JP2012518647A - クプレドキシン由来ペプチドの修飾及びその使用方法 - Google Patents

クプレドキシン由来ペプチドの修飾及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、薬物動態特性の向上された薬理活性を有する修飾クプレドキシン由来ペプチド及びこの薬理活性に関連する種々の症状に罹患している哺乳動物を処置するためのその使用方法を提供する。クプレドキシン由来ペプチドの修飾体には、ペプチドの血漿半減期を延長し、薬理活性の比活性を増大させ、免疫原性を低下させ、ペプチドの生体内変換を低減させる、アミノ酸配列バリアント及び構造誘導体が含まれる。修飾クプレドキシン由来ペプチドは、癌、不適切な血管形成に関連する症状、ウイルス感染及び細菌感染、特にＨＩＶ及びマラリア、エフリンシグナル伝達に関連する症状について哺乳動物を処置する方法及び診断化合物等のカーゴ化合物を癌細胞に送達する方法に使用することができる。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２００７年１２月１４日付で提出された米国特許出願第６１／０１３，７０９号の優先権を主張する２００８年１２月１５日付で提出された同第１２／３１４，７０３号の一部係属出願である２００９年２月１９日付で提出された同第１２／３８９，１２０号の米国特許法第１１９条及び１２０条に基づく優先権を主張する一部係属出願であり；２００６年９月１１日付で提出された米国特許仮出願第６０／８４３，３８８号の優先権を主張する２００７年９月１１日付で提出された米国特許出願第１１／８５３，４９７号の一部係属出願であり；２００４年１０月７日付で提出された米国特許仮出願第６０／６１６，７８２号、２００５年５月１３日付で提出された同第６０／６８０，５００号、及び２００５年７月１９日付で提出された同第６０／７００，２９７号の優先権を主張する２００５年１０月６日付で提出された米国特許出願第１１／２４４，１０５号の一部係属出願である。これらの出願の全内容を参照により完全に本明細書に援用する。
技術分野
本発明は、薬物動態特性の向上した薬理活性を有する修飾クプレドキシン由来ペプチド及びこの薬理活性に関連する種々の状態に罹患している哺乳動物を処置するためのその使用方法に関する。
クプレドキシン由来ペプチドの修飾体としては、ペプチドの血漿半減期を延ばし得、薬理活性の比活性を増大させ得、免疫原性を低下させ得、及び／又はペプチドの生体内変換を低減させ得る、アミノ酸配列バリアント及び構造誘導体が含まれる。修飾クプレドキシン由来ペプチドは、癌、不適切な血管形成に関連する状態、ウイルス感染及び細菌感染、特にＨＩＶ及びマラリア、エフリンシグナル伝達に関連する状態に関して哺乳動物を処置する方法及び診断化合物等のカーゴ化合物を癌細胞に送達する方法において使用することができる。
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のクプレドキシンアズリンは、有望な新規の治療及び診断用分子である。緑膿菌によって産生される２種類の酸化還元タンパク質、クプレドキシンアズリン及びシトクロムｃ５５１（Ｃｙｔ ｃ５５１）は、どちらもＪ７７４細胞に移入し、正常細胞と比べてヒト癌細胞に有意な細胞毒性活性を示す（非特許文献１）。アズリンは、ヒトメラノーマＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞又はヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞にも移入することができる（非特許文献２〜４）。更に、緑膿菌のアズリンは、Ｊ７７４マウス細網細胞肉腫細胞に優先的に移入し、腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３と複合体を形成してこれを安定化し、ｐ５３の細胞内濃度を上昇させ、アポトーシスを誘導する（非特許文献５）。アズリンはまた、非癌細胞と比べてヒト骨肉腫細胞中でアポトーシスを有意に増加させた（非特許文献６）。鉄酸化細菌のラスチシアニンもマクロファージに移入してアポトーシスを誘導することができる（非特許文献７及び８）。フォルミジウム・ラミノスム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｌａｍｉｎｏｓｕｍ）のプラストシアニン及びアクロモバクター・サイクロクラステス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｅｓ）のシュードアズリンもマクロファージに対して細胞毒性である（２００６年２月２３日公開の特許文献１）。細胞移入に使用されているであろう経路は同定されていないが、アズリン分子の種々のドメインの詳細な研究から、アミノ酸５０〜７７（ｐ２８）（配列番号１３）が内部移行及びその後のアポトーシス活性に重要な推定タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）であると示唆されている（非特許文献８）。
アズリンは、現在、治療的に重要な別の薬理活性を有することも知られている。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中で血管形成を抑制することが知られている（２００６年７月１９日付で提出された特許文献２）。緑膿菌のアズリンは、末梢血単核細胞におけるＨＩＶ−１感染の増加を抑制し、マリアナ感染哺乳動物の赤血球の寄生虫血症を抑制する能力があることも知られている（非特許文献９）。緑膿菌のアズリンは、種々の哺乳動物の細胞及び組織中でエフリンシグナル伝達系に干渉することも知られている（２００６年５月１９日付で提出された特許文献３）。
したがって、アズリン、特にアズリンに由来する２つのペプチド（１８マー及び２８マー）が治療及び診断に有用であることも見出されている。しかし、患者の体内における治療薬の効力は種々の要因に依存する。治療薬自体の活性に加えて、治療薬物の薬物動態特性及び薬物投与後に起こる種々のプロセス、すなわち吸収、分布、代謝、及び排泄にそれがどのように関連するかということもある。薬物のこれらの薬物動態特性は、投与された薬物の効力にこれらの生物学的プロセスがどのように及びどの程度影響するかを明らかにし、そのような特性としては、血流中の薬物半減期、薬物の肝臓初回通過代謝、薬物の分布容積、薬物のアルブミン結合の程度等が含まれる。これらの薬物動態特性のそれぞれが薬物の効力に大きな影響を有し得る。
患者の血流中へと薬物が吸収される部位は投与経路に依存する。例えば、経口投与された薬は、薬物の化学的及び物理的性質のため、消化管の１つの部位で他の部位よりも多く吸収され得る。一方、非経口投与による吸収は、特に静脈内投与では、失われる薬物がはるかに少ないため、経口投与より速いだけでなく、薬物の血中濃度をはるかに高い精度で予測することができる。投与された薬物のうち、全身循環に達するものの割合をバイオアベイラビリティという。
血流から細胞外液（間質）及び／又は組織の細胞への薬物の分布は、薬物の種々の性質によって変わり得る。体内での薬物分布は「薬物の分布容積」として表すことができ、これは薬物が広がる液体の仮想体積である。疎水性の薬物はほとんどの生物学的膜をより容易により多く通過し、組織の細胞内に分布され得るという点で、薬物の構造は薬物分布に影響し得る。薬物はまた、血液タンパク質に結合し得るため、周囲の組織中への通過が遅延され得る。例えば、血流中では、ナプロキセンは９９％が血漿タンパク質に結合し、ペニシリンＧは６０％が結合し、アモキシシリンは２０％だけが結合し、ミノキシジルは結合しない（非特許文献１０）。結合薬物（ｂｏｕｎｄ ｄｒｕｇ）は、体の解毒プロセスに曝されず、腎糸球体でのろ過により血流から除去されることもない。結合薬物は不活性体（ｉｎａｃｔｉｖｅ ｐｏｒｔｉｏｎ）と呼ばれ、非結合体は活性体（ａｃｔｉｖｅ ｐｏｒｔｉｏｎ）と見なされる。薬物の結合体は、薬物を貯蔵する働きをし、その後、遊離薬物がタンパク質の飽和に十分な濃度でなくなると、薬物が非結合・活性型として血流中に放出される。したがって、血流中で結合している薬物は、より長期間体内に留まり、投薬の頻度が少なくて済む。
患者の体内における薬物代謝も薬物の効力に影響を与える。多くの薬物は、体から排泄される前に生体内変換を受ける。薬物が生体内変換されることで、水溶性がより高い薬物形態、よりイオン化された薬物形態、血漿及び組織中でタンパク質に結合する能力がより低い薬物形態、細胞膜透過能がより低い薬物形態、並びに薬物の薬理学的活性を低減するその他の形態になり得る。したがって、生体内変換された薬物は、より毒性が低く、より容易に排泄され得る。薬物の生体内変換には、酸化、還元、加水分解、及び抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の主に４つがある。酸化反応は、肝細胞内の小胞体に結合したオキシダーゼにより主に触媒される。還元反応は、主に腸及び肝臓中のレダクターゼにより触媒される。加水分解による分解は、主に肝臓中のエステラーゼにより触媒される。薬物の生体内変換の最も一般的な経路であるグルクロニド抱合は、薬物とグルクロン酸が合わさることで起こり、体から容易に排出されるイオン形態の薬物が形成される（非特許文献１１）。排出を促進するその他の生体内変換プロセスとしてメチル化及びアシル化が含まれる。
体からの薬物の排出は種々の経路で起こり得る。尿中への薬物排出には腎臓が主な役割を果たす。しかし、薬物は肝臓を介して血漿からも排除され得る。特に経口投与される薬物では、薬物の血漿半減期の決定に肝臓が重要な役割を果たし得る。
米国特許出願公開第２００６／００４０２６９号明細書 米国特許出願第１１／４８８，６９３号明細書 米国特許出願第１１／４３６，５９２号明細書
Ｚａｂｏｒｉｎａ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６：２５２１−２５３０（２０００） Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ９９：１４０９８−１４１０３（２００２） Ｐｕｎｊ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：２３６７−２３７８（２００４） Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４１８−１４３１（２００５） Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ７０：７０５４−７０６２（２００２） Ｙｅ ｅｔ ａｌ，Ａｉ Ｚｈｅｎｇ ２４：２９８−３０４（２００３） Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ３：１１８２−１１８７（２００４） Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏ．７：１４１８−１４３１（２００５） Ｃｈａｕｄｈａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．５：１６４２−１６４８（２００６） Ｈｏｗａｒｄ Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ １２９（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ １９９９） Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：９１−９５（１９８５）
本発明の一態様は、クプレドキシン由来ペプチドのバリアント、切断型、又は誘導体である単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、修飾は環化を含む。一実施形態では、環化は酵素的環化である。別の実施形態では、環化によりチオエーテル環が生じる。別の実施形態では、チオエーテル環は、デヒドロアラニン残基及びデヒドロブチリン残基にシステイン残基を付加することで形成される。別の実施形態では、デヒドロアラニン残基及びデヒドロブチリン残基はそれぞれセリン及びスレオニンの脱水に由来する。別の実施形態では、ＮｉｓＢがセリン及びスレオニンを脱水する。
一実施形態では、単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドは、非修飾クプレドキシン由来ペプチドと比べて向上された薬物動態特性を有する。向上された薬物動態特性は、（１）ペプチドが患者の体内で生体内変換を受けにくいこと、（２）ペプチドが患者の体からより遅い速度で排泄されること、（３）ペプチドの三次構造の安定性が向上されていること、及び（４）ペプチドの血漿半減期がより長いこと、の１又は複数であり得る。更に、単離されたペプチドは、クプレドキシンの少なくとも１つの薬理活性を有し得る。関心のある具体的な薬理活性としては、（１）哺乳動物の癌細胞に移入すること、（２）哺乳動物の非癌細胞に移入しないこと、（３）哺乳動物の前悪性細胞に移入すること、（４）哺乳動物の癌細胞を死滅させること、（５）哺乳動物の前悪性細胞を死滅させること、（６）哺乳動物の癌細胞の成長を抑制すること、（７）ＨＩＶ−１感染を抑制すること、（８）マラリア感染赤血球の寄生虫血症を抑制すること、（９）エフリンシグナル伝達系に干渉すること、及び（１０）血管形成を阻害することが含まれる。
修飾クプレドキシン由来ペプチドは、緑膿菌、フォルミジウム・ラミノスム、ウルバ・ペルツシス（Ｕｌｖａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、鉄酸化細菌、アクロモバクター・サイクロクラステス、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、及び淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のクプレドキシンに由来し得る。クプレドキシンは、アズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、シュードアズリン、オーラシアニン、ステラシアニン、キュウリ塩基性タンパク質、又はアズリン様タンパク質であり得る。具体的な実施形態では、クプレドキシンは配列番号１〜１２のいずれかであり得る。単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドはクプレドキシンの切断型であり得る。具体的な実施形態では、ペプチドは配列番号１３〜４７のいずれかであり得る。別の具体的な実施形態では、配列番号１〜１２は、単離されたペプチドに少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドは、対応する非修飾クプレドキシンよりも加水分解されにくいものであり得る。具体的には、単離されたペプチドは、別のアミノ酸残基（特にグルタミン酸残基又はスレオニン残基）で置換された、クプレドキシン由来ペプチドの配列中の１又は複数のアスパラギン残基又はセリン残基を有し得る。
いくつかの実施形態では、単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドはより脱アミド化されにくい。具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基（特にスレオニン残基又はアラニン残基）で置換されている。いくつかの実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５８又は６３に相当するクプレドキシン由来ペプチド中のグリシン残基の１又は複数が置換されていてよい。別の具体的な実施形態では、単離されたペプチドは配列番号３０を含み得る。
いくつかの実施形態では、単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドは、より酸化されにくい。具体的には、単離されたペプチドは、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のメチオニン残基又はシステイン残基が別のアミノ酸残基（特にロイシン残基又はバリン残基）で置換されていてもよい。具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５６又は６４に相当するクプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のメチオニン残基が置換されている。別の具体的な実施形態では、単離されたペプチドは配列番号３１又は配列番号３２を含み得る。いくつかの実施形態では、単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドはジケトピペラジン及びピログルタミン酸をより形成しにくい。具体的には、単離されたペプチドは、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端から１、２、又は３位のグリシン残基が別のアミノ酸残基で置換されていてもよい。更に、単離されたペプチドは、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端から３位以内のプロリン残基が別のアミノ酸で置換されていてもよい。更に、単離されたペプチドは、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端のアスパラギン残基が別のアミノ酸残基で置換されていてもよい。
いくつかの実施形態では、単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドは、よりラセミ化されにくいものであり得る。具体的には、単離されたペプチドは、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアミノ酸残基がアミノ酸残基のＤ−異性体で置換されていてもよい。具体的な一実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの全アミノ酸残基がアミノ酸残基のＤ−異性体で置換されている。別の具体的な実施形態では、単離されたペプチドは配列番号４５を含む。
いくつかの実施形態では、単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドはより分解されにくいものであり得る。具体的には、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端がアセチル化されていてよい。更に、クプレドキシン由来ペプチドのＣ末端がアミド化されていてもよい。具体的な一実施形態では、単離されたペプチドは配列番号３３である。いくつかの実施形態では、単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドは、三次構造の安定性が向上するように修飾されている。具体的には、単離されたペプチドは、少なくとも１つのαヘリックスの安定性が増加するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの少なくとも１つのグリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジン、及びアルギニンアミノ酸残基がロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンで置換されている。具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの置換残基は、緑膿菌アズリンの残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０に相当する残基内であり得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリンの残基５７に相当する残基のグルタミンがトリプトファン残基で置換されていてもよく、緑膿菌アズリンの残基５２に相当する残基のスレオニンがトリプトファン残基で置換されていてもよく、緑膿菌アズリンの残基６１に相当する残基のスレオニンがトリプトファン残基で置換されていてもよく、及び／又は緑膿菌アズリンの残基６３に相当する残基のグリシンがトリプトファン残基で置換されている。別の具体的な実施形態では、単離されたペプチドは配列番号３４〜４４のいずれかを含む。
別の実施形態では、単離されたペプチドは、クプレドキシン由来ペプチドの２個以上のリジン残基が、ｉ（ｉ＋４）のスペーシングでε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−リジン残基で置換されていてよい。具体的には、クプレドキシン由来ペプチドの置換残基は、緑膿菌アズリンの残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０に相当する残基内であり得る。別の実施形態では、単離されたペプチドは、クプレドキシン由来ペプチド中にｉ（ｉ＋４）のスペーシングでヒスチジン−システイン残基対又はヒスチジン−ヒスチジン残基対並びにＣｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、及びＲｕの少なくとも１つが置換導入されていてよい。具体的な実施形態では、単離されたペプチドは、緑膿菌アズリンの残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０に相当する残基内にクプレドキシン由来ペプチドの置換残基を有し得る。
別の実施形態では、単離されたペプチドは、クプレドキシン由来ペプチド中の天然アミノ酸残基の１又は複数対が、天然アミノ酸に対応するオレフィン含有テザーを有するα，α−二置換非天然アミノ酸で置換されていてもよい。単離されたペプチドは、緑膿菌アズリンの残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０に相当する残基内にクプレドキシン由来ペプチドの置換残基を有し得る。
いくつかの実施形態では、単離された修飾クプレドキシン由来ペプチドは、クプレドキシン由来ペプチドに共有結合した１又は複数のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）分子を有し得る。具体的には、単離されたペプチドは、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のシステイン残基に共有結合した１又は複数のＰＥＧ分子を有し得る。具体的な実施形態では、単離されたペプチドは、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基３、６、及び１１２の１又は複数に相当する１又は複数のシステイン残基に共有結合した１又は複数のＰＥＧ分子を有し得る。別の実施形態では、システイン残基がクプレドキシン由来ペプチドに置換導入されてＰＥＧ分子に共有結合していてもよい。
別の実施形態では、単離されたペプチドは、クプレドキシン由来ペプチドのリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、チロシン、Ｎ末端アミノ基、又はＣ末端カルボン酸に共有結合した１又は複数のＰＥＧ分子を有し得る。具体的な実施形態では、単離されたペプチドはＰＥＧ分子に共有結合した１又は複数のリジン残基又はＣ末端カルボン酸を有する。別の実施形態では、１又は複数のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、及びチロシン残基がクプレドキシン由来ペプチドに置換導入されてＰＥＧ分子に結合していてもよい。
別の実施形態では、１又は複数のＰＥＧ分子が、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアミノ基に共有結合されているかクプレドキシン由来ペプチドにランダムに共有結合していてよい。
クプレドキシン由来ペプチド１個当たりのＰＥＧ分子の平均分子量は約２００〜約１００，０００ダルトンであり得る。クプレドキシン由来ペプチドは、１又は複数の分岐ＰＥＧ分子に共有結合していてもよく、具体的には分岐ＰＥＧ分子は約５０ｋＤａである。クプレドキシン由来ペプチドは、１又は複数の線状ＰＥＧ分子に共有結合していてもよく、具体的には線状ＰＥＧ分子は約５ｋＤａである。
本発明の別の態様は、修飾クプレドキシン由来ペプチド及び薬学的に許容されるキャリアを含み得る医薬組成物である。
本発明の別の態様は、哺乳動物が罹患している状態を処置する方法であって、哺乳動物に治療有効量の修飾クプレドキシン由来ペプチドを投与することを含み得る、方法である。具体的な実施形態では、哺乳動物はヒトである。
本発明の別の態様は、アミノ酸配列Ｘ１ＳＸ２ＡＡＤＸ３Ｘ４Ｘ５ＶＶＸ６ＤＸ７Ｘ８ＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＸ９（配列番号４８）（式中、Ｘ１はＬ及びアセチル化−Ｌからなる群から選択され；Ｘ２はＴ及びＷからなる群から選択され；Ｘ３はＭ、Ｌ、及びＶからなる群から選択され；Ｘ４はＱ及びＷからなる群から選択され；Ｘ５はＧ及びＡからなる群から選択され；Ｘ６はＴ及びＷからなる群から選択され；Ｘ７はＧ、Ｔ、及びＷからなる群から選択され；Ｘ８は、Ｍ、Ｌ、及びＶからなる群から選択され；Ｘ９はＤ及びアミド化−Ｄからなる群から選択される）を含む又はからなる単離されたペプチドである。
本発明の別の態様は、アミノ酸配列Ｘ１ＤＰＫＬＹＤＫＤＬＧＳＡＸ２Ｘ３ＤＸ４ＶＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＤＡＡＸ８ＳＸ９（配列番号４９）（式中、Ｘ１はＤ及びアセチル化−Ｄからなる群から選択され；Ｘ２はＭ、Ｌ、及びＶからなる群から選択され；Ｘ３はＧ、Ｔ、及びＷからなる群から選択され；Ｘ４はＴ及びＷからなる群から選択され；Ｘ５はＧ及びＡからなる群から選択され；Ｘ６はＱ及びＷからなる群から選択され；Ｘ７はＭ、Ｌ、及びＶからなる群から選択され；Ｘ８はＴ及びＷからなる群から選択され；Ｘ９はＬ及びアミド化−Ｌからなる群から選択される）を含む又はからなる単離されたペプチドである。
本発明の別の態様は、本明細書に開示されている技術及び方法の１又は複数を用いて修飾されたクプレドキシン由来ペプチドである、配列番号５０〜３５０４の配列を含む又はからなる単離されたペプチドである。
配列の簡単な説明
配列番号１は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンのアミノ酸配列である。
配列番号２はフォルミジウム・ラミノスム由来プラストシアニンのアミノ酸配列である。
配列番号３は鉄酸化細菌由来ラスチシアニンのアミノ酸配列である。
配列番号４はアクロモバクター・サイクロクラステス由来シュードアズリンのアミノ酸配列である。
配列番号５はシュードモナス・シリンゲ由来アズリンのアミノ酸配列である。
配列番号６は淋菌由来Ｌａｚのアミノ酸配列である。
配列番号７は髄膜炎菌由来Ｌａｚのアミノ酸配列である。
配列番号８は腸炎ビブリオ由来アズリンのアミノ酸配列である。
配列番号９は気管支敗血症菌由来アズリンのアミノ酸配列である。
配列番号１０はクロロフレクサス・アウランティアカス由来オーラシアニンＡのアミノ酸配列である。
配列番号１１はクロロフレクサス・アウランティアカス由来オーラシアニンＢのアミノ酸配列である。
配列番号１２は百日咳菌由来アズリンのアミノ酸配列である。
配列番号１３は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンの５０〜７７アミノ酸断片（ｐ２８）のアミノ酸配列である。
配列番号１４は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンの５０〜６７アミノ酸断片（ｐ１８）のアミノ酸配列である。
配列番号１５は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンの３６〜１２８アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号１６は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンの３６〜８９アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号１７は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンの３６〜７７アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号１８は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンの３６〜５０アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号１９は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンの５０〜６６アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号２０は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンの６７〜７７アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号２１はクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＢの５７〜８９アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号２２は百日咳菌由来アズリンの５０〜７７アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号２３は髄膜炎菌由来Ｌａｚタンパク質の８９〜１１５アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号２４は緑膿菌由来アズリンの５３〜７０アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号２５は緑膿菌由来アズリンの５３〜６４アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号２６は緑膿菌由来アズリンの５１〜７７アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号２７はシュードモナス・シリンゲ由来アズリンの５１〜７７アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号２８は腸炎ビブリオ由来アズリンの５２〜７８アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号２９は気管支敗血症菌由来アズリンの５１〜７７アミノ酸断片のアミノ酸配列である。
配列番号３０は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号３１は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号３２は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号３３は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号３４は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号３５は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号３６は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号３７は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号３８は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号３９は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号４０は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号４１は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号４２は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号４３は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号４４は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号４５は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す人工配列である。
配列番号４６はアズリンの保存アミノ酸配列であり、Ｄはアスパラギン酸、Ｇはグリシン、Ｙはチロシン、Ｋはリジン、Ｘは任意のアミノ酸である。
配列番号４７はアズリンの保存アミノ酸配列であり、Ｄはアスパラギン酸、Ｇはグリシン、Ｙはチロシン、Ｋはリジン、Ｘは任意のアミノ酸である。
配列番号４８は緑膿菌のアズリン５０〜７７の修飾体の人工配列である。
配列番号４９は緑膿菌のアズリン５０〜７７のＤ−異性体修飾体の人工配列である。
配列番号５０〜３５０４は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５０５は１３マーの環状オリゴペプチドであるＰｅｐ４２のアミノ酸配列である。
配列番号３５０６は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンの６６〜７７アミノ酸断片（ｐ１２）のアミノ酸配列である。
配列番号３５０７は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５０８は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５０９は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５１０は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５１１は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５１２は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５１３は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５１４は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５１５は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５１６は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５１７は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５１８は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５１９は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５２０は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５２１は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５２２は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５２３は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５２４は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５２５は緑膿菌アズリンの５０〜７７アミノ酸領域のバリアント型を表す配列である。
配列番号３５２６は緑膿菌由来ｗｔ−アズリンの６０〜７７アミノ酸断片（ｐ１８ｂ）のアミノ酸配列である。
配列番号３５２７はＡｒｇ−８のアミノ酸配列である。
標識ｐ１８（配列番号１４）を投与されたマウスのマウス全体スキャンの画像を示す図である。ＩＲＤｙｅ（登録商標）標識ｐ１８（配列番号１４）（１２５μｇ）を静脈内投与し、腫瘍中及び臓器中の標識色素を検出するためにＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて記載されている時間間隔で胸腺欠損マウスをスキャンした。 標識ｐ１８（配列番号１４）を投与されたマウスのマウス全体スキャン及び臓器スキャンで得られた画像を示す図である。１２５μｇのＩＲＤｙｅ（登録商標）標識ｐ１８（配列番号１４）、ｉｖ投与１２０時間後（屠殺直前）。切除した臓器のスキャンを右側に示す。ｐ１８（配列番号１４）のシグナルは腎臓及びＭｅｌ−２腫瘍で観察された。 Ｍｅｌ−２細胞を注射してから３週間後に１２５μｇのＩＲＤｙｅ（登録商標）標識ｐ１８（配列番号１４）をｉｖ投与したＭｅｌ−２皮下腫瘍を示す図である。４８時間後にＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外スキャンを行った。８００ｎｍのチャンネルで記録した画像はＩＲＤｙｅ（登録商標）由来の特異的ｐ１８（配列番号１４）シグナルを示し、７００ｎｍのチャンネルで記録した画像はバックグラウンドを表す。腎臓及びＭｅｌ−２腫瘍からｐ１８（配列番号１４）シグナルが観察された。 αヘリックス構造を有するアズリン切断型及び７０ｎｓのシミュレーションの結果を示す図である。 シミュレーションされた構造中のＣα原子間の距離に基づく、ｐ２８（配列番号１３）中のチオエーテルブリッジ位置の測定を示す図である。 多様な組織起源の癌細胞株及びその対応する正常細胞中へのアズリン由来ペプチドｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の透過を示す写真である。（Ａ）３７℃で２時間後のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８（配列番号１３）又はｐ１８（配列番号１４）の透過を示す写真である。陽イオン性Ａｒｇ−８（配列番号３５２７）を対照として用いた。 多様な組織起源の癌細胞株及びその対応する正常細胞中へのアズリン由来ペプチドｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の透過を示す写真である。（Ｂ）同じ細胞株中への３７℃で２時間後のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８（配列番号１３）又はｐ１８（配列番号１４）の透過のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。 多様な組織起源の癌細胞株及びその対応する正常細胞中へのアズリン由来ペプチドｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の透過を示す写真である。（Ｃ）正常細胞の蛍光に対する増加倍率を示すグラフである。４つのメラノーマ細胞株へのｐ２８（配列番号１３）又はｐ１８（配列番号１４）の移入を同様に観察した結果、正常細胞からの蛍光に比べて数倍の増加が示された。 正常細胞の蛍光に対する増加倍率を示すグラフである。 癌細胞及び正常細胞中へのａｚｕ６０〜７７（ｐ１８ｂ）（配列番号３５２６）及びａｚｕ６６〜７７（ｐ１２）（配列番号３５０６）の移入を示す写真である。細胞をａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８ｂ（配列番号３５２６）（Ａ）又はｐ１２（配列番号３５０６）（Ｂ）と３７℃で２時間インキュベートし、共焦点顕微鏡で画像を記録した。 アズリン及びそのペプチドの細胞膜毒性を示すグラフである。（Ａ）３７℃で種々の濃度のｐ２８（配列番号１３）、ｐ１８（配列番号１４）、及びアズリンに１０分間暴露したＵＩＳＯＭｅｌ−２細胞のＬＤＨ漏出アッセイ。標準可溶化バッファー（ｃｙｔｏｔｏｘ−ｏｎｅ試薬）を正の対照として含めた。暴露後の蛍光の変化をｋ，ｘ５６０ｎｍ及びｋｅｍ５９０ｎｍで測定した。可溶化バッファーを１００％ＬＤＨ放出と定義した。データは正の対照の蛍光に対する％を表す。データは平均値±ＳＥＭで表す。（Ｂ）ｐ２８（配列番号１３）、ｐ１８（配列番号１４）、及びアズリンとインキュベートしたヒト赤血球からのヘモグロビン漏出。ヒト赤血球をペプチドと３７℃で３０分間インキュベートし、５４０ｎｍの吸光度を測定した。０．１％トリトンＸ１００後のヘモグロビンの放出を１００％のヘモグロビン放出と定義した。データは３回の測定の平均値±ＳＥＭを表す。 ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）の温度依存的且つ競合的な内部移行を示す写真である。２０１１ＭのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８（配列番号１３）（Ａ）又はｐ１８（配列番号１４）（Ｂ）の透過を種々の温度での共焦点顕微鏡法によって評価した。（Ｃ）及び（Ｄ）非標識ペプチド（２００倍過剰量）存在化／非存在下における３７℃で３０分後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への５μＭのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ２８（配列番号１３）（Ｃ）又はｐ１８（配列番号１４）（Ｄ）の移入の共焦点分析を示す図である。 （Ａ）ヘパリン硫酸（１００μｇ／ｍｌ）の存在下／非存在下において３７℃で１時間後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への２８、ｐ１８（配列番号１４）（２０μＭ）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）（１０μＭ）の移入の共焦点分析を示す写真である。 （Ｂ）阻害剤存在下におけるｐ２８（配列番号１３）又はｐ１８（配列番号１４）の移入のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。阻害剤非存在下における細胞蛍光強度（対照）を１００％と見なした。 （Ｃ）阻害剤存在下における線維芽細胞中へのｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）の移入のＦＲＣＳ分析を示すグラフである。 （Ｄ）ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）とカベオリンＩの共局在を示す写真である（パネル１）。ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞をＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８（配列番号１４）又はｐ２８（配列番号１３）（２０μＭ）又は培地と３７℃で２時間インキュベートした。細胞を固定し、抗カベオリン１免疫染色用に処理した。３７℃で２時間後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８（配列番号１４）又はｐ２８（配列番号１３）（２０μＭ）の移入の抗ゴルジン９７抗体による共焦点分析（パネル２）。ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中におけるＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたアズリン、ｐ２８（配列番号１３）、及びｐ１８（配列番号１４）（赤色）とｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ色素（緑色）（パネル３）及びＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ色素（緑色）（パネル４）の共局在。細胞を２０μＭのアズリン、ｐ２８（配列番号１３）、ｐ１８（配列番号１４）、又は培地のみと３７℃でインキュベートした。９０分インキュベートした後、ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ／ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒプローブを添加して細胞を３０分間インキュベートした。細胞をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。アズリン、ｐ２８（配列番号１３）、又はｐ１８（配列番号１４）の共局在は黄色蛍光として見られる。 種々の濃度のアズリン、ｐ２８（配列番号１３）、又はｐ１８（配列番号１４）と３７℃で７２時間インキュベートしたＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を示すグラフである；ＭＴＴ（Ａ）、直接細胞計数（Ｂ）。対照ウェル中の細胞生存率（ＭＴＴ）又は細胞数を１００％と見なした。データは平均値±ＳＥＭを表す。 細胞をタンパク質及び／又はバッファーで処置した後に共焦点顕微鏡で撮影した、細胞による化合物の取込みを示す写真である。（Ａ）ヒト脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞を２０μＭの非標識タンパク質又はＰＢＳバッファーで２時間前処置した後、ＰＢＳバッファーで３回洗浄した。バッファーを全て捨てた後、２０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｐａｚを３７℃で３０分間添加した。（Ｂ）次いで、ＬＮ−２２９細胞を２０μＭの非標識タンパク質又はＰＢＳバッファー及び２０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｐａｚで３７℃にて３０分間処置した。（Ｃ）ヒト脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞の別の群を、１０μＭの非標識タンパク質又はＰＢＳバッファーで２時間前処置した後、ＰＢＳバッファーで３回洗浄した。バッファーを全て捨てた後、１０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｐａｚを３７℃で３０分間添加した。（Ｄ）次いで、ＬＮ−２２９細胞を１０μＭの非標識タンパク質又はＰＢＳバッファー及び１０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｐａｚで３７℃にて３０分間処置した。（Ｅ）ヒト脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞を２０μＭの非標識タンパク質又はＰＢＳバッファー及び２０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｐａｚで３７℃にて３０分間処置した。（Ｆ）ヒト脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞を２０μＭのＡｌｅｘ５６８−Ｈ．８で３７℃にて３０分間処置した。（Ｇ）ヒト脳腫瘍ＬＮ−２２９細胞を２０μＭのＡｌｅｘ５６８−タンパク質で３７℃にて３０分間処置した。（Ｈ）ヒト乳腺癌ＭＣＦ−７細胞を２０μＭのＡｌｅｘ５６８−タンパク質で３７℃にて３０分間処置した。 細胞へのペプチドの結合及び移入を示すグラフ及びチャートを示す図である。（Ａ）ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２又は線維芽細胞（３×１０５細胞）をフェノールレッドを含まないＭＥＭＥ培地に懸濁した。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ２８（配列番号１３）を氷上で１０、５０、１００、１５０、２５０、３００、及び４００μＭで３０、６０、９０、及び１２０秒間添加することで反応を開始させた。細胞をフローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）ペプチド濃度（μＭ）に速度（ＭＦＩ／秒）をプロットすることでＫｍ及びＶｍａｘを計算した。（Ｃ）ペプチドの結合及び移入の決定には、Ｍｅｌ２全細胞（ｗｈｏｌｅ Ｍｅｌ２ ｃｅｌｌ）（５０，０００細胞／ｍｌ）を用い、１０００倍過剰量の非標識ｐ２８（配列番号１３）又はアズリンの存在下／非存在下で種々の濃度（０〜１７５ｎＭ）の放射性標識アズリンと３７℃で３０分間インキュベートし、γ線計数器を用いて細胞ペレットに残った放射活性を計測した。１２５Ｉアズリンのみとインキュベートした細胞中の放射活性を全結合と見なし、非標識アズリン又はｐ２８（配列番号１３）存在下の放射活性を非特異的結合と見なした。全結合から非特異的結合を引くことで特異的結合を求め、スキャッチャード・プロットを作製した。 ６０μモル濃度のｐ２８（配列番号１３）色素複合体２５０μＬを注射した後及び対照のＰＢＳを注射した後、（Ａ）２４時間目に撮影した、メラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ６０μモル濃度のｐ２８（配列番号１３）色素複合体２５０μＬを注射した後及び対照のＰＢＳを注射した後、（Ｂ）４８時間目に撮影した、メラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ６０μモル濃度のｐ２８（配列番号１３）色素複合体２５０μＬを注射した後及び対照のＰＢＳを注射した後、（Ｃ）濃度２００μＭのｐ２８（配列番号１３）を注射した２４時間後及び４８時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ６０μモル濃度のｐ１８（配列番号１４）を注射した（Ａ）１７時間後に撮影した、メラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ６０μモル濃度のｐ１８（配列番号１４）を注射した（Ｂ）２４時間後に撮影した、メラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ６０μモル濃度のｐ１８（配列番号１４）を注射した（Ｃ）４６時間後に撮影した、メラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。（Ｃ）は、ｐ１８（配列番号１４）を注射した４６時間後に撮影した心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、及び脳を含むマウス臓器の写真も示す。 （Ａ）ｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を６０μモル濃度で注射した１２時間後に撮影した腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。（Ｂ）ｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した１２時間後に撮影した、マウスの脳を含むマウス臓器の写真である。 （Ａ）尾静脈に濃度６００μＭのｐ１８（配列番号１４）及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した４０時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−６腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。ｐ１８（配列番号１４）で処置した動物は５０万個の細胞を注入したものであり、Ａｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した動物は百万個の細胞を注入したものである。 （Ｂ）濃度６００μＭのｐ１８（配列番号１４）及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した４０時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 （Ａ）濃度６０μＭのｐ２８（配列番号１３）、ｐ１８（配列番号１４）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した１６時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 （Ｂ）濃度６０μＭのｐ２８（配列番号１３）、ｐ１８（配列番号１４）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した２４時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 メラノーマＭＥＬ−２３を有するマウスに濃度６０μＭのｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）色素ペプチド複合体を注射した４８時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 ＭＥＬ−２３腫瘍及び臓器を有するマウスに濃度６０μＭのｐ２８（配列番号１３）を注射した２４時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 濃度６０μＭのｐ２８（配列番号１３）及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した１６時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 濃度６０μＭのｐ１８（配列番号１４）を注射した１６時間後に撮影したメラノーマＭＥＬ−２３腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 濃度２４０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）による高投与量処置の１０時間後及び２４時間後に撮影した、腫瘍を有するマウスの側面写真である。 濃度２４０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）による高投与量処置の２８時間後に撮影した、ＭＣＦ−７腫瘍及び臓器を有するマウスの側面写真及び背面写真である。濃度２４０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）による高投与量処置の２８時間後に撮影したＭＣＦ−７を有するマウスの臓器の写真も示す。 濃度２４０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）による高投与量処置の５０時間後に撮影した、腫瘍を有するマウスの側面写真及び背面写真である。 ＨＣＴ−１１６腫瘍及び臓器を有するマウスの尾静脈に濃度１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した２４時間後に撮影したマウス臓器の写真である。 （Ａ）ＨＣＴ−１１６腫瘍及び臓器を有するマウスの尾静脈に濃度１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した２４時間後に撮影したマウス臓器の写真である。（Ｂ）尾静脈に濃度１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した２１時間後に撮影したＨＣＴ−１１６腫瘍を有するマウスの側面写真である。 （Ａ）尾静脈に百万個の細胞を注射した４７日後に濃度１２０μＭのｐ２８（配列番号１３）を注射した２４時間後のＨＣＴ−１１６を有するマウスの側面写真及び背面写真である。（Ｂ）尾静脈に百万個の細胞を注射した４７日後に濃度１２０μＭ濃度のｐ２８（配列番号１３）を注射した４時間後のＨＣＴ−１１６を有するマウスから得られたマウス臓器の写真である。 濃度１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した２４時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 （Ａ）濃度１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）並びに濃度６０６０μＭのＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した２２時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真である。（Ｂ）濃度１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）並びに濃度６０μＭのＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した後のＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 （Ａ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの臓器の写真である。 （Ａ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの臓器の写真である。（Ｂ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの脳の写真を並べたものであり、脳へのｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の取込みの差を示している。 濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した１６時間後に撮影した、ドキソルビシン及びｐ２８（配列番号１３）の実験中のＨＴ−１０８０マウスの側面写真及び背面写真である。 （Ａ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ２８（配列番号１３）及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの臓器の写真である。 （Ｂ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ２８（配列番号１３）及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの脳の写真を並べたものである。 （Ａ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの臓器の写真である。 （Ｂ）濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの脳の写真を並べたものである。 尾静脈を介して処置した肺転移を有するＨＴ−１０８０マウスの写真である。（Ａ）ドキソルビシン、３ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、３回処置；（Ｂ）ｐ２８（配列番号１３）、５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、毎日処置；（Ｃ）ＰＢＳ対照、ＰＢＳ、ＩＰ、毎日処置；（Ｄ）ｐ２８（配列番号１３）、１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、毎日処置；（Ｅ）２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、毎日処置。 （Ａ）１×１０６個の細胞を尾静脈に注射（４３日）し、処置された全マウスが肺転移を有する動物実験において、濃度６０μＭのｐ２８（配列番号１３）を尾静脈に注射した２４時間後及び２６時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの臓器の写真である。動物６９８２は撮影時には死亡していた。 （Ｂ）１×１０６個の細胞を尾静脈に注射（４３日）する動物実験において、濃度６０μＭのｐ２８（配列番号１３）を尾静脈に注射した２２時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの側面写真及び背面写真である。動物６９８２は撮影時には死亡していた。 １×１０６個の細胞を尾静脈に注射（４３日）する動物実験において、濃度６０μＭのｐ２８（配列番号１３）を尾静脈に注射した２６時間後に撮影したＨＴ−１０８０マウスの側面写真及び背面写真である。 Ｂａｌｂ−Ｃペプチド実験において濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した１２時間後に撮影した（Ａ）マウスの臓器及び（Ｂ）マウスの背面の写真である。 Ｂａｌｂ−Ｃペプチド実験において濃度６０μＭ及び１２０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した２４時間後に撮影した（Ａ）マウスの臓器及び（Ｂ）マウスの側面の写真である。 濃度６０μＭのｐ１８（配列番号１４）及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を尾静脈に注射した１６時間後の（５０万個の細胞を尾静脈に注射された）ＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真である。 ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）で処置した後のマウスの臓器、特にマウスの脳の写真である。 ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）で処置した後のマウスの臓器、特にマウスの脳の写真である。 ｐ２８（配列番号１３）、ｐ１８（配列番号１４）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で処置した２４時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 （Ａ）濃度６０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した３時間後のＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真である。 （Ｂ）濃度６０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した２２時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真並びにＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 （Ｃ）濃度６０μＭのｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を注射した２４時間後のＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 （Ａ）マウス脳及び（Ｂ）マウス臓器へのｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の取込みを示す図である）。 ５０万個の細胞を尾静脈にＩ．Ｖ．注射した実験（４４日後）において、濃度２４μＭのｐ１８（配列番号１４）及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を尾静脈に注射した１２０時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真である。 ｐ１８（配列番号１４）で処置した１６８時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの臓器の写真である。 細胞注射４１日後にＡｒｇ−８（配列番号３５２７）及びｐ１８（配列番号１４）を注射した７２時間後に撮影したＭＥＬ−６マウスの側面写真及び背面写真である。 Ａｒｇ−８（配列番号３５２７）及びｐ１８（配列番号１４）の注射後に撮影したマウスの背面写真である。 Ａｒｇ−８（配列番号３５２７）及びｐ１８（配列番号１４）を注射した３、２４、及び４８時間後に撮影したマウスの側面写真及び前面写真である。
定義
本明細書において、「細胞」という用語は、特に「単一細胞」として記載していない限り、単数及び複数の両方を含む。
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して同義で使用されている。これらの用語は、１又は複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用される。また、天然のアミノ酸ポリマーにも適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、限定されるものではないがグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ＡＤＰリボシル化等の修飾も含む。ポリペプチドは常に完全な直鎖とは限らないと理解される。例えば、ポリペプチドはユビキチン化によって分岐されていてもよく、典型的には天然のプロセシング及び天然には起こらない人為的操作により生じるイベント等の翻訳後のイベントの結果、環状であってもよい（分岐はあってもなくてもよい）。環状、分岐、及び環状分岐鎖ポリペプチドは、翻訳でない天然のプロセス及び完全に合成的な方法によっても合成され得る。合成ペプチドとは細胞成分の助けなしに作製されるものである。ペプチドを作製する合成方法は当該技術分野で周知であり、商業的に利用可能である。更に、本発明は、本発明のタンパク質の、メチオニンを含むアミノ末端バリアント及びメチオニンを含まないアミノ末端バリアントの両方の使用を予期する。
本明細書において、「状態」という用語は、身体機能のパフォーマンスを妨げるか変化させる、生きている動物又はその一部の正常状態の障害を構成する正常状態からの解剖学的及び生理学的逸脱を含む。
本明細書において、「細胞成長を阻害する」という用語は、細胞分裂及び／又は細胞増殖を鈍化又は停止させることを意味する。この用語には、細胞発達の阻害又は細胞死の増加も含まれる。
本明細書において、「罹患している（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ）」という用語は、状態の症状を現在示していること、観察可能な症状を伴わずに状態を有していること、状態からの回復中であること、又は状態から回復したことを含む。
本明細書において、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、処置される状態に関連する状態又は症状の進行又は重症度を防止、低減、停止、又は逆転させることを含む。したがって、「処置」という用語は、適切な医学的、治療的、及び／又は予防的投与を含む。
「治療有効量」とは、処置されている対象の特定の状態又は特定の状態に存在する症状の発達の防止、低減、停止、若しくは逆転又は部分的若しくは完全な軽減に有効な量である。当業者であれば治療有効量を決定することができる。
本明細書において、「薬理活性」という用語は、生体系への薬物又はその他の化学物質の効果を意味する。化学物質の効果は有益であることもあり（治療的）、有害であることもある（毒性）。純粋な化学物質又は混合物は、天然（植物、動物、又はミネラル）起源であってもよく、合成化合物であってもよい。
本明細書において、「前悪性（ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ）」という用語は、前癌性（ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ）、すなわち異常細胞が制御されずに分裂する前を意味する。
本明細書において、「薬物動態特性（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）」という用語は、生物又は宿主中で活性な薬剤又は薬物の体内動態（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を記述するパラメータを意味する。代表的な薬物動態特性としては、血漿半減期、肝臓の初回通過代謝、分布容積、血清タンパク質（例えばアルブミン）の結合の程度等が含まれる。
本明細書において、「血漿半減期」という用語は、生体代謝、排泄等の生物学的プロセスにより、投与された薬物の２分の１が患者の血漿から排除される時間を意味する。
本明細書において、「分布容積」という用語は、生物の種々のコンパートメント、例えば細胞内及び細胞外の空間、組織、臓器等における、薬物の分布及び保持の程度を意味する。この要素は、「見かけの分布容積」又はＶｄと表され、これは薬物が分布された体の推定容積である。大きなＶｄは、薬物が体全体により広く分布されたことを示唆し、血漿中にある薬物がより少なく、そのため排除場所の腎臓及び肝臓にまで送達される薬物がより少なくなるため、より長い半減期に関連し得る。
本明細書において、「血清結合の程度」という用語は、アルブミン等の血清タンパク質が薬物に結合する傾向を意味する。
本明細書において、「効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）」という用語は、特定の活性薬剤の意図する目的の有効性、すなわち所定の活性薬剤がその所望の薬理学的効果を生じる能力を意味する。
本明細書において、「比活性」という用語は、酵素１ミリグラム当たり、所定の条件下、所定の時間で酵素により形成される生成物の量を意味する。比活性は、反応速度に反応体積をかけ、酵素の質量で割ったものに等しい。輸送ペプチドの場合、比活性は、１ミリグラムの輸送ペプチド又は輸送ペプチド−カーゴ複合体当たり、所定の条件下、所定の時間中に細胞中に内部移行された輸送ペプチド又は輸送ペプチド−カーゴ複合体の量である。
本明細書において、「実質的に純粋な」という用語は、本発明のタンパク質又はその他の細胞産物を修飾して用いる場合、例えば、成長培地又は細胞内容物から他のタンパク質及び／又は活性阻害化合物が実質的に含まれない又は混ざっていない形態で単離されているタンパク質を意味する。「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で単離画分の少なくとも約７５％の量の因子を指し、すなわち少なくとも「７５％実質的に純粋」であることを指す。より具体的には、「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で少なくとも約８５％の化合物（活性化合物）を指し、すなわち少なくとも「８５％実質的に純粋」であることを指す。最も具体的には、「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で少なくとも約９５％の化合物（活性化合物）を指し、すなわち少なくとも「９５％実質的に純粋」であることを指す。例えば合成反応の試薬及び副産物から合成タンパク質を単離した場合、「実質的に純粋な」という用語は、合成されたタンパク質又は化合物を修飾しても使用され得る。
本明細書において、本発明のペプチド又は化合物に言及する場合の「医薬品グレード（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｇｒａｄｅ）」という用語は、自然の状態で見られる場合に材料に通常付随する成分（例えば合成試薬及び副産物）から実質的に又は本質的に単離されており、医薬品としての使用の障害となる成分から実質的又は本質的に単離されている、ペプチド又は化合物である。例えば、「医薬品グレード」のペプチドは如何なる発癌物質からも単離・分離されている。場合によっては、「医薬品グレード」という用語は、組成物を患者への静脈内投与に不適切にする如何なる物質からも実質的に又は本質的に単離されたペプチド又は化合物を指定するために、「静脈内医薬品グレード」のように、意図する投与方法によって修飾され得る。例えば、「静脈内医薬品グレード」のペプチドは、ＳＤＳ等の界面活性剤及びアジド等の抗菌剤から単離されているものであり得る。
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」という語句は、自然の状態で材料に通常不随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を指す。したがって、本発明に係る単離ペプチドは、好ましくは、それらのｉｎ ｓｉｔｕ環境でペプチドに通常会合している材料を含まない。「単離された」領域とは、その領域が由来するポリペプチドの全配列を含まない領域を指す。「単離された」核酸、タンパク質、又はその各断片は、限定されるものではないが、ヌクレオチドシークエンシング、制限消化、部位特異的突然変異誘発、並びに核酸断片を得るため及びタンパク質又はタンパク質断片を実質的に純粋な量で得るための発現ベクターへのサブクローニング等の当業者による操作が可能なように、そのインビボ環境から実質的に取り出されているものである。
本明細書においてペプチドを指して使用される「野生型」という用語は、ペプチドが天然のペプチドと同じ配列を有することを意味する。
本明細書において、ペプチドに関して、「バリアント」という用語は、野生型ポリペチドと比べて置換、欠失、又は挿入されたアミノ酸を有し得るアミノ酸配列バリアントを指す。バリアントは野生型ペプチドの切断型であってもよい。「欠失」とは、野生型タンパク質からの１又は複数のアミノ酸の除去であり、「切断」は、野生型タンパク質の１又は複数の末端からの１又は複数のアミノ酸の除去である。したがって、バリアントペプチドはポリペプチドをコードする遺伝子を操作することで作製され得る。バリアントは、ポリペプチドの基本的薬理活性の少なくとも一部を変化させずにポリペプチドの基本的な組成又は特徴を変化させることで作製され得る。例えば、緑膿菌移行ペプチドの「バリアント」は、癌細胞に移入する能力を保持する変異された緑膿菌移行ペプチドであり得る。場合によっては、バリアントペプチドは、ε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基等の非天然アミノ酸で合成されている（Ｇｈａｄｉｒｉ ＆ Ｆｅｒｎｈｏｌｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１２：９６３３−９６３５（１９９０））。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて２０、１９、１８、１７、又は１６個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて１５、１４、１３、１２、又は１１個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて１０、９、８、又は７個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて６個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて５又は４個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。いくつかの実施形態では、バリアントは野生型ペプチド又はその一部と比べて３、２、又は１個以下のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されている。
本明細書において、「アミノ酸」という用語は、任意の天然又は非天然又は合成のアミノ酸残基を含むアミノ酸部分、すなわち、１、２、３、又はそれ以上の炭素原子（典型的には１個の（α）炭素原子）で直接連結された少なくとも１つのカルボキシル残基と少なくとも１つのアミノ残基とを含む任意の部分を意味する。アミノ酸は、アミノ酸のＬ−異性体であってもよく、Ｄ−異性体であってもよい。
本明細書において、「修飾残基」という用語は、限定されるものではないが本明細書に開示する方法及び技術の１又は複数を含み得る方法又は技術を用いて修飾されたアミノ酸を意味する。
本明細書において、ペプチドに関して、「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」という用語は、対象のペプチドに由来するペプチドを指す。誘導は、ペプチドの基本的薬理活性の一部が保持されるようなペプチドの化学的修飾を含む。例えば、緑膿菌の輸送ペプチドの「誘導体」は、例えば癌細胞に移入する能力を保持している化学的に修飾された緑膿菌輸送ペプチドであり得る。関心のある化学的修飾としては、限定されるものではないがペプチドのアミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾、リン酸化、又はグリコシル化が含まれる。更に、誘導体ペプチドは、ポリペプチドと、限定されるものではないが、例えば別のペプチド、薬物分子、又はその他の治療薬剤若しくは医薬品又は検出可能なプローブ等の化合物との融合体であってもよい。
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、ポリペプチドと候補配列を整列させた時に候補配列中のアミノ酸残基と同一である、ポリペプチド中のアミノ酸残基の割合と定義される。％アミノ酸同一性を決定するには、配列を整列させ、必要に応じて最大の％配列同一性を得るためにギャップを導入する。保存的置換は配列同一性の一部と見なさない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列アラインメント方法は当業者に周知である。多くの場合、ペプチド配列の整列にはＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社製）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアが用いられる。具体的な実施形態では、Ｂｌａｓｔｐ（メリーランド州ベセスダの国立バイオテクノロジー情報センターから利用可能）を、ｌｏｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒ、ｅｘｐｅｃｔ １０、ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ ３、ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、及びｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １のデフォルトのパラメータで用いる。
アミノ酸配列を整列させる場合、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する、所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（所与のアミノ酸配列Ａが所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して、特定の％アミノ酸配列同一性を有するとも表現できる）は、
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ＊１００
（式中、
Ｘは、配列整列用のプログラム又はアルゴリズムによるＡ及びＢの整列により同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、
Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の合計数である）として計算することができる。
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性はＡに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならない。長い配列と短い配列を比較する場合、短い方の配列を「Ｂ」の配列とする。例えば、切断型ペプチドを対応する野生型ポリペプチドと比較する場合、切断型ペプチドを「Ｂ」の配列とする。
概略
本発明は、クプレドキシンの１又は複数の薬理活性を維持しており、とりわけ向上された安定性、比活性、血流中での半減期、及び／又は免疫原性の低下等の向上された薬物動態特性を有し得る、クプレドキシン由来ペプチドに関する。更に、本発明は、修飾クプレドキシン由来ペプチドに由来する化合物に関し、これもクプレドキシンの１又は複数の薬理活性を維持しており、薬物動態特性が向上されている。最後に、本発明は、哺乳動物患者が罹患する種々の状態を処置及び／又は診断するため並びに哺乳動物患者が罹患する種々の状態を研究するための、修飾クプレドキシン由来ペプチド及びそれから製造された化合物の使用方法に関する。本明細書と共に提出する配列表全体を参照により本明細書に援用する。
組成物
本発明は、クプレドキシン由来ペプチドの修飾体であるペプチドに関する。いくつかの実施形態では、修飾ペプチドは薬物動態特性が向上されている。いくつかの実施形態では、これらの修飾クプレドキシン由来ペプチドはクプレドキシンの少なくとも１つの薬理活性を保持している。いくつかの実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、単離されているか、実質的に純粋であるか、医薬品グレードである。具体的な実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは静脈内用の医薬品グレードである。
クプレドキシン、特に緑膿菌由来のアズリンは、哺乳動物患者の処置及び／又は診断並びに哺乳動物患者が罹患する状態の研究の実施に有用な複数の薬理活性を有することが知られている。例えば、多くのクプレドキシンタンパク質、例えば緑膿菌アズリンは、多くの種類の哺乳動物癌細胞に特異的に移入してこれを死滅させる能力を有する（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４１８−１４３１（２００５）；Ｈｉｒａｏｋａ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ １０１：６４２７−６４３２（２００４）；Ｈｉｒａｏｋａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３３８：１２８４−１２９０（２００５）；２００５年１０月６日付で提出された米国特許出願第１１／２４４，１０５号；２００３年１１月２４日付で提出された同第１０／７２０，６０３号；２００２年１月１５日付で提出された同第１０／０４７，７１０；２００６年７月１３日付で提出された同第１１／４８５，２５２号、これら全ての全体を参照により本明細書に明示的に援用する）。緑膿菌のアズリンは、ウイルス感染又は細菌感染、より具体的には末梢血単核細胞におけるＨＩＶ−１感染の増加を抑制すること及びマラリア感染哺乳動物の赤血球の寄生虫血症を抑制することも知られている（Ｃｈａｕｄｈａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．５：１６４２−１６４８（２００６）；２００６年５月１９日付で提出された米国特許出願第１１／４３６，５９１；２００６年５月１９日付で提出された同第１１／４３６，５９０号、これらの両方の全体を明示的に参照により本明細書に援用する）。緑膿菌のアズリンは、種々の哺乳動物の細胞及び組織中におけるエフリンのシグナル伝達系に干渉することも知られている（その全体を明示的に参照により本明細書に援用する、２００６年５月１９日付で提出された米国特許出願第１１／４３６，５９２号）更に、緑膿菌アズリン由来のペプチドが哺乳動物細胞、特にヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において血管形成を阻害することが知られている（その全体を明示的に参照により本明細書に援用する、２００６年７月１９日付で提出された米国特許出願第１１／４８８，６９３号）。いくつかの実施形態では、本発明の修飾クプレドキシン由来ペプチドは、それらが由来するクプレドキシンの少なくとも１つの薬理活性を保持している。クプレドキシンの薬理活性は、クプレドキシンの任意の有用な活性であり得る。特に関心のある薬理活性としては、限定されるものではないが、哺乳動物の癌細胞に特異的に移入する能力、哺乳動物の非癌細胞に移入することができないこと、哺乳動物の前悪性細胞に移入する能力、哺乳動物の癌細胞を死滅させる能力、哺乳動物の前悪性細胞を死滅させる能力、ウイルス感染又は細菌感染の増加を抑制する能力、末梢血単核細胞においてＨＩＶ−１感染を抑制する能力、マラリア感染赤血球においてマラリアによる寄生虫血症を抑制する能力、及び哺乳動物細胞、特にＨＵＶＥＣにおいて血管形成を阻害する能力が含まれる。ペプチドの薬理活性の量を測定する方法は上記に参照した出願及び刊行物に記載されている。
緑膿菌のクプレドキシンであるアズリンは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を用いてヒト癌細胞に選択的に移入する。これらのクプレドキシンが用いる最小モチーフＰＴＤはこれまで同定されていなかった。アズリン、ｐ１８（配列番号１４）、及びｐ２８（配列番号１３）による移入のメカニズムは本セクションと後述する実施例中に詳細に記載されている。一般的に、ＰＴＤは、構造的特徴、陽イオン性残基、又は両親媒性α−へリックスに基づいて２つのグループに分類される。但し、両方のクラスに当てはまるものもある。一般的に陽イオン性ペプチドは負に帯電した表面糖タンパク質に結合することで原核種及び真核種の細胞膜と最初に相互作用し、幅広い正常細胞株及び悪性細胞株への効率的移入を促進する（Ｋｏｎｄｅｊｅｗｓｋｉ，Ｌ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：６７−７４（２００２）；Ｆｕｃｈｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｒａｉｎｅｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３：２４３８−２４４４（２００４））。ＨＳへの陽イオン性ペプチドの結合は、ＨＳに対する親和性（Ｋｄ−１０９ｎＭ）が高いことと一致し、この値はアズリン、ｐ１８（配列番号１４）、及びｐ２８（配列番号１３）で報告されている値よりも相当高い（Ｔｒａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７９５７−７９６１（１９８７））。
しかし、合成陽イオン性両親媒性α−ヘリックスジアステレオマーペプチドによる細胞毒作用は一般的に癌細胞特異的ではない。癌細胞に細胞毒性である両親媒性細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）は癌細胞膜を破壊するか、ミトコンドリア透過性を変化させるか、特異的受容体を介したメカニズムによって作用する（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ，Ｃ．ａｎｄ Ｈａｎｓｅｌ，Ｗ．，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ， １０：２２９９−２３１０（２００４））。合成マゲイニン、Ｌｙｓ、Ａｌａ、及びＬｅｕ残基のみを含むものを含む線状、らせん状、チャンネル形成性、又はイオノフォアクラスのペプチドは、正常細胞に細胞毒性である投与量よりも低い投与量で、急速且つ不可逆的に造血器腫瘍及び固体腫瘍標的細胞を溶解するが、癌細胞を優先的に透過する特性は有しない（Ｊａｖａｐｏｕｒ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，３９：３１０７−３１１３（１９９６）；Ｃｒｕｃｉａｎｉ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：３７９２−３７９６（１９９１）；Ｐａｐｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｓｈａｉ，Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：９３４６−９３５４（２００３）。ファージディスプレイ技術を用いて作製されたペプチドも、リンパ管及び腫瘍血管に幾分特異的であるが、癌細胞の直接透過による細胞毒性は誘導しない。
一方、アズリン及びアズリンに由来する２つのペプチド（ｐ２８、配列番号１３及びｐ１８、配列番号１４）は、癌細胞に優先的に移入して細胞分裂停止メカニズム及び細胞毒性メカニズムによりその増殖を抑制するという固有の特性を有する。共焦点顕微鏡法及びＦＡＣＳにより、ｐ１８（配列番号１４）がヒト癌細胞中へのアズリンの優先的移入に関与する最小モチーフであることが示されている。
ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）は、癌細胞に移入することに加え、実施例９に開示の方法を用いて得られた図１４〜４９に示すように、腫瘍及び哺乳動物の臓器に移入することができる。驚くべきことに、ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）は、例えば図１６Ａ、１６Ｂ、１７Ｂ、１９、２０、２４、２６、２７Ａ、２８Ｂ、２９、３０Ｂ、３１Ａ〜Ｂ、３３Ａ〜Ｃ、３４Ａ〜Ｃ、３６Ａ、３８Ａ、３９Ａ、４１Ａ〜Ｄ、４２、４３Ｂ、４４Ａ〜Ｂ、及び４６に示されるように、血液脳関門を透過して哺乳動物の脳に移入することもできる。
アズリン等の酸化還元タンパク質は、通常、ＣＰＰ又は抗増殖剤に分類されない。両親媒性アズリン断片ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）は、アズリンの５４〜６７アミノ酸のαヘリックス構造及び部分的βシート構造を含み、それぞれ、癌細胞移入及び細胞周期阻害活性のための最小限の配列を示す。アズリン、ｐ２８（配列番号１３）、及びｐ１８（配列番号１４）の移入は陽イオン性ＣＰＰの移入とは別個のものである。多様な組織起源の癌の進行及び転移の変化にインテグリン及びカドヘリンを含む複数の細胞表面受容体の異常なＮ−グリコシル化が関連していることから、アズリン、ｐ１８（配列番号１４）、及びｐ２８（配列番号１３）の透過初期段階におけるまだ知られていないＮ−グリコシル化細胞表面タンパク質の役割が示唆されている（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：１２０−１２４（２００４）；Ｓｅａｌｅｓ，Ｅ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５：４６４５−４６５２（２００５））。
エンドサイトーシス成分の細胞透過を補助する陽イオン性ＣＰＰの温度依存的移入がアズリン及びアミノ酸断片５０〜７７（ｐ２８：配列番号１３）の移入に反映されている（Ｙａｍａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７：１４１８−１４３１（２００５））。正常細胞及び悪性細胞へのアズリンのアミノ酸５０〜６７（ｐ１８：配列番号１４）の移入はｐ２８（配列番号１３）よりも速いようである。ｐ１８（配列番号１４）の方がＫｍが低く、Ｖｍａｘが高いことから、アミノ酸５０〜６７はリン脂質膜と会合した時にアズリンの実際のＰＴＤにより近い両親媒性構造を形成することが示唆される。しかし、エネルギー依存的エンドサイトーシスプロセス及びポアに関連するプロセスがこれらのペプチドが利用可能な唯一の移入メカニズムではないようである。例えば、陽イオン性ペプチドの移入を阻害する代謝及び膜電位の阻害剤であるアジ化ナトリウム及びウアバイン（Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤）は、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞又は線維芽細胞へのｐ１８（配列番号１４）又はｐ２８（配列番号１３）の移入を阻害しなかった（図１０Ｂ、Ｃ）。このことは、いずれのペプチドも直接細胞膜を透過し得ることを示唆している。
ｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、及びアズリンは、形質膜を透過して、カベオラに結合した後期エンドソーム、リソソーム、及びゴルジに達し、これはダイナミン非依存性のクラスリン依存性キャリアを介した様式と考えられる（Ｋｉｒｋｈａｍ， Ｍ． ａｎｄ Ｐａｒｔｏｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７４６：３４９−３６３（２００５））。カベオラ輸送及びカベオラ介在性エンドサイトーシスを撹乱するノコダゾールは透過を５０〜６５％阻害した。ノコダゾールによる顕著な透過阻害と、アクチンフィラメントを破壊するサイトカラシンＤによる阻害の相対的欠如は、カベオラを介した移入を裏付けている。特に、スタウロスポリンの影響がないことは、ダイナミンがいずれのペプチドの透過にも大きな役割を果たしていないことを示している（上記文献）。この移入経路は、不可欠な細胞表面成分及び一見異なる分子、すなわちデキストラン、並びに古典的エンドサイトーシス経路を回避するためにカベオラを利用する様々な病原体又はその生産物によるものが説明されている。β−メチルシクロデキストラン、フィリピン、又はナイスタチンを用いて形質膜からコレステロールを除去することで、膜成分を隔てる液体プラットフォームを提供し且つ膜を区分する形質膜ドメインである脂質ラフトを破壊すると、ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞及び線維芽細胞中への透過が有意に阻害され（それぞれ５０％及び約６０％；それぞれ３５％及び４２％）、このことはかなりの割合（約６０％）のｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）がカベオラを介して形質膜を透過することを示している。カベオラは、シグナル伝達の制御因子として機能するカベオリンに特有のタンパク質（カベオリン−１、−２、又は−３）の存在により規定される形質膜の脂質ラフト陥入部の５０〜１００ｎｍのオメガ型サブセットである。
ブレフェルジンＡはゴルジ装置を破壊し、ｐ１８（配列番号１４）の蓄積を阻害する。したがって、この経路もｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の移入及び細胞内輸送に利用されている。カベオラを介したｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の細胞透過は、Ｎ−グリコシル化阻害剤がＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞への細胞移入を約６０％低下させ、線維芽細胞への細胞移入をそれぞれ２５％及び３５％低下させるという証拠と一致している。ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の移入のパーセンタイルの差は、癌細胞と正常細胞におけるＮ−グリコシル化膜構造の数及びこのメカニズムを介したｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）の相対的移入経路に関連している。
アズリン、ｐ２８（配列番号１３）、及びｐ１８（配列番号１４）は全て、多くの他の潜在的抗癌ペプチドよりも高い親和性及び高い容量で癌細胞に結合する。結合後、このタンパク質／受容体複合体はカベオラ中に局在し、内部移行し、最終的に（カベオソームを介して）ゴルジ、ＥＲ、及び核に移行する。カベオラを介した移入に加えて、カイネティクス解析により、ｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）が非クラスリン・カベオラ介在性プロセスにより形質膜を透過することも示されている。例えばインターロイキン２受容体及び特定のグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定タンパクのための構成的内部移行メカニズムとして、クラスリン及びカベオリン非依存性経路が存在し得る（Ｌａｍａｚｅ，Ｃ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７：６６１−６７１（２００１）；Ｓａｂｈａｒａｎｊａｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，２：４１１−４２３（２００２））。病原体は細胞に侵入するためにクラスリン及びカベオリン非依存性エンドサイトーシスも利用しており、これは、マウスポリオーマウイルスの場合のように単独であってもよく、インフルエンザウイルスの場合のように従来の経路と併用されることもある（Ｅｗｅｒｓ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：１５１１０−１５１１５（２００５）；Ｓｉｅｃｚｋａｒｓｋｉ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｇ．Ｒ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：１０４５５−１０４６４（２００２））。癌細胞で正常細胞よりもカベオリン−１の発現が増加していることが癌細胞中にアズリン、ｐ２８（配列番号１３）、及びｐ１８（配列番号１４）が優先的に移入するための唯一の基礎ではないと思われる。線維芽細胞及び複数のその他の正常細胞もその表面にかなりの数のカベオラを有する。
ｐ１８（アズリンのアミノ酸５０〜６７：配列番号１４）及びｐ２８（アズリンのアミノ酸５０〜７７：配列番号１３）は、細胞膜グリコサミノグリカンが結合せず、エンドサイトーシス経路、カベオソームに向かう経路、及びカベオソーム非依存経路により癌細胞を優先的に透過する。ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の細胞透過は、癌細胞への選択性という点で現在のあらゆるＣＰＰと比べて特徴的である。驚くべきことに、ｐ２８（配列番号１３）のＣ末端１０〜１２アミノ酸は、細胞周期阻害及びアポトーシス活性／細胞毒性に関与するドメインを含むことが実証されている。更に、この同じドメインは、細胞膜上の特定の残基に接触して移入を最も促進し易い。特に、アズリンのアミノ酸６９、７０、７５、７６、及び８５は細胞膜との接触を提供する。内部移行した後、ｐ２８（配列番号１３）は最初に細胞分裂停止メカニズムを介して癌細胞の増殖を阻害する。したがって現在、ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）がそれぞれヒト癌細胞へのアズリンの優先的移入並びにヒト癌細胞に対するアズリンの抗増殖活性がかなり高いことの原因であることが分かっている。
クプレドキシン由来ペプチドは、任意のクプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物、又はその切断型であってよい。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、クプレドキシンの少なくとも１つの薬理活性を保持している。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、限定されるものではないが、アズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、シュードアズリン、オーラシアニン、又はアズリン様タンパク質であり得る。クプレドキシン由来ペプチドは、限定されるものではないが、緑膿菌、フォルミジウム・ラミノスム、鉄酸化細菌、アクロモバクター・サイクロクラステス、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａ）、髄膜炎菌、腸炎ビブリオ、気管支敗血症菌、百日咳菌、クロロフレクサス・アウランティアカス、及び淋菌を含む任意の生物に由来し得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、限定されるものではないが特に、緑膿菌、シュードモナス・シリンゲ、淋菌、腸炎ビブリオ、又は気管支敗血症菌等の生物に由来するアズリンであり得る。
クプレドキシン由来ペプチドは、クプレドキシンの任意のバリアント、誘導体、又は構造的等価物であり得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドはクプレドキシンの切断型であり得る。クプレドキシン由来ペプチドは、当該技術分野で公知であり且つ／又は２００５年１０月６日付で提出された米国特許出願第１１／２４４，１０５号；２００３年１１月２４日付で提出された同第１０／７２０，６０３号；２００２年１月１５日付で提出された同第１０／０４７，７１０号（現在の米国特許第７，０８４，１０５号）；２００６年７月１３日付で提出された米国特許出願第１１／４８５，２５２号；２００６年５月１９日付で提出された同第１１／４３６，５９１号；２００６年５月１９日付で提出された同第１１／４３６，５９０号；２００６年５月１９日付で提出された同第１１／４３６，５９２号；及び２００６年７月１９日付で提出された同第１１／４８８，６９３号等の以前の出願に記載されている任意のクプレドキシンペプチドであり得る。これら全出願の全体を参照により明示的に本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、ペプチドは単離されている。いくつかの実施形態では、ペプチドは実質的に純粋であるか、医薬品グレードである。別の実施形態では、ペプチドは、ペプチドを含む又はから本質的になる組成物に含まれている。別の具体的な実施形態では、ペプチドは、哺乳動物、より具体的にはヒトにおいて、免疫応答を惹起しない。
クプレドキシン由来ペプチドは、野生型クプレドキシンと比較してアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されたアミノ酸配列バリアントであり得る。これらのバリアントは野生型クプレドキシンの切断型であり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、非天然アミノ酸又は修飾アミノ酸で置換されてもよい。非天然アミノ酸とは２０個の共通アミノ酸以外のアミノ酸である。クプレドキシン由来ペプチドは、全長野生型ポリペプチドよりも短いクプレドキシンの領域を含む。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、約１０残基超、約１５残基超、又は約２０残基超の切断型クプレドキシンを含む。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、約１００残基以下、約５０残基以下、約４０残基以下、約３０残基以下、又は約２０残基以下の切断型クプレドキシンを含む。いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、クプレドキシン由来ペプチドに対して、より具体的には配列番号１〜１２に対して、少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
特定の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは緑膿菌のアズリン残基５０〜７７（配列番号１３）、アズリン残基５０〜６７（配列番号１４）、又はアズリン残基３６〜８９（配列番号１６）を含む。別の実施形態では、クプレドキシンのバリアントは、緑膿菌のアズリン残基５０〜７７（配列番号１３）、アズリン残基５０〜６７（配列番号１４）、又はアズリン残基３６〜８９（配列番号１６）からなる。別の特定の実施形態では、バリアントは、アズリン以外のクプレドキシンの同等な残基からなる。別のクプレドキシンの同等な残基を決定するためには、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社製）を用いて対象のクプレドキシンアミノ酸配列を緑膿菌アズリン配列と整列させ、緑膿菌アズリンアミノ酸配列上の関連する残基を特定し、対象のクプレドキシン配列上の同等な残基を見出すことで、同等なペプチドを設計する。
本発明の一実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドはクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＢの少なくともアミノ酸５７〜８９（配列番号２１）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドはシュードモナス・シリンゲのアズリンの少なくともアミノ酸５１〜７７（配列番号２７）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは髄膜炎菌のＬａｚの少なくともアミノ酸８９〜１１５（配列番号２３）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは腸炎ビブリオのアズリンの少なくともアミノ酸５２〜７８（配列番号２８）を含む。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは気管支敗血症菌のアズリンの少なくともアミノ酸５１〜７７（配列番号２９）を含む。
クプレドキシン由来ペプチドは、天然ではない合成アミノ酸できたペプチドも含む。例えば、非天然アミノ酸をバリアントペプチドに組み込んで血流中での組成物の半減期を延長又は最適化してもよい。そのようなバリアントとしては、限定されるものではないがＤ，Ｌ−ペプチド（ジアステレオマー）（例えばＦｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（８）：５８３６−４０（２００１）；Ｐａｐｏ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４（１６）：５７７９−８６（２００４）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６（ｌ）：１６９−７６，（１９８７）参照）；異常アミノ酸を含むペプチド（例えばＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６３（２）：６９−８４（２００４）参照）、オレフィン含有非天然アミノ酸後の炭化水素ステープリング（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｓｔａｐｌｉｎｇ）（例えばＳｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１４６６−１４７０（２００４）参照）、及びε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基を含むペプチドが含まれる。
別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドはクプレドキシンの誘導体である。クプレドキシンの誘導体とは、ペプチドが基本的な薬理活性の一部を保持したままでいるようなペプチドの化学的修飾体である。例えば、アズリンの「誘導体」は、例えば、哺乳動物癌細胞の成長を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであり得る。関心のある化学的修飾としては、限定されるものではないが、ペプチドの炭化水素安定化、アミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾、リン酸化、及びグリコシル化が含まれる。更に、誘導体ペプチドは、クプレドキシン又はそのバリアント、誘導体、若しくは構造的等価物と、限定されるものではないが、例えば別のペプチド、薬物分子、又はその他の治療薬剤若しくは医薬品又は検出可能なプローブ等の化合物との融合体であってもよい。関心のある誘導体としては、例えば、限定されるものではないが、環状ペプチド（例えばＭｏｎｋ ｅｔ ａｌ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ １９（４）：２６１−７８（２００５）；ＤｅＦｒｅｅｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６３（５）：４０９−１９（２００４）参照）、Ｎ末端及びＣ末端の修飾体（例えばＬａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．１３（５）：２７５−８（１９９０）参照）、並びにオレフィン含有非天然アミノ酸後の炭化水素ステープリング（例えばＳｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１４６６−１４７０（２００４）参照）等の当業者に周知の複数の方法により本発明のペプチド及び組成物の血流中の半減期を延長又は最適化することができる化学的修飾体が含まれる。
別の実施形態では、ペプチドはクプレドキシンの構造的等価物又はクプレドキシンの切断型である。クプレドキシンとその他のタンパク質の間の有意な構造的相同性を決定する研究の例としては、Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ １：８２−９２（２００１））が含まれる。具体的には、クプレドキシンと構造的等価物の間の有意な構造的相同性はＶＡＳＴアルゴリズムを用いて決定される（Ｇｉｂｒａｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：３７７−３８５（１９９６）；Ｍａｄｅｊ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２３：３５６−３６９０（１９９５））。具体的な実施形態では、クプレドキシンと構造的等価物の構造比較から得られるＶＡＳＴのｐ値は約１０−３未満、約１０−５未満、又は約１０−７未満である。別の実施形態では、クプレドキシンと構造的等価物の有意な構造的相同性はＤＡＬＩアルゴリズムを用いて決定される（Ｈｏｌｍ ＆ Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３３：１２３−１３８（１９９３））。具体的な実施形態では、ペアワイズ構造比較のＤＡＬＩのＺスコアは少なくとも約３．５、少なくとも約７．０、又は少なくとも約１０．０である。
関心のある具体的なクプレドキシン由来ペプチドの１つはクプレドキシン移入ドメインとカーゴ化合物の融合体である。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは哺乳動物の癌細胞に特異的に移入し得、したがって、細胞中、具体的には癌細胞中にカーゴ化合物を送達するために使用され得る。クプレドキシン輸送ペプチドはクプレドキシン移入ドメインを含む。「クプレドキシン移入ドメイン」という用語は、哺乳動物の癌細胞中へのクプレドキシンの移入に必要なアミノ配列を含むクプレドキン断片を指す。具体的な実施形態では、クプレドキシン輸送ペプチドは配列番号１３〜１７又は別のクプレドキシン由来の同等な残基である。本発明は、薬物動態特性を向上するように修飾されたカーゴ化合物と複合体化されたクプレドキシン輸送ペプチドを包含する。カーゴ化合物及びクプレドキシン輸送ペプチドは、薬物動態特性を向上させるための本明細書に記載されている方法によって修飾され得る。その後、これらの複合体は、哺乳動物の癌細胞にカーゴ化合物を送達して癌に罹患している患者を処置するための本発明の方法において使用することができる。本発明の材料及び方法によって送達されるカーゴ化合物としては、限定されるものではないが、タンパク質、リポタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、アンチセンス核酸等の核酸、色素、蛍光タグ、放射活性タグ、微粒子、ナノ粒子、毒素、無機分子、有機分子、金属、小分子、及び薬物が含まれる。いくつかの実施形態では、薬物及び毒素が腫瘍細胞を死滅させる。そのようなクプレドキシン輸送ペプチド及びそれを用いて作製された複合体は、その全体を参照により明示的に本明細書に援用する２００５年１０月６日付で提出された米国特許出願第１１／２４４，１０５号に記載されている。
いくつかの実施形態では、カーゴ化合物とクプレドキシン由来ペプチドの融合体は、融合ペプチドが細胞に移入した後に選択的に切断される結合によるものであり得る。いくつかの実施形態では、そのような結合はクプレドキシン輸送ペプチド−カーゴ化合物複合体の薬物動態特性を向上させる。いくつかの実施形態では、血漿中でのクプレドキシン輸送ペプチド−カーゴ化合物複合体の安定性が向上されている。いくつかの実施形態では、この結合は、哺乳動物細胞のリソソーム中で選択的に切断される結合であり得る。別の実施形態では、結合は、リソソーム中又は癌部位若しくは関節炎部位の近傍の細胞外に存在するシステインプロテアーゼであるカテスピン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）Ｂによって切断される結合であり得る。いくつかのそのような実施形態では、結合はＶａｌ−Ｃｉｔ結合である。
別の実施形態では、ペプチドは、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）に特異的に結合して癌細胞中に内部移行される１３マーの環状オリゴペプチドＣＴＶＡＬＰＧＧＹＲＶＲＶＣ（配列番号３５０５）であるＰｅｐ４２のコンジュゲートであるクプレドキシン又はそのバリアント、構造的等価物、若しくは誘導体である。クプレドキシン又はクプレドキシンのバリアント、構造的等価物、若しくは誘導体は、その開示全体を参照により本明細書に援用するＹｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ，“Ａ ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｉｃ ＧＲＰ７８ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８：１６３２−１６３６（２００８）に開示されている合成方法に従いＰｅｐ４２（配列番号３５０５）とコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドはＰｅｐ４２（配列番号３５０５）に結合していてもよい。いくつかの実施形態では、Ｐｅｐ４２（配列番号３５０５）は更に薬物と融合されてもよい。Ｐｅｐ４２（配列番号３５０５）は、癌細胞中で過剰発現されており且つ癌細胞表面上に特異的に存在するグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）に特異的に結合すると考えられている（Ｙｏｎｅｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８ １６３２−１６３６（２００８））。Ｐｅｐ４２（配列番号３５０５）はＧＲＰ７８受容体を介して効率的に内部移行される。したがって、いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチド−Ｐｅｐ４２融合ペプチドはより高い癌細胞特異性を有し得る。いくつかのそのような実施形態では、Ｐｅｐ４２（配列番号３５０５）とクプレドキシン由来タンパク質との融合体はＶａｌ−Ｃｉｔ結合を介し得る（カテスピンＢ）。いくつかの実施形態では、Ｐｅｐ４２−薬物コンジュゲートはＶａｌ−Ｃｉｔ結合を介し得る。カテプシンＢで切断可能なリンカーを含むＰｅｐ４２−薬物コンジュゲートは、血漿中で安定であり、特に標的組織中で薬物を選択的に放出すると思われる。本発明のいくつかの実施形態では、Ｐｅｐ４２（配列番号３５０５）はアミド結合を介してｐ−アミノベンジルアルコールに連結され、次いでカルボナート又はカルバマート官能基を介して薬物又はクプレドキシン由来ペプチドに結合される。そのような実施形態では、癌細胞内での酵素切断により、非修飾クプレドキシン由来タンパク質又は薬物が細胞中に送達される。
いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、治療用途、診断、及びイメージングに使用できるハイブリッドシステムを創出するために、ナノ粒子、例えば金、白金等の貴金属にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、所望の薬理活性を有するクプレドキシン間で保存されているクプレドキシン由来ペプチド中のアミノ酸残基が、薬物動態特性の向上された修飾クプレドキシン中で保存されている。例えば、緑膿菌アズリンのクプレドキシン移入ドメイン内では、複数の種、緑膿菌、シュードモナス・シリンゲ、淋菌、腸炎ビブリオ、及び気管支敗血症菌に由来するアズリン及びアズリン様タンパク質間で複数の残基が保存されていることが知られている（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：１４１８−１４３１（２００５））。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基６２、６３、６９、７２、７４、及び７７に相当する１又は複数のアミノ酸残基を保持している。別の実施形態では、クプレドキシンペプチドは保存アミノ酸配列ＤＧＸＸＸＸＸＤＸＸＹＸＫＸＸＤ（配列番号４６）又はＤＧＸＸＸＸＤＸＸＹＸＫＸＸＤ（配列番号４７）（式中、Ｄはアスパラギン酸、Ｇはグリシン、Ｙはチロシン、Ｋはリジン、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む。
修飾
本発明は、バリアント又は誘導体又は切断型であり、具体的な実施形態では１又は複数の薬理活性を維持し、且つ／又はペプチドの薬物動態特性を向上させる、クプレドキシン由来ペプチドの修飾体に関する。これらの修飾体には、限定されるものではないが、哺乳動物の癌細胞に移入し且つ／又は哺乳動物の癌細胞の成長を阻害するクプレドキシンの能力を保持しながら、その安定性、比活性、血漿半減期を増加させ得且つ／又はクプレドキシン由来ペプチドの免疫原性を低下させ得る、ペプチドのバリアント及び誘導体が含まれる。そのようなバリアントとしては、限定されるものではないが、ペプチドの加水分解を減少させるもの、ペプチドの脱アミド化を減少させるもの、酸化を低減するもの、免疫原性を低下させるもの、及び／又はペプチドの構造安定性を向上させるものが含まれる。１つの修飾クプレドキシン由来ペプチド中で本明細書に記載の修飾の２つ以上が組み合わされてもよく、本明細書に記載の１又は複数の修飾と当業者に周知の薬物動態特性を向上させるその他の修飾とが組み合わされてもよいと考えられる。そのようなバリアント及び誘導体を設計するための多くの方法が当該技術分野で周知である。
クプレドキシン又はシトクロムｃ５５１又はそのバリアント、誘導体、切断型、若しくは構造的等価物を化学的に修飾する方法の１つは、例えば疎水性Ｎ末端修飾、全タンパク質−ポリマーコンジュゲート化学物質の合成、コードされているアミノ酸及びコードされていないアミノ酸の突然変異誘発、ペプチド骨格の操作、並びに部位特異的ポリマー付加による、薬学的活性の向上した抗ＨＩＶ小タンパク質、ＣＣＬ−５（ＲＡＮＴＥＳ）の設計でとられるステップに従うことであり得る。ポリマー置換基が種々の位置に付加されたＣＣＬ−５アナログに天然及び非天然アミノ酸残基を導入することで抗ＨＩＶタンパク質を設計することができる。ポリマー修飾ＣＣＬ−５誘導体のインビトロ抗ＨＩＶ活性がＣＣＲ−５シグナル伝達に関連していることが研究により示されているので、ペプチドへの変化はＣＣＲ−５活性を破壊すべきでない（その開示全体を本明細書に援用するＭｉｒａｎｄａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１３１５３−１３１５９（２００７）参照）。
生体内変換
ペプチドの薬物動態特性を向上させるアプローチの１つは、より生体内変換を受けにくいクプレドキシン由来ペプチドのバリアント及び誘導体を作製することである。生体内変換は、ペプチドの薬理活性を低下させ且つ患者の体から排出される速度を速め得る。これを達成するための方法の１つは、最も生体内変換されやすいアミノ酸及び／又はアミノ酸配列を決定し、それらのアミノ酸をその特定の変換プロセスを受けにくいアミノ酸で置換することである。
いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、非天然アミノ酸又は修飾アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、特定の非天然アミノ酸を導入することでクプレドキシン由来ペプチドの薬物動態特性を向上させる。そのような導入は、部位特異的であってもよく、インビボでの特定の生化学的修飾を回避するようになされてもよい。例示的な非天然アミノ酸としては、β−アミノ酸（例えば、ｂ３及びｂ２）、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、芳香族アミノ酸、Ｐｒｏ及びＰｙｒの誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換Ｐｈｅ及びＴｙｒ誘導体、α，α−二置換アミノ酸、直鎖コアアミノ酸（Ｌｉｎｅａｒ Ｃｏｒｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）、及びジアミノ酸が含まれる。そのような非天然アミノ酸は、ペプチドの部位特異的修飾、リボソーム翻訳、又は化学合成によってペプチドに導入され得る。これらの方法のそれぞれがクプレドキシン由来ペプチドの合成に適用され得る。
例えば、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、非天然クプレドキシンバリアントを作製するための非天然アミノ酸構成要素と野生型アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）を使用することで合成され得る（Ｈａｒｔｍａｎ， ｅｔ ａｌ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２（１０）：ｅ９７２（２００７）；Ｍｉｒａｎｄａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１３１５３−１３１５９（２００７）参照）。リボソーム翻訳を用いてペプチドに導入することができる非天然アミノ酸の多様性はリボソーム翻訳装置の特異性によって限定される。側鎖及び骨格のアナログを含む、ＡＡＲＳの基質となる９０を超える非天然構成要素が明らかにされている（Ｈａｒｔｍａｎ， ｅｔ ａｌ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２（１０）：ｅ９７２（２００７））。５０を超える非天然アミノ酸が、全て酵素による翻訳系を用いてペプチド中に高効率で導入され得、最大１３個までの異なる非天然アミノ酸がペプチドに含まれ得る（Ｈａｒｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２（１０）：ｅ９７２（２００７））。非天然アミノ酸としては、限定されるものではないが４−フルオロ−グルタマート、４−メチルアナログ、Ｌ−スレオ−βアスパラギン酸、Ｓ−２−アミノエチルシステイン、トランス−デヒドロリジン、アザ−ロイシン、Ｌ−カナバニン、Ｌ−ＮＧ−メチルアルギニン、ＮＧヒドロキシアルギニン、ビニル−Ｌ−ＮＩＯ、ＤＬ−β−ヒドロキシノルバリン、Ｌ−Ｇｌｕ ｙ−メチルエステル、Ｌ−Ａｓｐ β−メチルエステル、Ｌ−グルタミン酸 ｙ−ヒドラジド、Ｌ−アルビジイン、Ｌ−テアニン、β−２−チアゾリル−アラニン、β−（１，２，４−トリアゾール−３−イル−アラニン）、３−フルオロチロシン、３−フルオロバリン、３−ニトロチロシン、２−フルオロＰｈｅ、２−チエニルＡｌａ、β−メチルＰｈｅ、β−チエニルＳｅｒ、ｐ−ニトロフェニルアラニン、３−（チアナフテン−３−イル）−Ｌ−アラニン、Ｌ−キスカル酸、イボテン酸、ＤＬ−α−（２−チエニル）グリシン、Ｌ−フェニルグリシン、２−アミノヘキサ−５−イン酸、クロチルグリシン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｌ−エチオニン、Ｌ−β−アジドホモアラニン、６，６，６，−トリフルオロノルロイシン、２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、Ｌ−Ｃ−プロパルギルグリシン、Ｌ−アリルグリシン、β−シクロプロピルアラニン、ｐｈｏｔｏ−Ｍｅｔ、３−フルオロ−バリン、ｔ−ブチル−グリシン、Ｏ−メチル−Ｌ−スレオニン、（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メトキシブタン酸、４−チア−イソロイシン、Ｌ−シクロヘキシルグリシン、５’，５’，５’−トリフルオロロイシン、β−ｔ−ブチル−アラニン、β−シクロペンチルアラニン、ｐｈｏｔｏ−Ｌｅｕ、チアゾリジン−２−カルボン酸、チアゾリジン−４−カルボン酸、３，４−デヒドロプロリン、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸、１−アミノシクロペンタン酸、１−アミノシクロヘキサン酸、β−ヒドロキシ酸、Ｎ−メチルＨｉｓ、Ｎ−メチルＡｓｐ、α−ヒドロキシ酸、及びα−ヒドロキシメチオニンが含まれる（Ｈａｒｔｍａｎｎ及びＭｉｒａｎｄａの参照文献並びにこれらの参照文献に記載及び開示されている全ての非天然ビルディングブロック及びアミノ酸の全てを参照により本明細書に援用する）。いくつかの実施形態では、このようなアミノ酸がクプレドキシン由来ペプチドに組み込まれ得る。
その他の修飾としては、光学活性α−アミノ酸の使用が含まれ得る。光学活性α−アミノ酸及びその誘導体は、医薬品中及び農薬中において、並びにキラル配位子として、その使用が広がっている。特に、キラルなグリシン及びアラニン同等物は重要な役割を果たす。α−アミノ酸を構築するための少なくとも１つの立体選択戦略が提唱されており、これは予め決定した立体化学のエナンチオピュアなα−アミノ酸を可能にする（２００８年９月１１日にインターネット上で公開された（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．で公開予定の）Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．“Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｃｌｉｃ ｉｍｉｎｏｌａｃｔｏｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ α−Ｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍａｌｄｅｈｙｄｅ”）。修飾クプレドキシン由来ペプチドは、エナンチオリッチな反復（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）を生成するための光学活性α−アミノ酸を用いて合成され得る。
アスパラギン酸を含むペプチドでは通常、加水分解が問題になる。アスパラギン酸は脱水されて環状イミド中間体を形成し易く、これにより、アスパラギン酸が潜在的に不活性なイソアスパラギン酸アナログに変換され、最終的にペプチド鎖が切断される。例えば、ペプチド配列中にアスパラギン酸−プロリンが存在すると、酸の触媒により環状イミド中間体が形成されることでペプチド鎖が切断され得る。同様に、ペプチド配列中にアスパラギン酸−グリシンが存在すると、環状中間体が元々のアスパラギン酸形態（無害）又はイソアスパラギン酸アナログのいずれかへと加水分解され得る。最終的に、全ての形態のアスパラギン酸がイソアスパラギン酸アナログに完全に変換され得る。同様に、セリンを含む配列も、脱水され、ペプチド鎖を切断し得る環状イミド中間体を形成し得る。ペプチドの切断は、ペプチドの血漿半減期の短縮及び特定の薬理活性の低下を招き得る。
クプレドキシン由来ペプチドの配列中のアスパラギン及び／又はセリンをその他のアミノ酸で置換することで、ペプチドの血漿半減期の延長及び薬理活性の比活性の上昇等の向上された薬物動態特性を有するペプチドが得られると考えられる。考えられるバリアントの１つでは、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアスパラギン残基が別のアミノ酸残基、具体的にはグルタミン酸残基で置換されていてよい。別の考えられるバリアントでは、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のセリン残基が別のアミノ酸残基、具体的にはスレオニン残基で置換されていてよい。クプレドキシン由来ペプチドのいくつかのバリアントでは、１又は複数のアスパラギン残基及び１又は複数のセリン残基が置換されている。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされている。別の実施形態では、非保存的置換がなされている。
アミノ酸残基の脱アミド化は生体内変換の中でも特に問題である。この塩基触媒反応はしばしばアスパラギン−グリシン又はグルタミン−グリシンを含む配列中で起こり、上記のアスパラギン酸−グリシン配列と同様なメカニズムによる。アスパラギン−グリシン配列の脱アミド化は環状イミド中間体を形成し、これはその後加水分解されてアスパラギン酸又はアスパラギンのイソアスパラギン酸アナログを形成する。更に、環状イミド中間体は、アスパラギンのＤ−アスパラギン酸又はＤ−イソアスパラギン酸アナログへのラセミ化を招き得、これらは全てペプチドを不活性型にし得る。
クプレドキシンペプチド中の脱アミド化はクプレドキシンのアスパラギン−グリシン又はグルタミン−グリシン配列のグリシン、アスパラギン、及び／又はグルタミンを別のアミノ酸で置換することで防止され、ペプチドの血漿半減期の延長及び薬理活性の比活性の上昇等の薬物動態特性が改善されたペプチドが得られると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のグリシン残基がスレオニン残基又はアラニン残基で置換される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアスパラギン残基又はグルタミン残基が別のアミノ酸で置換される。具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアスパラギン残基又はグルタミン残基がアラニン残基で置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５８及び／若しくは６３のグリシン又は他のクプレドキシン対応するグリシンがアラニン又はスレオニンで置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５９のメチオニン又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応するメチオニン残基がアラニン残基で置換される。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基６３のグリシン又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応するグリシン残基がスレオニン残基で置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。具体的な実施形態では、本発明の修飾クプレドキシン由来ペプチドは以下の配列を含む（下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌アズリン配列中に置換により導入されている）：
ＬＳＴＡＡＤＭＱＡＶＶＴＤＴＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３０）。
アミノ酸の可逆的酸化及び不可逆的酸化は、クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性及び／又は血漿半減期を低減させ得るという問題を引き起こし得る別の生体内変換プロセスである。システイン及びメチオニン残基が可逆的酸化を受ける主な残基である。システインの酸化は、チオールがより容易に脱プロトン化されて鎖内又は鎖間ジスルフィド結合を容易に形成する、より高いｐＨで促進される。これらのジスルフィド結合は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）ヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）で処理することでインビトロで容易に逆転することができる。メチオニンは化学的経路及び光化学的経路の両方によって酸化されてメチオニンスホキシドを形成し、更にメチオニンスルホンになる。これらはどちらもほとんど逆転させることができない。
クプレドキシン由来ペプチド中の酸化はメチオニン及び／又はシステイン残基を別の残基で置換することで防ぐことができると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のメチオニン及び／又はシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、メチオニン残基がロイシン又はバリン残基で置換される。別の具体的な実施形態では緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５６及び６４のメチオニンの１若しくは複数又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応するメチオニン残基がロイシン又はバリンで置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。具体的な実施形態では、本発明のクプレドキシンペプチドは以下の配列のいずれかを含む（下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌のアズリン配列中に置換により導入されている）：
ＬＳＴＡＡＤＬＱＧＶＶＴＤＧＬＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３１）
又は
ＬＳＴＡＡＤＶＱＧＶＶＴＤＧＶＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３２）。
クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性、血漿半減期、及び／又は免疫原性に影響を与え得る別の生体内変換プロセスとしてジケトピペラジン及びピログルタミン酸の形成が挙げられる。ジケトピペラジン形成は通常、グリシンがＮ末端から３位以内にある場合、より具体的にはプロリン又はグリシンが１位又は２位以内にある場合に起こる。この反応は、２番目及び３番目のアミノ酸の間のアミドカルボニル上のＮ末端窒素の求核攻撃を含み、これにより、最初の２つのアミノ酸が切断されてジケトピペラジンが形成される。一方、ピログルタミン酸形成は、Ｎ末端にグルタミンがある場合にはほとんど避けられないであろう。これは、Ｎ末端窒素がグルタミンの側鎖カルボニル炭素を攻撃して脱アミノ化されたピログルタマイルペプチドアナログが形成される、同様な反応である。この変換はＮ末端にアスパラギンを含むペプチドでも起こるが、頻度はかなり低くなる。
Ｎ末端から１、２、又は３位のグリシン、Ｎ末端から３位のプロリン、又はペプチドのＮ末端のアスパラギンを別のアミノ酸残基で置換することで、クプレドキシン由来ペプチドでジケトピペラジン及びピログルタミン酸形成が減少すると考えられる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端から１、２、又は３位のグリシンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、グリシン残基がスレオニン又はアラニン残基で置換される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端から３位のプロリンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、プロリンがアラニン残基で置換される。別の実施形態では、Ｎ末端のアスパラギンが別のアミノ酸残基で置換される。具体的な実施形態では、アスパラギン残基がグルタミン残基で置換される。いくつかの実施形態では、保存的置換がなされる。別の実施形態では、非保存的置換がなされる。
クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性、血漿半減期、及び／又は免疫原性に影響を与え得る別の生体内変換プロセスとしてラセミ化が挙げられる。この用語はアミノ酸又はペプチドのキラル整合性の全体的消失を指して緩く使用される。ラセミ化では、アミノ酸の一方のエナンチオマー（通常Ｌ型）がＬ型及びＤ型のエナンチオマーの１：１混合物に塩基触媒変換される。一般的なペプチドの安定性を高める方法の１つは、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型（Ｄ異性体）ペプチドを作製することである。ペプチド構造の二重変換は、側鎖の表面トポロジーを損なわないことが多く、生物学的活性ペプチドを安定化するために広範に使用されてきた（Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２：０１８６−０１９３（２００４））。Ｌ−アミノ酸ペプチドだけでなくＤ−アミノ酸置換Ｔａｔも細胞中に内部移行する（Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５８３６−５８４０（２００１）；Ｈｕｑ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：５１７２−５１７７（１９９９））。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のアミノ酸残基がそのアミノ酸残基のＤ異性体で置換される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸残基全てがそれらの残基のＤ異性体で置換される。一実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはクプレドキシン由来ペプチドのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ（Ｄ−異性体）型である。具体的な実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは
ＤＤＰＫＬＹＤＫＤＬＧＳＡＭＧＤＴＶＶＧＱＭＤＡＡＴＳＬ（配列番号４５）
である。
別の具体的な実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、配列番号１７７７〜３５０４を含むクプレドキシン由来ペプチドのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型である。
生体内変換による分解からクプレドキシン由来ペプチドを保護するその他の方法にＮアセチル化及びＣアミド化がある。これらの誘導体は、ペプチドを分解から保護し得、クプレドキシン由来ペプチドに天然タンパク質中のアルファアミノ基及びカルボキシル基の電荷状態をより正確に模倣させ得る。Ｎアセチル化及び／又はＣアミド化を有するペプチドは市販の供給業者から供給され得る。本発明の一実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＮ末端がアセチル化されていてよい。本発明の別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのＣ末端がアミド化されていてよい。具体的な一実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドは
アセチル化−ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ−アミド化（配列番号３３）
である。
環化は、本明細書に記載のクプレドキシンを含む治療用ペプチドに有益であり得る更なる様式の生体内変換である。環化により、治療用ペプチドが安定化することで、より長期の保存、より少ない投与量での投与、より少ない頻度での投与が可能になり得る。環化はペプチダーゼ及びプロテアーゼによる分解からペプチドを保護することが示されている。環化は化学的になされてもよく、酵素的になされてもよい。化学的環化は位置特異性及び立体特異性がないことがあり、環化ではなく多量体化が起こることがあり、複雑な多段階プロセスが必要になることがあるため、酵素的環化が一般的に化学的環化よりも問題が少ない。実際、タンパク質分解酵素に対してチオエーテル環化はジスルフィド結合よりも保護的且つ安定であることが示されている。
ランチビオティック−（メチル）ランチオニン含有細菌ペプチド中における酵素的環化が報告されている（例えば、Ｒ．Ｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．，“Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｓ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｔｈａｔ Ｃａｎ Ｂｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｌａｎｔｉｂｉｏｉｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ”４４ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８８７３−８２（２００５）；Ｒ．Ｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｈｙｄｒｏａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ”７３：６ Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７９２−９６（２００７）；Ｒ．Ｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．，“ＮｉｓＣ， ｔｈｅ Ｃｙｌｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｎｉｓｉｎ，Ｃａｎ Ｃａｔａｌｙｚｅ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｎｏｎｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”４６ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１７９−８９（２００７））（これらのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。ランチビオティックはグラム陽性細菌により産生され、その成長を阻害する。ランチビオティック中では、酵素を介したセリン及びスレオニン残基の脱水によりデヒドロアラニン及びデヒドロブチリンが生じ、次いで、脱水されたセリン及びスレオニン残基にシステインが酵素的に結合されてチオエーテル環が形成される。天然のランチビオティックは、最大１９残基離れた残基間でチオエーテル結合を介したそのような結合を有する。チオエーテル環形成はリーダーペプチドに依存する。環化の位置は、シクラーゼを介した位置特異的且つ立体特異的な閉環並びに脱水可能なセリン及びスレオニン残基の位置に依存する。
特徴が最も解析されているランチビオティックは、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）により産生される５員環ペプチド抗生物質であるナイシンである。ナイシンは、４個のメチルランチオニン、１個のランチオニン、２個のデヒドロアラニン、１個のデヒドロブチリン、及び２６個の非修飾アミノ酸で構成される。ナイシンの５個のチオエーテル架橋は、セリン及びスレオニンに由来するデヒドロアラニン残基及びデヒドロブチリン残基にシステイン残基が付加されることで形成される。ナイシンは、膜結合タンパク質酵素複合体により翻訳後に導入されるチオエーテル含有アミノ酸を含む。この酵素複合体は、輸送体であるＮｉｓＴ、セリン及びスレオニンのデヒドラターゼであるＮｉｓＢ、並びにシクラーゼであるＮｉｓＣを含む。ＮｉｓＢはセリン残基及びスレオニン残基を脱水してそれらをそれぞれデヒドロアラニン及びデヒドロブチリンに変換する。その後、形成されたデヒドロ残基へのエナンチオ選択的なシステインの結合をＮｉｓＣが触媒する。ＮｉｓＴは修飾プレナイシンの搬出を促進する。ＮｉｓＰという別の酵素がプレナイシンからナイシンリーダーペプチドを切断する。
シクラーゼＮｉｓＣは十分に特徴が解析されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｃｙｌｃｌａｓｅ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｎｉｓｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”３１１ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４６４−６７（２００６））（その全体を参照により本明細書に援用する）。
ランチビオティックにおける環化の分析から、ペプチド中の環化し易いアミノ酸配列及び特徴が特定された。ＮｉｓＢ酵素は特定のアミノ酸が隣接する場合にセリン及びスレオニン残基をより頻繁に脱水することが示されている。セリン残基及びスレオニン残基に疎水性の非芳香族残基が近接する場合にランチビオティックプロペプチド中で環化がより多く起こることが示されている。修飾されたシステイン隣接残基は通常、修飾されたスレオニン及びセリン隣接残基よりも疎水性が低い。ヘキサペプチドＶＳＰＰＡＲ（配列番号３５２８）、ＹＴＰＰＡＬ（配列番号３５２９）、及びＦＳＦＦＡＦ（配列番号３５３０）等の例外も見つかっている。これらのヘキサペプチドは、３位又は４位にプロリンが存在するか両側に隣接するフェニルアラニンを有することで脱水が阻止され得ることを示唆している。環は通常、脱水残基がＣ末端側に位置するシステインに結合されることで形成される。しかし、脱水残基がＮ末端側に位置するシステインに結合されることでも環は形成され得る。
ナイシンを脱水及び輸送する酵素はナイシンに特異的でなく、実際、非ナイシンペプチド（及び非ランチビオティックペプチド）の修飾に使用され得ることも示されている。ＮｉｓＢは、ランチビオティックリーダーペプチドにヒトペプチドホルモン等のペプチドがＮ末端融合された時に、そのようなペプチド中のセリン残基及びスレオニン残基を脱水することが示されている。非ランチビオティックペプチド上でも同様な環形成の特徴が適用される。すなわち、脱水の程度は、脱水可能なセリン残基及びスレオニン残基に隣接する領域のアミノ酸の内容により調節することができる。セリン及びスレオニンの周辺に疎水性隣接残基（例えばアラニン及びバリン）が存在すると、完全な脱水が可能になり、チオエーテル環形成が促進された。Ｎ末端アスパラギン及びＣ末端隣接アルギニンは脱水を防止した。プロリン残基及びフェニルアラニン残基の存在が脱水に好ましくないことも示されている。一般的に、親水性隣接残基が存在するとセリン残基及びスレオニン残基の脱水が防止された。疎水性隣接残基は脱水に好ましく、親水性隣接残基は脱水に好ましくない。実験により、脱水が起こる場合、セリン及びスレオニンの隣接残基の平均疎水性は正であり、Ｎ末端側で−０．４０、Ｃ末端側で０．１３であることが示された。また、脱水されないセリン及びスレオニンに隣接する残基の平均疎水性は負であり、Ｎ末端側で−０．３６、Ｃ末端側で−１．０３である。脱水は、一連の隣接するスレオニン残基の存在により制限されず、ナイシンリーダーペプチドと脱水される残基の間の距離にも制限されない。
ＮｉｓＣは天然のランチビオティックとは無関係のペプチド中でチオエーテル環の位置特異的形成を触媒することが示されている。通常は、そのようなペプチドがナイシンリーダーペプチドに融合する必要がある。場合によっては、例えばデヒドロアラニンが２個のアミノ酸によってシステインから隔てられた場合、チオエーテル環は自然発生的に形成され得る。自然発生的な環化と異なり、ＮｉｓＣが触媒する環化は脱水されたプレナイシンに立体特異的である。その結果、ナイシン中のメチルランチオニン及びランチオニンはＤＬ形態になる。非ランチビオティック中の環化も立体特異的であると考えられている。
これらの原理は、クプレドキシン並びにそのバリアント及び切断型を含む本明細書に記載の化合物にも適用することができる。
チオエーテルブリッジ
天然には、ランチビオティックの酵素で誘導されるチオエーテルブリッジはブリッジ下に最大１９個のアミノ酸を有するように形成される。ブリッジ下に２〜４個のアミノ酸を有するチオエーテルブリッジは多数存在する。
いくつかの実施形態では、クプレドキシンは、構造中にチオエーテルブリッジを導入することで修飾され得る。この方法を用いて例えばアズリン切断型ｐ２８（配列番号１３）が修飾され得る。ソフトウェアパッケージＧＲＯＭＡＣＳ（ｗｗｗ．ｇｒｏｍａｃｓ．ｏｒｇ）を用いた拡張分子動力学シミュレーション（７０ｎｓ）は、３７℃において、６〜１６位までのｐ２８（配列番号１３）のαヘリックス領域が不安定であり、ペプチドがβシータ形態をとりやすいことを示唆している（図４参照）。このことと、ｐ５３との相互作用に関与すると推定される分子部分が溶媒に曝されたままであることから、ｐ２８（配列番号１３）ペプチドのこの領域にチオエーテルブリッジを導入しても機能性に影響しないことが示唆される。
ｐ２８のアミノ酸配列は配列番号１３（ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ）である。ｐ１８として知られるアミノ酸配列は配列番号１４（ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧ）である。ｐ２８（配列番号１３）中、配列ＳＧＬＤＫＤ（配列番号３５３１）がｐ５３と相互作用し得る。チオエーテルブリッジはＮ側のＳｅｒ／ＴｈｒとＣ側のＣｙｓの間で形成され得る。このセリン／スレオニンは脱水され、その後、システインに結合され得る。セリンよりも容易に脱水されるため、スレオニンが好ましい。一般的に、スレオニンに隣接する疎水性残基（少なくとも１つ）は脱水の程度を高くするため好ましい。隣接残基である負に帯電したアミノ酸、グルタミン酸及びアスパラギン酸は、脱水に強い負の影響を与える。通常、親水性隣接残基、特にグリシンは、脱水に好ましくない。Ｃｙｓの前は帯電した親水性残基、特にグルタミン酸／アスパラギン酸になる傾向がわずかにある。チオエーテル環のサイズによっては、環を形成するアミノ酸の嵩高さが重要になる。
一実施形態では、切断型アズリン配列は配列番号３５０７（ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＴＰＧＣ）である。２５位と２８位の間でチオエーテルブリッジが形成され、カルボキシエチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｉｄａｓｅ）に対して完全に保護される。２、３、及び２５位が脱水されるが、移入配列及びｐ５３との相互作用に関与すると思われる配列はチオエーテル環の導入により変化しない。したがって、ペプチド活性は変化しないと考えられる。スレオニンは２個の疎水性アミノ酸の間にあるので、特定の基準に従ってデヒドラターゼＮｉｓＢによって完全に脱水されると予想される（Ｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５参照）。同じ基準により、特にシステインの前にアスパラギン酸が位置するため、シクラーゼＮｉｓＣによる２５位及び２８位を含む環化も予測される。
別の実施形態では、切断型アズリン配列はＬＳＴＡＡＤＣＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５０８）であり、３位と７位の間にチオエーテルブリッジが形成される。３位と７位の間の環はナイシンの環Ａを模倣しており、２位のスレオニンを利用する。６位のアスパラギン酸は環化に好ましい。
別の実施形態では、切断型アズリン配列はＬＳＴＡＡＣＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５０９）であり、２位のスレオニンがチオエーテルブリッジの形成に利用される。
別の実施形態では、上記段落に記載した切断型アズリン中のチオエーテル環の２つ以上が１つのペプチド中で組み合わされる。
別の実施形態では、多くの切断型アズリン配列を作製し、硫黄ブリッジ下に１個のランチオニン環及び２〜３個の更なるアミノ酸を有するペプチドを分析することでスレオニン環についてスクリーニングしてもよい。例えば、これには、以下の配列の１つ又は組合せが含まれ得、太字で表した変異は完全な修飾を容易にする：
ＬＳＴＡＣＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５１０）
ＬＳＴＡＡＴＭＱＣＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５１１）
ＬＳＴＡＡＴＭＱＧＣＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５１２）
ＬＳＴＡＡＮＴＱＧＣＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５１３）
ＬＳＴＡＡＮＴＱＧＶＣＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５１４）
ＬＳＴＡＡＤＭＴＡＶＣＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５１５）
ＬＳＴＡＡＤＭＴＡＶＶＣＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５１６）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＴＶＶＣＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５１７）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＴＶＶＴＣＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５１８）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＡＴＶＴＣＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５１９）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＡＴＶＴＤＣＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５２０）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＴＡＤＣＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５２１）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＴＡＤＧＣＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５２２）
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＮＧＣＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５２３）。
実用的アプローチは、このような配列を大量に遺伝的に作製し、修飾の程度及び生成レベルに基づいて選択して精製することである。
別の実施形態では、チオエーテルブリッジはｐ２８（配列番号１３）の１２位のスレオニンとペプチドのＣ末端の間に形成される。１３位のＣαと２８位のアスパラギン酸の距離は１７．５２オングストロームであり得、これは１．５ナノメートルよりも大きく、ペプチド構造の大きな変化が示唆される（図５参照）。
別の実施形態では、ペプチド配列はＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＡＴＭＧＳＧＬＣＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５２４）であり、１４位から２位に４．３８オングストロームの距離のチオエーテルブリッジを有する。１３位のアスパラギン酸のアラニンへの変異は１４位のスレオニンの脱水に好ましい。１６位のアラニンのグリシンへの変異は１７位のセリンの脱水を完全に妨げ、環化を促進する。
別の実施形態では、ペプチド配列はＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＬＴＡＳＧＬＣＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５２５）であり、１５位から２０位に５．８３オングストロームの距離のチオエーテルブリッジを有する。この場合、１４位のグリシンのロイシンへの変異は１５位のスレオニンの脱水に好ましい。
三次構造の安定化
クプレドキシン由来ペプチドの三次構造の安定性は、とりわけ薬理活性、血漿半減期、及び／又は免疫原性を含む薬物動態のほとんどの面に影響を与える（Ｋａｎｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２：２０２−２０８（２００３）；Ｋａｎｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ２３：１２４３８−１２４４３（２００１）参照）。ペプチドのヘリックスはしばしばランダムコイルへとほどかれ、プロテアーゼの攻撃をより受けやすくなり、細胞膜を十分に透過しないことがある（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１−５８９２（２０００））。したがって、ペプチドの全体的構造を安定化する方法の一つはペプチドのαヘリックス構造を安定化することである。ヘリックス形成に関与する分子内水素結合は極性アミド骨格の露出を減らすことで輸送ペプチドの膜透過の障壁を低減するため、関連する薬理活性を高め、プロテアーゼ切断に対するペプチドの抵抗性を高める（上記文献）。緑膿菌アズリン（配列番号１）は残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０にαヘリックスを有する。
αヘリックスを安定化する方法の１つは、αヘリックス中のグリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸等のヘリックス破壊性アミノ酸残基又はアラニン、スレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジン、若しくはアルギニン等のヘリックスに対して中立のアミノ酸残基を、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、メチオニン等のヘリックス形成性残基又は例えばαアミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）等のヘリックスに好ましいアミノ酸残基置換体で置換することである（Ｍｉｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５１，２７５８−２７６５（２００８）参照）。１又は複数のグリシン、プロリン、セリン、及び／又はアスパラギン酸残基を他のアミノ酸に置換することでクプレドキシン由来ペプチドのαヘリックスを安定化することも考えられる。具体的な実施形態では、グリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジン、及び／又はアルギニン残基がロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、Ａｉｂ、及び／又はメチオニン残基で置換される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｌ．１１：２１（２００５）参照）。別の具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中の１又は複数のセリン残基又はグルタミン残基が置換され得る。更により具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０中のセリン及び／若しくはグルタミン残基又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基５７のグルタミン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基５２のスレオニン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基６１のスレオニン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基６３のグリシン残基又は別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）のアミノ酸残基５２、５７、６１、又は６３の１又は複数のスレオニン、グルタミン、又はグリシン残基あるいは別のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。具体的な実施形態では、クプレドキシンペプチドは以下の配列のいずれかを含む（下線を引いたアミノ酸が野生型緑膿菌アズリン配列中に置換により導入されている）：
ＬＳＷＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３４）；
ＬＳＴＡＡＤＭＷＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５）；
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＷＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３６）；
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＷＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３７）；
ＬＳＷＡＡＤＭＷＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３８）；
ＬＳＷＡＡＤＭＱＧＶＶＷＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３９）；
ＬＳＷＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＷＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４０）；
ＬＳＴＡＡＤＭＷＧＶＶＷＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４１）；
ＬＳＴＡＡＤＭＷＧＶＶＴＤＷＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４２）；
ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＷＤＷＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４３）；又は
ＬＳＷＡＡＤＭＷＧＶＶＷＤＷＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号４４）。
別の実施形態では、他のクプレドキシン由来ペプチド中の対応するアミノ酸がトリプトファンで置換される。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、πスタッキング可能な非天然アミノ酸残基を使用する。例えば、Ａｎｄｒｅｗｓ ａｎｄ Ｔａｂｏｒ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５５：１１７１１−１１７４３（１９９９））では、ペプチドのαヘリックス領域中に種々のスペーシングのε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基対が置換により導入されている。全体の結果は、ｉ，（ｉ＋４）のスペーシングが配置の安定化に最も効率的であることを示していた。水の割合を最大９０％まで増加させると、ペプチド中のヘリックス含有量が増加した。同じｉ，（ｉ＋４）のスペーシングのε−アシル−Ｌｙｓ残基対は安定化効果を示さなかった。このことは、安定化の大部分がπ−π相互作用によるものであることを示している。一実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、リジン残基がε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓ残基で置換されるように修飾され得る。具体的な実施形態では、リジン残基がｉ，（ｉ＋４）のスペーシングでε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−Ｌｙｓにより置換され得る。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、αヘリックスの側鎖間の静電相互作用を利用する。ペプチド中にＨｉｓ−Ｃｙｓ又はＨｉｓ−Ｈｉｓ残基対をｉ，（ｉ＋４）配置で置換により導入した場合、Ｃｕ、Ｚｎ、又はＣｄイオンの添加でペプチドは約５０％ヘリックスから約９０％ヘリックスに変化した。ルテニウム（Ｒｕ）塩をＨｉｓ−Ｈｉｓペプチドに添加した場合、大環状のシス−［Ｒｕ−（ＮＨ３）４Ｌ２］３＋錯体（式中、Ｌ２は２個のヒスチジンの側鎖である）である置換不活性複合体（ｅｘｃｈａｎｇｅ−ｉｎｅｒｔ ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成され、ヘリックスの安定性が改善された（Ｇｈａｄｉｒｉ ａｎｄ Ｆｅｒｎｈｏｌｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２，９６３３−９６３５（１９９０））。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、大環状のシス−［Ｒｕ−（ＮＨ３）４Ｌ２］３＋錯体（式中、Ｌ２は２個のヒスチジンの側鎖である）を含み得る。いくつかの実施形態では、１又は複数のヒスチジン−システイン又はヒスチジン−ヒスチジン残基対が、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中にｉ，（ｉ＋４）配置で置換により導入され得る。別の実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中にｉ，（ｉ＋４）配置の１又は複数のヒスチジン−システイン又はヒスチジン−ヒスチジン残基対が置換により導入され得る。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは更にＣｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、及び／又はＲｕイオンを含み得る。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、αヘリックスの側鎖間でジスルフィド結合を形成する。ペプチド配列中の隔てられた残基間の正式な共有結合によってヘリックス構造を安定化することも可能である。一般的に用いられる天然の方法はジスルフィド結合の利用である（Ｐｉｅｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４６：４７１−４７９（１９９５）。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中に１又は複数のシステイン残基対が置換により導入される。別の実施形態では、緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中に１又は複数のシステイン残基が置換により導入される。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法では、側鎖のラクタムブリッジを利用する。ラクタムとは、アミノ酸の環化により形成され得る環状アミドである。側鎖と側鎖のブリッジは、種々のペプチド及びペプチドアナログ、例えば両親媒性又はモデルαヘリックスペプチド、オキシトシンアンタゴニスト、メラノプトロピン（ｍｅｌａｎｏｐｔｒｏｐｉｎ）アナログ、グルカゴン、及びＳＤＦ−１ペプチドアナログにおける束縛にうまく利用されてきた。例えば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、ヘリックスに好ましい特定の条件下で徐々にヘリックス構造をとり、ラクタムブリッジを用いて安定化することができる（Ｍｉｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５１，２７５８−２７６５（２００８））。これらのラクタムブリッジは、サイズ、もたらされる効果（ｅｆｆｅｃｔｉｎｇ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、及び結合親和性が異なり得る（上記文献）。そのような修飾は、血漿中での化合物の安定性を向上させた（上記文献）。環化部位間のスペース及び残基の選択によっては、ターン構造又はヘリックス構造の誘導及び安定化にラクタムブリッジを用いることができる。いくつかの実施形態では、近傍のアミノ酸間にラクタムブリッジ（例えばｉからｉ＋４へのグルタミン酸−リジンの束縛）を有する１又は複数のクプレドキシン又はバリアントアナログが作製される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドはαヘリックス含有量を高くするためにそのような修飾を含み得る。
αヘリックスの三次構造を安定化する別の方法は、全て炭素による架橋（ａｌｌ−ｃａｒｂｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）である。全炭化水素架橋はヘリックス構造の安定化、プロテアーゼ抵抗性、及び細胞透過性を強化することが証明されている（Ｗａｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５，１４６６−１４７０（２００４））。α，α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーをペプチドに導入する。ルテニウムが触媒するオレフィンのメタセシスにより全て炭化水素による「ステープル」が生成してヘリックスが架橋される（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２，５８９１−５８９２（２０００）；Ｗａｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．の上記文献）。非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーは、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（上記文献）及びＷｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｉｍ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１３：９２７６−９２８６（１９９１））に記載されている方法により合成することができる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは全炭化水素ステープルにより安定化される。具体的な実施形態では、天然のアミノ酸に対応するα，α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーの１又は複数対がクプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中に置換により導入される。別の実施形態では、天然アミノ酸に対応するα、α−二置換非天然アミノ酸を含むオレフィン含有テザーの１又は複数対が緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０又は他のクプレドキシン由来ペプチドの対応する残基中に置換により導入される。
いくつかの実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはＸ１ＳＸ２ＡＡＤＸ３Ｘ４Ｘ５ＶＶＸ６ＤＸ７Ｘ８ＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＸ９（配列番号４８）（式中、Ｘ１はＬ又はアセチル化−Ｌであり、Ｘ２はＴ又はＷであり、Ｘ３はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ４はＱ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＴ又はＷであり、Ｘ７はＧ、Ｔ、又はＷであり、Ｘ８はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ９はＤ又はアミド化−Ｄである）を含み得る。別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはＸ１ＳＸ２ＡＡＤＸ３Ｘ４Ｘ５ＶＶＸ６ＤＸ７Ｘ８ＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＸ９（配列番号４８）（式中、Ｘ１はＬ又はアセチル化−Ｌであり、Ｘ２はＴ又はＷであり、Ｘ３はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ４はＱ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＴ又はＷであり、Ｘ７はＧ、Ｔ、又はＷであり、Ｘ８はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ９はＤ又はアミド化−Ｄである）からなり得る。別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはＸ１ＤＰＫＬＹＤＫＤＬＧＳＡＸ２Ｘ３ＤＸ４ＶＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＤＡＡＸ８ＳＸ９（配列番号４９）（式中、Ｘ１はＤ又はアセチル化−Ｄであり、Ｘ２はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ３はＧ、Ｔ、又はＷであり、Ｘ４はＴ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＱ又はＷであり、Ｘ７はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ８はＴ又はＷであり、Ｘ９はＬ又はアミド化−Ｌである）を含み得る。別の実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドはＸ１ＤＰＫＬＹＤＫＤＬＧＳＡＸ２Ｘ３ＤＸ４ＶＶＸ５Ｘ６Ｘ７ＤＡＡＸ８ＳＸ９（配列番号４９）（式中、Ｘ１はＤ又はアセチル化−Ｄであり、Ｘ２はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ３はＧ、Ｔ、又はＷであり、Ｘ４はＴ又はＷであり、Ｘ５はＧ又はＡであり、Ｘ６はＱ又はＷであり、Ｘ７はＭ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ８はＴ又はＷであり、Ｘ９はＬ又はアミド化−Ｌである）からなり得る。関心のある具体的なペプチドを表３に示す。
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ＰＥＧ化
治療及び診断に重要な薬物にＰＥＧを共有結合により付加すると、インビボでの薬物の血漿半減期が延長され且つ／又はそれらの免疫原性及び抗原性が低下した（Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２：２１４−２２１（２００３））。例えば、ＰＥＧの付加は、とりわけ、インターロイキン（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１５０６４（１９８８）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ３３：４４７（１９９５））、インターフェロン（Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ６：１５７（１９９０））、カタラーゼ（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：３５８２（１９７７））、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３１：２５（１９８３））、及びアデノシンデアニマーゼ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：２９３（１９８１））等の多くの治療タンパク質の薬物動態特性を向上させた。ＦＤＡは、食品、化粧品、及び注射可能な製剤、局所製剤、直腸用製剤、経鼻製剤等の医薬品における賦形剤又は基材としてのＰＥＧの使用を承認している。ＰＥＧはほとんど毒性を示さず、体からそのまま、腎臓により排除されるか（ＰＥＧ＜３０ｋＤａの場合）、便中に排出される（ＰＥＧ＞２０ｋＤａの場合）。ＰＥＧは水溶性が高い。
治療ペプチドのＰＥＧ化は、腎臓の限外ろ過を少なくすることで患者の血流中におけるペプチドの寿命を延長するために用いられ得、これにより、身体からの薬物の排出が減少する。電荷の遮蔽は腎臓透過に影響を与え得る。帯電遮蔽は、タンパク質のイオン化可能な官能基、すなわちアミン又はカルボキシルの、パラムケミカル（ｐａｒａｍｃｈｅｍｉｃａｌ）な修飾により生じ得る。特に、タンパク質−ＰＥＧ誘導体を製造するための最も一般的な手法では、タンパク質のアミノ基をアミドに変換して正電荷を失わせ、これにより、タンパク質の限外濾過を変化させることができる。腎臓の限外濾過は中性又は陽性の巨大分子よりもゆっくりと陰イオン性巨大分子を除去することがわかっているので、アミノ基にＰＥＧをコンジュゲートすると血流中でのＰＥＧ化ペプチドの寿命が延びると予想される。
分子サイズ及び球状（ｇｌｏｂｕｌａｒ）限外ろ過も治療ペプチドの腎臓限外ろ過に影響を与え得る。腎臓で天然球状タンパク質を排除するための分子量のカットオフは約７０ｋＤａであると考えられており、これは血清アルブミンの分子量に近い。したがって、分子量が７０ｋＤａを超えるタンパク質は、肝臓への取込み、タンパク質の消化、免疫系によるクリアランス等の腎臓限外ろ過以外の経路によって主に体から排出される。したがって、ＰＥＧ化により治療ペプチドのサイズを大きくすることで患者の血流からのそのペプチドの腎臓限外ろ過を低減することができる。
更に、治療ペプチドのＰＥＧ化は、ペプチドの免疫原性を低下させ得、また、タンパク質分解酵素、食細胞、及び治療ペプチドとの直接接触を必要とするその他の因子からペプチドを保護し得る。分岐ＰＥＧの傘様構造は特に、接近するタンパク質分解酵素、抗体、食細胞等に対して線状ＰＥＧよりも保護効果が高いことが判明している（Ｃａｌｉｃｅｔｉ ａｎｄ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５５：１２６１−１２７７８（２００３））。
いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、システイン分子に共有結合した１又は複数のＰＥＧ分子を有するように修飾されている。共有結合は、ＰＥＧ分子からクプレドキシン由来ペプチドへの直接の共有結合でなくてもよく、互いに共有結合した及び／又はクプレドキシン由来ペプチドに共有結合した、１又は複数のリンカー分子に共有結合されていてもよい。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは部位特異的ＰＥＧ化を有する。具体的な実施形態では、ＰＥＧ分子は緑膿菌アズリン（配列番号１）のシステイン残基３、２６、及び／又は１１２に共有結合していてよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチド中に１又は複数のシステイン残基が置換導入され、ＰＥＧ化される。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドをＰＥＧ化する方法は、とりわけ、ＮＨＳ、還元的アニメ化、マリミド、又はエポキシドであり得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１又は複数のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、若しくはチロシン、又はＮ末端アミノ基若しくはＣ末端カルボン酸上でＰＥＧ化されてもよい。より具体的な実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１若しくは複数のリジン又はＮ末端アミノ基でＰＥＧ化されてよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチド中に１又は複数のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、又はチロシン残基が置換により導入され、ＰＥＧ化される。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１又は複数のアミノ基でＰＥＧ化されてよい。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、ランダムに部位非特異的にＰＥＧ化されてよい。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、ＰＥＧベースポリマーの平均分子量が約２００〜約１００，０００ダルトン、約２，０００〜約２０，０００ダルトン、又は約２，０００〜約５，０００ダルトンであり得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは、分岐ＰＥＧ、特に約５０ｋＤａの分岐ＰＥＧ分子である１又は複数のＰＥＧ分子を含み得る。別の実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドは１又は複数の線状ＰＥＧ分子、特に約５ｋＤａの線状ＰＥＧ分子を含み得る。
クプレドキシン
「クプレドキシン」は、例えば細菌の酸化還元鎖又は光合成に関与する、電子伝達特性を有する小さなブルー銅含有タンパク質（１０〜２０ｋＤａ）である。銅イオンにはタンパク質基質だけが結合している。銅の周りに２個のヒスチジンリガンド及び１個のシステインリガンドを有する特別な歪んだ三角形平面配置が、金属部位の非常に特殊な電子特性及び強い青色を生じさせる。複数のクプレドキシンが中〜高分解能で結晶解析されている。クプレドキシンにはアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、シュードアズリン、オーラシアニン、及びアズリン様タンパク質が含まれる。本明細書において、「クプレドキシン」という用語は、銅含有タンパク質のみならず、銅原子が存在しないタンパク質形態も含む。
アズリン
アズリンは、植物及び特定の細菌の電子伝達に関与するクプレドキシンファミリーに属する１２８アミノ酸残基の銅含有タンパク質である。アズリンには、緑膿菌由来のもの（配列番号１）（「ｗｔアズリン」）、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のもの、及びアクロモバクター・デニトリフィカンス（Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のものが含まれる（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１５：８５９−８７１（２００２））。アズリン間のアミノ酸配列相同性は６０〜９０％と様々であるが、これらの分子間の構造的相同性は高い。全てのアズリンは、ギリシャキーモチーフを有する特徴的なβサンドイッチを有し、単一の銅原子が常にタンパク質の同じ領域に配置される。更に、アズリンは、銅部位を囲む本質的に中性の疎水性パッチを有する（上記文献）。
プラストシアニン
プラストシアニンは、真核植物及びラン藻で見られるクプレドキシンである。これらは分子１個当たり１個の銅分子を含み、酸化型では青色である。これらは、葉緑体中で生じ、そこで電子キャリアとして機能する。１９７８年にポプラのプラストシアニンの構造が決定されてから、藻類（セネデスムス属、エンテロモルファ属、クラミドモナス属）及び植物（フレンチビーン）のプラストシアニンの構造が結晶学的方法又はＮＭＲ法により決定され、ポプラの構造は１．３３Åの解像度まで解明された。配列番号２にラン藻フォルミジウム・ラミノスム由来のプラストシアニンのアミノ酸配列を示す。
藻類と維管束植物のプラストシアニン間では、配列は相違している（例えば、クラミドモナスとポプラのタンパク質間で６２％の配列同一性）が、三次元構造は保存されている（例えば、クラミドモナスとポプラのタンパク質のＣアルファ位において０．７６Åのｒｍｓ偏差）。構造的特徴としては、８本鎖逆平行ベータバレルの一端における歪んだ四面体銅結合部位、顕著な負のパッチ、及び平坦な疎水性表面が含まれる。銅部位は、電子伝達機能に最適化されており、負及び疎水性のパッチが生理学的反応相手の認識に関与すると提唱されている。化学修飾、架橋、及び部位特異的突然変異誘発実験により、シトクロムｆとの結合相互作用における負及び疎水性のパッチの重要性が確認され、プラストシアニン中で２つの機能的に大きな電子伝達系路のモデルが確認された。推定電子伝達系路の１つは比較的短く（約４Å）、疎水性パッチ中の溶媒に露出した銅リガンドＨｉｓ−８７が関与し、もう一方の経路はそれより長く（約１２〜１５Å）、負のパッチ中にほぼ保存された残基Ｔｙｒ−８３が関与する（Ｒｅｄｉｎｂｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｅｎｅｒｇ． Ｂｉｏｍｅｍｂｒ． ２６（１）：４９−６６（１９９４））。
ラスチシアニン
ラスチシアニンは、チオバチルス属から得られたブルー銅含有単鎖ポリペプチドである。鉄酸化細菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）由来の非常に安定で非常に酸化性のクプレドキシンラスチシアニン（配列番号３）の酸化型のＸ線結晶構造が多波長異常回折により決定され、１．９Åの解像度まで解明されている。ラスチシアニンは、６本鎖及び７本鎖のβシートで構成されるコアベータサンドイッチフォールドから構成される。他のクプレドキシン同様、歪んだ四面体形に配置された４個の保存残基（Ｈｉｓ８５、Ｃｙｓ１３８、Ｈｉｓ１４３、Ｍｅｔ１４８）のクラスターが銅イオンに配位している（Ｗａｌｔｅｒ， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：７３０−５１（１９９６））。
オーラシアニン
好熱性緑色滑走光合成細菌クロロフレクサス・アウランティアカスからオーラシアニンＡ、オーラシアニンＢ１、及びオーラシアニンＢ−２と命名された３つの小さなブルー銅タンパク質が単離されている。２個のＢ型は互いにほぼ同じ特性を有するが、Ａ型とは明らかに異なる。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、見かけのモノマー分子質量が１４（Ａ）、１８（Ｂ−２）、及び２２（Ｂ−１）ｋＤａであることが示された。
オーラシアニンＡのアミノ酸配列が決定され、オーラシアニンＡは１３９残基のポリペプチドであることが示された（Ｖａｎ Ｄｒｅｉｓｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８：９４７−９５７（１９９９））。公知の小さな銅タンパク質プラストシアニン及びアズリン同様、Ｈｉｓ５８、Ｃｙｓ１２３、Ｈｉｓ１２８、及びＭｅｔ１３２が、それらが進化上保存されている金属リガンドであるとした場合に予想される通りの間隔で配置されている。二次構造予測も、オーラシアニンが緑膿菌のアズリン及びポプラの葉のプラストシアニンと同様な一般的なベータバレル構造を有することを示している。しかし、オーラシアニンは、両方の小さな銅タンパク質配列クラスの配列特徴を有しているようである。アズリンのコンセンサス配列との全体的類似性はプラストシアニンのコンセンサス配列との全体的類似性とほぼ同じであり、３０．５％である。オーラシアニンのＮ末端配列領域１〜１８にはグリシン及びヒドロキシアミノ酸が顕著に多い（上記文献）（例示的アミノ酸配列としてクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンの鎖Ａである配列番号１０を参照されたい（ＮＣＢＩタンパク質データバンクアクセッション番号ＡＡＭ１２８７４））。
オーラシアニンＢ分子は標準的なクプレドキシンフォールドを有する。クロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＢの結晶構造が研究されている（Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ３０６：４７−６７（２００１））。追加的Ｎ末端鎖を除き、この分子は細菌のクプレドキシンであるアズリンと非常に類似している。他のクプレドキシンにおけるのと同様、ポリペプチドの鎖４上にＣｕリガンドの１つが存在し、残りの３つは鎖７及び鎖８の間の大きなループに沿って存在する。Ｃｕ部位の形状は後者の３つのリガンド間のアミノ酸間隔を用いて記述される。結晶解析されたオーラシアニンＢのＣｕ結合ドメインはおそらく、複数の他の膜結合電子伝達タンパク質において知られているテザーと有意な配列同一性を示すＮ末端テイルによって細胞質膜のペリプラスム側に繋ぎ止められている。Ｂ型のアミノ酸配列はＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：６５３１−６５４０（１９９２）に記載されている（例示的アミノ酸配列としてクロロフレクサス・アウランティアカスのオーラシアニンＢの鎖Ａについて配列番号１１を参照されたい（ＮＣＢＩタンパク質データバンクアクセッション番号１ＱＨＱＡ））。
シュードアズリン
シュードアズリンはブルー銅含有単鎖ポリペプチドファミリーである。アクロモバクター・サイクロクラステスから得られたシュードアズリンのアミノ酸配列を配列番号４に示す。シュードアズリンのＸ線構造分析は、シュードアズリンがアズリンと配列相同性は低いが同様な構造を有することを示している。シュードアズリンとアズリンの全体的構造の主な違いは２つである。シュードアズリンはアズリンよりも長いカルボキシ末端を有し、これは２個のアルファヘリックスからなる。ペプチド中央の領域で、アズリンは短いαヘリックスを含むフラップを形成する伸張されたループを含むが、これがシュードアズリンでは短くなっている。銅部位における唯一の主な違いはＭＥＴ側鎖のコンホメーション及びＭｅｔ−Ｓ銅結合長であり、シュードアズリンのＭｅｔ−Ｓ銅結合長はアズリンよりも有意に短い。
修飾クプレドキシン由来ペプチドは標準的な技術で合成され得る。バリアントは、天然化合物から直接又は修飾若しくは部分的置換によって形成されるアミノ酸配列である。クプレドキシンの薬理活性を無効にする、クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列中に変化を生じさせる変化が、クプレドキシン由来ペプチド中に導入され得る。「非必須」アミノ酸残基とは、薬理活性を無効化することなくクプレドキシン由来ペプチドの配列から変化させることができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基はそのような薬理活性に必要なものである。
「保存的」置換を行うことができるアミノ酸は当該技術分野で周知である。有用な保存的置換を表１の「好ましい置換」に示す。１つのクラスのアミノ酸を同じクラスの別のアミノ酸で置換する保存的置換は、置換がクプレドキシン由来ペプチドの所望の薬理活性を無効にしない限り、本発明の範囲内である。クプレドキシン由来薬理活性を変化させるそのような交換も、そのような薬理活性がはっきりと認められる限り、本発明の一部と見なされる。いくつかの実施形態では、クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性は、それが由来する野生型クプレドキシンの比活性の約５％未満、約１０％未満、約２５％未満、又は約５０％未満である。クプレドキシン由来ペプチドの比活性の幾分の消失は、血漿半減期の延長又は免疫原性の低下等、クプレドキシン由来ペプチドのその他の向上された性質により相殺されるのであれば、許容可能であると考えられる。
Figure 2012518647
（１）βシート又はαヘリックスコンホメーション等のポリペプチド骨格の構造、（２）電荷、（３）疎水性、又は（４）側鎖の嵩、に影響を与える「非保存的」置換は、クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性を変化させ得る。残基は、表２に示すように一般的な側鎖特性に基づいてグループに分類される。非保存的置換ではこれらのクラスの１つのメンバーが別のクラスに交換される。
１つのクラスのアミノ酸が異なるクラスの別のアミノ酸で置換される非保存的置換は、置換がクプレドキシン由来ペプチドの薬理活性を無効にしない限り、本発明の範囲に含まれる。クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性を変化させるそのような交換は、そのような薬理活性がはっきりと認められる限り、本発明の一部と見なされる。
Figure 2012518647
オリゴヌクレオチド介在（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲによる突然変異誘発等の当該技術分野で公知の方法を用いてクプレドキシン由来ペプチドへの修飾を行うことができる。部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２３７：１−７（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３２９−５０（１９８７））、カセット変異導入、制限部位選択変異導入法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ ３４：３１５−２３（１９８５））、又はその他の公知の技術を、クローニングしたＤＮＡに行うことで、クプレドキシン由来ペプチドをコードするバリアント核酸を作製することができる。更に、当該技術分野で周知の方法により、クプレドキシンの構造的等価物であるクプレドキシン由来ペプチドをコードするヌクレオチドを合成することができる。更に、当該技術分野で周知の方法により、修飾クプレドキシン由来ペプチドであるタンパク質分子を合成することができる。
クプレドキシン移入ドメイン及びカーゴ化合物に連結されたクプレドキシン移入ドメインの複合体をコードする核酸
別の態様では、本発明は、本発明の修飾クプレドキシン由来ペプチドをコードする核酸分子を提供する。この核酸分子は当該技術分野で公知の方法の組合せによって作製することができる。例えば、修飾クプレドキシン由来ペプチドの核酸配列は化学合成又はクローニングによって個別に作製することができる。
クプレドキシン、修飾クプレドキシン、又は修飾クプレドキシン由来ペプチドとナノ粒子とを含むハイブリッドシステム
別の態様では、本発明は、本明細書に開示されている方法又は技術の１又は複数を用いて修飾されていてよい、金又は白金等の貴金属であり得るナノ粒子にコンジュゲートした、緑膿菌アズリン（配列番号１）等のクプレドキシン及び／又はクプレドキシン由来ペプチドである生物学的分子を提供する。この生物学的分子は、電子相互作用又はその他の手段を介してナノ粒子にコンジュゲートしていてよい。具体的には、コンジュゲートは電子移動を介してもよい（その開示全体を参照により本明細書に援用するＤｅｌｆｉｎｏ， Ｉ ａｎｄ Ｃａｎｎｉｓｔｒａｒｏ， Ｓ．， ”Ｏｐｔｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｚｕｒｉｎ−ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３９（２００９）１−７（２００８年９月３０日、オンラインで入手可能）参照）。いくつかの実施形態では、修飾クレドキシン由来ペプチド及びナノ粒子を含むハイブリッドシステムは、イメージング、診断、及び／又は癌治療の目的に使用され得る。
修飾クプレドキシン由来ペプチドを含む医薬組成物
修飾クプレドキシン由来ペプチドを含む医薬組成物を任意の従来の様式、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。修飾クプレドキシン由来ペプチドは、当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアと容易に組み合わせることができる。そのようなキャリアは、調合物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に製剤することを可能にする。好適な補形剤としては、例えば充填剤及びセルロース標品も含まれ得る。その他の補形剤としては、例えば、香味剤、着色剤、脱粘着剤、増粘剤、及びその他の許容可能な添加剤、アジュバント、又は結合剤が含まれ得る。そのような組成物は、例えば、癌の処置又は診断、不適切な血管形成の処置、ＨＩＶ及び／又はマラリアによる感染、及びエフリンシグナル伝達に関連する状態の処置において使用することができる。組成物は、患者が罹患している状態を防止又は処置するために十分な量で投与することができる。通常、患者生物はヒト又は動物等の哺乳動物である。
クプレドキシン移入ドメインを含む組成物の投与
修飾クプレドキシン由来ペプチドを含む組成物は、任意の好適な経路、例えば、経口、頬側、吸入、舌下、直腸内、膣内、経尿道、経鼻、局所、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓすなわちｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）又は非経口（例えば静脈内、筋肉内、皮下、及び冠動脈内投与）によって投与され得る。組成物及びその医薬製剤は意図する目的を達成するために有効な任意の量で投与され得る。ある状態に罹患している患者を処置するために投与される場合、組成物は治療有効量で投与される。「治療有効量」とは、処置対象の発達を防止するかその既存の症状を軽減するのに有効な量である。当業者であれば治療有効量を決定することができる。
種々の実施形態で、組成物は、キャリア及び補形剤（限定されるものではないが、例えばバッファー、炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド又はアミノ酸、例えばグリシン、酸化防止剤、静菌剤、キレート化剤、懸濁剤、増粘剤、及び／又は保存剤）、水、油、生理食塩水、デキストロース及びグリセロールの水溶液、並びに薬理学的状態に近づけるために必要なその他の薬学的に許容される補助剤、例えば緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤等を含む。当業者に公知の任意の好適なキャリアが本発明の組成物の投与に使用され得るが、キャリアの種類は投与形態によって変わると理解される。化合物は、周知の技術を用いてリポソーム内にカプセル化されてもよい。生分解性マイクロスフェアも本発明の組成物のキャリアとして使用され得る。好適な生分解性マイクロスフェアは例えば米国特許第４，８９７，２６８号、同第５，０７５，１０９号、同第５，９２８，６４７号、同第５，８１１，１２８号、同第５，８２０，８８３号、同第５，８５３，７６３号、同第５，８１４，３４４号、及び同第５，９４２，２５２号に示されている。
本明細書において、「化合物」とは、本発明のペプチド、アミノ酸配列、カーゴ化合物、及び複合体を含む。
本発明の組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌されてよく、滅菌ろ過されてもよい。得られた水溶液は、使用のためにそのままパッケージ化してもよく、凍結乾燥してもよく、凍結乾燥標品は投与前に滅菌溶液と混合される。
本発明の組成物は、注射（例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等）、吸入、局所投与、坐剤、経皮パッチの使用、又は経口等の種々の方法で投与され得る。
投与が注射によるものである場合、組成物は、水溶液、好ましくは生理学的に適合性のあるバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファー等の中に処方され得る。溶液は、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤等の製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含み得る。あるいは、組成物は、使用前に好適なビヒクル（例えば発熱性物質を含まない滅菌水）と構築されるための粉末形態であってもよい。
投与が吸入によるものである場合、組成物は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素、又はその他の好適な気体等の好適な噴射剤を用いて加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達され得る。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するための弁を設けることで用量単位が決定され得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）又は吹き付け器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するためのカプセル及び薬包（例えばゼラチン）は、タンパク質とラクトース又はでんぷん等の好適な粉末基材との粉末混合物を含むように製剤化され得る。
投与が局所投与によるものである場合、組成物は、当該技術分野で周知のように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液等として製剤化され得る。いくつかの実施形態では、投与は経皮パッチによる。投与が坐剤によるものである場合（例えば直腸内又は腟内）、組成物は、従来の坐剤基剤を含む組成物に製剤化されてもよい。
投与が経口によるものである場合、組成物は、当該技術分野で周知の薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて容易に製剤化され得る。マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム等の固体キャリアを用いてもよく、そのようなキャリアは、ケモタキシンを、処置する対象による経口摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤化することを可能にする。例えば散剤、カプセル剤、錠剤等の経口用固体製剤のための好適な補形剤としては、糖、セルロース標品、造粒剤、結合剤等の充填剤が含まれる。
当該技術分野で周知のその他の従来のキャリアとして、細菌莢膜性多糖類、デキストラン、又は遺伝子操作されたベクター等の多価キャリアも含まれる。更に、組成物を含む徐放性製剤は、長期間にわたる組成物の放出を可能し、徐放性製剤でない場合には治療効果が引き出される又は高められる前に組成物が対象の系から除去され且つ／又は例えばプロテアーゼ及び単純な加水分解により分解される。
正確な処方、投与経路、及び用量は通常、患者の状態を考慮して主治医が決定する。投薬の量及び間隔は、複合体の血漿濃度が治療効果を維持するのに十分であるように個別に調節され得る。通常、所望の組成物は、意図する投与経路及び標準的な薬学的実務に即して選択された薬学的キャリアとの混合物の形態で投与される。
適切な用量は、当然ながら、例えば使用されるクプレドキシ移入ドメインを含む化合物、宿主、投与形態、並びに処置及び診断されている状態の性質及び重症度によって変わる。しかし、本発明の方法の一実施形態では、１日の用量が、修飾クプレドキシン由来ペプチドを含む化合物約０．００１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の時に、ヒトにおいて満足の行く処置結果が得られることが示されている。一実施形態では、ヒトの処置に指定される１日用量は、修飾クプレドキシン由来ペプチドを含む化合物約０．７〜約１４００ｍｇであり得、これは、例えば１日１回、週１回、月１回、及び／又は連続投与によって適宜投与される。１日投与量は、１日当たり１〜１２回の個別の用量にしてもよい。あるいは、投与量を、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、週に１回、以下同様に１日単位で最大３１日に１回投与してもよい。投薬は、錠剤、パッチ、ｉｖ投与等を含む任意の適用可能な投与形態を用いた連続投与、間欠投与、又は単回投与であり得る。より具体的には、組成物は治療有効量で投与される。具体的な実施形態では、治療有効量は約０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である。具体的な実施形態では、投与量レベルは約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約１５ｍｇ／ｋｇ／日、約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約３５ｍｇ／ｋｇ／日、約４０ｍｇ／ｋｇ／日、約４５ｍｇ／ｋｇ／日、又は約５０ｍｇ／ｋｇ／日である。
修飾クプレドキシン由来ペプチドを含む化合物を患者に導入する方法は、いくつかの実施形態では、その状態の処置に知られる他の薬物との同時投与である。そのような方法は当該技術分野で周知である。具体的な実施形態では、修飾クプレドキシン由来ペプチドを含む化合物は、癌、ＨＩＶ、マラリア、不適切な血管形成、及びエフリンシグナル伝達に関連する状態を処置する他の薬物を含む又はそれと組み合わされたカクテル又は共投与物の一部である。他にも多数のこのような化合物が当業者に公知であり、参照により明示的に援用した特許出願に記載されている。
クプレドキシン由来ペプチド又はクプレドキシン由来ペプチドとカーゴ化合物を組み合わせた融合タンパク質をコードする核酸分子をベクターに挿入して遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，３２８，４７０号）又は定位注射（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７（１９９４））により対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容可能な希釈剤を含んでもよく、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含んでもよい。あるいは、組換え細胞から完全な遺伝子送達ベクター（例えばレトロウイルスベクター）が無傷（ｉｎｔａｃｔ）で産生される場合、医薬製剤は、遺伝子送達系を生成する１又は複数の細胞を含み得る。
一態様では、組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕで複合体が作製されるようにＤＮＡとして送達される。一実施形態では、ＤＮＡは、例えばＵｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９（１９９３）に記載されているように、また、Ｃｏｈｅｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９ １６９１−１６９２（１９９３）に概括されているように、「ネイキッド（ｎａｋｅｄ）」である。ネイキッドＤＮＡの取込みは、細胞中に効率的に輸送されるキャリア（例えば生分解性ビーズ）上にＤＮＡをコーティングすることで促進され得る。そのような方法では、ＤＮＡは、核酸発現系、細菌発現系、及びウイルス発現系等の当業者に公知の種々の送達系のいずれかに含まれて存在し得る。そのような発現系にＤＮＡを組み込む技術は当業者に周知である（例えば、国際公開第９０／１１０９２号、同第９３／２４６４０号、同第９３／１７７０６号、及び米国特許第５，７３６，５２４号参照）。
生物間で遺伝材料をシャトルするために使用されるベクターは２つの一般的なクラスに分けられる。クローニングベクターは、ＤＮＡを挿入することができる適切な宿主細胞中での増殖に必須でない領域を有する複製プラスミド又はファージであり、外来ＤＮＡはベクターの構成要素のように複製及び増殖される。発現ベクター（例えばプラスミド、酵母、又は動物ウイルスゲノム）は、組成物のＤＮＡ等の外来ＤＮＡを転写及び翻訳するために宿主の細胞又は組織中に外来遺伝材料を導入するために用いられる。発現ベクターでは、導入されたＤＮＡは、挿入されたＤＮＡを転写するように宿主細胞にシグナルを送るプロモーター等のエレメントに作動可能に連結されている。特定の因子に応答して遺伝子転写を制御する誘導可能なプロモーター等の一部のプロモーターは非常に有用である。組成物ポリヌクレオチドを誘導可能なプロモーターに作動可能に連結することで、本発明の修飾クプレドキシン由来ペプチドの発現を制御することができる。誘導可能な古典的プロモーターの例としては、α−インターフェロン、ヒートショック、重金属イオン、及びステロイド、例えばグルココルチコイド（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５：４８７−５１１（１９９０））、及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。その他の望ましい誘導可能なプロモーターとしては、コンストラクトを導入する細胞に内在性でないが、外部から誘導物質を供給した時にこれらの細胞中で応答性であるものが含まれる。一般的に、有用な発現ベクターは多くの場合プラスミドである。しかし、他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）も予期される。
ベクターの選択は、用いる生物及び細胞並びに所望するベクターの運命により決定される。通常、ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。
修飾クプレドキシン由来ペプチドを含むキット
別の態様では、本発明は、パッケージ又は容器中に以下の１又は複数を含むキットを提供する：（１）修飾クプレドキシン由来ペプチドを含む試薬；（２）薬学的に許容されるアジュバント又は補形剤を含む試薬、（３）シリンジ等の、投与のための手段（ｖｅｈｉｃｌｅ）；（４）投与のための指示書。同じ容器中に要素（１）〜（４）の２つ以上が見られる実施形態も考えられる。
キットを提供する場合、組成物の種々の成分は、別個の容器にパッケージ化され、使用直前に混合されてもよい。そのように成分を別個にパッケージ化することで、活性成分の機能を失うことなく長期間の保存が可能になり得る。
キットに含まれる試薬は、種々の成分の寿命が維持され且つ容器の材料による吸着又は変化が起こらない任意の種類の容器に入れて提供され得る。例えば、密封されたガラス製アンプルに、凍結乾燥したポリペプチド若しくはポリヌクレオチド又はバッファーを窒素等の中性の非反応性気体下でパッケージ化して含めてもよい。アンプルは、任意の好適な材料、例えばガラス、有機ポリマー、例えばポリカーボナート、ポリスチレン等、セラミック、金属、又は同様な試薬を保持するために通常使用される任意のその他の材料からなり得る。好適な容器のその他の例としては、アンプルと同様な物質で作製され得る単純なボトル、及び裏地がアルミニウム又は合金等のホイルである内部を含み得る包み（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）が含まれる。その他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ等が含まれる。容器は、皮下注射針で孔を開けることができるストッパーを有するボトルのように、無菌アクセスポートを有し得る。別の容器は、容易に除去可能な膜で隔てられた２つのコンパートメントを有し得、この膜を除去することで成分を混合することができる。除去可能な膜はガラス、プラスチック、ゴム等であり得る。
キットに指示書を添付してもよい。指示は、紙等の基体に印刷されてもよく且つ／又は電子読取り可能な媒体、例えばフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープ、フラッシュメモリー素子等として提供されてもよい。詳細な指示は物理的にキットに付属されなくてもよく、その代わりに、キットのメーカー又は販売業者が指定するインターネットウェブサイトに使用者を誘導してもよく、又は電子メールで提供されてもよい。
以下の具体的な実施例を参照することで本発明を更に完全に理解することができる。実施例は説明のみを目的として記載するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。状況から示唆され得る又は適切であり得る形態の変更及び均等物の置換も考えられる。本明細書中では具体的な用語を使用するが、そのような用語は説明的であることを意図しており、限定することを目的としたものではない。前述したような本発明の修正例及び変更例をその精神及び範囲から逸脱することなく作製することができ、したがって、添付の実施形態により示される限定のみが適用されるべきである。
癌に罹患している患者の修飾クプレドキシン由来ペプチドを用いた処置
チオエーテル環化ｐ２８（配列番号１３）融合体（治験薬）の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を癌に罹患した患者に行う。具体的には、緑膿菌由来のｐ２８（配列番号１３）をチオエーテル環化により修飾する。
現在利用可能なＦＤＡに承認されている化学療法薬及び治療計画による適切な処置後に臨床的に、又はＸ線検査で、進行又は再発を示す、組織学的に乳癌、結腸癌、及びメラノーマが確認されている成人患者４９名を、治験薬を投与する非盲検前向き研究に登録する。研究登録の対象となる全ての患者は、承認されている化学療法計画完了後に測定可能な腫瘍の体積増加を示す。持続的な転移性沈着物（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｅｐｏｓｉｔ）及び／又は連続的なサイズ若しくは体積の増加の証拠が組織学的に確認される必要がある。この組織学的証拠は、穿刺吸引（ＦＮＡ）細胞診により得ることができる。
処置プログラムは、イリノイ大学シカゴ校の施設内審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）及びＦＤＡに従い、全ての患者からインフォームド・コンセントを得た後に開始する。患者は、他の悪性腫瘍、悪性腫瘍の既往歴、血液疾患、インシュリン依存性糖尿病、又は提唱する治療法の効果の適切な評価を妨げ得るその他の重篤な循環器疾患等の併発疾患（ｉｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ ｉｌｌｎｅｓｓ）を有しないものとする。治療法開始前に、肝機能試験（ＬＦＴ）を含む基準となる血液検査（全血球計算［ＣＢＣ］及び血液生化学検査（Ｓｅｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））を行う。全ての対象患者は、治験期間中、如何なる癌化学療法も同時に受けてはいけない。
治験薬は、治験薬の薬学的に許容される標品を、１２週間、毎日静脈内注射することで投与され、対象はあらゆる用量制限毒性について観察される。１０ｍｇ／ｋｇ／日から、５ｍｇ／ｋｇ／日単位で最大投与量５０ｍｇ／ｋｇ／日までの７種類の投与量レベルがある。測定可能な進行癌（乳癌、結腸癌、及びメラノーマ）を有する患者７名について、各投与量レベルの効力を記録する。
応答は、測定可能な腫瘍を２次元（ａ及びｂ）で測定することで推定される。１）標的転移性腫瘍の完全な消失は完全な応答（ＣＲ）と見なされ；２）７５％の減少は優れた部分的応答（ＰＲ）と見なされ；３）良好な応答（ＰＲ）は、処置後のサイズで５０％の減少である。４）２５％のサイズ減少は安定疾患（ＳＤ）と見なされ、５）２５％未満は応答なし（ＮＲ）と見なされる。疾患の進行を示す患者は処置を中断するが、更に１２週間フォローされる。
標的転移性腫瘍の完全な消失及びサイズの何らかの減少は、アズリン処置が癌の処置に効果的であることを示す。チオエーテル環化ｐ２８（配列番号１３）処置が効果的であることを示すその他の指標として、新たな転移性腫瘍の出現速度の低下及び腫瘍に関連する血管形成の減少が挙げられる。
記載されている本発明の実施例及び系の本発明の範囲及び精神から逸脱しない種々の改変例及び変更例は当業者に明らかである。本発明を具体的な実施形態と関連付けて記載してきたが、特許請求の対象となる発明はそのような具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、記載されている発明を実施するための形態の当業者に明らかな種々の改変例が以下の実施形態の範囲に含まれることが意図される。
実施例１８−ヒト細胞株中へのｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の移入
細胞培養及び細胞株：ヒトの癌及び非癌（不死化及び非不死化）細胞株をＡＴＣＣから入手した［肺癌（Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ２３腺癌）、正常肺（ＣＣＤ−１３Ｌｕ）、前立腺癌（ＤＵ１４５及びＬＮ−ＣＡＰ）、正常前立腺（ＣＲＬ１１６１１）、乳癌（ＭＣＦ−７）、正常乳房（ＭＣＦ−１０Ａ）、結腸癌（ＨＣＴ１１６）、正常結腸（ＣＣＤ３３Ｃｏ）、線維肉腫（ＨＴ１０８０）、及び卵巣癌（ＳＫ−ＯＶ３腺癌）］。皮膚から単離した正常線維芽細胞を樹立した。正常卵巣細胞（ＨＯＳＥ６−３）はＤｒ．Ｓ．Ｗ．Ｔｓａｏ（香港大学）から寄贈された。メラノーマ系統（ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２、２３、２９）を樹立及び特徴解析した。ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２を除く全ての細胞を、１０％熱失活ウシ胎児血清（ジョージア州ローレンスビルのアトランタバイオロジカル社（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）製）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＭＥＭ−Ｅ（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２又は空気中で培養した。
増殖アッセイ／細胞成長：メラノーマ細胞を１２×１０３細胞／ウェルの密度で平底２４ウェルプレート（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製）に播種（４複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ））した。２４時間後、培地を交換し、新鮮なｐ１８、ｐ２８（配列番号１３）、アズリン、又はペプチドを含まない同様な体積の培地（８複製）を７２時間毎日添加した。次いで、細胞をベックマンコールター（Ｚ１コールター粒子カウンター）で計数した。値は４つの複製の平均値±ＳＤを表す。
ＭＴＴアッセイ：メラノーマ細胞を２０００細胞／ウェルの密度で平底９６ウェルプレート（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディッキンソン社製）に播種し、２４時間付着させた。次いで、新たに調製したペプチド（１０μｌ）又は培養培地を各ウェルに添加した。２４時間後、培地を交換し、ｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、又はアズリンを毎日添加した。７２時間インキュベートした後、１０μｌのＭＴＴ試薬（メリーランド州ゲイサーズバーグのトレビジェン社（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）製）を各ウェルに添加し、試料をＲＴ／ｓｉｇで３時間インキュベートし、界面活性剤１００μｌを各ウェルに添加し、更に３７℃で３時間試料をインキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０プレートリーダー（カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイス社製）で吸光度を測定し、非処置対照と比較した処置細胞の５７０ｎｍの吸光度変化率を決定した。値は平均値±−ＳＤを表す。対照と処置群の間の有意性はスチューデントｔ検定により決定した。
ペプチド合成：ｐ１８（Ｌｅｕ５０〜Ｇｌｙ６７：ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧ（配列番号１４））、ｐ２８（Ｌｅｕ５０〜Ａｓｐ７７：ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号１３））、ｐ１８ｂ（Ｖａｌ６０〜Ａｓｐ７７：ＶＴＤＧＭＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号３５２６））、ＭＡＰ、マストパラン−７、及びポリアルギニン（Ａｒｇ−８：ＲＲＲＲＲＲＲＲ、配列番号３５２７）を含む全てのアズリン由来ペプチドはＣ Ｓ Ｂｉｏ社（Ｃ Ｓ Ｂｉｏ， Ｉｎｃ．；カリフォルニア州メローパーク）による合成である。ペプチドは分注された凍結乾燥粉末として受け取り、気密デシケーター中に−２０℃で保存した。その後、全てのペプチドを質量分析法及び逆相ＨＰＬＣで分析し、９５％超の純度及びマスバランス（ｍａｓｓ ｂａｌａｎｃｅ）であることを確認した。
アズリンペプチドの予測的モデリング：ＧＥＮＥＴＹＸソフトウェア（ｖｅｒ．６．１）を用いてアズリン由来ペプチドのＲｏｂｓｏｎの構造モデルを作製した（Ｇａｍｉｅｒ， Ｊ．， Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ， Ｄ．Ｊ．， ａｎｄ Ｒｏｂｓｏｎ， Ｂ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １２０：９７−１２０（１９７８））。ＭＡＰＡＳソフトウェアを用いて、強く膜に接触するための所与のタンパク質構造を予測し、そのような接触部を最も形成し易いタンパク質表面領域を決定した（Ｓｈａｒｉｋｏｖ， Ｙ． ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ５：１１９（２００８））。タンパク質すなわちアズリンが、膜親和性残基スコア（ＭＲＳ）＞３、膜親和性領域スコア（ＭＡＳ）＞６０％、及び膜親和性非対称係数（Ｋｍｐｈａ）＞２．５である場合、タンパク質が実際に膜接触領域を有する確率は高い。
ペプチド／タンパク質の標識：ペプチドを１ｍｌのＰＢＳに溶解させ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８色素（オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブ社製）とタンパク質：色素の比率１：２で混合し、１００μｌの重炭酸ナトリウムを添加し、混合物を連続撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。ｐ１２（配列番号３５０６）にはＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒｇ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ １０００ ＭＷＣＯ、その他のものには２０００ ＭＷＣＯ（イリノイ州ロックフォードのピアース・バイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）製）を用いて、冷ＰＢＳに対して透析することで、標識ペプチドを遊離の色素から分離した。
細胞透過／共焦点分析：細胞をガラス製のカバースリップ上に播種し、５％ＣＯ２下にて３７℃で一晩付着させた。細胞を新鮮な培地ですすぎ、予め温めた、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識アズリンペプチド（２０μＭ）若しくはＡｒｇ−８（配列番号３５２７）（５μＭ）を含む培地中又は培地のみの中で、３７℃にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップをＰＢＳで３回すすぎ、細胞を２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回、ｄ．ｉ．Ｈ２Ｏで１回洗浄し、カバースリップを、核対比染色用の１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（カリフォルニア州バーリンゲームのベクター・ラボラトリーズ社製ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標））を含む培地中でマウントした。細胞の取込み及び分布を倒立共焦点レーザー走査顕微鏡（ドイツ、ゲッティンゲン、カールツァイス社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．）のモデルＬＣ５１０）下で撮影した。
ガラス製カバースリップ上で成長中の細胞を、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８で標識されたアズリン又はペプチドと３７℃にて２時間インキュベートすることで、リソソーム又はミトコンドリアとペプチドの共局在を調べた。Ｍｉｔｒｏｔｒａｃｋｅｒ（ＭｉｔｒｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＦＭ、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）又はｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ−２６、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）をインキュベーションの最後の３０分間に添加した（終濃度１μＭ）。細胞をＰＢＳで３回すすぎ、２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％トリトン−Ｘ１００を含むＰＢＳ中で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を１μｇ／ｍｌウサギ抗ヒトゴルジン（ｇｏｌｇｉｎ）９７又は抗ヒトカベオリンＩ（マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｂｃａｍ社製）を含むＰＢＳ中で１％ＢＳＡと共にインキュベートした。４℃で１時間インキュベートした後、カバースリップをＰＢＳで１回洗浄し、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４６８コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体を含むＰＢＳ中で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回、ｄ．ｉ．Ｈ２Ｏで１回洗浄した。次いで、カバースリップを核対比染色用の１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含む培地中でマウントした。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８（赤色）とＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４６８（緑色）の共局在（黄色）を分析し、撮影した。
カバースリップ上のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を、１００μｇ／ｍｌのヘパリン硫酸（ミズーリ州セントルイスのシグマ−アルドリッチ社製）を含むＭＥＭ−Ｅ中で３０分間プレインキュベートし、ｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、又はＡｒｇ−８（配列番号３５２７）を終濃度が２０μＭになるように添加した。１時間後、カバースリップを前述のように洗浄、固定、及び分析した。
ＦＦＡＣＳによる細胞透過：細胞（１．０×１０６／５００μｌＰＢＳ）を、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８で標識したｐ１８（配列番号１４）若しくはｐ２８（配列番号１３）（２０μＭ）、Ａｒｇ−８（配列番号３５２７）（５μＭ）と又は培地のみと３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、２．５％ホルマリンで５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、篩に通して単一細胞懸濁液を得た。ＭｏＦｌｏ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（デンマーク、グロストルップ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ）のＤａｋｏ社製）λｅｘ５６８ｎｍ及びλｅｍ６０３ｎｍを用いて試料を分析し、バックグラウンドレベルに対する平均蛍光強度の倍率を計算した。結果は３つの別個の実験の平均蛍光を表す。
移入阻害剤：３７℃でフェノールレッド及び血清を含まないＭＥＭ−Ｅ中に維持したＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞（３×１０５／３００μｌ）を以下を含む阻害剤で前処置した：クロロプロマジン（Ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｍａｚｉｎｅ）（クラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害剤、１０μｇ／ｍｌ、６０分間）；アミロリド（マクロピノサイトーシス阻害剤、５０μＭ、３０分間）；ナイスタチン（５０μｇ／ｍｌ、３０分間）；メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ、５ｍＭ、６０分間）；フィリピン（カベオラ介在性エンドサイトーシスの阻害剤、３μｇ／ｍｌ、６０分間）；タキソール（微小管安定化剤、２０μＭ、３０分間）；スタウロスポリン（細胞周期阻害剤、２５０ｎＭ、１０分間）；アジ化ナトリウム（代謝阻害剤、１ｍＭ、６０分間）；ウアバイン（ＡＴＰａｓｅ依存性Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプ阻害剤、５０ｍＭ、６０分間）；ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ；ゴルジ装置破壊剤、１００μＭ、６０分間）；ワートマニン（初期エンドソーム阻害剤、１００ｎＭ、３０分間）；モネンシン（後期エンドソーム／リソソームにおける阻害、１０μＭ、６０分間）；ノコダゾール（カベオソーム形成を阻害、１０μＭ、６０分間）；サイトカラシンＤ（アクチンフィラメント及び微小管の破壊剤、５μＭ、３０分間）；ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＢｎＧａｌＮａｃ；Ｏ結合型グリコシル化阻害剤、３ｍＭ、４８時間）；ツニカマイシン（Ｎ結合型グリコシル化阻害剤、２０μｇ／ｍｌ、４８時間）；及びノイラミニダーゼ（タンパク質からシアル酸残基を切断、ＩＵ／ｍｌ、３０分間）。終濃度は個々の阻害剤の用量反応曲線から決定した。次いで、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８（配列番号１４）又はｐ２８（配列番号１３）（２０μＭ）を添加し、１時間インキュベートし、細胞を洗浄及び固定し、前述したようにサイトメトリー分析用に調製した。
細胞膜毒性アッセイ／ＬＤＨ漏出アッセイ：ＬＤＨ漏出アッセイをメーカーの取扱説明書（ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ、ウィスコンシン州のプロメガ社）に従い１００μｌのＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞（５×１０３）を用いて行った。ペプチド／タンパク質なしの細胞を負の対照として用いた。実験は３回繰り返した（データは平均値±ＳＥＭを表す）。
溶血アッセイ：ヒト全血試料（２〜３ｍｌ）を１０００×ｇで１０分間遠心し、ペレットをＰＢＳで１回、ｐＨ７．４のＨＫＲバッファーで１回洗浄した（１８）。次いで、赤血球が４％となるように細胞ペレットをＨＫＲバッファーに再懸濁し、５０μｌを、ペプチド、アズリン（５、５０、及び１００μＭ）、又は０．１％トリトンＸ−１００を含むＨＲＫバッファー９５０μｌと共に１．５ｍｌ試験管に移してＲＢＣ膜を完全に破壊した。ＭＡＰ及びマストパラン７（カリフォルニア州トランスのＢａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｉｎｃ．製）を正の対照とした。３７℃で３０分間回転させながらインキュベートした後、チューブを１０００×ｇで２分間遠心し、上清３００μｌを９６ウェルプレートに移し、５４０ｎｍの吸光度を記録した。
移入のカイネティクス：１．５ｍｌチューブ中のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞（５×１０５細胞）をフェノールレッドを含まないＭＥＭＥ培地に懸濁した。Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ１８を０、１０、２０、５０、１００、１５０、及び２００μＭで５、１０、１５、及び２０秒間又はＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートｐ２８（配列番号１３）を１、１０、２５、５０、１００、１５０、及び２００μＭで３０、６０、９０、及び１２０秒間氷上で添加することで、反応を開始させた。インキュベーション後、２５０μｌの反応混合液に１ｍｌの冷ＰＢＳを添加した。細胞を４℃、６００×ｇで２分間、２回遠心した。各反応液について少なくとも１０，０００個の固定細胞をフローサイトメトリーで分析し、バックグラウンド及び相対蛍光を計算した。
アズリンのＩ １２５ 標識及び競合アッセイ：ペプチドの結合及び移入の測定には、ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を含むＨＥＰＥＳ溶液（５０，０００細胞／ｍｌ）を用いた全細胞（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ）アッセイを用い、１０００倍過剰量の非標識ｐ１８（配列番号１４）、ｐ２８（配列番号１３）、又はアズリン存在下／非存在下で種々の濃度（０〜１７５ｎＭ）の放射性標識されたアズリンと３７℃で３０分間インキュベートし、次いで氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、細胞ペレットに残っている放射活性をγ線計数器で測定した。Ｉ１２５アズリンのみとインキュベートした細胞中の放射活性を全結合と見なし、非標識アズリン、ｐ１８（配列番号１４）、又はｐ２８（配列番号１３）存在下での放射活性を非特異的結合と見なした。全結合から非特異的結合を引くことで特異的結合を決定し、スキャッチャード・プロットを作製した。
癌細胞中への優先的移入に関与するｐ２８（配列番号１３）のＮ末端ドメイン
ペプチド−ＧＳＴコンストラクトから得られた初期のデータから、アズリンのアミノ酸５０〜７７が細胞透過の推定ＰＴＤとして定義され、これはアズリン分子を安定化するアズリンの残基５４〜６７を含むαヘリックス領域を示す構造的証拠とよく一致している。ｐ２８／アズリンのｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）（図６Ａ）はヒトメラノーマ、前立腺癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、及び卵巣癌細胞を比較的同様な効率で透過するが、組織学的に対応する正常細胞株は同じ程度に透過しないことが最初に共焦点分析により示唆された（図６Ａ）。唯一の例外は肺線維芽細胞に由来する細胞株であるＣＣＤ１３−Ｌｕであった。陽イオン性のＡｒｇ−８（配列番号３５２７）は素早く効率的に線維芽細胞（図６Ａ）及び試験した全てのその他の正常細胞株に取り込まれた（データ示さず）。
これらの観察結果は、より感度の高いＦＡＣｓ解析で本質的に確認され（図６Ｂ）、肺癌を除き、ｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）の蛍光は対応する正常細胞株よりもそれぞれ約０．５〜６倍及び約０．５〜３倍高かった。組織学的亜種メラノーマ内でも細胞内蛍光強度に同様なパターンが観察され、ｐ１８（配列番号１４）の相対強度はｐ２８（配列番号１３）で観察された強度の約５０％であった（図６Ｃ）。バックグランドに対する蛍光強度も、ｐ２８（配列番号１３）に曝された正常細胞及び癌細胞の組よりもｐ１８（配列番号１４）に曝された正常細胞及び癌細胞の組で一貫して低く（データ示さず）、ここでも、個々の細胞への移入はｐ１８の方が少ないことが示唆された。全ての場合で、癌細胞又は正常細胞中へのｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の移入の程度は、移入に優先性の観察されなかったＡｒｇ−８（配列番号３５２７）で観察されたよりも有意に低かった（図６Ａ）。予測されたｐ１８（配列番号１４）のＲｏｂｓｏｎ構造（データ示さず）はＣ末端アミノ酸が部分的なβシートを形成することを示唆している。このこと及びｐ１８（配列番号１４）がｐ２８（配列番号１３）の親水性Ｃ末端１０アミノ酸（アミノ酸６８〜７７）を欠いており短いことは、アズリンの推定ＰＴＤとしてのｐ１８（配列番号１４）の癌細胞及び正常細胞への移入が、エンドサイトーシスプロセス又は膜受容体介在プロセスによる移入よりも非エンドサイトーシスプロセスによる移入の方が速いであろうことを示唆している。ＭＡＰＡＳのデータ（ＭＲＳ ３．７４、ＭＡＳ ８７．１、Ｋｍｐｈａ ２．３７）から、アズリンのアミノ酸６９、７０、７５、７６、８５が最も膜に接触し易いことが予想され、ｐ１８（配列番号１４）（アミノ酸５０〜６７）には存在しないｐ２８（配列番号１３）のＣ末端領域が細胞の状態に関係なく細胞膜上の特定の残基に最も接触し易いことが示唆される。
同じ細胞株をアズリン６０〜７７（ｐ１８ｂ）又はｐ２８（配列番号１３）のＣ末端１２アミノ酸であるアミノ酸６６〜７７（ｐ１２）に曝すことでｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の優先的透過を確認した（図７Ａ、Ｂ）。ここでは、ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）で観察された優先的透過は完全に消失していた。ｐ１８ｂ（配列番号３５２６）（理論的ｐＩ ４．１３）は短いαヘリックス及び部分的βシートを有し、極端に親水性であり、これらが合わさって優先的移入が消失している可能性がある。ｐ１２（配列番号３５０６）（理論的ｐＩ ４．３３）はαヘリックス二次構造を欠くがやはり親水性であり、全体的な親水性が細胞透過の選択性低下への主要な要因であることが示唆される。
細胞透過は膜破壊によるものではない
アズリン、ｐ２８（配列番号１３）、及びｐ１８（配列番号１４）による細胞透過は膜破壊によるものではない。５〜１００μＭのｐ２８（配列番号１３）、ｐ１８（配列番号１４）、又はアズリン存在下でＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞を用いたＬＤＨ漏出アッセイ（図８Ａ）により、ペプチドもアズリンも形質膜の完全性を変化させて細胞に移入するのではないことが示唆された（１８）。両親媒性αヘリックスとして細胞膜を通過してヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化する肥満細胞脱顆粒ペプチドマストパラン７及び受容体模倣ＭＡＰに対してヒト赤血球へのアズリン、ｐ２８（配列番号１３）、及びｐ１８（配列番号１４）の溶血活性を測定することで、膜破壊がないことを確認した。マストパラン７は２５μＭで完全な細胞溶解を引き起こしたが、アズリン、ｐ２８（配列番号１３）、及びｐ１８（配列番号１４）は対照（ペプチドなし）と比べて溶血効果を有さなかった（図８Ｂ）。
ｐ１８／ｐ２８の透過はエネルギー依存的且つ飽和性である
ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ２８（配列番号１３）（図９Ａ）及びｐ１８（配列番号１４）（図９Ｂ）の透過は温度依存性である。細胞透過及び細胞内輸送は４℃では３時間にわたり比較的ゆっくりと起こるが、２２℃及び３７℃では移入及び種々のコンパートメントを介した細胞内輸送は素早く起こり、ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）は暴露から２時間以内にＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞の核中に存在した。２００倍過剰量の非標識ペプチド存在下で３０分後のＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中への５μＭのｐ２８（配列番号１３）（図９Ｃ）又はｐ１８（配列番号１４）（図９Ｄ）の透過は強く抑制され、このことは、移入が飽和プロセスであり、特異的受容体又は細胞表面のタンパク質若しくは特定の残基が少なくとも一部初期の移入に関与していることを示唆している。
ｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）のカイネティクス
ヒト線維芽細胞と比較したＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）の移入のカイネティクスを、インキュベーション後、細胞を固定して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した時に計算した。ペプチド濃度（μＭ）と速度（ＭＦＩ／秒）をプロットするかスキャッチャード分析により、各ペプチドのＫｍ及びＶｍａｘを算出した。アズリン断片５０〜６７（ｐ１８）及び５０〜７７（ｐ２８）の癌細胞への透過（それぞれＶｍａｘ ２．４６、Ｋｍ １０１．６及びＶｍａｘ １．８７、Ｋｍ １５９．１）及び正常細胞中への透過（それぞれＶｍａｘ ２．８８、Ｋｍ １０２．１及びＶｍａｘ １．８９、Ｋｍ １６６．０）は互いに有意に異なり、ｐ１８（配列番号１４）が約４２％速く移入するが、正常細胞及び癌細胞中への各ペプチドの移入速度は実質的に同じである。ｐ１８（配列番号１４）よりもｐ２８（配列番号１３）に癌細胞を暴露した後の方が蛍光量が増加しているのは、悪性細胞へのｐ２８（配列番号１３）の移入量の増加によるものであろう。１２５Ｉアズリン及びｐ１８（配列番号１４）は同様な親和性でＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に結合した。対称的に、より高い温度（３７℃ｖｓ４℃）でより長い時間（２０分間ｖｓ２分間）暴露した場合、ｐ１８（配列番号１４）（Ｋｄ １８分、Ｂｍａｘ ０．５１ｐｍ）又はアズリン（Ｋｄ １０ｎｍ及び０．４８ｐｍ）よりもｐ２８（配列番号１３）がより高い親和性で有意により多くＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に結合した（Ｋｄ ２．５μｍ、Ｂｍａｘ ３．０ｐｍ）。これらの結果は、アズリン、ｐ２８（配列番号１３）、及びｐ１８（配列番号１４）は全て移入前に癌細胞及び正常細胞の表面の部位に比較的高い親和性及び容量で結合するが、移入は２つ以上のメカニズムを介し得ることを示唆している。
ｐ１８／ｐ２８の透過にはカベオラ及びゴルジ複合体が関与する
１つのクラスとして、ｐＴａｔ、Ａｒｇ−８（配列番号３５２７）等の陽イオン性ＣＰＰは、エンドサイトーシスの前に陰イオン性の硫酸化プロテオグリカンに最初に結合することで細胞に移入する。無血清条件下で１００μｇ／ｍｌのヘパリン硫酸（ＨＳ）の存在下／非存在下でｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）及びＡｒｇ−８（配列番号３５２７）をＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞とインキュベートすると、細胞内のＡｒｇ−８（配列番号３５２７）の量は有意に低下するが、ｐ２８（配列番号１３）又はｐ１８（配列番号１４）の移入は変化しない（図１０Ａ）。Ｏ結合型グリコシル化の特異的阻害剤ＢｎＧａｌＮａｃ及びシアル酸残基を切断するネルアミニダーゼ（ｎｅｒｕａｍｉｎｉｄａｓｅ）の存在下／非存在下におけるＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の透過を更に特徴解析した結果（図１０Ｂ）、透過阻害は観察されなかった。しかし、Ｎ結合型グリコシル化の阻害剤であるツニカマイシンは細胞膜を横切るｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の透過を有意に低下させた。
ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞中へのｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の移入を、エネルギー依存的輸送機構（すなわちＡＴＰ）の阻害剤を用いて更に分析した。アジ化ナトリウム（図１０Ｂ）及びウアバイン（Ｎａ＋Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅポンプ）はどちらのペプチドの透過も有意に阻害せず、このことはこれらのペプチドの透過に非エンドサイトーシス経路が関与し得ることを示唆している。クラスリン介在性エンドサイトーシスの特異的阻害剤であるクロルプロマジン（ＣＰＺ）も透過に影響を与えず、マクロピノサイトーシス阻害剤であるアミロリドも影響を与えなかった（図１０Ｂ）。タキソールによる微小管の安定化も透過に影響を与えなかったが、サイトカラシンＤを用いたアクチンフィラメントの破壊及びマクロピノサイトーシスの阻害はｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の透過を再現可能に少し（約２０％）阻害した。アミロリドが影響を与えなかったことから、サイトカラシンＤの阻害活性はアクチンフィラメントへの影響によるものと考えられる。
スタウロスポリンで細胞周期を阻害しても透過はブロックされなかった。このことは、透過が細胞周期特異的でないことを示唆している。ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の癌細胞形質膜の透過にスタウロスポリンが影響しないことから、Ｓｒｃキナーゼ／チロシンキナーゼ依存性経路が透過に関与しなかったこと、ダイナミン非依存性、したがってカベオラの出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）非依存性であったことも示唆される。ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）のどちらも、形質膜内に存在しエンドサイトーシス中間体の特定の集団内に存在するタンパク質であるフロチリン−１と共局在せず（データ示さず）、このことからも、内部移行におけるフロチリン及びダイナミンの役割は否定される。一方、カベオラ輸送を阻害しコレステロール動員の阻害剤である、したがって、カベオラ介在性エンドサイトーシスの阻害剤である、ノコダゾールは、透過を５０〜６５％阻害した。
次いで、初期エンドソーム形成阻害剤であるワートマニン、後期エンドソーム／リソソームを阻害するモネンシン、及びゴルジ装置破壊剤であるブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を用いてｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の細胞内配置を解析した。ワートマニンは、ｐ１８（配列番号１４）又はｐ２８（配列番号１３）のいずれの細胞内蓄積もブロックしなかったことから、コレラ毒素とは異なり、ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の細胞内輸送にはカベオラから初期エンドソームへの経路が関与しないことが示唆された。ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の細胞内輸送に初期エンドソームが関与しないことから、クラスリン介在性エンドサイトーシスもこれらのペプチドの内部移行に関与しないことが示唆される。
しかし、モネンシン（図１０Ｂ）及びＢＦＡは両方のペプチドの細胞内蓄積を低下させ、ｐ２８（配列番号１３）への阻害効果（約３０％）はｐ１８（配列番号１４）への阻害効果（約１０％）よりも大きかった（図１０Ｂ）。線維芽細胞中へのｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）の透過もＭβＣＤ、ノコダゾール、モネンシン、及びツニカマイシンで阻害されたが、アミロリド、アジ化ナトリウム、及びＣＰＺでは阻害されなかった（図１０Ｃ）。このことは、癌細胞及び正常細胞中への移入の少なくとも１つのメカニズムが類似し得るが、癌細胞中への更なる優先的蓄積は、共通する膜の受容体又は構造体（すなわちカベオラ）の数によって変わり得ることを示唆している（図１０Ｄ、パネル１、２）。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８標識されたｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）はカベオリン−１及びゴルジン９７抗体と共局在した（図１０Ｄ、パネル１、２）。このことから、これらのオルガネラがｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の細胞内輸送に関与することが確認された。興味深いことに、アズリンはミトコンドリア特異的蛍光と共局在したが、ｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）はミトコンドリア特異的蛍光と共局在しなかった（図１０Ｄ、パネル３）。一方、ｐ２８（配列番号１３）及びアズリンはリソソームと共局在したが、ｐ１８（配列番号１４）はリソソームと共局在しなかった（図１０Ｄ、パネル４）。
ｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）の機能的解析
アズリンは複数のヒト癌細胞株の成長をインビトロ及びインビボで阻害する。図１１Ａ及びＢに、ＭＴＴ及び細胞計数により測定したＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞に対するｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の効果をアズリン及びダカルバジン（ＤＴＩＣ）と比較して示す。暴露７２時間後、アズリンは１００μＭ及び２００μＭで細胞生存率を約１５％低下させた（ｐ＜０．０５）（図１１Ａ）。ｐ２８（配列番号１３）は１００μＭ及び２００μＭで細胞の生存をそれぞれ１４％及び２２％阻害した（ｐ＜０．０５）。一方、ｐ１８（配列番号１４）は何ら影響を与えず、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２の生存を用量依存的に有意に低下させた。アズリン及びｐ２８（配列番号１３）（２００μＭ）はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２３細胞及びＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２９細胞の生存も有意に低下させた。ｐ１８（配列番号１４）はＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２細胞の増殖に何ら影響しなかった。細胞の直接計数により測定されたｐ２８（配列番号１３）及びアズリンによるメラノーマ細胞増殖阻害の明らかな上昇（約３０〜３５％：ＵＩＳＯ−Ｍｅｌ−２）は、阻害効果が何らかの遅延後のアポトーシスを伴う細胞周期のレベルに主に存在することを示唆している。ｐ１８（配列番号１４）は、癌細胞を優先的に透過したが、ｐ２８（配列番号１３）とは異なり、細胞増殖に対する阻害活性を実質的に有していなかった。この結果は、ｐ２８（配列番号１３）の細胞分裂阻害活性及び細胞毒性活性が配列のＣ末端１０〜１２アミノ酸にあることを示している。
マウス臓器中へのｐ１８（配列番号１４）及びｐ２８（配列番号１３）の移入のイメージング
小動物のインビボイメージングは、ヒト癌研究を含む生物学的研究に重要な意義を有する。タグ化した生物学的プローブを追跡及び可視化できれば、研究者は、生物学的プロセスを可視化し、作用及び効力のメカニズムを推定することができる。イメージングを用いて、異種移植されたヌードマウスにおける原発性腫瘍及び転移性腫瘍の部位への、アズリン並びにアズリン断片ｐ２８（配列番号１３）及びｐ１８（配列番号１４）を含む近赤外標識したクプレドキシンクラスのタンパク質ペプチドの輸送を直接可視化することができる（Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ １０：０５４０１０−１−１１， ２００５；Ｊ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｎｅｕｏｔｈｅｒ ２：２１５−２２５， ２００５；Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍ ２２２：１−２９， ２００２）。
手順
Ｍｅｌ２異種移植腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスを腫瘍サイズが０．５ｃｍ３に達するまでモニタリングした。ケタミン：キシラジンの２：１混合物を用いてマウスを麻酔した。推奨用量は１０μｌ／ｇｍマウスｂ．ｗ．（ｓ．ｃ．）である。標識ペプチドを注射する前後に、ｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｅｒを用いて麻酔下のマウスを直接スキャンした。麻酔下のマウスに、濃度１．２５μｇ／μｌ、１００μｌ（マウス１頭当たり１２５μｇ）のＩＲＤｙｅ（商標）８００ｃｗ標識ｐ１８／ｐ２８をｉｖ注射した（尾静脈）。過剰な色素が系から除去されるまで（通常約５日間）少なくとも２４時間に１回マウスをスキャンした。５日目に、マウスを屠殺し、個々の動物の最後のスキャンを行った。腎臓、胃、腸、脾臓、脳、心臓、及び肺を含む臓器並びに腫瘍を切除し、半分に分け、半分を組織学的検査用に固定した。臓器及び腫瘍の残り半分は、少量のＰＢＳで覆い、その後スキャンした。

Claims (63)

  1. 修飾残基を有するクプレドキシン又はクプレドキシンの切断型を含む単離されたペプチドであって、野生型クプレドキシンの少なくとも１つの薬理活性を有する、単離されたペプチド。
  2. 前記野生型クプレドキシンの薬理活性が、（１）哺乳動物の癌細胞に移入すること、（２）哺乳動物の非癌細胞に移入しないこと、（３）哺乳動物の前悪性細胞に移入すること、（４）哺乳動物の癌細胞を死滅させること、（５）哺乳動物の前悪性細胞を死滅させること、（６）哺乳動物の癌細胞の成長を抑制すること、（７）ＨＩＶ−１感染を抑制すること、（８）マラリア感染赤血球の寄生虫血症を抑制すること、（９）エフリンシグナル伝達系に干渉すること、及び（１０）血管形成を阻害することからなる群の１又は複数から選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  3. 野生型クプレドキシンと比較して少なくとも１つの向上された薬物動態特性を有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  4. 前記修飾残基が、環化された２個以上の残基を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  5. 前記残基が酵素的環化によって環化されている、請求項４に記載の単離されたペプチド。
  6. 前記環化残基がチオエーテルを含む、請求項４に記載の単離されたペプチド。
  7. 前記環化残基がラクタムブリッジを含む、請求項４に記載の単離されたペプチド。
  8. 前記チオエーテルが、デヒドロアラニン残基及びデヒドロブチリン残基へのシステイン残基の付加によって形成される、請求項６に記載の単離されたペプチド。
  9. 前記デヒドロアラニン残基及びデヒドロブチリン残基が、それぞれセリン及びスレオニンの脱水に由来する、請求項８に記載の単離されたペプチド。
  10. 前記少なくとも１つの向上された薬物動態特性が、（１）患者の体内で生体内変換を受けにくいこと、（２）患者の体からよりゆっくりと排泄されること、（３）三次構造の安定性向上、及び（４）より長い血漿半減期からなる群の１又は複数から選択される、請求項３に記載の単離されたペプチド。
  11. 前記クプレドキシンが、緑膿菌、フォルミジウム・ラミノスム、ウルバ・ペルツシス、鉄酸化細菌、アクロモバクター・サイクロクラステス、シュードモナス・シリンゲ、髄膜炎菌、腸炎ビブリオ、気管支敗血症菌、百日咳菌、クロロフレクサス・アウランティアカス、及び淋菌からなる群から選択される生物に由来する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  12. 前記クプレドキシンが、アズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、シュードアズリン、オーラシアニン、ステラシアニン、キュウリ塩基性タンパク質、及びアズリン様タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  13. 前記クプレドキシンが配列番号１〜１２からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  14. 配列番号１３〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  15. 配列番号１〜１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  16. より加水分解されにくい、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  17. 前記修飾残基が、アスパラギン又はセリン以外のアミノ酸残基で置換されたクプレドキシン中の１又は複数のアスパラギン残基又はセリン残基を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  18. 前記アスパラギン残基又はセリン残基がグルタミン酸残基又はスレオニン残基で置換されている、請求項１７に記載の単離されたペプチド。
  19. より脱アミド化されにくい、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  20. 前記修飾残基が、グリシン以外のアミノ酸残基で置換されたクプレドキシン由来ペプチドの１又は複数のグリシン残基を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  21. 前記１又は複数のグリシン残基がスレオニン残基又はアラニン残基で置換されている、請求項２０に記載の単離されたペプチド。
  22. 緑膿菌アズリン（配列番号１）の残基５８又は６３に相当する前記クプレドキシン由来ペプチド中の１又は複数のグリシン残基が置換されている、請求項２１に記載の単離されたペプチド。
  23. より酸化されにくい、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  24. 前記修飾残基が、別のアミノ酸残基で置換された前記クプレドキシン由来ペプチド中の１又は複数のメチオニン残基又はシステイン残基を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  25. ジケトピペラジン及びピログルタミン酸をより形成しにくい、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  26. 前記修飾残基が、グリシン以外のアミノ酸残基で置換された前記クプレドキシンのＮ末端から１、２、又は３位のグリシン残基を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  27. 前記修飾残基が、プロリン以外のアミノ酸残基で置換された前記クプレドキシンのＮ末端から３位以内のプロリン残基を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  28. 前記修飾残基が、アスパラギン以外のアミノ酸残基で置換された前記クプレドキシンのＮ末端のアスパラギン残基を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  29. よりラセミ化されにくい、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  30. 前記修飾残基が、アミノ酸残基のＤ−異性体で置換された前記クプレドキシンの１又は複数のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  31. 前記クプレドキシンの前記アミノ酸残基のそれぞれが、前記アミノ酸残基のＤ−異性体で置換されている、請求項３０に記載の単離されたペプチド。
  32. 前記クプレドキシンが配列番号４５を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  33. より分解されにくい、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  34. 前記修飾残基が前記クプレドキシンのＮ末端のアセチル化を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  35. 前記修飾残基が前記クプレドキシンのＣ末端のアミド化を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  36. 前記修飾残基が三次構造の安定性を向上させる、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  37. 前記修飾残基が少なくとも１つのα−ヘリックスの安定性を向上させる、請求項３６に記載の単離されたペプチド。
  38. 前記修飾残基がラクタムブリッジを含む、請求項３６に記載の単離されたペプチド。
  39. 前記修飾残基が非天然アミノ酸を含む、請求項３６に記載の単離されたペプチド。
  40. 前記修飾残基がα−アミノ−イソ酪酸を含む、請求項３６に記載の単離されたペプチド。
  41. グリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジン、及びアルギニンからなる群から選択される前記クプレドキシン由来ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、メチオニン、及びα−アミノ−イソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸残基で置換されている、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  42. 配列番号３４〜４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  43. 前記クプレドキシンの２つ以上のリジン残基が、ｉ（ｉ＋４）のスペーシングでε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−リジン残基で置換されている、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  44. 前記クプレドキシンが、配列番号１を含み、前記修飾残基が、配列番号１の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０からなる群から選択される１又は複数におけるものである、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  45. 前記修飾残基が、天然アミノ酸に対応するオレフィン含有テザーを有するα，α−二置換非天然アミノ酸で置換された前記クプレドキシン中の１又は複数対の天然アミノ酸残基を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  46. 前記クプレドキシンが、配列番号１を含み、前記修飾残基が、配列番号１の残基５３〜５６、５８〜６４、及び６８〜７０からなる群から選択される１又は複数におけるものである、請求項４５に記載の単離されたペプチド。
  47. 前記修飾残基が、カテプシンＢにより切断可能な結合によりＰｅｐ４２（配列番号３５０５）に融合した残基を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  48. 前記修飾残基が光学活性アミノ酸を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  49. 請求項１に記載の単離されたペプチド及び薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
  50. 治療有効量の請求項１に記載の単離されたペプチドを哺乳動物に投与することを含む、方法。
  51. 前記哺乳動物がヒトである、請求項５０に記載の方法。
  52. クプレドキシンの１又は複数のアミノ酸残基の修飾であって、野生型クプレドキシンの少なくとも１つの薬理活性を保持する修飾
    を含む、クプレドキシンの薬物動態特性を向上させる方法。
  53. 前記修飾が、１又は複数の残基の環化を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記修飾が、前記クプレドキシン中の天然アミノ酸の非天然アミノ酸による置換を含む、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記修飾が、前記クプレドキシンのαヘリックス含量を増加させることを含む、請求項５２に記載の方法。
  56. 前記修飾が、前記クプレドキシンにラクタムブリッジを付加することを含む、請求項５２に記載の方法。
  57. 前記修飾が、酵素による翻訳系を用いた非天然アミノ酸の付加を含む、請求項５２に記載の方法。
  58. 前記クプレドキシンが、配列番号１３又は配列番号１３の切断型を含む、請求項５２に記載の方法。
  59. 前記クプレドキシンが、配列番号１又は配列番号１の切断型からなる、請求項５２に記載の方法。
  60. ナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項１に記載の単離されたペプチド。
  61. 前記ナノ粒子が貴金属である、請求項６０に記載の単離されたペプチド。
  62. 前記貴金属が金である、請求項６１に記載の単離されたペプチド。
  63. 電子移動経路を介してナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項６０に記載の単離されたペプチド。
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