DE69534743T2

DE69534743T2 - FÜR DAS IgG-Fc-BINDENDE PROTEIN KODIERENDES GEN

Info

Publication number: DE69534743T2
Application number: DE69534743T
Authority: DE
Inventors: Minoru Morikawa; Naoki Harada
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-04-01
Filing date: 1995-04-03
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2015-04-04
Also published as: WO1995027057A1; ATE315644T1; AU2085195A; JPH08112096A; EP0776972A1; DE69534743D1; EP0776972B1; JP3619282B2; EP0776972A4; US6271362B1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft ein Gen, das ein IgG-Fc-Region-bindendes Protein [nachstehend bezeichnet als FcγBP (Fcγ-Bindungsprotein) oder IgG-Fc-BP] codiert, welches ein speziell an die Fc-Region von Immunglobulin G (IgG) bindendes Protein ist, ein rekombinanter Vektor, der dieses Gen enthält, durch diesen rekombinanten Vektor transformierte Wirtszellen, ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, welches durch Inkubation dieser Wirtszellen erhalten wird, und ein Protein, das rekombinante IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität aufweist, das durch das vorstehend erwähnte Verfahren erhalten wird.
Stand der Technik
Ein Makrophage nimmt als immunkompetente Zelle über Phagozytose einen fremden Eindringling, oder einen Immunglobulin G (IgG) Komplex davon, in der Zelle auf und verdaut ihn anschließend. Er ist auch im Stande einen Antigenpräsentierenden Effekt auszuüben, um so die Produktion eines Antikörpers durch Lymphozyten zu induzieren. Der wichtigste Zugang dieser Phagozytose ist ein Fc-Rezeptor [FcγR (Fcγ-Rezeptor)] von IgG, welcher auf der Oberfläche der Makrophagenzelle lokalisiert ist. Die inhärente Funktion dieses Fcγ-Rezeptors, der ein an der Bindung der Fc-Region von IgG teilhabender Rezeptor ist, ist die Eliminierung eines Pathogens oder eines Antigen-IgG-Immunkomplexes, der mit IgG überzogen ist (Opsonisation).
Es ist bekannt gewesen, dass Fcγ-Rezeptoren grob in drei Typen klassifiziert werden können, einschließlich RI, RII und RIII [J.V. Ravetch und J.-P. Kinet, Annu. Rev. Immunol. (1991), 9:457-492]. Die cDNA von jedem dieser Rezeptoren ist erfolgreich cloniert worden. Darüber hinaus fanden verschiedene Gruppen von Forschern von 1990 bis 1991 Proteine, die mit diesen Fc-Rezeptoren in Zusammenhang standen und für die Initiation der Inkorporierung der bindenden Anteile durch Fcγ-Rezeptoren benötigt wurden und welche dadurch einen Hinweis zur Klärung des Wechselmechanismus bereitstellten [L.L. Lanier, G. Yu und J.H. Phillips, Nature (1989), 342:803-805; T. Kurosaki und J.V. Ravetch, Nature (1989), 342:805-807; D.G. Orioff, C. Ra, S.J. Frank, R.D. Klausner und J.-P. Kinet, Nature (1989), 347:189-191; P. Anderson, M. Caligiuri, C. O'Brien, T. Manley, J. Ritz und S.F. Schlossman. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 87:2274-2278; T. Kurosaki, I. Gander und J.V. Ravetch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88:3837-3841; L. Azzoni, M. Kamoun, T.W. Salcedo, P. Kanakaraj und B. Perussia, J. Exp. Med. (1992), 176:1745-1750; A.T. Ting, L.M. Karnitz, R.A. Schoon, R.T. Abraham und P.J. Leibson, J. Exp. Med. (1992), 176:1751-1755].
Andererseits berichteten Kobayashi et al., von einem Protein-Fcγ-BP, welches spezifisch an die Fc-Region von IgG binden konnte und verschieden zu den herkömmlich bekannten Fcγ-Rezeptoren war, die in menschlichen intestinalen und Colon-Epithelzellen, insbesondere in Becherzellen, vorkommen. Die spezifische Bindung dieses Proteins an die IgG-Fc-Region wurde unter Verwendung von mit Meerrettich-Peroxydase markierten Substanzen bestätigt. Nämlich FcγBP, welches ausschließlich an die Fc-Region von IgG gebunden war, aber nicht an IgGFab, IgA oder IgM. Ferner ist FcγBP keine Kreuzreaktion mit Antikörpern der Fcγ-Rezeptoren I, II und III eingegangen [K. Kobayashi, M.J. Blaser und W.R. Brown, J. Immunol. (1989), 143:2567-2574].
Weiterhin reinigten sie FcγBP teilweise von menschlichen Kolon-Epithelzellen und konstruierten Maus-monoclonale Antikörper unter Verwendung dieses Proteins als einem Antigen. Auf diese Weise wurde bestätigt, dass FcγBP nicht nur an diese Antikörper bindet, sondern auch an Maus-IgG [K. Kobayashi, Y. Hamada, M.J. Blaser und W.R. Brown, J. Immunol. (1991), 146:68-74].
Das teilweise gereinigte FcγBP wurde mit SDS (Natrium-Dodecyl-Sulfat) einer Elektrophorese und dann unter Verwendung der monoclonalen Antikörper einem Western-Blot unterzogen. Als Ergebnis davon wurde herausgefunden, dass FcγBP ein Assoziat von 200 kDa oder darüber bildete, welche ein Protein von 78 kDa enthielt [K. Kobayashi, Y. Hamada, M.J. Blaser und W.R. Brown, J. Immunol. (1991), 146:68-74].
Das vorstehend erwähnte FcγBP ist zu den Fc-Rezeptoren in dem Punkt identisch, dass es im Stande ist die Fc-Region von IgG zu binden. Die Stabilität und Struktur von FcγBP als ein Protein und seine in vivo Rolle bleiben jedoch nach wie vor unbekannt. Es ist daher höchst interessant FcγBP zu analysieren, um seine Struktur und Funktion zu klären.
Wie nachstehend beschrieben, wird angenommen, dass FcγBP zusammen mit Schleim auf Schleimhäuten abgesondert wird und Krankheitserreger oder Viren einfängt, welche in den Körper über die Schleimhaut eindringen, um dadurch die Ausscheidung dieser Eindringliche zu erleichtern und auf diese Weise am Schutzmechanismus gegen Infektion beteiligt ist. Ein Autoantikörper, der in einer an Entzündung leidenden Schleimhaut im Überschuss erzeugt wird, aktiviert das Komplementsystem oder erzeugt Cytotoxizität durch Makrophagen usw. und verschlimmert somit die Entzündung. Es wird angenommen, dass FcγBP die Fc-Region eines solchen Autoantikörpers blockiert, um dadurch das Fortschreiten der Entzündung zu hemmen. Da FcγBP diese Funktionen aufweist, könnte es für Arzneimittel einsetzbar sein, zum Beispiel als Wirkstoffe zum Schütz gegen Infektion, entzündungshemmende (antiphlogistische) Wirkstoffe oder diagnostische Arzneimittel für Autoimmunerkrankungen wie zum Beispiel entzündliche Colitis und Crohn-Krankheit usw.
Um FcγBP für diese medizinischen Zwecke einzusetzen, ist es notwendig FcγBP in einer großen Menge und in einem einheitlichen Zustand zu erhalten. In einem einheitlichen Zustand kann FcγBP jedoch kaum in einer großen Menge durch das Verfahren erhalten werden, worin FcγBP von einem tierischen Gewebe an sich oder einem Kulturüberstand von FcγBP-erzeugenden Zellen isoliert wird. Es ist daher nötig FcγBP durch Verwendung von Genrekombinationstechniken in einer großen Menge zu erzeugen.
Die gegenwärtigen Erfinder identifizierten die Basensequenz eines FcγBP-codierenden Gens erfolgreich durch Clonierung der cDNA, unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern gegen FcγBP.
Diese cDNA wurde in einen geeigneten Vektor inseriert und Wirtszellen wurden durch den so erhaltenen Expressionsvektor transformiert. Dann wurde die erhaltene Transformante inkubiert und das so erzeugte Zielprotein wurde aufbereitet und gereinigt. Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass das auf diese Weise erzeugte Protein eine spezifische Bindungseigenschaft für menschlichen IgG aufwies. Die gegenwärtigen Erfinder haben auf diese Weise verdeutlicht, dass FcγBP in einer großen Menge und in einem einheitlichen Zustand hergestellt werden kann.
Offenbarung der Erfindung
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Gen bereit, welches FcγBP, wie in den Ansprüchen charakterisiert, codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus einen rekombinanten Vektor bereit, welcher ein Gen enthält, das FcγBP codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus prokaryontische und eukaryontische Wirtszellen bereit, welche durch einen rekombinanten Vektor transformiert sind, der ein Gen enthält, das FcγBP codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung von FcγBP bereit, welches Inkubation der Wirtszellen, die durch einen rekombinanten Vektor transformiert sind, der ein Gen enthält, das FcγBP codiert und Auftrennung und Reinigung des auf diese Weise hergestellten Proteins umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus ein Protein bereit, welches IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität zeigt, welches durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus ein Verfahren zur Verwendung einen Gens bereit, welches FcγBP oder einen Teil davon als Sonde im Northern-Blot oder in der in situ Hybridisierung zur Identifizierung des Gewebes, welches FcγBP-mRNA synthetisiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Elektrophorogramm, welches die Ergebnisse der Hybridisierung von FcγBP-mRNA zeigt, durchgeführt unter der Verwendung von Sonde Q.
2 zeigt die Beziehungen zwischen der partiellen cDNA (etwa 7,8 kbp), eingesetzt in der Expression von FcγBP und der Clone NZ4, C72, Y1, X1 und V11.
3 stellt morphologische Photos bereit, welche die Expression des Proteins in COS7-Zellen bereitstellen, transformiert durch Verwendung des Vektors pNV11-SR. Als der primäre Antikörper wurde in A der den K9 monoclonalen Antikörper erzeugende Hybridom-Kulturüberstand verwendet, während der den K17 monoclonalen Antikörper erzeugende Hybridom-Kulturüberstand in B verwendet wurde. In C wurde kein primärer Antikörper hinzugefügt (d.h. im Kontrollfall). In jedem Fall wurde das mit Meerrettich-Peroxydase markierte Ziege-anti-Maus-IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment als der sekundäre Antikörper hinzugefügt.
4 stellt morphologische Photos bereit, welche die Fähigkeit des Proteins zeigen an menschliches IgG zu binden, welches in COS7-Zellen exprimiert worden ist, die unter Verwendung des Vektors pNV11-SR transformiert wurden. In jedem Fall wurde das mit Meerrettich-Peroxydase markierte menschliche IgG als der primäre Antikörper eingesetzt. Die als die Antagonisten verwendeten sekundären Antikörper sind wie folgt; A: keiner (d.h. der Kontrollfall), B: eine menschliche IgG-Fraktion, gereinigt durch Chromatographie, und C: eine menschliche IgG-Fraktion, gereinigt durch Chromatographie.
5 stellt morphologische Photos bereit, welche die Fähigkeit des Proteins zeigen an menschliches IgG zu binden, welches in COS7-Zellen exprimiert worden ist, die unter Verwendung des Vektors pNV11-SR transformiert wurden. In jedem Fall wurde das mit Meerrettich-Peroxydase markierte menschliche IgG als der primäre Antikörper eingesetzt. Die als die Antagonisten verwendeten sekundären Antikörper sind wie folgt; D: eine menschliche IgG F(ab')₂-Fraktion, gereinigt durch Chromatographie, E: eine menschliche IgM-Fraktion, gereinigt durch Chromatographie, F: menschliches Serum IgA gereinigt durch Chromatographie und G: menschlicher Sekretions-IgA, gereinigt durch Chromatographie.
6 ist eine Elektrophorogramm von einem Northern-Blot, welches die Spezifität der Expression von FcγBP-mRNA in menschlichen Geweben zeigt.
7 ist ein Elektrophorogramm, welches eine Northern-Blot-Analyse von FcγBP-mRNA in Kolonsschleimhaut-Epithelzellen zeigt, wobei die Sonden Q, A und Y verwendet wurden.
8 zeigt die Struktur der Volllängen-cDNA von FcγBP.
9 stellt morphologische Photos bereit, welche die Fähigkeit von COS7-Zellen zeigen, die unter Verwendung der Plasmide piF-A53 und piF-A8 transformiert worden sind, an ein Gemisch aus den monoclonalen Antikörpern K9/K17 zu binden. A: piF-A53 und B: piF-A8.
10 zeigt einen Vergleich zwischen den Basensequenzen des Exon/Intron-Übergangsbereichs von FcγBP. Die eingerahmten Großbuchstaben zeigen Exons, während die Kleinbuchstaben Introns zeigen. Die unterstrichenen Teile zeigen hochkonservierte Sequenzen. R: Purin, und Y: Pyrimidin.
11 zeigt die Basensequenz in der Nachbarschaft der Startstelle auf der 5'-Seite der genomischen DNA von FcγBP, wobei Großbuchstaben Exons zweigen, während Kleinbuchstaben Intron zeigen. Die unterstrichenen Teile sind mit der Sequenz der cDNA identisch. Die schattierten dicken Buchstaben zeigen das TGA-Stopp-Codon im Leserahmen und das ATG-Codon, von welchem angenommen wird, dass es die Startstelle ist. Basen in den Exons werden ausschließlich nummeriert, indem das 5'-Ende des cDNA-Clons NZ4 als +1 bezeichnet wird.
12 zeigt die Struktur des menschlichen FcγBP und die Stellen darin, welche den Clonen entsprechen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
13 stellt morphologische Photos bereit, welche CHO-Zellen zeigen, die das FcγBP-Fragment darin exprimieren. Die Probe (A) ist mit 6,4 μM Methotrexat, aber ohne Natrium-Butyrat behandelt worden, während Probe (B) mit 6,4 μM Methotrexat und 5 mM Natrium-Butyrat behandelt worden ist.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die FcγBP codierende cDNA kann zum Beispiel durch Produktion der mRNA von Zellen erhalten werden, welche FcγBP produzieren und durch Umwandlung der mRNA in die doppelsträngige cDNA durch ein bekanntes Verfahren. Obwohl menschliche Kolonschleimhaut-Epithelzellen in der vorliegenden Erfindung als die mRNA-Quelle eingesetzt werden, kann von Gewebehomogenisaten Gebrauch gemacht werden, in welchen FcγBP ohne Einschränkung verteilt ist (zum Beispiel menschlichem Dünndarm, Zwölffingerdarm, Magen, Unterkieferdrüse, Unterzungendrüse, allgemeiner Gallengang, Bronchie usw.). Es ist auch bekannt, dass eine Zelllinie HT-29-18-N2, welche aus menschlichen Kolonkrebszellen stammt und ihre Unterarten FcγBP produzieren. Diese Zelllinien können daher als die mRNA-Quelle verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung wird ein verändertes AGPC-Verfahren (P. Chomczynski et al., Analytical Biochem., 162:156-159, 1987) angewandt, um die mRNA zu erzeugen. Alternativ können alle RNAs gemäß dem Verfahren von Chirgwin et al. (Biochemistry 18:5294-5299, 1979) erzeugt werden. Es ist auch möglich die mRNA durch Verfahren herzustellen, die in der Clonierung der Gene von andern physiologisch aktiven Proteinen eingesetzt wurden, zum Beispiel die Behandlung mit einem Tensid in der Anwesenheit eines Ribonuclease-Inhibitors (zum Beispiel einem Vanadium-Komplex) oder Behandlung mit Phenol.
Um die doppelsträngige DNA von der so erlangten mRNA zu erhalten, wird Reverse-Transkription unter Verwendung der mRNA als Matrize und einem Oligo(dT) oder einem zufälligen Primer durchgeführt, der komplementär zu der polyA-Kette am 3'-Ende ist oder einem synthetischen Oligonucleotid als einem Primer, welches einem Teil der Aminosäuresequenz von FcγBP entspricht, um dadurch eine DNA zu synthetisieren, die komplementär zu der mRNA ist (d.h. die cDNA).
In der vorliegenden Erfindung wird die cDNA durch reverse Transkription von der polyadenylierten RNA in Übereinstimmung mit dem veränderten Gubler & Hoffman-Verfahren unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Kits, hergestellt von Amersham oder InVitrogen und zufälligen Primern konstruiert.
Ein Adapter wird dann an diese cDNA ligiert, gefolgt durch die Insertion in die EcoRI-Stelle des λgt11-Vektors. Die auf diese Weise konstruierte cDNA-Bank wird unter Verwendung eines in vitro Gigapack II Gold Verpackungs-Kits, hergestellt von Stratagene, in den λ-Phagen verpackt und in Escherichia coli exprimiert. Das so exprimierte cDNA-Protein wird unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern als Sonde durchmustert.
Als die in der vorstehend erwähnten Clonierung verwendeten Antikörper werden jene, die im Stande sind FcγBP im Western-Blot nachzuweisen, unter 3 monoclonalen Antikörpern (K9, K10 und K17) ausgewählt, welche die Bindung von IgGFc an FcγBP inhibieren können (Kobayashi et al., J. Immunology, 146:68-74, 1991; Kobayashi et al., J. Immunology, 143:2567-2574, 1989). Wenn nämlich der Antiköper K9 verwendet wird, wird unter nicht-reduzierenden Bedingungen eine Bande beobachtet, die größer als etwa 200 kDa ist. Wenn der Antiköper K17 verwendet wird, werden andererseits unter reduzierenden Bedingungen Banden bei 70-80 kDa und 130-140 kDa beobachtet. Basierend auf diesen Ergebnissen werden jene monoclonalen Antikörper in der Clonierung eingesetzt, die im Stande sind 2 verschiedene Epitope zu erkennen.
Als ein Ergebnis dieser Durchmusterung wird von etwa 1.000.000 Clone unter Verwendung des Antikörpers K9 ein Clon erhalten, der als Sonde Q (600 bp) bezeichnet wird, während 7 Clone von etwa 600.000 Clonen unter Verwendung des Antikörpers K17 erhalten werden, unter welchen ein DNA-Fragment von 700 bp als Sonde A bezeichnet wird und ein anderes DNA-Fragment von 600 bp als Sonde B bezeichnet wird.
Durch Verwendung dieser Sonde Q, wird die Größe der FcγBP-mRNA durch Vergleich mit den mRNAs von bekannten Proteinen berechnet. Als Ergebnis wird geschätzt, dass das FcγBP-mRNA-Molekül eine Größe von etwa 17 kbp (1) hat.
Als Nächstes wird die zweite cDNA-Bank in λgt10 verpackt und wird unter Verwendung der Sonden Q, A und B durchmustert. Zuerst werden die mit einer der Sonden Q, A und B hybridisierbaren Clone aufgetrennt. Unter diesen Clonen wird einer erhalten, der ausschließlich mit der Sonde A hybridisierbar ist. Das Ende dieses Clons, auf der gegenüberliegenden Seite von A, wird als Probe X bezeichnet (etwa 700 bp) und ein mit dieser Sonde X hybridisierbarer cDNA-Clon wird abgetrennt. Der erhaltene Clon, der in der Mitte ein X aufweist und den A-B-Bereich an einem Ende, wird als X1 bezeichnet. Anschließend wird ein Teil (etwa 800 bp) dieses Clons X1, gegenüber dem A-B-Bereich als Sonde Y bezeichnet und die cDNA-Bank wird wieder durchmustert. So wird ein mit dieser Sonde Y hybridisierbarer cDNA-Clon erhalten und als Y1 bezeichnet. Dieser Clon Y1 weist an einem Ende einen Teil des X-Bereichs und den Y-Bereich in der Mitte auf. Ein Teil (etwa 150 bp) dieses Clons Y1, am gegenüberliegenden Ende zum X-Bereich, wird als Sonde Y150 bezeichnet. Durch Verwendung dieser Sonde Y150, wird die cDNA-Bank nochmals durchmustert. Auf diese Weise wird ein Clon ausgewählt und als Clon C72 bezeichnet, der die längste Ausdehnung auf der gegenüberliegenden Seite zu dem Y150-Bereich zeigt. Anschließend wird ein Teil (etwa 450 bp) dieses Clons C72 in der Nachbarschaft des gegenüberliegenden Endes zum Y150-Bereich als Sonde Z bezeichnet und cDNA-Clone, die mit dieser Sonde Z hybridisierbar sind, werden abgetrennt. Von diesen Clonen wird einer abgetrennt und als Clone NZ4 bezeichnet, der den längsten nicht mit Clon C72 überlappenden Teil aufweist.
Von den cDNA-Clonen, die mit jedem der Clone A, B und Q hybridisierbar waren wurde andererseits einer ausgewählt und als Clon V11 bezeichnet, der im A-B-Bereich die gleiche Basensequenz aufwies, wie der A-B-Bereich im Clon X1.
Dann werden die Basensequenzen dieser 5 Clone (X1, Y1, C72, NZ4 und V11) identifiziert und die Aminosäuresequenzen der Proteine bestätigt. Auf diese Weise wird ein offener Leserahmen mit ATG als Startcodon gefunden (2).
Ferner wird eine partielle cDNA (etwa 7,8 kbp), die FcγBP codiert von diesen Clonen erhalten und ihre Basensequenz wird identifiziert (SEQ ID NR: 6 zeigt die Basensequenz und die Aminosäuresequenz).
Darüber hinaus wird jeder der mittels Durchmusterung über Hybridisierung unter Verwendung der vorstehend erwähnten Sonde A, B oder Q erhaltenen cDNA-Clone in Escherichia coli amplifiziert und durch Verwendung der Sonden A, B und Q kartiert. Als Ergebnis davon wird angenommen, dass die cDNA von FcγBP eine Struktur von 16,4 kbp in der Gesamtlänge, mit einer Einheit von 3,5 kbp aufweist, wobei Sequenzen, die jeweils mit den Sonden A, B und Q homolog sind, in der Reihenfolge von A→B→Q miteinander verbunden und hintereinander wiederholt sind.
In dem cDNA-Clon, der mit der Sonde B hybridisierbar ist, wird ein Teil der Basensequenz der Sonde durch PCR amplifiziert und die Basensequenz des auf diese Weise erhaltenen Fragments wird analysiert. Auf diese Weise wird geklärt, dass die Volllängen-cDNA von FcγBP die in 8 gezeigte Struktur aufweist und die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 7 dargestellte Basensequenz und Aminosäuresequenz.
Durch Integration des auf diese Weise clonierten FcγBP-codierenden Gens in den entsprechenden Vektor, können prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen transformiert werden.
Darüber hinaus kann ein geeigneter Promotor oder eine mit der phenotypischen Expression in Zusammenhang stehende Sequenz in einen solchen Vektor eingeführt werden, um dadurch das Gen in Wirtszellen zu exprimieren. Es ist auch möglich, dass das Zielgen mit einem zusätzlichen Gen ligiert wird, das ein anderes Polypeptid codiert und auf diese Weise als ein Fusionsprotein exprimiert wird, um die Reinigung zu erleichtern oder die Expressionsausbeute zu erhöhen. Das Zielprotein kann außerdem durch Ausführung einer geeigneten Behandlung im Reinigungsverfahren entfernt werden.
Man ist allgemein der Ansicht, dass ein eukaryontisches Gen, wie im Falle von jenem für menschliches Interferon, Polymorphismus zeigt. Infolge dieses Polymorphismus sind daher in manchen Fällen eine oder mehrere Aminosäuren ersetzt oder jede Aminosäure bleibt in anderen Fällen ungeachtet der Veränderungen in der Basensequenz unverändert.
Folglich wird manchmal beobachtet, dass ein Polypeptid, welches die Deletion, Addition oder den Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NR: 6 oder SEQ ID NR: 7 im Sequenzprotokoll oder einem Teil davon dargestellt wird, die Bindungsaktivität der IgG-Fc-Region aufweist. Zum Beispiel ist allgemein bekannt, dass wenn die Basensequenz, welche im menschlichen Interleukin 2 (IL-2)-Gen einem Cystein entspricht, in eine andere Basensequenz umgewandelt wird die Serin entspricht, das so erhaltene Polypeptid seine IL-2-Aktivität dennoch beibehält (Wang et al., Science, 224:1431, 1984).
Wenn Polypeptide in eukaryontischen Zellen exprimiert werden, findet in vielen Fällen Glycosylierung statt. Die Glycosylierung kann durch Umwandlung einer oder mehrerer Aminosäuren reguliert werden. In einem solchen Fall hat das erhaltene Polypeptid manchmal die IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität. Wenn das FcγBP-Gen der vorliegenden Erfindung künstlich modifiziert wird und die so erhaltenen Polypeptide die IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität aufweisen, sind daher alle diese Polypeptide codierenden Gene im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die vorliegende Erfindung schließt ferner Gene ein, welche Polypeptide codieren, die IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität aufweisen und mit den im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 6 oder SEQ ID NR: 7 dargestellten Genen oder einem Teil davon hybridisierbar sind. Die Hybridisierung kann unter den herkömmlich in Sonden-Hybridisierung angewandten Bedingungen durchgeführt werden (Bezug nehmend auf zum Beispiel an Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Wie vorstehend beschrieben ist es klar, dass die vorliegende Erfindung nicht nur Basensequenzen einschließt, die Aminosäuresequenzen codieren, die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 6 und SEQ ID NR: 7 dargestellt sind, sondern auch verschiedene modifizierte DNAs, solange sie im Stande sind, Proteine zu exprimieren, die spezifisch an die Fc-Region von Immunglobulin (IgG) binden.
Außerdem fallen DNA-Fragmente, welche die vorstehend erwähnten Funktionen aufweisen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung schließt eine Replikationsursprung, einen selektiven Marker, einen Promotor, eine RNA-Spleißstelle, ein Polyadenylierungssignal, usw. ein.
Beispiele der prokaryontischen Wirtszellen, die in dem Expressionssystem der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, schließen Escherichia coli, Bacillus subtilis, usw. ein. Beispiele von eukaryontischen Wirtszellen, die hierin verwendbar sind schließen Hefen und Schleimpilze ein. Insektenzellen wie zum Beispiel Sf9, können auch als die Wirtszellen verwendet werden. Ferner schließen Beispiel von Wirtszellen, welche aus tierischen Zellen stammen COS-, CHO-, C127- und 3T3-Zellen ein.
Die Wirtszellen werden daher durch das Gen transformiert, welches das Ziel-FcγBP codiert und die daraus resultierende Transformante wird inkubiert. Das auf diese Weise produzierte Protein, das IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität aufweist, kann dann intrazellulär oder extrazellulär aufgetrennt und gereinigt werden.
Die Verfahren für die Auftrennung und Reinigung des Proteins, welches IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität aufweist, nämlich das Zielprotein der vorliegenden Erfindung, sind nicht auf jene beschränkt, die nachstehend in den Beispielen angewandt werden, sondern können beliebig aus den herkömmlich in der Auftrennung und Reinigung von Proteinen angewandten Verfahren ausgewählt werden. Zum Beispiel verschiedene chromatographische Verfahren, Ultrafiltration, Aussalzen, Dialyse usw. können daher entsprechend ausgewählt und kombiniert werden.
Es wird dann untersucht, ob das auf diese Weise erhaltene rekombinante Protein die Aktivität zur Bindung an menschliches IgG, ähnlich zu dem nativen FcγBP aufweist oder nicht. Als Ergebnis wird bewiesen, dass dieses rekombinante Protein spezifisch an menschliches IgGFc bindet.
Wie vorstehend beschrieben weist die Volllängen-cDNA von FcγBP der vorliegenden Erfindung die in 8 gezeigte Struktur und die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR: 7 dargestellte Basensequenz und Aminosäuresequenz auf. Ferner wurde in der folgenden Weise nochmals bestätigt, dass eine Reihe von in der vorliegenden Erfindung eingesetzten cDNAs, aus einer einzelnen mRNA stammte.
Das heißt, cDNA-Fragmente in einer sich wiederholenden Struktur, unterschiedlich von pNV11SR, einschließlich der in der Expression eingesetzten 5'-Ende-cDNA, werden exprimiert und mit den monoclonalen Antikörpern K9 und K17 umgesetzt, welche FcγBP erkennen. Als Ergebnis wird bestätigt, dass diese cDNA-Produkte durch einen oder beide von K9 und K17 erkannt werden.
Ferner wird die Gewebsspezifität der Expression der mRNA von FcγBP untersucht. Auf diese Weise wird herausgefunden, dass dieses Protein in der menschlichen Plazenta exprimiert wird. Folglich ist es möglich unter Verwendung des Gens der vorliegenden Erfindung, das FcγBP codiert oder eines Teils davon als Sonde, durch Northem-Blot oder in situ Hybridisierung ein Gewebe zu identifizieren, welches die FcγBP-mRNA synthetisiert.
Darüber hinaus kann das Vorkommen des Polymorphismus auf dem Chromogen von FcγBP durch Verwendung von Restriktionsenzymen bewiesen werden.
Die folgenden Beispiele werden angeführt, um einen Verfahren zum Erhalt des FcγBP-codierenden Gens der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten Vektor, der dieses Gen enthält, eine Transformante, die diesen Vektor enthält, das Zielprotein, welches durch Inkubieren dieser Transformante erhalten wird und ein Verfahren zur Herstellung eines jeden davon, zu erläutern. Es ist jedoch selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht derart beschränkt ist.
Beispiele
Beispiel 1: Clonierung von partieller cDNA, welche FcγBP codiert unter Verwendung von monoclonalem Antikörper (A: Konstruktion einer cDNA-Bank)
(1) Aufbereitung von menschlichen Kolonschleimhaut-Epithelzellen
Ein menschliches Kolongewebestück wurde mit RPMI-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthält, gründlich gewaschen und mechanisch von der muskulären Schleimhaut heruntergelöst, um dadurch die Epithelzellen von der Lamina propria mucosae abzutrennen. Als Nächstes wurde es am Stab fixiert und mit einem Rührer in 10% fötales Rinderserum/5 mM EDTA/PBS (-) für 90 Minuten auf Eis energisch gerührt, um dadurch die Epithelzellen abzutrennen. Die die Epithelzellen enthaltende Lösung wurde dann für 10 Minuten bei 1.500 UpM zentrifugiert, um dadurch einen Zellniederschlag zu ergeben.
(2) Reinigung von mRNA
Alle RNAs wurden von den Schleimhaut-Epithelzellen durch ein modifiziertes AGPC-Verfahren extrahiert (P. Chomczynski et al., Analytical Biochem., 162:156-159, 1987). Und zwar wurden zu 1 ml Zellpellets 9 ml einer Denaturierungslösung hinzugefügt [4 M Guanidin-Thiocyanat, 25 mM Natrium-Citrat (pH-Wert 7), 0,5% Sarkosyl, 0,1 M 2-Mercaptoethanol]. Nach dem Lysieren der Zellen wurden hierzu nacheinander 1 ml 2 M Natriumacetat (pH-Wert 4), 10 ml einer gesättigten wässrigen Phenol-Lösung und 2 ml Chlorophorm/Isoamylalkohol (49:1) hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 10 Sekunden gerührt, für 15 Minuten eisgekühlt und dann bei 10.000 × g für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde aufgenommen. Zu 8 ml dieses Überstands wurden 0,8 ml Natriumacetat, 8 ml Wasser-gesättigtes Phenol und 1,6 ml Chloroform/Isoamylalkohol in ähnlicher Weise hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann für 10 Sekunden durchgemischt, für 15 Minuten eisgekühlt und bei 10.000 × g für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde aufgenommen. Zu 7 ml dieses Überstands wurde die gleiche Menge an Chlorophorm/Isoamylalkohol hinzugefügt und das erhalte Gemisch wurde gerührt und zentrifugiert, um dadurch den Überstand zu ergeben. Zum erhaltenen Überstand wurde die gleiche Menge an Isopropanol hinzugefügt und das Gemisch wurde bei –20°C für 30 Minuten gekühlt und dann bei 10.000 × g für 15 Minuten zentrifugiert, um dadurch den Niederschlag aller RNAs zu gewinnen.
Zu einer Lösung von 1 mg aller RNAs wurde ein Elutionspuffer [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 % SDS] hinzugefügt, um so das Gesamtvolumen auf 1 ml anzugleichen. Dann wurde 1 ml OligoTex-dT30 <Super> (hergestellt von Takara Shuzo) hinzugefügt und das Gemisch wurde für 5 Minuten auf 65°C erhitzt und auf Eis für 3 Minuten abgeschreckt. Nach Hinzufügen von 0,2 ml 5 M NaCl und Aufrechterhalten bei 37°C für 10 Minuten, wurde das Gemisch für 3 Minuten bei 15.000 UpM zentrifugiert und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Die Pellets wurden in 2,5 ml Waschpuffer suspendiert [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,1% SDS] und bei 15.000 UpM für 3 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Die Pellets wurden in 1 ml sterilisiertem Wasser suspendiert, für 5 Minuten auf 65°C erhitzt und dann für 3 Minuten auf Eis abgeschreckt. Dann wurden sie für 3 Minuten bei 15.000 UpM zentrifugiert und der Überstand wurde aufgenommen. Zum Überstand wurden 50 μl auf 5 M NaCl und 2,5 ml Ethanol hinzugefügt und das Gemisch wurde bei –20°C für 30 Minuten gekühlt und zentrifugiert (3.000 UpM, 4°C). Der Niederschlag der polyadenylierten RNA wurde dann gewonnen.
(3) Synthese von DNA
Von der mRNA, wurde cDNA durch ein modifiziertes Verfahren von Gubler und Hoffman [U. Gubler und B.J. Hoffman (1983), Gene, 25:263] unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Kits, hergestellt von Amersham oder InVitrogen, synthetisiert. Und zwar wurden 5 μg der polyadenylierten RNA, hergestellt von den Colonschleimhaut-Epithelzellen bei 42°C für 90 Minuten in 50 μl eines Puffers (hergestellt von Amersham) inkubiert, welcher 50 U menschlichen Plazenta-Ribonucleaseinhibitor, 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,5 mM dTTP, 100 U AMV-Reverse-Transkriptase und Natriumpyrophosphat zusammen mit 750 ng zufälligen Hexanucleotiden oder 4 μg Oligo(dT)-Primer enthält. 50 μl dieses Reaktionsgemisches wurden in einem Puffer, der 4.0 U Escherichia coli Ribonuclease H und 115 U Escherichia coli DNA-Polymerase I enthielt nacheinander bei 12°C für 60 Minuten und bei 22°C für 60 Minuten erfolgreich umgesetzt (hergestellt von Amersham) und dann bei 70°C für 10 Minuten inkubiert. Nach dem Zurückstellen auf Eis wurden dazu 10 U T4 DNA-Polymerase hinzugefügt und bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Als Nächstes wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 10 μl 0,25 M EDTA (pH-Wert 8) beendet. Zu 250 μl des Reaktionsgemisches wurde die gleiche Menge an 7,5 M Ammoniumacetat und viermal so viel Ethanol hinzugefügt. Nach dem Rühren wurde das Gemisch für 30 Minuten auf –20°C abgekühlt und zentrifugiert, um dadurch cDNA zu sammeln. Die cDNA wurde in 10 μl sterilisiertem Wasser aufgelöst und 1 μl dieser Lösung wurde auf einem 0,8% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um die Synthese zu bestätigen und die Konzentration zu bestimmen.
(4) Ligation des Adaptors
Zu der vorstehend in (3) synthetisierten cDNA wurde in Mol zehnmal so viel von einem Adaptor (EcoRI-NotI-BamHI-Adaptor, hergestellt von Takara Shuzo) hinzugefügt. Dann wurde eine Ligationslösung A (Ligations-Kit, hergestellt von Takara Shuzo), in einer achtmal höheren Menge als das Gesamtgemisch und eine Ligationslösung B (Ligations-Kit, hergestellt von Takara Shuzo), in der gleichen Menge wie das Gesamtgemisch, hinzugefügt. Nach gründlichem Rühren wurde das daraus resultierende Gemisch bei 16°C für 30 Minuten inkubiert, um dadurch den Adaptor an die cDNA zu ligieren.
Dieses Reaktionsgemisch wurde auf einem 1 % Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt in einem TAE-Puffersystem (einer Elektrophorese unterzogen (Sea Plaque Agarose, hergestellt von Takara Shuzo) und auf diese Weise wurde eine Gelenthaltende cDNA-Fraktion von 0,5 kbp oder darüber gewonnen. Durch dieses Verfahren wurde gleichzeitig der nicht and die cDNA ligierte Adaptor entfernt. Dann wurde dazu TE-Puffer in der zweifachen Menge als das Nassgewicht des vorstehend gewonnenen Gels hinzugefügt und das Gemisch wurde für 10 Minuten auf 65°C gehalten. Dem auf diese Weise aufgelösten Agarosegel, wurde dann Tris-gesättigtes Phenol, in der gleichen Menge wie das Gesamtgemisch, hinzugefügt. Dann wurde das resultierende Gemisch gründlich gerührt, eisgekühlt und zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde dann aufgenommen und nochmals mit der gleichen Menge an Tris-gesättigtem Phenol behandelt. Nach der Zentrifugation wurde die wässrige Phase aufgenommen und es wurde dazu die gleiche Menge an Chloroform hinzugefügt. Das Gemisch wurde gründlich gerührt und zentrifugiert. Als Nächstes wurde die wässrige Phase aufgenommen und es wurden dazu in einer 1/10-fachen Menge davon 3 M Natriumacetat, 20 μg Glykogen (hergestellt von Boehringer-Mannheim) und in einer 2,5-fachen Menge davon, Ethanol hinzugefügt. Nach Abkühlen bei –20°C für 30 Minuten wurde das Gemisch bei 15.000 UpM für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um dadurch einen Niederschlag der cDNA zu ergeben.
(5) Konstruktion der λgt11-Bank
Die vorstehend in (4) erhaltene cDNA, zu welcher der Adaptor ligiert worden war, wurde in 96 μl einer Lösung aufgelöst, die 500 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 10 mM ATP umfasst. Nach Hinzufügen von 40 U Polynucleotidkinase, wurde das Gemisch bei 37°C für 60 Minuten inkubiert, um dadurch das 5'-Ende des Adaptors zu phosphorylieren. Nach Abschluss der Reaktion wurden dazu nacheinander 200 μl TE-Puffer und 300 μl mit Tris gesättigtem Phenol hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde gerührt und zentrifugiert (15.000 UpM, Raumtemperatur, 2 Minuten) und der Überstand wurde aufgenommen. Auf ähnliche Weise wurde durch aufeinander folgende Verwendung einer mit Tris gesättigten Phenol/Chloroform (1:1)-Lösung und eine Chloroform-Lösung, die 2% Isoamylalkohol enthält, Zentrifugationen durchgeführt, um dadurch schlussendlich 250 μl des Überstands zu ergeben. Zu diesem Überstand wurden 250 μl einer 4 M Ammoniumacetatlösung und 1.250 μl Ethanol hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde für 30 Minuten auf –20°C abgekühlt und dann zentrifugiert (15.000 UpM, 4°C, 10 Minuten), um dadurch den Niederschlag zu erhalten. Zu dem cDNA-Niederschlag wurde 1 μg EcoRI-gespaltener, dephosphorylierter λgt11-Arm (#234211, hergestellt von Stratagene) hinzugefügt und in 5 μl einer Lösung aufgelöst, die 100 mM (die Endkonzentration) Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 5 mM MgCl₂ und 300 mM NaCl enthält. Dann wurden 5 μl der Ligationslösung B (DNA-Ligationskit, hergestellt von Takara Shuzo) hinzugefügt und das Gemisch gründlich durchgemischt und dann bei 26°C für 10 Minuten umgesetzt. Um die cDNA in den λ-Phagen zu verpacken wurden 4 μl des Ligationsgemisches, welches die cDNA enthält, zu 10 μl Freeze/Thaw-Extrakt (Gigapack II gold, hergestellt von Stratagene) hinzugefügt. Gleich danach wurde dazu Sonic-Extrakt (Gigapack II gold) hinzugefügt und das daraus resultierende Gemisch wurde langsam gerührt. Nach Inkubation bei 22°C für 2 Stunden wurden 500 μl einer Lösung zur Verdünnung des Phagen hinzugefügt [5 g NaCl, 2g MgSO₄·7H₂O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 5 ml 2% Gelatin pro Liter] und 10 μl Chloroform hinzugefügt und auf diese Weise war die in vitro Verpackungsreaktion abgeschlossen. Diese Phagenlösung wurde bei 4°C gelagert und in der Durchmusterung eingesetzt.
Beispiel 2: Clonierung partieller FcγBP codierender cDNA unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers (B: Durchmusterung der cDNA-Bank unter Verwendung des Antikörpers)
(1) Durchmusterung
1 × 10⁴ Pfu (200 μl) der in den λ-Phagen verpackten cDNA-Bank von den Kolonschleimhaut-Epithelzellen, welche im vorstehenden Beispiel 1 erzeugt worden ist, wurde mit 200 μl eines Escherichia coli Stamms Y1090γ^-, der über Nacht inkubiert worden ist, gemischt und dann bei 37°C für 15 Minuten inkubiert. 0,8% Top-Agarosegel wurden gesondert mit LB-Medium gemischt, darin aufgelöst und auf 55°C gehalten. Dann wurden 5 ml dieses Materials zu der Vorinkubation des Phagen mit Escherichia coli hinzugefügt und homogen gemischt. Das erhaltene Gemisch wurde einheitlich auf eine 1,5% LB-Agaroseplatte (10 × 14 cm) aufgetragen und in einem Inkubator bei 42°C für 3,5 Stunden gelagert. Nach der Bestätigung, dass sich kleine Plaques gebildet hatten, wurde ein mit Nylon verstärkter Nitrozellulosefilter (#BAS85, hergestellt von Schleicher & Schuell), welcher mit IPTG imprägniert und luftgetrocknet worden war, wurde auf die Platte gelegt, gefolgt von Lagerung bei 37°C für 3,5 Stunden. Dann wurde der Filter von der Platte abgezogen und in einer Waschflüssigkeit [0,05% Tween-20, 25 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 150 mM NaCl, 3 mM KCl] bei Raumtemperatur für 30 Minuten geschüttelt. Anschließend wurde er zur Blockierung in PBS (-), der 5% Magermilch enthielt, bei Raumtemperatur für 30 Minuten geschüttelt und dann mit der Waschflüssigkeit zweimal für 20 Minuten gewaschen. Dann wurde die Nitrozellulosemembran in 5 ml eines Hybridom-Kulturüberstands, der den Maus-monoclonalen Antikörper K9 oder K17 enthielt, welcher in Colonschleimhaut-Epithelzellen gegen FcγBP erzeugt wurde, eingetaucht [Kobayashi et al., J. Immunology (1991), 146:68-74; Kobayashi et al., J. Immunology (1989), 143:2567-2574]. Nach dem Schütteln bei Raumtemperatur für 2 Stunden, wurde die Membran mit der Waschflüssigkeit zweimal für 20 Minuten gewaschen. Als Nächstes wurde sie in mit Meerrettich-Peroxydase markiertem Ziege-anti-Maus IgG (H+L)-Antiserum (hergestellt von Zymed), welches 1.000-fach mit der Waschflüssigkeit verdünnt worden war, bei Raumtemperatur für 1 Stunde geschüttelt und mit der Waschflüssigkeit zweimal für 20 Minuten gewaschen. Nach dem Waschen mit einer TBS-Lösung ohne Tween-20 für 10 Minuten, wurde sie in einem Gemisch aus einer 50 ml Diaminobenzidin-Lösung [1 mg/ml 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,2)], 50 ml einer 0,02% Lösung von H₂O₂ und 50 μl einer 8% Lösung von NiCl₂ getaucht, um dadurch die positiven Plaques nachzuweisen.
(2) Extraktion von λDNA
Beim Screening unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers K9 wurde unter etwa 1.000.000 Plaques ein Clon erhalten, der ein cDNA-Insert von etwa 600 bp enthält. Dieser Plaque wurde mit einem Zahnstocher entnommen und der λ-Phage wurde in 200 μl eines Mediums (LB-Medium, das 20 mM MgSO₄, 0,2% Maltose und 5 μl der Suspension einer Übernacht-Kultur des Escherichia coli Stammes Y1090γ^- enthält), bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. 2 μl (1 × 10⁷ ptu/μl) des Kulturmediums, welches den Phagen enthält, wurde zu 10 ml LB-Medium hinzugefügt (das 20 mM MgSO₄ und 0,25 ml der Suspension einer Übernacht-Kultur des Escherichia coli Y1090γ^- Stammes enthält), welcher auf diese Weise damit infiziert wurde. Dann wurde der λ Phage durch Inkubation bei 37°C für 5 Stunden unter Schütteln vermehrt.
Nach Inkubation für 5 bis 6 Stunden und Bestätigung des Eintritts der Bakteriolyse, wurden 50 μl Chloroform und 2 ml 5 M NaCl hinzugefügt, gefolgt von Schütteln bei 37°C für 10 Minuten. Dann wurde das Gemisch bei 3.500 UpM für 15 Minuten zentrifugiert. Zu dem auf diese Weise erhaltenen Überstand wurde Polyethylenglycol 6000 in einer solchen Menge hinzugefügt, um so eine Konzentration von 10% zu ergeben. Das resultierende Gemisch wurde für 30 bis 60 Minuten auf Eis zu stehen gelassen und dann wurde es bei 4.000 UpM für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um den Phagen dadurch auszufällen. Der Niederschlag wurde in 1 ml Puffer A suspendiert [0,5% NP-40, 30 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 5 mM MgCl₂, 125 mM KCl, 3,6 mM CaCl₂, 0,5 mM EDTA, 0,25% Natrium-Desoxycholat, 60 mM Mercaptoethanol] und zusammen mit 100 μg/ml RNase A und 20 μg/ml DNase I bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Dann wurde dazu Chloroform in der gleichen Menge wie Puffer A hinzugefügt und das Gemisch wurde verrührt und bei 15.000 UpM für 2 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, gefolgt von der Wiedergewinnung des Überstands. Dann wurde wieder die gleiche Menge Chloroform hinzugefügt und das Gemisch wurde in der gleichen Weise zentrifugiert, gefolgt von der Wiedergewinnung des Überstands. Zum Überstand wurden 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8), 20 mM EDTA, 0,5% SDS und 100 μl/ml Proteinase K und das resultierende Gemisch wurde bei 55°C für 60 Minuten inkubiert. Um die λ-DNA zu reinigen wurden Behandlungen mit Phenol, Phenol/Chloroform und Chloroform, jede in der herkömmlichen Weise, durchgeführt, um die DNAse, Protease, usw. zu inaktivieren. Dann wurden dazu 1/20-fach so viel 5 M NaCl und einmal so viel Isopropanol hinzugefügt. Auf diese Weise wurde ein Niederschlag der λ-DNA erhalten, welche das cDNA-Fragment darin inseriert hatte.
(3) Konstruktion von Sonden-DNA
Von der λ-DNA, welche das vorstehend (2) gereinigte Fragment aufweist wurde das DNA-Insert unter Verwendung der BamHI-Restriktionsenzymstelle herausgeschnitten und als eine Sonde zum Durchmustern der zweiten cDNA-Bank (diese Sonde wurde Sonde Q genannt) verwendet.
Durch das gleiche Verfahren wurden DNA-Sonden von 700 bp und 600 bγ mit BamHI von dem Clon herausgeschnitten, der das längste Insert (etwa 1.300 bp) unter den 7 λ-Clonen aufwies, die durch Verwendung des monoclonalen Antikörpers K17 erhalten wurden. In diesen Sonden wurde das DNA-Fragment von 700 bp, welches anscheinend die cDNA enthält, die das Epitop des Antikörpers K17 codiert, als Sonde A bezeichnet, während ein anderes Fragment von 600 bγ als Sonde B bezeichnet wurde. Diese Sonden wurden in der Durchmusterung der zweiten cDNA-Bank eingesetzt.
(4) Northern-Blotting
Es wurde durch Northern-Blotting bestätigt, dass die Sonden A und Q, die beim Screening unter Verwendung der Antikörper erhalten wurden, mit der gleichen mRNA hybridisierbar waren.
15 μg aller aus Kolonschleimhaut-Epithelzellen durch das AGPC-Verfahren extrahierten RNAs wurden in 4,5 μl sterilisiertem Wasser aufgelöst, dann mit 2 μl 5 × MOPS-Puffer, 3,5 μl Formaldehyd und 10 μl Formamid vermischt und durch Wärme bei 60°C für 15 Minuten denaturiert. Als Nächstes wurde das denaturierte Produkt auf einem 1 % Agarosegel in der Anwesenheit von Formaldehyd einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Beendigung der Elektrophorese wurden die RNAs durch das Kapillarverfahren über Nacht auf eine Nylonmembran (Biodyne A, hergestellt von Pall Corp.) transferiert. Nach dem Fixieren der RNAs auf der Nylonmembran durch UV-Crosslinking, wurde die Vorhybridisierung in 10 ml einer Hybridisierungslösung (5 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung, 50% Formamid, 0,5% SDS, 100 μg/ml thermisch denaturierte Lachssperma-DNA) bei 42°C für 8 Stunden durchgeführt.
Anschließend wurden die durch Antikörperscreening erhaltenen Sonden A und Q jeweils unter Verwendung von α[³²P]dCTP durch den Megaprime-Labeling-Kit (hergestellt von Amersham) mit Radioisotopen markiert. 1 × 10⁸ dpm von jeder Sonde wurden zusammen mit 5 ml der Hybridisierungslösung zu der Nylonmembran hinzugefügt, die vorhybridisiert worden war. Nach dem Verschweißen wurde die Hybridisierung bei 42°C über Nacht durchgeführt. Die Nylonmembran wurde in einer 0,2 × SSC und 0,2% SDS enthaltenden Lösung bei 65°C dreimal für 40 Minuten gewaschen. Dann wurde die Nylonmembran getrocknet und einem Röntgenfilm über Nacht ausgesetzt.
Auf diese Weise wurde eine Bande von etwa 17 kbp durch Verwendung von jeder der Proben A und Q nachgewiesen, was bewiesen hat, dass diese 2 Sonden vom Standpunkt des Molekulargewichts mit der gleichen mRNA hybridisierbar waren.
Beispiel 3: Zweite Clonierung von FcγBP codierender cDNA
(A: Konstruktion der cDNA-Bank)
(1) Aufbereitung menschlicher Kolonschleimhaut-Epithelzellen
Ein Gewebestück von menschlichem Kolon wurde gründlich mit RPMI-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthält gewaschen und mechanisch von der muskulären Schleimhaut abgezogen, um dadurch die Epithelzellen von der Lamina-Propria-Mucosae abzutrennen. Als Nächstes wurde es am Stab fixiert und mit einem Rühren energisch in 10% fötales Rinderserum/5 mM EDTA/PBS (1) für 90 Minuten auf Eis gerührt, um dadurch die Epithelzellen abzutrennen. Dann wurde die die Epithelzellen enthaltende Lösung bei 1.500 UpM für 10 Minuten zentrifugiert, um dadurch einen Zellniederschlag zu erhalten.
(2) Aufreinigung der mRNA
Alle RNAs werden von den Schleimhaut-Epithelzellen durch ein modifiziertes AGPC-Verfahren [P.Chomczynski et al., Analytical Biochem., (1987) 162:156-159] extrahiert. Und zwar wurden zu 1 ml der Zellpellets 9 ml einer Denaturierungslösung [4 M Guanidin-Thiocyanat, 25 mM Natrium-Citrat (pH-Wert 7), 0,5% Sarkosyl, 0,1 M 2-Mercaptoethanol] hinzugefügt. Nach dem Lysieren der Zellen wurden dazu 1 ml 2 M Natriumacetat (pH-Wert 4), 10 ml einer gesättigten wässrigen Phenol-Lösung und 2 ml von Chloroform/Isoamylalkohol (49:1) nacheinander hinzugefügt. Dann wurde das Gemisch für 10 Sekunden gerührt, für 15 Minuten eisgekühlt und dann bei 10.000 × g für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde dann aufgenommen. Zu 8 ml dieses Überstands wurden in ähnlicher Weise 0,8 ml Natriumacetat, 8 ml Wasser-gesättigtes Phenol und 1,6 ml Chloroform/Isoamylalkohol hinzugefügt. Dann wurde das Gemisch für 10 Sekunden gerührt, für 15 Minuten eisgekühlt und dann bei 10.000 × g für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde aufgenommen. Zu 7 ml dieses Überstands wurde die gleiche Menge an Chloroform/Isoamylalkohol hinzugefügt und das erhaltene Gemisch wurde gerührt und zentrifugiert, um dadurch den Überstand zu erhalten. Zu dem erhaltenen Überstand wurde die gleiche Menge Isopropanol hinzugefügt und das Gemisch wurde für 30 Minuten auf –20°C gekühlt und dann bei 10.000 × g für 15 Minuten zentrifugiert, um dadurch den Niederschlag aller RNAs zu gewinnen.
Zu einer Lösung von 1 mg aller RNAs wurde ein Elutionspuffer [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA, 0,1% SDS] hinzugefügt, um das Gesamtvolumen so auf 1 ml einzustellen. Dann wurde dazu 1 ml OligoTex-dT30 <Super> (hergestellt von Takara Shuzo) hinzugefügt und das Gemisch wurde bei 65°C für 5 Minuten erhitzt und für 3 Minuten auf Eis abgeschreckt. Nach dem Hinzufügen von 0,2 ml an 5 M NaCl und 10 Minuten Stehenlassen bei 37°C wurde das Gemisch für 3 Minuten bei 15.000 UpM zentrifugiert und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Die Pellets wurden in 2,5 ml eines Waschpuffers [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA, 0,5 mM NaCl, 0,1% SDS] suspendiert und für 3 Minuten bei 15.000 UpM zentrifugiert und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Die Pellets wurden in 1 ml sterilisiertem Wasser suspendiert, bei 65°C für 5 Minuten erhitzt und dann für 3 Minuten auf Eis abgeschreckt. Dann wurde es für 3 Minuten bei 15.000 UpM zentrifugiert und der Überstand wurde aufgenommen. Zum Überstand wurden 50 μl 5 M NaCl und 2,5 ml Ethanol hinzugefügt und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei –20°C gekühlt und zentrifugiert (3.000 UpM, 4°C). Dann wurde der polyadenylierte RNA-Niederschlag gewonnen.
(3) Synthese von cDNA
Von der mRNA wurde durch ein verändertes Verfahren von Gubler und Hoffman unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Kits, hergestellt von Amersham oder InVitrogen, cDNA synthetisiert. Und zwar wurden 5 μg der polyadenylierten RNA, hergestellt von Kolonschleimhaut-Epithelzellen bei 42°C für 90 Minuten in 50 μl eines Puffers (hergestellt von Amersham) inkubiert, der 50 U von menschlichem Placenta-Ribonuclease-Inhibitor, 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,5 mM dTTP, 100 U AMV-reverse-Transkriptase und Natriumpyrophosphat zusammen mit 750 ng zufälligen Hexanucleotide oder 4 μg oligo(dT)-Primer enthält. 50 μl dieses Reaktionsgemisches wurden nacheinander bei 12°C für 60 Minuten und bei 22°C für 60 Minuten und dann bei 70°C für 10 Minuten in einem Puffer (hergestellt von Amersham) umgesetzt, der 4.0 U Escherichia coli Ribonuclease H und 115 U Escherichia coli DNA-Polymerase I enthielt. Nach dem Zurückstellen auf Eis, wurden dazu 10 U T4 DNA-Polymerase hinzugefügt und bei 37°C für 10 Minuten umgesetzt. Als Nächstes wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 10 μl 0,25 M EDTA (pH-Wert 8) beendet. Zu 250 μl des Reaktionsgemisches wurde die gleiche Menge an 7,5 M Ammoniumacetat und viermal so viel Ethanol hinzugefügt. Nach dem Rühren wurde das Gemisch bei –20°C für 30 Minuten gekühlt und zentrifugiert, um dadurch die cDNA zu ernten. Die cDNA wurde in 10 μl sterilisiertem Wasser aufgelöst und 1 μl dieser Lösung wurde einer Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel unterzogen, um die Synthese zu bestätigen und die Konzentration zu bestimmen.
(4) Ligation des Adaptors
Zu der vorstehend (3) synthetisierten cDNA wurde an Mol zehnmal so viel Adaptor (EcoRI-NotI-BamH-Adaptor, hergestellt von Takara Shuzo) hinzugefügt. Dann wurde dazu eine Ligationslösung A (Ligationskit, hergestellt von Takara Shuzo) in einer achtfachen Menge des Gesamtgemischs und eine Ligationslösung B (Ligationskit, hergestellt von Takara Shuzo) in der gleichen Menge wie das Gesamtgemisch hinzugefügt. Nach gründlichem Rühren wurde das Gemisch bei 16°C für 30 Minuten inkubiert, um dadurch den Adaptor an die cDNA zu ligieren.
Dieses Reaktionsgemisch wurde auf einem 0,8% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (Sea Plaque Agarose Gel, hergestellt von Takara Shuzo) in einem TAE-Puffersystem einer Elektrophorese unterzogen und so wurde eine Gel gewonnen, das eine cDNA-Fraktion von etwa 4 kbp oder darüber enthielt. Durch dieses Verfahren wurde gleichzeitig der nicht an die cDNA ligierte Adaptor eliminiert. Dann wurde TE-Puffer in der doppelten Menge wie das Nassgewicht des vorstehend gewonnenen Gels hinzugefügt und das Gemisch wurde für 10 Minuten auf 65°C gehalten. Nachdem das Agarosegel auf diese Weise aufgelöst wurde, wurde in der gleichen Menge wie das Gesamtgemisch, Tris-gesättigtes Phenol hinzugefügt. Das resultierende Gemisch wurde gründlich gerührt, eisgekühlt und zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde aufgenommen und nochmals mit der gleichen Menge an Trisgesättigtem Phenol behandelt. Nach dem Zentrifugieren wurde die wässrige Phase aufgenommen und dazu wurde die gleiche Menge an Chloroform hinzugefügt. Das Gemisch wurde gründlich gerührt und zentrifugiert. Als Nächstes wurde die wässrige Phase aufgenommen und dazu 1/10-mal soviel 3 M Natriumacetat, 20 μg Glykogen (hergestellt von Boehringer-Mannheim) und 2,5 mal so viel Ethanol hinzugefügt. Nach dem Kühlen bei –20°C für 30 Minuten, wurde das Gemisch bei 15.000 UpM für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um dadurch einen Niederschlag der cDNA zu ergeben.
(5) Konstruktion der λgt11-Bank
Die vorstehend in (4) erhaltene cDNA, zu welcher der Adaptor ligiert worden war, wurde in 96 μl einer Lösung aufgelöst, die 500 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 10 mM ATP enthielt. Nach Hinzufügen von 40 U Polynucleotid-Kinase, wurde das Gemisch bei 37°C für 60 Minuten inkubiert, um dadurch das 5'-Ende des Adaptors zu phosphorylieren. Nach Abschluss der Reaktion wurden dazu nacheinander 200 μl TE-Puffer und 300 μl Tris-gesättigtes Phenol hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde gerührt und zentrifugiert (15.000 UpM, Raumtemperatur, 2 Minuten) und der Überstand wurde aufgenommen. Auf ähnliche Weise wurde die Zentrifugation durch aufeinander folgende Verwendung einer Tris-gesättigten Phenol/Chloroform (1:1)-Lösung und einer Chloroform-Lösung, die 2% Isoamylalkohol enthält durchgeführt, um dadurch schließlich 250 μl des Überstands zu ergeben. Zu diesem Überstand wurden 250 μl einer 4 M Ammoniumacetatlösung und 1.250 μl Ethanol hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde bei –20°C für 30 Minuten gekühlt und zentrifugiert (15.000 UpM, 4°C, 10 Minuten), um dadurch den Niederschlag zu gewinnen. Zu dem cDNA-Niederschlag wurde 1 μg EcoRI-gespaltener dephosphorylierter λgt10-Arm (#233211, hergestellt von Stratagene) hinzugefügt und in 5 μl einer Lösung aufgelöst, die 100 mM (Endkonzentration) Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 5 mM MgCl₂ und 300 mM NaCl enthält. Dann wurden 5 μl der Ligationslösung B (DNA-Ligationskit, hergestellt von Takara Shuzo) hinzugefügt und das Gemisch wurde gründlich gerührt und dann bei 26°C für 10 Minuten umgesetzt. Um die cDNA in den λ-Phagen zu verpacken, wurden 4 μl des die cDNA enthaltenden Ligationsgemisches zu 10 μl Freeze/Thaw-Extrakt (Gigapack II Gold, hergestellt von Stratagene) hinzugefügt. Sofort danach wurde dazu das Sonic-Extrakt (Gigapack II Gold) hinzugefügt und das resultierende Gemisch wurde langsam gerührt. Nach Inkubation bei 22°C für 2 Stunden wurden 500 μl einer Lösung zur Verdünnung des Phagen [5 g NaCl, 2 g MgSO₄·7H₂O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 5 ml 2% Gelatin pro Liter] und 10 μl Chloroform hinzugefügt und so wurde die in vitro Verpackungsreaktion abgeschlossen. Diese Phagenlösung wurde bei 4°C gelagert und für das Screening eingesetzt.
Beispiel 4: Clonierung der Gesamtlängen cDNA, die FcγBP codiert
(B: Screening der cDNA-Bank durch Verwendung einer DNA-Sonde)
(1) Blotting
200 μl eines Escherichia coli Stammes c600hf1, welcher über Nacht inkubiert worden war, wurde mit der Kolonschleimhaut-Epithelzell-cDNA (2 × 10⁴ pfu) in den λ-Phagen verpackt und dann bei 37°C für 15 Minuten gehalten. Nach Hinzufügen eines bei 55°C gehaltenen 0,8% Top-Agarose/LB-Mediums wurde das Gemisch sofort auf eine LB-Platte ausgestrichen (10 × 14 cm) und bei 37°C für 12 Stunden inkubiert. Sobald der Durchmesser eines Plaques 1 mm erreichte, wurde eine Nylonmembran (Biodyne A, Porengröße: 0,2 μm hergestellt von Pall Corp.) darauf gelegt, gefolgt von Kühlung bei 4°C für 10 Minuten. Dann wurde die Nylonmembran von der Platte abgezogen und mit der Blottinglösung I (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl), der Blottinglösung II [1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,4)] und der Blottinglösung III [0,5 M Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 1,5 M NaCl] jeweils 5 Minuten behandelt. Dann wurde die DNA unter Verwendung eines UV-Crosslinkinggeräts (UV Stratalinker 2400, hergestellt von Stratagene) bei 1.200 μJ auf der Nylonmembran fixiert.
(2) Hybridisierung
Zu einer Nylonmembran, auf der die λ-DNA fixiert war, wurden 10 ml einer Hybridisierungslösung hinzugefügt (5 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung, 50% Formamid, 0,5% SDS, 100 μg/ml durch Hitze denaturierte Lachssperma DNA). Als Nächstes wurde das Gemisch in einen Hybridisierungsbeutel eingeschweißt und bei 42°C für 8 Stunden einer Vorhybridisierung unterzogen. Anschließend wurde jede der durch die Antikörperscreening erhaltenen Sonden Q, A und B unter Verwendung von α[³²P]dCTP durch das Random-Priming-Verfahren mit einem Radioisotop markiert. 1 × 10⁸ dpm von jeder Sonde wurden zusammen mit 5 ml der Hybridisierungslösung zu der Nylonmembran hinzugefügt, welche der Vorhybridisierung unterzogen wurde. Nach dem Einschweißen wurde die Hybridisierung über Nacht bei 42°C durchgeführt. Sobald die Hybridisierung abgeschlossen war, wurde die Nylonmembran dreimal bei 65°C für 40 Minuten in einer Lösung gewaschen, die 0,2 × SSC und 0,2% SDS enthielt. Die Nylonmembran wurde dann getrocknet und über Nacht einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Bei dem vorstehend erwähnten Screening wurden 69 λ-Clone erhalten, welche mit einer oder mehreren der Sonden A, B und Q hybridisierbar waren. Von jedem dieser Clone wurde durch das vorstehend beschriebe Verfahren λ-DNA erzeugt, mit einem Restriktionsenzym EcoRI behandelt und einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Größe des DNA-Inserts zu bestätigen.
Beispiel 5: Schätzung der FcγBP-mRNA Größe
Durch Verwendung der in Beispiel 2 erhaltenen Sonde Q wurde die molekulare Größe der mRNA von FcγBP bewertet. Zum Vergleich wurden die mRNAs von bekannten Proteinen benutzt, d.h. Dystrophin-mRNA mit 14.0 kbp [M. Koenig et al., (1988), Cell 53:219-288] und Ryanodin-Receptor-mRNA mit 15,2 kbp [F. Zarzato et al., (1990), J. Biol. Chem., 265:2244-2256]. Als cDNA-Sonden für diese Vergleichs-mRNAs, wurden synthetische Sonden erzeugt, welche jeweils die im Literaturhinweis angezeigte Basensequenz aufwiesen und in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt, um dadurch die Sonden DYS bzw. RDR zu erhalten.
Die Dystrophin mRNA und Ryanodin-Rezeptor-mRNA stammten aus polyadenylierten RNA aus menschlichem Skelettmuskel (hergestellt von Clontech).
2 μg der aus Kolonschleimhaut-Epithelzellen erhaltenen polyadenylierten RNA, 1 μg der polyadenylierten RNA aus der menschlichen Skelettmuskulatur oder ein Gemisch davon wurde in der gleichen Weise, wie der in Beispiel 2 (4) beschrieben einer Elektrophorese unterzogen und so auf eine Nylonmembran transferiert. Diese Nylonmembran wurde dann unter Verwendung von Sonde Q einer Hybridisierung unterzogen, gefolgt vom Nachweis durch Autoradiographie.
Um die Hybridisierung der Vergleichs-RNAs auf der gleichen Membran durchzuführen, wurde diese Nylonmembran bei 70°C für 1 Stunde zusammen mit 20 ml einer Lösung inkubiert, die 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,5), 1,25 mM EDTA, 3 × SSC, 1 × Denhardt-Lösung, 1 % SDS und 50% Formamid enthält. Anschließend wurde sie zweimal bei Raumtemperatur für 10 Minuten durch Schütteln in einer Waschflüssigkeit gewaschen, die 0,2 × SSC und 0,1% SDS enthält. Dann wurde die Nylonmembran einer Autoradiographie unterzogen und auf diese Weise wurde bestätigt, dass die Bande verschwunden war (Dehybridisierung).
Als Nächstes wurde unter Verwendung der Sonde DYS in der vorstehend beschriebenen Weise die Hybridisierung durchgeführt, gefolgt vom Nachweis durch Autoradiographie. Diese Nylonmembran wurde durch das gleiche Verfahren wie das vorstehend beschriebene der Dehybridisierung unterzogen und es wurde bestätigt, dass die Bande verschwunden war. Schließlich wurde die Hybridisierung in der gleichen Weise mit der Sonde RDR durchgeführt, gefolgt vom Nachweis der Bande durch Autoradiographie.
Basierend auf den so erlangten Ergebnissen, wurden die Mobilitäten der Banden der Dystrophin mRNA und Ryanodin-Rezeptor-mRNA jeweils gegen die molekulare Größe aufgetragen, um dadurch eine Standardkurve zu ergeben. Auf diese Weise wurde die Größe der mRNA von FcγBP anhand ihrer Mobilität als etwa 17 kbp berechnet (1).
Beispiel 6: Identifizierung der Basensequenz der cDNA, die FcγBP codiert (1)
Um die Basensequenz des Bereichs zu identifizieren, der die Aminosäuresequenz des Proteins codiert, das die IgG-Fc-Teil-Bindeaktivität aufweist, wurden durch die folgenden Verfahren 5 notwendige Clone unter den im vorstehenden Beispiel 4 erhaltenen 69 λ-Clonen ausgewählt. Dann wurde die Basensequenz unter Verwendung eines DNA-Sequenziergeräts (Model 373A, hergestellt von Applied Biosystems) identifiziert.
(1) Clon X1
Unter den durch das Screening mittels Hybridisierung mit den Sonden A, B und Q erhaltenen cDNA-Clonen wurde eine erhalten, welche nicht mit den Sonden Q und B, sondern mit der Sonde A alleine hybridisierbar war. Dann wurde ein Fragment von etwa 700 bp gewonnen, welches mit EcoRI und SmaI am gegenüberliegenden Ende zur Sonde A im cDNA-Inserts dieses Clons herausgeschnitten und als Sonde X bezeichnet wurde. Als Nächstes wurde die cDNA-Bank durch das gleiche Verfahren wie dem von Beispiel 3 unter Verwendung dieser Sonde X gescreent. Auf diese Weise wurde ein Clon X1 erhalten, der mit den Sonden X, A und B hybridisierbar war. Das cDNA-Insert dieses Clons X1 wurde mit EcoRI gespalten und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch eine DNA von etwa 3.300 bp abzutrennen und zu gewinnen. Diese DNA wurde dann in die EcoRI-Stelle eines Plasmidvektors pBlueskript SK(+) inseriert. Anschließend wurde die Restriktionskarte erstellt und die Basensequenz wurde identifiziert.
(2) Clon Y1
Ein Fragment von etwa 800 bp, welches mit EcoRI und SacI an der gegenüberliegenden Seite des Bereichs herausgeschnitten wurde, der Sonde B in der cDNA des Clons X1 enthält, wurde gewonnen und als Sonde Y bezeichnet. Als Nächstes wurde die cDNA-Bank durch das gleiche Verfahren wie dem von Beispiel 3 unter Verwendung dieser Sonde Y gescreent. Von den auf diese Weise erhaltenen Clonen war Clon Y1 der, der die längste cDNA aufwies. Das cDNA-Insert dieses Clons Y1 wurde mit EcoRI gespalten und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch eine DNA von etwa 1.900 bp abzutrennen und zu gewinnen. Dann wurde diese DNA in die EcoRI-Stelle eines pBlueskript SK(+) Plasmidvektors inseriert. Anschließend wurde die Restriktionskarte erstellt und die die Basensequenz wurde identifiziert.
(3) Clon C72
Ein Fragment von etwa 150 bp, das mit SacI und SphI auf der gegenüberliegenden Seite der Region herausgeschnitten wurde, die die Sonde X in der cDNA des Clons Y1 enthält, wurde gewonnen und als Sonde Y150 bezeichnet. Als Nächstes wurde die cDNA-Bank (cDNA-Größe, die sich von 2 bis 4 kbp erstreckte) durch das gleiche Verfahren wie dem von Beispiel 3 unter Verwendung dieser Sonde Y150 gescreent, um dadurch 9 Clone zu ergeben. Von den cDNA-Inserts der auf diese Weise erhaltenen Clone wurde eine cDNA erhalten und als Clon C72 bezeichnet, welche die längste Ausdehnung auf der gegenüberliegenden Seite zum Y-Bereich von Y150 zeigte und Y150 enthielt. Das cDNA-Insert dieses Clons C72 wurde mit EcoRI gespalten und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch eine DNA von etwa 1.200 bp abzutrennen und zu gewinnen. Dann wurde diese DNA in die EcoRI-Stelle eines pBlueskript SK(+) Plasmidvektors inseriert. Anschließend wurde die Restriktionskarte erstellt und die Basensequenz wurde identifiziert.
(4) Clon NZ4
Ein Fragment von etwa 450 bp, welches mit EcoRI und SacI auf der gegenüberliegenden Seite der Region herausgeschnitten wurde, die die Sonde Y150 in der cDNA des Clons C72 enthält, wurde gewonnen und als Sonde Z bezeichnet. Durch Verwendung der inkubierten Zelllinie HT-29-18-N2, die von menschlichem Kolonkrebs abstammt, wurde durch das gleiche Verfahren, wie das in Beispiel 3 (2) bis (5) beschriebene, eine λgt10-cDNA-Bank konstruiert. Dann wurde diese Genbank durch das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 3, unter Verwendung der vorstehend erwähnten Sonde Z gescreent, um dadurch 4 Clone zu ergeben.
Von den auf diese Weise erhaltenen Clonen wurde einer ausgewählt und als Clon NZ4 bezeichnet, der den längsten mit C27 nicht überlappenden Teil aufwies. Das cDNA-Insert dieses Clons NZ4 wurde mit NotI gespalten und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch eine DNA von etwa 900 bp abzutrennen und zu gewinnen. Dann wurde diese DNA in die EcoRI-Stelle eines pBlueskript SK(+)-Plasmidvektors inseriert. Anschließend wurde die Restriktionskarte erstellt und die die Basensequenz wurde identifiziert.
(5) Clon V11
Die Basensequenz der Clone, die mit allen Sonden A, B und Q in dem Screening unter Verwendung dieser Sonden hybridisierbar waren, wurden analysiert, um dadurch einen Clon zu ergeben, welcher die gleiche Basensequenz wie der von der A-B-Region aufweist, der auf der terminalen Seite des Clons X1 liegt und der vorher sequenziert worden ist. Dieser Clon wurde als Clon V11 bezeichnet. Das cDNA-Insert dieses Clons V11 wurde mit EcoRI gespalten und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch eine DNA von etwa 3.700 bp abzutrennen und zu gewinnen. Dann wurde diese DNA in die EcoRI-Stelle eines pBluescript SK(+)-Plasmidvektors inseriert. Anschließend wurde die Restriktionskarte erstellt und die Basensequenz identifiziert.
Beispiel 7: Annahme bezüglich der Anwesenheit von Clon NZ4 in der Nachbarschaft des 5'-Endes der FcyBP-mRNA
Die in Beispiel 6 erhaltenen 5 Clone wurden in der Reihenfolge von NZ4-C72-Y1-X1-V11 in Richtung des 5'-Endes oder des 3'-Endes verlängert. Wenn die Basensequenz dieser Clone in Aminosäuren translatiert wurde, wurde angenommen, dass sie in Richtung des 5'-Endes verlängert wurden. Eine durch zufälliges Priming konstruierte Genbank wurde daher unter Verwendung der DNA von Clon-NZ4 gescreent, welche momentan am äußersten Ende des Sequenzverlaufs gelegen war. Als ein Ergebnis wurden 13 unabhängige Clone erhalten, aber keiner wurde 5'-stromaufwärts von NZ4 verlängert. Wenn die Basensequenz von NZ4 in Aminosäuren translatiert wurde, war das dem Methionin entsprechende ATG-Codon, welches ähnlich der Kozak-Regel scheinbar am äußersten 5'-Ende des Sequenzverlaufs im offenen Leserahmen gelegen war, was darauf hindeutet, dass dieses ATG das Startmethionin sein könnte. Das erste A in diesem ATG-Codon tauchte jedoch früh in dem Clon NZ4 auf (d.h. an der 9-Position lokalisiert) und in den vorausgehenden 9 Basen war im Leserahmen kein Stopp-Codon vorhanden. Es konnte daher nicht bestritten werden, dass die cDNA-Sequenz nicht nur im Transkriptionsprodukt, sondern auch auf dem Translationsniveau in Richtung auf das 5'(N)-Ende verlängert werden könnte. Es wurde daher der folgende Versuch durchgeführt, um die Stelle des Transkriptionsstarts zu untersuchen und die Translationsstartstelle durch das Primer-Extentionsverfahren vorauszusagen.
(1) Erzeugung aller RNAs und polyadenylierter RNA
Zwei Primer, d.h. Primer 1 (GCTGATAGTTCTGCAGGAAGGCTGT GAGGAATTCCTCTCTGCCAGTGTT-50 mer) und Primer 2 (GCTCCAGCCCAG AGTATCCACCAGCTCCATAGG-33 mer) wurden mit einem DNA-Synthesegerät (Modell 394, hergestellt von Applied Biosystems) synthetisiert und mit einer OPC-Säule (hergestellt von Applied Biosystems) gereinigt. 100 pmol von jedem Primer wurden mit γ[³²P]ATP unter Verwendung von T4 Polynucleotidkinase markiert und mit einer Microspin^TM S-200HR-Säule (hergestellt von Pharmacia) gereinigt. In jeder Reaktion wurden 0,5 pmol jedes Primers verwendet.
(3) Primer-Anlagerung und Verlängerungsreaktion
Alle RNAs (20 μg) und polyadenylierte RNA (2,5 μg), die aus menschlichen Kolonschleimhaut-Epithelzellen stammten und HT-29-18-N2 wurden jeweils mit den Primern in einem Annealingpuffer [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA, 250 mM KCl] gemischt und durch Erwärmen bei 95°C für 5 Minuten hitzedenaturiert.
Dann wurde die Hybridisierung durch Inkubation bei 58°C für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur oder 37°C für 1,5 Stunden durchgeführt. Anschließend wurde die Verlängerungsreaktion in der folgenden Weise durchgeführt. Eine Annealingprobe wurde aus Ethanol ausgefällt und der erhaltene Niederschlag wurde in RTase-Puffer aufgelöst [33 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 20 mM KCl, 13,3 mM MgCl₂, 13,3 mM DTT, 0,33 mM dNTPs, 50 μg/ml Actinomycin D]. Nach Hinzufügen von 20 U einer reversen Transkriptase (RNaseH-freie MMLV RTase, hergestellt von Toyobo), wurde das Gemisch bei 42°C für 1 Stunde inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch für 3 Minuten bei 95°C behandelt, um dabei die RTase zu inaktivieren. Dann wurde RNase A hinzugefügt, um eine Konzentration von 10 μg/ml zu ergeben und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 37oC inkubiert, um dadurch die Matritzen-RNA abzubauen. Nach der schrittweisen Extraktion mit Phenol/Chloroform und Chloroform und Ethanolfällung, wurde der Niederschlag auf einem 5% Sequenzgel einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel mit einer Fixierungslösung (10% Essigsäure, 15% Methanol) behandelt, getrocknet und dann einer Autoradiographie unterzogen. Als ein Marker wurde M13mp18 verwendet, welcher mit dem Sequenase-Version-2.0 DNA-Sequenzierungskit (hergestellt von Toyobo) umgesetzt worden war.
So wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. Als ein Ergebnis der Verlängerung mit dem Primer 1 unter Verwendung aller RNA-Proben als eine Matrize, wurde ungefähr bei der Base an der Position 118 vom Primer eine starke Bande festgestellt. Als das Ergebnis der Verlängerung mit dem Primer 1 unter Verwendung jeder der polyadenylierten RNA-Proben als Matrize, wurde ungefähr bei der Base an Position 157 eine schwache Verlängerungsbande festgestellt, zusätzlich zu einer um Position 118. Das 5'-Ende von NZ4 von dem angenommen wird, dass es am äußersten 5'-Ende des Sequenzverlaufs liegt, wurde der Einfachheit halber als +1 bezeichnet. Dann entsprachen diese Banden jeweils +27 und –13. Die Verlängerung war bei dieser Position +27 beendet. Das ist anscheinend aufgrund einer Palindromstruktur was darauf hinweist, dass es zur Bildung einer Sekundärstruktur um das 5'-Ende von NZ4 kommen könnte. Im Fall von Primer 2, welcher 5'-stromaufwärts gelagert war und der konstruiert wurde, um die Bildung einer solchen Sekundärstruktur zu minimieren, wurde tatsächlich eine breite Bande von –10 bis –16 beobachtet und eine schwache Einzelbande wurde ferner bei der Position nachgewiesen, die –23 entspricht. Keine Bande wurde stromaufwärts von –23 entdeckt.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Transkriptionsstartstelle 10 bis 20 Basen stromaufwärts vom 5'-Ende von NZ4 liegt. Wenn kein ATG-Codon im Leserahmen in diesem Bereich eingeschlossen ist, gibt es eine starke Möglichkeit, dass das ATG-Codon, welches momentanen am äußersten 5'-Ende des Sequenzverlaufs liegt, die Translationsstartstelle sein würde. Diese Tatsachen machen deutlich, dass der Clon NZ4, in der Reihenfolge von NZ4-C72-Y1-X1-V11, äußerst nahe dem N-Ende liegt.
Beispiel 8: Konstruktion eines Expressions-cDNANektorsystems
(A: Erzeugung von partieller cDNA, eingesetzt in der Expression)
Zur Expression des Proteins wurden die λ-DNA-Clone (#NZ4, #C72, #Y1, #X1 und #V11), die partielle cDNA von FcγBP darin inseriert aufwiesen, mit EcoRI oder NotI gespalten und die cDNA-Inserts wurden in ein zyklisches pBlueskript SK(+) Plasmid subcloniert. Die auf diese Weise erhalten Plasmide wurden jeweils als pNZ4, pC72, pY1, pX1 und pV11 bezeichnet.
(1) pNZ4
Der λ-Clon (#NZ4) wurde vollständig mit NotI gespalten. Dann wurde das Insert von etwa 900 bp durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt und gereinigt und dann in die NotI-Stelle von pBlueskript SK(+) ligiert. Dann wurde ein Clon ausgewählt, in welchem die 5'-3'-Richtung des Protein-codierenden Strangs der cDNA in der entgegengesetzten Richtung zum IacZ-Gen des Plasmids inseriert worden war. Die gesamte Basensequenz des Inserts wird in SEQ ID NO: 1 gezeigt.
Im Sequenzprotokoll der vorliegenden Erfindung werden Basensequenzen, die aus cDNAs stammen als Großbuchstaben angeführt, jene die aus pBlueskript SK(+) stammen, werden als Kleinbuchstaben angeführt und jene, die aus synthetischen Adaptoren und synthetischen Oligonucleotiden stammen, werden als unterstrichene Kleinbuchstaben angeführt.
Jede im Sequenzprotokoll angeführte Aminosäuresequenz ist eine, die auf Grund der Basensequenz des universellen Codes angenommen wurde, während das ATG, welches mit der Kozak-Sequenz übereinstimmt, als das Startcodon bezeichnet wird.
(2) pC72
Der λ-Clon (#C72) wurde vollständig mit EcoRI gespalten. Dann wurde das Insert von etwa 1.300 bp durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt und gereinigt und dann in die EcoRI-Stelle von pBlueskript SK(+) ligiert. Dann wurde ein Clon ausgewählt, in welchem die 5'-3'-Richtung der cDNA in der entgegengesetzten Richtung zum lacZ-Gen des Plasmids inseriert worden war. Die gesamte Basensequenz des Inserts wird in SEQ ID NR: 2 gezeigt.
(3) pY1
Der λ-Clon (#Y1) wurde vollständig mit EcoRI gespalten. Dann wurde das Insert von etwa 1.900 bp durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt und gereinigt und dann in die EcoRI-Stelle von pBlueskript SK(+) ligiert. Dann wurde ein Clon der gleichen Größe ausgewählt. Die gesamte Basensequenz des Inserts wird in SEQ ID NR: 3 gezeigt.
(4) pX1
Der λ-Clon (#X1) wurde vollständig mit EcoRI gespalten. Dann wurde das Insert von etwa 3.300 bp durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt und gereinigt und dann in die EcoRI-Stelle von pBlueskript SK(+) ligiert. Dann wurde ein Clon der gleichen Größe ausgewählt. Die gesamte Basensequenz des Inserts wird in SEQ ID NR: 4 gezeigt.
(5) pV11
Der λ-Clon (#V11) wurde vollständig mit EcoRI gespalten. Dann wurde das Insert von etwa 3.700 bp durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt und gereinigt und dann in die EcoRI-Stelle von pBlueskript SK(+) ligiert. Dann wurde ein Clon der gleichen Größe ausgewählt. Die gesamte Basensequenz des Inserts wird in SEQ ID NR: 5 gezeigt.
Beispiel 9: Konstruktion des Expressions-cDNA/Vektorsystems
(B: Ligation von partieller cDNA für die Expression des Proteins)
(1) Erzeugung von pNZC7
Das Plasmid pNZ4 (5 μg), welches den cDNA-Clon darin inseriert hat, wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen XhoI und BgIII (jeweils 50 U) gespalten und auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt einer Elektrophorese unterzogen. Dann wurde ein Fragment von etwa 400 bp abgetrennt, welches das 5'-Ende der cDNA von FcγBP enthielt, mit Phenol extrahiert und durch Ausfällung aus Ethanol (Fragment 1) gewonnen. Als Nächstes wurde das zweite Plasmid pC72 (5μg) vollständig mit XhoI und BgIII gespalten. Dann wurde ein Fragment von etwa 4,2 kbp, welches den Vektorteil enthielt, durch Elektrophorese in der gleichen Weise wie das eine vorstehend beschriebene (Fragment 2) isoliert. Die Fragmente 1 und 2 wurden dann jeweils in 10 μl TE-Puffer aufgelöst. 2 μl Anteile dieser Lösungen wurden mit 16 μl der Lösung A (DNA-Ligationskit, hergestellt von Takara Shuzo) und 4 μl der Lösung B gemischt und bei 16°C für 30 Minuten inkubiert, um dadurch die Ligation durchzuführen. Durch 5 μl dieses Gemischs wurden 100 μl kompetente E. coli (XL1-Blue) transformiert, die dann auf einer LB-Platte, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37°C über Nacht inkubiert wurden. Von den so gebildeten Kolonien wurde die Plasmid-DNA gereinigt, um dadurch ein Plasmid pNZC7 zu ergeben, worin das Fragment 1 an das Fragment 2 ligiert worden war.
(2) Erzeugung von Framgent 5
pNZC7 (5μg) wurde vollständig mit 50 U-Anteilen an XhoI und BstI gespalten und ein Fragment von etwa 1.300 bp (Fragment 3) wurde durch Elektrophorese gewonnen. Das dritte Plasmid pY1 (5 μg) wurde vollständig mit 50 U-Anteilen an BstXI und HincII gespalten und ein Fragment (Fragment 4) von etwa 420 bp wurde durch Elektrophorese gewonnen. Dann wurden diese Fragmente 3 und 4 durch das gleiche Verfahren, welches vorstehend beschriebenen wurde, mit DNA-Ligase aneinander ligiert und einer Elektrophorese unterworfen. So wurde ein Fragment von etwa 1.750 bp gewonnen (Fragment 5), in welchem sich die vorstehenden Fragmente (jeweils 1 Mol) an der BstX1-Stelle verbunden hatten.
(3) Erzeugung von pXV2
Das vierte Plasmid pX1 (5 μg) wurde mit 50 U-Anteilen an HincII und BamHI vollständig gespalten und ein Fragment (Fragment 6) von etwa 2.780 bp wurde durch Elektrophorese gewonnen. Das fünfte Plasmid pV11 (5 μg) wurde mit 50 U BamHI vollständig gespalten und ein Fragment (Fragment 7) von etwa 3.350 bp wurde durch Elektrophorese gewonnen. Dann wurden diese Fragmente 6 und 7 mit DNA-Ligase, durch das gleiche Verfahren, welches vorstehend beschrieben wurde, aneinander ligiert und einer Elektrophorese unterzogen. So wurde ein Fragment von etwa 6.100 bp gewonnen (Fragment 8), in welchem die vorstehenden Fragmente (jeweils 1 Mol) aneinander gebunden hatten. Dieses Fragment 8 wurde dann mit DNA-Ligase an pBlueskript SK(+) ligiert, welcher mit HincII und BamHI gespalten worden war und kompetente E. coli wurden dann dadurch transformiert. Von den so erhaltenen Transformanten wurden Plasmide gewonnen und die Basensequenzen von jedem Plasmid wurden identifiziert. So wurde ein Plasmidclon erhalten, der Fragment 8 enthält, in welchem die Fragmente 6 und 7 in der richtigen Ausrichtung ligiert worden waren. Der eine, in welchem die 5'-3'-Richtung von Fragment 8 in der entgegengesetzten Richtung zum IacZ-Gen des Plasmids inseriert worden war, wurde als pXV2 bezeichnet.
(4) Erzeugung von pNV11
pXV2 wurde vollständig mit XhoI und HincII gespalten und ein Fragment (etwa 9,1 kbp), welches den Vektor enthielt, wurde durch Elektrophorese gewonnen (Fragment 9). Dieses Fragment 9 wurde unter Verwendung von DNA-Ligase an das vorstehend erwähnte Fragment 5 ligiert und dann wurden kompetente E. coli (XL1-Blue) damit transformiert. Von den so erhaltenen Transformanten wurde Plasmid pNV11 (etwa 10,8 kbp) erhalten, welches eine cDNA von etwa 7,8 kbp (Fragment 10) enthält.
(5) Synthese des Oligonucleotidadaptors, der ein Stopp-Codon (übereinstimmend mit UAG) enthält.
Unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts (Model 394, hergestellt von Applied Biosystems) wurden die folgenden Oligonucleotide synthetisiert, welche drei TAG die sich im Leserahmen unterscheiden sowie an beiden Enden NotI und SpeI-Stellen aufwiesen: (1) 5'-CTA GTT AGT TAG TTA GGG TAC CGC-3'; und (2) 5'-GGC CGC GGT ACC CTA ACT AAC TAA-3'. 10 nMol-Anteile der Oligonucleotide 1 und 2 wurden zusammen gemischt (146 μl insgesamt), bei 95°C für 1 Minute und bei 85°C für 10 Minuten erhitzt und dann schrittweise, bei einer Rate von 0,33°C/Minute auf 40°C abgekühlt, um dadurch einen Adaptor zu erzeugen, der das Stopp-Codon (TA-III Adaptor) enthält. Dann wurde das 5'-Ende dieses Adaptors (2,1 nMol) durch das Standardverfahren unter Verwendung von ATP und Polynucleotid-Kinase phosphoryliert.
0,83 pMol des pBlueskript SK(+)-Vektors wurden mit NotI und SpeI vollständig gespalten und dann mit 250 pmol des phosphorylierten TA-III Adaptors gemischt und durch Inkubation bei 1.6°C für 30 Minuten unter Verwendung eines DNA-Ligationskits daran ligiert. Nach Ethanolfällung wurde der Niederschlag in 50 μl des Reaktionsvolumens in einer solchen Weise vollständig mit NotI gespalten, um so die Adaptorsequenz einmal zu ergeben. Als Nächstes wurde eine Bande von etwa 3 kbp durch Elektrophorese in einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gewonnen, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Verwendung eines DNA-Ligationskits einer Autoligation unterzogen und dann wurden kompetente E.coli (XL1-Blue) dadurch transformiert. Unter den Plasmiden, die von den durch Inkubation der Transformanten auf einer Ampicillinenthaltenden Platte über Nacht gebildeten Kolonien erhalten wurden, wurde ein Plasmid ausgewählt in welches der TA-III Adaptor inseriert worden war (pBLS/TAIII).
(6) Erzeugung von pNV11-ST
5μg des Plasmids pNV11 wurden vollständig mit SpeI gespalten und ein Fragment von etwa 7,8 kbp wurde durch Elektrophorese gewonnen und in 10 μl TE-Puffer aufgelöst (Fragment 11). 2 μg des Plasmids (pBLS/TAIII) wurden mit SpeI vollständig gespalten und seine Enden wurden mit bakterieller alkalischer Phosphatase (2U) dephosphoryliert. Dann wurde es zweimal mit Phenol/Chloroform behandelt und mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde in 10 μl TE-Puffer (Fragment 12) aufgelöst. Als Nächstes wurden 2 μl -Anteile der Fragmente 10 und 11 zusammengemischt und unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert. Dann wurden kompetente E. coli (XL1-Blue) dadurch transformiert und auf einer LB-Platte die Ampicillin enthält über Nacht inkubiert. Unter den so gebildeten Kolonien wurde durch Analyse der Restriktionskarte und der Basensequenz eine ausgewählt, in welcher der TA-III Adaptor an die 3'-Seite der inserierten cDNA ligiert worden war. Auf diese Weise wurde der Clon pNV11-ST erhalten.
Der E. coli-Stamm, welcher das vorstehend erwähnte Plasmid pNV-ST enthielt, wurde als Escherichia coli XL1-Blue [pNV11-ST] am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaragi) unter der Hinterlegungsnummer FERM BP- 4625 in Übereinstimmung mit dem Budapester Abkommen seit 1. April 1994 hinterlegt.
2 zeigt das Verhältnis zwischen der partiellen cDNA (Clon pNV11-ST; etwa 7,8 kbp) eingesetzt in der Expression von FcγBP und den Clonen NZ4, C72, Y1, X1 und V11, die in Beispiel 6 beschrieben und zu dessen Konstruktion eingesetzt wurden.
Beispiel 10: Konstruktion des Expressions-cDNA/Vektorsystems
(C: Integration in einen Protein-Expressionsvektor)
(1) Herstellung des pcDL-SRα/NOT-Vektors
Um die Integration der cDNA zu ermöglichen wurden die Restriktionsschnittstellen des Vektors pcDL-SRa296 (freundlicherweise gestattet durch Dr. Yutaka Takebe, National Institute of Health; nachstehend einfach manchmal als SRα bezeichnet) geändert. Zuerst wurden 2 μg SRα vollständig mit EcoRI verdaut und mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde dann in Klenow-Pufter [70 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 70 mM MgCl₂, 1 mM Anteile an dATP, dCTP, dGTP und dTTP] aufgelöst und mit 0,4 U Klenow-Fragment bei 37°C für 15 Minuten inkubiert, um dadurch das Plasmid mit glatten Enden zu versehen. Nach der Ethanolfällung wurde der Niederschlag in TE-Puffer aufgelöst und ein NotI-Linker, der am 5'-Ende phosphoryliert worden war, wurde unter Verwendung eines DNA-Ligationskits daran ligiert. Nach der Ethanolfällung wurde der Niederschlag vollständig mit NotI gespalten und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen. So wurde eine DNA von etwa 3,7 kbp herausgeschnitten und durch Extraktion mit Phenol gewonnen. Die auf diese Weise gewonnene DNA wurde durch Verwendung eines DNA-Ligationskits der Autoligation unterzogen und dann wurden dadurch kompetente E. coli (XL1-Blue) transformiert. Als Nächstes wurde das Zielplasmid (pcDL-SRα/NOT) selektiert, welches nicht mit EcoRI sondern mit NotI gespalten wurde.
(2) Insertion der Expressions-cDNA
Der Protein-Expressionsvektor (pcDL-SRα/NOT) wurde mit NotI und KpnI vollständig gespalten und ein Fragment von etwa 3,7 kbp wurde durch Elektrophorese gewonnen (Fragment A).
Der cDNA-Insertionsvektor (pNV11-ST) wurde vollständig mit NotI und KpnI gespalten und ein Fragment von etwa 7,8 kbp wurde durch Elektrophorese gewonnen (Fragment 13). Die gesamte Basensequenz dieses Fragments 13 wird in SEQ ID NR: 6 gezeigt.
Diese Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz wurden mit GenBank Rel. 80 wiedergefunden. So wurde bestätigt, dass die Basensequenz und die Aminosäuresequenz beide neu sind.
Das Fragment A und das Fragment 13 wurden unter Verwendung eines DNA-Ligationskits ligiert und dann wurden dadurch kompetente E. coli (XL1-Blue) transformiert. Aus den durch Inkubation der Transformanten auf einer LB-Platte, die 100 μg/ml Ampicillin enthält, gebildeten Kolonien, wurde durch Spaltung mit Restriktionsenzymen ein Plasmid ausgewählt, welches Fragment 13 darin inseriert aufwies. So wurde der Clon pNV11-SR erhalten.
Beispiel 11: Expression von partieller cDNA von FcγBP in COS7-Zellen
(1) Gewinnung des Expressions-cDNA/Vektors von Escherichia coli
Der in Beispiel 10 erhaltene, durch das FcγBP-cDNA-Expressionsplasmid (pNV11-SR) transformierte Escherichia coli wurde unter Schütteln über Nacht bei 37°C in 10 ml LB-Medium inkubiert. Als Nächstes wurde Kulturmedium zu 500 ml LB-Medium hinzugefügt und das Schütteln wurde fortgesetzt, bis eine OD₆₀₀ von 0,8 erreicht war. Sobald eine OD₆₀₀ von 0,8 erreicht war, wurden dazu 2,5 ml einer Chloramphenicol-Lösung (34 mg/ml) hinzugefügt und das Gemisch wurde über Nacht inkubiert. Nach Abtrennung der Zellen durch Zentrifugation wurde die Plasmid-DNA durch das Alkaliverfahren in der herkömmlichen Weise erzeugt. Das Plasmid wurde durch Ultrazentrifugation (90.000 UpM, 3 Stunden) unter einem Dichtegradienten von Cäsiumchlorid zweimal gereinigt und gegen TE-Puffer dialysiert und dann in der Expression des Proteins eingesetzt.
(2) Transfektion in COS7-Zellen
Die Transfektion wurde in der folgenden Weise durchgeführt, um die Eigenschaften des Proteins durch vorläufige Expression des Plasmidvektors (pNV11-SR) in COS7-Zellen zu untersuchen, welche die partielle cDNA (etwa 7,8 kbp) von FcγBP darin integriert hatte. 2 × 10⁷ COS7-Zellen wurden zu einer Schale mit 35 mm Durchmesser hinzugefügt und in RPMI 1640-Medium (0,2% Natrium- Hydrogencorbonat, 10 U/ml Penicillin, 0,01 % Streptomycin), welches 10% fötales Rinderserum enthielt, über Nacht inkubiert.
Nach Erreichen von 40-60% Konfluenz, wurden die Zellen zweimal mit serumfreien RPMI 1640-Medium gewaschen.
10 μl von in 250 μl RPMI 1640-Medium aufgelöstem Plasmid pNV11-SR wurden mit 10 μl eines Lipofektinreagens (Transfectam, hergestellt von Sepracor) gemischt, welches in 250 μl RPMI 1640-Medium aufgelöst war und das erhaltene Gemisch wurde sofort auf die COS7-Zellen gegeben. Nach Inkubation bei 37°C für 6 Stunden wurde das Medium entfernt, gefolgt von der Zugabe von 2 ml RPMI 1640-Medium, welches 10% Serum enthielt. Dann wurde die Inkubation bei 37°C unter 5% CO₂ für 2 Tage durchgeführt.
(3) Bestätigung von exprimiertem Protein
Die Schale (Durchmesser: 35 mm), worin die mit pNV11-SR transformierten COS7-Zellen inkubiert worden waren, wurden zweimal mit 2 ml PBS (-) gewaschen. Dann wurden 2 ml 99,5% Ethanol hinzugefügt und die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten fixiert und dann zweimal mit 2 ml PBS (-) gewaschen. 1 ml Anteil des Kulturüberstands der Hybridome wurden hinzugefügt, welche die monoclonalen Antikörper (K9 und K17) gegen FcγBP produzierten, die beim Screening des λ-Phagen eingesetzt wurden. Jedes so erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert und dreimal mit PBS (-) gewaschen. Dann wurde dazu mit Meerrettich-Peroxydase markiertes Ziege-anti-Maus IgG (N+L) F(ab')₂-Fragment (hergestellt von Zymed) hinzugefügt, gefolgt von Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nach dreimaligem Waschen mit 2 ml PBS (-) wurde eine 0,036% wässrige Lösung an Hydrogenperoxid und eine 0,1 % Lösung an Diaminobenzidin in 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,2) in einem Verhältnis von 1:1 hinzugefügt, um Farbentwicklung zu erreichen (Raumtemperatur, 10 Minuten). So wurden die Zellen in welchen das Protein exprimiert wurde bestätigt. Als Kontrolle wurde eine Probe verwendet, zu welcher kein primärer Antikörper, aber mit Meerrettich-Peroxydase markiertes Ziege-anti-Maus IgG (N+L) F(ab')₂-Fragment alleine, als sekundärer Antikörper hinzugefügt wurde.
3 zeigt die Ergebnisse. Wenn der Kulturüberstand der Hybridome, die den monoclonalen Antikörper K9 (3, A) produzierten oder jener, der Hybridome die den monoclonalen Antikörper K17 (3, B) produzierten hinzugefügt wurde, wurden in jedem Fall Zellen beobachtet, welche spezifisch damit reagierten. Andererseits wurden in der Kontrolle (3, C) keine reaktiven Zellen beobachtet.
Beispiel 12: Nachweis der Fähigkeit des rekombinanten Proteins an menschliches IgG zu binden und seine Eigenschaften
(1) Bestätigung der Bindung von menschlichem IgG
Die mit dem Plasmid pNV11-SR transfizierten COS7-Zellen (in einer Schale von 35 mm Durchmesser), in welchem die partielle cDNA von FcγBP integriert worden war, wurden zweimal mit PBS (-) gewaschen. Dann wurden dazu 2 ml 99,5% Ethanol hinzugefügt und die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten fixiert und dann zweimal mit 2 ml PBS (-) gewaschen. Als Nächstes wurde eine durch Affinitäts-Chromatographie gereinigte menschliche IgG-Fraktion (hergestellt von Cappel) mit RPMI 1640-Medium, welches 10% fötales Rinderserum enthielt verdünnt, um so eine Konzentration von 10 μg/ml zu ergeben. 1 ml der erhaltenen Verdünnung wurde zu der Schale hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach dem dreimaligen Waschen mit 2 ml PBS (-) wurde sie mit einer mit Meerrettich-Peroxydase-markieren Ziege-anti-Maus IgG F(ab')₂-Fraktion (#109-D36-088, hergestellt von Cosmo Bio) bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit 2 ml PBS (-) wurde ein Gemisch (1:1) einer 0,036% wässrigen Lösung aus Wasserstoffperoxyd und einer 0,1% Lösung aus Diaminobenzidin in 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,2) hinzugefügt, um so die Farbentwicklung zu erreichen (Raumtemperatur, 10 Minuten). Auf diese Weise wurde die Bindung von IgG an das exprimierte Protein bestätigt.
(2) Spezifische Bindung von IgG
Die mit pNV11-SR transfizierten COS7-Zellen (in einer Schale von 35 mm Durchmesser) wurden zweimal mit 2 ml PBS (-) gewaschen. Dann wurden dazu 2 ml 99,5% Ethanol hinzugefügt und die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten fixiert und dann zweimal mit 2 ml PBS (-) gewaschen.
Als Nächstes wurde mit Meerrettich-Peroxydase markierte, durch Affinitätschromatographie gereinigte, menschliche IgG-Fraktion (#55902, hergestellt von Cappel) mit RPMI 1640-Medium verdünnt, welches 10% fötales Rinderserum enthielt, um so eine Konzentration von 10 μg/ml zu ergeben (Lösung 1). Zu dieser Lösung wurden die folgenden Immunglobuline (50 μg/ml) als kompetitiver Inhibitor hinzugefügt.

(1) Menschliche IgG-Fraktion, gereinigt durch Chromatographie (#55908, hergestellt von Cappel).
(2) Menschliche IgG-Fraktion, gereinigt durch Chromatographie (#55911, hergestellt von Cappel).
(3) Menschliche IgG F(ab')₂-Fraktion, gereinigt durch Chromatographie (#55910, hergestellt von Cappel).
(4) Menschliche IgM-Fraktion, gereinigt durch Chromatographie (#55916, hergestellt von Cappel).
(5) Menschlicher Serum-IgA, gereinigt durch Chromatographie (#55906, hergestellt von Cappel).
(6) Menschlicher Sekretor-IgA, gereinigt durch Chromatographie (#55905, hergestellt von Cappel).

Die vorstehenden kompetitiven Inhibitoren (1) bis (6) wurden getrennt zu der Lösung 1 hinzugefügt. 1 ml von jeder auf diese Weise erhaltenen Lösung wurde zu der Schale hinzugefügt, in welcher die Zellen fixiert worden waren, gefolgt von Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Nach dreifachem Waschen mit 2 ml PBS (-) wurde ein Gemisch (1:1) einer 0,036% wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxyd und einer 0,1 % Lösung von Diaminobenzidin in 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,2) hinzugefügt, um so die Farbentwicklung zu erreichen (Raumtemperatur, 10 Minuten). Auf diese Weise wurde die Bindung von IgG an das exprimierte Protein untersucht. Lösung 1, die keinen kompetitiven Inhibitor enthielt, wurde als eine Kontrolle genutzt.
4 und 5 zeigen die Ergebnisse. Wenn kein kompetitiver Inhibitor hinzugefügt wurde (d.h. die Kontrolle), waren die Zellen gefärbt (4, A). Wenn die gereinigte menschliche IgG-Fraktion (4, B) und die gereinigte menschliche IgG-Fc-Fraktion (4, C) hinzugefügt wurden, waren die Zellen jedoch nicht gefärbt. Andererseits konnte die Zugabe der IgG F(ab')₂-Fraktion (5, D) der menschlichen IgM-Fraktion (5, E), des menschlichen Serum-IgA (5, F) und des menschlichen Sekretor-IgA (5, G) die Bindung des mit Meerrettich-Peroxydase markiertem menschlichem IgG nicht hemmen. Diese Tatsachen weisen darauf hin, dass FcγBP spezifisch an IgG-Fc in menschlichen Antikörpern bindet.
Beispiel 13: Gewebsspezifität der Expression von FcγBP-mRNA
Um die Spezifität der Expression von FcγBP in menschlichen Geweben zu untersuchen, wurde die Expression der mRNA durch einen Northem-Blot untersucht. Eine Nylonmembran, auf welche 2 μg-Anteile an polyadenylierten RNAs übertragen worden waren (menschliche mehrfache Northern Blots #7706-1, hergestellt von Clontech), die aus dem menschlichen Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas gereinigt waren, wurde unter den gleichen Bedingungen wie jenen, die in Beispiel 2 (4) angewandt wurden, einer Vorhybridisierung unterzogen, gefolgt durch Hybridisierung unter Verwendung der mit [³²P] markierten Sonde Y. Nach dem Waschen wurden die Banden durch Autoradiographie nachgewiesen. Nach Durchführen der Autoradiographie bei –80°C für 2 Tage wurde eine Bande von etwa 17 kbp in der Plazenta (6) nachgewiesen, während die anderen Gewebe negative Ergebnisse zeigten. Es wurde daher angenommen, dass das FcγBP-Protein in der Plazenta exprimiert worden war.
Beispiel 14: Northern-Blot-Analyse mit 3 verschiedenen Sonden
Die von Kolonschleimhaut-Epithelzellen extrahierte mRNA wurde unter Verwendung der in Beispiel 2 (3) erhaltenen Sonden Q und A und der in Beispiel 6 (2) erhaltenen Sonde Y einem Northern-Blot unterzogen, um zu bestätigen, dass diese Sonden mit der gleichen mRNA hybridisierbar waren.
15 μg von allen RNAs, welche von Kolonschleimhaut-Epithelzellen durch das AGPC-Verfahren extrahiert wurden, wurden in 4,5 μl sterilisiertem Wasser aufgelöst, mit 2 μl 5 × MOPS-Puffer, 3,5 μl Formaldehyd und 10 μl Formamid gemischt und dann durch Hitze bei 60°C für 15 Minuten denaturiert, gefolgt von Elektrophorese auf einem 1 % Agarosegel in der Gegenwart von Formaldehyd. Nach Abschluss der Elektrophorese wurden die RNAs über Nacht durch das Kapillarverfahren auf eine Nylonmembran transferiert (Biodyne A, hergestellt von Pall Corp.). Nach Fixieren der RNAs durch UV-Crosslinking auf der Nylonmembran, wurde die Vorhybridisierung in 10 ml einer Hybridisierungslösung (5 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung, 50% Formamid, 0,5% SDS, 100 μg/ml thermisch denaturierter Lachssperma-DNA) bei 42°C für 8 Stunden durchgeführt.
Anschließend wurde jede der Sonden A, Q und Y unter Verwendung des Megaprime-Labelingkits (hergestellt von Amersham) mit α[³²P] dCTP radioaktiv markiert. 1 × 10⁸ dpm von jeder Sonde wurden zusammen mit 5 ml der Hybridisierungslösung zu der Nylonmembran hinzugefügt, welche der Vorhybridisierung unterzogen worden war. Nach Verschweißen wurde über Nacht bei 42°C die Hybridisierung durchgeführt. Die Nylonmembran wurde dann dreimal bei 65°C für 40 Minuten in einer Lösung gewaschen, die 0,2 × SSC und 0,2% SDS enthielt. Dann wurde die Nylonmembran getrocknet und über Nacht auf einem Röntgenfilm exponiert.
Als Ergebnis davon wurde eine Bande von ungefähr 17 kbp durch Verwendung jeder der Sonden A, Q und Y nachgewiesen, was beweist, dass diese 3 Sonden, vom Standpunkt des Molekulargewichts, mit der gleichen mRNA hybridisierbar sind (7).
Beispiel 15: Identifizierung der Basensequenz der FcγBP-codierenden cDNA (2)
Beispiele 4 und 6 stellen die Identifizierung der partiellen Basensequenz [d.h. etwa 7,8 kbp (7.826 Basen) beginnend vom 5'-Ende] der cDNA dar, welche die Aminosäuresequenz des Proteins codiert, das im Stande ist an die Fc-Region von IgG zu binden. Nun wird das Verfahren zur Identifizierung der restlichen Basensequenz (etwa 8,6 kbp) erläutert.
(1) Struktur und Klassifizierung der cDNA
Die durch Screening über Hybridisierung unter Verwendung der Sonde A, B oder Q in Beispiel 4 erhaltenen cDNA-Clone, wurden jeweils in Escherichia coli amplifiziert und dann unter Verwendung der Sonden A, B und Q kartiert. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass jeder dieser Clone mit mindestens einer der 3 Sonden hybridisierbar war und die mit diesen Sonden homologen Stellen wurden in der Reihenfolge von A→B, B→Q oder Q→A auf den cDNAs ausfindig gemacht.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde angenommen, dass das FcγBP-Gen eine Struktur aufweist, worin eine Einheit, bestehend aus den homologen Sequenzen mit den in der Reihenfolge von A→B→Q miteinander verbunden Sonden A, B und Q, in Tandem wiederholt ist.
In cDNA-Clonen, die mit der Sonde B hybridisierbar waren, wurde ein Teil (etwa 280 bp) dieser Basensequenzen der Sonde B durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer hybridisiert.
Primer (P-1):
5'-GCC TGC GTG CCC ATC CAG-3'.
Primer (P-2):
5'-CTC ATA GTT GGG CAG CGAC-3'.
Die durch PCR amplifizierten Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt und aus dem Gel gewonnen, gefolgt von der Analyse der Basensequenz. Basierend auf diesen Basensequenzen wurden die cDNA-Clone, die mit der Sonde B hybridisierbar waren, in die folgenden 3 Gruppen eingeteilt, während die cDNA-Clone, die nicht mit der Sonde B hybridisierbar waren, als Gruppe 4 bezeichnet wurden.
Gruppe 1: cDNA-Clone, welche die gleiche Sequenz aufweisen wie jene, die vom Fragment des Clons V11 amplifiziert wurden.
Gruppe 2: jene, die verglichen mit der Sequenz von Gruppe 1, den Austausch von 5 Basen erleiden und keine HincII-Stelle im Fragment aufweisen.
Gruppe 3: jene, die verglichen mit der Sequenz von Gruppe 1, den Austausch von 7 Basen erleiden und keine HincII-Stelle im Fragment aufweisen.
Gruppe 4: jene, die nicht mit der Sonde B hybridisierbar sind.
(2) Clon T5
Um die cDNA zu isolieren, welche auf der 3'-Seite einen poly-A-Rest aufweist, wurde die in Beispiel 3 konstruierte cDNA-Bank unter Verwendung des oligo-dT-Primers, durch Verwenden der Sonde A, B oder Q in der gleichen Weise wie jener gescreent, die in Beispiel 4 beschrieben ist. Als Ergebnis fand die Hybridisierung ausschließlich mit der Sonde Q statt. Unter den so erhaltenen cDNA-Clonen, wurde der eine, der das längste cDNA-Insert aufwies, als Clon T5 bezeichnet.
Das cDNA-Insert des Clons T5 wurde mit EcoRI gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und gereinigt, gefolgt von der Insertion in die EcoRI-Stelle des Plasmidvektors pBluescript SK(+). Anschließend wurde die Restriktionskarte von T5 gebildet und die gesamte Basensequenz davon wurde identifiziert.
Im cDNA-Insert des Clons T5 wurde ein Bereich von etwa 550 bp zwischen der BamHI-Stelle, etwa 1 bp abseits des Poly-(A⁺) auf der 5'-Stelle und der PstI-Stelle, etwa 1,6 kbp abseits vom Poly-(A⁺) auf der 5'-Seite, als Sonde V bezeichnet. Diese Sonde V war mit den Clonen NZ4, C72, Y1, X1, V11, A53, A40 und A31 nicht hybridisierbar, sondern für T5 spezifisch.
(3) Clon A43
Die mit den Sonden A, B oder Q hybridisierbaren cDNA-Clone wurden unter Verwendung der Sonde V, in der gleichen Weise wie jener in Beispiel 4 (2) beschriebenen, der Hybridisierung unterzogen, um dadurch einen Clon zu ergeben, welcher nicht mit den Sonden A und B, sondern mit den Sonden V und Q, hybridisierbar war. Das cDNA-Insert dieses Clons wurde mit EcoRI gespalten und durch Agarosegelektrophorese aufgetrennt und gereinigt, gefolgt von Insertion in die EcoRI-Stelle des Plasmidvektors pBlueskript SK(+). Anschließend wurde die Restriktionskarte gebildet und die gesamte Basensequenz davon wurde identifiziert.
Als Ergebnis der Analyse der Basensequenz wurde bestätigt, dass die Sequenz von etwa 2 kbp, welche den Bereich enthielt, der mit der Sonde Q hybridisierbar war, mit der Sequenz des mit T5 überlappenden Teils übereinstimmte.
(4) Clon A8
Um eine cDNA zu erhalten, die gegen das 5'-Ende des Clons A43 verlängert war, wurde eine Synthese der folgenden Primer durchgeführt, durch welche die Basensequenz (etwa 240 bp) um das 5'-Ende des Clons A43 amplifiziert werden konnte.
Primer (P-3):
5'-TGT TGG GAC GAA TGT CGG-3'.
Primer (P-4):
5'-TCA CAG CCA ACC TGT GCC-3'.
Die wie in Beispiel 15 (1) klassifizierten cDNA-Clone der Gruppen 1, 2 und 3 wurden unter Verwendung der vorstehend erwähnten Primer (P-3) und (P-4) einer PCR unterzogen. Die durch PCR amplifizierten Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und daraus gewonnen, gefolgt von der Analyse der Basensequenz. Auf diese Weise wurde, wie in Beispiel 15 (1) eingeteilt, ein cDNA-Clon unter den cDNA-Clonen der Gruppe 3 ausgewählt, welcher ein PCR-Fragment der gleichen Basensequenz, wie jenes von A43 aufweist. Dieser Clon wurde als Clon A8 bezeichnet. Die gesamte Basensequenz des Clons A8 wurde analysiert und es wurde auf diese Weise bestätigt, dass die Basensequenz auf der 3'-Seite völlig identisch mit der überlappenden Sequenz auf der 5'-Seite von A43 war.
(5) Clone A53 und A40
Unter den in die Gruppe 2 fallenden Clonen, wurden 2 unterschiedliche Clone basierend auf den Restriktionskarten ausgewählt, die einen Bereich aufwiesen, der mit den Sonden Q und A auf der 5'-Seite hybridisierbar war. Unter diesen so ausgewählten Clonen wurde einer, der den längeren die 3'-Seite des Clons C11 überlappenden Bereich aufwies, als Clon A53 bezeichnet, während der andere, welche den kürzeren Bereich aufwies, als Clon A40 bezeichnet wurde.
Die gesamte Basensequenz der Clone A53 und A40 wurde analysiert. Auf diese Weise wurde bestätigt, dass ein Bereich auf der 3'-Seite des Clons A53 (etwa 2,4 kbp) und ein Bereich auf der 5'-Seite des Clons A40, die einander überlappten, die gleiche Basensequenz aufwiesen. Ferner deutete ein Vergleich zwischen einer Region (etwa 1,8 kbp) auf der 3'-Seite von V11 und einem Bereich auf der 5'-Seite von A53, die einander überlappen, darauf hin, dass die Basensequenzen dieser Bereiche, mit Ausnahme einer Base (d.h. der Base an Position 6273: A in V11, G in A53), völlig miteinander übereinstimmten.
(6) Clon A31
Um eine cDNA zu screenen, welche gegen das 3'-Ende von Clon A40 verlängert war, wurde der folgende Vorgang durchgeführt. In den Clonen A53 und A40 waren die Basensequenzen der durch die Primer (P-3) und (P-4) amplifizierten Fragmente weder mit der Sequenz von V11 der Gruppe 1 noch der Sequenz von A8 der Gruppe 3 identisch. Das Screening wurde daher in der folgenden Weise unter Verwendung dieser Sequenzen als Indikatoren durchgeführt. Und zwar wurden cDNA-Clone, die mit der Sonde A, B oder Q hybridisierbar waren, von den cDNA-Clonen (gesamt 69) anders als jenen, die zu den Gruppen 1 und 3 gehörten, unter Verwendung der Primer (P-3) und (P-4) einer PCR unterzogen und die Basensequenzen der auf diese Weise amplifizierten Fragmente wurden identifiziert. Dann wurden die cDNA-Clone ausgewählt, welche die gleiche Basensequenz wie jene der Clone A53 und A40 aufwiesen. Aus diesen Clonen wurde einer ausgewählt und als Clon A31 bezeichnet, der die PCR-amplifizierte Sequenz auf der 5'-Seite aufwies und zum 3'-Ende hin verlängert war.
Durch Analysieren der gesamten Basensequenz des Clons A31 wurde bestätigt, dass die Sequenz auf der 5'-Seite von A31 identisch mit dem überlappenden Bereich auf der 3'-Seite des Clons A40 war, während die Sequenz auf der 3'-Seite von A31 mit dem überlappenden Bereich auf der 5'-Seite von Clon A8 identisch war.
Beispiel 16: Identifikation der Basensequenz der FcγBP-codierenden cDNA (3)
Die cDNA von FcγBP hatte in der gesamten Länge eine Struktur von 16,4 kbp, in welcher eine Sequenz bestehend aus einer Einheit von 3,5 kbp (umfassend die mit den Sonden A, B und Q homologen Bereiche) dreimal in Tandem wiederholt war und die wiederholten Sequenzen eine Homologie von mindestens 95% miteinander aufwiesen (8).
Wie vorstehend beschrieben sind die in der Identifikation der Basensequenzen in dieser wiederholten Struktur eingesetzten cDNAs abhängig von der starken Reaktivität mit den Sonden A, B und Q cloniert worden. Durch Vergleichen dieser Basensequenzen miteinander wurde bestätigt, dass die Basensequenzen von überlappenden Bereichen identisch waren und die Beziehungen unter der cDNA wurden so geklärt. Infolgedessen wurde bewiesen, dass eine Reihe von DNA-Fragmenten von einer einzelnen mRNA (Gen) abstammten. Um diese Tatsache nochmals zu bestätigen wurde ein cDNA-Fragment in einer wiederholenden Struktur, die unterschiedlich von pNV11 war und die 5'-terminale cDNA enthielt, welche schon in der Expression eingesetzt worden war, dazu veranlasst Proteinexpression durchzumachen. Dann wurde untersucht ob, das auf diese Weise exprimierte Protein durch die monoclonalen Antikörper K9 und K17 erkannt wird, welche im Stande sind FcyBP zu erkennen, oder nicht.
(1) Synthese eines Adaptors, der ein Startcodon enthält
Um jede cDNA, die in voller Länge in einen Vektor vom 5'-Ende inseriert werden soll, zu exprimieren, ist es notwendig das Startcodon (ATG) an das 5'-Ende der cDNA zu ligieren. Um die Translation des Proteins innerhalb des gleichen Leserahmens wie jenem von FcγBP zu erreichen, ist es darüber hinaus erforderlich, den Leserahmen zwischen dem Startcodon (ATG) und dem 5'-Ende der cDNA zu regulieren. Es wurden daher Oligonucleotide für einen Adaptor synthetisiert, welche die folgenden Bedingungen erfüllten.
Jedes synthetische Oligonucleotid enthält eine Basensequenz bestehend aus 7 Basen (GCCATGG), welche die gleiche Sequenz wie die des Initiationsbereichs von pNV11 SR, welche das inhärente Startcodon (ATG) von FcγBP umfasst und mit der Kozak-Regel übereinstimmt.
Um die Insertion in den Vektor zu erleichtern wurde die HindIII und EcoRI-Stelle jeweils zu der 5'-Seite und 3'-Seite dieses Oligonucleotids hinzugefügt. Um den Leserahmen zu regulieren wurden die folgenden 3 Oligonucleotide (FR-1S, FR-2S, FR-3S) konstruiert. Darüber hinaus wurden die Oligonucleotide FR-1A, FR-2A und FR-3A synthetisiert, die jeweils komplementär zu den vorstehend erwähnten Oligonucleotiden waren. Oligonucleotide für den Adaptor:
Jedes Oligonucleotid wurde unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts (Modell 1395, hergestellt von ABI) synthetisiert und gereinigt.
Als Nächstes wurden FR-1S, FR-2S und FR-3S, in der gleichen Weise wie in Beispiel 9 (5) beschrieben, jeweils an FR-1A, FR-2A, und FR-3A angelagert, gefolgt von der Phosphorylierung der Nucleotide am 5'-Ende. Die so gebildeten Adaptoren wurden jeweils als Adaptoren FR-1, FR-2 und FR-3 bezeichnet.
(2) Änderung des TAIII/SK-Vektors
Die XbaI-Stelle wurde zu dem das Stoppcodon enthaltenden Vektor pBLS/TAIII hinzugefügt, der in Beispiel 9 (5) in der folgenden Weise konstruiert wurde.
Und zwar wurde pBLS/TAIII vollständig mit dem Restriktionsenzym XhoI durch das gleiche Verfahren wie dem in Beispiel 10 (1) gespalten und dann mit glatten Enden versehen. Nachdem ein XbaI-Linker, welcher phosphorylierte Enden aufweist, daran ligiert wurde, wurde er nochmals mit XbaI gespalten und dann mit sich selbst ligiert. Dann wurden kompetente E. coli dadurch transformiert und so wurde ein Vektor pBLS/TAIII 2 erhalten, der eine XbaI-Stelle inseriert in die XhoI-Stelle von pBLS/TAIII aufweist.
(3) Insertion des Oligonucleotids, welches das Startcodon enthält
pBLS/TAIII 2 wurde vollständig mit EcoRI und HindIII gespalten und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch einen Vektoranteil von etwa 3 kbp zu gewinnen. Dann wurden die Adaptoren FR-1, FR-2 und FR-3, in der gleichen Weise wie in Beispiel 9 (5), jeweils in den vorstehend erwähnten pBLS/TAIII2 inseriert. Durch Analysieren der Basensequenzen wurden Plasmide erhalten, die jeweils einen Adaptor (FR-1, FR-2 oder FR-3) richtig darin inseriert hatten, und jeweils als Fr1-SK2, Fr2-SK2 und Fr3-SK2 bezeichnet.
(4) Insertion des cDNA-Fragments von FcγBP
Um den cDNA-Clon A53 im gleichen Leserahmen wie jenem von FcγBP zu exprimieren, wurde der cDNA-Anteil von A53 mit EcoRI herausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle von Fr3-SK2 inseriert. Dann wurde ein Plasmid ausgewählt, in welchem das 5'-Ende der cDNA auf der Seite des Startcodons lag, und als piF-A53 bezeichnet.
In ähnlicher Weise wurde das cDNA-Insert des Clons A8 in Fr2-SK2 inseriert, um dadurch piF-A8 zu ergeben.
Die so erhaltenen piF-A53 und piF-A8 wurden in der gleichen Weise wie beschrieben in Beispiel 11 (1) gereinigt und dann in einem Proteinexpressions-Experiment eingesetzt.
(5) Expression von piF-A53 und piF-A8
piF-A53 und piF-A8 wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 11-(2) in COS7-Zellen transfiziert. Nach Inkubation für 2 Tage wurden die Zellen unter Verwendung der monoclonalen Antikörper (K9/K17-Gemisch) durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 11 (3) gefärbt, um dadurch die vorläufig exprimierten Proteine nachzuweisen. Als Ergebnis wurden die mit piF-A53 transfizierten Zellen sowie jene, die mit piF-A8 transfiziert waren, beide mit den monoclonalen Antikörpern gefärbt, was darauf hindeutete, dass diese cDNAs irgendeinen Teil des Proteins codierten, welches durch einen oder beide monoclonalen Antikörper K9 und K17 erkannt wurde (9A und B). Es ist daher bewiesen worden, dass A53 und A8 jeweils ein Teil der wiederholten Sequenz der gesamten cDNA von FcγBP darstellen. Beispiel 17: Annahme der Anwesenheit von Clon NZ4 in der Nachbarschaft des 5'-Endes der FcγBP-mRNA (2)
Basierend auf den Ergebnissen der in Beispiel 7 durchgeführten Primer-Extension wurde angenommen, dass die Transkriptionsstartstelle innerhalb von etwa 20 Basen stromaufwärts des Clons NZ4 gelagert sein könnte, welche momentan am äußersten 5'-Ende des Sequenzverlaufs gelagert war; und dass das ATG auf Position 9 in NZ4 die Translationsstartstelle sein könnte. Das FcγBP-Gen wurde deshalb von der genomischen DNA-Bank isoliert, um zu untersuchen, ob das ATG im Leserahmen war oder nicht, oder das Stoppcodon stromaufwärts von NZ4 lokalisiert war und seine partielle Basensequenz wurde identifiziert.
(1) Genomische DNA-Bank
Als Genbank wurde eine im Handel erhältliche verwendet, die aus menschlichen Leukozyten (Vektor, EMBL3 SP6/T7, hergestellt von Clontech) stammt.
(2) Sonde
Als die Sonden, die zum Screening eingesetzt werden sollten, wurde eine verwendet, die durch Herausschneiden des cDNA-Clons NZ4 vom Vektor mit BamHI erzeugt wurde und das in Beispiel 7 eingesetzte synthetische Oligonucleotid, (Primer 2: (GCTCCAGCCCAGAGTATCCACCAGCTCCATAGG-33 mer) Markiert mit α[³²P]dCTP bzw. γ[³²P]ATP durch zufällige Primer-Markierung (NZ4) oder Endmarkierung (Primer 2).
(3) Screening
Das Screening mit der Sonde NZ4 wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren zum Screening einer cDNA-Bank, wie beschrieben in Beispiel 3, durchgeführt. Beim Screening mit der synthetischen Oligonucleotidsonde wurde andererseits die Formamid-Konzentration der Hybridisierungslösung auf 20% eingestellt und das Waschen wurde fünfmal bei 45°C für 30 Minuten in einer Lösung wiederholt, die 0,3 × SSC/0,1 % SDS enthielt.
Mit jeder Sonde wurde eine Genbank von 1.000.000 Clonen durchmustert. Als Ergebnis wurden 2 positive Plaques unter Verwendung der Sonde NZ4 erhalten, während 1 positiver Plaque unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotidsonde erhalten wurde. Jede Durchmusterung wurde wiederholt, bis alle Plaques positiv wurden.
(4) Extraktion der λDNA
Jeder positive Clon wurde unter Verwendung von Escherichia coli LE392 als Wirt in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren vermehrt und dann wurde die DNA extrahiert.
(5) Partielle Kartierung und Sequenzierung
Die vorstehend in (4) erhaltenen λ-DNAs (GHFc-1, 2 und 3) wurden vollständig mit Restriktionsenzymen (ApaI, BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, NcoI, PstI, SacI, ScaI, SmaI, SpeI, SphI, StuI, XbaI und Xhol) gespalten, auf einem 1 Agarosegel einer Elektrophorese und dann einem Southern-Blot unterzogen. Dann wurde jedes Gel für 30 Minuten in 0,25 N HCl getränkt und weiter zweimal unter Schütteln in einem Denaturierungspuffer (0,4 N NaOH/1,5 M NaCl) bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehen gelassen. Anschließend wurde es ferner zweimal unter Schütteln in einem Neutralisierungspuffer (1 M NH₄OAc/0,02 N NaOH) bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehen gelassen. Als Nächstes wurde jedes Gel auf 2 Nylonmembranen (bidirektionaler Transfer) transferiert und diese 2 Membranen wurden der Hybridisierung mit der Sonde NZ4 bzw. der synthetischen Oligonucleotidsonde unterzogen.
Positive Fragmente von GHFc-1, 2 (ApaI, EcoRI, SacI und XhoI) und GHFc-3 (BamHI, EcoRI und XbaI) wurden in einen pBlueskript-Vektor (hergestellt von Toyobo) subcloniert und einer teilweisen Sequenzierung unterzogen. Die Sequenzierung wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Beispiel 6 durchgeführt.
(6) Ergebnis
Als Ergebnis der partiellen Kartierung und Sequenzierung wurde herausgefunden, dass die Clone GHFc-1, 2 und 3 unabhängige Clone waren, die Inserts von etwa 15 kb (GHFc-1 und 2) und 13 kb (GHFc-3) aufwiesen und GHFc-1 überlappte teilweise mit GHFc-2. Introns, welche die GTiAG-Regel erfüllten, waren zwischen den Basen an den Positionen 63 und 64 gelegen und jene an den Positionen 1311 und 1312 der cDNA von FcγBP (10) und die Basensequenz der Exon-Region bis zur Position 1311, waren völlig identisch mit jener der cDNA (11). Ferner war die Sequenz, welche 5'stromaufwärts des cDNA-Clons NZ4 lag, in GHFc-3 enthalten und das Stoppcodon (TGA) im Leserahmen war 87 Basen stromaufwärts vom angenommenen Tranlationsstartcodon ATG, beschrieben in Beispiel 7 (d.h. 79 Basen stromaufwärts vom 5'-Ende von NZ4, dargestellt durch SEQ ID NR:1) gelagert. Sonst wurde kein anderes ATG im Leserahmen beobachtet. Diese Ergebnisse untermauern stark die Möglichkeit, dass das ATG im Clon NZ4, welches von der Base an der 9-Position startet, das Translationsstart-ATG des FcγBP-Gens ist.
Beispiel 18: Korrelation zwischen Struktur von menschlichem FcγBP und der Bindungsaktivität der IgG Fc-Region
Die bis jetzt erhaltene Proteinstruktur, welche die Aminosäuresequenz von der gesamten Basensequenz der cDNA von FcγBP angenommen wird, aufweist, ist eine, die eine einmalige Sequenz aufweist, in welcher eine Einheit bestehend aus etwa 400 Aminosäureresten im Gesamten 12-Mal wiederholt wird (R1-R12-Domäne) und eine Sequenz, bestehend aus 450 Aminosäuren (H-Domäne) und einer anderen Sequenz, bestehend aus etwa 200 Aminosäuren (T-Domäne) liegen vor und nach dem R1-R12-Teil. Wie 12 zeigt haben unter den Wiederholungs-Einheiten in der R-Domäne, die Einheiten R3, R6 und R9 eine Homologie von mindestens 95% miteinander. In ähnlicher Weise haben die Einheiten R4/R7/R10 und R5/R8/R11 jeweils eine Homologie von mindestens 95%. Andererseits haben die Einheiten R1 bis R5 eine Homologie von etwa 40% miteinander. Um die Funktion dieser Proteindomänen zu diskutieren wurden mutierte Clone, die einige Defekte in den cDNAs aufwiesen, abgetrennt und in COS-Zellen exprimiert. So wurden die Funktionen, einschließlich Bindungsaktivität an IgG usw. untersucht.
Wie 12 zeigt, setzte sich das partielle cDNA-Plasmid pNV11, welches in tierischen Zellen exprimiert worden war, um die Fc-Bindungsaktivität zu bestimmen, aus H, R1, R2, R3, R4, R5 und einem Teil von R6 zusammen. Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um klarzustellen welche Einheit die Fc- Bindungsaktivität aufweist. Und zwar wurden cDNA-Fragmente in einen Expressionsvektor SRα inseriert, von welchen ein Teil von NV11 deletierf worden war durch Spaltung und/oder neuer Bindung mit Restriktionsenzymen oder durch Ligation entsprechender Clone miteinander, um so einen passenden Aminosäureleserahmen zu erhalten, und dann wurde dadurch E. Coli XL-1 transformiert. Tabelle 1 zeigt die Sequenzen nach der Deletion eines Teils von NV11, ausgedrückt in den DNA-Basenzahlen. In der cDNA von NV11 wird die erste Base, von welcher die Translation in das Protein initiiert wird, als Nr. 1 bezeichnet, während die letzte Base als No. 7776 bezeichnet wird.
Der Expressionsvektor, welcher jedes cDNA-Fragment enthält, wurde von Escherichia coli gereinigt, vorläufig in COS7-Zellen in der gleichen Weise wie in Beispiel 11 exprimiert und dann mit der menschlichen IgG-Fc-Region und den für FcγBP spezifischen monoclonalen Antikörpern K9 und K17 gefärbt.
Ferner wurde die folgende Färbung durchgeführt, um die Hemmung der Bindung an die IgG-Fc-Region durch die monoclonalen Antikörper zu untersuchen. Die COS7-Zellen, welche die cDNA darin vorläufig exprimiert hatten, wurden mit Ethanol fixiert. Dann wurde durch Hitze denaturierter menschlicher IgG mit dem Hybridom-Kulturüberständen verdünnt, welche einen der beiden inhibierenden Antikörper K9 und K17 oder antiFcγRIII (ein Kontrollantikörper) enthielten, um so eine Konzentration von 1 μg/ml zu ergeben. Dann wurden die fixierten Zellen gemeinsam mit jedem Überstand inkubiert. Nachdem sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen wurden, wurden die Zellen weiter zusammen mit Meerrettich-Peroxydase-markiertem anti-Mensch-IgG (N+L)-Antikörper F(ab7)₂-Fragment inkubiert und dann wurde die Bindung des denaturierten IgGs nachgewiesen.
Die Ergebnisse sind wie folgt. Um zu untersuchen ob das Genexpressionsprodukt IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität aufwies oder nicht, wurde menschlicher IgG als der primäre Antikörper eingesetzt, während der mit Meerrettich-Peroxydase markierte anti-Mensch IgG-Antikörper als der sekundäre Antikörper eingesetzt wurde. IgG-Bindungsaktivität wurde in den Clonen festgestellt, welche die gesamte Sequenz der H-Domäne und darüber hinaus den gesamten Bereich von mindestens einer R-Einheit (NV11, NX, NZCY, ΔBssH, ΔTth, ΔSp1, ΔBssH/Tth, NXΔBssH und NZCV11) aufwiesen. Die Stärke der Färbung, die auf die IgG- Bindungsaktivität hindeutete, neigte dazu mit einer Erhöhung der Zahl der in dem Clon enthaftenden R-Einheiten stärker zu werden. Die Clone von denen die H-Domäne vollständig oder teilweise deletiert worden war (ΔHinc, ΔHinc/BssH, V11 und X1) und der Clon, der nur einen Teil einer R-Einheit aufwies (NZC), zeigten jedoch keine IgG-Bindungsaktivität.
Bezüglich der Färbung der Genprodukte mit den monoclonalen Antikörpern, wurden andererseits die Clone, welche die gesamte oder teilweise Sequenz von R5 aufwiesen (NV11, ΔHinc, ΔBssH, ΔTth, ΔSp1, ΔBssH/Tth, ΔHinc/BssH, NZCV11 und V11) mit dem monoclonalen Antikörper K9 gefärbt, während die Clone, welche die gesamte oder einen Teil der Sequenz von R3 oder R6 aufwiesen (alle Clone außer NZCY und NZC) mit dem monoclonalen Antikörper K17 angefärbt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass in den Clonen, welchen die H-Domäne fehlt (ΔHinc/BssH, V11 und X1), keine IgG-Bindungsaktivität erreicht werden konnte, obwohl darin die mit den FcγBP-spezifischen Antikörpern reagierenden Proteine produziert wurden. Es wird daher vorgeschlagen, dass die H-Domäne eine Funktion aufweisen würde, die für Verleihung der IgG-Bindungsaktivtät an die Produkte der R-Domäne unbedingt benötigt wird. Der Clon NZC zeigte keine IgG-Bindungsaktivität und war in der K9/K17-Färbung negativ, was darauf hindeutet, dass die R-Einheiten (R1 bis R5) der IgG-Bindungsstelle entsprechen.
Nachfolgend wird von den Ergebnissen der Inhibierung der IgG-Bindung durch die monoclonalen Antikörper K9 und K17 berichtet werden. Tabelle 1 fasst die inhibierenden Effekte auf jeden Klon zusammen.

(1) Die IgG-Bindungsaktivitäten der Clone, welche mindestens eine R-Einheit zusätzlich zu R3 und R5 (NV11, ΔTth und NZCV11) aufweisen, wurden bis zu einem gewissen Grad durch K9 und K17 inhibiert. Wenn diese Antikörper zusammen gegeben wurden, war die Inhibierung verstärkt, obwohl keine vollständige Inhibierung stattfand.
(2) Die IgG-Bindungsaktivität des Clons, der mindestens eine R-Einheit zusätzlich zu R3 (NX) aufweist, wurde durch K17 nicht vollständig aber bis zu einem gewissen Grad inhibiert. Die Aktivität dieses Clons wurde nie durch K9 inhibiert.
(3) Die IgG-Bindung des Clons, der R3 alleine enthält (NXΔBssH), wurde durch K17 vollständig inhibiert. Im Gegensatz dazu wurde die Bindung durch K9 nicht beeinflusst.
(4) Die IgG-Bindung des Clons, der R5 alleine enthält (ΔBssH/Tth) wurde von K9 vollständig inhibiert. Im Gegensatz dazu wurde die Bindung durch K 17 nicht beeinflusst.
(5) Sowohl K9 als auch K17 haben die IgG-Bindung des Clons, der weder R3 noch R5 enthielt (NZCY), nicht inhibiert.
(6) Die Inhibierung der IgG-Bindung durch den Kontrollantikörper (antiFcγRIII-Antikörper) wurde in keinem der Clone beobachtet.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde angenommen, dass die IgG-Fc-Bindungsstellen im R1-R5-Bereich, einschließlich R3 und R5, liegen und dass jeder R-Bereich unabhängig an IgG binden kann. Es wird außerdem die Möglichkeit aufgezeigt, dass 2 oder mehrere IgGs an die cDNA-Clone gebunden sein können, die 2 oder mehr R-Einheiten aufweisen (NV11, usw.). Diese Tatsachen deuten darauf hin, dass jede von R1 bis R12 bei Berücksichtigung der Homologie in den Aminosäuresequenzen, die IgG-Bindungsstelle aufweisen kann.

Beispiel 19: Partielle Analyse des FcγBP-Genomgens
(Bestimmung der Transkriptionsstartstelle)
Basierend auf den Ergebnissen der in Beispiel 7 durchgeführten Primer-Extension, wurde angenommen, dass die Transkriptionsstartstelle innerhalb von 20 Basen stromaufwärts von Clon NZ4 gelegen sein könnte, der momentan am äußersten 5'-Ende des Sequenzverlaufs gelegen war; und dass das ATG an der Position 9 im NZ4 die Translationsstartstelle sein könnte. Um zu überprüfen ob das ATG im Leserahmen vorlag oder nicht, oder ob das Stoppcodon stromaufwärts von NZ4 gelegen war, wurde daher das FcγBP-Gen von der genomischen DNA-Bank isoliert und seine partielle Basensequenz wurde identifiziert.
Ferner wurde die Transkriptionsstartstelle durch S1-Kartierung genauer bestimmt.
(1) Genomische DNA-Bank
Als Genbank wurde von einer im Handel erhältlichen Gebrauch gemacht, die ihren Ursprung in menschlichen Leukocyten hatte (Vektor, EMBL3 SP6/T7, hergestellt von Clontech).
(2) Sonde
Als Sonde für das Screening wurde von einer Gebrauch gemacht, die durch Herausschneiden des cDNA-Clons NZ4 mit BamHI aus dem Vektor erzeugt wurde und dem in Beispiel 7 angewandten synthetischen Oligonucleotid (Primer 2: (GCTCCAGCCCAGAGTATCCACCAGCTCGATAGG-33 mer), markiert jeweils mit α[³²P]dCTP und γ[³²P]ATP durch zufällige Primermarkierung (NZ4) oder Endmarkierung (Primer 2).
(3) Screening
Das Screening mit der Sonde NZ4 wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, gemäß dem Verfahren zum Screening einer cDNA-Bank durchgeführt. Beim Screening mit der synthetischen Oligonucleotidsonde wurde die Formamid-Konzentration der Hybridisierungslösung andererseits auf 20% eingestellt und das Waschen wurde bei 45°C jeweils für 30 Minuten 5 mal in einer Lösung wiederholt, die 0,3 × SSC/0,1% SDS enthielt.
Mit jeder Sonde wurde eine Genbank von 1.000.000 Clonen durchmustert. Als ein Ergebnis wurden 2 positive Plaques durch die Verwendung der Sonde NZ4 erhalten, während 1 positiver Plaque durch Verwendung der synthetischen Oligonucleotidsonde erhalten wurde. Jedes Screening wurde wiederholt, bis alle Plaques positiv waren.
(4) Extraktion der λ-DNA
Jeder positive Clon wurde unter Verwendung von Escherichia coli LE392 als Wirt in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren vermehrt und dann wurde die DNA extrahiert.
(5) Partielle Kartierung und Sequenzierung
Die vorstehend in (4) erhaltenen λDNAs (GHFc-1, 2, und 3) wurden vollständig mit den Restriktionsenzymen (ApaI, BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, NcoI, PstI, SacI, ScaI, SmaI, SpeI, SphI, StuI, XbaI und XhoI) gespalten, auf einem 1 Agarosegel einer Elektrophorese und dann einem Southern-Blot unterzogen. Dann wurde jedes Gel mit 0,25 N HCl, 0,4 N NaOH/1,5 M NaCl und 1 M NH₄Ac/0,02 N NaOH jeweils zweimal für 15 Minuten behandelt. Als Nächstes wurde jedes Gel auf 2 Nylonmembranen transferiert (bidirektionaler Transfer) und diese beiden Membranen wurden einer Hybridisierung mit der Sonde NZ4 bzw. der synthetischen Oligonucleotidsonde unterzogen.
Positive Fragmente von GHFc-1, 2 (Apal, EcoRI, SacI und XhoI) und GHFc-3 (BamHI, EcoRI und XhoI) wurden in einen pBlueskript-Vektor (hergestellt von Toyobo) subcloniert und einer partiellen Sequenzierung unterzogen. Die Sequenzierung wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 ausgeführt.
(6) S1-Kartierung
Einzelsträngige DNA wurde als eine Matrize zur Konstruktion der S1-Sonde verwendet, die durch Subclonierung des EcoRI/SacI-Fragments (entsprechend etwa 2 kb stromaufwärts von NZ4 im cDNA-Clon) des Clons GHFc-3 in pBluescript SK⁺ erzeugt wurde und mit einem Helferphagen VCSM13 behandelt wurde. An diese Matrize wurde der in der Primer-Extention verwendete markierte Primer 2 angelagert, gefolgt von der Synthese mit BcaBEST-Polymerase (hergestellt durch Takara) bei 65°C für 10 Minuten. Dann wurde das Syntheseprodukt mit BamHI gespalten, mit Hitze denaturiert und durch Verwendung eines 7,5% Polyacrylamidgels, das 8 M Harnstoff enthielt, aufgetrennt. Dann wurde das Zielgel herausgeschnitten. Das auf diese Weise herausgeschnittene Gel wurde in G-Puffer (1 M NH₄AC, 20 mM Mg(OAc)₂, 0,1 M EDTA, 0,2% SDS, 10 μg/ml Hefe-tRNA) bei 37°C über Nacht inkubiert, um dadurch die Sonde zu eluieren. Diese S1-Sonde (1 × 10⁵ cpm) wurde mit 40 μg aller RNAs, die aus nicht-menschlichen Colon-Epithelzellen stammen und 1,5 μg polyA ⁺RNA gemischt. Nach Ausfällung aus Ethanol wurde der Niederschlag in 20 μl einer S1-Hybridisierungslösung aufgelöst (80% Formamid, 40 mM PIPES, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA). Nach der Behandlung bei 80°C für 10 Minuten wurde er bei 42°C über Nacht einer Hybridisierung unterzogen. Dann wurden dazu 200 μl einer S1-Lösung hinzugefügt [30 mM NaOAc (pH-Wert 4,6), 280 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 1 mg/ml einzelsträngige DNA, 150 U S1-Nuclease], gefolgt von Spaltung bei 37°C für 40 Minuten. Als Nächstes wurde sie auf einem 6% Sequenzgel einer Elektrophorese unterzogen und das Gel wurde fixiert, getrocknet und einer Autoradiographie unterzogen.
Ergebnisse und Diskussion
Als Ergebnisse der partiellen Kartierung und Sequenzierung wurde herausgefunden, dass die Clone GHFc-1, 2 und 3 unabhängige Clone waren, welche Inserts von etwa 15 kb (GHFc-1 und 2) und 13 kb (GHFc-3) aufweisen und GHFc-1 überlappte GHFc-2 teilweise. Introns, welche der GT/AG-Regel entsprachen lagen zwischen den Basen an der Position 63 und 64 und jenen, an den Positionen 1311 und 1312 der cDNA von FcγBP und die Basensequenz des Exon-Bereichs bis zur Position 1311 war vollkommen identisch mit jener der cDNA (10 und 11). Ferner war die Sequenz 5'-stromaufwärts vom cDNA-Clon NZ4 in GHFc-3 enthalten und das Stoppcodon (TGA) lag im Laserahmen 87 Basen stromaufwärts von dem in Beispiel 7 beschriebenen vermuteten Translationsstartcodon ATG (d.h. 79 Basen stromaufwärts vom 5'-Ende von NZ4). Sonst wurde kein anderes ATG im Leserahmen beobachtet. Diese Ergebnisse untermauern stark die Möglichkeit, dass das ATG, welches von der Base an Position 9 im Clon NZ4 beginnt, das Translationsstart-ATG des FcγBC-Gens ist. Ferner war kein typisches Promotormotiv (TATA/CCAAT usw.) innerhalb von etwa 2 kbp 5'-stromaufwärts vom NZ4 vorhanden. Die Ergebnisse der S1-Kartierung deuteten darauf hin, dass die Banden der entsprechenden Längen 8, 9 und 10 Basen stromaufwärts von diesem ATG beobachtet wurden. Unter diesen Banden zeigte die eine des A-Rests auf Position 10 das stärkste Signal, was darauf hindeutet, dass die Transkription von diesem A-Rest initiiert werden würde.
Beispiel 20: Analyse des Polymorphismus des FCγBP-Gens
Als ein Ergebnis der Sequenzierung der cDNA von FcγBP wurde darauf hingewiesen, dass der Polymorphismus an spezifischen Stellen im codierenden Bereich stattfand. Und zwar wurde die Sequenz CCCGGG an den SmaI-Stellen, die an den Positionen 5120, 8723 und 12326 in der cDNA von FcγBP lag, durch CCTGGG im gleichen Bereich des Clons A52 ersetzt. Die Genbank, die zum Screening der cDNA eingesetzt wurde, stammte nicht aus Genen einer einzelnen Person, sondern aus verschiedenen Testpersonen. Demgemäß wurde das folgende Experiment durchgeführt, um zu bestätigen, ob der vorstehend erwähnte Basenaustausch unter Individuen beobachtet wurde, oder in der Haupt-Wiederholungssequenz (dreimal) pro haploidem Genom in einem einzelnen Individuum.
Die folgenden 2 Primer wurden als die Primer auf der Vorwärts-Seite synthetisiert:
BC1: ACCACTCCTTCCATGGCC, und
GS1: ACCTGTAACTATGTGCTGGC.
Andererseits wurden die folgenden 4 Primer als Primer der Reversen-Seite synthetisiert:
GS2: TGGTGGTGACGGTGAAGGG,
GS3: ACAGCAGGTTGCCCCGG,
GS4: TGGTGCCGAGGGCAGCCACG,
BC2: TGGGTCACTGAAATCCG.
Ferner wurden Leukocyten von 6 gesunden Testpersonen und Kolon-Epithelzellen von normalen Teilen von 4 Patienten mit Krebs aufgetrennt und die DNAs wurden davon durch das Verfahren von Nelson et al. extrahiert. Zu 20 ng von jeder DNA wurden die Primersets BC1/BC2, BC1/GS3, BC1/GS4, GS1/GS3 und GS1/GS4 hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 20 pmol zu erzeugen. Dann wurde PCR in einem PCR-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 200 μM dNTPs, 0,001 % Gelatin, 2,5 U Taq-Polymerase] in 30 Zyklen durchgeführt, jeder Zyklus bestand aus 94°C für 1 Minute, 60°C für 1,5 Minuten und 72°C für 2,5 Minuten. Die PCR-Produkte wurden mit SmaI gespalten, einer Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel unterzogen und dann mit Ethidiumbromid gefärbt.
Als Ergebnis der SmaI-Behandlung der PCR-Produkte für die Primersets wurde festgestellt, dass in jedem der Primersets, außer in BC1/BC2 Polymorphismus beobachtet wurde.
Und zwar war unter den 10 DNA-Proben eine vollständig mit SmaI gespalten. Demgemäß hatte diese Probe die SmaI-Stellen zumindest in allen der 6 Wiederholungseinheiten, welche die Allele umfassten. Im Gegensatz dazu wurden die SmaI-gespaltenen und die nicht-gespaltenen Produkte in verschiedenen Verhältnissen in anderen Proben beobachtet. Im Gegensatz dazu war keine dieser 10 Proben frei von irgendeiner SmaI-Stelle. Darüber hinaus wurde RT-PCR in HT-29N2-Zellen unter Verwendung des gleichen Primersets durchgeführt, gefolgt von Spaltung mit SmaI. Als Ergebnis enthielten alle diese Proben die Stellen.
Die Primer BC1/BC2 zeigten keinen Polymorphismus. Das ist anscheinend, weil das PCR-Produkt eine Kettenlänge von etwa 1,8 kbp hatte und daher kein Intron (etwa 1,6 kbp) zwischen dem GS4 Primer und dem BC2 Primer vorhanden war und die SmaI-Stelle am 5'-Ende dieses Introns lag. Daher wurde angenommen, dass kein Polymorphismus nachgewiesen wurde, da die vorstehend erwähnte Stelle überaus nahe an der Ziel-SmaI-Stelle lag, die Polymorphismus zeigte und sich das BC1/BC2-Amplifikationsprodukt in der Kettenlänge kaum vom SmaI-Spaltungsprodukt unterschied.
Beispiel 21: Trennung der induzierbaren Hoch-Expressions-CHO-Zelllinie und Nachweis von FcγBP
Um eine Zelllinie zu etablieren, die im Stande ist eine große Menge des in Beispiel 11 beschriebenen FcγBP-Fragments in einem stabilen Zustand zu exprimieren, wurde NV11 St (d.h. die partielle FcγBP-cDNA) unter Verwendung von pMSXND, eines Expressionsvektors für tierische Zellen, exprimiert. Der pMSXND Vektor weist einen Metallothionein-Promotor als ein Expressionspromotor auf, der die Expression eines Proteins mit Natrium-Butyrat usw. induzieren kann und der in einer solchen Weise konstruiert ist, dass er das dhfr-Gen aufweist, welches nach der Integration in chromosomale DNA Genamplifikation ermöglicht.
(1) Änderung des Vektors pMSXND
Zuerst wurde das Plasmid entsprechend der cDNA-Clonierungsstelle von pMSXND, vollständig mit XhoI gespalten. Anschließend wurde es durch Behandlung mit 0,4 U Klenow-Fragment für 15 Minuten mit glatten Enden versehen.
Als Nächstes wurde der NotI-Linker (5'-pGCGGCCGC-3') an den Vektor ligiert, gefolgt von einer vollständigen Spaltung mit NotI. Nach der Beendigung der Autoligation wurden dadurch kompetente E. coli XL1-B transformiert. Die auf diese Weise erhaltenen Klone wurden analysiert, um dadurch ein Plasmid pMSXND-NOT zu ergeben, in welchem der NotI-Linker in die XhoI-Stelle von pMSXND inseriert war.
(2) Insertion von cDNA
pMSND-NOT wurde vollkommen mit NotI gespalten und dann durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Als Nächstes wurde das Plasmid pNV11-ST, das im Beispiel 6-(6) erzeugt wurde und darin die FcγBP-cDNA integriert hatte, vollständig mit NotI gespalten und einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterzogen, um dadurch ein cDNA-Fragment von 8 kbp abzutrennen und zu gewinnen. Diese Expressionsvektoren wurden an das cDNA-Insert ligiert und kompetente E. coli (XL1-B) wurde dadurch transformiert. Von den durch Inkubation der Transformanten auf einer Ampicillin-enthaltenden LB-Platte gebildeten Kolonien wurde ein Plasmid ausgewählt, in welchem die cDNA in der Sense-Richtung zum Metallothionein-Promotor inseriert worden war und als pNV11-MSX bezeichnet.
(3) Expression von partieller cDNA der IgG-FcBP-Region in CHO-Zellen
Die Plasmid pNV11-MSX enthaltenden Escherichia coli wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 11 beschrieben inkubiert und das so amplifizierte Plasmid wurde gereinigt. Dann wurden 10 μl dieses Plasmids, aufgelöst in 250 μl F-12-Medium (Nucleotide enthaltend), mit 10 μl eines Lipofektamin-Reagens (Transfectum, hergestellt von Sepacor), das in 250 μl F-12-Medium aufgelöst war gemischt und das resultierende Gemisch wurde sofort auf CHO-Zellen (dhfr-defiziente Linie) gegeben. Nach Inkubation bei 37°C für 6 Stunden wurde das Medium durch F-12-Medium ersetzt, das 10% Serum enthielt und die Inkubation wurde für 3 Tage fortgesetzt. Als Nächstes wurde das Medium durch α-MEM-Medium ersetzt (Nucleotid-frei, hergestellt von Gibco), das 1 mg/ml G418 und 10% fötales Rinderserum enthielt. Dann wurde die Inkubation für 14 Tage durchgeführt während das Medium in Intervallen von 3 Tagen ersetzt wurde. Als Nächstes wurden Zellen ausgewählt, die ein Plasmid darin inseriert hatten. Die Zellen wurden auf diese Weise durch die limitierende Verdünnungsanalyse von einer Schale cloniert in welcher sich mehrere Dutzend Kolonien gebildet hatten. Unter den so erhaltenen Zellclonen wurden jene ausgewählt, die Expression des Plasmids mit hoher Fc-Bindungsaktiviät zeigten. Anschließend wurde Genamplifizierung durchgeführt, um die Expressionsausbeute zu erhöhen.
(4) Genamplifikation
Das integrierte Gen wurde durch Behandlung mit Methotrexat amplifiziert, um so die Expressionsausbeute des Proteins durch den Zellclon zu erhöhen, der pNV11-MSX integriert in das Chromosom von CHO-Zellen aufwies und in der Lage war das FcγBP-Fragment stabil zu exprimieren.
Und zwar wurde der vorstehend erwähnte Zellclon, der stabile Expression zeigte, für 3 bis 4 Wochen in α-MEM-Medium (Nucleotid-frei) inkubiert, das 0,005 μM Methotrexat und 500 μg/ml G418 enthielt und die auf diese Weise gezüchteten Zellen wurden ausgewählt. Als Nächstes wurde die Methotrexat-Konzentration 4-fach erhöht (0,02 μM) und die Inkubation wurde in der gleichen Weise für weitere 3 bis 4 Wochen fortgesetzt. Das Verfahren der 4-fachen Erhöhung der Methotrexat-Konzentration, gefolgt von Inkubation, wurde wiederholt, um dadurch schließlich Zellen zu ergeben, die sich in der Anwesenheit von 6,4 bis 25 μM Methotrexat vermehrten. Diese Zellen wurden durch die limitierte Verdünnungsanalyse cloniert, um dadurch eine Zelllinie mit hoher Expression des FcγBP-Fragments zu ergeben. Ähnlich zu den Beispielen 11 und 12 wurde die Erhöhung der Expressionsausbeute durch das primäre Beurteilen mittels histochemischer Färbung mit den monoclonalen Antikörpern K9/K17 bestimmt oder durch den Nachweis der IgG-Bindungsaktivität.
(5) Erzeugung der Zellprobe
5 × 10⁵ Zellen der CHO-Zelllinie, die das FcγBP-Fragment stabil mit hohem Ertrag exprimieren konnten, wurden in eine Schale transferiert (Durchmesser: 100 mm) und in α-MEM-Medium inkubiert, das 6,4 μM Methotrexat und 1 mg/ml G418 enthielt. Wenn notwendig, wurde Natriumbutyrat in einer Menge hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 5 mM zu ergeben, und dadurch die Expression des Proteins zu induzieren. Nach 3 Tagen wurde der Kulturüberstand (SUP1) gewonnen. Dann wurde SUP1 bei 100.000 × g für 60 Minuten zentrifugiert, um dadurch Zellstücke davon zu entfernen und der Überstand (SUP2) wurde gewonnen. Die Zellen wurden in 500 μl eines Cytolysepuffers aufgelöst [50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 mM Monoiodo-Acetamind, 10 μg/ml Approtinin, 10 μg/ml Leupeptin] und der Ultraschallbehandlung (30 Sekunden × 3 mal) und Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten bei 4°C unterzogen. Nach der Beendigung der Zentrifugation wurde der Überstand (Lys1) eliminiert. Zu diesem Rückstand wurden 400 μl des Cytolysepuffers hinzugefügt, der 1 % NP-40 enthält, gefolgt von Ultraschallbehandlung und Zentrifugation. Nach Gewinnung des Überstands (LYS2) wurde der Rückstand in 200 μl Cytolysepuffer aufgelöst, der 1 % NP-40, 0,1% SDS und 0,5% Natrium-Desoxycholat enthält, gefolgt von Ultraschallbehandlung und Zentrifugation. Nach Gewinnung des Überstands (LYS3) wurde der Rückstand in 100 μl des Cytolysepuffers aufgelöst (LYS4). Als eine Kontrolle wurden die Lösungen von Kolon-Epithelzellen (verdünnt 100- bis 3.200-fach) verwendet.
(6) Sandwich ELISA
Um das so erzeugte FcγBP-Fragment quantitativ nachzuweisen, wurde unter Verwendung der monoclonalen Antikörper K9 und K17 ein Sandwich-ELISA-System entwickelt, das spezifisch für FcγBP war. Der Antikörper K9, der durch Affinitätschromatographie gereinigt war, wurde in einem 0,05 M Carbonatpuffer (pH-Wert 9,2) in einer derartigen Weise aufgelöst, um eine Konzentration von 5 μg/ml zu ergeben und zu einer ELISA-Platte (PRO-BIND, hergestellt von Falcon) in einem Verhältnis von 50 μl/Vertiefung hinzugefügt. Nach dem Stehenlassen bei 4°C über Nacht, wurden die Vertiefungen mit einer Waschflüssigkeit dreimal gewaschen [PBS (-) enthaltend 0,05% Tween-20]. Dann wurde 50 μl/Vertiefung einer Blockierungslösung (RPIM 1640-Medium, enthaltend 10% Serum) hinzugefügt und die Platte wurde bei Raumtemperatur für 60 Minuten stehen gelassen.
Nach Eliminierung der Blockierungslösung wurden 50 μl Anteile der vorstehend in (5) erzeugten Proben hinzugefügt und die Platte wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden stehen gelassen. Nach dreimaligem Waschen mit der Waschflüssigkeit wurden 50 μl an mit Meerrettich-Peroxydase markiertem K17-Antikörper hinzugefügt, der mit der Blockierungslösung verdünnt worden war, um eine Konzentration von 4 mg/ml zu ergeben und die Platte wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde zu stehen gelassen. Dann wurde sie dreimal mit der Waschflüssigkeit gewaschen und 50 μl einer Farbentwicklungslösung [20 mg O-Phenylendiamin und 80 μl N₂O₂ (30%) aufgelöst in 50 ml Citratpuffer] wurden hierzu hinzugefügt, gefolgt von Farbentwicklung bei Raumtemperatur für 3 Minuten. Anschließend wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 50 μl einer 2,5 M H₂SO₄-Lösung beendet und die Absorption bei 492 nm gemessen.
[Ergebnis]
(i) Eine vorstehend erhaltene typische CHO-Zelllinie, die FcγBP-Expression zeigt
Nach Inkubation in der Anwesenheit von Methotrexat, wahlweise gefolgt von der Behandlung mit Natriumbutyrat, wurde die Expressionsausbeute des FcγBP-Fragments nach 3 Tagen durch das Zellfärbeverfahren unter Verwendung der monoclonalen Antikörper K9/K17 nachgewiesen. Auf diese Weise konnte, wie in 13 gezeigt, eine Zelllinie mit einer hohen Expressionsausbeute isoliert werden.
(ii) Ergebnisse der Bestimmung des FcγBP-Fragments durch ELISA
Die von der Zelllinie erhaltenen Proben mit einer hohen Expressionsausbeute an FcγBP-Fragment wurden einem Sandwich-ELISA unterzogen. Als Resultat davon enthielten die Cytolyse-Lösungen (LYS1-LYS4) das FcγBP-Fragment in größeren Mengen als die Kulturüberstände (SUP1-SUP2), wie gezeigt in den in der folgenden Tabelle aufgeführten Absorptionen. Diese Tatsache weist darauf hin, dass das so exprimierte FcγBP-Fragment nicht in den Zellen akkumulierte, sondern davon abgesondert wurde. Tabelle 2
[Sequenzprotokoll]

Claims

DNA, die ein Protein mit IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNAs, die ein Polypeptid codieren, umfassend die Aminosäuresequenz wie in der ursprünglich eingereichten SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 angegeben; (b) DNAs, umfassend die in der ursprünglich eingereichten SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 angegebene Nucleotidsequenz; (c) DNAs, die mit einer wie in (a) oder (b) definierten DNA hybridisieren und die ein Protein mit IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität codieren; und (d) DNAs, deren Nucleotidsequenz aufgrund des genetischen Codes gegenüber einer Nucleotidsequenz einer wie in (a), (b) oder (c) definierten DNA degeneriert ist und die ein Protein mit IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität codieren.
DNA gemäß Anspruch 1 die in ein pNV11-ST-Plasmid (FERM BP-4625) inseriert wurde.
Rekombinanter Vektor, der die DNA gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.
Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen, die mit einem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 3 transformiert sind.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, das die Inkubation der Wirtszellen gemäß Anspruch 4 und das Abtrennen und Reinigen des auf diese Weise hergestellten Proteins umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins gemäß Anspruch 5, wobei das rekombinante Protein eine IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität aufweist.
Rekombinantes Protein, das eine IgG-Fc-Region-Bindungsaktivität aufweist, das von einer DNA gemäß Anspruch 1 oder 2 codiert wird oder das durch die intrazelluläre oder extrazelluläre Abtrennung und Reinigung der Kultur erhalten wird, die durch Inkubation der Wirtszellen gemäß Anspruch 4 erhalten wurde.
Verfahren zur Identifizierung eines Gewebes, das mRNA des IgG-Fc-Region-bindenden Proteins synthetisiert, durch Northern-Blotting oder in situ- Hybridisierung unter Verwendung der DNA gemäß Anspruch 1 oder 2 als Sonde.
Arzneimittel oder diagnostische Zusammensetzung, umfassend eine DNA gemäß Anspruch 1 oder 2 und/oder ein Protein gemäß Anspruch 7.