WO1995027057A1 - GENE CODANT LA PROTEINE DE LIAISON IgG-Fc - Google Patents

GENE CODANT LA PROTEINE DE LIAISON IgG-Fc Download PDF

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WO1995027057A1
WO1995027057A1 PCT/JP1995/000638 JP9500638W WO9527057A1 WO 1995027057 A1 WO1995027057 A1 WO 1995027057A1 JP 9500638 W JP9500638 W JP 9500638W WO 9527057 A1 WO9527057 A1 WO 9527057A1
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PCT/JP1995/000638
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Minoru Morikawa
Naoki Harada
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)

Definitions

  • the present invention describes a protein that specifically binds to the Fc portion of immunoglobulin G (IgG); a protein that binds to the IgGF c portion (FcaBP: FcyBinding Protein and IgGFcBP).
  • IgG immunoglobulin G
  • FcaBP FcyBinding Protein and IgGFcBP
  • Macrophages as one of the immunocompetent cells, take up foreign substances and their immunoglobulin G (IgG) complex, which have entered from outside the body, by phagocytosis, digest them, and digest them by lymphocytes. It also has the ability to exhibit antigen presentation to induce antibody production.
  • the main entrance of such a phagocytic mechanism is the IgG Fc receptor (Fc7 receptor: FcR) present on the cell surface of macrophages.
  • the Fc receptor is a receptor that binds the Fc portion of IgG, but its primary function is to remove the IgG-covered (opsonized) pathogen or antigen-IgG immune complex. .
  • Fc7 receptors roughly three types have been known, and these are termed RI, RII, and RIII (JV Ravetch and J.-P. Kinet, Annu.Rev.Immunol. 1991), 9: 457-492). All of these receptors have already been cloned for their cDNA. In addition, from 1990 to 1991, several groups identified proteins that were associated with these Fc7 receptors and that initiate the necessary movement of the Fc7 receptor to incorporate its conjugate. The mechanism of the switch mechanism was revealed (LLLanier, G. Yu and JH Phillips, Nature (1989), 342: 803-805; T.
  • FcyBP protein FcyBP that can specifically bind to the Fc portion of IgG in human small intestine and colonic epithelial cells, especially goblet cells, and that differs from the conventional Fcr receptor. Specific binding of this protein to the IgGF c moiety has been confirmed using horseradish peroxidase (HRP) label. That is, Fc7BP binds only to the Fc portion of IgG, and does not bind to IgGFab, IgA, or IgM. FcaBP does not cross-react with Fcareceptor I, II, or III antibodies (K. Kobayashi, M. J. Blaser and W. R. Brown, J. Immunol. (1989), 143: 2567-2574).
  • HRP horseradish peroxidase
  • Fc7BP human colon epithelial cells
  • mouse monoclonal antibodies they partially purified Fc7BP from human colon epithelial cells and used them as antigens to produce mouse monoclonal antibodies. It was confirmed that these antibodies not only bind to FcrBP but also to mouse IgG (K. Kobayashi, Y. Hamada, MJ Blaser and WR Brown, J. Immunol. (1991), 146: 68-74).
  • FcrBP was found to be 200 kD containing a protein with a molecular weight of 78 kDa. It was clarified that a complex of a or more was formed (K. Kobayashi, Y. Hamada, MJ Blaser and WR Brown, J. Immunol. (1991), 146: 68-74).
  • the F c BP exhibits the same properties as the F c receptor in that it can bind to the F c portion of IgG.
  • the stability, structure and role of FcaBP as a protein in vivo were not clear at all. Therefore, it is of great interest to analyze FcyBP and elucidate its structure and function.
  • F cy BP is secreted on the mucous membrane together with mucus, and together with IgG antibodies, pathogenic bacteria and viruses that try to enter the body are trapped in the mucus to facilitate excretion outside the body. However, it is presumed that it plays a part in infection control.
  • FcrBP for such a medical use, it was necessary to obtain FcrBP in a large amount and uniformly.
  • FcrBP it has been difficult to obtain a large amount of uniform Fc7BP by the method of isolating FcBP from the animal tissue itself or the culture supernatant of cells producing the FcBP. Therefore, it has been desired to produce FcaBP in large quantities using genetic recombination technology.
  • the present inventors have succeeded in elucidating the nucleotide sequence of the gene encoding Fca BP by cloning the cDNA of Fca BP using a monoclonal antibody against Fca BP. .
  • the present invention provides a gene encoding FcyBP.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding FC7BP.
  • the present invention further provides a prokaryotic or eukaryotic host cell transformed with a recombinant vector containing a gene encoding FcABP.
  • the present invention further provides a method for culturing a transformant obtained by transformation using a recombinant vector containing a gene encoding FcaBP, and isolating and purifying the produced target protein.
  • a method for producing F c BP which is characterized by:
  • the present invention further provides a protein produced by the above-mentioned production method, which has an activity of binding to an IgG c portion.
  • the present invention further provides the use of the gene encoding FcABP or a part thereof as a probe for Northern plot analysis or in situ hybridization for identifying a synthetic tissue of FcyB PmRNA.
  • FIG. 1 is a diagram (photograph of electrophoresis) showing the results of hybridization of FcrBP mRNA performed using probe Q.
  • FIG. 2 shows the partial cDNA (about 7.8 kbp) used for the expression of FcBP, and the interrelationship of clones NZ4, C72, Yl, XI and VI1.
  • FIG. 3 is a diagram (a photograph showing the morphology of an organism) confirming the protein expressed in COS 7 cells transformed with vector-pNV11-SR.
  • A used a K9 monoclonal antibody-producing hybridoma culture supernatant
  • B used a K17 monoclonal antibody-producing hybridoma culture supernatant.
  • HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (H + L) F (ab ') 2 fragment was added as a secondary antibody to any of the control c to which no primary antibody was added.
  • FIG. 4 is a diagram (photograph showing the morphology of an organism) showing the ability of a protein expressed by COS 7 cells transformed with vector-1 pNVl1-SR to bind human IgG.
  • HRP-conjugated human IgG was used as a primary antibody in each case.
  • the secondary antibodies used as antagonists are as follows: A: not added (control), B: chromatographically purified human IgG fraction, C: chromatographically purified human IgG Fc fraction.
  • FIG. 5 is a diagram (photograph showing the form of an organism) showing the ability of a protein expressed by COS 7 cells transformed with the vector pNV 11-SR to bind human IgG.
  • HRP-conjugated human IgG was used as a primary antibody in each case.
  • the secondary antibodies used as antagonists are as follows; D: chromatographically purified human IgG F (a b ′) 2 fractions, E: chromatographically purified human IgM fraction, F: chromatographically purified human serum IgA, G: chromatographically purified human secretory IgA.
  • FIG. 6 is a Northern blot diagram (photograph of electrophoresis) showing the specificity of expression of FC7BP mRNA in human tissues.
  • FIG. 7 is a diagram (photograph of electrophoresis) showing a Northern blot analysis of FcaBPmRNA in colonic mucosal epithelial cells carried out using probes Q, A and Y.
  • FIG. 8 is a diagram showing the structure of full-length cDNA of FcBP.
  • FIG. 9 is a diagram (photograph showing the form of an organism) showing the binding ability of COS 7 cells transformed with plasmids pF-A53 and pF-A8 to a mixed solution of monoclonal antibody K9ZK17.
  • FIG. 10 is a diagram showing a comparison of the nucleotide sequence of the exon intron boundary region of FcyBP. Uppercase letters (boxes) indicate exons, lowercase letters indicate introns. The underlined part indicates a highly conserved sequence.
  • R Purine
  • y Pyrimidine.
  • FIG. 11 is a diagram showing the nucleotide sequence near the translation initiation site on the 5 ′ side of Fca BP genomic DNA.
  • Uppercase letters indicate ⁇ xon, lowercase letters indicate introns.
  • the underlined portion indicates the same portion as the cDNA, and the bold-shaded characters indicate the TGA stop codon at inframe and the ATG codon presumed to be the translation initiation site.
  • the number is set to +1 at the 5 'end of cDNA clone NZ4, and the number is given only above exon.
  • FIG. 12 shows the structure of human FcaBP and the corresponding position of each clone used in the present invention.
  • FIG. 13 shows CHO cells expressing the Fca BP fragment (photograph showing the morphology of the organism).
  • A shows methotrexate 6.4 M without sodium butylate treatment
  • B shows methotrexate 6.4 fiM ⁇ 5 mM after sodium butyrate treatment.
  • CDNA encoding FcrBP is prepared, for example, by preparing mRNA from cells producing FcrBP and converting it to double-stranded cDNA by a known method. Can be obtained.
  • human colon mucosal epithelial cells were used as a source of mRNA, but the present invention is not limited to this.
  • Fcr such as human small intestine, duodenum, stomach, submandibular gland, sublingual gland, common bile duct, bronchi, etc.
  • BP good c also be used such as Homojiweneto of tissue that distributed, human Bok colon cancer cell-derived HT29- 18- N 2 strains and their variants are known to be producing F cr BP Therefore, these cell lines may be used as a source of mRNA.
  • RNA for example, as used in the present invention, a modified method of the AG PC method (P. Chomcczynski et al. Analytical Biochem. 162: 156-159, 1987), Chirgwin et al. Biochemistry 18: 5294-5299, 1979), and total RNA can be prepared.
  • the method used when cloning genes of other bioactive proteins can be carried out, for example, by treating with a surfactant or phenol in the presence of ribonuclease inhibitor such as a vanadium complex.
  • the mRNA is made into type III, and an oligo (dT) or random primer complementary to the poly A-chain at the 3 ′ end, or Fc Reverse transcription is performed using a synthetic oligonucleotide corresponding to a part of the amino acid sequence of BP as a primer to synthesize DNA (cDNA) complementary to mRNA.
  • dT oligo
  • cDNA synthesize DNA
  • cDNA was synthesized from polyadenylated RNA by reverse transcription using a cDNA synthesis kit manufactured by Amersham or Invitrogen and random primers. was made.
  • the cDNA library thus prepared was packaged into sphage using the phage invitro No. 0 packaging kit Gigapac kllGold from Stratagene, and then expressed in Escherichia coli.
  • the expressed cDNA protein was screened using a monoclonal antibody as a probe.
  • the antibody used for the above cloning prevents the binding between IgGFc and FcABP.
  • K9, ⁇ 10, ⁇ 17 harmful monoclonal antibodies
  • An antibody capable of detecting FcABP in Western plot analysis was selected. That is, under non-reducing conditions, bands with a molecular weight of about 200 kDa were observed with the K9 antibody, and under reducing conditions, bands were observed with the K17 antibody at 70-80 kDa and 130-140 kDa, respectively.
  • FcrBP mRNA The size of FcrBP mRNA was estimated by comparing with known protein mRNA using probe Q. As a result, the molecular size of Fc7BP mRNA was estimated to be about 17 kbp (FIG. 1).
  • probes Q, A and B screening of the second cDNA library packaged in Sgt10 was performed.
  • cDNA clones that hybridized with either probe A, B or Q were isolated. From these, a clone hybridizing only with A was obtained, and a cDNA clone hybridizing with probe X (about 700 bp) was isolated using probe X at the end opposite to A as probe X. The resulting clone had X at the center and an AB region at one end, and was named XI.
  • the cDNA library was screened again using about 800 bp of the portion opposite to the AB region of clone X1 as probe Y to obtain a cDNA clone that hybridized with probe Y.
  • This clone was named Y1.
  • Clone Y1 has a portion of the X region at one end and a Y region at the center. Approximately 150 bp at the end opposite to the X region of clone Y1 was used as probe Y150.
  • the cDNA library was screened using probe Y150. From these, the clone that extended the longest in the opposite side to the Y150 region was selected and designated as clone C72.
  • clone NZ4 The cDNA clones to be re-isolated were isolated. Among these, the clone having the longest possible non-overlapping portion with clone C72 was isolated and designated as clone NZ4.
  • a partial cDNA (about 7.8 kbp) encoding FcaBP was obtained from these clones, and the nucleotide sequence thereof was determined (SEQ ID NO: 6 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence).
  • mapping was performed using probes A, B and Q.
  • the cDNA of FcyBP had a unit of 3.5 kbp in a total length of 16.4 kbp (a sequence homologous to each of probes A, B, and Q was connected in the order of A ⁇ B ⁇ Q).
  • the cDNA clone that hybridizes with probe B a portion of the probe nucleotide sequence was amplified by PCR, and the nucleotide sequence of the obtained fragment was analyzed. It was found to have the structure shown in FIG. 8 and the base sequence and amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
  • the gene encoding the cloned FcA BP thus obtained can be transformed into a prokaryotic or eukaryotic host cell by incorporating it into an appropriate vector.
  • the gene can be expressed in each host cell by introducing an appropriate promoter and a sequence related to expression into these vectors.
  • an appropriate promoter and a sequence related to expression into these vectors.
  • eukaryotic genes are considered to exhibit polymorphism, as is known for the human interferon gene, and this polymorphism may replace one or more amino acids.
  • the amino acid may not change at all even if the nucleotide sequence changes.
  • a modified polypeptide may have a binding property to IgGFc.
  • IL-2 human interleukin 2
  • sugar chains when expressed in eukaryotic cells, sugar chains are added in many cases, but sugar chain addition can be regulated by converting one or more amino acids. May have c-part binding activity. Therefore, as long as the obtained polypeptide has the activity of binding to the IgG Fc portion, the polypeptide obtained by artificially modifying the gene for FcABP in the present invention can be used to convert those polypeptides. All coding genes are included in the present invention.
  • the present invention also includes a gene having the activity of binding to the IgG Fc portion of the obtained polypeptide and hybridizing to the gene shown in SEQ ID NO: 6 or 7 or a part thereof.
  • the hybridization conditions can be the same as those used in probe hybridization which is usually performed (for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., And Old Spring Harbor). Laboratory Press, 1989).
  • any DNA capable of expressing a protein that specifically binds to the Fc portion of immunoglobulin G encodes the amino acid shown in SEQ ID NO: 6 or 7 in the sequence listing. Not only the nucleotide sequence but also various modified DNAs are included in the present invention, and it is clear that DNA fragments having the functions are also part of the gene of the present invention.
  • the expression vector of the present invention contains an origin of replication, a selection marker, a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation signal, and the like.
  • Prokaryotic host cells among the hosts used in the expression system of the present invention include, for example, Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • host cells of eukaryotic microorganisms include, for example, yeast and slime mold.
  • insect cells such as Sf9 may be used as host cells.
  • host cells derived from animal cells include, for example, COS cells, CHO cells, C127 cells, 3T3 cells, and the like.
  • the transformant transformed with the gene encoding the desired Fc7BP as described above is cultured, and the protein having the activity of binding to the IgGF c portion is separated from the inside or outside of the cell. It can be purified.
  • the separation and purification of the protein having the activity of binding to the IgGF c portion, which is the target protein of the present invention is not limited to the methods described in the Examples, but may be any of the separation and purification methods used for ordinary proteins. Can be used. For example, various types of chromatography, ultrafiltration, salting out, dialysis and the like can be appropriately selected and combined.
  • the full-length cDNA of FcaBP of the present invention has the structure shown in FIG. 8 and has the nucleotide sequence and amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing. It was reconfirmed as follows that a series of cDNAs used in the invention were derived from a single mRNA. That is, a cDNA fragment in a repeat structure different from pNV11SR containing the 5'-end cDNA used for expression was expressed in protein, and reacted with K9 and K17, which are monoclonal antibodies that recognize FcaBP. As a result, it was confirmed that these cDNA products were recognized by one or both of K9 and K17.
  • the code encoding the FcaBP of the present invention Using the gene or a part thereof as a probe, the synthetic tissue of FcrBP mRNA can be identified by Northern blot analysis or in situ hybridization.
  • the method will be described in detail in the following examples, but the present invention is not limited by these examples.
  • Example 1 Cloning of partial cDNA encoding FcaBP using monoclonal antibody (A: Preparation of cDNA library)
  • the human colon explants were washed with 1 ⁇ 1 ⁇ 1 medium containing 10% ⁇ 83 and then mechanically detached from the mucosal muscularis to separate the epithelial cells from the lamina intestinal. This was fixed to a center rod, and vigorously stirred with a stirrer in ice-cooled 10% FBS // 5 mM EDTA / PBS (-) for 90 minutes to separate epithelial cells. The solution containing epithelial cells was centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to obtain cell precipitates.
  • RNA from mucosal epithelial cells was performed by a modification of the AGPC method (P. Chomczynski et al., Analytical Biochem., (1987) 162: 156-159). That is, 9 ml of denaturing solution (4 M guanidine thiocyanate, 25 mM sodium citrate (pH 7), 0.5% sarkosyl, 0.1 M 2-mercaptoethanol) was added to 1 ml of the cell pellet. After the cells were lysed, lm 1 of 2M sodium acetate (pH 4), 10 ml of a water-saturated phenol solution, and 2 ml of formaldehyde isoamyl alcohol (49: 1) were sequentially added.
  • denaturing solution 4 M guanidine thiocyanate, 25 mM sodium citrate (pH 7), 0.5% sarkosyl, 0.1 M 2-mercaptoethanol
  • Elution buffer (1 OmM Tris—HCl (pH 7.5), lmM EDTA, 0.1% SDS) was added to 1 mg of total RNA, and the total volume was adjusted to 1 ml.
  • the pellet is suspended in 2.5 ml of a washing buffer (10 mM Tris-HCI (pH 7.5), ImM EDTA, 0.5 M NaCl, 0.1% SDS), and then centrifuged at 15,000 rpm for 3 minutes. Separated and the supernatant was carefully removed. Suspend the pellet in 1 ml of sterile water, 65. Heated at C for 5 minutes and quenched on ice for 3 minutes. After centrifugation at 15,000 rpm for 3 minutes, the supernatant was recovered. After adding 50 // 1 of 5 M NaCl and 2.5 ml of ethanol, cool at 120 ° C for 30 minutes, centrifuge (3,000 rpm, 4 ° C) to obtain polyadenylated RNA. Was collected.
  • a washing buffer 10 mM Tris-HCI (pH 7.5), ImM EDTA, 0.5 M NaCl, 0.1% SDS
  • Synthesis of cDNA from mRNA was carried out by an improved method of Gub er and H offman (U. Gu bier and BJ Hoffman (1983) Gene 25: 263), using cDNA from Amersham or In V itrogen. This was performed using a synthetic kit. That is, 5 g of polyadenylated RNA prepared from colonic mucosal epithelial cells was incubated at 42 ° C for 90 minutes for 50 units of human placental ribonuclease inhibitor, ImMdATP.ImMdGTP, ImMdCTP, 0.5 mM dTTP, 100 mM.
  • the cells were incubated with 750 ng of random hexanucleotide or 4 g of oligo (dT) primer in a buffer (Amersham) 501 containing the unit AMV reverse transcriptase and sodium pyrophosphate.
  • the reaction solution 50 ⁇ 1 was added to 4.0 units of E. coli ribonuclease 11, 115 units of E. coli. After a reaction at 12 ° C for 60 minutes and then at 22 ° C for 60 minutes in a buffer containing DNA polymerase I (Amersham), the mixture was incubated at 70 ° C for 10 minutes. After returning to ice, 10 units of T4 DNA polymerase were added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 10 minutes.
  • reaction was stopped by adding 101 0.25 0 EDTA ( ⁇ 8).
  • an equal amount of ammonium acetate acetate and 4 times the amount of ethanol were added.
  • the mixture was cooled at 120 ° C for 30 minutes, and cDNA was recovered by centrifugation. c DNA was dissolved in 10 ⁇ 1 of sterile water and subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis using 11 to confirm the synthesis and quantify the concentration.
  • An adapter (EcoRI—NotI-BamHI adapter, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added to give a molar ratio of 10-fold relative to the synthetic cDNA obtained in (3) above, and the total amount was increased. 8 times the amount of Raigeshiyon solution a (ligase Chillon kit, Takara Shuzo Co., Ltd.) with 1 volume of Raigeshiyon solution B (ligase Chillon kit, Takara Shuzo Co., Ltd.) after c was thoroughly stirred plus, 16 ° C For 30 minutes and the adapter was ligated to the cDNA.
  • Raigeshiyon solution a (ligase Chillon kit, Takara Shuzo Co., Ltd.) with 1 volume of Raigeshiyon solution B (ligase Chillon kit, Takara Shuzo Co., Ltd.) after c was thoroughly stirred plus, 16 ° C For 30 minutes and the adapter was ligated to the cDNA.
  • the reaction mixture is electrophoresed on a 1% low melting point agarose gel (Sea P1a Que agarose, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) in a TAE buffer system, and a gel containing a cDNA fragment of 0.5 kbp or more is recovered. did. By this operation, adapters that did not bind to cDNA were also removed. Add 2 volumes of TE buffer to the wet weight of the recovered gel, incubate at 65 ° C for 10 minutes, dissolve the agarose gel, add an equal amount of Tris-saturated huninol to the whole amount, and mix well. After stirring, the mixture was ice-cooled.
  • the aqueous phase was recovered by centrifugation, and treated again with an equal amount of tris-saturated phenol.
  • the aqueous phase was recovered by centrifugation, and finally an equal amount of black-mouthed form was added. Thereafter, the aqueous phase was collected, 110 g of 3M sodium acetate, 20 g of glycogen (manufactured by Bryan Mannheim) and 2.5 volumes of ethanol were added, and after cooling at 120 ° C for 30 minutes, After centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, a precipitate of cDNA was obtained.
  • Sonic extract (Gigapac kll go 1d) was immediately added, followed by gentle stirring. After 2 hours fin incubation at 22 ° C, 500 1 of phage diluting solution (5 g N a C 1, 2 g MgS0 4 ⁇ 7H 2 0. 50ml 1M Tr is -. HC 1 (pH7 5) , 5 ml of 2% gelatin liter) and 101 of form-form were added, and the in vitro packaging reaction was completed. This phage solution was stored at 4 ° C and used for screening.
  • Example 2 Cloning of partial cDNA encoding FcaBP using monoclonal antibody (B: Screening of cDNA library using antibody) (1) Screening Prepared in Example 1, a lxl 0 4 pfu, 200 zl of c DNA library of colonic mucosal epithelial cells was packaged into Sufaji, combined with E. coli strain Y 1 0907- 200 ⁇ 1 was Ichi ⁇ culture, 37 Incubated at ° C for 15 minutes. After dissolving 0.8% top agarose mixed with LB medium and keeping at 55 ° C, add 5 ml of the mixture to the phage and E. coli pre-incubation solution, mix, and mix with 1.5% LB agarose.
  • the nylon-reinforced nitrocellulose filter (# BA—S) that has been impregnated with 10 mM I PTG and air-dried in advance. 85, manufactured by Schleicher & Schne 11) and kept at 37 ° C for 3.5 hours. Remove the filter from the plate and shake for 30 minutes at room temperature in a washing solution (0.05% Tween-20> 25mM Tris-HC1 (pH7.5), 15OmM NaCl, 3mM KC1). did.
  • the plate was shaken in PBS (—) containing 5% skim milk at room temperature for 30 minutes to perform a blocking treatment, and then washed twice with a washing solution for 20 minutes.
  • a mouse monoclonal antibody prepared against FcaBP in colonic mucosal epithelial cells Korean a mouse monoclonal antibody prepared against FcaBP in colonic mucosal epithelial cells (Kobayashi et al., J. Immunology (1991) 146: 68-74; Kobayashi et al., J. Immunology (1989) 143: 2567-2574), immerse the hybridoma culture supernatant containing K9 or Kl7 in 5 ml per nitrocellulose membrane, shake at room temperature for 2 hours, and wash with the washing solution for 20 minutes. Washed twice.
  • the mixture was centrifuged at 5,000 rpm for 2 minutes at room temperature, and the supernatant was collected. The same amount of chloroform was added again, and the mixture was centrifuged in the same manner to recover the supernatant. Thereafter, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 2 OmM EDTA, 0.5% SDS, and 100 gZm1 protease K were added to the supernatant, respectively, and incubated at 55 ° C for 60 minutes. To purify ⁇ , perform phenol treatment, phenol nocloform form treatment, and chromate form treatment in order to deactivate DNAase, protease, etc. as usual, and then add 120 volumes of 5M NaC 1 and 1 Twice the volume of isopropanol was added and the cDNA fragment was introduced; a precipitate of IDNA was obtained.
  • the inserted DNA was cut out using the BamHI restriction enzyme site, and a probe for screening the second cDNA library (this was Probe Q).
  • RNA was immobilizing to the nylon membrane by UV cross-linking
  • 10 ml of hybridization solution (5 x SSPE, 5 x Denhardt's solution, 50% formamide, 0.5% SDS, 100 ⁇ gZml heat denaturation)
  • Prehybridization was performed in salmon sperm DNA) at 42 ° C for 8 hours.
  • each probe A and Q obtained by the antibody screening, using a [32 P] d CTP, radiolabeled Te Megaprime labeling kit (Ame rsham Co.) Niyotsu.
  • Each probe (1 ⁇ 10 8 dpm) was added to the pre-hybridized nylon membrane together with 5 ml of the hybridization solution, sealed, and then subjected to 100 ° C.
  • Example 3 Second cloning of cDNA encoding FcA BP (A: Preparation of cDNA library)
  • Human colon tissue was washed with 1 ⁇ ⁇ medium containing 10% 83, and then mechanically detached from the mucosal muscularis to separate epithelial cells and lamina intestinal. This was fixed to a center rod, and vigorously stirred with a stirrer in ice-cooled 10% FBSZ5mM EDTAZPBS (-) for 90 minutes to separate epithelial cells. The solution containing epithelial cells was centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to obtain cell precipitates.
  • RNA from mucosal epithelial cells was performed by a modification of the AGPC method (P. Chomczynski et al., Analytical Biochem., (1987) 162: 156-159). Specifically, 9 ml of denaturing solution (4 M guanidine thiocyanate, 25 mM sodium citrate (pH 7), 0.5% sarkosyl, 0.1 M 2-mercaptoethanol) was added to 1 ml of the cell pellet. After dissolving, lm 1 of 2M sodium acetate (pH 4), 10 ml of a water-saturated phenol solution, and 2 ml of chloroform / isoamyl alcohol (49: 1) were sequentially added.
  • denaturing solution 4 M guanidine thiocyanate, 25 mM sodium citrate (pH 7), 0.5% sarkosyl, 0.1 M 2-mercaptoethanol
  • Elution buffer (1 OmM Tris-HC1 (pH 7.5), lmM EDTA, 0.1% SDS) was added to the total lmg of the RNA, and the total volume was adjusted to 1 ml, and then 01 igoTex— dT30 Super> (Takara Shuzo) 1 ml was added, heated at 65 ° C for 5 minutes, and rapidly cooled on ice for 3 minutes. After adding 0.2 ml of 5M NaCl, the mixture was incubated at 37 ° C for 10 minutes, centrifuged at 15, OOO rpm for 3 minutes, and the supernatant was carefully removed.
  • wash buffer 10 mM Tris—H CI (pH 7.5), ImM EDTA, 0.5M NaCl, 0.1% SDS
  • cDNA from mRNA was carried out using a cDNA synthesis kit manufactured by Amersham or InVitrogen by an improved method of Gubler and Hoffman. That is, 5 ⁇ g of polyadenylated RNA prepared from colonic mucosal epithelial cells was incubated at 42 ° C. for 90 minutes at 50 units of human placental ribonuclease inhibitor, ImMdATP. Incubate with 750 ng random hexanucleotide or 4 / g oligo (dT) primer in 50 ⁇ l of buffer containing AMV reverse transcriptase and sodium pyrophosphate (Amersham). Pete.
  • This reaction solution 501 was placed in a buffer (Amersham) containing 4.0 units of E. coli ribonuclease 11 and 115 units of E. coli DNA polymerase I at 12 ° C for 60 minutes. Then, the mixture was reacted at 22 ° C for 60 minutes, and then incubated at 70 ° C for 10 minutes. After returning to ice, 10 units of T4 DNA polymerase were added, and the mixture was allowed to react at 37 ° C. for 10 minutes. Then, 101 1 of 0.25M EDTA (pH 8) was added to stop the reaction.
  • An adapter (EcoRI-NotI-BamHI adapter, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added in a molar ratio of 10 times the amount of the synthetic cDNA obtained in (3) above. After adding ligation solution A (Ligation kit, Takara Shuzo) of 8 times the body weight and Ligeosion solution B (Ligeision kit, Takara Shuzo) of 1 time volume c After incubation at 16 ° C for 30 minutes, the adapter was ligated to the cDNA.
  • ligation solution A Ligation kit, Takara Shuzo
  • Ligeosion solution B Ligeosion solution, Takara Shuzo
  • the reaction solution is subjected to electrophoresis on a 0.8% low-melting-point agarose gel (SeaP1aque agarose, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) in a TAE buffer system, and a gel containing a cDNA fraction of about 4 kbp or more is obtained.
  • adabuters that did not bind to cDNA were also removed.
  • Add 2 volumes of TE buffer to the wet weight of the recovered gel incubate at 65 ° C for 10 minutes to dissolve the agarose gel, add an equal amount of Tris-saturated phenol to the whole volume, and mix well Then, it was ice-cooled.
  • the aqueous phase was recovered by centrifugation and subjected to an equal amount of Tris saturation treatment again.
  • the aqueous phase was recovered by centrifugation, and finally an equal amount of black-mouthed form was added. After sufficient stirring, the mixture was centrifuged. Thereafter, the aqueous phase was collected, 10 volumes of 3M sodium acetate, 20 g of glycogen (manufactured by Boehringer-Mannheim) and 2.5 volumes of ethanol were added, and the mixture was cooled at 120 ° C for 30 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to obtain a precipitate of cDNA.
  • cDNA colon culture mucosal epithelial cells (2 x 10 Pfu) packaged into sphage cells into a single culture of E. coli strain C600hf12001
  • the cells were incubated at 37 ° C for 15 minutes. .
  • cDNA colon culture mucosal epithelial cells
  • the mixture was spread on an LB plate (10 ⁇ 14 cm), and then incubated at 37 ° C for 12 hours.
  • a nylon membrane Biodyne A, pore size: 0.2 zm, manufactured by Pall Corporation
  • the size of FcrBP mRNA was estimated.
  • mRNA of known protein for comparison 14. 075 1; 1 "0 ⁇ hin mRNA (M. Koenig et al. (1988) Cell 53: 219-228) and 15.2 kbp Ry anodine Receptor mRNA (F. Zarzato et al. (1990 ) J. Biol. Chem., 265: 2244-2256)
  • the cDNA probe for each of these control mRNAs was prepared by preparing a synthetic probe having a nucleotide sequence obtained from the literature. Were prepared by the polymerase chain reaction (PCR) method and used as probe DYS and probe RDR, respectively.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the source of Dy strophin mRNA and Ry anodine Receptor mRNA is human skeletal muscle polyadenylated RNA (manufactured by C1ontech). 2 g of polyadenylated RNA or 1 g of human skeletal muscle polyadenylated RNA obtained from colonic mucosal epithelial cells, or a mixture of both, is subjected to electrophoresis in the same manner as in Example 2, (4), and transferred to a nylon membrane. did. This nylon membrane was subjected to hybridization using probe Q, and detected by autoradiography.
  • this nickel membrane was mixed with 50 mM Tris-HC1 buffer (pH 7.5), 1.25 mM EDTA, 3xSSC, lX Denhard's solution, 1% The plate was incubated with 20 ml of a solution containing SDS and 50% formamide at 70 ° C for 1 hour. Next, the operation of shaking and washing with a washing solution containing 0.2 ⁇ SSC and 0.1% SDS at room temperature for 10 minutes was performed twice. Thereafter, autoradiography was performed with a nylon membrane to confirm that the band had disappeared (dehybridization). Next, hybridization was performed using the probe DYS in the same manner as described above, and detection was performed by autoradiography.
  • Example 4 From the 69 clones obtained in Example 4 above, the necessary 5 clones were determined to determine the nucleotide sequence of the region encoding the amino acid sequence of the protein having the ability to bind to the IgGF c portion. And the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer (Model 373A, manufactured by Applied Biosystems).
  • the cloned cDNA of the clone XI was digested with EcoRI, and the DNA of about 3300 bp was separated by agarose gel electrophoresis.Then, the DNA was collected and collected at the BcoRI site of the plasmid vector pBluescript SK (+). Inserted. Thereafter, a restriction map was prepared and the nucleotide sequence was determined.
  • cDNA of clone XI a fragment of about 8 O Obp cleaved by Ec0RI and SacI on the opposite side to the portion containing probe B was recovered and used as probe Y.
  • the cDNA library was screened in the same manner as in Example 3, and among the obtained clones, a clone Y1 having the longest cDNA was obtained.
  • the inserted cDNA of clone Y1 was cleaved with Ec0RI, and about 1900 bp of DNA was separated by agarose gel electrophoresis and recovered, and the EcoRI of plasmid vector pBluescript SK (+) was recovered. Inserted into the site. Thereafter, a restriction enzyme map was prepared and the nucleotide sequence was determined.
  • cDNA of clone Y1 a fragment of about 150 bp cut out by SacI and SphI on the opposite side to the portion containing probe X was recovered and used as probe Y150.
  • probe Y150 a cDNA library (cDNA size of 2 to 4 kbp) was screened in the same manner as in Example 3 to obtain 9 clones.
  • a cDNA extending the longest to the opposite side of the Y region from Y150 as a boundary and containing Y150 was obtained, which was designated as clone C72.
  • the insert cDNA of clone C72 was digested with Ec0RI, and agarose gel electrophoresis was performed to cut about 1200 b of the cDNA. After the DNA was separated, it was recovered and inserted into the EcoRI site of the plasmid vector pBluescript SK (+). Thereafter, a restriction enzyme map was prepared and the base sequence was determined.
  • Example 3 (2) Using a human colon cancer-derived cultured cell strain HT29-18-N2 strain in the same manner as in Example 1 (5); preparing an Igt10 cDNA library and using probe Z to prepare Example 3 Screening was performed in the same manner as described above, and four clones were obtained. Among the obtained clones, a clone NZ4 containing the longest portion not overlapping with C72 was obtained.
  • the five clones obtained in Example 6 extend in the order of NZ 4—C 72 -Y 1 -X 1 -V 11 toward the 5 ′ end or 3 ′ end.
  • the sequence was translated into amino acids, it was presumed to extend toward the 5 'end. Therefore, when screening the library 1 prepared by random priming using the clone NZ 4 DNA, which is currently the most upstream, as a probe, 13 independent clones were obtained, but 5 'side of NZ 4 No extended clone was obtained.
  • the nucleotide sequence of NZ4 was translated into amino acids, the ATG codon near the expected 5 'upstream methionine ATG codon on the open reading frame was similar to Kozak's rule, so this ATG started.
  • RNA and polyadenylated RNA were prepared from human colon mucosal epithelial cells and HT29-18-N2 cells in the same manner as in Example 1 (2) or Example 3 (2).
  • Primer 1 GCTGATAGTTCTGC AGGAA GGCTGTGAGGAATTCCTCTCTGCCAGTGTT—50mer
  • Primer 2 GCTCCAGCCCAGAGTATCCACCAGCTCCA TAGG—33mer were synthesized on a DNA synthesizer (Model 394, PC column made by Applied Biosystems). (Applied Biosystems). End labeled with T4 polynucleotide kinase of each primer 100 pmo 1 at ⁇ [32 P] ATP, purified by Mi crospin TM S- 200HR column (Ph a rma cia Co.), each 0. 5 pmo 1 each Used for reaction.
  • RNA (20 g) and polyadenylated RNA (2.5 g) from human colon mucosal epithelial cells and HT29-18-N2 were combined with a primer and an annealing buffer, respectively.
  • Hypridease was performed by incubating for 5 hours.
  • annealing sample was precipitated with ethanol, and this precipitate was washed with RTase buffer (33 mM Tris—HC 1 H8.3, 2 OmM KC 1, 13.3 mM MgCl 2 , 13.3 mM After dissolving in DTT, 0.33 mM dNTPs, 50 ⁇ gm 1 actinomycin D), add 20 units of reverse transcriptase (RNase H-free MM LV RTase, manufactured by TOYOBO) at 42 ° C, Incubated for hours. After the reaction, the mixture was treated at 95 ° C for 3 minutes to inactivate the RTase.
  • RTase buffer 33 mM Tris—HC 1 H8.3, 2 OmM KC 1, 13.3 mM MgCl 2 , 13.3 mM
  • RTase buffer 33 mM Tris—HC 1 H8.3, 2 OmM KC 1, 13.3 mM MgCl 2 , 13.3 mM
  • RNAse A was added so as to obtain lO ⁇ gZml, and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes to decompose the template RNA. After that, extraction with phenol / chloroform and chlorophyll form, and ethanol precipitation were performed in that order, followed by electrophoresis on a 5% sequence gel. After drying, autoradiography was performed. A marker obtained by reacting Ml3mp18 with Sequenase Ver2.0 DNA Sequencing Kit (TOYOBO) was used.
  • primer 2 on the 5 'side synthesized for the purpose of suppressing such secondary structure as much as possible, shows a strong broad band from 110 to around 116, and a weak single band at a position corresponding to 123. was detected. No band was detected in the high molecular weight region from 23rd. won.
  • a partial cDNA of FcyBP was inserted; I DNA clone (# NZ4, # C72, # Y1, # X1, # V11) was inserted into EcoRI or NotI. After the cleavage, the cDNA at the insert was subcloned into the recruitment plasmid pB1uescript SK (+), and named pNZ4, pC72, pYl, pXl, and pV11, respectively.
  • ⁇ 4 Lambda clone (# NZ4) was completely digested with Notl, followed by separation and purification of an insert of about 900 bp by agarose gel electrophoresis. Notation of pB1uescript SK (+) Ligation at the I site. A clone was selected in which the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction of the protein code strand of the cDNA was inserted in the direction opposite to the direction of the LacZ gene in the plasmid. SEQ ID NO: 1 shows the entire base sequence at the insertion site.
  • the base sequence derived from cDNA is in upper case
  • the base sequence derived from pBluescript SK (+) is in lower case
  • the base sequences derived from the synthetic adapter and the synthetic oligonucleotide are in lower case.
  • amino acid sequence shown was a sequence deduced from the base sequence by universal codon, with ATG matching the Kozak sequence as the start codon.
  • the plasmid pNZ4 (5 ⁇ ) into which the cDNA clone has been inserted is completely digested with the restriction enzymes XhoI and Bg1II (each 50 units), and then subjected to low melting point agarose gel electrophoresis. An approximately 400 bp fragment containing the 5 'end of the cDNA of Fc7BP was separated, extracted with phenol, and recovered by ethanol precipitation (fragment 1).
  • the second plasmid PC72 (5 / g) was completely digested with Xhol and BglII, and the approximately 4.2 kbp fragment containing the vector fragment was isolated by electrophoresis in the same manner. (Fragment 2).
  • Fragment 1 and fragment 2 are each dissolved in 10 1 TE buffer, and each 2 ⁇ 1 is combined with 16 ⁇ 1 A solution (DNA ligation kit, Takara Shuzo) and 4 ⁇ 1 B solution. The mixture was mixed, incubated at 16 ° C. for 30 minutes, and ligated. This mixture 5 ⁇ 1 was transformed with 100 // 1 combination E. c 0 1 i (XL 1 -B 1 ue) and placed on an LB plate containing ampicillin (100 g / m 1) at 37 ° C. C1 ⁇ cultured. A colony that has formed The purified DNA was purified to obtain a plasmid pNZC7 in which fragment 1 and fragment 2 were ligated.
  • a solution DNA ligation kit, Takara Shuzo
  • This mixture 5 ⁇ 1 was transformed with 100 // 1 combination E. c 0 1 i (XL 1 -B 1 ue) and placed on an LB plate containing ampicillin (100 g / m 1) at 37
  • fragment 3 After the third plasmid pYl (5 g) was completely digested with 50 units of BstXI and HincII, a fragment of about 420 bp was recovered by electrophoresis (fragment 4). Fragment 3 and Fragment 4 were ligated by DNA ligase in the same manner, and electrophoresis was carried out to recover a fragment of about 1750 bp in which both were ligated at the BstXI site (fragment 5).
  • the fourth plasmid pXl (5 g) was completely digested with Hinell and BamHI (50 units each), and a fragment of about 278 Obp was recovered by electrophoresis (fragment 6).
  • the fifth plasmid pVl1 was completely digested with BamHI (50 units), and a fragment of about 3350 bp was recovered by electrophoresis (fragment 7). Fragment 6 and Fragment 7 were ligated using DNA ligase, and a fragment of about 6100 bp in which both were ligated one by one was recovered by electrophoresis (Fragment 8).
  • the fragment 8 was ligated to pBluescriptSK (+) digested with Hinell and BamHI with DNA ligase, and then transformed into a competent E.coli. After recovering plasmids from a plurality of transformants, the nucleotide sequence of each was determined, and a plasmid clone containing fragment 8 in which the orientations of fragment 6 and fragment 7 were correctly linked was obtained, and 5 ′ of fragment 8 was obtained. PXV2 was inserted when the 3 'direction was inserted in the direction opposite to the direction of the LacZ gene in plasmid.
  • fragment 9 After complete digestion of PXV2 with Xhol and HincII, a fragment containing the vector portion of about 9.1 kbp was recovered by electrophoresis (fragment 9). After ligation of the fragment 9 and the fragment 5 using DNA ligase, the transformant E.c01i (XL1-B1ue) was transformed. About 7.8 from the transformant Approximately 1 kbp plasmid p NV11 containing kb cDNA (fragment 10) was obtained.
  • pBluescript SK (+) vector 0.83 pmol was completely digested with Notl and SpeI, mixed with 250 pmo1 of phosphorylated TA-III adapter, and mixed at 16 ° C with a DNA ligation kit. After incubating for 10 minutes and ligating, ethanol precipitation was performed. The precipitate was completely digested with Not I in 50 ⁇ 1, and allowed to have only one sequence per adapter, and then subjected to low melting point agarose gel electrophoresis to collect a band of about 3 kbp. After extraction, ethanol precipitation was performed. The resulting precipitate was self-ligated using a DNA ligation kit, and then transformed into a competent E.coli (XL1-Blue). Among plasmids obtained from colonies formed by culturing once on an LB plate containing ampicillin, a plasmid into which a TA-III adapter was inserted was selected (pBLS / TAIII).
  • the cells were cultured on an LB plate containing ampicillin. From the resulting colonies, a plasmid in which a TA-III adapter was ligated to the 3 'end of the inserted cDNA was selected by examining the restriction enzyme map and nucleotide sequence. The resulting clone is pNV11-ST.
  • Escherichia coli containing the plasmid pNV11-ST was designated as Escherichiacoli XL1-B1ue [pNVl1-ST] by the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-3-1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture). Was deposited internationally under the Budapest Treaty on April 1, 2013 under the name of Life Science Article No. 4625 (FERM BP-4625).
  • the partial cDNA (clone pNVl 1-ST) (about 7.8 kbp) used for the expression of F c BP, and the clones NZ 4, C72, Yl, Figure 2 shows the relationship between XI and VI1.
  • Example 10 Construction of an expression c DNAZ vector system (C: integration into a protein expression vector)
  • c cDL Restriction enzyme of pCDL—SRa 296 vector (benefited from Dr. Yutaka Takebe, National Institute of Preventive Health: sometimes referred to as SR below) to enable integration of DN DN
  • the site was modified. First, 2 g of SRa was completely digested with EcoRI and then precipitated with ethanol. The precipitate K 1 en 0 w buffer (7 OmM Tr is ⁇ HC 1 (p H 7.
  • the protein expression vector (pcDL—SR NOT) was completely digested with NotI and Kpnl, and a fragment of about 3.7 kbp was recovered by electrophoresis (fragment A).
  • the DNA insertion vector (pNV11-ST) was completely digested with NotI and KpnI, and an approximately 7.8 kbp fragment was recovered by electrophoresis (fragment 13).
  • SEQ ID NO: 6 shows the entire nucleotide sequence of fragment 13.
  • Fragment A and fragment 13 were ligated using a DNA ligation kit, and then transformed into a competent E.coli (XL1-Blue). From the colonies formed by culturing on LB plates containing ampicillin (100 ⁇ g Zml), the plasmid into which fragment 13 was inserted was selected by restriction enzyme digestion. The resulting clone is pNV 11-SR.
  • Example 11 Expression of FcrBP partial cDNA in COS 7 cells
  • Escherichia coli transformed with the FcaBP cDNA expression plasmid (pNVl1-SR) obtained in Example 10 was cultured with shaking at 37 ° C overnight in a 10 ml LB medium. This was added to 500 ml of LB medium, and shaking was continued until ODeoo reached 0.8. When OD 6 Q 0 reaches 0.8, 2.5 ml of chloramphenicol solution (34 mg / m 1) and cultured overnight. After the bacteria were centrifuged, plasmid DNA was prepared by the alkaline method as usual. After ultracentrifugation twice (90,000 rpm, 3 hours) using a density gradient of cesium chloride, dialysis was performed with a TE buffer, and a plasmid was purified and used for protein expression.
  • a plasmid vector (pNV11-SR) incorporating the approximately 7.8 kbp partial cDNA of FcaBP was transiently expressed in COS 7 cells, and the properties of the protein were examined as follows. Transfection was performed. Add 2 x 10 5 COS 7 cells to a 35 mm dish, RPM1 1640 medium containing 10% FBS (0.2% sodium bicarbonate, 10 units Zm 1 penicillin, 0.01% streptomycin ) Overnight. At 40-60% confluence, cells were washed twice with serum-free RPMI 1640 medium.
  • the dish (035 mm) in which the COS 7 cells transfected with pNV 11-SR were cultured was washed twice with 2 ml of PBS (-). 29.5 ml of 99.5% ethanol was added and fixed at room temperature for 5 minutes. The plate was washed twice with 2 ml of PBS (—). Culture supernatant lm1 of monoclonal antibody-producing hybridomas (1: 9 and 1 ⁇ 17) against FcrBP used for screening of lambda phage was added, respectively, and incubated at room temperature for 1 hour.
  • FIG. 3 shows the results obtained by using only the HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (H + L) F (ab ') 2 fragment as a secondary antibody as a secondary antibody without adding the primary antibody.
  • the culture supernatant was added to the hybridoma producing K9 monoclonal antibody (Fig. 3A) and the hybridoma producing K17 monoclonal antibody (Fig. 3B), cells that specifically reacted with these were observed. (Fig. 3C) was not observed.
  • Example 12 Detection and characterization of human IgG binding ability of recombinant protein
  • COS 7 cells ( ⁇ 35 mm dish) transfected with plasmid pNV11-SR incorporating Fc7BP partial cDNA were washed twice with PBS (-). 99. 2 ml of 5% ethanol was added and fixed at room temperature for 5 minutes. Washed twice with 2 ml of PBS (1). Next, a human IgG fraction (Cappe 1) purified by affinity chromatography was adjusted to a concentration of 10 tz g / m1 in RPMI 1640 medium containing 10% FBS. 1 was added to the dish and incubated at room temperature for 1 hour.
  • COS 7 cells (435 mm dish) transfected with pNVl-SR were washed twice with 2 ml of PBS (-). 99. Add 2 ml of 5% ethanol and fix at room temperature for 5 minutes. 21111? Washed twice with 83 (—).
  • the HRP-bound affinity-purified human IgG fraction (# 55902 Cappe 1) was added to RPMI 1640 medium containing 10% FBS at 10 g / It was adjusted to a concentration of ml (solution 1).
  • the following immunoglobulins (500 g / m 1) were added as competitive inhibitors:
  • RNA expression was examined by Northern blotting analysis.
  • 2 g of polyadenylated RNA purified from human heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, and kidney tissues Pre-hybridization was performed on the coated nylon membrane (Humn Multiple Nort B 1 ots, # 7760-1, manufactured by Clontech) under the same conditions as in (4) of Example 2. after were hybrida I See Chillon using professional one blanking Y labeled with [32 p]. After washing, bands were detected by autoradiography. As a result of performing autoradiogram at 180 ° C for 2 days, a band was detected at about 17 kbp in the placenta (Fig. 6), but negative in other tissues. Therefore, protein expression of FcaBP in the placenta was estimated.
  • Example 14 Northern blot analysis with three different probes
  • Example 2 (3) In order to confirm that the probes Q and A obtained in Example 2 (3) and the probe Y obtained in Example 6 (2) hybridize with the same mRNA, Northern blot analysis of mRNA extracted from colonic mucosal epithelial cells was performed using the above three types of probes Q, A, and Y.
  • RNA on nylon membrane After immobilizing RNA on nylon membrane by UV cross-linking, in 10 ml of hybridization solution (5xSSPE, 5x Denhardt's solution, 50% formamide, 0.5% SDS, 100 ⁇ gZml heat-denatured salmon sperm DNA) Prehybridization at 42 ° C for 8 hours.
  • hybridization solution 5xSSPE, 5x Denhardt's solution, 50% formamide, 0.5% SDS, 100 ⁇ gZml heat-denatured salmon sperm DNA
  • nucleotide sequence from the 5 'end to about 7.8 kbp (7826 bases) of the cDNA encoding the amino acid sequence of the protein capable of binding to the IgGF c portion see Examples 4 and 6. It described in. The method for determining the nucleotide sequence of the remaining nucleotide sequence of about 8.6 kbp is described below.
  • Example 4 a plurality of cDNA clones obtained by screening by hybridization using probes A, B or Q were amplified in E. coli, and then mapped using probes A, B and Q. was done. As a result, each clone hybridized with one or more of the three types of probes, and the probe homologous site was located on the cDNA in the order of A ⁇ B or B ⁇ Q or Q ⁇ A.
  • the F cy BP gene has a structure in which a sequence homologous to each of probes A, B, and Q is repeated in tandem multiple times in the order of A ⁇ B ⁇ Q.
  • a portion (about 280 base pairs) of the nucleotide sequence of probe B was amplified by PCR using the following primers.
  • the fragments amplified by PCR were separated by agarose gel electrophoresis and recovered from the gel, and the nucleotide sequence was analyzed. Based on this nucleotide sequence difference, the cDNA clones that hybridize with probe B were classified into the following three groups. The uncleaned cDNA clone was designated as group 4.
  • Group 1 Group having the same sequence as the amplification fragment of clone VI1.
  • Group 2 A group that has 5 base substitutions compared to the sequence of Group 1, and does not contain a HincII site in the fragment.
  • Group 3 A group that has 7 base substitutions compared to the sequence of Group 1, and contains a HincII site in the fragment.
  • Group 4 Group not hybridized with probe B.
  • a cDNA library prepared using the oligo dT primer in Example 3 was prepared in the same manner as in Example 4 using the probe A, B or Q. When screened by the method, it hybridized with probe Q only. Among the obtained cDNA clones, the clone having the longest cDNA insert was designated as clone T5.
  • the inserted cDNA of clone T5 was cut with Ec0RI, separated and purified by agarose gel electrophoresis, and inserted into the EcoRI site of plasmid vector pB1uescriptSK (+). Thereafter, a restriction enzyme map of T5 was prepared and the entire nucleotide sequence was determined.
  • the BamHI site about 1 km from the poly ( ⁇ +) base and about 1.6 kb from the poly (A +) 5 '
  • Approximately 550 base pairs sandwiched between the PstI sites of the above were used as probe V.
  • Probe V did not hybridize with clones NZ4, C72, Yl, XI, VII, # 53, # 40 and A31, and had a sequence specific for # 5.
  • a cDNA clone that hybridizes with probes ⁇ , ⁇ or Q is hybridized with probe V in the same manner as in Example 4, (2), and hybridized with probes ⁇ and ⁇ . However, clones hybridizing only with probes V and Q were obtained.
  • the inserted cDNA of this clone was cut with EcoRI, separated and purified by agarose gel electrophoresis, and inserted into the EcoRI site of the plasmid vector pBluescript SK (+). After this, the restriction map Preparation and analysis of the entire nucleotide sequence were performed.
  • the cDNA clones of the first, second, and third groups classified in (1) of Example 15 were subjected to PCR using the primers (P-3) and (P-4).
  • the fragments amplified by PCR were separated and collected by agarose gel electrophoresis, and the nucleotide sequences were analyzed.
  • a clone having the same nucleotide sequence as that of A43 in the PCR fragment was selected and designated as clone A8.
  • the entire nucleotide sequence of clone A8 was analyzed, and it was confirmed that the nucleotide sequence on the 3 'side completely matched the overlapping sequence on the 5' side of A43.
  • clone A53 the longer one of the portions overlapping the 3 'side of clone VII was designated as clone A53, and the shorter one was designated as clone A40.
  • clone A53 and clone A40 the nucleotide sequence of the fragment amplified by the primer (P-3) and the primer (P-4) is different from the sequence of VI1 in the first group, and also the sequence of A8 in the third group. Because of the difference, the following screening was performed using the sequence of this portion as an index. In other words, cDNA clones that hybridize with probe A, B or Q for the cDNA clones excluding group 1 and group 3 out of 69 clones were analyzed using primer (P-3) and primer (P-4).
  • PCR was performed using, and the nucleotide sequence of the amplified fragment was determined. CDNA clones whose nucleotide sequences were identical to clones A53 and A40 were selected. From these, a clone having the PCR amplified sequence at the 5 'end and extending to the 3' side was selected and designated as clone A31.
  • F cy BP cDNA is composed of three tandem repeats of a 3.5 kilobase pair unit (including homologous portions to probes A, B, and Q) in a total length of 16.4 kilobase pairs. Each repeat had a structure with 95% or more homology with each other (Fig. 8).
  • the cDNA used in the determination of the nucleotide sequence in the repeat structure has been cloned because it has strong reactivity with each of the A, B and Q probes.
  • the nucleotide sequences it was confirmed that the nucleotide sequences of the overlapping portions were the same, and the sequence of the cDNAs was clarified, whereby a series of cDNA fragments was converted into a single mRNA ( Gene).
  • a translation initiation codon (ATG) must be ligated to the 5' portion of the cDNA.
  • the frame in order for the protein to be translated to be translated in the same frame as FcaBP, the frame must be regulated between the initiation codon (ATG) and the 5 'end of the cDNA. Therefore, an oligonucleotide for an adapter satisfying the following two conditions was synthesized.
  • the synthetic oligonucleotide contains the same 7 base sequence (GCCATGG) as the start region of pNV11SR including the original start codon (ATG) of FcyBP, and shall conform to the Kozak rule.
  • a Hindill site is added to the 5 'end and an EcoRI site is added to the 3' end to facilitate insertion into the vector.
  • the following three oligonucleotides (FR-1S, FR-2S, FR-3S) were prepared to regulate the frame. Then, FR-1A, FR-2A, and FR-3A complementary to each oligonucleotide were also synthesized.
  • Each oligonucleotide was synthesized using a DNA synthesizer (model 11394, manufactured by ABI) and then purified.
  • FR-1S and FR-1A, FR-2S and FR-2A, FR-3S and FR-3A were annealed in the same manner as in Example 9- (5).
  • the 5 'terminal nucleotide was phosphorylated.
  • Example 9 The following operation was performed to add an XbaI site to the vector pBLSZT containing the stop codon prepared in accordance with item (5).
  • p BLSZTAIII was completely digested with the restriction enzyme XhoI, and the ends were blunted. After ligating the terminally phosphorylated Xba I phosphorylase, re-digesting with Xbal, self-ligating, and transforming the competent E. coli, the Xba I site in the Xho I site of pBLSZTAIII Into which pBL SZTAIII2 was inserted.
  • the cDNA portion of A53 was cut out with EcoRI and then inserted into the EcoRI site of Fr3-SK2. Select a plasmid in which the 5 'end of the cDNA is located at the start codon side of Fr3_SK2, and call this plasmid piF-A53.
  • PiF-A53 and piF-A8 were purified in the same manner as in Example 11- (1), and then used for protein expression experiments.
  • Example 11 PiF-A53 and piF-A8 were transfected into COS 7 cells in the same manner as in (2). After culturing for 2 days, cell staining was performed using a monoclonal antibody (mixture of K9 and K17) in the same manner as in Example 11- (3). A transiently expressed protein was detected. As a result, cells transfected with either piF-A53 or piF-A8 were stained with the monoclonal antibody, and both cDNAs were identified as proteins that were recognized by either or both K9 and K17. It was shown to be partially coded (see Figure 9, A and B). This confirmed that A53 and A8 were part of the repetitive sequence in the entire cDNA of FcaBP.
  • Example 17 Presumption that clone NZ4 is near the 5 'end of FcaBP mRNA 2
  • the transcription start site is present within about 20 bases upstream of clone NZ4, which is currently the most 5 'side, and the ninth ATG in NZ4 is the translation start site.
  • the FcaBP gene was isolated from the genomic DNA library, and the partial nucleotide sequence was determined.
  • the library 1 used was commercially available from human leukocytes (Vector 1, EMBL3 SP6 T7: manufactured by CLONTECH).
  • a cDNA clone NZ4 cut out from a vector with BamHI and the synthetic oligonucleotide (primer 2: GCTCCAGCCCAGAGTATCCACCAGCT CCATAGG, 33mer) used in Example 7 were each a [ 32 P] d CTP And ⁇ [ 32 P] ATP labeled by random priming (NZ 4) or end-labeled (primer 12) were used.
  • Screening with the probe NZ4 was performed according to the method of screening one cDNA library described in Example 3. In screening using synthetic oligonucleotide probes, the formamide concentration of the hybridization solution was determined. Washing was performed 5 times at 45 ° C for 30 minutes in a solution containing 0.3XSSCZ0.1% SDS.
  • Each positive clone was grown using host E. coli LE392 according to the method described in Example 2, and DNA was extracted.
  • IDNA (GHFc-l, 2,3) obtained in (4) was replaced with restriction enzymes (ApaI, BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, NcoI, P After complete digestion with stl, SacScal, Smal, Spel, Sphl, Stul, Xbal, and Xhol, 1% agarose gel electrophoresis followed by Southern blotting. Transfer to nylon membrane converts gel to 0.25N HC1
  • the insert size was approximately 15 kb (GHF c—1.2) and 13 kb (G HF c-3) were independent clones, and GHF c-1 and 2 were partially duplicated.
  • introns conforming to the GTZ AG rule exist between bases corresponding to positions 63 and 64 and between bases corresponding to positions 1311 and 1312 of the FcA BP cDNA (see FIG. 10).
  • the nucleotide sequence of the exon up to the 1311th nucleotide was completely identical to that of the cDNA (see Fig. 11).
  • the 5 'upstream of the cDNA clone NZ4 was contained in GHF c-3, but 87 bases from the putative translation initiation ATG described in Example 7, that is, 79 bases from the 5' end of NZ4 (SEQ ID NO: 1).
  • Example 18 Correlation between human FcrBP structure and IgGFc binding activity function
  • the protein structure having the amino acid sequence deduced from the entire nucleotide sequence of the Fc7BP cDNA obtained so far consists of about 400 amino acid residues.
  • R3, R6, and R9 have a homology of 95% or more with each other among the repeating units in the R section, and similarly, the three members R4, R7, and R10, R5, R8, The three members of R11 also had greater than 95% homology.
  • the units R1 to R5 had about 40% homology to each other. Therefore, in order to study the functions of these protein domains, we isolated mutant clones with several deletion sites in cDNA, expressed them in COS cells, and examined functions such as IgG binding activity. did.
  • the partial cDNA expressed in animal cells, pNV11 was expressed as one of H, R1, R2, R3, R4, R5 and R6 as shown in FIG.
  • the following experiment was performed to confirm where the Fc binding activity exists in each unit. That is, after inserting a cDNA fragment in which a part of NV11 has been deleted so that the amino acid matches the frame by cutting and recombining with restriction enzymes or combining clones to be ligated, the fragment is inserted into the expression vector SR. Enterobacter XL1-B was transformed.
  • Table 1 the sequence after partial deletion from NV11 was indicated by the base number of DNA. In the cDNA portion of NV11, the first base at which translation into protein is started is numbered 1, and the last base is numbered 7776.
  • the expression vector containing each cDNA fragment was purified from Escherichia coli, transiently expressed in COS 7 cells in the same manner as in Example 11, and then stained with human IgG Fc portion, and Fc7 BP specific. Staining with specific monoclonal antibodies K9 and K17. Further, in order to examine the inhibition of the monoclonal antibody on the binding of IgG Fc, the following staining was performed.
  • COS 7 cells in which cDNA was transiently expressed were fixed with ethanol. Heat-denatured human IgG is diluted to 1 / g nom with hybridoma culture supernatant containing one or both of inhibitory antibodies K9 and K17, or anti-FwRn (control antibody), and fixed.
  • the results are shown below.
  • human IgG was used as a primary antibody and an HRP-labeled anti-human IgG antibody was used as a secondary antibody in order to examine whether the gene expression product had IgG Fc binding activity.
  • the IgG binding activity is shown by the clones containing the entire sequence of the H region and, in addition, at least one whole region of the R region (NV11, NX, NZCY, ABssH, ATth, ASpl, ABssH / Tth , NXABssH, NZ CV11).
  • the intensity of the stainability indicating the binding activity of IgG tended to increase as the number of R portions contained increased.
  • clones having all or part of the R5 sequence (NV11, AHinc, ABssH, ATth, ASpl, ⁇ BssHZTth, AHinc / BssH, NZCVl l, VI 1) Staining of the monoclonal antibody K9 was observed, and all or part of R3 or R6 Lone (all clones except NZ CY and NZ C) showed staining for monoclonal antibody K17.
  • K9 or K17 showed some inhibition of IgG binding, which was higher than when both were added. Strongly inhibited, but not completely.
  • IgG Fc binding sites exist in the R1 to R5 regions including the R3 and R5 regions, and each R region can independently bind IgG.
  • each R region can independently bind IgG.
  • cDNA clones containing multiple R regions such as NV11 have the potential to bind multiple IgGs.
  • Example 19 Partial analysis of Fc7B P genomic gene (determination of transcription start site) Based on the results of primer extension in Example 7, the transcription start site is located within approximately 20 bases upstream of clone NZ4, which is currently the 5'-most clone It is presumed that the 9th ATG in NZ4 is the translation initiation site, but confirm whether an in-frame ATG or stop codon exists upstream of the NZ4. For this purpose, the Fc7BP gene was isolated from a genomic DNA library and its partial base sequence was determined.
  • Library one is derived from commercially available human leukocytes (vector, EMB L 3 SP 6 /
  • Example 7 Origonuku Reochido (Primer 2: GCTCCAGCCCAGAGTATCCACCAGCTCCATAGG, 33 mer), respectively [32 P] dCTP, r [32 P] labeled by random priming with ATP (NZ 4), or was used as the end-labeled (oligonucleotide).
  • Screening with the probe NZ4 was performed in accordance with the method for screening a cDNA library described in Example 4.
  • the formamide concentration of the hybridization solution was 20%, and washing was performed at 45 ° in a solution containing 0.3 x SS CZ 0.1% SDS. C, washing operation for 30 minutes was repeated 5 times.
  • IDNA (GHFc-1, 2, 3) obtained from step 4 was replaced with restriction enzymes (Apal, BamHI, EcoRI, Hindlll, Kpnl, Ncol, PstL Sacl, Seal, Smal, Spel, Sphl, Stul, Xbal, Xhol)
  • restriction enzymes Apal, BamHI, EcoRI, Hindlll, Kpnl, Ncol, PstL Sacl, Seal, Smal, Spel, Sphl, Stul, Xbal, Xhol
  • Southern blotting was performed. Transfer one to a nylon membrane 0.25 N HC1 gel, 0.4N NaOH / 1. 5M NaCl , 1M NH 4 Ac / 0.02N NaOH in 15 minutes, respectively, after treatment 2 times, at the same time one gel per the two membranes Transfer (bidirectional transfer) was performed.
  • Each of the two membranes was hybridized with an NZ4 probe and a synthetic oligonucleotide probe.
  • ssDM prepared with helper phage VCSM13 was used after subcloning EcoEI / SacI fragment of clone GHFc-3 (corresponding to about 2 kb upstream of cDNA clone NZ4) into pBluescriptSK +.
  • This template was annealed with the labeled primer 12 used in the primer extension, and synthesized with BcaBEST polymerase (TAKARA) at 65 ° C. for 10 minutes. This was digested with BamHI, denatured by heat, separated on a 7.5% polyacrylamide gel containing 8 M urea, and the target band was cut out.
  • the excised gel was incubated at 37 ° C in G buffer (1 M NH 4 OAc / 20 mM g (OAc) 2 /0.1 M EDTA / 0.2% SDS / 10 ug / ral yeast tRNA) and probed. Eluted.
  • the S 1 probe (lxl0 5 cpiii) mixing human colon epithelium-derived total RNA (40 // g) and polyA + RNA (1.5iig), S 1 hybrida I internalization solution after ethanol precipitation, respectively 20 / il (80 % Formamide / 40 mM PIPES / 400 mM NaCl / lmM EDTA).
  • clones GHFc-1 and 2.3 were independent clones with an insert size of approximately 15 kbp (GHFcl, 2) and 13 Kbp (GHFc3), and GHFcl and 2 were partially isolated. overlapped.
  • introns conforming to the GT / AG rule exist between bases corresponding to positions 63 and 64 and between bases corresponding to positions 1311 and 1312 in the FBP cDNA. ( Figures 10 and 11).
  • the 5 'upstream of the cDNA clone NZ4 is contained in GHFc3
  • the putative translation initiation ATG is 87 bases
  • a stop codon (TGA) in frame 79 bases upstream from the 5' end of NZ4
  • TGA stop codon
  • a typical promoter motif such as TATAZCCAAT was not contained within about 2 kbp 5 ′ upstream of NZ4.
  • a band having a length corresponding to 8, 9, and 10 bases upstream from this ATG was observed. Of these, the A residue of -10 showed the strongest signal. It was considered that transcription started from the group.
  • Example 2 0 F c 7 Analysis of BP gene polymorphism
  • the sequence of FCT BP cDNA indicated the presence of a gene polymorphism at a specific site within the coding region.
  • substitution of CCCGGG to CCTGGG was observed in the same region of Kuwaen A52 for the Smal site at positions 5120, 8723, and 12326 of F C7 BP cDNA. Since the library used for cDNA cloning is not derived from a single individual but from several genes, this base substitution is observed between individuals or the major one that exists per haploid genome in the same individual The following experiment was performed to confirm whether it was recognized between three repetition areas. Was done.
  • BC1 ACCACTCCTTCGATGGCC
  • GS1 ACCTGTAACTATGTGCTGGC
  • GS4 TGGTGCCGAGGGCAGCCACG
  • BC2 TGGGTCACTGAAATCCG, was synthesized.
  • DNA was extracted by Nelson et al.
  • Primer sets BC1 / BC2, BC1 / GS3, BC1 / GS4, GS1 / GS3, GS1 / GS4 are added to 20 ng of each DNA at a final concentration of 20 pmole, and PCR buffer (lOmM Tris HC1 pH 8.3, 50 mM KC1, 1.5 m MgCl 2 , 200 // M dNTPs, 0.001% gelatin, 2.5 unit taq polymerase) Medium, (94 ° C lmin-60 ° C 1.5 min-72 ° C 2.5 min x 30 cycles) PCR was performed under the following conditions. The PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel after Smal digestion, and stained with EtBr.
  • the reason that the polymorphism was not observed in the primer BC1ZBC2 was that the PCR product had a chain length of about 1.8 kbp, so an intron of approximately 1.6 kbp was present between the primer GS4 and the primer BC2, and the 5 ' Smal site on the side I was instigated. The length between this site and the target Smal site showing the polymorphism was very short, and the polymorphism was not detected because the difference in chain length between the BC1ZB C2 amplification product and its Smal digestion product was small. Was presumed.
  • Example 21 Isolation of inducible high expression CHO cell line and detection of FwBP
  • the pMS XND vector has, as an expression promoter, a metamouth thionein promoter capable of inducing protein expression by sodium butyrate, etc., and has a dh fr gene that enables gene amplification after integration into chromosomal DNA. It has been built.
  • plasmid was completely digested with XhoI, which is a cDNA cloning site of pMSXND, and then treated with 0.4 units of Klenow Fragment for 15 minutes to blunt the ends.
  • Not I linker (5'-pGCGGCCGC-3 ') was ligated to the vector, completely digested with Not I, self-ligated, and transformed into competent E. col XL 1-B. .
  • the resulting clone was analyzed to obtain a plasmid pMSXND-NOT in which the NotI linker was inserted at the XhoI site of pMSXND.
  • pNVl1-ST which is a plasmid into which Fc7BPc DNA prepared in Example 6- (6) was incorporated, was completely digested with NotI, and the cDNA fragment of 8 kbp was analyzed by agarose gel electrophoresis. Was separated and recovered.
  • These expression vectors were ligated with the cDNA insert to transform the competent E. c01 (XL1-B). From the colonies grown on the LB plate containing ampicillin, a plasmid in which cDNA was inserted in the sense direction with respect to the metallothionein promoter was selected to obtain pNV11-MSX.
  • the medium was replaced with lmgZnii G418, 10% fetal bovine serum-free MEM medium (without nucleotides, manufactured by GIBCO), and cultured for 14 days while changing the medium every 3 days.
  • the selected cells were selected. Cells were cloned by limiting dilution from the dish in which several tens of colonies were formed in this way. From the obtained cell clones, those showing protein expression with high Fc binding activity were selected, and then gene amplification was performed to obtain a higher expression level.
  • pNV11—MSX is integrated into the chromosome of CHO cells, and the amplified gene is amplified by methotrexate treatment to increase the protein production of cell clones that stably express the FCTB P fragment.
  • Cells were in a cell lysis buffer of 500 // (50 mM Tris-HCi (pH7.5), 15 OmM NaCf, lmM EDTA, ImM PMSF, 10 mM monoiodo acetamide, 10 // g / mi approtin ine, lQiig / l leupeptin) After suspension, the cells were subjected to sonication (30 seconds> ⁇ 3 times), and centrifuged at 4 ° C for 10 minutes at 10, OOxg. The supernatant after centrifugation (LYS 1) was removed, and the residue was added with 400 W of cell lysis buffer containing 1% NP-40.
  • 500 50 mM Tris-HCi (pH7.5), 15 OmM NaCf, lmM EDTA, ImM PMSF, 10 mM monoiodo acetamide, 10 // g / mi approtin ine, lQiig / l leupeptin
  • LYS 2 After sonication, the mixture was centrifuged and the supernatant was collected (LYS 2). The residue was further dissolved in 200 W of cell lysis buffer containing 1% NP-40, 0.1% SDS, and 0.5% sodium deoxycholate, and then centrifuged to collect the supernatant (LYS 3). Residue was suspended in 10 ⁇ of cell lysis buffer (LYS 4). A lysate of colon epithelial cells (1/100 to 1/3200 dilution) was used as a control.
  • FCTB P fragments To quantitatively detect produced is FCTB P fragments, we developed a sandwich EL ISA system using specific monoclonal antibodies K 9 and K 1 7 against the Fc T BP. Prepare the affinity-purified K9 antibody to a concentration of 5 / g / mf in 0.05M carbonate buffer (PH9.2), and add it to an ELISA plate (PRO-BI ND, Falcon) at 50WZ per well. After that, the mixture was allowed to stand at 4 ° C. Wash the gel 3 times with a washing solution (PBS (-) containing 0.05% Tween-20), add 50 ⁇ ⁇ / ⁇ l of blocking solution (RPM 1640 medium containing 10% serum), and in a greenhouse for 60 minutes. I left it.
  • PBS washing solution
  • RPM 1640 medium containing 10% serum
  • Fc7B P fragment results measured at Sanditsuchi ELISA method
  • TGS AC- C TH ZAG GCG? .TGTCCT AAGkGTGACT CTACAGCCCT 600
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • CCAAGCTCAC CTGGGAGGCT GTGCCAGGCA GTGAGTTCTC G ATGCTGAA 50 GTGG.
  • GCTCG GCCAGCTGA CATGATCCAC ACGGCCGGG CCACCACC1A 100 CTTGGGACTG CTCA.CCTTCG GGCTGGCCA GGCTATAGGC TACGC CAG 150 CTGC GATTG CGGCCGGAC GTACTGTCCC CAGTGGAQCC CTCC GCG ⁇ A 200 GGCATGCAGT GCGCAGCCGG GC.GCGCTGC CAGGTGG AG GCGGG ⁇ AGGC 250 CC-GGTGTGIG GCGGAGTCCA CCGCTGTCTG CCGCGCCCAG GGCGACCCCC 300 OTACACCAC CTTCC ⁇ CGGC CGTCGCTACG ACATGATGGG CACCTGTTCG 350 TAC3 ⁇ 4CG3 ⁇ 4TGG TGG?
  • CTTCGACGGC CGTCGCTACG ACATGATGGG CACCTGTTCG TACACGA.TGG 50 TGG3 ⁇ 4GCTGTG CAGCGAGGAC GACACCCTGC CCGCCTTCAG CGTGG .GGCC 100? • AGAACGAGC ACCGGGGCAG CCGCCGCG C TCCTACGTGG GCCTCG CAC 150
  • GCT C GACGGCCGGC GCTTCGACTT 1200 .
  • TC-C-GCACC TGC3 ⁇ 4CGTACC TGCTGGTCGG C CK
  • CTTCG CTTCG .
  • TGGC 2350 CGCCGCTTCG ACTTC3 ⁇ 4TGGG CACC GCG G TATGTGCTGG CTC3 ⁇ 4GA.CCTG 2400 CGC A.CCCG3 C GXCTGC ATCC-TTTGC CGTCCTC AG Q ⁇ ACG C-:-2450 CCTGGC-GT ⁇ A TGGGCQ -TC AGTGTGTGACCA C-GGI .TC3 ⁇ 4C GG CCAGG G 2500 GOLACTTCA CCCTGCGGC GGAC- ⁇ .GG TCACGC-TGAA 2550 CG3 GTGGAC ATG?
  • SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 5 Sequence length: 3661 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: cDNA sequence.
  • CTATGTGCGG GTCACCGTCC CCGGAAACTA CTACCAGCAG ATG GTGGCC 50 TGTGTGGGAA CTACAACGGC GACCCCAAGG ATG ITCCA GAAGCCCAT 100 GGCTCACAGG CAGGC CGC CAATGAGTTC GGC CTCCT GGG3 ⁇ 4GGA.GGT 150
  • GCGTC3 ⁇ 4COA AGA.CCCGTGC CACGGCGTG3 ⁇ 4 CATGCCGGCC ACAGG G CA 850
  • TCTCCGCCAC 2700 CG ⁇ CGGCCCG CTGGCGCCCT GCQ .CGGCCT TGTGCCGCCC GCGCAGTACT 2750 TCCAGGGC G C TGCTGGAC GCCTGCC ⁇ AG T CAGGGCd TCCTGGA.GGC 2800 CTCTC-TCCTG CAGTGGCCAC CTACGTGG ⁇ GCCTGTCAGG CCGCTGGGGC, 2350 CC3 ⁇ 4GCTCCQC GGCCGGACTT CTGTCCCCTC CGTGTCCCTTC
  • AAAGAAGGIC ACAGTGAGGC CCGGGGAGTC GGTCATGGTC 3 ⁇ 4AC3 ⁇ 4TCAGTG 300 rLysLysVal ThrValArg? RcGlvGluSe r aL ⁇ tVal AsnlleSerA
  • CTGTGCGC3 ⁇ 4G CCTGCAACC3 ⁇ 4 TGTGGTTGAG CAGCTGCTAC 750 rCysAiaC-ln LysHisThr hrCysAs HisValValGlu GlnLeuLeu?
  • GTGSGC3 ⁇ 4TCC AGGTCCTGTT GTTTGGCA.
  • GA.GTGAAG A CTTTGCCCAC TG GCTGCCC ACCCCACAGC CACTATGAGG 3450 gSerGluGIu LeuCysProL euS Mi rCysProProHisSer HisTyrGIiA
  • CTGCCTGCCG CCCACCCCTT GCCCGCCGGG G GCGAGG ⁇ C TGTATCCCC ⁇ . 4350 oCysLeuPro ProThrPrcC ysProProGlySer la ⁇ CysIleProS
  • TGTGC-GCTCC CTCCAGCCC C CAGGGCCA CTGTCCTCCT GCCA.C
  • GCAGGTGTGC C .GCCCTCCG GAGGC ⁇ TCCT GAGCTGCGTC ACCAAAQ C 4950 yGlnValCys GlnProSerG lyGlylleLe uSerCysVal ThrLysAsp?
  • GGCCTQ .C CCTTCACCG CACCACC AG CCAGAACC GGGGCAACCC 5200 GlyLeuThr? RoPheT rVa IThrThrLys AsnGlnAsnA rgGlyAsnPr
  • TCTCQi-TCCA CAAGGACGAG ATCGGCAAAG TCCGGGTG A CGGTGTGCTC 5300 '-leSerlleP-i sLysAspGlu IleGlyLysV aL3 ⁇ 4rgVaL3 ⁇ 4s nGlyValLeu
  • GGCGA.GCCCC AQXTGGGAC CCACTGTGTT GGG? -CG3 ⁇ 4ATG TCGGGGGTCC 5600 rpArgAiaPr cC-ly rpAs? ProLeuCysT rpAspGluCy sArgGlySer
  • CTGCGGA CCC CTGGCCCCCG GCAC ⁇ GGGGG CCCTTTCACC ACCTGCCATG 5700 eCysGIyPro LeuAi ProG l ThrGl Gly yProPheThr ThrCysKisA
  • CTGCTCCC ⁇ G TGGTGTCGCT GC GGCC GC- GGGTGGCTCG CTGGTCTQC ⁇ 6150 rCysSerGln TrpCysArgC-ysGlyProGl yGlyGlySer LeuVaiCysT
  • ACGATGACCG CTACTACCCA CTCGGCCAGA CCTTCTACCC TGGCCCTGGG 7250 isAspAspAr gTyrTyrPro LeuGlyGlnT hrPheTyrProGlyProGly
  • GCTGCGTGC-C CGTGGGCTCT ACCACCTGCC AGGCGTCGGG AG ⁇ TCCCCAC 7400 l CysVaiAl aValGlySer Thr hrCysG InAlaSerC-lyAspProHis
  • Sequence length 16382
  • Sequence type nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA sequence
  • ACGTCTGCCT 750 sHisThrThr CvsAsnHisValValGIuGl nLeuLeuPro ThrSen3 ⁇ 4laT
  • CTGCTCACCT TCGGGCTGGC C AGGCTATA GGCTACG AA
  • GCC1H G AGC .CCGGGG CAGCCGCCGC GTCTCCTACG TGGGCCTCGT 1600 AlaLysAsnG luHisArgGi vSerArgArg ValSerTyrV alGivLeuVa
  • GCCTGCCTGC ACGCTTCC A GACCAGGTGT GCGGGCTGTG TGC ACTAT 1850 erLeuProAl aArgPheGln AspGlnValC ysGlyLeuCy sGlyAsnTyr
  • GICC AGCT GG ⁇ CTCCCTG GTGGCCCAGC AGCTGCAG ⁇ G CAAGAATGAG 3200 ysProLysLe uAspSerLeu ValAlaGlnG InLeuGlnSe rLvsAsnGiu
  • ACCCACCAGG CCAGACCTTC TACCCTGGCC CCGG3 ⁇ 4TGTGA TTCCCTTTGC 3650 isProProGl vGlnThrPhe TyrProGlyP roGlyCysAs pSerLeuCys
  • CTGCGGCACC CGGCCTGGCC TGO TCGGIT TGCCGTCCTG CAGGAG ACG 3900 rCysGlvThr ArgProGlyL euHisArgPh e laValLeu GlnGluAsnV
  • TGCCTGCCCA ACTATG3 ⁇ 4GGC CACG GCTGG CTGTGGGGCG ACCCACACTA 5050 CysLeuProA snTyrGluAl aThrCysTrp LeuTrpGlyA spProHisTy
  • TTCACCGTCA CCACC AG A CCAG ACCGG GG AACCCTG CTGTGTCCTA 5200 PheThrValT hrThrLysAs nGlnAs ⁇ rg Gly.3 ⁇ 43nProA laValSer v
  • CTGAGAGCTT CTTCAAGGGC TGTGTTCTGG ACGTCTGCAT GGGTGGTC-GG 5750 roGluSerPh ePheLysGly CysValLeuA spVa! Cys ⁇ fe tGlvGlvGly
  • CCCATTACGT 6250 GlnProVaiSerThrAiaGl uCysGlnAla Trp31yAs? ProHisTyrVa
  • CTGCGTGTGG CCTACG3 ⁇ 4CCT TGIGTACTAT GTGCGGGTCA CCGTCCCTGG 7750 LeuArgVaL ⁇ laTyrAspLe uValTyrTyr VaL rgValT hrValProGl ACTACTAC CAGC GATGT GTGGCCTGTC- TGGG ACTAC AACGGCGACC 7800 vAsnTyrXlyCyrTyrGyrCyr 10 20 30 40 50
  • CAGTC-TCACC CTC ATCT ACAACCACAG CCTG CACTG AGTGCCCGCT 10050 cSerValThr LeuGlnlleT yrAsnHisSe rLeuThrleu SerAiaArgT
  • GTGGC .GCCT G CAGGCCGC TGGGGCCC .G CTCCGCGA.GT GG .GGCGGCC 10600 ValAiaAiaC ysGlnAlaAl aGly aGln LeuArgGluT rpArgArgPr
  • GZCGZCGZCC ACCTGCCCGC CGGGG .GCG .GGGCTGTATC CCCAGCGAGG 11550 uProProPro ThrCvsProP rcGlySerC-1 uGlyCysle PrcSerGluG
  • CTCCTCTCCA GCCCCACAGG GC .
  • CTGTCC TCCTGCCACA AGCTGGTGGA 11650 LeuLeuSerSerProThrGl yProLeuSer SerCysHisL ysLeuValAs
  • ACACCCTTCA CCGTCACCAC CAAG ⁇ -ACCAG AACCGGGGCA ACCCTGCTGT 12400 ThrProPheT hrValThrTh rLysAsnGln AsnArgGlyA snProAlaVa
  • TTGCCTGTCT CCGTGGCCGA CGGGCGGATT TCAGTGGCCC AGGGTC .
  • TC 12550 I ⁇ uProValS erVaL ⁇ laAs pGlyArglle SerValAlaG InGlyAiaSe d 3 ⁇ 43GCACTG CTGGTGGCTG ACTTTGGACT GCAAGTCAGC TATGACTGGA 12600 rLys laLeu uValAlaA spPheGlyLe uGlnValSer TyrAspTrpA r 10 20 30 40 50
  • GGTGGGGACC ATGAC TTCT TTGCAAGGCT CTGGCTTCCT ACGTGGCCC-C 13000
  • GlyGlyAspH isAspIleLe uCysLysMa LeuAlaSerT yrValAiaAl
  • GGC CCTACC ACG?, GGCGGG CAGTGAG TT TGGGCTGATG GCACCTGCTC 13300 Gly-Thr yrH isGluAiaGlySerGIuPhe TrpAl AspG Iv ⁇ hrCysSe

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Description

明 細 書
I gGF c部結合タンパク質をコードする遺伝子 技術分野
本発明は免疫グロブリン G ( I gG) の F c部分と特異的に結合するタンパク ； 質である I gGF c部結合タンパク質 （F cァ BP ： F c y B i n d i n g P r o t e i nおよび I gGF c B Pと記載することもある） をコ一ドする遺伝 子、 該遺伝子を含有する組換えべクタ一、 該組換えベクターにより形質転換され た宿主細胞、 該宿主細胞を培養して得られる組換えタンパク質の製造方法、 なら びに上記方法で得られる組換え I gGF c部結合活性を示すタンパク質に関する c
背景技術
マクロファージは免疫担当細胞の 1つとして、 生体外から侵入してきた異物や そのィムノグロブリン G ( I gG) 複合体を貪食作用 （p h a go c y t o s i s) により細胞内に取り込み、 消化し、 またリンパ球による抗体産生を誘起させ るために、 抗原提示作用を示す能力も有する。 このような貪食機構の主たる入口 がマクロファージの細胞表面上に存在する I gGの F cレセプター （F c 7レセ プター： F cァ R) である。 F cァレセプターは I gGの F c部を結合するレセ プターであるが、 その本来の機能は、 I gGによっておおわれた （ォプソニン化） 病原体あるいは抗原一 I gG免疫複合体を除去することにある。
従来 F c 7レセプターには大別して 3種類の存在が知られており、 これらは R I、 RII, RIIIと名付けられている (J. V. Ravetch and J. -P. Kinet, Annu. Rev. I mmunol. (1991), 9:457-492)。 これらのレセプターはいずれもすでにその c DN Aがクロ一ニングされている。 さらに、 1990年〜 1991年にはいくつかの グループによって、 これら F c 7レセプターに会合しており、 F cァレセプター がその結合物を内部に取り込むために必要な動きを始めるためのタンパク質が見 いだされ、 スィッチ機構の糸口が明らかにされた （L.L.Lanier, G. Yu and J. H. P hillips, Nature (1989), 342:803-805; T. Kurosaki and J. V. Ravetch, Nature (1989), 342:805-807; D. G. Oriof f , C. Ra, S.J.Frank, R. D. Klausner and J. -P. Kinet, Nature (1989), 347 :189 - 191; P. Anderson, M. Caligiuri, C.0' Brien, T. Manley, J. Ritz and S. F. Schlossman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 87:227 4-2278; T. Kurosaki, I. Gander and J. V. Ravetch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19 91), 88:3837-3841; L. Azzoni, M. Kamoun, T. W. Salcedo, P. Kanakaraj and B. Pe russia, J. Exp. Med. (1992), 176:1745-1750; A. T. Ting, L. M. Karnitz, R. A.Sch oon, E. T. Abraham and P. J. Leibson, J. Exp. Med. (1992), 176:1751-1755) 。
—方、 小林らはヒト小腸および大腸上皮細胞、 特にゴブレツ ト細胞に I gGの F c部と特異的に結合でき、 かつ従来の F c rレセプターとは異なるタンパク質 F c y B Pの存在を報告した。 このタンパク質の I gGF c部との特異的結合は ホースラディッシュペルォキシダ一ゼ （HRP) 標識物を用いて確認されている。 すなわち、 F c 7 B Pは I gGの F c部とのみ結合し、 I gGF a b、 I gA、 I gMとは結合しない。 また F cァ B Pは F cァレセプター I、 II、 III抗体と交 差反応しない （K.Kobayashi, M. J. Blaser and W. R. Brown, J. Immunol. (1989), 143:2567-2574) 。
さらに、 彼らは F c 7 BPをヒト大腸上皮細胞から部分精製し、 これを抗原と してマウスモノクローナル抗体を作製した。 これらの抗体と F c r B Pが結合す るだけでなく、 マウス I gGとも結合することが確認された （K.Kobayashi, Y. H amada, M. J. Blaser and W. R. Brown, J. Immunol. (1991)， 146:68-74) 。
また、 部分精製 F cァ BPをドデシル硫酸ナトリウム （SDS) 電気泳動した 後、 モノクローナル抗体を用いたウェスタンプロッ ト解析に付したところ、 F c r B Pは分子量 78 k D aのタンパク質を含む 200 k D a以上の会合体を形成 していることが明らかとなった （K. Kobayashi, Y. Hamada, M. J. Blaser and W. R. Brown, J. Immunol. (1991), 146:68-74) 。
上記 F cァ BPは I gGの F c部と結合できるという点においては F cァレセ プターと同様の性質を示す。 しかしながら、 F cァ B Pのタンパク質としての安 定性、 構造およびその生体内の役割については何ら明らかではなかった。 したがつ て、 F c y BPを解析し、 その構造と機能を明らかにすることは極めて興味深い。 さらに後述するように、 F c y B Pは粘液とともに粘膜上に分泌され、 I g G 抗体とともに、 体内に侵入しょうとする病原菌やウィルスなどを粘液中にトラッ プし、 体外に排泄し易くすることで、 感染防御の一端をになっていると推定され る。 また、 炎症の起こった粘膜で過剰に産生された自己抗体は、 補体系を活性化 したり、 マクロファージなどによる細胞障害を起こさせたりして、 炎症の悪化に つながるが、 F cァ B Pはこのような自己抗体の F c部をプロックして炎症の進 展を防ぐと推定される。 このような F cァ B Pの機能から感染防御剤、 および漬 瘍性大腸炎やクローン病などの自己免疫疾患に対する抗 （消） 炎症剤や診断薬な どの医薬用途に利用できる可能性を有している。
そこで F c r B Pをこのような医薬用途に用いるにはこれを大量にかつ均一に 得る必要があった。 しかしながら、 F cァ B Pを動物組織自体、 またはその産生 細胞の培養上清から単離する方法では大量に均一な F c 7 B Pを得ることは困難 であった。 したがって、 遺伝子組換え技術を用いて F cァ B Pを大量に製造する ことが望まれていた。
本発明者らは、 F cァ B Pに対するモノクローナル抗体を用いて F cァ B Pの c D N Aのクローニングを行って、 F cァ B Pをコ一ドする遺伝子の塩基配列を 明らかにすることに成功した。
また、 この c D N Aを適当なベクタ一に挿入して得られる発現ベクターで宿主 細胞を形質転換し、 得られる形質転換体を培養し、 次いで産生された目的タンパ ク質を分離、 精製したところ、 産生タンパク質はヒト I g Gと特異的に結合する 性質を有していた。 これにより F cァ B Pを大量かつ均一に製造することができ ることも明らかにした。 発明の開示
したがって、 本発明は F c y B Pをコードする遺伝子を提供する。
本発明はまた、 F C 7 B Pをコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供す る
本発明はさらに、 F cァ B Pをコ一ドする遺伝子を含む組換えベクターによつ て形質転換された原核もしくは真核宿主細胞を提供する。 本発明はさらに、 F cァ BPをコードする遺伝子を含む組換えべクタ一によつ て形質転換して得られた形質転換体を培養し、 産生された目的タンパク質を分離、 精製することを特徴とする、 F cァ BPの製造方法を提供する。
本発明はさらに、 上記製造方法で製造された I gGF c部結合活性を示すタン パク質を提供する。
本発明はさらに、 F cァ B Pをコードする遺伝子またはその一部を、 F c yB PmRN Aの合成組織を同定するためのノーザンプロッ ト解析法またはィンサイ チュハイブリダィゼーシヨン法のプローブとして使用する方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 プローブ Qを用いて行った F c r B P mRNAのハイブリダイゼー シヨンの結果を示す図 （電気泳動の写真） である。
図 2は、 F cァ B Pの発現に用いた部分 c DNA (約 7. 8 k b p) 、 ならび にクローン NZ4、 C72、 Yl、 XIおよび VI 1の相互の関係を示す。
図 3は、 ベクタ一 pNV 11一 SRを用いて形質転換した COS 7細胞の発現 するタンパク質を確認する図 （生物の形態を示す写真） である。 一次抗体として、 Aは K 9モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマ培養上清、 Bは K17モノクロ ーナル抗体産生ハイプリ ドーマ培養上清を用いた。 Cは一次抗体を加えない対照 c いずれのものにも二次抗体として HRP結合ャギ抗マウス I gG (H + L) F (a b' ) 2フラグメントを加えた。
図 4は、 ベクタ一 pNVl 1— SRを用いて形質転換した COS 7細胞の発現 するタンパク質のヒト I gG結合能を示す図 （生物の形態を示す写真） である。 いずれのものにも一次抗体として HRP結合ヒト I gGを用いた。 拮抗剤として 用いた二次抗体は以下の通り ； A：加えず （対照） 、 B ： クロマトグラフィー精 製ヒト I gG画分、 C ： クロマトグラフィー精製ヒト I gG F c画分。
図 5は、 ベクター pNV 11— SRを用いて形質転換した COS 7細胞の発現 するタンパク質のヒト I gG結合能を示す図 （生物の形態を示す写真） である。 いずれのものにも一次抗体として HRP結合ヒト I gGを用いた。 拮抗剤として 用いた二次抗体は以下の通り ； D： クロマトグラフィー精製ヒト I gG F (a b' ) 2画分、 E ： クロマトグラフィー精製ヒト I gM画分、 F ： クロマトグラ フィ一精製ヒ卜血清 I gA、 G： クロマトグラフィー精製ヒト分泌型 I gA。 図 6は、 F C 7 B P mRN Aのヒ 卜組織での発現の特異性を示すノーザンブ ロッ 卜の図 （電気泳動の写真） である。
図 7は、 プローブ Q、 Aおよび Yを用いて実施した大腸粘膜上皮細胞中の F c ァ B P mRN Aのノーザンブロッ ト解析を示す図 （電気泳動の写真） である。 図 8は、 F cァ B Pの全長 c DNAの構造を示す図である。
図 9は、 プラスミ ド p i F— A53および p i F— A 8を用いて形質転換した COS 7細胞とモノクローナル抗体 K9ZK1 7混液との結合能を示す図 （生物 の形態を示す写真） である。 A : p i F— A53、 B : p i F— A8。
図 10は、 F c y BPのェキソン イントロン境界領域の塩基配列の比較を示 す図である。 大文字 （ボックス） はェキソン、 小文字はイントロンを示す。 また 下線部は高度に保存された配列を示す。 R：プリン、 y ： ピリミジン。
図 1 1は、 F cァ BPゲノム DNAの 5' 側翻訳開始部位近傍の塩基配列を示 す図である。 大文字はヱキソン、 小文字はイントロンを示す。 下線で示した部分 は c DNAと同一の部分を、 また s h a d eされた太文字は i n f r ameで の TGAストップコドンおよび翻訳開始部位と推定される ATGコドンを示す。 なお、 数字は c DNAクローン NZ 4の 5' 末端を + 1とし、 ェキソンの上にの み番号を付けた。
図 12は、 ヒト F cァ B Pの構造と、 本発明で用いた各クローンの対応する位 置を示す。
図 13は、 F cァ BPフラグメントを発現する CHO細胞を示す （生物の形態 を示す写真） 。 （A) はメ トトレキセート 6. 4 M、 ナトリウムプチレート非 処理； （B) はメ ト トレキセ一ト 6. 4 fiM^ 5mM ナトリウムブチレート処 理後を示す。 発明の詳細な説明
F c r B Pをコードする c DNAは、 例えば F c r B Pを産生する細胞などか ら mRNAを調製した後、 既知の方法により二本鎖 c DNAに変換することによ り得られる。 mRNAの供給源としては、 本発明ではヒト大腸粘膜上皮細胞を用 いたが、 これに限らず、 ヒト小腸、 十二指腸、 胃、 顎下腺、 舌下腺、 総胆管、 気 管支などの F c r B Pが分布している組織のホモジヱネートなどを用いてもよい c また、 ヒ 卜大腸癌細胞由来 HT29— 18— N 2株およびその亜種は F c r BP を産生していることが知られているので、 これらの株化細胞を mRNAの供給源 として用いてもよい。
mRNAを調製するには、 例えば本発明で用いたように、 AG PC法 （P. Cho mczynski et al. Analytical Biochem. 162:156-159, 1987) の改変法の他、 C h i r gwi nら （Biochemistry 18:5294-5299, 1979) の方法にしたがって、 全 RNAを調製できる。 また、 他の生理活性タンパク質の遺伝子をクローン化す るときに用いられた方法、 例えばバナジウム複合体などのリボヌクレアーゼィン ヒビタ一存在下に界面活性剤処理、 フ Xノール処理を行うことによっても実施す ることができる
こうして得られた mRNAから二本鎖 c DN Aを得るには、 例えば mRNAを 铸型にして、 3' 末端にあるポリ A—鎖に相補的なオリゴ （dT) またはランダ ムプライマー、 あるいは F cァ B Pのアミノ酸配列の一部に相応する合成オリゴ ヌクレオチドをプライマ一として逆転写反応を行い、 mRNAに相捕的な DNA (c DNA) を合成する。
本発明では、 Gub l e r & H o f f m a nの改良法を用いて、 Am e r s h am社製または I n V i t r o g e n社製の c DNA合成キッ 卜とランダム プライマーを用いて、 ポリアデニル化 RNAから逆転写反応により cDNAを作 製した。
この c DN Aにアダプターを連結させた後、 ；i g t 11ベクターの E c oR I 部位に挿入した。 このようにして作製した c DN Aライブラリーを、 S t r a t a g e n e社のファージ i n v i t r oノ、0ッケージングキッ ト G i ga p a c kllG o 1 dを用いて、 スファージにパッケージングした後大腸菌に発現させた。 発現した c DN Aのタンパク質をモノクローナル抗体をプローブとしてスクリー ニングを行った。
上記クローニングに用いる抗体は、 I gGF cと F cァ BPとの間の結合を阻 害する 3種類のモノクローナル抗体 （K9、 Κ10、 Κ 17) (Kobayashi et a 1. J. Immunology 146:68-74， 1991; Kobahashi et al. J. Immunology 143:256 7-2574, 1989) の中から、 ウェスタンプロッ ト解析において F cァ B Pを検出で きる抗体を選択した。 すなわち、 非還元条件下では K 9抗体で分子量約 200 k D aより大きいバンドが、 還元条件下では K 17抗体で 70— 80 kD aと 13 0— 140 kD aにバンドがそれぞれ認められた。 以上の結果より、 クローニン グにはこの 2種の異なるェピトープを認識するモノクローナル抗体を用いた。 このスクリーニングの結果、 K 9抗体では、 約 10ひ万個のクローンより 1個 のクローン （プローブ Qと命名： 600 b p) を、 また K 17抗体では、 約 60 万個のクローンより 7個のクローン （そのうちの 700 b pの DNA断片をプロ ーブ Aと命名； 600 b pの DNA断片をプローブ Bと命名） を得た。
プローブ Qを用いて既知夕ンパク質の mRN Aと比較することによって、 F c r B P mRNAのサイズを推定した。 その結果、 F c 7 B P mRNAの分子 サイズは約 17 k b pであると推定された （図 1) 。
次いでプローブ Q、 Aおよび Bを用いてス g t 10にパッケージングした第 2 c DNAライブラリ一のスクリーニングを行った。 まずプローブ A、 Bまたは Q のいずれかとハイブリダイズする c DNAクローンを分離した。 これらのうちか ら、 Aとのみハイブリダィズするクローンを得て、 Aとは反対側の末端部をプロ ーブ Xとして、 プローブ X (約 700 b p) とハイブリダィズする c DNAクロ ーンを分離した。 得られたクローンは Xを中心部にし、 一端に A— B領域をもつ ており、 これを XIと命名した。 続いて、 クローン X 1の A— B領域とは反対側 の部分約 800 b pをプローブ Yとして、 再び c DN Aライブラリーをスクリー ニングし、 プローブ Yとハイブリダィズする cDN Aクローンを得た。 このクロ ーンを Y1と命名した。 クローン Y1は一端に X領域の一部を有し、 中心部に Y 領域を有する。 このクローン Y1の X領域とは反対側の端にある約 150 b pを プローブ Y 150とした。 再び c DN Aライブラリ一をプローブ Y 150を用い てスクリーニングした。 この中から Y150領域と反対側に最も長く伸びたクロ ーンを選び、 クローン C 72とした。 次に、 クローン C 72がもつ Y 150領域 とは反対側の端近くにある約 450 b pをプローブ Zとし、 プローブ Zとハイブ リダイズする c DN Aクローンを分離した。 これらの中からクローン C 72と重 複しない部分ができるだけ長いものを分離し、 クローン NZ 4とした。
一方、 A、 Bおよび Qのいずれともハイブリダィズする c DNAクローンの中 から、 A— B領域の塩基配列がクローン XIの A— B領域の塩基配列と同一のも のを選び出し、 これをクローン V 11とした。
以上の 5個のクローン、 XI、 Yl、 C 72、 NZ 4および V 11の塩基配列 を決定し、 タンパク質のアミノ酸配列を確認したところ、 ATGを開始コドンと する 1本のオープンリーディングフレームを見いだした （図 2参照） 。
さらに、 これらのクローンから F cァ BPをコードする部分 cDNA (約 7. 8kb p) を得て、 その塩基配列を決定した （配列番号 6に塩基配列およびァミ ノ酸配列を示す） 。
さらに、 上記プローブ A、 Bまたは Qを用いたハイブリダィゼーシヨンによる スクリーニングで得られた複数の c D N Aクローンをそれぞれ大腸菌内で増幅し た後、 プローブ A、 B、 Qを用いてマッピングを行った。 その結果、 F c y BP の cDNAは全長 16. 4kb pの中に 3. 5 k b pをユニッ トとする単位 （プ ローブ A、 B、 Qのそれぞれと相同な配列が A→B→Qの順に連なった単位） が タンデムに複数回繰り返した構造を有することが推定された。
そこでプローブ Bとハイブリダイズする c DN Aクローンについて、 プローブ の塩基配列の一部を PC Rにより増幅させ、 得られたフラグメン卜の塩基配列を 解析することにより、 F cァ B Pの全長 c DNAは図 8に示す構造を有し、 配列 表の配列番号 7に示す塩基配列とァミノ酸配列を有することが明らかとなつた。 このようにして得られたクローン化された F cァ BPをコードする遺伝子は適 当なベクターに組み込むことにより、 原核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質 転換することができる。
さらに、 これらのベクターに適当なプロモーターや形質発現にかかわる配列を 導入することにより、 それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現することが可能 である。 また、 目的とする遺伝子に他のポリペプチドをコードする遺伝子を連結 して、 融合タンパク質として発現させ、 精製を容易にしたり、 発現量を上げたり、 また精製工程において適当な処理を施すことにより、 目的タンパク質を切り出す ことも可能である。
一般に、 真核生物の遺伝子はヒトインタ一フエロン遺伝子で知られているよう に、 多形現象を示すと考えられ、 この多形現象によって 1個またはそれ以上のァ ミノ酸が置換される場合もあれば、 塩基配列の変化はあってもアミノ酸は全く変 わらない場合もある。
また、 配列表の配列番号 6または 7あるいはその一部に示すァミノ酸配列中の 1個またはそれ以上のアミノ酸を欠くかまたは付加したポリべプチド、 あるいは アミノ酸が 1個またはそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでも I g G F cへの結合性を有することがある。 例えば、 ヒトインターロイキン 2 ( I L— 2 ) 遺伝子のシスティンに相当する塩基配列をセリンに相当する塩基配列に変換 して得られたポリべプチドが I L— 2活性を保持することも既に公知になってい る (Wang et al. , Science 224 : 1431, 1984) 。
また、 真核細胞で発現させた場合、 その多くは糖鎖が付加されるが、 アミノ酸 を 1個ないしそれ以上変換することにより糖鎖付加を調節することができるが、 この場合でも I g G F c部結合活性を有することがある。 それゆえ、 本発明にお ける F cァ B Pの遺伝子を人工的に改変したものを用いて、 得られたポリべプチ ドが I g G F c部結合活性を有する限り、 それらのポリべプチドをコ一ドする遺 伝子はすべて本発明に含まれる。
さらに、 得られたポリペプチドが I g G F c部結合活性を有し、 配列番号 6ま たは 7あるいはその一部に示す遺伝子とハイプリダイズする遺伝子も本発明に含 まれる。 なお、 ハイブリダィゼーシヨン条件は、 通常行われているプローブハイ ブリダィゼーシヨンの条件を適用することができる （例えば、 Molecular Clonin g : A Laboratory Mannual, Sambrook et al. , し old Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 。
以上のように、 免疫グロブリン G ( I g G ) の F c部分と特異的に結合するタ ンパク質を発現できる D N Aであれば、 配列表の配列番号 6または 7に示すアミ ノ酸をコードする塩基配列に限らず、 種々の修飾体の D N Aが本発明に含まれる し、 またその機能を有する D N A断片も本発明の遺伝子の一部であることは明白 である。 本発明の発現ベクターは、 複製起源、 選択マーカー、 プロモーター、 RNAス プライス部位、 ポリアデニル化シグナルなどを含む。
本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、 例えば、 大腸 菌、 枯草菌などが挙げられる。 また、 真核生物のうち、 真核微生物の宿主細胞と しては、 例えばイースト、 粘菌が挙げられる。 あるいは、 S f 9などの昆虫細胞 を宿主細胞として使用してもよい。 さらに、 動物細胞由来の宿主細胞としては、 例えば、 COS細胞、 CHO細胞、 C 127細胞および 3 T 3細胞などが挙げら れる。
以上のようにして目的とする F c 7 BPをコードする遺伝子で形質転換した形 質転換体を培養し、 産生された I gGF c部結合活性を有するタンパク質は細胞 内または細胞外から分離し、 精製することができる。
なお、 本発明の目的タンパク質である I gGF c部結合活性を有するタンパク 質の分離、 精製には実施例に記載する方法に限定されることなく、 通常のタンパ ク質で用いられる分離、 精製方法を使用することができる。 例えば、 各種クロマ トグラフィー、 限外濾過、 塩析、 透析などを適宜選択、 組み合わせて使用するこ とができる。
かく して得られた組換えタンパク質が天然型 F c 7 BPと同様のヒト I gGと の結合活性を有するかを検討したところ、 ヒト I gGF cと特異的に結合するこ とが明らかとなった。
上記したように、 本発明の F cァ B Pの全長 c DN Aは図 8に示す構造を有し、 配列表の配列番号 7に示す塩基配列とアミノ酸配列を有するものであるが、 さら に本発明で用いた一連の c DNAが単一の mRNAに由来するものであることを 以下のようにして再確認した。 すなわち、 発現に用いた 5' 末端 cDNAを含む pNV 11 SRとは別のリピート構造内の c DNA断片を夕ンパク質発現させ、 F cァ BPを認識するモノクローナル抗体である K 9および K17と反応させた ところ、 これらの cDNA産物が K9と K17のいずれかまたは両方により認識 されることを確認した。
さらに、 F cァ B Pの mRNAの発現の組織特異性を試験したところ、 ヒト胎 盤における発現が確認された。 したがって、 本発明の F cァ B Pをコードする遺 伝子またはその一部をプローブとして用いて、 ノーザンブロッ ト解析またはイン サイチュハイブリダイゼーションによって F c r B P mRNAの合成組織を同 定することができる。
さらに、 F C 7 BPの染色体遺伝子上の多型性の存在を制限酵素の利用により 不し た
本発明の F c 7 BPをコードする遺伝子を得る方法、 該遺伝子を有する組換え ベクタ一およびこれを含有する形質転換体ならびに該形質転換体を培養して得ら れる目的タンパク質、 ならびにそれぞれの製造方法について、 以下の実施例で詳 細に説明するが、 この実施例によって本発明が限定されるものではない。 実施例
実施例 1 ： モノクローナル抗体を用いた F cァ BPをコードする部分 c DNA のクローニング （A： cDNAライブラリーの作製）
(1) ヒト大腸粘膜上皮細胞の調製
ヒト大腸組織片を 10%?83を含む1 ?1^1培地でょく洗浄した後、 粘膜筋 板の部位から機械的に剥離させ、 上皮細胞と粘膜固有層を分離した。 これを中心 棒に固定するようにして、 10%FBS//5mM EDTA/PBS (-) 中で 氷冷しながら 90分間スターラーで激しく撹拌し、 上皮細胞を分離した。 上皮細 胞を含む溶液を 1500 r pmで 10分間遠心し、 細胞の沈殿を得た。
(2) mRNAの精製
粘膜上皮細胞からの全 RN Aの抽出は AG P C法 （P. Chomczynski et al. , A nalytical Biochem. , (1987) 162:156-159) を改変して行った。 すなわち、 細胞 ペレッ ト lm lに対し、 9m 1の変性溶液 （4 Mチォシアン酸グァニジン、 25 mMクェン酸ナトリウム （pH 7) 、 0. 5%サルコシル、 0. 1M 2—メル カプトエタノール） を加え、 細胞を溶解した後、 lm 1の 2M酢酸ナトリウム (pH4) 、 10m 1の水飽和フヱノール溶液、 2m 1のクロ口ホルムノイソァ ミルアルコール （49 ： 1) を順次加えた。 10秒間撹拌し、 15分間氷冷した 後、 10, 000 X gで 15分間遠心し、 上清を回収した。 上清 8m 1に対し、 同様に 0. 8m lの酢酸ナトリウム、 8m 1の水飽和フヱノール、 1. 6m lの クロ口ホルム Zイソアミルアルコールを加え、 10秒撹拌、 15分氷冷、 10, 000 X gで 15分間遠心し、 上清を回収した。 上清 7 m 1に対し、 等量のクロ 口ホルムノイソアミルアルコールを加え撹拌後、 遠心分離により上清を得た。 上 清に対し、 等量のイソプロパノールを加え、 一 20°Cで 30分間冷却後、 10, 000 X gで 15分間遠心し、 全 RNAの沈殿を回収した。
全 RNA 1 mgの溶液に溶出バッファ一 （ 1 OmM Tr i s—HC l (p H 7. 5) 、 lmM EDTA、 0. 1% S D S ) を加え、 全量で 1 m 1とした 後、 01 i goTe x— dT30<Sup e r > (宝酒造社製） 1 m 1を加え、 65 °Cで 5分間加熱し、 氷上で 3分間急冷した。 5M Na C 1 0. 2m lを 加え、 37°Cで 10分間保温した後、 15, 000 r pmで 3分間遠心分離し、 上清を注意深く除去した。 ペレッ トを洗浄バッファー （10mM T r i s -H C I (pH7. 5) 、 ImM EDTA、 0. 5M NaC l、 0. 1% SD S) 2. 5mlに懸濁した後、 15, 000 r p mで 3分間遠心分離し、 上清を 注意深く除去した。 ペレッ トを滅菌水 1 m 1に懸蘅し、 65。Cで 5分間加熱し、 氷上で 3分間急冷した。 15, 000 r p mで 3分間遠心分離した後、 上清を回 収した。 50// 1の 5M NaC lと 2. 5 m 1のエタノールを加えた後、 一 2 0°Cで 30分冷却し、 遠心 （3, 000 r pm、 4°C) して、 ポリアデニル化 R N Aの沈殿を回収した。
(3) cDNAの合成
mRNAからの c DNAの合成は、 G u b 1 e rおよび H o f f m a n (U. Gu bier and B.J.Hoffman (1983) Gene 25:263) の改良法により、 Ame r s h a m社製または I n V i t r o g e n社製の c DNA合成キッ トを用いて行った。 すなわち、 大腸粘膜上皮細胞より調製したポリアデニル化 RNA 5 gを 42°C にて 90分間、 50ユニッ トのヒ ト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、 ImM d ATP. ImM dGTP、 ImM dCTP、 0. 5mM dTTP、 1 00ユニッ トの AMV逆転写酵素、 ピロリン酸ナトリウムを含む緩衝液 （Ame r s h am社製） 50 1中で、 750 n gのランダムへキサヌクレオチドまた は 4 gのオリゴ （dT) プライマーと共にインキュベートした。 この反応液 5 0〃 1を 4. 0ユニッ トの大腸菌リボヌクレア一ゼ11、 115ユニッ トの大腸菌 DN Aポリメラーゼ Iを含む緩衝液 （Ame r s h a m社製） 中で、 12°Cで 6 0分間、 次いで 22°Cで 60分間反応させた後、 70°Cで 10分間インキュベー 卜した。 氷中に戻し、 10ユニッ トの T4 DNAポリメラーゼを加え、 37°C で 10分間反応させた後、 10 1の 0. 25Μ EDTA (ρΗ8) を加えて 反応を停止させた。 反応液 250 1に対し、 等量の 7. 5 Μ酢酸アンモニゥム と、 4倍量のエタノールを加え、 撹拌後、 一 20°Cにて 30分間冷却し、 遠心分 離により c DNAを回収した。 c DNAを 10〃 1の滅菌水に溶かし、 1 1を 用いて 0. 8%ァガロースゲル電気泳動を行い、 合成の確認と濃度の定量を行つ た。
(4) アダプターの連結
上記 （3) で得た合成 cDN Aに対して 10倍量のモル比となるようにァダプ ター （E c oR I— No t I -B amH Iアダプター、 宝酒造社製） を加え、 全 体量の 8倍量のライゲーシヨン溶液 A (ライゲーシヨンキッ ト、 宝酒造社製） と 1倍量のライゲーシヨン溶液 B (ライゲーシヨンキッ ト、 宝酒造社製） を加えた c 十分撹拌した後、 16°Cで 30分間インキュベートし、 アダプターを c DNAへ 連結させた。
この反応液を T A E緩衝液系で 1%の低融点ァガロースゲル （S e a P 1 a Q u eァガロース、 宝酒造社製） で電気泳動を行い、 0. 5kb p以上の cDN A画分を含むゲルを回収した。 この操作により、 c DNAに結合しなかったァダ プターも同時に除いた。 回収したゲルの湿重量に対し、 2倍量の TE緩衝液を加 え、 65°Cで 10分間保温し、 ァガロースゲルを溶解した後、 全体量に対し等量 のトリス飽和フニノールを加え、 十分に撹拌後、 氷冷した。 遠心分離により水相 を回収し、 等量のトリス飽和フエノール処理を再び行った。 遠心分離により水相 を回収し、 最後に等量のクロ口ホルムを加え、 十分撹拌後遠心分離した。 その後、 水相を回収し、 1 10量の 3M酢酸ナトリウム、 20 gのグリコーゲン （ベ 一リンガーマンハイム社製） 、 2. 5倍量のエタノールを加え、 一 20°Cで 30 分間冷却した後、 15， 000 r p mで 10分間 4 °Cで遠心し、 c D N Aの沈殿 を得た。
(5) λ g t 11ライブラリ一の作製 上記 （4) で得たアダプターを連結した c DNAを 96〃 1の 500mM T r i s -HC 1 ( H 7. 5) 、 10 OmM MgC l 2、 1 OmM DTT、 l OmM A TPからなる溶液に溶解し、 40ユニッ トのポリヌクレオチドキナ ーゼを加え、 37°Cで 60分間インキュベーションし、 アダプターの 5' 末端を リン酸化した。 反応終了後、 200 1の TE緩衝液を加え、 300 1のトリ ス飽和フェノールを加え、 撹拌後、 遠心分離 （15， 000 r p m、 室温、 2分 間） により上清を回収した。 同様の遠心分離処理をトリス飽和フ Xノール ·クロ 口ホルム （1 : 1) 溶液、 続いて 2%イソアミルアルコールを含むクロ口ホルム 溶液によって行い、 最終的に 250 ^ 1の上清を得た。 この上清に 250 1の 4M酢酸アンモニゥム溶液、 1250〃 1のエタノールを加え、 一 20°C、 30 分間冷却後、 遠心分離 （15, 000 r pm、 4°C、 10分間） により沈殿を回 収した。 cDNAの沈殿に 1 n gの E c oR I消化脱リン酸 λ g t 11アーム (#234211、 S t r a t a g e n e社製） を加え、 終濃度 100 mM T r i s -HC 1 (p H 7. 6) 、 5 mM MgC l 2、 30 OmM Na C lの 溶液 5 1に溶解した。 ライゲーシヨン溶液 B (DN Aライゲーシヨンキッ ト、 宝酒造社製） を 5/ 1加え、 十分撹拌した後、 26°Cで 10分間反応させた。 c DN Aを； Iファージにパッケージするために、 c DN Aを含むライゲーション反 応液 4 // 1を、 10/ 1の F r e e z eZTh aw抽出液 （G i ga p a c kll o l d. S t r a t a g e n e社製） に加え、 直ちに S o n i c抽出液 （G i g a p a c kll g o 1 d ) を加え、 ゆっくり撹拌した。 22 °Cにて 2時間ィ ンキュベーションした後、 500 1のファージ希釈用溶液 （5 g N a C 1、 2 g MgS04 · 7H20. 50ml 1M Tr i s - HC 1 (pH7. 5) 、 5ml 2%ゼラチン リッ トル） と、 10 1のクロ口ホルムを加え、 インビ トロパッケージング反応を終了した。 このファージ溶液は 4 °Cに保存し、 スクリ —二ングに用いた。 実施例 2 ： モノクローナル抗体を用いた F cァ B Pをコードする部分 c DNA のクローニング （ B ：抗体を用いた c D N Aライブラリーのスクリーニング） (1) スクリーニング 実施例 1で作製した、 スファージにパッケージングをした大腸粘膜上皮細胞の c DNAライブラリーの l x l 04p f u、 200 z lを、 一晚培養した大腸菌 株 Y 1 0907— 200〃 1と混ぜ合わせ、 37°Cで 15分間インキュベーショ ンした。 LB培地を混合した 0. 8%トップァガロースを溶解した後、 55°Cに 保温したもの 5m 1をファージと大腸菌のプレインキュベーション液に加えて混 ぜ合わせ、 1. 5% LBァガロースプレート （10 X 14 cm) 上に均一に広 げた。 42°Cのインキュベータ一中にて 3. 5時間保温し、 小さなプラークが確 認された後、 あらかじめ 10mM I PTGをしみこませた後風乾させておいた ナイロン強化二トロセルロースフィルター （#BA— S 85、 S c h l e i c h e r & S c h n e 1 1社製） を重ね、 37°Cにて 3. 5時間保温した。 フィ ルターをプレートからはがし、 洗浄液 （0. 05% Twe e n-20> 25m M T r i s - HC 1 (pH7. 5) 、 15 OmM N a C l、 3mM KC 1 ) 中、 室温で 30分間振とうした。 次に、 5%スキムミルクを含む PB S (—） 中、 室温で 30分間振とうし、 ブロッキング処理を行った後、 洗浄液にて 20分間、 2回洗浄した。 次いで、 大腸粘膜上皮細胞中の F cァ B Pに対して作製されたマ ウスモノクローナル抗体 （Kobayashi et al.， J. Immunology (1991) 146:68-74 ； Kobayashi et al.， J. Immunology (1989) 143:2567-2574) である K 9または Kl 7を含むハイプリ ドーマ培養上清を、 ニトロセルロース膜 1枚に対し 5m l に浸し、 室温で 2時間振とうした後、 洗浄液で 20分間、 2回洗浄した。 洗浄液 にて 1Z1000倍に希釈したホースラディッシュペルォキシダーゼ （HRP) 結合抗マウス I gG (H + L) ャギ抗血清 （ザィメッ ト社製） 中、 室温で 1時間 振とうした後、 洗浄液で 20分間、 2回洗浄した。 Twe e n— 20を含まない TB S溶液で 10分間洗浄した後、 50 m 1のジァミノベンチジン溶液 （ 1 m g / 1 0. 1M T r i s— HC 1 (pH 7. 2) ) と、 50m lの 0. 02 % H2〇2溶液と 50 1の 8% N i C 12溶液の混合液に浸し、 陽性ブラー クの検出を行った。
(2) ;i DNAの抽出
K9モノクローナル抗体を用いたスクリーニングにより、 約 1 00万個のブラ ーク中から 1個の約 600塩基対の挿入 c DN Aを含むクローンを得た。 このプ ラークをつまようじでピックアップして、 200 1の培地 （2 OmM Mg S
04、 0. 2%マルト一ス、 5 1の Y 1 090ァ-大腸菌株の一晚培養懸濁液を 含む LB培地） で、 スファージを 37°C、 4時間培養した。 このファージを含む 培養液 2〃 1 (1 X 1 07P f u/μ. 1 ) を、 10m l LB培地 （2 OmM Mg S 04と 0. 25m 1の Y l 090ァ—大腸菌株の一晩培養懸濁液を含む） に 添加、 感染させ、 37°C、 5時間振とう培養し、 スファージを増殖させた。
5〜6時間培養後、 溶菌を確認してから、 50 1のクロ口ホルム、 2m lの 5M Na C lを加え、 37。C、 10分間振とうした。 3, 500 r pm. 15 分間遠心した上清に対して 10%となるようポリエチレングリコール 6000を 加え、 氷上で 30〜60分置いた後、 4°C、 4, 000 r pmで 15分間遠心分 離し、 ファージを沈殿させた。 沈殿を lm 1の A緩衝液 （0. 5% NP-40 3 OmM T r i s - HC 1 (pH7. 5) 、 5mM Mg C 12> 125mM KC 1、 3. 6mM C a C 12、 0. 5mM EDTA、 0. 25%デォキ シコール酸ナトリウム、 6 OmM 2—メルカプトエタノール） に懸濁し、 1.0 0 u g/m 1 RN a s e A. 20 a g/m 1 D N a s e Iと共に 37 °C、 3 0分間インキュベートした。 A緩衝液と等量のクロ口ホルムを加え、 撹拌後、 1
5, 000 r pm、 2分間、 室温で遠心分離し、 上清を回収した。 再び同量のク ロロホルムを加えて同様に遠心分離して上清を回収した。 その後、 上清液に 50 mM T r i s—HC l (pH8) 、 2 OmM EDTA、 0. 5% SDS、 100 gZm 1プロテアーゼ Kとなるようにそれぞれ添加し、 55°C、 60分 間インキュベートした。 λ ϋΝΑを精製するため、 定法通り順次フヱノール処理、 フエノールノクロ口ホルム処理、 クロ口ホルム処理を行い、 DNAa s e、 プロ テアーゼなどを失活させた後、 1 20量の 5M N a C 1と 1倍量のイソプロ パノールを加え、 c DNAフラグメントが揷入された； I DN Aの沈殿を得た。
(3) プローブ DNAの作製
上記 （ 2 ) で精製した c D N Aフラグメントを含むス D N Aから B a mH I制 限酵素部位を用いて揷入 DNAを切り出し、 第 2 c DNAライブラリーのスクリ 一二ングのためのプローブ （これをプローブ Qと命名した） とした。
同様の方法で、 K 1 7モノクローナル抗体を用いて得られた 7個のスクローン のうち最長の揷入部 （約 1 300塩基） をもつクローンより B amH Iによって 切り出される 700塩基と 600塩基の DNAプローブを得た。 このうち K 1 7 抗体のェピトープをコ一ドする c DNAを含むと推定される 700塩基の DNA 断片をプローブ A、 600塩基の断片をプローブ Bとし、 第 2 c DNAライブラ リーのスクリーニングに用いた。
(4) ノーザンブロッティング
抗体によるスクリ一二ングによって得られた A、 Qの各プローブが同一の mR N Aとハイプリダイズすることをノ一ザンブロッ トにより確認した。
大腸粘膜上皮細胞より AG P C法により抽出した全 RNA 15 gを 4. 5 n 1の滅菌水に溶かした後、 2 1の 5 xMOP S緩衝液、 3. 5 ^ 1のホルムァ ルデヒド、 10 1のホルムアミ ドと混合し、 60°C、 15分間熱変性した後、 ホルムアルデヒド存在下で 1%ァガロースゲル上で電気泳動した。 電気泳動終了 後、 RN Aをナイロン膜 （バイオダイン A、 ポール社製） へキヤビラリ一法にて —晚トランスファーを行った。 UV架橋により RN Aをナイロン膜に固定した後、 10m lのハイブリダイゼーション溶液 （5 x S S PE、 5 xD e n h a r d t ' s溶液、 50%ホルムアミ ド、 0. 5% SD S、 100〃 gZm l熱変性サ ケ精子 DNA) 中にて 42°C、 8時間、 プレハイブリダィゼーシヨンを行った。 次に抗体スクリーニングにより得られたプローブ Aおよび Qを各々、 a [32P] d CTPを用い、 メガプライムラベリングキッ ト （Ame r s h a m社製） によつ て放射性標識した。 各プローブ 1 x 108d pmを各々、 5m lのハイブリダィ ゼ一ション溶液と共にプレハイブリダィゼーション処理したナイロン膜に加え、 密封した後、 42°C、 一晚ハイブリダィゼーシヨンを行った。 ナイロン膜の洗浄 は 0. 2 x S S C、 0. 2% SDSを含む溶液中で、 65°C、 40分間の洗浄 操作を 3回繰り返し行った。 ナイロン膜を乾燥後、 X線フィルムに一晩露光した。 以上の方法より、 プローブ Aおよび Qを用いて推定約 1 7 k b pのバンドがー 本それぞれ検出され、 2種類のプローブが分子量的に同一の mRN Aとハイブリ ダイズすることを確認した。 実施例 3 ： F cァ BPをコ一ドする c DN Aの第 2のクローニング （A： c D NAライブラリ一の作製）
(1) ヒト大腸粘膜上皮細胞の調製
ヒト大腸組織片を 10% 83を含む1^ ^^培地でょく洗浄した後、 粘膜筋 板の部位から機械的に剥離させ、 上皮細胞と粘膜固有層を分離した。 これを中心 棒に固定するようにして、 10%FBSZ5mM EDTAZPBS (—） 中で 氷冷しながら 90分間スターラーで激しく撹拌し、 上皮細胞を分離した。 上皮細 胞を含む溶液を 1500 r pmで 10分間遠心し、 細胞の沈殿を得た。
(2) mRNAの精製
粘膜上皮細胞からの全 RN Aの抽出は AG P C法 （P. Chomczynski et al. , A nalytical Biochem. , (1987) 162:156-159) を改変して行った。 すなわち、 細胞 ペレッ ト lmlに対し、 9m 1の変性溶液 （4 Mチォシアン酸グァニジン、 25 mMクェン酸ナトリウム （pH 7) 、 0. 5%サルコシル、 0. 1M 2—メル カプトエタノール） を加え、 細胞を溶解した後、 lm 1の 2M酢酸ナトリウム (pH4) 、 10m 1の水飽和フヱノール溶液、 2m 1のクロ口ホルム/イソァ ミルアルコール （49 : 1) を順次加えた。 10秒間撹拌し、 15分間氷冷した 後、 10, 000 X gで 15分間遠心し、 上清を回収した。 上清 8m 1に対し、 同様に 0. 8mlの酢酸ナトリウム、 8m 1の水飽和フヱノール、 1. 6 mlの クロ口ホルム/イソァミルアルコールを加え、 10秒撹拌、 15分氷冷、 10, 000 X gで 15分間遠心し、 上清を回収した。 上清 7m 1に対し、 等量のクロ 口ホルム イソアミルアルコールを加え撹拌後、 遠心分離により上清を得た。 上 清に対し、 等量のイソプロパノールを加え、 一 20°Cで 30分間冷却後、 10, 000 X gで 15分間遠心し、 全 RN Aの沈殿を回収した。
全 RNAlmgの溶液に溶出バッファー （1 OmM T r i s -HC 1 (p H 7. 5) 、 lmM EDTA、 0. 1% S D S ) を加え、 全量で 1 m 1とした 後、 01 i goTe x— dT30く S u p e r > (宝酒造社製） 1 m 1を加え、 65 °Cで 5分間加熱し、 氷上で 3分間急冷した。 5M Na C l 0. 2m lを 加え、 37 °Cで 10分間保温した後、 15， O O O r pmで 3分間遠心分離し、 上清を注意深く除去した。 ペレツ トを洗浄バッファー （10mM Tr i s— H C I (p H 7. 5) 、 ImM EDTA、 0. 5M Na C l、 0. 1% S D S) 2. 5mlに懸濁した後、 15, 000 r p mで 3分間遠心分離し、 上清を 注意深く除去した。 ペレッ トを滅菌水 1 m 1に懸濁し、 65 °Cで 5分間加熱し、 氷上で 3分間急冷した。 15, 000 r p mで 3分間遠心分離した後、 上清を回 収した。 50 1の 5M Na C lと 2. 5 m 1のエタノールを加えた後、 一 2 0°Cで 30分冷却し、 遠心 （3, 000 r pm、 4°C) して、 ポリアデニル化 R NAの沈殿を回収した。
(3) cDNAの合成
mRNAからの c DNAの合成は、 Gub l e rおよび Ho f f ma nの改良 法により、 Ame r s h am社製または I n V i t r o g e n社製の c DNA合 成キッ トを用いて行った。 すなわち、 大腸粘膜上皮細胞より調製したポリアデニ ル化 RNA5〃 gを 42°Cにて 90分間、 50ュニッ トのヒト胎盤リボヌクレア ーゼインヒビター、 ImM d ATP. ImM dGTP、 ImM dCTP、 0. 5mM dTTP、 100ユニッ トの AM V逆転写酵素、 ピロリン酸ナトリ ゥムを含む緩衝液 （Ame r s h am社製） 50 μ 1中で、 750n gのランダ ムへキサヌクレオチドまたは 4 / gのオリゴ （dT) プライマーと共にインキュ ペートした。 この反応液 50 1を 4. 0ユニッ トの大腸菌リボヌクレア一ゼ11、 115ュニッ 卜の大腸菌 DN Aポリメラ一ゼ Iを含む緩衝液 （Ame r s h am 社製） 中で、 12°Cで 60分間、 次いで 22°Cで 60分間反応させた後、 70°C で 10分間インキュベートした。 氷中に戻し、 10ユニッ トの T4 DNAポリ メラーゼを加え、 37°Cで 10分間反応させた後、 10 1の 0. 25M ED TA (pH8) を加えて反応を停止させた。 反応液 250 1に対し、 等量の 7. 5M酢酸アンモニゥムと、 4倍量のエタノールを加え、 撹拌後、 —20°Cにて 3 0分間冷却し、 遠心分離により c DNAを回収した。 cDNAを 10 / 1の滅菌 水に溶かし、 1 1を用いて 0. 8%ァガロースゲル電気泳動を行い、 合成の確 認と濃度の定量を行った。
(4) アダプターの連結
上記 （3) で得た合成 cDNAに対して 10倍量のモル比となるようにァダプ ター （E c oR I— No t I— B amH Iアダプター、 宝酒造社製） を加え、 全 体量の 8倍量のライゲーシヨン溶液 A (ライゲーシヨンキッ ト、 宝酒造社製） と 1倍量のライゲ一シヨン溶液 B (ライゲ一シヨンキッ ト、 宝酒造社製） を加えた c 十分撹拌した後、 16 °Cで 30分間インキュベートし、 アダプターを cDNAへ 連結させた。
この反応液を TAE緩衝液系で 0. 8%の低融点ァガロースゲル （S e a P 1 a qu eァガロース、 宝酒造社製） で電気泳動を行い、 約 4 k bp以上の cD NA画分を含むゲルを回収した。 この操作により、 c DNAに結合しなかったァ ダブターも同時に除いた。 回収したゲルの湿重量に対し、 2倍量の TE緩衝液を 加え、 65°Cで 10分間保温し、 ァガロースゲルを溶解した後、 全体量に対し等 量のトリス飽和フエノールを加え、 十分に撹拌後、 氷冷した。 遠心分離により水 相を回収し、 等量のトリス飽和処理を再び行った。 遠心分離により水相を回収し、 最後に等量のクロ口ホルムを加え、 十分撹拌後遠心分離した。 その後、 水相を回 収し、 1 ェ 0量の 3M酢酸ナトリウム、 20〃 gのグリコーゲン （ベーリンガ 一マンハイム社製） 、 2. 5倍量のエタノールを加え、 一 20°Cで 30分間冷却 した後、 15， 000 r pmで 10分間 4°Cで遠心し、 cDNAの沈殿を得た。
(5) ;i g t l 0ライブラリーの作製
上記 （4) で得たアダプターを連結した c DNAを 96〃 1の 50 OmM T r i s -HC 1 (pH7. 5) 、 100 mM MgC l 2、 10 mM DTT、 1 OmM ATPからなる溶液に溶解し、 40ユニッ トのポリヌクレオチドキナ ーゼを加え、 37°Cで 60分間インキュベーションし、 アダプターの 5' 末端を リン酸化した。 反応終了後、 200 1の TE緩衝液を加え、 300 1のトリ ス飽和フ ノールを加え、 撹拌後、 遠心分離 （15， 000 r pm、 室温、 2分 間） により上清を回収した。 同様の遠心分離処理をトリス飽和フエノール · クロ 口ホルム （1 ： 1) 溶液、 続いて 2%イソアミルアルコールを含むクロ口ホルム 溶液によって行い、 最終的に 250 1の上清を得た。 この上清に 250 lの 4M酢酸アンモニゥム溶液、 1250 1のエタノールを加え、 一 20°C、 30 分間冷却後、 遠心分離 （15, 000 r pm. 4°C、 10分間） により沈殿を回 収した。 c DNAの沈殿に の E c oR I消化脱リン酸ス g t 10アーム (#233211、 S t r a t a g e n e社製） を加え、 終濃度 100 mM T r i s -HC 1 (pH 7. 6) 、 5m MgC l 2、 300mM N a C lの 溶液 5 / 1に溶解した。 ライゲーシヨン溶液 B (DNAライゲ一シヨンキッ ト、 宝酒造社製） を 加え、 十分撹拌した後、 26°Cで 10分間反応させた。 c DNAを；lファージにパッケージするために、 c DN Aを含むライゲーション反 応液 4 / 1を、 10 1の F r e e z eZTh a w抽出液 （G i g a p a c kll g o l d. STRATAGENE社製） に加え、 直ちに S o n i c抽出液 （G
1 g a p a c kll g o l d) を加え、 ゆつくり撹拌した。 22°Cにて 2時間ィ ンキュベーシヨンした後、 500 ^ 1のファージ希釈用溶液 （5 g Na C 1、
2 g Mg S04 ' 7H20、 50m l 1M T r i s -HC l (pH7. 5) 、 5m 1 2%ゼラチン リッ トル） と、 10 1のクロ口ホルムを加え、 インビ トロパッケージング反応を終了した。 このファージ溶液は 4 °Cに保存し、 スクリ 一二ングに用いた。 実施例 4 ： F c 7 B Pをコ一ドする全長 c DNAのクローニング （B ： DNA プローブを用いた c DNAライブラリ一のスクリ一二ング）
(1) プロッティング
スファージにパッケージングを行った大腸粘膜上皮細胞の c DN A (2 x 10 P f u) を、 一晚培養した大腸菌株 C 600 h f 1 200 1に感染させた 後、 37 °Cで 15分間保温した。 55°Cに保温した 0. 8%トツプアガロースノ LB培地を加えた後直ちに LBプレート （10 X 14 cm) 上に広げた後、 37 °Cにて 12時間ィンキュベートした。 プラークの直径が lmm程度になったとこ ろで、 ナイロン膜 （B i o d y n e A、 孔径 0. 2 zm, ポール社製） を重ね、 4°C、 1 0分間冷却した。 ナイロン膜をプレートよりはがし、 ブロッテイング溶 液 I (0. 5M Na OH, 1. 5M N a C 1 ) 、 ブロッテイ ング溶液 II ( 1 M T r i s -HC l (pH 7. 4 ) ) 、 ブロッテイング溶液 III ( 0. 5M T r i s -HC l (pH 7. 4) 、 1. 5M Na C l ) で各々 5分間処理した 後、 UVクロスリ ンク装置 （UV S t r a t a l i n k e r 2400, STR ATAGENE社製） を用いて 1200 ジュールにて DNAをナイ口ン膜に固 定した。 (2) ハイブリダイゼーション
ス DNAを固定したナイ口ン膜 1枚当り、 10mlのハイブリダイゼ一ション 溶液 （5XSSPE, 5xDe nh a r d f s溶液、 50%ホルムァミ ド、 0. 5%SDS、 100 gZm 1熱変性サケ精子 DNA) を加え、 ハイブリダィゼ ーシヨンバッグに密封した後、 42 °Cで 8時間プレハイブリダィゼーシヨンを行- た。 次に、 抗体スクリーニングにより得られたプローブ Q, A, Bを各々 [32 P] dCTPを用いてランダムプライミング法により放射性標識した。 プローブ Q, A， Bの各 1 X 108d pmを 5m 1のハイブリダィゼーシヨン溶液と共に プレハイブリダィゼーシヨンの終了したナイロン膜に加え、 密封後、 42でで一 晚ハイブリダィゼーシヨンを行った。 インキュベーションの終了後、 ナイロン膜 を 0. 2xSSC、 0. 2%SDSの溶液で 65°C40分間洗浄する操作を 3回 くり返した後、 X線フィルムにー晚露光した。
以上のスクリーニングにより、 プローブ A, B, Qの 1種または、 複数とハイ ブリダィズする 69個のラムダクローンを得た。 それぞれから、 前述の通りの方 法で; IDNAを調製し、 制限酵素 E c oR Iで処理した後、 電気泳動し、 挿入 D N Aのサイズの確認を行った。 実施例 5 ： F c r B PmRNAのサイズ推定
実施例 2で得たプローブ Qを用いて F c r B PmRNAのサイズを推定した。 比較のための既知タンパク質の mRNAとして、 14.
Figure imgf000024_0001
の075 1； 1" 0 ρ h i n mRNA (M. Koenig et al. (1988) Cell 53:219-228) と、 15. 2 kb pの Ry an o d i n e Re c e p t o r mRNA (F. Zarzato et al. (1990) J. Biol. Chem.， 265:2244-2256) を用いた。 これらの対照 mRNAに 対する c DNAプローブは、 いずれも文献から得られる塩基配列をもつ合成プロ ーブを調製し、 これらを用いてポリメラーゼチヱインリアクション （PCR) 法 により作製し、 それぞれプローブ DYSおよびプローブ RDRとした。
Dy s t r o p h i n mRNAと Ry a n o d i n e Re c e p t o r mRNAの供給源はヒト骨格筋ポリアデニル化 RNA (C 1 o n t e c h社製） である。 大腸粘膜上皮細胞より得られたポリアデニル化 RN A 2 gまたはヒト骨格筋 ポリアデニル化 RNA1 g、 あるいは両者の混合物を実施例 2の （4) と同様 の方法で電気泳動を行い、 ナイロン膜上にトランスファーした。 このナイロン膜 をプローブ Qを用いてハイブリダィゼーションを行い、 ォートラジオグラフィー により検出した。
次いで同じ膜で対照 mRNAのハイブリダイゼーションを行うため、 このナイ 口ン膜を 50 mM T r i s— HC 1バッファー （pH7. 5) 、 1. 25mM EDTA、 3xS SC、 lXDe nh a r d' s溶液、 1%SDS、 50%ホ ルムアミ ドを含む溶液 20m 1とともに、 70°C、 1時間インキュベーションし た。 次いで、 0. 2xSSC、 0. 1%SDSを含む洗浄液で室温、 10分間振 とうし洗浄する操作を 2回行った。 その後、 ナイロン膜でオートラジオグラフィ 一を行い、 バンドの消失されたこと （デハイブリダィゼーシヨン） を確認した。 次に、 上記と同様の方法にて、 プローブ DYSによるハイブリダィゼーシヨン を行い、 オートラジオグラフィ一により検出した。 このナイロン膜を上記と同様 の方法でデハイブリダィゼーシヨンを行った後、 ォ一トラジオグラフィーでバン ドの消失されたことを確認した。 最後にプローブ RDRによるハイプリダイゼー ションを同様に行い、 ォートラジオグラフィーによるバンドの検出を行った。 以上の結果より得られた Dy s t r o ph i n mRNA、 Ry ano d i n e Re c e t o r mRNAの各バンドの移動度を分子サイズに対してプロッ トを行い、 標準曲線を得て、 F c 7 BPmRNAの移動度よりその分子サイズを 約 17kbpと推定した （図 1) 。 実施例 6 ： F c r B Pをコ一ドする c DNAの塩基配列の決定 （1)
I gGF c部結合能をもつタンパク質のァミノ酸配列をコードする領域の塩基 配列を決定するために、 上記実施例 4で得られた 69個のスクローンの中から、 必要な 5個のクローンを以下の方法で選択し、 DNAシーケンサ一 （モデル 37 3A、 Ap p l i e d B i o s y s t ems社製） で塩基配列を決定した。
(1) クローン XI
プローブ A、 Bおよび Qとのハイプリダイゼーションによるスクリ一二ングに より得られた c DNAクローンの中で、 プローブ Qおよび Bとはハイブリダイズ せず、 プローブ Aとのみハイブリダィズするクローンを得た。 このクローンの挿 入 c DN Aの中でプローブ Aとは反対側の末端で E c oR Iと Sma Iによって 切り出される約 700 b pのフラグメントを回収し、 これをプローブ Xとした。 次に、 プローブ Xを用いて実施例 3と同様の方法で cDNAライブラリーのスク リーニングを行い、 プローブ Xおよびプローブ A、 Bとハイブリダィズするクロ ーン XIを得た。 そして、 クローン XIの揷入部 cDNAを E c oR Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動により約 3300 b pの DNAを分離した後回収し、 プ ラスミ ドベクター pB l u e s c r i p t S K ( + ) の Ε c oR I部位に挿入 した。 この後、 制限酵素地図の作製および塩基配列の決定を行った。
(2) クローン Y1
クローン XIの cDNAの中で、 プローブ Bを含む部分とは反対側で E c 0 R Iと S a c Iによって切り出される約 8 O Obpのフラグメントを回収し、 これ をプローブ Yとした。 プローブ Yを用いて実施例 3と同様の方法で c DNAライ ブラリーのスクリ一二ングを行い、 得られたクローンのうち、 最長の c DNAを もつクローンであるクローン Y1を得た。 そして、 クローン Y1の揷入部 cDN Aを E c 0 R Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動により約 1900 b pの DN Aを分離した後回収し、 プラスミ ドベクター p B l u e s c r i p t SK ( + ) の E c oR I部位に挿入した。 この後、 制限酵素地図の作製および塩基配列の決 定を行った。
(3) クローン C72
クローン Y1の cDNAの中で、 プローブ Xを含む部分とは反対側で S a c I と S p h Iによって切り出される約 150 b pのフラグメン卜を回収し、 これを プローブ Y150とした。 プローブ Y150を用いて実施例 3と同様の方法で c DNAライブラリー （c DNAサイズが 2から 4 k b pのもの） のスクリーニン グを行い、 9個のクローンを得た。 得られたクローンの挿入 c DN A部分の中で、 Y 150を境として Y領域とは反対側に最も長く伸び、 かつ Y 150を含む c D NAを得て、 これをクローン C 72とした。 そして、 クローン C 72の挿入部 c DNAを E c 0 R Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動により約 1200 b の DN Aを分離した後回収し、 プラスミ ドベクター pB l u e s c r i p t SK (+ ) の E c oR I部位に挿入した。 この後、 制限酵素地図の作製および塩基配 列の決定を行った。
(4) クローン NZ4
クローン C 72の揷入部 c DNAの中で、 プローブ Y 150を含む部分とは反 対側で E c oR Iと S a c Iによって切り出される約 450 b pのフラグメント を回収し、 これをプローブ Zとした。 ヒト大腸癌由来培養細胞 HT29— 18— N2株を用いて、 実施例 3 (2) 一 (5) と同様の方法で; I g t 10 cDNA ライブラリーを作製し、 プローブ Zを用いて実施例 3と同様にスクリーニングを 行い、 4個のクローンを得た。 得られたクローンのうち、 C 72と重複しない部 分を最も長く含むクローン NZ4を得た。 そして、 クローン NZ 4の挿入部 c D NAを No t Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動により約 900 b pの DNA を分離した後回収し、 プラスミ ドベクター pB l u e s c r i p t SK ( + ) の E c oR I部位に挿入した。 この後、 制限酵素地図の作製および塩基配列の決 定を行った。
(5) クローン V 11
プローブ A、 Bおよび Qによるスクリ一二ングでいずれともハイプリダイズす る c DNAクローンのプローブ A、 Bとハイブリダイズする部分の塩基配列を解 析し、 先に塩基配列を決定したクローン X 1の末端側にある A— B領域と同一の 塩基配列をもつクローンを得て、 クローン VI Iとした。 クローン VI Iの挿入 部 cDNAを E c oR Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動により約 3700 b pの DNAを分離した後回収し、 プラスミ ドベクター pB l u e s c r i p t SK ( + ) の E c oR I部位に挿入した。 この後、 制限酵素地図の作製および塩 基配列の決定を行った。 実施例 7 ： クローン NZ 4が F cァ B P mRNAの 5' 末端近傍であること の推定
実施例 6で得られた 5種のクローンが NZ 4— C 72 -Y 1 -X 1 -V 11の 順に 5' 末端方向または 3' 末端方向に向かって伸展しているが、 それらの塩基 配列をアミノ酸に翻訳したところ、 5' 末端方向へ伸びていることが推定された。 そこで、 現在最上流に位置するクローン NZ 4 DNAをプローブとしてランダム プライミングで作製したライブラリ一をスクリ一二ングしたところ、 13種の独 立したクローンが得られたが、 NZ4よりも 5' 側に伸長したクローンは得られ なかった。 また、 NZ 4の塩基配列をアミノ酸へ翻訳したところ、 オープンリー デイングフレーム上、 予想される最も 5' 上流に位置するメチォニンに対する A TGコドン近傍は Ko z a k則に類似していたため、 この ATGが開始メチォ二 ンである可能性が示唆された。 し力、し、 この ATGコドンの最初の Aは、 クロー ン NZ 4では僅か 9番目に位置し、 その 9塩基内には i n f r ameにストツ プコドンは存在しないことから転写産物のみならず翻訳レベルでも 5' (N末端） 方向へ c DNAの配列が伸長している可能性を否定できない。 したがって、 ブラ イマ一ェクステンション法により転写開始部位の検証ならびに翻訳開始部位を推 定する目的で以下の実験を行った。
(1) 全 RNAとポリアデニル化 RNAの調製
ヒ ト大腸粘膜上皮細胞および HT 29—18— N 2細胞から、 実施例 1の （2) または実施例 3の （2) と同様に全 RNAとポリアデニル化 RNAを調製した。
(2) エクステンションプライマーの合成
2種のプライマー、 プライマ一 1 ： GCTGATAGTTCTGC AGGAA GGCTGTGAGGAATTCCTCTCTGCCAGTGTT— 50me r、 プライマー 2 ： GCTCCAGCCCAGAGTATCCACCAGCTCCA TAGG— 33me rは、 DNA合成機 （Mo d e l 394、 Ap p l i e d B i o s y s t ems社製） にて合成し、 OPCカラム （Ap p l i e d B i o s y s t ems社製） にて精製した。 各プライマー 100 pmo 1をァ [32 P] ATPにて T4ポリヌクレオチドキナーゼにより末端ラベルし、 Mi c r o s p i nTMS— 200HRカラム （Ph a rma c i a社製） により精製し、 各 0. 5 pmo 1を各反応に用いた。
(3) プライマーアニーリングとエクステンション反応
ヒ ト大腸粘膜上皮細胞および HT29— 18— N2由来の全 RNA (20 g) とポリアデニル化 RNA (2. 5 g) をそれぞれプライマーとアニーリングバッ ファー （10mM Tr i s— HC 1 pH7. 5、 lmM EDTA、 250 mM KC 1) 中で混合し、 95°C、 5分間加熱変性し、 58°C、 1時間、 さら に室温または 37°Cで 1. 5時間ィンキュベー卜することによりハイプリダイゼ —シヨンを行った。 続いて、 エクステンション反応を行うため、 アニーリングサ ンプルをエタノール沈殿し、 この沈殿を RTa s eバッファー （33mM T r i s— HC 1 H8. 3、 2 OmM KC 1、 13. 3mM MgC l 2、 1 3. 3mM DTT、 0. 33 mM dNTP s、 50〃 g m 1ァクチノマイ シン D) に溶解後、 20 u n i tの逆転写酵素 （RN a s e H- f r e e MM LV RT a s e、 TOYOBO社製） を加え、 42°C、 1時間インキュベート した。 反応後、 95°Cで 3分処理し RT a s eを失活させた後、 l O^gZml となるように RNa s e Aを加え、 37°C、 30分間インキュベートしてテンプ レート RNAを分解した。 その後フヱノール/クロ口ホルム、 クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿を順次行った後、 5%のシークェンスゲルにて泳動し、 泳動後ゲ ルは固定液 （10%酢酸、 15%メタノール） で処理し、 乾燥後オートラジオグ ラフィーを行った。 なお、 マーカーとして Ml 3mp 18をシークェナーゼ V e r 2. 0 DNAシークェンシングキッ ト （TOYOBO社製） で反応させたも のを用いた。
以上の方法により次に述べる結果が得られた。 いずれの全 R N A標品をテンプ レートとして用いても、 プライマー 1でのエクステンションの結果、 プライマ一 より 118塩基付近の位置に強いバンドが見られ、 またいずれのポリアデニル化 RNA標品をテンプレー卜に用いたものでも 118塩基付近だけでなく、 157 塩基付近の位置に弱いエクステンションバンドが見られた。 現在最も 5' 側のク ローンと考えられる NZ 4の 5' 末端を便宜上 + 1とすると、 これらはそれぞれ + 27、 一13に相当した。 この +27でエクステンション反応が止まった理由 として、 NZ4の 5' 末端近傍の 2次構造の形成を予測させるパリンドロミック な構造が存在することが挙げられる。 事実できるだけそうした 2次構造を抑える 目的で合成したより 5' 側にあるプライマー 2での結果では一 10から一 16付 近にかけて強いブロードなバンドが、 さらに一 23に相当する位置に弱いシング ルバンドが検出された。 そして、 一 23より高分子領域にはバンドは検出されな かった。
以上の結果から、 NZ4の 5' 末端より 10から 20塩基上流付近に転写開始 部位の存在が示唆され、 この範囲に i n f r ameでの ATGコドンが存在し な L、場合には現在 ORF上最も 5' 端にある ATGが翻訳開始部位である可能性 が強く推定された。 これらの事実はクローン NZ4が NZ4— C 72— Y1—X 1 -V 11の順で極めて N末端に近いことを示している。 実施例 8 ：発現 c DNAZベクター系の構築 （A：発現に用いた部分 c DNA の調製）
タンパク質発現のために、 F c y B Pの部分 c DNAの挿入された； I DNAク ローン （#NZ4、 #C72、 #Y1、 #X1、 #V11) を、 E c oR Iまた は No t Iにて切断した後、 挿入部の c DNAを還状プラスミ ド pB 1 u e s c r i p t SK ( + ) へサブクローニングし、 それぞれ pNZ 4、 p C 72、 p Yl、 pXl、 p V 11と命名した。
(1) ρΝΖ4 : λクローン （#NZ4) を No t lで完全消化した後、 ァガ ロースゲル電気泳動にて約 900 b pの挿入部を分離 ·精製し、 p B 1 u e s c r i p t SK ( + ) の No t I部位に結合させた。 cDNAのタンパク質コー ドストランドの 5' →3' 方向がプラスミ ド中の L a c Z遺伝子の方向と逆向き に挿入されたクロ一ンを選択した。 揷入部の全塩基配列を配列番号 1に示す。 なお、 本発明の塩基配列表においては、 c DNA由来の塩基配列を大文字で、 pB l u e s c r i p t SK ( + ) 由来の塩基配列を小文字で、 また合成ァダ プターおよび合成オリゴヌクレオチド由来の塩基配列を小文字のアンダーライン でそれぞれ示した。
また、 アミノ酸配列は、 Ko z a k配列と一致する ATGを開始コドンとし、 塩基配列よりユニバーサルコドンにより推定した配列を示した。
(2) p C 72 ： スクローン （#C 72) を E c oR Iで完全消化した後、 ァ ガロースゲル電気泳動にて約 1300 b pの揷入部を分離 ·精製し、 p B 1 u e s c r i t SK ( + ) の E c oR I部位に結合させた。 cDNAの 5' →3 ' 方向がプラスミ ド中の L a c Z遺伝子の方向と逆向きに挿入されたクローンを 選択した。 挿入部の全塩基配列を配列番号 2に示す。
(3) p Y 1 ： スクローン （#Y 1) を E c 0 R Iで完全消化した後、 ァガロ ースゲル電気泳動にて約 1900 b ρの挿入部を分離精製し、 p B 1 u e s c r i p t SK ( + ) の E c o R I部位に結合させた。 同じサイズの DNA揷入部 をもつクローンを選択した。 揷入部の全塩基配列を配列番号 3に示す。
(4) pX 1 ： スクローン （#X 1) を E c oR Iで完全消化した後、 ァガロ ースゲル電気泳動にて約 3300 b pの挿入部を分離 ·精製し、 p B 1 u e s c r i p t SK ( + ) の E c o R I部位に結合させた。 同じサイズの DNA挿入 部をもつクローンを選択した。 揷入部の全塩基配列を配列番号 4に示す。
(5) ρνΐ 1 : λクローン （#V11) を E c oR Iで完全消化した後、 ァ ガロースゲル電気泳動にて約 3700 b pの揷入部を分離 ·精製し、 p B 1 u e s c r i p t SK ( + ) の E c oR I部位に結合させた。 同じサイズの DNA 挿入部をもつク口一ンを選択した。 揷入部の全塩基配列を配列番号 5に示す。 実施例 9 ：発現 c DNAZベクター系の構築 （B ： タンパク質発現のための部 分 c DNAの連結）
(1) pNZ C 7の調製
c DNAクローンを挿入したプラスミ ド pNZ 4 (5 β ) を制限酵素 Xh o I及び B g 1 II (各々 50ユニッ ト） で完全消化した後、 低融点ァガロースゲル 電気泳動する。 F c 7 B Pの c DNAの 5' 末端を含む約 400 b pのフラグメ ントを分離し、 フエノール抽出した後、 エタノール沈殿により回収した （フラグ メント 1) 。 次に第 2番目のプラスミ ド P C 72 (5 / g) を Xh o lと B g l IIで完全消化し、 ベクタ一部分を含む約 4. 2 k b pのフラグメントを同様の方 法で電気泳動により単離した （フラグメント 2) 。 フラグメント 1とフラグメン ト 2を各々 10 1の TE緩衝液に溶解し、 各 2〃 1を 16〃 1の A溶液 （DN Aライゲーシヨンキッ ト、 宝酒造社製） 、 4 ^ 1の B溶液と混合し、 16°Cにて 30分間ィンキュベ一トし連結させた。 この混合液 5 ^ 1を 100 // 1のコンビ テント E. c 0 1 i (XL 1 -B 1 u e) を形質転換し、 アンピシリン （1 00 g/m 1 ) を含む L Bプレート上で 37°C1晚培養した。 生成したコロニーよ りプラスミ ド DN Aを精製し、 フラグメント 1とフラグメント 2の連結したプラ スミ ド pNZ C 7を得た。
(2) フラグメント 5の調製
PNZC 7 (5 // g) を各々 50ユニッ トの Xho lと B s t X Iで完全消化 した後、 電気泳動により約 1300 b pのフラグメン卜を回収した （フラグメン ト 3) 。 第 3番目のプラスミ ド pYl (5 g) を各 50ユニッ トの B s t X I と H i n c IIで完全消化した後、 電気泳動により約 420 b pのフラグメントを 回収した （フラグメント 4) 。 フラグメント 3とフラグメント 4を同様の方法で DN Aリガーゼにより連結し、 電気泳動を行い両者が 1分子ずつ B s tX I部位 で連結した約 1750 b pのフラグメントを回収した （フラグメント 5) 。
(3) pXV2の調製
第 4番目のプラスミ ド pXl (5 g) を H i n ell及び B amH I (各 50 ュニッ ト） で完全消化し電気泳動により、 約 278 O b pのフラグメントを回収 した （フラグメント 6) 。 第 5番目プラスミ ド pVl 1を B amH I (50ュニッ ト） で完全消化し電気泳動により約 3350 b pのフラグメントを回収した （フ ラグメント 7) 。 フラグメント 6とフラグメント 7を DNAリガーゼを用いて連 結させ、 両者が 1分子ずつ連結された約 6100 b pのフラグメントを電気泳動 により回収した （フラグメント 8) 。 このフラグメント 8を H i n ellと B am H Iで消化した p B l u e s c r i p t SK ( + ) に DNAリガーゼで連結し た後コンビテント E. c o 1 iを形質転換した。 複数の形質転換体よりプラスミ ドを回収した後、 各々の塩基配列を決定し、 フラグメント 6とフラグメント 7の 方向性が正しく連結されたフラグメント 8を含むプラスミ ドクローンを得て、 フ ラグメント 8の 5' →3' 方向がプラスミ ド中の L a c Z遺伝子の方向と逆向き に挿入されたものを p XV 2とした。
(4) pNV 11の調製
PXV2を Xho lと H i n c IIで完全消化後、 電気泳動的に約 9. 1 k b p のベクター部分を含むフラグメントを回収した （フラグメント 9) 。 フラグメン ト 9と前記フラグメント 5を DNAリガーゼを用いて連結した後、 コンビテント E. c 0 1 i (XL 1— B 1 u e) を形質転換した。 形質転換体より、 約 7. 8 k b の c DNA (フラグメント 10) を含む約 1◦. 8 k b pのプラスミ ド p NV11を得た。
(5) ストップコドン （U AGに対応するもの） を含むオリゴヌクレオチドァ グプタ一の合成
DNA合成機 （mo d e 1394、 A p p 1 i e d B i o s y s t ems社 製） を用いてフレームを異にする 3個の TAGを含み、 両端に No t I部位と S P e I部位をそれぞれもつ次のオリゴォキシヌクレオチド、 （1) 5' -CTA GTT AGT TAG TTA GGG TAC CGC— 3' , (2) 5 ' 一 GGC CGC GGT ACC CTA ACT AAC TAA- 3' を合成した。 オリゴヌクレオチド 1及び 2各 10 nmo 1を混合し （合計 146 1) た後、 95°C、 1分間、 次いで 85°C、 10分間、 次いで 0. 33°CZ分 の速さで 40°Cまで徐々に冷却を行い、 停止コドンを含むアダプターを作製した (TA— IIIアダプター） 。 このアダプター （2. 1 nmo 1 ) の 5' 末端を A TPとポリヌクレオチドキナーゼを用いて標準方法にてリン酸化した。
pB l u e s c r i p t SK ( + ) ベクター 0. 83 pmo lを No t lと S p e Iにて完全消化した後リン酸化した TA— IIIアダプタ一 250 pmo 1 と混合し、 DNAライゲーションキッ トを用いて 16°C30分間ィンキュベ一ト し連結させた後、 エタノール沈殿した。 この沈殿を 50 β 1中にて No t Iで完 全消化し、 アダプタ一シークェンス 1回だけ持たせるようにした後、 低融点ァガ ロースゲル電気泳動を行い約 3 k b pのバンドを回収し、 フヱノール抽出した後、 エタノール沈殿を行った。 得られた沈殿を、 DNAライゲーシヨンキッ トを用い て自己連結させた後、 コンビテント E. c o l i (XL 1— B l u e) を形質転 換した。 アンピシリンを含む LBプレート上で一晚培養し生じたコロニーより得 られたプラスミ ドのうち、 TA— IIIアダプターが挿入されたプラスミ ドを選択 した （p B L S/TAIII) 。
(6) pNV 11— STの調製
5 のプラスミ ド （pNVl l) を S p e Iで完全消化した後、 電気泳動的 に約 7. 8 k b pのフラグメントを回収し、 10 / 1の TE緩衝液に溶解した (フラグメント 11) 。 2 n gのプラスミ ド （p B L S/TAIII) を S p e I で完全消化し、 バクテリアアルカリホスファターゼ （2ュニッ ト） を用いて末端 を脱リン酸化した後、 フヱノールノクロロホルム処理を 2回行い、 エタノール沈 殿した。 沈殿を 10 n 1の TE緩衝液に溶解した （フラグメント 12) 。 各 2〃 1のフラグメント 10とフラグメント 11を混合し、 DN Aライゲーシヨンキッ 卜 （宝酒造社製） を用いて連結させた後、 コンビテント E. c o l i (XL 1- B l u e) を形質転換し、 アンピシリンを含む LBプレート上で一晚培養した。 生じたコロニーのうち、 揷入した cDNAの 3' 末端側に TA— IIIアダプター が連結されているプラスミ ドを制限酵素地図及び塩基配列を調べる事により選択 した。 得られたクローンが p NV 11— STである。
前記プラスミ ド pNV 11一 STを含有する大腸菌は E s c h e r i c h i a c o l i XL 1-B 1 u e [pNVl 1 - S T] として工業技術院生命工学 技術研究所 （茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に平成 6年 4月 1日に生命研条 寄第 4625号 （FERM BP-4625) としてブタペスト条約に基づき国 際寄託された。
なお、 F cァ B Pの発現に用いた部分 c DNA (クローン pNVl 1— ST) (約 7. 8kbp) 、 ならびにその構築に用いた実施例 6に記載のクロ一ン NZ 4、 C72、 Yl、 XIおよび VI 1の相互の関係を図 2に示す。 実施例 10 ：発現 c DNAZベクター系の構築 （C： タンパク質発現べクタ一 への組込み）
(1) p c DL— SR ΖΝΟΤベクターの作製
c DN Αの組込みを行えるよう次の様に p cDL— SRa 296ベクタ一 （国 立予防衛生研究所、 武部豊博士より恵与された：以下 SRなと記載することもあ る） の制限酵素部位を改変した。 まず、 2 gの SRaを E c oR Iで完全消化 した後、 エタノールで沈殿した。 沈殿を K 1 e n 0 w緩衝液 （7 OmM Tr i s · HC 1 (p H 7. 5) 、 ImM EDTA、 20 OmM NaC l、 70m M MgC l 2、 各 ImM d AT P、 d C T P、 d GT P、 d TT P) に溶解 し、 0. 4ュニッ 卜の 1 e n owフラグメントと共に 37°C15分間ィンキュ ペートし、 プラスミ ドの末端を平滑化した。 エタノール沈殿の後、 TE緩衝液に 溶解し、 5' 末端がリン酸化された No t I リンカ一を DNAライゲーシヨンキッ トを用いて連結した。 エタノール沈殿を行った後、 No t Iで完全消化し、 ァガ ロースゲル電気泳動を行い約 3. 7 k b pの DNAを切出し、 フ ノール抽出に て DN Aを回収した。 回収した DN Aをライゲーションキッ トにて自己連結した 後、 コンビテント E. c o l i (XL 1 -B 1 u e) を形質転換した。 E c oR Iで消化されず、 No t Iで消化されるような目的のプラスミ ド （p cDL— S Ra/NOT) を選択した。
(2) 発現 cDNAの挿入
蛋白発現ベクター （p cDL— SRなノ NOT) を No t Iと Kpn lで完全 消化し、 電気泳動により約 3. 7 k b ρのフラグメントを回収した （フラグメン ト A) 。
c DNA挿入べクタ一 （pNV 11— ST) を No t Iと Kp n Iで完全消化 し、 電気泳動により約 7. 8 k b pのフラグメントを回収した （フラグメント 1 3) 。 フラグメント 13の全塩基配列を配列番号 6に示す。
この塩基配列およびそこから演繹されるアミノ酸配列を G e n B a n k Re 1. 80により検索したところ、 塩基配列およびアミノ酸配列とも新規であるこ とが確認された。
フラグメント Aとフラグメント 13を DN Aライゲーシヨンキッ トを用いて連 結した後、 コンビテント E. c o l i (XL 1— B l u e) を形質転換した。 ァ ンピシリン （100〃gZml) を含む LBプレート上で培養し生じたコロニー のうち、 フラグメント 13が挿入されたプラスミ ドを制限酵素切断により選択し た。 得られたクローンが pNV 11— SRである。 実施例 11 ： C O S 7細胞での F c r B P部分 c DNAの発現
(1) 発現 c DNAノベクターの大腸菌からの回収
実施例 10で得られた F cァ BP c DNA発現プラスミ ド （pNVl 1— S R) にて形質転換した大腸菌を 10m 1の L B培地で一晩 37°Cで振とう培養し た。 これを 500m 1の L B培地に加え、 ODeooが 0. 8になるまで振とうを 続けた。 OD6Q0が 0. 8に達したら 2. 5m 1のクロラムフエ二コール溶液 (34mg/m 1 ) を加え、 一晩培養した。 菌を遠心分離した後、 常法通りアル カリ法にてプラスミ ド DN Aを調製した。 塩化セシウムの密度勾配による超遠心 分離 （90, 000 r pm、 3時間） を 2回行ったのち、 TE緩衝液で透析しプ ラスミ ドを精製し蛋白発現に用いた。
(2) COS 7細胞へのトランスフヱクシヨン
F cァ BPの約 7. 8 k b pの部分 c D N Aを組み込んだプラスミ ドベクター (pNV 11 -SR) を COS 7細胞へ一過性に発現させて、 タンパク質の性質 を調べるために次の様にトランスフエクションを行った。 COS 7細胞 2 X 10 5個を 35mmディッシュに加え、 10%FB Sを含む RPM 1 1640培地 (0. 2%炭酸水素ナトリウム、 10ユニッ ト Zm 1ペニシリン、 0. 01%ス トレプトマイシンを含む） で一晩培養した。 40— 60%コンフルェントになつ たところで、 血清を含まない RPMI 1640培地で細胞を 2回洗浄した。
10/i gの pNVl l— SRプラスミ ドを 250 / Iの RPMI 1640培地 に溶解したものと、 10 1のリボフヱクション試薬 （Tr a n s f e c t am、 S e p r a c o r社製） を 250 // 1の R PM I 1640培地に溶解したものを 混合し、 直ちに COS 7細胞上に加える。 37 °Cで 6時間培養後、 培地を除き、 10%血清を含む RPMI 1640培地を 2m 1加え、 37°C、 5%C02で 2 日間培養した。
(3) 発現タンパク質の確認'
pNV 11— SRをトランスフヱクシヨンした COS 7細胞を培養したディッ シュ （035mm) を 2mlの PBS (-) で 2回洗浄した。 99. 5%ェタノ ールを 2ml加え、 室温で 5分間固定した。 2m lの PBS (—） で 2回洗浄し た。 ラムダファージのスクリ一ニングに用いた F c r B Pに対するモノクローナ ル抗体産生ハイプリ ドーマ （1：9及び1^17) の培養上清 lm 1をそれぞれ加え、 室温で 1時間インキュベートした。 PBS (—） にて 3回洗浄した後、 ホースラ ディッシュペルォキシダーゼ （HRP) を結合したャギ抗マウス I g G (H + L) F (a b' ) 2フラグメント （Zyme d社製） を加え室温で 30分間インキュ ペートした。 2m lの PBS (—） で 3回洗浄した後、 0. 036 %過酸化水素 水溶液と 0. 1%ジァミノベンチジン 0. 1M T r i s HC 1 (p H 7. 2) 溶液の 1 ： 1を加え、 室温にて 10分間発色させ、 タンパク質の発現する細 胞を確認した。 一次抗体を加えずに、 二次抗体として HRP結合ャギ抗マウス I gG (H + L) F (a b' ) 2フラグメントのみを加えたものを対照として用い 結果を図 3に示す。 K 9モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ （図 3 A) および K17モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ （図 3 B) 培養上清を加 えたものでは、 いずれもこれらと特異的に反応する細胞が観察されたが、 対照 (図 3 C) では観察されなかった。 実施例 12 ：組換えタンパク質のヒト I gG結合能の検出と性状
(1) ヒ ト I gGの結合の確認
F c 7 BPの部分 cDN Aを組み込んだプラスミ ド pNV 11— SRをトラン スフヱク トした COS 7細胞 （ø 35mm d i s h) を PBS (-) で 2回洗 浄した。 99. 5%エタノールを 2m 1加え室温で 5分間固定した。 2mlの P B S (一） で 2回洗浄した。 次に、 ァフィ二ティークロマ卜で精製したヒト I g G画分 （C a p p e 1社製） を、 10%FBSを含む RPMI 1640培地にて 10 tz g/m 1の濃度に調製し、 その lm 1をデイツシュに加え室温で 1時間ィ ンキュペートした。 2mlの PBS (—） で 3回洗浄した後、 HRPを結合させ たャギ抗ヒト I gG F (a b' ) 2画分 （# 109— D36— 088、 コスモ バイオ社製） にて室温で 30分間インキュベートした。 2mlの PBS (—） で 3回洗浄した後、 0. 036%過酸化水素水溶液と、 0. 1%ジァミノベンチジ ン Zl. 0M Tr i s HC 1 (pH7. 2 ) 溶液の 1 ： 1混液を加え室温に て 10分間発色させ、 発現タンパク質への I gGの結合を確認した。
(2) I gGの特異的結合
pNVl l— SRをトランスフエク トした COS 7細胞 （435 mmディッシ. ) を 2mlの PBS (-) にて 2回洗浄した。 99. 5%エタノールを 2m l加 え室温で 5分間固定する。 21111の？83 (—） で 2回洗浄した。
次に、 HRPを結合したァフィ二ティ一精製ヒト I gG画分 （# 55902 C a p p e 1社製） を 10%FB Sを含む RPM I 1640培地にて 10 g/ m lの濃度に調製した （溶液 1) 。 溶液 1に対し、 次のィムノグロブリン （50 0 g/m 1 ) を拮抗阻害物質として加えた：
①クロマトグラフィー精製ヒ ト I gG画分 （#55908、 C a p p e 1社製）
②クロマトグラフィー精製ヒト I gG F c画分 （#55911， C a p p e 1 社製） ，
③クロマトグラフィー精製ヒト I gG F (a b' ) 2画分 （# 55910， C a ρ p e 1社製） 、
④ク口マトグラフィ一精製ヒト I gM画分 （#55916， C a p p e 1社製）
⑤クロマトグラフィー精製ヒ卜血清 I gA (# 55906, C a p p e 1社製） ⑥クロマトグラフィー精製ヒト分泌型 I gA (# 55905， C a p p e l社製） 溶液 1に上記①から⑥の各拮抗阻害物質を各々別々に加えた溶液 lm 1を、 細 胞を固定したディッシュに加え、 室温で 1時間ィンキュペートした。 2m 1の P BS (一） で 3回洗浄した後、 0. 036%過酸化水素水溶液と、 0. 1%ジァ ミノベンチジン 0. 1% T r i s HC 1 ( H 7. 2) 溶液の 1 : 1の混 液を加え、 室温にて 10分間発色させ、 発現タンパク質への I gGの結合を検討 した。 溶液 1のみで拮抗阻害物質を何も加えなかったものを対照として用いた。 結果を図 4および図 5に示す。 対照実験である無添加条件では細胞が染色され る （図 4、 A) が、 精製ヒト I gG画分 （図 4、 B) と精製ヒト I gG F c画 分 （図 4、 C) を添加すると細陴は染色されなかった。 一方、 他の添加物 I gG F (a b' ) 2画分 （図 5、 D) ゃヒト I gM画分 （図 5、 E) 、 ヒト血清 I g A (図 5、 F) 、 ヒト分泌型 I gA (図 5、 G) では HRP結合ヒト I gGの結 合を阻害できなかった。 このことはヒト抗体の場合 I gGF c部に F c y B P力 特異的に結合することを示している。 実施例 13 : F c 7 BP mRN A発現の組織特異性
F cァ B Pのヒ卜組織での発現の特異性を調べるために、 ノーザンプロッティ ング解析により mRN Aの発現を調べた。 ヒ ト心臓、 脳、 胎盤、 肺、 肝臓、 骨格 筋、 腎臓、 脬臓の各組織から精製したポリアデニル化 RNA 2 gをブロッティ ングしたナイロン膜 （Huma n Mu l t i p l e No r t h e r n B 1 o t s、 #7760— 1、 C l on t e c h社製） を、 実施例 2の （4) と同様 の条件でプレハイブリダィゼーシヨンを行った後、 [32p] でラベルしたプロ一 ブ Yを用いてハイブリダィゼーシヨンを行った。 洗浄の後、 オートラジオグラフィ 一にてバンドの検出を行った。 一 80°Cで 2日間オートラジオグラムを行った結 果、 胎盤において約 17 k b p付近にバンドを検出できた （図 6) が、 その他の 組織においては陰性であった。 したがって、 胎盤において F cァ B Pのタンパク 発現が推定された。 実施例 14 ： 3種の異なるプローブによるノーザンブロッ ト解析
実施例 2の （3) で得たプローブ Qと A、 および実施例 6の （2) で得たプロ —ブ Yがいずれも同一の mRNAとハイブリダィゼーシヨンすることを確認する ために、 大腸粘膜上皮細胞から抽出した mRN Aのノーザンブロッ ト解析を上記 3種のプローブ Q、 A、 Yを用いて行った。
大腸粘膜上皮細胞より AGPC法により抽出した全 RNA15//gを 4. 5 u 1の滅菌水に溶かした後、 2〃 1の 5 xMOP S緩衝液、 3. 5^ 1のホルムァ ルデヒド、 10 1のホルムアミ ドと混合し、 60°C、 15分間熱変性した後、 ホルムアルデヒド存在下で 1%ァガロースゲル上で電気泳動した。 電気泳動終了 後、 RN Aをナイロン膜 （バイオダイン A、 ポール社製） へキヤビラリ一法にて —晚トランスファ一を行った。 UV架橋により RNAをナイロン膜に固定した後、 10mlのハイブリダイゼ一ション溶液 （5xSSPE、 5xDe nh a r d t ' s溶液、 50%ホルムアミ ド、 0. 5% SDS、 100〃gZml熱変性サ ケ精子 DNA) 中にて 42°C、 8時間プレハイブリダィゼーシヨンを行った。 次いで 3種のプローブ A、 Q、 Yを各々、 α [32P] dCTPを用い、 メガプ ライムラベリングキッ ト （Ame r s h am社製） によって放射性標識した。 各 プローブ 1 X 108d pmを各々、 5 m 1のハイブリダイゼーション溶液と共に プレハイブリダィゼーシヨン処理したナイロン膜に加え、 密封した後、 42 で —晚ハイブリダィゼーシヨンを行った。 ナイロン膜の洗浄は 0. 2xS SC、 0. 2% SDSを含む溶液中で、 65°C、 40分間の洗浄操作を 3回繰り返し行つ た。 ナイロン膜を乾燥後、 X線フィルムにー晚露光した。
以上の結果、 プローブ A、 Q、 Yを用いて推定約 17 k b pのバンドが 1本そ れぞれ検出され、 3種類のプローブが分子量的に同一の mRNAとハイプリダイ ズすることを確認した （図 7) 。 実施例 15 : F c 7 BPをコードする c DN Aの塩基配列の決定 （2)
I gGF c部結合能をもつタンパク質のァミノ酸配列をコードする c DNAの うち、 5' 末端から約 7. 8 kb p (7826塩基） までの塩基配列の決定につ いては実施例 4および 6に記載した。 残された塩基配列約 8. 6kbpの塩基配 列決定法を以下に記載する。
(1) cDNAの構造と分類
上記実施例 4において、 プローブ A、 Bまたは Qを用いたハイブリダィゼ一ショ ンによるスクリーニングで得られた複数の cDN Aクローンを、 それぞれ大腸菌 内で増幅した後、 プローブ A、 B、 Qを用いてマッピングを行った。 その結果、 各クローンは 3種のプローブの 1つまたは複数とハイブリダィズし、 cDNA上 に A→Bまたは B→Qまたは Q→ Aの順にプローブ相同部位が位置するものであつ た。
これらの結果から、 F c y BPの遺伝子には、 プローブ A、 B、 Qのそれぞれ と相同な配列が A→B→Qの順に連なった単位がタンデムに複数回繰り返した構 造を有することが推定された。 そこで、 プローブ Bとハイブリダィズする cDN Aクローンについて、 プローブ Bの塩基配列の一部 （約 280塩基対） を次のプ ライマーを用いて P CRにより増幅させた。
プライマー （P— 1) ：
5' 一 GCC TGC GTG CCC ATC CAG - 3'
プライマー （P— 2) ：
5' 一 CTC ATA GTT GGG CAG GCAC-3'
P CRにより増幅したフラグメントをァガロースゲル電気泳動にて分離後ゲル から回収し、 塩基配列を解析した。 この塩基配列の違いから、 プローブ Bとハイ プリダイズする c DN Aクローンを次の 3群に分類し、 プローブ Bとハイプリダ ィズしない c DN Aクローンを第 4群とした。
第 1群： クローン VI 1の増幅フラグメン卜と同一の配列をもつ群。
第 2群：第 1群の配列と比較して 5塩基の置換があり、 フラグメント中に H i n c I I部位を含まない群。
第 3群：第 1群の配列と比較して 7塩基の置換があり、 フラグメント中に H i n c I I部位を含む群。
第 4群：プローブ Bとハイブリダィズしない群。
(2) クローン T5
3' 末端側のポリ A部分をもつ cDN Aを分離するために、 実施例 3において オリゴ dTプライマーを用いて作製した cDNAライブラリーを、 プローブ A、 Bまたは Qを用いて実施例 4と同様の方法でスクリーニングを行ったところ、 プ ローブ Qのみとハイブリダイズした。 得られた c DN Aクローンのうち最長の c DN A挿入部をもつものをクローン T 5とした。
クローン T5の挿入 c DNAを E c 0 R Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動 により分離、 精製し、 プラスミ ドベクター p B 1 u e s c r i p t SK ( + ) の E c oR I部位に挿入した。 この後、 T 5の制限酵素地図の作製および全塩基 配列の決定を行った。
また、 クローン Τ5揷入部の c DNAのうちで、 ポリ （Α+) から約 1キロ塩 基対 5' 側の BamH I部位と、 同じくポリ （A+) から約 1. 6キロ塩基対 5 ' 側の P s t I部位に挟まれた約 550塩基対をプローブ Vとした。 プローブ V はクローン NZ4、 C 72、 Yl、 XI、 VI I、 Α53、 Α40および A31 とはハイブリダイズせず、 Τ 5に特異的な配列であつた。
(3) クローン Α43
プローブ Α、 Βまたは Qとハイプリダイズする c DNAクローンをプローブ V を用いて実施例 4の （2) と同様の方法でハイブリダィゼーシヨンを行い、 プロ ーブ Αおよび Βとはハイプリダイズせず、 プローブ Vおよび Qとのみハイプリダ ィズするクローンを得た。 このクローンの挿入 c DNAを E c 0 R Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動により分離、 精製し、 プラスミ ドベクター p B l u e s c r i p t SK ( + ) の E c oR I部位に挿入した。 この後、 制限酵素地図の 作製および全塩基配列の解析を行った。
塩基配列解析の結果、 プローブ Qとハイプリダイズする部分を含む約 2キロ塩 基対の部分が T 5と重複する部分の配列と一致することを確認した。
(4) クローン A8
クローン A43より 5' 方向に伸長した c DNAを得るため、 クローン A43 の 5' 付近の塩基配列 （約 240塩基対） を増幅可能な次のプライマーを合成し た。
プライマー （P— 3) ：
5' -TGT TGG GAC GAA TGT CGG - 3'
プライマー （P— 4) ：
5' - TCA CAG CCA ACC TGT GCC - 3'
実施例 15の （1) において分類した第 1群、 第 2群、 第 3群の cDNAクロ ーンを上記プライマー （P— 3) および （P— 4) を用いて PCRを行った。 P CRにより増幅したフラグメントをァガロースゲル電気泳動にて分離後回収し、 塩基配列を解析した。 これにより、 実施例 15の （1) において分類した第 3群 の c DNAクローンの中で、 PCRフラグメン卜の配列が A43と同一の塩基配 列をもつものを選択し、 クローン A 8とした。 クローン A 8の全塩基配列を解析 し、 3' 側の塩基配列が A43の 5' 側の重複する配列と完全に一致することを 確認した。
(5) クローン A53およびクローン A40
第 2群に属する cDNAクローンのうち、 プローブ Qおよび Aとハイブリダイ ズする部分を 5 ' 側にもつ 2つの異なるクローンを制限酵素地図より選択した。 このうち、 クローン VI Iの 3' 側と重複する部分のより長い方をクローン A 5 3、 より短い方をクローン A40とした。
クローン A 53およびクローン A 40の全塩基配列を解析し、 クローン A53 の 3' 側とクローン A40の 5' 側の重複する部分 （約 2. 4キロ塩基対） の塩 基配列が同一であることを確認した。 また、 VI Iの 3' 側と A 53の 5' 側の 重複する約 1. 8キロ塩基対を比較したところ、 1塩基 （第 6273塩基； V 1 1では Aであり、 A 53では G) を除いてこれらの塩基配列が完全に一致するこ とを確認した。
(6) クローン A31
クローン A40より 3' 方向に伸長した c DNAをスクリーニングするために 次の操作を行った。 クローン A53およびクローン A40において、 プライマー (P-3) およびプライマー （P— 4) によって増幅されるフラグメントの塩基 配列が第 1群の VI 1の配列と異なり、 また第 3群の A 8の配列とも異なってい たため、 この部分の配列を指標に次のスクリーニングを行った。 すなわち、 全ク ローン 69個のうち第 1群と第 3群を除く cDN Aクローンについてプローブ A、 Bまたは Qとハイブリダィズする c DNAクローンを、 プライマー （P— 3) お よびプライマー （P— 4) を用いて PCRを行い、 増幅したフラグメントの塩基 配列を決定した。 この塩基配列がクローン A 53および A 40と同一である c D NAクローンを選択した。 この中から、 PCRの増幅配列を 5' 側の端にもち、 3' 側に伸長するクローンを選択し、 これをクローン A31とした。
クローン A31の全塩基配列を解析した結果、 A31の 5' 側の配列がクロー ン A40の 3' 側の重複する部分と、 また A31の 3' 側の配列がクローン A8 の 5 ' 側の重複する部分の配列と同一であることを確認した。 実施例 16 ： F c 7 B Pをコ一ドする c DNAの塩基配列の決定 （3)
F c y B Pの c DNAは全長 16. 4キロ塩基対の中に、 3. 5キロ塩基対を ュニッ トとする配列 （プローブ A、 B、 Qと相同部分を含む） の 3回のタンデム リピ一卜が存在し、 それぞれの繰り返し配列が互いに 95%以上の相同性を有す る構造をしていた （図 8) 。
このリピート構造内の塩基配列の決定に用いた c DN Aは、 前述の通り、 A、 Bまたは Qの各プローブと強い反応性を有することでクロ一ニングされてきた。 そして各々の塩基配列を比較することにより重複する部分の塩基配列が同一であ ることを確認して、 c DN A同士の連なりを明らかにし、 これにより一連の cD NA断片が単一の mRNA (遺伝子） に由来するものであることを明らかにして きた。 この事実を再確認するために、 既に発現に用いた 5' 末端 cDNAを含む pNV 11 SRとは別のリピー卜構造内の cDN A断片をタンパク質発現させ、 F c r B Pを認識するモノクローナル抗体である K 9および Κ 17によりこの発 現タンパク質断片が認識されるかどうかの検定を行つた。
(1) 開始コドンを含むアダプターの合成
ベクターに組み込む各 cDNA断片を、 その 5' 部分から全長を発現させるに は、 c DNAの 5' 部分に翻訳開始コ ドン （ATG) を連結させなくてはならな い。 また、 翻訳するタンパク質が F cァ BPと同一のフレームで翻訳されるため に、 開始コドン （ATG) と cDNAの 5' 端の間でフレームを調節する必要が ある。 そこで、 以下の 2つの条件を満足するアダプター用オリゴヌクレオチドを 合成した。
合成オリゴヌクレオチドは、 F c y B Pの本来の開始コドン （ATG) を含む pNV 11 SRの開始領域と同じ 7塩基配列 （GCCATGG) を含み、 Ko z a k則に合致するものとする。
また、 このオリゴヌクレオチドには、 ベクターへの挿入が容易となるように、 5' 端側に H i n dill部位を、 3' 端側に E c o R I部位を付加する。 フレー ムを調節するために、 次の 3つのオリゴヌクレオチド （FR—1 S、 FR— 2 S、 FR-3 S) を作製した。 そして、 それぞれのオリゴヌクレオチドと相補的な F R— 1A、 FR— 2A、 FR— 3 Aをも併せて合成した。
アダプター用合成オリゴヌクレオチド
FR- 1 S ： 5' -A GCT TCT GCA GCC ATG GG-3'
FR- 1 A： 3' -AGA CGT CGG TAC CCT TAA-5'
FR-2 S ： 5' -A GCT TCT GCA GCC ATG GGG-3'
F R— 2 A： 3' -AGA CGT CGG TAC CCC-5'
F R - 3 S ： 5' -A GCT TCT GCA GCC ATG GGA G-3'
FR-3 A： 3' -AGA CGT CGG TAC CCT CTT AA-5'
各オリゴヌクレオチドは、 DNA合成機 （mo d e 1 1394、 A B I社製） を用いて合成した後、 精製を行った。
次に、 実施例 9— (5) と同様の方法にて、 FR— 1 Sと FR—1A、 FR— 2 Sと FR—2A、 FR— 3 Sと FR— 3 Aを各々アニーリングした後、 5' 末 端のヌクレオチドをリン酸化した。 作製した各アダプターをアダプター FR— 1、 アダプター FR— 2、 アダプター FR— 3とする。
(2) TAIIIZSKベクターの改変
実施例 9一 (5) により作製したストップコドンを含むベクタ一 pBLSZT ΑΠΙに Xb a I部位を付加するために以下の操作を行った。
すなわち、 実施例 10— （1) と同様の方法で、 p BLSZTAIIIを制限酵 素 Xho Iで完全消化後、 末端を平滑化した。 末端をリン酸化した Xb a I リン 力一を連結後、 Xb a lで再消化し、 自己連結した後、 コンビテント E. c o l iを形質転換する操作により、 pBLSZTAIIIの Xho I部位に Xb a I部 位が挿入されたベクター p BL SZTAIII2を得た。
(3) 開始コドンを含むオリゴヌクレオチドの挿入
p B L SZTAIII2を E c oR Iと H i n dillで完全消化後、 ァガロースゲ ル電気泳動にて約 3キロ塩基対のベクター部分を回収した。 実施例 9一 (5) と 同様の方法で、 アダプタ一 FR— 1、 FR—2、 FR— 3を各々、 上記 pBLS ΖΤΑΠΙ2に揷入した。 塩基配列を解析し、 FR— 1、 FR—2、 FR— 3の 各アダプターが 1つずつ正しく挿入されたプラスミ ドを得て、 各々を F r 1— S K2、 F r 2— SK2、 F r 3— SK2とした。
(4) F c r BP cDNA断片の揷入
cDNAクローン A53を F cァ B Pと同じフレームで発現させるために、 A 53の cDNA部分を E c o R Iで切り出した後、 F r 3— SK2の E c oR I 部位に挿入した。 cDNAの 5' 末端が F r 3 _SK 2の開始コドン側にある方 向のプラスミ ドを選択し、 これを p i F— A53とする。
同様にクローン A8の揷入cDNAをF r 2— SK2に挿入して p i F-A8 を得た。
p i F— A53と p i F— A 8は実施例 11— (1) と同様にして精製後、 タ ンパク発現の実験に用いた。
(5) p i F— A 53および p i F— A 8の発現
実施例 11一 （2) と同様の方法にて、 P i F— A53および p i F— A8を COS 7細胞にトランスフエクションした。 2日間培養後、 実施例 11一 （3) と同様の方法でモノクローナル抗体 （K 9ノ K 17混液） を用いて細胞染色を行 い、 一過性に発現したタンパク質を検出した。 その結果、 p i F— A53および p i F— A 8のいずれをトランスフヱク トした細胞もモノクロ一ナル抗体による 染色が認められ、 両 c DNAが K9と K 17のいずれかまたは両方により認識さ れるタンパク質の一部をコードすることが示された （図 9の A、 B参照） 。 これ より、 A 53および A 8が F cァ B Pの全 c DN Aの中の反復配列の一部である ことが確定された。 実施例 17 ： クローン NZ 4が F cァ B P mRNAの 5' 末端近傍であるこ との推定 2
実施例 7でのプライマーエクステンションの結果より、 現在最も 5' 側に存在 するクローン NZ 4の上流およそ 20塩基内に転写開始部位が存在し、 NZ 4内 に存在する 9番目の A T Gが翻訳開始部位である可能性が推定された。 そこで、 NZ 4の上流に i n f r ameの ATGあるいはストップコドンが存在するか どうかを確認する目的で、 ゲノム DN Aライブラリーより F cァ BP遺伝子を単 離し、 部分塩基配列を決定した。
(1) ゲノム DNAライブラリー
ライブラリ一は市販のヒト白血球由来 （ベクタ一、 EMBL3 SP6 T7 ： CLONTECH社製） のものを用いた。
(2) プローブ
スクリーニングに用いるプローブとして、 cDNAクローン NZ4を B amH Iでベクターより切り出したもの、 および実施例 7で用いた合成オリゴヌクレオ チド （プライマー 2 ： GCTCCAGCCCAGAGTATCCACCAGCT CCATAGG、 33me r) をそれぞれ a [32P] d CTP、 γ [32P] AT Pでランダムプライミングによる標識 （NZ 4) 、 あるいは末端標識 （プライマ 一 2) したものを用いた。
(3) スクリーニング
プローブ NZ 4によるスクリーニングは実施例 3で述べた c DNAライブラリ 一のスクリーニングの方法に準じて行った。 合成オリゴヌクレオチドプローブを 用いたスクリーニングでは、 ハイブリダィゼーシヨン溶液のホルムアミ ド濃度を 20%とし、 また洗浄は 0. 3XSSCZ0. 1% SDSを含む溶液中で 45 °C、 30分間の洗浄操作を 5回繰り返して行った。
各プローブに対し、 およそ 100万のライブラリ一についてスクリ一二ングを 行い、 その結果 NZ 4プローブについて 2つの、 また合成オリゴヌクレオチドプ ローブについて 1つの陽性プラークが得られ、 それぞれすべてのプラークが陽性 となるまで繰り返してスクリ一二ングを行った。
(4) ;iDNAの抽出
各陽性クローンは、 宿主大腸菌 LE 392を用い、 実施例 2で述べた方法に準 じて増殖させ、 DN Aを抽出した。
(5) 部分マッピングとシークェンス
(4) で得た各々の； IDNA (GHF c— l, 2, 3 ) を制限酵素 （ A p a I、 B amH I、 E c oR I、 H i nd I I I、 Kpn I、 Nc o I、 P s t l、 S a c S c a l、 Sma l、 Sp e l、 Sp h l、 S t u l、 Xb a l、 Xh o I) で完全消化し、 1%ァガロースゲル電気泳動後、 サザンブロッテイングを 行った。 ナイロンメンブレンへのトランスファ一はゲルを 0. 25N HC 1に
30分間浸し、 続いて変性緩衝液 （0. 4N NaOH/1. 5M NaC l) 中で 15分間 x 2回室温にて振とう放置し、 さらに中和緩衝液 （1M NH40 Ac/0. 02N NaOH) 中で 15分間 x2回室温にて振とう放置した。 そ の後、 ゲル 1枚につきメンブレン 2枚へ同時にトランスファ一 （b i d i r e c t i on a l t r an s f e r) した。 2枚のメンブレンは各々 NZ 4プロ一 ブおよび合成オリゴヌクレオチドプローブにてハイブリダィゼーションを行った c
GHF c - 1, 2 (Ap a l、 E c oR I、 S a c l、 Xh o I ) および GH F c - 3 (B amH I、 E c oR I、 Xb a I ) の各陽性フラグメン を p B 1 u e s c r i p tベクター （TOYOBO社製） にサブクローニングし、 一部シ 一クエンス反応を行った。 シークエンス反応は実施例 6の方法に準じて行った。
(6) 結果
クローン GHF c— 1, 2, 3とも部分的なマッピングとシークェンシングの 結果、 ィンサートサイズがおよそ 15kb (GHF c— 1. 2) 、 13 k b (G HF c— 3) のそれぞれ独立したクローンであり、 GHF c— 1と 2は一部重複 していた。 また、 F cァ BP cDNAの63、 64番目に相当する塩基間およ び 1311、 1312番目に相当する塩基間に GTZ AG則に一致したィントロ ン （図 10参照） が存在しており、 また 1311番目までのェキソン部分の塩基 配列は c DNAのものと完全に一致していた （図 11参照） 。 さらに、 cDNA クローン NZ4の 5' 上流は GHF c— 3に含まれていたが、 実施例 7において 記載した推定上の翻訳開始 ATGより 87塩基、 すなわち NZ4 (配列番号 1) の 5' 端より 79塩基上流に i n f r am eでのストップコドン （TGA) が 存在し、 その間に他の i n f r ameでの ATGは認められなかった。 したがつ て、 これらの結果はクローン NZ 4に存在する 9塩基目からの ATGが F cァ B P遺伝子の翻訳開始 A T Gである可能性を強く支持する。 実施例 18 ： ヒト FcrBPの構造と IgGFc結合活性機能との相関関係 これまでに得られた Fc7B Pの cDNAの全塩基配列より推定されたアミノ酸 配列をもつタンパク構造は、 約 400アミノ酸残基より成るュニッ トのくり返し が合計 12回存在し （R1—R12 部） 、 その前後に約 450アミノ酸 （H部） と約 200アミノ酸 （T部） のユニークな配列を有するものであった。 図 12に 示すように、 R部のくり返しユニッ トの内、 R3, R6, R9は相互に 95%以 上の相同性を有し、 同様に R4, R7, R10の 3者、 R5, R8, R11の 3 者もまた 95%以上の相同性があった。 一方、 R1から R 5の各ユニッ トは相互 に約 40%程度の相同性があった。 そこで、 これらの蛋白質ドメインの機能を検 討するために、 cDN A中にいくつかの欠損部位を持たせた変異クローンを分離 し、 それらを COS細胞に発現させ、 IgG結合活性などの機能を検討した。
Fc結合活性の測定のため、 動物細胞に発現させた部分 cDN Aプラス'ミ ド pN V 11は図 12に示したように、 H, Rl， R 2, R3， R 4, R5及び R6の 一部の各ュニッ 卜で構成されるが、 これらのうちどこに Fc結合活性が存在する のかを確かめるために、 以下の実験を行った。 即ち、 制限酵素による切断 ·再結 合または、 連結するクローンの組合せにより NV11の一部をアミノ酸に対する フレームが合う様に欠除した cDNA断片を、 発現べクタ一 SRなに挿入後、 大 腸菌 XL 1— Bを形質転換した。 表 1に示したように、 NV 11より一部を削除 した後の配列を DNAの塩基番号で示した。 尚、 NV11の cDNA部分のうち、 タンパク質への翻訳の始まる最初の塩基を 1番とし、 最後の塩基を 7776番と する。
各 c DNA断片を含む発現ベクターを大腸菌より精製した後、 実施例 11と同 様の方法で、 COS 7細胞に一過性に発現させた後、 ヒト IgG Fc部による染 色、 及び Fc7 BP特異的モノクローナル抗体 K 9, K 17による染色を行った。 更に、 IgG Fcの結合に対するモノクローナル抗体の阻害を調べるために、 次の染色を行った。 cDN Aを一過性に発現させた COS 7細胞をエタノールで 固定した。 熱変性したヒト IgGを l//gノ m となるように、 阻害抗体 K9と K1 7の 1つあるいは両方、 または抗 FwRn (コントロール抗体） を含むハイブリ ドーマ培養上清にてそれぞれ希釈し、 固定細胞とインキュベートした。 室温で 1 時間放置後、 PBS (-) にて洗浄し、 HRPを結合した抗ヒト IgG (H+L) 抗体 F (a b' ) 2フラグメントと同様にィンキュベ一卜し、 変性ヒト I gGの結 合を検出した。
以下に結果を示す。 まず、 遺伝子発現産物が IgG Fc結合活性を有するかを 検討するために、 ヒト IgGを一次抗体とし、 二次抗体として HRP標識抗ヒト IgG抗体を用いた。 IgGの結合活性を示すのは、 H部の全配列及び、 それに加 え、 少なくとも 1つ以上の R部の全領域を含有するクローン （NV11, NX, NZCY, ABssH, ATth, ASpl, ABssH/Tth, NXABssH, NZ CV11) であった。 また、 IgGの結合活性を示す染色性の強度は、 R部の含有 数が増加するにつれて強度も増加する傾向にあった。 し力、し、 H部の全部または —部を削除したクローン （AHinc, AHinc/BssH, VI 1, XI) 及び、 R 部の一部しかもたないクローン （NZC) では I gGの結合活性は示さなかった。 一方、 モノクローナル抗体での遺伝子産物の染色性については、 R 5配列の全 部又は一部をもつクローン （NV11, AHinc, ABssH, ATth, ASpl, △ BssHZTth, AHinc/BssH, NZCVl l, VI 1) ではモノクローナ ル抗体 K 9の染色が認められ、 また、 R3または R6の全部または一部をもつク ローン （NZ C Yと NZ Cを除く全てのクローン） ではモノクローナル抗体 K 1 7の染色が認められた。 これらの結果により、 H部を欠くクローン （AHincZ BssH, VI 1, XI) では FCTB P特異的抗体で反応する蛋白質が発現産生さ れているにもかかわらず、 IgG結合活性は得られず、 H部は R部産物に IgG活 性を与えるに必須な機能を有していることが示唆された。 また、 クローン NZC が I gG活性および K9ZK 17染色に対して陰性であることから、 R部（Rl〜 R 5)は IgGの結合部位に対応することも示唆された。
続いて、 モノクローナル抗体 K 9, K17による IgG 結合の阻害結果を示す。 各クローンに対する阻害効果は表 1にまとめて示したが、
① R3と R5に加えて、 他の 1つ以上の R領域を含むクローン （NV11, △ Tth， NZCV11)では、 K9または K17によりある程度の IgG結合の阻 害が認められ、 両者を加えたときより強く阻害されたが、 完全には阻害されなかつ た。
② R 3に加えて他の 1つ以上の R領域を含むクローン （NX) では、 K17 によりある程度の I gG結合の阻害が認められたが、 完全には阻害されなかった。 また、 K9によっては全く阻害されなかった。
③ R 3領域のみを含むクローン （NXABssH) では、 K 17により結合が 完全に阻害されたが、 K 9は影響しなかった。
④ R 5領域のみを含むクローン （ABssHZTth) では K 9により結合が完 全に阻害されたが K17は影響しなかった。
⑤ R3及び R5領域を両方とも含まないクローン （NZCY) では、 K9, K17とも IgGの結合を全く阻害しなかった。
⑥ 全てのクローンにおいて、 コントロール抗体の抗 FCTRDI抗体による I g G結合の阻害はみられなかった。
以上の事より、 IgG Fc の結合部位は、 R 3領域及び R 5領域を含めて R 1 〜R 5領域に存在し、 それぞれの R領域が独立で IgGを結合する事が可能であ る事が推定された。 また、 NV 11等 R領域を複数含む cDNAクローンでは複 数の IgG を結合する可能性をもつ事が示された。 これらの事実は、 アミノ酸配 列の相同性から、 R 1~R 12がいずれも I gG結合部位を持ち得ることを推定 させる。
発 現 テ ー ブ ル モノク口抗体の結合性 IgGの結合
クローン名 塩基番号 （始め〜終わり） K9 K17 抗体なし + K9 + K17 + K9+K17
NV 1 1 I- -7776 + + + + + + + + + + + + + +
NX ト -4692 一 + + + + + + + + +
NZ C Y ト -3013 - - + + + +
NZ C 1- -1473 - 一 一
△ Hinc 1- -271, 1657〜7776 + + + + + + -
△ BssH 1- -1600, 2761〜7776 + + + + + + + +
△ Tth 1 -3272, 5477〜7776 + + + + + + + + + + + + + +
AS pi 1 - -6066 + + + + + + +
△ BssH/Tth 1" -1600, 2761-3272.5477-7776 + + + + + + + + + +
NXABssH 1 - -1600, 2761〜4692 + + + + +
△ Hinc/BssH ト 271,2761〜7776 + + + + + +
NZ CV 11 ト 1473,4165〜7776 + + + + + + + + + + + + + +
V 11 4165-7776 + + +
X 1 1445〜4692 + + +
実施例 19 ： Fc7B Pゲノム遺伝子の部分解析 （転写開始部位の確定） 実施例 7でのプライマーエクステンションの結果より、 現在最も 5' 側に存在 するクローン NZ 4の上流およそ 20塩基内に転写開始部位が存在し、 NZ 4内 に存在する 9番目の ATGが翻訳開始部位である可能性が推定されたが、 その N Z 4の上流に in frameの ATGあるいはストップコドンが存在するかどうかを確 認する目的でゲノム DNAライブラリーより Fc7 B P遺伝子を単離し、 部分塩 基配列を決定した。
また、 S 1マッピングを行い、 より正確な転写開始部位の決定を行った。
(1) ゲノム DNAライブラリ一
ライブラリ一は市販のヒト白血球由来 （ベクター、 EMB L 3 S P 6/
T 7 ： CLONTECH社） のものを用いた。
(2) プローブ
スク 一二ングに用いるプローブとして cDNAクローン NZ 4を BamH Iでベクターより切り出したもの、 および実施例 7で用いた合成オリゴヌク レオチド （プライマー 2 ： GCTCCAGCCCAGAGTATCCACCAGCTCCATAGG, 33 mer) をそれぞれ [32P] dCTP、 r [32P] ATPでランダムプライミング による標識 （NZ 4) 、 あるいは末端標識 （オリゴヌクレオチド） したもの を用いた。
(3) スクリーニング
プローブ NZ 4によるスクリーニングは実施例 4で述べた cDNAライブ ラリーのスクリ一ニングの方法に準じて行った。 合成ォリゴヌクレオチドプ ローブを用いたスクリ一二ングでは、 ハイブリダイゼィション溶液のホルム アミ ド濃度を 20%とし、 また Washingは 0. 3 x S S CZ0. 1%SDSを 含む溶液中で 45°C， 30分間の洗浄操作を 5回繰り返して行った。
各プローブに対し、 およそ 100万のライブラリーについてスクリーニン グを行い、 その結果 NZ 4プローブについて 2つの、 また合成オリゴヌクレ ォチドプローブについて 1つの陽性プラークが得られ、 それぞれすべてのプ ラークが陽性となるまで繰り返しスクリ一ニングを行った。
(4) 2 DNAの抽出 各陽性クローンは、 宿主大腸菌 L E 392を用い、 実施例 2で述べた方法 に準じて増殖させ、 DNAを抽出した。
(5) 部分マッピングとシークェンス
4で得た各々の； IDNA (GHFc-1, 2, 3) を制限酵素 (Apal, BamHI, EcoRI, Hindlll, Kpnl, Ncol, PstL Sacl, Seal, Smal, Spel, Sphl, Stul, Xbal, Xhol) で完 全消化し、 1%ァガロースゲル電気泳動後、 サザンブロッテイングを行った 。 ナイロンメンブレンへのトランスファ一はゲルを 0.25N HC1, 0.4N NaOH/1. 5M NaCl, 1M NH4Ac/0.02N NaOH でそれぞれ 15分、 2回処理した後、 ゲル 1枚につきメンブレン 2枚へ同時にトランスファー（bidirectional transfe r)した。 2枚のメンブレンは各々 NZ 4プローブおよび合成オリゴヌクレオ チドプローブにてハイブリダイゼーションを行った。
GHFc-1, 2(ApaI, EcoRI, Sacl, Xhol) および GHFc-3(BamHI, EcoRI, Xhol) の各 陽性フラグメントを pBluescriptベクター （TOYOBO社） にサブクロー ニングし、 一部シークェンス反応を行った。 シークェンス反応は実施例 6で の方法に準じて行った。
(6) S 1マツビング
S 1プローブ作製用テンペレートとして、 クローン GHFc- 3の EcoEI/SacI断 片 （cDNAクローン NZ4の上流約 2kbに相当） を pBluescriptSK+にサブクロー二 ングした後、 ヘルパーファージ VCSM13により調製した ssDMを用いた。 この テンペレートにプライマーェクステンションで用いたラベルされたプライマ 一 2をァニールし、 BcaBESTポリメラ一ゼ （TAKARA) により 65°C、 1 0分間合成を行った。 これを BamHI消化し、 熱変性後 8 M尿素を含む 7.5 % ポリアクリルアミ ドゲルにて分離し目的とするバンドを切り出した。 切り出 したゲルは G緩衝液 (1M NH4OAc/20mM g(OAc)2/0.1M EDTA/0.2% SDS/10 ug/ral yeast tRNA) 中、 37°Cでー晚ィンキュベー卜してプローブを溶出 した。 この S 1プローブ（lxl05cpiii)をヒト大腸上皮由来全 RNA(40//g)と polyA +RNA (1.5iig) を混合し、 エタノール沈澱後それぞれ 20/ilの S 1ハイブリダ ィゼーション液 （80%ホルムアミ ド /40mM PIPES/400mM NaCl/lmM EDTA)に溶 解した。 これを 80°Cで 10分処理した後、 42 °Cで一晩ハイブリダィゼー シヨンを行った。 これに 200/ilの S 1溶液 （30mM NaOAc (pH4. 6) /280mM Na Cl/lmM ZnS04/lmg/ml ssDNA/150unit SIヌクレアーゼ） を加え 3 7 °C 4 0分間消化した。 これを 6 %のシークェンスゲルにて泳動しゲルは固定、 乾 燥後、 オートラジオグラフィーを行った。
^π^κと 祭
クローン GHFc - 1, 2. 3とも部分的なマッピングとシークェンシングの結果、 ィンサートサイズがおよそ 15kbp (GHFcl, 2), 13Kbp(GHFc3)のそれぞれ独立し たクローンであり GHFclと 2は一部 overlapしていた。 また、 F BPcDNAの 63、 64番目に相当する塩基間および 1311， 1312番目に相当する塩基間に GT/AG則 に一致したイントロンが存在しており 1311番目までのヱキソン部分の塩基配 列は cDNAのものと完全に一致していた （図 1 0 , 1 1参照） 。 さらに、 cDNA クローン NZ4の 5'上流は GHFc3に含まれており、 推定上の翻訳開始 ATGより 87b ase， NZ4 の 5'端より 79base上流に in frameでのストップコドン（TGA) が存 在し、 その間に他の in frameでの ATGは認められなかった。 従って、 これら の結果はクローン NZ4に存在する 9番目の ATGが Fc7BP遺伝子の翻訳開始 ATG である可能性を強く支持するものである。 また、 NZ4の 5' 上流およそ 2 kbp 内に TATAZCCAAT等の典型的なプロモーターモチーフは含まれていなかった 。 さらに、 S 1マッピングの結果から、 この ATGより 8, 9, 10塩基上流に相当 する長さのバンドが見られ、 その内- 10の A残基でもっともそのシグナルが 強いことから、 この A残基より転写が開始するものと考えられた。 実施例 2 0 ： F c7 B P遺伝子多型の解析
F CT B P cD N Aのシークェンスの結果、 コーディング領域内の特定部位に遺 伝子多型の存在が示唆された。 すなわち F C7 B P cD N Aの 5120， 8723, 12326 番目に存在する Smal部位についてク口ーン A52の同領域では CCCGGGから CCTGGGへ の塩基の置換が認められた。 cD N Aクローニングに用いたライブラリ一は単一 個体由来ではなく数人の遺伝子をその由来とするために、 この塩基置換が個体間 で認められるものかあるいは同一個体において半数体ゲノムあたり存在する主要 な 3回の繰り返し領域間に認められるものかどうかを確認するために以下の実験 を行った。
Forward側プライマーとして
BC1 : ACCACTCCTTCGATGGCC，
GS1： ACCTGTAACTATGTGCTGGC, の 2種、
Reverse側プライマーとして
GS2： TGGTGGTGACGGTGAAGGG,
GS3:ACAGCAGGGTTGCCCCGG,
GS4： TGGTGCCGAGGGCAGCCACG,
BC2： TGGGTCACTGAAATCCG, の 4種を合成した。
また 6名の健常人白血球並びに 4名の担癌患者大腸の正常部位より上皮細胞 を分離後、 Nelson等の方法により D N Aを抽出した。 各 D N A20ngにプライマ ーセッ ト BC1/BC2, BC1/GS3, BC1/GS4, GS1/GS3, GS1/GS4を終濃度 20pmoleで加え、 P C R緩衝液 (lOmM Tris HC1 pH8. 3, 50mM KC1, 1. 5m MgCl2, 200//M dNTPs, 0. 001% gelatin, 2. 5unit taqポリメラ一ゼ） 中、 （94°C lmin- 60°C 1. 5 min - 72°C 2. 5 min x 30サイクル） の条件で P C Rを行った。 P C R産物は Smal消 化後 2%ァガロースゲルにて泳動し、 EtBrにて染色を行った。
以上の結果、 各プライマーセッ トに対する P C R産物を Smal処理することによ りプライマー BC1/BC2を除いた各セッ 卜で遺伝子多型が存在することが明かとなつ た。
すなわち、 1 0種の D N A標品の内、 1つは Smal にて完全消化されることか らこのサンプルは少なくとも対立遺伝子を含めた 6力所の繰り返し部位すべてに Smal部位が存在し、 他のサンプルでは Smalでの消化、 未消化産物の割合が各種の 頻度で観察された。 逆に、 これら 1 0サンプルの内 Smalサイ トをも全くもたない ものは存在しなかった。 また、 HT- 29N2 細胞において同じプライマーセッ トを用 いて R T— P C Rした後、 Smalにて消化したところ、 全てそのサイ トを含んでい た。
また、 プライマー BC1ZBC2で多型が認められなかった理由として P C R産物の 鎖長が約 1. 8kbpあることからプライマー GS4とプライマー BC2の間におよそ 1. 6kbp のイントロンが存在し、 このイントロンの 5' 側に Smal部位が存在することが示 唆された。 この部位と多型を示す目的の Smal部位間の長さが非常に短く、 BC1ZB C2での増幅産物とその Smal消化産物との鎖長差が僅かであるために多型が検出さ れなかつたものと推定された。 実施例 21 ：誘導型高発現 CHO細胞株の分離と FwB Pの検出
実施例 11で示した Fc7B Pフラグメントを多量に、 安定して発現する細胞株 を樹立する目的で、 動物細胞用発現ベクター、 pMSXNDを用いて FCTB P部 分 cDNA、 NV 11 STを発現させた。 pMS XNDベクターは蛋白発現の誘 導がナトリウムブチレ一トなどにより可能なメタ口チォネインプロモーターを発 現プロモーターとして有し、 染色体 DNAに組み込まれた後に遺伝子増幅を可能 にする dh f r遺伝子をもつ様構築されている。
(1) pMSXNDベクターの改変
まず、 pMSXNDの c DNAクローニング部位である Xh o Iにてプラス ミ ドを完全消化した後、 0.4単位の Klenow Fragmentにて 15分間処理し、 末端 を平滑化した。
次に、 No t Iリンカ一 （5' -pGCGGCCGC— 3' )をベクターにライゲーシヨンし た後 No t Iで完全消化し、 自己連結させてからコンビテント E. c o l XL 1—Bを形質転換した。 得られたクローンを解析し、 pMSXNDの Xho I部 位に No t I リンカ一が挿入されたプラスミ ド pMSXND— NOTを得た。
(2) cDNAの揷入
pMSXND— NOTを No t Iで完全消化した後、 アルカリフォスファタ一 ゼ処理により脱リン酸化を行った。 次に、 実施例 6— (6)で作製した F c 7 BP c DNAを組み込んだプラスミ ドである pNVl 1— STを No t Iで完全消化 し、 ァガロースゲル電気泳動にて 8 k b pの c DNA部分を分離、 回収した。 こ れらの発現ベクターと c DNA挿入部分をライゲーシヨンし、 コンビテント E. c 0 1 (XL 1 -B) を形質転換した。 アンピシリンを含む LBプレート上で培 養し生じたコロニーのうち、 メタロチォネィンプロモーターに対しセンスの方向 で c DN Aが挿入されたプラスミ ドを選択し、 pNV 11— MSXを得た。
(3) CHO細胞での IgG FcB P部分 c DNAの発現 実施例 11と同様の方法にて pNV 11— MS Xプラスミ ドを含む大腸菌を培 養し、 增幅したプラスミ ドを精製した。 このプラスミ ド 10//gを の F- 12培地 (ヌクレオチド添加） に溶解したものと、 のリボフヱクシヨン試薬 （Trans fectum, SE PR A C OR社） を 250 に溶解したものを混合し、 直ちに CH0細胞 (dhfr欠損株） 上に加えた。 37°Cで 6時間培養後、 10%血清を含む F— 12培地で 置換し 3日間培養した。 次に、 培地を lmgZniiの G418、 10%牛胎児血清を含む な一 MEM培地 （ヌクレオチド不含、 G I B C O社製） に置換し、 3日毎に培地 交換しながら 1 4日間培養し、 プラスミ ドの挿入された細胞を選択した。 このよ うにして数十個のコロニーを形成したディッシュより、 限界希釈法にて細胞をク ローニングした。 得られた細胞クローンのうち F c結合活性の高い蛋白発現を示 すものを選択し、 より多くの発現量を得るために次に遺伝子増幅を行った。
(4) 遺伝子増幅
pNV 1 1— MS Xが CHO細胞の染色体に組み込まれ、 安定に FCTB Pフ ラグメントを発現する細胞クローンの蛋白質産生量を増加させるために、 メ ト ト レキセ一ト処理によって組み込み遺伝子の増幅を行った。
即ち、 前記の安定発現細胞クローンを、 0.005 Μのメ トトレキセ一ト、
mi の G418含む a— MEM培地 （ヌクレオチド不含） にて 3— 4週間培養し、 生 育する細胞を選択した。 次に、 メ トトレキセート濃度を 4倍 （0.02//M) に増加し、 同様の方法で 3— 4週間培養した。 メ トトレキセート濃度を 4倍に増加させ培養 する操作をくり返し、 最終的に 6.4//Μ〜25 Μ のメ トトレキセート存在下で増殖す る細胞を得た。 この細胞を限界希釈法にてクローニングを行い、 FC7B Pフラグ メントを高発現する細胞株を得た。 発現量の増加は、 実施例 11および 12にお けると同様に、 K9ZK17モノクローナル抗体による組織化学的染色または I gG結合能の検出法による第一次的判定によった。
(5) 細胞試料の作製
FcTB Pフラグメントを安定的に高発現する CHO細胞株 5 X105細胞を 0100 随ディッシュに移し、 6.4//Mメ ト トレキセー卜、 lmgZmf G418を加えたひ - MEM 培地にて培養した。 必要に応じて終濃度 5mMとなるようナトリウムブチレ一トを 添加し、 蛋白質の発現誘導を行った。 3曰後に、 培養上清 （S U P 1 ) を採取し、 さらに SUP 1から細胞片を除くため 100,000xg, 60分間遠心後、 上清 （SUP 2) を回収した。 細胞は、 500// の細胞溶解緩衝液 (50mM Tris-HCi (pH7.5), 15 OmM NaCf, lmM EDTA, ImM PMSF, 10mM monoiodo acetamide, 10//g/mi approtin ine, lQiig/ l leupeptin) に懸濁後、 超音波処理 （30秒>< 3回） を行い 10,0 OOxg, 10分間 4°Cの遠心を行った。 遠心後の上清 （L Y S 1 ) を除き、 残渣に、 1%NP— 40を含む細胞溶解緩衝液 400W を加え、 超音波処理後、 遠心し上清 を回収した （L Y S 2) 。 更にこの残渣に 1 %N P— 4 0, 0.1% S D S, 0.5% デォキシコール酸ナトリウムを含む細胞溶解緩衝液 200 Wに溶解後、 遠心し上 清を回収した （LYS 3) 。 残渣は 10 Οιιίの細胞溶解緩衝液に懸濁した （LY S 4) 。 また、 コントロールとして大腸上皮細胞の溶解液 （1/100〜1/3200希釈） を用いた。
(6) サンドイッチ EL I SA
産生された FCTB Pフラグメントを定量的に検出するために、 FcTB Pに対す る特異的モノクローナル抗体 K 9および K 1 7を用いたサンドイッチ EL I S A 系の開発を行った。 ァフィ二ティー精製した K9抗体を 5//g/mfとなるよう 0.05M 炭酸緩衝液 （PH9.2) にて調製し、 50WZゥヱルで EL I S Aプレート（PRO— B I ND, ファルコン社製） に加えた後、 4°Cでー晚放置した。 ゥヱルを洗浄溶 液 （0.05%Tween- 20を含む PBS (—）） で 3回洗浄した後、 ブロッキング溶液（10 %血清を含む RPM 1 1640培地） を 50 ^ί/ゥエル加え、 温室で 60分間 放置した。
ブロッキング溶液を除き、 （5) にて調製した試料を各々 50 /^加え、 室温 2時間放置した。 洗浄溶液にて 3回洗浄し、 ブロッキング溶液にて 4mg/mnこ希 釈した HRP結合 K 1 7抗体を 5 加え、 室温 1時間放置した。 洗浄溶液にて 3回洗浄後、 5 の発色液 （ 20 mg 0- phenylenediamine, SOni H202(30 %) を 5 Omiのクェン酸緩衝液に溶解） を加え、 室温で 3分間発色させた。 5 の 2. 5M H2S〇4溶液を加え反応を停止してから 492 nmの吸光度を測定した。 〔結果〕
( i ) 得られた代表的な FCT B P発現 C HO細胞株について
メ 卜トレキセート存在下で培養後、 ナトリウムプチレート処理後および未処理 後 3日目における Fc7B Pフラグメン卜の発現量を K9ZK17モノフローナル 抗体による細胞染色法により検出した。 図 13に示すように、 高発現株が分離で きた。
(ii) EL I SAによる FC7BPフラグメントの定量結果
Fc7B Pフラグメン卜の安定高発現株から調製された各試料をサンドィツチ E L I S A法にて測定した結果、 次の表 2の吸光度が示す様に、 Fc7BPフラグメ ントは細胞溶解液中 （LYS 1〜4) に比べて、 培養上清中 （SUP 1, 2) に より多く検出された。 この事実は発現させた FcrB Pフラグメントは細胞内に蓄 積するのではなく細胞外に分泌されることを示している。
2 試 料 OD. 大腸上皮細胞溶解液 1/100 希釈 2.184 (コ ン ト ロール）
1/200 2.024
1/400 1.516
1/800 0.935
1/1600 0.514
1/3200 0.264
発現誘導細胞 SUP1 0.731
SUP2 0.712 LYS1 0.044 LYS2 0.174 LYS3 0.013 LYS4 0.095 発現非誘導細胞 SUP1 0.259
SUP2 0.273 LYS1 0.027 LYS2 0.070 LYS3 0.012 LYS4 0.019
5/27057
【配列表〕
【配列番号 1】 列番号： 1
配列の長さ ： 908
配列の ：核 g
^の数：ニ本鎮
トポロジー： 1：線状
配列の種類： c DNA
配列
10 20 30 40 - 50
1234567890 1234557890 1234557890 1234567890 1234567890
CTG .GCC¾r G3G GCCCTA TGGA.GCTGGT GGATACTCTG GGC GGAGCA 53 ACCCTCCTGT 'GG GiTIGAC CCAGGAGGCT TCAGTGG¾X TCAAGAACAC 100 GG AGAGAG GAATTCC CA C¾GCCTTCCT GCAGAAC AT C¾ TGGCC 150
CTACCCCOGC CTCC TATCT C ¾GTCTGTC AGAGAGCCCC 200
G TTC.C-TCT CCA.TCCI AG CC?.GGC¾GAC AACACCTOA AGA GGTCAC 250
AGTG.GC-CCC G3GGAGTCC-C- TCATGG CAA ^.TC¾GTGCC AAGGC GAG^ 300
TG^TAGGCAG CAAG^TCTTC CAGCATGCGG TGGIITCCA TTCTGAC AT 350
GCC^T-CTCTG TGC¾GG ¾CT AATGCCAAG CC G CACAG CGG .GCTG?.C 400
AC C-CTC-CGG CCCi.TCC¾3G CCCTAGG ¾C CGAG A G GC?C CAC 450
CCCCCGG AC CTCAGCCAGG AATG CA GG GTTTGCCG? GGTGC-CCQGT 500
GCCC .GG G CCTCGG CAG TG CACG G A¾SGGGTC¾3 TGACAT CAA 550
TGS:AC- C TH ZAG GCG?.TGTCCT AAGkGTGACT CTACAGCCCT 600
AC^ATGTGG: CG.GCTACAG AG:TCAGTG:- ATCTCTCG G GTC^AGG C 650
AC¾C-CTAGTA GCCCG3TGGC TGTCCTCTCT G3CCACAGC G GCG ^A 700
A .TACG?.CC TGCAACCATG TGGT G¾3CA GCTGCTACCC ACGTCTGCCT 750
G:-S3 ¾XCA CTATC-TAG A CCCACGCTGC- CCICC ^ATC TCC-CTATG^.T 800
TTG3 CTTCG TTGTGGCCAG CCAGGCCAC^ AAGC GACC ACACCA.TGG 850
G:-3 A CACT GGCTCCCC-TG GGCTCCAGGC ^- TG.TGTG GTA ¾GIT G 900
？ J3 TCCG3 908 【配列番号 2】
配列番号： 2
配列の長さ ： 1336
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類： c DNA
配列
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567390
G CCTACAGC A¾GGCCTACC CCCGCCTCCT TATCTCCAG CTG CAGAG¾ 50 GCCCCGCTTC AGTCTCC¾TC CTC.GCCAGG CAGACAACAC CTCAAAG^AG 100 GICACAC-TGA GGZCCGGGGA GTCGGTC^.TG G CAACATCA GTGCC^AGGC 150
TG¾G.¾TG?,TA GG ¾GCAG¾ TCT CCAGCA TGCGGTGGTG ATCC.T CTG 200
AC ATGCCAT CTCTGTC -G GC CL .TG CCAAGCCTG¾ C¾ ¾GCGG¾.G 250
CTG?.C¾.CTGC TGCGGCCCAT CCAGGCCCTA GG ¾CCG¾GT ATT TGTGCT .300
G ACCCCCC GGCACCTCAG CCAGGAATGT CAAGG^GITT GCCGTGGIGG 350
CCGGTGCCGC AGGTGCCTCC- GTCAGTG CA CGCTGAGGG GTCAGTGACA 400
TTCATGGC\ AGTTCTATCC A.GC¾GGCG¾T GTCCT.AGA.G TG TCTACA 450
GCCCTACAT G GGCCCAGC TAC¾G¾GCTC AGTGGA.TC C TCGGGGTCA 500
AG-T ¾CAGC TAGTAGCCCC GTGGCTGTCC TC CTGGCCA CAGCTGTGCG 550
CAGA CATA CGACCTGCA CCATG GGT G¾X¾3CTGC TACCCACC-TC 600
TGCCTGGG-C ACCCACTATG TAGTACCC¾C C-CIGGCCTCC OL.TCTCGCT 650
ATG?.TTTGGC CTTCGTTGTG GCCAGCCAGG CCACAAAGCT G^CCTACAC 700
C^TGC-GGG A TCACTGGCTC CCG GGGCTC CAGGCAGGTG ATGTGGTAG. 750 .
GT TGAGGTC CGGCCATCCT GGCC.CTCTA CCTG CTGCA AATGTGGGCA 800 .
TCCA.GGTCCT GTTGTTTGGC ACAGGTGCCA T^AGGAATG. AGTG^C TAT 850
G^CCCCTACC TQ3TCCTG.¾T CCCAGITG G G GGCCTACT GCCCAGCCTA S00
TGTGGTCAG AGTGTACCAG GCTGTGAGGC- CGIGGCCCTG GTAGTGGCAC 950
AGACGAAGGC TATC=,GCGC-G CTGACCATAG ATGGC .TGC AG GGGGGCC 1000
AGCTCACCT GGG .GGCTGT GCCAGGOGT GAC-T CTCC-T ATGCTGAAGT 1050
GGA.GCTCGC-C ACAGCTGACA TGATCCACAC GGCCG¾GGCC ACCACCAACT 1100
TGC-G?.CTGCT CACCTTCGGG CTGGCCiAGG CTATAGGCTA CGCAACAGCT 1150
GCTGATTGCG GCCGGACTGT ACTGTCCCCA GTGGAGCCCT CCTGCG AGG 1200
CATGCAGTGC GCAGCCGGGC AGCGCTGCCA G3TGGTAGGC GGGAAGGCCG 1250
GGTGTGTGGC GGAGTCCACC GCTGTCTGCC GCGCCC.GGG CGACCCCCAT 1300
TAC.CCA.CCT TCGACGGCCG TCGCTACGA.C ATGATG 1336 / 95/ 068
【配列番号 3】 配列番号： 3
配列の長さ ： 1878
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類： c DNA
配列
O 95/27057
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 12^4567890
CCAAGCTCAC CTGGGAGGCT GTGCCAGGCA GTGAGTTCTC G ATGCTGAA 50 GTGG.GCTCG GCCAGCTGA CATGATCCAC ACGGCCGGG CCACCACC1A 100 CTTGGGACTG CTCA.CCTTCG GGCTGGCCA GGCTATAGGC TACGC CAG 150 CTGC GATTG CGGCCGGAC GTACTGTCCC CAGTGGAQCC CTCC GCG^A 200 GGCATGCAGT GCGCAGCCGG GC.GCGCTGC CAGGTGG AG GCGGG^AGGC 250 CC-GGTGTGIG GCGGAGTCCA CCGCTGTCTG CCGCGCCCAG GGCGACCCCC 300 OTACACCAC CTTCC^CGGC CGTCGCTACG ACATGATGGG CACCTGTTCG 350 TAC¾CG¾TGG TGG?.GC GTG CAGCGAGGAC G CCCTGC CCGCCTTCAG 400 G3 GGA.GG C AAG ACGAGC ACCGGGGCAG CCGCCGCG C TCCIACGTG3 450 G:CTCGTCAC TC-TGCGCGCC TACAGCCACT CTGIG CGC GACCCGCG I 300 GAAGTTGGCT TCGTCCTGGI TG ACCAG CGC CGCGCC TGCCAGTCTC 550 CC d.G G¾：- GGTCGCCTGC GTGTGTACC¾ G¾GCGGA.CC¾ CGGGCCGTGG 600 TC-GA.GCTGG CT TGGGCTG G GG CACTT ATGACTGGGA CTGCCAGCTG 650 GCACTCAGCC TGCCTGCACG C TCCA GAC CAGGTGTGCG GGCTGTGTGG 700 CACTATAAT GG GACCCAG O .CGACTT CCTC^CGCCT G? GGGGCTC 750 TGGCTCCTG?. CGCTGTG3AG TTCGCAAGTA GCTGGAAGCT GGATG-TGGG 800 GA.CTACCTGT G GAGG^TGG CTGCCAGAAC CTG CCCG CC GCACCCC 850 ¾3GCCAGGCC C^CAC ATG AGC-GCG..CCG ACTCTGTGGC ATGCTGACCA S00 AGCTCG?.TGG CCCCTTCGCT GTCTGCCATG AC¾CCCTGG¾ CCCCAGGCCC 950 TTCCTGGAGC AGTGTG ATA TGACCTGTGT GTGGTCGC-TG GGGAGCGGCT 1000 C.GCCTGTGC CG GGCCTCA GCGCCTATGC CCAGGCCTGT CTGGAGCT G 1050 GC. TCTCGGI TGGGG?.CTGG AGATCACCAG CC^ACTGCCC CCTGTCCTGC 1100 CCTGCC¾AC¾ GCCGC ATGA GCTCTGCGGC CCTGCTTGCC CG .CCTCC G 1150 CAACC-GGGC? GCC-C-CGCCG CCAACTGCTC CGGGCGCCCC TGCGTGG .GG 1200 GC Q -STGTG CCTCCC.GGC TTCGTGGCCA GCGXGGCGC CTGCGTGCCG 1250 GCCTCGTCGT GTGGCTG .G CTTCCAGGGT CTCC.GCTCG CTCCGGGCC¾ 1300 " GGAAGTGTGG GCGGA.CGAGT TGTGCCAAAG GCGCTGC^CC TG ACGGCG 1350 CCACCCATCA GGTCACCTGC CGCGACAAGC AGAGCTGCCC GGCGGGTGAG 1400 . CGCTG ¾GCG TCC.G.AACGG CCTCCIGGGC TGCTACCCCG ATCGCTICGG 1450 ' G CCTGCCAG GGGTCCGGGG ACCCACACTA TGTGAGCTTC G.CGGCCGGC 1500 GCTTCG2..CT1 CATGGGCACC TGC¾CGTACC TGCTGC-TCGG CTC¾TGCGGC 1550 CAGACGCAG CGC GCCTGC C CCGGG G C GGTGGi^A ACG?,G \TCG 1600 GGG ^GCCG ACTGTG¾GCT ACACGCGCGC CGTGCC-GGTG GAGGCCCGCG 1650 GC-GTGAAGGT GGCCGTC-CGC CGGGA.GTACC CCG-GCAG GCTC-G GG .T 1700 G?,G^ICCTTC AGIATCTGCC CTTCCAAGCA GCAGATGGGC AGGTG A.GGT 1750 C-TTCCG¾C G GGC¾3GG¾TG CCGTCGTGCG G.CGGACTTT GC-CCTG-^CTG 1800 TCCTTATG¾ CTGGAATGC¾ CG? -TG?..CTG CCAAGGIGCC CAGCAGCTAT 1850 GCTG¾GGCCC TCTGTGGACT CTGTGGGA 1878 【配列番号 4】 配列番号： 4 配列の長さ ： 3247 配列の型：核 鎖の数：二本鎖 トボロジー：直線,伏 配列の種類： c DN A 配列
O 95/27057
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
CTTCGACGGC CGTCGCTACG ACATGATGGG CACCTGTTCG TACACGA.TGG 50 TGG¾GCTGTG CAGCGAGGAC GACACCCTGC CCGCCTTCAG CGTGG .GGCC 100 ？•AGAACGAGC ACCGGGGCAG CCGCCGCG C TCCTACGTGG GCCTCG CAC 150
TGTGCGCGCC TAQVGCC.CT CTGTGTCGCT GACCCGCGG GAAGTTGGCT 200
TCGTCCTGGT TGACAACCAG CGCTCGCGCC TGCCAGTCTC CCTGAGTGA.G 250
GGTCGCCTGC GTGTGIACC¾ GAGCGGACCA CGGGCCGTGG TGGAGCTGC-T 300
CTTTGGGCTG GTGGTCAC T ATGACTGGGA CTGCCAGCTG GCACTCAGCC 350
TGCCTGCACG CTTCCAAGAC C.GGTGTGCG GG TGrC-TC-3 C ACTATAAT 400
G:-TG¾XCAG C¾GACG¾TTT CCTCACGCCT GACGGGGC C TGGCTCCTGA 450
CGCTGTGGAG TTCGO-AGTA GCTGGAAGCT GdH G G^CTACCTC-T 500
GTGAGGATGG CTGCC¾G?AC AACTGTCCCG CCIGCACCCC AGG CAGGCC 550
G^.C¾CTATG AQG3ZQ^£ G ACTCTGTGGC ATGCTG^C ^ AGCTCG\TGG 600
CCCCTTCGCT GTCTGCC.TG AC¾CCCTGG¾ CCCC.GGCCC TTCCTGG..GC 650
AGTGTGTATA TGA.CCTGTGT G GC-TCC-GTG GGGAGCC-GCT C¾GCCTGTGC 700
CGTGGCCTCA GCGCCTATGC CCAGGCCTGT CTGG?.GCTTG G =-.TCTCGG 750
TGGGG? TG:- AGATCACCAG CCAACTGCCC CCTGTCCTGC CCTGCCAACA 800
GCCGCTAT ¾ GCTCTGCGGC CC GCTTC-CC CG?.CCTCCTG C CGGGGCT 850
GCGGCGCCGT CCAACTGCTC CGGGCGCCCC TGCG C-G¾GG GCTGCGTGTG 900
CC CCCAGGC TTCGTGGCC¾ GCGGCGGCC-C CTGCG GCCG GCCTCGTCGT 950
G GGCTGCAC CTTC AC-GGT CTCCAGC CG C CCGGGCCA GGAAGTGIGG 1000
GCGG^CGAG TG GCCAAAG GCGCTC .CC TGCAACGGCG CCACCCATCA 1050
GGTCGCCTGC CGCG¾CAAGC AGA.GCTGCCC GGCGGGTG¾G CGCTGCAGCG 1100
TCC¾G?ACGG CCTCCTGC-GC TGCTACCCCG ATCGCTTCGG GACCTCCCAG 1150
GGG CCGGGG ACCCACAC A TGTG. GCT C GACGGCCGGC GCTTCGACTT 1200 .TC-C-GCACC TGC¾CGTACC TGCTGGTCGG C CK GGC CAGAACGCAG 1250
CGCTGCCTGC CTTCCGGGTG CTGGTGGAAA ACGAGCATCG GGGCAGCC¾G 1300
- ACTGTGAGCT AC.CGCGCGC CGTGCGGGTG G¾GGCCCGCG GGG GAAGGT 1350
GGCCG GCGC CGGGA.G ACC CCGG3CA¾3 GCTGG GG¾T G CGTCCT C 1400
AGTATC C C CTTCC¾¾XA GCAG?,TGGGC AGGTGCAGG G TCCGACAG 1450
GGCAGGG TG CCG CGTGCG CACGGA.CTTT Q3CCTGA.CTG TC¾CTTATGA 1500
CTGGAATGCA CG¾GTG .CTG CCAAGGTGCC CAGC¾ ?AT GCTGA.GGCCC 1550
TC-iGTGG?,CT CTGTGGG^AC TTC^ACGGGG ACCC¾GCTG¾ T^.CCTGG T 1600 CTGCGGC-GTG G33GKAAGC TGC -ATG ¾ CTGGCCT G GG?ACAGC G 1650 GCAAGAAGAG ACG.GC-CCCG GCTGTGG?.GC -ACTGAACCC- GG GACTGTC 1700 CCAGCTGGA CTCCCTGGTG GCCC¾GC.GC TGCAGAGCAA GAATG GTGT 1750 GG ATCCTTG CCGACCCCAA GGGGCCC TC CGGGA.GTGCC ATAGCAAGCT 1800 GGACCCCCAG GGTGCCGTGC GCG CTGTGT CTATG?.CCGC TGCCTGCTGC 1850 CAGGCCAGTC TGGGCC.CTG TGTGA GCAC TGGC ^CCTA TGCTGCTGC¾ 1900 10 20 30 40 50
1234567890 12345678^0 1234567890 1234567890 1234567890.
TGCC¾ GCTG CTGG.GCCAC AG GCACCCC TGGAGGAG G AAGAAOTTG 1950 CCCACTGAGC TGCCCACCCC AC.GCC¾CTA TG GGCGTGT TCCTACGGCT 2000 GCCCGC GTC CTGTGGAGAC CTCCC GTGC CCGGGGGCTG TC-GCTCA.GP-A 2050 TGCC.TGAGG GCTGCGTGTG CGATGAGGGC TT GCGCTC¾ GTGGTGA.GTC 2100 CTGCCTGCCC CTGGCCTCCT GTGGCTGCGT ACACCGGGC ACCTACCA.CC 2150 CACCAGGCCA GACCT CTAC CCTGGCCCCG G.A.TGTGATTC CCT TGCC.C 2200 TGCC¾ GAGG GCGGCCTGGr GTCCTGTG^G TCCTCCAGCT GCGGACCGCA 2250 CG.GGCCTGC CAGCCA CCG GIGGCAGC T GGGCTGTGTG GCCGTG]GCT 2300 CTAGGCCTG CGAGGCG C¾ GGAGACCCCC ACTAC¾X¾： CTTCG?.TGGC 2350 CGCCGCTTCG ACTTC¾TGGG CACC GCG G TATGTGCTGG CTC¾GA.CCTG 2400 CGC A.CCCG3 C GXCTGC ATCC-TTTGC CGTCCTC AG Q^ACG C-:- 2450 CCTGGC-GT^A TGGGCQ -TC AGTGTGACCA C-GGI .TC¾C GG CCAGG G 2500 GOLACTTCA CCCTGCGGC GGAC - ^. G-G GGAGG TCACGC-TGAA 2550 CG3 GTGGAC ATG?AGCTC-C CCGTGGTGCT GGCCAACGGC CAGATCCGTG 2600 CCTCCCAGCA TGGTT .G¾T GT GIG^TTG AGACCG^CTT CGGCCTGCG 2650 GTGGCCTACG ACCTTGTGTA CTATG GCGG GTCACCGTCC CCGGAAACTA 2700 CTACCAGCAG ATGTGTGGCC TG G GC-G?A CTAC^ACG C GACCCC¾AGG 2750- ATG?.CTTCC¾ G^JGCCCAAT GGCIO .GG C G: ACGC ATGAGI C 2800 GGCAC CCT GGGA.GG GGT GG GCCCG^.C TCTCCCTGCC TGCCGCCC^.C 2850 CCCTTGCCCG CCGGGGAGCC- AGG .CTGTAT CCCCAGCCAC .AGTGTCCTC 2S00 CCG.AGCTGG?. GAAG?AGT C.G AGGA.GG AGTTCTGTC-G GCTCCTCTCC 2950 AGCCCCACAG GGCCACTGTC CTCCTGCCAC A¾GCTGGTGG ATCCCCAGG:- 3000 TCCCTTG^A G-T GCATCT TTG?,TCTC G CCTGC-GTGGT GGGAACCTG^. 3050 GC\TTCTCTG C^C AC^TC C.TGCCTACG TGA.GIGCTTG CdGGCGGCT 3100 GG.GGCCACG TGGA.GCCCTG G¾GG?d A ACTTTCTGIC CC^GG .GTG 3150 CCCTCCGAAC AG C¾CTACG AGCTC GTGC GG¾2? CTC-C TCCCTGGQ T 3200 ' GCTC.GC CT CAGTGCCCCT CC.CGTGCC AGG -TGGGTG TGCTG?.G 3247
O 95/27057
【配列番号 5】 配列番号： 5 配列の長さ ： 3661 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類： c DNA 配列 .
O 95/27057
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
CTATGTGCGG GTCACCGTCC CCGGAAACTA CTACCAGCAG ATG GTGGCC 50 TGTGTGGGAA CTACAACGGC GACCCCAAGG ATG ITCCA GAAGCCCAT 100 GGCTCACAGG CAGGC CGC CAATGAGTTC GGC CTCCT GGG¾GGA.GGT 150
GGTGCCCG¾C TCTCCCTGCC TGCCGCCCA.C CCCTTGCCCG CCGGGGA.GCG 200
AGG?.CTGTAT CCCCAGCCAC GTGTCC C CCGAGCTGGA GAAGAAGTAT 250
CAG^AGGAGG AGTTCTGTGG GCTCCTCTCC AGCCCCACAG GGCC¾CTG C 300
CTCC GCCAC AAGCTGGTGG ATCCCCAGGG TCCCTTG¾.A G..TTGC.TCT 350
TTGATCTC G CCTGGGTGGT GGGAACCTGA GC^TTC CTG CAGCH 400
C^TC-CCTACG TGAG GCTTG CCAGGCGGCT GGAGGCCACG TGGAGCCCTG 450
G .GGACTGAA ACTTTC G C CCATGGAGTG CCCTCCG AC AGTC^.CTACC- 500
AGCTCTGTGC GGACACCTGC TCCCTGGGCT GCTC.GCTCT CAGIGCCCCT 530
CCAC GTGCC AGG^TGGGTG TGCT ^GGGC TGCCAGTGTG ACTCCGGCTT 600
CCTCTAC^AT GGCC¾AGCCT GCGTGCCCAT CCAG ATGC GGCTG T?.CC 650
ACATGGTG CTAC ATG^G CCGGAC - CAGTCC?CAT TGAC CTGT 700
CGGC^GCAGT GCACGTGCCA TGCGGGT.^A GGC¾TC?rGT GCC^G^AC^. 750
CAGCTGCAAG CCGGGG .GG TGIGCCAGCC CTCCGGA.GGC ATCCTG .GCT 800
GCGTC¾COA AGA.CCCGTGC CACGGCGTG¾ CATGCCGGCC ACAGG G CA 850
TGG^C-G?.GC AGGGTGGCCA GGGCGTGTG CTGCCOACT ATG?-GGCCAC S00
G GCTGGCTG TGGGGCGA.CC CACAC ACCA C CCT CGAT GGCCGGAAGT 950
TTGACT CC GGGC¾CCTGT CTATGTGC TGGCTGCCCG 1000
GGGGTCAGCA CCCAGGGCCT .GACACCC C ACCGTCACCA CC GAACCA 1050
GAACCGGQX AACCCTGCTG TG CCTACGT GA.GA.GTCGIC ACCGTGGC G 1100
CCCTCGG .C CAACATCTCC ATCC^CAGG ACGA.G?.TCGG G^AGTCCGG 1150
GTGAACGG C- TGCTCACAGC CTTGCCTGIC TCTC-TGXCG ACC XGG^T 1200
T CAGTGACC CAGGGIGCAT CGAAGGCACT GCTGG GGC G.CTTTGG^.C 1250
TGCAAGTCAG CTATG-^CTGG AACTGGCGGG TAG.CGK¾C GCTGCCCAGC 1300
' AGCTATC^TG GCGC.G GTG CGGGCTCTGC GG AACATGG ACCGCAACCC 1350
G^AC¾ATG¾: GVGGTCTTCC C TGGCAC ACTGGCTCCC TCCATACCCA 1400
TCTGGGGCGG C¾3CTGGCG¾ GCCCCAGGC GGG¾CCC¾CT GTGTTGGGAC 1450
G?L¾TGTCGGG GGTCCTGCCC AACGTGCCCT G¾GG¾XGGT TCGAGCAGIA 1500
CGAG-GCCCT GGCTTCTGCG G^.CCCCTGGC CCCCGGCACA GGGGC-CCCTT 1550
TCACCACC G CCATGCTCAT GTGCCACCTG AG?.GCTTCTT CAAGGGCTGT 1600
C- TCTG ACG TC GCA GGG TC-GTGGGG?,C CGTGACATTC T TG AC-C-C 1650 TCTC-C-CTTCC TATGTGGCCG CC GCCAGGC TGCTGGGGTT GTCATCG^AG 1700 ACTGGCGX-C ACAGGTTQGC TGKATCA CCTGCCCAGV- CAGCCAC 1750 TATG¾ -TCT GTGGCCCACC CTGCCCGGCC AGCTG CCGT CCCCTGCACC 1800 CCTTACGA.CG CC^GCCGTAT GTGAGGGCCC CTGIGTG^.G GGCTGCCAGT 1850 GCGACGCGGG TTTCGTGTTA AGTGCTG .CC GCTGTGTTCC CCTCHAC 1900 O 95/27057
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 T ?34567890
GGCTGCGGCT GCTGGGCCAA TGGCACCTAC CACGAGGCGG GCAGTGAG 1950 TTGGGCTG^.T GGCACCTGC CCC GTGGTG TCGCTGCGGG CCTGGGGGTG 2000 GCTCGCTGGT CTGCACACCT GCCGCTGTG GGCTGGGTGA AGTGTGTGGC 2050 CTCCTGCC^T CCGGCCAGCA CGGCTGCCAG CCCGICGCA C¾GCTGG G 2100 CCAGGCGTGG GGTG.CCCCC ATTACGTC¾C TCTGGATGGG CACCGATTCA 2150 ATTTCCAAGG CCCTGCGAG TACCTGCTGA GTGCACCCTG CCACGG¾XA 2200 CCCTTGGGGG CTGA.GAACT CAC GTCACT GIAGCC¾A.TG AGCACCGGGG 2250 CAGCCAGGC GTCAGCTACA CCCGCAGTGT CACCCTGC ATCTACAACC 2300 AC¾GCCTGAC ACTG¾GTGCC CGCTGGCCCC GG?AGC AC¾ GG GGACGGC 2350 C-TC-TTCGTC¾ CI TGCCCTT CCAGC GGAC TCGCTCCTGC ACGCAC¾XT 2400 G.GCGGCGCC G-CGTGGTGG TG¾C ¾C^.C CTC¾GGGCTC TCGCTGGC T 2450 TCGACGGGGA CAGCTTCGTG CGCCTGCGCG TGCCGGCGGC GTACGCGC-C-C 2500 TCTCTCTGTG GCTTATGCGG GACTACAC C¾GG.¾CCCCG CAGACGACC? 2550 GAAGGCGG G GGCGGGAAGC CCGCCGG.A.TC- GC¾GGTGGGC GGCGCCCA.GG 2600 GCTGCGGG3?, ATGTG GTCC AAGCCATGCC CGTCGCCGTG CACCCCAG?-G 2650 CAGCAGAC-T CCTTCGGCGG CCCGG^CGCC TGCGGCGTG?, TCTCCGCCAC 2700 CG^CGGCCCG CTGGCGCCCT GCQ.CGGCCT TGTGCCGCCC GCGCAGTACT 2750 TCCAGGGC G C TGCTGGAC GCCTGCC^AG T CAGGGCd TCCTGGA.GGC 2800 CTCTC-TCCTG CAGTGGCCAC CTACGTGG ^ GCCTGTCAGG CCGCTGGGGC , 2350 CC¾GCTCCQC GGCCGGACTT CTGTCCCTTC C¾GTGCCC G ' 2900
CCCACAGCCA CTACGAGCTC TGCGGTG..CT CCTGTCCTGG GA.GCTGCCCG 2950 AGCCTG CGG CACCCG^GGG CTGTGAG CG GCCTGCCGTG GGCTGTG 3000 C GCGTGCT GXTTCGTGC TCAG GGTG^ CACGTGIG A CCTGTGGGCC 3050 AG C-TGGC G CCTCCACG¾I G¾CCGCTAC ACCC^C GGG CCAGACC TC 3100 TACCCTGGCC CTGGG GTGA TTCCC TTGC CGCTGCCGGG AGGGCGGTGA 3150 GGTGTCCTCT G¾XCCTCC GC GCGGCCC GC¾TGAGA.CC TGCCGGCCA? 3200 ' CCGGTGGCAG CTTGGGCTGC GIGGCCG GG GCTCTACCA.C CTGCC¾GGCG 3250 TCGGG¾GATC CCCACTACAC CACCTTCGA.T GGCCGCCGCT TCGCTTCAT 3300 . GC-C-CaccTGC GrGLATGIGC TGGC CAGAC CTGCGGCACC CGGCCIGGCC 3350 ' TACA CGG T TGCCGTCCTG CAGG^G?ACG TGGCCTGGGG T^ATGGGCGA 3400 GT ¾GTC-TGA CC¾C-GGTG?-T CA.CGC-TCC.G GTGGC¾?ACT TC¾CCCTGCC- 3450 GCTGGAGCAG AGACAG GG^ AGGTCACGGT G^ACGG GTG GA.C¾TG.AGC 3500 TGCCCGTGGT GCTG CAC GGCCAGATCC GTGCCTCCCA GCATGGT CA 3550 GATG TGTG?- TTGAG.CCQ CTTCGGCCTG GGTGTGGCC ACGA.CCTTGT 3600 C-TACTATC-TG CGGG CACCG CCCTGG AA CTACTACCAG CTGATGTG G 3650 GCCTGIGTGG G 3661 【配列番号 6】 配列番号： 6 配列の長さ ： 7824 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類： c DN A 配歹! 1 ·
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
aaccacaap± ΓΓΤΓΓΓΑΩΤ: ATGGGTGCCC TATGGAGCTG GTGGATAC C 5D l fetGlyAlaL euTrpSerTr pTrpIleLeu
TGGGCTGG?.G CAACCCTCCT GTGGGGATTG ACCC¾GG?-GG CTTCAGIGG . 100 TrpAlaGlyA laThrLeuLe uTrpGlyLeu ThrGlnGluA laSerVaL s
CCTCSAGAAC ACTGGC¾GAG AGGP-ATTCCT CACAGCCTTC CTGCAGAACT 150 pLeuLysAsn ThrGlyArgG luGiuPheLe uThrAiaPhe LeuGlnAsnT
ATCAGCTGGC CTAC^G AG GCCTACCCCC GCCTCCTTAT CTCCAGTCTG 200 rGlnleuAl aTyrSerLys AiaTyrProA rgLe'jLeuIl eSerSerLeu
TCAGAGAGCC CCGCTTCAG CTCCATCCTC AGCCA.GGC .G AC CACCTC 250 SerGluSer?ご。 AiaSerVa ISerlleLeu SerC-lnAiaA spAsnThrSe
AAAGAAGGIC ACAGTGAGGC CCGGGGAGTC GGTCATGGTC ¾AC¾TCAGTG 300 rLysLysVal ThrValArg? rcGlvGluSe r aL^tVal AsnlleSerA
CO-AGGCTG¾ G¾TGATAGGC AG AGATCT TCCAGCATGC GGTGG GA.TC - 350 IsLysAlaC-l stlleGly SerLysIieP heGlnKisAl sVslVallle
C¾ TCTGACT ATGCCA.TCTC G GCAGGCA CT JGCCA AGCCTGACAC 400 HisSerAspT yrAlalleSe rValGInAla LeuAsnAlaL ysProAspTh
AGCGG -CTG AC .CTGCTGC GGCCCATCCA GGCCCTAGGC ACCGAGTATT 450 rAlaGIuLeu ThrLeuLeuA rg?r。Il C-l nAlaLeuGly ThrGluTyr?
TTG GCTC .C ACCCCCCGGC ACCTC¾GCC¾ GGAATGTCAA GGAGTHGCC 500 heValLeuTh rProProGly ThrSerAlaA rgAsnValLy sGluPheAla
C-TGGTGGCCG G GCCGC .GG TGCCTCGGTC AGTGICACGC TGAAGGGGTC 550 ValVaI?LLaG IvAlaAlaGl yAlaSerVal SerValThrL euLysGiySe
AGTGAG T C . ATC-GC AGT TCTATCC .GC AGGCG.¾TG C CTAAGAGTG?, 600 rValThrPhe AsnGlyLysP heTyrPro aC-ly?^pVaI LeuArgValT 95/27057
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CTCTACAGCC CTACAATGTG GCCCAGCTAC AGAGCTCAGT GGATCTCTCG 650 hrLeuGlnPr oTyrAsnVal AlaGlnLeuG InSerSerVa lAspLeuSer
GGGTCAAAGG TC¾C¾GCTAG TAGCCCCGTG GCTGTCCTCT CTGGCCACAG フ 00 GlySerLysV alThrAlaSe rSerProVal AlaValLeuS erGlyHisSe
CTGTGCGC¾G CCTGCAACC¾ TGTGGTTGAG CAGCTGCTAC 750 rCysAiaC-ln LysHisThr hrCysAs Hi sValValGlu GlnLeuLeu?
CCACG CTGC CTGGGGCACC C .CTATGTAG TACCC CGCT GGCCTCCCAA 800 ro hrSe^l aTrpGlv- hr HisTyrValV alProThrle a¾laSerC-ln
TCTCC-CT TG AT TGGCCTT CGTTGTGGCC AGCCAGGCCA CAAAGCTGAC 850 SerArgTyrA spLeuAlaPh eVaiVaLAla SerGlnAlaT hrLysLeuTh
CTACAACC T GGGGGTATC¾ CTGGCTCCCG TGGGCTCCAG GCAGGTGATG 900 rTyr^nHis Gl C-lylleT hrGlySerAr gC-lyLeuGIn AlsGlyAspV
TGGTAQ GTT TGA.GGTCCGG CC¾TCCTGGC CACTCTACCT GTCTGC AT 950 alValGluPh eGluValArg ProSer rp? roLeuTVrLe uSer aA5n
GTGSGC¾TCC AGGTCCTGTT GTTTGGCA.CA GGTGCCATAA GG ATG^AG 1000 ValGlylleG InValLeuLe uPheGlyThr GlyAlalleA rgAsnGluVa
GA.CTTATGAC CCCTACCTGG TCCTGATCCC ¾3A.TGTQXG GCCTACTGCC 1050 IThr yrAsp ProTyrLeuV alleuIlePr oAspVaL¾la AlaTyrCys?
CAGCCTATG GG C AGAG GTACCAGGCT GTG .GGGCG GGCCCTGGTA 1100 roAla yrva lValLysSer ValProGlyC ysGluGlyVa LMaLeuVal
GTGGCACAG . CG AGGC AT CAGCGGGCTG ACCATAGATG GGC^TGCAGT 1150 VaL¾iaGInT hrLysAlall eSerGlyLeu Thrlle scG ' IvHisAlaVa
Q -GGGCC^AG CTC¾CCTGGG AGGCTGTGCC ¾GC- ¾GTGA.G TTCTCC-TATG 1200 lGlyAiaLys LeuThr rpG lu aValPr cGlySerGlu PheSerTyrA
ー フ 2 — 95/27057
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CTGAAGTGGA GCTCGGCACA GCTGACATGA TCCACACGGC CGAGGCCACC 1250 laGluValGl uLeuGlyThr AlaAsp^tetl leHisThrAl aGluAlaThr
ACC^ACTTGG GACTGCTCAC CTTCGGGCTG GCCAAGGCTA TAGGCTACGC 1300 ThrAsnLeuG lyLeuLeuTh rPheGlvLeu AlaLysAlal leC-lvTyrAl
AAC .GCTGCT G¾TTGCGGCC GG. .CTGTACT GTCCCC .G G GA.GCCCTCCT 1350 aThrAlaAla .^pCysC-lyA rgThrValLe uSerProVal GluProSerC
GCGAAGGCAT GCAC-TGCGCA GCCGGGC^GC C-C GCC¾GG GGTAGGCGGG 1400 ysGluGlyi fe tGInCysAla AlaC-lyGlrA rcCysGlnVa IValGl -C-ly
AAGGCCGGGT GTGTGGCGGA GTCCACCGCT GTCTGCCGCG CCCAGGGCGA 1450 LysMaGlyC ysVa!AlsGl uSerT rAla ValCysArgA laGlnGlyAs
CCCCCATTAC ACCACCT CG ACGGCCGTCG CTACG .CA.TG ATGGGC CCT 1500 pProHisTyr T rThrPheA s GIy^ g^ g y Asp!^t i^fetGlyTh C
GTTCGTAC .C GA.TGGTGGAG CTGTG A.GCG AGGACG¾C¾C CCTGCCCGCC 1550 ysSerTyrTh ri^tValGlu LeuCysSerG luAspAspTh rLeuProAla
TTC¾GCGTGG AGGCO^AG A CG .GCACCGG GGCAGCCGCC GCGTCTCCIA 1600 PheSerValG luAlaLysAs nGluHisArg GlySerArgA rgVaiSerTy
CGTGGGCCTC G A.CTG GC GCGCCTAC¾G CCACTCTGTG TCGCTG¾CCC 1650 rValGlvLeu ValThrValA rgAiaTyrSe rKisSerVal SerLeuThrA
GCGG GAAGT TGGCTTCGTC CTGGTTGACA AC .GCGCTC GCGCCTGCCA 1700. rgGlvGluVa IGlyPheVal LeuVaL¾spA snGlnArgSe rArgLeuPro
G CTCCCTGA GTG^GGGTCG CCTGCGTGTG TACC^GAGCG GACCACGGGC -1750 ValSerLeuS erGluGlvAr gLeuArgVal TyrGlnSerG IvProArgAl
CG GC-TGGAG CTGGICTTTG GGCTGGTGGT C .CTTATG¾C TGGGACTGCC 1800 aVa!ValGlu LeuValPheC- lyLeuValVa IThr yrAs? TrpAspCysG O 95/27057
10 20 30 40 50
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AGCTGGCACT CAGCCTGCCT GCACGCTTCC MGACCAGGT GTGCGGGCTG 1850 InLeuAlaLe uSerLeuPro AlaArgPheG InAspGlnVa lCysGlyLeu .
TG GGC¾ACT AT.AATGGTGA CCCAGCAG .C GACTTCCTCA CGCCTGACGG 1900 CysGlyAsnT yrAsnGlyAs pProAlaAsp AspPheLeuT hrProAspGl
GGCTCTGGCT CCTGA.CGCTG TGGAGTTCGC GTAGCTGG AAGCTGGATG 1950 vAiaLeuAia ？ roAspAlaV alGI PheAl aSerSerTrp LysLeuAspA
ATGGG3¾CTA CCTGTG G¾G G^.TGGCTGCC AGAAC^ACTG TCCCGCCTGC 2000 spGiy.AspTy rleuCysC-lu AspGiyCysG InAs snCy s?ro?l=Cys
ACCCC¾3GCC AGGCCCAACA CTATGAGGGC G¾CCG¾ TCT GTGGCATGCT 2050 ThrProGIyG InAiaGlnKi sTyrC-luGly AspArgLeuC ysGlyi fetLe
GA.CC AGCTC G TGGCCCCT TCGCTGTCTG CCATGACACC CTGGACCCCA 2100 uThrLysLeu AspGlyProP heAlaValCy sHisAspThr LeuAspProA
GGCCCTTCCT GG GCAGIGT GTATATG¾CC TGTGrGTGGT CGGTGGGGA.G 2150 rgProPheLe uGluGlnCys ValTyrAspL euCysValVa IGlyGlyC-lu
CGGCTCAGCC TGTGCCGTGG CCTCAGCGCC TATGCCC GG CC GTCTGG¾ 2200 ： gLeuSerL euCysArgC-1 yLeuSerAla TyrAlaGlnA laCysLeuGi
GCTTGGC .TC TCGGTTGGGG ACTGGAGATC ¾X¾ CAAC TGCCCCCTGT 2250 u!euGlyllミ SerValGlyA spTrpArgSe rProAiaAsn CysProLeuS ·
CCTGCCCTGC CAACAGCCGC TATGA.GCTCT GCGGCCCTGC TTGCCCGA.CC 2300 erCysProAl aAsnSe Arg TyrGiuLeuC ysGlyProAi aCysProThr
TCCTGC^ACG GGGCTGCGGC GCCGTCC AC TGCTCCGGGC GCCCCTGCGT 2350 SerOysAs G lyAiaAiaAl aProSerAsn CysSerGlyA rgPrcCysVa
GGA.G GCTGC GTGTGCCTCC CAGGCTTCGT GGCCA.GCGGC GGCGCCTGCG 2400 IGluGlv-Cys ValCysLeuP roGlyPheVa !AlaSerGlv GlyAiaCysV フ4 一 95/27057
10 20 30 40 50
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TGCCGGCCTC GTCGTCTGGC TGCACCTTCC AGGGTCTCCA GCTCGCTCCG 2450 alProAlaSe rSerCysGly CysThrPheG InC-lyLeuGl nLeuAlaPro
GGCCAGGAAG TGTGGGCGGA CGAGTTGTGC CA i¾3GCGC Q ACCTGCAA 2500 GlyGlnGluV alTrpAlaAs pGluLeuCys GlnArgArgC ysThrCysAs
CGGCGCCACC C¾TC¾GGTC¾ CCTGCCGCG^. CAAGCAGAGC TGCCCGGCGG 2550 nGIyAlaThr KisGInValT hrCysArgAs pLysGlnSer CysProAiaG
G G¾GCGCTG C^GCG CCAG MCGGCCTCC TGX-CTGCTA CCCCG^.TCGC 2600 ly-GluArgCy sSerValGin AsnGlyLeuL e Glv-CysTy rProAspArg TCGGGACCT GCC .GGGGTC CGGGGACCC¾ G ATGTGA GCTTCGACGG 2550 ？ heGlyThrC ysGinGlySe rGlyAspPro HisTyrValS er?he¾s Gl
CCGGCGCTTC GACTTCATGG GCACC GCAC GTACCTGCTG GTCGGCTC^T 2700 yArcArgPhe AspPhe^ietG lyThrCysTh rTyrl uIeu ValGlvSerC
GCGGCCAGAA CGCAGCGCTG CCTGCCTTCC GGC-TGCTGGT GGAAAACGAG 2750 vsGlyGlnAs nAlaAlaLeu ProAla?ha¾ rgValLeuVa IGluAsnGiu
CATCGGGGCA GCCA.GACIGT GAGCTACACG CGCGGCGIGC GC-GTGG¾GGC 2800 EisArgGlyS erGlnThrVa lSerTyrThr ArgAiaVaL¾ rgValGi ^l
CCGCGGGGTG AAGGTGGCCG TGCGCCGGG^. GTACCCCGGG C AC-TGCTGG 2850 cArgGlyVal LysValAiaV slArgArgGl uTyrPrcGly GinvaiLeuV
TGGATG¾CGT CCTICA.GTAT CTGCCCTTCC A¾GC¾GCAGA TGGGCAGGTG 2900 al-^As Va ILeuGInTyr LeuProPheG laAlaAlaAs pGlyGlnVal
CAGGTGTTCC GACAGGGCAC- GG¾.TGCCG C GTGCGC^CGG ACTTTGGCCT 2S50 GInValPheA rgGlnGlyAr gAspAlaval VaL rgT rA spPheGlyLe
GACTG CACT T.¾T ¾CTGG¾ ATGCACG G G¾nGCC?AG G GCCCAGCA 3000 uThrValThr TyrAroTrpA snAlaArgVa IrnrAlaLys ValProSerS 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 123456フ 890
GCTATGCTGA GGCCCTGTGT GGACTCTG G GGAA TTCAA CGGGGACCCA 3050 erTyrAlaGl uAlaLeuCys GlyLeuCysG lyAsnPheAs nGIyAspPro
GCTGATGACC TGGCTCTC-CG GGG GGGGGT C AGCTGCCA ATGCACTGGC 3100 AlaAspAspL euAlaleuAr gGlyC-lyGly GlnAlaAlaA snAlaLeuAl
CTTTGGGAAC AGCTGG AG AAG¾3\CG G GCCCGGCTGI GG¾3CAACTC- 3150 aPheGly.^n SerTrpGlnG luGl ThrAr gProGlyCys GlyAiaThrG
AACCGG -TGA CTGTCCCAAG CTGG. .CTCCC TC-G GGCCCA GCAGCTGCAG 3200 luPrcGlyAs pCysProLys LeuAspSerL euVaL¾laGl r.GlnLeuGin
AGCAAGAATG AGTG GGAAT CCTIGCCGA.C CCC^AGGGGC CC TCCGGGA 3250 SerLysAsnG luCysGlyll eLeuAiaAsp ProLysGIy? roPhe^ cGi
GTGCCATAGC GCTGG^CC CCCA.GGGTGC CGTGCGCGAC TGTGTCTATG 3300 uCysHisSer LysLeuAsp? roGlnGly l aV ！ArgAsp CysValTyrA
ACCGCTGCCT GCTGCCAGX CAGTC GGGC G CTGIGTG?. CGCACTGGCC 3350 spA gCysLe uLeuProGly GlnSerGly? roLeuCysAs pAiaLeuAia .
ACCIATGCTG CTGC¾TGCCA GGCTGCTGGA GCCAC GIGC ACCCCTGGA.G . 3400 Thr - rAlaA laAlaCysGl nAlaAlaGlv AlaThrVaiH IsProTrpAr
GA.GTGAAG A CTTTGCCCAC TG GCTGCCC ACCCCACAGC CACTATGAGG 3450 gSerGluGIu LeuCysProL euSミ rCysPr oProHisSer HisTyrGIiA
CGTGTTCCTA CGGCTGCCCG CTGTCCTGTG GAGA.CCTCCC AGTCCCCGGG 3500 laCysSerTy rGlyCysPro LeuSerCysG IvAspLeuPr oValProGly
C-GCTGTGGCT CAGAA GCCA TG?£-GGCTGC GTGTGCGA.TG AGQGCTTTGC 3550 GlyCysGlyS erGluCysHi sGIuGlvO/s ValCysAspG luGlyPheJ .
GCTC .GTGG G^GTCCTGCC TGCCCCTGGC CICCTG GGC TGCGTAC .CC 3600 LeuSerGly GluSerCysL euProLe l aSerCvsGlv CvsValHisG 95/27057
10 20 30 40 50
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AGGGCACCTA CCACCCACCA GGCCAGACCT TCTACCCTGG CCCCGGATGT 3650 InGlyThrTy rHisProPro GlyGlnThrP heTyrProGl yProGlyCys
GATTCCCTTT GCCACTGCCA GGAGGGCGGC CTGGTGTCCT GTGAGTCCTC 3700 AspSerLeuC ysHisCysGl nGluGlvGly LeuValSerC ysGluSerSe
CAGC GCGGA CCGCACGAGG CCTGCCAGCC ATCCGGTGGC AGCTTGC-GCT 3750 rSerCysGly ProHisGluA laCysGlnPr oSerGlyGly SerLeuGlyC
GTGTGXCGT GGGCTCTAGC ACCTGCCaC-G CGICAGGd CCCCCP TAC 3800 ysVaL^iaVa IC-lySerSer ThrCysGlnA laSerGlyAs pProHisTyr
ACCACCTTCG ATGGCCGCCG CT CG¾CTTC ATGGGC¾CCT GCGTGTATGT 3850 T r hrPheA spGlyArgAr gPheAspPhe ! fetGlv-ThrC ysValTyrVa
GCTGGCTCAG ACCIGCGGCA CCCGGCCTGG CCTGCA.TCGG TTTGCCGICC 3900 lLeu^laGln Tb.rCysGi T hrArgProGl vLeuHisArg Ph AlaValL
TGCAGG¾¾A CGTGGCCTGG GG TGGGC G^GKAGTGT GACCAGGGIG 3950 euGlnGIuAs nValAlaTrp GlyAsnGlyA rgValSerVa IThrArgVal
ATCACGGTCC AGGIGGCAAA CTTCACCCTG tGGCTGGAGC GACSG G 4000 IleThrValG InValAlaAs nPheThrLeu ArgLeuGIuG. InArgGlnTr
GAAGG CACG GIGAACGGTG TGGA.O TG¾A GCTGCCCGTG GTGCTGGCCA 4050 pLysValThr ValAsnGlyV aiAspMetLy sLeuProVal ValLeuAlaA
ACGGCC .G .T CCGTGCCTCC CA.GCATGGIT CAGA.TGTTGT G¾TTGAG .CC 4100 snGlyGlnll eArgAlaSer GlnHisGlyS erAspValVa lIleGluThr
GA.CTTCGGCC TGCGTGTGGC CTACGACCTT GTGTACTATG TGCC-C-GTC .C 4150 AspPheGlyL euArgValAi aTyrAspLeu ValTvrTyrV ai gValTh
CGTCCCCGGA .AACTACTACC AGC¾G?.TGTG TGC-CCTGTGT GGGAACTAC^ 4200 rValProGly ^nTyr yr InGInMetCy sGlyLeuCys GiyAsnTyrA 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
ACGGCGACCC CAAGGA GAC TTCCAGAAGC CCAATGGCTC ACAGGCAGGC 4250 snGlyAspPr oLysAspAsp PheGlnLys? roAsnGlySe rGlnAlaGly
AACGCCAATG AGTTCGG AA CTCCTGGGAG G¾GGTGGTGC CCG?.CTCTCC 4300 AsnAlaAsnG luPheGlyAs nSerTrpGlu GluValValP roAspSerPr
CTGCCTGCCG CCCACCCCTT GCCCGCCGGG G GCGAGG^C TGTATCCCC^. 4350 oCysLeuPro ProThrPrcC ysProProGl ySer la^ CysIleProS
GCC¾1 GTG TCCTCCCGAG CTGGAGA .GA AGTATCAGPA GGA.GGA.GTTC 4400 erKisL sO sProPrcGlu LeuGluL sL vsTyrGlnLy sGIuGluP e
TGTGC-GCTCC CTCCAGCCC C CAGGGCCA CTGTCCTCCT GCCA.C A.GCT 4450 CysGlyLeuL euSerSerPr oThrGlyPro LeuSerSe^ ysHisLysLe
GGTGGATCCC CAGGG CCCT TGAAAG .TTG CATCTTTG T CTCTGCCTGG 4500 uValAspPro GlnGlyProL euLysAspC slle?he¾sp LeuCysLeuG
G GGTGGGAA CCTQ GC¾TT C CTGCAGCA ACATCCATGC CTACGTQ-C-T 4550 lyGi -Giy.^ nleuSerlle LeuCysSerA snlleHisAl aTyrValSer
GCTTGCCAGG CGGCTGGA.GG CC¾CGTGG¾G CCCTGGAGGA CTGAAACTT 4600 AlaCysGlnA IaAlaGlyC-1 yHisValGlu ProTrpArgT hrGluThrPh
CTG CCCATG GA.G GCCCTC CGAACAC-?CA CTACGA.GCTC TGTGCGGACA 4650 eCysProifet GluCysProP roAsnSerHi sTyrGluLeu CysAlaAspT
CCTGCTCCCT GQGCTC-CTCA GCTCTCAGTG CCCCTCCACA GTGCCA Q T 4700 hrCysSerLe uGlyCysSer AiaLeuSerA laProPrcGl nCysGlnfts
C-GGTGTGCTC- AGGGCTGCC¾ GTGTG¾CTCC GGCTTCCTCT AG-ATGGCC^ 4750 GlyCysAiaG luGiyCysGl nCysAspSer C-lyP eLeuT vrAsnGlyC-1
AGCCTGCGTG CCCATCCAGC . ATGCGGCTG CTACCACAAT GGTGTCTACT 4800 nAlaCysVai ProIleGlnG InCysGlvCv sTyrHisAsn GlyValTyr O 95/27057
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 123 567RQ0 1234567890 1234567890
ATGAGCCGGA GCAGACAGTC CTCATTGACA ACTG CGGCA. GCAGTGCACG 4850 yrGluProGl uGlnThrVal LeuIleAspA snCysArgGl nGlnCysThr
TGCCATGCGG GT通 GGCAT GGTGTGCCAG GAACAC¾GCT GCAAGCCGGG 4900 CysHisAlaG IvLysGl Me tValCysGIn GluHisSerC ysLysPrcGl
GCAGGTGTGC C .GCCCTCCG GAGGC\TCCT GAGCTGCGTC ACCAAAQ C 4950 yGlnValCys GlnProSerG lyGlylleLe uSerCysVal ThrLysAsp?
CC-TGCC^CGG CG GACATGC CGGCCACAGG AGACATC A C-G¾GC¾GGGT 5000 roCysHisGl yValThrCys ArgProGlnG luThrCysLy sGluGinGly
GGCCAGGGCG TGTGCCTGCC C AC ATGA.G GCCACG GCT G TGTGGGG 5050 Glv-GlnGlyV alCysLeuPr oAsnTyrGlu AlaT rCysT rpLeuTrpGl
CGACCCACAC TACCACTCCT TCG. .TGGCCG G AGTTTG^C TTCCAGGGCA 5100 yAspProHis TyrHisSerP heAspGlyAr gLysPheAsp PheGlnGi r
CCTGTAACTA GIGCTGGCA AC ACTGGCT GCCCGGGGGT CAGCACCCAG 5150 hrCysAsnTy ryalLeuPda ThrThrGlyC ysPrcGIyVa ISerThrGln
GGCCTQ .C CCTTCACCG CACCACC AG CCAGAACC GGGGCAACCC 5200 GlyLeuThr? roPheT rVa IThrThrLys AsnGlnAsnA rgGlyAsnPr
TGCTGTGTCC TACGTG.A.GAG TCGTCACCG GGCTGCCCTC GGC¾CC AC¾ 5250 oュ aValSer TyrValArgV alValThrVa lAlaAlaLeu GlyThr¾snI
TCTCQi-TCCA CAAGGACGAG ATCGGCAAAG TCCGGGTG A CGGTGTGCTC 5300 '- leSerlleP-i sLysAspGlu IleGlyLysV aL¾rgVaL¾s nGlyValLeu
AC .GCCTTGC CTGTCTCTGT GGCCGACGGG CGGMTTC G TGACCCAGGG 5350 ThrAlaLeuP roValSerVa LAlaAspGly ArglleSerV alThrGlnGl
TGC TCGAAG G ACTGCTGG TGGCTG.A.CTT TGGACTGC GTCAGCTATG 5400 y?J.aSerLys AiaLeuLeuV a!AlaAspPh eC-lyL&jGIn VaiSerTyrA 95/27057
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
ACTGGAACTG GCGGGTAGAC G GACGCTGC CCAGCAGCTA TCATGGCGCA 5450 SpTrpAsnTr pArgValAsp ValThrLeuP roSerSerTy rHisGlyAla
GTGTGCGGGC TCTGCGGTM CATGGACCGC AACCCCAACA ATG.¾CC?£-GT 5500 ValCysGlyL euCysGlyAs nl fe AspArg AsnProAsnA snAspGlnVa
CTTCCCT T GGCA.CA.CTGG CTCCCTCCAT ACCCATCTGG GC-CGGCAGCT 5550 l?he?roAsn Glv hrLeuA laProSerll eProIleTr? GlyC-lySerT
GGCGA.GCCCC AQXTGGGAC CCACTGTGTT GGG?-CG¾ATG TCGGGGGTCC 5600 rpArgAiaPr cC-ly rpAs? ProLeuCysT rpAspGluCy sArgGlySer
TGCCC ACGT GCCCTG GGA CCGG TGGP-G G-G ACG^GG GCCCTGGCTT 5650 CysProThrC ysPrcGluAs pArgLeuGlu GlnTyrGluG ly?rcGly?
CTGCGGA.CCC CTGGCCCCCG GCAC^GGGGG CCCTTTCACC ACCTGCCATG 5700 eCysGIyPro LeuAi ProG l ThrGl Gl yProPheThr ThrCysKisA
C CATG GCC ACC G^-GAGC TTCITOAGG GCTGTGTTCT GG .CGTCTGC 5750 LaHisValPr oPrcGluSer PhePheLvsG IvCvsValLe uAspValCys
ATGGGTGGTG GGGACCGTGA CAT CTTTGC . AGGCrCTGC- CTTCCTATGT 5800 -^ Gl -Gl G IvAspArgAs pIleLeuCys LysAlaLeuA laiSerTyrVa
GGCCGCCTGC CAGGCTGCTG GGGTTGTC¾T CG¾¾3ACTGG CGGC-C¾ ¾GG 5850 L¾laAiaCys GlnAlaAiaG lyValValli eGluAspTrp ArgAiaGlnV
TTGGCTGTGA GATCACCTGC CCAGAAAACA GCCACTATG¾ GG CTGTGGC 5S00 alGlyCysGl uIleT rCys ProGluAsnS erHisTyrGi uValCysGly
CCACCCTGCC CGGCCAC TG TCCGTCCCCT GCACCCCT A CGACGCCAGC 5S50 ？ roProCys? rcAlaSerCy sProSerPro Al≥?roLeuT hrTnrProAl
CG ATGTGA.G GGCCCCTGTG TGGAGGGCTG CC^GTOCGAC GCQGGTTTCG 6000 aVaiCysGlu C-lvPrcCvsV alGluC-lvCv sGlnCvsAso AiaGlyPheV 10 20 30 40 50
123456789Q 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
TGTTAAGTGC TGACCGCTG GTTCCCCTCA ACAACGGCTG CGGCTGCTGG 6050 alLeuSerAl aAspArgCys ValProLeuA snAsnGlyCy sGlyCysTrp
GCCAATGGCA CCTACCACGA GGCGGGCAGT G^GTTITGGG CTGATGGCAC 6100 AiaAsnGlyT hrTyrHisGl uAlaGlySer GluPheTrpA laAspGly h
CTGCTCCC^G TGGTGTCGCT GC GGCC GC- GGGTGGCTCG CTGGTCTQC^ 6150 rCysSerGln TrpCysArgC - ysGlyProGl yGlyGlySer LeuVaiCysT
CACCTGCCAG CTGTGGGCTG GGTG AGTGT GTGGCCTCCT GCC^TCCGGC 6200 hrProAlaSe rCysGlvLeu GlyC-luValC ysGlvLeuLe uProSerGly
CAGCACGGCT GCCAGCCCGT CAGCACAGCI GAGTGCCAGG CGTGQGGTGA 6250 GlnHisGlyC ysGlnProVa !SerT rAla GluCvsGlnA laTi GlvAs
CCCCCATTAC GTCACTCTGG AIGGGCACCG ATTCAATTTC C¾¾3GCACCT 6300 pProHisTyr ValThrLeuA scGlyKis^ gPheAsnPhe C-lnC-lyThrC
GCG .GTACCT GCTGAG GCA CCCTGCC^CG GACCACCCT GGGGGCTGAG 6350 ysGluTyrLe uLeuSerAla ProCysKisG IvProProLe uGlyidaGlu
AACTTC¾CTG TCACTG AGC C ATGA.GCAC CGGGGC .GCC AGGCTGTC .G 6400 AsnPheThrV alThrVaOAl aAsnGluHis . rgC-lySerG InAlaValSe
CTACACCCGC AGTGTCACCC TGC^ATCTA CAACCACAGC CTGACACIGA 6450 rTyrThrArg SerValThrL euGlnlleTy rAsnHisSer LeuThrLeuS
GTGCCCGCTG GCCCCGGAAG CTAC^GGTGG ACGGCGTGTT CGTCACTCTG 6500 erM.cArg r pProArgLys LeuGlnValA spGlyValPh eValThrLeu
CCCT CCAGC TGGAC CGCT CCTGCACGC CACCTG¾XG GCGCCG.¾CGT 6550 ？ roPheGlnL euAspSerLe uLeuHisAla HisLeuSerG ly=da.^ Va
C-GTGGTGACC ACAACCTCAG GGCTCICC-CT GGO TCGAC GGGGACAGCT 6600 IValValThr ThrThrSerG lyLeuSerLe uAlaPheJ so GlyAspSer? 95/27057
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
TCGTGCGCCT GCGCGTGCCG GCGGCGTACG CGGGCTCTCT CTGTGGCTTA '6650 heValArgLe uArgValPro AlaAlaTyrA laGlySerLe uCysGlyLeu
TGCGGGAACT AC^ACCAGGA CCCCGCAGAC GACCTGAAGG CGGTGGGCGG 6700 CysGlyAsnT yrAsnGlnAs pProAlaAsp AspLeuLysA laValGlyGi
GAAGCCCGCC GGATGGCAGG TGGGCGGCGC CCAGGGCTGC GGGGAATGTG 6750 vLysProAla GlyTrpGlnV alGlyGivAl aC-lnGlyCys GlyGluCysV
TGTCC^AGCC ATGCCCGTCG CCGTGCACCC CAG GCAGCA AG. .GTCCTTC 6800 alSerLysPr cCysProSer？ roCysT r? rcGluGlnGl nGiuSerPne
GC-CGGCCCGG ACGCCTGCGG CGTG^TCTCC GCCACCQ G GCCCGCTGGC 6350 C-lyGlyProA spAlaCysGl yVallleSer AlsThrAscG lyProLeuAl
GCCCTGCCAC GGCCTTGTGC CGCCCGCGCA G ACTTCCAG GGCTGCTTGC 6900 aPrcCysKis GlyLeuVal? roProAlaC-l r.TyrPheGln GlvCysLeuL
TGGACGCCTC- CCAAG TCAG GGCC^TCCTG GA.GGCCTCTG TCCTGCA.GTG 6950 euAspAlaCy sGinValGln GlyHisProG lyGlyLeuCy sProAlaVal
GCG CTACG IC-GCAGCCTG TC .GGCCGCT GGGGeCC GC TCCGCG GIC- - 7000 AiaThrTyrV alAlaAlaCy sGInAlaAia GlyAlaGinL euArgGluTr
GA.GGCGGCCG G¾CTTCIGTC CCT CCAG G CCCTGCCCAC AGCC TACG 7050 pArgArgPro AspPheCysP roPheGinCy sProAlaHis SerHisTyrG
AGCTCTGCGG TG. .CTCCTG CCTGGGAGCT GCCCGA.GCCT GTCGGCACCC 7100 luLeuCvsGl yAspSerCys ProGlySerC ysProSerLe uSerAlaPro
G .QC-GCTGTG AGTCGGCCTC- CCGTG AGGC TGTGiCTGCG ATGCTGGCTT 7150 GluGlyCysG LuSerAlaCy sArgGluGly CysValCysA spAlaGlyP
CG GCTCAGT GGTGA.CACGT GTGIACCTG GGC-CC .G GT GGCTGCCTCC 7200 eValLeuSer GlyAspThrC ysValProVa IGlyGln.Cys GlyCysLeuH O 95/27057
10 20 30 40 50
1234567R90 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
ACGATGACCG CTACTACCCA CTCGGCCAGA CCTTCTACCC TGGCCCTGGG 7250 isAspAspAr gTyrTyrPro LeuGlyGlnT hrPheTyrPr oGlyProGly
TGTGATTCCC TTTGCCGCTG CCGGGAGGGC GGTGAGGTG CCTGTGAGCC 7300 CysAspSerL euCysArgCy sArgGluGly GiyGluValS erCysGiuPr
CTCC .GCTGC GGCCCGCATG AGACCTGCCG GCCATCCGGT GG ^GCTTC-G 7350 oSerSerCys GlyProHisG luThrCysAr cProSerGly GlySerLeuG
GCTGCGTGC-C CGTGGGCTCT ACCACCTGCC AGGCGTCGGG AG^TCCCCAC 7400 l CysVaiAl aValGlySer Thr hrCysG InAlaSerC-l yAspProHis
TAC¾CC¾CCT TCGATGGCCG CCGCTTCGAC TTCATGGGCA CCTGCGTGTA 7450 TyrThrThr? heAspGlvAr gArgPheAsp Phe^tetGlyT hrCysValTy
TGTGCTGGCT CAGACCTGCG GCACCCGGCC TGGCCTAC .T CGGTTTGCCG 7500 rValLeuAis GlnThrCysG lyThrArgPr oGIyLeuKis ArgPh AlaV
TCCTG A.GG¾ GAACGTGGCC TGGGGT ATG GGCGAGICAG TG GACC GG 7550 alLeuGlnGl uAsnVaL^la TrcGlyAsnG lyArgValSe rVa!ThrArg
- G GATCACGG TCCAGG GGC AAACT CACC CTGCGGCTGG AGCAGAGAC¾ 7600 VallleThrV aIGlnVaL¾l aAsnPheThr Le ArgLeuG luGlnArgGl
GTGG^AGGTC ACGGTGAACG G G GGACAT G¾AGCTGCCC GTGGTGCTGG 7650 nTrpLysV l ThrVaiAsnG lyVs!AsptXfe tLysLeuPro ValValLeuA
CCAACGGCC¾ GA.TCCGTGCC TCCCAGCATG GTTC GATGT TG GATTG^G "7700 laAsnGlyGl nlla^rgAla SerGlnHisG lySerAspVa IVallleC-lu
ACCG.ACTTCG GCCTGCGTGT GGCCTACG¾C CT GrGTACT ATGTGCGGGI 7750 ThrAspPheG IvLeuArgVa LAla yrAsp LeuValTyrT yrVa!ArgVa
C .CCGTCCCT GGAAACTACT ACCAGCTG T GTGTGGCCTG TGTGGC-ggat 7800 IThrValPro GlyAsnTyr yrGInLeuPfe tCysC-lyLeu CysGlyGiyS s200/s6aATGdL
Figure imgf000086_0001
【配列番号 7】 配列番号： 7
配列の長さ ： 16382 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類： c DNA 配列
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
CTGCAGCCAT GGGTGCCCTA TGGAGCTGGT GGATACTCTG GGCTGGAGCA 50
Me tGlvAlaLeu TrpSerTrpT rpIleLeuTr pAlaGlyAla
ACCCTCCTGT GGGGATTGAC CCAGGAGGC TC .GIGGACC TC AGAAC¾C 100 ThrLeuLeuT rpGlyLeuTh rGlnGluAla SerVaL spL euL sAsnTh
TGGC¾G .G .G G ATTCCTCA CAGCCTTCCT GCAGAACTAT CAGCTGGCCT 150 rGlvArgGlu GluPheLeuT hrAlaPheLe uGlnAsnTyr GlnLeuAlaT
ACAGCAAGGC CTACCCCCGC CTCCTTATCT CCAC-TCTC-TC AGA.GA.GCCCC 200 yrSerLysAl aTyrProArg LeuLeuIleS erSerLeuSe rGiuSerPro
GCTTCAGTCT CCATCCTCAG CCAGGCAG¾C AACACCTCAA AGAAGGTCAC 250 laSerValS erllel^uSe rGlnAlcAsp AsnThrSerL ysLysValTh
AGTG?.GGCCC GGGG .C-TCGG TCATGGTC A CATCAGTGCC AAGGCTGAG?, 300 rValArgPro GlyC-iuSerV al!XfetValAs nlleSerAla LysAlaGluiM
TG¾TAGGC¾G CAAGATCTTC dAGC TGCGG TGGTG¾TCC¾ TTCTG .CTAT 350 etlieGlySe rLysIlePhe GlnHisAiaV alVslIleHi sSerAspTyr
GCC¾TCTCTG TGCAGGCACT AAATGCCAAG CCIGAO .G CGG^.GCTGAC 400 AlalleSerV alGlnAlaLe uAsnAlaLys ？ roAspThrA laGiuLeuTh
ACTGCTGCGG CCCATCCAGG CCCTAGGCAC CGAGTATTTT G GCTC CAC 450 rLeuLeuArg ProIleGlnA laLeuGlyTh rGluTyrPhe ValLeuThr?
CCCCCGGCAC CTCAGCCAGG AATGTC AGG AGTTTGCCGT GGTC-GCCGGT 500 rcProGIvTn rSer?J.£Arg AsnValLysG luPheAlaVa IVaL laGly
GCCGCAGGTG CCTCGGTCAG TGTCACGCTG AAGGGGTCAG TGACATTCAA 550 MaAlaGlyA laSerValSe rValThrLeu LysGlySerV alThrPheAs
TGGCAAGTTC TATCCAGCAG GCGATGTCCT AAGAC-TGACT CTACAGCCCT 600 nGlvLysPhe TyrProAlaG IvAspValLe uArgValThr LeuGlnProT 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1.234567890
ACAATGTGGC CCAGCTACAG AGCTCAGTGG ATCTCTCGGG GTCAAAGGTC 650 yrAsnVa!Al aGlnLeuGln SerSerValA spLeuSerGl ySerLysVal
AC¾GCTAGTA GCCCCGTGGC TGTCCTCTCT GGCCACAGCT GTGCGCAG A フ 00 ThrAlaSerS er?roVaL¾l aValLeuSer GlyHisSerC vsAlaGlnLy
AC^TACGACC TGCAACCATG TGC-TTGAGCA GCTGCTACCC ACGTCTGCCT 750 sHisThrThr CvsAsnHisV alValGIuGl nLeuLeuPro ThrSen¾laT
GGGGCACCCA CTATGTAGTA CCCACGCTGG CCTCCC ATC TCGCTATG¾T 800 rpGlvThrHi sTyrValVal ProThrLeuA laSerGinSe rArg y Asp
TTGGCCTTCG TTGTGGCCAG CCAGGCCACA AAGC GACCT ACAAC A.TGG 850 L ij laPheV alValAlaSe rGlnAlaThr LysLeuThrT yrAsnHisGl
GGGTAT .CT GGCTCCCGTG GGCTCCAGGC AGGTG^TGTG G AGAGTTTG 900 yGlylleThr GlySerArgG lyLeuGlnAl aC-lyAspVal ValGluPheG
AGGTCCGGCC ATCCTCGCCA CTCTACCTC-T CTGCAAATG GGGCATCCAG 950 IuValArgPr oSerTrpPro LeuTyrLeuS erAlcAsnVa IGlylleGin
GTCCTGTTGT TTGGCACAGG TGCC¾T. AGG AATGAAGTG¾ CTTATGACCC 1000 ValLeuLsu? heGiyThrGl yAlalleArg AsnGluValT hrTyrAspPr
CTACCTGGTC CTGA.TCCCAG ATGTGGCGGC CTACTGCCCA GCCTATGIGG 1050 oTyrLeuVal LeuIleProA spVaL¾laAl aTyrCysPro AlaTyrVslV
TCAAGAGTG ACCAGGCTGT G.¾GGGCGIGG CCCTGGTAGT GGC¾C¾Q CG 1100 aiLysSerVa lProGlyCys GluGlyValA laLeuValVa LAlaGlnThr
？ ·ΑοαατΑτα¾ GCGGGCTGA.C CA.TAGA.TGGG CATGCAGTGG GGGCC AGCT 1150
LysAlalleS erGlyLeuTh rlleAs Gly HisAlaValG lyAlaLysLe
CACCTGGG^G GCTGTGCCAG GCAGTGAGTT CTCGTATGCT GPAGTGGAGC 1200 uThrTrpGlu AlaValProG lySerGluPh eSerTyrAla GluValGluL 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890.
TCGGCACAGC TQ .TGATC CACACGGCCG AGGCCACCAC CAACTTGGG¾ 1250 euGlyThrAl aAsd^fetlle HisThrAlaG luAlaThrTh rAsnLeuGly
CTGCTCACCT TCGGGCTGGC C AGGCTATA GGCTACG AA CAGCTGCTGA 1300 LeuLeuThr? heC-lyLeuAl aLysAialle GiyTyrAlaT hrAlaAlaAs
TTGCGGCCGG ACTGTACTGT CCCCAGTGGA GCCC CCTGC GA GGCATGC 1350 pCysC-lyArg ThrValLeuS erProValC-l uPrcSerCys GluGly^tG
AGTGCGO GC CGGGC¾GCGC TGCCAGG GC- TAGC-CGGGAA GGCCGGGTGT 1400 InCysAlaAl aGlyGlnArg CysGlnValV alGlyC-lvLy sAlaGlyCys
GTGGCGGAGT CCACCGCTG CTGCCGCGCC ¾GGGCG¾CC CCCATTACAC 1450 VaL^iaGluS er hrAlaVa ICysArg la GlnGIyAsp? roHisTyrTh
CACCTTCGAC GGCCGTCGCT ACG¾C¾TG¾T GGC .CCTGT TCGTACACG .500 rThrPheAsp GlyArgArg yr¾sp e J fe tGlylhrCys SerTyr hrM
TGGTGGAGCT GTGCAGCGAG GP-CGACACCC TGCCCGCCTT CAGCGTGGAG 1550 etValGiuLe uCvsSerGlu AsoAsoThrL euProAlaP'n eSerValGlu
GCC1H G AGC .CCGGGG CAGCCGCCGC GTCTCCTACG TGGGCCTCGT 1600 AlaLysAsnG luHisArgGi vSerArgArg ValSerTyrV alGivLeuVa
CA.CTG GCGC GCCTACA.GCC ACTCTGTGTC GCTG¾CCCGC GG GAAGTTG 1650 IThrVaL^ g AlaTyrSerH isSerValSe rLeuThrArg GlyGluValG
GCTTCGTCCT GGTTGACAAC CAGCGCTCGC GCCTGCCAGT CTCCCTG .GT 1700 lyPheVaile uValAspAsn GinArgSerA irgL jProVa ISerLeuSer
G .GGGTCGCC TGCGTGTGTA CC¾G¾XGG . CC .CGGGCCG TGGTGG. .GCT 1750 GluGlyArgL euArgValTy rGinSerGly ProArgAlaV alValGiuLe
GGTCTTTGGG CTGGTGGTCA CTTATGACTG GGOTGCCAG CTGGCACTCA 1800 uValPheC-ly LeuValValT hrTyrAspTr pAs CysGln LeuAlaLeuS 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
GCCTGCCTGC ACGCTTCC A GACCAGGTGT GCGGGCTGTG TGC ACTAT 1850 erLeuProAl aArgPheGln AspGlnValC ysGlyLeuCy sGlyAsnTyr
AATGGTGACC CAGCAGACG - CTTCCTCACG CCTGACGGGG CTCTGGCTCC 1900 AsnGlyAspP roAlaAspAs pPheLeuThr ProAspGlyA laLeuAlaPr
TGS.CGCTGTG GAGTTCGCAA G AGCTGG A GC GGATG^T GGG3ACTACC 1950 oAspAlaVal GluPheAiaS erSerTrpLy sLeuAspAsp GlyAspTyrL
TGTGTGA.GGP, TGGCTGCCAG ¾AC A.CTGTC CCGCCTGCAC CCC GXC G 2000 euCysGluAs pGiyCysGin AsnAsnCysP roAlaCysTh rProGlyGin
GCCCAACACT ATGAGGGCGA CCGACTCTGT GGCATGCTG^ CCAAGCTCG^- 2050 AlaGinHisT vrGluGiyAs pArgLeuCys GlyMstLeuT hrLysLeuAs
TGGCCCCTTC GCTGTCTGCC ATGA.CACCCT GGACCCCAGG CCCTTCCTGG 2100 pGlyProPhe MaValCysH isAspThrLe uAspProArg ProPheLeuG
AGCAGTGTGT ATATGA.CCTG TGTGTGGTCG GIGGGGA.GCG GCTCA.GCCTG 2150 luGlnCysVa ITyrAspLeu CysVaiValG lyC-lyGluAr gLeuSerLeu
TC-CCGTGGCC TCAGCGCCTA TGCCCAGGCC TGTCTGGAGC TTGGCATCTC 2200 CysArgGlyL euSerAiaTy rAlaGlnZ a CysLeuGiuL euGlylleSe
GGTTGGGGAC TGGAG¾TCAC CAGCCAACTG CCCCCTGTCC TGCCCTGCCA 2250 rValGlyAsp TrpArgSer? roAlaAsnCy sProLeuSer CysProAlaA
A ^GCCGCTA TGAGCTCTGC GGCCCTGCTT GCCCGACCTC CTGCAACGGG 2300 snSer¾rgly rGluLeuCys GlyProAlaC ysProThrSe rCysAsnGly
GCTGCGGCGC CGTCC ACTG CTCCGGGCGC CCCTGCGTGG AGGGCTGCGT 2350 AlaAlaAiaP roSerAsnCy sSerGlyArg ProCysVaiG luGlyCysVa
GTGCCTCCCA GGCTTCGTGG CCAGCGGCGG CGCCTGCGTG CCGGCCTCGT 2400 ICysLeuPro GlyPheVaL^ laSerC-lyC-l yAlaCysVal ProAlaSerS
Figure imgf000092_0001
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
CCCTGTGTGG ACTCTGTGGG AACTTC CG GGGACCCAGC TGATGACCTG 3050 laLeuCysGl yLeuCysGly AsnPheAsnG IvAspProAl aAspAspLeu
GCTCTGCGGG GTGGGGGTCA AGCTGCCAAT C .CTGGCCT TTGGGAACAG 3100 AlaLeuArgG lyGIyGlyC-1 riAiaAisAsn AiaLeuAla? heGlyAsnSe
CTGC AG.¾A GAG^CGAGGC CCGGCTGTG3 AGC ACTGAA CCGGGTGACT 3150 rlrpGInGlu GluThrArg? roGiyCysGl yAlaThrC-lu ProGlyAs?C
GICC AGCT GG^CTCCCTG GTGGCCCAGC AGCTGCAG^G CAAGAATGAG 3200 ysProLysLe uAspSerLeu ValAlaGlnG InLeuGlnSe rLvsAsnGiu
TGTGGAATCC TTGCCGACCC CAAGGGGCCC TTCCGGG^G GCCATAGCAA 3250 CysGlylleL euAlaAspPr oLysGlyPro Phe rgGluC ysHisSerLy
GCTGGACCCC CAGGGTGCCG TGCGCGA.CTG TGTCTATG .C CGCTGCCTGC 3300 sLeijAspPro GlnGlyAlaV aL¾rgAspCy sValTyrAsp ArgCysLeuL
TGCCAGGCCA GTCTGGGCCA CTGTGTGA.CG CACTGGCCAC CTATGCTGCT 3350 euProGlvGi nSerGIyPro LeuCysAspA laLeuAlaTh rTyrAlaAla
GG TGCCAGG CTGCTGGA.GC G AGTGC C CCCTGG¾GG¾ GTGPAG ACT 3400 Al'aCysGlnA laAlaGlyAi aThrVaiHis ProTrpArgS erGluGl
T GCCCACTG AGCTGCCCAC CCCACAGCCA CTATGAGGCG TGTTCCTACG 3450 uCys? roLeu ^ -SerCysProP roHisSerKi sTyrGluAla CysSerTyrG
GCTGCCCGCT GTCCTGTGG - G¾.CCTCCC¾G TGCCCGGGGG CTGTGGCTCA 3500 IvCvsProLe uSerCvsGly AspLe'jProV alProGlvGl yCysGlySer
G- ATGCCATG AGGGCTGCGT GTGCG^TG^G G CTTTGCGC TCAGTGGTG^ 3550 GiuCysHisG luGlyCysVa lCysAscC-lu GlyPheAlaL euSerGlvGl
GTCCTGCCTG CCCCTGGCCT CCTGTGGCTG CGTAC .CC¾G GGCACCTACC 3600 uSerCysLeu ProLeuAlaS erCvsGlvCv sValHisGin GlyThrTyrH 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
ACCCACCAGG CCAGACCTTC TACCCTGGCC CCGG¾TGTGA TTCCCTTTGC 3650 isProProGl vGlnThrPhe TyrProGlyP roGlyCysAs pSerLeuCys
C¾CTGCCAGG AGGGCGGCCT GGTGTCCTGT GAGTCCTCCA GCTGCGGACC 3700 KisCysGlnG luGlyGlyLe uValSerCys GluSerSerS erCysGlyPr
G 2,CGA.GGCC TGCCAGCCAT CCGGTGGCAG CTTGGGCTGT GTGGCCGTGG 3750 onisGluAia CysGlnProS erC-lyC-lySe rLeuGlyCys VaL¾laValG
GCTCTAGC¾C CTGCCAGGCG TCAGGAG^CC CCCACTACAC CACCTTCGAT 3800 lySerSerTn rCysGlnAla SerGlyAspP roHisTyrTh r rPheAsp
GGCCGCCGCT TCG .CTTO T GGGCACCTGC GTGTATG GC GGCTCAGAC 3850
Figure imgf000094_0001
he spPh C-lylhrCys VaiTyrValL euAlaGlnTh
CTGCGGCACC CGGCCTGGCC TGO TCGGIT TGCCGTCCTG CAGGAG ACG 3900 rCysGlvThr ArgProGlyL euHisArgPh ei laValLeu GlnGluAsnV
TGGCCTGGGG TAATGGGCG¾ GTCAGTGTG¾ CC¾GGGTG¾T CACGGTCCAG 3950 aL laTrpGl vAsnGlyArg ValSerValT hrArgVslIl eThrValGln
GTGGCAAACT TCACCCTGCG GCTGG¾GC¾G AGAC¾GTGG¾ AGGTCA.CGGT 4000 VamaAsn? heThrLeuAr gLeuGluGln ArgGlnTrpL ysValThrVa
GAACGGTG G GACATGAAGC TGCCCGTGGT GCTGGCC AC GGCCAGATCC 4050 L snGlyVal AspiMfetLysL oProValVa ILeu aAsn GlyGlnlleA
GTGCCTCCCA G JGG TCA G .TG TGTG . TTG¾GA.CCG¾ CTTCGGCCTG 4100 rgAiaSerGl nHisGlySer AspValVslI leGluThii s pPheGlyLeu
CGTGTGGCCT ？, CGACCTTG GTACTATG G CGGG CA.CCG TCCCCGGP^A 4150 . cVaL¾laT yrAspLeuVa ITyrTvrVai ArgValThrV alProGlyAs
C ACTACC^G CAG^TGTGTG GCCTGTGTGG GAACTACAAC GGCG?-CCCC 4200 nTv-rTyrC-ln GlniyfetCysG lyLeuCysGi yAsnTyrAsn GlyAspProL 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
AGGATGACTT CCAGAAGCCC MTGGCTCAC AGGCAGGCAA CGCC¾ATG¾G 4250 ysAspAspPh eGinLysPro AsnGlySerG InAlaGlyAs nAlaAsnGlu
TTCGGCAACT CCTGGG¾GGA GGTGGTGCCC GACTCTCCCT GCCTGCCGCC 4300 PheGlyAsnS erTrpGluGl uValValPro AspSerProC ysLeu?ro?r
CACCCCTTGC CCG CGGGGA GCGAGGACTG TATCCCC¾GC CACAAGTG C 4350 oThrProCys ProProGlyS erGluAspCy sIle?roSer HisLysCys?
' CTCCCGAGCT GGAGAAGAAG TATCAGAAGG AGGAGTTCTG TGGGCTCCTC 4400 roProGluLe uGluLysLys TyrGlnLysG luGluPheCy sGlyLeuLeu
TCC¾GCCCCA CAGGGCCACT GTCCTCCTGC CAC GCTGG TGG .TCCCCA 4450 SerSerProT hrGlyProLe uSerSerCys HisLysLeuV a!AspPrcGl
GGGTCCCTTG A AG¾TTGCA TCTTTGAICT CTGCCTGGGT GGTGGGAACC 4500 nGlyProLeu LysAspCysI ： LePheAspLe uCysLeuGiy GlyGlyAsnL GAGCATTCT CTGCAGCAAC ATCCATGCCT ACGTG¾GTGC TTGCCAGGCG 4550 euSerlleLe uCysSerAsn IleHisAl T yrValSerAl aCysGinAia
GCTGQ¾GGCC ACGTGG .GCC CTGGAGGACT GAAACTTTCT GTCCG TC-G¾ 4600 AiaGlyGlyH isValGluPr oTrpArgThr GluThrPheC ysProi fetGl
GTGCCCTCCG AACAGTCACT ACGAGCTCTG TGCGGAC¾CC TGCTCCCTGG 4650 uCysProPro AsnSerHisT yrGluLeuCv sAlaAspThr CysSerLeuG
GCTGCTCAGC TCTCAGTGCC CCTCCACAG GCC .GG .TGG G GTGCTG¾G 4700 lyCysSerAl ai^uSerAla ProProGlnC ysC-lnAspGl vCvsAlaGlu
GGCTGCCAGT GTG^CTCCGG CTTCCTCTAC ^ATGGC AG CCTGCC-TGCC 4750 GlyCysC-inC ysAspSerC-1 yPheLeuTyr AsnGlyGlnA laCysValPr
CATCCAGCAA TGCGGCTGCT ACCACAATGG TGTCTACTAT GAGCCGGAGC 4800 oIleGlnGln CysGlyCysT yrHisAsnGl yValTyrTyr GluProGiuG 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
AG¾CAGTCCT C¾TTG¾CAAC TGTCGGCAGC AGTGCACGTG CCATGCGGGT 4850 InThrValLe uIleAspAsn CysArgGlnG InCysThrCy sHisAiaGly
A GGCATGG TGTGCCAGGA ACACAGC GC AAGCCGGGGC AGGTGTGC ¾ 4900 LysGlyiMetV alCysGlnC-1 uHisSerCys LysProGlyG InValCysGl
GCCCTCCG - GGCATCCTGA GCTGCGTCAC CAAAG^.CCCG TGCCACGGCG 4950 nProSerGly GlyllsLeuS erCysValTh rLysAspPro CysHisGlyV
TGACATGCCG GCCACAGGAG AC¾TGCAAGG AGCAGGGTGG CC .GGGCGTG 5000 alThrCvsAr gProGlnC-lu ThrCysLysG luGlnGlyGl yGlnGlyVal
TGCCTGCCCA ACTATG¾GGC CACG GCTGG CTGTGGGGCG ACCCACACTA 5050 CysLeuProA snTyrGluAl aThrCysTrp LeuTrpGlyA spProHisTy
CCACTCCTTC G .TGGCCGGA AGTTTG .CT CCAGGGCACC TGTAACTATG 5100 rHisSerPhe AspGlyArgL ysPheAspFh eGlnGlvThr CysAsnTyrV
TGCTGGC C AACTGGCTGC CCGGGGG CA GC¾CCCAGGG CCTGACACCC 5150 alLeuAlaTh rThrGlyCys ProGiyVaiS e^hrGlnGl yleuThrPro
TTCACCGTCA CCACC AG A CCAG ACCGG GG AACCCTG CTGTGTCCTA 5200 PheThrValT hrThrLysAs nGlnAs ^rg Gly.¾3nProA laValSer v
CG GAGAGTC GTCACCGTGG CTGCCCTCGG CACCAACATC TCCATCCACA 5250 rValArgVal.. ValThrValA laAlaLeuGl yThrAsnlle SerlieHisL
AGG?.CG¾G .T CGG AAGTC CGGGTG ACG G GTGCTCAC AGCCTTGCCT 5300 ysAspGluIl eGlyLysVal ArgValAsnG lyValLeuTh rAlaLeuPro
GTCTCTGTGG CCG¾CGGGCG GJ TTTCAGTG ACCCAGGGTG CATCG¾AGGC 5350 ValSerVaL¾ laAspGlyAr glleSerVal ThrGlnGlyA laSerLysAl
ACTGCTGGTG GCTGA.CTTTG GACTGC GT CAGCTATCAC TGGAACTGGC 5400 aLeuLeuVal AlaAspPheG lyLeuGlnVa lSerTyrAsp TrpAsnTrpA O 95/27057
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
GGGTAGACGT GACGCTGCCC AGCAGCTATC ATGGCGOVGT GTGCGGGCTC 5450 rgValAspVa IThrLeuPro SerSerTyrH isGlyAlaVa lCysGlyLeu
TGCGGT CA TGGACCGCAA CCCCAACAAT GACCAGGTCT TCCCTAATGG 5500 CysGlyAsnM etAspArgAs nProAsnAsn AspGinVal? heProAsnGl
CTOCTGGCT CCCTCCATAC CCATCTGGGG CGGCAGCTGG CGAGCCCCAG 5550 y rLeuAla ProSerlle? roIleTrpGl yGlySerTrp ArgAla？ roG
GCTGGGACCC ACTGTGTTGG GACG ATGTC GGGGGTCCTG CCCAACGTGC 5600 lyTrpAspPr oLeuCysTrp AspGluCysA rgGlySerCy sProThrCys
CCTGA.GGACC GGI GGAGCA GTACGAGGGC C TCGCTTCT GCGGACCCCT 5650 ProGiuAspA rgLeuGluGl nTyrGiuGly PrcGIyPheC ysGiyProLe
GGCCCCCGGC ACAGGGGGCC CTTTCACCAC CTGCC .TGCT CATGTGCCAC 5700 uAlaProGly ThrGlyGly? roPheThrTh rCysHisAla HisValProP
CTGAGAGCTT CTTCAAGGGC TGTGTTCTGG ACGTCTGCAT GGGTGGTC-GG 5750 roGluSerPh ePheLysGly CysValLeuA spVa!Cys^fe tGlvGlvGly
G¾CCGTGACA TTCTTTGCAA GGCTCTGGCT TCCTATGTGG CCGCCTGCCA 5800 AspArgAs I leLeuCysLy sAlaLeu JLa SerTyrValA laAlaCysGl
GGCTGCTGGG GT G CA.TCG GACTGGCG GGCACAGGTT GGCTG GAG¾ 5850 nAlaAlaGly ValVallleG luAspTrpAr gAlaGlnVal GlyCysGluI
TC CCTGCCC AG JL ACAGC C .CT TG .GG TCTGTGGCCC ACCCTGCCCG 5900 leT rCysPr cGluAsnSer HisTyrGluV alCysGlyPr oProCysPro
GCCAGCTGTC CGTCCCCTGC ACCCCTTACG ACGCCA.GCCG TATGTG¾GGG 5950 AlaSerCys? roSerProAl aProLeuThr ThrProAlaV alCysGluGl
CCCCTGTGTG G .GGGCTGCC AGTGCGACGC GGGTTTCGTG TTAAGTGCTC- 6000 yProCysVal GluGlyCysG InCysAspAi aGlyPheVal LeuSerAlaA . 10 20 30 0 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
ACCGCTGTGT TCCCCTCAAC AACGGCTGCG GCTGCTGGGC CAATGGCACC 6050 spArgCysVa IProLeuAsn AsnGlyCysG lyCysTrpAl aAsnGlvThr
TACCACGAGG CGGGCAGTG^ GTTTTC-GGCT G^TGGCACCT GCTCCCAGTG 6100 TyrHisGluA laGlySerGl uPheTrpAls AspGly hrC vsSerGinTr
G GICGCTGC GGGCCTGGGG GTGGCTCC-CT GG CTGCACA CCTGCCAGCT 5150 pCysArgCys GlyProGlyG lyGlySerLe uValCysThr ProAlaSerC
GTGGGCTGGG TG AGTGTGT GGCCTCCTGC CA CCGGCCA GCACGGCTGC 6200 ysGlvLeuGl yC-luValCys GlyLeuLeu? roSeiGlyGl nHisGivCvs
CAGCCCGTCA GCACAGCTGA GTGCCAGGCG TGC-GGTG .CC CCCATTACGT 6250 GlnProVaiS erThrAiaGl uCysGlnAla Trp31yAs?P roHisTyrVa
CACTCTGG^T GGGC .CCGAT TCAATTTCCA AGG ^CCTGC GAGTACCTGC 6300 IThrLeuAsp GlyHisArgP heAsnPheGl nGlyThrCys GluTyrLeuL
TGA.GTGCACC CTGCC .CGG¾ CCACCCTTGG GGGCTGAG?^ CTTCACTGTC 6350 euSerAlaPr oCysHisGly ProProLeuG IvAlaGluAs rPheThrVal
ACTGTAGCCa ATGAGCACCG GGGCA.GCCAG GCTGTC¾GCT ACACCCGCAG 6400 ThrValAlaA snGluHisAr gGlySerGln AlaValSerT yrThrArgSe TG CACCCTG CAAATCTAOV ACCAC¾GCCT G .CA.CTGAG GCCCGCTGGC 6450 rValThrLeirGlnlle yrA snHisSerLe uThrLeuSer AlaArgTrp?
CCCGGAAGCT ACA.GGTGG .C GGCGTGTTCG TCACTCTGCC CTTCC .GCTG 6500 roArgLysLe uGlnVaiAsp GlyValPheV alThrLeuPr oPheGlnLeu
GA.CTCGCTCC TGCACGCACA CCTGAGCGGC GCCGACGTGG TGGTQ CC 6550 AsoSerLeuL euHisAlaHi sLeuSerGlv AlaAsoValV alValThrTh CCTCAGGG CTCTCGCTGG CTTTCGACGG GG¾C¾GCTTC GTGCGCCTGC 6600 rThrSerGly LeuSerLeuA laPheAspGl yAspSerPhe VaL^rgL^uA 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
GCGTGCCGGC GXGTACGCG GGCTCTCTCT GTGGCTTATG CGO^ACTAC 6650 rgValProAl aAlaTv'rAla GlySerLeuC ysGivLeuCy sGlyAsnTyr
AACCAGG -CC CCGCAG¾CGA CCTGAAGGCG GTGGGCGGG¾ AGCCCGCCGG 6700 AsnGlnAsp? roAlaAspAs pLeuLysAla V lGlyGlyL ysProAiaGl
ATGGCAGC-TG GGCGGCGCCC AGGGCTGCGG GGAATGTGTG TCCAAGCCM? 6750 yTrpGInVal C-lyGlyAlaG InGlyCysGl yGluCysVal SerLysProC
GCCCGTCGCC GTGCACCCCA GAGCA.GCAAG AGTCCTTCGG CGGCCCGGA.C 6800 ys?roSer?r oCysThrPro GluGlnGinG IuSerPheGi yGiyProAsp
GCCTGCGGCG TGATCTCCGC CACCGACGGC CCGCTGGCGC CCTGCCACGG 6850 AiaCysGiyV allleSerAl aThrAspGly ProLeuAls? roCysHisC-1
CCTTGTGCCG CCCGCGCAGT ACTTCCAGGG CTGCTTGCTG GACGCCTGCC 6S00 yleuValPro ProAlaGlnT yrPheGinGi yCysLeuLeu AspAlaCysG
^GITC¾.GGG CCATCCTGG¾ GGCCTCTGTC* CTGC .GTGGC C\CCTACGTG 6950 InValGlnGl yKisProGly GlyLeuCys? roAlaValAl aThr yrVal
GCAGCCTGTC AGGCCGCTGG GGCCG C-CTC CGCG GTGGA GGCGGCCGG¾ 7000 Al'oAlaCysG InAlaAlaGi yAlaGinLeu ArgGluTrpA rgArgProAs
CTTCTGTCCC TTCCAGTGCC CTGCCCACAG CCACTACG -G CTCTGCGGTG 7050 pPheC s？ ro^ -PheGlnCy sP roAlaHisSe rKisTyrGlu LeuCysGlyA
ACTCCTGTCC TGGGAGCTGC CCGA.GCCTG CGGCACCCG¾ GGGCTGTG G 7100 spSerCysPr oGlySerCys ProSerLeuS erAlaProGl uGlyCysGlu
TCGGCCTGCC GTG¾AGGCTG TGTCTGCGJ T C-CTGGCTTCG TGCTCA.GTGG 7150 SerAlaCysA rgC-luGlyCy sValCysAsp AlaGlyPheV alLeuSerGl
TG¾C¾CGTGT GTACCTGTGC- GCCAGTGTGG CTGCCTCCAC GA.TGACCGCT 7200 yAspThrCys ValProValG lyGlnCvsGl yCysLeuHis AspAspArgT 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
ACTACCCACT GGGCCAGACC TTCTACCCTG GCCCTGGGTG TG¾TTCCCTT 7250 yrTyrProLe uGlyGinThr PheTyrProG lyProGlyCy sAspSerLeu
TGCCGCTGCC GGG^GGGCGG TGAGGTGTCC TGTGA.GCCCT CC¾GCTGCGG 7300 CysArgCysA rgC-luGlyGl yC-luValSer CysGluProS erSerCysGl
CCCGCATGAG ACCTGCCGGC CATCCGGTGG C .GCTTGGGC TGCGTGGCCG 7350 yProHisGlu ThrCysArg? roSerGlvGl ySerLeuC-ly CysVal aV
TGGGCTCTAC CACCTGCCAG GCGTCGGGAG ATCCCCACTA CACCACCTTC 7400 alC-lySerTh rThrCysGln AlaSerGlyA spProHisTy rThrThrPhe
GATGGCCGCC GCTTCG .CTT CATGGGCACC TGC'GTGTATG TGCTGGCTCA 7450 pGlyArgA rgPheAspPh ei fetGiy hr CysValTyrV alleuAlaGl
G¾CCTGCGGC ACCCGGCCTG GCCTACATCG GTTTGCCGTC CTGCAGG -G . 7500 nThrCysGly ThrArgProG lyLeuHisAr gPh AlaVal LeuGlnC-luA
ACGTGGCCTG GGGTAATGG CGAGTCAGIG TG?-CC¾GGGT G^TCACGGTC 7550 snValAlaTr pGlyAsnGly ArgValSerV alThrArgVa llieThrVal
CAGGTGGCAA ACTTCACCCT GCGGCTGGAC- C .GA.GA.C .GT GG^AGGTCAC 7600 GlhVaLAlaA snPheThrLe uArgLeuGlu GlnArgGlnT rpLysValTh GGTGAACGGT GTGGACATGA AGCTGCCCGT GGTCCTGGCC CGGCCAG - 7650 rvalAsnGly- VaL^su^tL ysLeuProVa IValLeuAla AsnGlyGinl
TCCGTGCCTC CCAGCATGG TCAGMTGTTG TGATIG^G C CG CTTCGGC 7700 leArgAlaSe rGinHisGly SerAspValV allleGluTh rAspPheGly
CTGCGTGTGG CCTACG¾CCT TGIGTACTAT GTGCGGGTCA CCGTCCCTGG 7750 LeuArgVaL^ laTyrAspLe uValTyrTyr VaL rgValT hrValProGl ACTACTAC CAGC GATGT GTGGCCTGTC- TGGG ACTAC AACGGCGACC 7800 vAsnTyrTyr GlnLeulXfetC ysGlvLeuCy sGlyAsnTyr AsnC-lyAspP 10 20 30 40 50
1 34567890 1234567890 12.345n B?0 12 5^ 8 0 123^ ^78 0
CCAAGGATGA CTTCCAGAAG CCCAATGGCT CGCAGGCAGG CAACGCCAAT 7850 roLysAspAs pPheGinLys ProAsnGlyS erGinAiaGl yAsniUaAsn
GAGTTCGGCA ACTCCTGGGA GGAGGTGGTG CCCGACTCTC CCTGCCTGCC 7900 GluPhe31yA snSerTrpGl uGluValVal ProAspSer? rcCvsLeuPr
GCCC-CCCACC TGCCCGCCGG GG¾3CG¾3GG CTGTATCCCC AGCGAGG^.GT 7950 oProProThr CysProPrcG lySerC-luGl yCysIiePro SerGluGluC
GTCCTCCCG.A GZTGG^Jl^AG G ATCAGA AGGAGGAGTT CTGTGGGCTC 8000 ysProPrcGl uLeuGluLys LysTyrC-lnL ysGluC-luPh eCysGlvLeu
C CTCCAGCC CCACAGGGCC ACTGTCCTCC TGCCP AGC TGC-TOG^.TCC 8050 LeuSerSerP roThrGlyPr oLeuSerSer CysHisLysL eu aL^pPr
CC¾GGGTCCC TTG AAGJ TT GCATC TTG^ TCTCTGCCTC- GGTGGTGGGA 8100 oGlnGlyPro LeijLysAspC ysIleP eAs pLeuCysLeu GlyGlyGlyA
ACCTGAGCAT TCTCTGCAGC AACATCCATG CCTACGTG .G TGCTTGCC .G 8150 snLeuSerll eLeuCvsSer AsnlleHisA laTvrValSe rAlaCvsGln
GCGGCTGa¾G GCC¾CGTGGA GCCCTGG¾GG . ATGAAACTT TCTGTCCCAT 8200 AlaMaGlv-G IvtiisValGl uProTrpArg AsnGluThr? heCys?roR¾
GGAATGCCCT^. C^.GAACAGTC ACTACGAGCT CTG GCGG^-C ACCTGCTCCC 8250 tGiuCysPro GinAsnSerH isTyrGluLe uCysAlaAsp TnrCysSerL ：
TGGGCTGCTC GGCTCTCAGT GCCCCTCTGC AGTGCCC^GA TGGC-TGTGCT 8300 euGlv-CysSe r.-laLeuSer AlaProLeuG InCysProAs pGlyCysAla
GAGG TGCC AGTGTGACTC CGGCTTCCTC TACAACGGCC AAGCCTGCGT 8350 GluGlyCysG InCysAspSe rGlyPheLeu TyrAsnGlyG In^laCysVa
GCCCATCCAG CAATGTGGCT GCTACCAC^A TGGTGCCTAC TATGAGCCGG 8400 IProIleGin GlnC sGlvC ysTyrHisAs nGl laT^/r TyrGluPrcG 10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234557890
AGCAGAC¾GT CCTCATTGAC AACTGTCGG AGCAGTGCAC GTGCCATGCG 8450 luGlnThrVa lLeuIleAsp AsnC s^ gG InGlnCysTh rCysHisAla
GGT. GTCG TGGTGTGCCA GGAACACAGC TGC^AGCCGG GGCAGGTGTG 8500 GlvLvsValV alValCvsGl nC-luHisSer CvsLvsProG lvC-lnValCv
CCAGCCCTCC GG?-.GG ATCC TG^.GCTGCGT CACC AAGAC CCGTGCCACG S550 sGlnProSer GlyGlylieL euSerCysVa IThrLysAsp PrcCysHisG
GCGTGACATG CCGGCCACAG GAQ >-TGCA AGG¾S AGG3 TGGCCAGGGT 8600 lyValThrCy sArgPrcGln GluThrCysL ysGluGlnGl yGlyC-lnGly
GTC-TGCCTGC CCAACTATGA GGCCACGTGC TGGCTGTGZ-G GCGACCO . 8650 ValCysLeu? roAsnTyrGl uAlaThrCys Tr LeuTrpG lyAspProF.i
CTACCACTCC TTCQ TGGCC GG AGTTTGA CTTCdGGGC ACCTGT CT 8700 sTyrHisSer PheAspGlyA rgLysPh As pPheGlnGly ThrCysAsnT TGTGCTGGC AAG ACTGGC TGCCCGGGGG TCA.GCA.CCQ· GGGCCTG¾C¾ 8750 yrValLeuAl aThr hrGly CysProGlyV alSerThrC-1 nGlyLeuThr
CCCTTCACCG TCACCACCAA GAACCAGAAC CGGGGC ACC CTGCTGTATC 8800 ProPheThrV alThrThrLy sAsnGlnAsn ArgC-lyAsnP roAlaValSe
CTACG GAQ GTCGTC¾CCG TGGCTGCCCT CGGCACCAAC ATCTCCATCC 8850 rTyrVslArg ValValThrV aL^laAlaLe uGlyThrAsn IleSerlleH
AC AGG^CGA GATCGG AA GTCCGGGTGA ACGGTGTGCT CACAGCCTTG 8900 isLysAspGl ulieC-lyLys VslArgVslA snGlyValLe uThrAlaLeu
CCTGTCTCCG TGGCCGACGG GCGGA.TTTCA GTGGCCCAGG GTGCATCG A 8950 ProValSerV a!AlaAs Gl ajrglleSer ValAiaGlnG L laSe L
GGCACTGCTG GTGGCTGACT TTGGACTGCA AGTCAGCTAT G .CTGGAACT 9000 sAialeuLeu ValAla ^pP heGlvLeuGl nValSer^yr AspTcpAsnT 10 20 30 40 50
123^フ8。0 12^ 8^0 12345ή7890 123^ 56 8 0 123456フ 390
GGCGGGTAGA CGTGACGCTC CCCAGCAGCT ATC^TGGCGC AGTGTGCG 9050 rpArgVaL^ pValThrLeu ProSerSerT yrHisGlvAl aValCysGly
CTCTC-CGGTA AC^TGGACCG C ACCCCA^.C TG .CCAGG TCTTCCCTAA 9100 LeuCysGlyA sr^tetAspAr gAsrProAsn AsnAspGlnV al?he?roAs
TGGCACACTG GCTCCCTCCA TACCCATCTG GGC-CGG .GC TGGCGAGCCC 9150 nGIv^hrLeu AiaProSerl leProIleTr pGlyGlySer TrpArgAla?
C¾GGCTC-GG¾ CCCACTGTGT TGGG .CGAAT GTCGGGGGTC CTGCC ACG 9200 rcGlv- rpAs pProLeuCys TrpAspGluC ysArgGlySe rCysProThr
TGZC TG?GG ACCGGTTGGA GCAGTACGAG GGCCCTGGCT TCTGCGGACC 9250 CysPrcGluA spArgLeuGl uGlnTyrGiu GlyPrcGlyP heCysGlyPr
CCTGGCCCCC GGG -GGGG GCCCTTTC .C CACCTGCCAT GCTCATGTGC 9300 oLeuAlsPro GlyThrGiyG lyProPheTh rThrCysHis AlaHisVal?
C¾CCTG?,G .G CTTCTTCAAG GGCTGTGTTC TGGACGTCTG CATGGGTGGT 9350 roPrcGluSe rPhePheLys GlyCysValL euAspValCy s^tGlyGly
GGC - CCATG AC¾TTCTTTG CAAGGCTCTG GCTTCCTACG TGGCCGCCTC- 9400 GlyAspKisA s IleLeuCy sLysAlaLeu AlaSei^IvrV aiAlaAlaCy
CCAGGCCGCT— GGGGTTGTCA TCGAAGACTG GCGGGCA.CA.G GTTGGCTGTG S450 sC-lnAlaAla，'GlyValV LlI leGluAspTr pArgAlaGln ValGlyCysG
AG TCACCTG CCCAQ^AAC AGCCACTATG AGGTCTGTGG CC ACCCTGC 9500 luIleThrCy sPrcGluAsn SerKisT rG luValCysGi yProPrcCys
CCGGCCAGCT GTCCGTCCCC TGCACCCCTT ACG .CGCC^G CCGTATGTG . 9550 Pro aSerC vsProSerPr oAiaProLeu ThrThrProA laValCvsGl
GGGCCCCTGT GTGGAGGGCT GCCAGTGCGA CGCGGGTTTC GTGTTMGTG 9600 uGlyProCys VaiGiuGiyC sGlnCys^ p laGlyPhe ValLeuSerA 10 20 30 0 50
1234561890 1234567890 123^56"390 123 50 QQ 1234567890
CTGACCGCTG TGTTCCCCTC AACAACGGCT GCGGCTGCTG GGCCAATGGC 9650 laAsp^gCy sVaiProLeu AsnAsnGlyC ysGlyCysTr pPdaAsnGly
ACCTACCACG AGGCGGGCAG TG .GTTTTGG GCT L .TGGCA CCTGCTCCCA 9700 ThrTvrHisG luAlaGlvSe rGluPheTro AiaAs Gl hr ysSerC-1
GTGGTGTCGC TGCC-X-CCTG GGGGTG -CTC GCTGGTCTGC ACACCTGCCA S~50 nTr CysArg CysGlyProG lyGlv-C-lySe rLeuValC s ThrPro aS
GCTGTGGGCT GGGTGAAGTG TGTGGCCTCC TGCCATCCG:- CCAGCACGGC 9800 erC sGlvLe uC-lyGluVal CysGlyLeuL euProSerGl C-lnHisGl
TGCCAGCCCG TCAGCACAGC TGAG GCCAG GCGTGGGG G ACCCCC^.TTA 9850 CvsGlnProV alSerThrJ^A aC-luCysC-ln AlaTrcGivA spProKisTy
CGTCACTCTG GATGGGCACC G TCG^.TTT CC^AGGCACC TGCGAGTACC 9900 rValThrLeu AspC-lyHisA rgPheAspPh eGlnGly hご CysGluTyrL
TGCTGIGTGC ACCCTGCCAC GGACCACCCT TGGGGGCTGA GAACTTCACT 9S50 • euLeuSerPQ. aPrcCvsKis GlvProProL euGlyAlaGl uAsnPheThr
GTCACTGTAG CCAATGAGCA CCGGGGC¾GC C GGCTGTCA GCTAC¾CCCG 10000 ValThrValA laAsnGluHi sArgGlySer GlnAiaValS erTyrT rAr
CAGTC-TCACC CTC . ATCT ACAACCACAG CCTG CACTG AGTGCCCGCT 10050 cSerValThr LeuGlnlleT yrAsnHisSe rLeuThrleu SerAiaArgT
GGCCCCGG^. GCTAC .GGTG G CGGCGTGT TCGTC CTCT GCCCTTCC G 10100 rpProArgLy sLeuGinVai AscGlyVal? heValThrLe ProPheGln '
CTGGACTCGC TCCTGCACGC ACACCTGAGC GGCGCCGACG TGGTGGTG .C 10150 Le ^pSerL euLeuHis aHisLeuSer GlyMaAspv alValValTh
CAC ACCTCA GGGCTCTCGC TGGCTTTCGA CGGGGA.CAGC TTCGTGCGCC 10200 rTh^ThrSer GlyLeuSerL euAi Phe^s pGly.^pSer PheVaL^gL , 10 20 30 40 50
T ? 45 8 0 123^567990 123^1567890 1234567890 12345678^0
TGCGCGTGCC GGCGGCGTAC GCGGGCTCTC TCTGTGGCTT ATGCGGG^.C 10250 eui-xgValPr oAlaAlaTyr AlaGlySerL euCysC-lyLe uCysGlyAsn
TACAACCAGG ACCCCGCAGA CGACCTG^AG GCGGTGGGCG GGAAGCCCGC 10300 Ty:AsnGlnA spProAlaAs pAspLeuLys AlaValGlyG IvLvsProAl
CGGATGGCAG GTG33CGGCG CCCAGGGCTG CGGGG. ATGT GTGTCC AGC 10350 aC-lv-Tr Gln ValGlvC-l A laGlnGlyCy sGlyGluCys ValSerLys?
C2-TGCCCGTC GCCGTGCACC CCAG .GCAGC AAGAGTCCTT CGGCGGCCCG 10400 rcCvsProSe rProCvsThr ProGluGinG InGiuSerPh eGlvGlvPro
G?.CGCCTGCG GCGTGATCTC CGCCACCGAC GGCCCGCTGG CGCCCTGCCA 10450 AspAlaC sC- lyVslIlsSe rAlaThrAsp GlyPr。LeuA laPrcCysHi
CGGCCTTGTG CCGCCCGCGC AGIACTTCG GGGCTGCTTG CTGGACGCCT 10500 sGlyLeuVal？ roProAlaG InTyrPheGl nGlyCysLeu LeuAspAlaC
C-CCAAGTTC^ GGGCCATCCT GG GC-CCTCT GTCCTGCAGT GGCCACCTAC 10550 ysGlnValC-l r.GlyHisPro Gly-GlyLeuC vsProAiaVa lAlaThr yr
GTGGC .GCCT G CAGGCCGC TGGGGCCC .G CTCCGCGA.GT GG .GGCGGCC 10600 ValAiaAiaC ysGlnAlaAl aGly aGln LeuArgGluT rpArgArgPr
GG^CTTCTGT .-CCCTTCCAGT GCCCTGCCCA CAGCC¾CTAC GAGCTCTGCG 10650 。AspPheCys ProPheGinC ysProAlarli sSerHisTyr GluLeuCysG
GTG¾CTCCTG TCCTGGGAGC TGCCCGAGCC TGTCGGCACC CG^.GGGCTG 10フ 00 ly.^pSerCy sPrcGlySer CysProSerL euSerAiaPr cGluGlvCvs
GAG CGGCCT GCCGTG AGG CTGTGTCTGC GATGCTGGCT TCGTGCTCAG 10750 GiuSerAlaC ysArgGluGl yCysValCys AspAiaGlyP heValLeuSe
TGGTGACACG TGTGTACCTG TGGGCCAGTG TGGCTGCCTC CACGATG .CC 10800 rGl /AspThr CysValProV alGlv 31nC sGlv vsL u HisAspAspA , 10 20 30 40 50
1 ?.14567890 1234567890 123^!5 » 0 12345 3^0 123456フ 890
GCTACTACCC ACTGGGCCAG ACCTTCTACC CTGGCCCTGG GTGTG .TTCC 10850 rgT- rTyrPr oLeuGlyGln ThrPheT- rP roGlyProGl vCys ^pSer
CTTTGCCGCT GCCGGG .GC-G CGGTGAGGTG TCCTGTGAGC CCTCC GCTG 10900 LeuCysArgC ysArgGluGl v<SlyGluVal SerCysGluP roSerSerCy
CGGCCCGCAT G¾ .CCTGCC GG CATCCGG TGGCAGCTTG G3CTGCGTGG 10950 sGlyProHis GluThrCysA rgProSerGl yC-l SerLeu Gl CysVslA
CCGTGGGCTC TACCACCTGC CAGGCGTCGG GAGATCCCCA CTACACC .CC 11000 laValGlySe rThrThrCys GlrAlaSerG IvAspProKi sTyrThrThr
TTCG TGGCC GCCGCTTCG . CTTCATGGGC ACCTGCGTGT ATGTGCTGC-C 11050 PheAspGlyA rgArgPheAs pPh ^tGly ThrCysValT yrValLe'jAl
TCAGACCTGC GGC .CCCGGC CTGGCCTACA TCGGTTTGCC GTCCTGO GG 11100 aGlnThrCys GlyThrArg? roGivLeuHi sArgPheAla ValLeuGlnG
AGAACGIC-C-C CTGGGGTA^.T GGGCGAGTCA GTGTGACCAG GGTGATCACG 11150 luAsnValAl alr GlyAsr. GiyArgVaiS erVaiThrAr gVallleThr
GTCCA.GGTGG CAAACTT A.C CCTGCGGCTG GAGCA.G .GA.C AGTGGPAGGT 11200 ValGlnValA laAsnPheTh rLeu^rgLeu GluGlnArgG InTrpLysVa
CACGGTGAAC GGTGTGG¾C¾ TGAAGCTGCC CGTGGTGCTG GCCAACGGCC 11250 IThrVaL^sn GlyValAspM etLysLeuPr oValValLeu AlaAsnGlvG
AG TCCGTGC CTCCCAGCAT GGTTCAG^TG TTGTQVTTGA G¾XG CTTC 11300 Ir.IleAr.gAl aSerGlnHis GlySer.^pV alVallleGl uThrAspPhe
GGCCTGCGTG TGGCCTACG . CCTTGTGTAC TATGTGCGGG TCACCGTCCC 11350 GlyLeuArgV alAlsTyrAs pLeuValTyr TyrVaL¾rgV alThrValPr
TGGAAACTAC TACCAGCTGA TGTGTGGCCT GTGTGGGA .C TACAACGGCG 11400 GGly srVTyr TvrGinLeuM etCysGl Le uCysGlyAsn TyrAsnGlyA 10 20 30 0 50
I 3j56 890 1234567890 12345 890 123^15^ 3^0 123^ 567890
ACCCCAAGGA TGACTTCCAG AAGCCC ATG GCTCGCAGGC AGGCAACGCC 11450 spProLys^ pAspPheGln LysProAsnG lySerGlnAl sGlyAsnAla
AATG^GTTCG GCAACTCCTG GGAGGAGGTG GTGCCCGACT CTCCCTGCCT 11500 AsnGluPheG lyAsnSerTr pGluGluVal VslProAspS erPrcCysLe
GZCGZCGZCC ACCTGCCCGC CGGGG .GCG . GGGCTGTATC CCCAGCGAGG 11550 uProProPro ThrCvsProP rcGlySerC-1 uGlyCysェ le PrcSerGluG
AGTGTCCTCC CGAGCTGGAG AAGAAGTATC AG AGGAGGA GTTCTGTGGG 11600 luCysProPr cGluLeuGlu LysLysTyrG InLysGluGl uPheCysGly
CTCCTCTCCA GCCCCACAGG GC .CTGTCC TCCTGCCACA AGCTGGTGGA 11650 LeuLeuSerS erProThrGl yProLeuSer SerCysHisL ysLeuValAs
TCCCCAGGGT CCCTTGJ^AG ATTGC¾TCTT TGATCTCTGC CTGGGTGGTG 11700 pProGlnGiy ProLeuLysA spCysIlePh eAspLeuCys LeuGiyGlyG
GGAACCTGAG CATTCTCTGC AGC AC .TCC ATGCCTACGT G.A.GTGCTTGC 11750 IvAsnLeuSe rlleLeuCvs SerAsnlleH isAlaTyrVs ISerAiaCvs
CAGGCGGCTG G .GGCC .CGT GGAGCCCTGG AGG¾ATG A CTTTCTGTCC 11800 GlnAlaAisG lyGlyHisVa IGiuProTrp ArgAsnGluT hrPheCysPr
CATGGAATG CCTCAG ACA GTC¾CTACGi GCTCTGTGCG GACACCTGCT 11850 OL^tGluCys PrcGlnAsnS erHisTyrGl uLeuCysAia AspThrCysS
CCCTGGGCTG CTCGGCTCTC AGTGCCCCTC TGCAGTGCCC AGH TGT 11900 erLeuGlyCy sSerAiaLeu SerAiaProL euGinCysPr oAspGl Cys
GCTGAGGGCT GCCAGTGTGA CTCCGGCTTC CTCTAC^ACG GCCAAGCCTG 11950 MaGluGlyC ysGlnCysAs pSerGlyPhe LeuTyr.^nG lv^lnAiaCy
CGTGCCCATC CAGCAATGTG GCTGCTACCA C^ATGGTGTC TACTATGA.GC 12000 sValProIle GinGinCvsG lyCysTyrHi sAsnGlvVal Tyr yr luP 10 20 30 40 50
Figure imgf000108_0001
CGGAGCAGAC AGTCCTG\TT GACAACTGTC GGCAGCAGTG CACGTGCCAT 12050 rcGluGlnTh rValLeuIle AspAsnCysA rgGlnGlnCy sThrCysHis
GTGGGTAAAG TCGTGGTGTG CCAGGAACAC AGCTGCAAGC CGGGGCAGGT 12100 ValGlyLysV alValV lCy sGlnGIuHis SerCysLysP rcGlyGlnVa
GTGC ^GCCC TCCGGAGGCA TCCTGAG:TG CGTCAACAAA GACCCGTGCC 12150 IC sGInPro SerGlyGlyl leLeuSerCy sVaL¾snLys AspPrcCysH
ACC-GCGTG¾C ATGCCGGCCA CAGG .GACAT GCAAGG¾GC¾ GGGTGGCCAG 12200 isGlyValTh rOysArgPro GlnGluThrC ysLysGluGl nC-lyGlvGln
GGTG GTGCC TGCCCAACTA TGAGGCCACG TGCTGGCTGT GGGGCGACCC 12250 GlyValCysL euProAsnTy rGl'jAlaThr C sTrpLeuT rpGly.^pPr
ACACTACCAC TCCTTCG .TG GCCGG AGTT TG .CTTCC G GGCACCTGTA 12300 oHisTyrKis SerPheAspG IvArgLysPh eAspPheGln GlyThrCysA
ACTATG GCT GGC AC ACT GGCTGCCCGG GGGTCAGCAC CCAGGGCCTG 12350 snTyrValLe uAlaThrThr GlyCysPrcG IvVaiSerTh rGlnGlyLeu
ACACCCTTCA CCGTCACCAC CAAG^-ACCAG AACCGGGGCA ACCCTGCTGT 12400 ThrProPheT hrValThrTh rLysAsnGln AsnArgGlyA snProAlaVa
ATCCTACGTG. AGAGTCGTO CCGTGGCTGC CCTCGGCACC CATCTCCA 12450 ISer yrVal ArgValValT hrVaL¾iaAl aLeuC-lyThr AsnlleSe ェ
TCCAG AGG¾ CG .GATCGGC AAAGTCCGGG TGAACGGTGT GCTCACAGCC 12500 IsHisL s^ pGluIleGly LysVaL^rgV aL¾snGlyVa ILeuThrAia
TTGCCTGTCT CCGTGGCCGA. CGGGCGGATT TCAGTGGCCC AGGGTC .TC 12550 I^uProValS erVaL^laAs pGlyArglle SerValAlaG InGlyAiaSe d ¾3GCACTG CTGGTGGCTG ACTTTGGACT GCAAGTCAGC TATGACTGGA 12600 rLys laLeu uValAlaA spPheGlyLe uGlnValSer TyrAspTrpA r 10 20 30 40 50
1 ? 4Sn7890 1234567890 1234567390 1234567B90 1234567890
ACTGGCGGGT AGACGTGACG CTCCCCAGCA GCTATCATGG CGCAGTGTGC 12650 snTrpArgVa lAspValThi: LeuProSerS erTyrHisGl y aValCys
GGGCTCTGCG GT CATGGA CCGCAACCCC AACAATGACC AGGTCTTCCC 12700 GlyLeuCysG lyAsr ^tetAs pArgAsnPro AsnAsnAspG In alPhePr
TAATGGCACA CTGGCTCCCT CCATACCCAT CTGGGGCGGC AGCTGGCC^G 12750 o^nGlyT r LeuAlaProS erlleProIl eTrpGlyGly SerTrpArgA
CCCCAGGCTG GGACCCACTG TGTTGGGACG AATGTCGGGG GTCCTGCCC¾ 12S00 laProGlvTr pAspProLeu CysTrpAspG luCysArgGl ySerCysPro
ACGTGCCCTG AGGACCGGTT GGAGCAGTAC G GGGGCCTG GCTTCTGCGG 12850 ThrCysPrcG luAspArgle uGluGinTyr GluGlyProG lyPheCysGl
ACCCCTGGCA TCTGGCACAG GGGGCCCCTT CACCACCTGC CATGCTCATG 12900 yProLeuAia SerC-lyThrG lyGlyProPh eThrThrCys HisAlaxHisV
TGCCACCTGA GCTTCTTC - AGGGCTG G TTCTGGACGT CTGCATGGGT 12950 alProPrcGi uSer?he?he LysGiyCysV alLeuAspVa ICys^fetGIy
GGTGGGGACC ATGAC TTCT TTGCAAGGCT CTGGCTTCCT ACGTGGCCC-C 13000 GlyGlyAspH isAspIleLe uCysLysMa LeuAlaSerT yrValAiaAl
CTGCCAGGCC GCTGC-GGTTG TCATCGAAG . CTGGCGGGCA CAGGTTGGCT 13050 aCysGlnAia"¾laGlyValV slIleGluAs pTrpArgAla GlnValGlyC
GTGAG^TCAC CTGCCCAG A AACAGCCAC ATGAGGTCTG TGGCCC¾CCC 13100 ysGluIleTh rCvsPrcGlu AsnSerHisT y^luValC sGlvProPro
TGCCCGGCCA GCTGTCCGTC CCCTGCACCC CTTACGACGC C .GCCG ATG 13150 CysPro aS erCvsProSe rProAlaPro LeuThrThrP roAiaValCv
TGAGGGCCCC TGTGTGGAGG GCTGCCAGTG CG .CGCGGGT TTCGTGTT 13200 sGluGlyPro CysV lGluG lyCysG上 nCy sAspAlaGly PheVaiLeuS ' 10 20 30 10 50
12345618 123 561fl?0 123^ 507890 123^1567890 1234567890
GTGCTG CCG CTGTGT CCC CTCAACAACG GCTGCGGCTG CTGGGCCAAT 13250 erAlaAspAr gCysValPro LeuAsnAsnG lvCysGlyCy sTrpAlaAsn
GGC CCTACC ACG?,GGCGGG CAGTGAG TT TGGGCTGATG GCACCTGCTC 13300 Gly-Thr yrH isGluAiaGl ySerGIuPhe TrpAl=AspG Iv^hrCysSe
CCAGTGGTGT CGCTGCGGGC CTGGGGGTGG CTCGCTGGTC TGCACACC G 13350 rGlnTrpCys Ar-gCysGlyP rcGly-GlvC-1 ySerLeuVal CysT rProA
CCAGCTGTGG GCTGGGTG.^A GTGTGTGGCC TCCTGCCATC CGGCCAGCAC 13400 laSerCysGl yLeuGlyC-lu ValCysGlyL euLeuProSe rGlyGlnKis
AGCTGCCAGC CCGTCAGCAC AGCTQ^GTC-C CAGGCGTGGG GTG .CCCCC¾ 13450 SerCysGln? roValSer rAlaGluCys GlnAiaTrpG ly.AspProKi CGTCACT CTGG^TGGGC ACCGATTCGA TTTCC AGGC ACCTGCGA.GT 13500 sTyrValThr LeuAspC-lyH isArgPheAs pPheGlnGly T rCysGluT
ACCTGCTG?.G TGCACCCTGC CACGGACCAC CCTTGGGGGC TGAGAACTTC 13550 yrLeuLeuSe rAlaPrcCys HisGlyProP roLeuGlyAl aGluAsnPhe
ACTGTC^.CTG TAGC ATGA GC .CCGGGGC AGCC .GGCTG TC¾GCTAC¾C 13600 ThrValThrV aL^laAsnC-l uHisArgGly SerGlnAlaV alSerTyrTh
CCGC .GTGTC ACCCTGCAAA TCTACAACCA CAGCCTG CA CTGAGTGCCC 13650 rArgSerVal' ThrLeuGlnェ leTyrAsnHi sSerLeuThr LeuSerAlaA
GCTGGCCCCG G?AGCTAC G GTCGACGGCG TGTTCGTGGC TCTGCCTTTC 13700 rg rpProAr gLysLeuGln VaL^pGlyV alP eVaL2-! aLeuPrcPhe
CAGCTGGACT CGCTCCTGCA CGCACACCTG AGCGGCGCCG ACGTGGTGGT 13750 GlnLeuAspS erLeuLeuHi sAlaHisLeu SerGly aA spValValVa
GACCACAACC TCAGGGCTCT CGCTGGCTTT CGATGGGG .C AGCTTCGTGC 13800 IThrThrThr SerC-lyLeuS erLeuAlaPh : spGlyAsp SerP eVaL¾ , 10 20 30 40 50
1 ?.34567890 123^557890 1234567890 1234567RQn 1234567890
GCCTGCGCGT GCCGGCGGCG TACGCGGCCT CTCTCTGTGG CTTATGCGGG 13850 rgLeuArgVa IProAlaAia TyrAlaAlaS erLeuCysGl vLeuCysGly
AACTACAACC AG ^CCCCGC AGACGACCTG AAGGCTGTGG GCGGG^AGCC 13900 AsnT rAsnG InAspPrcAl aAspAspLsu LysAlaValG lyGlyLysPr
CC IG^.TCG C^GGTGGGCG GGGCCCAGGG CTGCGGGGAA TGTGTC-TCCA 13950 oAiaGly r? GlnValGlyG lyAlaGlnC-l CysGl Glu CvsValSerL
AGCCATGCCC GTCGCCGTGC ACCCCAGAGC AGCAGGAGTC CTTCGGCGGC 14000 ysProCysPr oSerPrcCys ThrProGluG InGlnGiuSe rPheGlyGly
CCGGACGCCT GCGGCGTGAT CTCCGCCACC GACGGCCCGC TGGCACCCTG 14050 ProAspAlaC ysGlyVslIl eSerklaThi: AspGlyProL euAlaProGy
CCACGGCCTT GTGCCGCCGG CGCAGTACTT CC .GGGCTGC TTGCTGGA.CG 14100 sHisGlyLeu ValProProA laGlnTyrPh eGlnGlv ys LeuLeuAspA
CCTGCCAAG TCAGGGCCAT CCTGGAGGCC TCTGTCCTGC AGTGGCTACC 14150 laCysGlnVa IGlnGlyHis PrcGlyC-lyL euCysProAl aVaL¾iaThr
TACGTGGCAG CCTGTCAGGC CGCTGGGGCC CAGCTCGGCG AGTGGAGGCG 14200 TyrV ！Al£A laCysGlnAl aAlaC-lyAla GlnLeuGlyG luTrpArgAr
GCCGGACTTC TGTCCCTTGC AG GCCCTGC CCACAGCCAC TATGAGCTCT 14250 gProAspPhe CysProLeuG InCysProAi aHisSerHis TyrGluLeuC
GCGGTGACTC CTGCCCTGTG AGCTGCCCG^ GCCTCTCAGC ACCCGA.GGGC 14300 ysGlvAspSe rCysProVal SerCysProS erLeuSer aProGluGly
TGTGA.GTCGG CCTGCCGTGA AGGCTGTGTC TGCGATGCTG GCTTCGTACT 14350 CysGiuSerA laCysArgGl uGlvCvsVal CysAsp aG lyPheValLe
CAGTGGTGAC ACCTGCGTAC CCGTGGGCGV GTGTGGCTGC CTCCATG^.TG 14400 uSerGlv.^p ThrCvsValP roValGlvCl nCvsGlvCvs LeuHis ^cG · ypyyg5eGlsSsB snpiIAnAコ Trer A AC¾heeCs LeCALuGlusGlvvく <.
GCCTGaG OTT o
Figure imgf000112_0001
O 95/27057
10 20 30 40 50
1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 123456フ 890
TCCTGCCCAA TGGCTCAGCA GCGTCCAGTG TGGAG CCTT CGGGGCTGCA 15050 alLeuProAs nGlySerAla AlaSerSerV alGluThrPh eGlyAlaAla
TGGCGGGTGC CCGGCTCCTC C^AGGGCTGT GGCGA.GGGCT GCGGGCCCCA 15100 TrpArgValP rcGlySerSe rLysGlyCys GlyGluGlyC ysGlyProGl
AGGCTGCCCA GTGTGCTTGG C¾3¾GGAGAC TGCACCCTAT GAGA.GC¾A.CG 15150 nGiyCysPro ValCysLeuA laGluC-iuTh rAlaProT r GluSerAsnG
AGGCCTGCGG GCAGCTCCGG AACCCCCAGG GCCCCTTCGC GACCTGCCAG 15200 luAlaCysGi vGinLeuArg AsnProGlnG lyProPhe l aThrCysGin
GCGGTGCT ¾ GTCCCTCTG¾ GTACTTCCGC CAATGCGTAT ACG?.CCTGTG 15250 AlaValLeuS erProSerGl uTyrPheArg GinCysValT yrAspLeuCy
CGCGC AAAG GGTGACAAAG CCTTCCTGTG CCGCAGCCTG GCAGCCTACA 15300 sAlaGlnLys GlyAspLysA laPheLeuCy sArgSerLeu AiaAlaTyrT
CGGCGGCCTG TC¾GGC¾GCT GGCGTGGCCG TGAAGCCCTG G¾GGAC¾G .C 15350 hrAlaAlaCy sGlnAlaAla GlyValAlaV alLysProTr pArgThrAsp
AGCTTCTGCC CGCTCCATTG CCCCGCCC .C AGCCACTACT CCATCTGCAC 15400 SerPheCys? roLeuHisCy sProAlaHis SerHisTyrS erlleCysTh
TCGCA.CCTGC CAGGG -TCCT GTGCGGCTCT CTCCGGCCTC ACGGGC GCA 15450 rArgThrCys- GlnGlySerC ysAlaAlaLe uSerGlyLeu ThrGlvCysT
CCACCCGCTG TTTTGAGGGC TGTGA.GTGCG ACGACCGCTT CCTGCTTTCC 15500 hrThrArgCy sPheGluGly CysGluCysA spAspArgPh eLeuLeuSer -
CAGGGTGTCT GCATCCCTGT CC AGATTG GGCTGC¾CCC ATAATGGCCC- 15550 GlnGlyValC ysIieProVa IGinAspCys GlyCysThrH isAsnGlyAr
ATACTTGCCG GTAAACTCCT CCCTGCTG .C CTCAGACTGC AGCGAGCGCT 15600 gTyrLeuPro VaiAsnSerS erLeuLeuTh rSerAspCys SerGluArgC 10 20 30 40 50
567890 123^1567890 1234567890 1234567890 123 5π7Β90
GTTCCTGTTC CTCAAGCTCT GGCCTGACAT GCCAGGCCGC TGGCTGCCCA 15650 ysSerCysSe rSerSerSer GlyLeuThrC ysGlnAlaAl aGlyCysPro
CCAGGCCGTG TATGTG^GGT CAAGGCTG A GCCCGGAACT GCTGGGCCAC 15700 PrcGlyArgV alCysGluVa lLysAlaGlu a^ gAsnC ysTrpAlaTh
CCGTGGTCTC TGTGTCCTGT CTGTGGG GC C ACCTG CC ACCTTTGA.TG 15750 rArgGl Leu CysVaiLeuS erValGlyAl aAsnLeuThr ThrPheAspG
GGGCCCC-TGG TGCCACCACC TCTCCTGG G TCTATG?.GCT CTCTTCCCGC 15800 lyAiaArgGl yAlaThrThr SerPrcGlyV alTyrC-luLe uSerSerArg
TGCCCA.GGAC TAC¾GAATAC CATCCCCTGG TACCGTGTAG TTGCCG. AGT 15850 CysProGIyL euGlnAsnTh rlleProTrp TyrArgValV aL^iaGluVa
CC¾GA.TC GC C¾TGGC^A¾ CGGA.GGCTGT GGGCCAGGTC CACATCTTC 15900 IGlnlleCys HisGlyLysT hrGluAlaVs IGlyGlnVal HisIlePheP
TCG^GG¾TGG GATGG G .CG TTGAC C A ACAAGGGTGT GTGGGTGAAT 15950 heGlnAspC-1 yMstValThr LeuThrProA snLysGlyVa lTrpVaL sn
GGTCTCCGAC- TGGATCTCCC AGCTGAG AG TTAGCATCTG TGTCCGTG .G 16000 GlyLeu rgV slAspLeuPr oAlaGIuLys LeuAlaSerV alSerValSe
TCGTACACCT GATGGCTCCC TGCTAGTCCG CCAGAAGGCA GGGGTCCA.GG 15050 rArg hrPro-.AspGlySerL euLeuVaL r gGlnLysAla GlyValGlnV
TG GGCTTGG AGCC ATGGG . AGGTGGCTG TGA.TTGTC .G C^ATG CCAT 16100 alTrpLeuGl yAlaAsnGly LysVaL laV ailleValSe rAsnAspHis
GC GGGAAAC TGTGTGGGGC CTGTGGAAAC TTTG?-.CGGGG ACCAGACCAA 16150 AlaGIyLysL euCysGly aCysGlyAsn PheAspGlyA spGlnThrAs
TGATTGGCAT GACTCCCAGG ^AGCCAGC G\TGGi GAAA TGGAG .GCGC 16200 nAspTrpHis AspSerGlnG luLysProM al^!etGluLys TrpArg aG . 10 20 30 40 50 l¾3 5h7P,90 123 5 78Q0 123-3567890 1234507890
AGGACTTCTC CCCATGTTAT GGCTGATCAG TCATCCACCA GGAACGAAGA 16250 InAspPheSe rPrcCysTyr Gly
TTTCCTGAAG AAG^.CCTGC-T CCCTCTGGAG GTTGCGGTGG CTG AGGATG 16300
C TCATGTGC TCCTACCCTG CTCTACCC-CT TTTCTGGGTC CAG GGCCA 15350
AATGTGGAG CATTGAATAA ATATCTT^AG CT 16332

Claims

請求の範囲
1. 配列表の配列番号 6に示すァミノ酸配列をコードする塩基配列、 またはこ れを一部置換、 欠失もしくは付加した塩基配列、 あるいはこれらにハイブリダィ ズする塩基配列を含む DN Aおよびその DN A断片。
2. プラスミ ド pNVl 1— ST (生命研条寄第 4625号： FERM BP -4625) 中に挿入されている請求項 1記載の DNAおよびその DNA断片。
3. 配列表の配列番号 7に示すァミノ酸配列をコードする塩基配列、 またはこ れを一部置換、 欠失もしくは付加した塩基配列、 あるいはこれらにハイブリダィ ズする塩基配列を含む DNAおよびその DNA断片。
4. 請求項 1または 3記載の DNAまたはその DN A断片を含有する組換えべ クタ一。
5. 請求項 4記載の組換えべクターにより形質転換された原核または真核宿主 細胞。
6. 請求項 5記載の宿主細胞を培養し、 産生されたタンパク質を分離、 精製す ることを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
7. 組換えタンパク質が I gGF c部結合活性を示す請求項 6記載の組換えタ ンパク質の製造方法。
8. 請求項 5記載の宿主細胞を培養して得られる培養物を細胞内または細胞外 から分離、 精製して得られる組換え I gGF c部結合活性を示すタンパク質。
9. 請求項 1または 3記載の DN Aまたはその DN A断片をプローブとして用 いて、 ノーザンブロッ ト解析またはインサイチュハイブリダィゼーシヨン法によ. て I gGF c部結合タンパク質の mRNAの合成組織を同定する方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0847398A1 (en) * 1995-06-06 1998-06-17 Human Genome Sciences, Inc. Colon specific genes and proteins
US6337195B1 (en) 1995-06-06 2002-01-08 Human Genome Sciences, Inc. Colon specific genes and proteins
US9523127B2 (en) 1997-10-24 2016-12-20 The University Of Utah Research Foundation KCNQ2 and KCNQ3—potassium channel genes which are mutated in benign familial neonatal convulsions (BFNC) and other epilepsies

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8597910B1 (en) 1985-04-11 2013-12-03 Children's Medical Center Corporation DNA encoding Von Willebrand Factor (VWF) and methods and cells for producing VFW, and VFW produced by the DNA, methods and cells
US7135457B1 (en) * 1997-05-15 2006-11-14 Cytogen Corporation Random peptides that bind to gastro-intestinal tract (GIT) transport receptors and related methods
US7284072B2 (en) * 2003-08-13 2007-10-16 Broadcom Corporation DMA engine for fetching words in reverse order
JP2005112827A (ja) * 2003-10-10 2005-04-28 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 抗体アフィニティ担体
WO2009020824A1 (en) * 2007-08-03 2009-02-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Polynucleotides encoding stop codons in multiple reading frames and methods of use
JP5448424B2 (ja) * 2007-11-20 2014-03-19 タカラバイオ株式会社 ヒトＩｇＧのＦｃを含有するタンパク質の測定試薬
KR101247374B1 (ko) * 2008-06-26 2013-03-26 한국생명공학연구원 면역글로불린 Ｇ의 Ｆｃ 부위에 선택적으로 결합하는 신규펩타이드 및 그의 제조방법
EP2630499A2 (en) * 2010-10-21 2013-08-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biomarkers for hcv infected patients
KR102006997B1 (ko) * 2012-07-03 2019-08-02 한국생명공학연구원 ＩｇＧ Ｆｃ 위치선택적 결합 펩티드 및 이를 포함하는 하이브리드 분자

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989005351A2 (en) * 1987-12-04 1989-06-15 Schering Biotech Corporation Human fc-gamma receptor
GB8904762D0 (en) * 1989-03-02 1989-04-12 Glaxo Group Ltd Biological process

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIGESTIVE DISEASES AND SCIENCES, Vol. 39, No. 3, (Mar. 1994), K. KOBAYASHI et al., "Study of Colonic IgG Fc Binding Site in Cultured Epithelial Cells", pages 526-33. *
JOURNAL OF IMMUNOLOGY, Vol. 143, No. 8, (1989), K. KOBAYASHI et al., "Identification of a Unique IgG Fc Binding Site in Human Intestinal Epithelium", pages 2567-74. *
JOURNAL OF IMMUNOLOGY, Vol. 146, No. 1, (1991), K. KOBAYASHI et al., "The Molecular Configuration and Ultrastructural Locations of an IgG Fc Binding Site in Human Colonic Epithelium", pages 68-74. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0847398A1 (en) * 1995-06-06 1998-06-17 Human Genome Sciences, Inc. Colon specific genes and proteins
US6337195B1 (en) 1995-06-06 2002-01-08 Human Genome Sciences, Inc. Colon specific genes and proteins
EP0847398A4 (en) * 1995-06-06 2003-02-05 Human Genome Sciences Inc COLON-SPECIFIC GENES AND PROTEINS
US6831152B2 (en) 1995-06-06 2004-12-14 Human Genome Sciences, Inc. Colon specific genes and proteins
US9523127B2 (en) 1997-10-24 2016-12-20 The University Of Utah Research Foundation KCNQ2 and KCNQ3—potassium channel genes which are mutated in benign familial neonatal convulsions (BFNC) and other epilepsies

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Publication number Publication date
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EP0776972A1 (en) 1997-06-04
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US6271362B1 (en) 2001-08-07
ATE315644T1 (de) 2006-02-15
AU2085195A (en) 1995-10-23
DE69534743T2 (de) 2006-11-02
DE69534743D1 (de) 2006-04-06
EP0776972A4 (en) 1998-12-30
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