CN110662759A - 肿瘤靶向肽变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了选择性地结合αvβ6整合素的肽，所述肽具有包含基序X1BnRGDLX2X3X4ZmX5的氨基酸序列，其中X1为任何D‑氨基酸，Bn为任何n个氨基酸的序列，所述氨基酸可以是天然的或非天然的，D‑或L‑的，并且可以相同或不同，其中n为1至10的数字，X2和X3独立选自任何氨基酸，X4为Leu或Ile，Zm为任何m个氨基酸的序列，所述氨基酸可以是天然的或非天然的，D‑或L‑的，并且可以相同或不同，其中m为1至10的数字，X5为任何L‑或D‑氨基酸。还提供了包含所述肽的缀合物，包含所述肽或所述缀合物的药物组合物，以及例如所述肽、缀合物或组合物在哺乳动物对象中对表达αvβ6之肿瘤进行治疗、成像和/或诊断的用途。

Description

肿瘤靶向肽变体
本申请要求2017年4月24日提交的GB1706472.6的优先权，出于所有目的，其内容和要素通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及肽变体、其缀合物和药物组合物，以及它们在医学中(包括用于治疗癌症和对肿瘤进行成像)的用途。
背景技术
整合素是β异源二聚体分子，其涵盖大的细胞表面受体家族，参与多个关键过程，包括细胞黏附、侵袭、增殖和凋亡[23]。在人中，有24个成员，其中8个类别通过存在于细胞外配体(例如纤连蛋白和玻连蛋白)上的高度保守的三肽基序Arg-Gly-Asp识别底物[27]。整合素αvβ6在许多癌症上高水平表达[4-9]，所述癌症例如口腔癌、头颈癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌，并且整合素αvβ6的表达水平升高已与肿瘤的进展相关。整合素αvβ6也可促进纤维化[11]和一些病毒感染，包括口蹄疫(foot and mouth disease)[28]。因此，整合素αvβ6是肿瘤学及其他领域中用于成像、诊断和治疗的主要靶标[29-30]。
A20FMDV2(H2N-1NAVPNLRGDLQVLAQKVAR20T-OH)(SEQ ID NO：1)是来源于口蹄疫病毒的病毒蛋白质的20个残基的线性肽[1-3，10]。该肽已显示出对癌细胞中高度表达的整合素跨膜受体αvβ6具有高选择性和亲和力[4-9]。A20FMDV2通过7RGDLQV13L(SEQ ID NO：2)片段的RGD三肽与αvβ6结合，并且RGDLQVL片段中存在的两个亮氨酸残基通过疏水相互作用增强了肽与受体的结合[10]，并且其也通过由C端肽基序10Leu-20Thr产生的α-螺旋而稳定化[1]。另外，当与放射性铟(111In)偶联时，A20FMDV2是肺纤维化中αvβ6的有效显像剂[24]。[18F]氟苯甲酰基标记的肽[18F]FBA-A20FMDV2已在人类临床试验中用作PET放射性示踪剂[25]。
通过与4-[18F]氟苯甲酸(FBA)(或衍生物)缀合[32-34]，以及使用引入金属螯合剂(例如EDTA)的A20FMDV2肽的64Cu标记[35-37]，A20FMDV2已经用于诊断成像应用的正电子发射断层成像(positron emission tomography，PET)[31]。最近，[18F]-FBA-A20FMDV2在特发性肺纤维化的治疗方案中[24]已进展至临床环境[25]，而111In标记的A20FMDV2衍生物已被示出对于使用单光子发射计算机断层成像(single-photon emission computedtomography，SPECT)对表达αvβ6整合素的乳腺癌进行成像是高度特异性的[9]。这些研究概述了A20FMDV2对靶向αvβ6整合素的目前诊断工具的重要性，并且巩固了αvβ6作为有效治疗靶标。
WO2007/039723描述了αvβ6肽配体、其功能变体和编码它们的核酸，以及它们在αvβ6介导的疾病(包括癌症)的治疗和成像中的用途。
遗憾的是，A20FMDV2的治疗价值受到其在血液中的短半衰期的限制，部分原因是其对血清蛋白酶(例如内肽酶和外肽酶)的高度敏感性，如在小鼠血浆研究中确定的[13]。
改善易感肽(和蛋白质)的半衰期的一种经报道方法是引入聚乙二醇(PEG)[38]。Hausner等通过在N端布置一个或两个PEG28部分[13]或者通过在N端和C端二者布置单个PEG28[39]制备了4-[18F]-FBA-A20FMDV2的PEG化形式，并得出结论：双末端PEG化的A20FMDV2衍生物[18F]-FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28表现出最有利的药代动力学。
线性肽的头到尾的环化也是使通过外肽酶的降解最小化的公认方法[40]；然而，需要仔细的实验以防止发生不期望的副反应，例如聚合或外消旋化。
然而，对具有强效结合活性、细胞摄取和长血浆半衰期的肿瘤靶向肽仍然存在未满足的需求。本发明解决了这些和其他需求。
发明简述
广泛地，本发明涉及A20FMDV2肽变体，与A20FMDV2肽相比，已经在细胞研究中意外地发现其显示出增强的αvβ6结合活性，并且在一些情况下，其具有增强的细胞摄取。特别地，如本文中进一步详细描述的，与对照A20FMDV2肽相比，已发现这样的肽变体表现出向表达αvβ6的异种移植肿瘤(相对于缺乏αvβ6表达的对照异种移植肿瘤)中增强的生物分布，如通过各肽的111In标记的形式所评估的。因此，这样的肽变体具有作为靶向肿瘤的化学治疗递送剂和肿瘤显像剂的巨大潜力。
因此，在第一个方面，本发明提供了选择性地结合αvβ6整合素的肽，所述肽具有包含基序X1BnRGDLX2X3X4ZmX5(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列，其中X1是任何D-氨基酸，Bn是任何n个氨基酸的序列，所述氨基酸可以是天然的或非天然的，D-或L-的，并且可以相同或不同，其中n为1至10的数字，X2和X3独立选自任何氨基酸，X4为Leu或Ile，Zm为任何m个氨基酸的序列，其可以是天然的或非天然的，D-或L-的，并且可以相同或不同，其中m为1至10的数字，X5为任何L-或D-氨基酸。
在一些实施方案中，肽的长度为至少17、18、19或20个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度不超过30、29、28、27、26、25、24、23、22、21个氨基酸或不超过20个氨基酸。在某些实施方案中，肽的长度为17至25个氨基酸，例如19至21个氨基酸。在一些特别的实施方案中，肽的长度为20个氨基酸。
在一些实施方案中，X1为D-Asn。如本文中的表2和3以及图3和4中所示，其中X1为D-Asn的示例性肽(肽19、21、25和26)表现出优异的相对活性(表2)，向表达αvβ6-的肿瘤中的高生物分布(表3和图4)以及良好的血浆稳定性(图3)。
在一些情况下，X5为L-Thr或D-Thr。
在一些情况下，X4为L-Leu。
在一些情况下，n为5。在一些情况下，m为6。在某些情况下，n为5并且m为6。
在一些情况下，Bn为AVPNL(SEQ ID NO：4)、KVPNL(SEQ ID NO：5)或K(生物素)VPNL。如果Bn为K(生物素)VPNL，则生物素可以是附接至赖氨酸侧链的D-生物素。
在一些情况下，Zm为AQKVAR(SEQ ID NO：6)。
在某些情况下，肽的氨基酸序列选自：
H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH(SEQ ID NO：7)；
H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH(SEQ ID NO：8)；
H2N-[D-Asn]-K(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-COOH(SEQ ID NO：8)；
H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH(SEQ ID NO：9)；
H2N-[D-Asn]-K(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH(SEQ ID NO：9)；以及
H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH(SEQ ID NO：10)。
特别地，肽可以是
H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH(SEQ ID NO：7)。
在某些情况下，肽可以是N和/或C端修饰的。例如，肽可被N-乙酰化和/或C-酰胺化。
在第二个方面，本发明提供了包含本发明第一方面的肽的缀合物，所述肽直接或通过接头与治疗部分、聚合物、多肽和/或可检测部分缀合。
在一些实施方案中，所述肽与包含抗癌剂的治疗部分缀合。
在一些实施方案中，抗癌剂选自：澳瑞他汀(auristatin)、美登木素生物碱(maytansinoids)、微管溶素(tubulysin)、倍癌霉素(duocarmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、α-鹅膏蕈碱(alpha-amanitin)、吡咯并苯二氮
Figure BDA0002244362840000043
(pyrrolobenzodiazepine，PβD)、伊立替康(irinotecan)、以及吲哚甲酰胺类(indolecarboxamide)，或者其类似物、衍生物、前药或活性代谢物。特别地，所述抗癌剂可包含：一甲基澳瑞他汀E(Monomethyl Auristatin E，MMAE)、美坦辛(mertansine，DM1)、拉夫坦辛(ravtansine，DM4)或辛坦霉素(Centanamycin)。
在某些情况下，治疗部分可包含治疗同位素。例如，治疗部分可包含选自以下的同位素：177Lu、90Y、211At、213Bi、212Pb、225Ac、223Ra、44Sc、67Ga、131I、188Re、186Re和67Cu。
在一些情况下，肽与可检测部分缀合，所述可检测部分可通过磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)、磁共振波谱(Magnetic Resonance Spectroscopy，MRS)、单光子发射计算机断层成像(Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT)、正电子发射断层成像(Positron Emission Tomography，PET)或光学成像来检测。特别地，可检测部分可包含荧光团、放射性核素或自旋标记物(spin label)。在某些情况下，可检测部分可包含：68Ga、
Figure BDA0002244362840000041
700、800、异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)、89Zr、124I、64Gu、62Cu、18F、86Y、111In、131I、123I、67Ga或99mTc。
特别地，可检测部分包含通过包含螯合剂的接头与肽偶联的111In。特别地，螯合剂可选自：二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriamine pentaacetic acid，DTPA)、四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(tetrazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid，DOTA)或乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)。螯合剂(例如DTPA、DOTA或EDTA)可连接至肽的N端或C端(例如其可连接至N端的D-Asn)。
在一些情况下，肽与延长血浆半衰期和/或生物分布的聚合物缀合。特别地，该肽可与一个或更多个(例如一个或两个，例如在N端和C端的每一端)聚乙二醇(PEG)基团缀合。在某些情况下，该肽可与包含-(OCH2CH2)n-的部分缀合，其中n≥1。特别地，n可以是是1至100、1至50、10至40、或20至30。例如，n可以是1或2。在某些情况下，肽可具有存在于N端或C端的两个乙二醇基团。
在第三个方面，本发明提供了药物组合物，其包含：
本发明第一个方面的肽或本发明第二个方面的缀合物；以及
可药用载体。
在第四个方面，本发明提供了本发明第一个方面的肽、本发明第二方面的缀合物或本发明第三方面的药物组合物，其用于医学。
在第五个方面，本发明提供了本发明第一个方面的肽、本发明第二个方面的缀合物或本发明第三个方面的药物组合物，其用于在哺乳动物中治疗表达αvβ6之肿瘤的方法。在一些实施方案中，所述肿瘤是宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。在特定情况下，缀合物或其药物组合物是包含一种或更多种所述抗癌剂的缀合物。在某些情况下，治疗方法可包括确定哺乳动物对象中的肿瘤是否表达αvβ6的步骤，其中如果确定肿瘤表达αvβ6，则进行所述治疗。
在第六个方面，本发明提供了治疗具有表达αvβ6之肿瘤的哺乳动物对象的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明第一个方面的肽、本发明第二个方面的缀合物、或本发明第三个方面药物组合物。在一些实施方案中，所述肿瘤是宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。在特定情况下，缀合物或其药物组合物是包含一种或更多种所述抗癌剂的缀合物。在某些情况下，治疗方法可包括确定哺乳动物对象中的肿瘤是否表达αvβ6的步骤，其中如果确定肿瘤表达αvβ6，则进行所述治疗。
在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面的肽、本发明第二个方面的缀合物或本发明第三个方面的药物组合物在制备用于在哺乳动物对象中治疗表达αvβ6之肿瘤的药物中用途。在一些实施方案中，所述肿瘤是宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。在特定情况下，缀合物或其药物组合物是包含一种或更多种所述抗癌剂的缀合物。在某些情况下，治疗方法可包括确定哺乳动物对象中的肿瘤是否表达αvβ6的步骤，其中如果确定肿瘤表达αvβ6，则进行所述治疗。
根据本发明的第四、第五、第六或第七个方面，所述肽、缀合物或药物组合物可与其他抗癌剂和/或放射治疗或手术一起施用或用于与其一起施用。特别地，具体地考虑了与第二化学治疗剂(同时、相继、分开或并行)和/或与放射治疗和/或在术前或术后的联合治疗。不希望受任何特定理论的束缚，本发明人相信与单药治疗相比，将本发明的基于αvβ6靶向肽或缀合物的治疗与一种或更多种受体酪氨酸激酶(RTK)的阻断相组合可增强抗癌治疗的有效性。初步抗体研究表明，αvβ6调节并可增强RTK信号转导。此外，相对于单药治疗，与抗αvβ6抗体组合的靶向肿瘤模型中的RTK(例如，表皮生长因子受体(EGFR)或erbB-2(也称为人表皮生长因子受体2或HER2/neu))增强了治疗。因此，本文中具体地考虑了本发明的基于αvβ6靶向肽或缀合物的治疗可特别地与以下一种或更多种组合：曲妥珠单抗
Figure BDA0002244362840000061
吉非替尼
Figure BDA0002244362840000062
厄洛替尼
Figure BDA0002244362840000063
拉帕替尼
Figure BDA0002244362840000064
西妥昔单抗和帕尼单抗
Figure BDA0002244362840000066
在第八个方面，本发明提供了在哺乳动物对象中对表达αvβ6之肿瘤进行成像的方法，其包括向该荷瘤对象施用本发明第二个方面的缀合物或其组合物，所述缀合物包含所述可检测部分，以及检测所述可检测部分，从而形成所述肿瘤的图像。通常来说，图像将在显示器(例如，数字显示屏)上形成，但是本文中具体地考虑了在对象的身体上或身体内直接成像。在一些实施方案中，所述肿瘤是宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。
在第九个方面，本发明提供了本发明第二个方面的缀合物或其组合物，所述缀合物包含所述可检测部分，用于在哺乳动物对象中诊断癌症的体内方法，其中所述方法包括向所述对象施用所述缀合物或所述其组合物，以及检测所述可检测部分，从而诊断所述对象中表达αvβ6之肿瘤的存在。在一些情况下，检测所述可检测部分包括测量所述可检测部分的量、浓度、水平、强度和/或位置，以及关联或解释该测量结果(例如通过将测量结果与参考水平、背景或对照进行比较)以确定测量结果是否表明对象中和/或对象体内特定位置处表达αvβ6之肿瘤的存在。在一些实施方案中，所述肿瘤是宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。
在第十个方面，本发明提供了癌症诊断方法，其包括向怀疑具有表达αvβ6之肿瘤的哺乳动物对象施用本发明第二方面的缀合物或其组合物，所述缀合物包含所述可检测部分；以及检测所述可检测部分，从而在所述对象中诊断表达αvβ6之肿瘤的存在。在某些情况下，检测所述可检测部分包括测量所述可检测部分的量、浓度、水平、强度和/或位置，以及关联或解释该测量结果(例如通过将测量结果与参考水平、背景或对照进行比较)以确定测量结果是否表明对象中和/或对象体内特定位置处表达αvβ6之肿瘤的存在。在一些实施方案中，所述肿瘤是宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。
根据本发明，对象可以是人、伴侣动物(例如狗或猫)、实验动物(例如小鼠、大鼠、兔、猪或非人灵长类)、家畜或农场动物(例如，猪、牛、马或绵阳)。优选地，对象是人。在某些情况下，对象是患有、被诊断具有或怀疑具有表达αvβ6之肿瘤的人。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非明显不允许或指出明确地避免这样的组合。本发明的这些以及另一些方面和实施方面在下面并且参考所附实施例和附图更详细地描述。
附图简述
图1显示了用于合成肽2-15的非蛋白质原性氨基酸(non-proteinogenic aminoacid)的结构。
图2显示了体外测试的肽22与肽25比较。筛选所有A20FMDV2变体的特异性、活性和内化。A)特异性为在1000nM下不存在与A375Puro的结合(上方直方图)，而仅与A375Pβ6结合(下方直方图)，并且该直方图的位移显示了通过Ai)肽22(左侧直方图)和Aii)肽25(右侧直方图)示出的在相同的100nM浓度下通过流式细胞术的平均荧光强度(Mean FluorescentIntensity，MFI)的几何平均值(Geometric Mean，GM)。B)通过流式细胞术测量在0.1、1、10、100和1000nM下与A375Pβ6的结合水平来确定亲和力。结果显示相对于商业来源的对照生物素化-A20FMDV2的肽结合。来自单个代表性实验的数据显示，与Bi)肽22(左侧图)相比，Bii)肽25(右侧图)在类似浓度下与A375Pβ6的结合得更好。C)内化显示使用由A375Pβ6细胞的αvβ6依赖性内化。数据显示了在0分钟时细胞表面的肽(绿色，每组中的右侧图像)，并且45分钟后，Ci)肽22和Cii)肽25已被内化，并且其具有类似的内化率(参见图像下方的图；肽22左侧图，肽25右侧图)。
图3显示了肽在人血浆(n＝2)和PBS(对照)中24小时之后的稳定性。与小于50％稳定的肽23和24相比，肽22、25和26在血浆中大于75％稳定。使用液相色谱-质谱法(LC-MS)对肽水平进行定量。24小时之后测定人血浆(标记为“血液”，每种肽的右侧条)和PBS(每种肽的左侧条)中肽的稳定性。在该实验中，PBS用作对照。
图4显示阳性表达αvβ6之肿瘤和阴性对照肿瘤(A375Puro)中111In-DTPA偶联肽的摄取。与阴性肿瘤(红色；每种肽的左侧条)相比，这些肽被特异性地摄入到表达αvβ6之肿瘤中(蓝色；每种肽的右侧条)。通过比例A375Puro∶A375β6示出了相对摄取。数据显示，与阴性肿瘤相比，25对表达αvβ6之肿瘤的特异性高几乎10倍。数据绘制为肽22-26中每一种的每克组织的平均注射剂量(Injected Dose，ID)±平均值的标准误(Standard Error oftheMean，SEM)。
发明详述
在描述本发明时，将采用以下术语，并且其意在如下所指出进行定义。
肽变体和非天然氨基酸
如本文中所定义，本发明的肽是亲本A20FMDV2肽的变体，并且可包含一个或更多个非天然氨基酸，前提是该肽如权利要求中所限定。合适的非天然氨基酸包括例如D-氨基酸、鸟氨酸、二氨基丁酸鸟氨酸、正亮氨酸鸟氨酸、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸、苯基甘氨酸、α和α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、天然氨基酸的卤化物衍生物(例如三氟酪氨酸、对-C1-苯丙氨酸、对-Br-苯丙氨酸、对-I-苯丙氨酸)、L-烯丙基-甘氨酸、β-丙氨酸、L-a-氨基丁酸、L-g-氨基丁酸、L-a-氨基异丁酸、L-e-氨基己酸、7-氨基庚酸、L甲硫氨酸砜、L-正亮氨酸、L-正缬氨酸、对硝基-L-苯丙氨酸、L-羟脯氨酸、L-硫代脯氨酸、苯丙氨酸的甲基衍生物(例如1-甲基-Phe、五甲基-Phe)、L-Phe(4-氨基)、L-Tyr(甲基)、L-Phe(4-异丙基)、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)、L-二氨基丙酸和L-Phe(4-苄基)。所述肽可被进一步修饰。例如，一个或更多个酰胺键可被酯或烷基主链键替代。可存在N或C烷基取代基、侧链修饰或约束(constraint)，例如二硫键(disulphide bridge)、侧链酰胺或酯键(ester linkage)。
本发明的肽可包含经修饰肽和合成肽类似物二者。可例如对肽进行修饰以改善配制和储存性质，或者通过引入非肽结构来保护不稳定的肽键。
本发明的肽可包含N端和/或C端修饰。例如，N-端乙酰化和/或C-端酰胺化。
可使用本领域已知的方法来制备本发明的肽。例如，可通过化学合成(例如固相技术和自动化肽合成仪)或通过重组方式(使用核酸，例如本文中描述的那些)产生肽。例如，可使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)化学在自动化多重肽合成仪(Abimed AMS 422)上使用固相策略合成肽。然后可通过反相HPLC来纯化肽并冻干。在下面的实施例中描述了用于制备本发明肽的特定合成方法。
在一些情况下，X2和X3是螺旋促进残基。在一些情况下，Zm氨基酸是螺旋促进残基。本文中使用的螺旋促进残基可独立地选自Glu、Ala、Leu、Met、Gln、Lys、Arg、Val、Ile、Trp、Phe和Asp。螺旋促进残基可包含一个或更多个人工或经修饰的氨基酸。
可检测部分
如本文中所用，本发明的肽可与可检测部分缀合。术语“可检测部分”是指这样的部分，其在本发明的缀合物施用到患者中之后位于靶位点时，可通常从身体和所定位的靶位点外部非侵入性地检测。因此，本发明该实施方案的缀合物可用于成像和诊断。易于检测的部分是可通过成像技术(例如磁共振成像(MRI)、磁共振波谱(MRS)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、正电子发射断层成像(PET)或光学成像)检测的实体。优选地，成像部分是在体外和体内条件下保持其特性的稳定的无毒实体。这样的部分的实例包括但不限于放射性部分，例如放射性同位素。合适的放射性原子包括用于闪烁显像(scintigraphic)研究的铟-111、锝-99m或碘-123。其他可容易地检测的部分包括，例如，用于MRI的自旋标记物，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-18、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁以及包括Cy5.5和量子点的光学部分。可检测部分的其他实例包括68Ga、
Figure BDA0002244362840000101
700、
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800、异硫氰酸荧光素(FITC)、89Zr、124I、64Cu、62Cu、18F、86Y、111In、131I、123I、67Ga和99mTc。
术语“治疗部分”涵盖具有有益、预防和/或治疗性质的部分。
细胞毒性化学治疗剂是本领域中公知的，并且包括抗癌剂，例如：烷基化剂，包括氮芥类，例如二氯甲基二乙胺(HN2)、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(L-溶肉瘤素(L-sarcolysin))和苯丁酸氮芥；10乙撑亚胺(ethylenimine)和甲基密胺(methylmelamine)，例如六甲密胺(hexamethylmelamine)、噻替派(thiotepa)；烷基磺酸酯类，例如白消安；亚硝基脲类，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNLJ)、司莫司汀(semustine)(甲基-CCN-U)和链脲菌素(streptozotocin)；以及三氮烯，例如达卡巴嗪(decarbazine)(DTIC；二甲基三氮烯咪唑甲酰胺(dimethyltriazenoimidazolecarboxamide))；
抗代谢物，包括叶酸类似物，例如甲氨蝶呤(氨甲喋呤)；嘧啶类似物，例如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)，氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)和阿糖胞苷(阿糖胞苷(cytosinearabinoside))；以及嘌呤类似物和相关的抑制剂，例如巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)，硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)和喷司他丁(pentostatin)(2′-脱氧助间型霉素(2′-deoxycofonnycin))。天然产物，包括长春花生物碱，例如长春碱(VLB)和长春新碱；表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，例如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，例如更生霉素(放线菌素D)，柔红霉素(daunorabicin)(道诺霉素(daunomycin)；红比霉素(rubidomycin))，多柔比星(doxorubicin)，博来霉素(bleomycin)，普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))和丝裂霉素(mitomycin)(丝裂霉素Q；酶，例如L-天冬酰胺酶；以及生物反应调节剂，例如干扰素α(interferon alphenomes)。杂类药剂，包括铂配合物，例如顺铂(cis-DDP)和卡铂；蒽醌类(anthracenedione)，例如米托蒽醌(mitoxantrone)和蒽环类(antbracycline)；经取代脲，例如羟基脲；甲基肼衍生物，例如丙卡巴肼(procarbazine)(N-甲基肼，MIH)；以及肾上腺皮质激素抑制剂，例如米托坦(o，p′-DDD)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；泰素及类似物/衍生物；以及激素激动剂/拮抗剂，例如氟他胺(flutamide)和他莫昔芬(tamoxifen)。
特别地，本发明的肽可与选自以下的抗癌剂缀合：澳瑞他汀、美登木素生物碱、微管溶素、倍癌霉素、卡奇霉素、α-鹅膏蕈碱、吡咯并苯二氮
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(PBD)、伊立替康、以及吲哚甲酰胺类，或者其类似物、衍生物、前药或活性代谢物。一些具体实例包括：一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、美坦辛(DM1)、拉夫坦辛(DM4)和辛坦霉素。
在某些情况下，抗癌剂可以是细胞毒性肽或多肽部分，据此我们包括了任何导致细胞死亡的部分。
细胞毒性肽和多肽部分是本领域中公知的，并且包括例如蓖麻毒蛋白(ricin)、相思豆毒蛋白(abrin)、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、组织因子等。
蓖麻毒蛋白作为细胞毒性剂的用途描述于Burrows&Thorpe，P.N.A.S.USA 90：8996-9000，1993，其通过引用并入本文，并且使用导致肿瘤的局部血液凝结和梗死的组织因子已由Ran et al，Cancer Res.58：4646-4653，1998和Huang et al，Science 275：25547-550，1997描述。Tsai et al，Dis.Colon Rectum 38：1067-1074，1995描述了与单克隆抗体缀合的相思豆毒蛋白A链，并且通过引用并入本文。另一些核糖体失活蛋白在WO 96/06641中被描述为细胞毒性剂。假单胞菌外毒素也可用作细胞毒性多肽部分(参见例如Aiello et al，P.N.A.S.USA 92：10457-10461，1995.)。
如果以足够的剂量递送，某些放射性原子也可具有细胞毒性。因此，抗癌剂可包含放射性原子，其在使用中将足够量的放射性传递至靶位点从而具有细胞毒性。合适的放射性原子包括磷-32、碘-125、碘-131、铟-111、铼-186、铼-188、砹-211或钇-90，或发射足够能量以破坏相邻细胞、细胞器或核酸的任何其他同位素。特别地，治疗性放射性同位素可选自：177Lu、90Y、211At、213Bi、212Pb、225Ac、223Ra、44Sc、67Ga、131I、188Re、186Re和67Cu。优选地，本发明化合物中放射性原子的同位素和密度使得将大于4000cGy、且更优选至少6000、8000或10000cGy的剂量递送至靶位点，并优选递送至靶位点的细胞及其细胞器，特别是胞核。放射性原子可以以已知方式连接至结合部分。例如，EDTA、DTPA、DOTA或其他螯合剂可连接至本发明的肽，并用于连接金属放射性核素，包括111In、68Ga、90Y或如上所述的放射性原子。酪氨酸残基可引入到本发明的肽中并且可用125I或131I标记。
将肽与治疗剂缀合的方法是本领域中公知的。这些可包括使用接头，例如可切割的接头。
术语“可药用载体”通常包括与肽或其缀合物相容并且对其接受者无害的组分。通常来说，载体将是无菌和无热原的水或盐水；然而，可使用其他可接受的载体。通常来说，本发明的药物组合物或制剂用于肠胃外施用，更特别地用于静脉内施用。
如本领域技术人员公知的，如上限定的本发明的药物或药物组合物可有效地施用于还施用其他药物的患者。例如，在癌症的情况下，可在施用其他抗癌剂之前、之后或期间(例如在化学治疗之前、之后或期间)，施用本发明的药物或药物组合物。在化学治疗之后用肽进行治疗可特别地用于降低或防止肿瘤复发或转移。例如，抗肿瘤剂可与本发明的肽直接或间接地共价连接。
确定ανβ6表哒
技术人员将知晓用于确定样品(例如肿瘤样品)是否表达整合素αvβ6的多种技术。在一些特别的实施方案中，待治疗的对象可患有具有表达整合素αvβ6的一种或更多种细胞的肿瘤。在某些情况下，肿瘤表达整合素αvβ6(即其为αvβ6阳性癌症)的发现可以是先前进行的，或者可从癌症类型中推断。例如，已知多种肿瘤类型表达整合素αvβ6，包括宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。不希望受任何特定理论的束缚，本发明人相信胃肠道(GI)道癌症和从许多上皮组织发生的癌可受益于使用本发明的肽或缀合物的αvβ6-靶向治疗。随着通过额外的研究工作发现表达αvβ6的癌症范围的扩大，因此预期可从使用本发明的肽或缀合物的αvβ6靶向治疗中显示出治疗益处的癌症的范围也在增大。
作为补充或替代，在某些情况下，治疗可包括确定肿瘤是否表达整合素αvβ6的主动步骤。这样的步骤可例如在开始用本发明的αvβ6靶向肽或缀合物的治疗之前进行，以便预测对象对于使用本发明的αvβ6靶向肽或缀合物进行治疗的可能的适合性。确定αvβ6的表达可涉及使用免疫组织化学测量肿瘤样品中的蛋白表达和/或水平，通过ELISA或Western印迹测量细胞裂解物中的蛋白水平，和/或使用能够与αvβ6或其片段或亚基特异性结合的结合剂。
在某些实施方案中，确定对象是否患有αvβ6-阳性癌症可对从获自癌症的细胞样品、从血液中循环的癌细胞样品和/或从血液或血浆中的循环肿瘤DNA(ctDNA)提取的核酸进行。
在某些情况下，确定αvβ6的表达包括从癌细胞样品提取RNA，并通过实时PCR和/或通过使用能够与编码αvβ6或其片段的RNA杂交的探针来测量表达。αvβ6整合素的存在或量可使用能够与αvβ6或其片段特异性结合的结合剂(例如本发明的抗体或肽或缀合物)直接测定。可对结合剂进行标记，以使其能够被检测和/或能够在与一种或更多种另外的物质反应之后检测，例如，使用被标记或能够产生可检测结果的二抗，例如在ELISA型测定中。
样品
如本文中所用，“受试样品”可以是细胞或组织样品(例如活检)、生物流体、提取物(例如从对象获得的蛋白质或DNA提取物)。特别地，样品可以是肿瘤样品、血液样品(包括血浆或血清样品)、脑脊髓液样品或非肿瘤组织样品。样品可以是从对象新鲜获得的样品，或者可以是在确定之前已被处理和/或储存的样品(例如，冷冻、固定或经历一个或更多个纯化、富集或提取步骤)。已经描述了用于富集血液或血浆样品的循环肿瘤DNA的技术(例如基于片段大小)。此外，已经描述了用于鉴定ctDNA中与癌症相关的突变的测序技术(例如，基于数字PCR、靶向深度测序、嵌套实时PCR等)。
在本文中使用的“和/或”应被视为具体公开了在具有或不具有另一个的情况下两个指定特征或部件中的每一种。例如，“A和/或B”应视为具体公开了(i)A、(ii)B以及(iii)A和B中的每一种，就像每个在本文中单独列出一样。
以其具体形式或根据用于执行所公开的功能的方式或用于获得所公开的结果的方法或过程在前文描述中、或在所附权利要求中或在附图中公开的特征适当时可单独地或以这样的特征的任何组合用于以其不同的形式实现本发明。
尽管已经结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是当考虑本公开时，许多等同的修改和变化对于本领域技术人员将变得明显。因此，以上阐述的本发明的示例性实施方案被认为是举例说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所描述的实施方案进行多种改变。为了避免任何疑问，提供本文中提供的任何理论解释是为了改善读者的理解。发明人不希望受到任何这些理论解释的束缚。
本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。
在整个说明书(包括所附的权利要求书)中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和“包含”以及变化形式将被理解为暗示包含所指出的整体或步骤或者整体或步骤的组，但是不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。
必须注意的是，说明书和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种，除非上下文另外明确指出。范围可在本文中表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一实施方案包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用在前的“约”将值表示为近似值时，将理解的是，特定值形成另一实施方案。相对于数值的术语“约”是任选的，并且是指例如+/-10％。
以下通过实施例的方式给出，并且不应被解释为对权利要求范围的限制。
实施例
为了使得能够通过流式细胞术测量与αvβ6整合素的结合活性，合成所有的肽，其引入2Lys(D-生物素)残基而不是天然Ala(即，如WO2007/039728中所公开的A20FMDV2，其在第2位处具有Ala)。为了进行比较，我们将自己的SPPS合成肽与商业合成的生物素化A20FMDV2(在下表2中称为生物素化A20FMDV2-A)进行了比较。在活性研究之后，然后选择表现出强结合活性的生物素化肽，并引入金属螯合剂二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)[17]以促进111In的偶联，用于血浆稳定性研究和体内生物分布研究。下文详细描述了生物素化的A20FMDV2、其非蛋白质原性衍生物以及生物素化和引入DPTA的类似物的合成、结合研究和血浆稳定性。
实验
一般信息
所有试剂均作为试剂级购买，并且在没有进一步纯化的情况下使用。HPLC溶剂作为HPLC级购买，并且在没有进一步纯化的情况下使用。FmocNH-L-Thr(tBu)-O-CH2-phi-OCH2-CH2-CO2H购自PolyPeptide(Strasbourg，France)。O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、Rink酰胺、4-(羟甲基)苯氧基乙酸(HMP)、Boc酸酐和N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)购自GL Biochem(中国上海)。N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(AR级)和乙腈(CH3CN)(HPLC级)购自Scharlau(Barcelona，Spain)。二异丙基乙胺(iPr2NEt)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、哌啶、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、可力丁(collidine)、1，8-二氮杂双环十一碳-7-烯(DBU)、2-巯基乙醇、三异丙基硅烷(TIPS)和3，6-二氧杂-1，8-辛二硫醇(DODT)购自Sigma-A1drich(StLouis，MO)。2-硝基苯磺酰氯(2-NBS-Cl)和硫酸二甲酯(DMS)获自K Scientific(UnionCity，CA)。三氟乙酸(TFA)购自Oakwood Chemicals(River Edge City，CA)。氨基甲基聚苯乙烯树脂和DTPA根据公开的程序[21，22]合成。Fmoc氨基酸购自GL Biochem，具有以下侧链保护：Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf＝2，2，4.6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、Fmoc-Asn(Trt)-OH(Trt＝三苯甲基)、Fmoc-Asp(tBu)-OH(tBu＝叔丁基)、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Dab(Boc)-OH、Fmoc-Dap(Boc)-OH、Fmoc-D-Thr(tBu)-OH和Fmoc-D-Asn(Trt)-OH。
电喷雾电离质谱(Electrospray ionisation mass spectra，ESI-MS)记录在与在线Hewlett Packard(Palo Alto，CA)1100MSD质谱仪相连的Agilent Technologies(SantaClara，CA)1120 Compact LC上。使用0.1％甲酸/H2O和0.1％甲酸/CH3CN(1∶1，v/v)，使用直接流动进样以0.2mL/分钟将样品引入到正模式的ESI源中。以xm/z(质荷比)的形式引用主要和重要片段。在Ultimate 3000系统上使用Waters
Figure BDA0002244362840000151
C18柱(5μm，4.6×150mm)，以1mL/min的流量进行分析型RP-HPLC。使用0.1％TFA/H2O(溶剂A)和0.1％TFA/CH3CN(溶剂B)的线性梯度，并在210nm处检测。在具有Waters 2487双波长吸光度检测器的Waters 600系统上使用Waters
Figure BDA0002244362840000152
Prep MS C18柱(10μm，19×300mm)，以10mL/分钟的流量进行制备型RP-HPLC。根据从分析型RP-HPLC色谱图中获得的洗脱曲线和峰曲线调整梯度系统。
一般肽合成程序
基于Fmoc化学策略，在氨基甲基聚苯乙烯树脂(0.8mmol/g)上进行固相肽合成(0.1mmol规模)。使用一般方法A(参见下文)将FmocNH-L-Thr(tBu)-O-CH2-phi-OCH2-CH2-CO2H连接至树脂，使用一般方法B将Rink酰胺连接至树脂，并且使用一般方法C将HMP偶联至树脂[20]。使用一般方法D实现Fmoc-D-Thr(tBu)-OH的偶联。使用一般方法E手动或者在TributeTM(Tucson，AZ)肽合成仪上合成期望的肽序列，并且使用一般方法F进行肽键N-甲基化[19]，并且使用一般方法G进行Fmoc-Gln(Trt)-OH与N-甲基化赖氨酸的偶联。使用一般方法H进行N端乙酰化，并且使用一般方法I将叔丁基保护的DTPA偶联至肽。使用一般方法J将D-生物素连接至肽。使用一般方法K从树脂上切割线性肽，并且根据一般方法L纯化粗制产物。
一般方法A：将FmocNH-L-Thr(tBu)-O-CH2-phi-OCH2-CH2-CO2H连接至氨基甲基聚苯乙烯树脂
将氨基甲基聚苯乙烯树脂(0.1mmol)在CH2Cl2/DMF(1∶1，v/v)中溶胀20分钟，并通过过滤除去溶剂。向树脂添加FmocNH-L-Thr(tBu)-O-CH2-phi-OCH2-CH2-CO2H(2当量)在10％DMF/CH2Cl2(1mL，v/v)中的溶液，然后添加DIC(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌3小时。排干溶液，并将树脂用DMF(3×5mL)、CH2Cl2(3×5mL)洗涤并且风干，以得到16。Kaiser测试阴性[41]表明反应完全。
一般方法B：将Rink酰胺连接至氨基甲基聚苯乙烯树脂
将氨基甲基聚苯乙烯树脂(0.1mmol)在CH2Cl2/DMF(1∶1，v/v)中溶胀20分钟，并通过过滤除去溶剂。向树脂添加Rink酰胺(2当量)在10％DMF/CH2Cl2(1mL，v/v)中的溶液，然后添加DIC(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌3小时。排干溶液，并将树脂用DMF(3×5mL)、CH2Cl2(3×5mL)洗涤并且风干。Kaiser测试阴性表明反应完全。
一般方法C：将4-(羟甲基)苯氧基乙酸(HMP)连接至氨基甲基聚苯乙烯树脂(树脂27的合成)
将氨基甲基聚苯乙烯树脂(0.1mmol)在CH2Cl2/DMF(1∶1，v/v)中溶胀20分钟，并通过过滤除去溶剂。向树脂添加HMP(2当量)在10％DMF/CH2Cl2(1mL，v/v)中的溶液，然后添加DIC(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌3小时。排干溶液，并将树脂用DMF(3×5mL)、CH2Cl2(3×5mL)洗涤并且风干，以得到27。Kaiser测试阴性[表明反应完全。
一般方法D：将Fmoc-D-Thr(tBu)-OH连接至HMP-树脂27
向树脂添加Fmoc-D-Thr(tBu)-OH(2当量)在DMF(1mL)中的溶液和DIC(2当量)，然后逐滴添加DMF(100μL)中的DMAP(10％当量)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。在排干溶液并用DMF(3×5mL)洗涤树脂后，再重复酯化2小时。向树脂中滴加20％乙酸酐/DMF(1mL)和DMAP(10％当量)在DMF(100μL)中的溶液，并将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后排干溶液并用DMF(3×5mL)洗涤树脂。
一般方法E：手动和自动Fmoc SPPS
向Fmoc保护的氨基酸(5当量)在DMF(1mL)中的溶液添加HBTU(4.75当量)和iPr2NEt(10当量)，并将该溶液添加至树脂。在将混合物在室温下搅拌30分钟后，排干溶液并用DMF(3×5mL)洗涤树脂。通过在室温下用20％哌啶/DMF(5mL，v/v)处理5分钟然后10分钟移除Fmoc保护基。
一般方法F：肽键N-甲基化
NBS保护：向2-NBS-Cl(4当量)在NMP(1mL)中的溶液添加可力丁(10当量)，然后将溶液添加至树脂，并将反应混合物在室温下搅拌15分钟。在排干溶液并用NMP(3×5mL)洗涤树脂之后，将反应再重复10分钟。N-甲基化：向树脂添加DBU(3当量)在NMP(1mL)中的溶液，并将反应混合物在室温下搅拌3分钟。然后将DMS(10当量)在NMP(1mL)中的溶液添加至反应混合物，并将反应混合物在室温下搅拌2分钟。在排干溶液并用NMP(3×5mL)洗涤树脂之后，将反应再重复2分钟。NBS脱保护：向树脂添加2-巯基乙醇(10当量)和DBU(5当量)在NMP(2mL)中的溶液，并将反应混合物在室温下搅拌5分钟。在排干溶液并用NMP(3×5mL)洗涤树脂之后，将反应再重复5分钟。
一般方法G：将Fmoc-Gln(Trt)-OH偶联至N-甲基化Lys
向Fmoc-Gln(Trt)-OH(5当量)在DMF(1mL)中的溶液添加HATU(4.75当量)和iPr2NEt(10当量)，并将溶液添加至树脂中并将反应混合物在室温下搅拌3小时。在排干溶液并用DMF(3×5mL)洗涤树脂之后，将反应再重复3小时。
一般方法H：N末端乙酰化
向树脂添加20％乙酸酐/DMF(1mL)的溶液，然后逐滴添加DMAP(10％当量)在DMF(100μL)中的溶液。在将反应混合物在室温下搅拌30分钟之后，排干溶液并用DMF(3×5mL)洗涤树脂。
一般方法I：连接叔丁基保护的DTPA
向42(5当量)在DMF(1mL)中的溶液添加HBTU(4.75当量)和iPr2NEt(10当量)，并将溶液添加至树脂。在将混合物在室温下搅拌30分钟之后，排干溶液并用DMF(3×5mL)洗涤树脂。
一般方法J：连接D-生物素
为了合成肽1-15以及肽17、19、20和21，通过在室温下用20％哌啶/DMF(5mL，v/v)处理5分钟然后10分钟移除N端Fmoc基团。在用DMF(3×5mL)洗涤之后，向树脂添加(Boc)2O(5当量)在DMF(1mL)中的溶液，并将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后用DMF(3×5mL)洗涤。通过在室温下使用2％肼/DMF(5mL，v/v)5分钟并用新鲜试剂重复10分钟移除Dde基团。在用DMF(3×5mL)洗涤之后，将D-生物素(5当量)、HBTU(4.75当量)和iPr2NEt(10当量)在DMF(1mL)中溶液添加至树脂，并将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后用DMF(3×5mL)洗涤。
为了合成肽16和18以及肽22-26，在室温下使用2％肼DMF(5mL，v/v)5分钟并且用新鲜试剂重复10分钟移除Dde基团。在用DMF(3×5mL)洗涤之后，将D-生物素(5当量)、HBTU(4.75当量)和iPr2NEt(10当量)在DMF(1mL)中溶液添加至树脂，并将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后用DMF(3×5mL)洗涤。
一般方法K：从树脂切割肽
将含有期望的线性肽的树脂在TFA/H2O/DODT/TIPS(94∶2.5∶2.5∶1.0，5mL，v/v/v/v)的混合物中搅拌3小时。向滤液添加冷乙醚(30mL)，并将产物混合物离心10分钟，然后弃去上清液。将该过程重复两次。将得到的固体溶解在H2O/CH3CN+0.1％的溶液(15mL)中并冻干。
一般方法L：纯化
将粗制肽溶解在H2O/0.1％TFA溶液中，并通过制备型反相(RP)-HPLC在
Figure BDA0002244362840000181
C18柱上进行纯化，其以10mL/分钟的流量使用0.5％B/分钟、然后0.2％B/分钟、直至35％B的5-20％B的梯度。通过流动进样(ESI+，100V)和分析型RP-HPLC(
Figure BDA0002244362840000182
C18柱，5-95％B，3％B/分钟，1mL/分钟)确定肽的纯度。
生物学研究
肽的制备
应注意，为了进行比较，从PPR(Cambridge，UK)购买了商业来源的生物素化DOTA-A20FMDV2肽(纯度为95％)。将肽重悬于0.1％TFA(在水中稀释)中，以制备1mM浓度的原液，将其等分并保存在-20℃下。
细胞系
体外和体内使用的细胞系是经转导的黑素瘤细胞系A375Ppuro和A375Pβ6(在Dulbecco的改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)/10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)中培养[9])。肽结合的特异性和结合水平-流式细胞术法
将细胞用胰蛋白酶消化，并且重悬于DMEM/0.1％(w/v)叠氮化钠/0.1％(w/v)BSA(流动介质)中，以制备4×106个细胞/ml的细胞悬液。从此时起所有都保持在冰上，将50μl细胞悬液等分到每个流动管(flow tube)中(Falcon 2054-Millipore)。将肽在流动介质以2×浓度连续稀释，因此，当将50μl的每种浓度的添加至50μl细胞时，最终浓度为1000nM、100nM、10nM、1nM、0.1nM和0nM。对于A375Ppuro细胞，仅将最高浓度的1000nM添加至细胞。然后将肽在冰上放置15分钟。然后通过重悬于流动介质中并以1200rpm离心3分钟而将细胞洗涤两次。
将小鼠抗生物素(以1∶200的50μl；Jackson ImmunoResearch，200-002-211)添加至每个样品持续15分钟，然后重复洗涤步骤。将与Alexa 488缀合(1∶250)的山羊抗小鼠IgG(50ul)添加至每样品，并在黑暗中于冰上放置15分钟。重复洗涤步骤，并将细胞重悬于380μl的流动介质中。使用FACS Calibur细胞仪(Becton-Dickinson)获取数据；记录每个样品的几何平均荧光强度。
内化测定法-图像流和流式细胞术
将细胞用胰蛋白酶消化，并且重悬于DMEM(无血清培养基)中，以制备4×106个细胞/ml的细胞悬液。从此时起所有都保持在冰上。将50μl细胞悬液等分到每个流动管中。将肽在冰冷的无血清培养基中稀释至200nM，当将50μl添加至细胞样品时，最终浓度为100nM。将肽在冰上放置15分钟，然后用流动介质洗涤两次，并在每个洗涤步骤之间以1200rpm离心3分钟。将小鼠抗生物素(以1∶200的50μl)添加至每个样品持续15分钟，然后重复洗涤步骤。除0时间点以外，将每个时间点样品都放入37℃的培养箱中，并在15、30和45分钟时将细胞在PBS中的4％甲醛中固定10分钟，在PBS中洗涤一次并添加0.1％Triton X-100洗涤剂5分钟，然后再次在PBS中洗涤。将与AlexaFLUOR 488缀合的山羊抗小鼠IgG(1∶250)(50μl)添加至每个样品，并在黑暗中于冰上放置15分钟。如上洗涤样品并重悬至30μl。用ImagestreamX Mark II(Amnis，Merck)检查样品。使用机载软件(on board software)，与0分钟样品相比，评估图像流图像的内化。
内化测定法-流式细胞术
如上制备细胞，只是用抗体检测生物素之前不添加洗涤剂。用FACScalibur(Bekton-Dickinson)血细胞计数器分析样品。随着时间测量的荧光信号的降低与结合肽的内化有关，如使用Imagestream视觉上确认的(数据未示出)。
血浆稳定性
向15μg DTPA缀合的肽添加15MBq的铟-111(Covidien-Petten，Netherlands)(最终体积为20μl)，然后添加5μl乙酸铵(1M)。将样品混合并在室温下放置30分钟。将2μl混合物添加至100μl蒸馏水，然后将混合物进样到梯度反相HPLC(Beckman)中。将样品在蒸馏水中的0.1％TFA中通过Agilent Eclipse XDB-C18柱运行。这是为了检查放射标记的效率，其通常＞95％。将人血液取入肝素钠管中，并以2000g离心10分钟。将血浆(300μ1)与7.5MBq的变体肽孵育，并立即取出150μl并置于37℃，并且将其余150μl用作0分钟样品。向其中添加等体积的冰冷的乙腈(1∶1)，将样品混合并在14000rpm下离心5分钟。收集上清液并真空干燥10分钟以除去乙腈。将残留物通过0.22μm过滤器过滤(以去除颗粒)，并将100μl进样到Radio-HPLC机中。24小时样品类似地处理。对照样品与PBS一起孵育。(注意：PBS对照不需要该过滤或添加乙腈的过程)。样品一式两份进行，其结果类似。
生物分布
将100μl中的2×106个细胞皮下注射到雌性CD1 Nu/Nu小鼠的肩部。肿瘤在左侧(A375Puro)和右侧(A375β6)肩部皮下生长2周。一旦肿瘤已生长至直径为约5mm，将肽用铟-111放射性标记，并通过Radio-HPLC进行分析以确定标记效率。将经标记的肽在无菌PBS/BSA中稀释，并进行给药以给予每只动物0.3MBq。然后向小鼠静脉内(尾静脉)注射放射性标记的肽，并在1小时之后剔除(culled)。第二天，取出血液、器官和肿瘤，称重，并用γ计数器(LKB Compugamma)测量残留活性。数据表示为％注射剂量/g组织(％ID/g)。
肽表征数据
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (1)(SEQ ID NO：11)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(1)(97.1mg，50％)。Rt＝13.2min(
Figure BDA0002244362840000211
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；
Figure BDA0002244362840000216
计算值1224.3；实测值1223.6。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQkVART-OH (2)(SEQ ID NO：12)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(2)(54.3mg，22％)。Rt＝11.9min(
Figure BDA0002244362840000212
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1224.3；实测值1223.7。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQ[鸟氨酸]VART-OH (3)(SEQ ID NO：13)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(3)(63.5mg，26％)。Rt＝12.7min(
Figure BDA0002244362840000213
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1217.3；实测值1216.7。
肽N-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQ[二氨基丁酸]VART-OH (4)(SEQ ID NO：14)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(4)(70.3mg，29％)。Rt＝12.7min(
Figure BDA0002244362840000214
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1210.3；实测值1209.8。
H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQ[二氨基丙酸]VART-OH (5)(SEQ ID NO：15)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(5)(59.9mg，25％)。Rt＝12.9min(C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1203.2；实测值1203.1。
H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQ-N-MeKVART-OH (6)(SEQ ID NO：16)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(6)(72.7mg，30％)。Rt＝11.5min(
Figure BDA0002244362840000221
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1231.3；实测值1230.7。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQV[氨基异丁酸]AQKVART-OH (7)(SEQ ID NO：17)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(7)(16.6mg，7％)。Rt＝11.9min(
Figure BDA0002244362840000222
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1209.7；实测值1210.2。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQV[正缬氨酸]AQKVART-OH (8)(SEQ ID NO：18)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(8)(19.5mg，8％)。Rt＝12.2min(
Figure BDA0002244362840000223
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1216.8；实测值1217.2。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQV[正亮氨酸]AQKVART-OH (9)(SEQ ID NO：19)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(9)(18.7mg，8％)。Rt＝12.7min(C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1223.8；实测值1224.7。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQV[烯丙基甘氨酸]AQKVART-OH (10)(SEQ ID NO：20)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(10)(5.5mg，2％)。Rt＝11.7min(
Figure BDA0002244362840000225
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1215.7；实测值1215.8。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQV[叔丁基丙氨酸]AQKVART-OH (11)(SEQ ID NO：21)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(11)(7.5mg，3％)。Rt＝12.9min(
Figure BDA0002244362840000226
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1230.8；实测值1230.7。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQV[高亮氨酸]AQKVART-OH (12)(SEQ ID NO：22)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(12)(26.1mg，11％)。Rt＝13.1min(
Figure BDA0002244362840000231
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1230.8；实测值1231.2。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQV[2-氨基-3-乙从戊酸]AQKVART-OH (13)SEQ IDNO：23)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(13)(10.1mg，4％)。Rt＝12.9min(C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1230.8；实测值1230.8。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQV[环己基丙氨酸]AQKVART-OH (14)(SEQ ID NO：24)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(14)(6.2mg，2％)。Rt＝13.4min(
Figure BDA0002244362840000233
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1243.8；实测值1244.2。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQV[金刚烷基甘氨酸]AQKVART-OH (15)(SEQ ID NO：25)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(15)(22.4mg，9％)。Rt＝13.7min(
Figure BDA0002244362840000234
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1262.8；实测值1263.3。
肽(16)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽AcHN-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (16)(SEQ ID NO：11)(具有N端乙酰化)(30.1mg，12％)。Rt＝13.9min(
Figure BDA0002244362840000235
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1244.8；实测值1245.2。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-NH2 (17)(SEQ ID NO：11)(具有C端酰胺化)
根据分析型RP-HPLC，以＞95％的纯度作为白色固体获得肽(17)(13.4mg，5％)。Rt＝13.5min(C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1223.8；实测值1223.3。
肽(18)
根据分析型RP-HPLC，以＞95％的纯度作为白色固体获得肽AcHN-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-NH2 (18)(SEQ ID NO：11)(具有N端乙酰化和C端酰胺化)(12.5mg，5％)。Rt＝13.9min(
Figure BDA0002244362840000241
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1244.3；实测值1244.6。
肽H2N-nK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (19)(SEQ ID NO：8)
根据分析型RP-HPLC，以＞95％的纯度作为白色固体获得肽(19)(47.7mg，19％)。Rt＝12.6min(
Figure BDA0002244362840000242
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1223.8；实测值1224.1。
肽H2N-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVARt-OH(20)(SEQ ID NO：26)
根据分析型RP-HPLC，以＞95％的纯度作为白色固体获得肽(20)(45.3mg，19％)。Rt＝13.0min(C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1223.8；实测值1224.2。
肽H2N-nK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVARt-OH (21)(SEQ ID NO：9)
根据分析型RP-HPLC，以＞95％的纯度作为白色固体获得肽(21)(36.4mg，15％)。Rt＝12.9min(
Figure BDA0002244362840000244
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1223.8；实测值1224.4。
肽DTPA-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (22)(SEQ ID NO：11)(N端DTPA)
根据分析型RP-HPLC，以＞99％的纯度作为白色固体获得肽(22)(53.7mg，24％)。Rt＝13.3min(
Figure BDA0002244362840000245
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1411.9；实测值1411.6。
肽DTPA-nK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (25)(SEQ ID NO：8)(N端DTPA)
根据分析型RP-HPLC，以＞95％的纯度作为白色固体获得肽(25)(37.5mg，13％)。Rt＝12.6min(
Figure BDA0002244362840000246
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1411.3；实测值1410.6。
肽DTPA-nK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVARt-OH (26)(SEQ ID NO：9)(N端DTPA)
根据分析型RP-HPLC，以＞95％的纯度作为白色固体获得肽(26)(12.5mg，4％)。Rt＝12.9min(C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1411.3；实测值1410.6。
肽DTPA-NK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-NH2 (24)(SEQ ID NO：11)(N端DTPA和C端酰胺化)
根据分析型RP-HPLC，以＞95％的纯度作为白色固体获得肽(24)(12.1mg，4％)。Rt＝13.0min(C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1410.8；实测值1410.1。
肽DTPA-GNK(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (23)(SEQ ID NO：27)(N端DTPA)
根据分析型RP-HPLC，以＞95％的纯度作为白色固体获得肽(23)(41.9mg，15％)。Rt＝12.6min(
Figure BDA0002244362840000253
C18，5-95％B，3％B/min，1.0mL/min)；m/z(ESI-MS)：[M+2H]2+计算值1439.9；实测值1439.2。
实施例1-生物素化的A20FMDV21、Lys16或Leu13修饰且生物素化的肽2-15、N和/或C端修饰且生物素化的肽16-21以及含(DTPA)的肽22-26的合成。
为了能够研究在A20FMDV2结合活性上引入非蛋白质原性氨基酸(图1所列)的方法，使用方案1中所述的条件通过标准Fmoc SPPS在递送C端羧酸的酸敏感的羟甲基苯氧基丙酸接头(HMPP)上合成了生物素化的肽1-15(见表1)(肽6除外)。使用20％哌啶/DMF以移除Fmoc保护基以及O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六福磷酸盐(HBTU)/DIPEA作为偶联剂组装期望的肽序列
由于将通过流式细胞术研究与αvβ6整合素的特异性结合，因此将A20FMDV2(1)及其所有类似物中第二个残基处的天然丙氨酸替换为生物素化的赖氨酸残基。先前已显示这种替换是良好耐受的[24，25]。我们选择通过侧链Nε-氨基上的1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)[19]基团的选择性脱保护然后使用HBTU/DIPEA与D-生物素缩合来安装D-生物素部分。三氟乙酸(TFA)/H2O/3，6-二氧杂-1，8-辛二硫醇(DODT)/三异丙基硅烷(TIPS)(94∶2.5∶2.5∶1.0，v/v/v/v)导致合成肽从相应的肽基-树脂切割。以2％-50％的良好产率和超过99％的纯度获得肽1-15(参见肽表征数据)。
为了合成含有N-L-甲基赖氨酸修饰的肽6，我们采用了树脂上N-甲基化方案[22]，在TFA介导的肽切割和RP-HPLC纯化之后，其以高产率(30％)得到肽6。
包含所有天然存在的氨基酸的先导肽(lead peptide)A20FMDV2会对作用于氨基和羧基端的外肽酶降解敏感。为了缓解这种情况，制备了六个N和/或C端修饰且生物素化的A20FDMV2模拟物，其中我们系统地修饰了氨基和羧基端(肽16-18)以及N端和C端氨基酸(分别为Asn1和Thr20，肽19-21)。N端/C端修饰的肽16-18是通过用乙酸酐在N端封端(16)或使用Rink酰胺接头以提供C端羧酰胺(17)或这二者的组合(肽18)获得的。
使用方案1中概述的合成途径获得了用非天然D-Asn1代替了生物素化的A20FMDV2(1)的N端的天然Asn1的肽19，只是将Fmoc-D-Asn(Trt)-OH构建块(building block)作为N端残基引入到了合成中。为了制备在C端包含非天然D-Thr的肽20和21，首先使用DIC/DMAP用Fmoc-D-Thr(tBu)-OH使HMP锚定的树脂27(参见方案1，HMP＝羟甲基苯氧基乙酸)酯化，并随后通过Fmoc SPPS使序列延长。
表1.制备的包含天然Lys16的替换(肽2-6)或Leu13的替换(肽7-15)的合成肽[N端]-X1K(生物素)VPNLRGDLQVX2AQX3VARX4-[C端]、C端/N端变体(肽16-21)和DTPA修饰的肽(22-26)。注意：该表中使用的术语(特别是X位置编号)与权利要求中使用的不同。
Figure BDA0002244362840000261
Figure BDA0002244362840000271
Figure BDA0002244362840000281
试剂和条件：(a)20％哌啶/DMF(v/v)，rt，1×5min，1×10min；(b)Fmoc-氨基酸-OH、HBTU、DIPEA、DMF，rt，30min；重复(a)和(b)；(c)(Boc)2O、DMF，rt，30min；(d)20％肼/DMF(v/v)，rt，1×5min，1×10min；(e)D-生物素、HBTU、DIPEA、DMF，rt，30min；(f)(tBu)DTPA、HBTU、DIPEA、DMF，rt，30min；(g)TFA/H2O/DODT/TIPS(9.4∶2.5∶2.5∶1，v/v/v/v)，rt，3h。
方案1.用于制备生物素化的A20FMDV2肽变体的合成方案。
从结合测定获得的结果(表2，参见下文)示出，1的N端和C端修饰(分别为肽16和17)或者将A20FMDV2(1)的天然Asn1以及Asn1和Thr20残基二者替换为其D对应物(分别为肽19和21)得到了与1相比表现出改善的生物活性的肽。因此，选择四种N和C端修饰的类似物(16、18、19和21)用于引入DTPA螯合剂以使得能够进行细胞内化研究和人血浆中的降解测定。还制备了含有DTPA的生物素化A20FMDV2肽(22)作为对照[25]。
如方案1中所述，使用Fmoc SPPS条件(用于去除Fmoc保护基的20％哌啶/DMF和HBTU/DIPEA作为偶联剂)合成了含有DTPA的生物素化的A20FMDV2肽22和类似物23-25。为了在A20FMDV2的N端连接DTPA，并在Lys2的侧链上连接D-生物素，首先使用20％哌啶/DMF除去N端Fmoc保护基，并将叔丁基保护的DTPA[21]偶联至使用HBTU/DIPEA得到的Nα-氨基。由于DTPA的四种羧酸被保护为对酸不稳定的叔丁基酯，因此可使用2％肼/DMF选择性地除去Dde保护基，并使用HBTU/DIPEA将D-生物素偶联至侧链氨基赖氨酰基。在肽23和24能够结合DTPA配体的情况下，使用甘氨酸间隔物以模拟肽16和18的乙酰基并允许DTPA通过酰胺键的形成容易地连接。
实施例2-肽变体的生物活性
为了测试哪种肽变体(如果有的话)优于原始的A20FMDV2，我们使用两种细胞系(A375Ppuro和A375Pβ6)设计了一系列测试，所述细胞系在遗传上相同，只是在A375Pβ6细胞系中表达整合素A375Pβ6[9]。由于A375Ppuro表达还与配体中的RGD基序结合的四种整合素(αvβ3、αvβ5、αvβ8和α5β1)，因此比较这两种细胞系的结合活性被认为是高度严格的测定。
作为用于表征经修饰肽1-15、16-21和22-25之行为的测定的一个例子，图2显示了肽22与25之间的比较。与其他整合素相比，A20FMDV2＞1000倍更选择性地与αvβ6结合[9]。为了证实经修饰的肽保留了特异性，我们使用流式细胞术确定了多少肽与A375Ppuro和A375Pβ6细胞结合。图2A显示在1000nM时，肽22(Ai)或肽25(Aii)均未与A375Ppuro结合(红色直方图；上图)。相反，这两种肽均以100nM与A375Pβ6良好结合(蓝色直方图；下图)。这些数据示出，在这些肽变体中保留了αvβ6结合特异性。此外，每种肽变体均不能以1000nM与A375Ppuro结合(数据未显示)，表明所有肽均保留了特异性。
为了确定经修饰的肽在100nM下是否也与亲本生物素化的A20FMDV2肽结合或结合得更好，我们测试了0、0.1、1、10、100和1000nM变体与A375Pβ6的结合活性。
例如，图2B显示肽22比市售生物素化的A20FMDV2更好，因为其在100nM时结合高16％。同样，肽25甚至更好，因为在100nM时，结合为市售获得的生物素化A20FMDV2的150％。这些数据来自单个实验。表2显示了所研究的所有肽的多至四个实验的平均值，并显示了，总体而言，肽22的活性平均来说比亲本(即市售获得的生物素化A20FMDV2)高5％，而肽25比亲本高36％。
为了评估细胞在37℃下的内化能力(以及因此潜在的治疗载体)，我们使用了
Figure BDA0002244362840000301
细胞计量术和流式细胞术。
Figure BDA0002244362840000302
拍摄每个细胞的荧光图像(图2C)，使得能够对表面和细胞内区室上的荧光进行图像分析。图2C中的直方图绘制了相对于0分钟时间点的内化。对于流式细胞术，当肽被内化时，我们监测了表面表达的损失。
表2总结了本研究中使用的所有肽相对于商业来源的生物素化A20FMDV2的活性和内化数据(本研究中合成的生物素化A20FMDV2(1)与市售获得的生物素化A20FMDV2的区别在于肽(1)包含用于偶联D-生物素的Ala2Lys突变。
表2还通过将结合亲和力值乘以内化的量以得出相对活性值，提供了每种肽在细胞内药物递送之潜力的任意值。可以看出，大多数的16Lys和13Leu修饰降低相对活性；除了肽(7)和(9)之外，它们的相对活性均低于对照生物素化-A20FMDV2。相反，与生物素化的A20FMDV2(1)相比，大多数N和C端修饰的肽(16-19和21)具有更好的结合亲和力并且具有改善的相对活性。例如，具有非蛋白质原性D-Asn氨基酸N端修饰的肽19与细胞αvβ6的结合平均来说比母体化合物好43％(表2)。相对于值为1.0的未经修饰的A20FMDV，肽16(N-乙酰化)、17(C-酰胺化)、18(N-乙酰化和C-酰胺化)、19(D-Asn替换)和21(D-Asn和D-Thr替换二者)的相对活性值比对照肽1高55％、31％、9％、27％和37％。
表2.Lys16(1-6)或Leu13(7-15)或者经C或N端修饰的(16-21)和DTPA偶联(22-26)a的合成肽的内化数据比较。
Figure BDA0002244362840000311
a：特定的肽(1、16、17、19、21)是DTPA偶联的。
b：相对于生物素化的A20FMDV2(100nM)的平均活性。
c：使用流式细胞术，相对于生物素化A20FMDV2(100nM)，在45分钟时的平均％内化
d：市售获得的生物素化的DOTA-A20FMDV2。
e：该工作中合成的生物素化的A20FMDV2。
令人鼓舞的是，DTPA与先导肽(16、17、19、21)缀合分别产生肽23-26，其对结合亲和力或内化具有非常小的影响，并因此保持了其提高的相对活性。
实施例3-血浆稳定性和生物分布研究
图3显示了相对于0分钟的时间点，在37℃下血浆中DTPA缀合肽(22-26)与PBS(黑色条段；每种肽段的左侧柱)在血浆中的稳定性(红色柱；每种肽的右侧柱)。数据显示在37℃下在PBS中24小时后，只有约10％的肽降解。相反，虽然肽(22、25、26)在24小时之后在血浆中的残留量相似(77％-80％)，但肽(23)(60％剩余)和肽(24)的降解程度很大(52％剩余)。因此，相对于对照亲本肽(1)，肽24和23的修饰(分别为C端酰胺化和N端乙酰化)具有提高的对血浆降解的敏感性。使用D氨基酸(D-Asn，化合物25和D-Asn/D-Thr化合物26)通过化学操作进行的肽修饰在改善对人血浆蛋白酶的敏感性方面是最佳的。
对在相对的肩部上荷有A375Ppuro和A375Pβ6肿瘤的免疫受损小鼠(n＝3至5)静脉内(iv)注射给予300Bq放射性标记的肽22-26，然后在1小时后处死。立即收集主要器官和血液，称重，并确定放射性。表3中的数据显示了所测试的5种DTPA缀合肽的行为。数据表示为平均％注射剂量/g组织。
表3：111In-DTPA标记的肽(22-26)的生物分布(平均值(％)ID/g±SEM)数据
a：数据获自取自荷有A375β6(αvβ6)和A375Puro(对照)异种移植物对的小鼠(n＝3)的切除的组织。在iv注射100Bq的各肽之后1小时将小鼠剔除。数据显示为每克组织的平均％注射剂量±平均值的标准误差。Bq：贝克勒尔(Becquerel)。
与我们以前的研究一样，胃肠道(胃和肠)以及肺都有显著保留[9，24]。我们报道不依赖于αvβ6的肾保留[9]对于五种肽是高度变化的，其中肽25和26显示最少的保留，而肽23和24显示远大于肽22(即亲本生物素化-A20FMDV2)的保留。与αvβ6阴性对照肿瘤相比，αvβ6阳性肿瘤对每种肽都有稳健的选择性摄取。图4以直方图突出显示了这些差异。与对照肽22相比，尽管与DTPA标记的母体肽22相比，肽23-26的摄取没有统计学上的提高，但与αvβ6阴性肿瘤相比，所有变体在αvβ6阳性肿瘤中的保留率均略高。对于肽25见到了与对照肽22相比在αvβ6阳性肿瘤相对于αvβ6阴性肿瘤的保留率最高。
讨论
20个残基的线性肽A20FMDV2对与肿瘤相关的αvβ6整合素表现出高特异性和亲和力，并且还表现出vvβ6依赖性内化到细胞中。因此，A20FMDV2被认为是向表达αvβ6的癌细胞传递治疗负荷(例如，化学疗法有效载荷(payload)的有前途的先导化合物。在以上实施例中，已经研究了A20FMDV2的天然氨基酸残基的非蛋白质原性替代物对体外行为、血浆稳定性和体内生物分布的影响。
通过Fmoc SPPS以高收率和优异的纯度合成了本文中所述的所有肽。对αvβ6整合素的结合研究表明，所有A20FMDV2类似物仅与A375Pβ6细胞结合，但不与A375Ppuro细胞结合，表明特异性不受修饰的影响。此外，掺有乙酰化的N端和酰胺化的C端或天然的1Asn和20Thr残基的非天然D形式的肽表现出比母体肽(A20FMDV2)更强的αvβ6结合活性，并且也比大多数含有天然16Lys和13Leu残基的非蛋白质原性替代物的肽更强效。例如，具有非蛋白质原性D-Asn氨基酸N端修饰的肽19与细胞αvβ6的结合平均来说比母体化合物好43％(表2)。
我们已经评估了人血浆中的稳定性，并且表明与我们先前在小鼠血清中的研究相比，该肽保持完整的时间要长得多，这表明人血浆对这些肽的降解性低于小鼠血清。在37℃下24小时之后，所有放射性标记肽的超过90％在PBS中保完整，而在37℃的人血浆中，仅含有D氨基酸25和26的A20FMDV2在24小时之后仍保持完整(76-80％)。
修饰对表达αvβ6之细胞的内化程度仅具有中等影响。因此，表2显示，对于所有受试肽，内化相对于市售生物素化A20FMDV2为0.78至1.11倍不等。由于肽的结合亲和力和内化二者对于递送细胞内细胞毒性都是必须考虑的，因此表2还显示了每种肽的相对活性的任意值。对照肽的值为1.0，而肽16、19、17、18和21的相对活性值分别比对照肽高55％、27％、31％、9％和37％。
为了使靶向αvβ6的肽递送治疗，其必须选择性地保留在表达αvβ6的肿瘤中。在生物分布研究中，我们发现测试的所有五种先导肽(22-26)都以比αvβ6阴性肿瘤高至少6至10倍的水平选择性地保留在αvβ6阳性肿瘤中。令人鼓舞的是，所有经修饰的肽都比DTPA标记且生物素化的肽22稍好。目前的结果表明，A20FMDV2的化学修饰改善了其选择性定位于表达αvβ6之癌症的能力。
参考文献
上述引用了许多出版物以更完全地描述和公开本发明以及本发明所属领域的现有技术。这些参考文献的完整引用如下提供。这些参考文献中每一个的全部内容并入本文。
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本文中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文并且用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请被具体地且单独地指出通过引用整体并入本文。
本文中描述的具体实施方案仅作为实例而不是作为限制而提供。本文中包含的任何小标题仅是为了方便起见，而不应被解释为以任何方式限制本公开内容。

Claims (34)

1.选择性地结合αvβ6整合素的肽，所述肽具有包含基序X1BnRGDLX2X3X4ZmX5(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列，其中X1为任何D-氨基酸，Bn为任何n个氨基酸的序列，所述氨基酸可以是天然的或非天然的，D-或L-的，并且可以相同或不同，其中n为1至10的数字，X2和X3独立选自任何氨基酸，X4为Leu或Ile，Zm为任何m个氨基酸的序列，所述氨基酸可以是天然的或非天然的，D-或L-的，并且可以相同或不同，其中m为1至10的数字，X5为任何L-或D-氨基酸。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽的长度为17至25个氨基酸，任选地其中所述肽的长度为20个氨基酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的肽，其中X1为D-Asn。
4.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中X5为L-Thr或D-Thr。
5.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中X4为Leu。
6.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中n为5和/或m为6。
7.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中Bn为AVPNL(SEQ ID NO：4)、KVPNL(SEQ IDNO：5)或K(生物素)VPNL。
8.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中Zm为AQKVAR(SEQ ID NO：6)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述肽的氨基酸序列选自：
H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH(SEQ ID NO：7)；
H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH(SEQ ID NO：8)；
H2N-[D-Asn]-K(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVART-COOH(SEQ ID NO：8)；
H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH(SEQ ID NO：9)；
H2N-[D-Asn]-K(生物素)VPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH(SEQ ID NO：9)；以及
H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH(SEQ ID NO：10)。
10.根据权利要求9所述的肽，其中所述肽为H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH(SEQ ID NO：7)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述肽是N-乙酰化和/或C-酰胺化的。
12.缀合物，其包含如权利要求1至11中任一项所限定的肽，所述肽直接或通过接头与治疗部分、聚合物、多肽和/或可检测部分缀合。
13.根据权利要求12所述的缀合物，其中所述治疗部分包含抗癌剂。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述抗癌剂选自：澳瑞他汀、美登木素生物碱、微管溶素、倍癌霉素、卡奇霉素、α-鹅膏蕈碱、吡咯并苯二氮、伊立替康、以及吲哚甲酰胺类，或者其类似物、衍生物、前药或活性代谢物。
15.根据权利要求14所述的缀合物，其中所述抗癌剂包含：一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、美坦辛(DM1)、拉夫坦辛(DM4)或辛坦霉素。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的缀合物，其中所述治疗部分包含选自以下的放射性同位素：177Lu、90Y、211At、213Bi、212Pb、225Ac、223Ra、44Sc、67Ga、131I、188Re、186Re和67Cu。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的缀合物，其中所述可检测部分可通过磁共振成像(MRI)、磁共振波谱(MRS)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、正电子发射断层成像(PET)或光学成像来检测。
18.根据权利要求17所述的缀合物，其中所述可检测部分包含荧光团、放射性核素或自旋标记物。
19.根据权利要求18所述的缀合物，其中所述可检测部分包含：68Ga、
Figure FDA0002244362830000022
异硫氰酸荧光素(FITC)、89Zr、124I、64Cu、62Cu、18F、86Y、111In、131I、123I、67Ga或99mTc。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的缀合物，其中所述可检测部分包含通过包含螯合剂的接头与所述肽偶联的111In，任选地其中所述螯合剂包含二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
21.根据权利要求12至20中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物包含一个或更多个(例如一个或两个)乙二醇基团或者一个或更多个(例如一个或两个)聚乙二醇(PEG)链。
22.根据权利要求21所述的缀合物，其中所述一个或更多个(例如一个或两个)PEG链的长度为1至50个乙二醇单元。
23.药物组合物，其包含：
如权利要求1至11中任一项所限定的肽或如权利要求12至22中任一项所限定的缀合物；以及
可药用载体。
24.如权利要求1至11中任一项所限定的肽、如权利要求12至22中任一项所限定的缀合物或如权利要求23所限定的药物组合物，其用于医学。
25.如权利要求1至11中任一项所限定的肽、如权利要求12至22中任一项所限定的缀合物或如权利要求23所限定的药物组合物，其用于在哺乳动物对象中治疗表达αvβ6之肿瘤的方法。
26.根据权利要求25所述应用的肽、缀合物或组合物，其中所述肿瘤是宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。
27.治疗具有表达αvβ6之肿瘤的哺乳动物对象的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的如权利要求1至11中任一项所限定的肽、如权利要求12至22中任一项所限定的缀合物或如权利要求23所限定的药物组合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤是宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。
29.如权利要求1至11中任一项所限定的肽、如权利要求12至22中任一项所限定的缀合物或如权利要求23所限定的药物组合物在制备用于在哺乳动物对象中治疗表达αvβ6之肿瘤的药物中用途。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述肿瘤是宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。
31.在哺乳动物对象中对表达αvβ6之肿瘤进行成像的方法，其包括向该荷瘤对象施用如权利要求17至22中任一项所限定的缀合物以及检测所述可检测部分，从而形成所述肿瘤的图像。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述肿瘤是宫颈肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤或胰腺肿瘤。
33.如权利要求17至22中任一项所限定的缀合物，其用于在哺乳动物对象中诊断癌症的体内方法，其中所述方法包括向所述对象施用所述缀合物以及检测所述可检测部分，从而在所述对象中诊断表达αvβ6之肿瘤的存在。
34.癌症诊断方法，其包括向怀疑具有表达αvβ6之肿瘤的哺乳动物对象施用如权利要求17至22中任一项所限定的缀合物以及检测所述可检测部分，从而在所述对象中诊断表达αvβ6之肿瘤的存在。
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