JP2020518656A - 腫瘍標的化ペプチドバリアント - Google Patents
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Abstract
Description
一部の場合において、X4は、L−Leuである。
一部の場合において、nは、5である。一部の場合において、mは、6である。特定の場合において、nは、5であり、mは、6である。
特定の場合において、ペプチドのアミノ酸配列は、
H2N−[D−Asn]−AVPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号7);
H2N−[D−Asn]−KVPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号8);
H2N−[D−Asn]−K(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号8);
H2N−[D−Asn]−KVPNLRGDLQVLAQKVAR[D−Thr]−COOH(配列番号9);
H2N−[D−Asn]−K(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVAR[D−Thr]−COOH(配列番号9);および
H2N−[D−Asn]−AVPNLRGDLQVLAQKVAR[D−Thr]−COOH(配列番号10)
からなる群から選択される。
H2N−[D−Asn]−AVPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号7)あってもよい。
第2の側面において、本発明は、治療的部分、ポリマー、ポリペプチドおよび/または検出可能な部分に直接もしくはリンカーを介してコンジュゲートされた本発明の第1の側面のペプチドを含むコンジュゲートを提供する。
一部の態様において、抗がん剤は、オーリスタチン、マイタンシノイド、チューブリシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、アルファ−アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)、イリノテカンおよびインドールカルボキサミド、またはその類似体、誘導体、プロドラッグもしくは活性代謝物からなる群から選択される。特に、抗がん剤は、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)、メルタンシン(DM1)、ラブタンシン(DM4)またはセンタナマイシンを含んでもよい。
本発明の第1の側面のペプチドまたは本発明の第2の側面のコンジュゲート;および
薬学的に許容可能な担体
を含む医薬組成物を提供する。
ペプチドバリアントおよび非天然アミノ酸
本明細書において定義される通り、本発明のペプチドは、親A20FMDV2ペプチドのバリアントであり、ペプチドが請求項に定義される通りであれば、1つまたは複数の非天然のアミノ酸を含んでもよい。適切な非天然のアミノ酸には、例えば、D−アミノ酸、オルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシンオルニチン、ピリジルアラニン(pyriylalanine)、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、アルファおよびアルファ二置換アミノ酸、N−アルキルアミノ酸、乳酸、トリフルオロチロシン、p−Cl−フェニルアラニン、p−Br−フェニルアラニン、p−I−フェニルアラニンなどの天然のアミノ酸のハロゲン化誘導体、L−アリルグリシン、b−アラニン、L−a−アミノ酪酸、L−g−アミノ酪酸、L−a−アミノイソ酪酸、L−e−アミノカプロン酸、7−アミノヘプタン酸、L−メチオニンスルホン、L−ノルロイシン、L−ノルバリン、p−ニトロ−L−フェニルアラニン、L−ヒドロキシプロリン、L−チオプロリン、1−メチル−Phe、ペンタメチル−Pheなどフェニルアラニンのメチル誘導体、L−Phe(4−アミノ)、L−Tyr(メチル)、L−Phe(4−イソプロピル)、L−Tic(1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボキシル酸)、L−ジアミノプロピオン酸ならびにL−Phe(4−ベンジル)がある。ペプチドは、さらに修飾されてもよい。例えば、1つまたは複数のアミド結合が、エステルまたはアルキル骨格結合によって置き換えられてもよい。NもしくはCアルキル置換基、側鎖修飾またはジスルフィド架橋、側鎖アミドもしくはエステル結合などの制約があってもよい。
本発明のペプチドは、当業者に公知の方法を使用して調製されてもよい。例えば、ペプチドは、化学合成(例えば固相技術および自動化ペプチド合成装置)によって、または組換え手段(本明細書に記述される核酸などを使用する)によって産生されてもよい。例えば、ペプチドは、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学を使用する自動化された複数ペプチド合成装置(Abimed AMS 422)で固相戦略を使用して合成されてもよい。ペプチドは、次いで逆相−HPLCによって精製され、凍結乾燥され得る。本発明のペプチドを作る特定の合成方法は、以下の実施例に記述される。
検出可能な部分
本明細書で使用される、本発明のペプチドは、検出可能な部分にコンジュゲートされてもよい。用語「検出可能な部分」は、患者に本発明のコンジュゲートを投与した後に標的部位に位置する場合に、身体の外側および標的が位置する部位から一般に非侵襲的に検出され得る部分に関する。したがって、本発明のこの態様のコンジュゲートは、画像化および診断に有用である。容易に検出可能な部分は、核磁気共鳴映像法(MRI)、磁気共鳴分光法(MRS)、単光子放出コンピュータ断層撮影法(SPECT)および陽電子放射断層撮影法(PET)などの画像化技術ならびに光学的画像化によって検出可能な実体である。好ましくは、画像化部分は、in vitroおよびin vivo条件下でその特性を保持する安定かつ非毒性な実体である。そのような部分の例には、それだけには限らないが放射性部分、例えば放射性同位元素がある。適切な放射性原子には、シンチグラフィー研究用のインジウム111、テクネチウム99mまたはヨウ素123がある。他の容易に検出可能な部分には、例えば、ヨウ素123、ヨウ素131、インジウム111、フッ素18、炭素13、窒素15、酸素17、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などMRI用のスピン標識ならびにCy5.5およびカンタムドットを含む光学的部分がある。検出可能な部分のさらなる例には、68Ga、IRDye(登録商標)700、IRDye(登録商標)800、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、89Zr、124I、64Cu、62Cu、18F、86Y、111In、131I、123I、67Gaおよび99mTcがある。
細胞傷害性化学療法薬は、当業者に周知であり:メクロレタミン(HN2)、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン(L−サルコリシン)およびクロラムブシルなどの窒素マスタードを含めたアルキル化剤;10個のエチレンイミンおよびヘキサメチルメラミンなどのメチルメラミン、チオテパ;ブスルファンなどのアルキルスルホナート;カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNLJ)、セムスチン(メチル−CCN−U)およびストレプトゾエイン(streptozoein)(ストレプトゾトシン)などのニトロソ尿素;ならびにダカルバジン(DTIC;ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド)などのトリアゼン;メトトレキサート(アメトプテリン)などの葉酸類似体を含めた代謝拮抗物質;フルオロウラシル(5−フルオロウラシル;5−FU)、フロキシウリジン(フルオロデオキシウリジン;FUdR)およびシタラビン(シトシンアラビノシド)などのピリミジン類似体;ならびにプリン類似体およびメルカプトプリン(6−メルカプトプリン;6−MP)、チオグアニン(6−チオグアニン;TG)およびペントスタチン(2’−デオキシコホルマイシン)などの関連阻害剤などの抗がん剤がある。天然物には、ビンブラスチン(VLB)およびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド;エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン;ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン(ダウノマイシン;ルビドマイシン)、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)およびマイトマイシン(マイトマイシンQなどの抗生物質;L−アスパラギナーゼなどの酵素;ならびにインターフェロンアルフェノーム(alphenomes)などの生物学的応答調節物質がある。その他の薬剤には、シスプラチン(cis−DDP)およびカルボプラチンなどのプラチナ配位錯体;ミトキサントロンおよびアントラサイクリン(antbracycline)などのアントラセンジオン;水酸化尿素などの置換尿素;プロカルバジン(N−メチルヒドラジン、MIH)などのメチルヒドラジン誘導体;ならびにミトタン(o、p’−DDD)およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤;タキソールおよび類似体/誘導体;ならびにフルタミドおよびタモキシフェンなどのホルモンアゴニスト/アンタゴニストがある。
細胞傷害性ペプチドおよびポリペプチド部分は、当業者に周知であり、例えば、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素、組織因子、等がある。
用語「薬学的に許容可能な担体」は、ペプチドまたはそのコンジュゲートと適合し、レシピエントに対して有害でない成分を一般に含む。一般に、担体は、無菌であり発熱物質を含まないことになる水または生理食塩水になるが;他の許容できる担体が使用されてもよい。一般に、本発明の医薬組成物または製剤は、非経口投与用、より具体的には静脈内投与用である。
当業者は、サンプル(腫瘍サンプルなど)がインテグリンαvβ6を発現するかどうか決定する数多くの技術を承知していよう。特定の態様において、処置されるべき対象は、インテグリンαvβ6を発現する細胞を1つまたは複数有する腫瘍を有してもよい。特定の場合において、腫瘍がインテグリンαvβ6を発現する(すなわちαvβ6陽性がんである)という所見は、前もって実施されてもよく、またはがんの型から推測されてもよい。例えば、いくつかの腫瘍型は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍を含め、インテグリンαvβ6を発現することが公知である。どんな特定の理論に束縛されることを望むものでもないが、本発明者らは、胃腸(GI)管のがんおよび多くの上皮組織から発達する癌腫が、本発明のペプチドまたはコンジュゲートを使用するαvβ6標的化治療から恩恵を受け得ると信じている。さらなる研究努力によってαvβ6を発現すると判明したがんの範囲が拡大するにつれて、その結果、本発明のペプチドまたはコンジュゲートを使用するαvβ6標的化治療から治療的恩恵を呈し得るがんの範囲は広がると期待される。
本明細書で使用される「試験サンプル」は、細胞または組織サンプル(例えば生検)、生体液、抽出物(例えば、対象から得られるタンパク質またはDNA抽出物)でもよい。特に、サンプルは、腫瘍サンプル、血液サンプル(血漿または血清サンプルを含む)、脳脊髄液サンプルまたは非腫瘍組織サンプルでもよい。サンプルは、対象から新たに得られたものでもよくまたは決定を行う前に処理および/もしくは貯蔵された(例えば凍結、固定または1つもしくは複数の精製、富化もしくは抽出工程に供された)ものでもよい。循環腫瘍DNAのために血液または血漿サンプルを富化する技術(例えば断片サイズに基づく)が、記述されている。さらに、ctDNA内のがん関連突然変異を同定する配列決定技術が、記述されている(例えばデジタルPCR、標的ディープシーケンシング、ネステッドリアルタイムPCR、等に基づく)。
この明細書の全体を通じて、続く請求項を含めて、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、単語「含む(comprise)」および「含む(include)」、ならびに「含む(comprises)」、「含む(comprising)」および「含む(including)」などの変形は、述べられる整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を内包するが、他の任意の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を除外しないことを意味すると理解されよう。明細書および添付の請求項に使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈に別段の明確な指図がない限り複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。範囲は、「約」ある特定の値から、および/または「約」別の特定の値までとして本明細書に表現されてもよい。そのような範囲が表現される場合、別の態様は、ある特定の値からおよび/または他の特定の値までを含む。同様に、先の「約」の使用によって値が近似値として表現される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されよう。数値に関する用語「約」は、随意であり、例えば+/−10%を意味する。
全般的な情報
全ての試薬を試薬品質で購入し、それ以上精製することなく使用した。HPLC溶媒をHPLC品質で購入し、それ以上精製することなく使用した。FmocNH−L−Thr(tBu)−O−CH2−phi−OCH2−CH2−CO2Hを、PolyPeptide(Strasbourg、France)から購入した。O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU)、O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HATU)、Rinkアミド、4−(ヒドロキシメチル)フェノキシ酢酸(HMP)、Boc無水物およびN,N−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を、GL Biochem(Shanghai、China)から購入した。N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(AR品質)およびアセトニトリル(CH3CN)(HPLC品質)を、Scharlau(Barcelona、Spain)から購入した。ジイソプロピルエチルアミン(iPr2NEt)、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)、ピペリジン、N−メチル−2−ピロリドン(NMP)、コリジン、1,8−ジアザビシクロウンデカ−7−エン(DBU)、2−メルカプトエタノール、トリイソプロピルシラン(TIPS)および3,6−ジオキサ−1,8−オクタンジチオール(DODT)を、Sigma−Aldrich(St Louis、MO)から購入した。2−ニトロベンゼンスルホニルクロリド(2−NBS−Cl)および硫酸ジメチル(DMS)を、AK Scientific(Union City、CA)から入手した。トリフルオロ酢酸(TFA)を、Oakwood Chemicals(River Edge City、CA)から購入した。アミノメチルポリスチレン樹脂およびDTPAを、公開されている手順にしたがって合成した[21、22]。以下の側鎖保護を持つFmoc−アミノ酸を、GL Biochemから購入した:Fmoc−Arg(Pbf)−OH(Pbf=2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル)、Fmoc−Asn(Trt)−OH(Trt=トリフェニルメチル)、Fmoc−Asp(tBu)−OH(tBu=t−ブチル)、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−D−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Orn(Boc)−OH、Fmoc−Dab(Boc)−OH、Fmoc−Dap(Boc)−OH、Fmoc−D−Thr(tBu)−OHおよびFmoc−D−Asn(Trt)−OH。
固相ペプチド合成(0.1mmol規模)を、Fmoc化学戦略に基づいてアミノメチルポリスチレン樹脂(0.8mmol/g)上で実行した。FmocNH−L−Thr(tBu)−O−CH2−phi−OCH2−CH2−CO2Hを、全般的な方法A(下記参照)を使用して樹脂に結合させ、Rinkアミドを、全般的な方法Bを使用して樹脂に結合させ、HMPを、全般的な方法Cを使用して樹脂にカップリングした[20]。Fmoc−D−Thr(tBu)−OHのカップリングを、全般的な方法Dを使用して達成した。所望のペプチド配列を、手作業でまたは全般的な方法Eを使用してTribute(商標)(Tucson、AZ)ペプチド合成装置で合成し、ペプチド結合N−メチル化を、全般的な方法Fを使用して実施し[19]、Nメチル化リジンへのFmoc−Gln(Trt)−OHのカップリングを、全般的な方法Gを使用して実施した。N末端アセチル化を、全般的な方法Hを使用して実施し、t−ブチル保護されたDTPAを、全般的な方法Iを使用してペプチドにカップリングした。D−ビオチンを、全般的な方法Jを使用してペプチドに結合させた。直鎖ペプチドを、全般的な方法Kを使用して樹脂から切断し、粗産物を、全般的な方法Lにしたがって精製した。
アミノメチルポリスチレン樹脂(0.1mmol)をCH2Cl2/DMF(1:1、容積/容積)中で20分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、10% DMF/CH2Cl2(1mL、容積/容積)中のFmocNH−L−Thr(tBu)−O−CH2−phi−OCH2−CH2−CO2H(2当量)溶液、その後DIC(2当量)を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)、CH2Cl2(3×5mL)で洗浄し、風乾して16を得た。陰性カイザー試験[41]は、完全な反応を示した。
アミノメチルポリスチレン樹脂(0.1mmol)をCH2Cl2/DMF(1:1、容積/容積)中で20分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、10% DMF/CH2Cl2(1mL、容積/容積)中のRinkアミド(2当量)溶液、その後DIC(2当量)を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)、CH2Cl2(3×5mL)で洗浄し、風乾した。陰性カイザー試験は、完全な反応を示した。
アミノメチルポリスチレン樹脂(0.1mmol)をCH2Cl2/DMF(1:1、容積/容積)中で20分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、10% DMF/CH2Cl2(1mL、容積/容積)中のHMP(2当量)溶液、その後DIC(2当量)を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)、CH2Cl2(3×5mL)で洗浄し、風乾して27を得た。陰性カイザー試験は、完全な反応を示した。
樹脂にDMF(1mL)中のFmoc−D−Thr(tBu)−OH(2当量)溶液およびDIC(2当量)を添加し、その後DMF(100μL)中のDMAP(10%当量)を滴下した。反応混合物を室温で2時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した後、エステル化をさらなる2時間繰り返した。樹脂に20%酢酸無水物/DMF(1mL)を添加し、DMF(100μL)中のDMAP(10%当量)溶液を滴下し、反応混合物を室温で1時間撹拌し、その後溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した。
DMF(1mL)中のFmoc保護されたアミノ酸(5当量)溶液にHBTU(4.75当量)およびiPr2NEt(10当量)を添加し、溶液を樹脂に添加した。混合物を室温で30分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した。Fmoc保護基を、室温で5分間次いで10分間の20%ピペリジン/DMF(5mL、容積/容積)による処理によって除去した。
NBS保護:NMP(1mL)中の2−NBS−Cl(4当量)溶液にコリジン(10当量)を添加し、溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で15分間攪拌した。溶液を排液し、樹脂をNMP(3×5mL)で洗浄した後、反応をさらなる10分間繰り返した。N−メチル化:樹脂にNMP(1mL)中のDBU(3当量)溶液を添加し、反応混合物を室温で3分間撹拌した。NMP(1mL)中のDMS(10当量)溶液を反応混合物に次いで添加し、反応混合物を室温で2分間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をNMP(3×5mL)で洗浄した後、反応をさらなる2分間繰り返した。NBS脱保護:樹脂にNMP(2mL)中の2−メルカプトエタノール(10当量)およびDBU(5当量)溶液を添加し、反応混合物を室温で5分間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をNMP(3×5mL)で洗浄した後、反応をさらなる5分間繰り返した。
DMF(1mL)中のFmoc−Gln(Trt)−OH(5当量)溶液にHATU(4.75当量)およびiPr2NEt(10当量)を添加し、溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で3時間攪拌した。溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した後、反応をさらなる3時間繰り返した。
樹脂に20%酢酸無水物/DMF(1mL)溶液を添加し、その後DMF(100μL)中のDMAP(10%当量)溶液を滴下した。反応混合物を室温で30分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した。
DMF(1mL)中の42(5当量)溶液にHBTU(4.75当量)およびiPr2NEt(10当量)を添加し、溶液を樹脂に添加した。混合物を室温で30分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した。
ペプチド1〜15およびペプチド17、19、20および21の合成のために、N末端Fmoc基を、室温で5分間次いで10分間の20%ピペリジン/DMF(5mL、容積/容積)による処理によって除去した。DMF(3×5mL)で洗浄した後、DMF(1mL)中の(Boc)2O(5当量)溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで、DMF(3×5mL)で洗浄した。Dde基を、2%ヒドラジン/DMF(5mL、容積/容積)を室温で5分間使用することによって除去し、新鮮な試薬で10分間繰り返した。DMF(3×5mL)で洗浄した後、DMF(1mL)中のD−ビオチン(5当量)、HBTU(4.75当量)およびiPr2NEt(10当量)溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで、DMF(3×5mL)で洗浄した。
所望の直鎖ペプチドを含有する樹脂を、TFA/H2O/DODT/TIPS(94:2.5:2.5:1.0、5mL、容積/容積/容積/容積)の混合物中で3時間撹拌した。濾液に冷ジエチルエーテル(30mL)を添加し、上清を廃棄する前に産物混合物を10分間遠心分離した。この手順を2回繰り返した。得られた固体を、H2O/CH3CN+0.1%TFA溶液(15mL)に溶解し、凍結乾燥した。
粗ペプチドを、H2O/0.1% TFA溶液に溶解し、流速10mL/分で、0.5%B/分で5〜20%B、次いで35%Bまで0.2%B/分の勾配を使用してXTerra(登録商標)C18カラムで分取逆相(RP)−HPLCによって精製した。ペプチドの純度を、フローインジェクション(ESI+、100V)および分析RP−HPLC[XTerra(登録商標)C18カラム、5〜95%B、3%B/分、1mL/分]によって決定した。
ペプチドの調製
比較ために、商業的に供給されているビオチン化DOTA−A20FMDV2ペプチド(純度95%)を、PPR(Cambridge、UK)から購入した点に注意されたい。ペプチドを0.1% TFA(水に希釈した)に再懸濁して濃度1mMの保存溶液を調製し、分注し、−20℃で貯蔵した。
in vitroおよびin vivoで使用した細胞株は、形質導入した黒色腫株A375Ppuro、およびA375Pβ6である[ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)/10%ウシ胎仔血清(FBS)中で培養した][9]。
細胞をトリプシン処理し、DMEM/0.1%(質量/容積)アジ化ナトリウム/0.1%(質量/容積)BSA(フロー培地)に再懸濁して、4×106個細胞/mLの細胞懸濁液を調製した。この時点から全てを氷上に保ち、細胞懸濁液50μLを、各フローチューブ(ファルコン2054−Millipore)に分注した。ペプチドを、2×濃度でフロー培地中に段階的に希釈した。したがって各濃度50μLを細胞50μLに添加した場合、終濃度1000nM、100nM、10nM、1nM、0.1nMおよび0nMを得た。A375Ppuro細胞の場合、最高濃度の1000nMだけを細胞に添加した。次いでペプチドを、氷上に15分間放置した。次いで、細胞をフロー培地に再懸濁し、1200rpmで3分間遠心分離することにより2回洗浄した。
細胞をトリプシン処理し、DMEM(無血清培地)に再懸濁して4×106個細胞/mLの細胞懸濁液を調製した。この時点から全てを氷上に保った。細胞懸濁液50μLを、各フローチューブに分注した。ペプチドを氷冷無血清培地中に200nMになるよう希釈し、細胞サンプルに50μLを添加した後に終濃度100nMを得た。ペプチドを氷上に15分間放置し、次いでフロー培地で2回洗浄し、各洗浄工程の間に1200rpmで3分間遠心分離した。マウス抗ビオチン(1:200で50μL)を各サンプルに15分間添加し、次いで洗浄工程を繰り返した。0時点を除いて、時点サンプルのそれぞれを、37℃で15、30および45分間インキュベーター内に置き、細胞を、PBS中の4%ホルムアルデヒドで10分間固定し、PBSで1回洗浄し、PBSで再度洗浄する前に0.1% Triton X−100界面活性剤を5分間添加した。AlexaFLUOR 488にコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG(1:250)を、各サンプルに添加し(50μL)、暗所で氷上に15分間放置した。サンプルを上記のように洗浄し、30μLになるように再懸濁した。サンプルを、Imagestream X Mark II(Amnis、Merck)で検査し、Imagestream画像を、搭載されているソフトウェアを使用して0分のサンプルと比較して内部移行について評価した。
細胞を、抗体でビオチンを検出する前に界面活性剤を添加しなかったことを除いて上記の通り調製した。サンプルを、FACScalibur(Bekton−Dickinson)血球計算器で分析した。経時的に測定した蛍光シグナルの減少は、Imagestreamを使用して視覚的に確認したように、結合しているペプチドの内部移行と関連付けられた(データ不掲載)。
DTPAコンジュゲートしたペプチド15μgにインジウム111(Covidien−Petten、Netherlands)15MBqを添加し(最終容積20μL)、その後酢酸アンモニウム(1M)5μLを添加した。サンプルを混合し、室温で30分間放置した。この混合物2μLを蒸留水100μLに添加し、次いで混合物を勾配逆相−HPLC(Beckman)に注射した。サンプルを、蒸留水中の0.1% TFA中でAgilent Eclipse XDB−C18カラムに流した。これは、一般に>95%である放射標識の効率を確認するためであった。ヒト血液を、ナトリウムヘパリン管に採取し、2000gで10分間遠心分離した。血漿(300μL)を、7.5MBqのバリアントペプチドとインキュベートし、直ちに150μLを除去し、37℃に置き、残りの150μLを、時間0分サンプルとして使用した。これに、氷冷アセトニトリル等容積を添加し(1:1)、サンプルを混合し、14000rpmで5分間遠心分離した。上清を採集し、10分間吸引乾燥してアセトニトリルを除去した。残滓を、0.22μmフィルターによって濾過し(微粒子を除去するため)、100μLを放射HPLC機械に注射した。24時間サンプルを同様に処理した。対照サンプルをPBSとインキュベートした。(注意:PBS対照は、濾過のこの工程またはアセトニトリルの添加を必要としなかった)。サンプルを複製して実行し、類似の結果であった。
100μL中に2×106個の細胞を、雌CD1 Nu/Nuマウスの肩に皮下注射した。腫瘍を、左肩(A375Puro)および右肩(A375β6)で2週間にわたり皮下成長させた。腫瘍が、直径およそ5mmに成長したら、ペプチドをインジウム111で放射性標識し、放射HPLCによって分析して標識効率を決定した。標識されたペプチドを無菌PBS/BSAに希釈し、動物1匹当たり0.3MBqを与えるように投薬した。次いでマウスに放射性標識ペプチドを静脈内(尾静脈)注射し、1時間後に殺処分した。血液、器官および腫瘍を摘出し、計量し、その翌日残留活性をガンマカウンター(LKB Compugamma)で測定した。データを、%注射用量/g組織(%ID/g)として表した。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(1)(配列番号11)
ペプチド(1)(97.1mg、50%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.2分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1224.3;Found 1223.6。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQkVART−OH(2)(配列番号12)
ペプチド(2)(54.3mg、22%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=11.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1224.3;Found 1223.7。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQ[オルニチン]VART−OH(3)(配列番号13)
ペプチド(3)(63.5mg、26%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.7分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1217.3;Found 1216.7。
ペプチドN−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQ[ジアミノ酪酸]VART−OH(4)(配列番号14)
ペプチド(4)(70.3mg、29%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.7分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1210.3;Found 1209.8。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQ[ジアミノプロピオン酸]VART−OH(5)(配列番号15)
ペプチド(5)(59.9mg、25%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1203.2;Found 1203.1。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQ−N−MeKVART−OH(6)(配列番号16)
ペプチド(6)(72.7mg、30%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=11.5分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1231.3;Found 1230.7。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[アミノイソ酪酸]AQKVART−OH(7)(配列番号17)
ペプチド(7)(16.6mg、7%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=11.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1209.7;Found 1210.2。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[ノルバリン]AQKVART−OH(8)(配列番号18)
ペプチド(8)(19.5mg、8%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.2分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1216.8;Found 1217.2。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[ノルロイシン]AQKVART−OH(9)(配列番号19)
ペプチド(9)(18.7mg、8%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.7分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1223.8;Found 1224.7。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[アリルグリシン]AQKVART−OH(10)(配列番号20)
ペプチド(10)(5.5mg、2%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=11.7分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1215.7;Found 1215.8。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[t−ブチル−アラニン]AQKVART−OH(11)(配列番号21)
ペプチド(11)(7.5mg、3%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1230.8;Found 1230.7。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[ホモロイシン]AQKVART−OH(12)(配列番号22)
ペプチド(12)(26.1mg、11%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.1分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1230.8;Found 1231.2。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[2−アミノ−3−エチルペンタン酸]AQKVART−OH(13)(配列番号23)
ペプチド(13)(10.1mg、4%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1230.8;Found 1230.8。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[シクロヘキシルアラニン]AQKVART−OH(14)(配列番号24)
ペプチド(14)(6.2mg、2%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.4分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1243.8;Found 1244.2。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[アダマンチルグリシン]AQKVART−OH(15)(配列番号25)
ペプチド(15)(22.4mg、9%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.7分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1262.8;Found 1263.3。
ペプチドAcHN−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(16)(配列番号11)(N末端アセチル化)(30.1mg、12%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1244.8;Found 1245.2。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−NH2(17)(配列番号11)(C末端アミド化)
ペプチド(17)(13.4mg、5%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=13.5分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1223.8;Found 1223.3。
ペプチドAcHN−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−NH2(18)(配列番号11)(N末端アセチル化およびC末端アミド化)(12.5mg、5%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=13.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1244.3;Found 1244.6。
ペプチドH2N−nK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(19)(配列番号8)
ペプチド(19)(47.7mg、19%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=12.6分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1223.8;Found 1224.1。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVARt−OH(20)(配列番号26)
ペプチド(20)(45.3mg、19%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=13.0分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1223.8;Found 1224.2。
ペプチドH2N−nK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVARt−OH(21)(配列番号9)
ペプチド(21)(36.4mg、15%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=12.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1223.8;Found 1224.4。
ペプチドDTPA−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(22)(配列番号11)(N末端DTPA)
ペプチド(22)(53.7mg、24%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.3分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1411.9;Found 1411.6。
ペプチドDTPA−nK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(25)(配列番号8)(N末端DTPA)
ペプチド(25)(37.5mg、13%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=12.6分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1411.3;Found 1410.6。
ペプチドDTPA−nK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVARt−OH(26)(配列番号9)(N末端DTPA)
ペプチド(26)(12.5mg、4%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=12.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1411.3;Found 1410.6。
ペプチドDTPA−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−NH2(24)(配列番号11)(N末端DTPAおよびC末端アミド化)
ペプチド(24)(12.1mg、4%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=13.0分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1410.8;Found 1410.1。
ペプチドDTPA−GNK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(23)(配列番号27)(N末端DTPA)
ペプチド(23)(41.9mg、15%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=12.6分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1439.9;Found 1439.2。
結合アッセイから得られた結果(表2、後を参照のこと)は、1のNおよびC末端の修飾(それぞれペプチド16および17)、またはA20FMDV2(1)の天然のAsn1およびAsn1とThr20両方の残基の、D対応物への置換(それぞれペプチド19および21)が、1と比較して生物学的活性の改善を呈するペプチドをもたらすことを示した。したがって、ヒト血漿における細胞内部移行研究および分解アッセイを実施できるように、その4つのNおよびC終点修飾類似体(16、18、19および21)を、DTPAキレート化剤を組み込むために選択した。含DTPAビオチン化A20FMDV2ペプチド(22)も対照として調製した[25]。
元のA20FMDV2より優れているペプチドバリアントがあるとすると、それはどのペプチドバリアントか試験するために、A375Pβ6細胞株におけるインテグリンαvβ6の発現[9]を除いて遺伝的に同一である2つの細胞株(A375PpuroおよびA375Pβ6)を使用して一連の試験を設計した。A375Ppuroは、そのリガンド内のRGDモチーフに結合するさらに4つのインテグリン(αvβ3、αvβ5、αvβ8およびα5β1)を発現するので、これら2つの細胞株における結合活性を比較することは、非常に厳しいアッセイであると考えられる。
実施例3−血漿安定性および体内分布研究
図3は、37℃でのPBS(黒色バー;各ペプチドについて左手のバー)と対比した血漿(赤色バー;各ペプチドについて右手のバー)中のDTPAコンジュゲートペプチド(22〜26)の安定性を、0分時点と比較して示す。データは、PBS中で37℃、24時間後にペプチドの約10%しか分解されなかったことを示す。それに対し、ペプチド(22、25、26)は、24時間後に血漿中で類似レベルの残存(77%〜80%)を示すが、ペプチド(23)(60%残存)およびペプチド(24)(52%残存)は大きく分解される。したがって、ペプチド24および23(それぞれC末端アミド化およびN末端アセチル化)の修飾は、対照親ペプチド(1)と比較して血漿分解に対する感受性を増大させた。Dアミノ酸(D−Asn、化合物25、およびD−Asn/D−Thr化合物26)を使用する化学操作によるペプチド修飾が、ヒト血漿プロテアーゼに対する感受性を改善するのに最適であった。
20残基直鎖ペプチドA20FMDV2は、腫瘍関連αvβ6インテグリンに対する高い特異性および親和性を呈し、細胞へのαvβ6依存的内部移行も呈する。したがってA20FMDV2は、αvβ6発現がん細胞に治療用担持物(例えば化学療法ペイロード)を送達するのに見込みがあるリード化合物と考えられる。上記の実施例において、in vitro挙動、血漿安定性およびin vivo体内分布に対するA20FMDV2の天然のアミノ酸残基の非タンパク新生置換物の影響について調査した。
本発明および本発明が関係する最新技術についてより完全に記述し、開示するためにいくつかの刊行物を上に引用している。これらの参照の完全な引用が、以下で提供される。これら参照のそれぞれの全体を、本明細書に組み込む。
本発明は、ペプチドバリアント、コンジュゲートおよびその医薬組成物、ならびにがんの処置および腫瘍の画像化を含めた医学におけるその使用に関する。
図3および図4に示されるように、X1がD−Asnである典型的なペプチド(ペプチド19、21、25および26)は、優れた相対的活性(表2)、αvβ6発現腫瘍への高い体内分布(表3および図4)および優れた血漿安定性(図3)を呈した。
一部の場合において、X4は、L−Leuである。
一部の場合において、nは、5である。一部の場合において、mは、6である。特定の場合において、nは、5であり、mは、6である。
特定の場合において、ペプチドのアミノ酸配列は、
H2N−[D−Asn]−AVPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号7);
H2N−[D−Asn]−KVPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号8);
H2N−[D−Asn]−K(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号8);
H2N−[D−Asn]−KVPNLRGDLQVLAQKVAR[D−Thr]−COOH(配列番号9);
H2N−[D−Asn]−K(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVAR[D−Thr]−COOH(配列番号9);および
H2N−[D−Asn]−AVPNLRGDLQVLAQKVAR[D−Thr]−COOH(配列番号10)
からなる群から選択される。
H2N−[D−Asn]−AVPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号7)あってもよい。
第2の側面において、本発明は、治療的部分、ポリマー、ポリペプチドおよび/または検出可能な部分に直接もしくはリンカーを介してコンジュゲートされた本発明の第1の側面のペプチドを含むコンジュゲートを提供する。
一部の態様において、抗がん剤は、オーリスタチン、マイタンシノイド、チューブリシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、アルファ−アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)、イリノテカンおよびインドールカルボキサミド、またはその類似体、誘導体、プロドラッグもしくは活性代謝物からなる群から選択される。特に、抗がん剤は、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)、メルタンシン(DM1)、ラブタンシン(DM4)またはセンタナマイシンを含んでもよい。
3Ra、44Sc、67Ga、131I、188Re、186Reおよび67Cuからなる群から選択される同位元素を含んでもよい。
本発明の第1の側面のペプチドまたは本発明の第2の側面のコンジュゲート;および
薬学的に許容可能な担体
を含む医薬組成物を提供する。
投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。特定の場合において、コンジュゲートまたはその医薬組成物は、前記抗がん剤を1つまたは複数含むコンジュゲートである。特定の場合において、処置の方法は、哺乳動物対象の腫瘍がαvβ6を発現しているかどうか決定する工程を含んでもよく、腫瘍が、αvβ6を発現していると決定された場合、前記処置が投与される。
は場所を測定する工程と、測定値を関連付けまたは解釈して(参照レベル、バックグラウンドまたは対照と測定値を比較することによるなど)、測定値が対象および/もしくは対象の身体内の特定の場所におけるαvβ6発現腫瘍の存在を示すか否か決定する工程とを含む。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。
ペプチドバリアントおよび非天然アミノ酸
本明細書において定義される通り、本発明のペプチドは、親A20FMDV2ペプチドのバリアントであり、ペプチドが請求項に定義される通りであれば、1つまたは複数の非天然のアミノ酸を含んでもよい。適切な非天然のアミノ酸には、例えば、D−アミノ酸、オルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシンオルニチン、ピリジルアラニン(pyriylalanine)、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、アルファお
よびアルファ二置換アミノ酸、N−アルキルアミノ酸、乳酸、トリフルオロチロシン、p−Cl−フェニルアラニン、p−Br−フェニルアラニン、p−I−フェニルアラニンなどの天然のアミノ酸のハロゲン化誘導体、L−アリルグリシン、b−アラニン、L−a−アミノ酪酸、L−g−アミノ酪酸、L−a−アミノイソ酪酸、L−e−アミノカプロン酸、7−アミノヘプタン酸、L−メチオニンスルホン、L−ノルロイシン、L−ノルバリン、p−ニトロ−L−フェニルアラニン、L−ヒドロキシプロリン、L−チオプロリン、1−メチル−Phe、ペンタメチル−Pheなどフェニルアラニンのメチル誘導体、L−Phe(4−アミノ)、L−Tyr(メチル)、L−Phe(4−イソプロピル)、L−Tic(1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボキシル酸)、L−ジアミノプロピオン酸ならびにL−Phe(4−ベンジル)がある。ペプチドは、さらに修飾されてもよい。例えば、1つまたは複数のアミド結合が、エステルまたはアルキル骨格結合によって置き換えられてもよい。NもしくはCアルキル置換基、側鎖修飾またはジスルフィド架橋、側鎖アミドもしくはエステル結合などの制約があってもよい。
本発明のペプチドは、当業者に公知の方法を使用して調製されてもよい。例えば、ペプチドは、化学合成(例えば固相技術および自動化ペプチド合成装置)によって、または組換え手段(本明細書に記述される核酸などを使用する)によって産生されてもよい。例えば、ペプチドは、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学を使用する自動化された複数ペプチド合成装置(Abimed AMS 422)で固相戦略を使用して合成されてもよい。ペプチドは、次いで逆相−HPLCによって精製され、凍結乾燥され得る。本発明のペプチドを作る特定の合成方法は、以下の実施例に記述される。
検出可能な部分
本明細書で使用される、本発明のペプチドは、検出可能な部分にコンジュゲートされてもよい。用語「検出可能な部分」は、患者に本発明のコンジュゲートを投与した後に標的部位に位置する場合に、身体の外側および標的が位置する部位から一般に非侵襲的に検出され得る部分に関する。したがって、本発明のこの態様のコンジュゲートは、画像化および診断に有用である。容易に検出可能な部分は、核磁気共鳴映像法(MRI)、磁気共鳴分光法(MRS)、単光子放出コンピュータ断層撮影法(SPECT)および陽電子放射
断層撮影法(PET)などの画像化技術ならびに光学的画像化によって検出可能な実体である。好ましくは、画像化部分は、in vitroおよびin vivo条件下でその特性を保持する安定かつ非毒性な実体である。そのような部分の例には、それだけには限らないが放射性部分、例えば放射性同位元素がある。適切な放射性原子には、シンチグラフィー研究用のインジウム111、テクネチウム99mまたはヨウ素123がある。他の容易に検出可能な部分には、例えば、ヨウ素123、ヨウ素131、インジウム111、フッ素18、炭素13、窒素15、酸素17、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などMRI用のスピン標識ならびにCy5.5およびカンタムドットを含む光学的部分がある。検出可能な部分のさらなる例には、68Ga、IRDye(登録商標)700、IRDye(登録商標)800、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、89Zr、124I、64Cu、62Cu、18F、86Y、111In、131I、123I、67Gaおよび99mTcがある。
細胞傷害性化学療法薬は、当業者に周知であり:メクロレタミン(HN2)、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン(L−サルコリシン)およびクロラムブシルなどの窒素マスタードを含めたアルキル化剤;10個のエチレンイミンおよびヘキサメチルメラミンなどのメチルメラミン、チオテパ;ブスルファンなどのアルキルスルホナート;カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNLJ)、セムスチン(メチル−CCN−U)およびストレプトゾエイン(streptozoein)(ストレプトゾトシン)などのニトロソ尿素;ならびにダカルバジン(DTIC;ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド)などのトリアゼン;メトトレキサート(アメトプテリン)などの葉酸類似体を含めた代謝拮抗物質;フルオロウラシル(5−フルオロウラシル;5−FU)、フロキシウリジン(フルオロデオキシウリジン;FUdR)およびシタラビン(シトシンアラビノシド)などのピリミジン類似体;ならびにプリン類似体およびメルカプトプリン(6−メルカプトプリン;6−MP)、チオグアニン(6−チオグアニン;TG)およびペントスタチン(2’−デオキシコホルマイシン)などの関連阻害剤などの抗がん剤がある。天然物には、ビンブラスチン(VLB)およびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド;エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン;ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン(ダウノマイシン;ルビドマイシン)、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)およびマイトマイシン(マイトマイシンQなどの抗生物質;L−アスパラギナーゼなどの酵素;ならびにインターフェロンアルフェノーム(alphenomes)などの生物学的応答調節物質がある。その他の薬剤には、シスプラチン(cis−DDP)およびカルボプラチンなどのプラチナ配位錯体;ミトキサントロンおよびアントラサイクリン(antbracycline)などのアントラセンジオン;水酸化尿
素などの置換尿素;プロカルバジン(N−メチルヒドラジン、MIH)などのメチルヒドラジン誘導体;ならびにミトタン(o、p’−DDD)およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤;タキソールおよび類似体/誘導体;ならびにフルタミドおよびタモキシフェンなどのホルモンアゴニスト/アンタゴニストがある。
細胞傷害性ペプチドおよびポリペプチド部分は、当業者に周知であり、例えば、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素、組織因子、等がある。
用語「薬学的に許容可能な担体」は、ペプチドまたはそのコンジュゲートと適合し、レシピエントに対して有害でない成分を一般に含む。一般に、担体は、無菌であり発熱物質を含まないことになる水または生理食塩水になるが;他の許容できる担体が使用されてもよい。一般に、本発明の医薬組成物または製剤は、非経口投与用、より具体的には静脈内投与用である。
当業者は、サンプル(腫瘍サンプルなど)がインテグリンαvβ6を発現するかどうか決定する数多くの技術を承知していよう。特定の態様において、処置されるべき対象は、
インテグリンαvβ6を発現する細胞を1つまたは複数有する腫瘍を有してもよい。特定の場合において、腫瘍がインテグリンαvβ6を発現する(すなわちαvβ6陽性がんである)という所見は、前もって実施されてもよく、またはがんの型から推測されてもよい。例えば、いくつかの腫瘍型は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍を含め、インテグリンαvβ6を発現することが公知である。どんな特定の理論に束縛されることを望むものでもないが、本発明者らは、胃腸(GI)管のがんおよび多くの上皮組織から発達する癌腫が、本発明のペプチドまたはコンジュゲートを使用するαvβ6標的化治療から恩恵を受け得ると信じている。さらなる研究努力によってαvβ6を発現すると判明したがんの範囲が拡大するにつれて、その結果、本発明のペプチドまたはコンジュゲートを使用するαvβ6標的化治療から治療的恩恵を呈し得るがんの範囲は広がると期待される。
本明細書で使用される「試験サンプル」は、細胞または組織サンプル(例えば生検)、生体液、抽出物(例えば、対象から得られるタンパク質またはDNA抽出物)でもよい。特に、サンプルは、腫瘍サンプル、血液サンプル(血漿または血清サンプルを含む)、脳脊髄液サンプルまたは非腫瘍組織サンプルでもよい。サンプルは、対象から新たに得られたものでもよくまたは決定を行う前に処理および/もしくは貯蔵された(例えば凍結、固定または1つもしくは複数の精製、富化もしくは抽出工程に供された)ものでもよい。循環腫瘍DNAのために血液または血漿サンプルを富化する技術(例えば断片サイズに基づく)が、記述されている。さらに、ctDNA内のがん関連突然変異を同定する配列決定技術が、記述されている(例えばデジタルPCR、標的ディープシーケンシング、ネステッドリアルタイムPCR、等に基づく)。
された特色または成分のそれぞれについての特定の開示と見なすべきである。例えば「Aおよび/またはB」は、まさにそれぞれが本明細書において個別に提示されるかのように、(i)A、(ii)Bならびに(iii)AおよびBのそれぞれについての特定の開示と見なすべきである。
この明細書の全体を通じて、続く請求項を含めて、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、単語「含む(comprise)」および「含む(include)」、ならびに「含む(comprises)」、「含む(comprising)」および「含む(including)」などの変形は、述べられる整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を内包するが、他の任意の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を除外しないことを意味すると理解されよう。明細書および添付の請求項に使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈に別段の明確な指図がない限り複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。範囲は、「約」ある特定の値から、および/または「約」別の特定の値までとして本明細書に表現されてもよい。そのような範囲が表現される場合、別の態様は、ある特定の値からおよび/または他の特定の値までを含む。同様に、先の「約」の使用によって値が近似値として表現される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されよう。数値に関する用語「約」は、随意であり、例えば+/−10%を意味する。
全般的な情報
全ての試薬を試薬品質で購入し、それ以上精製することなく使用した。HPLC溶媒をHPLC品質で購入し、それ以上精製することなく使用した。FmocNH−L−Thr(tBu)−O−CH2−phi−OCH2−CH2−CO2Hを、PolyPeptide(Strasbourg、France)から購入した。O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU)、O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HATU)、Rinkアミド、4−(ヒドロキシメチル)フェノキシ酢酸(HMP)、Boc無水物およびN,N−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を、GL Biochem(Shanghai、China)から購入した。N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(AR品質)およびアセトニトリル(CH3CN)(HPLC品質)を、Scharlau(Barcelona、Spain)から購入した。ジイソプロピルエチルアミン(iPr2NEt)、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)、ピペリジン、N−メチル−2−ピロリドン(NMP)、コリジン、1,8−ジアザビシクロウンデカ−7−エン(DBU)、2−メルカプトエタノール、トリイソプロピルシラン(TIPS)および3,6−ジオキサ−1,8−オクタンジチオール(DODT)を、Sigma−Aldrich(St Louis、MO)から購入した。2−ニトロベンゼンスルホニルクロリド(2−NBS−Cl)および硫酸ジメチル(DMS)を、AK Scientific(Union City、CA)から入手した。トリフルオロ酢酸(TFA)を、Oakwood Chemicals(River Edge City、CA)から購入した。アミノメチルポリスチレン樹脂およびDTPAを、公開されている手順にしたがって合成した[21、22]。以下の側鎖保護を持つFmoc−アミノ酸を、GL Biochemから購入した:Fmoc−Arg(Pbf)−OH(Pbf=2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル)、Fmoc−Asn(Trt)−OH(Trt=トリフェニルメチル)、Fmoc−Asp(tBu)−OH(tBu=t−ブチル)、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−D−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Orn(Boc)−OH、Fmoc−Dab(Boc)−OH、Fmoc−Dap(Boc)−OH、Fmoc−D−Thr(tBu)−OHおよびFmoc−D−Asn(Trt)−OH。
TFA/H2O(溶媒A)および0.1% TFA/CH3CN(溶媒B)の直線勾配を、210nmの検出で使用した。分取RP−HPLCを、流速10mL/分でWaters XTerra(登録商標)Prep MS C18カラム(10μm、19×300mm)を使用してWaters 2487二波長吸光度検出器を備えたWaters600システムで実行した。勾配システムを、溶出プロファイルおよび分析RP−HPLCクロマトグラムから得られるピークプロファイルにしたがって調整した。
固相ペプチド合成(0.1mmol規模)を、Fmoc化学戦略に基づいてアミノメチ
ルポリスチレン樹脂(0.8mmol/g)上で実行した。FmocNH−L−Thr(tBu)−O−CH2−phi−OCH2−CH2−CO2Hを、全般的な方法A(下記参照)を使用して樹脂に結合させ、Rinkアミドを、全般的な方法Bを使用して樹脂に結合させ、HMPを、全般的な方法Cを使用して樹脂にカップリングした[20]。Fmoc−D−Thr(tBu)−OHのカップリングを、全般的な方法Dを使用して達成した。所望のペプチド配列を、手作業でまたは全般的な方法Eを使用してTribute(商標)(Tucson、AZ)ペプチド合成装置で合成し、ペプチド結合N−メチル化を、全般的な方法Fを使用して実施し[19]、Nメチル化リジンへのFmoc−Gln(Trt)−OHのカップリングを、全般的な方法Gを使用して実施した。N末端アセチル化を、全般的な方法Hを使用して実施し、t−ブチル保護されたDTPAを、全般的な方法Iを使用してペプチドにカップリングした。D−ビオチンを、全般的な方法Jを使用してペプチドに結合させた。直鎖ペプチドを、全般的な方法Kを使用して樹脂から切断し、粗産物を、全般的な方法Lにしたがって精製した。
アミノメチルポリスチレン樹脂(0.1mmol)をCH2Cl2/DMF(1:1、容積/容積)中で20分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、10% DMF/CH2Cl2(1mL、容積/容積)中のFmocNH−L−Thr(tBu)−O−CH2−phi−OCH2−CH2−CO2H(2当量)溶液、その後DIC(2当量)を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)、CH2Cl2(3×5mL)で洗浄し、風乾して16を得た。陰性カイザー試験[41]は、完全な反応を示した。
アミノメチルポリスチレン樹脂(0.1mmol)をCH2Cl2/DMF(1:1、容積/容積)中で20分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、10% DMF/CH2Cl2(1mL、容積/容積)中のRinkアミド(2当量)溶液、その後DIC(2当量)を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)、CH2Cl2(3×5mL)で洗浄し、風乾した。陰性カイザー試験は、完全な反応を示した。
アミノメチルポリスチレン樹脂(0.1mmol)をCH2Cl2/DMF(1:1、容積/容積)中で20分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、10% DMF/CH2Cl2(1mL、容積/容積)中のHMP(2当量)溶液、その後DIC(2当量)を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)、CH2Cl2(3×5mL)で洗浄し、風乾して27を得た。陰性カイザー試験は、完全な反応を示した。
樹脂にDMF(1mL)中のFmoc−D−Thr(tBu)−OH(2当量)溶液およびDIC(2当量)を添加し、その後DMF(100μL)中のDMAP(10%当量)を滴下した。反応混合物を室温で2時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した後、エステル化をさらなる2時間繰り返した。樹脂に20%酢酸無水物/DMF(1mL)を添加し、DMF(100μL)中のDMAP(10%当量)溶液を滴下し、反応混合物を室温で1時間撹拌し、その後溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した。
DMF(1mL)中のFmoc保護されたアミノ酸(5当量)溶液にHBTU(4.75当量)およびiPr2NEt(10当量)を添加し、溶液を樹脂に添加した。混合物を室温で30分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した。Fmoc保護基を、室温で5分間次いで10分間の20%ピペリジン/DMF(5mL、容積/容積)による処理によって除去した。
NBS保護:NMP(1mL)中の2−NBS−Cl(4当量)溶液にコリジン(10当量)を添加し、溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で15分間攪拌した。溶液を排液し、樹脂をNMP(3×5mL)で洗浄した後、反応をさらなる10分間繰り返した。N−メチル化:樹脂にNMP(1mL)中のDBU(3当量)溶液を添加し、反応混合物を室温で3分間撹拌した。NMP(1mL)中のDMS(10当量)溶液を反応混合物に次いで添加し、反応混合物を室温で2分間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をNMP(3×5mL)で洗浄した後、反応をさらなる2分間繰り返した。NBS脱保護:樹脂にNMP(2mL)中の2−メルカプトエタノール(10当量)およびDBU(5当量)溶液を添加し、反応混合物を室温で5分間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をNMP(3×5mL)で洗浄した後、反応をさらなる5分間繰り返した。
DMF(1mL)中のFmoc−Gln(Trt)−OH(5当量)溶液にHATU(4.75当量)およびiPr2NEt(10当量)を添加し、溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で3時間攪拌した。溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した後、反応をさらなる3時間繰り返した。
樹脂に20%酢酸無水物/DMF(1mL)溶液を添加し、その後DMF(100μL)中のDMAP(10%当量)溶液を滴下した。反応混合物を室温で30分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した。
DMF(1mL)中の42(5当量)溶液にHBTU(4.75当量)およびiPr2NEt(10当量)を添加し、溶液を樹脂に添加した。混合物を室温で30分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をDMF(3×5mL)で洗浄した。
ペプチド1〜15およびペプチド17、19、20および21の合成のために、N末端Fmoc基を、室温で5分間次いで10分間の20%ピペリジン/DMF(5mL、容積/容積)による処理によって除去した。DMF(3×5mL)で洗浄した後、DMF(1mL)中の(Boc)2O(5当量)溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで、DMF(3×5mL)で洗浄した。Dde基を、2%ヒドラジン/DMF(5mL、容積/容積)を室温で5分間使用することによって除去し、新鮮な試薬で10分間繰り返した。DMF(3×5mL)で洗浄した後、DMF(1mL)中のD−ビオチン(5当量)、HBTU(4.75当量)およびiPr2NEt(10当量)溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで、DMF(3×5mL)で洗浄した。
、新鮮な試薬で10分間繰り返した。DMF(3×5mL)で洗浄した後、DMF(1mL)中のD−ビオチン(5当量)、HBTU(4.75当量)およびiPr2NEt(10当量)溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで、DMF(3×5mL)で洗浄した。
所望の直鎖ペプチドを含有する樹脂を、TFA/H2O/DODT/TIPS(94:2.5:2.5:1.0、5mL、容積/容積/容積/容積)の混合物中で3時間撹拌した。濾液に冷ジエチルエーテル(30mL)を添加し、上清を廃棄する前に産物混合物を10分間遠心分離した。この手順を2回繰り返した。得られた固体を、H2O/CH3CN+0.1%TFA溶液(15mL)に溶解し、凍結乾燥した。
粗ペプチドを、H2O/0.1% TFA溶液に溶解し、流速10mL/分で、0.5%B/分で5〜20%B、次いで35%Bまで0.2%B/分の勾配を使用してXTerra(登録商標)C18カラムで分取逆相(RP)−HPLCによって精製した。ペプチドの純度を、フローインジェクション(ESI+、100V)および分析RP−HPLC[XTerra(登録商標)C18カラム、5〜95%B、3%B/分、1mL/分]によって決定した。
ペプチドの調製
比較ために、商業的に供給されているビオチン化DOTA−A20FMDV2ペプチド(純度95%)を、PPR(Cambridge、UK)から購入した点に注意されたい。ペプチドを0.1% TFA(水に希釈した)に再懸濁して濃度1mMの保存溶液を調製し、分注し、−20℃で貯蔵した。
in vitroおよびin vivoで使用した細胞株は、形質導入した黒色腫株A375Ppuro、およびA375Pβ6である[ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)/10%ウシ胎仔血清(FBS)中で培養した][9]。
細胞をトリプシン処理し、DMEM/0.1%(質量/容積)アジ化ナトリウム/0.1%(質量/容積)BSA(フロー培地)に再懸濁して、4×106個細胞/mLの細胞懸濁液を調製した。この時点から全てを氷上に保ち、細胞懸濁液50μLを、各フローチューブ(ファルコン2054−Millipore)に分注した。ペプチドを、2×濃度でフロー培地中に段階的に希釈した。したがって各濃度50μLを細胞50μLに添加した場合、終濃度1000nM、100nM、10nM、1nM、0.1nMおよび0nMを得た。A375Ppuro細胞の場合、最高濃度の1000nMだけを細胞に添加した。次いでペプチドを、氷上に15分間放置した。次いで、細胞をフロー培地に再懸濁し、1200rpmで3分間遠心分離することにより2回洗浄した。
細胞をトリプシン処理し、DMEM(無血清培地)に再懸濁して4×106個細胞/mLの細胞懸濁液を調製した。この時点から全てを氷上に保った。細胞懸濁液50μLを、各フローチューブに分注した。ペプチドを氷冷無血清培地中に200nMになるよう希釈し、細胞サンプルに50μLを添加した後に終濃度100nMを得た。ペプチドを氷上に15分間放置し、次いでフロー培地で2回洗浄し、各洗浄工程の間に1200rpmで3分間遠心分離した。マウス抗ビオチン(1:200で50μL)を各サンプルに15分間添加し、次いで洗浄工程を繰り返した。0時点を除いて、時点サンプルのそれぞれを、37℃で15、30および45分間インキュベーター内に置き、細胞を、PBS中の4%ホルムアルデヒドで10分間固定し、PBSで1回洗浄し、PBSで再度洗浄する前に0.1% Triton X−100界面活性剤を5分間添加した。AlexaFLUOR 488にコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG(1:250)を、各サンプルに添加し(50μL)、暗所で氷上に15分間放置した。サンプルを上記のように洗浄し、30μLになるように再懸濁した。サンプルを、Imagestream X Mark II(Amnis、Merck)で検査し、Imagestream画像を、搭載されているソフトウェアを使用して0分のサンプルと比較して内部移行について評価した。
細胞を、抗体でビオチンを検出する前に界面活性剤を添加しなかったことを除いて上記の通り調製した。サンプルを、FACScalibur(Bekton−Dickinson)血球計算器で分析した。経時的に測定した蛍光シグナルの減少は、Imagestreamを使用して視覚的に確認したように、結合しているペプチドの内部移行と関連付けられた(データ不掲載)。
DTPAコンジュゲートしたペプチド15μgにインジウム111(Covidien−Petten、Netherlands)15MBqを添加し(最終容積20μL)、その後酢酸アンモニウム(1M)5μLを添加した。サンプルを混合し、室温で30分間放置した。この混合物2μLを蒸留水100μLに添加し、次いで混合物を勾配逆相−HPLC(Beckman)に注射した。サンプルを、蒸留水中の0.1% TFA中でAgilent Eclipse XDB−C18カラムに流した。これは、一般に>95%である放射標識の効率を確認するためであった。ヒト血液を、ナトリウムヘパリン管に採取し、2000gで10分間遠心分離した。血漿(300μL)を、7.5MBqのバリアントペプチドとインキュベートし、直ちに150μLを除去し、37℃に置き、残りの150μLを、時間0分サンプルとして使用した。これに、氷冷アセトニトリル等容積を添加し(1:1)、サンプルを混合し、14000rpmで5分間遠心分離した。上清を採集し、10分間吸引乾燥してアセトニトリルを除去した。残滓を、0.22μmフィルターによって濾過し(微粒子を除去するため)、100μLを放射HPLC機械に注射した。24時間サンプルを同様に処理した。対照サンプルをPBSとインキュベートした。(注意:PBS対照は、濾過のこの工程またはアセトニトリルの添加を必要としなかった)。サンプルを複製して実行し、類似の結果であった。
100μL中に2×106個の細胞を、雌CD1 Nu/Nuマウスの肩に皮下注射した。腫瘍を、左肩(A375Puro)および右肩(A375β6)で2週間にわたり皮下成長させた。腫瘍が、直径およそ5mmに成長したら、ペプチドをインジウム111で放射性標識し、放射HPLCによって分析して標識効率を決定した。標識されたペプチドを無菌PBS/BSAに希釈し、動物1匹当たり0.3MBqを与えるように投薬した。次いでマウスに放射性標識ペプチドを静脈内(尾静脈)注射し、1時間後に殺処分した。
血液、器官および腫瘍を摘出し、計量し、その翌日残留活性をガンマカウンター(LKB
Compugamma)で測定した。データを、%注射用量/g組織(%ID/g)として表した。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(1)(配列番号11)
ペプチド(1)(97.1mg、50%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.2分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1224.3;Found 1223.6。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQkVART−OH(2)(配列番号12)
ペプチド(2)(54.3mg、22%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=11.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1224.3;Found 1223.7。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQ[オルニチン]VART−OH(3)(配列番号13)
ペプチド(3)(63.5mg、26%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.7分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1217.3;Found 1216.7。
ペプチドN−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQ[ジアミノ酪酸]VART−OH(4)(配列番号14)
ペプチド(4)(70.3mg、29%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.7分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1210.3;Found 1209.8。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQ[ジアミノプロピオン酸]VART−OH(5)(配列番号15)
ペプチド(5)(59.9mg、25%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1203.2;Found 1203.1。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQ−N−MeKVART−OH(6)(配列番号16)
ペプチド(6)(72.7mg、30%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=11.5分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1231.3;Found 1230.7。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[アミノイソ酪酸]AQKVART−OH(7)(配列番号17)
ペプチド(7)(16.6mg、7%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=11.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1209.7;Found 1210.2。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[ノルバリン]AQKVART−OH(8)(配列番号18)
ペプチド(8)(19.5mg、8%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%
の白色固体として得た。Rt=12.2分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1216.8;Found 1217.2。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[ノルロイシン]AQKVART−OH(9)(配列番号19)
ペプチド(9)(18.7mg、8%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.7分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1223.8;Found 1224.7。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[アリルグリシン]AQKVART−OH(10)(配列番号20)
ペプチド(10)(5.5mg、2%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=11.7分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1215.7;Found 1215.8。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[t−ブチル−アラニン]AQKVART−OH(11)(配列番号21)
ペプチド(11)(7.5mg、3%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1230.8;Found 1230.7。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[ホモロイシン]AQKVART−OH(12)(配列番号22)
ペプチド(12)(26.1mg、11%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.1分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1230.8;Found 1231.2。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[2−アミノ−3−エチルペンタン酸]AQKVART−OH(13)(配列番号23)
ペプチド(13)(10.1mg、4%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=12.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1230.8;Found 1230.8。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[シクロヘキシルアラニン]AQKVART−OH(14)(配列番号24)
ペプチド(14)(6.2mg、2%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.4分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1243.8;Found 1244.2。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQV[アダマンチルグリシン]AQKVART−OH(15)(配列番号25)
ペプチド(15)(22.4mg、9%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.7分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1262.8;Found 1263.3。
ペプチドAcHN−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(16)(配列番号11)(N末端アセチル化)(30.1mg、12%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.9分[XTerra
(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1244.8;Found 1245.2。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−NH2(17)(配列番号11)(C末端アミド化)
ペプチド(17)(13.4mg、5%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=13.5分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1223.8;Found 1223.3。
ペプチドAcHN−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−NH2(18)(配列番号11)(N末端アセチル化およびC末端アミド化)(12.5mg、5%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=13.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1244.3;Found 1244.6。
ペプチドH2N−nK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(19)(配列番号8)
ペプチド(19)(47.7mg、19%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=12.6分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1223.8;Found 1224.1。
ペプチドH2N−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVARt−OH(20)(配列番号26)
ペプチド(20)(45.3mg、19%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=13.0分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1223.8;Found 1224.2。
ペプチドH2N−nK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVARt−OH(21)(配列番号9)
ペプチド(21)(36.4mg、15%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=12.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1223.8;Found 1224.4。
ペプチドDTPA−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(22)(配列番号11)(N末端DTPA)
ペプチド(22)(53.7mg、24%)を、分析RP−HPLCによって純度>99%の白色固体として得た。Rt=13.3分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1411.9;Found 1411.6。
ペプチドDTPA−nK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(25)(配列番号8)(N末端DTPA)
ペプチド(25)(37.5mg、13%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=12.6分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1411.3;Found 1410.6。
ペプチドDTPA−nK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVARt−OH(26)(配列番号9)(N末端DTPA)
ペプチド(26)(12.5mg、4%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=12.9分[XTerra(登録商標)C18、5〜9
5%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1411.3;Found 1410.6。
ペプチドDTPA−NK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−NH2(24)(配列番号11)(N末端DTPAおよびC末端アミド化)
ペプチド(24)(12.1mg、4%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=13.0分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1410.8;Found 1410.1。
ペプチドDTPA−GNK(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−OH(23)(配列番号27)(N末端DTPA)
ペプチド(23)(41.9mg、15%)を、分析RP−HPLCによって純度>95%の白色固体として得た。Rt=12.6分[XTerra(登録商標)C18、5〜95%B、3%B/分、1.0mL/分];m/z(ESI−MS):[M+2H]2+Calc.1439.9;Found 1439.2。
SPPSによって合成した。所望のペプチド配列を、20%ピペリジン/DMFを使用して取り付けて、Fmoc保護基およびカップリング試薬であるO−(ベンゾトリアゾール(benzotriazol)−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸(HBTU)/DIPEAを除去した。
無水酢酸でキャッピングする(16)もしくはRinkアミドリンカーを利用してC末端カルボキサミドを与える(17)または両方を組合せる(ペプチド18)ことによって得た。
結合アッセイから得られた結果(表2、後を参照のこと)は、1のNおよびC末端の修飾(それぞれペプチド16および17)、またはA20FMDV2(1)の天然のAsn1およびAsn1とThr20両方の残基の、D対応物への置換(それぞれペプチド19および21)が、1と比較して生物学的活性の改善を呈するペプチドをもたらすことを示した。したがって、ヒト血漿における細胞内部移行研究および分解アッセイを実施できるように、その4つのNおよびC終点修飾類似体(16、18、19および21)を、DTPAキレート化剤を組み込むために選択した。含DTPAビオチン化A20FMDV2ペプチド(22)も対照として調製した[25]。
元のA20FMDV2より優れているペプチドバリアントがあるとすると、それはどのペプチドバリアントか試験するために、A375Pβ6細胞株におけるインテグリンαvβ6の発現[9]を除いて遺伝的に同一である2つの細胞株(A375PpuroおよびA375Pβ6)を使用して一連の試験を設計した。A375Ppuroは、そのリガンド内のRGDモチーフに結合するさらに4つのインテグリン(αvβ3、αvβ5、αvβ8およびα5β1)を発現するので、これら2つの細胞株における結合活性を比較することは、非常に厳しいアッセイであると考えられる。
3Leu修飾は相対的活性を減少させ、相対的活性が対照ビオチン化A20FMDV2より低かったことが分かる。それに対し、NおよびC末端修飾ペプチドのほとんど(16〜19および21)は、ビオチン化A20FMDV2(1)と比較してより優れた結合親和性を有し、相対的活性が改善された。例えば、非タンパク新生D−Asnアミノ酸N末端修飾を有するペプチド19は、細胞αvβ6に対し親化合物よりも平均で43%良好に結合した(表2)。1.0の値を有する非修飾A20FMDVと比較して、ペプチド16(Nアセチル化)、17(Cアミド化)、18(Nアセチル化およびCアミド化)、19(D−Asn置換)および21(D−AsnおよびD−Thr置換両方)は、対照ペプチド1より55%、31%、9%、27%、および37%高い相対的活性値を有する。
にほとんど効果がなく、したがって相対的活性の増大が維持された。
実施例3−血漿安定性および体内分布研究
図3は、37℃でのPBS(黒色バー;各ペプチドについて左手のバー)と対比した血漿(赤色バー;各ペプチドについて右手のバー)中のDTPAコンジュゲートペプチド(22〜26)の安定性を、0分時点と比較して示す。データは、PBS中で37℃、24時間後にペプチドの約10%しか分解されなかったことを示す。それに対し、ペプチド(22、25、26)は、24時間後に血漿中で類似レベルの残存(77%〜80%)を示すが、ペプチド(23)(60%残存)およびペプチド(24)(52%残存)は大きく分解される。したがって、ペプチド24および23(それぞれC末端アミド化およびN末端アセチル化)の修飾は、対照親ペプチド(1)と比較して血漿分解に対する感受性を増大させた。Dアミノ酸(D−Asn、化合物25、およびD−Asn/D−Thr化合物26)を使用する化学操作によるペプチド修飾が、ヒト血漿プロテアーゼに対する感受性を改善するのに最適であった。
異を強調する。DTPA標識親ペプチド22に対してペプチド23〜26に統計的な取り込みの増大はないが、全てのバリアントは、対照ペプチド22と比較してαvβ6陽性腫瘍対αvβ6陰性腫瘍の残留の平均比がわずかに高い。対照ペプチド22と比較して、αvβ6陰性腫瘍に対するαvβ6陽性腫瘍おける最も高い残留比はペプチド25で見られた。
20残基直鎖ペプチドA20FMDV2は、腫瘍関連αvβ6インテグリンに対する高い特異性および親和性を呈し、細胞へのαvβ6依存的内部移行も呈する。したがってA20FMDV2は、αvβ6発現がん細胞に治療用担持物(例えば化学療法ペイロード)を送達するのに見込みがあるリード化合物と考えられる。上記の実施例において、in vitro挙動、血漿安定性およびin vivo体内分布に対するA20FMDV2の天然のアミノ酸残基の非タンパク新生置換物の影響について調査した。
本発明および本発明が関係する最新技術についてより完全に記述し、開示するためにい
くつかの刊行物を上に引用している。これらの参照の完全な引用が、以下で提供される。これら参照のそれぞれの全体を、本明細書に組み込む。
Claims (34)
- αvβ6インテグリンに選択的に結合し、モチーフX1BnRGDLX2X3X4ZmX5(配列番号3)を含むアミノ酸配列を有するペプチドであって、式中、X1は、任意のD−アミノ酸であり、Bnは、任意のnアミノ酸の配列であり、前記アミノ酸は、天然でも非天然でもよく、D−またはL−でもよく、同一でも異なっていてもよく、nは、1〜10の数であり、X2およびX3は、任意のアミノ酸からそれぞれ独立に選択され、X4は、LeuまたはIleであり、Zmは、任意のmアミノ酸の配列であり、前記アミノ酸は、天然でも非天然でもよく、D−またはL−でもよく、同一でも異なっていてもよく、mは、1〜10の数であり、X5は、任意のL−またはD−アミノ酸である、ペプチド。
- 前記ペプチドの長さが、17〜25アミノ酸であり、任意選択で前記ペプチドの長さが20アミノ酸である、請求項1に記載のペプチド。
- X1が、D−Asnである、請求項1または請求項2に記載のペプチド。
- X5が、L−ThrまたはD−Thrである、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
- X4が、Leuである、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
- nが5であり、および/またはmが6である、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
- Bnが、AVPNL(配列番号4)、KVPNL(配列番号5)またはK(ビオチン)VPNLである、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
- Zmが、AQKVAR(配列番号6)である、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記ペプチドのアミノ酸配列が、
H2N−[D−Asn]−AVPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号7);
H2N−[D−Asn]−KVPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号8);
H2N−[D−Asn]−K(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号8);
H2N−[D−Asn]−KVPNLRGDLQVLAQKVAR[D−Thr]−COOH(配列番号9);
H2N−[D−Asn]−K(ビオチン)VPNLRGDLQVLAQKVAR[D−Thr]−COOH(配列番号9);および
H2N−[D−Asn]−AVPNLRGDLQVLAQKVAR[D−Thr]−COOH(配列番号10)
からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。 - 前記ペプチドが、H2N−[D−Asn]−AVPNLRGDLQVLAQKVART−COOH(配列番号7)である、請求項9に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、Nアセチル化および/またはCアミド化されている、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
- 治療的部分、ポリマー、ポリペプチドおよび/または検出可能な部分に直接もしくはリンカーを介してコンジュゲートした請求項1から11のいずれか一項に記載のペプチドを含むコンジュゲート。
- 前記治療的部分が、抗がん剤を含む、請求項12に記載のコンジュゲート。
- 前記抗がん剤が、オーリスタチン、マイタンシノイド、チューブリシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、アルファ−アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、イリノテカンおよびインドールカルボキサミド、またはその類似体、誘導体、プロドラッグもしくは活性代謝物からなる群から選択される、請求項13に記載のコンジュゲート。
- 前記抗がん剤が、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)、メルタンシン(DM1)、ラブタンシン(DM4)またはセンタナマイシンを含む、請求項14に記載のコンジュゲート。
- 前記治療的部分が、177Lu、90Y、211At、213Bi、212Pb、225Ac、223Ra、44Sc、67Ga、131I、188Re、186Reおよび67Cuからなる群から選択される放射性同位元素を含む、請求項12から15のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記検出可能な部分が、核磁気共鳴映像法(MRI)、磁気共鳴分光法(MRS)、単光子放出コンピュータ断層撮影法(SPECT)、陽電子放射断層撮影法(PET)または光学的画像化によって検出可能である、請求項12から16のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記検出可能な部分が、フルオロフォア、放射性核種またはスピン標識を含む、請求項17に記載のコンジュゲート。
- 前記検出可能な部分が、68Ga、IRDye(登録商標)700、IRDye(登録商標)800、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、89Zr、124I、64Cu、62Cu、18F、86Y、111In、131I、123I、67Gaまたは99mTcを含む、請求項18に記載のコンジュゲート。
- 前記検出可能な部分が、キレート化剤を含むリンカーを介してペプチドとカップリングされた111Inを含み、任意選択で前記キレート化剤が、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、テトラアザシクロドデカン(tetrazacyclododecane)−1,4,7,10−四酢酸(DOTA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む、請求項12から19のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記ポリマーが、1つもしくは複数(例えば1つまたは2つ)のエチレングリコール基または1つもしくは複数(例えば1つまたは2つ)のポリエチレングリコール(PEG)鎖を含む、請求項12から20のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記1つまたは複数(例えば1つまたは2つ)のPEG鎖が、長さ1〜50個のエチレングリコール単位である、請求項21に記載のコンジュゲート。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項12から22のいずれか一項に記載のコンジュゲート;および
薬学的に許容可能な担体
を含む医薬組成物。 - 医学に使用するための、請求項1から11のいずれか一項に記載のペプチド、請求項12から22のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項23に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物対象においてαvβ6発現腫瘍の処置の方法に使用するための、請求項1から11のいずれか一項に記載のペプチド、請求項12から22のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項23に記載の医薬組成物。
- 前記腫瘍が、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である、請求項25に記載の使用のためのペプチド、コンジュゲートまたは組成物。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のペプチド、請求項12から22のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項23に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、αvβ6発現腫瘍を有する哺乳動物対象を処置する方法。
- 前記腫瘍が、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である、請求項27に記載の方法。
- 哺乳動物対象のαvβ6発現腫瘍を処置するための医薬の調製における請求項1から11のいずれか一項に記載のペプチド、請求項12から22のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項23に記載の医薬組成物の使用。
- 前記腫瘍が、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である、請求項29に記載の使用。
- 前記腫瘍がある対象に請求項17から22のいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより前記腫瘍の画像を形成する工程とを含む、哺乳動物対象のαvβ6発現腫瘍を画像化する方法。
- 前記腫瘍が、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である、請求項31に記載の方法。
- 前記対象にコンジュゲートを投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより前記対象におけるαvβ6発現腫瘍の存在を診断する工程とを含む、哺乳動物対象におけるがんの診断のin vivo方法に使用するための請求項17から22のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- αvβ6発現腫瘍を有すると疑われる哺乳動物対象に請求項17から22のいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより対象におけるαvβ6発現腫瘍の存在を診断する工程とを含む、がん診断の方法。
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