JP2009509562A - αｖβ６ペプチドリガンド及びその活用 - Google Patents

Abstract

ＡＶβ６ペプチドリガンド、それの機能的変異体、それらをコードしている核酸は、ＡＶβ６を介した疾病の治療及び画像化についてのそれらの用途とともに開示される。

Description

本発明は、αｖβ６ペプチドリガンド並びに、その機能的変異体並びに、それらをコードする核酸並びに、治療におけるそれらの使用並びにαｖβ６を介した疾病に関する。

インテグリンは、細胞間及び細胞−細胞外基質（ＥＣＭ）間における接着の媒介に関与する、細胞表面受容体の大きなファミリーである。少なくとも２４種類のインテグリンが存在し、各ヘテロダイマーはα及びβサブユニットより構成され、それらの発現は、組織、発生の段階、炎症及び癌のようなさまざまな組織の病変を含む、いくつもの要因によって決定される。インテグリン自体は固有の酵素活性を全く持たないが、リガンドの結合に続いて、インテグリンは細胞外の合図を細胞内のシグナルに翻訳し、それは細胞質の構造的でかつシグナルを送る分子の複合体によって並行的に持ち込まれることによるものであり、この複合体はその後、相互作用して細胞応答を決定する。インテグリンは、運動性、増殖、浸潤、生存を含む、細胞挙動の多くの要素に関わっているので、疾病におけるそれらの役割は広く報告されている。事実、インテグリンの中には、癌を含むある種の疾病を助長するのに、能動的な役割を果たしていると考えられているものがある。例えばαｖβ３は、移動促進及び生存シグナルを提供するのに加え、浸潤を促進させるメタロプロテアーゼをアップレギュレートすることを含む多様な能力のために、メラノーマとグリオブラストーマの浸潤性の表現型を促進することが示唆されている。インテグリンαｖβ３は血管新生のための血管における内皮細胞でもアップレギュレートされ、癌における新生血管の発達にも同様のシグナルを提供している可能性があり、それらのデータにより、多くの製薬会社及び大学機関が治療を目的としてαｖβ３のアンタゴニストの開発を行っており、それらの多くはペプチドあるいはペプチドミメティクスである。それ故に、インテグリン−リガンド相互作用の構造上の基本を理解することは、インテグリンのアンタゴニストの改良設計に役立つだろう。

αｖβ６は内皮細胞でのみ発現している。このインテグリンは正常組織と病態組織の両方のプロセスに関与する。それ故に、αｖβ６は創傷治癒及び炎症の間、アップレギュレートされる。αｖβ６の能力は、ＴＧＦβの防御プロぺプチドである潜在型結合ペプチド（ＬＡＰ）に結合することによって、ＴＧＦβを局所的に活性化させるαｖβ６の能力により、これらの一過性の病理におけるαｖβ６の機能が説明できそうである。それ故に、ＴＧＦβは炎症反応及び上皮の増殖を抑制することができるので、αｖβ６はこれらのプロセスを抑制するためのネガティブコントロールとしての役割を果たすことが示唆されている。しかしながら、慢性炎症によってＴＧＦβの、過剰なαｖβ６依存的な活性化へと到ることが可能であり、結果的に実験動物は肺線維症になる。結果的に線維症になったヒトの病理の中には、αｖβ６依存的なＴＧＦβの活性化が関与しているケースが見込まれる。マウスの皮膚におけるαｖβ６の構成的な過剰発現は、結果的に慢性的な損傷をもたらし、トランスジェニックマウスのかなり多くにも見受けられる。それ故に、ヒトの疾病と相関した慢性損傷（例として、ある種の表皮水疱症）は、損傷したケラチノサイトにおけるαｖβ６のアップレギュレーションによって促進または悪化する可能性がある。

最近、インテグリンαｖβ６は癌における主要な新しい標的であることが明らかになっている。αｖβ６は上皮特異的であるにも関わらず、多くの静止した上皮組織では弱いか検出ができないが、多くのタイプの癌の、しばしば浸潤的な最前部で、強くアップレギュレートされている。αｖβ６は、ＭＭＰをアップレギュレートし、運動性の増加を促進させることによって、癌腫の浸潤を促進でき、それによりαｖβ６はＡｋｔをアップレギュレートして癌腫の細胞の生存を促進することが示されている。これらのデータはαｖβ６が浸潤的な表現型を活性的に促進することを強く示唆する。この示唆は、αｖβ６の高発現が、結腸がん患者の平均生存期間の有意な減少と相関している最近の報告により支持される。

αｖβ６は、ウィルスカプシド・タンパク質であるＶＰ１のＲＧＤモチーフと結合することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）のレセプターとして、同定されている。
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本発明は、αｖβ６を対象とする治療を改善し、特に新規結合リガンドを発見することを目的とした研究に起因し、そのリガンドは例えば、性合親和性を増加させ、及び／またはαｖβ６を介した疾病の治療及び画像化を改良させる特異性を持つ。これらは、例えば慢性線維症または癌腫のようなαｖβ６を介した疾病を持つ患者に、主な利点を持つ可能性がある。特にαｖβ６を改良したアンタゴニストには、高い需要がある。

概して、本発明は、αｖβ６のペプチドアンタゴニストの有効性が、ペプチドアンタゴニスト内の、及び配列モチーフＲＧＤＬＸＸＬ/Ｉを含む特有のペプチド内の、特異的な二次構造の存在に依存するという、驚くべき発見に基づいており、ここでＬＸＸＬ/Ｉはαヘリックス構造内に含まれる。以前ＦＭＤＶの結晶構造解析により、ヘアピンカーブの先端にあって続いて３_１０ヘリックスが続く、ＶＰ１カプシド・タンパク質のＧ−Ｈループ内に、ＲＧＤモチーフが含まれることが示された一方で、特異的な二次構造内における結合モチーフの位置が、その結合能に重要であるという指摘はなかった。本発明者たちは、ＲＧＤモチーフを含むＶＰ１タンパク質由来の欠失ペプチドが、結合能を増加させること及び結合特異性を示すことを発見した。特に、結合特異性及び性合親和性が、ペプチドの結合領域内におけるヘリックス傾向をさらに増加させた。学説に拘束されないのであれば、αｖβ６結合ペプチドのＬＸＸＬモチーフ内におけるαヘリックス構造により、疎水性側鎖がαｖβ６の結合部位と相互作用することを、ＲＧＤＬＸＸＬモチーフの正確な配向性が、可能にすることを許していると考えられる。さらに、ヘリックス内の残基とN末端内の残基間における非共有結合的な接触が、ヘアピン構造を安定化し、特異的結合のための好ましいＲＧＤモチーフをαｖβ６に提示する。

従って、第１の態様では、本発明は、配列モチーフＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６ＬまたはＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６Ｉを含むペプチドを規定し、ここでＬＸ^５Ｘ^６Ｌまたは ＬＸ^５Ｘ^６Ｉはαヘリックス構造内に含まれる。

さらなる態様では、本発明は、本明細書で規定したぺプチドをコードする単離した核酸分子、及びその核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

さらなる態様では、本発明は、治療または診断の使用のために、本明細書で規定したペプチド、核酸分子または発現ベクターを提供する。

さらなる態様では、本発明は、本明細書で規定した、医薬組成物のペプチド、核酸分子または発現ベクター、並びに医薬として許容される担体を提供する。

さらなる態様では、本発明は、本明細書で規定したペプチド、核酸分子または発現ベクターを、治療に有効量で、必要とする患者に投与することを含む、細胞がαｖβ６を過剰発現している疾病またはαｖβ６を介した疾病の治療方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、αｖβ６を介した疾病あるいは細胞がαｖβ６を過剰発現している疾病の治療のための薬剤の調合のために、本明細書で規定した、ペプチド、核酸分子または発現ベクターの使用を提供する。一例として、これらの疾病は、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性損傷皮膚病（例として、表皮水疱症）あるいは癌を含む。

さらなる態様では、本発明は、個体の体内の表皮細胞の画像化の方法を提供し、その方法には、本明細書で規定したペプチドを、治療に有効量で、個体に投与すること並びにその体内のペプチドの存在を検出することが含まれる。

さらなる態様では、本発明は、αｖβ６を介した疾病の診断または予後診断のための方法を提供し、その方法には、本明細書で規定したペプチドを、治療に有効量で、個体に投与すること及び体内のペプチドの存在を検出することが含まれる。

さらなる態様では、本発明は、αｖβ６を発現している細胞あるいは患者内でαｖβ６を発現している細胞を含んでいる組織に、治療上の活性部分を送達する方法を提供し、その方法には、本発明のペプチドを投与することが含まれる。

さらなる態様では、本発明は、ペプチドのαヘリックスの含有量を増加させることによって、αｖβ６結合ペプチドの結合特異性を改善する方法を提供する。

本発明の実施態様は、これより一例として及び添付の図表を参照することに限られずにさらに記載される。

αｖβ６ペプチドリガンド
本発明は、配列モチーフＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６ＬまたはＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６Ｉを含むペプチドリガンドの使用に関係し、ここでＬＸ^５Ｘ^６ＬまたはＬＸ^５Ｘ^６Ｉはαヘリックス構造内に含まれる。他に特に規定がなければ、本明細書のアミノ酸の位置は、ペプチドのＮ末端からＣ末端にかけて番号がつけられる。

用語「αヘリックス構造」は、特定の水素結合パターンで相互作用するペプチド内のアミノ酸の連続的な群と理解されており、それ故にヘリックス構造と規定される。例えば、標準的なαヘリックスにおける水素結合パターンは、残基ｎのカルボニル酸素から残基ｎ＋４のアミド水素の間にある。３_１０ヘリックスに関しては、この水素結合パターンは、残基ｎからｎ＋３の間にあり、πヘリックスに関しては、それは残基ｎからｎ＋５の間にある。各αヘリックス１回転あたり残基数は、標準的なαヘリックス、３_１０ヘリックス及びπヘリックスに対してそれぞれ３．６、３．０及び４．４である。

本発明で有用なαヘリックスは、国際公開第９５/００５３４号で記述されているように、αヘリックスミメティクスでもよい。αヘリックスミメティクスは、天然に存在する、または合成ペプチドの、構造を安定化させることのできるαヘリックス構造である。

本発明のペプチドは、標準的なヘリックスまたは３_１０ヘリックスまたはπヘリックスまたはそれらのどれかの組み合わせを含めてもよい。例えば、本発明のヘリックスは、そのヘリックスの側面に位置する、好ましくは２つのキャップである、Ｎ末端キャップおよびＣ末端キャップである、キャップ構造を形成するアミノ酸を含めてもよい。

本発明の好ましい実施態様では、前記に規定したペプチドは、配列ＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６ＬＸ^８Ｘ^９Ｘ^１０を含む。好ましくは、このペプチドは、配列ＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６ＬＸ^８Ｘ^９Ｘ^１０Ｚ_ｎを含み、そのＺはヘリックスを促進させる残基であり、ｎは１から２０の間の任意の数である。好ましくは、ｎは５から１５の間であり、より好ましくは、ｎは８から１２の間である。位置Ｚにヘリックス残基を含むためのヘリックスの伸張は、それらがαｖβ６への結合をも強化可能なヘリックスの双極子をさらに強化するので、好ましい実施態様である。

本発明のペプチドは、前記で規定したペプチドの機能的変異体にもなり得ることができ、前記のペプチドと少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を持つペプチドを含み、人工アミノ酸または修飾アミノ酸が含まれるペプチドをも含む。適切な人工アミノ酸は、一例として、Ｄ−アミノ酸、オルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシンオルニチン、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、α及びα−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、トリフルオロチロシンのようなｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン、天然アミノ酸のハロゲン化物の誘導体であるＬ−アリル−グリシン、ｂ−アラニン、Ｌ−ａ−アミノ酪酸、Ｌ−ｇ−アミノ酪酸、Ｌ−ａ−アミノイソ酪酸、Ｌ−ｅ−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌメチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ハイドロキシプロリン、Ｌ−チオプロリン、１−メチル−Ｐｈｅ、ペンタメチル−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）のようなフェニルアラニンのメチル化物の誘導体、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）、Ｌ−ジアミノプロピオン酸及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）を含む。このペプチドはさらに改良してもよい。例えば、１またはそれ以上のアミド結合は、エステルあるいはアルキルのバックボーン結合によって置換してもよい。ＮまたはＣアルキル置換基、側鎖修飾あるいは例えばジスルフィド架橋、アミド側鎖あるいはエステル結合のような拘束があってもよい。

本発明のぺプチドは、改良したペプチド及び合成ペプチドの類似体の両方を含めてもよい。例えば、ペプチドは、処方及び貯蔵特性を改善するために、あるいは非ペプチド構造を組み込むことによって、不安定なペプチド結合を保護するために、改良してもよい。

本発明のペプチドは、当該技術分野で既知の方法で調整してもよい。例えば、例として固相法及び自動ペプチド合成装置のような化学合成によって、あるいは（本明細書で規定したような核酸を用いた）組換方法によって、合成してもよい。例えばペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法を用いる自動多重ペプチド合成機（アビメドＡＭＳ４２２）で固相化させる戦略を用いて合成してもよい。このペプチドはその後、逆相ＨＰＬＣによって精製可能であり、及び凍結乾燥可能である。このペプチドは、より長いペプチド、例えば５Ｔ４ペプチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｚ２９０８３）を切断することにより調整してもよい。従って、ペプチドは５Ｔ４配列の断片でもよい。ペプチドは、本発明で規定したポリヌクレオチドの組換発現によって調整してもよい。ペプチドを、適切なホスト細胞で発現させて、当該技術分野で既知の方法を用いて単離する。好ましくは、Ｘ^５−Ｘ^６及びＸ^８−Ｘ^１０はヘリックスを促進させる残基である。好ましくは、ヘリックスを促進させる残基は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ及びＡｓｐからなる群から独立して選択される。このヘリックスを促進させる残基は、人口アミノ酸または修飾アミノ酸も可能である。

用語「ヘリックスを促進させる残基」は、αヘリックスの中央において発見されている１．０よりずっと大きな配座優先を伴ったアミノ酸を含む（Creighton, 1993 and Pace CN. and Scholtz J. M. (1998), Biophysical Journal, Vol. 75, pages 422-427より）。しかしながら、アミノ酸の連結を促進させる非標準ヘリックスも、それらがαｖβ６に対しての結合特異性及び/または性合親和性を増強するのであれば、本発明の範囲内に入る。

本発明者たちは「末端のキャッピング」によって、αヘリックスの双極子の安定化を図り、それによりヘリックスのＮ末端終端はグルタミン酸のように、負に荷電したアミノ酸によってキャップされる。同様に、Ｃ末がリシンのように正に荷電したアミノ酸によってキャップされてもよい。キャッピングの残基は、Ａｕｒｏｒａ及びＲｏｓｅによって規定されたキャッピングのルールを順守する可能性がある(Protein Sci. 7(l):21-38; 1998)が、非標準ヘリックスのキャッピングのモチーフは、それらが構造的な相互作用によりペプチドを安定化させるのであれば、本発明の範囲内にも入る。

さらなる実施態様において、本発明のペプチドを環化してもよい。本発明のペプチド内に環構造を導入する方法は周知の技術であり、それにより、結果的に安定性を獲得する構造の配座制約を提供する。例えば、Ｃ末システインあるいはＮ末システインを、環ペプチドを生成するペプチドに付加することが可能であり、それにより、このペプチドは酸化される場合にジスルフィド結合を含む。ペプチドを環化する他の方法は、チオエーテルの形成及び、カルボキシル−とアミノ−末端アミド、及びエステルを含む。たくさんの合成技術が、合成循環ペプチドを生成するために開発されている(Tam & Lu, Protein Sci . , 7(7): 1583-1592, 1998;Romanovskis & Spatola, J. Pept . Res., 52(5): 356-374, 1998; Camarero & Muir, J. Amer. Chem. Soc, 121: 5597- 5598, 1999; Valero et al., J. Pept. Res., 53(1): 5G-67, 1999)。一般的に、環ペプチドの役割は２つのフォールディング：（ａ）in vivoの加水分解を減少させ並びに（ｂ）熱力学的に変性状態を不安定化し、二次構造形成を促進させる。残基Ｘ^５−Ｘ^６の設計が特異性をも増強できるように、ＲＧＤのＮ末残基の疎水性の一群が反対側のヘリックスの面に沿うことは、潜在的に重要である。

本発明のさらなる実施態様において、ペプチドは次式、Ｂ_ｎＲＧＤＬＸＸＬＸＸＸＺ_ｍで示され、ここで残基Ｂは、ＬＸＸＬより規定したヘリックスとの疎水性の相互作用を増強する残基であり、ハンマーヘッド型ＲＧＤが結合することをも強化させ、並びにＺはヘリックスを促進させる残基であり、ｎは１から３５の間の数字であり、ｍはそれとは独立の１から３５の間の数字である。好ましくは、ｎは、Ｂが疎水性/非共有結合性相互コアを促進させることができるのに十分長いように、選択される。これらの残基の実際の性質は、その領域の一般的な設計に依存し、特に、（例えばＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕのような残基と）疎水性相互作用する、及び/または（ここで規定した（ＬＸＸＬの２つのＬｅｕ残基間の）Ｘ_１５−Ｘ_１６の位置において、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ及びＡｒｇを用い、それらは対応するもののイオン対を伴った）静電気的な相互作用する、混合物であることが好ましい。

さらなる実施態様において、このペプチドは、ＧＦＴＴＧＲＲＧＤＬＡＴＩＨＧＭＮＲＰＦ、ＹＴＡＳＡＲＧＤＬＡＨＬＴＴＴＨＡＲＨＬまたはＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴの群から選択される配列が含まれるか、または、から成る。

さらなる実施態様において、このペプチドのαヘリックス構造により、残基ＬＸＸＬ/Ｉの疎水性側鎖が、そのヘリックスの一方から突き出ることが可能になる。

さらなる実施態様において、αヘリックス構造は少なくとも１つの回転（ｔｕｒｎ）を持つ。

さらなる好ましい実施態様において、このペプチドは７から４５アミノ酸長の間であり、好ましくは７から４０、３５、３０、２５、２０または１５アミノ酸の間である。例えば、ペプチドは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２２、２４、２６、２８、３２、３４、３６、３８、４２または４４アミノ酸の長さでもよい。どの場合においても、本発明のペプチドは３次構造の形成を可能にする長さを超えるべきではなく、単離した分子として入手できるのであれば、通常は４５アミノ酸残基を超えるべきではない。しかしながら、このペプチドは、ペプチド内の三次構造の形成を妨げることができるような、より大きな分子、例えば抗体または他のタンパク質または巨大分子と結合した場合には、４５アミノ酸を超えてもよい。とても好ましいのは、ペプチドは２０アミノ酸長である。

さらなる好ましい態様において、本発明で規定したペプチドは、容易に検出可能な部分と連結してもよい。用語「容易に検出可能な部分」とは、患者に本発明のペプチドを投与した後にそれが標的部位で局在した時、通常は体外および局在した標的部位から不可逆に検出される可能性のある、部分に関する。それ故に、本発明のこの実施態様でのペプチドは、画像化及び診断に有用である。容易に検出可能な部分は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、磁気共鳴スペクトロスコピー（ＭＲＳ）、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）及び光学的画像のような画像化技術によって検出可能な実在物である。好ましくは、画像化部分は安定で非毒性の特性をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ条件下において保有する実在物である。そのような部分の例としては、放射性部分、例えば放射性同位体を含むが、それだけには限られない。適当な放射性原子には、シンチグラフ検査のためのテクニチウム９９ｍまたはヨウ素１２３が含まれる。他の容易に検出可能な部分には、例えば、ＭＲＩ用のスピンラベルである、例えば重複するがヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１８、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄並びにＣｙ５．５及び量子ドットを含む光学的な部分が含まれる。

本発明のさらなる好ましい実施態様において、ポリペプチドは治療上の活性部分と連結していて、その部分には細胞傷害性があると好ましい。

用語「治療上の活性部分」は、有益で、予防のため及び/または治療の特性を持っている部分を含む。

ある実施態様においては、治療上の活性部分とは、細胞傷害性化学療法剤である。細胞傷害性化学療法剤は周知の技術であり、抗がん剤を含むが、それには例えば、ナイトロジェン・マスタード（例えばメクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）及びクロラムブシル）を含むアルキル化薬、ＩＧエチレンイミン及びメチルメラミン（例えばヘキサメチルメラミン、チオテパ）、ブスルファンのようなアルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素（例えばカルマスティン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＬＪ）、セムスチン（メチルＣＣＮＵ）及びストレプトゾシン（ストレプトゾトシン））、並びにダカルバジン（例えばジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド（ＤＴＩＣ））のようなトリアジン化合物、メトトレキサート（アメトプテリン）のような葉酸類似体を含む代謝拮抗物質、ピリミジン類似体（例えばフルオロウラシル（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））、フロキシウリジン（フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ））及びシタラビン（シトシンアラビノシド））並びにメルカプトプリン（６−メルカプトプリン（６−ＭＰ））のようなプリン類似体及び関連阻害剤、チオグアニン（６−チオグアニン（ＴＧ））及びペントスタチン（２’−ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｎｎｙｃｉｎ）。ビンブラスチン（ＶＬＢ）及びビンクリスチンのようなビンカ・アルカロイド、エトポシド及びテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシン（マイトマイシンＱ、例えばＬ−アスパラギナーゼのような酵素、並びにインターフェロンａｌｐｈｅｎｏｍｅｓのような生物反応修飾物質）のような抗生物質を含む天然物。シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）及びカルボプラチンのようなプラチナ配位調整複合体を含んだ混合剤、ミトキサントロン及びアントラサイクリンのようなアンスラセンジオン、ヒドロキシウレアのような置換尿素、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ））のようなメチルヒドラジン誘導体、並びにミトタン（ｏ、ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドのような副腎皮質サプレッサー、タキソール及びアナログ／誘導体、並びにフルタミド及びタモキシフェンのようなホルモンのアゴニスト／アンタゴニストがある。

治療剤にポリペプチドを結合させる方法は、周知の技術である。

本発明のさらなる実施態様において、ポリペプチドは、治療剤を含む粒子と結合される。この場合の粒子は、ナノ粒子及び脂質ベースの小嚢（例えばリポソームまたは脂質から成る他の類似構造）を含む。それ故に、本発明は、本明細書で規定したペプチド及びリポソーム担体及び本明細書で規定したペプチドを含むナノ粒子を提供する。

リポソームは、物質（例えば薬剤または遺伝物質）を送達する薬剤として使用してもよいリン脂質二重層を含む球状小嚢である。リポソームは、混成した脂質鎖（卵ホスファチジルエタノールアミン）を伴った天然由来のリン脂質から、またはＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）のような純粋な構成成分から、構成することが可能である。このリポソームの合成及び用途は、今日では技術的に十分に確立されている。リポソームは、一般に、水のような適当な媒体で、リン脂質の超音波処理によって作られる。低剪断速度では、多層構造を持つ多重膜リポソームが作られる。連続した高剪断な超音波処理では、より小さい単層リポソームが形成される傾向にある。リポソームを、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングすることによって、リポソームが免疫系によって発見されることを避けることが、研究により可能になっている。リポソーム内に分子を取込むことも可能であり、例えばそれは、本発明のペプチドが、送達部位（例として細胞内またはｉｎ ｖｉｖｏ）を標的とするのに役立つ。

ナノ粒子と、連結するまたは結合する物質についての、送達剤としてのナノ粒子の使用は、既知の技術である。ある種のナノ粒子は、しばしば金属及び/または半導体原子のコアを含み、それは一つ以上多くの異なるタイプのリガンドが結合されてもよく、例として、本発明のペプチドが一つ以上含まれており、国際公開第０２／３２４０４号、国際公開第２００５／１０８１６号及び国際公開第２００５／１１６２２６号を例として参照のこと。別種のナノ粒子は、例えばリポソームのような物質から形成されてもよい。時には、このナノ粒子は、誘導体化されてもよく、あるいは異なる特性または機能をナノ粒子に提供するために存在する可能性のある他のリガンドに結合されてもよい。ある実施態様においては、このナノ粒子は量子ドット（つまりバルク個体とは著しく異なる、顕著な化学的及び物理的特性を有する半導性材料のナノクリスタル）でもよい（Gleiter, Adv. Mater. 1992, 4, 474-481を参照のこと）。それらの量子サイズ効果は今や理解され、それらのシステムにおける基礎及び応用研究はますます盛んになっている。興味深い活用には、生体系に対しての蛍光ラベルとしてのナノクリスタルの利用があり、例として以下を参照のこと（Brucher et al, Science 1998, 281, 2013-2016、Chan & Nie, Science, 1998, 281, 2016-2018、Mattousi et al, J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 12142-12150及びA. P. Alivisatos, Pure Appl . Chem. 2000, 72, 3-9）。量子ドットは、従来の蛍光色素に対していくつかの利点を有する。すなわち、それ自身のサイズに応じてさまざまな、決まった波長で光を発すること及び蛍光ライフタイムが長い。

さらなる実施態様において、この細胞傷害性の部分とは、細胞傷害性ペプチドまたはポリペプチド部分であり、本発明者たちが細胞死につながるいずれかの部分を含めることによる。

細胞傷害性ペプチド及びポリペプチド部分は周知の技術であり、例えば、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素、組織因子などを含む。細胞傷害性薬剤としてのリシンの用途は、Burrows & Thorpe, P. N.A. S. USA 90: 8996-9000, 1993において記載されており、本明細書でも参照により取入れられる。組織因子の用途は、腫瘍の局部的な血液凝固及び梗塞へと至り、Ran et al, Cancer Res. 58: 4646-4653, 1998及びHuang et al, Science 275: 25 547-550, 1997.にて記載されている。アブリンＡ鎖がモノクローナル抗体に結合していることが、Tsai et al, Dis. Colon Rectum 38: 1067- 1074, 1995に記載されており、本明細書でも参照により取入れられる。他のリボソーム不活性化タンパク質は、国際公開第９６／０６６４１号において細胞傷害性薬剤として記載されている。シュードモナス外毒素は細胞傷害性ポリペプチド部分として使用してもよい（例としてAiello et al, P. N.A. S. USA 92: 10457-10461, 1995.を参照のこと）。

ＴＮＦα及びＩＬ−２のような、ある種のサイトカインは、細胞傷害性及び/または治療用薬剤としてもまた有用な可能性がある。

ある種の放射性原子もまた、十分な線量で送達されれば、細胞傷害性となるであろう。それ故に、細胞傷害性部分には、使用時には、細胞傷害性になるために十分な線量の放射能を標的部位に対して送達する放射性原子が含まれてもよい。適当な放射性原子には、リン３２、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、レニウム１８６、レニウム１８８またはイットリウム９０、あるいは隣接する細胞、オルガネラまたは核酸を破壊するために十分なエネルギーを放出するいずれか他の同位体も含む。好ましくは、本発明の化合物内の放射性原子の同位体及び濃度（ｄｅｎｓｉｔｙ）が４０００ｃＧｙより大きい線量であり、より好ましくは少なくとも６０００、８０００または１００００ｃＧｙであり、標的部位に送達され、好ましくは標的部位の細胞及びオルガネラ、特に核に送達される。

放射性原子は、既知の方法で結合部分に連結されてもよい。例えば、ＥＤＴＡまたは他のキレート剤が結合部分に結合されてもよく、^１１１Ｉｎまたは^９０Ｙを連結させるために用いられてもよい。チロシン残基は^１２５Ｉまたは^１３１Ｉでラベルしてもよい。

さらなる実施態様において、本発明は、ＤＮＡをコードしている治療用遺伝子を送達するウィルスの指向性を変化させるために、ＥＭＤＶ以外のウィルスコートタンパク質に結合するポリペプチドを提供する。

あるいは、これらのシステムのどれもが、プロドラッグ系で利用することが可能である。そのようなプロドラッグ系は周知の技術である。

他の態様において、本発明は、本明細書で規定したペプチドをコードしている核酸を使用する。

用語「（ペプチド）をコードしている核酸」は、配列モチーフＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６ＬまたはＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６Ｉを含むペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列と関連があり、ここでＬＸ^５Ｘ^６ＬまたはＬＸ^５Ｘ^６Ｉは、本発明、あるいは機能的変異体、あるいはプロペプチドまたはプリプロペプチドのような前駆体段階、に従って使用され得るαヘリックス構造内に含まれる。このペプチドは、全長配列によって、またはこのペプチドが機能的変異体である場合はコード配列のいずれかの部分によって、コードされ得る。用語「変異体」は、ＤＮＡ配列（参照配列）に対して相補的な全てのＤＮＡ配列を指し示し、本発明に従って使用されるペプチド、特に前記で規定したペプチドまたはそれらの機能的な変異体のペプチドをコードし、それらは約７０％を下らない、特には約８０％を下らない、さらに特には約９０％を下らない配列同一性を、参照配列に対して示す。用語「変異体」は、さらに、参照配列に相補的な全てのＤＮＡ配列を指し示し、それはストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズし、並びに参照配列によってコードされるペプチド及びそれらの変性型とも、本質的に同じ活性を示すペプチドをコードする。本発明に従って使用される核酸配列には、小さな変異が存在し得ることが知られており、例えば、機能的変異体の特性が欠損されなければ、これらの変化は、遺伝子コードの縮重によって、あるいは核酸の５’末端及び／または３’末端に付加された非翻訳配列によってもたらされる。それ故に、本発明は、前記に規定した核酸のいわゆる「変異体」も含む。用語「ストリンジェントなハイブリダイズする条件」は、特に、ハイブリダイゼーションが生じる条件を意味するものとして理解されており、例えば、２．５×ＳＳＣバッファーで６０℃の後に、より低いバッファー濃度において３７℃で数回洗浄段階を経て、安定した状態になっているものである。

本発明のペプチド及び核酸は、天然物、組換体または合成起源のものであることが可能であると一般的に理解される。ペプチドを作製し、合成しまたは改良する方法は、周知の技術である。適切な方法には、化学合成、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニングまたはより長いポリヌクレオチドからの直接切断が含まれる。本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明のペプチド作製に有用であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｅｘ ｖｉｖｏで行ってもよい。ポリヌクレオチドは、治療剤または免疫付与剤として、それ自体使用してもよいし、または組換ペプチド合成に用いてもよい。

さらなる態様において、本発明は、本明細書で規定した核酸を含むベクターを提供する。

本発明のベクターは発現ベクターであるのが好ましく、医薬応用に適合し得る真核生物の発現ベクターであるのが好ましい。

「ベクター」は、細胞内に遺伝物質を送達させるのに適した核酸分子から成る、またはそれらを含む構造を参照する。一般的に、選択される核酸配列は、ベクターの核酸分子内に挿入される。例としては、プラスミド及びウィルスベクターが含まれる。「発現ベクター」は、細胞内で挿入された核酸のコード配列の発現が可能となるように作製され適合されたベクターである。それ故に、このベクターは核酸配列を含み、コード配列に対して適切な位置での転写開始を可能にさせる。発現ベクターは、原核または真核細胞内での発現に適合され得るので、「真核細胞発現ベクター」は、真核細胞内でのコード配列の発現を可能とするよう作製される。本発明の発現ベクターの好ましい例としては、アデノウィルス、ＡＡＶ、レンチウィルスが含まれる。

さらなる態様において、本発明は、前記で規定したペプチド及び／または核酸及び／または発現ベクターを含む医薬組成物並びに医薬として許容される担体を提供する。

用語「医薬として許容される担体」は、一般的に、ペプチド、核酸またはベクターが混合可能な成分を含み、並びに受益者にとって有害でない成分を含む。一般的に、担体は、無菌及びパイロジェンフリーの、水または生理的食塩水である。しかしながら、他の可能な担体を使用してもよい。一般的に、本発明の医薬組成物及び処方は、非経口的投与であり、特には、静脈内投与である。

さらなる態様において、本発明は、αｖβ６を介した疾病あるいはαｖβ６が過剰発現している疾病における治療用薬剤の調合のために、本発明に従ってペプチド及び／または核酸及び／または発現ベクターの用途を提供する。

さらなる態様において、本発明は、前記で規定したペプチド及び／または核酸及び／または発現ベクター及び／または医薬組成物を患者に投与することを含む、αｖβ６を介した疾病を治療するための方法を提供する。本明細書で触れたように、これらの条件は、損傷治癒及び炎症の一般的な部分内のものでよい。

この疾病は、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性損傷皮膚病（例えば表皮水泡症）または癌から選ばれるのが好ましい。

前記で規定した本発明の薬剤または医薬組成物は、当業者に技術的に既知のように、他の薬剤を投与されている患者に投与することもまた有用であろう。例えば、癌の場合においては、本発明の薬剤または医薬組成物は、他の抗腫瘍剤の投与の前、後または間に患者に投与されてもよく、例えば化学療法の前、後または間でもよい。化学療法後のペプチドによる治療は、特に癌の再発または転移を、減少若しくは抑制させるのに有効な可能性がある。例えば、抗腫瘍剤は、（リポソーム／ナノ粒子を通して）直接または間接的に、本発明のペプチドに共有的に結合され得る。

さらなる態様においては、本発明は、個体の体内におけるαｖβ６を過剰発現している上皮細胞を画像化する方法を提供し、その方法は、前記で規定したペプチドを有効量で個体に投与することが含まれる。この方法は、特に、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性損傷皮膚病（例えば表皮水泡症）または上皮腫瘍細胞の画像化に有用である。例えば、画像化の方法は、標的ペプチドを蛍光プローブに連結させることを含んでもよく、並びにうがい薬、チューインガム、スプレーまたは他の利点となる物（例えばαｖβ６が結合したペプチド−プローブ複合体は、この蛍光タグによって視覚化されてもよい）の中に取入れられてもよい。

さらなる態様において、本発明は、αｖβ６を介した疾病またはαｖβ６が過剰発現している疾病を持つ個体の診断または予後診断のための方法を提供し、その方法には、前記で記載されたペプチドを有効量個体に投与すること並びにペプチドがαｖβ６に結合することを検出することが含まれる。

さらなる態様において、本発明は、αｖβ６を発現している細胞あるいは患者のαｖβ６を発現している細胞を含んでいる組織に対しての治療上の活性部分を投与する方法を提供し、その方法には、特許権を取得すべく前記に規定した治療上の活性部分に連結されたペプチドを投与することが含まれる。

さらなる態様において、本発明は、ペプチドのαヘリックス含量を増加させまたは変更させることによって、αｖβ６結合ペプチドの結合特異性を改善する方法を提供する。例えば、ペプチドのαヘリックス含量は、配列Ｂ_ｎＲＧＤＬＸＸＬＸＸＸＺ_ｍ内の残基を、他の天然または合成アミノ酸のいずれかに変え、その結果として生じるペプチドのαヘリックス含量を測定することによって、増加する可能性がある。あるいは、ペプチドは飽和移動差ＮＭＲを用いることによって改良され得るが、それにより、ペプチドのどの残基が、精製されたインテグリン（そのインテグリンは、α５β１、α８β１、α２ｂβ３、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８を含んでよい）と最も直接相互作用する可能性が高いかを決定でき、並びに、特定の側鎖、比電荷分布、または（非αｖβ６インテグリンに対しての結合を減少させ若しくはαｖβ６インテグリンに対しての結合を増加させるような）他の改良を適切に所持する残基を、それに引き続いて挿入することができる。

用語「結合特異性を改善する」には、例えばαｖβ３のような、他のインテグリンに対しての親和性と比較して、αｖβ６に対してのペプチドの親和性を増加させることが含まれる。

細胞株及び抗体
レトロウィルス感染は、本研究で用いるαｖβ６ポジティブ及びネガティブ細胞株を作製するために利用された。マウス３Ｔ３繊維芽細胞並びにヒト黒色腫細胞株Ａ３７５Ｐ及びＤＸ３は、３Ｔ３β６ｐｕｒｏ、Ａ３７５Ｐβ６ｐｕｒｏ及びＤＸ３β６ｐｕｒｏを作製するために、ヒトｂ６及びピューロマイシン耐性遺伝子をコードするレトロウィルスによって感染された（Thomas et al; J Invest Dermatol.116(6) :898-904, 2001）。コントロール細胞はピューロマイシンのみを発現した（Ａ３７５Ｐｐｕｒｏ細胞並びに、しばしば３Ｔ３β６．１９またはＮＩＨ３Ｔ３β６．１９と呼ばれる、３Ｔ３β６ｐｕｒｏのコントロールとして供されるＤＸ３ｐｕｒｏ親細胞３Ｔ３細胞）。

インテグリンサブユニットの細胞質及び膜貫通領域が欠損している、組換可溶αｖβ６を分泌する、ＣＨＯβ６細胞
ＶＢ６は、αｖβ６を高発現している口腔扁平上皮癌（Thomas et al, 2001）であり、Ｖ（＋）Ｂ２は、αｖβ１を高発現しているヒト黒色腫である（Marshall et al 1995）。さまざまなマウスモノクローナル抗体を用いた。αｖβ３（ＬＭ６０９）、αｖβ６（１０Ｄ５）及びａ５（Ｐ１Ｄ６）に対しての抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ｅｍｅｃｕｌａ ＣＡ．，ＵＳＡ）から購入した。６３Ｇ９（抗αｖβ６）及び３７Ｅ１（抗αｖβ８）、Ｐ２Ｗ７（抗αｖ；所内作製）、Ｌ２３０（抗αｖ；ＡＴＣＣより）、Ｐ１Ｆ６（抗αｖβ５；Ｄｒ Ｄｅａｎ Ｓｈｅｐｐａｒｄより譲受）及びＡ２Ｂ２（抗β１；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａより購入）は、それぞれハイブリドーマから所内で作製した。フィブロネクチン（Ｆ２００６；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、メーカーの使用説明書に従って、キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＫ）を用いてビオチニル化した。他の全ての試薬は、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。

組換可溶αｖβ６の作製
ＣＨＯβ細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が添加されたＲＰＭＩ培地で８０−９０％の密集度で培養し、低血清培地（ＬｏｗＳＭ；ＲＰＭＩ（０．５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ）で一度洗浄し、ＬｏｗＳＭで４８時間インキュベーションした。細胞残屑は９８２ｇで遠心分離によって馴化培地から除去し、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを腐剤として添加した。馴化培地を（３００倍まで）濃縮し、同時にカットオフが１００ｋＤａ（ミリポア）のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−８０遠心フィルター器具を用いて、ＰＢＳでダイアフィルターした。メーカーの使用説明書に従ってＣａｒｂｏｌｉｎｋキット（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＫ Ｌｔｄ）を用いるグラビティーフローアガロースビーズカラムで７ｍｌに、マウスモノクローナル抗αｖ抗体Ｌ２３０（カップリングバッファー０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ＰＨ７．０において）を共役させることによって作製したイムノアフィニティーカラムに、この濃縮物を加えた。組換可溶αｖβ６（ｒｓαｖβ６）を、１００ｍＭ、ｐＨ２．５−３．０のグリシンで溶出し、２ｍｌのフラクションごとに１Ｍ、ｐＨ７．５のＴｒｉｓを３００μｌ添加することにより、即座に中和した。ピークフラクションを、２８０ｎｍの吸光度にしたがって選択し、カットオフが５０ｋＤａ（ミリポア）の公称分子重量を持つＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルター器具（ＮＭＷＣＯ）を用いて、ＰＢＳで透析した。溶出したタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定し、その濃度を、ＢＳＡスタンダードを用いて、ＢｉｏＲａｄのＤＣプロテイン濃縮アッセイによって決定した。ｒｓαｖβ６の機能保全（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を、９６ウェルプレートに固定化したフィブロネクチン及び潜在型結合ペプチド（ＬＡＰ）（αｖβ６リガンド）に結合するインテグリンを示すことにより、確認した。

細胞接着アッセイ
ＥＣＭリガンドでコーティングされた９６ウェルフレキシブルプレートへの、［^５１Ｃｒ］でラベルされた細胞の接着は、以前より記載されている（Thomas et al, 2001）。手短に言えば、プレートをＬＡＰ（ＮＩＨ３Ｔ３β６．１９に対して０．２５μｇ／ｍｌ、ＶＢ６に対して０．５μｇ／ｍｌ）またはビトロネクチン（１０μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）でコーティングした。細胞を４０分間（ＶＢ６、ＮＩＨ３Ｔ３β６．１９）または６０分間（Ｖ＋Ｂ２）接着を可能にさせた後に、プレートを陽イオン（０．５ｍＭ Ｍｇ^２＋、１ｍＭ Ｃａ^２＋）を添加したＰＢＳで２度洗浄した。プレートをハサミで切り、各ウェルの放射能を、Ｗｉｚａｒｄ１４７０自動ガンマ線測定器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）で定量化した。接着率は、次式のとおり、各ウェルと相関する残留放射能を、細胞に最初にインプットした細胞の放射能と比較することにより計算した。
接着率（％）＝ウェルの残留放射能（ｃｐｍ）Ｘ１００／インプットした放射能（ｃｐｍ）

全てのサンプルは、少なくとも３回の別々のアッセイにおいて、４ウェル１組で評価された。

競合的なサンドイッチＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＢ，Ｔｈｅｒｍｏ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を、ＰＢＳに１０μｇ／ｍｌのＰ２Ｗ７を添加して、４℃で一晩、コーティング後、ＰＢＳで洗浄する前に、ＰＢＳに２％（ｗ／ｖ）のカゼインを添加して、インキュベーションによりブロッキングした。その後のすべての洗浄には洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２）を用い、その後のすべてのインキュベーションは、コンジュゲートバッファー（１％カゼイン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２）で行った。ウェルをｒｓαｖβ６で１時間インキュベーションし、洗浄後、ペプチド及び２μｇ／ｍｌのビオチニル化したフィブロネクチンのプレミックス溶液にエクスポーズした。結合したビオチニル化したフィブロネクチンを、エクストラアビジンＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ）で、１：１０００の希釈で検出し、ＴＭＢ＋システム（ＤＡＫＯ）を用いて現像した。アッセイを、Ｔｅｃａｎ ＧＥＮｉｏｓプレートリーダーで、Ａ４５０ｎｍの吸光度を測定することにより定量化した。全てのデータは、各プレートにおいてビオチニル化したフィブロネクチンの標準曲線によって確認され、線形範囲（ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ）内にあった。

フローサイトメトリー
細胞株におけるインテグリンの発現を、以前記載されたように（Marshall et al . , 1995）、フローサイトメトリーによって評価した。手短に言えば、細胞懸濁液を、１０μｇ／ｍｌの抗インテグリン抗体またはさまざまな濃度のビオチニル化したペプチドで、インキュベーションした。４℃で４５分後、細胞を洗浄し、結合した抗体／ペプチドを、マウス抗ビオチン（１：１００、Ｓｔｒａｔｅｃｈ，ＵＫ）で３０分のインキュベーションを行った後、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ（終濃度１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）またはストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（終濃度１：２００）でそれぞれさらに30分間インキュベーションした後に検出した。サンプルあたり１０，０００事象を検出するＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアが適合されたＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で細胞を解析した。

ペプチド合成
ペプチドは、標準的な固相ペプチド合成法を用いて、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで合成された。手短に言えば、保護アミノ酸及びプレロードするワング樹脂を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）より手に入れた。溶媒及びＨＢＴＵ［３−テトラメチルウロニウム３，１，−１，２−（^１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ヘキサフルオロリン酸塩］は、アプライドバイオシステムズ社（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）より手に入れた。ベーシックフィードバックモニターサイクル及びカップリング試薬としてのＨＢＴＵを用いて、プレロードしたワング樹脂上で、アップデートしたモデル４３１Ａ及び４３３Ａアプライドバイオシステムズ社の固相ペプチド合成機により、このペプチドを合成した。９−フルオレニルメチルオキシカルボニルは、一時的なａ−アミノ基の保護に用いられ、ピペリジンを用いて除去した。側鎖の保護基は、Ｌｙｓに対してはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルであり、Ｈｉｓ、Ａｓｎ及びＧｌｎに対してはトリチルであり、Ａｒｇに対しては２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニルであり、Ｇｌｕ及びＡｓｐに対してはｔｅｒｔ−ブチルエステルであり、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ及びＴｙｒに対してはｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。

樹脂からの切断及びこのペプチドの脱保護は、９．２５ｍｌのトリフルオロ酢酸、０．２５ｍｌのエタンジチオール、０．２５ｍｌのトリイソプロピルシラン、０．２５ｍｌの水を含んだ、１０ｍｌの混合物で、２０℃（室温）で４時間、ペプチジル−レジンを処理することにより実行できた。このペプチドを、氷で冷やしたジエチルエーテルを用いて沈殿させてから、軽いバキュームの下、細いガラスろ過漏斗でろ過した。このペプチドの沈殿物を、１０％酢酸／水溶液に溶解し、凍結乾燥させた。

粗ペプチドを、Ａｑｕａｐｏｒｅ ＯＤＳ２０ ｍｉｃｒｏｎ２５０Ｘ１０ｍｍのカラムで逆相ＨＰＬＣにより精製した後、精製したペプチドの信憑性を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ社ＬＣＱイオントラップ質量分析計を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法ＴＯＦ型）質量分析により確認した。ペプチドの中には、標準的な手順を用いる樹脂担体上で、ｉｎ ｓｉｔｕでビオチニル化されたものがあった。

ＮＭＲ用サンプル調整
濃度２５ｍＭリン酸及び濃度１００ｍＭ生理食塩水を加えた、２ｍＭ、ＰＨ６．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、精製し凍結乾燥させたペプチドを、Ｓｈｉｇｅｍｉ社ＢＭＳ００５Ｖ ＮＭＲチューブで使用できるよう溶解することにより、全てのＮＭＲ用サンプルを、最終容量３００μｌに調整した。構造研究用に、トリフルオロエタノール−ｄ３（ＴＦＥ）を、３０％（ｖ／ｖ）の終濃度を提供できるように、ヘリックス安定剤として加えた。飽和移動差ＮＭＲ（ＳＴＤ ＮＭＲ）のサンプルを、追加成分（２８μＭのインテグリンαｖβ６、０．５ｍＭ、Ｍｇ^２＋（ＭｇＣｌ_２として添加）及び１．０ｍＭ Ｃａ^２＋（ＣａＣｌ_２として添加））を加えて同様に調整した。ＳＴＤ ＮＭＲサンプルはＴＦＥを含まなかった。

ＮＭＲスペクトロスコピー
全ての実験を、標準的な手順を用いるｚ−ｓｈｉｅｌｄｅｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｔｒｉｐｌｅ共鳴プローブを用いて、Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ社製ＩＮＯＶＡ６００ＭＨｚのＮＭＲスペクトロメータで記録した。型構造物実験は各ペプチドサンプルに対して１０℃で行い、それにはｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ（２Ｄ）ｎｕｃｌｅａｒ Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＮＯＥＳＹ）、ｔｏｔａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＴＯＣＳＹ）及びｒｏｔａｔｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＲＯＥＳＹ）実験（それぞれミキシング時間を２５０、７０．０及び１００ｍｓで記録した）が含まれた。これらの実験は、^１Ｈ次元で間接的及び直接的にそれぞれ収集される６４及び１２８ｍｓの収集時間における、５１２及び１０２４ポイント（ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｏｉｎｔ）において収集された。さらに、二量子フィルターによる相関分光法（ＤＱＦＣＯＳＹ）実験では、各ペプチドについて１０℃で、^１Ｈ次元で間接的及び直接的にそれぞれ収集される、１２８及び２５６ｍｓの収集時間における１０２４及び２０４８ポイント（ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｏｉｎｔ）において収集された。アミドプロトンの遅い置換が、５０ｍｓのミキシング時間でのＮＯＥＳＹ実験（^１Ｈ次元で間接的及び直接的にそれぞれ収集される、１６及び１２８ｍｓの収集時間における、１２８及び１０２４ポイント（ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｏｉｎｔ）において、それぞれ収集された）でのフィンガープリント領域より検出された。データの処理及び解析は、処理用にはＮＭＲＰｉｐｅ(Delaglio et al, 1995)上で、並びに計算された構造を見るためにはＮＭＲＶｉｅｗ (Johnson and Blevins, 1994)を用いる、Ｓｕｎ Ｂｌａｄｅ１００、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃ Ｏｃｔａｎｅ２及びＴｒａｎｓｔｅｃ Ｘ２１００ Ｌｉｎｕｘ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎｓで行った。飽和移動差ＮＭＲ（ＳＴＤ ＮＭＲ）実験は、標準的な飽和移動実験装置を用いて、Ｍａｙｅｒ及びＭｅｙｅｒ（それぞれ１９９９年、２００１年）によって記載されたように、ただしＹａｎなどによって２００３年に記載されたようにハーンエコーフィルターを組み入れて、行った。ＳＴＤ差異データは、３０ｍｓのハーンエコーフィルター長並びに、全てのデータポイント並びに、８１９２及び１６３８４での一時的なデータポイントをそれぞれ用いて、６０００Ｈｚの分光幅で２５℃において得られた。オンレゾナンス照射は−２．５ｐｐｍでありオフレゾナンス照射は−７０．０ｐｐｍであった。照射は、連続した９．４ｍｓのガウスパルスを用いて作動され、各パルスは、１．７ｍｓ遅れることによって分離される各パルスと、１００Ｈｚの帯域幅を持っていた。全パルス列は２．０ｓ間作動された。ＳＴＤ ＮＭＲの転送データのアサインメントを可能にするため、ペプチド配置（ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）を、２５℃で得られた、（２Ｄ）ｎｕｃｌｅａｒ Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＮＯＥＳＹ）、ｔｏｔａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＴＯＣＳＹ）及びｒｏｔａｔｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＲＯＥＳＹ）実験より作成した。レゾナンスの体積積分（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｖｏｌｕｍｅ ｉｎｔｅｇｒａｌ）は、ＳＵＮ ＵＮＩＸ（登録商標）ワークステーションを動作させるＶＮＭＲソフトウェア、並びに７１．４を超えるリガンドを用いるＳＴＤ増幅係数を得るためにＭａｙｅｒ及びＭｅｙｅｒ（２００１年）によって概説された方法に従って解析されたデータ、を用いて得られた。個別の拡散係数は、各残基に対しての各^１Ｈレゾナンスからの拡散係数の和により、各アミノ酸残基について得られた。残基増幅係数を、最も高い残基係数（つまり１００％）と比較可能とするために、残基のＳＴＤ増幅係数の百分率に変換した。

円偏光二色性
ＣＤスペクトルは、ＮＭＲでの研究で用いたものと同一でＴＦＥ（０−５０％（ｖ／ｖ））を含んでいるバッファーにおいて、０．４ｍＭ濃度のペプチドを用いて、室温で、Ｊａｓｃｏ社Ｊ−６００分光偏光計上で記録した。各溶液を５ｍｍの長さ（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）の石英キュベットにロードし、各スペクトルは、１９０から２６０ｎｍ間の範囲で４回スキャンしたときの平均値から算出したが、それらを、２０ｎｍ／分の速さ、１ｎｍの帯域幅、２ｓの応答、０．２ｎｍの分解能で記録した。このスペクトルは、ベースライン補正なしで示す。分光偏光計により得られたＯＤ値を、楕円率に変換し、並びにＪ−７００ウインドウ標準解析（ｖ．１．５０．０１）ソフトウェアによって相対的なペプチド濃度に合致させた。３つの波長、２２２、２０８及び１９２ｎｍでの楕円率の値を、Ｆｏｒｏｏｄなど（１９９３年）により記載された手法を用いて、ＴＦＥ濃度（０−５０％（ｖ／ｖ））間での各ペプチドに対して得られる平均楕円率（平均値ｑ）に変換した。

構造の計算及び解析
全ての構造計算は、シリコングラフィックス社Ｏｃｔａｎｅ２及びＴｒａｎｓｔｅｃ社Ｘ２１００リナックスワークステーション（Brunger et al, 1998）上で作動する結晶学及びＮＭＲシステム（ＣＮＳ）バージョン１．１を用いて取得した。伸長され、及び折畳まれた、前駆体の両方からの拘束を伴う動的アニーリングを行うための、平均化する和を、標準的なＣＮＳ ＮＭＲアニールプロトコルを用いることにより、伸長された座標から計算された、最終構造が２．５−５．０Åの間の幅広い分類の中に、全てのＮＯＥ及びＲＯＥの接触（ｃｏｎｔａｃｔ）を、分類した。各ペプチドに対しての４０個の構造の最終的な構造アンサンブルは、構造的な情報の統計的エネルギー及び標準偏差（ｒ．ｍ．ｓ）を算出するのに用いられる全ての構造とともに算出された。骨格及び重原子のｒ．ｍ．ｓの偏差値は、ＭＯＬＭＯＬバージョン２ｋ．２(Koradi et al, 1996)を、ＰＣ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００を動作させることにより得られた。各アンサンブルの構造的なインテグリティ（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、Ｔｒａｎｓｔｅｃ社Ｘ２１００リナックスワークステーション上で動作する、ＰＲＯＣＨＥＣＫ−ＮＭＲ(Laskowski et al, 1996)を用いて評価した。ＣＮＳで作製される構造アンサンブル間のエネルギー比較を、ＤＥＥＰＶＩＥＷバージョン３．７(Guex and Peitsch, 1997)内でのＧＲＯＭＯＳ９６ ４３Ｂｌパラメーターセット(van Gunsteren, 1994)を用いることにより行った。

〈実施結果〉
αｖβ６リガンド由来ペプチドがＤＬＸＸＬに必要なことを確認
インテグリンαｖβ６は、ある程度、このペプチドのモチーフであるＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の認識を介して、このリガンドに結合する。インテグリンαｖβ６のリガンドには、本発明者たちが高い選択性を持つαｖβ６接着リガンドであることを発見したＴＧＦβ潜在型結合ペプチド（ＬＡＰ）、並びにフィブロネクチン並びに口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）を含むある種のウィルスが含まれる。それ故に、本発明者たちは、必要なＲＧＤモチーフが含まれた、既知のαｖβ６リガンド由来の、並びにＬＡＰ及びＦＭＤＶ（ＤＤ１−ＤＤ１９）の２つの血清型由来の、重複した７−１２ｍｅｒの直鎖ペプチドを調べることを選択した。初期研究では、このペプチドを、腫瘍細胞３Ｔ３β６．１９及びＶＢ６のＬＡＰに対してのαｖβ６依存的な接着の阻害能力を調べるために、５００μＭの濃度で試験した。最も有効なペプチドは、以前に重要性が発見されていた、配列ＤＬＸＸＬ（あるいは類似のＤＬＸＸＩ）を持つペプチドであることが示された(Kraft et al, J Biol Chem. Jan 22; 274 (4) : 1979-85. 1999)。

第二世代のαｖβ６標的ペプチド：２０ｍｅｒの、リガンドベースな、ＲＧＤＬＸＸＬ／Ｉペプチド
より長いペプチドまたは、少なくともＲＧＤモチーフのＣ末により多くの残基を持つペプチドは、Ｎ末に配列を付加したペプチドに比べて、αｖβ６依存的な接着に対して、より効果的な阻害剤となることが示唆された。この可能性を調査するために、本発明者たちは、ＬＡＰβ１（Ａ２０ＬＡＰ）及び口蹄疫ウィルスの血清型Ｃ−Ｓ８ｃ１（Ａ２０ＦＭＤＶ１−Mateu et al.,1996）及びＯ１ＢＦＳ（Ａ２０ＦＭＤＶ２−Logan et al., 1993）由来の、伸長したＣ末領域を持つ２０ｍｅｒのペプチドを作り出し、実験を繰返した。

図２により、Ａ２０ＬＡＰ、Ａ２０ＦＭＤＶ及びＡ２０ＦＭＤＶ２が、ＬＡＰへの３Ｔ３β６．１９（図２（ａ））及びＶＢ６（図２（ｂ））のαｖβ６依存的な結合を阻害するのに、遥かに有効的であることが確認される。それ故に、３Ｔ３β６．１９のＤＤ１阻害における、最短ＬＡＰペプチドのＩＣ５０が、２１６μＭ（データは示していない）である一方で、Ａ２０ＬＡＰのＩＣ５０は１３．８μＭである。同様に、ＤＤ１９に対してのＩＣ５０は、Ａ２０ＦＭＤＶ２が１．２μＭであるのに比較して、短いＦＭＤＶ２ペプチドは１９０μＭである。

２０ｍｅｒのＲＧＤＬＸＸＬ／Ｉペプチドは、より短いＲＧＤＬＸＸＬ／Ｉペプチドよりも、αｖβ６依存的な細胞接着の接着阻害剤としてより有効である
伸長させたＣ末配列が、抗αｖβ６ペプチドの有効性を増加させるという仮説を調査するために、Ａ２０ＬＡＰのαｖβ６特異的な活性を、同じペプチドの短いバージョンである、ＤＤ１，２，３と比較した。Ａ２０ＬＡＰは、ＬＡＰでコーティングしたプレートでの３Ｔ３β６．１９のαｖβ６依存的な細胞接着阻害について、有意により有効であった。それ故に、Ａ２０ＬＡＰ、ＤＤ１及びＤＤ３のＲＧＤのアミノ酸Ｃ末の数は、それぞれ１１、５及び４であり、これはペプチドの効力順を再現する。上述したのを受けて、２０μＭのＡ２０ＬＡＰ、ＤＤ１及びＤＤ３の存在時には、ＬＡＰとの３Ｔ３β６．１９の接着は、それぞれ、コントロールの細胞接着の３２±７％、５７±４％及び７９±２２％だけであった。さらに、この実験は、別の細胞株、ＶＢ６を用いて繰返した。ＶＢ６は、αｖβ６を高発現しているヒト口腔扁平上皮癌である（Thomas et al, 2001b）。したがって、ヒトαｖβ６がもっぱら天然の上皮環境で発現されているので、より適したモデルである。３Ｔ３β６．１９と同様に、ＬＡＰとのＶＢ６の接着は、αｖβ６阻害抗体６３Ｇ９により無効になり、それ故にもっぱらαｖβ６依存的と考えられる。アッセイ中のバラツキによる定量の困難さの一方で、３Ｔ３β６．１９で見られたのと同じ傾向が、ＶＢ６を用いたアッセイでも広く観察できる。上述したように、１００μＭのＤＤ１、ＤＤ２及びＤＤ３では、ＬＡＰとのＶＢ６の接着に関する効果はほとんどないが、しかし一方で、より長いペプチドＡ２０ＬＡＰは、この濃度での細胞接着を完全に阻害する。

同様に、Ａ２０ＦＭＤＶ２は、同じアミノ酸配列に基づいたより短いペプチドであるＤＤ１９よりも、ＬＡＰとのＶＢ６接着について、著しく有効な阻害剤である。この効果は劇的である、すなわち、２０μＭのＤＤ１９存在下での細胞接着は、ペプチド不存在下での接着と同じであるのに対して、２０μＭのＡ２０ＦＭＤＶ２の存在下では、接着はバックグラウンドレベルまで減少する。

競合的なサンドイッチＥＬＩＳＡ
この傾向が、別のプロテインアッセイでも再現できるか確認するために、競合的なサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。手短に言えば、９６ウェルプレートは、４℃で一晩インキュベーションすることにより、抗αｖ抗体Ｐ２Ｗ７でコーティングした。残存した非特異的な結合部位は、２％（ｗ／ｖ）カゼイン入りのＰＢＳ溶液でインキュベーションすることにより阻害した。ウェルは、その後ｒｓαｖβ６でインキュベーションした後、洗浄し、ビオチニル化したフィブロネクチン及びペプチドのプレミックス溶液にエクスポーズした。結合した、ビオチニル化したフィブロネクチンは、ペルオキシダーゼ共役エクストラアビジンで検出した。９点の用量反応曲線を、７つの濃度のぺプチド及びポジティブコントロール及びネガティブコントロールを用いて作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアでのシグモイドカーブフィットモデルを用いてＩＣ５０の濃度を決定した。

興味深いことに、競合的なサンドイッチＥＬＩＳＡで観察されたこれらの傾向は、細胞接着アッセイで観察されたものとわずかに異なっている。ＬＡＰベースの短いペプチドＤＤ２及びＤＤ３は、より長いペプチドＡ２０ＬＡＰよりも、有意な、より低いＩＣ５０を持つにも関わらず、短いペプチドＤＤ１は、Ａ２０ＬＡＰのＩＣ５０と非常に類似する。

細胞接着アッセイによる、２０ｍｅｒのＲＧＤＬＸＸＬ／Ｉペプチドの解析
３つの２０ｍｅｒのペプチドＡ２０ＬＡＰ、Ａ２０ＦＭＤＶ１及びＡ２０ＦＭＤＶ２は、αｖβ６依存的な細胞接着の阻害のために評価された。多種多様なペプチド濃度を、阻害カーブを作成するために用い、その阻害カーブより、下表で示すように、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＩＣ５０値を計算した。３Ｔ３β６．１９とＶＢ６の両アッセイにおいて、Ａ２０ＦＭＤＶ２が最も有効なαｖβ６依存的な細胞接着の阻害剤であり、Ａ２０ＬＡＰがそれに続いた。Ａ２０ＦＭＤＶ１は両アッセイにおいて最も効果の弱い阻害剤であった。それ故に、予測されたヘリックス構造は、αｖβ６依存的な細胞接着アッセイの阻害におけるペプチドの有効性と相関性がある。興味深いことに、全てのペプチドのＩＣ５０は、競合的ＥＬＩＳＡでの細胞接着アッセイよりも、細胞接着アッセイでは約１０００倍以上高かった。なお、この効果は、抗αｖβ３ペプチドにおいて以前に報告されている（Goodman et al, 2002）。

２０ｍｅｒのペプチドアンタゴニストの結合型ヒエラルキー
αｖβ６に対しての各ペプチドの結合能を比較するために、９６ウェルプレートにｒｓαｖβ６を固定化した。さまざまな濃度のビオチニル化したＡ２０ＦＭＤＶ１、Ａ２０ＬＡＰまたはＡ２０ＦＭＤＶ２が、１ｍＭのＣａ^２＋及び０．５ｍＭのＭｇ^２＋イオン存在下で、４５分間プレートに加えられた。結合したペプチドは、ストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した。さらに、ビオチニル化した、各ペプチドのスクランブル仕様（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）でも試験した。図３は、αｖβ６への結合能を、Ａ２０ＦＭＤＶ２、Ａ２０ＬＡＰ及びＡ２０ＦＭＤＶ１の順に示す。上述したように、Ａ２０ＦＭＤＶ２は全ての濃度において、固定化したｒｓαｖβ６に対してより強く結合した。１０ｎＭの濃度では、各ペプチドは、ほとんど最大の結合能を依然として示したが、それと対照的に、スクランブルコントロール（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）は、結合を示さなかった。１ｎＭでさえ、Ａ２０ＦＭＤＶ２は最大の５０％の結合能を示した。興味深いことに、スクランブルＡ２０ＬＡＰは１０μＭ及び１μＭで結合を示したが、それと対照的に、ＦＭＤＶペプチドは、試験したどの濃度でも、ほとんど結合を示さなかった。

ＡＧＡＤＩＲで、２０ｍｅｒのαｖβ６アンタゴニストのヘリックス傾向を予測する
ＬＡＰベースとＦＭＤＶベースの両ペプチドにおいては、より長いペプチドが、より短いペプチドよりも、αｖβ６をより有効に阻害したが、それは用いた全てのペプチドが、決定的なＲＧＤＬＸＸＬ／Ｉモチーフを含んでいた場合であった。しかしながら、このモチーフを除けば、Ａ２０ＬＡＰ及びＡ２０ＦＭＤＶ２の配列間には明白な類似性はない。それ故に、このモチーフが単に、より長いペプチド内で伸長されただけというのはありそうにない。他に考えられる説明は、増加された長さが、ＲＧＤＬＸＸＬ／Ｉモチーフの提示を変化させることによって、αｖβ６に対してのペプチドの親和性の変化を引き起こしたというものであった。それ故に、ＲＧＤＬＸＸＬ／Ｉの活性立体配座を潜在的に安定化できる、二次構造の存在が考えられた。

直観的には、長い直鎖ペプチドは、三次元（３Ｄ）空間において、より短いペプチドの場合よりも、より多くの形態が想定可能であり、これらの長い形態のほとんどは、受容体に対しての最適なリガンドとなる見込みはなさそうである。本発明者たちの実験より、より長いペプチドは、より短いペプチドよりも、αｖβ６における、より有効な阻害剤であることから、可能となる３Ｄ立体配座の数を最小限にさせる二次構造の可能性が示唆される。溶液中では、ＶＰｌコートタンパク質は、構造化されていない（Logan et al 1993）。しかし、Ｌｏｇａｎと同僚たちは、ＦＭＤＶのＶＰ１ドメインの免疫原性Ｇ−Ｈループの結晶構造の特性化を行った。彼らは、そのループが、結晶内にヘリックス構造を持つであろうことを報告した。それ故に、本発明者たちは、前記２０ｍｅｒペプチドもまた、構造を熱力学的に安定化させるであろうヘリックス構造を持つと考えた。本発明者たちは、ペプチド内のヘリックス傾向を予測する、ＡＧＡＤＩＲ（Munoz and Serrano, 1994, 1995）ソフトウェア内にアミノ酸配列を挿入した。このソフトウェアにより、ペプチド内の個々の残基がヘリックス構造部分である確立値が割当てられた。このソフトウェアは、ヘリックス構造を合理的に予測する正確な方法として広く認められている。図４は、三つ全ての２０ｍｅｒのペプチドが、Ａ２０ＦＭＤＶ２＞Ａ２０ＬＡＰ＞Ａ２０ＦＭＤＶ１の順番で、ＤＬＸＸＬ／Ｉ領域内にヘリックス傾向を持つこと、しかしながらＡ２０ＦＭＤＶ２は、Ａ２０ＬＡＰまたはＡ２０ＦＭＤＶ１のいずれよりも、ヘリックス傾向の見込みがずっと高いこと、並びにそれはＤＬＸＸＬ／Ｉを超えて伸長されていることを示した。それ故、２０ｍｅｒのペプチドの予測されたヘリックス傾向は、αｖβ６アンタゴニストとして有効であることと相関する。この仮説を調べるために、３つの、２０ｍｅｒのペプチドを、生化学的及び構造的に、より詳細に研究した。

遠紫外線ＣＤ解析
円偏光二色性は、紫外線がキラルな環境を通過した時に発生する、偏光の変化に基づく光学的な技術である。左円及び右円の偏光の差吸光度により、円偏光が楕円偏光化することが引き起こされる。二次構造の異なる形態（βシート、ヘリクスターンヘリックス、さらには構造を持たない「ランダムコイル」の状態）の異なるキラルな環境が、それぞれに対して、それ自身の特徴ある遠紫外線ＣＤスペクトルを生じさせる。それ故に、ＣＤは、特定のタンパク質またはペプチドにおける、二次構造の各タイプの量を研究するために用いられ得る。

本発明者たちの２０ｍｅｒのペプチドが、ヘリックス構造を形成するかを確認するために、本発明者たちは、ヘリックス安定剤であるＴＦＥの濃度を増加させて、各ペプチドの遠紫外線円偏光二色性（遠紫外線ＣＤ）スペクトルを決定した（図５）。サンプル間の相互比較を可能とするために、０−５０％（ｖ／ｖ）の間の割合でＴＦＥが入ったＰＢＳ内での、各ペプチドの平均残基楕円率（θ−［ｑ］２２２）を、図５で示す。図４（Ａ−Ｃ）は、２状態の平衡が、各ペプチドの折り畳まれていない状態とヘリックスペプチド状態間に存在しているということを指し示す、２０２ｎｍでのｉｓｏｄｉｃｈｒｏｉｃ ｐｏｉｎｔをそれぞれ説明する（Khandelwal et al, 1999）。平均分子楕円率により、Ａ２０ＦＭＤＶ２とＡ２０ＬＡＰの両方が、ＴＦＥ１０−２５％間でヘリックスへ遷移し、その一方で、Ａ２０ＦＭＤＶは、ＴＦＥにおいて、より広範な濃度範囲（ＰＢＳ中、１０−４０％（ｖ／ｖ））で遷移することが同定される。それ故に、もし安定化の影響が存在するのであれば、三つ全ての２０ｍｅｒのペプチドが、それらの構造内にヘリックスを形成することになるが、Ａ２０ＦＭＤＶ１と比較した場合に、Ａ２０ＦＭＤＶ２及びＡ２０ＬＡＰでヘリックスを形成するための傾向が増加されることが、ＣＤデータにより示される。それ故に、実験で決定されるヘリックス傾向は、抗αｖβ６の有効性と相関する。

αｖβ６の２０ｍｅｒ−ペプチドアンタゴニストのＮＭＲ解析
スピン系を、共鳴アサインメント（帰属）（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）とともに、二次元ＤＱＦ−ＣＯＳＹ及びＴＯＣＳＹ ＮＭＲスペクトルの解析によって同定し、並びに観察された^１Ｈ化学シフトは全て表３にリスト化した。全ての^１Ｈスピン系での核の大部分のアサインメントが、Ａ２０ＦＭＤＶのＴｈｒ２及びＡ２０ＬＡＰのＧｌｙ１を除いては、Ａ２０ＦＭＤＶ１、Ａ２０ＦＭＤＶ２及びＡ２０ＬＡＰペプチドで可能であった。

スルースペースアサインメント（Ｔｈｒｏｕｇｈ−ｓｐａｃｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）は、３０％ＴＦＥ（ｖ／ｖ）における各ペプチドの二次元ＮＯＥＳＹ及びＲＯＥＳＹスペクトルを用いて、得られた。遅い置換（ｓｌｏｗ ｅｘｃｈａｎｇｅ）により、並びに水素結合ドナーであると考えられるアミドは、そもそもＤ２０における各ペプチドの再懸濁後に得られたＮＯＥＳＹ実験により同定され、ＣＮＳ計算による、中間体構造の視覚的な検査により確認された。付加的なｆ拘束（ｆ ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）は、高分解能ＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルより得られる、３ＪＨＮＨａとのＫａｒｐｌｕｓ関係式の適用により得られた。５Ｈｚ未満の３ＪＨＮＨａ値は、−６０°±３０°に対するその残基のｆを制約するために用いられた。５Ｈｚのカットオフ値は、ＤＱＦ−ＣＯＳＹによって得られる３ＪＨＮＨａ値が、より正確なヘテロ核ＮＭＲの方法（Cavanagh et al . , 1996）により得られる値よりも、常に大きくなることを可能にするために用いられた。

ＮＯＥ及びＲＯＥの接触の分布（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、調査したこのペプチドのそれぞれにおけるＣ末端残基とそれに続くＲＧＤで、より大きいことが発見された。接触タイプ（ｃｏｎｔａｃｔ ｔｙｐｅ）の数及び付加的な拘束（ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）の要約を、図６（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で示した各ペプチドに対しての拘束の分布（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）とともに、表４に示す。図６（ａ）で観察される接触タイプは、標準的なヘリックス配座により、Ｃ末端が、Ｈａ：ｉ及びＨｂ：ｉ＋３のみならず、Ｈａ：ｉ及びＨＮ：ｉ＋３の間で観察される接触を持つＲＧＤモチーフに向けられることを支持する。さらに、ＨＮの遅い置換及び５Ｈｚ未満の３ＪＨＮＨａ値が、図６で示したように、いくつかの残基で観察された。

図７は、三つ全てのペプチドの２Ｄ ＮＯＥＳＹスペクトルの、主なヘリックス接触領域を明らかにし、並びに接触数及び共鳴分散が、Ａ２０ＦＭＤＶ２で最大で、Ａ２０ＦＭＤＶ１で最小であることを示す。ヘリックスの特性を支持する接触は、Ａ２０ＦＭＤＶ１において最も散在的に、Ａ２０ＦＭＤＶ２において最もはっきりと現れ、Ａ２０ＬＡＰの接触の分布は、これら２つの極端例の間に収まる。

構造計算及び解析
ＮＭＲは、三つの２０ｍｅｒのペプチドの溶液構造を決定するために、並びにＣＤ及びｉｎ ｓｉｌｉｃｏ（ＡＧＡＤＩＲ）データを確認するために用いられた。ＮＭＲデータは、例えば核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）の形で、一連の制約（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）を生み出す。ＮＯＥは、２つの原子が、ＮＭＲの光学的な緩和がそれらの間で生じるのに、十分近い空間に存在する時に、観察される。２つの原子が、一次構造で近接していないと同定された場合には、各ＮＯＥは、近接近してこれらの領域を維持している二次構造が存在することを指し示すための、証拠を提供する。さらにＮＯＥは、一覧にされ、構造モデルを作り出すのに一緒になって用いられる距離拘束（ｄｉｓｔａｎｃｅ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）を提供する。物理的に可能なペプチドの立体配座の数を制限する制約が存在するので、コンピューターアルゴリズムは、これらの制約に適合する、たくさんの（アンサンブルとして知られる）立体配座を作製するために用いられる。

実験手段で明記したように、全ての構造データを、ＣＮＳを用いて決定した。計算された構造では、４０個全ての構造を、アンサンブル平均構造セットと競合させるために用いた時、０．２Åより大きいバイオレーション（ｖｉｏｌａｔｉｏｎ）または５°より大きい結合角のバイオレーションは得られなかった。３つ全てのペプチドの構造エネルギー統計学及び骨格の実行値（ｒ．ｍ．ｓ）の偏差を表３に全て示し、全てのアンサンブル及びアンサンブル平均構造を図５に示す。骨格の実行値（ｒ．ｍ．ｓ）の偏差は、各ペプチドの残基ＬＸＸ〔Ｌ／Ｉ〕ＸＸについて見積もられており、それにより、各ペプチドの比較解析が可能となる。４０個の構造アンサンブルそれぞれに対してのＰＲＯＣＨＥＣＫ−ＮＭＲ解析により、全ての残基の９４．３％、９４．８％及び９３．６％が、Ａ２０ＦＭＤＶ１、Ａ２０ＦＭＤＶ２及びＡ２０ＬＡＰそれぞれにおける、ラマチャンドランプロットの許容領域内に収まることが同定された。許容領域外に収まった残基は、各ペプチドの最初の４アミノ酸由来であり、それらの偏差は、ほとんど、または全く、拘束データが得られない領域に対しての構造計算から得られるデータと、一致していた。図３及び図５で示すヘリックス制限（螺旋制限）を、計算された構造アンサンブル、及び元データではないところから得られた、二面角及び水素結合のジオメトリーにより、同定した。この手法により、全ての構造的な情報の組み合わせによって、各ペプチドの幾何学的特性を得ることが可能になった。各ペプチドのヘリックス関連残基を、Ａ２０ＦＭＤＶ１に対してはＡｌａ１０−Ｔｈｒ１４、Ａ２０ＦＭＤＶ２に対してはＬｅｕ１０−Ｖａｌ１７、Ａ２０ＬＡＰに対してはＬｅｕ１０−Ｇｌｙ１５として同定した。

Ａ２０ＦＭＤＶ１、Ａ２０ＬＡＰ及びＡ２０ＦＭＤＶ２の４０個の構造アンサンブルを図５に示す。３つ全てのペプチドは似た構造を示し、ＲＧＤ配列はループの先端を形成しており、その後にはすぐにヘリックス領域が続く。アルギニン及びアスパラギン酸塩残基はループの外側を向き、ＲＧＤペプチドに結合する、αｖβ３の結晶構造で観察されるものに似た、一種のハンマーヘッド型を形成する（Xiong et al, 2002）。ヘリックス領域は、３つのペプチド間で長さが異なる。Ａ２０ＦＭＤＶ２は、最も整然とした構造（図５Ｅ＆Ｆ）及び最長のヘリックスを持ち、およそ三回転を含んでいる。Ａ２０ＬＡＰはわずかに短いヘリックスを持ち、Ａ２０ＦＭＤＶ１はとても短いヘリックスを持ち、一回転から成る。上述したように、ＬＸＸＬ／Ｉ領域内ヘリックス構造は、抗αｖβ６生物活性と相関する。

このように、三つ全てのペプチドはそれらの構造内にヘリックスを持ち、並びにこの伸長されたαヘリックス分子の位置で、Ｃ末端をＲＧＤモチーフに向ける、ＣＤデータが、ＮＭＲ解析により確かめられた。図３でＮＨ−ＮＨで示すように、残基ｉ−ｊ接触により、三つ全てのペプチドに（ＲＧＤモチーフがヘアピン構造のターンに存在することを可能にする）一回転の立体配座を導入する制約が同定される。長距離接触（Ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ｃｏｎｔａｃｔ）を、Ａ２０ＦＭＤＶのＡｌａ３−Ｔｈｒｌ７及びＳｅｒ４−Ｔｈｒｌ５の間、Ａ２０ＦＭＤＶ−２のＶａｌ３−Ａｒｇｌ９、Ｖａｌ３−Ｔｈｒ２０、Ｐｒｏ４−Ｖａｌｌ７、Ｌｅｕ６−Ｖａｌｌ２及びＧｌｙ８−Ｖａｌｌ２の間、Ａ２０ＬＡＰのＰｒｏ２−Ａｌａｌｌ、Ｐｒｏ２−Ｉｌｅｌ３、Ｐｒｏ２−Ｈｉｓｌ４、Ｔｈｒ４−Ａｌａｌｌ及びＧｌｙ５−Ｈｉｓｌ４の間で観察した。

飽和移動差ＮＭＲ
３つの２０ｍｅｒのペプチド内のＲＧＤモチーフへの、αヘリックスのＣ末端の長さは、ペプチドの有効性を増加させると、増加することが明らかになっている（図３参照）。これらのデータにより、ヘリックスの長さまたは安定性が、αｖβ６アンタゴニストとして機能するペプチドの有効性に、貢献する可能性が示唆される。しかし、本発明者たちのペプチド内の、ＲＧＤに対するαヘリックスのＣ末端における、ＮＭＲによる同定は、ヘリックス安定化剤であるＴＦＥの存在下で行われた。生理的緩衝液内でαｖβ６と結合する際に、このペプチドがヘリックスの形をとるかどうかを決定するために、本発明者たちは飽和移動差ＮＭＲを利用した。最も有効的なαｖβ６アンタゴニストペプチドである、Ａ２０ＦＭＤＶ２が、インテグリンαｖβ６と相互作用することを同定した、ＳＴＤ ＮＭＲスペクトルを、図６に示す。ＳＴＤ差スペクトルの解析は、ＴＦＥ不存在下において、このペプチド内の適当なＮＭＲ共鳴分散によって可能となった。縮退した化学シフトによりオーバーラップが生成された所では、いずれのＳＴＤ差値も両方の核に同じように起因するので、このデータより、いずれの潜在的なバイアスをも除去することができる。
コントロール^１Ｈ ＳＴＤ ＮＭＲスペクトル図６（ａ）及び図６（ｃ）により、このペプチドの全ての^１Ｈ ＮＭＲ共鳴が明らかにされ、図６（ｂ）及び図６（ｄ）で示されたＳＴＤ差スペクトルにより、結合事象間のインテグリンに近接しているそれらの^１Ｈ共鳴が明らかにされる。図６（ｃ）及び図６（ｄ）は重要な接触ポイントの同定を可能にし、それにはＡｒｇ７ Ｈｂ／Ｈｄ、Ｔｈｒ２０ Ｈｇ及びＬｙｓｌ６、Ｈｂ／ＨｄのみならずＬｅｕ３及びＬｅｕ１０のＨｄ及びＨｂが含まれる。ＳＴＤ差スペクトルが減少したかあるいは存在しないことが明らかにされている重要な共鳴には、Ｌｅｕ６ Ｈｄ及びＧｌｎ１１、Ｖａｌ１２及びＧｌｎ１５及びＶａｌ１７のＨｇが含まれた。個々の核のＳＴＤ増幅係数（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）は、Ａ２０ＦＭＤＶ２の全残基で観察された残基の合計増幅係数が０．０から８．８１までのこれらのデータより算出した。Ａ２０ＦＭＤＶ２の全残基に対する相対的ＳＴＤ増幅係数を図７に示し、これにより、Ａｒｇ７、Ａｓｐ９、Ｌｅｕ１０、Ｖａｌ１２、Ｌｅｕ１３、Ｌｙｓ１６、Ｖａｌ１７及びＴｈｒ２０で観察される、主な相互作用を伴ったこのペプチドの全体を通して、接触が明らかになることが、同定される。これらのデータにより、ＤＬＸＸＬ／Ｉヘリックスモチーフを超えた接触が、αｖβ６に結合することを改善するのに、重要である可能性を示唆する。

αｖβ６結合ペプチドでのヘリックス構造の存在
このヘリックスの存在は、ＤＬＸＸＬ／Ｉモチーフの非連続なロイシン及びロイシン／イソロイシン残基を並列にすることを引き起こし、それにより小さな疎水性パッチを形成する。疎水性パッチ間の相互作用は、タンパク質−タンパク質結合の古典的なメカニズムの一つであるので、ヘリックスによって引起されるロイシン−ロイシンまたはロイシン−イソロイシンのパッチが、αｖβ６とのペプチド結合に直接的に関わるという仮説を立てることが可能である。このことは、「ＸＸ」残基の同定が、ＤＬＸＸＬ／Ｉモチーフのロイシン及びロイシン／イソロイシン残基よりも、なぜ重要でないかを説明するだろう（Kraft et al 1999）。この仮説を検証するために、本発明者たちは、飽和移動差（ＳＴＤ）ＮＭＲを採用したが、この技術により、大きなタンパク質（本件ではｒｓαｖβ６）からずっと小さな分子（本件ではペプチドＡ２０ＦＭＤＶ２）へのエネルギー遷移を測定する。この技術は、原子特異的な原理によって作用し、大きな受容体タンパク質（ｒｓαｖβ６）に対しての、小さなリガンドＡ２０ＦＭＤＶ２内の個々の残基の、近接性を測定することを可能にする。このようにして、受容体とのペプチド結合に関わる、正確な残基の同定をすることが可能になる。Ａｒｇ^７（ＲＧＤモチーフの一部としてのＡｒｇは、αｖβ６と強力な接触を示すことが予期される）を除いて、エネルギー遷移が最も高い残基は、Ｌｅｕ^１０、Ｌｅｕ^１３、Ｌｙｓ^１６及びＶａＩ^１７である。したがって、αｖβ６との主な接触は、おおよそ３つの残基の規則的な周期性を持つ。このことは、結合に関しての、ヘリックス構造の存在を強く示唆する。溶液ＮＭＲ実験と異なり、ＳＴＤ ＮＭＲは、生理学的なバッファー（ＰＢＳ）及び、ヘリックス安定化アルコールであるＴＦＥの不存在下で実施したことを記述しておくことは重要である。それ故に、このことは、Ａ２０ＦＭＤＶ２がヘリックス及びランダムコイルの状態間で、溶液内で平衡的に存在するにも関わらず、αｖβ６結合ペプチドは主にヘリックスの状態で存在することの強い証拠となる。実際、αｖβ６と最も密接な接触をする残基が、３０％ＴＦＥにおけるＡ２０ＦＭＤＶ２の平均三次元構造上にマッピングされた時には、これらの残基はこのペプチドの片面上に一列になる。このことは、ヘリックス構造の存在が、これら他の近接しない残基を並列にすることを強く示唆し、それによりαｖβ６との直接相互作用のための一つの結合面を形成する。

αヘリックスは、αｖβ６との最適な結合に必要とされる
前記データは、Ａ２０ＦＭＤＶ２がαｖβ６と結合する時に、αヘリックスのＣ末端がＲＧＤに存在することを明らかに示す。さらに、これにより、Ｌ１０及びＬ１３での２つの非接触ロイシンを並列にさせることにより、リガンド（Ａ２０ＦＭＤＶ２）−インテグリン間での密接な接触が可能になる。αヘリックスが、αｖβ６とのリガンド結合に必要とされることを証明するために、本発明者たちは、位置Ｄ１２及びＤ１７で、Ｌ−バリンをＤ−バリンで置換した、３つのＡ２０ＦＭＤＶ２変異体ペプチドを合成した。図４は、これらのバリンのそれぞれが、Ａ２０ＦＭＤＶ２によって形成されるαヘリックス内に存在することが予測されていることを示し、それはＮＭＲによって確認された。Ｄ−バリンを挿入することにより、本発明者たちは、重要な接触残基（Ａｒｇ７、Ａｓｐ９、Ｌｅｕ１０及びＬｅｕ１３）の相互作用の可能性を除外することなく、ペプチドのヘリックス習性を崩壊させ、その一方でこのペプチドの他の態様（例えば電化分布及びｐＨ）が保たれることを予期した。

Ｄ−バリンペプチドを、３Ｔ３β６．１９及びＶＢ６細胞株を用いて、細胞接着アッセイにより解析し、そのデータを下記の表に要約した。この結果により、ＬからＤへの置換は、累積効果を持つことが示された。その一方で、ペプチドＤＶ１２及びＤＶ１７は、「親」ペプチドであるＡ２０ＦＭＤＶ２に比べて約３倍以上の高いＩＣ５０を示し、ＤＶ１２１７の有効性は、ＶＢ６アッセイで約２０倍、３Ｔ３β６．１９アッセイで約４０倍減少した（下記表参照）。

表７：細胞接着アッセイにおけるＤバリンを含むペプチドのＩＣ５０値。ＳＤ、標準偏差；ｎ、実験数；ＮＤ、未決定

ペプチドＤＶ１２１７を単独のレセプター結合アッセイにおけるＡ２０ＦＭＤＶ１、Ａ２０ＬＡＰ、Ａ２０ＦＭＤＶ２とも比較し、それにはＮ末端にビオチンを持つ合成ペプチドを用いた。手短に言えば、９６ウェルプレートをｒｓαｖβ６でコーティングし、残存非特異的タンパク質結合部位を１％（ｗ／ｖ）カゼイン入りＰＢＳでインキュベーションすることにより阻害した。ウェルをビオチニル化したペプチドでインキュベーションした後洗浄し、その後エクストラアビジンＨＲＰで結合ペプチドを検出した。ビオチニル化したペプチドは固定化したｒｓαｖβ６に特異的に結合し、ｒｓαｖβ６の不存在下での結合はなかった。スクランブル配列を持つコントロールペプチドが、原配列と比較してほとんど結合せず、１００ｎＭ以下の濃度では全く結合を示さなかったことから、結合は配列特異的であった。ペプチドＡ２０ＦＭＤＶ２は、Ａ２０ＬＡＰよりもαｖβ６に対してより結合しやすく、それら両方はＡ２０ＦＭＤＶ１よりも結合しやすいことが示された。ペプチドＤＶ１２１７は、Ｄ−ＶａＩ^１２及びＤ−ＶａＩ^１７の異性体並びに、結果として化学的にＡ２０ＦＭＤＶ２と同一であるヘリックス構造を持たないものを除けば、Ａ２０ＦＭＤＶ１と同様に結合した。それ故に、ヘリックス構造は、細胞接着アッセイにおける阻害のみならず、単独のプロテインアッセイにおけるｒｓαｖβ６との結合とも相関する。これらのデータにより、ヘリックス構造の存在がαｖβ６に対する結合を促進する一方で、ヘリックス構造が形成される可能性は、結合のために事前には要求されないことが示されるが、それはＡ２０ＤＶ１２１７への用量依存的な結合による証拠に基づく。

Ｄ−バリンの置換が実際にヘリックス形成を崩壊させるかを確認するために、本発明者たちは、ＣＤ及びＮＭＲによって二重変異体を解析した。ＣＤデータにより、ＤＶ１２１７変異体は、５０％ＴＦＥでさえヘリックスを形成できないことが示され、ＮＭＲにより、ヘリックス形成は４０個の重複したアンサンブルからは予測されないことが解析された。Ａ２０ＦＭＤＶ２及びＤＶ１２１７二重変異体の間には、構造的な違いがあるだけで、配列や比電荷分布に違いはないので、これらのデータにより、ＲＧＤへのαヘリックスのＣ末端が、最適なαｖβ６特異的な結合モチーフの、必要不可欠な要素であることが強く示唆される。

Ｐ１８−ＩＮＫ６由来ペプチド
Ａ２０ＦＭＤＶ１、Ａ２０ＦＭＤＶ２及びＡ２０ＬＡＰは、インテグリンαｖβ６に結合することで知られるタンパク質配列由来であるのだが、本発明者たちは、ＲＧＤＬＸＸＬ／Ｉ配列モチーフを含む他の配列において、ＬＸＸＬ／Ｉモチーフが、αヘリックス構造内に含まれるかを調査した。本発明者たちは、下記で示す配列とともに、（サイクリン依存性キナーゼ４インヒビターＣまたはＰ１８−ＩＮＫ４ｃとしても知られる）Ｐ１８−ＩＮＫ６遺伝子内に含まれるモチーフを選択した。

Ｐ１８−ＩＮＫ６配列は、ＲＧＤＬＸＸＬ配列を含み、並びに、ＡＧＡＤＩＲソフトウェアを用いて解析すると、Ｐ１８−ＩＮＫペプチド内のＬＥＱＬ配列が、αヘリックスモチーフを形成することが示された。それ故に、生理学的な相互作用の見込みが制限されているにも関わらず、この配列はαｖβ６結合特性を持つことが予測されたが、それはｐ１８−ＩＮＫ６が細胞内にある一方で、αｖβ６リガンド結合部位は細胞外にあるためである。

インテグリンαｖβ６への、Ｐ１８−ＩＮＫの性合親和性をＤＤ１９（αヘリックス構造ではない所にＬＸＸＬ配列を持つＲＧＤＬＸＸＬペプチド）のと比較することにより、Ｐ１８−ＩＮＫの性合親和性は、ＤＤ１９のよりも、著しく大きいことが示された（図８）。これにより、αｖβ６に結合することが知られてはいないタンパク質に含まれるが、αヘリックスの一部としてＬＸＸＬモチーフを含む、ＲＧＤＬＸＸＬ配列は、単離して存在したときにも、αｖβ６に依然として結合することが示唆される。

ＡＧＡＤＩＲを用いるＰ−ＩＮＫペプチドのｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデリング
さらに、ペプチドのヘリックス構造を増強させ、それによって潜在的に抗αｖβ６の有効性を増大させるための、（ＡＧＡＤＩＲアルゴリズムによる）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏデザインを用いる可能性を調査するため、このシステムを使うことを決めた。Ａ２０ＦＭＤＶ２とｐ１８−ＩＮＫ配列の異なった方法での組み合わせを調査し、ＬＸＸＬＸＸ領域（ＩＮＫ−ＦＭＤＶ）内でのヘリックス構造が最も高く予想されたものを、さらなる研究のために選んだ。その結果、１アミノ酸が置換された、さらに２つのペプチドを作製した。１つ目は、ペプチドの予測されたヘリックス構造を全体的に増加させる、ＩＮＫ−ＦＭＤＶ−Ｘ。２つ目は、ＲＧＤの予測されるヘリックス構造を減少させる一方で、ＬＸＸＬＸＸ領域の予測されるヘリックス構造を増加させる、ｐＩＮＫ−ＦＭＤＶ２−ＸＸ。

これらのペプチドを、スクリーニングＥＬＩＳＡ法を用いて解析した。手短に言えば、ｒｓαｖβ６を、抗αｖモノクローナル抗体（Ｐ２Ｗ７）でコーティングしたプレートにエクスポーズすることによって、９６ウェルプレートの表面上で固定化した。固定化したｒｓαｖβ６をその後、１時間、ペプチドとビオチニル化したフィブロネクチンの混合物にエクスポーズしてから、結合していない物質を洗浄し、結合したビオチニル化したフィブロネクチンを、エクストラアビジンＨＲＰで検出した。ペプチドの連続希釈によって、用量依存性カーブを算出し、そこからシグモイドカーブフィットモデル（Ｐｒｉｓｍソフトウェア）を用いてＩＣ５０を決定した。

この結果から、ｐ１８−ＩＮＫ６配列由来の２０ｍｅｒペプチドは、組換えαｖβ６の機能的阻害剤であり、競合的ＥＬＩＳＡにより、ＩＣ５０は２３ｎＭであることが示された。ペプチドＰ−ＩＮＫは、予備的な細胞接着アッセイにおいても、αｖβ６依存的な接着を阻害した。

細胞内タンパク質ｐ１８−ＩＮＫ６由来のペプチドは、それ故に、組換えαｖβ６または細胞αｖβ６を阻害することができる。αｖβ６のリガンド結合ドメインが細胞外にあるので生理学的な影響はなさそうであり、それ故、ｐ１８−ＩＮＫ６を「観察する」ことはなさそうである。しかしながら、これらのデータは、本明細書で提案したモデル（ＬＸＸＬ領域内にヘリックス傾向を持つＲＧＤＬＸＸＬモチーフが、αｖβ６結合活性を持つ可能性）を支持するのに役立つ。

フローサイトメトリーによるペプチド特異性の評価
ビオチニル化したペプチドは、Ａ３７５Ｐｐｕｒｏ及びＡ３７５Ｐβ６ｐｕｒｏに結合することができ、その結合は、マウス抗ビオチン抗体とそれに続くＡｌｅｘａFｌｕｏｒ４８８標識羊抗マウス抗体によって検出される。ビオチンに結合した二次抗体の使用は、重要な増幅段階を提供するが、それは、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣの直接検出を試みた予備的実験では、ほとんど若しくはまったくシグナル検出ができなかったためである。ペプチドは、複数の異なる濃度で試験され、Ａ３７５Ｐβ６ｐｕｒｏ細胞株への濃度特異的な異なる結合性を示した。ＤＶ１２１７はＡ３７５Ｐβ６ｐｕｒｏに高い特異性を持っていたが、それは、調査したどの濃度（１００μＭまで）でも、Ａ３７５Ｐｐｕｒｏに対しては顕著には結合しなかったが、Ａ３７５Ｐβ６に対しては１０μＭおよび１μＭで結合したためである。Ａ２０ＦＭＤＶ２はＡ３７５Ｐｐｕｒｏに１０μＭのみで結合し、その一方でＡ３７５Ｐβ６ｐｕｒｏに１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭ、０．００１μＭの、４段階での濃度における異なる結合性によって、結合するのが観察された。Ａ２０ＦＭＤＶ１も比較的特異性があり、Ａ３７５Ｐβ６ｐｕｒｏに１μＭで結合を示したが、その濃度ではＡ３７５Ｐｐｕｒｏには結合しなかった。Ａ２０ＬＡＰは、Ａ３７５Ｐβ６ｐｕｒｏに相対的にほとんど特異性を示さず、両方の細胞株において１０μＭと１μＭで結合したが、Ａ３７５Ｐβ６ｐｕｒｏへの結合は両濃度でわずかに大きくなった。

すべてのペプチドは、ＲＧＤＬＸＸＬ／Ｉモチーフを含んでいたため、このモチーフの存在では、αｖβ６への特異性は保証されない。さらに、試験した４つのペプチドのうち、最も安定（Ａ２０ＦＭＤＶ２）な、及び最も不安定（Ａ２０ＤＶ１２１７）な、ヘリックスを、ＲＧＤの後の配列（ｐｏｓｔ−ＲＧＤ配列）内に持つ２つのペプチドは、他のＲＧＤ指向性インテグリンが存在する場合に、αｖβ６に対してもっとも特異的であった。それ故に、ＲＧＤの後の配列内のヘリックス構造は、αｖβ６に対して特異性を提供はしない。しかしながら、これらのデータにより、αｖβ６に対する高い性合親和性を与えるＲＧＤの後の配列におけるヘリックス構造の重要性が確かめられ、１０ｎＭのＡ２０ＦＭＤＶ２と同程度の結合性を得るためには、１０μＭのＡ２０ＤＶ１２１７が必要とされる。それ故に本アッセイでは、ヘリックス構造を失うと、抗αｖβ６の有効性が１０００分の１倍に失われる結果となった。

Ａ２０ＦＭＤＶ２の環状ジスルフィド誘導体の合理的設計
本発明者たちは、直鎖ペプチドはｉｎ ｖｉｖｏでは、血清プロテアーゼによる攻撃にしばしばさらされる可能性があるので、環化（反応）及びＤ−アミノ酸の使用により、生物活性を、維持し、または改良する間における、このペプチドの安定化について調査が可能であると考えた(Okarvi, 2004)。それ故に、合理的な構造によって導き出されるデザインを用いて、リードペプチドＡ２０ＦＭＤＶ２である、２つのジスルフィド環化した変異体を導き出した。目標は、以下のことに対して、３倍にすることである。親和性を向上させることによって、活性構造を安定化させること。血清プロテアーゼに対する抵抗性を改善させること。そして、適切に配置されたリシン及びチロシン残基を、それぞれ４−［^１８Ｆ］−フルオロ安息香酸または^１２５Ｉで直接放射性ラベルすること。

デザインソフトウェア(Dombkowski,2003;www.ehscenter.org/dbd/)によるジスルフィドは、一対の残基を同定するのに、３０％ＴＦＥ内でのＡ２０ＦＭＤＶ２の溶液構造とともに用いられ、その残基は、ジスルフィド結合システイン残基で置換を可能にするための、空間および幾何学的な仕様を兼ね備えるものと考えられた。リシンおよびチロシン残基を、放射性同位体でラベルするために加えた。しかしながら、Ａ２０ＦＭＤＶ２の完全な構造ユニットを維持し、並びにαｖβ６結合活性との起こりうる干渉を防ぐために、これらの残基は、Ｄ−アミノ酸の「尾」として、ペプチドのＮ末端に加えられた。このペプチドをＤＢＤ１と規定した（下表参照）。皮肉なことに、予備的な血清安定研究では、Ｄ−アミノ酸の「尾」は、それ自身タンパク質分解されやすい可能性が示された。それ故に、ペプチドＤＢＤ２を、全ての残基がジスルフィド環内に含まれるように設計した（表６．１）。ペプチド「Ｒａｎ」をコントロールとして合成し、ＤＢＤ１と同じ残基から構成したが、ジスルフィド環内の残基をスクランブルした。細胞αｖβ６及び組換えαｖβ６に結合するペプチドの直接解析を可能にするために、各ペプチドのＮ末端にも、ビオチン部分及びスペーサーを加えた（ビオチニル化した−Ａ２０ＦＭＤＶ２、−ＤＢＤｌ、−Ｒａｎ及び−ＤＢＤ２は、したがって、Ｂ−Ａ２０ＦＭＤＶ２、Ｂ−ＤＢＤｌ、Ｂ−Ｒａｎ及びＢ−ＤＢＤ２として参照のこと）。

表８：小文字で表記された、環状及びコントロールの、ペプチド残基の配列は、Ｄアミノ酸を表す。ＲＧＤＬＸＸＬモチーフにアンダーラインを引いている。環化（反応）のために用いたシステイン残基を太字で強調し、アンダーラインを引いている。チロシン（ｙ／ｙ）及びリシン（ｋ／ｋ）残基を、それぞれ^１２５Ｉ及び^１８Ｆ−フルオロ安息香酸で直接放射性ラベルできるように加えた。グルタミン酸（ｅ）及びリシン（Ｋ）残基を、側鎖−側鎖の共有結合性環化（反応）が潜在的に可能となるように加えた。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの環状ペプチドの親和性及び特異性
αｖβ６への環状ペプチドの親和性を、非競合的に結合させるＥＬＩＳＡで最初に調査した。ペプチドのビオチニル化により、ＥＬＩＳＡプレート上の固定化したｒｓαｖβ６に結合することが可能となり、結合したペプチドは、ペルオキシダーゼ共役エクストラアビジンで検出した。スクランブルペプチドＢ−Ｒａｎはまったく結合を示さなかったが、Ｂ−ＤＢＤ１とＢ−ＤＢＤ２の両方とも、ｒｓαｖβ６に対する濃度依存的な結合を示した。結合の濃度は、Ｂ−Ａ２０ＦＭＤＶ２の場合と似ていた。用量反応曲線への適合によるデータの定量化と、５０％の結合性に必要なペプチド濃度（ＥＣ５０）の計算により、Ｂ−Ａ２０ＦＭＤＶ２、Ｂ−ＤＢＤ１及びＢ−ＤＢＤ２が、本アッセイにおいて同程度の有効性を示すことを実証し、低ナノモル濃度で結合が検出できることが示されたことに矛盾しなかった（下表参照）。

表９：ビオチニル化した環状ペプチドが、固定化したｒｓαｖβ６に結合するためのＥＣ５０。データを、シグモイドの用量反応曲線に適合させ、最大５０％の結合に必要なペプチド濃度（ＥＣ５０）を、各ペプチドについて決定した。データは、４回の独立した実験からのＥＣ５０の平均値及び標準偏差について示す。ＮＤ；決定されていない。

αｖβ６のペプチド特異性を、対をなすαｖβ６ポジティブ及びαｖβ６ネガティブの、細胞株Ａ３７５ｐβ６及びＡ３７５Ｐｐｕｒｏへの結合を比較することにより評価した（図９及び１０）。両細胞株とも、インテグリンαｖβ３、αｖβ５、αｖβ８及びα５β１を同レベル程度に発現しているが、Ａ３７５ｐβ６だけがαｖβ６を発現している。ビオチニル化したペプチドの結合を、フローサイトメトリーにより評価した。Ｂ−Ａ２０ＦＭＤＶ２、Ｂ−ＤＢＤ１及びＢ−ＤＢＤ２は、Ａ３７５ｐβ６に対しての濃度依存的な結合を示し、１ｎＭの低い濃度で高い結合能を示した。対照的に、これらの３つのペプチドは、Ａ３７５Ｐｐｕｒｏへの低い結合能のみを示し、それは高い濃度のみであった。コントロールスクランブルペプチド（Ｂ−Ｒａｎ）は、どちらの細胞株にも結合しなかった。

Ａ３７５Ｐβ６と相互作用する特異性を確認するため、１ｎＭペプチドの結合を、６３Ｇ９（αｖβ６特異的機能阻害モノクローナル抗体）または関連性のないＩｇＧコントロールのどちらかの存在下で、評価した。Ｂ−Ａ２０ＦＭＤＶ２、Ｂ−ＤＢＤ１及びＢ−ＤＢＤ２は、コントロールＩｇＧの存在下で強く結合した。しかしながら、６３Ｇ９の存在下では、結合は大幅に減少し、Ｂ−Ａ２０ＦＭＤＶ２及びＢ−ＤＢＤ２の場合には、結合は完全になくなった。Ｂ−Ｒａｎはどちらの抗体の存在下でも結合しなかった。この結果により、１ｎＭでは、Ｂ−Ａ２０ＦＭＤＶ２、Ｂ−ＤＢＤ１及びＢ−ＤＢＤ２は、主にαｖβ６を介してＡ３７５Ｐβ６に結合することが確かめられる。それ故に、Ｂ−Ａ２０ＦＭＤＶ２、Ｂ−ＤＢＤ１及びＢ−ＤＢＤ２は、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ８及びα５β１に比べてαｖβ６への高い親和性及び高い特異性の両方を持つ。さらに、ペプチド結合は安定で寿命が長く、それはペプチド−インテグリン複合体がＥＤＴＡで繰り返し処理しても安定であるためである。

^１８ＦでラベルしたＡ２０ＦＭＤＶ２及びＤＢＤ２のｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
リードペプチドＢ−Ａ２０ＦＭＤＶ２及びＢ−ＤＢＤ２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるαｖβ６に対して、高い親和性及び高い特異性を示す。Ａ２０ＦＭＤＶ２及びＤＢＤ２は、^１８Ｆ−Ａ２０ＦＭＤＶ２及び^１８Ｆ−ＤＢＤ２を作り出すために、ペプチドのＮ末端を放射性同位体でラベルすることができる。画像化及び標的目標とするための、インテグリンαｖβ６の潜在的な用途を、（^１８Ｆまたは別の放射性同位体部分を持つ）ラベル化したペプチドを、対となったαｖβ６ポジティブ（ＤＸ３β６）異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）及びαｖβ６ネガティブ（ＤＸ３ｐｕｒｏ）異種移植片を持つマウスにインジェクションすることによって評価し、それによりαｖβ６陽性腫瘍の特異的な視覚化が可能となる。

〈考察〉
インテグリンαｖβ６は、癌の画像化及び治療のための、新しい主要な標的である。抗αｖβ６薬剤を創出するための方法として、本発明者たちは、αｖβ６のペプチドアンタゴニストを創出するために、αｖβ６の既知リガンドに基づく、合理的な設計アプローチを利用した。これらの研究により、αｖβ６の生物学的挙動に重要である、新規インテグリン−リガンド相互作用の構造的基礎が明らかになった。本発明者たちは、これらの直鎖ペプチド内で二次構造が示唆されているペプチドの長さの増加に伴って、αｖβ６のペプチドアンタゴニストの有効性が増加されることを、初めて指摘した。本発明者たちのペプチドが、ヘリックスモチーフを持つ可能性は、ＦＭＤＶの結晶構造に基づいた（Logan et al 1993）。これらの著者たちは、ＦＭＤＶのＶＰ１カプシド・タンパク質のＧ−Ｈループが、ヘアピンカーブの先端で、ＲＧＤモチーフから構成され、その後に３_１０ヘリックスが続くことを示した。この構造は、ＶＰ１及びＶＰ２タンパク質間のジスルフィドシステイン架橋結合が存在した場合に限り、現れた。本発明者たちは、ＡＧＡＤＩＲソフトウェアを用いて、３つのリードペプチドＡ２０ＦＭＤＶ１、Ａ２０ＦＭＤＶ２及びＡ２０ＬＡＰのヘリックス傾向を調べた。ヘリックス傾向が、Ａ２０ＦＭＤＶ＜Ａ２０ＬＡＰ＜Ａ２０ＦＭＤＶ２の順で増大され、配列が生物学的効果と相関することが予測された。遠紫外線／ＣＤ解析により、全ての２０ｍｅｒが、ＴＦＥを０−５０％（ｖ／ｖ）添加させることにより、ヘリックスの性質の増大が示されることを確かめた。Ａ２０ＦＭＤＶでヘリックス形成へ遷移するための、より広範な分析結果により、より高い割合のＴＦＥが、このペプチドが安定的なヘリックスを形成することに必要とされ、並びにこのペプチドのヘリックス傾向は、ＡＧＡＤＩＲ予測が確忍されたＡ２０ＦＭＤＶ２またはＡ２０ＬＡＰのデータにおけるものよりも低いことが示唆される。遠紫外線−ＣＤデータは、ＮＭＲによる３つ全てのペプチドの相対的な構造を得るために、ＴＦＥの濃度がどれほど必要かを予測するためにも、利用された。平均楕円率のプロットにより、４０−５０％ＴＦＥでは、ヘリックスの安定化は、３つ全てのペプチドで完全になると示唆された。それ故に、３０％（ｖ／ｖ）の濃度は、Ａ２０ＦＭＤＶ２とＡ２０ＬＡＰの両方で、遷移のギリギリの濃度となり、これらのペプチドのヘリックス傾向の違いを明らかにするのが可能になる。（直接比較を可能とするため、３０％ＴＦＥは、続く全てのＮＭＲ解析用に選択された。）

ＮＭＲによる３つ全てのペプチドの構造アサインメントにより、全ての共鳴の９７％以上の同定が可能となったが、Ａ２０ＦＭＤＶ１のＴｈｒ２、及びＡ２０ＬＡＰのＧｌｙ１での、欠損する共鳴の大部分は、アミド水素置換及びオーバーラップの結果、アサインする（ａｓｓｉｇｎ）のが難しいものであった。高度なアサインメントにより、各ペプチドの構造解明のための正確な接触アサインメント、並びに図３、図４で示したようにαヘリックスの形成に関与する鍵となる接触の評価及び文書化が、可能となった。Ａ２０ＦＭＤＶに対して図３（ａ）で示した接触によって、このヘリックスが、使用された条件化では、最も規定されていないことが明らかである。ａＨ−ＮＨ ｉ−ｉ＋３及びａＨ−ｂＨ ｉ−ｉ＋３は、ＲＧＤに対するその領域Ｃ末端の全部については完全には規定されておらず、並びにＡｌａ１０−Ｔｈｒ１４のヘリックス伸長は、水素結合アクセプター及びｆ拘束（ｆ ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）によって規定されていない。対照的に、図３（ｂ）で示したＡ２０ＦＭＤＶ２の接触は、ａＨ−ＮＨ ｉ−ｉ＋３、ａＨ−ｂＨ ｉ−ｉ＋３、ＮＨ−ＮＨ ｉ−ｉ＋１、及び水素結合及びｆ拘束を伴う、Ｌｅｕ１０−Ｖａｌｌ７での、十分に形成されたヘリックスを明らかにする。図３（ｃ）におけるＡ２０ＬＡＰの制約は、Ａ２０ＦＭＤＶ及びＡ２０ＦＭＤＶ２で観察された制約の間に収まる。Ｌｅｕ１０−Ｇｌｙ１５のヘリックス領域を超えた所には、Ａ２０ＬＡＰは、規定されたａＨ−ＮＨ ｉ−ｉ＋３接触を高度に持つが、規定されたａＨ−ｂＨ ｉ−ｉ＋３接触はより少ない数しか持たない。Ａ２０ＬＡＰでもまた、水素結合及びｆ拘束は、ヘリックスのＮ末端でより規定されているが、Ｃ末部分ではそれがない。Ａ２０ＦＭＤＶ１とＡ２０ＬＡＰの両方に対する、規定された、水素結合及びｆ拘束の不足は、ＮＭＲデータで創作されるモデルにおけるヘリックス形成の減少の一因となっているが、３０％ＴＦＥ（ｖ／ｖ）内でのこれらのペプチド間の根本的な違いを反映する。接触データ（理想的なヘリックス構造はＡ２０ＦＭＤＶ２で観察され、Ａ２０ＬＡＰでは幾分理想度が下がり、Ａ２０ＦＭＤＶ１ではそれが乏しい）により提供されるヘリックス構造のスケールは、図４で示される実験データからも、直接観察する事もできる。図４（ｂ）、４（ｅ）及び４（ｈ）におけるＡ２０ＦＭＤＶ２データは、構造が存在していることを示す、より多くの接触とより高いシグナル分散を示す。今一度、これらの観察はＡ２０ＬＡＰで減少したが、接触回数及び分散はＡ２０ＦＭＤＶが最も低かった。表２の接触データにより、これらの視覚的な観察が確かめられる。これらのヘリックスの性質にも関わらず、各ペプチドは1回転の立体配座を示し、長距離接触（すなわち、ペプチドのＮ末とＣ末の中間部分における残基間）は全てのペプチドで観察される。これらの接触が最も多く、Ａ２０ＦＭＤＶ２で最も明らかにされており、ヘリックス形成が安定した1回転の配位を形成するための鍵であることが、示唆されている。しかしながら、Ｎ末端の６−７アミノ酸は、構造を持たなさそうであるにも関わらず、それらは、活性の検討材料としてやはり重要であるかもしれず、全体的な３Ｄ構造の安定化を提供すると思われるＮ−及びＣ−末残基間に、たくさんのＮＯＥ相互作用があるためである。

接触データより説明される、これらのペプチドのそれぞれの全体的なヘリックス構造の傾向（Ａ２０ＦＭＤＶ２＞＞Ａ２０ＬＡＰ＞＞Ａ２０ＦＭＤＶ１）は、さらに、ＣＮＳソフトウェアを用いた構造解明によって支持される。構造情報により、これらのペプチドのヘリックス傾向の定量的な解析が可能となり、それは、図１及び図２にある遠紫外線−ＣＤデータからは即座には明らかにはならない方法による。図５におけるアンサンブルの平均は、各ペプチドに、ＲＧＤモチーフへ直接Ｃ末端が延びているヘリックス部分があることを示す。ヘリックスは、Ａ２０ＦＭＤＶ１、Ａ２０ＬＡＰ及びＡ２０ＦＭＤＶ２に対して、それぞれ約１．４、１．６及び２．２回転であることが示されており、並びに、これらのペプチドに対して、全体的に予測されるヘリックス傾向に関する、ＡＧＡＤＩＲから観察される傾向と一致していると思われる。すぐ後にＲＧＤモチーフが続くように形成されるヘリックスの性質は、前記で強調した残基ＬＸＸ〔Ｌ／Ｉ〕の側鎖が、ヘリックスの一方から突き出ることを可能にする。結果として、これにより、最近ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）に結合すると記述された、ＬＸＸＬＬモチーフに似たヘリックスを含んでいる、構造モチーフを形成するだろう（Klein et al, 2005）。ＲＧＤＬＸＸＬ配列は、αｖβ６特異的なモチーフであるとしてＫｒａｆｔなど（１９９９年）によって、ペプチドファージディスプレイを用いて同定され、これらの残基の重要性は、より初期の研究で発見されたが、それは、ＦＭＤＶによって実験的な感染を阻害するために要求されるＦＭＤＶ由来ペプチドにおける、重要なアミノ酸を調べたものであった（Mateu et al, 1996）。

インテグリンαｖβ６とともにＡ２０ＦＭＤＶ２を用いた本発明者たちのＳＴＤ ＮＭＲ調査により、αｖβ６へのリガンド結合に、残基ＬＸＸＬが重要であることが確認できた。図６で示したＳＴＤ ＮＭＲ差データにより、残基Ｌｅｕ１０及びＬｅｕ１３のＨｄを介して相互作用することの重要性が強調され、それは、結合が主にＡｒｇ７−Ｔｈｒ２０由来ペプチド部分を含むことが直接的に明らかにされている、Ｌｅｕ６のＨｄの不存在を伴う。このことは、各残基で示されるＳＴＤ増幅係数の解析によって確かめられ、この各残基により、主な接触面が、残基Ａｒｇ７、Ｌｅｕ１０、Ｌｅｕ１３、Ｌｙｓ１６及びＶａｌ１７で、生じることもまた明らかとなる。それ故に、本発明者たちのデータは、αｖβ６特異的なリガンドとしての、ＲＧＤＬＸＸＬの発見に対しての構造的な説明を提供し、その理由は、ヘリックスにより、直鎖的にαｖβ６の表面と相互作用する、非接触的なＬｅｕ１０及びＬｅｕ１３残基が、並列になるためである。インテグリンαｖβ６が認識されることについての、残基Ｌｙｓ１６及びＶａｌ１７の重要性にも注意を要するが、それは、この観察が、ＲＧＤＬＸＸＬを超えて伸長したモチーフが、重要である可能性を、強調するためである。二次的に上昇される相互作用が、Ａｓｐ９、Ｖａｌ１２及びＴｈｒ２０でも観察される。ＳＴＤデータは、ＴＦＥ不存在で、生理学的なバッファー（ＰＢＳ）で得られたため、Ａ２０ＦＭＤＶ２が、αｖβ６へのヘリックスとして結合することが強く示唆される。３アミノ酸の段階で生じる主な接触残基により、αｖβ６と相互作用する間に、Ａ２０ＦＭＤＶ２内でのヘリックス形成が説明され、このαｖβ６により、全ての主な残基側鎖が、インテグリンの標的と一面で相互作用することを可能にする。さらに、少なくともＬｅｕ１０−Ｌｙｓ１６間のヘリックスのＮ末部分は、Ｌｏｇａｎなど（１９９３年）のと一致して、ＬＸＸＬＸＸＫの規則的なパターンに起因して、３，１０−ヘリックス構造になることが可能である。本発明者たちのデータは、インテグリンαｖβ６に特異的なペプチドが、ＲＧＤＬＸＸＬに基づいたモチーフを持つ、伸長された回転の立体配座を必要とすることを示唆する。このモチーフが直接重要であることに加えて、αｖβ６特異的なペプチドは、ヘリックス傾向の増加を必要とし、並びに、ＲＧＤがより有効に結合するために、Ｃ末残基の数の増加を伴ったヘリックスを形成する能力を必要とする。おそらく、このことは、他のインテグリン（例としてαｖβ３及びα２ｂｂ３）のペプチド阻害剤の開発が、可能な、最小の環状ペプチドを得ようとしばしば努力されてきたための、予期せぬ発見によるものであった。αｖβ６のα−ヘリックスモチーフは、いくつかの役割を持つようである。おもに、それは、ＬＸＸＬの正確な幾何学的配置によって、疎水性側鎖がαｖβ６の結合部位と相互作用することを可能にするが、それに加えて、伸長された配列ＲＧＤＬＸＸＬＸＸＹＹ内での位置ＹＹにおける正確な残基を提示することによっても、結合を促進する。さらに、ヘリックス内の残基とＮ末端内での残基の間の長距離接触は、ヘアピン構造を安定化させ、それ故にＲＧＤモチーフを好ましく提示する。

構造（ＮＭＲ及び遠紫外線／ＣＤ解析）及び機能（ＥＬＩＳＡ及び接着アッセイ）データの組合せにより、本発明者たちのペプチドアンタゴニストは、αｖβ６と相互作用する際に、ヘリックス部分を持つことが予測された。このことは、ＳＴＤ ＮＭＲによるＡ２０ＦＭＤＶ２／αｖβ６相互作用により確かめられた。αｖβ６に結合するペプチド内のヘリックスの重要性は、ヘリックス内のバリンをＤ−異性体で置換することによって、ヘリックスを保存的に破壊することにより示された。その結果として得られるＤＶ１２１７ペプチドは全くヘリックス特性を持たず、並びにαｖβ６阻害剤としての有効性が２０−４０分の１に減少した。

フィブロネクチンのようないくつかの基質は、α−ヘリックスＣ末端をＲＧＤに持つことは予測されないが、αｖβ６のリガンドとして機能することができる。しかしながら、αｖβ６は、フィブロネクチンよりもＬＡＰに対して遥かに強い親和性を持つ。ＬＡＰはＲＧＤ−αヘリックスモチーフを保有するため、本発明者たちの結果は、この増加された親和性に対する構造的な説明を提供し、恐らくは、それはαｖβ６とフィブロネクチン間よりも、αｖβ６とＬＡＰ間でより強い物理的相互作用があるためである。本発明者たちのデータは、αｖβ６がどのようにＴＧＦβを活性化するかもまた説明しそうである。αｖβ６によるＴＧＦβ１（及び恐らくはＴＧＦβ３）のこのような活性化は、機能的なアクチン細胞骨格を必要とし、物理的な張力が、ＴＧＦβ−プロペプチドであるＬＡＰに対して作用されている可能性を、おそらく示唆している。本発明者たちのペプチド内で、Ｃ末端をＲＧＤ結合モチーフに生じさせる接触部位の大多数は、ＬＡＰへのこの強い結合が、どのように媒介され得るかに関しての説明を提供する。このことにより、けん引／張力を含んだ、ヘリックスを介した強い結合を通じての、ＴＧＦβによるαｖβ６の活性化の可能性があり、あるいは恐らくは結合によって誘導される、構成されていないループから、ＴＧＦβを開放する、ＬＡＰ内での立体配座を引き起こす、ヘリックスの安定化の可能性がある。

ＲＧＤＬＸＸＬモチーフは、多くのタンパク質で発見されているが、それらの全てが細胞外タンパク質であるわけではない。これらの調査に基づいて、新規の、しかしながらまだ特徴付けされていないリガンドが、αｖβ６に対して存在する可能性が示唆され、例えばそれは、アカゲザルの肺表面活性物質関連タンパク質Ｃを含む可能性がある。ＲＧＤＬＸＸＬモチーフを持った細胞内タンパク質の存在は、それらが、細胞内αｖβ６に結合する可能性を示唆するかもしれず、生物学的な用途があるだろう。

要約すると、２０ｍｅｒのペプチドＡ２０ＦＭＤＶ２は、インテグリンと結合する際に、α−ヘリックスのＣ末端をＲＧＤに形成する。ヘリックス傾向とペプチド傾向の間には相関性があるために、このことは、ヘリックス形成がαｖβ６への結合の結果として生じるものではないが、それよりもむしろ、リガンド（Ａ２０ＦＭＤＶ２）が、結合前にα−ヘリックスのＣ末端をＲＧＤに持ち、並びにこの結合がヘリックスを安定化させる可能性を示唆する。このヘリックスの主な機能は、ＲＧＤモチーフの非接触残基のＣ末端が、αｖβ６の表面に対して直鎖的な面として提示させることを可能にし、それ故に、リガンドとインテグリン間の潜在的な接触ポイントを増加させる。これらのデータは、線維症の治療のみならず、癌の画像化及び治療に必要とされる有効なαｖβ６特異的な薬剤を設計するための構造的なフレームワークとして提供されるだろう。

情報開示陳述書の一環として提出する参考文献を含んだ、本明細書で引用し、またはこの出願書類とともに提出する全ての出版物、特許及び特許出願書類は、参照により完全に含まれる。

０−５０％（ｖ/ｖ）間のＴＦＥ濃度を持つＰＢＳにおける（Ａ）Ａ２０ＦＭＤＶ１ペプチド、（Ｂ）Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチド及び（Ｃ）Ａ２０ＬＡＰペプチドの、遠紫外線のＣＤスペクトル。 ０−５０％（ｖ/ｖ）間のＴＦＥ濃度を持つＰＢＳにおける（ａ）Ａ２０ＦＭＤＶ１ペプチド、（ｂ）Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチド及び（ｃ）Ａ２０ＬＡＰペプチドの、平均分子楕円率。 （ａ）Ａ２０ＦＭＤＶ１、（ｂ）Ａ２０ＦＭＤＶ２及び（ｃ）Ａ２０ＬＡＰに対する、主なＮＯＥ及びＲＯＥの接触タイプ（ｃｏｎｔａｃｔ ｔｙｐｅ）、水素結合アクセプター及びｆ拘束（ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）、を生じさせる残基の図表。 Ａ２０ＦＭＤＶ１に対する２Ｄ ＮＯＥＳＹ ＮＭＲスペクトル部分（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）。同様にＡ２０ＦＭＤＶ２に対して（ｂ）、（ｅ）及び（ｈ）。同様にＡ２０ＬＡＰに対して（Ｃ）、（Ｆ）及び（Ｉ）。スペクトル（ａ−ｃ）はＨａ−Ｈｂ領域を対象にし、（ｄ−ｆ）はＮＨ−ＮＨ領域を対象にし、（ｇ−ｉ）はＮＨ−ａＨ領域を対象にする。全ての化学シフトは、１００μＭジメチルシラペタンスルホン酸（ＤＳＳ）入りＰＢＳ／３０％（ｖ／ｖ）ＴＦＥ溶液で外部から参照される。 Ａ２０ＦＭＤＶ１（ａ−ｃ）、Ａ２０ＦＭＤＶ２（ｄ−ｆ）及びＡ２０ＬＡＰ（ｇ−ｉ）に対しての計算された構造。４０個の構造アンサンブル（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）は全ての骨格結合（残基１−２０）を示す。４０個の構造アンサンブル（ｂ）、（ｅ）及び（ｈ）は、各ヘリックスの計算された収束を強調するための、ＧＬＸＸからＣ末端までの骨格結合を示す。赤で色付けられた結合により、アンサンブルを適合させ、表２のデータを作成するために用いられたＬＸＸ[Ｌ／Ｉ]ＸＸＸ領域が特定される。リボンの図形（ｃ）、（ｆ）及び（ｉ）は、球と棒で示されるＲＧＤモチーフを持つ各ペプチドにおけるアンサンブル平均構造を示す。全ての図形を、ＭＯＬＭＯＬ２ｋ．２で作成した（Koradi et al, 1996）。 Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋の存在でのインテグリンαｖβ６及びペプチドＡ２０ＦＭＤＶ２の^１Ｈ ＳＴＤ ＮＭＲスペクトル。（ａ）及び（ｃ）はコントロールスペクトル（ペプチドシグナルを示すＳＴＤ遷移がない）であり、（ｂ）及び（ｄ）は３０ｍｓのスピン固定フィルターを用いてのＳＴＤ差スペクトルである。拡大図（ｃ）及び（ｄ）は重要な残基の共鳴を持ち、それらをデータで明示する。 Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋の存在での各アミノ酸ペプチドの割合として示される、インテグリンαｖβ６及びＡ２０ＦＭＤＶ２間での完全なＳＴＤ ＮＭＲ遷移。 ＬＡＰに対する３Ｔ３Ｂ６．１９のαｖβ６依存的な接着に関するＩＮＫ及びＤＤ１９ペプチドの効果。細胞接着の割合に対してプロットした両ペプチドのペプチド濃度を示す。 抗αｖβ６環状ペプチドは、αｖβ６発現細胞に選択的に結合する。ビオチニル化したＡ２０ＦＭＤＶ２−Ｃｙｃ２または環状のスクランブル仕様を、Ａ３７５ＰｐｕｒｏまたはＡ３７５Ｐｂ６ｐｕｒｏ細胞に加えた。結合ペプチドは、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣまたは、マウス抗ビオチン抗体とそれに続くＡｌｅｘａFｌｕｏｒ４８８標識羊抗マウス抗体のいずれかによって検出し、サンプルをフローサイトメトリーで解析した。ペプチドデータを明るい灰色で、バックグラウンド（ストレプトアビジン−ＦＩＴＣまたはマウス抗ビオチン抗体とそれに続くＡｌｅｘａFｌｕｏｒ４８８標識羊抗マウス抗体のみ）を黒で示す。Ａ２０ＦＭＤＶ２−Ｃｙｓ２シグナルは、Ａ３７５Ｐｂ６ｐｕｒｏ細胞で高いことを指摘しておく。 Ａ３７５Ｐβ６ｐｕｒｏ及びＡ３７５Ｐｐｕｒｏに対するビオチニル化したペプチドの濃度依存的結合。ビオチニル化したペプチドＤＶ１２１７、Ａ２０ＦＭＤＶ１、Ａ２０ＬＡＰ及びＡ２０ＦＭＤＶ２は、陽イオン（０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２）及び０．１％アジ化ナトリウムの存在でのＡ３７５Ｐβ６ｐｕｒｏ及びＡ３７５Ｐｐｕｒｏへの結合が可能であった。灰色及び黒色の実線は、コントロール抗体である、１０Ｄ５（抗αｖβ６、灰色の実線）及び非免疫ＩｇＧ（黒色の実線）を表す。赤線は、１０μＭのビオチニル化したペプチド。オレンジの線は、１μＭのビオチニル化したペプチド。緑の線は、０．１μＭのビオチニル化したペプチド。青線は、０．０１μＭのビオチニル化したペプチド。紫の線は、０．００１μＭのビオチニル化したペプチド。データは、同様の結果となった、少なくとも２回の独立した実験の代表例である。

Claims (30)

1. ＬＸ^５Ｘ^６ＬまたはＬＸ^５Ｘ^６Ｉをαヘリックス構造内に含む、配列モチーフＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６ＬまたはＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６Ｉを含むペプチド。
2. 配列ＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６ＬＸ^８Ｘ^９Ｘ^１０を含む、請求項１に記載のペプチド。
3. Ｚはヘリックスを促進させる残基であり、ｎは１から２０の間の任意の数である、配列ＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６ＬＸ^８Ｘ^９Ｘ^１０Ｚ_ｎを含む、請求項１または２に記載のペプチド。
4. ｎが５から１５の間である、請求項３に記載のペプチド。
5. Ｘ^５−Ｘ^６がヘリックスを促進させる残基である、請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチド。
6. Ｘ^８−Ｘ^１０がヘリックスを促進させる残基である、請求項２から５のいずれか一項に記載のペプチド。
7. 前記ヘリックスを促進させる残基が、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ及びＡｓｐの群から独立して選択される、請求項５または６に記載のペプチド。
8. 前記αヘリックス構造により、残基ＬＸＸＬ／Ｉの側鎖が前記ヘリックスの一方から突き出ることを可能にする、請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチド。
9. 前記αヘリックス構造が１から５回転を持つ、請求項１から８のいずれか一項に記載のペプチド。
10. 前記ペプチドが１２から４５アミノ酸長である、請求項１から９のいずれか一項に記載のペプチド。
11. 前記ペプチドが２０アミノ酸長である、請求項１０に記載のペプチド。
12. 前記ペプチドが環化されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド。
13. 前記ペプチドが、システイン残基を介してジスルフィド結合によって環化されている、請求項１２に記載のペプチド。
14. 前記ペプチドが、表４において示されているように、Ａ２０ペプチド、ｐ１８−ＩＮＫペプチド、Ｂ−Ａ２０ペプチドまたは環状ペプチドである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のペプチド。
15. 前記ペプチドが検出可能な部分に連結されている、請求項１から１４のいずれか一項に記載のペプチド。
16. 前記検出可能な部分が、磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）、磁気共鳴スペクトロスコピー（ＭＲＳ）、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）または光学的画像によって検出可能なものである、請求項１５に記載のペプチド。
17. 前記検出可能な部分が放射能を持った部分である、請求項１５または１６に記載のペプチド。
18. 前記ペプチドが治療上の活性部分に連結されている、請求項１から１７のいずれか一項に記載のペプチド。
19. 前記治療上の活性部分が抗がん剤である、請求項１８に記載のペプチド。
20. 請求項１から１９のいずれか一項に記載のペプチドをコードする、単離された核酸分子。
21. 請求項２０に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
22. 治療または診断の使用のための、請求項１から２１のいずれか一項に記載の、ペプチド、核酸分子または発現ベクター。
23. 請求項１から１９のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２０に記載の核酸分子または請求項２１に記載の発現ベクター、並びに医薬として許容される担体、を含む医薬組成物。
24. 請求項１から１９のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２０に記載の核酸分子または請求項２１に記載の発現ベクターを、治療に有効量で、必要とする患者に投与することを含む、細胞がαｖβ６を過剰発現している疾病あるいはαｖβ６を介した疾病の治療方法。
25. 細胞がαｖβ６を過剰発現している疾病またはαｖβ６を介した疾病の治療用薬剤の調製のための、請求項１から１９のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２０に記載の核酸分子または請求項２１に記載の発現ベクター、の使用。
26. 前記疾病が、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性損傷皮膚病または癌から選択される、請求項２４または２５に記載の前記の方法または使用。
27. 前記慢性損傷皮膚病が表皮水疱症である、請求項２６に記載の前記の方法または使用。
28. 請求項１５から１８のいずれか一項に記載のペプチドを有効量で個体に投与すること並びにその体内で前記ペプチドの存在を検出することを含む、個体の体内での上皮細胞の画像化の方法。
29. 請求項１５から１８のいずれか一項に記載のペプチドを有効量で個体に投与すること並びにその体内でペプチドの存在を検出することを含む、αｖβ６を介した疾病の診断または予後診断の方法。
30. 請求項１８または１９に記載のペプチドを投与することを含む、治療上の活性部分をαｖβ６発現細胞または患者内でαｖβ６を発現している細胞を含んでいる組織に送達する方法。

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