CZ20003022A3 - Léčení a diagnostika onemocnění zprostředkovaných makrofágy s použitím ligandů FC receptorů - Google Patents

Abstract

Způsoby a prostředky pro selektivní cílené zaměření makrofágů v lokalizované oblasti. Prostředky obsahují činidlo vážící se na Fc receptor a toxické nebo detekovatelné činidlo. Jsou popsány způsoby pro depleci nebo inhibici aktivity makrofágů za použití těchto prostředků. Uvedené prostředky mohou být použity terapeuticky a diagnosticky u onemocnění zprostředkovaných makrofágy.

Description

Léčba a diagnostika onemocnění zprostředkovaných makrofágy pomocí ligandů Fc receptoru

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobů a prostředků pro selektivní ovlivnění makrofágů v lokalizované oblasti.

Prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují vazebné činidlo pro Fc receptor a toxické nebo detekovatelné činidlo.

Dále vynález popisuje způsoby pro vyrušení nebo inhibici aktivity makrofágů pomocí prostředků podle předkládaného vynálezu. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity terapeuticky nebo diagnosticky.

Dosavadní stav techniky

V normální lidské kůži lze odlišovat dvě vrstvy. Horní vrstva, epidermis, se skládá z keratinocytů, Langerhansových buněk a T-lymfocytů. Dolní vrstva, dermis, se skládá z fibroblastů, endotelových buněk, dendritických buněk, Tlymfocytů, žírných buněk a makrofágů.

Kůže slouží jako významná bariera mezi vnitřním prostředím a okolím. Primárně brání kontaktu s potenciálně škodlivými antigeny. V případě průniku antigenu/patogenu se indukuje in vivo zánětlivá reakce, která má eliminovat antigen. Tato reakce vede k infiltraci dermis, kde složení infiltrátu závisí na typu indukované reakce, ale obsahuje především T-lymfocyty, polymorfonukleární buňky a monocyty (Williams, I.R. a Kupper,

T.S: (1996), Life Sci. 58: 1485-1507; Stingl, G. (1993) Recent Result Cancer Res. 128: 45-57). Dále, alergenně-nespecifické podněty, jako je poranění a ultrafialové záření, mohou také spouštět zánětlivou reakci. Obecně, mechanismy způsobující

Alergenně-nespecifickou reakci jsou použity také v efektorové fázi alergenně-specifické reakce.

Makrofágy jsou buňky odvozené od kostní dřeně mající velkou heterogenitu a všestrannost. Tyto buňky mohou produkovat mnoho různých mediátorů a mají různé biologické funkce (Ganz, T. (1993), New Horiz. 1: 23-27). Jejich fenotyp a funkce jsou určovány lokálním prostředím a mediátory vznikající v makrofágách mohou naopak ovlivňovat toto mikroprostředí. Toto mikroprostředí způsobuje existenci regionálně odlišných podtypů makrofágů a různé podtypy makrofágů mohou být přítomny i lokálně (Gordon, S. (1995) Bioessays 17: 977-986). Tyto buňky jsou účinnými efektorovými buňkami produkujícími reaktivní sloučeniny kyslíku a proteolytické enzymy, které mohou přímo narušovat tkáně (Laskin, D.L. a Pendino, K.J. (1995), Annu Rev. Pharmacol. Toxicol. 35: 655-677).Za normálních podmínek regulují makrofágy proliferaci buněk vytvářejících extracelulární mezibuněčnou hmotu, jako jsou například kožní fibroblasty (Gonzales-Ramos, A. et al., (1996), J. Invest. Dermatol. 106: 305-311). Kromě toho mají makrofágy významné imunoregulační funkce a proto mají zásadní význam pro kontrolu a řízení imunitní reakce (Gordon, S.

(1995) Bioessays 17: 977-986; Thepen, T. et al., (1994), Ann.

N.Y. Acad. Sci. 725: 200-206). Tyto buňky mohou sloužit jako antigen-presentující buňky, ale mohou také přímo inhibovat presentaci antigenu dendritickými buňkami (Holt, P.G. et al., (1993), J._ Exp. Med. 177: 397-407). Proliferace, fenotyp a tím i funkce T-lymfocytů, a tak i typ indukované imunitní reakce, mohou být ovlivněny makrofágy.

Bylo prokázáno, že kožní makrofágy mají významnou úlohu v regulaci buněčného růstu různých nehematopoetických buněk (jako jsou fibroblasty a keratinocyty), stejně jako funkci T3 lymfocytů a dendritických buněk. Za klidového stavu je počet kožních makrofágů relativně nízký. Nicméně, za různých patologických stavů (jak jsou například aktivní léze) se počet makrofágů aktivně zvyšuje. Tkáňové makrofágy a infiltrující monocyty jsou spojeny se změněnou funkcí fibroblastů a keratinocytů v zánětlivých lézích, stejně jako s aberantní funkcí T-lymfocytů a/nebo dendritických buněk.

Bylo prokázáno, že ultrafialové záření indukuje populaci kožních makrofágů tak, že jsou - na rozdíl od Langerhansových buněk - schopné aktivovat autoreaktivní T-lymfocyty.

Deregulovaná funkce makrofágů přímo koreluje s abnormální kožní imunoreaktivitou u různých onemocnění, jako je kožní Tlymfocytární lymfom (mycosis fungoides), psoriasa, atopická dermatitida a kožní lupus erythematodes (Cooper, K.D. et al., (1993), J. Invest. Dermatol. 101: 155-163; Gonzales-Ramos, A. et al., (1996), J. Invest. Dermatol. 106: 305-311). Tyto buňky mohou také aktivovat již přítomné a zánětlivé makrofágy, což vede ke vzniku začarovaného kruhu, který udržuje kožní zánětlivou reakci. Kromě regulace buněčných funkcí jsou makrofágy významnými výrobci toxických sloučenin, jako jsou kyslíkové radikály a proteolytické enzymy. Bylo prokázáno, že tyto toxické sloučeniny způsobují přímé poškození tkáně.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje způsoby a prostředky pro selektivní zaměření cytotoxických sloučenin pomocí Fc receptorů na fagocytující buňky odvozené od monocytů (t.j. na makrofágy). Vynález může být proto použit pro selektivní snížení počtu nebo aktivity populace makrofágů v lokalizované oblasti, jako je kůže, klouby nebo plíce.

V jednom provedení vynález poskytuje sloučeninu vážící se na makrofágy, která obsahuje alespoň první část, která se váže na Fc receptor přítomný na makrofágách, a alespoň druhou část, která usmrcuje makrofágy nebo která inhibuje funkci makrofágů. Část, která se váže na Fc receptor, může být tvořena jakoukoliv molekulou schopnou vazby na Fc receptor, jako je protilátka, peptid (například peptido-mimetikum) nebo chemická sloučenina. V jednom provedení je částí vážící se na Fc receptor protilátka nebo protilátkový fragment (například Fab, Fab', F(ab')2, Fv nebo jednořetězcový Fv). Ve výhodném provedení jsou anti-Fc receptorová protilátka nebo protilátkový fragment humanizované (například mají alespoň komplementaritu určující region (CDR) nebo jeho část z nonlidské protilátky (například myší) a zbývající částfifmají lidské). Ve jiném výhodném provedení je anti-Fc receptorová protilátka nebo protilátkový fragment lidská monoklonální protilátka (například protilátka produkovaná v myši geneticky upravené tak, aby exprimovala kompletní lidskou protilátku).

Do těchto provedení také patří sloučeniny (například peptidy nebo chemické sloučeniny), které napodobují vazbu takových protilátek proti Fc-receptoru (Jenks et al., J. Nati. Cancer Inst. (1992), 84(2): 79; Saragovi et al., Science (1991), 253: 792; Hinds et al. , J. Med. Chem. (1991), 34 : 1777-1789; Fassina, Immunomethods (1994) 5: 121-129). V jiném provedení je vazebnou částí pro Fc-receptor sloučeniny vážící se na makrofágy kyaninová sloučenina, jako je fluorescentní barvivo Cy5.18.OSu (zde dále označované Cy5), která se váže s vysokou afinitou a specificitou na FcyRI receptor přítomný na makrofágách. Kyaninové prostředky mohou obsahovat alespoň dvě skupiny: kyanin-sukcinimidyl ester a fykobilisomový protein, například PE.

• ·

Fc receptor rozpoznávaný sloučeninami vážícími se na makrofágy podle předkládaného vynálezu může být IgG receptor, například Fc-gamma receptor (FcyR), jako je FcyRI (CD64),

FcyRII (CD32) a FcyRIII (CD16), nebo IgA receptor, například FcaR (například FcaRI, CD89) . Fc receptor je výhodně lokalizován na povrchu makrofágu, například kožního makrofágu, takže může být rozpoznán sloučeninou a může dojít k vazbě sloučeniny. Ve výhodné*provedení se anti-Fc receptorová vazebná část sloučeniny vážící se na makrofágy váže na Fc receptor v jiném místě než endogenní imunoglobuliny (například IgG nebo IgA). Proto není vazba sloučenin vážících se na makrofágy blokována fyziologickými koncentracemi imunoglobulinů.

Výhodným Fc receptorem na makrofágách pro cílené působení je vysoce afinitní Fcy receptor, FcyRI. Proto v jednom provedení je anti-Fc receptorovou částí sloučenin vážících se na makrofágy podle předkládaného vynálezu anti-FcyRI protilátka nebo její fragment. Příklady anti-FcyRI protilátek jsou mAb 22, mAb 44, mAb 62 a mAb 197. Ve výhodných provedeních je použita humanizovaná forma takových protilátek proti FcyRI receptoru, jako je humanizovaná monoklonální protilátka 22 (H22) nebo její fragment.

Část sloučeniny vážící se na makrofágy, která zabíjí nebo ovlivňuje (například snižuje) aktivitu makrofágu (antimakrofágové činidlo) může být vybrána z vhodných cytotoxinů nebo léčiv. Například může být anti-makrofágovým činidlem Gelonin, Saporin, Onconasa, Exotoxin A, Ricin A, dichlormethylendifosfonat (CL2MDP) nebo jejich derivát. V jednom provedení je anti-makrofágové činidlo přímo navázáno na část vážící se na Fc-receptor sloučeniny vážící se na

» · · • « • · « ·

«I · · makrofágy. V jiném provedení vynálezu je anti-makrofágové činidlo nepřímo navázáno na část vážící se na Fc receptor. Například může být anti-makrofágové činidlo obaleno v liposomů, který je navázán na část vážící se na Fc receptor.

Sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu mohou být použity v různých terapeutických a diagnostických metodách. V jednom provedení jsou tyto sloučeniny použity pro diagnostiku onemocnění charakterizovaného abnormálním počtem nebo funkcí makrofágů. Způsob obsahuje kontaktování nebo podání sloučeniny vážící se na makrofágy do testované oblasti nebo do kultivovaného vzorku za podmínek umožňujících vazbu sloučeniny na makrofágy přítomné ve vzorku. Vazba sloučenin může být potom detekována jako ukazatel přítomnosti (například počtu) a/nebo funkce makrofágů ve vzorku. Například, detekované statisticky významné zvýšení koncentrace Fc-receptorového proteinu, ukazující na zvýšený počet makrofágů, může být ukazatelem onemocnění. Testovanou oblastí nebo vzorkem může být, například, kůže (například lidská kůže) nebo jiná tkáň obsahující makrofágy.

V jiném provedení jsou sloučeniny vážící se na makrofágy použity pro léčbu onemocnění, na kterém se účastní proliferace a/nebo abnormální funkce makrofágů. Po kontaktování sloučeniny vážící se na makrofágy s léčenou oblastí se sloučenina váže na makrofágy prostřednictvím jejich Fc receptoru a zabíjí makrofágy nebo snižuje aktivitu těchto buněk. Tak mohou být za použití sloučenin podle předkládaného vynálezu léčena, terapeuticky nebo preventivně, nebo diagnostikována různá onemocnění s účastí makrofágů (například s proliferací makrofágů a/nebo s abnormální funkcí makrofágů). Taková onemocnění mohou být způsobena vnitřními příčinami (jak je

Ί

tomu například u autoimunitních onemocnění) nebo zevními příčinami (jako je například kontaktní přecitlivělost, polymorfní světelné erupce (PLE) a dráždivě reakce). Kožní onemocnění může být také manifestací systémového onemocnění, jak je tomu například u atopické dermatitidy (AD) v případě atopie, a při systémovém lupus erythematodes. Příklady onemocnění, které mohou být léčeny prostředky a způsoby podle předkládaného vynálezu, zahrnují: autoimunitní onemocnění, respirační onemocnění, infekční onemocnění, dermatologická onemocnění a zénětlivá onemocnění. Konkrétní příklady takových onemocnění zahrnují psoriasu, atopickou dermatitidu, roztroušenou sklerosu, sklerodermii, kožní lupus erythematodes, revmatoidní artritidu, infekci virem lidské imunodeficience (HIV), chronickou polymorfní světelnou dermatosu (CPDL), chronickou obstrukční nemoc bronchopulmonální (CHONBP), například alergické asthma a sarkoidosu, Wegenerovu granulomatosu a zánětlivá onemocnění, jako je kožní léze (například otevřené rány nebo popáleniny). Dále mohou být způsoby a prostředky podle předkládaného vynálezu použity in vitro pro diagnostiku takových onemocnění nebo pro výzkum (například pro studium patologické úlohy makrofágů při těchto onemocněních).

Při použití in vivo pro terapeutické účely mohou být sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu podány lokálně (například lokálně, intradermálně, subkutánně nebo inhalačně ve formě aerosolu) do vybrané oblastí v množství účinném pro snížení počtu nebo aktivity makrofágů v oblasti podání. V některých provedeních může sloučenina vážící se na makrofágy obsahovat fotosenzibilizační činidlo, které je inaktivní během, aplikace (například systémové, lokální nebo intramuskulární), ale které je aktivováno světlem (například viditelným nebo UV světlem). Podobně mohou sloučeniny vážící se na makrofágy obsahovat Fc-vazebné činidlo navázané na terapeutické nebo diagnostické činidlo prostřednictvím světlem štěpitelné vazby, které se uvolňuje působením světla. Tyto sloučeniny umožňují zabíjení nebo inaktivaci makrofágů pouze ve vybraných tkáních vystavených působení světla.

Předkládaný vynález dále obsahuje prostředky, například farmaceutické prostředky, obsahující sloučeniny vážící se na makrofágy spolu s přijatelnými nosiči nebo ředidly, které jsou použity ve způsobech popsaných výše.

Další charakteristiky a výhody vynálezu budou zřejmé z následujících obrázků, podrobného popisu, příkladů provedení a patentových nároků.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je sloupcový graf znázorňující procento inkorporace [³H]-thymidinu v kultuře U937 nebo IIA1.6 buněk kultivovaných za přítomnosti nebo za nepřítomnosti různých koncentrací CD64imunotoxinu (H22-ricin A, H22-R nebo 197-Ricin A, 197-R) ve srovnání s kontrolou za přítomnosti pouze media (±SEM). U937 buňky byly kultivovány buď s (plné sloupce) nebo bez (šrafováné sloupce) IFNy za přítomnosti uvedených koncentrací H22-R (panel A) nebo 197-R (panel Β). V dolních panelech C a D byly IIA1.6 buňky, buď transfektované hFcyRI (plné sloupce) nebo netransfektované (šrafováné sloupce) inkubovány s různými koncentracemi H22-R (panel C) nebo 197-R (panel D) .

Obr. 2 ukazuje propidium jodidovou fluorescenci U937 buněk, neboť tyto buňky podléhají apoptose po inkubaci s různými koncentracemi H22-R. Fragmentace jader byla analyzována barvením propidium jodidem a subdiploidní jádra jsou označena přímkami. Čísla nad přímkami uvádějí procento subdiploidních a proto apoptotických jader. Kon = kontrola.

Obr. 3A a 3B jsou grafy ukazující vliv jedné intradermální injekce imunotoxinu na zánětlivé buňky v kůži v závislosti na čase. Data představují průměrný počet buněk na mm (± SEM) a představují průměr > 3 pokusů. Uvedeny jsou kinetiky buněk exprimujících hFcyRI (plné čtverečky, obr. 3A), makrofágů (prázdné čtverečky, obr. 3A), T-lymfocytů (plné čtverečky, obr. 3B) a dendritických buněk (prázdné čtverečky, obr. 3B).

Obr. 4A a 4B jsou grafy-ukazující snížení lokální teploty kůže po intradermální injekci imunotoxinu. Obr. 4A ukazuje lokální snížení teploty kůže (±SEM) pro SLS léčené hFcyRI ťransgenní myši po jedné injekci IT (·)(n=6) nebo kontrolního vehikula (o)(n=6). Obr. 4B ukazuje průběh teploty (±SEM) u SLS léčených hFcyRI transgenních myší, kterým byl injekčně podán buď IT (o) (n=6) nebo kontrolní vehikulum (·) (n=6) . Lokální kožní teplota byla sledována denně a po zvýšení byla zvířatům podána další injekce ve stejném místě (dny jsou označeny *).

Podrobný popis vynálezu

Abnormální funkce makrofágů, včetně aberantní proliferace a/nebo aktivity, se předpokládá při mnoha onemocněních, jako jsou dermatologická onemocnění, autoimunitní onemocnění, infekční onemocnění a zánětlivá onemocnění. Dosud mají způsoby pro lokalizovanou eliminaci makrofágů pomocí cytotoxických činidel, například imunotoxinů, omezenou účinnost. Předkládaný vynález poskytuje způsoby a prostředky pro diagnostiku, léčbu a prevenci takových onemocnění pomocí selektivní deplece a/nebo inhibice aktivity makrofágů v lokalizované oblasti.

• · · ·

Buňky jsou depletovány (například usmrceny) a/nebo inhibovány (například snížením jejich aktivity) cíleným působením toxického činidla prostřednictvím jejich Fc receptorů. Například, studie popsané v předkládaném vynálezu ukazují použití sloučenin vážících se na makrofágy skládajících se z části vážící se na Fc receptor, například z humanizované protilátky proti lidskému FcyRI receptoru, konjugované na toxin, například na Ricin A, pro selektivní eliminaci makrofágů in vivo v transgenních myších exprimujících lidský FcyRI. Termíny makrofág a fagocytující buňka odvozená od monocytů, jak jsou zde použity, jsou zaměnitelné.

V souladu s tím poskytuje předkládaný vynález v jednom provedení sloučeninu vážící se na makrofágy obsahující činidlo, které se váže na Fc receptor přítomný na makrofágách a činidlo, které zabíjí nebo inhibuje aktivitu makrofágů, na kterých je navázáno. Mezi vhodné složky pro vazbu na Fc receptory patří, například, proteiny (například anti-FcR protilátky a peptidy nebo chemické sloučeniny napodobující tyto sloučeniny, nebo ligandy pro FcR receptor) a chemické skupiny (například barviva a syntetické FcR ligandy). Taková činidla vážící se na Fc receptor mohou být monospecifická, bispecifická nebo multispecifická v tom, že obsahují jeden, dva nebo více než dva vazebné regiony. Například, činidlo se může vázat na dva nebo více různých regionů Fc receptoru, nebo na Fc receptor a jinou skupinu na stejné nebo na jiné buňce.

Ve-všech případech obsahuje činidlo alespoň jednu část, která se váže na Fc receptor.

V jednom provedení je částí vážící se na Fc receptor protilátka nebo protilátkový fragment, včetně například Fab, Fab', F(ab')-2, Fv nebo jednořetězcového Fv. Protilátka může být také dimer lehkého řetězce nebo těžkého řetězce, nebo jejich • ·

minimální fragment, jako je Fv, nebo jednořetězcový konstrukt, jak je popsán v Ladher et al., U.S. patent č. 4946778, uděleném 7.8.1990, jehož obsah je zde uveden jako odkaz.

V jiném provedení je částí vážící se na Fc receptor činidlo napodobující protilátku (například peptid nebo chemická sloučenina) (Jenks et al., J. Nati. Cancer Inst. (1992) 84(2): 79; Saragovi et al., Science (1991), 253:792; Hinds et al., J. Med. chem. (1991), 34:1777-1789; Fassina, Immunomethods (1994), 5:121-129).

V jiném provedení je Fc vazebná složka bispecifická nebo multispecifická molekula. Termín bispecifická molekula označuje jakoukoliv sloučeninu, například chemickou skupinu nebo protein, peptid nebo proteinový či peptidový komplex, která má dvě různé vazebné specificity a která se váže na (nebo interaguje s) (a) Fc receptor na povrchu makrofágu, a (b) na druhý, jiný cílový antigen. Termín multispecifická molekula nebo heterospecifická molekula označuje jakoukoliv sloučeninu, například chemickou skupinu nebo protein, peptid nebo proteinový či peptidový komplex, která má více než dvě různé vazebné specificity a která se váže na (nebo interaguje s) (a) Fc receptor na povrchu makrofágu, a (b) na dva nebo více jiných cílových antigenů. Proto patří mezi činidla vážící se na Fc receptor, která mohou být použita ve sloučeninách podle předkládaného vynálezu, bispecifické, trispecifické, tetraspecifické a jiné multispecifické molekuly, které jsou namířeny proti Fc receptorům na makrofágách.

Například může být činidlem heteroprotilátka složená ze dvou nebo více na sebe navázaných protilátek, vazebných fragmentů protilátek (například Fab) nebo jejich derivátů, které mají různé specificity. Těmito různými specificitami • · · · · · · • · ··· « · ·· mohou být dvě nebo více různých vazebných specificit na Fc receptorů. Alternativně mohou obsahovat vazebnou specificitu pro Fc receptor a alespoň jednu jinou vazebnou specificitu na stejné buňce (t.j. na makrofágu) nebo na jiné cílové buňce (například na jiné buňce imunitního systému nebo na patogenu).

V těch provedeních, kde je Fc-vazebné činidlo bispecifická nebo multispecifická molekula, může činidlo vyvolávat fyzikální kontakt mezi cytotoxickou efektorovou buňkou a cílovým makrofágem, takže může být dosažena účinější cílená eliminace makrofágů. Termín efektorová buňka, jak je zde použit, označuje imunitní buňku, která se účastní efektorové fáze imunitní reakce, oproti rozpoznávací a aktivační fázi imunitní reakce. Příklady imunitních buněk jsou buňky myeloidního nebo lymfoidního původu, například lymfocyty (například B-lymfocyty a T-lymfocyty včetně cytotoxických Tlymfocytů (CTL)),žabíječů, přirozených zabíječů (NK buněk), eosinofilů, neutrofilů, polymorfonukleárů, granulocytů, žírných buněk a basofilů. Podobně jako makrofágy exprimuji efektorové buňky specifické Fc receptory a provádějí specifické imunitní funkce. Ve výhodných provedeních je efektorová buňka schopná indukovat buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC) a může jí být například neutrofil schopný indukce ADCC. Například neutrofily, eosinofily a lymfocyty, které exprimuji FcdR, se účastní specifického zabíjení cílových buněk a presentace antigenů dalším složkám imunitního systému, nebo vazby na buňky presentující antigeny. V jiném provedení může efektorová buňka fagocytovat cílový antigen nebo buňku (například makrofág) nebo mikroorganismus, nebo může způsobit lýzu cílové buňky, například makrofágu. Exprese určitého Fc receptorů na efektorové buňce může být regulována humorálními faktory, jako jsou cytokiny. Například bylo zjištěno, že exprese FcyRI je • ·

zvýšena v důsledku působení interferonu gamma (IFNy). Tyto zvýšená exprese zvyšuje cytotoxickou aktivitu buněk nesoucích GcyRI proti cílům, kterými mohou být například makrofágy.

V jiných provedeních předkládaného vynálezu je činidlem vážícím se na Fc receptor monoklonální protilátka nebo její fragment. Termín monoklonální protilátka nebo přípravek monoklonální protilátky, jak je zde použit, označuje protilátkové molekuly mající shodnou strukturu. Přípravek monoklonální protilátky má jedinou vazebnou specificitu a afinitu pro určitý epitop. Monoklonální protilátka může být myší nebo lidská monoklonální protilátka (například protilátka produkovaná v myši geneticky upravené tak, aby exprimovala kompletní lidské protilátky).

V ještě jiných provedeních předkládaného vynálezu je činidlem vážícím se na Fc receptor chimérická protilátka nebo její fragment nebo humanizovaná protilátka nebo její fragment. Termín chimérická protilátka označuje protilátku, ve které jsou variabilní regiony od jednoho živočišného druhu a konstantní regiony od jiného živočišného druhu. Například, chimérická protilátka může být protilátka mající variabilní regiony odvozené od myší monoklonální protilátky a lidské konstantní regiony. Ve výhodných provedeních vynálezu obsahuje sloučenina vážící se na makrofágy humanizovanou protilátku nebo její vazebný fragment. Termín humanizovaná protilátka označuje protilátky, ve kterých jsou hypervariabiiní regiony (komplementaritu určující regiony (CDR)) od jednoho živočišného druhu a regiony pracovních rámců a konstantní regiony jsou od jiného živočišného druhu. V humanizované protilátce podle předkládaného vynálezu jsou CDR z myší monoklonální protilátky a ostatní regiony protilátky jsou lidské. Ve výhodných provedeních je lidská protilátka odvozena

od známých proteinů NEWM a KOL pro variabilní regiony těžkého řetězce (VH) a REI pro variabilní regiony lg kappa řetězce (VK). Termín protilátka, jak je zde použit, označuje chimérické a humanizované protilátky, vazebné fragmenty protilátek nebo jejich modifikované verze.

Termíny fragmenty nebo vazebné fragmenty protilátky nebo proteinu schopné vazby na antigen zahrnují fragmenty protilátky nebo proteinu, které jsou dostačující pro vazbu na antigen. Vazba vazebného fragmentu protilátky na antigen může probíhat se stejnou afinitou nebo s různou afinitou, například nižší nebo vyšší afinitou, jako vazba celé protilátky na antigen. Příklady vazebných fragmentů zahrnutých v termínu protilátka jsou: Fab fragment skládající se z Vl, Vh, Cl a Chi domén; Fd fragment skládající se z Vh a Chi domén; Fv fragment skládající se z Vl a Vh domén jednoho ramena protilátky; dAb fragment (Ward et al., 1989, Nátuře 341:544-546) skládající se z V_H domény; izolovaný komplementaritu určující region (CDR); a F(ab')2 fragment, bivalentní fragment obsahující dva Fab' fragmenty navázané disulfidovým můstkem v pantovém regionu. Vazebný fragment, například vazebný fragment protilátky, může být aktivní nebo funkční vazebný fragment. V souladu s tím zahrnuje termín funkční nebo aktivní vazebný fragment vazebné fragmenty, které jsou schopné spustit alespoň jednu aktivitu nebo funkci spouštěnou kompletní molekulou. Například, aktivní vazebný fragment monoklonální protilátky M22 nebo H22 je fragment protilátky, který je schopen vazby na FcyR a ^pouštění receptorem-zprostředkované buněčné aktivity, například produkce superoxidového aniontů. Tyto protilátkové fragmenty lze získat za použití běžných technik známých v oboru a tyto fragmenty jsou testovány na použitelnost stejným způsobem jako kompletní protilátky.

·· · ·· ·· ·· • · · · · ·« · • · · · · · · · · ·« ·

Termíny činidlo, které se váže na nebo vazebná specificita jsou zaměnitelné s termíny vazebné místo pro antigen, vazebný region pro antigen a determinanta vazby protilátky. Tyto termíny označují region molekuly, například protilátky, který se účastní vazby na antigen. Vazebné místo protilátky pro antigen obsahuje, ale není omezeno na, aminokyseliny protilátky, které kontaktují antigen. Vazebný region protilátky pro antigen může být variabilní region protilátky. Vazebný region protilátky pro antigen může být také hypervariabilní region protilátky. Vazebný region protilátky pro antigen mohou být také aminokyselinové zbytky v hypervariabilním regionu protilátky, které kontaktují antigen a/nebo které způsobují správnou terciální strukturu vazebného regionu pro antigen. Jsou dostupné různé způsoby pro stanovení toho, které aminokyselinové zbytky variabilního nebo hypervariabilního regionu protilátky kontaktují antigen a/nebo jsou významné pro správné uspořádání vazebného regionu pro antigen. Například může být provedena analýza mutagenesí. Konkrétně, v rekombinantně produkovaná protilátce je možno substituovat jednu aminokyselinu za jinou aminokyselinu a je možno provést vazebné studie in vitro pro stanovení rozsahu změny vazebné afinity modifikované protilátky pro antigen ve srovnání s nemodifikovanou protilátkou. Pokud se vazba snižuje v důsledku substituce jedné aminokyseliny za jinou, tak je aminokyselina patrně významná pro vazbu protilátky na antigen. Jiné způsoby pro stanovení toho, které aminokyseliny variabilního regionu protilátky se účastní vazby protilátky na antigen jsou založeny na krystalografické analýze, například na rentgenové krystalografii.

Termín protilátka, která se váže specificky na antigen, označuje protilátku, která se váže na specifický antigen s výrazně vyšší afinitou než na jiné antigeny, t.j. definuje • ·· · · ·· · « · ·· · • · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·· ·· ·· specificitu protilátky, jak je definována v oboru. Termíny protilátka rozpoznávající antigen a protilátka specifická pro antigen jsou zaměnitelné s termínem protilátka, která se váže specificky na antigen.

Příprava činidel vážících se na Fc-receptor

I. Produkce protilátek proti Fc-receptoru

Protilátky proti Fc receptoru pro použití ve sloučeninách vážících se na makrofágy podle předkládaného vynálezu zahrnují protilátky připravené pomocí jakékoliv známé techniky, s podmínkou, že protilátka je schopná vazby na Fc receptor na makrofágů. Výhodné protilátky jsou vhodné pro klinické použití (například mohou být podány lidem). Zejména výhodné protilátky jsou neimunogenní při podání lidem (například se jedná o lidské protilátky produkované v transgenních zvířatech) nebo jsou modifikované pro snížení imunogenicity při podání lidem (například jsou humanizované).

V jednom provedení je protilátka proti Fc receptoru monoklonální protilátka, například myší nebo lidská monoklonální protilátka, která se váže na IgG receptor nebo na IgA receptor, výhodně va takovém místě, které není blokováno (t.j. vazbou) lidským imunoglobulinem G (IgG) nebo imunoglobulinem A (IgA). Termín IgG receptor, jak je zde použit, označuje jakýkoliv z osmi Fcy receptorových genů lokalizovaných na chromosomu 1. Tyto geny kódují celkem 12 transmembránových nebo solubilních isoforem receptorů, které jsou uskupeny do tří tříd Fcy receptorů: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) a FcyRIII (CD16). V jednom výhodném provedení je Fcy receptor lidský vysokoafinitní FcyRI. Lidský FcyRI je 72 kDa 8 9 molekula, která má vysokou afinitu pro monomerní IgG (10 -10 *« ·« * «· 99 »9 • · · · · · · ··«.· ····· ··· ··«· • · · 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 999 99 9 9 99

Μ^-1). Produkce a charakterizace těchto výhodných monoklonálních protilátek jsou popsány ve Fanger et al., v PCT přihlášce WO 88/00052 a v U.S. patentu č. 4954617, které jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti. Tyto protilátky se váží na epitop FcyRI, FcyRII nebo FcyRIII v místě, které je jiné než Fcy vazebné místo receptoru a proto není jejich vazba významně blokována fyziologickými koncentracemi IgG. Konkrétními antiFcyRI protilátkami použitelnými v předkládaném vynálezu jsou mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 a mAb 197. Hybridom produkující mAb 32 je dostupný od American Type Culture Collection, ATCC přírůstkové č. HB9469. Anti-FcyRI mAb 22 a F(ab')2 fragmenty mAb 22 mohou být získány od Medare-x lne., ^ůnnanndale, N.J.) . Hybridom produkující mAb 22 je uložen od 9.7.1996 v ATCC pod přírůstkovým č. HB-12147. V jiných provedeních je protilátka proti Fcy receptoru humanizovanou formou monoklonální protilátky 22 (H22). Produkce a charakterizace protilátky H22 je popsána v Graziano, R.F. et al., (1995), J. Immunoí.

155(10): 4996-5002 a v PCT/US93/10384. Buněčná linie produkující H22 protilátku byla uložena v American Type Culture Collection 4.11.1992 pod označením HA022CL1 a má přírůstkové č. CRL 11177.

V jiných provedeních je anti-FcR protilátka specifická pro IgA receptor. Termín IgA receptor označuje genový produkt jednoho α-genu (FcaR) umístěného na chromosomu 19. Je známo, že tento gen kóduje několik alternativně sestřižených transmembránových isoforem velikosti 55 až 110 kDa. FcaR (CD89) je konstitutivně exprimován na monocytech/makrofágách, eosinofilních a neutrofilních granulocytech, ale ne na populaci neefektorových buněk. FcaR má střední afinitu (« 5 x 10⁷ M^-1) pro IgAl a IgA2, která se zvyšuje působením cytokinů jako je G-CSF nebo GM-CSF (Morton, H.C. et al., (1996), * · «· e «« ·· «· » · · · · · · « · · • · · · 0 ·· » · · · · • * · 0 · 0 « · ·· · » 0 · · · · · 0 » 0 0 ·· ·· ·♦· ·· «· ··

Critical Reviews in Immunology 16: 423-440) . Příklady monoklonálních protilátek proti FcaR jsou My 43, A77, A62, A59 a A3 (Monteiro et al., (1992), J. Immunol. 148: 1764; Shen et al., (1989), J. Immunol. 143: 4117). Výhodné anti-FcaR protilátky jsou schopné vazby na FcaR bez inhibice IgA. Protilátka A77 byla připravena imunizací myší akrylamidovými gely obsahujícími FcaR, který byl pomocí IgA afinitně přečištěn z lyzátů lidských buněk. Monoklonální protilátky byly testovány podle tří charakteristik: barvení U937 buněk s vyšší densitou po aktivaci PMA, selektivní reaktivity s krevními monocyty a granulocyty a schopnosti imunitně srážet molekuly velikosti přibližně 55 až 75 kDa od neutrofilů a aktivovaných U937 buněk.

Monoklonální protilátky proti Fc-receptorům použité ve sloučeninách podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny různými technikami, včetně běžných technik přípravy monoklonálních protilátek, například za použití standardní hybridizace somatických buněk podle Kohlera a Milsteina (1975) Nátuře 256: 495. Ačkoliv je výhodné použití způsobu hybridizace somatických buněk, mohou být použity jiné techniky pro přípravu monoklonálních protilátek, jako je například virová nebo onkogenní transformace B-lymfocytů.

Výhodným zvířecím systémem pro přípravu hybridomů je myší systém. Produkce hybridomů u myší je dobře známá. Imunizační protokoly a techniky pro izolaci^-imunizovaných splenocytů pro fúze jsou dobře známé v oboru. Partnery pro fúzi (například myší myelomové buňky) a fúzní postupy jsou také dobře známé.

Lidské monoklonální protilátky (mAb) namířené proti lidským proteinům mohou být připraveny za použití transgenních myší nesoucích kompletní lidský imunitní systém místo myšího «· «« « · * * * · · · • · · ·· ·· imunitního systému. Splenocyty z těchto transgenních myší imunizovaných vybraným antigenem jsou použity pro přípravu hybridomů, které secernují lidské mAb se specifickými afinitami pro epitopy lidského proteinu (viz například Wood et al., Mezinárodní přihláška WO 91/00906, Kucherlapati et al.,

PCT přihláška WO 91/10741; Lonberg et al., Mezinárodní přihláška WO 92/03918; Kay et al., Mezinárodní přihláška 92/03917; Lonberg, N. et al., 1994, Nátuře 368: 856-859;

Green, L.L. et al., 1994, Nátuře Genet. 7: 13-121; Morrison,

S.L. et al., (1994), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855;

Bruggeman et al. (1993) Year Immunol. 7:33-40; Tuaillon et al., (1993), PNAS 90: 3720-3724; Bruggeman et al., (1991),

Eur. J. Immunol. 21: 1323-1326).

V příkladném provedení mohou být pomocí inaktivace genů kódujících myší protilátky připraveny myši (HuMab myši), které produkují po imunizaci kompletní lidskou protilátkovou odpověď. Inaktivace genů může být provedena přípravou dvojitě knock-outovaných myší, ve kterých jsou geny pro imunoglobulinový těžký řetězec a κ-lehký řetězec vyřazeny cílenou deleci exonů kódujících konstantní regiony (Cp a JCk). Mohou být připraveny samostatné transgeny, které obsahují lidské geny pro těžký řetězec imunoglobulinu a lidské geny pro K lehký řetězec. U lidí mají tyto geny každý velikost přibližně 1-2 megabáze, což je příliš pro intaktní izolaci. Zásadní regiony mohou být uspořádány do kondenzované formy takzvaného minil-okusu . Minilokus těžkého řetězce obsahuje 26 segmenty Vh genu, 15 segmentů D_h a 6 Jh genu a Sp a Cp a Syl a Cyl genové segmenty. Minilokus κ-lehkého řetězce obsahuje 1-17 segmentů VK-genu, 5 Jk a Ck genové segmenty (Lonberg, N. et al., 1994, Nátuře 368: 856-859; Tuaillon et al., (1993), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724). Tyto minilokusy mohou být • · • · · · ► · · » · · · · potom inkorporovány do genomu dvojitě knock-outovaných myší. Může být připraveno několik postupných verzí těchto dvojitě knock-outovaných/dvojitě transgenních HuMab myší, které obsahují zvyšující se množství lokusů lidského těžkého a lehkého řetězce. Například byly připraveny HuMab myši obsahující 100 kb transgen těžkého řetězce obsahující šest V segmentů, a 200 kb transgen lehkého řetězce obsahující 17 VKsegmentů. Tyto HuMab myši mohou být imunizované za použití běžných imunizačních protokolů a bylo prokázáno, že účinně vytvářejí vysoce-afinitní lidské IgGl protilátky proti širokému panelu antigenů (Fishwild, D.M. et al., (1996),

Nátuře Biotech. 14: 845-851; Lonberg, N. and D.Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93). Bylo prokázáno, že protilátky připravené podle tohoto protokolu mají vynikající biologickou aktivitu a dlouhý sérový poločas.

Chimérické myší-lidské monoklonální protilátky (t.j. chimérické protilátky) mohou být připraveny rekombinantními DNA technikami známými v oboru. Například, gen kódující Fc konstantní region myší (nebo od jiného druhu) monoklonální protilátky se tráví restrikčnímy enzymy pro odstranění regionu kódujícího myší Fc a ekvivalentní část genu kódujícího lidský Fc konstantní region se substituuje za tento region (viz Robinson et al., Mezinárodní patentová přihláška

PCT/US86/02269; Akira et al., Evropská patentová přihláška 184187; Taniguchi, M., Evropská patentová přihláška 171496; Morrison et al., Evropská patentová přihláška 173494; _

Neuberger et al., Mezinárodní přihláška WO 86/01533; Cabilly et al., U.S. patent č. 4816567; Cabilly et al., Evropská patentová přihláška 125023; Better et al. (1988, Science 240: 1041-1043); Liu et al. (1987), PNAS 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:

214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer Res. 47: 999-1005;

Wood et al. (1985) Nátuře 314: 446-449; a Shaw et al., 1988,

J. Nati. Cancer Inst. 80: 1553-1559).

Chimérická protilátka může být dále humanizována nahrazením sekvencí Fv variabilního regionu, které se přímo neúčastní vazby antigenu, ekvivalentními sekvencemi z lidských Fv variabilních regionů. Obecný přehled humanizovaných chimérických protilátek je uveden v Morrison, S.L., 1985, Science 229: 1202-1207 a v Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214. Tyto metody obsahují izolaci, manipulaci a expresi sekvencí nukleových kyselin, které kódují celé nebo části imunoglobulinových Fv variabilních regionů z alespoň jednoho těžkého nebo lehkého řetězce. Zdroje takových nukleových kyselin jsou dobře známé v oboru a mohou být získány, například, z 7E3, hybridomu produkujícího anti-GPIIblIIa protilátku. Rekombinantní DNA kódující chimérickou protilátku nebo její fragment může být potom klonována do vhodného expresního vektoru. Vhodné humanizované protilátky mohou být alternativně produkovány substitucí CDR (U.S. patent 5225539; Joes et al., 1986, Nátuře 321: 552-525; Verhoyan et al., 1988, Science 239: 1534; a Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4053-4060.

Všechny CDR určité lidské protilátky mohou být nahrazeny alespoň částí jiného než lidského CDR nebo mohou být jiným než lidským CDR nahrazeny pouze některé CDR. Je pouze nutné nahradit počet CDR nutný pro vazbu humanizované p“rotilátky na Fc receptor.

Protilátka může být humanizována jakýmkoliv způsobem, který umožňuje nahrazení alespoň části CDR lidské protilátky CDR odvozeným z jiné než lidské protilátky. Winter popisuje způsob, který může být použit pro přípravu humanizovaných protilátek podle předkládaného vynálezu (UK patentová přihláška GB 2188638A, podaná 26.3.1987, jejíž obsah je zde uveden jako odkaz). Lidský CDR může být nahrazen jiným než lidským CDR za použití oligonukleotidové místně cílené mutagenese, jak je popsána v Mezinárodní přihlášce WO 94/10332, která má název Humanized Antibodies to Fc Receptors for Imunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes.

Do rozsahu předkládaného vynálezu také spadají chimérické a humanizované protilátky, ve kterých byly specifické aminokyseliny substituované, deletované nebo přidané. Výhodné humanizované protilátky mají aminokyselinové substituce v regionu pracovního rámce, které zlepšují vazbu na antigen. Například, v humanizované protilátce mající myší CDR mohou být aminokyseliny umístěné v lidském pracovním regionu nahrazeny aminokyselinami umístěnými v příslušných pozicích v myši protilátce. Je známo, že takové substituce zlepšují v některých případech vazbu humanizované protilátky na antigen. Protilátky, ve kterých byly aminokyseliny přidány, deletovány nebo substituovány, jsou zde označovány jako modifikované protilátky nebo pozměněné protilátky.

Termín modifikovaná protilátka také zahrnuje protilátky, jako jsou monoklonální protilátky, chimérické protilátky a humanizované protilátky, které byly modifikovány například delecí, přidáním nebo substitucí části protilátky. Například může být protilátka modifikována delecí konstantního regionu a jeho nahrazením jiným konstantním regionem pro zvýšení poločasu, například sérového poločasu, stability nebo afinity protilátky. Jakákoliv modifikace spadá do rozsahu předkládaného vynálezu, pokud má sloučenina vážící se na makrofágy alespoň jeden vazebný region pro antigen specifický pro FcR a pokud spouští alespoň jednu efektorovou funkci.

Monoklonální protilátky mohou být také připraveny jinými metodami známými odborníkům v oboru rekombinantní DNA. Alternativní způsob, označovaný jako kombinatoriální protilátkové zobrazování, byla vyvinuta pro identifikaci a izolaci protilátkových fragmentů majících určitou antigenní specificitu, a tento způsob může být použit pro přípravu monoklonálních protilátek (pro popis kombinatoriálního protilátkového zobrazování viz například Sastry et al.

(1989), PNAS 86: 5728; Huse et al., (1989), Science 246: 1275;

a Orlandi et al. (1989) PNAS 86: 3833). Po imunizaci zvířete imunogenem, jak je popsána výše, se klonuje protilátkový repertoár vzniklých B-lymfocytů. Známé jsou způsoby pro získání DNA sekvencí variabilních regionů různorodé populace imunoglobulinových molekul za použití směsi oligomerových primerů a PCR. Například, směs oligonukleotidových primerů odpovídajících 5' vedoucím (signálním) sekvencím a/nebo sekvencím pracovního rámce 1 (FR1), stejně jako primer pro konzervovaný 3' konstantní region, mohou být použity pro PCR amplifikaci variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce z mnoha myších protilátek (Larrick et al., 1991, Biotechniques 11: 152-156). Podobná strategie může být také použita pro amplifikaci lidských variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce z lidských protilátek (Larrick et al., 1991, Methods: Companion to Methods in Enzymology 2: 106-110).

V ilustrativním provedení je RNA izolována například z Blymfocytů, buněk periferní krve, kostní dřeně nebo sleziny za použití standardních protokolů (například U.S. patent č. 4683202; Orlandi et al., PNAS (1989), 86: 3833-3837; Sastry et al. , PNAS (1989), 86: 5728-5732; a Huse et al. (1989), Science

246: 1275-1281). První řetězec cDNA je syntetizován za použití primerů specifických pro konstantní region těžkého řetězce a κ • · « * * • · · a λ řetězce, stejně jako primerů pro signální sekvenci. Pomocí PCR primerů pro variabilní regiony jsou amplifikovány variabilní regiony těžkých a lehkých řetězců, samostatně nebo v kombinaci, a jsou ligovány do vhodných vektorů pro další zpracování při přípravě zobrazovacích přípravků. Oligonukleotidové primery použitelné v amplifikačních protokolech mohou být jedinečné nebo degenerované nebo mohou obsahovat inosin v degenerovaných pozicích. Primery mohou rovněž obsahovat rozpoznávací místa pro restrikční endonukleasy, která umožňují klonování amplifikovaného fragmentu do vektoru v předem určeném čtecím rámci pro expresi.

V-genová knihovna klonovaná z imunizací indukovaného protilátkového repertoáru může být exprimována populací zobrazovacích nosičů, výhodně odvozených od filamentosního fágu, za vzniku protilátkové zobrazovací knihovny. Ideálně obsahuje zobrazovací nosič, který umožní vzorkování velmi různorodých protilátkových zobrazovacích knihoven, rychlé třídění po každém kole afinitní separace a snadnou izolaci protilátkového genu z přečištěných zobrazovacích nosičů. Kromě komerčně dostupných kitů pro přípravu fágových zobrazovacích knihoven (například Pharmacia Recombinant Phage Antiboody

TM

System, katalogové c. 27-9400-01; a Stratagene SurfZAP phage display kit, katalogové č. 240612) mohou být způsoby a činidla vhodná pro tvorbu variabilních protilátkových zobrazovacích .knihoven nalezeny v Ladner et al., U^S. patent č. 5223409;

Kang et al., Mezinárodní přihláška č. WO 92: 18619; Dower et al., Mezinárodní přihláška č. WO 91/17271; Winter et al., Mezinárodní přihláška č. WO 92/20791; Markland et al., Mezinárodní přihláška č. WO92/15679; Breitling et al., Mezinárodní přihláška č. WO 93/01288; McCafferty et al., Mezinárodní přihláška č. WO 92/01047; Garrard et al., • ·

Mezinárodní přihláška č. WO 92/09690; Ladner et al.,

Mezinárodní přihláška č. WO 90/02809; Fuchs et al., (1991)

Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al.,(1992), Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., (1989), Science 246: 12751281; Griffths et al., (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al., (1992), J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clacfeon et al., (1991), Nátuře 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 35763580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137; a Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982.

V některých provedeních mohou být domény V regionu těžkého a lehkého řetězce exprimovány na stejném polypeptidu, mohou být spojeny flexibilní spojovací skupinou za vzniku jednořetězcového Fv fragmentu a scFV gen může být potom klonován do vybraného expresního vektoru nebo fágového genomu. jak je obecně popsáno v McCafferty et al., Nátuře (1990) 348: 552-554, kompletní Vh a Vl domény protilátky, spojené flexibilní (Gly4-Ser)3 spojovací skupinou, mohou být použity pro produkci jednořetězcové protilátky, která může napomoci separaci zobrazovacího nosiče na základě afinity k antigenu. Izolované scFV protilátky imunoreaktivní s antigenem mohou být potom připraveny ve formě farmaceutického prostředku pro použití ve způsobu podle předkládaného vynálezu.

Po zobrazení na povrchu zobrazovacího nosiče (například filamentosního fágu) se protilátková knihovna vyšetřuje pomocí FcyR nebo jeho peptidového fragmentu, pro identifikaci a izolaci nosičů, které exprimují protilátku specifickou pro FcyR. Nukleová kyselina kódující vybranou protilátku může být získána ze zobrazovacího nosiče (například z genomu fágu) a může být subklonována do jiných.expresních vektorů za použití standardních technik rekombinantní DNA.

• ·

Činidlo vážící se na Fc receptor a/nebo jiné vazebné činidlo ve sloučeninách vážících se na makrofágy podle předkládaného vynálezu s vysokou afinitou pro cílový antigen (například povrchový protein) může být připraveno pomocí dobře známých metod, například metod využívajících vyšetřování knihoven (Ladner, R.C. et al., U.S. patent 5233409; Ladner,

R.C. et al., U.S. patent 5403484). Dále, způsoby využívající těchto knihoven mohou být použity pro vyhledávání vazebných determinant, které napodobují strukturální determinanty protilátek. Konkrétně, Fv vazebný povrch určité protilátky interaguje s epitopem podle zásad interakcí protein-protein, a proto může sekvence Vh a Vl (kde Vl může být z κ nebo λ řetězce) základem pro techniky genového inženýrství známé odborníkům v oboru. Podrobnosti o proteinovém povrchu, který obsahuje vazebné determinanty, mohou být získány z dat sekvence protilátky, modelováním využívajícím dříve určených trojrozměrných struktur jiných protilátek získaných z NMR analýz a krystalografie. Viz například Bajorath, J. a S. Sheriff, 1996, Proteins: Struct., Funct. and Genet. 24(2):152157; Webster, D.M. a A.R. Rees, 1995, Molecular Modeling of antibody-combining sites, v S. Paul, ed., Methods in Molecular Biol. 51, Antibody Engeneering Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, str. 17-49; a Johnson, G., Wu, T.T. a E.A. Kabat, 1995, Seqhunt: A program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences, v Methods in Molecular Biol. 51, op. cit. str. 1-15.

V jednom provedení obsahuje vazebné činidlo pro Fc receptor vazebné místo pro antigen, které je odvozené od protilátky a které je přeneseno na neprotilátkovou molekulu. Například může být vazebný region pro antigen přenesen na peptid nebo protein. V jednom provedení je jedna část vazebného regionu pro antigen, například část podobná vazebnému regionu pro • · ·· · ·· ·· ··· ··*« · · · • ···· ·· · · ·· • · antigen z lehkého řetězce protilátky, přenesena na jeden protein nebo peptid a druhá část vazebného regionu pro antigen, například část podobná vazebnému regionu pro antigen z těžkého řetězce protilátky, je přenesena na jiný protein nebo peptid. Ve výhodném provedení vynálezu jsou dva proteiny nebo peptidy obsahující každý část vazebného regionu pro antigen spojeny, například chemickou vazbou, rekombinantně nebo nekovalentní vazbou, takže vzniká protein obsahující vazebné místo pro antigen specifické pro FcR pro lidské Ig, které spouští alespoň jednu funkci efektorových buněk zprostředkovanou Fc receptorem.

Vazebný region pro antigen může být také získán vyšetřováním různých typů kombinatoriálních knihoven požadovanou vazebnou aktivitou a identifikací aktivních druhů, za použití popsaných způsobů. Například, techniky fágového zobrazování (Marks et al., (1992), J. Biol. chem. 267: 1600716010) mohou být použity pro identifikaci proteinů vážících se na FcyR. Fágové zobrazovací knihovny byly popsány výše. Například, rozsáhlé peptidové knihovny mohou být exprimovány populací zobrazovacích nosičů za zisku peptidové zobrazovací knihovny. Ideálně obsahuje zobrazovací nosič, který umožní vzorkování velmi různorodých peptidových zobrazovacích knihoven, rychlé třídění po každém kole afinitní separace a snadnou izolaci genu kódujícího peptid z přečištěných zobrazovacích nosičů. Peptidové zobrazovací knihovny mohou být v, například, prokaryotických organismech a virech, které mohou být rychle amplifikovány a které se relativně snadno zpracovávají a které umožňují vytvoření velkého množství klonů. Mezi výhodné zobrazovací nosiče patří, například, vegetativní bakteriální buňky, bakteriální spory a nejlépe bakteriální viry (zejména DNA viry). Nicméně, předkládaný vynález také předpokládá použití eukaryotických buněk, včetně ·

• · · · kvasinek a jejich spor, jako možných zobrazovacích nosičů. Fágové zobrazovací knihovny byly popsány výše.

Mezi další techniky patří afinitní chromatografie s vhodným receptorem, například s FcyRI nebo FcaR, pro izolaci vazebného činidla, po které následuje identifikace izolovaných vazebných činidel nebo ligandů za použití běžných technik (například hmotnostní spektrometrie a NMR). Výhodně je solubilní receptor ligován na značící činidlo (například na fluorofor, kolorimetrické enzymy, radioaktivní izotopy nebo luminiscenční sloučeniny), který může být detekován pro znázornění vazby ligandu. Alternativně může být imobilizovaná sloučenina selektivně uvolňována a může difundovat skrz membránu za interakce s receptorem.

Kombinatoriální knihovny sloučenin mohou být také syntetizovány s koncovkami pro kódování identity každého člena knihovny (viz například W.C. Still et al., Mezinárodní přihláška WO 94/08051). Obecně tato metoda spočívá v použití inertních, ale snadno detekovatelných koncovek, které jsou navázány na pevný nosič nebo na sloučeninu. Když je aktivní sloučenina detekována, tak je identita sloučeniny určena identifikací jedinečné navázané koncovky. Tato metoda koncovek umožňuje syntézu velkých knihoven sloučenin, které mohou být identifikovány při nízkých koncentracích v celkové sadě všech sloučenin v knihovně.

II. Kyaninové prostředky

V jiném provedení vynálezu je činidlem vážícím se na Fc receptor ve sloučenině vážící se na makrofágy chemická skupina, jako je kyaninový prostředek, včetně například fluorescentního barviva Cy5.18.Su (označovaného jako Cy5) a • · jeho kojugátů a derivátů. Je známo, že kyaninové prostředky se váží s vysokou afinitou a specificitou na FcyRI receptory. V některých případech může kyaninový prostředek obsahovat dvě nebo více skupin, jakoo je kyanin-sukcinimidyl ester a fykobilisomový protein, například PE. Termín PE-Cy5, jak je zde použit, označuje barvivo složené z fykoerythrinu a Cy5.18.OSu; termín PE-Cy5 činidlo označuje, například, PECy5 konjugovaný s protilátkou, s geneticky upravenými vazebnými proteiny a peptidy (U.S.P.N. 5233409 a 5403484), avidinem, biotinem a nebo jinými molekulami. Pe-Cy5 kojugát může být použit v terapeutických a diagnostických aplikacích.

Kyanin byl izolován z chrpy (Centaurea cyanus) a strukturálně se jedná o 3,5-diglukosid kyanidinu, což je 2(3,4-dihydroxyfenyl)-3,5,7-trihydroxy-l-benzopyryliumchlorid, který byl izolován z banánu (Merck Index). Je popsáno, že jiný kyanidinový derivát, 3-rhamnoglukosid izolovaný z kyselých třešní, má terapeutické použití v léčbě šerosleposti. Anthokyanosidy z borůvek (Vaccinium myrtillus) jsou prodávány jako nutriční potravinové doplňky, které jsou, podle jednoho výrobce (Amrion lne., Boulder, CO) požívány orálně pro zlepšení vasodilatace, snížení permeability kapilár, chránění kolagenu v krevních cévách, jako antioxidační činidlo a jako doplněk pro kontrolu zánětlivých stavů, pro zlepšení zraku, pro zlepšení žaludeční výstelky, hematoencephalické bariery a žil na dolních končetinách a tlustém střevu (Gen. Engin. News _16(11), str. 27, 1996). _ .

Barvivo Cy5, kyanidinový derivát, též označované Cy5.18.OSu, je chemicky disukcinimidylester 5,5'-bis-sulfo-1,1'- (ε-karboxyfenyl)-3,3,3',3'-tetramethylindodikarbokyaninu (A.S. Waggoner et al., v: Clinical Flow Cytometry, str. 185 (ed.) A. Landav et al., The New York Academy of Sciences, New

York, New York, 1993). Byla popsána kyaninová značící činidla pro sulfhydrylcvé skupiny (Ernst, L.A. et al., 1989, Cytometry 10:3) a sukcínímidyl ester karboxymethylindokyaninu (Southwick, P.L. et al., 1990, Cytometry 11:418) a jsou chráněna v patentových přihláškách (USPN 4981977 a 5286486), jejichž obsah je zde uveden jako odkaz. Struktura Cy5 a jeho syntéza a spektra pro absorpci a emisi světla jsou uvedeny v Mujumdar, R.B., 1993, Bioconj..Chem. 4: 105. Cy5 je sukcinimidylový ester sulfoindokyaninu, což je amino-reaktivní kyanin obsahující negativně nabitou sulfonatovou skupinu na aromatickém jádru indokyaninového fluoroforu. Cy5 členy této skupiny jsou charakterizovány nenasyceným polymethinovým můstkem na 5 uhlíku, který spojuje dva substituované kruhy.

Cy5 může být excitován HeNe laserem při 633 nm nebo Dr laserem při 647 nm. Cy5 a jeho deriváty jsou významné z důvodu fotostability, která je srovnatelná nebo lepší než fotostabilita fluoresceinu. Extinkční koeficient (L/mol cm) 250000 je velmi vysoký. Příbuzná barviva (Mujumdar et al., výše), s podobnou strukturou a způsobem syntézy, jsou zde označena termínem Cy5, který zahrnuje sulfoindokyaninsukcinimidyl estery kyaninových značkovacích činidel obecně, například Cy3.29.OSu (známé jako Cy3) a Cy7.18.OH. Termíny Cy5 činidlo, Cy5 konjugát a Cy5 derivát označují konjugát obsahující alespoň jednu Cy5 skupinu a jinou molekulu. Byly popsány další nové deriváty této základní struktury, sulfobenzindokyaninové sukcinimidylové estery kyaninových činidel (Mujumdar, S.R. et al., 1996, Bioconj. Chem. 7: 356), které mají stejné vlastnosti jako Cy5 a jiné sukcinimidylové estery sulfoindokyaninu a předpokládá se, že se váží na FcýRI s afinitou a specificitou.

Použití Cy5 činidla PE-Cy5, které se skládá z Cy5 v tandemu s PE, pro dosažení tříbarevné fluorescence při excitaci • ·

• · · · ···· ··· · · · · · · paprskem argonového laseru při 488 nm je popsáno ve Waggoner et al. , 1993, výše, stejně jako podmínky pro optimalizaci.

Hlavní problémy s tandemovými barvivý na bázi Texaské červeně spočívají v nestabilitě jedné skupiny, která vede při použití k úniku emise do spektra jiné skupiny, což limituje možnost použití Texaské červeně emitující světlo vlnové délky blížící se vlnové délce druhé skupiny. Cy5 a barviva stejné třídy, nicméně, emitují světlo při delších vlnových délkách než texaská červeň, takže analýza dat získaných při použití Cy5 s jinými barvivý vyžaduje minimální kompenzaci kanálu při nastavování detekčního okna a v následných výpočtech. Pro nejlepší způsob použití Cy5 činidla musí být brán v úvahu proces syntézy Cy5 činidla ze složek, protože poměr počtu Cy5 molekul navázaných na molekulu konjugátu ovlivňuje relativní spektrum emisních vlnových délek produktu syntézy. Pro PE-Cy5 se účinnost přenosu energie z PE na Cy5 zvyšuje se stoupajícím počtem molekul Cy5 navázaných na každý PE až do optimální hodnoty, nad kterou dochází k utlumení interakcí v nadbytku Cy5 skupin. Optimální poměr je 4 až 8 Cy5 na PE v PE-Cy5 tandemovém barvivu (Waggoner et al., 1993, výše). Tandemová barviva jsou citlivá na světlo a stabilita při použití je zlepšena tehdy, jsou-li skladování, použití barviv a pokusy provedeny za temných podmínek.

Zlepšená síla signálu způsobená významnou fluorescencí a nepřítomností pozadí pro PE-Cy5, ve srovnání s dříve syntetizovanými tandemovými barvivý, činí z této sloučeniny výhodný analytický prostředek pro studování buněk pomocí konjugátů protilátka-barvivo. Nicméně, byla publikována alespoň jedna studie popisující nespecifickou vazbu různých PE-Cy5 přípravků od různých dodavatelů na myeloidní buňky (Stewart, S.J. et al., výše), kde tato vazba se přisuzuje Cy5 skupině, protože konjugáty PE-texaská červeň nemají tuto • · vlastnost, naopak, Takizawa et al. popisují vazbu PE a jeho konjugátů s mAb na nízko-afinitní myší IgG receptory FcyRII a FcyRIII (J. Immunol. Methods, 1993, 162: 269).

Výroba cytotoxických činidel, která usmrcují makrofágy nebo snižují jejich aktivitu

I. Cytotoxiny

Různá cytotoxická činidla mohou být cíleně zaměřena na makrofágy pomocí sloučenin podle předkládaného vynálezu (tj. například pomocí vazby na činidlo, které se váže na Fc receptor na makrofágů). Termíny cytotoxin a cytotoxické činidlo, jak jsou zde použitý, označují jakoukoliv sloučeninu (například léčivo) schopnou usmrcovat nebo snižovat aktivitu makrofágů. Například může být sloučenin toxin, jako je Gelonin, Saporin, Exotoxin A, Onkonasa nebo Ricin A, nebo léčivo, jako je dichlormethylendifosfonat (CL2MDP) nebo jeho deriváty. Cytotoxiny vhodné pro použití v předkládaném vynálezu mohou dále obsahovat činidlo nebo skupinu, která zvyšuje terapeutickou aktivitu těchto sloučenin.

Například může cytotoxin obsahovat činidlo, které navozuje apoptosu, inhibitor mitosy, alkylační činidlo, antimetabolit, činidlo způsobující interkalaci nukleové kyseliny, inhibitor topoizomerasy, léčivo specifické pro makrofágy nebo radionuklid. Předkládaný vynález nabízí výhodu cíleného zaměření takových cytotoxinů na vysoce-afinitní Fcy receptory (například za použití protilátky jako je Mab 22, Mab 32 nebo jejich humanizované formy) na makrofágách, kde mohou být tyto sloučeniny například internalizovány do buněk. Proto mohou být tyto cytotoxiny účinnější v usmrcování buněk nebo v ovlivňování jejich funkce ve srovnání s činidly, která nejsou internalizována, nebo která jsou internalizována s pomalejší kinetikou.

Cytotoxickým činidlem může být toxické léčivo nebo enzymaticky aktivní toxin bakteriálního nebo rostlinného původu, nebo biologicky aktivní fragment (A řetězec) takového toxinu. Příklady enzymaticky aktivních toxinů a jejich fragmentů zahrnují difterický A řetězec, nevazebné aktivní fragmenty difterického toxinu, exotoxinový A řetězec (od Pseudomonas aeruginosa), ricinový A řetězec, abrinový A řetězec, modecinový A řetězec, alfa-sarcin, proteiny Aleurites fordii, dianthinproteiny, proteiny phytolacca americana (PAPI, PAPII a PAP-S), momordicacharantia inhibitor, curcin, crotin, inhibitor saponaria officinalis, gelonin, mitogellin, restritocin, phenomycin a enomycin. Výhodnými toxiny, které mohou být použity, jsou Gelonin, Saporin, Exotoxin A,

Onconasa, Ricin A, difterický toxin a P.seudomonadový exotoxin nebo podjednotky těchto toxinů. Popisy přípravy, použití in vivo a farmakokinetik těchto toxinů jsou popsány v, například, Vitetta et al., (1987), Science 238: 1098-1104; Spitlet, L. et al., (1987), Clin. Chem. 33 (b): 1054; Uhr et al., Monoclonal

Antibodies and Cancer, Academie Press, Inc., str. 85-98 (1983). Konjugáty sloučenin podle předkládaného vynálezu a takových toxických činidel mohou být připraveny pomocí různých bifunkčních proteinových kopulačních činidel, jak jsou podrobně popsána v části nazvané způsoby příprajvy konjugátů sloučenin vážících se na makrofágy. Příklady takových činidel jsou SPDP, IT bifunkční deriváty imidoesterů, jako je dimethyladipimidat, HCl, aktivní estery, jako je disukcinimidylsuberat, aldehydy jako je glutaraldehyd, bisazido-sloučeniny jako je bis-(p-azidobenzoyl)hexandiamin, bisdiazoniové deriváty, jako je bis-(p-diazoniumbenzoyl)34

ethylendiamid, diisokyanatany, jako je toluen-2,6diisokyanatan a bis-aktivní sloučeniny fluoru, jako je

1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen.

V jiných provedeních je cytotoxinem léčivo. Mezi příklady léčiv patří dichlormethylendifosfonat (CL2MDP) nebo jiné klodronatové deriváty (Bogers et al., (1991), Clin. Exp. Immunol. 86: 328-333). Alternativně může být cytotoxinem činidlo navozující apoptosu, inhibitor mitosy, alkylační činidlo, antimetabolit, činidlo způsobující interkalaci nukleových kyselin a inhibitor topoizomerasy. Příklady takových činidel, která mohou být použita ve sloučeninách podle předkládaného vynálezu zahrnují inhibitory topoizomerasy II ellipticin, amsacrin, adriamycin a mitrozantron, inhibitor DNA gyrasy prokaryont coumermycin Al a činidla vážící se na DNA neocarzinostatin a chlorochin (která způsobují buď interkalaci nebo zářezy v DNA). Způsoby pro podání takových léků, například pro podání v liposomech, jsou popsány dále.

V některých provedeních může cytotoxin obsahovat fotosenzibilizační skupinu (například fotosenzibilizační léčivo). Cytotoxiny tvořené takovými fotosenzibilizačními skupinami jsou použitelné pro senzibilizaci cíle, například makrofágů, pro destrukci po fotoaktivaci, například ozářením viditelným světlem. Výhodně nemá fotosenzibilizační skupina před fotoaktivaci žádný přímý biologický účinek. Sloučeniny obsahující takové skupiny mohou být podány jedinci například lokálně nebo injekčně. Po fotoaktivaci vystavením těchto sloučenin působení světla určité vlnové délky, například viditelného světla, se skupina stane toxickou (buď sama o sobě nebo aktivací cytotoxinu asociovaného se skupinou) a selektivně zničí makrofág. Bez vazby na konkrétné teorii se předpokládá, že mechanismus fotoaktivace zahrnuje přenos

energie ze fotosenzitivní sloučeniny na endogenní kyslík, který se přemění na singletový kyslík. Předpokládá se, že singletový kyslík je odpovědný za cytotoxický efekt.

Sloučeniny vážící se na makrofágy obsahující fotosenzibilizační skupiny jsou zejména vhodné pro léčbu dermatologických onemocnění.

Příklady fotosenzibilizačních činidel, která mohou být použita v předkládaném vynálezu, zahrnují sloučeniny příbuzné porfyrinu, například hematoporfyrinové deriváty (Lipson, R.L. et al., (1961), J. National Cancer Inst. 26: 1-8), přípravky Photophrin II ÍUS 4649151, Dogherty, TJ. (1983) Adv. Exp. Med. Bio. 160: 3-13; Kessel, D. et al., (1987), Photochem.

Photobiol. 46: 463-568, a Scourides, P.A. et al., (1987)

Cancer Res. 47: 3439-3445), pyrofeoforbidové sloučeniny (US 5459159; US 4996312, a US 4849207 a EP 220686); deriváty chlorofylu a bakteriofilu (EPA 93111942.4); 9-substituované deriváty porfycenu (WO 96/31451); deriváty frobinu (WO 95/08551); stejně jako chloriny, ftalokyaniny a porfiny (přehled je uveden v Harvey, I. Pass. (1993), J. Nati. Canc. Inst. 85: 443-457). Fotoaktivované formy fotosenzibilizačních sloučenin, které emitují fluorescentní signál, mohou být také použity v diagnostice pro značení sloučenin vážících se na makrofágy podle předkládaného vynálezu.

V jiných provedeních může sloučenina vážící se na makrofágy podle’ předkládaného vynálezu obsahovat Fc vazebné činidlo navázané na terapeutické nebo diagnostické činidlo, například na toxické činidlo, prostřednictvím vazby štěpitelné světlem. Výhodně je vazba zprostředkována činidlem štěpitelným světlem, jako je chromofor, které uvolňuje terapeutické nebo diagnostické činidlo působením světla (Goldmacher et al., (1992), Bioconj. Chem. 3: 104-107). Například, • · · · * ··· 4 4 * · « • · · · · · · • · ··· · · · • · · · · « · • · · 9 4 4 4 ·4 v dermatologických aplikacích bude světlo indukovat degradaci vazby, čímž se lokálně uvolní aktivní toxin (například v kůži). Mezi činidla štěpitelná světlem vhodná pro uvolnění navázaného terapeutického nebo diagnostického činidla patří jakékoliv činidlo, které může být navázáno na funkční skupinu (například fenol) terapeutického nebo diagnostického činidla a které, působením světla, uvolňuje terapeutické nebo diagnostické činidlo ve funkční formě, například může být činidlem štěpitelným světlem chromofor. Vhodnými chromofory jsou obvykle takové chromofory, které absorbují světlo dodatelné běžnými zdroji záření (jako je například UV světlo vlnové délky 240-370 nm). Příklady chromoforů, které jsou fotocitlivé na takové vlnové délky zahrnují, například, akridiny, nitroaromatické sloučeniny a arylsulfonamidy.

Při použití chromoforů se účinnost a vlnová délka, při které se chromofor stává fotoaktivovaným a tak uvolňuje nebo vypouští terapeutické činidlo velmi různí, podle konkrétních funkčních skupin navázaných na chromofor. Například při použití nitroaromatických sloučenin, jako jsou deriváty onitrobenzylových sloučenin, může být absorpční vlnová délka významně zvětšena přidáním methoxy-skupin. V jenom provedení je nitrobenzyl (NB) a nitrofenylethyl (NPE) modifikován přidáním dvou methoxy- zbytků do 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzylu (DMNB) a 1-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenyl)ethyu (DMNPE), v příslušném pořadí, což zvýší absorpční vlnovou délku na 340360 nm (X_max = 355 nm) . Záření uvolňující terapeutické nebo diagnostické činidlo může být dodáno různými zdroji, včetně, například, nekoherentních zdrojů UV světla a excimerových zdrojů. V jednom provedení může být použit KrF excimerový laser pracující při 248 nm. Alternativně může být použit YAG laser využívající neodymia v pevném stavu se čtyřmi frekvencemi nebo podobný přístroj pracující při 266 nm, nebo • » »

» · · ·* · ·

I « « 1 ► · · ι

Argonový laser pracující při 257 nebo 275 nm. Světlem aktivovatelné činidlo může reagovat s terapeutickým činidlem za vzniku světlem štěpitelné vazby. Při použití chromoforů jako světlem aktivovatelných činidel může být excitační vlnová délka vybrána tak, aby selektivně excitovala určité chromofory. Například je možno fotoštěpitelně navázat dva různé léky nebo dva různé chromofory na substrát a potom nezávisle nebo sekvenčně uvolňovat dva léky pomocí excitační vlnové délky odpovídající příslušnému chromoforů. Chromofor a excitační vlnová délka mohou být dále vybrány tak, aby se předešlo nežádoucím fotolytickým reakcím léku (například inaktivaci) nebo okolní tkáně. Například, fotosensitivita nukleových kyselin je dobře známa. Pokud je lékem nukleová kyselina, tak by neměla být použita excitační energie, která může poškodit nukleovou kyselinu (například vlnová délka kratší než 280 nm).

Dále, sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu mohou být značeny (například pro diagnostické účely) navázáním sloučeniny na radionuklidy, jako je ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁰⁵Rh,

Sc, Cu, Bi a At, jak je popsáno například v Goldenberg D.M. et al., (1981), Cancer Res. 41: 4354-4360; v EP 0365997; Carrasquillo et al., Cabcer Treat. Rep. 68: 317-328 (1984); Zaloberg et al., J. Nati. Cancer Institute 72: 697-704 (1984);

Jones et al., Int. J. Cancer 35: 715-720 (1985); Lange et al., Surgery 98: 143-150 (1985); Kaltovich et al., J. Nucl. Med.

27: 897 (1986); Order et al., Intl. J. Radiother. Oncl. Biol.

Phys. 8: 259-261 (1982); Courtenay-Luck et al., Lancet 1: 1441-1443 (1983); Ettinger et al., Cancer Treat. Rep. 56: 289297 (1982); kde tyto publikace jsou zde všechny uvedeny jako odkazy. Takové radionuklidy mohou také zvyšovat cytotoxický efekt fotosenzibilizačních sloučenin.

Vl · · · · • · · · 9 • 99 ·· »· • · ♦ 9 9 · · ·

9 · · « « «

9 9 «99* • Λ » 99 9* 99

V takových diagnostických aplikacích je žádoucí navázání značící skupiny na sloučeniny vážící se na makrofágy pro usnadění jejich detekce (například jejich vazby na makrofágy ve vzorku). V souladu s tím takové značící skupiny zahrnují kromě radionuklidů uvedených výše například fluorofory, kolorimetrické enzymy, radioizotopy nebo luminiscentní sloučeniny. Například, pokud je značící skupinou enzym, tak bude enzym navázaný na sloučeninu vážící se na makrofágy reagovat s vhodným substrátem, výhodně s chromogenním substrátem, tak, že vznikne detekovatelný chemický signál, který může být detekován například spektrofotometricky, fluorimetricky nebo vizuálně. Mezi enzymy, které mohou být použity pro detekovatelné značení protilátky, patří například malat-dehydrogenasa, staphylokoková nukleasa, delta-5-steroidizomerasa, kvasinková alkohol-dehydrogenasa, α-glycerofosaftdehydrogenasa, triosafosfat-izomerasa, křenová peroxidasa, alkalická fosfatasa, asparaginasa, glukosa-oxidasa, βgalaktosidasa, ribonukleasa, ureasa, katalasa, glukosa-6fosfat dehydrogenasa, glukoamylasa a acetylcholinesterasa. Detekce může být provedena kolorimetrickým způsobem, který využívá chromogenní substrát pro enzym. Detekce může být provedena také vizuálně srovnáním rozsahu enzymatické reakce substrátu s podobně připravenými standardy.

Detekce vazby sloučenin vážících se na makrofágy na makrofágy může být provedena za použití jakéhokoliv z mnoha imunotestů. Například může být_použit radioimunotest (RIA) (viz například Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March 1986, který je zde uveden jako odkaz). Alternativně může být použit enzymový imunotest (EIA) (Voliér, The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates ·· • ww ·· ·· • « · I* · * » • a · · > · ·· ··

Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voliér et al., J. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1978); Butler, Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio (ed.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boča Raton, FL, 1980; Ishikawa et al. (eds.) Enzyme

Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo, 1981). Radioaktivní izotop může být detekován například za použití γ-kamery nebo scintilační kamery nebo autoradiograficky.

Je také možno označit sloučeninu vážící se na makrofágy fluorescentní sloučeninou. Když je fluorescenčně značená sloučenina vystavena působení světla správné vlnové délky, může být detekována její přítomnost. Nej častěji používanými fluorescenčními značkovacími sloučeninami jsoou fluorescein isothiokyanatan, rhodamin, fykoerythrin, fykokyanin, allofykkyanin, o-ftalaldehyd a fluorescamin.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také značeny za použití kovů emitujících fluoorescenci, jako je 152Eu nebo jiné kovy lanthanidové řady. Tyto kovy mohou být navázané na protilátku pomocí skupin zprostředkujících chelaci kovů jako je kyselina diethylentriaminpentoctová (DTPA) nebo kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA). Alternativně mohou být tyto sloučeniny značeny pomocí vazby na chemiluminiscentní sloučeniny. Přítomnost sloučeniny navázané na chemiluminiscentní činidlo je potom detekována podle luminiscence vznikající během chemické reakce. Příklady použitelných chemiluminiscentních značících sloučenin jsou luminol, isoluminol, theromatický ester akridinia, imidazol, sůl akrinidia a ester oxalatu.

Podobně může být pro označení sloučenin vážících se na makrofágy podle předkládaného vynálezu použita bioluminiscentní sloučenina. Bioluminiscence je typem • · · · · ·· «· · · • · · ···· *··· ····· ♦ « · ···· • ·· ·· · · · · · ·· ·

ΛΛ · · · · ·····«· ‘♦U ·· ·· C·· ·· ·· ·· chemiluminiscence, která se vyskytuje v biologických systémech, kde katalytický protein zvyšuje účinnost chemiluminiscentní reakce. Přítomnost bioluminiscentního proteinu je určena podle detekce přítomnosti luminiscence.

Významnými bioluminiscentními sloučeninami pro účely značení jsou luciferin, luciferasa a aequorin.

Konjugace činidel vážících se na Fc receptor s cytotoxiny

Sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu obsahují, spolu s dalšími volitelnými složkami, činidlo, které se váže na Fc-receptor na makrofágů navázané na cytotoxin. Pro přípravu takových sloučenin je činidlo vážící se na Fc-receptor konjugováno (například kovalentním zesítěním) na cytotoxin za použití různých známých technik (viz například D.M. Kranz et al. (1981) Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 78: 5807, U.S. patent 4474893) nebo může být připraveno rekombinantní expresí činidla vážícího se na Fc-receptor a cytotoxinu ve formě fúsní molekuly.

Vhodná činidla, například zesíťovací činidla, jsou oboru známá. Termíny zesíťovací činidlo nebo spojovací skupina označuje molekuly, které mohou fungovat jako přemosťující molekuly mezi dvěma jinými molekulami díky tmu, že obsahují dvě reaktivní funkční skupiny, z nichž jedna reaguje za vzniku kovalentní vazby s jednou molekulou a druhá z nich reaguje za vzniku kovalentní vazby s druhou molekulou, čímž se dosáhne účinného spojení těchto dvou molekul. Výhodně obsahuje zesíťovací činidlo dvě reaktivní funkční skupiny mající různé funkční vlastnosti. Příklady takových vhodných funkčních skupin jsou amino-skupiny, karboxylové skupiny, sulfhydrylové skupiny a hydroxylové skupiny. Při reakci jedné funkční skupiny spojovací skupiny s molekulou (například činidle • ·

vážícím se na Fc-receptor) může být - pokud je to vhodné druhá funkční skupina chráněna před reakcí s touto molekulou pomocí chránící skupiny, která modifikuje druhou funkční skupinu spojovací skupiny tak, že nemůže reagovat s touto molekulou. Po dokončení první reakce může být chránící skupina odstraněna, čímž se obnoví druhá funkční skupina a ta může potom reagovat s jinou molekulou (například s toxinem).

Sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny konjugací složek, například anti-FcR a cytotoxinu, za použití způsobů známých v oboru. Například může být každé činidlo sloučeniny vážící se na makrofágy připraveno samostatně a potom mohou být tyto složky konjugovány dohromady. Pokud jsou vazebnými skupinami proteiny nebo peptidy, tak mohou být použita různá kopulační nebo spojovací činidla pro kovalentní konjugaci. Příklady spojovacích činidel jsou protein A, karbodiimid, Nsukcinimidyl-S-acetyl-thioacetat (ŠATA), N-sukcinimidyl-3-(2pyridylthio)propioonat (SPDP) a sulfosukcinimidyl-4-(Nmaleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylat (sulfo-SMCC) (viz například Karpovsky et al., 1984, J. Exp. Med. 160: 1686; Liu,

M.A. et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 8648). Mezi další techniky patří techniky popsané v Paulus (Behring Ins. Mitt., 1985, č. 78: 118-132); Brennan et al., (Science, 1985, 229: 81-83); a Glennie et al., (J. Immunol., 1987, 139: 23672375). Výhodnými konjugačními činidly jsou ŠATA a sulfo-SMCC, které jsou obě dostupné od Pierce Chemical Co.-(Rockford, IL).

V případech, kdy molekula vážící se na makrofágy obsahuje dvě protilátky (například bispecifickou protilátku), mohou být tyto protilátky konjugovány prostřednictvím sulfhydrylové vazby C-konce pantových regionů dvou těžkých řetězců. Ve výhodném provedení je pantový region modifikován tak, aby před « ·

konjugací obsahoval lichý počet sulfhydrylových zbytků, výhodně jeden. Alternativně mohou být obě činidla kódovaná ve stejném vektoru a mohou být exprimovaná a sestavená ve stejné hostitelské buňce. Tento způsob je zejména výhodný tehdy, jeli sloučeninou vážící se na makrofágy fúsní protein mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 nebo ligand x Fab. Sloučenina vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu, například bispecifická molekula, může být jednořetězcová molekula, jako je například jednořetězcová bispecifická protilátka, jednořetězcová bispecifická molekula obsahující jeden jediný řetězec protilátky a vazebnou determinantu, nebo se může jednat o jednořetězcovou bispecifickou molekulu obsahující dvě vazebné determinaty. Sloučeninami vážícími se na makrofágy mohou být také jednořetězcové molekuly nebo mohou tyto sloučeniny obsahovat alespoň dvě jednořetězcové molekuly. Způsoby pro přípravu bi- a multispecifických molekul jsou popsány například v U.S. patentu č. 5260203; U.S. patentu 5455030; U.S. patentu 4881175; U.S. patentu č. 5132405; U.S. patentu č. 5091513; U.S. patentu č. 5476786; U.S. patentu č. 5013653; U.S. patentu č.5258498; a U.S. patentu č. 5482858.

Po přípravě pomocí způsobů popsaných výše může být sloučenina vážící se na makrofágy testována na vazbu na makrofágy za použití známých technik, jako je enzymový imunosorbentní test (ELISA), radioimunotest (RIA) nebo westernový přenos. Každý z těchto tesů obecně detekuje přítomnost komplexů protein - protilátka za použitíznačkovacího činidla (například protilátky) specifického pro požadovaný komplex. Například, komplexy FcR-protilátka mohou být detekovány za použití protilátky nebo fragmentu protilátky navázaného na enzym, které rozpoznávají a specificky se váží na komplexy FcR-protilátka. Alternativně mohou být komplexy detekovány za použití jakéhokoliv jiného známého imunotestu.

9

Například může být protilátka značena radioaktivně a může být použita v radioimunotestu (RIA) (viz, například, Weintraub,

B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March 1986, který je zde uveden jako odkaz). Radioaktivní izotop může být detekován například za použití γ-kamery nebo scintilační kamery nebo autoradiograficky.

Farmaceutické prostředky a způsoby podání

Sloučenina vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu je výhodně připravena ve formě prostředku společně s nosičem nebo ředidlem. Pro in vivo podání jedinci (například pro léčbu nebo diagnostiku onemocnění) jsou sloučeniny výhodně připraveny spolu s farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo ředidly. Jak je podrobněji popsán dále, farmaceutické sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být speciálně připraveny pro podání v pevné nebo v kapalné formě, včetně sloučenin připravených pro: (1) orální podání, například ve formě kapalin (vodných nebo non-vodných roztoků nebo suspenzí), tablet, hlinek, prášků, granulí, past; (2) parenterální podání, například pro podkožní, nitrosvalové nebo nitrožilní injekce ve formě, například, sterilních roztoků nebo suspenzí; (3) lokální podání, například ve formě krému, masti nebo spreje aplikovaného na kůži; (4) intravaginální nebo intrarektální podání, například ve formě pesaru, krému nebo pěny; nebo (5) inhalační podání^ například ve formě vodného aerosolu, liposomálního přípravku nebo pevných částic obsahujících sloučeninu.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být podány také v kombinované terapii, t.j. v kombinaci s dalšími činidly. Například může kombinovaná terapie zahrnovat • · • · · · » · · · prostředek podle předkládaného vynálezu společně s alespoň jedním jiným anti-makrofágovým činidlem nebo s jiným konvenčním terapeutickým činidlem. Příklady anti-makrofágových činidel jsou klodronatové sloučeniny, například dichlormethylendifosfonat (CL2MDP).

Termín farmaceuticky přijatelný nosič, jak je zde použit, označuje farmaceuticky přijatelný materiál, prostředek nebo vehikulum, jako je kapalné nebo solidní plnivo, ředidlo, přísada, rozpouštědlo nebo obalový materiál, které přenáší nebo transportuje chemickou sloučeninu z jednoho orgánu nebo části těla do jiného orgánu nebo části těla. Každý nosič musí být přijatelný ve smyslu kompatibility s dalšími složkami prostředku a nesmí být škodlivý pro pacienta. Mezi příklady materiálů, které mohou sloužit jako farmaceuticky přijatelné nosiče, patří: (1) cukry, jako je laktosa, glukosa a sacharosa; (2) Škroby, jako je kukuřičný škrob a bramborový škrob; (3) celulosa a její deriváty, jako je karboxymethylcelulosa sodná, ethylcelulosa a celulosaacetat;

(4) práškový tragant; (5) slad; (6) želatina; (7) talek; (8) přísady, jako je kakaové máslo a vosky pro čípky; (9) oleje, jako je podzemnicový olej, olej z bavlníkových semen, saflorový olej, sesamový olej, olivový olej, kukuřičný olej a sojový olej; (10) glykoly, jako je propylenglykol; (11) polyoly, jako je glycerin, sorbitol, manitol a polyethylenglykol; (12) estery, jako je ethyloleat a ethyllaurat; (13) agar; (14) pufrovací činidla, jako je hydroxid hořečnatý a hydroxid hlinitý; (15) kyselina alginová; (16) apyrogenní voda; (17) izotonický salinický roztok; (18) Ringerův roztok; (19) ethylalkohol; (20) fosfátem pufrované roztoky; a (21) jiné netoxické kompatibilní substance používané ve farmaceutických prostředcích.

• λ

Termín farmaceuticky přijatelný sůl označuje sůl, která zachovává požadovanou biologickou aktivitu původní sloučeniny a nezpůsobuje žádné nežádoucí toxické účinky (viz například Berge, S.M. et al., (1977), J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Příklady takových solí jsou adiční soli s kyselinami a adiční soli s bázemi. Mezi adiční soli s kyselinami patří soli odvozené od netoxických anorganických kyselin, jako je kyselina chlorovodíková, dusičná, fosforečná, sírová, bromovodíková, jodovodíková, fosforitá a podobně, stejně jako od netoxických organických kyselin, jako jsou alifatické mono- a dikarboxylové kyseliny, fenylem substituované alkanové kyseliny, aromatické kyseliny, alifatické a aromatické sulfonové kyseliny a podobně. Mezi adiční soli s bázemi patří soli odvozené od kovů alkalických zemin, jako jsou sodné, draselné, hořečnaté, vápenaté a podobné soli, stejně jako soli odvozené od netoxických organických aminů, jako je N,N'dibenzylethylendiamin, N-methylglukamin, chlorprokain, cholin, diethanolamin, ethylendiamin, prokain a podobně.

Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být podány různými způsoby známými v oboru. Jak bude odborníkům jasné, způsob podání bude záviset na požadovaných výsledcích.

Termín podání označuje jakoukoliv cestu vpravení sloučeniny vážící se na makrofágy do jedince, která umožní požadované působení sloučeniny (například redukci a/nebo inhibici makrofágů). Mezi“ způsoby podání, které mohou být použity, patří injekční podání (subkutánní, intravenosní, parenterální, intraperitoneální, intrathekální atd.), orální, inhalační, rektální a transdermální podání. Farmaceutické prostředky jsou samozřejmě připraveny ve formách vhodných pro každý způsob podání. Například jsou tyto prostředky podány ve formě tablet nebo kapslí, injekcí, inhalačních prostředků, • ·

.... .....

očních kapek, mastí, čípků atd.; mohou být podány injekčně, infusně nebo inhalačně; lokálně pomocí mastí či lotií; a rektálně ve formě čípků. Injekce může být bolusová injekce nebo kontinuální infuse. V závislosti na způsobu podání může být sloučenina vážící se na makrofágy potažena nebo umístěna ve vybraném materiálu, který ji bude chránit před okolním prostředím, které může nežádoucím způsobem ovlivňovat její účinnost. Sloučenina vážící se na makrofágy může být podána samostatně nebo společně s jiným činidlem, jak bylo popsáno výše, nebo s farmaceuticky přijatelným nosičem, nebo s oběma výše uvedenými činidly. Sloučenina vážící se na makrofágy může být podána před podáním jiného činidla, současně s podáním jiného činidla nebo po podání jiného činidla. Dále, sloučenina může být také podána ve formě proléčiva nebo v inaktivní formě (například v případě sloučeniny vážící se na makrofágy obsahující toxin citlivý na světlo), která je přeměněna na aktivní metabolit nebo na více aktivní metabolit in vivo, například působením světla.

Termíny parenterální podání a podána parenterálně, jak jsou zde použity, označují způsoby podání jiné než enterální a lokální podání, obvykle podání injekční a zahrnují, bez omezení, intravenosní, inramuskulární, intraarteriální, intrathekální, intrakapsulární, intraorbitální, intrakardiální, intradermální, intraperitoneální, transtracheální, subkutání, subkutikulární, intraartikulární, subkapsulární, subarachnoidální, intraspinální a intrasternální injekci a infusi.

Termíny systémové podání, podaný systémově, periferní podání a podaný periferně, jak jsou zde použity, označují taková podání sloučeniny vážící se na makrofágy, že vstupuje • · * ·· ·· ·· • · ···· ···· ···· · · · · ·· · • * do systému jedince a tak je předmětem metabolismu nebo jiných procesů, a označují například podkožní podání.

Obecně jsou sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu podané lokálně pro léčbu nebo diagnostiku onemocnění charakterizovaných abnormálním počtem a/nebo funkcí makrofágů v určité oblasti nebo regionu těla (například v plících, kůži, kloubech nebo svalové/nervové tkáni). Pro dermatologické aplikace jsou sloučeniny výhodně podány lokálně nebo ve formě transdermálních náplastí. Lokální podání je výhodné při léčbě kožních lézí, včetně lézí na kštici, rohovce (keratitis) a lézí na sliznicích, kde je taková přímá aplikace možná. Prostředky ve formě šamponů jsou někdy výhodné pro léčbu lézí na kštici, jako je seborhoická dermatitida a psoriasa kštice. Ústní vody a orální pasty jsou výhodné pro léze na sliznici dutiny ústní, jako jsou orální léze a leukoplakie. Výhodným způsobem použití předkládaného vynálezu je aplikace sloučeniny vážící se na makrofágy v krémovém nebo olejovém nosiči přímo na lézi, například na psoriatickou lézi. Obvykle je koncentrace sloučeniny vážící se na makrofágy v krému nebo v oleji 1-2%. Dále, intradermální podání je alternativou pro dermální léze, jako jsou psoriatické léze a poranění. Alternativně může být lokálně použit aerosol. Orální podání je výhodnou alternativou pro léčbu kožních lézí a jiných lézí uvedených výše tehdy, není-li lokální podání praktické, a je výhodným způsobem podání pro jiné aplikace.“

Dále mohou být prostředky podány parenterálně, zejména při léčbě artritidy, jako je psoriatická artritida a revmatoidní artritida, a mohou být injekčně podány přímo do kožních lézí. Parenterální terapie je obvykle intradermální, intraartikulární, intramuskulární nebo intravenosní.

Intraartikulární injekce je výhodnou alternativou při léčbě jednob^nebo pouze několika (2-6) kloubů. Dále mohou být terapeutické sloučeniny v některých případech injikovány přímo do lézí (intralézně). Při léčbě artritidy mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu podány také systémově.

Při léčbě respiračních onemocnění mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu podány nasálně ve formě aerosolu nebo inhalačně. Takové prostředky mohu být připraveny jako roztoky v salinickém roztoku, za použití benzylalkoholu nebo jiných vhodných konzervačních činidel, činidel podporujících absorpci pro zvýšení biologické dostupnosti, fluorokarbonů a/nebo jiných běžných solubilizačních nebo disperzních činidel.

V některých provedeních mohou být prostředky obsahující sloučeniny podány systémově nebo lokoregionálně. Například, prostředky obsahující sloučeniny vážící se na makrofágy obsahující skupinu citlivou na světlo, například toxin nebo spojovací skupinu, mohou být podány takovým způsobem. Kromě toho, některá autoimunitní onemocnění, jako je roztroušená sklerosa, jsou výhodně léčena lokoregionálním nebo systémovým podáním prostředků podle předkládaného vynálezu.

Prášky a spreje mohou obsahovat, kromě sloučenin podle předkládaného vynálezu, nosiče jako je laktosa, talek, kyselina křemičitá,^- hydroxid hlinitý, křemičitany vápenaté a polyamidový prášek, nebo směsi takových substancí. Spreje mohou dále obsahovat běžné hnací plyny, jako jsou chlorfiuorhydrokarbony a těkavé nesubstituované uhlovodíky, jako je butan a propan.

Obvykle je vodný aerosol připraven jako vodný roztok nebo suspenze činidla s běžnými farmaceuticky přijatelnými nosiči a stabilizačními činidly. Nosiče a stabilizační činidla se liší podle konkrétních sloučenin, ale obvykle mezi ně patří neiontové surfaktanty (Tween, Pluronic nebo polyethylenglykol) , neškodlivé proteiny jako je sérový albumin, estery sorbitanu, kyselina olejová, lecitin, aminokyseliny jako je glycin, pufry, soli, cukry nebo alkoholy cukrů. Aerosoly jsou obvykle připraveny z izotonických roztoků.

Bez ohledu na vybraný způsob podání jsou sloučeniny vážící se na makrofágy, které mohou být použity ve vhodné hydratované formě, a/nebo farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu, připraveny ve formě farmaceuticky přijatelných dávkových forem za použití běžných technik známých odborníkům v oboru.

Skutečné dávky a načasování podání aktivní složek ve farmaceutických prostředcích podle předkládaného vynálezu se může lišit tak, aby bylo dosaženo množství aktivní sloučeniny, které je účinné pro dosažení požadované terapeutické odpovědi u určitého pacienta, prostředku a způsobu podání, bez toxicity pro pacienta.

Aktivní sloučeniny mohou být připraveny s nosiči, které budou chránit sloučeninu před rychlým uvolňováním, jak je tomu například v prostředcích s kontrolovaným uvolňováním, včetně implantátů, transdermálních náplastí a mikroobalených systémů pro podání. Mohou být použity biodegradovatelné, biologicky kompatibilní polymery, jako je ethylenvinylacetat, polyanhydridy, kyselina polyglykolová, kolagen, polyortoestery a kyselina polymléčná. Mnoho způsobů pro přípravu takových • · *

I • · prostředků je patentováno nebo je známo odborníkům v oboru.

Viz například Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, lne., New York, 1978 .

Pro podání sloučeniny podle předkládaného vynálezu některými způsoby podání může být nutné potáhnou sloučeninu materiálem bránícím její inaktivaci nebo ji podat současně s takovým materiálem. Například může být sloučenina podána jedinci ve vhodném nosiči, například v liposomech, nebo ředidle. Mezi farmaceuticky přijatelná ředidla patří salinický roztok a vodné pufrovací roztoky. Mezi liposomy patří CGF emulse voda v oleji ve vodě, stejně jako běžné liposomy (Strejan et al., 1984, J. Neuroimunnol. 7:27). Mezi farmaceuticky přijatelné nosiče patří sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro okamžitou přípravu sterilních injekčních roztoků nebo disperzí. Použití takových medií a činidel pro farmaceuticky aktivní substance je známé v oboru. Pokud není běžné medium nebo činidlo inkompatibilní s aktivní sloučeninou, může být použito v prostředcích podle předkládaného vynálezu. Doplňkové aktivní sloučeniny mohou být také obsaženy v prostředcích.

Terapeutické prostředky musí být obvykle sterilní a stabilní za podmínek výroby a skladování. Prostředky mohou být formulovány jako roztoky, mikroemulse, liposomy nebo jiné běžné struktury vhodné pro vysokou koncentraci léku. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní medium obsahující, například, vodu, ethynol, polyol (například glycerol, propylenglykol a kapalný polyethylenglykol a podobně), nebo jejich směs. Správná tekutost může být udržována, například, pomocí potahovacích činidel jako je lecitin, udržováním vhodné velikosti částic v případě disperze a pomocí surfaktantů. V • · mnoha případech je v prostředcích výhodné použití činidel upravujících izotonicitu, jako jsou například cukry, polyalkoholy jako je manitol, sorbitol, nebo chlorid sodný. Prodloužená absorpce injekčních prostředků může být dosažena pomocí činidel oddalujících absorpci, jako jsou například monostearatové soli a želatina.

Sterilní roztoky mohou být připraveny rozpuštěním aktivní sloučeniny v požadovaném množství ve vhodném rozpouštědle spolu s jedním nebo více složkami uvedenými výše, a potom provedením sterilizace mikrofiltrací. Obyčejně jsou disperze připraveny zapracováním aktivní sloučeniny do sterilního vehikula, které obsahuje základní disperzní medium a vybrané další složky, jak byly uvedeny výše. V případě sterilních prášků pro přípravu sterilních injekčních roztoků je výhodným způsobem přípravy sušení ve vakuu a sublimace ze zmrazeného stavu (lyofilizace), při kterých se z předem filtrovaného roztoku získá prášek tvořený aktivní složkou a dalšími přísadami.

Dávkování je upraveno tak, aby bylo dosaženo optimálního účinku (například terapeutického účinku). Například může být podána jedna bolusová dávka, několik dělených dávek za určitý čas nebo může být dávka snižována nebo zvyšována podle terapeutické situace. Je zejména výhodné připravit prostředky ve formě jednotkových dávek umožňujících snadné podání a jednotné dávkování. Termín dávková jednotka, jak je zde použit, označuje diskrétní jednotku použitelnou jako jediná dávka pro podání léčenému jedinci; každá dávková jednotka obsahuje předem určené množství aktivní sloučeniny vhodné pro dosažení požadovaného terapeutického účinku společně s vybraným farmaceutickým nosičem. Vlastnosti jednotkových dávek podle předkládaného vynálezu jsou určovány a jsou přímo závislé na (a) jedinečných charakteristikách aktivní sloučeniny a požadovaném terapeutickém účinku; a (b) omezeních známých v oboru přípravy takových aktivních sloučenin pro léčbu onemocnění u jedinců.

Příklady farmaceuticky přijatelných antioxidačních činidel jsou: (1) antioxidační činidla rozpustná ve vodě, jako je kyselina askorbová, hydrochloridová sůl cysteinu, hydrogensíran sodný, metahydrogensíran sodný, siřičitan sodný a podobně; (2) antioxidační činidla rozpustná v oleji, jako je askorbyl palmitat, butylovaný hydroxyanisol (BHA), butylovaný hydroxytoluen (BHT), lecitin, propylgallat, alfa-tokoferol a podobně; a (3) činidla chelatující kovy, jako je kyselina citrónová, kyselina ethylendiamidtetraoctová (EDTA), sorbitol, kyselina vinná, kyselina fosforečná a podobně.

Pro terapeutické účely zahrnují prostředky podle předkládaného vynálezu prostředky vhodné pro lokální, dermální nebo epidermální podání. Prostředky mohou být běžně připraveny ve formě jednotkových dávek a mohou být připraveny jakýmikoliv způsoby známými ve farmacii. Množství aktivní složky, které může být smísena s nosičem za vzniku jednotkové dávky, se liší podle léčeného jedince a konkrétního způsobu podání. Množství aktivní složky, které může být smísena s nosičem za vzniku jednotkové dávky, bude obvykle takové množství, které vyvolá terapeutický účinek. Obecně je toto množství v rozmezí od 0,01% do 99% aktivní složky, lépe “od přibližně 0,1% do přibližně 70%, nejlépe od přibližně 1% do přibližně 30%.

Mezi dávkové formy pro lokální nebo transdermální podání prostředků podle předkládaného vynálezu patří prášky, spreje, masti, pasty, krémy, lotia, gely, roztoky, náplasti a inhalační prostředky. Aktivní sloučenina může být smísena za • · sterilních podmínek s farmaceuticky přijatelným nosičem a s jakýmkoliv konzervačním činidlem, pufrem nebo hnacím plynem, které mohou být potřebné.

Příklady vhodných vodných a nevodných nosičů, které mohou být použity ve farmaceutických prostředcích podle předkládaného vynálezu, jsou voda, ethanol, polyoly (jako je glycerol, propylenglykol, polyethylenglykol a podobně) a jejich vhodné směsi, rostlinné oleje, jako je olivový olej a injikovatelné organické estery, jako je ethyloleat. Správná tekutost může být udržována, například, pomocí potahovacích činidel jako je lecitin, udržováním vhodné velikosti částic v případě disperze a pomocí surfaktantů.

Tyto prostředky mohou také obsahovat pomocná činidla jako jsou konzervační činidla, smáčivá činidla, emulgační činidla a disperzní činidla. Prevence přítomnosti mikroorganismů může být zajištěna jak sterilizačními postupy, jak byly uvedeny výše, tak použitím různých antibakteriálních a antimykotických činidel, jako je například paraben, chlorbuťanol, kyselina fenolsorbová a podobně. Také může být v takových prostředcích žádoucí použití činidel upravujících izotonicitu, jako jsou cukry, chlorid sodný a podobně. Dále, prodloužená absorpce injekčních farmaceutických forem může být dosažena pomocí činidel oddalujících absorpci, jako jsou například monostearan hlinitý a želatina.

Když jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu podány jako farmaceutická činidla lidem nebo zvířatům, tak mohou být podány samostatně nebo ve formě farmaceutického prostředku obsahujícího například 0,01 až 99,5% (lépe 0,1 až 90%) aktivní složky v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

• · • · · · · · · ··· · · · · ··

Skutečné dávky aktivní složek ve farmaceutických prostředcích podle předkládaného vynálezu se mohou lišit tak, aby bylo získáno množství aktivní sloučeniny, které je účinné pro dosažení požadované terapeutické odpovědi u určitého pacienta, prostředku a způsobu podání, bez toxicity pro pacienta. Vybraná dávka závisí na různých farmakokinetických faktorech, včetně aktivity použitého prostředku podle předkládaného vynálezu nebo jeho esteru, soli nebo amidu, způsobu podání, doby podání, rychlosti vylučování použité sloučeniny, trvání léčby, jiných léků, sloučenin a/nebo materiálů použitých v kombinaci s použitou sloučeninou, věku, pohlaví, hmotnosti, celkového stavu a anamnese léčeného pacienta a podobných faktorech známých v oboru.

Lékař nebo veterinář mající zkušenosti v oboru může snadno stanovit a předepsat účinné množství farmaceutického prostředku. Například může lékař nebo veterinář zahájit léčbu dávkami sloučeniny podle předkládaného vynálezu ve farmaceutickém prostředku, které jsou nižší než dávky nutné pro dosažení požadovaného terapeutického účinku, a může postupně zvyšovat dávky do dosažení požadovaného účinku. Obecně je vhodnou denní dávkou prostředku podle předkládaného vynálezu takové množství sloučeniny, které je nejnižší dávkou vyvolávající terapeutický účinek. Taková účinná dávka závisí na faktorech popsaných výše. Je výhodné, aby podání bylo lokální, například lokální, subkutánní, intradermální, výhodn v blízkosti cílového místa. Pokud je to žádoucí, může být účinná denní dávka terapeutického prostředku podána ve dvou, třech, čtyřech, pěti, šesti nebo více dělených dávkách oddělených vhodnými intervaly během dně, volitelně ve formě jednotkových dávek. Ačkoliv je možné podat sloučeninu podle předkládaného vynálezu samostatně, je výhodné její podání ve formě farmaceutického prostředku.

cd<

Terapeutické prostředky mohou být podány pomocí lékařských pomůcek známých v oboru. Například, ve výhodném provedení může být terapeutický prostředek podle předkládaného vynálezu podán pomocí hypodermického injekčního prostředku bez jehly, jak je popsán v U.S. patentech č. 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 nebo 4596556. Příklady dobře známých implantátů a modulů použitelných v předkládaném vynálezu zahrnují: U.S. patent č. 4487603, který popisuje implantovatelnou mikroinfusní pumpu pro podání léčiva kontrolovanou rychlostí; U.S. patent č. 4486194, který popisuje terapeutický prostředek pro podání léčiv přes kůži; U.S: patent č.^447233, který popisuje infusní pumpu pro podání léčiva přesnou rychlostí infuse; U.S. patent č. 4447224, který popisuje implantovatelný infusní přístroj s variabilním průtokem pro kontinuální podání léčiva; U.S. patent č.

4439196, který popisuje osmotický systém pro podání léčiva mající multi-komůrkové kompartmenty; a U.S. patent č. 4475196, který popisuje osmotický systém pro podání léčiva. Tyto patenty jsou zde uvedeny jako odkazy. Mnoho dalších takových implantátů, systémů pro podání a modulů je známo odborníkům v oboru.

V některých provedeních mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu připraveny pro zajištění správné distribuce in vivo. V jednom provedení mohou být molekuly vážící sě na makrofágy obaleny v liposomech. Pro způsoby výroby liposomů viz například U.S. patenty 4522811; 5374548 a 5399331. Liposomy mohou obsahovat jednu nebo více skupin, které jsou selektivně transportovány do specifických buněk nebo orgánů, což zvyšuje cílené podání léčiva (viz například V.V. Ranade (1939), J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Například, v některých provedeních je výhodné použít jednořetězcové » · · • · protilátky proti Fc receptoru (scFv), například H22 scFv, pro cílené dopravení sloučenin podle předkládaného vynálezu na makrofágy nesoucí Fc. Protokoly pro přípravu scFc fragmentů obalených v liposomech jsou popsány v de Kruif, J. et al. (1996) FEBS 399: 232-236. Například, lipidem-modifikovaná H22 scFv může být navázaná na liposomy tvořené vaječným fosfatidylcholinem (EPC), vaječným fosfatidylglycerolem (EPG), cholesterolem a volitelně rhodamin-fosfatidylethanolaminem (rhodaminem) jako fluorescentním dvouvrstevným markérem, v molárním poměru 10:1:5:0,01, pomocí ředění směsi micel obsahujících n-oktyl-P-D-glukosid, lipidu a lipidem modifikované scFv na kritickou koncentraci micel v detergentu. Inkorporace scFv molekul do liposomů může být potvrzena SDSPAGE .

Terapeuticky účinná dávka je dávka, která snižuje počet makrofágů ve vybrané léčené oblasti vzhledem k neléčené kontrole, nebo která inhibuje aktivitu makrofágů v léčené oblasti tak, že - například - dále neproliferuji nebo nepřispívají k zánětlivé reakci v této oblasti. V důsledku toho jsou příznaky onemocnění zprostředkovaného makrofágy zlepšeny. Schopnost sloučenin podle předkládaného vynálezu usmrcovat nebo inhibovat populaci makrofágů může být hodnocena na zvířecích modelech, jako jsou transgenní zvířata exprimující lidský Fc receptor, jak jsou popsána dále v příkladech. Alternativně může být tato schopnost hodnocena v testech _in vitro známých odborníkům v oboru. Terapeuticky účinné množství terapeutické sloučeniny může snižovat populaci nebo aktivitu makrofágů, nebo může jinak zmírňovat příznaky u jedince. Odborník v oboru bude schopen určit takové množství podle faktorů jako je velikost jedince, závažnost příznaků u jedince a podle konkrétní sloučeniny a způsobu podání.

»· »· · · · · · tt * · * · · » · ·»#· ····· · · · ·»·« • · · 9 9 9 9 * « · t · « ···· ··· · · r ·

9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9

Prostředek musí být sterilní a musí být natolik tekutý, aby bylo možné jeho podání injekční stříkačkou. Kromě vody může být nosičem izotonický pufrovaný salinický roztok, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a kapalný polyethylenglykol a podobně) a jejich vhodné směsi. Správná tekutost může být udržována například pomocí potahů jako je lecitin, udržováním vhodné velikosti částic v případě disperzí a použitím surfaktantů. V mnoha případech je v prostředcích výhodné použití činidel upravujících izotonicitu, jako jsou například cukry, polyalkoholy jako je manitol, sorbitol, nebo chlorid sodný. Prodloužená absorpce injekčních prostředků může být dosažena pomocí činidel oddalujících absorpci, jako jsou například monostearatové soli a želatina.

Použití a způsoby vynálezu

Sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu mají několik diagnostických, terapeutických a výzkumných použití. Mohou být podány k buňkám in vitro (do kultury), ex vivo nebo in vivo (jedinci), pro léčbu, diagnostiku nebo výzkum mnoha onemocnění.

V jednom provedení vynález poskytuje způsob pro depleci (například snížení počtu) nebo inhibici aktivity makrofágů ve vybrané léčené nebo diagnostikované oblasti. Tento způsob obsahuje kontaktování vybrané oblasti se sloučeninou vážící se na makrofágy v množství dostatečnémpro dosažení výše uvedeného výsledku. Termíny vybraná oblast nebo lokální oblast, jak jsou zde použity, označují jakýkoliv vybraný vzorek tkáně nebo buněk (buď in vitro nebo in vivo), který obsahuje nebo může obsahovat makrofágy přispívající k onemocnění, jako je například lokalizovaná oblast lidského těla (kůže, plíce, klouby atd.) nebo vzorek tkáňové kultury.

» *· · · » · · » · · · ·

Kontaktování může proběhnout in vitro (například buňky v kultuře) nebo in vivo (například podáním sloučeniny podle předkládaného vynálezu jedinci).

Termín jedinec, jak je zde použit, označuje člověka a jiná zvířata. Výhodně je člověkem pacient trpící onemocnění charakterizovaným aberantní aktivitou makrofágů, například kožních makrofágů. Termín aktivita zahrnuje všechny biologické funkce makrofágů, včetně například proliferace, diferenciace, přežívání, sekrece růstových faktorů a cytokinů. Termín jiné zvíře než člověk v předkládaném vynálezu označuje všechny obratlovce, například savce a ostatní, jako jsou primáti, ovce, psi, krávy, kuřata, obojživelníci , plazi atd.

Sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu mohou být nejprve testovány in vitro. Například může být aktivita těchto molekul usmrcujících makrofágy a/nebo modulujících, například snižujících, aktivitu makrofágů, testována na buněčných liniích odvozených od makrofágů, kultivovaných diferencovaných krevních monocytech a na primárních kulturách. Protokoly pro testování aktivity sloučenin vážících se na makrofágy in vitro mohou být nalezeny, například, v Imunopharmacology of Macrophages and Other Antigen-Presenting Cells (ISBN 0-12-137800-4, 1994, Academie Press Limited). Například, primární kultury kožních makrofágů mohou být získány z kůže zdravých jedinců a jedinců s dermatologickým onemocněním. Aktivity makrofágů, například proliferace buněk a nebo sekrece cytokinů, mohou být testovány ve specifických časových intervalech po přidání různých koncentrací sloučenin podle předkládaného vynálezu. V jednom provedení mohou být použity biopsie kůže od zdravých jedinců a od jedinců s dermatologickým onemocněním. Tyto vzorky mohou » *

být kultivovány buď ponořené do kultivačního media nebo epidermálním povrchem na vrchu kultivačního media, do kterého se přidávají sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Po kultivaci se sloučeninami vážícími se na makrofágy podle předkládaného vynálezu může být vliv těchto sloučenin na aktivitu makrofágů testován imunohistochemicky nebo pomocí ELISA, RIA nebo EIA.

Protokoly pro detekci změn v proliferaci buněk, jako je například test inkorporace thymidinu nebo BrdU, jsou známé v oboru. Výhodné sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu snižují nebo eliminují aktivitu makrofágů. Změny v koncentraci cytokinů mohou být detekovány pomocí různých imunotestů, jako enzymově vázaný imunotest (ELISA), enzymový imunotest (EIA) nebo radioimunotest (RIA), které jsou známé v oboru (viz například Keler, T. et al., (1997), Cancer Research 57: 4008-14). Příklady cytokinů, které mohou být testovány, zahrnují: faktor stimulující kolonie granulocytů/makrofágů (GM-CSF), faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), faktor stimulující kolonie makrofágů (MCSF), interleukiny 1-12 (IL-1 až IL-12) a TNFa. Koncentrace cytokinů může být měřena pomocí EIA detekcí interakce cytokinů s protilátkou, která je konjugována na enzym. Aktivita enzymu je detekována podle reakce s vhodným substrátem, výhodně s chromogenním substrátem, při které je produkována detekovatelná chemická skupina, která je detekována například spektrofotometricky, fluorimetricky nebo vizuálně (Voliér,

The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voliér et al. , J. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1978); Butler, Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio (ed.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boča Raton, FL, 1980; Ishikawa et al. (eds.) Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin,

Tokyo, 1981) . Enzymy, které mohou být použity pro detekovatelné značení protilátky, jsou popsány výše. Detekce může být provedena kolorimetrickými způsoby, které využívají chromogenní subbstráty pro enzym. Detekce může být provedena také vizuálním srovnáním rozsahu enzymatické reakce substrátu s podobně připravenými standardy.

Detekce cytokinu může být také provedena pomocí radioimunotestu (RIA) (viz například Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March 1986, který je zde uveden jako odkaz). Radioaktivní izotop může být detekován například za použití γ-kamery nebo scintilační kamery nebo autoradiograficky.

Také je možné značit protilátku proti cytokinu fluorescentní sloučeninou. Když je fluorescenčně značená sloučenina vystavena působení světla správné vlnové délky, může být detekována její přítomnost. Nejčastěji používanými fluorescenčními značkovacími sloučeninami jsou fluorescein isothiokyanatan, rhodamin, fykoerythrin, fykokyanin, allofykkyanin, o-ftalaldehyd a fluorescamin. Protilátka může být také detekovatelné značena za použití kovů emitujících fluoorescenci, jako je 152Eu nebo jiné kovy lanthanidové řady. Tyto kovy mohou být navázané na protilátku pomocí skupin způsobujících chelaci kovů jako je kyselina diethylentriaminpentoctová (DTPA) nebo kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA). Protilátky mohou být také detekovatelné značeny pomocí vazby na chemiluminiscentní sloučeniny. Přítomnost protilátky navázané na chemiluminiscentní činidlo je potom detekována podle luminiscence vznikající během chemické reakce. Příklady použitelných chemiluminiscentních značících sloučenin jsou • · · « · ·

luminol, isoluminol, theromatický ester akridinia, imidazol, sůl akrinidia a ester oxalatu. Podobně může být pro označení protilátky použita bioluminiscentní sloučenina.

Bioluminiscence je typem chemiluminiscence, která se vyskytuje v biologických systémech, kde katalytický protein zvyšuje účinnost chemiluminiscentní reakce. Přítomnost bioluminiscentního proteinu je určena podle detekce přítomnosti luminiscence. Významnými bioluminiscentními sloučeninami pro účely značení jsou luciferin, luciferasa a aequorin.

Sloučeniny vážící se na makrofágy mohou být také testovány in vivo. Například mohou být tyto sloučeniny testovány za použití myší exprimujicích lidské Fc receptory, jak jsou popsány v části příkladů. V jednom provedení může sloučenina vážící se na makrofágy injikována intradermálně těmto transgenním myším. Kontroly, kterým je injikováno vehikulum, jsou léčeny paralelně. Chronický kožní zánět může být pokusně indukován u těchto myší opakovanou lokální aplikací 5% lauryl síranu sodného. Účinek těchto sloučenin může být detekován imunohistochemicky, například makroskopicky nebo klinicky, v různých časových intervalech po injekci.

Sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu mhou být použity pro léčbu onemocnění charakterizovaných aberantní aktivitou nebo počtem makrofágů. Termín aberantní označuje koncentraci makrofágů v dané oblasti, která je odlišná (například vyšší) než koncentrace makrofágů ve stejné oblasti u normálního, zdravého pacienta. Termín aberantní také označuje abnormální aktivitu makrofágů, jako je abnormálně vysoká buněčná proliferace nebo sekrece cytokinů. V souladu s tím obsahuje vynález způsob léčby nebo prevence onemocnění charakterizovaných aberantním *· B« • ·» Β· ·· « · 4 · 4 ** · • Β · « & « 4 • · « ·· · » • · · · · * * • 44 ·· ·· ·♦ počtem nebo aktivitou makrofágů ve vybrané oblasti, při kterém je pacientovi podán, obvykle do lokální oblasti vyžadující léčbu, farmaceutický prostředek obsahující jednu nebo více sloučenin vážících se na makrofágy.

Sloučeniny vážící se na makrofágy jsou obyčejně požity jako činidla cíleně dopravující cytotoxiny (například léčiva) na makrofágy nesoucí Fc receptory. V jednom provedení vynálezu je cytotoxin obalen v liposomu, který je sám cíleně namířen na makrofágy nesoucí Fc receptory. Tak obsahuje sloučenina vážící se na makrofágy část vážící se na Fc receptor navázanou na liposom obsahující cytotoxin. Ve výhodném provedení je částí vážící se na Fc receptor jednořetězcová protilátka namířená proti Fc receptoru (scFv), jako je H22 scFv. Anti-FcR scFv je navázaná na nebo vložená do lipidové dvojvrstvy liposomu takovým způsobem, který umožňuje scFv rozpoznávat a vázat se na Fc receptory mimo liposom. Toto může být provedeno za použití známých protokolů, jako jsou protokoly popsané v de Kruif, J. et al., 1996, FEBS 399: 232-236. Konečným výsledkem je cytotoxin namířený na FcR, který je dopraven k buňkám ve formě liposomu.

Jak je zde použit, označuje termín terapeuticky účinné množství sloučeniny vážící se na makrofágy množství sloučeniny, které je účinné, po jediném nebo po opakovaném podání jedinci, pro inhibici růstu buněk nebo pro zlepšení klinických příznaků ve srovnání se stavem bez takové léčby.

Jak je zde použit, označuje termín profylakticky účinné množství sloučeniny vážící se na makrofágy množství sloučeniny, které je účinné, po jediném nebo po opakovaném podání jedinci, v prevenci nebo oddálení vzniku nebo recidivy onemocnění zprostředkovaného makrofágy.

·* ·· ·· p ·· ► 4 » 4 • · • ·· • · · • · • · * · »·· *· • » «

* » • · tr

Termíny indukce, inhibice, potenciace, elevace, zvýšení, snížení a podobně, které popisují kvantitativní rozdíly mezi dvěma stavy, označují statisticky významné rozdíly mezi dvěma stavy. Například, výraz množství účinné pro inhibici růstu makrofágů znamená, že rychlost růstu buněk je statisticky významně odlišná od rychlosti růstu neléčených buněk.

Sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro léčbu různých onemocnění zprostředkovaných makrofágy. Tato onemocnění nejsou nutně charakterizována pouze aberantním počtem a/nebo aktivitou makrofágů, ale mohou být také charakterizovány nežádoucí aktivitou makrofágů, která je škodlivá pro pacienta. V jednom provedení jsou sloučeniny použity pro léčbu autoimunitních onemocnění, jako je například diabetes mellitus, artritida (včetně revmatoidní artritidy, juvenilní revamatoidní artritidy, osteoartritidy, psoriatické artritidy), roztroušená sklerosa, encephalomyelitida, diabetes, myastenia gravis, systémový lupus erythematodes, autoimunitní thyreoiditis, dermatitis (včetně atopické dermatitidy a ekzematosní dermatitidy), psoriasy, Sjogrenova syndromu, včetně keratoconjunctivitis sicca sekundárně po Sjogrenové syndromu, alopecia areata, alergické reakce způsobené reakcí na bodnutí členovce, Crohnova nemooc, aftosní vřed, iritis, conjunctivitis, keratoconjunctivitis, colitis ulrerosa, asthma, alerické asthma, kožní lupus erythematodes, sklerodermie, vaginitis, proctitis, alergické polékové erupce, leprosní reverzní reakce, erythema nodosum leprosum, autoimunitní uveitis, alergická encephalomyelitis, akutní nekrotizující hemoragická encephalopatie, idiopatická bilaterální progresivní sensoricko-neurální hluchota, • · aplastická anemie, čistá erytrocytární anemie, idiopatická trombocytopenie, polychondritis, Wegenerova granulomatosa, chronická aktivní hepatitis, Steven-Johnsonův syndrom, idiopatická sprue, lichen planus, Crohnova nemoc, Gravesova oftalmopatie, sarkoidosa, primární biliární cirhosa, uveitis posterior a intersticiální plicní fibrosa. Snížení aktivity imunitního systému je také žádoucí v případě alergie, jako je atopická alergie.

Mezi příklady autoimunitních/dermatologických onemocnění, u kterých může být přednostně použit způsob podle předkládaného vynálezu jako součást léčebného režimu, zahrnují: psoriasu, atopickou dermatitidu, roztroušenou sklerosu, sklerodermii a kožní lupus erythematodes. Například, způsoby a prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro léčbu atopické dermatitidy (AD). Bez vazby na určitou teorii se předpokládá, že během akutní fáze kožní zánětlivé reakce při AD se fenotyp lokálních T lymfocytů přemění z počátečního Th2 na Thl v chronické fázi. V tomto okamžiku je detekováno zvýšení produkce IL-12 v lézi, společně se silnou migrací aktivovaných zánětlivých makrofágů. Makrofágy jsou silnými producenty IL-12, který indukuje T-lymfocyty k produkci IFN-γ, který je silným aktivátorem makrofágů (thepen, T. et al.,

1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97: 828-837; Grewe, M. et al., (1998), Immunl. Today 19: 359-361). Taková pozitivní zpětná vazba potenciálně vytváří bludný kruh, který může sám o sobě udržovat lokální zánětlivou reakci bez potřeby zevních podnětů. Jiné takové mechanismy, vznikající v důsledku kontinuální reakce nespecifické pro alergen, vznikající v důsledku dysregulace makrofágů, jsou pravděpodobné, když je brán v úvahu regulační potenciál makrofágů. Selektivní, lokalizovaná eliminace zánětlivých makrofágů cíleným zaměřením Fc receptoru, například FcýRI, popsaná v příkladech uvedených

dále, činí prostředky podle předkládaného vynálezu vhodnými pro redukci nebo eliminaci pozitivní zpětné vazby vytvořené v důsledku sekrece makrofágů a tím pro léčbu onemocnění jako je

AD.

Dalšími příklady onemocnění, která mohou být léčena terapeutickými způsoby podle předkládaného vynálezu, jsou infekční onemocnění, například infekce HIV, respirační onemocnění, například chronická polymorfní světelná dermatosa (CPDL), chronická obstrukční nemoc bronchopulmonální (COPD), například alergické asthma a sarkoidosa a zánětlivé reakce, jako jsou reakce pozorované v otevřených ranách a nebo popáleninách.

V jiných provedeních mohou být prostředky a způsoby podle předkládaného vynálezu použity v kosmetických aplikacích. Například, sloučeniny vážící se na makrofágy mohou být aplikovány lokálně na kůži pro oddálení a/nebo prevenci stárnutí kůže.

Terapeutické způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být prováděny společně s jinými způsoby pro odstraňování makrofágů. Například může být terapie využívající sloučenin vážících se na makrofágy podle předkládaného vynálezu použita společně s chirurgií, chemoterapií nebo radioterapií.

Sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro modulování množství FcyR na efektorových buňkách, například pomocí vazby na receptory a eliminací receptorů na povrchu buněk. Pro tento účel mohou být také použity směsi anti-Fc receptorů.

• · • · • · ·

Předkládaný vynález dále obsahuje kity obsahující jednu nebo více dávek sloučeniny vážící se na makrofágy a návod pro použití.

V jiných provedeních mohou být kombinace sloučenin vážících se na makrofágy podle předkládaného vynálezu použity pro selektivní usmrcení nebo pro snížení aktivity makrofágů, například může být použita kombinace první sloučeniny mající alespoň jeden vazebný region pro antigen specifický pro FcR a toxin a druhé sloučeniny mající alespoň jeden vazebný region pro antigen specifický pro jiný epitop FcR receptoru nebo pro jiný Fc receptor, například Fca receptor. V některých provedeních může být druhá sloučenina vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu použita v konjunkci s první. Například může mít tato druhá sloučenina vážící se na makrofágy alespoň jeden vazebný region pro antigen specifický pro IgA receptor, například Fca receptor, IgE receptor, například FcE receptor, Fcó receptor a/nebo Fcg receptor.

Před podáním sloučenin vážících se na makrofágy jedinci může být jedinec předléčen činidlem, které moduluje, například zesiluje nebo snižuje, expresi nebo aktivitu Fcý receptorů, například může být jedinec předléčen cytokinem. Mezi cytokiny vhodné pro podání během léčby sloučeninou vážící se na makrofágy patří faktor stimulující kolonie granulocytů (GCSF), faktor stimulující kolonie granulocytů/makrofágů (GMCSFj , interferon-γ (IFN-γ) , a faktor nekrosy nádorů (TNF) .

Sloučeniny vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu mohou být také použity diagnosticky in vivo a in vitro pro detekci a/nebo měření populace makrofágů pomocí měření úrovně vazby na Fc receptor. Například, jak je uvedeno • · • · · • 9 v příkladech vynálezu, nadměrná exprese FcyRI je detekována v dermis při akutním i chronickém kožním zánětu u člověka. Proto mohou být zde popsané sloučeniny vážící se na makrofágy použity pro diagnostiku takových zánětlivých onemocnění. Pro taková použití může být sloučenina navázána na molekulu, která může být detekována. Detekovatelnou značkou může být například radioizotop, fluorescentní sloučenina, enzym nebo kofaktor enzymu. V souladu s tím poskytuje vynález v jiném provedení způsob pro in vitro nebo in vivo diagnostiku onemocnění charakterizovaných aberantním počtem makrofágů (například proliferací makrofágů) a/nebo expresí Fc receptoru (například zvýšeným počtem buněk exprimujících Fc receptor a/nebo zvýšenou expresí Fc receptoru v daných buňkách). Měřením úrovně vazby sloučeniny podle předkládaného vynálezu v daném testovaném vzorku nebo v lokalizované oblasti ukazuje na přítomnost makrofágů v oblasti nebo ve vzorku, za podmínky, že anti-Fc receptorová složka sloučeniny je specifická pro makrofágové Fc receptory. Toto měření může být provedeno (i) získáním tělesného vzorku, například tělesné kapaliny, tkáně (například vzorku kůže) nebo biopsie od pacienta; (ii) kontaktováním tělesného vzorku se sloučeninou vážící se na makrofágy podle předkládaného vynálezu nebo jejím fragmentem; (iii) stanovením úrovně vazby uvedené sloučeniny vážící se na makrofágy na vzorek; (iv) srovnáním počtu molekul navázaných na tělesný vzorek s počtem navázaným na kontrolní vzorek, například na biologický vzorek od zdravého jedince nebo s předem stanovenou základní hodnotou, kdy vazba větší než kontrolní ukazuje na přítomnost makrofágového onemocnění, například kožního onemocnění. Výhodně je úroveň exprese Fc receptoru detekována primárně na populaci makrofágů vzhledem k jiným buňkám exprimujícím Fc receptor. Protokoly pro diagnostické testy in vivo a in vitro jsou uvedeny v PCT/US 88/01941, EP 0365997 a US 4954617.

• ·

Vynález je dále popsán následujícími příklady, které neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Obsahy všech citací, podaných patentových přihlášek a publikovaných patentů, citovaných v předkládaném vynálezu, jsou zde uvedeny jako odkazy.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Následující postupy byly použity v následujících studiích. Termíny sloučeniny vážící se na makrofágy, CD64 imunotoxiný (CD64 IT) nebo imunotoxiný (IT) jsou zaměnitelné.

Monoklonální protilátky

Příklady uvedené dále popisují použití anti-CD64 (anti-FcR) protilátky odpovídající humanizované formě monoklonální protilátky 22 (H22), která je popsána v U.Š.P.N 5635600, která je zde uvedena jako odkaz. Produkce a charakterizace H22 protilátky jsou popsány v Graziano, R.F. et al., 1995, J. Immunol. 155(10): 4996-5002 a v PCT/US93/10384. Buněčná linie produkující H22 protilátky byla uložena v American Type Culture Collection 4.11.1992 pod označením HA022CLI a má ATCC přírůstkové číslo CRL 11177.

Jinými specifickými anti-CD64 protilátkami, které mohou být použity ve způsobech a prostředcích podle předkládaného vynálezu, jsou myší protilátky mAb 32.2, mAb 44, mAb 62 a mAb 197. Hybridom produkující mAb 32.2 je dostupný od American Type Culture Collection pod ATCC přírůstkovým č. HB9469.

Příprava mAb 197-Ricin A konjugátů je popsána v následujících příkladech.

Anti-FcR mAb byly přečištěny ze supernatantů příslušných hybridomů protein A - afinitní chromatografií (Bio-Rad, Richmond, CA).

Imunohistochemické barvení

A: CD64 barvení

Biopsie byly nařezány na 6 Hm řezy na mrazícím mikrotomu a byly umístěny na potažená sklíčka. Po sušení přes noc se řezy fixovaly po dobu 10 minut suchým acetonem a sušily se vzduchem. Sklíčka se inkubovala s FITC-konjugovanou 10.1 (Serotec 1:40) v PBS 2% normálním myším séru (NMS) po dobu 45 minut. Sklíčka byla promývána po dobu 5 minut PBS, 0,05% Tween a potom byla inkubována s ovčí anti-FITC protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatasou (AP) (Boehringer

Mannheim, 1:400) v PBS (1% lidské AB sérum, 1% NMS, 30 minut). Po promytí dvakrát PBS/Tween a jednou Tris-HCl (0,1 M, pH 8,5) byla AP aktivita demonstrována pomocí naftol AS-BI fosfátu (sodné soli, 50 mg/100 ml; Sigma) jako substrátu a nového fuchsinu (10 mg/100 ml; Merck, Whitehouse Station, NJ) jako chromogenu, který byl rozpuštěn v 0,1 M TrisHCl, pH 8,5, čímž se dosáhlo růžového/červeného zbarvení. Endogenní AP aktivita byla inhibována přidáním levamisolu (35 mg/100 ml, Sigma) do reakční směsi. Sklíčka byla jemně kontrastně barvena hematoxylinem.

B: Markéry

Sklíčka byla fixována v suchém acetonu s H2O2 (30%, 100 μ1/100 ml) po dobu 7 minut. Sklíčka byla inkubována s primárními krysími protilátkami v optimálním ředění po dobu 45 minut v PBS 2% NMS. Následující protilátky byly použity pro barvení makrofágů: MOMA-2 (Kraal, G., et al., 1987, Scand. J. Immunol. 26: 653-661); dendritických buněk: NLDC145 (Kraal, G. et al., 1986, J. Exp. Med. 163: 981-997); T-lymfocytů: KT3 (Tomonari, K., 1988, Immunogenetics 28: 455-458). Po třech promytích (5 minut v PBS, 0,05% Tween 20) byla provedena 30minutová inkubace s peroxidasou značenou králičí anti-krysí protilátkou (DAKO, 1:200) v PBS (1% lidské AB sérum, 1% NMS). Po dvojím promytí v PSB a jednom promytí v NaAc (0,1 M, pH 5,0) byla PO aktivita demonstrována za použití H2O2 jako substrátu a DAB (SIGMA) jako chromogenu, což vedlo k hnědému zabarvení.

Studie na zvířatech

Indukce kožního zánětu, injekce imunotoxinu a biopsie.

V pokusech popsaných dále byly použity transgenní FVB/N myši exprimující lidský FcyRI (Heijnen, I.A. et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 331-338). Netransgenní mláďata ze stejného vrhu byla použita jako kontroly. Pro indukci chronického kožního zánětu byla plocha 1,5 na 1,0 cm na obou bocích myší oholena a denně po dobu 10 následujících dní byl aplikován epikutánně lauryl síran sodný.

Zvířata byla uvedena do anestesie pomocí 20 μΐ směsi 4:3 Aescoketu (Aesculaap, Gent, Belgium) a Rompunu (Bayer, Leverkussen, Germany), která byla podána intramuskulárně. Byly podány dvě sousední intradermální injekce (každá 10 μΐ, 2 x • · • · ·

ΙΟ^-8 Μ Ricin A skupiny v salinickém roztoku). Pro kontrolu byly na kontralaterální straně podány stejné injekce salinického roztoku.

Zvířata byla uvedena do anestesie způsobem popsaným výše a byly odebrány 3 mm průbojníkové biopsie, které byly zmrazený ponořením do kapalného dusíku a uskladněny při -70 °C do použití. Kůže byla uzavřena stehem.

Průbojníkové biopsie (3 mm) byly také odebrány za lokální anestesie (1% lidocain) z ložisek AD kůže (n=3) a PLE kjůže vystavené 24 h APT <n=3), 48h SLS (n=2) a 72 h WB. Biopsie byly zmrazený ponořením do kapalného dusíku a uskladněny při -70 °C do použití.

Příklad 1: Příprava C64 imunotoxinů

CD64 monoklonální protilátky 197 (Guyre, P.M. et al., 1989, J. Immunol. 143: 1650-1655) a H22 (Graziano, R.F. et al.,

1995, J. Immunol. 155(10): 4996-5002) byly konjugovány na deglykosylovaný Ricin A (30 kDa, Sigma) za použití vhodné spojoavcí skupiny (jako je například heterobifunkční štěpitelná spojovací skupina N-sukcinimidyl-3-(2pyridylthio)propionat (SPDP) (Pierce) za GLP podmínek podle návodu výrobce. Stručně, SPDP byl konjugován na CD64 mAb, například na H22, a potom byl určen molární poměr mAb-PDP. Po stanovení molárního poměru mAb-PDP byl přidán Ricin A. Volné PDP skupiny a volné řetězce ricinu A byly inaktivovány a směs byla přečištěna chromatografií s vylučováním podle velikosti. Čistota konjugátů H22-Ricin A byla dále ověřena SDS-PAGE. Konjugáty H22-Ricin A byly sterilizovány za použití 0,2 gm filtru. Všechny kroky byly provedeny za Good Manufacturing Practice podmínek.

• · · · • · · ·

Příklad 2: Účinné usmrcování makrofágů za použití CD64 imunotoxinů

Konstitutivní exprese FcyRI je primárně omezena na buňky myeloidní řady a je silně zvýšena za prozánětlivých a zánětlivých stavů (Velde, A.A. et al., 1992, J. Immunol. 149: 4048-4052; Schiff, D.E. et al., 1997, Blood, 90: 3187-3194). Schopnost FcyRI rychle a účinně zprostředkovávat endocytosu činí tento receptor vhodným cílem pro aktivované zánětlivé makrofágy (Heijnen, I.A. et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 331-338) . Několik imunotoxinů proti hFcyRI bylo připraveno způsobem popsaným v příkladu 1 za použití konjugátů toxinu Ricinu A a CD64 protilátek.

Pro stanovení účinnosti těchto konjugátů v indukci zabíjení makrofágů byla kultivovaná lidská promonocytární buněčná linie U937, buď nestimulovaná nebo stimulovaná IFN-γ, vyšetřována na přítomnost nebo nepřítomnost prostředku podle předkládaného vynálezu (obr. IA a B). Kultivační podmínky a stimulace U937 buněk jsou popsány v Guyre, P.M. et al., 1983, J. Clin.

Invest. 72: 393-397. Stručně, U937 buňky byly kultivovány za přítomnosti 300 U/ml IFNy po dobu 24 hodin pro zvýšení exprese FcyRI. Hladiny FcyRI byly sledovány průtokovou cytometrií. Kromě toho byly testovány , IIA1.6 buňky, buď netransfektované nebo transfektované FcyRI cDNA. IIA1.6 buňky jsou odvozeny od myšího A20 B-buněčného lymfomu a nedávno bylo prokázáno, že jsou samostatnou podtřídou CD5+ B buněk/makrofágů /van Vugt, M.J. et al., 1998, Clin. Exp. Immunol. 113: 415-422).

Cytotoxická účinnost CD64 imunotoxinů (IT) byla hodnocena měřením inhibice inkorporace [³H]-thymidinu v závislosti na

koncentraci (Post, J. et al., Leuk. Res. 19:241-247). Stručně, Buňky byly umístěny v počtu 5xl0⁴ buněk na jamku do 96jamkových ploten s oblým dnem a byly inkubovány s CD64 IT po dobu 72 hodin při koncentracích ricinové skupiny v rozmezí od 10”¹² do 10^-7. Buňky byly vystaveny na 4 hodiny působení [³H]thymidinu (1 μθί) a potom byly sklízeny na filtrech ze skelné vaty a odečítány na čítači beta-záření. Všechny inkubace byly provedeny v kultivačním mediu doplněném 2% lidským AB sérem pro blokování Fc-vazebných míst FcyRI, což umožnilo vazbu IT pouze pomocí jeho rozpoznávacího místa pro antigen. Počet umístěných buněk byl vybrán tak, aby byla inkorporace [³H]thymidinu lineární funkcí počtu buněk. Základní hodnoty inkorporace [³H]-thymidinu byly získány inkubací s 0,1 mM cykloheximidu.

Výsledky jsou vyjádřeny jako procento inkorporace [³H]thymidinu ve srovnání s kontrolními buňkami. Na obr. 1A-1B znázorňují sloupcové grafy procento inkorporace [³H]-thymidinu ve srovnání s kontrolou ošetřenou mediem (± SEM). Snížení inkorporace [³H]-thymidinu závislé na dávce jako funkce zvyšující se koncentrace H22-R nebo 197-R ukazuje na cytotoxicitu imunotoxinů pro stimulované U937 buňky. V panelech 1C-1D znázorňují sloupcové grafy procento inkorporace [³H]-thymidinu ve srovnání s kontrolou ošetřenou mediem (± SEM). Snížení inkorporace [³H]-thymidinu závislé na dávce při zvyšujících se koncentracích H22-R nebo 197-R ukazuje na cytotoxicitu imunotoxinů pro IIA1.6 buňky transfektované hFcyRI. Toto dokazuje specificitu obou IT pro buňky exprimující hFcyRI.

• ·

Dva testované imunotoxiny byly účinnými induktory usmrcování buněk. Nicméně, H22 Ricin A (H22-R) byl celkově účinnější v indukci usmrcování buněk, zejména nestimulovaných buněk, než 197 Ricin A (197-R). Inkubace s Ricinem A samotným při koncentracích 10’⁸ a 10~⁹ M neměly významný vliv (88,9 ± 14,2 a 100,4 ± 13,5%, v příslušném pořadí). Dále, nebyl zjištěn žádný významný účinek obou IT na netransfektované IIA1.6 buňky, což je v protikladu k účinnému usmrcování IIA1.6 buněk transfektovaných hFcyRI, jak bylo detekováno při použití obou těchto IT (obr. 1, panely C a D).

Tyto výsledky ukazují jak účinnost, tak specificitu CD64 IT v usmrcování buněk exprimujicích FcyRI in vitro. Na základě těchto pokusů byl H22-R použit v koncentraci 2 x 10^-8 M v in vivo pokusech popsaných dále.

Příklad 3: Indukce apoptosy CD64 imunotoxiny

Pro stanovení toho, zda byl cytotoxický účinek H22 Ricin A imunotoxinu způsoben indukcí apoptosy bylo provedeno barvení propidiumjodidem v hypotonickém pufru. V tomto testu jsou segmentovaná apoptotická jádra rozpoznána podle subdiploidního obsahu DNA. Při provedení těchto testů byla fragmentace jader detekována pomocí barvení propidiumjodidem, jak je popsáno v Nicoletti, I. et al., (1991), J. Immunol. Methods 139: 271279. Stručně, buňky byly inkubovány s IT a byly odebírány v různých časech. Buňky byly fixovány-ethanolem při -20 °C, byly inkubovány s extrakčním pufrem (0,05 M Na2HPO4; 0,0025 M kyselina citrónová; 0,1% Triton X-100; 20 ng/ml propidiumjodid). Fluorescence propidiumjodidu byla analyzována pomocí Fluorescent Activated Cell Sorter (FACScan) průtokovým cytometrem (Beckton and Dickinson, San Jose, CA).

Jak je uvedeno na obr. 2, apoptotická jádra byla detekována v kulturách ošetřených IT ve srovnání s kontrolou. V tomto pokusu byly U937 buňky stimulovány IFNy a byly inkubovány po dobu 6 hodin s různými koncentracemi H22-R. Apoptotická jádra byla detekována již 2 hodiny po vystavení působení IT a byla stále patrná po 16 hodinách od ošetření. Toto zjištění ukazuje, že cytotoxický účinek H22 Ricin A-IT je způsoben indukcí apoptosy. Apoptosou zprostředkované usmrcování buněk omezuje potenciálně škodlivé účinky prostřednictvím deplece buněk exprimujících FcyRI in vivo. Kromě toho, dlouhodobé usmrcování buněk indukované H22-R (i po 16 hodinách) naznačuje použitelnost H22-R jako IT pro depleci buněk exprimujících FcyRI in vivo.

Příklad 4: Detekce buněk exprimujících FcyRI v chronickém kožním zánětu u člověka

Barvící schopnost jiné CD64 monoklonální protilátky, 10.1 (Dougherty, G.J. et al., 1987, Eur. J. Immunoí. 17: 14531459), byla testována po pre-inkubaci řezů s H22 protilátkou a za přítomnosti různých koncentrací H22 protilátky. Protože

10.1 a H22 protilátky rozpoznávají různé epitopy na hFcyRI, nebyla po simultánní inkubaci pozorována významná změna intenzity nebo charakteru barvení. Na základě těchto výsledků byla protilátka 10.1 použita ve všech pokusech obsahu j ících_ imunohistochemické hodnocení odebrané tkáně. ~

Pro vyšetření přítomnosti buněk exprimujících FcyRI v chronickém kožním zánětu u lidí byly odebrány biopsie z chronicky zánětlivé změněné tkáně od pacientů s atopickou dermatitidou (AD). Diagnosa AD byla stanovena podle kriterií • »

uvedených v Hanífin, J.M., a Rajka, G., 1980, Acta Derm. Venereol. (Stockholm) 92: 44-47). Náplasťový test na atopii (APT) byl proveden způsobem popsaným v Langeveld-Wildschut, E.G. (1995), J. Allergy Clin. Immuno. 96: 66-73. Stručně, kůže byla desetkrát otřena a potom byl za použiti Leucotestů (Beiersdorf, Hamburg, Germany) aplikován alergen

Dermatophagoides pteronyssinus (Haarlem's Allergenen

Laboratorium, The Netherlands; 80 μΐ, 10000 AU/ml) na klinicky normální kůži na zádech pacienta s diagnostikovanou AD. Na analogickou kůži byl podobným způsobem aplikován lauryl síran sodný (SLS, Sigma, 0,1% v salinickém roztoku). Polymorfní světelné erupce (PLE) byly diagnostikovány podle polymorfního klinického obrazu s přítomností papulí a vesikul, silného svědění a klinické odpovědi po WA a/nebo WB ozáření. Předem neexponovaná kůže byla ozářena 6 minimálními erythemovými dávkami za použití zdroje UVB Philips TL12.

Řezy z lidské kůže byly imunohistochemicky barveny pomocí FcyRI protilátek. Buňky exprimující FcyRI byly detekovány podle růžového/červeného zabarvení a byly kontrastně barveny hematoxylinem. V normální nepostižené kůži exprimovalo několik buněk FcyRI. Tyto buňky byly umístěny primárně v dermis.

Naopak, nadměrná exprese FcyRI v dermis byla pozorována v kůži s chronickými lézemi, například v kůži postižené atopickou dermatitidou. Zbarvené buňky byly lokalizovány jak v infiltrátech, tak byly rozptýlené v dermis. Nebylo pozorováno žádné významné zbarvení vepidermis. Potom byly odebrány biopsie z modelů akutní fáze zánětu, jako například 24 hodin po atopickém náplasťovém testu (APT), 72 hodin po polymorfních světelných erupcích na kůži (PLE) a 48 hodin po ošetření kůže lauryl síranem sodným (SLS). Tyto biopsie dávaly stejné výsledky, nicméně počet buněk exprimujicích FcyRI byl o něco • · · · • · · · vyšší než v chronické zánětlivé tkáni. Přítomnost velkého počtu buněk exprimujících FcyRI jak v akutní, tak v chronické fázi zánětu ukazuje na úlohu těchto buněk v kožní zánětlivé reakci.

Příklad 5: Příprava myšího modelu pro chronický kožní zánět

Pro stanovení toho, zda je eliminace zánětlivých makrofágů z kůže proveditelná a zda je přínosem při kožním zánětu byl H22-R imunotoxin testován na pokusných zvířatech. Indukce chronického kožního zánětu byla studována za použití hFcyRItransgenních myší s oholenou kůží a jejich netransgenních sourozenců po opakované lokální aplikaci SLS. Charakter exprese, genová regulace a funkce hFcy-RI u těchto myší jsou podobné jako u člověka (Heíjnen, I.A. et al. (1996), J. Clin. Invest. 97: 331-338). Bylo testováno několik protokolů a denní aplikace 5% SLS po dobu 10 dnů se ukázala být adekvátní, jak je popsáno v části Materiály a metody.

Nízký počet T-lymfocytů, dendritických buněk a makrofágů byl detekován v normální, neošetřené kůži (5+4; 7±4 a 15±3 na mm , v příslušném poradí). Dále, několik buněk exprimující FcyRI bylo detekováno v normální, neošetřené kůži (5±2 na mm ) a jejich distribuce byla podobná jako distribuce v normální lidské kůži. Ošetření SLS vedlo ke ztluštění epidermis a infiltraci dermis, která se skládala z T-lymfocytů, dendritických buněk a makrofágů (obr. 3A) . Prí těchto pokusech byla do kůže postižené chronickým zánětem podána jediná intradermální injekce IT a v různých intervalech byly odebírány biopsie, které byly imunohistochemicky barveny.

Počet buněk exprimujících hFcyRI se také výrazně zvýšil (obr. 3A) (75 ± 11 na mm²) a podobně jako v chronickým zánětem • · • · postižené lidské kůži byly tyto buňky primárně distribuovány v dermis. Nebyly pozorovány významné rozdíly ve složení buněk mezi hFcyRI transgenních a netransgenních myších. U netransgenních myší však nebylo pozorováno významné barvení buněk na hFcyRI. Po injekci pouze H22-R nebyla detekována přítomnost buněk exprimujících hFcyRI ani makrofágů.

Podobnost ve složení buněk a expresi hFcyRI mezi chronickým zánětem postiženou lidskou kůží a SLS-indukovaným zánětem u hFcyRI-transgenních myší činí tento model vhodným pro studium úlohy buněk exprimujících hFcyRI během chronického kožního zánětu. Tento model v kombinaci s H22-R IT byl použit v následujících příkladech.

Příklad 6: Účinná deplece makrofágů exprimujících FcyRI in vivo

Pro stanovení toho, zda je H22-R účinný v zabíjení buněk exprimujících hFcyRI in vivo, jak bylo zjištěno in vitro, byl H22-R injikován intradermálně myším ošetřeným SLS. Chronický kožní zánět byl indukován u transgenních myší exprimujících lidský FcyRI opakovanou lokální aplikací iritačního činidla, 5% lauryl síranu sodného, jak bylo popsáno ve části Materiály a metody. Dvě sousedili 10 μϊ intradermální injekce obsahující 2 x 10’⁸ M (3 μρ H22 a 0,6 μρ Ricim/A) byly podány jedenkrát do kůže hFcyRI-transgenních a netransgenních myší ošetřené SLS. Na kontralaterální' straně byly podány identické kontrolní injekce obsahující vehikulum. Aplikace SLS pokračovala a v různých časech byly odebírány vzorky kůže, spádových lymfatických uzlin, jater a sleziny na imunohistochemickou analýzu.

Lokalizovaný charakter intradermálních injekcí byl vyšetřován detekcí vychytávání uhlíkových části makrofágy.

Příčné řezy myší kůží po intradermální injekci uhlíkových částic ukázaly přítomnost uhlíkových částic v dermis, ale ne pod kožní svalovinou. Tato distribuce ukazuje na lokalizovaný charakter intradermálních injekcí.

Representativní imunohistochemické řezy kůží transgenních myší exprimujících lidský FcyRI po opakované lokální aplikaci lauryl síranu sodného a po intradermální injekci kontrolního vehikula nebo Ricin A-H22 ukázaly ztluštění epidermis a velké množství infiltrujících buněk v dermis 24 hodin po léčbě.

Tento charakter barvení ukazuje na přítomnost chronického zánětu indukovaného dráždivým činidlem. Většina infiltrujících buněk byly FcyRI-pozitivní makrofágy (zbarvené růžově). Naopak, barvení infiltrujících buněk exprimujících Fcy receptor bylo významně sníženo 24-hodin po injekci imunotoxinu Ricin A-H22.

Snížení počtu buněk exprimujících hFcyRI z kůže bylo detekováno během 24 hodin po injekci IT (obr. 3A). I přes pokračující aplikaci SLS trvala deplece do přibližně 96 hodin, po kterých došlo k repopulaci. Repopulace byla dokončena ve 120 hodině (obr. 3A). Ve spádových lymfatických uzlinách, játrech a slezině nebyly pozorovány změny v expresi hFcyRI.

Toto pozorování naznačuje, že efekt zůstává omezen na místo injekce. V místě injekce kontrolního vehikula a u netransgenních myši nebyly pozorovány žádné změny. Rychlé a téměř úplné vymizení buněk exprimujících hFcyRI a jejich dlouhodobá nepřítomnost v kůži ukazují na použitelnost H22-R IT pro eliminaci buněk exprimujících hFcyRI při chronickém kožním zánětu in vivo.

Příklad 7: Účinek deplece buněk exprimujících hFcyRI na lokální kožní zánět

Současně se snížením počtu buněk exprimujících hFcyRI došlo také ke snížení počtu makrofágů exprimujících MOMA-2. Toto zjištění ukazuje, že injekce H22-R vede k účinné depleci zánětlivých makrofágů v postižené kůži (obr. 3A). Naopak, k žádným významným změnám v populaci makrofágů nedošlo u netransgenních myší. Tato selektivní deplece potvrzuje specificitu H22-R v zaměření a eliminaci makrofágů z kůže.

Pro další hodnocení lokalizovaného charakteru deplece makrofágů byly také vyšetřeny hematopoetické tkáně, jako jsou lymfatické uzliny, slezina a játra. Žádná významná deplece buněk v důsledku působení imunotoxinu nebyla pozorována v jiných hematopoetických tkáních. Identická léčba netransgenních sourozenců nevedla k žádným detekovatelným změnám v jakékoliv vyšetřované buněčné populaci. Tyto výsledky ukazují, že deplece makrofágů byla specifická pro buňky nesoucí lidský FcyRI a zůstávala omezená na místo injekce.

Specificita postupu pro lokální eliminaci makrofágů je dále prokázána vymizením makrofágů již během 24 hodin bez jakékoliv významné deplece dendritických buněk, T-lymfocytů či

Langerhansových buněk během zkoumaného období. Injekce H22-R neměla žádný přímý účinek na počet T-lymfocytů a dendritických buněk (obr. 3B). Nicméně, po vymizení makrofágů exprimujících hFcyRI se začal počet T-lymfocytů a dendritických buněk v kůži snižovat. Snížení počtu T-lymfocytů a dendritických buněk v kůži ukazuje na vymizení lokálního zánětu a tak na příznivý účinek vymizení zánětlivých makrofágů na lokální zánět, I přes trvalou přítomnost zánětlivých podnětů (obr. 3B) .

Tato zjištění demonstrují účinnost a specificitu CD64 IT v eliminaci zánětlivých makrofágů z kůže na histologické úrovni.

*· * * · · * · »» ^ř · * ···# « · · · ····♦ ··» · Μ « <

• ♦· » · ·· ··· «« » ···· ··« ·««· • » · · · * « « « « » «

Následné vymizení jiných zánětlivých buněk ukazuje na škodlivou úlohu makrofágů při chronickém kožním zánětu.

Příklad 8: Lokální deplece makrofágů vede ke klinickému zlepšení stavu kůže

Pro stanovení toho, zda lokální deplece makrofágů vede ke klinickému zlepšení stavu kůže byly měřeny dva parametry: lokální teplota kůže a erythem. Erythem je primárně způsoben zvýšenou dilatací kapilár a s touto dilatací přímo souvisí zvýšená teplota kůže.

Pro detekci změn teploty kůže indukované aplikací' SLS a injekcí IT byla zvířata imobilizována mírnou sedací etherem a lokální teplota byla měřena pomocí kožní sondy (Ellab A-Hl,

Denmark). Pro hodnocení dilatace kapilár a prostupnosti cév jako parametru zánětu byla zvířata zklidněna etherem a byl jim intravenosně podán 1% roztok Evansovi modři. Po 15 minutách byla zvířata utracena a kůže byla odebrána na vyšetření.

Pomocí malé kožní sondy byly lokální změny kožní teploty měřeny u kontrolních zvířat a u zvířat ošetřených IT. Po ošetření SLS byl detekován vzestup teploty, což potvrzuje indukci lokálního zánětu. Obr. 4A je sloupcový graf ukazující vliv intradermální injekce H22-R na lokální kožní teplotu v závislosti na čase. Pokles teploty dosahuje úrovně srovnatelné s neléčenou, nepostiženou kůží. Toto snížení teploty u zvířat léčených IT obvykle trvalo 96 hodin. Po této době se teplota znovu zvýšila a dosáhla hodnot srovnatelných s hodnotami před injekcí IT. Tyto změny teploty ukazují na vyřešení zánětu. Ani při kontrolní injekci vehikula, ani u netransgenních myší nebylo pozorováno podobné snížení teploty. Kromě toho byla pozorována těsná dočasná korelace mezi vymizením makrofágů a ·« • ·* »· · • · · snížením lokální kožní teploty. Naopak, po znovuobjevení makrofágů bylo detekováno zvýšení teploty. Tato zjištění ukazují na zásadní úlohu makrofágů při lokálním zánětu.

U myší se zarudnutí kůže špatně hodnotí z důvodů malé tloušťky myší kůže. Pro usnadnění vizualizace lokální dilatace kapilár byla těmto zvířatům podána intravenosní injekce Evansovi modři. Pro tyto pokusy byl chronický kožní zánět indukován u hFcyRI-transgenních myší (n=9) nebo u netransgenních myší (n=9) epikutánní aplikací SLS a IT nebo kontrolní vehikulum byly podány intradermálně. Evansova modř byla injikována intravenosně a o 24 hodin a 30 minut později byla zvířata utracena a byla odebrána kůže ze střední části. Pomocí této techniky byla detekována přítomnost zánětlivé reakce po SLS ošetření. Žádný významný vliv IT na dilataci kapilár nebyl detekován u netransgenních myší : , nebo pro kontrolní vehikulum. V místě podání H22-R nebylo přítomno modré zbarvení v místě injekce, což ukazuje na vymizení zánětu. Dále, celková intenzita modrého zabarvení byla nižší na straně, kam byla podána injekce H22-R.

Příklad 9: Dlouhodobé potlačení zánětu in vivo po opakovaných injekcích CD64-IT

Pro zjištění toho, zda může být IT používán dlouhodobě, byla kožní teplota měřena denně a po jejím zvýšení byla zvířatům opět podána injekce na stejné straně. Během pokusu pokračovala aplikace SLS. Obr. 4B ukazuje, že zánět může být kontrolován po dobu alespoň 18 dnů u hFcyRI transgenních myší, kterým je podáván pouze H22-R. Kontrolní vehikulum ani netransgenní myši nevykazovaly významné snížení teploty v jakékoliv sledované době. Op akované injekce IT ukázaly, že je možné potlačit zánět na dlouhou dobu. Toto zjištění ukazuje na • · • · použitelnost dlouhodobé IT léčby chronických kožních zánětů u pacientů. Dohromady tyto pokusy ukazují výhodu lokální eliminace makrofágů při chronickém kožním zánětu indukovaném aplikací SLS.

Dohromady ukazují pokusy popsané v příkladech provedení vynálezu to, že aktivované makrofágy mohou být selektivně eliminovány za použití způsobů a prostředků podle předkládaného vynálezu, bez významného ovlivnění jiných populací kožních nebo hematopoetických buněk. Kromě toho, účinky imunotoxinu zůstávají omezeny na oblast podání, což snižuje negativní systémové účinky na jiné buňky exprimující FcyR. Snížení zánětu po eliminaci makrofágů podtrhává význam zánětlivých makrofágů jako složek indukujících a udržujících kožní zánět. Snížení zánětlivé reakce je detekováno na histologické úrovni, stejně jako podle klinických parametrů jako je lokální kožní teplota a zarudnutí kůže. Kromě toho, opakovaná aplikace vede k potlačení zánětu na dlouhou dobu. Dlouhodobá účinnost ukazuje na možnost použití způsobů a prostředků podle předkládaného vynálezu v léčbě lokálních kožních zánětů u pacientů s chronickými kožními nemocemi. Postup podle předkládaného vynálezu může mít širší uplatnění, protože zánětlivé makrofágy mají pravděpodobně klíčový význam pro chronický charakter jiných chronických zánětů, jako je například revmatoidní artritida.

Barvení na CD64 v lidské kůži ukázalo mnoho buněk i exprimujících FcyRI jak během akutní, tak během chronické fáze zánětu. Tato pozorování naznačují, že cílené zaměření makrofágů prostřednictvím jejich FcyRI může poskytnout nový terapeutický postup pro léčbu kožních zánětlivých onemocnění u člověka. Účinné snížení chronického zánětu indukovaného SLS u • · • · • · · · • · • · « · · hFcyRI-transgenních myší, které je zde popsáno, podporuje možné terapeutické použití těchto imunotoxinů.

Odborníkům v oboru budou zřejmé - nebo budou moci běžnými pokusy zjistit - mnohé ekvivalenty popsaných specifických provedení předkládaného vynálezu. Takové ekvivalenty spadají do rozsahu následujících patentových nároků.

Claims (33)

1. Patentové nároky

   1. Použití sloučeniny vážící se na makrofágy obsahující: (a) činidlo, které se váže na Fc receptor v odlišném místě než se váží endogenní imunoglobuliny; a (b) činidlo, které usmrcuje makrofágy nebo snižuje aktivitu makrofágů, pro výrobu léčiva pro selektivní snižování počtu nebo aktivity makrofágů.
2. 2. Použití sloučeniny vážící se na makrofágy obsahující: (a) činidlo, které se váže na Fc receptor v odlišném místě než se váží endogenní imunoglobuliny; a (b) činidlo, které usmrcuje makrofágy nebo snižuje aktivitu makrofágů, pro výrobu léčiva pro léčbu nebo prevenci onemocnění charakterizovaného aberantní aktivitou nebo počtem makrofágů ve vybrané oblasti u j edince.
3. 3. Použití podle které se váže na neváže endogenní kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, kde činidlo, Fc receptor, se váže v místě, ve kterém se IgG nebo IgA.
4. 4. Použití podle kteréhokoliv z receptor je Fcy receptor (FcyR) nároků 1 nebo 2, nebo Fca receptor kde Fc (FcaR).
5. 5. Použití podle nároku 4, kde Fcy receptor je vybrán ze skupiny skládající se z FcyRI, FcyRII a FcyRIII.
6. 6. Použití podle nároku 5, kde Fcy receptor je lidský FcyRI.
7. 7. Použití podle nároku 4, kde Fc receptor je lidský FcaR.
8. 8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, kde sloučenina vážící se na makrofágy zahrnuje protilátku proti Fc receptoru konjugovanou na toxin.

   • · • · · · · • · · ·

   86 ·· ·’
9. 9. Použití podle nároku 8, kde protilátka proti Fc receptorů je protilátka proti Fcy receptorů nebo její fragment.
10. 10. Použití podle nároku 9, kde protilátka proti Fcy receptorů je monoklonální protilátka vybraná ze skupiny skládající se z mAb 22, 32 a 197 nebo jejích fragmentů.
11. 11. Použití podle nároku 9, kde protilátka proti Fcy receptorů je humanizovaná protilátka H22 produkovaná buněčnou linií mající ATCC přírůstkové číslo CRL 1117 nebo její fragment.
12. 12. Použití podle nároku 8, kde toxin je vybrán ze skupiny zahrnující Gelonin, Saporin, Exotoxin A, Onconasu a Ricin A.
13. 13. Použití podle nároku 1, kde činidlo usmrcující makrofágy nebo snižující aktivitu makrofágů je obaleno v liposomů.
14. 14. Použití podle nároku 13, kde činidlo usmrcující makrofágy nebo snižující aktivitu makrofágů je dichlormethylendifosfonat (CL2MDP) nebo jeho derivát.
15. 15. Použití podle nároku 13, kde činidlo, které se váže na Fc receptor, je jednořetězcová protilátka.
16. 16. Použití podle nároku 13, kde činidlo, které se váže na Fc receptor, je protilátka proti Fcy receptorů nebo její fragment.
17. 17. Použití podle nároku 13, kde činidlo, které se váže na Fc receptor, je jednořetězcová protilátka proti Fcy receptorů nebo její fragment.
18. 18. Použití podle nároku 1, kde krok kontaktování probíhá v kultuře.

    • 9
19. 19. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, kde sloučenina vážící se na makrofágy je podána lokálně, intradermálně nebo subkutánně ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
20. 20. Použití podle nároku 2, kde onemocnění je charakterizováno zvýšenou proliferací makrofágů a/nebo zvýšenou sekrecí růstových faktorů makrofágy.
21. 21. Použití podle nároku 2, kde onemocnění je vybráno ze skupiny zahrnující psoriasu, atopickou dermatitidu, sklerodermii, kožní lupus erythematodes, infekci virem lidské imunodeficience, roztroušenou sklerosu, revmatoidní artritidu, chronickou polymorfní světelnou dermatosu, chronickou obstrukční nemoc bronchopulmonální a Wegenerovu granulomatosu.
22. 22. Způsob diagnostiky onemocnění charakterizovaného aberantním počtem nebo aktivitou makrofágů u jedince, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    - kontaktování biologického vzorku od jedince se sloučeninou vážící se na makrofágy zahrnující (a) činidlo, které se váže na Fc receptor v odlišném místě než se váží endogenní imunoglobuliny; a (b) činidlo, které usmrcuje makrofágy nebo snižuje aktivitu makrofágů; a

    - detekování úrovně vazby na Fc receptor ukazující na množství Fc-receptorového proteinu ve vzorku;

    kde zvýšená exprese Fc-receptorového proteinu nebo zvýšení počtu makrofágů exprimujících Fc-receptorový protein ukazuje na přítomnost onemocnění zprostředkovaného makrofágy.
23. 23. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že sloučenina vážící se na makrofágy dále zahrnuje detekovatelné značkovací činidlo.

    • ·
24. 24. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že exprese Fc-receptorového proteinu je detekována autoradiografickou, kolorimetrickou, luminiscenční nebo fluorescenční detekcí.
25. 25. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že onemocnění je vybráno ze skupiny zahrnující psoriasu, atopickou dermatitidu, roztroušenou sklerosu, sklerodermii, kožní lupus erythematodes, infekci virem lidské imunodeficience, chronickou polymorfní světelnou dermatosu, chronickou obstrukční nemoc bronchopulmonální a Wegenerovu granulomatosu.
26. 26. Použití sloučeniny vážící makrofágy, zahrnující (a) činidlo, které se váže na Fc receptor v odlišném místě než se váží endogenní imunoglobuliny; a (b) činidlo, které usmrcuje makrofágy nebo snižuje aktivitu makrofágů, přičemž činidlo, které usrmcuje makrofágy nebo snižuje jejich aktivitu, je obaleno v liposomů, pro výrobu léčiva pro selektivní snižování počtu nebo aktivity makrofágů.
27. 27. Použití podle nároku 26, kde činidlem usmrcujícím makrofágy nebo snižujícím jejich aktivitu je dichlormethylendifosfonat (CL2MDP) nebo jeho derivát.
28. 28. Použití podle nároku 26, kde činidlem, které se váže na Fc receptor, je jednořetězcová protilátka.
29. 29. Použití podle nároku 26, kde činidlem, které se váže na Fc receptor, je protilátka proti Fcy receptorů nebo její fragment.

    • · • 9 · · » · · * ' ·· ·· ·» · ··
30. 30. Použití podle nároku 26, kde činidlem, které se váže na Fc receptor, je jednořetězcová protilátka proti Fcy receptoru nebo její fragment.
31. 31. Použití sloučeniny vážící makrofágy, zahrnující (a) činidlo, které se váže na Fc receptor; a (b) činidlo, které usmrcuje makrofágy nebo snižuje aktivitu makrofágů, pro výrobu léčiva pro selektivní snižování počtu nebo aktivity makrofágů přičemž sloučenina vážící makrofágy se podává lokálně, intradermálně nebo subkutánně ve farmaceuticky vhodném nosiči.
32. 32. Použití sloučeniny vážící se na makrofágy obsahující: (a) činidlo, které se váže na Fc receptor; a (b) činidlo, které usmrcuje makrofágy nebo snižuje aktivitu makrofágů, pro výrobu léčiva pro léčbu nebo prevenci onemocnění charakterizovaného aberantní aktivitou nebo počtem makrofágů ve vybrané oblasti u jedince, přičemž sloučenina vážící makrofágy se do oblasti podává lokálně, intradermálně nebo subkutánně ve farmaceuticky vhodném nosiči.
33. 33. Použití podle nároku 32, kde onemocnění je charakterizováno zvýšenou proliferací makrofágů a/nebo zvýšenou sekrecí růstových faktorů makrofágy.