KR20190141195A - 종양-표적 펩타이드 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 αvβ6 인테그린 (integrin)에 선택적으로 결합하는 펩타이드로,
상기 펩타이드는 X1BnRGDLX2X3X4ZmX5 의 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, X1은 임의의 D-아미노산이고, Bn은 임의의 n개의 아미노산의 서열로 이는 천연 또는 비천연, D- 또는 L- 일 수 있고, 동일하거나 상이할 수 있으며, n은 1 내지 10 사이의 수이고, X2 및 X3는 독립적으로 임의의 아미노산에서 선택되고, X4는 Leu 또는 Ile이고, Zm은 임의의 m개의 아미노산의 서열로, 이는 천연 또는 비천연, D- 또는 L- 일 수 있고, 동일하거나 상이할 수 있으며, m은 1 내지 10 사이의 수이고, X5는 임의의 L-또는 D-아미노산인 펩타이드를 제공한다. 또한, 상기 펩타이드를 포함하는 접합체, 상기 펩타이드 또는 상기 접합체를 포함하는 약학적 조성물, 및 예를 들어, 포유동물 대상체에서 αvβ6- 발현 종양의 치료, 영상화 및/또는 진단에서의 상기 펩타이드, 접합체 또는 조성물의 용도를 제공된다.

Description

종양-표적 펩타이드 변이체
본 출원은 2017년 4월 24일 출원된 GB1706472.6의 우선권을 주장하며, 그 내용 (contents) 및 요소 (elements)는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 통합된다.
본 발명은 펩타이드 변이체, 접합체, 이들의 약학적 조성물 및 암의 치료 및 종양의 영상화 (imaging)를 포함하여, 의약에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
인테그린은 세포 부착 (cell adhesion), 침습 (invasion), 증식 (proliferation) 및 세포사멸 (apoptosis)을 포함하는 여러 주요 과정에 관여하는 세포 표면 수용체의 큰 패밀리를 포괄하는 이종이량체 분자 (heterodimeric molecules)이다 [23]. 인간에는 피브로넥틴 (fibronectin) 및 비트로넥틴 (vitronectin)과 같은 세포 외 리간드 (extracellular ligand)에 존재하는, 고도로 보존된 트리펩타이드 모티프인 Arg-Gly-Asp를 통해 기질을 인식하는 8개 클래스의 24개 멤버가 있다. 인테그린 αvβ6는 구강 (oral), 경구 (head and neck), 췌장 (pancreatic), 난소 (ovaian) 및 유방 (breast)과 같은 수많은 암에서 고도로 발현되고 [4-9], 인테그린 αvβ6의 증가된 발현량은 종양 진행과 상관관계가 있다. 인테그린 αvβ6는 또한 섬유증 [11] 및 구제역 (foot-and-mouth disease) 을 포함한 일부 바이러스 감염 [28]을 촉진할 수 있다. 이와 같이, 인테그린 αvβ6는 종양학 및 그 밖의 분야에서, 영상, 진단 및 치료를 위한 주요 표적이다 [29-30].
A20FMDV2 (H2N-1NAVPNLRGDLQVLAQKVAR20T-OH) (서열번호 1)는 구제역 바이러스의 바이러스성 단백질로부터 유래된 20개 잔기의 선형 펩타이드이다 [1-3, 10]. 이 펩타이드는 암 세포에서 고도로 발현되는 인테그린 막횡단 수용체인 αvβ6에 높은 선택성 (selectivity)과 친화성 (affinity)을 나타내었다 [4-9]. A20FMDV2는 7RGDLQV13L (서열번호 2) 단편의 RGD 트리펩타이드를 통해 αvβ6에 결합하고, RGDLQVL 단편에 존재하는 2개의 류신 잔기는 소수성 상호 작용을 통해 펩타이드와 수용체의 결합을 강화시키고 [10], 또한 C- 말단 펩타이드 모티프 10Leu-20Thr로부터 생성된 α-나선에 의해 안정화된다 [1]. 또한, A20FMDV2 는 방사성 인듐 (111In)과 결합될 때 폐 섬유증에서 αvβ6에 대한 효과적인 영상화제 (imaging agent)이다 [24]. [18F]플루오로벤조일 표지된 펩타이드 ([18F]fluorobenzoyl-labelled peptide), [18F] FBA-A20FMDV2는 인간 임상 시험에서 PET 방사성 추적자로 사용되는 것으로 밝혀졌다 [25].
A20FMDV2는 4-[18F] 플루오로벤조산 (FBA) (또는 유도체)에 접합 (conjugate) [32-34] 및 DOTA와 같은 금속 킬레이터를 결합한 (incorporate) A20FMDV2 펩타이드를 사용한 64Cu 표지 [35-38]에 의해, 진단 영상 적용을 위한 양전자 방출 단층 촬영 (PET)에 사용되었다 [31]. 최근에는, 111In 표지된 A20FMDV2 유도체는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)을 사용한 αvβ6 인테그린을 발현하는 유방암의 영상화에 매우 특이적인 것으로 나타난 반면 [9], [18F]-FBA-A20FMDV2는 특발성 폐 섬유증의 치료 요법에 [24] 임상 세팅 (clinical setting)으로 발전하였다 [25]. 이러한 연구는 αvβ6 인테그린을 표적으로 하여 진행중인 진단 도구에 대한 A20FMDV2의 중요성을 설명하고 αvβ6가 유효한 치료 표적임을 뒷받침한다.
WO2007/039723은 αvβ6 펩타이드 리간드, 이의 기능적 변이체 및 이를 암호화하는 핵산 뿐만 아니라, 암을 포함하여 αvβ6 매개 질환의 치료 및 영상화에서의 이의 용도를 기술한다.
불행히도, A20FMDV2의 치료적 가치는 부분적으로 생쥐 혈장 연구에서 결정된 바와 같이 엔도- 및 엑소- 펩티다아제와 같은 혈청 프로테아제에 대한 높은 민감성 (susceptibility)에 기인한 혈액에서의 짧은 반감기에 의해 제한된다 [13].
민감한 펩타이드 (및 단백질)의 반감기를 개선시키는 한 가지 보고된 방법은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 도입이다 [38]. Hausner et al.은 N 말단에 1개 또는 2개의 PEG28 모이어티 [13] 또는 N 및 C 말단 모두에 하나씩 PEG28를 배치 [39]하여 4-[18F]-FBA-A20FMDV2의 PEG화 된 버전들을 제조하였으며, 이중 말단 PEG화 된 (bi-terminally PEGylated) A20FMDV2 유도체, [18F] -FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28이 가장 유리한 약동학을 나타내는 것으로 결론지었다.
선형 펩타이드의 헤드-테일 고리화 (head-to-tail cyclisation)는 엑소 펩티다아제에 의한 분해를 최소화하기 위하여 잘 확립된 방법이다 [40]; 그러나 중합 (polymerizaiton) 또는 라세미 (racemisation)와 같은 바람직하지 않은 부반응 (side reaction)을 방지하기 위해 조심스러운 실험이 요구된다.
그러나 강력한 결합 활성, 세포 흡수 (cellular uptake) 및 연장된 혈장 반감기를 갖는 종양-표적 펩타이드에 대한 충족되지 않은 요구가 남아 있다. 본 발명은 이들 및 다른 요구에 대해 다루고자 한다.
광범위하게, 본 발명은 세포 연구에서 예기치 않게 밝혀진, 향상된 αvβ6 결합 활성을 나타내고 일부 경우에서 A20FMDV2 펩타이드와 비교하여 향상된 세포 흡수를 나타내는 A20FMDV2 펩타이드 변이체에 관한 것이다. 특히, 본원에 추가로 상세히 기술된 바와 같이, 이러한 펩타이드 변이체는 각각의 펩타이드의 111In- 표지된 버전에 의해 평가된 바와 같이, 대조군 A20FMDV2 펩타이드와 비교하여 αvβ6- 발현 이종 이식편 종양 (αvβ6-expressing xenograft tumours)으로 (αvβ6 발현이 결여된 대조군 이종 이식편 종양에 비해) 향상된 생체 분포 (bio-distribution)를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 펩타이드 변이체는 따라서 종양-표적 화학요법 전달제 (tumour-targeted chemotherapeutic delivery agents) 및 종양 영상화제 (tumour imaging agents)로서 큰 잠재력을 갖는다.
따라서, 첫 번째 관점에서, 본 발명은 αvβ6 인테그린 (integrin)에 선택적으로 결합하는 펩타이드로,
상기 펩타이드는 X1BnRGDLX2X3X4ZmX5 (서열번호 3)의 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, X1은 임의의 D-아미노산이고, Bn은 임의의 n개의 아미노산의 서열로 이는 천연 또는 비천연, D- 또는 L- 일 수 있고, 동일하거나 상이할 수 있으며, n은 1 내지 10 사이의 수이고, X2 및 X3는 독립적으로 임의의 아미노산에서 선택되고, X4는 Leu 또는 Ile이고, Zm은 임의의 m개의 아미노산의 서열로, 이는 천연 또는 비천연, D- 또는 L- 일 수 있고, 동일하거나 상이할 수 있으며, m은 1 내지 10 사이의 수이고, X5는 임의의 L-또는 D-아미노산인 펩타이드를 제공한다.
일부 양태에서, 펩타이드의 길이는 최소 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산이다. 일부 양태에서, 펩타이드의 길이는 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 이하 또는 20개 이하의 아미노산이다. 특정 양태에서 펩타이드의 길이는 17 내지 25개 아미노산, 예를 들어 19 내지 21개의 아미노산이다. 특정 양태에서, 펩타이드의 길이는 20개의 아미노산이다.
일부 양태에서 X1은 D-Asn이다. 본원의 표 2와 3, 도 3과 4에 나타낸 바와 같이, X1이 D-Asn (펩타이드 19, 21, 25 및 26)인 예시적인 펩타이드들은 우수한 상대 활성 (표 2), αvβ6- 발현 종양으로의 높은 생체 분포, (표 3 및 도 4) 및 우수한 혈장 안정성 (도 3)을 나타내었다.
일부 경우에서, X5 는 L-Thr 또는 D-Thr 이다.
일부 경우에서, X4 는 L-Leu 이다.
일부 경우에서, n은 5이다. 일부 경우에서 m은 6이다. 특정 경우에서 n은 5, m은 6이다.
일부 경우에서 Bn 은 AVPNL (서열번호 4), KVPNL (서열번호 5) 또는 K(biotin)VPNL이다. Bm 이 K(biotin)VPNL 인 경우, 비오틴 (biotin)은 라이신 측쇄에 부착된 D-biotin 일 수 있다.
일부 경우에서 Zm 은 AQKVAR (서열번호 6) 이다.
특정 경우에서, 펩타이드의 아미노산 서열은 다음으로 구성된 군에서 선택된다:
H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (서열번호 7);
H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (서열번호 8);
H2N-[D-Asn]-K(biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (서열번호 8);
H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (서열번호 9);
H2N-[D-Asn]-K(biotin)VPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (서열번호 9); 및
H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (서열번호 10).
특히, 상기 펩타이드는 H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (서열번호 7) 일 수 있다.
특정 경우에서, 상기 펩타이드는 N- 및/또는 C-말단이 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드는 N-아세틸화 (N-acetylated) 및/또는 C-아미드화 (C-amidated) 될 수 있다.
두 번째 관점에서, 본 발명은 직접 또는 링커를 통해 치료 모이어티, 중합체, 폴리펩타이드 및/또는 검출용 모이어티에 접합된 본 발명 첫 번째 관점의 펩타이드를 포함하는 접합체를 제공한다.
일부 양태에서, 상기 펩타이드는 항암제를 포함하는 치료 모이어티에 접합된다.
일부 양태에서, 상기 항암제는 다음으로 구성된 군에서 선택된다: 아우리스타틴 (auristatin), 메이탄시노이드 (maytansinoids), 튜불리신 (tubulysin), 듀오카르마이신 (duocarmycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 알파-아마니틴 (alpha-amanitin), 피롤로벤조디아제핀 (pyrrolobenzodiazepine, PBD), 이리노테칸 (irinotecan) 및 인돌카르복스아미드 (indolecarboxamide), 또는 이의 아날로그 (analogue), 유도체 (derivatives), 프로드러그 (prodrug) 또는 활성 대사산물 (active metabolite). 특히, 상기 항암제는 모노메틸 아우리스타틴 E (Monomethyl Auristatin E (MMAE)), 메르탄신 (mertansine (DM1)), 라브탄신 (ravtansine (DM4)) 또는 센타마이신 (Centanamycin)을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 상기 치료 모이어티는 치료 동위원소 (therapeutic isotope)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 치료 모이어티는 177Lu, 90Y, 211At, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 223Ra, 44Sc, 67Ga, 131I, 188Re, 186Re 및 67Cu 로 구성된 군에서 선택되는 동위원소 (isotope)를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 펩타이드는 자기 공명 영상 (Magnetic Resonance Imaging, MRI), 자기 공명 분광법 (Magnetic Resonance Spectroscopy, MRS), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (Single Photon Emission Computed Tomography, SPECT), 양전자 방출 단층 촬영기 (Positron Emission Tomograph, PET) 또는 광학 영상 (optical imaging)에 의해 검출되는 검출용 모이어티에 접합된다. 특히, 상기 검출용 모이어티는 형광단 (fluorophore), 방사성 핵종 (radionuclide) 또는 스핀 라벨 (spin label)을 포함할 수 있다. 특정 경우에서, 상기 검출용 모이어티는 68Ga, IRDye® 700, IRDye® 800, 플루오레신 이소티오시아네이트 (Fluorescein isothiocyanate, FITC), 89Zr, 124I, 64Cu, 62Cu, 18F, 86Y, 111In, 131I, 123I, 67Ga 또는 99mTc를 포함할 수 있다.
특히, 상기 검출용 모이어티는 킬레이터 (chelator)를 포함하는 링커를 통해 상기 펩타이드와 커플링 된 111In을 포함할 수 있다. 특히 상기 킬레이터는 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (diethylenetriamine pentaacetic acid, DTPA), 테트라자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (tetrazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, DOTA), 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 상기 킬레이터 (예컨대, DTPA, DOTA 또는 EDTA)는 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다 (예를 들어, 이는 N-말단에서 D-Asn에 연결될 수 있다.
일부 경우에서, 펩타이드는 혈장 반감기 및/또는 생체 분포를 향상시키는 중합체(polymer)에 접합된다. 특히, 상기 펩타이드는 하나 이상의 (예컨대, N-말단 및 C- 말단 각각에서와 같이, 하나 또는 두 개의) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기에 접합될 수 있다. 특정 경우에서, 상기 펩타이드는 -(OCH2CH2)n- (여기서 n ≥ 1)을 포함하는 모이어티, 여기서 n ≥ 1에 접합될 수 있다. 특히, n은 1 내지 100, 1 내지 50, 10 내지 40, 또는 20 내지 30 일 수 있다. 예를 들어, n은 1 또는 2일 수 있다. 특정 경우에서, 상기 펩타이드는 N- 말단 또는 C- 말단에 2개의 에틸렌 글리콜기를 가질 수 있다.
세 번째 관점에서, 본 발명은 다음을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다:
본 발명의 첫 번째 관점의 펩타이드 또는 본 발명의 두 번째 관점의 접합체; 및
약학적으로 허용되는 담체.
네 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 관점의 펩타이드, 본 발명의 두 번째 관점의 접합체, 본 발명의 세 번째 관점의 약학적 조성물의 의약적 용도 (use in medicine)를 제공한다.
다섯 번째 관점에서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 αvβ6- 발현 종양의 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 첫 번째 관점의 펩타이드, 본 발명의 두 번째 관점의 접합체, 본 발명의 세 번째 관점의 약학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서 상기 종양은 자궁경부 종양 (cervical tumour), 두경부 종양 (head or neck tumour), 유방 종양 (breast tumour), 폐 종양 (lung tumour), 피부 종양 (skin tumour), 결장 종양 (colon tumour), 난소 종양 (ovarian tumour) 또는 췌장 종양 (pancreatic tumour)이다. 특정 경우에서, 상기 접합체 또는 이의 약학적 조성물은 상기 하나 이상의 항암제를 포함하는 접합체이다. 특정 경우에서, 상기 치료방법은 포유동물 대상체에서 종양이 αvβ6를 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 치료는 상기 종양이 αvβ6를 발현하는 것으로 결정되면 투여된다.
여섯 번째 관점에서 본 발명은 이를 필요로하는 대상체에 치료학적 유효량의 본 발명의 첫 번째 관점의 펩타이드, 본 발명의 두 번째 관점의 접합체, 본 발명의 세 번째 관점의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, αvβ6- 발현 종양을 갖는 포유동물 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 종양은 자궁경부 종양, 두경부 종양, 유방 종양, 폐 종양, 피부 종양, 결장 종양, 난소 종양 또는 췌장 종양이다. 특정 경우에서, 상기 접합체 또는 이의 약학적 조성물은 하나 이상의 상기 항암제를 포함하는 접합체이다. 특정 경우에서, 상기 치료방법은 포유동물 대상체의 종양이 αvβ6을 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 치료는 종양이 αvβ6을 발현하는 것으로 결정되면 투여된다.
일곱 번째 관점에서 본 발명은 포유동물 대상체에서 αvβ6-발현 종양의 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 첫 번째 관점의 펩타이드, 본 발명의 두 번째 관점의 접합체, 본 발명의 세 번째 관점의 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 종양은 자궁경부 종양, 두경부 종양, 유방 종양, 폐 종양, 피부 종양, 결장 종양, 난소 종양 또는 췌장 종양이다. 특정 경우에서, 상기 접합체 또는 이의 약학적 조성물은 하나 이상의 상기 항암제를 포함하는 접합체이다. 특정 경우에서, 상기 치료방법은 포유동물 대상체의 종양이 αvβ6을 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 치료는 종양이 αvβ6을 발현하는 것으로 결정되면 투여된다.
본 발명의 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 또는 일곱 번째 관점에 따르면, 상기 펩타이드, 접합체 또는 약학적 조성물은 다른 항암제 및/또는 방사선 요법 또는 수술과 함께 투여되거나 투여되기 위한 것일 수 있다. 특히, 제2 화학요법 치료제 (동시 (simultaneous), 순차적 (sequential), 개별 (separate) 또는 공존하여 (concurrent)) 및/또는 방사선 요법 및/또는 수술 전 또는 수술 후의 병용 요법 (combination therapy)이 구체적으로 고려된다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않기를 바라며, 본 발명자들은 본 발명의 αvβ6- 표적 펩타이드 (targeting peptide) 또는 접합체-기반 요법을 하나 이상의 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 차단 (blockade)과 조합하면 단일 요법 (monotherapy)과 비교하여 항암 치료 효과를 향상시킬 수 있을 것으로 생각한다. 예비 항체 연구는 αvβ6이 RTK 신호 전달을 조절하고 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, 항 -αvβ6 항체와 조합하여 종양 모델에서 RTK (예를 들어, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 또는 erbB-2 (인간 표피 성장 인자 수용체 2 또는 HER2/neu로도 알려져 있음)를 표적으로 하는 것은 단일 요법에 비해 요법 (therapy)을 향상시킨다. 따라서, 본원에서 본 발명의 αvβ6 표적 펩타이드 또는 접합체-기반 요법은 특히 다음 중 하나 이상과 조합될 수 있음이 구체적으로 고려된다: Trastuzumab (Herceptin®), Gefitinib (Iressa®), Erlotinib (Tarceva®), Lapatinib (Tykerb®), Cetuximab (Erbitux®) 및 Panitumumab (Vectibix®).
여덟 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 두 번째 관점의 접합체 또는 이의 조성물을 종양 보유 대상체에 투여하는 단계 및 검출용 모이어티를 검출함으로써 상기 종양의 이미지를 형성하는 단계를 포함하는 포유동물 대상체에서 αvβ6-발현 종양의 영상화 (imaging) 방법을 제공하며, 상기 접합체는 상기 검출용 모이어티를 포함한다. 전형적으로 영상은 디스플레이 (예를 들어, 디지털 디스플레이 스크린) 상에 형성될 것이지만, 대상체의 신체 내 또는 신체 상의 직접 이미징이 본 명세서에서 구체적으로 고려된다. 특정 양태에서 상기 종양은 자궁경부 종양, 두경부 종양, 유방 종양, 폐 종양, 피부 종양, 결장 종양, 난소 종양 또는 췌장 종양이다.
아홉 번째 관점에서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 암의 생체 내 (in vivo) 진단 방법에 사용하기 위한 본 발명의 두 번째 관점의 접합체 또는 이의 조성물을 제공하며, 상기 접합체는 상기 검출용 모이어티를 포함하고, 상기 방법은 상기 접합체 또는 이의 조성물을 대상체에 투여하는 단계 및 상기 검출용 모이어티를 검출하여 대상체에서 αvβ6- 발현 종양의 존재를 진단하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 검출용 모이어티를 검출하는 단계는 대상체에 및/또는 대상체 신체의 특정 위치에 αvβ6-발현 종양의 존재가 측정되어 나타나는지 여부를 결정하기 위하여 상기 검출용 모이어티의 양, 농도, 수준, 강도 및/또는 위치를 측정하는 단계 및 (예를 들어, 해당 측정을 기준 레벨 (reference level), 배경 (background) 또는 대조군 (control)과 비교함으로써) 해당 측정을 보정 (correlating) 또는 해석 (interpreting) 하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서 상기 종양은 자궁경부 종양, 두경부 종양, 유방 종양, 폐 종양, 피부 종양, 결장 종양, 난소 종양 또는 췌장 종양이다.
열 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 두 번째 관점의 접합체 또는 이의 조성물을 αvβ6- 발현 종양을 갖는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에 투여하는 단계 및 상기 검출용 모이어티를 검출하여 대상체에서 αvβ6- 발현 종양의 존재를 진단하는 단계를 포함하는 암 진단방법을 제공하며, 상기 접합체는 상기 검출용 모이어티를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 검출용 모이어티를 검출하는 단계는 대상체에 및/또는 대상체 신체의 특정 위치에 αvβ6-발현 종양의 존재가 측정되어 나타나는지 여부를 결정하기 위하여 상기 검출용 모이어티의 양, 농도, 수준, 강도 및/또는 위치를 측정하는 단계 및 (예를 들어, 해당 측정을 기준 레벨 (reference level), 배경 (background) 또는 대조군 (control)과 비교함으로써) 해당 측정을 보정 또는 해석하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서 상기 종양은 자궁경부 종양, 두경부 종양, 유방 종양, 폐 종양, 피부 종양, 결장 종양, 난소 종양 또는 췌장 종양이다.
본 발명에 따르면, 상기 대상체는 인간, 반려 동물 (예를 들어, 개 또는 고양이), 실험실 동물 (예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 돼지 또는 비인간 영장류), 가축 또는 농장 동물 (예를 들어, 돼지, 소, 말 또는 양) 일 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체는 인간이다. 특정 경우에, 상기 대상체는 αvβ6-발현 종양으로 고통받고 있거나 진단 되었거나 이를 갖는 것으로 의심되는 인간일 수 있다.
본 발명은 그러한 조합이 명백히 허용되지 않거나 명백히 회피되는 것으로 언급된 경우를 제외하고 기술된 관점 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다. 본 발명의 이들 및 추가의 관점 및 양태는 첨부된 실시예 및 도면을 참조하여 아래에 더 상세히 설명된다.
도 1은 펩타이드 2 - 15의 합성에 사용되는 비-단백질성 (non-proteinogenic) 아미노산의 구조를 보여준다.
도 2는 시험관 내에서 시험한 펩타이드 22와 펩타이드 25를 비교한 것을 도시한다. 모든 A20FMDV2 변이체의 특이성 (specificity), 활성 (activity) 및 내재화 (internalisation)가 스크리닝 되었다. a) 특이성은 1000nM 에서 A375Puro에 결합하지 않고 (상단 히스토그램) A375Pβ6 에만 결합하는 것이며 (하단 히스토그램), 히스토그램의 이동 (shift)은 ai) 펩타이드 22 (좌측 히스토그램) 및 aii ) 펩타이드 25 (우측 히스토그램)에 의해 도시된 100 nM 동일한 농도에서 유세포 분석을 통한 평균 형광 강도 (Mean Fluorescent Intensity, MFI)의 기하 평균 ( Geometric Mean, GM)을 나태낸다. b) 친화도는 유세포 분석을 통해 0.1, 1, 10, 100 및 1000 nM에서 A375Pβ6에 대한 결합 수준을 측정함으로써 결정되었다. 그 결과는 상업적으로 공급되는 대조군 비오틴화-A20FMDV2 (biotinylated-A20FMDV2)에 대한 상대적인 펩타이드의 결합을 보여준다. 하나의 대표 실험으로부터의 데이터는 bii ) 펩타이드 25 (우측 그래프)가 bi) 펩타이드 22 (좌측 그래프)에 비해 유사한 농도에서 A375Pβ6에 더 잘 결합한다는 것을 보여준다. c) 내재화는 Imagestream®을 사용하여 A375Pβ6 세포에 의한 αvβ6 의존적 내재화를 보여준다. 데이터는 0 분 및 45 분 후 세포 표면의 펩타이드를 나타내고 (각 패널의 녹색, 우측 이미지), ci) 펩타이드 22 및 cii ) 펩타이드 25는 내재화되었으며 유사한 내재화 속도를 갖는다 (이미지 아래의 그래프 참조; 펩타이드 22 좌측 그래프, 펩타이드 25 우측 그래프).
도 3은 24 시간 후 인간 혈장 (n = 2) 및 PBS (대조군)에서 펩타이드의 안정성을 보여준다. 펩타이드 22, 25 및 26은 50 % 미만 안정한 펩타이드 23 및 24와 비교하여, 혈장에서 75 % 이상 안정하다. 펩타이드 수준 (level)은 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)을 사용하여 정량화되었다. 인간 혈장 ("혈액" 으로 표시됨, 각 펩타이드에서 우측 막대) 및 PBS (각 펩타이드에서 좌측 막대) 에서의 펩타이드의 안정성은 24 시간 후에 측정되었다. 이 실험에서, PBS를 대조군으로 사용하였다.
도 4는 양성 αvβ6- 발현 종양 및 음성 대조군 종양 (A375Puro)에서 111In-DTPA 커플링 된 펩타이드의 흡수 (uptake)를 보여준다. 펩타이드는 음성 종양 (적색; 각 펩타이드에서 좌측 막대)과 비교하여 αvβ6- 발현 종양 (청색; 각 펩타이드에서 우측 막대)에 특이적으로 흡수된다. 상대적인 흡수는 A375Puro : A375β6의 비율로 표시된다. 데이터는 25가 음성 종양과 비교하여 αvβ6- 발현 종양에 대해 거의 10배 더 특이적임을 보여준다. 데이터는 각각의 펩타이드 22 - 26에 대해 조직 그램 당 평균 주사 용량 (ID) ± 평균 표준 오차 (SEM) (mean Injected Dose per gram of tissue ± Standard Error of the Mean)로서 플롯팅 되었다.
본 발명을 기술함에 있어, 다음 용어들이 사용되며, 이는 아래에 기재된 바와 같이 정의되는 것을 의도한다.
펩타이드 변이체 및 비천연 아미노산 (Peptide variants and unnatural amino acids)
본원에 정의된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 A20FMDV2 모 펩타이드의 변이체이며, 펩타이드가 청구범위에 정의된 바와 같이, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 적합한 비천연 아미노산은 예를 들어, D-아미노산, 오르니틴 (ornithine), 디아미노부티르산 오르니틴 (diaminobutyric acid ornithine), 노르 류신 오르니틴 (norleucine ornithine), 피리일알라닌 (pyriylalanine), 티에닐알라닌 (thienylalanine), 나프틸알라닌 (naphthylalanine), 페닐글리신 (phenylglycine), 알파 및 알파-이치환 된 아미노산 (alpha and alpha-disubstituted amino acids), N- 알킬 아미노산 (N-alkyl amino acids), 락트산 (lactic acid), 트리플루오로티로신 (trifluorotyrosine)과 같은 천연 아미노산의 할라이드 유도체 (halide derivatives of natural amino acids), p-Cl-페닐알라닌 (p-Cl-phenylalanine), p-Br-페닐알라닌 (p-Br-phenylalanine), p-I-페닐알라닌 (p-I-phenylalanine), L- 알릴-글리신 (L-allyl-glycine), b-알라닌 (b-alanine), L-a-아미노부티르산 (L-a-amino butyric acid), L-g-아미노부티르산 (L-g-amino butyric acid), L-a-아미노 이소부티르산 (L-a-amino isobutyric acid), L-e-아미노 카프로산 (L-e-amino caproic acid), 7- 아미노 헵탄산 (7-amino heptanoic acid), L 메티오닌 설폰 (L methionine sulfone), L- 노르루신 (L-norleucine), L- 노르발린 (L-norvaline), p-니트로-L-페닐알라닌 (p-nitro-L-phenylalanine), L- 하이드록시프롤린 (L-hydroxyproline), L- 티오프롤린 (L-thioproline), 1- 메틸 -Phe (1-methyl-Phe)과 같은 페닐알라닌의 메틸 유도체, 펜타메틸-Phe (pentamethyl-Phe), L-Phe(4-아미노) (L-Phe(4-amino)), L-Tyr(메틸) (L-Tyr(methyl)), L-Phe(4-이소프로필) (L-Phe(4-isopropyl)), L-Tic(1,2,3,4-테트라 히드로이소퀴놀린-3-카르복실산) (L-Tic(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxyl acid)), L- 디아미노프로피온산 (L-diaminopropionic acid) 및 L-Phe(4- 벤질) (L-Phe(4-benzyl))을 포함한다. 이들 펩타이드는 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미드 결합이 에스테르 또는 알킬 골격 결합에 의해 대체될 수 있다. N 또는 C 알킬 치환기, 측쇄 변형 또는 이황화 가교 (disulphide bridges)와 같은 제약 (constraint), 측쇄 아미드 또는 에스테르 결합이 있을 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 변형된 펩타이드 및 합성 펩타이드 유사체 모두를 포함할 수 있다. 펩타이드는 예를 들어, 제형 (formulation) 과 저장 특성 (storage properties)을 개선하거나 비펩타이드성 구조를 통합 (incorporate)함으로써 불안정한 (labile) 펩타이드 결합을 보호하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, N-말단 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단 아미드화 (amidation).
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 화학적 합성, 예컨대 고체상 기술 및 자동화된 펩타이드 합성기에 의해, 또는 재조합 수단 (본원에 기재된 것과 같은 핵산을 사용하여)에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 화학을 사용하여 자동화된 다중 펩타이드 합성기 (Abimed AMS 422)에서 고체상 (solid phase) 전략을 사용하여 합성될 수있다. 이후, 펩타이드는 역상 -HPLC에 의해 정제하고 동결 건조 시킬 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 제조하기 위한 특정 합성 방법은 하기 실시예에 기재되어 있다.
일부 경우에서 X2 및 X3은 나선 촉진 잔기 (helix promoting residues)이다. 일부 경우에서 Zm 아미노산은 나선 촉진 잔기이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 나선 촉진 잔기는 Glu, Ala, Leu, Met, Gln, Lys, Arg, Val, Ile, Trp, Phe 및 Asp로 구성된 군에서 독립적으로 선택될 수 있다. 나선 촉진 잔기는 하나 이상의 인공 (artificial) 또는 변형된 (modified) 아미노산을 포함할 수 있다.
검출용 모이어티 (Detectable moiety)
본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 검출용 모이어티에 접합될 수 있다. 용어 "검출용 모이어티"는 본 발명의 접합체를 환자로 투여함에 따라 표적 부위에 위치할 때, 전형적으로 신체 및 위치된 표적 부위 외부에서 비침습적으로 검출될 수 있는 모이어티에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 이러한 양태의 접합체는 영상화 및 진단에 유용하다. 용이하게 검출 가능한 모이어티 (detectable moiety)는 MRI (Magnetic Resonance Imaging), MRS (Magnetic Resonance Spectroscopy), SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) 및 PET (Positron Emission Tomography) 및 광학 영상과 같은 이미징 기술로 검출할 수 개체 (entities)이다. 바람직하게는 영상 (imiaging) 모이어티는 시험관 내 및 생체 내 조건 하에서 그 특성을 유지하는 안정한 비독성 개체이다. 이러한 모이어티의 예는 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어 방사성 동위 원소와 같은 방사성 모이어티를 포함한다. 적합한 방사선 원자는 섬광 연구 (scintigraphic studies)를 위한 인듐(indium)-111, 테크네튬(technetium)-99m 또는 요오드(iodine)-123을 포함한다. 다른 용이하게 검출 가능한 모이어티는 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-18, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철과 같은 MRI를 위한 스핀 표지 (spin labels) 및 Cy5.5 및 양자점 (quantum dots)을 포함하는 광학 모이어티를 포함한다. 검출 가능한 모이어티의 추가적인 예는 68Ga, IRDye® 700, IRDye® 800, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (Fluorescein isothiocyanate, FITC), 89Zr, 124I, 64Cu, 62Cu, 18F, 86Y, 111In, 131I, 123I, 67Ga 및 99mTc를 포함한다.
용어 "치료 모이어티 (therapeutic moiety)"는 유익하고 (beneficial) 예방적 (prophylactic) 및/또는 치료적 (therapeutic) 특성을 갖는 모이어티를 포괄한다.
세포독성 화학요법 치료제(cytotoxic chemotherapeutic agents)는 당업계에 잘 알려져 있으며, 다음과 같은 항암제를 포함한다:
메클로레타민 (mechlorethamine)(HN2), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란 (melphalan) (L-사르코리신) (L-sarcolysin) 및 클로람부실 (chlorambucil)과 같은 질소 머스타드 (nitrogen mustards); 헥사메틸멜라민 (hexamethylmelamine), 티오테파 (thiotepa)와 같은 10 에틸렌 이민 (ethylenimines) 및 메틸 멜라민 (methylmelamines); 부설판 (busulfan)과 같은 알킬 설포네이트 (alkyl sulphonates); 카르무스틴 (carmustine) (BCNU), 로무스틴 (lomustine) (CCNLJ), 세무스틴 (semustine) (메틸 -CCN-U) 및 스트렙토조인 (streptozoein) (스트렙토조토신 (streptozotocin))과 같은 니트로소우레아 (nitrosoureas); 및 데카바진 (decarbazine) (DTIC; 디메틸트리아제노이미다졸카르복스아미드 (dimethyltriazenoimidazolecarboxamide))과 같은 트리아진 (triazenes)를; 포함하는 알킬화제 (alkylating agents);
메토트렉세이트 (methotrexate) (아메토프테린 (amethopterin))과 같은 엽산 유사체 (folic acid analogues); 플루오로우라실 (5-플루오로우라실; 5-FU) (fluorouracil)(5- fluorouracil; 5-FU), 플록시리딘 (플루오로데옥시 우리딘; FUdR) (loxuridine (fluorodeoxyuridine; FUdR)) 및 시타라빈 (사이토신 아라비노사이드) (cytarabine (cytosine arabinoside))과 같은 피리미딘 유사체 (pyrimidine analogues); 머캅토 퓨린 (6-머캅토 퓨린; 6-MP) (mercaptopurine (6-mercaptopurine; 6-MP)), 티오구아닌 (6-티오구아닌; TG) (thioguanine (6-thioguanine; TG)) 및 펜토스타틴 (2'- 데옥시코폰키닌) (pentostatin (2'-deoxycofonnycin)) 같은 퓨린 유사체 및 관련 억제제;를 포함하는 항 대사물질 (antimetabolites). 빈블라스틴 (vinblastine) (VLB) 및 빈크리스틴 (vincristine)과 같은 빈카 알칼로이드 (vinca alkaloids); 에토포시드 (etoposide) 및 테니포시드 (teniposide)와 같은 에피포도필로톡신 (epipodophyllotoxins); 닥티노마이신 (액티노마이신 D) (dactinomycin (actinomycin D)), 다우노라비신 (다우노마이신; 루비도마이신) (daunorabicin (daunomycin; rubidomycin)), , 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리카마이신 (미트라마이신) (plicamycin (mithramycin)) 및 미토마이신 (미토마이신 Q) (mitomycin (mitomycin Q))과 같은 항생제; L- 아스파라기나아제 (L-asparaginase)와 같은 효소; 및 인터페론 알페놈 (interferon alphenomes)과 같은 생물학적 반응 조절제 (biological response modifiers)를 포함하는 천연물질 (Natural Products). 시스플라틴 (cisplatin) (cis-DDP) 및 카보플라틴 (carboplatin)과 같은 백금 배위 착물 (platinum coordination complexes); 미토크산트론 (mitoxantrone) 및 안트라사이클린 (antbracycline)과 같은 안트라세니온 (anthracenedione); 하이드록시우레아 (hydroxyurea)와 같은 치환된 우레아 (substituted urea); 프로카르바진 (N-메틸히드라진, MIH) (procarbazine (N-methylhydrazine, MIH))과 같은 메틸 히드라진 유도체; 미토탄 (mitotane) (o, p'-DDD) 및 아미노글루티미드 (aminoglutethimide)와 같은 부신피질 억제제 (adrenocortical suppressant); 탁솔 (taxol) 및 유사체/유도체; 및 플루타미드 (flutamide) 및 타목시펜 (tamoxifen)과 같은 호르몬 작용제/길항제 (hormone agonists/antagonists)를 포함하는 기타 제제 (miscellaneous agents).
특히, 본 발명의 펩타이드는 아우리스타틴 (auristatin), 메이탄시노이드 (maytansinoids), 튜블리신 (tubulysin), 듀오카르마이신 (duocarmycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 알파-아마니틴 (alpha-amanitin), 피롤로벤조디아제핀 (pyrrolobenzodiazepine) (PBD), 이리노테칸 (irinotecan) 및 인돌카복사미드 (indolecarboxamide), 또는 이의 유사체, 유도체, 프로 드러그 또는 활성 대사 산물로부터 선택되는 항암제에 접합될 수 있다. 구체적인 예는 모노메틸 아우리스타틴 E (Monomethyl Auristatin E) (MMAE), 머탄신 (mertansine) (DM1), 라브탄신 (ravtansine) (DM4) 및 센타나마이신 (Centanamycin)을 포함한다.
특정 경우에서, 상기 항암제는 세포 사멸 (cell death)을 초래하는 임의의 모이어티를 포함하는 세포 독성 펩타이드 (cytotoxic peptide) 또는 폴리펩타이드 모이어티 (polypeptide moiety)일 수 있다.
세포 독성 펩타이드 및 폴리펩타이드 모이어티는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 리신 (ricin), 아브린 (abrin), 슈도모나스 외독소 (Pseudomonas exotoxin), 조직 인자 (tissue factor) 등을 포함한다.
세포 독성제로서 리신 (ricin)의 사용은 Burrows & Thorpe, P.N.A.S. USA 90: 8996-9000, 1993에 기술되어 있으며, 본원에 참조로서 병합된다. 국소 혈액 응고 및 종양 경색 (infarction)을 초래하는 조직 인자의 사용은 Ran et al, Cancer Res. 58: 4646-4653, 1998 및 Huang et al, Science 275: 25 547-550, 1997.에 기술되어 있다. Tsai et al, Dis. Colon Rectum 38: 1067- 1074, 1995은 모노클로날 항체에 접합된 아브린 A 쇄를 기술하고 있으며 본원에 참조로 포함된다. 다른 리보솜 불활성화 단백질이 WO 96/06641에 세포 독성제로서 기술되어 있다. 슈도모나스 외독소는 또한 세포 독성 폴리펩타이드 모이어티로서 사용될 수 있다 (예를 들어, Aiello et al, P.N.A.S. USA 92: 10457-10461, 1995 참조).
충분한 양으로 전달 (deliver)되면 특정 방사성 원자는 세포 독성이 있을 수 있다. 따라서, 항암제는, 사용시 세포독성이 있도록 표적 부위에 충분한 양의 방사능을 전달하는 방사성 원자를 포함할 수 있다. 적합한 방사성 원자는 인 (phosphorus)-32, 요오드(iodine)-125, 요오드(iodine)-131, 인듐(indium)-111, 레늄(rhenium)-186, 레늄(rhenium)-188, 아스타틴(astantine)-211 또는 이트륨(ytrium)-90, 또는 이웃하는 세포, 소기관 (organelles), 또는 핵산을 파괴하기에 충분한 에너지를 방출하는 다른 동위원소를 포함한다. 특히, 치료적 방사성 동위원소는 177Lu, 90Y, 211At, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 223Ra, 44Sc, 67Ga, 131I, 188Re, 186Re 및 67Cu로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 화합물에서 동위원소 및 방사성 원자의 밀도는 4000 cGy 이상, 더욱 바람직하게는 최소 6000, 8000 또는 10000 cGy의 투여량 (dose)이 표적 부위, 바람직하게는 표적 부위의 세포 및 그의 소기관, 특히 핵으로 전달된다. 방사성 원자는 공지된 방식으로 결합 모이어티 (binding moiety)에 부착될 수 있다. 예를 들어, EDTA, DTPA, DOTA 또는 다른 킬레이트제가 본 발명의 펩타이드에 부착될 수 있고, 상기한 바와 같이 111In, 68Ga, 90Y 또는 방사성 원자를 포함하는 금속 방사성 핵종 (metal radionuclides)을 부착하는데 사용될 수 있다. 티로신 잔기가 본 발명의 펩타이드에 도입될 수 있고, 125I 또는 131I로 표지될 수 있다.
펩타이드를 치료에제 접합시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이들은 링커, 예를 들어 절단 가능한 링커 (cleavable linker)의 사용을 포함할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)"는 일반적으로 펩타이드 또는 이의 접합체와 함께 사용될 수 있고 (compitable), 이를 받는 자 (recipient)에게 유해 (deleterious)하지 않은 성분을 포함한다. 전형적으로, 담체는 멸균되고 발열원이 없는 (pyrogen free) 물 또는 식염수 일 것이나; 다른 허용되는 담체도 사용될 수 있다. 전형적으로 본 발명의 약학적 조성물이나 제형은 비경구 투여, 특히 정맥 내 투여를 위한 것이다.
상기 정의된 바와 같은 본 발명의 의약 (medicament) 또는 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 바와 같이, 다른 의약을 투여받는 환자에게 유용하게 투여될 수 있다. 예를 들어, 암의 경우, 본 발명의 의약 또는 약학적 조성물은 다른 항-종양제(들)의 투여 전, 후, 또는 동안, 예를 들어 화학 요법 전, 후 또는 동안의 환자에게 투여될 수 있다. 화학요법 후 펩타이드로의 치료는 종양 또는 전이의 재발을 감소시키거나 예방하는데 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 항-종양제는 본 발명의 펩타이드에 직접 또는 간접적으로 공유결합 될 수 있다.
αvβ6 발현의 결정 (Determining αvβ6 expression )
당업자는 샘플 (예를 들어 종양 샘플)이 인테그린 αvβ6를 발현하는지 여부를 결정하기 위한 수많은 기법 (techniques)을 알고 있을 것이다. 특정 양태에서, 치료될 대상체는 인테그린 αvβ6를 발현하는 하나 이상의 세포를 갖는 종양을 가질 수 있다. 특정 경우에서, 종양이 인테그린 αvβ6를 발현한다 (즉, 그것이 αvβ6-양성 세포이다)는 발견은 이전에 수행되었거나 암 유형으로부터 유추될 수 있다. 예를 들어, 자궁경부 종양, 두경부 종양, 유방 종양, 폐 종양, 피부 종양, 결장 종양, 난소 종양 또는 췌장 종양을 포함하는 다양한 종양 유형이 인테그린 αvβ6을 발현하는 것으로 알려져 있다. 임의의 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않으며, 본 발명자들은 많은 상피 조직으로부터 발생하는 위장관 (gastrointestinal, (GI) tract)으로부터의 암과 암종 (carcinoma)이 본 발명의 펩타이드 또는 접합체를 사용한 αvβ6 표적 요법으로부터 이익을 얻을 수 있다고 생각한다. αvβ6을 발현하는 것으로 밝혀진 암의 범위가 추가적인 연구 노력을 통해 확대됨에 따라, 본 발명의 펩타이드 또는 접합체를 사용한 αvβ6-표적 요법으로부터 치료적 이점을 나타낼 수 있는 암의 범위가 증가할 것으로 예상된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 특정 경우에서 치료는 종양이 인테그린 αvβ6을 발현하는지 여부를 결정하는 능동적인 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계는, 본 발명의 αvβ6- 표적 펩타이드 또는 접합체를 사용하는 치료를 위한 대상체의 예상되는 적합성 (likely suitability)을 예측하기 위하여, 예를 들어, 본 발명의 αvβ6- 표적 펩타이드 또는 접합체로 치료를 개시하기 전에 수행될 수 있다. αvβ6 발현을 결정하는 단계는 면역조직화학법 (immunohistochemistry)을 사용하여 종양 샘플에서 단백질 발현 및/또는 수준을 측정하는 단계, ELISA 또는 웨스턴 블롯팅에 의해, 및/또는 αvβ6 또는 이의 단편 또는 서브 유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제 (binding agent)를 사용하여, 세포 용해물의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 대상체가 αvβ6-양성 암을 갖는지 여부의 결정은 암에서 얻은 세포 샘플로부터, 혈액에서 순환하는 암세포 샘플로부터 및/또는 혈액 또는 혈장에서의 순환 종양 DNA (ctDNA)로부터 추출된 핵산 상에서 수행될 수 있다.
특정 경우에서, αvβ6의 발현을 결정하는 단계는 암세포의 샘플로부터 RNA를 추출하는 단계; 및 실시간 (real time) PCR 및/또는 αvβ6 또는 이의 단편을 인코딩하는 RNA에 혼성화 할 수 있는 프로브를 사용하여 발현을 측정하는 단계를 포함한다. αvβ6 인테그린의 존재 또는 양은 항체 또는 본 발명의 펩타이드 또는 접합체와 같이 αvβ6 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제 (binding agent)를 사용하여 집적적으로 결정될 수 있다. 결합제는, 예컨대 ELISA 유형 분석에서, 표지되거나 또는 검출 가능한 결과를 생성할 수 있도록 예를 들어 이차 항체를 사용하여, 하나 이상의 추가 종 (species)과의 뒤이은 반응 (following reaction)을 검출되거나 검출될 수 있도록 표지될 수 있다.
샘플 (Samples)
본원에서 사용된 바와 같이 "테스트 샘플 (test sample)"은 세포 또는 조직 샘플 (예: 생검), 생물학적 유체, 추출물 (예: 대상체로부터 얻은 단백질 또는 DNA 추출물)일 수 있다. 특히, 샘플은 종양 샘플, 혈액 생플 (혈장 또는 혈청 샘플 포함), 뇌척수액 (cerebrospinal fluid) 샘플 또는 비-종양 조직 샘플일 수 있다. 샘플은 대상체로부터 새로이 (freshly) 얻은 것이거나 또는 결정 (determination)에 선행하여 처리 (processed) 및/또는 보관된 것일 수 있다 (예: 냉동, 고정 또는 하나 이상의 정제, 농축 (enrichment) 또는 추출 단계). 순환 종양 DNA를 위한 혈액 또는 혈장 샘플을 농축시키는 기법 (예를 들어, 단편 크기에 기초한)이 기술되어 있다. 또한, ctDNA에서 암-연관 돌연변이를 확인 (identify)하기 위한 시퀀싱 기법 (예를 들어, digital PCR, targeted deep sequencing, nested real-time PCR 등을 기반으로 한)이 기술되어 있다.
본원에서 사용된 "및/또는"은 2개의 특정한 특징 또는 구성요소 각각이 나머지 (the other)와 함께하거나 함께하지 않는 것으로 (with or without) 구체적으로 개시된 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B (A and/or B)"는 마치 각각이 개별적으로 제시 (set out)된 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 구체적인 개시로서 간주되어야 한다.
전술한 설명, 다음의 청구범위 또는 첨부도면에 개시된 특징들은 특정 형태로 또는 개시된 기능을 수행하기 위한 수단으로 표현되고, 또는 개시된 결과를 얻기 위한 방법 또는 과정은, 적절하다면, 개별적으로 또는 이러한 특징들의 임의의 조합으로, 본 발명을 다양한 형태로 실현하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 전술한 예시적인 양태와 결합하여 설명되었지만, 본 개시가 주어질 때 많은 균등한 변형 (modifications) 및 수정 (variations)이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 상술한 본 발명의 예시적인 양태는 제한적인 것이 아닌 예시적인 것으로 간주된다. 설명된 양태의 다양한 변경이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위해, 본원에서 제공되는 이론적 설명은 독자의 이해를 향상시키기 위한 목적으로 제공된다. 본 발명자들은 이러한 이론적 설명에 구속되기를 원하지 않는다.
본원에 사용된 임의의 섹션 제목 (section heading)은 단지 구성 (organization)의 목적을 위한 것이며, 서술되는 내용 (subject matter)를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
이후의 청구범위를 포함한 본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다 (comprise)" 및 "함유하다 (include)" 및 "포함하다 (comprises)", "comprising (포함하는)" 및 "including (함유하는)"과 같은 변형은 언급된 정수 (interger) 또는 단계 (step) 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것은 아님을 이해할 것이다. 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an"및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 범위 (range)는 "약" 하나의 특정 값으로부터 (from “about” one particular value), 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지 (to “about” another particular value)와 같이 본원에 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또 다른 양태는 하나의 특정 값으로부터 (from the one particular value) 및/또는 다른 특정값까지 (to the other particular value)를 포함한다. 마찬가지로, 값이 근사치로 표현될 때, 선행되는 "약"을 사용함으로써 특정 값은 또 다른 양태를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 수치와 관련하여 용어 "약"은 선택적이며, 예를 들어 +/- 10%를 의미한다.
다음은 실시예 (examples)로서 제시되며 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 (Examples)
유세포 분석에 의해 αvβ6 인테그린에 대한 결합 활성을 측정할 수 있도록, 모든 펩타이드는 천연 Ala 대신에 2Lys (D-비오틴) 잔기를 병합 (incorporating)하여 합성되었다 (즉, WO2007/039728에 개시된 바와 같이 A20FMDV2는 위치 2에 Ala를 가짐). 비교를 위해, 우리는 우리 자신의 SPPS 합성 펩타이드 (SPPS synthesized peptides)를 상업적으로 합성된 비오틴화-A20FMDV2 (biotinylated-A20FMDV2) (아래 표 2에서 비오틴화-A20FMDV2-A라고 함)와 비교하였다. 활성 연구 후, 강력한 결합 활성을 나타내는 비오틴화 펩타이드를 선택하고, 혈장 안정성 연구 (plasma stability studies) 및 생체 내 분포 연구 (in vivo biodistribution studies)를 위하여 금속 킬레이터 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (diethylenetriamine pentaacetic acid, DTPA) [17]을 병합하여 111In의 커플링을 촉진시켰다. 비오틴화 A20FMDV2 (biotinylated A20FMDV2), 이의 비-단백질성 유도체 (non-proteinogenic derivatives), 비오틴화 및 DPTA 병합 유사체 (biotinylated and DPTA-incorporated analogues)의 합성, 결합 연구 및 혈장 안정성은 아래에 상세히 기술된다.
실험 (Experimental)
일반 정보 (General Informationa )
모든 시약은 시약 등급으로 구입하여 추가 정제없이 사용하였다. HPLC 용매는 HPLC 등급으로 구매하고 추가 정제없이 사용하였다. FmocNH-L-Thr(tBu)-O-CH2-phi-OCH2-CH2-CO2H는 PolyPeptide (프랑스, 스트라스부르)로부터 구입하였다. O- (벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로 포스페이트 (O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluoro phosphate, HBTU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로 포스페이트 (O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HATU), 링크 아미드 (Rink amide), 4-(히드록시메틸)페녹시 아세트산 (4-(hydroxymethyl)phenoxyacetic acid, HMP), Boc 무수물 (Boc anhydride) 및 N,N-디이소프로필카르보디이미드 (N,N-diisopropylcarbodiimide, DIC)는 GL Biochem (중국, 상하이)에서 구입하였다. N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide, DMF) (AR 등급) 및 아세토니트릴 (cetonitrile, CH3CN) (HPLC 등급)은 Scharlau (스페인, 바르셀로나)로부터 구입하였다. 디이소프로필에틸아민 (Diisopropylethylamine, iPr2NEt), 4-디메틸아미노피리딘 (4-dimethylaminopyridine, DMAP), 피페리딘 (piperidine), N-메틸-2-피롤리돈 (N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 콜리딘 (collidine), 1,8-디아자비시클로운데크-7- 엔 (1,8-diazabicycloundec-7-ene, DBU), 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), 트리이소프로필실란 (triisopropylsilane, TIPS) 및 3,6-디옥사-1,8-옥탄디티올 (3,6-dioxa-1,8-octanedithiol, DODT)은 Sigma-Aldrich (미주리주, 세인트루이스)에서 구입하였다. 2-니트로벤젠설포닐 클로라이드 (2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 2-NBS-Cl) 및 디메틸설페이트 (dimethylsulfate, DMS)는 AK Scientific (캘리포니아주, 유니온 시티)으로부터 얻었다. 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid, TFA)은 Oakwood Chemicals (캘리포니아주, 리버 에지 시티)로부터 구입하였다. 아미노메틸 폴리스티렌 수지 (aminomethyl polystyrene resin ) 및 DTPA는 공지된 과정에 따라 합성되었다 [21, 22]. Fmoc-아미노산은 다음 측쇄 보호와 함께 GL Biochem으로부터 구입하였다: Fmoc-Arg(Pbf)-OH (Pbf= 2,2,4.6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-설포닐(2,2,4.6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl)), Fmoc-Asn(Trt)-OH (Trt=트리페닐메틸 (triphenylmethyl)), Fmoc-Asp(tBu)-OH (tBu=tert-부틸), Fmoc-Gln (Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-Dab (Boc)-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH, Fmoc-D-Thr(tBu)-OH 및 Fmoc-D-Asn(Trt)-OH.
전기 분무 이온화 질량 스펙트럼 (Electrospray ionisation mass spectra, ESI-MS)은 인라인 휴렛 팩커드 (캘리포니아주, 파울로 알토) 1100MSD 분광계에 연결된 애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies) (캘리포니아주, 산타 클라라) 1120 컴팩트 LC에 기록하였다. 0.1% 포름산/H2O 및 0.1% 포름산/CH3CN (1:1, v/v)을 사용하여 포지티브 모드에서 0.2 mL/분으로 ESI 공급원에 직접 유동 주입을 사용하여 샘플을 도입하였다. 주요 및 중요 단편은 xm/z (질량 대 전하비) 형태로 뒷받침되었다. Waters XTerra® C18 컬럼 (5μm, 4.6 x 150 mm)을 1 mL/min의 유속으로 사용하여 Ultimate 3000 시스템에서 분석 RP-HPLC를 수행하였다. 0.1% TFA/H2O (용매 A) 및 0.1% TFA/CH3CN (용매 B)의 선형 구배가 210 nm에서 검출과 함께 사용되었다. 예비 RP-HPLC는 Waters XTerra® Prep MS C18 컬럼 (10 μm, 19 x 300 mm)을 10 mL/분의 유속으로 사용하여 Waters 2487 이중 파장 흡광 검출기를 갖춘 Waters 600 시스템에서 수행되었다. 구배 시스템은 분석 RP-HPLC 크로마토그램으로부터 얻은 용리 프로파일 및 피크 프로파일에 따라 조정되었다.
일반적 펩타이드 합성 과정 (General peptide synthesis procedure)
Fmoc 화학 전략에 기초하여 아미노메틸 폴리스티렌 수지 (0.8 mmol/g) 상에서 고체상 펩타이드 합성 (0.1 mmol 스케일)을 수행하였다. FmocNH-L-Thr(tBu)-O-CH2-phi-OCH2-CH2-CO2H를 일반적인 방법 A (하기 참조)를 사용하여 수지에 부착시키고, 링크 아미드를 일반적인 방법 B를 사용하여 수지에 부착시킨 후, HMP는 일반적인 방법 C를 사용하여 수지에 커플링 시켰다 [20]. Fmoc-D-Thr(tBu)-OH의 커플링은 일반적인 방법 D를 사용하여 달성되었다. 원하는 펩타이드 서열을 수동으로 또는 일반적인 방법 E를 사용하여 TributeTM (애리조나주, 투손) 펩타이드 합성기에서 합성하였고, 펩타이드 결합 N-메틸화 (peptide bond N-methylation)는 일반적인 방법 F [19]으로 수행하였고, Fmoc-Gln(Trt)-OH와 N-메틸화된 라이신의 커플링은 일반적인 방법 G를 사용하여 수행하였다. N-말단 아세틸화는 일반적인 방법 H를 사용하여 수행하였고, tert-부틸 보호된 DTPA를 일반적인 방법 I을 사용하여 펩타이드에 커플링시켰다. D-비오틴은 일반적인 방법 J를 사용하여 펩타이드에 부착하였다. 일반적인 방법 K를 사용하여 수지로부터 선형 펩타이드를 절단하였고, 조 생성물 (crude products)은 일반적인 방법 L에 따라 정제하였다
일반적인 방법 A: FmocNH -L- Thr ( t Bu )-O-CH 2 -phi- OCH 2 -CH 2 - CO 2 H를 아미노 메틸 폴리스티렌 수지 ( aminomethyl polystyrene resin)에 부착
아미노메틸 폴리스티렌 수지 (0.1 mmol)를 CH2Cl2/DMF (1:1, v/v)에서 20 분 동안 팽윤시키고, 용매를 여과 (filtration)로 제거하였다. 수지에 10% DMF/CH2Cl2 (1 mL, v/v) 상의 FmocNH-L-Thr(tBu)-O-CH2-phi-OCH2-CH2-CO2H (2 당량 (eq.)) 용액에 이어서 DIC (2 당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반 (agitate)하였다. 용액을 배출하고, 수지를 DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL)로 세척하고 공기 건조하여 16을 얻었다. 음성 카이저 시험 (negative Kaiser test) [41]은 완전한 반응을 나타내었다.
일반적인 방법 B: 링크 아미드 (Rink amide)를 아미노메틸 폴리스티렌 수지에 부착
아미노메틸 폴리스티렌 수지 (0.1 mmol)를 CH2Cl2/DMF (1:1, v/v)에서 20 분 동안 팽윤시키고, 용매를 여과로 제거하였다. 수지에 10% DMF/CH2Cl2 (1 mL, v/v) 상의 링크 아미드 (2 당량) 용액에 이어서 DIC (2 당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 용액을 배출시키고, 수지를 DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL)로 세척하고 공기 건조시켰다. 음성 카이저 테스트는 완전한 반응을 나타내었다.
일반적인 방법 C: 4-( 하이드록시메틸 ) 페녹시아세트산 (4-(hydroxymethyl)phenoxyacetic acid)( HMP )을 아미노메틸 폴리스티렌 수지에 부착 (수지 27 합성)
아미노메틸 폴리스티렌 수지 (0.1 mmol)를 CH2Cl2/DMF (1:1, v/v)에서 20 분 동안 팽윤시키고, 용매를 여과로 제거하였다. 수지에 10% DMF/CH2Cl2 (1 mL, v/v) 상의 HMP (2 당량) 용액에 이어서 DIC (2 당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용액을 배출하고, 수지를 DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL)로 세척하고 공기 건조하여 27을 얻었다. 음성 카이저 테스트는 완전한 반응을 나타내었다.
일반적인 방법 D: Fmoc -D- Thr ( t Bu )-OH를 HMP -수지 27에 부착
수지에 DMF (1 mL) 상의 Fmoc-D-Thr(tBu)-OH (2 당량) 및 DIC (2 당량)의 용액을 첨가한 후 DMF (100 μL) 중 DMAP (10% 당량)을 적가 (dropwise addition)하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 용액을 배출하고 수지를 DMF (3 x 5 mL)로 세척 후, 에스테르화 (esterification)를 추가 2시간 동안 반복하였다. 수지에 20% 아세트산 무수물/DMF (1mL) 및 DMF (100μL) 상의 DMAP (10% 당량)의 용액을 적가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반한 후 용액을 배출하고, 수지를 DMF (3 x 5 mL)로 세척하였다.
일반적인 방법 E: 수동 및 자동 Fmoc SPPS
DMF (1 mL) 상의 Fmoc 보호된 아미노산 (5 당량)의 용액에 HBTU (4.75 당량) 및 iPr2NEt (10 당량)를 첨가하고, 그 용액을 수지에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 용액을 배출시키고 수지를 DMF (3 x 5 mL)로 세척하였다. Fmoc 보호기는 실온에서 5 분 동안, 이후 10 분 동안 20 % 피페리딘/DMF (5mL, v/v)로 처리하여 제거하였다.
일반적인 방법 F: 펩타이드 결합 N-메틸화 (peptide bond N- methylation )
NBS 보호 (protection): NMP (1 mL) 상의 2-NBS-Cl (4 당량)의 용액에 콜리 딘 (10 당량)을 첨가하고, 그 용액을 수지에 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 15 분 동안 교반하였다. 용액을 배출하고 수지를 NMP (3 × 5 mL)로 세척한 후, 반응을 추가 10 분 동안 반복하였다. N-메틸화: 수지에 NMP (1 mL) 상의 DBU (3 당량)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3 분 동안 교반하였다. NMP (1 mL) 상의 DMS (10 당량)의 용액을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2 분 동안 교반하였다. 용액을 배출하고 수지를 NMP (3 x 5 mL)로 세척한 후, 반응을 추가 2 분 동안 반복하였다. NBS 탈보호 ( deprotection ) : 수지에 NMP (2 mL) 상의 2-머캅토에탄올 (10 당량) 및 DBU (5 당량)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 5 분 동안 교반하였다. 용액을 배출하고 수지를 NMP (3 × 5 mL)로 세척한 후, 반응을 추가 5 분 동안 반복하였다.
일반적인 방법 G: Fmoc - Gln ( Trt )-OH와 N-메틸화된 Lys의 커플링
DMF (1 mL) 상의 Fmoc-Gln(Trt)-OH (5 당량)의 용액에 HATU (4.75 당량) 및 iPr2NEt (10 당량)를 첨가하고, 용액을 수지에 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 용액을 배출하고 수지를 DMF (3 x 5 mL)로 세척한 후, 반응을 추가 3 시간 동안 반복하였다.
일반적인 방법 H: N-말단 아세틸화
수지에 20% 아세트산 무수물/DMF (1mL)의 용액을 첨가한 후, DMF (100μL) 상의 DMAP (10 % 당량)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반한 후, 용액을 배출시키고, 수지를 DMF (3 x 5 mL)로 세척하였다.
일반적인 방법 I: tert -부틸 보호된 DTPA의 부착
DMF (1 mL) 상의 42 (5 당량)의 용액에 HBTU (4.75 당량) 및 iPr2NEt (10 당량)를 첨가하고, 용액을 수지에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반 한 후, 용액을 배출시키고 수지를 DMF (3 x 5 mL)로 세척하였다.
일반적인 방법 J: D-비오틴의 부착
펩타이드 1-15 및 펩타이드 17, 19, 20 및 21의 합성을 위해, N- 말단 Fmoc기를 실온에서 20% 피페리딘/DMF (5 mL, v/v)로 5 분 동안, 이후 10분 동안 처리하여 제거하였다. DMF (3 × 5mL)로 세척한 후, DMF (1mL) 상의 (Boc)2O (5 당량)의 용액을 수지에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반한 다음 DMF (3 x 5 mL)로 세척하였다. Dde 기를 실온에서 5 분 동안 2% 히드라진/DMF (5 mL, v/v)를 사용하여 제거하고 새로운 시약으로 10분 동안 반복하였다. DMF (3 × 5 mL)로 세척한 후, DMF (1 ㎖) 상의 D-비오틴 (5 당량), HBTU (4.75 당량) 및 iPr2NEt (10 당량)의 용액을 수지에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반한 다음 DMF (3 x 5 mL)로 세척하였다.
펩타이드 16 및 18 및 펩타이드 22-26의 합성을 위해, Dde 기를 실온에서 5 분 동안 2% 히드라진/DMF (5 mL, v/v)를 사용하여 제거하고 새로운 시약으로 10 분 동안 반복하였다. DMF (3 × 5 mL)로 세척한 후, DMF (1 ㎖) 상의 D-비오틴 (5 당량), HBTU (4.75 당량) 및 i Pr2NEt (10 당량)의 용액을 수지에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반 한 다음 DMF (3 × 5 mL)로 세척하였다.
일반적인 방법 K: 수지로부터 펩타이드의 절단
원하는 선형 펩타이드를 함유하는 수지를 TFA/H2O/DODT/TIPS (94:2.5:2.5:1.0, 5 mL, v/v/v/v)의 혼합물에서 3시간 동안 교반하였다. 여과액에 차가운 디에틸에테르 (30 mL)를 첨가하고, 생성물 혼합물을 10 분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버렸다. 이 절차를 두 번 반복하였다. 생성된 고체를 H2O/CH3CN + 0.1 % TFA (15 mL)의 용액에 용해시키고 동결 건조시켰다.
일반적인 방법 L: 정제
조 펩타이드 (crude)를 H2O/0.1% TFA의 용액에 용해시키고, 0.5%B/min 으로 5-20%B의 구배를 사용하고, 이후 0.2%B/min으로 35%B까지 10 mL/min 유속에서 XTerra® C18 column 으로 preparative reverse-phase (RP)-HPLC로 정제하였다. 펩타이드의 순도는 흐름 주입 (flow injection) (ESI+, 100V) 및 분석 RP-HPLC (XTerra® C18 컬럼, 5-95%B, 3%B/분, 1mL/분)에 의해 결정되었다.
생물학적 연구 (Biology studies)
펩타이드의 제조 (Preparation of peptide )
비교를 위한 상업적으로 공급되는 비오틴화 DOTA-A20FMDV2 펩타이드 (95 % 순도)는 PPR (영국, 캠브리지)로부터 구입하였다. 펩타이드를 0.1 % TFA (물에 희석됨)에 재현탁시켜 1mM 농도의 저장 용액 (stock solution)을 제조하고, 소분하여 -20 ℃에서 저장하였다.
세포주 (Cell lines)
시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo)에서 사용된 세포주는 형질 도입된 흑색종 A375Ppuro 및 A375Pβ6 (Dulbecco's Modified Eagle 's Medium (DMEM)/10 % 태아 소혈청 (FBS)에서 배양됨)이다 [9].
펩타이드의 특이성 및 결합 수준 - 유세포 분석법 (Specificity and Level of Binding of peptides-Flow Cytometry method)
세포를 트립신 처리하고 DMEM/0.1% (w/v) 소듐아자이드/0.1%(w/v) BSA (flow media)에 재현탁시켜 4x106 세포/ml의 세포 현탁액을 제조하였다. 이 시점부터 모든 것이 얼음에 유지되고, 50㎕의 세포 현탁액이 각 유동 튜브 (flow tube) (Falcon 2054 -Millipore)에 소분 (aliquot)되었다. 펩타이드를 2x 농도로 유동 배지 (flow media)에 연속 희석하고, 각 농도의 50㎕를 50㎕ 세포에 첨가하여 1000nM, 100nM, 10nM, 1nM, 0.1nM 및 0nM의 최종 농도를 제공하였다. A375Ppuro 세포의 경우, 1000nM의 최고 농도만이 세포에 첨가되었다. 이후, 펩타이드를 15 분 동안 얼음 위에 두었다. 이어서, 세포를 유동 배지에 재현탁시키고 1200rpm에서 3 분 동안 원심 분리하며 2 회 세척하였다.
마우스 항-비오틴 (1:200에서 50㎕; Jackson ImmunoResearch, 200-002-211)을 15 분 동안 각 샘플에 첨가한 후 세척 단계를 반복하였다. Alexa 488 (1:250)에 접합된 염소 항-마우스 IgG를 각 샘플에 첨가하고 (50㎕), 어둠 속에서 얼음에 15 분 동안 방치하였다. 세척 단계를 반복하고 세포를 380㎕의 유동 배지에 재현탁시켰다. FACSCalibur 세포 계측기 (Becton-Dickinson)를 사용하여 데이터를 획득하고; 각 샘플에 대해 기하 평균 형광 강도를 기록하였다.
내재화 분석 방법 - 이미지 스트림 및 유세포 분석 ( Internalisation assay method - Imagestream and Flow Cytometry )
세포를 트립신 처리하고 DMEM (무-혈청 배지)에 재현탁시켜 4x106 세포/ml의 세포 현탁액을 제조하였다. 이 시점부터 모든 것은 얼음에 보관하였다. 세포 현탁액 50㎕를 각 유동 튜브에 소분 하였다. 펩타이드를 차가운 무-혈청 배지를 이용하여 200nM로 희석하고 50㎕가 세포 샘플에 첨가될 때 100nM의 최종 농도가 되도록 하였다. 펩타이드를 얼음 상에 15 분 동안 방치한 후, 유동 배지로 2 회 세척하였으며, 각 세척 단계 사이에는 1200rpm에서 3 분 동안 원심분리하였다. 마우스 항 비오틴 (1:200으로 50㎕)을 15 분 동안 각 샘플에 첨가한 후 세척 단계를 반복하였다. 0인 시점 이외에, 각 시점의 샘플을 37℃에서 인큐베이터에 넣고, 15분, 30분, 45분에 세포를 PBS 중 4% 포름 알데히드에 10분 동안 고정 시킨 후 PBS로 1회 세척하고, PBS로 다시 세척하기 전 0.1 % Triton X-100 디터전트 (detergent)를 5 분 동안 첨가하였다. AlexaFLUOR 488 (1:250)에 접합된 염소 항-마우스 IgG를 각 샘플에 첨가하고 (50㎕) 어둠 속에서 얼음 위에 15 분 동안 방치하였다. 샘플을 상기와 같은 방법으로 세척하고 30㎕로 재현탁 시켰다. 샘플을 Imagestream X Mark II (Amnis, Merck)로 검사하였다. Imagestream 이미지를 온보드 소프트웨어를 사용하여 0 분 샘플과 비교하여 내재화를 평가하였다.
내재화 분석 방법 - 유세포 분석 ( Internalisation assay method - Flow Cytometry)
항체로 비오틴을 검출하기 전에 디터전트를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기와 같은 방법으로 세포를 준비하였다. 샘플은 FACScalibur (Bekton-Dickinson) 세포분석기에서 분석되었다. 시간에 경과하며 측정되는 형광 신호의 감소는 이미지스트림을 사용하여 시각적으로 확인된 바와 같이 결합된 펩타이드의 내재화와 연관되어 있었다 (데이터는 나타내지 않음).
혈장 안정성 (Plasma Stability)
15 ㎍의 DTPA-접합된 펩타이드에 15 MBq의 인듐-111 (Covidien-Petten, 네덜란드)을 첨가하고 (최종 부피 20 ㎕) 이어서 5 ㎕의 암모늄 아세테이트 (1M)를 첨가하였다. 샘플을 혼합하고 실온에서 30 분 동안 방치하였다. 이 혼합물 2㎕를 증류수 100㎕에 첨가한 후, 구배 역상-HPLC (Beckman)에 주입하였다. 샘플을 증류수 중 0.1 % TFA 중 Agilent Eclipse XDB-C18 컬럼을 통해 통과시켰다. 이는 일반적으로 > 95 % 인 방사성 표지의 효율성을 확인하는 것이다. 인간의 혈액을 나트륨 헤파린 튜브로 취하고 2000g에서 10 분 동안 원심분리 하였다. 혈장 (300㎕)을 7.5MBq의 변이체 펩타이드와 인큐베이션하고 즉시 150㎕를 제거하여 37 ℃에 놓고, 나머지 150㎕를 0 분 시간 샘플로 사용하였다. 여기에 동량의 차가운 아세토니트릴 (1:1)을 첨가하고 샘플을 혼합하였으며, 14000rpm에서 5분 동안 원심 분리 하였다. 상청액을 수집하고 10분 동안 진공 건조시켜 아세토니트릴을 제거하였다. 잔류물을 0.22μm 필터 (미립자를 제거하기 위해)를 통해 여과하고 100μl를 Radio-HPLC 기계에 주입하였다. 24 시간 샘플을 유사하게 처리하였다. 대조군 샘플을 PBS와 함께 인큐베이션 하였다. (참고 : PBS 대조군은 이 여과 과정 또는 아세토니트릴의 첨가를 요구하지 않았다). 샘플은 유사한 결과로 이중 (duplicate)으로 수행하였다.
생체 분포 ( Biodistribution )
100㎕의 2x106 세포를 암컷 CD1 Nu/Nu 마우스의 어깨에 피하주사하였다. 2 주에 걸쳐 좌측 (A375Puro) 및 우측 (A375β6) 어깨에서 종양이 피하로 성장하였다. 종양이 대략 5mm 직경으로 성장한 후에 펩타이드를 인듐-111로 방사성 표지하고, 방사성-HPLC로 분석하여 표지 효율을 결정하였다. 표지된 펩타이드를 멸균 PBS /BSA에 희석시키고 동물 당 0.3MBq를 제공하도록 하였다 (dosed). 이어서, 마우스에 방사성 표지된 펩타이드를 정맥 내 (꼬리 정맥) 주사하고 1 시간 후에 희생 (cull)하였다. 혈액, 기관 및 종양을 제거하여 무게를 측정하고, 다음날 감마 카운터 (LKB Compugamma)에서 잔류 활성을 측정하였다. 데이터는 % 주사된 용량/g 조직 (% ID/g)으로 표현되었다.
펩타이드 특성화 데이터 (Peptide Characterization Data)
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (1) (서열번호 11)
펩타이드 (1) (97.1 mg, 50%) 는 RP-HPLC 분석 (analytical RP-HPLC)에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 13.2 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1224.3; Found 1223.6.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQkVART-OH (2) (서열번호 12)
펩타이드 (2) (54.3 mg, 22%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 11.9 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1224.3; Found 1223.7.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQ[ornithine]VART-OH (3) (서열번호 13)
펩타이드 (3) (63.5 mg, 26%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.7 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1217.3; Found 1216.7.
펩타이드 N-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQ[diaminobutyric acid]VART-OH (4) (서열번호 14)
펩타이드 (4) (70.3 mg, 29%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.7 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1210.3; Found 1209.8.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQ[diaminopropionic acid]VART-OH (5) (서열번호 15)
펩타이드 (5) (59.9 mg, 25%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.9 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1203.2; Found 1203.1.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQ-N-MeKVART-OH (6) (서열번호 16)
펩타이드 (6) (72.7 mg, 30%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 11.5 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1231.3; Found 1230.7.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQV[aminoisobutyric acid]AQKVART-OH (7) (서열번호 17)
펩타이드 (7) (16.6 mg, 7%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 11.9 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1209.7; Found 1210.2.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQV[norvaline]AQKVART-OH (8) (서열번호 18)
펩타이드 (8) (19.5 mg, 8%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.2 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1216.8; Found 1217.2.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQV[norleucine]AQKVART-OH (9) (서열번호 19)
펩타이드 (9) (18.7 mg, 8%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.7 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1223.8; Found 1224.7.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQV[allylglycine]AQKVART-OH (10) (서열번호 20)
펩타이드 (10) (5.5 mg, 2%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 11.7 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1215.7; Found 1215.8.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQV[tert-butyl-alanine]AQKVART-OH (11) (서열번호 21)
펩타이드 (11) (7.5 mg, 3%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.9 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1230.8; Found 1230.7.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQV[homoleucine]AQKVART-OH (12) (서열번호 22)
펩타이드 (12) (26.1 mg, 11%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 13.1 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1230.8; Found 1231.2.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQV[2-amino-3-ethylpentanoic acid]AQKVART-OH (13) (서열번호 23)
펩타이드 (13) (10.1 mg, 4%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.9 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1230.8; Found 1230.8.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQV[cyclohexylalanine]AQKVART-OH (14) (서열번호 24)
펩타이드 (14) (6.2 mg, 2%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 13.4 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1243.8; Found 1244.2.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQV[adamantylglycine]AQKVART-OH (15) (서열번호 25)
펩타이드 (15) (22.4 mg, 9%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 13.7 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1262.8; Found 1263.3.
펩타이드 (16)
펩타이드 AcHN-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (16) (서열번호 11) (with N-term. acetylation)
(30.1 mg, 12%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 13.9 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2 + Calc. 1244.8; Found 1245.2.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-NH2 (17) (서열번호 11) (with C-term. amidation)
펩타이드 (17) (13.4 mg, 5%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 95 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 13.5 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1223.8; Found 1223.3.
펩타이드 (18)
펩타이드 AcHN-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-NH2 (18) (서열번호 11) (with N-term. acetylation and C-term. amidation) (12.5 mg, 5%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 95 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 13.9 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2 + Calc. 1244.3; Found 1244.6.
펩타이드 H2N-nK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (19) (서열번호 8)
펩타이드 (19) (47.7 mg, 19%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 95 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.6 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1223.8; Found 1224.1.
펩타이드 H2N-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVARt-OH (20) (서열번호 26)
펩타이드 (20) (45.3 mg, 19%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 95 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 13.0 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1223.8; Found 1224.2.
펩타이드 H2N-nK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVARt-OH (21) (서열번호 9)
펩타이드 (21) (36.4 mg, 15%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 95 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.9 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1223.8; Found 1224.4.
펩타이드 DTPA-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (22) (서열번호 11) (N-term. DTPA)
펩타이드 (22) (53.7 mg, 24%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 99 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 13.3 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1411.9; Found 1411.6.
펩타이드 DTPA-nK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (25) (서열번호 8) (N-term. DTPA)
펩타이드 (25) (37.5 mg, 13%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 95 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.6 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1411.3; Found 1410.6.
펩타이드 DTPA-nK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVARt-OH (26) (서열번호 9) (N-term. DTPA)
펩타이드 (26) (12.5 mg, 4%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 95 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.9 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1411.3; Found 1410.6.
펩타이드 DTPA-NK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-NH2 (24) (서열번호 11) (N-term. DTPA and C-term. amidation)
펩타이드 (24) (12.1 mg, 4%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 95 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 13.0 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1410.8; Found 1410.1.
펩타이드 DTPA-GNK(Biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (23) (서열번호 27) (N-term. DTPA)
펩타이드 (23) (41.9 mg, 15%) 는 RP-HPLC 분석에 따라 > 95 % 순도의 백색 고체로서 수득되었다. R t = 12.6 min (XTerra® C18, 5-95% B, 3% B/min, 1.0 mL/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1439.9; Found 1439.2.
실시예 1 - 비오틴화 A20FMDV2 1, Lys16 또는 Leu13 변형 및 비오틴화 펩타이드 2-15, N- 및/또는 C-말단 변형 및 비오틴화 펩타이드 16-21 및 ( DTPA )-함유 펩타이드 22-26의 합성
A20FMDV2 결합 활성에 비 단백질성 아미노산 (도 1에 나열) 도입을 조사할 수 있도록, 펩타이드 6을 제외한, 비오틴화 펩타이드 1-15 (표 1 참조)를 반응식 1에 도시된 조건을 사용하여 C- 말단 카르복시산을 전달하는 산성 민감성 (acid liable) 히드록시메틸페녹시프로피온산 링커 (hydroxymethylphenoxypropionic acid linker) (HMPP) 상에서 표준 Fmoc SPPS에 의해 합성되었다. Fmoc 보호기 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) (HBTU)/DIPEA를 제거하고자 20% 피페리딘/DMF를 커플링 시약으로 사용하여 원하는 펩타이드 서열을 조립하였다.
αvβ6 인테그린에 대한 특이적 결합이 유세포 분석법에 의해 연구되었기 때문에, A20FMDV2(1)과 모든 이의 유사체에서 두번째 잔기인 천연 알라닌은 비오틴화 된 리신 잔기로 치환되었다. 이 치환은 이전 연구에서 내성 좋은 (well tolerated) 것으로 확인된 바 있다 [24,25]. 측쇄 Nε-아미노기에 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소 시클로헥스-1-일리덴)에틸 (1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl) (Dde) [19] 기의 선택적 탈 보호에 의해 D-비오틴 모이어티를 자리 잡게 하고, 이어서 HBTU/DIPEA를 사용하여 D- 비오틴과 축합시켰다. 트리플루오로 아세트산 (TFA)/H2O/3,6-디옥사-1,8-옥탄디티올(DODT)/트리이소프로필실란(TIPS)(Trifluoroacetic acid (TFA)/H2O/3,6-dioxa-1,8-octanedithiol(DODT)/triisopropylsilane (TIPS))(94:2.5:2.5:1.0, v/v/v/v)로 상응하는 펩타이딜 수지로부터 합성된 펩타이드를 절단하였다. 펩타이드 1-15는 99%를 초과하는 순도 및 2%-50 % 범위의 양호한 수율로 수득되었다(펩타이드 특성 데이터 참조).
N-L-메틸리신 변형 (N-L-methyllysine modification)을 함유하는 펩타이드 6의 합성을 위해 수지상 N-메틸화 프로토콜 (on-resin N-methylation protocol)[22]을 채용하였고, 펩타이드 6는 TFA-매개 펩타이드 절단 및 RP-HPLC 정제 후 양호한 수율 (30%)로 수득되었다.
천연 아미노산만을 함유하는 리드 펩타이드 (lead peptide) A20FMDV2는 아미노 및 카르복시 말단에 작용하는 엑소펩티다아제 (exopeptidase)에 의한 분해에 ㅁ민감하다. 이를 완화하기 위해, 6개의 N- 및/또는 C- 말단 변형 및 비오틴화 된 A20FDMV2 모방체 (mimics)를 제조하였으며, 여기서 우리는 아미노 및 카르복시 말단 (펩타이드 16-18) 및 N- 말단 및 C- 말단 아미노산 (Asn1 및 Thr20, 각각 펩타이드 19- 21)을 체계적으로 변형시켰다. N-말단/C-말단 변형된 펩타이드 16-18은 아세트산 무수물로 N- 말단을 캡핑하거나 (16), C- 말단 카르복스 아미드를 수득하기 위해 링크 아미드 (Rink amid) 링커를 사용하거나 (17), 이 둘을 조합하여 (펩타이드 18) 수득하였다.
비오틴화 된 A20FMDV2 (1)의 N- 말단에서 천연 Asn1 대신에 비천연 D-Asn1을 갖는 펩타이드 19는 Fmoc-D-Asn(Trt)-OH 빌딩 블록이 N- 말단 잔기로서 합성에 도입된 것을 제외하고는 반응식 1에 개략된 합성 경로를 사용하여 수득하였다. C- 말단에서 비 천연 D-Thr을 함유하는 펩타이드 20 및 21의 제조를 위해, HMP-고정된 수지 27 (반응식 1, HMP = 하이드록시메틸페녹시 아세트산 (hydroxymethylphenoxyacetic acid))을 DIC/DMAP를 사용하여 Fmoc-D-Thr(tBu)-OH로 에스테르화 되고, 이어서 Fmoc SPPS로 서열을 연장하였다.
[표 1]
천연 Lys16에 대한 치환 (펩타이드 2-6) 또는 Leu13에 대한 치환 (펩타이드 7-15), C-말단/N-말단 변이체 (펩타이드 16-21) 및 DTPA- 변형 펩타이드 (22- 26)를 함유하도록 제조된 합성 펩타이드 [N-term]-X 1 K(Biotin)VPNLRGDLQVX 2 AQX 3 VARX 4 -[C-term]의 리스트. NB : 명명법, 특히 이 표에 사용된 X 위치 번호는 청구범위에 사용된 것과 동일하지 않다.
Figure pct00001
Figure pct00002
반응식 1. 비오틴화 된 A20FMDV2 펩타이드 변이체의 제조를 위한 합성 프로토콜.
결합 분석으로부터 얻은 결과 (이후의 표 2 참조)는 1의 N- 및 C- 말단의 변형 (각각 펩타이드 16 및 17) 또는 A20FMDV2 (1)의 천연 Asn1과, Asn1 및 Thr20 잔기 모두를 이들의 D-카운터파트 (counterpart)로의 치환 (각각 펩타이드 19 및 21)이 1에 비해 개선된 생물학적 활성을 나타내는 펩타이드를 생성하였음을 보여준다. 이들의 4개의 N- 및 C- 말단-변형 유사체 (16, 18, 19 및 21)가 인간 혈장에서 세포 내재화 연구 및 분해 분석 (degradation assays )을 수행할 수 있도록, DTPA 킬레이트제의 병합 (incorporation)을 위해 선택되었다. DTPA- 함유 비오틴화 된 A20FMDV2 펩타이드 (22)도 대조군으로 제조되었다 [25].
반응식 1에 도시된 바와 같이, DTPA- 함유 비오틴화 된 A20FMDV2 펩타이드 22 및 유사체 23- 25)를 Fmoc SPPS 조건 (Fmoc 보호기 제거를 위한 20% 피페리딘/DMF 및 커플링 시약으로 HBTU/DIPEA)을 사용하여 합성하였다. A20FMDV2의 N- 말단에 DTPA를, Lys2의 측쇄에 D-비오틴을 부착시키기 위해, N-말단 Fmoc 보호기는 먼저 20 % 피페리딘/DMF를 사용하여 제거되었고, tert- 부틸 보호된 DTPA [21]는 그 결과로 생긴 (resultant) Nα-아미노기에 HBTU/DIPEA를 사용하여 결합되었다. DTPA의 4개의 카르복시산이 산성에서 반응하는 tert -부틸 에스테르 (acid-labile tert-butyl esters)로 보호됨에 따라, 2% 히드라진/DMF를 사용하여 Dde 보호기를 선택적으로 제거할 수 있고, D-비오틴은 HBTU/DIPEA를 사용하여 측쇄 아미노 리실 (amino lysyl)에 커플링 되었다. 펩타이드 23 및 24의 경우, DTPA 리간드의 병합 (incorporation)을 가능하게 하기 위하여, 펩타이드 16 및 18의 아세틸기를 모방하고 아미드 결합 형성을 통한 DTPA의 부착을 촉진하기 위한 글리신 스페이서 (glycine spacer)가 채용되었다.
실시예 2 - 펩타이드 변이체의 생물 활성 (Biological activity of peptide variants)
펩타이드 변이체 중 원래의 A20FMDV2 보다 우수한 펩타이드를 시험하기 위해, 우리는 A375Pβ6 세포주에서 인테그린 αvβ6의 발현만 제외하고 [9] 유전적으로 동일한 두 세포주 (A375Ppuro 및 A375Pβ6)를 이용하는 일련의 테스트를 설계하였다. A375Ppuro는 그들의 리간드의 RGD 모티프에 결합하는 4 개의 인테그린 (αvβ3, αvβ5, αvβ8 and α5β1)을 발현하므로, 이 두 세포주에서 결합 활성을 비교하는 것은 매우 엄격한 분석법 (stringent assay)으로 간주된다.
변형된 펩타이드 1-15, 16-21 및 22-25의 거동을 특징짓기 위해 사용된 분석의 일례로서, 도 2는 펩타이드 22와 25 간의 비교를 보여준다. A20FMDV2는 다른 인테그린보다 αvβ6에 > 1000 배 더 선택적으로 결합한다 [9]. 변형된 펩타이드가 이러한 특이성을 유지하는지 확인하기 위하여, 유세포 분석기를 사용하여 얼마나 많은 펩타이드가 A375Ppuro와 A375Pβ6 세포에 결합하는지 결정하였다. 도 2a는 1000 nM에서 펩타이드 22 (ai) 및 펩타이드 25 (aii)가 A375Ppuro (적색 히스토그램; 상단 패널)에 결합되지 않음을 보여준다. 이와 대조적으로, 두 펩타이드 모두 100 nM에서 A375Pβ6 (청색 히스토그램; 하단 패널)에는 잘 결합하였다. 이들 데이터는 이들 펩타이드 변이체에서 αvβ6 결합 특이성이 유지됨을 보여준다. 또한, 모든 펩타이드 변이체는 1000 nM에서 A375Ppuro에 결합하지 못하여 (데이터는 나타내지 않음), 모든 펩타이드가 특이성을 유지함을 나타내었다.
변형된 펩타이드가 100 nM에서의 모 (parent) 비오틴화-A20FMDV2 펩타이드와 비교하여 이와 유사하거나 더 나은 정도로 결합하는지 확인하기 위하여, 우리는 0, 0.1, 1, 10, 100 및 1000 nM에서 변이체의 A375Pβ6에 대한 결합 활성을 시험 하였다.
일 예로, 도 2b는 100 nM에서 펩타이드 22가 상업적으로 수득한 비오틴화 된-A20FMDV2에 비해 16% 높게 결합하여, 더 나은 결합 활성을 나타냄을 보여준다. 유사하게, 펩타이드 25는 100 nM에서 결합이 상업적으로 수득한 비오틴화 된-A20FMDV2에 비해 150%인 바, 훨씬 나은 결합 활성을 보여준다. 이들 데이터는 단일 실험에서 얻은 것이다. 표 2는 연구된 모든 펩타이드에 대해 최대 4 회의 실험의 평균을 나타내고, 전체적으로 펩타이드 22는 모 (즉, 상업적으로 얻은 비오틴화 -A20FMDV2) 보다 평균 5% 더 높은 활성을 가졌고 펩타이드 25는 모보다 36% 더 높음을 보여준다.
37℃에서 세포에 의해 내재화되는 능력 (따라서 치료를 위한 잠재적 벡터로의 능력)을 평가하기 위해 Imagestream® 세포분석법 (cytometry) 및 유세포 분석법을 사용하였다. Imagestream®은 각 세포의 형광이미지를 가져와 (도 2C), 표면 대 세포 내 구획의 형광의 이미지 분석을 가능하게 한다. 도 2c의 히스토그램은 0 분 시점(time point)에 대한 상대적인 내재화를 나타낸다. 유세포 분석을 위해, 펩타이드의 내재화에 따른 표면 발현의 손실을 모니터링 하였다.
표 2는 상업적으로 공급된 비오틴화 -A20FMDV2 에 상대적으로 본 발명에 사용된 모든 펩타이드에 대한 활성 및 내재화 데이터를 요약한 것이다 (이 연구에서 합성된 비오틴화 A20FMDV2 (1)는, 이 펩타이드(1)가 D-비오틴 커플링에 이용되는 Ala2Lys 돌연변이를 포함한다는 점에서 상업적으로 얻어진 비오틴화-A20FMDV2와 상이하다).
표 2는 또한 상대 활성 값 (Relative Activity value)을 제공하기 위하여 결합 친화도 값 (binding affinity value)에 내재화된 양 (the amount internalized)을 곱하여 세포 내 약물 전달에 대한 각 펩타이드의 잠재력에 대한 임의적인 값 (arbitrary value)을 제공한다. 대부분의 16Lys 및 13Leu 변형은 상대적 활성을 감소시켰으며; 펩타이드 (7) 및 (9)를 제외하고는 이들의 상대적 활성은 대조군 비오틴화-A20FMDV2 보다 낮았다. 대조적으로, N- 및 C- 말단 변형된 펩타이드의 대부분 (16-19 및 21)은 비오틴화-A20FMDV2 (1)와 비교하여 더 우수한 결합 친화도와 더 개선된 상대적 활성을 가졌다. 예를 들어, 비 단백질성 D-Asn 아미노산 N- 말단 변형을 갖는 펩타이드 19는 모 화합물보다 세포성 αvβ6에 평균 43% 더 잘 결합된다 (표 2). 1.0의 값을 갖는 변형되지 않은 A20FMDV와 비교하여, 펩타이드 16 (N-아세틸화), 17 (C-아미드화), 18 (N-아세틸화 및 C-아미드화), 19 (D-Asn 치환) 및 21 (D-Asn 및 D-Thr 치환)은 대조 펩타이드 1 보다 55%, 31%, 9%, 27% 및 37% 높은 상대 활성 값을 갖는다.
[표 2]
Lys16 (1-6) 또는 Leu13 (7-15) 또는 C- 또는 N- 말단 변형 (16-21) 및 DTPA-커플 (22-26)a 합성 펩타이드에 대한 내재화 데이터의 비교.
Figure pct00003
a특정 펩타이드 (1, 16, 17, 19, 21)는 DTPA-커플됨
b비오틴화 A20FMDV@에 상대적인 평균 활성 (100nM)
c유세포 분석법을 이용한 45분에서의 비오틴화 A20FMDV2 (100nM)에 상대적인 평균 % 내재화
d상업적으로 수득한 비오틴화 DOTA-A20FMDV2
e본 연구에서 합성된 비오틴화 A20FMDV2
고무적이게도, 각각 펩타이드 23-26을 생성하기 위한 리드 펩타이드 (16, 17, 19, 21)에 DTPA의 접합은 결합 친화성 또는 내재화에 거의 영향을 미치지 않았고, 따라서 이들의 증가된 상대 활성이 유지되었다.
실시예 3 - 혈장 안정성 및 생물분포 연구 (Plasma stability and bio-distribution studies)
도 3은 0 분 시점과 비교하여, 37℃에서 혈장 (적색 막대; 각 펩타이드에서 우측 막대) 대 PBS (검은 막대; 각 펩타이드에서 좌측 막대)에서 DTPA- 접합 펩타이드 (22-26)의 안정성을 나타낸다. 데이터는 24시간 후 37℃에서 PBS 중의 펩타이드가 약 10%만이 분해되었음을 보여준다. 대조적으로, 펩타이드 (22, 25, 26)는 24 시간 후에 유사한 수준(77%-80%)으로 남아있는 것으로 나타났지만, 펩타이드 (23) (60% 잔류) 및 펩타이드 (24) (52% 잔류)는 주요한 분해가 있었다. 따라서, 펩타이드 24 및 23의 변형 (각각 C- 말단 아미드화 및 N- 말단 아세틸화)은 대조군 모 펩타이드 (1)에 비해 혈장 분해에 대한 감수성을 증가시켰다. D 아미노산을 이용한 화학적 조작에 의한 펩타이드 변형 (D-Asn, 화합물 25, 및 D-Asn/D-Thr 화합물 26)은 인간 혈장 프로테아제에 대한 감수성을 개선시키는 데 적합하였다.
각 반대쪽 어깨에 A375Ppuro 및 A375Pβ6 종양을 갖는 면역손상 마우스 (immunocompromised mice)(n=3-5)에 300Bq의 방사성 표지된 펩타이드 22-26을 정맥 내(iv) 주입한 후 1 시간 후에 희생시켰다. 주요 기관 및 혈액을 즉시 수집하고 무게를 측정하고 방사능을 측정하였다. 표 3의 데이터는 시험된 5 개의 DTPA- 접합 된 펩타이드의 거동을 보여준다; 데이터는 평균 % 주사 용량 / g 조직 (mean % injected dose/g tissue)으로 표현된다.
[표 3]
111In-DTPA 표지된 펩타이드(22-26)에 대한 생체 분포 (평균 (%) ID / g ± SEM) 데이터
Figure pct00004
a 데이터는 A375β6 (αvβ6) 및 A375Puro (대조군) 이종이식을 갖는 마우스 (n=3)으로부터 얻은 절제된 조직 유래이다. 마우스는 각 펩타이드 100Bq의 iv 주입 후 1 시간에 희생되었다. 데이터는 평균 % 주사 용량 / g 조직 (mean % injected dose per g of tissue) ± 평균 표준오차 (standard error of mean)으로 표시되었다. Bq: Becquerel.
우리의 이전 연구와 마찬가지로, 위장관 (위와 장)과 폐에서 상당한 유지 (retention)가 있었다 [9, 24]. 우리가 보고한 것은 αvβ6와 독립적이고 [9], 신장에서의 유지는 5개의 펩티이드에서 매우 다양하게 나타나는데, 펩타이드 25와 26은 최소의 유지를 보이고 펩타이드 23과 24는 모 비오틴화된 A20FMDV2 인 펩타이드 22 보다 훨씬 나은 유지를 나타내었다. αvβ6-음성 대조군 종양과 비교할 때 αvβ6-양성 종양에 의한 각 펩타이드의 강력한 선택적 흡수 (uptake)가 있었다. 도 4는 히스토그램에서 이러한 차이점을 강조한다. DTPA- 표지된 모 펩타이드 22에 비해 펩타이드 23-26의 통계적으로 증가된 흡수는 없지만, 모든 변이체는 대조군 펩타이드 22와 비교하여 αvβ6- 음성 종양 대비 αvβ6-양성 종양에서의 평균 체류율 (mean ratio of retention)이 약간 더 높았다. 대조군 펩타이드 22와 비교하여 αvβ6- 음성 종양 대비 αvβ6-양성 종양에서의 가장 높은 체류율은 펩타이드 25에서 관찰되었다.
논의 (Discussion)
20-잔기 선형 펩타이드 A20FMDV2는 종양-관련 αvβ6 인테그린에 대한 높은 특이성 (specificity) 및 친화도 (affinity)를 나타내며, 또한 세포 내로 αvβ6 - 의존적 내재화 (internalization)를 나타낸다. 따라서, A20FMDV2는 치료적 로드 (therapeutic loads) (예를 들어, 화학치료적 페이로드 (chemotherapeutic payloads))를 αvβ6-발현 암세포에 전달하는 유망한 리드 화합물 (lead compound)로 간주된다. 상기 실시예에서, A20FMDV2의 천연 아미노산 잔기의 비-단백질성 치환체 (non-proteinogenic substitutes)가 시험관 내 거동 (in vitro behaviour), 혈장 안정성 (plasma stability) 및 생체 내 생체 분포 (in vivo bio-distribution)에 미치는 영향이 조사되었다.
본원에 기술된 모든 펩타이드는 Fmoc SPPS에 의해 좋은 수율 및 우수한 순도로 합성되었다. αvβ6 인테그린에 대한 결합 연구 (binding study)는 모든 A20FMDV2 유사체가 A375Pβ6 세포에만 결합하지만 A375Ppuro 세포에는 결합되지 않았음을 보여주어, 특이성은 변형에 의해 영향을 받지 않음을 보여주었다. 또한, 아세틸화 된 N-말단 및 아미드화된 C-말단이 병합된 펩타이드 또는 천연 1Asn 및 20Thr 잔기의 비 천연 D-버전은 모 펩타이드 (parent peptide) (A20FMDV2)보다 더 강력한 αvβ6- 결합 활성을 나타내었고, 또한 천연 16Lys 및 13Leu 잔기의 비-단백질 대체제 (non-proteinogenic substitutes)를 함유하는 대부분의 펩타이드보다 더 강력하였다. 예를 들어, 비 단백질성 D-Asn 아미노산 N- 말단 변형을 갖는 펩타이드 19는 모 화합물보다 세포의 αvβ6에 평균 43% 더 잘 결합된다 (표 2).
우리는 인간 혈장에서의 안정성을 평가하고, 펩타이드가 마우스 혈청에 대한 이전의 연구보다 훨씬 더 오랫동안 온전하게 남아 있음을 보인바, 이는 이들 펩타이드에 대해 마우스 혈청보다 인간 혈장이 덜 분해적 (less degradative) 임을 시사한다. 모든 방사성 표지된 펩타이드의 90% 이상이 37℃에서 24 시간 후에 PBS에서 온전한 상태로 유지되었고, 오직 D 아미노산을 함유하는 A20FMDV2인 25 및 26만이 37℃의 인간 혈장에서 24시간 후 대체로 (mostly) 온전한 상태 (76-80 %)로 유지되었다.
변형은 αvβ6 발현 세포로의 내재화 정도에 중간 정도의 영향 (moderate effects)을 미쳤다. 따라서, 표 2는 시험된 모든 펩타이드에 대해, 상업적 비오틴화 된 A20FMDV2와 비교하여 내재화가 0.78 내지 1.11 배로 다양함을 보여준다. 세포 내 세포독성의 전달을 위해서는 펩타이드의 결합 친화도 및 내재화가 모두 필요하기 때문에, 표 2는 또한 각 펩타이드의 상대적 활성 (Relative Activity))에 대한 임의적 값 (arbitrary value)을 보여준다. 대조 펩타이드는 1.0의 값을 갖는 반면, 펩타이드 16, 19, 17, 18 및 21은 대조 펩타이드보다 각각 55%, 27%, 31%, 9% 및 37% 높은 상대적 활성 값을 갖는다.
αvβ6-표적 펩타이드가 약물 (therapies)을 전달하기 위해서는 αvβ6- 발현 종양에서 선택적으로 유지 (retain)되어야 한다. 생체 분포 연구에서, 우리는 시험된 5 개의 리드 펩타이드 (22-26) 모두가 αvβ6-음성 종양보다 적어도 6-10 배 높은 수준으로 αvβ6-양성 종양에 선택적으로 유지됨을 알아냈다. 모든 변형된 펩타이드가 DTPA- 표지 및 비오틴화 된 펩타이드 22보다 약간 우수하다는 것이 고무적이다. 본 결과는 A20FMDV2의 화학적 변형이 αvβ6-발현 암에 선택적으로 위치 (selectively locating)하기 위한 능력을 향상시켰음을 보여준다.
본 발명 및 본 발명이 속하는 기술의 상태를 보다 완전하게 기술하고 개시하고자 다수의 간행물이 인용되었다. 이들 참고문헌에 대한 전체 인용은 다음과 같다. 이들 참고문헌 각각은 본원에 통합된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Cancer Research Technology Limited <120> TUMOUR-TARGETING PEPTIDE VARIANTS <130> Pi19-B285 <140> PCT/EP2018/060474 <141> 2018-04-24 <150> GB1706472.6 <151> 2017-04-24 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 <400> 1 Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 2 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide motif <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = any D-amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Asx = is a sequence of any n amino acids, which may be natural or unnatural, D- or L-, and may be the same or different, wherein n is a number between 1 and 10 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = independentlly selected from any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa = independently selected from any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa = is Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Glx = a sequence of any m amino acids, which may be natural or unnatural, D- or L-, and may be the same or different, wherein m is a number between 1 and 10 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa = any L- or D-amino acid <400> 3 Xaa Asx Arg Gly Asp Leu Xaa Xaa Xaa Glx Xaa 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide motif <400> 4 Ala Val Pro Asn Leu 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide motif <400> 5 Lys Val Pro Asn Leu 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide motif <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = K(biotin), the biotin may be D-biotin attached to the Lysine side chain <400> 6 Xaa Val Pro Asn Leu 1 5 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = D-Asn <400> 7 Xaa Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 pepide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = D-Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = is K or K(biotin) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = is Lys or K(biotin) <400> 8 Xaa Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Lys or K(biotin) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa = D-Thr <400> 9 Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val 1 5 10 15 Ala Arg Xaa <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = D-Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa = D-Thr <400> 10 Xaa Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Xaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptd <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <400> 11 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <400> 12 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Xaa = Orn <400> 13 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Xaa 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Xaa = Dbu <400> 14 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Xaa 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Xaa = Dbu <400> 15 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Xaa 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa = N-methyl Leucine <400> 16 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Xaa 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa = Aib <400> 17 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Xaa Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa = Nva <400> 18 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Xaa Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa = Nle <400> 19 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Xaa Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa = Allylglycine <400> 20 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Xaa Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa = tert-butyl-alanine <400> 21 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Xaa Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa = homoleucicne <400> 22 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Xaa Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa = 2-amino-3-ethylpentanoic acid <400> 23 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Xaa Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa = cyclohexylalanine <400> 24 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Xaa Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa = adamantylglycine <400> 25 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Xaa Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa = D-Thr <400> 26 Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Xaa 20 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = K(biotin) <400> 27 Gly Asn Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln 1 5 10 15 Lys Val Ala Arg Thr 20 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A20FMDV2 synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Asn or D-Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = K(biotin) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa = Leu, L-2-aminoisobutyric acid, L-norvaline, L-allylglycine, L-tert-butylalanine, L-homoleucine, L-2-amino-3-ethylpentanoic acid, L-cyclohexylalanine, or L-adamantylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa = Leu, L-2-aminoisobutyric acid, L-norvaline, L-norleucine, L-allylglycine, L-tert-butylalanine, L-homoleucine, L-2-amino-3-ethylpentanoic acid, L-cyclohexylalanine, or L-adamantylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa = Lys, D-Lys, L-Orn, (1-2,4-diaminobutyric acid), (1-2,3-diaminopropionic acid), or N-L-methyllysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa = Thr or D-Thr <400> 28 Xaa Xaa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Xaa Ala Gln Xaa 1 5 10 15 Val Ala Arg Xaa 20

Claims (34)

  1. αvβ6 인테그린 (integrin)에 선택적으로 결합하는 펩타이드로,
    상기 펩타이드는 X1BnRGDLX2X3X4ZmX5 (서열번호 3)의 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, X1은 임의의 D-아미노산이고, Bn은 임의의 n개의 아미노산 서열로 이는 천연 또는 비천연, D- 또는 L- 일 수 있고, 동일하거나 상이할 수 있으며, n은 1 내지 10 사이의 수이고, X2 및 X3는 독립적으로 임의의 아미노산에서 선택되고, X4는 Leu 또는 Ile이고, Zm은 임의의 m개의 아미노산 서열로, 이는 천연 또는 비천연, D- 또는 L- 일 수 있고, 동일하거나 상이할 수 있으며, m은 1 내지 10 사이의 수이고, X5는 임의의 L- 또는 D-아미노산인 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 17 내지 25개의 아미노산이고, 선택적으로 상기 펩타이드의 길이는 20개의 아미노산인 펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X1은 D-Asn인 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X5는 L-Thr 또는 D-Thr인 펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X4는 Leu인 펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, n은 5 및/또는 m은 6인 펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Bn은 AVPNL (서열번호 4), KVPNL (서열번호 5) 또는 K(비오틴(biotin))VPNL인 펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Zm은 AQKVAR (서열번호 6)인 펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 펩타이드:
    H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (서열번호 7);
    H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (서열번호 8);
    H2N-[D-Asn]-K(biotin)VPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (서열번호 8);
    H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (서열번호 9);
    H2N-[D-Asn]-K(biotin)VPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (서열번호 9); 및
    H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (서열번호 10).
  10. 제9항에 있어서, 상기 펩타이드는 H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (서열번호 7)인 펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 N-아세틸화 (N-acetylated) 및/또는 C-아미드화 (C-amidated) 된 펩타이드.
  12. 직접 또는 링커를 통해 치료 모이어티 (therapeutic moiety), 중합체 (polymer), 폴리펩타이드 및/또는 검출용 모이어티 (detectable moiety)와 접합되어 있는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항으로 정의된 펩타이드를 포함하는 접합체 (conjugate).
  13. 제12항에 있어서, 상기 치료 모이어티는 항암제 (anti-cancer agent)를 포함하는 접합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항암제는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 접합체: 아우리스타틴 (auristatin), 메이탄시노이드 (maytansinoids), 튜불리신 (tubulysin), 듀오카르마이신 (duocarmycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 알파-아마니틴 (alpha-amanitin), 피롤로벤조디아제핀 (pyrrolobenzodiazepine), 이리노테칸 (irinotecan) 및 인돌카르복스아미드 (indolecarboxamide), 또는 이의 아날로그 (analogue), 유도체 (derivatives), 프로드러그 (prodrug) 또는 활성 대사산물 (active metabolite).
  15. 제14항에 있어서, 상기 항암제는 모노메틸 아우리스타틴 E (Monomethyl Auristatin E (MMAE)), 메르탄신 (mertansine (DM1)), 라브탄신 (ravtansine (DM4)) 또는 센타마이신 (Centanamycin)을 포함하는 접합체.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 모이어티는 177Lu, 90Y, 211At, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 223Ra, 44Sc, 67Ga, 131I, 188Re, 186Re 및 67Cu 로 구성된 군에서 선택되는 방사성 동위원소 (radioactive isotope)를 포함하는 접합체.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출용 모이어티는 자기 공명 영상 (Magnetic Resonance Imaging, MRI), 자기 공명 분광법 (Magnetic Resonance Spectroscopy, MRS), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (Single Photon Emission Computed Tomography, SPECT), 양전자 방출 단층 촬영기 (Positron Emission Tomograph, PET) 또는 광학 영상 (optical imaging)에 의해 검출되는 접합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 검출용 모이어티는 형광단 (fluorophore), 방사성 핵종 (radionuclide) 또는 스핀 라벨 (spin label)을 포함하는 접합체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 검출용 모이어티는 68Ga, IRDye® 700, IRDye® 800, 플루오레신 이소티오시아네이트 (Fluorescein isothiocyanate, FITC), 89Zr, 124I, 64Cu, 62Cu, 18F, 86Y, 111In, 131I, 123I, 67Ga 또는 99mTc를 포함하는 접합체.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출용 모이어티는 킬레이터 (chelator)를 포함하는 링커를 통해 상기 펩타이드와 커플링 된 111In을 포함하고, 선택적으로 상기 킬레이터는 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (diethylenetriamine pentaacetic acid, DTPA), 테트라자사이클로도데칸-1,4,7, 10-테트라아세트산 (tetrazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, DOTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)을 포함하는 중합체.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체는 하나 이상의 (예를 들어 하나 또는 두 개의) 에틸렌글리콜기 (ethylene glycol group) 또는 하나 이상의 (예를 들어 하나 또는 두 개의) 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG) 쇄 (chain)를 포함하는 접합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 (예를 들어 하나 또는 두 개의) PEG 쇄는 1 내지 50의 에틸렌 글리콜 단위를 길이로 갖는 접합체.
  23. 다음을 포함하는 약학적 조성물:
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항으로 정의된 펩타이드 또는 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항으로 정의된 접합체; 및
    약학적으로 허용되는 담체.
  24. 의약에 사용하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항으로 정의된 펩타이드, 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항으로 정의된 접합체 또는 제23항으로 정의된 약학적 조성물.
  25. 포유동물 대상체(mammalian subject)에서 αvβ6-발현 종양의 치료 방법에 사용하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항으로 정의된 펩타이드, 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항으로 정의된 접합체 또는 제23항으로 정의된 약학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 종양은 자궁경부 종양 (cervical tumour), 두경부 종양 (head or neck tumour), 유방 종양 ( breast tumour), 폐 종양 (lung tumour), 피부 종양 (skin tumour), 결장 종양 (colon tumour), 난소 종양 (ovarian tumour) 또는 췌장 종양 (pancreatic tumour)인 펩타이드, 접합체 또는 약학적 조성물.
  27. αvβ6-발현 종양을 갖는 포유동물 대상체 (mammalian subject)을 치료하는 방법으로, 상기 방법은 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항으로 정의된 펩타이드, 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항으로 정의된 접합체 또는 제23항으로 정의된 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체 (subject)에 치료적 유효량 (therapeutically effective amount)으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 종양은 자궁경부 종양 (cervical tumour), 두경부 종양 (head or neck tumour), 유방 종양 ( breast tumour), 폐 종양 (lung tumour), 피부 종양 (skin tumour), 결장 종양 (colon tumour), 난소 종양 (ovarian tumour) 또는 췌장 종양 (pancreatic tumour)인 방법.
  29. 포유동물 대상체에서 αvβ6-발현 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항으로 정의된 펩타이드, 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항으로 정의된 접합체 또는 제23항으로 정의된 약학적 조성물의 용도.
  30. 제29항에 있어서, 상기 종양은 자궁경부 종양 (cervical tumour), 두경부 종양 (head or neck tumour), 유방 종양 ( breast tumour), 폐 종양 (lung tumour), 피부 종양 (skin tumour), 결장 종양 (colon tumour), 난소 종양 (ovarian tumour) 또는 췌장 종양 (pancreatic tumour)인 용도.
  31. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항으로 정의된 접합체를 종양을 갖는 대상체에 투여하는 단계; 및 상기 검출용 모이어티를 검출하여 상기 종양의 이미지를 형성하는 단계를 포함하는 포유동물 대상체에서 αvβ6-발현 종양을 이미징하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 종양은 자궁경부 종양 (cervical tumour), 두경부 종양 (head or neck tumour), 유방 종양 ( breast tumour), 폐 종양 (lung tumour), 피부 종양 (skin tumour), 결장 종양 (colon tumour), 난소 종양 (ovarian tumour) 또는 췌장 종양 (pancreatic tumour)인 방법.
  33. 포유동물 대상체에서 암을 진단하기 위한 생체 내 방법에 사용하기 위한 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항으로 정의된 접합체로, 상기 방법은 상기 접합체를 대상체에 투여하는 단계; 및 상기 검출용 모이어티를 검출하여 대상체에서 αvβ6-발현 종양의 존재 (presence)를 진단하는 단계를 포함하는, 접합체.
  34. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항으로 정의된 접합체를 αvβ6-발현 종양을 갖는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에 투여하는 단계 및 상기 검출용 모이어티를 검출하여 대상체에서 αvβ6-발현 종양의 존재를 진단하는 단계를 포함하는 암 진단 방법.
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