JP2000505300A

JP2000505300A - 組換えリボヌクレアーゼタンパク質

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Publication number: JP2000505300A
Application number: JP9530289A
Authority: JP
Inventors: エム．リバク，スザンナ; エル．ニュートン，ダイアン; ボクィー，リュイス; ウロダワー，アレクサンダー
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 2000-05-09
Anticipated expiration: 2017-02-19
Also published as: DE69731463D1; JP3469247B2; IL125771A; ES2232860T3; CN1229498C; EP0896625A2; AU2130697A; EP0896625B1; DE69731463T2; AU726379B2; NZ331298A; WO1997031116A2; ATE281528T1; WO1997031116A3; CN1212016A; IL125771A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、ラナ・ピピエンス（Rana pipiens）の卵母細胞内に見い出されるネイティブリボヌクレアーゼ由来のリボヌクレアーゼに関する。これらの分子の種々のヒトに適応させた及び組換えの形態、並びにそれらについての使用が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】組換えリボヌクレアーゼタンパク質発明の分野本発明は、関心の細胞に毒性であるリボヌクレアーゼ分子の生産に関する。発明の背景リボヌクレアーゼＡ（“RNase Ａ”）のようなリボヌクレアーゼ及びそれらの腫瘍細胞に対する細胞毒性は、1960年代及び1970年代に行われた研究から十分に証明されており、Roth J．(1963，Cancer Res. 23：657-666)に報告されている。ヒト血清も、組織特異的様式で発現されるいくつかのRNase(Reddi，E.，1975 ，Biochem．Biophys．Res．Commun．67：110-118，Blankら、Human body fluid ribonucleases：detection，interrelationships and significance 1-203-209( IRL Press，London，1981))を含むことが発見されている。好酸球のホスト防御活性に関連するタンパク質はRNaseと相同であり、RNase活性を発現する(Gleich ら、1986，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 83：3146-3150；Slifmanら、1986，J ．Immunol，137：2913-2917)。これにより、ヒト血清RNaseはホスト防御活性も有すると信じられている。これらに加えて、初期の研究は、ラナ・ピピエンス（Rana pipiens）の卵母細胞からの抗腫瘍タンパク質がRNase Ａとの相同性を有することを発見した（Arde ltら、1991，J．Biol．Chem．256：245 orporation，N．J.,例えばDarzynkiewiczら(1988)Cell Tissue K inet ．21，169-182，Mikulskiら、（1990）Cell Tissue Kinet．23，237-246も参照のこと）。このタンパク質は米国特許第4,888,172号にも記載される。種々の固体腫瘍の患者における単一治療剤(Mikulskiら(1993)Int．J．of Oncology 3 ，57-64)として、又は進行した膵臓癌の患者におけるタモキシフェンと組み合わせたONCONA いる（Chunら(1995)Proc Amer Soc Clin Oncol 14 No．157，210）の腫瘍細胞に対する能力を増加させた（Rybakら(1993) Drug Deli 在的な選択物細胞殺傷剤の製造に有利である特性を有することを示す。しかしながら、これはヒト由来タンパク質でないので、ヒトに用いる場合に不要な免疫応答を剌激する傾向がある。これにより、ヒトにおけるその免疫原性を削減しながらこの分子の潜在的細胞毒性特性を保持することが要求されよう。更に、特定の細胞に標的づけするためによりよく他の分子に化学的にコンジュゲートされ又は組換え的に連結され得るように、組換えでのこの分子の誘導体を作ることが要求されよう。本明細書に記載される本発明に至るまでは、は困難であった。組換え分子のイチオニン−グルタミン酸アミノ末端は分子が大きな酵素活性を有することを妨げると考えられるが、この問題を解決するための手段は、本明細書の本発明まではなかった。更に、タンパク質デザイン技術の進展は免疫毒性の抗体部分に関連する免疫毒性のいくつかを緩和しそうである（Birdら、1988，Science 242：423；Hustonら、1988，Proc Natl Acad Sci USA 85 ：5879；Wardら、1989，Nature 341：544）、患者の免疫抑制以外の毒素部分の免疫原性についての解決策はない（Khazaeliら、1988，Proceedings of AACR 29 ：418）。これにより、ラナ・ピピエンス（Rana pipiens）由来の毒素成分の免疫原性を減らすであろう方法及び組成物についての継え間ない必要性がある。化学的（Rybakら(1991) J ．Biol．Chem 266，1202-21207，Newtonら(1992) J ．Biol．Chem 267，19572-19578)又は組換え的手段（RybakらProc ．Natl．Acad ．Sci．USA 89，3165，Newtonら(1994) J ．Biol．Chem．269，26739-26745）による腫瘍関連抗原に関連するRNase Ａスーパーファミリーの非細胞毒性ヒトメンバーは、植物及びバクテリア毒素を用いる現在のストラテジーより少ない免疫原性で腫瘍細胞を選択的に殺すためのストラテジーを供することが示されている（ Rybak，S．M．& Youle，R．J．（1991） Immunol ．and Allergy Clinics of Nor th America 11：2，359-380）。関心のヒト由来リボヌクレアーゼは、好酸球由来ニューロトキシン(EDN)及びアンギオゲニンを含む。発明の概要体であるRNaseをいかに作製するかを発見した。nOncが組換え発現された場合、大きな細胞毒性を有することは見い出されなかった。しかしながら、我々の改良した型（rOnc）は高い細胞毒性を有し、定の場合にはそれらは増加された細胞毒性特性も有する。rOnc分子は単独で用いても便利には化学的コンジュゲートを形成するように用いてもよく、そして標的組換え免疫融合体を形成する。これらのrOnc分子は腫瘍細胞成長を減少させるために用いることができる、 nOncの有効な組換え形態は、有利にはその組換え分子が組換えにより、関心の他の治療又は標的分子に融合するのを許容する。更に、rOnc分子は、以下に示すように、細胞毒性を増強するように修飾することができる。nOncは、標的化剤を用いずに腫瘍細胞増殖を減少又は阻害するために患者に直接単独で投与することができる点で特有のリボヌクレアーゼであるので、我々のnOnc由来分子も要求される。本発明は、本発明の選択的細胞毒性試薬を作り出すためにリガンドに結合した rOncを用いて細胞を選択的に殺す方法も含む。本方法は、殺されるべき細胞に試薬を特異的に送るリガンド結合成分を有する本発明の細胞毒性試薬に、殺されるべき細胞を接触させることを含む。この本発明の方法は、要求されない細胞の型を選択的に殺すことにより試験管内での細胞分離のため、例えば骨髄剥離を患う患者への移植の前に骨髄において、又は移植片対ホストの病気を引きおこすであろう白血病細胞又はＴ細胞を殺すために用いることができる。その毒素は培養中に不要な細胞を選択的に殺すのにも用いることができる。人体に適応させた型の我々のrOnc分子は、アンギオゲニン又はヒト好酸球由来ニューロトキシン(EDN)のような哺乳動物又はヒト由来RNaseのrOnc由来分子への移植部分についても記述される。本発明の好ましい実施形態は、EDNのアミノ末端をrOnc分子のアミノ末端上におく分子である。リボヌクレアーゼ活性及び試験管内抗腫瘍効果に関するこれらのハイブリッドタンパク質の驚くべき特性が記載される。図面の簡単な説明図面の凡例図１は、以下に記載されるラナ（Rana）クローン９の予想されるアミノ酸配列（配列番号：２）及びnOncのアミノ酸配列（配列番号：１）での配列アラインメントを示す。ボールド部分はnOncとラナクローン９との間の同一の残基を示す。ドットは、PCRクローンにおいて見い出せなかったアミノ酸を示す。図２Ａ及び２Ｂは、実施例に例示されるDNA構成物の配置を示す。ラナ・ピピエンスDNAが得られたPCR産物はラナ９として同定される。そのＮ−及びＣ−末端は合成的に満たされており、Ｎ末端のEDN／Oncハイブリッドについて〔Met−（ −１）〕rOnc又はEDNをコードする構成物内nOncとして同定される。対応するアミノ酸残基を各々の構成物の下に示す。図２Ｂは、nOnc（配列番号：３）、rEDN （配列番号：４）、位置20においてAspのかわりにGly（Ｇ）を含む〔Met−（− １）〕rOnc（配列番号：５）、アミノ酸位置26においてAspを有するrEDN_(1-21)r Onc（配列番号：６）及び位置26においてGlyを有するrEDN_(1-21)rOncＧ26（配列番号：７）のＮ末端配列の配列アラインメントを示す。ボールド文字は保存性残基を示し、大文字は、ラナクローン９から予想される配列を示す。図３Ａ−３Ｄは、nOnc，rEDN，〔Met−（−１）〕rOnc又はハイブリッドタンパク質によるヒト腫瘍細胞におけるタンパク質合成の阻害を示す。細胞(10⁴)を個々の96ウエルマイクロタイター培養プレート中にプレートし、48時間、種々の濃度の各々の剤で処理した。細胞生存力を、以下の実施例セクションに記載されるように決定した。１超の個体の実験からの結果を組み合わせて平均データ点を算出した。それらがそのシンボルより大きい場合、その平均の標準誤差を示す。細胞系：ACHN、腎臓癌（図３Ａ）；MDA−MB−231（図３Ｂ）及びHS 578Ｔ（図３Ｄ）、乳癌；SF−539（図３Ｃ）、CNS癌；EDN（中あき三角形）：nOnc（中あき四角形）；〔Met−（−１）〕rOnc（中ぬり三角形）；rEDN_(1-21)rOnc（中あき円）；rEDN_(1-21)rOncＧ26 （中ぬり円）。図４は、RNase Ａスーパーファミリーのいくつかのメンバーの配列アラインメントを示す。カエルレクチンはラナ・カテスベイアナ酸球カチオン性タンパク質）、Angはウシアンギオゲニン、精液はウシ精液RNase 、そしてRNase Ａはウシ膵臓RNase Ａである（各々配列番号：８、１及び９−13 ）。全てのメンバー内で保存されるアミノ酸は大文字で示し、そして活性部位残基Ｈ12，Ｋ41、及びＨ119（RNase Ａナンバリング）はアスタリスクで示す。図５は、MetSerOnc及びMetSer−又はMetGlu−OncFvsによるタンパク質合成の阻害を示す。一本鎖抗体rOnc融合タンパク質；Ｅ６FB〔Met−（−１）〕SerrOnc （中ぬり円）、〔Met−（−１）〕SerrOnc−Ang FBE６（中あき四角）及び〔Met −（−１）〕GlurOnc FBE６（中ぬり四角）の細胞毒性効果を、SF539細胞内のタンパク質合成の阻害を決定することにより、非標的化組換えタンパク質〔Met− （−１）〕SerrOnc（中あき円）と比較した。細胞を、10％熱不活性化胎児ウシ血清を加えたダルベッコの最小必須培地内の96ウエルマイクロタイタープレート内にプレートした。全量を10μｌにし、そのプレートを３日間、37℃でインキュベートした。0.1mCiの〔¹⁴Ｃ〕ロイシンを含むリン酸緩衝塩類溶液を２〜４時間加え、その細胞を：PHD細胞ハーベスターを用いてガラスファイバーフィルター上に収集し、水で洗い、エタノールで乾燥して計数した。その結果は、偽処理ウエル内の〔¹⁴Ｃ〕ロイシン組込みのパーセントとして表現される。図６Ａ及び６Ｂは、細胞系SF 539、ヒトグリオーム細胞、並びにMetLysTryrOn cと呼ばれるrOnc融合タンパク質（中あき円、図６Ａ）；MetAlaAlaTyrOnc（中ぬり円、図６Ａ）；並びにシグナルペプチド、MetKDEL SerrOnc（中あき円、図６Ｂ）及びMetNLSerrOnc（中ぬり円、図６Ｂ）とのrOnc 融合タンパク質を用いて、図３Ａ−３Ｄに記載されるようなアッセイにおけるタンパク質合成の阻害を示す。図７は、細胞系SF 539、ヒトグリオーマ細胞を用いて図３Ａ−３Ｄについて記載されるようなアッセイにおけるタンパク質合成の阻害を示し、MetSerOncに対応する３つの融合タンパク質(Met−Serアミノ末端を有する配列番号：39）：Met SerOnc（中ぬり円）、MetSerOnc Ｃ４（配列番号：39のアミノ酸位置５において Cysを有するMetSerOnc、中ぬり四角）及びMetSerOnc Ｃ72（配列番号：39のアミノ酸位置73においてCysを有するMetSerOnc、中あき円）を比較する。詳細な記載本発明は、細胞、特に腫瘍細胞を選択的に殺し標的化するのに用いることができる高い活性で細胞毒性のリボヌクレアーゼ分子を供する。特定の実施形態において、その分子は、高い活性及び細胞毒性を有するが、ヒトにおいて免疫原性が弱い重なる利点を有するヒト由来のリボヌクレアーゼからの配列を組み込むようにデザインされる。本発明のrOnc分子は、組換えnOnc由来配列であるものである。 nOnc分子は後の配列番号：１のアミノ酸配列を有する。ウシ膵臓RNase Ａは後の配列番号：13のアミノ酸配列を有する。他に示さなければ、本明細書に記載されるアミノ酸配列位置は、RNaseの分野で一般に用いられる引用配列であるような、配列番号：13の標準のウシ膵臓RNase Ａ配列の枠として用いる。このような位置デザインがクレームされる分子自体のアミノ酸の数を示すのではなく、クレームされる分子配列をウシRNaseとアラインした時にクレームされる分子内での残基のある位置を示すものであることが理解されるはずである。本明細書に記載され、クレームされるrOnc分子は、好ましくは、アミノ酸位置 26，40，58，84，95及び110に対応するアミノ酸位置でのシステイン残基；位置4 1のリシン及び位置119のヒスチジンを、ウシRNase Ａ（配列番号13）を引用して有する（このような位置は配列番号：１に示されるnOnc配列のアミノ酸位置19， 30，48，68，75及び90並びに87及び104に各々相当する）。本発明のrOnc分子は、以下に定義されるように、測定可能なリボヌクレアーゼ活性を有するものである。そのリボヌクレアーゼは、（ａ）メチオニンで始まり、次にグルタミン酸(Glu)以外のいずれかのアミノ酸があるアミノ末端；（ｂ）ウシRNase Ａのアミノ酸配列（配列番号：13）の番号を引用して決定した位置におけるアミノ酸位置26，40，58，84，95及び110におけるシステイン；位置41におけるリシン及び位置119におけるヒスチジン；並びに（ｃ）nOnc由来アミノ酸配列も有するであろう。好ましくは、rOnc分子は、 Met-Ala； Met-Ala-Ala-Ser； Met-Arg； Met-（Ｊ）； Met-Lys-（Ｊ）； Met-Arg-（Ｊ）； Met-Lys； Met-Lys-Pro； Met-Lys-（Ｊ）-Pro（配列番号：14）； Met-Lys-Pro-（Ｊ）（配列番号：15）； Met-Asn； Met-Gln； Met-Asn-（Ｊ）； Met-Gln-（Ｊ）； Met-Asn-（Ｊ）-Pro（配列番号：16）； Met-（Ｊ）-Lys； Met-（Ｊ）-Lys-Pro（配列番号：17）；及び Met-（Ｊ）-Pro-Lys（配列番号：18）；（ここで（Ｊ）はSer，Tyr又はThrである）からなる群から選択されるアミノ末端を有するだろう。更に、rOnc分子は、nOncのアミノ酸位置２（ウシRNase Ａの配列を引用して位置４）のアスパラギン酸が欠失され又はAlaもしくはAsnにより置換されるように修飾されるのか好ましい。 rOnc分子の他の形態において、その分子は、EDNのアミノ末端由来の配列及び次のrOncからの配列によりコードされるアミノ末端を用いるであろう。このような形態において、そのアミノ酸配列は、式： Met（−１）EDN_(1-m) Onc_(n-104) （式中、Met（−１）はMetのアミノ末端残基をいい；EDN_(1-m)は、EDN（配列番号：９）のアミノ酸位置１で始まり、それに続いてEDNのアミノ酸位置“ｍ” までを含む、長さのアミノ酸の連続配列をいい；Onc_(n-104)は、アミノ酸位置“ ｎ”で始まりそれに続いて配列番号：１に示すようなアミノ酸位置104までを含む連続アミノ酸の配列をいい、ここで、ｍが21であるなら、ｎは16又は17であり；ｍが22であるなら、ｎは17であり；ｍが20であるなら、ｎは16であり；ｍが19であるなら、ｎは15であり；ｍが18であるなら、ｎは14であり；ｍが17であるなら、ｎは12又は13であり；ｍが16であるなら、ｎは11，12，13又は14であり；ｍが15であるなら、ｎは10であり；ｍが14であるなら、ｎは９であり；ｍが13であるなら、ｎは８であり；そしてｍが５であるなら、ｎは１である）の配列と実質的に同一である配列からなる群から選択されるものである。他のかわりの実施形態において、rOnc分子は、そのカルボキシル末端においてアンギオゲニンからの配列、例えば配列番号：11に例示される配列又は配列番号 20のアミノ酸位置101〜107における配列に融合されるであろう。ヒトアンギオゲニンの核酸配列は周知であり、米国特許出願第08／125,462号に記載される。好ましいrOnc核酸配列は、配列番号：20，22，24，26，28及び30の配列と実質的に同一である好ましいrOncアミノ酸配列をコードする配列である（対応する核酸配列は各々配列番号19，21，23，25,27及び29に示される）。最も好ましいrOn cアミノ酸配列は、実質的に、配列番号：20，22，24及び26に記載される配列と同一である配列である。それらに対応する核酸配列も好ましく、それらの保存的に修飾された変異体を含む配列番号19，21，23及び25に示される。最も好ましい配列は、nOncのアミノ酸残基20(Asp)がGlyで置換された、nOnc配列の16〜104アミノ酸に移植されたEDNのアミノ末端の１〜21（典型的には21）のアミノ酸を含むアミノ末端を用いる配列番号：22を含む。好ましい、rOnc配列は、任意に、配列番号：39 を引用して、アミノ酸位置５もしくは73に相当する位置にCys、又はCysの位置のアミノ酸配列88にAlaを含むであろう。本明細書に供されるrOnc配列の比較は、膵臓RNase Ａスーパーファミリー内の記載される配列に対して行うことができる。このようなメンバーの多くは周知であり、これらに限定されないが、ラナ・カテスベイアナ（Rana catesbeiana）からのカエルレクチン（Tita ．ら、J ．Biol．Chem. 266：245(1991))；好酸球由来ニューロトキシン(EDN)（R osenbergら.,前掲）；ヒト好酸球カチオン性タンパク質(ECP)（Rosenbergら., J ．Exp．Med ．170：163(1989)）；アンギオゲニン(Ang)（Fett，J．W．ら., Bioc hemistry 24：5480(1985)）；ウシ精液 RNase（Preussら., Nuc ．Acids．Res． 18：1057(1990)）；及びウシ膵臓RNase（Beintamaら.，Prog ．Biophys．Mol．Bi ol. 51：165(1988)）を含む。これら全てのタンパク質についての文献は、本明細書に引用により組み込まれる。このようなRNaseについてのアミノ酸配列アラインメントは、図４並びに引用により本明細書に組み込まれるYouleら(Crit ．Re v．Ther．Drug．Carrier Systems 10：1-28(1993))及び米国特許出願通し番号08 ／125,462号に示される。定義本明細書で他に示さない限り、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。 Singletonら（（1994）Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，s econd edition，John Wiley and Sons（New York））、並びにHale及びMarham（（1991）The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY）は、本明細書に用いられる用語の多くの一般的辞書を当業者に供する。本明細書に記載されるものと同様又は同等であるいずれかの方法及び材料を、本発明の実施及びテストに用いることができるが、好ましい方法及び材料が記載される、本発明の目的のため、以下の用語は次のように定義される。アミノ酸は、本明細書で、IUPAC-IUB生化学命名協会により推奨される一般的に知られる３文字記号又は１文字記号のいずれかにより言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に許容される一文字コードにより言及され得る。用語“測定可能なリボヌクレアーゼ活性”又は“大きなリボヌクレアーゼ活性 ”とは、タンパク質合成を、酸沈澱性タンパク質への〔³⁵Ｓ〕メチオニンの組込みにより測定しながら阻害するウサギ網状赤血球ライゼートアッセイに加えた時に40未満のIC₅₀（ng／ml）を有する分子をいう。IC₅₀は、アッセイにおいて50％だけタンパク質合成を阻害するのに必要なタンパク質の濃度である。そのライゼートアッセイは、Promega Corporation，Madison，WIから市販されるPromegaライゼートアッセイキットに記載されるように行うことができる。高分子量RNA及びtRNAを用いるリボヌクレアーゼ活性は、公開されているプロトコル(Newton，D ．L．ら（1996）Biochemistry 35：545-553)に従う過塩素酸可溶性ヌクレオチドの形成により37℃で決定される。ポリ（Ａ，Ｃ）UpG及びポリＵと共に、リボヌクレアーゼ活性は、DePriscoら.,並びにLibonati及びFloridi(DePrisco，R.,ら．（1984）Biochimica et Biophysica Acta 788：356-363；Libonati，M．ら．（1969）European J．Biochem．8：81-87)に従ってアッセイされる。活性は、26 0nmにおける吸光度の時間での増加を測定することによりアッセイされる。インキュベーション混合物（10mMイミダゾール、0.1Ｍ NaCl，pH6.5又はpH７の１ml ）は、25℃において基質及び適切な量の酵素溶液を含む。試験管内翻訳アッセイ(St．Clair，D．K.ら(1987)Proc．Natl．Acad．Sci．84，8330 -8334)及び３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；チアゾリルブルー(MMT)を用いる細胞生存率アッセイ(Mossman，T．（1983）J．Immunol．Methods 65：55-63)は、上述のように行われる（Pearson，J．Wら(1991) J ．Natl．Cancer Inst. 83：1386-1391）。 “nOnc由来”アミノ酸配列は、nOncアミノ酸配列（配列番号：１）のアミノ酸位置１（Gluがpyro Gluにおきかわる）、２，３，４，５，６，７，８，11，12 ，13，14，15，16，18，19，20，22，23,24，25，26，27，28，29，30，31，32 ，33，34，35，36，37，41,42，43，44，45，46，47，50，52，54，56，59，60 ，61，62，63,64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，76，80，81，82, 84，85，86，87，91，92，93，95、又は96で始まる配列の群から選択される６アミノ酸の連続配列と同一である６連続アミノ酸の少なくとも１のストリングを含むものである。特定の核酸配列の“保存的に修飾された変異体”とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしないなら、本質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮重のため、大数の機能的同一の核酸がいずれかの所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンGLA，G CC，GCG及びGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。これにより、アラニンがコドンにより特定される各々の位置において、そのコドンは、そのコードされたポリペプチドを変えずに、記載される対応するコドンのいずれかに変えることができる。このような核酸変異は保存的に修飾された変異体の一種である“サイレント変異”である。ポリペプチドをコードする本明細書の各々の核酸は、その核酸の各々の可能なサイレント変異体を記述する。当業者は、（通常、メチオニンのための唯一のコドンであるAUGを除く）核酸における各々のコドンが、修飾されて機能的に同一の分子を作り出すことができることが認められよう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変異体は、各々の記載される配列に含まれる。更に、当業者は、単一のアミノ酸又はコード化配列中のアミノ酸の数％を変換、付加又は削除する個々の置換、欠失又は付加は、その変換が化学的に類似したアミノ酸であるアミノ酸の置換を生ずる場合、“保存的に改変された変異体 ”であることを認めるであろう。機能的に類似したアミノ酸を供する保存的置換テーブルは当該技術で公知である。以下の６つのグループ各々は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｚ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。 Creighton（1984）Proteins W．H．Freeman and companyも参照のこと。用語“単離”又は“生物学的に純粋”とは、その天然の環境で見い出されるな通常それに伴う構成物が実質的又は本質的にない材料をいう。その単離された材料は、任意に、その自然の環境内の材料と共に見い出されない材料を含む。本明細書に記載されるrOncsは単離され、それらが関係のないラナ・ピピエンスタンパク質の欠如下で組換え生産されるので、生物学的に純粋である。しかしながら、それらは、異種細胞構成物、リガンド結合成分、及びラベル等を含む。用語“核酸”とは、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーをいい、他に限定しなければ、天然のヌクレオチドと同様に核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの周知のアナログを含む。他に示さなければ、特定の核酸配列はその相補配列を含む。核酸は、それが特定の核酸と同じであるか又は特定の核酸と相補的である他の核酸をコードする。 “発現ベクター”は、細胞により転写され翻訳され得るrOncポリペプチドをコードする核酸を含む組換え発現カセットを含む。組換え発現カセットは、標的細胞内で特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素と共に、組換え又は合成で作られた核酸構成物である。発現ベクターは、プラスミド、ウィルス、又は核酸フラグメントの一部であり得る。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は転写されるべき核酸、及びプロモーターを含む。タンパク質を引用して用いられる用語“組換え”とは、細胞が、その起源がその細胞に対して外因性である核酸によりコードされるペプチド又はタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、その細胞のネイティブ（非組換え）形態において見い出されない遺伝子を発現することができる。組換え細胞は、その遺伝子が人工的な手段により細胞内に再導入される細胞のネイティブ形態において見い出される遺伝子を、異種プロモーターの制御下で発現することもできる。特定の核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語“サブ配列”とは、特定の核酸又はポリペプチドに等しい又はそれより小さい核酸又はポリペプチドの領域をいう。核酸ハイブリダイゼーション実験例えばサザン及びノーザンハイブリダイゼーションの文脈における“ストリンジエントハイブリダイゼーション洗浄条件”は配列依存性であり、異なる環境パラメータ下において異なる。核酸のハイブリダイゼーションへの更なる案内は、Tijssen（(1993 Laboratory Techniques in Bi ochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I，Chapter 2“Overview of principles of hybridization and the stra tegy of nucleic acid probe assays”，Elsevier，New York）に見い出される。一般に、高いストリンジェント洗浄条件は、所定のイオン強度及びpHにおいて特定の配列について熱的融点より約５℃低いように選択される。Tmは、標的配列の50％が完全に適合したプローブにハイブリダイズする（所定のイオン強度及び pH下での）温度である。極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブについてTm点に等しいように選択される。ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるなら、なお実質的に同一である。これは、例えば核酸のコピーが、遺伝コードにより許容される最大のコドン縮重を用いて作られた場合におこる。２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語“同一”とは、特定の比較窓にわたって最大の一致でアラインした場合に同じである２つの配列中の残基をいう。配列同一性のパーセンテージがタンパク質プロペプチドを引用して用いられる場合、同一でない残基部分は、保存的アミノ酸置換によりしばしば異なり、ここでアミノ酸残基は同様の化学特性（例えば電荷又は疎水性）の他のアミノ酸残基に置換され、それゆえその分子の機能的特性を変化させないことが認められる。配列が保存的置換において異なる場合、置換の保存的性質を正すために、配列同一性の割合（％）は上昇するよう調整することができる。この調整を行うための手段は当業者に公知である。典型的には、これは、全てのミスマッチよりむしろ部分的なミスマッチとして保存的置換を点数化することにより、配列同一性の割合を増加させることに関する。これにより、例えば、同一のアミノ酸なら１のスコアが供され、非保存性置換なら０のスコアが供され、保存性置換なら０と１との間のスコアが供される。保存性置換の点数化は、例えばプログラムPC／GENE(Intelligenetics，Mountain View，California ，USA)において扱われるMeyer及びMiller(Computer Applic．Biol．Sci.，４：1 1-17(1988))のアルゴリズムに従って計算される。比較のための配列のアラインメントの方法は当該技術で公知である。比較のための配列の最適のアラインメントは、Smith及びWaterman（(1981)Adv．Appl．Ma th．２：482の局所的相同性アルゴリズムにより；Needleman及びWunsch（(1970) J．Mol．Biol．48：443の相同性アラインメントアルゴリズムにより；Pearson及びLipman（(1988)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85．2444）の類似性方法についての調査により；これらのプログラムのコンピュータ化操作（例えばこれらに限定されないが、the PC／GeneプログラムのCLUSTAL(Intelligenetics，Mountain View，California)，GAP，BESTFIT，FASTA,及びTFASTA(Wisconsin Genetics Sof tware Package，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，W isconsin，USA))により行うことができる。CLUSTALプログラムはHiggins及びSha rp（(1988)Gene，73：237-244）並びにHiggins及びSharp（(1989) Computer App lications in the Biosciences ５：151-153）；Corpet，ら．((1988)Nucleic A cids Research 16，10881-90)；Huang，ら．(1992)Computer Applications in t he Bi osciences 8，155-65)，及びPearson,ら．((1994)Methods in Molecular Biolog y 24，307-31)に十分に開示される。アラインメントは、しばしば視察及び手動のアラインメントにより行われる。ポリペプチドの文脈における用語“実質的同一性”又は“実質的類似性”とは、ポリペプチドが、引用配列と少なくとも70％の配列同一性、又は好ましくは引用配列と80％、もしくはより好ましくは85％の配列同一性、又は最も好ましくは約10〜20アミノ酸残基の比較窓にわたって90％の同一性の配列を含むことを示す。２つのポリペプチド配列が実質的に同一であることの示唆は、１つのペプチドが第２のペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に反応することである。これにより、ポリペプチドは、例えば２つのポリペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの１つの指摘は、１番目の核酸がコードするポリペプチドが、２番目の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。２つの核酸配列が実質的に同一であることを指摘は、２つの分子がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることである。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度及びpHにおいて特定の配列について熱的融点（Tm）より約５℃〜20℃低くなるよう選択される。Tmは、標的配列の50％が完全に適応したプローブとハイブリダイズする（所定のイオン強度及びpH下での）温度である。しかしながら、ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一でなくてもなお実質的に同一である。これは、例えば核酸のコピーが遺伝コードにより許容される最大のコドン縮重を用いて作られる場合におこる。本明細書に用いられる用語“特異的に送り出す（特異的デリバリー）”とは、標的分子を欠く細胞又は組織には会合しないが特定の標的分子又はマーカーを有する細胞又は組織との優先的な会合をいう。もちろん、分子と非標的細胞又は組織との間にある程度の非特定の相互作用がおこり得ることが認められる。しかしながら、特異的デリバリーは、標的分子の特定の認識を通して媒介されることで区別することができる。典型的な特異的デリバリーは、送り出された分子と標的分子を欠く細胞との間より送り出された分子と標的細胞を有する細胞との間のかなり強い会合を生ずる特異的デリバリーは、典型的には、標的分子又はマーカーを欠く細胞又は組織と比べて、標的分子を有する細胞又は組織に対する送り出された分子の（単位時間当りの）量で２倍超、好ましくは５倍超、より好ましくは 10倍超、そして最も好ましくは100倍超、増加する。本明細書に用いられる用語“残基”とは、ポリペプチドに組み込まれたアミノ酸をいう。そのアミノ酸は天然のアミノ酸であり得、そして他に限定しなければ、天然のアミノ酸と同様に機能し得る天然のアミノ酸の周知のアナログを含み得る。 “融合タンパク質”又は分子が他の分子に“連結される”場合とは、１つのポリペプチドのアミノ末端と他のポリペプチドのカルボキシ末端との間に形成されたペプチドを通して２又はそれ超のポリペプチドの連結により形成されたキメラ分子をいう。融合タンパク質又は連結した分子は、その構成分子の化学的カプリングにより形成されるか、又は一本鎖の連続する融合タンパク質をコードする核酸配列からの一本鎖ポリペプチドとして表現され得る。一本鎖融合タンパク質は、一本鎖の連続したポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。本明細書に用いられる“リガンド”又は“リガンド結合成分”とは、一般に、分子を特異的に送り出し、標的細胞上のレセプターと反応し又はさもなければそれを認識もしくはそれと結合することができる全ての分子をいう。特に、リガンドの例は、これらに限られないが、抗体、リンホカイン、サイトカイン、レセプタータンパク質、例えばCD４及びCD８、可溶化レセプタータンパク質、例えば可溶性CD４、ホルモン、成長因子、及び要求される標的細胞に特異的に結合する他のものを含む。 rOnc 由来核酸及びポリペプチドの作製 rOnc由来ポリペプチドをコードするいくつかの特定の核酸が本明細書に記載される。これらの核酸は、標準的な組換え又は合成技術を用いて行うことができる。本発明の核酸を仮定すれば、当業者は、同じポリペプチドをコードする核酸のような機能的に等価な核酸を含む種々のクローンを作製することができる。これらの目的を達成するためのクローニング方法及び核酸の配列を確認するための配列決定法は当該技術で公知である。適切なクローニング及び配列決定技術の例、並びに多くのクローニング課題を通して当業者に指示するのに十分な説明は、Be rger及びKimmel（Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymo logy volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)）；Sambrook ら（(1989)Molecular Cloning‐A Laboratory Manual（2nd ed.）Vol．1-3）；並びにCurrent Protocols in Molecular Biology（F．M．Ausubel et al.，eds. ，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associate s，Inc．and John Wiley&Sons，Inc.，(1994 Supplement)(Ausubel)）に見い出される。生物学的試薬及び実験装置の製造元からの製品情報は、周知の生物学的方法に役立つ情報も提供する。このような製造元は、SIGMA chemical company (Saint Louis，MO)，R&D systems(Minneapolis，MN)，Pharmacia LKB Biotechno logy(Piscataway，NJ)，CLONTECH Laboratories，Inc．(Palo Alto，CA)，Chem Genes Corp.，Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)，Glen Research，Inc .，GIBCO BRL Life Technologies，Inc．(Gaithersberg，MD)，Fluka Chemica-B iochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)，Invitrogen，Sa n Diego，CA，及びApplied Biosystems(Foster City，CA)、並びに当業者に周知である多くの他の商業的ソースを含む。本発明の核酸組成物は、RNA，cDNA、ゲノムDNA、又は種々の組合せのハイブリッドにかかわらず、生物学的ソースから単離されるか、又は試験管内で合成される。本発明の核酸は、形質転換又は形質導入された細胞中、形質転換又は形質導入された細胞ライゼート中、又は部分的に精製もしくは実質的に純粋を形態で存在する。分子プローブとして用いるための配列を増幅するため又は後のサブクローニングのための核酸フラグメントを形成するための試験管内増幅技術は周知である。このような試験管内増幅法を通して当業者に指図するのに十分な技例の例、例えばポリメラーゼ鎮反応(PCR)、リガーゼ鎮反応(LCR)、Ｑβ−レプリカーゼ増幅及び他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えばNASBA)は、Berger，sambrookら．（(198 9)Molecular Cloning‐A Laboratory Manual（2nd Ed）Vol．1-3）；及びAusube l,並びにMullisら（(1987)米国特許第4,683,202号；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications（(Innis et al．eds）Academic Press Inc．San Die go，CA(1990)(Innis)）；Arnheim&Levinson（(October 1，1990)C&EN 36-47）； The Journal of NIH Research（(1991)3，81-94）；Kwohら．（(1989)Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 86，1173）；Guatelliら．（(1990)Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 87，1874）；Lomellら．（(1989 )J．Clin．Chem35，1826）；Landegrenら((1988)Science 241，1077-1080)；Van Brunt（(1990)Biotechnology 8，291-294）；Wu及びWallace，（(1989)Gene 4 ，560）；Barringerら．（(1990)Gene 89，117）、並びにSooknanan及びMalek（ (1995)Biotechnology 13：563-564）に見い出される。試験管内で増幅された核酸の改良された方法は、Wallaceら（米国特許第5,426,039号）に記載される。例えば試験管内rOnc核酸増幅方法において、又はrOnc核酸を検出するために核酸プローブとして用いるためのプローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、典型的には、例えばNeedham-VanDevanterら((1989)Nucleic Acids Res.， 12：6159-6168)に記載されるような、例えば自動合成機を用いて、Beaucage及び Caruthers（(1981)，Tetrahedron Letts.，22（20）：1859-1862）により記載される固相ホスホルアミジトトリエステル法に従って化学的に合成される。オリゴヌクレオチドは、注文生産され、当業者に周知の種々の商業的ソースからオーダーすることができる。オリゴヌクレオチドの精製は、必要なら、典型的には、Pe arson及びRegnier((1983)J．Chrom．255：137-149)に記載されるように、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動又は陰イオン交換HPLCのいずれかにより行われる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Maxam及びGilbert(1980)(Grossman and Moldave（eds.）Academic Press，New York，Method in Enzymology 65：499-56 0）の化学的デグラデーション法を用いて確認することができる。当業者は、所定の核酸配列において要求される変換を行う多くの方法を認めるだろう。このような公知の方法は、部位特異的変異誘発、縮重したオリゴヌクレオチドを用いるPCR増幅、核酸を含む細胞の、変異誘発剤又は放射線への露出、要求されるオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば大きな核酸を作り出すための連結及び又はクローニングと組合わせたもの）及び他の公知の技術を含む。Giliman及びSmith（(1979)Gene ８：81-97）；Robertsら．（(1987)Nature 328：731-734）並びにSambrookら．（(1989)Molecular Cloning‐A Laboratory Manual（2nd Ed）Vol．1-3）；Inni s，Ausbel，Berger，NeedhamVanDevanter及びMullis（全て前掲）を参照のこと。本発明のポリペプチドは、広範囲の公知の方法において合成で調製することができる。比較的短い大きなのポリペプチドは、典型的には、慣用的な技術に従って、溶液又は固体支持体内において合成される。例えば、Merritield((1963)J． Am．Chem．Soc．85：2149-2154)を参照のこと。種々の自動合成機及びシーケンサーが市販されており、周知のプロトコルに従って用いることができる。例えば、Stewart及びYoung（(1984)Solid Phase Peptide Synthesis，2d．ed．Pierce Chemical co）を参照のこと。ポリペプチドは、そのポリペプチドをコードする核酸の組換え発現、及びその後の標準的技術を用いる精製により製造することができる。本発明の核酸及びポリペプチドの保存的改変物の作製当業者は、開示される配列の多くの保存的変異が実質的に同一のrOncを生産することを認めるであろう。例えば、遺伝コードの縮重のため、“サイレント置換 ”（即ちコードされたポリペプチドにおいて変化を生じない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードする各々の核酸配列の内在する特徴である。同様に、アミノ酸配列における１又はいくつかのアミノ酸が高い類似特性で異なるアミノ酸で置換されている保存的アミノ酸置換（定義セクション、前掲を参照のこと）は、開示されるアミノ酸配列と、又はアミノ酸をコードする開示される核酸配列と高い類似性を有するとしても直ちに同定される。このように保存的に置換された（又は改変された）各々の明らかに開示された配列の変異は本発明の特徴である。当業者は、所定の核酸配列において要求される変換を行う多くの方法を認めるだろう。このような公知の方法は、部位特異的変異誘発、縮重したオリゴヌクレオチドを用いるPCR増幅、核酸を含む細胞の、変異誘発剤又は放射線への露出、要求されるオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば大きな核酸を作り出すための連結部及び又はクロ−ニングと組合わせたもの）及び他の公知の技術を含む。Gi liman及びSmith（(1979) Gene８：81-97）；Robertsら．（(1987）Nature 328： 731-734）並びにSambrook，らInnis，Ausbel，Berger，Needham VanDevanter及びMullis（全て前掲）を参照のこと。最も一般的には、ポリペプチド配列は、対応する核酸配列を変化させ、そのポリペプチドを発現させることにより変えられる。しかしながら、ポリペプチド配列は、任意に、いずれかの要求されるポリペプチドを作り出すために、市販のペプチド合成機を用いて合成して作られる（Merrifield，並びにStewart及びYoung 、前掲を参照のこと）。当業者は、供される配列及びリボヌクレアーゼ全般に関する当該技術の知識に基づいて本発明の要求される核酸又はポリペプチドを選択することができる。RN aseの物理的特徴及び一般的特性は当業者に周知である。RNaseにおける特定の変異の特定の効果は周知である。更に、タンパク質及び核酸の性質に関する一般的知識により、当業者は、本明細書に列記される配列において開示される核酸及びポリペプチドに類似した又はそれと等価な活性を有する適切な配列を選択することができる。本明細書の定義セクションは、典型的な保存性アミノ酸置換を記載する。最後に、核酸及びポリペプチドへのほとんどの改変は、要求される特徴のための適切なアッセイにおける慣用的なスクリーニング技術により評価される。例えば、ポリペプチドの免疫学的特徴における変化は、適切な免疫学的アッセイによって検出することができる。他の特性、例えば標的核酸への核酸ハイブリダイゼーション、タンパク質の酸化還元もしくは熱的安定性、熱的ヒステリシス、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、又は凝集する傾向は、全て標準的技術に従ってアッセイされる。 rOnc 融合タンパク質及び他の治療成分 rOnc分子は、種々の薬理剤を含む薬理剤又はカプセル化システムも含み得る。それらは、典型的には、要求される細胞にrOncを向けるための標的化分子として機能するためのリガンドを含むであろう。rOncは、rOncを送り出すのを助けるであるリガンド又はアンチセンス分子に直接、結合させることができる。例えば、配列番号：40−61を参照のこと。rOncは、細胞内でrOncを方向づけるために、配列番号：32（及び配列番号：31）のアミノ酸位置１〜７に記載されるもののような核局在化シグナル（“NLS”）を含むように処理することもできる。あるいは、配列番号：31の位置８のMet及び位置22−24の対応する核酸が省略されており、又は省略することができる。NLSについての核酸配列は、配列番号：31の核酸１−21である。シグナルペプチドは、配列番号：63のアミノ酸位置１−25にも例示される。 rOnc分子は遺伝子治療の適用に独特に適用される。それらは、他の治療剤に融合させることができ、例えばそれらは抗Ｂ細胞リンパ腫抗体に融合させることができよう。例えば、以下により詳細に説明されるであろうように、抗トランスフェリンレセプター抗体又は抗結腸癌抗体に組換えで融合したrOnc分子は活性であった。上述の通り、nOncは、生体内で抗腫瘍効果を有し、血清又はrasのような成長促進剤により刺し殺された迅速に分割する細胞を優先的に殺す。その分子は、細胞内で直ちにインターナライズされる。それらの活性は、細胞内で分子を方向づけるために、核局在化シグナル等にそれらを連結することにより、更に容易にすることができる。腫瘍細胞における特別の使用は、酵素をRNaseによるデグラデーションにしむけるテロメラーゼを標的化することであろう。我々は、マイクロインジェクション研究においてOncがrasと共同作用することを見い出した。これは、Onc及びrasが細胞内で一緒でなければならないことを意味する。Oncは、それ自体の経路を経て細胞に入った時にrasと共同作用しない。 CAAX（配列番号：33）モチーフは、形質膜においてrasを局在化するために必要とされる。（Ｃ＝Cys,Ａ＝脂肪族アミノ酸、Ｘ＝Ｓ，Ｍ，Ｃ，Ａ、又はＱ、一例はCys-Val-Ile-Met(配列番号：34)である）。重要なのは、この型の配列は、異種タンパク質を形質膜に標的化することが示されていることである(Hancock，J. ，Cadwallader，K.，Paterson，H.及びC．Marshall（1991）EMBOJ．10：4033)。実施例で供されるようなCAAX（配列番号：33）シグナル、又は以下に記載されるようなKDELをコードするDNAにrOnc遺伝子を連結することが要求されるであろう。テロメラーゼは、“普遍的癌標的”として研究されている（G．B．Morin，JNC I．（1995）87：859）。それは、核の中に位置するRNAタンパク質である。テロメラーゼRNAに対するアンチセンスは、その酵素の機能を阻害し、癌細胞の増殖をブロックすることができることが示されている（J．Fengら、Science（1995） 269：1236）。RNaseは、酵素の活性も破壊することができる。Oncは、テロメラーゼを含む細胞抽出液とインキュベートした場合、酵素の活性を破壊することもできる。（配列番号：32に示されるような）NLS／ Onc分子は、それがテロメラーゼを分解できるようにOncを核に導くために作製することができる。我々の用いるNLSは、核の抗原の機能を妨害する目的のため、タンパク質を核に再び向かわせることが示されている（S．Bioca，M．S．Neuber ger and A Cattaneo，(1990)９：101）。我々のNLS／Onc分子は細胞を殺すのに有効である。その組換え分子のアミノ末端配列は、標的細胞のサイトソルへ分子を転移されるのに要求される場合に好ましい。このようなシグナルペプチドは、典型的には、タンパク質のアミノ末端に挿入される。例えば、（Metの後の）本明細書に記載される組換え分子の最初のアミノ酸はKDEL（配列番号：64）であり得、そしてその分子を小胞体にシグナルを送るのを達成するであろう。本明細書に“内質保持配列”として言及されるKDEL，KDELの繰返し、又はタンパク質を小胞体内に維持し、又はリサイクルするよう機能する他の配列を用いることができる。任意に、リガンドに結合したrOnc分子は、カプセル化システム、例えば更なる治療組成物、例えば好ましくは循環系への直接的露出からシールドされた薬剤、核酸（例えばアンチセンス核酸）、又は他の治療成分を含むリポソーム又はミセルを含み得る。抗体に結合したリポソームを調製する手段は当業者に公知である。例えば米国特許第4,957,735（Connorら、Pharm．Ther.，28：341-365（1985）を参照のこと。当業者は、リガンド分子又は他の治療構成物及びrOnc分子かいずれかの順番で一緒に連結され得ることを認めるであろう。これにより、リガンドがポリペプチドである場合、rOncはそのリガンドのアミノもしくはカルボキシ末端のいずれかに連結され得、又はその結合が分子の各々の活性を妨害しない限り、いずれかの分子の内部領域に連結され得る。その分子は、当業者に公知であるいくつかの手段のいずれかにより結合させることができる。典型的には、rOncは、リガンドに、直接的に又はリンカー（スペーサー）を通してコンジュゲートされるであろう。しかしながら、rOnc及びリガンド又は他の治療剤の両方がポリペプチドであるなら、一本鎖融合タンパク質としてキメラ分子を組換え発現するのが好ましい。一実施形態において、rOnc分子は他の分子（例えばサイトトキシン、ラベル、リガンド、又は薬剤もしくはリポソーム）に化学的にコンジュゲートされる。分子を化学的にコンジュゲートする手段は当業者に公知である。剤を抗体又は他のポリペプチド標的化分子に結合させるための手順は、その剤の化学構造により種々であろう。ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基；例えば他の分子をそれに結合するrOnc分子上の適切な官能基との反応のために利用できるカルボン酸（COOH）又は遊離アミン(−NH₂)基を含む。あるいは、リガンド及び／又はrOnc分子は、更なる反応性官能基を露出し又はそれに結合するために誘導化することができる。その誘導化は、いくつかのリンカー分子のいずれか、例えばPierce Chemical Company，Rockford．Illinotsから利用できるものの結合に関連し得る。本明細書に用いられる“リンカー”は、２つの分子を連結するのに用いられる分子である。そのリンカーは、両方の分子に共有結合を形成することができる。適切なリンカーは当業者に公知であり、これらに限定されないが、直鎖もしくは分枝鎖炭素リンカー、ヘテロ環式リンカー、又はペプチドリンカーを含む。両方の分子がポリペプチドである場合、そのリンカーは、それらの側鎖を通して（例えばシステインへのジスルフィド結合を通して）構成アミノ酸に連結され得る。しかしながら、好ましい実施形態において、リンカーは、末端アミノ酸のα炭素原子及びカルボキシル基に連結されよう。特定の剤上の基と反応性のある１の官能基、及び抗体と反応性のある他の基を有する二種官能性リンカーを、要求されるイムノコンジュゲートを形成するのに用いることができる。あるいは、誘導化は、リガンドの化学的処理、例えば遊離アルデヒド基を作り出すためのペルイオデートでのグリコプロテイン抗体の糖成分のグリコール開裂を含み得る。抗体上の遊離アルデヒド基は剤に結合するための剤上の遊離アミン又はヒドラジン基と反応し得る（米国特許第4,671,958号を参照のこと）。抗体又は抗体フラグメントのようなポリペプチド上の遊離スルフヒドリル基を形成するための手順も周知である（米国特許第4,659,839号を参照のこと）。放射性核種金属キーレート剤、毒素及び薬剤を含む種々の化合物の、抗体のようなタンパク質への結合のための多くの手順及びリンカー分子が周知である。例えば、引用により本明細書に組み込まれる欧州特許出願第188,256号；米国特許第4,671,958、4,659,839、4,414,148、4,699,784；4,680,338：4,569,789；及び 4,589,071号；並びにBorlinghausら（Cancer Res．47：4671-4075（1987）を参照のこと。特に、種々のイムノトキシンの生産は当該技術において公知であり、例えば引用により本明細書に組み込まれる“Monoclonal Antibody-Toxin Conjug ates：Aiming the Magic Bullet,”(Thorpeら.，Monoclonal Antibodies in Cli nical Medicine，Academic Press，pp．168-190(1982))，Waldman（Science，25 2：1657（1991）、米国特許第4,545,985号及び4,894,443号において見い出すことができる。特定の環境において、キメラ分子がその標的部位に達した時にリガンドからrO ncを遊離することが要求される。それゆえ、標的部位の近傍において開裂する結合を含むキメラコンジュゲートは、そのエフェクターが標的部位において遊離される場合に用いることができる。リガンドから剤を遊離するための結合の開裂は、酵素活性又はイムノコンジュゲートが標的細胞の内側又は標的部位の近傍のいずれかにおいてさらされる条件により刺し殺され得る。標的部位が腫瘍であるなら、腫瘍部位において存在する条件下で開裂可能であるリンカー（例えば腫瘍関連酵素又は酸性pHに露出された場合）を用いることができる。いくつかの異なる開裂性リンカーが当業者に知られている。米国特許第4,618, 492号；4,542,225号、及び4,625,014号を参照のこと。これらのリンカー基からの剤の遊離のためのメカニズムは、例えば、光不安定性結合の照射及び酸触媒性加水分解を含む。米国特許第4,671,958号は、例えば、患者の補足システムのタンパク質分解酵素により生体内で標的部位で開裂されるリンカーを含むイムノコンジュゲートの記載を含む。種々の放射性診断化合物、放射性治療化合物、薬剤、毒素、及び他の剤を抗体に結合させることについて報告されている多数の方法に関して、当業者は、抗体又は他のポリペプチドに所定の剤を結合するための適切な方法を決定することができるであろう。 rOnc 分子又は融合タンパク質の生産関心の分子が比較的小さい（即ち約50アミノ酸未満）場合、それらは標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて合成することができる。関心の２つの分子が比較的短い場合、そのキメラ分子は一本鎖の連続ポリペプチドとして合成することができる。あるいは、その分子は、別個に合成して、次に１つの分子のアミノ末端の、他方の分子のカルボキシ末端との縮合によりペプチド結合を形成することにより融合させることができる。あるいは、その分子は、各々ペプチドスペーサー分子の一端と縮合させて連続した融合タンパク質を形成することができる。配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、次にその配列の残りのアミノ酸が連続的に付加される固相合成法が、本発明のポリペプチドの化学的合成のための好ましい方法である。固相合成のための技術は、引用により本明細書に組み込まれるBarany及びMerrifield（Solid-Phase Peptide Synthesis；pp．3-284 in The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology．Vol．２：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,）Merrifield,ら．(J．Am．Chem．Soc.，85：2 149-2156(1963))，並びにStewartら，(Solid Phase Peptide Synthesis，2nd ed ．Pierce Chem．Co.，Rockford，III．(1984))に記載される。好ましい実施形態において、本発明のキメラ融合タンパク質は、組換えDNA法を用いて合成される。一般に、これは、融合タンパク質をコードするDNA配列を作り、特定のプロモーターの制御下で発現カセット中にそのDNAをおき、宿主内でそのタンパク質を発現させ、その発現したタンパク質を単離し、そして必要に応じてそのタンパク質を再生することに関する。本発明の融合タンパク質をコードするDNA及びrOnc分子自体は、いずれかの適切な方法、例えば適切な配列のクローニング及び制限、又は全て引用により本明細書に組み込まれるNarangら（Meth．Enzymol．68：90-99(1979)）のホスホトリエステル法；Brownら，(Meth．Enzymol．68：109-151(1979))のホスホジエステル法；Beaucageら(Tetra．Lett.，22：1859-1862(1981))のジエチルホスホルアミジト法及び米国特許第4,458,066号の固体支持体法のような方法による直接的化学合成により調製することができる。化学的合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを作り出す。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションにより、又はテンプレートとして一本鎖を用いてDNA ポリメラーゼでの重合化により、二本鎖DNAに転化することができる。当業者は、DNAの全体の化学合成が約100塩基の配列に制限されるが、短い配列の連結によりより長い配列を得ることができることを認めるであろう。あるいは、サブ配列はクローンすることができ、適切なサブ配列は、適切な制限酵素を用いて開裂することができる。次にそのフラグメントを連結して要求されるDNA配列を作ることができる。好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質又はrOnc分子をコードするDNAは、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)のようなDNA増幅法を用いてクローンすることができる。２分子が一緒に連結されるなら、当業者は、その分子が１又は複数のアミノ酸からなるペプチドスペーサーにより分離することができることを認めるだろう。一般に、スペーサーは、タンパク質を連結すること又はそれらの間の特定の距離又は他の空間的関係を保護すること以外に特定の生物活性を有さないであろう。しかしながら、そのスペーサーの構成アミノ酸は、ホールディング、正味の電荷、又は疎水性のような分子の特定の特性に影響を与えるように選択することができる。 rOnc分子又は融合タンパク質をコードする核酸配列は、種々の宿主細胞、例えば大腸菌、他のバクテリア宿主、イースト、及び種々の高等真核細胞、例えばCO S，CHO及びHeLa細胞系及びミエローマ細胞系において発現させることができる。組換えタンパク質遺伝子に、各々の宿主のための適切な発現調節配列に作用的に結合されるであろう。大腸菌について、これは、プロモーター、例えばＴ７，tr p、又はラムダプロモーター、リボソーム結合部位及び好ましくは転写終了シグナルを含む。真核細胞について、調節配列は、プロモーター及び好ましくは、イムノグロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウィルス等由来のエンハンサー、並びにポリアデニル化配列を含むであろう。そしてそれはスプライスドナー及びアクセプター配列を含み得る。本発明の発現ベクター又はプラスミドは、公知の方法、例えば大腸菌について塩化カルシウム形態転換及び哺乳動物細胞についてリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションにより、所定の宿主細胞に移すことができる。プラスミドにより形質転換された細胞は、プラスミド上に含まれる遺伝子、例えばamp，gpt ，neo及びhygにより供される抗生物質に対する耐性により選択することかできる。発現された後、組換えrOnc又は融合タンパク質は、当該技術の標準的手順、例えば硫酸アンモニウム沈澱、アフイニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等（全般的に、R．Scopes，Protein Purification，Springer-Ve rlag，N．Y．(1982)，Deut scher，Methods in Enzymology Vol．182：Guide to Protein Purification.，Academic Press，Inc．N．Y．(1990)を参照のこと）に従って精製することができる。少なくとも約90〜95％の均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、98〜99％又はそれ超の均一性が医薬として用いるために最も好ましい。精製した後、次に、部分的に又は要求される均一性まで、ポリペプチドは治療に用いることができる。従って、本発明は、上述の核酸配列を含む宿主細胞及び発現ベクターも提供する。更に、本発明は、本発明の選択的細胞毒性試薬を作るために、リガンドに連結したrOncを用いて細胞を選択的に殺す方法を含む。その方法は、殺されるべき細胞に試薬を特異的に送り出すリガンドを有する本発明の細胞毒性試薬に、殺すべき細胞を接触させることを含む。この本発明の方法は、例えば、移植片対ホストの病気を引きおこすであろう白血病細胞又はＴ細胞を殺すために、放射により骨髄剥離を患う患者への移植の前に骨髄において、不要な細胞の型を選択的に殺すことにより試験管内で細胞分離を行うために用いることができる。試験管内での使用の方法について、好ましくは、この方法に用いられる試薬の哺乳動物タンパク質は、その試薬が使用を意図する種に対して異種である。好ましくは、ヒトにおける使用のために、細胞毒性試薬は、ヒトに適応させたキメラ抗体及びヒトに適応させたrOncを含む融合タンパク質である。本発明の特定の生体内方法は、哺乳動物において癌を化学治療的に緩和する方法であって、細胞毒性の量の本発明による選択的細胞毒性試薬を投与することを含む方法を含む。その方法は、特に、細胞毒性試薬にセンシティブな腫瘍を治療するのに役立つ。特定の関心の腫瘍は、膵臓、直腸胸及び腎臓腫瘍を含む。医薬組成物 rOnc分子及び本発明のそれらを用いる融合タンパク質は、診断及び／又は治療処置のために、エーロゾルにより又は経皮により、非経口的、局所的、経口的、又は局所的投与のために役立つ。その医薬組成物は、投与の方法により種々の単位投与形態で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位投与形態は、粉末、錠剤、丸剤、カプセル及びロゼンジを含む。本分子及び融合タンパク質、並びに本発明の医薬組成物は、経口的に投与した時に消化から保護されなければならないことが認められる。これは、典型的には、そのタンパク質を、酸及び酵素加水分解に対してそのタンパク質を耐性にする組成物と複合化することにより、又はそのタンパク質を、リポソームのような適切な耐性担体中に充填することにより達成される。タンパク質を消化から保護する手段は当該技術で公知である。本発明の医薬組成物は、静脈内投与又は体腔もしくは器官のルーメン内への投与のような非経口的投与について特に役立つ。投与のための組成物は、一般に、医薬として許容される担体、好ましくは水性担体中に溶かしたキメラ分子の溶液を含むであろう。種々の水性担体、例えば緩衝塩類溶液等を用いることができる。これらの溶液は滅菌状態であり、一般に不要な物質を含まない。これらの組成物は、慣用的な公知の滅菌技術により滅菌することができる。その組成物は、適切な生理条件に必要とされるような医薬として許容される補助剤、例えばpH調節及び緩衝剤、毒性調節剤等。例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含み得る。これらの製剤中の治療分子の濃度は極めて広範囲であり得、選択された投与の特定の態様及び患者の必要に従って、主に流体容量、粘度、体重等から選択されよう。これにより、静脈内投与のための典型的な医薬組成物は、１日当り患者当り約 0.1〜10mgであろう。１日当り患者当り0.1から約100mgまでの投与量が、特にその薬剤を血液内でなく隔離した部位、例えば体腔又は器官のルーメン内に投与する時に用いることができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者に周知又は明らかであろうし、Remington's Pharmaceutical Science ，15th ed（Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania（1980）のような出版物により詳細に記載される。本rOnc分子もしくは融合タンパク質又はその混合物（即ち他のタンパク質との混合物）を含む組成物は、治療処置のために投与することができる。治療的適用のために、組成物は、関心の細胞を殺すのに十分な量である細胞毒性量で、病気を患う患者に投与される。これを達成するのに適した量は、“治療に有効な投与量”として定義される。これに有効な量は病気の厳しさ及び患者の健康の全般的状態によるであろう。本組成物の単一又は多重の投与を、その投与量並びに患者により必要とされ許容される頻度により、行うことができる。いずれの場合にも、本組成物は患者を有効に治療するのに十分な量の本発明のタンパク質を供するべきである。本明細書に言及される全ての特許、出願及び出版物は引用により本明細書に組み込まれる。以下の実施例は詳説目的のために供され、いずれかの方法によって本発明を限定するものとして解釈すべきでない。実施例実施例１ rOnc及びEDNとのOncコンジュゲートのクローニング及び発現Ａ．材料（1991）J．Biol．Chem．256，245-251）及び組換えヒトEDN（“rEDN”）（配列番号：９）（Newtonら(1994)J．Biol．Chem．269，26739-26745）を、各々記載されるようにラナ・ピピエンス卵母細胞（NASCO，Fort Atklnson，WI）及び大腸菌から精製した。変性させたタンパク質に対する抗体を、Assay Research，Inc ．（College Park，MD）により精製した。PCR及びPCR産物の直接的クローニングを行うための試薬をPerkin-Elmer Corp．(Norwalk，CT)及びInvitrogen（San Di ego，(A)から各々得た。リボヌクレアーゼアッセイのための基質を、Sigma（St．Louis，MO）及びBoehringer Mannheim(Indianapolis ，IN)から購入した。その作製及び組換えタンパク質の発現に用いる材料及びそれらのソース並びに網状赤血球ライゼートは、Newtonら（Biochemistry 35：545 (1996)に記載される。Ｂ．オンコナーゼのPCRクローニングラナ・ピピエンスゲノムDNAを、プロテインキナーゼＫを用いて標準的手順に従って単離した（Maniatis，T.，Fritsch，E．F．&Sanbrook，J，Molecular Clo ning，a laboratory manual（Cold Spring Harbor，Laboratory，Cold Spring H arbor，New York，1982）。一連の縮重プライマーを、公開させたnOnc配列の種々の領域中のアミノ酸に対応するようにデザインした（Ardeltら(1991)J．Biol ．Chem．256，245-251）。そのPCR反応を、100μｌ中15μｇのゲノムDNAを用いて、製造元の説明に従って行った。DNAを除く全ての試薬を組み合わせ、８分間、95℃でインキュベートして、TagDNAポリメラーゼを加える前にいずれの残ったプロテインキナーゼＫも不活性化した。94℃、１分の変性、55℃、２分のアニーリング、及び72℃、２分のプライマー伸長の40サイクルについてPCRを行った。いくつかのプライマーの対により、予想される大きさの産物を供した。最も大きな産物(252bp)は、アミノ酸残基15-23(AG(GA)GATGT(GT)GATTG(TC)GATAA(CT)ATCA TG)（配列番号：35）をコードする正プライマー及びアミノ酸残基90-98(TGTGA(A G)AA(CT)CAGGC(AC)CC(TA)GT(GT)CA(CT)TTT)（配列番号：36）をコードする逆プライマーを用いて得た。このフラグメントをTAクローニングによりpCR^TMIIにサブクローンし、適切な大きさの挿入物を有するクローンを通接配列決定し、nOnc のアミノ酸残基16−98（“Rana９”）（配列番号：２）をコードすることが見い出された。対応する核酸配列を配列番号：37に示す。Ｃ．プラスミド作製、発現、タンパク質精製及び試験管内アッセイ nOncのＮ−及び−Ｃ−末端を、nOncのアミノ酸残基１−15又はＮ末端における EDNのアミノ酸残基1-21及びＣ末端におけるnOncのアミノ酸残基99−104でのオーバーラップ伸長（Hortenら（1990）Biotechniques 8，528-532）によるスプライシングのPCR技術を用いて再構成した。そのアセンブルした遺伝子を、バクテリア発現ベクターpET-lld(Novagen，Madison，WI)のXbaI及びBamHI部位の間に挿入した。全ての手順は、本質的にNewtonら((1994)J．Biol．Chem．269，26739-267 45)に記載されるように行った。供給元（Novagen，Medison WI)により推奨されるように、BL21（DE３）大腸菌細胞内でプラスミドを発現させた。その融合タンパク質を（Ｍ−Sephadex Ｃ−50カラム（Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway ，NJに適用する前にNewtonら((1994)J．Biol Chem．269，26739-26745に記載されるように封入体から単離し、変性し、そして透析した。そのタンパク質を、10 ％グリセロールを含む20mM Tris-HCl，pH7.5中NaCl勾配10-0.5μ）で溶出した。 95％超への最終的精製を、平衡化したSephadey Ｇ−100上で５％ギ酸で溶出するサイズ排除クロマトグラフィーにより行った。そのタンパク質をプールし、YM３膜(Amicon，Beverly，MA)を用いるアミコン限外ろ過により濃縮（又は凍結乾燥）し、アッセイする前に、10％グリセロールを含む20mM Tris-HCl，pH7.5に対して透析した。高分子量RNA及びtRNAを用いるリボヌクレアーゼ活性を、公開されたプロトコル（Newtonら(1996)Biochem．35：545-553）に従う過塩素酸可溶性ヌクレオチドの形成を通して37℃で、公開されたプロトコル（Newtonら、(1994)J．Neurosci 14，538-544）に従って決定した。ポリ(A,C)，UpG及びポリＵで、DePriscoら，並びにLibo nati及びFlorida Depriscoら．（1984）Biochimica et Biophysica Acta 788，3 56-363，Libonati，M．&Floridi，A．(1969)European J．Biochem．8，81-87に従って、リボヌクレアーゼ活性を分光光度測定でアッセイした。要約すると、26 0nmでの吸光度の増加を測定することにより活性をアッセイした。インキュベーション混合物(1mlの10mMイミダゾール、0.1Ｍ NaCl，pH6.5又はpH７)は、25℃において基質及び適切な量の酵素を含んでいた。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；チアゾリルブルー〕(MTT)（Mossman，T．(1983)は、Immunol Method 65，55-63）を用いる試験管内翻訳アッセイ（St．Clalrら(1987)Proc．Natl．Acad．Scl．84，8330-8334) 、及び細胞生存アッセイ(Pearsonら、（1991）J．Natl．Cancer Inst．83，1386 -1391)を上述の通り行った。Ｄ．〔Met−（−１）〕rOnc及びrOncキメラのクローニング及び発現８の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを、nOncの一次アミノ酸構造内の特定領域に対応するようにデザインし（Ardeltら((1991)J．Biol．Chem．256，245 -251)、ラナ・ピピエンスゲノムDNAの増幅を、上述の通り熱的サイクラー内で行った。nOncのアミノ酸残基15〜23及び90〜98に対応する各々のプライマー対は25 2bpフラグメントを形成した。本明細書でラナ・クローン９と呼ぶこのPCR産をpC R^TMII内にクローン化し、配列分析により、そのPCR産物がアミノ酸残基16〜98からのOnc（全部で104アミノ酸）をコードすることを確認した（図１）。全体の組換えOnc(“rOnc”)遺伝子（配列番号：38）を、PCR伸長により作製し、上述の方法を用いて発現ベクターにクローン化した（Newtonら(1994)J．Biol ．Chem．269，26739-26745）。rOncのアミノ及びカルボキシ末端を、各々nOncの最初の15及び最後の６アミノ酸を挿入して完成させた。半合成rOnc遺伝子の配置を図２Ａの上に示す。そのプライマーを、ラナ・クローン９PCR産物のDNA配列とオーバーラッブするようデザインした。そのプラスミドをBL21（DE３）大腸菌内で発現させ、組換えタンパク質を、CM Sephadex Ｃ−50カラムに適用する前にNewtonら（（1994）J．Biol．Chem．26 9，26739-26745に記載されるように封入体から単離した。サイズ排除クロマトグラフィーにより95％超までの最終的精製を達成した。この発現システムにおいてバクテリアから得たrOncは、ネイティブタンパク質（配列番号：１）の真のピログルタミンアミノ酸残基（＜Glu-１）と対照的に、アミノ末端の〔Met−（−１）〕において付加的なメチオニンを含む（配列番号：９）。活性部位残基のアラインメントを維持しながら〔Met−（−１）〕rOncをヒトに適合させるために（図２Ｂ）、ラナ・クローン９のＮ末端も、ヒト好酸球RNas e，EDNの最初の21アミノ酸残基(図２Ｂ，rEDN_(1-21)Onc)をコードするオリゴヌクレオチドで再構成した。PCRクローニングは配列誤差を生じ得る。実際、EDN₍₁ _-21) Oncをコードする遺伝子のDNA配列は、ＡからＧへの置換を含んでおり、それはキメラ（nOnc中残基20）において位置26のAspからGlyへの変化を生じ、図２ＢにおいてrEDN_(1-21)rOncＧ₂₆としてデザインされる。コード化rEDN_(1-21)rOncを含む他のプラスミドを配列決定し、正確なDNA配列を有することを見い出した。その変異は、電界のあるアミノ酸の小さな中性残基での置換を生ずるので、その変異キメラも発現し、活性についてキヤラクタライズした。更に、〔Met−（− １）〕rOncを位置20においてAspからGlyに変異させた（rOncGly₂₀、図２Ａ及びＢ）。Ｅ．Onc，EDN、〔Met−（−１）〕rOnc及びハイブリッドrOncタンパク質のリボヌクレアーゼ活性 nOnc(Lin，J．J.ら（1994）Biochem．Biophys，Res．Commun．204，156-162) 及びEDN(Saxenaら（1992）J．Biol．Chem．267，21982-21986)の両方は、それらの各々の核分解活性に依存するメカニズムによりウサギ網状赤血球ライゼート内の試験管内翻訳の潜在的インヒビターである。表１に示すように、ウサギ網状赤血球ライゼートへのnOnc又はEDNの添加は、〔³⁵Ｓ〕メチオニンの酸沈澱性タンパク質への組込みにより測定されるようなタンパク質合成の阻害を引きおこした。nOnc及びEDNの両方は各々に0.2及び1.3ng／mlのIC₅₀で、タンパク質合成を阻害したので、〔Met−（−１）〕rOnc、〔Met−（−１）〕rOncＧ20、及びrEDN₍₁ _-21) 、rOncＧ26はかなり小さい能力であった（各々98，28及び28ng／mlのIC₅₀）。このアッセイにおける最少の活性のRNaseは1600ng／mlのrEDN_(1-21)rOncであった。脂質リボヌクレアーゼインヒビター(PRI)はEDNに堅く結合し、その酵素活性を阻害する(Sorrentinoら（1992）J．Biol．Chem．267，14859-14865)が、そのEDN及び膵臓RNaseスーパーファミリーの他のメンバーとの相同性にかかわらず、nOnc活性はPRIによりほとんど影響を受けない（Wu，Y．Nら（1993）Journal o f Biological Chemistry 268，10686-10693及び表１）。この点に関してrEDN_(1- ₂₁₎ rOncの活性は、nOncと同様に、ほとんどPRIにより影響を受けず、他方Gly変異を有するハイブリッドRNaseは、その活性がPRIにより大きく阻害される（21倍）点においてEDNと同様にふるまう。これらのタンパク質のリボヌクレアーゼ活性を、高及び低分子量基質を用いるアッセイにおいても評価した。表２に示すように、EDN及びnOncは、先に公開された結果（Ardeltら．(1991)J．Blol．Chem．256，245-251，Sorrentinoら．(19 92)J．Biol．Chem．267， 14859-14865，Ardeltら．(1994)Proteln Sci 3，Suppl．1，137）と一貫して異なる基質特異性を有する。表１に供される結果で一貫して、〔Met−（−１）〕r Onc（配列番号：39）及びrEDN_(1-21)rOncは、全ての基質で極めて小さな活性であった（用いてアッセイ条件下で検出できないか又は極めて小さい活性）。驚くことに、ハイブリッドタンパク質を含むGlyは、特にEDN酵素活性について最適な条件下で、大きなリボヌクレアーゼ活性を示した。EDNは中性pHにおいてより活性であり(Sorrentinoら（1992）J．Biol．Chem．267，14859-14865)、表２に見られるように、pH６と比較してpH7.5においてtRNAのEDNデグラデーションの著しい増加があった（42.3倍）。また、EDNと同様に、Gly含有ハイブリッドは６から 7.5へのpHシフトで活性が増加し（21.7倍）、他方nOncは６〜6.5の範囲の至適pH で、一貫してpH7.5で活性を失った（Ardeltら（1991）J．Blol．Chem．256，245 -251，Ardeltら（1994）Protein Sci 3,Suppl．1，137）。Gly含有ハイブリッドタンパク質の増強されたEDN様活性は、EDNのための優れた基質であるポリ（Ａ，Ｃ）でのそのふるまいによっても証明される。表２で見ることができるように、 rEDN_(1-21)rOncＧ26のみがこの基質でEDNの酵素活性の約50％を示し、他方他のR Naseの活性は無視できるものである。ポリ（Ｕ）でも同様の結果が観察された。対照的に、最適なオンコナーゼ（Onconase）基質であるUpGではrEDN又はrEDN_(1- ₂₁₎ rOncＧ26の活性は検出できなかった（Ardeltら（1994）Protein Sci 3，Supp l．1，137）。要約すると、〔Met−（−１）〕rOnc及びrEDN_(1-21)rOncの両方は nOnc又はrEDNより小さい酵素活性である。rEDN_(1-21)rOncＧ26は、所定の基質及びEDNのための最適の条件を用いてアッセイした時、大きなEDN様酵素活性を示すが、それはいずれのアッセイにおいてもEDNほど活性ではない、これは、減ぜられた酵素基質相互作用から、又はこのハイブリッド酵素のためのサブ最適アッセイ条件の使用から生じ得るのであろう。表１． PRIの存在又は欠如下でのrEDN又はnOncと比較したウサギ網状赤血球ライゼート中での〔Met−（−１）〕rOnc又はハイブリッドタンパク質の活性 ^aIC₅₀は、ウサギ網状赤血球ライゼート中で50％だけタンパク質合成を阻害するのに必要なタンパク質の濃度である。データーは、少なくとも３回のアッセイの平均からのものである。表２．異なる基質でのRNaseの活性 ^aRNase活性は、過塩素酸可溶性ヌクレオチドの形成により定量した。unitは、アッセイの直線的部分の傾斜から計算した分当りのＡ₂₆₆の変化量として定義される。各々の値は別個の実験の２〜３回のアッセイの平均値である。^b分光光度測定アッセイは、Materials and Methodsに記載されるDepriscoら（ 1984）並びにLibonati及びFloridら（1969）に従って行った。unitは、アッセイの直線部分の傾斜から計算した分当りのＡ260の変化量として定義される。各々の値は２又はそれ超の測定の平均値である。 ^c〔Met−（−１）〕rOncＧ20は検出可能な活性を有さなかった。Ｆ． RNaseによる４つのヒト腫瘍細胞系におけるタンパク質合成の阻害〔Met−（−１）〕rOnc及び２つのハイブリッドRNaseの細胞毒性効果を、MTT アッセイを用いて細胞生存性を測定することによりrEDN及びnOncと比較した。図３に示すように、nOncは全ての４つのヒト腫瘍細胞系において腫瘍細胞生存性を減少させた。示される濃度において、rEDNはいずれの細胞系の生存性にも効果を有さなかった。nOncと対照的に、〔Met−（−１）〕rOnc及び〔Met−（−１）〕 rOncＧ20は一貫して、全ての４つの細胞系において毒性が少なかった。しかし、 rEDN_(1-21)rOncＧ26は、ヒト腎臓癌細胞であるACHNにおいてnOncより細胞毒性であり、ヒト乳癌細胞系のMDA−MB−231において等しく細胞毒性であった。rEDN₍₁ _-21) rOncＧ26はSF−539及びHS 578Ｔヒトグリオーム並びに乳癌細胞系各々においてnOncより活性がなかった。それはなお、位置26にAsnを含む〔Met−（−１）〕rOnc又はrEDN_(1-21)rOncタンパク質より活性であった。Ｇ．ハイブリッドRNaseの構造分析ハイブリッドRNaseのモデリングは、Oncについての構造のアラインメント（Mosimann S．C.，Ardelt W.，James M．N．G.，(1994),Ｐ30タンパク質の精密化した1.7ÅＸ線結晶構造、抗腫瘍活性を有する両性数のリボヌクレアーゼ(J．Mol．Biol 236，1141-1153）及びEDN(Mosimann S．C．Newton D．L. ，Youle R．J.，James M．，Ｘ−ray crystallograplic structure of recombin ant eosinophil-derived neurotoxin at 1.83Åresolution J．Mol．Biol.)に基づいた。これ及び次のアラインメントは、ALIGN（Satow Y.，Cohen G．H.，Pa dlan E．A.，Davies，D．R.，(1986)，J．Mol．Biol190，593-604）を用いて行った。Ｈ．ハイブリッドRNaseの構造のモデリング Onc及びEDNの座標をＣ^αトレースアラインメントに基づいて重ね合わせた。保存的ゾーン、特に活性部位における残基は、両方の構造を比べた場合、極めて少しの置換しか示さなかった(90のＣ^α原子対について1.44Åの球状r．m．s．d ．)。そのハイブリッドタンパク質を、手動の再構成及びTOM(Combillaw C.，Hor jales E.，(1987)，J．Mol．Graph 5，174-177)を用いる幾何学的標準化によりモデル化した。次に、rEDN_(1-21)rOnc及びrEDN_(1-21)rOncＧ26のモデルを、全ての非水素原子について15Å²の全体のＢ因子にアサインし、独立して、プログラムXPLORでのポテンシャルエネルギー最小化の300サイクルにかけた（Brunger A ．(1992)XPLOR：a system for Ｘ−ray crystallogvrphy and NMR.，New Haven ：Yale University Press)。その最小化は、両方の場合で実質的に同一の構造を生じ、Ｃ^αトレースアラインメントに基づく最も高い距離は変異した残基26のＣ^α について0.44であった。最終的なモデルの幾何学的質は、PROCHECKで評価した (Laskowski R．A.，MacArthur M．W.，Moss D．S.，Thornton J．M.，(1993)，J ．Appl．Crystallogr 26，283-291)。ハイブリッドRNaseを含むGlyとAsp間の活性の著しい差についての構造的基板は、特に残基26が活性部位から離れているのでこれらのタンパク質のモデリングからは明らかでない。ペンタヌクレオチドと複合化したRNase Ａの高い相同性の構造（Fontecilla-Camps J．C.，delorens R.，leDu M．H.，Cuchillo C．M.，( 1994)，J．Biol Chem 269，21526-21531）をハイブリッドタンパク質モデルの構造と重ね合わせた場合、そのヌクレオチドも変異の領域から遠いことが観察された。しかしながら、異なるRNaseにおけるポリヌクレオチド鎖の配列は必ずしも一致しない。EDNの構造において、活性部位におけるものに加えて、２番目の硫酸イオンが見い出された（Mosimann S．C.，Newton D．L.，Youle R．J．James M.，Ｘ−ray crystallographic structure of recombinant eosinophil-derived neurotoxin at 1.83Åresolution J．Mol．Biol）。この第２の硫酸は、開裂するヌクレオチドからのリン酸を置換するが、RNase Ａ−ペンタヌクレオチド複合体内の同じ位置に位置するリン酸イオンはないようである。更に、この複合体中のリン酸の１つは、それが両分子内で異なるトポロジーを有するループ内に位置するので、Onc内に対を有さない残基であるLys-66と塩橋を形成している。これにより、キメラ内でのAsp及びGly変異体間での酵素活性の差が基質についての結合アフィニティーの変化に関連するか否かは未解決の問題のままである。２つのEDN−Oncハイブリッドの活性の差についての構造的基盤は明らかでないが、rEDN_(1-21)rOncＧ26ハイブリッドのEDN様のふるまいは、Ｎ末端領域の形状に寄与し得るようである。なぜなら、nOnc中のピログルタミン酸及びEDN中のLys -１の両方は活性部位の領域に位置するからである。（Mosimann S．C.，Ardelt W.，James M．N．G.，(1994)，Refined 1.7ＡＸ-ray crystallographic st ructure of p-30 protein，an amphibian ribonuclease with anti-tumor activ ity J Mol Biol 236，1141-1153；Mosimann S．C.，Newton D．L.，Youle R．J. ，James M.,Ｘ-ray crystallographicstructure of recombinant eosinophil-de rived neurotoxin at 1.83Ａ resolution J Mol Biol）。更に、〔Met−（−１）〕rOnc内のGly変異の導入は酵素活性に大きな影響を与えなかった。RNaseＡのＢ１サブ部位におけるＣより優るＵの選択性は、特定の残基（Asp-83）の存在に関連している（DelCardayre S．B．Raines R．T．，(1995)。残基間の水素結合はリボヌクレアーゼＡのヌクレオチド特異性を媒介する(J．Mol．Biol 252，328 -336)。nOnc中の対応する残基もアスパラギン酸（Asp-67）であるが、EDNにおいてはこの位置がヒスチジン（His-82）により占有されている。EDNがポリ（Ａ，Ｃ）に対してより活性があることは、おそらくそれがnOnc及びRNase Ａにおいてアスパラギン酸であるのに対してヒスチジン残基を含むので、Ｂ１サブ部位においてＣを“好む”ことを示唆する。まとめると、これは、rEDNに関するハイブリッドを含むGlyの活性の減少を説明し得るであろう。なぜなら、この仮説に従うと、rOnc配列により供されるAsp残基の存在はＣよりもＵの結合を好むであろうからである。PRI阻害の差に関して、ハイブリッドタンパク質とRNase Ａとの間の重ね合わせは、EDN−Oncキメラ内のAsp-26が、PRIと接触すると報告されているRNase Ａ中のAsn-27と等しい位置にあることを証明する（Kobe B.，Deisenhof er J.，(1995)，Nature 374，183-186）。更に、両方のキメラにおけるAsp-24はこの領域において極めて近接している。これにより、この領域における負の電荷の蓄積はインヒビターによる結合を防ぎ得るであろう。もしそうなら、AspのGly への置換は、負の電荷を減少させ、結合能力をもとにもどすであろう。実施例II rOnc−抗体融合タンパク質更なるrOnc−抗体及びリガンドタンパク質を作製した。それは高度に活性である。Ｅ６FB〔Met−（−１）〕SerrOncは、配列番号：40に示す核酸配列及び配列番号：41に示すアミノ酸配列を有し、抗トランスフェリンレセプター抗体である抗体Ｅ６からのFv配列を含むrOnc分子である。配列番号：41のアミノ酸位置１− 237におけるＥ６の配列を参照のこと。“FB”とは、抗体及び分子のrOnc部分を連結するのに用いられ、配列番号：40の核酸位置712〜750で見い出されるリンカーをいう。この分子は、アミノ酸位置252において、GluのかわりにSerを含む。Ｅ６FB〔Met−（−１）〕GlurOncとは、配列番号：40の配列をいう。同様のハイブリッド分子を作製した。Met−NLS(シグナルペプチド)−Gln−rOnc FBE６についての核酸及びＴミ酸配列を配列番号：42及び43に示す。他のＥ６／rOnc分子を Met−Ser−rOncＡ87 FBE６とデザインし、配列番号：44及び45に見い出される。 “Ａ87”とは、Alaがアミノ酸位置87にある事実をいう。 Met−Ser−rOnc−Ang−FBE ６は配列番号：46及び47に示す。Ｅ６FBMet−Ser−rOncは配列番号：48及び49に示す。 Met−Glu−rOnc FBE６は配列番号：50及び51に示す。 Met−Ser−rOnc FBE６は、アミノ酸位置２においてSerがGluを置換することを除いて配列番号：50及び51に示す。 MOC31及びMOC162は、Dr．Hennie Hoogenboomが得た17−１−Ａ汎癌（pancar cinoma）抗原に対して生じた抗直腸癌抗体をいう。これらの抗体のFv領域をrOnc に融合した。MetSerrOncＡ87 FBMOC31についての核酸及びアミノ酸配列を配列番号：52及び53に示す。MOC31FBMetSerrOncについての核酸及びアミノ酸配列を配列番号：54 及び55に示す。MetSerrOncFBMOC161についての核酸及びアミノ酸配列を配列番号：56及び57に示す。リガンドIL２（インターロイキン２）を更にrOncに組換えで融合させた。IL２ FBMetSerrOnCについては配列番号：58及び59を参照のこと。MetSerrOncFBIL２については配列番号：60及び61を参照のこと。（トランスフェリンレセプターを有する）SF539細胞におけるタンパク質合成の阻害を、〔Met−（−１）Ser〕rOnc，Ｅ６FB〔Met−(−１)Ser〕rOnc，〔Met −(−１)Ser〕rOnc-AngFBE６及び〔Ｍet−(−１)Glu〕rOnc FBE６構成物について、上述の通り測定し、nOncと比較した。その結果を表３に示す。３つのＥ６構成物は、特に、２つの非Ｅ６分子より45倍までの差の極めて高レベルの活性を有した。図５も参照のこと。MetSerrOncAng分子を、配列番号：47のアミノ酸１−1 07に対応させて作製した。表３．タンパク質合成への改変rOnc及び改変rOncFvsの活性ヒトグリオーム細胞において50％だけタンパク質合成を阻害するのに必要な濃度。NSD、大きな差なし。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/22 5/10 Ａ６１Ｋ 37/54 9/22 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ボクィー，リュイスアメリカ合衆国，メリーランド 21702, フレデリック，グリーンウェイドライブ 187 (72)発明者ウロダワー，アレクサンダーアメリカ合衆国，メリーランド 21702, フレデリック，ブットジャックドライブ 5512

Claims

【特許請求の範囲】 1. （ａ）測定可能なリボヌクレアーゼ活性と；（ｂ）メチオニンで始まり、次にグルタミン酸以外のいずれかのアミノ酸が続くアミノ末端と；（ｃ）ウシRN ase Ａ（配列番号：13）で特定されるアミノ酸位置を基準にして決定した位置において、アミノ酸位置26，40，58，84，95及び110におけるシステイン；位置41 におけるリシン；並びに位置119におけるヒスチジンと；（ｄ）nOnc由来のアミノ酸配列と、を有するリボヌクレアーゼ分子。 2. Met−Lys；Met−Tyr；Met−Ser；Met−Ala；Met−Arg；及びMet−Asnからなる群から選択されるアミノ末端を有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 3. Met-Ala； Met-Ala-Ala； Met-Ala-Ala-Ser； Met-Arg； Met-（Ｊ）； Met-Lys-（Ｊ）； Met-Arg-（Ｊ）； Met-Lys； Met-Lys-Pro； Met-Lys-（Ｊ）-Pro（配列番号：14）； Met-Lys-Pro-（Ｊ）（配列番号：15）； Met-Asn； Met-Gln； Met-Asn-（Ｊ）； Met-Gln-（Ｊ）； Met-Asn-（Ｊ）-Pro（配列番号：16）； Met-（Ｊ）-Lys； Met-（Ｊ）-Lys-Pro（配列番号：17）；及び Met-（Ｊ）-Pro-Lys（配列番号：18）；（ここで、（Ｊ）はSer，Tyr又はThrである）からなる群から選択されるアミノ末端を有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 4. Met-Alaのアミノ末端を有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 5. Met-Argのアミノ末端を有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 6. Met-Lysのアミノ末端を有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 7. Met-Asnのアミノ末端を有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 8. Met-Glnのアミノ末端を有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 9. Met-Ser；Met-Tyr又はMet-Thrからなる群から選択されるアミノ末端を有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 10．nOncのアミノ酸位置２（ウシRNaseの配列を基準にして位置４）のアスパラギン酸が削除され、又はAlaもしくはAsnにより置換されていることを特徴とする請求項３に記載のリボヌクレアーゼ。 11．rOncからの配列の前に、EDNのアミノ末端由来の配列によりコードされるアミノ末端を有する分子を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 12．前記アミノ酸配列が、式： Met（−１）EDN_(1-m) Onc_(n-104) （式中、Met（−１）はMetのアミノ末端残基であり；EDN_(1-m)は、EDN（配列番号：９）のアミノ酸位置１で始まり、それに続いて、EDNのアミノ酸位置“ｍ ”までを含む長さのアミノ酸の隣接配列であり；Onc_(n-104)は、配列番号：１に示す配列の、アミノ酸位置“ｎ”で始まり、それに続いて、アミノ酸位置104までを含む隣接アミノ酸の配列であり、ここで、ｍが21である場合、ｎは16又は17であり；ｍが22である場合、ｎは17であり；ｍが20である場合、ｎは16であり；ｍが19である場合、ｎは15であり；ｍが18である場合、ｎは14であり；ｍが17である場合、ｎは12又は13であり；ｍが16である場合、ｎは11，12，13又は14であり；ｍが15である場合、ｎは10であり；ｍが14である場合、ｎは９であり；ｍが13である場合、ｎは８であり；そしてｍが５である場合、ｎは１である）の配列と実質的に同一である配列からなる群から選択される配列であることを特徴とする請求項11に記載のリボヌクレアーゼ。 13．配列番号：28に記載の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 14．配列番号：22に記載の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 15．配列番号：24に記載の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 16．配列番号：26に記載の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 17．配列番号：30に記載の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 18．配列番号：32に記載の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 19．配列番号：２に記載の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 20．アンギオゲニン由来のカルボキシル末端を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 21．配列番号：20に記載の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む請求項20に記載のリボヌクレアーゼ。 22．配列番号：２に記載の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列。 23．リガンド結合成分又はラベルに連結した請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 24．前記分子が抗体に連結している請求項23に記載のリボヌクレアーゼ分子。 25．請求項１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列。 26．細胞毒性の量の請求項１に記載のリボヌクレアーゼと、医薬として許容される担体と、を含む医薬組成物。 27．前記リボヌクレアーゼが、リガンド結合成分に連結している請求項２６に記載の医薬組成物。 28．投与すべき細胞を、リガンド結合成分に連結した請求項１に記載のリボヌクレアーゼに接触させることを含む細胞を選択的に殺す方法。 29．核局在化シグナルを更に有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ分子。 30．内質保持配列を更に有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ分子。 31．請求項１に記載のリボヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクター。 32．請求項１に記載のリボヌクレアーゼをコードする核酸を含む宿主細胞。