KR20010041010A - Ｆｃ 수용체 리간드를 사용하여 마크로파지 매개 질환을치료하고 진단하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 국부화된 부분에서 선택적으로 마크로파지를 표적화하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 Fc 수용체 결합제, 및 유독하거나 검출가능한 제제를 포함한다. 본 발명의 조성물을 사용하여 마크로파지의 활성을 소멸시키거나 억제시키는 방법을 밝힌다. 본 발명의 조성물은 치료학적으로 및 진단학적으로 사용될 수 있다.

Description

ＦＣ 수용체 리간드를 사용하여 마크로파지 매개 질환을 치료하고 진단하는 방법 {TREATING AND DIAGNOSING MACROPHAGE-MEDIATED DISEASES USING FC RECEPTOR LIGANDS}
정상적인 인간의 피부는 두 구획 층으로 구별될 수 있다. 상층인 표피는 케라티노사이트, 랑게르한스 세포 및 T 세포로 이루어져 있다. 하층인 진피는 섬유아세포, 수상 세포, T 세포, 비만 세포 및 마크로파지로 이루어져 있다.
피부는 내부 환경과 주위 환경 사이의 중요한 경계막 역할을 한다. 주로, 잠재적으로 해로운 항원과의 접촉을 방지한다. 항원/병원균 침투의 경우, 염증 반응이 생체내에서 유도되어 항원을 제거한다. 이러한 반응은 피부 침윤을 유도하며, 이의 조성물은 유도되는 반응의 유형에 의존적이나, 주로 T 세포, 다형핵 세포 및 단핵세포로 이루어져 있다(Williams. I.R.. and Kupper.T.S. (1996) Life Sci 58:1485-1507: Stingl, G (1993) Recent Results Cancer Res. 128:45-57). 게다가, 조직 손상 및 자외선과 같은 알레르겐 비특이적 자극 또한 염증 반응을 유도할 수 있다. 일반적으로, 알레르겐 비특이적 반응에 기초를 두고 있는 메카니즘은 또한, 알레르겐 특이적 반응의 이펙터 페이스 동안 이용될 수 있다.
마크로파지는 큰 이원성 및 가변성(versatility)을 갖는 골수 유도 세포이다. 이러한 세포는 광범위한 매개체를 생산할 수 있으며, 많은 생물학적 작용을 수행한다(Ganz, T. (1993) New Horiz. 1:23-27). 이들의 표현형 및 작용은 주로 국부적 환경에 의해 결정되는 반면, 마크로파지 유도된 매개체는 이들의 미세환경에 영향을 끼칠 수 있다. 이러한 미세환경은 부분적으로 상이한 서브셋의 마크로파지를 유도하며, 심지어 국부적으로 상이한 마크로파지 서브셋이 존재할 수 있다(Gordon, S. (1995) Bioessavs 17:977-986). 이러한 세포는 조직에 직접 해를 끼칠 수 있는 반응적인 산소 생성물 및 단백질가수분해 효소를 생산하는 유력한 이펙터 세포이다(Laskin, D L., and Pendino.K.J. (1995) Annu Rev Pharmacol Toxicol 35:655-677). 표준 조건하에서, 마크로파지는 피부의 섬유아세포와 같은 세포외 매트릭스 형성 세포의 증식을 조절한다(Gonzalez-Romas, A. et al(1996) J Invest Dermatol 106: 305-311). 게다가, 마크로파지는 중요한 면역조절 작용을 수행할 수 있으며, 이러한 방식으로 면역 반응을 조절하고 유도하는데 결정적인 역할을 수행한다(Gordon, S. (1995) Bioessays 17:9 77-980: Thepen, T. et al. (1994) Ann, N Y Acad. Sci 725:200-206). 이러한 세포는 항원 표출 세포로서 작용하지만, 또한 수상 세포에 의해 항원 표출을 직접적으로 억제할 수 있다(Holt, P G. et al (1993) J Exp Med 177:397-407). 마크로파지는 T 세포의 증식, 표현형 및 작용, 그리고 이에 따라 유도된 면역 반응의 유형에 영향을 끼칠 수 있다.
피부 마크로파지는 상이한 비헤마토포이에틱(non-hematopoietic) 세포(섬유아세포 및 케라티토사이트와 같은)의 세포 성장 조절에서 중요한 역할을 하며, T 세포 및 수상 세포의 작용에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. "평형 상태" 하에서, 피부 마크로파지의 수는 비교적 적다. 그러나, 다양한 병리학적 상태(예를 들어, 활성 장애)하에서, 마크로파지의 수는 현저하게 증가한다. 조직 마크로파지 및 침윤 단핵세포는 염증 장애, 및 T 세포 및/또는 수상 세포의 이상 작용시 변형된 섬유아세포 및 케라티노사이트와 결합된다.
자외선 노출은 피부의 파아크로파아지의 개체군을 유도하며, 랑게르한스 세포와 반대로, 자가반응성 T 세포를 활성화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 조절되지 않은 마크로파지 작용은 피부 T 세포 림프종(균상식육증), 건선, 아토프성 피부염 및 피부홍반성 루푸스를 포함한 다양한 질환에서 비정상적인 피부 면역 반응성과 직접적으로 관련이 있다(Cooper, K.D. et al. (1993) J. Invest. Dermatol. 101:155-163; Gonzalez-Ramos, A. et al. (1996) J. Invest. Dermatol. 106:305-311). 이러한 세포는 또한, 고유의 염증 마크로파지를 활성화시킬 수 있으며, 이는 피부 염증을 유지하는 "악순환"을 초래한다. 세포 작용의 조절 이외에, 마크로파지는 산소 라디칼 및 단백질가수분해 효소와 같은 독성 화합물의 중요한 생성체이다. 이러한 독성 화합물은 직접적인 조직 손상을 야기하는 것으로 알려져 있다.
발명의 개요
본 발명은 단핵세포 유도된 식세포(즉, 마크로파지)에 세포독성 화합물을 Fc 수용체를 통해 선택적으로 표적화시키는 방법 및 화합물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 피부, 관절 또는 폐와 같은 국부적 부위내의 마크로파지의 개체군의 수 또는 활성을 선택적으로 감소시키는데 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 마크로파지상에 존재하는 Fc 수용체에 결합하는 하나 이상의 제 1 부분, 및 마크로파지의 작용을 파괴하거나 억제하는 하나 이상의 제 2 부분을 함유하는 마크로파지 결합 화합물을 제공한다. Fc 수용체에 결합하는 부분은 항체, 펩티드(예를 들어, 펩티드 모방체) 또는 화학 화합물과 같은 Fc 수용체 결합가능한 임의의 분자를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, Fc 수용체 결합 부분은 항체 또는 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv)이다. 바람직한 구체예에서, 항-Fc 수용체 항체 또는 항체 단편은 "인간화된"다(예를 들어, 비인간 항체로부터 유도된 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR) 또는 이것의 부분과 인간으로부터 기원된 나머지 부분(들)을 가짐). 또 다른 바람직한 구체예에서, 항-Fc 수용체 항체 또는 항체 단편은 인간 단일클론 항체이다(예를 들어, 완전하게 인간 항체를 발현시키기 위해 유전자 공학에 의해 생성된 마우스에서 생성된 항체). 또한, 이들 구체예중에는 항-Fc 수용체 항체의 결합을 "모방"하는 화합물(예를 들어, 펩티드 또는 화학 종)이 포함된다(Jenks et al. J. Natl. Cancer Inst. (1992)84(2):79; Saragovi et al. Science (1991) 253:792; Hinds et al. J. Med. Chem (1991) 34:1777-1789; Fassina Immunomethods (1994) 5:121-129). 또 다른 구체예에서, 마크로파지 결합 화합물의 Fc 수용체 결합 부분은 시아닌 조성물, 예컨데 형광성 염료 Cy5.18.OSu("Cy5"로서 기재할 것임)이며, 높은 친화도 및 특이성으로 마크로파지 세포상에 존재하는 FcγRI에 결합한다. 시아닌 조성물은 두개 이상의 부분을 포함할 수 있다: 시아닌 숙시니미딜 에스테르 및 피코빌좀 단백질, 예를 들어, PE.
본 발명의 마크로파지 결합 화합물에 의해 인지된 Fc 수용체는 IgG 수용체, 예를 들어, Fc-감마 수용체(FcγR), 예컨데, FcγRI(CD64), FcγRⅡ(CD32) 및 FcγRⅢ(CD16), 또는 IgA 수용체, 예를 들어, FcαR(예를 들어, FcαRI, CD89)일 수 있다. Fc 수용체는 바람직하게는, 마크로파지, 예를 들어, 피부 마크로파지의 표면상에 위치하여, 화합물에 의해 인식되고 결합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 마크로파지 결합 화합물의 항-Fc 수용체 결합 부분은 내인성 면역글로블린(예를 들어, IgG 또는 IgA)에 의해 결합된 부위와는 구별되는 부위에서 Fc 수용체에 결합한다. 따라서, Fc 수용체로의 마크로파지 결합 화합물의 결합은 면역글로블린의 생리학적 수준에 의해 차단되지 않는다.
표적화를 위한 마크로파지상의 바람직한 Fc 수용체는 높은 친화도의 Fcγ 수용체, FcγRI이다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물의 항-Fc 수용체 결합 부분은 항-FcγRI 항체 또는 이것의 단편을 포함한다. 전형적인 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 항-FcγRI 수용체 항체의 인간화된 형태, 예컨대, 인간화된 단일클론 항체 22(H22) 또는 이것의 단편이 사용된다.
마크로파지의 활성을 파괴하거나 제어하는(예를 들어, 감소시키는) 마크로파지 결합 화합물(항-마크로파지 약제)의 일부는 적합한 세포독소 또는 약물로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 항-마크로파지 약제는 겔로닌, 사포린, 온코나아제, 엑소톡신 A, 리신 A, 디클로로메틸렌 디포스포네이트(CL2MDP), 또는 이것의 유도체일 수 있다. 한 구체예에서, 항-마크로파지 약제는 마크로파지 결합 화합물의 항-Fc 수용체 결합 부분에 직접적으로 연결된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 항-마크로파지 약제는 항-Fc 수용체 결합 부분에 간접적으로 연결된다. 예를 들어, 항-Fc 수용체 결합 부분에 연결되는 항-마크로파지 약제는 리포좀내로 캡슐화될 수 있다.
본 발명의 마크로파지 결합 화합물은 다양한 치료 및 진단 방법에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 화합물은 마크로파지의 비정상적인 수 또는 작용에 의해 특성결정되는 질환을 진단하는데 사용된다. 이러한 방법은, 샘플중에 존재하는 마크로파지에 화합물이 결합할 수 있는 조건하에 마크로파지 결합 화합물을 시험 부위 또는 배양된 샘플과 접촉시키거나 이에에 투여하는 것을 포함한다. 그 후, 화합물의 결합은 샘플중의 마크로파지의 존재(예를 들어, 수) 및/또는 작용의 표시로서 검출될 수 있다. 예를 들어, 마크로파지의 수의 증가를 나타내는, 명백하게 검출된 Fc 수용체 단백질의 통계적으로 현저하게 증가된 수준은 질환의 표시일 수 있다. 시험 부위 또는 샘플은 마크로파지 세포를 함유하는 예를 들어, 피부(예를 들어, 인간 피부) 또는 다른 조직의 형태일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 마크로파지 결합 화합물은 마크로파지의 증식 및/또는 비정상적인 작용과 관련된 질환을 치료하는데 사용된다. 마크로파지 결합 화합물을 치료가 필요한 부위과 접촉시키면, 화합물은 Fc 수용체를 통해 마크로파지에 결합하며, 이러한 세포의 활성을 파괴하거나 감소시킨다. 따라서, 마크로파지와 관련된 광범위한 질환(예를 들어, 마크로 파아지 증식 및/또는 비정상적인 작용)은 본 발명을 사용하여 치료되고, 예방되고 진단될 수 있다. 이러한 질환은 자체에서(예를 들어, 자가면역 질환) 또는 외부에서(예를 들어, 접촉 과민증, 다형성 경 발진(PLE) 및 자극성 반응) 유도될 수 있다. 게다가, 피부 질환은 아토피성 경우의 아토피성 피부염, 및 전신 피부 홍반성 루푸스과 같은 더욱 전신적인 질환의 징후이다. 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료도리 수있는 비제한적인 질환은 자가면역 질환, 호흡 질환, 감염성 질환, 피부성 질환 및 염증 질환을 포함한다. 이러한 질환의 특이적 실례는 건선, 아토피성 피부염, 다발성 경화증, 피부경화증, 피부홍반성루푸스, 류마티스 관절염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염, 만성 다형성 경 피부염(CPLD), 만성 장해 폐 질환(COPD), 예를 들어, 알레르기성 천식 및 유육종증(예를 들어, 아물지 않은 상처 또는 화상)을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 방법 및 화합물은 이러한 질환을 진단하거나, 연구 목적(예를 들어,이러한 질환에서 마크로파지의 병리학적 역할 연구)에 사용될 수 있다.
치료학적 목적으로 생체내에서 사용되는 경우, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물은 유효량으로 선택된 부위으로 국부적으로 투여되어(예를 들어, 국부적, 피내, 피하내로 흡입에 의해 에어로졸로서) 투여 부위내의 마크로파지의 활성을 제거하거나 감소시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 마크로파지 결합 화합물은 투여될 경우(예를 들어, 전신적으로, 국부적으로, 근육내로) 불활성인 감광성을 유도하지만, 빛(예를 들어, 가시적 또는 UV 광선)에 노출되므로써 활성화될 수 있다. 유사하게는, 마크로파지 결합 화합물은 광분해성 결합에 의해 치료제(또는 진단제)에 결합된 FC 결합제를 포함할 수 있으며, 이는 광 노출시에 시약을 방출시킨다. 이들 화합물은 광에 노출된 선택된 조직 내에서만 마크로파지의 조절된 치사 또는 비활성화를 가능하게 한다.
본 발명은 상기 기술된 본 발명의 방법에 사용되는, 마크로파지 결합 화합물과 허용되는 담체 또는 희석제를 함유하는 조성물, 예를 들어 약제 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명의 그 밖의 특징 및 잇점은 하기 도면, 상세한 설명, 실시예 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 다양한 농도의 CD64-면역독소(H22-Ricin A, H22-R, 또는 197-Ricin A, 197-R)의 존재 또는 부재하에 증식시킨 배양된 U937 또는 HA1.6 세포의 [3H]-티미딘 혼입의 퍼센트를 배지 대조표준(±SEM)의 퍼센트와 비교한 막대 그래프이다. U937 세포를 지시된 농도의 H22-R(패널 A) 또는 197-R(패널 B)의 존재하에 IFNγ와 함께(흑색 막대) 또는 IFNγ 없이(갈색 막대) 배양시켰다. 하부 패널 C와 D의 경우, hFcγR1로 트랜스펙션되거나(흑색 막대) 트렌스펙션되지 않은(갈색 막대) HA1.6 세포를 다양한 농도의 H22-R(패널 C) 또는 197-R(패널 D)과 인큐베이팅시켰다.
도 2는 다양한 농도의 H22-R과 인큐베이팅시킨 후에 아폽토시스됨에 따른 U937 세포의 요오드화 프로피듐 형광의 스캔을 도시한 도면이다. 핵 단편화를 요오드화 프로피듐 염색에 의해 분석하였고, 서브다이플로이드(subdiploid) 핵은 막대로 나타난다. 막대 위의 숫자는 서브다이플로이드의 퍼센트를 나타내므로, 아폽토시스성 핵 농도는 대조표준과 같다.
도 3A 및 B는 시간에 따른 피부 내의 염증 세포에 대한 면역독소의 1회 피내 주사의 효과를 나타내는 그래프이다. 데이터 점은 mm2당 평균 세포수(±SEM)을 나타내고, 데이터 점은 3회 실험을 초과한 평균을 나타낸다. hFcγRI 발현 세포(흑색 네모, 도 3A), 마크로파지(백색 네모, 도 3A), T 세포(흑색 네모, 도 3B) 및 수상돌기 세포(백색 네모, 도 3B)의 속도론이 도시되어 있다.
도 4A 내지 4B는 면역독소의 피내 주사시 국소 피부 온도의 감소를 나타내는 그래프이다. 도 4A는 IT(●)(n=6) 또는 비히클 대조표준(○)(n=6)에 의한 1회 주사 후의 SLS 처리된 hFcγRI 형질전환된 마우스의 국소 피부 온도 판독(±SEM)을 도시한다. 도 4B는 IT(○)(n=6) 또는 비히클 대조표준(●)(n=6)이 주사된 SLS 처리된 hFcγRI 형질전환된 마우스의 온도 진행(±SEM)을 도시한다. 국소 피부 온도를 매일 모니터링하고, 증가시에, 동물을 동일한 부위에 재주사하였다(*로 표시된 날).
발명의 상세한 설명
비정상적 증식 및/또는 활성을 포함하는 비정상적 마크로파지 기능은 다수의 질환, 예를들어, 피부학적 질병, 자기면역 질병, 감염성 질병 및 염증 질환과 관련이 있어 왔다. 현재까지, 세포독성제, 예를 들어 면역독소를 사용하여 대시구의 국소 제거시키는 방법은 제한된 효능을 가졌다. 본 발명은 국소 부위 내의 마크로파지의 활성을 선택적으로 고갈시키고/시키거나 억제시킴으로써 이러한 질환을 진단하고, 치료하고, 예방하는 방법 및 조성물을 제공한다. 세포는 독성 약제를 이들의 Fc 수용체를 통해 이들 세포에 표적화시킴으로써 고갈(예를 들어, 치사)되고/되거나 억제(예를 들어, 활성이 감소)된다. 예를 들어, 본원에 기술된 실험은 항-Fc 수용체 결합 단백질, 예를 들어 인간 FcγRI 수용체에 대한 인간화된 항체가 독소, 예를 들어 리친 A에 접합된 형태로 구성된 마크로파지 결합 화합물이 인간 FcγRI를 발현시키는 형질전환된 마우스의 생체내에서 마크로파지를 선택적으로 제거시키는 용도를 입증한다. 본원에 사용된 용어 "마크로파지" 및 "단핵세포 유도된 식세포"는 상호교환적으로 사용될 것이다.
따라서, 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 마크로파지 상에 존재하는 Fc 수용체에 결합하는 약제와 결합된 마크로파지를 치사시키거나 이의 활성을 억제시키는 약제를 포함하는 마크로파지 결합 화합물을 제공한다. Fc 수용체와 결합하는데 적당한 성분으로는 예를 들어 단백질(예를 들어, 항-FcR 항체 및 이들의 펩티드 또는 키메라 의사물질, 또는 FcR 수용체 리간드) 및 화학적 부분(예를 들어, 염료 및 합성 FcR 리간드)이 있다. 이러한 Fc 수용체 결합 약제는 이들이 각각 하나, 둘 또는 둘을 넘는 결합 부위을 함유한다는 점에서 단일특이적, 2중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 예를 들어, 약제는 Fc 수용체의 둘 이상의 상이한 부위 또는 Fc 수용체와 동일하거나 또 다른 세포의 상이한 성분에 결합할 수 있다. 모든 경우, 약제는 Fc 수용체에 결합하는 하나 이상의 부분을 함유한다.
한 가지 구체예에 있어서, Fc 수용체 결합 약제는 항체이거나, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv를 포함하는 항체 단편이다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체이거나, 이것의 임의의 최소 단편, 예를 들어 본원에 참고문헌으로 인용된 1990년 8월 7일 허여된 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 제 4,946,778호에 기술된 Fv 또는 단일 사슬 구성물일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, Fc 수용체 결합 약제는 항체 의사물질(예를 들어, 펩티드 또는 화학적 화합물)이다 (참조: Jenks et al. J. Natl. Cancer Inst (1992) 84(2) 79; Saragovi et al. Science (1991) 253:792; Hinds et al. J Med Chem. (1991) 34:1777-1789; Fassina Immunomethods (1994) 5:121-129).
또 다른 구체예에 있어서, Fc 결합 성분은 2중특이적 또는 다중특이적 분자이다. 용어 "2중특이적 분자"는 결합하는 두 개의 상이한 결합 특이성을 갖거나, (a) 마크로파지의 표면 상의 Fc 수용체 및 (b) 제 2의 상이한 표적 항원과 상호작용하는, 임의의 화합물, 예를 들어 화학적 부분 또는 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체를 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"는 결합하는 두 개가 넘는 상이한 결합 특이성을 갖거나, (a) 마크로파지의 표면 상의 Fc 수용체, (b) 둘 이상의 상이한 표적 항원과 상호작용하는 임의의 화합물, 예를 들어 화학적 부분 또는 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물에 사용될 수 있는 Fc 수용체 결합 약제로는 마크로파지 상의 Fc 수용체에 대해 유도된 2중특이적, 3중특이적, 4중특이적 및 그 밖의 다중특이적 분자가 있다.
예를 들어, 약제는 상이한 특이성을 갖는 둘 이상의 항체, 항체 결합 단편(예를 들어, Fab), 또는 이들의 유도체를 함께 결합된 형태로 포함하는 이종항체일 수 있다. 이러한 상이한 특이성은 Fc 수용체에 대한 둘 이상의 상이한 결합 특이성을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이들은 Fc 수용체에 대한 하나의 결합 특이성을 포함할 수 있고, 동일한 세포(즉, 마크로파지) 또는 상이한 표적 세포(예를 들어, 또 다른 면역 세포 또는 병원균)에 대해 하나 이상의 다른 결합 특이성을 포함할 수 있다.
Fc 결합제가 이특이적 또는 다특이적인 분자인 상기 구체예에서, 결합제는 물리적으로 표적 마크로파지에 세포 파괴 이펙터 세포를 함께 이끄는 기능을 할 수 있어, 더욱 효율적으로, 마크로파지의 표적화된 제거가 달성될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이펙터 세포"는 면역 반응의 인식 및 활성화 단계에 반하는, 면역 반응의 이펙터 단계에 관여하는 면역 세포를 말한다. 면역 세포의 예로는 마이엘로이드 또는 림포이드 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예를 들어, B 세포 및 세포용해성 T 세포(CTL)를 포함하는 T 세포), 치사 세포, 천연 치사 세포, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립성 백혈구, 유방 세포 및 호염기성 세포가 포함된다. 마크로파지와 유사하게, 이펙터 세포는 특이적인 Fc 수용체를 발현시키고, 특이적인 면역 기능을 수행한다. 바람직한 구체예에서, 이펙터 세포는 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 유도할 수 있다. 예를 들어, 호중구는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcαR을 발현시키는 호중구, 호산구 및 림프구는 표적 세포의 특이적인 치사 및 면역 시스템의 다른 성분에의 항원의 제공, 또는 항원이 존재하는 세포에의 결합에 관여한다. 다른 구체예에서, 이펙터 세포는 표적 항원 또는 세포(예를들어, 마크로파지), 또는 미생물을 식균시킬 수 있거나, 표적 세포, 예를 들어 마크로파지를 용해시킬 수 있다. 이펙터 세포에서 특정 Fc 수용체의 발현은 사이토카인과 같은 체액 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 발현은 인터페론 감마(IFN-γ)에 의해 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 향상된 발현은 표적, 예를 들어 마크로파지에 대해 FcγRI 함유 세포의 세포파괴 활성을 증가시킨다.
본 발명의 다른 구체예에서, Fc 수용체 결합제는 단일클론 항체 또는 이것의 단편이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제조에 관한 것이다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 단일클론 항체는 뮤린, 또는 인간 단일클론 항체(예를 들어, 인간 항체를 완전히 발현시키도록 유전 조작된 마우스에서 생성된 항체)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, Fc 수용체 결합제는 키메라 항체 또는 이것의 단편, 또는 인간화된 항체 또는 이것의 단편이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 가변성 부위가 어느 한 종의 동물로부터 유래되고 불변 부위가 또 다른 종의 동물로부터 유래되는 항체를 포함함을 의미한다. 예를 들어, 키메라 항체는 마우스 단일클론 항체로부터 유래되는 가변성 부위와 인간으로부터 유래되는 불변 부위를 갖는 항체일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 마크로파지 결합 화합물은 인간화된 항체 또는 이것의 결합 단편을 포함한다. 용어 "인간화된 항체"는 초가변성 부위(이것은 또한 상보성-결정 부위(CDR)로 명명된다)이 어느 한 종의 동물로부터 유래되고 항체의 프레임워크 부위 및 불변 부위가 상이한 종의 동물로부터 유래되는 항체를 포함함을 의미한다. 본 발명의 인간화된 항체에서, CDR은 마우스 단일클론 항체로부터 유래되고, 항체의 다른 부위는 인간으로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 인간 항체는 중쇄 가변성 부위(VH)에 대해서는 공지된 단백질 NEWM 및 KOL, 및 Ig 카파 사슬, 가변성 부위(VK)에 대해서는 REI로부터 유래된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 항체는 키메라 및 인간화된 항체, 이들의 항체의 결합 단편 또는 개질된 변형체를 포함한다.
항원에 결합할 수 있는 항체 또는 단백질의 "단편" 또는 "결합 단편"은 항원에 결합하기에 충분한 항체 또는 단백질의 단편을 포함한다. 항원에의 항체의 결합 단편의 결합은 항원에의 전체 항체의 결합과 같은 친화도 또는 상이한 친화도, 예를 들어 더 낮거나 높은 친화도를 이용하여 이루어질 수 있다. 용어 항체에 포함되는 결합 단편의 예로는 VL, VH, CL및 CH1부위로 이루어진 Fab 단편; VH및 CH1부위로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL및 VH부위로 이루어진 Fv 단편; VH부위로 이루어진 dAb 단편(참조 : Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), 분리된 상보성 결정 부위(CDR); 및 F(ab')2단편, 힌지 부위에서 다이설파이드 브릿지에 의해 결합되는 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편이 포함된다. 결합 단편, 예를 들어 항체의 결합 단편은 활성 또는 작용성 결합 단편일 수 있다. 따라서, 활성 또는 작용성 결합 단편은 하나 이상의 활성을 유발하거나 완전 길이 분자에 의해 유발된 기능을 할 수 있는 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 단일클론 항체 M22 또는 H22의 활성 결합 단편은 FcγR에 결합할 수 있고 수용체-매개된 이펙터 세포 활성, 예를 들어 과산화물 음이온의 생성을 유발할 수 있는 항체의 단편이다. 이들 항체 단편들은 당업자들에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 고유의 항체와 같은 방식으로 이용하기 위해 스크리닝된다.
본 명세서에서 용어 "~에 결합하는 약제" 또는 "결합 특이성"은 "항원 결합 부위", "항원 결합 부위" 및 "항체의 결합 결정인자"와 번갈아 사용된다. 이들 용어는 항원의 결합에 관여하는 분자의 부위, 예를 들어 항체를 포함한다. 항체의 항원 결합 부위는 항원과 접촉하는 항체의 아미노산을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 항원 결합 부위는 항체의 가변성 부위일 수 있다. 항체의 항원 결합 부위는 또한 항원과 접촉하고/접촉하거나 항원 결합 부위의 적당한 3차 구조를 제공하는 항체의 초가변성 부위중의 아미노산 잔기일 수 있다. 항체의 가변성 부위 또는 초가변성 부위의 아미노산 잔기가 항원에 접촉하고/접촉하거나 정확하게 중첩된 항원 결합 부위에서 중요한 지를 결정하는데 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발 분석이 수행될 수 있다. 특히, 재조합적으로 생성된 항체중의 다른 아미노산에 대해서 하나 이상의 아미노산을 치환시키고 항원에 대해 개질된 항체의 결합 친화도가 개질되지 않은 항체에 비해 변화되는 정도를 결정하는 생체외 결합 연구를 수행하는 것이 가능하다. 결합이 다른 것으로의 아미노산 치환에 의해 감소하는 경우, 아미노산은 항원에의 항체의 결합에 있어서 가장 중요하다. 항체의 가변성 부위의 아미노산이 항원에의 항체의 결합에 관여하는지를 결정하는 다른 방법은 결정학상 분석, 예를 들어 X-레이 결정법을 기초로 한다.
용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"는 다른 항원에 결합하는 것 보다 상당히 높은 친화도를 갖는 특이적인 항원에 결합하는 항체를 포함한다. 즉, 이것은 당해 분야에 정의된 항체의 특이성을 정의함을 의미한다. 용어 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 번갈아 사용된다.
항-Fc 수용체 결합제의 생성
I. 항-Fc 수용체 항체의 생성
본 발명의 마크로파지 결합 화합물에 사용하기 위한 항-Fc 수용체 항체는 다양한 공지된 기술 중 어느 하나를 사용하여 개발된 항체를 포함하며, 단 항체는 마크로파지상에서 Fc 수용체에 결합할 수 있다. 바람직한 항체는 임상 용도에 실용적이다(예를 들어, 인간에게 투여될 수 있다). 특히 바람직한 항체는 인간에게 투여되는 경우에 비면역성이거나(예를 들어, 유전자이식 동물에서 생성되는 인간 항체이다), 인간에게 투여되는 경우에 면역성을 감소시키도록 개질된다(예를 들어, 인간화된다).
한 가지 구체예에서, 항-Fc 수용체 항체는 단일클론 항체, 예를 들어 뮤린 또는 인간 단일클론 항체이며, 이는 바람직하게 인간 면역글로블린 G(IgG) 또는 면역글로블린 A(IgA)에서 IgG 수용체 타입 또는 IgA 수용체 타입에 결합한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "IgG 수용체"는 염색체 I 상에 위치한 Fcγ 수용체 유전자 중 어느 하나를 의미한다. 이들 유전자는 3가지 Fcγ 수용체 부류, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)로 분류되는 12개의 트랜스막 또는 가용성 수용체 아이소폼(isoform) 전체를 암호화한다. 한 가지 바람직한 구체예에서, Fcγ 수용체는 인간 고친화성 FcγRI이다. 인간 FcγRI는 72kDa 분자이며, 이는 단량체성 IgG(108내지 109M-1)에 대해서 고친화성을 나타낸다. 바람직한 단일클론 항체의 생성 및 특징화는 팡거(Fanger) 등의 PCT 출원 WO 88/00052호 및 미국 특허 제 4,954,617호에 기술되어 있으며, 이들의 내용은 본 명세서에 참고적으로 완전히 인용되어 있다. 상기 항체들은 수용체의 Fcγ 결합 부위와 다른 부위에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII에 결합하여, 이들의 결합은 IgG의 생리학적 수준에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이적인 항-FcγRIII 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생성하는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC) 기탁번호 제 HB9469호로부터 이용가능하다. 항-FcγRI mAb 22, mAb 22의 F(ab') 단편은 1996년 7월 9일에 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 기탁번호 제 HB-12147호로 지정되었다. 다른 구체예에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 뉴저지 안난데일에 소재하는 메다렉스 인코포레이티드 (Medarex, Inc.)로부터 수득될 수 있다. mAb 22를 생성하는 하이브리도마는 1996년 7월 9일에 ATCC에 기탁되었으며, ATCC 기탁번호 제 HB-12147호로 지정되었다. 다른 구체예에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 단일클론 항체 22(H22)로부터 인간화된다. H22 항체의 생성 및 특징은 문헌[Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002] 및 PCT/US93/10384에 기술되어 있다. 세포 라인을 생성하는 H22 항체는 HA022CLI로의 지정하에 1992년 11월 4일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었으며, 그 기탁번호는 제 CRL 11177호이다.
다른 구체예에서, 항-FcR 항체는 IgA 수용체에 대해 특이적이다. 용어 "IgA 수용체"는 염색체 19상에 위치한 하나의 α-유전자(FcαR)의 유전자 생성물을 포함한다. 이 유전자는 55 내지 110kDa의 수가지 선택적으로 스플라이싱된 트랜스막 아이소폼을 암호화하는 것으로 공지되어 있다. FcαR(CD89)는 단핵구/마크로파지, 호산구 및 호중구형의 과립형 백혈구상에서 구조적으로 발현되지만, 비이펙터 세포 개체상에서는 그러하지 않다. FcαR은 IgA1 및 IgA2 모두에 대해서 중간의 친화도(약 5×107M-1)를 가지며, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인에의 노출시에 증가한다 [참조: Morton, H.C. et al. (1996) Crincal Reviews in Immunology 16:423-440]. 항-Fcα 수용체 단일클론 항체의 예로는 My 43, A77, A62, A59 및 A3이 포함된다 [참조: Monteiro et al. (1992) J. Immunol, 148:1764; Shen et al. (1989) J. Immunol 143:4117]. 바람직한 항-FcαR 항체는 IgA에 억제되지 않고서 FcαR에 결합할 수 있다. 항체 A77은 인간 세포 용해물로부터 정제된, IgA 친화성의 FcαR 하유 아크릴아미드 겔 슬라이스로 마우스를 면역화시킴으로써 생성하였다. 단일클론 항체는 3가지 특성, PMA 활성화후 고밀도에서의 U937 세포의 착색, 혈중 단핵구 및 과립형 백혈구와의 선택적인 반응성, 및 호중구 및 활성화된 U937 세포로부터의 약 55 내지 75kDa의 분자를 면역 침전시키는 능력에 따라 스크리닝된다.
본 발명의 화합물에 사용되는 단일클론 항-Fc 수용체 항체는 통상적인 단일클론 항체 계통적 분류법, 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein, (1975) Nature 256L 495]의 표준 체성 세포 혼성화 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 체성 세포 혼성화 공정이 이론상 바람직할지라도, 단일클론 항체를 생성하기 위한 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환이 사용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기에 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스중의 하이브리도마 생성은 잘 설정된 공정이다. 융합을 위한 면역화된 비세포의 분리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너(예를 들어 뮤린 마이엘로마 세포) 및 융합 공정 또한 공지되어 있다.
인간 단백질에 대해 유도되는 인간 단일클론 항체(mAb)는 마우스 시스템 보다는 완전한 인간 면역 시스템을 갖는 유전자이식 마우스를 사용하여 발생될 수 있다. 관심을 끄는 항원으로 면역화시킨 유전자이식 마우스로부터의 비세포는 인간 단백질로부터의 에피토프에 대해 특이적인 친화성을 갖는 인간 mAb를 분비하는 하이브리도마를 생성하는데 사용된다 [참조: 우드(Wood) 등의 국제 출원 WO 91/00906호, 쿠허라파리(Kucherlapari) 등의 PCT 공고 WO 91/10741호; 론베르크(Lonberg) 등의 국제 출원 WO 92/03918호; 케이(Kay) 등의 국제 출원 제 92/03917호; 론베르크, 문헌: Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7.13-21; Morrison, S.L. et al. (1994) Proc Natl Acad Sci, USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. (1993) Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. (1993) PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. (1991) Eur. j. Immunol. 21:1323-1326].
예시적인 구체예에서, 면역화후에 완전한 인간 항체 반응이 일어나는 마우스(HuMab 마우스)를 마우스 항체에 대한 유전자 코팅을 불활성화시킴으로써 발생될 수 있다. 이는 내인성 면역글로블린 중쇄 및 κ-경쇄 유전자가 불변 부위(Cμ 및 JCκ)에 대한 엑손 코팅의 표적화된 삭제에 의해 분열되는 '이중-녹아웃(knockout) 마우스'를 발생시킴으로써 달성될 수 있다. 인간 면역글로블린 중쇄 유전자 및 인간 κ 경쇄 유전자 모두를 포함하는 별도의 트랜스유전자가 구성될 수 있다. 인간에게서, 이들 유전자는 약 1 내지 2개의 메가 염기를 포함하며, 이들 각각은 크기가 너무 커서 그대로 분리시키기 어렵다. 본질적인 부위는 소위 '미니로커스(minilocus)'로 축합된 형태로 어셈블링될 수 있다. 중쇄 미니로커스는 2-6 Vh유전자 절편, 15 Dh및 6 Jh유전자 절편, 및 Sμ, Cμ, Sγl 및 Cγl 유전자 절편을 함유한다. κ-경쇄 미니로커스는 1-17 Vκ-유전자 절편, 5 Jκ 및 Cκ 유전자 절편을 함유한다 [참조: Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368:856-859; Tuaillon, N. et al., (1993) Proc Natl. Acad, Sci, USA 90:3720-3724]. 이들 미니로커스는 연속적으로 '이중-녹아웃' 마우스의 지놈내로 혼입될 수 있다. 이들 이중-녹아웃/이중 유전자이식 HuMab 마우스의 수가지 연속적인 버전이 형성될 수 있으며, 이들은 증가된 양의 인간의 중쇄 및 경쇄 로커스를 혼입하였다. 예를 들어, 6개의 V 절편을 함유하는 100kb 중쇄 트랜스유전자 및 17 Vκ 절편을 함유하는 200kb의 κ 경쇄 트랜스유전자를 혼입시킨 HuMab 마우스가 형성되었다. 이들 HuMab 마우스는 통상적인 면역화 프로토콜을 사용하여 면역화될 수 있으며, 광범위한 패널의 항원에 대해 고친화성 인간 IgG1 항체를 효과적으로 발생시키는 것으로 제시되었다 [참조: Fishwild, D.M. et al. (1996) Nature Biotech 14: 845-851; Lonberg, N. and D. Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93]. 이들 프로토콜에 따라서 발생된 항체는 우수한 생물학적 활성, 및 장기간의 혈청 반감기를 갖는 것으로 제시되었다.
키메라 마우스-인간 단일클론 항체(즉, 키메라 항체)는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 뮤린 (또는 다른 종) 단일클론 항체 분자의 Fc 불변 부위를 암호화하는 유전자는 반응 효소로 분해되어 뮤린 Fc를 암호화하는 부위를 제거하며, 인간 Fc 불변 부위를 암호화하는 유전자의 등가 부분이 치환된다 [참조: 로빈슨(Robinson)등의 국제 출원 공고 PCT/US86/02269호, 아키라(Akira) 등의 유럽 특허 출원 제 184,187호; 타니구치, 엠(Taniguchi, M) 등의 유럽 특허 출원 제 171,496호, 모리슨(Morrison) 등의 유럽 특허 출원 제 173,494호; 노이버거(Neuberger) 등의 국제 출원 WO 86/01533호; 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제 4,816,567호; 카빌리 등의 유럽 특허 출원 제 125,023호; 문헌: Better et al. (1988) Science, 240:1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559].
키메라 항체는 항원 결합에 직접 관여하지 않는 Fv 가변성 부위의 서열을 인간 Fv 가변성 부위로부터의 등가 서열로 대체함으로써 추가로 인간화될 수 있다. 인간화된 키메라 항체의 일반적인 견해는 문헌[Morrison, S. L., 1985, Science 229: 1202-1207] 및 문헌[Oi et al., 1986, BioTechniques , 4:214]에 제공되어 있다. 이들 방법들은 중쇄 또는 경쇄 중 하나 이상으로부터의 면역글로블린 Fv 가변성 부위의 일부 또는 전부를 암호화하는 핵산 서열의 분리, 조작 및 발현을 포함한다. 상기 핵산의 공급원은 당업자들에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 7E3, 항-GPIIbIIIa항체 생성 하이브리도마로부터 수득될 수 있다. 그 다음, 키메라 항체 또는 이들의 단편을 암호화하는 재조합 DNA는 적당한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 적당한 인간화된 항체는 선택적으로 CDR 치환에 의해 생성될 수 있다 [참조: 미국 특허 제 5,225,539호; Jones et al., 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; 및 Beidler et al., 1988, J. Immunol, 141:4053-4060].
특정 인간 항체의 CDR 전부는 비인간 CDR의 일부 또는 전부로 대체될 수 있거나, CDR의 일부만이 비인간 CDR로 대체될 수 있다. Fc 수용체에 인간화된 항체를 결합시키는데 필요한 CDR의 수를 변화시키는 것만이 필요하다.
항체는 비인간 항체로부터 유도된 CDR로 인간 항체의 CDR의 일부 또는 전부를 대체시킬 수 있는 방법으로 인간화될 수 있다. 윈터(Winter)는 본 발명의 인간화된 항체를 제조하는 사용될 수 있는 방법을 기술하였으며(영국 특허 출원 GB 2188638A호, 1987년 3월 26일 출원), 그 내용은 본 명세서에 참고적으로 인용된다. 인간 CDR은 국제 출원 WO 94/10332호("Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes")에 기술된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 부위 유도된 돌연변이유발을 이용하여 비인간 CDR로 대체될 수 있다.
또한, 특정 아미노산이 치환되거나, 결실되거나, 첨가된 키메라 및 인간화된 항체가 본 발명의 범위에 속한다. 특히, 바람직한 인간화된 항체는 항원에 대한 결합을 개선시키기 위해 프레임워크 부위에서 아미노산 치환을 갖는다. 예를 들어, 마우스 CDR을 갖는 인간화된 항체의 경우, 인간 프레임워크 부위에 위치한 아미노산은 마우스 항체의 상응하는 위치에 있는 아미노산과 치환될 수 있다. 이러한 치환은 몇몇 경우에 인간화된 항체가 항원에 결합하는 것을 개선시키는 것으로 공지되어 있다. 아미노산이 첨가되거나, 결실되거나, 치환된 항체는 본 명세서에서 개질된 항체 또는 변경된 항체로서 언급된다.
개질된 항체란 용어는 예를 들어 항체의 일부의 결실, 첨가 또는 치환에 의해 개질된 단일클론 항체, 키메라 항체, 및 인간화된 항체와 같은 항체를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 항체는 불변 부위를 결실시키고, 이것을 항체의 반감기, 예를 들어 혈청 반감기, 안정성 또는 친화성을 증가시키도록 의도된 불변 부위과 치환시킴으로써 개질될 수 있다. 임의의 개질은, 마크로파지 결합 화합물이 FcR에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 가져서 하나 이상의 이펙터 기능을 자극시키는 한은 본 발명의 범위에 속한다.
단일클론 항체는 재조합 DNA 기술 분야의 당업자에게 알려진 그 밖의 방법에 의해 또한 생성될 수 있다. "조합식 항체 디스플레이" 방법으로서 언급되는 또 다른 방법이 특정 항원 특이성을 갖는 항체 단편을 확인하고 분리시키기 위해 개발되었고, 단일클론 항체를 생성시키기 위해 이용될 수 있다 (조합식 항체 디스플레이에 대해서는 다음 문헌을 참조하라: Sastry et al. (1989) PNAS 86:5728; Huse et al. (1989) Science 246:1275; and Orlandi et al. (1989) PNAS 86:3833). 동물을 상기 기술된 면역원으로 면역시킨 후, 생성된 B 세포 풀(pool)의 항체 레퍼토리가 클로닝된다. 올리고머 프라이머의 혼합물과 PCR을 사용하여 면역글로블린 분자의 다양한 집단의 가변 부위의 DNA 서열을 수득하는 방법은 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 5' 리더(신호 펩티드) 서열 및/또는 프레임워크 1(FR1) 서열에 상응하는 혼합 올리고뉴클레오티드 프라이머 뿐만 아니라 보존된 3' 불변 부위 프라이머에 대한 프라이머가 다수의 뮤린 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 부위의 PCR 증폭을 위해 사용될 수 있다 (참조: Larrick et al., 1991, Biotechniques 11:152-156). 유사한 방법이 인간 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 증폭시키는데 또한 사용될 수 있다 (참조: Larrick et al., 1991, Methods: Companion to Methods in Enzymology 2:106-110).
예시적 구체예에 있어서, RNA는 표준 프로토콜을 사용하여 B 림프구, 예를 들어 말초혈 세포, 골수, 또는 비장 준비재료로부터 분리된다 [참조: U.S. Patent No. 4,683,202; Orlandi, et al PNAS (1989) 86;3833-3877; Sastry et al., PNAS(1989) 86:5728-2732; and Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281] 제 1 가닥 cDNA는 중쇄(들) 및 각각의 κ 및 λ 경쇄의 불변 부위에 특이적인 프라이머 뿐만 아니라 신호 서열에 대한 프라이머를 사용하여 합성된다. 가변 부위 PCR 프라이머를 사용하는 경우, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 부위는 단독 증폭되거나 함께 증폭되고, 디스플레이 패키지를 생성시키는 추가 조작을 위해 적합한 벡터 내로 연결된다. 증폭 프로토콜에 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 축중 위치에서 독특하거나 축중성이거나 일체성일 수 있다. 한정 효소 인식 서열이 또한 프라이머 내로 삽입되어, 발현을 위해 소정의 리딩 프레임에서 증폭된 단편을 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다.
면역 유도된 항체 레퍼토리로부터 클로닝된 V 유전자 라이브러리는 바람직하게는 사상 파지로부터 유도된 디스플레이 패키지의 집단에 의해 발현되어, 항체 디스플레이 라이브러리를 형성시킬 수 있다. 이상적으로는, 디스플레이 패키지는 매우 거대하고 다양한 항체 디스플레이 라이브러리의 샘플링, 각각의 친화성 분리 라운드 후의 신속한 분류, 및 정제된 디스플레이 패키지로부터의 항체 유전자의 용이한 분리를 가능하게 하는 시스템을 포함한다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키기 위한 시판 키트 이외에(참조: the Pharmacia-Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01; and the Stratagene SurfZAPTMphage display kit, catalog no. 240612), 다양한 항체 디스플레이 라이브러리를 생성시키는데 특히 쉽게 사용되는 방법 및 시약의 예는, 예를 들어, 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 제 5,223,409호; 강(Kang) 등의 국제 공개 출원 WO 92/15679; 브레이틀링(Breitling) 등의 국제 공개 출원 WO 93/01288; 맥카퍼티(McCafferty) 등의 국제 공개 출원 WO 92/01047; 개라드(Garrard) 등의 국제 공개 출원 WO 92/09690; 라드너 등의 국제 공개 출원 WO 90/02809; 푸치스(Fuchs) 등의 문헌[(1991) Bio/Technology 9:1370-1372]; 해이(Hay) 등의 문헌[(1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85]; 후세(Huse) 등의 문헌[(1989) Science 246:1275-1281]; 그리피스(Griffiths) 등의 문헌[(1993) EMBO J 12:725-734]; 호킨스(Hawkins) 등의 문헌[(1992) J Mol Biol 226:889-896]; 클락손(Clackson) 등의 문헌[(1991) Nature 352:624-628]; 그람(Gram) 등의 문헌[(1992) PNAS 89:3576-3580]; 개라드 등의 문헌[(1991) Bio/Technology 9:1373-1377]; 후겐붐(Hoogenboom) 등의 문헌[(1991) Nuc Acid Res 19:133-4137]; 및 바바스(Barbas) 등의 문헌[(1991) PNAS 88:7978-7982]에서 발견될 수 있다.
특정 구체예에 있어서, 중쇄 및 경쇄의 V 부위 도메인은 가요성 링커와 결합된 동일한 폴리펩티드 상에서 발현되어 단일 사슬 Fv 단편을 형성시킬 수 있고, 그 후, scFV 유전자는 원하는 발현 벡터 또는 파지 지놈 내로 클로닝될 수 있다. 맥카퍼티 등의 문헌[Nature (1990) 348:552-554]에 일반적으로 기재된 바와 같이, 가요성 (Gly4-Ser)3링커와 결합된 항체의 완전한 VH및 VL도메인은 디스플레이 패키지가 항원 친화성을 기초로 분리될 수 있도록 하는 단일 사슬 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 그 후, 항원과 면역반응성인 분리된 scFV 항체는 본 발명의 방법에 사용되는 약제학적 제조물로 제형화될 수 있다.
디스플레이 패키지의 표면 상에서 디스플레이되는 경우(예를 들어, 사상 파지), 항체 라이브러리는, FcγR에 대해 특이성을 갖는 항체를 발현시키는 패키지를 확인하고 분리시키기 위해, FcγR 또는 이것의 펩티드 단편에 의해 스크리닝된다. 선택된 항체를 암호화하는 핵산은 디스플레이 패키지(예를 들어, 파지 지놈)으로부터 회수될 수 있고, 표준 재조합 DNA 기법에 의해 그 밖의 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다.
표적 항원(예를 들어, 표면 단백질)에 대해 높은 친화성을 갖는 본 발명의 마크로파지 결합 화합물에 속하는 항-Fc 수용체 결합제, 및/또는 그 밖의 결합제는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 라이브러리의 스크리닝을 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다 [참조: Ladner, R.C., et al, U.S. Patent 5,233,409; Ladner, R.C., et al., U.S. Patent 5,403,484]. 또한, 이러한 라이브러리 방법은 항체의 구조 결정기의 의사체인 결합 결정기를 수득하기 위해 스크린에서 사용될 수 있다. 특히, 특정 항체 분자의 Fv 결합 표면은 단백질-단백질 상호작용의 원리에 따라 이것의 에피토프와 상호작용하므로, VH및 VL에 대한 서열 데이터(후자는 κ 또는 λ 사슬 형태를 가질 수 있음)는 당업자에게 공지된 단백질 공학처리 기법에 대한 기초가 된다. 결합 결정기를 포함하는 단백질 표면의 상세한 사항은 NMR 실험 또는 결정학적 데이터로부터 수득된 그 밖의 항체로부터의 이미 결정된 3차원 구조를 사용하는 모델링 과정에 의해 항체 서열 정보로부터 수득될 수 있다. [참조: Bajorath, J. and S. Sheriff, 1996, Proteins, Struct., Funct. and Genet 24(2), 152-157; Webster, D.M and A. R. Rees, 1995, "Molecular modeling of antibody-combining sites" in S. Paul, Ed., Methods in Molecular Biol. 51, Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp 17-49; and Johnson, G., Wu, T.T. and E.A. Kabat, 1995, "Seqhunt. A program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences", in Methods in Molecular Biol 51, opcu., pp 1-15].
한 가지 구체예에 있어서, 항-Fc 수용체 결합제는 항체로부터 유도되고 항체 분자 이외의 분자 상으로 그래프팅되는 항원 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 항원 결합 부위는 펩티드 또는 단백질 상으로 그래프팅될 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 항원 결합 부위의 한 부분, 예를 들어 항체의 경쇄로부터의 항원 결합 부위과 유사한 부분은 하나의 단백질 또는 펩티드 상으로 그래프팅되고, 항원 결합 부위의 또 다른 부분, 예를 들어 항체의 중쇄로부터의 항원 결합 부위과 유사한 부분은 또 다른 단백질 또는 펩티드 상으로 그래프팅된다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 각각 항원 결합 부위의 일부를 갖는 두 개의 단백질 또는 펩티드는, 하나 이상의 Fc 수용체 매개되는 이펙터 세포 기능을 자극하는 인간 Ig에 대한 FcR에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 갖는 단백질을 생성시키기 위해, 예를 들어, 화학적 결합에 의해, 재조합적으로, 또는 비공유 상호작용에 의해 결합된다.
항원 결합 부위는 다양한 타입의 조합식 라이브러리를 원하는 결합 활성에 대해 스크리닝함으로써 또한 수득될 수 있고, 기술된 방법에 의해 활성 종이 확인될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 기법(참조: Marks et al. (1992) J Biol Chem 267:16007-16010)이 단백질 결합 FcγR을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리는 상기 기술되었다. 예를 들어, 다양한 펩티드 라이브러리가 디스플레이 패키지의 집단에 의해 발현되어 펩티드 디스플레이 라이브러리를 형성시킬 수 있다. 이상적으로는, 디스플레이 패키지는 매우 거대하고 다양한 항체 디스플레이 라이브러리의 샘플링, 각각의 친화성 분리 라운드 후의 신속한 분류, 및 정제된 디스플레이 패키지로부터의 항체 유전자의 용이한 분리를 가능하게 하는 시스템을 포함한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리는 예를 들어, 신속히 증폭할 수 있고, 비교적 조작이 용이하며, 다수의 클론을 생성시킬 수 있는 원핵 생물 및 바이러스에 존재할 수 있다. 바람직한 디스플레이 패키지로는 예를 들어 증식성 박테리아 세포, 박테리아 포자, 가장 바람직하게는 박테리아 바이러스(특히, DNA 바이러스)가 있다. 그러나, 본 발명은 효모 및 이들의 포자를 포함하는 진핵 세포를 가능한 디스플레이 패키지로서 사용하는 것을 또한 고려한다. 파지 디스플레이 라이브러리는 상기 기술되어 있다.
그 밖의 기법으로는 적당한 "수용체", 예를 들어 FcγRI 또는 FcαR을 사용하여 결합제를 분리시킨 후, 통상적 기법(예를 들어, 질량 분광법 및 NMR)에 의해 분리된 결합제 또는 리간드를 확인하는 친화성 크로마토그래피가 있다. 바람직하게는, 가용성 수용체는 리간드 결합을 나타내기 위해 검출될 수 있는 표지(예를 들어, 형광단, 비색 효소, 방사성동위원소, 또는 발광 화합물)에 접합된다. 또한, 고정화된 화합물이 선택적으로 방출되고, 막을 통해 확산되어 수용체와 상호작용할 수 있다.
화합물의 조합식 라이브러리는 라이브러리의 각각의 일원의 본질을 암호화하기 위해 "태그"로 또한 합성될 수 있다 (참조: W.C. Still et al., International Application WO 94/08051). 일반적으로, 이러한 방법은 고체 지지체 또는 화합물에 부착되는 비활성이지만 용이하게 검출가능한 태그를 사용함을 특징으로 한다. 활성 화합물이 검출되는 경우, 화합물의 본질은 독특한 동반 태그를 확인함으로써 결정된다. 이러한 태깅 방법은 라이브러리 중의 전체 화합물의 총 세트 중에서 매우 낮은 수준으로 확인될 수 있는 화합물의 거대한 라이브러리의 합성을 가능하게 한다.
II. 시아닌 조성물
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 마크로파지 결합 화합물의 Fc 수용체 결합제는 형광 염료 Cy5.18.OSu(Cy5로 일컬어짐) 및 이것의 접합체와 유도체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 시아닌 조성물과 같은 화학적 부분이다. 시아닌 조성물은 높은 친화성 및 특이성을 지니면서 FcγRI 수용체에 결합하는 것으로 알려져 있다. 몇몇 경우에, 시아닌 조성물은 시아닌 숙신이미딜 에스테르 및 피코빌리솜 단백질, 예를 들어 PE와 같은 둘 이상의 부분을 함유할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "PE-Cy5'란 용어는 피코에리트린과 Cy5.18.OSu로 구성된 특정 탠덤 염료를 나타내고; "PE-Cy5 시약"이란 용어는 예를 들어 항체, 유전공학처리된 결합 단백질 및 펩티드(U.S.P.N. 5,233,409 및 5,403,484), 아비딘, 비오틴 또는 그 밖의 분자 물질에 대한 PE-Cy5 접합체를 나타내지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
시아닌은 수레국화(Centaurea cyanus)로부터 분리되며, 2-(3,4-디히드록시페닐)-3,5,7-트리히드록시-1-벤조피릴륨 클로라이드로서 바나나로부터 분리되는 구조적으로 시아니딘의 3,5-디글루코시드이다 (참조: Merck Index). 신버찌(sour cherry)로부터 분리된 또 다른 시아니딘 유도체인 3-람노글루코시드는 야맹증에 대해 치료적으로 이용되는 것으로 기술되어 있다. 월귤나무(Vaccinium myrtillus) 열매의 안토시아노시드는, 한 제조회사(Amrion, Inc., Boulder, CO)에 따르면 혈관확장을 개선시키고, 모세관 투과성을 감소시키고, 혈관 내의 콜라겐을 막고, 산화방지제로서 작용하고, 염증 작용의 조절을 뒷받침하여 전반적인 시력, 위장 내면, 혈뇌 장벽 및 다리와 결장의 정맥을 개선시키기 위해 경구적으로 소비되는 누트라세티칼(nutraceutical) 식품 첨가물로서 시판되고 있다 (참조: Gen Engin News 16(11), p 27, 1996).
Cy5.18.OSu로도 표시되는 시아니딘 유도체 염료 Cy5는 화학적 구조 5,5'-비스-설포-1,1'-(ε-카르복시페닐)-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르복시아닌-디숙신이미딜 에스테르를 갖는다 [참조: A.S. Waggoner et al., In: Clinical Flow Cytometry, p.185 (Eds) A. Landay et al. The New York Academy of Sciences, New York, New York, 1993]. 술프히드릴기에 대한 시아닌 염료 표지화 시약(참조: Emst. L.A. et al., 1989, Cytometry 10:3) 및 카르복시메틸인도시아닌 숙신이미딜 에스테르(참조: Southwick, P.L. et al., 1990. Cytometry 11:418)이 기술되었고, 조성물은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 특허 출원(USPN 4,981,977 및 5,268,486)에 청구되어 있다. Cy5의 구조, 및 이것의 합성방법 및 광 흡수 및 방출에 대한 스펙트럼은 무줌다르, 알.비.(Mujumdar, R.B.)의 문헌[1993. Bioconj Chem 4:105]에 기재되어 있다. Cy5는 인도시아닌 형광단의 방향족 핵에 있는 음하전된 설포네이트기를 함유하는 아미노 반응성 시아닌 염료인 설포인도시아닌 숙신이미딜 에스테르이다. 이러한 패밀리의 Cy5 일원은 두 개의 치환된 고리 구조를 연결시키는 탄소수가 5개인 불포화 폴리메틴 브리지를 특징으로 한다. Cy5는 633nm HeNe 레이저 라인 또는 Dr 레이저의 647nm 라인에 의해 여기될 수 있다. Cy5 및 이것의 유도체는 플루오레세인의 광안정성에 필적하거나 이보다 우수한 광안정성이 특징이다. 250,000의 소멸 계수(L/mol cm)는 매우 높다. 구조와 합성 방식이 유사한 관련된 염료(Mujumdar et al., supra)는 본 명세서에서 "Cy5"란 표현속에 포함되므로, 이러한 표현은 일반적으로 시아닌 염료 표지화 시약의 설포인도시아닌 숙신이미딜 에스테르, 예를 들어 Cy3 29.OSu(Cy3으로 공지되어 있음) 및 Cy7 18.OH를 포함한다. Cy5 시약, 즉, Cy5 접합체 및 Cy5 유도체란 용어는 적어도 Cy5 부분 및 또 다른 부자 물질을 포함하는 접합체를 의미할 것이다. 이러한 기본 구조를 갖는 또 다른 신규한 유도체로서, Cy5 및 그 밖의 설포인도시아닌 숙신이미딜 에스테르의 특성을 공유하고, 친화성과 특이성을 지니면서 FcγRI과 결합하는 것으로 고려되는 시아닌 시약의 설포벤즈인도시아닌 숙신이미딜 에스테르가 기술되었다 (참조: Mujumdar, S.R. et al., 1996, Bioconj. Chem 7:356).
단일 488nm 아르곤 이온 레이저 라인에 의한 여기에 의해 3색 형광을 제공하는, Cy5가 PE와 탠덤 형태로 구성된 Cy5 시약 PE-Cy5의 용도가 최적화에 대한 조건으로서 상기 와고너(Waggoner) 등의 문헌(1993)에 기재되어 있다. 텍사스 레드(Texas Red)를 기초로 하는 탠덤 염료와 관련된 문제점은 사용 도중에 다른 부분의 스펙트럼 내로의 방출의 누출을 일으켜서 제 2의 부분의 파장 또는 이 파장 근처에서 광을 방출시키는 텍사스 레드 염료을 사용하는 능력을 한정하는 한 부분의 불안정성에 기인한다. 그러나, Cy5 및 염료의 이것의 시약 패밀리는 텍사스 레드 보다 긴 파장에서 광을 방출시키므로, 다른 염료와 함께 Cy5를 사용하는 것으로부터 수득되는 데이터의 분석에는 세팅 검출 윈도우 및 다운스트림 계산에서의 최소 패널 보충이 필요해진다. Cy5 시약의 최상 방식 사용에 대한 고려에는 성분으로부터의 Cy5 시약의 합성 공정이 포함되는데, 이는 접합체의 분자 당 결합된 Cy5 분자의 수의 비가 합성 생성물의 상대적 방출 파장 스펙트럼에 영향을 미치기 때문이다. 따라서, PE-Cy5의 경우, PE로부터 Cy5로의 에너지 전달의 효율은 더 많은 Cy5 분자가 각각의 PE에 최적 범위까지 결합될수록 증가한다. 최적 비는 PE-Cy5 탠덤 염료에서 PE 당 4개 내지 8개 Cy5 이다 (참조: Waggoner et al., 1993, supra). 탠덤 염료는 광감성이고, 사용 도중의 안정성은 염료가 저장되어 처리되고 실험이 어두운 조건하에 수행되는 경우에 개선된다.
이미 합성된 탠덤 염료의 신호 크기와 비교하여 PE-Cy5에 대한 형광의 정도 및 백그라운드의 부재로 인한 개선된 신호 크기는 이것을 항체-염료 접합체에 의한 세포 분석 실험에 대한 성공적인 분석 도구가 되게 한다. 그러나, 골수 세포에 대한 상이한 공급원으로부터의 다양한 PE-Cy5 생성물의 "비특이적" 결합에 대한 하나 이상의 보고서에는 PE-텍사스 레드 접합체가 이러한 특성을 나타내지 않기 때문에 Cy5 부분에 기인하는 것으로 발표되었다 (참조: Stewart SJ, et al., supra). 대조적으로, 다키자와(Takizawa) 등은 저친화성 마우스 IgG 수용체 FcγRII 및 FcγRIII에 대한 PE와 이것의 mAb 접합체의 결합을 발표하였다 (참조: J. Immunol Methods, 1993, 162:269).
마크로파지를 치사시키거나 이들의 활성을 감소시키는 세포독성제의 제조
I. 세포독소
다양한 세포독성제가 본 발명의 화합물에 의해(즉, 마크로파지에 있는 Fc 수용체에 결합하는 제제에 결합됨으로써) 마크로파지에 대해 표적화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "세포독소" 및 "세포독성제"는 마크로파지를 치사시키거나 이의 활성을 감소시킬 수 있는 임의의 화합물(예를 들어, 약물)을 포함한다. 예를 들어, 화합물은 독소, 예를 들어 겔로닌(Gelonin), 사포린(Saporin), 엑소톡신(Exotoxin) A, 온코나아제(Onconase) 또는 리친(Ricin) A, 또는 약물, 예를 들어 디클로로메틸렌 디포스포네이트(CL2MDP) 또는 이것의 유도체일 수 있다. 본 발명에 사용되는 세포독소는 본 발명의 화합물의 치료 활성을 향상시키는 제제 또는 부분을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 세포독소는 아폽토시스(apoptosis)를 촉진시키는 약제, 유사분열 억제제, 알킬화제, 항대사물, 핵산 삽입제, 토포이소머라아제 억제제, 마크로파지 특이적 약제 또는 방사성핵종을 포함할 수 있다. 본 발명은 이러한 세포독소를 예를 들어 세포에 의해 내면화되는 마크로파지 상에서 높은 친화도 Fcγ 수용체로 표적화시키는(예를 들어, Mab22, Mab32 또는 이의 인간화된 형태와 같은 항체를 사용하여) 잇점을 제공한다. 따라서, 이들 세포독소는 내면화되지 않은 다른 약제 또는 느린 속도로 내면화된 약제보다 세포 치사 또는 세포 기능을 변형시키는 데 보다 효과적일 수 있다.
세포독소제는 박테리아 또는 식물 기원의 독성 약제 또는 효소활성 독소, 또는 이러한 독소의 생활성 단편("사슬")일 수 있다. 예시적인 효소 활성 독소 및 이의 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴프로테인, 피톨락카 아메리카나 프로테인(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카카르안티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신이 포함된다. 사용될 수 있는 바람직한 독소에는 겔로닌, 사포린, 엑소톡신 A, 온코나제, 리신 A, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소 또는 이들 독소의 아단위가 포함된다. 이들 독소의 제법, 생체내 용도 및 약물동력학은 문헌에 기재되어 있다[참조예: Vitetta et al(1987) Science 238:1098-1104; Spitlet, L. et al. (1987) Clin, Chem. 33(b): 1054; Uhr et al. Monoclonal Antibodies and Cancer, Academic Press, Inc., pp. 85-98(1983)]. 본 발명의 화합물의 접합체 및 이러한 독소제는 하기(부제: "마크로파지 결합 화합물의 접합체를 제조하는 방법")에서 상세히 기술되는 바와 같이 여러 가지 이작용기성 단백질 커플링제를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 약제의 예로는, SPDP, IT; 디메틸 아디피미데이트와 같은 이미도에스테르의 이작용기성 유도체, 디숙신이미딜 수베레이트와 같은 활성 에스테르, 글루타르알데히드와 같은 알데히드, 비스-(p-아지도벤조일)헥산디아민과 같은 비스-아지도 화합물, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민과 같은 비스-디아조늄 유도체, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트와 같은 디이소시아네이트, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은 비스-활성 불소 화합물이 포함된다.
다른 구체예에서, 세포독소는 약제이다. 약제의 예로는 디클로로메틸렌 디포스포네이트(CL2MDP) 또는 그 밖의 클로드로네이트 유도체가 포함된다[참조: Bogers et al(1991) Clin Exp. Immunol. 86:328-333]. 다르게는, 세포독소는 아폽토시스를 촉진시키는 약제, 유사분열 억제제, 알킬화제, 항대사물, 핵산 삽입제, 및 토포이소머라제 억제제일 수 있다. 본 발명의 화합물에 사용될 수 있는 이러한 약제의 예로는 토포이소머라제 II 억제제 엘리프티신, 암사크린, 아드리아마이신 및 미트로잔트론, 원핵 DNA 자이라제 억제제 코우머마이신 A1 및 DNA 결합제 네오카르지노스타틴 및 클로로퀸(DNA를 게재시키거나 절개하는)이 포함된다. 이러한 약제의 전달, 예를 들어, 리포좀-전달을 위한 방법이 하기에 기재된다.
특정 구체예에서, 세포독소는 감광화 부분(예를 들어, 감광화 약제)을 포함할 수 있다. 이러한 감광화 부분으로 구성된 세포독소는 표적, 예를 들어, 마크로파지를 예를 들어, 가시선을 조사시키므로써 광활성시 파괴시키는 것으로 감광시키는데 유용하다. 바람직하게는, 감광화 부분은 광활성화 전에는 직접적인 생물학적 영향을 미치지 않는다. 이러한 부분을 포함하는 화합물은 예를 들어, 국부적으로 또는 주사에 의해 대상에 투여될 수 있다. 이러한 화합물을 광, 예를 들어, 가시광 노출에 의해 특정 파장에 노출시키므로써 광활성화시키는 경우, 감광화 부분은 독성(그 자체에 의해서 또는 그 부분과 연관된 세포독성을 활성화시키므로써)이 되어, 선택적으로 마크로파지를 파괴한다. 어떠한 특정 이론에 결부시키지 않고, 광활성화 메카니즘은 감광화 부분으로부터의 에너지를 내인성 산소에 전달하므로써 이 산소를 단일 산소로 전환시키는 것을 포함하는 것으로 여겨진다. 단일 산소는 세포독성 효과의 원인이 되는 것으로 여겨진다. 감광화 부분을 함유하는 마크로파지 결합 화합물은 피부병의 치료에 특히 유용하다.
본 발명에 사용될 수 있는 예시적 감광화제에는, 포르피린 관련 화합물, 예를 들어, 헤마토포르피린 유도체(Lipson, R.L. et al. (1961), J. National Cancer Inst. 26:1-8); Photophrin II 조성물(US 4,649,151, Dougherty, T.J.(1983) Adv Exp Med. Bio. 160;3-13, Kessel, D. et al.(1987) Photochem Photobiol. 46: 463-568 and Scourides, P.A. et al. (1987) Cancer Res. 47. 3439-3445), 피로페오포르비드 화합물(US 5,459,159; US 4,996,312 및 US 4,849,207 및 EP 220686); 클로로필 및 박테리오필 유도체(EPA 93111942.4); 9-치환된 포르피센 유도체(WO 96/31451); 프로빈 유도체(WO 95/08551), 뿐만 아니라 클로린, 프탈로시아닌 및 포르핀(Harvey, I. Pass(1993) J. Natl. Canc. Inst. 85:443-457)이 포함된다. 또한, 형광 시그날을 방출시킬 수 있는 감광화제의 광활성 형태는 본 발명의 표지 마크로파지 결합 화합물에 대한 진단 용도로 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물은 광분해가능한 결합을 통해 치료제 또는 진단제, 예를 들어 독성제에 결합된 Fc 결합제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결합은 광에 노출되는 경우에 진단제 또는 치료제를 방출시키는 발색단과 같은 광활성제에 의해 매개된다[참조: Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107]. 예를 들어, 피부병 적용에서, 광은 결합의 분해를 유발하여 활성 독소를 국부적으로(예를 들어, 피부) 유리시킬 것이다. 결합된 치료제 또는 진단제를 방출시키기에 적합한 광활성제에는 치료제 또는 진단제의 작용기(예를 들어, 페놀)에 결합될 수 있으며, 광에 노출되는 경우에 작용기 형태로 치료제 또는 진단제를 방출시키는 약제는 어느 것이라도 포함된다. 예시된 바와 같이, 광활성제는 발색단일 수 있다. 적합한 발색단은 일반적으로 통상적인 조사원(예를 들어, 240 내지 370nm 범위의 UV광)으로부터 전달될 수 있는 흡광율에 대해 선택된다. 이러한 파장에 광반응성인 발색단의 예로는 아크리딘, 질소방향족 및 아릴술폰아미드가 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다.
발색단을 사용하는 경우, 발생단이 광활성되어 치료제를 방출하거나 "해방"시키는 효율 및 파장은 발색단에 결합된 특정 작용기에 따라 다를 것이다. 예를 들어, o-니트로벤질 화합물의 유도체와 같은 질소방향족을 사용하는 경우, 흡광 파장은 메톡시기의 첨가에 의해 상당히 연장될 수 있다. 일 구체예에서, 니트로벤질(NB) 및 니트로페닐에틸(NPE)은 두개의 메톡시 잔기를 첨가하여 각각 4,5-디메톡시-2-니트로벤질(DMNB) 및 1-(4,5-디메톡시-2-니트로페닐)에틸(DMNPE)로 변형되고, 이로써 340 내지 360nm(λmax= 355nm)로 흡수 파장 범위를 증대시킨다. 치료제 또는 진단제의 광방출을 조장하는 조사는 비간섭 UV 광원 및 엑시머 광원을 포함하는 여러 가지 광원에 의해 제공되나, 이로 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 248nm에서 작동하는 KrF 엑시머 레이저가 사용될 수 있다. 다르게는 266nm에서 작동하는 주파수-4중, 고체 상태 네오디뮴 도핑된 YAG 레이저 등이 사용되거나, 257 또는 275nm에서 작동하는 아르곤 이온 레이저가 사용될 수 있다. 광활성제는 치료제와 반응하여 광방출 결합을 생성시킬 수 있다. 광활성제로서 발색단이 사용되는 경우, 여기 파장은 선택적으로 특정 파장을 여기시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 두개의 상이한 약제 또는 두개의 상이한 발색단을 기질에 광방출에 의해 결합시킨 후, 독립적으로 또는 연속해서 상응하는 발색단에 맞는 여기 파장을 선택하므로써 두개의 약제를 방출시키는 것이 가능하다. 발색단 및 여기 파장은 약제 또는 주변 조직의 바람직하지 않은 광분해 반응(예를 들어, 비활성화)을 피하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 핵산의 감광화가 널리 알려져 있다. 약제가 핵산인 경우, 핵산을 손상시킬 수 있는 여기 에너지(예를 들어, 280nm보다 짧은 파장)는 피해야 한다.
또한, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물은 하기 문헌에 기재된 바와 같이 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi 및 211At와 같은 방사성핵종에 화합물을 커플링시키므로써 표지될 수 있다(예를 들어, 진단 용도를 위해)[참고예: Goldenberg, D.M. et al. (1981) Cancer Res. 41: 4354-4360; EP 0365 997; Carrasquillo et al., Cancer Treat Rep., 68,317-328(1984); Zaloberg et al., J. Natl. Cancer Institute 72:697-704(1984); Jones et al., Int. J. Cancer 35:715-720(1985); Lange et al., Surgery 98: 143-150(1985), Kaltovich et al., J. Nucl. Med 27:897(1986); Order et al., Intl. J. Radiother, Oncl. Biol. Phys. 8:259-261(1982); Courtenay-Luck et al., Lancet 1:1441-1443(1983); Ettinger et al., Cancer Treat Rep. 56:289-297(1982), 이들 문헌은 모두 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용됨]. 또한, 이러한 방사성핵종은 감광화 부분의 세포독성 효과를 증진시킬 수 있다.
이러한 진단 적용에 있어서, 표지기를 마크로파지 결합 화합물에 결합시켜 검출(예를 들어, 샘플내 마크로파지에 대한 결합)을 용이하게 하도록 하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 기재된 방사성핵종 이외에, 적합한 표지화기에는 예를 들어, 플루오로포어, 비색 효소, 방사성동위원소, 또는 형광 화합물이 포함된다. 예를 들어, 표지화기가 효소인 경우, 마크로파지 결합 화합물에 결합된 효소는 예를 들어 분광 광도, 플루오로미터 또는 기타 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 시그날을 발생시키는 방법으로 적합한 기질, 바람직하게는 색원 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출가능하도록 표지하는데 사용될 수 있는 효소는 말레이트 디히드로게나제, 스타필로콕칼 누클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 이스트 알코올 디히드로게나제, 알파-글리세로포스페이트, 디히드로게나제, 트로이제 포스페이트 이소머라제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보누클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린스테라제가 포함되나 이로 한정되는 것은 아니다. 검출은 효소에 대해 색원 기질을 사용하는 비색계 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 검출은 유사하게 제조된 표준물질과 비교하여 기질의 효소 반응 정도를 시각적으로 비교하므로써 달성될 수 있다.
또한, 마크로파지 결합 화합물의 마크로파지로의 결합 측정은 다양한 면역분석법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 방사성면역분석법(RIA)가 사용될 수 있다[참조예: Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986. 본 명세서에서 참고문헌으로 인용됨]. 다르게는, 효소 면역분석법(EIA)가 사용될 수 있다[참조: Voller, "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)", Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller, et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520(1978); Butler, Meth. Enzymol. 73:482-523(1981), Maggio, (ed.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980; Ishikawa, et al, (eds.) Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo, 1981]. 방사성활성 동위원소는 γ 계수기 또는 섬광 계수기와 같은 수단을 사용하거나 방사능사진에 의해 검출될 수 있다.
마크로파지 결합 화합물을 형광 화합물로 표지하는 것도 가능하다. 형광 표지된 화합물이 적당한 파장의 광에 노출되는 경우, 그 존재가 검출될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 형광 표지화 화합물 중에는 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데히드 및 플루오레스카민이 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 152Eu과 같은 형광 방출 금속, 또는 기타 란탄화물 계열을 사용하여 표지화될 수 있다. 이러한 금속은 디에틸렌트리아민펜트아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)와 같은 금속 킬레이트화기를 사용하여 항체에 결합될 수 있다. 다르게는, 이러한 화합물은 화학발광 화합물에 커플링하므로써 표지화될 수 있다. 이때, 화학발광 태그 화합물의 존재는 화학 반응 과정 동안에 일어나는 형광을 검출하므로써 측정된다. 특히 유용한 화학발광 표지화 화합물의 예로는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르가 있다.
유사하게, 생물 발광 화합물이 본 발명의 마크로파지 결합 화합물을 표지하는데 사용될 수 있다. 생물 발광은 촉매적 단백질이 화학 발광 반응의 효율을 증가시키는 생물 시스템에서 발견되는 화학 발광의 한 유형이다. 생물 발광 단백질의 존재는 형광의 존재를 검출하므로써 측정된다. 표지화에 중요한 생물 발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 아에쿠오린이 있다.
세포독소로의 항-Fc 수용체 결합제 접합
본 발명의 마크로파지 결합 화합물은 기타 임의의 성분과 함께 세포독소에 결합된 마크로파지 상의 Fc 수용체에 결합하는 약제를 포함한다. 따라서, 이러한 화합물을 제조하기 위해, 항-Fc 수용체 결합제가 여러 가지 공지된 방법(참조예: D.M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807, U.S. Patent 4,474,893)을 사용하거나, 항-Fc 수용체 결합제와 융합 분자로서 세포독소를 함께 재조합 발현시키므로써 세포독소에 접합된다(예를 들어, 공유적으로 가교시키므로써).
본 발명에 사용될 수 있는 가교제와 같은 적합한 약제는 당해 공지되어 있다. 용어 "가교화제" 및 "가교제"은 하나는 제 1 분자와 공유 결합을 형성하도록 반응하고, 다른 하나는 제 2 분자와 공유 결합을 형성하도록 반응하여 두개의 분자를 효과적으로 결합시키는 두개의 반응성 작용기를 가지므로써 두개의 다른 분자 간에 브릿징 분자로서 작용할 수 있는 분자를 포함하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 가교제는 상이한 작용기 부분의 두개의 반응성 작용기를 갖는다. 적합한 작용기의 예로는 아미노기, 카르복실기, 설프히드릴기 및 히드록시가 포함된다. 가교제의 하나의 작용기가 분자(예를 들어, Fc 수용체 결합제)와 반응하는 경우, 나머지 작용기는, 필요에 따라 가교제의 제 2 작용기를 변형시켜 분자와 결합할 수 없도록 하는 보호기에 의해 상기 분자와 반응하지 않도록 방지될 수 있다. 제 1 반응이 완료된 후, 보호기가 제거되어 제 2 작용기를 회복시킨 후, 제 2 작용기는 다른 분자(예를 들어, 독소)와 반응할 수 있다.
본 발명의 마크로파지 결합 화합물은 공지된 방법을 사용하여 예를 들어, 항-FcR 및 세포독성와 같은 성분 약제를 접합시키므로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 마크로파지 결합 화합물의 각각의 약제는 별도로 생성되어 서로 접합될 수 있다. 결합 특이 물질이 단백질 또는 펩티드인 경우에, 여러 가지 커플링 또는 가교제가 공유 접합에 사용될 수 있다. 가교제의 예로는, 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(설포-SMCC)가 포함된다[참조: Karpovsky et al.(1984) J. Exp. Med. 160:1686, Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648]. 다른 방법에는 파울루스(Paulus)의 문헌(Behring Ins. Mitt.(1985) No. 78, 118-132); 브렌난(Brennan) 등의 문헌(Science(1985) 229:81-83) 및 글렌(Glennie) 등의 문헌(J. Immunol. (1987) 139:2367-2375)에 기재된 방법이 포함된다. 바람직한 접합제는 SATA 및 설포-SMCC이며, 이둘 모두 피어스 케미칼 코포레이션사(Pierce Chemical Co. Rockford, IL)로부터 입수할 수 있다.
마크로파지 결합 분자가 두개의 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함하는 경우에, 이들 항체는 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설프히드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수개의 설프히드릴 잔기, 바람직하게는 하나를 함유하여 변형된다. 다르게는, 두개의 약제는 동일한 벡터로 코딩되고 발현되어 동일한 숙주 세포에서 회합될 수 있다. 이 방법은, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물, 예를 들어, 이중특이적 분자가 단일 사슬 이중 특이적 항체와 같은 단일 사슬 분자, 하나의 단일 사슬 항체를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자 및 결합 결정자 또는 두개의 결합 결정자를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자일 수 있다. 또한, 마크로파지 결합 화합물은 단일 사슬 분자일 수 있거나 두개 이상의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중 및 다중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제 5,260,203호, 제 5,455,030호, 제 4,881,175호, 제 5,132,405호, 제 5,091,513호, 제 5,476,786호, 제 5,013,653호, 제 5,258,498호 및 제 5,482,858호에 기술되어 있다.
상기 개요에 따라 제조되면, 마크로파지 결합 화합물은, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성면역분석법(RIA) 또는 웨스턴 블롯 분석법과 같은 공지된 기술을 사용하여 마크로파지에 결합시키는 시험을 할 수 있다. 각각의 이들 분석법은 일반적으로 가치 있는 착물에 특이적인 표지된 약제(예를 들어, 항체)를 사용하므로써 특정 가치 있는 단백질-항체 착물의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 착물은 예를 들어, 항체-FcR 착물을 인식하고 특이적으로 결합하는 효소 결합 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있다. 다르게는, 상기 착물은 여러 가지 다른 면역분석법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 방사성 표지화되어 방사성면역분석법(RIA)에 사용될 수 있다[참조예: Weintraub. B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용됨]. 방사활성 동위원소는 γ 계수기 또는 섬광 계수기와 같은 수단을 사용하거나 자동방사능사진법에 의해 검출될 수 있다.
약제 조성물 및 투여 방법
본 발명의 마크로파지 결합 화합물은 운반체 또는 희석제와 함께 조성물중에 존재하는 것이 바람직하다. 피검자의 생체내 투여(예를 들어, 질환의 치료 및 진단 목적)를 위해서, 화합물은 약제학적으로 허용되는 운반체 또는 희석제와 함께 존재하는 것이 바람직하다. 후술되는 바와 같이, 본 발명의 약제 조성물은 (1) 예를 들어 음약(수성 또는 비수성 액제 또는 현탁액), 정제, 거환약, 분체, 과립, 페이스트 형태로의 경구 투여; (2) 예를 들어, 무균 액제 또는 현탁액 형태로의 피하, 근내 또는 정맥내 주사; (3) 크림제, 연고제 또는 피부에의 분무 형태로의 국소 도포; (4) 패서리, 크림제 또는 발포제 형태로의 질내 또는 직장내 투여; 또는 (5) 에어로졸, 예를 들어, 화합물을 함유하는 수성 에어로졸, 리포솜 제조물 또는 고형 입자 형태로 투여되는 것을 포함하여, 고체 또는 액체 형태로 투여하기에 특히 적합할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 또한 조합물 치료제, 즉, 다른 약제와 조합된 치료제 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합물 치료제는 1종 이상의 다른 항마크로파지제와 함께 본 발명의 조성물을 포함할 수 있다. 항마크로파지제의 예로는 클로드로네이트 화합물, 예를 들어, 디클로로메틸렌 디포스포네이트(CL2MDP)가 있다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "약제학적으로 허용되는 운반체"는 화학물질을 하나의 기관, 또는 신체의 일부로부터 또 다른 기관 또는 신체의 일부로 운반하거나 이송시키는 것을 포함하여, 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 운반체는 제형의 다른 성분들과는 양립 가능하고 환자에게는 해가 되지 않는다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 약제학적으로 허용되는 운반체로서 기능을 할 수 있는 물질의 일부 예로는 (1) 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트래거캔스; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수 기름 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예를 들어, 마그네슘 히드록사이드 및 알루미늄 히드록사이드; (15) 알긴산; (16) 피로겐 비함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알코올; (20) 포스페이트 완충 용액; 및 (21) 약제 제형에 사용되는 그 밖의 비독성적인 양립가능한 물질들이 있다.
"약제학적으로 허용되는 염"은 모화합물의 요망 생물학적 활성을 보유하면서 어떠한 원치않는 독물학적 효과도 제공하지 않는 염을 언급한다[참고문헌: Berge, S.M., et al. (1997) J Pharm Sci. 66:1-19]. 이러한 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 있다. 산 부가염으로는 비독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노 및 디카르복실산, 페닐 치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 바향족 술폰산 등 뿐만 아니라 비독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유도된 염들이 있다. 염기 부가염으로는 비독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등 뿐만 아니라 알칼리토 금속, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 염들이 있다.
본 발명의 조성물은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자라면 알 수 있듯이, 투여 방식은 원하는 결과에 따라 다를 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "투여"는 화합물이 의도된 기능(즉, 마크로파지 감소 및/또는 억제)을 수행토록 하는 본 발명의 마크로파지 결합 화합물을 피검자내에 도입하는 어떠한 방식도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 사용될 수 있는 투여 방법의 예로는 주사(피하, 정맥내, 장관외, 복막내, 수막강내 투여 등), 경구, 흡입, 직장 및 경피 투여가 있다. 약제학적 약제는 물론 각각의 투여 방법에 적합한 형태로 제공된다. 예를 들어, 이들 약제는 정제 또는 캡슐 형태로 주사제, 흡입제, 점안제, 연고제, 좌약 등에 의한 투여; 주사제, 주입액 또는 흡입액에 의한 투여; 로션 또는 연고제에 의한 국소 도포; 및 좌약에 의한 직장 투여로 투여된다. 주사제는 거환약일 수 있거나 연속 주입액일 수 있다. 투여 방법에 따라서, 마크로파지 결합 화합물은 이의 능력에 불리하게 영향을 미쳐 이의 의도된 기능을 수행하는 천연 조건으로부터 이들을 보호하기 위해 선택된 물질로 코팅되거나 이들 선택된 물질에 배치될 수 있다. 마크로파지 결합 화합물은 단독으로, 또는 상기된 또 다른 약제 또는 약제학적으로 허용되는 운반체, 또는 이들 모두와 함께 투여될 수 있다. 마크로파지 결합 화합물은 다른 약제의 투여 전에 약제와 동시에 또는 약제의 투여 후에 투여될 수 있다. 더욱이, 상기 화합물은 예를 들어 광에 노출시에 생체내에서 활성의 대사산물 또는 보다 큰 활성의 대사산물로 전환되는 대용 형태 또는 불활성 형태(예를 들어, 광에 민감한 독소를 포함하는 마크로파지 결합 화합물)로 투여될 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "장관외 투여" 및 "장관외로 투여된"은 장 및 국소 투여, 보통은 주사에 의한 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근내, 동맥내, 수막강내, 포내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관, 피하; 관절내, 피막하, 거미망막하, 수강내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하며 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "전신 투여", "전신에 투여된", "말초 투여" 및 "말초에 투여된"은 마크로파지 결합 화합물이 피검자에게 투여되어 피검자의 기관계에 유입되어 대사작용 및 다른 유사한 과정을 거치게 하는 투여, 예를 들어 피하 투여를 의미한다.
일반적으로, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물은 신체의 특정 영역(예를 들어, 피부, 폐, 관절 또는 근육/신경 조직)내의 마크로파지의 비정상적인 수 및/또는 기능에 의해 특성화된 질환을 치료하거나 진단하기 위해 국소적으로 투여된다. 피부병 분야에 적용하기 위해, 상기 화합물은 국소적으로 또는 경피적 패치에 의해 전달되거나 투여되는 것이 바람직하다. 국소 투여는 두피의 병변, 각막의 병변(각막염), 및 점막의 병변을 포함하는 피부 병변을 치료하는데 바람직하다. 샴푸 제형은 지루 피부염 및 두피의 건선과 같은 두피 병변을 치료하는데 때로는 유리하다. 함수제 및 구강 페이스트 제형은 구강 병변 및 백반증과 같은 점막 병변에 유리할 수 있다. 본 발명을 실시하는 바람직한 방법은 마크로파지 결합 화합물을 크림제 또는 오일 기재 운반체로 병변, 예를 들어, 건선성 병변에 직접 도포하는 것이다. 전형적으로, 크림제 또는 오일중의 마크로파지 결합 화합물의 농도는 1-2%이다. 또한, 피내 투여는 건선 및 창상의 병변과 같은 피부 병변에 대한 대안이다. 경구 투여는 피부 병변 및 직접 도포가 실시되지 않는 그 밖의 상기된 병변의 치료에 바람직한 대안이며, 다른 적용분야에도 바람직한 방법이다.
또한, 조성물은 특히 건선성 관절염 또는 류마티스성 관절염과 같은 관절염의 치료를 위해 그리고 피부 병변의 직접 주사를 위해 장관외로 전달될 수 있다. 장관외 치료는 전형적으로 피내, 관절내, 근내 또는 정맥내 주사로 수행된다. 관절내 주사 하나 또는 극소수(예, 2-6)의 관절을 치료하는 경우에 바람직한 대안이다. 또한, 치료를 위해 사용되는 화합물은 적합한 경우에는 병변에 직접 주사된다. 관절염 치료시의 대안으로서, 본 발명의 화합물이 전신에 투여될 수 있다.
호흡기 질환의 경우, 본 발명의 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 벤질 알코올 또는 그 밖의 적합한 보존제, 생체 활성을 증대시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 통상의 가용화제 또는 분산제를 사용하여, 염수중의 액제로서 제조될 수 있다.
특정 구체예로서, 화합물을 포함하는 조성물은 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 광에 민감한 부분, 예를 들어 독소 또는 링커를 포함하는 마크로파지 결합 화합물의 조성물이 이러한 방식으로 투여될 수 있다. 더욱이, 다발성 경화증과 같은 일부 자가면역 질환은 본 발명 조성물의 국소 또는 전신 투여에 의해 우선적으로 치료된다.
분말 및 스프레이는 본 발명의 화합물에 더하여 운반체, 예를 들어, 락토오스, 탈크, 규산, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 통상의 분사제, 예를 들어, 클로로플루오로히드로카본 및 휘발성 비치환된 탄화수소, 예를 들어 부탄 및 프로판을 추가로 함유할 수 있다.
일반적으로, 수성 에어로졸은 통상의 약제학적으로 허용되는 운반체 및 안정화제와 함께 약제의 수성 용액 또는 현탁액을 제형화시킴으로써 제조된다. 상기 운반체 및 안정화제는 특정 화합물의 요건에 따라 달라지지만, 전형적으로는 비이온성 계면활성제(트윈스(Tweens), 플루로닉스(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜), 무독성 단백질 유사 혈청 알부민, 소로비탄 에스테르, 올레산, 레시틴, 아미노산, 예를 들어 글리신, 완충액, 염, 당 또는 당 알코올을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장성 용액으로부터 제조된다.
선택된 투여 방법과 무관하게, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 마크로파지 결합 화합물 및/또는 약제 조성물은 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 약제학적으로 허용되는 용량형으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제 조성물중의 활성 성분의 실제 용량 수준 및 투여 시간은 특정 환자, 조성물 및 투여 형태(환자에게 해롭지 않은)에 대한 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해서 변할 수 있다.
활성 화합물은 이식, 경피적 패치 및 마이크로캡슐화된 전달계를 포함하여, 조절 방출 제형화와 같이 화합물이 빠르게 방출되지 못하게 하는 운반체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성 및 생적합성 중합체가 사용될 수 있다. 상기 제형을 제조하기 위한 많은 방법은 특허되었거나 당업자에게는 일반적으로 공지되어 있다[참고문헌 : Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].
특정의 투여 방법에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서는, 화합물의 활성이 감소되지 못하게 하는 물질로 화합물을 코팅하거나 이들 물질과 화합물을 공통투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 적합한 운반체, 예를 들어 리포솜 또는 희석제로 피검자에게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제는 염수 및 수성 완충 용액을 포함한다. 리포솜은 통상의 리포솜 뿐만 아니라 수중오일중의 물 CGF 에멀션을 포함한다[참고문헌 : Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7:27]. 약제학적으로 허용되는 운반체는 무균상태의 주사가능한 용액 또는 현탁액의 임시적 제조를 위한 무균상태의 수성 용액 또는 현탁액 및 무균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 약제의 용도는 당해기술분야에 공지되어 있다. 어떠한 통상의 매질 또는 약제가 활성 화합물과 양립하지 않는 경우를 제외하고, 본 발명의 약제 조성물에서의 이들의 용도가 고려된다. 보충적인 활성 화합물이 조성물내로 혼입될 수도 있다.
치료학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에서 무균상태이면서 안정해야 한다. 이러한 조성물은 액제, 마이크로에멀션, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 그 밖의 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 운반체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산의 경우에 요구되어지는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 약제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물중에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어 모노스테아레이트염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
무균 용액은 상기 열거된 성분중의 한 성분 또는 이들의 조합 성분을 갖는 적합한 용매에 활성 화합물을 필요량으로 혼합시키고, 필요한 경우에, 무균 상태로 미세여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 성분들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 무균상태의 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 무균상태의 주사가능한 액제의 제조를 위한 무균상태의 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이전에 무균 여과된 액제로부터 활성 성분과 어떠한 추가의 원하는 성분들로 이루어진 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조법이다.
용량 섭생은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료학적 반응)을 제공하도록 조절된다. 예를 들어, 하나의 단일 거환약이 투여되거나, 수개의 일정 용량이 시간에 따라 투여되거나, 치료적 상황의 긴박도에 따라 용량이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 조성물을 용량의 균일성 및 투여의 용이성을 위해 단위 용량형으로 제형화시키는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 단위 용량형은 치료 대상 피검자에 대한 단위 용량으로서 적합한 물리적 분리량을 언급하며, 각각의 단위는 요구되는 약제 운반체와 함께 원하는 치료 효과를 내도록 계산된 소정량의 활성 성분을 함유한다. 본 발명의 단위 용량형에 대한 명세사항은 (a) 활성 성분의 독특한 특성 및 달성하고자 하는 특정의 치료 효과, 및 (b) 개인의 민감도를 치료하기 위해 활성 화합물을 화합시키는 기술의 고유 제한에 의해 규정되며 이들에 직접적으로 좌우된다.
약제학적으로 허용되는 산화방지제의 예로는 (1) 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 나트륨 바이술페이트, 나트륨 메타바이술페이트, 나트륨 술파이트 등과 같은 수용성 산화방지제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시아니솔(BHA), 부틸화된 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 오일 가용성 산화방지제, 및 (3) 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 포스폰산 등과 같은 금속성 킬레이트화제가 있다.
치료학적 조성물의 경우에, 본 발명의 제형은 국소, 피부 또는 상피 투여에 적합한 조성물을 포함한다. 제형은 단위 용량형으로 용이하게 제시될 수 있으며 약학 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 운반체 물질과 조합되어 단일 용량형을 생성시킬 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 피검자, 및 특정의 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 운반체 물질과 조합되어 단일 용량형을 생성시킬 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100%를 기준으로 할 때, 이러한 양은 약 0.01 % 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30% 범위일 것이다.
본 발명의 조성물의 국소 및 경피적 투여를 위한 용량형은 분말, 스프레이, 연고제, 페이스트, 크림제, 로션, 겔, 액제, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 무균 조건하에서 약제학적으로 허용되는 운반체, 및 어떠한 보존제, 완충액, 또는 요구될 수 있는 분사제와 혼합될 수 있다.
본 발명의 약제 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 운반체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르가 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하고, 분산의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
이들 조성물은 보존제, 습윤화제, 에멀션화제 및 분산제와 같은 보조제도 함유할 수 있다. 미생물 존재의 억제는 앞서 언급한 무균화 과정 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 함유에 의해 보장될 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등장성 약제를 조성물중으로 포함시키는 것도 요망될 수 있다. 또한, 주사 가능한 약제형의 장기간 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 약제를 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
본 발명의 화합물이 약제로서 인간 및 동물에게 투여될 때, 이들 화합물은 단독으로, 또는 예를 들어 0.01 내지 99.5%(보다 바람직하게는. 0.1 내지 90%)의 활성 성분으로서 약제학적으로 허용되는 운반체와 함께 제공될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성 없이 특정한 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대하여 목적하는 치료 반응을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 얻기 위하여 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 함께 병용하여 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 연령, 성별, 체중, 일반 건강 상태 및 치료전의 환자의 약제 투여 병력, 및 의료 분야에서 잘 알려진 인자들을 포함한 다양한 약물동력학적 인자에 의존할 것이다.
당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 의사 또는 수의사는 요구되는 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하여 처방할 수 있다. 예컨대, 의사 또는 수의사들은 약제학적 조성물로 사용된 본 발명의 화합물의 복용량을 목적하는 치료 효과를 얻기 위하여 필요한 양 보다 더 낮은 수준에서 시작하여 목적하는 효과가 얻어질 때까지 투여량을 점차적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적당한 1일 복용량은 치료효과를 내는데 유효한 최저 복용량인 화합물량일 것이다. 이러한 유효 복용량은 일반적으로 상기한 인자에 의존할 것이다. 국소 투여, 예컨대 국부, 피하, 피내 투여가 바람직하고, 바람직하게는 표적 부위에 근접하여 투여된다. 필요에 따라, 치료적 조성물의 유효 1일 복용량은 하루 동안 적당한 간격으로, 임의적으로는 단위 투여량 형태로, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 아복용량으로 나누어 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 단독 투여가 가능한 경우, 약제학적 제형(조성물)으로서 화합물을 투여하는 것이 바람직하다.
치료적 조성물은 당해 분야에서 공지된 의료 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예컨대, 한 바람직한 구체예에서는 본 발명의 치료적 조성물은 미국 특허 제 5,399,163호, 제 5,383,851호, 제 5,312,335호, 제 5,064,413호, 제 4,941,880호, 제 4,790,824호 또는 제 4,596,556호에 개시된 장치와 같은 무주사침 피하 주사 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 이식제 및 모듈의 예는 조절된 속도로 약제를 투여하기 위한 이식가능한 마이크로 주입 펌프를 개시한 미국 특허 제 4,487,603호; 피부를 통하여 약제를 투여하기 위한 치료 장치를 개시한 미국 특허 제 4,486194호; 정확한 주입 속도로 약제를 도달시키기 위한 약제 주입 펌프를 개시한 미국 특허 제 4,447,233호; 계속적인 약물 도달을 위한 다양한 유출량의 이식가능한 주입 장치를 개시한 미국 특허 제 4,447,224호; 다중 챔버 구획을 가진 삼투성 약물 도달 시스템을 개시한 미국 특허 제 4,439,196호; 및 삼투성 약물 도달 시스템을 개시한 미국 특허 제 4,475,196호를 포함한다. 이러한 특허는 본 명세서에서 참조문헌으로 삽입된다. 기타 많은 이러한 이식제, 도달 시스템, 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
특정한 구체예에서는, 본 발명의 화합물은 생체내에서 적당한 분포를 보증하기 위하여 제형화될 수 있다. 한 구체예에서는, 마크로파지 결합 분자는 리포좀내로 포위될 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대해서는 예컨대 미국 특허 제 4,522,811호; 제 5,374,548호; 및 제 5,399,331호를 참조하라. 리포좀은 특이적 세포 또는 기관으로 선택적으로 수송되는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있으므로 표적화된 약물 도달을 향상시킨다[V.V. Ranade(1989) J Clin Pharmaco. 29:685]. 예컨대, 특정 구체예에서 본 발명의 화합물을 Fc 보유 마크로파지로 표적화시키기 위해서는 Fc 수용체(scFv)에 대한 단쇄 항체, 예컨대 H22 scFv를 사용하는 것이 바람직하다. scFv 단편을 포위한 리포좀을 제조하기 위한 프로토콜은 Kruif, J. et al.(1996) FEBS 399:232-236에 기재되어 있다. 예컨대, 지질 변형된 H22 scFv는 n-옥틸 β-D-글루코시드, 지질 및 지질 변형된 scFv를 세정제의 임계 미셀 농도 미만의 수준으로 함유한 혼합 미셀을 희석시킴으로써, 10:1.5:0.01의 몰비의 난 포스파티딜콜린(EPC), 난 포스파티딜글리세롤(EPG), 콜레스테롤 및, 임의적으로 형광성 이중층 마커로서 로다민-포스파티딜에탄올아민(로다민)로 구성된 리포좀과 커플링될 수 있다. 리포좀내에 scFv 분자의 혼입은 SDS-PAGE에 의해 증명될 수 있다.
"치료적 유효 투여량"은 비치료된 대조와 비교하여 선택된 치료 영역 내의 마크로파지의 수를 감소시키거나, 선택된 영역내의 마크로파지의 활성을 저해하여, 예컨대 마크로파지가 그 영역내에서 보다 장기간 증식하거나 염증 반응에 기여하지 않도록 하는 투여량이다. 결과적으로, 마크로파지 매개 질환의 증상이 개선된다. 마크로파지 개체군을 죽이거나 저해하는 본 발명의 화합물의 효능은 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 인간의 Fc 수용체를 발현시키는 유전자이식 동물과 같은 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 이러한 작용은 당업자에게 공지된 시험관내 검정으로 평가될 수 있다. 치료 화합물의 치료적 유효량은 마크로파지 세포 개체군 또는 활성을 감소시키거나 피검자에서 증상을 개선시킬 수 있다. 당업자는 피검자의 크기, 피검자의 증상의 중증도, 및 특정한 조성물 또는 선택된 투여 경로와 같은 인자에 근거한 양을 결정할 수 있다.
조성물은 멸균되어야 하고 조성물이 시린지에 의해 도달될 수 있을 정도로 유동성이 있어야 한다. 물 뿐만 아니라, 담체는 등장 완충 식염 용액, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적당한 혼합물일 수 있다. 적당한 유동성은 예컨대 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산물인 경우 필요한 입자경의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 에컨대 당, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 폴리알코올, 및 염화 나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연하는 약제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
발명의 용도 및 방법
본 발명의 마크로파지 결합성 화합물은 여러가지 진단학적, 치료학적 및 연구성 유용성을 가진다. 이들은 다양한 질환을 치료, 진단 또는 연구하기 위하여 시험관내(배양물에서), 생체외, 또는 생체내(피검자에서) 세포에 투여될 수 있다.
한 구체예에서, 선택된 치료 또는 진단 영역에서 마크로파지 활성을 고갈시키거나(예컨대, 수의 감소) 저해하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 선택된 영역을 상기한 결과를 얻기에 충분한 양의 마크로파지 결합성 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "선택된 영역" 또는 "국소 영역"은 총괄적으로 인체의 국소 영역(피부, 폐, 관절 등) 또는 조직 배양 샘플과 같이 질환에 기여하는 마크로파지를 포함하거나 포함할 수 있는 조직 또는 세포의 선택된 샘플(시험관내 또는 생체내)을 지칭한다. 접촉은 시험관내(예컨대, 배양액중의 세포) 또는 생체내(예컨대, 피검자에게 본 발명의 화합물을 투여함으로써)에서 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "피검자"는 인간 및 인간이 아닌 동물을 포함하는 것을 의미한다. 바람직한 인간은 마크로파지 세포, 예컨대 피부 마크로파지 세포의 이상 활성을 특징으로 하는 질환을 가진 환자를 포함한다. 용어 "활성"은 특히 증식, 분화, 생존, 성장 인자 또는 사이토카인 분비를 포함한 마크로파지 세포의 모든 생물학적 기능을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 용어 "인간이 아닌 동물"은 모든 척추동물, 예컨대 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 설치류와 같은 포유류 및 비포유류를 포함한다.
본 발명의 마크로파지 결합성 화합물은 초기에 시험관내에서 시험될 수 있다. 예컨대, 마크로파지의 활성을 제거 및/또는 변조, 예컨대 감소하는 이러한 분자의 활성은 마크로파지 유도 세포주, 배양된 분화 혈액 단구, 및 1차 배양 시스템에서 검정될 수 있다. 마크로파지 결합성 화합물의 시험관내 활성을 검정하기 위한 프로토콜은 예컨대, Immunopharmacology of Macrophages and Other Antigen-presenting Cells[ISBN 0-12-137800-4, 1994, Academic Press Limited]에서 발견될 수 있다. 예컨대, 1차 피부 마크로파지 배양물은 건강한 피검자 및 피부병의 피검자로부터 유래된 피부 세포로부터 성립될 수 있다. 마크로파지 활성, 예컨대 세포 증식 또는 사이토카인 분배는 일정 범위 농도의 본 발명의 화합물의 첨가후에 특정한 시간 간격으로 검정될 수 있다. 한 구체예에서, 건강한 피검자 및 피부병의 피검자로부터 수득된 '펀치 생검'이 사용될 수 있다. 펀치 생검은 본 발명의 화합물이 첨가될 수 있는 배양 매질중에 침지되거나 표피 측이 드러난 채로 배양될 수 있다. 본 발명의 마크로파지 결합성 화합물과 함께 배양한 후에, 마크로파지 활성에서 이러한 화합물의 효과는 면역조직화학적으로 또는 ELISA, RIA 또는 EIA에 의해 검정될 수 있다.
세포 증식의 변화를 검출하기 위한 프로토콜, 예컨대 티미딘 또는 BrdU 혼입 검정은 당해 분야에서 공지되어 있다. 본 발명의 바람직한 마크로파지 결합성 화합물은 마크로파지 활성을 감소 또는 제거한다. 사이토카인 농도의 변화를 검출하기 위한 프로토콜은 당해 기술분야에서 공지된 효소 결합 면역검정(ELISA), 효소 면역검정(EIA) 또는 방사면역검정(RIA)과 같은 다양한 면역검정법에 의하여 검출될 수 있다[예컨대, Keler, T et al.(1997) Cancer Research 57 4008-14 참조]. 검정될 수 있는 사이토카인의 예는 하기를 포함한다: 과립구/마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-SCF), 인터류킨 1 내지 12(IL-1 내지 IL-12), 및 TNF-α. 사이토카인의 농도는 효소에 차례로 접합되는 항체와 사이토카인의 상호작용을 검출함으로써 EIA를 사용하여 측정될 수 있다. 효소의 활성은 적당한 기질, 바람직하게는 색소성 기질과의 반응에 의해 예컨대 분광광도계, 형광광도계 또는 광학적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 부분을 생성하는 방식으로 검출된다[Voller, "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)", Diagnostic Horizeons 2: 1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller et al. J. Clin. Pathol. 31:507-520(1978); Butler, Meth. Enzymol. 73:482-523(1981); Maggio,(ed) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980; Ishikawa, et al., (eds) Enzyme Immunoassay, Kgaku Shom, Tokyo,1981]. 항체를 검출가능하도록 표지화하는데 사용될 수 있는 효소는 이상에서 기술되어 있다. 검출은 효소에 대한 색소성 기질을 사용하는 비색법에 의하여 수행될 수 있다. 검출은 유사하게 제조된 표준과 비교하여 기질의 효소적 반응의 정도를 광학적으로 비교함으로써 수행될 수도 있다.
사이토카인의 검출은 방사면역검정(RIA)을 사용하여 수행될 수도 있다[예컨대, 본원에 참조문헌으로 삽입된 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조]. 방사성 동위원소는 γ계수기 또는 신틸레이션 계수기의 사용과 같은 수단에 의해 또는 방사선 사진법에 의해 검출될 수 있다.
항-사이토카인 항체를 형광성 화합물로 표지하는 것도 가능하다. 형광 표지된 항체가 적당한 파장 길이의 광에 노출되는 경우, 그의 존재가 검출될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 형광 표지화 화합물로서 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레스카민이 있다. 항체는 152Eu과 같은 플루로레세인 방출 금속 또는 란탄족의 기타 금속을 사용하여 검출가능하도록 표지화될 수도 있다. 이러한 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이팅 군을 사용하여 항체에 결합될 수 있다. 항체는 화학발광 화합물과 커플링함으로써 검출가능하게 표지화될 수도 있다. 화학발광 태깅된 항체의 존재는 화학 반응 과정 동안 일어나는 발광을 검출함으로써 측정된다. 특히 유용한 화학발광성 표지화 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다. 생체발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율성을 증가시키는 생물체내에 존재하는 화학발광의 형태이다. 생체발광성 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로서 측정된다. 표지화 목적을 위한 중요 생체발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 애쿠오린이다.
마크로파지 결합성 화합물은 생체내에서 시험될 수도 잇다. 예컨대, 이러한 화합물은 본원의 실시예에서 기술된 바와 같이 인간의 Fc 수용체를 발현하는 마우스를 사용하여 시험될 수 있다. 한 구체예에서, 마크로파지 결합성 화합물은 이러한 유전자이식 마우스에 피내주사될 수 있다. 비히클을 주사한 대조군은 유사하게 처리될 수 있다. 만성 피부염은 5% 라우릴 황산 나트륨의 반복적 국소 적용에 의해 이러한 마우스에서 실험적으로 유도될 수 있다. 이러한 화합물의 효과는 주사후 여러 시간 간격에서 면역조직화학적으로, 예컨대 육안 또는 임상적으로 모니터링될 수 있다.
본 발명의 마크로파지 결합성 화합물은 마크로파지의 이상 활성 또는 수치를 특징으로 하는 질환의 치료에 사용될 수 있다. "이상" 이라는 용어는 정상의 건강한 환자의 동일한 영역에서 발견되는 것과 상이한(예컨대, 보다 높은), 선택 영역 내의 마크로파지 밀도를 지칭한다. 또한, "이상" 이라는 용어는 비정상적으로 높은 세포 증식 또는 사이토카인 분비과 같은 비정상적인 마크로파지 활성을 포함한다. 따라서, 한 구체예에서 본 발명은 선택된 영역 내에서 마크로파지의 이상 수치 또는 활성을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방적으로 예방하는 방법을 제공하며, 본 방법은 피검자에게 일반적으로 치료를 요하는 국소 영역에 하나 이상의 마크로파지 결합성 화합물을 함유한 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
마크로파지 결합성 화합물은 일반적으로 Fc 수용체 보유 마크로파지에 세포독소(예컨대, 약물)를 도달시키는 표적화제로서 사용된다. 본 발명의 한 구체예에서, 세포독소는 그 자체가 Fc 수용체 보유 마크로파지에 표적화되는 리포좀내에 포위된다. 따라서, 마크로파지 결합성 화합물은 세포독소를 함유한 리포좀과 결합된 항 Fc 수용체 결합 부분을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 항 Fc 수용체 결합 부분은 H22 scFv와 같은 Fc 수용체(scFv)에 길항하도록 된 단쇄 항체이다. 항 FcR scFv는 scFv가 리포좀 외부의 Fc 수용체를 인식하고 결합을 허용하는 방식으로 리포좀의 지질 이중층에 결합 또는 삽입된다. 이것은 Kruif, J. et al.에 의해 기술된 바[(1996) FEBS 399: 232-236]와 같은 공지된 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다. 최종 결과는 리포좀의 형태로 세포에 도달된 FcR 표적화된 세포독소이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 마크로파지 결합성 화합물의 "치료적 유효량"은 피검자에게 1회 또는 수회 복용량 투여시 세포 증식의 저해 또는 이러한 치료의 부재시의 임상 증상의 개선에 유효한 화합물의 양을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 화합물의 "예방적 유효량"은 피검자에게 1회 또는 수회 복용량 투여시 마크로파지 매개 질환 상태의 발병 또는 재발을 예방 또는 지연시키는데 유효한 마크로파지 결합성 화합물의 양을 지칭한다.
2가지 상태 사이의 정량적인 차이를 나타내는 용어 "유도한다", "저해한다", "증강한다", "상승시킨다", "증가시킨다", "감소시킨다" 등은 2가지 상태 사이의 통계적으로 유의한 차이 이상을 지칭한다. 예컨대, "마크로파지 세포의 증식을 저해하는데 유효한 양"은 세포의 증식 속도가 비치료된 세포에 비해 적어도 통계적으로 유의하게 다르다는 것을 의미한다.
본 발명의 마크로파지 결합성 화합물은 다양한 마크로파지 매개 질환의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 질환은 반드시 마크로파지의 이상 수치 및/또는 활성만을 특징으로 하는 것은 아니지만, 이들 각각은 환자에게 유해한 비바람직한 마크로파지 활성을 포함한다. 한 구체예에서, 화합물은 예컨대 당뇨병, 관절염(류마티스성 관절염, 청년 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염을 포함), 다발성 경화증, 뇌척수염, 당뇨병, 중증 근무력증, 전신 홍반성 낭창, 자가면역성 갑상선염, 피부염(아토피성 피부염 및 습진성 피부염을 포함), 건선, 쇼그렌 증후군에 속발성인 건성 각결막염을 포함한 쇼그렌 증후군, 원형 탈모증, 절지동물 교창 반응에 기인한 앨러지 반응, 크론병, 아프타성 궤양, 홍채염, 결막염, 각결막염, 궤양성 대장염, 천식, 앨러지성 천식, 피부 홍반성 낭창, 공피증, 질염, 직장항문염, 약진, 나병 반전 반응, 나병성 결절성 홍반, 자가면역 포도막염, 앨러지성 뇌척수염, 급성 괴사성 출혈성 뇌질환, 특발성 양측성 진행성 감각신경 청각 소실, 재생불량성 빈혈, 진정 적혈구성 빈형, 특발성 혈소판감소증, 다연골염, 베게너 육아종증, 만성 활동성 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발성 스푸루우, 편평태선, 크롬병, 그레브스 안질환, 유육종증, 원발성 담즙성 간경변, 후포도막염, 및 간질성 폐 섬유증을 포함한 자가면역성 질환을 치료하는데 사용된다. 또한 면역 활성의 하향조절은 아토피성 앨러지와 같은 앨러지의 경우에 바람직할 것이다.
표제 방법이 치료 레지멘의 부분으로 사용될 수 있는 바람직한 자가면역/피부병적 질환의 예는 하기를 포함한다: 건선, 아토피성 피부염, 다발성 경화증, 공피증 및 피부 홍반성 낭창. 예컨대, 본 발명의 방법 및 조성물은 아토피성 피부염(AD)을 치료하는데 사용될 수 있다. 이론상 구속됨이 없이, AD에서 피부염의 급성 단계 동안 국소 T 세포의 표현형은 초기의 Th2 타입에서 만성 단계의 Th1 타입으로 전환되는 것으로 생각된다. 이 시점에서, 활성화된 염증성 마크로파지의 강한 유입과 함께 병변중의 IL-12 생성의 증가가 발견된다.
마크로파지는 IL-12의 유력한 생산자이고, IL-12는 T 세포가 IFN-γ를 생산하도록 유도하며, IFN-γ는 유력한 마크로파지 활성화인자이다[Thepen, T. 등 (1996) J Allergy Clin. Immunol 97:828-837; Grewe, M. 등 (1998) Immunol. Today 19:359-361]. 그러한 양성 피드백은 잠재적으로 악순환을 낳아, 외부 자극의 필요성 없이 단독으로 국부적 염증을 유지할 수 있다. 마크로파지의 조절불량에 기인하는, 계속적인 알레르겐 비특이적 반응을 유발하는 다른 그러한 메카니즘이 마크로파지의 조절 능력을 고려할 때 가능성이 있다. 하기 실시예에 기술된 Fc 수용체, 예를 들면, FcγRI의 표적화에 의해 염증성 마크로파지를 선택적으로 국부 제거하는 것은 본 발명의 조성물을 마크로파지 분비시 생성되는 양성 피드백 루프를 감소시키거나 제거하여, AD와 같은 질환을 치료하는데 유용하게 한다.
본 발명의 치료방법에 의해 치료될 수 있는 질환의 부가적 예는 전염성 질환, 예를 들면, HIV 감염, 호흡기 질환, 예를 들면, 만성 다형성 광 피부병(CPLD), 만성 장애 폐병(COPD), 예를 들면, 알러지성 천식 및 사코이도시스, 및 개방창(open wound) 또는 화상에서 관찰되는 것과 같은 염증성 반응을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 화장용으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 마크로파지 결합 화합물은 피부에 국부적으로 도포되어 피부의 노화 과정을 지연 및/또는 방지할 수 있다.
본 발명의 치료방법은 마크로파지 세포의 제거를 위한 다른 기술과 함께 수행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물을 사용하는 치료법은 수술, 화학 요법 또는 방사선 요법과 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물은 작동인자 세포상의 FcγRI 수준을, 예를 들면, 세포 표면상의 수용체의 캡핑 및 제거에 의해 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 항 Fc 수용체 혼합물도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 1회 이상의 투여량의 마크로파지 결합 화합물 및 사용 지시서를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 구체예에서는, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물의 배합물, 예를 들면, FcR 및 독소에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위을 가지는 제 1 화합물과 FcR 수용체의 다른 에피토프 또는 다른 Fc 수용체, 예를 들면, Fcα 수용체에 특이적인 항원 결합 부위을 가지는 제 2 화합물의 배합물이 마크로파지의 활성을 선택적으로 제거하거나 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 제 2 마크로파지 결합 화합물은 제 1 화합물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 제 2 마크로파지 결합 화합물은 IgA 수용체, 예를 들면, Fcα 수용체, IgE 수용체, 예를 들면, Fcε 수용체, Fcδ 수용체 및/또는 Fcμ 수용체에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위을 가질 수 있다.
마크로파지 결합 화합물을 피검자에 투여하기 전에, 피검자는 예를 들면, 시토킨으로 처리함으로써, Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절, 예를 들면, 증가 또는 억제시키는 물질로 예비 처리될 수 있다. 마크로파지 결합 화합물에 의한 치료 동안에 투여하기에 바람직한 시토킨은 과립성 백혈구 콜로니 형성 자극인자(G-CSF), 과립성 백혈구 마크로파지 콜로니 형성 자극인자(GM-CSF), 인터페론-γ(INF-γ) 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한다.
또한, 본 발명의 마크로파지 결합 화합물은 Fc 수용체 결합 수준을 측정함으로써 마크로파지 개체수를 검출 및/또는 측정하기 위하여 생체내 및 생체외에서 진단적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예에 개시되어 있는 바와 같이, FcγRI 의 풍부한 발현이 인간의 급성 및 만성 피부 염증의 진피에서 검출된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 마크로파지 결합 화합물은 그러한 염증성 질환을 진단하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 용도를 위하여, 화합물은 검출될 수 있는 분자와 결합될 수 있다. 검출가능한 표지는 예를 들면, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자일 수 있다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 마크로파지(예를 들면, 마크로파지 증식) 및/또는 Fc 수용체 발현(예를 들면, Fc 수용체를 발현하는 세포수의 증가 및/또는 일정한 세포에서 Fc 수용체 발현의 증가)의 비정상적인 수가 특징인 생체내 또는 생체외 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 일정한 시험 샘플 또는 국부적 부위내에서 본 발명의 화합물의 결합 수준을 측정함으로써, 그 부위 또는 샘플내의 마크로파지의 존재를 추론할, 수 있는데, 단 화합물의 항 Fc 수용체 성분은 마크로파지 Fc 수용체에 특이적이어야 한다. 이는 (i) 환자로부터 체액, 조직(예를 들면, 피부 샘플), 또는 생검시료와 같은 생체 시료를 입수하고; (ii) 생체 시료를 본 발명의 마크로파지 결합 화합물 또는 그의 단편과 접촉시키고; (iii) 생체 시료에 대한 상기 마크로파지 결합 화합물의 결합 수준을 측정하고; (iv) 생체 시료에 결합된 분자의 양을 대조 시료, 예를 들면, 3명의 건강한 피검자로부터의 생물학적 시료 또는 미리 결정된 기본 수준과 비교함으로써 수행될 수 있으며, 대조 수준 보다 큰 결합은 마크로파지 질환, 예를 들면, 피부 질환의 존재를 나타낸다. 바람직하게, Fc 수용체 발현의 수준은 주로 마크로파지 세포 개체군상에서 다른 Fc 수용체 발현 세포와 비교하여 검출된다. 생체내 및 생체외 진단 분석법의 프로토콜이 PCT/US88/01941, EP 0 365 997 및 US 4,954,617에 개시되어 있다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌, 계류중인 특허출원 및 공개된 특허의 내용은 명백히 본 명세서에 참고로서 편입된다.
재료 및 방법
하기의 방법론을 하기의 연구에서 사용하였다. 마크로파지 결합 화합물, CD64 면역독소(CD64 IT), 또는 면역독소(IT)란 용어는 본 명세서에서 교환가능하게 사용된다.
단일클론 항체
하기 실시예는 본 명세서에 참고로서 편입되는 미국특허 제 5,635,600호에 기술된 단일클론 항체 22(H22)의 인간화 형태에 해당하는 항 CD64(항 FcR)의 사용을 기술한다. H22 항체의 제조 및 특성은 참고문헌[Graziano, R.F. 등 (1995) J Immuno 155 (10):4996-5002] 및 PCT/US93/10384에 기술되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 1992년 11월 4일자로 HA022CL1이라는 명칭으로 기탁하였고, ATCC 수탁번호는 CRL 11,177이다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 다른 특이적 항 CD64 항체는 뮤린 항체 mAb 32.2, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32.2를 생산하는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수가능하다. ATCC 수탁번호는 HB9469이다. mAb 197-Ricin A 접합체의 제조는 하기 실시예에 기술되어 있다.
항 FcR mAb는 각각의 하이브리도마 상청액으로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다(Bio-Rad, Richmond, CA).
면역조직화학적 염색
A: CD64 염색
생검시료를 동결 마이크로톰상에서 6㎛ 절편으로 절단하고 코팅된 슬라이드에 고정시켰다. 하룻밤 동안 건조시킨 후에, 절편을 10분 동안 건조 아세톤으로 고정시키고 공기 건조시켰다. 슬라이드를 PBS 2% 정상 마우스 혈청(NMS)에서 FITC 접합된 10.1(Serotec 1:40)과 함께 45분 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 PBS, 0.05% Tween으로 5분 동안 3회 세척한 후, PBS(1% 인간 AB 혈청, 1% NMS)에서 알칼리성 포스파타아제(AP) 접합된 양 항 FITC(Boehringer Mannheim, 1:400)과 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. PBS/Tween에서 2회 및 Tris-HCl(0.1M, pH 8.5)에서 1회 세척한 후, AP 활성을 0.1M Tris-HCl, pH 8.5에 용해된 기질로서의 나프톨 AS-BI 포스페이트(나트륨 염, 50mg/ml; Sigma) 및 색원체로서의 신규한 푹신(10mg/100ml; Merck, Whitehouse Station, N.J.)을 사용하여 나타내었는데, 분홍색/적색 염색이 발생하였다. 내인성 AP 활성을 반응 혼합물에 레바미솔 (35mg/100ml, Sigma)를 첨가하여 억제하였다. 슬라이드를 헤마토실린으로 가볍게 역염색하였다.
B: 마커
절편을 건조 아세톤에서 H2O2(30%, 100㎕/100㎖)로 7분 동안 고정시켰다. 슬라이드를 PBS 2% NMS에서 45분 동안 최적 희석 상태에서 1차 쥐 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 하기 항체를 마크로파지를 염색시키기 위해 사용하였다: MOMA-2(Kraal, G. 등 (1987) Scand. J. Immunol. 26:653-661); 수지상 세포; NLDC145(Kraal, G. 등 (1986) J. Exp. Med. 163:981-997); T 세포; KT3(Tomonari, K. (1988) Immunogenetics 28:455-458). 3회 세척한 후(PBS, 0.05% Tween 20에서 5분 동안), PBS(1% 인간 AB 혈청, 1% NMS)에서 퍼옥시다아제 표지 토끼 항 쥐 접합체(DAKO, 1:200)과 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. PBS로 2회 및 NaCa(0.1M, pH 5.0)로 1회 린스한 후, PO 활성을 기질로서의 H2O2및 색원체로서의 DAB(Sigma)를 사용하여 나타내었는데, 갈색 염색이 발생하였다.
동물 실험
피부 염증의 유도, 면역독소 주사 및 생검시료. 이 실험에서는, 인간 FcγRI을 발현하는 유전자이식 FVB/N 마우스를 사용하였다[Heijnen, I.A., 등 (1996) J. Clin. Invest. 97:331-338]. 비유전자이식 동복자를 대조구로서 사용하였다. 만성 피부 염증을 유도하기 위하여, 마우스의 양쪽 옆구리상의 1.5x1.0cm 면적을 면도하고, 자극성 라우릴 황산나트륨(SLS)(식염수중 5%)을 연속 10일 동안 매일 피부상에 도포하였다.
동물을 근육내 주사된 Aescoket(Aesculaap, Gent, Belgium) 및 Rompun(Bayer, Leverkussen, Germany)의 4:3 혼합물 20㎕로 마취시켰다. 2회의 인접한 피내 주사(각각 10㎕, 식염수중 2x10-8M, Ricin A 부분을 기준으로)를 투여하였다. 대조용으로, 동일한 식염수 주사를 반대쪽에 투여하였다.
동물을 상기한 바와 같이 마취시키고, 3mm 펀치 생검시료를 취하고, 액체 질소에서 스냅 동결시키고, 사용전에 -70℃에서 저장하였다. 피부를 1회 봉합으로 닫았다.
펀치 생검시료(3mm)를 국부 마취하에(1% 리도카인) 손상 AD 피부(n=3), 24시간 APT(n=3), 48시간 SLS(n=2) 및 72시간 WB 처리된 PLE 피부로부터 취하였다. 생검시료를 액체 질소에서 스냅 동결시키고 사용전에 -70℃에서 저장하였다.
실시예 1: CD64 면역독소의 제조
CD64 단일클론 항체 197(Guyre, P.M., 등 1989, J. Immunol 143:1650-1655) 및 H22(Graziano, R.F., 등 1955, J. Immunol. 155:4996-5002)를 탈글리코실화 Ricin A(30KDa, Sigma)에 적합한 링커(예를 들면, 헤테로이작용기 절단가능한 크로스링커 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)(Pierce))를 사용하여 제조자의 지시에 따라 GLP 조건에서 접합시켰다. 간단히, SPDP를 CD64 mAb, 예를 들면, H22에 접합시킨 다음, mAb-PDP의 몰비를 측정하였다. mAb-PDP의 몰비를 측정한 후, Ricin A를 첨가하였다. 유리 PDP기 및 유리 Ricin A 사슬을 불활성화시키고, 혼합물을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. H22-Ricin A 접합체의 순도를 SDS-PAGE에 의해 추가로 체크하였다. H22-Ricin A 접합체를 0.2㎛ 필터를 사용하여 멸균시켰다. 모든 제조 단계를 Good Manufacturing Practice 조건에서 수행하였다.
실시예 2: CD64 면역독소를 사용한 마크로파지의 유효한 세포 사멸
FcγRI의 구성적 발현은 주로 골수계 세포에 제한되고 전염증성 및 염증성 질환하에서 강하게 상향조절된다[Velde, A.A., 등 (1992) J. Immunol. 149:4048-4052; Schiff, D.E., 등 (1997) Blood 90:3187-3194]. 세포내흡입 작용을 신속하고 효율적으로 중재하는 FcγRI의 능력에 의해 이 수용체는 활성화된 염증성 마크로파지의 유효한 표적이 된다[Heijnen, I.A. 등 (1996) J. Clin. Invest. 97:331-338]. hFcγRI에 대한 몇가지 면역독소를 독소 Ricin A 및 CD64 항체의 접합체를 사용하여 실시예 I에 기술된 바와 같이 제조하였다.
마크로파지 사멸을 유도하는데 있어서 이러한 접합체의 효율을 확인하기 위하여, IFN-γ로 자극되거나 자극되지 않은, 배양된 인간 전단구 세포주 U937을 본 발명의 조성물의 존재 또는 부재하에 검사하였다(도 1, A 및 B). 배양 조건 및 시토킨에 의한 U937의 자극은 참고문헌[Guyre, P.M, 등 (1983) J. Clin. Invest 72:393-397]에 기술되어 있다. 간단히, U937 세포를 300U/㎖ IFN-γ의 존재하에서 24시간 동안 배양하여 FcγRI 발현을 상향조절하였다. FcγRI 수준은 유동 세포계산법에 의해 관찰하였다. 아울러, FcγRIa cDNA로 트랜스팩션되거나 트랜스펙션되지 않은 IIA1.6 세포를 시험하였다. IIA1.6 세포는 뮤린 A20 B 세포 림프종으로부터 유래하고, 최근에 CD5+ B세포/마크로파지 세포의 독특한 서브세트에 속하는 것으로 나타났다[van Vugt. M.J., 등 1998, Clin. Exp. Immunol. 113:415-422].
CD64 면역독소(IT)의 세포독성 효능을 농도 의존 방식으로 [3H]티미딘 혼입의 억제를 측정함으로써 평가하였다[Post, J 등 Leuk. Res. 19:241-247]. 간단히, 세포를 96 웰 둥근바닥 플레이트에 5x104세포/웰로 시딩하고 CD64 IT와 함께 72시간 동안 리신 부분을 기준으로 10-12내지 10-7M 범위의 농도에서 인큐베이션시켰다. 세포를 4시간 동안 [3H]티미딘(aμCi)로 펄싱한 다음 유리솜 필터에서 회수하고 베타 플레이트 스캐너상에서 계수하였다. 모든 인큐베이션을 2% 인간 AB 혈청이 보충된 배지에서 수행하여 FcγRI의 Fc 결합 부위를 차폐함으로써, IT가 그것의 항원 인식부위에만 결합하도록 하였다. 시딩된 세포수를 [3H]티미딘 혼입이 세포수의 선형 함수가 되도록 선택하였다. [3H]티미딘 혼입의 배경값을 0.1mM 시클로헥스이미드와의 인큐베이션에 의해 수득하였다.
결과는 모의 처리된 세포와 비교하여 [3H]티미딘 혼입율로서 표시하였다. 도 1A-1B에서, 막대 그래프는 [3H]티미딘 혼입율을 배지 대조구의 것과 비교하여 나타낸다(±SEM). H22-R 또는 197-R의 증가하는 농도의 함수로서 [3H]티미딘 혼입의 투여량 의존적 감소는 자극된 U937 세포에 대한 면역독소의 새포독성을 나타낸다. 패널 1C-1D의 경우에, 막대 그래프는 [3H]티미딘 혼입율을 배지 대조구의 것과 비교하여 나타낸다(±SEM). H22-R 또는 197-R의 증가하는 농도에 대하여 [3H]티미딘 혼입의 투여량 의존적 감소는 hFcγRI 트랜스팩션된 IIA1.6 세포에 대한 면역독소의 새포독성을 나타낸다. 이는 hFcγRI 발현 세포에 대한 두 IT의 특이성을 입증한다.
시험된 두 면역독소는 세포 사멸의 유력한 유도인자였다. 그러나, H22- Ricin A(H22-R)이 대체로 세포 사멸을 유도하는데 있어서, 특히 비자극된 세포에서 197-Ricin A(197-R) 보다 더 효과적이었다. 10-8및 10-9M의 Ricin A 단독과의 인큐베이션은 유의적인 효과를 갖지 않았다(각각 88.9±14.2 및 100.4±13.5%). 더욱이, 어느 IT의 유의적인 효과도 비트랜스펙션된 IIA1.6 세포에서 발견되지 않았으며, 이는 hFcγRI 트랜스팩션된 IIA1.6 세포의 효과적인 사멸이 이들 IT의 어느 하나를 사용하여도 검출되는 것과 대조적이다(도 1, 패널 C 및 D).
이들 결과는 생체외에서 hFcγRI 발현 세포를 사멸시키는데 있어서 CD64 IT의 효능 및 특이성 둘다를 입증한다. 이러한 실험에 기초하여, H22-R을 하기 생체내 실험에서 2x10-8M의 농도로 사용하였다.
실시예 III: CD64-면역독소에 의한 아폽토시스의 유도
H22-Ricin A의 세포독성 효과가 아폽토시스 유도때문이었는지를 확인하기 위하여, 저장성 완충액에서 프로피듐 요오다이드 염색을 수행하였다. 이 분석법에서, 분절된 아폽토틱 핵은 아이배체 DNA 함량에 의해 인식된다. 이러한 실험을 수행하기 위하여, 핵분열을 참고문헌[Nicoletti, I., 등 (1991) J. Immunol. Methods 139:271-279]에 기술된 바와 같이 프로피듐 요오다이드 염색을 사용하여 검출하였다. 간략히, 세포를 IT와 함께 인큐베이션시키고 다른 시점에서 회수하였다. 세포를 에탄올로 -20℃에서 고정시키고, 추출 완충액(0.05M Na2HPO4; 0.0025M 시트르산; 0.1% Triton X-100; 20㎍/㎖ 프로피듐 요오다이드)과 함께 인큐베이션시켰다. 프로피듐 요오다이드 형광을 Fluorescent Activated Cell Sorter(FACScan) 유동 세포계산기(Beckton 및 Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다.
도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 아폽토틱 핵은 대조구와 비교하여 IT 처리된 배양물에서 검출되었다. 이 실험에서는, U937 세포를 IFN-γ로 자극하고, 다른 농도의 H22-R과 함께 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 아폽토틱 핵은 IT 노출 2시간 후에 검출되었고, 처리 16시간 후에도 여전히 분명하였다. 이러한 발견은 H22-Ricin A IT의 세포독성 효과가 아폽토시스의 유도로부터 발생함을 나타낸다. 아폽토시스-매개 세포 사멸은 생체내에서 hFcγRI 발현 세포의 고갈에 의해서 잠재적인 유해 효과를 제한한다. 아울러, H22-R에 의해 유도되는 장기간 지속되는 세포 사멸(심지어 16시간 후에도)은 생체내에서 hFcγRI 발현 세포를 고갈시키는 IT로서 H22-R의 실용성을 제안한다.
실시예 Ⅳ: 인간의 만성 피부염중 FcγRI 발현 세포의 검출
다른 CD64 단일클론 항체, 10.1(Dougherty, G.J et al, 1987. Eur. J. Immunol. 17:1453-1459)의 염색 능력을 부위를 H22 항체로 예비 인큐베이션시킨 후에 다른 농도의 H22 항체의 존재하에 시험하였다. 10.1 및 H22가 hFcγRI상의 다른 에피토프를 인식하므로, 염색 강도 또는 패턴에서의 현저한 변화는 동시 인큐베이션경우에 검출할 수 없었다. 이러한 결과에 기초하여, 상기 10.1 항체를, 수집된 조직의 면역조직화학적 평가를 포함하는 모든 시험에 사용했다.
인간의 만성 피부염중 FcγRI 발현 세포의 존재를 조사하기 위해, 아토피성 피부질환(AD) 환자의 만성 피부염 세포로부터의 생검을 수집했다. AD의 진단을 하니핀과 라이즈카(Hanifin, J.M., and Rajka, G.(1980) Acta Derm Venereol (Stockholm) 92:44-47)의 표준 방법에 따라 수행했다. 아토피성 패치 시험(APT)을 랑게펠트-빌트슈트(Laneveld-Wildshut, E.G., et al.(1995) J. Allergy Clin. Immunol. 96:66-73)의 기술내용에 따라 수행했다. 요약하면, 피부를 10 테입 박피시키고 알레르겐 더마토파고이데스 프테로니시누스(Haarlem's Allergenen Laboratorium, Haarlem, The Netherlands; 80㎕, 10,000AU/㎖)를 아토피성 피부질환자의 등의 임상적으로 정상인 피부상에 류코테스트(Leucotest)(Beiersdorf, Hamburg, Germany)를 사용하는 동안에 적용시켰다. 상사 피부상에 나트륨 라우릴 설페이트(SLS, Sigma, 염수중 0.1%)를 비슷한 방법으로 적용시켰다. 폴리모르픽 광 발생(PLE)을 구진 및 액포, WA 및/또는 WB 조사 후의 심한 가려움 및 임상 반응의 존재와 함께, 폴리모르픽 임상 화면에 기초하여 진단했다. 과거에 노출된 적이 없는 피부를 6 최소 홍반 조사량으로 필립스 TL12 UVB원을 사용하여 조사시켰다.
인간 피부로부터의 부위를 FcγRI 항체를 사용하여 면역조직화학적으로 염색시켰다. FcγRI 발현 세포를 분홍/빨간색으로서 검출하고, 헤마톡실린으로 대조 염색시켰다. 정상의 비감염된 피부중에, FcγRI 발현된 세포는 거의 없었다. 반대로, 만성 병변 예를 들어, 아토피성 피부질환 피부에서는 진피중에 많은 양의 FcγRI 발현을 관찰했다. 표피중에 현저한 염색은 관찰하지 못했다. 후속하여, 급성상 모델로부터 예를 들어, 급성 패치 시험(APT)후 24시간 후, 폴리모르픽 광 발생 피부(PLE) 후 72시간 후, 및 나트륨 라우릴 설페이트(SLS) 처리 48시간 후에 생검체를 수집했다. 그러나, 이들 생검체는 유사한 결과로서, FcγRI 발현 세포의 수가 만성 감염된 조직에서 보다 다소 더 높은 결과를 가져왔다. 급성상 및 만성상 양자 모두에서 다수의 FcγRI 발현 세포의 존재는 염증성 피부 반응중 이들 세포에 대한 역할을 지시하였다.
실시예 Ⅴ: 만성 피부염에 대한 뮤린 모델의 설정
피부로부터 염증성 마크로파지의 제거의 가능성 및 이러한 제거가 피부염에 유익한 효과를 가지는지 여부를 결정하기 위해, H22-R을 실험 동물중에서 시험했다. SLS를 반복하여 국부 적용한 후에, hFcγRI 유전자이식 마우스 및 이들의 한 배 새끼의 털을 제거한 피부를 사용하여 만성 피부염의 도입을 관찰했다. 이들 마우스에서의 hFcγRI의 발현 패턴, 유전자 조절 및 기능은 인간에서의 경우를 대변했다(Heijinen, I. A., et al.(1996) J. Clin. Invest. 97:331 338). 수 개의 프로토콜을 시험하였으며, 5% SLS를 10일간 매일 적용하는 것이 상기 시료 및 방법 항목에 기술한 바와 같이 적합함을 밝혔다.
적은 수의 T세포, 수상세포, 및 마크로파지를, 정상의 비처리 피부(각각 ㎟당 5±4; 7±4; 및 15±3)중에서 검출했다. 또한, 정상의 비처리 세포부(㎟당 5±2)에서 hFcγRI 발현 세포를 거의 검출할 수 없었으며, 그 분포는 정상의 비감염성 인간 피부의 경우와 유사했다. SLS 처리 결과 표피 및 T세포, 수상세포, 및 마크로파지로 구성된 다량의 진피 침윤물이 두꺼워졌다(도 3a). 이러한 실험을 위해, 한 차례의 피하 IT 주사를 만성 염증성 피부에 투여하고, 다른 간격으로 펀치 생검을 취하고 면역조직화학적으로 염색시켰다. hFcγRI 발현 세포는 또한 극적으로 증가했으며(도 3a)(㎟당 75±11), 만성 감염성 인간 피부에서와 같이, 이들 세포는 주로 진피에 분포했다. hFcγRI 유전자이식 마우스와 비 유전자이식 마우스 사이에 세포 조성물에서 현저한 차이점은 없었다. 그러나, 비 유전자이식 마우스 세포에서, hFcγRI에 대한 현저한 세포 염색을 관찰할 수 없었다. H22-R만을 단독으로 접종한 후에, hFcγRI 발현 세포 또는 마크로파지의 검출량을 관찰할 수 없었다. 만성 염증성 인간 피부와 hFcγRI 유전자이식 마우스중 SLS 도입 감염사이에, 세포 조성물 및 hFcγRI 발현과 관련한 유사성은 이것을 만성 피부염에서 hFcγRI 발현 세포의 역할을 연구하는데 적합하게 하였다. H22-R IT와 결합시킨 이러한 모델을 하기 실시예에 이용하였다.
실시예 Ⅵ: 생체내 hFcγRI 발현 마크로파지의 효과적인 소멸
H22-R이 시험관내에서 입증된 것과 같이, 생체내에서 hFcγRI 발현 세포의 사멸에 유효한지 여부를 측정하기 위해, H22-R을 상기 시료 및 방법 항목에 기술한 바와 같이, 인간 hFcγRI 발현 유전자이식 마우스내로 자극제, 5% 나트륨 라우릴 설페이트를 반복하여 국부 적용함에 의해 도입시켰다. hFcγRI 유전자이식 마우스 및 비 유전자이식 마우스의 SLS 처리 피부에 2×10-8M(H22 3㎍ 및 리신(Ricin) A 0.6㎍)을 2회 연속하여 10㎕씩 피하 주사했다. SLS 적용을 지속하는 동안 다른 시점에서 피부 샘플, 유출 림프절, 간 및 비장을 면역조직화학적 분석을 위해 수집했다.
피하 주사의 국부화된 특성을, 마크로파지에 의한 탄소 입자의 흡착을 검출함에 의해 조사했다. 탄소 입자의 주입 후의 뮤린의 피부 단면은 탄소 입자가 진피에 주로 존재하나, 피부 조직밑에는 존재하지 않음을 보였다. 이러한 분포는 피하 주입의 국부화된 특성을 입증했다.
나트륨 라우릴 설페이트의 반복된 국부 적용, 및 대조 비히클 또는 리신 A H22와 함께 피하 주입 후, 인간 FcγRI 발현 유전자이식 마우스의 대표적인 면역조직화학적 단면은 처리 24시간 후, 외피의 비후화 및 많은 수의 진피 침윤 세포를 보여주었다. 염색 패턴은 자극제에 의해 유도된 만성 염증을 지시했다. 검출된 대다수의 침윤 세포가 FcγRI 양성 마크로파지(분홍색 염색)였다. 이와 반대로, Fcγ 수용체 발현 침윤 세포의 염색은 면역 독성 리신 A-H22의 접종 후 24시간 후에 현저히 감소했다.
피부로부터 hFcγRI 발현 세포의 소멸을 IT 노출 24시간내에 검출했다(도 3a). 계속적인 SLS 적용에도 불구하고, 상기 소멸은 재집단화(repopulation) 발생후 약 96시간에 이르러서야 완성되었다. 재집단화는 120시간에 비로소 완성되었다 (도 3a). 유출 림프절, 간, 및 비장에서, hFcγRI중에 어떠한 현저한 변화도 관찰할 수 없었다. 이러한 관찰은 잔존 효과가 주사 부위에 제한된다는 사실을 강조하였다. 대조 비히클 접종 부위 및 비 유전자이식 마우스에서, 어떠한 현저한 변화도 관찰할 수 없었다. hFcγRI 발현 세포의 신속하고, 거의 완전한 소멸 및 피부로부터 이들의 방어 부재는, 생체내 만성 피부염중 hFcγRI 발현 세포의 제거에 있어 H22-R IT의 이용가능성을 제시했다.
실시예 Ⅶ: 국부 피부염상 hFcγRI 발현 세포의 소멸의 효과
hFcγRI 발현 세포의 감소와 동시에, 다량의 MOMA-2 발현 마크로파지가 감소했다. 이러한 발견은 H22-R의 주입이 감염 피부로부터 염증성 마크로파지의 효과적인 감소를 초래하였음을 제시하였다(도 3a). 이와 반대로, 비 유전자이식 마우스에서는 마크로파지 수의 변화가 전혀 없었다. 이러한 선택적인 감소는 피부로부터 마크로파지를 표적화하고 제거하는데 H22-R의 선택성을 확증시켜 주었다.
마크로파지 소멸의 국부화된 특성을 추가로 평가하기 위해, 조혈 조직 예컨데, 림프절, 비장, 및 간을 조사했다. 다른 조혈조직에서 면역독소에 의한 세포수의 현저한 감소는 관찰할 수 없었다. 비 유전자이식 한 배 새끼의 마우스에 대한 상기와 동일한 처리는, 조사된 세포 수에 있어서 검출 불가능한 작은 변화를 가져왔다. 이러한 결과는 마크로파지의 소멸이 인간 hFcγRI 발현 세포에 대해 특이적이며, 접종 부위에 한정됨을 지시했다.
국부적으로 마크로파지를 제거하는 상기 방법의 특이성을, 조사된 시점 동안, 수상세포, T세포 집단, 또는 랑게르한스섬 세포에서는 어떠한 현저한 소멸이 없는 반면에, 마크로파지가 24시간 이내 정도로 조기에 소멸함에 의해 추가로 입증했다. 상기 H22-R 주입은 T세포 및 수상세포의 수에 어떠한 현저한 영향을 주지 않았다(도 3b). 그러나, hFcγRI 발현 마크로파지의 소멸 후, 피부중 T세포 및 수상세포의 수가 감소하기 시작했다. 심지어 염증성 자극의 지속적인 존재하에서도, T세포 및 수상세포의 수의 감소는 국부 감염의 해소 및 그에 따른 국부 염증에서의 염증성 마크로파지의 유익한 감소 효과를 지시했다(도 3b).
이러한 발견은 피부로부터 염증성 마크로파지의 조직학적 수준에서의 소멸중에 CD64 IT의 유효성 및 특이성을 입증했다. 후속하는 다른 염증성 세포의 소멸은 만성 피부염에서 마크로파지의 해악을 지적한다.
실시예 Ⅷ: 국부적 마크로파지의 소멸의 피부의 임상적 개선 초래
국부적인 마크로파지의 소멸이 피부의 임상적 개선을 초래하는지 여부를 측정하기 위해, 2개의 변수를 측정했다: 국부 피부 온도 및 홍반. 홍반은 주로 증가된 모세관 팽창의 결과이며, 증가된 피부 온도와 직접적으로 관련된다.
SLS 적용 및 IT 접종에 의해 유도된 피부의 온도 변화를 검출하기 위해, 약한 진정제로 동물을 고정시키고, 스킨 프로브(Ellab A-H1, Denmark)를 사용하여 국부 온도를 측정했다. 염증의 변수로서 모세관 팽창 및 혈관 연결을 명료하게 하기 위해, 에테르로 동물을 진정시키고, 1% 에반스 블루 용액을 정맥주사했다. 15분 후에 동물을 죽이고, 검사를 위해 박피시켰다.
작은 스킨 프로브를 사용하여, IT 처리 및 대조 동물중 피부 온도의 국부 적 변화를 측정했다. SLS 처리 후의 온도 증가를 측정하여 국부 염증의 도입을 확인했다. 도 4a는 H22-R의 피하 주사가 국부 피부 온도에 미치는 영향을 시간의 함수로서 나타낸 막대 그래프이다. 온도의 감소가 비처리된, 비감염된 피부에 필적할 정도의 수준에 이르렀다. IT 처리 동물에서 이러한 온도 감소를 통상 96시간 동안 지속적으로 검출했다. 이러한 시간의 경과 후에, 상기 온도는 다시 증가하여, IT 접종 이전의 수준에 필적할 정도의 수준에 이르렀다. 이러한 온도 변화는 염증의 해소를 지시하였다. 대조 비히클 또는 비유전자이식 마우스중 어느 것에서도 유사한 온도 감소를 볼 수 없었다. 또한, 마크로파지의 소멸과 국부적 피부 온도의 감소 사이의 밀접한 일시적인 상호관련성을 관찰했다. 다시 말하면, 마크로파지의 재출현시에 온도 증가를 검출했다. 이러한 발견은 국부 염증에서 마크로파지의 결정적인 역할에 대한 고도의 암시였다.
마우스에서, 피부의 적색화는 뮤린의 피부가 얇기 때문에 감지하기 어렵다. 국부적인 모세관 팽창의 시각화를 용이하게 하기 위해, 에반스 블루를 이들 마우스내로 정맥주사했다. 이들 구체예에서, hFcγRI 유전자이식 마우스(n=9) 또는 비유전자이식 마우스(n=9)를 SLS 및 IT를 피하 적용함에 의해 만성 피부염을 도입시키거나, 대조 비히클을 피하 투여했다. 동물을 죽인 후 24시간 30분 후에, 에반스 블루를 정맥주사하고, 피부를 중간 부위로부터 박피했다. 이러한 방법을 사용하여, SLS 처리후의 염증성 반응의 존재를 검출했다. 비 유전자이식 마우스 또는 대조 비히클중, 모세관 팽창에서 IT의 현저한 효과는 없었다. 그러나, 후자의 H22-R 주사면에서, 접종 부위 그 자체는 국부 염증의 해소를 제시하는 블루 염색이 없었다. 또한, 블루 염색의 전체적인 강도는 H22-R 주사면이 보다 더 약했다.
실시예 Ⅸ: 생체내에서 CD64-IT로 반복 주입시 연장된 염증 억제
IT가 연장된 시간 동안 사용될 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 피부 온도를 매일 측정하고, 증가시에 동물을 같은 부위에 다시 접종했다. 시험중, 계속하여 SLS를 적용했다. 도 4b는 염증이 H22-R만 주입시킨 hFcγRI 유전자이식 마우스에서 18일 이상 조절될 수 있음을 제시한다. 대조 비히클 및 비유전자이식 마우스는 시험된 어떤 시점에서도 온도의 현저한 증가를 제시하지 못했다. IT의 반복 주입은 염증을 연장된 시간동안 억제시키는 것이 가능함을 제시했다. 이러한 발견은 환자의 만성 피부염에 연장된 IT 처리의 적용 가능성을 입증했다. 이러한 사실을 모두 고려하면, 이들 실험은 SLS 적용에 의해 유도시킨 만성 피부염에서 국부적 마크로파지의 제거의 유익한 효과를 제시한다.
요약하면, 하기 실시예중에 제시된 실험은 활성화된 마크로파지가 본 발명의 조성물 및 방법에 의해, 다른 피부 또는 조혈 세포 집단에 현저한 영향을 주지않고, 선택적으로 제거될 수 있으며, 효과적으로 제거될 수 있음을 제시한다. 또한, 면역독성의 효과는 주로 전달된 영역에 국부화되며, 따라서 다른 FcγRI 발현 세포에 대한 부정적인 효과를 감소시킨다. 마크로파지의 제거시 염증의 감소는 피부염의 도입 및 지속제로서의 염증성 마크로파지의 중요성을 암시한다. 염증성의 감소는 임상적 변수 예컨데, 국부 피부 온도 및 피부의 적색화의 감소에 의함은 물론, 조직학적 수준에서 검출된다. 또한, 반복 적용은 연장된 기간 동안 염증의 억제를 가져온다. 연장된 유효성은 본 발명의 방법 및 조성물을 만성 피부 질환을 겪고 있는 환자의 국부 피부염을 치료하는데 사용할 수 있는 잠재적 용도를 제시한다. 본원의 상기한 접근은, 염증성 마크로파지가 다른 유형의 만성 염증 예컨데, 류마티스 관절염의 만성에 주요 역할을 할 가능성이 크므로, 보다 더 광범위한 적용 가능성을 가진다.
인간의 CD64에 대한 염색은 급성 또는 만성 피부염중에 다수의 FcγRI 발현 세포를 제시한다. 이러한 관찰은 FcγRI를 통한 마크로파지의 표적화가 인간의 피부염에 대해 신규한 접근법을 제공할 수 있음을 제시한다. 실제로, 본원에 제시된 hFcγRI 유전자이식 마우스에서 SLS 유도시킨 만성 염증의 효과적인 감소는 이들 면역독소의 잠재적인 치료적 용도를 제시한다.
균등물
본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 기술자라면,단지 일반적인 실험을 수행함에 의해, 본원에 기술한 특정 구체예의 많은 균등물을 인식할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구항에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (25)

  1. (a)Fc 수용체와 결합하는 약제 및 (b)마크로파지를 치사시키거나 이의 활성을 감소시키는 약제를 포함하는 마크로파지 결합 화합물과 마크로파지를 접촉시키는 것을 포함하여, 마크로파지의 수 또는 활성을 선택적으로 감소시키는 방법.
  2. (a)Fc 수용체와 결합하는 약제 및 (b)마크로파지를 치사시키거나 이의 활성을 감소시키는 약제를 포함하는 마크로파지 결합 화합물을 피검자의 선택된 부분에 국부적으로 투여하는 것을 포함하여, 피검자의 선택된 부분내에 있는 마크로파지의 비정상적인 활성 또는 수가 특징인 피검자의 질병을 치료하거나 예방하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, Fc 수용체와 결합하는 부분이 내인성 면역글로블린에 의해 결합되지 않는 부위에서 결합함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, Fc 수용체가 Fcγ 수용체(FcγR) 또는 Fcα 수용체(FcαR)임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, Fcγ 수용체가 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, Fcγ 수용체가 인간 FcγRI임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서, Fc 수용체가 인간 FcαR임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 마크로파지 결합 화합물이 독소와 접합된 항-Fc 수용체 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 항-Fc 수용체 항체가 항-Fcγ 수용체 항체 또는 이들의 단편임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 항-Fcγ 수용체 항체가 mab 22, 32 및 197 또는 이들의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 단일클론 항체임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 항-Fcγ 수용체 항체가 ATCC 접수 번호 CRL 1117 또는 이들의 단편을 가진 세포 라인에 의해 생성된 인간화된 항체 H22임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8항에 있어서, 독소가 겔로닌, 사포린, 외독소 A, 온코나제 및 리신 A로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 마크로파지를 치사시키거나 이의 활성을 감소시키는 약제가 리포좀내로 캡슐화됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 마크로파지를 치사시키거나 이의 활성을 감소시키는 약제가 디클로로메틸렌 디포스포네이트(CL2MDP) 또는 이들의 유도체임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13항에 있어서, Fc 수용체와 결합하는 약제가 단일 사슬 항체임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 13항에 있어서, Fc 수용체와 결합하는 약제가 항-Fcγ 수용체 항체 또는 이들의 단편임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 13항에 있어서, Fc 수용체와 결합하는 약제가 단일 사슬 항-Fcγ 수용체 항체 또는 이들의 단편임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 접촉 단계가 배양물에서 일어남을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 마크로파지 결합 화합물이 약제학적으로 허용되는 운반체내에서 국소, 피내 또는 피하 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 2항에 있어서, 질병이 마크로파지의 증식 및/또는 성장 인자 분비 증강이 특징임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 2항에 있어서, 질병이 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 피부 홍반성 낭창, 인간 면역결핍 바이러스 감염, 다발성 경화증, 류마티즘성 관절염, 만성 다형광선피진, 만성폐쇄성 폐질환 및 베게너 육아종증으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  22. Fc 수용체와 결합하는 약제를 포함하는 마크로파지 결합 화합물과 피검자로부터의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 및 이 샘플에서 Fc 수용체 단백질의 양에 대한 지표로서 Fc 수용체 결합의 수준을 탐지하는 단계를 포함(여기에서 Fc 수용체 단백질의 증가된 발현 또는 Fc 수용체 단백질을 발현시키는 마크로파지의 수의 증가는 마크로파지 매개 질병의 지표임)하여 마크로파지의 비정상적인 수 또는 활성이 특징인 피검자의 질병을 진단하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 마크로파지 결합 화합물이 탐지가능한 표지물을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22항에 있어서, Fc 수용체 단백질 발현이 자동방사선사진, 비색, 발광 또는 형광 탐지법에 의해 탐지됨을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22항에 있어서, 질병이 건선, 아토피성 피부염, 다발성 경화증, 경피증, 피부 홍반성 낭창, 인간 면역결핍 바이러스 감염, 만성 다형광 선피진, 만성폐쇄성 폐질환 및 베게너 육아종증으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
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