JP2018521663A - 治療薬 - Google Patents

Abstract

（ｉ）第二世代キメラ抗原受容体であって、（ａ）シグナル伝達領域；（ｂ）共刺激シグナル伝達領域；（ｃ）膜貫通ドメイン；および（ｄ）標的抗原上の第１のエピトープと特異的に相互作用する結合エレメントを含む第二世代キメラ抗原受容体と、（ｉｉ）キメラ共刺激受容体であって、（ｅ）（ｂ）の共刺激シグナル伝達領域と異なる共刺激シグナル伝達領域；（ｆ）膜貫通ドメイン；および（ｇ）標的抗原上の第２のエピトープと特異的に相互作用する結合エレメントを含むキメラ共刺激受容体とを発現するＴ細胞などの免疫応答細胞。この配置は、並列キメラ活性化受容体（ｐＣＡＲ）と称される。このタイプの細胞は治療において有用であり、かつそれらを使用するためのキットおよび方法ならびにそれらを調製するための方法が記載されかつ特許請求される。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸ならびにＣＡＲ自体、核酸を組み込んだ細胞および治療におけるそれらの使用、特に選択された標的に対するＴ細胞応答を促進するためにそれらが使用される方法に関する。

人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ免疫受容体と称されることもあるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は操作された受容体であり、当該技術分野において周知である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、特定の特異性を有する免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞を得るために、そうした細胞を形質転換するのに主に使用される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、特に養子細胞移入などの技術にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用できる癌免疫療法の分野で研究中である。これらの治療では、Ｔ細胞を患者から採取し、特定の癌の形態に見られる抗原に特異的な受容体を発現するように改変する。その後、癌細胞を認識して殺すことができるこのＴ細胞を患者に再導入する。

第一世代ＣＡＲは、最も一般的にはＣＤ３ゼータ（ｚ）を用いてＴＣＲ様シグナルを与えることで殺腫瘍機能を引き出す。しかしながら、ＣＤ３ｚ鎖融合受容体の関与は、同時に起こる共刺激シグナルの非存在下では、実質的なＩＬ−２分泌および／または増殖を引き出すのに十分でないことがある。生理的なＴ細胞応答の場合、最適なリンパ球活性化には、ＣＤ２８または４−１ＢＢなどの１つまたは複数の共刺激受容体（シグナル２）の関与が不可欠である。したがって、Ｔ細胞は、腫瘍抗原依存性に共刺激シグナルを受け取るようにさらに操作されている。

これに関連した重要な発展は、ヒトプライマリーＴ細胞において機能的な抗原依存性共刺激シグナルを伝達し、殺腫瘍活性に加えてＴ細胞増殖を可能にした「第二世代ＣＡＲ」の設計の成功であった。第二世代ＣＡＲは、最も一般的にはＣＤ２８または４−１ＢＢに由来するモジュールを用いて共刺激を与える。共刺激とＣＤ３ゼータシグナルとを組み合わせた送達により、第二世代ＣＡＲは、その第１世代のカウンターパート（ＣＤ３ｚシグナル単独）と比較して機能の点で明らかに優れている。第二世代ＣＡＲの例は、米国特許第７，４４６，１９０号明細書で確認される。

最近になって、いわゆる「第三世代ＣＡＲ」が調製された。これは、ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＣＤ３ｚまたはＣＤ２８＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ｚなどの複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせて効力をさらに増大させたものである。第三世代ＣＡＲの場合、シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ細胞内ドメインに直列に並べられ、ＣＤ３ｚの上流に置かれる。

しかし、残念ながら、一般にこの第三世代ＣＡＲにより得られる結果は、第二世代の立体配置に対してわずかな改善のみを示している。

複数のコンストラクトで形質転換させた細胞の使用も提案されてきた。たとえば、Ｋｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２４５９には、第１の抗原を標的とするシグナル活性化領域（ＣＤ３ゼータ鎖）と、ＣＤ２８および４−１ＢＢの共刺激領域の両方を含み、第２の抗原を標的とするキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）とを含むＣＡＲのＴ細胞への形質導入が記載されている。２つのコンストラクトは、異なる結合親和性でそれらそれぞれの抗原に結合し、これにより、副作用を減らすために治療の特異性を高め得る「腫瘍センシング」効果が生じる。

抗原を発現する腫瘍標的細胞により複数回繰り返される刺激を経て、Ｔ細胞が成長しサイトカインを産生して死滅シグナルを送達できる状態にＴ細胞を維持できるシステムを開発することが望ましい。Ｔ細胞は、最適でない共刺激を受けると、再刺激時にこれらのエフェクター機能を急速に失い、「アネルギー」と呼ばれる状態に入る。ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで連続的に再刺激されると、徐々にエフェクター特性（たとえば、ＩＬ−２産生、増殖能力）を失い、分化してよりエフェクター様になり、換言すれば共刺激の効果が現れにくくなる。これは、癌免疫療法にとって望ましくない。より分化した細胞は腫瘍微小環境において繰り返し刺激されると、寿命が短くなり、さらなる成長／活性化を行う能力が低下する傾向があるためである。

本出願人らは、複数の共刺激領域を異なるコンストラクトに配置したコンストラクトの組み合わせを使用して、効果的なＴ細胞応答を惹起し得ることを見出した。

本発明の第１の態様によれば、免疫応答細胞であって、
（ｉ）第二世代キメラ抗原受容体であって、
（ａ）シグナル伝達領域；
（ｂ）共刺激シグナル伝達領域；
（ｃ）膜貫通ドメイン；および
（ｄ）標的抗原上の第１のエピトープと特異的に相互作用する結合エレメント
を含む第二世代キメラ抗原受容体と、
（ｉｉ）キメラ共刺激受容体であって、
（ｅ）（ｂ）の共刺激シグナル伝達領域と異なる共刺激シグナル伝達領域；
（ｆ）膜貫通ドメイン；および
（ｇ）標的抗原上の第２のエピトープと特異的に相互作用する結合エレメント
を含むキメラ共刺激受容体と
を発現する免疫応答細胞を提供する。

本出願人らは、この系の有効性が優れており、特に類似のエレメントを有する従来の第三世代ＣＡＲを用いて達成される有効性より優れている可能性があることを見出した。本発明のタイプのコンストラクトは、「並列キメラ活性化受容体」または「ｐＣＡＲ」と呼ばれ得る。

さらに、細胞の増殖、その細胞傷害能を維持しかつＩＬ−２を放出するその能力も、抗原を発現する腫瘍細胞による多数回繰り返される刺激を通して維持される。

理論に束縛されるものではないが、ｐＣＡＲのエレメントの配置が活性を促進し得る。たとえば、定義によれば、第三世代ＣＡＲの共刺激モジュールの１つは、形質膜の内側に近いその自然な位置から離して置かなければならない。これにより、必須の膜結合パートナー分子へのアクセスが妨げられるため、共刺激モジュールが正常にシグナル伝達しないことがある。あるいは、第三世代ＣＡＲの２つの共刺激シグナル伝達モジュールの近接により、立体上の問題が生じ、１つまたは複数の下流シグナル伝達経路の十分な関与を妨げる可能性がある。これらの問題の両方が本発明の配置で回避される。シグナル伝達部分（ｂ）および（ｅ）の両方が膜貫通ドメインに直接融合して、その両方が細胞内の形質膜に隣接することを確実にし得る。さらに、シグナル伝達部分（ｂ）および（ｅ）は、立体的に互いに相互作用しないように、細胞内の異なる部位で間隔を置いて配置してもよい。

本発明の第１の態様に使用するのに好適な免疫応答細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞または制御性Ｔ細胞などのＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。特に、免疫応答細胞はＴ細胞である。

好適な上記のエレメント（ａ）は、たとえば、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ ２０１０ ２（６）ｌ ａ００２４８５により概説されている免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む任意の領域を含む任意の好適なシグナル伝達領域を含んでもよい。特定の実施形態では、シグナル伝達領域は、たとえば、米国特許第７，４４６，１９０号明細書に記載されているようなヒトＣＤ３［ゼータ］鎖の細胞内ドメインまたはその変異体を含む。

特に、これは、全長ヒトＣＤ３ゼータ鎖のアミノ酸残基５２〜１６３にわたるドメインを含む。このドメインは、それぞれ配列番号１および２として示したいくつかの多形（たとえば、配列番号ｇｂ｜ＡＡＦ３４７９３．１およびｇｂ｜ＡＡＡ６０３９４．１）を有する。

本明細書で使用する場合、「変異体」という用語は、天然に存在する塩基配列の多形および鎖内の１つまたは複数のアミノ酸が挿入、除去または置換されている合成変異体であるポリペプチド配列を指す。しかしながら、変異体は、その塩基配列の生物学的作用と同様の生物学的作用を発揮する。たとえば、上述の変異体は、ヒトＣＤ３［ゼータ］鎖の細胞内ドメインの生物学的作用と同様に作用する。アミノ酸置換は、アミノ酸が、概ね類似した特性を有する同じクラスの別のアミノ酸で置換されている「保存的」置換と見なすことができる。非保存的置換は、アミノ酸が異なるタイプまたはクラスのアミノ酸で置換されている置換である。

アミノ酸のクラスは、以下の通り定義される。

当業者によく知られているように、保存的置換によりペプチドの一次構造を変化させてもそのペプチドの活性を大きく変化させることはできない。配列に挿入されるアミノ酸の側鎖は、置換されたアミノ酸の側鎖と同様の結合および接点を形成でき得るためである。これは、置換がペプチドのコンフォメーションの決定に重要な領域におけるときでもそうである。

非保存的置換が上記のようなポリペプチドの機能を妨害しない場合、非保存的置換も可能であり得る。大まかに言えば、ポリペプチドの生物活性を変化させなければ、比較的少ない非保存的置換は可能である。

一般に、変異体は塩基配列、たとえば配列番号１または配列番号２と少なくとも７０％、たとえば少なくとも７１％、７５％、７９％、８１％、８４％、８７％、９０％、９３％、９５％、９６％または９８％同一のアミノ酸配列を有する。これに関連して、同一性は、塩基配列としての配列番号２またはフラグメント、特に下記のようなフラグメントを用いてＢＬＡＳＴＰコンピュータープログラムを用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴソフトウェアは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ（２００９年３月１２日にアクセス可能）で一般に入手可能である。

共刺激シグナル配列（ｂ）は、好適には、膜貫通ドメイン（ｃ）とシグナル伝達領域（ａ）との間に位置し、結合エレメント（ｄ）から遠い。同様に共刺激シグナル配列（ｅ）は、好適には、膜貫通ドメイン（ｆ）に隣接して位置し、結合エレメント（ｇ）から遠い。

上記のエレメント（ｂ）および（ｅ）として使用するのに好適な共刺激シグナル伝達領域も当該技術分野において周知であり、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー、たとえばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２もしくはＰＤＣＤ６；またはＩＬＴ／ＣＤ８５ファミリータンパク質、たとえばＬＩＬＲＡ３、ＬＩＬＲＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３もしくはＬＩＬＲＢ４；または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーメンバー、たとえば４−１ＢＢ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ Ｒ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシン−α、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦ−αもしくはＴＮＦ ＲＩＩ；またはＳＬＡＭファミリーのメンバー、たとえば２Ｂ４、ＢＬＡＭＥ、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８４、ＣＤ２２９、ＣＲＡＣＣ、ＮＴＢ−ＡもしくはＳＬＡＭ；またはＴＩＭファミリーのメンバー、たとえばＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３もしくはＴＩＭ−４；または他の共刺激分子、たとえばＣＤ７、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、Ｄｅｃｔｉｎ−１、ＤＰＰＩＶ、ＥｐｈＢ６、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３もしくはＴＳＬＰ Ｒが挙げられる。

共刺激シグナル伝達領域の選択は、形質転換細胞の個々の使用目的に応じて選択され得る。特に、上記の（ｂ）および（ｅ）で選択される共刺激シグナル伝達領域は、共に協同的または相乗的に作用し得るものである。たとえば、（ｂ）および（ｅ）の共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＲ３またはＣＤ４０から選択され得る。

特定の実施形態では、（ｂ）または（ｅ）の一方はＣＤ２８であり、および他方は４−１ＢＢまたはＯＸ４０である。

特定の実施形態では、（ｂ）はＣＤ２８である。

別の特定の実施形態では（ｅ）は４−１ＢＢまたはＯＸ４０であり、特に４−１ＢＢである。別の実施形態では、（ｅ）はＣＤ２７である。

上記の（ｃ）および（ｆ）の膜貫通ドメインは同一でもまたは異なってもよいが、特に細胞表面上の各コンストラクトの分離を確保するために異なっている。さらに異なる膜貫通ドメインの選択によりベクターの安定性が高まることがある。ウイルスベクターにダイレクトリピート核酸配列が含まれると、ベクターが再構成を起こしやすく、ダイレクトリピート間の配列が欠失するためである。ただし、（ｃ）および（ｆ）の膜貫通ドメインが同じである場合、同じタンパク質配列をコードするように選択されたコドンを改変するかまたは「ゆらぎを生じさせる（ｗｏｂｂｌｉｎｇ）」ことにより、このリスクを低下させることができる。

好適な膜貫通ドメインは当該技術分野において公知であり、たとえば、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４またはＣＤ３ｚの膜貫通ドメインが挙げられる。

共刺激シグナル伝達領域が上記のようにＣＤ２８を含む場合、ＣＤ２８膜貫通ドメインが好適な選択肢の代表例である。全長ＣＤ２８タンパク質は、配列番号３

の２２０アミノ酸のタンパク質であり、膜貫通ドメインを太字で示す。

特に、共刺激シグナル伝達領域の１つは、ＣＤ２８のヒンジ領域、好適にはさらに膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに基づく。特に、配列番号４として下記に示した配列番号３のアミノ酸１１４〜２２０を含む。

特定の実施形態では、上記の共刺激シグナル伝達領域（ｂ）または（ｅ）の１つは、配列番号５のｃ−ｍｙｃタグを含む配列番号４の改変形態である。

ｃ−ｍｙｃタグはよく知られており、配列番号５
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号５）
のタグである。

ｃ−ｍｙｃタグは、細胞外ドメインへの挿入または細胞外ドメインの領域の置き換えにより共刺激シグナル伝達領域（ｂ）または（ｅ）に加えることができ、したがって配列番号３のアミノ酸１〜１５２の領域内にある。

特に好ましい実施形態では、ｃ−ｍｙｃタグはＣＤ２８配列のＭＹＰＰＰＹモチーフに置き換わっている。このモチーフは、潜在的に有害な配列である。このモチーフは、ＣＤ２８とその天然リガンドＣＤ８０およびＣＤ８６との間の相互作用を担っており、したがってＣＡＲ Ｔ細胞がこれらのリガンドの何れかを発現する標的細胞に遭遇した際、オフターゲット毒性が生じる可能性がある。上記のようにこのモチーフをタグ配列で置き換えることで、望ましくない副作用の可能性が低下する。

したがって、特定の実施形態では、コンストラクトの共刺激シグナル伝達領域（ｂ）は、配列番号６

の領域である。

さらに、ｃ−ｍｙｃエピトープが含まれることは、モノクローナル抗体を用いたＣＡＲ Ｔ細胞の検出が容易になることを意味する。一部の入手可能な抗体を使用した際にフローサイトメトリー検出が信頼できないことが立証されているため、これは非常に有用である。

さらに、ｃ−ｍｙｃエピトープタグを付けると、たとえば溶液中のまたは固相（たとえば、バッグ）に固定化した適切なモノクローナル抗体を用いたＣＡＲの架橋結合により、標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の抗原非依存性増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）が促進され得る。

加えて、ＴＣＲの可変領域内の抗−ヒトｃ−ｍｙｃ抗体９ｅ１０のエピトープの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で抗体および補体による細胞毒性を与えるのに十分であることが既に示されている（Ｋｉｅｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５（２）６２３−８）。したがって、そうしたエピトープタグを付けると「自殺システム」として使用することもでき、毒性が生じた場合に抗体を用いてｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＲ Ｔ細胞を枯渇させることができる。

結合エレメント（ｄ）および（ｇ）は異なり、同一エピトープ、重複エピトープまたは異なるエピトープに結合する。特定の実施形態では、第１および第２のエピトープは、同一の受容体または抗原と関連付けられている。したがって、上記のような第１および第２のエピトープは、場合により同一でもまたは重複していてもよく、したがって結合エレメント（ｄ）および（ｇ）は、それらの結合において競合することになる。あるいは、第１および第２のエピトープは異なっており、想定される特定の治療に応じて同一の抗原と関連付けられていてもまたは異なる抗原と関連付けられていてもよい。一実施形態では、抗原は異なるものの、特定の同一の癌などの同一の疾患と関連付けられていてもよい。

本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、結合エレメントに結合する特異的結合対の任意のメンバーである。したがって、この用語は標的細胞上の受容体を含む。

したがって、好適な結合エレメント（ｄ）および（ｇ）は、関心のある標的を認識する能力をｐＣＡＲに与える任意のエレメントでよい。本発明のｐＣＡＲを向かわせる標的は、Ｔ細胞応答を誘発することが望ましいと考えられ、臨床的に関心のある任意の標的でよい。これは、たとえば、１つもしくは複数のＥｒｂＢ受容体またはα_ｖβ_６インテグリンを含む様々なタイプの癌に関連するマーカー、前立腺癌（たとえば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する結合エレメントを使用する）、乳癌（たとえば、Ｈｅｒ−２（ＥｒｂＢ２とも呼ばれる）を標的とする結合エレメントを使用する）および神経芽細胞腫（たとえば、ＧＤ２を標的とする結合エレメントを使用する）に関連するマーカー、メラノーマ、小細胞または非小細胞性肺癌、肉腫ならびに脳腫瘍を含む。特定の実施形態では、標的は、上記のような１つもしくは複数のＥｒｂＢ２量体またはコロニー刺激因子−１の受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）あるいはα_ｖβ_６インテグリンであり、これらはすべていくつかの固形腫瘍に関与している。

本発明のｐＣＡＲに使用される結合エレメントは、選択された標的を認識する抗体を含んでもよい。便宜上、結合エレメントとして使用される抗体は、好ましくはラクダ科、ヒトまたは他の種由来の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または単一ドメイン抗体である。一本鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングしてもよい。そうしたハイブリドーマの作製は日常的なものになっており、その手順はここで繰り返さない。可変領域重鎖（ＶＨ）および可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングに使用することができる技術は、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：３８３３−３８３７（１９８９）に記載されている。簡単に説明すると、ｍＲＮＡをハイブリドーマ細胞株から単離し、たとえば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）キットを用いて相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写する。ＶＨおよびＶＬ遺伝子の配列に対応する配列特異的プライマーを使用する。クローニングした産物の配列解析、ならびにＶＨおよびＶＬ遺伝子の既知の配列との比較を用いて、クローニングしたＶＨ遺伝子が期待に合ったことを示すことができる。次いで、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を、たとえば（ｇｌｙ４−ｓｅｒ）３リンカーをコードするオリゴヌクレオチドを用いて一緒に結合する。

あるいは、ｐＣＡＲの結合エレメントは、Ｔ１Ｅペプチド（ＥｒｂＢホモおよびヘテロ２量体に結合する）、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）またはＩＬ−３４（両方ともＣＳＦ−１受容体に結合する）などのリガンドを含んでもよい。Ｔ１Ｅペプチドは、成熟ヒトＴＧＦ−αタンパク質の最Ｎ末端の７アミノ酸（ｐｒｏ−トランスフォーミング成長因子αアイソフォーム１（ＮＰ＿００３２２７．１）のアミノ酸４０〜４６）で置き換えられた最Ｎ末端の５アミノ酸（ｐｒｏ−上皮成長因子前駆体（ＮＰ＿００１９５４．２）のアミノ酸９７１〜９７５）を除く、全成熟ヒトＥＧＦタンパク質からなるキメラ融合タンパク質である。

別の実施形態では、ｐＣＡＲの結合エレメントは、α_ｖβ_６インテグリン特異的結合剤を含む。インテグリンαｖβ６は、現在、多くのタイプの癌で強く上方制御されることが分かっているため、癌の標的と見なされている。α_ｖβ_６は、ウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１のＲＧＤモチーフを介した結合により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の受容体として同定された。そのため、たとえば米国特許第８，３８３，５９３号明細書に記載されているように、ＦＭＤＶに由来する一定範囲のペプチド、特にＦＭＤＶのＶＰ１タンパク質に由来しかつＲＧＤモチーフを含むペプチドは、結合能および結合特異性の増加を示した。特に、これらのペプチドは、配列モチーフ
ＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６Ｌ（配列番号７）、または
ＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６Ｉ（配列番号８）
を含み、ＬＸ^５Ｘ^６ＬまたはＬＸ^５Ｘ^６Ｉは、αヘリックス構造内に含まれ、Ｘ^５およびＸ^６は、［α］−ヘリックスの中央に見られるために１．０より大きい配座優先性を有するヘリックス促進残基である（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９９３ ａｎｄ Ｐａｃｅ Ｃ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｃｈｏｌｔｚ Ｊ．Ｍ．（１９９８），Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．７５，ｐａｇｅｓ ４２２−４２７から）。特に、そうした残基は、独立に、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＡｓｐからなる群から選択される。

そうした配列の具体的な例として、配列番号９〜１１
ＹＴＡＳＡＲＧＤＬＡＨＬＴＴＴＨＡＲＨＬ（配列番号９）
ＧＦＴＴＧＲＲＧＤＬＡＴＩＨＧＭＮＲＰＦ（配列番号１０）、もしくは
ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ（配列番号１１）
またはそれらの変異体が挙げられる。

これらのペプチドは、本出願のＣＡＲの結合エレメントの特定の基を形成してもよい。

ホジキンリンパ腫および一部の乳癌などの選択された悪性腫瘍では、２つの天然リガンドとしてＣＳＦ−１およびＩＬ−３４があり、これらは（ｄ）および（ｇ）の特に好適な結合エレメントを形成する。しかしながら、これらは異なる親和性で結合する。結合の親和性は、観察される活性に影響を与え得る。この場合、結合親和性が低い方の結合エレメントを結合エレメント（ｄ）として使用し、結合親和性の高い方を結合エレメント（ｇ）として使用すると有益であり得る。特に、一実施形態では、第二世代ＣＡＲ（ｉ）の、それに対応する標的に対する相対親和性は、パートナーであるＴＮＦＲを用いたキメラ共刺激受容体（ｉｉ）の相対親和性より低い。これは、こうした相対的な親和関係が維持されるのであれば、高親和性標的化部分または低親和性標的化部分のそれぞれの位置における使用を妨げるものではない。したがって、本発明の場合、特定の実施形態では、結合エレメント（ｄ）は、相対的に低い結合親和性を有するＣＳＦ−１である一方、結合エレメント（ｇ）は、より高い結合親和性を有するＩＬ−３４を含む。

好適には、結合エレメントは、細胞表面上の発現を促進するリーダー配列と関連付けられている。多くのリーダー配列が当該技術分野において公知であり、それらとして、マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＦＭＳ）リーダー配列またはＣＤ１２４リーダー配列が挙げられる。

さらなる実施形態では、ｐＣＡＲを発現する細胞は、キメラサイトカイン受容体、特に４αβキメラサイトカイン受容体を共発現するように操作される。４αβの場合、ＩＬ−４受容体α鎖の細胞外ドメインがＩＬ−２／１５受容体βの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに連結される。これにより、好適な支持培地中でこれらの細胞を培養することで、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子操作Ｔ細胞の選択的増殖および富化が可能になる。４αβの場合、この好適な支持培地は唯一のサイトカイン添加物としてＩＬ−４を含むと考えられる。同様に、この系は、ＩＬ−４受容体α鎖の細胞外ドメインが、やはり共通γ鎖に結合するサイトカインが自然に結合する別の受容体の膜貫通および細胞内ドメインに連結したキメラサイトカイン受容体と共に使用してもよい。

論じたように、これらの細胞は、標的細胞集団に対するＴ細胞性免疫応答を刺激するための治療において有用である。したがって、本発明の第２の態様は、標的細胞集団に対するＴ細胞性免疫応答の刺激を、それを必要とする患者において行うための方法であって、上記のような免疫応答細胞の集団を患者に投与することを含み、結合エレメント（ｄ）および（ｇ）が標的細胞に特異的である、方法を提供する。

本発明の第３の態様では、先行する請求項の何れか１項に記載の免疫応答細胞を調製するための方法であって、上記で定義された構造（ｉ）のＣＡＲをコードする第１の核酸およびまた上記で定義された構造（ｉｉ）のＣＡＲをコードする第２の核酸を細胞に形質導入することを含む方法を提供する。

特に、本方法では、患者由来のリンパ球に（ｉ）および（ｉｉ）のＣＡＲをコードする核酸を形質導入する。特に、Ｔ細胞に、たとえばレトロウイルスによる形質導入により遺伝子改変を行い、核酸をコードするＣＡＲを宿主Ｔ細胞ゲノムに導入することで安定なＣＡＲ発現を可能にする。次いで、Ｔ細胞を、任意選択的に増殖後、患者に再導入して有益な治療効果を得ることができる。Ｔ細胞などの細胞が４αβなどのキメラサイトカイン受容体を共発現するように操作されている場合、増殖ステップは、サイトカインを含む培地、たとえば４αβの場合には唯一のサイトカイン添加物としてＩＬ−４を含む培地中のｅｘ ｖｉｖｏでの培養ステップを含んでもよい。あるいは、キメラサイトカイン受容体は、ＩＬ−７などの異なる特性を有する共通γサイトカインに使用される細胞内ドメインに連結した、ＩＬ−４受容体α鎖の細胞外ドメインを含んでもよい。この設定では、ＩＬ−４を用いた細胞の増殖により細胞分化が低下し、ＩＬ−７の本来の能力を十分に生かしてこの効果を達成することができる。このように、所望の分化状態にある遺伝子操作Ｔ細胞の選択的増殖および富化を確実なものにできる。

本発明の第４の態様では、上記の（ｉ）のＣＡＲをコードする第１の核酸と、上記の（ｉｉ）のＣＣＲをコードする第２の核酸との組み合わせを提供する。前に示したように、この組み合わせはｐＣＡＲと称される。核酸の好適な配列は当業者に明らかになるであろう。配列は、必要とされる免疫応答細胞に使用できるように最適化してもよい。しかしながら、場合により、上記で論じたように、コドンは、反復配列を避けるために最適条件から異なっていてもよく、または「ゆらぎがあって」もよい。そうした核酸の特定の例は、上述の好ましい実施形態をコードする。

形質導入を達成するため、本発明の第４の態様の核酸は、好適には、プラスミドまたはレトロウイルスベクターなどのベクターに導入される。プラスミドベクターを含むそうしたベクターまたはそれらを含む細胞株は、本発明のさらなる態様を形成する。

第１および第２の核酸またはそれらを含むベクターは、本発明の第１の態様の免疫応答細胞をｉｎ ｓｉｔｕで産生するために供給されるキットに含めてもよい。

上述の核酸によりコードされた並列キメラ活性化受容体（ｐＣＡＲ）は、本発明のさらなる態様を形成する。

次に、例示としてかつ以下の図を参照しながら本発明が詳細に記載される。

図１は、本発明を実施した一連のＣＡＲおよびｐＣＡＲ（Ｃ３４Ｂおよび３４ＣＢと命名される）を示す概略図である。ＣＡＲおよびｐＣＡＲのすべては、ＩＬ−４受容体α細胞外ドメインがＩＬ−２受容体βの膜貫通および細胞内ドメインと融合されたキメラサイトカイン受容体４αβと共にＳＦＧレトロウイルスベクター中で共発現させた。４αβを使用すると、それがガンマｃ（γｃ）鎖をリクルートするため、ＩＬ−４を用いた培養により遺伝子改変Ｔ細胞の選択的富化および増殖が可能になる。 図２は、図１に示すＣＡＲを用いた実験の結果を示す。これらのＣＡＲおよびｐＣＡＲ（または対照としての、形質導入していない（ＵＴ））を発現するＴ細胞（１×１０^６細胞）を、対応する標的抗原（コロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、ｃ−ｆｍｓによりコードされる）を発現する（Ｔ４７Ｄ−ＦＭＳ）または欠いている（Ｔ４７Ｄ）Ｔ４７Ｄ腫瘍細胞と２４時間ｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した。次いで、ＭＴＴアッセイにより残存生腫瘍細胞を定量した。 図３は、図１のＣＡＲおよびｐＣＡＲを発現するＴ細胞（または対照としての形質導入していないＴ細胞）を、外来性サイトカインの非存在下で連続回のＡｇ刺激に供した代表的な実験を示す。刺激はＴ４７Ｄ ＦＭＳ単層に週間培養により与え、Ｔ細胞数を表記の間隔で数え上げた。 図４は、図３に示した実験に類似した７回の反復実験をプールしたデータを示し、各刺激サイクル後の１週間で生じたＣＡＲ Ｔ細胞の増殖倍数を示した。 図５は、図３に示す実験刺激サイクル２、６、９および１２の時点で行った例示的細胞毒性アッセイを示す。これは、各再刺激サイクル時から２４時間後のＴ４７Ｄ ＦＭＳ単相および改変していないＴ４７Ｄ単層を殺す能力についてＴ細胞を試験（ＭＴＴアッセイ）した結果である。 図６は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ含量について、各刺激サイクル後の翌日培養物から採取した上清をＥＬＩＳＡにより試験した結果を示す。 図７は、その後のＣＡＲおよびｐＣＡＲ操作Ｔ細胞の抗腫瘍活性試験を可能にした、ＣＳＦ−１Ｒを発現する未分化大細胞リンパ腫の異種移植モデルのｉｎ ｖｉｖｏでの確立を図示する。このモデルは、ホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ）および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するように操作されたＫ２９９細胞を用いて確立した。図７Ａは、表記の用量のＫ２９９ ｌｕｃ細胞の静脈内注射後、生物発光イメージング（ＢＬＩ）により定量した腫瘍形成を示す。図７Ｂは、２百万個の腫瘍細胞を投与したマウスの代表的なＢＬＩ画像を示す。図７Ｃは、表記の組織におけるＲＦＰ^＋腫瘍細胞の発現を示し、本モデルでは腫瘍がリンパ節のみに形成されたことを図示する。図７Ｄは、５個の代表的なリンパ節腫瘍上のＣＳＦ−１Ｒの発現を示す。 図８は、Ｋ２９９ ｌｕｃ細胞をＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウス（各群ｎ＝９、３回以上の別の実験に分けた）に静脈内注射した治療研究の結果を示す。５日後、マウスをＣＡＲ Ｔ細胞で処置した。図８Ａは、腫瘍からのプールした生物発光の光を示す。図８Ｂは、各マウス由来の生物発光の光を示す。図８Ｃは、マウスの生存率を示す。 図９は、治療研究に使用した動物の一定期間における体重を示す。 図１０は、本発明の二重ＣＡＲ（Ｃ３４Ｂ）発現Ｔ細胞の「疲弊マーカー」発現の解析結果であり、ＰＤ１解析の結果を示す。 図１１は、本発明の二重ＣＡＲ（Ｃ３４Ｂ）発現Ｔ細胞の「疲弊マーカー」発現の解析結果であり、ＴＩＭ３解析の結果を示す。 図１２は、本発明の二重ＣＡＲ（Ｃ３４Ｂ）発現Ｔ細胞の「疲弊マーカー」発現の解析結果であり、ＬＡＧ３解析の結果を示す。 図１３は、本発明の二重ＣＡＲ（Ｃ３４Ｂ）発現Ｔ細胞の「疲弊マーカー」発現の解析結果であり、２Ｂ４解析の結果を示す。 図１４は、本発明を実施するｐＣＡＲ（ＳＦＧ ＴＩＥ−４１ＢＢ／Ａ２０−２８ｚと命名される）を含む、インテグリンαｖβ６を標的とする調製した一連のＣＡＲおよびコンストラクトの概略図である。Ａ２０−２８ｚは、口蹄疫ウイルスに由来するＡ２０ペプチドを用いて標的化した第二世代ＣＡＲである。Ａ２０は、αｖβ６に高親和性であり、他のＲＧＤ結合インテグリンに８５〜１０００倍低い親和性で結合する。Ｃ２０−２８ｚは、Ａ２０の重要要素がインテグリン結合活性を阻害するように変異させた適合対照である。ＣＡＲは、すべて図１に記載されているように４αβと共発現させた。 図１５は、Ａ３７５ ｐｕｒｏ細胞およびＰａｎｃ１細胞のフローサイトメトリーにより得られた、インテグリン発現を図示する一連のヒストグラムである。細胞は抗β６（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、続いて二次抗マウスＰＥ、抗αｖβ３または抗αｖβ５（両方ともＡＰＣコンジュゲート、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ）で染色した。ゲートは、二次抗体単独またはアイソタイプ対照に基づき設定した。 図１６は、αｖβ６を標的とする本発明のｐＣＡＲを含むＣＡＲの細胞毒性を図示する一連のグラフである。表記のＣＡＲおよびｐＣＡＲを発現するＴ細胞をαｖβ６陰性（Ｐａｎｃ１およびＡ３７５ ｐｕｒｏ）またはαｖβ６陽性（Ｂｘｐｃ３およびＡ３７５ ｐｕｒｏ β６）腫瘍細胞と共培養した。データは、２〜７回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示し、各実験を３回繰り返して行った。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１７は、本発明のｐＣＡＲを含む、αｖβ６を標的とするＣＡＲによるＩＦＮ−γの産生を示す一連のグラフである。表記のＣＡＲおよびｐＣＡＲを発現するＴ細胞をαｖβ６陰性（Ｐａｎｃ１およびＡ３７５ ｐｕｒｏ）またはαｖβ６陽性（Ｂｘｐｃ３およびＡ３７５ ｐｕｒｏ β６）腫瘍細胞と共培養した。データは、５〜６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示し、各実験を２回繰り返して行った。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ−有意差なし。 図１８は、上述のＣＡＲおよびｐＣＡＲ操作したＴ細胞を用いた再刺激実験の結果を示し、Ａ２０−２８ｚ／Ｔ１Ｅ−４１ＢＢ ｐＣＡＲ Ｔ細胞が、Ｔ細胞の増殖およびαｖβ６インテグリンを発現する（Ｂｘｐｃ３）またはしない（Ｐａｎｃ１）標的細胞の破壊を伴って、繰り返し抗原刺激を行う能力を示す。 図１９は、Ａ２０−２８ｚをＴ１Ｅ−４１ＢＢ、Ｔ１Ｅ−ＣＤ２７またはＴ１Ｅ−ＣＤ４０と共発現させ、ＴＮＦ受容体ファミリーの追加メンバーによる共刺激の比較評価を可能にしたｐＣＡＲ操作Ｔ細胞を用いた再刺激実験の結果を示す。対照Ｔ細胞に形質導入しなかった（ＮＴ）一方、ＣＡＲは切断（ｔｒ）細胞内ドメインを含んでいた。αｖβ６インテグリンを発現する（Ｂｘｐｃ３）またはしない（Ｐａｎｃ１）標的細胞上でＴ細胞を再刺激して、刺激していないＴ細胞との比較を行った。Ｂｘｐｃ３細胞の場合、細胞障害活性の持続（図１９Ｂ）を伴う優れた増殖（図１９Ａ）がＡ２０−２８ｚ／Ｔ１Ｅ−ＣＤ２７Ｔ細胞で観察された。一方、Ｐａｎｃ１細胞の場合、細胞障害活性の持続（図１９Ｂ）を伴う優れた増殖（図１９Ａ）がＡ２０−２８ｚ／Ｔ１Ｅ−ＣＤ２７Ｔ細胞で観察された。これらのデータから、ＴＮＦ受容体ファミリーの追加メンバーもｐＣＡＲ形式を用いた共刺激を伝達できることが証明される。

実施例１
ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、およびたとえばトリプルネガティブ乳癌などの一部の固形腫瘍に過剰発現するＣＳＦ−１受容体（ｃ−ＦＭＳによりコードされる）を標的とする一連のＣＡＲを調製した。これらを概略的に図１に示す。これらの一連のＣＡＲは、標的化部分として２つの天然リガンドＣＳＦ−１またはＩＬ−３４の何れかを有する第二世代および第三世代ＣＡＲの両方を含んでいた。ＣＳＦ−１およびＩＬ−３４の両方がＣＳＦ−１受容体に結合するが、ＩＬ−３４の方がかなり高い親和性（ＣＳＦ−１より３４倍高い）で結合する。

コンストラクトＳＦＧ Ｃ２８ζおよびＳＦＧ ＣＴｒをＳＦＧ レトロウイルスベクターにＮｃｏＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローニングし、その開始コドンは、除去したｅｎｖ遺伝子が以前にあった、天然に存在するＮｃｏＩ部位にあるようにする。遺伝子発現は、プロモーター活性を有するモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）から達成され、ＲＮＡのウイルスパッケージングは、スプライス供与部位とスプライス受容部位とに挟まれたＭｏＭＬＶ Ψパッケージングシグナルにより確保される。

他のコンストラクトは、すべてポリメラーゼ不完全プライマー伸長（ＰＩＰＥ）クローニング法を用いて設計およびクローニングした。ＰＩＰＥクローニング法は、従来の制限酵素およびライゲーションに依存したクローニング法に代わるＰＣＲを用いたクローニング法である。ＰＩＰＥクローニング法では、追加の不要な残基を発現タンパク質にコードする可能性がある制限部位を組み込む必要がない。ＰＩＰＥ法は、おそらくｄＮＴＰの利用率の低下によると考えられる、ＰＣＲ反応の最終サイクルにおける増幅プロセスの非効率性に依存しており、その結果、５’末端オーバーハングを有する一部一本鎖（ＰＩＰＥ）ＰＣＲ産物が生成される。１組のベクター特異的プライマーを使用してＰＣＲベクターを線状化し、次いで５’ベクター末端の重複配列を有するもう１組のプライマーを使用してインサートを増幅し、ＰＩＰＥにより不完全な伸長産物を得た。次のステップでＰＩＰＥ産物を混合し、一本鎖重複配列がアニールし、完全なＳＦＧ ＣＡＲコンストラクトとしてアセンブルされた。クローニングの成功は、診断制限消化（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）により確認した。ＤＮＡシーケンシングをすべてのコンストラクトについて行って、予想されたコード配列が存在し、ＰＣＲによる変異がまったくないことを確認した（Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）。

パネルには、ＣＳＦ−１またはＩＬ−３４が２８ｚおよび４−１ＢＢにまたはその逆に連結された２つの「二重標的化」キメラ活性化受容体（ｐＣＡＲ）が含まれていた。次いで、二重標的化ｐＣＡＲ組み合わせを、トーセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ）（Ｔ）２Ａを含むレトロウイルスベクターを用いて同一のＴ細胞集団において化学量論的に共発現させた。これらのＣＡＲの一方を「Ｃ３４Ｂ」（ＣＳＦ１−２８ｚプラスＩＬ３４−４１ＢＢ）と命名し、他方を「３４ＣＢ」（ＩＬ３４−２８ｚプラスＣＳＦ１−４１ＢＢ）と命名した。

これらの二重標的化ＣＡＲ Ｔ細胞では、共刺激モチーフ（ＣＤ２８／４−１ＢＢ）を膜に近いそれらの天然の位置に置き、物理的に相互に分離して、同一のＴ細胞内で共発現させる。

ＣＡＲのすべては、追加のＴ２Ａエレメントを含むベクターを用いてＩＬ−４応答性４αβ受容体と共発現させた。これによりＩＬ−４を用いたＴ細胞の富化／増殖が可能になり、選択後のこれらの多様な細胞集団の機能が比較しやすくなる。

本実験の主な焦点は、ＦＭＳ／ＣＳＦ−１受容体標的を発現するかまたは欠いている腫瘍標的細胞を用いて繰り返される再刺激に対するＴ細胞の挙動を試験することであった。各サイクルにおいて、１００万個の表記のＩＬ−４により増殖したＣＡＲ Ｔ細胞をＲＰＭＩ＋ヒトＡＢ血清に懸濁し、抗原発現標的（Ｔ４７Ｄ ＦＭＳ）または抗原なし標的（Ｔ４７Ｄ）のコンフルエントな単層（２４ウェルディッシュ）で培養した。

その後、ＣＡＲ Ｔ細胞が生存し続けて単層を破壊した場合、１００万個のＴ細胞を採取し、毎週同じ方法で再刺激した。総細胞数は、週１回のサイクルごとに起こったＴ細胞の増殖に応じて各時点で推定した。

これらの実験のすべてを通して、ＩＬ−２またはＩＬ−４などの任意の外来性サイトカインの非存在下でＴ細胞を培養したため、Ｔ細胞は、生存し続けて増殖するためにそれ自体のサイトカインを産生しなければならなかった。サイトカイン（ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２）産生を、Ｔ細胞／腫瘍細胞共培養物から回収した上清においてＥＬＩＳＡにより測定し、効果的な共刺激の第２のマーカーを得た。

標的（ＦＭＳによりコードされるＣＳＦ−１受容体）を発現する腫瘍単層へのＣＡＲの最初の曝露で、殺すと予想されたＣＡＲはすべてそうすることが分かった（図２）（１２回の実験をプールしたデータ）。対照はＵＴ（形質導入していない）、Ｐ４（無関係な抗原、ＰＳＭＡを標的とする）、および細胞内ドメインが切断されたＣＴ４である。予想通り、ＣＳＦ−１受容体を欠いている腫瘍細胞（Ｔ４７Ｄ）を殺すＣＡＲ Ｔ細胞はない。

代表的な再刺激実験を図３に示す。７回の実験をプールした再刺激データを図４に示す。この場合、第１のサイクルにおける増殖は大部分のコンストラクトで類似していたが、ＩＬ−３４標的第二世代および第三世代コンストラクトはより少なかった。これは、ＩＬ−３４標的化部分の親和性が高すぎるためであり得る。

しかしながら、その後のサイクルでは、Ｃ３４Ｂ二重ｐＣＡＲ組み合わせ（ＣＳＦ−１標的２８ｚ第二世代ＣＡＲがＩＬ−３４標的４−１ＢＢ共刺激モチーフと共発現したもの）の明確な優位性が一貫して明らかになった。

図３に示す実験では、各再刺激サイクル時から２４時間後に上清を集め、サイトカイン含量（ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２）についてＥＬＩＳＡにより解析した。残存腫瘍細胞生存率の割合をＭＴＴアッセイにより測定した（代表的な例を図５に示す）。サイトカイン産生の結果を図６に示す。Ｃ３４Ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞のみが各刺激サイクル全体を通してＩＬ−２を作る能力を保持することが分かった。これは、最初のサイクル後、それ以外のＣＡＲ組み合わせのすべてで失われた。繰り返される再刺激を通してＩＬ−２を作る能力が持続的に保持されることは、ＣＡＲ Ｔ細胞では通常見られず、これは、こうした二重共刺激の伝達がｉｎ ｖｉｔｒｏでこれらの細胞の分化を基本的に変化させ、アネルギーの発生を遅延させることを示唆する。

連続サイクルのＡｇ刺激による単層破壊後の生存Ｔ細胞数もモニターし、結果を図５に示す。第２のサイクルの再刺激後、Ｃ３４Ｂを除くすべてのＣＡＲが、ＣＳＦ−１Ｒ依存性の腫瘍細胞殺傷を達成する能力を失い始める。一方、Ｃ３４Ｂを発現するＴ細胞は、本細胞傷害性アッセイにおいて最大１３の反復サイクルの再刺激で抗原依存性の潜在力を保持するが、改変していないＴ４７Ｄ細胞に対してＴ細胞毒性を誘導しない。

さらに、これらのＴ細胞上のいわゆる「疲弊マーカー」（ＰＤ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４およびＬＡＧ３）についてもフローサイトメトリーにより測定した。結果を図１０〜１３に示す。予想通り、様々な疲弊マーカーを発現したＴ細胞の割合は、再刺激したＴ細胞で徐々に増加したものの、これが抗原刺激時のＣ３４Ｂ細胞による増殖、腫瘍細胞破壊またはサイトカイン放出を遅らせることはなかった。これは、Ｃ３４Ｂの優れた機能が疲弊マーカーのアップレギュレーションの遅延の結果でないことを示唆する。

要約すると、本発明のｐＣＡＲアプローチは、より多くのサイクルの再刺激を介して抗原に対する応答性を細胞が保持する状態に細胞を維持すると思われる。ｐＣＡＲアプローチは、制御された記憶状態を超える分化を遅らせ得る傾向があり、かつ細胞が活性化時にＩＬ−２を作る能力を保持しながら、アネルギーの発生を遅延させるようである。

実施例２
ｉｎ ｖｉｖｏでの作用の解析
上記の実施例１に使用した一連のＣＡＲについて、ＣＳＦ−１受容体標的を低レベルで発現し、かつ疾患がリンパ節全体に散在する、高悪性度ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植モデルを用いて抗腫瘍活性を試験した（図７）。腫瘍細胞にホタルルシフェラーゼタグを付加し、疾患負荷の非侵襲的モニタリングを可能にした。

ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウスを６群に無作為に割り付け（３回以上の独立した実験を合わせて各群９匹）、２００μＬのＰＢＳに再懸濁した２×１０^６個のＫ２９９腫瘍細胞を静脈内に（ＩＶ）接種した。５日目、各群を下記に示した治療レジメン：
・Ｃ４Ｂ群：２０×１０^６個のＣ４Ｂ Ｔ細胞 ＩＶ
・Ｃ３４Ｂ群：２０×１０^６個のＣ３４Ｂ Ｔ細胞 ＩＶ
・４３４２８Ｂｚ：２０×１０^６個の４３４２８Ｂｚ Ｔ細胞 ＩＶ
・３４ＣＢ群：２０×１０^６個の３４ＣＢ Ｔ細胞 ＩＶ
・ＵＴ（形質導入していない）群：２０×１０^６個の形質導入していないＴ細胞 ＩＶ
・ＮＴ（無処置）群：２００μＬ ＰＢＳ ＩＶ
の１つで処置した。

腫瘍成長は、本研究の期間中の適切な時点で生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いてモニターした。

結果を図８に示す。この場合も、最高の効果を発揮した系はｐＣＡＲ、Ｃ３４Ｂの系であり、ＢＬＩ発光の平均値の低さ（図８Ａ〜Ｂ）、腫瘍進行の遅延または腫瘍退縮が見られ、マウスの生存の長期化につながった（図８Ｃ）。

実験を通して動物の体重を測定したが、著しい毒性は示されかなった（図９）。

実施例３
αｖβ６依存性にＴ細胞活性化を誘導するｐＣＡＲを操作するための標的化部分の選択
αｖβ６インテグリンを単独または伸長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ＥｒｂＢファミリーと一緒に標的とする一連のＣＡＲを調製した。これらを図１４に概略的に示す。この事例に使用した結合エレメントは、口蹄疫ウイルス（血清型０１ ＢＦＳ）由来のカプシドタンパク質ＶＰ１のＧＨループに由来するＡ２０ペプチド（配列番号１１）であった（米国特許第８，９２７，５０１号明細書）。これをＣＤ１２４シグナルペプチドの下流に置き、ＣＤ２８およびＣＤ３ζ細胞内ドメインと融合して第二世代ＣＡＲ、Ａ２０−２８ζを形成した。同様のコンストラクトを含むが、重要なＲＧＤＬモチーフをＡＡＡＡで置き換えてスクランブルした標的化ペプチド（Ｃ２０と命名される）を用いて対照（Ｃ２０−２８ζ）を調製した。第２の対照は、ＣＤ２８切断細胞内ドメインと融合したＡ２０（Ａ２０−Ｔｒ）を含んでいた。

本発明のｐＣＡＲ（ＴＩＥ−４１ＢＢ／Ａ２０−２８ｚと命名される）を作製するため、Ａ２０−２８ｚを、ＣＤ８α膜貫通ドメインおよび４１ＢＢ細胞内ドメインと融合したｐａｎ−ＥｒｂＢ標的ペプチド（Ｔ１Ｅ）を含むキメラ共刺激受容体と共発現させた。

記載がある場合、ＣＡＲは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−４を介した富化を可能にするために４αβキメラサイトカイン受容体と共発現させた。ＩＬ−４受容体α細胞外ドメインをＩＬ−２／１５共有受容体βの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと融合したＩＬ−４応答性４αβキメラサイトカイン受容体の等モル共発現は、トーセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ）（Ｔ）２Ａリボソームスキップペプチドを用いて達成した。これらのキメラ分子をレトロウイルス遺伝子導入によりヒトＴ細胞で発現させた。

癌細胞株Ａ３７５のインテグリン発現パターンを、フローサイトメトリーを用いて評価し（図１５）、これらをαｖβ６陰性（Ｐａｎｃ１およびＡ３７５ ｐｕｒｏ）またはαｖβ６陽性（Ｂｘｐｃ３およびＡ３７５ ｐｕｒｏ β６）腫瘍細胞に分けた。これらの細胞をＣＡＲ Ｔ細胞と１：１のエフェクター：ターゲット比で２４時間、２８時間または７２時間共培養し、その後、細胞毒性をＭＴＴアッセイにより評価し、未処理腫瘍細胞と比較して示した。結果を図１６に示す。

これらのデータから、Ａ２０−２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞がαｖβ６インテグリンを発現するすべての標的細胞（Ｂｘｐｃ３およびＡ３７５ β６ ｐｕｒｏ）を殺すが、このインテグリンを欠いている標的（Ｐａｎｃ１およびＡ３７５ ｐｕｒｏ）を殺さないことが示される。第２に、本アッセイにおいて対照ＣＡＲ Ｃ２０〜２８ｚおよびＡ２０−Ｔｒは不活性である。第３に、Ｔ１Ｅ−４１ＢＢ／Ａ２０−２８ｚ ｐＣＡＲを発現するＴ細胞は、αｖβ６インテグリンを発現する標的細胞（Ｂｘｐｃ３およびＡ３７５ β６ ｐｕｒｏ）の効果的殺傷を引き起こす。これらの結果はすべて予想通りである。一方、特記される点として、Ｔ１Ｅ−４１ＢＢ／Ａ２０−２８ｚ ｐＣＡＲを発現するＴ細胞は、αｖβ６を欠いている標的細胞（Ｐａｎｃ１およびＡ３７５ ｐｕｒｏ）の殺傷も引き起こす。これは、ｐＣＡＲの立体配置内のＡ２０ペプチドが低親和性の非αｖβ６インテグリンに結合する能力が、これらの操作したＴ細胞の活性化を引き起こすのに十分であることの表れである。

次いで、ｐＣＡＲおよび対照操作したＴ細胞のＩＦＮ−γの産生を評価した。αｖβ６を欠いた（Ｐａｎｃ１およびＡ３７５ ｐｕｒｏ）またはαｖβ６を発現した（Ｂｘｐｃ３およびＡ３７５ ｐｕｒｏ β６）腫瘍細胞を、遺伝子操作Ｔ細胞と１：１のエフェクター：ターゲット比で共培養し、２４時間、４８時間または７２時間後に上清を集めた。ＩＦＮ−γのレベルをＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により定量した。結果を図１７に示す。予想通り、対照が産生したＩＦＮ−γの量はわずかであった一方、Ａ２０−２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、αｖβ６陽性（Ｂｘｐｃ３およびＡ３７５ ｐｕｒｏ β６）腫瘍細胞と培養した場合にＩＦＮ−γを放出した。特記される点として、本発明のｐＣＡＲ、ＴＩＥ−４１ＢＢ／Ａ２０ｚを発現するＴ細胞は、αｖβ６陽性（Ｂｘｐｃ３）腫瘍細胞と培養した場合、Ａ２０−２８ｚ Ｔ細胞より多くのＩＦＮ−γを産生する。さらに、ＴＩＥ−４１ＢＢ／Ａ２０ｚ^＋Ｔ細胞は、αｖβ６陰性（Ｐａｎｃ１およびＡ３７５ ｐｕｒｏ）腫瘍細胞と培養した場合もＩＦＮ−γを産生した。ここでもまた、このことから、ｐＣＡＲの立体配置内の非αｖβ６インテグリンに対するＡ２０ペプチドの低親和結合が、これらの操作したＴ細胞の活性化を引き起こすのに十分であることが立証される。

次に、ＣＡＲ Ｔ細胞集団をＰａｎｃ１（αｖβ６陰性）またはＢｘｐｃ３（αｖβ６陽性）腫瘍細胞上でＩＬ−２添加物の非存在下、２週間に１回再刺激した。腫瘍細胞を、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の患者に由来するＣＡＲ Ｔ細胞と１：１のエフェクター：ターゲット比で共培養した（図１８）。Ｔ細胞を最初に２×１０^５細胞／ウェルで加え、共培養から７２時間後にカウントして増殖を評価した（上図）。細胞毒性は、Ｔ細胞の添加後の７２時間でＭＴＴアッセイにより評価した（下図）。十分な数のＴ細胞（２×１０^５）が存在した場合、Ｔ細胞を新鮮な腫瘍単層上で再刺激し、さらに７２時間後にこのプロセスを繰り返した。

結果を図１８に示す。これらから、Ａ２０−２８ｚ／Ｔ１Ｅ−４１ＢＢ^＋Ｔ細胞がＩＬ−２放出（データ示さず）およびαｖβ６^＋Ｂｘｐｃ３細胞の破壊を伴い数回の増殖を行うことが例証される。ここでもまた、Ａ２０−２８ｚ／Ｔ１Ｅ−４１ＢＢ^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２放出およびＰａｎｃ１腫瘍細胞の破壊を伴う数回の増殖も行った。

全体として、これらの結果から、Ａ２０−２８ｚ／Ｔ１Ｅ−４１ＢＢを含むｐＣＡＲは、αｖβ６を標的とする第二世代ＣＡＲと比較してｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能性の向上を示すことが明らかに示された。さらに、Ａ２０−２８ｚ／Ｔ１Ｅ−４１ＢＢ^＋Ｔ細胞は、このインテグリンを微小レベルから検出不可能なレベルで発現するＰａｎｃ１またはＡ３７５ ｐｕｒｏ細胞によっても活性化を受ける。Ｃ３４Ｂ ｐＣＡＲ（実施例１および２）を用いて得られた知見と合わせて考えると、これは、ｐＣＡＲの立体配置が、４１ＢＢ ＣＣＲによる高親和性結合の相互作用が起こると同時に、２８ｚ第二世代ＣＡＲによる低親和性の相互作用が起こると、連続的な再刺激時にＴ細胞活性化が起こることを可能にすることの表れである。

実施例４
機能的ｐＣＡＲを操作するための代替のＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＣＤ２７の使用
Ａ２０−２８ｚ／Ｔ１Ｅ−４１ＢＢ ｐＣＡＲを出発材料として使用して、４１ＢＢモジュールをＴＮＦ受容体ファミリーの代替メンバー、すなわちＣＤ２７またはＣＤ４０で置き換えた別のｐＣＡＲを操作した。細胞内ドメインを切断した（ｔｒ）対照ｐＣＡＲを操作した。αｖβ６を発現する（Ｂｘｐｃ３）または欠いている（Ｐａｎｃ１）標的細胞を２４ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０^４細胞の密度で蒔いた。２４時間後、５×１０^４個のｐＣＡＲ Ｔ細胞を、外来性サイトカイン添加物を用いずに標的細胞または空ウェル（「刺激していない」）に加えた。さらに７２時間後、Ｔ細胞をウェルから回収し、カウントした（図１９Ａ）。ＭＴＴアッセイを行って残存標的細胞の生存割合を判定し、Ｔ細胞を添加せずに蒔いてあった対照標的細胞と比較した（図１９Ｂ）。各刺激サイクル後にＴ細胞が増殖した場合、上記の通りに新鮮な標的細胞上で再刺激した。ｐＣＡＲ Ｔ細胞の増殖（図１９Ａ）およびＭＴＴアッセイ（図１９Ｂ）は、前の場合と同様に７２時間後に行った。ｐＣＡＲ Ｔ細胞の反復再刺激および標的細胞殺傷の評価は、このように７２時間の各サイクル期間にわたりＴ細胞がもはや増殖しなくなるまで継続した。

これらのデータから、Ｔ細胞がＰａｎｃ１標的細胞上で刺激されるときにＴ細胞増殖および腫瘍細胞殺傷の持続により示される、Ａ２０−２８ｚ／Ｔ１Ｅ−４１ＢＢ ｐＣＡＲの優れた機能性がここでもまた確認される。このことから、非αｖβ６インテグリンに対するＡ２０ペプチドの低親和性結合は、これらの操作したＴ細胞の活性化を引き起こすのに十分であることもさらに確認される。一方、特記される点として、Ａ２０−２８ｚ／Ｔ１Ｅ−ＣＤ２７ ｐＣＡＲは、αｖβ６を発現するＢｘｐｃ３細胞上で再刺激されると、最大レベルの増殖（図１９Ａ）および腫瘍細胞殺傷の持続（図１９Ｂ）を達成した。一方、ＣＤ４０を用いたｐＣＡＲは、これらのアッセイにおいて中程度の機能を示した。総合すると、これらのデータから、ＣＤ２７または４１ＢＢが例示されるいくつかのＴＮＦ受容体ファミリーメンバーを利用して、優れた機能性を示すｐＣＡＲを操作できることが立証される。

Claims (21)

1. 免疫応答細胞において、
   （ｉ）第二世代キメラ抗原受容体であって、
   （ａ）シグナル伝達領域；
   （ｂ）共刺激シグナル伝達領域；
   （ｃ）膜貫通ドメイン；および
   （ｄ）標的抗原上の第１のエピトープと特異的に相互作用する結合エレメント
   を含む第二世代キメラ抗原受容体と、
   （ｉｉ）キメラ共刺激受容体であって、
   （ｅ）（ｂ）の共刺激シグナル伝達領域と異なる共刺激シグナル伝達領域；
   （ｆ）膜貫通ドメイン；および
   （ｇ）標的抗原上の第２のエピトープと特異的に相互作用する結合エレメント
   を含むキメラ共刺激受容体と
   を発現することを特徴とする免疫応答細胞。
2. 請求項１に記載の免疫応答細胞において、Ｔ細胞であることを特徴とする免疫応答細胞。
3. 請求項１または２に記載の免疫応答細胞において、前記シグナル伝達領域（ａ）は、ヒトＣＤ３［ゼータ］鎖の細胞内ドメインまたはその変異体を含むことを特徴とする免疫応答細胞。
4. 請求項１乃至３の何れか１項に記載の免疫応答細胞において、（ｂ）および（ｅ）の共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＲ３またはＣＤ４０から選択されることを特徴とする免疫応答細胞。
5. 請求項４に記載の免疫応答細胞において、（ｂ）または（ｅ）の一方はＣＤ２８であり、および他方は４−１ＢＢまたはＯＸ４０であることを特徴とする免疫応答細胞。
6. 請求項５に記載の免疫応答細胞において、（ｂ）はＣＤ２８であることを特徴とする免疫応答細胞。
7. 請求項５または６に記載の免疫応答細胞において、（ｅ）は４−１ＢＢまたはＣＤ２７であることを特徴とする免疫応答細胞。
8. 請求項１乃至７の何れか１項に記載の免疫応答細胞において、（ｃ）および（ｆ）の前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインおよびＣＤ２８膜貫通ドメインから選択されることを特徴とする免疫応答細胞。
9. 請求項１乃至８の何れか１項に記載の免疫応答細胞において、前記第１および第２のエピトープは、同一の受容体または抗原と関連付けられていることを特徴とする免疫応答細胞。
10. 請求項１乃至９の何れか１項に記載の免疫応答細胞において、キメラサイトカイン受容体を共発現することを特徴とする免疫応答細胞。
11. 請求項１０に記載の免疫応答細胞において、前記キメラサイトカイン受容体は４αβであることを特徴とする免疫応答細胞。
12. 請求項１乃至１１の何れか１項に記載の免疫応答細胞において、結合エレメント（ｄ）または結合エレメント（ｇ）の少なくとも１つは、ＥｒｂＢ２量体のリガンド、コロニー刺激因子−１の受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）またはα_ｖβ_６インテグリン特異的結合剤であることを特徴とする免疫応答細胞。
13. 請求項１乃至１２の何れか１項に記載の免疫応答細胞において、結合エレメント（ｄ）はＣＳＦ−１を含み、および結合エレメント（ｇ）はＩＬ−３４を含むことを特徴とする免疫応答細胞。
14. 請求項１乃至１２の何れか１項に記載の免疫応答細胞において、結合エレメント（ｄ）は、α_ｖβ_６インテグリン特異的結合剤であって、配列モチーフ
    ＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６Ｌ（配列番号７）、または
    ＲＧＤＬＸ^５Ｘ^６Ｉ（配列番号８）
    を含むペプチドであり、ＬＸ^５Ｘ^６ＬまたはＬＸ^５Ｘ^６Ｉは、αヘリックス構造内に含まれ、Ｘ^５およびＸ^６はヘリックス促進残基である、α_ｖβ_６インテグリン特異的結合剤であり、および結合エレメント（ｇ）はＴＩＥペプチドであることを特徴とする免疫応答細胞。
15. 請求項１乃至１４の何れか１項に記載の免疫応答細胞において、結合エレメント（ｄ）の結合親和性は結合エレメント（ｇ）の結合親和性より低いことを特徴とする免疫応答細胞。
16. 請求項１乃至１５の何れか１項に記載の免疫応答細胞を調製するための方法において、請求項１に定義された構造（ｉ）のＣＡＲをコードする第１の核酸およびまた請求項１に定義された構造（ｉｉ）のＣＣＲをコードする第２の核酸を細胞に形質導入するステップを含むことを特徴とする方法。
17. 請求項１６に記載の方法において、前記免疫応答細胞はキメラサイトカイン受容体を含み、増殖ステップは、サイトカインの存在下で行われることを特徴とする方法。
18. 組み合わせにおいて、請求項１に定義された（ｉ）のＣＡＲをコードする第１の核酸と、請求項１に定義された（ｉｉ）のＣＣＲをコードする第２の核酸との組み合わせであることを特徴とする組み合わせ。
19. ベクターまたはベクターの組み合わせにおいて、請求項１８に記載の組み合わせを含むことを特徴とするベクターまたはベクターの組み合わせ。
20. キットにおいて、請求項１８または１９に記載の組み合わせを含むことを特徴とするキット。
21. 標的細胞集団に対するＴ細胞性免疫応答の刺激を、それを必要とする患者において行うための方法において、上記のような請求項１乃至１５の何れか１項に記載の免疫応答細胞を前記患者に投与するステップを含み、前記結合エレメント（ｄ）および（ｇ）は標的細胞に特異的であることを特徴とする方法。

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