KR20140004530A - ＩｇＧ Ｆｃ 위치선택적 결합 펩티드 및 이를 포함하는 하이브리드 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 광반응성 작용기를 구비한 Fc 위치선택적 결합 펩티드, 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드 및 광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 Fc 도메인 함유 분자를 구비한 하이브리드 분자 및 이의 제조방법, 및 상기 하이브리드 분자의 용도에 관한 것이다.

Description

ＩｇＧ Ｆｃ 위치선택적 결합 펩티드 및 이를 포함하는 하이브리드 분자{A site-selective binding peptide for IgG Fc and a hybrid molecule comprising the same}
본 발명은 광반응성 작용기를 구비한 IgG Fc 위치선택적 결합 펩티드, 상기 IgG Fc 위치선택적 결합 펩티드 및 광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 IgG Fc 도메인 함유 분자를 구비한 하이브리드 분자 및 이의 제조방법, 및 상기 하이브리드 분자의 용도에 관한 것이다.
지난 20년간 항체공학은 생쥐에서 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb)를 개발하는 하이브리도마(hybridoma) 기술을 바탕으로 키메릭 항체(chimeric mAb), 인간화 항체(humanized mAb) 및 인간 항체(fully human mAb)의 제조기술 개발로 거듭났으며, 지금은 항체가 하나의 치료용 약물(therapeutic mAb)로서 인정받고 있다. 현재까지 FDA의 승인을 받은 치료용 항체는 28가지로 이식거부반응, 암, 자가면역질환, 염증, 심장질환, 전염성 감염 등의 광범위한 질병치료제로서 사용되고 있으며, 약 300여 종의 치료용 항체가 현재 임상개발 단계에 있어 앞으로 더 많은 치료용 항체가 개발되는 동시에 상업화될 것으로 전망된다. 또한 나아가 기존의 항체(naked mAb)보다 효능을 향상시킨 차세대 치료용 항체 개발을 위한 많은 연구가 진행 중이다. 상기 차세대 항체로는 기존의 항체에 약물을 결합시킨 항체-약물 콘쥬게이트(antibody-drug conjugate; ADC), 이중특이항체(bispecific antibody) 및 슈퍼바이오시밀러(super biosimilar)라고도 불리는 바이오베터(biobetter)가 있으며, 이중 ADC는 성공적인 치료용 항체 개발의 이정표(milestone)로 이미 높은 수익을 올리고 있다. ADC는 단클론 항체의 특이성과 약물의 세포독성(cytotoxicity)의 두가지 구성요소의 최적의 특성을 조합한 것이다. 따라서 이러한 ADC를 개발함에 있어서, 단클론 항체의 특이성을 해치지 않으면서 일정량의 약물을 견고하게 결합시킬 수 있는 기술의 개발이 중요하다.
앞서 언급한 바와 같이 ADC는 특이성(specificity), 체내 혈액순환시 비독성(non-toxicity in circulation) 및 약동학(pharmacokinetics) 등 항체의 장점을 최대한 활용하여 약물이 구체적으로 특정 조직(예를 들어, 암세포)만을 타겟팅하는데 초점을 맞춘 기술이다. 따라서, ADC는 면역콘쥬게이트(immunoconjugate)라고도 불리며 "표적화학요법(targeted chemotherapeutics)"을 위한 항암 약물도 이에 속한다. ADC는 약물, 단클론 항체 및 상기 항체와 약물을 연결하는 링커(linker)를 포함하는 세 가지 요소로 구성되며, 구체적으로 항암 목적에 있어서, ADC 기술은 암세포의 표면에 발현되는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 약물을 종양세포에 전달하는 방법이다.
이와 같은 치료용 ADC를 개발할 때 고려해야할 사항은 ADC가 체내 혈액순환(circulation)시 콘쥬게이트 되지 않은 항체와 동일한 특성을 보유해야 한다는 것이다. 특히, 링커는 혈류에도 안정하여 약물이 항체로부터 분리되는 것을 방지하여 표적 조직에 도달할 때까지 전구약물(prodrug) 상태를 유지하여 정상조직을 손상하지 않도록 해야한다. 또한, ADC의 항체는 약물과 결합되기 전의 항체와 같은 친화력을 유지할 수 있어야 한다. 즉, 항체와 약물의 결합으로 인해 본연의 항원-항체 결합이 저해되어서는 안된다.
따라서, 최적화된 ADC를 제조하기 위하여 고려해야할 ADC의 표적 지향적 약물 전달을 결정하는 주된 요소는 항체의 특성, 약물의 효능(potency) 및 항체와 약물의 결합방식(conjugation method)이다.
항체의 특성 및 약물의 효능은 각각의 내재적 특성에 의존하는 것이므로 임의로 조절하기 어렵다. 따라서, 항체와 약물의 결합방식을 조절하여 표적 지향적 약물 전달체로서의 ADC의 특성을 최적화할 수 있다. 일반적으로 ADC에 사용되는 링커로는 산성에 불안정한 히드라존(acid-labile hydrazone), 단백질분해효소에 불안정한 펩티드(protease-labile peptide) 및 환원제(reducing agent)에 민감한 이황화물(disulfide)이 있다. 또한 절단되지 않는(non-cleavable) 티올에테르(thioether) 링커도 사용된다. 항체와 약물의 견고한 결합을 위하여 현재 사용되는 방법은 돌연변이에 의해 항체에 반응성 높은 시스테인 잔기를 도입하고 해당 시스테인 잔기에서 직접 또는 링커를 통해 약물과 결합하도록 하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 이러한 방법은 항체에 돌연변이를 일으키므로 항체 자체의 활성 즉, 항원과의 특이적 결합력을 손상시키지 않는다고 보장할 수 없다. 또한 결합력 및 결합률도 예측하기 어렵다.
이 외에 항체와 약물이 결합하는 콘쥬게이션 화학에 있어서 항체 대 약물의 몰 화학량 비(molar stoichiometric ratio)와 항체 내의 약물이 결합하는 부위도 중요하다. 대부분 ADC는 IgG 골격(backbone)에 2 내지 8개의 약물이 항체의 라이신(lysine)의 ε-아미노기에 결합된다. 이와 같은 결합방법은 비 특이적이므로 항체에 있는 용매에 노출된 모든 라이신 잔기에 무작위로 결합되기도 하고 항체 대 약물 몰비도 일정하지 않아 불균일한 ADC를 생산하게 된다. 이때, 다수의 약물이 콘쥬게이트된 항체는 생체 내 약동학 특성에 영향을 준다. 예를 들어, 8개의 약물이 하나의 항체에 결합된 ADC는 4개 또는 2개의 약물이 결합된 ADC 및 비결합 모항체보다 훨씬 더 빠르게 제거된다. 따라서, 단위 항체 당 일정한 수의 약물이 결합하도록 조절할 필요가 있다. 그러나, 화학적 방법에 의해 하나의 항체에 2 내지 4개의 약물이 결합된 균일한 ADC를 생산하는 것은 어렵다. 부위 특이적 약물결합(site-specific drug conjugation) 및 항체 대 약물 화학량 비를 조절하여 균일한 ADC를 생산하고자 항체 공학이 이용되고 있으나, 현재 사용되고 있는 방법은 링커를 통한 결합을 용이하게 하기 위하여 돌연변이에 의해 항체 내 특정 자리에 반응성이 높은 시스테인 잔기를 도입하여 해당자리에 약물을 직접 또는 링커를 통해 결합시키는 방법이므로 항체 자체의 활성을 보장하기 어렵다.
항원-항체 반응을 이용한 면역센서, 표적지향형 약물전달시스템(targeted drug delivery system), 단백질 칩, 진단 키트 등의 면역반응을 이용한 응용 분야에서 다양한 고체 물질(흡착지, 나노입자, 마이크로입자, 유리 및 금 등)의 표면 또는 다른 생체분자(펩타이드, 단백질, 핵산 및 리피드 등)에 항체를 고정하는 것은 필수 불가결한 과정이다. 따라서, 항체의 항원결합부위가 표면에 잘 노출될 수 있도록 항체의 배향성(orientation)을 조절하여 그 고유한 결합 특성을 유지하면서 높은 재현성을 가지고 항체를 고정하는 기술은 칩 또는 센서의 검출 감도에 직접적으로 연결될 뿐 아니라, 약물 전달체의 생체적용을 위하여 필수 불가결한 요소이다.
현재까지 고체지지체에 항체를 고정하는 방법은 주로 물리적 흡착 또는 선택성이 결여된 공유결합형성 반응에 의존하고 있다. 그러나, 이러한 방법으로 항체를 고정하게 되면 입체적 장애(steric hindrance) 또는 무작위적 배향(random orientation) 등으로 인해 항체 고유의 활성이 감소되는 결과를 초래한다. 이에 대한 대안으로 단백질 A(Protein A) 및 단백질 G(Protein G) 등과 같은 미생물 유래의 항체결합 단백질들(antibody binding protein)이 사용되기도 한다. 상기 단백질들은 항원-항체 반응에 참여하지 않는 항체의 Fc 부위에 강하게 결합함으로써 항원의 접근성을 용이하게 한다. 또한, 상기 단백질들과 항체와의 결합에는 별도의 화학적 수식이 필요하지 않으므로 항체의 고유 기능을 해치지 않는 장점이 있다. 따라서, 최근에는 유전공학적, 화학적 방법으로 항체결합 단백질을 변형시킴으로써 상기 문제를 극복하는 연구에 초점이 맞춰지고 있다. 그러나, 상기 단백질들은 비용이 높고 안정성이 낮으며 정제 과정에서의 오염물질 혼합가능성이 존재하고, 항체 활성 감소하거나 선택성이 결여될 수 있는 등의 단점을 가지고 있다. 특히 미생물 유래의 단백질이므로 임상적용이 불가능하다. 상기 문제점들을 극복하기 위한 방법으로써 저분자 물질에 대한 연구가 이루어지고 있다. 종래에는 덴드리머(dendrimer), 철 이온 또는 캘릭스크라운(calixcrown) 유도체들을 이용한 방법들이 개발되었으나, 상기 물질들은 항체에 대한 배향성 조절이 불가능하고 선택성이 결여되어 모든 종류의 단백질에 비슷한 정도의 결합을 나타내며 결합력이 강하지 못하다는 단점이 있다. 이에 본 발명자들은 기존의 항체결합 단백질 또는 항체 고정용 저분자 물질의 단점을 극복할 수 있는 Fc 부위에 선택적으로 강하게 결합하는 신규한 저분자 펩타이드를 개시한 바 있다.
이에 본 발명자들은 항체는 변형시키지 않으면서 균일하고 견고하게 약물을 결합시킬 수 있는 방법을 예의 연구노력한 결과, 항체의 항원결합에 관여하지 않는 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 펩타이드에 UV와 같은 광조사에 의해 공유결합을 형성할 수 있는 광반응성 인공 아미노산을 하나 이상 치환시켜 저분자 펩타이드 변이체를 제조하고, 상기 제조된 저분자 펩타이드 변이체를 이용하여 단위 항체 당 일정한 수의 약물이 예측가능한 일정한 위치에 결합된 균일한 항체-약물 콘쥬게이트를 제조할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 하나의 목적은 항체 Fc 도메인의 특정 부위에 특이적으로 인접 또는 결합가능한 IgG Fc 위치선택적 결합 펩티드로서, 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 상기 Fc 도메인의 특정 부위에 인접 또는 결합하는 부위에 광반응성 작용기를 구비한 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 Fc 위치선택적 결합 펩티드 및 Fc 도메인 함유 분자를 포함한 하이브리드 분자를 제조하는 방법으로서, 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 Fc 도메인 함유 분자와 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물에 광을 조사하여 광반응성 작용기를 통해 Fc 도메인의 특정부위가 Fc 위치선택적 결합 펩티드와 공유결합된 하이브리드 분자를 생성시키는 단계를 포함하는 것이 특징인 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드; 및 광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 Fc 도메인 함유 분자를 구비한 하이브리드 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드; 광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 Fc 도메인 함유 분자; 및 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 직접 또는 링커를 통해 생물 활성 화합물이 결합된 약물복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하이브리드 분자가 고체지지체에 결합된 바이오칩 또는 바이오센서에 있어서, 상기 하이브리드 분자는 Fc 위치선택적 결합 펩티드; 및 광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 Fc 도메인 함유 분자를 구비하는 것이 특징인 바이오칩 또는 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 화학식 6의 화합물, 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다:
[화학식 6]
H-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Pcl-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-NH2
상기 Pcl은 포토루신, 포토메티오닌, 포토이소루신, 및 벤조페논 또는 아릴 아자이드가 직접 또는 링커를 통해 결합된 시스테인으로 구성되는 군으로부터 선택된 것임.
상기 목적을 달성하기 위한 제1양태로서, 본 발명은 항체 Fc 도메인의 특정 부위에 특이적으로 인접 또는 결합가능한 Fc 위치선택적 결합 펩티드로서, 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 상기 Fc 도메인의 특정 부위에 인접 또는 결합하는 부위에 광반응성 작용기를 구비한 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 제공한다.
본 발명에서 광반응성 작용기가 도입되기 전의 "Fc 위치선택적 결합 펩티드"는 항체의 Fc 도메인의 특정 부위를 인식하여 해당부위에 특이적으로 인접 또는 결합할 수 있는 펩티드일 수 있다. 즉, 표적 분자인 Fc 도메인에 충분한 친화력(affinity)과 특이성(specificity)을 가지고 시험관 내에서, 바람직하게는 생체 내에서 결합할 수 있는 펩티드일 수 있다. 상기 결합은 수소결합(hydrogen bonding), 이온결합(ionic bonding), 소수성 상호작용(hydrophobic interaction), 반데르 발스 상호작용(Van der Waals interaction) 등의 비공유결합(non-covalent bonding)에 의한 것일 수 있다. 선형 또는 내부에 이황결합을 갖는 원형 펩티드일 수 있으며, 내부에 이황결합을 형성하는 원형 펩티드의 경우 하나 이상의 아미노산으로 분리된 두 개 이상의 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 항체의 Fc 영역을 인식하여 특이적으로 인접 또는 결합할 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있으나, 비제한적인 예는 EP 1757701A1에 기재되어 있다. 상기 Fc 위치선택적 펩티드는 자연적으로 발현되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 인공적으로 합성될 수 있다.
상기 친화력은 해리상수(dissociation constant; Kd)로 표현될 수 있다. 본 발명의 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 표적 분자인 Fc 도메인에 대해 1 μM 미만의 해리상수를 나타낸다. 바람직하게 100 nM 미만, 보다 바람직하게 10 nM 미만의 해리상수를 나타낼 수 있다. 그러나 1 nM 미만의 해리상수를 가질 수 있으며, 바람직하게 1 pM 내지 1 nM의 해리상수를 갖는 펩티드도 본 발명의 범주에 속한다.
또한 본 발명의 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 항체 Fc 도메인의 특정부위에 특이적으로 인접 또는 결합할 수 있는 한 펩티드 뿐만아니라 펩티드 유도체(peptide derivatives), 예를 들어, 펩티드 모방체(peptide mimetics) 및 유사물(peptide analogues)을 포함할 수 있다.
상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 약 40개 이하의 아미노산으로 구성될 수 있고, 바람직하게는 30개 이하의 아미노산으로 구성될 수 있으며, 보다 바람직하게는 10 내지 15개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 이미 언급한 바와 같이 상기 아미노산은 공지된 20개의 아미노산 이외에 아미노산 모방체 또는 유사물과 같은 아미노산 유도체일 수 있다.
상기 펩티드 또는 아미노산의 모방체 또는 유사물은 천연의 아미노산 또는 본 발명에 따른 Fc 위치선택적 결합 펩티드와 유사한 구조를 갖는 비아미노산 화합물 구조체를 포함한다. 상기 모방체 또는 유사물은 적절한 공간적 배향에서 이에 상응하는 아미노산 또는 펩티드가 나타내는 크기, 전하 또는 소수성 등의 유사한 물리적 특성을 나타내는 물질로서 정의된다. 구체적인 예로서, 펩티드 모방 화합물은 하나 또는 그 이상의 아미노산 사이에 존재하는 아미드 결합이 탄소-탄소 결합 또는 당업계에 공지된 다른 결합으로 치환된 화합물일 수 있다.
따라서, 본 발명의 용어 "아미노산"은 광의적인 개념에서 자연적으로 발생하는 L α-아미노산 또는 그 잔기(residue) 뿐만 아니라, 더불어 D-아미노산 및 화학적으로 변형된(chemically modified) 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 상기한 아미노산 모방체 및 유사물을 포함하며, 본 발명에서 상기 모방체 및 유사물은 기능적 등가물을 포함할 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 11개의 아미노산으로 구성되었으며, 1번과 11번 아미노산이 분자 내 이황결합을 형성하여 고리모양의 구조를 가진 펩타이드로 사람, 돼지, 토끼 등에 존재하는 면역글로불린 G (immunoglobulin G, IgG)의 Fc 영역에 특이적 결합을 하는 것으로 알려져 있다. 이를 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 파아지-디스플레이(phage-display)에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에서 용어 "파아지-디스플레이"는 단백질과 이를 코딩하는 유전정보를 연결시키기 위하여 박테리오파지를 이용하여 단백질-단백질, 단백질-펩티드 및 단백질-DNA 상호작용을 연구하기 위한 실험기법이다. 상기 파아지-디스플레이를 이용하여 제약된(constrained) 및 제약되지 않은(unconstrained) 펩티드 라이브러리를 제조할 수 있다. 상기 라이브러리는 특정한 표적 분자와 결합하는 펩티드를 동정하고 선별하기 위하여 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에서는 상기 파이지-디스플레이 기법을 이용하여 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 펩티드를 동정하고 선별하였으며, 이를 Fc 위치선택적 결합 펩티드라 하였다.
본 발명에 따라 광반응성 작용기를 구비한 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 제조하는 방법은 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 아미노산 서열을 동정하고, 이를 공지의 방법으로 예컨대, 상기 펩티드를 발현할 수 있는 발현벡터를 제조하여 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 기법으로 발현시키거나, 인공적으로 합성하여 제조한 후 공지의 방법으로 이중 하나 이상의 아미노산 잔기를 광반응성 작용기를 갖는 아미노산으로 치환하여 제조할 수 있거나 또는 인공 합성시 하나 이상의 광반응성 작용기를 갖는 아미노산을 포함시켜 합성할 수 있다.
"본 발명에 따른 Fc 위치선택적 결합 펩티드"는 항체 Fc 도메인의 특정 부위에 특이적으로 인접 또는 결합가능하고, 상기 Fc 도메인의 특정 부위에 인접 또는 결합하는 부위에 광반응성 작용기를 구비한 것이 특징이다.
상기 본 발명의 용어 "광반응성 작용기"는 광조사시 특정 파장의 빛을 흡수하여 인접한 반응성 작용기와 공유결합을 형성할 수 있는 작용기일 수 있다.
항체와 혼합하였을 때, 본 발명의 광반응성 작용기를 구비한 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 내재적 특성인 특이성에 의해 항체의 Fc 도메인에 인접 또는 결합한다. 이후, 상기 혼합물에 빛을 조사하면 특정 파장의 빛을 흡수하여 광반응성 작용기를 통해 이와 인접한 항체 Fc 도메인 상의 반응성 작용기와 공유결합을 형성할 수 있다. 즉, 본 발명의 Fc 위치선택적 펩티드는 광조사시 상기 광반응성 작용기를 통해 Fc 위치선택적 결합 펩티드가 Fc 도메인의 특정부위에 공유결합될 수 있는 것이 특징이다.
상기 공유결합 형성을 위한 빛은 자외선일 수 있으며, 바람직하게는 320 내지 370 nm 파장의 빛일 수 있고, 보다 바람직하게는 355 내지 365 nm 파장의 빛일 수 있다.
상기 광조사에 의해 Fc 도메인 중의 반응성 작용기와 공유결합을 형성할 수 있는 Fc 위치선택적 결합 펩티드 내 광반응성 작용기를 갖는 아미노산은 포토루신, 포토메티오닌, 포토이소루신, 및 벤조페논 또는 아릴 아자이드가 직접 또는 링커를 통해 결합된 시스테인일 수 있다. 예를 들어 상기 화합물들은 하기의 화학식 1 내지 5로 표시되는 화합물일 수 있으며, 바람직하게, 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드 내 광반응성 작용기를 갖는 아미노산은 포토루신, 포토메티오닌 또는 포토이소루신일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00002
[화학식 2]
Figure pat00003
[화학식 3]
Figure pat00004
[화학식 4]
Figure pat00005
[화학식 5]
Figure pat00006
광조사시 상기 광반응성 작용기와 공유결합되는 Fc 도메인 내 부위는 반응성 높은 작용기를 갖는 아스파르트산(aspartic acid; Asp), 글루탐산(Glutamic acid; Glu), 펩티드 결합(peptide bonding) 또는 아미노산 측쇄일 수 있다.
통상 "Fc 도메인"은 면역글로불린(immunoglubuline; Ig) 또는 T 세포 수용체의 일정한 아미노산 배열을 가진 부위로써, 항원과의 결합에는 관여하지 않는다. 일정한 수의 아미노산 잔기를 하나의 구분으로 하여 -S-S- 루프에 의해 고차구조를 형성하며, 각 구분은 펩타이드 결합으로 연결되어 있다. 바람직하게 본 발명의 항체 Fc 도메인은 IgG의 Fc 도메인일 수 있다.
상기 본 발명의 Fc 위치선택적 결합 펩티드가 인접 또는 결합하는 Fc 도메인은 천연형이거나 비천연형 변이체일 수 있다. 상기 비천연형 변이체의 구체적인 예는 후술할 것이다.
상기 본 발명의 Fc 위치선택적 결합 펩티드에는 생물시료의 검출, 질병의 진단 및 치료 등을 위해 고체 지지체, 검출가능단, 조영제 또는 생물활성 화합물이 직접 또는 링커를 통해 연결될 수 있다(도 1A).
상기 본 발명의 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 연결되는 생물 활성 화합물은 치료제제 또는 진단제제일 수 있다. 상기 치료제제 또는 진단제제는, 효소, 호르몬(Hormon), 사이토카인, 항체, 항체 단편, 진통제, 해열제, 항염증제, 항생 물질, 항바이러스(virus)제, 항진균약, 심장혈관약, 중추 신경 작용약, 신장 기능 및 전해질 대사 작용약 또는 화학 요법제일 수 있다.
상기 본 발명의 생물 활성 화합물은 치료제제 또는 진단/검출제제일 수 있다. 구체적으로, 상기 생물 활성 화합물로서 사용되는 항체는 치료용 항체일 수 있다. 치료용 항체는 현재 약 30 종이 FDA의 승인을 받았으며 생체 내 존재하는 IgG와 성질이 거의 흡사하여 그 안전성이 매우 높다. 치료용 항체는 광범위한 질병 치료제(예를 들어, 이식거부반응, 암, 자가면역질환과 염증, 심장질환 및 전염성 감염 등)로 사용되고 있다. 특히 Fc 도메인 함유 분자가 치료용 항체인 경우 상기 치료용 항체는 질병이 생긴 조직에 특이적으로 존재하는 수용체 단백질 혹은 항원단백질을 인식하여 결합하기 때문에 그 특이성이 매우 높다. 따라서 치료용 항체에 생물 활성 화합물로서 분자영상프로브나 약물전달체를 결합시키면 약물병용효과와 함께 치료과정을 모니터링할 수 있는 테라그노시스(theragnosis) 제제로 전환할 수 있다. 또한 단순한 표적화 항체에도 분자영상프로브나 약물전달체를 결합시킴으로써 진단, 치료, 혹은 진단과 치료를 동시에 진행하는 테라그노시스 제제를 개발할 수 있다.
치료제제의 비제한적인 예로는 항체, 항체단편, 약물, 독소, 핵산가수분해효소(nuclease), 호르몬, 면역조절제, 킬레이터, 붕소화합물, 광활성(photoactive)제제 또는 염료, 및 방사성동위원소를 포함한다.
진단제제/검출제제의 비제한적인 예로는 방사성동위원소, 염료(예를들어, 비오틴(biotin)-스트렙타비딘(streptavidin) 복합체), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 자기공명 영상화(MRI)에의 증가제(상자성 이온)을 포함한다. 바람직하게, 진단제제는 방사성동위원소, 자기공명 영상에서 사용되는 증가제, 및 형광화합물을 포함한다. 항체성분을 방사성 금속 또는 상자성 이온과 부하하기 위해, 이온을 결합하는데 킬레이트기의 다수와 부착된 긴 꼬리를 갖는 반응물과 반응하는 것이 필요할 수도 있다. 상기의 꼬리는 폴리리신, 폴라사카라이드와 같은 고분자, 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA; diethylenetriaminepentaacetic acid), 포르피린(porphyrin), 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카르바존(thiosemicarbazone), 폴리옥심(polyoximes)과 같은 킬레이트기와 결합될 수 있는 펜던트기를 갖고 상기 목적에 유용하다고 알려진 기를 갖는 유도화되거나 유도될 수 있는 사슬일 수 있다. 킬레이트는 정상적으로 면역반응성의 최소 손실과 최소 집합체 및/또는 내부 교차연결로 분자에 결합을 형성할 수 있는 작용기에 의해 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 연결될 수 있다.
특히, 유용한 금속-킬레이트 조합은 진단성 동위원소와 60~4,000keV의 일반적인 에너지 범위에서 사용되는 2-벤질-DTPA 및 이의 모노메틸 및 시클로헥실 유사체를 포함하고, 예를 들어 방사성 영상화제에는 125I, 131I, 123I, 124 I, 62Cu, 64Cu, 18F, 111In, 67Ga, 99mTc, 94mTc, 11C, 13N, 15O, 76Br이 있다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비-방사성 금속과 복합화될 경우, 같은 킬레이트는 본 발명의 나노입자 또는 항체와 사용될 때 MRI에 유용하다. NOTA, DOTA, 및 TETA와 같은 거대고리(macrocyclic) 킬레이트는 금속 및 방사성 금속의 종류와 사용되고, 바람직하게는 갈륨, 이트륨(yttrium) 및 구리의 방사성핵종과 각각 사용된다. 상기 금속-킬레이트 복합체는 대상의 금속에 고리크기를 맞춤으로써 매우 안정하게 제조될 수 있다. RAIT에 223Ra와 같은 핵종과 안정하게 결합하는데 유용한 거대고리 폴리에테르류와 같은 고리형 킬레이트는 본 발명에 의해 성취된다.
이뮤노컨쥬게이트(immunoconjugate)는 치료제제 또는 진단제제와 항체 성분의 컨쥬게이트이다. 상기 진단제제는 방사성 또는 비방사성 표지, 조영제(자기공명영상화, 컴퓨터단층촬영(computed tomography), 또는 초음파에 적절한 조영제)를 포함하고, 방사성 라벨은 감마-, 베타-, 알파-, 오제 전자- 또는 양전자 방출 동위원소일 수 있다.
면역조절제는 본 발명에서 정의된 바와 같이 치료제제이며, 전형적으로 대식세포(macrophage), B-세포, 및/또는 T-세포와 같은 면역반응 캐스캐이드(immune response cascade)에서 증식하거나 활성화되는 면역세포를 자극한다. 상기 면역조절제의 예는 사이토카인이다. 당업자들은 인터루킨 및 인터페론이 T-세포 또는 기타 면역세포 활성을 자극하는 사이토카인의 일종임을 이해할 것이다.
또한 본 발명의 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)가 직접 또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 DNA, RNA, PNA 및 LNA는 상보적 서열을 갖는 물질과 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 중합체이므로 상기 DNA, RNA, PNA 또는 LNA를 연결시킨 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 유전자 스크리닝, 바이오센서 등에 사용될 수 있다.
상기 DNA, RNA, PNA 또는 LNA를 연결시킨 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 바이오칩, 바이오센서, 면역검출키트 또는 상보적 자기주소지정칩(complementary self-addressable chip)으로 활용하기 위하여 고체 지지체에 고정시켜 사용할 수 있다.
제2양태로서, 본 발명은 Fc 위치선택적 결합 펩티드 및 Fc 도메인 함유 분자를 포함한 하이브리드 분자를 제조하는 방법으로서, 본 발명에 따른 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 Fc 도메인 함유 분자와 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물에 광을 조사하여 광반응성 작용기를 통해 Fc 도메인의 특정부위가 Fc 위치선택적 결합 펩티드와 공유결합된 하이브리드 분자를 생성시키는 단계를 포함하는 것이 특징인 제조방법을 제공한다.
본 발명의 "Fc 도메인 함유 분자"는 Fc 도메인을 포함하여 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 의해 특이적으로 인식되어 인접 또는 결합할 수 있는 분자를 제한없이 포함한다. 상기 Fc 도메인 함유 분자는 Fc 도메인을 포함하는 단백질, 펩티드, 글리코프로틴, 글리코펩티드, 항체, 항체의 단편, 면역글로불린 또는 면역글로불린의 단편 등을 포함한다. 상기 항체 및 면역글로불린은 약 150 kDa의 이종 4분자체 당단백질(heterotetrameric glycoprotein)으로, 동일한 두 개의 경쇄 및 동일한 두 개의 중쇄를 포함한다. Fc 도메인을 포함하는 이의 단편은 항체 또는 면역글로불린에 파파인을 처리하여 얻은 경쇄 및 중쇄가 제거된 단편일 수 있다.
상기 공유결합된 하이브리드 분자를 생성시키는 단계에 사용되는 광은 자외선일 수 있으며, 바람직하게는 320 내지 370 nm 파장의 빛일 수 있고, 보다 바람직하게는 355 내지 365 nm 파장의 빛일 수 있다.
종래 항체와 약물을 결합시킨 하이브리드 분자를 제조하는 방법은 항체에 점돌연변이 등에 의해 하나 이상의 아미노산을 반응성 높은 시스테인으로 치환하고 화학반응을 이용하여 해당 자리에서 직접 또는 링커를 통해 약물과 결합시키는 방법이다. 따라서, 항체 수식을 위해 시스테인 잔기를 도입하기 위한 돌연변이에 의해 항체 자체의 항원에 대한 특이성 및 결합력이 저해될 수 있으며, 단위 항체 당 도입되는 약물의 갯수를 보장할 수 없다는 단점이 있다.
그러나, 본 발명에 따르면, Fc 위치선택적 결합 펩티드는 Fc 도메인의 예정된 특정부위에만 특이적으로 인접 또는 결합하고, 이에 따라 각각의 Fc 도메인의 특정부위에는 하나의 펩티드가 결합할 수 있으므로, 예정된 개수만큼, 예컨대 하나의 항체에 대해 2개의 Fc 위치선택적 결합 펩티드가 공유결합된 하이브리드 분자를 제조할 수 있다.
제3양태로서, 본 발명은 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드; 및 광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 Fc 도메인 함유 분자를 구비한 하이브리드 분자를 제공한다.
상기 Fc 도메인 함유 분자는 표적분자에 특이적으로 결합가능한 표적지향형 천연 또는 비천연 항체일 수 있다. 상기 항체의 종류는 Fc 도메인을 함유하고 표적물질에 특이적으로 결합가능한 한 제한되지 아니하며, 항체, Fc 도메인, 또는 이들의 단편 또는 이들의 유도체/유사체를 포함할 수 있다. 항체는 IgG인 것이 바람직하다.
항체 유도체는 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/블로킹기에 의한 유도, 단백질 분해, 세포내 리간드 또는 기타 단백질 등에 의해 변형된 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 임의의 다양한 화학적 변형이 특이적 화학적 분해, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 비고전 아미노산을 함유할 수 있다.
항체는 키메라, 인간화된 또는 인간 항체 등의 특정 재조합 항체뿐만 아니라, 폴리클론 및 단클론 항체를 모두 포함한다.
본 발명에서 항체는 수용체-특이적 항체 또는 리간드-특이적 항체일 수 있다. 본 발명에서 항체는 또한 리간드 결합을 방지하지 않으나 수용체 활성화를 방지하는 수용체-특이적 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 치료용 항체일 수도 있고, 별도의 치료제제 또는 진단제제와 결합할 수 있는 항체일 수도 있고, 치료 효과가 없는 표적화를 위한 항체일 수도 있고, 단순히 항원-항체 반응을 할 수 있는 항체일 수도 있다.
바람직하게, 상기 Fc 도메인 함유 분자는 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합 또는 이들의 Fc 영역일 수 있다.
제4양태로서, 본 발명은 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드; 광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 Fc 도메인 함유 분자; 및 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 직접 또는 링커를 통해 생물 활성 화합물이 결합된 약물복합체를 제공한다.
상기 생물 활성 화합물은 효소, 호르몬(Hormon), 사이토카인, 항체, 항체 단편, 진통제, 해열제, 항염증제, 항생 물질, 항바이러스(virus)제, 항진균약, 심장혈관약, 중추 신경 작용약, 신장 기능 및 전해질 대사 작용약 또는 화학 요법제일 수 있다. 상기 생물 활성 화합물의 구체적인 예시는 전술한 바와 같다.
본 발명의 약물복합체에서 상기 생물 활성 화합물은 직접 또는 링커를 통해 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 연결된다. 이때, 사용되는 링커는 종류에 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 탄소사슬(carbon chain) 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)일 수 있다. 보다 바람직하게는 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)일 수 있다. 상기 링커를 사용함으로 제조되는 약물복합체의 유연성 및/또는 수용성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 약물복합체는 단위 Fc 도메인 함유 분자에 대한 생물 활성 화합물의 몰 화학량 비는 1:1 이상으로 일정한 것이 특징인 균일한 약물복합체일 수 있다. 바람직하게는 1:2의 비율을 갖는 약물복합체일 수 있다. 상기 본 발명의 약물복합체는 Fc 도메인 중 예정된 특정부위에만 예정된 개수만큼 Fc 위치선택적 결합 펩티드가 공유결합된 약물복합체일 수 있다. 이때, 단위 Fc 도메인 함유 분자 당 복수개로 도입되는 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 서로 동일하거나 다른 것일 수 있다. 또한 상기 복수개로 도입되는 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 직접 또는 링커를 통해 연결된 서로 동일하거나 다른 생물 활성 화합물을 추가로 포함하는 약물복합체일 수 있다.
제5양태로서, 본 발명은 하이브리드 분자가 고체지지체에 결합된 바이오칩 또는 바이오센서에 있어서, 상기 본 발명의 하이브리드 분자는 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드; 및 광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 Fc 도메인 함유 분자를 구비하는 것이 특징인 바이오칩 또는 바이오센서를 제공한다.
상기 본 발명의 하이브리드 분자는 고체지지체에 고정되어 생물시료의 검출 및/또는 분석을 위한 바이오칩으로 사용될 수 있다. 상기 하이브리드 분자는 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 통해 고체지지체에 연결될 수 있다. 상기 고체지지체로 사용될 수 있는 기질은 바이오칩에 사용될 수 있는 것이라면 한정되지 않는다. 바람직하게는 별도의 처리를 하여 표면이 개질되거나 개질되지 않은 금, 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘, 변형된 실리콘 및 금속일 수 있다. 구체적으로 상기 고분자는 테트라플루오로에틸렌(tetrafluoroethylene), 폴리스티렌(polystyrene) 또는 폴리프로필렌(polypropylene)일 수 있으며, 상기 기판 상에 처리하여 표면을 개질시킬 수 있는 물질은 고분자, 플라스틱, 수지, 탄수화물, 실리카, 실리카 유도물질, 탄소, 금속, 무기 유리 및 막과 같은 물질일 수 있다. 상기 고체지지체는 지지체로서의 역할 뿐 아니라, 고정된 항체와 시료와의 반응을 위한 장소를 제공한다. 상기 고체지지체의 규격 및 그 위에 항체가 고정되는 위치, 크기 및 모양은 분석의 목적, 점적 기기(spotting machine) 및 스캐너 등의 분석기기에 따라 변화될 수 있다.
상기 본 발명의 바이오칩을 이용하여 생물시료를 검출 및/또는 분석하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로, 본 발명의 항원이 고정된 바이오칩에 생물시료, 바람직하게는 환자로부터 채취한 혈액 또는 채액 등과 반응시켜 검출할 수 있다. 상기 검출을 위하여 본 발명의 하이브리드 분자는 형광체 등의 표지물질을 추가로 구비할 수 있다.
상기 검출 대상이 되는 항원은 면역분석 방법에 의하여 검출 가능한 모든 생체활성물질(bioactive materials)로서 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 자가항체(autoantibody), 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 대상 시료는 어떤 처리도 거치지 않은 상태로 사용되거나 적당한 완충용액에 의해서 희석된 상태로 사용될 수 있다. 적당한 시간 동안 인큐베이션한 후, 포획항체와 미처 결합하지 못한 표적 물질 및 결합이 가능하지 않은 시료 내 다른 물질은 다음 단계 수행 전에 세척하여 제거하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
제5양태로서, 본 발명은 하기 화학식 6의 화합물, 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 6]
H-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Pcl-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-NH2
상기 Pcl은 포토루신, 포토메티오닌, 포토이소루신, 및 벤조페논 또는 아릴 아자이드가 직접 또는 링커를 통해 결합된 시스테인으로 구성되는 군으로부터 선택된 것임.
바람직하게 상기 화학식 6의 화합물은 분자 내 두 개의 Cys 잔기가 이황결합을 형성한 고리형태의 분자 또는 서로 독립적으로 존재하는 선형의 분자일 수 있다.
본 발명의 광반응성 작용기를 포함하는 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 직접 또는 링커를 통해 생물 활성 화합물을 연결할 수 있고, Fc 도메인의 특정부위에 특이적으로 인접 또는 결합가능하다. 또한 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 광조사시에는 인접 또는 결합된 Fc 도메인에 공유결합을 형성하여 견고한 복합체를 형성할 수 있다. 이때, Fc 위치선택적 결합 펩티드는 항원결합과는 무관한 항체의 Fc 도메인에 결합하므로, 형성된 복합체는 항체 고유의 항원특이성을 가지면서 Fc 도메인에 공유결합된 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 링커로 하여 생물 활성 화합물과 연결되므로, 표적지향적 약물전달체로 주목받고 있는 견고한 항체-약물 콘쥬게이트(antibody-drug conjugate)로 활용될 수 있다. 또한 항체의 배향성을 조절하여 항체 고유의 결합 특성을 유지하면서 높은 재현성을 가지고 항체를 고체지지체에 고정하는 기술로 검출 감도가 향상된 바이오칩 또는 바이오센서로 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시양태에 따른 (A) 생물 활성 화합물이 결합된 광반응성 작용기를 갖는 아미노산을 구비한 Fc 위치선택적 결합 펩티드 및 (B) 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드가 항체의 Fc 도메인에 결합된 하이브리드 분자의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시양태에 따른 광반응성 작용기를 갖는 아미노산을 구비한 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 화학 구조식을 나타낸 도이다. 상기 펩티드는 링커(파란색)를 통해 연결된 생물 활성 화합물(별)을 추가로 포함할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시양태에 따른 광반응성 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 고정화과정을 SPR로 모니터링한 결과를 나타낸 도이다. (A)는 광반응성-루신(leucine)-FcBP의 고정화 과정을, (B)는 광반응성-메티오닌(methionine)-FcBP의 고정화 과정을 나타내었다.
도 4는 본 발명의 일 실시양태에 따른 광반응성 Fc 위치선택적 결합 펩티드칩 상에 항체 농도를 증가시키면서 적용할 때, 칩 표면에 결합된 항체의 양을 검출한 결과를 나타낸 도이다. (A)는 광반응성-leucine-FcBP 칩에서의 항체 적용 과정을, (B)는 광반응성-methionine-FcBP 칩에서의 항체 적용 과정을 나타내었다. 그 결과 두 칩 모두에서 적용되는 항체의 농도가 증가함에 따라 결합되는 항체의 양도 증가하는 것을 확인하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시양태에 따른 두 가지 펩티드 칩에 있어서, 25℃에서 동일 농도의 인간 항체(Ig G)와 결합하는 과정을 굴절률 변화(sensogram)로 모니터링한 결과를 도이다. (A)는 광반응성-leucine-FcBP 칩에서의 항체 적용 과정을, (B)는 광반응성-methionine-FcBP 칩에서의 항체 적용 과정을 나타내었다.
도 6은 본 발명의 일 실시양태에 따른 광반응성 작용기를 갖는 아미노산을 구비한 Fc 위치선택적 결합 펩티드와 항체의 Fc 도메인을 이용한 바이오칩의 예이다.
도 7은 본 발명의 일 실시양태에 따른 광반응성 작용기를 갖는 아미노산을 구비한 Fc 위치선택적 결합 펩티드와 항체의 Fc 도메인이 공유결합된 하이브리드 분자의 검출결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 광반응성 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 제조
<펩티드의 합성>
하기 아미노산 서열을 갖는 광반응성 Fc 도메인 결합 펩티드(이하 '광반응성-FcBP' 또는 'FcBP*'로 표기)의 고체상 합성방법 및 N-말단에 링커가 도입된 FcBP 유도체를 합성하는 방법은 하기와 같다. 본 발명에 제시된 다른 펩티드 및 그의 유도체도 동일한 합성방법을 사용하여 제조하였다.
i) 화학구조
시스테인(cystein; Cys)은 분자 내 이황결합(disulfide bond)을 형성한 구조에서 최적의 효과를 가지나, 이황결합을 형성하지 않은 구조도 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명에 따른 광반응성 작용기를 포함하며 시스테인에 의한 분자 내 이황결합을 형성하는 광반응성 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 링커를 통해 생물 활성 화합물을 결합시킨 콘쥬게이션을 도 2에 나타내었다.
이하, Pcl은 광반응성 작용기를 나타낸다.
1.1. 광반응성-FcBP(FcBP * )
6Pcl-FcBP 또는
H-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Pcl-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-NH2
1.2. 아미노-dPEG 6 -FcBP * (amino-dPEG 6 -FcBP * )
1-아미노-dPEG6-아시도일-FcBP*(1-amino-dPEG6-acidoyl-FcBP*) 또는
1-아미노-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤네이코산-21-오일-FcBP*(1-amino-3,6,9,12,15,18-hexaoxaheneicosan-21-oyl-FcBP*) 또는
Figure pat00007

1.3. 히드라지도석신아미도일-dPEG 6 -FcBP * (hydrazidosuccinamidoyl-dPEG 6 -FcBP * )
26-히드라지닐-23,26-디옥소-4,7,10,13,16,19-헥사옥사-22-아자헥사코산-1-오일-FcBP*(26-hydrazinyl-23,26-dioxo-4,7,10,13,16,19-hexaoxa-22-azahexacosan-1-oyl-FcBP*) 또는
Figure pat00008

ii) 합성을 위한 기구 및 시약
펩티드 합성에 사용된 시약은 DMF(dimethylformamide), DCM(dichloromethane), DIPEA(N,N-diisopropylethylamine), 0.5 M 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-benzotriaxole-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate; HBTU) 함유 DMF, 0.5 M 히드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole; HOBt) 함유 DMF, 20% 피페리딘 함유 DMF이며, 하기 열거된 Fmoc-아미노산 블록 및 링커를 사용하여 C-말단 아미노산부터 고체상 펩티드 합성법에 따라 순차적으로 진행하였다.
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L-Pcl-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-amido-dPEG6-acid 및 4-(N'-Boc-hydrazino)-4-oxobutyricacid.
iii) 합성과정
방법 A. FcBP * 의 합성
하기 합성에 사용된 시약의 양은 0.25 mmole을 기준으로 한다. 0.5 g 클리어 아미드 수지(Clear amide resin, 0.5 mmole/g, Peptide International, USA)를 합성반응기에 넣고, 각각의 Fmoc-아미노산 블록은 1 mmole의 무게를 달아 합성하고자 하는 펩티드의 아미노산 서열 순서대로 C-말단으로부터 N-말단까지 준비하였다. 클리어 아미드 수지로부터 Fmoc 보호를 제거하고, Fmoc-아미노산을 활성화하여 클리어 아미드 수지에 활성화된 잔기를 결합시키는 반응을 C-말단 아미노산으로부터 순차적으로 진행하였다. Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 ml의 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 2 ml의 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 및 174 μl DIPEA와 혼합한 다음 수지가 담긴 반응기에 부어 2시간 동안 반응시켰다. 도입 여부의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며, 미반응으로 확인되면 도입반응을 1회 더 반복하거나 20% Ac2O 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 각각의 도입반응과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 전환하기 전 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척하였다. 상기 과정을 FcBP*의 펩티드 서열이 완성될 때까지 반복하였다. 합성이 끝난 후, 보호기로 보호된 FcBP*가 부착된 수지를 펩티드 반응기에서 건조하였고 중량을 측정하였다(H-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Pcl-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Clear Amide resin, 1.25 g).
방법 B. 아미노-dPEG 6 -FcBP * 의 합성
상기 방법 A에서 제조된 보호기로 보호된 FcBP*가 부착된 수지에서 펩티드의 N-말단에 간격링커를 도입하는 과정을 수행하였다. 이때, 사용한 링커는 FcBP*와 도입되는 생물 활성 화합물(예를 들어, 약물) 간에 5 내지 50 원자 또는 5 내지 50 Å의 거리를 유지할 수 있는 링커의 조합에서 선택할 수 있다. 본 발명에서는 22 원자길이 또는 23 Å의 거리를 유지시켜 주는 아미노-dPEG6-애시드(amino-dPEG6-acid, Peptide International, USA)를 간격링커로 사용하였다. 아미노-dPEG6-애시드의 도입은 일반적인 고체상 펩티드 합성법에 따라 진행하였다. 방법 A에서 제조된 펩티드가 부착된 수지 250 mg을 반응기에 넣고 DCM를 첨가하여 10분 이상 정치시켜 충분히 불린 후, 0.2 mmole의 Fmoc-아미노-dPEG6-애시드와 0.4 ml의 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 0.4 ml의 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 및 34.8 μl DIPEA를 5분간 혼합한 혼합액을 상기 수지가 담긴 반응기에 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 도입 여부의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며, 미반응으로 확인되면 도입반응을 1회 더 반복하거나 20% Ac2O 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 간격링커의 도입을 확인한 후 20% 피페리딘 함유 DMF 용액으로 처리(5분씩 3회)하고 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척한 다음 진공에서 건조시켰다(1-amino-3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosan-21-oyl-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Pcl-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Clear Amide resin, 262 mg).
방법 C: 히드라지도석신아미도일-dPEG 6 -FcBP * 의 합성
상기 방법 B에서 제조한 펩티드 수지에 간격링커가 도입된 dPEG6-FcBP*의 N-말단에 접합용 링커를 도입하는 과정을 수행하였다. 이때, 사용되는 접합용 링커는 히드라진(hydrazine) 또는 애시드 히드라지드(acid hydrazide)를 포함하는 링커들로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서는 숙신산 무수물(succinic anhydride)로부터 제조된 4-히드라지닐-4-옥소-부티르산(4-hydrazinyl-4-oxo-butyric acid)을 사용하였다. 4-히드라지닐-4-옥소-부티르산의 도입은 고체상 펩티드 합성법에 따라 진행하였다. 먼저 방법 A에서 제조된 수지 150 mg을 반응기에 넣고 DCM을 가하여 10분 이상 정치시켜 충분히 불려주었다. 0.1 mmole의 4-(N'-Boc-히드라지노)-4-옥소-부티르산(4-(N'-Boc-hydrazino)-4-oxo-butyric acid)을 0.2 ml의 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 0.2 ml의 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 및 17.4 μl DIPEA와 5분간 혼합하였다. 상기 혼합액을 미리 준비한 수지가 담긴 반응기에 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 도입 여부의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며, 미반응으로 확인되면 도입반응을 1회 더 반복하거나 20% Ac2O 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 접합용 링커의 도입을 확인한 후 20% 피페리딘 함유 DMF 용액으로 처리(5분씩 3회)하고 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척한 다음 진공에서 건조시켰다(26-hydrazinyl-23,26-dioxo-4,7,10,13,16,19-hexaoxa-22-azahexacosan-1-oyl--Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Pcl-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Clear Amide resin, 161 mg).
방법 D: 보호기의 제거와 수지의 분리
상기 방법 C에서 제조된 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA(trifluoroacetic acid), TIS, 물 및 EDT를 94:1:2.5:2.5의 비율로 혼합한 용액 2 ml과 실온에서 120분간 교반하여 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 절단 혼합물을 여과하여 수지를 제거하고 여과액을 질소가스로 약 1/2의 부피로 농축시킨 후 에테르를 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% ACN(acetonitrile)을 함유하는 수용액에 녹인 후 6시간 동안 교반하고 농축하였다.
농축액을 ACN과 0.1M 아세트산 암모늄(ammonium acetate)을 1:1로 혼합한 용액에 0.1 mg/ml의 농도로 녹인 후 공기에 노출된 상태로 24시간 동안 교반시켰다. 이황결합 형성 반응의 진행은 HPLC(high performance liquid chromatography)로 관찰하였으며, 반응이 멈춘 것으로 판단되면 반응액을 동결건조하여 펩티드 침전물을 수득하였다(순도 80% 이상, 31 mg).
방법 E: 펩티드 리간드의 정제
상기 방법 D에서 제조하여 동결건조한 펩티드 침전물을 prep-LC 1차 정제조건에서 분리한 다음 prep-LC 2차 정제조건으로 추가 정제하여 동결건조하였다. 구체적인 정제조건은 하기 표 2와 3에 나타내었다. 수득한 펩티드는 각각 98% 이상의 순도를 가짐을 분석용 HPLC를 이용하여 확인하였다. 더불어 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량분석기를 이용하여 합성된 펩티드의 분자량을 측정하였다(히드라지도석신아미도일-dPEG6-FcBP; MW=1991.89; M+1=1993.22).
Figure pat00009
Figure pat00010
방법 F. 약물 컨쥬게이션
Figure pat00011
생물 활성 화합물로 독소루비신(doxorubicin)을 사용하여 광반응성-FcBP와 콘쥬게이션시켰다. 상기 독소루비신과의 콘쥬게이션은 독소루비신의 13-케토(keto) 위치에서의 반응으로 FcBP*와 결합을 형성하였다. 구체적으로 각각 5 mg의 독소루비신과 히드라지드-dPEG6-FcBP*를 1 ml의 DMF에 녹였다. 37℃를 유지하면서 18시간 동안 혼합하고 MES 완충액(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer; 500 mM, pH 5.5, 1 ml)으로 희석시켰다. 희석액을 세파덱스 G-10 컬럼(Sephadex G-10 column)에서 MES 완충액을 용출액으로 사용하여 정제하였다(독소루비신 결합-dPEG6-FcBP*; MW=2517.05; M+1=2518.06).
방법 G: DNA 콘쥬게이션
Figure pat00012
상기 본 발명의 광반응성 FcBP와 DNA 콘쥬게이션을 제조하기 위하여 먼저 광반응성 FcBP에 DNA와의 결합을 위한 작용기를 도입하였다. 구체적으로 2-시클로옥틴-옥시아세트산(2-cyclooctyne-oxyacetic acid) 160 mg을 0.2 ml 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 0.2 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 및 17.4 μl DIPEA와 5분간 혼합한 후 상기 방법 B에서 제조한 수지가 담긴 반응기에 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 이후 상기 방법 D와 E를 이용하여 상기 화학식을 갖는 화합물을 제조하였다(2-시클로옥틴 결합-dPEG6-FcBP*; MW=2041.93; M+1=2043.32).
상기 제조된 2-시클로옥틴 결합-dPEG6-FcBP*를 아지도-표지된 DNA와 함께 DMF에 녹이고 상온에서 2시간 동안 정치하여 반응시킨 후, 형성된 DNA-dPEG6-FcBP*를 HPLC로 정제하였다. 상기 반응에 사용된 DNA는 (I) N3CH2CONH(CH2)6-OP(O)2O-AGCTGGCTATGGCTT와 (II) N3CH2CONH(CH2)6-OP(O)2O-AGCTGGCTATGGCTT로 바이오니아에서 구입한 DNA에 N3CH2COONHS를 반응시켜 제조하였다. 항체고정용 칩은 (I') TCGACCGATACCGAA-링커와 (II') TCGACCGATACCGAA-링커를 고체 칩 위에 고정시켜 제조하였다.
방법 H: 항체에 대한 DNA-dPEG 6 -FcBP * 콘쥬게이션의 결합
항체 1(항-AFP 항체)과 항체 2(항-PSA 항체)를 각각 DNA(I)-dPEG6-FcBP* 및 DNA(II)-dPEG6-FcBP*와 PBS 완충액에서 혼합한 후 5분간 360 nm의 자외선을 조사하여 항체-DNA 복합체를 형성하고 이를 이온교환수지(MONO Q)를 이용하여 정제하였다(DNA(I)dPEG6-FcBP*-항-AFP 및 DNA(II)-dPEG6-FcBP*-Herceptin). 상기 UV 조사에 의해 항체와 DNA-dPEG6-FcBP* 콘쥬게이션이 공유결합하는 과정을 도 1B에 도시화하였다.
상기 정제된 복합체를 방법 G에서 제작한 DNA 칩에 적용하여 상온에서 2시간 동안 반응시키고 과량의 항원을 PBS로 세척하여 제거하였다. Cy3로 표지된 AFP와 Cy5로 표지된 PSA를 칩에 적용하고 형광스캐너로 각각의 형광을 검출하여 항체 1과 항체 2가 각각 DNA(I) 및 DNA(II)와 콘쥬게이션된 광반응성 FcBP에 선택적으로 고정된 것을 확인하였다.
실시예 2: UV 조사에 의한 공유결합 형성에 따른 항체와 광반응성 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 결합력 측정
우선, 본 발명에 따른 광반응성 작용기로서 광반응성 아미노산을 포함한 Fc 위치선택적 결합 펩티드와 항체와의 결합력을 측정하였으며, 그 결과 광반응성 아미노산을 포함한 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 기존의 Fc 결합 펩티드와 유사한 항체에 대한 결합력을 갖는 것을 확인하였다.
실험예 1: 항체 결합력 측정을 위한 광반응성 Fc 위치선택적 결합 펩티드(광반응성-FcBP) 칩의 제작
광반응성 펩티드와 항체(IgG)의 결합 친화력(binding affinity)을 확인하기 위하여, 비아코어 3000(Biacore AB, Uppsala, Sweden) 장비를 사용한 표면 플라즈마 공명(surface plasma resonance; SPR) 분석으로 항체와 Fc 위치선택적 결합 펩티드(광반응성-FcBP)의 결합 해리상수를 측정하였다.
우선, SPR 분석을 위해 분석가능한 표면에 광반응성-FcBP를 고정시켰다. 광반응성-FcBP 칩의 제작 과정은 비아코어(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에서 공급하는 덱스트란 기질이 결합되어 있는 CM5 센서 칩(CM-5 Au)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 하기의 방법으로 수행하였다.
카르복시메틸화 덱스트란 표면에 200 mM 1-에틸-3-3-디메틸아미노 프로필카르보디이미드(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimide, EDC)(Sigma-Aldrich, USA) 및 50 mM NHS(N-hydroxysuccinimide)의 혼합수용액을 7 μl/min의 유속으로 7분 동안 주입하였다. 광반응성-FcBP는 우선 수용성 완충용액에 10 mg/ml의 농도로 녹인 후, 아세테이트 완충액으로 희석하여 100 μg/ml로 제조하고, 상기 희석된 광반응성-FcBP 용액 1 ml(pH 4.5, 10 mM)을 활성화된 SPR칩에 주입하여 덱스트란 표면에 광반응성-FcBP를 고정하였다. 또한 미반응하여 잔존하는 NHS 에스테르는 1 M 에탈올아민 염산염(ethanolamine hydrochloride, pH 8.5) 수용액으로 7분 동안 처리하여 불활성화 시킴으로써 광반응성-FcBP 칩 제작을 완성하였다. 위의 광반응성-FcBP 칩의 제작 과정은 비아코어3000(SPR 분석 장비)를 통하여 모니터링 하였으며 상기의 결과를 도 3에 나타내었다.
실험예 2: 제작된 광반응성-FcBP 칩을 이용한 항체 결합력 측정
제작된 칩 성능을 검사하기 위해 비아코어 SPR을 이용하여 상기 실험예 1에서 제조한 펩타이드 칩 표면에 실험실에서 보유한 인간 항체(Ig G)가 결합하는 과정을 굴절률 변화(sensogram)를 측정하여 모니터링 하였다.
구체적으로, 인간 항체 IgG를 25, 50, 100, 250, 500 및 1000 nM의 농도로 1X PBS 완충액에 희석하여 25℃에서 30 μl/min의 유속으로 칩 표면에 주입하였다. 광반응성 아미노산의 종류에 따라 (A) 광반응성-루신(leucine)-FcBP 칩 상에서 (B)광반응성-메티오닌(methionine)-FcBP 칩 상에서 항체와의 결합 정도는 약간의 차이를 보이지만 각각의 칩에 대해 적용한 항체의 농도에 비례하여 항체가 칩 표면에 결합하는 것을 결합된 항체 양의 증가로 확인할 수 있었으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다. 또한 동일한 농도의 항체를 처리하였을 때 (B) 광반응성- methionine-FcBP 칩에 비해 (A) 광반응성-루신-FcBP 칩 상에 보다 많은 항체가 결합하는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
각각의 항체 시료를 주입한 후, 분석 사이클 마지막 단계에선 칩의 표면을 20 mM NaOH로 1분간 세척함으로써 칩 표면을 재생시켰다. 결합된 항체의 양은 바탕값(background)으로 보정한 값에 대해, 칩 제조자로부터 제공된 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어를 사용하여 결합 상수를 산출하였다. 소프트웨어 내의 랭뮤어(Langmuir)(1:1) 모델에서 측정한 결과, 해리 상수(Kd)가 2±0.5 nM임을 확인하였다.
실험예 3: 광반응성-FcBP와 항체 간의 광반응성 결합 확인
상기 제작된 광반응성-FcBP 칩이 UV 조사에 의해 주입된 항체와 광반응성에 의해 공유결합을 형성하는지 확인하기 위해서 비아코어 3000(SPR 장비)을 이용하였다. 비아코어 3000은 장비의 특성상 골드칩 상에서 분자 간의 결합 정도를 수치로 확인하는 것이 가능하므로 광반응성-FcBP와 항체의 결합 정도를 수치화 할 수 있는 장점을 가지고 있다.
상기 실험예 2와 동일한 조건으로 즉, 25℃에서 30 μl/min의 유속으로 일정 농도의 인간 항체(Ig G)를 광반응성-FcBP 칩 표면 흘려주어 항체의 결합 과정을 굴절률 변화(sensogram)를 측정하여 모니터링하였고 비아코어 3000 상에서는 광반응 조건을 처리할 수 없기 때문에 장비로부터 광반응성-FcBP 칩을 분리하여 UV를 조사하였다. 상기 UV 조사 유무에 따라 기대되는 펩티드 칩 상에서의 반응은 도 6에 나타내었다.
우선 25℃의 정치 조건하에서 광반응성-FcBP 칩에 100 nM의 인간 항체시료를 주입한 후 5분간 인큐베이션하여 펩티드와 항체와의 특이적인 결합을 유도하였다. 상기 반응시킨 칩을 다시 검출기에 장착하고 20 mM NaOH를 흘려주면서 굴절률 변화(sensogram)를 모니터링하였다. 그 결과 실험예 2에서 광반응성-FcBP와 항체와 결합한 정도만큼 굴절률이 감소함을 확인할 수 있었다(도 7A).
다음으로 25℃의 정치 조건하에서 광반응성-FcBP 칩에 100 nM의 인간 항체시료를 주입한 후 5분간 자외선(UV)을 조사하면서 인큐베이션시켜 광반응에 의한 광반응성 펩티드와 항체의 공유결합을 유도하였다. 상기 반응시킨 칩을 다시 검출기에 장착하고 20 mM NaOH를 흘려주면서 굴절률 변화(sensogram)를 모니터링하였다. 그 결과 실험예 2에서 제조된 서로 다른 광반응성 아미노산을 포함하는 두 가지 칩에서 모두 110 내지 130 RU의 감소만을 확인할 수 있었다(도 7B).
따라서 UV를 조사하지 않은 조건에서는 항체와 펩타이드의 특이적 결합은 시간이 경과함에 따라하면 감소하고, 20 mM NaOH를 흘려주어 세척하였을 때 비공유결합으로 결합된 항체가 완전히 분리되어 제거됨을 확인할 수 있었다. UV를 조사하여 광반응을 유도한 조건에서는 20 mM NaOH를 흘려주어 세척함으로 비공유결합으로 결합된 물질을 제거했을 때에도 항체와의 결합을 계속 유지함을 확인할 수 있었다. 따라서, 광반응성 아미노산의 광반응에 의한 광반응성-FcBP와 항체 간의 공유결합이 형성되었음을 확인할 수 있었다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A site-selective binding peptide for IgG Fc and a hybrid molecule comprising the same <130> PA120631/KR <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 1 <400> 1 Cys His Lys Arg Ser Phe Trp Ala Asp Asn Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 2 <400> 2 Cys Arg Thr Gln Phe Arg Pro Asn Gln Thr Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 3 <400> 3 Cys Gln Leu Cys Asp Phe Trp Arg Thr Arg Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 4 <400> 4 Cys Phe Glu Asp Phe Asn Glu Gln Arg Thr Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 5 <400> 5 Cys Leu Ala Lys Phe Leu Lys Gly Lys Asp Cys 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 6 <400> 6 Cys Trp His Arg Arg Thr His Lys Thr Phe Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 7 <400> 7 Cys Arg Thr Ile Gln Thr Arg Ser His Trp Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 8 <400> 8 Cys Ile Lys Leu Ala Gln Leu His Ser Val Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 9 <400> 9 Cys Trp Arg His Arg Asn Ala Thr Glu Trp Cys 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 10 <400> 10 Cys Gln Asn Trp Ile Lys Asp Val His Lys Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 1 <400> 11 tgtcataaga ggagtttttg ggcggataat tgc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 2 <400> 12 tgtcgtacgc agtttcggcc taatcagact tgc 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 3 <400> 13 tgtcagctgt gcgacttctg gcgcactcga tgc 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 4 <400> 14 tgttttgagg attttaatga gcagaggact tgc 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 5 <400> 15 tgtcttgcga agtttttgaa ggggaaggat tgc 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 6 <400> 16 tgttggcata gacgaactca taagaccttc tgc 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 7 <400> 17 tgtcggacga ttcagacgag gtctcattgg tgc 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 8 <400> 18 tgtattaagt tggctcagct tcattctgtt tgc 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 9 <400> 19 tgttggaggc atcgtaatgc tactgagtgg tgc 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP 10 <400> 20 tgtcagaatt ggattaagga tgtgcataag tgc 33

Claims (30)

  1. 항체 Fc 도메인의 특정 부위에 특이적으로 인접 또는 결합가능한 Fc 위치선택적 결합 펩티드로서,
    상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 상기 Fc 도메인의 특정 부위에 인접 또는 결합하는 부위에 광반응성 작용기를 구비한 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    광조사시 상기 광반응성 작용기를 통해 Fc 위치선택적 결합 펩티드가 Fc 도메인의 특정부위에 공유결합될 수 있는 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드 내 광반응성 작용기를 갖는 아미노산은 포토루신, 포토메티오닌, 포토이소루신, 및 벤조페논 또는 아릴 아자이드가 직접 또는 링커를 통해 결합된 시스테인으로 구성되는 군으로부터 선택된 것인 Fc 도메인 결합 펩티드.
  4. 제1항에 있어서,
    광조사시 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합되는 Fc 도메인 내 부위는 아스파르트산(aspartic acid; Asp), 글루탐산(Glutamic acid; Glu), 펩티드 결합(peptide bonding) 또는 아미노산 측쇄인 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항체 Fc 도메인은 IgG의 Fc 도메인인 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드가 인접 또는 결합하는 Fc 도메인은 천연형이거나 비천연형 변이체인 것인 Fc 위치선택적 결합 펩티드.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 고체 지지체, 검출가능단, 조영제 또는 생물활성 화합물이 직접 또는 링커를 통해 연결되어 있는 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생물 활성 화합물이 치료제제 또는 진단제제인 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 치료제제 또는 진단제제는, 효소, 호르몬(Hormon), 사이토카인, 항체, 항체 단편, 진통제, 해열제, 항염증제, 항생 물질, 항바이러스(virus)제, 항진균약, 심장혈관약, 중추 신경 작용약, 신장 기능 및 전해질 대사 작용약, 화학 요법제로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 DNA, RNA, PNA 또는 LNA가 직접 또는 링커를 통해 연결되어 있는 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드.
  11. 제7항에 있어서,
    고체 지지체는 바이오칩, 바이오센서, 면역검출키트 또는 상보적 자기주소지정칩(complementary self-addressable chip)의 기재인 것이 특징인 Fc 위치선택적 결합 펩티드.
  12. Fc 위치선택적 결합 펩티드 및 Fc 도메인 함유 분자를 포함한 하이브리드 분자를 제조하는 방법으로서,
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 Fc 도메인 함유 분자와 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합물에 광을 조사하여 광반응성 작용기를 통해 Fc 도메인의 특정부위가 Fc 위치선택적 결합 펩티드와 공유결합된 하이브리드 분자를 생성시키는 단계를 포함하는 것이 특징인 하이브리드 분자 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 광은 자외선인 것이 특징인 하이브리드 분자 제조방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 하이브리드 분자는 Fc 도메인 중 예정된 특정부위에만 예정된 개수만큼 Fc 위치선택적 결합 펩티드가 공유결합된 것이 특징인 하이브리드 분자 제조방법.
  15. 제12항에 있어서,
    2종 이상의 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 사용하여, Fc 도메인 함유 분자 단량체 당 2종 이상의 Fc 위치선택적 결합 펩티드가 공유결합된 하이브리드 분자를 제조하는 것이 특징인 하이브리드 분자 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    2종 이상의 생물 활성 화합물이 각각 결합된 2종 이상의 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 사용하여, Fc 도메인 함유 분자에 2종 이상의 생물 활성 화합물이 결합된 하이브리드 분자를 제조하는 것이 특징인 하이브리드 분자 제조방법.
  17. (i) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 Fc 위치선택적 결합 펩티드; 및
    (ii) 광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 Fc 도메인 함유 분자
    를 구비한 하이브리드 분자.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 Fc 도메인 함유 분자는 표적분자에 특이적으로 결합가능한 표적지향형 천연 또는 비천연 항체인 것이 특징인 하이브리드 분자.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 Fc 도메인 함유 분자는 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합 및 이들의 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 하이브리드 분자.
  20. (i) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 Fc 위치선택적 결합 펩티드;
    (ii) 광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 Fc 도메인 함유 분자; 및
    (iii) 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 직접 또는 링커를 통해 생물 활성 화합물이 결합된 약물복합체.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 생물 활성 화합물이 치료제제 또는 진단제제인 것이 특징인 약물복합체.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 치료제제 또는 진단제제는 효소, 호르몬(Hormon), 사이토카인, 항체, 항체 단편, 진통제, 해열제, 항염증제, 항생 물질, 항바이러스(virus)제, 항진균약, 심장혈관약, 중추 신경 작용약, 신장 기능 및 전해질 대사 작용약, 화학 요법제로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 약물복합체.
  23. 제20항에 있어서,
    단위 Fc 도메인 함유 분자에 대한 생물 활성 화합물의 몰 화학량 비는 1:1 이상으로 일정한 것이 특징인 균일한 약물복합체.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 약물복합체는 Fc 도메인 중 예정된 특정부위에만 예정된 개수만큼 Fc 위치선택적 결합 펩티드가 공유결합된 것이 특징인 약물복합체.
  25. 제20항에 있어서,
    복수개로 도입되는 Fc 위치선택적 결합 펩티드는 서로 동일하거나 다른 것이 특징인 약물복합체.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 복수개로 도입되는 Fc 위치선택적 결합 펩티드에 직접 또는 링커를 통해 연결된 생물 활성 화합물은 서로 동일하거나 다른 것이 특징인 약물복합체.
  27. 하이브리드 분자가 고체지지체에 결합된 바이오칩 또는 바이오센서에 있어서,
    상기 하이브리드 분자는
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 Fc 위치선택적 결합 펩티드; 및
    광조사에 의해 상기 Fc 위치선택적 결합 펩티드의 광반응성 작용기를 통해 공유결합된 Fc 도메인 함유 분자를 구비하는 것이 특징인 바이오칩 또는 바이오센서.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 고체지지체는 금, 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘, 변형된 실리콘 및 금속으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 바이오칩 또는 바이오센서.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 하이브리드 분자는 Fc 위치선택적 결합 펩티드를 통해 고체지지체에 연결된 것이 특징인 바이오칩 또는 바이오센서.

  30. 하기 화학식 6의 화합물, 이의 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 6]
    H-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Pcl-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-NH2
    상기 Pcl은 포토루신, 포토메티오닌, 포토이소루신, 및 벤조페논 또는 아릴 아자이드가 직접 또는 링커를 통해 결합된 시스테인으로 구성되는 군으로부터 선택된 것임.
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