JPH08112096A - ＩｇＧＦｃ部結合タンパク質をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部分と特
異的に結合するタンパク質を遺伝子工学的手法によって
生産し、その医薬用途への適用を図る。 【構成】 ＩｇＧＦｃ部結合タンパク質（ＦＣγＢＰ）
をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクタ
ー、該組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、
該宿主細胞を培養して得られる組換えタンパク質の製造
方法、ならびに上記方法で得られる組換えＩｇＧＦｃ部
結合活性を示すタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）のＦｃ部分と特異的に結合するタンパク質であるＩ
ｇＧＦｃ部結合タンパク質（ＦｃγＢＰ：Ｆｃγ Ｂｉ
ｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎおよびＩｇＧＦｃＢＰと記載
することもある）をコードする遺伝子、該遺伝子を含有
する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換
された宿主細胞、該宿主細胞を培養して得られる組換え
タンパク質の製造方法、ならびに上記方法で得られる組
換えＩｇＧＦｃ部結合活性を示すタンパク質に関する。

【０００２】

【従来の技術】マクロファージは免疫担当細胞の１つと
して、生体外から侵入してきた異物やそのイムノグロブ
リンＧ（ＩｇＧ）複合体を貧食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔ
ｏｓｉｓ）により細胞内に取り込み、消化し、またリン
パ球による抗体産生を誘起させるために、抗原提示作用
を示す能力も有する。このような貧食機構の主たる入口
がマクロファージの細胞表面上に存在するＩｇＧのＦｃ
レセプター（Ｆｃγレセプター：ＦｃγＲ）である。Ｆ
ｃγレセプターはＩｇＧのＦｃ部を結合するレセプター
であるが、その本来の機能は、ＩｇＧによっておおわれ
た（オプソニン化）病原体あるいは抗原−ＩｇＧ免疫複
合体を除去することにある。

【０００３】従来Ｆｃγレセプターには大別して３種類
の存在が知られており、これらはＲＩ、ＲＩＩ ＲＩＩ
Ｉと名付けられている（Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎ
ｄＪ．−Ｐ．Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．（１９９１），９：４５７−４９２）。これら
のレセプターはいずれもすでにそのｃＤＮＡがクローニ
ングされている。さらに、１９９０年〜１９９１年には
いくつかのグループによって、これらＦｃγレセプター
に会合しており、Ｆｃγレセプターがその結合物を内部
に取り込むために必要な動きを始めるためのタンパク質
が見いだされ、スイッチ機構の糸口が明らかにされた
（Ｌ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ，Ｇ．Ｙｕ ａｎｄ Ｊ．Ｈ．
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９），３４
２：８０３−８０５；Ｔ．Ｋｕｒｏｓａｋｉ ａｎｄ
Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９），
３４２：８０５−８０７；Ｄ．Ｇ．Ｏｒｉｏｆｆ，Ｃ．
Ｒａ，Ｓ．Ｊ．Ｆｒａｎｋ，Ｒ．Ｄ．Ｋｌａｕｓｎｅｒ
ａｎｄ Ｊ．−Ｐ．Ｋｉｎｅｔ，Ｎａｔｕｒｅ（１９
８９），３４７：１８９−１９１；Ｐ．Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎ，Ｍ．Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｃ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，
Ｔ．Ｍａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｒｉｔｚ ａｎｄ Ｓ．Ｆ．Ｓ
ｃｈｌｏｓｓｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０），８７：２２７４−２２７
８；Ｔ．Ｋｕｒｏｓａｋｉ，Ｉ．Ｇａｎｄｅｒ ａｎｄ
Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１），８８：３８３７−
３８４１；Ｌ．Ａｚｚｏｎｉ，Ｍ．Ｋａｍｏｕｎ，Ｔ．
Ｗ．Ｓａｌｃｅｄｏ，Ｐ．Ｋａｎａｋａｒａｊ ａｎｄ
Ｂ．Ｐｅｒｕｓｓｉａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９
９２），１７６：１７４５−１７５０；Ａ．Ｔ．Ｔｉｎ
ｇ，Ｌ．Ｍ．Ｋａｒｎｉｔｚ，Ｒ．Ａ．Ｓｃｈｏｏｎ，
Ｒ．Ｔ．Ａｂｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐ．Ｊ．Ｌｅｉｂｓ
ｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２），１７６：１
７５１−１１７５５）。

【０００４】一方、小林らはヒト小腸および大腸上皮細
胞、特にゴブレット細胞にＩｇＧのＦｃ部と特異的に結
合でき、かつ従来のＦｃγレセプターとは異なるタンパ
ク質ＦｃγＢＰの存在を報告した。このタンパク質のＩ
ｇＧＦｃ部との特異的結合はホースラディッシュペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）標識物を用いて確認されている。
すなわち、ＦｃγＢＰはＩｇＧのＦｃ部とのみ結合し、
ＩｇＧＦａｂ、ＩｇＡ、ＩｇＭとは結合しない。またＦ
ｃγＢＰはＦｃγレセプターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ抗体と交
差反応しない（Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｊ．Ｂｌ
ａｓｅｒ ａｎｄ Ｗ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．（１９８９），１４３：２５６７−２５７
４）。

【０００５】さらに、彼らはＦｃγＢＰをヒト大腸上皮
細胞から部分精製し、これを抗原としてマウスモノクロ
ーナル抗体を作製した。これらの抗体とＦｃγＢＰが結
合するだけでなく、マウスＩｇＧとも結合することが確
認された（Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．Ｈａｍａｄ
ａ，Ｍ．Ｊ．Ｂｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｗ．Ｒ．Ｂｒｏｗ
ｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１），１４６：６８
−７４）。

【０００６】また、部分精製ＦｃγＢＰをドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）電気泳動した後、モノクローナル
抗体を用いたウエスタンブロット解析に付したところ、
ＦｃγＢＰは分子量７８ｋＤａのタンパク質を含む２０
０ｋＤａ以上の会合体を形成していることが明らかとな
った（Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．Ｈａｍａｄａ，
Ｍ．Ｊ．Ｂｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｗ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎ，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１），１４６：６８−７
４）。

【０００７】

【発明が解決すべき課題】上記ＦｃγＢＰはＩｇＧのＦ
ｃ部と結合できるという点においてはＦｃγレセプター
と同様の性質を示す。しかしながら、ＦｃγＢＰのタン
パク質としての定性、構造およびその生体内の役割につ
いては何ら明らかではなかった。したがって、ＦｃγＢ
Ｐを解析し、その構造と機能を明らかにすることは極め
て興味深い。

【０００８】さらに後述するように、ＦｃγＢＰは粘液
とともに粘膜上に分泌され、ＩｇＧ抗体とともに、体内
に侵入しようとする病原菌やウイルスなどを粘液中にト
ラップし、体外に排泄し易くすることで、感染防御の一
端をになっていると推定される。また、炎症の起こった
粘膜で過剰に産生された自己抗体は、補体系を活性化し
たり、マクロファージなどによる細胞障害を起こさせた
りして、炎症の悪化につながるが、ＦｃγＢＰはこのよ
うな自己抗体のＦｃ部をブロックして炎症の進展を防ぐ
と推定される。このようなＦｃγＢＰの機能から感染防
御剤、および潰瘍性大腸炎やクローン病などの自己免疫
疾患に対する抗（消）炎症剤や診断薬などの医薬用途に
利用できる可能性を有している。

【０００９】そこでＦｃγＢＰをこのような医薬用途に
用いるにはこれを大量にかつ均一に得る必要があった。
しかしながら、ＦｃγＢＰを動物組織自体、またはその
産生細胞の培養上清から単離する方法では大量に均一な
ＦｃγＢＰを得ることは困難であった。したがって、遺
伝子組換え技術を用いてＦｃγＢＰを大量に製造するこ
とが望まれていた。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＦｃγＢ
Ｐに対するモノクローナル抗体を用いてＦｃγＢＰのｃ
ＤＮＡのクローニングを行って、ＦｃγＢＰをコードす
る遺伝子の塩基配列を明らかにすることに成功した。

【００１１】また、このｃＤＮＡを適当なベクターに挿
入して得られる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、
得られる形質転換体を培養し、次いで産生された目的タ
ンパク質を分離、精製したところ、産生タンパク質はヒ
トＩｇＧと特異的に結合する性質を有していた。これに
よりＦｃγＢＰを大量かつ均一に製造することができる
ことも明らかにした。

【００１２】したがって、本発明はＦｃγＢＰをコード
する遺伝子を提供する。

【００１３】本発明はまた、ＦｃγＢＰをコードする遺
伝子を含む組換えベクターを提供する。

【００１４】本発明はさらに、ＦｃγＢＰをコードする
遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された原
核もしくは真核宿主細胞を提供する。

【００１５】本発明はさらに、ＦｃγＢＰをコードする
遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換して得ら
れた形質転換体を培養し、産生された目的タンパク質を
分離、精製することを特徴とする、ＦｃγＢＰの製造方
法を提供する。

【００１６】本発明はさらに、上記製造方法で製造され
たＩｇＧＦｃ部結合活性を示すタンパク質を提供する。

【００１７】本発明はさらに、ＦｃγＢＰをコードする
遺伝子またはその一部を、ＦｃγＢＰｍＲＮＡの合成組
織を同定するためのノーザンブロット解析法またはイン
サイチュハイブリダイゼーション法のプローブとして使
用する方法を提供する。

【００１８】

【具体的な説明】ＦｃγＢＰをコードするｃＤＮＡは、
例えばＦｃγＢＰを産生する細胞などからｍＲＮＡを調
製した後、既知の方法により二本鎖ｃＤＮＡに変換する
ことにより得られる。ｍＲＮＡの供給源としては、本発
明ではヒト大腸粘膜上皮細胞を用いたが、これに限ら
ず、ヒト小腸、十二指腸、胃、顎下腺、舌下腺、総胆
管、気管支などのＦｃγＢＰが分布している組織のホモ
ジェネートなどを用いてもよい。また、ヒト大腸癌細胞
由来ＨＴ２９−１８−Ｎ２株およびその亜種はＦｃγＢ
Ｐを産生していることが知られているので、これらの株
化細胞をｍＲＮＡの供給源として用いてもよい。

【００１９】ｍＲＮＡを調製するには、例えば本発明で
用いたように、ＡＧＰＣ法（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋ
ｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１６２：１５６−１５９，１９８７）の改変法の
他、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１
８：５２９４−５２９９，１９７９）の方法にしたがっ
て、全ＲＮＡを調製できる。また、他の生理活性タンパ
ク質の遺伝子をクローン化するときに用いられた方法、
例えばバナジウム複合体などのリボヌクレアーゼインヒ
ビター存在下に界面活性剤処理、フェノール処理を行う
ことによっても実施することができるこうして得られた
ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを得るには、例えばｍＲＮ
Ａを鋳型にして、３’末端にあるポリＡ−鎖に相補的な
オリゴ（ｄＴ）またはランダムプライマー、あるいはＦ
ｃγＢＰのアミノ酸配列の一部に相応する合成オリゴヌ
クレオチドをプライマーとして逆転写反応を行い、ｍＲ
ＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。

【００２０】本発明では、Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆ
ｍａｎの改良法を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製または
ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製のｃＤＮＡ合成キットとラン
ダムプライマーを用いて、ポリアデニル化ＲＮＡから逆
転写反応によりｃＤＮＡを作製した。

【００２１】このｃＤＮＡにアダプターを連結させた
後、λｇｔ１１ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
このようにして作製したｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社のファージｉｎ ｖｉｔｒｏパッケ
ージングキットＧｉｇａｐａｃｋＩＩＧｏｌｄを用い
て、λファージにパッケージングした後大腸菌に発現さ
せた。発現したｃＤＮＡのタンパク質をモノクローナル
抗体をプローブとしてスクリーニングを行った。

【００２２】上記クローニングに用いる抗体は、ＩｇＧ
ＦｃとＦｃγＢＰとの間の結合を阻害する３種類のモノ
クローナル抗体（Ｋ９、Ｋ１０、Ｋ１７）（Ｋｏｂａｙ
ａｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １
４６：６８−７４，１９９１；Ｋｏｂａｈａｓｈｉ ｅ
ｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５６
７−２５７４，１９８９）の中から、ウエスタンブロッ
ト解析においてＦｃγＢＰを検出できる抗体を選択し
た。すなわち、非還元条件下ではＫ９抗体で分子量約２
００ｋＤａより大きいバンドが、還元条件下ではＫ１７
抗体で７０−８０ｋＤａと１３０−１４０ｋＤａにバン
ドがそれぞれ認められた。以上の結果より、クローニン
グにはこの２種の異なるエピトープを認識するモノクロ
ーナル抗体を用いた。

【００２３】このスクリーニングの結果、Ｋ９抗体で
は、約１００万個のクローンより１個のクローン（プロ
ーブＱと命名：６００ｂｐ）を、またＫ１７抗体では、
約６０万個のクローンより７個のクローン（そのうちの
７００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブＡと命名；６００ｂ
ｐのＤＮＡ断片をプローブＢと命名）を得た。

【００２４】プロープＱを用いて既知タンパク質のｍＲ
ＮＡと比較することによって、ＦｃγＢＰ ｍＲＮＡの
サイズを推定した。その結果、ＦｃγＢＰ ｍＲＮＡの
分子サイズは約１７ｋｂｐであると推定された（図
１）。

【００２５】次いでプローブＱ、ＡおよびＢを用いてλ
ｇｔ１０にパッケージングした第２ｃＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニングを行った。まずプローブＡ、Ｂまた
はＱのいずれかとハイブリダイズするｃＤＮＡクローン
を分離した。これらのうちから、Ａとのみハイブリダイ
ズするクローンを得て、Ａとは反対側の末端部をプロー
ブＸとして、プローブＸ（約７００ｂｐ）とハイブリダ
イズするｃＤＮＡクローンを分離した。得られたクロー
ンはＸを中心部にし、一端にＡ−Ｂ領域をもっており、
これをＸ１と命名した。続いて、クローンＸ１のＡ−Ｂ
領域とは反対側の部分約８００ｂｐをプローブＹとし
て、再びｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、プ
ローブＹとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンを得
た。このクローンをＹ１と命名した。クローンＹ１は一
端にＸ領域の一部を有し、中心部にＹ領域を有する。こ
のクローンＹ１のＸ領域とは反対側の端にある約１５０
ｂｐをプローブＹ１５０とした。再びｃＤＮＡライブラ
リーをプローブＹ１５０を用いてスクリーニングした。
この中からＹ１５０領域と反対側に最も長く伸びたクロ
ーンを選び、クローンＣ７２とした。次に、クローンＣ
７２がもつＹ１５０領域とは反対側の端近くにある約４
５０ｂｐをプローブＺとし、プローブＺとハイブリダイ
ズするｃＤＮＡクローンを分離した。これらの中からク
ローンＣ７２と重複しない部分ができるだけ長いものを
分離し、クローンＮＺ４とした。

【００２６】一方、Ａ、ＢおよびＱのいずれともハイブ
リダイズするｃＤＮＡクローンの中から、Ａ−Ｂ領域の
塩基配列がクローンＸ１のＡ−Ｂ領域の塩基配列と同一
のものを選び出し、これをクローンＶ１１とした。

【００２７】以上の５個のクローン、Ｘ１、Ｙ１、Ｃ７
２、ＮＺ４およびＶ１１の塩基配列を決定し、タンパク
質のアミノ酸配列を確認したところ、ＡＴＧを開始コド
ンとする１本のオープンリーディングフレームを見いだ
した（図２参照）。

【００２８】さらに、これらのクローンからＦｃγＢＰ
をコードする部分ｃＤＮＡ（約７．８ｋｂｐ）を得て、
その塩基配列を決定した（配列番号６に塩基配列および
アミノ酸配列を示す）。

【００２９】さらに、上記プローブＡ、ＢまたはＱを用
いたハイブリダイゼーションによるスクリーニングで得
られた複数のｃＤＮＡクローンをそれぞれ大腸菌内で増
幅した後、プローブＡ、Ｂ、Ｑを用いてマッピングを行
った。その結果、ＦｃγＢＰのｃＤＮＡは全長１６．４
ｋｂｐの中に３．５ｋｂｐをユニットとする単位（プロ
ーブＡ、Ｂ、Ｑのそれぞれと相同な配列がＡ→Ｂ→Ｑの
順に連なった単位）がタンデムに複数回繰り返した構造
を有することが推定された。

【００３０】そこでプローブＢとハイブリダイズするｃ
ＤＮＡクローンについて、プローブの塩基配列の一部を
ＰＣＲにより増幅させ、得られたフラグメントの塩基配
列を解析することにより、ＦｃγＢＰの全長ｃＤＮＡは
図８に示す構造を有し、配列表の配列番号７に示す塩基
配列とアミノ酸配列を有することが明らかとなった。

【００３１】このようにして得られたクローン化された
ＦｃγＢＰをコードする遺伝子は適当なベクターに組み
込むことにより、原核細胞または真核細胞の宿主細胞を
形質転換することができる。

【００３２】さらに、これらのベクターに適当なプロモ
ーターや形質発現にかかわる配列を導入することによ
り、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現すること
が可能である。また、目的とする遺伝子に他のポリペプ
チドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質と
して発現させ、精製を容易にしたり、発現量を上げた
り、また精製工程において適当な処理を施すことによ
り、目的タンパク質を切り出すことも可能である。

【００３３】一般に、真核生物の遺伝子はヒトインター
フェロン遺伝子で知られているように、多形現象を示す
と考えられ、この多形現象によって１個またはそれ以上
のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化
はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。

【００３４】また、配列表の配列番号６または７あるい
はその一部に示すアミノ酸配列中の１個またはそれ以上
のアミノ酸を欠くかまたは付加したポリペプチド、ある
いはアミノ酸が１個またはそれ以上のアミノ酸で置換さ
れたポリペプチドでもＩｇＧＦｃへの結合性を有するこ
とがある。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−
２）遺伝子のシステインに相当する塩基配列をセリンに
相当する塩基配列に変換して得られたポリペプチドがＩ
Ｌ−２活性を保持することも既に公知になっている（Ｗ
ａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４
３１，１９８４）。

【００３５】また、真核細胞で発現させた場合、その多
くは糖鎖が付加されるが、アミノ酸を１個ないしそれ以
上変換することにより糖鎖付加を調節することができる
が、この場合でもＩｇＧＦｃ部結合活性を有することが
ある。それゆえ、本発明におけるＦｃγＢＰの遺伝子を
人工的に改変したものを用いて、得られたポリペプチド
がＩｇＧＦｃ部結合活性を有する限り、それらのポリペ
プチドをコードする遺伝子はすべて本発明に含まれる。

【００３６】さらに、得られたポリペプチドがＩｇＧＦ
ｃ部結合活性を有し、配列番号６または７あるいはその
一部に示す遺伝子とハイブリダイズする遺伝子も本発明
に含まれる。なお、ハイブリダイゼーション条件は、通
常行われているプローブハイブリダイゼーションの条件
を適用することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９）

【００３７】以上のように、免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）のＦｃ部分と特異的に結合するタンパク質を発現で
きるＤＮＡであれば、配列表の配列番号６または７に示
すアミノ酸をコードする塩基配列に限らず、種々の修飾
体のＤＮＡが本発明に含まれるし、またその機能を有す
るＤＮＡ断片も本発明の遺伝子の一部であることは明白
である。

【００３８】本発明の発現ベクターは、複製起源、選択
マーカー、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリ
アデニル化シグナルなどを含む。

【００３９】本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生
物宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌などが挙
げられる。また、真核生物のうち、真核微生物の宿主細
胞としては、例えばイースト、粘菌が挙げられる。ある
いは、Ｓｆ９などの昆虫細胞を宿主細胞として使用して
もよい。さらに、動物細胞由来の宿主細胞としては、例
えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞および３
Ｔ３細胞などが挙げられる。

【００４０】以上のようにして目的とするＦｃγＢＰを
コードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養し、
産生されたＩｇＧＦｃ部結合活性を有するタンパク質は
細胞内または細胞外から分離し、精製することができ
る。

【００４１】なお、本発明の目的タンパク質であるＩｇ
ＧＦｃ部結合活性を有するタンパク質の分離、精製には
実施例に記載する方法に限定されることなく、通常のタ
ンパク質で用いられる分離、精製方法を使用することが
できる。例えば、各種クロマトグラフィー、限外濾過、
塩析、透析などを適宜選択、組み合わせて使用すること
ができる。

【００４２】かくして得られた組換えタンパク質が天然
型ＦｃγＢＰと同様のヒトＩｇＧとの結合活性を有する
かを検討したところ、ヒトＩｇＧＦｃと特異的に結合す
ることが明らかとなった。

【００４３】上記したように、本発明のＦｃγＢＰの全
長ｃＤＮＡは図８に示す構造を有し、配列表の配列番号
７に示す塩基配列とアミノ酸配列を有するものである
が、さらに本発明で用いた一連のｃＤＮＡが単一のｍＲ
ＮＡに由来するものであることを以下のようにして再確
認した。すなわち、発現に用いた５’末端ｃＤＮＡを含
むｐＮＶ１１ＳＲとは別のリピート構造内のｃＤＮＡ断
片をタンパク質発現させ、ＦｃγＢＰを認識するモノク
ローナル抗体であるＫ９およびＫ１７と反応させたとこ
ろ、これらのｃＤＮＡ産物がＫ９とＫ１７のいずれかま
たは両方により認識されることを確認した。

【００４４】さらに、ＦｃγＢＰのｍＲＮＡの発現の組
織特異性を試験したところ、ヒト胎盤における発現が確
認された。したがって、本発明のＦｃγＢＰをコードす
る遺伝子またはその一部をプローブとして用いて、ノー
ザンブロット解析またはインサイチュハイブリダイゼー
ションによってＦｃγＢＰ ｍＲＮＡの合成組織を同定
することができる。さらに、ＦｃγＢＰの染色体遺伝子
上の多型性の存在を制限酵素の利用により示し得た。

【００４５】本発明のＦｃγＢＰをコードする遺伝子を
得る方法、該遺伝子を有する組換えベクターおよびこれ
を含有する形質転換体ならびに該形質転換体を培養して
得られる目的タンパク質、ならびにそれぞれの製造方法
について、以下の実施例で詳細に説明するが、この実施
例によって本発明が限定されるものではない。

【００４６】

【実施例】

実施例１：モノクローナル抗体を用いたＦｃγＢＰをコ
ードする部分ｃＤＮＡのクローニング（Ａ：ｃＤＮＡラ
イブラリーの作製） （１）ヒト大腸粘膜上皮細胞の調製 ヒト大腸組織片を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地でよ
く洗浄した後、粘膜筋板の部位から機械的に剥離させ、
上皮細胞と粘膜固有層を分離した。これを中心棒に固定
するようにして、１０％ＦＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／Ｐ
ＢＳ（−）中で氷冷しながら９０分間スターラーで激し
く撹拌し、上皮細胞を分離した。上皮細胞を含む溶液を
１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞の沈殿を得た。

【００４７】（２）ｍＲＮＡの精製 粘膜上皮細胞からの全ＲＮＡの抽出はＡＧＰＣ法（Ｐ．
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９８７）１６２：１
５６−１５９）を改変して行った。すなわち、細胞ペレ
ット１ｍｌに対し、９ｍｌの変性溶液（４Ｍチオシアン
酸グアニジン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ
７）、０．５％サルコシル、０．１Ｍ ２−メルカプト
エタノール）を加え、細胞を溶解した後、１ｍｌの２Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、１０ｍｌの水飽和フェノー
ル溶液、２ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール
（４９：１）を順次加えた。１０秒間撹拌し、１５分間
氷冷した後、１０，０００×ｇで１５分間遠心し、上清
を回収した。上清８ｍｌに対し、同様に０．８ｍｌの酢
酸ナトリウム、８ｍｌの水飽和フェノール、１．６ｍｌ
のクロロホルム／イソアミルアルコールを加え、１０秒
撹拌、１５分氷冷、１０，０００×ｇで１５分間遠心
し、上清を回収した。上清７ｍｌに対し、等量のクロロ
ホルム／イソアミルアルコールを加え撹拌後、遠心分離
により上清を得た。上清に対し、等量のイソプロパノー
ルを加え、−２０℃で３０分間冷却後、１０，０００×
ｇで１５分間遠心し、全ＲＮＡの沈殿を回収した。

【００４８】全ＲＮＡ１ｍｇの溶液に溶出バッファー
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）を加え、全量で１ｍｌ
とした後、ＯｌｉｇｏＴｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞
（宝酒造社製）１ｍｌを加え、６５℃で５分間加熱し、
氷上で３分間急冷した。５Ｍ ＮａＣｌ ０．２ｍｌを
加え、３７℃で１０分間保温した後、１５，０００ｒｐ
ｍで３分間遠心分離し、上清を注意深く除去した。ペレ
ットを洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１％ ＳＤＳ）２．５ｍｌに懸濁した後、１
５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を注意深く
除去した。ペレットを滅菌水１ｍｌに懸濁し、６５℃で
５分間加熱し、氷上で３分間急冷した。１５，０００ｒ
ｐｍで３分間遠心分離した後、上清を回収した。５０μ
ｌの５Ｍ ＮａＣｌと２．５ｍｌのエタノールを加えた
後、−２０℃で３０分冷却し、遠心（３，０００ｒｐ
ｍ、４℃）して、ポリアデニル化ＲＮＡの沈殿を回収し
た。

【００４９】（３）ｃＤＮＡの合成 ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、Ｇｕｂｌｅｒおよび
Ｈｏｆｆｍａｎ（Ｕ．Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｊ．
Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：２６３）
の改良法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製またはＩｎＶｉ
ｔｒｏｇｅｎ社製のｃＤＮＡ合成キットを用いて行っ
た。すなわち、大腸粘膜上皮細胞より調製したポリアデ
ニル化ＲＮＡ５μｇを４２℃にて９０分間、５０ユニッ
トのヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、１ｍＭ
ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、０．
５ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ユニットのＡＭＶ逆転写酵
素、ピロリン酸ナトリウムを含む緩衝液（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ社製）５０μｌ中で、７５０ｎｇのランダムベキサ
ヌクレオチドまたは４μｇのオリゴ（ｄＴ）プライマー
と共にインキュベートした。この反応液５０μｌを４．
０ユニットの大腸菌リボヌクレアーゼＨ、１１５ユニッ
トの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを含む緩衝液（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）中で、１２℃で６０分間、次いで２２
℃で６０分間反応させた後、７０℃で１０分間インキュ
ベートした。氷中に戻し、１０ユニットのＴ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼを加え、３７℃で１０分間反応させた後、
１０μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を加えて反
応を停止させた。反応液２５０μｌに対し、等量の７．
５Ｍ酢酸アンモニウムと、４倍量のエタノールを加え、
撹拌後、−２１℃にて３０分間冷却し、遠心分離により
ｃＤＮＡを回収した。ｃＤＮＡを１０μｌの滅菌水に溶
かし、１μｌを用いて０．８％アガロースゲル電気泳動
を行い、合成の確認と濃度の定量を行った。

【００５０】（４）アダプターの連結 上記（３）で得た合成ｃＤＮＡに対して１０倍量のモル
比となるようにアダプター（ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−Ｂ
ａｍＨＩアダプター、宝酒造社製）を加え、全体量の８
倍量のライゲーション溶液Ａ（ライゲーションキット、
宝酒造社製）と１倍量のライゲーション溶液Ｂ（ライゲ
ーションキット、宝酒造社製）を加えた。十分撹拌した
後、１６℃で３０分間インキュベートし、アダプターを
ｃＤＮＡへ連結させた。

【００５１】この反応液をＴＡＥ緩衝液系で１％の低融
点アガロースゲル（Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅアガロース、
宝酒造社製）で電気泳動を行い、０．５ｋｂｐ以上のｃ
ＤＮＡ画分を含むゲルを回収した。この操作により、ｃ
ＤＮＡに結合しなかったアダプターも同時に除いた。回
収したゲルの湿重量に対し、２倍量のＴＥ緩衝液を加
え、６５℃で１０分間保温し、アガロースゲルを溶解し
た後、全体量に対し等量のトリス飽和フェノールを加
え、十分に撹拌後、氷冷した。遠心分離により水相を回
収し、等量のトリス飽和フェノール処理を再び行った。
遠心分離により水相を回収し、最後に等量のクロロホル
ムを加え、十分撹拌後遠心分離した。その後、水相を回
収し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２０μｇのグ
リコーゲン（ベーリンガーマンハイム社製）、２．５倍
量のエタノールを加え、−２０℃で３０分間冷却した
後、１５，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心し、ｃＤ
ＮＡの沈殿を得た。

【００５２】（５）λｇｔ１１ライブラリーの作製 上記（４）で得たアダプターを連結したｃＤＮＡを９６
μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ
ＡＴＰからなる溶液に溶解し、４０ユニットのポリヌ
クレオチドキナーゼを加え、３７℃で６０分間インキュ
ベーションし、アダプターの５’末端をリン酸化した。
反応終了後、２００μｌのＴＥ緩衝液を加え、３００μ
ｌのトリス飽和フェノールを加え、撹拌後、遠心分離
（１５，０００ｒｐｍ、室温、２分間）により上清を回
収した。同様の遠心分離処理をトリス飽和フェノール・
クロロホルム（１：１）溶液、続いて２％イソアミルア
ルコールを含むクロロホルム溶液によって行い、最終的
に２５０μｌの上清を得た。この上清に２５０μｌの４
Ｍ酢酸アンモニウム溶液、１２５０μｌのエタノールを
加え、−２０℃、３０分間冷却後、遠心分離（１５，０
００ｒｐｍ、４℃、１０分間）により沈殿を回収した。
ｃＤＮＡの沈殿に１μｇのＥｃｏＲＩ消化脱リン酸λｇ
ｔ１１アーム（＃２３４２１１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社製）を加え、終濃度１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３００ｍＭ Ｎ
ａＣｌの溶液５μｌに溶解した。ライゲーション溶液Ｂ
（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒造社製）を５μｌ
加え、十分撹拌した後、２６℃で１０分間反応させた。
ｃＤＮＡをλファージにパッケージするために、ｃＤＮ
Ａを含むライゲーション反応液４μｌを、１０μｌのＦ
ｒｅｅｚｅ／Ｔｈａｗ抽出液（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩｇ
ｏｌｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に加え、直ちにＳ
ｏｎｉｃ抽出液（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ ｇｏｌｄ）を
加え、ゆっくり撹拌した。２２℃にて２時間インキュベ
ーションした後、５００μｌのファージ希釈用溶液（５
ｇ ＮａＣｌ、２ｇ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５０ｍｌ
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍｌ ２
％ゼラチン／リットル）と、１０μｌのクロロホルムを
加え、インビトロパッケージング反応を終了した。この
ファージ溶液は４℃に保存し、スクリーニングに用い
た。

【００５３】実施例２：モノクローナル抗体を用いたＦ
ｃγＢＰをコードする部分ｃＤＮＡのクローニング
（Ｂ：抗体を用いたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング） （１）スクリーニング 実施例１で作製した、λファージにパッケージングをし
た大腸粘膜上皮細胞のｃＤＮＡライブラリーの１×１０
^４ｐｆｕ、２００μｌを、一晩培養した大腸菌株Ｙ１０
９０γ⁻ ２００μｌと混ぜ合わせ、３７℃で１５分間
インキュベーションした。ＬＢ培地を混合した０．８％
トップアガロースを溶解した後、５５℃に保温したもの
５ｍｌをファージと大腸菌のプレインキュベーション液
に加えて混ぜ合わせ、１．５％ ＬＢアガロースプレー
ト（１０×１４ｃｍ）上に均一に広げた。４２℃のイン
キュベーター中にて３．５時間保温し、小さなプラーク
が確認された後、あらかじめ１０ｍＭ ＩＰＴＧをしみ
こませた後風乾させておいたナイロン強化ニトロセルロ
ースフィルター（＃ＢＡ−Ｓ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ＆ Ｓｃｈｎｅｌｌ社製）を重ね、３７℃にて３．
５時間保温した。フィルターをプレートからはがし、洗
浄液（０．０５％ ＴＷｅｅｎ−２０、２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
３ｍＭ ＫＣｌ）中、室温で３０分間振とうした。次
に、５％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）中、室温で３
０分間振とうし、ブロッキング処理を行った後、洗浄液
にて２０分間、２回洗浄した。次いで、大腸粘膜上皮細
胞中のＦｃγＢＰに対して作製されたマウスモノクロー
ナル抗体（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）１４６：６８−７４；
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ（１９８９）１４３：２５６７−２５７４）であ
るＫ９またはＫ１７を含むハイブリドーマ培養上清を、
ニトロセルロース膜１枚に対し５ｍｌに浸し、室温で２
時間振とうした後、洗浄液で２０分間、２回洗浄した。
洗浄液にて１／１０００倍に希釈したホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ（Ｈ
＋Ｌ）ヤギ抗血清（ザイメット社製）中、室温で１時間
振とうした後、洗浄液で２０分間、２回洗浄した。ＴＷ
ｅｅｎ−２０を含まないＴＢＳ溶液で１０分間洗浄した
後、５０ｍｌのジアミノベンチジン溶液（１ｍｇ／ｍｌ
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２））と、５
０ｍｌの０．０２％ Ｈ_２Ｏ_２溶液と５０μｌの８％
ＮｉＣｌ_２溶液の混合液に浸し、陽性プラークの検出を
行った。

【００５４】（２）λＤＮＡの抽出 Ｋ９モノクローナル抗体を用いたスクリーニングによ
り、約１００万個のプラーク中から１個の約６００塩基
対の挿入ｃＤＮＡを含むクローンを得た。このプラーク
をつまようじでピックアップして、２００μｌの培地
（２０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２％マルトース、５μｌ
のＹ１０９０γ⁻大腸菌株の一晩培養懸濁液を含むＬＢ
培地）で、λファージを３７℃、４時間培養した。この
ファージを含む培養液２μｌ（１×１０^７ｐｆｕ／μ
ｌ）を、１０ｍｌ ＬＢ培地（２０ｍＭＭｇＳＯ_４と
０．２５ｍｌのＹ１０９０γ⁻大腸菌株の一晩培養懸濁
液を含む）に添加、感染させ、３７℃、５時間振とう培
養し、λファージを増殖させた。

【００５５】５〜６時間培養後、溶菌を確認してから、
５０μｌのクロロホルム、２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを加
え、３７℃、１０分間振とうした。３，５００ｒｐｍ、
１５分間遠心した上清に対して１０％となるようポリエ
チレングリコール６０００を加え、氷上で３０〜６０分
置いた後、４℃、４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離
し、ファージを沈殿させた。沈殿を１ｍｌのＡ緩衝液
（０．５％ ＮＰ−４０、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１２５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、３．６ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、６０ｍＭ
２−メルカプトエタノール）に懸濁し、１００μｇ／
ｍｌ ＲＮａｓｅＡ、２０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩと
共に３７℃、３０分間インキュベートした。Ａ緩衝液と
等量のクロロホルムを加え、撹拌後、１５，０００ｒｐ
ｍ、２分間、室温で遠心分離し、上清を回収した。再び
同量のクロロホルムを加えて同様に遠心分離して上清を
回収した。その後、上清液に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤ
Ｓ、１００μｇ／ｍｌプロテアーゼＫとなるようにそれ
ぞれ添加し、５５℃、６０分間インキュベートした。λ
ＤＮＡを精製するため、定法通り順次フェノール処理、
フェノール／クロロホルム処理、クロロホルム処理を行
い、ＤＮＡａｓｅ、プロテアーゼなどを失活させた後、
１／２０量の５Ｍ ＮａＣｌと１倍量のイソプロパノー
ルを加え、ｃＤＮＡフラグメントが挿入されたλＤＮＡ
の沈殿を得た。

【００５６】（３）プローブＤＮＡの作製 上記（２）で精製したｃＤＮＡフラグメントを含むλＤ
ＮＡからＢａｍＨＩ制限酵素部位を用いて挿入ＤＮＡを
切り出し、第２ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
のためのプローブ（これをプローブＱと命名した）とし
た。

【００５７】同様の方法で、Ｋ１７モノクローナル抗体
を用いて得られた７個のλクローンのうち最長の挿入部
（約１３００塩基）をもつクローンよりＢａｍＨＩによ
って切り出される７００塩基と６００塩基のＤＮＡプロ
ーブを得た。このうちＫ１７抗体のエピトープをコード
するｃＤＮＡを含むと推定される７００塩基のＤＮＡ断
片をプローブＡ、６００塩基の断片をプローブＢとし、
第２ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。

【００５８】（４）ノーザンブロッティング 抗体によるスクリーニングによって得られたＡ、Ｑの各
プローブが同一のｍＲＮＡとハイブリダイズすることを
ノーザンブロットにより確認した。

【００５９】大腸粘膜上皮細胞よりＡＧＰＣ法により抽
出した全ＲＮＡ１５μｇを４．５μｌの滅菌水に溶かし
た後、２μｌの５×ＭＯＰＳ緩衝液、３．５μｌのホル
ムアルデヒド、１０μｌのホルムアミドと混合し、６０
℃、１５分間熱変性した後、ホルムアルデヒド存在下で
１％アガロースゲル上で電気泳動した。電気泳動終了
後、ＲＮＡをナイロン膜（バイオダインＡ、ポール社
製）へキャピラリー法にて一晩トランスファーを行っ
た。ＵＶ架橋によりＲＮＡをナイロン膜に固定した後、
１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰ
Ｅ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ホルムアミ
ド、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精
子ＤＮＡ）中にて４２℃、８時間、プレハイブリダイゼ
ーションを行った。

【００６０】次に抗体スクリーニングにより得られたプ
ローブＡおよびＱを各々、α［^３２Ｐ］ｄＣＴＰを用
い、メガプライムラベリングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ
社製）によって放射性標識した。各プローブ１×１０^８
ｄｐｍを各々、５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液と
共にプレハイブリダイゼーション処理したナイロン膜に
加え、密封した後、４２℃、一晩ハイブリダイゼーショ
ンを行った。ナイロン膜の洗浄は０．２×ＳＳＣ、０．
２％ ＳＤＳを含む溶液中で、６５℃、４０分間の洗浄
操作を３回繰り返し行った。ナイロン膜を乾燥後、Ｘ線
フィルムに一晩露光した。

【００６１】以上の方法より、プローブＡおよびＱを用
いて推定約１７ｋｂｐのバンドが一本それぞれ検出さ
れ、２種類のプローブが分子量的に同一のｍＲＮＡとハ
イブリダイズすることを確認した。

【００６２】実施例３：ＦｃγＢＰをコードするｃＤＮ
Ａの第２のクローニング（Ａ：ｃＤＮＡライブラリーの
作製） （１）ヒト大腸粘膜上皮細胞の調製 ヒト大腸組織片を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地でよ
く洗浄した後、粘膜筋板の部位から機械的に剥離させ、
上皮細胞と粘膜固有層を分離した。これを中心棒に固定
するようにして、１０％ＦＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／Ｐ
ＢＳ（−）中で氷冷しながら９０分間スターラーで激し
く撹拌し、上皮細胞を分離した。上皮細胞を含む溶液を
１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞の沈殿を得た。

【００６３】（２）ｍＲＮＡの精製 粘膜上皮細胞からの全ＲＮＡの抽出はＡＧＰＣ法（Ｐ．
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９８７）１６２：１
５６−１５９）を改変して行った。すなわち、細胞ペレ
ット１ｍｌに対し、９ｍｌの変性溶液（４Ｍチオシアン
酸グアニジン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ
７）、０．５％サルコシル、０．１Ｍ ２−メルカプト
エタノール）を加え、細胞を溶解した後、１ｍｌの２Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、１０ｍｌの水飽和フェノー
ル溶液、２ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール
（４９：１）を順次加えた。１０秒間撹拌し、１５分間
氷冷した後、１０，０００×ｇで１５分間遠心し、上清
を回収した。上清８ｍｌに対し、同様に０．８ｍｌの酢
酸ナトリウム、８ｍｌの水飽和フェノール、１．６ｍｌ
のクロロホルム／イソアミルアルコールを加え、１０秒
撹拌、１５分氷冷、１０，０００×ｇで１５分間遠心
し、上清を回収した。上清７ｍｌに対し、等量のクロロ
ホルム／イソアミルアルコールを加え撹拌後、遠心分離
により上清を得た。上清に対し、等量のイソプロパノー
ルを加え、−２０℃で３０分間冷却後、１０，０００×
ｇで１５分間遠心し、全ＲＮＡの沈殿を回収した。

【００６４】全ＲＮＡ１ｍｇの溶液に溶出バッファー
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）を加え、全量で１ｍｌ
とした後、ＯｌｉｇｏＴｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞
（宝酒造社製）１ｍｌを加え、６５℃で５分間加熱し、
氷上で３分間急冷した。５Ｍ ＮａＣｌ ０．２ｍｌを
加え、３７℃で１０分間保温した後、１５，０００ｒｐ
ｍで３分間遠心分離し、上清を注意深く除去した。ペレ
ットを洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１％ ＳＤＳ）２．５ｍｌに懸濁した後、１
５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を注意深く
除去した。ペレットを滅菌水１ｍｌに懸濁し、６５℃で
５分間加熱し、氷上で３分間急冷した。１５，０００ｒ
ｐｍで３分間遠心分離した後、上清を回収した。５０μ
ｌの５Ｍ ＮａＣｌと２．５ｍｌのエタノールを加えた
後、−２０℃で３０分冷却し、遠心（３，０００ｒｐ
ｍ、４℃）して、ポリアデニル化ＲＮＡの沈殿を回収し
た。

【００６５】（３）ｃＤＮＡの合成 ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、Ｇｕｂｌｅｒおよび
Ｈｏｆｆｍａｎの改良法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製
またはＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製のｃＤＮＡ合成キット
を用いて行った。すなわち、大腸粘膜上皮細胞より調製
したポリアデニル化ＲＮＡ５μｇを４２℃にて９０分
間、５０ユニットのヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビ
ター、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ
ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ユニットのＡ
ＭＶ逆転写酵素、ピロリン酸ナトリウムを含む緩衝液
（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）５０μｌ中で、７５０ｎｇの
ランダムヘキサヌクレオチドまたは４μｇのオリゴ（ｄ
Ｔ）プライマーと共にインキュベートした。この反応液
５０μｌを４．０ユニットの大腸菌リボヌクレアーゼ
Ｈ、１１５ユニットの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを含
む緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）中で、１２℃で６０
分間、次いで２２℃で６０分間反応させた後、７０℃で
１０分間インキュベートした。氷中に戻し、１０ユニッ
トのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを加え、３７℃で１０分
間反応させた後、１０μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８）を加えて反応を停止させた。反応液２５０μｌに
対し、等量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムと、４倍量のエ
タノールを加え、撹拌後、−２０℃にて３０分間冷却
し、遠心分離によりｃＤＮＡを回収した。ｃＤＮＡを１
０μｌの滅菌水に溶かし、１μｌを用いて０．８％アガ
ロースゲル電気泳動を行い、合成の確認と濃度の定量を
行った。

【００６６】（４）アダプターの連結 上記（３）で得た合成ｃＤＮＡに対して１０倍量のモル
比となるようにアダプター（ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−Ｂ
ａｍＨＩアダプター、宝酒造社製）を加え、全体量の８
倍量のライゲーション溶液Ａ（ライゲーションキット、
宝酒造社製）と１倍量のライゲーション溶液Ｂ（ライゲ
ーションキット、宝酒造社製）を加えた。十分撹拌した
後、１６℃で３０分間インキュベートし、アダプターを
ｃＤＮＡへ連結させた。

【００６７】この反応液をＴＡＥ緩衝液系で０．８％の
低融点アガロースゲル（Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅアガロー
ス、宝酒造社製）で電気泳動を行い、約４ｋｂｐ以上の
ｃＤＮＡ画分を含むゲルを回収した。この操作により、
ｃＤＮＡに結合しなかったアダプターも同時に除いた。
回収したゲルの湿重量に対し、２倍量のＴＥ緩衝液を加
え、６５℃で１０分間保温し、アガロースゲルを溶解し
た後、全体量に対し等量のトリス飽和フェノールを加
え、十分に撹拌後、氷冷した。遠心分離により水相を回
収し、等量のトリス飽和処理を再び行った。遠心分離に
より水相を回収し、最後に等量のクロロホルムを加え、
十分撹拌後遠心分離した。その後、水相を回収し、１／
１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２０μｇのグリコーゲン
（ベーリンガーマンハイム社製）、２．５倍量のエタノ
ールを加え、−２０℃で３０分間冷却した後、１５，０
００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心し、ｃＤＮＡの沈殿を
得た。

【００６８】（５）λｇｔ１０ライブラリーの作製 上記（４）で得たアダプターを連結したｃＤＮＡを９６
μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ
ＡＴＰからなる溶液に溶解し、４０ユニットのポリヌ
クレオチドキナーゼを加え、３７℃で６０分間インキュ
ベーションし、アダプターの５’末端をリン酸化した。
反応終了後、２００μｌのＴＥ緩衝液を加え、３００μ
ｌのトリス飽和フェノールを加え、撹拌後、遠心分離
（１５，０００ｒｐｍ、室温、２分間）により上清を回
収した。同様の遠心分離処理をトリス飽和フェノール・
クロロホルム（１：１）溶液、続いて２％イソアミルア
ルコールを含むクロロホルム溶液によって行い、最終的
に２５０μｌの上清を得た。この上清に２５０μｌの４
Ｍ酢酸アンモニウム溶液、１２５０μｌのエタノールを
加え、−２０℃、３０分間冷却後、遠心分離（１５，０
００ｒｐｍ、４℃、１０分間）により沈殿を回収した。
ｃＤＮＡの沈殿に１μｇのＥｃｏＲＩ消化脱リン酸λｇ
ｔ１０アーム（＃２３３２１１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社製）を加え、終濃度１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３００ｍＭ Ｎ
ａＣｌの溶液５μｌに溶解した。ライゲーション溶液Ｂ
（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒造社製）を５μｌ
加え、十分撹拌した後、２６℃で１０分間反応させた。
ｃＤＮＡをλファージにパッケージするために、ｃＤＮ
Ａを含むライゲーション反応液４μｌを、１０μｌのＦ
ｒｅｅｚｅ／Ｔｈａｗ抽出液（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩｇ
ｏｌｄ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に加え、直ちにＳ
ｏｎｉｃ抽出液（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ ｇｏｌｄ）を
加え、ゆっくり撹拌した。２２℃にて２時間インキュベ
ーションした後、５００μｌのファージ希釈用溶液（５
ｇ ＮａＣｌ、２ｇ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５０ｍｌ
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍｌ ２
％ゼラチン／リットル）と、１０μｌのクロロホルムを
加え、インビトロパッケージング反応を終了した。この
ファージ溶液は４℃に保存し、スクリーニングに用い
た。

【００６９】実施例４：ＦｃγＢＰをコードする全長ｃ
ＤＮＡのクローニング（Ｂ：ＤＮＡプローブを用いたｃ
ＤＮＡライブラリーのスクリーニング） （１）ブロッティング λファージにパッケージングを行った大腸粘膜上皮細胞
のｃＤＮＡ（２×１０^４ｐｆｕ）を、一晩培養した大腸
菌株Ｃ６００ｈｆｌ ２００μｌに感染させた後、３７
℃で１５分間保温した。５５℃に保温した０．８％トッ
プアガロース／ＬＢ培地を加えた後直ちにＬＢプレート
（１０×１４ｃｍ）上に広げた後、３７℃にて１２時間
インキュベートした。プラークの直径が１ｍｍ程度にな
ったところで、ナイロン膜（ＢｉｏｄｙｎｅＡ、孔径
０．２μｍ，ポール社製）を重ね、４℃、１０分間冷却
した。ナイロン膜をプレートよりはがし、ブロッティン
グ溶液Ｉ（０．５Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ）、ブロッティング溶液ＩＩ（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４））、ブロッティング溶液ＩＩＩ（０．
５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ＤＨ７．４）、１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ）で各々５分間処理した後、ＵＶクロスリンク装置
（ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ２４００，ＳＴＲＡ
ＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて１２００μジュールにてＤ
ＮＡをナイロン膜に固定した。

【００７０】（２）ハイブリダイゼーション λＤＮＡを固定したナイロン膜１枚当り、１０ｍｌのハ
イブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ，５×Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ホルムアミド、０．５％Ｓ
ＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ）を加
え、ハイブリダイゼーションバッグに密封した後、４２
℃で８時間プレハイブリダイゼーションを行った。次
に、抗体スクリーニングにより得られたプローブＱ，
Ａ，Ｂを各々α［^３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いてランダムプ
ライミング法により放射性標識した。プローブＱ，Ａ，
Ｂの各１×１０^８ｄｐｍを５ｍｌのハイブリダイゼーシ
ョン溶液と共にプレハイブリダイゼーションの終了した
ナイロン膜に加え、密封後、４２℃で一晩ハイブリダイ
ゼーションを行った。インキュベーションの終了後、ナ
イロン膜を０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液で６
５℃４０分間洗浄する操作を３回くり返した後、Ｘ線フ
ィルムに一晩露光した。

【００７１】以上のスクリーニングにより、プローブ
Ａ，Ｂ，Ｑの１種または、複数とハイブリダイズする６
９個のラムダクローンを得た。それぞれから、前述の通
りの方法でλＤＮＡを調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩで処
理した後、電気泳動し、挿入ＤＮＡのサイズの確認を行
った。

【００７２】実施例５：ＦｃγＢＰｍＲＮＡのサイズ推
定 実施例２で得たプローブＱを用いてＦｃγＢＰｍＲＮＡ
のサイズを推定した。比較のための既知タンパク質のｍ
ＲＮＡとして、１４．０ｋｂｐのＤｙｓｔｒｏｐｈｉｎ
ｍＲＮＡ（Ｍ．Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９８
８）Ｃｅｌｌ５３：２１９−２２８）と、１５．２ｋｂ
ｐのＲｙａｎｏｄｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍＲＮＡ
（Ｆ．Ｚａｒｚａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．
Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．，２６５：２２４４−２２５６）
を用いた。これらの対照ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡプロ
ーブは、いずれも文献から得られる塩基配列をもつ合成
プローブを調製し、これらを用いてポリメラーゼチェイ
ンリアクション（ＰＣＲ）法により作製し、それぞれプ
ローブＤＹＳおよびプローブＲＤＲとした。

【００７３】Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｍＲＮＡとＲｙａ
ｎｏｄｉｎｅ ＲｅｃｅｐｔｏｒｍＲＮＡの供給源はヒ
ト骨格筋ポリアデニル化ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社
製）である。

【００７４】大腸粘膜上皮細胞より得られたポリアデニ
ル化ＲＮＡ２μｇまたはヒト骨格筋ポリアデニル化ＲＮ
Ａ１μｇ、あるいは両者の混合物を実施例２の（４）と
同様の方法で電気泳動を行い、ナイロン膜上にトランス
ファーした。このナイロン膜をプローブＱを用いてハイ
ブリダイゼーションを行い、オートラジオグラフィーに
より検出した。

【００７５】次いで同じ膜で対照ｍＲＮＡのハイブリダ
イゼーションを行うため、このナイロン膜を５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ＤＨ７．５）、１．２５
ｍＭＥＤＴＡ、３ｘＳＳＣ、１ＸＤｅｎｈａｒｄ’ｓ溶
液、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドを含む溶液２０ｍ
ｌとともに、７０℃、１時間インキュベーションした。
次いで、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液
で室温、１０分間振とうし洗浄する操作を２回行った。
その後、ナイロン膜でオートラジオグラフィーを行い、
バンドの消失されたこと（デハイブリダイゼーション）
を確認した。

【００７６】次に、上記と同様の方法にて、プローブＤ
ＹＳによるハイブリダイゼーションを行い、オートラジ
オグラフィーにより検出した。このナイロン膜を上記と
同様の方法でデハイブリダイゼーションを行った後、オ
ートラジオグラフィーでバンドの消失されたことを確認
した。最後にプローブＲＤＲによるハイブリダイゼーシ
ョンを同様に行い、オートラジオグラフィーによるバン
ドの検出を行った。

【００７７】以上の結果より得られたＤｙｓｔｒｏｐｈ
ｉｎ ｍＲＮＡ、Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ ｍＲＮＡの各バンドの移動度を分子サイズに対して
プロットを行い、標準曲線を得て、ＦｃγＢＰｍＲＮＡ
の移動度よりその分子サイズを約１７ｋｂｐと推定した
（図１）。

【００７８】実施例６：ＦｃγＢＰをコードするｃＤＮ
Ａの塩基配列の決定（１） ＩｇＧＦｃ部結合能をもつタンパク質のアミノ酸配列を
コードする領域の塩基配列を決定するために、上記実施
例４で得られた６９個のλクローンの中から、必要な５
個のクローンを以下の方法で選択し、ＤＮＡシーケンサ
ー（モデル３７３Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ社製）で塩基配列を決定した。

【００７９】（１）クローンＸ１ プローブＡ、ＢおよびＱとのハイブリダイゼーションに
よるスクリーニングにより得られたｃＤＮＡクローンの
中で、プローブＱおよびＢとはハイブリダイズせず、プ
ローブＡとのみハイブリダイズするクローンを得た。こ
のクローンの挿入ｃＤＮＡの中でプローブＡとは反対側
の末端でＥｃｏＲＩとＳｍａＩによって切り出される約
７００ｂｐのフラグメントを回収し、これをプローブＸ
とした。次に、プローブＸを用いて実施例３と同様の方
法でｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、プ
ローブＸおよびプローブＡ、Ｂとハイブリダイズするク
ローンＸ１を得た。そして、クローンＸ１の挿入部ｃＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動に
より約３３００ｂｐのＤＮＡを分離した後回収し、プラ
スミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）の
ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、制限酵素地図の作
製および塩基配列の決定を行った。

【００８０】（２）クローンＹ１ クローンＸ１のｃＤＮＡの中で、プローブＢを含む部分
とは反対側でＥｃｏＲＩとＳａｃＩによって切り出され
る約８００ｂｐのフラグメントを回収し、これをプロー
ブＹとした。プローブＹを用いて実施例３と同様の方法
でｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、得ら
れたクローンのうち、最長のｃＤＮＡをもつクローンで
あるクローンＹ１を得た。そして、クローンＹ１の挿入
部ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気
泳動により約１９００ｂｐのＤＮＡを分離した後回収
し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、制限酵素
地図の作製および塩基配列の決定を行った。

【００８１】（３）クローンＣ７２ クローンＹ１のｃＤＮＡの中で、プローブＸを含む部分
とは反対側でＳａｃＩとＳｐｈＩによって切り出される
約１５０ｂｐのフラグメントを回収し、これをプローブ
Ｙ１５０とした。プローブＹ１５０を用いて実施例３と
同様の方法でｃＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡサイズが
２から４ｋｂｐのもの）のスクリーニングを行い、９個
のクローンを得た。得られたクローンの挿入ｃＤＮＡ部
分の中で、Ｙ１５０を境としてＹ領域とは反対側に最も
長く伸び、かつＹ１５０を含むｃＤＮＡを得て、これを
クローンＣ７２とした。そして、クローンＣ７２の挿入
部ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気
泳動により約１２００ｂｐのＤＮＡを分離した後回収
し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、制限酵素
地図の作製および塩基配列の決定を行った。

【００８２】（４）クローンＮＺ４ クローンＣ７２の挿入部ｃＤＮＡの中で、プローブＹ１
５０を含む部分とは反対側でＥｃｏＲＩとＳａｃＩによ
って切り出される約４５０ｂｐのフラグメントを回収
し、これをプローブＺとした。ヒト大腸癌由来培養細胞
ＨＴ２９−１８−Ｎ２株を用いて、実施例３（２）−
（５）と同様の方法でλｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリ
ーを作製し、プローブＺを用いて実施例３と同様にスク
リーニングを行い、４個のクローンを得た。得られたク
ローンのうち、Ｃ７２と重複しない部分を最も長く含む
クローンＮＺ４を得た。そして、クローンＮＺ４の挿入
部ｃＤＮＡをＮｏｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動により約９００ｂｐのＤＮＡを分離した後回収し、プ
ラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）
のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、制限酵素地図の
作製および塩基配列の決定を行った。

【００８３】（５）クローンＶ１１ プローブＡ、ＢおよびＱによるスクリーニングでいずれ
ともハイブリダイズするｃＤＮＡクローンのプローブ
Ａ、Ｂとハイブリダイズする部分の塩基配列を解析し、
先に塩基配列を決定したクローンＸ１の末端側にあるＡ
−Ｂ領域と同一の塩基配列をもつクローンを得て、クロ
ーンＶ１１とした。クローンＶ１１の挿入部ｃＤＮＡを
ＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により約
３７００ｂｐのＤＮＡを分離した後回収し、プラスミド
ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）のＥｃｏＲ
Ｉ部位に挿入した。この後、制限酵素地図の作製および
塩基配列の決定を行った。

【００８４】実施例７：クローンＮＺ４がＦｃγＢＰ
ｍＲＮＡの５’末端近傍であることの推定 実施例６で得られた５種のクローンがＮＺ４−Ｃ７２−
Ｙ１−Ｘ１−Ｖ１１の順に５’末端方向または３’末端
方向に向かって伸展しているが、それらの塩基配列をア
ミノ酸に翻訳したところ、５’末端方向へ伸びているこ
とが推定された。そこで、現在最上流に位置するクロー
ンＮＺ４ＤＮＡをプローブとしてランダムプライミング
で作製したライブラリーをスクリーニングしたところ、
１３種の独立したクローンが得られたが、ＮＺ４よりも
５’側に伸長したクローンは得られなかった。また、Ｎ
Ｚ４の塩基配列をアミノ酸へ翻訳したところ、オープン
リーディングフレーム上、予想される最も５’上流に位
置するメチオニンに対するＡＴＧコドン近傍はＫｏｚａ
ｋ則に類似していたため、このＡＴＧが開始メチオニン
である可能性が示唆された。しかし、このＡＴＧコドン
の最初のＡは、クローンＮＺ４では僅か９番目に位置
し、その９塩基内にはｉｎ ｆｒａｍｅにストップコド
ンは存在しないことから転写産物のみならず翻訳レベル
でも５’（Ｎ末端）方向へｃＤＮＡの配列が伸長してい
る可能性を否定できない。したがって、プライマーエク
ステンション法により転写開始部位の検証ならびに翻訳
開始部位を推定する目的で以下の実験を行った。

【００８５】（１）全ＲＮＡとポリアデニル化ＲＮＡの
調製 ヒト大腸粘膜上皮細胞およびＨＴ２９−１８−Ｎ２細胞
から、実施例１の（２）または実施例３の（２）と同様
に全ＲＮＡとポリアデニル化ＲＮＡを調製した。

【００８６】（２）エクステンションプライマーの合成 ２種のプライマー、プライマー１：ＧＣＴＧＡＴＡＧＴ
ＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣ
ＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴ−５０ｍｅｒ、プライ
マー２：ＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡＣ
ＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡＧＧ−３３ｍｅｒは、ＤＮＡ合成
機（Ｍｏｄｅｌ ３９４、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ社製）にて合成し、ＯＰＣカラム（Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて精製した。各プ
ライマー１００ｐｍｏｌをγ［^３２Ｐ］ＡＴＰにてＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼにより末端ラベルし、Ｍｉｃ
ｒｏｓｐｉｎ^ＴＭＳ−２００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社製）により精製し、各０．５ｐｍｏｌを各反応
に用いた。

【００８７】（３）プライマーアニーリングとエクステ
ンション反応 ヒト大腸粘膜上皮細胞およびＨＴ２９−１８−Ｎ２由来
の全ＲＮＡ（２０μｇ）とポリアデニル化ＲＮＡ（２．
５μｇ）をそれぞれプライマーとアニーリングバッファ
ー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ ＫＣｌ）中で混合し、９５
℃、５分間加熱変性し、５８℃、１時間、さらに室温ま
たは３７℃で１．５時間インキュベートすることにより
ハイブリダイゼーションを行った。続いて、エクステン
ション反応を行うため、アニーリングサンプルをエタノ
ール沈殿し、この沈殿をＲＴａｓｅバッファー（３３ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、２０ｍＭ ＫＣｌ、
１３．３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１３．３ｍＭ ＤＴＴ、
０．３３ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５０μｇ／ｍｌアクチノマ
イシンＤ）に溶解後、２０ｕｎｉｔの逆転写酵素（ＲＮ
ａｓｅＨ−ｆｒｅｅＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ、ＴＯＹＯＢ
Ｏ社製）を加え、４２℃、１時間インキュベートした。
反応後、９５℃で３分処理しＲＴａｓｅを失活させた
後、１０μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅＡを加え、
３７℃、３０分間インキュベートしてテンプレートＲＮ
Ａを分解した。その後フェノール／クロロホルム、クロ
ロホルム抽出、エタノール沈殿を順次行った後、５％の
シークエンスゲルにて泳動し、泳動後ゲルは固定液（１
０％酢酸、１５％メタノール）で処理し、乾燥後オート
ラジオグラフィーを行った。なお、マーカーとしてＭ１
３ｍｐ１８をシークエナーゼｖｅｒ２．０ ＤＮＡシー
クエンシングキット（ＴＯＹＯＢＯ社製）で反応させた
ものを用いた。

【００８８】以上の方法により次に述べる結果が得られ
た。いずれの全ＲＮＡ標品をテンプレートとして用いて
も、プライマー１でのエクステンションの結果、プライ
マーより１１８塩基付近の位置に強いバンドが見られ、
またいずれのポリアデニル化ＲＮＡ標品をテンプレート
に用いたものでも１１８塩基付近だけでなく、１５７塩
基付近の位置に弱いエクステンションバンドが見られ
た。現在最も５’側のクローンと考えられるＮＺ４の
５’末端を便宜上＋１とすると、これらはそれぞれ＋２
７、−１３に相当した。この＋２７でエクステンション
反応が止まった理由として、ＮＺ４の５’末端近傍の２
次構造の形成を予測させるパリンドロミックな構造が存
在することが挙げられる。事実できるだけそうした２次
構造を抑える目的で合成したより５’側にあるプライマ
ー２での結果では−１０から−１６付近にかけて強いブ
ロードなバンドが、さらに−２３に相当する位置に弱い
シングルバンドが検出された。そして、−２３より高分
子領域にはバンドは検出されなかった。

【００８９】以上の結果から、ＮＺ４の５’末端より１
０から２０塩基上流付近に転写開始部位の存在が示唆さ
れ、この範囲にｉｎ ｆｒａｍｅでのＡＴＧコドンが存
在しない場合には現在ＯＲＦ上最も５’端にあるＡＴＧ
が翻訳開始部位である可能性が強く推定された。これら
の事実はクローンＮＺ４がＮＺ４−Ｃ７２−Ｙ１−Ｘ１
−Ｖ１１の順で極めてＮ末端に近いことを示している。

【００９０】実施例８：発現ｃＤＮＡ／ベクター系の構
築（Ａ：発現に用いた部分ｃＤＮＡの調製） タンパク質発現のために、ＦｃγＢＰの部分ｃＤＮＡの
挿入されたλＤＮＡクローン（＃ＮＺ４、＃Ｃ７２、＃
Ｙ１、＃Ｘ１、＃Ｖ１１）を、ＥｃｏＲＩまたはＮｏｔ
Ｉにて切断した後、挿入部のｃＤＮＡを還状プラスミド
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）へサブクローニン
グし、それぞれｐＮＺ４、ｐＣ７２、ｐＹ１、ｐＸ１、
ｐＶ１１と命名した。

【００９１】（１）ｐＮＺ４：λクローン（＃ＮＺ４）
をＮｏｔＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動
にて約９００ｂｐの挿入部を分離・精製し、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＮｏｔＩ部位に結合させ
た。ｃＤＮＡのタンパク質コードストランドの５’→
３’方向がプラスミド中のＬａｃＺ遺伝子の方向と逆向
きに挿入されたクローンを選択した。挿入部の全塩基配
列を配列番号１に示す。

【００９２】なお、本発明の塩基配列表においては、ｃ
ＤＮＡ由来の塩基配列を大文字で、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＳＫ（＋）由来の塩基配列を小文字で、また合成
アダプターおよび合成オリゴヌクレオチド由来の塩基配
列を小文字のアンダーラインでそれぞれ示した。

【００９３】また、アミノ酸配列は、Ｋｏｚａｋ配列と
一致するＡＴＧを開始コドンとし、塩基配列よりユニバ
ーサルコドンにより推定した配列を示した。

【００９４】（２）ｐＣ７２：λクローン（＃Ｃ７２）
をＥｃｏＲＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳
動にて約１３００ｂｐの挿入部を分離・精製し、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に結合
させた。ｃＤＮＡの５’→３’方向がプラスミド中のＬ
ａｃＺ遺伝子の方向と逆向きに挿入されたクローンを選
択した。挿入部の全塩基配列を配列番号２に示す。

【００９５】（３）ｐＹ１：λクローン（＃Ｙ１）をＥ
ｃｏＲＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動に
て約１９００ｂｐの挿入部を分離精製し、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に結合させ
た。同じサイズのＤＮＡ挿入部をもつクローンを選択し
た。挿入部の全塩基配列を配列番号３に示す。

【００９６】（４）ｐＸ１：λクローン（＃Ｘ１）をＥ
ｃｏＲＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動に
て約３３００ｂｐの挿入部を分離・精製し、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に結合させ
た。同じサイズのＤＮＡ挿入部をもつクローンを選択し
た。挿入部の全塩基配列を配列番号４に示す。

【００９７】（５）ｐＶ１１：λクローン（＃Ｖ１１）
をＥｃｏＲＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳
動にて約３７００ｂｐの挿入部を分離・精製し、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に結合
させた。同じサイズのＤＮＡ挿入部をもつクローンを選
択した。挿入部の全塩基配列を配列番号５に示す。

【００９８】実施例９：発現ｃＤＮＡ／ベクター系の構
築（Ｂ：タンパク質発現のための部分ｃＤＮＡの連結） （１）ｐＮＺＣ７の調製 ｃＤＮＡクローンを挿入したプラスミドｐＮＺ４（５μ
ｇ）を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩ（各々５０ユニ
ット）で完全消化した後、低融点アガロースゲル電気泳
動する。ＦｃγＢＰのｃＤＮＡの５’末端を含む約４０
０ｂｐのフラグメントを分離し、フェノール抽出した
後、エタノール沈殿により回収した（フラグメント
１）。次に第２番目のプラスミドｐＣ７２（５μｇ）を
ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで完全消化し、ベクター部分を含
む約４．２ｋｂｐのフラグメントを同様の方法で電気泳
動により単離した（フラグメント２）。フラグメント１
とフラグメント２を各々１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解
し、各２μｌを１６μｌのＡ溶液（ＤＮＡライゲーショ
ンキット、宝酒造社製）、４μｌのＢ溶液と混合し、１
６℃にて３０分間インキュベートし連結させた。この混
合液５μｌを１００μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ
（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を形質転換し、アンピシリン（１
００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上で３７℃１晩培
養した。生成したコロニーよりプラスミドＤＮＡを精製
し、フラグメント１とフラグメント２の連結したプラス
ミドｐＮＺＣ７を得た。

【００９９】（２）フラグメント５の調製 ｐＮＺＣ７（５μｇ）を各々５０ユニットのＸｈｏＩと
ＢｓｔＸＩで完全消化した後、電気泳動により約１３０
０ｂｐのフラグメントを回収した（フラグメント３）。
第３番目のプラスミドｐＹ１（５μｇ）を各５０ユニッ
トのＢｓｔＸＩとＨｉｎｃＩＩで完全消化した後、電気
泳動により約４２０ｂｐのフラグメントを回収した（フ
ラグメント４）。フラグメント３とフラグメント４を同
様の方法でＤＮＡリガーゼにより連結し、電気泳動を行
い両者が１分子ずつＢｓｔＸＩ部位で連結した約１７５
０ｂｐのフラグメントを回収した（フラグメント５）。

【０１００】（３）ｐＸＶ２の調製 第４番目のプラスミドｐＸ１（５μｇ）をＨｉｎｃＩＩ
及びＢａｍＨＩ（各５０ユニット）で完全消化し電気泳
動により、約２７８０ｂｐのフラグメントを回収した
（フラグメント６）。第５番目プラスミドｐＶ１１をＢ
ａｍＨＩ（５０ユニット）で完全消化し電気泳動により
約３３５０ｂｐのフラグメントを回収した（フラグメン
ト７）。フラグメント６とフラグメント７をＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結させ、両者が１分子ずつ連結された約
６１００ｂｐのフラグメントを電気泳動により回収した
（フラグメント８）。このフラグメント８をＨｉｎｃＩ
ＩとＢａｍＨＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ（＋）にＤＮＡリガーゼで連結した後コンピテント
Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。複数の形質転換体よりプ
ラスミドを回収した後、各々の塩基配列を決定し、フラ
グメント６とフラグメント７の方向性が正しく連結され
たフラグメント８を含むプラスミドクローンを得て、フ
ラグメント８の５’→３’方向がプラスミド中のＬａｃ
Ｚ遺伝子の方向と逆向きに挿入されたものをｐＸＶ２と
した。

【０１０１】（４）ｐＮＶ１１の調製 ｐＸＶ２をＸｈｏＩとＨｉｎｃＩＩで完全消化後、電気
泳動的に約９．１ｋｂｐのベクター部分を含むフラグメ
ントを回収した（フラグメント９）。フラグメント９と
前記フラグメント５をＤＮＡリガーゼを用いて連結した
後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を
形質転換した。形質転換体より、約７．８ｋｂｐのｃＤ
ＮＡ（フラグメント１０）を含む約１０．８ｋｂｐのプ
ラスミドｐＮＶ１１を得た。

【０１０２】（５）ストップコドン（ＵＡＧに対応する
もの）を含むオリゴヌクレオチドアダプターの合成 ＤＮＡ合成機（ｍｏｄｅｌ３９４、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてフレームを異にする
３個のＴＡＧを含み、両端にＮｏｔＩ部位とＳｐｅＩ部
位をそれぞれもつ次のオリゴオキシヌクレオチド、
（１）５’−ＣＴＡＧＴＴ ＡＧＴ ＴＡＧ ＴＴＡ
ＧＧＧ ＴＡＣ ＣＧＣ−３’，（２）５’−ＧＧＣ
ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＴＡ ＡＣＴ ＡＡＣ Ｔ
ＡＡ−３’を合成した。オリゴヌクレオチド１及び２各
１０ｎｍｏｌを混合し（合計１４６μｌ）た後、９５
℃、１分間、次いで８５℃、１０分間、次いで０．３３
℃／分の速さで４０℃まで徐々に冷却を行い、停止コド
ンを含むアダプターを作製した（ＴＡ−ＩＩＩアダプタ
ー）。このアダプター（２．１ｎｍｏｌ）の５’末端を
ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いて標準方法に
てリン酸化した。

【０１０３】ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）ベク
ター０．８３ｐｍｏｌをＮｏｔＩとＳｐｅＩにて完全消
化した後リン酸化したＴＡ−ＩＩＩアダプター２５０ｐ
ｍｏｌと混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて
１６℃３０分間インキュベートし連結させた後、エタノ
ール沈殿した。この沈殿を５０μｌ中にてＮｏｔＩで完
全消化し、アダプターシークエンス１回だけ持たせるよ
うにした後、低融点アガロースゲル電気泳動を行い約３
ｋｂｐのバンドを回収し、フェノール抽出した後、エタ
ノール沈殿を行った。得られた沈殿を、ＤＮＡライゲー
ションキットを用いて自己連結させた後、コンピテント
Ｅ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を形質転換した。ア
ンピシリンを含むＬＢプレート上で一晩培養し生じたコ
ロニーより得られたプラスミドのうち、ＴＡ−ＩＩＩア
ダプターが挿入されたプラスミドを選択した（ｐＢＬＳ
／ＴＡＩＩＩ）。

【０１０４】（６）ｐＮＶ１１−ＳＴの調製 ５μｇのプラスミド（ｐＮＶ１１）をＳｐｅＩで完全消
化した後、電気泳動的に約７．８ｋｂｐのフラグメント
を回収し、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した（フラグメ
ント１１）。２μｇのプラスミド（ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩ
Ｉ）をＳｐｅＩで完全消化し、バクテリアアルカリホス
ファターゼ（２ユニット）を用いて末端を脱リン酸化し
た後、フェノール／クロロホルム処理を２回行い、エタ
ノール沈殿した。沈殿を１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し
た（フラグメント１２）。各２μｌのフラグメント１０
とフラグメント１１を混合し、ＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、コンピテン
トＥ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂ１ｕｅ）を形質転換し、ア
ンピシリンを含むＬＢプレート上で一晩培養した。生じ
たコロニーのうち、挿入したｃＤＮＡの３’末端側にＴ
Ａ−ＩＩＩアダプターが連結されているプラスミドを制
限酵素地図及び塩基配列を調べる事により選択した。得
られたクローンがｐＮＶ１１−ＳＴである。

【０１０５】前記プラスミドｐＮＶ１１−ＳＴを含有す
る大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＸＬ１−
Ｂ１ｕｅ［ｐＮＶ１１−ＳＴ］として工業技術院生命工
学技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平
成６年４月１日に生命研条寄第４６２５号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４６２５）としてブタペスト条約に基づき国際寄
託された。

【０１０６】なお、ＦｃγＢＰの発現に用いた部分ｃＤ
ＮＡ（クローンｐＮＶ１１−ＳＴ）（約７．８ｋｂ
ｐ）、ならびにその構築に用いた実施例６に記載のクロ
ーンＮＺ４、Ｃ７２、Ｙ１、Ｘ１およびＶ１１の相互の
関係を図２に示す。

【０１０７】実施例１０：発現ｃＤＮＡ／ベクター系の
構築（Ｃ：タンパク質発現ベクターへの組込み） （１）ｐｃＤＬ−ＳＲα／ＮＯＴベクターの作製 ｃＤＮＡの組込みを行えるよう次の様にｐｃＤＬ−ＳＲ
α２９６ベクター（国立予防衛生研究所、武部豊博士よ
り恵与された：以下ＳＲαと記載することもある）の制
限酵素部位を改変した。まず、２μｇのＳＲαをＥｃｏ
ＲＩで完全消化した後、エタノールで沈殿した。沈殿を
Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液（７０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、７０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、各１ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）に溶解し、０．４ユニット
のＫｌｅｎｏｗフラグメントと共に３７℃１５分間イン
キュベートし、プラスミドの末端を平滑化した。エタノ
ール沈殿の後、ＴＥ緩衝液に溶解し、５’末端がリン酸
化されたＮｏｔＩリンカーをＤＮＡライゲーションキッ
トを用いて連結した。エタノール沈殿を行った後、Ｎｏ
ｔＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動を行い約
３．７ｋｂｐのＤＮＡを切出し、フェノール抽出にてＤ
ＮＡを回収した。回収したＤＮＡをライゲーションキッ
トにて自己連結した後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｘ
Ｌ１−Ｂｌｕｅ）を形質転換した。ＥｃｏＲＩで消化さ
れず、ＮｏｔＩで消化されるような目的のプラスミド
（ｐｃＤＬ−ＳＲα／ＮＯＴ）を選択した。

【０１０８】（２）発現ｃＤＮＡの挿入 蛋白発現ベクター（ｐｃＤＬ−ＳＲα／ＮＯＴ）をＮｏ
ｔＩとＫｐｎＩで完全消化し、電気泳動により約３．７
ｋｂｐのフラグメントを回収した（フラグメントＡ）。

【０１０９】ｃＤＮＡ挿入ベクター（ｐＮＶ１１−Ｓ
Ｔ）をＮｏｔＩとＫｐｎＩで完全消化し、電気泳動によ
り約７．８ｋｂｐのフラグメントを回収した（フラグメ
ント１３）。フラグメント１３の全塩基配列を配列番号
６に示す。

【０１１０】この塩基配列およびそこから演繹されるア
ミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅ１．８０により検索
したところ、塩基配列およびアミノ酸配列とも新規であ
ることが確認された。

【０１１１】フラグメントＡとフラグメント１３をＤＮ
Ａライゲーションキットを用いて連結した後、コンピテ
ントＥ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を形質転換し
た。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレ
ート上で培養し生じたコロニーのうち、フラグメント１
３が挿入されたプラスミドを制限酵素切断により選択し
た。得られたクローンがｐＮＶ１１−ＳＲである。

【０１１２】実施例１１：ＣＯＳ７細胞でのＦｃγＢＰ
部分ｃＤＮＡの発現 （１）発現ｃＤＮＡ／ベクターの大腸菌からの回収 実施例１０で得られたＦｃγＢＰ ｃＤＮＡ発現プラス
ミド（ｐＮＶ１１−ＳＲ）にて形質転換した大腸菌を１
０ｍｌのＬＢ培地で一晩３７℃で振とう培養した。これ
を５００ｍｌのＬＢ培地に加え、ＯＤ_６００が０．８に
なるまで振とうを続けた。ＯＤ_６００が０．８に達した
ら２．５ｍｌのクロラムフェニコール溶液（３４ｍｇ／
ｍｌ）を加え、一晩培養した。菌を遠心分離した後、常
法通りアルカリ法にてプラスミドＤＮＡを調製した。塩
化セシウムの密度勾配による超遠心分離（９０，０００
ｒｐｍ、３時間）を２回行ったのち、ＴＥ緩衝液で透析
しプラスミドを精製し蛋白発現に用いた。

【０１１３】（２）ＣＯＳ７細胞へのトランスフェクシ
ョン ＦｃγＢＰの約７．８ｋｂｐの部分ｃＤＮＡを組み込ん
だプラスミドベクター（ｐＮＶ１１−ＳＲ）をＣＯＳ７
細胞へ一過性に発現させて、タンパク質の性質を調べる
ために次の様にトランスフェクションを行った。ＣＯＳ
７細胞２×１０^５個を３５ｍｍディッシュに加え、１０
％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（０．２％炭酸水
素ナトリウム、１０ユニット／ｍｌペニシリン、０．０
１％ストレプトマイシンを含む）で一晩培養した。４０
−６０％コンフルエントになったところで、血清を含ま
ないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を２回洗浄した。

【０１１４】１０μｇのｐＮＶ１１−ＳＲプラスミドを
２５０μ１のＲＰＭＩ１６４０培地に溶解したものと、
１０μｌのリポフェクション試薬（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔ
ａｍ、Ｓｅｐｒａｃｏｒ社製）を２５０μｌのＲＰＭＩ
１６４０培地に溶解したものを混合し、直ちにＣＯＳ７
細胞上に加える。３７℃で６時間培養後、培地を除き、
１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を２ｍｌ加え、
３７℃、５％ＣＯ_２で２日間培養した。

【０１１５】（３）発現タンパク質の確認 ｐＮＶ１１−ＳＲをトランスフェクションしたＣＯＳ７
細胞を培養したディッシュ（φ３５ｍｍ）を２ｍｌのＰ
ＢＳ（−）で２回洗浄した。９９．５％エタノールを２
ｍｌ加え、室温で５分間固定した。２ｍｌのＰＢＳ
（−）で２回洗浄した。ラムダファージのスクリーニン
グに用いたＦｃγＢＰに対するモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマ（Ｋ９及びＫ１７）の培養上清１ｍｌを
それぞれ加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢ
Ｓ（−）にて３回洗浄した後、ホースラディッシュペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したヤギ抗マウスＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント（Ｚｙｍｅｄ社
製）を加え室温で３０分間インキュベートした。２ｍｌ
のＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、０．０３６％過酸化
水素水溶液と０．１％ジアミノベンチジン／０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．２）溶液の１：１を加え、
室温にて１０分間発色させ、タンパク質の発現する細胞
を確認した。一次抗体を加えずに、二次抗体としてＨＲ
Ｐ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２フ
ラグメントのみを加えたものを対照として用いた。

【０１１６】結果を図３に示す。Ｋ９モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ（図３、Ａ）およびＫ１７モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ（図３、Ｂ）培養上清
を加えたものでは、いずれもこれらと特異的に反応する
細胞が観察されたが、対照（図３、Ｃ）では観察されな
かった。

【０１１７】実施例１２：組換えタンパク質のヒトＩｇ
Ｇ結合能の検出と性状 （１）ヒトＩｇＧの結合の確認 ＦｃγＢＰの部分ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＮ
Ｖ１１−ＳＲをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（φ
３５ｍｍ ｄｉｓｈ）をＰＢＳ（−）で２回洗浄した。
９９．５％エタノールを２ｍｌ加え室温で５分間固定し
た。２ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗浄した。次に、アフ
ィニティークロマトで精製したヒトＩｇＧ画分（Ｃａｐ
ｐｅｌ社製）を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０
培地にて１０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、その１ｍｌを
ディッシュに加え室温で１時間インキュベートした。２
ｍｌのＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、ＨＲＰを結合さ
せたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２画分（＃１０９
−Ｄ３６−０８８、コスモバイオ社製）にて室温で３０
分間インキュベートした。２ｍｌのＰＢＳ（−）で３回
洗浄した後、０．０３６％過酸化水素水溶液と、０．１
％ジアミノベンチジン／１．０Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（ｐＨ７．２）溶液の１：１混液を加え室温にて１０分
間発色させ、発現タンパク質へのＩｇＧの結合を確認し
た。

【０１１８】（２）ＩｇＧの特異的結合 ｐＮＶ１１−ＳＲをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞
（φ３５ｍｍディッシュ）を２ｍｌのＰＢＳ（−）にて
２回洗浄した。９９．５％エタノールを２ｍｌ加え室温
で５分間固定する。２ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗浄し
た。

【０１１９】次に、ＨＲＰを結合したアフィニティー精
製ヒトＩｇＧ画分（＃５５９０２、Ｃａｐｐｅｌ社製）
を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて１０μ
ｇ／ｍｌの濃度に調製した（溶液１）。溶液１に対し、
次のイムノグロブリン（５００μｇ／ｍｌ）を拮抗阻害
物質として加えた： クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ画分（＃５５９０
８、Ｃａｐｐｅｌ社製） クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ Ｆｃ画分（＃５
５９１１，Ｃａｐｐｅｌ社製）， クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２
画分（＃５５９１０，Ｃａｐｐｅｌ社製）、 クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＭ画分（＃５５９１
６，Ｃａｐｐｅｌ社製） クロマトグラフィー精製ヒト血清ＩｇＡ（＃５５９０
６，Ｃａｐｐｅｌ社製） クロマトグラフィー精製ヒト分泌型ＩｇＡ（＃５５９
０５，Ｃａｐｐｅｌ社製）。

【０１２０】溶液１に上記からの各拮抗阻害物質を
各々別々に加えた溶液１ｍｌを、細胞を固定したディッ
シュに加え、室温で１時間インキュベートした。２ｍｌ
のＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、０．０３６％過酸化
水素水溶液と、０．１％ジアミノベンチジン／０．１％
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．２）溶液の１：１の混液
を加え、室温にて１０分間発色させ、発現タンパク質へ
のＩｇＧの結合を検討した。溶液１のみで拮抗阻害物質
を何も加えなかったものを対照として用いた。

【０１２１】結果を図４および図５に示す。対照実験で
ある無添加条件では細胞が染色される（図４、Ａ）が、
精製ヒトＩｇＧ画分（図４、Ｂ）と精製ヒトＩｇＧ Ｆ
ｃ画分（図４、Ｃ）を添加すると細胞は染色されなかっ
た。一方、他の添加物ＩｇＧＦ（ａｂ’）_２画分（図
５、Ｄ）やヒトＩｇＭ画分（図５、Ｅ）、ヒト血清Ｉｇ
Ａ（図５、Ｆ）、ヒト分泌型ＩｇＡ（図５、Ｇ）ではＨ
ＲＰ結合ヒトＩｇＧの結合を阻害できなかった。このこ
とはヒト抗体の場合ＩｇＧＦｃ部にＦｃγＢＰが特異的
に結合することを示している。

【０１２２】実施例１３：ＦｃγＢＰ ｍＲＮＡ発現の
組織特異性 ＦｃγＢＰのヒト組織での発現の特異性を調べるため
に、ノーザンブロッティング解析によりｍＲＮＡの発現
を調べた。ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎
臓、膵臓の各組織から精製したポリアデニル化ＲＮＡ２
μｇをブロッティングしたナイロン膜（Ｈｕｍａｎ Ｍ
ｕｌｔｉｐｌｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ、＃７
７６０−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、実施例２の
（４）と同様の条件でプレハイブリダイゼーションを行
った後、［^３２Ｐ］でラベルしたプローブＹを用いてハ
イブリダイゼーションを行った。洗浄の後、オートラジ
オグラフィーにてバンドの検出を行った。−８０℃で２
日間オートラジオグラムを行った結果、胎盤において約
１７ｋｂｐ付近にバンドを検出できた（図６）が、その
他の組織においては陰性であった。したがって、胎盤に
おいてＦｃγＢＰのタンパク発現が推定された。

【０１２３】実施例１４：３種の異なるプローブによる
ノーザンブロット解析 実施例２の（３）で得たプローブＱとＡ、および実施例
６の（２）で得たプローブＹがいずれも同一のｍＲＮＡ
とハイブリダイゼーションすることを確認するために、
大腸粘膜上皮細胞から抽出したｍＲＮＡのノーザンブロ
ット解析を上記３種のプローブＱ、Ａ、Ｙを用いて行っ
た。

【０１２４】大腸粘膜上皮細胞よりＡＧＰＣ法により抽
出した全ＲＮＡ１５μｇを４．５μｌの滅菌水に溶かし
た後、２μｌの５×ＭＯＰＳ緩衝液、３．５μｌのホル
ムアルデヒド、１０μｌのホルムアミドと混合し、６０
℃、１５分間熱変性した後、ホルムアルデヒド存在下で
１％アガロースゲル上で電気泳動した。電気泳動終了
後、ＲＮＡをナイロン膜（バイオダインＡ、ポール社
製）へキャピラリー法にて一晩トランスファーを行っ
た。ＵＶ架橋によりＲＮＡをナイロン膜に固定した後、
１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰ
Ｅ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ホルムアミ
ド、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精
子ＤＮＡ）中にて４２℃、８時間プレハイブリダイゼー
ションを行った。

【０１２５】次いで３種のプローブＡ、Ｑ、Ｙを各々、
α［^３２Ｐ］ｄＣＴＰを用い、メガプライムラベリング
キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）によって放射性標識し
た。各プローブ１×１０^８ｄｐｍを各々、５ｍｌのハイ
ブリダイゼーション溶液と共にプレハイブリダイゼーシ
ョン処理したナイロン膜に加え、密封した後、４２℃で
一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロン膜の洗
浄は０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを含む溶液中
で、６５℃、４０分間の洗浄操作を３回繰り返し行っ
た。ナイロン膜を乾燥後、Ｘ線フィルムに一晩露光し
た。

【０１２６】以上の結果、プローブＡ、Ｑ、Ｙを用いて
推定約１７ｋｂｐのバンドが１本それぞれ検出され、３
種類のプローブが分子量的に同一のｍＲＮＡとハイブリ
ダイズすることを確認した（図７）。

【０１２７】実施例１５：ＦｃγＢＰをコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列の決定（２） ＩｇＧＦｃ部結合能をもつタンパク質のアミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡのうち、５’末端から約７．８ｋｂ
ｐ（７８２６塩基）までの塩基配列の決定については実
施例４および６に記載した。残された塩基配列約８．６
ｋｂｐの塩基配列決定法を以下に記載する。

【０１２８】（１）ｃＤＮＡの構造と分類 上記実施例４において、プローブＡ、ＢまたはＱを用い
たハイブリダイゼーションによるスクリーニングで得ら
れた複数のｃＤＮＡクローンを、それぞれ大腸菌内で増
幅した後、プローブＡ、Ｂ、Ｑを用いてマッピングを行
った。その結果、各クローンは３種のプローブの１つま
たは複数とハイブリダイズし、ｃＤＮＡ上にＡ→Ｂまた
はＢ→ＱまたはＱ→Ａの順にプローブ相同部位が位置す
るものであった。

【０１２９】これらの結果から、ＦｃγＢＰの遺伝子に
は、プローブＡ、Ｂ、Ｑのそれぞれと相同な配列がＡ→
Ｂ→Ｑの順に連なった単位がタンデムに複数回繰り返し
た構造を有することが推定された。そこで、プローブＢ
とハイブリダイズするｃＤＮＡクローンについて、プロ
ーブＢの塩基配列の一部（約２８０塩基対）を次のプラ
イマーを用いてＰＣＲにより増幅させた。 プライマー（Ｐ−１）： ５’−ＧＣＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＣＣＣ ＡＴＣ ＣＡ
Ｇ−３’ プライマー（Ｐ−２）： ５’−ＣＴＣ ＡＴＡ ＧＴＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＣ
ＡＣ−３’ ＰＣＲにより増幅したフラグメントをアガロースゲル電
気泳動にて分離後ゲルから回収し、塩基配列を解析し
た。この塩基配列の違いから、プローブＢとハイブリダ
イズするｃＤＮＡクローンを次の３群に分類し、プロー
ブＢとハイブリダイズしないｃＤＮＡクローンを第４群
とした。 第１群：クローンＶ１１の増幅フラグメントと同一の配
列をもつ群。 第２群：第１群の配列と比較して５塩基の置換があり、
フラグメント中にＨｉｎｃＩＩ部位を含まない群。 第３群：第１群の配列と比較して７塩基の置換があり、
フラグメント中にＨｉｎｃＩＩ部位を含む群。 第４群：プローブＢとハイブリダイズしない群。

【０１３０】（２）クローンＴ５ ３’末端側のポリＡ部分をもつｃＤＮＡを分離するため
に、実施例３においてオリゴｄＴプライマーを用いて作
製したｃＤＮＡライブラリーを、プローブＡ、Ｂまたは
Ｑを用いて実施例４と同様の方法でスクリーニングを行
ったところ、プローブＱのみとハイブリダイズした。得
られたｃＤＮＡクローンのうち最長のｃＤＮＡ挿入部を
もつものをクローンＴ５とした。

【０１３１】クローンＴ５の挿入ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ
で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離、精製
し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この後、Ｔ５の制
限酵素地図の作製および全塩基配列の決定を行った。

【０１３２】また、クローンＴ５挿入部のｃＤＮＡのう
ちで、ポリ（Ａ^＋）から約１キロ塩基対５’側のＢａｍ
ＨＩ部位と、同じくポリ（Ａ^＋）から約１．６キロ塩基
対５’側のＰｓｔＩ部位に挟まれた約５５０塩基対をプ
ローブＶとした。プローブＶはクローンＮＺ４、Ｃ７
２、Ｙ１、Ｘ１、Ｖ１１、Ａ５３、Ａ４０およびＡ３１
とはハイブリダイズせず、Ｔ５に特異的な配列であっ
た。

【０１３３】（３）クローンＡ４３ プローブＡ、ＢまたはＱとハイブリダイズするｃＤＮＡ
クローンをプローブＶを用いて実施例４の（２）と同様
の方法でハイブリダイゼーションを行い、プローブＡお
よびＢとはハイブリダイズせず、プローブＶおよびＱと
のみハイブリダイズするクローンを得た。このクローン
の挿入ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル
電気泳動により分離、精製し、プラスミドベクターｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に挿
入した。この後、制限酵素地図の作製および全塩基配列
の解析を行った。

【０１３４】塩基配列解析の結果、プローブＱとハイブ
リダイズする部分を含む約２キロ塩基対の部分がＴ５と
重複する部分の配列と一致することを確認した。

【０１３５】（４）クローンＡ８ クローンＡ４３より５’方向に伸長したｃＤＮＡを得る
ため、クローンＡ４３の５’付近の塩基配列（約２４０
塩基対）を増幅可能な次のプライマーを合成した。 プライマー（Ｐ−３）： ５’−ＴＧＴ ＴＧＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＴＧＴ ＣＧ
Ｇ−３’ プライマー（Ｐ−４）： ５’−ＴＣＡ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＣＣ ＴＧＴ ＧＣ
Ｃ−３’ 実施例１５の（１）において分類した第１群、第２群、
第３群のｃＤＮＡクローンを上記プライマー（Ｐ−３）
および（Ｐ−４）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲによ
り増幅したフラグメントをアガロースゲル電気泳動にて
分離後回収し、塩基配列を解析した。これにより、実施
例１５の（１）において分類した第３群のｃＤＮＡクロ
ーンの中で、ＰＣＲフラグメントの配列がＡ４３と同一
の塩基配列をもつものを選択し、クローンＡ８とした。
クローンＡ８の全塩基配列を解析し、３’側の塩基配列
がＡ４３の５’側の重複する配列と完全に一致すること
を確認した。

【０１３６】（５）クローンＡ５３およびクローンＡ４
０ 第２群に属するｃＤＮＡクローンのうち、プローブＱお
よびＡとハイブリダイズする部分を５’側にもつ２つの
異なるクローンを制限酵素地図より選択した。このう
ち、クローンＶ１１の３’側と重複する部分のより長い
方をクローンＡ５３、より短い方をクローンＡ４０とし
た。

【０１３７】クローンＡ５３およびクローンＡ４０の全
塩基配列を解析し、クローンＡ５３の３’側とクローン
Ａ４０の５’側の重複する部分（約２．４キロ塩基対）
の塩基配列が同一であることを確認した。また、Ｖ１１
の３’側とＡ５３の５’側の重複する約１．８キロ塩基
対を比較したところ、１塩基（第６２７３塩基；Ｖ１１
ではＡであり、Ａ５３ではＧ）を除いてこれらの塩基配
列が完全に一致することを確認した。

【０１３８】（６）クローンＡ３１ クローンＡ４０より３’方向に伸長したｃＤＮＡをスク
リーニングするために次の操作を行った。クローンＡ５
３およびクローンＡ４０において、プライマー（Ｐ−
３）およびプライマー（Ｐ−４）によって増幅されるフ
ラグメントの塩基配列が第１群のＶ１１の配列と異な
り、また第３群のＡ８の配列とも異なっていたため、こ
の部分の配列を指標に次のスクリーニングを行った。す
なわち、全クローン６９個のうち第１群と第３群を除く
ｃＤＮＡクローンについてプローブＡ、ＢまたはＱとハ
イブリダイズするｃＤＮＡクローンを、プライマー（Ｐ
−３）およびプライマー（Ｐ−４）を用いてＰＣＲを行
い、増幅したフラグメントの塩基配列を決定した。この
塩基配列がクローンＡ５３およびＡ４０と同一であるｃ
ＤＮＡクローンを選択した。この中から、ＰＣＲの増幅
配列を５’側の端にもち、３’側に伸長するクローンを
選択し、これをクローンＡ３１とした。

【０１３９】クローンＡ３１の全塩基配列を解析した結
果、Ａ３１の５’側の配列がクローンＡ４０の３’側の
重複する部分と、またＡ３１の３’側の配列がクローン
Ａ８の５’側の重複する部分の配列と同一であることを
確認した。

【０１４０】実施例１６：ＦｃγＢＰをコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列の決定（３） ＦｃγＢＰのｃＤＮＡは全長１６．４キロ塩基対の中
に、３．５キロ塩基対をユニットとする配列（プローブ
Ａ、Ｂ、Ｑと相同部分を含む）の３回のタンデムリピー
トが存在し、それぞれの繰り返し配列が互いに９５％以
上の相同性を有する構造をしていた（図８）。

【０１４１】このリピート構造内の塩基配列の決定に用
いたｃＤＮＡは、前述の通り、Ａ、ＢまたはＱの各プロ
ーブと強い反応性を有することでクローニングされてき
た。そして各々の塩基配列を比較することにより重複す
る部分の塩基配列が同一であることを確認して、ｃＤＮ
Ａ同士の連なりを明らかにし、これにより一連のｃＤＮ
Ａ断片が単一のｍＲＮＡ（遺伝子）に由来するものであ
ることを明らかにしてきた。この事実を再確認するため
に、既に発現に用いた５’末端ｃＤＮＡを含むｐＮＶ１
１ＳＲとは別のリピート構造内のｃＤＮＡ断片をタンパ
ク質発現させ、ＦｃγＢＰを認識するモノクローナル抗
体であるＫ９およびＫ１７によりこの発現タンパク質断
片が認識されるかどうかの検定を行った。

【０１４２】（１）開始コドンを含むアダプターの合成 ベクターに組み込む各ｃＤＮＡ断片を、その５’部分か
ら全長を発現させるには、ｃＤＮＡの５’部分に翻訳開
始コドン（ＡＴＧ）を連結させなくてはならない。ま
た、翻訳するタンパク質がＦｃγＢＰと同一のフレーム
で翻訳されるために、開始コドン（ＡＴＧ）とｃＤＮＡ
の５’端の間でフレームを調節する必要がある。そこ
で、以下の２つの条件を満足するアダプター用オリゴヌ
クレオチドを合成した。

【０１４３】合成オリゴヌクレオチドは、ＦｃγＢＰの
本来の開始コドン（ＡＴＧ）を含むｐＮＶ１１ＳＲの開
始領域と同じ７塩基配列（ＧＣＣＡＴＧＧ）を含み、Ｋ
ｏｚａｋ則に合致するものとする。

【０１４４】また、このオリゴヌクレオチドには、ベク
ターへの挿入が容易となるように、５’端側にＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位を、３’端側にＥｃｏＲＩ部位を付加する。
フレームを調節するために、次の３つのオリゴヌクレオ
チド（ＦＲ−１Ｓ、ＦＲ−２Ｓ、ＦＲ−３Ｓ）を作製し
た。そして、それぞれのオリゴヌクレオチドと相補的な
ＦＲ−１Ａ、ＦＲ−２Ａ、ＦＲ−３Ａをも併せて合成し
た。アダプター用合成オリゴヌクレオチド ＦＲ−１Ｓ： ５’−Ａ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＡ Ｇ
ＣＣ ＡＴＧ ＧＧ−３’ ＦＲ−１Ａ： ３’−ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＧＧ
ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＡ−５’ ＦＲ−２Ｓ： ５’−Ａ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＡ Ｇ
ＣＣ ＡＴＧＧＧＧ−３’ ＦＲ−２Ａ： ３’−ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＧＧ
ＴＡＣ ＣＣＣ−５’ ＦＲ−３Ｓ： ５’−Ａ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＡ Ｇ
ＣＣ ＡＴＧ ＧＧＡＧ−３’ ＦＲ−３Ａ： ３’−ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＧＧ
ＴＡＣ ＣＣＴ ＣＴＴ ＡＡ−５’ 各オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機（ｍｏｄｅｌ
１３９４、ＡＢＩ社製）を用いて合成した後、精製を行
った。

【０１４５】次に、実施例９−（５）と同様の方法に
て、ＦＲ−１ＳとＦＲ−１Ａ、ＦＲ−２ＳとＦＲ−２
Ａ、ＦＲ−３ＳとＦＲ−３Ａを各々アニーリングした
後、５’末端のヌクレオチドをリン酸化した。作製した
各アダプターをアダプターＦＲ−１、アダプターＦＲ−
２、アダプターＦＲ−３とする。

【０１４６】（２） ＴＡＩＩＩ／ＳＫベクターの改変 実施例９−（５）により作製したストップコドンを含む
ベクターｐＢＬＳ／ＴＩＩＩにＸｂａＩ部位を付加する
ために以下の操作を行った。

【０１４７】すなわち、実施例１０−（１）と同様の方
法で、ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩを制限酵素ＸｈｏＩで完全
消化後、末端を平滑化した。末端をリン酸化したＸｂａ
Ｉリンカーを連結後、ＸｂａＩで再消化し、自己連結し
た後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉを形質転換する操作に
より、ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩのＸｈｏＩ部位にＸｂａＩ
部位が挿入されたベクターｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩ２を得
た。

【０１４８】（３）開始コドンを含むオリゴヌクレオチ
ドの挿入 ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩ２をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ
で完全消化後、アガロースゲル電気泳動にて約３キロ塩
基対のベクター部分を回収した。実施例９−（５）と同
様の方法で、アダプターＦＲ−１、ＦＲ−２、ＦＲ−３
を各々、上記ｐＢＬＳ／ＴＡＩＩＩ２に挿入した。塩基
配列を解析し、ＦＲ−１、ＦＲ−２、ＦＲ−３の各アダ
プターが１つずつ正しく挿入されたプラスミドを得て、
各々をＦｒ１−ＳＫ２、Ｆｒ２−ＳＫ２、Ｆｒ３−ＳＫ
２とした。

【０１４９】（４）ＦｃγＢＰ ｃＤＮＡ断片の挿入 ｃＤＮＡクローンＡ５３をＦｃγＢＰと同じフレームで
発現させるために、Ａ５３のｃＤＮＡ部分をＥｃｏＲＩ
で切り出した後、Ｆｒ３−ＳＫ２のＥｃｏＲＩ部位に挿
入した。ｃＤＮＡの５’末端がＦｒ３−ＳＫ２の開始コ
ドン側にある方向のプラスミドを選択し、これをｐｉＦ
−Ａ５３とする。

【０１５０】同様にクローンＡ８の挿入ｃＤＮＡをＦｒ
２−ＳＫ２に挿入してｐｉＦ−Ａ８を得た。

【０１５１】ｐｉＦ−Ａ５３とｐｉＦ−Ａ８は実施例１
１−（１）と同様にして精製後、タンパク発現の実験に
用いた。

【０１５２】（５）ｐｉＦ−Ａ５３およびｐｉＦ−Ａ８
の発現 実施例１１−（２）と同様の方法にて、ｐｉＦ−Ａ５３
およびｐｉＦ−Ａ８をＣＯＳ７細胞にトランスフェクシ
ョンした。２日間培養後、実施例１１−（３）と同様の
方法でモノクローナル抗体（Ｋ９／Ｋ１７混液）を用い
て細胞染色を行い、一過性に発現したタンパク質を検出
した。その結果、ｐｉＦ−Ａ５３およびｐｉＦ−Ａ８の
いずれをトランスフェクトした細胞もモノクローナル抗
体による染色が認められ、両ｃＤＮＡがＫ９とＫ１７の
いずれかまたは両方により認識されるタンパク質の一部
をコードすることが示された（図９のＡ、Ｂ参照）。こ
れより、Ａ５３およびＡ８がＦｃγＢＰの全ｃＤＮＡの
中の反復配列の一部であることが確定された。

【０１５３】実施例１７：クローンＮＺ４がＦｃγＢＰ
ｍＲＮＡの５’末端近傍であることの推定２ 実施例７でのプライマーエクステンションの結果より、
現在最も５’側に存在するクローンＮＺ４の上流およそ
２０塩基内に転写開始部位が存在し、ＮＺ４内に存在す
る９番目のＡＴＧが翻訳開始部位である可能性が推定さ
れた。そこで、ＮＺ４の上流にｉｎ ｆｒａｍｅのＡＴ
Ｇあるいはストップコドンが存在するかどうかを確認す
る目的で、ゲノムＤＮＡライブラリーよりＦｃγＢＰ遺
伝子を単離し、部分塩基配列を決定した。

【０１５４】（１）ゲノムＤＮＡライブラリー ライブラリーは市販のヒト白血球由来（ベクター、ＥＭ
ＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７：ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）のもの
を用いた。

【０１５５】（２）プローブ スクリーニングに用いるプローブとして、ｃＤＮＡクロ
ーンＮＺ４をＢａｍＨＩでベクターより切り出したも
の、および実施例７で用いた合成オリゴヌクレオチド
（プライマー２：ＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＴＡＴ
ＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡＧＧ、３３ｍｅｒ）をそ
れぞれα［^３２Ｐ］ｄＣＴＰ、γ［^３２Ｐ］ＡＴＰでラ
ンダムプライミングによる標識（ＮＺ４）、あるいは末
端標識（プライマー２）したものを用いた。

【０１５６】（３）スクリーニング プローブＮＺ４によるスクリーニングは実施例３で述べ
たｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの方法に準じ
て行った。合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたス
クリーニングでは、ハイブリダイゼーション溶液のホル
ムアミド濃度を２０％とし、また洗浄は０．３×ＳＳＣ
／０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で４５℃、３０分間の
洗浄操作を５回繰り返して行った。

【０１５７】各プローブに対し、およそ１００万のライ
ブラリーについてスクリーニングを行い、その結果ＮＺ
４プローブについて２つの、また合成オリゴヌクレオチ
ドプローブについて１つの陽性プラークが得られ、それ
ぞれすべてのプラークが陽性となるまで繰り返してスク
リーニングを行った。

【０１５８】（４）λＤＮＡの抽出 各陽性クローンは、宿主大腸菌ＬＥ３９２を用い、実施
例２で述べた方法に準じて増殖させ、ＤＮＡを抽出し
た。

【０１５９】（５）部分マッピングとシークエンス （４）で得た各々のλＤＮＡ（ＧＨＦｃ−１，２，３）
を制限酵素（ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、Ｓａｃ
Ｉ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、Ｓｔｕ
Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ）で完全消化し、１％アガロー
スゲル電気泳動後、サザンブロッティングを行った。ナ
イロンメンブレンへのトランスファーはゲルを０．２５
Ｎ ＨＣｌに３０分間浸し、続いて変性緩衝液（０．４
Ｎ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ）中で１５分間×２
回室温にて振とう放置し、さらに中和緩衝液（１Ｍ Ｎ
Ｈ_４ＯＡｃ／０．０２Ｎ ＮａＯＨ）中で１５分間×２
回室温にて振とう放置した。その後、ゲル１枚につきメ
ンブレン２枚へ同時にトランスファー（ｂｉｄｉｒｅｃ
ｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。２枚のメンブ
レンは各々ＮＺ４プローブおよび合成オリゴヌクレオチ
ドプローブにてハイブリダイゼーションを行った。

【０１６０】ＧＨＦｃ−１，２（ＡｐａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ）およびＧＨＦｃ−３（Ｂａｍ
ＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ）の各陽性フラグメントを
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ＴＯＹＯＢＯ社製）
にサブクローニングし、一部シークエンス反応を行っ
た。シークエンス反応は実施例６の方法に準じて行っ
た。

【０１６１】（６）結果 クローンＧＨＦｃ−１，２，３とも部分的なマッピング
とシークエンシングの結果、インサートサイズがおよそ
１５ｋｂ（ＧＨＦｃ−１，２）、１３ｋｂ（ＧＨＦｃ−
３）のそれぞれ独立したクローンであり、ＧＨＦｃ−１
と２は一部重複していた。また、ＦｃγＢＰ ｃＤＮＡ
の６３、６４番目に相当する塩基間および１３１１、１
３１２番目に相当する塩基間にＧＴ／ＡＧ則に一致した
イントロン（図１０参照）が存在しており、また１３１
１番目までのエキソン部分の塩基配列はｃＤＮＡのもの
と完全に一致していた（図１１参照）。さらに、ｃＤＮ
ＡクローンＮＺ４の５’上流はＧＨＦｃ−３に含まれて
いたが、実施例７において記載した推定上の翻訳開始Ａ
ＴＧより８７塩基、すなわちＮＺ４（配列番号１）の
５’端より７９塩基上流にｉｎ ｆｒａｍｅでのストッ
プコドン（ＴＧＡ）が存在し、その間に他のｉｎ ｆｒ
ａｍｅでのＡＴＧは認められなかった。したがって、こ
れらの結果はクローンＮＺ４に存在する９塩基目からの
ＡＴＧがＦｃγＢＰ遺伝子の翻訳開始ＡＴＧである可能
性を強く支持する。

【０１６２】実施例１８：ヒトＦｃγＢＰの構造とＩｇ
ＧＦｃ結合活性機能との相関関係 これまでに得られたＦｃγＢＰのｃＤＮＡの全塩基配列
より推定されたアミノ酸配列をもつタンパク構造は、約
４００アミノ酸残基より成るユニットのくり返しが合計
１２回存在し（Ｒ１−Ｒ１２部）、その前後に約４５０
アミノ酸（Ｈ部）と約２００アミノ酸（Ｔ部）のユニー
クな配列を有するものであった。図１２に示すように、
Ｒ部のくり返しユニットの内、Ｒ３，Ｒ６，Ｒ９は相互
に９５％以上の相同性を有し、同様にＲ４，Ｒ７，Ｒ１
０の３者、Ｒ５，Ｒ８，Ｒ１１の３者もまた９５％以上
の相同性があった。一方、Ｒ１からＲ５の各ユニットは
相互に約４０％程度の相同性があった。そこで、これら
の蛋白質ドメインの機能を検討するために、ｃＤＮＡ中
にいくつかの欠損部位を持たせた変異クローンを分離
し、それらをＣＯＳ細胞に発現させ、ＩｇＧ結合活性な
どの機能を検討した。

【０１６３】Ｆｃ結合活性の測定のため、動物細胞に発
現させた部分ｃＤＮＡプラスミドｐＮＶ１１は図１２に
示したように、Ｈ，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及び
Ｒ６の一部の各ユニットで構成されるが、これらのうち
どこにＦｃ結合活性が存在するのかを確かめるために、
以下の実験を行った。即ち、制限酵素による切断・再結
合または、連結するクローンの組合せによりＮＶ１１の
一部をアミノ酸に対するフレームが合う様に欠除したｃ
ＤＮＡ断片を、発現ベクターＳＲαに挿入後、大腸菌Ｘ
Ｌ１−Ｂを形質転換した。表１に示したように、ＮＶ１
１より一部を削除した後の配列をＤＮＡの塩基番号で示
した。尚、ＮＶ１１のｃＤＮＡ部分のうち、タンパク質
への翻訳の始まる最初の塩基を１番とし、最後の塩基を
７７７６番とする。

【０１６４】各ｃＤＮＡ断片を含む発現ベクターを大腸
菌より精製した後、実施例１１と同様の方法で、ＣＯＳ
７細胞に一過性に発現させた後、ヒトＩｇＧ Ｆｃ部に
よる染色、及びＦｃγＢＰ特異的モノクローナル抗体Ｋ
９，Ｋ１７による染色を行った。

【０１６５】更に、ＩｇＧ Ｆｃの結合に対するモノク
ローナル抗体の阻害を調べるために、次の染色を行っ
た。ｃＤＮＡを一過性に発現させたＣＯＳ７細胞をエタ
ノールで固定した。熱変性したヒトＩｇＧを１μｇ／ｍ
ｌとなるように、阻害抗体Ｋ９とＫ１７の１つあるいは
両方、または抗ＦｃγＲＩＩＩ（コントロール抗体）を
含むハイブリドーマ培養上清にてそれぞれ希釈し、固定
細胞とインキュベートした。室温で１時間放置後、ＰＢ
Ｓ（−）にて洗浄し、ＨＲＰを結合した抗ヒトＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）抗体Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントと同様にイ
ンキュベートし、変性ヒトＩｇＧの結合を検出した。

【０１６６】以下に結果を示す。まず、遺伝子発現産物
がＩｇＧ Ｆｃ結合活性を有するかを検討するために、
ヒトＩｇＧを一次抗体とし、二次抗体としてＨＲＰ標識
抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた。ＩｇＧの結合活性を示すの
は、Ｈ部の全配列及び、それに加え、少なくとも１つ以
上のＲ部の全領域を含有するクローン（ＮＶ１１，Ｎ
Ｘ，ＮＺＣＹ，△ＢｓｓＨ，△Ｔｔｈ，△Ｓｐ１，△Ｂ
ｓｓＨ／Ｔｔｈ，ＮＸ△ＢｓｓＨ，ＮＺＣＶ１１）であ
った。また、ＩｇＧの結合活性を示す染色性の強度は、
Ｒ部の含有数が増加するにつれて強度も増加する傾向に
あった。しかし、Ｈ部の全部または一部を削除したクロ
ーン（△Ｈｉｎｃ，△Ｈｉｎｃ／ＢｓｓＨ，Ｖ１１，Ｘ
１）及び、Ｒ部の一部しかもたないクローン（ＮＺＣ）
ではＩｇＧの結合活性は示さなかった。

【０１６７】一方、モノクローナル抗体での遺伝子産物
の染色性については、Ｒ５配列の全部又は一部をもつク
ローン（ＮＶ１１，△Ｈｉｎｃ，△ＢｓｓＨ，△Ｔｔ
ｈ，△Ｓｐ１，△ＢｓｓＨ／Ｔｔｈ，△Ｈｉｎｃ／Ｂｓ
ｓＨ，ＮＺＣＶ１１，Ｖ１１）ではモノクローナ ル抗
体Ｋ９の染色が認められ、また、Ｒ３またはＲ６の全部
または一部をもつクローン（ＮＺＣＹとＮＺＣを除く全
てのクローン）ではモノクローナル抗体Ｋ１７の染色が
認められた。これらの結果により、Ｈ部を欠くクローン
（△Ｈｉｎｃ／ＢｓｓＨ，Ｖ１１，Ｘ１）ではＦｃγＢ
Ｐ特異的抗体で反応する蛋白質が発現産生されているに
もかかわらず、ＩｇＧ結合活性は得られず、Ｈ部はＲ部
産物にＩｇＧ活性を与えるに必須な機能を有しているこ
とが示唆された。また、クローンＮＺＣがＩｇＧ活性お
よびＫ９／Ｋ１７染色に対して陰性であることから、Ｒ
部（Ｒ１〜Ｒ５）はＩｇＧの結合部位に対応することも
示唆された。

【０１６８】続いて、モノクローナル抗体Ｋ９，Ｋ１７
によるＩｇＧ結合の阻害結果を示す。各クローンに対す
る阻害効果は表１にまとめて示したが、 Ｒ３とＲ５に加えて、他の１つ以上のＲ領域を含む
クローン（ＮＶ１１，△Ｔｔｈ，ＮＺＣＶ１１）では、
Ｋ９またはＫ１７によりある程度のＩｇＧ結合の阻害が
認められ、両者を加えたときより強く阻害されたが、完
全には阻害されなかった。 Ｒ３に加えて他の１つ以上のＲ領域を含むクローン
（ＮＸ）では、Ｋ１７によりある程度のＩｇＧ結合の阻
害が認められたが、完全には阻害されなかった。また、
Ｋ９によっては全く阻害されなかった。 Ｒ３領域のみを含むクローン（ＮＸ△ＢｓｓＨ）で
は、Ｋ１７により結合が完全に阻害されたが、Ｋ９は影
響しなかった。 Ｒ５領域のみを含むクローン（△ＢｓｓＨ／Ｔｔ
ｈ）ではＫ９により結合が完全に阻害されたがＫ１７は
影響しなかった。 Ｒ３及びＲ５領域を両方とも含まないクローン（Ｎ
ＺＣＹ）では、Ｋ９，Ｋ１７ともＩｇＧの結合を全く阻
害しなかった。 全てのクローンにおいて、コントロール抗体の抗Ｆ
ｃγＲＩＩＩ抗体によるＩｇＧ結合の阻害はみられなか
った。

【０１６９】以上の事より、ＩｇＧ Ｆｃの結合部位
は、Ｒ３領域及びＲ５領域を含めてＲ１〜Ｒ５領域に存
在し、それぞれのＲ領域が独立でＩｇＧを結合する事が
可能である事が推定された。また、ＮＶ１１等Ｒ領域を
複数含むｃＤＮＡクローンでは複数のＩｇＧを結合する
可能性をもつ事が示された。これらの事実は、アミノ酸
配列の相同性から、Ｒ１〜Ｒ１２がいずれもＩｇＧ結合
部位を持ち得ることを推定させる。

【０１７０】

【表１】

【０１７１】実施例１９：ＦｃγＢＰゲノム遺伝子の部
分解析（転写開始部位の確定） 実施例７でのプライマーエクステンションの結果より、
現在最も５’側に存在するクローンＮＺ４の上流およそ
２０塩基内に転写開始部位が存在し、ＮＺ４内に存在す
る９番目のＡＴＧが翻訳開始部位である可能性が推定さ
れたが、そのＮＺ４の上流にｉｎ ｆｒａｍｅのＡＴＧ
あるいはストップコドンが存在するかどうかを確認する
目的でゲノムＤＮＡライブラリーよりＦｃγＢＰ遺伝子
を単離し、部分塩基配列を決定した。

【０１７２】また、Ｓ１マッピングを行い、より正確な
転写開始部位の決定を行った。 （１）ゲノムＤＮＡライブラリー ライブラリーは市販のヒト白血球由来（ベクター、ＥＭ
ＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７：ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）のものを
用いた。 （２）プローブ スクリーニングに用いるプローブとしてｃＤＮＡクロー
ンＮＺ４をＢａｍＨＩでベクターより切り出したもの、
および実施例７で用いた合成オリゴヌクレオチド（プラ
イマー２：ＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡ
ＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＡＧＧ，３３ｍｅｒ）をそれぞれ
α［^３２Ｐ］ｄＣＴＰ、γ［^３２Ｐ］ＡＴＰでランダム
プライミングによる標識（ＮＺ４）、あるいは末端標識
（オリゴヌクレオチド）したものを用いた。 （３）スクリーニング プローブＮＺ４によるスクリーニングは実施例４で述べ
たｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの方法に準じ
て行った。合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたス
クリーニングでは、ハイブリダイゼイション溶液のホル
ムアミド濃度を２０％とし、またＷａｓｈｉｎｇは０．
３ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含む溶液中で４５℃，３
０分間の洗浄操作を５回繰り返して行った。各プローブ
に対し、およそ１００万のライブラリーについてスクリ
ーニングを行い、その結果ＮＺ４プローブについて２つ
の、また合成オリゴヌクレオチドプローブについて１つ
の陽性プラークが得られ、それぞれすべてのプラークが
陽性となるまで繰り返しスクリーニングを行った。 （４）λＤＮＡの抽出 各陽性クローンは、宿主大腸菌ＬＥ３９２を用い、実施
例２で述べた方法に準じて増殖させ、ＤＮＡを抽出し
た。 （５）部分マッピングとシークエンス ４で得た各々のλＤＮＡ（ＧＨＦｃ−１，２，３）を制
限酵素（ＡｐａＩ，ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ，ＫｐｎＩ，ＮｃｏＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｃＩ，Ｓ
ｃａＩ，ＳｍａＩ，ＳｐｅＩ，ＳｐｈＩ，ＳｔｕＩ，Ｘ
ｂａＩ，ＸｈｏＩ）で完全消化し、１％アガロースゲル
電気泳動後、サザンブロッティングを行った。ナイロン
メンブレンへのトランスファーはゲルを０．２５Ｎ Ｈ
Ｃｌ，０．４Ｎ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ，１Ｍ
ＮＨ_４Ａｃ／０．０２ＮＮａＯＨでそれぞれ１５分、
２回処理した後、ゲル１枚につきメンブレン２枚へ同時
にトランスファー（ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ）した。２枚のメンブレンは各々ＮＺ４プ
ローブおよび合成オリゴヌクレオチドプローブにてハイ
ブリダイゼーションを行った。ＧＨＦｃ−１，２（Ａｐ
ａＩ ＥｃｏＲＩ，ＳａｃＩ，ＸｈｏＩ）およびＧＨＦ
ｃ−３（ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）の各陽性
フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ＴＯ
ＹＯＢＯ社）にサブクローニングし、一部シークエンス
反応を行った。シークエンス反応は実施例６での方法に
準じて行った。 （６）Ｓ１マッピング Ｓ１プローブ作製用テンペレートとして、クローンＧＨ
Ｆｃ−３のＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片（ｃＤＮＡクロー
ンＮＺ４の上流約２ｋｂに相当）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ^＋にサブクローニングした後、ヘルパーファー
ジＶＣＳＭ１３により調製したｓｓＤＮＡを用いた。こ
のテンペレートにプライマーエクステンションで用いた
ラベルされたプライマー２をアニールし、ＢｃａＢＥＳ
Ｔポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）により６５℃、１０分
間合成を行った。これをＢａｍＨＩ消化し、熱変性後８
Ｍ尿素を含む７．５％ポリアクリルアミドゲルにて分離
し目的とするバンドを切り出した。切り出したゲルはＧ
緩衝液（１Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ／２０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡ
ｃ）_２／０．１Ｍ ＥＤＴＡ／０．２％ ＳＤＳ／１０
ｕｇ／ｍｌ ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ）中、３７℃で一晩
インキュベートしてプローブを溶出した。このＳ１プロ
ーブ（１ｘ１０^５ｃｐｍ）をヒト大腸上皮由来全ＲＮＡ
（４０μｇ）とｐｏｌｙＡ^＋ＲＮＡ（１．５μｇ）を混
合し、エタノール沈澱後それぞれ２０μｌのＳ１ハイブ
リダイゼーション液（８０％ホルムアミド／４０ｍＭ
ＰＩＰＥＳ／４００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）に溶解した。これを８０℃で１０分処理した後、４
２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。これに２
００μｌのＳ１溶液（３０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．
６）／２８０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＺｎＳＯ_４／１
ｍｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ／１５０ｕｎｉｔ Ｓ１ヌクレ
アーゼ）を加え３７℃４０分間消化した。これを６％の
シークエンスゲルにて泳動しゲルは固定、乾燥後、オー
トラジオグラフィーを行った。

【０１７３】結果と考察 クローンＧＨＦｃ−１，２．３とも部分的なマッピング
とシークエンシングの結果、インサートサイズがおよそ
１５ｋｂｐ（ＧＨＦｃ１，２），１３Ｋｂｐ（ＧＨＦｃ
３）のそれぞれ独立したクローンでありＧＨＦｃｌと２
は一部ｏｖｅｒｌａｐしていた。また、ＦｃγＢＰｃＤ
ＮＡの６３、６４番目に相当する塩基間および１３１
１，１３１２番目に相当する塩基間にＧＴ／ＡＧ則に一
致したイントロンが存在しており１３１１番目までのエ
キソン部分の塩基配列はｃＤＮＡのものと完全に一致し
ていた（図１０，１１参照）。さらに、ｃＤＮＡクロー
ンＮＺ４の５’上流はＧＨＦｃ３に含まれており、推定
上の翻訳開始ＡＴＧより８７ｂａｓｅ，ＮＺ４ の５’
端より７９ｂａｓｅ上流にｉｎ ｆｒａｍｅでのストッ
プコドン（ＴＧＡ）が存在し、その間に他のｉｎ ｆｒ
ａｍｅでのＡＴＧは認められなかった。従って、これら
の結果はクローンＮＺ４に存在する９番目のＡＴＧがＦ
ｃγＢＰ遺伝子の翻訳開始ＡＴＧである可能性を強く支
持するものである。また、ＮＺ４の５’上流およそ２ｋ
ｂｐ内にＴＡＴＡ／ＣＣＡＴ等の典型的なプロモーター
モチーフは含まれていなかった。さらに、Ｓ１マッピン
グの結果から、このＡＴＧより８，９，１０塩基上流に
相当する長さのバンドが見られ、その内−１０のＡ残基
でもっともそのシグナルが強いことから、このＡ残基よ
り転写が開始するものと考えられた。

【０１７４】実施例２０：ＦｃγＢＰ遺伝子多型の解析 ＦｃγＢＰ ｃＤＮＡのシークエンスの結果、コーディ
ング領域内の特定部位に遺伝子多型の存在が示唆され
た。すなわちＦｃγＢＰ ｃＤＮＡの５１２０，８７２
３，１２３２６番目に存在するＳｍａＩ部位についてク
ローンＡ５２の同領域ではＣＣＣＧＧＧからＣＣＴＧＧ
Ｇへの塩基の置換が認められた。ｃＤＮＡクローニング
に用いたライブラリーは単一個体由来ではなく数人の遺
伝子をその由来とするために、この塩基置換が個体間で
認められるものかあるいは同一個体において半数体ゲノ
ムあたり存在する主要な３回の繰り返し領域間に認めら
れるものかどうかを確認するために以下の実験を行っ
た。

【０１７５】Ｆｏｒｗａｒｄ側プライマーとして ＢＣ１：ＡＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＡＴＧＧＣＣ， ＧＳ１：ＡＣＣＴＧＴＡＡＣＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣ，
の２種、 Ｒｅｖｅｒｓｅ側プライマーとして ＧＳ２：ＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧ， ＧＳ３：ＡＣＡＧＣＡＧＧＧＴＴＧＣＣＣＣＧＧ， ＧＳ４：ＴＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＧ， ＢＣ２：ＴＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＣＧ，の４種
を合成した。 また６名の健常人白血球並びに４名の担癌患者大腸の正
常部位より上皮細胞を分離後、Ｎｅｌｓｏｎ等の方法に
よりＤＮＡを抽出した。各ＤＮＡ２０ｎｇにプライマー
セットＢＣ１／ＢＣ２，ＢＣ１／ＧＳ３，ＢＣ１／ＧＳ
４，ＧＳ１／ＧＳ３，ＧＳ１／ＧＳ４を終濃度２０ｐｍ
ｏｌｅで加え、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ ＨＣ
ｌ ｐＨ８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ_２，２００μＭ ｄＮＴＰｓ，０．００１％ ｇｅ
ｌａｔｉｎ，２．５ｕｎｉｔｔａｑポリメラーゼ）中、
（９４℃ １ｍｉｎ−６０℃ １．５ｍｉｎ−７２℃
２．５ｍｉｎ ｘ ３０サイクル）の条件でＰＣＲを行
った。ＰＣＲ産物はＳｍａＩ消化後２％アガロースゲル
にて泳動し、ＥｔＢｒにて染色を行った。

【０１７６】以上の結果、各プライマーセットに対する
ＰＣＲ産物をＳｍａＩ処理することによりプライマーＢ
Ｃ１／ＢＣ２を除いた各セットで遺伝子多型が存在する
ことが明かとなった。

【０１７７】すなわち、１０種のＤＮＡ標品の内、１つ
はＳｍａＩにて完全消化されることからこのサンプルは
少なくとも対立遺伝子を含めた６カ所の繰り返し部位す
べてにＳｍａＩ部位が存在し、他のサンプルではＳｍａ
Ｉでの消化、未消化産物の割合が各種の頻度で観察され
た。逆に、これら１０サンプルの内ＳｍａＩサイトをも
全くもたないものは存在しなかった。また、ＨＴ−２９
Ｎ２細胞において同じプライマーセットを用いてＲＴ−
ＰＣＲした後、ＳｍａＩにて消化したところ、全てその
サイトを含んでいた。

【０１７８】また、プライマーＢＣ１／ＢＣ２で多型が
認められなかった理由としてＰＣＲ産物の鎖長が約１．
８ｋｂｐあることからプライマーＧＳ４とプライマーＢ
Ｃ２の間におよそ１．６ｋｂｐのイントロンが存在し、
このイントロンの５’側にＳｍａＩ部位が存在すること
が示唆された。この部位と多型を示す目的のＳｍａＩ部
位間の長さが非常に短く、ＢＣ１／ＢＣ２での増幅産物
とそのＳｍａＩ消化産物との鎖長差が僅かであるために
多型が検出されなかったものと推定された。

【０１７９】実施例２１：誘導型高発現ＣＨＯ細胞株の
分離とＦｃγＢＰの検出 実施例１１で示したＦｃγＢＰフラグメントを多量に、
安定して発現する細胞株を樹立する目的で、動物細胞用
発現ベクター、ｐＭＳＸＮＤを用いてＦｃγＢＰ部分ｃ
ＤＮＡ、ＮＶ１１ＳＴを発現させた。ｐＭＳＸＮＤベク
ターは蛋白発現の誘導がナトリウムブチレートなどによ
り可能なメタロチオネインプロモーターを発現プロモー
ターとして有し、染色体ＤＮＡに組み込まれた後に遺伝
子増幅を可能にするｄｈｆｒ遺伝子をもつ様構築されて
いる。

【０１８０】（１） ｐＭＳＸＮＤベクターの改変 まず、ｐＭＳＸＮＤの ｃＤＮＡクローニング部位であ
るＸｈｏＩにてプラスミドを完全消化した後、０．４単
位のＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔにて１５分間処理
し、末端平滑化した。次に、ＮｏｔＩリンカー（５’−
ｐＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）をベクターにライゲーショ
ンした後ＮｏｔＩで完全消化し、自己連結させてからコ
ンピテントＥ．Ｃｏｌ ＸＬ１−Ｂを形質転換した。得
られたクローンを解析し、ｐＭＳＸＮＤのＸｈｏＩ部位
にＮｏｔＩリンカーが挿入されたプラスミドｐＭＳＸＮ
Ｄ−ＮＯＴを得た。

【０１８１】（２） ｃＤＮＡの挿入 ｐＭＳＸＮＤ−ＮＯＴをＮｏｔＩで完全消化した後、ア
ルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化を行っ
た。次に、実施例６−（６）で作製したＦｃγＢＰｃＤ
ＮＡを組み込んだプラスミドであるｐＮＶ１１−ＳＴを
ＮｏｔＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動にて８
ｋｂｐのｃＤＮＡ部分を分離、回収した。これらの発現
ベクターとｃＤＮＡ挿入部分をライゲーションし、コン
ピテントＥ．ｃｏｌ（ＸＬ１−Ｂ）を形質転換した。ア
ンピシリンを含むＬＢプレート上で培養し生じたコロニ
ーのうち、メタロチオネインプロモーターに対しセンス
の方向でｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを選択し、ｐ
ＮＶ１１−ＭＳＸを得た。

【０１８２】（３） ＣＨＯ細胞でのＩｇＧ ＦｃＢＰ
部分ｃＤＮＡの発現 実施例１１と同様の方法にてｐＮＶ１１−ＭＳＸプラス
ミドを含む大腸菌を培養し、増幅したプラスミドを精製
した。このプラスミド１０μｇを２５０μｌのＦ−１２
培地（ヌクレオチド添加）に溶解したものと、１０μｌ
のリポフェクション試薬（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｕｍ，Ｓ
ＥＰＲＡＣＯＲ社）を２５０μｌに溶解したものを混合
し、直ちにＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ欠損株）上に加えた。
３７℃で６時間培養後、１０％血清を含むＦ−１２培地
で置換し３日間培養した。次に、培地を１ｍｇ／ｍｌの
Ｇ４１８、１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ヌ
クレオチド不含、ＧＩＢＣＯ社製）に置換し、３日毎に
培地交換しながら１４日間培養し、プラスミドの挿入さ
れた細胞を選択した。このようにして数十個のコロニー
を形成したディッシュより、限界希釈法にて細胞をクロ
ーニングした。得られた細胞クローンのうちＦｃ結合活
性の高い蛋白発現を示すものを選択し、より多くの発現
量を得るために次に遺伝子増幅を行った。

【０１８３】（４） 遺伝子増幅 ｐＮＶ１１−ＭＳＸがＣＨＯ細胞の染色体に組み込ま
れ、安定にＦｃγＢＰフラグメントを発現する細胞クロ
ーンの蛋白質産生量を増加させるために、メトトレキセ
ート処理によって組み込み遺伝子の増幅を行った。即
ち、前記の安定発現細胞クローンを、０．００５μＭの
メトトレキセート、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８含むα
−ＭＥＭ培地（ヌクレオチド不含）にて３−４週間培養
し、生育する細胞を選択した。次に、メトトレキセート
濃度を４倍（０．０２μＭ）に増加し、同様の方法で３
−４週間培養した。メトトレキセート濃度を４倍に増加
させ培養する操作をくり返し、最終的に６．４μＭ〜２
５μＭのメトトレキセート存在下で増殖する細胞を得
た。この細胞を限界希釈法にてクローニングを行い、Ｆ
ｃγＢＰフラグメントを高発現する細胞株を得た。発現
量の増加は、実施例１１および１２におけると同様に、
Ｋ９／Ｋ１７モノクローナル抗体による組織化学的染色
またはＩｇＧ結合能の検出法による第一次的判定によっ
た。

【０１８４】（５） 細胞試料の作製 ＦｃγＢＰフラグメントを安定的に高発現するＣＨＯ細
胞株５×１０^５細胞をφ１００ｍｍディッシュに移し、
６．４μＭメトトレキセート、１ｍｇ／ｍｌＧ４１８を
加えたα−ＭＥＭ培地にて培養した。必要に応じて終濃
度５ｍＭとなるようナトリウムブチレートを添加し、蛋
白質の発現誘導を行った。３日後に、培養上清（ＳＵＰ
１）を採取し、さらにＳＵＰ１から細胞片を除くため１
００，０００ｘｇ，６０分間遠心後、上清（ＳＵＰ２）
を回収した。細胞は、５００μｌの細胞溶解緩衝液（５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１０
ｍＭ ｍｏｎｏｉｏｄｏ ａｃｅｔａｍｉｄｅ，１０μ
ｇ／ｍｌ ａｐｐｒｏｔｉｎｉｎｅ，１０μｇ／ｍｌ
ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に懸濁後、超音波処理（３０秒×
３回）を行い、１０，０００ｘｇ，１０分間４℃の遠心
を行った。遠心後の上清（ＬＹＳ１）を除き、残渣に、
１％ＮＰ−４０を含む細胞溶解緩衝液４００μｌを加
え、超音波処理後、遠心し上清を回収した（ＬＹＳ
２）。更にこの残渣に１％ＮＰ−４０，０．１％ＳＤ
Ｓ，０．５％デオキシコール酸ナトリウムを含む細胞溶
解緩衝液２００μｌに溶解後、遠心し上清を回収した
（ＬＹＳ３）。残渣は１００μｌの細胞溶解緩衝液に懸
濁した（ＬＹＳ４）。また、コントロールとして大腸上
皮細胞の溶解液（１／１００〜１／３２００希釈）を用
いた。

【０１８５】（６） サンドイッチＥＬＩＳＡ 産生されたＦｃγＢＰフラグメントを定量的に検出する
ために、ＦｃγＢＰに対する特異的モノクローナル抗体
Ｋ９およびＫ１７を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系の
開発を行った。アフィニティー精製したＫ９抗体を５μ
ｇ／ｍｌとなるよう０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．２）
にて調製し、５０μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート
（ＰＲＯ−ＢＩＮＤ，ファルコン社製）に加えた後、４
℃で一晩放置した。ウェルを洗浄溶液（０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−））で３回洗浄した後、
ブロッキング溶液（１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０
培地）を５０μｌ／ウェル加え、温室で６０分間放置し
た。

【０１８６】ブロッキング溶液を除き、（５）にて調製
した試料を各々５０μｌ加え、室温２時間放置した。洗
浄溶液にて３回洗浄し、ブロッキング溶液にて４ｍｇ／
ｍｌに希釈したＨＲＰ結合Ｋ１７抗体を５０μｌ加え、
室温１時間放置した。洗浄溶液にて３回洗浄後、５０μ
ｌの発色液（２０ｍｇ Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａ
ｍｉｎｅ，８０μｌ Ｈ_２Ｏ_２（３０％）を５０ｍｌの
クエン酸緩衝液に溶解）を加え、室温で３分間発色させ
た。５０μｌの２．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４溶液を加え反応を
停止してから４９２ｎｍの吸光度を測定した。

【０１８７】〔結果〕 （ｉ）得られた代表的なＦｃγＢＰ発現ＣＨＯ細胞株に
ついて メトトレキセート存在下で培養後、ナトリウムブチレー
ト処理後および未処理後３日目におけるＦｃγＢＰフラ
グメントの発現量をＫ９／Ｋ１７モノフローナル抗体に
よる細胞染色法により検出した。図１３に示すように、
高発現株が分離できた。 （ｉｉ）ＥＬＩＳＡによるＦｃγＢＰフラグメントの定
量結果 ＦｃγＢＰフラグメントの安定高発現株から調製された
各試料をサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した結果、
次の表２の吸光度が示す様に、ＦｃγＢＰフラグメント
は細胞溶解液中（ＬＹＳ１〜４）に比べて、培養上清中
（ＳＵＰ１，２）により多く検出された。この事実は発
現させたＦｃγＢＰフラグメントは細胞内に蓄積するの
ではなく細胞外に分泌されることを示している。

【０１８８】

【表２】

【０１８９】

【発明の効果】本発明により、ＩｇＧＦｃ部結合活性を
示すタンパク質を大量かつ均一に生産することが可能と
なった。したがって、本発明によって得られるＩｇＧＦ
ｃ部結合活性を示すタンパク質を、感染防御剤および潰
瘍性大腸炎やクローン病などの自己免疫疾患に対する抗
（消）炎症剤や診断薬などの医薬用途に利用する可能性
を有している。

【０１９０】

【配列表】

【０１９１】

【配列番号１】

【０１９２】

【配列番号２】

【０１９３】

【配列番号３】

【０１９４】

【配列番号４】

【０１９５】

【配列番号５】

【０１９６】

【配列番号６】

【０１９７】

【配列番号７】

【図面の簡単な説明】

【図１】プローブＱを用いて行ったＦｃγＢＰ ｍＲＮ
Ａのハイブリダイゼーションの結果を示す図（電気泳動
の写真）である。

【図２】ＦｃγＢＰの発現に用いた部分ｃＤＮＡ（約
７．８ｋｂｐ）、ならびにクローンＮＺ４、Ｃ７２、Ｙ
１、Ｘ１およびＶ１１の相互の関係を示す。

【図３】ベクターｐＮＶ１１−ＳＲを用いて形質転換し
たＣＯＳ７細胞の発現するタンパク質を確認する図（生
物の形態を示す写真）である。一次抗体として、ＡはＫ
９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ培養上清、Ｂ
はＫ１７モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ培養上
清を用いた。Ｃは一次抗体を加えない対照。いずれのも
のにも二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを加えた。

【図４】ベクターｐＮＶ１１−ＳＲを用いて形質転換し
たＣＯＳ７細胞の発現するタンパク質のヒトＩｇＧ結合
能を示す図（生物の形態を示す写真）である。いずれの
ものにも一次抗体としてＨＲＰ結合ヒトＩｇＧを用い
た。拮抗剤として用いた二次抗体は以下の通り；Ａ：加
えず（対照）、Ｂ：クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ
画分、Ｃ：クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ Ｆｃ画
分。

【図５】ベクターｐＮＶ１１−ＳＲを用いて形質転換し
たＣＯＳ７細胞の発現するタンパク質のヒトＩｇＧ結合
能を示す図（生物の形態を示す写真）である。いずれの
ものにも一次抗体としてＨＲＰ結合ヒトＩｇＧを用い
た。拮抗剤として用いた二次抗体は以下の通り；Ｄ：ク
ロマトグラフィー精製ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２画
分、Ｅ：クロマトグラフィー精製ヒトＩｇＭ画分、Ｆ：
クロマトグラフィー精製ヒト血清ＩｇＡ、Ｇ：クロマト
グラフィー精製ヒト分泌型ＩｇＡ。

【図６】ＦｃγＢＰ ｍＲＮＡのヒト組織での発現の特
異性を示すノーザンブロットの図（電気泳動の写真）で
ある。

【図７】プローブＱ、ＡおよびＹを用いて実施した大腸
粘膜上皮細胞中のＦｃγＢＰｍＲＮＡのノーザンブロッ
ト解析を示す図（電気泳動の写真）である。

【図８】ＦｃγＢＰの全長ｃＤＮＡの構造を示す図であ
る。

【図９】プラスミドｐｉＦ−Ａ５３およびｐｉＦ−Ａ８
を用いて形質転換したＣＯＳ７細胞とモノクローナル抗
体Ｋ９／Ｋ１７混液との結合能を示す図（生物の形態を
示す写真）である。Ａ：ｐｉＦ−Ａ５３、Ｂ：ｐｉＦ−
Ａ８。

【図１０】ＦｃγＢＰのエキソン／イントロン境界領域
の塩基配列の比較を示す図である。大文字（ボックス）
はエキソン、小文字はイントロンを示す。また下線部は
高度に保存された配列を示す。Ｒ：プリン、ｙ：ピリミ
ジン。

【図１１】ＦｃγＢＰゲノムＤＮＡの５’側翻訳開始部
位近傍の塩基配列を示す図である。大文字はエキソン、
小文字はイントロンを示す。下線で示した部分はｃＤＮ
Ａと同一の部分を、またｓｈａｄｅされた太文字はｉｎ
ｆｒａｍｅでのＴＧＡストップコドンおよび翻訳開始
部位と推定されるＡＴＧコドンを示す。なお、数字はｃ
ＤＮＡクローンＮＺ４の５’末端を＋１とし、エキソン
の上にのみ番号を付けた。

【図１２】ヒトＦｃγＢＰの構造と、本発明で用いた各
クローンの対応する位置を示す。

【図１３】ＦｃγＢＰフラグメントを発現するＣＨＯ細
胞を示す（生物の形態を示す写真）。（Ａ）はメトトレ
キセート６．４μＭ、ナトリウムブチレート非処理；
（Ｂ）はメトトレキセート６．４μＭ、５ｍＭ ナトリ
ウムブチレート処理後を示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列
   をコードする塩基配列、またはこれを一部置換、欠失も
   しくは付加した塩基配列、あるいはこれらにハイブリダ
   イズする塩基配列を含むＤＮＡおよびそのＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 プラスミドｐＮＶ１１−ＳＴ（生命研条
   寄第４６２５号：ＦＥＲＭ ＢＰ−４６２５）中に挿入
   されている請求項１記載のＤＮＡおよびそのＤＮＡ断
   片。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列
   をコードする塩基配列、またはこれを一部置換、欠失も
   しくは付加した塩基配列、あるいはこれらにハイブリダ
   イズする塩基配列を含むＤＮＡおよびそのＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 請求項１または３記載のＤＮＡまたはそ
   のＤＮＡ断片を含有する組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターにより形
   質転換された原核または真核宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項５記載の宿主細胞を培養し、産生
   されたタンパク質を分離、精製することを特徴とする組
   換えタンパク質の製造方法。
7. 【請求項７】 組換えタンパク質がＩｇＧＦｃ部結合活
   性を示す請求項６記載の組換えタンパク質の製造方法。
8. 【請求項８】 請求項５記載の宿主細胞を培養して得ら
   れる培養物を細胞内または細胞外から分離、精製して得
   られる組換えＩｇＧＦｃ部結合活性を示すタンパク質。
9. 【請求項９】 請求項１または３記載のＤＮＡまたはそ
   のＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ノーザンブロッ
   ト解析またはインサイチュハイブリダイゼーション法に
   よってＩｇＧＦｃ部結合タンパク質のｍＲＮＡの合成組
   織を同定する方法。