JP3619282B2 - ＩｇＧＦｃ部結合タンパク質をコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部分と特異的に結合するタンパク質であるＩｇＧＦｃ部結合タンパク質（ＦｃγＢＰ：Ｆｃγ ＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎおよびＩｇＧＦｃＢＰと記載することもある）をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養して得られる組換えタンパク質の製造方法、ならびに上記方法で得られる組換えＩｇＧＦｃ部結合活性を示すタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マクロファージは免疫担当細胞の１つとして、生体外から侵入してきた異物やそのイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）複合体を貧食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）により細胞内に取り込み、消化し、またリンパ球による抗体産生を誘起させるために、抗原提示作用を示す能力も有する。このような貧食機構の主たる入口がマクロファージの細胞表面上に存在するＩｇＧのＦｃレセプター（Ｆｃγレセプター：ＦｃγＲ）である。ＦｃγレセプターはＩｇＧのＦｃ部を結合するレセプターであるが、その本来の機能は、ＩｇＧによっておおわれた（オプソニン化）病原体あるいは抗原−ＩｇＧ免疫複合体を除去することにある。
【０００３】
従来Ｆｃγレセプターには大別して３種類の存在が知られており、これらはＲＩ、ＲＩＩ ＲＩＩＩと名付けられている（Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｊ．−Ｐ．Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１），９：４５７−４９２）。これらのレセプターはいずれもすでにそのｃＤＮＡがクローニングされている。さらに、１９９０年〜１９９１年にはいくつかのグループによって、これらＦｃγレセプターに会合しており、Ｆｃγレセプターがその結合物を内部に取り込むために必要な動きを始めるためのタンパク質が見いだされ、スイッチ機構の糸口が明らかにされた（Ｌ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ，Ｇ．Ｙｕ ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９），３４２：８０３−８０５；Ｔ．Ｋｕｒｏｓａｋｉ ａｎｄ Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９），３４２：８０５−８０７；Ｄ．Ｇ．Ｏｒｉｏｆｆ，Ｃ．Ｒａ，Ｓ．Ｊ．Ｆｒａｎｋ，Ｒ．Ｄ．Ｋｌａｕｓｎｅｒ ａｎｄ Ｊ．−Ｐ．Ｋｉｎｅｔ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９），３４７：１８９−１９１；Ｐ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｃ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｔ．Ｍａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｒｉｔｚ ａｎｄ Ｓ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０），８７：２２７４−２２７８；Ｔ．Ｋｕｒｏｓａｋｉ，Ｉ．Ｇａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１），８８：３８３７−３８４１；Ｌ．Ａｚｚｏｎｉ，Ｍ．Ｋａｍｏｕｎ，Ｔ．Ｗ．Ｓａｌｃｅｄｏ，Ｐ．Ｋａｎａｋａｒａｊ ａｎｄ Ｂ．Ｐｅｒｕｓｓｉａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２），１７６：１７４５−１７５０；Ａ．Ｔ．Ｔｉｎｇ，Ｌ．Ｍ．Ｋａｒｎｉｔｚ，Ｒ．Ａ．Ｓｃｈｏｏｎ，Ｒ．Ｔ．Ａｂｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐ．Ｊ．Ｌｅｉｂｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２），１７６：１７５１−１１７５５）。
【０００４】
一方、小林らはヒト小腸および大腸上皮細胞、特にゴブレット細胞にＩｇＧのＦｃ部と特異的に結合でき、かつ従来のＦｃγレセプターとは異なるタンパク質ＦｃγＢＰの存在を報告した。このタンパク質のＩｇＧＦｃ部との特異的結合はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識物を用いて確認されている。すなわち、ＦｃγＢＰはＩｇＧのＦｃ部とのみ結合し、ＩｇＧＦａｂ、ＩｇＡ、ＩｇＭとは結合しない。またＦｃγＢＰはＦｃγレセプターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ抗体と交差反応しない（Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｊ．Ｂｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｗ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９），１４３：２５６７−２５７４）。
【０００５】
さらに、彼らはＦｃγＢＰをヒト大腸上皮細胞から部分精製し、これを抗原としてマウスモノクローナル抗体を作製した。これらの抗体とＦｃγＢＰが結合するだけでなく、マウスＩｇＧとも結合することが確認された（Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．Ｈａｍａｄａ，Ｍ．Ｊ．Ｂｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｗ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１），１４６：６８−７４）。
【０００６】
また、部分精製ＦｃγＢＰをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）電気泳動した後、モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析に付したところ、ＦｃγＢＰは分子量７８ｋＤａのタンパク質を含む２００ｋＤａ以上の会合体を形成していることが明らかとなった（Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．Ｈａｍａｄａ，Ｍ．Ｊ．Ｂｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｗ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１），１４６：６８−７４）。
【０００７】
【発明が解決すべき課題】
上記ＦｃγＢＰはＩｇＧのＦｃ部と結合できるという点においてはＦｃγレセプターと同様の性質を示す。しかしながら、ＦｃγＢＰのタンパク質としての定性、構造およびその生体内の役割については何ら明らかではなかった。したがって、ＦｃγＢＰを解析し、その構造と機能を明らかにすることは極めて興味深い。
【０００８】
さらに後述するように、ＦｃγＢＰは粘液とともに粘膜上に分泌され、ＩｇＧ抗体とともに、体内に侵入しようとする病原菌やウイルスなどを粘液中にトラップし、体外に排泄し易くすることで、感染防御の一端をになっていると推定される。また、炎症の起こった粘膜で過剰に産生された自己抗体は、補体系を活性化したり、マクロファージなどによる細胞障害を起こさせたりして、炎症の悪化につながるが、ＦｃγＢＰはこのような自己抗体のＦｃ部をブロックして炎症の進展を防ぐと推定される。このようなＦｃγＢＰの機能から感染防御剤、および潰瘍性大腸炎やクローン病などの自己免疫疾患に対する抗（消）炎症剤や診断薬などの医薬用途に利用できる可能性を有している。
【０００９】
そこでＦｃγＢＰをこのような医薬用途に用いるにはこれを大量にかつ均一に得る必要があった。しかしながら、ＦｃγＢＰを動物組織自体、またはその産生細胞の培養上清から単離する方法では大量に均一なＦｃγＢＰを得ることは困難であった。したがって、遺伝子組換え技術を用いてＦｃγＢＰを大量に製造することが望まれていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＦｃγＢＰに対するモノクローナル抗体を用いてＦｃγＢＰのｃＤＮＡのクローニングを行って、ＦｃγＢＰをコードする遺伝子の塩基配列を明らかにすることに成功した。
【００１１】
また、このｃＤＮＡを適当なベクターに挿入して得られる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られる形質転換体を培養し、次いで産生された目的タンパク質を分離、精製したところ、産生タンパク質はヒトＩｇＧと特異的に結合する性質を有していた。これによりＦｃγＢＰを大量かつ均一に製造することができることも明らかにした。
【００１２】
したがって、本発明はＦｃγＢＰをコードする遺伝子を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ＦｃγＢＰをコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ＦｃγＢＰをコードする遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された原核もしくは真核宿主細胞を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ＦｃγＢＰをコードする遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換して得られた形質転換体を培養し、産生された目的タンパク質を分離、精製することを特徴とする、ＦｃγＢＰの製造方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、上記製造方法で製造されたＩｇＧＦｃ部結合活性を示すタンパク質を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、ＦｃγＢＰをコードする遺伝子またはその一部を、ＦｃγＢＰｍＲＮＡの合成組織を同定するためのノーザンブロット解析法またはインサイチュハイブリダイゼーション法のプローブとして使用する方法を提供する。
【００１８】
【具体的な説明】
ＦｃγＢＰをコードするｃＤＮＡは、例えばＦｃγＢＰを産生する細胞などからｍＲＮＡを調製した後、既知の方法により二本鎖ｃＤＮＡに変換することにより得られる。ｍＲＮＡの供給源としては、本発明ではヒト大腸粘膜上皮細胞を用いたが、これに限らず、ヒト小腸、十二指腸、胃、顎下腺、舌下腺、総胆管、気管支などのＦｃγＢＰが分布している組織のホモジェネートなどを用いてもよい。また、ヒト大腸癌細胞由来ＨＴ２９−１８−Ｎ２株およびその亜種はＦｃγＢＰを産生していることが知られているので、これらの株化細胞をｍＲＮＡの供給源として用いてもよい。
【００１９】
ｍＲＮＡを調製するには、例えば本発明で用いたように、ＡＧＰＣ法（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９，１９８７）の改変法の他、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５２９４−５２９９，１９７９）の方法にしたがって、全ＲＮＡを調製できる。また、他の生理活性タンパク質の遺伝子をクローン化するときに用いられた方法、例えばバナジウム複合体などのリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノール処理を行うことによっても実施することができる
こうして得られたｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを得るには、例えばｍＲＮＡを鋳型にして、３’末端にあるポリＡ−鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）またはランダムプライマー、あるいはＦｃγＢＰのアミノ酸配列の一部に相応する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして逆転写反応を行い、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。
【００２０】
本発明では、Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎの改良法を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製またはＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製のｃＤＮＡ合成キットとランダムプライマーを用いて、ポリアデニル化ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを作製した。
【００２１】
このｃＤＮＡにアダプターを連結させた後、λｇｔ１１ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。このようにして作製したｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のファージｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングキットＧｉｇａｐａｃｋＩＩＧｏｌｄを用いて、λファージにパッケージングした後大腸菌に発現させた。発現したｃＤＮＡのタンパク質をモノクローナル抗体をプローブとしてスクリーニングを行った。
【００２２】
上記クローニングに用いる抗体は、ＩｇＧＦｃとＦｃγＢＰとの間の結合を阻害する３種類のモノクローナル抗体（Ｋ９、Ｋ１０、Ｋ１７）（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４６：６８−７４，１９９１；Ｋｏｂａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５６７−２５７４，１９８９）の中から、ウエスタンブロット解析においてＦｃγＢＰを検出できる抗体を選択した。すなわち、非還元条件下ではＫ９抗体で分子量約２００ｋＤａより大きいバンドが、還元条件下ではＫ１７抗体で７０−８０ｋＤａと１３０−１４０ｋＤａにバンドがそれぞれ認められた。以上の結果より、クローニングにはこの２種の異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を用いた。
【００２３】
このスクリーニングの結果、Ｋ９抗体では、約１００万個のクローンより１個のクローン（プローブＱと命名：６００ｂｐ）を、またＫ１７抗体では、約６０万個のクローンより７個のクローン（そのうちの７００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブＡと命名；６００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブＢと命名）を得た。
【００２４】
プロープＱを用いて既知タンパク質のｍＲＮＡと比較することによって、ＦｃγＢＰ ｍＲＮＡのサイズを推定した。その結果、ＦｃγＢＰ ｍＲＮＡの分子サイズは約１７ｋｂｐであると推定された（図１）。
【００２５】
次いでプローブＱ、ＡおよびＢを用いてλｇｔ１０にパッケージングした第２ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。まずプローブＡ、ＢまたはＱのいずれかとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンを分離した。これらのうちから、Ａとのみハイブリダイズするクローンを得て、Ａとは反対側の末端部をプローブＸとして、プローブＸ（約７００ｂｐ）とハイブリダイズするｃＤＮＡクローンを分離した。得られたクローンはＸを中心部にし、一端にＡ−Ｂ領域をもっており、これをＸ１と命名した。続いて、クローンＸ１のＡ−Ｂ領域とは反対側の部分約８００ｂｐをプローブＹとして、再びｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、プローブＹとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンを得た。このクローンをＹ１と命名した。クローンＹ１は一端にＸ領域の一部を有し、中心部にＹ領域を有する。このクローンＹ１のＸ領域とは反対側の端にある約１５０ｂｐをプローブＹ１５０とした。再びｃＤＮＡライブラリーをプローブＹ１５０を用いてスクリーニングした。この中からＹ１５０領域と反対側に最も長く伸びたクローンを選び、クローンＣ７２とした。次に、クローンＣ７２がもつＹ１５０領域とは反対側の端近くにある約４５０ｂｐをプローブＺとし、プローブＺとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンを分離した。これらの中からクローンＣ７２と重複しない部分ができるだけ長いものを分離し、クローンＮＺ４とした。
【００２６】
一方、Ａ、ＢおよびＱのいずれともハイブリダイズするｃＤＮＡクローンの中から、Ａ−Ｂ領域の塩基配列がクローンＸ１のＡ−Ｂ領域の塩基配列と同一のものを選び出し、これをクローンＶ１１とした。
【００２７】
以上の５個のクローン、Ｘ１、Ｙ１、Ｃ７２、ＮＺ４およびＶ１１の塩基配列を決定し、タンパク質のアミノ酸配列を確認したところ、ＡＴＧを開始コドンとする１本のオープンリーディングフレームを見いだした（図２参照）。
【００２８】
さらに、これらのクローンからＦｃγＢＰをコードする部分ｃＤＮＡ（約７．８ｋｂｐ）を得て、その塩基配列を決定した（配列番号６に塩基配列およびアミノ酸配列を示す）。
【００２９】
さらに、上記プローブＡ、ＢまたはＱを用いたハイブリダイゼーションによるスクリーニングで得られた複数のｃＤＮＡクローンをそれぞれ大腸菌内で増幅した後、プローブＡ、Ｂ、Ｑを用いてマッピングを行った。その結果、ＦｃγＢＰのｃＤＮＡは全長１６．４ｋｂｐの中に３．５ｋｂｐをユニットとする単位（プローブＡ、Ｂ、Ｑのそれぞれと相同な配列がＡ→Ｂ→Ｑの順に連なった単位）がタンデムに複数回繰り返した構造を有することが推定された。
【００３０】
そこでプローブＢとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンについて、プローブの塩基配列の一部をＰＣＲにより増幅させ、得られたフラグメントの塩基配列を解析することにより、ＦｃγＢＰの全長ｃＤＮＡは図８に示す構造を有し、配列表の配列番号７に示す塩基配列とアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
【００３１】
このようにして得られたクローン化されたＦｃγＢＰをコードする遺伝子は適当なベクターに組み込むことにより、原核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質転換することができる。
【００３２】
さらに、これらのベクターに適当なプロモーターや形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現することが可能である。また、目的とする遺伝子に他のポリペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質として発現させ、精製を容易にしたり、発現量を上げたり、また精製工程において適当な処理を施すことにより、目的タンパク質を切り出すことも可能である。
【００３３】
一般に、真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子で知られているように、多形現象を示すと考えられ、この多形現象によって１個またはそれ以上のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。
【００３４】
また、配列表の配列番号６または７あるいはその一部に示すアミノ酸配列中の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠くかまたは付加したポリペプチド、あるいはアミノ酸が１個またはそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでもＩｇＧＦｃへの結合性を有することがある。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシステインに相当する塩基配列をセリンに相当する塩基配列に変換して得られたポリペプチドがＩＬ−２活性を保持することも既に公知になっている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４３１，１９８４）。
【００３５】
また、真核細胞で発現させた場合、その多くは糖鎖が付加されるが、アミノ酸を１個ないしそれ以上変換することにより糖鎖付加を調節することができるが、この場合でもＩｇＧＦｃ部結合活性を有することがある。それゆえ、本発明におけるＦｃγＢＰの遺伝子を人工的に改変したものを用いて、得られたポリペプチドがＩｇＧＦｃ部結合活性を有する限り、それらのポリペプチドをコードする遺伝子はすべて本発明に含まれる。
【００３６】
さらに、得られたポリペプチドがＩｇＧＦｃ部結合活性を有し、配列番号６または７あるいはその一部に示す遺伝子とハイブリダイズする遺伝子も本発明に含まれる。なお、ハイブリダイゼーション条件は、通常行われているプローブハイブリダイゼーションの条件を適用することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）
【００３７】
以上のように、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部分と特異的に結合するタンパク質を発現できるＤＮＡであれば、配列表の配列番号６または７に示すアミノ酸をコードする塩基配列に限らず、種々の修飾体のＤＮＡが本発明に含まれるし、またその機能を有するＤＮＡ断片も本発明の遺伝子の一部であることは明白である。
【００３８】
本発明の発現ベクターは、複製起源、選択マーカー、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどを含む。
【００３９】
本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌などが挙げられる。また、真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例えばイースト、粘菌が挙げられる。あるいは、Ｓｆ９などの昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよい。さらに、動物細胞由来の宿主細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞および３Ｔ３細胞などが挙げられる。
【００４０】
以上のようにして目的とするＦｃγＢＰをコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養し、産生されたＩｇＧＦｃ部結合活性を有するタンパク質は細胞内または細胞外から分離し、精製することができる。
【００４１】
なお、本発明の目的タンパク質であるＩｇＧＦｃ部結合活性を有するタンパク質の分離、精製には実施例に記載する方法に限定されることなく、通常のタンパク質で用いられる分離、精製方法を使用することができる。例えば、各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩析、透析などを適宜選択、組み合わせて使用することができる。
【００４２】
かくして得られた組換えタンパク質が天然型ＦｃγＢＰと同様のヒトＩｇＧとの結合活性を有するかを検討したところ、ヒトＩｇＧＦｃと特異的に結合することが明らかとなった。
【００４３】
上記したように、本発明のＦｃγＢＰの全長ｃＤＮＡは図８に示す構造を有し、配列表の配列番号７に示す塩基配列とアミノ酸配列を有するものであるが、さらに本発明で用いた一連のｃＤＮＡが単一のｍＲＮＡに由来するものであることを以下のようにして再確認した。すなわち、発現に用いた５’末端ｃＤＮＡを含むｐＮＶ１１ＳＲとは別のリピート構造内のｃＤＮＡ断片をタンパク質発現させ、ＦｃγＢＰを認識するモノクローナル抗体であるＫ９およびＫ１７と反応させたところ、これらのｃＤＮＡ産物がＫ９とＫ１７のいずれかまたは両方により認識されることを確認した。
【００４４】
さらに、ＦｃγＢＰのｍＲＮＡの発現の組織特異性を試験したところ、ヒト胎盤における発現が確認された。したがって、本発明のＦｃγＢＰをコードする遺伝子またはその一部をプローブとして用いて、ノーザンブロット解析またはインサイチュハイブリダイゼーションによってＦｃγＢＰ ｍＲＮＡの合成組織を同定することができる。
さらに、ＦｃγＢＰの染色体遺伝子上の多型性の存在を制限酵素の利用により示し得た。
【００４５】
本発明のＦｃγＢＰをコードする遺伝子を得る方法、該遺伝子を有する組換えベクターおよびこれを含有する形質転換体ならびに該形質転換体を培養して得られる目的タンパク質、ならびにそれぞれの製造方法について、以下の実施例で詳細に説明するが、この実施例によって本発明が限定されるものではない。
【００４６】
【実施例】
実施例１：モノクローナル抗体を用いたＦｃγＢＰをコードする部分ｃＤＮＡのクローニング（Ａ：ｃＤＮＡライブラリーの作製）
（１）ヒト大腸粘膜上皮細胞の調製
ヒト大腸組織片を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地でよく洗浄した後、粘膜筋板の部位から機械的に剥離させ、上皮細胞と粘膜固有層を分離した。これを中心棒に固定するようにして、１０％ＦＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）中で氷冷しながら９０分間スターラーで激しく撹拌し、上皮細胞を分離した。上皮細胞を含む溶液を１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞の沈殿を得た。
【００４７】
（２）ｍＲＮＡの精製
粘膜上皮細胞からの全ＲＮＡの抽出はＡＧＰＣ法（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９８７）１６２：１５６−１５９）を改変して行った。すなわち、細胞ペレット１ｍｌに対し、９ｍｌの変性溶液（４Ｍチオシアン酸グアニジン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）、０．５％サルコシル、０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール）を加え、細胞を溶解した後、１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、１０ｍｌの水飽和フェノール溶液、２ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）を順次加えた。１０秒間撹拌し、１５分間氷冷した後、１０，０００×ｇで１５分間遠心し、上清を回収した。上清８ｍｌに対し、同様に０．８ｍｌの酢酸ナトリウム、８ｍｌの水飽和フェノール、１．６ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコールを加え、１０秒撹拌、１５分氷冷、１０，０００×ｇで１５分間遠心し、上清を回収した。上清７ｍｌに対し、等量のクロロホルム／イソアミルアルコールを加え撹拌後、遠心分離により上清を得た。上清に対し、等量のイソプロパノールを加え、−２０℃で３０分間冷却後、１０，０００×ｇで１５分間遠心し、全ＲＮＡの沈殿を回収した。
【００４８】
全ＲＮＡ１ｍｇの溶液に溶出バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）を加え、全量で１ｍｌとした後、ＯｌｉｇｏＴｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（宝酒造社製）１ｍｌを加え、６５℃で５分間加熱し、氷上で３分間急冷した。５Ｍ ＮａＣｌ ０．２ｍｌを加え、３７℃で１０分間保温した後、１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を注意深く除去した。ペレットを洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ）２．５ｍｌに懸濁した後、１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を注意深く除去した。ペレットを滅菌水１ｍｌに懸濁し、６５℃で５分間加熱し、氷上で３分間急冷した。１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を回収した。５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌと２．５ｍｌのエタノールを加えた後、−２０℃で３０分冷却し、遠心（３，０００ｒｐｍ、４℃）して、ポリアデニル化ＲＮＡの沈殿を回収した。
【００４９】
（３）ｃＤＮＡの合成
ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（Ｕ．Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｊ．Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：２６３）の改良法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製またはＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製のｃＤＮＡ合成キットを用いて行った。すなわち、大腸粘膜上皮細胞より調製したポリアデニル化ＲＮＡ５μｇを４２℃にて９０分間、５０ユニットのヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ユニットのＡＭＶ逆転写酵素、ピロリン酸ナトリウムを含む緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）５０μｌ中で、７５０ｎｇのランダムベキサヌクレオチドまたは４μｇのオリゴ（ｄＴ）プライマーと共にインキュベートした。この反応液５０μｌを４．０ユニットの大腸菌リボヌクレアーゼＨ、１１５ユニットの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを含む緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）中で、１２℃で６０分間、次いで２２℃で６０分間反応させた後、７０℃で１０分間インキュベートした。氷中に戻し、１０ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを加え、３７℃で１０分間反応させた後、１０μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を加えて反応を停止させた。反応液２５０μｌに対し、等量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムと、４倍量のエタノールを加え、撹拌後、−２１℃にて３０分間冷却し、遠心分離によりｃＤＮＡを回収した。ｃＤＮＡを１０μｌの滅菌水に溶かし、１μｌを用いて０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、合成の確認と濃度の定量を行った。
【００５０】
（４）アダプターの連結
上記（３）で得た合成ｃＤＮＡに対して１０倍量のモル比となるようにアダプター（ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター、宝酒造社製）を加え、全体量の８倍量のライゲーション溶液Ａ（ライゲーションキット、宝酒造社製）と１倍量のライゲーション溶液Ｂ（ライゲーションキット、宝酒造社製）を加えた。十分撹拌した後、１６℃で３０分間インキュベートし、アダプターをｃＤＮＡへ連結させた。
【００５１】
この反応液をＴＡＥ緩衝液系で１％の低融点アガロースゲル（Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅアガロース、宝酒造社製）で電気泳動を行い、０．５ｋｂｐ以上のｃＤＮＡ画分を含むゲルを回収した。この操作により、ｃＤＮＡに結合しなかったアダプターも同時に除いた。回収したゲルの湿重量に対し、２倍量のＴＥ緩衝液を加え、６５℃で１０分間保温し、アガロースゲルを溶解した後、全体量に対し等量のトリス飽和フェノールを加え、十分に撹拌後、氷冷した。遠心分離により水相を回収し、等量のトリス飽和フェノール処理を再び行った。遠心分離により水相を回収し、最後に等量のクロロホルムを加え、十分撹拌後遠心分離した。その後、水相を回収し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２０μｇのグリコーゲン（ベーリンガーマンハイム社製）、２．５倍量のエタノールを加え、−２０℃で３０分間冷却した後、１５，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心し、ｃＤＮＡの沈殿を得た。
【００５２】
（５）λｇｔ１１ライブラリーの作製
上記（４）で得たアダプターを連結したｃＤＮＡを９６μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＴＰからなる溶液に溶解し、４０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃で６０分間インキュベーションし、アダプターの５’末端をリン酸化した。反応終了後、２００μｌのＴＥ緩衝液を加え、３００μｌのトリス飽和フェノールを加え、撹拌後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、室温、２分間）により上清を回収した。同様の遠心分離処理をトリス飽和フェノール・クロロホルム（１：１）溶液、続いて２％イソアミルアルコールを含むクロロホルム溶液によって行い、最終的に２５０μｌの上清を得た。この上清に２５０μｌの４Ｍ酢酸アンモニウム溶液、１２５０μｌのエタノールを加え、−２０℃、３０分間冷却後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）により沈殿を回収した。ｃＤＮＡの沈殿に１μｇのＥｃｏＲＩ消化脱リン酸λｇｔ１１アーム（＃２３４２１１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を加え、終濃度１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３００ｍＭ ＮａＣｌの溶液５μｌに溶解した。ライゲーション溶液Ｂ（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒造社製）を５μｌ加え、十分撹拌した後、２６℃で１０分間反応させた。ｃＤＮＡをλファージにパッケージするために、ｃＤＮＡを含むライゲーション反応液４μｌを、１０μｌのＦｒｅｅｚｅ／Ｔｈａｗ抽出液（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩｇｏｌｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に加え、直ちにＳｏｎｉｃ抽出液（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ ｇｏｌｄ）を加え、ゆっくり撹拌した。２２℃にて２時間インキュベーションした後、５００μｌのファージ希釈用溶液（５ｇ ＮａＣｌ、２ｇ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５０ｍｌ １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍｌ ２％ゼラチン／リットル）と、１０μｌのクロロホルムを加え、インビトロパッケージング反応を終了した。このファージ溶液は４℃に保存し、スクリーニングに用いた。
【００５３】
実施例２：モノクローナル抗体を用いたＦｃγＢＰをコードする部分ｃＤＮＡのクローニング（Ｂ：抗体を用いたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
（１）スクリーニング
実施例１で作製した、λファージにパッケージングをした大腸粘膜上皮細胞のｃＤＮＡライブラリーの１×１０^４ｐｆｕ、２００μｌを、一晩培養した大腸菌株Ｙ１０９０γ⁻ ２００μｌと混ぜ合わせ、３７℃で１５分間インキュベーションした。ＬＢ培地を混合した０．８％トップアガロースを溶解した後、５５℃に保温したもの５ｍｌをファージと大腸菌のプレインキュベーション液に加えて混ぜ合わせ、１．５％ ＬＢアガロースプレート（１０×１４ｃｍ）上に均一に広げた。４２℃のインキュベーター中にて３．５時間保温し、小さなプラークが確認された後、あらかじめ１０ｍＭ ＩＰＴＧをしみこませた後風乾させておいたナイロン強化ニトロセルロースフィルター（＃ＢＡ−Ｓ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｎｅｌｌ社製）を重ね、３７℃にて３．５時間保温した。フィルターをプレートからはがし、洗浄液（０．０５％ ＴＷｅｅｎ−２０、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ）中、室温で３０分間振とうした。次に、５％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）中、室温で３０分間振とうし、ブロッキング処理を行った後、洗浄液にて２０分間、２回洗浄した。次いで、大腸粘膜上皮細胞中のＦｃγＢＰに対して作製されたマウスモノクローナル抗体（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）１４６：６８−７４；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８９）１４３：２５６７−２５７４）であるＫ９またはＫ１７を含むハイブリドーマ培養上清を、ニトロセルロース膜１枚に対し５ｍｌに浸し、室温で２時間振とうした後、洗浄液で２０分間、２回洗浄した。洗浄液にて１／１０００倍に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ抗血清（ザイメット社製）中、室温で１時間振とうした後、洗浄液で２０分間、２回洗浄した。ＴＷｅｅｎ−２０を含まないＴＢＳ溶液で１０分間洗浄した後、５０ｍｌのジアミノベンチジン溶液（１ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２））と、５０ｍｌの０．０２％ Ｈ_２Ｏ_２溶液と５０μｌの８％ ＮｉＣｌ_２溶液の混合液に浸し、陽性プラークの検出を行った。
【００５４】
（２）λＤＮＡの抽出
Ｋ９モノクローナル抗体を用いたスクリーニングにより、約１００万個のプラーク中から１個の約６００塩基対の挿入ｃＤＮＡを含むクローンを得た。このプラークをつまようじでピックアップして、２００μｌの培地（２０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２％マルトース、５μｌのＹ１０９０γ⁻大腸菌株の一晩培養懸濁液を含むＬＢ培地）で、λファージを３７℃、４時間培養した。このファージを含む培養液２μｌ（１×１０^７ｐｆｕ／μｌ）を、１０ｍｌ ＬＢ培地（２０ｍＭＭｇＳＯ_４と０．２５ｍｌのＹ１０９０γ⁻大腸菌株の一晩培養懸濁液を含む）に添加、感染させ、３７℃、５時間振とう培養し、λファージを増殖させた。
【００５５】
５〜６時間培養後、溶菌を確認してから、５０μｌのクロロホルム、２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、３７℃、１０分間振とうした。３，５００ｒｐｍ、１５分間遠心した上清に対して１０％となるようポリエチレングリコール６０００を加え、氷上で３０〜６０分置いた後、４℃、４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ファージを沈殿させた。沈殿を１ｍｌのＡ緩衝液（０．５％ ＮＰ−４０、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１２５ｍＭ ＫＣｌ、３．６ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、６０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に懸濁し、１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ、２０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩと共に３７℃、３０分間インキュベートした。Ａ緩衝液と等量のクロロホルムを加え、撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、２分間、室温で遠心分離し、上清を回収した。再び同量のクロロホルムを加えて同様に遠心分離して上清を回収した。その後、上清液に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌプロテアーゼＫとなるようにそれぞれ添加し、５５℃、６０分間インキュベートした。λＤＮＡを精製するため、定法通り順次フェノール処理、フェノール／クロロホルム処理、クロロホルム処理を行い、ＤＮＡａｓｅ、プロテアーゼなどを失活させた後、１／２０量の５Ｍ ＮａＣｌと１倍量のイソプロパノールを加え、ｃＤＮＡフラグメントが挿入されたλＤＮＡの沈殿を得た。
【００５６】
（３）プローブＤＮＡの作製
上記（２）で精製したｃＤＮＡフラグメントを含むλＤＮＡからＢａｍＨＩ制限酵素部位を用いて挿入ＤＮＡを切り出し、第２ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのプローブ（これをプローブＱと命名した）とした。
【００５７】
同様の方法で、Ｋ１７モノクローナル抗体を用いて得られた７個のλクローンのうち最長の挿入部（約１３００塩基）をもつクローンよりＢａｍＨＩによって切り出される７００塩基と６００塩基のＤＮＡプローブを得た。このうちＫ１７抗体のエピトープをコードするｃＤＮＡを含むと推定される７００塩基のＤＮＡ断片をプローブＡ、６００塩基の断片をプローブＢとし、第２ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。
【００５８】
（４）ノーザンブロッティング
抗体によるスクリーニングによって得られたＡ、Ｑの各プローブが同一のｍＲＮＡとハイブリダイズすることをノーザンブロットにより確認した。
【００５９】
大腸粘膜上皮細胞よりＡＧＰＣ法により抽出した全ＲＮＡ１５μｇを４．５μｌの滅菌水に溶かした後、２μｌの５×ＭＯＰＳ緩衝液、３．５μｌのホルムアルデヒド、１０μｌのホルムアミドと混合し、６０℃、１５分間熱変性した後、ホルムアルデヒド存在下で１％アガロースゲル上で電気泳動した。電気泳動終了後、ＲＮＡをナイロン膜（バイオダインＡ、ポール社製）へキャピラリー法にて一晩トランスファーを行った。ＵＶ架橋によりＲＮＡをナイロン膜に固定した後、１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ホルムアミド、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ）中にて４２℃、８時間、プレハイブリダイゼーションを行った。
【００６０】
次に抗体スクリーニングにより得られたプローブＡおよびＱを各々、α［^３２Ｐ］ｄＣＴＰを用い、メガプライムラベリングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）によって放射性標識した。各プローブ１×１０^８ｄｐｍを各々、５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液と共にプレハイブリダイゼーション処理したナイロン膜に加え、密封した後、４２℃、一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロン膜の洗浄は０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを含む溶液中で、６５℃、４０分間の洗浄操作を３回繰り返し行った。ナイロン膜を乾燥後、Ｘ線フィルムに一晩露光した。
【００６１】
以上の方法より、プローブＡおよびＱを用いて推定約１７ｋｂｐのバンドが一本それぞれ検出され、２種類のプローブが分子量的に同一のｍＲＮＡとハイブリダイズすることを確認した。
【００６２】
実施例３：ＦｃγＢＰをコードするｃＤＮＡの第２のクローニング（Ａ：ｃＤＮＡライブラリーの作製）
（１）ヒト大腸粘膜上皮細胞の調製
ヒト大腸組織片を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地でよく洗浄した後、粘膜筋板の部位から機械的に剥離させ、上皮細胞と粘膜固有層を分離した。これを中心棒に固定するようにして、１０％ＦＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）中で氷冷しながら９０分間スターラーで激しく撹拌し、上皮細胞を分離した。上皮細胞を含む溶液を１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞の沈殿を得た。
【００６３】
（２）ｍＲＮＡの精製
粘膜上皮細胞からの全ＲＮＡの抽出はＡＧＰＣ法（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９８７）１６２：１５６−１５９）を改変して行った。すなわち、細胞ペレット１ｍｌに対し、９ｍｌの変性溶液（４Ｍチオシアン酸グアニジン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）、０．５％サルコシル、０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール）を加え、細胞を溶解した後、１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、１０ｍｌの水飽和フェノール溶液、２ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）を順次加えた。１０秒間撹拌し、１５分間氷冷した後、１０，０００×ｇで１５分間遠心し、上清を回収した。上清８ｍｌに対し、同様に０．８ｍｌの酢酸ナトリウム、８ｍｌの水飽和フェノール、１．６ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコールを加え、１０秒撹拌、１５分氷冷、１０，０００×ｇで１５分間遠心し、上清を回収した。上清７ｍｌに対し、等量のクロロホルム／イソアミルアルコールを加え撹拌後、遠心分離により上清を得た。上清に対し、等量のイソプロパノールを加え、−２０℃で３０分間冷却後、１０，０００×ｇで１５分間遠心し、全ＲＮＡの沈殿を回収した。
【００６４】
全ＲＮＡ１ｍｇの溶液に溶出バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）を加え、全量で１ｍｌとした後、ＯｌｉｇｏＴｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（宝酒造社製）１ｍｌを加え、６５℃で５分間加熱し、氷上で３分間急冷した。５Ｍ ＮａＣｌ ０．２ｍｌを加え、３７℃で１０分間保温した後、１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を注意深く除去した。ペレットを洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ）２．５ｍｌに懸濁した後、１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を注意深く除去した。ペレットを滅菌水１ｍｌに懸濁し、６５℃で５分間加熱し、氷上で３分間急冷した。１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を回収した。５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌと２．５ｍｌのエタノールを加えた後、−２０℃で３０分冷却し、遠心（３，０００ｒｐｍ、４℃）して、ポリアデニル化ＲＮＡの沈殿を回収した。
【００６５】
（３）ｃＤＮＡの合成
ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎの改良法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製またはＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製のｃＤＮＡ合成キットを用いて行った。すなわち、大腸粘膜上皮細胞より調製したポリアデニル化ＲＮＡ５μｇを４２℃にて９０分間、５０ユニットのヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ユニットのＡＭＶ逆転写酵素、ピロリン酸ナトリウムを含む緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）５０μｌ中で、７５０ｎｇのランダムヘキサヌクレオチドまたは４μｇのオリゴ（ｄＴ）プライマーと共にインキュベートした。この反応液５０μｌを４．０ユニットの大腸菌リボヌクレアーゼＨ、１１５ユニットの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを含む緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）中で、１２℃で６０分間、次いで２２℃で６０分間反応させた後、７０℃で１０分間インキュベートした。氷中に戻し、１０ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを加え、３７℃で１０分間反応させた後、１０μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を加えて反応を停止させた。反応液２５０μｌに対し、等量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムと、４倍量のエタノールを加え、撹拌後、−２０℃にて３０分間冷却し、遠心分離によりｃＤＮＡを回収した。ｃＤＮＡを１０μｌの滅菌水に溶かし、１μｌを用いて０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、合成の確認と濃度の定量を行った。
【００６６】
（４）アダプターの連結
上記（３）で得た合成ｃＤＮＡに対して１０倍量のモル比となるようにアダプター（ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター、宝酒造社製）を加え、全体量の８倍量のライゲーション溶液Ａ（ライゲーションキット、宝酒造社製）と１倍量のライゲーション溶液Ｂ（ライゲーションキット、宝酒造社製）を加えた。十分撹拌した後、１６℃で３０分間インキュベートし、アダプターをｃＤＮＡへ連結させた。
【００６７】
この反応液をＴＡＥ緩衝液系で０．８％の低融点アガロースゲル（Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅアガロース、宝酒造社製）で電気泳動を行い、約４ｋｂｐ以上のｃＤＮＡ画分を含むゲルを回収した。この操作により、ｃＤＮＡに結合しなかったアダプターも同時に除いた。回収したゲルの湿重量に対し、２倍量のＴＥ緩衝液を加え、６５℃で１０分間保温し、アガロースゲルを溶解した後、全体量に対し等量のトリス飽和フェノールを加え、十分に撹拌後、氷冷した。遠心分離により水相を回収し、等量のトリス飽和処理を再び行った。遠心分離により水相を回収し、最後に等量のクロロホルムを加え、十分撹拌後遠心分離した。その後、水相を回収し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２０μｇのグリコーゲン（ベーリンガーマンハイム社製）、２．５倍量のエタノールを加え、−２０℃で３０分間冷却した後、１５，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心し、ｃＤＮＡの沈殿を得た。
【００６８】
（５）λｇｔ１０ライブラリーの作製
上記（４）で得たアダプターを連結したｃＤＮＡを９６μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＴＰからなる溶液に溶解し、４０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃で６０分間インキュベーションし、アダプターの５’末端をリン酸化した。反応終了後、２００μｌのＴＥ緩衝液を加え、３００μｌのトリス飽和フェノールを加え、撹拌後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、室温、２分間）により上清を回収した。同様の遠心分離処理をトリス飽和フェノール・クロロホルム（１：１）溶液、続いて２％イソアミルアルコールを含むクロロホルム溶液によって行い、最終的に２５０μｌの上清を得た。この上清に２５０μｌの４Ｍ酢酸アンモニウム溶液、１２５０μｌのエタノールを加え、−２０℃、３０分間冷却後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）により沈殿を回収した。ｃＤＮＡの沈殿に１μｇのＥｃｏＲＩ消化脱リン酸λｇｔ１０アーム（＃２３３２１１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を加え、終濃度１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３００ｍＭ ＮａＣｌの溶液５μｌに溶解した。ライゲーション溶液Ｂ（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒造社製）を５μｌ加え、十分撹拌した後、２６℃で１０分間反応させた。ｃＤＮＡをλファージにパッケージするために、ｃＤＮＡを含むライゲーション反応液４μｌを、１０μｌのＦｒｅｅｚｅ／Ｔｈａｗ抽出液（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩｇｏｌｄ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に加え、直ちにＳｏｎｉｃ抽出液（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ ｇｏｌｄ）を加え、ゆっくり撹拌した。２２℃にて２時間インキュベーションした後、５００μｌのファージ希釈用溶液（５ｇ ＮａＣｌ、２ｇ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５０ｍｌ １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍｌ ２％ゼラチン／リットル）と、１０μｌのクロロホルムを加え、インビトロパッケージング反応を終了した。このファージ溶液は４℃に保存し、スクリーニングに用いた。
【００６９】
実施例４：ＦｃγＢＰをコードする全長ｃＤＮＡのクローニング（Ｂ：ＤＮＡプローブを用いたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
（１）ブロッティング
λファージにパッケージングを行った大腸粘膜上皮細胞のｃＤＮＡ（２×１０^４ｐｆｕ）を、一晩培養した大腸菌株Ｃ６００ｈｆｌ ２００μｌに感染させた後、３７℃で１５分間保温した。５５℃に保温した０．８％トップアガロース／ＬＢ培地を加えた後直ちにＬＢプレート（１０×１４ｃｍ）上に広げた後、３７℃にて１２時間インキュベートした。プラークの直径が１ｍｍ程度になったところで、ナイロン膜（ＢｉｏｄｙｎｅＡ、孔径０．２μｍ，ポール社製）を重ね、４℃、１０分間冷却した。ナイロン膜をプレートよりはがし、ブロッティング溶液Ｉ（０．５Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌ）、ブロッティング溶液ＩＩ（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））、ブロッティング溶液ＩＩＩ（０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ＤＨ７．４）、１．５Ｍ ＮａＣｌ）で各々５分間処理した後、ＵＶクロスリンク装置（ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ２４００，ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて１２００μジュールにてＤＮＡをナイロン膜に固定した。
【００７０】
（２）ハイブリダイゼーション
λＤＮＡを固定したナイロン膜１枚当り、１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ）を加え、ハイブリダイゼーションバッグに密封した後、４２℃で８時間プレハイブリダイゼーションを行った。次に、抗体スクリーニングにより得られたプローブＱ，Ａ，Ｂを各々α［^３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いてランダムプライミング法により放射性標識した。プローブＱ，Ａ，Ｂの各１×１０^８ｄｐｍを５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液と共にプレハイブリダイゼーションの終了したナイロン膜に加え、密封後、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。インキュベーションの終了後、ナイロン膜を０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液で６５℃４０分間洗浄する操作を３回くり返した後、Ｘ線フィルムに一晩露光した。
【００７１】
以上のスクリーニングにより、プローブＡ，Ｂ，Ｑの１種または、複数とハイブリダイズする６９個のラムダクローンを得た。それぞれから、前述の通りの方法でλＤＮＡを調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後、電気泳動し、挿入ＤＮＡのサイズの確認を行った。
【００７２】
実施例５：ＦｃγＢＰｍＲＮＡのサイズ推定
実施例２で得たプローブＱを用いてＦｃγＢＰｍＲＮＡのサイズを推定した。比較のための既知タンパク質のｍＲＮＡとして、１４．０ｋｂｐのＤｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｍＲＮＡ（Ｍ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５３：２１９−２２８）と、１５．２ｋｂｐのＲｙａｎｏｄｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍＲＮＡ（Ｆ．Ｚａｒｚａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．，２６５：２２４４−２２５６）を用いた。これらの対照ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡプローブは、いずれも文献から得られる塩基配列をもつ合成プローブを調製し、これらを用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法により作製し、それぞれプローブＤＹＳおよびプローブＲＤＲとした。
【００７３】
Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｍＲＮＡとＲｙａｎｏｄｉｎｅ ＲｅｃｅｐｔｏｒｍＲＮＡの供給源はヒト骨格筋ポリアデニル化ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）である。
【００７４】
大腸粘膜上皮細胞より得られたポリアデニル化ＲＮＡ２μｇまたはヒト骨格筋ポリアデニル化ＲＮＡ１μｇ、あるいは両者の混合物を実施例２の（４）と同様の方法で電気泳動を行い、ナイロン膜上にトランスファーした。このナイロン膜をプローブＱを用いてハイブリダイゼーションを行い、オートラジオグラフィーにより検出した。
【００７５】
次いで同じ膜で対照ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを行うため、このナイロン膜を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ＤＨ７．５）、１．２５ｍＭＥＤＴＡ、３ｘＳＳＣ、１ＸＤｅｎｈａｒｄ’ｓ溶液、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドを含む溶液２０ｍｌとともに、７０℃、１時間インキュベーションした。次いで、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液で室温、１０分間振とうし洗浄する操作を２回行った。その後、ナイロン膜でオートラジオグラフィーを行い、バンドの消失されたこと（デハイブリダイゼーション）を確認した。
【００７６】
次に、上記と同様の方法にて、プローブＤＹＳによるハイブリダイゼーションを行い、オートラジオグラフィーにより検出した。このナイロン膜を上記と同様の方法でデハイブリダイゼーションを行った後、オートラジオグラフィーでバンドの消失されたことを確認した。最後にプローブＲＤＲによるハイブリダイゼーションを同様に行い、オートラジオグラフィーによるバンドの検出を行った。
【００７７】
以上の結果より得られたＤｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｍＲＮＡ、Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍＲＮＡの各バンドの移動度を分子サイズに対してプロットを行い、標準曲線を得て、ＦｃγＢＰｍＲＮＡの移動度よりその分子サイズを約１７ｋｂｐと推定した（図１）。
【００７８】
実施例６：ＦｃγＢＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列の決定（１）
ＩｇＧＦｃ部結合能をもつタンパク質のアミノ酸配列をコードする領域の塩基配列を決定するために、上記実施例４で得られた６９個のλクローンの中から、必要な５個のクローンを以下の方法で選択し、ＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で塩基配列を決定した。
【００７９】
（１）クローンＸ１
プローブＡ、ＢおよびＱとのハイブリダイゼーションによるスクリーニングにより得られたｃＤＮＡクローンの中で、プローブＱおよびＢとはハイブリダイズせず、プローブＡとのみハイブリダイズするクローンを得た。このクローンの挿入ｃＤＮＡの中でプローブＡとは反対側の末端でＥｃｏＲＩとＳｍａＩによって切り出される約７００ｂｐのフラグメントを回収し、これをプローブＸとした。次に、プローブＸを用いて実施例３と同様の方法でｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、プローブＸおよびプローブＡ、ＢとハイブリダイズするクローンＸ１を得た。そして、クローンＸ１の挿入部ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により約３３００ｂｐのＤＮＡを分離した後回収し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、制限酵素地図の作製および塩基配列の決定を行った。
【００８０】
（２）クローンＹ１
クローンＸ１のｃＤＮＡの中で、プローブＢを含む部分とは反対側でＥｃｏＲＩとＳａｃＩによって切り出される約８００ｂｐのフラグメントを回収し、これをプローブＹとした。プローブＹを用いて実施例３と同様の方法でｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、得られたクローンのうち、最長のｃＤＮＡをもつクローンであるクローンＹ１を得た。そして、クローンＹ１の挿入部ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により約１９００ｂｐのＤＮＡを分離した後回収し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、制限酵素地図の作製および塩基配列の決定を行った。
【００８１】
（３）クローンＣ７２
クローンＹ１のｃＤＮＡの中で、プローブＸを含む部分とは反対側でＳａｃＩとＳｐｈＩによって切り出される約１５０ｂｐのフラグメントを回収し、これをプローブＹ１５０とした。プローブＹ１５０を用いて実施例３と同様の方法でｃＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡサイズが２から４ｋｂｐのもの）のスクリーニングを行い、９個のクローンを得た。得られたクローンの挿入ｃＤＮＡ部分の中で、Ｙ１５０を境としてＹ領域とは反対側に最も長く伸び、かつＹ１５０を含むｃＤＮＡを得て、これをクローンＣ７２とした。そして、クローンＣ７２の挿入部ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により約１２００ｂｐのＤＮＡを分離した後回収し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、制限酵素地図の作製および塩基配列の決定を行った。
【００８２】
（４）クローンＮＺ４
クローンＣ７２の挿入部ｃＤＮＡの中で、プローブＹ１５０を含む部分とは反対側でＥｃｏＲＩとＳａｃＩによって切り出される約４５０ｂｐのフラグメントを回収し、これをプローブＺとした。ヒト大腸癌由来培養細胞ＨＴ２９−１８−Ｎ２株を用いて、実施例３（２）−（５）と同様の方法でλｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリーを作製し、プローブＺを用いて実施例３と同様にスクリーニングを行い、４個のクローンを得た。得られたクローンのうち、Ｃ７２と重複しない部分を最も長く含むクローンＮＺ４を得た。そして、クローンＮＺ４の挿入部ｃＤＮＡをＮｏｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により約９００ｂｐのＤＮＡを分離した後回収し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、制限酵素地図の作製および塩基配列の決定を行った。
【００８３】
（５）クローンＶ１１
プローブＡ、ＢおよびＱによるスクリーニングでいずれともハイブリダイズするｃＤＮＡクローンのプローブＡ、Ｂとハイブリダイズする部分の塩基配列を解析し、先に塩基配列を決定したクローンＸ１の末端側にあるＡ−Ｂ領域と同一の塩基配列をもつクローンを得て、クローンＶ１１とした。クローンＶ１１の挿入部ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により約３７００ｂｐのＤＮＡを分離した後回収し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、制限酵素地図の作製および塩基配列の決定を行った。
【００８４】
実施例７：クローンＮＺ４がＦｃγＢＰ ｍＲＮＡの５’末端近傍であることの推定
実施例６で得られた５種のクローンがＮＺ４−Ｃ７２−Ｙ１−Ｘ１−Ｖ１１の順に５’末端方向または３’末端方向に向かって伸展しているが、それらの塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、５’末端方向へ伸びていることが推定された。そこで、現在最上流に位置するクローンＮＺ４ＤＮＡをプローブとしてランダムプライミングで作製したライブラリーをスクリーニングしたところ、１３種の独立したクローンが得られたが、ＮＺ４よりも５’側に伸長したクローンは得られなかった。また、ＮＺ４の塩基配列をアミノ酸へ翻訳したところ、オープンリーディングフレーム上、予想される最も５’上流に位置するメチオニンに対するＡＴＧコドン近傍はＫｏｚａｋ則に類似していたため、このＡＴＧが開始メチオニンである可能性が示唆された。しかし、このＡＴＧコドンの最初のＡは、クローンＮＺ４では僅か９番目に位置し、その９塩基内にはｉｎ ｆｒａｍｅにストップコドンは存在しないことから転写産物のみならず翻訳レベルでも５’（Ｎ末端）方向へｃＤＮＡの配列が伸長している可能性を否定できない。したがって、プライマーエクステンション法により転写開始部位の検証ならびに翻訳開始部位を推定する目的で以下の実験を行った。
【００８５】
（１）全ＲＮＡとポリアデニル化ＲＮＡの調製
ヒト大腸粘膜上皮細胞およびＨＴ２９−１８−Ｎ２細胞から、実施例１の（２）または実施例３の（２）と同様に全ＲＮＡとポリアデニル化ＲＮＡを調製した。
【００８６】
（２）エクステンションプライマーの合成
２種のプライマー、プライマー１：ＧＣＴＧＡＴＡＧＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴ−５０ｍｅｒ、プライマー２：ＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡＧＧ−３３ｍｅｒは、ＤＮＡ合成機（Ｍｏｄｅｌ ３９４、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて合成し、ＯＰＣカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて精製した。各プライマー１００ｐｍｏｌをγ［^３２Ｐ］ＡＴＰにてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより末端ラベルし、Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ^ＴＭＳ−２００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により精製し、各０．５ｐｍｏｌを各反応に用いた。
【００８７】
（３）プライマーアニーリングとエクステンション反応
ヒト大腸粘膜上皮細胞およびＨＴ２９−１８−Ｎ２由来の全ＲＮＡ（２０μｇ）とポリアデニル化ＲＮＡ（２．５μｇ）をそれぞれプライマーとアニーリングバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ ＫＣｌ）中で混合し、９５℃、５分間加熱変性し、５８℃、１時間、さらに室温または３７℃で１．５時間インキュベートすることによりハイブリダイゼーションを行った。続いて、エクステンション反応を行うため、アニーリングサンプルをエタノール沈殿し、この沈殿をＲＴａｓｅバッファー（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、２０ｍＭ ＫＣｌ、１３．３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１３．３ｍＭ ＤＴＴ、０．３３ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５０μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ）に溶解後、２０ｕｎｉｔの逆転写酵素（ＲＮａｓｅＨ−ｆｒｅｅ ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ、ＴＯＹＯＢＯ社製）を加え、４２℃、１時間インキュベートした。反応後、９５℃で３分処理しＲＴａｓｅを失活させた後、１０μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅＡを加え、３７℃、３０分間インキュベートしてテンプレートＲＮＡを分解した。その後フェノール／クロロホルム、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を順次行った後、５％のシークエンスゲルにて泳動し、泳動後ゲルは固定液（１０％酢酸、１５％メタノール）で処理し、乾燥後オートラジオグラフィーを行った。なお、マーカーとしてＭ１３ｍｐ１８をシークエナーゼｖｅｒ２．０ ＤＮＡシークエンシングキット（ＴＯＹＯＢＯ社製）で反応させたものを用いた。
【００８８】
以上の方法により次に述べる結果が得られた。いずれの全ＲＮＡ標品をテンプレートとして用いても、プライマー１でのエクステンションの結果、プライマーより１１８塩基付近の位置に強いバンドが見られ、またいずれのポリアデニル化ＲＮＡ標品をテンプレートに用いたものでも１１８塩基付近だけでなく、１５７塩基付近の位置に弱いエクステンションバンドが見られた。現在最も５’側のクローンと考えられるＮＺ４の５’末端を便宜上＋１とすると、これらはそれぞれ＋２７、−１３に相当した。この＋２７でエクステンション反応が止まった理由として、ＮＺ４の５’末端近傍の２次構造の形成を予測させるパリンドロミックな構造が存在することが挙げられる。事実できるだけそうした２次構造を抑える目的で合成したより５’側にあるプライマー２での結果では−１０から−１６付近にかけて強いブロードなバンドが、さらに−２３に相当する位置に弱いシングルバンドが検出された。そして、−２３より高分子領域にはバンドは検出されなかった。
【００８９】
以上の結果から、ＮＺ４の５’末端より１０から２０塩基上流付近に転写開始部位の存在が示唆され、この範囲にｉｎ ｆｒａｍｅでのＡＴＧコドンが存在しない場合には現在ＯＲＦ上最も５’端にあるＡＴＧが翻訳開始部位である可能性が強く推定された。これらの事実はクローンＮＺ４がＮＺ４−Ｃ７２−Ｙ１−Ｘ１−Ｖ１１の順で極めてＮ末端に近いことを示している。
【００９０】
実施例８：発現ｃＤＮＡ／ベクター系の構築（Ａ：発現に用いた部分ｃＤＮＡの調製）
タンパク質発現のために、ＦｃγＢＰの部分ｃＤＮＡの挿入されたλＤＮＡクローン（＃ＮＺ４、＃Ｃ７２、＃Ｙ１、＃Ｘ１、＃Ｖ１１）を、ＥｃｏＲＩまたはＮｏｔＩにて切断した後、挿入部のｃＤＮＡを還状プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）へサブクローニングし、それぞれｐＮＺ４、ｐＣ７２、ｐＹ１、ｐＸ１、ｐＶ１１と命名した。
【００９１】
（１）ｐＮＺ４：λクローン（＃ＮＺ４）をＮｏｔＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動にて約９００ｂｐの挿入部を分離・精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＮｏｔＩ部位に結合させた。ｃＤＮＡのタンパク質コードストランドの５’→３’方向がプラスミド中のＬａｃＺ遺伝子の方向と逆向きに挿入されたクローンを選択した。挿入部の全塩基配列を配列番号１に示す。
【００９２】
なお、本発明の塩基配列表においては、ｃＤＮＡ由来の塩基配列を大文字で、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）由来の塩基配列を小文字で、また合成アダプターおよび合成オリゴヌクレオチド由来の塩基配列を小文字のアンダーラインでそれぞれ示した。
【００９３】
また、アミノ酸配列は、Ｋｏｚａｋ配列と一致するＡＴＧを開始コドンとし、塩基配列よりユニバーサルコドンにより推定した配列を示した。
【００９４】
（２）ｐＣ７２：λクローン（＃Ｃ７２）をＥｃｏＲＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動にて約１３００ｂｐの挿入部を分離・精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に結合させた。ｃＤＮＡの５’→３’方向がプラスミド中のＬａｃＺ遺伝子の方向と逆向きに挿入されたクローンを選択した。挿入部の全塩基配列を配列番号２に示す。
【００９５】
（３）ｐＹ１：λクローン（＃Ｙ１）をＥｃｏＲＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動にて約１９００ｂｐの挿入部を分離精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に結合させた。同じサイズのＤＮＡ挿入部をもつクローンを選択した。挿入部の全塩基配列を配列番号３に示す。
【００９６】
（４）ｐＸ１：λクローン（＃Ｘ１）をＥｃｏＲＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動にて約３３００ｂｐの挿入部を分離・精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に結合させた。同じサイズのＤＮＡ挿入部をもつクローンを選択した。挿入部の全塩基配列を配列番号４に示す。
【００９７】
（５）ｐＶ１１：λクローン（＃Ｖ１１）をＥｃｏＲＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動にて約３７００ｂｐの挿入部を分離・精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に結合させた。同じサイズのＤＮＡ挿入部をもつクローンを選択した。挿入部の全塩基配列を配列番号５に示す。
【００９８】
実施例９：発現ｃＤＮＡ／ベクター系の構築（Ｂ：タンパク質発現のための部分ｃＤＮＡの連結）
（１）ｐＮＺＣ７の調製
ｃＤＮＡクローンを挿入したプラスミドｐＮＺ４（５μｇ）を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩ（各々５０ユニット）で完全消化した後、低融点アガロースゲル電気泳動する。ＦｃγＢＰのｃＤＮＡの５’末端を含む約４００ｂｐのフラグメントを分離し、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した（フラグメント１）。次に第２番目のプラスミドｐＣ７２（５μｇ）をＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで完全消化し、ベクター部分を含む約４．２ｋｂｐのフラグメントを同様の方法で電気泳動により単離した（フラグメント２）。フラグメント１とフラグメント２を各々１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、各２μｌを１６μｌのＡ溶液（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒造社製）、４μｌのＢ溶液と混合し、１６℃にて３０分間インキュベートし連結させた。この混合液５μｌを１００μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上で３７℃１晩培養した。生成したコロニーよりプラスミドＤＮＡを精製し、フラグメント１とフラグメント２の連結したプラスミドｐＮＺＣ７を得た。
【００９９】
（２）フラグメント５の調製
ｐＮＺＣ７（５μｇ）を各々５０ユニットのＸｈｏＩとＢｓｔＸＩで完全消化した後、電気泳動により約１３００ｂｐのフラグメントを回収した（フラグメント３）。第３番目のプラスミドｐＹ１（５μｇ）を各５０ユニットのＢｓｔＸＩとＨｉｎｃＩＩで完全消化した後、電気泳動により約４２０ｂｐのフラグメントを回収した（フラグメント４）。フラグメント３とフラグメント４を同様の方法でＤＮＡリガーゼにより連結し、電気泳動を行い両者が１分子ずつＢｓｔＸＩ部位で連結した約１７５０ｂｐのフラグメントを回収した（フラグメント５）。
【０１００】
（３）ｐＸＶ２の調製
第４番目のプラスミドｐＸ１（５μｇ）をＨｉｎｃＩＩ及びＢａｍＨＩ（各５０ユニット）で完全消化し電気泳動により、約２７８０ｂｐのフラグメントを回収した（フラグメント６）。第５番目プラスミドｐＶ１１をＢａｍＨＩ（５０ユニット）で完全消化し電気泳動により約３３５０ｂｐのフラグメントを回収した（フラグメント７）。フラグメント６とフラグメント７をＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、両者が１分子ずつ連結された約６１００ｂｐのフラグメントを電気泳動により回収した（フラグメント８）。このフラグメント８をＨｉｎｃＩＩとＢａｍＨＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）にＤＮＡリガーゼで連結した後コンピテントＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。複数の形質転換体よりプラスミドを回収した後、各々の塩基配列を決定し、フラグメント６とフラグメント７の方向性が正しく連結されたフラグメント８を含むプラスミドクローンを得て、フラグメント８の５’→３’方向がプラスミド中のＬａｃＺ遺伝子の方向と逆向きに挿入されたものをｐＸＶ２とした。
【０１０１】
（４）ｐＮＶ１１の調製
ｐＸＶ２をＸｈｏＩとＨｉｎｃＩＩで完全消化後、電気泳動的に約９．１ｋｂｐのベクター部分を含むフラグメントを回収した（フラグメント９）。フラグメント９と前記フラグメント５をＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を形質転換した。形質転換体より、約７．８ｋｂｐのｃＤＮＡ（フラグメント１０）を含む約１０．８ｋｂｐのプラスミドｐＮＶ１１を得た。
【０１０２】
（５）ストップコドン（ＵＡＧに対応するもの）を含むオリゴヌクレオチドアダプターの合成
ＤＮＡ合成機（ｍｏｄｅｌ３９４、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてフレームを異にする３個のＴＡＧを含み、両端にＮｏｔＩ部位とＳｐｅＩ部位をそれぞれもつ次のオリゴオキシヌクレオチド、（１）５’−ＣＴＡＧＴＴ ＡＧＴ ＴＡＧ ＴＴＡ ＧＧＧ ＴＡＣ ＣＧＣ−３’，（２）５’−ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＴＡ ＡＣＴ ＡＡＣ ＴＡＡ−３’を合成した。オリゴヌクレオチド１及び２各１０ｎｍｏｌを混合し（合計１４６μｌ）た後、９５℃、１分間、次いで８５℃、１０分間、次いで０．３３℃／分の速さで４０℃まで徐々に冷却を行い、停止コドンを含むアダプターを作製した（ＴＡ−ＩＩＩアダプター）。このアダプター（２．１ｎｍｏｌ）の５’末端をＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いて標準方法にてリン酸化した。
【０１０３】
ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）ベクター０．８３ｐｍｏｌをＮｏｔＩとＳｐｅＩにて完全消化した後リン酸化したＴＡ−ＩＩＩアダプター２５０ｐｍｏｌと混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて１６℃３０分間インキュベートし連結させた後、エタノール沈殿した。この沈殿を５０μｌ中にてＮｏｔＩで完全消化し、アダプターシークエンス１回だけ持たせるようにした後、低融点アガロースゲル電気泳動を行い約３ｋｂｐのバンドを回収し、フェノール抽出した後、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を、ＤＮＡライゲーションキットを用いて自己連結させた後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢプレート上で一晩培養し生じたコロニーより得られたプラスミドのうち、ＴＡ−ＩＩＩアダプターが挿入されたプラスミドを選択した（ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩ）。
【０１０４】
（６）ｐＮＶ１１−ＳＴの調製
５μｇのプラスミド（ｐＮＶ１１）をＳｐｅＩで完全消化した後、電気泳動的に約７．８ｋｂｐのフラグメントを回収し、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した（フラグメント１１）。２μｇのプラスミド（ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩ）をＳｐｅＩで完全消化し、バクテリアアルカリホスファターゼ（２ユニット）を用いて末端を脱リン酸化した後、フェノール／クロロホルム処理を２回行い、エタノール沈殿した。沈殿を１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した（フラグメント１２）。各２μｌのフラグメント１０とフラグメント１１を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂ１ｕｅ）を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレート上で一晩培養した。生じたコロニーのうち、挿入したｃＤＮＡの３’末端側にＴＡ−ＩＩＩアダプターが連結されているプラスミドを制限酵素地図及び塩基配列を調べる事により選択した。得られたクローンがｐＮＶ１１−ＳＴである。
【０１０５】
前記プラスミドｐＮＶ１１−ＳＴを含有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂ１ｕｅ［ｐＮＶ１１−ＳＴ］として工業技術院生命工学技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成６年４月１日に生命研条寄第４６２５号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６２５）としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。
【０１０６】
なお、ＦｃγＢＰの発現に用いた部分ｃＤＮＡ（クローンｐＮＶ１１−ＳＴ）（約７．８ｋｂｐ）、ならびにその構築に用いた実施例６に記載のクローンＮＺ４、Ｃ７２、Ｙ１、Ｘ１およびＶ１１の相互の関係を図２に示す。
【０１０７】
実施例１０：発現ｃＤＮＡ／ベクター系の構築（Ｃ：タンパク質発現ベクターへの組込み）
（１）ｐｃＤＬ−ＳＲα／ＮＯＴベクターの作製
ｃＤＮＡの組込みを行えるよう次の様にｐｃＤＬ−ＳＲα２９６ベクター（国立予防衛生研究所、武部豊博士より恵与された：以下ＳＲαと記載することもある）の制限酵素部位を改変した。まず、２μｇのＳＲαをＥｃｏＲＩで完全消化した後、エタノールで沈殿した。沈殿をＫｌｅｎｏｗ緩衝液（７０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、７０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、各１ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）に溶解し、０．４ユニットのＫｌｅｎｏｗフラグメントと共に３７℃１５分間インキュベートし、プラスミドの末端を平滑化した。エタノール沈殿の後、ＴＥ緩衝液に溶解し、５’末端がリン酸化されたＮｏｔＩリンカーをＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。エタノール沈殿を行った後、ＮｏｔＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動を行い約３．７ｋｂｐのＤＮＡを切出し、フェノール抽出にてＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをライゲーションキットにて自己連結した後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を形質転換した。ＥｃｏＲＩで消化されず、ＮｏｔＩで消化されるような目的のプラスミド（ｐｃＤＬ−ＳＲα／ＮＯＴ）を選択した。
【０１０８】
（２）発現ｃＤＮＡの挿入
蛋白発現ベクター（ｐｃＤＬ−ＳＲα／ＮＯＴ）をＮｏｔＩとＫｐｎＩで完全消化し、電気泳動により約３．７ｋｂｐのフラグメントを回収した（フラグメントＡ）。
【０１０９】
ｃＤＮＡ挿入ベクター（ｐＮＶ１１−ＳＴ）をＮｏｔＩとＫｐｎＩで完全消化し、電気泳動により約７．８ｋｂｐのフラグメントを回収した（フラグメント１３）。フラグメント１３の全塩基配列を配列番号６に示す。
【０１１０】
この塩基配列およびそこから演繹されるアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅ１．８０により検索したところ、塩基配列およびアミノ酸配列とも新規であることが確認された。
【０１１１】
フラグメントＡとフラグメント１３をＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を形質転換した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上で培養し生じたコロニーのうち、フラグメント１３が挿入されたプラスミドを制限酵素切断により選択した。得られたクローンがｐＮＶ１１−ＳＲである。
【０１１２】
実施例１１：ＣＯＳ７細胞でのＦｃγＢＰ部分ｃＤＮＡの発現
（１）発現ｃＤＮＡ／ベクターの大腸菌からの回収
実施例１０で得られたＦｃγＢＰ ｃＤＮＡ発現プラスミド（ｐＮＶ１１−ＳＲ）にて形質転換した大腸菌を１０ｍｌのＬＢ培地で一晩３７℃で振とう培養した。これを５００ｍｌのＬＢ培地に加え、ＯＤ_６００が０．８になるまで振とうを続けた。ＯＤ_６００が０．８に達したら２．５ｍｌのクロラムフェニコール溶液（３４ｍｇ／ｍｌ）を加え、一晩培養した。菌を遠心分離した後、常法通りアルカリ法にてプラスミドＤＮＡを調製した。塩化セシウムの密度勾配による超遠心分離（９０，０００ｒｐｍ、３時間）を２回行ったのち、ＴＥ緩衝液で透析しプラスミドを精製し蛋白発現に用いた。
【０１１３】
（２）ＣＯＳ７細胞へのトランスフェクション
ＦｃγＢＰの約７．８ｋｂｐの部分ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドベクター（ｐＮＶ１１−ＳＲ）をＣＯＳ７細胞へ一過性に発現させて、タンパク質の性質を調べるために次の様にトランスフェクションを行った。ＣＯＳ７細胞２×１０^５個を３５ｍｍディッシュに加え、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（０．２％炭酸水素ナトリウム、１０ユニット／ｍｌペニシリン、０．０１％ストレプトマイシンを含む）で一晩培養した。４０−６０％コンフルエントになったところで、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を２回洗浄した。
【０１１４】
１０μｇのｐＮＶ１１−ＳＲプラスミドを２５０μ１のＲＰＭＩ１６４０培地に溶解したものと、１０μｌのリポフェクション試薬（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｓｅｐｒａｃｏｒ社製）を２５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地に溶解したものを混合し、直ちにＣＯＳ７細胞上に加える。３７℃で６時間培養後、培地を除き、１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を２ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ_２で２日間培養した。
【０１１５】
（３）発現タンパク質の確認
ｐＮＶ１１−ＳＲをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞を培養したディッシュ（φ３５ｍｍ）を２ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗浄した。９９．５％エタノールを２ｍｌ加え、室温で５分間固定した。２ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗浄した。ラムダファージのスクリーニングに用いたＦｃγＢＰに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（Ｋ９及びＫ１７）の培養上清１ｍｌをそれぞれ加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え室温で３０分間インキュベートした。２ｍｌのＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、０．０３６％過酸化水素水溶液と０．１％ジアミノベンチジン／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．２）溶液の１：１を加え、室温にて１０分間発色させ、タンパク質の発現する細胞を確認した。一次抗体を加えずに、二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのみを加えたものを対照として用いた。
【０１１６】
結果を図３に示す。Ｋ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（図３、Ａ）およびＫ１７モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（図３、Ｂ）培養上清を加えたものでは、いずれもこれらと特異的に反応する細胞が観察されたが、対照（図３、Ｃ）では観察されなかった。
【０１１７】
実施例１２：組換えタンパク質のヒトＩｇＧ結合能の検出と性状
（１）ヒトＩｇＧの結合の確認
ＦｃγＢＰの部分ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＮＶ１１−ＳＲをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（φ３５ｍｍ ｄｉｓｈ）をＰＢＳ（−）で２回洗浄した。９９．５％エタノールを２ｍｌ加え室温で５分間固定した。２ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗浄した。次に、アフィニティークロマトで精製したヒトＩｇＧ画分（Ｃａｐｐｅｌ社製）を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて１０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、その１ｍｌをディッシュに加え室温で１時間インキュベートした。２ｍｌのＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、ＨＲＰを結合させたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２画分（＃１０９−Ｄ３６−０８８、コスモバイオ社製）にて室温で３０分間インキュベートした。２ｍｌのＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、０．０３６％過酸化水素水溶液と、０．１％ジアミノベンチジン／１．０Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．２）溶液の１：１混液を加え室温にて１０分間発色させ、発現タンパク質へのＩｇＧの結合を確認した。
【０１１８】
（２）ＩｇＧの特異的結合
ｐＮＶ１１−ＳＲをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（φ３５ｍｍディッシュ）を２ｍｌのＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。９９．５％エタノールを２ｍｌ加え室温で５分間固定する。２ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗浄した。
【０１１９】
次に、ＨＲＰを結合したアフィニティー精製ヒトＩｇＧ画分（＃５５９０２、Ｃａｐｐｅｌ社製）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて１０μｇ／ｍｌの濃度に調製した（溶液１）。溶液１に対し、次のイムノグロブリン（５００μｇ／ｍｌ）を拮抗阻害物質として加えた：
▲１▼クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ画分（＃５５９０８、Ｃａｐｐｅｌ社製）
▲２▼クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ Ｆｃ画分（＃５５９１１，Ｃａｐｐｅｌ社製），
▲３▼クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２画分（＃５５９１０，Ｃａｐｐｅｌ社製）、
▲４▼クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＭ画分（＃５５９１６，Ｃａｐｐｅｌ社製）
▲５▼クロマトグラフィー精製ヒト血清ＩｇＡ（＃５５９０６，Ｃａｐｐｅｌ社製）
▲６▼クロマトグラフィー精製ヒト分泌型ＩｇＡ（＃５５９０５，Ｃａｐｐｅｌ社製）。
【０１２０】
溶液１に上記▲１▼から▲６▼の各拮抗阻害物質を各々別々に加えた溶液１ｍｌを、細胞を固定したディッシュに加え、室温で１時間インキュベートした。２ｍｌのＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、０．０３６％過酸化水素水溶液と、０．１％ジアミノベンチジン／０．１％ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．２）溶液の１：１の混液を加え、室温にて１０分間発色させ、発現タンパク質へのＩｇＧの結合を検討した。溶液１のみで拮抗阻害物質を何も加えなかったものを対照として用いた。
【０１２１】
結果を図４および図５に示す。対照実験である無添加条件では細胞が染色される（図４、Ａ）が、精製ヒトＩｇＧ画分（図４、Ｂ）と精製ヒトＩｇＧ Ｆｃ画分（図４、Ｃ）を添加すると細胞は染色されなかった。一方、他の添加物ＩｇＧＦ（ａｂ’）_２画分（図５、Ｄ）やヒトＩｇＭ画分（図５、Ｅ）、ヒト血清ＩｇＡ（図５、Ｆ）、ヒト分泌型ＩｇＡ（図５、Ｇ）ではＨＲＰ結合ヒトＩｇＧの結合を阻害できなかった。このことはヒト抗体の場合ＩｇＧＦｃ部にＦｃγＢＰが特異的に結合することを示している。
【０１２２】
実施例１３：ＦｃγＢＰ ｍＲＮＡ発現の組織特異性
ＦｃγＢＰのヒト組織での発現の特異性を調べるために、ノーザンブロッティング解析によりｍＲＮＡの発現を調べた。ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓の各組織から精製したポリアデニル化ＲＮＡ２μｇをブロッティングしたナイロン膜（Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ、＃７７６０−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、実施例２の（４）と同様の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、［^３２Ｐ］でラベルしたプローブＹを用いてハイブリダイゼーションを行った。洗浄の後、オートラジオグラフィーにてバンドの検出を行った。−８０℃で２日間オートラジオグラムを行った結果、胎盤において約１７ｋｂｐ付近にバンドを検出できた（図６）が、その他の組織においては陰性であった。したがって、胎盤においてＦｃγＢＰのタンパク発現が推定された。
【０１２３】
実施例１４：３種の異なるプローブによるノーザンブロット解析
実施例２の（３）で得たプローブＱとＡ、および実施例６の（２）で得たプローブＹがいずれも同一のｍＲＮＡとハイブリダイゼーションすることを確認するために、大腸粘膜上皮細胞から抽出したｍＲＮＡのノーザンブロット解析を上記３種のプローブＱ、Ａ、Ｙを用いて行った。
【０１２４】
大腸粘膜上皮細胞よりＡＧＰＣ法により抽出した全ＲＮＡ１５μｇを４．５μｌの滅菌水に溶かした後、２μｌの５×ＭＯＰＳ緩衝液、３．５μｌのホルムアルデヒド、１０μｌのホルムアミドと混合し、６０℃、１５分間熱変性した後、ホルムアルデヒド存在下で１％アガロースゲル上で電気泳動した。電気泳動終了後、ＲＮＡをナイロン膜（バイオダインＡ、ポール社製）へキャピラリー法にて一晩トランスファーを行った。ＵＶ架橋によりＲＮＡをナイロン膜に固定した後、１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ホルムアミド、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ）中にて４２℃、８時間プレハイブリダイゼーションを行った。
【０１２５】
次いで３種のプローブＡ、Ｑ、Ｙを各々、α［^３２Ｐ］ｄＣＴＰを用い、メガプライムラベリングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）によって放射性標識した。各プローブ１×１０^８ｄｐｍを各々、５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液と共にプレハイブリダイゼーション処理したナイロン膜に加え、密封した後、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロン膜の洗浄は０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを含む溶液中で、６５℃、４０分間の洗浄操作を３回繰り返し行った。ナイロン膜を乾燥後、Ｘ線フィルムに一晩露光した。
【０１２６】
以上の結果、プローブＡ、Ｑ、Ｙを用いて推定約１７ｋｂｐのバンドが１本それぞれ検出され、３種類のプローブが分子量的に同一のｍＲＮＡとハイブリダイズすることを確認した（図７）。
【０１２７】
実施例１５：ＦｃγＢＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列の決定（２）
ＩｇＧＦｃ部結合能をもつタンパク質のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡのうち、５’末端から約７．８ｋｂｐ（７８２６塩基）までの塩基配列の決定については実施例４および６に記載した。残された塩基配列約８．６ｋｂｐの塩基配列決定法を以下に記載する。
【０１２８】
（１）ｃＤＮＡの構造と分類
上記実施例４において、プローブＡ、ＢまたはＱを用いたハイブリダイゼーションによるスクリーニングで得られた複数のｃＤＮＡクローンを、それぞれ大腸菌内で増幅した後、プローブＡ、Ｂ、Ｑを用いてマッピングを行った。その結果、各クローンは３種のプローブの１つまたは複数とハイブリダイズし、ｃＤＮＡ上にＡ→ＢまたはＢ→ＱまたはＱ→Ａの順にプローブ相同部位が位置するものであった。
【０１２９】
これらの結果から、ＦｃγＢＰの遺伝子には、プローブＡ、Ｂ、Ｑのそれぞれと相同な配列がＡ→Ｂ→Ｑの順に連なった単位がタンデムに複数回繰り返した構造を有することが推定された。そこで、プローブＢとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンについて、プローブＢの塩基配列の一部（約２８０塩基対）を次のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させた。
プライマー（Ｐ−１）：
５’−ＧＣＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＣＣＣ ＡＴＣ ＣＡＧ−３’
プライマー（Ｐ−２）：
５’−ＣＴＣ ＡＴＡ ＧＴＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＣＡＣ−３’
ＰＣＲにより増幅したフラグメントをアガロースゲル電気泳動にて分離後ゲルから回収し、塩基配列を解析した。この塩基配列の違いから、プローブＢとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンを次の３群に分類し、プローブＢとハイブリダイズしないｃＤＮＡクローンを第４群とした。
第１群：クローンＶ１１の増幅フラグメントと同一の配列をもつ群。
第２群：第１群の配列と比較して５塩基の置換があり、フラグメント中にＨｉｎｃＩＩ部位を含まない群。
第３群：第１群の配列と比較して７塩基の置換があり、フラグメント中にＨｉｎｃＩＩ部位を含む群。
第４群：プローブＢとハイブリダイズしない群。
【０１３０】
（２）クローンＴ５
３’末端側のポリＡ部分をもつｃＤＮＡを分離するために、実施例３においてオリゴｄＴプライマーを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを、プローブＡ、ＢまたはＱを用いて実施例４と同様の方法でスクリーニングを行ったところ、プローブＱのみとハイブリダイズした。得られたｃＤＮＡクローンのうち最長のｃＤＮＡ挿入部をもつものをクローンＴ５とした。
【０１３１】
クローンＴ５の挿入ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により分離、精製し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、Ｔ５の制限酵素地図の作製および全塩基配列の決定を行った。
【０１３２】
また、クローンＴ５挿入部のｃＤＮＡのうちで、ポリ（Ａ^＋）から約１キロ塩基対５’側のＢａｍＨＩ部位と、同じくポリ（Ａ^＋）から約１．６キロ塩基対５’側のＰｓｔＩ部位に挟まれた約５５０塩基対をプローブＶとした。プローブＶはクローンＮＺ４、Ｃ７２、Ｙ１、Ｘ１、Ｖ１１、Ａ５３、Ａ４０およびＡ３１とはハイブリダイズせず、Ｔ５に特異的な配列であった。
【０１３３】
（３）クローンＡ４３
プローブＡ、ＢまたはＱとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンをプローブＶを用いて実施例４の（２）と同様の方法でハイブリダイゼーションを行い、プローブＡおよびＢとはハイブリダイズせず、プローブＶおよびＱとのみハイブリダイズするクローンを得た。このクローンの挿入ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により分離、精製し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、制限酵素地図の作製および全塩基配列の解析を行った。
【０１３４】
塩基配列解析の結果、プローブＱとハイブリダイズする部分を含む約２キロ塩基対の部分がＴ５と重複する部分の配列と一致することを確認した。
【０１３５】
（４）クローンＡ８
クローンＡ４３より５’方向に伸長したｃＤＮＡを得るため、クローンＡ４３の５’付近の塩基配列（約２４０塩基対）を増幅可能な次のプライマーを合成した。
プライマー（Ｐ−３）：
５’−ＴＧＴ ＴＧＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＴＧＴ ＣＧＧ−３’
プライマー（Ｐ−４）：
５’−ＴＣＡ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＣＣ ＴＧＴ ＧＣＣ−３’
実施例１５の（１）において分類した第１群、第２群、第３群のｃＤＮＡクローンを上記プライマー（Ｐ−３）および（Ｐ−４）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅したフラグメントをアガロースゲル電気泳動にて分離後回収し、塩基配列を解析した。これにより、実施例１５の（１）において分類した第３群のｃＤＮＡクローンの中で、ＰＣＲフラグメントの配列がＡ４３と同一の塩基配列をもつものを選択し、クローンＡ８とした。クローンＡ８の全塩基配列を解析し、３’側の塩基配列がＡ４３の５’側の重複する配列と完全に一致することを確認した。
【０１３６】
（５）クローンＡ５３およびクローンＡ４０
第２群に属するｃＤＮＡクローンのうち、プローブＱおよびＡとハイブリダイズする部分を５’側にもつ２つの異なるクローンを制限酵素地図より選択した。このうち、クローンＶ１１の３’側と重複する部分のより長い方をクローンＡ５３、より短い方をクローンＡ４０とした。
【０１３７】
クローンＡ５３およびクローンＡ４０の全塩基配列を解析し、クローンＡ５３の３’側とクローンＡ４０の５’側の重複する部分（約２．４キロ塩基対）の塩基配列が同一であることを確認した。また、Ｖ１１の３’側とＡ５３の５’側の重複する約１．８キロ塩基対を比較したところ、１塩基（第６２７３塩基；Ｖ１１ではＡであり、Ａ５３ではＧ）を除いてこれらの塩基配列が完全に一致することを確認した。
【０１３８】
（６）クローンＡ３１
クローンＡ４０より３’方向に伸長したｃＤＮＡをスクリーニングするために次の操作を行った。クローンＡ５３およびクローンＡ４０において、プライマー（Ｐ−３）およびプライマー（Ｐ−４）によって増幅されるフラグメントの塩基配列が第１群のＶ１１の配列と異なり、また第３群のＡ８の配列とも異なっていたため、この部分の配列を指標に次のスクリーニングを行った。すなわち、全クローン６９個のうち第１群と第３群を除くｃＤＮＡクローンについてプローブＡ、ＢまたはＱとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンを、プライマー（Ｐ−３）およびプライマー（Ｐ−４）を用いてＰＣＲを行い、増幅したフラグメントの塩基配列を決定した。この塩基配列がクローンＡ５３およびＡ４０と同一であるｃＤＮＡクローンを選択した。この中から、ＰＣＲの増幅配列を５’側の端にもち、３’側に伸長するクローンを選択し、これをクローンＡ３１とした。
【０１３９】
クローンＡ３１の全塩基配列を解析した結果、Ａ３１の５’側の配列がクローンＡ４０の３’側の重複する部分と、またＡ３１の３’側の配列がクローンＡ８の５’側の重複する部分の配列と同一であることを確認した。
【０１４０】
実施例１６：ＦｃγＢＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列の決定（３）
ＦｃγＢＰのｃＤＮＡは全長１６．４キロ塩基対の中に、３．５キロ塩基対をユニットとする配列（プローブＡ、Ｂ、Ｑと相同部分を含む）の３回のタンデムリピートが存在し、それぞれの繰り返し配列が互いに９５％以上の相同性を有する構造をしていた（図８）。
【０１４１】
このリピート構造内の塩基配列の決定に用いたｃＤＮＡは、前述の通り、Ａ、ＢまたはＱの各プローブと強い反応性を有することでクローニングされてきた。そして各々の塩基配列を比較することにより重複する部分の塩基配列が同一であることを確認して、ｃＤＮＡ同士の連なりを明らかにし、これにより一連のｃＤＮＡ断片が単一のｍＲＮＡ（遺伝子）に由来するものであることを明らかにしてきた。この事実を再確認するために、既に発現に用いた５’末端ｃＤＮＡを含むｐＮＶ１１ＳＲとは別のリピート構造内のｃＤＮＡ断片をタンパク質発現させ、ＦｃγＢＰを認識するモノクローナル抗体であるＫ９およびＫ１７によりこの発現タンパク質断片が認識されるかどうかの検定を行った。
【０１４２】
（１）開始コドンを含むアダプターの合成
ベクターに組み込む各ｃＤＮＡ断片を、その５’部分から全長を発現させるには、ｃＤＮＡの５’部分に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を連結させなくてはならない。また、翻訳するタンパク質がＦｃγＢＰと同一のフレームで翻訳されるために、開始コドン（ＡＴＧ）とｃＤＮＡの５’端の間でフレームを調節する必要がある。そこで、以下の２つの条件を満足するアダプター用オリゴヌクレオチドを合成した。
【０１４３】
合成オリゴヌクレオチドは、ＦｃγＢＰの本来の開始コドン（ＡＴＧ）を含むｐＮＶ１１ＳＲの開始領域と同じ７塩基配列（ＧＣＣＡＴＧＧ）を含み、Ｋｏｚａｋ則に合致するものとする。
【０１４４】
また、このオリゴヌクレオチドには、ベクターへの挿入が容易となるように、５’端側にＨｉｎｄＩＩＩ部位を、３’端側にＥｃｏＲＩ部位を付加する。フレームを調節するために、次の３つのオリゴヌクレオチド（ＦＲ−１Ｓ、ＦＲ−２Ｓ、ＦＲ−３Ｓ）を作製した。そして、それぞれのオリゴヌクレオチドと相補的なＦＲ−１Ａ、ＦＲ−２Ａ、ＦＲ−３Ａをも併せて合成した。
アダプター用合成オリゴヌクレオチド
ＦＲ−１Ｓ： ５’−Ａ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＧ−３’
ＦＲ−１Ａ： ３’−ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＧＧ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＡ−５’
ＦＲ−２Ｓ： ５’−Ａ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＴＧＧＧＧ−３’
ＦＲ−２Ａ： ３’−ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＧＧ ＴＡＣ ＣＣＣ−５’
ＦＲ−３Ｓ： ５’−Ａ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＧＡＧ−３’
ＦＲ−３Ａ： ３’−ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＧＧ ＴＡＣ ＣＣＴ ＣＴＴ ＡＡ−５’
各オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機（ｍｏｄｅｌ １３９４、ＡＢＩ社製）を用いて合成した後、精製を行った。
【０１４５】
次に、実施例９−（５）と同様の方法にて、ＦＲ−１ＳとＦＲ−１Ａ、ＦＲ−２ＳとＦＲ−２Ａ、ＦＲ−３ＳとＦＲ−３Ａを各々アニーリングした後、５’末端のヌクレオチドをリン酸化した。作製した各アダプターをアダプターＦＲ−１、アダプターＦＲ−２、アダプターＦＲ−３とする。
【０１４６】
（２） ＴＡＩＩＩ／ＳＫベクターの改変
実施例９−（５）により作製したストップコドンを含むベクターｐＢＬＳ／ＴＩＩＩにＸｂａＩ部位を付加するために以下の操作を行った。
【０１４７】
すなわち、実施例１０−（１）と同様の方法で、ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩを制限酵素ＸｈｏＩで完全消化後、末端を平滑化した。末端をリン酸化したＸｂａＩリンカーを連結後、ＸｂａＩで再消化し、自己連結した後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉを形質転換する操作により、ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩのＸｈｏＩ部位にＸｂａＩ部位が挿入されたベクターｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩ２を得た。
【０１４８】
（３）開始コドンを含むオリゴヌクレオチドの挿入
ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩ２をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで完全消化後、アガロースゲル電気泳動にて約３キロ塩基対のベクター部分を回収した。実施例９−（５）と同様の方法で、アダプターＦＲ−１、ＦＲ−２、ＦＲ−３を各々、上記ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩ２に挿入した。塩基配列を解析し、ＦＲ−１、ＦＲ−２、ＦＲ−３の各アダプターが１つずつ正しく挿入されたプラスミドを得て、各々をＦｒ１−ＳＫ２、Ｆｒ２−ＳＫ２、Ｆｒ３−ＳＫ２とした。
【０１４９】
（４）ＦｃγＢＰ ｃＤＮＡ断片の挿入
ｃＤＮＡクローンＡ５３をＦｃγＢＰと同じフレームで発現させるために、Ａ５３のｃＤＮＡ部分をＥｃｏＲＩで切り出した後、Ｆｒ３−ＳＫ２のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ｃＤＮＡの５’末端がＦｒ３−ＳＫ２の開始コドン側にある方向のプラスミドを選択し、これをｐｉＦ−Ａ５３とする。
【０１５０】
同様にクローンＡ８の挿入ｃＤＮＡをＦｒ２−ＳＫ２に挿入してｐｉＦ−Ａ８を得た。
【０１５１】
ｐｉＦ−Ａ５３とｐｉＦ−Ａ８は実施例１１−（１）と同様にして精製後、タンパク発現の実験に用いた。
【０１５２】
（５）ｐｉＦ−Ａ５３およびｐｉＦ−Ａ８の発現
実施例１１−（２）と同様の方法にて、ｐｉＦ−Ａ５３およびｐｉＦ−Ａ８をＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした。２日間培養後、実施例１１−（３）と同様の方法でモノクローナル抗体（Ｋ９／Ｋ１７混液）を用いて細胞染色を行い、一過性に発現したタンパク質を検出した。その結果、ｐｉＦ−Ａ５３およびｐｉＦ−Ａ８のいずれをトランスフェクトした細胞もモノクローナル抗体による染色が認められ、両ｃＤＮＡがＫ９とＫ１７のいずれかまたは両方により認識されるタンパク質の一部をコードすることが示された（図９のＡ、Ｂ参照）。これより、Ａ５３およびＡ８がＦｃγＢＰの全ｃＤＮＡの中の反復配列の一部であることが確定された。
【０１５３】
実施例１７：クローンＮＺ４がＦｃγＢＰ ｍＲＮＡの５’末端近傍であることの推定２
実施例７でのプライマーエクステンションの結果より、現在最も５’側に存在するクローンＮＺ４の上流およそ２０塩基内に転写開始部位が存在し、ＮＺ４内に存在する９番目のＡＴＧが翻訳開始部位である可能性が推定された。そこで、ＮＺ４の上流にｉｎ ｆｒａｍｅのＡＴＧあるいはストップコドンが存在するかどうかを確認する目的で、ゲノムＤＮＡライブラリーよりＦｃγＢＰ遺伝子を単離し、部分塩基配列を決定した。
【０１５４】
（１）ゲノムＤＮＡライブラリー
ライブラリーは市販のヒト白血球由来（ベクター、ＥＭＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７：ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）のものを用いた。
【０１５５】
（２）プローブ
スクリーニングに用いるプローブとして、ｃＤＮＡクローンＮＺ４をＢａｍＨＩでベクターより切り出したもの、および実施例７で用いた合成オリゴヌクレオチド（プライマー２：ＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡＧＧ、３３ｍｅｒ）をそれぞれα［^３２Ｐ］ｄＣＴＰ、γ［^３２Ｐ］ＡＴＰでランダムプライミングによる標識（ＮＺ４）、あるいは末端標識（プライマー２）したものを用いた。
【０１５６】
（３）スクリーニング
プローブＮＺ４によるスクリーニングは実施例３で述べたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの方法に準じて行った。合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたスクリーニングでは、ハイブリダイゼーション溶液のホルムアミド濃度を２０％とし、また洗浄は０．３×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で４５℃、３０分間の洗浄操作を５回繰り返して行った。
【０１５７】
各プローブに対し、およそ１００万のライブラリーについてスクリーニングを行い、その結果ＮＺ４プローブについて２つの、また合成オリゴヌクレオチドプローブについて１つの陽性プラークが得られ、それぞれすべてのプラークが陽性となるまで繰り返してスクリーニングを行った。
【０１５８】
（４）λＤＮＡの抽出
各陽性クローンは、宿主大腸菌ＬＥ３９２を用い、実施例２で述べた方法に準じて増殖させ、ＤＮＡを抽出した。
【０１５９】
（５）部分マッピングとシークエンス
（４）で得た各々のλＤＮＡ（ＧＨＦｃ−１，２，３）を制限酵素（ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ）で完全消化し、１％アガロースゲル電気泳動後、サザンブロッティングを行った。ナイロンメンブレンへのトランスファーはゲルを０．２５Ｎ ＨＣｌに３０分間浸し、続いて変性緩衝液（０．４Ｎ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ）中で１５分間×２回室温にて振とう放置し、さらに中和緩衝液（１Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ／０．０２Ｎ ＮａＯＨ）中で１５分間×２回室温にて振とう放置した。その後、ゲル１枚につきメンブレン２枚へ同時にトランスファー（ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。２枚のメンブレンは各々ＮＺ４プローブおよび合成オリゴヌクレオチドプローブにてハイブリダイゼーションを行った。
【０１６０】
ＧＨＦｃ−１，２（ＡｐａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ）およびＧＨＦｃ−３（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ）の各陽性フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ＴＯＹＯＢＯ社製）にサブクローニングし、一部シークエンス反応を行った。シークエンス反応は実施例６の方法に準じて行った。
【０１６１】
（６）結果
クローンＧＨＦｃ−１，２，３とも部分的なマッピングとシークエンシングの結果、インサートサイズがおよそ１５ｋｂ（ＧＨＦｃ−１，２）、１３ｋｂ（ＧＨＦｃ−３）のそれぞれ独立したクローンであり、ＧＨＦｃ−１と２は一部重複していた。また、ＦｃγＢＰ ｃＤＮＡの６３、６４番目に相当する塩基間および１３１１、１３１２番目に相当する塩基間にＧＴ／ＡＧ則に一致したイントロン（図１０参照）が存在しており、また１３１１番目までのエキソン部分の塩基配列はｃＤＮＡのものと完全に一致していた（図１１参照）。さらに、ｃＤＮＡクローンＮＺ４の５’上流はＧＨＦｃ−３に含まれていたが、実施例７において記載した推定上の翻訳開始ＡＴＧより８７塩基、すなわちＮＺ４（配列番号１）の５’端より７９塩基上流にｉｎ ｆｒａｍｅでのストップコドン（ＴＧＡ）が存在し、その間に他のｉｎ ｆｒａｍｅでのＡＴＧは認められなかった。したがって、これらの結果はクローンＮＺ４に存在する９塩基目からのＡＴＧがＦｃγＢＰ遺伝子の翻訳開始ＡＴＧである可能性を強く支持する。
【０１６２】
実施例１８：ヒトＦｃγＢＰの構造とＩｇＧＦｃ結合活性機能との相関関係
これまでに得られたＦｃγＢＰのｃＤＮＡの全塩基配列より推定されたアミノ酸配列をもつタンパク構造は、約４００アミノ酸残基より成るユニットのくり返しが合計１２回存在し（Ｒ１−Ｒ１２部）、その前後に約４５０アミノ酸（Ｈ部）と約２００アミノ酸（Ｔ部）のユニークな配列を有するものであった。図１２に示すように、Ｒ部のくり返しユニットの内、Ｒ３，Ｒ６，Ｒ９は相互に９５％以上の相同性を有し、同様にＲ４，Ｒ７，Ｒ１０の３者、Ｒ５，Ｒ８，Ｒ１１の３者もまた９５％以上の相同性があった。一方、Ｒ１からＲ５の各ユニットは相互に約４０％程度の相同性があった。そこで、これらの蛋白質ドメインの機能を検討するために、ｃＤＮＡ中にいくつかの欠損部位を持たせた変異クローンを分離し、それらをＣＯＳ細胞に発現させ、ＩｇＧ結合活性などの機能を検討した。
【０１６３】
Ｆｃ結合活性の測定のため、動物細胞に発現させた部分ｃＤＮＡプラスミドｐＮＶ１１は図１２に示したように、Ｈ，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６の一部の各ユニットで構成されるが、これらのうちどこにＦｃ結合活性が存在するのかを確かめるために、以下の実験を行った。即ち、制限酵素による切断・再結合または、連結するクローンの組合せによりＮＶ１１の一部をアミノ酸に対するフレームが合う様に欠除したｃＤＮＡ断片を、発現ベクターＳＲαに挿入後、大腸菌ＸＬ１−Ｂを形質転換した。表１に示したように、ＮＶ１１より一部を削除した後の配列をＤＮＡの塩基番号で示した。尚、ＮＶ１１のｃＤＮＡ部分のうち、タンパク質への翻訳の始まる最初の塩基を１番とし、最後の塩基を７７７６番とする。
【０１６４】
各ｃＤＮＡ断片を含む発現ベクターを大腸菌より精製した後、実施例１１と同様の方法で、ＣＯＳ７細胞に一過性に発現させた後、ヒトＩｇＧ Ｆｃ部による染色、及びＦｃγＢＰ特異的モノクローナル抗体Ｋ９，Ｋ１７による染色を行った。
【０１６５】
更に、ＩｇＧ Ｆｃの結合に対するモノクローナル抗体の阻害を調べるために、次の染色を行った。ｃＤＮＡを一過性に発現させたＣＯＳ７細胞をエタノールで固定した。熱変性したヒトＩｇＧを１μｇ／ｍｌとなるように、阻害抗体Ｋ９とＫ１７の１つあるいは両方、または抗ＦｃγＲＩＩＩ（コントロール抗体）を含むハイブリドーマ培養上清にてそれぞれ希釈し、固定細胞とインキュベートした。室温で１時間放置後、ＰＢＳ（−）にて洗浄し、ＨＲＰを結合した抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントと同様にインキュベートし、変性ヒトＩｇＧの結合を検出した。
【０１６６】
以下に結果を示す。まず、遺伝子発現産物がＩｇＧ Ｆｃ結合活性を有するかを検討するために、ヒトＩｇＧを一次抗体とし、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた。ＩｇＧの結合活性を示すのは、Ｈ部の全配列及び、それに加え、少なくとも１つ以上のＲ部の全領域を含有するクローン（ＮＶ１１，ＮＸ，ＮＺＣＹ，△ＢｓｓＨ，△Ｔｔｈ，△Ｓｐ１，△ＢｓｓＨ／Ｔｔｈ，ＮＸ△ＢｓｓＨ，ＮＺＣＶ１１）であった。また、ＩｇＧの結合活性を示す染色性の強度は、Ｒ部の含有数が増加するにつれて強度も増加する傾向にあった。しかし、Ｈ部の全部または一部を削除したクローン（△Ｈｉｎｃ，△Ｈｉｎｃ／ＢｓｓＨ，Ｖ１１，Ｘ１）及び、Ｒ部の一部しかもたないクローン（ＮＺＣ）ではＩｇＧの結合活性は示さなかった。
【０１６７】
一方、モノクローナル抗体での遺伝子産物の染色性については、Ｒ５配列の全部又は一部をもつクローン（ＮＶ１１，△Ｈｉｎｃ，△ＢｓｓＨ，△Ｔｔｈ，△Ｓｐ１，△ＢｓｓＨ／Ｔｔｈ，△Ｈｉｎｃ／ＢｓｓＨ，ＮＺＣＶ１１，Ｖ１１）ではモノクローナ ル抗体Ｋ９の染色が認められ、また、Ｒ３またはＲ６の全部または一部をもつクローン（ＮＺＣＹとＮＺＣを除く全てのクローン）ではモノクローナル抗体Ｋ１７の染色が認められた。これらの結果により、Ｈ部を欠くクローン（△Ｈｉｎｃ／ＢｓｓＨ，Ｖ１１，Ｘ１）ではＦｃγＢＰ特異的抗体で反応する蛋白質が発現産生されているにもかかわらず、ＩｇＧ結合活性は得られず、Ｈ部はＲ部産物にＩｇＧ活性を与えるに必須な機能を有していることが示唆された。また、クローンＮＺＣがＩｇＧ活性およびＫ９／Ｋ１７染色に対して陰性であることから、Ｒ部（Ｒ１〜Ｒ５）はＩｇＧの結合部位に対応することも示唆された。
【０１６８】
続いて、モノクローナル抗体Ｋ９，Ｋ１７によるＩｇＧ結合の阻害結果を示す。各クローンに対する阻害効果は表１にまとめて示したが、
▲１▼ Ｒ３とＲ５に加えて、他の１つ以上のＲ領域を含むクローン（ＮＶ１１，△Ｔｔｈ，ＮＺＣＶ１１）では、Ｋ９またはＫ１７によりある程度のＩｇＧ結合の阻害が認められ、両者を加えたときより強く阻害されたが、完全には阻害されなかった。
▲２▼ Ｒ３に加えて他の１つ以上のＲ領域を含むクローン（ＮＸ）では、Ｋ１７によりある程度のＩｇＧ結合の阻害が認められたが、完全には阻害されなかった。また、Ｋ９によっては全く阻害されなかった。
▲３▼ Ｒ３領域のみを含むクローン（ＮＸ△ＢｓｓＨ）では、Ｋ１７により結合が完全に阻害されたが、Ｋ９は影響しなかった。
▲４▼ Ｒ５領域のみを含むクローン（△ＢｓｓＨ／Ｔｔｈ）ではＫ９により結合が完全に阻害されたがＫ１７は影響しなかった。
▲５▼ Ｒ３及びＲ５領域を両方とも含まないクローン（ＮＺＣＹ）では、Ｋ９，Ｋ１７ともＩｇＧの結合を全く阻害しなかった。
▲６▼ 全てのクローンにおいて、コントロール抗体の抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体によるＩｇＧ結合の阻害はみられなかった。
【０１６９】
以上の事より、ＩｇＧ Ｆｃの結合部位は、Ｒ３領域及びＲ５領域を含めてＲ１〜Ｒ５領域に存在し、それぞれのＲ領域が独立でＩｇＧを結合する事が可能である事が推定された。また、ＮＶ１１等Ｒ領域を複数含むｃＤＮＡクローンでは複数のＩｇＧを結合する可能性をもつ事が示された。これらの事実は、アミノ酸配列の相同性から、Ｒ１〜Ｒ１２がいずれもＩｇＧ結合部位を持ち得ることを推定させる。
【０１７０】
【表１】

【０１７１】
実施例１９：ＦｃγＢＰゲノム遺伝子の部分解析（転写開始部位の確定）
実施例７でのプライマーエクステンションの結果より、現在最も５’側に存在するクローンＮＺ４の上流およそ２０塩基内に転写開始部位が存在し、ＮＺ４内に存在する９番目のＡＴＧが翻訳開始部位である可能性が推定されたが、そのＮＺ４の上流にｉｎ ｆｒａｍｅのＡＴＧあるいはストップコドンが存在するかどうかを確認する目的でゲノムＤＮＡライブラリーよりＦｃγＢＰ遺伝子を単離し、部分塩基配列を決定した。
【０１７２】
また、Ｓ１マッピングを行い、より正確な転写開始部位の決定を行った。
（１）ゲノムＤＮＡライブラリー
ライブラリーは市販のヒト白血球由来（ベクター、ＥＭＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７：ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）のものを用いた。
（２）プローブ
スクリーニングに用いるプローブとしてｃＤＮＡクローンＮＺ４をＢａｍＨＩでベクターより切り出したもの、および実施例７で用いた合成オリゴヌクレオチド（プライマー２：ＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡＧＧ，３３ｍｅｒ）をそれぞれα［^３２Ｐ］ｄＣＴＰ、γ［^３２Ｐ］ＡＴＰでランダムプライミングによる標識（ＮＺ４）、あるいは末端標識（オリゴヌクレオチド）したものを用いた。
（３）スクリーニング
プローブＮＺ４によるスクリーニングは実施例４で述べたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの方法に準じて行った。合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたスクリーニングでは、ハイブリダイゼイション溶液のホルムアミド濃度を２０％とし、またＷａｓｈｉｎｇは０．３ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含む溶液中で４５℃，３０分間の洗浄操作を５回繰り返して行った。
各プローブに対し、およそ１００万のライブラリーについてスクリーニングを行い、その結果ＮＺ４プローブについて２つの、また合成オリゴヌクレオチドプローブについて１つの陽性プラークが得られ、それぞれすべてのプラークが陽性となるまで繰り返しスクリーニングを行った。
（４）λＤＮＡの抽出
各陽性クローンは、宿主大腸菌ＬＥ３９２を用い、実施例２で述べた方法に準じて増殖させ、ＤＮＡを抽出した。
（５）部分マッピングとシークエンス
４で得た各々のλＤＮＡ（ＧＨＦｃ−１，２，３）を制限酵素（ＡｐａＩ，ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ，ＮｃｏＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｃＩ，ＳｃａＩ，ＳｍａＩ，ＳｐｅＩ，ＳｐｈＩ，ＳｔｕＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ）で完全消化し、１％アガロースゲル電気泳動後、サザンブロッティングを行った。ナイロンメンブレンへのトランスファーはゲルを０．２５Ｎ ＨＣｌ，０．４Ｎ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ，１Ｍ ＮＨ_４Ａｃ／０．０２Ｎ ＮａＯＨでそれぞれ１５分、２回処理した後、ゲル１枚につきメンブレン２枚へ同時にトランスファー（ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。２枚のメンブレンは各々ＮＺ４プローブおよび合成オリゴヌクレオチドプローブにてハイブリダイゼーションを行った。
ＧＨＦｃ−１，２（ＡｐａＩ ＥｃｏＲＩ，ＳａｃＩ，ＸｈｏＩ）およびＧＨＦｃ−３（ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）の各陽性フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ＴＯＹＯＢＯ社）にサブクローニングし、一部シークエンス反応を行った。シークエンス反応は実施例６での方法に準じて行った。
（６）Ｓ１マッピング
Ｓ１プローブ作製用テンペレートとして、クローンＧＨＦｃ−３のＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片（ｃＤＮＡクローンＮＺ４の上流約２ｋｂに相当）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^＋にサブクローニングした後、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３により調製したｓｓＤＮＡを用いた。このテンペレートにプライマーエクステンションで用いたラベルされたプライマー２をアニールし、ＢｃａＢＥＳＴポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）により６５℃、１０分間合成を行った。これをＢａｍＨＩ消化し、熱変性後８Ｍ尿素を含む７．５％ポリアクリルアミドゲルにて分離し目的とするバンドを切り出した。切り出したゲルはＧ緩衝液（１Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ／２０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２／０．１Ｍ ＥＤＴＡ／０．２％ ＳＤＳ／１０ｕｇ／ｍｌ ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ）中、３７℃で一晩インキュベートしてプローブを溶出した。このＳ１プローブ（１ｘ１０^５ｃｐｍ）をヒト大腸上皮由来全ＲＮＡ（４０μｇ）とｐｏｌｙＡ^＋ＲＮＡ（１．５μｇ）を混合し、エタノール沈澱後それぞれ２０μｌのＳ１ハイブリダイゼーション液（８０％ホルムアミド／４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ／４００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。これを８０℃で１０分処理した後、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。これに２００μｌのＳ１溶液（３０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．６）／２８０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＺｎＳＯ_４／１ｍｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ／１５０ｕｎｉｔ Ｓ１ヌクレアーゼ）を加え３７℃４０分間消化した。これを６％のシークエンスゲルにて泳動しゲルは固定、乾燥後、オートラジオグラフィーを行った。
【０１７３】
結果と考察
クローンＧＨＦｃ−１，２．３とも部分的なマッピングとシークエンシングの結果、インサートサイズがおよそ１５ｋｂｐ（ＧＨＦｃ１，２），１３Ｋｂｐ（ＧＨＦｃ３）のそれぞれ独立したクローンでありＧＨＦｃｌと２は一部ｏｖｅｒｌａｐしていた。また、ＦｃγＢＰｃＤＮＡの６３、６４番目に相当する塩基間および１３１１，１３１２番目に相当する塩基間にＧＴ／ＡＧ則に一致したイントロンが存在しており１３１１番目までのエキソン部分の塩基配列はｃＤＮＡのものと完全に一致していた（図１０，１１参照）。さらに、ｃＤＮＡクローンＮＺ４の５’上流はＧＨＦｃ３に含まれており、推定上の翻訳開始ＡＴＧより８７ｂａｓｅ，ＮＺ４ の５’端より７９ｂａｓｅ上流にｉｎ ｆｒａｍｅでのストップコドン（ＴＧＡ）が存在し、その間に他のｉｎ ｆｒａｍｅでのＡＴＧは認められなかった。従って、これらの結果はクローンＮＺ４に存在する９番目のＡＴＧがＦｃγＢＰ遺伝子の翻訳開始ＡＴＧである可能性を強く支持するものである。また、ＮＺ４の５’上流およそ２ｋｂｐ内にＴＡＴＡ／ＣＣＡＴ等の典型的なプロモーターモチーフは含まれていなかった。さらに、Ｓ１マッピングの結果から、このＡＴＧより８，９，１０塩基上流に相当する長さのバンドが見られ、その内−１０のＡ残基でもっともそのシグナルが強いことから、このＡ残基より転写が開始するものと考えられた。
【０１７４】
実施例２０：ＦｃγＢＰ遺伝子多型の解析
ＦｃγＢＰ ｃＤＮＡのシークエンスの結果、コーディング領域内の特定部位に遺伝子多型の存在が示唆された。すなわちＦｃγＢＰ ｃＤＮＡの５１２０，８７２３，１２３２６番目に存在するＳｍａＩ部位についてクローンＡ５２の同領域ではＣＣＣＧＧＧからＣＣＴＧＧＧへの塩基の置換が認められた。ｃＤＮＡクローニングに用いたライブラリーは単一個体由来ではなく数人の遺伝子をその由来とするために、この塩基置換が個体間で認められるものかあるいは同一個体において半数体ゲノムあたり存在する主要な３回の繰り返し領域間に認められるものかどうかを確認するために以下の実験を行った。
【０１７５】
Ｆｏｒｗａｒｄ側プライマーとして
ＢＣ１：ＡＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＡＴＧＧＣＣ，
ＧＳ１：ＡＣＣＴＧＴＡＡＣＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣ，の２種、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側プライマーとして
ＧＳ２：ＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧ，
ＧＳ３：ＡＣＡＧＣＡＧＧＧＴＴＧＣＣＣＣＧＧ，
ＧＳ４：ＴＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＧ，
ＢＣ２：ＴＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＣＧ，の４種を合成した。
また６名の健常人白血球並びに４名の担癌患者大腸の正常部位より上皮細胞を分離後、Ｎｅｌｓｏｎ等の方法によりＤＮＡを抽出した。各ＤＮＡ２０ｎｇにプライマーセットＢＣ１／ＢＣ２，ＢＣ１／ＧＳ３，ＢＣ１／ＧＳ４，ＧＳ１／ＧＳ３，ＧＳ１／ＧＳ４を終濃度２０ｐｍｏｌｅで加え、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２００μＭ ｄＮＴＰｓ，０．００１％ ｇｅｌａｔｉｎ，２．５ｕｎｉｔ ｔａｑポリメラーゼ）中、（９４℃ １ｍｉｎ−６０℃ １．５ｍｉｎ−７２℃２．５ｍｉｎ ｘ ３０サイクル）の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はＳｍａＩ消化後２％アガロースゲルにて泳動し、ＥｔＢｒにて染色を行った。
【０１７６】
以上の結果、各プライマーセットに対するＰＣＲ産物をＳｍａＩ処理することによりプライマーＢＣ１／ＢＣ２を除いた各セットで遺伝子多型が存在することが明かとなった。
【０１７７】
すなわち、１０種のＤＮＡ標品の内、１つはＳｍａＩにて完全消化されることからこのサンプルは少なくとも対立遺伝子を含めた６カ所の繰り返し部位すべてにＳｍａＩ部位が存在し、他のサンプルではＳｍａＩでの消化、未消化産物の割合が各種の頻度で観察された。逆に、これら１０サンプルの内ＳｍａＩサイトをも全くもたないものは存在しなかった。また、ＨＴ−２９Ｎ２細胞において同じプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲした後、ＳｍａＩにて消化したところ、全てそのサイトを含んでいた。
【０１７８】
また、プライマーＢＣ１／ＢＣ２で多型が認められなかった理由としてＰＣＲ産物の鎖長が約１．８ｋｂｐあることからプライマーＧＳ４とプライマーＢＣ２の間におよそ１．６ｋｂｐのイントロンが存在し、このイントロンの５’側にＳｍａＩ部位が存在することが示唆された。この部位と多型を示す目的のＳｍａＩ部位間の長さが非常に短く、ＢＣ１／ＢＣ２での増幅産物とそのＳｍａＩ消化産物との鎖長差が僅かであるために多型が検出されなかったものと推定された。
【０１７９】
実施例２１：誘導型高発現ＣＨＯ細胞株の分離とＦｃγＢＰの検出
実施例１１で示したＦｃγＢＰフラグメントを多量に、安定して発現する細胞株を樹立する目的で、動物細胞用発現ベクター、ｐＭＳＸＮＤを用いてＦｃγＢＰ部分ｃＤＮＡ、ＮＶ１１ＳＴを発現させた。ｐＭＳＸＮＤベクターは蛋白発現の誘導がナトリウムブチレートなどにより可能なメタロチオネインプロモーターを発現プロモーターとして有し、染色体ＤＮＡに組み込まれた後に遺伝子増幅を可能にするｄｈｆｒ遺伝子をもつ様構築されている。
【０１８０】
（１） ｐＭＳＸＮＤベクターの改変
まず、ｐＭＳＸＮＤの ｃＤＮＡクローニング部位であるＸｈｏＩにてプラスミドを完全消化した後、０．４単位のＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔにて１５分間処理し、末端平滑化した。
次に、ＮｏｔＩリンカー（５’−ｐＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）をベクターにライゲーションした後ＮｏｔＩで完全消化し、自己連結させてからコンピテントＥ．Ｃｏｌ ＸＬ１−Ｂを形質転換した。得られたクローンを解析し、ｐＭＳＸＮＤのＸｈｏＩ部位にＮｏｔＩリンカーが挿入されたプラスミドｐＭＳＸＮＤ−ＮＯＴを得た。
【０１８１】
（２） ｃＤＮＡの挿入
ｐＭＳＸＮＤ−ＮＯＴをＮｏｔＩで完全消化した後、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化を行った。次に、実施例６−（６）で作製したＦｃγＢＰｃＤＮＡを組み込んだプラスミドであるｐＮＶ１１−ＳＴをＮｏｔＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動にて８ｋｂｐのｃＤＮＡ部分を分離、回収した。これらの発現ベクターとｃＤＮＡ挿入部分をライゲーションし、コンピテントＥ．ｃｏｌ（ＸＬ１−Ｂ）を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢプレート上で培養し生じたコロニーのうち、メタロチオネインプロモーターに対しセンスの方向でｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを選択し、ｐＮＶ１１−ＭＳＸを得た。
【０１８２】
（３） ＣＨＯ細胞でのＩｇＧ ＦｃＢＰ部分ｃＤＮＡの発現
実施例１１と同様の方法にてｐＮＶ１１−ＭＳＸプラスミドを含む大腸菌を培養し、増幅したプラスミドを精製した。このプラスミド１０μｇを２５０μｌのＦ−１２培地（ヌクレオチド添加）に溶解したものと、１０μｌのリポフェクション試薬（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｕｍ，ＳＥＰＲＡＣＯＲ社）を２５０μｌに溶解したものを混合し、直ちにＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ欠損株）上に加えた。３７℃で６時間培養後、１０％血清を含むＦ−１２培地で置換し３日間培養した。次に、培地を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ヌクレオチド不含、ＧＩＢＣＯ社製）に置換し、３日毎に培地交換しながら１４日間培養し、プラスミドの挿入された細胞を選択した。このようにして数十個のコロニーを形成したディッシュより、限界希釈法にて細胞をクローニングした。得られた細胞クローンのうちＦｃ結合活性の高い蛋白発現を示すものを選択し、より多くの発現量を得るために次に遺伝子増幅を行った。
【０１８３】
（４） 遺伝子増幅
ｐＮＶ１１−ＭＳＸがＣＨＯ細胞の染色体に組み込まれ、安定にＦｃγＢＰフラグメントを発現する細胞クローンの蛋白質産生量を増加させるために、メトトレキセート処理によって組み込み遺伝子の増幅を行った。
即ち、前記の安定発現細胞クローンを、０．００５μＭのメトトレキセート、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８含むα−ＭＥＭ培地（ヌクレオチド不含）にて３−４週間培養し、生育する細胞を選択した。次に、メトトレキセート濃度を４倍（０．０２μＭ）に増加し、同様の方法で３−４週間培養した。メトトレキセート濃度を４倍に増加させ培養する操作をくり返し、最終的に６．４μＭ〜２５μＭのメトトレキセート存在下で増殖する細胞を得た。この細胞を限界希釈法にてクローニングを行い、ＦｃγＢＰフラグメントを高発現する細胞株を得た。発現量の増加は、実施例１１および１２におけると同様に、Ｋ９／Ｋ１７モノクローナル抗体による組織化学的染色またはＩｇＧ結合能の検出法による第一次的判定によった。
【０１８４】
（５） 細胞試料の作製
ＦｃγＢＰフラグメントを安定的に高発現するＣＨＯ細胞株５×１０^５細胞をφ１００ｍｍディッシュに移し、６．４μＭメトトレキセート、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を加えたα−ＭＥＭ培地にて培養した。必要に応じて終濃度５ｍＭとなるようナトリウムブチレートを添加し、蛋白質の発現誘導を行った。３日後に、培養上清（ＳＵＰ１）を採取し、さらにＳＵＰ１から細胞片を除くため１００，０００ｘｇ，６０分間遠心後、上清（ＳＵＰ２）を回収した。細胞は、５００μｌの細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１０ｍＭ ｍｏｎｏｉｏｄｏ ａｃｅｔａｍｉｄｅ，１０μｇ／ｍｌ ａｐｐｒｏｔｉｎｉｎｅ，１０μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に懸濁後、超音波処理（３０秒×３回）を行い、１０，０００ｘｇ，１０分間４℃の遠心を行った。遠心後の上清（ＬＹＳ１）を除き、残渣に、１％ＮＰ−４０を含む細胞溶解緩衝液４００μｌを加え、超音波処理後、遠心し上清を回収した（ＬＹＳ２）。更にこの残渣に１％ＮＰ−４０，０．１％ＳＤＳ，０．５％デオキシコール酸ナトリウムを含む細胞溶解緩衝液２００μｌに溶解後、遠心し上清を回収した（ＬＹＳ３）。残渣は１００μｌの細胞溶解緩衝液に懸濁した（ＬＹＳ４）。また、コントロールとして大腸上皮細胞の溶解液（１／１００〜１／３２００希釈）を用いた。
【０１８５】
（６） サンドイッチＥＬＩＳＡ
産生されたＦｃγＢＰフラグメントを定量的に検出するために、ＦｃγＢＰに対する特異的モノクローナル抗体Ｋ９およびＫ１７を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系の開発を行った。アフィニティー精製したＫ９抗体を５μｇ／ｍｌとなるよう０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．２）にて調製し、５０μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート（ＰＲＯ−ＢＩＮＤ，ファルコン社製）に加えた後、４℃で一晩放置した。ウェルを洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−））で３回洗浄した後、ブロッキング溶液（１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地）を５０μｌ／ウェル加え、温室で６０分間放置した。
【０１８６】
ブロッキング溶液を除き、（５）にて調製した試料を各々５０μｌ加え、室温２時間放置した。洗浄溶液にて３回洗浄し、ブロッキング溶液にて４ｍｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ結合Ｋ１７抗体を５０μｌ加え、室温１時間放置した。洗浄溶液にて３回洗浄後、５０μｌの発色液（２０ｍｇ Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，８０μｌ Ｈ_２Ｏ_２（３０％）を５０ｍｌのクエン酸緩衝液に溶解）を加え、室温で３分間発色させた。５０μｌの２．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４溶液を加え反応を停止してから４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【０１８７】
〔結果〕
（ｉ）得られた代表的なＦｃγＢＰ発現ＣＨＯ細胞株について
メトトレキセート存在下で培養後、ナトリウムブチレート処理後および未処理後３日目におけるＦｃγＢＰフラグメントの発現量をＫ９／Ｋ１７モノフローナル抗体による細胞染色法により検出した。図１３に示すように、高発現株が分離できた。
（ｉｉ）ＥＬＩＳＡによるＦｃγＢＰフラグメントの定量結果
ＦｃγＢＰフラグメントの安定高発現株から調製された各試料をサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した結果、次の表２の吸光度が示す様に、ＦｃγＢＰフラグメントは細胞溶解液中（ＬＹＳ１〜４）に比べて、培養上清中（ＳＵＰ１，２）により多く検出された。この事実は発現させたＦｃγＢＰフラグメントは細胞内に蓄積するのではなく細胞外に分泌されることを示している。
【０１８８】
【表２】

【０１８９】
【発明の効果】
本発明により、ＩｇＧＦｃ部結合活性を示すタンパク質を大量かつ均一に生産することが可能となった。したがって、本発明によって得られるＩｇＧＦｃ部結合活性を示すタンパク質を、感染防御剤および潰瘍性大腸炎やクローン病などの自己免疫疾患に対する抗（消）炎症剤や診断薬などの医薬用途に利用する可能性を有している。
【０１９０】
【配列表】
【０１９１】
【配列番号１】

【０１９２】
【配列番号２】

【０１９３】
【配列番号３】

【０１９４】
【配列番号４】

【０１９５】
【配列番号５】

【０１９６】
【配列番号６】

【０１９７】
【配列番号７】

【図面の簡単な説明】
【図１】プローブＱを用いて行ったＦｃγＢＰ ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの結果を示す図（電気泳動の写真）である。
【図２】ＦｃγＢＰの発現に用いた部分ｃＤＮＡ（約７．８ｋｂｐ）、ならびにクローンＮＺ４、Ｃ７２、Ｙ１、Ｘ１およびＶ１１の相互の関係を示す。
【図３】ベクターｐＮＶ１１−ＳＲを用いて形質転換したＣＯＳ７細胞の発現するタンパク質を確認する図（生物の形態を示す写真）である。一次抗体として、ＡはＫ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ培養上清、ＢはＫ１７モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ培養上清を用いた。Ｃは一次抗体を加えない対照。いずれのものにも二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを加えた。
【図４】ベクターｐＮＶ１１−ＳＲを用いて形質転換したＣＯＳ７細胞の発現するタンパク質のヒトＩｇＧ結合能を示す図（生物の形態を示す写真）である。いずれのものにも一次抗体としてＨＲＰ結合ヒトＩｇＧを用いた。拮抗剤として用いた二次抗体は以下の通り；Ａ：加えず（対照）、Ｂ：クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ画分、Ｃ：クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ Ｆｃ画分。
【図５】ベクターｐＮＶ１１−ＳＲを用いて形質転換したＣＯＳ７細胞の発現するタンパク質のヒトＩｇＧ結合能を示す図（生物の形態を示す写真）である。いずれのものにも一次抗体としてＨＲＰ結合ヒトＩｇＧを用いた。拮抗剤として用いた二次抗体は以下の通り；Ｄ：クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２画分、Ｅ：クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＭ画分、Ｆ：クロマトグラフィー精製ヒト血清ＩｇＡ、Ｇ：クロマトグラフィー精製ヒト分泌型ＩｇＡ。
【図６】ＦｃγＢＰ ｍＲＮＡのヒト組織での発現の特異性を示すノーザンブロットの図（電気泳動の写真）である。
【図７】プローブＱ、ＡおよびＹを用いて実施した大腸粘膜上皮細胞中のＦｃγＢＰｍＲＮＡのノーザンブロット解析を示す図（電気泳動の写真）である。
【図８】ＦｃγＢＰの全長ｃＤＮＡの構造を示す図である。
【図９】プラスミドｐｉＦ−Ａ５３およびｐｉＦ−Ａ８を用いて形質転換したＣＯＳ７細胞とモノクローナル抗体Ｋ９／Ｋ１７混液との結合能を示す図（生物の形態を示す写真）である。Ａ：ｐｉＦ−Ａ５３、Ｂ：ｐｉＦ−Ａ８。
【図１０】ＦｃγＢＰのエキソン／イントロン境界領域の塩基配列の比較を示す図である。大文字（ボックス）はエキソン、小文字はイントロンを示す。また下線部は高度に保存された配列を示す。Ｒ：プリン、ｙ：ピリミジン。
【図１１】ＦｃγＢＰゲノムＤＮＡの５’側翻訳開始部位近傍の塩基配列を示す図である。大文字はエキソン、小文字はイントロンを示す。下線で示した部分はｃＤＮＡと同一の部分を、またｓｈａｄｅされた太文字はｉｎ ｆｒａｍｅでのＴＧＡストップコドンおよび翻訳開始部位と推定されるＡＴＧコドンを示す。なお、数字はｃＤＮＡクローンＮＺ４の５’末端を＋１とし、エキソンの上にのみ番号を付けた。
【図１２】ヒトＦｃγＢＰの構造と、本発明で用いた各クローンの対応する位置を示す。
【図１３】ＦｃγＢＰフラグメントを発現するＣＨＯ細胞を示す（生物の形態を示す写真）。（Ａ）はメトトレキセート６．４μＭ、ナトリウムブチレート非処理；（Ｂ）はメトトレキセート６．４μＭ、５ｍＭ ナトリウムブチレート処理後を示す。

Claims (9)

1. 以下のものから選ばれるＤＮＡ：
   （１）配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （２）配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧＦｃ部結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （３）配列表の配列番号６に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを含む溶液中で、６５℃、４０分間の洗浄条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧＦｃ部結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
2. プラスミドｐＮＶ１１−ＳＴ（生命研条寄第４６２５号：ＦＥＲＭＢＰ−４６２５）中に挿入されている請求項１記載のＤＮＡ。
3. 以下のものから選ばれるＤＮＡ：
   （１）配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （２）配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧＦｃ部結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （３）配列表の配列番号７に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを含む溶液中で、６５℃、４０分間の洗浄条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧＦｃ部結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
4. 請求項１または３記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
5. 請求項４記載の組換えベクターにより形質転換された原核または真核宿主細胞。
6. 請求項５記載の宿主細胞を培養し、産生されたタンパク質を分離、精製することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
7. 組換えタンパク質がＩｇＧＦｃ部結合活性を示す請求項６記載の組換えタンパク質の製造方法。
8. 請求項５記載の宿主細胞を培養して得られる培養物を細胞内または細胞外から分離、精製して得られる組換えＩｇＧＦｃ部結合活性を示すタンパク質。
9. 配列表の配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡまたは６００ｂｐ以上の大きさのそのＤＮＡ断片、あるいは配列表の配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡまたは６００ｂｐ以上の大きさのそのＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ノーザンブロット解析またはインサイチュハイブリダイゼーション法によってＩｇＧＦｃ部結合タンパク質のｍＲＮＡの合成組織を同定する方法。

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