ社（Ｌife Ｔechnologies,Ｉnc.）、ゲーサーズ バーグ、メリーランド州、米国）を用いて、アガロースゲルから精製し、Ｈｉｎ ｄ IIIとＸｂａＩで消化した。消化した産物を、Ｈｉｎｄ IIIとＸｂａＩで消化 したｐＲｃ−ＣＭＶベクタ ー（インビトロゲン社（Ｉnvitrogen,Ｉnc）に連結し、エレクトロコンピタント （electrocompetent）なＤＨ５α細胞（分子クローニング、サムブルーク（Ｓam brook）ら、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress）（1989））を形質転換するのに使用した。ｆｍｏ ｌ ＤＮＡ配列決定システム（プロメガ社（Ｐromega Ｃorp.）、マジソン、ウィ スコンシン州）（Ｍeadら、プロメガノート（Ｐromega Ｎotes）、16,(1988)） を用いて、ｐＣＭＶ−ｐｇａ１挿入体の配列決定を行なった。大腸菌（Ｅ.coli ）ペニシリンＧアミダーゼの配列に関する初期の２つの報告は、６つの位置で異 なる（Ｏhら（1987）およびＳchumacherら（1986）、前述）。６つのすべての位 置で、我々の配列はＳchumacherら（1986、前述）と完全に一致した。また、我 々のペニシリンＧアミダーゼ配列は、リボゾーム結合部位にヴァレ（Ｖalle）ら 、（Ｇene,50,115-122(1986)）、の報告した４つの追加ヌクレオチドを含有しな かった。 ｐＣＭＶ−ｐｇａ１に産生されるペニシリンＧアミダーゼの構成性発現は、修 飾ペニシリンＧアミダーゼ遺伝子を有する細菌宿主の増殖の間毒性であったため 、ｐＣＭＶ−ｐｇａ１をさらに修飾して、細菌のすべてのプロモーター配列を除 去してｐＣＭＶ−ｐｇａ２を作成した。このクローンの１つの追加の修飾は、真 核細胞の翻訳効率の増強の可能性のためのＡＴＧ開始コドンのすぐ５’へのＫoz ak共通（ＡＣＣＧＣＣ）配列の追加であった。 ペニシリンＧアミダーゼ測定法 − ペニシリンＧアミダーゼの触媒活性を、 ５０mＭ リン酸塩（ｐＨ７．５）中の０．４mＭ ６−ニトロ−フェニルアセトア ミド−安息香酸１mｌの加水分解中のＡ₄₀₅の増加から求めた（Ｋutzbachら、Ｈo ppe-Ｓeyler's Ｚ.Ｐhyslol.Ｃhem.,354,45-53(1974)）。 インビトロ発現 − ヒト細胞株Ａ５４９（肺腺癌）とＮＣＩ−ＮＣＩ−Ｈ４ ４１（肺 Ｃlara−様）を、ＡＴＣＣ（ロックヴィル、メリーランド州、米国） から得た。細胞を、電気穿孔法により一過性にトランスフェクションした（製造 業者の説明書、バイオラッド（Ｂio-Ｒad）、ハーキューリーズ（Ｈercules）、 カリホルニア州）。６mgのプラスミドＤＮＡを用いるトランスフェクションは、 ＲＰＭＩ１６−４０培地＋グルタミン（メディアテク（ＭediaＴech）、ワシン トン、ＤＣ、米国）、および１０mＭグルコースおよび０．１mＭ ＤＴＴ中で、 ０． ２キロボルトで０．４cmの空間を有する電気穿孔法キュベット中で９６０マイク ロファラドで行なった（バイオラッド（Ｂio-Ｒad）、ハーキューリーズ（Ｈerc ules）、カリホルニア州、米国）。トランスフェクション２４時間後に、１００ ％ＤＭＳＯ中の４１９９Ｗ９３を、最終濃度１０μＭになるように加えた（ＤＭ ＳＯ濃度は最終的に２％であった）。４８時間後に、トリパンブルー色素の存在 下で細胞を数えて、生存細胞を定量した。 ＲＮＡ解析 − Ａ５４９肺腺癌細胞を、前記のようにｐＣＭＶ−ｐｇａ１と ｐＣＭＶ−ＢＬ（ｐＣＭＶ−ｐｇａ１と同じ構築物であるが、但しペニシリンＧ アミダーゼコード配列をＴＥＭ β−ラクタマーゼのコード配列で置換した）と ともに同時トランスフェクションした。ＲＮＡを、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍo lecular Ｂiology（４．２．４節）に記載のように調製した。１０μｇの精製し たＲＮＡを、ハイボンド（Ｈybond）−Ｎフィルター（アマーシャム（Ａmersham ）、アーリントンハイツ（Ａrlington Ｈeights）、イリノイ州）にスロットブ ロットし、紫外線照射で架橋し、プラスミドｐＣＭＶ−ｐｇａ１またはｐＣＭＶ −ＢＬを示す［³²Ｐ］−標識ＤＮＡとプローブ結合させた。プラスミドＤＮＡを 、製造業者の説明書に従って、ランダムプライマーＤＮＡ標識システム（ライフ テクノロジーズ社（Ｌife Ｔechnologies,Ｉnc.）、ゲーサーズバーグ、メリー ランド州）により、プラスミドＤＮＡを標識した。［³²Ｐ］−標識プローブのハ イブリダイゼーションにより測定されるＲＮＡの相対量を、ホスホリミジャー(p hoshorimager)（モレキュラーダイナミクス（Ｍolecular Ｄynamics））を用い てイメージクアント（ＩmageＱuant）ソフトウェアを用いて定量した。 （略語：Ｅ.coli、Ｅscherichia coli；ＨＳＶ、単純ヘルペスウイルス；ＤＴＴ 、ジチオスレイトール；ＰＣＲ、ポリメラーゼチェイン反応） （iii）結果 プロドラッグ；細胞毒性および活性化 − 広範囲の細胞毒性薬剤の必須のア ミノ基をフェニルアセチル化すると、細胞毒性が大幅に失われる（Ｓenterら、( 1990)、前述）。我々は、Ｎ−（２−フェニルアセチル）ダウノマイシン（４１ ９９Ｗ９３）とＮ−（２−フェニルアセチル）メトトレキセートを合成し、Ｗｉ Ｄｒ大腸癌細胞中のこれらのプロドラッグの細胞毒性を、これらの親薬剤と比較 して測定した。結果を表５に示す。予想されたように、ダウノマイシンのフェニ ルアセチル化により、ダウノマイシンの細胞毒性が低下し、ＩＣ₅₀値が数オーダ ー上昇した。これに対して、メトトレキセートのフェニルアセチル化は、ＩＣ₅₀ 値を５倍増加させたのみである（表５）。これらの差の理由を検討するために、 我々はこれらの実験の間の親薬剤の産生を、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ ＬＣ）で追跡した。我々は、ダウノマイシンがこれらの培養物中で検出されてお らず、実験の間中、Ｎ−（２−フェニルアセチル）ダウノマイシンは非常に安定 であることを観察した（データは示していない）。これに対して、Ｎ−（２−フ ェニルアセチル）メトトレキセートでインキュベートした組織培養物中では、多 量のメトトレキセートが産生された（データは示していない）。これらの実験で Ｎ−（２−フェニルアセチル）メトトレキセートの半減期は、約５０時間であっ た。 ペニシリンＧアミダーゼ（ＰＧＡ）は多くの異なる化合物からフェニルアセチ ル基を除去することができる（Ｓenterら、(1990)、前述）。ＰＧＡの精製した 調製物は、ＲＰＬＣで追跡するとＮ−（２−フェニルアセチル）ダウノマイシン を効率的にダウノマイシンに変換した。しかし、プロドラッグは不溶性であるた め、活性化の詳細な動力学を測定することはできなかった。我々は、ＲＰＬＣを 用いて精製したＰＧＡにより、Ｎ−（２−フェニルアセチル）メトトレキセート の活性化の動力学を測定した。基質濃度が飽和している時、活性化反応は、時間 と酵素濃度の関数として直線的であり、酵素は正常なミカエリ−メントン（Ｍic haelis-Ｍenton）動力学に従った（データは示していない）。Ｎ−（２−フェニ ルアセチル）メトトレキセートを基質としたＰＧＡのｋ_catおよびＫ_mの値を測定 し、それぞれ１．０sec^-1と０．１２mＭであった。これは、基質特異性定数（ｋ_cat ／Ｋ_m）＝８．３sec^-1mＭ^-1に対応する。 真核生物発現ベクターの作製 − 大腸菌（Ｅ.coli）ペニシリンＧアミダーゼ コード配列を含む２つの真核生物発現ベクター（ｐＣＭＶ−ｐｇａ１とｐＣＭＶ −ｐｇａ２と呼ぶ）を構築した。プラスミドはその細菌宿主の溶解を引き起こし た ため、ｐＣＭＶ−ｐｇａ１の精製は問題であった。ｐＣＭＶ−ｐｇａ１で形質転 換した大腸菌（Ｅ.coli）ＤＨ５αを３７℃で増殖させると、組換え株はＯＤ₆₀₀ が０．４に達するまで親ＤＨ５α株と同じ動力学に従い、その後急速にほとんど 完全に溶解した（図５）。ｐＣＭＶ−ｐｇａ１を含有するＤＨ５αを寒天プレー トの表面で増殖させた時、異常なコロニーの形態で判断されるように、細菌の溶 解が明らかであった。ｐＣＭＶ−ｐｇａ１により誘導される細菌の溶解は、活性 ペニシリンＧアミダーゼの産生によるものであった（データは示していない）。 ｐＣＭＶ−ｐｇａクローンのプラスミド産生を促進するために、大腸菌（Ｅ． coli）中のペニシリンＧアミダーゼ遺伝子の妨害性発現を阻止した。このために 、細菌のプロモーター配列を全て除去して、ｐＣＭＶ−ｐｇａ１を修飾して、ｐ ＣＭＶ−ｐｇａ２を作成した（図６）。このクローンの１つの追加の修飾は、真 核細胞の翻訳効率の増強の可能性のためのＡＴＧ開始コドンのすぐ５’へのＫoz ak共通（ＡＣＣＧＣＣ）配列の追加であった。このプラスミドを有するコロニー は正常な増殖特性を有し、プラスミド精製物中で多量のプラスミドを産生した。 Ａ５４９肺腺癌およびＮＣＩ−Ｈ４４１肺Ｃlara様細胞株中に一過性にトランス フェクションすると、ｐＣＭＶ−ｐｇａ２はこれらの細胞株に対して、ｐＣＭＶ −ｐｇａ２と同じＮ−アセチルフェニルダウノマイシンに対する同程度の感作を 与えた（データは示していない）。 ヒト肺癌細胞株でのＰＧＡの発現 − ｐＣＭＶ−ｐｇａ１による培養細胞の 一過性トランスフェクションが、比較的非毒性で安定なプロドラッグＮ−アセチ ルフェニルダウノマイシンに対する細胞の感度を上昇させるかどうかを決定する ために、我々は細胞ベースの測定を行なった（表６）。２つのヒト肺癌細胞株（ ＮＣＩ−Ｈ４４１とＡ５４９）を、ｐＣＭＶ−ｐｇａ１で一過性にトランスフェ クションした。トランスフェクションの２４時間後、プロドラッグを最終濃度１ ０μＭで加えた。結果を表６に示す。プロドラッグの添加のみでは、細胞形態や 生存Ａ５４９細胞またはＨ４４１細胞の総数にはほとんど影響を与えなかった。 さらに、プロドラッグと組合せて対照構築物でトランスフェクションしても、生 存細胞数は大きく低下しなかった。ＮＣＩ−Ｈ４４１とＡ５４９の両方をｐＣＭ Ｖ−ｐｇａ１でトランスフェクションしてプロドラッグを加えると、４８時間後 生 存細胞の数は劇的に低下し、形態が変化し、そして細胞破片がたくさん蓄積され た。これに対して、プロドラッグと組合せて対照構築物でトランスフェクション しても、生存細胞の数は大きく低下しなかった。 傍観者（Ｂy-Ｓtander）癌細胞細胞毒性と酵素の低レベル − 同じトランス フェクション条件をβ−ガラクトシダーゼ遺伝子受容体を用いてＡ５４９中で評 価して、我々は、全細胞のわずか０．１％のみがトランスフェクションされるこ とを見いだした。すなわち、プロドラッグとｐＣＭＶ−ｐｇａ１で処理した細胞 中の細胞数の観察された低下は、トランスフェクションされた細胞の死滅作用が 非トランスフェクション細胞に輸送されたことが原因のはずであり、おそらく細 胞外酵素により触媒的に産生されたダウノマイシンの拡散によるのであろう。 しかし、以下の観察は、産生された細胞外酵素活性の量は比較的小さいことを 示唆する。上記感受性実験で使用されるプロドラッグの濃度は、ＷｉＤｒの生存 活性を１００％低下させるダウノマイシンの濃度より約２００倍多い。すなわち 、等量の親薬剤は上記実験では産生されず、産生された酵素の活性または酵素の レベルが比較的低いことを示している。 産生された酵素レベルが比較的低いことは、いくつかの要因が原因であり、１ ）ヒト細胞中でのｍＲＮＡの不安定性、２）タンパク質の不安定性、３）翻訳後 プロセシングと前駆体の分泌の非効率性がある。トランスフェクションで産生さ れるペニシリンＧアミダーゼ遺伝子の低いレベルに関与する要因を検討するため に、我々は、発現の第１段階を試験し、ペニシリンＧアミダーゼｍＲＮＡ定常状 態レベルを、同じ発現制御シグナル（例えば、ＣＭＶ極初期プロモーター）を用 いて、同じ発現ベクターから産生される別の遺伝子と比較して、定量した。これ らの実験で、Ａ５４９細胞は、一過性にｐＣＭＶ−ｐｇａ１とｐＣＭＶ−ＢＬ（ ＴＥＭβ−ラクタマーゼ遺伝子を発現する発現ベクター）で同時トランスフェク ションされた。総ＲＮＡを細胞から調製し、等量を固体支持体上にブロットし、 それぞれをペニシリンＧアミダーゼまたはＴＥＭ β−ラクタマーゼ［³²Ｐ］− 標識プローブとプローブ結合させた。我々は、ペニシリンＧアミダーゼｍＲＮＡ の定常状態レベルは、β−ラクタマーゼレベルより有意に低いことを見いだした （データは示していない）。すなわち、ペニシリンＧアミダーゼの低レベルの発 現は、 ｍＲＮＡの定常状態レベルが低いことで一部は説明できるかも知れない。 （iv）考察 我々は、ｐＣＭＶ−ｐｇａ構築物は腫瘍細胞に送達されると、活性なペニシリ ンＧアミダーゼを生成することを証明した。ペニシリンＧアミダーゼのプロセシ ングされていない前駆体タンパク質は不活性であることが証明されている（Ｂur tscherら、Ｂrit.Ｊ.Ｂiochem.205,77-83(1992)）ため、ヒト細胞中の前駆体を 示す遺伝子からの機能性酵素の発現は、ペニシリンＧアミダーゼ前駆体タンパク 質からエンドペプチド配列の一部またはすべてを除去することができる。大腸菌 （Ｅ.coli）では、ペニシリンＧアミダーゼ前駆体は、細胞質周辺の膜を通過し て輸送されている時プロセシングされる。ヒトの細胞が相同な酵素を有すること 、またはエンドペプチドはタンパク質分解に対して感受性であり、細胞中に存在 する一般的なプロテアーゼ活性により除去される可能性がある。 我々は、ｐＣＭＶ−ｐｇａベクターにより産生される酵素はヒト細胞から分泌 されるという証拠を提供した。これは、酵素が細菌のシグナルペプチドを含有し 、細菌のシグナルペプチドは真核細胞中で機能性であるとして証明されている事 実と一致する（Ｍullerら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.257,11860-11863(1982)）。分泌さ れた酵素によるプロドラッグ活性化は、傍観者効果（すなわち、トランスフェク ションされた細胞から隣の細胞への細胞毒性のトランスファー）を最大にする可 能性がある。現代の遺伝子トランスファー技術の限界を考えるとこの特徴は決定 的に重要である。もちろん、この作用は他の要因（例えば、腫瘍部位からの酵素 の拡散、および細胞外スペースでの酵素の安定性）により影響されるであろう。 ペニシリンＧアミダーゼが複数のプロドラッグを活性化することができるとい う事実は、複数の薬剤の効果を評価することを可能にする。各薬剤やプロドラッ グはそれ自身の特徴的な薬物速度論や薬物動力学を示すため、各薬剤および薬物 の組合せは、多くの条件下で探索しなければならない。プロドラッグをうまく選 択することにより、傍観者作用が上昇すると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ 38/51 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 38/52 Ａ６１Ｋ 37/50 38/53 37/52 45/00 37/54 47/48 37/56 48/00 ＡＤＵ 37/58 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/60 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ (72)発明者 ムーア、 ジョン・トムリン アメリカ合衆国、ノースカロライナ州 27709、リサーチ・トライアングル・パー ク、ファイブ・ムーア・ドライブ（番地な し）、グラクソ・ウェルカム・インコーポ レーテッド内 (72)発明者 オームステッド、 キャロル − アン アメリカ合衆国、ノースカロライナ州 27709、リサーチ・トライアングル・パー ク、ファイブ・ムーア・ドライブ（番地な し）、グラクソ・ウェルカム・インコーポ レーテッド内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． プロドラッグと共に使用するための分子キメラであって：標的哺乳類細 胞中で活性化され得る転写調節ＤＮＡ配列と、該転写調節ＤＮＡ配列と機能的に リンクし且つ分泌シグナルペプチドおよび異種酵素をコードするＤＮＡコード化 配列とを具備し、標的細胞中で前記コード化配列が活性化されると、前記異種酵 素は細胞原形質膜を通過することができ、且つ細胞外において前記プロドラッグ の細胞毒剤もしくは細胞抑制剤への変換を触媒することができる分子キメラ。 ２． 請求項１に記載の分子キメラであって、前記異種酵素は、酵素前駆体か ら、前記標的哺乳類細胞の細胞外にある病理学的に関連したプロテアーゼによる 蛋白分解部位での開裂によって得られる分子キメラ。 ３． 請求項２に記載の分子キメラであって、前記病理学的に関連したプロテ アーゼは腫瘍関連プロテアーゼである分子キメラ。 ４． 請求項２または３に記載の分子キメラであって、前記蛋白分解部位は、 腫瘍関連マトリックスメタロプロテアーゼによる開裂を受け易い配列を有する分 子キメラ ５． 請求項１〜４の何れか１項に記載の分子キメラであって、前記分泌シグ ナルペプチドは前記異種酵素をコードするＤＮＡに対して加工されたＤＮＡ配列 によってコードされる分子キメラ。 ６． 請求項１〜５の何れか１項に記載の分子キメラであって、前記異種酵素 は哺乳類酵素変異体である分子キメラ。 ７． 請求項１〜５の何れか１項に記載の分子キメラであって、前記異種酵素 は非哺乳類酵素である分子キメラ。 ８． 請求項１〜７の何れか１項に記載の分子キメラであって、前記転写調節 ＤＮＡ配列は、前記標的哺乳類細胞内で選択的に活性化される分子キメラ。 ９． 請求項８に記載の分子キメラであって、前記転写調節ＤＮＡ配列は、ア ルブミン、アルファフェトプロテイン、癌胎児性抗原、チロシンヒドロキシラー ゼ、コリンアセチルトランスフェラーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ、グリア 繊維酸性タンパク(glial fibro acid protein)、インスリン、ガンマグルタミル トランスペプチダーゼ、ドーパデカルボキシラーゼ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、および Ｎ− ｍｙｃの遺伝子の転写調節ＤＮＡ配列から選択される分子キメラ。 １０． 請求項１〜９の何れか１項に記載のキメラを含んでいるベクター。 １１． 請求項１０に記載のベクターを含んでいるパッケージング細胞系。 １２． 請求項１１に記載のパッケージング細胞系から発生した感染性ビリオ ン。 １３． レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスである、 請求項１２に記載の感染性ビリオン。 １４． プロドラッグと共に使用するための、標的哺乳類細胞に対して選択的 に感染することができる感染性ビリオンであって：該ビリオンは分子キメラを包 み込んでおり、この分子キメラは標的哺乳類細胞中で活性化され得る転写調節Ｄ ＮＡ配列と、該転写調節ＤＮＡ配列と機能的にリンクし且つ分泌シグナルペプチ ドおよび異種酵素をコードするＤＮＡコード化配列とを具備していて、標的細胞 中で前記コード化配列が活性化されると、前記異種酵素は細胞原形質膜を通過す ることができ、且つ細胞外において前記プロドラッグの細胞毒剤もしくは細胞抑 制剤への変換を触媒することができる分子キメラである感染性ビリオン。 １５． 請求項１４に記載の感染性ビリオンであって、前記異種酵素は、酵素 前駆体から、前記標的哺乳類細胞の細胞外にある病理学的に関連したプロテアー ゼによる蛋白分解部位での開裂によって得られる感染性ビリオン。 １６． 請求項１４または１５に記載の感染性ビリオンであって、前記シグナ ルペプチドは、前記異種酵素をコードするＤＮＡに対して加工されたＤＮＡ配列 によってコードされる感染性ビリオン。 １７． 請求項１４〜１６の何れか１項に記載の感染性ビリオンであって、前 記転写調節ＤＮＡ配列は、サイトメガロウイルス、グリセロアルデヒド−３−燐 酸、βアクチン若しくはチューブリン、アルブミン、アルファフェトプロテイン 、癌胎児性抗原、チロシンヒドロキシラーゼ、コリンアセチルトランスフェラー ゼ、ニューロン特異的エノラーゼ、グリア繊維酸性タンパク(glial fibro acid protein)、インスリン、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、ドーパデカル ボキシラーゼ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、およびＮ−ｍｙｃの遺伝子の転写調節ＤＮＡ 配列から選択される分子キメラ。 １８． レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスである、 請求項１４〜１７の何れか１項に記載の感染性ビリオン。 １９． 請求項１４〜１８の何れか１項に記載の感染性ビリオンを産生できる パッケージング細胞系。 ２０． 治療に使用する医薬を製造するための請求項１４〜１８の何れか１項 に記載の感染性ビリオンの使用であって、前記治療には、レトロウイルス感染、 アデノウイルス感染もしくはアデノ関連ウイルス感染、物理的に局在した供給ま たは加工されたウイルス被覆タンパクを用いた、標的哺乳類細胞の選択的感染が 含まれる使用。 ２１． 請求項１〜９の何れか１項に記載の分子キメラ、請求項１０に記載の ベクター、請求項１１および１９の何れかに記載のパッケージング細胞系、また は請求項１２〜１８の何れか１項に記載の感染性ビリオンを含有する医薬処方。 ２２． 治療に使用する医薬を製造するための請求項１〜９の何れか１項に記 載の感染性ビリオンの使用であって、前記治療には、リン酸カルシウムトランス フェクション法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、リポソームトラン スファー法、遺伝子銃(ballistic barrage)、レトロウイルス感染およびアデノ ウイルス感染もしくはアデノ関連ウイルス感染から選択される方法によって前記 分子キメラを投与することが含まれる使用。