CN111656195B - 单核/巨噬细胞在主动脉损伤中的诊断和治疗应用 - Google Patents

单核/巨噬细胞在主动脉损伤中的诊断和治疗应用 Download PDF

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Abstract

单核/巨噬细胞在主动脉损伤中的诊断和治疗应用。通过单核/巨噬细胞的浸润情况来诊断主动脉夹层(AD)相关的疾病，如血管撕裂、血管壁增厚、中膜与外膜之间形成血栓、弹性纤维断裂等，还可以通过敲除单核/巨噬细胞，或者使用单核/巨噬细胞的抑制剂，来预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病。

Description

单核/巨噬细胞在主动脉损伤中的诊断和治疗应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及单核/巨噬细胞在主动脉损伤中的诊断和治疗应用。
背景技术
AD是一种十分危险的主动脉疾病，具有发病急、进展迅速和死亡率较高的特点。近年来随着人口老龄化的加剧，高血压、动脉粥样硬化等发病率的上升，AD发病率也呈现逐渐增高的趋势。由于AD的发病机制仍然不明，严重制约该疾病的临床防治水平。
目前临床用于AD研究的组织往往是在病人手术时所获得，也就是说只能获得发病后的病人样本，由于无法预测AD的发生，也就无法获取发病前的患者样本，因此临床样本不能完全满足考察主动脉夹层发生发展的研究需求。AD实验动物模型的利用成为AD发生发展的研究中必不可少的体系。基础研究中，经典的AD模型是通过在apoE-/-或老年小鼠的体内埋置渗透泵持续释放血管紧张素II引起的自发性AD。该类模型较易形成主动脉瘤，AD的发生率较低，因此急需能够反映夹层患者发生前的组织改变且能稳定形成夹层的动物模型。
大量临床实验发现C反应蛋白、钠利钛以及D二聚体等炎症标志物在AD患者的血浆水平都显著增加并且这些标志物在夹层的急性期和慢性期表现出不同的时程变化，甚至与疾病的预后密切关系。但是炎症细胞在AD发生、发展中的具体作用仍然不得而知。
因此，本领域迫切需要提供炎症细胞在主动脉损伤中的诊断和治疗应用。
发明内容
本发明的目的在于提供单核/巨噬细胞在主动脉损伤中的诊断和治疗应用。
本发明的第一方面提供了一种单核/巨噬细胞或其检测试剂的用途，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于诊断主动脉夹层(AD)相关疾病。
在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。
在另一优选例中，所述诊断包括辅助性诊断和/或确认性诊断。
在另一优选例中，所述的单核/巨噬细胞来源于哺乳动物，较佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人。
在另一优选例中，所述检测试剂包括单核/巨噬细胞的特异性抗体、单核/巨噬细胞的特异性结合分子、特异性扩增引物、探针或芯片。
在另一优选例中，所述的单核/巨噬细胞或其特异性抗体或特异性结合分子偶联有或带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中，所述单核/巨噬细胞的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述主动脉夹层(AD)相关疾病选自下组：血管撕裂、血管壁增厚、中膜与外膜之间形成血栓、弹性纤维断裂或其组合。
本发明第二方面提供了一种用于诊断主动脉夹层(AD)相关的血管撕裂的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测单核/巨噬细胞的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于诊断与主动脉夹层(AD)相关疾病。
在另一优选例中，所述主动脉夹层(AD)相关疾病选自下组：血管撕裂、血管壁增厚、中膜与外膜之间形成血栓、弹性纤维断裂或其组合。
在另一优选例中，所述的检测单核/巨噬细胞的检测试剂包括：
(a).抗单核/巨噬细胞的特异性抗体；和/或
(b)对单核/巨噬细胞具有特异亲和力的标记物或者染料。
在另一优选例中，所述检测是活体组织检测。
在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：
(i)当检测对象(subject)的待测组织中单核/巨噬细胞的聚集数量与正常组织中单核/巨噬细胞的数量之比(C1/C0)≥10，较佳地，≥20，更佳地，≥30，则提示该检测对象发生主动脉夹层(AD)相关的血管撕裂的风险高于普通人群或提示所述血管已经出现撕裂。
在另一优选例中，所述的检测对象为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测人的主动脉。
本发明第三方面提供了一种诊断主动脉夹层(AD)相关疾病发生风险的方法，包括步骤：
a)提供一检测单核/巨噬细胞的检测试剂；
b)用所述检测试剂，检测待测对象中的待测的主动脉组织的单核/巨噬细胞的聚集数量C1；和
c)将步骤b)中所测定的单核/巨噬细胞的聚集数量C1与正常组织的聚集数量C0进行比较，从而诊断与主动脉夹层(AD)相关疾病的发生风险；
其中，所述的正常组织的聚集数量C0为正常人群的主动脉组织的单核/巨噬细胞聚集数量，或者是所述待测对象中的正常主动脉组织的单核/巨噬细胞的聚集数量。
在另一优选例中，在步骤c)中，计算C1与C0的比值Rc(Rc＝C1/C0)，并与参考值(或阈值)R0进行比较，当Rc大于或等于R0，(例如当Rc≥10，较佳地，≥20，更佳地，≥30)，则表明受试者发生与主动脉夹层(AD)相关的血管撕裂的几率高于普通人群。
在另一优选例中，所述的聚集数量包括单位体积内的聚集数量、或某一组织区域内的聚集数量、或总聚集数量。
在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的检测试剂为造影剂。
在另一优选例中，所述的检测试剂为带有可检测标志(detectable label)的纳米载体。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括：
(a).抗单核/巨噬细胞的特异性抗体；和/或
(b)对单核/巨噬细胞具有特异亲和力的标记物或者染料。
本发明第四方面提供了一种单核/巨噬细胞抑制剂的用途，用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病。
在另一优选例中，所述单核/巨噬细胞抑制剂包括抑制单核/巨噬细胞浸润到主动脉损伤部位。
在另一优选例中，所述单核/巨噬细胞抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、siRNA、反义核酸、基因编辑试剂(如CRISPR编辑试剂)、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：CD68抗体、B7-1/CD80、B7-2/CD86、CCR5、CD11b/integrin αM、CD11c、CD14、CD15(SSEA-1)/Lewis X、CD68/SR-D1、CD163、EMR1、F4/80、FcγRI/CD64、FcγRII/CD32、FcγRIII/CD16、Gelectin-3/Mac-2、GITR Ligand、HLA-DR、整合素αL/CD11a(IntegrinαL/CD11a)、LAMP2/CD107b、LIRB4/CD85k/ILT3、M-CSF R/CD115、MHC ClassII、Siglec-3/CD33、TLR2、TLR4、CD45+、PPARγ、CD43+、CX3CR1+、Dectin-1+、IRF4+、IL-4 Rα、MMR/CD206、SR-B1+、TLR1、整合素αM/CD11(IntegrinαM/CD11)、或其组合。
在另一优选例中，所述单核/巨噬细胞抑制剂选自下组：CD68抗体、或含CD68抗体的抗体-药物偶联物(ADC)。
在另一优选例中，所述主动脉夹层(AD)相关的疾病选自下组：血管撕裂、血管壁增厚、中膜与外膜之间形成血栓、弹性纤维断裂、或其组合。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体以及(a)单核/巨噬细胞抑制剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a)占所述药物组合物总重量的0.1-99wt％，较佳地1-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述组合物还包括其他的预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述组合物或制剂在预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的应用中，可单独使用，或联合使用。
在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其它预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的药物联合使用。
在另一优选例中，所述单核/巨噬细胞抑制剂的使用剂量为0.1-100mg/kg，较佳地1-50mg/kg，更佳地2-10mg/kg。
本发明第五方面提供了一种用于预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的药物组合物，包括：
(a)单核/巨噬细胞抑制剂；和
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的单核/巨噬细胞抑制剂是能够被单核/巨噬细胞特异吞噬而发挥杀伤作用的制剂。
在另一优选例中，所述的抑制剂选自下组：抑制单核/巨噬细胞生长的抑制剂、诱导单核/巨噬细胞凋亡的抑制剂、抑制单核/巨噬细胞聚集的抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述单核/巨噬细胞抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、siRNA、反义核酸、基因编辑试剂(如CRISPR编辑试剂)、或其组合。
在另一优选例中，所述单核/巨噬细胞抑制剂选自下组：CD68抗体、或含CD68抗体的抗体-药物偶联物(ADC)。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他的预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、和口服剂型。
在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。
本发明第六方面提供了一种药盒，包括：
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a)单核/巨噬细胞抑制剂，或含有活性成分(a)的药物；
(ii)任选的第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(b)其他的预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的药物，或含有活性成分(b)的药物；
和(iii)说明书，所述说明书记载了联合给予活性成分(a)和任选的活性成分(b)从而预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的方法。
在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含单核/巨噬细胞抑制剂的单方制剂。
在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含其他的预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的药物的单方制剂。
在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。
在另一优选例中，所述第一容器与第二容器可以为同一(相同)或不同的容器。
本发明第七方面提供了一种预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的方法，包括步骤：
给需要的对象，施用单核/巨噬细胞抑制剂，从而预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病。
在另一优选例中，所述对象为主动脉夹层(AD)相关的疾病的易感对象。
在另一优选例中，所述对象为患有主动脉夹层(AD)相关的疾病的对象。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。
在另一优选例中，所述单核/巨噬细胞抑制剂的施用剂量为0.1-100mg/kg体重，较佳地为1-50mg/kg体重，最佳地为5-20mg/kg体重。
在另一优选例中，所述单核/巨噬细胞抑制剂的施用频率为1-2次/周或1-5次/天，较佳地为1天/次。
在另一优选例中，所述单核/巨噬细胞抑制剂的施用时间为5-100天，较佳地为10-50天，最佳地为14-21天。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示给予小鼠不同剂量β-氨基丙腈组合血管紧张素II模拟AD进程的实验方案。
图2显示给予小鼠不同剂量β-氨基丙腈组合血管紧张素II的生存曲线和AD发生率。(A)生存曲线(B)AD发生率，这个发生率包括死于主动脉破裂的小鼠。
图3显示给予小鼠不同剂量β-氨基丙腈组合血管紧张素II的各组动物血压。
图4显示了主动脉四个不同部位的组织结构。(A)主动脉分为主动脉弓(AoA)、胸降主动脉(DAo)、肾上主动脉(SAo)、肾下主动脉(IAo)的示意图(B)给予小鼠不同剂量β-氨基丙腈组合血管紧张素II处理组的H&E染色代表图。
图5显示主动脉弓(AoA)、胸降主动脉(DAo)、肾上主动脉(SAo)、肾下主动脉(IAo)四个部位的血管壁最大厚度的定量。
图6显示给予小鼠不同剂量β-氨基丙腈组合血管紧张素II后各组弹力纤维的染色和定量。(A)地衣红染色考察弹力纤维的代表图，标尺200μm。(B)弹力纤维断裂的定量结果。
图7显示了胸降主动脉部位不同剂量β-氨基丙腈组合血管紧张素II处理组的电镜代表图。
图8显示给予小鼠不同剂量β-氨基丙腈组合血管紧张素II模拟AD疾病进程中外周血白细胞及其分型的计数。
图9显示了AD进程中T淋巴细胞的浸润(A)主动脉弓(AoA)和肾上主动脉(SAo)部位CD3免疫组化的代表图，(B)主动脉弓(AoA)和肾上主动脉(SAo)部位CD3+细胞百分比的定量。
图10显示了AD进程中中性粒细胞的浸润。(A)主动脉弓(AoA)和肾上主动脉(SAo)部位Gr-1免疫组化的代表图，(B)主动脉弓(AoA)和肾上主动脉(SAo)部位Gr-1细胞百分比的定量。
图11显示了AD进程中巨噬细胞的浸润。(A)主动脉弓(AoA)和肾上主动脉(SAo)部位CD68免疫组化的代表图，(B)主动脉弓(AoA)和肾上主动脉(SAo)部位CD68细胞百分比的定量。
图12显示了主动脉由损伤前转向夹层发生时间点的设计示意图，也就是建立在24小时内触发AD发生的急性动物模型示意图。
图13显示了1％β-氨基丙腈和AngII诱导急性主动脉夹层的实验方案。
图14显示了正常对照组，β-氨基丙腈组和β-氨基丙腈+AngII组的AD发生率，包括死于主动脉破裂的小鼠。
图15显示了AD发生前后主动脉结构的改变。(A)正常对照组，β-氨基丙腈组和β-氨基丙腈+AngII组的H&E染色代表图，(B)最大血管壁厚度的定量
图16显示了AD发生时主动脉弓(AoA)弹性纤维的降解。(A)正常对照组，β-氨基丙腈组和β-氨基丙腈+AngII组的地衣红染色代表图，标尺200μm，(B)弹性纤维断裂数的定量
图17显示了T淋巴细胞浸润在发生夹层主动脉弓(AoA)组织中。(A)CD3免疫组化的代表图，标尺50μm.(B)CD3+细胞百分比的定量
图18显示了中性粒细胞浸润在发生夹层的主动脉弓(AoA)组织中。(A)Gr-1免疫组化的代表图，标尺50μm.(B)Gr-1+细胞百分比的定量
图19显示了巨噬细胞浸润在发生夹层的主动脉弓(AoA)组织中。(A)CD68免疫组化的代表图，标尺50μm(B)CD68+细胞百分比的定量
图20显示了1％β-氨基丙腈和AngII共同处理T细胞免疫缺陷鼠(nu/nu)和其对照鼠(Balb/c)考察主动脉夹层发生的实验方案。
图21显示了BALB/c和nu/nu小鼠在β-氨基丙腈及β-氨基丙腈+AngII处理下的AD发生率，发生率的计算包括死于主动脉破裂的小鼠。
图22显示了T淋巴细胞缺失对主动脉弓(AoA)结构的影响。(A)BALB/c和nu/nu小鼠H&E染色的代表图，标尺200μm，(B)最大血管壁厚度的定量
图23显示了T淋巴细胞缺失对主动脉弓(AoA)弹性纤维断裂的影响。(A)BALB/c和nu/nu小鼠地衣红染色的代表图，标尺200μm，(B)弹性纤维断裂的定量
图24显示了T淋巴细胞的缺失对主动脉弓(AoA)T淋巴细胞浸润的影响。(A)CD3免疫组化的代表图，标尺50μm，(B)CD3+细胞百分比的定量
图25显示了T淋巴细胞的缺失对主动脉弓(AoA)中性粒细胞浸润的影响。(A)Gr-1免疫组化的代表图，标尺50μm(B)Gr-1+细胞百分比的定量
图26显示了T淋巴细胞的缺失对主动脉弓(AoA)巨噬细胞浸润的影响(A)CD68免疫组化的代表图，标尺50μm，(B)CD68+细胞百分比的定量
图27显示了LysMiDTR小鼠构建的示意图。
图28显示了LysMiDTR小鼠的基因型的鉴定，wt、hete和homo分别标示野生型、杂合型和纯合型。
图29显示采用LysMiDTR小鼠考察单核/巨噬细胞敲除对主动脉损伤及夹层其发生率的实验方案示意图，“+”表示DT注射的时间。
图30显示单核/巨噬细胞敲除降低主动脉损伤及夹层发生率。(A)Control和DT组的主动脉血管的大体观，(B)Control和DT组的AD发生率。
图31显示了单核/巨噬细胞敲除对主动脉弓(AoA)结构的影响。(A)H&E染色代表图，标尺50μm，(B)血管壁最大厚度的定量。
图32显示了单核/巨噬细胞敲除对主动脉弓(AoA)弹性纤维断裂的影响。(A)地衣红染色代表图，标尺50μm，(B)主动脉弹性纤维断裂数的定量。
图33显示了单核/巨噬细胞敲除对主动脉弓(AoA)巨噬细胞浸润的影响。(A)CD68免疫组化代表图，标尺50μm，(B)CD68+细胞百分比定量图。
图34显示了单核/巨噬细胞敲除对主动脉弓(AoA)T淋巴细胞浸润的影响。(A)T淋巴细胞免疫组化的代表图，标尺50μm，(B)CD3+细胞百分比的定量。
图35显示了单核/巨噬细胞敲除对主动脉弓(AoA)中性粒细胞浸润的影响。(A)中性粒细胞免疫组化的代表图，标尺50μm，(B)Gr-1+细胞百分比的定量。
图36显示在LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠进行单核重建，考察AD发生的实验方案示意图，“+”表示DT注射的时间点，“#”表示单核细胞回输的时间点。
图37显示单核细胞回输LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠，对主动脉夹层发生的影响。(A)LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠(DT组)和单核细胞回输小鼠(DT+monocyte组)的主动脉大体图，(B)LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠(DT组)和单核细胞回输小鼠(DT+monocyte组)的AD发生率。
图38显示单核细胞回输LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠，对主动脉结构的影响。(A)LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠(DT组)和单核细胞回输小鼠(DT+monocyte组)的H&E染色代表图，(B)血管壁最大厚度的定量。
图39显示单核细胞回输LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠，对弹性纤维断裂的影响。(A)LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠(DT组)和单核细胞回输小鼠(DT+monocyte组)地衣红染色代表图，标尺50μm，(B)主动脉弹性纤维断裂数的定量。
图40显示单核细胞回输LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠，对巨噬细胞浸润的影响。(A)LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠(DT组)和单核细胞回输小鼠(DT+monocyte组)的CD68免疫组化代表图，标尺50μm，(B)CD68+细胞百分比的定量。
图41显示单核细胞回输LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠，对T淋巴浸润的影响。(A)LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠(DT组)和单核细胞回输小鼠(DT+monocyte组)的CD3免疫组化代表图，标尺50μm，(B)CD3+细胞百分比的定量。
图42显示单核细胞回输LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠，对中性粒细胞浸润的影响。(A)LysMiDTR单核/巨噬细胞敲除的小鼠(DT组)和单核细胞回输小鼠(DT+monocyte组)Gr-1免疫组化代表图，标尺50μm，(B)Gr-1+细胞百分比的定量。
图43显示CD68抗体对主动脉夹层的防治作用。(A)CD68抗体处理的具体实验方案示意图。(B)CD68抗体降低主动脉夹层的发生率。(C)H&E染色代表图。(D)血管壁最大直径的定量结果。(E)地衣红染色代表图。(F)主动脉弹性纤维断裂数的定量。(G)CD68免疫组化代表图。(H)CD68+细胞百分比的定量
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外的发现，主动脉夹层(AD)的发生伴有单核/巨噬细胞在主动脉损伤部位的浸润，并首次明确巨噬细胞是浸润在血管损伤部位的主体炎症细胞，因此可根据单核/巨噬细胞的浸润情况来诊断主动脉夹层(AD)相关的疾病(如血管撕裂、血管壁增厚、中膜与外膜之间形成血栓、弹性纤维断裂等)。此外，本发明还意外的发现，敲除单核/巨噬细胞会显著预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病。在此基础上，本发明人完成了本发明。
CD68抗体、B7-1/CD80、B7-2/CD86、CCR5、CD11b/integrinαM、CD11c、CD14、CD15(SSEA-1)/Lewis X、CD68/SR-D1、CD163、EMR1、F4/80、FcγRI/CD64、FcγRII/CD32、FcγRIII/CD16、Gelectin-3/Mac-2、GITR Ligand、HLA-DR、整合素αL/CD11a(Integrin αL/CD11a)、LAMP2/CD107b、LIRB4/CD85k/ILT3、M-CSF R/CD115、MHC ClassII、Siglec-3/CD33、TLR2、TLR4、CD45+、PPARγ、CD43+、CX3CR1+、Dectin-1+、IRF4+、IL-4 Rα、MMR/CD206、SR-B1+、TLR1、整合素αM/CD11(IntegrinαM/CD11)均为市售抗体。
样品
本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。
主动脉夹层(AD)相关疾病
主动脉夹层(aortic dissection，AD)是临床上一类非常凶险且死亡率极高，以大血管撕裂为特征的代谢性疾病。发病时主动脉腔内血液从主动脉内膜撕裂处进入主动脉中膜，使中膜分离，并沿主动脉长轴方向扩展，形成主动脉壁的分离状态，该疾病在心血管系统凶险疾病中排名第一，发病隐匿。此外，该病的误诊率高，并发症严重，救治率低，进展迅速，如不及时医治多数患者将在发病后数小时至数天内死亡。主动脉瘤，壁间血肿，马凡综合征征等疾病在发展到后期，都会出现血管壁的撕裂，进而导致患者的死亡。
在本发明中，主动脉夹层(AD)相关疾病选自下组：血管撕裂、血管壁增厚、中膜与外膜之间形成血栓、弹性纤维断裂、或其组合。
单核/巨噬细胞(单核-巨噬细胞)
单核-巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等重要作用。在抗感染方面，非特异性吞噬杀伤多种病原微生物，是机体非特异性免疫防御中的重要细胞。在特异性免疫应答中，绝大多数TD抗原(胸腺依赖抗原)都需经巨噬细胞吞噬和加工处理，并与其表面的MHC分子形成抗原肽-MHC复合物，表达在细胞膜表面，提呈给T细胞。巨噬细胞表面有很多黏附分子，可与T细胞表面的协同刺激分子受体结合，产生协同刺激信号，诱导T细胞的活化，启动免疫应答。在抗肿瘤方面，巨噬细胞被某些细胞因子如IFN-γ激活后能有效地杀伤肿瘤细胞，是参与免疫监视的重要效应细胞。
单核/巨噬细胞抑制剂
如本文所用，术语“单核/巨噬细胞抑制剂”是指能够被单核/巨噬细胞特异吞噬而发挥杀伤作用的制剂。在一优选实施方式中，所述的抑制剂包括抑制单核/巨噬细胞生长的抑制剂、诱导单核/巨噬细胞凋亡的抑制剂、抑制单核/巨噬细胞聚集的抑制剂、或其组合。
在本发明中，所述单核/巨噬细胞抑制剂没有特别限制，只要能够抑制单核/巨噬细胞浸润到主动脉损伤部位，或抑制单核/巨噬细胞生长、诱导单核/巨噬细胞凋亡、抑制单核/巨噬细胞聚集的物质均在本发明的保护范围内。
在一优选实施方式中，本发明单核/巨噬细胞抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、siRNA、反义核酸、基因编辑试剂(如CRISPR编辑试剂)、或其组合。
在一优选实施方式中，所述单核/巨噬细胞抑制剂选自下组：CD68抗体、或含CD68抗体的抗体-药物偶联物(ADC)。
在一优选实施方式中，通过基因敲除或敲减方法使得主动脉组织中的单核/巨噬细胞的浸润数量显著下降86.6％。
特异性抗体
在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗单核/巨噬细胞的特异性抗体”可互换使用。
本发明还包括对人的单核/巨噬细胞具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人的单核/巨噬细胞。较佳地，指那些能与人的单核/巨噬细胞结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人的单核/巨噬细胞的分子，也包括那些并不影响人的单核/巨噬细胞功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人的单核/巨噬细胞结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人的单核/巨噬细胞或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人的单核/巨噬细胞或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人的单核/巨噬细胞功能的抗体以及不影响人的单核/巨噬细胞功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人的单核/巨噬细胞的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人的单核/巨噬细胞的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人的单核/巨噬细胞的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本)中的单核/巨噬细胞。
在本发明中，所述抗体不仅可以用于活体检测单核/巨噬细胞在主动脉中的聚集情况(如通过造影技术)，还可以用于预防和治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病。
用于诊断时，一种优选方式是将所述的特异性抗体与合适的造影剂偶联，形成纳米造影载体。
用于治疗时，一种优选方式是将所述的特异性抗体与合适的药物(或毒性物质)偶联，形成抗体-药物偶联物(ADC)。能够被单核/巨噬细胞特异吞噬而发挥杀伤作用的制剂，是特别优选的。
在一优选实施方式中，所述抗体选自下组：CD68抗体、B7-1/CD80、B7-2/CD86、CCR5、CD11b/integrinαM、CD11c、CD14、CD15(SSEA-1)/Lewis X、CD68/SR-D1、CD163、EMR1、F4/80、FcγRI/CD64、FcγRII/CD32、FcγRIII/CD16、Gelectin-3/Mac-2、GITR Ligand、HLA-DR、整合素αL/CD11a(IntegrinαL/CD11a)、LAMP2/CD107b、LIRB4/CD85k/ILT3、M-CSFR/CD115、MHC ClassII、Siglec-3/CD33、TLR2、TLR4、CD45+、PPARγ、CD43+、CX3CR1+、Dectin-1+、IRF4+、IL-4 Rα、MMR/CD206、SR-B1+、TLR1、整合素αM/CD11(IntegrinαM/CD11)、或其组合。
一种特别优选的抗体是抗CD68的抗体。
诊断方法
利用单核/巨噬细胞可在主动脉损伤部位浸润，并与AD发生密切相关这一特点，本发明提供了诊断主动脉夹层(AD)相关的疾病的方法。
诊断试剂盒
本发明提供了一种用于诊断主动脉夹层(AD)相关的疾病的试剂盒。
在一优选实施方式中，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测单核/巨噬细胞的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于(i)诊断与主动脉夹层(AD)相关疾病。
在一优选实施方式中，所述的标签或说明书中注明以下内容：
(i)当检测对象(subject)的待测组织中单核/巨噬细胞的聚集数量与正常组织中单核/巨噬细胞的数量之比(C1/C0)≥10，较佳地，≥20，更佳地，≥30，则提示该检测对象发生主动脉夹层(AD)相关的血管撕裂的风险高于普通人群或提示所述血管已经出现撕裂。
复方药物组合物和药盒
本发明提供了含有活性成分(a)单核/巨噬细胞抑制剂；以及(b)药学上可接受的载体的复方药物组合物。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。本发明的药物组合物优选为注射制剂。此外，本发明药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。并且，本发明的药物组合物还可以包括额外的组分，所述额外的组分为其他预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关疾病的药物。本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了一种可用于预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关疾病的药盒，该药盒含有：
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a)单核/巨噬细胞抑制剂，或含有活性成分(a)的药物；
(ii)第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(b)其他的预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的药物，或含有活性成分(b)的药物；和
(iii)说明书，所述说明书记载了联合给予活性成分(a)和活性成分(b)从而预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的说明。
在另一优选例中，所述第一容器与第二容器为统一(相同)或不同的容器。
本发明的药物组合物和药盒适用于预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关疾病。
本发明制剂可以每一天服用三次到每十天服用一次，或者以缓释方式每十天服用一次。优选的方式是每天服用一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺应性。
服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量应低于(或少数病例等于或略大于)各个单药的每天常用剂量，当然，所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而有所变化。
治疗方法
本发明还提供了用本发明的活性成分或相应的药物来预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关疾病的方法，它包括给哺乳动物施用有效量的活性成分(a)单核/巨噬细胞抑制剂；或者施用含有所述活性成分(a)的药物组合物。
当本发明的活性成分被用于上述用途时，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.01-99％，更佳地约为0.1％-90％(重量)的活性成分。
本发明的两种活性成分或药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、瘤内或局部给药。优选的给药途径包括口服给药、肌内给药或静脉内给药。
从易于给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物，尤其是注射剂。
此外，本发明的活性成分或药物还可与其他预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关疾病的药物联合使用。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次公开，主动脉夹层(AD)的发生伴有单核/巨噬细胞在主动脉损伤部位的浸润，因此可根据单核/巨噬细胞的浸润情况来诊断主动脉夹层(AD)相关的疾病(如血管撕裂、血管壁增厚、中膜与外膜之间形成血栓、弹性纤维断裂等)。
(2)本发明首次公开，敲除单核/巨噬细胞会显著预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病。
(3)本发明首次公开针对单核/巨噬细胞的特异性抗体(如CD68抗体)可显著预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病。
(4)本发明首次公开相较于T细胞，中性粒细胞等炎症细胞，单核/巨噬细胞是聚集于主动脉夹层损伤区域的主体炎症细胞。
(5)本发明首次公开相较于T细胞，中性粒细胞等，单核/巨噬细胞具有触发AD发生的能力。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例中用到的材料和试剂如无特殊说明，均为市售产品。
以CD68抗体为例。
实施例1
AD进程中炎症细胞在主动脉的浸润
1.1实验材料
实验动物
C57小鼠：雄性，64只，由中国科学院上海实验动物中心提供，饲养于中国科学院上海药物所实验动中心SPF级动物室，恒温22±2℃，12h光照，标准饮食，自由饮水。
高脂饲料：饲料含蛋白18.8％，脂肪16.2％，由上海斯莱克实验动物有限公司提供
1.2实验方法
1.2.1主动脉夹层模型的制备
为了建立模拟AD疾病进程的小鼠模型，将C57小鼠按照体重随机分为4组：0％β-氨基丙腈组(n＝16)，0.125％β-氨基丙腈组(n＝16)，0.25％β-氨基丙腈组(n＝16)以及0.5％β-氨基丙腈组(n＝16)。0.125％β-氨基丙腈组、0.25％-氨基丙腈组以及0.5％β-氨基丙腈组分别给予含有相应含量β-氨基丙腈饲料喂养，每日皮下注射AngII；0％β-氨基丙腈组每日给予正常饲料喂养，皮下注射相同体积的生理盐水作为正常对照组。AngII的注射剂量根据实验过程中小鼠的存活状况进行相应的调整，第0天至第7天的AngII剂量为1.44mg/kg/day，第8天至第14天的AngII剂量为0.72mg/kg/day，第15天和第16天的AngII剂量为0.36mg/kg/day，造模第15天检测小鼠血压，第16天取血进行血常规检测，然后取材考察主动脉夹层的发生情况。该项研究获得上海药物研究所实验动物管理与使用委员会的批准(SIMM-2015-03-GDA-27)，具体研究方案见图1。
1.2.2无创血压测定
采用无创尾套检测法测量小鼠血压，首先需对小鼠进行适应性驯化，以保证血压数值真实反映小鼠的血压状态，驯化的过程需要小鼠在清醒的状态下，每轮接受5次血压测定，且测得的血压数值上下偏差不超过20mmHg。
测定血压时，首先连接仪器并设定动物恒温系统为37℃，将小鼠放入配有恒温毯的固定器中，鼠尾穿过固定器后部的气囊，尽量使鼠尾固定器贴合小鼠的尾巴根部固定。打开电脑中的检测系统软件，在线监测压力波形图。压力感受器从尾部固定器左侧插入固定于小鼠尾部正下方，调节固定器旋钮使压力传感器与小鼠尾部接触的松紧程度适中。观察波形图振幅，待其稳定后，设定最大充气压在180mmHg，开始检测，每只小鼠重复测定至少5次，取均值。
1.2.3血常规检测
首先打开加有异氟烷的气体麻醉机，与麻醉机相连接的透明缸逐渐充满异氟烷后，将小鼠放入透明缸内进行麻醉，待小鼠麻醉状态适中时取出小鼠使用乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂从眼眶收集外周血。然后根据仪器使用说明书使用全血细胞分析仪对白细胞进行计数，包括单核细胞，淋巴细胞和中性粒细胞。
1.2.4透射电镜
低温环境下，迅速剪取合适大小的胸主动脉放在2.5％戊二醛中固定2小时，然后置于二甲胂酸盐缓冲液中洗涤过夜，取出在1％四氧化锇中后固定1小时，经水漂洗后在梯度乙醇溶液中逐级脱水至环氧丙烷，然后用环氧树脂包埋，超薄切片机切片，乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电子显微镜检查。
1.2.5溶液的配置
10％福尔马林固定液：称取4g NaH2PO4和6.5g Na2HPO4溶于900ml蒸馏水中，并加入100ml甲醛。
苏木素染色液：苏木精2g溶于250ml无水乙醇中，硫酸铝钾17g溶于500ml蒸馏水中，两种溶液混合并用蒸馏水定量至1000ml后，依次加入碘酸钠0.2g和冰醋酸20ml，混匀，使用前过滤。
伊红染色液：伊红5g置于490ml蒸馏水中，加入10ml浓盐酸，搅拌充分后静置过滤。所得的滤渣放入烘箱内烘干，烘干后滤渣用1000ml的95％乙醇溶解即可。
1％盐酸乙醇分化液：向300ml 75％乙醇中加入3ml浓盐酸，充分搅拌即可。
地衣红染色液：地衣红1g溶于75％乙醇99ml中，再加入1ml浓盐酸混匀即可。
PBS溶液：NaCl 8.18g，KCl 0.2g，NaH2PO43.58g和Na2HPO40.25g加入1000ml蒸馏水，充分溶解即可。
1.2.6苏木素-伊红染色
石蜡切片厚度为4μm，首先将石蜡组织进行烤片(65℃，45-50分钟)，然后进行脱蜡至水相(二甲苯20分钟，无水乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，75％乙醇3分钟，流水冲洗1分钟)；放入苏木素染色液中进行染色15分钟后，流水冲洗4分钟；用1％盐酸乙醇分化10秒(分化时间根据分化液的放置的时间作做调整)，放入水中流水冲5分钟；伊红染色液染色1分钟后置于水中1分钟；脱水再经二甲苯透化(75％乙醇2分钟，95％乙醇4分钟，无水乙醇4分钟，二甲苯20分钟)，中性树胶封片。
1.2.7地衣红染色
将石蜡切片65℃烤片45-50分钟，然后二甲苯20分钟，无水乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，75％乙醇3分钟，水1分钟进行脱蜡；地衣红染色液染色1小时；1％盐酸乙醇分化20分钟；脱水经二甲苯透化(75％乙醇2分钟，95％乙醇4分钟，无水乙醇4分钟，二甲苯20分钟)，中性树胶封片。
1.2.8免疫组织化学
10％多聚赖氨酸在玻璃片上涂匀，取4μm主动脉组织切片，放干待用。将石蜡切片65℃烤片45-50分钟后脱蜡至水相；切片置于柠檬酸修复液(pH＝6.0)微波加热至95℃ 20分钟，取出室温冷却，PBS漂洗3次，每次5分钟；用3％过氧化氢室温避光孵育15分钟以减少内源性过氧化物酶的干扰，PBS漂洗3次，每次5分钟；切片上加入10％正常山羊血清封闭液，37℃孵育30分钟；吸去封闭液加入一抗，4℃过夜；用PBS漂洗5次，每次5分钟；加入二抗，37℃孵育1小时；用PBS漂洗3次，每次5分钟，加入现配的DAB工作液，显色2分钟，水冲洗3分钟；苏木素复染15分钟；1％盐酸乙醇分化10秒(分化时间根据分化液的放置的时间作做调整)，流水冲5分钟；脱水经二甲苯透化(75％乙醇2分钟，95％乙醇4分钟，无水乙醇4分钟，二甲苯15分钟)，中性树胶封片。
1.2.9统计学方法
所有实验数据以均数±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，多组间比较采用完全随机设计单因素方差分析(one-way ANVOVA)，多个样本均数间的两两比较采用Bonferroni法；采用卡方检验比较主动脉夹层发生率；采用Kaplane-Meier方法分析存活概率，并通过GraphPad Prism5.0中的对数秩检验进行比较；P＜0.05为差异有统计学意义。
1.3实验结果
1.3.1生存分析与AD发生率
为了模拟AD的进程，我们以不同剂量的β-氨基丙腈喂养小鼠，如错误！未找到引用源。2A所示，随着β-氨基丙腈剂量的增加，小鼠的存活率呈现了降低的趋势，分别是100％(0％β-氨基丙腈)、56％(0.125％β-氨基丙腈)、31％(0.25％β-氨基丙腈)以及28％(0.5％β-氨基丙腈)；与生存率的变化趋势相反(图2B)，随着β-氨基丙腈剂量的增加主动脉夹层的发生率呈现上升的趋势，分别是0％(0％β-氨基丙腈)、43％(0.125％β-氨基丙腈)、81％(0.25％β-氨基丙腈)以及94％(0.5％β-氨基丙腈)。
图2不同剂量β-氨基丙腈处理组的生存曲线和AD发生率。(A)不同剂量β-氨基丙腈处理组的生存曲线(B)不同剂量β-氨基丙腈处理组的AD发生率，包括死于主动脉破裂的小鼠
1.3.2慢性AD进程中的血压监测
通过ALC-NIBP无创尾动脉血压测量分析系统，对所有小鼠在第15天进行血压监测。结果显示，0％β-氨基丙腈组小鼠的收缩压为108.3±5.3mmHg，0.125％β-氨基丙腈组小鼠的收缩压为143.7±5.1mmHg，0.25％β-氨基丙腈组小鼠的收缩压为142.8±5.9mmHg，0.5％β-氨基丙腈组小鼠的收缩压为146.1±6.3mmHg。与0％β-氨基丙腈组相比，0.125％、0.25％和0.5％β-氨基丙腈组的血压均显著升高(p＜0.001，图3)。
1.3.3慢性AD进程中主动脉不同部位结构评价
如图4A所示，实验结束后分别取小鼠的主动脉弓(aortic arch，AoA)、胸降主动脉(descending thoracic aorta，DAo)、肾上主动脉(suprarenal aorta，SAo)以及肾下主动脉(infrarenal aorta，IAo)进行固定、脱水、切片，然后行H&E染色，观察不同部位主动脉结构的改变(图4B)。在主动脉的4个不同部位中，AoA和SAo的病变较为明显，DAo次之，SAo基本没有变化。与0％β-氨基丙腈组小鼠相比，0.125％β-氨基丙腈组小鼠主动脉管壁增厚，但并无夹层形成；0.25％β-氨基丙腈组也出现了血管壁的增厚，部分血管中膜与外膜之间形成了假腔；0.5％β-氨基丙腈组小鼠血管壁增厚最为明显，中膜与外膜之间形成假腔，并有大量的红细胞溢出，形成血栓。根据H&E染色的结果对4个不同部位的血管壁最大厚度进行定量，结果如图5所示，在AoA中，与0％β-氨基丙腈组相比，0.5％β-氨基丙腈组的血管壁最大厚度显著增加(P＜0.01)；在DAO和SAo中，随着β-氨基丙腈剂量的增加，血管壁的最大厚度呈现逐渐增加的趋势，但没有统计学差异；在IAo中不同剂量β-氨基丙腈组的血管壁最大厚度几乎相同。
1.3.4慢性AD进程中主动脉弹性纤维的评价
取小鼠4个不同部位的主动脉进行地衣红染色以观察弹性纤维结构的改变(图6A)。在4个主动脉的不同部位，AoA和SAo的弹性纤维断裂较为明显，DAo次之，SAo基本没有变化。在不同剂量β-氨基丙腈的处理组中，0％β-氨基丙腈组小鼠主动脉弹性纤维排列整齐，很少出现断裂或降解，间距较为均匀，呈现同心圆结构；与0％β-氨基丙腈组小鼠主动脉相比，0.125％β-氨基丙腈组小鼠主动脉出现少量弹性纤维的缺失，0.25％β-氨基丙腈组小鼠主动脉弹性纤维的断裂较为明显，而0.5％β-氨基丙腈组小鼠主动脉的中膜已经失去原有结构，降解较为严重，层次模糊不清甚至减少，缺失和断裂更加明显。在对实验室前期方法进行微小调整后，我们根据弹力纤维的断裂端的数量对其进行定量。定量结果如图6B所示，与0％B-氨基丙腈组小鼠主动脉相比，在AoA(P＜0.01)和SAo部位(和P＜0.05)，0.5％β-氨基丙腈组小鼠主动脉的弹性纤维断裂数显著增加；在DAo部位，随着B-氨基丙腈剂量的增加，弹性纤维断裂数呈现增加的趋势，但没有统计学差异；在IAo中不同剂量β-氨基丙腈处理组的弹性纤维断裂数很少，没有显著差异。
1.3.5慢性AD进程中主动脉组织超显微结构的观察
为了观察AD进程中血管壁超微结构的改变，取各组的胸主动脉做电镜检测，结果如图7所示，与0％β-氨基丙腈组小鼠主动脉相比，0.5％β-氨基丙腈组弹性纤维断裂明显，血管平滑肌细胞数量减少、肿胀、空泡化。
1.3.6慢性AD进程中外周血中白细胞水平的评价
我们以前的实验已经报道了AD患者的外周血中白细胞的变化与主动脉夹层的进程和类型有关，因此我们通过血常规检测对白细胞及其分型进行了计数，结果如图8所示，外周血中的白细胞和淋巴细胞以一种β-氨基丙腈剂量依赖性的方式逐渐增加，单核细胞和中性粒细胞随着AD进程没有发现显著地变化。
1.3.7慢性AD进程中主动脉组织中炎症细胞细胞的浸润
为了检测AD进程中主动脉组织中炎症细胞的浸润，我们首先采用免疫组织化学方法检测了CD3+T淋巴细胞在AoA和SAo的浸润。图9A为各组CD3免疫组织化学染色的代表图。对各组CD3+T淋巴细胞进行定量，如图9B所示，T淋巴细胞在各组AoA和SAo部位的浸润量极少，虽然有逐渐增加的趋势，但并没有统计学差异。
接着我们又采用免疫组织化学方法检测了Gr-1+中性粒细胞在AoA和SAo的浸润。图10A为各组Gr-1免疫组织化学染色的代表图。对各组Gr-1+中性粒细胞进行定量，如图10B所示，中性粒细胞在AoA和SAo中的浸润量也很少，且没有统计学差异。
最后我们对巨噬细胞在AoA和SAo的浸润进行了检测。图11A为各组CD68免疫组织化学染色的代表图。对各组CD68+巨噬细胞进行定量，如图11B所示，巨噬细胞在AoA和SAo的浸润极为显著，与0％β-氨基丙腈组相比，0.5％β-氨基丙腈组巨噬细胞在AoA部位的的浸润增加了约30倍，SA部位也增加了20倍左右。
实施例2炎症细胞在急性主动脉夹层发生前、后的浸润
2.1实验材料
C57小鼠：雄性，42只，由中国科学院上海实验动物中心提供
2.2实验方法
2.2.1急性主动脉夹层模型的制备
为了更加深入的研究炎症细胞在AD发生中所扮演的角色，我们建立了急性AD的研究体系(图12)，AD发生的时间点被定义为从夹层发生前的主动脉损伤阶段(通过β-氨基丙腈来模拟)向主动脉出现撕裂或者破裂(通过β-氨基丙腈+AngII来模拟)的转换，通过对比这两个时间点主动脉组织中炎症细胞的变化来进一步探讨其作用。C57BL/6小鼠42只，均为雄性，体重11±2g，饲养于中国科学院上海药物所实验动中心SPF级动物室，恒温22±2℃，12h光照，标准饮食，自由饮水。将C57小鼠按随机分为3组：Control组(n＝8)，β-氨基丙腈组(n＝14)，β-氨基丙腈+AngII组(n＝20)。Control组每日给予普通饲料喂养作为正常对照组，第15天取材观察主动脉夹层的发生情况；β-氨基丙腈组和β-氨基丙腈+AngII组则给予含有1％B-氨基丙腈的饲料喂养，β-氨基丙腈组在第15天取材观察主动脉夹层的发生情况，而β-氨基丙腈+AngII在第15天皮下注射AngII(1.44mg/kg)，24h后取材观察AD的发生情况，具体实验过程如图13所示。该项研究方案获得上海药物研究所实验动物管理与使用委员会的批准(SIMM-2015-03-GDA-27)。
2.3实验结果
2.3.1主动脉夹层的发生率
为了验证我们所建立的急性主动脉夹层研究体系，分别考察了各组的AD发生率(图14)。与我们所设想的一致，Control组小鼠未有夹层发生，β-氨基丙腈组的AD发生率为14％，β-氨基丙腈+AngII组的小鼠主动脉夹层发生率为94％。与Control组小鼠相比，β-氨基丙腈组的AD发生率没有显著变化。与β-氨基丙腈组小鼠相比，β-氨基丙腈+AngII组的AD发生率明显增加(P＜0.001)。
2.3.2急性AD发生前后主动脉结构的评价
实验结束后取各组小鼠的AoA进行固定、脱水、切片，然后行H&E染色，观察各组主动脉结构的改变。如图15A所示，与Control组小鼠相比，β-氨基丙腈组小鼠主动脉的结构与之几乎相同，血管结构保持完整；与β-氨基丙腈组相比，β-氨基丙腈+AngII组的小鼠血管壁明显增厚，出现了撕裂或破裂，外膜有大量的细胞聚集且排列杂乱，中膜与外膜之间形成假腔，假腔内有血栓形成。基于H&E染色对血管壁最大厚度进行定量(图15B)，结果显示：与Control组相比，β-氨基丙腈组血管壁最大厚度未发生显著变化(95.8±7.0μm versus119.9±23.6μm)；与β-氨基丙腈组相比，β-氨基丙腈+AngII组血管壁最大厚度明显增加(119.9±23.6μm versus 365.5±62.7μm，P＜0.001)。
2.3.3急性AD发生前后弹性纤维的评价
弹力蛋白是维持血管弹性的重要细胞外基质成分之一，对小鼠主动脉的AoA部位进行地衣红染色，地衣红将血管中膜弹力纤维染成紫红色，以便观察和定量弹力纤维被降解的程度(图16)。图16A为各组血管壁中膜弹性纤维染色代表图，图16B为各组弹性纤维降解定量结果。从图中可以看出Control组弹性纤维排列整齐，很少出现断裂或降解，厚度较为均匀，呈现同心圆结构，与Control组相比，β-氨基丙腈组的弹性纤维几乎没有发生显著改变；与β-氨基丙腈组相比，β-氨基丙腈+AngII组的中膜已经失去原有结构，降解较为严重，层次模糊不清甚至减少，弹性纤维断裂数显著增加(P＜0.001)。
2.3.4急性AD发生前、后组织中T淋巴细胞的浸润
采用CD3免疫组织化学方法检测T淋巴细胞在主动脉组织的浸润情况。图17A为各组的CD3免疫组织化学染色代表图，图17B为各组CD3+T淋巴细胞百分比的定量结果。与Control组相比，β-氨基丙腈组几乎没有T淋巴细胞的浸润；与β-氨基丙腈组相比，β-氨基丙腈+AngII组的T淋巴细胞浸润显著增加(P＜0.01)，主要存在于中膜及外膜。
2.3.5急性AD发生前、后组织中中性粒细胞的浸润
用Gr-1免疫组织化学方法检测各组血管中性粒细胞的浸润。图18A为各组的Gr-1免疫组织化学染色代表图，图18B为各组Gr-1+中性粒细胞百分比的定量结果。与Control组相比，β-氨基丙腈组的外膜有极少量的中性粒细胞的浸润，但不存在统计学差异；与β-氨基丙腈组相比，β-氨基丙腈+AngII组中性粒细胞的浸润数量显著增加(P＜0.001)。
2.3.6急性AD发生前、后组织巨噬细胞的浸润
采用CD68免疫组织化学检测各组血管巨噬细胞的浸润。图19A为各组的CD68免疫组织化学染色代表图，图19B为各组CD68+巨噬细胞百分比的定量结果。与Control组相比，β-氨基丙腈组的外膜有极少量的巨噬细胞的浸润，但不存在统计学差异；与β-氨基丙腈组相比，β-氨基丙腈+AngII组的外膜存在大量的巨噬细胞浸润，巨噬细胞的浸润数量显著增加(P＜0.001)。
实施例3 T淋巴细胞在主动脉夹层发生中的作用研究
前面的实验已经明确炎症细胞在主动脉损伤部位的浸润，但是这些炎症细胞浸润主动脉对于疾病的进程发挥什么样的作用，一直没有明确。裸鼠(nu/nu小鼠)由于先天性缺乏FOXN1基因，导致T淋巴细胞缺乏的免疫系统缺陷，本实施例利用裸鼠研究T淋巴细胞缺失对主动脉夹层发生的影响。
3.1.实验材料
3.1.1实验动物
BALB/c小鼠：雄性，36只，由中国科学院上海实验动物中心提供
nu/nu小鼠：雄性，36只，由中国科学院上海实验动物中心提供
3.2急性主动脉夹层模型的制备
BALB/c小鼠36只，均为雄性，体重10±2g，饲养于中国科学院上海药物所实验动中心SPF级动物室，恒温22±2℃，12h光照，标准饮食，自由饮水。BALB/c小鼠被随机分为2组：β-氨基丙腈组(n＝15)和β-氨基丙腈+AngII组(n＝21)。β-氨基丙腈组和β-氨基丙腈+AngII组均给予含有1％β-氨基丙腈的普通饲料喂养，β-氨基丙腈组在第15天取材观察主动脉夹层的发生情况，β-氨基丙腈+AngII组在第15天皮下注射AngII(1.44mg/kg)，24h后取材观察主动脉夹层的发生情况；nu/nu小鼠的分组和实验过程同BALB/c小鼠一致，具体实验过程如图20所示。该研究方案获得上海药物研究所实验动物管理与使用委员会的批准(SIMM-2016-04-GDA-34)。
3.3实验结果
3.3.1 T淋巴细胞缺失对主动脉夹层发生率的影响
如图21所示，与C57品系小鼠的结果类似，BALB/c和nu/nu小鼠的β-氨基丙腈组几乎都没有夹层发生，AD发生率分别为20％和7％；BALB/c和nu/nu小鼠β-氨基丙腈+AngII组的夹层发生率分别为86％和62％，没有统计学差异，说明T淋巴细胞的缺失对主动脉夹层的发生有下调趋势，但无显著统计学差异。
3.3.2 T淋巴细胞缺失对主动脉结构的影响
各组小鼠的AoA经过固定、脱水、切片，然后进行H&E染色，观察各组主动脉结构的改变。如图22A所示，BALB/c和nu/nu小鼠的β-氨基丙腈组主动脉血管结构基本保持完整；β-氨基丙腈+AngII组的小鼠血管壁明显增厚，出现了撕裂或破裂，外膜有大量的细胞聚集且排列杂乱。中膜与外膜之间形成假腔，假腔内有血栓形成。根据H&E染色结果对血管壁最大厚度进行定量(图22B)，结果显示，BALB/c小鼠的β-氨基丙腈组与β-氨基丙腈+AngII组相比，血管壁最大厚度明显增加(200.6±99.3μm versus 626.9±143.6μm，P＜0.05)；nu/nu小鼠的β-氨基丙腈组与β-氨基丙腈+AngII组相比，血管壁最大厚度虽然有所增加，但无统计学差异(145.8±72.1μm versus 439.8±132.4μm)；nu/nu小鼠与BALB/c小鼠两个种系的β-氨基丙腈+AngII组相比，两者最大血管壁厚度没有显著差异，说明T淋巴细胞的缺失对主动脉结构没有显著影响。
3.3.3 T淋巴细胞缺失对弹性纤维断裂的影响
弹力蛋白是维持血管弹性的重要细胞外基质成分之一，本实验采用地衣红染色将血管中膜弹力纤维染成紫红色，以便观察和定量弹力纤维被降解的程度。图23A为各组血管壁中膜弹性纤维代表图，图23B为各组弹性纤维降解定量结果。从图中可以看出BALB/c和nu/nu小鼠的β-氨基丙腈组弹性纤维排列整齐，很少出现断裂或降解，厚度较为均匀，呈现同心圆结构，两组小鼠的β-氨基丙腈+AngII组的中膜均已经失去原有结构，降解较为严重，层次模糊不清甚至减少，弹性纤维断裂数显著增加(p＜0.01)。将nu/nu小鼠的β-氨基丙腈+AngII组与BALB/c小鼠的β-氨基丙腈+AngII组相比，两者弹性纤维断裂没有显著差异，说明T淋巴细胞的缺失对弹性纤维的断裂没有显著的保护作用。
3.3.4 T淋巴细胞缺失对主动脉组织中T淋巴细胞浸润的评价
采用CD3免疫组织化学方法检测T淋巴细胞在主动脉组织的浸润情况。图24A为各组CD3免疫组织化学染色代表图，图24B为CD3+T淋巴细胞百分比的定量结果。BALB/c小鼠的β-氨基丙腈+AngII组与β-氨基丙腈组相比，T淋巴细胞浸润显著增加(P＜0.01)；nu/nu小鼠的β-氨基丙腈+AngII组与β-氨基丙腈组相比，T淋巴细胞浸润没有发生显著改变；nu/nu小鼠的β-氨基丙腈+AngII组与BALB/c小鼠的β-氨基丙腈+AngII组相比，主动脉组织中T淋巴细胞的浸润显著降低(P＜0.01)，说明缺失T淋巴细胞的nu/nu小鼠未见主动脉组织T细胞的显著浸润。
3.3.5 T淋巴细胞缺失对主动脉组织中中性粒细胞浸润的评价
用Gr-1免疫组织化学方法检测各组血管中性粒细胞的浸润。图25A为各组的Gr-1免疫组织化学染色代表图，如图25B为各组Gr-1+中性粒细胞百分比的定量结果。BALB/c小鼠的β-氨基丙腈+AngII组与β-氨基丙腈组相比，中性粒细胞浸润显著增加(P＜0.05)；nu/nu小鼠的B-氨基丙腈+AngII组与β-氨基丙腈组相比，中性粒细胞浸润也显著增加(P＜0.01)；nu/nu小鼠的β-氨基丙腈+AngII组与BALB/c小鼠的β-氨基丙腈+AngII组相比，主动脉组织中中性粒细胞的浸润没有明显差异，说明T淋巴细胞的缺失对组织中中性粒细胞的浸润没有显著的影响。
3.3.6 T淋巴细胞缺失对主动脉组织中巨噬细胞浸润的评价
用CD68免疫组织化学方法检测各组血管巨噬细胞的浸润。图26A为各组的CD68免疫组织化学染色代表图，图26B为各组CD68+巨噬细胞百分比的定量结果。BALB/c小鼠的β-氨基丙腈+AngII组与β-氨基丙腈组相比，巨噬细胞浸润显著增加(P＜0.05)；nu/nu小鼠的β-氨基丙腈+AngII组与β-氨基丙腈组相比，巨噬细胞浸润也显著增加(P＜0.01)；nu/nu小鼠的β-氨基丙腈+AngII组与BALB/c小鼠的β-氨基丙腈+AngII组相比，主动脉组织中巨噬细胞的浸润没有明显差异，说明T淋巴细胞的缺失对组织中巨噬细胞的浸润没有显著的影响。
实施例4 LysMiDTR转基因小鼠的鉴定及单核细胞的敲除
4.1 LysMiDTR转基因小鼠的构建及单核细胞的敲除
LysM-Cre小鼠是一种Cre重组酶特异性的作用在单核细胞/巨噬细胞上的小鼠，而ROSA26iDTR转基因小鼠具有白喉毒素受体(Diphtheria Toxin Receptor，DTR)序列且DTR基因上游有两个loxP位点包含的终止子，当LysM-Cre转基因小鼠和ROSA26iDTR转基因小鼠杂交时，在Cre重组酶存在的情况下，能够剪切两个loxP位点之间的终止子，留下一个loxP位点，同时启动下游DTR表达，白喉毒素(Diphtheria Toxin，DT)与DTR特异结合时，即能敲除表达DTR的单核细胞/巨噬细胞(图27)。
通过剪尾法和PCR对LysMiDTR小鼠进行基因型鉴定，将鼠尾剪碎置于1.5ml离心管中(底部加入适量磁珠)，加入500μl鼠尾裂解液和5μl蛋白酶K，核酸提取仪震荡消化，然后将匀浆液置于离心管12000rpm离心5min，取上清液加入500μl酚氯仿，混匀后12000rpm离心10min，取上清加无水乙醇，轻柔混匀后DNA即可析出，然后12000rpm离心5min，弃去上清液，加入75％乙醇，12000rpm离心5min，弃去上清液，待乙醇挥发后加入ddH2O将DNA溶解，4℃保存即可。使用日本Takara公司的2×Power Taq PCR mastermix进行PCR反应，25μl体系，12μl预混酶，8.5μl水，引物各1μl，突变体引物为0.5μl，模板为2μl。PCR反应设置：95℃，30s；退火温度为55℃，30s；延伸72℃，1min；40次循环，最后72℃延伸3min。PCR反应所需引物如下：野生型ROSA26iDTR引物(603bp)5-GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG-3(SEQ ID NO.：1)，杂合型ROSA26iDTR引物(242bp and 603bp)5-AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT-3(SEQ ID NO.：2)和突变体ROSA26iDTR引物(242bp)；野生型LysM-Cre引物(350bp)5-TTA CAG TCG GCCAGG CTG AC-3(SEQ ID NO.：3)，杂合型LysM-Cre引物(350bp and 700bp)5-CTT GGG CTGCCA GAA TTT CTC-3(SEQ ID NO.：4)，突变体LysM-Cre引物(700bp)5-CCC AGA AAT GCCAGA TTA CG-3(SEQ ID NO.：5)，只有双纯合的小鼠才用于后续的实验(图28)。
4.2主动脉夹层模型的制备
LysMiDTR小鼠30只，均为雄性，体重10±2g，饲养于中国科学院上海药物所实验动中心SPF级动物室，恒温22±2℃，12h光照，标准饮食，自由饮水。将小鼠按体重随机分为2组：Control组(n＝15)和DT组(n＝15)。Control组和DT组均给予含有1％β-氨基丙腈的普通饲料喂养，在第15天皮下注射AngII(1.44mg/kg)，24h后取材观察主动脉夹层的发生情况；但是DT组每隔一天腹腔注射一次DT(25μg/kg，第三次和第四次注射间隔两天)，Control组则以相同方式注射相同体积的生理盐水作为对照组，具体实验过程如图29所示。该项研究方案获得上海药物研究所实验动物管理与使用委员会的批准(SIMM-2016-04-GDA-34)。
4.3实验结果
4.3.1单核/巨噬细胞敲除对主动脉夹层发生率的影响
在造模后的第16天取小鼠主动脉观察单核细胞敲除对主动脉夹层发生的影响。如图30A所示，Control组主动脉大体观颜色发红，血管壁间有血栓形成，而DT组小鼠主动脉大体观血管颜色透明，无血栓形成。Control与DT组的AD发生率分别为65％和12％，与Control组相比，单核细胞敲除后主动脉夹层的发生率显著下降(P＜0.05，图30B)。
4.3.2单核/巨噬细胞敲除对主动脉结构的影响
实验结束后取各组小鼠的AoA进行固定、脱水、切片，然后行H&E染色，观察各组主动脉结构的改变。如图31A所示，Control组小鼠血管壁明显增厚，出现了撕裂或破裂，外膜有大量的细胞聚集且排列杂乱，中膜与外膜之间形成假腔，假腔内有血栓形成。而DT组小鼠主动脉的结构保持相对完整。基于HE染色对血管壁最大厚度进行定量(图31B)，结果显示：与Control组相比，DT组血管壁最大厚度显著降低(283.7±55.8μm versus 87.8±14.0μm，p＜0.01)。
4.3.3单核/巨噬细胞敲除对弹性纤维断裂的影响
取小鼠主动脉的AoA部位进行地衣红染色，图32A为各组血管壁中膜弹性纤维代表图，图32B为各组弹性纤维降解定量结果。从图32B中可以看出Control组中膜已经失去原有结构，降解较为严重，层次模糊不清甚至减少，DT组的弹性纤维排列整齐，很少出现断裂或降解，厚度较为均匀，呈现同心圆结构，弹性纤维几乎没有发生改变；与Control组相比，DT组的弹性纤维断裂数显著降低(p＜0.001)。
4.3.4单核/巨噬细胞敲除对主动脉组织中巨噬细胞浸润的影响
采用CD68免疫组织化学考察各组血管巨噬细胞的浸润。图33A为各组的CD68免疫组织化学染色代表图，图33B为各组CD68+巨噬细胞百分比的定量结果。Control组外膜存在大量的巨噬细胞浸润，与Control相比，DT组的巨噬细胞的浸润数量显著降低(P＜0.001)。
4.3.5单核/巨噬细胞敲除对主动脉组织中T淋巴细胞浸润的影响
采用CD3免疫组织化学考察各组血管T淋巴细胞的浸润。图34A为各组的CD3免疫组织化学染色代表图，图34B为各组CD3+T淋巴细胞百分比的定量结果。Control组的中膜和外膜有少量的T淋巴细胞浸润，与Control相比，DT组T淋巴细胞的浸润显著降低，几乎没有CD3+的T淋巴细胞(P＜0.05)。
4.3.6单核/巨噬细胞敲除对主动脉组织中中性粒细胞浸润的影响
采用Gr-1免疫组织化学考察各组血管中性粒细胞的浸润。图35A为各组的Gr-1免疫组织化学染色代表图，图35B为各组Gr-1+中性粒细胞百分比的定量结果。Control组的有大量的中性粒细胞浸润，与Control相比，DT组几乎没有Gr-1+的中性粒细胞(P＜0.05)。
实施例5单核细胞回输对主动脉夹层发生的影响
5.1实验材料
5.1.1实验动物
LysM-Cre转基因小鼠和ROSA26iDTR转基因小鼠均购自美国杰克逊实验室。
5.2实验方法
5.2.1 LysMiDTR转基因小鼠的构建
同实施例4
5.2.2 LysMiDTR转基因小鼠的鉴定及单核细胞的敲除
同实施例4
5.2.3骨髓单核细胞的提取及回输
取6-7周C57小鼠股骨和胫骨的骨髓，用PBS冲洗干净后置于200目的细胞筛网上使细胞滤出，将滤液转移至15ml离心管，1200rpm离心7min，弃去上清液，加入5ml PBS，充分洗涤细胞后12000rpm离心6min，弃去上清液，加入360μl磁珠分选缓冲液，再加入40μl CD11b磁珠抗体将细胞充分混匀，置4℃孵育15min，向孵育后细胞悬液中加入1ml磁珠分选缓冲液，离心洗去多余抗体，得到的细胞用1ml磁珠缓冲液重悬。根据说明书，将上述细胞悬液加入磁珠柱中，待细胞完全流过柱子，再加入1ml磁珠缓冲液润洗一遍，将柱子从磁力架取下，向柱中加入1ml磁珠缓冲液，用推射器将吸附于磁珠上的细胞用力全部推出，即可得到CD11b+单核细胞。通过自动细胞计数仪测试单核细胞的活力，将活力超过90％的5×105个单核细胞通过静脉注射回输到LysMiDTR小鼠体内，以上所有操作均在无菌环境中进行。
5.2.4主动脉夹层模型的制备
LysMiDTR小鼠30只，均为雄性，体重10±2g，饲养于中国科学院上海药物所实验动物中心SPF级动物室，恒温22±2℃，12h光照，标准饮食，自由饮水。将小鼠按体重随机分为2组：DT组(n＝15)和DT+monocyte组(n＝15)。DT组和DT+monocyte组均给予含有1％β-氨基丙腈饲料喂养，在指定的时间点腹腔注射DT(25μg/kg)第15天皮下注射AngII(1.44mg/kg)；DT组在第2、5、8、11及14天尾静脉注射单核细胞用于重建单核细胞，而DT组以相同方式注射相同体积的生理盐水作为对照组，具体实验过程如图36所示。该项研究方案获得上海药物研究所实验动物管理与使用委员会的批准(SIMM-2016-04-GDA-34)。
5.3实验结果
5.3.1单核细胞回输对主动脉夹层发生率的影响
在造模后的第16天取小鼠主动脉观察单核细胞回输对主动脉夹层发生的影响。如图37A所示，DT组小鼠主动脉大体观血管颜色透明，无血栓形成，而DT+monocyte组小鼠主动脉大体观颜色发红，血管壁间有血栓形成。DT与DT+monocyte组的AD发生率分别为18％和40％，与DT组相比，回输单核细胞使主动脉夹层的发生率上升，但无统计学差异(图37B)。
5.3.2单核细胞回输对主动脉结构的影响
实验结束后取各组小鼠的AoA进行固定、脱水、切片，然后行H&E染色，观察各组主动脉结构的改变。如图38A所示，DT组小鼠主动脉的结构保持相对完整，DT+monocyte组小鼠血管壁增厚，出现了撕裂或破裂，外膜有大量的细胞聚集且排列杂乱，中膜与外膜之间形成假腔，假腔内有血栓形成。基于H&E染色对血管壁最大厚度进行定量(图38B)，结果显示：与DT相比，DT+monocyte组血管壁最大厚度显著增加(111.3±39.9μm versus 218.1±67.1μm，P＜0.05)。
5.3.3单核细胞回输对弹性纤维断裂的影响
取小鼠主动脉的AoA部位进行地衣红染色，图39A为各组血管壁中膜弹性纤维代表图，图39B为各组弹性纤维降解定量结果。从图中可以看出DT组的弹性纤维排列整齐，很少出现断裂或降解，厚度较为均匀，呈现同心圆结构，弹性纤维几乎没有发生改变，DT+monocyte组中膜已经失去原有结构，弹性纤维层次模糊不清；与DT组相比，DT+monocyte组的弹性纤维断裂数有所增加(p＝0.0503)。
5.3.4单核细胞回输对主动脉组织中巨噬细胞浸润的影响
采用CD68免疫组织化学考察各组血管巨噬细胞的浸润。图40A为各组的CD68免疫组织化学染色代表图，图40B为各组CD68+巨噬细胞百分比的定量结果。与DT相比，DT+monocyte组的巨噬细胞的浸润有增加的趋势，但无统计学差异。
5.3.5单核细胞回输对主动脉组织中T淋巴细胞浸润的影响
采用CD3免疫组织化学考察各组血管T淋巴细胞的浸润。图41A为各组的CD3免疫组织化学染色代表图，图41B为各组CD3+T淋巴细胞百分比的定量结果。与DT相比，DT+monocyte组T淋巴细胞的浸润有增加的趋势，但没有统计学差异。
5.3.6单核细胞回输对主动脉组织中中性粒细胞浸润的影响
采用Gr-1免疫组织化学检测各组血管中性粒细胞的浸润。图42A为各组的Gr-1免疫组织化学染色代表图，图42B为各组Gr-1+中性淋巴细胞百分比的定量结果。与DT相比，DT+monocyte组的中性粒细胞浸润有增加的趋势，但没有统计学差异。
实施例6 CD68抗体对主动脉夹层的防治作用
6.1实验动物和实验方法
C57小鼠：雄性，40只，由中国科学院上海实验动物中心提供，饲养于中国科学院上海药物所实验动物中心SPF级动物室，恒温22±2℃，12h光照，标准饮食，自由饮水。
将C57小鼠按照体重随机分为4组：Control组(n＝10)，三组β-氨基丙腈+AngII模型动物依据不同给药方式分为Saline组(n＝10)，IgG组(n＝10)和CD68组(n＝10)。Control组每日给予普通饲料喂养作为正常对照组；三组β-氨基丙腈+AngII组给予含有1％β-氨基丙腈的普通饲料喂养，在第15天皮下注射AngII(1.44mg/kg)，其中Saline组在第14天尾静脉注射生理盐水，IgG组在第14天尾静脉注射80μg/只IgG，CD68组在第14天尾静脉注射80μg/只CD68抗体蛋白，具体实验过程如图43A所示。HE染色、地衣红染色、免疫组织化学染色方法见前文叙述。
6.2实验结果
首先考察主动脉夹层发生率，结果显示正常Control组为0％，β-氨基丙腈+AngII的Saline组为77.8％，β-氨基丙腈+AngII的IgG组为66.7％，β-氨基丙腈+AngII的CD68组为30％，也就是说给予CD68抗体可以使主动脉夹层的发生率下降55％(图43B)。HE染色可以非常清晰地评价血管撕裂的状态(图43C)，CD68抗体组相较Saline组的血管最大直径显著下调(p＜0.05，图43D)。地衣红染色可以考察血管弹力层的结构(图43E)，给予CD68抗体相较IgG组显著改善血管弹力层的完整性(p＜0.001，图43F)。巨噬细胞在主动脉的浸润相较IgG组有显著抑制(p＜0.001，图43G和图43H)。综上所述，CD68抗体可显著改善主动脉的结构，抑制巨噬细胞的浸润，最终防治主动脉夹层的发生。
在本发明中，用其他的单核/巨噬细胞抑制剂，比如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、CCR5、CD11b/integrinαM、CD11c、CD14、CD15(SSEA-1)/Lewis X、CD68/SR-D1、CD163、EMR1、F4/80、FcγRI/CD64、FcγRII/CD32、FcγRIII/CD16、Gelectin-3/Mac-2、GITR Ligand、HLA-DR、整合素αL/CD11a(IntegrinαL/CD11a)、LAMP2/CD107b、LIRB4/CD85k/ILT3、M-CSF R/CD115、MHC ClassII、Siglec-3/CD33、TLR2、TLR4、CD45+、PPARγ、CD43+、CX3CR1+、Dectin-1+、IRF4+、IL-4 Rα、MMR/CD206、SR-B1+、TLR1、整合素αM/CD11(IntegrinαM/CD11)所获得的效果与CD68抗体的效果类似。
结论：
在本发明中，条件性敲除单核/巨噬细胞显著抑制AD的发生(夹层发生率从65％降低到12％)、降低血管壁的增厚以及弹性纤维的断裂。值得注意的是，单核/巨噬细胞的敲除抑制了主动脉夹层发生的同时伴随着血管壁中性粒细胞和T淋巴细胞浸润的减少，提示可能是巨噬细胞的浸润导致了AD的形成以及其他炎症细胞的浸润。然后，通过向单核/巨噬细胞敲除的LysMiDTR小鼠体内回输单核细胞进一步明确了单核/巨噬细胞在AD形成过程中的起始作用。回输单核细胞使A D的发生率从18％上升到40％，并且加重了血管壁的增厚、弹性纤维的断裂以及炎症细胞在主动脉组织的浸润。
本发明公开了T淋巴细胞的敲除对夹层组织中中性粒细胞和巨噬细胞的浸润没有影响，而本发明中单核细胞的敲除在抑制主动脉夹层发生的同时减少了夹层组织中中性粒细胞和T淋巴细胞的浸润，表明巨噬细胞能够触发主动脉夹层的形成及其伴随的炎症。在证明了单核细胞对主动脉夹层及其相关炎症的触发作用之后，还通过向LysMiDTR小鼠体内回输单核细胞来进一步确证其作用。此外，采用CD68抗体，同样验证干预单核/巨噬细胞在主动脉组织的浸润可以显著降低主动脉夹层的发生率，再次确认单核/巨噬细胞在启动AD发生中的关键作用。
结合上面的实验结果，可以看出主动脉夹层的发生是个逐级放大的过程，首先是高血压(AngII)等危险因素对血管的刺激，引起了巨噬细胞的浸润，启动其他炎症细胞的浸润，破话主动脉结构的完整性，最终出现了血管壁的撕裂或破裂。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
<120> 单核/巨噬细胞在主动脉损伤中的诊断和治疗应用
<130> P2020-0183
<150> CN201710823431.1
<151> 2017-09-13
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
ggagcgggag aaatggatat g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aaagtcgctc tgagttgtta t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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ttacagtcgg ccaggctgac 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
cttgggctgc cagaatttct c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cccagaaatg ccagattacg 20

Claims (6)

1.一种单核/巨噬细胞抑制剂的用途，其特征在于，用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病，所述单核/巨噬细胞抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、siRNA、反义核酸、基因编辑试剂、或其组合。
2.一种用于预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的药物组合物，其特征在于，包括：
(a)单核/巨噬细胞抑制剂，所述单核/巨噬细胞抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、siRNA、反义核酸、基因编辑试剂、或其组合；和
(b)药学上可接受的载体。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的单核/巨噬细胞抑制剂是能够被单核/巨噬细胞特异吞噬而发挥杀伤作用的制剂。
4.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的抑制剂选自下组：抑制单核/巨噬细胞生长的抑制剂、诱导单核/巨噬细胞凋亡的抑制剂、抑制单核/巨噬细胞聚集的抑制剂、或其组合。
5.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括其他的预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的药物。
6.一种药盒，其特征在于，包括：
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a)单核/巨噬细胞抑制剂，或含有活性成分(a)的药物，所述单核/巨噬细胞抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、siRNA、反义核酸、基因编辑试剂、或其组合；
(ii)任选的第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(b)其他的预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的药物，或含有活性成分(b)的药物；
和(iii)说明书，所述说明书记载了联合给予活性成分(a)和任选的活性成分(b)从而预防和/或治疗主动脉夹层(AD)相关的疾病的方法。
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