CN1307590A - 用fc受体配基治疗和诊断巨噬细胞介导的疾病 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于在局部区域选择性地靶向巨噬细胞的方法和组合物。本发明的组合物包含Fc受体结合试剂,以及毒性的或可检测的试剂。公开了缺失或抑制巨噬细胞活性的方法。本发明的组合物可用于治疗或诊断目的。
Description
发明背景
在正常人的皮肤中可区分出两个分开的层。上层,表皮层,由角质细胞、郎格罕氏细胞和T细胞组成。下层,真皮层,由纤维原细胞、内皮细胞和树突状细胞、T细胞、肥大细胞和巨噬细胞组成。
皮肤是外环境和内环境之间的重要分界。它主要防止和潜在的有害物质接触。在抗原/病原体侵入时在体内诱导炎症反应以清除抗原。该反应导致真皮渗透,渗透的成分依赖于所诱导的应答的类型,但主要由T细胞、多形核细胞和单细胞组成(Williams.I.R.,andKupper.T.S.(1996)Life Sci.58:1485-1507;Stingl,G.(1993)Recent Results Cancer Res.128:45-47)。此外,非特异性的过敏原刺激如组织损伤和紫外线也能诱发炎症反应。通常,在过敏原特异性反应的效应器阶段也应用了过敏原非特异性反应的机制。
巨噬细胞是来自骨髓的细胞,具有很大的异质性和多样性。这些细胞能产生范围很广泛的介导物质并执行许多生物功能(Ganz,T.(1993)New Horiz.1:23-27)。它们的表型和功能很大程度上受局部环境决定,而源自巨噬细胞的介导物质因此能影响它们的微环境。这种微环境导致区域性的不同巨噬细胞子集,出现区域化的不同巨噬细胞亚群(Gordon,S.(1995)Bioessays 17:977-986)。这些细胞是强有力的效应细胞,它们产生能直接损伤组织的活性氧产物和蛋白水解酶(Laskin,D.L.,and Pendino,K.J.,(1995)Annu RevPharmacol Toxicol.35:655-677)。在正常条件下巨噬细胞调节细胞外基质形成细胞如皮肤中的纤维原细胞(Gonzalez-Ramos,A.etal.(1996)J.Invest.Dermal.106:305-311)。此外,巨噬细胞能执行重要的免疫调节功能,通过这种方式在控制和导向免疫应答中起着重要的作用(Gordon,S.(1995)Bioessays 17:977-986;Thepen,T.et al.,(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.725:200-206)。这些细胞可作为抗原递呈细胞,但也通过树突状细胞直接抑制抗原递呈(Holt,P.G.et al.(1993)J.Exp Med。177:397-407)。巨噬细胞可影响T细胞的增殖、表型和功能,从而影响所诱导的免疫应答。
皮肤巨噬细胞在调节不同非造血细胞(例如纤维原细胞和角化细胞)以及T细胞和树枝状的细胞的生长中起了重要的作用。在“稳态”条件下,皮肤巨噬细胞的数量相对较少。然而,在各种病理条件下(例如,活跃的伤口),巨噬细胞的数量显著增加。组织巨噬细胞和渗透单核细胞与发炎伤口中的修饰纤维原细胞和角化细胞的功能以及T细胞和/或树枝状细胞的异常功能是相关的。
和郎格罕氏细胞相反,暴露于紫外线能在皮肤中诱导出一类能激活自活性(autoreactive)T细胞的巨噬细胞群。已经发现巨噬细胞功能失控与各种疾病,包括皮肤T细淋巴瘤(霉菌类)、牛皮癣、遗传性过敏皮肤炎和红斑狼疮中的异常皮肤免疫应答直接相关(Cooper,K.D.et al.,(1993)J.Invest.Dermatol.101:155-163;Gonzalez-Ramos,A.et al.(1996)J.Invest.Dermatol.106:305-311)。这些细胞也能激活常驻的或炎症的巨噬细胞,导致维持着皮肤炎症的“恶性循环”。除了调节细胞功能外巨噬细胞还是产生毒性化合物如氧自由基和蛋白水解酶的有力生产者。已知这些毒性化合物导致直接的组织损伤。
发明概述
本发明提供通过Fc受体选择性地将细胞毒化合物靶向到单核细胞来源的噬菌细胞(即巨噬细胞)的组合物和方法。因此本发明被用于在局部区域如皮肤、关节和肺部选择性地减少一群巨噬细胞的数量。
在一个实施方案中,本发明提供了一种结合巨噬细胞的化合物,该化合物至少含有能结合到呈现于巨噬细胞的Fc受体的第一部分,和至少含有能杀灭或抑制巨噬细胞功能的第二部分。上述结合到Fc受体的部分可以包括任何能结合Fc受体的分子,例如抗体、肽(例如肽模拟物)或化学化合物。在一个实施方案中,Fc受体结合部分是抗体或抗体片段(例如Fab,Fab’,F(ab’)2,Fv,或单链Fv)。在一个优选的实施方案中,抗-Fc受体抗体或抗体片段是“人源化的”(例如至少有一个源自非人类抗体(例如鼠)的互补性决定区(CDR)或互补性决定区的一部分,其它部分是人源的)在另一个优选的实施方案中,抗-Fc受体抗体或抗体片段是人单克隆抗体(例如由能表达完整人抗体的基因工程鼠产生的抗体)。这些方案中还包含“模仿”这样的抗-Fc受体抗体的结合的化合物(例如肽或化学物质)(Jenks et al.J.Natl.Cancer Inst.(1992)84(2):79;Saragovi et al.Science,(1991)253:792;Hinds et al.J.Med,Chem.(1991)34:1777-1789:Fassina Immunomethods(1994)5:121-129)。在另一个实施方案中,巨噬细胞结合化合物的Fc受体结合部分是花青苷组合物,如荧光染料Cy5.18.OSu(此处用“Cy5”表示),它和呈现于巨噬细胞的FcγRI受体以很高的亲和性和特异性结合。花青苷组分可包括至少两个部分:花青苷琥珀酰亚胺(succimidyl)酯和藻胆蛋白体蛋白,例如PE。
为本发明的巨噬细胞结合化合物所识别的Fc受体可以是IgG受体,例如Fc-γ受体(FcγR),如FcγRI(CD64),FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16),或IgA受体,如FcαR(例如FcαRI,CD89)。Fc受体优选地位于巨噬细胞,例如皮肤巨噬细胞,的表面,以便它能被上述化合物所识别和结合。在一个优选的实施方案中上述巨噬细胞结合化合物的抗Fc受体结合部分和Fc受体结合的位点和内源性免疫球蛋白(例如IgG或IgA)所结合的位点截然不同。因此,上述巨噬细胞结合化合物与Fc受体的结合不会被生理水平的免疫球蛋白阻断。
巨噬细胞上用于定位的一种优选的Fc受体是高亲和性的Fcγ受体,FcγRI。因此在本发明的巨噬细胞结合化合物的抗Fc受体结合部分包括一个抗FcγRI抗体,或该抗体的一个片段。抗FcγRI抗体的例子包括mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。在一个优选实施方案中使用了这样的抗FcγRI受体抗体的人源化形式,如人源化单克隆抗体22(H22)或其片段。
上述巨噬细胞结合化合物的杀死巨噬细胞或调节(即降低)巨噬细胞活性的部分(抗巨噬细胞物质)可选自适当的细胞毒素或药物。例如抗巨噬细胞物质可以是Gelonin、皂草素、癌酶(Onconase)、外毒素A、蓖麻蛋白A(Ricin A)、二氯甲烷二膦酸酯(CL2MDP)或它们的衍生物。在一个实施方案中抗巨噬细胞物质是直接连接到巨噬细胞结合化合物的抗Fc受体结合部分的。在另一个实施方案中抗巨噬细胞物质是不直接连接到巨噬细胞结合化合物的抗Fc受体结合部分的。例如,抗巨噬细胞物质被包到和抗Fc受体结合部分连接的脂质体中。
本发明的巨噬细胞结合化合物可被用于多种治疗和诊断方法。在一个实施例中这些化合物被用于诊断一种疾病,该疾病的特征为巨噬细胞的数量或功能不正常。这些方法包括在允许上述化合物和样品中的巨噬细胞结合的条件下,在一个测试区域,或人工培养的样品中接触或施用上述巨噬细胞结合化合物。然后可检测化合物的结合,作为样品中巨噬细胞的存在(数量)和/或功能的指标。例如,特异性检测到的Fc受体蛋白水平的统计学意义上的显著升高表明巨噬细胞数量的增加,这可能意味着疾病。测试区域或样品可来自,例如,皮肤(如人类皮肤)或其它含巨噬细胞的组织。
在另一个实施方案中,巨噬细胞结合化合物被用于治疗一种涉及巨噬细胞的增殖和/或异常功能的疾病。当巨噬细胞化合物接触需要治疗的区域时,该化合物通过巨噬细胞的Fc受体结合到巨噬细胞上并且杀死这些细胞或降低这些细胞的活性。相应地,利用本发明的化合物可以治疗、预防或诊断广泛的涉及巨噬细胞(例如,巨噬细胞增殖和/或异常功能)的各种疾病。这些疾病可以是内源性的(例如自体免疫疾病),或外源性的(例如接触过敏症,多形性光疹(polymorphic light eruption,PLE),和过敏反应)。在遗传性过敏症和全身性红斑狼疮的情况下皮肤疾病可能是更为全身性的疾病,如遗传性过敏皮炎(AD),的先兆。可以用本发明的组合物和方法治疗非限制性疾病列表包括自体免疫疾病、呼吸道疾病、感染疾病、皮肤疾病和炎症。这些疾病的具体例子包括,但不限于,牛皮癣、遗传性过敏皮炎、多发性硬化、硬皮病、皮肤红斑狼疮、类风湿性关节炎、人类免疫缺陷病毒感染、慢性多形性光照皮肤病(CPLD)、慢性阻塞性肺病(COPD),例如过敏性哮喘和类肉状瘤病、Wegener氏肉芽肿病和炎症,如皮肤损伤(例如开放的伤口或烧伤)。进而,本发明的方法和组合物可被用于体外诊断这样的疾病,或用于研究目的(例如研究巨噬细胞在这样的疾病中的角色)。
当用于体内治疗目的时可将优选剂量的本发明的巨噬细胞结合化合物局部施用(例如局部地,皮内地,皮下地或作为雾剂吸入)到选中区域以衰竭或降低施用区域内的巨噬细胞活性。在某些实施方案中巨噬细胞结合化合物可包括在施用(例如全身施用、局部施用或肌肉内施用)无活性,但暴露于光(如可见或紫外光)时被激活的光敏物质。类似地,结合化合物可包括通过光敏连接连接到Fc结合剂上的治疗(或诊断)试剂,暴露于光时这些试剂被释放。这些化合物允许可控制地仅仅杀死或失活所选的暴露于光组织中的巨噬细胞。
本发明进而提供用于上述方法的组合物,例如含有巨噬细胞结合化合物以及可接受的自体或稀释液的药用组合物。
在下文的附图、详述、实施例和权利要求中本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
附图简述
图1是描述和培养基对照(±SEM)相比,[3H]-胸腺嘧啶掺入到培养的U937或IIA1.6细胞的百分比的柱状图。上述细胞是在存在或不存在不同浓度的CD64-免疫毒素(H22蓖麻毒素A,H22-R或197蓖麻毒素A,197R)的条件下生长的。在图示浓度的H22-R(图A)或197-R存在的情况下U937细胞与IFNγ(黑条)或不与(灰条)IFNγ一起培养。在图C和D中转化了hFcγRI(黑条)或未转化(灰条)的IIA1.6细胞与不同浓度的H22-R(图C)或197-R(图D)一起培养。
图2是U937细胞的碘化丙锭荧光扫描,因为这些细胞和不同浓度的H22-R保温后导致了细胞调亡。用碘化丙锭染色分析了核碎片并用柱图表示了亚二倍体核。柱图上的数字表示亚二倍体的百分比,即调亡核。con=对照。
图3A和B表明一次皮下注射免疫毒素对皮肤的炎症细胞的效力与时间的关系。数据点代表每平方毫米(±SEM)中细胞的平均数量并且数据点代表了大于三次实验的平均结果。所描述的是hFcγRI-表达细胞(实心方格,图3A)、巨噬细胞(空方格,图3A)、T细胞(实心方格,图3B)和树枝状细胞(空方格,图3B)的动力学。
图4A-4B表明皮下注射免疫毒素时局部皮肤温度的降低。图4A描述了SLS处理的hFcγRI转基因鼠经过一次注射IT(·)(n=6)或载体对照(O)(n=6)以后局部皮肤温度读数(±SEM)。图4B表明SLS处理的hFcγRI转基因鼠注射IT(·)(n=6)或载体对照(O)(n=6)时的温度过程。每天监测局部皮肤温度,并且温度升高时就在同样的部位重新注射动物(天数用*标记)。
发明详述
在许多种病症中,例如皮肤疾病、自体免疫疾病、传染疾病和炎症中都表明存在巨噬细胞功能异常,包括增殖和/或活性异常。目前为止,利用细胞毒素例如免疫毒素局部消除巨噬细胞的方法的功效是有限的。本发明提供了用于诊断、治疗和预防这些疾病的方法和组合物,该方法和组合物通过在局部区域有选择地减少巨噬细胞和/或抑制巨噬细胞的活性。通过巨噬细胞的Fc受体将毒性物质定位到巨噬细胞上使细胞减少(例如被杀死)和/或被抑制(例如活性降低)。例如,此处描述的研究演示了巨噬细胞结合化合物的应用,该化合物含有偶联到一种毒素上,例如蓖麻毒蛋白A,的抗-Fc受体结合部分,例如抗人FcγRI受体的人源抗体,以便在表达人hFcγRI的转基因鼠体内有选择地排除巨噬细胞。此处所用的术语“巨噬细胞”“源自单核细胞的吞噬细胞”应该是可以互换使用的。
相应地,在一个实施方案中,本发明提供了一种巨噬细胞结合化合物,该化合物包含一种能结合到呈现于巨噬细胞的Fc受体上的试剂和一种能杀死所结合的巨噬细胞或抑制该巨噬细胞活性的试剂。用于结合Fc受体的适当组分包括,例如,蛋白(例如抗-FcR抗体和肽或其化学模拟物,或FcR受体配基)和化学部分(例如染料和合成的FcR配基)。这些Fc受体结合试剂可以是单特异性、双特异性、或多特异性的,因为它们分别含有一个、两个或两个以上的结合区域。例如,该试剂可结合到Fc受体的两个或更多个不同区域,或结合到Fc受体以及同一细胞或另一细胞的不同组分。在所有的情况下该试剂含有至少一个结合Fc受体的部分。
在一个实施方案中Fc受体结合试剂是抗体或抗体片段,包括,如,Fab,Fab’,F(ab)2,Fv,或单链Fv。上述抗体也可以是轻链或重链二聚体或其任何极小片段,如Fv或1990年8月7日发表的Ladner等,美国专利第4,946,778号中所公布的单链构建物,上述专利的内容在此引入作为参考。
在另一个实施方案中Fc受体结合试剂是抗体模拟物(如肽或化学化合物)(Jenks et al.J.Natl.Cancer Inst.(1992)84(2):79;Saragovi et al.Science(1991)253:792;Hinds et al.J.Med.Chem.(1991)34:1777-1789;Fassina Immunomethods(1994)5:121-129)。
在另一个实施方案中Fc结合组分是双特异性或多特异性分子。术语“双特异性分子”是用于包括任何具有两个不同的结合特异性的化合物,如,化学部分或蛋白、肽或蛋白或肽的复合物,它和(a)巨噬细胞表面上的Fc受体,以及(b)第二个不同的目的抗原结合或相互作用。术语“多特异性分子”或“杂合特异性分子”是用于包括任何具有两个以上不同的结合特异性的化合物,如,化学部分或蛋白、肽或蛋白或肽的复合物,它和(a)巨噬细胞表面上的Fc受体,以及(b)两个或更多个不同的目的抗原结合或相互作用。相应地,可被用于本发明的巨噬细胞结合化合物的Fc受体结合试剂包括针对巨噬细胞Fc受体的双特异性、三特异性、四特异性和其它多特异性分子。
例如,该试剂可以是包含连接到一起的具有不同特异性的两个或多个抗体、抗体结合片段(例如Fab)或其衍生物的杂合抗体。这些不同的特异性可包括Fc受体上的两个或更多个不同的结合特异性。替代地,它们可包括一个Fc受体上的结合特异性和至少一个同一细胞(即巨噬细胞)或不同靶细胞(即其它免疫细胞或病原体)上的其它不同的结合特异性。
在Fc结合试剂是双特异性或多特异性分子的实施方案中该试剂可通过在物理上使得细胞毒性效应细胞和靶巨噬细胞靠近而发挥功能,从而更有效地靶向消灭巨噬细胞。如此处所用,术语“效应细胞”指参与免疫应答的效应阶段的免疫细胞,而不是参与免疫应答的识别阶段或激活阶段。免疫细胞的例子包括源自骨髓或淋巴的细胞,如淋巴细胞(如B细胞和T细胞,包括细胞毒性T细胞(CTLs))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。类似巨噬细胞,效应细胞表达特异的Fc受体并执行特异的免疫功能。在优选的实施方案中效应细胞能诱导抗体依赖的细胞毒性(ADCC),如嗜中性粒细胞能诱导ADCC。例如,表达FcαR的嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和T细胞参与特异性地杀死靶细胞并将抗原递呈给免疫系统的其它成员,或和呈现该抗原的细胞结合。在另一个实施方案中效应细胞能吞噬靶抗原或细胞(例如巨噬细胞),或微生物或能裂解该靶细胞,如巨噬细胞。特定的Fc受体在效应细胞上的表达可为体液因子如细胞因子所调节。例如有人发现FcγRI的表达为干扰素γ(IFNγ)所上调。这种增强后的表达能提高带FcγRI的细胞针对目标,如巨噬细胞,的细胞毒性。
在本发明的另一个实施方案中Fc受体结合试剂是单克隆抗体或其片段。此处所用的术语“单克隆”或“单克隆抗体组分”指单一分子组分的抗体制备物。单克隆抗体表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体可以是鼠的或人的单克隆抗体(例如,表达完整人抗体的遗传工程鼠产生的抗体)。
在本发明的另一个实施方案中Fc受体结合试剂是嵌合抗体或其片段,或人源抗体或其片段。“嵌合抗体”是用于包括一种抗体,其可变区源自一种动物而其恒定区源自另一种动物。例如,一种嵌合抗体可以是含有源自小鼠单克隆抗体的可变区和源自人的恒定区的抗体。在本发明的一个优选实施方案中,巨噬细胞结合化合物含有人源抗体或其结合片段。术语“人源抗体”是用于包括一种抗体,其高变区,也称为互补决定区(CDRs)源自一种动物,而其框架区和恒定区源自不同不同种的动物。在本发明的一种人源抗体中CDRs是源自小鼠而该抗体的其它区域源自人类。在优选的实施方案中重链可变区(VHs)源自已知蛋白NEWM和KOL,Ig Kappa链可变区源自REI。此处所用的术语抗体是用于包括嵌合和人源抗体、抗体的结合片段或其修饰形式。
术语抗体或蛋白的能结合抗原的“片段”或“结合片段”是用来包括抗体或蛋白能结合抗原的片段。和完整抗体和抗原的结合相比,抗体的结合片段和抗原的结合可以具有相同的亲和性或不同的亲和性,例如,更高或更低的亲和性。术语抗体中所包含的结合片段的例子包括:由VL,VH,CL和CH1结构域组成的Fab片段;由VH和CH1组成的Fd片段;由一个抗体的一条臂的VH和VL组成的Fv片段;有VH结构域组成的dAb片段(Ward et al.1989 Nature 341:544-546);分离的互补决定区(CDR);和F(ab)’2片段,一种由两个Fab片段在铰链区通过二硫键连接在一起的片段。结合片段,例如抗体的结合片段,可以是活性或功能性的结合片段。相应地,活性或功能性结合片段用来包括能引发至少一种全长分子所引发的功能或活性的结合片段。例如单克隆抗体M22或H22的活性结合片段是该抗体能和结合FcγR并引发受体介导的效应细胞活性的片段。这些抗体是通过本领域中具有一定技术的人员所已知的传统技术得到的,并通过和完整抗体一样的方法筛选这些片段的用途。
在此所用的“和……结合的试剂”或“结合特异性”与术语“抗原结合位点”、“抗原结合区域”以及“抗体的结合决定簇”是可以互换使用的。这些术语用于包括分子,例如抗体,的参与结合抗原的区域。抗体的抗原结合位点包括,但不限于,抗体和抗原接触的氨基酸。抗原结合区域可以是抗体的可变区。抗原结合区域也可以是抗体的高变区。抗体的抗原结合区域也可以是抗体高变区的与抗原接触和/或为抗原结合区域提供适当三级结构的氨基酸残基。有许多方法可用于决定抗体可变区或高变区的哪些氨基酸残基接触抗原和/或对抗原结合区域的正确折叠是重要的。例如,可进行基因突变分析。特别地,可以在重组抗体中把一个或多个氨基酸替换成其它氨基酸,并且进行体外结合实验以确定和非修饰的抗体相比,修饰抗体抗原结合力的改变程度。如果结合力下降是由于一个氨基酸替换成另一个氨基酸,那么该氨基酸在抗体结合抗原时很可能是重要的。确定抗体可变区的哪些氨基酸残基参与抗体和抗原结合的其它方法是建立在晶体学分析,例如,X-射线晶体学,的基础上的。
术语“特异性结合抗原的抗体”用于包括一种抗体,该抗体和特异性抗原结合的亲和性显著高于和其它抗原的结合,即,它用于按照本领域中的方式定义抗体的特异性。术语“识别抗原的抗体”、“对抗原特异的抗体”在此处可以与“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
抗-Fc受体结合试剂的生产
I.抗-Fc受体抗体的生产
用于本发明巨噬细胞结合化合物的抗-Fc受体抗体包括任何通过各种已知的技术生产的抗体,前提是该抗体能结合到巨噬细胞的Fc受体上。优选的抗体是可用作临床用途的(例如,可施用于人类)。特别优选的抗体对人类施用时是非免疫原性的(例如,转基因动物产生的人抗体),或该抗体被修饰以便当抗体施用于人类时免疫原性减小(例如,人源化的)。
在一个实施方案中,抗-Fc受体抗体是单克隆抗体,例如,鼠或人的单克隆抗体,该抗体结合到IgG受体或IgA受体上,优选地结合到不会被人类免疫球蛋白G(IgG)或免疫球蛋白A(IgA)阻断(例如,结合)的位点上。此处所用的术语“IgG受体”指位于染色体1上的任意八个FcγRI受体基因。这些基因编码全部的十二种跨膜或可溶的同工型受体,这些同工型受体分为三类FcγR受体:FcγRI(CD64),FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中,Fcγ受体是人高亲和性的FcγRI。该人FcγRI是72KD的分子,表现出对单体IgG(108-109M-1)的高亲和性。Fanger et al.在PCT申请WO88/00052和在美国专利号,4,954,617,中,描述了这些优选的单克隆抗体的生产和特征,其中的讲授内容在此全文引入作为参考。这些抗体结合到FcγRI、FcγRII或FcγRIII表位上与受体Fcγ结合位点不同的位点上,因此它们的结合基本上不会被生理学水平的IgG所阻断。本发明中有用的抗-FcγRI特异性抗体是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。产生mAb32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心获得,ATCC登记号HB9469。抗-FcγRI mAb22,mAb22的F(ab’)2片段可以从Medarex,Inc(Annandale,N.J.)获得。产生mAb32的杂交瘤于1996年7月从ATCC得到,并且指定的ATCC登记号为HB-12147。在另一个实施方案中,抗-Fcγ受体是人源化的单克隆抗体22(H22)。Graziano,R.F.et al.(1995)J.Immunol 155(10):4996-5002和PCT/US93/10384描述了H22抗体的生产和特征。产生H22抗体的细胞系于1992年11月储存在美国典型培养物保藏中心,名称为HA022CLl,登记号为CRL11177。
在其它的实施方案中,抗-FcR抗体是对IgA受体特异的。术语“IgA受体”用于包括位于19号染色体上的一个α-基因(FcαR)的基因产物。已知该基因编码几个55-110KDa的可选择剪切的跨膜同工型。FcαR(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞中组成性地表达,但不是在非效应细胞群中表达。FcαR对IgA1和IgA2有中等的亲和力(≈5×107M-1),暴露于例如G-CSF或FM-CSF的细胞因子时上述两种抗体增加(Morton,H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。抗-Fcα受体单克隆抗体的例子包括My43、A77、A62、A59和A3(Aonteiro et al.(1992)J.Immunol.148:1764;Shen et al.(1989)J.Immunol.143:4117)。优选的抗-FcαR抗体能结合到FcαR上而不会被IgA抑制。通过用含FcαR的丙烯酰胺凝胶片免疫小鼠产生了抗体A77,上述FcαR是利用IgA亲和性从人类细胞溶解物纯化得到的。单克隆抗体的筛选根据三个特征:被PMA激活后对U937细胞的染色密度更高,选择性地与血液单核细胞和粒细胞反应,能与嗜中性粒细胞和激活的U937细胞的大约55-75KDa的分子发生免疫沉淀反应。
用于本发明的化合物的抗-Fc单克隆抗体可通过多种技术得到,包括传统的单克隆抗体方法,例如,常规体细胞杂交技术,Kohlerand Milstein,(1975)Nature 256:495。虽然体细胞杂交方法在是优选的,但是从原理上说也可以应用其它单克隆抗体制备技术,例如,B淋巴细胞的病毒性或致癌性的转化。
制备杂交瘤的优选动物体系是鼠系。在鼠中生产杂交瘤是一种已经建立得很完善的方法。分离用于融合的免疫脾细胞的免疫方法和技术在本领域中是已知的。融合伙伴(fusion partner)(例如,鼠的骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
产生抗人蛋白的人单克隆抗体(mAbs)用的是携带完整的人免疫体系的转基因鼠而不是小鼠系统。源自用感兴趣的抗原免疫的这些转基因鼠的脾细胞被用于产生杂交瘤,该杂交瘤分泌对人蛋白表位具有特异亲和性的人mAbs。(参见,例如,Wood et al.国际申请WO91/00906,Kucherlapati et al.PCT发表WO 91/10741;Lonberget al.国际申请WO92/03918;Key et al.国际申请92/03917;Lonberg,N.et al.1994 Nature 368:856-859;Green,L.L.et al.1994 Nature Genet 7:13-21;Morrison,S.L.et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855;Bruggeman et al.(1993)Year Immunol.7:33-40;Tuaillon et al.(1993)PNAS 90:3720-3724;Bruggeman et al.(1991)Eur J.Immunol.21:1323-1326)。
在一个示例性的实施方案中,免疫后产生完全的人抗体应答的小鼠(HuMab鼠)可通过失活编码鼠抗体的基因而得到。这可以通过产生“双重敲除(double knockout)小鼠”而实现;通过定向缺失编码恒定区外显子(Cμ和JCκ)上述小鼠的内源免疫球蛋白重链和κ-轻链基因被破坏。可以分别构建包含人免疫球蛋白重链基因和人κ-轻链基因的基因。在人类中,这些基因分别包含1-2兆碱基,这样的长度太大了,不能完整分离。必需的区域可以被组装成被称为′微基因座(minilocus)′的简化形式。重链微基因座包含2-6个Vh基因片段、15Dh和6Jh基因片段,以及Sμ、Cμ、Sγ1、Cγ1。κ-轻链微基因座包含1-17Vκ-基因片段、5Jκ和Cκ基因片段(Lonberg,N.et al.(1994)Nature 368:856-859;Tuaillon,N.et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724)。随后这些微基因座可以插入’双重敲除’小鼠的基因组中。可以产生这些双重敲除/双转基因HuMab小鼠的几个连续株,这些小鼠中插入了越来越多的人重链和轻链loci。例如,已经得到的一种HuMab小鼠中插入了一段含六个V片段的100kb重链转基因和一段含17个Vκ-片段的200kb的轻链转基因。这些HuMab小鼠可以用传统的方法免疫,并且已经发现这些小鼠能高效地产生针对许多抗原的IgG1高亲和性抗体(Fishwild,D.M.et al.(1996)nature Biotech 14:845-851;Lonberg,N.and D.Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13:65-93)。已经发现按照这些方法得到的抗体具有很好的生物学活性已经很长的血清半衰期。
可通过本领域中一种的重组DNA技术得到小鼠-人嵌合单克隆抗体(即嵌合抗体)。例如,用限制性内切酶消化编码小鼠单克隆抗体Fc恒定区基因以除去编码小鼠Fc的区域,并用编码人Fc恒定区基因的对等部分替代(参见Robinson et al.,国际专利PCT/US86/02269;Akira,et al.,欧洲专利申请184,187;tANIGUCHI,m.,欧洲专利申请171,496;Morrison et al.,欧洲专利申请173,494;Neuberger et al.,国际专利申请WO86/01533;Cabilly et al.美国专利第4,816,567号;Cabilly et al.欧洲专利申请125.023,Better et a;/(1988 Science 240:1041-1043);Liu et al.(1987)PNAS 84:3439-3443;Liu et al.1987,J Immunol129:3521-3526;Sun et al.(1987)PNAS 84:214-218;Nishimuraet al.,1987,Canc.Res.47:999-1005;Wood et al.(1985)Nature 314:446-449;and Shaw et al.,1988,J.Natl Cancer Inst.80:1553-1559)。
嵌合抗体可通过用对等的人Fv可变区序列取代不直接参与抗原结合的Fv可变区的序列而进一步人源化。人源抗体的总体综述参见Morrison,S.L.,1985,Science 229:1202-1207和Qi et al.,1986,BioTechniques 4:214。这些方法包括编码源自至少重链或轻链之一的免疫球蛋白的所有或部分Fv可变区的核酸序列的分离、操作、和表达。这些核酸的来源对于本领域中技术熟练的人员是众所周知的,例如,可来自7E3,一种产生抗GPIIbIIIa抗体的杂交瘤。然后编码嵌合抗体或其片段的重组DNA可被克隆到适当的表达载体中。替代地,人源抗体可通过CDR替换产生美国专利5,225,539;Jones et al.1986 Nature 321:552-525;Verhoeyan et al.1988 Science 239:1534;和Beidler et al.1988 J.Immunol.141:4053-4060。
一种特定人类抗体的CDRs可被至少一部分非人类CDR置换,或只有一些CDRs能被非人类CDRs置换。只需要置换对人源抗体和Fc受体的结合必需的CDRs。
任何能用来自非人类抗体的CDR置换至少一部分人类抗体CDR的方法都可用于抗体的人源化。Winter描述了一种可用于制备本发明的人源化抗体的方法(英国专利申请GB2188638A,1987年3月提交。)其内容清楚地在此引入作为参考。可用题为Humanized Antibodiesto Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human MonoculearPhagocytes的国际专利申请WO94/10332中所描述的寡聚核苷酸定点突变的方法用非人类CDRs置换人类CDRs。
特定氨基酸被替换、缺失或添加的人源化抗体也包括在本发明的范围之内。特别是,优选的人源化抗体在框架区域进行了氨基酸替换,以增进和抗原的结合。例如,在CDRs为小鼠的人源化抗体中位于人类框架区域的可用小鼠抗体相应区域的氨基酸替换。已知这种替换在一些情况下能增进人源化抗体和抗原的结合。氨基酸被添加、缺失或替换的抗体在此被称为修饰抗体或改变的抗体。
术语修饰抗体也用来包括抗体的部分被缺失、添加或替换的抗体,如单克隆抗体,嵌合抗体和人源化抗体。例如,可通过缺失一种抗体的恒定区并用一种恒定区替换从而修饰该抗体以提高抗体的半衰期,如血清半衰期,稳定性或亲和性。只要巨噬细胞结合化合物具有至少一个对FcR特异的结合区域并能引发至少一种效应功能,那么任何修饰都是在本发明的范围内的。
也可通过重组DNA技术领域中的技术熟练人员已知的其它方法产生单克隆抗体。已经发展了一种被称为“组合抗体呈现”(combinatorial antibody display)的替代方法以鉴定和分离具有特定抗原特异性的抗体片段,并可被用于产生单克隆抗体(组合抗体呈现的描述参见,例如,Sastry et al.(1989)PNAS 86:5728;Huse et al(1989)Science 246:1275 and Orlandi et al.(1989)PNAS 86:3833)。按照上文描述的方法用免疫原免疫动物后,克隆了得到的B细胞库的抗体库。利用寡聚引物混合物和PCR得到多种免疫球蛋白群可变区DNA序列的方法大体上是已知的。例如,可利用相应于5’引导(信号肽)序列和/或框架(FR1)序列的寡聚核苷酸引物混合物以及相应于保守的3’恒定区的引物通过PCR从许多鼠类抗体中扩增重链和轻链可变区(Larrick et al.,1991,Biotechniques 11:152-156)。类似的测量可被用于从人类抗体中扩增重链和轻链可变区(Larrick et al.,1991,Methods:Companion to Methods inEnzymology 2:106-110)。
在一个示例性的实施方案中利用常规方法从B淋巴细胞,例如外周血细胞、骨髓或脾脏制备物,中分离了RNA(例如,美国专利第4,683,202;Orlandi et al.PNAS(1989)86:3833-3837;Sastryet al.,PNAS(1989)86:5728-5732;and Huse et al.(1989)Science 246:1275-1281)。用对重链、κ轻链和λ轻链恒定区特异的引物以及对信号序列特异的引物合成了第一条cDNA链。用可变区PCR引物单独或联合扩增了重链和轻链的可变区,并连接到适当的载体上以进一步操作以产生呈现包(display package)。用于扩增方法的寡聚核苷酸引物可以是独特的或简并的,或在简并位置掺入了次黄嘌呤。也可在引物中引入限制性内切酶位点以将扩增片段克隆到载体的预先决定的阅读框中进行表达。
从源自免疫的抗体库克隆得到的V基因文库可由一群呈现包表达,以形成抗体呈现文库,上述呈现包优选地来自丝状噬菌体。理想的呈现包包含一个体系,该体系允许非常多样化的抗体呈现文库的采样,经过每轮亲和分离后能快速归类,并且很容易从纯化的呈现包中分离抗体基因。除了可由商业途径获得的制备噬菌体呈现文库的试剂盒外(例如,the Pharmacia Recombinant Phage AntibodySystem,catalog no.27-9400-01;and the Stratagene SurfZAPTMphage display kit,catalog no.240612),可以找到特别适合用于生产噬菌体呈现文库的方法和试剂的例子,例如,Ladner et al.美国专利第5,223,409号;Kang et al.国际公开No.WO92/18619;Dower et al.国际公开No.WO91/17271;Winter et al.国际公开WO92/20791;Markland et al.国际公开No.WO92/15679;Breitling et al.国际公开WO93/01288;McCafferty et al.国际公开No.WO92/01047;Garrard et al.国际公开No.WO92/09690;Lader et al.国际公开No.WO90/02809;Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372;Hay et al.(1992)Hum AntibodHybridomas 3:81-85;Huse et al.(1989)Science 246:1275-1281;Griffths et al.(1993)EMBO J12:725-734;Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226:889-896;Clackson et al.(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res19:4133-4137;and Barbas et al.(1991)PNAS 88:7978-7982。
在一些实施方案中,可以在同一多肽上表达重链和轻链的V区结构域,上述结构域通过柔性的连接序列连接形成单链Fv片段,并且随后scFv基因被克隆到合乎需要的表达载体或噬菌体基因组中。如McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-554中所描述,通过柔性的(Gly4-Ser)3连接序列连接在一起的抗体的完整VH和VL结构域可被用于产生单链抗体,上述单链抗体可根据抗原亲和性赋予呈现包可分离性。然后分离的对抗原具有免疫反应性的scFV抗体可被配制成药用制备物以用于目的方法中。
一旦抗体库呈现于呈现包(例如,丝状噬菌体)的表面,就用FcγR或其肽片段筛选,以鉴定和分离能表达对FcγR特异的抗体的呈现包。可以从呈现包中回收编码选中的抗体的核酸(例如从噬菌体基因组中)并通过常规重组DNA技术亚克隆到其它表达载体中。
本发明的巨噬细胞结合化合物中对靶抗原具有高亲和性的抗Fc受体结合试剂和/或其它结合试剂的制备可根据本领域中的人员已知的方法,例如涉及文库筛选的方法(Ladner,R.C.,et al.,美国专利5,233,409;Ladner,R.C.,et al.,美国专利5,403,484)。进而,这些文库中的方法可被用于筛选以得到模拟抗体的结构决定簇的结合决定簇。特别是,特定抗体分子的Fv结合表面依照蛋白-蛋白相互作用的原则与其表位相互作用,因此,VH和VL(后者可能是κ或λ链型)的序列数据是本领域的技术人员已知的蛋白工程技术的基础。利用先前已确定的其它抗体的三维结构通过建模的方法可以从抗体的序列信息得到包含结合决定簇的蛋白表面细节,上述三维结构是从NMR研究或晶体学数据得到的。例子参见Bajorath.J.and S.Sheriff.1996.Proteins:Struct.,Funct.,and Genet.24(2),152-157;Webster,D.M.and A.R.Rees,1995.“抗体结合位点的分子模型”,in S.Paul,Ed.,分子生物学方法MolecularBiol.51,抗体工程方法。Humana Press,Totowa,NJ,pp 17-49;and Johnson,G.,Wu,T.T.and E.A.Kabat,1995,“Seqhunt:顺序排列的核苷酸和氨基酸序列的筛选程序”分子生物学方法Biol.51,op.cit.,pp1-15。
在一个实施方案中,抗-Fc受体结合试剂包含源自抗体的,并且移植到非抗体分子中的抗原结合位点。例如,抗原结合区域可以移植到肽或蛋白上。在一个实施方案中,抗体结合区域的一部分,例如,类似源自抗体轻链的抗原结合区域的部分,被移植到蛋白或肽上,并且抗原结合区域的另一部分,例如,类似源自抗体重链的抗原结合区域的部分,被移植到另一个蛋白或肽上。在本发明的一个优选的实施方案中,分别具有抗原结合区域的一部分的两种蛋白或肽通过例如化学连接、重组方法、或非共价作用,连接,以便产生具有对人免疫球蛋白的FcR特异的抗原结合位点的蛋白,该蛋白引起至少一种Fc受体介导的效应细胞功能。
也可以通过筛选多种类型的组合文库以获得具有所需结合活性的抗原结合区域,并且通过已经描述的方法鉴定活性种类。例如,可以用噬菌体呈现技术(Marks et al.(1992)J Biol Chem267:16007-16010)鉴定结合FcγRs的蛋白。噬菌体呈现文库已经在上面描述过了。例如,可以用呈现包种群表达多样化的肽文库以建立肽呈现文库。理想的呈现包包含一个体系,该体系允许非常多样化的抗体呈现文库的采样,经过每轮亲和分离后能快速归类,并且很容易从纯化的呈现包中分离抗体基因。肽呈现文库可以在,例如,原核生物和病毒中,它们可以快速扩增,相对容易操纵,并且可以产生大量克隆。优选的呈现包包括,例如,植物细菌细胞、细菌芽孢,并且最优选的是细菌病毒(特别是DNA病毒)。然而,本发明也考虑使用真核细胞,包括酵母和其孢子,作为潜在的呈现包。噬菌体呈现文库在上文已有描述。
其它技术,包括利用适当“受体”,例如,FcγRI或FcαR,进行亲和层析以分离结合试剂,然后利用传统技术(例如质谱或NMR)鉴定分离的结合试剂或配基。优选地,可溶性受体被偶联到可被探测的标记(如荧光色素、显色酶类、放射性同位素或发光化合物)上以显示配基的结合。替代地,固定的化合物可被选择性地释放以允许其扩散通过膜和受体相互作用。
化合物组合文库可被合成得带有“标签”以编码文库每个成员的身份(参见,如,W.C.Still et al.,国际申请WO94/08051)。总的来说,这种方法的特征为连接到固相支持物上或化合物上的惰性但容易检测的标签。当检测到活性化合物时通过鉴定该化合物所伴随的独特标签鉴定该化合物的身份。这种标签方法允许合成很大的化合物文库,可以在文库中的全套所有化合物中鉴定含量很低的化合物。
II花青苷组分
在本发明的另一实施方案中巨噬细胞结合化合物的Fc受体结合试剂是化学部分,如花青苷组分,包括但不限于,荧光染料Cy5.180Su(称为Cy5)以及其偶联与衍生物。已知花青苷组分以很高的亲和力和特异性和FcγRI结合。在一些情况下花青苷组分可含有两个或多个部分,如花青苷琥珀酰亚胺基酯和藻胆体蛋白,如,PE。此处所用的术语“PE-Cy5”指由藻红蛋白和Cy5.180Su组成的特定色素串联;术语“PE-Cy5试剂”指,例如但不限于,和抗体、遗传工程结合蛋白和肽(美国专利地5,233,409号和第5,403,484号)、亲和素、生物素或其它分子实体偶联的PE-Cy5。PE-Cy5偶联物可被用于治疗或诊断用途。
从矢车菊(Centaurea cyanus)分离得到的花青苷结构上是花青素(cyanidin)的3,5-二糖苷,花青素是从香蕉分离得到的2-(3,4-二羟基苯基)-3,5,7-三羟基-1-苯并吡唑氯化鎓(benzopyryliumchloride)(Merck Index)。另一种花青素衍生物,从酸莓中分离得到的3-鼠李糖苷,被认为对夜盲症具有治疗作用。越桔(Vacciniummyrtillus)果实分离得到的花青糖苷(anthocyanoside)在市场上是作为食疗(nutraceutical)食品添加剂,据一个制造商说,口服后它能促进血管舒张,降低毛细管渗透性,保护血管中的胶原,能作为抗氧化剂发挥作用,并支持对炎症过程的控制,改善整体视力,胃内壁(stomachlining),血脑屏障和腿以及结肠的血管(Gen.Engin.News 16(11),p27,1996)。
花青素的衍生物染料Cy5,也称为Cy5.180Su,的化学结构为5,5’-双磺基-1,1’-(ε-羧基苯基)-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二羰基花青苷二琥珀酰亚胺基酯(A.S Waggoner et al.,In:ClinicalFlow Cytometry,p.185(Eds)A.Landay et al.The New YorkAcademy of Sciences,New York,New York,1993)。用于巯基(Ernst,L.,A.et al.,1989,Cytometry 10:3)和羧甲基吲哚花青苷琥珀酰亚胺基酯(South wick,P.L.et al.,1990 Cytometry 11:418)的花青苷染料标记试剂已有描述,并且组分已经申请专利(美国专利第4,981,977和5,268,486号),上述专利的内容在此引入作为参考。Mujumdar,R.B.,1993,Bioconj.Chem 4:105中给出了Cy5的结构、其合成已经光吸收和发射光谱。Cy5是硫代吲哚花青苷琥珀酰亚胺基酯,是在吲哚花青苷荧光色素的芳香核带有带负电的磺酸基的氨基反应活性花青苷染料。这个家族的Cy5成员的特征为5-碳,连接两个取代环的不饱和次甲桥。Cy5可为633nm的氦氖激光或647nm的Dr激光所激发。Cy5及其衍生物以其光稳定性而闻名,可以与荧光素相比或更好。250,000的消光系数(L/mol cm)是非常高的。此处表达方式“Cy5”包括了结构和合成方式类似的相关染料(Mu jumdar et al.,supra),以便该表达方式大体上包括了花青苷染料标记试剂的硫代吲哚花青苷琥珀酰亚胺基酯,例如,Cy3.29.0Su(被称为Cy3)和Cy7.18.OH。术语Cy5试剂、Cy5偶联物和Cy5衍生物的意思应为含有至少一个Cy5部分和其它分子实体的偶联物。这种基础结构的其它性衍生物已有描述,花青苷试剂的硫代苯基吲哚花青苷琥珀酰亚胺基酯和Cy5以及其它硫代吲哚花青苷琥珀酰亚胺基酯具有共性,并且被预期能特异地亲和地结合FcγRI。
在Waggoner et al.,1993,上文描述了用单一488nm氩离子激光激发Cy5和PE串联组成的Cy5试剂PE-Cy5产生三色荧光,还描述了优化条件。基于德克萨斯红的串联染料的主要问题是由于一个组成部分的不稳定性,导致了在使用过程中一部分发射泄漏到另一组成部分的光谱,从而当德克萨斯红发射光谱位于或接近于第二部分的发射光谱时其应用受到限制。然而,Cy5和它的染料家族试剂发射光波长大于德克萨斯红,因此通过使用Cy5和其它染料得到的数据的分析时所要求的检测窗口设置频道补偿和下游计算频道补偿极小。Cy5试剂最佳使用方式所考虑的因素包括从组分合成Cy5试剂的合成方法,因为每分子偶联物结合的Cy5分子的数量比率影响合成产物的相对发射波长光谱。因此,对于PE-Cy5,当更多的Cy5分子结合到每个PE,从PE到Cy5的能量转化效率提高,直至最佳范围,超过这个范围就观察到过多的Cy5组成部分的相互淬灭作用。在PE-Cy5串联染料中的最佳比率为每个PE对4至8个Cy5分子(Waggoner et al.,1993.supra)。串联染料是光敏的,如果染料的储存和操作以及实验是在暗处进行的,那么染料在使用中的稳定性将提高。
与先前合成的串联染料相比,PE-Cy5由于没有背景信号,由于荧光强度增强,其信号大小得以改善,这使得它在用抗体染料偶联物进行细胞分析研究时成为一种成功的分析工具。但是,至少有一个报道认为由于Cy5组成部分,来自不同供应商的多种PE-Cy5都和骨髓细胞“非特异性”结合(Stewart SJ,et al.supra),因为PE-德克萨斯红偶联物没有这种性质。与之相反,Takizawa et al.报道了PE及其mAb偶联物与低亲和性小鼠IgG受体FcγRII和FcγRIII的结合(J.Immunol.Methods,1993,162:269)
杀伤巨噬细胞或降低巨噬细胞活性的细胞毒性试剂的生产
1.细胞毒素
许多细胞毒性试剂可通过本发明的化合物被导向到巨噬细胞上(即通过与结合巨噬细胞上Fc受体的试剂连接)。如此处所用,术语“细胞毒素”和“细胞毒性试剂”包括任何能杀伤巨噬细胞或降低其活性的化合物(例如药物)。例如,该化合物可以是毒素,如Gelonin,皂草素、外毒素A、癌酶或蓖麻蛋白A,或药物,如二氯亚甲基二膦酸酯(CL2MDP)或其衍生物。用于本发明的细胞毒性可进而包括增强该化合物治疗活性的试剂或组成部分。
例如,细胞毒素可包括细胞调亡促进剂、有丝分裂抑试剂、烷化剂、抗代谢物、核酸嵌入剂、拓扑异构酶抑试剂、巨噬细胞特异性药物或放射性核素。本发明优点是将这些细胞毒素定向到巨噬细胞高亲和性的Fcγ受体(例如,使用如Mab22、Mab32或其人源化形式的抗体)上,在那里细胞毒素被巨噬细胞,例如,内化。因此,这些细胞毒素在杀伤细胞或调节细胞功能上比其它不被内化的试剂或内化速度较慢的试剂更有效。
细胞毒素试剂可以是细菌或植物起源的毒性药物或具有酶活性的毒素或它们的生物活性片段(“一条链”)。酶活性毒素及其片段的例子包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、modeccinA链、α-八叠球菌、Aleurites fordii蛋白、dianthinproteins、phytolacca americana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、momordicacharantia抑试剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、saponaria officinalis抑试剂、gilonin、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素。优选的可用毒素包括Gelonin、皂草素、外毒素A、癌酶、蓖麻毒素A、白喉毒素、假单孢杆菌属外毒素或这些毒素的亚基。这些毒素的制备研究、体内用途、和药物动力学已有描述,例如,Vitetta et al.(1987)Science 238:1098-1104;Spitlet,L.et al.(1987)Clin.Chem.33(b):1054;Uhr et al.MonoclonalAntibodies and Cancer,Academic Press,Inc.,PP.85-98(1983)。本发明化合物和上述毒素试剂的偶联物可以通过使用多种的双功能蛋白偶联试剂制备,下文题为“巨噬细胞结合偶联物的制备方法”的部分详细描述了双功能蛋白偶联试剂。这些试剂的例子包括SPDP、IT、酰亚胺酯的双功能衍生物如己二酸二甲酯、HCl、活性酯如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯、醛类如戊二醛、双叠氮化合物如双-(对叠氮苯甲酰基)己二胺、二重氮化合物衍生物如双-(对氮基苯甲酰基)乙二胺、二异氰酸酯如甲苯2,6-二异氰酸酯和双活性氟化合物如1,5-二氟-2,4-二硝基苯。
在其它实施方案中细胞毒素是一种药物。药物的例子包括二氯亚甲基二膦酰酯(CL2MDP)或其它chlodronate衍生物(Bogers etal.(1991)Clin.Exp.Immunol.86:328-333)。替代地,细胞毒素可以是细胞调亡促进剂、有丝分裂抑试剂、烷化剂、抗代谢物、核酸插入剂、拓扑异构酶抑试剂。可用于本发明化合物试剂的例子包括拓扑异构酶II抑试剂椭圆素(它插入DNA或在DNA上形成缺口)。运送这些药物的方法,例如,脂质体,在下文有所描述。
在一些实施例中细胞毒素可包括光敏组成部分(例如光敏药物)。包括光敏这样的组成部分的细胞毒素可被用于敏化目标,例如巨噬细胞,使之在受到光激活时,例如通过可见光的辐射激活,被摧毁。优选地,光敏组成部分在光激活之前没有直接的生物学活性。包含这样的组成部分的化合物可被,例如局部地或通过注射,施用到客体上。当这些化合物暴露于特定波长的光,例如可见光,而被光激活时该组成部分变成毒性的(自身变成毒性或通过激活与该组成部分相连的细胞毒素)并选择性地摧毁巨噬细胞。光激活的机制不局限于任何特定理论,一般认为它包括能量从光敏部分向内源氧的转移,从而将其转化为单线态氧。单线态氧被认为是对细胞毒性效应负责的。含有光敏组成部分的巨噬细胞结合化合物在治疗皮肤疾病时尤其有用。
可用于本发明的光敏试剂的例子包括卟啉类化合物,例如,血卟啉衍生物(Lipson,R.L.et al.(1961),J.National Cancer Inst.26:1-8;Photophrin II Compositions(US4,649,151,Dougherty,T.J.(1983)Adv.Exp.Med.Bio.160:3-13 Kessel,D.et al.(1987)Photochem.Photobiol.46:463-568 and Scourides,P.A.et al.(1987)Cancer Res.47:3439-3445)焦脱镁叶绿酸化合物(US5,459,159;US4,996,312,和US4,849,207,和EP220686);叶绿素和细菌叶绿素衍生物(EPA 93111942.4);porphycene衍生物(WO96/31451);phrobine衍生物(WO95/08551)以及氯、酞菁染料、和卟吩(综述见Harvey,I.Pass.(1993)J.Natl.Canc.Inst 85:443-457)。能发出荧光信号的光敏试剂的光激活形式也可用于标记本发明的巨噬细胞结合化合物以用于诊断目的。
在其它实施方案中本发明的巨噬细胞结合化合物可包含通过光裂解连接与治疗或诊断试剂,例如细胞毒性试剂,偶联的Fc受体结合试剂。优选地,上述连接是通过光激活试剂。如一种生色基,介导的,在暴露于光时上述光激活试剂释放治疗或诊断试剂(Goldmacheret al.(1992)Bioconj.Chem 3:104-107)。例如,在皮肤病的应用中光将诱导连接的降解,在局部区域(例如皮肤)释放活性毒素。适于释放所结合的治疗或诊断试剂的光激活试剂包括任何能连接到治疗或诊断试剂的功能基团(例如苯酚)上的试剂,上述光激活试剂在暴露于光时释放功能形式的治疗或诊断试剂。作为一个例子,上述光激活试剂可以是生色基团。通常所选择的吸收光可由常见的辐射源(例如240-370nm的紫外光)发的出生色基团。对这样的波长具有光反应性的生色基团包括,但不限于,吖啶类、硝基芳香族类化合物和芳基磺胺类。
当使用生色基团时生色基团被光激活并释放或“解放”治疗试剂的波长和效率将根据生色基团所连接的特定功能基团而有所不同。例如,当使用硝基芳香类化合物如邻硝基苯甲基化合物时吸收波长可由于添加甲氧基而明显变长。在一个实施方案中硝基甲基苯(NB)和硝基乙基苯(NPE)分别被添加两个甲氧基而被修饰成4,5-二甲氧基-2-硝基苯(DMNB)和1-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯)乙基(DMNPE),从而将它们吸收波长范围增加到340-360nm(λmax=355nm)。促进治疗或诊断试剂光释放的辐射可由多种辐射源提供,这些辐射源包括,但不限于,非相干紫外光源和受激准分子。在一个实施方案中,可以使用在248nm工作的KrF受激准分子激光。替代地,也可以使用在266nm工作的四倍频固态掺钕(neodymium-doped)YAG激光或其类似物,或使用在257nm或275nm工作的氩离子激光。光激活试剂可与治疗试剂反应产生一种光释放连接物。当使用生色基团作为光激活试剂时,可以选择激发波长以便选择性地激发特定的生色基团。例如,可以将两种不同的药物或两种不同的生色基团以光释放的方式连接到底物上,然后通过选择与相应生色基团匹配的激发波长独立释放或先后释放这两种药物。可以进而选择生色基团和激发波长以避免药物(例如,失活)或周围组织的不合乎需要的光反应。例如,核酸的光敏性是众所周知的。当药物是核酸时,必须避免破坏核酸的激发能量(例如,波长小于280nm)。
此外,物可以通过将本发明的巨噬细胞结合化合偶联到放射性核素,例如,131I、90Y、105Rh、47Sc、67Cu、212Bi和211At,以标记该化合物,如Goldenberg,D.M.et al.(1981)Cancer Res.41:4354-4360;in EP0365997;Carrasquillo et al.,Cancer Treat.Rep.,68:317-328(1984);Zaloberg et al.,J.Natl.CancerInstitute 72:697-704(1984);Jones et al.,Int.J.Cancer35:715-720(1985);Lange et al.,Surgery 98:143-150(1985);Kaltovich et al.,J.Nucl.Med.27:897(1986);Order et al.,Intl.J.Radiother.Oncl.Biol.Phys.8:259-261(1982);Courtenay-Luck et al.Lancet 1:1441-1443(1983);Ettinger etal.,Cancer Treat.Rep.56:289-297(1982)中所描述;所有这些专利的公开内容在此引入作为参考。这样的放射性核素也能增强光敏组成部分的细胞毒性效应。
在这些诊断应用中,连接一个标记基团到巨噬细胞结合化合物上以便利它们的检测是合乎需要的(例如,在一个样品中它们结合到巨噬细胞上)。相应地,除了上文所列的核素外,适合的标记基团包括,例如,荧光色素、显色酶、放射性同位素或发光的化合物。例如,当标记基团是酶时,连接到巨噬细胞结合化合物上的酶将与适当的底物,优选地与产色素的底物,反应,这样以便产生可探测的化学信号,例如,可通过分光光度计、荧光光度计或通过视觉手段探测的信号。可用于抗体的可探测性标记的酶包括,但不限于,苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、,δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。检测可以通过比色法完成,在比色法中使用了上述酶的产颜色底物。检测也可以通过目测底物的酶促反应的程度,并与类似方法制备的标准进行比较而进行。
巨噬细胞结合化合物与巨噬细胞结合的检测也可以通过使用多种免疫测定方法中的任何一种方法来完成。例如,可以使用放射性免疫检测(RIA)(参见,例如,Weintraub,B.,Principles ofRadioimmunoassays,Seventh Training Course on RadioligandAssay Techniques,The Endocrine Society,March,1986,在此引入作为参考)。替代地,可以使用酶免疫分析(EIA)(Voller.“TheEnzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)”,DiagnosticHorizons 2:1-7,1978,Microbiological Associates QuarterlyPublication,Walkersville,MD;Voller,et al.,J.Clin.Pathol.31:507-520(1978);Butler,Meth.Enzymol.73:482-523(1981);Maggio,(ed.)Enzyme Immunoassay,CRC Press,Boca Raton,FL,1980;Ishikawa,et al.,(eds.)Enzyme Immunoassay,Kgaku Shoin,Tokyo,1981)。放射性同位素的检测可以通过这些方法,例如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射性自显影。
也可以用荧光化合物标记巨噬细胞结合化合物。当荧光标记的化合物暴露于合适波长的光时,就可以检测到它的存在。在多数普遍应用的荧光标记化合物中有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、藻青蛋白同分异构体、邻苯二醛和荧光胺。
可以用荧光发射金属,如152Eu或其它镧系元素,标记本发明的化合物。这些金属可以通过例如二乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)金属螯合基团被连接到抗体上。替代地,这些化合物也可以通过与化学发光化合物的偶联而被标记。然后,化学发光标记的化合物的存在是通过检测化学反应中发出的光。特别有用的化学发光标记化合物的例子有发光氨、异发光氨、theromatic acridinium酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
类似地,可以用生物发光的化合物标记本发明的巨噬细胞结合化合物。生物发光是在生物体系中的一类化学发光,生物体系中的催化蛋白提高了化学发光反应的效率。通过检测发光的存在鉴定生物发光蛋白的存在。用于标记的重要生物发光化合物有虫萤光素、萤光素酶和发光蛋白质。
抗-Fc受体结合试剂与细胞毒素的偶联
本发明的巨噬细胞结合化合物除了其它供选成分外还包含一种与细胞毒素连接的,能结合到巨噬细胞Fc受体上的试剂。相应地,为了产生这样的化合物,通过多种已知技术,或通过将抗-Fc受体结合试剂和细胞毒素一起作为融合分子进行重组表达,抗-Fc受体结合试剂被偶联(例如,通过共价偶联)到细胞毒素上(参见例如,D.M.Kranz et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5807,美国专利4,474,893)。
适用于上述目的的试剂,例如偶联试剂,在本领域中是众所周知的。术语“偶联试剂”和“交联剂”用于包括具有两个反应功能基团的能在两个其它分子之间起桥梁作用的分子,上述两个功能基团中,其中一个与第一个分子反应形成共价键并且另一个与第二个分子反应形成共价键,因此有效地将两个分子连接在一起。优选地,交联剂的两个反应功能基团的功能组成部分不同。合适的功能基团的例子包括氨基、羧基、巯基和羟基。当交联剂的一个功能基团与一个分子(例如,Fc受体结合试剂)反应时,另一个功能基团可以,如果需要,通过保护基团防止与上述分子的反应,该保护基团是修饰交联剂的第二个功能基团的以便第二个功能基团不会与上述分子反应。第一次反应完成后,保护基团可以被除去,恢复了第二个功能基团,然后第二个功能基团可以与另一个分子(例如,毒素)反应。
本发明的巨噬细胞结合化合物的制备可以通过本领域已知的方法将它们的组分试剂,例如,抗-FcR和细胞毒素,进行交联。例如,巨噬细胞结合化合物的每个试剂可以分别生产,然后彼此交联。当结合特异性为蛋白或肽时,可以用多种的偶联或交联试剂进行共价交联。交联剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)和硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸(sulf-SMCC)(例子参见,Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.160:1686;Liu,MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其它方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78,118-132);Brennan et al.(Science(1985)229:81-83),和Glennie et al.(J.Immunol.(1987)139:2367-2375)所描述的。优选的交联剂是SATA和sulfo-SMCC,两者都可以从Pierce Chemical公司(Rockford,IL)获得。
在巨噬细胞结合分子包含两种抗体(例如,双特异抗体)的情况下,这些抗体可以通过两个重链C-末端铰链区域的巯基键而交联。在特定的优选的实施方案中,在交联之前铰链区域被修饰以包含奇数个巯基残基,优选的是一个巯基。替代地,两种试剂都可以在同一载体中编码并且在同一宿主细胞中表达和组装。这种方法在巨噬细胞结合化合物为mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×(Fab)2或配基×Fab融合蛋白的情况下特别有用。本发明的巨噬细胞结合化合物,例如,双特异分子可以是单链分子,例如单链双特异抗体,包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链双特异分子,或包含两个结合决定簇的单链双特异分子。巨噬细胞结合化合物也可以是单链分子或可以包含至少两种单链分子。制备双特异和多特异分子的方法在,例如,美国专利第5,260,203号、美国专利第5,455,030号、美国专利第4,881,175号、美国专利第5,132,405号、美国专利第5,091,513号、美国专利第5,476,786号、美国专利第5,013,653号、美国专利第5,258,498号和美国专利第5,482,858号中有所描述。
一旦产生符合上述指导方针的巨噬细胞结合化合物,就可以利用已知的技术,例如酶联免疫吸附检测(ELISA)、放射性免疫检测(RIA)或Western Blot检测,检测该化合物与巨噬细胞的结合。这些检测方法一般通过运用对感兴趣复合物特异的标记试剂(例如,抗体)检测特别感兴趣的蛋白-抗体复合物的存在。例如,可以使用例如酶联抗体或识别抗体-FcR复合物并且与之特异性结合的抗体片段检测FcR-抗体复合物。替代地,可以通过使用多种其它免疫检测的任何一种方法检测上述复合物。例如,抗体可以被放射性标记并且用于放射性免疫检测中(RIA)(参见,例如,Weintraub,B.,Principlesof Radioimmunoassays,Seventh Training Course on RadioligandAssay Techniques,The Endocrine Society,March,1986,在此引入作为参考)。放射性同位素的检测可以通过这些方法,例如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射性自显影。
药用组合物和施用途径
本发明的巨噬细胞结合化合物优选地和载体或稀释剂一起存在于组合物中。对于患者的体内施用而言(例如,治疗或诊断一种病症),该化合物优选地存在于药用上可接受的载体或稀释剂中。如下文详细描述的,本发明的药用组合物可以被特定地配制成固体或液体的形式以便施用,包括适合以下施用形式的配制方式:(1)口服施用,例如,灌服(水或非水溶液或悬浮液)、药片、大丸药、粉剂、颗粒、糊剂;(2)肠胃外的施用,例如,通过作为如无菌的溶液或悬浮液进行皮下的、肌肉的或静脉内的注射。(3)局部的运用,例如,施用于皮肤的油膏、药膏或喷雾。(4)阴道内或直肠内,例如,作为阴道栓剂、油膏或泡沫;(5)气溶胶,例如,作为水的气溶胶、脂质体的制备或包含该化合物的固体颗粒。
本发明的药用组合物也可用在联合治疗中,即与其它的试剂联合。例如,该联合治疗可以包括本发明的组合物与至少一种其它抗巨噬细胞试剂或其它常规治疗。抗巨噬细胞试剂的例子包括chlodronate化合物,例如,二氯亚甲基二膦酸酯(CL2MDP)。
此处所用的短语“药用上可接受的载体”是指药用上可接受的材料、组分或载体,例如液体或固体的填充剂、稀释剂、赋形剂、溶解或形成胶囊的材料,这些材料参与将目的化学药品从一个器官或身体的一部分携带或运送到另一个器官或身体的一部分。每个载体必须在与其它的配制成分相容并且对病人无害的意义上是“可接受的”。可以用作药用上可接受载体的材料的例子包括:(1)糖类,例如乳糖、葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉类,例如谷物淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素及其衍生物,例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素;(4)粉状黄蓍胶;(5)麦芽;(6)凝胶;(7)滑石粉;(8)赋形剂,例如可可粉黄油和栓剂蜡;(9)油,例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、谷物油和豆油;(10)乙二醇类,例如丙烯乙二醇;(11)多羟基化合物,例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇;(12)酯,例如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲试剂,例如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)褐藻酸;(16)无热源水;(17)等渗盐水;(18)Ringer’s溶液;(19)乙醇;(20)磷酸缓冲溶液;和(21)其它运用于药物配制的无毒相容物质。
“药用上可接受的盐”是指保留了原初化合物的合乎需要的生物活性并且不会带来任何不合乎需要的毒性效应的盐(参见,例如,Berge,S.M.,et al.(1997)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这些盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来自无毒无机酸,例如盐酸、硝酸、磷酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸、磷等等的盐,也包括来自无毒有机酸,例如脂肪族的单羧基和双羧基酸、苯基取代链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等等的盐。碱加成盐包括来自碱土金属,例如钠、钾、镁、钙等等,也包括来自无毒的有机胺,例如N,N’-二苯甲基乙二胺、N-甲基还原葡萄糖胺、氯化普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等等。
本发明的组合物可以通过本领域中多种已知的方法施用。技术熟练的人员将认识到施用的途径和/或方式将根据所需要的结果而不同。
术语“施用”用于包括将本发明的巨噬细胞结合化合物引入到患者中并且允许该化合物执行其预定功能(即巨噬细胞减少和/被抑制)的任何途径。可以使用的施用途径的例子包括注射(皮下的、静脉的、肠胃外的、腹膜内的、鞘内的等等)、口服、吸入、直肠和真皮内。当然所提供的药用制备物是适用于各个施用途径的。例如,这些制备物是通过注射、吸入、眼药水、药膏、栓剂等等以药片或胶囊的形式施用的;通过注射、灌输或吸入施用;通过洗剂或药膏的局部施用;和通过栓剂对直肠的施用。注射可以是大药丸或可以是连续的灌输。根据施用途径,巨噬细胞结合化合物可以被包上指定的材料或放置在指定的材料中以防止其和天然环境的接触,上述天然环境可能不利于该化合物执行预定的功能。巨噬细胞结合化合物可以单独施用,或与上文描述的另一试剂或药用上可接受的载体联合施用,或都与两者联合施用。巨噬细胞结合化合物可以在其它试剂施用以前施用、与其它试剂同时施用或在其它试剂施用之后施用。更进一步地,该化合物可以以前体形式或无活性的形式(例如,包含光敏毒素的巨噬细胞结合化合物)施用,上述前体或无活性形式可以在体内被转化成活性代谢物或活性更高的代谢物,例如,当暴露于光时。
此处所用的短语“肠胃外的施用”和“施用于肠胃外”意思是除了通过肠道途径施用和局部的施用以外的施用方式,通常通过注射,包括,但不限于,静脉内的、肌肉内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眼窝内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、气管内的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的和胸骨内的注射和灌输。
此处所用的短语“全身的施用”“施用于全身”“肠胃外的施用”和“施用于肠胃外”是指施用巨噬细胞结合化合物以便其患者系统中并且,因此,受到新陈代谢和其它类似过程的代谢,例如,皮下的施用。
通常,本发明的巨噬细胞结合化合物用于局部施用以治疗或诊断疾病,上述疾病的特征是身体特定范围或区域(例如,皮肤、肺、关节或肌肉/神经组织)内巨噬细胞的数量和/或功能异常。对于皮肤病学的运用,该化合物优选地通过局部途径或透皮贴片(transdermalpatch)运送或施用。在皮肤损伤的治疗中局部施用是优选的,包括头皮损伤、角膜损伤(角膜炎)和粘膜损伤,在这些情况下这种直接运用是可行的。香波配制物有时有利于治疗头皮损伤例如脂溢性皮炎和头皮牛皮癣。漱口药和口服糊剂配制物能有利于粘膜损伤,例如口损伤和黏膜白斑病。实践本发明的一种优选途径是将含巨噬细胞结合化合物的药膏或基于油的载体,直接施用于伤口,例如,牛皮癣的伤口。通常在药膏或油中的巨噬细胞结合化合物的浓度是1-2%。此外,真皮内施用是真皮损伤例如真皮牛皮癣和伤口的一种选择。替代地,可以局部地使用气溶胶。在局部直接运用不可行的情况下口服施用是治疗上述皮肤损伤和其它损伤的优选的选择,并且对其它运用也是优选的途径。
进而,该组合物可以通过肠胃外的途径运送,尤其是在治疗关节炎,如牛皮癣关节炎或类风湿性关节炎时以及皮肤损伤的直接注射时。肠胃外治疗通常是真皮内、关节内、肌肉内或静脉内的。在治疗一个或只有少数(例如2-6)关节时,关节内的注射是优选的选择。此外,在适当的情况下治疗组合物被直接注射到损伤部位(损伤部位内施用)。作为治疗关节炎的选择,本发明的组合物可以全身施用。
对于治疗呼吸道疾病,本发明的组合物通过鼻的气溶胶或吸入而被施用。这样的组合物可以被制备成盐溶液,并使用苄醇或其它的合适的防腐剂,提高生物利用率的吸收促进剂、碳氟化合物和/或常规的增溶或分散剂。
在一些实施方案中,包含上述化合物的组合物可以被全身或局部施用。例如,包含光敏组成部分,如毒素或连接物,的巨噬细胞结合化合物的组合物,可以以这样的方式被施用。更进一步地,优选地通过本发明组合物的局部或全身的施用治疗一些自免疫疾病,例如多发性硬化症。
除了本发明的化合物外粉末和喷雾还可以包含载体,例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末,或这些物质的混合物。此外喷雾还包含通常的推进剂,例如氯氟烃和挥发性的非取代烃,例如丁烷和丙烷。
通常,水的气溶胶是由水溶液或试剂的悬浮液与常规的药用上可接受的载体和稳定剂一起配制成的。载体和稳定剂因特定混合物的需要而不同,但通常包含非离子表面活性剂(吐温、Pluronics、聚乙二醇)、无毒的蛋白如血清白蛋白、山梨聚糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、缓冲液、盐、糖或糖醇。气溶胶通常从等渗的溶液制备。
不论选用什么施用途径,本发明的巨噬细胞结合化合物和/或药用组合物都通过本领域的技术人员已知的常规方法被配制成药用上可接受的剂量形式;上述巨噬细胞结合化合物可以以水化的形式应用。
为了达到对特定病人、组合物以及施用方式的合乎需要的治疗效果而不至于对病人产生毒性,可以改变本发明药用组合物中活性组分的实际剂量水平以及施用的疗程。
活性化合物可以和能防止该化合物快速释放的载体一起制备,例如受调控的释放配方,包括植入、透皮贴片和装入微胶囊的运送系统。可以使用生物可降解的、生物兼容的聚合物,例如乙酸乙烯乙酯、聚酐类、聚乙二醇酸(polyglycolic acid)、胶原质、聚原酸酯类和聚乳酸。制备这些制备物的许多方法是授予专利的或对于本领域的技术人员通常是已知的。参见,例如,Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.,New York,1978。
为了通过某些施用途径施用本发明的化合物,也许有必要用一种材料将该化合物包上或和该化合物共同施用以防止该化合物的失活。例如,该化合物可以在合适的载体,例如脂质体或稀释液,中施用于患者。药用上可接受的稀释液包括盐和水的缓冲溶液。脂质体包括水包油包水(water-in-oil-in-water)CGF乳浊液以及常规脂质体(Streijan et al.,(1984)J.Neutoimmunol.7:27)。药用上可接受载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。这些介质和试剂在药用活性物质中的应用在本领域是已知的。除了一些常规介质和试剂与活性化合物不相容外,它们在本发明的药用组合物中的应用是预期的。补充的活性化合物也可以被掺入到该组合物中。
治疗组合物通常必须是无菌的并且在生产和贮存的条件下是稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳浊液、脂质体或其它适合用于高药物浓度的有序结构。载体可以是含有,例如,水、乙醇、多羟基化合物(例如,甘油、聚丙二醇和液态聚乙二醇等等)及它们的适当混合物,的溶剂或分散介质。可以通过,例如,使用外包物如卵磷脂,通过分散时维持合乎需要的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下,组合物中优选地包含等渗试剂,例如,糖类、多元醇类如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。通过在组合物中包含一种延迟吸收的试剂,例如单硬脂酸盐和明胶,可以延迟注射组合物的吸收。
可以根据需要通过将所需数量的活性化合物与上述列举的一种或多种组分合并到适当的溶剂中,然后进行除菌微孔过滤而制备无菌溶液。通常,分散液的制备是通过将活性化合物合并到无菌载体中,上述载体包含基础分散介质以及合乎需要的其它上述列举成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)以产生活性组分以及来自先前无菌过滤溶液中任何其它合乎需要的组分的粉末。
调节剂量服用方式以提供最佳合乎需要的反应(例如,治疗反应)。例如,可以施用单个的大药丸,可以随时间施用分开的剂量或可以根据治疗状况的紧急程度按比例减少或增加剂量。为了便于施用和使剂量一致,将组合物配制成剂量单位的形式是特别有利的。此处所用的剂量单位形式是指适于作为患者治疗时的单一剂量的物理分离的单元,每个单位包括根据计算能产生所需治疗效果的预定数量的活性化合物以及合乎需要的药用载体。本发明的剂量单位形式的规格的指导原则和直接根据是(a)活性化合物的独特特征和需要得到的特定治疗效果,(b)合成这样的活性化合物以治疗个体的敏感性时本领域的内在局限性。
药用上可接受的抗氧化剂的例子包括:(1)水溶性抗氧化剂,例如抗坏血酸、盐醇半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸钠、硫酸钠等等;(2)脂溶性抗氧化剂,例如棕榈酸抗坏血酯、丁化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等;(3)金属螯合剂,例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。
对于治疗组合物,本发明的制备物包括适合局部、皮内或皮下施用的制备物。该制备物通常可以以单位剂量形式存在并且可以通过制药领域中任何已知方法制备。与载体材料结合产生单一剂量形式的活性组分的量可根据被治疗患者和特定施用方式而不同。与载体材料结合产生单一剂量形式的活性组分的量通常是能产生治疗效果的组合物的量。通常,没有百分之百,活性组分的数量范围大约从0.01%至99%,优选地大约从0.1%至70%,最优选地从1%至30%。
本发明的组合物用于局部和皮内施用的剂量形式包括粉末、喷雾、油膏、糊剂、药膏、洗液、凝胶、溶液、贴片和吸入剂。可以在无菌的条件下将活性化合物与可能需要的药用上可接受的载体、任何防腐剂、缓冲液或推进剂一起混合。
可以用于本发明的药用组合物的适合的含水和无水载体的例子包括水、乙醇、多羟基化合物(例如,甘油、聚丙二醇和聚乙二醇等等)以及它们的适当混合物、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以通过,例如,使用外包物例如卵磷脂,通过分散时维持合乎需要的颗粒大小以及通过使用表面活性剂以维持适当的流动性。
这些组合物也可以含有佐剂例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可通过无菌过程,参照上文,和抗细菌及抗真菌试剂,例如,对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚山梨酸等等。也可以根据需要在组合物中包含等渗试剂,例如糖、氯化钠等等。此外,通过包含一种延迟吸收的试剂,例如单硬脂酸铝和明胶,可以延迟注射的药用形式的吸收。
当本发明的化合物作为药物施用于人和动物时,它们可以单独施用或作为药用组合物施用,该药用组合物包括,例如,0.01-99.5%(更优选的是0.1-90%)的活性组分并且和药用上可接受的载体结合在一起。
可以改变本发明药用组合物中活性组分的实际剂量水平以便获得活性组分的一定剂量,该剂量是有效达到对特定病人、组合物以及施用方式的合乎需要的治疗效果而不至于对病人产生毒性。剂量水平的选择依赖于许多药物动力学因素,这些因素包括使用的本发明特定组合物或它们的酯、盐或酰胺的活性、施用的途径、施用的时间、使用的特定化合物的排泄率、治疗持续的时间、其它药物、用于和使用的特定组合物结合的化合物和/或材料、受治疗的病人的年龄、性别、体重、状况、整体健康和先前的病史和在医学领域众所周知的类似因素。
具有本领域的普通技术的内科医生和兽医可以很快地决定并且开出所需的药用组合物的有效数量。例如,为了获得合乎需要的治疗效果,医生或兽医开始时开出的用于药用组合物中的本发明的化合物剂量水平低于所需的剂量水平,并且逐步地增加剂量直到达到所需的治疗效果。通常,本发明组合物的每日剂量为能有效产生治疗效果的最低剂量。这样的有效剂量通常由上述因素决定。局部施用是优选的,例如,局部的、皮下的、皮内的,优选地施用于接近目标的位点上。如果需要,治疗组合物有效的每日剂量可以在每日适当的间隔以二、三、四、五、六或更多个小剂量分别施用,供选地,可以以单位剂量形式施用。尽管本发明的化合物可以被单独施用,但优选地将该化合物作为药用制备物(组合物)施用。
可以通过本领域已知的医疗设备施用治疗组合物。例如,在一个优选的实施方案中,可以通过无针的皮下注射设备施用本发明的治疗组合物,这样的设备公布在美国专利第5,399,163,5,383,851,5,312,335,5,064,413,4,941,880,4,790,824,或4,596,556号。用于本发明的众所周知的移植片和模块的例子包括:美国专利第4,487,603号公布的用于分配药物的可调速可植入微灌输泵;美国专利第4,486,194号公布的通过皮肤施用药物的治疗设备;美国专利第4,447,233号公布的用于运送药物的灌输速度精确的药物灌输泵;美国专利第4,447,224号公布的用于连续运送药物的可变流可植入灌输装置;美国专利第4,439,196号公布的具有多室分隔间的渗透性药物运送系统;美国专利第4,475,196号公布的渗透性药物运送系统。这些专利在此引入作为参考。许多其它这样的植入、运送系统和模块已被本领域技术人员所知。
在一些实施方案中,本发明的化合物可以被制备成能确保其在体内适当的分配。在一个实施方案中,巨噬细胞结合分子可以被包入脂质体中。制造脂质体的方法参见,例如,美国专利第4,522,811;5,374,548和5,399,331号。上述脂质体可以包含一个或更多个被选择性运送到特定细胞或器官中的组成部分,从而增进目的药物的运送(参见,例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。例如,某些实施方案,优选地使用抗Fc受体的单链抗体(scFv)如H22 scFv抗体,将本发明的化合物导向Fc承载(Fc-bearing)巨噬细胞。包有scFv片段的脂质体的制备方法在de Kruif,J.et al.(1996)FEBS 399:232-236中有所描述。例如,通过稀释含有正辛基β-D-葡萄糖苷,脂类和脂类修饰的scFv的混合物微团使得去污剂浓度远远低于去污剂的临界微团浓度,可以将脂类修饰的H22 scFv偶联到含有蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、蛋黄磷脂酰甘油(EPG)、胆固醇以及,供选地,作为双分子层荧光标记物的罗丹明-磷脂酰乙醇胺(罗丹明),的脂质体上,上述脂质体成分的摩尔比为10∶1∶5∶0.01。可以通过SDS-PAGE鉴定脂质体中scFv分子的掺入。
“有效治疗剂量”是指该剂量能使指定治疗的区域与未治疗的对照区域相比,巨噬细胞数量减少,或该剂量能在指定的区域抑制巨噬细胞的活性,例如,该区域的巨噬细胞不再增生或参与该区域的炎症反应。因此,巨噬细胞介导的疾病的症状得到改善。可以在动物模型系统中评价本发明的化合物杀伤巨噬细胞群或抑制巨噬细胞群活性的能力,上述动物例如本文例子中所描述的表达人Fc受体的转基因动物。替代地,可以通过专业人员已知的体外实验评估这些功能。治疗化合物的有效治疗剂量可以减少巨噬细胞群或抑制巨噬细胞群的活性,或者改善患者的症状。本领域普通技术人员可以根据这些因素例如患者的大小、患者症状的严重性和特定的组合物或选择施用的途径,确定这样的剂量。
组合物必须是无菌的和流动性的,流动的程度是使组合物可以通过注射运送。除了水外,载体可以是等渗缓冲盐溶液、乙醇、多羟基化合物(例如,甘油、聚丙二醇和液态聚乙二醇等等)以及它们的适当混合物。可以,例如,通过使用外包物如卵磷脂,通过分散时维持合乎需要的颗粒大小以及通过使用表面活性剂以维持适当的流动性。在许多情况下,组合物中优选地包含等渗试剂,例如,糖类、多元醇类如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含一种延迟吸收的试剂,例如单硬脂酸铝和明胶,以延迟注射组合物的吸收。
发明用途和方法
本发明的巨噬细胞结合化合物具有一些诊断、治疗和研究的用途。它们可以施用于体外细胞(培养)、来自体内的细胞、或体内细胞(患者中)以治疗、诊断或研究各种病症。
在一个实施方案中,提供了在指定治疗区域或诊断区域减少(例如减少数量)或抑制巨噬细胞活性的方法。该方法是通过让足够数量的巨噬细胞结合化合物接触指定的区域以获得上述的效果。此处所用的术语“指定的区域”或“局部区域”都指包含或可能包含导致病症的巨噬细胞的组织或细胞的任何指定样品(体外或体内),例如人体的局部区域(皮肤、肺、关节等等)或培养样品的组织。接触可以发生在体外(例如培养细胞)或体内(例如,通过对患者施用本发明的化合物)。
此处所用的术语“患者”用于包括人和非人类动物。优选的人类包括具有疾病的病人,该疾病的特征是巨噬细胞,例如,皮肤巨噬细胞,的活性异常。术语“活性”用于包括巨噬细胞的所有生物功能,包括增殖、分化、生存、生长因子或细胞因子分泌作用,还有其它。本发明的术语“非人类动物”包括所有脊椎动物,例如,哺乳动物和非哺乳动物,例如,非灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等等。
本发明的巨噬细胞结合化合物最初可以在体外检测。例如,可以在源自巨噬细胞的细胞系、培养分化的血液单核细胞和原代培养体系中检测这些分子杀死巨噬细胞和/或调节,例如降低,巨噬细胞活性的活性。可以在,例如,Immunopharmacology of Macrophages andOther Antigen-presenting Cells(ISBN 0-12-137800-4,1994,Academic Press Limited)中找到体外检测巨噬细胞活性的方法。例如,从来自健康受检者和皮肤病患者的皮肤细胞中可以建立原代皮肤巨噬细胞培养物。可以在经过掺入一系列浓度的本发明的化合物后,按特定的时间间隔检测巨噬细胞的活性,例如细胞增殖或细胞因子分泌。在一个实施方案中,可以利用来自健康受检者和皮肤病患者的“穿刺活组织”。穿刺活组织培养时可以被浸没在培养基中或表皮的一面在培养基中,该培养基可以掺入本发明的化合物。用本发明的巨噬细胞结合化合物培养之后,可以通过免疫组织化学或ELISA、RIA、EIA检测这些化合物对巨噬细胞活性的影响。
检测细胞增殖过程中发生的变化的方法,例如,掺入胸腺嘧啶核苷或BrdU的检测方法,在本领域中是已知的。本发明优选的巨噬细胞结合化合物降低或消除巨噬细胞的活性。可以通过多种的免疫检测,例如酶联免疫检测(ELISA)、酶免疫检测(ESA)或放射性免疫检测(RIA),检测细胞因子浓度的变化(参见,例如,Keler,T.etal.(1997)Cancer Research 57:4008-14),这些免疫检测方法在本领域中是已知的。可以检测的细胞因子的例子包括:粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素1-12(IL-1至IL-12)和TNF-α。利用EIA通过检测细胞因子和一种酶联抗体的相互作用可以测量细胞因子的浓度。检测酶活性是通过酶与适当的底物,优选的是产色的底物,反应,这样以便产生可检测的化学组成部分,该化学组分可以通过,例如,分光光度计、荧光光度计或可见的方法检测(Voller,“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA).”Diagnostic Horizons 2:1-7,1978,MicrobiologicalAssociates Quarterly Publication.Walkersville,MD;Voller,et al.,J.Clin.Pathol.31:507-520(1978);Butler.Meth.Enzymol.73:482-523(1981);Maggio,(ed.)Enzyme Immunoassay,CRC Press.Boca Raton,FL,1980;Ishikawa,et al.,(ed.)EnzymeImmunoassay,Kgaku Shoin.Tokyo,1981).可用作抗体的可检测性标记的酶在上文有描述。检测可以通过比色方法来完成,该方法运用了该酶的产色底物。检测也可以通过目测底物酶促反应的程度,并与类似制备的标准物相比较而进行。
细胞因子的检测也可以通过放射性免疫检测(RIA)来完成(参见,例如,Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,TheEndocrine Society,March,1986,在此引入作为参考)。检测放射性同位素可以通过这些方法例如γ计数器或闪烁计数器或放射性自显影探测。
也可以用荧光化合物标记抗细胞因子抗体。当荧光标记的抗体暴露于合适波长的光时,就可以检测它的的存在。在最普遍应用的荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、藻青蛋白同分异构体、邻苯二醛和荧光胺。可以用荧光发射金属,如152Eu或其它镧系元素,可探测地标记该抗体。这些金属可以通过例如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)金属螯合基团被连接到抗体上。该抗体也可以通过与化学发光化合物的偶联而被探测地标记。然后,化学发光标记的抗体的存在是通过检测化学反应中发出的光。特别有用的化学发光标记化合物的例子有发光氨、异发光氨、theromatic acridinium酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。类似地,可以用生物发光的化合物标记该抗体。生物发光是在生物体系中的一类化学发光,生物体系中的催化蛋白提高了化学发光反应的效率。通过检测发光的存在鉴定生物发光蛋白的存在。用于标记的重要生物发光化合物有虫萤光素、萤光素酶和发光蛋白质。
也可以在体内检测巨噬细胞结合化合物。例如,可以用本文实施例中所描述的表达Fc受体的小鼠检测这些化合物。在一个实施方案中,巨噬细胞结合化合物被注射到这些转基因小鼠的真皮中。同时平行进行注射载体的对照实验。通过对小鼠的局部反复施用5%的月桂硫酸钠可以产生慢性皮肤炎。这些化合物的效果可以在注射后的不同时间间隔用免疫组织化学的方法,例如,宏观地或临床地,监测。
本发明的巨噬细胞结合化合物可以用于治疗疾病,上述疾病的特征为巨噬细胞活性或数量异常。术语“异常”是指在指定区域的巨噬细胞的密度不同于(例如,高于)正常健康人的相同区域的巨噬细胞的密度。术语“异常”也包括异常的巨噬细胞活性,例如异常高的细胞增殖或细胞因子分泌。相应地,在一个实施方案中,本发明提供了治疗或预防疾病的方法,该疾病的特征是在指定区域巨噬细胞的数量或活性异常,该方法包括通常在需要治疗的局部区域施用于患者,药用组合物包含一个或更多的巨噬细胞结合化合物。
巨噬细胞结合化合物通常作为定位试剂将细胞毒素(例如,药物)运送到承载Fc受体的巨噬细胞上。在本发明的一个实施方案中,细胞毒素被包入脂质体中,该脂质体本身被导向承载Fc受体的巨噬细胞上。因此,巨噬细胞结合化合物包含连接到脂质体上的抗Fc受体结合部分,上述脂质体含有细胞毒素。在一个优选的实施方案中,抗Fc受体结合部分是抗Fc受体的单链抗体(scFv)如H22 scFv。抗-FcR scFv连接或插入到脂质体磷脂双分子层中的方式允许scFv仍然识别和结合脂质体外的Fc受体。这可以通过已知的方法来完成,例如de Kruif,J.et al.(1996)FEBS 399:232-236中所描述的方法。最终结果是定位于FcR的细胞毒素以脂质体的形式被运送到细胞上。
此处所用的巨噬细胞结合化合物的“有效治疗剂量”是指该化合物以一次或多次施用于患者时,能抑制细胞的生长或缺少这样的治疗就会增进临床症状的有效剂量。
此处所用的化合物的“有效预防剂量”是指巨噬细胞结合化合物以一次或多次施用于病人时,能防止或延迟巨噬细胞介导疾病的发生或复发的有效剂量。
“诱导”、“抑制”、“加强”、“提高”、“增加”、“减少”等等,例如,表示两种状态的数量差别的术语,至少表明两种状态的统计学上的显著差别。例如,“抑制巨噬细胞生长的有效剂量”表示细胞的生长速度将至少在统计学上显著不同于未治疗的细胞。
本发明的巨噬细胞结合化合物可以用于治疗各种巨噬细胞介导的疾病。这些疾病的特征不必仅仅是巨噬细胞数量和/或活性异常,但它们各自涉及不合乎需要的对病人有害的巨噬细胞活性。在一个实施方案中,该化合物用于治疗自免疫疾病,该自免疫疾病包括,例如,糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣关节炎)、多发性硬化症、脑脊髓炎、糖尿病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自免疫甲状腺炎、皮炎(包括遗传过敏性皮炎和湿疹性皮炎)、牛皮癣、Sjogren’s综合症、Sjogren’s综合症继发干性角膜结膜炎、斑秃、由于节肢动物咬伤反应引起的过敏反应、Crohn’s疾病、口腔溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃烂大肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻疯病逆向反应、结节性红斑皮屑、自免疫葡萄膜炎、过敏性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、自发性两侧渐进性感觉神经听力丧失、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血、慢性活动肝炎、Stevens-Johnson综合症、自发性口炎性腹泻、扁平地衣症、Crohn’s疾病、Graves眼病、肉状瘤病、原发性胆硬化、晚期葡萄膜炎和肺间质纤维症)。在过敏症,例如遗传性过敏症中免疫活性的下调也是合乎需要的。
可以将上述方法作为疗法的一部分的优选自免疫/皮肤疾病的例子包括:牛皮癣、免疫遗传过敏性皮肤炎、多发性硬化症、硬皮病和皮肤红斑狼疮。例如,本发明的方法和组合物可用于治疗遗传过敏性皮肤炎(AD)。不局限于理论,有人认为在AD的皮肤炎症急性期局部T细胞的表型从Th2型转变成慢性期的Th1型。在此时间点在损伤部位发现产生的IL-12的量增加,同时大量流入激活的巨噬细胞。巨噬细胞是诱导T细胞产生IFN-γ的有效生产者,而IFN-γ反过来又是巨噬细胞的有效激活剂(Thepen,T.et al.(1996)J AllergyCl in.Immunol.97:828-837;Grewe,M.et al.(1998)Immunol.Today 19:359361)。这样的正反馈可能产生恶性循环,这种恶性循环自身就能够维持局部炎症而不需要外来刺激。考虑到巨噬细胞的调控潜能,其它这样的由于巨噬细胞的异常调控而导致连续免疫原非特异性反应的机制也似乎是可能的。如下文的实施例所描述,通过定位Fc受体,例如FcγRI,在局部区域特异性地消除巨噬细胞炎症使得本发明可用于减小或消除由于巨噬细胞分泌而导致的正反馈循环,从而治疗诸如AD这样的疾病。
可用本发明的治疗方法治疗的疾病的例子进而包括传染性疾病,例如,HIV感染、呼吸道疾病,例如,慢性多型性光皮肤炎(CPLD),慢性阻塞性肺病(COPD),例如,过敏性哮喘和类肉状瘤病以及炎症反应如在开放伤口或烧伤中观察到的炎症。
在其它实施方案中本发明的组合物和方法可用于化妆品。例如,巨噬细胞结合化合物可被局部施用到皮肤以延迟和/或防止皮肤的衰老过程。
本发明的治疗方法可以与其它去除巨噬细胞的技术联合使用。例如,本发明的巨噬细胞结合化合物可以和外科手术、化学疗法或放射性疗法联合使用。
本发明的巨噬细胞结合化合物可用于调节效应细胞上的FcγR水平,例如通过覆盖和消除细胞表面的受体。抗Fc受体抗体的化合物也可被用于此目的。
本发明进而提供了一种试剂盒,该试剂盒中包含了单一剂量或多剂量的巨噬细胞结合化合物以及使用说明。
在其它实施方案中本发明的巨噬细胞结合化合物的复合物可被用于选择性地杀伤巨噬细胞或降低巨噬细胞的活性,例如,由第一种化合物和第二种化合物组成的复合物,上述第一种化合物具有至少一个对FcR特异的抗原结合区域以及毒素,,上述第二种化合物具有针对FcR受体的不同表位的抗原结合区域或针对不同Fc受体,例如Fcα受体的抗原结合区域。在一些实施方案中本发明的第二种巨噬细胞结合化合物可以和第一种联合使用。例如,该第二种巨噬细胞结合化合物可以具有至少一个对IgA受体,例如,Fcα受体,和IgE受体,例如,Fcε受体,Fcδ受体和/或Fcμ受体,特异的抗原结合区域。
在对患者施用巨噬细胞结合化合物之前可以预先用一种调节,例如增强或抑制,Fcγ受体的表达或活性的试剂处理,例如对患者用细胞因子处理。在用巨噬细胞结合化合物治疗期间施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的巨噬细胞结合化合物也可被用于体内和体外诊断以通过测量结合Fc受体的水平探测和/或测量巨噬细胞群。例如,如本文所提供的实施例中所显示,在人类急性或慢性皮肤炎的皮肤炎症中都检测到了FcγRI的大量表达。因此,此处所描述的巨噬细胞结合化合物可被用于诊断诸如炎症这样的情况。对于这样的用途,该化合物可以与一个可检测的分子连接。该可检测的标记可以是,例如,放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子。相应地,在其它实施方案中本发明提供了一种用于体内或体外诊断疾病的方法,上述疾病的特征为巨噬细胞数量(例如,巨噬细胞异常)和/或Fc受体表达的异常(例如,表达Fc受体的细胞数增加和/或在一定细胞上的Fc受体表达水平升高)。通过测量给定样品中或局部区域中本发明化合物的结合水平可以推算出该区域中或样品中巨噬细胞的存在,如果该化合物中的抗Fc受体组分是对Fc受体特异的话。这可以这样完成:(i)取得身体样品,如体液、组织(例如皮肤样品)或病人的活体组织(ii)将身体样品与本发明的巨噬细胞结合化合物或其片段接触;(iii)测定上述巨噬细胞结合化合物与身体样品结合的水平(iv)比较身体样品和对照样品,例如源自健康受检者的生物样品,与分子结合的量,或者与预先确定的基础水平进行比较,使得比对照水平高的结合能显示巨噬细胞疾病的存在,例如皮肤病的存在。优选地,相对于其它表达Fc受体的细胞,检测到的Fc受体的表达主要是在巨噬细胞上。体内和体外诊断的方法参见PCTUS88/01941,EP0365997和US4,954,617。
下文将通过实施例进一步阐述本发明,这不应被理解为进一步的限制。所有在本申请中引用的所有参考文献、未定专利申请以及已发表专利的内容都在此引入作为参考。
实施例
材料与方法
以下的方法将用于下文所描述的研究。术语巨噬细胞结合化合物,CD64免疫毒素(CD64IT)或免疫毒素(IT)在此可以互换使用。
单克隆抗体
下文的实施例描述相应于单克隆抗体22的人源化形式(H22)的抗CD64(抗FcR)抗体,上述单克隆抗体22的人源化形式在美国专利第5,635,600中有所描述,该专利在此引入作为参考。产生H22抗体的细胞系1992年11月4日储存于美国典型培养物保藏中心,命名为HA022CL,ATCC登记号为CRL11,177。
其它可以用于本发明的组合物和方法的特异性抗CD64抗体为鼠抗体mAb32.2、mAb44、mAb62和mAb197。产生mAb32.2的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心得到。ATCC登记号HB9469。mAb 197-Ricin A偶联物的制备在以下的实施例中有所描述。
抗FcR mAb可通过蛋白A亲和层析(Bio-Rad,Richmond,CA)纯化各自的杂交瘤上清。
免疫组织化学染色
A:CD-64染色
活组织样品在冰冻切片机上被切成6μM的切片并固定到包被的载玻片上。干燥过夜后切片用无水丙酮固定10分钟然后在空气中干燥。在PBS,2%正常小鼠血清(NMS)中切片与偶联FITC10.1(Serotec1:40)偶联物温育45分钟。用PBS,0.05%吐温洗涤切片3次,每次5分钟,然后与碱性磷酸酶(AP)偶联的绵羊抗FITC抗体(Boehringer Mannheim,1:400)在PBS中温育(1%人AB血清,1%NMS 30分钟)。用PBS/吐温洗涤两次和Tris-HCl(0.1M,pH8.5)洗涤一次后用溶于0.1M Tris-HCl,pH8.5的萘酚AS-BI磷酸盐(钠盐,50mg/100ml;Sigma)作为底物,新品红(10mg/100ml;Merck,Witehouse Station,N.J.)作为显色剂显示AP的活性,得到粉红色/红色的染色。内源性AP活性通过在反应混合物中加入左旋咪唑(35mg/100ml,Sigma)得以抑制。切片用苏木精轻微染色作为背景。
B:标记
切片在无水丙酮中用过氧化氢(30%,100μl/100ml)固定7分钟。切片与最佳稀释度的第一大鼠抗体在PBS,2%NMS中温育45分钟。以下的抗体用于染色巨噬细胞:MOMA-2(Krall,G.et al,(1987)Scand.J.Immunol.26:653-661);树突状细胞:NLDC145(Krall,G.et al(1986)J.Exp.Med.163:981-997);T细胞:KT3(Tomonari,K.(1988)Immunogenetics 28:455-458)。洗涤3次后(PBS,0.05%吐温20,5分钟)在PBS(1%人AB血清,1%NMS)中与过氧化物酶标记的兔抗鼠偶联物(DAKO)温育30分钟。用PBS漂洗两次和用NaAc(0.1M,pH5.0)漂洗1次后用过氧化氢作为底物,DAB作为显色剂显示PO的活性,得到褐色的染色。
动物研究
皮肤炎症的诱导,免疫毒素的注射和活组织检查。在此处所描述的实施方案中使用了表达人FcγRI的转基因FVB/N小鼠(Heijnen,I.A.,et al.(1996)J.Clin.Invest.97:331 338)。以同窝出生的未转基因小鼠作为对照。小鼠的两侧腹1.5×1.0的区域的毛被剃光并且每天在表皮上施用刺激性的月桂基硫酸钠(SLS)(5%于盐水中),连续刺激10天以诱导慢性皮肤炎症。
用20μl Aescoket(Aesculaap,Gent,Belgium)和Rompun(Bayer,Leverkussen,Germany)4:3的混合物注射动物肌肉使之麻醉。连续施用两次真皮注射(每次10μl,2×10-8M,指Ricin A部分,于盐水中)。用相同的盐水注射动物对侧以用于对照。
按照上述方法麻醉动物并取出3mm穿刺活体组织,在液氮中速冻并且储存在-70℃备用。该处皮肤用缝合线缝合。
从局部麻醉(1%利多卡因)的AD损伤皮肤(n=3),24hAPT(n=3),48h SLS(n=2)取出穿刺活体组织(3mm),并且72h WB激发PLE皮肤。活体组织在液氮中速冻并且储存于-70℃备用。
实施例1:CD 64免疫毒素的制备
利用合适的连接物(例如利用杂合的双功能可切割的交联剂N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸(SPDP)(Pierce)按照产品说明书在GLP条件下进行偶联)将CD64单克隆抗体197(Guyre,P.M.,et al.1989.J.Immunol.143:1650-1655)和H22(Graziano,R.F.,et al.1995.J.Immunol.155:4996-5002)偶联到去糖基化的Ricin A上(30KDa,Sigma)。简言之,SPDP被偶联到CD64mAb,例如H22,上,然后确定mAb-PDP的摩尔比。在确定mAb-PDP的摩尔比后,加入Ricin A。PDP自由基团和Ricin A自由链失活后该混合物用分子排阻层析纯化。进而用SDS-PAGE鉴定了H22-RicinA偶联物的纯度。用0.2μm的滤膜将H22-Ricin A偶联物除菌。所有的制备步骤都在良好的药品管理规范的条件下进行。
实施例II:利用CD64细胞毒素有效地杀伤巨噬细胞
FcγRI的组成性表达主要限制于骨髓细胞系,并且在前炎症和炎症条件下被强烈上调(Velde,A.A.,et al.(1992)J.Immunol.149:4048-4052;Schiff,D.E.,et al.(1997)Blood 90:3187-3194)。FcγRI快速而有效地介导内吞作用的能力使该受体成为激活炎症巨噬细胞上的一个有效目标(Heijnen,I.A et al.(1996)J.Clin.Invest.97:331 338)。按照实施例I中所描述的方法用毒素Ricin-A和CD64抗体的偶联物制备了一些抗h FcγRI的免疫毒素。
为了得知偶联物在诱导杀伤巨噬细胞上的效率,在存在与不存在本发明组合物条件下检测了干扰素-γ刺激的或未经干扰素-γ刺激的人类前单核细胞系U937培养物(图1,A和B)。Guyre,P.M.,etal.(1983)J,Clin.Invest.72:393-397描述了U937细胞的培养条件和用细胞因子刺激U937细胞。简言之,U937细胞在300U/ml干扰素-γ存在的条件下培养24小时以便上调FcγRI的表达。用流式细胞仪监测FcγRI的水平。此外,还检测了转染或未转染FcγRIa cDNA的IIAl.6细胞。IIA1.6细胞来自鼠的A20 B淋巴细胞并且最近表明属于CD5+B细胞/巨噬细胞的独特亚群(van Vugt,M.J.,et al.1998.Clin.Exp.Immunol.113:415-422)。
通过测量对[3H]胸苷的浓度依赖性掺入的抑制来评判CD64免疫毒素(IT)的细胞毒素功效(Post,J et al.Leuk.Res.19:241-247)。简言之,细胞被接种到5×104个细胞/每孔的96孔圆底板上并且与ricin部分的浓度为10-12至10-7M的CD64 IT一起温育72小时。细胞用[3H]胸苷(1μCi)脉冲掺入4小时,随后用玻璃棉滤膜收集并且在β平面扫描仪计数。所有的温育都在补充了2%人AB血清的培养基中进行以阻断FcγRI的Fc结合位点,因此只允许IT通过抗原识别位点结合。选择接种的细胞数,使得掺入的[3H]胸苷是细胞数的线性函数。[3H]胸苷掺入的本底值是通过与0.1mM的放线酮一起温育得到的。
结果表示为与模拟处理的细胞相比,[3H]胸苷掺入的百分比。在图1A-1B中,柱形图表示与培养基对照(±SEM)相比[3H]胸苷掺入的百分比。[3H]胸苷掺入量随H22-R或197-R浓度的增加而剂量依赖性地减少表明了免疫毒素对刺激的U937细胞的细胞毒性。对于图1C-1D,柱形图表示与培养基对照(±SEM)相比[3H]胸苷掺入的百分比。[3H]胸苷掺入随H22-R或197-R浓度的增加而剂量依赖性地减少表明了免疫毒素对hFcγRI-转染的IIA1.6细胞的细胞毒性。这表明两种IT对hFcγRI表达细胞的特异性。
上述检测的两种免疫毒素是细胞杀伤的有力诱导剂。然而,在诱导细胞杀伤时,H22 Ricin-A(H22-R)整体上比197 Ricin-A(197-R)更有效,特别是对未刺激的细胞。单独与Ricin-A在10-8和10-9M时没有明显的效果(88.9±14.2和100.4±13.5%,分别地)。更进一步地,与使用这两种ITs的任何一种都能有效杀伤hFcγRI-转染的IIA1.6细胞相比,在未转染的IIA1.6细胞上没有发现哪种IT有明显的效果(图1,图C和D)。
这些结果表明了CD 64 IT在体外杀伤hFcγRI-表达细胞的有效性和特异性。基于这些实施方案,H22-R以2×10-8M的浓度被用于下文所描述的体内实施方案中。
实施例III:通过CD 64-免疫毒素诱导细胞调亡
为了明确H22 Ricin-A的细胞毒性效应是否因为诱导了细胞调亡,在低渗缓冲液中进行了碘化丙啶染色。在这个检测中,通过亚二倍体DNA内容物识别细胞调亡核碎片。为进行这些实验,按照Nicoletti,I.,et al.(1991)J.Immunol.Methods 139:272-279所描述的方法用碘化丙啶染色检测了核碎片。简言之,细胞与IT一起温育并在不同所时间收集。细胞用乙醇在-20℃固定,与提取缓冲液(0.05M Na2HPO4;0.0025M柠檬酸;0.01%Triton X-100;20μg/ml碘化丙啶)一起温育。碘化丙啶的荧光分析用的是荧光激活细胞分选器(FACScan)流式细胞术(Beckon and Dickinson,San Jose,CA)。
如图2所示,相对于对照,在IT-处理的培养物中检测到了调亡核。在这个实验中,U937细胞用IFNγ刺激并且与不同浓度的H22-R一起温育6小时。在暴露于IT后2小时即检测到了调亡核,并且该调亡核经过16小时处理后仍然是明显的。这个发现表明H22 Ricin-AIT的细胞毒性效应来自细胞调亡的诱导。细胞调亡介导的细胞杀伤通过减少体内的hFcγRI-表达细胞而限制了潜在的破坏作用。此外,H22-R诱导的持续细胞杀伤(甚至在16小时后)意味着H22-R作为IT减少体内hFcγRI-表达细胞的可行性。
实施例IV:在人类慢性皮肤炎中检测hFcγRI-表达细胞
在切片与H22抗体预温育后并且在不同浓度H22抗体存在的情况下,检测了另一种CD 64单克隆抗体,10.1(Dougherty,G.J et al.1987.Eur.J.Immunol.17:1453-1459)的染色能力。由于10.1和H22识别hFcγRI上的不同表位,同时温育时染色强度或样式没有显著的变化。基于这些结果,在评判所收集的组织的所有涉及免疫组化的实验中都使用了10.1抗体。
为了检测人类慢性皮肤炎中hFcγRI-表达细胞的存在,收集了过敏性皮炎(AD)病人的慢性炎症皮肤活体组织。按照Hanifin和Raika的标准诊断了AD(Hanifin,J.M.,and Rajka,G.(1980)Acta Derm.Venereol.(Stockholm)92:44-47)。按照Langeveld-Wildschut,E.G.,et al.(1995)J.Allergy Clin.Immunol.96:66-73所描述的方法进行了遗传过敏症帖片测试(APT)。简言之,皮肤用胶带剥离10次并且在被诊断为AD的病人背部的临床上正常的皮肤上用Leucotests(Beiersdorf,Hamburg,Germany)施用了过敏原Dermatophagoides pteronyssinus(Haarlem’s AllergenenLaboratorium,Haarlem,The Netherlands;80μl,10,000AU/ml)。在相似的皮肤上以类似的方式施用了月桂基磺酸钠(SLS,Sigma,0.1%盐溶液)。多形性光疹(PLE)的诊断是基于多形临床图中存在WA和/或WB照射后产生的丘疹和水泡以及严重骚痒和临床反应。使用Philips TL12 UVB源,用6个最小红斑剂量照射了先前未暴露的皮肤。
利用FcγRI抗体对来自人类皮肤的切片进行了免疫组化染色。检测到的FcγRI-表达细胞表现为粉红/红色的染色结果并且与苏木精复染色形成对比。在正常未感染的皮肤中,很少细胞表达FcγRI。这些细胞主要位于真皮内。相反,在慢性损伤的皮肤,例如,遗传性过敏皮肤炎的皮肤,中观察到了FcγRI在真皮中的大量表达。染色的细胞同时位于真皮的渗透物中以及扩散通过了真皮。在表皮没有观察到明显的染色。接着,收集来自急性期模型的生物活体组织,例如遗传过敏症补片测试(APT)后24小时、多形性光疹(PLE)后72小时、月桂基磺酸钠(SLS)处理后48小时。这些生物活体组织给出了相似的结果,然而,FcγRI表达细胞的数量稍微高于慢性感染的组织。在急性和慢性期都存在大量FcγRI-表达细胞表明了在皮肤炎症反应中这些细胞有一定的作用。
实施例V:慢性皮肤炎症鼠模型的建立
为了确定从皮肤中消除炎症巨噬细胞是否可行并且对皮肤炎症是否有益,在实验动物中检测了H22-R。利用剃过毛的hFcγRI-转基因小鼠以及它们未转基因的同窝出生小鼠在局部反复施用SLS后研究慢性皮肤炎症的诱导。在这些小鼠中hFcγRI的表达模式、基因调控和功能反映了在人中hFcγRI的表达模式、基因调控和功能(heijnen,I.A.,et al.(1996)J.Clin.Invest.97:331-338)。如材料和方法部分中所描述,检测了几种方法并且证明了每天施用5%SLS,施用10天就足够了。
在正常的未处理的皮肤中检测到的T细胞、树枝状细胞和巨噬细胞数量很少(分别为5±4;7±4和15±3每mm2)。此外,在正常的未处理的皮肤中(5±2每mm2),检测到的T细胞、树枝状细胞和巨噬细胞表达细胞很少,并且它们的分布类似于正常的未感染的人皮肤。SLS处理的结果是表皮变厚以及由T细胞、树枝状细胞和巨噬细胞组成的大量真皮渗透物(图3A)。对于这些实验,在慢性炎症皮肤中施用了一次IT真皮注射并且在不同的间隔取出刺穿活体组织并进行免疫组化染色。表达hFcγRI的细胞数量也显著地增加(图3A)(75±11每mm2)并且与在慢性感染的人皮肤中一样,这些细胞主要分布在真皮中。在hFcγRI-转基因和未转基因的小鼠中,细胞组成没有明显的区别。然而在后者中,没有观察到明显的hFcγRI细胞染色。只用H22-R注射后没有检测到hFcγRI-表达细胞或巨噬细胞的存在。
在慢性炎症病人皮肤和SLS诱导hFcγRI-转基因小鼠的炎症之间在细胞组成以及hFcγRI表达上的相似性使之成为研究慢性皮肤炎症中hFcγRI表达细胞的作用的合适模型。该模型与H22-R IT一起用于下文描述的实施例中。
实施例VI:体内FcγRI-表达巨噬细胞的有效减少
为了确定H22-R在体内对hFcγRI-表达细胞的杀伤是否与体外所证明的一样有效,在SLS处理的小鼠中真皮注射了H22-R。如上文材料和方法部分所描述,在表达人FcγRI的转基因小鼠中局部反复施用刺激物质5%月桂基硫酸钠从而诱导了慢性皮肤炎症。对皮肤进行了SLS处理的hFcγRI-转基因和未转基因小鼠的一次施用中连续进行了两次10μl 2×10-8M(3μg H22和0.6μg的Ricin A)的真皮注射。在对侧施用相同的载体作为对照。继续施用SLS,同时在不同的时间点收集皮肤样品、导液淋巴结(draining lymph nodes)、肝脏和脾用于免疫组化分析。
通过检测巨噬细胞对碳颗粒的摄取检测到了真皮内注射定位特征。真皮注射碳颗粒的鼠的皮肤横截面表明了碳颗粒主要位于真皮,而不是在皮下的肌肉组织。这个分布表明了真皮内注射的定位特征。
经过月桂基硫酸钠的局部反复施用以及载体对照或Ricin A-H22的真皮注射后,表达人FcγRI的转基因小鼠皮肤的一个代表性免疫组化切片表明处理后24小时表皮变厚并且大量渗透细胞位于真皮。这种染色样式表明刺激物诱导了慢性炎症。大部分检测的渗透细胞是FcγRI-阳性巨噬细胞(被染成粉红色)。相反,经过免疫毒素RicinA-H22注射后24小时表达Fcγ受体的渗透细胞的染色显著减少。
检测到了源自皮肤的表达hFcγRI的细胞在暴露于IT 24小时内就消失了(图3A)。尽管继续施用SLS,这种减少直到接近96小时才结束,之后发生种群恢复。种群恢复只在120小时完成(图3A)。在引流淋巴结、肝脏和脾中没有观察到明显的hFcγRI表达水平的变化。这个现象强调了该效应局限于注射位点的事实。在载体对照注射位点和未转基因的小鼠中没有观察到明显的变化。hFcγRI表达细胞的快速且接近完全地消失以及它们在皮肤的持续缺乏表明用H22-R IT在慢性皮肤炎症中消除体内hFcγRI-表达细胞的可行性。
实施例VII:在局部皮肤炎症中hFcγRI-表达细胞缺少的效果
在hFcγRI-表达细胞减少的同时,MOMA-2-表达巨噬细胞的丰度也降低。这个发现表明H22-R注射导致感染皮肤中炎症巨噬细胞的有效减少(图3A)。相反,在未转基因小鼠的巨噬细胞群中没有明显变化。这种有选择的减少确认了H22-R在皮肤中定位和减少巨噬细胞的特异性。
为了进一步地评价巨噬细胞减少的定位特征,检测了造血组织例如淋巴结、脾和肝脏。在其它的造血组织中没有检测到免疫毒素造成的细胞明显减少。对未转基因的同窝出生小鼠的处理没有导致任何细胞群的可探测变化。这些结果表明巨噬细胞的减少是对人FcγRI-承载细胞特异的并且局限于注射位点。
在24小时内巨噬细胞即消失而在该检测时间点没有检测到树枝状细胞、T细胞群或郎罕氏细胞的明显减少,进一步表明了该方法在局部减少巨噬细胞上的特异性。H22-R的注射对T细胞和树枝状细胞的数量没有直接影响(图3B)。然而,在hFcγRI-表达巨噬细胞消失后,皮肤中T细胞和树枝状细胞的数量开始减少。T细胞和树枝状细胞数量减少表明了局部炎症的消退,因而表明了甚至在炎症刺激物继续存在的情况下,局部炎症中巨噬细胞减少仍然具有有益的效果(图3B)。
这些结果在组织学水平上表明了CD 64 IT在减少皮肤炎症巨噬细胞上的有效性和特异性。随后其它炎症细胞的消失表明了在慢性皮肤炎症中巨噬细胞的有害作用。
实施例VIII:局部巨噬细胞的减少改善了皮肤的临床症状
为了确定局部巨噬细胞的减少是否改善了皮肤的临床症状,测量了两种参数:局部皮肤温度和红斑。红斑主要是由于微血管扩张增强并且直接关系到皮肤温度的升高。
为了检测施用SLS和IT注射导致的皮肤温度变化,利用温和的乙醚镇静剂将动物镇静并且用皮肤探针测量局部的温度(Ellab A-H1,Denmark)。为了说明作为炎症参数的微血管扩张和血管渗漏,用乙醚将动物镇静并且用1%的Evans蓝溶液静脉注射动物。15分钟后动物被致死并且取出动物皮肤用于测量。
利用小皮肤探针测量了IT-处理的和对照动物的皮肤温度的局部变化。SLS处理后检测到温度升高,这确认了局部炎症的诱导。图4A是柱状图,描述了真皮内注射H22-R对皮肤温度的影响随时间变化的函数。温度下降达到的水平可与未处理的未感染的皮肤相比。在IT-处理的动物中检测到的温度下降通常持续96小时。之后,温度又升高,达到的水平可与IT注射以前相比。这些温度变化表明炎症的消退。载体对照和未转基因的小鼠都没有显示类似的温度下降。而且,发现巨噬的消失和局部皮肤温度下降之间有密切的时间关系。反之,巨噬细胞重新出现时检测到了温度升高。这个结果高度表明了在局部炎症中巨噬细胞的重要作用。
在小鼠中,由于鼠皮肤很薄很难评价皮肤红色。为了方便看清局部微血管的扩张,将Evans蓝注射到这些小鼠的静脉中。对于这些实验,通过表皮施用SLS在hFcγRI-转基因小鼠(n=9)或未转基因小鼠(n=9)以诱导慢性皮肤炎症,并且在真皮内施用了IT或载体对照。在第24小时静脉注射Evans蓝,30分钟后动物被杀死并且中间部分的皮肤被移走。利用这个技术检测到SLS处理后存在炎症反应。在未转基因小鼠或载体对照中没有检测到IT对微血管扩张的明显作用。然而,在后者的H22-R注射的一侧,该注射位点本身没有染成蓝色,表明了局部炎症的消退。而且,在所有染成蓝色的地方很少在H22-R注射的一侧。
实施例IX:体内反复注射CD64-IT延长了对炎症的抑制
为了确定IT是否可以施用更长的时间,每天检测皮肤温度并且温度上升时在动物的同一部位再注射IT。在这个实验中,继续施用SLS。图4B表明只有在注射H22-R的hFcγRI-转基因小鼠中炎症可以被控制至少18天。在任何时间点检测载体对照和未转基因小鼠没有显示出明显的温度下降。用IT反复注射表明长时间地抑制炎症是可能的。这个结果表明了在病人慢性皮肤炎症中延长IT处理的适用性。总的来说,这些实验表明了在SLS诱导的慢性皮肤炎症中局部消除巨噬细胞的有益作用。
总而言之,本文实施例所描述的实验表明了利用本发明的组合物和方法可以选择性地并且有效地消除活性巨噬细胞,而对其它皮肤或造血细胞群没有显著的影响。而且,免疫毒素的作用主要位于运送的区域,因此减少了对全身的其它FcγR表达细胞的副作用。巨噬细胞消除时炎症减弱强调了炎症巨噬细胞在诱导和维持皮肤炎症中的重要作用。炎症的减弱是在组织学水平上并且通过临床参数例如局部皮肤温度和皮肤的红色的降低来检测的。而且,反复施用能延长对炎症的抑制。延长效力表明了本发明的方法和组合物在治疗患有慢性皮肤病的病人局部皮肤炎症上的潜在用途。本文所描述的方法可能有更广泛的用途,因为炎症巨噬细胞可能在其它类型的慢性炎症例如风湿性关节炎中起重要作用。
在人皮肤中的CD64染色显示了在急性和慢性皮肤炎症中存在大量的FcγRI-表达细胞。这个结果表明通过FcγRI定位巨噬细胞可以真正提供治疗人皮肤炎症疾病的新方法。事实上,本文展示的SLS诱导的hFcγRI-转基因小鼠慢性炎症的有效减弱支持了免疫毒素的潜在治疗用途。
等价方案
本领域的技术人员不需要常规实验以外的方法就能够辨别或确认此处所描述特定实施方案的等价方案。下文的权利要求将这些等价方案包括在内。
Claims (25)
1.有选择地减少巨噬细胞的数量或降低巨噬细胞活性的方法,包括用巨噬细胞结合化合物接触巨噬细胞,该巨噬细胞结合化合物包含(a)结合Fc受体的试剂(b)杀伤巨噬细胞或降低巨噬细胞活性的试剂。
2.治疗或预防患者疾病方法,该疾病的特征是在患者的特定区域内巨噬细胞活性或数量异常,包括在局部区域施用巨噬细胞结合化合物,上述巨噬细胞结合化合物包含(a)结合Fc受体的试剂(b)杀伤巨噬细胞或降低巨噬细胞活性的试剂。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法,其中结合Fc受体的组成部分的结合位点不会被内源性免疫球蛋白结合。
4.根据权利要求1或权利要求2的方法,其中Fc受体是Fcγ受体(FcγR)或Fcα受体(FcαR)。
5.根据权利要求4的方法,其中Fcγ受体选自FcγRI、FcγRII、FcγRIII。
6.根据权利要求5的方法,其中Fcγ受体是人FcγRI。
7.根据权利要求4的方法,其中Fc受体是人FcαR。
8.权利要求1或2的方法,其中巨噬细胞结合化合物包含偶联了毒素的抗-Fc受体抗体。
9.根据权利要求8的方法,其中抗-Fc受体抗体是抗-Fcγ受体抗体或其片段。
10.根据权利要求9的方法,其中抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体,它选自mab22、32和197或其片段。
11.根据权利要求9的方法,其中抗-Fcγ受体抗体是人源化的抗体H22或其片段,该抗体由ATCC登记号为CRL1117的细胞系产生。
12.根据权利要求8的方法,其中毒素选自Gelonin、皂草素、外毒素A、癌酶和蓖麻毒蛋白A。
13.根据权利要求1的方法,其中杀伤巨噬细胞或减少巨噬细胞活性的试剂被包入脂质体中。
14.根据权利要求13的方法,其中杀伤巨噬细胞或减少巨噬细胞活性的试剂是二氯亚甲基二磷酸酯(CL2MDP)或其衍生物。
15.根据权利要求13的方法,其中结合Fc受体的试剂是单链抗体。
16.根据权利要求13的方法,其中结合Fc受体的试剂是抗-Fcγ受体抗体或其片段。
17.根据权利要求13的方法,其中结合Fc受体的试剂是单链抗-Fcγ受体抗体或其片段。
18.根据权利要求1的方法,其中接触步骤发生在培养中。
19.根据权利要求1或权利要求2的方法,其中巨噬细胞结合化合物是在药用上可接受的载体中被局部、皮内或皮下施用。
20.根据权利要求2的方法,其中疾病的特征是巨噬细胞的增殖和/或生长因子的分泌增强。
21.根据权利要求2的方法,其中疾病选自牛皮癣、遗传性过敏皮炎、硬皮病、皮肤红斑狼疮、人类免疫缺陷病毒感染、多发性硬化症、风湿性关节炎、慢性多形性光照皮肤病、慢性梗阻性肺病和Wegener’s肉芽肿病。
22.诊断患者中以巨噬细胞数量或活性异常为特征的疾病的方法,包括用包含结合Fc受体试剂的巨噬细胞结合化合物接触源自患者的生物样品;检测Fc受体结合的水平,该水平表明样品中Fc受体蛋白的数量,其中Fc受体蛋白表达水平的升高或表达Fc受体蛋白的巨噬细胞数量的增加表明存在巨噬细胞介导的疾病。
23.根据权利要求22的方法,其中巨噬细胞结合化合物进一步包含可探测的标记物。
24.根据权利要求22的方法,其中Fc受体蛋白的检测是通过放射性自显影、比色法、发光或荧光检测。
25.根据权利要求22的方法,其中疾病选自牛皮癣、遗传性过敏皮炎、多发性硬化症、硬皮病、皮肤红斑狼疮、人类免疫缺陷病毒感染、慢性多形性光照皮肤病、慢性梗阻性肺病和Wegener’s肉芽肿病。
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---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
REG | Reference to a national code |
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